知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
▶ ヴァスジーン セラピューティクス インコーポレイテッドの特許一覧
特表2022-520596前立腺がんを治療するための新規マーカーとしてのＥＰＨＢ４－エフリンＢ２受容体リガンド対
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-03-31
(54)【発明の名称】前立腺がんを治療するための新規マーカーとしてのＥＰＨＢ４－エフリンＢ２受容体リガンド対
(51)【国際特許分類】
A61K 38/17 20060101AFI20220324BHJP
A61P 13/08 20060101ALI20220324BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220324BHJP
A61K 47/64 20170101ALI20220324BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20220324BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20220324BHJP
A61K 47/66 20170101ALI20220324BHJP
G01N 33/68 20060101ALI20220324BHJP
C07K 14/47 20060101ALN20220324BHJP
【ＦＩ】
A61K38/17
A61P13/08 ZNA
A61P35/00
A61K47/64
A61K45/00
A61P43/00 121
A61K47/66
G01N33/68
C07K14/47
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021547322
(86)(22)【出願日】2020-02-13
(85)【翻訳文提出日】2021-09-24
(86)【国際出願番号】 US2020018160
(87)【国際公開番号】W WO2020168110
(87)【国際公開日】2020-08-20
(31)【優先権主張番号】62/805,291
(32)【優先日】2019-02-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】521355784
【氏名又は名称】ヴァスジーン セラピューティクス インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＶＡＳＧＥＮＥ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ ＩＮＣ
(74)【代理人】
【識別番号】110001302
【氏名又は名称】特許業務法人北青山インターナショナル
(72)【発明者】
【氏名】クラスノペロフ，ヴァレリー
【テーマコード（参考）】
2G045
4C076
4C084
4H045
【Ｆターム（参考）】
2G045AA26
2G045CB02
2G045DA36
2G045FB03
2G045FB12
2G045FB13
4C076CC17
4C076CC27
4C076CC41
4C076EE41Q
4C076EE59Q
4C076FF63
4C084AA01
4C084AA02
4C084AA19
4C084BA08
4C084BA22
4C084BA23
4C084CA18
4C084MA02
4C084NA03
4C084ZA811
4C084ZA812
4C084ZB261
4C084ZB262
4C084ZC751
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA40
4H045EA20
(57)【要約】
ＥｐｈＢ４またはエフリンＢ２を介した機能を阻害するポリペプチド剤の治療有効量を対象に投与することを含む、対象における前立腺がん（ＰＣ）を治療するための組成物および方法が提供される。より具体的には、ＰＴＥＮ欠損ＰＣ、またはアンドロゲン受容体（ＡＲ）標的療法を用いた治療に対して難治性であるＰＣの治療で使用される方法が提供される。治療薬としての可溶性ＥｐｈＢ４が、腫瘍形成を抑制し、樹立された去勢前腫瘍および去勢後腫瘍において腫瘍縮小を誘導したことは重要なことである。驚くべきことに、治療によりアンドロゲン受容体（ＡＲ）レベルも減少した。ＰＩ３Ｋアイソフォーム分析から、ＰＩ３Ｋ ｐ１１０βのみのダウンレギュレーションにより、ＡＲレベルが直接制御されることが示された（ＰＩ３Ｋβの異所性発現によりＡＲ減少がレスキューされた）。よって、ＥｐｈＢ４は前立腺がんにおける新規の標的となる。
【選択図】 なし
【選択図】 なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
患者における前立腺がんの治療で使用される医薬品を製造するための、ＥｐｈＢ４またはエフリンＢ２を介した機能を阻害する単離ポリペプチド剤の使用であって、前記ポリペプチド剤がＥｐｈＢ４タンパク質の単量体リガンド結合部分であり、血中半減期を延長させる改変を含む、
単離ポリペプチド剤の使用。
【請求項2】
前記ポリペプチド剤が、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）（「ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡ」）およびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（「ｓＥｐｈＢ４－ＢＳＡ」）からなる群から選択されるアルブミンと共有結合的または非共有結合的に結び付いた、配列番号１（「ｓＥｐｈＢ４ポリペプチド」）の１～１９７番、１６～１９７番、２９～１９７番、１～３１２番、１６～３１２番、２９～３１２番、１～３２１番、１６～３２１番、２９～３２１番、１～３２６番、１６～３２６番、２９～３２６番、１～４１２番、１６～４１２番、２９～４１２番、１～４２７番、１６～４２７番、２９～４２７番、１～４２９番、１６～４２９番、２９～４２９番、１～５２６番、１６～５２６番、２９～５２６番、１～５３７番、１６～５３７番、および２９～５３７番アミノ酸からなる群から選択される配列を含む、請求項１に記載の使用。
【請求項3】
前記ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡが、配列番号２の２５～６０９番残基に直接融合した配列番号１の１６～３２６番残基を含む、請求項１～２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項4】
前記ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡが、配列番号２の２５～６０９番残基に直接融合した配列番号１の１６～５３７番残基を含む、請求項１～２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項5】
前記対象が再発がんを有する、請求項１～４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項6】
前記対象が抵抗性または難治性のがんを有する、請求項１～４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項7】
前記がんが、アンドロゲン除去療法、ＡＲ標的療法、ホルモン除去療法、免疫療法による治療、化学療法剤による治療、特定の腫瘍抗原に対する除去抗体を用いた治療、共刺激分子または共抑制分子（免疫チェックポイント）に対するアゴニスト抗体、アンタゴニスト抗体、または阻止抗体を用いた治療、免疫複合体、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）、または特定の腫瘍抗原腫瘍抗原に対する除去抗体と細胞毒とを含む融合分子による標的治療、小分子キナーゼ阻害剤による標的治療、外科手術を用いた治療、幹細胞移植を用いた治療、および放射線を用いた治療からなる群から選択される抗がん療法に対して難治性である、請求項６に記載の使用。
【請求項8】
前記がんが化学療法を用いた治療に対して難治性である、請求項７に記載の使用。
【請求項9】
前記がんがアンドロゲン除去療法を用いた治療に対して難治性である、請求項７に記載の使用。
【請求項10】
前記がんがホルモン除去療法を用いた治療に対して難治性である、請求項７に記載の使用。
【請求項11】
前記がんがＡＲ標的療法を用いた治療に対して難治性である、請求項７に記載の使用。
【請求項12】
前記がんが放射線を用いた治療に対して難治性である、請求項７に記載の使用。
【請求項13】
前記がんがシプロイセルＴを用いた治療に対して難治性である、請求項７に記載の使用。
【請求項14】
前記がんがラジウム２２３を用いた治療に対して難治性である、請求項７に記載の使用。
【請求項15】
患者における前立腺がんの治療で使用される医薬品を製造するための、ＥｐｈＢ４またはエフリンＢ２を介した機能を阻害する単離ポリペプチド剤の使用であって、前記ポリペプチド剤が、ＥｐｈＢ４タンパク質の単量体リガンド結合部分であり、血中半減期を延長させる改変を含み、
前記治療が第二の抗がん療法の同時投与を含み、
前記第二の抗がん療法がＥｐｈＢ４またはエフリンＢ２を介した機能を阻害する前記ポリペプチド剤と相乗的に働く、
単離ポリペプチド剤の使用。
【請求項16】
前記抗がん療法が、アンドロゲン除去療法、ＡＲ標的療法、ホルモン除去療法、免疫療法による治療、化学療法剤による治療、特定の腫瘍抗原に対する除去抗体を用いた治療、共刺激分子または共抑制分子（免疫チェックポイント）に対するアゴニスト抗体、アンタゴニスト抗体、または阻止抗体を用いた治療、免疫複合体、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）、または特定の腫瘍抗原腫瘍抗原に対する除去抗体と細胞毒とを含む融合分子による標的治療、小分子キナーゼ阻害剤による標的治療、外科手術を用いた治療、幹細胞移植を用いた治療、および放射線を用いた治療からなる群から選択される、請求項１５に記載の使用。
【請求項17】
患者における前立腺がんを治療するための方法であって、（ａ）患者由来の１または複数のがん細胞がＥｐｈＢ４を発現または過剰発現しているかどうかを判定すること；および
（ｂ）１または複数の細胞がＥｐｈＢ４を発現または過剰発現している場合、ＥｐｈＢ４またはエフリンＢ２を介した機能を阻害する単離ポリペプチド剤の有効量を投与すること、
を含む、方法。
【請求項18】
前記ポリペプチド剤が、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）（「ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡ」）およびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（「ｓＥｐｈＢ４－ＢＳＡ」）からなる群から選択されるアルブミンと共有結合的または非共有結合的に結び付いた、配列番号１（「ｓＥｐｈＢ４ポリペプチド」）の１～１９７番、１６～１９７番、２９～１９７番、１～３１２番、１６～３１２番、２９～３１２番、１～３２１番、１６～３２１番、２９～３２１番、１～３２６番、１６～３２６番、２９～３２６番、１～４１２番、１６～４１２番、２９～４１２番、１～４２７番、１６～４２７番、２９～４２７番、１～４２９番、１６～４２９番、２９～４２９番、１～５２６番、１６～５２６番、２９～５２６番、１～５３７番、１６～５３７番、および２９～５３７番アミノ酸からなる群から選択される配列を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
前記ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡが、配列番号２の２５～６０９番残基に直接融合した配列番号１の１６～３２６番残基を含む、請求項１７～１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項20】
前記ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡが、配列番号２の２５～６０９番残基に直接融合した配列番号１の１６～５３７番残基を含む、請求項１７～１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
前記対象が再発がんを有する、請求項１７～２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項22】
前記対象が抵抗性または難治性のがんを有する、請求項１７～２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項23】
前記がんが、アンドロゲン除去療法、ＡＲ標的療法、ホルモン除去療法、免疫療法による治療、化学療法剤による治療、特定の腫瘍抗原に対する除去抗体を用いた治療、共刺激分子または共抑制分子（免疫チェックポイント）に対するアゴニスト抗体、アンタゴニスト抗体、または阻止抗体を用いた治療、免疫複合体、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）、または特定の腫瘍抗原腫瘍抗原に対する除去抗体と細胞毒とを含む融合分子による標的治療、小分子キナーゼ阻害剤による標的治療、外科手術を用いた治療、幹細胞移植を用いた治療、および放射線を用いた治療からなる群から選択される抗がん療法に対して難治性である、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
前記がんが化学療法を用いた治療に対して難治性である、請求項２３に記載の方法。
【請求項25】
前記がんがアンドロゲン除去療法を用いた治療に対して難治性である、請求項２３に記載の方法。
【請求項26】
前記がんがホルモン除去療法を用いた治療に対して難治性である、請求項２３に記載の方法。
【請求項27】
前記がんがＡＲ標的療法を用いた治療に対して難治性である、請求項２３に記載の方法。
【請求項28】
前記がんが放射線を用いた治療に対して難治性である、請求項２３に記載の方法。
【請求項29】
前記がんがシプロイセルＴを用いた治療に対して難治性である、請求項２３に記載の方法。
【請求項30】
前記がんがラジウム２２３を用いた治療に対して難治性である、請求項２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連特許出願
本願は２０１９年２月１３日に出願された米国仮特許出願第６２／８０５，２９１号の利益を主張するものであり、当該仮特許出願はその全体が参照により本明細書に援用される。
本願は２０１９年２月１３日に出願された米国仮特許出願第６２／８０５，２９１号の利益を主張するものであり、当該仮特許出願はその全体が参照により本明細書に援用される。
【0002】
配列表
本願は、「紙コピー」（ＰＤＦファイル）形態の配列表と、本明細書内で提出される、参照配列（配列番号１～２）をコンピューター可読形態で含むファイル（ＳＴ２５形式テキストファイル）とを含む。配列表では、米国特許法施行規則§１．８２２の規定の通り、アミノ酸は標準的な３文字表記を用いて示している。
本願は、「紙コピー」（ＰＤＦファイル）形態の配列表と、本明細書内で提出される、参照配列（配列番号１～２）をコンピューター可読形態で含むファイル（ＳＴ２５形式テキストファイル）とを含む。配列表では、米国特許法施行規則§１．８２２の規定の通り、アミノ酸は標準的な３文字表記を用いて示している。
【0003】
技術分野
今日、がんは、高度な診断法や治療法が数多く開発されているにもかかわらず、世界中で主要な死因であり続けている。臨床腫瘍学における治療プロトコルは、外科的切除、電離放射線、および細胞障害性化学療法の組み合わせに依存したままである。がんの治療や予防を成功させる際の大きな障壁として、多くのがんが現在の化学療法や免疫療法による治療介入に応答せず、積極的な治療を行った後も多くの人が再発を起こしたり死亡したりしているという事実がある。これらの欠点を解決するために、がんにおいて制御不全となったシグナル伝達軸を調節できる標的治療を開発することが、創薬におけるトレンドとなっている。現在、数え切れないほどの臨床的に重要な標的の、治療を目的とした操作を可能にする、多くの抗体や小分子がＦＤＡの承認を受けている。
今日、がんは、高度な診断法や治療法が数多く開発されているにもかかわらず、世界中で主要な死因であり続けている。臨床腫瘍学における治療プロトコルは、外科的切除、電離放射線、および細胞障害性化学療法の組み合わせに依存したままである。がんの治療や予防を成功させる際の大きな障壁として、多くのがんが現在の化学療法や免疫療法による治療介入に応答せず、積極的な治療を行った後も多くの人が再発を起こしたり死亡したりしているという事実がある。これらの欠点を解決するために、がんにおいて制御不全となったシグナル伝達軸を調節できる標的治療を開発することが、創薬におけるトレンドとなっている。現在、数え切れないほどの臨床的に重要な標的の、治療を目的とした操作を可能にする、多くの抗体や小分子がＦＤＡの承認を受けている。
【0004】
前立腺がん（ＰＣ）は、男性の皮膚以外のがんでは最も多く、男性のがんによる死亡原因の第２位であり、米国だけでも毎年約３万人の患者が転移性疾患により死亡している。アンドロゲン除去療法（ＡＤＴ）は、進行前立腺がんに対する一般的な治療戦略であり、前立腺腫瘍の顕著な退縮を引き起こす。しかし、ＡＤＴは最初は治療応答が得られるものの、最終的にはほぼ全ての患者が応答しなくなる。その結果、患者は去勢抵抗性前立腺がん（ＣＲＰＣ）を発症する。ＣＲＰＣでは、治療開始後２～３年以内に、アンドロゲンが枯渇した環境下で、抗悪性度の致死的な前立腺がんが決まって再発する。残念ながら、ＣＲＰＣは現在のところ不治の病であり、転移性ＣＲＰＣを有するほぼ全ての患者が最終的にはこの疾患により死亡する。以来、様々な薬物療法が開発され、患者に適用されてきたが、アンドロゲン除去の背後にある基本的な前提はほとんど変わっていない。世界では毎年２５万人以上の男性が致死性の前立腺がんで死亡している。以上のことから、患者のための治療法の選択肢が早急に必要とされている。本開示は、このような、また他の、重要な目的を対象としている。
【0005】
次世代シーケンスによって、ＰＩ３ＫＣＡおよびホスファターゼ・テンシン・ホモログ（ＰＴＥＮ）における変異を含む、ホスファチジルイノシトール－４，５－ビスリン酸３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）経路における変異が、ＰＣの初期イベントとして同定された（Ｂｅｚｉｎｅｌｌｉら、Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、５２巻（１０号）、頁１３８４－１３８９、２０１７年）。現在、ＰＩ３Ｋアイソフォーム特異的な阻害剤の検討が臨床試験で行われているが、ＰＩ３Ｋ経路阻害剤はこの時点では活性が限定されている。このように、ＰＣの支配的な駆動因子を特定し、これらの極めて重要な標的に影響を与える新規の治療法を開発することが必要である。
【0006】
Ｅｐｈ（エリスロポエチン産生肝細胞癌）受容体およびリガンドは、最大の受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）ファミリーの一部である。このファミリーは、配列相同性と２つの異なる種類の膜固定エフリンリガンドに対する結合親和性に基づいて、クラスＡとクラスＢに細分される。各Ｅｐｈ受容体およびリガンドは、複数のリガンドおよび受容体に結合することができ、ある特定の受容体が推定上の腫瘍抑制因子として、また他の受容体は発癌プロモーターとして仮定されてきた（Ｖａｕｇｈｔら、Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、１０巻（６号）：頁２１７－２２４、２００８年）。ＥｐｈＢ４およびエフリンＢ２は、主に内皮細胞に存在するチロシンキナーゼ受容体－リガンド対として機能し、脈管形成や血管新生に関与している。エフリンＢ２－ＥｐｈＢ４相互作用の阻害は、インビトロおよびエキソビボで、腫瘍細胞増殖に対し直接的な阻害効果を有する。ＥｐｈＢ４またはエフリンＢ２を介した機能を阻害するポリペプチド剤が、本発明者らによって以前に報告された（例えば、米国特許第７，３８１，４１０号；同第７，８６２，８１６号；同第７，９７７，４６３号；同第８，０６３，１８３号；同第８，２７３，８５８号；同第８，９７５，３７７号；同第８，９８１，０６２号；同第９，５３３，０２６号を参照；それぞれは全ての目的においてその全体が参照によって本明細書に援用される）。
【0007】
本発明者らによって、ＥｐｈＢ４受容体がＰＣにおける新規の標的候補となることが確認された。遺伝的な検証試験で、前立腺上皮においてＰｔｅｎを欠失させた状況下でＥｐｈＢ４を条件的に欠失させた場合、腫瘍形成が止まり、ＰＩ３Ｋ経路誘導が抑制された。さらに、治療薬としての可溶性ＥｐｈＢ４（ｓＥｐｈＢ４）が、腫瘍形成を抑制し、樹立された去勢前腫瘍および去勢後腫瘍において腫瘍縮小を誘導した。驚くべきことに、治療によりＡＲレベルも減少した。ＰＩ３Ｋアイソフォーム分析から、ＰＩ３Ｋ ｐ１１０βのみのダウンレギュレーションにより、ＡＲレベルが直接制御されることが示された（ＰＩ３Ｋβの異所性発現によりＡＲ減少がレスキューされた）。
【0008】
参照による援用
特許文献の米国特許第７，３８１，４１０号；同第７，８６２，８１６号；同第７，９７７，４６３号；同第８，０６３，１８３号；同第８，２７３，８５８号；同第８，９７５，３７７号；同第８，９８１，０６２号；同第９，５３３，０２６号；および本明細書で開示される全ての参考文献は、全ての目的においてその全体が参照によって本明細書に援用される。
特許文献の米国特許第７，３８１，４１０号；同第７，８６２，８１６号；同第７，９７７，４６３号；同第８，０６３，１８３号；同第８，２７３，８５８号；同第８，９７５，３７７号；同第８，９８１，０６２号；同第９，５３３，０２６号；および本明細書で開示される全ての参考文献は、全ての目的においてその全体が参照によって本明細書に援用される。
【発明の概要】
【0009】
本明細書において、対象における前立腺がんを治療するための新規の方法および組成物が提供される。一つの態様において、本発明は、前立腺がん（ＰＣ）の治療で使用される医薬品の製造における、ＥｐｈＢ４またはエフリンＢ２を介した機能を阻害するポリペプチド剤の使用に関する。より具体的には、ＰＴＥＮ欠損ＰＣ、またはアンドロゲン受容体（ＡＲ）標的療法を用いた治療に対して難治性であるＰＣの治療で使用される、医薬品の製造における使用である。
【0010】
各種実施形態において、ＥｐｈＢ４またはエフリンＢ２を介した機能を阻害するポリペプチド剤は、ＥｐｈＢ４タンパク質もしくはエフリンＢ２タンパク質の単量体リガンド結合部分、またはＥｐｈＢ４もしくはエフリンＢ２に結合し作用する抗体である。各種実施形態において、上記ポリペプチド剤は、エフリンＢ２ポリペプチドに特異的に結合し、ＥｐｈＢ４タンパク質の細胞外ドメインのアミノ酸配列を含む、可溶性ＥｐｈＢ４（ｓＥｐｈＢ４）ポリペプチドである。各種実施形態において、ｓＥｐｈＢ４ポリペプチドは、ＥｐｈＢ４タンパク質の球状ドメインを含む。
【0011】
各種実施形態において、ｓＥｐｈＢ４ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列の、１～５２２番残基と少なくとも９０％同一の配列、１～４１２番残基と少なくとも９０％同一の配列、および１～３１２番残基と少なくとも９０％同一の配列からなる群から選択される配列を含む。各種実施形態において、ｓＥｐｈＢ４ポリペプチドは、球状（Ｇ）ドメイン（配列番号１の２９～１９７番アミノ酸）と、所望により、システインリッチドメイン（配列番号１の２３９～３２１番アミノ酸）、第一フィブロネクチン３型ドメイン（配列番号１の３２４～４２９番アミノ酸）、および第二フィブロネクチン３型ドメイン（配列番号１の４３４～５２６番アミノ酸）などの追加のドメインとを含む配列を含み得る。各種実施形態において、ｓＥｐｈＢ４ポリペプチドは、配列番号１の１～５３７番アミノ酸を含むこととなる。各種実施形態において、ｓＥｐｈＢ４ポリペプチドは、配列番号１の１～４２７番アミノ酸を含むこととなる。各種実施形態において、ｓＥｐｈＢ４ポリペプチドは、配列番号１の１～３２６番アミノ酸を含むこととなる。各種実施形態において、ｓＥｐｈＢ４ポリペプチドは、配列番号１の１～１９７番、２９～１９７番、１～３１２番、２９～１３２番、１～３２１番、２９～３２１番、１～３２６番、２９～３２６番、１～４１２番、２９～４１２番、１～４２７番、２９～４２７番、１～４２９番、２９～４２９番、１～５２６番、２９～５２６番、１～５３７番、および２９～５３７番アミノ酸を含むこととなる。各種実施形態において、ｓＥｐｈＢ４ポリペプチドは、配列番号１の１６～１９７番、１６～３１２番、１６～３２１番、１６～３２６番、１６～４１２番、１６～４２７番、１６～４２９番、１６～５２６番、および１６～５３７番アミノ酸を含むこととなる。
【0012】
各種実施形態において、Ｆｃ融合タンパク質としての発現または別の多量体化ドメインとの融合などにより、多量体形態の可溶性ポリペプチドが作製されてもよい。
【0013】
