(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-03-29
(54)【発明の名称】オリゴペプチドリンカー中間体及びその製造方法
(51)【国際特許分類】
C07K 4/00 20060101AFI20220322BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20220322BHJP
C07F 7/10 20060101ALN20220322BHJP
【ＦＩ】
C07K4/00
A61K47/68
C07F7/10 A
C07F7/10 L
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2019572784
(86)(22)【出願日】2019-10-23
(85)【翻訳文提出日】2020-01-20
(86)【国際出願番号】 CN2019112671
(87)【国際公開番号】W WO2021077317
(87)【国際公開日】2021-04-29
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】519463064
【氏名又は名称】煙台邁百瑞国際生物医薬股▲ふん▼有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＭａｂＰｌｅｘ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．
【住所又は居所原語表記】Ｎｏ．６０， Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｍｉｄｄｌｅ Ｒｏａｄ， Ｙａｎｔａｉ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｚｏｎｅ， Ｙａｎｔａｉ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｃｈｉｎａ（Ｓｈａｎｄｏｎｇ） Ｐｉｌｏｔ Ｆｒｅｅ Ｔｒａｄｅ Ｚｏｎｅ Ｙａｎｔａｉ， Ｓｈａｎｄｏｎｇ ２６４００６ Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】110000084
【氏名又は名称】特許業務法人アルガ特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】李 楽楽
(72)【発明者】
【氏名】黄 長江
【テーマコード（参考）】
4C076
4H045
4H049
【Ｆターム（参考）】
4C076AA95
4C076CC41
4C076EE59
4C076FF68
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA09
4H045DA76
4H045EA20
4H049VN01
4H049VP01
4H049VQ38
4H049VR24
4H049VU06
(57)【要約】
本発明は、新たなオリゴペプチド類リンカー中間体及びその製造方法を提供し、当該オリゴペプチド類中間体の製造方法は、反応条件が温和で、容易に実現され、反応において副反応がほとんどなく、不純物が少なく、生成物が純粋で精製しやすく、予想外の技術効果がある。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
構造式（１）～（４）で表されるオリゴペプチドリンカー中間体。【化1】
【請求項2】
前記ＡＡ1、ＡＡ2、ＡＡ3、ＡＡ4は、それぞれ独立に、－バリン－（－Ｖａｌ－）、－シトルリン－（－Ｃｉｔ－）、－アラニン－（－Ａｌａ－）、－リシン－（－Ｌｙｓ－）、－リシン（トリチル）－（－Ｌｙｓ（Ｔｒｔ）－）、－リシン（モノメトキシトリチル）－（－Ｌｙｓ（Ｍｍｔ）－）、－リシン（フルオレニルメチルオキシカルボニル）－（－Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）－）、－アルギニン－（－Ａｒｇ－）、－フェニルアラニン－（－Ｐｈｅ－）、－グリシン－（－Ｇｌｙ－）、－ロイシン－（－Ｌｅｕ－）、－イソロイシン－（－Ｉｌｅ－）から選ばれる、ことを特徴とする請求項１に記載のオリゴペプチドリンカー中間体。
【請求項3】
前記－ＡＡ1－ＡＡ2－は、－バリン－シトルリン－（－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－）、－バリン－アラニン－（－Ｖａｌ－Ａｌａ－）、－バリン－リシン－（－Ｖａｌ－Ｌｙｓ－）、－バリン－リシン（トリチル）－（－Ｖａｌ－Ｌｙｓ（Ｔｒｔ）－）、－バリン－リシン（モノメトキシトリチル）－（－Ｖａｌ－Ｌｙｓ（Ｍｍｔ）－）、－バリン－リシン（フルオレニルメチルオキシカルボニル）－（－Ｖａｌ－Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）－）、－バリン－アルギニン－（－Ｖａｌ－Ａｒｇ－）、－フェニルアラニン－シトルリン－（－Ｐｈｅ－Ｃｉｔ－）、－フェニルアラニン－リシン－（－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ－）、－フェニルアラニン－リシン（トリチル）－（－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ（Ｔｒｔ）－）、－フェニルアラニン－リシン（モノメトキシトリチル）－（－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ（Ｍｍｔ）－）、－フェニルアラニン－リシン（フルオレニルメチルオキシカルボニル）－（－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）－）、ロイシン－シトルリン－（－Ｌｅｕ－Ｃｉｔ－）、イソロイシン－シトルリン－（－Ｉｌｅ－Ｃｉｔ－）、－フェニルアラニン－アルギニン－（－Ｐｈｅ－Ａｒｇ－）から選ばれ、前記－ＡＡ1－ＡＡ2－ＡＡ3－は、－フェニルアラニン－アルギニン－アルギニン－（－Ａｌａ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－）から選ばれ、前記－ＡＡ1－ＡＡ2－ＡＡ3－ＡＡ4－は、－グリシン－グリシン－フェニルアラニン－グリシン－（－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－）、－グリシン－フェニルアラニン－ロイシン－グリシン－（－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ－）、－アラニン－ロイシン－アラニン－ロイシン（－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－）から選ばれる、ことを特徴とする請求項２に記載のオリゴペプチドリンカー中間体。
【請求項4】
前記オリゴペプチドリンカー中間体は、以下の構造を含む、ことを特徴とする請求項３に記載のオリゴペプチドリンカー中間体。【化2】
【化3】
【請求項5】
抗体薬物複合体に用いられるリンカーの前駆体が請求項１～４のいずれか１項に記載のオリゴペプチドリンカー中間体である、抗体薬物複合体。
【請求項6】
請求項１に記載の構造式（１）～（３）で表されるオリゴペプチドリンカー中間体の製造方法であって、反応経路は、１）カルボニル化試薬及び２－（トリメチルシリル）エタノールを順にアミノ酸ＡＡ1、アミノ酸ＡＡ2と、又は順にアミノ酸ＡＡ1、アミノ酸ＡＡ2、アミノ酸ＡＡ3と、又は順にアミノ酸ＡＡ1、アミノ酸ＡＡ2、アミノ酸ＡＡ3、アミノ酸ＡＡ4と縮合反応させて２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－オリゴペプチド縮合物を得、
２）反応で得られた２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－オリゴペプチド縮合物をｐ－アミノベンジルアルコールと反応させて２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－オリゴペプチド－ｐ－アミノベンジルアルコール縮合物を得ることであり、
ここで、前記カルボニル化試薬は、任意のカルボニル基を含む化合物である、製造方法。
【請求項7】
前記構造式（１）で表されるオリゴペプチドリンカー中間体の反応経路は、以下の通りであり、【化4】
１）カルボニル化試薬を２－（トリメチルシリル）エタノール及びアミノ酸ＡＡ1と縮合反応させて２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－アミノ酸縮合物を得るステップと、
２）２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－アミノ酸縮合物とアミノ酸ＡＡ2とを縮合反応させて２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－ジペプチド縮合物を得るステップと、
３）２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－ジペプチド縮合物とｐ－アミノベンジルアルコールとを縮合反応させて２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－ジペプチド－ｐ－アミノベンジルアルコール縮合物を得るステップとを含む、ことを特徴とする請求項６に記載の製造方法。
【請求項8】
前記構造式（２）で表されるオリゴペプチドリンカー中間体の反応経路は、以下の通りであり、【化5】
１）カルボニル化試薬を２－（トリメチルシリル）エタノール及びアミノ酸ＡＡ1と縮合反応させて２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－アミノ酸縮合物を得るステップと、
２）２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－アミノ酸縮合物とアミノ酸ＡＡ2とを縮合反応させて２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－ジペプチド縮合物を得るステップと、
３）２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－ジペプチド縮合物とアミノ酸ＡＡ3とを縮合反応させて２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－トリペプチド縮合物を得るステップと、
