特表 2022-520885 神経変性疾患を処置するための組成物および方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-04-01

(54)【発明の名称】神経変性疾患を処置するための組成物および方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/113 20100101AFI20220325BHJP

   A61P 21/02 20060101ALI20220325BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20220325BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20220325BHJP

   C07K 16/00 20060101ALN20220325BHJP

【ＦＩ】

C12N15/113 130Z

A61P21/02

A61K48/00

A61P25/00

C07K16/00 ZNA

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021557334

(86)(22)【出願日】2020-03-25

(85)【翻訳文提出日】2021-11-05

(86)【国際出願番号】 US2020024554

(87)【国際公開番号】W WO2020198270

(87)【国際公開日】2020-10-01

(31)【優先権主張番号】62/824,066

(32)【優先日】2019-03-26

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】510144959

【氏名又は名称】ラトガース，ザ ステート ユニバーシティ オブ ニュー ジャージー

(71)【出願人】

【識別番号】521402206

【氏名又は名称】シラジーン，インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100127926

【弁理士】

【氏名又は名称】結田 純次

(74)【代理人】

【識別番号】100140132

【弁理士】

【氏名又は名称】竹林 則幸

(72)【発明者】

【氏名】サミュエル・イアン・ガンダーソン

(72)【発明者】

【氏名】ラファル・ゴラツニアク

【テーマコード（参考）】

4C084

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C084AA13

4C084NA14

4C084ZA01

4C084ZA22

4C084ZA94

4H045AA10

4H045AA30

4H045BA54

4H045CA40

4H045DA75

4H045EA20

(57)【要約】

変性性脊髄症（ＤＭ）または筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を阻害、処置および／または予防するための組成物および方法が提供される。
【選択図】図１Ａ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

スーパーオキシドジスムターゼ遺伝子の発現を阻害するためのＵ１アダプターオリゴヌクレオチドであって、前記Ｕ１アダプターオリゴヌクレオチドが、少なくとも１つのエフェクタードメインに作動可能に連結されたアニーリングドメインを含む核酸分子であり、前記アニーリングドメインが、前記スーパーオキシドジスムターゼ１遺伝子のプレｍＲＮＡにハイブリダイズし、前記エフェクタードメインが、Ｕ１ ｓｎＲＮＰのＵ１ ｓｎＲＮＡにハイブリダイズする、Ｕ１アダプターオリゴヌクレオチド。

【請求項2】

前記アニーリングドメインは、約１０～約３０ヌクレオチドの長さである、請求項１に記載のＵ１アダプターオリゴヌクレオチド。

【請求項3】

前記エフェクタードメインは、約８～約２０ヌクレオチドの長さである、請求項１に記載のＵ１アダプターオリゴヌクレオチド。

【請求項4】

前記エフェクタードメインおよびアニーリングドメインは、約１～約１０ヌクレオチドの結合またはリンカードメインによって連結されている、請求項１に記載のＵ１アダプターオリゴヌクレオチド。

【請求項5】

前記エフェクタードメインは、配列５’－ＣＡＧＧＵＡＡＧＵＡ－３’（配列番号１）、５’－ＣＡＧＧＵＡＡＧＵＡＵ－３’（配列番号４）、または５’－ＧＣＣＡＧＧＵＡＡＧＵＡＵ－３’（配列番号５）を含む、請求項１に記載のＵ１アダプターオリゴヌクレオチド。

【請求項6】

少なくとも１つのターゲティング部分および／または細胞透過性部位をさらに含み、前記ターゲティング部分および／または細胞透過性部分が前記Ｕ１アダプターオリゴヌクレオチドに作動可能に連結されている、請求項１に記載のＵ１アダプターオリゴヌクレオチド。

【請求項7】

前記Ｕ１アダプターオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのヌクレオチドアナログを含む、請求項１に記載のＵ１アダプターオリゴヌクレオチド。

【請求項8】

前記Ｕ１アダプターオリゴヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチルヌクレオチド、２’－Ｏ－メチルオキシエトキシヌクレオチド、２’－ハロ（例えば、２’－フルオロ）、および／またはロックド核酸を含む、請求項１に記載のＵ１アダプターオリゴヌクレオチド。