各種実施形態において、ｓＥｐｈＢ４ポリペプチドは、エフリンＢ２結合活性を保持しながら血中半減期を増加させる追加の成分をさらに含むこととなる。各種実施形態において、ｓＥｐｈＢ４ポリペプチドは単量体であり、１または複数のポリオキシアルキレン（ｐｏｌｙｏｘｙａｋｌｙｌｅｎｅ）基（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン）に共有結合的に連結されている。各種実施形態において、ｓＥｐｈＢ４ポリペプチドは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基に共有結合的に連結されている（以下、「ｓＥｐｈＢ４－ＰＥＧ」）。
【0014】
各種実施形態において、ｓＥｐｈＢ４ポリペプチドは、実質的にエフリンＢ２結合性を減弱させずに半減期を向上させる第二安定化ポリペプチドと安定に結び付けられている。各種実施形態において、上記の安定化ポリペプチドは、ヒト患者（または畜患、この場合、動物への使用が企図される）と免疫適合性であり、重要な生物活性をほとんどまたは全く持たない。各種実施形態において、ｓＥｐｈＢ４ポリペプチドは、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）（以下、「ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡ」）およびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（以下、「ｓＥｐｈＢ４－ＢＳＡ」）からなる群から選択されるアルブミンと共有結合的または非共有結合的に結び付けられている。各種実施形態において、ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡは、配列番号２の２５～６０９番残基に直接融合した配列番号１の１６～１９７番残基を含む。各種実施形態において、ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡは、配列番号２の２５～６０９番残基に直接融合した配列番号１の１６～３１２番残基を含む。各種実施形態において、ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡは、配列番号２の２５～６０９番残基に直接融合した配列番号１の１６～３２１番残基を含む。各種実施形態において、ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡは、配列番号２の２５～６０９番残基に直接融合した配列番号１の１６～３２６番残基を含む。各種実施形態において、ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡは、配列番号２の２５～６０９番残基に直接融合した配列番号１の１６～４１２番残基を含む。各種実施形態において、ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡは、配列番号２の２５～６０９番残基に直接融合した配列番号１の１６～４２７番残基を含む。各種実施形態において、ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡは、配列番号２の２５～６０９番残基に直接融合した配列番号１の１６～４２９番残基を含む。各種実施形態において、ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡは、配列番号２の２５～６０９番残基に直接融合した配列番号１の１６～５２６番残基を含む。各種実施形態において、ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡは、配列番号２の２５～６０９番残基に直接融合した配列番号１の１６～５３７番残基を含む。
【0015】
別の態様において、本発明は、対象におけるがんを治療するための併用療法で使用される医薬品の製造における、ＥｐｈＢ４またはエフリンＢ２を介した機能を阻害するポリペプチド剤の使用に関する。各種実施形態において、上記の併用療法は、対象における前立腺がんを治療する方法であって、ａ）治療有効量のｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡポリペプチド、およびｂ）治療有効量の第二の抗がん療法を対象に投与することを含む、方法に関する。上記の併用療法は相乗的なものであってもよい。上記の併用療法は抗がん療法の治療指数を増加させるものであってもよい。
【0016】
各種実施形態において、上記の第二の抗がん療法は、アンドロゲン除去療法（ＡＤＴ）、ＡＲ標的療法、ホルモン除去療法、免疫療法、化学療法、特定の腫瘍抗原に対する除去抗体を用いた標的治療、共刺激分子または共抑制分子（免疫チェックポイント）に対するアゴニスト抗体、アンタゴニスト抗体、または阻止抗体を用いた標的治療、免疫複合体、ＡＤＣ、または特定の腫瘍抗原に対する除去抗体と細胞毒とを含む融合分子による標的治療、小分子キナーゼ阻害剤標的療法、外科手術、放射線治療、ＤＨＴ遮断薬を用いた治療、および幹細胞移植からなる群から選択される。各種実施形態において、上記の第二の抗がん療法は、ＣＤ２７６、ＣＤ２７２、ＣＤ１５２、ＣＤ２２３、ＣＤ２７９、ＣＤ２７４、ＴＩＭ－３、およびＢ７－Ｈ４を含むがこれらに限定はされないリストからの、免疫チェックポイントタンパク質抗原と特異的に結合する抗体；または、当該技術分野において教示される任意の免疫チェックポイントタンパク質抗原抗体の投与を含む。
【0017】
各種実施形態において、上記の対象は抵抗性または難治性の前立腺がんを有する。各種実施形態において、上記のがんは化学療法に対して難治性のものである。各種実施形態において、上記のがんはアンドロゲン除去療法（ＡＤＴ）に対して難治性のものである。各種実施形態において、上記のがんはＡＲ標的療法に対して難治性のものである。各種実施形態において、上記のがんはホルモン除去療法に対して難治性のものである。各種実施形態において、上記のがんは免疫療法による治療に対して難治性のものである。各種実施形態において、上記のがんは、特定の腫瘍抗原に対する除去抗体を用いた治療に対して難治性のものである。各種実施形態において、上記のがんは、共刺激分子または共抑制分子（免疫チェックポイント）に対するアゴニスト抗体、アンタゴニスト抗体、または阻止抗体を用いた治療に対して難治性のものである。各種実施形態において、上記のがんは、免疫複合体、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）、または特定の腫瘍抗原腫瘍抗原に対する除去抗体と細胞毒とを含む融合分子による標的治療に対して難治性のものである。各種実施形態において、上記のがんは、小分子キナーゼ阻害剤による標的治療に対して難治性のものである。各種実施形態において、上記のがんは、外科手術を用いた治療に対して難治性のものである。各種実施形態において、上記のがんは、幹細胞移植を用いた治療に対して難治性のものである。各種実施形態において、上記のがんは、放射線を用いた治療に対して難治性のものである。各種実施形態において、上記のがんは、ＤＨＴ遮断薬を用いた治療に対して難治性のものである。各種実施形態において、上記のがんは、例えば以下のうちの２つ以上を含む併用療法に対して難治性のものである：アンドロゲン除去療法、ＡＲ標的療法、ホルモン除去療法、免疫療法による治療、化学療法剤による治療、腫瘍抗原特異的な除去抗体による治療、免疫複合体、ＡＤＣ、または腫瘍抗原特異的な除去抗体と細胞毒とを含む融合分子による治療、小分子キナーゼ阻害剤による標的治療、外科手術を用いた治療、幹細胞移植を用いた治療、ＤＨＴ遮断薬を用いた治療、および放射線を用いた治療。
【0018】
各種実施形態において、上記の対象は、以前に抗がん療法による治療に応答したが、治療の休止後、再発（以下、「再発性増殖性疾患」）を引き起こしたものである。
【図面の簡単な説明】
【0019】
【図1】前立腺がんにおけるエフリンＢ２－ＥｐｈＢ４の誘導。（Ａ）ＥｐｈＢ／エフリンＢファミリーメンバーの遺伝子発現を、ＴＣＧＡ（Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ）に基づいて、体細胞突然変異を有する４９２人の前立腺がん患者において実施した。（Ｂ）１４８のヒト前立腺がん組織アレイ（バイオマックス社（Ｂｉｏｍａｘ Ｉｎｃ．）ＰＲ１９２１ｂ）における、ヘマトキシリン・エオシン染色（Ｈ＆Ｅ）、およびエフリンＢ２の免疫組織化学（ＩＨＣ）染色。エフリンＢ２は、前立腺がんで高発現されるが、正常な前立腺組織では高発現されない。上部のバーは前立腺がんのグリソンスコアを示している。上２段のパネルは低倍率（２００ｘ）を示し；下２段のパネルは高倍率（４００ｘ）を示す。表は、グリソンスコア６および７でのエフリンＢ２発現を示しており、それを超えると有意な変化がない。（Ｃ）ＰＴＥＮヌルマウスにおける原発性前立腺がんの成長を、生物発光画像法（ＢＬＩ）によって非侵襲的に追跡した。ルシフェラーゼシグナルの発現は、４か月齢から７か月齢までの間に経時的に増加した。各色は、ルシフェラーゼシグナルの強度を示す。青は弱いシグナル、緑色と黄色は中間のシグナル、赤は強いシグナルを示す。（Ｄ）Ｃｒｅ－ＰＴＥＮ－／－－ルシフェラーゼ（ＣＰＰＬ）マウス前立腺と比較した、野生型（ＷＴ）マウス前立腺における、ＥｐｈＢ４、ＰＴＥＮ、リン酸化ＡＫＴ（ｐＡＫＴ）、リン酸化Ｓ６（ｐＳ６）タンパク質レベルの、Ｈ＆ＥおよびＩＨＣ。（Ｅ）１匹の野生型（ＷＴ）マウスおよび３匹のＣＰＰＬマウスにおける、ＥｐｈＢ４、ＥｐｈＢ２、ＥｐｈＢ３、およびＰｔｅｎタンパク質レベルの、ウエスタンブロット。グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）をプローブすることで、ロードの等しさを確認した。（Ｆ）ＥｐｈＢ４、ＥｐｈＢ１、ＥｐｈＢ２、およびＥｐｈＢ３のＲＮＡレベルの定量的ＲＴ－ＰＣＲを、野生型（青）およびＣＰＰＬマウス（赤）において測定した。β－アクチンに対し遺伝子発現を正規化した。エラーバーは標準偏差（ｓ．ｄ．）を表す。これらの実験を少なくとも２回繰り返したところ、同様の結果が得られた。Ｐ値は対応のない両側スチューデントｔ検定を用いて算出した。＊＊Ｐ＜０．００２。
【図2】ＥｐｈＢ４遺伝子マウスモデル。（Ａ）ｌｏｘＰが導入された対立遺伝子を有する誘導性ＥｐｈＢ４コンディショナルノックアウト（ＥｐｈＢ４ ＣＫＯ）マウスを模式的にしている。数字はエクソン１～４を示す。太い黒矢印は、エクソン２とエクソン３に挟まれた２つのｌｏｘＰ部位を示す。Ｐ１とＰ２は遺伝子型同定のためのＰＣＲプライマー部位を示す。（Ｂ）遺伝子型同定ＰＣＲにより、野生型、ヘテロ接合型、およびホモ接合型の、ｌｏｘＰが導入されたＰｔｅｎおよびＥｐｈＢ４を確認した。左のパネル：野生型ＥｐｈＢ４（ＷＴ、ＥｐｈＢ４野生型／野生型）は１８９ｂｐのバンドを１本有し、ヘテロ接合型ＥｐｈＢ４（Ｆ／＋、ＥｐｈＢ４ｌｏｘＰ導入／野生型）はサイズが１８９ｂｐおよび２８２ｂｐの２本のバンドを有し、ホモ接合型ＥｐｈＢ４（Ｆ／Ｆ、ＥｐｈＢ４ｌｏｘＰ導入／ｌｏｘＰ導入）は１本の２８２ｂｐバンドを有する。右のパネル：野生型Ｐｔｅｎ（ＷＴ、Ｐｔｅｎ野生型／野生型）は３２１ｂｐのバンドを１本有し、ヘテロ接合型Ｐｔｅｎ（Ｆ／＋、ＰｔｅｎｌｏｘＰ導入／野生型）はサイズが３２１ｂｐおよび４９３ｂｐの２本のバンドを有し、ホモ接合型Ｐｔｅｎ（Ｆ／Ｆ、ＰｔｅｎｌｏｘＰ導入／ｌｏｘＰ導入）は１本の４９３ｂｐバンドを有する。ｂｐは塩基対を表す。（Ｃ）ＥｐｈＢ４、ＥｐｈＢ１、ＥｐｈＢ２、およびＥｐｈＢ３ ＲＮＡレベルの定量的ＲＴ－ＰＣＲを、野生型マウス（ＥｐｈＢ４およびＰｔｅｎの両方が野生型、青）、ＣＰＰＬマウス（野生型のＥｐｈＢ４を有するＣＰＰＬマウス、赤）、ＥｐｈＢ４ヘテロＣＰＰＬマウス（ヘテロ接合型のＥｐｈＢ４欠失を有するＣＰＰＬマウス、緑）、およびＥｐｈＢ４ホモＣＰＰＬマウス（ホモ接合型のＥｐｈＢ４欠失を有するＣＰＰＬマウス、紫）の前立腺組織において、測定した。β－アクチンに対し遺伝子発現を正規化した。エラーバーは標準偏差（ｓ．ｄ．）を表す。これらの実験を少なくとも３回繰り返したところ、同様の結果が得られた。Ｐ値は対応のない両側スチューデントｔ検定を用いて算出した。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．００２。
【図3】ＥｐｈＢ４のノックアウトは、ＰＴＥＮ欠失により誘導される前立腺がんの進行を阻害する。（Ａ）３か月齢、５か月齢、および７か月齢を含む、経時的な、生きたマウスのイメージングの、ルシフェラーゼ発現。ＥｐｈＢ４＋／＋；ＣＰＰＬは、ＣＰＰＬマウスが野生型のＥｐｈＢ４を有することを表す。ＥｐＨＢ４Ｆ／Ｆ；ＣＰＰＬは、ＣＰＰＬマウスがホモ接合型のＥｐｈＢ４を有することを表す。左のパネルは１４匹のＥｐｈＢ４＋／＋；ＣＰＰＬのうちの代表的な３匹である。右のパネルは２９匹のＥｐＨＢ４Ｆ／Ｆ；ＣＰＰＬのうちの代表的な３匹である。カラーバーは、ルシフェラーゼシグナルの強度を示す。青は弱いシグナル、緑色と黄色は中間のシグナル、赤は強いシグナルを示す。（Ｂ）合計１４匹のＥｐｈＢ４＋／＋；ＣＰＰＬマウスおよび２９匹のＥｐＨＢ４Ｆ／Ｆ；ＣＰＰＬマウスの生物発光画像法（ＢＬＩ）シグナル強度の定量的測定。青：３か月齢。赤：５か月齢。緑：７か月齢。ＢＬＩの強度を各バーの上部に標識した。エラーバーは標準偏差（ｓ．ｄ．）を表す。（Ｃ）ＥｐｈＢ４野生型ＰＴＥＮヌルマウス（ＥｐｈＢ４＋／＋；ＣＰＰＬ）、ＥｐｈＢ４ヘテロ接合体ＰＴＥＮヌルマウス（ＥｐｈＢ４Ｆ／＋；ＣＰＰＬ）、およびＥｐｈＢ４ホモ接合体ＰＴＥＮヌルマウス（ＥｐｈＢ４Ｆ／Ｆ；ＣＰＰＬ）由来の前立腺を解剖した。赤の破線は腫瘍領域を表す。（Ｄ）マウスの前立腺から採取した腫瘍より、ＥｐｈＢ４のウエスタンブロットを実施した。ロードが等しいことの確認にβ－アクチンをプローブした。これらの実験を少なくとも３回繰り返したところ、同様の結果が得られた。（Ｅ）異なる倍率（それぞれ１００倍、２００倍、および４００倍）の、ＷＴマウス、ＥｐｈＢ４＋／＋；ＣＰＰＬマウス、およびＥｐＨＢ４Ｆ／Ｆ；ＣＰＰＬマウス由来の前立腺のＨ＆Ｅ染色。（Ｆ）前立腺組織におけるＫｉ６７のＩＨＣ染色。右パネルに示されたシグナル強度は、ＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）ソフトウェアを用いて、陽性に染まったピクセルドットに基づいて定量化されたものである。エラーバーは全て標準偏差（ｓ．ｄ．）を表す。（Ｇ）前立腺組織におけるＥｐｈＢ４、ＰＴＥＮ、ｐＡＫＴ、およびｐＳ６のＩＨＣ染色。ＷＴ：ＥｐｈＢ４およびＰｔｅｎ共に野生型；ＥｐｈＢ４＋／＋；ＣＰＰＬ：ＥｐｈＢ４野生型ＰＴＥＮヌルマウス；ＥｐＨＢ４Ｆ／Ｆ；ＣＰＰＬ：ＥｐｈＢ４ホモ接合体ＰＴＥＮヌルマウス。これらの実験を少なくとも３回繰り返したところ、全て同様の結果が得られた。
【図4】ｓＥｐｈＢ４によるＥｐｈＢ４シグナル伝達の阻害は、ＰＴＥＮ欠失により誘導される前立腺がんの進行を抑制する。（Ａ）それぞれ処置期間０か月間、１か月間、２か月間、および３か月間に対応する４か月齢、５か月齢、６か月齢、および７か月齢の、生きたマウスのイメージングの、ルシフェラーゼ発現。左パネル：対照として用いられた、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で処置されたＣＰＰＬ。右パネル：可溶性ＥｐｈＢ４－アルブミン（ｓＥｐｈＢ４－Ａｌｂ）で処置されたＣＰＰＬ。各群から３匹のマウスを代表として示した。カラーバーは、ルシフェラーゼシグナルの強度を示す。（Ｂ）合計８匹のＣＰＰＬ；ＰＢＳ処置マウスおよび１５匹のＣＰＰＬ；ｓＥｐｈＢ４処置マウスの生物発光画像法（ＢＬＩ）シグナル強度の定量的測定。ＢＬＩの強度を各バーの上部に標識した。（Ｃ）それぞれｓＥｐｈＢ４－アルブミン処置期間０か月間、１か月間、２か月間、および３か月間に対応する７か月齢、８か月齢、９か月齢、および１０か月齢の、生きたマウスのイメージングの、ルシフェラーゼ発現。３匹のマウスを代表として示した。カラーバーは、ルシフェラーゼシグナルの強度を示す。（Ｄ）合計８匹のＣＰＰＬ；ｓＥｐｈＢ４処置マウスの生物発光画像法（ＢＬＩ）シグナル強度の定量的測定。青：０か月間処置。赤：１か月間処置。緑：２か月間処置。紫：３か月間処置。ＢＬＩの強度を各バーの上部に標識した。エラーバーは標準偏差（ｓ．ｄ．）を表す。（Ｅ）ＰＢＳ処置ＣＰＰＬマウスとｓＥｐｈＢ４－アルブミン処置ＣＰＰＬマウスの前立腺組織のＴＵＮＥＬイムノアッセイの比較（上パネル）。下側のパネルは同じ組織から得られた連続スライドのＨ＆Ｅ染色である。（Ｆ）野生型（ＷＴ）、ＰＢＳ処置ＣＰＰＬ（ＣＰＰＬ；ＰＢＳ）、およびｓＥｐｈＢ４－アルブミン処置ＣＰＰＬ（ＣＰＰＬ；ｓＥｐｈＢ４－Ａｌｂ）の前立腺組織におけるＥｐｈＢ４、ｐＡＫＴ、およびｐＳ６のＩＨＣ染色。これらの実験を少なくとも３回繰り返したところ、全て同様の結果が得られた。
【図5】ｓＥｐｈＢ４によるＥｐｈＢ４シグナル伝達の阻害は、アンドロゲン抵抗性前立腺がんの進行を阻害する。（Ａ）それぞれ去勢後０か月、１．５か月、４．５か月間、６か月間、および１０．５か月間に対応する４か月齢、５．５か月齢、８．５か月齢、１０か月齢、および１４．５か月齢の、生きたマウスのイメージングの、ルシフェラーゼ発現。マウスは、両群で８．５か月齢から、ＰＢＳ処置またはｓＥｐｈｂ４－アルブミン処置を開始した。左パネル：リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で処置されたＣＰＰＬ。右パネル：可溶性ＥｐｈＢ４－アルブミン（ｓＥｐｈＢ４－Ａｌｂ）で処置されたＣＰＰＬ。各群から３匹のマウスを代表として示した。（Ｂ）カラーバーは、ルシフェラーゼシグナルの強度を示す。合計８匹のＣＰＰＬ；ｓＥｐｈＢ４処置マウスの生物発光画像法（ＢＬＩ）シグナル強度の定量的測定。ＢＬＩの強度を各バーの上部に標識した。エラーバーは標準偏差（ｓ．ｄ．）を表す。
【図6】ＥｐｈＢ４はインビトロでＰＩ３Ｋ経路において機能する。（Ａ）２種のヒト前立腺がん細胞株Ｃ４－２ＢおよびＰＣ３における、ＥｐｈＢ４、Ｐ１１０α、Ｐ１１０β、Ｐ１１０γ、リン酸化ＡＫＴ（ｐＡＫＴ）、ＡＫＴ、リン酸化Ｓ６（ＰＳ６）、Ｓ６、リン酸化Ｐ３８（ｐＰ３８）、Ｐ３８のウエスタンブロット。ＥｐｈＢ４ ｓｉＲＮＡは、ＰＣ３細胞株およびＣ４－２Ｂ細胞株の両方で、ＰＩ３Ｋ下流マーカー（ｐＡＫＴ、ｐＳ６）およびＰ１１０サブユニットβを特異的にダウンレギュレートしたが、ｐ１１０αおよびγはダウンレギュレートしなかった。ロードが等しいことの確認にβ－アクチンをプローブした。実験はトリプリケートで行った。（Ｂ）ホスファチジルイノシトール（３，４，５）三リン酸（ＰＩＰ３）の免疫蛍光（ＩＦ）染色。ＤＡＰＩは核染色を示す。ＰＩＰ３とＤＡＰＩのマージ。ＰＩＰ３はＥｐｈＢ４ ｓｉＲＮＡによるノックダウンでも減弱した。（Ｃ）ＥｐｈＢ４のウエスタンブロット。これにより、全ての試験試料においてＥｐｈＢ４ ｓｉＲＮＡによるＥｐｈＢ４のノックダウンが確認された。（Ｄ）ＡＫＴおよびｐＡＫＴのウエスタンブロット。野生型ＡＫＴ（ｗｔ－ＡＫＴ）および体質的（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌｌｙ）活性型ＡＫＴ（ΔＡＫＴ）の過剰発現は共に、ＥｐｈＢ４ｓｉＲＮＡから、ＡＫＴレベルおよびｐＡＫＴレベルをレスキューした。ベクター：対照としての空ベクター。ロードが等しいことの確認にβ－アクチンをプローブした。（Ｅ）細胞生存率（ＭＴＴ）アッセイによって、ｗｔ－ＡＫＴまたはΔＡＫＴの過剰発現が、対照ｓｉＲＮＡと比較して、ｓｉＥｐｈＢ４により引き起こされた細胞死をレスキューするが、空ベクターではレスキューされないことが確認された。細胞生存率を各バーの上部に標識した。実験はトリプリケートで行った。
【図7】ＰＩ３Ｋ経路はＰ１１０βアイソフォームを介してＡＲを制御する。（Ａ）ウエスタンブロットにより、各種がん細胞株２２ＲＶ１、Ｃ４－２Ｂ、ＰＣ３、Ｋ５６２、およびＲＡＪＩにおけるＰ８５、Ｐ１１０α、Ｐ１１０β、Ｐ１１０γ、およびＰ１１０δの発現レベルを示された。（Ｂ）種々の濃度のＰ１１０α阻害剤（ＢＹＬ７１９）、Ｐ１１０β阻害剤（ＧＳＫ２６３６７７１）、Ｐ１１０γ阻害剤（ＩＰＩ－５４９）、およびＰ１１０δ阻害剤（ＧＳＫ２２６９５５７）で処理後の、２２ＲＶ１前立腺細胞株におけるＳ６、ｐＳ６、ＥｐｈＢ４、およびＡＲのウエスタンブロット。αアイソフォームおよびβアイソフォームの阻害によりｐＳ６レベルが有意に減少した。Ｐ１１０β阻害のみがＥｐｈＢ４およびＡＲを減少させ、一方、Ｐ１１０α／γ／δの各阻害剤はいずれのタンパク質にも影響を与えなかった。一番下のパネルは相対ｐＳ６／Ｓ６比の定量分析を示しており、ＥｐｈＢ４およびＡＲのタンパク質レベルはＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）を用いて作成された。ロードが等しいことの確認にβ－アクチンをプローブした。実験はトリプリケートで行った。
【図8】ＥｐｈＢ４はＰ１１０βアイソフォームを介してＡＲを制御する。（Ａ）２２ＲＶ１細胞およびＣ４－２Ｂ細胞におけるＥｐｈＢ４およびＡＲのウエスタンブロット。対照ｓｉＲＮＡ（対照ｓｉ）およびｓｉＲＮＡなし（モック）と比較して、ＥｐｈＢ４ｓｉＲＮＡ（Ｂ４ｓｉ）を用いてＥｐｈＢ４をノックダウンした場合に、ＡＲが有意にダウンレギュレートされた。ロードが等しいことの確認にβ－アクチンをプローブした。（Ｂ）野生型（ＷＴ）、ＰＢＳ処置ＣＰＰＬ（ＣＰＰＬ；ＰＢＳ）、ＥｐｈＢ４ノックアウトＣＰＰＬ（ＣＰＰＬ；ＥｐｈＢ４Ｆ／Ｆ）、および可溶性ＥｐｈＢ４－Ａｌｂ処置ＣＰＰＬ（ＣＰＰＬ；ｓＥｐｈＢ４－Ａｌｂ）由来のマウス前立腺組織における、抗ＡＲ抗体（褐色）を用いたＩＨＣ染色（１００倍、４００倍、１０００倍）。点線の四角はより高倍率で示された対応画像を示している。（Ｃ）対照ｓｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡなし（モック）と比較した、ＥｐｈＢ４ｓｉＲＮＡを用いた、定量的ＲＴ－ＰＣＲによる、ＥｐｈＢ４ノックダウンした２２ＲＶ１細胞およびＣ４－２Ｂ細胞におけるＡＲのｍＲＮＡレベル。左パネルは、相対的なＥｐｈＢ４レベルおよびＡＲレベルの定量分析を示しており、これらのレベルはｓｉＥｐｈＢ４処理したＣ４－２Ｂ細胞株および２２ＲＶ１細胞株において有意に減少した。実験はトリプリケートで行った。Ｐ値は対応のない両側スチューデントｔ検定を用いて算出した。ＮＳ、有意差なし；＊Ｐ＜０．０５；（Ｄ）ＡＲレスキュー実験。ＥｐｈＢ４ ｓｉＲＮＡと、ＥｐｈＢ４、ｐ１１０α、ｐ１１０β、およびｐ１１０γの各プラスミドを同時トランスフェクションした２２ＲＶ１細胞における、ＡＲ、ＥｐｈＢ４、ＡＫＴ、ｐ１１０α、ｐ１１０β、およびｐ１１０γのウエスタンブロット。相対的ＡＲレベルの定量分析をＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）を用いて行った。この実験において、ＥｐｈＢ４ ｓｉＲＮＡにより引き起こされたＡＲレベルの減少は、Ａｋｔおよびｐ１１０βの過剰発現でレスキューできるが、ｐ１１０αおよびｐ１１０γの過剰発現ではレスキューできない。興味深いことに、ｐ１１０αおよびｐ１１０γの過剰発現はＡＲレベルをさらに阻害でき、これは他の研究と一致している。
【図9】ｓＥｐｈＢ４はＣＲＰＣ患者のＰＳＡレベルを減少させた。前立腺腫瘍生検のエフリンＢ２およびＣＤ３１のＨ＆Ｅ染色およびＩＨＣ染色。右下のグラフは、数週間に亘るｓＥｐｈＢ４－Ａｌｂ処置後のＰＳＡレベルの変化を示したものである。
【図10】ＥｐｈＢ４ ＣＫＯ１（－／－）；ＣＭＶ－Ｃｒｅ（＋）マウス表現型。Ｅ９．５日目のマウス胚の解剖。胎生致死を起こした、１つのＥｐｈＢ４ ＣＫＯ１（ｗｔ／ｗｔ）胚および３つのＥｐｈＢ４ ＣＷＫＯ１（－／－）胚。
【図11】ＣＰＰＬマウスとＥｐｈ４ノックアウトＣＰＰＬマウスとで比較した、ＢＬＩの強度。図は年齢に基づいたＢＬＩ強度をまとめたものである。各ドットは各マウスを表している。赤線はある特定の年齢の全てのマウスの平均ＢＬＩ強度を示したものである。左パネル：ＥｐｈＢ４野生型ＣＰＰＬマウス（ＣＰＰＬのみ）。右パネル：Ｅｐｈ４ノックアウトＣＰＰＬマウス（ＥｐｈＢ４（Ｆ／Ｆ）；ＣＰＰＬ）。各パネルの底部は、年齢群に対応する生きたマウスの数を示したものである。
【図12】ＰＢＳ処置ＣＰＰＬマウスとｓＥｐｈ４－Ａｌｂ処置ＣＰＰＬマウスとで比較した、ＢＬＩの強度。図は年齢に基づいたＢＬＩ強度をまとめたものである。各ドットは各マウスを表している。赤線はある特定の年齢の全てのマウスの平均ＢＬＩ強度を示したものである。左パネル：ＰＢＳ処置ＣＰＰＬマウス。右パネル：ｓＥｐｈ４－Ａｌｂ処置ＣＰＰＬマウス。各パネルの底部は、年齢群に対応する生きたマウスの数を示したものである。
【図13】退縮実験におけるＰＢＳ処置ｓＥｐｈ４－Ａｌｂ処置ＣＰＰＬマウスのＢＬＩの強度。図は年齢に基づいたＢＬＩ強度をまとめたものである。各ドットは各マウスを表している。赤線はある特定の年齢の全てのマウスの平均ＢＬＩ強度を示したものである。パネルの底部は、年齢群に対応する生きたマウスの数を示したものである。
【図14】前立腺がん細胞株におけるＥｐｈＢ４のノックダウンのＡＲレベル。ＲＴ－ＰＣＴ曲線は、対照ｓｉＲＮＡと比較して、Ｃ４－２Ｂ細胞株（左）および２２ＲＶ１細胞株（右）における、ＥｐｈＢ４ ｓｉＲＮＡによる、ＡＲ、ＥｐｈＢ４、ＧＡＤＰＨの遺伝子レベル変化を示している。
【発明を実施するための形態】
【0020】
定義