４）２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－トリペプチド縮合物とｐ－アミノベンジルアルコールとを縮合反応させて２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－トリペプチド－ｐ－アミノベンジルアルコール縮合物を得るステップとを含む、ことを特徴とする請求項６に記載の製造方法。
【請求項9】
前記構造式（３）で表されるオリゴペプチドリンカー中間体の反応経路は、以下の通りであり、【化6】
１）カルボニル化試薬を２－（トリメチルシリル）エタノール及びアミノ酸ＡＡ1と縮合反応させて２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－アミノ酸縮合物を得るステップと、
２）２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－アミノ酸縮合物とアミノ酸ＡＡ2とを縮合反応させて２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－ジペプチド縮合物を得るステップと、
３）２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－ジペプチド縮合物とアミノ酸ＡＡ3とを縮合反応させて２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－トリペプチド縮合物を得るステップと、
４）２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－トリペプチド縮合物とアミノ酸ＡＡ4とを縮合反応させて２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－テトラペプチド縮合物を得るステップと、
５）２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－テトラペプチド縮合物とｐ－アミノベンジルアルコールとを縮合反応させて２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－テトラペプチド－ｐ－アミノベンジルアルコール縮合物を得るステップとを含む、ことを特徴とする請求項６に記載の製造方法。
【請求項10】
請求項１に記載の構造式（４）で表されるオリゴペプチドリンカー中間体の製造方法であって、反応経路は、カルボニル化試薬及び２－（トリメチルシリル）エタノールを順にアミノ酸ＡＡ1、アミノ酸ＡＡ2、アミノ酸ＡＡ3、アミノ酸ＡＡ4と縮合反応させて２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－テトラペプチド縮合物を得ることであり、ここで、前記カルボニル化試薬は、カルボニル基を含む任意の化合物である、製造方法。
【請求項11】
前記構造式（４）で表されるオリゴペプチドリンカー中間体の反応経路は、以下の通りであり、【化7】
１）カルボニル化試薬を２－（トリメチルシリル）エタノール及びアミノ酸ＡＡ1と縮合反応させて２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－アミノ酸縮合物を得るステップと、
２）２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－アミノ酸縮合物とアミノ酸ＡＡ2とを縮合反応させて２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－ジペプチド縮合物を得るステップと、
３）２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－ジペプチド縮合物とアミノ酸ＡＡ3とを縮合反応させて２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－トリペプチド縮合物を得るステップと、
４）２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－トリペプチド縮合物とアミノ酸ＡＡ4とを縮合反応させて２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－テトラペプチド縮合物を得るステップとを含む、ことを特徴とする請求項１０に記載の製造方法。
【請求項12】
前記カルボニル化試薬は、式（５）で表される構造を持つ、ことを特徴とする請求項６～１１のいずれか１項に記載の製造方法。【化8】
【請求項13】
前記カルボニル化試薬は、【化9】
【請求項14】
前記のＡＡ1、ＡＡ2、ＡＡ3、ＡＡ4は、それぞれ独立に、－バリン－（－Ｖａｌ－）、－シトルリン－（－Ｃｉｔ－）、－アラニン－（－Ａｌａ－）、－リシン－（－Ｌｙｓ－）、－リシン（トリチル）－（－Ｌｙｓ（Ｔｒｔ）－）、－リシン（モノメトキシトリチル）－（－Ｌｙｓ（Ｍｍｔ）－）、－リシン（フルオレニルメチルオキシカルボニル）－（－Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）－）、－アルギニン－（－Ａｒｇ－）、－フェニルアラニン－（－Ｐｈｅ－）、－グリシン－（－Ｇｌｙ－）、－ロイシン－（－Ｌｅｕ－）、－イソロイシン－（－Ｉｌｅ－）から選ばれる、ことを特徴とする請求項６～１１のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項15】
前記－ＡＡ1－ＡＡ2－は、－バリン－シトルリン－（－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－）、－バリン－アラニン－（－Ｖａｌ－Ａｌａ－）、－バリン－リシン－（－Ｖａｌ－Ｌｙｓ－）、－バリン－リシン（トリチル）－（－Ｖａｌ－Ｌｙｓ（Ｔｒｔ）－）、－バリン－リシン（モノメトキシトリチル）－（－Ｖａｌ－Ｌｙｓ（Ｍｍｔ）－）、－バリン－リシン（フルオレニルメチルオキシカルボニル）－（－Ｖａｌ－Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）－）、－バリン－アルギニン－（－Ｖａｌ－Ａｒｇ－）、－フェニルアラニン－シトルリン－（－Ｐｈｅ－Ｃｉｔ－）、－フェニルアラニン－リシン－（－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ－）、－フェニルアラニン－リシン（トリチル）－（－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ（Ｔｒｔ）－）、－フェニルアラニン－リシン（モノメトキシトリチル）－（－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ（Ｍｍｔ）－）、－フェニルアラニン－リシン（フルオレニルメチルオキシカルボニル）－（－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）－）、ロイシン－シトルリン－（－Ｌｅｕ－Ｃｉｔ－）、イソロイシン－シトルリン－（－Ｉｌｅ－Ｃｉｔ－）、－フェニルアラニン－アルギニン－（－Ｐｈｅ－Ａｒｇ－）から選ばれ、前記－ＡＡ1－ＡＡ2－ＡＡ3－は、－フェニルアラニン－アルギニン－アルギニン－（－Ａｌａ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－）から選ばれ、前記－ＡＡ１－ＡＡ２－ＡＡ３－ＡＡ４－は、－グリシン－グリシン－フェニルアラニン－グリシン－（－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－）、－グリシン－フェニルアラニン－ロイシン－グリシン－（－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ－）、－アラニン－ロイシン－アラニン－ロイシン（－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－）から選ばれる、ことを特徴とする請求項１４に記載の製造方法。
【請求項16】
前記－ＡＡ1－ＡＡ2－は、以下の構造から選ばれる、ことを特徴とする請求項１５に記載の製造方法。【化10】
【請求項17】
前記－ＡＡ1－ＡＡ2－ＡＡ3－は、以下の構造から選ばれる、請求項１５に記載の製造方法。【化11】
【請求項18】
前記－ＡＡ1－ＡＡ2－ＡＡ3－ＡＡ4－は、以下の構造から選ばれる、ことを特徴とする請求項１５に記載の製造方法。【化12】
【請求項19】
前記縮合反応で用いられる溶媒は、任意の極性溶媒又は非極性溶媒であり、好ましくは、前記溶媒が、テトラヒドロフラン、ジオキサン、アセトニトリル、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、ＤＭＡｃ、ＤＭＰＵ、ＨＭＰＡ、エチレングリコールジメチルエーテル、ジエチルエーテル、ｔ－ブチルメチルエーテル、ｔ－ブタノール、水、酢酸エチル、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素から選ばれる１種又は複数種であり、さらに好ましくは、前記溶媒が、テトラヒドロフラン、ジオキサン、アセトニトリル、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、水、メタノール、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、エタノールから選ばれる１種又は複数種である、ことを特徴とする請求項６～１８のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項20】
請求項１～４のいずれか１項に記載の中間体の、抗体薬物複合体の調製における応用。
【請求項21】
請求項６～１９のいずれか１項に記載の製造方法の、抗体薬物複合体の調製における応用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、抗体薬物複合体の分野に関し、具体的には、オリゴペプチドリンカーの製造方法及びその中間体に関する。
【背景技術】
【0002】