【請求項9】

Ｕ１アダプターオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエートを含む、請求項１に記載のＵ１アダプターオリゴヌクレオチド。

【請求項10】

前記アニーリングドメインは、スーパーオキシドジスムターゼ１遺伝子の３’末端エクソン中の標的配列とハイブリダイズする、請求項１に記載のＵ１アダプターオリゴヌクレオチド。

【請求項11】

前記エフェクタードメインは、前記アニーリングドメインの３’末端、前記アニーリングドメインの５’末端、または前記アニーリングドメインの５’および３’末端の両方に作動可能に連結されている、請求項１に記載のＵ１アダプターオリゴヌクレオチド。

【請求項12】

前記アニーリングドメインは、少なくとも７つのデオキシリボヌクレオチドのストレッチを含む、請求項１に記載のＵ１アダプターオリゴヌクレオチド。

【請求項13】

前記Ｕ１ ｓｎＲＮＡは、Ｕ１変異体ｓｎＲＮＡである、請求項１に記載のＵ１アダプターオリゴヌクレオチド。

【請求項14】

前記Ｕ１アダプターオリゴヌクレオチドおよび前記ターゲティング部分および／または細胞透過性部分は、リンカーを介してコンジュゲートされている、請求項６に記載のＵ１アダプターオリゴヌクレオチド。

【請求項15】

前記リンカーは、切断可能である、請求項１４に記載のＵ１アダプターオリゴヌクレオチド。

【請求項16】

前記ターゲティング部分および／または細胞透過性部分は、Ｕ１アダプターオリゴヌクレオチドの３’末端、５’末端、または５’および３’末端の両方に作動可能に連結されている、請求項６に記載のＵ１アダプターオリゴヌクレオチド。

【請求項17】

前記ターゲティング部分および／または細胞透過性部分は、Ｕ１アダプターオリゴヌクレオチドの５’末端に作動可能に連結されている、請求項１６に記載のＵ１アダプターオリゴヌクレオチド。

【請求項18】

前記Ｕ１アダプターオリゴヌクレオチドは、３’末端で第１のターゲティング部分および５’末端で第２のターゲティング部分に作動可能に連結されている、請求項１に記載のＵ１アダプターオリゴヌクレオチド。

【請求項19】

前記ターゲティング部分は、抗体またはその断片である、請求項６に記載のＵ１アダプターオリゴヌクレオチド。

【請求項20】

前記スーパーオキシドジスムターゼ１遺伝子は、イヌのである、請求項１に記載のＵ１アダプターオリゴヌクレオチド。

【請求項21】

前記アニーリングドメインは、配列番号８とハイブリダイズする、請求項１～２０のいずれか１項に記載のＵ１アダプターオリゴヌクレオチド。

【請求項22】

前記Ｕ１アダプターオリゴヌクレオチドは、配列番号９を含む、請求項１～２０のいずれか１項に記載のＵ１アダプターオリゴヌクレオチド。

【請求項23】

請求項１～２２のいずれか１項に記載の少なくとも１つのＵ１アダプターオリゴヌクレオチドと、少なくとも１つの薬学的に許容される担体とを含む組成物。

【請求項24】

前記組成物は、前記スーパーオキシドジスムターゼ１遺伝子に対して向けられた少なくとも１つのｓｉＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項２３に記載の組成物。

【請求項25】

請求項１～２２のいずれか１項に記載の少なくとも１つのＵ１アダプターオリゴヌクレオチドを細胞に送達することを含む、スーパーオキシドジスムターゼ１遺伝子の発現を阻害する方法。

【請求項26】

少なくとも２つの前記Ｕ１アダプターオリゴヌクレオチドが送達され、前記Ｕ１アダプターオリゴヌクレオチドのアニーリングドメインが、前記スーパーオキシドジスムターゼ１遺伝子の異なる標的配列とハイブリダイズする、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

請求項１～２２のいずれか１項に記載の少なくとも１つのＵ１アダプターオリゴヌクレオチドを、それを必要とする対象に投与することを含む、前記対象における変性性脊髄症（ＤＭ）または筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を処置する方法。

【請求項28】

少なくとも２つの前記Ｕ１アダプターオリゴヌクレオチドが投与され、前記Ｕ１アダプターオリゴヌクレオチドのアニーリングドメインが、前記スーパーオキシドジスムターゼ１遺伝子の異なる標的配列とハイブリダイズする、請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