本明細書で別途定義がない限り、本発明に関連して使用される科学用語および技術用語は、当業者が通常理解する意味を有するものとする。さらに、文脈上特に必要がない限り、単数形の用語は複数形を包含するものとし、複数形の用語は単数形を包含するものとする。通常、本明細書に記載の、細胞培養および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、並びにタンパク質および核酸の化学、並びにハイブリダイゼーションと関連して使用される命名法、並びにその技術は、一般に使用され、当該技術分野において周知のものである。本発明の方法および技術は、特に記載がない限り、本明細書の全体を通して引用および考察された、様々な、一般的な、より具体的な参考文献に記載される、当該技術分野において周知の従来法に従って、通常実施される。例えば、参照によって本明細書に援用される、Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第４版、コールド・スプリング・ハーバー研究所出版局、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク州（２０１２年）を参照されたい。酵素反応および精製技術は、製造業者の仕様書に従って、当該技術分野において通常果たされるように、または本明細書に記載のように、実施される。本明細書に記載の分析化学、有機合成化学、医薬品化学、および製薬化学と関連して使用される命名法、並びにその実験手順および実験手法は、当該技術分野において通常使用され周知のものである。化学合成、化学分析、医薬製剤、製剤、および送達、並びに対象の治療には、標準的な技術が使用される。
本明細書で別途定義がない限り、本発明に関連して使用される科学用語および技術用語は、当業者が通常理解する意味を有するものとする。さらに、文脈上特に必要がない限り、単数形の用語は複数形を包含するものとし、複数形の用語は単数形を包含するものとする。通常、本明細書に記載の、細胞培養および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、並びにタンパク質および核酸の化学、並びにハイブリダイゼーションと関連して使用される命名法、並びにその技術は、一般に使用され、当該技術分野において周知のものである。本発明の方法および技術は、特に記載がない限り、本明細書の全体を通して引用および考察された、様々な、一般的な、より具体的な参考文献に記載される、当該技術分野において周知の従来法に従って、通常実施される。例えば、参照によって本明細書に援用される、Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第４版、コールド・スプリング・ハーバー研究所出版局、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク州（２０１２年）を参照されたい。酵素反応および精製技術は、製造業者の仕様書に従って、当該技術分野において通常果たされるように、または本明細書に記載のように、実施される。本明細書に記載の分析化学、有機合成化学、医薬品化学、および製薬化学と関連して使用される命名法、並びにその実験手順および実験手法は、当該技術分野において通常使用され周知のものである。化学合成、化学分析、医薬製剤、製剤、および送達、並びに対象の治療には、標準的な技術が使用される。
【0021】
本明細書で使用される場合、「増殖性疾患」は、腫瘍疾患（良性またはがん性のものを含む）および／または任意の転移を包含する。増殖性疾患は、過形成、線維症（特に肺線維症であるが、腎線維症などの他のタイプの線維症もある）、血管新生、乾癬、アテローム性動脈硬化症、および血管内平滑筋増殖などの過剰増殖状態を包含する場合があり、例えば狭窄または血管形成術後再狭窄などである。各種実施形態において、増殖性疾患はがんである。各種実施形態において、増殖性疾患は非がん性疾患である。各種実施形態において、増殖性疾患は良性腫瘍または悪性腫瘍である。
【0022】
用語「腫瘍」とは、本明細書で使用される場合、悪性か良性かを問わず、全ての新生細胞の成長および増殖、並びに全ての前がん性およびがん性の細胞および組織を指す。
【0023】
用語「原発腫瘍」とは、細胞の自律的な無制御の成長が開始した解剖学的部位（例えば最初のがん性腫瘍の臓器）に位置する、悪性か良性かを問わない、全ての新生細胞の成長および増殖、並びに全ての前がん性およびがん性の細胞および組織を指す。原発腫瘍は転移を包含しない。
【0024】
本明細書で使用される場合、用語「転移」とは、元のがん性腫瘍の臓器と直接繋がっていない、臓器または身体部分におけるがん性腫瘍の成長を指す。転移は、元のがん性腫瘍の臓器（例えば、原発腫瘍を含む臓器）と直接繋がっていない臓器または身体部分に、検出不能な量のがん性細胞が存在することである、微小転移を包含すると理解されたい。転移は、元の腫瘍部位（例えば、原発腫瘍部位）からのがん細胞の離脱、並びに他の身体部分へのがん細胞の遊走および／または浸潤などの、いくつかのプロセス段階と定義することもできる。
【0025】
「抵抗性または難治性のがん」とは、例えば、アンドロゲン除去療法（ＡＤＴ）、ホルモン除去療法、化学療法、外科手術、放射線治療、幹細胞移植、および免疫療法を含む、以前の抗がん療法に応答しなかった腫瘍細胞またはがんを指す。腫瘍細胞は、治療の開始時に抵抗性または難治性のものとすることもできるし、あるいは、治療中に抵抗性または難治性になってもよい。難治性の腫瘍細胞は、治療開始時に応答しない、または最初は短期間応答するが治療に応答しない、腫瘍を包含する。難治性の腫瘍細胞は、抗がん療法による治療に応答し、それ以降の治療に応答しない、腫瘍も包含する。本発明の目的のために、難治性の腫瘍細胞は、抗がん療法による治療によって抑制されたように見えたが、治療中断後５年以内、時に１０年以内またはそれ以上経過後に再発する、腫瘍も包含する。抗がん療法では、化学療法剤単独、放射線単独、標的療法単独、外科手術単独、またはこれらの組み合わせを用いることができる。限定のためではなく説明を簡単にするために、難治性腫瘍細胞は抵抗性腫瘍細胞と同義であると理解されたい。
【0026】
本明細書で使用される場合、「治療」（および「治療する」や「治療すること」などのその文法的変形語）は、治療を受けている個体における病気の自然経過を変化させるための臨床的介入を指し、予防のために実施することもできるし、臨床病理の経過中に実施することもできる。望ましい治療効果としては、疾患の発生または再発の予防、症状の緩和、疾患の任意の直接的または間接的な病理的帰結の低減、転移の予防、疾患増悪速度の減少、病状の改善または軽減、および寛解または予後の改善が挙げられるが、これらに限定はされない。本明細書で使用される場合、疾患、障害、または状態を「緩和する」こととは、当該疾患、障害、または状態の症状の重症度および／または発生頻度を減少させることを意味する。さらに、本明細書における「治療」への言及は、治癒的、対症的および予防的な治療への言及を包含する。
【0027】
用語「有効量」または「治療有効量」とは、本明細書で使用される場合、症状の１または複数を改善する、緩和する、軽減する、および／または遅延するなど、特定の障害、状態、または疾患を治療するのに十分な化合物または組成物の量を指す。ＮＨＬなどのがんや他の望まれない細胞増殖に関して、有効量は、（ｉ）がん細胞の数を減少させる；（ｉｉ）腫瘍サイズを減少させる；（ｉｉｉ）末梢器官へのがん細胞浸潤をある程度阻害、遅滞、減速し、好ましくは止める；（ｉｖ）腫瘍転移を阻害する（すなわち、ある程度減速し、好ましくは止める）；（ｖ）腫瘍増殖を阻害する；（ｖｉ）腫瘍の発生および／もしくは再発を防止または遅延する；並びに／または、（ｖｉｉ）当該がんに伴う症状の１または複数をある程度軽減する、のに十分な量を含む。有効量は、一回または複数回の投与で投与することができる。
【0028】
「補助療法背景（ａｄｊｕｖａｎｔ ｓｅｔｔｉｎｇ）」とは、対象が、増殖性疾患、特にがんの病歴を有し、通常（ただし必須ではなく）、外科手術（外科的切除など）、放射線療法、および化学療法を含むがこれらに限定はされない治療法に対して応答性であった、臨床背景を指す。しかし、増殖性疾患（がんなど）の病歴のために、これらの対象は、当該疾患の発症リスクがあると見なされる。「補助療法背景」における治療または投与はその後の治療様式を指す。リスクの程度（すなわち、補助療法背景にある対象が「高リスク」または「低リスク」と見なされる場合の）は、いくつかの要因、最も多くは最初に治療を受けた際の疾患の程度、に依存する。
【0029】
「相乗効果」という表現は、有効成分同士を一緒に使用した場合に達成される効果が、各有効成分を個別に使用することにより得られる効果の和よりも大きいことを言う。用語「シナジー」、「相乗作用」、「相乗的」、「併用相乗量（ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ ａｍｏｕｎｔ）」、および「相乗的な治療効果」は、本明細書では同義的に使用される。
【0030】
「投与すること」または「投与を受けさせる（ｃａｕｓｅ ｔｏ ｂｅ ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ）」という表現は、医療従事者（例えば、医師）、または対象の医療を管理する者が行う行為であって、対象への問題の薬剤／化合物の投与を管理および／または許可することを指す。投与を受けさせること（ｃａｕｓｉｎｇ ｔｏ ｂｅ ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ）は、対象への、適切な治療法の診断および／もしくは判定、並びに／または特定の薬剤／化合物を処方すること、を含み得る。このような処方としては、例えば、処方箋を書くこと、診療録に注釈を付けることなどを挙げることができる。本明細書で投与を記載する場合、「投与を受けさせること（ｃａｕｓｉｎｇ ｔｏ ｂｅ ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ）」も企図される。
【0031】
用語「患者」、「個体」、および「対象」は、同義的に使用される場合があり、哺乳動物、好ましくはヒトまたはヒト以外の霊長類を指すが、ペット哺乳類（例えば、イヌまたはネコ）、実験室用哺乳類（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット）、および農業用哺乳類（例えば、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ）も指す。各種実施形態において、患者は、病院で、精神医療施設で、外来患者として、または他の臨床状況で、医師または他の医療従事者のケアを受けているヒト（例えば、成人男性、成人女性、青年男性、青年女性、男児、女児）とすることができる。各種実施形態において、患者は、免疫無防備状態の患者または免疫系が弱まった患者としてもよく、例えば、原発性免疫不全症患者、エイズ患者；ある種の免疫抑制剤を服用中のがん患者および移植患者；並びに、免疫系（例えば、先天性無ガンマグロブリン血症、先天性ＩｇＡ欠損症）に影響を与える遺伝病を有する患者が挙げられるが、これらに限定はされない。各種実施形態において、患者は免疫原性のがんを有しており、例えば、膀胱がん、肺がん、メラノーマ、および変異率が高いと報告されている他のがん（Ｌａｗｒｅｎｃｅら、Ｎａｔｕｒｅ、４９９巻（７４５７号）：頁２１４－２１８、２０１３年）が挙げられるが、これらに限定はされない。
【0032】
本明細書で使用される場合、本発明の融合分子および１または複数の他の治療薬を指して、用語「同時投与」、「同時投与された」、および「～と組み合わせて」とは、以下を意味することが意図され、以下を指して包含する：治療を必要としている対象への本発明の融合分子と治療薬とのそのような組み合わせの同時投与であって、そのような成分が合剤化されて単一剤形となり、上記各成分が実質的に同時に上記対象に放出される、同時投与；治療を必要としている対象への本発明の融合分子と治療薬とのそのような組み合わせの実質的な同時投与であって、そのような成分が互いに別々に製剤化されて別々の剤形となり、それらが上記対象によって実質的に同時に摂取された際、上記各成分が実質的に同時に上記対象に放出される、実質的な同時投与；治療を必要としている対象への本発明の融合分子と治療薬とのそのような組み合わせの連続投与であって、そのような成分が互いに別々に製剤化されて別々の剤形となり、それらが各投与の間にかなりの時間間隔を置いて上記対象によって連続した時間に摂取された際、上記各成分が実質的に異なる時間に上記対象に放出される、連続投与；並びに、治療を必要としている対象への本発明の融合分子と治療薬とのそのような組み合わせの連続投与であって、そのような成分が合剤化されて単一剤形となり、上記各成分が徐放的に放出される際、それらが同時および／または異なる時間に同時発生的、連続的、および／または重複的に上記対象に放出され、各部分は同じ経路または異なる経路で投与され得る、連続投与。
【0033】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、アミノ酸残基の重合体を指して、本明細書では同義的に使用される。ある実施形態では、「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」は、α炭素がペプチド結合を介して連結し合っているアミノ酸鎖である。よって、上記鎖の一方の端の末端アミノ酸（アミノ末端）は遊離アミノ基を有し、一方で、上記鎖の他方の端の末端アミノ酸（カルボキシ末端）は遊離カルボキシル基を有する。本明細書で使用される場合、用語「アミノ末端」（Ｎ末端と省略）は、ペプチドのアミノ末端のアミノ酸上の遊離α－アミノ基を指すか、あるいは、ペプチド内の任意の他の場所のアミノ酸のα－アミノ基（ペプチド結合に参加している場合はイミノ基）を指す。同様に、用語「カルボキシ末端」は、ペプチドのカルボキシ末端の遊離カルボキシル基、またはペプチド内の任意の他の場所のアミノ酸のカルボキシル基を指す。ペプチドは、実質的に任意のポリアミノ酸も包含し、ペプチド模倣薬が挙げられるがこれに限定はされず、例えば、アミノ酸同士がアミド結合ではなくエーテルによって連結されているものなどである。
【0034】
用語「組み換えポリペプチド」とは、本明細書で使用される場合、宿主細胞にトランスフェクトされた組み換え発現ベクターを用いて発現されたポリペプチドなどの、組み換え手段によって作製、発現、生成、派生、または単離された融合分子を含む、全てのポリペプチドを包含することが意図される。
【0035】
本開示のポリペプチドは、例えば、（１）タンパク質分解に対する感受性の低減、（２）酸化に対する感受性の低減、（３）タンパク質複合体形成を目的とした結合親和性の変化、（４）結合親和性の変化、および、（５）他の物理化学的特性または機能特性の付与または改変など、いかなる方法およびいかなる理由で改変されたポリペプチドも包含する。例えば、単一または複数のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）が、天然起源配列（例えば、分子間接触を形成しているドメインの外側のポリペプチド部分の天然起源配列）になされていてもよい。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸ポリペプチドにおける、機能的な類似アミノ酸との置換を指す。以下の６つの群はそれぞれ、互いに対し保存的置換となるアミノ酸を含む：
アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、およびスレオニン（Ｔ）
アスパラギン酸（Ｄ）およびグルタミン酸（Ｅ）
アスパラギン（Ｎ）およびグルタミン（Ｑ）
アルギニン（Ｒ）およびリジン（Ｋ）
イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、およびバリン（Ｖ）
フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、およびトリプトファン（Ｗ）。
アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、およびスレオニン（Ｔ）
アスパラギン酸（Ｄ）およびグルタミン酸（Ｅ）
アスパラギン（Ｎ）およびグルタミン（Ｑ）
アルギニン（Ｒ）およびリジン（Ｋ）
イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、およびバリン（Ｖ）
フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、およびトリプトファン（Ｗ）。
【0036】
用語「ポリペプチド断片」および「切断型ポリペプチド」とは、本明細書で使用される場合、対応する完全長のタンパク質と比較した場合にアミノ末端および／またはカルボキシ末端の欠失を有するポリペプチドを指す。ある実施形態において、断片は、例えば、５以上、１０以上、２５以上、５０以上、１００以上、１５０以上、２００以上、２５０以上、３００以上、３５０以上、４００以上、４５０以上、５００以上、６００以上、７００以上、８００以上、９００以上、または１０００以上のアミノ酸長とすることができる。ある実施形態において、断片は、例えば、１０００以下、９００以下、８００以下、７００以下、６００以下、５００以下、４５０以下、４００以下、３５０以下、３００以下、２５０以下、２００以下、１５０以下、１００以下、５０以下、２５以下、１０以下、または５以下のアミノ酸長とすることもできる。断片は、その一方または両方の末端に、１または複数の追加のアミノ酸、例えば、異なる天然起源タンパク質（例えば、Ｆｃまたはロイシンジッパードメイン）由来のアミノ酸配列または人工アミノ酸配列（例えば、人工リンカー配列）をさらに含むことができる。
【0037】
「ポリペプチドバリアント」および「ポリペプチド変異体」という用語は、本明細書で使用される場合、別のポリペプチド配列と比較して、１または複数のアミノ酸残基がアミノ酸配列に挿入されている、１または複数のアミノ酸残基がアミノ酸配列から欠失している、且つ／または、１または複数のアミノ酸残基がアミノ酸配列中に置換されている、アミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。ある実施形態では、挿入、欠失、または置換されているアミノ酸残基の数は、例えば、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１５０、少なくとも１７５、少なくとも２００、少なくとも２２５、少なくとも２５０、少なくとも２７５、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも４５０、または少なくとも５００のアミノ酸長とすることができる。本開示のバリアントは融合タンパク質を包含する。
【0038】
用語「可溶性ポリペプチド」は、本明細書で使用される場合、当該ポリペプチドが、膜貫通領域、または当該ポリペプチドの生理的食塩水への溶解性を損なうのに十分な膜貫通領域の一部を含有していないことを単に示す。
【0039】
「医薬組成物」は、動物における製薬学的用途において好適な組成物を指す。医薬組成物は、薬理学的有効量の活性薬剤と薬剤的に許容できる担体とを含む。「薬理学的有効量」とは、意図された薬理学的結果を得るのに有効な薬剤量を指す。「薬剤的に許容できる担体」とは、任意の標準的な医薬担体、溶剤、緩衝液、および医薬品添加物を指し、例えば、リン酸緩衝生理食塩水、５％ブドウ糖水溶液、およびエマルジョン（油／水エマルジョンまたは水／油エマルジョンなど）、並びに各種の湿潤剤および／または補助剤などである。好適な医薬担体および製剤については、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第２１版、２００５年、マック出版社（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ）、イーストン、に記載がある。「薬剤的に許容できる塩」は、製薬学的用途の化合物に製剤化できる塩であり、例えば、金属塩（ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなど）およびアンモニアまたは有機アミンの塩が挙げられる。
【0040】
本明細書に記載の本発明の態様および実施形態は、態様および実施形態「からなる」もの、および／または態様および実施形態「から本質的になる」ものを包含すると理解される。
【0041】
本明細書において、「約」値または「約」パラメータという場合、その値またはパラメータそれ自体を対象とした変動を包含（および説明）している。例えば、「約Ｘ」という記載は「Ｘ」という記載を包含する。
【0042】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈によって特に明示されない限り、複数の指示対象を包含する。
【0043】
本開示を実施するための形態
本開示の方法は、単独療法として、または第二の抗がん療法と組み合わせて、ＥｐｈＢ４またはエフリンＢ２を介した機能を阻害するポリペプチド剤を投与することによって、前立腺がんの原発腫瘍の成長もしくは形成、または前立腺がんの転移を治療、低減、予防することを含む。
本開示の方法は、単独療法として、または第二の抗がん療法と組み合わせて、ＥｐｈＢ４またはエフリンＢ２を介した機能を阻害するポリペプチド剤を投与することによって、前立腺がんの原発腫瘍の成長もしくは形成、または前立腺がんの転移を治療、低減、予防することを含む。
【0044】
ＥｐｈＢ４－エフリンＢ２阻害剤
ＥｐｈＢ４は、最も大きな受容体型チロシンキナーゼファミリーのメンバーであり、脊椎動物における１６種のうちの最初のもの（ＥｐｈＡ１）がエリスロポエチン産生肝細胞癌細胞株からクローニングされた。Ｅｐｈ受容体と相互作用する（ｉｎｔｅｒａｔｉｎｇ）エフリンリガンドも膜結合性である。ＥｐｈＡ（ＥｐｈＡ１～８、１０）亜群リガンド（エフリンＡ１～５）はグリコシル－ホスファチジルイノシトールＧＰＩアンカーを介して細胞表面に局在しており、一方、Ｂファミリーリガンド（エフリンＢ１～３）は膜貫通型タンパク質である（Ｇａｌｅら、Ｎｅｕｒｏｎ、１７巻（１号）：頁９－１９、１９９６年）。細胞と結合しているため、Ｅｐｈ－エフリン相互作用は細胞と細胞の接触時に生じる。Ｅｐｈとエフリンの二量体が高親和性のヘテロ四量体複合体を形成し、これにより、受容体発現細胞およびリガンド発現細胞における双方向性のシグナルが惹起される（Ｄｒａｖｉｓら、Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ、２７１巻（２号）：頁２７２－２９０、２００４年）。Ｅｐｈおよびエフリンは、細胞局在、組織境界形成、および軸索誘導における重要な生物学的機能を制御している。また、Ｅｐｈおよびエフリンは、腸陰窩・絨毛細胞における前駆細胞および成熟細胞の適切なポジショニング（Ｊｕｂｂら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、１１巻（１４号）：頁５１８１－５１８７、２００５年）、並びに泌尿生殖器系における尿道発生（Ｐｅｕｃｋｅｒｔら、Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ、９０巻（２号）：頁３７３－３８８、２０１６年）においても必要とされる。
ＥｐｈＢ４は、最も大きな受容体型チロシンキナーゼファミリーのメンバーであり、脊椎動物における１６種のうちの最初のもの（ＥｐｈＡ１）がエリスロポエチン産生肝細胞癌細胞株からクローニングされた。Ｅｐｈ受容体と相互作用する（ｉｎｔｅｒａｔｉｎｇ）エフリンリガンドも膜結合性である。ＥｐｈＡ（ＥｐｈＡ１～８、１０）亜群リガンド（エフリンＡ１～５）はグリコシル－ホスファチジルイノシトールＧＰＩアンカーを介して細胞表面に局在しており、一方、Ｂファミリーリガンド（エフリンＢ１～３）は膜貫通型タンパク質である（Ｇａｌｅら、Ｎｅｕｒｏｎ、１７巻（１号）：頁９－１９、１９９６年）。細胞と結合しているため、Ｅｐｈ－エフリン相互作用は細胞と細胞の接触時に生じる。Ｅｐｈとエフリンの二量体が高親和性のヘテロ四量体複合体を形成し、これにより、受容体発現細胞およびリガンド発現細胞における双方向性のシグナルが惹起される（Ｄｒａｖｉｓら、Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ、２７１巻（２号）：頁２７２－２９０、２００４年）。Ｅｐｈおよびエフリンは、細胞局在、組織境界形成、および軸索誘導における重要な生物学的機能を制御している。また、Ｅｐｈおよびエフリンは、腸陰窩・絨毛細胞における前駆細胞および成熟細胞の適切なポジショニング（Ｊｕｂｂら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、１１巻（１４号）：頁５１８１－５１８７、２００５年）、並びに泌尿生殖器系における尿道発生（Ｐｅｕｃｋｅｒｔら、Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ、９０巻（２号）：頁３７３－３８８、２０１６年）においても必要とされる。
【0045】
本発明者らは以前に、遺伝子発現レベルおよびタンパク質発現レベルの両方で、ＰＣにおけるＥｐｈＢ４の誘導を示した（Ｘｉａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、６５巻（１１号）：頁４６２３－４６３２、２００５年）。ＰＣにおけるＥｐｈＢ４の潜在的役割と一致して、ＥｐｈＢ４はＰＣを促進することが以前に示された（Ａｌａｚｚｏｕｚｉら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、６５巻（２２号）：頁１０１７０－１０１７３、２００５年）。本発明者らは以前、ＥｐｈＢ４がＰＩ３Ｋ経路およびβ－カテニン経路により前立腺がんにおいて誘導されることを示した（Ｂａｔｌｌｅら、Ｃｅｌｌ、１１１巻（２号）：頁２５１－２６３、２００２年；Ｋｕｍａｒら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、６９巻（９号）：頁３７３６－３７４５、２００９年）。ＥｐｈＢ４はＰＩ３Ｋ経路のさらなる活性化により腫瘍細胞に生存優位性を与える。対照的に、ＥｐｈＢ受容体ファミリーの別のメンバーであるＥｐｈＢ２は、機能喪失型変異が特にアフリカ系アメリカ人男性において前立腺がんのリスクを増大させることから、腫瘍抑制因子として機能する（Ｒｏｂｂｉｎｓら、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ、６巻（５号）、ｅ１９４９、２０１１年）。また、本発明者らは以前、結腸がんおよび膀胱がんにおいて、ＥｐｈＢ２発現が腫瘍形成中に減少し、それに伴いＥｐｈＢ４が誘導されることを確認した（Ｏｚｇｕｒら、Ｕｒｏｌ Ｏｎｃｏｌ、２９巻（１号）：頁７８－８４、２０１１年；Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎら、ＢＭＣ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、２巻、頁１５、２００１年）。