抗体薬物複合体（Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、ＡＤＣ）は、新たなタイプの生物医薬品として、モノクローナル抗体のターゲティング能力と低分子薬物の細胞毒性との強力な組み合わせを達成し、腫瘍標的療法の最も急速に成長している分野の１つになっている。ＡＤＣの三つのコンポーネント（抗体、細胞毒素及びリンカー）はともに標的薬物送達システムを構成し、中でも、リンカーの構築及び最適化は、この種の医薬品開発の鍵となる。リンカーは、ＡＤＣが細胞毒性薬を効果的に送達するための基盤であり、ＡＤＣ製品の毒性を決定する重要な要因でもあり、血液循環における薬物の早期放出は、全身毒性と治療指数の低下につながる可能性がある。既存のカップリング技術を最適化し、安定したリンカーを開発し、新たな毒素放出メカニズムを探索するなどにより、ＡＤＣに一般的に存在する、細胞毒素のオフターゲット及び薬剤耐性といった問題を解決するので、その薬効及び安全性をさらに向上させることが期待される。
【0003】
現在の段階では、オリゴペプチドを基づいて設計された分解可能なＡＤＣｓは、主流を占めており（文献１：Ｗａｎｇ Ｙ、 Ｆａｎ Ｓ、 Ｚｈｏｎｇ Ｗ、 ｅｔ ａｌ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｖａｌｉｎｅ－ａｌａｎｉｎｅ ｂａｓｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｗｉｔｈ ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌ ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ ｅ ａｓ ｔｈｅ ｐｏｔｅｎｔ ｐａｙｌｏａｄ［Ｊ］． Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｃｉｅｎｃｅｓ、 ２０１７、 １８（９）： １８６０．）、それは標的細胞リソソームのカテプシンＢにより分解して毒素を放出し、最終的に腫瘍を殺す。なお、オリゴペプチドリンカー（例えば、バリン－シトルリンジペプチド（Ｖａｌ－Ｃｉｔ、ＶＣ））は、各種のＡＤＣ薬のリンカーに広く使用されている。現在（２０１９年７月まで）、世界で承認されている５つの抗体薬物複合体（表１）において、シアトルジェネティクス社（Ｓｅａｔｔｌｅ）と武田薬品工業社のＢｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ及びジェネンテック（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）のＰｏｌａｔｕｚｕｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ－ｐｉｉｑのリンカーはいずれもオリゴペプチドリンカー（バリン－シトルリンジペプチド類リンカー）である。
【0004】
【表1】
【0005】
現在、オリゴペプチド類リンカーの合成方法は、主に３種があり（文献２：Ｍｏｎｄａｌ Ｄ、 Ｆｏｒｄ Ｊ、 Ｐｉｎｎｅｙ Ｋ Ｇ． Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ａ Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｂ Ｃｌｅａｖａｂｌｅ Ｄｉｐｅｐｔｉｄｅ Ｌｉｎｋｅｒ、 Ｗｉｄｅｌｙ Ｕｓｅｄ ｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ［Ｊ］． Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ｌｅｔｔｅｒｓ、 ２０１８、 ５９（４０）： ３５９４－３５９９．）、第一種は、Ｆｍｏｃ保護基の使用、第二種は、Ｃｂｚ保護基の使用、第三種は、Ｂｏｃ保護基の使用である。
【0006】
以下、バリン－シトルリンジペプチド類リンカーを例として上記３種の調製プロセスを述べる。
（１）Ｆｍｏｃ保護基の使用
（１）Ｆｍｏｃ保護基の使用
【0007】
【化1】
【0008】
当該方法は、まず、Ｆｍｏｃ－ＶａｌをＣｉｔと縮合させてＦｍｏｃ－Ｖａｌ－Ｃｉｔを生成し、さらに、ｐ－アミノベンジルアルコールと縮合してＦｍｏｃ－ Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢを得、次にＦｍｏｃを除去してＶａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢを得る。但し、当該方法は、Ｆｍｏｃ保護基を除去する場合に、一般的に低級アミン類を選択し、副生成物を容易に生成し、完全な除去が困難である。また、Ｆｍｏｃの強い紫外吸収は非常に強く、痕跡量で残留しても製品の純度測定に大きな影響を与える。
【0009】
（２）Ｃｂｚ保護基の使用
【化2】
【0010】
当該方法は、まず、Ｃｂｚ－ＶａｌをＣｉｔと縮合させてＣｂｚ－Ｖａｌ－Ｃｉｔを生成し、さらに、ｐ－アミノベンジルアルコールと縮合してＣｂｚ－ Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢを得、次にＣｂｚを除去してＶａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢを得る。但し、当該方法は、Ｃｂｚ保護基を除去する場合には、遷移金属による触媒が必要であり、最も一般的に使用される金属はＰｄであり、人体に有害であり、重金属の残留をもたらしやすく、除去しにくい。また、水素源を使用する必要もあり、最も一般的に使用されるのは水素ガスであり、爆発しやすく、事故リスクが高く、大規模な使用に不便である。他の水素源も用いられるが、使用中では、一部の水素ガスも放出し、安全性リスクが存在する。
【0011】
（３）Ｂｏｃ保護基の使用
【0012】
【化3】
【0013】
当該方法は、まず、Ｂｏｃ－ＶａｌをＣｉｔと縮合してＢｏｃ－Ｖａｌ－Ｃｉｔを生成し、さらに、ｐ－アミノベンジルアルコールと縮合してＢｏｃ－ Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢを得、次いでＢｏｃを除去してＶａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢを得る。但し、当該方法は、Ｂｏｃ保護基を除去する場合には、強酸を使用する必要があり、ＨＣｌ溶液及びトリフルオロ酢酸が最も一般的に使用される。Ｂｏｃ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢの分子中には、ベンジル位でのアルコール性ヒドロキシル基を有し、ＨＣｌの使用際に、アルコール性ヒドロキシル基の塩素化反応が起こり、対応する塩化ベンジルを生成し、製品の品質に影響を与える。トリフルオロ酢酸を使用する場合には、ベンジル位でのアルコールがエステル化反応を起こし、対応するトリフルオロ酢酸エステルを生成し、Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢを得るように追加の加水分解反応が必要であり、別に工程を増加し、また、塩基性加水分解はアミノ酸単位でのキラル中心をラセミ化するリスクがある。
【発明の概要】
【0014】
本発明は、上記の問題を解決するために、オリゴペプチド類リンカーを調製するための新しい方法を提供し、本発明で提供された、Ｔｅｏｃを保護基としてＶａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢを調製する方法は、反応条件が温和で、容易に実現され、反応において副反応がほとんどなく、不純物が少なく、生成物が純粋で精製しやすく、予想外の技術効果がある。
【0015】
具体的には、本発明は、構造式（１）～（４）で表されるオリゴペプチドリンカー中間体を提供する。
【0016】
【化4】
【0017】
さらに、前記のＡＡ1、ＡＡ2、ＡＡ3、ＡＡ4は、それぞれ独立に、－バリン－（－Ｖａｌ－）、－シトルリン－（－Ｃｉｔ－）、－アラニン－（－Ａｌａ－）、－リシン－（－Ｌｙｓ－）、－リシン（トリチル）－（－Ｌｙｓ（Ｔｒｔ）－）、－リシン（モノメトキシトリチル）－（－Ｌｙｓ（Ｍｍｔ）－）、－リシン（フルオレニルメチルオキシカルボニル）－（－Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）－）、－アルギニン－（－Ａｒｇ－）、－フェニルアラニン－（－Ｐｈｅ－）、－グリシン－（－Ｇｌｙ－）、－ロイシン－（－Ｌｅｕ－）、－イソロイシン－（－Ｉｌｅ－）から選ばれる。
【0018】
さらに、前記－ＡＡ1－ＡＡ2－は、－バリン－シトルリン－（－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－）、－バリン－アラニン－（－Ｖａｌ－Ａｌａ－）、－バリン－リシン－（－Ｖａｌ－Ｌｙｓ－）、－バリン－リシン（トリチル）－（－Ｖａｌ－Ｌｙｓ（Ｔｒｔ）－）、－バリン－リシン（モノメトキシトリチル）－（－Ｖａｌ－Ｌｙｓ（Ｍｍｔ）－）、－バリン－リシン（フルオレニルメチルオキシカルボニル）－（－Ｖａｌ－Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）－）、－バリン－アルギニン－（－Ｖａｌ－Ａｒｇ－）、－フェニルアラニン－シトルリン－（－Ｐｈｅ－Ｃｉｔ－）、－フェニルアラニン－リシン－（－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ－）、－フェニルアラニン－リシン（トリチル）－（－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ（Ｔｒｔ）－）、－フェニルアラニン－リシン（モノメトキシトリチル）－（－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ（Ｍｍｔ）－）、－フェニルアラニン－リシン（フルオレニルメチルオキシカルボニル）－（－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）－）、ロイシン－シトルリン－（－Ｌｅｕ－Ｃｉｔ－）、イソロイシン－シトルリン－（－Ｉｌｅ－Ｃｉｔ－）、－フェニルアラニン－アルギニン－（－Ｐｈｅ－Ａｒｇ－）から選ばれ、前記－ＡＡ1－ＡＡ2－ＡＡ3－は、－フェニルアラニン－アルギニン－アルギニン－（－Ａｌａ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－）から選ばれ、前記－ＡＡ1－ＡＡ2－ＡＡ3－ＡＡ4－は、－グリシン－グリシン－フェニルアラニン－グリシン－（－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－）、－グリシン－フェニルアラニン－ロイシン－グリシン－（－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ－）、－アラニン－ロイシン－アラニン－ロイシン（－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－）から選ばれる。