前記スーパーオキシドジスムターゼ１遺伝子に対して向けられた少なくとも１つのｓｉＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することをさらに含む、請求項２７に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願は、２０１９年３月２６日に出願された米国仮特許出願第６２／８２４，０６６号に対する米国特許法第１１９条に基づく優先権を主張する。前述の出願は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

本発明は、一般に、遺伝子サイレンシングの分野に関する。具体的には、本発明は、スーパーオキシドジスムターゼ遺伝子の発現を調節するための組成物および方法を提供する。

【背景技術】

【0003】

変性性脊髄症（ＤＭ）は、ヒトにおける筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳまたはルーゲーリッグ病）によく似たゆっくりと進行する脊髄疾患である。具体的には、ＤＭは、多くのイヌ種が罹患し、６～１２ヶ月の期間にわたり麻痺を引き起こす老齢のイヌの神経変性疾患である（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５）。ＤＭは、スーパーオキシドジスムターゼ、ＳＯＤ１の遺伝子における変異と非常に関連がある。この変異は、機能の喪失を引き起こさないが、ＳＯＤ１タンパク質のミスフォールディングおよび凝集を引き起こし、その結果、神経細胞死に至る（非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９）。同様に、変異ＳＯＤ１タンパク質は、ＡＬＳにおいて毒性の凝集体を導く（非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２）。したがって、この変異した遺伝子の発現を減らすことは、重要な治療目標となる。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0004】

【非特許文献1】Ａｖｅｒｉｌｌ，Ｄ．Ｒ．，Ｊ．Ａｍ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．（１９７３）１６２（１２）：１０４５－１０５１

【非特許文献2】Ｃｏａｔｅｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｖｅｔ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ Ａｍ．Ｓｍａｌｌ Ａｎｉｍ．Ｐｒａｃ．（２０１０）４０（５）：９２９－９５０

【非特許文献3】Ｃｏａｔｅｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｅｔ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．（２００７）２１（６）：１３２３－１３３１

【非特許文献4】Ｓｈｅｌｔｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．（２０１２）３１８（１－２）：５５－６４

【非特許文献5】Ｂｒａｕｎｄ，ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．（１９７８）３９（８）：１３０９－１３１５

【非特許文献6】Ｋｏｈｙａｍａ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．（２０１７）７９（２）：３７５－３７９

【非特許文献7】Ｎａｋａｍａｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ（２０１５）３０３：２２９－４０

【非特許文献8】Ｃｒｉｓｐ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．（２０１３），２４８：１－９

【非特許文献9】Ｔｕｒｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｇ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．（２００８）８５：９４－１３４）

【非特許文献10】Ｔｉｗａｒｉ，ｅｔ ａｌ．Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒ．Ｄｉｓ．（２００５）２（３－４）：１１５－２７

【非特許文献11】Ｒａｋｈｉｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．（２００６）１７６２（１１－１２）：１０２５－３７

【非特許文献12】Ｂｅｎｋｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．（２０１８）８（１）：１６３９３

【発明の概要】

【0005】

本発明によれば、スーパーオキシドジスムターゼ１遺伝子（ＳＯＤ）の発現を阻害するための核酸分子が提供される。特定の実施形態では、核酸分子は、少なくとも１つのエフェクタードメインに作動可能に連結されたアニーリングドメインを含み、アニーリングドメインがＳＯＤ（例えば、イヌまたはヒト）のプレｍＲＮＡにハイブリダイズし、エフェクタードメインがＵ１ ｓｎＲＮＰのＵ１ ｓｎＲＮＡにハイブリダイズする。

【0006】

本発明の別の態様によれば、核酸分子は、ターゲティング部分に（例えば、直接またはリンカーを介して）結合されうる。ターゲティング部分は、内部ヌクレオチド、５’末端および／または３’末端を含む任意の化学的に実施可能な位置に結合されうる（例えば、核酸は、同じまたは異なる２つのターゲティング部分を含んでもよい）。特定の実施形態では、核酸分子はアプタマーに結合される。

