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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-03-29
(54)【発明の名称】低酸素応答性キメラ抗原受容体
(51)【国際特許分類】
C12N 15/62 20060101AFI20220322BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20220322BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20220322BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20220322BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220322BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20220322BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20220322BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20220322BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20220322BHJP
【ＦＩ】
C12N15/62 Z ZNA
C12N15/12
C12N15/13
C12N5/10
A61P35/00
A61K35/17 Z
A61P37/04
A61K48/00
A61K35/76
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021548250
(86)(22)【出願日】2020-02-19
(85)【翻訳文提出日】2021-10-04
(86)【国際出願番号】 GB2020050401
(87)【国際公開番号】W WO2020169974
(87)【国際公開日】2020-08-27
(31)【優先権主張番号】1902277.1
(32)【優先日】2019-02-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】500532757
【氏名又は名称】キングス カレッジ ロンドン
【氏名又は名称原語表記】ＫＩＮＧＳ ＣＯＬＬＥＧＥ ＬＯＮＤＯＮ
(74)【代理人】
【識別番号】110001302
【氏名又は名称】特許業務法人北青山インターナショナル
(72)【発明者】
【氏名】アーノルド，ジェームス ノーブル
(72)【発明者】
【氏名】マーハー，ジョン
(72)【発明者】
【氏名】コスティ，パラスケバス
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA94X
4B065AB01
4B065BA02
4B065CA44
4C084AA13
4C084MA55
4C084MA56
4C084MA65
4C084NA14
4C084ZB26
4C084ZC48
4C087AA01
4C087AA02
4C087AA03
4C087BB37
4C087BC83
4C087CA12
4C087MA55
4C087MA56
4C087MA65
4C087NA14
4C087ZB09
4C087ZB26
(57)【要約】
本発明は、治療剤、特には治療用ポリペプチドおよび低酸素の条件下での選択的発現のための能力を有する核酸、該核酸を組み込んだ細胞および療法における、特に低酸素の条件、例えば、典型的には固形がんにおいて見出される該条件下での選択的発現を要求する方法における、それらの使用に関する。核酸は、新規の低酸素応答性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする。本発明はまた低酸素応答性調節性核酸に関する。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
１つまたは複数の酸素依存性分解ドメイン（ＯＤＤ）および抗腫瘍特性を有する少なくとも１つのポリペプチドを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸分子であって、前記核酸分子の発現が、低酸素応答性調節性核酸により低酸素応答性の方式で調節される、核酸分子。
【請求項2】
前記低酸素応答性調節性核酸が、複数の低酸素応答エレメント（ＨＲＥ）を含み、から本質的になり、またはからなり、前記複数のＨＲＥの各個々のＨＲＥが、独立して、（ｉ）少なくとも１つのＨＩＦ結合部位（ＨＢＳ）：５’－（Ａ／Ｇ）ＣＧＴ（Ｇ／Ｃ）－３’（配列番号１）、および任意選択的に（ｉｉ）少なくとも１つのＨＩＦ補助部位（ＨＡＳ）：５’－ＣＡ（Ｃ／Ｇ）（Ｇ／Ａ）（Ｔ／Ｃ／Ｇ）－３’（配列番号２）、および（ｉｉｉ）さらに任意選択的に少なくとも１つのＨＮＦ－４部位：５’－ＴＧＡＣＣＴ－３’（配列番号３）を含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項3】
前記ＨＢＳおよび存在する場合に前記ＨＡＳがリンカーにより分離されており、任意選択的に前記リンカーが少なくとも６ヌクレオチドの長さ、例えば６または８ヌクレオチドの長さである、請求項２に記載の核酸分子。
【請求項4】
前記複数のＨＲＥが、表１（配列番号５～１７）に示される少なくとも１つもしくは複数の配列または配列番号５～１７のいずれかに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくはより高い配列同一性を有し、かつ表１に示されるもしくは配列番号１および２により表される前記ＨＢＳおよび任意選択的にＨＡＳを含む配列を含む、請求項２または３に記載の核酸分子。
【請求項5】
前記複数が、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれより多くの個々のＨＲＥであり、前記個々のＨＲＥが、連続的に位置していてもよいかつ／または空間的に分離していてもよい、請求項２～４のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項6】
前記複数が、任意選択的に連続的に位置した、少なくとも３つの個々のＨＲＥであり、または前記複数が、任意選択的に連続的に位置した、少なくとも９つの個々のＨＲＥである、請求項２～５のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項7】
前記低酸素応答性調節性核酸が、配列番号１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６もしくは２７またはその機能的断片もしくはそのホモログのいずれかを含み、から本質的になり、またはからなり、前記機能的断片およびホモログが複数のＨＲＥを含む、請求項２～６のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項8】
前記低酸素応答性調節性核酸が、配列番号１９もしくは２６またはそれに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくはより高い配列同一性を有するそのホモログを含む、から本質的になる、またはからなる、請求項２～７のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項9】
前記低酸素応答性調節性核酸が、レトロウイルスまたはレンチウイルスベクター中、任意選択的にＳＦＧレトロウイルスベクター中に含まれる、請求項２～８のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項10】
前記レトロウイルスまたはレンチウイルスベクターのエンハンサー領域が、複数のＨＲＥ、好ましくは、連続的に位置していてもよいかつ／または空間的に分離していてもよい９つのＨＲＥを含むように改変されている、請求項９に記載の核酸分子。
【請求項11】
前記エンハンサー領域が複数のＨＲＥで置き換えられており、かつ任意選択的に前記レトロウイルスまたはレンチウイルスベクターのプロモーターが改変されていない、請求項９または１０に記載の核酸分子。
【請求項12】
前記ＨＲＥが、以下の酸素応答性遺伝子のいずれか１つもしくは複数またはそのオルソログもしくはパラログ：エリスロポエチン（ＥＰＯ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、グルコーストランスポーター（例えばＧｌｕｔ－１）、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）、アルドラーゼ（ＡＬＤ）、エノラーゼ（例えばＥＮＯ３）、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、一酸化窒素シンテターゼ（ＮＯＳ）、ヘムオキシゲナーゼ、筋肉解糖酵素ピルビン酸キナーゼ（ＰＫＭ）、エンドセリン－１（ＥＴ－１）に由来し、前記ＨＲＥが哺乳動物遺伝子、任意選択的にヒトに由来し、かつ／または人工的に合成されていてもよい、請求項２～１１のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項13】
前記ＯＤＤが、配列番号２８：Ｘ１Ｘ２ＬＥＭＬＡＰＹＩＸＭＤＤＤＸ３Ｘ４Ｘ５により表され、「Ｘ１～５」が任意のアミノ酸残基であることができ、任意選択的に、Ｘ１が「Ｌ」または任意の保存的置換であり、Ｘ２が「Ｄ」または任意の保存的置換であり、Ｘ３が「Ｆ」または任意の保存的置換であり、Ｘ４が「Ｑ」または任意の保存的置換であり、Ｘ５が「Ｌ」または任意の保存的置換である、任意の先行する請求項に記載の核酸分子。
【請求項14】
前記ＯＤＤが、配列番号２９、３０もしくは３１、またはそれに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくはより高い配列同一性を有し、かつ配列番号２８を含むそのホモログにより表される、任意の先行する請求項に記載の核酸分子。
【請求項15】
前記ＯＤＤが、配列番号５、または配列番号５に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくはより高い配列同一性を有するそのバリアントにより表され、前記機能的断片またはバリアントが配列番号４を含む、任意の先行する請求項に記載の核酸分子。
【請求項16】
抗腫瘍特性を有する前記ポリペプチドが細胞外抗原特異的標的化領域を含む、任意の先行する請求項に記載の核酸分子。
【請求項17】
抗腫瘍特性を有する前記ポリペプチドが、腫瘍への送達のための１つまたは複数のタンパク質を含み、前記タンパク質が、免疫刺激抗体；細胞活性化および腫瘍殺傷能力を付与する表面もしくは細胞内受容体；Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）；免疫調節性サイトカイン（例えば、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５）、デコイ抗体（例えば、ＰＤアクシス相互作用性抗体）、ならびに／または宿主細胞機能を有益に変更する任意の他の核酸（Ｌｃｋ、ＴＣＲゼータ鎖、ＺＡＰ７０など）を含むがこれらに限定されない、任意の先行する請求項に記載の核酸分子。
【請求項18】
抗腫瘍特性を有する前記ポリペプチドが正常酸素条件下で分解される、任意の先行する請求項に記載の核酸分子。
【請求項19】
低酸素が、５％より低い、好ましくは３％より低いＯ２濃度、または対応する非がん性臓器、組織もしくは細胞のＯ２利用可能性もしくは分圧と比べて低減したＯ２利用可能性を含み、かつ正常酸素が５％より高いＯ２濃度を含む、任意の先行する請求項に記載の核酸分子。
【請求項20】
前記ＣＡＲが、任意選択的に請求項１０～１２において定義される、少なくとも１つの酸素依存性分解ドメイン（ＯＤＤ）を含むまたはそれと会合した任意のＣＡＲであり、かつ前記ＣＡＲの発現が請求項２～１２のいずれかに記載の調節性核酸配列の制御下にある、任意の先行する請求項に記載の核酸分子。
【請求項21】
前記ＣＡＲが、第１、第２、第３、第４世代ＣＡＲ、スプリットＣＡＲ設計、アーマードＣＡＲから選択される、任意の先行する請求項に記載の核酸分子。
【請求項22】
前記ＣＡＲがＥｒｂＢファミリーの受容体に対して特異性を有する、任意の先行する請求項に記載の核酸分子。
【請求項23】
任意の先行する請求項に記載のＣＡＲを含むかつ／または発現する免疫応答細胞であって、任意選択的に以下：（ｉ）腫瘍局在化、例えばケモカイン受容体、（ｉｉ）オフターゲット効果を予防すること、（ｉｉｉ）エクスビボ拡大増殖を促すことのいずれか１つまたは複数を促すための少なくとも１つの追加のＣＡＲおよび／またはさらなるキメラポリペプチドおよび／またはポリペプチドを含む、免疫応答細胞。
【請求項24】
前記さらなるキメラポリペプチドが、１つまたは複数のＯＤＤ、例えば、少なくとも１つのＯＤＤと組み合わせたインターロイキン（インターロイキン－ＯＤＤ）を含み、前記インターロイキンが、任意選択的にＩＬ１２、ＩＬ１８、ＩＦＮｇである、請求項２３に記載の免疫応答細胞。
【請求項25】
前記ＣＡＲが低酸素の条件下で発現され、かつ正常酸素条件下で実質的に発現されず、かつ抗腫瘍特性を有する前記ポリペプチドが正常酸素条件下で実質的に分解される、請求項２３または２４に記載の免疫応答細胞。
【請求項26】
免疫応答細胞の調製方法であって、ａ．対象からリンパ系または骨髄由来細胞を単離すること、
ｂ．前記細胞を改変して、請求項１～２２のいずれか１項に記載の核酸分子を導入すること、
ｃ．前記改変された細胞をエクスビボで拡大増殖させること、
ｄ．低酸素の条件下で前記核酸分子を発現することができる拡大増殖された細胞を得ること
を含む、方法。
【請求項27】
請求項２６に記載の方法により得られ得る免疫応答細胞。
【請求項28】
リンパ系由来細胞、例えばナチュラルキラー細胞、Ｂ細胞またはＴ細胞、好ましくはＴ細胞であり、任意選択的に前記免疫応答細胞が骨髄由来細胞、例えばマクロファージまたは好中球であり、任意選択的に前記免疫応答細胞が幹細胞、例えばｉＰＳＣである、請求項２３～２５のいずれかに記載の免疫応答細胞。
【請求項29】
血液または固形がんの治療方法であって、それを必要とする患者に請求項２６に記載の方法により得られ得る改変された免疫応答細胞を投与することまたは請求項２３～２５、２８および２８のいずれかに記載の改変された免疫応答細胞を投与することを含む、方法。
【請求項30】
前記固形がんが頭頸部扁平細胞癌（ＨＮＳＣＣ）である、請求項２９に記載の方法。
【請求項31】
前記固形がんが早期ステージがんである、請求項３０に記載の方法。
【請求項32】
前記投与することが、以下：腫瘍内、静脈内、胸水、腹腔内のいずれかにより実行される、請求項２９～３１のいずれかに記載の方法。
【請求項33】
請求項２６に記載の方法により得られ得る免疫応答細胞または請求項２３～２５、２７および２８のいずれかに記載の免疫応答細胞を含む、医薬組成物。
【請求項34】
請求項２６に記載の方法により得られ得る免疫応答細胞または請求項２３～２５、２７および２８のいずれかに記載の免疫応答細胞ならびに／または請求項３３に記載の医薬組成物を含む、キット。
【請求項35】
がん、特には固形がんの治療における、請求項２６に記載の方法により得られ得る免疫応答細胞の使用または請求項２３～２５、２７および２８のいずれかに記載の免疫応答細胞の使用ならびに／または請求項３３に記載の医薬組成物の使用。
【請求項36】
持続性ＣＡＲシグナル伝達の予防における、請求項２～２３のいずれかに記載の低酸素応答性調節性核酸の使用および／または請求項１～２２のいずれかに記載の核酸の使用。
【請求項37】
少なくとも９つの個々のＨＲＥを含む低酸素応答性調節性核酸であって、任意選択的に前記ＨＲＥがレトロウイルスまたはレンチウイルスベクター中、任意選択的にＳＦＧレトロウイルスベクター中に含まれる、低酸素応答性調節性核酸。
【請求項38】
前記レトロウイルスまたはレンチウイルスベクターのエンハンサー領域が、前記少なくとも９つのＨＲＥを含むように改変されている、低酸素応答性調節性核酸。
【請求項39】
前記レトロウイルスまたはレンチウイルスベクターのエンハンサー領域が複数のＨＲＥで実質的に置き換えられており、かつ任意選択的に前記レトロウイルスまたはレンチウイルスベクターのプロモーターが改変されていない、請求項３７または３８に記載の低酸素応答性調節性核酸。
【請求項40】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸分子の発現を駆動するための、請求項３７～３９のいずれかに記載の低酸素応答性調節性核酸の使用であって、任意選択的に、前記ＣＡＲが任意選択的に１つまたは複数の酸素依存性分解ドメイン（ＯＤＤ）を含むまたはそれと関連付けられている、使用。
【請求項41】
請求項２９～３２のいずれかに記載の治療に対する対象の好適性を決定する方法であって、前記方法が、少なくとも２、３、４つまたは５つ全ての以下の遺伝子：ＰＧＫ１、ＳＬＣ２Ａ１、ＣＡ９、ＡＬＤＯＡおよびＶＥＧＦＡの共発現についてモニターすることを含み、前記対象における前記遺伝子の共発現が治療に対する前記対象の好適性を指し示し、かつ／または、前記方法が、対象からの腫瘍生検の免疫組織化学染色ならびに前記腫瘍もしくは間質中のＨＩＦ安定化および／もしくは前記腫瘍のＨＩＦ安定化領域へのＴ細胞浸潤（および／もしくは他の免疫応答細胞の前記浸潤）を評価することを含み、前記腫瘍のＨＩＦ安定化領域への前記免疫応答細胞の浸潤が治療に対する対象の好適性を指し示す、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、治療剤、特には治療用ポリペプチドおよび低酸素応答性発現が可能な核酸、それを組み込んだ細胞および治療的または予防的処置における、特に低酸素の条件、例えば、典型的には固形がん環境中に見出される該条件下での治療剤の選択的発現を要求する方法における、それらの使用に関する。核酸は、新規の低酸素応答性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードしてもよい。本発明はまた低酸素応答性調節性核酸に関する。
【背景技術】
【0002】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するように操作されたＴ細胞は、ヒト身体中のがん細胞を標的化してそれを破壊するように免疫系を再方向付けする有効なやり方である。特にＣＡＲ Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ）療法は、血液がんに対する有効かつ実行可能な治療として大きな見込みを示している。しかしながら、固形がん微環境の複雑性は現行のＣＡＲ－Ｔアプローチに対して課題を提起する。１つの主な障害は腫瘍特異的な標的抗原の不足であり、その非存在は、結果的な副作用と共に正常組織内でのオフターゲットＣＡＲ Ｔ細胞活性化を結果としてもたらし得る。抗原に結合すると、ＣＡＲは堅牢なＴ細胞活性化および標的細胞のその後の細胞溶解性殺傷を開始させる。しかしながら、腫瘍細胞のＣＡＲ媒介性殺傷の選択性は現在、ＣＡＲ抗原の体内分布によってのみ支配されている。現行のアプローチにおいて、ＣＡＲ Ｔ細胞のオンターゲットオフ腫瘍活性化は潜在的に致死的な毒性を結果としてもたらし得るので、腫瘍選択性はしたがってＣＡＲ－Ｔ療法の成功にとって決定的なものである。
【0003】
低酸素はほとんどの固形腫瘍に特徴的であり、固形腫瘍において腫瘍細胞の増殖性および高い代謝性の要求は、非効率的な腫瘍血管系と共に、健常臓器／組織の酸素供給（５～１０％のＯ２）と比較して不十分な酸素供給（＜２％のＯ２）の状態を結果としてもたらす。臨床的に、低酸素は、予後不良、ならびに化学療法および放射線療法の両方に対する抵抗性と関連付けられている。細胞は、構成的に発現される転写因子低酸素誘導因子アルファ（ＨＩＦ１α）を通じて低酸素を検出しかつそれに急速に応答するためのエレガントな生物学的機構を進化させてきた。十分なＯ２の条件下で、ＨＩＦ１αは、その構造内の酸素依存性分解ドメイン（ＯＤＤ）中の２つのプロリンのヒドロキシル化を通じて分解される。ヒドロキシル化されたＯＤＤはその後にフォンヒッペル－リンドウ腫瘍抑制因子により認識され、これは、ＨＩＦ１αをユビキチン化し、それによりプロテアソーム分解に対してそれを標的化する、Ｅ３ユビキチンリガーゼ複合体の部分を形成する。反対に、限定的Ｏ２濃度下でＨＩＦ１αは安定化され、核に移行して、そこでＨＩＦ１βおよびｐ３００／ＣＢＰに結合する。この複合体は次に、転写を開始させるいくつかの低酸素応答性遺伝子のプロモーター領域中の低酸素応答エレメント（ＨＲＥ）と会合し得る。
【0004】
低い酸素張力を活用する様々ながん療法が開発中であり、これには特に、低酸素特異的遺伝子療法、低酸素活性化プロドラッグ、ＨＩＦ１相互作用性薬物および偏性嫌気性細菌が含まれる。低酸素は腫瘍微環境を健常な正常酸素組織のそれから区別するので、ＣＡＲ Ｔ細胞発現の誘導のための望ましいマーカーとなる。Ｊｕｉｌｌｅｒａｔ ｅｔ ａｌ．，２０１７，（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ７，３９８３３）は、ＯＤＤと融合したＣＡＲを調べた。このアプローチはＣＡＲ Ｔ細胞に、インビトロの低酸素条件下で腫瘍細胞を殺傷する向上した能力を付与したが、著者らは、正常酸素条件下で残余の腫瘍殺傷を観察しており、システムの望ましくない漏出性を指し示した。
【0005】
オフターゲット効果を低減させるように低酸素の区画に発現を厳密に制限することができる、例えばＣＡＲおよびＣＡＲ Ｔ細胞の形態の、治療用核酸、ポリペプチド、および操作された細胞を開発することが望ましい。これは次いで、治療、特には固形がんの治療を、より広い種類の腫瘍抗原、特には正常組織上の他に腫瘍上に見出される腫瘍抗原に拡張することを可能とする。
【0006】
腫瘍部位において治療剤の発現を駆動および調節することを可能にする技術を向上させることもまた望ましい。
【0007】
治療前に、ＣＡＲ Ｔ細胞療法に対する対象の好適性を決定できるようにすることもまた望ましい。
【発明の概要】
【0008】
本出願人は、１つまたは複数の酸素依存性分解ドメイン（ＯＤＤ）および抗腫瘍特性を有する少なくとも１つのポリペプチドを含むキメラポリペプチドをコードする核酸分子を含む二重酸素感知システムであって、該核酸分子が、複数の低酸素応答エレメント（ＨＲＥ）を含む、から本質的になる、またはからなる低酸素応答性調節性核酸に作動可能に連結している、システムを発明した。これは、核酸分子が低酸素条件下で発現されるが、正常酸素条件下で無視できる発現を伴うことを可能とする。二重酸素感知システムは、低酸素応答性調節性核酸の作用と組み合わせて、ＯＤＤの存在のため、正常酸素条件における、抗腫瘍特性を有する少なくとも１つのポリペプチドの分解をさらに提供する。核酸分子および／またはキメラポリペプチドは、例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）中および／または免疫応答細胞中に含まれかつ／または発現されてもよい。１つまたは複数のＯＤＤに連結されかつ低酸素応答性調節性核酸の制御下で発現されるＣＡＲの組み合わせた使用は本明細書において「ｈｙｐｏｘｉＣＡＲ」と称される。抗腫瘍特性を有するポリペプチドの正常酸素条件における分解を引き起こす１つまたは複数のＯＤＤにより付与される能力と共に、実質的に低酸素の条件においてのみ発現を可能とする低酸素応答性調節性核酸の組み合わせた使用は、任意のオフターゲット効果の低減または実質的な排除を可能とする。
【0009】
本出願人はまた、ｈｙｐｏｘｉＣＡＲを用いる治療に対する対象の好適性を決定する方法を開発した。これは、任意の２、３、４または５つの以下の遺伝子：ＰＧＫ１、ＳＬＣ２Ａ１、ＣＡ９、ＡＬＤＯＡおよびＶＥＧＦＡの共発現をモニターすることにより為されてもよく、そのような共発現は治療に対する対象の好適性を指し示す。代替的または追加的に、対象からの腫瘍生検は、免疫組織化学的に染色され、かつ腫瘍もしくは間質中のＨＩＦ安定化および／または腫瘍のＨＩＦ安定化領域へのＴ細胞もしくは他の免疫応答細胞の浸潤について評価されてもよく、そのようなＨＩＦ安定化または腫瘍のＨＩＦ安定化領域への免疫応答細胞の浸潤は治療に対する対象の好適性を指し示す。
【0010】
本出願人はまた、本発明の低酸素応答性調節性核酸は、従来の調節性核酸と比べて、固形腫瘍の部位において発現をより良好に駆動および調節できることを発見した。
【発明を実施するための形態】
【0011】
低酸素応答性調節性核酸
本発明の第１の態様は、複数の低酸素応答エレメント（ＨＲＥ）を含む、から本質的になる、またはからなる低酸素応答性調節性核酸を提供する。低酸素応答性調節性核酸は、優先的に低酸素の条件下で核酸分子の発現を駆動および調節することができる。
本発明の第１の態様は、複数の低酸素応答エレメント（ＨＲＥ）を含む、から本質的になる、またはからなる低酸素応答性調節性核酸を提供する。低酸素応答性調節性核酸は、優先的に低酸素の条件下で核酸分子の発現を駆動および調節することができる。
【0012】
低酸素応答性調節性核酸は、複数のＨＲＥをその中に導入するように改変された既知の調節性核酸に由来しまたは基づいてもよい。代替的に、複数のＨＲＥは単独でそれら自体が、調節機能、すなわち、転写を開始させかつそれに作動可能に連結した核酸分子の発現を駆動する能力を有してもよい。そのような場合、複数のＨＲＥは単独で低酸素応答性調節性核酸を構成する。
【0013】
本発明の低酸素応答性調節性核酸は低酸素応答性であり、すなわち、それに作動可能に連結した核酸分子の発現は優先的に低酸素条件下で誘導される。これは、有利なことに、発現が身体の低酸素性領域中、例えば固形腫瘍、低酸素性組織および低酸素性臓器中（地理的標的化）；またはある特定の時間的期間の間、例えば低酸素、虚血の期間の間（時間的標的化）；またはある特定の環境条件に応答して、例えば条件が低酸素性である場合（環境的標的化もしくはトリガーによる標的化）においてのみ誘導されることを可能とする。本明細書における「優先的」な発現に対する言及は、正常酸素条件に対して選好的に低酸素条件下で発現が駆動されることを意味するものと解釈される。調節性核酸は場合により「漏出性」の発現を有するが、本発明の低酸素応答性調節性核酸は、インビトロおよびインビボの両方で正常酸素条件または組織における活性化の証拠を示さなかった。
【0014】
さらには、低酸素環境において、本発明の調節性核酸は、予想外および有利なことに、ＳＦＧプロモーターなどの現行の使用における最も強いレンチウイルスおよびレトロウイルスプロモーターのいくつかよりも強い。結果として、本発明の調節性核酸を使用した場合に、低酸素環境において従来のレトロウイルスおよびレンチウイルスプロモーターを使用した場合に見られる発現レベルと比較して、腫瘍の部位における（すなわち、低酸素環境における）発現レベルの増加が可能である。これは、例えば、一過性もしくは低レベルの低酸素において標的化する場合、または特異的に低酸素性微環境中での治療剤の高い負荷の送達が要求される場合、または低密度抗原を標的化する場合、または弱い治療剤、例えば弱いＣＡＲを使用する場合に、特に有利に本発明の調節性核酸を利用する。
【0015】
本発明の低酸素応答性調節性核酸の使用は、腫瘍の部位における発現が所望される応用に限定される必要はない。それらは、低酸素応答性発現が所望される任意の応用のために使用されてもよい。
【0016】
本明細書において定義される「調節性核酸」という用語は、それに作動可能に連結した核酸分子の発現を駆動することができる核酸を指し、「発現を駆動する」は転写の開始を指す。調節性核酸に作動可能に連結した核酸分子の発現はまた転写の調節に依存性であり、該調節は、要因、例えば、（例えば１細胞当たりで発現される導入遺伝子の数により決定されるような）発現の強さ、核酸分子が発現される場所（例えば組織特異的発現）、および核酸分子が発現される時（例えば誘導性発現）を決定する。本明細書において定義される「低酸素応答性調節性核酸」は、したがって、低酸素の条件下でそれに作動可能に連結した核酸分子の発現を優先的に駆動することができる。
【0017】
発現の調節は、転写制御エレメントを介して媒介されてもよく、転写制御エレメントは、一般に、発現される核酸分子の５’隣接または上流の核酸配列中に埋め込まれている。この上流核酸領域は多くの場合に「プロモーター」と称され、その理由は、それは転写開始複合体の結合、形成および／または活性化を促進し、したがって、３’下流の核酸分子の発現を駆動および／または調節することができるからである。
【0018】
「プロモーター」という用語は、本明細書において使用される場合、それらが作動可能に連結した配列の発現をもたらす（駆動および／または調節する）ことができる調節性核酸を指す。「プロモーター」は、古典的なゲノム遺伝子に由来する転写調節性核酸を包含する。通常、プロモーターはＴＡＴＡボックスを含み、ＴＡＴＡボックスは、転写開始複合体を適切な転写開始の開始部位に方向付けることができる。しかしながら、一部のプロモーターはＴＡＴＡボックスを有さないが（ＴＡＴＡレスプロモーター）、発現を駆動および／または調節するために依然として十分に機能的である。プロモーターはＣＣＡＡＴボックス配列ならびに追加の調節エレメント（すなわち、上流活性化配列またはシス－エレメント、例えばエンハンサーおよびサイレンサー）を追加的に含んでもよい。（低酸素応答性）「調節性核酸」、「調節配列」および「プロモーター」という用語は本明細書において交換可能に使用される。調節性核酸は、「単離され」ていてもよく、すなわち、その元々の供給源から除去されていてもよい。
【0019】
プロモーターまたは調節性核酸に「作動可能に連結した」に対する本明細書における言及は、発現されるべき核酸分子の発現をプロモーター／調節性核酸が駆動できるような、プロモーター／調節性核酸および該核酸分子の配置および相対的な位置取りを指す。「核酸分子」は、好適には、遺伝子、導入遺伝子、コーディングもしくは非コーディング配列、ＲＮＡ分子（例えばｍＲＮＡもしくはサイレンシング用のＲＮＡ分子、例えば（ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡｉ）、調節マイクロＲＮＡ（ｍｉｃｒｏ－ＲＮＡ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ；ｍｉＲ）、触媒性ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡアプタマーなど）、発現ベクター、ＴＣＲ、ＣＡＲ（第１、第２、第３、第４もしくは任意のその後の世代のＣＡＲ）、または任意の他の関心対象の核酸配列であってもよい。
【0020】
低酸素応答性調節性核酸は、複数のＨＲＥを含むようにまたは追加のＨＲＥを付加するように改変された既知の調節配列であってもよい。複数のＨＲＥは、既知のプロモーター（該プロモーターは、追加の調節エレメント、例えば上流活性化配列もしくはシス－エレメント、例えばエンハンサーおよびサイレンサーを含んでもよい）内のいずれの場所に位置していてもよく、低酸素応答性を付与してもよく、または低酸素応答性の既存のレベルを増強してもよい。複数のＨＲＥは、既知のプロモーター配列内の挿入であってもよく、かつ／または既知のプロモーターの全てのもしくは１つもしくは複数の部分を置換してもよい。追加的または代替的に、複数のＨＲＥは、既知のエンハンサー内の挿入であってもよく、かつ／または既知のエンハンサーの全てのもしくは１つもしくは複数の部分を置換してもよい。複数のＨＲＥは、空間的に分離していてもよく、もしくは連続的であってもよく、または両方の組み合わせであってもよい。
【0021】
複数のＨＲＥを含むように改変されるプロモーターは、原核性または真核性プロモーター、例えば、以下の機能的断片および最小バージョンを含めて、ＳＦＧ、ｈＡＣＴＢ、ｈＥＦ－１アルファ、ＣＡＧ、ＣＭＶ、ＨＳＶ－ＴＫ、ｈＡＣＴＢ、ｈＡＣＴＢ－Ｒ、ＬＴＲ、ＥＦ１ａ、ＳＶ４０、ＰＧＫ１、Ｕｂｃ、ヒトベータアクチン、ＴＲＥ、ＵＡＳ、Ａｃ５、ポリヘドリン、ＣａＭＫＩＩａ、ＧＡＬ１，１０、ＴＥＦ１、ＧＤＳ、ＡＤＨ１、ＣａＭＶ３５Ｓ、Ｕｂｉ、Ｈ１、Ｕ６、Ｔ７、Ｔ７ｌａｃ、Ｓｐ６、ａｒａＢＡＤ、ｔｒｐ、ｌａｃ、Ｐｔａｃ、ｐＬ、ＮＦＡＴ相互作用性プロモーター（ＩＬ－２プロモーターなど）から選択されてもよい。複数のＨＲＥを含むように改変されてもよい他のプロモーターとしては、Ｐｏｗｅｌ ｅｔ ａｌ．，（Ｄｉｓｃｏｖ Ｍｅｄ．２０１５，１９（１０２），４９－５７）からの以下の表１に列記されるプロモーターが挙げられ、これには、表１に列記されるプロモーターの機能的断片および最小バージョンも含まれる。
【0022】
本発明の低酸素応答性調節性核酸は、複数のＨＲＥに加えて別のプロモーターからの１つまたは複数の部分、好ましくは機能的部分を含んでもよい、「ハイブリッドプロモーター」、例えばキメラプロモーターであってもよい。そのような部分の例は、最小プロモーター、活性をさらに増強するためならびに／または空間的および／もしくは時間的発現パターンを変更するための追加の調節エレメントを含む。
【0023】
【0024】
（複数のＨＲＥの）各単一のＨＲＥエレメントは独立して、任意の順序で、少なくとも１つのＨＩＦ結合部位（ＨＢＳ）および任意選択的に少なくとも１つのＨＩＦ補助部位（ＨＩＦ ａｎｃｉｌｌａｒｙ ｓｉｔｅ；ＨＡＳ）を含み、から本質的になり、またはからなり、任意選択的に前記ＨＢＳおよびＨＡＳはリンカーにより分離されている。好適には、ＨＲＥはＨＮＦ－４部位をさらに含んでもよい。
【0025】
ＨＢＳおよびＨＡＳの両方を含むＨＲＥが好ましいが、ＨＡＳの存在は任意選択的である。したがって、ＨＲＥに対する本明細書における任意の言及はまた、ＨＲＥがＨＡＳエレメントを有しないオプションを含む。
【0026】
ＨＩＦ結合部位（ＨＢＳ）：５’－（Ａ／Ｇ）ＣＧＴ（Ｇ／Ｃ）－３’（配列番号１）。ＨＢＳは任意選択的にＡＣＧＴＧであってもよい。
【0027】
ＨＩＦ補助部位（ＨＡＳ）：５’－ＣＡ（Ｃ／Ｇ）（Ｇ／Ａ）（Ｔ／Ｃ／Ｇ）－３’（配列番号２）。ＨＡＳは任意選択的にＣＡＣＡＧであってもよい。
【0028】
ＨＮＦ－４部位：５’－ＴＧＡＣＣＴ－３’（配列番号３）。
【0029】
ＨＢＳおよびＨＡＳ（存在する場合）は、剛性または柔軟であってもよいリンカーにより分離されていてもよい。好適には、リンカーは少なくとも６ヌクレオチドの長さであり、任意選択的に８ヌクレオチドより長い。好ましくは、リンカーは６または８ヌクレオチドの長さである。
【0030】
リンカーは、酸素応答性遺伝子のプロモーター領域中に天然に見出されるリンカーに対応してもよい。好適なリンカーの例は配列番号４（５’－ＧＴＣＴＣＡ－３’）に与えられる。他の好適なリンカーは当該技術分野において周知であり、当業者はリンカー設計の原理に精通している。
【0031】
以下の表２は、ＨＲＥの代表的であるが非限定的な例を示す。ＨＲＥが由来する遺伝子供給源は左手列に示される。ＨＢＳおよびＨＡＳ（存在する場合）は太字および下線で示される。
【0032】
【0033】
上記の表２に示されるＨＲＥ含有遺伝子に加えて、他の遺伝子供給源としては、アルドラーゼＡ、アルドラーゼＣ、ＨＩＦ－１β、ＨＩＦ－２β、ＣＴＬＡ－４、ＰＨＤ２、ＰＨＤ３、エノラーゼ１、エノラーゼ２、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコースリン酸イソメラーゼ１、ＨＩＦ－３α、１Ｌ－１０、インターフェロン－γ、リンパ球活性化遺伝子３、ミトコンドリアによりコードされる１２Ｓ ｒＲＮＡ、６－ホスホフルクト－２－キナーゼ／フルクトース－２，６－ビホスファターゼ３（ｆｒｕｃｔｏｓｅ－２，６－ｂｉｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ３）、ホスホフルクトキナーゼ；ホスホグリセリン酸キナーゼ１、ホスホグルコムターゼ２、ピルビン酸キナーゼ、パーフォリン１、ｇｌｕｔ１、ｇｌｕｔ３、トリオースリン酸イソメラーゼ１、血管内皮増殖因子Ａ、フォンヒッペル－リンドウ腫瘍抑制因子が挙げられる。上述の遺伝子は、低酸素への曝露でＴ細胞中で上方調節されることがＧｒｏｐｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１７（Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２０，２５４７－２５５５）により示された。低酸素応答性調節性核酸中に含まれるＨＲＥは、したがって、上述の遺伝子のいずれかまたは表２に列記される遺伝子のいずれかに由来してもよい。代替的に、低酸素応答性調節性核酸中に含まれるＨＲＥは人工的に合成されてもよい。
【0034】
低酸素応答性調節性核酸は、表２（配列番号５～１７）に示される少なくとも１つもしくは複数の配列または配列番号７～１９のいずれかに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはより高い配列同一性を有する配列であって、表１に示されるようなもしくは本明細書において定義されるような少なくともＨＢＳ（および任意選択的にＨＡＳも）を含む、本質的にからなる、もしくはからなる配列を含む、本質的にからなる、またはからなるものであってもよい。
【0035】
低酸素応答性調節性核酸は複数のＨＲＥを含み、本質的にからなり、またはからなり、各個々のＨＲＥエレメントは、任意の順序で以下：