【0019】
好ましくは、前記オリゴペプチドリンカー中間体は、以下の構造を含む。即ち、
【0020】
【化5】
【0021】
【化6】
【0022】
本発明は、さらに、上記構造式（１）～（３）で表されるオリゴペプチドリンカー中間体の製造方法を提供し、前記方法の反応経路は、以下の通りであり、即ち、
１）カルボニル化試薬及び２－（トリメチルシリル）エタノールを、順にアミノ酸ＡＡ1、アミノ酸ＡＡ2と、又は順にアミノ酸ＡＡ1、アミノ酸ＡＡ2、アミノ酸ＡＡ3と、又は順にアミノ酸ＡＡ1、アミノ酸ＡＡ2、アミノ酸ＡＡ3、アミノ酸ＡＡ4と縮合反応させて２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－オリゴペプチド縮合物を得、
２）反応で得られた２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－オリゴペプチド縮合物とｐ－アミノベンジルアルコールとを反応させて２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－オリゴペプチド－ｐ－アミノベンジルアルコール縮合物を得、
ここで、前記カルボニル化試薬は、カルボニル基を含む任意の化合物である。
１）カルボニル化試薬及び２－（トリメチルシリル）エタノールを、順にアミノ酸ＡＡ1、アミノ酸ＡＡ2と、又は順にアミノ酸ＡＡ1、アミノ酸ＡＡ2、アミノ酸ＡＡ3と、又は順にアミノ酸ＡＡ1、アミノ酸ＡＡ2、アミノ酸ＡＡ3、アミノ酸ＡＡ4と縮合反応させて２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－オリゴペプチド縮合物を得、
２）反応で得られた２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－オリゴペプチド縮合物とｐ－アミノベンジルアルコールとを反応させて２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－オリゴペプチド－ｐ－アミノベンジルアルコール縮合物を得、
ここで、前記カルボニル化試薬は、カルボニル基を含む任意の化合物である。
【0023】
さらに、前記構造式（１）で表されるオリゴペプチドリンカー中間体の反応経路は、以下の通りである。
【0024】
【化7】
【0025】
前記製造方法は、
１）カルボニル化試薬を２－（トリメチルシリル）エタノール及びアミノ酸ＡＡ1と縮合反応させて２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－アミノ酸縮合物を得るステップと、
２）２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－アミノ酸縮合物とアミノ酸ＡＡ2を縮合反応させて２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－ジペプチド縮合物を得るステップと、
３）２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－ジペプチド縮合物とｐ－アミノベンジルアルコールとを縮合反応させて２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－ジペプチド－ｐ－アミノベンジルアルコール縮合物を得るステップと、を含む。
１）カルボニル化試薬を２－（トリメチルシリル）エタノール及びアミノ酸ＡＡ1と縮合反応させて２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－アミノ酸縮合物を得るステップと、
２）２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－アミノ酸縮合物とアミノ酸ＡＡ2を縮合反応させて２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－ジペプチド縮合物を得るステップと、
３）２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－ジペプチド縮合物とｐ－アミノベンジルアルコールとを縮合反応させて２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－ジペプチド－ｐ－アミノベンジルアルコール縮合物を得るステップと、を含む。
【0026】
さらに、前記構造式（２）で表されるオリゴペプチドリンカー中間体的反応経路は、以下の通りである。
【0027】
【化8】
【0028】
前記製造方法は、
１）カルボニル化試薬を２－（トリメチルシリル）エタノール及びアミノ酸ＡＡ1と縮合反応させて２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－アミノ酸縮合物を得るステップと、
２）２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－アミノ酸縮合物とアミノ酸ＡＡ2とを縮合反応させて２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－ジペプチド縮合物を得るステップと、
３）２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－ジペプチド縮合物とアミノ酸ＡＡ3とを縮合反応させて２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－トリペプチド縮合物を得るステップと、
４）２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－トリペプチド縮合物とｐ－アミノベンジルアルコールとを縮合反応させて２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－トリペプチド－ｐ－アミノベンジルアルコール縮合物を得るステップと、を含む。
１）カルボニル化試薬を２－（トリメチルシリル）エタノール及びアミノ酸ＡＡ1と縮合反応させて２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－アミノ酸縮合物を得るステップと、
２）２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－アミノ酸縮合物とアミノ酸ＡＡ2とを縮合反応させて２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－ジペプチド縮合物を得るステップと、
３）２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－ジペプチド縮合物とアミノ酸ＡＡ3とを縮合反応させて２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－トリペプチド縮合物を得るステップと、
４）２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－トリペプチド縮合物とｐ－アミノベンジルアルコールとを縮合反応させて２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－トリペプチド－ｐ－アミノベンジルアルコール縮合物を得るステップと、を含む。
【0029】
さらに、前記構造式（３）で表されるオリゴペプチドリンカー中間体的反応経路は、以下の通りである。
【0030】
【化9】
【0031】
前記製造方法は、
１）カルボニル化試薬を２－（トリメチルシリル）エタノール及びアミノ酸ＡＡ1と縮合反応させて２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－アミノ酸縮合物を得るステップと、
２）２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－アミノ酸縮合物とアミノ酸ＡＡ2とを縮合反応させて２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－ジペプチド縮合物を得るステップと、
３）２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－ジペプチド縮合物とアミノ酸ＡＡ3とを縮合反応させて２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－トリペプチド縮合物を得るステップと、
４）２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－トリペプチド縮合物とアミノ酸ＡＡ4とを縮合反応させて２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－テトラペプチド縮合物を得るステップと、
５）２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－テトラペプチド縮合物とｐ－アミノベンジルアルコールとを縮合反応させて２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－テトラペプチド－ｐ－アミノベンジルアルコール縮合物を得るステップと、を含む。
１）カルボニル化試薬を２－（トリメチルシリル）エタノール及びアミノ酸ＡＡ1と縮合反応させて２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－アミノ酸縮合物を得るステップと、
２）２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－アミノ酸縮合物とアミノ酸ＡＡ2とを縮合反応させて２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－ジペプチド縮合物を得るステップと、
３）２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－ジペプチド縮合物とアミノ酸ＡＡ3とを縮合反応させて２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－トリペプチド縮合物を得るステップと、
４）２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－トリペプチド縮合物とアミノ酸ＡＡ4とを縮合反応させて２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－テトラペプチド縮合物を得るステップと、
