▶ フンダシオン インスティテュート デ インヴェスティガシオン コントラ ラ レウセミア ジュゼップ カレラス （アイジェイシー）の特許一覧 ▶ インスティトゥシオ カタラーナ デ レセルカ イ エストゥディス アバンカツ （アイシーアールイーエー）の特許一覧 ▶ フンダシオ インスティテュート ディンベスティガシオ エン シエンシエス デ ラ サリュ ジャーマンス トライアス アイ プジョルの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-03-30
(54)【発明の名称】ＣＤ１ａ陽性癌の治療のためのＣＡＲ Ｔ細胞
(51)【国際特許分類】
C12N 5/0783 20100101AFI20220323BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20220323BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20220323BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220323BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20220323BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20220323BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20220323BHJP
C12N 15/62 20060101ALN20220323BHJP
A61K 39/00 20060101ALN20220323BHJP
【ＦＩ】
C12N5/0783 ZNA
C12N5/10
A61K35/17 Z
A61P35/00
A61P35/02
A61P37/04
C12N15/13
C12N15/62 Z
A61K39/00 H
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021547571
(86)(22)【出願日】2020-02-13
(85)【翻訳文提出日】2021-10-08
(86)【国際出願番号】 EP2020053769
(87)【国際公開番号】W WO2020165350
(87)【国際公開日】2020-08-20
(31)【優先権主張番号】19382104.8
(32)【優先日】2019-02-14
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】521358187
【氏名又は名称】フンダシオン インスティテュート デ インヴェスティガシオン コントラ ラ レウセミア ジュゼップ カレラス （アイジェイシー）
(71)【出願人】
【識別番号】513019977
【氏名又は名称】インスティトゥシオ カタラーナ デ レセルカ イ エストゥディス アバンカツ （アイシーアールイーエー）
(71)【出願人】
【識別番号】519023754
【氏名又は名称】フンダシオ インスティテュート ディンベスティガシオ エン シエンシエス デ ラ サリュ ジャーマンス トライアス アイ プジョル
(74)【代理人】
【識別番号】110000796
【氏名又は名称】特許業務法人三枝国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】メネンデス ブハン パブロ
(72)【発明者】
【氏名】サンチェス マルティネス ディエゴ
(72)【発明者】
【氏名】ブエノ ウロス クララ
(72)【発明者】
【氏名】グティエレス アグエラ フランシスコ
(72)【発明者】
【氏名】ロカ－オ ヘレイア
【テーマコード（参考）】
4B065
4C085
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA94X
4B065AA94Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065CA24
4B065CA25
4B065CA44
4C085AA02
4C085BB11
4C085BB12
4C085CC03
4C085DD62
4C085EE01
4C085GG01
4C087AA01
4C087AA02
4C087AA03
4C087BB64
4C087BB65
4C087CA04
4C087NA14
4C087ZB02
4C087ZB09
4C087ZB26
4C087ZB27
(57)【要約】
再発性／難治性Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）は、悲惨な転帰を有し、Ｔ－ＡＬＬの効果的な標的化免疫療法は存在しない。キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲＴ）のＴ－ＡＬＬへの拡張は、ＣＡＲＴとＴ－ＡＬＬ芽球との間の標的抗原の共通発現がＣＡＲＴフラトリサイドを引き起こすことから困難なままである。ＣＤ１ａは、Ｔ－ＡＬＬの主要サブセットである皮質Ｔ－ＡＬＬにおいてのみ発現される。ＣＤ１ａの発現は、皮質胸腺細胞に限定され、ＣＤ３４＋前駆体もＴ細胞も個体発生時にＣＤ１ａを発現せず、オンターゲット／オフ腫瘍毒性のリスクが限定される。本発明は、Ｔ細胞に形質導入又は形質転換することができるＣＤ１ａ標的化部分を含むＣＡＲを提供する。得られるＣＡＲＴは、皮質Ｔ－ＡＬＬの治療に適している。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＣＤ１ａ陽性癌を治療する方法に使用される、（ｉ）ＣＤ１ａ標的化部分を含む細胞外ドメインであって、該ＣＤ１ａ標的化部分が、配列番号７のみからなるＶＬドメイン及び配列番号８のみからなるＶＨドメインを含むｓｃＦＶである、細胞外ドメインと、
（ｉｉ）膜貫通ドメインと、
（ｉｉｉ）細胞内シグナル伝達ドメインと、
を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を含むＴ細胞。
【請求項2】
前記膜貫通ドメインがＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７又はＣＤ１５４の膜貫通ドメインを含む、請求項１に記載の使用のためのＴ細胞。
【請求項3】
前記膜貫通ドメインがＣＤ８の膜貫通ドメインを含む、請求項２に記載の使用のためのＴ細胞。
【請求項4】
前記細胞内シグナル伝達ドメインがＣＤ３ζ、ＦｃＲγ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ又はＣＤ６６ｂの細胞内ドメインを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の使用のためのＴ細胞。
【請求項5】
前記細胞内シグナル伝達ドメインがＣＤ３ζの細胞内ドメインを含む、請求項４に記載の使用のためのＴ細胞。
【請求項6】
前記ＣＡＲが共刺激シグナル伝達ドメインを更に含み、好ましくは該共刺激シグナル伝達ドメインがＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ１３４、ＣＤ３０、ＣＤ４０、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＣＤ２７８又はＣＤ２７６の細胞内ドメインを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の使用のためのＴ細胞。
【請求項7】
前記共刺激シグナル伝達ドメインがＣＤ１３７の細胞内ドメインを含む、請求項６に記載の使用のためのＴ細胞。
【請求項8】
ＣＤ１ａ陽性癌を治療する方法に使用される、請求項１～７のいずれか一項に記載の複数の細胞と、薬学的に許容可能な担体又は希釈剤とを含む医薬組成物。
【請求項9】
前記ＣＤ１ａ陽性癌が皮質Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病、好ましくは再発性／難治性皮質Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病である、請求項１～７のいずれか一項に記載の使用のためのＴ細胞。
【請求項10】
前記ＣＤ１ａ陽性癌が皮質Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病、好ましくは再発性／難治性皮質Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病である、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項11】
前記ＣＤ１ａ陽性癌がＣＤ１ａ＋Ｔ細胞リンパ芽球性リンパ腫、好ましくは再発性／難治性ＣＤ１ａ＋Ｔ細胞リンパ芽球性リンパ腫である、請求項１～７のいずれか一項に記載の使用のためのＴ細胞。
【請求項12】
前記ＣＤ１ａ陽性癌がＣＤ１ａ＋Ｔ細胞リンパ芽球性リンパ腫、好ましくは再発性／難治性ＣＤ１ａ＋Ｔ細胞リンパ芽球性リンパ腫である、請求項８に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病及びＴ細胞リンパ芽球性リンパ腫等のＣＤ１ａ陽性癌の治療のための治療法を提供する。特に、本発明は、ＣＤ１ａを標的化することができるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞を提供する。
【背景技術】
【0002】
Ｔ細胞系列急性リンパ芽球性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）は、胸腺Ｔ細胞前駆体の白血病性形質転換に起因する悪性障害である１。Ｔ－ＡＬＬは、表現型的かつ遺伝的に不均一であり、一般に造血幹／前駆細胞（ＨＳＰＣ）の恒常性に関与する転写因子及びＴ細胞発生の主要制御因子の遺伝子変化／突然変異と関連する２。Ｔ－ＡＬＬは、小児及び成人において診断される全ての急性白血病のそれぞれ１０％～１５％及び２０％～２５％を占め３、４、診断時年齢中央値は９歳である５～７。集中的な化学療法レジメンによりＴ－ＡＬＬ患者の生存の改善がもたらされている。しかしながら、無イベント生存（ＥＦＳ）及び全生存（ＯＳ）は、７０％未満のままであり、再発性／難治性（Ｒ／Ｒ）Ｔ－ＡＬＬは、特に転帰が不良である。現在、造血細胞移植及び従来の化学療法よりも有力な治療選択肢は存在せず、これは毒性の大きなトレードオフと関係し４、８、新規の標的化療法の必要性が高まっている。Ｔ細胞リンパ芽球性リンパ腫（ＴＣＬ）は、Ｔ－ＡＬＬとは病因的かつ病原的に異なるが、表現型的には非常によく似ている。主な違いは、ＴＣＬが髄外に見られ、Ｔ－ＡＬＬが骨髄疾患であることである。
【0003】
免疫療法は、癌治療においてかつてないほどの期待を生み出し、癌に対する強力な武器として免疫系に依存する。近年では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に基づく養子細胞性免疫療法が大きな可能性を示している。ＣＡＲ療法では、遺伝子操作されたＴ細胞を、特定の抗原を発現する腫瘍細胞を主要組織適合遺伝子複合体とは独立して特異的に認識し、排除するようにリダイレクトする９、１０。ＣＤ１９又はＣＤ２２に対するＣＡＲ Ｔ細胞（ＣＡＲＴ）のリダイレクトの成功は、Ｂ細胞悪性腫瘍（主にＢ－ＡＬＬ）については現在議論の余地がない１１～１４。しかし、ＣＡＲＴを用いてＴ細胞悪性腫瘍を標的とする戦略は、ＣＡＲＴとＴ系列腫瘍細胞との間の標的抗原の共通発現のために困難なままである。この点で、汎Ｔ細胞抗原に対するＣＡＲＴは、ｉ）ＣＡＲＴの自己標的化／フラトリサイド（fratricide）、及びｉｉ）致死的な免疫不全につながるＴ細胞形成不全という２つの大きな欠点を有する１５～１７。
【0004】
最近の的確な研究から、最も発現される汎Ｔ細胞抗原であるＣＤ７、ＣＤ３、ＣＤ５又はＴＣＲ ＣＡＲのいずれかで形質導入したＴ細胞は、Ｔ－ＡＬＬ芽球をｉｎ ｖｉｔｒｏで効率的に排除し、疾患をｉｎ ｖｉｖｏで制御することが可能であることが実証されている１５～２０。それにもかかわらず、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集又はタンパク質発現ブロッカー等のアプローチは、依然として臨床には程遠く、広範な自己抗原により誘導されるフラトリサイドを回避するためにＣＡＲ形質導入の前にＴ細胞中の標的抗原の破壊を必要としていた１５～１７、１９。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
このため、Ｔ－ＡＬＬを首尾よく治療することができる療法が依然として必要とされている。本発明は、ＣＤ１ａ陽性Ｔ－ＡＬＬを治療する療法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0006】
Ｔ細胞をリダイレクトすることが望まれる抗原の選択は、正常Ｔ細胞と悪性Ｔ細胞との間のＴ細胞マーカーの共通発現と関連する問題を解決するための大きな進歩を示す。脂質提示分子であるＣＤ１ａが、Ｔ－ＡＬＬの大きなサブセット、すなわち皮質Ｔ－ＡＬＬの治療に適した標的であると特定した。
【0007】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの異種移植片モデルの両方でＴ－ＡＬＬ細胞株及び一次皮質ＣＤ１ａ＋Ｔ－ＡＬＬ細胞に対して強い細胞毒性を示すＣＤ１ａ特異的ＣＡＲＴを開発し、機能的に特性評価した。ＣＤ１ａ ＣＡＲＴは、モックＴ細胞と同様、連続的に２００倍に増加し、ＣＤ１ａ抗原に対するＣＡＲＴのリダイレクトがＴ細胞フラトリサイドを誘導しないことが実証された。また、皮質Ｔ－ＡＬＬへのＣＤ１ａ ＣＡＲＴの使用は、自己抗原により誘導されるフラトリサイドを回避する戦略としてＣＡＲ形質導入の前に精巧なゲノム編集に基づきＴ細胞中の標的抗原を破壊する必要性をなくす１５～１７、１９。定常状態の造血では、ＣＤ１ａが皮質ＣＤ３４＋ＣＤ７＋胸腺Ｔ前駆体のサブセットのみで発現され、より早期のＣＤ３４ｈｉｇｈＣＤ７ｈｉｇｈＴ前駆体がＣＤ１ａを欠いていることを更に実証した。加えて、複数の組織に由来する正常ＣＤ３４＋ＨＳＰＣも成熟Ｔ細胞も個体発生時にＣＤ１ａを発現せず、オンターゲット／オフ腫瘍毒性（on-target/off-tumor toxicity）のリスクが最小限に抑えられる。実際に、ヒト胎児胸腺由来のＣＤ７＋胸腺細胞をＣＤ１ａ ＣＡＲＴに曝露すると、ＣＤ１ａ＋皮質胸腺細胞のみがＣＤ１ａ ＣＡＲＴによって排除され、発生的により初期及び後期の胸腺Ｔ系列集団（ＣＤ３４＋及びＣＤ３４－）は標的化されず、オンターゲット／オフ腫瘍効果が皮質胸腺細胞の発生的に一時的な胸腺集団に限定され、ＣＤ１ａ ＣＡＲＴのフラトリサイド耐性が更に確認された。
【0008】
皮質胸腺細胞の排他的な胸腺局在性、及び生理学的／定常的に機能的Ｔ細胞に成熟するＣＤ３４＋ＣＤ７＋ＣＤ１ａ－Ｔ細胞前駆体の胸腺亜集団がＣＤ１ａ＋皮質胸腺細胞の上流に存在するという事実から、Ｒ／Ｒ Ｔ－ＡＬＬ患者におけるＣＤ１ａ ＣＡＲＴの使用について付加的なレベルの安全性がもたらされる。以下の理由からＣＤ１ａ ＣＡＲＴに起因する不可逆的毒性又は重度のＴ細胞形成不全は予期されない：ｉ）ＣＤ１ａ＋胸腺細胞集団は、一時的な胸腺Ｔ細胞画分であり、最終的に上流のＣＤ１ａ－Ｔ細胞前駆体によって再生する；ｉｉ）ＣＤ１ａ ＣＡＲＴ自体が通常はウイルス抗原に対して応答し、したがって病原体を防ぐ可能性がある；ｉｉｉ）ＣＤ５又はＣＤ７に対する特異抗体の臨床使用４２は、重度の又は不可逆的な毒性を示さなかった；ｉｖ）部分又は完全胸腺摘出を受けた患者において少なくとも部分的に免疫学的防御を保証し得る、Ｔ細胞の胸腺外成熟及び自然免疫系と適応免疫系との間のバランスを実証する複数の研究がある４５～４７。
【0009】
このため、一態様において、本発明は、ＣＤ１ａ標的化部分を含む細胞外ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。
【0010】
本発明は、本発明のＣＡＲをコードする核酸も提供する。さらに、本発明は、本発明の核酸及び／又はＣＡＲを含む細胞を提供する。また、本発明は、本発明による複数の細胞と、薬学的に許容可能な担体又は希釈剤とを含む医薬組成物を提供する。
【0011】
医薬として使用される本発明の細胞又は本発明の医薬組成物が提供される。特に、本発明は、本発明の細胞又は本発明の医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、ＣＤ１ａ陽性癌を治療する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】Ｔ－ＡＬＬにおけるＣＤ１ａ発現、並びに正常な造血及び胸腺細胞増殖を示す図である。（Ａ）指定のマーカーに対するデノボＴ－ＡＬＬサンプル（ｎ＝３８）の免疫表現型。上及び中間の波括弧は、それぞれＣＤ１ａ＋／＋＋及びＣＤ１ａｌｏｗ／＋ｃｏＴ－ＡＬＬ患者を特定する。下部の黒丸は、非ｃｏＴ－ＡＬＬ患者を表す。（Ｂ）ｃｏＴ－ＡＬＬ患者の代表的なＦＡＣＳドットプロット。ＣＤ７＋ＣＤ１ａ＋細胞は、ｃｏＴ－ＡＬＬ芽球であり、ＣＤ３＋ＣＤ７＋ＣＤ１ａ－（ＣＤ４＋又はＣＤ８＋のいずれか）は、診断サンプル中に存在する正常成熟Ｔ細胞である。（Ｃ）ＣＤ１ａは、再発時に保持される（ｎ＝５の診断－再発ｃｏＴ－ＡＬＬ対）。診断適合サンプルに対する再発サンプルにおけるＣＤ１ａ発現として示されるデータ（診断を１００％の発現として示す）。（Ｄ）Ｔ細胞及びＣＤ３４＋ＨＳＰＣは、個体発生全体にわたってＣＤ１ａを発現しない。（Ｅ）発生中の胸腺Ｔ細胞集団の表現型を示すスキーム。（Ｆ）前皮質（pre-cortical）（ＣＤ３４ｈｉｇｈＣＤ７＋＋ＣＤ１ａ－）及び皮質（ＣＤ３４＋ＣＤ７＋＋ＣＤ１ａ＋）胸腺細胞についての代表的なＦＡＣＳ。ＤＸ：診断。ＲＸ：再発。