（ｉ）例えば配列番号１により表されるような、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５またはそれより多くのＨＩＦ結合部位（ＨＢＳ）、および任意選択的に
（ｉｉ）例えば配列番号２により表されるような、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５またはそれより多くのＨＩＦ補助部位（ＨＡＳ）、および任意選択的に
（ｉｉｉ）例えば配列番号３により表されるような、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５またはそれより多くのＨＮＦ－４部位
の任意の組み合わせを含む、本質的にからなる、またはからなる。
（ｉ）例えば配列番号１により表されるような、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５またはそれより多くのＨＩＦ結合部位（ＨＢＳ）、および任意選択的に
（ｉｉ）例えば配列番号２により表されるような、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５またはそれより多くのＨＩＦ補助部位（ＨＡＳ）、および任意選択的に
（ｉｉｉ）例えば配列番号３により表されるような、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５またはそれより多くのＨＮＦ－４部位
の任意の組み合わせを含む、本質的にからなる、またはからなる。
【0036】
低酸素応答性調節性核酸は、配列番号１の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれより多くのコピー、および任意選択的に配列番号２の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれより多くのコピー、およびさらに任意選択的に配列番号３の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれより多くのコピーを含む、本質的にからなる、またはからなるものであってもよい。
【0037】
本明細書において定義される「複数」のＨＲＥは、単一のＨＲＥエレメントの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれより多くのコピーを意味するものと解釈され、単一のＨＲＥエレメントは本明細書において定義される通りである。複数のＨＲＥを構成する単一（個々）のＨＲＥエレメントは、空間的に分離していてもよく（例えばエレメント、例えばエンハンサー、リンカー、介在性配列により分離されている）、または連続的、もしくは両方の組み合わせであってもよい。有利には、低酸素応答性の強さは、低酸素応答性における増加と相関するＨＲＥの数における増加を用いて必要性にしたがって適応されてもよい。
【0038】
１つの実施形態によれば、低酸素応答性調節性核酸または複数のＨＲＥは、３つの連続的な「ＨＢＳ－リンカー－ＨＡＳ」配列、すなわち、ＨＢＳ－リンカー－ＨＡＳ－リンカー－ＨＢＳ－リンカー－ＨＡＳ－リンカー－ＨＢＳ－リンカー－ＨＡＳを含む、から本質的になる、またはからなる。リンカーは、本明細書において定義される通りであるか、または任意の好適なリンカーである。代替的な実施形態において、リンカーは存在せず、またはあらゆるＨＢＳ－ＨＡＳがリンカーにより分離されているわけではない。代替的な実施形態において、ＨＡＳエレメントは存在しない。
【0039】
１つの実施形態によれば、低酸素応答性調節性核酸または複数のＨＲＥは、６つの連続的な「ＨＢＳ－リンカー－ＨＡＳ」配列、すなわち、ＨＢＳ－リンカー－ＨＡＳ－リンカー－ＨＢＳ－リンカー－ＨＡＳ－リンカー－ＨＢＳ－リンカー－ＨＡＳ－リンカー－ＨＢＳ－リンカー－ＨＡＳ－リンカー－ＨＢＳ－リンカー－ＨＡＳ－リンカー－ＨＢＳ－リンカー－ＨＡＳを含む、から本質的になる、またはからなる。リンカーは、本明細書において定義される通りであるか、または任意の好適なリンカーである。代替的な実施形態において、リンカーは存在せず、またはあらゆるＨＢＳ－ＨＡＳがリンカーにより分離されているわけではない。代替的な実施形態において、ＨＡＳエレメントは存在しない。
【0040】
１つの実施形態によれば、低酸素応答性調節性核酸または複数のＨＲＥは、９つの連続的な「ＨＢＳ－リンカー－ＨＡＳ」配列、すなわち、ＨＢＳ－リンカー－ＨＡＳ－リンカー－ＨＢＳ－リンカー－ＨＡＳ－リンカー－ＨＢＳ－リンカー－ＨＡＳ－リンカー－ＨＢＳ－リンカー－ＨＡＳ－リンカー－ＨＢＳ－リンカー－ＨＡＳ－リンカー－ＨＢＳ－リンカー－ＨＡＳ－リンカー－ＨＢＳ－リンカー－ＨＡＳ－リンカー－ＨＢＳ－リンカー－ＨＡＳ－リンカー－ＨＢＳ－リンカー－ＨＡＳを含む、から本質的になるまたはからなる。リンカーは、本明細書において定義される通りであるか、または任意の好適なリンカーである。代替的な実施形態において、リンカーは存在せず、またはあらゆるＨＢＳ－ＨＡＳがリンカーにより分離されているわけではない。代替的な実施形態において、ＨＡＳエレメントは存在しない。
【0041】
各個々のＨＲＥエレメントを構成する部分、すなわち、ＨＢＳ、および任意選択的にＨＡＳおよびさらに任意選択的にＨＮＦ－４は、任意の順序であってもよい。部分は連続的に位置していてもよく、かつ／または、例えば好適なリンカー、介在性配列などの使用を通じて、空間的に分離していてもよい。連続的な位置取りは本明細書において「タンデムで」または「スタックして」（ｓｔａｃｋｅｄ）と称されることもある。
【0042】
ＨＲＥまたはＨＲＥを構成する部分（すなわち、ＨＢＳ、および任意選択的にＨＡＳおよびさらに任意選択的にＨＮＦ－４）は、好適には、好ましくは哺乳動物遺伝子供給源、例えばヒト遺伝子供給源からの、任意の酸素応答性遺伝子に由来してもよく、またはそれらは人工的に合成されてもよい。そのような酸素応答性遺伝子の例としては、とりわけ、表２に列記される遺伝子；低酸素への曝露でＴ細胞において上方調節されることがＧｒｏｐｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１７（Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２０，２５４７－２５５５）により示されたような本明細書中で上記に列記された遺伝子；エリスロポエチン（ＥＰＯ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、グルコーストランスポーター（例えば、Ｇｌｕｔ－１）、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）、アルドラーゼ（ＡＬＤ）、エノラーゼ（例えばＥＮＯ３）、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、一酸化窒素シンテターゼ（ＮＯＳ）、ヘムオキシゲナーゼ、筋肉解糖酵素ピルビン酸キナーゼ（ＰＫＭ）、エンドセリン－１（ＥＴ－１）が挙げられ、これには上述の任意のもののオルソログまたはパラログが含まれる。「オルソログ」および「パラログ」は、遺伝子の祖先関係性を記載するために使用される進化的概念を包含する相同性の２つの形態である。「パラログ」という用語は、パラロガス遺伝子に繋がる種のゲノム内の遺伝子重複に関する。「オルソログ」という用語は、種分化に起因する異なる生物における相同遺伝子に関する。オルソログおよびパラログは、（相互）ｂｌａｓｔ検索を使用して当業者により容易に同定され得る。
【0043】
複数のＨＲＥは、発現ベクター、レトロウイルスベクター、またはレンチウイルスベクター、例えばｐＥＬＮＳなど、またはＣＡＲを発現するために好適な任意のベクター内のいずれかの場所に置かれてもよい。任意選択的に、複数のＨＲＥは、レトロウイルス発現ベクター中、例えばレトロウイルスプロモーターのプロモーターまたは長鎖末端反復（ＬＴＲ）中のいずれかの場所に置かれる。複数のＨＲＥは、例えばＬＴＲ中のいずれかの場所に置かれてもよく、かつ／またはオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に並置されてもよい。複数のＨＲＥは、例えば、ＬＴＲ、エンハンサーおよび／またはプロモーターの実質的に全体または部分をＨＲＥで置換してもよい。任意選択的に、ＬＲＴの３’末端は、複数のＨＲＥを含むように改変される。任意選択的に、ＳＦＧレトロウイルスベクターの３’ＬＴＲは、任意選択的に天然プロモーターまたはその部分を保持しながら、天然のエンハンサーの実質的に全体を複数のＨＲＥで置き換えるように改変される。
【0044】
以下の配列番号１８は、ＳＦＧレトロウイルスベクター中の非改変の３’ＬＴＲを示す。
配列番号１８
ＣＴＧＡＡＴＡＴＧＧＧＣＣＡＡＡＣＡＧＧＡＴＡＴＣＴＧＴＧＧＴＡＡＧＣＡＧＴＴＣＣＴＧＣＣＣＣＧＧＣＴＣＡＧＧＧＣＣＡＡＧＡＡＣＡＧＡＴＧＧＡＡＣＡＧＣＴＧＡＡＴＡＴＧＧＧＣＣＡＡＡＣＡＧＧＡＴＡＴＣＴＧＴＧＧＴＡＡＧＣＡＧＴＴＣＣＴＧＣＣＣＣＧＧＣＴＣＡＧＧＧＣＣＡＡＧＡＡＣＡＧＡＴＧＧＴＣＣＣＣＡＧＡＴＧＣＧＧＴＣＣＡＧＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＴＴＴＣＴＡＧＡＧＡＡＣＣＡＴＣＡＧＡＴＧＴＴＴＣＣＡＧＧＧＴＧＣＣＣＣＡＡＧＧＡＣＣＴＧＡＡＡＴＧＡＣＣＣＴＧＴＧＣＣＴＴＡＴＴＴＧＡＡＣＴＡＡＣＣＡＡＴＣＡＧＴＴＣＧＣＴＴＣＴＣＧＣＴＴＣＴＧＴＴＣＧＣＧＣＧＣＴＴＣＴＧＣＴＣＣＣＣＧＡＧＣＴＣＡＡＴＡＡＡＡＧＡＧＣＣＣＡＣＡＡＣＣＣＣＴＣＡＣＴＣＧＧＧＧＣＧＣＣＡＧＴＣＣＴＣＣＧＡＴＴＧＡＣＴＧＡＧＴＣＧＣＣＣＧＧＧＴＡＣＣＣＧＴＧＴＡＴＣＣＡＡＴＡＡＡＣＣＣＴＣＴＴＧＣＡＧＴＴＧＣＡＴＣＣＧＡＣＴＴＧＴＧＧＴＣＴＣＧＣＴＧＴＴＣＣＴＴＧＧＧＡＧＧＧＴＣＴＣＣＴＣＴＧＡＧＴＧＡＴＴＧＡＣＴＡＣＣＣＧＴＣＡＧＣＧＧＧＧＧＴＣＴＴＴＣＡ
配列番号１８
ＣＴＧＡＡＴＡＴＧＧＧＣＣＡＡＡＣＡＧＧＡＴＡＴＣＴＧＴＧＧＴＡＡＧＣＡＧＴＴＣＣＴＧＣＣＣＣＧＧＣＴＣＡＧＧＧＣＣＡＡＧＡＡＣＡＧＡＴＧＧＡＡＣＡＧＣＴＧＡＡＴＡＴＧＧＧＣＣＡＡＡＣＡＧＧＡＴＡＴＣＴＧＴＧＧＴＡＡＧＣＡＧＴＴＣＣＴＧＣＣＣＣＧＧＣＴＣＡＧＧＧＣＣＡＡＧＡＡＣＡＧＡＴＧＧＴＣＣＣＣＡＧＡＴＧＣＧＧＴＣＣＡＧＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＴＴＴＣＴＡＧＡＧＡＡＣＣＡＴＣＡＧＡＴＧＴＴＴＣＣＡＧＧＧＴＧＣＣＣＣＡＡＧＧＡＣＣＴＧＡＡＡＴＧＡＣＣＣＴＧＴＧＣＣＴＴＡＴＴＴＧＡＡＣＴＡＡＣＣＡＡＴＣＡＧＴＴＣＧＣＴＴＣＴＣＧＣＴＴＣＴＧＴＴＣＧＣＧＣＧＣＴＴＣＴＧＣＴＣＣＣＣＧＡＧＣＴＣＡＡＴＡＡＡＡＧＡＧＣＣＣＡＣＡＡＣＣＣＣＴＣＡＣＴＣＧＧＧＧＣＧＣＣＡＧＴＣＣＴＣＣＧＡＴＴＧＡＣＴＧＡＧＴＣＧＣＣＣＧＧＧＴＡＣＣＣＧＴＧＴＡＴＣＣＡＡＴＡＡＡＣＣＣＴＣＴＴＧＣＡＧＴＴＧＣＡＴＣＣＧＡＣＴＴＧＴＧＧＴＣＴＣＧＣＴＧＴＴＣＣＴＴＧＧＧＡＧＧＧＴＣＴＣＣＴＣＴＧＡＧＴＧＡＴＴＧＡＣＴＡＣＣＣＧＴＣＡＧＣＧＧＧＧＧＴＣＴＴＴＣＡ
【0045】
９つのＨＲＥを含むように改変されたＳＦＧレトロウイルスベクターのＭＬＶエンハンサー領域を以下に示す。以下の配列番号１９は、ＨＲＥ改変された３’ＬＴＲの配列を示す。下線を引いたセクションは、９つの連続的に置かれたＨＲＥを示し、単一のＨＲＥエレメントは太字下線で指し示される。
【0046】
配列番号１９
【0047】
配列番号２０～２５は、配列番号１８および１９の構成部分をアノテートする。当業者に明らかなように、全ての構成部分が機能のために必要なわけではない。また、配列番号２０～２５により表される構成部分の１つまたは複数が、本明細書において定義されるようなハイブリッドプロモーターを作成するために使用されてもよい。
【0048】
ＭＬＶプロモーター：配列番号２０
ＧＡＡＣＣＡＴＣＡＧＡＴＧＴＴＴＣＣＡＧＧＧＴＧＣＣＣＣＡＡＧＧＡＣＣＴＧＡＡＡＴＧＡＣＣＣＴＧＴＧＣＣＴＴＡＴＴＴＧＡＡＣＴＡＡＣＣＡＡＴＣＡＧＴＴＣＧＣＴＴＣＴＣＧＣＴＴＣＴＧＴＴＣＧＣＧＣＧＣＴＴＣＴＧＣＴＣＣＣＣＧＡＧＣＴＣＡＡＴＡＡＡＡＧＡＧＣＣＣＡＣＡＡＣＣＣＣＴＣＡＣＴＣＧＧ
ＧＡＡＣＣＡＴＣＡＧＡＴＧＴＴＴＣＣＡＧＧＧＴＧＣＣＣＣＡＡＧＧＡＣＣＴＧＡＡＡＴＧＡＣＣＣＴＧＴＧＣＣＴＴＡＴＴＴＧＡＡＣＴＡＡＣＣＡＡＴＣＡＧＴＴＣＧＣＴＴＣＴＣＧＣＴＴＣＴＧＴＴＣＧＣＧＣＧＣＴＴＣＴＧＣＴＣＣＣＣＧＡＧＣＴＣＡＡＴＡＡＡＡＧＡＧＣＣＣＡＣＡＡＣＣＣＣＴＣＡＣＴＣＧＧ
【0049】
ＣＣＡＡＴボックス：配列番号２１
ＣＴＡＧＡＧＡＡＣＣＡＴＣＡＧＡＴＧＴＴＴＣＣＡＧＧＧＴＧＣＣＣＣＡＡＧＧＡＣＣＴＧＡＡＡＴＧＡＣＣＣＴＧＴＧＣＣＴＴＡＴＴＴＧＡＡＣＴＡＡＣＣＡＡＴＣＡＧＴＴＣＧＣＴＴＣＴＣＧＣＴＴＣＴＧＴＴＣＧＣＧＣＧＣＴＴＣ
ＣＴＡＧＡＧＡＡＣＣＡＴＣＡＧＡＴＧＴＴＴＣＣＡＧＧＧＴＧＣＣＣＣＡＡＧＧＡＣＣＴＧＡＡＡＴＧＡＣＣＣＴＧＴＧＣＣＴＴＡＴＴＴＧＡＡＣＴＡＡＣＣＡＡＴＣＡＧＴＴＣＧＣＴＴＣＴＣＧＣＴＴＣＴＧＴＴＣＧＣＧＣＧＣＴＴＣ
【0050】
ＴＡＴＡボックス：配列番号２２
ＴＧＣＴＣＣＣＣＧＡＧＣＴＣＡＡＴＡＡＡＡＧＡＧＣＣＣＡＣＡＡＣＣＣＣＴＣＡＣＴＣＧＧＧＧＣＧＣＣＡＧＴＣＣＴＣＣＧＡＴ
ＴＧＣＴＣＣＣＣＧＡＧＣＴＣＡＡＴＡＡＡＡＧＡＧＣＣＣＡＣＡＡＣＣＣＣＴＣＡＣＴＣＧＧＧＧＣＧＣＣＡＧＴＣＣＴＣＣＧＡＴ
【0051】
ポリＡ部位：配列番号２３
ＴＧＡＣＴＧＡＧＴＣＧＣＣＣＧＧＧＴＡＣＣＣＧＴＧＴＡＴＣＣＡＡＴＡＡＡＣＣＣＴＣＴＴＧＣＡＧＴＴＧＣＡ
ＴＧＡＣＴＧＡＧＴＣＧＣＣＣＧＧＧＴＡＣＣＣＧＴＧＴＡＴＣＣＡＡＴＡＡＡＣＣＣＴＣＴＴＧＣＡＧＴＴＧＣＡ
【0052】
ｓｔｒｏｎｇ－ｓｔｏｐ－ｃＤＮＡ用のＲＮＡ鋳型：配列番号２４
ＧＣＧＣＣＡＧＴＣＣＴＣＣＧＡＴＴＧＡＣＴＧＡＧＴＣＧＣＣＣＧＧＧＴＡＣＣＣＧＴＧＴＡＴＣＣＡＡＴＡＡＡＣＣＣＴＣＴＴＧＣＡＧＴＴＧＣＡＴＣＣＧＡＣＴＴＧＴＧＧＴＣＴＣＧＣＴＧＴＴＣＣＴＴＧＧＧＡＧＧＧＴＣＴＣＣＴＣＴＧＡＧＴＧＡＴＴＧＡＣＴＡＣＣＣＧＴＣＡＧＣＧＧＧＧＧＴＣＴＴＴＣＡ
ＧＣＧＣＣＡＧＴＣＣＴＣＣＧＡＴＴＧＡＣＴＧＡＧＴＣＧＣＣＣＧＧＧＴＡＣＣＣＧＴＧＴＡＴＣＣＡＡＴＡＡＡＣＣＣＴＣＴＴＧＣＡＧＴＴＧＣＡＴＣＣＧＡＣＴＴＧＴＧＧＴＣＴＣＧＣＴＧＴＴＣＣＴＴＧＧＧＡＧＧＧＴＣＴＣＣＴＣＴＧＡＧＴＧＡＴＴＧＡＣＴＡＣＣＣＧＴＣＡＧＣＧＧＧＧＧＴＣＴＴＴＣＡ
【0053】
１１塩基逆位反復：配列番号２５
ＧＧＧＧＴＣＴＴＴＣＡ
ＧＧＧＧＴＣＴＴＴＣＡ
【0054】
代替的に、複数のＨＲＥはそれら自体が十分な調節機能／プロモーター活性、すなわち、転写を開始させかつそれに作動可能に連結した核酸分子の発現を駆動および調節する能力を有してもよく、その場合、複数のＨＲＥは単独で低酸素応答性調節性核酸を構成する。複数のＨＲＥの各個々のＨＲＥエレメントは、空間的に分離されていてもよく（例えばエレメント、例えばエンハンサー、リンカー、介在性配列により分離されている）、または連続的、もしくは両方の組み合わせであってもよい。
【0055】
以下の配列番号２６は、複数のＨＲＥ自体が低酸素応答性調節性核酸を構成する例を示す。ＨＲＥの９つの連続的なコピーが示され、単一のＨＲＥエレメントに下線を引いている。
【0056】
配列番号２６
ＧＧＣＣＣＴＡＣＧＴＧＣＴＧＴＣＴＣＡＣＡＣＡＧＣＣＴＧＴＣＴＧＡＣＧＧＣＣＣＴＡＣＧＴＧＣＴＧＴＣＴＣＡＣＡＣＡＧＣＣＴＧＴＣＴＧＡＣＧＧＣＣＣＴＡＣＧＴＧＣＴＧＴＣＴＣＡＣＡＣＡＧＣＣＴＧＴＣＴＧＡＣＧＧＣＣＣＴＡＣＧＴＧＣＴＧＴＣＴＣＡＣＡＣＡＧＣＣＴＧＴＣＴＧＡＣＧＧＣＣＣＴＡＣＧＴＧＣＴＧＴＣＴＣＡＣＡＣＡＧＣＣＴＧＴＣＴＧＡＣＧＧＣＣＣＴＡＣＧＴＧＣＴＧＴＣＴＣＡＣＡＣＡＧＣＣＴＧＴＣＴＧＡＣＧＧＣＣＣＴＡＣＧＴＧＣＴＧＴＣＴＣＡＣＡＣＡＧＣＣＴＧＴＣＴＧＡＣＧＧＣＣＣＴＡＣＧＴＧＣＴＧＴＣＴ
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【0057】
以下の配列番号２７は単一のＨＲＥエレメントの例を示し、ＨＢＳおよびＨＡＳを太字で示している。低酸素応答性調節性核酸は、少なくともＨＢＳおよび任意選択的にＨＡＳエレメントを含む配列番号２７またはその部分の複数のコピー、例えば、配列番号２７またはその部分の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれより多くのコピーを含む、本質的にからなる、またはからなるものであってもよい。各個々のＨＲＥコピーは、空間的に分離していてもよく（例えばエレメント、例えばエンハンサー、リンカー、介在性配列により分離されている）、または連続的（本明細書において「タンデムで」もしくは「スタックして」と称されることもある）、もしくは両方の組み合わせであってもよい。
【0058】
配列番号２７
【0059】
本発明はまた、本発明の調節性核酸の機能的断片を提供し、本明細書において定義される該「機能的断片」は、複数のＨＲＥを含み、から本質的になり、またはからなり、かつそれに作動可能に連結した核酸分子の発現を駆動および調節する能力を保持する。機能的断片は、それらが由来する、または断片が基づく非改変の配列と同じやり方で（但し、同じ程度ではない可能性がある）発現を駆動および／または調節する能力を保持する。好適な機能的断片は、当業者に周知の標準的な技術を使用して発現を駆動および／または調節するそれらの能力について試験されてもよい。機能的断片は、それらが由来する配列の少なくとも２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３４０、３４５、３５０、３５５、３６０、３６５、３７０、３７５、３８０、３８５、３９０、３９５、４００、４０５、４１０、４１５、４２０、４２５、４３０、４３５、４４０、４４５、４５０、４５５、４６０、４６５、４７０、４７５、４８０、４８５、４９０、４９５、５００またはそれより多くの連続するヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、機能的断片は、配列番号１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６または２７の機能的断片であり、かつ該機能的断片は、本明細書において定義されるような複数のＨＲＥを含むまたはからなる。
【0060】
別の実施形態によれば、低酸素応答性調節性核酸は、配列番号１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６もしくは２７またはその機能的断片もしくはその相補体により表され、またはそれを含む、本質的にからなる、もしくはからなる。
【0061】
低酸素応答性調節性核酸はまた、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６もしくは２７のいずれかと、または本明細書において定義されるような機能的断片とハイブリダイズすることができる配列を含む、本質的にからなる、またはからなるものであってもよく、該ハイブリダイズする配列は、複数のＨＲＥを含み、から本質的になり、またはからなり、かつそれに作動可能に連結した核酸分子の発現を駆動および調節する能力を保持する。ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションは、温度および塩濃度の定義された条件下で標的核酸分子にハイブリダイズする核酸分子の能力を指す。典型的には、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、ネイティブなデュプレックスの融解温度（Ｔｍ）より２５℃～３０℃以下（例えば２０℃、１５℃、１０℃または５℃）だけ低い。Ｔｍを算出する方法は当該技術分野において周知である。非限定的な例として、ストリンジェントなハイブリダイゼーションを達成するための代表的な塩および温度条件は、１×ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳ、６５℃である。略語ＳＳＣは、核酸ハイブリダイゼーション溶液において使用される緩衝液を指す。１リットルの２０×（２０倍濃縮）ストックＳＳＣ緩衝溶液（ｐＨ ７．０）は１７５．３ｇの塩化ナトリウムおよび８８．２ｇのクエン酸ナトリウムを含有する。ハイブリダイゼーションを達成するための代表的な期間は１２時間である。
【0062】
低酸素応答性調節性核酸は、配列番号１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６もしくは２７またはその機能的断片に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはより高い配列同一性を有するホモログを含むまたはからなるものであってもよく、該ホモログは、複数のＨＲＥを含む、本質的にからなる、またはからなる。同一性パーセンテージは、アライメントプログラムを使用して算出されてもよい。好ましくは、ペアワイズグローバルアライメントプログラムが使用されてもよく、これはＮｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３－４５３，１９７０）のアルゴリズムを実行する。このアルゴリズムは、マッチの数を最大化し、かつギャップの数を最小化する。そのようなプログラムは、例えば、ＧＡＰ、Ｎｅｅｄｌｅ（ＥＭＢＯＳＳパッケージ）、ｓｔｒｅｔｃｈｅｒ（ＥＭＢＯＳＳパッケージ）またはＡｌｉｇｎ Ｘ（Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ ｓｕｉｔｅ ５．５）であり、標準的なパラメーター（例えばギャップオープニングペナルティ１５およびギャップ伸長ペナルティ６．６６）を使用してもよい。代替的に、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２，４８２－４８９（１９８１））のアルゴリズムを実行するローカルアライメントプログラムが使用されてもよい。そのようなプログラムは、例えばＷａｔｅｒ（ＥＭＢＯＳＳパッケージ）またはｍａｔｃｈｅｒ（ＥＭＢＯＳＳパッケージ）である。
【0063】
本発明の低酸素応答性調節性核酸の他のバリアントまたは配列番号１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６もしくは２７のバリアントとしては、突然変異バリアント、置換バリアント、挿入バリアント、誘導体、介在性配列を含むバリアント、スプライスバリアントおよびアレルバリアントが挙げられ、該バリアントは複数のＨＲＥを含むまたはからなる。
【0064】
核酸の「突然変異バリアント」は、組換えＤＮＡマニピュレーション技術またはヌクレオチド合成を使用して容易に作ることができる。そのような技術の例としては、Ｍ１３突然変異誘発、Ｔ７－Ｇｅｎインビトロ突然変異誘発（ＵＳＢ、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、Ｏｈｉｏ）、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部位特異的突然変異誘発（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）、ＰＣＲ媒介性部位特異的突然変異誘発または他の部位特異的突然変異誘発プロトコールを介する部位特異的突然変異誘発が挙げられる。代替的に、本発明の核酸は、無作為に突然変異していてもよい。
【0065】
「置換バリアント」は、核酸配列中の少なくとも１つの残基が除去され、異なる残基がその場所に挿入されたバリアントを指す。核酸置換は典型的には単一の残基のものであるが、核酸配列に課される機能的な制約に依存してクラスター化されてもよく、挿入は、通常、約１～約１０個の核酸残基のオーダーであり、欠失は約１～約２０個の残基の範囲に及び得る。
【0066】
核酸の「挿入バリアント」は、１つまたは複数の核酸残基がその核酸中の予め決定された部位に導入されているバリアントである。挿入は、５’末端および／または３’末端融合の他に、単一または複数のヌクレオチドの配列内挿入を含んでもよい。一般に、核酸配列内の挿入は、約１～１０個の残基のオーダーで、５’または３’末端融合よりも小さい。５’または３’末端融合の例としては、酵母２ハイブリッドシステムもしくは酵母１ハイブリッドシステムにおいて使用されるような転写活性化因子の結合ドメインもしくは活性化ドメインの、またはファージコートタンパク質のコーディング配列、（ヒスチジン）６タグ、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼタグ、プロテインＡ、マルトース結合タンパク質、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、Ｔａｇ・１００エピトープ、ｃ－ｍｙｃエピトープ、ＦＬＡＧ（登録商標）－エピトープ、ｌａｃＺ、ＣＭＰ（カルモジュリン結合ペプチド）、ＨＡエピトープ、プロテインＣエピトープおよびＶＳＶエピトープが挙げられる。
【0067】
核酸の「誘導体」という用語は、天然の核酸と比較して天然に存在するおよび天然に存在しない核酸残基の置換、および／または欠失および／または付加を含んでもよい。誘導体は、例えば、メチル化されたヌクレオチド、または人工的なヌクレオチドを含んでもよい。
【0068】
調節配列は、介在性配列により割り込まれていてもよい。「介在性配列」により、別の配列に割り込んだ任意の核酸またはヌクレオチドが意味される。介在性配列の例は、イントロン、核酸タグ、Ｔ－ＤＮＡおよび移動可能な核酸配列、例えば組換えを介して移動可能なトランスポゾンまたは核酸を含む。特定のトランスポゾンの例は、Ａｃ（活性化因子）、Ｄｓ（解離）、Ｓｐｍ（抑制因子－ミューテーター）またはＥｎを含む。介在性配列がイントロンである場合、選択的スプライスバリアントが生じることがある。「選択的スプライスバリアント」という用語は、本明細書において使用される場合、介在するイントロンが切除、置き換えまたは付加された核酸配列のバリアントを包含する。そのようなスプライスバリアントは天然に見出されるものであってもよく、または人工的なものであってもよい。
【0069】
本発明の低酸素応答性調節性核酸は、低酸素の条件下で発現を駆動することができ、本明細書において定義される低酸素の条件は、５％より低い（４％、３％、２％、１％、０．５％、０．２５％もしくは０．１％より低いもしくはｍｍＨｇ相当など）のＯ２濃度または対応する非がん性臓器、組織もしくは細胞のＯ２利用可能性もしくは分圧と比べて低減したＯ２利用可能性を意味するものと解釈される。反対に、本明細書において定義される「正常酸素」は、５％より高いＯ２濃度または健常臓器と関連付けられるＯ２利用可能性を意味するものと解釈される。当業者は、任意の所与の環境が低酸素または正常酸素のいずれであるのかを容易に決定することができる。プロモーターの想定される使用に依存して、当業者は、低酸素応答性の程度を調整するために異なる数のＨＲＥコピーを使用することができ、ＨＲＥコピーにおける増加は低酸素応答性における増加に相関する。
【0070】
低酸素応答性調節性核酸は、核酸分子の発現を駆動することができ、該核酸分子は、好適には、遺伝子、導入遺伝子、コーディングもしくは非コーディング配列、ＲＮＡ分子（例えばｍＲＮＡもしくはサイレンシング用のＲＮＡ分子、例えば（ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡｉ）、調節マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）、触媒性ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡアプタマーなど）、発現ベクター、および操作された受容体、例えばＣＡＲ（第１、第２、第３、第４もしくは任意のその後の世代のＣＡＲ）もしくはＴＣＲ、または任意の他の関心対象の配列であってもよい。
【0071】
操作された受容体
１つの態様において、低酸素応答性調節性核酸は、操作された受容体の発現を駆動し、該操作された受容体は、免疫応答細胞中で発現される場合、予め決定された抗原特異性を該細胞に付与し、かつ予め決定された抗原への該細胞の結合で、活性化シグナル、および任意選択的に１つまたは複数の共刺激シグナルを該細胞に送出する。典型的な実施形態において、免疫応答細胞は、ナチュラルキラー細胞、インバリアントＮＫＴ細胞、ＮＫ Ｔ細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、例えば細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞もしくは制御性Ｔ細胞、αβ Ｔ細胞、γδ Ｔ細胞、または骨髄由来細胞、例えばマクロファージもしくは好中球、幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。
１つの態様において、低酸素応答性調節性核酸は、操作された受容体の発現を駆動し、該操作された受容体は、免疫応答細胞中で発現される場合、予め決定された抗原特異性を該細胞に付与し、かつ予め決定された抗原への該細胞の結合で、活性化シグナル、および任意選択的に１つまたは複数の共刺激シグナルを該細胞に送出する。典型的な実施形態において、免疫応答細胞は、ナチュラルキラー細胞、インバリアントＮＫＴ細胞、ＮＫ Ｔ細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、例えば細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞もしくは制御性Ｔ細胞、αβ Ｔ細胞、γδ Ｔ細胞、または骨髄由来細胞、例えばマクロファージもしくは好中球、幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。
【0072】
操作された受容体をコードするポリヌクレオチドに低酸素応答性調節性核酸を作動可能に連結することは、操作された受容体に低酸素応答性発現を付与し、かつ／またはそれを、免疫応答細胞を固形腫瘍塊に標的化するために好適なものとする。
【0073】
最初期のキメラ抗体－ＴＣＲは、Ｋｕｗａｎａ ｅｔ ａｌ．１９８７（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｖｏｌ．１４９，Ｎｏ．３）により作られた。最初期のＣＡＲの１つは、Ｚｅｌｉｇ Ｅｓｈｈａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｗｅｉｚｍａｎｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｓｒａｅｌ（Ｇｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，１９８９（ＰＮＡＳ，Ｖｏｌ．８６，ｐｐ．１００２４－１００２８）；Ｅｓｈｈａｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３（ＰＮＡＳ，Ｖｏｌ．９０，ｐｐ．７２０－７２４））により開発された。それらの発見に基づいて、細胞内ＴＣＲシグナル伝達ドメインを有する抗体からのＦａｂ抗原結合領域の融合物はキメラ受容体を生じさせ、これは、Ｔ細胞上に発現された場合に機能的であり、指定されたＭＨＣ／ＨＬＡ非依存性抗原に応答してＴＣＲシグナルを送出する。様々な機能性ドメインを含む、ＣＡＲのモジュール式の構造は、抗原特異性の選択およびシグナル伝達強度の微細な制御を可能にする。ＣＡＲは単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含むことができ、ｓｃＦｖは、ＴＡＡまたは受容体に対するペプチドリガンドまたはペプチドの融合物に特異的な抗体の可変重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）領域、好適なスペーサードメイン、例えばＣＤ８、ＣＤ２８またはＩｇＧ－Ｆｃ（その他が当該技術分野において周知である）、膜貫通ドメインならびにエンドドメインを含有する。スペーサーは、効率的なシグナル伝達が起こるようにｓｃＦｖをＴ細胞形質膜から最適な距離に置く。これ以外に、スペーサーは、受容体のホモ二量体化、柔軟性ならびに分離および凝集において重要な役割を果たす。シグナル伝達エンドドメインは、ネイティブなＴＣＲ活性化のための共刺激を提供するシグナル伝達モチーフを含有するタンパク質から作られている。エンドドメインは、とりわけ、ＣＤ３ζ、ＦｃＲγ、ＣＤ２８、ＯＸ４０および／または４－１ＢＢを含有することができ、これらのドメインの組み合わせは、時間と共により洗練されてきたキメラ受容体の世代を決定する。
【0074】
本発明の第１の態様による低酸素応答性調節性核酸の調節エレメントは、任意の操作された受容体の発現を駆動および調節するために使用されてもよい。
【0075】
追加的に、ある特定の実施形態において、操作された受容体、例えばＣＡＲは、本明細書において定義されるような１つまたは複数の酸素依存性分解ドメイン（ＯＤＤ）、および抗腫瘍特性を有する少なくとも１つのポリペプチドを含む。
【0076】
ＣＡＲのモジュール式の性質に起因して、１つまたは複数のＯＤＤまたはキメラポリペプチドは、任意の公知のＣＡＲ設計において容易に含めることができ、例えば、それらは、第１、第２、第３、第４もしくはその後の世代のＣＡＲ；スプリットＣＡＲシステム；ＴＲＵＣＫまたはアーマードＣＡＲ（ａｒｍｏｕｒｅｄ ＣＡＲ）などに含めることができる。公知のＣＡＲは、本明細書において定義されるような１つもしくは複数のＯＤＤの包含を通じて、かつ／または本発明の第１の態様による低酸素応答性調節性核酸の使用を通じて、低酸素応答性を付与しまたは低酸素応答性を向上させるように適応されてもよい。
【0077】
第１世代ＣＡＲは、細胞外結合ドメイン、ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、および１つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインから構成される。一般的に、細胞外結合ドメインは、腫瘍抗原反応性抗体に由来する単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含み、腫瘍抗原に対する高い特異性を通常有する。第１世代ＣＡＲは、典型的には、シグナルの一次トランスミッターである細胞内シグナル伝達ドメインとしてＣＤ３ζ鎖ドメインまたはその改変された誘導体を含む。
【0078】
第２世代ＣＡＲもまた、共刺激ドメイン、例えばＣＤ２８および／または４－１ＢＢを含有する。細胞内共刺激ドメインの包含は、Ｔ細胞の増殖、サイトカイン分泌、アポトーシスに対する抵抗性、およびインビボ持続を向上させる。第２世代ＣＡＲの共刺激ドメインは、典型的には、１つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインとシスであり、その上流にある。
【0079】
第３世代ＣＡＲは、Ｔ細胞活性を増大させるために、１つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインとシスで複数の共刺激ドメインを組み合わせている。例えば、第３世代ＣＡＲは、ＣＤ３ｚに由来する細胞内シグナル伝達ドメインと共に、ＣＤ２８および４１ＢＢに由来する共刺激ドメインを含んでもよい。他の第３世代ＣＡＲは、ＣＤ３ｚに由来する細胞内シグナル伝達ドメインと共に、ＣＤ２８およびＯＸ４０に由来する共刺激ドメインを含んでもよい。
【0080】
第４世代ＣＡＲ（ＴＲＵＣＫまたはアーマードＣＡＲとしても公知）は、第２世代ＣＡＲの発現を、抗腫瘍活性を増強する因子（例えば、サイトカイン、共刺激リガンド、ケモカイン受容体または免疫調節もしくはサイトカイン受容体のさらなるキメラ受容体）と組み合わせている。因子は、ＣＡＲとトランスまたはシスであってもよく、典型的にはＣＡＲとトランスである。
【0081】
ＣＡＲまたはＣＡＲをコードする核酸は、オフターゲット効果、用量制御、活性化の位置およびタイミングに対処するための他の機構を追加的に含んでもよい。例えば、ＣＡＲをコードする核酸は、自殺遺伝子、例えば単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫ）もしくは誘導性カスパーゼ９（ｉＣａｓ９）、またはオフターゲット効果を制御するための他の手段を含んでもよい。ＣＡＲ活性の制御のための他の手段としては、（例えばＧｉｏｒｄａｎｏ－Ａｔｔｉｎｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，２０２０，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓにおいて報告されるような）小分子剤の使用が挙げられる。これらの制御システムは、免疫応答細胞のアポトーシスを誘導するために細胞外分子により活性化され得る。
【0082】
別の例としては、２つまたはそれより多くの抗原特異的標的化領域（本明細書において定義される）を発現するように設計されたＣＡＲが挙げられる。ＣＡＲは、ＣＡＲの治療機能が腫瘍抗原および良性外因性分子の両方の存在を要求するスプリットＣＡＲシステムであってもよい。そのようなシステムは、ＯＤＤの配置を制御するために本発明において使用されてもよい。
【0083】
様々な実施形態において、操作された受容体は第１世代ＣＡＲ、例えばＥｓｈｈａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９３）９０（２）：７２０－７２４に記載されるものである。
【0084】