【0046】
ＥｐｈＢ４は、それ自体は癌遺伝子ではないが、ＰＴＥＮ減少および／またはＰＩ３Ｋ活性化という状況で、発がんイニシエーションを促進し得る。ＰＩ３Ｋ活性化によりＥｐｈＢ４誘導がもたらされることが以前に示された（Ｒ．Ｌｉｕら、ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ、１３巻：頁２６９、２０１３年）。次いで、ＥｐｈＢ４の活性化により、ＰＩ３Ｋ－ＡＫＴ経路活性の誘導が引き起こされる。ＰＩ３Ｋ経路はＰＣ初期では約４０％、転移性ＰＣではほぼ１００％において誘導されるため、増殖因子を介した転写付加に加えて、ＰＩＫＣＡおよびＰＴＥＮに変異が頻繁に確認される（Ｓａｒｋｅｒら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、１５巻（１５号）：頁４７９９－４８０５、２００９年）。これまでの知見では、ＰＣイニシエーションにおけるＥｐｈＢ４の役割は不明である。
【0047】
また、ＥｐｈＢ４がＰＩ３Ｋ－ＡＫＴ経路のどこで交わっているかについても不明である。ＰＩ３ＫがＡＫＴを活性化すること、およびＡＫＴの恒常的活性化によってＥｐｈＢ４欠損細胞がレスキューされたことから、ＡＫＴにおいて、またはＡＫＴの上流でＥｐｈＢ４が交わることが示された。ＥｐｈＢ４はこのようにＰＩ３Ｋそれ自体のレベルに関与している可能性があった。クラスＩＰＩ３Ｋは４つの触媒アイソフォームｐ１１０α、ｐ１１０β、ｐ１１０γ、およびｐ１１０δを有しており、それぞれ調節サブユニットと二量体をつくり、複合体の活性および細胞内局在を調節する。ＥｐｈＢ４ノックダウンはＰＩ３Ｋ ｐ１１０βのみを減少させ、それがＰＴＥＮ欠損細胞において最も顕著な形態であることから、それが交点であると考えられる。上皮細胞はＰＩ３Ｋ ｐ１１０αアイソフォームに依存しているが、ＰＴＥＮが欠失している場合、ＰＩ３Ｋ ｐ１１０βを介してシグナル伝達し、腫瘍を進行させる。
【0048】
ＥｐｈＢ４またはエフリンＢ２を介した機能を阻害するポリペプチド剤が、本発明者らによって以前に報告された（例えば、米国特許第７，３８１，４１０号；同第７，８６２，８１６号；同第７，９７７，４６３号；同第８，０６３，１８３号；同第８，２７３，８５８号；同第８，９７５，３７７号；同第８，９８１，０６２号；同第９，５３３，０２６号を参照；それぞれは全ての目的においてその全体が参照によって本明細書に援用される）。本発明の各種実施形態において、ＥｐｈＢ４またはエフリンＢ２を介した機能を阻害するポリペプチド剤は、ＥｐｈＢ４タンパク質もしくはエフリンＢ２タンパク質の単量体リガンド結合部分、またはＥｐｈＢ４もしくはエフリンＢ２に結合し作用する抗体である。各種実施形態において、上記ポリペプチド剤は、エフリンＢ２ポリペプチドに特異的に結合し、ＥｐｈＢ４タンパク質の細胞外ドメインのアミノ酸配列を含む、可溶性ＥｐｈＢ４（ｓＥｐｈＢ４）ポリペプチドである。各種実施形態において、ｓＥｐｈＢ４ポリペプチドは、ＥｐｈＢ４タンパク質の球状ドメインを含む。
【0049】
各種実施形態において、ｓＥｐｈＢ４ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列の、１～５２２番残基と少なくとも９０％同一の配列、１～４１２番残基と少なくとも９０％同一の配列、および１～３１２番残基と少なくとも９０％同一の配列からなる群から選択される配列を含む。各種実施形態において、ｓＥｐｈＢ４ポリペプチドは、球状（Ｇ）ドメイン（配列番号１の２９～１９７番アミノ酸）と、所望により、システインリッチドメイン（配列番号１の２３９～３２１番アミノ酸）、第一フィブロネクチン３型ドメイン（配列番号１の３２４～４２９番アミノ酸）、および第二フィブロネクチン３型ドメイン（配列番号１の４３４～５２６番アミノ酸）などの追加のドメインとを含む配列を含み得る。各種実施形態において、ｓＥｐｈＢ４ポリペプチドは、配列番号１の１～５３７番アミノ酸を含むこととなる。各種実施形態において、ｓＥｐｈＢ４ポリペプチドは、配列番号１の１～４２７番アミノ酸を含むこととなる。各種実施形態において、ｓＥｐｈＢ４ポリペプチドは、配列番号１の１～３２６番アミノ酸を含むこととなる。各種実施形態において、ｓＥｐｈＢ４ポリペプチドは、配列番号１の１～１９７番、２９～１９７番、１～３１２番、２９～１３２番、１～３２１番、２９～３２１番、１～３２６番、２９～３２６番、１～４１２番、２９～４１２番、１～４２７番、２９～４２７番、１～４２９番、２９～４２９番、１～５２６番、２９～５２６番、１～５３７番、および２９～５３７番アミノ酸を含むこととなる。各種実施形態において、ｓＥｐｈＢ４ポリペプチドは、配列番号１の１６～１９７番、１６～３１２番、１６～３２１番、１６～３２６番、１６～４１２番、１６～４２７番、１６～４２９番、および１６～５２６番アミノ酸を含むこととなる。各種実施形態において、ｓＥｐｈＢ４ポリペプチドは、エフリンＢ２結合活性を保持しながら、前述のアミノ酸配列のいずれかと少なくとも９０％、所望により９５％または９９％同一のアミノ酸配列を含むものであってもよい。各種実施形態において、配列番号１に示される配列からのアミノ酸配列におけるいずれの変化も、特に表面ループ領域内の、わずか１個、２個、３個、４個、または５個のアミノ酸の保存的な変化または欠失である。
【0050】
各種実施形態において、Ｆｃ融合タンパク質としての発現または別の多量体化ドメインとの融合などにより、多量体形態の可溶性ポリペプチドが作製されてもよい。
【0051】
各種実施形態において、ｓＥｐｈＢ４ポリペプチドは、エフリンＢ２結合活性を保持しながら血中半減期を増加させる追加の成分をさらに含むこととなる。各種実施形態において、ｓＥｐｈＢ４ポリペプチドは単量体であり、１または複数のポリオキシアルキレン（ｐｏｌｙｏｘｙａｋｌｙｌｅｎｅ）基（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン）に共有結合的に連結されている。各種実施形態において、ｓＥｐｈＢ４ポリペプチドは、単一のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基に共有結合的に連結されている（以下、「ｓＥｐｈＢ４－ＰＥＧ」）。各種実施形態において、ｓＥｐｈＢ４ポリペプチドは、２個、３個、またはそれ以上のＰＥＧ基に共有結合的に連結されている。
【0052】
各種実施形態において、上記の１または複数のＰＥＧは、約１ｋＤａ～約１００ｋＤａ、約１０～約６０ｋＤａ、約１０～約４０ｋＤａの範囲の分子量を有するとしてもよい。ＰＥＧ基は直鎖ＰＥＧであっても分岐ＰＥＧであってもよい。各種実施形態において、ｔｈｅ 可溶性単量体ｓＥｐｈＢ４複合体は、好ましくはｓＥｐｈＢ４リジンのｓ－アミノ基またはＮ末端アミノ基を介して、約１０～約４０ｋＤａ、または約１５～３０ｋＤａの１つのＰＥＧ基に共有結合的に連結したｓＥｐｈＢ４ポリペプチド（モノＰＥＧ化ＥｐｈＢ４）を含む。各種実施形態において、ｓＥｐｈＢ４は、ｓＥｐｈＢ４リジンのｓ－アミノ基およびＮ末端アミノ基からなる基のうちの１つのアミノ基においてランダムにＰＥＧ化されている。
【0053】
各種実施形態において、ｓＥｐｈＢ４ポリペプチドは、実質的にエフリンＢ２結合性を減弱させずに半減期を向上させる第二安定化ポリペプチドと安定に結び付けられている。各種実施形態において、上記の安定化ポリペプチドは、ヒト患者（または畜患、この場合、動物への使用が企図される）と免疫適合性であり、重要な生物活性をほとんどまたは全く持たない。各種実施形態において、ｓＥｐｈＢ４ポリペプチドは、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）（以下、「ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡ」）およびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（以下、「ｓＥｐｈＢ４－ＢＳＡ」）からなる群から選択されるアルブミンと共有結合的または非共有結合的に結び付けられている。ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡは、１２３．３ｋＤａの単一の境目のないタンパク質として発現された後にアルブミンとＣ末端で融合された可溶性ＥｐｈＢ４細胞外ドメインから構成される完全ヒト融合タンパク質である。ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡはエフリンＢ２に特異的に結合する。腫瘍モデルにおけるｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡの予備研究では、腫瘍へのＴ細胞およびＮＫ細胞の遊走増加が示されている。これは、腫瘍血管におけるＩＣＡＭ－１の誘導を伴う。ＩＣＡＭ－１は、内皮へのＴ細胞およびＮＫ細胞の接着と、その後の腫瘍への細胞の遊出を促進するインテグリンである。ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡは、腫瘍細胞および腫瘍血管において、ＥｐｈＢ－エフリンＢ２相互作用をブロックすることによる、ＰＩ３Ｋシグナル伝達のダウンレギュレーションも示す。膜貫通型タンパク質であるエフリンＢ２は腫瘍血管で誘導されている。エフリンＢ２は、腫瘍細胞において誘導されるＥｐｈＢ受容体型チロシンキナーゼファミリーのいくつかのメンバーと結合する。エフリンＢ２－ＥｐｈＢ４は双方向性のシグナル伝達を誘導する。ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡは、このシグナル伝達をブロックし、腫瘍への免疫細胞輸送を促進し、ＰＩ３Ｋ経路をダウンレギュレートすることにより腫瘍細胞における生存シグナルを阻害する。
【0054】
各種実施形態において、上記の共有結合は、ｓＥｐｈＢ４ポリペプチドのヒト血清アルブミンとの同時翻訳融合体としての発現によって達成されてもよい。アルブミン配列は、ｓＥｐｈＢ４ポリペプチドのＮ末端、Ｃ末端、または非破壊的内部位置に融合されてよい。ｓＥｐｈＢ４の露出されたループはアルブミン配列を挿入するための適切な位置となるだろう。アルブミンは、化学的架橋などによってｓＥｐｈＢ４ポリペプチドに翻訳後結合されてもよい。各種実施形態において、ｓＥｐｈＢ４ポリペプチドは、２つ以上のアルブミンポリペプチドと安定的に結び付けられてもよい。
【0055】
各種実施形態において、ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡ融合体は、エフリンＢ２とＥｐｈＢ４との間の相互作用、エフリンＢ２もしくはＥｐｈＢ４のクラスター化、エフリンＢ２もしくはＥｐｈＢ４のリン酸化、またはこれらの組み合わせを阻害する。各種実施形態において、ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡ融合体は、未改変の野生型ポリペプチドと比べて、インビボ安定性が増強されている。
【0056】
各種実施形態において、ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡは、配列番号２の２５～６０９番残基に直接融合した配列番号１の１６～１９７番残基を含む。各種実施形態において、ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡは、配列番号２の２５～６０９番残基に直接融合した配列番号１の１６～３１２番残基を含む。各種実施形態において、ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡは、配列番号２の２５～６０９番残基に直接融合した配列番号１の１６～３２１番残基を含む。各種実施形態において、ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡは、配列番号２の２５～６０９番残基に直接融合した配列番号１の１６～３２６番残基を含む。各種実施形態において、ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡは、配列番号２の２５～６０９番残基に直接融合した配列番号１の１６～４１２番残基を含む。各種実施形態において、ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡは、配列番号２の２５～６０９番残基に直接融合した配列番号１の１６～４２７番残基を含む。各種実施形態において、ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡは、配列番号２の２５～６０９番残基に直接融合した配列番号１の１６～４２９番残基を含む。各種実施形態において、ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡは、配列番号２の２５～６０９番残基に直接融合した配列番号１の１６～５２６番残基を含む。各種実施形態において、ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡは、配列番号２の２５～６０９番残基に直接融合した配列番号１の１６～５３７番残基を含む。
【0057】
前立腺がん
前立腺がんは、男性において最も一般的な非皮膚性悪性腫瘍であり、西欧諸国ではがんに由来する男性の主要死因の第２位となっている。前立腺がんは前立腺における異常細胞の無制御な成長を原因とする。前立腺がん腫瘍が発達すると、テストステロンなどのアンドロゲン類が前立腺がん腫瘍増殖を促進する。初期段階では、局所的な前立腺がんが、前立腺の外科的切除および放射線療法などを含む局所療法で治療される場合が多い。しかし、局所療法が前立腺がんを治癒できない場合、これは男性の３分の１にまでのぼることであるが、この疾患は不治の転移性疾患へと進行する（すなわち、がんが身体の一部分から他の部分へと広がった疾患）。本明細書で使用される場合、用語「前立腺がん」は、最も広い意味で使用され、前立腺組織から生じた全ての病期および全ての形態のがんを指す。用語「前立腺がん」は、前立腺組織に位置するあらゆる種類の悪性（すなわち非良性）腫瘍を包含し、例えば、前立腺腺癌、前立腺肉腫、未分化前立腺がん、前立腺扁平上皮癌、前立腺管移行性癌、および前立腺上皮内腫瘍などである。
前立腺がんは、男性において最も一般的な非皮膚性悪性腫瘍であり、西欧諸国ではがんに由来する男性の主要死因の第２位となっている。前立腺がんは前立腺における異常細胞の無制御な成長を原因とする。前立腺がん腫瘍が発達すると、テストステロンなどのアンドロゲン類が前立腺がん腫瘍増殖を促進する。初期段階では、局所的な前立腺がんが、前立腺の外科的切除および放射線療法などを含む局所療法で治療される場合が多い。しかし、局所療法が前立腺がんを治癒できない場合、これは男性の３分の１にまでのぼることであるが、この疾患は不治の転移性疾患へと進行する（すなわち、がんが身体の一部分から他の部分へと広がった疾患）。本明細書で使用される場合、用語「前立腺がん」は、最も広い意味で使用され、前立腺組織から生じた全ての病期および全ての形態のがんを指す。用語「前立腺がん」は、前立腺組織に位置するあらゆる種類の悪性（すなわち非良性）腫瘍を包含し、例えば、前立腺腺癌、前立腺肉腫、未分化前立腺がん、前立腺扁平上皮癌、前立腺管移行性癌、および前立腺上皮内腫瘍などである。
【0058】
ＡＪＣＣ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｔａｇｉｎｇ Ｍａｎｕａｌ（第７版、２０１０年）の米国がん合同委員会（ＡＪＣＣ）のＴＮＭ（ｔｕｍｏｒ，ｎｏｄｅ，ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）病気分類システムによれば、各種ステージの前立腺がんは以下の通りに定義される：腫瘍：Ｔ１：触知もイメージングによる可視化もできない臨床的に不顕性の腫瘍、Ｔ１ａ：切除された組織の５％以下における腫瘍の偶発的組織所見、Ｔ１ｂ：切除された組織の５％超における腫瘍の偶発的組織所見、Ｔｉｃ：針生検で特定された腫瘍；Ｔ２：前立腺内に限局している腫瘍、Ｔ２ａ：腫瘍が片葉の１／２以下に及ぶ、Ｔ２ｂ：腫瘍が片葉の１／２超に及ぶが、両葉ではない、Ｔ２ｃ：腫瘍が両葉に及ぶ；Ｔ３：腫瘍が前立腺の被膜を超えて広がる、Ｔ３ａ：被膜外への進展（片側性または両側性）、Ｔ３ｂ：腫瘍が精嚢に浸潤；Ｔ４：腫瘍が精嚢以外の隣接構造体（膀胱頸部、外括約筋、直腸、挙筋、または骨盤壁（ｐｅｌｖｉｃ ｗａｉｌ））に固定または浸潤。通常、臨床的Ｔ（ｃＴ）病期はＴ１またはＴ２であり、病態的Ｔ（ｐＴ）期はＴ２以上である。節：Ｎ０：所属リンパ節転移なし；Ｎ１：所属リンパ節における転移。転移：Ｍ０：遠隔転移なし；Ｍ１：遠隔転移あり。
【0059】
ＰＣはＡＲシグナル伝達により駆動される、進行後の疾患では第一選択療法のアンドロゲン除去療法が治療の土台となっているが、腫瘍はＡＲ機能を維持したまま除去に抵抗性となる。例えば、ＡＲ遺伝子増幅は高感度化をもたらす可能性があり、一方、リガンド結合ドメインにおける変異はエストロゲン、プロゲステロン、およびグルココルチコイドと結合してＡＲシグナル伝達を活性化する可能性がある。ＡＲ変異は、リガンド結合とは無関係の恒常的な活性化に繋がることもある。皮肉なことに、ＰＩ３Ｋ経路の活性化はしばしばＡＲレベルを減少させるため、Ｐａｎ－ＰＩ３Ｋ阻害剤によるＰＩ３Ｋ経路の阻害はＡＲ経路の活性をアップレギュレートする。同様に、ＡＲ阻害は、部分的にはＰＨＬＰＰホスファターゼの減少によるｐＡＫＴの維持によって、ＰＩ３Ｋ経路を活性化する（Ｃａｒｖｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ、１９巻（５号）：頁５７５－５８６、２０１１年）。従って、これら２つの経路は互いに逆に制御し合い、互いの阻害剤に対する回避機構となっている。本明細書に記載されているように、本発明者は、ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡがＡＲそれ自体に影響を与えるかどうかを評価することにし、ＰＩ３Ｋ阻害剤を用いた場合に見られるようにＡＲが増加する可能性があると仮定した。これを受けて、ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡ処置マウス由来の腫瘍におけるＡＲを測定した。驚くべきことに、ＡＲレベルに顕著な減少が確認された。本発明者はまた、ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡがＰＴＥＮ欠損に関連したＰＩ３Ｋβ阻害を起こし得るか、また、ＰＩ３βがＡＲ減少の原因であるかどうかを評価した。ＰＩ３ＫβはＡＲ発現を誘導するが（Ｚｈｕら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２７巻（３３号）、頁４５６９－４５７９、２００８年）、ＰＩ３ＫαはＡＲ発現を誘導しないことが示されている。ＰＩ３Ｋアイソタイプ特異的阻害剤によって、ＰＩ３ＫβがＡＲレベルの制御に関与していることが示された。また、ＥｐｈＢ４の減少はＰＩ３Ｋ ｐ１１０β阻害で最も顕著であった。同様に、ＥｐｈＢ４阻害はＡＲを低下させたが、ｐ１１０βを発現させることでレスキューされた。すなわち、ＥｐｈＢ４はＰＩ３Ｋを制御するだけでなく、ＡＲレベルの調節も行っている。
【0060】
治療方法
各種実施形態において、本発明は、係る治療を必要としている対象における前立腺がんを治療する方法であって、ＥｐｈＢ４またはエフリンＢ２を介した機能を阻害するポリペプチド剤の治療有効量を上記ヒトに投与することを含む、方法に関する。
各種実施形態において、本発明は、係る治療を必要としている対象における前立腺がんを治療する方法であって、ＥｐｈＢ４またはエフリンＢ２を介した機能を阻害するポリペプチド剤の治療有効量を上記ヒトに投与することを含む、方法に関する。
【0061】
各種実施形態において、本発明は、係る治療を必要としている対象における前立腺がんを治療する方法であって、ａ）ＥｐｈＢ４またはエフリンＢ２を介した機能を阻害するポリペプチド剤の治療有効量を上記ヒトに投与すること、およびｂ）第二の抗がん療法の治療有効量を投与すること、を含む、方法に関する。上記の併用療法は相乗的なものであってもよい。上記の併用療法は抗がん療法の治療指数を増加させるものであってもよい。
【0062】
各種実施形態において、上記の第二の抗がん療法は、アンドロゲン除去療法（ＡＤＴ）、ＡＲ標的療法、ホルモン除去療法、免疫療法、化学療法、特定の腫瘍抗原に対する除去抗体を用いた標的治療、共刺激分子または共抑制分子（免疫チェックポイント）に対するアゴニスト抗体、アンタゴニスト抗体、または阻止抗体を用いた標的治療、免疫複合体、ＡＤＣ、または特定の腫瘍抗原に対する除去抗体と細胞毒とを含む融合分子による標的治療、小分子キナーゼ阻害剤標的療法、外科手術、放射線治療、ＤＨＴ遮断薬を用いた治療、および幹細胞移植からなる群から選択される。各種実施形態において、上記の第二の抗がん療法は、ＣＤ２７６、ＣＤ２７２、ＣＤ１５２、ＣＤ２２３、ＣＤ２７９、ＣＤ２７４、ＴＩＭ－３、およびＢ７－Ｈ４を含むがこれらに限定はされないリストからの、免疫チェックポイントタンパク質抗原と特異的に結合する抗体；または、当該技術分野において教示される任意の免疫チェックポイントタンパク質抗原抗体の投与を含む。
【0063】
アンドロゲン除去療法（「ＡＤＴ」）またはアンドロゲン抑制療法は、精巣のテストステロン産生を抑制するために実施される。ＡＤＴは手術による去勢（精巣摘除術）を包含する。本明細書で使用される場合、「アンドロゲン」または「アンドロゲン化合物」とは、テストステロン、ジヒドロテストステロン、アンドロステンジオン、デヒドロエピアンドロステロン、アンドロステンジオール、アンドロステロンなどを指す。各種実施形態において、「アンドロゲン」とは、テストステロンまたはジヒドロテストステロンを指す。本明細書で使用される場合、「抗アンドロゲン化合物」とは、体内のアンドロゲンレベルを低下させることができる任意の化合物を指す。抗アンドロゲン化合物は、小分子、ペプチド、またはタンパク質とすることができる。各種実施形態において、抗アンドロゲン化合物とは、化学的な精巣摘除に使用される化合物を指す。各種実施形態において、抗アンドロゲン化合物は、性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）アンタゴニストである。各種実施形態において、抗アンドロゲン化合物は、性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）アゴニストである。各種実施形態において、抗アンドロゲン化合物は、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）アゴニストである。各種実施形態において、抗アンドロゲン化合物は、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）アンタゴニストである。各種実施形態において、抗アンドロゲン化合物は、アバレリックス、アビラテロン、アパルタミド、ビカルタミド、デガレリクス、エンザルタミド、フルタミド、ゴセレリン、リュープロレリン（別名リュープロリド）、ニルタミド、オザレリクス、またはこれらのうちの２以上の組み合わせである。各種実施形態において、抗アンドロゲン化合物はアバレリックスである。各種実施形態において、抗アンドロゲン化合物はアビラテロンである。各種実施形態において、抗アンドロゲン化合物はアパルタミドである。各種実施形態において、抗アンドロゲン化合物はビカルタミドである。実施形態において、抗アンドロゲン化合物はデガレリクスである。各種実施形態において、抗アンドロゲン化合物はエンザルタミドである。各種実施形態において、抗アンドロゲン化合物はフルタミドである。実施形態において、抗アンドロゲン化合物はゴセレリンである。各種実施形態において、抗アンドロゲン化合物はリュープロレリンである。各種実施形態において、抗アンドロゲン化合物はニルタミドである。各種実施形態において、抗アンドロゲン化合物はオザレリクスである。各種実施形態において、抗アンドロゲン化合物は、薬剤的に許容できる塩の形態である。各種実施形態において、上記薬剤は、ＡＲシグナル経路を標的とする薬剤であり、例えば、より有効性が高い抗アンドロゲン薬、ＣＹＰ１７の阻害剤、アンドロゲン合成に必要な酵素、５α－還元酵素の阻害剤、ＡＲを分解から保護するＨＳＰ９０の阻害剤、最適なＡＲ介在性転写に必要なヒストン脱アセチル化酵の阻害剤、およびチロシンキナーゼ阻害剤の阻害剤が挙げられる。
【0064】