５）２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－テトラペプチド縮合物とｐ－アミノベンジルアルコールとを縮合反応させて２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－テトラペプチド－ｐ－アミノベンジルアルコール縮合物を得るステップと、を含む。
【0032】
本発明は、さらに、前記構造式（４）で表されるオリゴペプチドリンカー中間体の製造方法を提供し、前記方法の反応経路は、カルボニル化試薬及び２－（トリメチルシリル）エタノールを、アミノ酸ＡＡ1、アミノ酸ＡＡ2、アミノ酸ＡＡ3、アミノ酸ＡＡ4と順に縮合反応させて２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－テトラペプチド縮合物を得ることであり、ここで、前記カルボニル化試薬はカルボニル基を含む任意の化合物である。
【0033】
さらに、前記構造式（４）で表されるオリゴペプチドリンカー中間体の反応経路は、以下の通りである。
【0034】
【化10】
【0035】
１）カルボニル化試薬を２－（トリメチルシリル）エタノール及びアミノ酸ＡＡ1と縮合反応させて２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－アミノ酸縮合物を得るステップと、
２）２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－アミノ酸縮合物とアミノ酸ＡＡ2とを縮合反応させて２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－ジペプチド縮合物を得るステップと、
３）２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－ジペプチド縮合物とアミノ酸ＡＡ3とを縮合反応させて２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－トリペプチド縮合物を得るステップと、
４）２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－トリペプチド縮合物とアミノ酸ＡＡ4とを縮合反応させて２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－テトラペプチド縮合物を得るステップと、を含む。
２）２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－アミノ酸縮合物とアミノ酸ＡＡ2とを縮合反応させて２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－ジペプチド縮合物を得るステップと、
３）２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－ジペプチド縮合物とアミノ酸ＡＡ3とを縮合反応させて２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－トリペプチド縮合物を得るステップと、
４）２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－トリペプチド縮合物とアミノ酸ＡＡ4とを縮合反応させて２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－テトラペプチド縮合物を得るステップと、を含む。
【0036】
さらに、前記カルボニル化試薬は、式（５）で表される構造を持つ。
【0037】
【化11】
【0038】
から選ばれる。
【0039】
さらに、前記カルボニル化試薬は、
【0040】
【化12】
【0041】
から選ばれる。
【0042】
さらに、前記のＡＡ1、ＡＡ2、ＡＡ3、ＡＡ4は、それぞれ独立に、－バリン－（－Ｖａｌ－）、－シトルリン－（－Ｃｉｔ－）、－アラニン－（－Ａｌａ－）、－リシン－（－Ｌｙｓ－）、－リシン（トリチル）－（－Ｌｙｓ（Ｔｒｔ）－）、－リシン（モノメトキシトリチル）－（－Ｌｙｓ（Ｍｍｔ）－）、－リシン（フルオレニルメチルオキシカルボニル）－（－Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）－）、－アルギニン－（－Ａｒｇ－）、－フェニルアラニン－（－Ｐｈｅ－）、－グリシン－（－Ｇｌｙ－）、－ロイシン－（－Ｌｅｕ－）、－イソロイシン－（－Ｉｌｅ－）から選ばれる。
【0043】
さらに、前記－ＡＡ1－ＡＡ2－は、－バリン－シトルリン－（－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－）、－バリン－アラニン－（－Ｖａｌ－Ａｌａ－）、－バリン－リシン－（－Ｖａｌ－Ｌｙｓ－）、－バリン－リシン（トリチル）－（－Ｖａｌ－Ｌｙｓ（Ｔｒｔ）－）、－バリン－リシン（モノメトキシトリチル）－（－Ｖａｌ－Ｌｙｓ（Ｍｍｔ）－）、－バリン－リシン（フルオレニルメチルオキシカルボニル）－（－Ｖａｌ－Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）－）、－バリン－アルギニン－（－Ｖａｌ－Ａｒｇ－）、－フェニルアラニン－シトルリン－（－Ｐｈｅ－Ｃｉｔ－）、－フェニルアラニン－リシン－（－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ－）、－フェニルアラニン－リシン（トリチル）－（－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ（Ｔｒｔ）－）、－フェニルアラニン－リシン（モノメトキシトリチル）－（－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ（Ｍｍｔ）－）、－フェニルアラニン－リシン（フルオレニルメチルオキシカルボニル）－（－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）－）、ロイシン－シトルリン－（－Ｌｅｕ－Ｃｉｔ－）、イソロイシン－シトルリン－（－Ｉｌｅ－Ｃｉｔ－）、－フェニルアラニン－アルギニン－（－Ｐｈｅ－Ａｒｇ－）から選ばれ、前記－ＡＡ1－ＡＡ2－ＡＡ3－は、－フェニルアラニン－アルギニン－アルギニン－（－Ａｌａ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－）から選ばれ、前記－ＡＡ１－ＡＡ２－ＡＡ３－ＡＡ４－は、－グリシン－グリシン－フェニルアラニン－グリシン－（－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－）、－グリシン－フェニルアラニン－ロイシン－グリシン－（－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ－）、－アラニン－ロイシン－アラニン－ロイシン（－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－）から選ばれる。
【0044】
好ましくは、前記－ＡＡ1－ＡＡ2－は、以下の構造から選ばれる。
【0045】
【化13】
【0046】
好ましくは、前記－ＡＡ1－ＡＡ2－ＡＡ3－は、以下の構造から選ばれる。
【0047】
【化14】
【0048】
好ましくは、前記－ＡＡ1－ＡＡ2－ＡＡ3－ＡＡ4－は、以下の構造から選ばれる。
【0049】
【化15】
【0050】
本発明は、さらに、上記のいずれか１項に記載の中間体の、抗体薬物複合体の調製における応用を提供する。
【0051】
さらに、上記のいずれか１項に記載の縮合反応で用いられる溶媒は、任意の極性溶媒又は非極性溶媒であり、好ましくは、前記溶媒が、テトラヒドロフラン、ジオキサン、アセトニトリル、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、ＤＭＡｃ、ＤＭＰＵ、ＨＭＰＡ、エチレングリコールジメチルエーテル、ジエチルエーテル、ｔ－ブチルメチルエーテル、ｔｅｒｔ－ブタノール、水、酢酸エチル、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素から選ばれる１種又は複数種であり、さらに好ましくは、前記溶媒が、テトラヒドロフラン、ジオキサン、アセトニトリル、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、水、メタノール、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、エタノールから選ばれる１種又は複数種である。
【0052】
幾つかの具体的な実施例において、カルボニル化試薬が２－（トリメチルシリル）エタノール及びアミノ酸ＡＡ1と縮合反応する場合には、前記縮合反応で用いられる試薬は、好ましくは、テトラヒドロフラン、ジオキサン、アセトニトリル、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、ＤＭＡｃ、ＤＭＰＵ、ＨＭＰＡ、エチレングリコールジメチルエーテル、ジエチルエーテル、ｔ－ブチルメチルエーテル、ｔｅｒｔ－ブタノール、水、酢酸エチルの１種又は複数種であり、さらに好ましくは、前記試薬は、テトラヒドロフラン、ジオキサン、アセトニトリル、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、水の１種又は複数種である。
【0053】
他の幾つかの具体的な実施例において、カルボニル化試薬と２－（トリメチルシリル）エタノール及びアミノ酸ＡＡ1との反応後の２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－アミノ酸縮合物とＡＡ2との縮合反応、及び他の幾つかの実施例においてさらにＡＡ3、ＡＡ4との縮合反応で用いられる試薬は、好ましくは、テトラヒドロフラン、ジオキサン、アセトニトリル、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、ＤＭＡｃ、ＤＭＰＵ、ＨＭＰＡ、メタノール、エタノール、イソプロパノール、エチレングリコールジメチルエーテル、ジエチルエーテル、ｔ－ブチルメチルエーテル、ｔ－ブタノール、水、酢酸エチルの１種又は複数種であり、さらに好ましくは、前記試薬が、テトラヒドロフラン、ジオキサン、アセトニトリル、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、水、メタノールの１種又は複数種である。