様々な実施形態において、操作された受容体は共刺激キメラ受容体、例えばＫｒａｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９８）１８８（４）：６１９－２６に記載されるものである。
【0085】
様々な実施形態において、操作された受容体は第２世代ＣＡＲ、例えばＦｉｎｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９８）１６１（６）：２７９１－７；Ｍａｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００２）２０（１）：７０－７５；Ｆｉｎｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００４）１７２（１）：１０４－１１３；およびＩｍａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ（２００５）１８（４）：６７６－８４に記載されるものである。
【0086】
様々な実施形態において、操作された受容体は第３世代ＣＡＲ、例えばＰｕｌｅ ｅｔ ａｌ．（２００５），Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１２（５）：９３３－９４１；Ｇｅｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ（２００１）９８：２３６４－７１；およびＷｉｌｋｉｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００８）１８０（７）：４９０１－９に記載されるものである。
【0087】
様々な実施形態において、操作された受容体は、Ａｈｍｅｄ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ（２０１３）２：ｅ１０５に記載されるようなタンデム（Ｔａｎ）ＣＡＲである。
【0088】
様々な実施形態において、操作された受容体は、Ｃｈｍｉｅｌｅｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（２０１１），７１：５６９７－５７０６（２０１１）に記載されるようなＴＲＵＣＫ ＣＡＲである。
【0089】
様々な実施形態において、操作された受容体は、Ｐｅｇｒａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ（２０１２）１１９：４１３３－４１４１およびＣｕｒｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．（２０１５）２３（４）：７６９－７８に記載されるようなＡｒｍｏｕｒｅｄ ＣＡＲである。
【0090】
様々な実施形態において、操作された受容体は、ＷＯ２０１３／０１９６１５に記載されるようなスイッチ受容体（Ｓｗｉｔｃｈ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）である。
【0091】
様々な実施形態において、操作された受容体は、他の操作された構築物と共に細胞中で発現される。
【0092】
これらの一部の実施形態において、操作された受容体は、Ｓｔｅｐｈａｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．（２００７）１３（１２）：１４４０－４９に記載されるような、シスおよびトランスで共刺激を提供するための他の操作された構築物と共に細胞中で発現される。
【0093】
これらの一部の実施形態において、操作された受容体は、二重標的化ＣＡＲを提供するための他の操作された構築物、例えばＷｉｌｋｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１２）３２（５）：１０５９－７０に記載されるものと共に細胞中で発現される。
【0094】
これらの一部の実施形態において、操作された受容体は、Ｆｅｄｏｒｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．（２０１３）５（２１５）：２１５ｒａ１７２に記載されるような、阻害性ＣＡＲ（ＮＯＴゲート）を提供するための他の操作された構築物と共に細胞中で発現される。
【0095】
これらの一部の実施形態において、操作された受容体は、Ｋｌｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１３）３１（１）：７１－５およびＷＯ２０１４／０５５６６８に記載されるような、コンビナトリアルＣＡＲ（ＡＮＤゲート）を提供するための他の操作された構築物と共に細胞中で発現される。
【0096】
これらの一部の実施形態において、操作された受容体は、Ｆｏｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２０１４），Ａｂｓｔｒａｃｔ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｌｏｏｄｊｏｕｒｎａｌ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／１２４／２１／１１２１？ｓｓｏ－ｃｈｅｃｋｅｄ＝ｔｒｕｅに記載されるような、Ｇｏ－ＣＡＲ Ｔを提供するための他の操作された構築物と共に細胞中で発現される。
【0097】
これらの一部の実施形態において、操作された受容体は、Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ（２０１５）２８：４１５０２８に記載されるような、操作された共刺激を提供するための他の操作された構築物と共に細胞中で発現される。
【0098】
これらの一部の実施形態において、操作された受容体は、Ｒｏｙｂａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ（２０１６）１６４：７７０－７９に記載されるような、ＳｙｎＮｏｔｃｈ／連続ＡＮＤゲートを提供するための他の操作された構築物と共に細胞中で発現される。
【0099】
ある特定の好ましい実施形態において、操作された受容体は、ＷＯ２０１７／０２１７０１に記載されるような、パラレルＣＡＲ（ｐＣＡＲ）を提供するための他の操作された構築物と共に細胞中で発現される。ｐＣＡＲは、
（ａ）シグナル伝達領域、
（ｂ）共刺激シグナル伝達領域、
（ｃ）膜貫通ドメイン、および
（ｄ）標的抗原上の第１のエピトープと特異的に相互作用する結合エレメント
を含む第２世代キメラ抗原受容体、ならびに
（ｅ）（ｂ）のものとは異なる共刺激シグナル伝達領域、
（ｆ）膜貫通ドメイン、および
（ｇ）標的抗原上の第２のエピトープと特異的に相互作用する結合エレメント
を含むキメラ共刺激受容体
を含んでもよい。
（ａ）シグナル伝達領域、
（ｂ）共刺激シグナル伝達領域、
（ｃ）膜貫通ドメイン、および
（ｄ）標的抗原上の第１のエピトープと特異的に相互作用する結合エレメント
を含む第２世代キメラ抗原受容体、ならびに
（ｅ）（ｂ）のものとは異なる共刺激シグナル伝達領域、
（ｆ）膜貫通ドメイン、および
（ｇ）標的抗原上の第２のエピトープと特異的に相互作用する結合エレメント
を含むキメラ共刺激受容体
を含んでもよい。
【0100】
様々な実施形態において、操作された受容体は、操作されたＴ細胞受容体、例えばＷＯ２０１０／０２６３７７、ＷＯ２０１０／１３３８２８、ＷＯ２０１１／００１１５２、ＷＯ２０１２３／０１３９１３、ＷＯ２０１３／０４１８６５、ＷＯ２０１７／１０９４９６、ＷＯ２０１７／１６３０６４、およびＷＯ２０１８／２３４３１９に記載されるものである。
【0101】
実施形態において、ＣＡＲは、腫瘍床にホーミングまたは浸潤するための手段を含む。例えば、ＣＡＲは、１つまたは複数のケモカイン受容体を含んでもよい。
【0102】
さらなる操作された受容体を含めることができる。追加の操作された受容体は、腫瘍床にホーミングまたは浸潤するための手段を含むように設計されてもよい。例えば、追加の操作された受容体は、キメラサイトカイン受容体またはケモカイン受容体を含んでもよい。
【0103】
以下にさらに議論されるように、任意の公知のＣＡＲ設計または種類、例えば上述の任意のものは、１つもしくは複数のＯＤＤの使用を通じて、かつ／または本発明の第１の態様による低酸素誘導性調節配列の使用を通じて、低酸素条件下での発現および調節のための能力を含むように適応されてもよい。
【0104】
低酸素誘導性調節配列の使用および以下にさらに議論されるような１つまたは複数のＯＤＤの任意選択的な包含に加えて、ＣＡＲは、典型的には、以下のＩ～ＩＶの下で記載される以下の公知の成分を含む。
【0105】
Ｉ．細胞外抗原特異的標的化領域（または抗腫瘍特性を有するポリペプチド）
少なくとも１つのＯＤＤに加えて、キメラポリペプチドは、本明細書において細胞外抗原特異的標的化領域と称されることもある、抗腫瘍特性を有する少なくとも１つのポリペプチドを含む。細胞外抗原特異的標的化領域および１つまたは複数のＯＤＤは連結していてもよい。
少なくとも１つのＯＤＤに加えて、キメラポリペプチドは、本明細書において細胞外抗原特異的標的化領域と称されることもある、抗腫瘍特性を有する少なくとも１つのポリペプチドを含む。細胞外抗原特異的標的化領域および１つまたは複数のＯＤＤは連結していてもよい。
【0106】
腫瘍への送達のためのそのようなタンパク質としては、以下：免疫刺激抗体；細胞活性化および腫瘍殺傷能力を付与する表面または細胞内受容体；Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のいずれか１つまたは複数が挙げられるがこれらに限定されない。
【0107】
抗原特異的標的化領域は、予め決定された関心対象の抗原に結合する能力をＣＡＲに提供する。抗原特異的標的化領域は、好ましくは、臨床的な関心対象の抗原を標的化する。抗原特異的標的化領域は、生物学的分子（例えば細胞表面受容体またはその成分）を特異的に認識して結合する能力を有する任意のタンパク質またはペプチドであってもよい。抗原特異的標的化領域としては、関心対象の生物学的分子の任意の天然に存在する、合成の、半合成の、または組換えにより製造された結合パートナーが挙げられる。実例的な抗原特異的標的化領域としては、抗体もしくは抗体断片または誘導体、受容体の細胞外ドメイン、細胞表面分子／受容体のリガンド、またはその受容体結合ドメイン、および腫瘍結合タンパク質が挙げられる。
【0108】
好ましい実施形態において、抗原特異的標的化領域は、抗体である、または抗体に由来する。抗体由来の標的化ドメインは、抗体の断片または抗体の１つもしくは複数の断片の遺伝子操作された生成物を含むことができ、該断片は抗原との結合に関与する。例としては、可変領域（Ｆｖ）、相補性決定領域（ＣＤＲ）、Ｆａｂ、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、重鎖可変領域（ＶＨ）、軽鎖可変領域（ＶＬ）および単一ドメイン抗体（ＶＨＨ）が挙げられる。抗原特異的標的化領域は、追加的または代替的にモノボディを含むまたはからなるまたはそれに由来するものであってもよい。好ましい実施形態において、結合ドメインは単鎖抗体（ｓｃＦｖ）である。ｓｃＦｖは、マウス、ヒトまたはヒト化ｓｃＦｖであってもよい。
【0109】
抗体またはその抗原結合断片に関する「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」は、抗体の重鎖または軽鎖の可変領域中の高度に可変のループを指す。ＣＤＲは、抗原コンホメーションと相互作用し、抗原への結合をおおかた決定し得る（但し、一部のフレームワーク領域は結合に関与することが公知である）。重鎖可変領域および軽鎖可変領域はそれぞれ３つのＣＤＲを含有する。「重鎖可変領域」または「ＶＨ」は、ＣＤＲよりも高度に保存された、ＣＤＲをサポートするためのスキャフォールドを形成する、フレームワーク領域として公知の隣接ストレッチの間に挿入された３つのＣＤＲを含有する抗体の重鎖の断片を指す。「軽鎖可変領域」または「ＶＬ」は、フレームワーク領域の間に挿入された３つのＣＤＲを含有する抗体の軽鎖の断片を指す。
【0110】
「Ｆｖ」は、完全な抗原結合部位を有するための抗体の最小の断片を指す。Ｆｖ断片は、単一の重鎖の可変領域に結合した単一の軽鎖の可変領域からなる。「単鎖Ｆｖ抗体」または「ｓｃＦｖ」は、互いに直接的にまたはペプチドリンカー配列を介して接続された軽鎖可変領域および重鎖可変領域からなる操作された抗体を指す。
【0111】
予め決定された抗原に特異的に結合するＣＡＲの抗原結合領域は、当該技術分野において周知の方法を使用して調製することができる。そのような方法としては、ファージディスプレイ、ヒトもしくはヒト化抗体を生成する方法、またはヒト抗体を産生するように操作されたトランスジェニック動物もしくは植物を使用する方法が挙げられる。部分的または全体的に合成の抗体のファージディスプレイライブラリーが利用可能であり、標的分子に結合できる抗体またはその断片についてそれをスクリーニングすることができる。ヒト抗体のファージディスプレイライブラリーもまた利用可能である。抗体のアミノ酸配列またはそれをコードするポリヌクレオチド配列が同定されたら、それを単離および／または決定することができる。
【0112】
本ＣＡＲにより標的化され得る抗原としては、固形がんと関連付けられる細胞上に発現される抗原が挙げられるがこれらに限定されない。
【0113】
標的化される抗原は限定されないが、以下ならびにその誘導体およびバリアントの１つまたは複数および任意の組み合わせから選択されてもよい：拡張されたＥｒｂＢファミリー、Ｅｒｂｂ１、Ｅｒｂｂ３、Ｅｒｂｂ４、Ｅｒｂｂ２／ＨＥＲ－２、ムチン、ＰＳＭＡ、ＣＥＡ、メソテリン、ＧＤ２、ＭＵＣ１、葉酸受容体、ＧＰＣ３、ＣＡＩＸ、ＦＡＰ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ｇｐ１００、ＰＳＣＡ、ＲＯＲ１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＤ１９、ＧＤ３、ＣＬＬ－１、腺管上皮ムチン、Ｇｐ３６、ＴＡＧ－７２、スフィンゴ糖脂質、神経膠腫関連抗原、ベータ－ｈＣＧ、ＡＦＰ（アルファ－フェトプロテイン）およびレクチン反応性ＡＦＰ、サイログロブリン、終末糖化産物受容体（ＲＡＧＥ）、ＴＥＲＴ、テロメラーゼ、カルボキシルエステラーゼ、Ｍ－ＣＳＦ、ＰＳＡ、サバイビン、ＰＣＴＡ－１、ＭＡＧＥ、ＣＤ２２、ＩＧＦ－１、ＩＧＦ－２、ＩＧＦ－１受容体、ＭＨＣ関連腫瘍ペプチド、５Ｔ４、腫瘍間質関連抗原、ＷＴ１、ＭＬＡＮＡ、ＣＡ １９－９、ＢＣＭＡ、αｖβ６インテグリン、ウイルス特異的抗原。
【0114】
好ましい細胞外抗原特異的標的化領域はＴ１Ｅ（Ｄａｖｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｍｏｌ Ｍｅｄ １８：５６５－５７６）、配列番号３２である。その機能的断片およびバリアントであって、バリアントが、配列番号３２に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはより高い配列同一性を有するものもまた、含まれる。
【0115】
Ｔ１Ｅペプチド（ヒトＴＧＦαおよびＥＧＦに由来する）；配列番号３２
ＶＶＳＨＦＮＤＣＰＬＳＨＤＧＹＣＬＨＤＧＶＣＭＹＩＥＡＬＤＫＹＡＣＮＣＶＶＧＹＩＧＥＲＣＱＹＲＤＬＫＷＷＥＬＲ（配列番号３２）。
ＶＶＳＨＦＮＤＣＰＬＳＨＤＧＹＣＬＨＤＧＶＣＭＹＩＥＡＬＤＫＹＡＣＮＣＶＶＧＹＩＧＥＲＣＱＹＲＤＬＫＷＷＥＬＲ（配列番号３２）。
【0116】
ＩＩ．細胞内シグナル伝達ドメイン（エンドドメインとも称される）
好適な細胞内シグナル伝達ドメインは当該技術分野において公知であり、例えば、例えばＬｏｖｅ ｅｔ ａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．Ｂｉｏｌ ２０１０ ２（６）ｌ ａ００２４８５により総説されるような、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む任意の領域が挙げられる。特定の実施形態において、シグナル伝達領域は、例えば米国特許第７，４４６，１９０号明細書に記載されるようなヒトＣＤ３［ゼータ］鎖の細胞内ドメイン、またはそのバリアントを含む。
好適な細胞内シグナル伝達ドメインは当該技術分野において公知であり、例えば、例えばＬｏｖｅ ｅｔ ａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．Ｂｉｏｌ ２０１０ ２（６）ｌ ａ００２４８５により総説されるような、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む任意の領域が挙げられる。特定の実施形態において、シグナル伝達領域は、例えば米国特許第７，４４６，１９０号明細書に記載されるようなヒトＣＤ３［ゼータ］鎖の細胞内ドメイン、またはそのバリアントを含む。
【0117】
細胞内シグナル伝達ドメインはまた、間接的なシグナル伝達のための転写因子であってもよい。
【0118】
細胞内ドメインは、配列番号３３またはその機能的断片もしくはバリアントにより表されてもよく、バリアントは、配列番号３３に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはより高い配列同一性を有する。
【0119】
ＣＤ３ｚまたはＣＤ３ゼータ（細胞内ドメイン）；配列番号３３
ＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号３３）。
ＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号３３）。
【0120】
ＩＩＩ．膜貫通ドメイン
ＣＡＲは、細胞膜の表面上に発現され、したがって典型的には膜貫通ドメインを含む。好適な膜貫通ドメインは当該技術分野において公知であり、例えば、Ｉ型、ＩＩ型またはＩＩＩ型膜貫通タンパク質のいずれかを含む、膜貫通ドメインを有する任意のタンパク質からの膜貫通配列を含む。ＣＡＲの膜貫通ドメインはまた人工的な疎水性配列を含んでもよい。ＣＡＲの膜貫通ドメインは、二量体化しないように選択されてもよい。好適な膜貫通ドメインとしては、ＣＤ８α、ＣＤ２８、ＣＤ４またはＣＤ３ζ膜貫通ドメインが挙げられる。
ＣＡＲは、細胞膜の表面上に発現され、したがって典型的には膜貫通ドメインを含む。好適な膜貫通ドメインは当該技術分野において公知であり、例えば、Ｉ型、ＩＩ型またはＩＩＩ型膜貫通タンパク質のいずれかを含む、膜貫通ドメインを有する任意のタンパク質からの膜貫通配列を含む。ＣＡＲの膜貫通ドメインはまた人工的な疎水性配列を含んでもよい。ＣＡＲの膜貫通ドメインは、二量体化しないように選択されてもよい。好適な膜貫通ドメインとしては、ＣＤ８α、ＣＤ２８、ＣＤ４またはＣＤ３ζ膜貫通ドメインが挙げられる。
【0121】
実施形態において、膜貫通ドメインは、配列番号３４またはその機能的断片もしくはバリアントにより表され、バリアントは、配列番号３４に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはより高い配列同一性を有する。
【0122】
ＣＤ２８（膜貫通ドメイン）；配列番号３４
ＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳ（配列番号３４）。
ＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳ（配列番号３４）。
【0123】
ＩＶ．共刺激ドメイン
好適な共刺激ドメインもまた当該技術分野において周知であり、Ｂ７／ＣＤ２８ファミリーのメンバー、例えばＢ７－１、Ｂ７－２、Ｂ７－Ｈ１、Ｂ７－Ｈ２、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、Ｂ７－Ｈ６、Ｂ７－Ｈ７、ＢＴＬＡ、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ－４、Ｇｉ２４、ＩＣＯＳ、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ２もしくはＰＤＣＤ６；またはＩＬＴ／ＣＤ８５ファミリータンパク質、例えばＬＩＬＲＡ３、ＬＩＬＲＡ４、ＬＩＬＲＢ１、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ３もしくはＬＩＬＲＢ４；または腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーメンバー、例えば４－１ＢＢ、ＢＡＦＦ、ＢＡＦＦ Ｒ、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＤＲ３、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＬＩＧＨＴ、リンホトキシン－アルファ、ＯＸ４０、ＲＥＬＴ、ＴＡＣＩ、ＴＬ１Ａ、ＴＮＦ－アルファもしくはＴＮＦ ＲＩＩ；またはＳＬＡＭファミリーのメンバー、例えば２Ｂ４、ＢＬＡＭＥ、ＣＤ２、ＣＤ２Ｆ－１０、ＣＤ４８、ＣＤ５８、ＣＤ８４、ＣＤ２２９、ＣＲＡＣＣ、ＮＴＢ－ＡもしくはＳＬＡＭ；またはＴＩＭファミリーのメンバー、例えばＴＩＭ－１、ＴＩＭ－３もしくはＴＩＭ－４；または他の共刺激分子、例えばＣＤ７、ＣＤ９６、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ３００ａ、ＣＲＴＡＭ、ＤＡＰ１２、デクチン－１、ＤＰＰＩＶ、ＥｐｈＢ６、インテグリンアルファ４ベータ１、インテグリンアルファ４ベータ７／ＬＰＡＭ－１、ＬＡＧ－３もしくはＴＳＬＰ Ｒが挙げられる。
好適な共刺激ドメインもまた当該技術分野において周知であり、Ｂ７／ＣＤ２８ファミリーのメンバー、例えばＢ７－１、Ｂ７－２、Ｂ７－Ｈ１、Ｂ７－Ｈ２、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、Ｂ７－Ｈ６、Ｂ７－Ｈ７、ＢＴＬＡ、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ－４、Ｇｉ２４、ＩＣＯＳ、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ２もしくはＰＤＣＤ６；またはＩＬＴ／ＣＤ８５ファミリータンパク質、例えばＬＩＬＲＡ３、ＬＩＬＲＡ４、ＬＩＬＲＢ１、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ３もしくはＬＩＬＲＢ４；または腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーメンバー、例えば４－１ＢＢ、ＢＡＦＦ、ＢＡＦＦ Ｒ、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＤＲ３、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＬＩＧＨＴ、リンホトキシン－アルファ、ＯＸ４０、ＲＥＬＴ、ＴＡＣＩ、ＴＬ１Ａ、ＴＮＦ－アルファもしくはＴＮＦ ＲＩＩ；またはＳＬＡＭファミリーのメンバー、例えば２Ｂ４、ＢＬＡＭＥ、ＣＤ２、ＣＤ２Ｆ－１０、ＣＤ４８、ＣＤ５８、ＣＤ８４、ＣＤ２２９、ＣＲＡＣＣ、ＮＴＢ－ＡもしくはＳＬＡＭ；またはＴＩＭファミリーのメンバー、例えばＴＩＭ－１、ＴＩＭ－３もしくはＴＩＭ－４；または他の共刺激分子、例えばＣＤ７、ＣＤ９６、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ３００ａ、ＣＲＴＡＭ、ＤＡＰ１２、デクチン－１、ＤＰＰＩＶ、ＥｐｈＢ６、インテグリンアルファ４ベータ１、インテグリンアルファ４ベータ７／ＬＰＡＭ－１、ＬＡＧ－３もしくはＴＳＬＰ Ｒが挙げられる。
【0124】
実施形態において、ＣＡＲは複数の共刺激ドメイン、例えば２つまたはそれより多くの共刺激ドメインを含む。一部の実施形態において、共刺激ドメインは、ＣＤ２８、４－１ＢＢおよび／またはＯＸ４０に由来する。
【0125】
実施形態において、共刺激ドメインはＣＤ２８であり、またはＣＤ２８に由来する。
【0126】
実施形態において、共刺激ドメインは４－１ＢＢであり、または４－１ＢＢに由来する。
【0127】
ＯＤＤを含むキメラポリペプチド
１つの実施形態によれば、低酸素応答性調節性核酸は、（ｉ）１つまたは複数の酸素依存性分解ドメイン（ＯＤＤ）および（ｉｉ）抗腫瘍特性を有する少なくとも１つのポリペプチドを含むキメラポリペプチドをコードする核酸分子に作動可能に連結している。
１つの実施形態によれば、低酸素応答性調節性核酸は、（ｉ）１つまたは複数の酸素依存性分解ドメイン（ＯＤＤ）および（ｉｉ）抗腫瘍特性を有する少なくとも１つのポリペプチドを含むキメラポリペプチドをコードする核酸分子に作動可能に連結している。
【0128】
ＯＤＤは、任意のＯＤＤ含有タンパク質、例えばＡＴＦ－４、ＨＩＦ１－アルファ、ＨＩＦ２－アルファおよびＨＩＦ３－アルファに由来してもよく、これらは、哺乳動物供給源、例えばヒト供給源からのものであってもよく、または人工的に作成されてもよい。
【0129】
ＯＤＤは、配列番号２８（Ｘ１Ｘ２ＬＥＭＬＡＰＹＩＸＭＤＤＤＸ３Ｘ４Ｘ５）（ここで「Ｘ１～５」は任意のアミノ酸残基であり得る）により表されてもよい。任意選択的に、Ｘ１は「Ｌ」または任意の保存的置換であり、Ｘ２は「Ｄ」または任意の保存的置換であり、Ｘ３は「Ｆ」または任意の保存的置換であり、Ｘ４は「Ｑ」または任意の保存的置換であり、Ｘ５は「Ｌ」または任意の保存的置換である。
【0130】
任意選択的に、ＯＤＤは、配列番号２９、３０もしくは３１、または配列番号２９、３０もしくは３１に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくはより高い配列同一性を有するそのホモログもしくはバリアントにより表されてもよく、ホモログまたはバリアントは配列番号２８を含む。
【0131】
配列番号２９（ＨＩＦ１－アルファアミノ酸４０１～６０３、配列番号２８を太字としている）
【0132】
配列番号３０（ＨＩＦ１－アルファアミノ酸５３０～６０３、配列番号２８を太字としている）
【0133】
配列番号３１（ＨＩＦ１－アルファアミノ酸５３０～６５３、配列番号２８を太字としている）
【0134】
追加的または代替的に、ＯＤＤは、配列番号２９、３０もしくは３１、または配列番号２９、３０もしくは３１に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはより高い配列同一性を有しかつ配列番号２８を含むそのホモログもしくはバリアントをコードする核酸によりコードされてもよい。
【0135】
本明細書において定義される「ホモログ」は、配列番号２９、３０または３１に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはより高い配列同一性を有し、かつ配列番号２７を含む。この文脈における（および本出願中の他の箇所において言及される）同一性は、塩基配列として例えば配列番号２９、３０または３１を用いて、ＢＬＡＳＴＰコンピュータプログラムを使用して決定されてもよい。ＢＬＡＳＴソフトウェアはｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ（２００９年３月１２日時点でアクセス可能）において公開されている。
【0136】
より一般には、他に記載されなければ、「バリアント」という用語は、本明細書において言及される場合、鎖内の１つまたは複数のアミノ酸が挿入、除去または置き換えされた、基本的な配列の天然に存在する多型形態であるポリペプチド配列の他に合成バリアントを指す。バリアントは、基本的な配列の生物学的効果に類似した生物学的効果を生じさせる。
【0137】
アミノ酸置換は、アミノ酸が、大まかに類似した特性を有する同じクラス中の異なるアミノ酸で置き換えられる場合に「保存的」とみなされ得る。非保存的置換は、アミノ酸が、異なる種類またはクラスのアミノ酸で置き換えられる場合である。
【0138】
アミノ酸クラスは以下のように定義される：
クラス アミノ酸の例
非極性： Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、Ｗ
非荷電極性： Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｙ、Ｎ、Ｑ
酸性： Ｄ、Ｅ
塩基性： Ｋ、Ｒ、Ｈ。
クラス アミノ酸の例
非極性： Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、Ｗ
非荷電極性： Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｙ、Ｎ、Ｑ
酸性： Ｄ、Ｅ
塩基性： Ｋ、Ｒ、Ｈ。
【0139】
当業者に周知のように、ペプチドの一次構造を保存的置換により変更することは、そのペプチドの活性を有意に変更しないことがあり、その理由は、配列に挿入されるアミノ酸の側鎖は、置換除去されたアミノ酸の側鎖と類似した結合および接触を形成できることがあるためである。置換がペプチドのコンホメーションの決定において不可欠な領域中にある場合にもこれはその通りである。
【0140】
非保存的置換はまた、これらが上記のようなポリペプチドの機能を妨害しないという条件で可能なことがある。大まかに言えば、より少数の非保存的置換はポリペプチドの生物学的活性を変更することなく可能である。
【0141】
低酸素応答性調節性核酸は、１つまたは複数のＯＤＤを含むキメラポリペプチドをコードする核酸分子に作動可能に連結している。キメラポリペプチドは、例えば、配列番号２９、３０および３１のいずれか、ならびに配列番号２８を含む本明細書において定義されるようなそのホモログおよびバリアントにより表されるような、少なくとも１、２、３、４、５またはそれより多くのＯＤＤを含んでもよい。１つより多くのＯＤＤの使用が想定される場合、それらは、同じ構築物中または別々の構築物中に提供されてもよく、同じ構築物上の場合、それらは連続的であってもよく、または空間的に分離していてもよい。
【0142】
１つまたは複数のＯＤＤは、ポリペプチドまたは核酸（ＲＮＡを含む）中のいずれかの場所に位置していてもよい。例えば、それらは、ＣもしくはＮ末端においてまたはポリペプチド鎖の間のいずれかの場所において、ポリペプチド鎖に直接的に取り付けられているか、またはリンカーを使用してポリペプチド鎖に連結されているかのいずれかで、位置していてもよく、ポリペプチドは抗腫瘍特性を有する。好適なリンカーは当該技術分野において周知であり、剛性または柔軟であってもよい。１つの実施形態において、ＯＤＤは、任意選択的にＣＡＲのＣ末端に融合して、ＣＡＲに含まれてもよい。
【0143】
本発明のポリペプチドおよびそれをコードする核酸、ＣＡＲならびに免疫応答細胞は、二重感知／二重発現、すなわち、固形がん環境中に見出されるような低酸素の条件下で腫瘍標的化ポリペプチドの活性または発現を引き起こすが、正常酸素環境中でほとんどまたは全く活性または発現を有しないことが可能である。これは、本発明の第１の態様に記載の低酸素応答性調節性核酸により駆動される発現と組み合わせたＯＤＤによりもたらされるような抗腫瘍特性を有するポリペプチドの分解のおかげである。
【0144】
本発明の第１の態様による低酸素応答性調節性核酸は、１つまたは複数の酸素依存性分解ドメイン（ＯＤＤ）および抗腫瘍特性を有する少なくとも１つのポリペプチドを含むキメラポリペプチドをコードする核酸分子の発現を調節することができる。キメラポリペプチドの発現は、１つまたは複数のＯＤＤと組み合わせた調節配列の作用のおかげで低酸素応答性の方式で制御され、システムの厳密性は、例えば、ＨＲＥコピーの数および／またはＯＤＤの数を調整することにより調整され得る。
【0145】
少なくとも１つのＯＤＤに加えて、キメラポリペプチドは、抗腫瘍特性を有する少なくとも１つのポリペプチドを含む。腫瘍への送達のためのそのようなタンパク質としては、以下：免疫刺激抗体；細胞活性化および腫瘍殺傷能力を付与する表面または細胞内受容体；Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＮＫ受容体、Ｔｏｌｌ様受容体のいずれか１つまたは複数が挙げられるがこれらに限定されない。抗腫瘍特性を有するポリペプチドと会合して、例えば細胞内シグナル伝達を促す、補助受容体もまた挙げられる。
【0146】
１つの実施形態によれば、核酸によりコードされるキメラポリペプチドはＣＡＲポリペプチド配列を含むまたはからなる。本発明のさらなる態様は、その発現が本発明の第１の態様による調節性核酸配列により駆動され、そしてまた１つまたは複数のＯＤＤおよび抗腫瘍特性を有する少なくとも１つのポリペプチドを含む、ＣＡＲを提供する。
【0147】
本発明によるＣＡＲの例が以下において提供され、アミノ酸配列（配列番号３５）および対応するヌクレオチド配列（配列番号３６）が提示され、それにおいてＣＳＦ１－Ｒリーダー配列（任意選択的な追加のグリシンを含む）を太字および下線としており、Ｔ１Ｅペプチド（ヒトＴＧＦαおよびＥＧＦに由来する）を太字としており、ＣＤ２８（細胞外、膜貫通および細胞内ドメイン）を斜体としており、ＣＤ３ζ（細胞内ドメイン）に下線を引いており、ＯＤＤドメイン（ヒトＨＩＦ１－アルファに由来する）を灰色の影付きとしている。
【0148】
Ｔ１Ｅ２８ｚ ＣＡＲおよび融合したＯＤＤアミノ酸配列（配列番号３５）
【0149】
対応するヌクレオチド配列（配列番号３６）
【0150】
ポリヌクレオチド
本発明の１つの態様によれば、キメラポリペプチドをコードする核酸分子が提供され、該キメラポリペプチドはＣＡＲを含んでもよい。
本発明の１つの態様によれば、キメラポリペプチドをコードする核酸分子が提供され、該キメラポリペプチドはＣＡＲを含んでもよい。
【0151】
本発明のポリヌクレオチドはＤＮＡまたはＲＮＡを含んでもよい。それらは一本鎖または二本鎖であってもよい。多数の異なるポリヌクレオチドは遺伝コードの縮重の結果として同じポリペプチドをコードできることが当業者により理解されるであろう。追加的に、当業者は、常用の技術を使用して、本発明のポリペプチドが発現されるべき任意の特定の宿主生物のコドン用法を反映するために本発明のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド配列に影響しないヌクレオチド置換を行ってもよいことが理解されるべきである。
【0152】
ポリヌクレオチドは、当該技術分野において利用可能な任意の方法により改変されてもよい。そのような改変は、本発明のポリヌクレオチドのインビボ活性または寿命を増強するために実行されてもよい。
【0153】
ポリヌクレオチド、例えばＤＮＡポリヌクレオチドは、組換えにより、合成的に、または当業者に利用可能な任意の手段により製造されてもよい。それらはまた、標準的な技術によりクローニングされてもよい。
【0154】
より長いポリヌクレオチドは、一般に、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）クローニング技術を使用して、組換え手段を使用して製造される。これは、クローニングが所望される標的配列に隣接する（例えば約１５～３０ヌクレオチドの）プライマーのペアを作ること、プライマーを、動物またはヒト細胞から得られたｍＲＮＡまたはｃＤＮＡと接触させること、所望の領域の増幅をもたらす条件下でポリメラーゼ連鎖反応を行うこと、増幅された断片を（例えば、アガロースゲルを用いて反応混合物を精製することにより）単離することおよび増幅されたＤＮＡを回収することを伴う。プライマーは、増幅されるＤＮＡを好適なベクターにクローニングできるような好適な制限酵素認識部位を含有するように設計されてもよい。
【0155】
本ポリヌクレオチドは、選択マーカーをコードする核酸配列をさらに含んでもよい。好適な選択マーカーは当該技術分野において周知であり、蛍光タンパク質、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）が挙げられるがこれに限定されない。選択マーカーをコードする核酸配列は、ポリシストロン性核酸構築物の形態で本ＣＡＲをコードする核酸配列と組み合わせて提供されてもよい。そのような核酸構築物はベクター中で提供されてもよい。
【0156】
ＣＡＲおよび選択マーカーをコードする核酸配列は、別々の実体としての各ポリペプチドの発現を可能にする共発現部位により分離されていてもよい。
【0157】
好適な共発現部位は当該技術分野において公知であり、例えば内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）および自己切断性ペプチドが挙げられる。
【0158】
さらなる好適な共発現部位／配列としては、自己切断または切断ドメインが挙げられる。
【0159】
そのような配列は、タンパク質製造の間に自己切断してもよく、または細胞中に存在する一般的な酵素により切断されてもよい。よって、ポリペプチド配列中にそのような自己切断または切断ドメインを含めることは、第１および第２のポリペプチドが単一のポリペプチドとして発現され、それがその後に切断されて、別々の分離された機能的なポリペプチドを提供することを可能にする。
【0160】
選択マーカーの使用は、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターが成功裏に導入された（それにより、コードされるＣＡＲが発現される）細胞が、一般的な方法、例えばフローサイトメトリーを使用して出発細胞集団から選択および単離されることを可能とするので、有利である。
【0161】
コドン最適化