本明細書で使用される場合、抗ホルモン療法は、選択されたホルモンまたはその効果を抑制するホルモン除去療法の１種である。抗ホルモン活性は、ホルモン機能をアンタゴナイズすることによって（例えば、ホルモン類似体もしくはホルモンアンタゴニスト、またはホルモンとその受容体との結合／結び付きをブロックする組成物（例えば、ホルモン遮断組成物または遮断物質）で）、および／または、ホルモン産生を阻止もしくは低減することによって、達成することができる。これは、薬剤、放射線、および／または外科的アプローチでなすこともできる。ある種のホルモンの抑制は、ある種のホルモンが腫瘍の成長を促進または助長しているがん患者に有益である可能性がある。例えば、内在性アンドロゲン産生を低減し体内のアンドロゲンレベルを低くするゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）アゴニストなどの試薬を用いるアンドロゲン除去療法を、前立腺がんの治療に用いることができる。
【0065】
本明細書で使用される場合、用語「免疫療法」とは、以下を含むがこれらに限定はされないがん治療を指す：特定の腫瘍抗原に対する除去抗体を用いた治療；抗体薬物複合体を用いた治療；ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＯＸ－４０、ＣＤ１３７、ＧＩＴＲ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ－３、およびＶＩＳＴＡなどの共刺激分子または共抑制分子（免疫チェックポイント）に対するアゴニスト抗体、アンタゴニスト抗体、または阻止抗体を用いた治療；ブリナツモマブなどの二重特異性Ｔ細胞誘導抗体（ＢｉＴＥ（登録商標））を用いた治療：ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、およびＩＦＮ－γなどの生物学的応答調節物質の投与を含む治療；シプロイセルＴなどの治療用ワクチンを用いた治療；樹状細胞ワクチンまたは腫瘍抗原ペプチドワクチンを用いた治療；キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）－Ｔ細胞を用いた治療；ＣＡＲ－ＮＫ細胞を用いた治療；腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を用いた治療；養子移植抗腫瘍Ｔ細胞（生体外で増殖された且つ／またはＴＣＲトランスジェニックのＴ細胞）を用いた治療；ＴＡＬＬ－１０４細胞を用いた治療；並びに、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストのＣｐＧおよびイミキモドなどの免疫刺激剤を用いた治療。
【0066】
共刺激分子または共抑制分子（免疫チェックポイント）に対するアゴニスト抗体、アンタゴニスト抗体、または阻止抗体を用いた免疫療法は、広範な研究および臨床評価の一領域であった。免疫チェックポイントタンパク質としては、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、およびＴＩＭ－３、並びに他のいくつかが挙げられる（Ｐａｒｄｏｌｌ ＤＭ．、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ、１２巻：頁２５２‐６４、２０１２年；Ｓｈａｒｐｅら、Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ、８巻：頁２３９‐４５、２００７年）。通常の生理的条件下では、免疫チェックポイントは自己寛容の維持（すなわち、自己免疫の防止）において極めて重要であり、免疫系が病原性感染に応答している際に組織をダメージから保護する。また、腫瘍は、特に腫瘍抗原に特異的なＴ細胞に対する、免疫耐性の主な仕組みとして、ある特定の免疫チェックポイント経路を取り込むことが、今では明らかとなっている（Ｐａｒｄｏｌｌ ＤＭ．、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ、１２巻：頁２５２‐６４、２０１２年）。これを受けて、例えば、ＣＴＬＡ－４（イピリムマブ）、ＰＤ－１（ニボルマブ；ペンブロリズマブ；ピジリズマブ）、およびＰＤ－Ｌ１（ＢＭＳ－９３６５５９；ＭＰＬＤ３２８０Ａ；ＭＥＤＩ４７３６；ＭＳＢ００１０７１８Ｃ）（例えば、ＰｈｉｌｉｐｓおよびＡｔｋｉｎｓ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２７巻（１号）；頁３９－４６、２０１４年１０月を参照）、並びにＯＸ－４０、ＣＤ１３７、ＧＩＴＲ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ－３、およびＶＩＳＴＡ（例えば、Ｓｈａｒｏｎら、Ｃｈｉｎ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．、３３巻（９号）：頁４３４－４４４、２０１４年９月；Ｈｏｄｉら、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ、２０１０年；Ｔｏｐａｌｉａｎら、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ、３６６巻：頁２４４３‐５４を参照）を包含する免疫チェックポイント分子に対する抗体を用いた治療が、がんなどの増殖性疾患を有する患者、特に難治性且つ／または再発性のがんを有する患者を治療するための、新規の代替免疫療法としての評価を受けている。これらの免疫療法のいくつかは、劇的な恩恵と大きな見込みを示したが、重篤な副作用の可能性に対する懸念と、多くの腫瘍が標的抗原を欠損してことから治療を回避するという事実によって、制限を受けている。通常、各種がん患者の約２０％がＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１抗体またはＣＴＬＡ－４抗体に応答する。従って、免疫チェックポイント療法（ＩＣＴ）に応答しない再発がん患者および／または難治性がん患者を治療するための新規の改善された免疫療法が、極めて重要なアンメットニーズとなっている。
【0067】
各種実施形態において、上記の追加の治療法は、ＣＤ２７６、ＣＤ２７２、ＣＤ１５２、ＣＤ２２３、ＣＤ２７９、ＣＤ２７４、ＴＩＭ－３、およびＢ７－Ｈ４を含むがこれらに限定はされないリストからの、免疫チェックポイントタンパク質抗原と特異的に結合する抗体；または、当該技術分野において教示される任意の免疫チェックポイントタンパク質抗原抗体の投与を含む。
【0068】
併用療法の性質にもよるが、本発明のポリペプチド治療薬の投与は、他方の治療法が施行されている間および／またはその後に、継続されてもよい。ポリペプチド治療薬は、追加の抗がん療法の前、同時、または後、通常は少なくとも約１週間以内、少なくとも約５日間以内、少なくとも約３日間以内、少なくとも約１日間以内に、投与されてもよい。ポリペプチド治療薬は、単回投与で送達されてもよいし、あるいは、複数回投与に分割されてもよく、例えば、一定期間に渡って送達されてもよく、毎日、１日２回、週２回、毎週の送達などが挙げられる。有効量は、投与経路、特定の薬剤、抗がん剤の用量などによって変わることとなり、当業者が経験に基づいて決定してもよい。
【0069】
各種実施形態において、患者は、以前に抗がん療法による治療に応答したが、治療の休止後、再発（以下、「再発性増殖性疾患」）を引き起こしたものである。
【0070】
各種実施形態において、患者は抵抗性または難治性のがんを有する。各種実施形態において、上記のがんはアンドロゲン除去療法に対して難治性のものである。各種実施形態において、上記のがんはＡＲ標的療法に対して難治性のものである。各種実施形態において、上記のがんはホルモン除去療法に対して難治性のものである。各種実施形態において、上記のがんは免疫療法による治療に対して難治性のものである。各種実施形態において、上記のがんは化学療法剤を用いた治療に対して難治性のものである。各種実施形態において、上記のがんは特定の腫瘍抗原に対する除去抗体を用いた治療に対して難治性のものである。各種実施形態において、上記のがんは、共刺激分子または共抑制分子（免疫チェックポイント）に対するアゴニスト抗体、アンタゴニスト抗体、または阻止抗体を用いた治療に対して難治性のものである。各種実施形態において、上記のがんは、免疫複合体、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）、または特定の腫瘍抗原に対する除去抗体と細胞毒とを含む融合分子による標的治療に対して難治性のものである。各種実施形態において、上記のがんは、小分子キナーゼ阻害剤による標的治療に対して難治性のものである。各種実施形態において、上記のがんは、ＤＨＴ遮断薬を用いた治療に対して難治性のものである。各種実施形態において、上記のがんは、放射線を用いた治療に対して難治性のものである。各種実施形態において、上記のがんは、例えば、以下のうちの２つ以上を含む併用療法に対して難治性のものである：免疫療法による治療、化学療法剤による治療、特定の腫瘍抗原に対する除去抗体を用いた治療、共刺激分子または共抑制分子（免疫チェックポイント）に対するアゴニスト抗体、アンタゴニスト抗体、または阻止抗体を用いた治療、免疫複合体、ＡＤＣ、または特定の腫瘍抗原に対する除去抗体と細胞毒とを含む融合分子による治療、小分子キナーゼ阻害剤による標的治療、外科手術を用いた治療、幹細胞移植を用いた治療、ＤＨＴ遮断薬を用いた治療、および放射線を用いた治療。
【0071】
医薬組成物
各種実施形態において、本発明のポリペプチド治療薬は、活性治療薬と、すなわち、種々の他の薬剤的に許容できる成分とを含む医薬組成物として、しばしば投与される。（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、第１５版、マック出版社（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ）、イーストン、ペンシルベニア州、１９８０年を参照）。好ましい形態は、目的の投与様式および治療適用に応じて変わる。上記組成物には、所望の製剤に応じて、薬剤的に許容できる無毒の担体または希釈剤を含ませることもでき、これらは動物投与またはヒト投与用の医薬組成物を製剤化するのに通常使用される溶剤と定義される。希釈剤は、組み合わせたものの生物活性に影響を与えないように選択される。そのような希釈剤の例としては、蒸留水、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、ブドウ糖液、およびハンクス液がある。加えて、医薬組成物または製剤には、他の担体、補助剤、または無毒性の、治療を目的としていない、非免疫原性の安定剤などを含ませてもよい。
各種実施形態において、本発明のポリペプチド治療薬は、活性治療薬と、すなわち、種々の他の薬剤的に許容できる成分とを含む医薬組成物として、しばしば投与される。（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、第１５版、マック出版社（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ）、イーストン、ペンシルベニア州、１９８０年を参照）。好ましい形態は、目的の投与様式および治療適用に応じて変わる。上記組成物には、所望の製剤に応じて、薬剤的に許容できる無毒の担体または希釈剤を含ませることもでき、これらは動物投与またはヒト投与用の医薬組成物を製剤化するのに通常使用される溶剤と定義される。希釈剤は、組み合わせたものの生物活性に影響を与えないように選択される。そのような希釈剤の例としては、蒸留水、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、ブドウ糖液、およびハンクス液がある。加えて、医薬組成物または製剤には、他の担体、補助剤、または無毒性の、治療を目的としていない、非免疫原性の安定剤などを含ませてもよい。
【0072】
各種実施形態において、原発性がんまたは転移性がんの治療用の医薬組成物は、非経口的、局所的、静脈内、腫瘍内、経口的、皮下、動脈内、頭蓋内、腹腔内、鼻腔内、または筋肉内手段により投与することができる。
【0073】
非経口投与の場合、本発明の医薬組成物は、注射用の用量の、水、油、食塩水、グリセロール、またはエタノールなどの滅菌液であり得る医薬担体を含む生理学的に許容される希釈剤中の当該物質の溶液または懸濁液として、投与することができる。さらに、湿潤剤、乳化剤、界面活性剤、ｐＨ緩衝物質などの補助剤を組成物中に存在させることもできる。医薬組成物の他の成分として、石油由来、動物由来、野菜由来、または合成由来のものがあり、例えば、ピーナッツ油、ダイズ油、およびミネラルオイルなどである。通常、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなどのグリコールが、特に注射剤用の、好ましい液体担体である。抗体および／またはポリペプチドは、有効成分の徐放を可能にするように製剤化され得る蓄積注射または移植製剤の形態で投与することができる。典型的には、医薬組成物は、溶液または懸濁液としての注射剤として調製され；注射前の液体溶剤への溶解または懸濁に好適な固体形態を調製することもできる。上記の調製物は、前述のようなアジュバント効果を増強するための、リポソーム、またはポリ乳酸、ポリグリコール酸、もしくはコポリマーなどの微小粒子中に、乳化またはカプセル化することもできる。Ｌａｎｇｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９巻：頁１５２７、１９９０年、およびＨａｎｅｓ、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ、２８巻：頁９７－１１９、１９９７年。本発明のポリペプチド剤は、有効成分の徐放またはパルス放出を可能にするように製剤化され得る蓄積注射または移植製剤の形態で投与することができる。
【0074】
他の投与様式に好適なさらなる製剤として、経口用、鼻腔内用、および肺内用の製剤、坐剤、並びに経皮適用が挙げられる。
【0075】
各種実施形態において、本発明の方法は、治療を必要としている患者に、本発明のｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡポリペプチドの治療有効量または有効量を投与することを含む。各種実施形態において、本明細書に記載の、例えば原発性がんまたは転移性がんの治療のための、本発明のポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｔｉｄｅ）の有効量は、投与手段、標的部位、患者の生理的状態、患者がヒトであるか動物であるか、施行される他の薬物治療、および治療が予防目的であるか治療目的であるか、を含む種々の要因に応じて変化する。通常、患者はヒトであるが、遺伝子導入哺乳類を含むヒト以外の哺乳類も治療できる。治療投与量は安全性および有効性を最適化するように用量設定する必要がある。
【0076】
各種実施形態において、上記投与量は、ホスト体重の、約０．０００１～１００ｍｇ／ｋｇの範囲を取ってもよく、通常は０．０１～５ｍｇ／ｋｇの範囲をとる。例えば、投与量は、１ｍｇ／ｋｇ体重または１０ｍｇ／ｋｇ体重または１～１０ｍｇ／ｋｇの範囲内とすることができる。各種実施形態において、患者に投与されるポリペプチドの投与量は、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約１．０ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ、約２．０ｍｇ／ｋｇ、約２．５ｍｇ／ｋｇ、約３．０ｍｇ／ｋｇ、約３．５ｍｇ／ｋｇ、約４．０ｍｇ／ｋｇ、約４．５ｍｇ／ｋｇ、約５．０ｍｇ／ｋｇ、約６．０ｍｇ／ｋｇ、約７．０ｍｇ／ｋｇ、約８．０ｍｇ／ｋｇ、約９．０ｍｇ／ｋｇ、および約１０．０ｍｇ／ｋｇからなる群から選択される。各種実施形態において、治療レジメン（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｒｅｇｉｍｅ）は、２週間毎に１回、または月１回、または３～６か月毎に１回の投与を伴う。本発明の治療物質は、通常、複数回投与される。１回の投与の間隔は毎週、隔週、毎月、または毎年とすることができる。患者内の治療物質の血中レベルを測定することで、表示のように、間隔を不規則にすることもできる。あるいは、本発明の治療物質は、徐放性製剤として投与することができ、その場合、必要な投与頻度は少なくなる。投与量および頻度は患者内のポリペプチドの半減期に応じて変わる。
【0077】
本明細書に記載のポリペプチドの毒性は、標準的な薬学的手法によって、細胞培養液または実験動物において、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に致死的な用量）またはＬＤ１００（集団の１００％に致死的な用量）を求めることによって、求めることができる。毒性効果と治療効果の用量比が治療指数となる。これらの細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータは、ヒトでの使用の場合に毒性とならない用量域を求める際に使用できる。本明細書に記載のポリペプチドの投与量は、毒性がほとんどまたは全くない有効量を含む血中濃度の範囲内であることが好ましい。投与量は、採用された剤形および使用される投与経路に応じて、この範囲内で変更できる。正確な製剤、投与経路、および投与量は、患者の状態を考慮して、対象医師（ｓｕｂｊｅｃｔ ｐｈｙｓｉｃｉａｎ）が選択することができる。（例えば、Ｆｉｎｇｌら、１９７５年、Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第１章を参照されたい）。
【実施例】
【0078】
以下の実施例は本開示をさらに詳細に説明するためのものである。
【0079】
実施例１
本実施例では、ＰＣにおけるＥｐｈＢの役割を明らかにするために、ＴＣＧＡ（Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ）データベース内の４９２人のＰＣ患者において、ＥｐｈＢ－エフリンＢ遺伝子発現解析を行った。その結果、ＥｐｈＢ受容体のうち、前立腺がんではＥｐｈＢ４が最も高発現であり、次いでＥｐｈＢ３、ＥｐｈＢ６となった。ＥｐｈＢ２とＥｐｈＢ１のレベルは有意に低かった（図１Ａ）。リガンドのうち、ＥｐｈＢ４の同族受容体であるエフリンＢ２のみが高レベルで発現し、エフリンＢ１とエフリンＢ３は非常に低いレベルである。
本実施例では、ＰＣにおけるＥｐｈＢの役割を明らかにするために、ＴＣＧＡ（Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ）データベース内の４９２人のＰＣ患者において、ＥｐｈＢ－エフリンＢ遺伝子発現解析を行った。その結果、ＥｐｈＢ受容体のうち、前立腺がんではＥｐｈＢ４が最も高発現であり、次いでＥｐｈＢ３、ＥｐｈＢ６となった。ＥｐｈＢ２とＥｐｈＢ１のレベルは有意に低かった（図１Ａ）。リガンドのうち、ＥｐｈＢ４の同族受容体であるエフリンＢ２のみが高レベルで発現し、エフリンＢ１とエフリンＢ３は非常に低いレベルである。
【0080】
次いで、７４のＰＣ試料と４０の正常前立腺組織において、エフリンＢ２タンパク質発現を測定した。エフリンＢ２は、前立腺がん組織の５８％で高発現していた 腫瘍細胞、腫瘍血管、および間質は全てエフリンＢ２陽性に染色されたが、４０の正常前立腺腺と正常血管は全て陰性であった（図１Ｂ）。グリソングレードとエフリンＢ２発現には相関がなかった。次に、グリソングレードとエフリンＢ２発現の相関関係を分析した。驚くべきことに、グリソングレードとステージが増加してもエフリンＢ２は増加しなかった。このことは、エフリンＢ２が前立腺がんの全ての腫瘍グレードおよびステージでアップレギュレートされていることを示している（表１参照）。
【0081】
【0082】
実施例２
本実施例では、ＥｐｈＢ４とエフリンＢ２の発現が、Ｐｔｅｎの機能喪失、ひいてはＰＩ３Ｋ経路の活性化によって制御されるかどうかを確認するための実験を行った。具体的には、前立腺特異的プロバシンプロモーター下でのコンディショナルなＰｔｅｎ－／－ルシフェラーゼ（ｃＰｔｅｎ－／－Ｌ）レポーターを実施した（下記「方法および材料」の項を参照）。ルシフェラーゼ発現により、リアルタイムで生きたままマウス腫瘍をイメージングすることができ、プロバシン駆動型のＣｒｅによりＰｔｅｎ対立遺伝子の欠失が生じる。ＰＣの発生は、テストステロンが上昇し始める９週齢に始まる。原発性前立腺がんの成長を生物発光画像法（ＢＬＩ）により非侵襲的に追跡した（Ｒ．Ｓ．Ｌｉａｏら、Ｔｒａｎｓｌ Ａｎｄｒｏｌ Ｕｒｏｌ、２巻（３号）：頁１８７－１９６、２０１３年）。６～８週齢から始めて、２週間間隔で５２週間まで、４５匹のマウスからなるコホートをＢＬＩを用いてモニターした。前立腺がん担持を表すルシフェラーゼの発現は、経時的に増加した（図１Ｃ）。生物発光シグナルの青から緑、赤への変化は、腫瘍量の増加を示している。マウス前立腺におけるＥｐｈＢ４発現を、免疫組織化学（ＩＨＣ）、およびウェスタンブロッティングにより測定した。腫瘍ではＥｐｈＢ４発現の増加が見られたが、正常な前立腺では発現は見られなかった（図１Ｄおよび図１Ｅ）。また、他のＥｐｈＢ受容体ファミリーメンバー（ＥｐｈＢ１、ＥｐｈＢ２、ＥｐｈＢ３）の発現についても調べた。ＥｐｈＢ２はウェスタンブロットでは顕著な変化を示さなかったが（図１Ｅ）、定量的ＰＣＲでは、Ｃｒｅ－Ｐｔｅｎ－／－－ルシフェラーゼ（ＣＰＰＬ）マウスのｍＲＮＡレベルにおいて、ＥｐｈＢ２のダウンレギュレーションとＥｐｈＢ４の増加が同時に見られた。ＥｐｈＢ１レベルは定量的ＰＣＲで検出不可であった（図１Ｆ）。さらに、腫瘍組織と正常組織の間で、ＥｐｈＢ３レベルに有意な変化は見られなかった（図１Ｅおよび図１Ｆ）。このように、Ｐｔｅｎの消失とＰＩ３Ｋの誘導により、ヒトＰＣと同様のＥｐｈＢ－エフリンＢ２受容体－リガンドが発現すると考えられる。
本実施例では、ＥｐｈＢ４とエフリンＢ２の発現が、Ｐｔｅｎの機能喪失、ひいてはＰＩ３Ｋ経路の活性化によって制御されるかどうかを確認するための実験を行った。具体的には、前立腺特異的プロバシンプロモーター下でのコンディショナルなＰｔｅｎ－／－ルシフェラーゼ（ｃＰｔｅｎ－／－Ｌ）レポーターを実施した（下記「方法および材料」の項を参照）。ルシフェラーゼ発現により、リアルタイムで生きたままマウス腫瘍をイメージングすることができ、プロバシン駆動型のＣｒｅによりＰｔｅｎ対立遺伝子の欠失が生じる。ＰＣの発生は、テストステロンが上昇し始める９週齢に始まる。原発性前立腺がんの成長を生物発光画像法（ＢＬＩ）により非侵襲的に追跡した（Ｒ．Ｓ．Ｌｉａｏら、Ｔｒａｎｓｌ Ａｎｄｒｏｌ Ｕｒｏｌ、２巻（３号）：頁１８７－１９６、２０１３年）。６～８週齢から始めて、２週間間隔で５２週間まで、４５匹のマウスからなるコホートをＢＬＩを用いてモニターした。前立腺がん担持を表すルシフェラーゼの発現は、経時的に増加した（図１Ｃ）。生物発光シグナルの青から緑、赤への変化は、腫瘍量の増加を示している。マウス前立腺におけるＥｐｈＢ４発現を、免疫組織化学（ＩＨＣ）、およびウェスタンブロッティングにより測定した。腫瘍ではＥｐｈＢ４発現の増加が見られたが、正常な前立腺では発現は見られなかった（図１Ｄおよび図１Ｅ）。また、他のＥｐｈＢ受容体ファミリーメンバー（ＥｐｈＢ１、ＥｐｈＢ２、ＥｐｈＢ３）の発現についても調べた。ＥｐｈＢ２はウェスタンブロットでは顕著な変化を示さなかったが（図１Ｅ）、定量的ＰＣＲでは、Ｃｒｅ－Ｐｔｅｎ－／－－ルシフェラーゼ（ＣＰＰＬ）マウスのｍＲＮＡレベルにおいて、ＥｐｈＢ２のダウンレギュレーションとＥｐｈＢ４の増加が同時に見られた。ＥｐｈＢ１レベルは定量的ＰＣＲで検出不可であった（図１Ｆ）。さらに、腫瘍組織と正常組織の間で、ＥｐｈＢ３レベルに有意な変化は見られなかった（図１Ｅおよび図１Ｆ）。このように、Ｐｔｅｎの消失とＰＩ３Ｋの誘導により、ヒトＰＣと同様のＥｐｈＢ－エフリンＢ２受容体－リガンドが発現すると考えられる。
【0083】
実施例３
本実施例では、Ｐｔｅｎヌルマウス前立腺がんにおける前立腺がんの発生および進行にＥｐｈＢ４が必要であるかどうかを調べるための研究を行った。Ｐｔｅｎ欠失と同様の、前立腺上皮における、ＥｐｈＢ４コンディショナルノックアウト（ＥｐｈＢ４ ＣＫＯ）マウスのための、ＥｐｈＢ４のｌｏｘＰ導入対立遺伝子を作製した（図２Ａ）。遺伝子型同定によって、野生型ＥｐｈＢ４（ＥｐｈＢ４野生型／野生型：１８９ｂｐ）、ヘテロ接合型ｌｏｘＰ導入ＥｐｈＢ４（ＥｐｈＢ４ｆｌｏｘ／野生型：１８９ｂｐおよび２８２ｂｐ）、およびホモ接合型ｌｏｘＰ導入ＥｐｈＢ４（ＥｐｈＢ４ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ：２８２ｂｐ）が確認された（図２Ｂ）。コンディショナルなＥｐｈＢ４欠失の表現型を確認するために、ＥｐｈＢ４ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ（ＥｐｈＢ４ｆ／ｆ）マウスをＣＭＶ－Ｃｒｅマウスと交配させて、全遺伝子欠失（ｇｌｏｂａｌ ｇｅｎｅ ｄｅｌｅｔｉｏｎ）を行った。胚体全身マウスＥｐｈＢ４ホモ接合欠失は、Ｅ８．５で形態的欠陥を示し、Ｅ９．５～Ｅ１０．５で胚性致死を示した（図１０）。これは、以前に報告（Ｇｅｒｅｔｙら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ、４巻（３号）：頁４０３－４１４、１９９９年）された古典的なＥｐｈＢ４ノックアウトによるＥ９．５～１０．５における胚性致死と一致する。一方、ヘテロ接合型の胚には明らかな欠陥はなかった。成人期のＥｐｈＢ４の役割を調べるために、１２週齢のマウスにおいて、ＥｐｈＢ４ｆ／ｆマウスとタモキシフェン誘導性ＣＭＶ－Ｃｒｅマウスを交配することで、マウス全身のコンディショナル欠失を行った。１５匹のマウスを２０か月間モニターした。明白な表現型は見られなかった。剖検時に採取した心臓、肺、肝臓、腎臓、大腸、脳を含む多臓器の分析において、組織学的検査で異常は見られなかった（データ未記載）。これらのデータをまとめると、ＥｐｈＢ４は胚発生では極めて重要な必要性を有するが、成体では必要とされないことが示唆された。