【図2】ＣＤ１ａ ＣＡＲＴがｉｎ ｖｉｔｒｏでＣＤ１ａ＋Ｔ－ＡＬＬ細胞株を特異的に標的化し、排除することを示す図である。（Ａ）使用されるＣＤ１ａＣＡＲ構築物のスキーム。（Ｂ）抗ｓｃＦｖ ＭｏＡｂ及びＧＦＰを用いた２９３Ｔ細胞におけるＣＡＲ検出。（Ｃ）ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞における代表的なＣＡＲ形質導入及び検出（ｎ＝６）。（Ｄ）適当なＴ細胞活性化（ｎ＝３）。（Ｅ）モック又はＣＤ１ａ ＣＡＲのいずれかで形質導入した活性化Ｔ細胞の強い増加は、フラトリサイドの兆候を示さない（ｎ＝４）。（Ｆ）Ｊｕｒｋａｔ、ＭＯＬＴ４及びＮＡＬＭ６細胞株におけるＣＤ１ａ（黒線）の表面発現。（Ｇ）細胞株、一次ｃｏＴ－ＡＬＬサンプル及びプリモグラフト（primografts）におけるＣＤ１ａ抗原密度。（Ｈ）１６時間のアッセイにおける指定のＥ：Ｔ比でのｃｏＴ－ＡＬＬ及びＢ－ＡＬＬ細胞株に対するＣＤ１ａ ＣＡＲＴ及びモックＴ細胞の細胞毒性（ｎ＝４）。（Ｉ）１：１のＥ：Ｔ比での７２時間の細胞毒性アッセイにおいてＦＡＣＳによって測定された生存ｅＦｌｕｏｒ＋標的細胞の絶対数。（Ｊ）ｅＦｌｕｏｒ６７０で標識した標的細胞による細胞毒性の代表的なＦＡＣＳ分析。（Ｋ）１：１のＥ：Ｔ比での１６時間のアッセイにおいてＪｕｒｋａｔ及びＮＡＬＭ６（陰性対照）細胞に曝露したＣＤ１ａ ＣＡＲＴによる炎症性サイトカインＩＬ－２、ＴＮＦα及びＩＦＮγの高レベルの産生を示すＥＬＩＳＡ（ｎ＝４）。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図3】ＣＤ１ａ ＣＡＲＴがｉｎ ｖｉｔｒｏで一次サンプル又はＰＤＸモデルに由来するＣＤ１ａ＋Ｔ－ＡＬＬ芽球を特異的に標的化し、排除することを示す図である。（Ａ）一次患者／プリモグラフトに由来するｃｏＴ－ＡＬＬ芽球におけるＣＤ１ａ対ＣＤ７の発現。ＣＤ１ａ＋芽球の％を示す。（Ｂ）４：１のＥ：Ｔ比での４８時間の細胞毒性アッセイにおいてＦＡＣＳによって測定された（ｅＦｌｕｏｒ＋細胞の絶対数での）細胞毒性（ｎ＝３）。（Ｃ）ＣＤ１ａ ＣＡＲＴの特異性を明らかにする細胞毒性アッセイの終了時のｅＦｌｕｏｒ標識標的細胞におけるＣＤ１ａの代表的なＦＡＣＳ分析（ｎ＝３）。（Ｄ）４：１のＥ：Ｔ比での１６時間のアッセイにおけるＥＬＩＳＡによって分析されたＣＤ１ａ ＣＡＲＴによる炎症誘発性サイトカインの高レベルの産生（ｎ＝３つの独立した上清）。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図4】ＣＤ１ａ ＣＡＲＴがマウス異種移植片状況においてｃｏＴ－ＡＬＬ細胞の進行を完全に制御することを示す図である。（Ａ）異種移植片モデルのスキーム。ＮＳＧマウス（ｎ＝６匹／群）に３×１０６個のＬｕｃ－ＧＦＰ発現Ｊｕｒｋａｔ細胞をｉ．ｖ．注射し、続いて３日後に５×１０６個のモック又はＣＤ１ａ ＣＡＲＴの単回ｉ．ｖ．注射を行った。腫瘍負荷を４日～６日に１回、ＩＶＩＳイメージングを用いて生物発光（ＢＬＩ）によってモニタリングした。モック処理動物が完全に白血病となった時点で、ＣＤ１ａ ＣＡＲＴ処理動物の半数を屠殺し、白血病負荷及びＣＡＲＴ持続性についてＦＡＣＳ（ＢＭ、ＰＢ及び脾臓）によって分析した。残りの動物を６週間後に１．５×１０６個のＬｕｃ－Ｊｕｒｋａｔで再チャレンジし、それまでと同様に追跡した。（Ｂ）指定の時点でＢＬＩによってモニタリングした腫瘍負荷のＩＶＩＳイメージング。（Ｃ）指定の時点での全放射輝度定量化（ｐ／秒／ｃｍ２／ｓｒ）。†：屠殺。（Ｄ）ＣＡＲＴ注入の１７日後のＰＢにおける循環Ｊｕｒｋａｔ細胞。（Ｅ）１７日目のＰＢ、並びに屠殺時の脾臓及びＢＭにおけるＴ細胞持続性。データは平均±ＳＤとして示す（ｎ＝６匹のマウス／群）。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図5】ＣＤ１ａ ＣＡＲＴがＰＤＸ状況において一次ＣＤ１ａ＋ｃｏＴ－ＡＬＬ芽球の進行を完全に消滅させることを示す図である。（Ａ）ＰＤＸモデルのスキーム。ＮＳＧマウス（ｎ＝５匹又は６匹／群）に１×１０６個の一次ｃｏＴ－ＡＬＬ細胞をｉ．ｖ．注射し、続いて３日後に１×１０６個のモック又はＣＤ１ａ ＣＡＲＴの単回ｉ．ｖ．注射を行った。腫瘍負荷を２週間に１回ＦＡＣＳによって、６週間後及び９週間後に採血及びＢＭ吸引によってモニタリングした。（Ｂ、Ｃ）白血病マウスの頻度、並びにＣＡＲＴの注入の６週間後及び９週間後のＢＭ（Ｂ）及びＰＢ（Ｃ）における白血病のレベル。左パネルは代表的なＦＡＣＳプロットを示す。一次ＣＤ１ａ＋Ｔ－ＡＬＬ芽球は、ボックス内に示される（灰色）。エフェクターＴ細胞は、ボックス外に灰色で示される。マウス細胞は黒色で示される。（Ｄ）ＣＤ１ａ ＣＡＲＴ又はモックＴ細胞のいずれかを与えたｃｏＴ－ＡＬＬプリモグラフトの９週間のＯＳ。（Ｅ）ＰＢ（２週目～９週目）及びＢＭ（６週目及び９週目）における経時的なエフェクターＴ細胞持続性。各ドットは独立したマウスを表す。＊＊ｐ＜０．０１、マルコム－コックス（Malcolm-Cox）検定。
【図6】ＣＤ１ａ ＣＡＲＴが再チャレンジＰＤＸ状況においてＣＤ１ａ＋細胞株及びｃｏＴ－ＡＬＬ一次サンプルの進行を制御する能力を保持することを示す図である。（Ａ）再チャレンジしたマウスにおけるＪｕｒｋａｔ細胞負荷のＩＶＩＳイメージング。（Ｂ）Ｊｕｒｋａｔ細胞で再チャレンジしたマウスにおける経時的な全放射輝度定量化（ｐ／秒／ｃｍ２／ｓｒ）。（Ｃ）再チャレンジの１６日後のＰＢにおける循環Ｊｕｒｋａｔ細胞。（Ｄ）再チャレンジした動物の屠殺時のＰＢ、ＢＭ及び脾臓における強いエフェクターＴ細胞持続性。（Ｅ）ｃｏＴ－ＡＬＬ一次サンプルを用いた再チャレンジＰＤＸ実験のスキーム。ＣＡＲＴ担持ＰＤＸマウスを初回ＣＡＲＴ注入の７週間後に１×１０６個の一次ＣＤ１ａ＋Ｔ－ＡＬＬで再チャレンジした。（Ｆ）白血病再チャレンジの６週間後の生着したＰＢ（左パネル）及びＢＭ（右パネル）における二次ｃｏＴ－ＡＬＬ負荷。（Ｇ）ｃｏＴ－ＡＬＬ一次サンプルで再チャレンジしたＰＤＸに由来するＰＢ（２週目、４週目及び６週目）における経時的なエフェクターＴ細胞持続性。各ドットは独立したマウスを表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊＜０．０００１。
【図7】発症時のｃｏＴ－ＡＬＬ患者に由来するＣＤ１ａ ＣＡＲＴが自己ＣＤ１ａ＋Ｔ－ＡＬＬ芽球を特異的に溶解することを示す図である。（Ａ）自己細胞毒性アッセイの実験設計を示すスキーム。成熟（正常）ＣＤ３＋ＣＤ１ａ－Ｔ細胞をｃｏＴ－ＡＬＬ患者のＰＢからＦＡＣＳ精製し、ＣＤ１ａ ＣＡＲを感染させ、増加させ、自己全ＰＢＭＣに曝露した。（Ｂ）１：１及び４：１のＥ：Ｔでの４８時間の自己細胞毒性アッセイのＦＡＣＳ分析。ｅＦｌｕｏｒ６７０標識全ＰＢＭＣ標的集団は、ＣＤ１ａ＋Ｔ－ＡＬＬ芽球（上のボックス）及び成熟ＣＤ３＋ＣＤ１ａ－Ｔ細胞（下のボックス）を含有する。（Ｃ）ｃｏＴ－ＡＬＬ芽球（上のパネル）及びＣＤ３＋ＣＤ１ａ－成熟Ｔ細胞（下のパネル）についてのＣＤ１ａ ＣＡＲＴ媒介特異的溶解の定量化。（Ｄ）ＣＭＶ、ＥＢＶ及びインフルエンザ（ＣＥＦ）に由来するペプチドのプールで刺激したモック対ＣＤ１ａ ＣＡＲＴからのＩＦＮγ ＳＦＣの数を示すＥＬＩＳｐｏｔ。ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）を陽性対照として使用した。
【図8】本研究において提示した個々のＣＤ１ａ＋＋ｃｏＴ－ＡＬＬ患者のそれぞれについての免疫表現型を示す図である。（Ａ）成熟正常Ｔ細胞（ＣＤ４＋又はＣＤ８＋のいずれかのＣＤ３＋＋ＣＤ１ａ－）及びｃｏＴ－ＡＬＬ芽球（ＣＤ７＋ＣＤ１ａ＋）を区別するゲーティング戦略。ｃｏＴ－ＡＬＬ芽球が一般にＣＤ３及び／又はＣＤ４／ＣＤ８）の異常発現を有することに留意されたい。（Ｂ）成熟正常Ｔ細胞（左象限）及びｃｏＴ－ＡＬＬ芽球（右象限）のパーセンテージを示すｎ＝１６の利用可能なＣＤ１ａ＋＋ｃｏＴ－ＡＬＬ患者についてのＣＤ７／ＣＤ３対ＣＤ１ａのＦＡＣＳドットプロット。
【図9】ＣＤ１ａ ＣＡＲＴのｉｎ ｖｉｔｒｏ特異性を示す図である。（Ａ）本研究に使用されるＣＤ１ａＣＡＲ、ＣＤ２２ＣＡＲ及びモック構築物のスキーム。（Ｂ）ＣＤ１ａ ＣＡＲＴはＴ－ＡＬＬ細胞株Ｊｕｒｋａｔを溶解するが、ＣＤ２２ ＣＡＲＴはＪｕｒｋａｔを溶解しない。ＣＤ２２ ＣＡＲＴはＢ－ＡＬＬ株ＮＡＬＭ６を溶解するが、ＣＤ１ａ ＣＡＲＴはＮＡＬＭ６を溶解しない。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図10】ＣＤ１ａ ＣＡＲＴの用量依存的なｉｎ ｖｉｖｏ細胞毒性を示す図である。（Ａ）早期の効率的なＴ－ＡＬＬ生着が確認された、実験の開始時にＢＬＩによってモニタリングした腫瘍負荷（スケール：３×１０４ｐ／秒／ｃｍ２／ｓｒ～１×１０５ｐ／秒／ｃｍ２／ｓｒ）。（Ｂ）２×１０６ｐ／秒／ｃｍ２／ｓｒ及び５×１０６ｐ／秒／ｃｍ２／ｓｒのＣＡＲＴ用量について指定の時点でＢＬＩによってモニタリングした腫瘍負荷のＩＶＩＳイメージング。（Ｃ）２×１０６及び５×１０６のＣＡＲＴ用量についての指定の時点での全放射輝度定量化（ｐ／秒／ｃｍ２／ｓｒ）。Ｎ＝３匹又は４匹のマウス／群。†：屠殺。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図11】ＣＤ１ａ ＣＡＲＴがＣＤ７＋ＣＤ１ａ－胸腺細胞を標的化しないことを示す図である。胎児胸腺細胞に対する細胞毒性アッセイをＣＤ１ａ ＣＡＲＴ及びモックＴ細胞について４：１のＥ：Ｔで１６時間及び７２時間の時点で行った（ｎ＝２）。
【図12】ＣＤ１ａ－一次ｃｏＴ－ＡＬＬ細胞の絶対数がモック又はＣＤ１ａのいずれかのＣＡＲＴ曝露後に同一のままであることを示す図である。これによりＣＤ１ａ発現が免疫圧によって喪失／下方調節されなかったことが確認される。
【発明を実施するための形態】
【0013】
定義
患者に医薬を「投与する」又は患者への医薬の「投与」（及びこの表現と文法的に同等のもの）は、医療専門家による患者への投与若しくは自己投与であり得る直接投与、及び／又は薬物を処方する行為であり得る間接投与を指す。例えば、医薬を自己投与するよう患者に指示するか、又は患者に薬物を処方する医師が患者に薬物を投与する。
患者に医薬を「投与する」又は患者への医薬の「投与」（及びこの表現と文法的に同等のもの）は、医療専門家による患者への投与若しくは自己投与であり得る直接投与、及び／又は薬物を処方する行為であり得る間接投与を指す。例えば、医薬を自己投与するよう患者に指示するか、又は患者に薬物を処方する医師が患者に薬物を投与する。
【0014】
「アフィボディ（affibody）」という用語は、プロテインＡのＺドメインに由来し、特定の標的に結合するように改変されたタンパク質を指す（Frejd & Kim, 2017. Exp Mol Med. 49(3): e306を参照されたい）。
【0015】
「抗体」という用語は、特定の標的に結合するか、又は特定の標的と免疫学的に反応性の少なくとも１つの免疫グロブリンドメインを含む分子を指す。この用語は、全抗体及びその任意の抗原結合部分又は一本鎖、並びにそれらの組合せを含む。例えば、「抗体」という用語は、特に二価抗体及び二価二重特異性抗体を含む。
【0016】
典型的なタイプの抗体は、ジスルフィド結合によって相互接続した少なくとも２つの重鎖（「ＨＣ」）と２つの軽鎖（「ＬＣ」）とを含む。
【0017】
各「重鎖」は、「重鎖可変ドメイン」（本明細書にて「ＶＨ」と略される）及び「重鎖定常ドメイン」（本明細書にて「ＣＨ」と略される）を含む。重鎖定常ドメインは通例、３つの定常ドメインＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含む。
【0018】
各「軽鎖」は、「軽鎖可変ドメイン」（本明細書にて「ＶＬ」と略される）及び「軽鎖定常ドメイン」（「ＣＬ」）を含む。軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）は、κ型又はλ型であり得る。ＶＨドメイン及びＶＬドメインは、「フレームワーク領域」（「ＦＷ」）と称される、より保存された領域が散在する、相補性決定領域（「ＣＤＲ」）と称される超可変性の領域に更に細分することができる。
【0019】
ＶＨ及びＶＬは各々、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって以下の順序で配置された３つのＣＤＲ及び４つのＦＷから構成される：ＦＷ１、ＣＤＲ１、ＦＷ２、ＣＤＲ２、ＦＷ３、ＣＤＲ３、ＦＷ４。本開示は特に、ＶＨ配列及びＶＬ配列、並びにＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に対応する部分配列を提示する。
【0020】
所与のＣＤＲの正確なアミノ酸配列の境界は、Kabat et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest," 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD（「Kabat」ナンバリングスキーム）、Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273, 927-948（「Chothia」ナンバリングスキーム）に記載されているものを含む多数の既知のスキームのいずれかを用いて決定することができる。
【0021】
したがって、ＦＷ１、ＦＷ２、ＦＷ３及びＦＷ４の配列が等しく開示されることが当業者には理解される。特定のＶＨについて、ＦＷ１はＶＨのＮ末端とＨ－ＣＤＲ１のＮ末端との間の部分配列であり、ＦＷ２はＨ－ＣＤＲ１のＣ末端とＨ－ＣＤＲ２のＮ末端との間の部分配列であり、ＦＷ３はＨ－ＣＤＲ２のＣ末端とＨ－ＣＤＲ３のＮ末端との間の部分配列であり、ＦＷ４はＨ－ＣＤＲ３のＣ末端とＶＨのＣ末端との間の部分配列である。同様に、特定のＶＬについて、ＦＷ１はＶＬのＮ末端とＬ－ＣＤＲ１のＮ末端との間の部分配列であり、ＦＷ２はＬ－ＣＤＲ１のＣ末端とＬ－ＣＤＲ２のＮ末端との間の部分配列である。ＦＷ３はＬ－ＣＤＲ２のＣ末端とＬ－ＣＤＲ３のＮ末端との間の部分配列であり、ＦＷ４はＬ－ＣＤＲ３のＣ末端とＶＬのＣ末端との間の部分配列である。
【0022】
重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、結合標的と相互作用する領域を含有し、この結合標的と相互作用する領域は、本明細書にて「抗原結合部位」（"antigen-binding site" or "antigen binding site"）とも称される。抗体の定常ドメインは、免疫系の様々な細胞（例えばエフェクター細胞）及び古典的補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）を含む宿主組織又は宿主因子への抗体の結合を媒介することができる。本開示の例示的な抗体としては、典型的な抗体だけでなく、Ｆ（ａｂ’）２等のその二価フラグメント及び変形も挙げられる。
【0023】
本明細書にて使用される場合、「抗体」という用語は、無傷ポリクローナル抗体、無傷モノクローナル抗体、二価抗体フラグメント（Ｆ（ａｂ’）２等）、二重特異性抗体等の多重特異性抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、及び抗原結合部位を含む任意の他の修飾免疫グロブリン分子を包含する。
【0024】
抗体は、それぞれα、δ、ε、γ及びμと称されるそれらの重鎖定常ドメインの同一性に基づいて、免疫グロブリンの５つの主要クラス（アイソタイプ）：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ、又はそのサブクラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）のいずれかとすることができる。異なるクラスの免疫グロブリンは、異なる既知のサブユニット構造及び三次元配置を有する。抗体は、裸であっても、又は治療剤若しくは診断剤等の他の分子とコンジュゲートして免疫複合体を形成してもよい。
【0025】
「アンチカリン（anticalin）」という用語は、リポカリンに由来し、特定の標的に結合するように改変されたタンパク質を指す（Skerra, 2008. FEBS J. 275(11):2677-83を参照されたい）。
【0026】
「抗原結合フラグメント」又は「Ｆａｂ」という用語は、重鎖及び軽鎖の各々の１つの定常ドメイン及び１つの可変ドメインを含む抗体フラグメントを指す。Ｆａｂフラグメントは、無傷モノクローナル抗体をパパインで消化することによって得ることができる。
【0027】
「癌」という用語は、生理的機能を有さず、無制御の、通常は急速な細胞増殖によって生じ、身体の他の部分に侵入又は転移する可能性がある、組織の任意の異常な良性又は悪性の新生物として定義され得る疾患群を指す。
【0028】
「ＣＤ１ａ」という用語は、β２－ミクログロブリンと関連して発現される非多型ＭＨＣクラス１関連細胞表面糖タンパク質を指す。ＣＤ１ａは皮質胸腺細胞、ランゲルハンス細胞及び指状嵌入細胞によって発現される。ＣＤ１ａは、Ｔ細胞系列の一部の悪性腫瘍及びランゲルハンス細胞組織球症でも発現される。ＣＤ１ａは皮質胸腺細胞、表皮ランゲルハンス細胞、樹状細胞、或る特定のＴ細胞白血病及び様々な他の組織において発現される。ＣＤ１ａは、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）タンパク質と構造的に関連し、β２－ミクログロブリンとヘテロ二量体を形成する。ヒトＣＤ１ａに関する例示的な配列及びデータは、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢデータベースにＩＤ番号Ｐ０６１２６で寄託されている。
【0029】
「ＣＤ１ａ陽性」癌性疾患を含む「ＣＤ１ａ陽性」癌は、ＣＤ１ａが細胞表面に存在する細胞を含む癌である。「ＣＤ１ａ陽性」という用語は、本発明のＣＡＲを含む細胞が、ＣＤ１ａへのＣＡＲの結合によって媒介される治療効果を有するのに十分なレベルのＣＤ１ａを細胞の表面に産生する癌も指す。幾つかの実施形態において、ＣＤ１ａ陽性癌は、皮質Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病及びＴ細胞リンパ芽球性リンパ腫又はランゲルハンス細胞組織球症（ＬＣＨ）である。
【0030】
「ＣＤ１ａ標的化部分」という用語は、ＣＤ１ａに結合することが可能な物質を指す。ＣＡＲとの関連で、ＣＤ１ａ標的化部分は、Ｔ細胞をＣＤ１ａ陽性細胞、好ましくは癌細胞に標的化する。ＣＡＲとの関連で、ＣＤ１ａ標的化部分が遺伝的にコード可能であることを理解されたい。