【0007】

本発明の別の態様によれば、本発明の核酸分子の少なくとも１つを細胞に送達することを含む、ＳＯＤの発現を阻害するための方法が提供される。

【0008】

本発明の別の態様によれば、本発明の核酸分子の少なくとも１つと、少なくとも１つの薬学的に許容される担体とを含む組成物が提供される。

【0009】

さらに別の態様では、本発明の核酸分子をコードするベクターも提供される。

【0010】

本発明の別の態様によれば、対象における神経変性疾患（例えば、変性性脊髄症（ＤＭ）または筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ））を処置、阻害、および／または予防する方法が提供される。方法は、治療上有効量の少なくとも１つの本発明の核酸分子（例えば、Ｕ１ＡＯまたはＵ１ＡＯをコードするベクター）を、それを必要とする対象に投与することを含む。特定の実施形態では、方法は、複数のＵ１ＡＯを投与することを含む。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1A】図１Ａは、Ｕ１アダプターオリゴヌクレオチドの２つのドメイン：３’末端エクソンの標的遺伝子のプレ－ｍＲＮＡへの塩基対に対するアニーリングドメインおよび内因性Ｕ１ ｓｎＲＮＰの結合を介してプレ－ｍＲＮＡの成熟を阻害するエフェクタードメインを示すＵ１アダプターオリゴヌクレオチドの模式図である。エフェクタードメインの提供される配列は、配列番号１である。

【図1B】図１Ｂは、プレｍＲＮＡを標的とするＵ１アダプターアニーリングの模式図である。エフェクタードメインの配列は配列番号１である。

【図1C】図１Ｃは、Ｕ１アダプターがＵ１ ｓｎＲＮＰを結合し、これによりポリ（Ａ）部位の阻害に至ることを示す模式図である。Ψ＝Ｕ１ ｓｎＲＮＰ中のＵ１ ｓｎＲＮＡのプソイドウリジン。Ｕ１ ｓｎＲＮＰ中のＵ１ ｓｎＲＮＡの提供された配列は、配列番号２である。

【図2】イヌＳＯＤ１に関するＭＤＣＫ細胞での定量的逆転写ＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）分析のグラフを提供する。ｃＤＮＡ量は、５０ｎｇ、２５ｎｇ、１２．５ｎｇ、６．２ｎｇ、３．１ｎｇ、および１．５ｎｇである。

【図3】未処置または２０ｎＭコントロールＵ１ＡＯ、５ｎＭ ｃＳＯＤ１－１、または２０ｎＭ ｃＳＯＤ１－２で処置したＭＤＣＫ細胞におけるイヌＳＯＤ１ ｍＲＮＡの発現を示すグラフである。未処置のＭＤＣＫ細胞におけるイヌＳＯＤ１ ｍＲＮＡの発現を１００％に設定した。発現はイヌＨＰＲＴ１で規格化（ｎｏｒｍａｌｉｚｅ）した。

【図4】未処置、または２０ｎＭコントロールＵ１ＡＯもしくは指示量のｃＳＯＤ１－１もしくはｃＳＯＤ１－２で処置されたＭＤＣＫ細胞におけるイヌＳＯＤ１ ｍＲＮＡの発現を示すグラフである。未処置のＭＤＣＫ細胞におけるイヌＳＯＤ１ ｍＲＮＡの発現を１００％に設定した。発現はイヌＨＰＲＴ１で規格化した。

【図5】未処置または指示量のコントロールＵ１ＡＯ、ｃＳＯＤ１－１もしくはｃＳＯＤ１－２で処置したＭＤＣＫ細胞におけるイヌＳＯＤ１ ｍＲＮＡの発現を示すグラフである。未処置のＭＤＣＫ細胞におけるイヌＳＯＤ１ ｍＲＮＡの発現を１００％に設定した。発現はイヌＨＰＲＴ１で規格化した。

【図6】生理食塩水（コントロール処置、ｎ＝２）またはｃＳＯＤ１－１（ｎ＝４）で処置したイヌの中枢神経系および脊髄領域の異なる領域におけるイヌＳＯＤ１ ｍＲＮＡの発現を示すグラフである。生理食塩水で処置したイヌにおけるイヌＳＯＤ１ ｍＲＮＡ発現量を１００％に設定した。発現はイヌＨＰＲＴ１で規格化した。Ｃｂｌ：小脳、Ｃｔｘ：頭頂葉皮質、Ｈｐｃ：海馬、Ｓｔｒ：線条体、ＳＣ：脊髄、Ｔ：胸部、Ｃ：頸部、Ｌ：腰部。