本実施例では、Ｐｔｅｎヌルマウス前立腺がんにおける前立腺がんの発生および進行にＥｐｈＢ４が必要であるかどうかを調べるための研究を行った。Ｐｔｅｎ欠失と同様の、前立腺上皮における、ＥｐｈＢ４コンディショナルノックアウト（ＥｐｈＢ４ ＣＫＯ）マウスのための、ＥｐｈＢ４のｌｏｘＰ導入対立遺伝子を作製した（図２Ａ）。遺伝子型同定によって、野生型ＥｐｈＢ４（ＥｐｈＢ４野生型／野生型：１８９ｂｐ）、ヘテロ接合型ｌｏｘＰ導入ＥｐｈＢ４（ＥｐｈＢ４ｆｌｏｘ／野生型：１８９ｂｐおよび２８２ｂｐ）、およびホモ接合型ｌｏｘＰ導入ＥｐｈＢ４（ＥｐｈＢ４ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ：２８２ｂｐ）が確認された（図２Ｂ）。コンディショナルなＥｐｈＢ４欠失の表現型を確認するために、ＥｐｈＢ４ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ（ＥｐｈＢ４ｆ／ｆ）マウスをＣＭＶ－Ｃｒｅマウスと交配させて、全遺伝子欠失（ｇｌｏｂａｌ ｇｅｎｅ ｄｅｌｅｔｉｏｎ）を行った。胚体全身マウスＥｐｈＢ４ホモ接合欠失は、Ｅ８．５で形態的欠陥を示し、Ｅ９．５～Ｅ１０．５で胚性致死を示した（図１０）。これは、以前に報告（Ｇｅｒｅｔｙら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ、４巻（３号）：頁４０３－４１４、１９９９年）された古典的なＥｐｈＢ４ノックアウトによるＥ９．５～１０．５における胚性致死と一致する。一方、ヘテロ接合型の胚には明らかな欠陥はなかった。成人期のＥｐｈＢ４の役割を調べるために、１２週齢のマウスにおいて、ＥｐｈＢ４ｆ／ｆマウスとタモキシフェン誘導性ＣＭＶ－Ｃｒｅマウスを交配することで、マウス全身のコンディショナル欠失を行った。１５匹のマウスを２０か月間モニターした。明白な表現型は見られなかった。剖検時に採取した心臓、肺、肝臓、腎臓、大腸、脳を含む多臓器の分析において、組織学的検査で異常は見られなかった（データ未記載）。これらのデータをまとめると、ＥｐｈＢ４は胚発生では極めて重要な必要性を有するが、成体では必要とされないことが示唆された。
【0084】
次に、Ｅｐｈｂ４ｆ／ｆ；ＣＰＰＬ前立腺組織におけるＥｐｈＢの発現を調べた。ＥｐｈＢ４のＲＮＡレベルは、ＥｐｈＢ４ヘテロ接合体で有意に減少し、ホモ接合型ノックアウトＣＰＰＬマウスではさらに大きく減少した（図２Ｆ）。
【0085】
前立腺がんの発生におけるＥｐｈＢ４の役割をＰｔｅｎ欠失と絡めて調べるために、ｌｏｘＰ導入ＥｐｈＢ４マウスをＣＰＰＬマウスと交配した。これらのマウスを７か月間モニターした。Ｅｐｈｂ４を欠失させた場合、２９匹中１６匹のマウスにおいてＰＣの発生が阻止され、残りの１３匹のマウスで確認された腫瘍の発生も最小限であった（図３Ａ、１１）。Ｅｐｈｂ４ノックアウトマウスは、ルシフェラーゼシグナルの定量的測定による評価において、これら２９匹のマウスにおけるルシフェラーゼレベルが著しく低く、それと比較して１４匹の対照マウスではシグナル強度に顕著な増加がみられた（Ｐｔｅｎ－／－；Ｅｐｈｂ４－／－対Ｐｔｅｎ－／－；Ｅｐｈｂ４＋／＋）（図３Ｂ）ことから示されるように、腫瘍の進行がないか、非常に遅かった。これらの観察結果は、前立腺組織分析の結果と一致していた。ＥｐｈＢ４野生型Ｐｔｅｎヌルマウス（Ｅｐｈｂ４＋／＋；ＣＰＰＬ）およびＥｐｈｂ４ヘテロ接合Ｐｔｅｎヌル動物（Ｅｐｈｂ４ｆ／＋；ＣＰＰＬ）では、前立腺は両側に大きな腫瘍を形成した。対照的に、Ｅｐｈｂ４とＰｔｅｎをノックアウトした遺伝子型（Ｅｐｈｂ４ｆ／ｆ；ＣＰＰＬ）では、正常な見た目の前立腺が得られた（図３Ｃ）。Ｐｔｅｎヌルマウス（Ｅｐｈｂ４＋／＋；ＣＰＰＬ）の前立腺から採取した腫瘍はＥｐｈＢ４レベルの上昇を示したが、野生型（Ｐｔｅｎ＋／＋；Ｅｐｈｂ４＋／＋）およびＥｐｈｂ４ノックアウトＣＰＰＬマウス（Ｅｐｈｂ４ｆ／ｆ；ＣＰＰＬ）の前立腺では最小限のシグナルしか得られなかった（図３Ｄ）。前立腺の病理学的分析において、Ｅｐｈｂ４欠損マウスでは、ほぼ正常な見た目の腺構造が示されたが、腺構造の細胞充実性にいくらかの増加が見られ、それと比較して、Ｐｔｅｎノックアウトマウスでは密な腫瘍が見られ、正常な構造が失われていた（図３Ｅ）。Ｅｐｈｂ４野生型群と比較して、Ｅｐｈｂ４ヌル群（ＣＰＰＬ；Ｅｐｈｂ４ｆ／ｆ；）では、腺構造においてアポトーシスが増加し、増殖が減少することが明らかになった（図３Ｆ）。Ｅｐｈｂ４ノックアウトＰｔｅｎヌルマウスの組織解析では、ＰＴＥＮ、ＥｐｈＢ４、リン酸化ＡＫＴ（ｐＡＫＴ）、およびリン酸化Ｓ６（ｐＳ６）の顕著な減少が示された（図３Ｇ）。ＰＴＥＮは正常な前立腺組織では発現されていたが、ＣＰＰＬマウスには存在していなかった。さらに、Ｅｐｈｂ４ヌル群では、Ｅｐｈｂ４野生型群と比較して、腺構造における増殖が少ないことが、Ｋｉ６７の免疫組織化学により示された（図３Ｆ）。
【0086】
実施例４
本実施例では、デコイ可溶性ＥｐｈＢ４受容体を用いてＥｐｈＢ４－エフリンＢ２双方向性シグナル伝達を遮断する研究を行った。可溶性ＥｐｈＢ４（ｓＥｐｈＢ４）は、ＥｐｈＢ４の完全長細胞外ドメインである。ｓＥｐｈＢ４は単量体タンパク質であり、同族リガンドであるエフリンＢ２と高い親和性で結合し、さらには、エフリンＢ２－ＥｐｈＢ４複合体を解離させる。この結合の結果、ｓＥｐｈＢ４は、内在性エフリンＢ２の内在性ＥｐｈＢ４、および他のＥｐｈＢ受容体への相互作用を遮断し、双方向性シグナル伝達を阻害する。ｓＥｐｈＢ４は、多くのＰＣ異種移植モデルで活性を有するが、遺伝的マウスモデルにおけるｓＥｐｈＢ４の活性は検証されていない。ＥｐｈＢ４の完全長細胞外ドメインと完全長マウスアルブミンとからなるマウスタンパク質を、Ｃ末端にインフレームに組み込み、１２９ｋＤの融合タンパク質（ｓＥｐｈＢ４－Ａｌｂ）を作製した。この融合タンパク質はマウスにおいて２４時間を超える半減期を示す。ｓＥｐｈＢ４－ＡｌｂのＣＰＰＬマウスにおける腫瘍発生の抑制活性を調べた。ｓＥｐｈＢ４－Ａｌｂ治療を８週齢に開始し、その後、発がんイニシエーションを青年期（１２週目以降）に開始して７か月齢目まで継続した。治療は週に３回、腹腔内（ＩＰ）投与で行った。定量的ＢＬＩで測定したところ、１５匹の治療マウス全てにおいて、腫瘍発生が顕著に抑制されていた。平均して、治療群のＢＬＩは、３か月間の治療後に、対照群と比べて７０，０００倍近く低くなった（Ｐ＜０．０５）（図４Ａおよび図４Ｂ、１２）。
本実施例では、デコイ可溶性ＥｐｈＢ４受容体を用いてＥｐｈＢ４－エフリンＢ２双方向性シグナル伝達を遮断する研究を行った。可溶性ＥｐｈＢ４（ｓＥｐｈＢ４）は、ＥｐｈＢ４の完全長細胞外ドメインである。ｓＥｐｈＢ４は単量体タンパク質であり、同族リガンドであるエフリンＢ２と高い親和性で結合し、さらには、エフリンＢ２－ＥｐｈＢ４複合体を解離させる。この結合の結果、ｓＥｐｈＢ４は、内在性エフリンＢ２の内在性ＥｐｈＢ４、および他のＥｐｈＢ受容体への相互作用を遮断し、双方向性シグナル伝達を阻害する。ｓＥｐｈＢ４は、多くのＰＣ異種移植モデルで活性を有するが、遺伝的マウスモデルにおけるｓＥｐｈＢ４の活性は検証されていない。ＥｐｈＢ４の完全長細胞外ドメインと完全長マウスアルブミンとからなるマウスタンパク質を、Ｃ末端にインフレームに組み込み、１２９ｋＤの融合タンパク質（ｓＥｐｈＢ４－Ａｌｂ）を作製した。この融合タンパク質はマウスにおいて２４時間を超える半減期を示す。ｓＥｐｈＢ４－ＡｌｂのＣＰＰＬマウスにおける腫瘍発生の抑制活性を調べた。ｓＥｐｈＢ４－Ａｌｂ治療を８週齢に開始し、その後、発がんイニシエーションを青年期（１２週目以降）に開始して７か月齢目まで継続した。治療は週に３回、腹腔内（ＩＰ）投与で行った。定量的ＢＬＩで測定したところ、１５匹の治療マウス全てにおいて、腫瘍発生が顕著に抑制されていた。平均して、治療群のＢＬＩは、３か月間の治療後に、対照群と比べて７０，０００倍近く低くなった（Ｐ＜０．０５）（図４Ａおよび図４Ｂ、１２）。
【0087】
ＰｔｅｎヌルモデルにおけるｓＥｐｈＢ４－Ａｌｂの有効性が実証されたので、ｓＥｐｈＢ４－Ａｌｂが樹立腫瘍の退縮を誘導できるかどうか、あるいはさらなる進行を遅らせることができるかどうかを調べる有効性試験を実施した。前立腺腫瘍の樹立がルシフェラーゼイメージングで実証された１６匹のマウスを、ｓＥｐｈＢ４－Ａｌｂ（ｎ＝８）またはＰＢＳ対照（ｎ＝８）のいずれかで治療した。マウスは３か月間治療し、４週間毎にＢＬＩを行った。薬剤治療群の８匹のマウス全てで腫瘍退縮が認められ、５匹では完全な退縮が、残りの３匹ではほぼ完全な退縮が認められた（図４Ｃおよび図４Ｄ、１３）。治療の結果、平均ＢＬＩシグナルは１．６８Ｅ＋０８から５．１３Ｅ＋０２まで下がった（治療コホートで３００，０００倍超）。試験終了後に前立腺を採取し、ＰＩ３Ｋ下流のシグナル伝達経路成分の分析を行った。ＥｐｈＢ４野生型群と比較して、ＥｐｈＢ４ヌル群では、腺構造におけるアポトーシス増加が認められた（図４Ｅ）。対照群と比較して、ｐＡＫＴとｐＳ６の両方が治療群で著しく低下していた（図４Ｆ）。
【0088】
実施例５
ＰＣにおける最大のアンメットニーズとして、アンドロゲン遮断に対し難治性の進行性腫瘍に対する治療がある。比較集団におけるｓＥｐｈＢ４－Ａｌｂの有効性を評価するために、１２週齢時に腫瘍を樹立した後に去勢することで、Ｐｔｅｎヌルマウスでアンドロゲン非依存性腫瘍を作製した。マウスは４週間毎に、去勢による腫瘍退縮とその後の再発についてモニターした。最初、生物発光シグナルは去勢後の最初の４～６週間で減少し、最終的には１０～１２週間かけてアンドロゲン非依存性腫瘍が再発した。その後、マウス（３匹／群）をＰＢＳまたはｓＥｐｈＢ４－Ａｌｂで処置した。全てのｓＥｐｈＢ４処置マウスでＢＬＩシグナルが減少したのに対し、対照群ではシグナルが増加し続け、薬物療法群と比較して対照群では平均１万倍（または１０４倍）超の倍数変化が見られた（６か月間の治療後、ｓＥｐｈＢ４－Ａｌｂ群では平均８．９６Ｅ＋０２、それに対し、対照群では平均９．１１Ｅ＋０７）（図５Ａおよび図５Ｂ）。まとめると、ｓＥｐｈＢ４－Ａｌｂがアンドロゲン非依存性腫瘍に有効であることが示唆される。本発明者にとって、去勢前の群における樹立腫瘍での有効性はやや驚くべきことであったが、去勢群における有効性はさらに驚くべきことであった。ｓＥｐｈＢ４－ＡｌｂはＰＩ３Ｋ経路を阻害するが、本発明者はＡＲ経路を介した腫瘍エスケープを予想していただろう。このデータに基づいて、ホルモン非依存性バリアントを含むインビトロＰＣ細胞株におけるＥｐｈＢ４ノックダウンを研究することで、作用機序を探ることとした。
ＰＣにおける最大のアンメットニーズとして、アンドロゲン遮断に対し難治性の進行性腫瘍に対する治療がある。比較集団におけるｓＥｐｈＢ４－Ａｌｂの有効性を評価するために、１２週齢時に腫瘍を樹立した後に去勢することで、Ｐｔｅｎヌルマウスでアンドロゲン非依存性腫瘍を作製した。マウスは４週間毎に、去勢による腫瘍退縮とその後の再発についてモニターした。最初、生物発光シグナルは去勢後の最初の４～６週間で減少し、最終的には１０～１２週間かけてアンドロゲン非依存性腫瘍が再発した。その後、マウス（３匹／群）をＰＢＳまたはｓＥｐｈＢ４－Ａｌｂで処置した。全てのｓＥｐｈＢ４処置マウスでＢＬＩシグナルが減少したのに対し、対照群ではシグナルが増加し続け、薬物療法群と比較して対照群では平均１万倍（または１０４倍）超の倍数変化が見られた（６か月間の治療後、ｓＥｐｈＢ４－Ａｌｂ群では平均８．９６Ｅ＋０２、それに対し、対照群では平均９．１１Ｅ＋０７）（図５Ａおよび図５Ｂ）。まとめると、ｓＥｐｈＢ４－Ａｌｂがアンドロゲン非依存性腫瘍に有効であることが示唆される。本発明者にとって、去勢前の群における樹立腫瘍での有効性はやや驚くべきことであったが、去勢群における有効性はさらに驚くべきことであった。ｓＥｐｈＢ４－ＡｌｂはＰＩ３Ｋ経路を阻害するが、本発明者はＡＲ経路を介した腫瘍エスケープを予想していただろう。このデータに基づいて、ホルモン非依存性バリアントを含むインビトロＰＣ細胞株におけるＥｐｈＢ４ノックダウンを研究することで、作用機序を探ることとした。
【0089】
実施例６
上皮増殖因子（ＥＧＦ）－ＥＧＦＲを含む増殖因子受容体を介してＰＩ３Ｋ－ＡＫＴ経路が活性化されると、ＥｐｈＢ４の発現がアップレギュレートされる（Ｋｕｍａｒら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、６９巻（９号）：頁３７３６－３７４５、２００６年）。さらに、クラスター化したエフリンＢ２－ＦｃによりＥｐｈＢ４受容体が活性化されると、リン酸化ＡＫＴレベルが増加し、正のフィードバックループが示された。以下、これをＰｔｅｎノックアウト前立腺がんの遺伝的マウスモデルで検証する。このモデルの前立腺腫瘍はＥｐｈＢ４の誘導を示すが、ＥｐｈＢ４をノックアウトすると、ＰＩ３Ｋ経路の活性化マーカーの減少に伴って、ＰＣのリスクが顕著に減少する。本発明者は、ＥｐｈＢ４のノックアウトが、ＰＣ３や去勢抵抗性前立腺がん細胞株（Ｃ４－２Ｂおよび２２Ｒｖ１）などの前立腺がん細胞株において、ＰＩ３Ｋのレベルを低下させるかどうかを決定することを望んだ。ＥｐｈＢ４ ｓｉＲＮＡによりＥｐｈＢ４発現をサイレンシングしたところ（Ｘｉａら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２５巻（５号）：頁７６９－７８０、２００６年）、ＥｐｈＢ４と、ＰＩ３Ｋ下流マーカーであるリン酸化ＡＫＴ（ｐＡＫＴ、Ｔｈｒ３０８）およびリン酸化リボソームタンパク質Ｓ６（ｐＳ６、Ｓｅｒ２３５／Ｓｅｒ２３６；図６Ａ）が低下した。注目すべきことに、ＥｐｈＢ４ ｓｉＲＮＡは、ＰＣ３細胞株とＣ４－２Ｂ細胞株の両方で、ＰＩ３Ｋ ｐ１１０サブユニットβを特異的にダウンレギュレートしたが、ｐ１１０α、γ、およびδはダウンレギュレートしなかった。ＰＩ３Ｋ ｐ１１０βおよびδの各アイソフォームは、いくつかのインビトロモデルでＰＣの発生と転移を促進し、臨床の前立腺がん標本でのその発現は手術後の再発と関連している。また、ホスファチジルイノシトール（３，４）二リン酸（ＰＩＰ２）をホスファチジルイノシトール（３，４，５）三リン酸（ＰＩＰ３）に変換するＰＩ３Ｋの生物学的機能も、ＥｐｈＢ４のノックダウンによって低減し（図６Ｂ）、ＥｐｈＢ４がＰＩ３Ｋ活性において重要な役割を果たしていることが示された。しかし、ＥｐｈＢ４のノックダウンは、ＭＡＰＫおよびｐ３８の全体または活性化形態には影響がなかった（図６Ａ）。すなわち、ＥｐｈＢ４の機能はＰＩ３Ｋ経路に特異的である。ＥｐｈＢ４のノックダウンは、インビトロでＰＣ細胞の成長を阻害することが示された（Ｋｅｒｔｅｓｚら、２００６年）。ＰＩ３Ｋ活性阻害におけるＥｐｈＢ４ ｓｉＲＮＡの特異性を調べるために、野生型ＡＫＴおよび体質的（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌｌｙ）活性ＡＫＴ（Δ－ＡＫＴ）の異所性発現による細胞生存レスキューアッセイ（Ｋｏｈｎら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２７１巻（３６号）：頁２１９２０－２１９２６、１９９６年）を行った（図６Ｃ、図６Ｄ）。野生型ＡＫＴとΔ－ＡＫＴの両方が、ＥｐｈＢ４ ｓｉＲＮＡによるＰＩ３Ｋ阻害をレスキューした（図６Ｅ）。これらのデータから、ＥｐｈＢ４が、ＡＫＴレベルから上で、ＰＩ３Ｋ経路を制御していることがさらに確認された。
上皮増殖因子（ＥＧＦ）－ＥＧＦＲを含む増殖因子受容体を介してＰＩ３Ｋ－ＡＫＴ経路が活性化されると、ＥｐｈＢ４の発現がアップレギュレートされる（Ｋｕｍａｒら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、６９巻（９号）：頁３７３６－３７４５、２００６年）。さらに、クラスター化したエフリンＢ２－ＦｃによりＥｐｈＢ４受容体が活性化されると、リン酸化ＡＫＴレベルが増加し、正のフィードバックループが示された。以下、これをＰｔｅｎノックアウト前立腺がんの遺伝的マウスモデルで検証する。このモデルの前立腺腫瘍はＥｐｈＢ４の誘導を示すが、ＥｐｈＢ４をノックアウトすると、ＰＩ３Ｋ経路の活性化マーカーの減少に伴って、ＰＣのリスクが顕著に減少する。本発明者は、ＥｐｈＢ４のノックアウトが、ＰＣ３や去勢抵抗性前立腺がん細胞株（Ｃ４－２Ｂおよび２２Ｒｖ１）などの前立腺がん細胞株において、ＰＩ３Ｋのレベルを低下させるかどうかを決定することを望んだ。ＥｐｈＢ４ ｓｉＲＮＡによりＥｐｈＢ４発現をサイレンシングしたところ（Ｘｉａら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２５巻（５号）：頁７６９－７８０、２００６年）、ＥｐｈＢ４と、ＰＩ３Ｋ下流マーカーであるリン酸化ＡＫＴ（ｐＡＫＴ、Ｔｈｒ３０８）およびリン酸化リボソームタンパク質Ｓ６（ｐＳ６、Ｓｅｒ２３５／Ｓｅｒ２３６；図６Ａ）が低下した。注目すべきことに、ＥｐｈＢ４ ｓｉＲＮＡは、ＰＣ３細胞株とＣ４－２Ｂ細胞株の両方で、ＰＩ３Ｋ ｐ１１０サブユニットβを特異的にダウンレギュレートしたが、ｐ１１０α、γ、およびδはダウンレギュレートしなかった。ＰＩ３Ｋ ｐ１１０βおよびδの各アイソフォームは、いくつかのインビトロモデルでＰＣの発生と転移を促進し、臨床の前立腺がん標本でのその発現は手術後の再発と関連している。また、ホスファチジルイノシトール（３，４）二リン酸（ＰＩＰ２）をホスファチジルイノシトール（３，４，５）三リン酸（ＰＩＰ３）に変換するＰＩ３Ｋの生物学的機能も、ＥｐｈＢ４のノックダウンによって低減し（図６Ｂ）、ＥｐｈＢ４がＰＩ３Ｋ活性において重要な役割を果たしていることが示された。しかし、ＥｐｈＢ４のノックダウンは、ＭＡＰＫおよびｐ３８の全体または活性化形態には影響がなかった（図６Ａ）。すなわち、ＥｐｈＢ４の機能はＰＩ３Ｋ経路に特異的である。ＥｐｈＢ４のノックダウンは、インビトロでＰＣ細胞の成長を阻害することが示された（Ｋｅｒｔｅｓｚら、２００６年）。ＰＩ３Ｋ活性阻害におけるＥｐｈＢ４ ｓｉＲＮＡの特異性を調べるために、野生型ＡＫＴおよび体質的（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌｌｙ）活性ＡＫＴ（Δ－ＡＫＴ）の異所性発現による細胞生存レスキューアッセイ（Ｋｏｈｎら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２７１巻（３６号）：頁２１９２０－２１９２６、１９９６年）を行った（図６Ｃ、図６Ｄ）。野生型ＡＫＴとΔ－ＡＫＴの両方が、ＥｐｈＢ４ ｓｉＲＮＡによるＰＩ３Ｋ阻害をレスキューした（図６Ｅ）。これらのデータから、ＥｐｈＢ４が、ＡＫＴレベルから上で、ＰＩ３Ｋ経路を制御していることがさらに確認された。
【0090】
ＥｐｈＢ４がＰＩ３Ｋレベルで経路を制御しているかどうかを調べるために、ＰＩ３Ｋ触媒ｐ１１０アイソフォームの発現レベル。ＥｐｈＢ４ ｓｉＲＮＡは、ＰＣ３細胞株とＣ４－２Ｂ細胞株の両方で、ＰＩ３Ｋ ｐ１１０サブユニットβを特異的にダウンレギュレートしたが、ｐ１１０α、γ、およびδはダウンレギュレートしなかった を調べた。ＰＩ３Ｋ ｐ１１０βおよびδアイソフォームは、ＰＣの発生および転移を促進し、前立腺腫瘍における発現の場合、手術後の生化学的再発と関連している（Ｈｉｌｌら、Ｐｒｏｓｔａｔｅ、７０巻（７号）、頁７５５－７６４、２０１０年）。まとめると、これらのデータは、ＥｐｈＢ４が、検討した細胞株において、ＰＩ３Ｋ ｐ１１０βレベルでＰＩ３Ｋ経路を制御することを示している。
【0091】
実施例７
ＥｐｈＢ４のノックダウンは、インビトロのＰＣ細胞株においてＰＩ３Ｋアイソフォームｐ１１０βのレベルを減少させる。次に、ＥｐｈＢ４が他のＰＩ３Ｋ触媒アイソフォームを制御するかどうかを調べた。２２ＲＶ１およびＣ４－２ＢはＰＩ３Ｋ ｐ１１０αおよびβを発現するが、他のアイソフォームは低レベルであるため、ｐ１１０γおよびｐ１１０δを高レベルで発現する、造血系の白血病細胞株およびリンパ腫細胞株である、Ｋ５６２（赤白血病細胞株）およびＲａｊｉ（バーキットリンパ腫細胞株）を陽性対照として用いた（図７Ａ）。次に、下流シグナルであるリン酸化Ｓ６の阻害について、各ＰＩ３Ｋアイソフォームの特異的阻害剤を試験した。ＰＩ３Ｋ ｐ１１０αアイソフォームの阻害剤（ＢＹＬ７１９）およびβアイソフォームの阻害剤（ＧＳＫ２６３６７７１）は、ｐＳ６レベルを有意に減少させたが、Ｓ６の総量は減少させなかった。ｐ１１０γの阻害剤（ＩＰＩ－５４９）またはｐ１１０δの阻害剤（ＧＳＫ２２６９５５７）では、ｐＳ６レベルに変化は見られなかった（図７Ｂ）。
ＥｐｈＢ４のノックダウンは、インビトロのＰＣ細胞株においてＰＩ３Ｋアイソフォームｐ１１０βのレベルを減少させる。次に、ＥｐｈＢ４が他のＰＩ３Ｋ触媒アイソフォームを制御するかどうかを調べた。２２ＲＶ１およびＣ４－２ＢはＰＩ３Ｋ ｐ１１０αおよびβを発現するが、他のアイソフォームは低レベルであるため、ｐ１１０γおよびｐ１１０δを高レベルで発現する、造血系の白血病細胞株およびリンパ腫細胞株である、Ｋ５６２（赤白血病細胞株）およびＲａｊｉ（バーキットリンパ腫細胞株）を陽性対照として用いた（図７Ａ）。次に、下流シグナルであるリン酸化Ｓ６の阻害について、各ＰＩ３Ｋアイソフォームの特異的阻害剤を試験した。ＰＩ３Ｋ ｐ１１０αアイソフォームの阻害剤（ＢＹＬ７１９）およびβアイソフォームの阻害剤（ＧＳＫ２６３６７７１）は、ｐＳ６レベルを有意に減少させたが、Ｓ６の総量は減少させなかった。ｐ１１０γの阻害剤（ＩＰＩ－５４９）またはｐ１１０δの阻害剤（ＧＳＫ２２６９５５７）では、ｐＳ６レベルに変化は見られなかった（図７Ｂ）。
【0092】
ｐ１１０βがアンドロゲン受容体（ＡＲ）およびＡＲ下流シグナル伝達を誘導することと、ｐ１１０βの特異的阻害がＡＲレベルを減少させることが以前に示されている（Ｈｉｌｌら、Ｐｒｏｓｔａｔｅ、７０巻（７号）、頁７５５－７６４、２０１０年）。本発明者は、ｐ１１０βの阻害がＥｐｈＢ４レベルおよびＡＲレベルを減少させるが、一方で、ｐ１１０α／γ／δの阻害剤はいずれのタンパク質にも影響を及ぼさないことを確認した（図７Ｂ）。従って、ＰＣにおけるｐ１１０βを介したＰＩ３ＫシグナルによるＥｐｈＢ４の誘導が、発がんイニシエーションと進行に繋がる可能性がある。ＥｐｈＢ４を標的とすることで、ｐ１１０βが阻害されて細胞生存率が低下するが、ＡＲ誘導を介したエスケープの可能性がある。
【0093】
実施例８
ＥｐｈＢ４の減少がＡＲレベルを低下させるかどうかを調べるために、ＥｐｈＢ４をノックダウンしてＡＲタンパク質レベルを確認する実験を行った。ｓｉＲＮＡによりＥｐｈＢ４をノックダウンしたところ、去勢抵抗性ＰＣ細胞株においてＡＲレベルが著しく低下し（図８Ａ）、このことから、ＡＲ発現におけるＥｐｈＢ４の役割が支持された。さらに、ＣＰＰＬマウスにおいてＥｐｈＢ４－エフリンＢ２競合的阻害剤ｓＥｐｈＢ４－Ａｌｂを用いるインビボ試験を行った。定量的ＰＣＲによる、アンドロゲン受容体のｍＲＮＡレベルは、薬剤処置マウスでは対照マウスと比較して８０％減少し（図８Ｂ）、ＥｐｈＢ４ノックダウン細胞株では８４％減少した（図８Ｃ、１４）。ＰＩ３ＫアイソフォームがＡＲのタンパク質レベルおよびｍＲＮＡレベルに対して異なる機能を有するという上記の知見に基づいて、本発明者は、ＥｐｈＢ４がＰＩ３Ｋ経路を介してＡＲを制御するかどうかを調べることを目指した。ＥｐｈＢ４ノックダウンと絡めて、ＡＫＴと各ＰＩ３Ｋアイソフォームによるレスキュー実験を行った。興味深いことに、ＡＫＴおよびＰＩ３Ｋ ｐ１１０βサブユニットの異所性発現によりＡＲ発現がレスキューされたが、αおよびγの場合ではレスキューされなかった（図８Ｄ）ことから、ＥｐｈＢ４がＰＩ３Ｋ経路、特にｐ１１０βを介してＡＲを制御することが示された。
ＥｐｈＢ４の減少がＡＲレベルを低下させるかどうかを調べるために、ＥｐｈＢ４をノックダウンしてＡＲタンパク質レベルを確認する実験を行った。ｓｉＲＮＡによりＥｐｈＢ４をノックダウンしたところ、去勢抵抗性ＰＣ細胞株においてＡＲレベルが著しく低下し（図８Ａ）、このことから、ＡＲ発現におけるＥｐｈＢ４の役割が支持された。さらに、ＣＰＰＬマウスにおいてＥｐｈＢ４－エフリンＢ２競合的阻害剤ｓＥｐｈＢ４－Ａｌｂを用いるインビボ試験を行った。定量的ＰＣＲによる、アンドロゲン受容体のｍＲＮＡレベルは、薬剤処置マウスでは対照マウスと比較して８０％減少し（図８Ｂ）、ＥｐｈＢ４ノックダウン細胞株では８４％減少した（図８Ｃ、１４）。ＰＩ３ＫアイソフォームがＡＲのタンパク質レベルおよびｍＲＮＡレベルに対して異なる機能を有するという上記の知見に基づいて、本発明者は、ＥｐｈＢ４がＰＩ３Ｋ経路を介してＡＲを制御するかどうかを調べることを目指した。ＥｐｈＢ４ノックダウンと絡めて、ＡＫＴと各ＰＩ３Ｋアイソフォームによるレスキュー実験を行った。興味深いことに、ＡＫＴおよびＰＩ３Ｋ ｐ１１０βサブユニットの異所性発現によりＡＲ発現がレスキューされたが、αおよびγの場合ではレスキューされなかった（図８Ｄ）ことから、ＥｐｈＢ４がＰＩ３Ｋ経路、特にｐ１１０βを介してＡＲを制御することが示された。
【0094】
実施例９
ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡは、ヒトの第Ｉ相試験で試験されており、長期間の治療でも許容できる安全性が確認されている（Ｅｌ－Ｋｈｏｕｅｉｒｙら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ、６９巻、Ｓ１１、２０１６年；Ｈａｓｉｎａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、７３巻（１号）：頁１８４－１９４、２０１３年；Ｔｈｏｍａｓら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、３６巻（４号）：頁２８５－２８５、２０１８年）。前立腺がんで臨床試験を実施する準備をしている間、本発明者は、去勢抵抗性前立腺がん（ＣＲＰＣ）を有する対象にコンパッショネート治療（ｃｏｍｐａｓｓｉｏｎａｔｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）を施す機会を得た。広範囲の骨、骨髄、内臓転移を伴うＣＲＰＣの６８歳男性は、以前に、ＡＤＴ、ＡＲ経路阻害（エンザルタミドおよびアビラテロン）、放射線、化学療法（ドセタキセル、カバジタキセル、およびカルボプラチン）、シプロイセルＴおよびラジウム２２３を含む、９種の治療計画で失敗していた。腫瘍を分析したところ、ＥｐｈＢ４とエフリンＢ２の発現が高いことが判明した（図９）。コンパッショネート使用に基づいた単一患者ＩＮＤ承認を得た。ＩＲＢ承認およびＦＡ承認の後、患者を１０ｍｇ／ｋｇの用量のｓＥｐｈＢ４－Ａｌｂで、３週間に亘って毎週、点滴静注で治療した。活性の代わりとなるＰＳＡは、治療開始時に１４１６であり、最初の３週間で２４３９まで増加し続けたが、その後１２００まで着実に減少し、その後６週間は低い値を維持したことから、ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡの生物学的活性が示された。
ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡは、ヒトの第Ｉ相試験で試験されており、長期間の治療でも許容できる安全性が確認されている（Ｅｌ－Ｋｈｏｕｅｉｒｙら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ、６９巻、Ｓ１１、２０１６年；Ｈａｓｉｎａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、７３巻（１号）：頁１８４－１９４、２０１３年；Ｔｈｏｍａｓら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、３６巻（４号）：頁２８５－２８５、２０１８年）。前立腺がんで臨床試験を実施する準備をしている間、本発明者は、去勢抵抗性前立腺がん（ＣＲＰＣ）を有する対象にコンパッショネート治療（ｃｏｍｐａｓｓｉｏｎａｔｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）を施す機会を得た。広範囲の骨、骨髄、内臓転移を伴うＣＲＰＣの６８歳男性は、以前に、ＡＤＴ、ＡＲ経路阻害（エンザルタミドおよびアビラテロン）、放射線、化学療法（ドセタキセル、カバジタキセル、およびカルボプラチン）、シプロイセルＴおよびラジウム２２３を含む、９種の治療計画で失敗していた。腫瘍を分析したところ、ＥｐｈＢ４とエフリンＢ２の発現が高いことが判明した（図９）。コンパッショネート使用に基づいた単一患者ＩＮＤ承認を得た。ＩＲＢ承認およびＦＡ承認の後、患者を１０ｍｇ／ｋｇの用量のｓＥｐｈＢ４－Ａｌｂで、３週間に亘って毎週、点滴静注で治療した。活性の代わりとなるＰＳＡは、治療開始時に１４１６であり、最初の３週間で２４３９まで増加し続けたが、その後１２００まで着実に減少し、その後６週間は低い値を維持したことから、ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡの生物学的活性が示された。
【0095】
本明細書に記載されたデータと観察結果によれば、ＥｐｈＢ４とエフリンＢ２はＰＣで高発現しており、本明細書に記載された実験は、ＰＩ３ＫおよびＡＲのシグナル伝達の制御を通じた、ＥｐｈＢ４－エフリンＢ２のペアによる重要な役割を示唆していると思われる。ＰＣにおけるＡＲおよびＰＩ３Ｋの中心的な役割を考慮に入れると、ｓＥｐｈＢ４はＰＣ、特にＰＴＥＮ欠失ＰＣおよび／またはＡＰ標的治療に対し難治性のＰＣを標的とする新規のアプローチを提供する。
【0096】
現在、ヒト型のｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡが臨床まで進んでおり、単剤および他の薬剤との併用で長期間投与することが可能であり、毒性は許容できるものである。本発明者は、ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡがこの高度なアンメットメディカルニーズにおいて潜在的利益を提供し得るという信念のもと、進行疾患であるＰＣを対象とした臨床試験を間もなく開始する予定である。
【0097】
方法および材料
ＰＴＥＮヌル前立腺がんマウスモデル
前立腺特異的ＰＴＥＮノックアウト（Ｃｒｅ－ＰＴＥＮ－／－－Ｌｕｃ、ＣＰＰＬ）マウスモデルは、Ｐｒａｄｉｐ Ｒｏｙ－Ｂｕｒｍａｎ博士の好意により提供された、以前の報告のものである（Ｃ．Ｐ．Ｌｉａｏら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、６７巻（１５号）：頁７５２５－７５３３、２００７年）。Ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｐｒｏｓｔａｔｅ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｃａｐａｃｉｔｙ ｔｏ ｍｏｎｉｔｏｒ ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ｂｙ ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｏｒ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ．、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、６７巻：頁７５２５－３３、２００７年）。Ｃｒｅ－ＰＴＥＮ－／Ｌｕｃマウスを無作為に２群（ｎ＝４）に分け、２０ｍｇ／ｋｇの可溶性ＥｐｈＢ４－アルブミンまたはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を週２回腹腔内投与し、処置前および処置後４週間毎に、生物発光（ｂｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）イメージング（ゼノジェン社（Ｘｅｎｏｇｅｎ））で前立腺腫瘍をモニターした。
ＰＴＥＮヌル前立腺がんマウスモデル
前立腺特異的ＰＴＥＮノックアウト（Ｃｒｅ－ＰＴＥＮ－／－－Ｌｕｃ、ＣＰＰＬ）マウスモデルは、Ｐｒａｄｉｐ Ｒｏｙ－Ｂｕｒｍａｎ博士の好意により提供された、以前の報告のものである（Ｃ．Ｐ．Ｌｉａｏら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、６７巻（１５号）：頁７５２５－７５３３、２００７年）。Ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｐｒｏｓｔａｔｅ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｃａｐａｃｉｔｙ ｔｏ ｍｏｎｉｔｏｒ ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ｂｙ ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｏｒ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ．、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、６７巻：頁７５２５－３３、２００７年）。Ｃｒｅ－ＰＴＥＮ－／Ｌｕｃマウスを無作為に２群（ｎ＝４）に分け、２０ｍｇ／ｋｇの可溶性ＥｐｈＢ４－アルブミンまたはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を週２回腹腔内投与し、処置前および処置後４週間毎に、生物発光（ｂｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）イメージング（ゼノジェン社（Ｘｅｎｏｇｅｎ））で前立腺腫瘍をモニターした。
【0098】
生物発光（ｂｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）イメージング（ＢＬＩ）
マウスにケタミン（５０ｍｇ／ｋｇ）とキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）を単回腹腔内注射し、その後ルシフェリン（５０ｍｇ／ｋｇ）を静脈内注射した。ルシフェリンを適切に分布させるため４．５分待った後、マウスをＩＶＩＳ２００光学イメージングシステム（ゼノジェン社）のチャンバー内に入れた。光を１分間集め、ＬＩＶＩＮＧ ＩＭＡＧＥソフトウェアバージョン２．５０（ゼノジェン社）を用いて画像を解析した。光子計数率／単位体面積／検出器に対する単位立体角（単位は光子数／ｓ／ｃｍ２／ステラジアン）として、特定の関心領域についてシグナル強度を定量化した。
マウスにケタミン（５０ｍｇ／ｋｇ）とキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）を単回腹腔内注射し、その後ルシフェリン（５０ｍｇ／ｋｇ）を静脈内注射した。ルシフェリンを適切に分布させるため４．５分待った後、マウスをＩＶＩＳ２００光学イメージングシステム（ゼノジェン社）のチャンバー内に入れた。光を１分間集め、ＬＩＶＩＮＧ ＩＭＡＧＥソフトウェアバージョン２．５０（ゼノジェン社）を用いて画像を解析した。光子計数率／単位体面積／検出器に対する単位立体角（単位は光子数／ｓ／ｃｍ２／ステラジアン）として、特定の関心領域についてシグナル強度を定量化した。
【0099】
ＥｐｈＢ４コンディショナルノックアウトマウスの作製および遺伝子型同定
ＥｐｈＢ４の既知の遺伝子構造に基づいて、ＥＳ細胞においてエクソン２～３およびイントロン１～４の一部をｐＥＺ ＦＲＴ Ｌｏｘカセット（Ｒｏｂｅｒｔ Ｍａｘｓｏｎ博士の研究室から譲渡）で置換する遺伝子ターゲティングベクターを構築した。１つ目のＬｏｘｐはイントロン１～２に挿入し、２つ目のＬｏｘｐはイントロン３～４に挿入し、欠失は、イントロン１～２の一部（２１８８ｂｐ）、エクソン２（７１ｂｐ）、イントロン２～３（１２０ｂｐ）、エクストロン（ｅｘｔｒｏｎ）３（２８８ｂｐ）、イントロン３～４の一部（５９８ｂｐｓ）を含むＨｉｎｄＩＩＩからＡｃｃＩまでの３３１６７ｂｐである。ｌａｃＺ遺伝子を、エクソン２の開始点でＥｐｈＢ４コード配列とインフレームで融合した。正しく標的化された２種のＥＳ細胞株をＰＣＲおよびサザンブロット解析で同定し、キメラマウスの作製に用いた。ジャームライントランスミッション後、ヘテロ接合体マウスをＦＬＰトランスジェニックマウスと交配し、Ｎｅｏを除去する。次いで、Ｎｅｏなしのヘテロ接合体マウスを野生型Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドマウスと交配し、ＦＬＰを除去する。
ＥｐｈＢ４の既知の遺伝子構造に基づいて、ＥＳ細胞においてエクソン２～３およびイントロン１～４の一部をｐＥＺ ＦＲＴ Ｌｏｘカセット（Ｒｏｂｅｒｔ Ｍａｘｓｏｎ博士の研究室から譲渡）で置換する遺伝子ターゲティングベクターを構築した。１つ目のＬｏｘｐはイントロン１～２に挿入し、２つ目のＬｏｘｐはイントロン３～４に挿入し、欠失は、イントロン１～２の一部（２１８８ｂｐ）、エクソン２（７１ｂｐ）、イントロン２～３（１２０ｂｐ）、エクストロン（ｅｘｔｒｏｎ）３（２８８ｂｐ）、イントロン３～４の一部（５９８ｂｐｓ）を含むＨｉｎｄＩＩＩからＡｃｃＩまでの３３１６７ｂｐである。ｌａｃＺ遺伝子を、エクソン２の開始点でＥｐｈＢ４コード配列とインフレームで融合した。正しく標的化された２種のＥＳ細胞株をＰＣＲおよびサザンブロット解析で同定し、キメラマウスの作製に用いた。ジャームライントランスミッション後、ヘテロ接合体マウスをＦＬＰトランスジェニックマウスと交配し、Ｎｅｏを除去する。次いで、Ｎｅｏなしのヘテロ接合体マウスを野生型Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドマウスと交配し、ＦＬＰを除去する。
【0100】
ｌｏｘＰ導入ＥｐｈＢ４エクソン２～３についてホモ接合型のＥｐｈＢ４ｆｌｏｘＰ／ｆｌｏｘＰマウスを、ジャクソン研究所（バーハーバー、メイン州）から入手したＣＭＶ－Ｃｒｅ系統、およびＣｒｅ導入遺伝子が改変プロバシンプロモーター（ＡＲＲ２ＰＢ）で制御されているＰＢ－Ｃｒｅ－Ｐｔｅｎ－Ｌｕｃマウスと交配した。Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｃｒｅ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｔｉｓｓｕｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｅｎｅ ａｂｌａｔｉｏｎ．、Ｍｅｃｈ Ｄｅｖ、１０１巻：頁６１－６９］。Ｃｒｅ導入遺伝子を持たない同腹仔対照を全ての実験で用いた。全ての手順は、施設内動物管理使用委員会の承認を得て、動物福祉法の規制に従って実施した。
【0101】
マウスを上述の通りにＰＣＲで遺伝子型決定した。マウスの尾部先端を切り離し、０．５μｇ／ｍＬのプロテイナーゼＫ（カタログ番号０３－Ｈ５－８０１－００１、ロシュ・ダイアグノスティックス社（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、インディアナポリス、インディアナ州）を含む溶解緩衝液（カタログ番号１０２－Ｔ、バイアジェン・バイオテック社（ＶＩＡＧＥＮ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ロサンゼルス、カリフォルニア州）中で５５℃で一晩インキュベートした。その後、使用前に、尾部先端試料を８５℃で４５分間インキュベートした。隣接するｌｏｘＰ部位を増幅することにより、野生型対立遺伝子と標的対立遺伝子を区別するために、フォワードプライマー１（５′－ＴＴＣＴＣＧＣＣＴＧＣＧＣＴＡＣＣＴＧＡＡＴＧ－３′）およびリバースプライマー２（５′－ＡＣＣＡＧＧＧＣＴＣＣＡＴＴＴＣＴＡＧＧＴＣＧ－３′）を用いた。Ｃｒｅ導入遺伝子の検出には、フォワードプライマー（５′－ＧＡＴＣＣＴＧＧＣＡＡＴＴＴＣＧＧＣＴＡＴ－３′）およびリバースプライマー（５′－ＴＴＧＣＣＴＧＣＡＴＴＡＣＣＧＧＴＣＧＡＴ－３′）を用いた。ゲノムＤＮＡ断片の増幅は、９５℃で５分、９５℃で４５秒、５８℃で４０秒、７２℃で６０秒を３６サイクル、その後７２℃で５分で行った。エクソン５欠失の検出用に、マウス尾部先端と同様の方法を用いて、各種マウス臓器からゲノムＤＮＡ試料を分離した。エクソン２～３欠失の検出には、フォワードプライマー（５′－ＴＡＧＧＣＴＧＧＧＣＡＧＴＧＣＴＧＴＴＣＴＧＧ－３′）、およびリバースプライマー（５－ＣＴＣＣＴＧＴＡＧＴＣＣＡＡＧＣＴＧＧＴＣＴＣ－３′）を用いた。
【0102】
抗体および他の試薬
Ｐ１１０α、Ｐ１１０β、Ｐ１１０γ、Ｐ１１０δ、ｐ８５（ＰＩ３Ｋサブユニット、ウサギモノクローナル）、Ａｋｔ、リン酸化Ａｋｔ（Ｔｈｒ３０８；Ｓｅｒ４７３）、Ｓ６、リン酸化Ｓ６（Ｓｅｒ２４０／２４４）、ＥＲＫ１／２（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）、リン酸化ｐ３８、ｐ３８、アンドロゲン受容体、ＰＴＥＮに対する各抗体は、セル・シグナリング社（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）（ダンバーズ、マサチューセッツ州）から入手した。β－アクチンはシグマ社（Ｓｉｇｍａ）（セントルイス、ミズーリ州）から入手し、ＧＡＰＤＨ（マウスモノクローナル）抗体はミリポア社（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）（テメクラ、カリフォルニア州）から入手した。Ｋｉ６７抗体はアブカム社（Ａｂｃａｍ）（ケンブリッジ、マサチューセッツ州）から入手し、抗ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３はエシェロン・バイオサイエンス社（Ｅｃｈｅｌｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）（ソルトレークシティ、ユタ州）から入手した。Ｅｐｈ受容体に対する抗体およびリガンドに対する抗体はＲ＆Ｄシステムズ社（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）（ミネアポリス、ミネソタ州）から入手した。ＥｐｈＢ４抗体はバスジーン・セラピューティクス社（ＶａｓＧｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）（ロサンゼルス、カリフォルニア州）から入手した。西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）およびＩＲＤｙｅ結合型二次抗体はロックランド社（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）（ギルバーツビル、ペンシルバニア州）から入手した。
Ｐ１１０α、Ｐ１１０β、Ｐ１１０γ、Ｐ１１０δ、ｐ８５（ＰＩ３Ｋサブユニット、ウサギモノクローナル）、Ａｋｔ、リン酸化Ａｋｔ（Ｔｈｒ３０８；Ｓｅｒ４７３）、Ｓ６、リン酸化Ｓ６（Ｓｅｒ２４０／２４４）、ＥＲＫ１／２（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）、リン酸化ｐ３８、ｐ３８、アンドロゲン受容体、ＰＴＥＮに対する各抗体は、セル・シグナリング社（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）（ダンバーズ、マサチューセッツ州）から入手した。β－アクチンはシグマ社（Ｓｉｇｍａ）（セントルイス、ミズーリ州）から入手し、ＧＡＰＤＨ（マウスモノクローナル）抗体はミリポア社（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）（テメクラ、カリフォルニア州）から入手した。Ｋｉ６７抗体はアブカム社（Ａｂｃａｍ）（ケンブリッジ、マサチューセッツ州）から入手し、抗ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３はエシェロン・バイオサイエンス社（Ｅｃｈｅｌｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）（ソルトレークシティ、ユタ州）から入手した。Ｅｐｈ受容体に対する抗体およびリガンドに対する抗体はＲ＆Ｄシステムズ社（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）（ミネアポリス、ミネソタ州）から入手した。ＥｐｈＢ４抗体はバスジーン・セラピューティクス社（ＶａｓＧｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）（ロサンゼルス、カリフォルニア州）から入手した。西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）およびＩＲＤｙｅ結合型二次抗体はロックランド社（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）（ギルバーツビル、ペンシルバニア州）から入手した。
【0103】
細胞外ドメイン全体を表すマウスＥｐｈＢ４の相補的（ｃＤＮＡ）コードを、成熟マウス血清アルブミンｐＣＲｓｃｒｉｐｔの上流にクローニングし、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株で安定的に発現される、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの制御下で哺乳類発現ベクターに入れた。発現されたｓＥｐｈＢ４－Ａｌｂ融合タンパク質を、前述のように精製して均一にした（Ｓｃｅｈｎｅｔ、Ｂｌｏｏｄ、２００９年、１１３巻：頁２５４－２６３）。
【0104】
８０症例の腺癌、８例の隣接正常前立腺組織、および８例の正常前立腺組織（症例毎に二つ組コア）を含む前立腺腺癌組織マイクロアレイを、バイオマックス社（Ｂｉｏｍａｘ）＃ＰＲ１９２１ｂ（ダーウッド、メリーランド州）から入手した。
【0105】
ウェスタンブロッティング
ウエスタンブロットでは、通常、２０μｇの全細胞溶解液を４～２０％Ｔｒｉｓ－グリシン勾配ゲル（バイオラド社、ハーキュリーズ、カリフォルニア州）上で泳動し、ニトロセルロース膜（バイオラド社、ハーキュリーズ、カリフォルニア州）に転写した。この膜を５％スキムミルク／ＴＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０（ＴＢＳＴ）で４０分間ブロッキングした後、１μｇ／ｍｌの一次抗体と４℃で一晩インキュベートした。膜を３回各１０分間洗浄し、ＨＲＰ標識二次抗体またはＩＲＤｙｅ標識二次抗体と４０分間インキュベートした。ＴＢＳＴで３回洗浄後、ＨＲＰシグナルはサーモサイエンティフィック社（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）から入手したＦｅｍｔｏ Ｍａｘｉｍｕｍ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ化学発光基質を用いて検出し、ＩＲＤｙｅシグナルはＯｄｙｓｓｅｙ（ライカー社（ＬＩＣＯＲ）、リンカーン、ネブラスカ州）で検出した。
ウエスタンブロットでは、通常、２０μｇの全細胞溶解液を４～２０％Ｔｒｉｓ－グリシン勾配ゲル（バイオラド社、ハーキュリーズ、カリフォルニア州）上で泳動し、ニトロセルロース膜（バイオラド社、ハーキュリーズ、カリフォルニア州）に転写した。この膜を５％スキムミルク／ＴＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０（ＴＢＳＴ）で４０分間ブロッキングした後、１μｇ／ｍｌの一次抗体と４℃で一晩インキュベートした。膜を３回各１０分間洗浄し、ＨＲＰ標識二次抗体またはＩＲＤｙｅ標識二次抗体と４０分間インキュベートした。ＴＢＳＴで３回洗浄後、ＨＲＰシグナルはサーモサイエンティフィック社（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）から入手したＦｅｍｔｏ Ｍａｘｉｍｕｍ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ化学発光基質を用いて検出し、ＩＲＤｙｅシグナルはＯｄｙｓｓｅｙ（ライカー社（ＬＩＣＯＲ）、リンカーン、ネブラスカ州）で検出した。
【0106】
免疫蛍光法および免疫組織化学
免疫蛍光法において、ＯＣＴに包埋した新鮮凍結組織を、５μｍに切片化し、リン酸緩衝４％パラホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳで洗浄した。次に、切片をヤギ血清でブロッキングし、一次抗体と一緒に４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳで洗浄後、抗体結合の位置決定を、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ結合型の適切な二次抗体（インビトロジェン社、カールズバッド、カリフォルニア州）を用いて行った。核をＤＡＰＩで対比染色した。ニコン社製Ｅｃｌｉｐｓｅ８０ｉ蛍光顕微鏡およびＭｅｔａ Ｍｏｒｐｈイメージングシリーズシステムで画像を撮影した。また、ＴＵＮＥＬ（ＴｄＴ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄＵＴＰ ｎｉｃｋ－ｅｎｄ ｌａｂｅｌｉｎｇ）アッセイキット（プロメガ社、マディソン、ウィスコンシン州）を製造業者の説明書に従って用いて、組織をアポトーシス分析用に処理した。
免疫蛍光法において、ＯＣＴに包埋した新鮮凍結組織を、５μｍに切片化し、リン酸緩衝４％パラホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳで洗浄した。次に、切片をヤギ血清でブロッキングし、一次抗体と一緒に４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳで洗浄後、抗体結合の位置決定を、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ結合型の適切な二次抗体（インビトロジェン社、カールズバッド、カリフォルニア州）を用いて行った。核をＤＡＰＩで対比染色した。ニコン社製Ｅｃｌｉｐｓｅ８０ｉ蛍光顕微鏡およびＭｅｔａ Ｍｏｒｐｈイメージングシリーズシステムで画像を撮影した。また、ＴＵＮＥＬ（ＴｄＴ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄＵＴＰ ｎｉｃｋ－ｅｎｄ ｌａｂｅｌｉｎｇ）アッセイキット（プロメガ社、マディソン、ウィスコンシン州）を製造業者の説明書に従って用いて、組織をアポトーシス分析用に処理した。
【0107】