【0031】
「キメラ抗原受容体」又は「ＣＡＲ」という用語は、Ｔ細胞を選ばれた抗原に標的化し、Ｔ細胞の機能、代謝及び持続性をリプログラミングする合成受容体を指す（Riviere & Sadelain, 2017. Mol Ther. 25(5):1117-1124を参照されたい）。同様に、「ＣＡＲＴ」という用語は、ＣＡＲを含むＴ細胞を指す。
【0032】
「併用療法」、「と組み合わせて」又は「と併用して」は、本明細書にて使用される場合、少なくとも２つの異なる治療モダリティ（modalities）（すなわち化合物、構成要素、標的化剤又は治療剤）による任意の形態の併用、並行、同時、連続又は間欠的治療を表す。そのため、これらの用語は、被験体への一方の治療モダリティの実施の前、その間又はその後の他方の治療モダリティの実施を指す。組合せでのモダリティは、任意の順序で投与することができる。治療効果のあるモダリティは、共に（例えば、同じ又は別個の組成物、配合物又は単位剤形において同時に）又は別個に（例えば、同じ日又は異なる日に、別個の組成物、配合物又は単位剤形に適切な投与プロトコルに従って任意の順序で）、医療従事者によって処方される又は規制機関に従う方式及び投与計画で実施される。概して、各治療モダリティは、その治療モダリティについて決定される用量及び／又は日程で実施される。任意に、３つ以上のモダリティを併用療法において用いてもよい。さらに、本明細書にて提供される併用療法は、他のタイプの治療と併用することができる。例えば、他の抗癌治療は、被験体に対する現在の標準治療と関連する幾つかの治療の中でも化学療法、外科手術、放射線療法（放射線）及び／又はホルモン療法からなる群より選択することができる。
【0033】
「完全奏効」又は「完全寛解」又は「ＣＲ」は、ＲＥＣＩＳＴ ｖ１．１ガイドラインにおいて規定される全ての標的病変の消失を示す。これは必ずしも癌が治癒したことを意味するわけではない。
【0034】
「共刺激シグナル伝達ドメイン」という用語は、例えばＴＣＲ／ＣＤ３複合体のＣＤ３ζ鎖によって与えられる一次シグナルに加えて、活性化、増殖、分化、サイトカイン分泌等を含むが、これらに限定されないＴ細胞応答を媒介するシグナルをＴ細胞に与えるシグナル伝達部分を指す。共刺激ドメインは、限定されるものではないが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、及びＣＤ８３と特異的に結合するリガンドの全て又は一部を含み得る。幾つかの実施形態において、共刺激シグナル伝達ドメインは、他の細胞内メディエーターと相互作用して、活性化、増殖、分化及びサイトカイン分泌等を含む細胞応答を媒介する細胞内シグナル伝達ドメインである。
【0035】
「設計アンキリンリピートタンパク質（designed ankyrin repeat proteins）」又は「ＤＡＲＰｉｎ」という用語は、アンキリンリピートに由来し、特定の標的に結合するように改変されたタンパク質を指す（Plueckthun, 2015. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 55:489-511を参照されたい）。
【0036】
「無病生存」（ＤＦＳ）は、患者が無病のままである治療中及び治療後の期間を指す。
【0037】
本明細書にて使用される場合、作用物質、例えばＣＡＲＴ等の治療剤の「有効量」という用語は、有益な又は所望の結果、例えば臨床結果をもたらすのに十分な量であり、このため、「有効量」は、それが適用される状況に左右される。例えば、Ｔ－ＡＬＬを治療する治療剤を投与する状況では、有効量は、癌細胞の数を減少させ、腫瘍サイズ若しくは負荷を減少させ、末梢器官への癌細胞の浸潤を阻害し（すなわち、或る程度遅らせ、或る特定の実施形態においては停止させる）、腫瘍転移を阻害し（すなわち、或る程度遅らせ、或る特定の実施形態においては停止させる）、腫瘍成長を或る程度阻害し、癌と関連する症状の１つ以上を或る程度緩和し、及び／又は無進行生存（ＰＦＳ）、無病生存（ＤＦＳ）若しくは全生存（ＯＳ）の増大、完全奏効（ＣＲ）、部分奏効（ＰＲ）、若しくは場合によっては病勢安定（ＳＤ）、進行性疾患（ＰＤ）の減少、進行までの時間（ＴＴＰ）の短縮、若しくはそれらの任意の組合せ等の有利な応答をもたらすことができる。「有効量」という用語は、「有効用量」、「治療有効量」又は「治療有効用量」と区別なく使用することができる。
【0038】
「フィノマー（fynomer）」という用語は、ヒトＦｙｎキナーゼのＳＨ３ドメインに由来し、特定の標的に結合するように改変されたタンパク質を指す（Bertschinger et al., 2007. Protein Eng Des Sel. 20(2):57-68を参照されたい）。
【0039】
「個体」、「患者」又は「被験体」という用語は、ヒトを指定するために本出願において区別なく使用され、決して限定することを意図するものではない。「個体」、「患者」又は「被験体」は、任意の年齢、性別及び身体状態であってもよい。「それを必要とする患者」という用語は、通常はＣＤ１ａ陽性癌を患う患者を指す。
【0040】
「注入」又は「注入する」は、治療目的での静脈を介した体内への治療剤を含有する溶液の導入を指す。概して、これは静注バッグ（intravenous bag）によって達成される。
【0041】
「細胞内シグナル伝達ドメイン」は、本明細書にて使用される場合、リンパ球の活性化をもたらす分子（ここではキメラ受容体分子）の１つ以上のドメインの全て又は一部を指す。かかる分子の細胞内ドメインは、細胞メディエーターと相互作用することによってシグナルを媒介し、増殖、分化、活性化及び他のエフェクター機能をもたらす。本発明のＣＡＲに使用される細胞内シグナル伝達ドメインの例としては、ＣＤ３ζ鎖の細胞内配列、及び／又はＣＡＲ連結後にシグナル伝達を開始するように協調して作用する補助受容体、並びにこれらの配列の任意の誘導体又は変異体、並びに同じ機能を有する任意の合成配列が挙げられる。Ｔ細胞活性化は、抗原依存性一次活性化を開始し、Ｔ細胞受容体様シグナルを与える配列（一次細胞質シグナル伝達配列）及び抗原非依存的に作用し、二次又は共刺激シグナルを与える配列（二次細胞質シグナル伝達配列）の２つの異なるクラスの細胞質シグナル伝達配列によって媒介されると言える。刺激性に作用する一次細胞質シグナル伝達配列は、受容体チロシン活性化モチーフ又はＩＴＡＭとして知られるシグナル伝達モチーフを含有し得る。ＩＴＡＭを含有する一次細胞質シグナル伝達配列の例としては、ＣＤ３ζ、ＦｃＲγ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ及びＣＤ６６ｄに由来するものが挙げられる。
【0042】
「モノボディ（monobody）」という用語は、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメインに由来し、特定の標的に結合するように改変されたタンパク質を指す（Koide et al., 2013. J Mol Biol. 415(2):393-405を参照されたい）。
【0043】
「ナノボディ」という用語は、重鎖抗体、好ましくはラクダ科重鎖抗体の可溶性単一抗原結合Ｖドメインを含むタンパク質を指す（Bannas et al., 2017. Front Immunol. 8:1603を参照されたい）。
【0044】
「全生存」（ＯＳ）は、患者の登録から死亡又は判明している最後の生存日で打ち切られるまでの期間を指す。ＯＳは、未投与又は未治療の個体又は患者と比較した平均余命の延長を含む。全生存は、例えば診断又は治療の時点から１年、５年等の規定の期間にわたって患者が生存し続ける状況を指す。
【0045】
「部分奏効」又は「ＰＲ」は、ＲＥＣＩＳＴ ｖ１．１ガイドラインにおいて規定される、治療に応答した、ベースライン直径和を参照として少なくとも３０％の標的病変の直径の和の減少を指す。
【0046】
「ペプチドアプタマー」という用語は、特定の標的に結合することができる短い５～２０アミノ酸残基の配列を指す。ペプチドアプタマーは通例、安定したタンパク質足場のループ領域内に挿入される（Reverdatto et al., 2015. Curr Top Med Chem. 15(12):1082-101を参照されたい）。
【0047】
本明細書にて使用される場合に、「薬学的に許容可能な担体」又は「薬学的に許容可能な希釈剤」は、医薬品投与と適合可能な任意の全ての溶剤、分散媒、コーティング剤、抗細菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤を意味する。医薬品活性物質用のそのような媒体及び作用物質の使用は、当該技術分野でよく知られている。許容可能な担体、賦形剤又は安定剤は、使用される投与量及び濃度でレシピエントに対して非毒性であり、本発明の範囲を限定するものではないが、追加の緩衝剤、保存剤、共溶媒、アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤、ＥＤＴＡ等のキレート化剤、金属複合体（例えば、Ｚｎ－タンパク質複合体）、ポリエステル類等の生分解性ポリマー、ナトリウム、多価糖アルコール等の塩形成対イオン、アラニン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、オルニチン、ロイシン、２－フェニルアラニン、グルタミン酸及びトレオニン等のアミノ酸、ラクチトール、スタキオース、マンノース、ソルボース、キシロース、リボース、リビトール、ミオイニシトース（myoinisitose）、ミオイニシトール（myoinisitol）、ガラクトース、ガラクチトール、グリセロール、シクリトール類（例えば、イノシトール）、ポリエチレングリコール等の有機糖類又は糖アルコール、尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、α－モノチオグリセロール及びチオ硫酸ナトリウム等の硫黄含有還元剤、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチン又は他の免疫グロブリン等の低分子量タンパク質、並びにポリビニルピロリドン等の親水性ポリマーが挙げられる。Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)に記載されるもののような他の薬学的に許容可能な担体、賦形剤又は安定剤が、医薬組成物の所望の特性に悪影響を及ぼさない限りにおいて、本明細書に記載される医薬組成物に含まれていてもよい。
【0048】
「進行性疾患」又は「進行した疾患」は、ＲＥＣＩＳＴ ｖ１．１ガイドラインにおいて規定される、もう１つの新たな病変若しくは腫瘍の出現及び／又は既存の非標的病変の明白な進行を指す。進行性疾患又は進行した疾患は、腫瘍の量又は広がりのいずれかの増大による治療開始からの２０パーセントを超える腫瘍成長を指す場合もある。
【0049】
「無進行生存」（ＰＦＳ）は、登録から疾患の進行又は死亡までの期間を指す。ＰＦＳは概して、カプラン－マイヤー法及び固形癌効果判定基準（Response Evaluation Criteria in Solid Tumors：ＲＥＣＩＳＴ）１．１標準を用いて測定される。概して、無進行生存は、癌が増悪することなく患者が生存し続ける状況を指す。
【0050】
「ＲＥＣＩＳＴ」という用語は、固形癌効果判定基準を意味する。ＲＥＣＩＳＴガイドライン、基準又は標準は、成人及び小児癌の臨床試験に用いられる腫瘍サイズの変化の客観的評定のための固形腫瘍の測定及び定義の標準アプローチを記載している。ＲＥＣＩＳＴ ｖ１．１は、改訂ＲＥＣＩＳＴガイドラインのバージョン１．１を意味し、European Journal of Cancers 45 (2009) 228-247に公開されている。
【0051】
「リピボディ（repebody）」という用語は、ロイシンリッチリピートモジュールに由来し、特定の標的に結合するように改変されたタンパク質を指す（Lee et al., 2012. PNAS. 109(9): 3299-3304を参照されたい）。
【0052】
「有利に応答する」という用語は概して、被験体において有益な状態を生じることを指す。癌治療に関して、この用語は、被験体に対して治療効果をもたらすことを指す。癌における好ましい治療効果は、多数の方法で測定することができる（Weber, 2009. J Nucl Med. 50 Suppl 1:1S-10Sを参照されたい）。例えば、腫瘍成長阻害、分子マーカー発現、血清マーカー発現及び分子イメージング技術は全て、抗癌治療法の治療効力を評定するために用いることができる。腫瘍成長阻害に関して、ＮＣＩ標準によると、Ｔ／Ｃ≦４２％が抗腫瘍活性の最低レベルである。Ｔ／Ｃ＜１０％は、高い抗腫瘍活性レベルとみなされ、Ｔ／Ｃ（％）＝治療した場合の腫瘍体積中央値／対照の腫瘍体積中央値×１００である。有利な応答は、例えば無進行生存（ＰＦＳ）、無病生存（ＤＦＳ）若しくは全生存（ＯＳ）の増大、完全奏効（ＣＲ）、部分奏効（ＰＲ）、若しくは場合によっては病勢安定（ＳＤ）、進行性疾患（ＰＤ）の減少、進行までの時間（ＴＴＰ）の短縮、又はそれらの任意の組合せによって評定することができる。
【0053】
「配列同一性」という用語は、ペアワイズ配列アラインメントツールを用いて２つの配列を比較した場合に得られるパーセンテージ値を指す。本件では、配列同一性は、デフォルト設定を用いるグローバルアラインメントツール「ＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅ」を用いて得られる（Rice et al., 2000. Trends Genet. 16(6):276-7、Li et al., 2015. Nucleic Acids Res. 43(W1):W580-4）。グローバルアラインメントツールは、https://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/で利用可能である。
【0054】
「一本鎖抗原結合フラグメント」又は「ｓｃＦａｂ」という用語は、抗体の重鎖の１つの可変ドメイン及び１つの定常ドメインに付着した抗体の軽鎖の１つの可変ドメイン及び１つの定常ドメインを含み、重鎖及び軽鎖が短ペプチドによって連結した融合タンパク質を指す。
【0055】
「一本鎖可変フラグメント」又は「ｓｃＦｖ」という用語は、ペプチドリンカーによって互いに連結した抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメインを含む融合タンパク質を指す。この用語は、ジスルフィド安定化Ｆｖ（ｄｓＦｖ）も含む。ジスルフィド結合によってｓｃＦｖを安定化する方法は、Reiter et al., 1996. Nat Biotechnol. 14(10):1239-45に開示されている。
【0056】
「病勢安定」は、ＲＥＣＩＳＴ ｖ１．１ガイドラインにおいて規定される、進行又は再発のない疾患を指す。病勢安定では、部分奏効とみなすのに十分な腫瘍縮小も、進行性疾患とみなすのに十分な腫瘍増加も見られない。
【0057】
「腫瘍進行までの時間」（ＴＴＰ）は、登録から疾患の進行までの時間として規定される。ＴＴＰは概して、ＲＥＣＩＳＴ ｖ１．１基準を用いて測定される。
【0058】
本出願で使用される「治療」及び「療法」という用語は、疾患及び／又は症状を治癒及び／又は緩和する目的と共に健康上の問題の改善を目標として使用される一連の衛生的手段、薬理学的手段、外科的手段及び／又は物理的手段を指す。「治療」及び「療法」という用語には、予防法及び治癒法が含まれる。それというのも、両者とも個体又は動物の健康の維持及び／又は回復に向けられるからである。症状、疾患及び廃疾の原因にかかわらず、健康上の問題を軽減及び／又は治癒するために適した医薬の投与は、本出願の文脈内の治療又は療法の形として解釈されるべきである。
【0059】
キメラ抗原受容体
一態様において、本発明は、ＣＤ１ａ標的化部分を含む細胞外ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。
一態様において、本発明は、ＣＤ１ａ標的化部分を含む細胞外ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。
【0060】
ＣＤ１ａ標的化部分
幾つかの実施形態において、ＣＤ１ａ標的化部分は抗体、アンチカリン、リピボディ、モノボディ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦａｂ、アフィボディ、フィノマー、ＤＡＲＰｉｎ、ナノボディ、又はＣＤ１ａに特異的に結合するペプチドアプタマーである。
幾つかの実施形態において、ＣＤ１ａ標的化部分は抗体、アンチカリン、リピボディ、モノボディ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦａｂ、アフィボディ、フィノマー、ＤＡＲＰｉｎ、ナノボディ、又はＣＤ１ａに特異的に結合するペプチドアプタマーである。
【0061】
ＣＤ１ａに特異的に結合する結合分子は、上述の障害の診断及び治療に非常に有用であり得る。ＣＤ１ａに対する幾つかのマウスモノクローナル抗体が本分野で知られている（Kelly (1994)、Amiot et al. (1986)、Furue et al. (1992)）。しかしながら、マウス抗体は、ｉｎ ｖｉｖｏ使用については、短い血清半減期、或る特定のヒトエフェクター機能を誘発することができないこと、及びマウス抗体に対する望ましくない免疫応答の発生等のヒトへのマウス抗体の投与に関連する問題のために限定される（Van Kroonenburgh and Pauwels (1988)）。これらの前述した欠点を克服する新たなヒト抗体が近年開発されている（Bechan (2012)及びGitanjali (2005)）。ＮＡ１／３４．ＨＬＫに加えて、他のハイブリドーマ、例えばSIGMA ALDRICHのＯＫＴ６（ＩｇＧ１アイソタイプ）が市販されている。
【0062】
以下を参照されたい：
Amiot M., Bernard A., Raynal B., Knapp W., Deschildre C. and Boumsell L. (1986), J. Immunol. 136:1752-1757.