【0054】
他の幾つかの具体的な実施例において、上記反応後のポリペプチド縮合物（即ち、２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－ジペプチド縮合物、２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－トリペプチド縮合物、２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－テトラペプチド縮合物）がｐ－アミノベンジルアルコールと縮合反応する際に用いられる試薬は、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、メタノール、エタノール、イソプロパノール、テトラヒドロフラン、ジオキサン、アセトニトリル、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、ＤＭＡｃ、ＤＭＰＵ、ＨＭＰＡ、エチレングリコールジメチルエーテル、ジエチルエーテル、ｔ－ブチルメチルエーテル、ｔ－ブタノール、酢酸エチルの１種又は複数種であることが好ましく、前記試薬は、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、メタノール、エタノール、ＤＭＦの１種又は複数種であることがさらに好ましい。
【0055】
本発明は、さらに、上記のいずれか１項に記載の製造方法の、抗体薬物複合体の調製における応用を提供する。
【0056】
抗体薬物複合体の調製中には、さらに、以下のＴｅｏｃ保護基除去工程を含む。
【0057】
【化16】
【0058】
上記Ｔｅｏｃ保護基除去後の生成物は、リンカーの一部とすることが大きく、抗体薬物複合体の調製中に、薬物部分に共有結合している。抗体部分との共有結合を達成するために、リンカー部分とカップリングする必要があることが多く、具体的には、反応経路は、以下の通りである。
【0059】
【化17】
【0060】
ある実施例において、前記リンカーＬは、
【0061】
【化18】
【0062】
から選ばれる。
【0063】
対応して、前記連結基Ｌ’は、
【0064】
【化19】
【0065】
から選ばれる。
特定の実施例において、前記オリゴペプチドリンカーは、
特定の実施例において、前記オリゴペプチドリンカーは、
【0066】
【化20】
【0067】
【化21】
【0068】
から選ばれる。
【図面の簡単な説明】
【0069】
【0070】
【0071】
【0072】
【0073】
【0074】
【0075】
【0076】
【0077】
【0078】
【0079】
【0080】
【0081】
【0082】
【0083】
【0084】
【0085】
【0086】
【0087】
【0088】
【0089】
【0090】
【発明を実施するための形態】
【略語】
【0091】
本発明で使用されるすべての略語は、断りがない限り、当業者によって理解されるのと同じ意味を有する。本発明で使用されるように、よく用いられる略語及びその定義は、下表に示される。
【0092】
【表2】
【定義】
【0093】
明細書の各側面に関連するさまざまな用語は、明細書及び特許請求の範囲に広く使用されている。その用語は、断りがない限り、当技術分野における通常の意味が与えられている。他の具体的に定義された用語は、本明細書で提供される定義と一致して理解すべきである。
【0094】
本明細書で使用されるように、用語「１つ」、「１種」、及び「前記」とは、文脈で特に指示がない限り、標準的な慣行に従って使用されるものであり、１つ又は複数を意味する。従って、例えば、「抗体薬物複合体」への言及には、２つ又は２つ以上の抗体薬物複合体の組み合わせなどを含む。
【0095】
「含む」という言葉を用いて本明細書で態様が説明された以外は、類似する態様を「からなる」及び/または「基本的に、…からなる」という言葉を用いて説明することも提供することを理解すべきである。
【0096】
本発明は数値範囲及びパラメータの近似値が広い範囲に示されるが、具体的な実施例に示される数値は可能な限り正確に記載されている。しかしながら、いずれの数値には元々、一定の誤差が必然として含まれることは、それぞれの測定値に存在する標準偏差によるものである。また、本明細書に開示されるすべての範囲は、そこに含まれる任意及びあらゆる部分範囲を網羅すると理解すべきである。例えば、記載された「１～１０」という範囲は、最小値１と最大値１０との間（端点を含む）にある任意及びあらゆる部分範囲を含むことを理解すべきであり、つまり、最小値１又はそれ以上で始まるすべてのサブ範囲、例えば、１乃至６．１、並びに最大値１０又はそれ以下で終わるサブ範囲、例えば、５．５乃至１０である。なお、「本明細書に組み込まれる」と呼ばれる参照文献は、その全体が組み込まれると理解されるべきである。
【0097】
本発明で使用される
【0098】
【化22】
【0099】
を含む基がここで化学結合によって他の基に連結されていることを意味する。
【0100】
本発明に係る用語「連結基」とは、それぞれタンパク質／抗体分子及びジペプチドリンカーと反応することができる、二官能基または多官能基を持つ分子を意味するため、「ブリッジ」としてタンパク質／抗体をジペプチドリンカーに連結している。
【0101】
本発明に係る用語「オリゴペプチドリンカー」とは、２つ又は２つ以上のアミノ酸残基を含む連結構造を広く指し、ｐ－ベンジルアルコール残基の構造も含まれる。前記２つのアミノ酸は脱水縮合により連結し、ここでいうアミノ酸は、アミノ基及びカルボキシル基を含む有機化合物を広く指し、すべての必須アミノ酸及び非必須アミノ酸を含む。好ましくは、前記アミノ酸は、－バリン－（－Ｖａｌ－）、－シトルリン－（－Ｃｉｔ－）、－アラニン－（－Ａｌａ－）、－リシン－（－Ｌｙｓ－）、－リシン（トリチル）－（－Ｌｙｓ（Ｔｒｔ）－）、－リシン（モノメトキシトリチル）－（－Ｌｙｓ（Ｍｍｔ）－）、－リシン（フルオレニルメチルオキシカルボニル）－（－Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）－）、－アルギニン－（－Ａｒｇ－）、－フェニルアラニン－（－Ｐｈｅ－）、－グリシン－（－Ｇｌｙ－）、－ロイシン－（－Ｌｅｕ－）、－イソロイシン－（－Ｉｌｅ－）を含むが、これらに限定されない。
【実施例】
【0102】
以下、具体的な実施例により本発明をさらに説明する。これらの実施例は、本発明を説明するためにのみ使用され、本発明の範囲を限定するものではないことを理解すべきである。次の実施例に具体的な条件が明示されていない実験方法は、一般的に、通常の条件又はメーカーが推奨する条件に従って実行し、具体的な来源が明示されていない試薬は、市販として購入された通常の試薬である。すべての百分率、比率、割合又は部は、断りがない限り、重量によるものである。
【0103】
本発明における重量体積百分率の単位は、当業者に周知である、例えば、１００ｍｌ溶液中の溶質の重量を指す。
【0104】
本明細書で用いられるすべての専門及び科学的用語は、断りがない限り、当業者に周知である意味と同じである。なお、記載された内容に類似または等しい任意の方法及び材料は、本発明の方法に使用されることができる。本明細書に記載されている好ましい実施形態及び材料は、例示としてのみ使用される。
【0105】
実施例１ Ｔｅｏｃ保護基法によるＶａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢの調製
【0106】
（１）Ｔｅｏｃ－Ｖａｌ－Ｃｉｔの調製
【0107】
【化23】
【0108】
５００ｍＬの一口フラスコに、順に２－（トリメチルシリル）エタノール（１２０ｍｍｏｌ）１４．１６ｇ、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（３００ｍｍｏｌ）３８．７ｇ、炭酸ビス（４－ニトロフェニル）（１００ｍｍｏｌ）３０．４ｇ、アセトニトリル４００ｍＬを加えた後、室温に維持しながら１６ｈ撹拌し、反応液１を形成した。Ｌ－バリン（１２０ｍｍｏｌ）１４．０８ｇ、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（２００ｍｍｏｌ）２５．８ｇを１Ｌの一口フラスコに加え、水４００ｍＬで溶解させ、反応液２を形成した。反応液１を撹拌しながら反応液２に加え、室温で１６ｈ撹拌した後、反応液について、反応の終了をＬＣ－ＭＳ法によって検出した。検出に合格した後、反応液の溶媒をロータリーエバポレータにより蒸発し、乾固させた後に水５００ｍＬを加え、撹拌しながら１ｍｏｌ／Ｌの塩酸を滴下してｐＨ値を１に調整した後、各回３００ｍＬの酢酸エチルで水相を２回抽出した。抽出液を合わせ、各回３００ｍＬの水で２回水洗した。水洗後に、抽出液に無水硫酸マグネシウムを加えて乾燥させ、乾燥後の溶媒をロータリーエバポレータにより蒸発し、淡黄色の粘稠固体として生成物（即ち、ｐ－ニトロフェノールを含む２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－Ｌ－バリン混合物（単に２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－Ｌ－バリン混合物と称され））５４ｇを得た。ＬＣ－ＭＳ（Ｍ－Ｈ）－：２６０．１。２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－Ｌ－バリンの混合物は、精製せずに、次の反応に直接使用される。
【0109】