【図7A】イヌＳＯＤ１におけるＵ１ＡＯの標的部位およびＤＮＡ形式のＵ１ＡＯ配列の例を示す。４および２９行目の標的配列は、それぞれ配列番号１１および８である。１～３行目、５～２８行目、３０～８４行目のターゲット配列は、それぞれ配列番号１２～９３である。ＤＮＡ形式で提供されるＵ１ＡＯ配列は、上から下に配列番号９４～１７７である。

【図7B】イヌＳＯＤ１におけるＵ１ＡＯの標的部位およびＤＮＡ形式のＵ１ＡＯ配列の例を示す。４および２９行目の標的配列は、それぞれ配列番号１１および８である。１～３行目、５～２８行目、３０～８４行目のターゲット配列は、それぞれ配列番号１２～９３である。ＤＮＡ形式で提供されるＵ１ＡＯ配列は、上から下に配列番号９４～１７７である。

【図8A】ヒトＳＯＤ１におけるＵ１ＡＯの標的部位およびＤＮＡ形式のＵ１ＡＯ配列の例を提供する。標的配列は、上から下に配列番号１７８～２９５である。ＤＮＡ形式で提供されるＵ１ＡＯ配列は、上から下に配列番号２９６－４１３である。

【図8B】ヒトＳＯＤ１におけるＵ１ＡＯの標的部位およびＤＮＡ形式のＵ１ＡＯ配列の例を提供する。標的配列は、上から下に配列番号１７８～２９５である。ＤＮＡ形式で提供されるＵ１ＡＯ配列は、上から下に配列番号２９６－４１３である。

【図8C】ヒトＳＯＤ１におけるＵ１ＡＯの標的部位およびＤＮＡ形式のＵ１ＡＯ配列の例を提供する。標的配列は、上から下に配列番号１７８～２９５である。ＤＮＡ形式で提供されるＵ１ＡＯ配列は、上から下に配列番号２９６－４１３である。

【図9】Ｄｏｇ－７３Ａの薬物動態／薬力学（ＰＫ／ＰＤ）データを提供する。上のグラフは、ＣＮＳおよび脊髄の異なる領域におけるＨＰＲＴで規格化したＳＯＤ１の発現レベルを示す。生理食塩水で処置したイヌを１００％に設定した。下のグラフは、ＣＮＳおよび脊髄の異なる領域における総ＲＮＡ当たりのＵ１ＡＯの量を示す。Ｃｂｌ：小脳、Ｃｔｘ：頭頂葉皮質、Ｈｐｃ：海馬、Ｓｔｒ：線条体、ＳＣ：脊髄、Ｔ：胸部、Ｃ：頸部、Ｌ：腰部、ＲＯＢ：脳の残部。

【図10】Ｄｏｇ－７３Ｅの薬物動態／薬力学（ＰＫ／ＰＤ）データを示す。上のグラフは、ＣＮＳおよび脊髄の異なる領域におけるＨＰＲＴで規格化されたＳＯＤ１の発現レベルである。生理食塩水で処置したイヌを１００％に設定した。下のグラフは、ＣＮＳおよび脊髄の異なる領域における総ＲＮＡ当たりのＵ１ＡＯの量を示す。Ｃｂｌ：小脳、Ｃｔｘ：頭頂葉皮質、Ｈｐｃ：海馬、Ｓｔｒ：線条体、ＳＣ：脊髄、Ｔ：胸部、Ｃ：頸部、Ｌ：腰部、ＲＯＢ：脳の残部。

【図11】５日間で単回ＩＴ処置を行ったＤｏｇ－７３Ｃの薬物動態／薬力学（ＰＫ／ＰＤ）データを提供する。上のグラフは、ＣＮＳおよび脊髄の異なる領域におけるＨＰＲＴで規格化されたＳＯＤ１の発現レベルである。生理食塩水で処置したイヌを１００％に設定した。下のグラフは、ＣＮＳおよび脊髄の異なる領域における総ＲＮＡ当たりのＵ１ＡＯの量を示す。Ｃｂｌ：小脳、Ｃｔｘ：頭頂葉皮質、Ｈｐｃ：海馬、Ｓｔｒ：線条体、ＳＣ：脊髄、Ｔ：胸部、Ｃ：頸部、Ｌ：腰部、ＲＯＢ：脳の残部。