Furue M., Nindl M., Kawabe K., Nakamura K., Ishibashi Y. and Sagawa K. (1992), J. Am. Acad. Dermatol. 27:419-42
Kelly K. M., Beverly P. C., Chu A. C., Davenport V., Gordon I., Smith M. and Pritchard J. (1994), J. Pediatr. 125:717-722
Van Kroonenburgh M. J. and Pauwels E. K. (1988), Nucl. Med. Commun. 9:919-930.
Gitanjali Bechan, David W. Lee, R. Maarten Egeler and Robert J. Arceci Blood 2005 106:4815
Bechan, G. I., Lee, D. W., Zajonc, D. M., Heckel, D. , Xian, R. , Throsby, M. , Meijer, M. , Germeraad, W. T., Kruisbeek, A. M., Maarten Egeler, R. and Arceci, R. J. (2012), Br J Haematol, 159: 299-310.
Amiot M., Bernard A., Raynal B., Knapp W., Deschildre C. and Boumsell L. (1986), J. Immunol. 136:1752-1757.
Furue M., Nindl M., Kawabe K., Nakamura K., Ishibashi Y. and Sagawa K. (1992), J. Am. Acad. Dermatol. 27:419-42
Kelly K. M., Beverly P. C., Chu A. C., Davenport V., Gordon I., Smith M. and Pritchard J. (1994), J. Pediatr. 125:717-722
Van Kroonenburgh M. J. and Pauwels E. K. (1988), Nucl. Med. Commun. 9:919-930.
Gitanjali Bechan, David W. Lee, R. Maarten Egeler and Robert J. Arceci Blood 2005 106:4815
Bechan, G. I., Lee, D. W., Zajonc, D. M., Heckel, D. , Xian, R. , Throsby, M. , Meijer, M. , Germeraad, W. T., Kruisbeek, A. M., Maarten Egeler, R. and Arceci, R. J. (2012), Br J Haematol, 159: 299-310.
【0063】
抗体を生成するファージディスプレイ及びコンビナトリアル方法が当該技術分野で既知である（例えば、Ladner et al.の米国特許第５，２２３，４０９号、Kang et al.の国際公開第９２／１８６１９号、Dower et al.の国際公開第９１／１７２７１号、Winter et al.の国際公開第９２／２０７９１号、Markland et al.の国際公開第９２／１５６７９号、Breitling et al.の国際公開第９３／０１２８８号、McCafferty et al.の国際公開第９２／０１０４７号、Garrard et al.の国際公開第９２／０９６９０号、Ladner et al.の国際公開第９０／０２８０９号、Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372、Hay et al. (1992) Hum Antibod Hybridomas 3:81-85、Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281、Griffths et al. (1993) EMBO J 12:725-734、Hawkins et al. (1992) J Mol Biol 226:889-896、Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628、Gram et al. (1992) PNAS 89:3576-3580、Garrad et al. (1991) Bio/Technology 9:1373-1377、Hoogenboom et al. (1991) Nuc Acid Res 19:4133-4137及びBarbas et al. (1991) PNAS 88:7978-7982に記載され、これらのいずれの内容も引用することにより本明細書の一部をなす）。
【0064】
さらに、特定の標的に結合する非免疫グロブリン足場を生成及び選択する方法が当該技術分野で既知である（例えば、Skrlec, et al., 2015. Trends Biotechnol. 33(7):408-18を参照されたい）。
【0065】
幾つかの実施形態において、ＣＤ１ａ標的化部分は、ＶＬドメインとＶＨドメインとを含む抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ又はｓｃＦａｂであり、該ＶＬドメインはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３ポリペプチドを含み、該ＶＨドメインはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３ポリペプチドを含み、ＬＣＤＲ１は［ＱＤＩＮＫＹ］（配列番号１）のみからなり、ＬＣＤＲ２は［ＹＴＳ］のみからなり、ＬＣＤＲ３は［ＬＨＹＤＮＬＰＷＴ］（配列番号３）のみからなり、ＨＣＤＲ１は［ＧＹＡＦＳＴＹＴ］（配列番号４）のみからなり、ＨＣＤＲ２は［ＩＮＰＮＳＡＳＴ］（配列番号５）のみからなり、ＨＣＤＲ３は［ＡＲＧＦＹＴＭＤＹ］（配列番号６）のみからなる。
【0066】
幾つかの実施形態において、ＣＤ１ａ標的化部分は、ＶＬドメインとＶＨドメインとを含むｓｃＦｖであり、該ＶＬドメインはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３ポリペプチドを含み、該ＶＨドメインはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３ポリペプチドを含み、ＬＣＤＲ１は［ＱＤＩＮＫＹ］（配列番号１）のみからなり、ＬＣＤＲ２は［ＹＴＳ］のみからなり、ＬＣＤＲ３は［ＬＨＹＤＮＬＰＷＴ］（配列番号３）のみからなり、ＨＣＤＲ１は［ＧＹＡＦＳＴＹＴ］（配列番号４）のみからなり、ＨＣＤＲ２は［ＩＮＰＮＳＡＳＴ］（配列番号５）のみからなり、ＨＣＤＲ３は［ＡＲＧＦＹＴＭＤＹ］（配列番号６）のみからなる。
【0067】
幾つかの実施形態において、ＣＤ１ａ標的化部分は、ＶＬドメインとＶＨドメインとを含む抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ又はｓｃＦａｂであり、ＶＬドメインは配列番号７のみからなり、ＶＨドメインは配列番号８のみからなる。
【0068】
幾つかの実施形態において、ＣＤ１ａ標的化部分は、ＶＬドメインとＶＨドメインとを含むｓｃＦｖであり、ＶＬドメインは配列番号７のみからなり、ＶＨドメインは配列番号８のみからなる。
【0069】
ＶＬドメイン（配列番号７）
[RDIQMTQSPSSLSASLGGKVTITCQASQDINKYIAWYQFKPGKGPRLLIHYTSTLQPAIPSRFSGSGSGREYSFSISNLEPEDIATYYCLHYDNLPWTFGGGTKLEIKRA]
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【0070】
ＶＨドメイン（配列番号８）
[QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYAFSTYTMHWVKQRPRQGLEWIGYINPNSASTSYNENFKDKATLTADKSSNTAYMHLSSLTSEDSAVYYCARGFYTMDYWGQGTSVTVSS]
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【0071】
幾つかの実施形態において、ＣＤ１ａ標的化部分は、配列番号９を含むか又はそれのみからなるｓｃＦｖである。
【0072】
クローンＮＡ１／３４．ＨＬＫに由来するｓｃＦｖ（配列番号９）
[QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYAFSTYTMHWVKQRPRQGLEWIGYINPNSASTSYNENFKDKATLTADKSSNTAYMHLSSLTSEDSAVYYCARGFYTMDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSRDIQMTQSPSSLSASLGGKVTITCQASQDINKYIAWYQFKPGKGPRLLIHYTSTLQPAIPSRFSGSGSGREYSFSISNLEPEDIATYYCLHYDNLPWTFGGGTKLEIKRA]
[QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYAFSTYTMHWVKQRPRQGLEWIGYINPNSASTSYNENFKDKATLTADKSSNTAYMHLSSLTSEDSAVYYCARGFYTMDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSRDIQMTQSPSSLSASLGGKVTITCQASQDINKYIAWYQFKPGKGPRLLIHYTSTLQPAIPSRFSGSGSGREYSFSISNLEPEDIATYYCLHYDNLPWTFGGGTKLEIKRA]
【0073】
膜貫通ドメイン
膜貫通ドメインは、天然供給源又は合成供給源のいずれに由来していてもよい。供給源が天然である場合、ドメインは任意の膜結合又は膜貫通タンパク質に由来し得る。膜貫通領域は、少なくともＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７又はＣＤ１５４のα鎖、β鎖又はζ鎖の膜貫通領域（複数の場合もある）を含み得る。
膜貫通ドメインは、天然供給源又は合成供給源のいずれに由来していてもよい。供給源が天然である場合、ドメインは任意の膜結合又は膜貫通タンパク質に由来し得る。膜貫通領域は、少なくともＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７又はＣＤ１５４のα鎖、β鎖又はζ鎖の膜貫通領域（複数の場合もある）を含み得る。
【0074】
膜貫通ドメインは、合成であっても又は自然発生膜貫通ドメインの変異体であってもよい。幾つかの実施形態において、合成又は変異体膜貫通ドメインは、主にロイシン及びバリン等の疎水性残基を含む。
【0075】
幾つかの実施形態において、膜貫通ドメインはＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４の膜貫通ドメイン、又はそれらの変異体を含み、それらの変異体は９５％の配列同一性を有する。
【0076】
幾つかの実施形態において、膜貫通ドメインはＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４の膜貫通ドメイン、又はそれらの変異体を含み、それらの変異体は９８％の配列同一性を有する。
【0077】
幾つかの実施形態において、膜貫通ドメインはＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、又はＣＤ１５４の膜貫通ドメインを含む。
【0078】
幾つかの実施形態において、膜貫通ドメインは、ＣＤ８の膜貫通ドメイン又はその変異体を含み、その変異体は９５％の配列同一性を有する。
【0079】
幾つかの実施形態において、膜貫通ドメインは、ＣＤ８の膜貫通ドメイン又はその変異体を含み、その変異体は９８％の配列同一性を有する。
【0080】
幾つかの実施形態において、膜貫通ドメインは、ＣＤ８の膜貫通ドメインを含む。
【0081】
幾つかの実施形態において、膜貫通ドメインは、配列番号１０又は配列番号１０に対して９５％の配列同一性を有する配列を含む。
【0082】
幾つかの実施形態において、膜貫通ドメインは、配列番号１０又は配列番号１０に対して９８％の配列同一性を有する配列を含む。
【0083】
幾つかの実施形態において、膜貫通ドメインは、配列番号１０を含む。幾つかの実施形態において、膜貫通ドメインは、配列番号１０のみからなる。
【0084】
ＣＤ８に由来する膜貫通ドメイン（配列番号１０）
[TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC]
[TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC]
【0085】
細胞内シグナル伝達ドメイン
細胞内シグナル伝達ドメインは、腫瘍細胞上で発現されるリガンドへの結合後にＣＡＲを発現する細胞の少なくとも１つの機能の活性化をもたらす。幾つかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインを含有する。幾つかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲを含む細胞の少なくとも１つの機能の活性化をもたらす細胞内シグナル伝達ドメインの一部及び／又は変異体である。
細胞内シグナル伝達ドメインは、腫瘍細胞上で発現されるリガンドへの結合後にＣＡＲを発現する細胞の少なくとも１つの機能の活性化をもたらす。幾つかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインを含有する。幾つかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲを含む細胞の少なくとも１つの機能の活性化をもたらす細胞内シグナル伝達ドメインの一部及び／又は変異体である。
【0086】
幾つかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζ、ＦｃＲγ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ６６ｂの細胞内ドメイン、又はそれらの変異体を含み、それらの変異体は９５％の配列同一性を有する。
【0087】
幾つかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζ、ＦｃＲγ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ６６ｂの細胞内ドメイン、又はそれらの変異体を含み、それらの変異体は９８％の配列同一性を有する。
【0088】
幾つかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζ、ＦｃＲγ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、又はＣＤ６６ｂの細胞内ドメインを含む。
【0089】
幾つかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζの細胞内ドメイン又はその変異体を含み、その変異体は９５％の配列同一性を有する。
【0090】
幾つかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζの細胞内ドメイン又はその変異体を含み、その変異体は９８％の配列同一性を有する。
【0091】
幾つかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζの細胞内ドメインを含む。
【0092】
幾つかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号１１又は配列番号１１に対して９５％の配列同一性を有する配列を含む。
【0093】
幾つかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号１１又は配列番号１１に対して９８％の配列同一性を有する配列を含む。
【0094】
幾つかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号１１又は配列番号１１に対して９９％の配列同一性を有する配列を含む。
【0095】
幾つかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号１１を含む。幾つかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号１１のみからなる。
【0096】
ＣＤ３ζに由来する細胞内シグナル伝達ドメイン（配列番号１１）
[RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR]
[RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR]
【0097】
共刺激シグナル伝達ドメイン
幾つかの実施形態において、ＣＡＲは共刺激シグナル伝達ドメインを更に含み得る。幾つかの実施形態において、共刺激シグナル伝達ドメインはＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ１３４、ＣＤ３０、ＣＤ４０、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＣＤ２７６の細胞内ドメイン、又はそれらの変異体を含み、それらの変異体は９５％の配列同一性を有する。
幾つかの実施形態において、ＣＡＲは共刺激シグナル伝達ドメインを更に含み得る。幾つかの実施形態において、共刺激シグナル伝達ドメインはＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ１３４、ＣＤ３０、ＣＤ４０、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＣＤ２７６の細胞内ドメイン、又はそれらの変異体を含み、それらの変異体は９５％の配列同一性を有する。
【0098】
幾つかの実施形態において、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ１３４、ＣＤ３０、ＣＤ４０、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＣＤ２７６の細胞内ドメイン又はそれらの変異体を含み、それらの変異体は９８％の配列同一性を有する。
【0099】