本発明において使用されるポリヌクレオチドはコドン最適化されていてもよい。コドン最適化は、ＷＯ１９９９／４１３９７およびＷＯ２００１／７９５１８において以前に記載されている。
本発明において使用されるポリヌクレオチドはコドン最適化されていてもよい。コドン最適化は、ＷＯ１９９９／４１３９７およびＷＯ２００１／７９５１８において以前に記載されている。
【0162】
異なる細胞は特定のコドンの用法において異なる。このコドンバイアスは、細胞種における特定のｔＲＮＡの相対的な存在量におけるバイアスに対応する。対応するｔＲＮＡの相対的な存在量とマッチするように配列中のコドンを変更することにより、発現を増加させることが可能である。同様に、対応するｔＲＮＡが特定の細胞種において希少であることが公知であるコドンを故意に選択することにより、発現を減少させることが可能である。そのため、追加の程度の翻訳制御が利用可能である。
【0163】
ベクター
本発明のさらなる態様は、本発明のポリヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。
本発明のさらなる態様は、本発明のポリヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。
【0164】
ベクターは、１つの環境から別の環境への実体の移動を可能とするまたは促すツールである。本発明によれば、および例として、組換え核酸技術において使用される一部のベクターは、実体、例えば核酸のセグメント（例えば異種ＤＮＡセグメント、例えば異種ｃＤＮＡセグメント）が標的細胞中に移動させられることを可能とする。ベクターは非ウイルス性またはウイルス性であってもよい。組換え核酸技術において使用されるベクターの例としては、プラスミド、ｍＲＮＡ分子（例えば、インビトロで転写されるｍＲＮＡ）、染色体、人工染色体およびウイルスが挙げられるがこれらに限定されない。ベクターはまた、例えば、ネイキッドの核酸（例えばＤＮＡ）であってもよい。その最も単純な形態において、ベクターはそれ自体が関心対象のヌクレオチドであってもよい。
【0165】
本発明において使用されるベクターは、例えば、プラスミド、ｍＲＮＡまたはウイルスベクターであってもよく、ポリヌクレオチドの発現のためのプロモーターおよび任意選択的にプロモーターの調節因子を含んでもよい。
【0166】
本発明のポリヌクレオチドを含むベクターは、当該技術分野において公知の様々な技術、例えば形質転換および形質導入を使用して細胞に導入されてもよい。いくつかの技術が当該技術分野において公知であり、これは例えば、組換えウイルスベクター、例えばレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、バキュロウイルスおよび単純ヘルペスウイルスベクターを用いた感染；核酸の直接注射ならびに微粒子銃形質転換である。
【0167】
非ウイルス送達システムとしてはＤＮＡトランスフェクション方法が挙げられるがこれに限定されない。ここで、トランスフェクションとしては、非ウイルスベクターを使用して遺伝子を標的細胞に送達する方法が挙げられる。
【0168】
典型的なトランスフェクション方法としては、エレクトロポレーション、ＤＮＡ微粒子銃、脂質媒介性トランスフェクション、コンパクト化ＤＮＡ媒介性トランスフェクション、リポソーム、免疫リポソーム、リポフェクチン、陽イオン性剤媒介性トランスフェクション、陽イオン性面両親媒性物質（ＣＦＡ）（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９６）１４：５５６）およびこれらの組み合わせが挙げられる。
【0169】
トランスフェクションのための他の方法としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、タンパク質、プラスミド、トランスポザーゼ活性を有するタンパク質、ＤＮＡを切断する能力を有するタンパク質（例えば、ｓｇＲＮＡ（スモールガイドＲＮＡ）に結合したＣａｓタンパク質）、核酸を編集するための分子、例えば、単独でのまたはガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）に連結したＣａｓ９タンパク質が挙げられる。
【0170】
例えば、遺伝子ノックアウト、ノックインもしくは遺伝子の発現の下方調節もしくは過剰発現を引き起こすため、または１つもしくは複数の欠失、挿入もしくは置換の形態で突然変異を導入するために、核酸を編集するための様々な方法が当該技術分野において公知である。例えば、様々なヌクレアーゼシステム、例えばジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、またはこれらの組み合わせの使用が核酸を編集するために当該技術分野において公知であり、これらは本発明において使用されてもよい。最近では、ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）ヌクレアーゼシステムがゲノム操作のためにより一般的に使用されている。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、例えば、ＷＯ２０１３／１７６７７２、ＷＯ２０１４／０９３６３５およびＷＯ２０１４／０８９２９０において詳述されている。
【0171】
例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は、Ｃａｓ９に対する結合部位を有するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）配列および改変されるべき区画に特異的な標的化配列を含んでもよい。Ｃａｓ９はｇＲＮＡに結合して、標的区画に結合してそれを切断するリボ核タンパク質を形成する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ９プラットフォーム（これはＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムである）に加えて、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、およびＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを含む、代替的なシステムが存在する。本発明のポリヌクレオチド配列を含むベクターを調製するために上記のＣＲＩＳＰＲシステムのいずれかが使用されてもよい。
【0172】
免疫応答細胞
さらなる態様で本発明は、１つまたは複数の酸素依存性分解ドメイン（ＯＤＤ）および抗腫瘍特性を有する少なくとも１つのポリペプチドを含むキメラポリペプチドをコードする核酸分子を含む免疫応答細胞を提供する。複数の核酸は、ＩＲＥＳまたは自己切断２Ａペプチドにより分離された２シストロン性またはポリシストロン性ベクターの形態で前記低酸素応答性調節性核酸に作動可能に連結され得る。さらなる態様において、本発明は、免疫応答細胞中の１つまたは複数の酸素依存性分解ドメイン（ＯＤＤ）および抗腫瘍特性を有する少なくとも１つのポリペプチドを含むＣＡＲを提供する。
さらなる態様で本発明は、１つまたは複数の酸素依存性分解ドメイン（ＯＤＤ）および抗腫瘍特性を有する少なくとも１つのポリペプチドを含むキメラポリペプチドをコードする核酸分子を含む免疫応答細胞を提供する。複数の核酸は、ＩＲＥＳまたは自己切断２Ａペプチドにより分離された２シストロン性またはポリシストロン性ベクターの形態で前記低酸素応答性調節性核酸に作動可能に連結され得る。さらなる態様において、本発明は、免疫応答細胞中の１つまたは複数の酸素依存性分解ドメイン（ＯＤＤ）および抗腫瘍特性を有する少なくとも１つのポリペプチドを含むＣＡＲを提供する。
【0173】
１つの実施形態において、免疫応答細胞は、ＣＡＲをコードする核酸を発現することができる。これらの細胞は「操作された細胞」であり、すなわち、細胞は、該細胞により天然にコードされないポリヌクレオチドを含むまたは発現するように改変されている。代替的に、操作された細胞は、天然に発現されるポリヌクレオチドを過剰発現するようにまたは天然の発現を低減／サイレンシングさせる（例えばｓｈＲＮＡを用いたノックダウン）ように改変されてもよい。細胞を操作する方法は当該技術分野において公知であり、例えば形質導入、例えばレトロウイルスまたはレンチウイルス形質導入、トランスフェクション（例えばＤＮＡまたはＲＮＡベースの一過性トランスフェクション）、例えばリポフェクション、ポリエチレングリコール、リン酸カルシウムおよびエレクトロポレーションによる、細胞の遺伝子改変が挙げられるがこれらに限定されない。核酸配列を細胞に導入するために任意の好適な方法が使用されてもよい。
【0174】
よって、本明細書に記載されるようなＣＡＲをコードする核酸分子は、対応する非改変の細胞により天然に発現されない。好適には、操作された細胞は、そのゲノムが、例えば形質導入またはトランスフェクションにより、改変された細胞である。好適には、操作された細胞は、そのゲノムがレトロウイルス形質導入により改変された細胞である。好適には、操作された細胞は、そのゲノムがレンチウイルス形質導入により改変された細胞である。
【0175】
本明細書において使用される場合、「導入される」という用語は、外来ＤＮＡまたはＲＮＡを細胞に挿入する方法を指す。本明細書において使用される場合、導入されるという用語は、形質導入およびトランスフェクションの両方の方法を含む。トランスフェクションは、非ウイルス的方法により核酸を細胞に導入する方法である。形質導入は、ウイルスベクターを介して外来ＤＮＡまたはＲＮＡを細胞に導入する方法である。本発明による操作された細胞は、ウイルスベクターを用いる形質導入、ＤＮＡまたはＲＮＡを用いるトランスフェクションを含む多くの手段の１つにより本明細書に記載されるようなＣＡＲをコードするＤＮＡまたはＲＮＡを導入することにより生成されてもよい。細胞は、本明細書に記載されるようなＣＡＲをコードするポリヌクレオチドの導入の前、または後に、活性化および／または拡大増殖されてもよい。本明細書において使用される場合、「活性化される」は、細胞の増殖を引き起こすように該細胞が刺激されていることを意味する。本明細書において使用される場合、「拡大増殖される」は、細胞または細胞の集団が増殖を誘導されていることを意味する。細胞の集団の拡大増殖は、例えば、集団中に存在する細胞の数をカウントすることにより、測定されてもよい。細胞の表現型は、当該技術分野において公知の方法、例えばフローサイトメトリーにより決定されてもよい。
【0176】
１つまたは複数のＯＤＤ、および抗腫瘍特性を有する少なくとも１つのポリペプチドを含むキメラポリペプチドをコードする核酸分子は、任意の哺乳動物細胞、好ましくは免疫応答細胞または腫瘍細胞中に含まれてもよい。細胞はインビトロまたはインビボであってもよい。免疫応答細胞は、それ自体がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）中に含まれていてもよいキメラポリペプチドを含んでもよく、ＣＡＲは低酸素の条件下で発現され、正常酸素条件下で実質的に発現されない。
【0177】
好適な免疫応答細胞としては、リンパ系由来細胞、例えばナチュラルキラー細胞、ＮＫ Ｔ細胞、インバリアントＮＫＴ細胞、もしくはＴ細胞、例えば細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞もしくは制御性Ｔ細胞；αβ Ｔ細胞、γδ Ｔ細胞、Ｂ細胞、または骨髄由来細胞、例えばマクロファージもしくは好中球；幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）が挙げられるがこれらに限定されない。
【0178】
好適には、免疫応答細胞、例えばＴ細胞は、対象から得られた末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離される。好適には、対象は哺乳動物、好ましくはヒトである。Ｔ細胞ががんを有する対象に必ずしも由来しない「オフザシェルフ」ＣＡＲ Ｔ細胞の場合、免疫応答細胞は任意選択的に同種異系であってもよい（例えば、Ｄｅｐｉｌ ｅｔ ａｌ．，２０２０（Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を参照）。
【0179】
好適には、細胞は対象にマッチしている、または自己である。細胞は、患者自身の末梢血から（ファーストパーティー）、またはドナー末梢血からの造血幹細胞移植の状況において（セカンドパーティー）、または繋がりのないドナーからの末梢血から（サードパーティー）エクスビボで生成されてもよい。好適には、細胞は対象にマッチしている、または自己である。
【0180】
本発明のさらなる態様は、本発明の方法により得られ得るまたは得られた免疫応答細胞、特にＴ細胞の他に、それを含む医薬組成物を提供する。
【0181】
免疫応答細胞の調製方法
本発明のさらなる態様において、免疫応答細胞を調製する方法であって、
－ 対象（がん患者または健常ドナーであってもよい）からリンパ系由来または骨髄由来細胞を単離すること、
－ 本明細書において定義されるような核酸分子および／またはＣＡＲを導入するように前記細胞を改変すること、
－ 前記改変された細胞をエクスビボで拡大増殖させること、
－ 低酸素の条件下で核酸分子および／またはＣＡＲを発現することができる細胞を得ること
を含む、方法が提供される。
本発明のさらなる態様において、免疫応答細胞を調製する方法であって、
－ 対象（がん患者または健常ドナーであってもよい）からリンパ系由来または骨髄由来細胞を単離すること、
－ 本明細書において定義されるような核酸分子および／またはＣＡＲを導入するように前記細胞を改変すること、
－ 前記改変された細胞をエクスビボで拡大増殖させること、
－ 低酸素の条件下で核酸分子および／またはＣＡＲを発現することができる細胞を得ること
を含む、方法が提供される。
【0182】
核酸分子またはＣＡＲの発現は、本明細書において定義されるように、複数のＨＲＥを含む低酸素応答性調節性核酸により駆動される。
【0183】
本発明の免疫応答細胞は、ウイルスベクターを用いる形質導入、ＤＮＡまたはＲＮＡを用いるトランスフェクションを含む多くの手段の１つにより、本明細書において定義されるような核酸分子および／またはＣＡＲをコードするＤＮＡまたはＲＮＡを導入することにより生成されてもよい。
【0184】
本発明の細胞は、（例えば形質導入またはトランスフェクションにより）本明細書において定義されるようなポリヌクレオチドまたはベクターを細胞に導入することにより作られてもよい。好適には、細胞は、対象から単離された試料からのものであってもよい。
【0185】
本発明のさらなる態様は、本発明の方法により得られ得る免疫応答細胞の他に、それを含む医薬組成物を提供する。
【0186】
医薬組成物
医薬組成物は、治療有効量の薬学的活性剤を含む、本質的にからなる、またはからなる組成物であり、ここで薬学的活性剤は改変された免疫応答細胞である。それは、好ましくは、薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤（これらの組み合わせを含む）を含む。治療的使用のための許容される担体または希釈剤は周知であり、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ ｅｄｉｔ．１９８５）において記載されている。薬学的担体、賦形剤または希釈剤の選択は、意図される投与の経路および標準的な薬学プラクティスに関して選択され得る。医薬組成物は、担体、賦形剤もしくは希釈剤として、またはそれに加えて、任意の好適な結合剤、滑沢剤、懸濁化剤、コーティング剤または可溶化剤を含んでもよい。
医薬組成物は、治療有効量の薬学的活性剤を含む、本質的にからなる、またはからなる組成物であり、ここで薬学的活性剤は改変された免疫応答細胞である。それは、好ましくは、薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤（これらの組み合わせを含む）を含む。治療的使用のための許容される担体または希釈剤は周知であり、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ ｅｄｉｔ．１９８５）において記載されている。薬学的担体、賦形剤または希釈剤の選択は、意図される投与の経路および標準的な薬学プラクティスに関して選択され得る。医薬組成物は、担体、賦形剤もしくは希釈剤として、またはそれに加えて、任意の好適な結合剤、滑沢剤、懸濁化剤、コーティング剤または可溶化剤を含んでもよい。
【0187】
薬学的に許容される担体の例としては、例えば、水、塩溶液、アルコール、シリコーン、ワックス、石油ゼリー、植物油、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、リポソーム、糖、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、界面活性剤、ケイ酸、粘性パラフィン、香油、脂肪酸モノグリセリドおよびジグリセリド、ペトロエトラル（ｐｅｔｒｏｅｔｈｒａｌ）脂肪酸エステル、ヒドロキシメチル－セルロース、およびポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
【0188】
治療方法
本発明のさらなる態様は、腫瘍の治療方法であって、それを必要とする対象に本発明の免疫応答細胞を投与することを含む、方法を提供する。
本発明のさらなる態様は、腫瘍の治療方法であって、それを必要とする対象に本発明の免疫応答細胞を投与することを含む、方法を提供する。
【0189】
本明細書に記載されるような治療のために好適な対象としては、哺乳動物、例えばヒト、非ヒト霊長動物、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、ウサギ、または齧歯動物が挙げられる。好ましい実施形態において、対象はヒトである。他の哺乳動物対象における、特に、ヒトにおける治療有効性を実証するためのモデルとして慣習的に使用されている哺乳動物（例えばマウス、霊長動物、ブタ、イヌ、またはウサギ動物）における本明細書に記載の方法の実施もまた包含される。投薬量および投薬スケジュールを最適化するために標準的な用量応答研究が使用される。
【0190】
「投与する」は、様々な公知の方法および送達システムのいずれかを使用する対象への免疫応答細胞の物理的導入を指す。例としては、腫瘍内（ｉ．ｔ．）、静脈内（ｉ．ｖ．）、筋肉内、皮下、腹腔内、胸膜内、脊髄、胸水、または他の非経口の投与経路、例えば注射もしくは注入によるものが挙げられる。「非経口投与」という語句は、本明細書において使用される場合、通常は注射による、経腸および外用投与以外の投与のモードを意味し、非限定的に、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、リンパ内、病巣内、嚢内、腔内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内注射および注入の他に、インビボエレクトロポレーションが挙げられる。投与することはまた、例えば、１回、複数回、および／または１つもしくは複数の長期間にかけて行われ得る。
【0191】
免疫応答細胞は、標的細胞集団に対するＴ細胞媒介性免疫応答を刺激するために療法または予防的処置において有用である。本発明はさらに、それを必要とする患者において標的細胞集団に対するＴ細胞媒介性免疫応答を刺激する方法であって、患者に上記のような免疫応答細胞の集団を投与することを含む、方法を提供する。
【0192】
免疫応答細胞は、固形がんの治療において特に有用である。本発明によるＣＡＲベースの抗がん免疫療法において、Ｔリンパ球ががん患者（または健常ドナー）から単離され、例えばレトロ／レンチウイルスベクターにより、エクスビボで改変および拡大増殖されて、腫瘍細胞により表面上に発現される腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対する結合特異性を有するＣＡＲ分子を細胞表面に構成的に発現するようにされ、次に患者に再注入される（図１）。結果として、患者自己Ｔ細胞および／または非患者由来同種異系Ｔ細胞の大きい集団はがん性細胞の殺傷に再方向付けされる。さらには、ＣＡＲの二重酸素感知特性は、（ＯＤＤの活性と組み合わせて低酸素応答性プロモーターの使用を通じて）オフターゲット効果が低減または排除されることを可能とし、さらには、従来の構成的なレトロウイルスプロモーターと比較して低酸素応答性プロモーターの予想外に増加した強さに起因して腫瘍の部位において抗腫瘍ポリペプチドの発現が増加する。
【0193】
疾患を治療する方法は、本発明の免疫応答細胞の治療的使用に関する。これに関して、細胞は、疾患と関連付けられる少なくとも１つの症状を減じ、低減させもしくは改善させるためおよび／または疾患の進行を減速させ、低減させもしくは遮断するために既存の疾患または状態を有する対象に投与されてもよい。
【0194】
治療方法は、本発明の細胞の予防的使用を含んでもよい。これに関して、細胞は、疾患の原因を予防しもしくは減退させるためまたは疾患と関連付けられる少なくとも１つの症状の発生を低減させもしくは予防するために疾患に未だ罹患していないかつ／または疾患のいかなる症状も示していない対象に投与されてもよい。対象は、疾患となる、またはその発症のリスクがあると考えられる素因を有してもよい。
【0195】
治療方法は、Ｔ細胞を使用して実行される必要はないが、他の好適な免疫応答細胞、例えばリンパ系由来細胞、例えばナチュラルキラー細胞、Ｂ細胞、インバリアントＮＫＴ細胞もしくはＴ細胞、例えば細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞もしくは制御性Ｔ細胞；または骨髄由来細胞、例えばマクロファージもしくは好中球を使用して実行されてもよい。
【0196】
開示される方法は、がんを治療するため、例えば、完全ながんの軽快を含む、がん成長を阻害するため、がん転移を阻害するため、およびがん抵抗性を促進するために有用である。「がん成長」という用語は、一般に、より進んだ形態へのがん内の変化を示唆する多数の指数のいずれか１つを指す。がん成長の阻害を測定するための指数としては、がん細胞生存における減少、（例えばコンピュータ断層撮影法（ＣＴ）、超音波検査、または他のイメージング方法を使用して決定されるような）腫瘍体積または形態における減少、腫瘍成長の遅延、腫瘍血管系の破壊、遅延過敏皮膚試験における成績の向上、細胞溶解性Ｔリンパ球の活性における増加、および腫瘍特異的抗原のレベルにおける減少が挙げられるがこれらに限定されない。「がん抵抗性」という用語は、がん成長、特に既に有するがんの成長に抵抗する対象の向上した能力を指す。換言すれば、「がん抵抗性」という用語は、対象におけるがん成長の減少した傾向を指す。
【0197】
がんを有する個体におけるがん細胞は、該個体における正常な体細胞とは免疫学的に別個であってもよい。例えば、がん細胞は、該個体において正常な体細胞により発現されない抗原（すなわち、腫瘍抗原）を発現してもよい。腫瘍抗原は当該技術分野において周知であり、本明細書においてより詳細に記載される。
【0198】
様々な種類のがんが当該技術分野において公知である。がんは転移性または非転移性であってもよい。がんは家族性または弧発性であってもよい。一部の実施形態において、がんは、白血病および多発性骨髄腫からなる群から選択される。本発明の方法を使用して治療され得る追加のがんとしては、例えば、良性および悪性固形腫瘍ならびに良性および悪性非固形腫瘍が挙げられる。
【0199】
例えば、がんは、固形腫瘍、例えば癌腫または肉腫を含んでもよい。
【0200】
癌腫としては、周囲組織に浸潤（ｉｎｆｉｌｔｒａｔｅ）、例えば侵入（ｉｎｖａｄｅ）して、転移を生じさせる上皮細胞に由来する悪性新生物が挙げられる。腺癌は、腺組織、または認識可能な腺構造を形成する組織に由来する癌腫である。
【0201】
治療され得る癌腫としては、副腎皮質、腺房、腺房細胞、房状（ａｃｉｎｏｕｓ）、腺嚢胞性、腺様嚢胞性、腺様扁平細胞、腺腫性がん（ｃａｎｃｅｒ ａｄｅｎｏｍａｔｏｓｕｍ）、腺扁平上皮、付属器（ａｄｎｅｘｅｌ）、副腎皮質のがん、副腎皮質、アルドステロン産生性、アルドステロン分泌性、肺胞、肺胞細胞、エナメル芽細胞、膨大部、甲状腺の退形成がん、アポクリン、基底細胞、基底細胞、肺胞、面皰基底細胞、嚢胞性基底細胞、斑状強皮症様基底細胞、多中心性基底細胞、結節潰瘍性（ｎｏｄｕｌｏ－ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ）基底細胞、色素性基底細胞、硬化性基底細胞、表在性基底細胞、類基底、基底扁平細胞、胆管、肝臓外胆管、肝臓内胆管、気管支肺胞上皮、細気管支、細気管支肺胞性、気管支肺胞、気管支肺胞細胞、気管支原性、大脳様、胆管細胞（ｃｈｏｌａｎｇｉｏｃｅｌｌｕａｒｌ）、絨毛性、脈絡叢、明細胞、総排泄肛門（ｃｌｏａｃｏｇｅｎｉｃ ａｎａｌ）、コロイド、面皰、体（ｃｏｒｐｕｓ）、子宮体のがん、コルチゾール産生性、篩状、円筒状、円筒細胞、腺管（ｄｕｃｔ）、腺管（ｄｕｃｔａｌ）、前立腺の腺管がん、原位置腺管がん（ＤＣＩＳ）、エクリン、胎児性、鎧状がん（ｃａｎｃｅｒ ｅｎ ｃｕｉｒａｓｓｅ）、子宮内膜、子宮内膜のがん、子宮内膜様、類表皮、混合腫瘍から生じたがん、多形性腺腫から生じたがん、外方増殖性、線維性層板状、線維性がん（ｃａｎｃｅｒ ｆｉｂｒｏ’ｓｕｍ）、甲状腺の濾胞がん、胃、ゼラチン状、ゼラチン様、巨細胞、甲状腺の巨細胞がん、巨細胞がん、腺、顆粒膜細胞（ｇｒａｎｕｌｏｓｅ ｃｅｌｌ）、肝細胞、ハースル細胞、副腎様、乳胎児性、膵島細胞癌、乳房の炎症性がん、原位置がん、腺管内、表皮内、上皮内、若年胎児性（ｊｕｖｅｎｉｌｅ ｅｍｂｒｙｏｎａｌ）、クルチッキー細胞、大細胞、軟膜、小葉、浸潤性小葉、侵入性小葉、原位置小葉がん（ＬＣＩＳ）、リンパ上皮、髄様がん、髄様、甲状腺の髄様がん、髄様性甲状腺、黒色性、髄膜、メルケル細胞、変型性（ｍｅｔａｔｙｐｉｃａｌ）細胞、微小乳頭状、粘液性、粘液性がん（ｃａｎｃｅｒ ｍｕｃｉｐａｒｕｍ）、粘液細胞がん（ｃａｎｃｅｒ ｍｕｃｏｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、粘膜表皮性、粘液がん（ｃａｎｃｅｒ ｍｕｃｏｓｕｍ）、粘液、鼻咽頭、皮膚の神経内分泌がん、非浸潤性、非小細胞、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、燕麦細胞、骨化性がん、類骨、パジェット、乳頭状、甲状腺の乳頭がん、膨大部周囲、前浸潤性、有棘細胞、原発性骨内（ｐｒｉｍａｒｙ ｉｎｔｒａｓｓｅｏｕｓ）、腎臓細胞、瘢痕、住血吸虫性膀胱、シュナイダー、スキルス、脂腺、印環細胞、単純がん、小細胞、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、紡錘細胞、海綿体がん、扁平、扁平細胞、終末管、退形成性甲状腺、濾胞性甲状腺、髄様性甲状腺、乳頭状甲状腺、皮膚の小柱状（ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ）がん、移行細胞、管状、甲状腺の未分化がん、子宮体部、疣状、絨毛状、絨毛がん、卵黄嚢、特に頭頸部の扁平細胞、食道扁平細胞、ならびに口腔がんおよび癌腫が挙げられる。
【0202】
がんの別の広いカテゴリーとしては肉腫および線維肉腫が挙げられ、これらは、その細胞が線維状または均質な物質、例えば胚性結合組織中に包埋されている腫瘍である。
【0203】
標的化され得る肉腫としては、脂肪、肺胞軟部、エナメル芽細胞、鳥類、葡萄状、葡萄状肉腫、ニワトリ、緑色、軟骨芽細胞、腎臓の明細胞肉腫、胎児性、子宮内膜間質、類上皮、ユーイング、筋膜、線維芽細胞、家禽、巨細胞、顆粒球性、血管内皮、ホジキン、特発性多発性色素性出血性、Ｂ細胞の免疫芽球性肉腫、Ｔ細胞の免疫芽球性肉腫、イェンセン、カポジ、クッパー細胞、白血球、リンパ、黒色性、混合細胞、多発性、リンパ管、特発性出血性、骨の多能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔｉａｌ）原発性肉腫、骨芽細胞性、骨原性、傍骨性、多形性、偽カポジ、細網細胞、脳の細網細胞肉腫、横紋筋肉腫、ラウス、軟組織、紡錘細胞、滑膜、毛細血管拡張性、骨の肉腫（骨肉腫）／悪性繊維性組織球腫、および軟組織肉腫が挙げられる。
【0204】
治療され得るリンパ腫としては、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）関連、非ホジキン、ホジキン、Ｔ細胞、Ｔ細胞白血病／リンパ腫、アフリカ、Ｂ細胞、単球様Ｂ細胞、ウシ悪性、バーキット、中心細胞性、皮膚リンパ腫、びまん性、びまん性、大細胞、びまん性、混合小および大細胞、びまん性、小分割細胞、濾胞性、濾胞中心細胞、濾胞性、混合小分割および大細胞、濾胞性、主に大細胞、濾胞性、主に小分割細胞、巨大濾胞、巨大濾胞性、肉芽腫性、組織球性、大細胞、免疫芽球性、大分割細胞、大非分割細胞、レンネルト、リンパ芽球性、リンパ球性、中間；リンパ球性、中分化、形質細胞性；低分化リンパ球性、小リンパ球性、高分化リンパ球性、ウシのリンパ腫；粘膜関連リンパ系組織（ＭＡＬＴ）、マントル細胞、外套帯、辺縁帯、地中海リンパ腫、混合リンパ球性－組織球性、結節性、形質細胞性、多形性、原発性中枢神経系、原発性滲出液、小Ｂ細胞、小分割細胞、小型非分割細胞、Ｔ細胞リンパ腫；回旋Ｔ細胞、皮膚Ｔ細胞、小リンパ球性Ｔ細胞、不確定リンパ腫、ｕ細胞、未分化、ａｉｄｓ関連、中枢神経系、皮膚Ｔ細胞、滲出液（身体腔ベース）、胸腺リンパ腫、ならびに皮膚Ｔ細胞リンパ腫が挙げられる。
【0205】
標的化され得る白血病および他の血液細胞悪性腫瘍としては、急性リンパ芽球性、急性骨髄、急性リンパ球性、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性、有毛細胞、赤白血病、リンパ芽球性、骨髄、リンパ球性、骨髄性、白血病、有毛細胞、Ｔ細胞、単球性、骨髄芽球性、顆粒球性、肉眼的（ｇｒｏｓｓ）、ハンドミラー細胞、好塩基性、血芽球性（ｈａｅｍｏｂｌａｓｔｉｃ）、組織球性、白血球減少性、リンパ、シリング、幹細胞、骨髄単球性、単球性、前リンパ球性、前骨髄球性、小骨髄芽球性、巨核芽球性、巨核球性（ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｔｙｉｃ）、リーデル細胞、ウシ、非白血病性、肥満細胞、骨髄球性、血漿細胞、亜白血病性、多発性骨髄腫、非リンパ球性、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、真性多血症、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫（無痛性および高悪性度形態）、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームのマクログロブリン血症、重鎖病、骨髄異形成症候群、脊髄形成異常ならびに慢性骨髄球性白血病が挙げられる。
【0206】
治療され得る脳および中枢神経系（ＣＮＳ）がんおよび腫瘍としては、星状細胞腫（小脳および大脳のものを含む）、脳幹部神経膠腫、脳腫瘍、悪性神経膠腫、上衣腫、膠芽腫、髄芽腫、テント上未分化神経外胚葉性腫瘍、視覚路および視床下部神経膠腫、原発性中枢神経系リンパ腫、上衣腫、脳幹部神経膠腫、視覚路および視床下部神経膠腫、頭蓋外生殖細胞腫瘍、髄芽腫、骨髄異形成症候群、乏突起膠腫、骨髄異形成／骨髄増殖性疾患、骨髄性白血病、骨髄性白血病、多発性骨髄腫、骨髄増殖性障害、神経芽腫、血漿細胞新生物／多発性骨髄腫、中枢神経系リンパ腫、内因性脳腫瘍、星状細胞脳腫瘍、神経膠腫、ならびに中枢神経系における転移性腫瘍細胞浸潤が挙げられる。
【0207】
治療され得る胃腸がんとしては、肝臓外胆管がん、結腸がん、結腸および直腸がん、結腸直腸がん、胆嚢がん、胃（ｇａｓｔｒｉｃまたはｓｔｏｍａｃｈ）がん、胃腸カルチノイド腫瘍、胃腸カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、膀胱がん、膵島細胞癌（内分泌性膵臓）、膵臓がん、膵島細胞膵臓がん、前立腺がん、直腸がん、唾液腺がん、小腸がん、結腸がん、ならびに結腸直腸新形成と関連付けられるポリープが挙げられる。
【0208】
治療され得る肺および呼吸器がんとしては、気管支腺腫／カルチノイド、食道がん、下咽頭がん、喉頭がん、下咽頭がん、肺カルチノイド腫瘍、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、肺の小細胞癌、中皮腫、鼻腔および副鼻腔がん、鼻咽頭がん、鼻咽頭がん、口腔がん、口腔および口唇がん、口咽頭がん；副鼻腔および鼻腔がん、ならびに肺胸膜芽細胞腫が挙げられる。
【0209】
治療され得る尿路および生殖器がんとしては、子宮頸がん、子宮内膜がん、卵巣上皮がん、性腺外生殖細胞腫瘍、頭蓋外生殖細胞腫瘍、性腺外生殖細胞腫瘍、卵巣生殖細胞腫瘍、妊娠性絨毛腫瘍、脾臓、腎臓がん、卵巣がん、卵巣上皮がん、高悪性度漿液性卵巣がん、卵巣生殖細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍、陰茎がん、腎臓細胞がん（癌腫を含む）、腎臓細胞がん、腎盂および尿管（移行細胞がん）、腎盂および尿管の移行細胞がん、妊娠性絨毛腫瘍、精巣がん、尿管および腎盂、移行細胞がん、尿道がん、子宮内膜子宮がん、子宮肉腫、膣がん、外陰がん、卵巣癌、原発性腹膜上皮新生物、子宮頸癌、卵胞中の子宮がんおよび固形腫瘍、表在性膀胱腫瘍、膀胱の浸潤性移行細胞癌、ならびに筋肉浸潤性膀胱がんが挙げられる。
【0210】
治療され得る皮膚がんならびに黒色腫（および非黒色腫）としては、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、眼内黒色腫、ヒト皮膚ケラチノサイトの腫瘍進行、基底細胞癌、および扁平細胞がんが挙げられる。標的化され得る肝臓がんとしては、肝臓外胆管がん、および肝細胞がんが挙げられる。標的化され得る眼がんとしては、眼内黒色腫、網膜芽腫、および眼内黒色腫が挙げられる。
【0211】
治療され得るホルモン性がんとしては、副甲状腺がん、松果体およびテント上未分化神経外胚葉性腫瘍、下垂体腫瘍、胸腺腫および胸腺癌、胸腺腫、胸腺がん、甲状腺がん、副腎皮質のがん、ならびに副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）産生腫瘍が挙げられる。
【0212】
標的化され得る種々雑多な他のがんとしては、進行性がん、ＡＩＤＳ関連、肛門がん、副腎皮質、再生不良性貧血、アニリン誘導性およびキンマ（ｂｅｔｅｌ）誘導性がん、頬部がん（ｂｕｙｏ ｃｈｅｅｋ ｃａｎｃｅｒ）、大脳様（ｃｅｒｅｂｒｉｆｏｒｍ）、煙突掃除人癌、クレイパイプ誘導性がん、コロイドがん、嚢胞性、樹状性、同棲がん（ｃａｎｃｅｒ ａ ｄｅｕｘ）、腺管、染料職人、脳様癌、鎧状がん、子宮内膜、内皮、上皮、腺、原位置がん（ｃａｎｃｅｒ ｉｎ ｓｉｔｕ）、カング（Ｋａｎｇ）がん、カングリ（Ｋａｎｇｒｉ）がん、潜伏性、髄質、黒色性、木綿紡績工、潜在性がん、パラフィン、アスファルト労働者、瘢痕、住血吸虫性膀胱、スキルス、リンパ節、軟性、煤煙、紡錘細胞、沼沢、タール、ならびに管状がんが挙げられる。
【0213】
標的化され得る種々雑多な他のがんとしてはまた、カルチノイド（胃腸および気管支）、キャッスルマン病、慢性骨髄増殖性障害、腱鞘の明細胞肉腫、ユーイングファミリー腫瘍、頭頸部がん、唇および口腔がん、原発不明の転移性扁平頸部がん、多発性内分泌腺腫症候群、ウィルムス腫瘍、菌状息肉症、褐色細胞腫、セザリー症候群、テント上未分化神経外胚葉性腫瘍、原発部位不明の腫瘍、腹膜滲出液、悪性胸水、栄養膜新生物、ならびに血管周囲細胞腫が挙げられる。
【0214】
がんは、以下：肺、乳房、卵巣、頭頸部、膵臓、上皮腫、肉腫、神経芽腫、前立腺、結腸直腸、胃、小腸、肝臓、骨、精巣、腎臓、甲状腺がんのいずれかを特に含んでもよいがこれらに限定されない。
【0215】
治療に対する対象の好適性を決定する方法
本発明のさらなる態様は、本発明の免疫応答細胞を用いる治療に対する対象の好適性を決定する方法を提供する。方法は、以下の遺伝子：ＰＧＫ１、ＳＬＣ２Ａ１、ＣＡ９、ＡＬＤＯＡおよびＶＥＧＦＡの少なくとも２、３、４つまたは５つ全ての共発現をモニターすることを含んでもよく、前記対象における前記遺伝子の共発現は治療に対する対象の好適性を指し示す。上述の遺伝子の発現レベルは、健常な対照における遺伝子発現レベルと比較して増加または変化していてもよい。
本発明のさらなる態様は、本発明の免疫応答細胞を用いる治療に対する対象の好適性を決定する方法を提供する。方法は、以下の遺伝子：ＰＧＫ１、ＳＬＣ２Ａ１、ＣＡ９、ＡＬＤＯＡおよびＶＥＧＦＡの少なくとも２、３、４つまたは５つ全ての共発現をモニターすることを含んでもよく、前記対象における前記遺伝子の共発現は治療に対する対象の好適性を指し示す。上述の遺伝子の発現レベルは、健常な対照における遺伝子発現レベルと比較して増加または変化していてもよい。
【0216】
追加的または代替的に、本発明の免疫応答細胞を用いる治療に対する対象の好適性は、対象からの生検組織を免疫組織化学的に染色することならびに腫瘍もしくは間質中のＨＩＦ安定化を評価することおよび／または腫瘍のＨＩＦ安定化領域へのＴ細胞（および／もしくは他の免疫応答細胞）の浸潤をモニターすることにより決定されてもよい。腫瘍のＨＩＦ安定化領域への免疫応答細胞の浸潤は、ＨｙｐｏｘｉＣＡＲシステムを含む本発明の免疫応答細胞を用いる治療に対する対象の好適性を指し示す。
【0217】
キット