【発明を実施するための形態】

【0012】

Ｕ１アダプター（またはＵ１アダプターオリゴヌクレオチド（Ｕ１ＡＯ））は、アンチセンスまたはｓｉＲＮＡとは機構的に異なる、オリゴヌクレオチドを介した遺伝子サイレンシング技術である。Ｕ１アダプターは、ｍＲＮＡの成熟における重要なステップ：３’ポリアデノシン（ｐｏｌｙＡ）テイルの付加を選択的に妨害することによって作用する。ほとんど全てのタンパク質コードｍＲＮＡはポリＡテイルを必要とし、ポリＡテイルが付加されないと、核内で新生ｍＲＮＡが急速に分解され、それによってタンパク質生成物の発現が妨げられる。Ｕ１アダプターは、米国特許第９，４４１，２２１号、米国特許第９，０７８，８２３号、米国特許第８，９０７，０７５号、および米国特許第８，３４３，９４１号（それぞれ参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。Ｕ１アダプターオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ耐性を向上させるための広範な化学修飾およびイメージングのためのタグまたは標的細胞による受容体を介した取り込みのためのリガンドなどの嵩高い基の取り付けを、サイレンシング活性を損なうことなく受け入れることができるため、インビボでの用途に適している。

【0013】

本明細書では、ＳＯＤ、特にＳＯＤ１（例えば、ヒトまたはイヌ）の発現を調節するための方法および組成物が提供される。本方法は、Ｕ１アダプターオリゴヌクレオチド／分子の使用を含む（一般に、図１を参照）。その最も単純な形態では、Ｕ１ＡＯは、２つのドメイン：（１）ＳＯＤ遺伝子のプレｍＲＮＡ（例えば末端エクソンにおける）に対する塩基対に設計されたアニーリングドメインおよび（２）内因性のＵ１ ｓｎＲＮＰと結合して標的プレｍＲＮＡの３’末端形成を阻害するエフェクタードメイン（Ｕ１ドメインとも呼ばれる）を有するオリゴヌクレオチドである。理論に束縛されることなく、Ｕ１アダプターは、内因性のＵ１ ｓｎＲＮＰを遺伝子特異的なプレ－ｍＲＮＡに繋ぎ、その結果、複合体が適切な３’末端形成を阻害する。特に、Ｕ１ ｓｎＲＮＰは、他のスプライセオソーム構成要素に比べて非常に豊富（約１００万／哺乳動物細胞核）であり、化学量論的に過剰である。そのため、内因性のＵ１ ｓｎＲＮＰの滴定することによる悪影響はない。

【0014】

Ｕ１ＡＯは、単独で、または送達試薬（例えば：脂質ベースのトランスフェクション試薬）との複合体で細胞内に入ることができる。また、Ｕ１ＡＯは核内に入ってプレｍＲＮＡに結合することもできる。実際、この特性は、小さな核酸分子では、オリゴが核に入ってプレｍＲＮＡに結合するＲＮａｓｅ Ｈ経路を利用するこれらのアンチセンスアプローチなどですでに確立されている。さらに、アンチセンスオリゴは、核内のプレｍＲＮＡに結合し、変化したスプライシングパターンに導くスプライシング因子のアクセスを立体的にブロックすることが示されている（Ｉｔｔｉｇ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３２：３４６－５３）。