幾つかの実施形態において、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ１３４、ＣＤ３０、ＣＤ４０、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、又はＣＤ２７６の細胞内ドメインを含む。
【0100】
幾つかの実施形態において、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ１３７の細胞内ドメイン又はその変異体を含み、その変異体は９５％の配列同一性を有する。
【0101】
幾つかの実施形態において、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ１３７の細胞内ドメイン又はその変異体を含み、その変異体は９８％の配列同一性を有する。
【0102】
幾つかの実施形態において、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ１３７の細胞内ドメインを含む。
【0103】
幾つかの実施形態において、共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号１２又は配列番号１２に対して９５％の配列同一性を有する配列を含む。
【0104】
幾つかの実施形態において、共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号１２又は配列番号１２に対して９８％の配列同一性を有する配列を含む。
【0105】
幾つかの実施形態において、共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号１２又は配列番号１２に対して９９％の配列同一性を有する配列を含む。
【0106】
幾つかの実施形態において、共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号１２を含む。幾つかの実施形態において、共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号１２のみからなる。
【0107】
ＣＤ１３７に由来する共刺激シグナル伝達ドメイン（配列番号１２）
[KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL]
[KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL]
【0108】
本発明による完全配列ＣＡＲ
幾つかの実施形態において、ＣＡＲは、
（ｉ）ＶＬドメインとＶＨドメインとを含むｓｃＦｖであって、ＶＬドメインがＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３ポリペプチドを含み、ＶＨドメインがＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３ポリペプチドを含み、ＬＣＤＲ１が［ＱＤＩＮＫＹ］（配列番号１）のみからなり、ＬＣＤＲ２が［ＹＴＳ］のみからなり、ＬＣＤＲ３が［ＬＨＹＤＮＬＰＷＴ］（配列番号３）のみからなり、ＨＣＤＲ１が［ＧＹＡＦＳＴＹＴ］（配列番号４）のみからなり、ＨＣＤＲ２が［ＩＮＰＮＳＡＳＴ］（配列番号５）のみからなり、ＨＣＤＲ３が［ＡＲＧＦＹＴＭＤＹ］（配列番号６）のみからなる、ｓｃＦｖと、
（ｉｉ）配列番号１０又は配列番号１０に対して９５％の配列同一性を有する配列を含む膜貫通ドメインと、
（ｉｉｉ）配列番号１１又は配列番号１１に対して９５％の配列同一性を有する配列を含む細胞内シグナル伝達ドメインと、
（ｉｖ）配列番号１２又は配列番号１２に対して９５％の配列同一性を有する配列を含む共刺激シグナル伝達ドメインと、
を含む。
幾つかの実施形態において、ＣＡＲは、
（ｉ）ＶＬドメインとＶＨドメインとを含むｓｃＦｖであって、ＶＬドメインがＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３ポリペプチドを含み、ＶＨドメインがＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３ポリペプチドを含み、ＬＣＤＲ１が［ＱＤＩＮＫＹ］（配列番号１）のみからなり、ＬＣＤＲ２が［ＹＴＳ］のみからなり、ＬＣＤＲ３が［ＬＨＹＤＮＬＰＷＴ］（配列番号３）のみからなり、ＨＣＤＲ１が［ＧＹＡＦＳＴＹＴ］（配列番号４）のみからなり、ＨＣＤＲ２が［ＩＮＰＮＳＡＳＴ］（配列番号５）のみからなり、ＨＣＤＲ３が［ＡＲＧＦＹＴＭＤＹ］（配列番号６）のみからなる、ｓｃＦｖと、
（ｉｉ）配列番号１０又は配列番号１０に対して９５％の配列同一性を有する配列を含む膜貫通ドメインと、
（ｉｉｉ）配列番号１１又は配列番号１１に対して９５％の配列同一性を有する配列を含む細胞内シグナル伝達ドメインと、
（ｉｖ）配列番号１２又は配列番号１２に対して９５％の配列同一性を有する配列を含む共刺激シグナル伝達ドメインと、
を含む。
【0109】
幾つかの実施形態において、ＣＡＲは、
（ｉ）ＶＬドメインとＶＨドメインとを含むｓｃＦｖであって、ＶＬドメインがＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３ポリペプチドを含み、ＶＨドメインがＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３ポリペプチドを含み、ＬＣＤＲ１が［ＱＤＩＮＫＹ］（配列番号１）のみからなり、ＬＣＤＲ２が［ＹＴＳ］のみからなり、ＬＣＤＲ３が［ＬＨＹＤＮＬＰＷＴ］（配列番号３）のみからなり、ＨＣＤＲ１が［ＧＹＡＦＳＴＹＴ］（配列番号４のみ）からなり、ＨＣＤＲ２が［ＩＮＰＮＳＡＳＴ］（配列番号５）のみからなり、ＨＣＤＲ３が［ＡＲＧＦＹＴＭＤＹ］（配列番号６）のみからなる、ｓｃＦｖと、
（ｉｉ）配列番号１０又は配列番号１０に対して９８％の配列同一性を有する配列を含む膜貫通ドメインと、
（ｉｉｉ）配列番号１１又は配列番号１１に対して９８％の配列同一性を有する配列を含む細胞内シグナル伝達ドメインと、
（ｉｖ）配列番号１２又は配列番号１２に対して９８％の配列同一性を有する配列を含む共刺激シグナル伝達ドメインと、
を含む。
（ｉ）ＶＬドメインとＶＨドメインとを含むｓｃＦｖであって、ＶＬドメインがＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３ポリペプチドを含み、ＶＨドメインがＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３ポリペプチドを含み、ＬＣＤＲ１が［ＱＤＩＮＫＹ］（配列番号１）のみからなり、ＬＣＤＲ２が［ＹＴＳ］のみからなり、ＬＣＤＲ３が［ＬＨＹＤＮＬＰＷＴ］（配列番号３）のみからなり、ＨＣＤＲ１が［ＧＹＡＦＳＴＹＴ］（配列番号４のみ）からなり、ＨＣＤＲ２が［ＩＮＰＮＳＡＳＴ］（配列番号５）のみからなり、ＨＣＤＲ３が［ＡＲＧＦＹＴＭＤＹ］（配列番号６）のみからなる、ｓｃＦｖと、
（ｉｉ）配列番号１０又は配列番号１０に対して９８％の配列同一性を有する配列を含む膜貫通ドメインと、
（ｉｉｉ）配列番号１１又は配列番号１１に対して９８％の配列同一性を有する配列を含む細胞内シグナル伝達ドメインと、
（ｉｖ）配列番号１２又は配列番号１２に対して９８％の配列同一性を有する配列を含む共刺激シグナル伝達ドメインと、
を含む。
【0110】
幾つかの実施形態において、ＣＡＲは、
（ｉ）ＶＬドメインとＶＨドメインとを含むｓｃＦｖであって、ＶＬドメインがＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３ポリペプチドを含み、ＶＨドメインがＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３ポリペプチドを含み、ＬＣＤＲ１が［ＱＤＩＮＫＹ］（配列番号１）のみからなり、ＬＣＤＲ２が［ＹＴＳ］のみからなり、ＬＣＤＲ３が［ＬＨＹＤＮＬＰＷＴ］（配列番号３）のみからなり、ＨＣＤＲ１が［ＧＹＡＦＳＴＹＴ］（配列番号４）のみからなり、ＨＣＤＲ２が［ＩＮＰＮＳＡＳＴ］（配列番号５）のみからなり、ＨＣＤＲ３が［ＡＲＧＦＹＴＭＤＹ］（配列番号６）のみからなる、ｓｃＦｖと、
（ｉｉ）配列番号１０又は配列番号１０に対して９８％の配列同一性を有する配列を含む膜貫通ドメインと、
（ｉｉｉ）配列番号１１又は配列番号１１に対して９９％の配列同一性を有する配列を含む細胞内シグナル伝達ドメインと、
（ｉｖ）配列番号１２又は配列番号１２に対して９９％の配列同一性を有する配列を含む共刺激シグナル伝達ドメインと、
を含む。
（ｉ）ＶＬドメインとＶＨドメインとを含むｓｃＦｖであって、ＶＬドメインがＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３ポリペプチドを含み、ＶＨドメインがＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３ポリペプチドを含み、ＬＣＤＲ１が［ＱＤＩＮＫＹ］（配列番号１）のみからなり、ＬＣＤＲ２が［ＹＴＳ］のみからなり、ＬＣＤＲ３が［ＬＨＹＤＮＬＰＷＴ］（配列番号３）のみからなり、ＨＣＤＲ１が［ＧＹＡＦＳＴＹＴ］（配列番号４）のみからなり、ＨＣＤＲ２が［ＩＮＰＮＳＡＳＴ］（配列番号５）のみからなり、ＨＣＤＲ３が［ＡＲＧＦＹＴＭＤＹ］（配列番号６）のみからなる、ｓｃＦｖと、
（ｉｉ）配列番号１０又は配列番号１０に対して９８％の配列同一性を有する配列を含む膜貫通ドメインと、
（ｉｉｉ）配列番号１１又は配列番号１１に対して９９％の配列同一性を有する配列を含む細胞内シグナル伝達ドメインと、
（ｉｖ）配列番号１２又は配列番号１２に対して９９％の配列同一性を有する配列を含む共刺激シグナル伝達ドメインと、
を含む。
【0111】
幾つかの実施形態において、ＣＡＲは、
（ｉ）ＶＬドメインとＶＨドメインとを含むｓｃＦｖであって、ＶＬドメインがＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３ポリペプチドを含み、ＶＨドメインがＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３ポリペプチドを含み、ＬＣＤＲ１が［ＱＤＩＮＫＹ］（配列番号１）のみからなり、ＬＣＤＲ２が［ＹＴＳ］のみからなり、ＬＣＤＲ３が［ＬＨＹＤＮＬＰＷＴ］（配列番号３）のみからなり、ＨＣＤＲ１が［ＧＹＡＦＳＴＹＴ］（配列番号４）のみからなり、ＨＣＤＲ２が［ＩＮＰＮＳＡＳＴ］（配列番号５）のみからなり、ＨＣＤＲ３が［ＡＲＧＦＹＴＭＤＹ］（配列番号６）のみからなる、ｓｃＦｖと、
（ｉｉ）配列番号１０を含む膜貫通ドメインと、
（ｉｉｉ）配列番号１１を含む細胞内シグナル伝達ドメインと、
（ｉｖ）配列番号１２を含む共刺激シグナル伝達ドメインと、
を含む。
（ｉ）ＶＬドメインとＶＨドメインとを含むｓｃＦｖであって、ＶＬドメインがＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３ポリペプチドを含み、ＶＨドメインがＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３ポリペプチドを含み、ＬＣＤＲ１が［ＱＤＩＮＫＹ］（配列番号１）のみからなり、ＬＣＤＲ２が［ＹＴＳ］のみからなり、ＬＣＤＲ３が［ＬＨＹＤＮＬＰＷＴ］（配列番号３）のみからなり、ＨＣＤＲ１が［ＧＹＡＦＳＴＹＴ］（配列番号４）のみからなり、ＨＣＤＲ２が［ＩＮＰＮＳＡＳＴ］（配列番号５）のみからなり、ＨＣＤＲ３が［ＡＲＧＦＹＴＭＤＹ］（配列番号６）のみからなる、ｓｃＦｖと、
（ｉｉ）配列番号１０を含む膜貫通ドメインと、
（ｉｉｉ）配列番号１１を含む細胞内シグナル伝達ドメインと、
（ｉｖ）配列番号１２を含む共刺激シグナル伝達ドメインと、
を含む。
【0112】
幾つかの実施形態において、ＣＡＲは、
（ｉ）ＶＬドメインとＶＨドメインとを含むｓｃＦｖであって、ＶＬドメインがＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３ポリペプチドを含み、ＶＨドメインがＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３ポリペプチドを含み、ＬＣＤＲ１が［ＱＤＩＮＫＹ］（配列番号１）のみからなり、ＬＣＤＲ２が［ＹＴＳ］のみからなり、ＬＣＤＲ３が［ＬＨＹＤＮＬＰＷＴ］（配列番号３）のみからなり、ＨＣＤＲ１が［ＧＹＡＦＳＴＹＴ］（配列番号４）のみからなり、ＨＣＤＲ２が［ＩＮＰＮＳＡＳＴ］（配列番号５）のみからなり、ＨＣＤＲ３が［ＡＲＧＦＹＴＭＤＹ］（配列番号６）のみからなる、ｓｃＦｖと、
（ｉｉ）配列番号１０からなる膜貫通ドメインと、
（ｉｉｉ）配列番号１１からなる細胞内シグナル伝達ドメインと、
（ｉｖ）配列番号１２からなる共刺激シグナル伝達ドメインと、
を含む。
（ｉ）ＶＬドメインとＶＨドメインとを含むｓｃＦｖであって、ＶＬドメインがＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３ポリペプチドを含み、ＶＨドメインがＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３ポリペプチドを含み、ＬＣＤＲ１が［ＱＤＩＮＫＹ］（配列番号１）のみからなり、ＬＣＤＲ２が［ＹＴＳ］のみからなり、ＬＣＤＲ３が［ＬＨＹＤＮＬＰＷＴ］（配列番号３）のみからなり、ＨＣＤＲ１が［ＧＹＡＦＳＴＹＴ］（配列番号４）のみからなり、ＨＣＤＲ２が［ＩＮＰＮＳＡＳＴ］（配列番号５）のみからなり、ＨＣＤＲ３が［ＡＲＧＦＹＴＭＤＹ］（配列番号６）のみからなる、ｓｃＦｖと、
（ｉｉ）配列番号１０からなる膜貫通ドメインと、
（ｉｉｉ）配列番号１１からなる細胞内シグナル伝達ドメインと、
（ｉｖ）配列番号１２からなる共刺激シグナル伝達ドメインと、
を含む。
【0113】
幾つかの実施形態において、ＣＡＲは、
（ｉ）ＶＬドメインとＶＨドメインとを含むｓｃＦｖであって、ＶＬドメインが配列番号７のみからなり、ＶＨドメインが配列番号８のみからなる、ｓｃＦｖと、
（ｉｉ）配列番号１０又は配列番号１０に対して９５％の配列同一性を有する配列を含む膜貫通ドメインと、
（ｉｉｉ）配列番号１１又は配列番号１１に対して９５％の配列同一性を有する配列を含む細胞内シグナル伝達ドメインと、
（ｉｖ）配列番号１２又は配列番号１２に対して９５％の配列同一性を有する配列を含む共刺激シグナル伝達ドメインと、
を含む。
（ｉ）ＶＬドメインとＶＨドメインとを含むｓｃＦｖであって、ＶＬドメインが配列番号７のみからなり、ＶＨドメインが配列番号８のみからなる、ｓｃＦｖと、
（ｉｉ）配列番号１０又は配列番号１０に対して９５％の配列同一性を有する配列を含む膜貫通ドメインと、
（ｉｉｉ）配列番号１１又は配列番号１１に対して９５％の配列同一性を有する配列を含む細胞内シグナル伝達ドメインと、
（ｉｖ）配列番号１２又は配列番号１２に対して９５％の配列同一性を有する配列を含む共刺激シグナル伝達ドメインと、
を含む。
【0114】
幾つかの実施形態において、ＣＡＲは、
（ｉ）ＶＬドメインとＶＨドメインとを含むｓｃＦｖであって、ＶＬドメインが配列番号７のみからなり、ＶＨドメインが配列番号８のみからなる、ｓｃＦｖと、
（ｉｉ）配列番号１０又は配列番号１０に対して９８％の配列同一性を有する配列を含む膜貫通ドメインと、
（ｉｉｉ）配列番号１１又は配列番号１１に対して９８％の配列同一性を有する配列を含む細胞内シグナル伝達ドメインと、
（ｉｖ）配列番号１２又は配列番号１２に対して９８％の配列同一性を有する配列を含む共刺激シグナル伝達ドメインと、
を含む。
（ｉ）ＶＬドメインとＶＨドメインとを含むｓｃＦｖであって、ＶＬドメインが配列番号７のみからなり、ＶＨドメインが配列番号８のみからなる、ｓｃＦｖと、
（ｉｉ）配列番号１０又は配列番号１０に対して９８％の配列同一性を有する配列を含む膜貫通ドメインと、
（ｉｉｉ）配列番号１１又は配列番号１１に対して９８％の配列同一性を有する配列を含む細胞内シグナル伝達ドメインと、
（ｉｖ）配列番号１２又は配列番号１２に対して９８％の配列同一性を有する配列を含む共刺激シグナル伝達ドメインと、
を含む。
【0115】
幾つかの実施形態において、ＣＡＲは、
（ｉ）ＶＬドメインとＶＨドメインとを含むｓｃＦｖであって、ＶＬドメインが配列番号７のみからなり、ＶＨドメインが配列番号８のみからなる、ｓｃＦｖと、
（ｉｉ）配列番号１０又は配列番号１０に対して９８％の配列同一性を有する配列を含む膜貫通ドメインと、
（ｉｉｉ）配列番号１１又は配列番号１１に対して９９％の配列同一性を有する配列を含む細胞内シグナル伝達ドメインと、
（ｉｖ）配列番号１２又は配列番号１２に対して９９％の配列同一性を有する配列を含む共刺激シグナル伝達ドメインと、
を含む。
（ｉ）ＶＬドメインとＶＨドメインとを含むｓｃＦｖであって、ＶＬドメインが配列番号７のみからなり、ＶＨドメインが配列番号８のみからなる、ｓｃＦｖと、
（ｉｉ）配列番号１０又は配列番号１０に対して９８％の配列同一性を有する配列を含む膜貫通ドメインと、
（ｉｉｉ）配列番号１１又は配列番号１１に対して９９％の配列同一性を有する配列を含む細胞内シグナル伝達ドメインと、
（ｉｖ）配列番号１２又は配列番号１２に対して９９％の配列同一性を有する配列を含む共刺激シグナル伝達ドメインと、
を含む。
【0116】
幾つかの実施形態において、ＣＡＲは、
（ｉ）ＶＬドメインとＶＨドメインとを含むｓｃＦｖであって、ＶＬドメインが配列番号７のみからなり、ＶＨドメインが配列番号８のみからなる、ｓｃＦｖと、
（ｉｉ）配列番号１０を含む膜貫通ドメインと、
（ｉｉｉ）配列番号１１を含む細胞内シグナル伝達ドメインと、
（ｉｖ）配列番号１２を含む共刺激シグナル伝達ドメインと、
を含む。
（ｉ）ＶＬドメインとＶＨドメインとを含むｓｃＦｖであって、ＶＬドメインが配列番号７のみからなり、ＶＨドメインが配列番号８のみからなる、ｓｃＦｖと、
（ｉｉ）配列番号１０を含む膜貫通ドメインと、
（ｉｉｉ）配列番号１１を含む細胞内シグナル伝達ドメインと、
（ｉｖ）配列番号１２を含む共刺激シグナル伝達ドメインと、
を含む。
【0117】
幾つかの実施形態において、ＣＡＲは、
（ｉ）ＶＬドメインとＶＨドメインとを含むｓｃＦｖであって、ＶＬドメインが配列番号７のみからなり、ＶＨドメインが配列番号８のみからなる、ｓｃＦｖと、
（ｉｉ）配列番号１０のみからなる膜貫通ドメインと、
（ｉｉｉ）配列番号１１のみからなる細胞内シグナル伝達ドメインと、
（ｉｖ）配列番号１２のみからなる共刺激シグナル伝達ドメインと、
を含む。
（ｉ）ＶＬドメインとＶＨドメインとを含むｓｃＦｖであって、ＶＬドメインが配列番号７のみからなり、ＶＨドメインが配列番号８のみからなる、ｓｃＦｖと、
（ｉｉ）配列番号１０のみからなる膜貫通ドメインと、
（ｉｉｉ）配列番号１１のみからなる細胞内シグナル伝達ドメインと、
（ｉｖ）配列番号１２のみからなる共刺激シグナル伝達ドメインと、
を含む。
【0118】