本発明のさらなる態様は、本発明のポリペプチド、核酸、構築物、ベクター、ＣＡＲ、免疫応答細胞および／または医薬組成物のいずれか１つまたは複数を含む、キットを提供する。
本発明のさらなる態様は、本発明のポリペプチド、核酸、構築物、ベクター、ＣＡＲ、免疫応答細胞および／または医薬組成物のいずれか１つまたは複数を含む、キットを提供する。
【0218】
核酸、ポリペプチド、ＣＡＲ構築物、ＣＡＲベクターはキット中に組み合わせられてもよく、該キットは、インサイチュで本発明の免疫応答細胞を生成させることを目的として供給される。
【0219】
使用
本発明のさらなる態様は、がん、特には固形がんの治療における本発明による免疫応答細胞またはそれを含む医薬組成物の使用を提供する。
本発明のさらなる態様は、がん、特には固形がんの治療における本発明による免疫応答細胞またはそれを含む医薬組成物の使用を提供する。
【0220】
がん、特には固形がんの治療における本発明によるポリペプチド、核酸、構築物、ベクター、ＣＡＲおよび免疫応答細胞の使用、またはそれを含む医薬組成物の使用もまた提供される。
【0221】
本発明はまた、同じ条件下での対応する非改変の野生型対応物と比較して低酸素条件下でＣＡＲの増加した発現を駆動するための本発明の調節性核酸の使用を提供する。本発明の低酸素応答性調節配列の使用は、一過性または低レベルの低酸素中で標的化する場合、低密度抗原を標的化する場合、および弱い治療剤、例えば弱いＣＡＲを使用する場合に特に有利である。
【0222】
持続性ＣＡＲシグナル伝達の予防または低減における本発明の第１の態様による低酸素応答性調節性核酸の使用もまた提供される。持続性ＣＡＲシグナル伝達の予防における本発明の二重感知システムの使用（すなわち、１つまたは複数のＯＤＤの使用と組み合わせた低酸素応答性調節性核酸の使用）もまた提供される。
【0223】
有利には、持続性ＣＡＲシグナル伝達は、本発明の二重感知システムを通じて実質的に予防または低減される。それらのエクスビボ拡大増殖の間およびそれらのインビボ注入後の両方における、ＣＡＲ Ｔ細胞中の持続性抗原非依存性シグナル伝達は、インビボでＴ細胞の分化および疲弊を増加させて効力を減少させ得る。この底質の持続性シグナル伝達は、ＣＡＲの高い細胞表面密度および自己凝集特性に起因して一般的に存在する。有利には、本発明の方法において、ＣＡＲコーディングＤＮＡを含有する免疫応答細胞は、低酸素環境、すなわち固形腫瘍中にあるまでは、その細胞表面上にいかなるＣＡＲも発現しない（または最小の数のみのＣＡＲを発現する）。このＣＡＲ Ｔ細胞が低酸素の区画中または腫瘍微環境中に見出される場合、それは高密度でその表面上にＣＡＲを発現し、これは、抗原標的が存在する場合に持続的なＴ細胞活性化およびＴ細胞媒介性腫瘍殺傷を引き起こす。
【0224】
本明細書および請求項の全体を通じて、「含む」（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）および「含有する」という語ならびにこれらの語のバリエーション、例えば「含む」（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）および「含む」（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）は、「含むがそれに限定されない」を意味し、他の成分、整数またはステップを除外しない。さらに、文脈が他に要求しなければ、単数は複数を包含し、特に、不定冠詞が使用される場合、文脈が他に要求しなければ、特定化は複数の他に単数を想定することが理解されるべきである。
【0225】
本発明の各態様の好ましい特徴が他の態様のいずれかとの繋がりで記載されることがある。本出願の範囲内で、以上の段落、請求項ならびに／または以下の記載および図面に記載の様々な態様、実施形態、例および選択肢、ならびに特にその個々の特徴は、独立してまたは任意の組み合わせで解釈され得ることが明示的に意図される。すなわち、そのような特徴が不適合でなければ、任意の実施形態の全ての実施形態および／または特徴を任意のやり方および／または組み合わせで組み合わせることができる。
【図面の簡単な説明】
【0226】
本発明の１つまたは複数の実施形態が、単に例として添付の図面を参照して、これより記載される。
【図1】図１は、ＣＡＲ Ｔ細胞免疫療法の図式的な表現を示す。ＣＡＲ Ｔ細胞免疫療法の実施において、Ｔ細胞ががん患者から単離され、例えばレトロもしくはレンチウイルス粒子またはＲＮＡエレクトロポレーションを使用して、エクスビボで遺伝子改変される。この手段により、Ｔ細胞は、関心対象の腫瘍抗原に対して特異的な結合親和性を有するキメラ受容体（ＣＡＲ）を発現するように操作される。この遺伝子改変後に、結果物のＣＡＲ発現Ｔ細胞は、適切なサイトカインを使用して拡大増殖され、拡大増殖された集団は患者に再注入されて、がんのＴ細胞媒介性標的化に繋がる。
【図2】図２は、哺乳動物細胞における酸素感知の図式的な表現（ｒｅｐｒｅｓｅｎａｔｉｏｎ）を示す。正常酸素の条件下（左）で、ＨＩＦ１αは、酸素を要求するプロセスにおいてＰＨＤ酵素によりヒドロキシル化される。ヒドロキシル化されたＨＩＦ１αは次にｐＶＨＬユビキチンリガーゼに結合することができ、ｐＶＨＬユビキチンリガーゼはＨＩＦ１α分子上にユビキチンを付加してそのプロテアソーム分解を引き起こす。低酸素の条件下（右）で、酸素の欠如に起因してＨＩＦ１αのヒドロキシル化および分解は遮断され、ＨＩＦ１αの安定化に繋がる。安定化されたＨＩＦ１αは次に核に移行し、そこでＨＩＦ１βならびに他の分子（例えばＰ３００およびＣＢＰ）と複合体を形成する。この複合体は次に、低酸素誘導性遺伝子の上流に存在してＨＩＦ結合部位（ＨＲＥ）に結合することができ、それらの転写を活性化させる。
【図3】図３は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）が、循環中または正常酸素張力下の組織中にある場合に、その表面上にいかなる人工的な受容体も発現しない、本発明のシステムの図式的な表現を示す。しかしながら、ＣＴＬが低酸素性領域中に位置する場合、それは、関心対象のがん抗原に対して特異的な結合親和性を有する細胞表面ＣＡＲを発現する。したがって、ＣＴＬ媒介性殺傷は、低酸素応答性調節性核酸の存在のおかげで、低酸素および関心対象の抗原の両方が存在する場合にのみ起こる。
【図4】図４は、ＨＩＦ結合または補助部位中のヌクレオチドの頻度ロゴを示す：Ａ．ヒト低酸素誘導性遺伝子中のＨＩＦ結合ヌクレオチドの頻度 Ｂ．マウス低酸素誘導性遺伝子中のＨＩＦ結合ヌクレオチドの頻度 Ｃ．低酸素誘導性遺伝子中のＨＩＦ補助ヌクレオチドの頻度。各文字の高さは、各位置における対応するヌクレオチドの出現の頻度を代表する。
【図5】図５は、３つのタンデムＨＲＥ設計の例を示す。ヒトエリスロポエチン（ｈＥＰＯ）ＨＲＥはタンデムで３つのＨＲＥを含み、各単一のＨＲＥは、ヒトＥＰＯ遺伝子に由来するＨＩＦ結合－リンカー－ＨＩＦ補助配列を含む。ヒト血管内皮増殖因子Ａ（ｈＶＥＧＦＡ）ＨＲＥはタンデムで３つのＨＲＥを含み、各単一のＨＲＥは、ヒトＶＥＧＦＡ遺伝子に由来するＨＩＦ結合－リンカー－ＨＩＦ補助配列を含む。ヒトグルコーストランスポーター３（ｈＧＬＵＴ３）ＨＲＥはタンデムで３つのＨＲＥを含み、各単一のＨＲＥは、ヒトＧＬＵＴ３遺伝子に由来するＨＩＦ結合－リンカー－ＨＩＦ補助配列を含む。
【図6】図６は、技術を最適化するために使用した構築物の直線マップ表現を示す：Ａ．クリックビートルルシフェラーゼ（ｃｂｌｕｃ）および増強型緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）ｃＤＮＡを含有する長鎖末端反復（ＬＴＲ）非改変ＳＦＧレポーターレトロウイルス構築物（レポーターＳＦＧ）、Ｂ．ｈＥＰＯ ＨＲＥが３’ＬＴＲ内に挿入された改変されたレポーターＳＦＧベクター、Ｃ．ｈＶＥＧＦ ＨＲＥが３’ＬＴＲ内に挿入された改変されたレポーターＳＦＧベクター、Ｄ．ｈＧＬＵＴ３ ＨＲＥが３’ＬＴＲ内に挿入された改変されたレポーターＳＦＧベクター。
【図8】図８は、技術を最適化するために使用したさらなる構築物の直線マップ表現を示す：Ａ．ｃｂｌｕｃルシフェラーゼ－ＯＤＤ融合物を含有するレポーターＳＦＧベクター、Ｂ．ｃｂｌｕｃルシフェラーゼ－ＯＤＤ融合物およびｈＥＰＯ ＨＲＥ ＬＴＲ改変を含有するレポーターＳＦＧベクター、Ｃ．ｃｂｌｕｃルシフェラーゼ－ＯＤＤ融合物およびｈＶＥＧＦＡ ＨＲＥ ＬＴＲ改変を含有するレポーターＳＦＧベクター、Ｄ．ｃｂｌｕｃルシフェラーゼ－ＯＤＤ融合物およびｈＧＬＵＴ３ ＨＲＥ ＬＴＲ改変を含有するレポーターＳＦＧベクター。
【図9】図９は、ウエスタンブロットの結果を示す。これらの結果は、０．１％の酸素および２０％の酸素中でのインキュベーション後に細胞系（２９３Ｔ、ＨＴ１０８０、Ｔ４７ＤおよびＪｕｒｋａｔ）において検出されたＨＩＦ１αタンパク質レベル（およびβ－アクチン参照）を表す。棒グラフはＨＩＦ１αバンドの強度を描写する。これは、ＩｍａｇｅＪを使用してバンドをプロットし、曲線下面積（ＡＵＣ）を算出することにより算出された。
【図10】図１０は、形質導入された細胞のｅＧＦＰ蛍光シグナルを測定することによるゲーティング戦略および（非改変ＳＦＧレポーター構築物の）形質導入効率の決定を示す（図６および図８）。７－ＡＡＤ陰性細胞（生存細胞）をゲーティングし、ヒストグラムにおけるｅＧＦＰ蛍光の評価において使用する。
【図11】図１１はｑＰＣＲアッセイの検証を示す。グラフは、形質導入された細胞におけるゲノムＴＡＴＡボックス結合タンパク質遺伝子（ＴＢＰ）およびルシフェラーゼ（ｌｕｃ；構築物によりコードされる）を検出するための熱サイクル数およびナノグラムでのＤＮＡ量（Ｌｏｇスケール）の間の直線的（ｙ＝ｘ）関係性を示す。
【図12】図１２は、指し示される構築物についての各々の正常酸素条件（左バー）と比較した５％（Ａ）、１％（Ｂ）および０．１％（Ｃ）の酸素（右バー）での１８時間のインキュベーション後に２９３Ｔ細胞から得られた相対光単位（ＲＬＵ）データを示す。
【図14】図１４は、健常マウス組織中のＥｒｂＢ受容体（ｅｇｆｒおよびｅｒｂｂ２－４）ならびにインテグリンβ６（ｉｎｔｇｂ６）遺伝子のｍＲＮＡ発現を示す。合計で１３の組織をこの実験において分析した。組織は、ハウスキーピング遺伝子、Ｔｂｐと比べた各ｍＲＮＡの発現レベルにしたがって順位付けされている。
【図15】図１５は、正常酸素の条件下でのルシフェラーゼの発現における対照（構成的）と対比した３および９つのＨＲＥコピーの効果を示す。ＨＲＥの包含は、下流のレポーター導入遺伝子（ルシフェラーゼ）の発現を有意にサイレンシングした。ＮＴ：非形質導入；構成的：野生型非ＨＲＥ改変ＬＴＲ；３ＨＲＥ：３つのタンデムＨＲＥエレメントを含有するように改変されたＬＴＲ；９ＨＲＥ：９つのタンデムＨＲＥエレメントを含有するように改変されたＬＴＲ。ＨＲＥエレメントはヒトＥＰＯ遺伝子プロモーターに由来した。複数のＨＲＥを含有するようにＬＴＲ（レトロウイルスプロモーター）を改変することにより、ルシフェラーゼの発現は正常酸素の条件下で有意に低減された。
【図16】図１６は、低酸素の条件下でのルシフェラーゼ発現の倍数誘導（低酸素の条件下での遺伝子発現を正常酸素の条件下で観察されたもので割ることにより算出される）を示す。構成的：野生型非ＨＲＥ改変ＬＴＲ；３ＨＲＥ：３つのタンデムＨＲＥエレメントを含有するように改変されたＬＴＲ；９ＨＲＥ：９つのタンデムＨＲＥエレメントを含有するように改変されたＬＴＲ。低酸素条件（０．１％のＯ２）下で、ルシフェラーゼの発現はプロモーター中に含まれるＨＲＥ数と相関する。
【図17】図１７は、非改変ＬＴＲを含有するＳＦＧベクター中のクリックビートルルシフェラーゼのＣ末端への異なる長さのヒトＨＩＦ１α ＯＤＤ（アミノ酸番号を指し示す）の融合の効果を示す。遺伝子発現を正常酸素条件において評価した。構成的：ＯＤＤ付加なしと、ルシフェラーゼへの異なる指し示される長さのＯＤＤの融合物との対比。
【図17A】クリックビートルルシフェラーゼのＣ末端に融合した可変ＯＤＤを含有する構築物。
【図17B】Ａに示される構築物の形質導入、非形質導入（ＮＴ）または構成的な形質導入（野生型非ＯＤＤ改変クリックビートルルシフェラーゼ）を行ったＴ４７Ｄ細胞を低酸素（０．１％の酸素）に１８ｈ曝露した。倍数誘導は、各構築物において正常酸素発現と比べた低酸素において見られたルシフェラーゼ発現誘導である。Ｎ＝３、線＝平均、エラーバーはＳＥＭ。
【図18】図１８は、ルシフェラーゼのＣ末端に融合したヒトＨＩＦ１α ＯＤＤ（アミノ酸４０１～６０３）との９つのＨＲＥプロモーター構造の組み合わせを示す。この二重酸素感知システムは、正常酸素の条件下でルシフェラーゼの検出可能な発現を示さなかったが、低酸素条件（０．１％の酸素）においてオンに切り替わった。
【図19】図１９は、Ｔ４－ＣＡＲ Ｔ細胞がｉ．ｖ．注入後に急性的に肝臓および肺に存在することを示す。ルシフェラーゼレポーターを共発現するＴ４－ＣＡＲ Ｔ細胞を、確立された皮下ＳＫＯＶ３腫瘍を有するＮＳＧ免疫不全マウスにｉ．ｖ．で注射した。ＩＶＩＳ生物発光イメージャーを使用してＣＡＲ Ｔ細胞を追跡した。（ａ）は、注入の４日後の、皮下に移植された確立されたＳＫＯＶ３ヒト卵巣腫瘍を有する３匹のマウス（左）および代表的なマウスからの解剖された臓器／腫瘍（右）においてＴ４－ＣＡＲ Ｔ細胞内に発現されるルシフェラーゼからの検出された光（写真上で青色／緑色に示される）を示す。（ｂ）各指し示される臓器中のルシフェラーゼシグナルの定量（ｎ＝６の個々のマウス）。注入の４日後の時点で見ることができるように、これらの細胞は腫瘍よりも肺および肝臓中に優先的に存在する。（ｃ）Ｔ４－ＣＡＲ Ｔ細胞は、全てではないにしてもほとんどの上皮細胞により発現されるＥｒｂｂ受容体ファミリーにより形成される８つのホモおよびヘテロ二量体に対して特異性を有する。ＥｒｂｂファミリーのｍＲＮＡ発現（ハウスキーピング遺伝子Ｔｂｐと比べて提示される）についての重要臓器の分析は、Ｔ４－ＣＡＲ Ｔ細胞が初期に蓄積する肺および肝臓の両方は共にＣＡＲリガンドの豊富な供給源であることを実証した。Ｎ＝６（組み合わせた生物学的複製物）。
【図20】図２０は、０．１％の酸素への曝露の２０ｈ後の指し示される群におけるゲーティングされた検出可能なＣＡＲ Ｔ細胞上のＣＡＲ発現のメジアン蛍光強度（ＭＦＩ）を示す（例えば低酸素条件；ｎ＝３の個々のＣＡＲ調製物）。「Ｔ４」は標準的なＳＦＧベクター（ＬＴＲベースのレトロウイルスプロモーター）を使用して発現され、「ＨＲＥ－ＣＡＲ」は改変されたＳＦＧベクター（９つのＨＲＥエレメントがＳＦＧベクターのＬＴＲに挿入されている）を使用して発現される。コードされるＨＲＥ ＣＡＲは追加のＯＤＤを含有しない。予想外なことに、ＣＡＲ発現のメジアン蛍光強度（ＭＦＩ）はＨＲＥ－ＣＡＲ群においてより大きかった。
【図21】図２１は、ＨｙｐｏｘｉＣＡＲ Ｔ細胞エフェクター機能は低酸素条件に厳密に制限されることを示す：（ａ）ヒトＴ細胞に形質導入されたＣＡＲ構築物（タンデムで９つのＨＲＥを有する、図示せず）、およびそれらのモジュール式の構成（ゲノム中に組み込まれた場合）を描写する模式図；ＬＴＲ－長鎖末端反復。（ｂ）表面ＣＡＲおよびＣＤ８α（ＣＤ８＋ Ｔ細胞を同定するため）を評価する代表的なフローサイトメトリードットプロット。データは、染色およびフローサイトメトリー分析の前に１８ｈ、正常酸素または低酸素（０．１％のＯ２）条件に維持された生存（７ＡＡＤ－）ＣＤ３＋ Ｔ４－ＣＡＲ、ＨｙｐｏｘｉＣＡＲまたは非形質導入Ｔ細胞によるＣＡＲ発現を実証する。（ｃ～ｈ）健常ドナーＣＤ３＋ Ｔ細胞（ｎ＝６）への形質導入を行ってＴ４－ＣＡＲまたはＨｙｐｏｘｉＣＡＲ Ｔ細胞を生成し、（ｃ）１８ｈまで０．１％のＯ２の低酸素条件に置いた後に正常酸素条件に戻し、フローサイトメトリー分析を使用して指し示される時点においてＣＡＲ発現を評価した。（ｄ）パネル（ｃ）からの０．１％のＯ２の低酸素への曝露の１８ｈ時におけるＴ４－ＣＡＲおよびＨｙｐｏｘｉＣＡＲ Ｔ細胞上のＣＡＲ発現のメジアン蛍光強度（ＭＦＩ）。（ｅ）減少性濃度のＯ２への１８ｈの曝露後のＨｙｐｏｘｉＣＡＲ Ｔ細胞上の検出可能な表面ＣＡＲ発現；統計的有意性を正常酸素条件下での発現と比較して評価した。（ｆ）正常酸素および０．１％のＯ２の低酸素条件における指し示される時点でのＴ４ ＣＡＲ、ＨｙｐｏｘｉＣＡＲ、またはＣＤ３切断ＨｙｐｏｘｉＣＡＲ（細胞内シグナル伝達を予防するためにＣＤ３ζエンドドメインを除去した）Ｔ細胞によるインビトロＳＫＯＶ３腫瘍細胞殺傷。（ｆ）において使用されたＴ細胞から放出されたＩＬ－２（ｇ）およびＩＦＮ－γ（ｈ）の定量化。ＳＫＯＶ３細胞への曝露の７２ｈ後に収集した培地に対してＥＬＩＳＡ分析を行い、非形質導入Ｔ細胞（「Ｔ細胞」）を使用して行った共培養物と比較した。実行した全ての統計的比較を示す。棒グラフ上のバーは群平均を示し、各ドットは群中の個々の健常ドナーを表す。＊ Ｐ＜０．０５、＊＊ Ｐ＜０．０１、＊＊＊ Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ Ｐ＜０．０００１。
【図22】図２２は、Ｔ細胞のゲノムに組み込まれた場合のＨｙｐｏｘｉＣＡＲレトロウイルス構築物の図式をパネルＡ）に示す。ＨｙｐｏｘｉＣＡＲ Ｔ細胞をＨＮ３腫瘍保有ＮＳＧマウスにｉ．ｖ．またはｉ．ｔ．のいずれかで注射した。Ｂ）注入の２４時間後に、腫瘍を切除し、酵素消化し、関心対象のマーカーについて染色した後にフローサイトメトリー分析を行った。指し示される組織中に存在するゲーティングされたＨｙｐｏｘｉＣＡＲ Ｔ細胞（ＣＤ３＋およびＣＤ４５＋）を示し、これを細胞表面ＣＡＲ発現（ヒストグラムのｘ軸）について評価した。ＣＡＲ発現は、腫瘍中に存在するＴ細胞においてのみ検出された。Ｃ）（Ｂに見られるような）表面ＣＡＲ発現の定量化であり、各ドットは各々の組織について個々のマウスを表す。
【図23】図２３は、ＨｙｐｏｘｉＣＡＲはＳＫＯＶ３およびＬＬ２腫瘍において腫瘍選択的なＣＡＲ発現を提供することを示す：（ａ）ＮＳＧマウスにおいて成長したＳＫＯＶ３腫瘍の成長曲線（ｎ＝６のマウス）。（ｂ）屠殺の２４ｈ前にＨｙｐｏｘｉＣＡＲ Ｔ細胞をｉ．ｖ．およびｉ．ｔ．で注射されたＳＫＯＶ３腫瘍保有マウスの酵素分散組織および血液における検出可能な細胞表面ＨｙｐｏｘｉＣＡＲ発現を示す代表的な積み重ねヒストグラム。ヒストグラムは、（ｎ＝６の個々のマウスにわたる）各々の組織におけるＣＡＲアイソタイプ染色腫瘍と共にゲーティングされた生存（７ＡＡＤ－）Ｔｅｒ１１９－ ＣＤ４５＋ ＣＤ３＋ Ｔ細胞（灰色ヒストグラム）（左）および検出可能なＣＡＲを有するＴ細胞のパーセントの全コホート定量化を示す。（ｃ）ｂに記載のものと同等であるがＬＬ２腫瘍保有Ｒａｇ２－／－マウスを用いた実験であり、（ｎ＝３の個々のマウスにわたる）各々の組織における各々の組織内のＴ細胞による代表的な細胞表面ＨｙｐｏｘｉＣＡＲ発現（左）およびＨｙｐｏｘｉＣＡＲ Ｔ細胞を発現するＣＡＲのパーセントの定量化（右）を示す。棒グラフ上のバーは群平均を示し、各ドットは群中の個々の健常マウスを表す。＊ Ｐ＜０．０５、＊＊ Ｐ＜０．０１、＊＊＊ Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ Ｐ＜０．０００１。
【図24】図２４：Ｔ４－ＣＡＲ Ｔ細胞は健常臓器において炎症を引き起こす。（Ａ）Ｔ４－ＣＡＲを描写する図式。（Ｂ）フローサイトメトリーを使用して評価された、生存（７ＡＡＤ－）ＣＤ３＋ Ｔ４－ＣＡＲまたは非形質導入ヒトＴ細胞上の細胞表面ＣＡＲ発現を示す代表的なヒストグラム。（Ｃ～Ｅ）皮下ＨＮ３腫瘍細胞接種後１３日目に、マウスにビヒクルまたは１０×１０６個の非形質導入もしくはＴ４－ＣＡＲ Ｔ細胞をｉ．ｖ．で注入した（ｎ＝５）。（Ｃ）実験を描写する模式図。（Ｄ）マウスの体重変化。矢印はＴ細胞注入を表し、クロスは、人道的なエンドポイントを超えたために選別した動物を指し示す。（Ｅ）注入の２４ｈ後の血清サイトカイン。（Ｆ）低用量ヒトＥｒｂＢ－ＣＡＲ／Ｌｕｃ Ｔ細胞（４．５×１０６）をＳＫＯＶ３腫瘍保有ＮＳＧマウスにｉ．ｖ．で注入し、４日後に生物発光イメージングを全身および解剖した臓器に対して行った。（Ｇ）全ての臓器のパーセントとしてのフォトン／ｓ／単位面積の定量化（ｎ＝６）、ＬＮ－鼠径部リンパ節、ＳＩ－小腸。（Ｈ、Ｉ）低用量（４．５×１０６個の細胞）Ｔ４－ＣＡＲもしくは非形質導入Ｔ細胞またはビヒクルのｉ．ｖ．での注入の５日後の肺（Ｈ）および肝臓（Ｉ）におけるＨ＆Ｅ染色切片（左）および骨髄浸潤の定量（右）。矢印は骨髄浸潤を指し示した。（Ｊ、Ｋ）腫瘍保有ＮＳＧマウスにおける還元的に活性化されたピモニダゾールについての組織切片の免疫組織化学（ＩＨＣ）染色（Ｊ）および染色の定量（Ｋ）。全ての実験は生物学的反復の代表である。線チャート、ドットは平均を示し、エラーバーはｓ．ｅ．ｍ．を表す。棒グラフは平均を示し、ドットは個々のマウスを示す。＊ Ｐ＜０．０５、＊＊ Ｐ＜０．０１。
【図25】図２５：ＨｙｐｏｘｉＣＡＲ Ｔ細胞エフェクター機能は低酸素に厳密に制限される。（Ａ）正常酸素および低酸素の条件下でのＨｙｐｏｘｉＣＡＲを描写する図式。（Ｂ）フローサイトメトリーを使用して評価された、正常酸素または１８ｈの低酸素（０．１％のＯ２）条件における生存（７ＡＡＤ－）ＣＤ３＋ Ｔ４－ＣＡＲ、ＨｙｐｏｘｉＣＡＲおよび非形質導入ヒトＴ細胞上の細胞表面ＣＡＲ発現を示す代表的なヒストグラム。（Ｃ）フローサイトメトリー分析を使用して評価された低酸素（０．１％のＯ２）または正常酸素の条件下での指し示される時点におけるＨｙｐｏｘｉＣＡＲ Ｔ細胞上の表面ＣＡＲ発現。値を１８ｈの低酸素において見られたものに対して正規化した（ｎ＝６）。（Ｄ）０．１、１、５％、２０％のＯ２への１８ｈの曝露後のＨｙｐｏｘｉＣＡＲ Ｔ細胞上の表面ＣＡＲ発現（ｎ＝６）。値を０．１％のＯ２において見られたものに対して正規化した。（Ｅ～Ｇ）正常酸素および０．１％のＯ２の低酸素条件におけるＴ４－ＣＡＲ、ＨｙｐｏｘｉＣＡＲ、ＣＤ３ζ切断ＨｙｐｏｘｉＣＡＲ（ＣＤ３－；細胞内シグナル伝達を予防するため）および非形質導入Ｔ細胞（ＣＡＲ＋エフェクター対標的腫瘍細胞比１：１）によるインビトロＳＫＯＶ３腫瘍細胞殺傷。（Ｆ）正常酸素および０．１％のＯ２の低酸素条件下での、それぞれＳＫＯＶ３細胞への２４ｈおよび４８ｈの曝露後に各々のＴ細胞から培地に放出されたＩＬ－２および（Ｇ）ＩＦＮγの定量化。チャート上のバーは平均を示し、ドットは各個々の健常ドナーを表す。データ点は並行して収集し、生物学的反復の代表である。線チャートにおいて、ドットは平均を示し、エラーバーはｓ．ｅ．ｍ．を表す。＊ Ｐ＜０．０５、＊＊ Ｐ＜０．０１、＊＊＊ Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ Ｐ＜０．０００１。
【図26】図２６：ＨｙｐｏｘｉＣＡＲ Ｔ細胞は全身毒性なしに抗腫瘍有効性を提供する。（Ａ～Ｃ）皮下ＨＮ３腫瘍保有ＮＳＧマウスにヒトＨｙｐｏｘｉＣＡＲ Ｔ細胞（ｉ．ｔ．で２．５×１０５個の細胞およびｉ．ｖ．で７．５×１０５個の細胞）をｉ．ｖ．およびｉ．ｔ．の両方で注射し、７２ｈ後に屠殺した。（Ａ）実験を描写する模式図。（Ｂ）指し示される酵素分散組織および血液中の生存有核細胞（７ＡＡＤ－、Ｔｅｒ１１９－）、ＣＤ４５＋ ＣＤ３＋ ＨｙｐｏｘｉＣＡＲ Ｔ細胞上の表面ＣＡＲ発現を示す代表的なヒストグラムならびに（Ｃ）ｎ＝９の個々のマウスにわたる各々の組織における定量化。（Ｄ～Ｆ）皮下ＨＮ３腫瘍細胞接種の１６日後に、マウスにビヒクルまたは１０×１０６個のＴ４－ＣＡＲ、ＨｙｐｏｘｉＣＡＲもしくは非形質導入ヒトＴ細胞（対照）のいずれかをｉ．ｖ．で注入した（ｎ＝４のマウス）。（Ｄ）実験を描写する模式図。（Ｅ）マウスの体重変化。（Ｆ）注入の２４ｈ後の血清サイトカイン。（Ｇ、Ｈ）低用量（４．５×１０６）Ｔ４－ＣＡＲまたはＨｙｐｏｘｉＣＡＲ Ｔ細胞をＮＳＧマウスにｉ．ｖ．で注入した。５日後に指し示される組織を切除し、骨髄浸潤を肺（Ｇ）および肝臓（Ｈ）においてスコア付けした。（Ｉ）（Ｄ～Ｆ）からのＨＮ３腫瘍成長曲線であり、矢印はＣＡＲ Ｔ細胞注入の時点を示す。全ての実験は生物学的反復の代表である。棒グラフは平均を示し、各ドットは個々のマウスを示す。線チャートにおいて、ドットは平均を示し、エラーバーはｓ．ｅ．ｍ．を表す。＊ Ｐ＜０．０５、＊＊ Ｐ＜０．０１、＊＊＊ Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ Ｐ＜０．０００１。
【図27】図２７：Ｔ細胞は、低酸素性頭頸部扁平細胞癌（ＳＣＣＨＮ）のＨＩＦ１α安定化領域から排除されない。（Ａ～Ｃ）ＨＲＥ調節遺伝子シグネチャーをＳＣＣＨＮ腫瘍において公知のＨＲＥ調節遺伝子から構築した（ｎ＝５２８）。（Ａ）個々の遺伝子についてのピアソン相関係数を示すヒートマップ。（Ｂ）腫瘍（Ｔ）ステージ（Ｔ１ ｎ＝４８、Ｔ２ ｎ＝１３６、Ｔ３ ｎ＝９９、Ｔ４ ｎ＝１７４）に基づくシグネチャー発現。（Ｃ）ＨＲＥ調節遺伝子シグネチャーの高および低発現についてのステージ３および４のＳＣＣＨＮを有する患者の生存曲線（それぞれｎ＝８７）。（Ｄ）ＨＩＦ１α（赤）およびＣＤ３（茶）についての代表的なＩＨＣ染色ＳＣＣＨＮ切片（ｎ＝６０）。（Ｅ～Ｆ）ＳＣＣＨＮ腫瘍中の上皮内Ｔ細胞（ＩＥＴ）の存在量を低い／非存在（ｎ＝４０）および高い（ｎ＝５５）としてグループ化した。ＩＥＴの例を（Ｄ）において黒矢印により示す。ＩＥＴ数を腫瘍のＨＩＦ１α安定化（Ｈ）－スコアに対して評価した（Ｅ）。大きい数のＩＥＴが存在する腫瘍について、腫瘍のＨＩＦ－１α安定化領域に直接的に浸潤する腫瘍浸潤性リンパ球（Ｈ－ＴＩＬ）を非存在（５５の腫瘍のうちｎ＝６）または存在（５５の腫瘍のうちｎ＝４６）としてグループ化した。Ｈ－ＴＩＬの例を（Ｄ）において白矢印により示す。Ｈ－ＩＥＴ数を腫瘍のＨ－スコアに対して評価した（Ｆ）。（Ｇ）ＤＡＰＩ（核；青）ならびにＣＤ３（緑）およびＨＩＦ１α（赤）に対する抗体を用いて染色された口腔舌癌の共焦点画像；白色はＣＤ３およびＨＩＦ１α共局在性を表す。ボックスプロットはメジアンおよび上位／下位四分位数を示し、ひげは最高および最低値を示す。＊ Ｐ＜０．０５、＊＊ Ｐ＜０．０１、＊＊＊ Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ Ｐ＜０．０００１。
【図28】図２８：ＨｙｐｏｘｉＣＡＲ Ｔ細胞は確立されたＳＫＯＶ３腫瘍に対して抗腫瘍有効性を提供する。ヒトＨｙｐｏｘｉＣＡＲ Ｔ細胞（１０×１０６ ｉ．ｖ．）または非形質導入対照Ｔ細胞を、確立された皮下ＳＫＯＶ３腫瘍を有するＮＳＧマウスにｉ．ｖ．で注射した。チャートは、マウスの各々のコホートの成長曲線を示す。矢印はＣＡＲ Ｔ細胞注入の時点を示す。ドットは平均を示し、エラーバーはｓ．ｅ．ｍ．を示す。
【図29】図２９：Ｔ４（構成的非ＨＲＥ改変）またはＨＲＥ改変（ＨＲＥ単独、ＯＤＤを欠いている）ＣＡＲ Ｔ細胞を正常酸素（２０％の酸素）または低酸素条件（０．１％の酸素）において指し示されるＣＡＲ＋エフェクター対標的比でＳＣＯＶ３標的細胞系と２４ｈ培養した。Ａ．は２４ｈの共培養後の共培養物中の生存標的の％を示し、Ｂ．は標的によるＴ細胞の抗原特異的な刺激後の共培養物中に放出されたＩＬ－２を示す。示されるデータは、パネルＡについて４人の独立したドナーからのＴ細胞を使用するｎ＝４の独立した実験からの平均、およびパネルＢについて３人の独立したドナーからのＴ細胞を使用するｎ＝３の独立した実験からの平均である。エラーバーはＳＥＭを示す。
【実施例】
【0227】
本発明をこれより以下の実施例を参照して説明する。
【0228】
材料および方法
構築物
それぞれヒトＥＰＯ、ＶＥＧＦＡおよびＧＬＵＴ３からのＨＢＳをタンデムで３つ含有する３つのＨＲＥ配列がＧｅｎｅＡｒｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により合成され、ＮｈｅＩおよびＸｂａＩ制限部位により隣接させた。これらの配列をサブクローニングし、ＳＦＧモロニーマウス白血病ウイルスプラスミドの３’ＬＴＲ内の天然のＮｈｅＩ／ＸｈｏＩ配列を置き換えた。３’ＬＴＲの特異的な改変は、制限酵素部位および各々のＨＲＥカセットに対する相補的配列を含有するプライマーを使用して達成された、ＨＲＥを含有するＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩ隣接中間断片の合成により達成した。断片のオーバーラップＰＣＲおよびサブクローニングによりＳＦＧベクターへの挿入を達成した。次に、Ｐ２Ａにより分離されたクリックビートルルシフェラーゼの緑色発光バリアントおよび緑色蛍光タンパク質をコードするタンパク質コーディング配列をＳＦＧのＮｃｏＩ／ＸｈｏＩ部位にクローニングした。Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂから購入した酵素および緩衝液を使用して制限消化を３７℃で行った。臭化エチジウム染色１．２％アガロースゲル中でＤＮＡを検出し、ＤＮＡラダーにしたがって評価されるような適切なサイズのバンドを切除し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してゲルから抽出した。付着末端ライゲーションは、１６℃で１時間のＴ４ ＤＮＡリガーゼ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により触媒された。
構築物
それぞれヒトＥＰＯ、ＶＥＧＦＡおよびＧＬＵＴ３からのＨＢＳをタンデムで３つ含有する３つのＨＲＥ配列がＧｅｎｅＡｒｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により合成され、ＮｈｅＩおよびＸｂａＩ制限部位により隣接させた。これらの配列をサブクローニングし、ＳＦＧモロニーマウス白血病ウイルスプラスミドの３’ＬＴＲ内の天然のＮｈｅＩ／ＸｈｏＩ配列を置き換えた。３’ＬＴＲの特異的な改変は、制限酵素部位および各々のＨＲＥカセットに対する相補的配列を含有するプライマーを使用して達成された、ＨＲＥを含有するＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩ隣接中間断片の合成により達成した。断片のオーバーラップＰＣＲおよびサブクローニングによりＳＦＧベクターへの挿入を達成した。次に、Ｐ２Ａにより分離されたクリックビートルルシフェラーゼの緑色発光バリアントおよび緑色蛍光タンパク質をコードするタンパク質コーディング配列をＳＦＧのＮｃｏＩ／ＸｈｏＩ部位にクローニングした。Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂから購入した酵素および緩衝液を使用して制限消化を３７℃で行った。臭化エチジウム染色１．２％アガロースゲル中でＤＮＡを検出し、ＤＮＡラダーにしたがって評価されるような適切なサイズのバンドを切除し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してゲルから抽出した。付着末端ライゲーションは、１６℃で１時間のＴ４ ＤＮＡリガーゼ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により触媒された。
【0229】
ＣＡＲ／レポーター構築物のクローニング
ヒトＴ１Ｅ ＣＡＲ含有ＳＦＧレトロウイルスベクターを改変して、この研究において利用する構築物を生成させた。ヒトＨＩＦ１αからのアミノ酸４０１～６０３（配列番号２９）をコードする全長ＯＤＤ ｃＤＮＡはｇＢｌｏｃｋ（登録商標）（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）として合成され、プライマー；５’－ＴＣＣＡＧＣＧＧＣＴＧＧＧＧＣＧＣＧＡＧＧＧＧＧＣＡＧＧＧＣＣ－３’および５’－ＧＧＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＴＣＧＣＧＣＣＣＣＡＧＣＣＧＣＴＧＧＡ－３’を用いて生産者の使用説明書にしたがってＰｌａｔｉｎｕｍ Ｐｆｘ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してオーバーラップＰＣＲを通じてＴ１Ｅ ＣＡＲ内のＣＤ３ζのＣ末端にこれを付加した。ＰＣＲ生成物を１．２％アガロース（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）ゲルに流し、１ｋｂ Ｐｌｕｓ ＤＮＡ ｌａｄｄｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に対して生成物サイズを推定した。予期されるサイズの断片を切除し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標） Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔを使用して精製した。ＳＦＧプラスミド中のおよびＴ１Ｅ ＣＡＲ－ＯＤＤ ｃＤＮＡに組み込まれたＡｇｅＩおよびＸｈｏＩ制限酵素部位を切断するためにＡｇｅＩおよびＸｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を使用してＴ１Ｅ ＣＡＲ－ＯＤＤをＳＦＧベクターにクローニングした。制限エンドヌクレアーゼ消化されたベクターおよび構築物をＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＱＩＧＥＮ）を使用して精製し、Ｔ４リガーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してライゲートした後にＯｎｅ Ｓｈｏｔ Ｓｔｂｌ３（商標）ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）への形質転換を行った。形質転換されたＥ．ｃｏｌｉを、アンピシリン（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）含有Ｌｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）Ａｇａｒ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）プレートを使用して選択した。形質転換されたコロニーをそこで１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢブロス（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）中で生育し、次にＱＩＡＧＥＮ Ｐｌａｓｍｉｄ ＭｉｄｉまたはＭａｘｉのいずれかのキットを使用して精製した。最終構築物の配列の検証を行った（Ｓｏｕｒｃｅ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ）。類似したアプローチを使用して、以下の追加の改変を行った：ウイルスＰ２Ａ配列により分離されたクリックビートルルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）およびｅＧＦＰを使用して構成的レポーター構築物を生成し、レポーター構築物は研究室において以前に生成してあった。これは、フォワードプライマー５’－ＣＣＡＴＧＧＴＧＡＡＧＣＧＴＧＡＧＡＡＡＡＡＴＧ－３’およびリバースプライマー５’－ＣＴＣＧＡＧＴＴＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴＧＣ－３’を用いて生産者のプロトコールにしたがってＰｌａｔｉｎｕｍ Ｐｆｘ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してＰＣＲ増幅により達成された。ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を用いて増幅生成物を消化し、ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩならびにＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してＳＦＧベクターにクローニングした。（上記のような）全長ＯＤＤをまた、プライマー：フォワード５’－ＧＡＧＡＡＧＧＣＣＧＧＣＧＧＴＧＣＣＣＣＡＧＣＣＧＣＴＧＧＡ－３’およびリバース５’－ＣＣＴＣＡＡＡＧＣＡＣＡＧＴＴＡＣＡＧＴＡＴＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＣＧＧＡＧＣＴＡＣＴＡＡＣＴＴＣＡＧ－３’を使用してオーバーラップＰＣＲによりレポーター構築物からのＬｕｃのＣ末端に付加して、相補的（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ）オーバーハングに隣接されたＯＤＤを増幅した。その後に、プライマー：フォワード５’－ＣＣＡＴＧＧＴＧＡＡＧＣＧＴＧＡＧＡＡＡＡＡＴＧ－３’およびリバース５’－ＣＴＣＧＡＧＴＴＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴＧＣ－３’を使用してオーバーラッピングフュージョンＰＣＲを行って、ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩ制限部位により隣接されるルシフェラーゼ－ＯＤＤ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰをコードする断片を生成させ、ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩ制限部位を使用してルシフェラーゼ－ＯＤＤ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰをＳＦＧベクターに挿入した。３’ＬＴＲ領域は組み込みで５’ＬＴＲにコピーされるので、ＨＲＥ改変をＳＦＧレトロウイルスベクターの３’ＬＴＲに標的化した。ＨＩＦ結合部位および補助部位の両方を含有する９つのタンデムの５’－ＧＧＣＣＣＴＡＣＧＴＧＣＴＧＴＣＴＣＡＣＡＣＡＧＣＣＴＧＴＣＴＧＡＣ－３’ＨＲＥモチーフを含有するＤＮＡをｇＢｌｏｃｋ（登録商標）（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）として合成し、ＮｈｅＩおよびＸｂａ１制限エンドヌクレアーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を使用してＮｈｅＩおよびＸｂａＩ制限エンドヌクレアーゼ部位の間でＳＦＧベクターの３’ＬＴＲにサブクローニングした。Ｔ１Ｅ ＣＡＲ ＣＤ３－切断対照構築物を、隣接するＳｂｆＩおよびＸｈｏＩ制限部位と共にｇＢｌｏｃｋ（登録商標）（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）として合成し、ＳｂｆＩおよびＸｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を使用してＨＲＥ改変ＳＦＧベクターにサブクローニングした。２シストロン性ルシフェラーゼ－Ｔ２Ａ－ＣＡＲ構築物を生成させるために、ＡｇｅＩおよびＮｏｔＩ制限部位に隣接されたルシフェラーゼ－Ｔ２Ａ－Ｔ１Ｅペプチド結合剤を含むように設計されたｇＢｌｏｃｋ（登録商標）（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をＴ１Ｅ ＣＡＲ構築物に挿入した。