５００ｍＬの一口フラスコに、順に上記調製された２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－Ｌ－バリン混合物（４０ｍｍｏｌ）１０．５ｇ、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチル－Ｏ－（Ｎ－スクシンイミジル）ウロニウムテトラフルオロボラート（８０ｍｍｏｌ）２４．３ｇ、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（２００ｍｍｏｌ）２５．８ｇ、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド２００ｍＬを加え、その後、室温で６ｈ撹拌し、反応液３を形成した。Ｌ－シトルリン（１２０ｍｍｏｌ）２１ｇを１Ｌの一口フラスコに加え、水４００ｍＬを加え、完全に溶解させるまで撹拌し、反応液４を形成した。５００ｍＬのビーカーにＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（１２０ｍｍｏｌ）１５．５ｇ、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド２００ｍＬを加え、反応液５を形成した。反応液５を反応液４に加えた後、低温浴槽に移し、－１０℃で０．５ｈ撹拌した。その後、－１０℃で撹拌しながら上記反応系に反応液３を徐々に滴下し、２ｈ程度かけて滴下し、滴下完了後に－１０℃で１６ｈ撹拌した後、ＬＣ－ＭＳ法により反応の終了を検出した。検出に合格した後、系における溶媒をロータリーエバポレータにより蒸発した。乾固させた後、０．１ｍｏｌ／Ｌの塩酸５００ｍＬを加えて十分に撹拌し、各回３００ｍＬの酢酸エチルで水相を２回抽出した。抽出液を合わせ、各回３００ｍＬの０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸で２回酸洗し、さらに、各回３００ｍＬの水で２回水洗した。水洗後に、抽出液に無水硫酸マグネシウムを加えて乾燥させ、乾燥後の溶媒をロータリーエバポレータにより蒸発し、酢酸エチル１００ｍＬ、トルエン１０００ｍＬを加えて１６ｈ撹拌した後、ろ過し、ケーキをＴＨＦ５０ｍＬで溶解させた後、メチルｔ－ブチルエーテル：ｎ－ヘキサン＝１：１の配合液１Ｌを加え、室温で１６ｈ撹拌した後、ろ過し、ケーキをＴＨＦ５０ｍＬで溶解させた後、トルエン １Ｌを加え、室温で６ｈ撹拌した後、ろ過し、ケーキを乾燥させ、類白色の粉末状固体として生成物１１．１ｇ（収率６８％）を得た。ＬＣ－ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）+： ４１８．７、ＬＣ－ＭＳ（Ｍ－Ｈ）-：４１６．７。
【0110】
（２）Ｔｅｏｃ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢの調製
【0111】
【化24】
【0112】
５００ｍＬの一口フラスコに、順に２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－Ｌ－バリニル－Ｌ－シトルリン（１８ｍｍｏｌ）７．５ｇ、Ｎ－エトキシカルボニル－２－エトキシ－１，２－ジヒドロキノリン（３６ｍｍｏｌ）９ｇ、ｐ－アミノベンジルアルコール（３６ｍｍｏｌ）４．５ｇ、ジクロロメタン １５０ｍＬ、メタノール ７５ｍＬを加え、その後、室温で１６ｈ撹拌した後、ＬＣ－ＭＳ法により反応の終了を検出した。検出に合格した後、反応液をロータリーエバポレータにより濃縮乾固させた後、ジクロロメタン ２００ｍＬ、酢酸エチル ２００ｍＬを加えて１６ｈ撹拌した後、ろ過した。ケーキにジクロロメタン １００ｍＬ、酢酸エチル １００ｍＬ、ｎ－ヘキサン ２００ｍＬを加え、１６ｈ撹拌した後、ろ過した。ケーキを乾燥させ、類白色の粉末状固体として生成物７．５ｇ（生成物は２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－Ｌ－バリニル－Ｌ－シトルルアミド－ｐ－ベンジルアルコール、即ち、Ｔｅｏｃ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢである）（収率８０％）を得た。ＬＣ－ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）+：５２３．５、ＬＣ－ＭＳ（Ｍ－Ｈ）-：５２２。
【0113】
（３）Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ（相対分子量：３７９．４６）の調製
【0114】
【化25】
【0115】
５００ｍＬの一口フラスコに、順に２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル－Ｌ－バリニル－Ｌ－シトルルアミド－ｐ－ベンジルアルコール（６．２ｍｍｏｌ）３．１５ｇ、フッ化カリウム（３７．２ｍｍｏｌ）２．１６ｇ、１．０ｍｏｌ／Ｌ フッ化テトラブチルアンモニウムのテトラヒドロフラン溶液１２．４ｍＬ、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド１００ｍＬを加え、その後、室温で２４ｈ撹拌した後、ＬＣ－ＭＳ法により反応の終了を検出した。反応終了後、反応液をろ過し、濾液の溶媒をロータリーエバポレータにより蒸発した後、無水エタノール１００ｍＬを加えて十分に溶解させ、１ｍｏｌ／Ｌ希塩酸溶液１８ｍＬを加えて充分に撹拌した後、無水硫酸マグネシウムを加えて乾燥させ、乾燥後、ろ過した。濾液をロータリーエバポレータにより濃縮乾固させた後、エタノール３０ｍＬを加えて完全に溶解させた後、室温で撹拌しながらメチルｔ－ブチルエーテル２００ｍＬとジクロロメタン２００ｍＬとの混合溶液を加えて１ｈ撹拌した後、ろ過した。ケーキを乾燥させ、類白色の粉末状固体として生成物１．８３ｇ（生成物はＬ－バリニル－Ｌ－シトルルアミド－ｐ－ベンジルアルコール、即ち、Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢである）（収率８０％）を得た。
【0116】
液体クロマトグラフィー質量分析において、図１は、ＭＳによるブラックコントロールチャートであり、図２は、ＨＰＬＣによるブラックコントロールチャートであり、図３は、Ｔｅｏｃ保護基法で調製されたＶａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ（本実施例の生成物）のマススペクトルであり、図４は、生成物のＨＰＬＣによるクロマトグラムであり、図５は、生成物の正イオン質量スペクトルであり、図６は、生成物の負イオン質量スペクトルである。図１と図３とを比較して、時間が２．８７ｍｉｎであるピークは生成物の分子イオンピークであることが分かり、図２と図４とを比較しては、生成物が強いＨＰＬＣ検出シグナルを持つことが分かり、図１及び図３と結合し、Ｔｅｏｃ保護基法で調製されたＶａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢは、不純物が少なくなることが分かった。２．８７ｍｉｎにある正イオン質量スペクトル（２．８４９ｍｉｎ）及び負イオン質量スペクトル（２．８６６ｍｉｎ）の解析により分かるように、ＬＣ－ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）+：３７９．６、ＬＣ－ＭＳ（Ｍ－Ｈ）-：３７８．０である。
【0117】
実施例２ Ｃｂｚ保護基法によるＶａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢの調製
【0118】
（１）Ｃｂｚ－Ｖａｌ－Ｃｉｔの調製
【0119】
【化26】
【0120】
１Ｌの一口フラスコに、順にＮ－ベンジルオキシカルボニル－Ｌ－バリン（即ち、Ｃｂｚ－Ｖａｌ）（４０ｍｍｏｌ）１０ｇ、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチル－Ｏ－（Ｎ－スクシンイミジル）ウロニウムテトラフルオロボラート（６０ｍｍｏｌ）１８．２ｇ、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（１２０ｍｍｏｌ）１５．５ｇ、アセトニトリル３００ｍＬを加え、その後、室温で４ｈ撹拌した。Ｌ－シトルリン（４４ｍｍｏｌ）７．７ｇを水３００ｍＬに溶解させた後、上記反応系に加え、室温で１６ｈ撹拌し、サンプルを採取してＬＣ－ＭＳで検出し、反応が完了した。撹拌しながら０．１ｍｏｌ／Ｌ 塩酸を滴下してｐＨ値を１に調整し、溶媒をロータリーエバポレータにより蒸発した後、水８００ｍＬを加え、室温で１６ｈ撹拌し、ろ過した。ケーキを真空乾燥させた後、酢酸エチル ４００ｍＬ、ジクロロメタン ４００ｍＬを加えて１６ｈ撹拌した後、ろ過した。ケーキを真空乾燥させた後、酢酸エチル ２００ｍＬ、ジクロロメタン ２００ｍＬ、ｎ－ヘキサン ４００ｍＬを加え、１６ｈ撹拌した後、ろ過し、ケーキを乾燥させ、類白色の粉末状固体として生成物１２．６５ｇ（即ち、Ｎ－ベンジルオキシカルボニル－Ｌ－バリニル－Ｌ－シトルリン、Ｃｂｚ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ）（収率７７％）を得た。ＬＣ－ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）+： ４０８．７、ＬＣ－ＭＳ（Ｍ－Ｈ）-：４０６．９。
【0121】
（２）Ｃｂｚ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢの調製
【0122】
【化27】
【0123】
５００ｍＬの一口フラスコに、順にＮ－ベンジルオキシカルボニル－Ｌ－バリニル－Ｌ－シトルリン（３１ｍｍｏｌ）１２．６５ｇ、Ｎ－エトキシカルボニル－２－エトキシ－１，２－ジヒドロキノリン（６２ｍｍｏｌ）１５．７４ｇ、ｐ－アミノベンジルアルコール（６２ｍｍｏｌ）７．５３ｇ、ジクロロメタン２００ｍＬ、メタノール１００ｍＬを加え、室温で１６ｈ撹拌した後、サンプルを採取してＬＣ－ＭＳで検出し、反応が完了した。反応液をロータリーエバポレータにより濃縮乾固させた後、ジクロロメタン２００ｍＬ、酢酸エチル２００ｍＬを加え、１６ｈ撹拌し、ろ過した。ケーキにジクロロメタン１００ｍＬ、酢酸エチル１００ｍＬ、ｎ－ヘキサン２００ｍＬを加え、１６ｈ撹拌し、ろ過した。ケーキを乾燥させ、類白色の粉末状固体として生成物９．１ｇ（収率６０％）を得た。ＬＣ－ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）+：５１３．６。
【0124】
（３）Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ（相対分子量：３７９．４６）の調製
【0125】
【化28】
【0126】
２５０ｍＬの一口フラスコに、順にＮ－ベンジルオキシカルボニル－Ｌ－バリニル－Ｌ－シトルルアミド－ｐ－ベンジルアルコール（２ｍｍｏｌ）１．１２ｇ、パラジウム炭素０．３ｇ、メタノール１００ｍＬを加え、１０℃で撹拌した。水素ガスで満たされたバルーンを反応系上にセットし、１０℃で１６ｈ撹拌し、サンプルを採取してＬＣ－ＭＳで検出し、反応が終了した。反応液をろ過し、濾液をロータリーエバポレータにより濃縮乾固させた後、ｎ－ヘキサン４００ｍＬを加えて１６ｈ撹拌した後、ろ過した。ケーキを乾燥させ、類白色の粉末状固体として生成物０．６９ｇ（収率９１％）を得た。
【0127】