幾つかの実施形態において、ＣＡＲは、配列番号２又は配列番号２と９５％の配列同一性を有する配列を含むか又はそれのみからなる。幾つかの実施形態において、ＣＡＲは、配列番号２又は配列番号２と９８％の配列同一性を有する配列を含むか又はそれのみからなる。幾つかの実施形態において、ＣＡＲは、配列番号２又は配列番号２と９９％の配列同一性を有する配列を含むか又はそれのみからなる。幾つかの実施形態において、ＣＡＲは、配列番号２を含むか又はそれのみからなる。
【0119】
ＣＡＲの完全配列（配列番号２）
[MALPVTGLLLSLGLLLHAARPTGQVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYAFSTYTMHWVKQRPRQGLEWIGYINPNSASTSYNENFKDKATLTADKSSNTAYMHLSSLTSEDSAVYYCARGFYTMDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSRDIQMTQSPSSLSASLGGKVTITCQASQDINKYIAWYQFKPGKGPRLLIHYTSTLQPAIPSRFSGSGSGREYSFSISNLEPEDIATYYCLHYDNLPWTFGGGTKLEIKRATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR]
[MALPVTGLLLSLGLLLHAARPTGQVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYAFSTYTMHWVKQRPRQGLEWIGYINPNSASTSYNENFKDKATLTADKSSNTAYMHLSSLTSEDSAVYYCARGFYTMDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSRDIQMTQSPSSLSASLGGKVTITCQASQDINKYIAWYQFKPGKGPRLLIHYTSTLQPAIPSRFSGSGSGREYSFSISNLEPEDIATYYCLHYDNLPWTFGGGTKLEIKRATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR]
【0120】
核酸
一態様において、本発明は、上記に開示するＣＡＲのいずれか１つを含む本発明のＣＡＲのいずれか１つをコードする核酸を提供する。キメラ受容体をコードする核酸配列は、効率的なＴ細胞活性化及びＣＤ１ａの認識に対してキメラ受容体をカスタマイズするために切除し、他の構成要素と置き換えることができる多数のモジュール構成要素同士を接続する。
一態様において、本発明は、上記に開示するＣＡＲのいずれか１つを含む本発明のＣＡＲのいずれか１つをコードする核酸を提供する。キメラ受容体をコードする核酸配列は、効率的なＴ細胞活性化及びＣＤ１ａの認識に対してキメラ受容体をカスタマイズするために切除し、他の構成要素と置き換えることができる多数のモジュール構成要素同士を接続する。
【0121】
幾つかの実施形態において、核酸は、細胞の形質導入又は形質転換に適している。幾つかの実施形態において、核酸は、養子免疫療法に使用されるＴ細胞の形質導入又は形質転換に適している。
【0122】
幾つかの実施形態において、核酸は、哺乳動物細胞における発現のためにコドン最適化される。コドン最適化方法は、当該技術分野で既知である（例えば、Parret et al., 2016. Curr Opin Struct Biol. 39: 155-162を参照されたい）。
【0123】
本発明の核酸は、Ｔ細胞の形質導入又は形質転換に使用することができるγ－レトロウイルスベクター又はレンチウイルスベクターに含まれ得る（Riviere & Sadelain, 2017. Mol Ther. 25(5):1117-1124を参照されたい）。ＤＮＡトランスポゾン、ＲＮＡトランスフェクション、又はＴＡＬＥＮ、ＺＦＮ及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９等のゲノム編集技術を用いて核酸を細胞に挿入することもできる（Riviere & Sadelain, 2017. Mol Ther. 25(5):1117-1124を参照されたい）。
【0124】
細胞
一態様において、本発明は、本発明の核酸及び／又は本発明のＣＡＲを含む細胞を提供する。幾つかの実施形態において、細胞はＴ細胞（ＣＡＲＴと称される）である。
一態様において、本発明は、本発明の核酸及び／又は本発明のＣＡＲを含む細胞を提供する。幾つかの実施形態において、細胞はＴ細胞（ＣＡＲＴと称される）である。
【0125】
幾つかの実施形態において、細胞はナイーブＴ細胞、メモリーステムＴ細胞又はセントラルメモリーＴ細胞である。これらの細胞が適応免疫療法により良好に適していると現在考えられている（Riviere & Sadelain, 2017. Mol Ther. 25(5):1117-1124を参照されたい）。
【0126】
幾つかの実施形態において、細胞は自己Ｔ細胞である。「自己細胞」という用語は、本発明の方法のいずれか１つを用いて治療されるのと同じ患者から得られた細胞を指す。活動性Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病を有する４０人の患者から得られた末梢血のフローサイトメトリー分析により、全ての患者における正常ＣＤ３＋ＣＤ１ａ－Ｔ細胞の存在が明らかとなったことに留意する。このため、本発明の核酸及び／又はＣＡＲを含む自己Ｔ細胞を用いて患者を治療することが全く可能である。
【0127】
幾つかの実施形態において、細胞は同種寛容（allo-tolerant）Ｔ細胞である。「同種寛容細胞」という用語は、移植片対宿主病応答のリスクを低下させるように改変された細胞を指す。幾つかの実施形態において、これはＴＣＲ及び／又はβ２－ミクログロブリンのゲノム編集を介した欠失によって達成される１５、１９。同種寛容細胞は、当該技術分野で既知である（Riviere & Sadelain, 2017. Mol Ther. 25(5):1117-1124の同種Ｔ細胞の章を参照されたい）。
【0128】
幾つかの実施形態において、Ｔ細胞は、ＣＤ３陽性かつＣＤ１ａ陰性のＴ細胞である。
【0129】
幾つかの実施形態において、細胞は、成熟Ｔ細胞へと分化する能力を有するリンパ球前駆体、胚性幹細胞又は誘導多能性幹細胞である（Riviere & Sadelain, 2017. Mol Ther. 25(5):1117-1124を参照されたい）。
【0130】
医薬組成物
一態様において、本発明は、本発明の複数の細胞と薬学的に許容可能な担体又は希釈剤とを含む医薬組成物を提供する。
一態様において、本発明は、本発明の複数の細胞と薬学的に許容可能な担体又は希釈剤とを含む医薬組成物を提供する。
【0131】
本明細書に記載される医薬組成物は、その他の物質も含有し得る。これらの物質としては、限定されるものではないが、凍結保護剤、界面活性剤、酸化防止剤及び安定剤が挙げられる。本明細書にて使用される「凍結保護剤」という用語は、凍結誘導ストレスに対してＣＡＲＴに安定性を与える作用物質を含む。凍結保護剤の非限定的な例としては、スクロース、グルコース、トレハロース、マンニトール、マンノース及びラクトース等の糖類、デキストラン、ヒドロキシエチルデンプン及びポリエチレングリコール等のポリマー、ポリソルベート等の界面活性剤（例えば、ＰＳ－２０又はＰＳ－８０）並びにグリシン、アルギニン、ロイシン及びセリン等のアミノ酸が挙げられる。生物系における毒性が低い凍結保護剤が一般的に使用される。
【0132】
幾つかの実施形態において、細胞を初めにそれらの培養培地から採取し、次いで細胞を洗浄し、投与に適している培地及び容器システム（「薬学的に許容可能な」担体）において治療有効量で濃縮することによって細胞を配合する。好適なインフュージョン培地は任意の等張培地配合物、通例、生理食塩水、Ｎｏｒｍｏｓｏｌ Ｒ（Abbott）又はＰｌａｓｍａ－Ｌｙｔｅ Ａ（Baxter）とすることができ、水又は乳酸リンゲル液中の５％デキストロースを用いることもできる。インフュージョン培地にヒト血清アルブミン、ウシ胎仔血清又は他のヒト血清成分を添加してもよい。
【0133】
一態様において、本発明は、医薬として使用される本発明による細胞又は本発明による医薬組成物を提供する。
【0134】
治療方法
一態様において、本発明は、本発明の細胞又は本発明の医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、ＣＤ１ａ陽性癌を治療する方法を提供する。
一態様において、本発明は、本発明の細胞又は本発明の医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、ＣＤ１ａ陽性癌を治療する方法を提供する。
【0135】
幾つかの実施形態において、患者に治療有効量の細胞を投与する。幾つかの実施形態において、患者に少なくとも１０２個、１０３個、１０４個、１０５個、１０６個、１０７個、１０８個、１０９個又は１０１０個の細胞を投与する。細胞の数は、組成物が対象とする最終的な用途によって決まり、組成物に含まれる細胞のタイプも同様である。例えば、特定の抗原に特異的な細胞が所望される場合、集団は７０％超、概して８０％超、８５％及び９０％～９５％のかかる細胞を含有する。本明細書にて提供される用途については、細胞は概して１リットル以下の体積であり、５００ｍｌ以下、更には２５０ｍｌ以下又は１００ｍｌ以下であり得る。臨床的に関連する細胞の数は、累積して１０２個、１０３個、１０４個、１０５個、１０６個、１０７個、１０８個、１０９個又は１０１０個の細胞に等しいか又はそれを超える複数回の注入に配分することができる。
【0136】
幾つかの実施形態において、細胞又は医薬組成物を静脈内に、腹腔内に、骨髄に、リンパ節に及び／又は脳脊髄液に投与する。
【0137】
幾つかの実施形態において、方法は併用療法を含む。幾つかの実施形態において、方法は、免疫チェックポイント阻害剤を更に投与することを含む（Lim & June, 2017. Cell. 168(4):724-740を参照されたい）。更なる実施形態において、方法は、免疫チェックポイント阻害剤及び／又はＩＡＰ阻害剤を更に投与することを含む（国際公開第２０１６／０５４５５５号を参照されたい）。
【0138】
幾つかの実施形態において、本明細書に記載される細胞又は医薬組成物を化学療法剤及び／又は免疫抑制剤と組み合わせて投与する。一実施形態において、患者を初めに他の免疫細胞を阻害又は破壊する化学療法剤、続いて本明細書に記載される細胞又は医薬組成物で治療する。場合によっては、化学療法を完全に回避することができる。
【0139】
幾つかの実施形態において、ＣＤ１ａ陽性癌は、皮質Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病又はランゲルハンス細胞組織球症である。幾つかの実施形態において、ＣＤ１ａ陽性癌は、皮質Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病である。幾つかの実施形態において、ＣＤ１ａ陽性癌は、再発性／難治性皮質Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病である。
【0140】
概して、白血病の再発は、初回寛解の数ヶ月又は数年後に現れる可能性があるが、殆どの再発は、初期治療後２年以内に起こる。不応性は、患者が再発後に少なくとも１つの治療戦略に応答しなくなったことを意味する用語である。
【0141】
特に成人におけるＡＬＬの第一選択試験では、再発が「以前の完全寛解（ＣＲ）の達成後の骨髄における５％を超える芽細胞の検出又は髄外白血病の関与の明白な証拠」として定義されるという幅広いコンセンサスがある（Goekbuget (2017)を参照されたい）。成人ＡＬＬに関する欧州作業部会（European Working Group on Adult ALL：ＥＷＡＬＬ）は、この声明を、「集中治療段階及び／又は再生時の或る段階で５％～２０％の芽細胞の場合、骨髄再発及び再生現象を区別するために骨髄の評価を１週間後に繰り返す必要がある」という付加的な説明と共にコンセンサス勧告に記録した（Dohner (2010)を参照されたい）。引用される定義は、Ｔ－ＡＬＬの場合と同様にＡＬＬの幾つかのサブタイプについて推定された急性骨髄性白血病における転帰パラメーターについての国際勧告に基づく（Cheson (2003)及びChantepie (213)を参照されたい）。
【0142】
近年、一部の試験では再発の概念さえ定義されなかった。したがって、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞を用いた研究は、「測定可能な疾患」を有する患者を含み、更には血液学的再発（付加的な指定なし）又は微小残存病変（ＭＲＥ）を有する患者を含むものであった（Lee (2015)及びMaude (2014)及びGoekbuget (2017)を参照されたい）。以下を参照されたい：
Dohner H, Estey EH, Amadori S, et al, Diagnosis and management of acute myeloid leukemia in adults: recommendations from an international expert panel, on behalf of the European Leukemia Net. Blood 2010;115:453-74.
Cheson BD, Bennett JM, Kopecky KJ, et al. Revised recommendations of the International Working Group for Diagnosis, Standardization of Response Criteria, Treatment Outcomes, and Reporting Standards for Therapeutic Trials in Acute Myeloid Leukemia. J Clin Oncol 2003;21:4642-9.
Chantepie SP, Cornet E, Salaun V, Reman O. Hematogones: an overview. Leuk Res 2013;37:1404-11.
13. Maude SL, Frey N, Shaw PA, et al. Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia. N Engl J Med 2014;371:1507-17.
Goekbuget N, Dombret H, Bassan R, Wadleigh M, Doubek M, Ribera J. Inclusion and response criteria for clinical trials in relapsed/refractory acute lymphoblastic leukemia and usefulness of historical control trials. Haematologica. 2017;102(3):e118-e119.
Dohner H, Estey EH, Amadori S, et al, Diagnosis and management of acute myeloid leukemia in adults: recommendations from an international expert panel, on behalf of the European Leukemia Net. Blood 2010;115:453-74.
Cheson BD, Bennett JM, Kopecky KJ, et al. Revised recommendations of the International Working Group for Diagnosis, Standardization of Response Criteria, Treatment Outcomes, and Reporting Standards for Therapeutic Trials in Acute Myeloid Leukemia. J Clin Oncol 2003;21:4642-9.
Chantepie SP, Cornet E, Salaun V, Reman O. Hematogones: an overview. Leuk Res 2013;37:1404-11.
13. Maude SL, Frey N, Shaw PA, et al. Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia. N Engl J Med 2014;371:1507-17.
Goekbuget N, Dombret H, Bassan R, Wadleigh M, Doubek M, Ribera J. Inclusion and response criteria for clinical trials in relapsed/refractory acute lymphoblastic leukemia and usefulness of historical control trials. Haematologica. 2017;102(3):e118-e119.
【0143】
幾つかの実施形態において、本発明の方法を用いて治療される患者は、別の療法による治療後の完全又はほぼ完全な寛解期にある。高活動性の再発性／難治性皮質Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病を有する患者の場合に幾つかの代替的なエフェクターＴ細胞が存在することから、本発明の方法を用いる前に腫瘍負荷を減少させることが好ましい（preferable desirable）場合がある。幾つかの実施形態において、本発明の方法を用いて治療される患者は、以前に部分奏効、完全奏効、病勢安定、進行性疾患の減少、腫瘍進行までの時間の短縮、又はそれらの任意の組合せをもたらした別の療法を用いて治療されている。
【実施例】
【0144】
材料及び方法
ＣＤ１ａ特異的ｓｃＦｖの生成及びＣＡＲの設計
ＣＤ１ａ特異抗体のＮＡ１／３４．ＨＬＫクローンに由来するＣＤ１ａ特異的一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を、マウスＩｇＧ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｅｔ（Progen）を用いた商業的合成（Sigma-Aldrich）を用いて得て、ヒトＣＤ８膜貫通（ＴＭ）ドメイン、ヒトＣＤ１３７及びＣＤ３ζエンドドメイン、並びにＴ２Ａ－ＧＦＰカセットを含有するｐＣＣＬレンチウイルスベースの第２世代ＣＡＲ骨格にクローニングした。ＧＦＰ単独（モックベクター）又はＣＤ２２ ＣＡＲ骨格のいずれかを発現する同一のレンチウイルスベクターを対照として使用した（図１Ｄ及び図８Ａ）。