ヒトＴ１Ｅ ＣＡＲ含有ＳＦＧレトロウイルスベクターを改変して、この研究において利用する構築物を生成させた。ヒトＨＩＦ１αからのアミノ酸４０１～６０３（配列番号２９）をコードする全長ＯＤＤ ｃＤＮＡはｇＢｌｏｃｋ（登録商標）（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）として合成され、プライマー；５’－ＴＣＣＡＧＣＧＧＣＴＧＧＧＧＣＧＣＧＡＧＧＧＧＧＣＡＧＧＧＣＣ－３’および５’－ＧＧＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＴＣＧＣＧＣＣＣＣＡＧＣＣＧＣＴＧＧＡ－３’を用いて生産者の使用説明書にしたがってＰｌａｔｉｎｕｍ Ｐｆｘ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してオーバーラップＰＣＲを通じてＴ１Ｅ ＣＡＲ内のＣＤ３ζのＣ末端にこれを付加した。ＰＣＲ生成物を１．２％アガロース（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）ゲルに流し、１ｋｂ Ｐｌｕｓ ＤＮＡ ｌａｄｄｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に対して生成物サイズを推定した。予期されるサイズの断片を切除し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標） Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔを使用して精製した。ＳＦＧプラスミド中のおよびＴ１Ｅ ＣＡＲ－ＯＤＤ ｃＤＮＡに組み込まれたＡｇｅＩおよびＸｈｏＩ制限酵素部位を切断するためにＡｇｅＩおよびＸｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を使用してＴ１Ｅ ＣＡＲ－ＯＤＤをＳＦＧベクターにクローニングした。制限エンドヌクレアーゼ消化されたベクターおよび構築物をＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＱＩＧＥＮ）を使用して精製し、Ｔ４リガーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してライゲートした後にＯｎｅ Ｓｈｏｔ Ｓｔｂｌ３（商標）ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）への形質転換を行った。形質転換されたＥ．ｃｏｌｉを、アンピシリン（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）含有Ｌｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）Ａｇａｒ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）プレートを使用して選択した。形質転換されたコロニーをそこで１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢブロス（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）中で生育し、次にＱＩＡＧＥＮ Ｐｌａｓｍｉｄ ＭｉｄｉまたはＭａｘｉのいずれかのキットを使用して精製した。最終構築物の配列の検証を行った（Ｓｏｕｒｃｅ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ）。類似したアプローチを使用して、以下の追加の改変を行った：ウイルスＰ２Ａ配列により分離されたクリックビートルルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）およびｅＧＦＰを使用して構成的レポーター構築物を生成し、レポーター構築物は研究室において以前に生成してあった。これは、フォワードプライマー５’－ＣＣＡＴＧＧＴＧＡＡＧＣＧＴＧＡＧＡＡＡＡＡＴＧ－３’およびリバースプライマー５’－ＣＴＣＧＡＧＴＴＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴＧＣ－３’を用いて生産者のプロトコールにしたがってＰｌａｔｉｎｕｍ Ｐｆｘ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してＰＣＲ増幅により達成された。ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を用いて増幅生成物を消化し、ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩならびにＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してＳＦＧベクターにクローニングした。（上記のような）全長ＯＤＤをまた、プライマー：フォワード５’－ＧＡＧＡＡＧＧＣＣＧＧＣＧＧＴＧＣＣＣＣＡＧＣＣＧＣＴＧＧＡ－３’およびリバース５’－ＣＣＴＣＡＡＡＧＣＡＣＡＧＴＴＡＣＡＧＴＡＴＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＣＧＧＡＧＣＴＡＣＴＡＡＣＴＴＣＡＧ－３’を使用してオーバーラップＰＣＲによりレポーター構築物からのＬｕｃのＣ末端に付加して、相補的（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ）オーバーハングに隣接されたＯＤＤを増幅した。その後に、プライマー：フォワード５’－ＣＣＡＴＧＧＴＧＡＡＧＣＧＴＧＡＧＡＡＡＡＡＴＧ－３’およびリバース５’－ＣＴＣＧＡＧＴＴＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴＧＣ－３’を使用してオーバーラッピングフュージョンＰＣＲを行って、ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩ制限部位により隣接されるルシフェラーゼ－ＯＤＤ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰをコードする断片を生成させ、ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩ制限部位を使用してルシフェラーゼ－ＯＤＤ－Ｐ２Ａ－ｅＧＦＰをＳＦＧベクターに挿入した。３’ＬＴＲ領域は組み込みで５’ＬＴＲにコピーされるので、ＨＲＥ改変をＳＦＧレトロウイルスベクターの３’ＬＴＲに標的化した。ＨＩＦ結合部位および補助部位の両方を含有する９つのタンデムの５’－ＧＧＣＣＣＴＡＣＧＴＧＣＴＧＴＣＴＣＡＣＡＣＡＧＣＣＴＧＴＣＴＧＡＣ－３’ＨＲＥモチーフを含有するＤＮＡをｇＢｌｏｃｋ（登録商標）（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）として合成し、ＮｈｅＩおよびＸｂａ１制限エンドヌクレアーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を使用してＮｈｅＩおよびＸｂａＩ制限エンドヌクレアーゼ部位の間でＳＦＧベクターの３’ＬＴＲにサブクローニングした。Ｔ１Ｅ ＣＡＲ ＣＤ３－切断対照構築物を、隣接するＳｂｆＩおよびＸｈｏＩ制限部位と共にｇＢｌｏｃｋ（登録商標）（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）として合成し、ＳｂｆＩおよびＸｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を使用してＨＲＥ改変ＳＦＧベクターにサブクローニングした。２シストロン性ルシフェラーゼ－Ｔ２Ａ－ＣＡＲ構築物を生成させるために、ＡｇｅＩおよびＮｏｔＩ制限部位に隣接されたルシフェラーゼ－Ｔ２Ａ－Ｔ１Ｅペプチド結合剤を含むように設計されたｇＢｌｏｃｋ（登録商標）（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をＴ１Ｅ ＣＡＲ構築物に挿入した。
【0230】
細菌形質転換
Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ Ｓｔｂｌ３ Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を形質転換のために使用した。氷上で解凍したＯｎｅ Ｓｈｏｔ Ｓｔｂｌ３細胞のバイアルに５μｌのライゲーション混合物を加えた。細胞をその後に氷上で３０分間インキュベートした。次に、細胞を熱ショック（４５秒、４２℃）し、氷上に２分間置き、次に２５０μｌのＳ．Ｏ．Ｃ．Ｍｅｄｉａを加え、３７℃の細菌シェーカー中でバイアルをインキュベートした。細胞をアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）寒天プレート上に広げ、加湿された細菌インキュベーター中３７℃で終夜インキュベートした。コロニーを摘み取り、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する３ｍｌのＬＢブロス中で生育させた。生産者のプロトコールにしたがってＱＩＡｐｒｅｐ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＤＮＡを細菌から抽出した。２８０ｎｍでｎａｎｏｄｒｏｐ分光光度計によりＤＮＡを定量化し、Ｓｏｕｒｃｅ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅによりシークエンシングした。ＳｎａｐＧｅｎｅソフトウェアをシークエンシングアライメントおよび検証のために使用した。
Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ Ｓｔｂｌ３ Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を形質転換のために使用した。氷上で解凍したＯｎｅ Ｓｈｏｔ Ｓｔｂｌ３細胞のバイアルに５μｌのライゲーション混合物を加えた。細胞をその後に氷上で３０分間インキュベートした。次に、細胞を熱ショック（４５秒、４２℃）し、氷上に２分間置き、次に２５０μｌのＳ．Ｏ．Ｃ．Ｍｅｄｉａを加え、３７℃の細菌シェーカー中でバイアルをインキュベートした。細胞をアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）寒天プレート上に広げ、加湿された細菌インキュベーター中３７℃で終夜インキュベートした。コロニーを摘み取り、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する３ｍｌのＬＢブロス中で生育させた。生産者のプロトコールにしたがってＱＩＡｐｒｅｐ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＤＮＡを細菌から抽出した。２８０ｎｍでｎａｎｏｄｒｏｐ分光光度計によりＤＮＡを定量化し、Ｓｏｕｒｃｅ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅによりシークエンシングした。ＳｎａｐＧｅｎｅソフトウェアをシークエンシングアライメントおよび検証のために使用した。
【0231】
細胞系
全ての細胞系は加湿インキュベーター中３７℃および５％のＣＯ２で生育させた。ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３、Ｐｈｏｅｎｉｘ－ＥＣＯ（Ｓａｎｄｒａ Ｄｉｅｂｏｌｄからの供与）、ヒト線維肉腫細胞系ＨＴ１０８０、ＢＷ５１４７．Ｇ．１．４（ＡＴＣＣから購入）、Ｊｕｒｋａｔ（Ｃｌｏｎｅ Ｅ６－１）（ＡＴＣＣ）を、１０％の胎仔ウシ血清（ＦＣＳ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を補足したＲＰＭＩ １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）中で維持した。１０％のＦＣＳおよびインスリン（０．２Ｕ／ｍｌ）を補足したＲＰＭＩ １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）中でＴ４７Ｄ細胞を維持した。
全ての細胞系は加湿インキュベーター中３７℃および５％のＣＯ２で生育させた。ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３、Ｐｈｏｅｎｉｘ－ＥＣＯ（Ｓａｎｄｒａ Ｄｉｅｂｏｌｄからの供与）、ヒト線維肉腫細胞系ＨＴ１０８０、ＢＷ５１４７．Ｇ．１．４（ＡＴＣＣから購入）、Ｊｕｒｋａｔ（Ｃｌｏｎｅ Ｅ６－１）（ＡＴＣＣ）を、１０％の胎仔ウシ血清（ＦＣＳ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を補足したＲＰＭＩ １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）中で維持した。１０％のＦＣＳおよびインスリン（０．２Ｕ／ｍｌ）を補足したＲＰＭＩ １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）中でＴ４７Ｄ細胞を維持した。
【0232】
ＳＫＯＶ３ヒト卵巣腺癌細胞は元々ＡＴＣＣから購入し、この研究のためにＡＴＣＣにより再立証された。ＨＮ３ヒト頭頸部腺癌はＬｕｄｗｉｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｌｏｎｄｏｎから入手し、Ｄ１０培地、１０％のＦＣＳおよびＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を補足したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｇｉｂｃｏ）中で生育させた。マウスルイス肺癌（ＬＬ２）細胞はＡＴＣＣから購入し、１０％のＦＣＳを補足したＲＰＭＩ １６４０中で培養した。ＭｙｃｏＡｌｅｒｔ（登録商標） Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｌｏｎｚａ）を使用してこの研究のために細胞系はマイコプラズマを含まないことを確認した。
【0233】
マウス
ＮＳＧ（ＮＯＤ－ｓｃｉｄ ＩＬ２Ｒｇａｍｍａｎｕｌｌ）マウスはＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒから購入し、内部で飼育した。Ｂａｌｂ／ｃ Ｒａｇ２－／－マウスはＰｒｏｆｅｓｓｏｒ Ａｄｒｉａｎ Ｈａｙｄａｙ（ＫＣＬ）から供与された。ＨＮ３を伴う研究のために雄マウスを使用し、ＳＫＯＶ３およびＬＬ２研究を伴う研究のために雌マウスを使用した。異所性腫瘍研究のために使用した全てのマウスは６～８週齢であり、約２２ｇの体重であった。
ＮＳＧ（ＮＯＤ－ｓｃｉｄ ＩＬ２Ｒｇａｍｍａｎｕｌｌ）マウスはＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒから購入し、内部で飼育した。Ｂａｌｂ／ｃ Ｒａｇ２－／－マウスはＰｒｏｆｅｓｓｏｒ Ａｄｒｉａｎ Ｈａｙｄａｙ（ＫＣＬ）から供与された。ＨＮ３を伴う研究のために雄マウスを使用し、ＳＫＯＶ３およびＬＬ２研究を伴う研究のために雌マウスを使用した。異所性腫瘍研究のために使用した全てのマウスは６～８週齢であり、約２２ｇの体重であった。
【0234】
レトロウイルスの生成
ヒト細胞に対するトロピズムを有するレトロウイルスを製造するために、ＦｕＧＥＮＥ ＨＤトランスフェクション試薬を使用して５０％～６０％コンフルエントＨＥＫ ２９３Ｔ細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳ）への（６ウェルプレートのウェル当たり）１．５μｇのＰｅｑ－Ｐａｍプラスミド（Ｍｏｌｏｎｅｙ ＧａｇＰｏｌ）、１μｇのＲＤＦプラスミド（ＲＤ１１４ ｅｎｖｅｌｏｐｅ）および１．５μｇのＳＦＧプラスミドを使用する三重トランスフェクションによりＲＤ１１４シュードタイプ一過性レトロウイルス粒子を生成させた。Ｐｅｑ－Ｐａｍ、ＲＤＦおよびＳＦＧプラスミドを単純なＲＰＭＩ １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）中室温（ＲＴ）で１５分間インキュベートし、次に２９３Ｔ細胞に滴下で加えた。レトロウイルス含有上清を４８時間後に回収し、ヒト細胞系への形質導入のために使用した。
ヒト細胞に対するトロピズムを有するレトロウイルスを製造するために、ＦｕＧＥＮＥ ＨＤトランスフェクション試薬を使用して５０％～６０％コンフルエントＨＥＫ ２９３Ｔ細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳ）への（６ウェルプレートのウェル当たり）１．５μｇのＰｅｑ－Ｐａｍプラスミド（Ｍｏｌｏｎｅｙ ＧａｇＰｏｌ）、１μｇのＲＤＦプラスミド（ＲＤ１１４ ｅｎｖｅｌｏｐｅ）および１．５μｇのＳＦＧプラスミドを使用する三重トランスフェクションによりＲＤ１１４シュードタイプ一過性レトロウイルス粒子を生成させた。Ｐｅｑ－Ｐａｍ、ＲＤＦおよびＳＦＧプラスミドを単純なＲＰＭＩ １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）中室温（ＲＴ）で１５分間インキュベートし、次に２９３Ｔ細胞に滴下で加えた。レトロウイルス含有上清を４８時間後に回収し、ヒト細胞系への形質導入のために使用した。
【0235】
低酸素条件
低酸素チャンバーはＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｎａｄａ）から購入し、一定の５％のＣＯ２と共に残余としてＮ２を使用して０．１％、１％または５％のＯ２を含有するＢＯＣにより供給される認証されたガスを用いてパージした。生産者のプロトコールにしたがって１回目のパージの１時間後にチャンバーを再パージした。等数の細胞を２つの並列プレートにプレーティングし、１８時間、１つは低酸素条件に曝露し、他方は正常酸素に維持した。Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｆｕｓｉｏｎ α－ＦＰプレートリーダー（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で生産者のプロトコールにしたがってルシフェラーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳ）を使用してルシフェラーゼ活性を次に測定した。低酸素応答性遺伝子発現を評価するためのインキュベーション時間は公知の研究に基づいた。低酸素条件もまた、１００μＭの最終濃度で塩化コバルト（ＩＩ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳ）（ＰＨＤ阻害剤）を使用して模倣した。
低酸素チャンバーはＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｎａｄａ）から購入し、一定の５％のＣＯ２と共に残余としてＮ２を使用して０．１％、１％または５％のＯ２を含有するＢＯＣにより供給される認証されたガスを用いてパージした。生産者のプロトコールにしたがって１回目のパージの１時間後にチャンバーを再パージした。等数の細胞を２つの並列プレートにプレーティングし、１８時間、１つは低酸素条件に曝露し、他方は正常酸素に維持した。Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｆｕｓｉｏｎ α－ＦＰプレートリーダー（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で生産者のプロトコールにしたがってルシフェラーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳ）を使用してルシフェラーゼ活性を次に測定した。低酸素応答性遺伝子発現を評価するためのインキュベーション時間は公知の研究に基づいた。低酸素条件もまた、１００μＭの最終濃度で塩化コバルト（ＩＩ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳ）（ＰＨＤ阻害剤）を使用して模倣した。
【0236】
ウエスタンブロット解析
１倍濃度のプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含有するウエスタン溶解緩衝液（２．５ｍｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ ６．８、１ｇのＳＤＳ、５ｍｌのグリセロール、１７．５ｍｌの水）に細胞を溶解させた。Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して細胞溶解液中の総タンパク質を定量化した。ＳｅｅＢｌｕｅ ｐｒｅ－ｓｔａｉｎｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌａｄｄｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と共に各溶解液からの１０ｕｇのタンパク質を１５０Ｖで１２％のドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ ＰＡＧＥ）を使用して分離させ、３０Ｖで２時間、活性化ＰＶＤＦニトロセルロース膜（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｉｅｒｃｅ）に転写させた。膜をＲＴで１ｈ、ＰＢＳ ０．１％ Ｔｗｅｅｎ－２０中の１％のミルクを用いてブロッキングし、次に１％のミルク中のウサギ抗ＨＩＦ１α抗体（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ、ＣＯ）（１：２０００）と４℃で終夜、またはポリクローナル抗β－アクチン（１：５０００；Ａｂｃａｍ）とインキュベートした。洗浄後、１％のミルク中の二次抗ウサギホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（１：５０００；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と膜をインキュベートした。次に、ＨＲＰ基質３，３’，５，５’テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）をＰＶＤＦ膜に加え、ＣＬ－ＸＰｏｓｕｒｅ Ｆｉｌｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびウエスタンブロットＸ線分析機を使用してシグナルを読み取った。
１倍濃度のプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含有するウエスタン溶解緩衝液（２．５ｍｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ ６．８、１ｇのＳＤＳ、５ｍｌのグリセロール、１７．５ｍｌの水）に細胞を溶解させた。Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して細胞溶解液中の総タンパク質を定量化した。ＳｅｅＢｌｕｅ ｐｒｅ－ｓｔａｉｎｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌａｄｄｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と共に各溶解液からの１０ｕｇのタンパク質を１５０Ｖで１２％のドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ ＰＡＧＥ）を使用して分離させ、３０Ｖで２時間、活性化ＰＶＤＦニトロセルロース膜（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｉｅｒｃｅ）に転写させた。膜をＲＴで１ｈ、ＰＢＳ ０．１％ Ｔｗｅｅｎ－２０中の１％のミルクを用いてブロッキングし、次に１％のミルク中のウサギ抗ＨＩＦ１α抗体（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ、ＣＯ）（１：２０００）と４℃で終夜、またはポリクローナル抗β－アクチン（１：５０００；Ａｂｃａｍ）とインキュベートした。洗浄後、１％のミルク中の二次抗ウサギホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（１：５０００；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と膜をインキュベートした。次に、ＨＲＰ基質３，３’，５，５’テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）をＰＶＤＦ膜に加え、ＣＬ－ＸＰｏｓｕｒｅ Ｆｉｌｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびウエスタンブロットＸ線分析機を使用してシグナルを読み取った。
【0237】
定量ＰＣＲ
生産者のプロトコールにしたがってＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してゲノムＤＮＡを細胞系から抽出し、２８０ｎｍの吸光度でｎａｎｏｄｒｏｐ分光光度計を用いて測定した。ゲノム中のＴｂｐ、ＬｕｃまたはＴ２Ａ配列からアンプリコンを生成させるための特別に設計されたプライマーを使用して生産者のプロトコールにしたがってＫｉＣｑＳｔａｒｔ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲ ＲｅａｄｙＭｉｘ ｗｉｔｈ ＲＯＸ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳから購入）を使用してｑＰＣＲを行った。使用したプライマーは、マウスＴｂｐ ５’－ＴＧＴＣＴＧＴＣＧＣＡＧＴＡＡＧＡＡＴＧＧＡ－３’および５’－ＡＡＡＡＴＣＣＣＡＧＡＣＡＣＧＧＴＧＧＧ－３’、ヒトＴｂｐ ５’－ＴＴＴＧＧＴＧＴＴＴＧＣＴＴＣＡＧＴＣＡＧ－３’および５’－ＡＴＡＣＣＴＡＧＡＡＡＡＣＡＧＧＡＧＴＴＧＣＴＣＡ－３’、Ｌｕｃ ５’－ＡＴＴＴＧＡＣＴＧＣＣＧＧＣＧＡＡＡＴＧ－３’および５’－ＡＡＧＡＴＴＣＡＴＣＧＣＣＧＡＣＣＡＣＡＴ－３’、Ｔ２Ａ ５’－ＣＧＧＡＧＡＡＡＧＣＧＣＡＧＣ－３’および５’－ ＧＧＧＴＣＣＧＧＧＧＴＴＣＴＣＴＴ－３’であった。関心対象の遺伝子の増幅をＡＢＩ ７９００ＨＴ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ機器（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上で検出した。
生産者のプロトコールにしたがってＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してゲノムＤＮＡを細胞系から抽出し、２８０ｎｍの吸光度でｎａｎｏｄｒｏｐ分光光度計を用いて測定した。ゲノム中のＴｂｐ、ＬｕｃまたはＴ２Ａ配列からアンプリコンを生成させるための特別に設計されたプライマーを使用して生産者のプロトコールにしたがってＫｉＣｑＳｔａｒｔ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲ ＲｅａｄｙＭｉｘ ｗｉｔｈ ＲＯＸ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳから購入）を使用してｑＰＣＲを行った。使用したプライマーは、マウスＴｂｐ ５’－ＴＧＴＣＴＧＴＣＧＣＡＧＴＡＡＧＡＡＴＧＧＡ－３’および５’－ＡＡＡＡＴＣＣＣＡＧＡＣＡＣＧＧＴＧＧＧ－３’、ヒトＴｂｐ ５’－ＴＴＴＧＧＴＧＴＴＴＧＣＴＴＣＡＧＴＣＡＧ－３’および５’－ＡＴＡＣＣＴＡＧＡＡＡＡＣＡＧＧＡＧＴＴＧＣＴＣＡ－３’、Ｌｕｃ ５’－ＡＴＴＴＧＡＣＴＧＣＣＧＧＣＧＡＡＡＴＧ－３’および５’－ＡＡＧＡＴＴＣＡＴＣＧＣＣＧＡＣＣＡＣＡＴ－３’、Ｔ２Ａ ５’－ＣＧＧＡＧＡＡＡＧＣＧＣＡＧＣ－３’および５’－ ＧＧＧＴＣＣＧＧＧＧＴＴＣＴＣＴＴ－３’であった。関心対象の遺伝子の増幅をＡＢＩ ７９００ＨＴ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ機器（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上で検出した。
【0238】
定量的逆転写ＰＣＲ
健常な雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスを屠殺し、以下の臓器を抽出した：乳腺、脂肪、肝臓、腎臓、結腸、小腸、胃、骨格筋、肺、心臓、脳、嗅球および目（ｎ＝１３）。臓器をＲＮＡｌａｔｅｒ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳ）試薬に浸して細胞性ＲＮＡを安定化および保護し、終夜４℃に保った。生産者のプロトコールにしたがってＰｒｅｐＥａｓｅ ＲＮＡ Ｓｐｉｎ Ｋｉｔ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、ＵＳ）を使用してＲＮＡを組織から単離し、２８０ｎｍでＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計を使用して定量化した。Ｅｇｆｒ Ｍｍ０１１８７８５８＿ｍ１、Ｅｒｂｂ２ Ｍｍ００６５８５４１＿ｍ１ Ｅｒｂｂ３ Ｍｍ０１１５９９９９＿ｍ１、Ｅｒｂｂ４ Ｍｍ０１２５６７９３＿ｍ１、Ｉｔｇｂ６ Ｍｍ０１２６９８６９＿ｍ１、Ｔｂｐ Ｍｍ０１２７７０４２＿ｍ１を含む関心対象の遺伝子についての要求に応じたアッセイと共に、ＥＸＰＲＥＳＳ Ｏｎｅ－ｓｔｅｐ Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ｑＲＴ－ＰＣＲ ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して定量的逆転写酵素ＰＣＲにより精製されたｍＲＮＡにおいてＥｒｂｂ１－４およびインテグリンβ－６ ｍＲＮＡ発現を分析した。ＡＢＩ ７９００ＨＴ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ機器（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してｑＲＴ ＰＣＲを行い、データ解析をＥｘｃｅｌで行った。ＲＮＡを－８０℃で貯蔵した。全ての遺伝子の発現は、ハウスキーピング遺伝子Ｔａｔａ結合タンパク質（Ｔｂｐ）と比べて表される。
健常な雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスを屠殺し、以下の臓器を抽出した：乳腺、脂肪、肝臓、腎臓、結腸、小腸、胃、骨格筋、肺、心臓、脳、嗅球および目（ｎ＝１３）。臓器をＲＮＡｌａｔｅｒ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳ）試薬に浸して細胞性ＲＮＡを安定化および保護し、終夜４℃に保った。生産者のプロトコールにしたがってＰｒｅｐＥａｓｅ ＲＮＡ Ｓｐｉｎ Ｋｉｔ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、ＵＳ）を使用してＲＮＡを組織から単離し、２８０ｎｍでＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計を使用して定量化した。Ｅｇｆｒ Ｍｍ０１１８７８５８＿ｍ１、Ｅｒｂｂ２ Ｍｍ００６５８５４１＿ｍ１ Ｅｒｂｂ３ Ｍｍ０１１５９９９９＿ｍ１、Ｅｒｂｂ４ Ｍｍ０１２５６７９３＿ｍ１、Ｉｔｇｂ６ Ｍｍ０１２６９８６９＿ｍ１、Ｔｂｐ Ｍｍ０１２７７０４２＿ｍ１を含む関心対象の遺伝子についての要求に応じたアッセイと共に、ＥＸＰＲＥＳＳ Ｏｎｅ－ｓｔｅｐ Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ｑＲＴ－ＰＣＲ ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して定量的逆転写酵素ＰＣＲにより精製されたｍＲＮＡにおいてＥｒｂｂ１－４およびインテグリンβ－６ ｍＲＮＡ発現を分析した。ＡＢＩ ７９００ＨＴ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ機器（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してｑＲＴ ＰＣＲを行い、データ解析をＥｘｃｅｌで行った。ＲＮＡを－８０℃で貯蔵した。全ての遺伝子の発現は、ハウスキーピング遺伝子Ｔａｔａ結合タンパク質（Ｔｂｐ）と比べて表される。
【0239】
【0240】
細胞生存
冷ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ）を用いて細胞を２回洗浄し、ＰＥ Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中に供給される１Ｘ結合緩衝液に再懸濁した。細胞を次にＰＥ Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔのプロトコール（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にしたがって暗所中ＲＴで１５分間ＰＥアネキシンＶおよび７－アミノ－アクチノマイシン（７－ＡＡＤ）を用いて染色し、洗浄し、１Ｘ結合緩衝液に再懸濁し、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩ Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により分析した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用してフローデータを分析した。ＰＥアネキシンＶおよび７－ＡＡＤ陰性細胞を生存と考え、ＰＥアネキシンＶ陽性および７－ＡＡＤ陰性細胞を早期アポトーシスとし、ＰＥアネキシンＶおよび７－ＡＡＤ陽性細胞を後期アポトーシスまたは死亡とする。
冷ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ）を用いて細胞を２回洗浄し、ＰＥ Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中に供給される１Ｘ結合緩衝液に再懸濁した。細胞を次にＰＥ Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔのプロトコール（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にしたがって暗所中ＲＴで１５分間ＰＥアネキシンＶおよび７－アミノ－アクチノマイシン（７－ＡＡＤ）を用いて染色し、洗浄し、１Ｘ結合緩衝液に再懸濁し、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩ Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により分析した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用してフローデータを分析した。ＰＥアネキシンＶおよび７－ＡＡＤ陰性細胞を生存と考え、ＰＥアネキシンＶ陽性および７－ＡＡＤ陰性細胞を早期アポトーシスとし、ＰＥアネキシンＶおよび７－ＡＡＤ陽性細胞を後期アポトーシスまたは死亡とする。
【0241】
Ｔ細胞単離