液体クロマトグラフィー質量分析において、図７は、ＭＳによるブラックコントロールチャートであり、図８は、ＨＰＬＣによるブラックコントロールチャートであり、図９は、Ｃｂｚ保護基法で調製されたＶａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ（本実施例の生成物）のマススペクトルであり、図１０は、生成物のＨＰＬＣによるクロマトグラムであり、図１１は、生成物の正イオン質量スペクトルであり、図１２は、生成物の負イオン質量スペクトルであり、図１３は、不純物の正イオン質量スペクトルであり、図１４は、不純物の負イオン質量スペクトルである。図７と図９とを比較して、４．３３ｍｉｎ及び６．５４ｍｉｎにある２つの強いイオンピークが認められ、図８と図１０とを比較して、４．１２ｍｉｎ及び５．３９ｍｉｎに強いＨＰＬＣ検出シグナルを持つ２つのピークが認められ、図７及び図９を結合し、これらの２つのピークのうちの１つは、生成物のピークであり、もう１つは不純物のピークであり、且つ不純物の含有量が多いと推測できる。４．３３ｍｉｎ及び５．５４ｍｉｎにある正イオン質量スペクトル及び負イオン質量スペクトルを分析することにより、４．３３ｍｉｎにあるピークは、生成物のピーク（ＬＣ－ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）+：３７９．６、ＬＣ－ＭＳ（Ｍ－Ｈ）-：３７８．０）であり、５．５４ｍｉｎにあるピークは、不純物のピーク（ＬＣ－ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）+：３６３．６）であることが分かり、Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ脱ヒドロキシル化の副生成物（分子量の相違が僅かに１６になる）であると推測された、且つその含有量は多い。副生成物は化学的性質が生成物と非常に類似しているため、除去されることは困難で、後の反応及び製品品質のいずれにも大きな影響を与える。さらに、脱保護プロセスで水素ガスを反応物として使用し、安全性リスクが存在する。
【0128】
実施例３ Ｂｏｃ保護基法によるＰｈｅ－Ｃｉｔ－ＰＡＢの調製
【0129】
（１）Ｂｏｃ－Ｐｈｅ－Ｃｉｔの調製
【0130】
【化29】
【0131】
２５０ｍＬの一口フラスコに、順にＮ－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－Ｌ－フェニルアラニン（１０ｍｍｏｌ）（即ち、Ｂｏｃ－Ｐｈｅ）２．６５ｇ、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチル－Ｏ－（Ｎ－スクシンイミジル）ウロニウムテトラフルオロボラート（１２ｍｍｏｌ）３．６１ｇ、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（３０ｍｍｏｌ）３．８７ｇ、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド５０ｍＬを加え、室温で４ｈ撹拌した。
【0132】
Ｌ－シトルリン（１０ｍｍｏｌ）１．７５ｇを水５０ｍＬに溶解させ、上記反応系に加え、室温で１６ｈ撹拌し、サンプルを採取してＬＣ－ＭＳで検出し、反応が完了した。撹拌しながら０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸を滴下してｐＨ値を１に調整した。系における溶媒をロータリーエバポレータにより蒸発した後、水２００ｍＬを加えて室温で１６ｈ撹拌し、ろ過した。ケーキを乾燥させた後、酢酸エチル１００ｍＬ、ジクロロメタン１００ｍＬを加え、１６ｈ撹拌し、ろ過し、ケーキを乾燥させ、粉末状の黄色固体として生成物３ｇ（即ち、Ｎ－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－Ｌ－フェニルアラニル－Ｌ－シトルリン、Ｂｏｃ－Ｐｈｅ－Ｃｉｔ）（収率７１％）を得た。ＬＣ－ＭＳ（Ｍ－Ｈ）-：４２１．４。
【0133】
（２）Ｂｏｃ－Ｐｈｅ－Ｃｉｔ－ＰＡＢの調製
【0134】
【化30】
【0135】
２５０ｍＬの一口フラスコに、順にＮ－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－Ｌ－フェニルアラニル－Ｌ－シトルリン（即ち、Ｂｏｃ－Ｐｈｅ－Ｃｉｔ）（７．１ｍｍｏｌ）３ｇ、Ｎ－エトキシカルボニル－２－エトキシ－１，２－ジヒドロキノリン（１４．２ｍｍｏｌ）３．５ｇ、ｐ－アミノベンジルアルコール（１４．２ｍｍｏｌ）１．７５ｇ、ジクロロメタン６０ｍＬ、メタノール３０ｍＬを加え、室温で１６ｈ撹拌し、サンプルを採取してＬＣ－ＭＳで検出し、反応が完了した。反応液をロータリーエバポレータにより濃縮乾固させた後、ジクロロメタン１００ｍＬ、酢酸エチル１００ｍＬを加えて１６ｈ撹拌し、遠心した。下層の白色固体にｎ－ヘキサン１００ｍＬを加え、２ｈ撹拌し、遠心した。下層の白色固体を乾燥させ、類白色の粉末状固体として生成物２．３ｇ（即ち、Ｎ－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－Ｌ－フェニルアラニル－Ｌ－シトルルアミド－ｐ－ベンジルアルコール、Ｂｏｃ－Ｐｈｅ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ）（収率６２％）を得た。ＬＣ－ＭＳ（Ｍ－Ｈ）-：５２６．２。
【0136】
（３）Ｐｈｅ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ（相対分子量：４２７．５１）の調製
【0137】
以下、それぞれ塩酸による脱保護法及びトリフルオロ酢酸による脱保護法を使用してＢｏｃ保護基を除去した。
【0138】
【化31】
【0139】
（ａ）塩酸による脱保護法
【0140】
１０ｍＬの一口フラスコに、順にＮ－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－Ｌ－フェニルアラニル－Ｌ－シトルルアミド－ｐ－ベンジルアルコール（即ち、Ｂｏｃ－Ｐｈｅ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ）（１ｍｍｏｌ）０．５ｇ、４ｍｏｌ／Ｌ 塩化水素・ジオキサン溶液３ｍＬ、ジオキサン３ｍＬを加え、その後、室温で３ｈ撹拌し、サンプルを採取してＬＣ－ＭＳで検出し、反応が完了した。
【0141】
液体クロマトグラフィー質量分析において、図１５は、Ｂｏｃ保護基法で調製されたＰｈｅ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ（本実施例の生成物）のマススペクトルであり、図１６は、生成物のＨＰＬＣによるクロマトグラムであり、図１７は、正イオン質量スペクトルであり、図１８は、負イオン質量スペクトルである。図１５より、５．３９ｍｉｎに強いイオンピークが現れることが認められ、ここでの正イオン質量スペクトル（５．３９０ｍｉｎ）及び負イオン質量スペクトル（５．４０３ｍｉｎ）を分析することにより、ＬＣ－ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）+：４４６．２、ＬＣ－ＭＳ（Ｍ－Ｈ）-：４４４．１であることが明らかになり、当該方法で調製された生成物において大部分の生成物はベンジル位のヒドロキシル基が塩素で置換された副成物であると推測された。
【0142】
（ｂ）トリフルオロ酢酸による脱保護法
【0143】
１０ｍＬの一口フラスコに、順にＮ－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－Ｌ－フェニルアラニル－Ｌ－シトルルアミド－ｐ－ベンジルアルコール（１ｍｍｏｌ）０．５ｇ、トリフルオロ酢酸３ｍＬを加え、その後、室温で２ｈ撹拌した後、ＬＣ－ＭＳ法により反応の終了を検出した。
【0144】
液体クロマトグラフィー質量分析において、図１９は、Ｂｏｃ保護基法で調製されたＰｈｅ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ（本実施例の生成物）のマススペクトルであり、図２０は、生成物のＨＰＬＣによるクロマトグラムであり、図２１は、正イオン質量スペクトルであり、図２２は、負イオン質量スペクトルである。図１９より、５．７７ｍｉｎに強いイオンピークが現れることが分かり、ここでの正イオン質量スペクトル（５．７６８ｍｉｎ）及び負イオン質量スペクトル（５．７８１ｍｉｎ）を分析することにより、ＬＣ－ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）+：５２４．４、ＬＣ－ＭＳ（Ｍ－Ｈ）-：５２２．１であることが明らかになり、当該方法で調製された生成物において大部分の生成物はベンジル位のヒドロキシル基がトリフルオロ酢酸エステルになった副生成物であると推測された。
【0145】
以上より、本発明で提供された、保護基としてＴｅｏｃによりＶａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢを調製する方法は、反応条件が温和で、容易に実現され、反応においてには副反応がほとんどなく、不純物が少なく、生成物が純粋で精製しやすく、保護基としてＣｂｚによりＶａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢを調製する方法は、脱ヒドロキシル化された副生成物が生成し、且つその含有量が大きくなる。副生成物は化学的性質が生成物と非常に類似しているため、除去されることは困難で、後の反応及び製品品質のいずれにも大きな影響を与える。さらに、その方法は、脱保護プロセスで水素ガスを反応物として使用し、安全性リスクが存在する。保護基としてＢｏｃによりＶａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢを調製する方法は、ベンジル位のヒドロキシル基が塩素で置換され、ベンジル位のヒドロキシル基がトリフルオロ酢酸エステルになるなどの問題が存在し、変換率が非常に高くなる。従って、他の２つの方法と比較して、本発明で提供されたＴｅｏｃ方法は、容易に実現され、且つ不純物が少なく、予想外の技術効果がある。
【0146】
【表3】
【0147】
本発明は、具体的な各実施例を例示して説明している。しかし、当業者にとっては、本発明が具体的な各実施例に限定されなく、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく本発明の範囲で様々な改良又は変更を加え、且つ本明細書に言及される各技術的特徴を組み合わせることができる。このような改良及び変更はいずれも本発明の範囲に含まれている。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【国際調査報告】