ＣＤ１ａ特異的ｓｃＦｖの生成及びＣＡＲの設計
ＣＤ１ａ特異抗体のＮＡ１／３４．ＨＬＫクローンに由来するＣＤ１ａ特異的一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を、マウスＩｇＧ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｅｔ（Progen）を用いた商業的合成（Sigma-Aldrich）を用いて得て、ヒトＣＤ８膜貫通（ＴＭ）ドメイン、ヒトＣＤ１３７及びＣＤ３ζエンドドメイン、並びにＴ２Ａ－ＧＦＰカセットを含有するｐＣＣＬレンチウイルスベースの第２世代ＣＡＲ骨格にクローニングした。ＧＦＰ単独（モックベクター）又はＣＤ２２ ＣＡＲ骨格のいずれかを発現する同一のレンチウイルスベクターを対照として使用した（図１Ｄ及び図８Ａ）。
【0145】
ＣＡＲ発現レンチウイルスの作製、Ｔ細胞の形質導入、活性化及び増加
ＶＳＶ－Ｇ偽型ＣＡＲ発現ウイルス粒子を、標準ポリエチレンイミントランスフェクションプロトコルを用いて２９３Ｔ細胞において生成し、他の部分で記載されるように超遠心分離によって濃縮した２７。ウイルス価は、一貫して１０８ＴＵ／ｍＬの範囲であった。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、健常なボランティアに由来するバフィーコートからフィコール－ハイパック勾配遠心分離によって単離した。バフィーコートは、ＩＲＢ承認（ＨＣＢ／２０１８／００３０）後にBarcelona Blood and Tissue Bank（BST）から入手した。Ｔ細胞を、プレートに結合した抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）抗体及び抗ＣＤ２８抗体（BD Biosciences）によって２日間活性化した後、インターロイキン－７（ＩＬ－７）及びＩＬ－１５（１０ｎｇ／ｍＬ、Mitenyi Biotec）の存在下にてＣＡＲ発現レンチウイルス（ＭＯＩ＝１０）で形質導入した１６、１８。ＣＤ１ａＣＡＲの細胞表面発現を、ＧＦＰの蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）同時発現によって追跡し、ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Jackson ImmunoResearch）を用いて確認した。ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞の適当な活性化を、２日間の増加後にＣＤ２５及びＣＤ６９について染色することによって実証した。
ＶＳＶ－Ｇ偽型ＣＡＲ発現ウイルス粒子を、標準ポリエチレンイミントランスフェクションプロトコルを用いて２９３Ｔ細胞において生成し、他の部分で記載されるように超遠心分離によって濃縮した２７。ウイルス価は、一貫して１０８ＴＵ／ｍＬの範囲であった。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、健常なボランティアに由来するバフィーコートからフィコール－ハイパック勾配遠心分離によって単離した。バフィーコートは、ＩＲＢ承認（ＨＣＢ／２０１８／００３０）後にBarcelona Blood and Tissue Bank（BST）から入手した。Ｔ細胞を、プレートに結合した抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）抗体及び抗ＣＤ２８抗体（BD Biosciences）によって２日間活性化した後、インターロイキン－７（ＩＬ－７）及びＩＬ－１５（１０ｎｇ／ｍＬ、Mitenyi Biotec）の存在下にてＣＡＲ発現レンチウイルス（ＭＯＩ＝１０）で形質導入した１６、１８。ＣＤ１ａＣＡＲの細胞表面発現を、ＧＦＰの蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）同時発現によって追跡し、ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Jackson ImmunoResearch）を用いて確認した。ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞の適当な活性化を、２日間の増加後にＣＤ２５及びＣＤ６９について染色することによって実証した。
【0146】
健常なＣＤ３４＋前駆体、Ｔ細胞及び一次Ｔ－ＡＬＬサンプルのイムノフェノタイピング
ＣＤ３４＋幹／前駆細胞（ＨＳＰＣ）、ＣＤ３４＋ＣＤ７＋胸腺Ｔ細胞前駆体及びＣＤ３＋Ｔ細胞におけるＣＤ１ａ抗原の発現を新鮮なヒト胸腺、胎児肝臓及び骨髄（ＢＭ）、臍帯血、並びに成人ＢＭ及び末梢血（ＰＢ）において予測分析した（ｎ＝３）。胎児の組織は、インフォームドコンセント並びに地域の倫理及びバイオハザード取締役会委員会による承認（ＣＭＲＢＣＥＩＣ－２６／２０１３）後にMRC/Wellcome Trust Human Developmental Biology Resourceから入手した妊娠１８週～２２週で中絶された発生中の胚から以前に記載されているように採取した２８、２９。新生児及び成人の組織は、ＩＲＢ承認（ＨＣＢ／２０１８／００３０）後にBSTから入手した。一次Ｔ－ＡＬＬサンプル及び診断的イムノフェノタイピングデータは、地域の病院であるSant Joan de Den、Germans Trias i Pujol及びSanta Creu i San Pau（Barcelona，Spain）から入手した。Ｔ－ＡＬＬ一次サンプルのイムノフェノタイピングについては、以下の蛍光色素コンジュゲートモノクローナル抗体（ＭｏＡｂ）を使用した：抗ＣＤ２－ＰＥ、ＣＤ７－ＦＩＴＣ／ＰＥ、ＣＤ１３－ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５、ＣＤ３４－ＡＰＣ、ＣＤ３－ＰＥ、ＣＤ５－ＦＩＴＣ、ＣＤ４－ＢＶ－４２１、ＣＤ８－ＡＰＣ－Ｃｙ７、ＣＤ４５－ＡｍＣｙａｎ、ＣＤ１ａ－ＢＶ－４２１／ＡＰＣ／ＰＥ、ＣＤ３３－ＡＰＣ及びＣＤ１２３－ＡＰＣ（BDBiosciencies又はMiltenyi Biotec）。アイソタイプ適合非反応性蛍光色素コンジュゲートＭｏＡｂを常に蛍光参照として使用した。簡潔に述べると、ＰＢ単核細胞（ＰＢＭＣ、約５×１０５個）を赤血球溶解溶液（BDBiosciencies）と共に１０分間インキュベートした後、ＭｏＡｂで染色した（暗所にて４℃で２０分間）。染色した細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で洗浄し、ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェアを備えるＦＡＣＳＣａｎｔｏ－ＩＩフローサイトメーター（BDBiosciencies）でＦＡＣＳによって分析した３０～３２。
ＣＤ３４＋幹／前駆細胞（ＨＳＰＣ）、ＣＤ３４＋ＣＤ７＋胸腺Ｔ細胞前駆体及びＣＤ３＋Ｔ細胞におけるＣＤ１ａ抗原の発現を新鮮なヒト胸腺、胎児肝臓及び骨髄（ＢＭ）、臍帯血、並びに成人ＢＭ及び末梢血（ＰＢ）において予測分析した（ｎ＝３）。胎児の組織は、インフォームドコンセント並びに地域の倫理及びバイオハザード取締役会委員会による承認（ＣＭＲＢＣＥＩＣ－２６／２０１３）後にMRC/Wellcome Trust Human Developmental Biology Resourceから入手した妊娠１８週～２２週で中絶された発生中の胚から以前に記載されているように採取した２８、２９。新生児及び成人の組織は、ＩＲＢ承認（ＨＣＢ／２０１８／００３０）後にBSTから入手した。一次Ｔ－ＡＬＬサンプル及び診断的イムノフェノタイピングデータは、地域の病院であるSant Joan de Den、Germans Trias i Pujol及びSanta Creu i San Pau（Barcelona，Spain）から入手した。Ｔ－ＡＬＬ一次サンプルのイムノフェノタイピングについては、以下の蛍光色素コンジュゲートモノクローナル抗体（ＭｏＡｂ）を使用した：抗ＣＤ２－ＰＥ、ＣＤ７－ＦＩＴＣ／ＰＥ、ＣＤ１３－ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５、ＣＤ３４－ＡＰＣ、ＣＤ３－ＰＥ、ＣＤ５－ＦＩＴＣ、ＣＤ４－ＢＶ－４２１、ＣＤ８－ＡＰＣ－Ｃｙ７、ＣＤ４５－ＡｍＣｙａｎ、ＣＤ１ａ－ＢＶ－４２１／ＡＰＣ／ＰＥ、ＣＤ３３－ＡＰＣ及びＣＤ１２３－ＡＰＣ（BDBiosciencies又はMiltenyi Biotec）。アイソタイプ適合非反応性蛍光色素コンジュゲートＭｏＡｂを常に蛍光参照として使用した。簡潔に述べると、ＰＢ単核細胞（ＰＢＭＣ、約５×１０５個）を赤血球溶解溶液（BDBiosciencies）と共に１０分間インキュベートした後、ＭｏＡｂで染色した（暗所にて４℃で２０分間）。染色した細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で洗浄し、ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェアを備えるＦＡＣＳＣａｎｔｏ－ＩＩフローサイトメーター（BDBiosciencies）でＦＡＣＳによって分析した３０～３２。
【0147】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性アッセイ及びサイトカイン放出の決定
細胞株Ｊｕｒｋａｔ、ＭＯＬＴ４及びＮＡＬＭ６をDSMZ（Braunschweig，Germany）から購入し、DSMZの推奨に従って増加させた。ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）／ＧＦＰ発現細胞を、レトロウイルス導入及びＧＦＰ＋細胞のＦＡＣＳ精製によって安定的に生成した３３。標的細胞（細胞株及び一次Ｔ－ＡＬＬ芽球）を３μＭ ｅＦｌｕｏｒ６７０（eBioscience）で標識し、ＣＤ１ａ、ＣＤ２２又はモックＣＡＲＴと共に異なるエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比にて指定の期間にわたってインキュベートした。ＣＡＲＴ媒介細胞毒性を、残存する生存（７－ＡＡＤ－）ｅＦｌｕｏｒ６７０＋標的細胞を各時点及びＥ：Ｔ比で分析することによって決定した。絶対細胞数は、Ｔｒｕｃｏｕｎｔ ａｂｓｏｌｕｔｅ ｃｏｕｎｔビーズ（BD Biosciences）を用いて決定した。さらに、発症時の皮質Ｔ－ＡＬＬ患者のＰＢに由来するＦＡＣＳ選別ＣＤ３＋ＣＤ１ａ－成熟Ｔ細胞を活性化し、ＣＤ１ａ ＣＡＲで形質導入し、それらのｅＦｌｕｏｒ６７０標識自己ＣＤ１ａ＋Ｔ－ＡＬＬ芽球に対して試験した。炎症誘発性サイトカインＩＬ－２、ＴＮＦα及びＩＦＮγの産生を、１６時間後に採取した上清中でＥＬＩＳＡ（Ｈｕｍａｎ ＥＬＩＳＡ ＳＥＴ、BD Biosciences）によって測定した。
細胞株Ｊｕｒｋａｔ、ＭＯＬＴ４及びＮＡＬＭ６をDSMZ（Braunschweig，Germany）から購入し、DSMZの推奨に従って増加させた。ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）／ＧＦＰ発現細胞を、レトロウイルス導入及びＧＦＰ＋細胞のＦＡＣＳ精製によって安定的に生成した３３。標的細胞（細胞株及び一次Ｔ－ＡＬＬ芽球）を３μＭ ｅＦｌｕｏｒ６７０（eBioscience）で標識し、ＣＤ１ａ、ＣＤ２２又はモックＣＡＲＴと共に異なるエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比にて指定の期間にわたってインキュベートした。ＣＡＲＴ媒介細胞毒性を、残存する生存（７－ＡＡＤ－）ｅＦｌｕｏｒ６７０＋標的細胞を各時点及びＥ：Ｔ比で分析することによって決定した。絶対細胞数は、Ｔｒｕｃｏｕｎｔ ａｂｓｏｌｕｔｅ ｃｏｕｎｔビーズ（BD Biosciences）を用いて決定した。さらに、発症時の皮質Ｔ－ＡＬＬ患者のＰＢに由来するＦＡＣＳ選別ＣＤ３＋ＣＤ１ａ－成熟Ｔ細胞を活性化し、ＣＤ１ａ ＣＡＲで形質導入し、それらのｅＦｌｕｏｒ６７０標識自己ＣＤ１ａ＋Ｔ－ＡＬＬ芽球に対して試験した。炎症誘発性サイトカインＩＬ－２、ＴＮＦα及びＩＦＮγの産生を、１６時間後に採取した上清中でＥＬＩＳＡ（Ｈｕｍａｎ ＥＬＩＳＡ ＳＥＴ、BD Biosciences）によって測定した。
【0148】
ｉｎ ｖｉｖｏのＪｕｒｋａｔ及びＴ－ＡＬＬ患者由来の異種移植片（ＰＤＸ）モデル
６週齢～１２週齢の非肥満糖尿病（ＮＯＤ）－Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウス（The Jackson Laboratory）を、Barcelona Biomedical Research Park（PRBB）の動物施設において病原体除去条件下で繁殖及び飼育した。マウスを放射線照射し（２Ｇｙ）、３×１０６個のＬｕｃ－ＧＦＰ発現Ｊｕｒｋａｔ細胞又は１×１０６個の一次皮質ＣＤ１ａ＋Ｔ－ＡＬＬ芽球（一次及びプリモグラフトで増加させた）を静脈内に（ｉ．ｖ．）移植した３４。１．５×１０６個～５×１０６個のＣＤ１ａ又はモックＣＡＲＴを３日後にｉ．ｖ．注入した。Ｌｕｃ－Ｊｕｒｋａｔ細胞を使用する場合、腫瘍負荷は、Ｘｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳ ５０ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Perkin Elmer）を用いて生物発光（ＢＬＩ）によって追跡した。発光を測定するために、マウスに１５０ｍｇ／ｋｇのＤ－ルシフェリンを腹腔内投与し、腫瘍負荷を指定の時点でモニタリングした。Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅソフトウェア（Perkin Elmer）を用いて全発光を可視化し、算出した。一次Ｔ－ＡＬＬサンプルの腫瘍負荷は、２週間に１回の採血及びＦＡＣＳ分析によって追跡した。モックＣＡＲＴ処理動物が白血病となった時点でマウスを屠殺し、腫瘍負荷（ｈＨＬＡ－ＡＢＣ＋ｈＣＤ４５＋ｈＣＤ１ａ＋グラフト）及びＣＡＲＴ持続性（ｈＨＬＡ－ＡＢＣ＋ｈＣＤ４５＋ｈＣＤ３＋ｈＣＤ１ａ－ＧＦＰ＋）をＢＭ、ＰＢ及び脾臓においてＦＡＣＳによって分析した。再チャレンジ実験では、５週間～６週間前にＣＤ１ａ ＣＡＲＴの注入を受けた、白血病でない動物に１．５×１０６個のＬｕｃ－Ｊｕｒｋａｔ細胞又は１×１０６個のＣＤ１ａ＋Ｔ－ＡＬＬプリモグラフトのいずれかを再注入し、疾患の再発を上記のようにＢＬＩ及びＦＡＣＳによって追跡した。全ての手順をPRBBの動物実験委員会（ＤＡＡＭ７３９３）に従って行った。
６週齢～１２週齢の非肥満糖尿病（ＮＯＤ）－Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウス（The Jackson Laboratory）を、Barcelona Biomedical Research Park（PRBB）の動物施設において病原体除去条件下で繁殖及び飼育した。マウスを放射線照射し（２Ｇｙ）、３×１０６個のＬｕｃ－ＧＦＰ発現Ｊｕｒｋａｔ細胞又は１×１０６個の一次皮質ＣＤ１ａ＋Ｔ－ＡＬＬ芽球（一次及びプリモグラフトで増加させた）を静脈内に（ｉ．ｖ．）移植した３４。１．５×１０６個～５×１０６個のＣＤ１ａ又はモックＣＡＲＴを３日後にｉ．ｖ．注入した。Ｌｕｃ－Ｊｕｒｋａｔ細胞を使用する場合、腫瘍負荷は、Ｘｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳ ５０ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Perkin Elmer）を用いて生物発光（ＢＬＩ）によって追跡した。発光を測定するために、マウスに１５０ｍｇ／ｋｇのＤ－ルシフェリンを腹腔内投与し、腫瘍負荷を指定の時点でモニタリングした。Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅソフトウェア（Perkin Elmer）を用いて全発光を可視化し、算出した。一次Ｔ－ＡＬＬサンプルの腫瘍負荷は、２週間に１回の採血及びＦＡＣＳ分析によって追跡した。モックＣＡＲＴ処理動物が白血病となった時点でマウスを屠殺し、腫瘍負荷（ｈＨＬＡ－ＡＢＣ＋ｈＣＤ４５＋ｈＣＤ１ａ＋グラフト）及びＣＡＲＴ持続性（ｈＨＬＡ－ＡＢＣ＋ｈＣＤ４５＋ｈＣＤ３＋ｈＣＤ１ａ－ＧＦＰ＋）をＢＭ、ＰＢ及び脾臓においてＦＡＣＳによって分析した。再チャレンジ実験では、５週間～６週間前にＣＤ１ａ ＣＡＲＴの注入を受けた、白血病でない動物に１．５×１０６個のＬｕｃ－Ｊｕｒｋａｔ細胞又は１×１０６個のＣＤ１ａ＋Ｔ－ＡＬＬプリモグラフトのいずれかを再注入し、疾患の再発を上記のようにＢＬＩ及びＦＡＣＳによって追跡した。全ての手順をPRBBの動物実験委員会（ＤＡＡＭ７３９３）に従って行った。
【0149】
酵素結合免疫スポットアッセイ（ＥＬＩＳｐｏｔ）
ＥＬＩＳｐｏｔプレート（Millipore）を抗ヒトＩＦＮγ抗体（１－Ｄ１Ｋ、Mabtech）でコーティングし、一晩４℃に維持した。次いで、プレートを、１％ウシ胎仔血清を含有するＰＢＳで６回洗浄した後、３匹の独立したドナーに由来する細胞を５×１０５～１×１０６細胞／ウェルでプレーティングし、３７℃及び５％ＣＯ２で２０時間、三連で培養した。サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）及びインフルエンザのＴ細胞エピトープのペプチドプールである１μｇ／ｍＬのＣＥＦ、並びに陽性対照としての１μｇ／ｍＬのブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）に応答したＩＦＮγ分泌細胞を測定した。次いで、プレートを以前に記載されているようにビオチン化抗ヒトＩＦＮγ、ストレプトアビジン－アルカリホスファターゼ（Mabtech）で解明した３５、３６。ＩＦＮγ分泌細胞の頻度を、ＩｍｍｕｎｏＣａｐｔｕｒｅ及びＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔソフトウェアを用いて定量化し、１０５個当たりのＩＦＮγスポット形成単位（ＳＦＵ）の数を算出した。
ＥＬＩＳｐｏｔプレート（Millipore）を抗ヒトＩＦＮγ抗体（１－Ｄ１Ｋ、Mabtech）でコーティングし、一晩４℃に維持した。次いで、プレートを、１％ウシ胎仔血清を含有するＰＢＳで６回洗浄した後、３匹の独立したドナーに由来する細胞を５×１０５～１×１０６細胞／ウェルでプレーティングし、３７℃及び５％ＣＯ２で２０時間、三連で培養した。サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）及びインフルエンザのＴ細胞エピトープのペプチドプールである１μｇ／ｍＬのＣＥＦ、並びに陽性対照としての１μｇ／ｍＬのブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）に応答したＩＦＮγ分泌細胞を測定した。次いで、プレートを以前に記載されているようにビオチン化抗ヒトＩＦＮγ、ストレプトアビジン－アルカリホスファターゼ（Mabtech）で解明した３５、３６。ＩＦＮγ分泌細胞の頻度を、ＩｍｍｕｎｏＣａｐｔｕｒｅ及びＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔソフトウェアを用いて定量化し、１０５個当たりのＩＦＮγスポット形成単位（ＳＦＵ）の数を算出した。