ヒトＴ細胞を単離するために、Ｇｕｙ’ｓ ａｎｄ Ｓｔ Ｔｈｏｍａｓ’Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＲＥＣ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ０９／Ｈ０８０４／９２）の承認の下で健常ボランティアから血液を得た。抗凝固剤（１０％のクエン酸塩）を含有するファルコンチューブに血液を収集し、ＲＰＭＩ １６４０と１：１で混合し、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で層化した。試料を２０℃において７５０ｇで３０分間遠心分離して、末梢血単核（ＰＢＭＣ）細胞画分を分離した。ＰＢＭＣを含有する血漿およびＦｉｃｏｌｌ層の間の境界面を無菌パスツールピペットを使用して回収し、ＲＰＭＩ １６４０中で洗浄した。ｈｕｍａｎ Ｐａｎ Ｔ－ｃｅｌｌ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用してＴ細胞をＰＢＭＣ画分から精製し、生産者のプロトコールにしたがってＭｉｄｉＭＡＣｓ（商標）セパレーターおよびＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して単離した。ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｈｕｍａｎ Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｇｉｂｃｏ）を１：１の細胞対ビーズ比で使用して、精製されたヒトＴ細胞を活性化させ、組織培養プレート中、５％のヒト血清（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）および１Ｘペニシリン／ストレプトマイシンを補足したＲＰＭＩ １６４０中に３×１０６で播種した。翌日、１００ＩＵ／ｍｌの組換えヒトＩＬ－２（ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ）を培養物に加えた。
ヒトＴ細胞を単離するために、Ｇｕｙ’ｓ ａｎｄ Ｓｔ Ｔｈｏｍａｓ’Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＲＥＣ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ０９／Ｈ０８０４／９２）の承認の下で健常ボランティアから血液を得た。抗凝固剤（１０％のクエン酸塩）を含有するファルコンチューブに血液を収集し、ＲＰＭＩ １６４０と１：１で混合し、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で層化した。試料を２０℃において７５０ｇで３０分間遠心分離して、末梢血単核（ＰＢＭＣ）細胞画分を分離した。ＰＢＭＣを含有する血漿およびＦｉｃｏｌｌ層の間の境界面を無菌パスツールピペットを使用して回収し、ＲＰＭＩ １６４０中で洗浄した。ｈｕｍａｎ Ｐａｎ Ｔ－ｃｅｌｌ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用してＴ細胞をＰＢＭＣ画分から精製し、生産者のプロトコールにしたがってＭｉｄｉＭＡＣｓ（商標）セパレーターおよびＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して単離した。ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｈｕｍａｎ Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｇｉｂｃｏ）を１：１の細胞対ビーズ比で使用して、精製されたヒトＴ細胞を活性化させ、組織培養プレート中、５％のヒト血清（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）および１Ｘペニシリン／ストレプトマイシンを補足したＲＰＭＩ １６４０中に３×１０６で播種した。翌日、１００ＩＵ／ｍｌの組換えヒトＩＬ－２（ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ）を培養物に加えた。
【0242】
Ｔ細胞および細胞系の形質導入
ヒト細胞に対するトロピズムを有するレトロウイルスを製造するために、以前に記載されたようなＨＥＫ ２９３Ｔ細胞の、ＦｕＧＥＮＥ ＨＤ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用し、Ｐｅｑ－Ｐａｍプラスミド（Ｍｏｌｏｎｅｙ ＧａｇＰｏｌ）、ＲＤＦプラスミド（ＲＤ１１４エンベロープ）および関心対象のＳＦＧプラスミドを使用する三重トランスフェクションにより、ＲＤ１１４シュードタイプレトロウイルス粒子を生成した。マウス細胞トロピズムを有するレトロウイルスを製造するために、関連するプラスミドを用いてＦｕＧＥＮＥ ＨＤ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してＰｈｏｅｎｉｘ－ＥＣＯレトロウイルスプロデューサー細胞へのトランスフェクションを行った。ウイルス粒子を含有する上清を回収し、関心対象の細胞と少なくとも４８ｈインキュベートしてそれらに形質導入させた。４℃で終夜４μｇ／ｃｍ２のＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ）を事前コーティングした非組織培養処理プレート中でＴ細胞への形質導入を行った。ヒトＴ細胞のレトロウイルス形質導入の前に、ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｈｕｍａｎ Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｇｉｂｃｏ）を除去し、Ｔ細胞単離のセクションにおいて記載したように新鮮なＩＬ－２を加えた。２シストロン性４αβ－Ｔ２Ａ－ＣＡＲ構築物を用いるＴ細胞形質導入の場合、Ｔ細胞形質導入後に、３０ｎｇ／ｍｌの最終濃度でヒトＩＬ－４（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を培養物に加えて、形質導入されたＴ細胞集団を富化した。ＳＫＯＶ－３およびＨＮ３を含む接着細胞系に、感染効率を増加させるために４μｇ／ｍｌの最終濃度でポリブレン（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ）を含有する培地溶液中、以前に指し示したように製造されたレトロウイルスを用いて形質導入を行った。Ｌｕｃ／ｅＧＦＰを発現するように改変された細胞を、ｅＧＦＰ蛍光に基づくＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用する細胞選別により精製した。
ヒト細胞に対するトロピズムを有するレトロウイルスを製造するために、以前に記載されたようなＨＥＫ ２９３Ｔ細胞の、ＦｕＧＥＮＥ ＨＤ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用し、Ｐｅｑ－Ｐａｍプラスミド（Ｍｏｌｏｎｅｙ ＧａｇＰｏｌ）、ＲＤＦプラスミド（ＲＤ１１４エンベロープ）および関心対象のＳＦＧプラスミドを使用する三重トランスフェクションにより、ＲＤ１１４シュードタイプレトロウイルス粒子を生成した。マウス細胞トロピズムを有するレトロウイルスを製造するために、関連するプラスミドを用いてＦｕＧＥＮＥ ＨＤ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してＰｈｏｅｎｉｘ－ＥＣＯレトロウイルスプロデューサー細胞へのトランスフェクションを行った。ウイルス粒子を含有する上清を回収し、関心対象の細胞と少なくとも４８ｈインキュベートしてそれらに形質導入させた。４℃で終夜４μｇ／ｃｍ２のＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ）を事前コーティングした非組織培養処理プレート中でＴ細胞への形質導入を行った。ヒトＴ細胞のレトロウイルス形質導入の前に、ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｈｕｍａｎ Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｇｉｂｃｏ）を除去し、Ｔ細胞単離のセクションにおいて記載したように新鮮なＩＬ－２を加えた。２シストロン性４αβ－Ｔ２Ａ－ＣＡＲ構築物を用いるＴ細胞形質導入の場合、Ｔ細胞形質導入後に、３０ｎｇ／ｍｌの最終濃度でヒトＩＬ－４（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を培養物に加えて、形質導入されたＴ細胞集団を富化した。ＳＫＯＶ－３およびＨＮ３を含む接着細胞系に、感染効率を増加させるために４μｇ／ｍｌの最終濃度でポリブレン（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ）を含有する培地溶液中、以前に指し示したように製造されたレトロウイルスを用いて形質導入を行った。Ｌｕｃ／ｅＧＦＰを発現するように改変された細胞を、ｅＧＦＰ蛍光に基づくＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用する細胞選別により精製した。
【0243】
インビトロ研究
０．１、１、５％のいずれかのＯ２、５％のＣＯ２および残余として窒素を含有するガス（ＢＯＣ）を用いて２５Ｌ／分で４分間パージした低酸素インキュベーターチャンバー（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してインビトロ低酸素を達成し、その後にチャンバーを密封した。このプロセスを１ｈ後に再び繰り返した。低酸素媒介性ＨＩＦ１α安定化は、一部の場合には、他に記載されなければ１００μＭの最終濃度で、ＨＩＦ１αヒドロキシル化を阻害する化学物質ＣｏＣｌ２（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用することにより模倣した。インビトロ細胞傷害性アッセイで、１×１０４個のＬｕｃ／ｅＧＦＰ発現ＳＫＯＶ３細胞を９６ウェル組織培養プレートに播種し、形質導入または非形質導入Ｔ細胞を、指し示されるエフェクター対標的比でウェルに加えた。共培養物を２４、４８および７２ｈの時点にわたりインキュベートし、標的細胞生存をルシフェラーゼ定量化（正常酸素条件において、１００μｌの培地当たりＰＢＳ中の１μｌの１５ｍｇ／ｍｌのＸｅｎｏＬｉｇｈｔ Ｄ－ルシフェリン（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）の添加後）により決定した。ＦＬＵＯｓｔａｒ Ｏｍｅｇａプレートリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）を使用して発光を定量化した。２４および４８ｈの共培養時点に培地の試料を共培養物から取り、その後にそれぞれＩＬ－２およびＩＦＮγ定量化のために使用した。生産者のプロトコールの通りにＨｕｍａｎ ＩＬ－２ ＥＬＩＳＡ Ｒｅａｄｙ－ＳＥＴ－Ｇｏ！Ｋｉｔ，２ｎｄ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用してＩＬ－２を定量化した。生産者のプロトコールの通りにＨｕｍａｎ ＩＦＮ－ｇａｍｍａ ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（Ｂｉｏ－Ｔｅｃｈｎｅ）を使用してＩＦＮγを定量化した。両方のＥＬＩＳＡにおいて、Ｆｕｓｉｏｎ ａｌｐｈａ－ＦＰ分光光度計（Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ）での４５０ｎｍにおける吸光度測定によりサイトカイン濃度を決定した。
０．１、１、５％のいずれかのＯ２、５％のＣＯ２および残余として窒素を含有するガス（ＢＯＣ）を用いて２５Ｌ／分で４分間パージした低酸素インキュベーターチャンバー（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してインビトロ低酸素を達成し、その後にチャンバーを密封した。このプロセスを１ｈ後に再び繰り返した。低酸素媒介性ＨＩＦ１α安定化は、一部の場合には、他に記載されなければ１００μＭの最終濃度で、ＨＩＦ１αヒドロキシル化を阻害する化学物質ＣｏＣｌ２（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用することにより模倣した。インビトロ細胞傷害性アッセイで、１×１０４個のＬｕｃ／ｅＧＦＰ発現ＳＫＯＶ３細胞を９６ウェル組織培養プレートに播種し、形質導入または非形質導入Ｔ細胞を、指し示されるエフェクター対標的比でウェルに加えた。共培養物を２４、４８および７２ｈの時点にわたりインキュベートし、標的細胞生存をルシフェラーゼ定量化（正常酸素条件において、１００μｌの培地当たりＰＢＳ中の１μｌの１５ｍｇ／ｍｌのＸｅｎｏＬｉｇｈｔ Ｄ－ルシフェリン（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）の添加後）により決定した。ＦＬＵＯｓｔａｒ Ｏｍｅｇａプレートリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）を使用して発光を定量化した。２４および４８ｈの共培養時点に培地の試料を共培養物から取り、その後にそれぞれＩＬ－２およびＩＦＮγ定量化のために使用した。生産者のプロトコールの通りにＨｕｍａｎ ＩＬ－２ ＥＬＩＳＡ Ｒｅａｄｙ－ＳＥＴ－Ｇｏ！Ｋｉｔ，２ｎｄ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用してＩＬ－２を定量化した。生産者のプロトコールの通りにＨｕｍａｎ ＩＦＮ－ｇａｍｍａ ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（Ｂｉｏ－Ｔｅｃｈｎｅ）を使用してＩＦＮγを定量化した。両方のＥＬＩＳＡにおいて、Ｆｕｓｉｏｎ ａｌｐｈａ－ＦＰ分光光度計（Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ）での４５０ｎｍにおける吸光度測定によりサイトカイン濃度を決定した。
【0244】
インビボ研究
６～８週齢の雌（ＳＫＯＶ３およびＬＬ２について）ならびに雄（ＨＮ３について）マウスへの皮下（ｓ．ｃ．）注射により腫瘍細胞系（ＰＢＳ中２．５×１０５個の細胞）を接種した。腫瘍が触知可能となったら、腫瘍の長（Ｌ）および短（Ｓ）寸法のデジタルキャリパー測定を２または３日毎に行った。以下の式：体積＝（Ｓ２×Ｌ）／２を使用して腫瘍体積を確立した。マウスから血液試料をＥＤＴＡコーティングＭｉｃｒｏｖｅｔｔｅ（商標）チューブ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）に採取し、２，０００ｇで５分間のこれらの試料の遠心分離により血漿を抽出した。３０Ｇ針を使用して尾静脈を通じて２００μｌのＰＢＳ中で指し示される用量のＣＡＲ Ｔ細胞を注射した。フローサイトメトリー分析用の腫瘍組織、および他の臓器を、以前に記載されたように酵素消化して単一細胞に解離させた。簡潔に述べれば、外科用メスを使用して組織をミンチし、次にＲＰＭＩ（Ｇｉｂｃｏ）中のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ Ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍからの１ｍｇ／ｍｌのＣｏｌｌａｇｅｎａｓｅ Ｉ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）および０．１ｍｇ／ｍｌのＤｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｓｅ Ｉ（ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ）を用いる３７℃で６０分間のインキュベーションにより単一細胞を解放させた。解離された細胞を次に７０μｍの細胞濾過器に通過させた後にフローサイトメトリー分析のために染色した。トリパンブルー（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）排除と共に血球計を使用して生存細胞を数えた。
６～８週齢の雌（ＳＫＯＶ３およびＬＬ２について）ならびに雄（ＨＮ３について）マウスへの皮下（ｓ．ｃ．）注射により腫瘍細胞系（ＰＢＳ中２．５×１０５個の細胞）を接種した。腫瘍が触知可能となったら、腫瘍の長（Ｌ）および短（Ｓ）寸法のデジタルキャリパー測定を２または３日毎に行った。以下の式：体積＝（Ｓ２×Ｌ）／２を使用して腫瘍体積を確立した。マウスから血液試料をＥＤＴＡコーティングＭｉｃｒｏｖｅｔｔｅ（商標）チューブ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）に採取し、２，０００ｇで５分間のこれらの試料の遠心分離により血漿を抽出した。３０Ｇ針を使用して尾静脈を通じて２００μｌのＰＢＳ中で指し示される用量のＣＡＲ Ｔ細胞を注射した。フローサイトメトリー分析用の腫瘍組織、および他の臓器を、以前に記載されたように酵素消化して単一細胞に解離させた。簡潔に述べれば、外科用メスを使用して組織をミンチし、次にＲＰＭＩ（Ｇｉｂｃｏ）中のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ Ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍからの１ｍｇ／ｍｌのＣｏｌｌａｇｅｎａｓｅ Ｉ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）および０．１ｍｇ／ｍｌのＤｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｓｅ Ｉ（ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ）を用いる３７℃で６０分間のインキュベーションにより単一細胞を解放させた。解離された細胞を次に７０μｍの細胞濾過器に通過させた後にフローサイトメトリー分析のために染色した。トリパンブルー（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）排除と共に血球計を使用して生存細胞を数えた。
【0245】
生物発光イメージング
インビボでルシフェラーゼ体内分布を評価するために、マウスの腹腔内（ｉ．ｐ．）に無菌ＰＢＳ中の２００μｌ（１５ｍｇ／ｍｌ）のＸｅｎｏＬｉｇｈｔ Ｄ－ルシフェリン（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を注射し、１０分後にイメージングを行った。イメージングのために動物を麻酔し、Ｉｎ ｖｉｖｏ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ＩＶＩＳ（登録商標））Ｌｕｍｉｎａ Ｓｅｒｉｅｓ ＩＩＩ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して発光を検出し、Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用してデータを分析した。光をフォトン／秒／単位面積で定量化した。
インビボでルシフェラーゼ体内分布を評価するために、マウスの腹腔内（ｉ．ｐ．）に無菌ＰＢＳ中の２００μｌ（１５ｍｇ／ｍｌ）のＸｅｎｏＬｉｇｈｔ Ｄ－ルシフェリン（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を注射し、１０分後にイメージングを行った。イメージングのために動物を麻酔し、Ｉｎ ｖｉｖｏ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ＩＶＩＳ（登録商標））Ｌｕｍｉｎａ Ｓｅｒｉｅｓ ＩＩＩ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して発光を検出し、Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用してデータを分析した。光をフォトン／秒／単位面積で定量化した。
【0246】
フローサイトメトリー
以前に記載されたようにフローサイトメトリーを行った。以下の抗体をｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入し、他に記載されなければ１μｇ／ｍｌで使用した：ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ３ε Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ４２１（商標）（ＳＫ７；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ（登録商標））、ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ８α Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（ＲＰＡ－Ｔ８）、ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ４ ＰＥ（ＲＰＡ－Ｔ４）、ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ４５ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ５１０（商標）（ＨＩ３０ Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ（登録商標））、ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＣＤ４ ＦＩＴＣ（Ｃｌｏｎｅ：ＲＭ４－５）、ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＣＤ８α ｅＦｌｕｏｒ（登録商標）４５０（Ｃｌｏｎｅ：５３－６．７）、ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＣＤ３ε ＰＥ（Ｃｌｏｎｅ：１４５－２Ｃ１１）、ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＣＤ１６／ＣＤ３２（Ｃｌｏｎｅ：２．４Ｇ２）。蛍光マイナス１染色試料を使用してバックグラウンド染色を確立した。ビオチン化抗ヒトＥＧＦ抗体（Ｂｉｏ－Ｔｅｃｈｎｅ：ＢＡＦ２３６）を用いてＴ１Ｅ ＣＡＲを染色し、ストレプトアビジンＡＰＣを使用して検出した。ｅＧＦＰをそのネイティブな蛍光により検出した。ａｎｔｉ－Ｔｅｒ－１１９ ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５（Ｔｅｒ－１１９；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）と共に１μｇ／ｍｌの７－アミノアクチノマイシンＤ（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）を使用して死細胞および赤血球細胞を排除した。データをＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で収集した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｆｒｅｅｓｔａｒ Ｉｎｃ．）を使用してデータを分析した。
以前に記載されたようにフローサイトメトリーを行った。以下の抗体をｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入し、他に記載されなければ１μｇ／ｍｌで使用した：ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ３ε Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ４２１（商標）（ＳＫ７；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ（登録商標））、ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ８α Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（ＲＰＡ－Ｔ８）、ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ４ ＰＥ（ＲＰＡ－Ｔ４）、ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ４５ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ５１０（商標）（ＨＩ３０ Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ（登録商標））、ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＣＤ４ ＦＩＴＣ（Ｃｌｏｎｅ：ＲＭ４－５）、ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＣＤ８α ｅＦｌｕｏｒ（登録商標）４５０（Ｃｌｏｎｅ：５３－６．７）、ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＣＤ３ε ＰＥ（Ｃｌｏｎｅ：１４５－２Ｃ１１）、ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＣＤ１６／ＣＤ３２（Ｃｌｏｎｅ：２．４Ｇ２）。蛍光マイナス１染色試料を使用してバックグラウンド染色を確立した。ビオチン化抗ヒトＥＧＦ抗体（Ｂｉｏ－Ｔｅｃｈｎｅ：ＢＡＦ２３６）を用いてＴ１Ｅ ＣＡＲを染色し、ストレプトアビジンＡＰＣを使用して検出した。ｅＧＦＰをそのネイティブな蛍光により検出した。ａｎｔｉ－Ｔｅｒ－１１９ ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５（Ｔｅｒ－１１９；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）と共に１μｇ／ｍｌの７－アミノアクチノマイシンＤ（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）を使用して死細胞および赤血球細胞を排除した。データをＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で収集した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｆｒｅｅｓｔａｒ Ｉｎｃ．）を使用してデータを分析した。
【0247】
統計
分散の正規性および均質性をそれぞれシャピロ－ウィルク正規性検定およびＦ検定を使用して決定した。次に、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６ソフトウェアを使用して、パラメトリックなデータについて両側の対応のないスチューデントｔ検定またはノンパラメトリックなデータについてマン－ホイットニー検定を使用して統計的有意性を決定した。対になったデータを比較する場合、ペア比スチューデントｔ検定を行った。不等分散の群を比較する場合、ウェルチ補正を適用した。ｓｔａｔｍｏｄソフトウェアパッケージの「ＣｏｍｐａｒｅＧｒｏｗｔｈＣｕｒｖｅｓ」機能を使用して腫瘍成長曲線の統計解析を行った。提示したいかなるデータからも外れ値を排除しなかった。
分散の正規性および均質性をそれぞれシャピロ－ウィルク正規性検定およびＦ検定を使用して決定した。次に、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６ソフトウェアを使用して、パラメトリックなデータについて両側の対応のないスチューデントｔ検定またはノンパラメトリックなデータについてマン－ホイットニー検定を使用して統計的有意性を決定した。対になったデータを比較する場合、ペア比スチューデントｔ検定を行った。不等分散の群を比較する場合、ウェルチ補正を適用した。ｓｔａｔｍｏｄソフトウェアパッケージの「ＣｏｍｐａｒｅＧｒｏｗｔｈＣｕｒｖｅｓ」機能を使用して腫瘍成長曲線の統計解析を行った。提示したいかなるデータからも外れ値を排除しなかった。
【0248】
結果
ＨＲＥの設計
Ｅｎｓｅｍｂｌデータベースから得られたゲノムデータの分析に基づいて、種間および低酸素誘導性遺伝子の間で保存されている推定上のＨＩＦ１結合部位（ＨＢＳ）を同定した。ＨＩＦに結合する６ヌクレオチド（ｎｔ）配列中の各位置における各ヌクレオチドの頻度に基づいてヒト、マウスおよびラットにおける異なる酸素感受性遺伝子からの推定上の６－ｎｔ長ＨＢＳを比較し、ヒトおよびマウスＨＢＳについて配列ロゴを構築した（図４Ａおよび図４Ｂ）。ＨＢＳエレメントの外側に、酸素制御される転写と関連付けられるゲノムＨＢＳ配列の８ｎｔ下流の配列もある。この部位はＨＩＦ補助部位（ＨＡＳ）として公知である（図４Ｃ）。
ＨＲＥの設計
Ｅｎｓｅｍｂｌデータベースから得られたゲノムデータの分析に基づいて、種間および低酸素誘導性遺伝子の間で保存されている推定上のＨＩＦ１結合部位（ＨＢＳ）を同定した。ＨＩＦに結合する６ヌクレオチド（ｎｔ）配列中の各位置における各ヌクレオチドの頻度に基づいてヒト、マウスおよびラットにおける異なる酸素感受性遺伝子からの推定上の６－ｎｔ長ＨＢＳを比較し、ヒトおよびマウスＨＢＳについて配列ロゴを構築した（図４Ａおよび図４Ｂ）。ＨＢＳエレメントの外側に、酸素制御される転写と関連付けられるゲノムＨＢＳ配列の８ｎｔ下流の配列もある。この部位はＨＩＦ補助部位（ＨＡＳ）として公知である（図４Ｃ）。
【0249】
ＨＲＥ設計は、ゲノム配列から取られた８ｎｔリンカー領域により分離されたＨＢＳおよびＨＡＳ部位を含んだ。第１の事例において、３つの連続的なＨＢＳ－ＨＡＳ配列を使用した。また、異なるＨＢＳ配列がＨＩＦに対して異なる感受性を有するかどうかを調べるために、３つの連続的なＨＢＳ－ＨＡＳ（簡便性のためにＨＲＥ）配列をそれぞれ含有する３つの構築物を最初に設計した。これらの構築物の間の差異は、各構築物中のＨＢＳは異なる遺伝子に由来することであった（図５）。これらの遺伝子はヒトＥｐｏ、ヒトＶＥＧＦＡおよびヒトＧＬＵＴ－３であった。
【0250】
ＬＴＲ中のＨＲＥ
宿主細胞のゲノムに構築物を安定的に組み込むために、以前に記載したように改変されたＬＴＲを有するＳＦＧレトロウイルスベクターを使用した。ＳＦＧベクターはモロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）に由来する。宿主細胞ゲノムへの導入遺伝子の組み込みに影響することなくＬＴＲ内のレトロウイルスエンハンサー領域を改変することを試みた。これは、ウイルスプロモーターの上流のＬＴＲのＮｈｅＩ／ＸｂａＩ部位にＨＲＥをクローニングすることにより以前に達成されている。ベクターまたは宿主ゲノムに組み込むためのその能力を不活性化することを回避するために、ＮｈｅＩ／ＸｂａＩ領域を類似した長さの断片で置き換えた。
宿主細胞のゲノムに構築物を安定的に組み込むために、以前に記載したように改変されたＬＴＲを有するＳＦＧレトロウイルスベクターを使用した。ＳＦＧベクターはモロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）に由来する。宿主細胞ゲノムへの導入遺伝子の組み込みに影響することなくＬＴＲ内のレトロウイルスエンハンサー領域を改変することを試みた。これは、ウイルスプロモーターの上流のＬＴＲのＮｈｅＩ／ＸｂａＩ部位にＨＲＥをクローニングすることにより以前に達成されている。ベクターまたは宿主ゲノムに組み込むためのその能力を不活性化することを回避するために、ＮｈｅＩ／ＸｂａＩ領域を類似した長さの断片で置き換えた。
【0251】
５’ＮｈｅＩおよび３’Ｘｂａｌ制限部位を含む我々のＨＲＥ配列を含有するＤＮＡ配列はＧｅｎｅＡｒｔにより合成された。これらの配列をＳＦＧ ＭＭＬＶベクターの３’ＬＴＲ中のＮｈｅＩ／ＸｂａＩ部位にサブクローニングした。逆転写が起こる場合に、改変された３’ＬＴＲ Ｕ３領域は５’ＬＴＲにコピーされるので、５’ＬＴＲではなく３’ＬＴＲを改変した。ＮｈｅＩ／ＸｂａＩはＳＦＧ中に独特の制限部位ではないという事実に起因して、３’ＬＴＲ中のＮｈｅＩ／ＸｂａＩ部位の特異的な改変を達成するために、独特の制限部位（ＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩ）を含有する連続的なオーバーラップＰＣＲを使用するいくつかのステップにおいて断片を合成した。酸素感知性レポーター構築物を作るために、Ｐ２Ａペプチド（自己切断性ペプチド）により分離されたクリックビートルルシフェラーゼの緑色発光バリアントおよび緑色蛍光タンパク質をＳＦＧベクターのＮｃｏＩ／ＸｈｏＩ部位にクローニングした。結果としてもたらされた構築物を図７に示す。
【0252】
ＯＤＤの追加
正常酸素の条件下でタンパク質分解を促すためにルシフェラーゼレポーターに取り付けられたＯＤＤドメインを有するベクターの追加のセットを同時にクローニングした。ＨＩＦ１α安定性は、ＯＤＤ中のプロリン（ｐ４０２およびｐ５６４）の酸素依存性ヒドロキシル化により制御される。この配列を関心対象のタンパク質と融合させて、タンパク質の分解を酸素依存性とさせた。Ｕｎｉｐｒｏｔデータベースに基づけば、ヒトＨＩＦ１αのＯＤＤドメイン（図７中で強調されている）は２０３アミノ酸の長さであり、マウスオルソログは２１３アミノ酸からなる。オーバーラップＰＣＲを使用して、ＨＩＦ１αからのアミノ酸配列５５７～５７４（図７中で太字）をルシフェラーゼのＣ末端に融合させた。正確なアミノ酸配列５５７～５７４（ＬＤＬＥＭＬＡＰＹＩＰＭＤＤＤＦＱＬ）はヒトおよびマウスにおいて保存されている。図８に描写されるように、結果としてもたらされた断片（ルシフェラーゼ－ＯＤＤ融合物）をＬＴＲ改変およびＬＴＲ非改変ＳＦＧレポーター構築物に挿入した。
正常酸素の条件下でタンパク質分解を促すためにルシフェラーゼレポーターに取り付けられたＯＤＤドメインを有するベクターの追加のセットを同時にクローニングした。ＨＩＦ１α安定性は、ＯＤＤ中のプロリン（ｐ４０２およびｐ５６４）の酸素依存性ヒドロキシル化により制御される。この配列を関心対象のタンパク質と融合させて、タンパク質の分解を酸素依存性とさせた。Ｕｎｉｐｒｏｔデータベースに基づけば、ヒトＨＩＦ１αのＯＤＤドメイン（図７中で強調されている）は２０３アミノ酸の長さであり、マウスオルソログは２１３アミノ酸からなる。オーバーラップＰＣＲを使用して、ＨＩＦ１αからのアミノ酸配列５５７～５７４（図７中で太字）をルシフェラーゼのＣ末端に融合させた。正確なアミノ酸配列５５７～５７４（ＬＤＬＥＭＬＡＰＹＩＰＭＤＤＤＦＱＬ）はヒトおよびマウスにおいて保存されている。図８に描写されるように、結果としてもたらされた断片（ルシフェラーゼ－ＯＤＤ融合物）をＬＴＲ改変およびＬＴＲ非改変ＳＦＧレポーター構築物に挿入した。
【0253】
その後の実験において配列番号２９、３０、３１を融合させた。３つ全ての配列番号は酸素感受性を融合パートナーに付与し、最適な結果は配列番号２９、すなわち、ＯＤＤ全体（４０１～６０３）を用いて得られた（図１７）。
【0254】
異なる細胞系における正常酸素または低酸素下でのＨＩＦ１α安定性
正常酸素または低酸素条件、それぞれ２０％または０．１％のＯ２中で細胞系を１８時間培養した。以下のヒト細胞系をこれらの条件下でスクリーニングした：ＨＥＫ２９３ Ｔ、ＨＴ１０８０、Ｔ４７ＤおよびＪｕｒｋａｔ（Ｃｌｏｎｅ Ｅ６－１）。１８時間の曝露の直後に、細胞を溶解し、方法に記載されるようにウエスタンブロットを行ってＨＩＦ１αを定量化した。試験した全ての細胞系において、正常酸素（２０％のＯ２）と比較した場合に、低酸素条件（０．１％のＯ２）下でＨＩＦ１αは安定化されたことが見出された（図１０）。ＩｍａｇｅＪ Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用してデンシトメトリーを使用してタンパク質を定量化した。２９３Ｔ細胞およびＨＴ１０８０細胞は低酸素条件下で最も高い量のＨＩＦ１αを有したが、これらの細胞系において正常酸素条件においてもある程度のＨＩＦ１αが検出された。Ｔ４７ＤおよびＪｕｒｋａｔ細胞の両方は低酸素条件下で検出可能なＨＩＦ１αタンパク質を有したが、正常酸素条件下でＴ４７ＤおよびＪｕｒｋａｔ細胞について検出可能なＨＩＦ１αバンドは見られなかった。
正常酸素または低酸素条件、それぞれ２０％または０．１％のＯ２中で細胞系を１８時間培養した。以下のヒト細胞系をこれらの条件下でスクリーニングした：ＨＥＫ２９３ Ｔ、ＨＴ１０８０、Ｔ４７ＤおよびＪｕｒｋａｔ（Ｃｌｏｎｅ Ｅ６－１）。１８時間の曝露の直後に、細胞を溶解し、方法に記載されるようにウエスタンブロットを行ってＨＩＦ１αを定量化した。試験した全ての細胞系において、正常酸素（２０％のＯ２）と比較した場合に、低酸素条件（０．１％のＯ２）下でＨＩＦ１αは安定化されたことが見出された（図１０）。ＩｍａｇｅＪ Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用してデンシトメトリーを使用してタンパク質を定量化した。２９３Ｔ細胞およびＨＴ１０８０細胞は低酸素条件下で最も高い量のＨＩＦ１αを有したが、これらの細胞系において正常酸素条件においてもある程度のＨＩＦ１αが検出された。Ｔ４７ＤおよびＪｕｒｋａｔ細胞の両方は低酸素条件下で検出可能なＨＩＦ１αタンパク質を有したが、正常酸素条件下でＴ４７ＤおよびＪｕｒｋａｔ細胞について検出可能なＨＩＦ１αバンドは見られなかった。