免疫組織化学においては、凍結切片を３％ホルムアルデヒドで室温で１５分間固定し、その後ＰＢＳで２回洗浄した。切片を３％Ｈ２Ｏ２で１０分間処理し、ヤギ血清で１時間ブロッキングし、４℃で一晩一次抗体とインキュベートした。次に、切片をＰＢＳで洗浄し、ＡＢＣキット（ベクター・ラボラトリーズ社（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｓ）、バーリンゲーム、カリフォルニア州）で処理した。オリンパス社製ＢＸ５１顕微鏡およびＩｍａｇｅ－Ｐｒｏ Ｐｌｕｓ ６．０システムで画像を撮影した。
【0108】
各試料につき４枚の代表的な写真を撮影し、ＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）で定量化を行った。Ｐ値は対応のない両側スチューデントｔ検定により求めた。
【0109】
細胞株および培養液
ＰＣ３細胞株はアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関から入手した。Ｃ４－２Ｂ細胞はＭｉｃｈａｅｌ Ｓｔａｌｌｃｕｐ（南カリフォルニア大学）に用意してもらったものであり、２２Ｒｖ１細胞株およびＫ５６２細胞株はＡｋｉｌ Ｍｅｒｃｈａｎｔ博士（南カリフォルニア大学）に用意してもらったものである。これらの細胞は全て、ＣｅｌｌＧｒｏより入手した、１０％ＦＢＳ、１００ユニット／ｍＬのペニシリン、および１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ－１６４０中で増殖させた。これらの細胞株は、ＨＬＡタイピングおよび各々の原発腫瘍と比較した分子的表現型検査により検証済みのものである。
ＰＣ３細胞株はアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関から入手した。Ｃ４－２Ｂ細胞はＭｉｃｈａｅｌ Ｓｔａｌｌｃｕｐ（南カリフォルニア大学）に用意してもらったものであり、２２Ｒｖ１細胞株およびＫ５６２細胞株はＡｋｉｌ Ｍｅｒｃｈａｎｔ博士（南カリフォルニア大学）に用意してもらったものである。これらの細胞は全て、ＣｅｌｌＧｒｏより入手した、１０％ＦＢＳ、１００ユニット／ｍＬのペニシリン、および１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ－１６４０中で増殖させた。これらの細胞株は、ＨＬＡタイピングおよび各々の原発腫瘍と比較した分子的表現型検査により検証済みのものである。
【0110】
インサイツハイブリダイゼーション
インサイツハイブリダイゼーションは、以前の記述の通りに（Ｄｒｕｍｍｏｎｄ，Ｉ．Ａ．ら、Ｅａｒｌｙ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ ｐｒｏｎｅｐｈｒｏｓ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ａｆｆｅｃｔｉｎｇ ｐｒｏｎｅｐｈｒｉｃ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１２５巻、頁４６５５－４６６７（１９９８年）、変更を加えて実施した。具体的には、切片インサイツ（ｓｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｓｉｔｕ）は、製造業者のプロトコルに従って、ＩＳＨキット（バイオチェイン社（Ｂｉｏｃｈａｉｎ）、ヘイワード、カリフォルニア州）を用いて実施した。ＤＩＧ標識したアンチセンスプローブおよびセンスプローブは、Ｔ７およびＴ３ ＲＮＡポリメラーゼ（プロメガ社、サンルイスオビスポ、カリフォルニア州）を用いたインビトロ転写により合成した。０．７ｋｂのＰＣＲ断片を、マウスＥｐｈＢ４の完全長ｃＤＮＡを含むプラスミド（ＢＣ０７６４２６）から増幅し、ｐＣＲ４．０ＴＯＰＯベクター（インビトロジェン社、カールズバッド、カリフォルニア州）にサブクローニングした。画像は、キューイメージング社製（ＱＩｍａｇｉｎｇ）Ｒｅｔｉｇａ２０００Ｒカメラを搭載したオリンパス社製（Ｏｌｙｍｐｕｓ）ＢＸ５１顕微鏡を用いて得た。
インサイツハイブリダイゼーションは、以前の記述の通りに（Ｄｒｕｍｍｏｎｄ，Ｉ．Ａ．ら、Ｅａｒｌｙ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ ｐｒｏｎｅｐｈｒｏｓ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ａｆｆｅｃｔｉｎｇ ｐｒｏｎｅｐｈｒｉｃ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１２５巻、頁４６５５－４６６７（１９９８年）、変更を加えて実施した。具体的には、切片インサイツ（ｓｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｓｉｔｕ）は、製造業者のプロトコルに従って、ＩＳＨキット（バイオチェイン社（Ｂｉｏｃｈａｉｎ）、ヘイワード、カリフォルニア州）を用いて実施した。ＤＩＧ標識したアンチセンスプローブおよびセンスプローブは、Ｔ７およびＴ３ ＲＮＡポリメラーゼ（プロメガ社、サンルイスオビスポ、カリフォルニア州）を用いたインビトロ転写により合成した。０．７ｋｂのＰＣＲ断片を、マウスＥｐｈＢ４の完全長ｃＤＮＡを含むプラスミド（ＢＣ０７６４２６）から増幅し、ｐＣＲ４．０ＴＯＰＯベクター（インビトロジェン社、カールズバッド、カリフォルニア州）にサブクローニングした。画像は、キューイメージング社製（ＱＩｍａｇｉｎｇ）Ｒｅｔｉｇａ２０００Ｒカメラを搭載したオリンパス社製（Ｏｌｙｍｐｕｓ）ＢＸ５１顕微鏡を用いて得た。
【0111】
定量的ＲＴ－ＰＣＲ
トータルＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉキット（キアゲン社、バレンシア、カリフォルニア州）を用いて、マウス前立腺組織から抽出した。２μｇのトータルＲＮＡからフェルメンタス社（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）製キットを用いてファーストストランドｃＤＮＡを合成した後、ＭＸ３０００ＰリアルタイムＰＣＲシステム（ストラタジーン社（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ラ・ホーヤ、カリフォルニア州）で、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ＩＩ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＱＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（ストラタジーン社、ラ・ホーヤ、カリフォルニア州）を製造業者の取扱説明書に従って用いて定量的ＰＣＲを実施した。全ての反応はトリプリケートで行った。増幅シグナルはβ－アクチンに対し正規化した。ＥｐｈＢ４ ｓｉＲＮＡのノックダウン効果を評価するために、ＥｐｈＢ４ ｓｉＲＮＡまたは３塩基ミスマッチ対照ｓｉＲＮＡ（対照ｓｉＲＮＡ）をトランスフェクトした培養細胞からトータルｍＲＮＡを抽出した。研究対象遺伝子のプライマー配列を表２に示す。
トータルＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉキット（キアゲン社、バレンシア、カリフォルニア州）を用いて、マウス前立腺組織から抽出した。２μｇのトータルＲＮＡからフェルメンタス社（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）製キットを用いてファーストストランドｃＤＮＡを合成した後、ＭＸ３０００ＰリアルタイムＰＣＲシステム（ストラタジーン社（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ラ・ホーヤ、カリフォルニア州）で、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ＩＩ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＱＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（ストラタジーン社、ラ・ホーヤ、カリフォルニア州）を製造業者の取扱説明書に従って用いて定量的ＰＣＲを実施した。全ての反応はトリプリケートで行った。増幅シグナルはβ－アクチンに対し正規化した。ＥｐｈＢ４ ｓｉＲＮＡのノックダウン効果を評価するために、ＥｐｈＢ４ ｓｉＲＮＡまたは３塩基ミスマッチ対照ｓｉＲＮＡ（対照ｓｉＲＮＡ）をトランスフェクトした培養細胞からトータルｍＲＮＡを抽出した。研究対象遺伝子のプライマー配列を表２に示す。
【0112】
【0113】
ｓｉＲＮＡおよびトランスフェクション
ＥｐｈＢ４ ｓｉＲＮＡ（配列は５’－ＣＣＧＧＧＡＡＧＧＵＧＡＡＵＧＵＣＡＡ－３’）はキアゲン社（バレンシア、カリフォルニア州）製の合成品である。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（インビトロジェン社、カールズバッド、カリフォルニア州）を用いて、製造業者の取扱説明書に従ってｓｉＲＮＡトランスフェクションを行った。
ＥｐｈＢ４ ｓｉＲＮＡ（配列は５’－ＣＣＧＧＧＡＡＧＧＵＧＡＡＵＧＵＣＡＡ－３’）はキアゲン社（バレンシア、カリフォルニア州）製の合成品である。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（インビトロジェン社、カールズバッド、カリフォルニア州）を用いて、製造業者の取扱説明書に従ってｓｉＲＮＡトランスフェクションを行った。
【0114】
ＡＫＴコンストラクト
野生型Ａｋｔ、およびｓｒｃミリストイル化シグナル配列を含むｍｙｒＡｋｔ Δ４－１２９（体質的（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ）活性化型ＡＫＴ）の各コンストラクトは、以前に報告された通りのものである（Ｋｏｈｎ Ａ．、Ｔａｋｅｕｃｈｉ Ｆ．、Ｒｏｔｈ Ｒ．Ａ．（１９９６年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７１巻、頁２１９２０－２１９２６）。これらのコンストラクトをｐＣＭＶ－ＳＰＯＲＴ６ベクターにクローニングした。
野生型Ａｋｔ、およびｓｒｃミリストイル化シグナル配列を含むｍｙｒＡｋｔ Δ４－１２９（体質的（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ）活性化型ＡＫＴ）の各コンストラクトは、以前に報告された通りのものである（Ｋｏｈｎ Ａ．、Ｔａｋｅｕｃｈｉ Ｆ．、Ｒｏｔｈ Ｒ．Ａ．（１９９６年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７１巻、頁２１９２０－２１９２６）。これらのコンストラクトをｐＣＭＶ－ＳＰＯＲＴ６ベクターにクローニングした。
【0115】
インビトロにおけるＡＫＴおよびリン酸化ＡＫＴのレスキュー実験
Ｃ４－２Ｂ細胞を２４ウェルプレート内に２×１０４細胞／ウェルの密度で総体積５００μＬとなるように播種し、２４時間後、細胞をＥｐｈＢ４ ｓｉＲＮＡまたは対照ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。さらに１２時間後、これらの細胞を、ＡＫＴ／ｐＣＭＶ－ＳＰＯＲＴ６完全長（ＢＣ０２０５３０．１、オープン・バイオシステムズ社（Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））、体質的（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ）活性化型ＡＫＴ／ｐＣＭＶ－ＳＰＯＲＴ６またはｐＣＭＶ－ＳＰＯＲＴ６プラスミドでさらにトランスフェクトした。処理の２日後、細胞生存率の評価を、３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロマイド（ＭＴＴ）を用いて、以前の報告の通りに行った（Ｋｕｍａｒ ＳＲ、Ｓｉｎｇｈ Ｊ、Ｘｉａ Ｇ、Ｋｒａｓｎｏｐｅｒｏｖ Ｖ、Ｈａｓｓａｎｉｅｈ Ｌ、Ｌｅｙ ＥＪら、Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ＥｐｈＢ４ ｉｓ ａ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｆａｃｔｏｒ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ．、Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ、２００６年；１６９巻（１号）：頁２７９－９３）。タンパク質発現は免疫ブロッティングで確認した。
Ｃ４－２Ｂ細胞を２４ウェルプレート内に２×１０４細胞／ウェルの密度で総体積５００μＬとなるように播種し、２４時間後、細胞をＥｐｈＢ４ ｓｉＲＮＡまたは対照ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。さらに１２時間後、これらの細胞を、ＡＫＴ／ｐＣＭＶ－ＳＰＯＲＴ６完全長（ＢＣ０２０５３０．１、オープン・バイオシステムズ社（Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））、体質的（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ）活性化型ＡＫＴ／ｐＣＭＶ－ＳＰＯＲＴ６またはｐＣＭＶ－ＳＰＯＲＴ６プラスミドでさらにトランスフェクトした。処理の２日後、細胞生存率の評価を、３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロマイド（ＭＴＴ）を用いて、以前の報告の通りに行った（Ｋｕｍａｒ ＳＲ、Ｓｉｎｇｈ Ｊ、Ｘｉａ Ｇ、Ｋｒａｓｎｏｐｅｒｏｖ Ｖ、Ｈａｓｓａｎｉｅｈ Ｌ、Ｌｅｙ ＥＪら、Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ＥｐｈＢ４ ｉｓ ａ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｆａｃｔｏｒ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ．、Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ、２００６年；１６９巻（１号）：頁２７９－９３）。タンパク質発現は免疫ブロッティングで確認した。
【0116】
統計解析
異なる試料間または群間の統計的有意差は、対応のない両側スチューデントｔ検定を用いて判定した。Ｐ値が０．０５未満である場合に結果を有意差ありと見なした。
異なる試料間または群間の統計的有意差は、対応のない両側スチューデントｔ検定を用いて判定した。Ｐ値が０．０５未満である場合に結果を有意差ありと見なした。
【0117】
本願で開示および特許請求される物品および方法は全て、本開示に照らして、必要以上の実験を行うことなく、製造および実行することができる。本発明の物品および方法を好ましい実施形態の観点から記述したが、本発明の精神および範囲から逸脱しない範囲で物品および方法に変形を適用してよいことは、当業者には明らかである。当業者には明らかな、そのような変形形態および均等物は全て、現存するものであれ後に開発されるものであれ、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の精神および範囲に包含されると見なされる。本明細書で挙げられた特許、特許出願、および刊行物は全て、本発明が属する技術分野における当業者の水準を示すものである。全ての特許、特許出願、および刊行物は、あたかもそれぞれの対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）刊行物が、その全体があらゆる目的で参照により援用されると明確且つ対象的（ｓｕｂｊｅｃｔｌｙ）に示されるのとの同程度に、それらの全体があらゆる目的で参照により本明細書に援用される。好適なものとして本明細書に例示的に記載された発明は、本明細書に特には開示されていないいかなる要素が存在せずとも、実施することができる。使用された用語および表現は、限定ではなく説明のための用語として使用されており、そのような用語および表現の使用に際して、示されそして説明された特徴またはその一部のいかなる均等物も排除する意図も無く、特許請求された本発明の範囲内で様々な変更形態が可能であると認識される。すなわち、好ましい実施形態および任意の特徴によって本発明が具体的に開示されたが、本明細書で開示された概念の変更および変形が当業者により行われてもよいこと、並びに、そのような変更形態および変形形態が添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲内であると見なされることを理解されたい。
【0118】
配列表
添付の配列表に列挙されたアミノ酸配列では、米国特許法施行規則§１．８２２の規定の通り、アミノ酸は標準的な３文字表記を用いて示している。
添付の配列表に列挙されたアミノ酸配列では、米国特許法施行規則§１．８２２の規定の通り、アミノ酸は標準的な３文字表記を用いて示している。
【0119】
配列番号１は、ヒトエフリンＢ型受容体前駆体（ＮＰ＿００４４３５．３）のアミノ酸配列である。１～１５番アミノ酸残基がシグナル配列をコードする。
ＭＥＬＲＶＬＬＣＷＡＳＬＡＡＡＬＥＥＴＬＬＮＴＫＬＥＴＡＤＬＫＷＶＴＦＰＱＶＤＧＱＷＥＥＬＳＧＬＤＥＥＱＨＳＶＲＴＹＥＶＣＤＶＱＲＡＰＧＱＡＨＷＬＲＴＧＷＶＰＲＲＧＡＶＨＶＹＡＴＬＲＦＴＭＬＥＣＬＳＬＰＲＡＧＲＳＣＫＥＴＦＴＶＦＹＹＥＳＤＡＤＴＡＴＡＬＴＰＡＷＭＥＮＰＹＩＫＶＤＴＶＡＡＥＨＬＴＲＫＲＰＧＡＥＡＴＧＫＶＮＶＫＴＬＲＬＧＰＬＳＫＡＧＦＹＬＡＦＱＤＱＧＡＣＭＡＬＬＳＬＨＬＦＹＫＫＣＡＱＬＴＶＮＬＴＲＦＰＥＴＶＰＲＥＬＶＶＰＶＡＧＳＣＶＶＤＡＶＰＡＰＧＰＳＰＳＬＹＣＲＥＤＧＱＷＡＥＱＰＶＴＧＣＳＣＡＰＧＦＥＡＡＥＧＮＴＫＣＲＡＣＡＱＧＴＦＫＰＬＳＧＥＧＳＣＱＰＣＰＡＮＳＨＳＮＴＩＧＳＡＶＣＱＣＲＶＧＹＦＲＡＲＴＤＰＲＧＡＰＣＴＴＰＰＳＡＰＲＳＶＶＳＲＬＮＧＳＳＬＨＬＥＷＳＡＰＬＥＳＧＧＲＥＤＬＴＹＡＬＲＣＲＥＣＲＰＧＧＳＣＡＰＣＧＧＤＬＴＦＤＰＧＰＲＤＬＶＥＰＷＶＶＶＲＧＬＲＰＤＦＴＹＴＦＥＶＴＡＬＮＧＶＳＳＬＡＴＧＰＶＰＦＥＰＶＮＶＴＴＤＲＥＶＰＰＡＶＳＤＩＲＶＴＲＳＳＰＳＳＬＳＬＡＷＡＶＰＲＡＰＳＧＡＶＬＤＹＥＶＫＹＨＥＫＧＡＥＧＰＳＳＶＲＦＬＫＴＳＥＮＲＡＥＬＲＧＬＫＲＧＡＳＹＬＶＱＶＲＡＲＳＥＡＧＹＧＰＦＧＱＥＨＨＳＱＴＱＬＤＥＳＥＧＷＲＥＱＬＡＬＩＡＧＴＡＶＶＧＶＶＬＶＬＶＶＩＶＶＡＶＬＣＬＲＫＱＳＮＧＲＥＡＥＹＳＤＫＨＧＱＹＬＩＧＨＧＴＫＶＹＩＤＰＦＴＹＥＤＰＮＥＡＶＲＥＦＡＫＥＩＤＶＳＹＶＫＩＥＥＶＩＧＡＧＥＦＧＥＶＣＲＧＲＬＫＡＰＧＫＫＥＳＣＶＡＩＫＴＬＫＧＧＹＴＥＲＱＲＲＥＦＬＳＥＡＳＩＭＧＱＦＥＨＰＮＩＩＲＬＥＧＶＶＴＮＳＭＰＶＭＩＬＴＥＦＭＥＮＧＡＬＤＳＦＬＲＬＮＤＧＱＦＴＶＩＱＬＶＧＭＬＲＧＩＡＳＧＭＲＹＬＡＥＭＳＹＶＨＲＤＬＡＡＲＮＩＬＶＮＳＮＬＶＣＫＶＳＤＦＧＬＳＲＦＬＥＥＮＳＳＤＰＴＹＴＳＳＬＧＧＫＩＰＩＲＷＴＡＰＥＡＩＡＦＲＫＦＴＳＡＳＤＡＷＳＹＧＩＶＭＷＥＶＭＳＦＧＥＲＰＹＷＤＭＳＮＱＤＶＩＮＡＩＥＱＤＹＲＬＰＰＰＰＤＣＰＴＳＬＨＱＬＭＬＤＣＷＱＫＤＲＮＡＲＰＲＦＰＱＶＶＳＡＬＤＫＭＩＲＮＰＡＳＬＫＩＶＡＲＥＮＧＧＡＳＨＰＬＬＤＱＲＱＰＨＹＳＡＦＧＳＶＧＥＷＬＲＡＩＫＭＧＲＹＥＥＳＦＡＡＡＧＦＧＳＦＥＬＶＳＱＩＳＡＥＤＬＬＲＩＧＶＴＬＡＧＨＱＫＫＩＬＡＳＶＱＨＭＫＳＱＡＫＰＧＴＰＧＧＴＧＧＰＡＰＱＹ（配列番号１）
ＭＥＬＲＶＬＬＣＷＡＳＬＡＡＡＬＥＥＴＬＬＮＴＫＬＥＴＡＤＬＫＷＶＴＦＰＱＶＤＧＱＷＥＥＬＳＧＬＤＥＥＱＨＳＶＲＴＹＥＶＣＤＶＱＲＡＰＧＱＡＨＷＬＲＴＧＷＶＰＲＲＧＡＶＨＶＹＡＴＬＲＦＴＭＬＥＣＬＳＬＰＲＡＧＲＳＣＫＥＴＦＴＶＦＹＹＥＳＤＡＤＴＡＴＡＬＴＰＡＷＭＥＮＰＹＩＫＶＤＴＶＡＡＥＨＬＴＲＫＲＰＧＡＥＡＴＧＫＶＮＶＫＴＬＲＬＧＰＬＳＫＡＧＦＹＬＡＦＱＤＱＧＡＣＭＡＬＬＳＬＨＬＦＹＫＫＣＡＱＬＴＶＮＬＴＲＦＰＥＴＶＰＲＥＬＶＶＰＶＡＧＳＣＶＶＤＡＶＰＡＰＧＰＳＰＳＬＹＣＲＥＤＧＱＷＡＥＱＰＶＴＧＣＳＣＡＰＧＦＥＡＡＥＧＮＴＫＣＲＡＣＡＱＧＴＦＫＰＬＳＧＥＧＳＣＱＰＣＰＡＮＳＨＳＮＴＩＧＳＡＶＣＱＣＲＶＧＹＦＲＡＲＴＤＰＲＧＡＰＣＴＴＰＰＳＡＰＲＳＶＶＳＲＬＮＧＳＳＬＨＬＥＷＳＡＰＬＥＳＧＧＲＥＤＬＴＹＡＬＲＣＲＥＣＲＰＧＧＳＣＡＰＣＧＧＤＬＴＦＤＰＧＰＲＤＬＶＥＰＷＶＶＶＲＧＬＲＰＤＦＴＹＴＦＥＶＴＡＬＮＧＶＳＳＬＡＴＧＰＶＰＦＥＰＶＮＶＴＴＤＲＥＶＰＰＡＶＳＤＩＲＶＴＲＳＳＰＳＳＬＳＬＡＷＡＶＰＲＡＰＳＧＡＶＬＤＹＥＶＫＹＨＥＫＧＡＥＧＰＳＳＶＲＦＬＫＴＳＥＮＲＡＥＬＲＧＬＫＲＧＡＳＹＬＶＱＶＲＡＲＳＥＡＧＹＧＰＦＧＱＥＨＨＳＱＴＱＬＤＥＳＥＧＷＲＥＱＬＡＬＩＡＧＴＡＶＶＧＶＶＬＶＬＶＶＩＶＶＡＶＬＣＬＲＫＱＳＮＧＲＥＡＥＹＳＤＫＨＧＱＹＬＩＧＨＧＴＫＶＹＩＤＰＦＴＹＥＤＰＮＥＡＶＲＥＦＡＫＥＩＤＶＳＹＶＫＩＥＥＶＩＧＡＧＥＦＧＥＶＣＲＧＲＬＫＡＰＧＫＫＥＳＣＶＡＩＫＴＬＫＧＧＹＴＥＲＱＲＲＥＦＬＳＥＡＳＩＭＧＱＦＥＨＰＮＩＩＲＬＥＧＶＶＴＮＳＭＰＶＭＩＬＴＥＦＭＥＮＧＡＬＤＳＦＬＲＬＮＤＧＱＦＴＶＩＱＬＶＧＭＬＲＧＩＡＳＧＭＲＹＬＡＥＭＳＹＶＨＲＤＬＡＡＲＮＩＬＶＮＳＮＬＶＣＫＶＳＤＦＧＬＳＲＦＬＥＥＮＳＳＤＰＴＹＴＳＳＬＧＧＫＩＰＩＲＷＴＡＰＥＡＩＡＦＲＫＦＴＳＡＳＤＡＷＳＹＧＩＶＭＷＥＶＭＳＦＧＥＲＰＹＷＤＭＳＮＱＤＶＩＮＡＩＥＱＤＹＲＬＰＰＰＰＤＣＰＴＳＬＨＱＬＭＬＤＣＷＱＫＤＲＮＡＲＰＲＦＰＱＶＶＳＡＬＤＫＭＩＲＮＰＡＳＬＫＩＶＡＲＥＮＧＧＡＳＨＰＬＬＤＱＲＱＰＨＹＳＡＦＧＳＶＧＥＷＬＲＡＩＫＭＧＲＹＥＥＳＦＡＡＡＧＦＧＳＦＥＬＶＳＱＩＳＡＥＤＬＬＲＩＧＶＴＬＡＧＨＱＫＫＩＬＡＳＶＱＨＭＫＳＱＡＫＰＧＴＰＧＧＴＧＧＰＡＰＱＹ（配列番号１）
【0120】
配列番号２は、ヒト血清アルブミンプレプロタンパク質（ＮＰ＿０００４６８．１）のアミノ酸配列である。２５～６０９番アミノ酸残基が成熟ペプチドをコードする。
ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＳＳＡＹＳＲＧＶＦＲＲＤＡＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫＤＬＧＥＥＮＦＫＡＬＶＬＩＡＦＡＱＹＬＱＱＣＰＦＥＤＨＶＫＬＶＮＥＶＴＥＦＡＫＴＣＶＡＤＥＳＡＥＮＣＤＫＳＬＨＴＬＦＧＤＫＬＣＴＶＡＴＬＲＥＴＹＧＥＭＡＤＣＣＡＫＱＥＰＥＲＮＥＣＦＬＱＨＫＤＤＮＰＮＬＰＲＬＶＲＰＥＶＤＶＭＣＴＡＦＨＤＮＥＥＴＦＬＫＫＹＬＹＥＩＡＲＲＨＰＹＦＹＡＰＥＬＬＦＦＡＫＲＹＫＡＡＦＴＥＣＣＱＡＡＤＫＡＡＣＬＬＰＫＬＤＥＬＲＤＥＧＫＡＳＳＡＫＱＲＬＫＣＡＳＬＱＫＦＧＥＲＡＦＫＡＷＡＶＡＲＬＳＱＲＦＰＫＡＥＦＡＥＶＳＫＬＶＴＤＬＴＫＶＨＴＥＣＣＨＧＤＬＬＥＣＡＤＤＲＡＤＬＡＫＹＩＣＥＮＱＤＳＩＳＳＫＬＫＥＣＣＥＫＰＬＬＥＫＳＨＣＩＡＥＶＥＮＤＥＭＰＡＤＬＰＳＬＡＡＤＦＶＥＳＫＤＶＣＫＮＹＡＥＡＫＤＶＦＬＧＭＦＬＹＥＹＡＲＲＨＰＤＹＳＶＶＬＬＬＲＬＡＫＴＹＥＴＴＬＥＫＣＣＡＡＡＤＰＨＥＣＹＡＫＶＦＤＥＦＫＰＬＶＥＥＰＱＮＬＩＫＱＮＣＥＬＦＥＱＬＧＥＹＫＦＱＮＡＬＬＶＲＹＴＫＫＶＰＱＶＳＴＰＴＬＶＥＶＳＲＮＬＧＫＶＧＳＫＣＣＫＨＰＥＡＫＲＭＰＣＡＥＤＹＬＳＶＶＬＮＱＬＣＶＬＨＥＫＴＰＶＳＤＲＶＴＫＣＣＴＥＳＬＶＮＲＲＰＣＦＳＡＬＥＶＤＥＴＹＶＰＫＥＦＮＡＥＴＦＴＦＨＡＤＩＣＴＬＳＥＫＥＲＱＩＫＫＱＴＡＬＶＥＬＶＫＨＫＰＫＡＴＫＥＱＬＫＡＶＭＤＤＦＡＡＦＶＥＫＣＣＫＡＤＤＫＥＴＣＦＡＥＥＧＫＫＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧＬ（配列番号２）
ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＳＳＡＹＳＲＧＶＦＲＲＤＡＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫＤＬＧＥＥＮＦＫＡＬＶＬＩＡＦＡＱＹＬＱＱＣＰＦＥＤＨＶＫＬＶＮＥＶＴＥＦＡＫＴＣＶＡＤＥＳＡＥＮＣＤＫＳＬＨＴＬＦＧＤＫＬＣＴＶＡＴＬＲＥＴＹＧＥＭＡＤＣＣＡＫＱＥＰＥＲＮＥＣＦＬＱＨＫＤＤＮＰＮＬＰＲＬＶＲＰＥＶＤＶＭＣＴＡＦＨＤＮＥＥＴＦＬＫＫＹＬＹＥＩＡＲＲＨＰＹＦＹＡＰＥＬＬＦＦＡＫＲＹＫＡＡＦＴＥＣＣＱＡＡＤＫＡＡＣＬＬＰＫＬＤＥＬＲＤＥＧＫＡＳＳＡＫＱＲＬＫＣＡＳＬＱＫＦＧＥＲＡＦＫＡＷＡＶＡＲＬＳＱＲＦＰＫＡＥＦＡＥＶＳＫＬＶＴＤＬＴＫＶＨＴＥＣＣＨＧＤＬＬＥＣＡＤＤＲＡＤＬＡＫＹＩＣＥＮＱＤＳＩＳＳＫＬＫＥＣＣＥＫＰＬＬＥＫＳＨＣＩＡＥＶＥＮＤＥＭＰＡＤＬＰＳＬＡＡＤＦＶＥＳＫＤＶＣＫＮＹＡＥＡＫＤＶＦＬＧＭＦＬＹＥＹＡＲＲＨＰＤＹＳＶＶＬＬＬＲＬＡＫＴＹＥＴＴＬＥＫＣＣＡＡＡＤＰＨＥＣＹＡＫＶＦＤＥＦＫＰＬＶＥＥＰＱＮＬＩＫＱＮＣＥＬＦＥＱＬＧＥＹＫＦＱＮＡＬＬＶＲＹＴＫＫＶＰＱＶＳＴＰＴＬＶＥＶＳＲＮＬＧＫＶＧＳＫＣＣＫＨＰＥＡＫＲＭＰＣＡＥＤＹＬＳＶＶＬＮＱＬＣＶＬＨＥＫＴＰＶＳＤＲＶＴＫＣＣＴＥＳＬＶＮＲＲＰＣＦＳＡＬＥＶＤＥＴＹＶＰＫＥＦＮＡＥＴＦＴＦＨＡＤＩＣＴＬＳＥＫＥＲＱＩＫＫＱＴＡＬＶＥＬＶＫＨＫＰＫＡＴＫＥＱＬＫＡＶＭＤＤＦＡＡＦＶＥＫＣＣＫＡＤＤＫＥＴＣＦＡＥＥＧＫＫＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧＬ（配列番号２）
【図1-1】
【図1-2】
【図2】
【図3-1】
【図3-2】
【図4-1】
【図4-2】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8-1】
【図8-2】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【配列表】
【国際調査報告】