【0150】
統計分析
少なくとも３匹の個々のドナーからのデータを全ての図に示し、実験的反復を常に行った。少なくとも５匹の動物を各ｉｎ ｖｉｖｏ条件で使用した。全てのｐ値を、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（GraphPad）を用いて対応のない両側スチューデントｔ検定によって算出した。マウスの無イベント生存（ＥＦＳ）を、マンテル－コックス検定を用いて決定した。０．０５未満のｐ値を統計的に有意とみなした。
少なくとも３匹の個々のドナーからのデータを全ての図に示し、実験的反復を常に行った。少なくとも５匹の動物を各ｉｎ ｖｉｖｏ条件で使用した。全てのｐ値を、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（GraphPad）を用いて対応のない両側スチューデントｔ検定によって算出した。マウスの無イベント生存（ＥＦＳ）を、マンテル－コックス検定を用いて決定した。０．０５未満のｐ値を統計的に有意とみなした。
【0151】
実施例１：ＣＤ１ａは皮質Ｔ－ＡＬＬ芽球を特異的にマークする
ＣＡＲＴとＴ系列芽球との間の標的抗原の共通発現により、Ｔ－ＡＬＬにおける免疫療法アプローチはＣＡＲＴ関連フラトリサイド及び潜在的な致死的Ｔ細胞形成不全のために限られている。しかしながら、ＣＤ１ａ抗原は、Ｔ－ＡＬＬの主要サブセットである皮質Ｔ－ＡＬＬにおいて発現され（図１Ａ、図１Ｂ）、全ての胸腺外組織において機能的Ｔ細胞では全く見られず２５、定常状態ＣＤ３４＋ＨＳＰＣは、個体発生にわたって複数の造血部位でＣＤ１ａ発現を欠いている（図１Ｃ）。Ｔ細胞発生は、初めにリンパ－骨髄能を有するＣＤ３４ｈｉｇｈＣＤ７－ＣＤ１ａ－原始ＨＳＰＣが定着することによって胸腺内で開始し、これが続いて胸腺微小環境に応答してＣＤ３４ｈｉｇｈＣＤ７＋ＣＤ１ａ－初期Ｔ細胞前駆体に分化する３７。Ｔ細胞前駆体は、胸腺分化を経て進行するにつれ、ＣＤ７発現を維持し、徐々にＣＤ３４発現を失うが、ＣＤ１ａ発現が現れ、これが一時的に皮質胸腺細胞に限定される３８（図１Ｅ、図１Ｆ）。ＣＤ３４＋胸腺集団では、約５０％を前皮質Ｔ細胞前駆体が占め（ＣＤ３４ｈｉｇｈＣＤ７＋ＣＤ１ａ－、図１Ｅ、図１Ｆ（灰色の細胞））、ＣＤ１ａが、致命的転帰を有する３、３９～４１、Ｒ／Ｒ皮質Ｔ－ＡＬＬにおける免疫療法の実現可能かつ安全な標的であり得ると仮定することができる。
ＣＡＲＴとＴ系列芽球との間の標的抗原の共通発現により、Ｔ－ＡＬＬにおける免疫療法アプローチはＣＡＲＴ関連フラトリサイド及び潜在的な致死的Ｔ細胞形成不全のために限られている。しかしながら、ＣＤ１ａ抗原は、Ｔ－ＡＬＬの主要サブセットである皮質Ｔ－ＡＬＬにおいて発現され（図１Ａ、図１Ｂ）、全ての胸腺外組織において機能的Ｔ細胞では全く見られず２５、定常状態ＣＤ３４＋ＨＳＰＣは、個体発生にわたって複数の造血部位でＣＤ１ａ発現を欠いている（図１Ｃ）。Ｔ細胞発生は、初めにリンパ－骨髄能を有するＣＤ３４ｈｉｇｈＣＤ７－ＣＤ１ａ－原始ＨＳＰＣが定着することによって胸腺内で開始し、これが続いて胸腺微小環境に応答してＣＤ３４ｈｉｇｈＣＤ７＋ＣＤ１ａ－初期Ｔ細胞前駆体に分化する３７。Ｔ細胞前駆体は、胸腺分化を経て進行するにつれ、ＣＤ７発現を維持し、徐々にＣＤ３４発現を失うが、ＣＤ１ａ発現が現れ、これが一時的に皮質胸腺細胞に限定される３８（図１Ｅ、図１Ｆ）。ＣＤ３４＋胸腺集団では、約５０％を前皮質Ｔ細胞前駆体が占め（ＣＤ３４ｈｉｇｈＣＤ７＋ＣＤ１ａ－、図１Ｅ、図１Ｆ（灰色の細胞））、ＣＤ１ａが、致命的転帰を有する３、３９～４１、Ｒ／Ｒ皮質Ｔ－ＡＬＬにおける免疫療法の実現可能かつ安全な標的であり得ると仮定することができる。
【0152】
実施例２：ＣＤ１ａリダイレクトＴ細胞（ＣＤ１ａ ＣＡＲＴ）は、Ｔ細胞フラトリサイドなしに増加する
抗ＣＤ１ａ ｓｃＦｖ、ＣＤ８ＴＭスペーサー、並びにＴ２Ａ配列を介してＧＦＰとインフレームで連結した４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）及びＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメインからなる第２世代ＣＤ１ａ ＣＡＲを設計した（図２Ａ）。ＣＤ１ａ ＣＡＲの発現は、２９３Ｔ細胞（図２Ｂ）並びに一次ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞サブセット（図２Ｃ）においてｓｃＦｖ及びＧＦＰの両方の同時発現によって容易に検出された。重要なことには、活性化（ＣＤ６９＋ＣＤ２５＋）ＣＤ１ａ ＣＡＲＴ（図２Ｄ）は、モックＴ細胞（図２Ｅ）と同様、１２日間にわたって連続的に２００倍に増加し、ＣＤ１ａ抗原に対するＣＡＲＴのリダイレクトがＴ細胞フラトリサイドを誘導しないことが実証された。
抗ＣＤ１ａ ｓｃＦｖ、ＣＤ８ＴＭスペーサー、並びにＴ２Ａ配列を介してＧＦＰとインフレームで連結した４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）及びＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメインからなる第２世代ＣＤ１ａ ＣＡＲを設計した（図２Ａ）。ＣＤ１ａ ＣＡＲの発現は、２９３Ｔ細胞（図２Ｂ）並びに一次ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞サブセット（図２Ｃ）においてｓｃＦｖ及びＧＦＰの両方の同時発現によって容易に検出された。重要なことには、活性化（ＣＤ６９＋ＣＤ２５＋）ＣＤ１ａ ＣＡＲＴ（図２Ｄ）は、モックＴ細胞（図２Ｅ）と同様、１２日間にわたって連続的に２００倍に増加し、ＣＤ１ａ抗原に対するＣＡＲＴのリダイレクトがＴ細胞フラトリサイドを誘導しないことが実証された。
【0153】
実施例３：ＣＤ１ａ ＣＡＲＴは、Ｔ－ＡＬＬ細胞株及び一次芽球をｉｎ ｖｉｔｒｏで特異的に根絶させる
次いで、ＣＤ１ａ ＣＡＲＴを、ＣＤ１ａ＋Ｔ－ＡＬＬ細胞株Ｊｕｒｋａｔ及びＭＯＬＴ４、並びに陰性対照としてのＢ－ＡＬＬ細胞株ＮＡＬＭ６を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで試験した（図２Ｆ）。対照ＣＡＲＴ（モックＴ細胞又はＣＤ２２ ＣＡＲＴのいずれか）と比較すると、ＣＤ１ａ ＣＡＲＴは、ＣＤ１ａ＋Ｔ－ＡＬＬ細胞をＥ：Ｔ比に依存して特異的に排除した。２：１又は４：１の比較的低いＥ：Ｔ比は、１６時間のアッセイにおいて５０％～８０％の特異的細胞溶解を誘導した（図２Ｈ、図２Ｉ、図９）。重要なことには、殆どのＣＤ１ａ＋Ｔ－ＡＬＬ細胞が、７２時間のアッセイにおいて１：１のＥ：Ｔ比ではＣＤ１ａ ＣＡＲＴへの曝露を生き延びなかった（図２Ｉ）。ＣＤ１ａ ＣＡＲＴは、ＣＤ１ａ＋Ｔ－ＡＬＬ細胞との同時培養時に高レベルの炎症誘発性サイトカインＩＬ－２、ＴＮＦα及びＩＦＮγを産生し、それらの作用が確認された（図２Ｋ）。
次いで、ＣＤ１ａ ＣＡＲＴを、ＣＤ１ａ＋Ｔ－ＡＬＬ細胞株Ｊｕｒｋａｔ及びＭＯＬＴ４、並びに陰性対照としてのＢ－ＡＬＬ細胞株ＮＡＬＭ６を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで試験した（図２Ｆ）。対照ＣＡＲＴ（モックＴ細胞又はＣＤ２２ ＣＡＲＴのいずれか）と比較すると、ＣＤ１ａ ＣＡＲＴは、ＣＤ１ａ＋Ｔ－ＡＬＬ細胞をＥ：Ｔ比に依存して特異的に排除した。２：１又は４：１の比較的低いＥ：Ｔ比は、１６時間のアッセイにおいて５０％～８０％の特異的細胞溶解を誘導した（図２Ｈ、図２Ｉ、図９）。重要なことには、殆どのＣＤ１ａ＋Ｔ－ＡＬＬ細胞が、７２時間のアッセイにおいて１：１のＥ：Ｔ比ではＣＤ１ａ ＣＡＲＴへの曝露を生き延びなかった（図２Ｉ）。ＣＤ１ａ ＣＡＲＴは、ＣＤ１ａ＋Ｔ－ＡＬＬ細胞との同時培養時に高レベルの炎症誘発性サイトカインＩＬ－２、ＴＮＦα及びＩＦＮγを産生し、それらの作用が確認された（図２Ｋ）。
【0154】
ＣＤ１ａ ＣＡＲＴを、原発腫瘍を排除するそれらの能力に更に取り組むために、一次皮質Ｔ－ＡＬＬサンプル（新たに採取した又はＰＤＸ由来の）と同時培養し、ＣＤ１ａ＋芽球の割合を８０％～９８％の範囲とした（図３Ａ）。モックＴ細胞と比較すると、ＣＤ１ａ ＣＡＲＴは、７２時間の細胞毒性アッセイにおいて４：１のＥ：Ｔ比で一次ＣＤ１ａ＋皮質Ｔ－ＡＬＬ細胞を特異的に排除した（図３Ｂ、図３Ｃ）。ＢＭにおいてＣＤ１ａ＋Ｔ－ＡＬＬ芽球と共存する正常造血細胞（ＣＤ１ａ－）は、ＣＤ１ａ ＣＡＲＴによって溶解されなかった（図３Ｃ）。高レベルのＩＦＮγ及びＴＮＦαもＣＤ１ａ＋一次Ｔ－ＡＬＬ細胞との同時培養時に分泌された（図３Ｄ）。まとめると、これらの結果から、ＣＤ１ａ ＣＡＲＴがｉｎ ｖｉｔｒｏでＴ－ＡＬＬ細胞株及び一次芽球に対して強力かつ特異的な抗白血病活性を有することが示される。
【0155】
実施例４：ＣＤ１ａ ＣＡＲＴは、ｉｎ ｖｉｖｏで強力な抗白血病活性を示す
次に、ＣＤ１ａ ＣＡＲＴの活性を、Ｌｕｃ発現Ｊｕｒｋａｔ Ｔ－ＡＬＬ細胞（図４、図１０）及び一次皮質Ｔ－ＡＬＬ異種移植片モデル３４（図５）の両方を用いてｉｎ ｖｉｖｏで評価した。ＮＳＧマウスに、２×１０６個又は５×１０６個のいずれかのＣＤ１ａ（又はモック）ＣＡＲＴのｉ．ｖ．注入の３日前に３×１０６個のＬｕｃ発現Ｊｕｒｋａｔ細胞を移植し、白血病の確立をＢＬＩによって毎週追跡した（図４Ａ、図１０）。ＢＬＩにより多大な腫瘍負荷が示された、モックＴ細胞を与えたマウスとは対照的に、ＣＤ１ａ ＣＡＲＴを与えたマウスは、２５日目まで実質的に白血病を有しなかった（図４Ｂ、図４Ｃ、図１０）。白血病の進行の制御は、ＣＤ１ａ ＣＡＲＴ細胞では用量依存的であった（図１０Ｂ、図１０Ｃ）。屠殺時のＰＢにおける腫瘍負荷のフローサイトメトリー分析によりＢＬＩデータを確認した（図４Ｄ）。重要なことには、ＦＡＣＳ分析から、分析した全ての造血組織におけるＴ細胞持続性が明らかとなった（図４Ｅ）。しかしながら、モックＴ細胞を与えたマウスにおけるＴ細胞生体内分布と比較して、ＢＭ及び脾臓においてＣＤ１ａ ＣＡＲＴの顕著に増加した生体内分布が見られ（図４Ｅ）、ＣＤ１ａ ＣＡＲＴによる播種性白血病の能動的制御が示された。
次に、ＣＤ１ａ ＣＡＲＴの活性を、Ｌｕｃ発現Ｊｕｒｋａｔ Ｔ－ＡＬＬ細胞（図４、図１０）及び一次皮質Ｔ－ＡＬＬ異種移植片モデル３４（図５）の両方を用いてｉｎ ｖｉｖｏで評価した。ＮＳＧマウスに、２×１０６個又は５×１０６個のいずれかのＣＤ１ａ（又はモック）ＣＡＲＴのｉ．ｖ．注入の３日前に３×１０６個のＬｕｃ発現Ｊｕｒｋａｔ細胞を移植し、白血病の確立をＢＬＩによって毎週追跡した（図４Ａ、図１０）。ＢＬＩにより多大な腫瘍負荷が示された、モックＴ細胞を与えたマウスとは対照的に、ＣＤ１ａ ＣＡＲＴを与えたマウスは、２５日目まで実質的に白血病を有しなかった（図４Ｂ、図４Ｃ、図１０）。白血病の進行の制御は、ＣＤ１ａ ＣＡＲＴ細胞では用量依存的であった（図１０Ｂ、図１０Ｃ）。屠殺時のＰＢにおける腫瘍負荷のフローサイトメトリー分析によりＢＬＩデータを確認した（図４Ｄ）。重要なことには、ＦＡＣＳ分析から、分析した全ての造血組織におけるＴ細胞持続性が明らかとなった（図４Ｅ）。しかしながら、モックＴ細胞を与えたマウスにおけるＴ細胞生体内分布と比較して、ＢＭ及び脾臓においてＣＤ１ａ ＣＡＲＴの顕著に増加した生体内分布が見られ（図４Ｅ）、ＣＤ１ａ ＣＡＲＴによる播種性白血病の能動的制御が示された。
【0156】
皮質Ｔ－ＡＬＬの臨床的により関連するＰＤＸモデルにおいて、ＮＳＧマウスに初めに１×１０６個の一次ＣＤ１ａ＋Ｔ－ＡＬＬ芽球を移植し、続いて３日後に１×１０６個のＣＤ１ａ（又はモック）ＣＡＲＴを注入した後、白血病の生着を２週間に１回、採血及びエンドポイントＢＭ分析によって追跡した（図５Ａ）。ＣＤ１ａ＋皮質Ｔ－ＡＬＬ細胞の生着は、モックＴ細胞処理ＰＤＸではＢＭ（図５Ｂ、６週目及び９週目にそれぞれ５０％±１３％及び５５％±１１％）及びＰＢ（図５Ｃ、６週目及び９週目にそれぞれ４．４％±２％及び１８％±６％）の両方において時間と共に徐々に増大し、有意に低い９週目のＯＳと関連していた（４２％対１００％、ｐ＝０．０１；図５Ｄ）。対照的に、ＣＤ１ａ ＣＡＲＴは、Ｔ－ＡＬＬの成長／生着を完全に消滅させ（ＢＭ及びＰＢにおいてそれぞれ０．３６％及び０％のＴ－ＡＬＬ芽球）、９週間後にＢＭ及びＰＢで残存していた（図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｅ）。
【0157】
実施例５：ｉｎ ｖｉｖｏで持続性のＣＤ１ａ ＣＡＲＴは、再チャレンジアッセイにおいて機能的である
造血組織におけるＣＡＲＴの持続性は、それらの臨床的成功に主要な生物学的パラメーターであるため、４０日～５０日後に残存するＣＤ１ａ ＣＡＲＴがＴ－ＡＬＬ進行の制御において機能的かつ効率的なままであるかを次に評定した。このため、ＣＤ１ａ ＣＡＲＴでの処理により白血病が消滅した、Ｔ－ＡＬＬを移植したマウスをＬｕｃ－Ｊｕｒｋａｔ細胞（図６Ａ～図６Ｄ）又はプリモグラフトに由来する一次Ｔ－ＡＬＬ（図６Ｅ～図６Ｇ）のいずれかで再チャレンジした。二次性白血病が急速（早ければ２週間後）かつ大幅に生着した対照とは対照的に、Ｊｕｒｋａｔ（図６Ｃ）又は６週間後のプリモグラフトモデル（図６Ｆ）では、Ｔ－ＡＬＬ生着はＢＬＩ又はＦＡＣＳのいずれによっても殆ど検出可能でなかった。
造血組織におけるＣＡＲＴの持続性は、それらの臨床的成功に主要な生物学的パラメーターであるため、４０日～５０日後に残存するＣＤ１ａ ＣＡＲＴがＴ－ＡＬＬ進行の制御において機能的かつ効率的なままであるかを次に評定した。このため、ＣＤ１ａ ＣＡＲＴでの処理により白血病が消滅した、Ｔ－ＡＬＬを移植したマウスをＬｕｃ－Ｊｕｒｋａｔ細胞（図６Ａ～図６Ｄ）又はプリモグラフトに由来する一次Ｔ－ＡＬＬ（図６Ｅ～図６Ｇ）のいずれかで再チャレンジした。二次性白血病が急速（早ければ２週間後）かつ大幅に生着した対照とは対照的に、Ｊｕｒｋａｔ（図６Ｃ）又は６週間後のプリモグラフトモデル（図６Ｆ）では、Ｔ－ＡＬＬ生着はＢＬＩ又はＦＡＣＳのいずれによっても殆ど検出可能でなかった。
【0158】
実施例６：患者由来のＣＤ１ａ ＣＡＲＴは、自己ＣＤ１ａ＋芽球を特異的に標的化し、抗ウイルス活性を保持する
標的抗原の適当な選択及びＴ細胞フラトリサイドの回避は、Ｔ－ＡＬＬの治療におけるＣＡＲＴの成功に不可欠である。したがって、皮質Ｔ－ＡＬＬを有する患者からのＰＢ由来のＣＤ３＋ＣＤ１ａ－Ｔ細胞を単離し、ＣＤ１ａ ＣＡＲを発現するように遺伝子操作することができるかを試験した（図７）。このため、患者からＣＤ３＋ＣＤ１ａ－Ｔ細胞を単離し（純度９５％超、データは示さない）、ＣＤ３／ＣＤ２８で活性化し、ＣＤ１ａ ＣＡＲ又はモックでレンチウイルス形質導入した（３１％～７０％の形質導入）。次に、活動性Ｔ－ＡＬＬ患者に適合したＰＢＭＣに対する一次Ｔ－ＡＬＬに由来するＣＤ１ａ ＣＡＲＴの細胞溶解能を調査した（図７Ａ）。自己細胞毒性能及びフラトリサイドの程度の両方を評定することが可能となることから、全ＰＢＭＣを標的として使用した。ｅＦｌｕｏｒ６７０標識した標的ＰＢＭＣにおいて、大半がＣＤ１ａ＋芽球であり、約１５％がＣＤ３＋ＣＤ１ａ－正常Ｔ細胞である（図７Ｂ）。モックＴ細胞と比較すると、ＣＤ１ａ ＣＡＲＴは、自己ＣＤ１ａ＋芽球に対して多大かつ特異的な細胞溶解能を示したが、ＣＤ１ａ－正常Ｔ細胞に対しては細胞溶解能を示さず（図６Ｂ）、ＣＤ１ａ ＣＡＲＴがフラトリサイド耐性であることが更に実証された。
標的抗原の適当な選択及びＴ細胞フラトリサイドの回避は、Ｔ－ＡＬＬの治療におけるＣＡＲＴの成功に不可欠である。したがって、皮質Ｔ－ＡＬＬを有する患者からのＰＢ由来のＣＤ３＋ＣＤ１ａ－Ｔ細胞を単離し、ＣＤ１ａ ＣＡＲを発現するように遺伝子操作することができるかを試験した（図７）。このため、患者からＣＤ３＋ＣＤ１ａ－Ｔ細胞を単離し（純度９５％超、データは示さない）、ＣＤ３／ＣＤ２８で活性化し、ＣＤ１ａ ＣＡＲ又はモックでレンチウイルス形質導入した（３１％～７０％の形質導入）。次に、活動性Ｔ－ＡＬＬ患者に適合したＰＢＭＣに対する一次Ｔ－ＡＬＬに由来するＣＤ１ａ ＣＡＲＴの細胞溶解能を調査した（図７Ａ）。自己細胞毒性能及びフラトリサイドの程度の両方を評定することが可能となることから、全ＰＢＭＣを標的として使用した。ｅＦｌｕｏｒ６７０標識した標的ＰＢＭＣにおいて、大半がＣＤ１ａ＋芽球であり、約１５％がＣＤ３＋ＣＤ１ａ－正常Ｔ細胞である（図７Ｂ）。モックＴ細胞と比較すると、ＣＤ１ａ ＣＡＲＴは、自己ＣＤ１ａ＋芽球に対して多大かつ特異的な細胞溶解能を示したが、ＣＤ１ａ－正常Ｔ細胞に対しては細胞溶解能を示さず（図６Ｂ）、ＣＤ１ａ ＣＡＲＴがフラトリサイド耐性であることが更に実証された。
【0159】
ＣＤ１ａ ＣＡＲＴの潜在的胸腺毒性を更に評定するために、ヒト正常胎児胸腺由来のＣＤ７＋胸腺細胞を標的細胞として次に使用した。ＣＤ１ａ＋皮質胸腺細胞（２番目及び３番目の灰色のボックス）のみがＣＤ１ａ ＣＡＲＴによって排除され、発生的により初期及び後期のＣＤ１ａ－（最初のボックス）胸腺Ｔ系列集団（ＣＤ７＋ＣＤ３４＋及びＣＤ７＋ＣＤ３４－）は標的化されず（図１Ｅ、図１Ｆ）、オンターゲット／オフ腫瘍効果が皮質胸腺細胞の発生的に一時的な胸腺集団に限定された。最後に、ＣＤ１ａ ＣＡＲＴが、免疫抑制患者においてウイルス血症を引き起こす最も一般的な病原体を標的化することによって単独で宿主を保護することができるかを決定しようとした。このため、ＣＭＶ、ＥＢＶ及びインフルエンザ抗原（ＣＥＦ）に対するＣＤ１ａ ＣＡＲＴの反応性を試験し、ＳＣＦをＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔによって定量化した。モックＴ細胞及びＣＤ１ａ ＣＡＲＴの両方がウイルスペプチドによる刺激に対して極めて似たような応答を示し、ＣＤ１ａ ＣＡＲＴが抗ウイルス活性を保持することが示唆された（図７Ｄ）。
【0160】
文献
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【図1-1】
【図1-2】
【図2-1】
【図2-2】
【図2-3】
【図3-1】
【図3-2】
【図4-1】
【図4-2】
【図4-3】
【図5-1】
【図5-2】
【図5-3】
【図6-1】
【図6-2】
【図7-1】
【図7-2】
【図8-1】
【図8-2】
【図8-3】
【図8-4】
【図9】
【図10-1】
【図10-2】
【図11】
【図12】
【配列表】
【国際調査報告】