【0255】
細胞選択
３つの理由から初期実験において２９３Ｔ細胞を使用することを選択した。第１に、ＨＩＦ１αウエスタンブロット解析は、２９３Ｔ細胞は、正常酸素において見出されるものより５倍高いレベルで、低酸素条件下でＨＩＦ１αタンパク質の強い発現を有することを示した。第２に、２９３ＴはＴ４７Ｄと比較した場合に急速に増殖する細胞であり、複数の実験を短い期間に行うことを可能とすることを我々は観察した。第３に、２９３Ｔ細胞は、レトロウイルスを製造するために我々が使用するパッケージング細胞系である。したがって、レトロウイルスを製造するための２９３Ｔ細胞のトランスフェクションは、２９３Ｔ細胞自体のオート形質導入を結果としてもたらす。
３つの理由から初期実験において２９３Ｔ細胞を使用することを選択した。第１に、ＨＩＦ１αウエスタンブロット解析は、２９３Ｔ細胞は、正常酸素において見出されるものより５倍高いレベルで、低酸素条件下でＨＩＦ１αタンパク質の強い発現を有することを示した。第２に、２９３ＴはＴ４７Ｄと比較した場合に急速に増殖する細胞であり、複数の実験を短い期間に行うことを可能とすることを我々は観察した。第３に、２９３Ｔ細胞は、レトロウイルスを製造するために我々が使用するパッケージング細胞系である。したがって、レトロウイルスを製造するための２９３Ｔ細胞のトランスフェクションは、２９３Ｔ細胞自体のオート形質導入を結果としてもたらす。
【0256】
フローサイトメトリーに基づく形質導入効率
我々の構築物中の導入遺伝子の発現は酸素感受性であるので、正確な形質導入効率を決定するためにフローサイトメトリーに依拠することはできない。構成的ルシフェラーゼ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ構築物（ＳＦＧレポーター構築物）を形質導入された２９３Ｔ細胞のフローサイトメトリー分析は、生細胞集団（７－ＡＡＤ陰性）における８３％の形質導入効率を明らかにした（図１０）。これらの結果は、我々が使用したレトロウイルス形質導入方法は効率的に機能することを指し示した。
我々の構築物中の導入遺伝子の発現は酸素感受性であるので、正確な形質導入効率を決定するためにフローサイトメトリーに依拠することはできない。構成的ルシフェラーゼ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ構築物（ＳＦＧレポーター構築物）を形質導入された２９３Ｔ細胞のフローサイトメトリー分析は、生細胞集団（７－ＡＡＤ陰性）における８３％の形質導入効率を明らかにした（図１０）。これらの結果は、我々が使用したレトロウイルス形質導入方法は効率的に機能することを指し示した。
【0257】
ＬＴＲ内の組み込み後ＨＲＥ配置を検証するためのシークエンシング
３’ＬＴＲ中の改変が５’ＬＴＲに複製されており、組み込まれたプロウイルス中で正確に配置されたことを確認するために、形質導入後に５’ＬＴＲ領域をシークエンシングした。形質導入された２９３Ｔ細胞からゲノムＤＮＡを単離し、ＰＣＲを介して５’ＬＴＲ領域を増幅し、１．２％アガロースゲルに流した。正確な長さのバンドを切除し、ゲルを精製し、次にシークエンシングした。配列解析は、３’ＬＴＲに対するＨＲＥ改変は正確にコピーされ、５’ＬＴＲ中で正確な配置を有することを明らかにした。
３’ＬＴＲ中の改変が５’ＬＴＲに複製されており、組み込まれたプロウイルス中で正確に配置されたことを確認するために、形質導入後に５’ＬＴＲ領域をシークエンシングした。形質導入された２９３Ｔ細胞からゲノムＤＮＡを単離し、ＰＣＲを介して５’ＬＴＲ領域を増幅し、１．２％アガロースゲルに流した。正確な長さのバンドを切除し、ゲルを精製し、次にシークエンシングした。配列解析は、３’ＬＴＲに対するＨＲＥ改変は正確にコピーされ、５’ＬＴＲ中で正確な配置を有することを明らかにした。
【0258】
コピー数アッセイ／ｑＰＣＲ（コピー数）アッセイ検証の確立
低酸素条件下でルシフェラーゼ発現を定量化する我々のアッセイのために、我々のデータを正規化する必要があり、これは、あらゆる細胞が形質導入されるわけではなく、一部の細胞はレポーター構築物の複数のコピーを含有している可能性があるためである。これを可能にするために、あらゆる細胞中に２コピー（ネイティブなゲノムＤＮＡ）として存在する参照遺伝子（ＴＢＰ）の増幅の他に、組み込まれた導入遺伝子の数を算出することを可能とする導入遺伝子（ルシフェラーゼ）の増幅を使用する定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を利用した。ｑＰＣＲプライマーを設計するために、Ｅｎｓｅｍｂｌデータベースを使用してインシリコで複数の可能なプライマー配列をスクリーニングして結合の高い特異性を確実にした。ＰＣＲにより生成されるアンプリコンが参照および導入遺伝子の遺伝子量の指標となるような関心対象の遺伝子中の独特の部位に結合するプライマーを選択した。クリックビートルルシフェラーゼならびにヒトおよびマウスＴＢＰ（ヒトおよびマウスの両方の細胞系を使用しているため）に結合するプライマーセットを設計した。このアプローチを使用して、以下の３セットのプライマーを設計した：マウスＴＢＰ遺伝子からの９４ｎｔ断片を特異的に増幅するフォワードマウスＴＢＰ（５’－ＴＧＴ ＣＴＧ ＴＣＧ ＣＡＧ ＴＡＡ ＧＡＡ ＴＧＧ Ａ－３’）およびリバースマウスＴＢＰ（５’－ＡＡＡ ＡＴＣ ＣＣＡ ＧＡＣ ＡＣＧ ＧＴＧ ＧＧ－３’）、ヒトＴＢＰからの１０３ｎｔ断片を特異的に増幅するフォワードヒトＴＢＰ（５’－ＴＴＴ ＧＧＴ ＧＴＴ ＴＧＣ ＴＴＣ ＡＧＴ ＣＡＧ－３’）およびリバースヒトＴＢＰ（５’－ＡＴＡ ＣＣＴ ＡＧＡ ＡＡＡ ＣＡＧ ＧＡＧ ＴＴＧ ＣＴＣ Ａ－３’）、ならびにルシフェラーゼ導入遺伝子からの９０ｎｔ断片を特異的に増幅するフォワードルシフェラーゼ（５’－ＡＴＴ ＴＧＡ ＣＴＧ ＣＣＧ ＧＣＧ ＡＡＡ ＴＧ－３’）およびリバースルシフェラーゼ（５’－ＡＡＧ ＡＴＴ ＣＡＴ ＣＧＣ ＣＧＡ ＣＣＡ ＣＡＴ－３’）。
低酸素条件下でルシフェラーゼ発現を定量化する我々のアッセイのために、我々のデータを正規化する必要があり、これは、あらゆる細胞が形質導入されるわけではなく、一部の細胞はレポーター構築物の複数のコピーを含有している可能性があるためである。これを可能にするために、あらゆる細胞中に２コピー（ネイティブなゲノムＤＮＡ）として存在する参照遺伝子（ＴＢＰ）の増幅の他に、組み込まれた導入遺伝子の数を算出することを可能とする導入遺伝子（ルシフェラーゼ）の増幅を使用する定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を利用した。ｑＰＣＲプライマーを設計するために、Ｅｎｓｅｍｂｌデータベースを使用してインシリコで複数の可能なプライマー配列をスクリーニングして結合の高い特異性を確実にした。ＰＣＲにより生成されるアンプリコンが参照および導入遺伝子の遺伝子量の指標となるような関心対象の遺伝子中の独特の部位に結合するプライマーを選択した。クリックビートルルシフェラーゼならびにヒトおよびマウスＴＢＰ（ヒトおよびマウスの両方の細胞系を使用しているため）に結合するプライマーセットを設計した。このアプローチを使用して、以下の３セットのプライマーを設計した：マウスＴＢＰ遺伝子からの９４ｎｔ断片を特異的に増幅するフォワードマウスＴＢＰ（５’－ＴＧＴ ＣＴＧ ＴＣＧ ＣＡＧ ＴＡＡ ＧＡＡ ＴＧＧ Ａ－３’）およびリバースマウスＴＢＰ（５’－ＡＡＡ ＡＴＣ ＣＣＡ ＧＡＣ ＡＣＧ ＧＴＧ ＧＧ－３’）、ヒトＴＢＰからの１０３ｎｔ断片を特異的に増幅するフォワードヒトＴＢＰ（５’－ＴＴＴ ＧＧＴ ＧＴＴ ＴＧＣ ＴＴＣ ＡＧＴ ＣＡＧ－３’）およびリバースヒトＴＢＰ（５’－ＡＴＡ ＣＣＴ ＡＧＡ ＡＡＡ ＣＡＧ ＧＡＧ ＴＴＧ ＣＴＣ Ａ－３’）、ならびにルシフェラーゼ導入遺伝子からの９０ｎｔ断片を特異的に増幅するフォワードルシフェラーゼ（５’－ＡＴＴ ＴＧＡ ＣＴＧ ＣＣＧ ＧＣＧ ＡＡＡ ＴＧ－３’）およびリバースルシフェラーゼ（５’－ＡＡＧ ＡＴＴ ＣＡＴ ＣＧＣ ＣＧＡ ＣＣＡ ＣＡＴ－３’）。
【0259】
プライマー結合特異性（単一の増幅生成物）を決定するために、細胞から抽出されたゲノムＤＮＡに対してｑＰＣＲを行い、ＰＣＲ生成物をアガロースゲルに流した。全てのＰＣＲ生成物は適切な長さの単一のバンドを与え、プライマーは特異的であることを実証した。
【0260】
コピー数アッセイを検証するために、非形質導入細胞からおよびクリックビートルルシフェラーゼを含有する構築物を形質導入された細胞からゲノムＤＮＡを抽出した。２００ｎｇのＤＮＡを段階希釈（１：２）し、設計されたプライマーを使用してｑＰＣＲを行った。各反応を３連で行った。予期されたように、非形質導入細胞から抽出されたＤＮＡ中にルシフェラーゼアンプリコンは検出されなかった。形質導入された細胞から抽出されたＤＮＡを使用して生成されたｑＰＣＲデータは、ルシフェラーゼおよびＴＢＰの両方のプライマーセットからのｑＰＣＲシグナルならびに反応のサイクル数の間に直線的関係性があることを実証し、アッセイが検証された。
【0261】
２０％、５％、１％および０．１％の酸素中での２９３Ｔ細胞の１８時間のインキュベーション
レトロウイルスを用いて２９３Ｔ細胞への形質導入を行い、形質導入効率をｑＰＣＲにより決定した。非形質導入２９３Ｔ細胞およびルシフェラーゼ構築物１～８を形質導入された２９３Ｔ細胞（図６および図８のＡ、Ｂ、ＣおよびＤ）を播種し、５％、１％および０．１％の酸素ならびに正常酸素（２０％の酸素）中で培養した。これらの条件下での１８時間のインキュベーション後に、ルシフェラーゼ発現、および細胞生存を決定した。５％の酸素および正常酸素中での２９３Ｔ細胞の１８ｈのインキュベーション後に得られた未加工の相対光単位（ＲＬＵ）データは、酸素制御されたルシフェラーゼ発現システムが生成されたことを指し示す（図１４Ａ）。全てのＨＲＥおよび／またはＯＤＤ改変構築物は、正常酸素と比較して低酸素（５％）中でＲＬＵにおける中程度の増加を与えたが、これはより低い酸素濃度において見られなかった。一般に、ＬＴＲ ＨＲＥ改変構築物は、細胞を０．１％の酸素に維持した場合にそれらのＬＴＲ野生型対応物と比較してより低いＲＬＵを与えた。先行する刊行物に基づけば、より深刻な低酸素は、正常酸素条件と対比して低酸素条件下でのタンパク質発現における倍数誘導を増加させる傾向がある。しかしながら、我々のデータにおいてこの傾向は見られなかった（図１２Ｃ）。
レトロウイルスを用いて２９３Ｔ細胞への形質導入を行い、形質導入効率をｑＰＣＲにより決定した。非形質導入２９３Ｔ細胞およびルシフェラーゼ構築物１～８を形質導入された２９３Ｔ細胞（図６および図８のＡ、Ｂ、ＣおよびＤ）を播種し、５％、１％および０．１％の酸素ならびに正常酸素（２０％の酸素）中で培養した。これらの条件下での１８時間のインキュベーション後に、ルシフェラーゼ発現、および細胞生存を決定した。５％の酸素および正常酸素中での２９３Ｔ細胞の１８ｈのインキュベーション後に得られた未加工の相対光単位（ＲＬＵ）データは、酸素制御されたルシフェラーゼ発現システムが生成されたことを指し示す（図１４Ａ）。全てのＨＲＥおよび／またはＯＤＤ改変構築物は、正常酸素と比較して低酸素（５％）中でＲＬＵにおける中程度の増加を与えたが、これはより低い酸素濃度において見られなかった。一般に、ＬＴＲ ＨＲＥ改変構築物は、細胞を０．１％の酸素に維持した場合にそれらのＬＴＲ野生型対応物と比較してより低いＲＬＵを与えた。先行する刊行物に基づけば、より深刻な低酸素は、正常酸素条件と対比して低酸素条件下でのタンパク質発現における倍数誘導を増加させる傾向がある。しかしながら、我々のデータにおいてこの傾向は見られなかった（図１２Ｃ）。
【0262】
構築物内にＯＤＤドメインを追加する効果は、構成的発現性非改変ＬＴＲ構築物＋／－ＯＤＤを比較することにより最良に評価される。図１７および図１８を参照。実験にわたり、ＯＤＤの追加は、これらの条件においてルシフェラーゼの検出を中程度にのみ減少させた。低酸素の有意な誘導の非存在は装置または実験手順の結果であった可能性が残っているので、これを排除するために、（ＨＩＦ１α分解のコバルト媒介性阻害により）低酸素条件を模倣する１８時間の１００μＭの塩化コバルトを用いて、形質導入された２９３Ｔ細胞を刺激した。しかしながら、塩化コバルトの非存在と比較して１００μＭの塩化コバルトの存在下でルシフェラーゼ誘導は観察されなかった（図１３）。
【0263】
図２９は、野生型と対比したＨＲＥプロモーターの優位性を実証する。ＨＲＥ改変は、低酸素、例えば、腫瘍環境において、同じ条件におけるその非改変の野生型対応物と比較して下流の遺伝子のより良好な発現を駆動する優位なプロモーターに繋がることを我々は観察した。図２９ＡおよびＢは、ＨＲＥ改変は単独で、全てのエフェクター：標的比において（１：２などの低いＥ：Ｔにおいても）低酸素（固形腫瘍）環境中でのＴ細胞における優位な標的殺傷および活性化能力に繋がることを実証する。患者において確立された固形腫瘍におけるエフェクター対標的比は通常低いため低いＥ：Ｔ比において効率的であるＨＲＥ－ＣＡＲの能力は決定的であり、ＣＡＲ Ｔ細胞免疫療法のアウトカムを決定し得るため、これは極めて重要である。追加的に、この増強したＣＡＲ発現は、その低酸素状態のために固形腫瘍内でのみ起こり、したがって、増強した発現は腫瘍特異的であるため、ＷＴ ＣＡＲからのリスクよりも高いオフ腫瘍毒性のいかなるリスクも課さない。
【0264】
プロモーター中のＨＲＥエレメントの数の増加の存在下での低酸素誘導可能性
図１５および図１６に示されるように、低酸素誘導可能性は、プロモーター中のＨＲＥエレメントの数の増加と共に増加する。複数のＨＲＥを含有するようにＬＴＲ（レトロウイルスプロモーター）を改変することにより、正常酸素の条件におけるルシフェラーゼの発現は有効にサイレンシングされた。
図１５および図１６に示されるように、低酸素誘導可能性は、プロモーター中のＨＲＥエレメントの数の増加と共に増加する。複数のＨＲＥを含有するようにＬＴＲ（レトロウイルスプロモーター）を改変することにより、正常酸素の条件におけるルシフェラーゼの発現は有効にサイレンシングされた。
【0265】
正常酸素（＋／－ＯＤＤ）中でのルシフェラーゼ安定性
様々なＯＤＤセグメントをルシフェラーゼのＣ末端に融合させ、その結果を図２０および図２１に示す。配列番号２９：ＯＤＤセグメント４０１～６０３、配列番号３０：ＯＤＤセグメント５３０～６０３および配列番号３１：ＯＤＤセグメント５３０～６５３を試験した。３つのＯＤＤセグメントのそれぞれの追加は、正常酸素条件において発現の低減を結果としてもたらし、配列番号２９（４０１～６０３のＯＤＤ）との９つのＨＲＥプロモーター構造の組み合わせは、正常酸素中でルシフェラーゼの発現を示さなかったが、低酸素においてオンに切り替わった（図１８）。
様々なＯＤＤセグメントをルシフェラーゼのＣ末端に融合させ、その結果を図２０および図２１に示す。配列番号２９：ＯＤＤセグメント４０１～６０３、配列番号３０：ＯＤＤセグメント５３０～６０３および配列番号３１：ＯＤＤセグメント５３０～６５３を試験した。３つのＯＤＤセグメントのそれぞれの追加は、正常酸素条件において発現の低減を結果としてもたらし、配列番号２９（４０１～６０３のＯＤＤ）との９つのＨＲＥプロモーター構造の組み合わせは、正常酸素中でルシフェラーゼの発現を示さなかったが、低酸素においてオンに切り替わった（図１８）。
【0266】
インビトロおよびインビボでのＴ４－ＣＡＲの結果
マウスおよびヒトの両方において可能なＥｒｂＢホモおよびヘテロ二量体の８／１０に対して特異性を有するｐａｎ－ＥｒｂＢ ＣＡＲ Ｔ１Ｅ２８ｚを利用した。Ｔ細胞に形質導入されるとインビボでの追跡を可能にするレポータークリックビートルルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）を同時に共発現するようにＣＡＲ構築物を改変した。皮下ＳＫＯＶ３卵巣がん異種移植片を有する免疫不全ＮＳＧマウスにＥｒｂＢ－ＣＡＲ／Ｌｕｃ Ｔ細胞をｉ．ｖ．で注入した。ＣＡＲ Ｔ細胞の体内分布を注入の４日後に分析した。この早い時点において、細胞の大部分は肺および肝臓に存在することが見られ、腫瘍への取り込みは最小であった（図１９ｂ）。ＥｒｂＢ１－４ ｍＲＮＡ発現についての臓器のプロファイリングは、ファミリーからの全ての受容体は、ＣＡＲ Ｔ細胞が注入後に蓄積されることが観察された肺および肝臓を含む全ての重要臓器にわたり発現されることを裏付けた。
マウスおよびヒトの両方において可能なＥｒｂＢホモおよびヘテロ二量体の８／１０に対して特異性を有するｐａｎ－ＥｒｂＢ ＣＡＲ Ｔ１Ｅ２８ｚを利用した。Ｔ細胞に形質導入されるとインビボでの追跡を可能にするレポータークリックビートルルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）を同時に共発現するようにＣＡＲ構築物を改変した。皮下ＳＫＯＶ３卵巣がん異種移植片を有する免疫不全ＮＳＧマウスにＥｒｂＢ－ＣＡＲ／Ｌｕｃ Ｔ細胞をｉ．ｖ．で注入した。ＣＡＲ Ｔ細胞の体内分布を注入の４日後に分析した。この早い時点において、細胞の大部分は肺および肝臓に存在することが見られ、腫瘍への取り込みは最小であった（図１９ｂ）。ＥｒｂＢ１－４ ｍＲＮＡ発現についての臓器のプロファイリングは、ファミリーからの全ての受容体は、ＣＡＲ Ｔ細胞が注入後に蓄積されることが観察された肺および肝臓を含む全ての重要臓器にわたり発現されることを裏付けた。
【0267】
低酸素は腫瘍微環境を健常組織から区別するので、これを活用して低酸素感知Ｔ４－ＣＡＲを作成することを試みた。Ｔ４は、細胞外ドメインへのＩＬ－４の結合で細胞内ＩＬ－２／ＩＬ－１５シグナルを送出し、それにより、Ｔ細胞のＣＡＲ依存性殺傷能力に影響することなくエクスビボ拡大増殖の間にＣＡＲ Ｔ細胞を選択的に富化するための手段を提供するキメラＩＬ－４受容体と共発現される次世代抗ＥｒｂＢ ＣＡＲである。Ｃ末端２０３アミノ酸のＯＤＤを含有するように抗ＥｒｂＢ ＣＡＲを操作し、Ｔ細胞に形質導入された場合にＣＡＲを低酸素に対して選択的に応答性とさせる一連の９つのＨＲＥを含有するように長鎖末端反復中のＣＡＲプロモーターを改変した（図式的な図２１）。インビトロで、「ＨｙｐｏｘｉＣＡＲ’」と命名したこのＣＡＲは、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋の両方のＴ細胞集団において厳密な低酸素特異的表面ＣＡＲ発現を実証した（図２１ｂ）。
【0268】
ＣＡＲ発現は高度にダイナミックであり、Ｏ２依存性の方式で「オン」および「オフ」され得るスイッチとなった（図２１ｃ）。ＨＲＥは、低酸素条件において、同等の形質導入効率および等しいＣＤ４／ＣＤ８＋ Ｔ細胞比にもかかわらず、親Ｔ４－ＣＡＲと比較してわずかにのみ低い総細胞表面ＣＡＲ発現が観察されたので、堅牢なプロモーターであることが判明した（図２１ｄ）。ＨｙｐｏｘｉＣＡＲは、環境上のＯ２に対する応答の好都合な感受性を実証し、ＣＡＲ発現は、健常臓器中で見出されるＯ２濃度（≧５％）で存在しないが、腫瘍微環境中に見られるＯ２レベル（≦１％）で検出可能であった。さらに、ＣＡＲ発現は低酸素の深刻度と正に相関した（図２１ｅ）。
【0269】
低酸素を感知するＨｙｐｏｘｉＣＡＲの能力が検証されたので、標的細胞の低酸素依存性殺傷を誘発するその能力を調べることを試みた。このために、ＥｒｂＢ１－４を発現するＳＫＯＶ３卵巣がん細胞を使用した。細胞を培養プレートに播種し、正常酸素（２０％のＯ２）および低酸素（０．１％のＯ２）条件下でＴ４－ＣＡＲまたはＨｙｐｏｘｉＣＡＲと共インキュベートした。同等の形質導入効率にもかかわらず、ＨｙｐｏｘｉＣＡＲは、ＳＫＯＶ３細胞の効率的な低酸素依存性殺傷を示し、正常酸素条件下で有意な殺傷はなかった。ＨｙｐｏｘｉＣＡＲの細胞内テイルを切断してシグナル伝達を予防した場合（ＣＤ３－）に殺傷は妨げられたので、標的細胞殺傷はＣＡＲ媒介性であった（図２１ｆ）。Ｔ細胞応答において重要な役割を果たす２つのサイトカインであるＩＬ－２（図２１ｇ）およびＩＦＮγ（図２１ｇ～ｈ）の両方の分泌もこれらの共培養物において評価した。ｈｙｐｏｘｉＣＡＲ Ｔ細胞によるサイトカイン産生はまた、検出可能なレベルは低酸素条件下でのみ見出されるように厳密に調節された。
【0270】
これらの観察をインビボに翻訳するために、ＨｙｐｏｘｉＣＡＲはＥｒｂＢ－ＣＡＲ Ｔ細胞のオフ腫瘍毒性を回避し得るかどうかを評価した。これは、診療所におけるそれらの全身投与を不可能にする主要な障害である。腫瘍状況においてこの技術を評価するために、ＨｙｐｏｘｉＣＡＲ Ｔ細胞をＨＮ３腫瘍保有ＮＳＧマウスにｉ．ｖ．およびｉ．ｔ．で並行して注射した。この手段により、エクスビボ研究のために腫瘍および重要臓器中のこれらの細胞の急速な蓄積を達成した（図２２Ａ）。ＨｙｐｏｘｉＣＡＲ注入の４日後に、組織を回収し、酵素消化し、フローサイトメトリーを使用してＣＡＲ発現についてＴ細胞を評価した。ＨｙｐｏｘｉＣＡＲは発現の腫瘍選択性を達成し、低酸素性腫瘍微環境内でのみ表面ＣＡＲ分子を提示し、Ｔ細胞が血液、肺、および肝臓に位置する場合にはＣＡＲ発現は存在しなかった（図２２Ｂ～Ｃ）。この観察は、ＳＫＯＶ３腫瘍を有するＮＳＧマウスおよびマウスルイス肺癌（ＬＬ２）腫瘍を有するＲａｇ２－／－マウスにおいても観察されたので、モデル特異的ではなかった。
【0271】
結果は、不十分な酸素供給により特徴付けられる微環境である固形腫瘍内でのｐａｎＥｒｂＢ標的化ＣＡＲの選択的発現を達成する厳密な低酸素感知ＣＡＲ Ｔ細胞アプローチを示す。健常臓器中でのＥｒｂＢ受容体の広範な発現にもかかわらず、アプローチは、マウス異種移植モデルにおいてオフ腫瘍毒性なしで抗腫瘍有効性を提供する。このダイナミックな酸素感知安全性スイッチは、固形悪性腫瘍を治療するためのＣＡＲ Ｔ細胞標的レパートリーの限りない拡大増殖を潜在的に促す。
【0272】
オフ腫瘍毒性を回避するためのアプローチの同定は、現在限られている、癌腫に対するＣＡＲ抗原標的の完全に新たなレパートリーの鍵を開ける潜在能力を有する。
【0273】
この問題を調べるために、可能なＥｒｂＢ受容体ホモおよびヘテロ二量体の８／１０に対して特異性を有し、かつ種の障壁を越えてマウスおよびヒトの両方の受容体に同等に結合する、第２世代ｐａｎ－ａｎｔｉ－ＥｒｂＢ ＣＡＲ Ｔ１Ｅ２８ｚを利用した。このＣＡＲは現在、ＳＣＣＨＮを有する患者における腫瘍内（ｉ．ｔ．）送達によるフェーズＩ評価を受けている。ＣＡＲは、細胞外ドメインへのＩＬ－４の結合でＩＬ－２／ＩＬ－１５シグナルを送出するキメラサイトカイン受容体（４αβ）と共発現され（図２４ＡおよびＢ）、エクスビボ拡大増殖の間にＣＡＲ Ｔ細胞を選択的に富化するための手段を提供するが、Ｔ細胞のＣＡＲ依存性殺傷能力に影響しない。この組み合わせはＴ４免疫療法と称される。Ｔ４－ＣＡＲ Ｔ細胞のｉ．ｔ．送達は人間において安全であることが判明しているが、ｉ．ｖ．注入は、これらの細胞が原発性腫瘍および転移の両方にホーミングすることを可能にするので望ましい。ＥｒｂＢ１－４を発現するＨＮ３腫瘍を有する免疫不全ＮＳＧマウスへのヒトＴ４－ＣＡＲ Ｔ細胞のｉ．ｖ．注入（図２４Ｃ）は、これらの動物における体重の急速な損失により明らかな致死的な毒性を結果としてもたらした（図２４Ｄ）。臨床的に観察されたように、これらのマウスの血液の分析は、炎症促進性サイトカインにおける増加の証拠を明らかにした（図２４Ｅ）。ＣＡＲ Ｔ細胞の体内分布を解明することを試みて、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）レポーターを同時に発現するようにＣＡＲ構築物を改変して、形質導入されたＴ細胞のインビボでの追跡を可能にした（図２４Ｆ）。亜致死用量のレポーターヒトＣＡＲ Ｔ細胞のｉ．ｖ．注入の４日後のイメージング分析は、大部分は肺および肝臓に蓄積し、これらの細胞上のＥｒｂＢ１－４（ＣＡＲ標的）の発現にもかかわらず少数のみが腫瘍中に存在することを明らかにした（図２４Ｇ）。同じレポーターＣＡＲを発現するようにマウスＴ細胞への形質導入を行い、それらをＲａｇ２－／－マウスにｉ．ｖ．で注入した場合（図２４Ｃ）に、それらは同じ組織中および脾臓中に蓄積した（図Ｓ３）ので、肝臓および肺中の蓄積は異種移植システムのアーチファクトではなかった。顕著なことに、Ｌｕｃレポーターを単独で発現するＴ細胞は肝臓において有意に少なかったので、肺ではなく肝臓中のマウスＴ細胞の蓄積はＣＡＲ依存性であった。肺におけるＣＡＲ非依存性Ｔ細胞蓄積はインテグリン依存性相互作用に起因する可能性があった。ＥｒｂＢ１－４ ｍＲＮＡ発現のプロファイリングは、４つ全ての受容体が、肺および肝臓を含む全ての重要臓器において発現されることを裏付けた。Ｔ４－ＣＡＲ Ｔ細胞媒介性の組織損傷の直接的な証拠を調べるために、亜致死用量のヒトＴ４－ＣＡＲ Ｔ細胞をＮＳＧマウスにｉ．ｖ．で注入し、肝臓および肺のヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色組織切片を使用する病理組織学的検査を５日後に実行した。この分析は、ＣＡＲ媒介性炎症のサロゲートマーカーとなる、肺および肝臓中の骨髄細胞浸潤物の存在を明らかにした（図２４ＨおよびＩ）。浸潤物は、血管周囲分布中に観察され、かつ実質の全体を通じて散乱しており、好中球（多形核細胞）、およびマクロファージの可能性がある、豊富な細胞質を有する大きい単核細胞の両方からなるものであった。肝細胞壊死／アポトーシスもまた一部の動物において見られた。Ｔ４－ＣＡＲ Ｔ細胞は、より低いレベルで腎臓中に蓄積し（図２４Ｇ）、この組織における炎症の有意な証拠はなかった。これらのデータは、肝臓および肺はオフ腫瘍ＣＡＲ Ｔ細胞活性化のための２つの鍵となる臓器となることを指し示す。
【0274】
低酸素はほとんどの固形腫瘍に特徴的である。腫瘍細胞の増殖性および高い代謝性の要求は、非効率的な腫瘍血管系と共に、健常臓器／組織（５～１０％のＯ２）と比較して不十分な酸素供給（＜２％のＯ２）の状態を結果としてもたらす（図２４ＪおよびＫ）。低酸素は腫瘍微環境を健常な正常酸素組織から区別するので、それはＣＡＲ Ｔ細胞発現の誘導のための望ましいマーカーとなる（図２４ＪおよびＫ）。厳密な低酸素調節性ＣＡＲ発現システムを作成するために、Ｔ４－ＣＡＲのための二重酸素感知アプローチを開発した（図２５Ａ）。これは、ＣＡＲ発現を低酸素に対して選択的に応答性とさせる一連の９つの連続するＨＲＥを含有するように長鎖末端反復（ＬＴＲ）エンハンサー領域中のＣＡＲプロモーターを改変することと同時に、Ｃ末端２０３アミノ酸のＯＤＤを抗ＥｒｂＢ ＣＡＲに付加することにより達成された。インビトロで、「ＨｙｐｏｘｉＣＡＲ」と命名したこのＣＡＲは、ヒトＴ細胞の細胞表面上のＣＡＲ分子の厳密な低酸素特異的提示を実証した（図２５Ｂ）。二重酸素感知システムは、９つのＨＲＥカセットまたはＯＤＤのいずれかを単独で使用したバリアントより優位であることを我々は実証した。両方の場合に、これらの代替的なアプローチは正常酸素の条件下でＣＡＲ発現の漏出性を示し、正常酸素条件下での腫瘍細胞殺傷を許容した。ＨｙｐｏｘｉＣＡＲのＣＡＲの発現はまた高度にダイナミックであり、Ｏ２依存性の方式で「オン」および「オフ」され得るスイッチとなった（図２５Ｃ）。さらなるインビトロの特徴付けにおいて、ＣＡＲ発現は健常臓器と合致するＯ２濃度（≧５％）下で存在しなかったが、腫瘍微環境中で見出されるものと同等であるＯ２濃度（≦１％）で細胞表面上に検出可能となったので、ＨｙｐｏｘｉＣＡＲの精巧なＯ２感受性が裏付けられた（図２５Ｄ）。腫瘍に浸潤したＴ細胞は腫瘍微環境から出て行くことが実証されており、ＣＡＲを発現する低酸素を経験したＨｙｐｏｘｉＣＡＲ Ｔ細胞が健常な正常酸素組織に再び入った場合に潜在的な安全性の懸念を強調している。しかしながら、標的細胞の細胞溶解性Ｔ細胞媒介性殺傷は最大６時間を要し得るので（２５）、その時間の間に正常酸素において、ＨｙｐｏｘｉＣＡＲの表面ＣＡＲの約６２±８％は既に分解されている可能性を予期することができ（図２Ｃ）、出て行ったＨｙｐｏｘｉＣＡＲ Ｔ細胞による任意のオフ腫瘍殺傷は限定されることが予期される。さらに、ＣＤ８＋ Ｔ細胞遊走はそれがそのコグネイト抗原を発現する腫瘍細胞に遭遇する領域において止まることが実証されているので、標的を殺傷するために十分なＣＡＲをＨｙｐｏｘｉＣＡＲが発現したら細胞放出は限定される。
【0275】
低酸素を感知するＨｙｐｏｘｉＣＡＲの能力が検証されたので、腫瘍標的細胞の低酸素依存性殺傷を誘発するその能力を調べることを試みた。ＳＫＯＶ３卵巣がん細胞を培養プレートに播種し、正常酸素および低酸素（０．１％のＯ２）条件下でＴ４－ＣＡＲまたはＨｙｐｏｘｉＣＡＲと共インキュベートした。同等の形質導入効率およびＣＤ４＋：ＣＤ８＋ Ｔ細胞比にもかかわらず、ＨｙｐｏｘｉＣＡＲ Ｔ細胞は、Ｔ４－ＣＡＲ Ｔ細胞とほぼ同等の、ＳＫＯＶ３細胞の効率的な低酸素依存性殺傷を示し、正常酸素条件下では有意な殺傷は観察されなかった（図２５Ｅ）。ＨｙｐｏｘｉＣＡＲの細胞内テイルを切断してＣＤ３ζシグナル伝達を予防した場合、殺傷は妨げられた（図２５Ｅ）ので、標的細胞破壊は厳密にＣＡＲ依存性であった。追加的に、ＨｙｐｏｘｉＣＡＲは、Ｔ細胞応答において重要な役割を果たす２つのサイトカインであるＩＬ－２（図２５Ｆ）およびＩＦＮγ（図２５Ｇ）の両方の厳密な低酸素に制限されたＴ細胞分泌を提供した。
【0276】
ＨｙｐｏｘｉＣＡＲがインビボで腫瘍に制限されたＣＡＲ発現を提供し得るかどうかを評価するために、ＨＮ３腫瘍を有するＮＳＧマウスに並行してｉ．ｖ．およびｉ．ｔ．でヒトＨｙｐｏｘｉＣＡＲ Ｔ細胞を注射した。これらの腫瘍はおおよそ５００ｍｍ３の体積を有し（図２６Ａ）、それにおける低酸素の存在が確認された（図２４Ｊ、Ｋ）。ＨｙｐｏｘｉＣＡＲ Ｔ細胞注入の４日後に、組織を回収し、酵素消化し、フローサイトメトリーを使用してＣＡＲ発現についてＴ細胞を評価した。インビトロ分析（図２５）により予測されたように、注入後のマウスの血液、肺、または肝臓から回収された場合にＨｙｐｏｘｉＣＡＲ Ｔ細胞は検出可能な細胞表面ＣＡＲ分子を発現しなかったが、それらは低酸素性腫瘍微環境内で細胞表面上にＣＡＲ分子を発現した（図２６Ｂ、Ｃ）。類似した観察が、ＳＫＯＶ３腫瘍を有するＮＳＧマウスおよびマウスルイス肺癌（ＬＬ２）腫瘍を有するＲａｇ２－／－マウスの両方においてなされたので、この発見はモデル特異的ではなかった。「Ｈｙｐｏｘｉ」構築物エレメントが腫瘍成長の異なるステージにわたり活性であるかどうかを確立するために、ＨＲＥプロモーターを使用してルシフェラーゼ－ＯＤＤの発現が駆動されるＨｙｐｏｘｉ－ルシフェラーゼレポーターを開発した。このレポーターを直接的にＳＫＯＶ３およびＨＮ３細胞系に安定的に形質導入した。ルシフェラーゼ－ＯＤＤは、正常酸素条件下の腫瘍細胞中で検出可能でなかったにもかかわらず、ＳＫＯＶ３およびＨＮ３の両方の腫瘍において、腫瘍が触知可能となる前であっても、腫瘍成長の全てのステージにおいてインビボで検出された。これは、ＨｙｐｏｘｉＣＡＲ Ｔ細胞は早期ステージの腫瘍に対してさえ活性である可能性を示唆した。これを試験するために、腫瘍が触知可能になる直前の、ＨＮ３腫瘍細胞の注射後１６日目にＨｙｐｏｘｉＣＡＲ Ｔ細胞をマウスに注入した。正常酸素組織中でのＴ細胞上のＣＡＲ発現の非存在と合致して、ＨｙｐｏｘｉＣＡＲはまた、高用量Ｔ４－ＣＡＲ Ｔ細胞のｉ．ｖ．注入を使用してその後に見られる治療制限毒性を回避した。実際に、ヒトＨｙｐｏｘｉＣＡＲ Ｔ細胞をｉ．ｖ．で注入されたマウスは、注入後に体重における急速な低下を示さず（図２６Ｄ、Ｅ）、全身循環における炎症促進性サイトカインの証拠はなく（図２６Ｆ）、肺、肝臓および腎臓のいずれにおいても組織損傷のいかなる徴候もなかった（図２６Ｇ、Ｈ）。重要なことに、ヒトＴ４－ＣＡＲ Ｔ細胞をｉ．ｖ．で注入されたマウスは全て２８ｈ時にそれらの人道的なエンドポイントに達したが（図２６Ｅ）、ＨｙｐｏｘｉＣＡＲ Ｔ細胞を注入されたマウスはオフ腫瘍毒性の徴候を示さず、腫瘍成長を予防した（図２６Ｉ）。そのため、ＨｙｐｏｘｉＣＡＲは、身体の全体を通じて正常組織中に発現される抗原を標的化するＣＡＲ Ｔ細胞の全身投与を現在不可能にしている主要な障害を克服する。
【0277】
低酸素はＳＣＣＨＮにおいて大規模に研究されてきた。いずれの患者がＨｙｐｏｘｉＣＡＲ Ｔ細胞免疫療法のために最も適切であり得るのかを評価するために、患者腫瘍トランスクリプトームデータを使用してＨＲＥ調節遺伝子シグネチャーを最初に生成させた。公知のＨＲＥ調節遺伝子を共発現について分析し、遺伝子ＰＧＫ１、ＳＬＣ２Ａ１、ＣＡ９、ＡＬＤＯＡおよびＶＥＧＦＡを利用する精密化されたシグネチャーを、これらの遺伝子の間に有意な正の相関が観察されたので選択した（図２７Ａ）。異なるＳＣＣＨＮサブタイプ（下咽頭、喉頭、口腔、および中咽頭）にわたりこのシグネチャーの発現において差異はなかった。しかしながら、この５遺伝子シグネチャーの発現は腫瘍サイズと共に有意に増加し（Ｔ－スコア；図２７Ｂ）、そしてまたステージ３および４のＨＮＳＣＣ患者におけるより不良な生存を予示した（図２７Ｃ）。ＨＲＥ調節遺伝子シグネチャーを利用して生検材料から低酸素を予測することは、ＨｙｐｏｘｉＣＡＲ療法に最良に応答し得る患者を評価するための単純な手段を提供し得る。
【0278】
ＨｙｐｏｘｉＣＡＲのＣＡＲ発現のためのマスター転写因子である安定化されたＨＩＦ１αについてのＳＣＣＨＮ腫瘍切片の免疫組織化学染色は、ＨＩＦ１αが安定化された腫瘍の大きい領域を明らかにした（図２７Ｄ）。いくつかの因子がＨＩＦ１αを安定化させ得るが、低酸素はこの観察について最も可能性のある説明となる。ＨＩＦ１α安定化および腫瘍内Ｔ細胞浸潤の両方における不均質性が患者の間で見られた。しかしながら有望なことに、ＨＩＦ１α安定化の最も高い頻度および／または強度を有する腫瘍は、Ｔ細胞が上皮内空間に入ることも、腫瘍のＨＩＦ１α安定化領域に入ることも排除しなかった（図２７Ｅ、Ｆ）。免疫蛍光を使用して、ＨＩＦ１α安定化腫瘍領域に浸潤するＣＤ３＋ Ｔ細胞はＨＩＦ１α自体も安定化させることも我々は実証し、これは、これらの環境においてＨｙｐｏｘｉＣＡＲ Ｔ細胞が活性化されることを示唆する（図２７Ｇ）。これらの観察は、ＨｙｐｏｘｉＣＡＲは、低酸素性腫瘍種、例えばＳＣＣＨＮにおいて臨床応用を有し得ることを示唆し、該腫瘍種において、遺伝子発現（図２７Ａ～Ｃ）、ＨＩＦ１α／ＣＤ３についての生検試料の染色（図２７Ｄ～Ｇ）およびイメージング技術、例えば６４Ｃｕ－ＡＴＳＭなどの低酸素放射性トレーサーを使用するＰＥＴ／ＣＴは、低酸素性腫瘍微環境の存在を裏付けかつ患者選択をガイドするためのバイオマーカーを提供し得る。
【0279】
ＣＡＲ Ｔ細胞の腫瘍特異性を向上させるためのアプローチ、例えば、ＨＬＡ提示抗原に対する特異性を有するＴ細胞受容体模倣性ＣＡＲ、腫瘍抗原の組み合わせた標的化、または高密度抗原を優先的に標的化するためのＣＡＲ親和性のチューニングが開発された。この研究は、腫瘍微環境の最も先天的な特徴の１つを活用する、がん選択的な免疫療法を達成するための代替的なアプローチを実証する。ここに記載される「二重低酸素感知」システムは、正常組織中の複数の標的を認識するＣＡＲのオフ腫瘍毒性を妨げながら有力な抗腫瘍有効性を達成する。ＣＡＲに付加された低酸素感知ＨＲＥモジュールおよびＯＤＤは相乗的に作用して、厳密な低酸素特異的標的殺傷を提供する（図２５Ｅ）。このアプローチは正常酸素の条件下でＣＡＲの転写（ＨＲＥ）および安定性（ＯＤＤ）の両方を制限し、これらの２つのシステムが同時に利用された場合に、それらは、いずれかのシステムが単独で使用された場合に観察される漏出性を克服した。
【0280】
低酸素性腫瘍微環境は効率的な免疫反応に資さない。低酸素は、間質細胞、例えばマクロファージにおいて免疫抑制プログラムを活性化させ、免疫チェックポイント分子の発現を調節し、かつより高悪性度の腫瘍細胞表現型を促進することができる。しかしながら、有望なことに、低酸素はインビトロで直接的にＴ細胞エフェクター機能に負に影響しない（図２５Ｅ～Ｇ）ことを我々は見出し、これは他の者により観察されたことと合致する。ＨｙｐｏｘｉＣＡＲ Ｔ細胞はまた、低酸素性腫瘍の成長を予防することができ（図２６Ｉ）、これは、試験されたインビボモデルにおいて、腫瘍微環境は、インビボ抗腫瘍治療有効性を与えるためのＨｙｐｏｘｉＣＡＲの能力に対する完全な障壁ではなかったことを示唆する。将来的に、腫瘍を標的化するＨｙｐｏｘｉＣＡＲ Ｔ細胞の能力をさらに向上させ得る微環境修飾剤、例えば免疫チェックポイント阻害剤とＨｙｐｏｘｉＣＡＲ Ｔ細胞療法を組み合わせる可能性もある。さらには、Ｔ細胞はヒト腫瘍のＨＩＦ１α安定化領域から排除されない（図２７Ｄ～Ｆ）ので、ＨｙｐｏｘｉＣＡＲ Ｔ細胞は、ＣＡＲ発現を活性化させるために適切な微環境にアクセスできる可能性がある。高用量ＨｙｐｏｘｉＣＡＲ Ｔ細胞を注入されたマウスにおいて治療制限毒性の証拠を我々は観察しなかったが（図２６ＥおよびＩ）、「生理学的低酸素」が観察されている腸粘膜などの健常組織中の微環境がある。そのような組織は、ＨｙｐｏｘｉＣＡＲ Ｔ細胞のオフ腫瘍活性化が起こり得る部位となる可能性がある。そのため、最も広汎性のＣＡＲのために追加のレベルの安全性を提供するために自殺スイッチがＨｙｐｏｘｉＣＡＲに組み込まれ得る。汎ＥｒｂＢ標的化ＣＡＲを使用して「ＨｙｐｏｘｉＣＡＲ」二重酸素感知システムを例示したが、固形悪性腫瘍の治療のために利用可能な安全な標的の不足を克服するために、広く応用可能な戦略が使用され得る。
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【図27-1】
【図27-2】
【図28】
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【配列表】
【国際調査報告】