【0015】

特定の実施形態では、Ｕ１アダプター分子のアニーリングドメインは、標的プレｍＲＮＡ（例えば、他のプレｍＲＮＡを除外して）上のターゲティング部分に対して高い親和性および特異性を有するように設計されている。特定の実施形態では、アニーリングドメインが短すぎると親和性が損なわれ、または長すぎると「オフターゲット」効果が促進されるか、もしくは他の細胞経路を変えるため、これらの間でバランスをとらなければならない。さらに、アニーリングドメインは、エフェクタードメインの機能を妨げてはならない（例えば、塩基対形成およびヘアピン形成によって）。Ｕ１ＡＯのアニーリングドメインには、長さに関する絶対的な要件はない。しかし、アニーリングドメインは、典型的には、約１０～約５０ヌクレオチドの長さ、より典型的には、約１０～約３０ヌクレオチドまたは約１０～約２０ヌクレオチドである。特定の実施形態では、アニーリングドメインは、少なくとも約１３または１５ヌクレオチドの長さである。アニーリングドメインは、目的の遺伝子（ＳＯＤ（例えば、イヌまたはヒト））に対して、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、または、より特に、１００％相補的であってもよい。一実施形態では、アニーリングドメインは、３’末端エクソン内のターゲティング部分とハイブリダイズし、これは末端コーディング領域および３’ＵＴＲおよびポリアデニル化シグナル配列（例えば、ポリアデニル化部位を介して）を含む。別の実施形態では、標的配列は、ポリ（Ａ）シグナル配列の約５００塩基対、約２５０塩基対、約１００塩基対、または約５０ｂｐ以内にある。

【0016】

イヌＳＯＤ１の例示的なアミノ酸およびヌクレオチド配列は、例えば、遺伝子ＩＤ：４０３５５９およびジェンバンク受入番号ＮＭ＿００１００３０３５．１およびＮＰ＿００１００３０３５に見出すことができる。ヒトＳＯＤ１の例示的なアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は、例えば、遺伝子ＩＤ：６６４７およびジェンバンク受入番号ＮＭ＿０００４５４およびＮＰ＿０００４４５．１に見出すことができる。

【0017】

Ｕ１ＡＯに対するＳＯＤ内のターゲティング部分は、本明細書において、遺伝子サイレンシングのための選択基準を用いて同定される。図７Ａおよび７Ｂは、最良のスコアを有するＵ１ＡＯに対するイヌＳＯＤ内のターゲティング部分をリストアップしている。特定の実施形態において、アニーリングドメインは、図７Ａ～７Ｂに提供されるターゲティング部分とハイブリダイズする。図８Ａ～８Ｃは、最良のスコアを有するＵ１ＡＯに対するヒトＳＯＤ内のターゲティング部分をリストアップしている。特定の実施形態において、アニーリングドメインは、図８Ａ～８Ｃに提供されるターゲティング部分とハイブリダイズする。特定の実施形態において、アニーリングドメインは、
ＧＣＴＴＧＴＧＧＴＧＴＣＡＴＴＧＧＧＡＴ（配列番号８）または
ＧＡＡＡＣＧＡＧＡＴＧＡＣＴＴＧＧＧＣＡ（配列番号１１）とハイブリダイズする。アニーリングドメインは、図７Ａ～７Ｂもしくは８Ａ～８Ｃまたは配列番号８もしくは配列番号１１、特に配列番号８内の任意の標的配列に対して、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、または、より特に１００％相補的であってもよい。アニーリングドメインは、図７Ａ－７Ｂもしくは８Ａ－８Ｃまたは配列番号８もしくは配列番号１１、特に配列番号８内の任意の標的配列の５’および／または３’末端に、追加のまたはより少ないヌクレオチドを含んでもよい。例えば、アニーリングドメインは、図７Ａ－７Ｂもしくは８Ａ－８Ｃまたは配列番号８または配列番号１１、特に配列番号８（例えば、ＳＯＤ遺伝子の配列から）内の任意の標的配列の５’および／または３’末端に付加された、少なくとも１、２、３、４、５、または最大で１０もしくは２０ヌクレオチドを含んでもよく、または、図７Ａ－７Ｂもしくは８Ａ－８Ｃまたは配列番号８もしくは配列番号１１、特に配列番号８内の任意の標的配列の５’および／または３’末端から少なくとも１、２、３、４、または５ヌクレオチドの欠失を有してもよい。

【0018】

特定の実施形態では、Ｕ１ＡＯのＵ１ドメインは、Ｕ１ ｓｎＲＮＰに高親和性で結合する。特定の実施形態では、Ｕ１ドメインは、内因性Ｕ１ ｓｎＲＮＡのヌクレオチド２～１１に相補的である。特定の実施形態では、Ｕ１ドメインは、５’－ＣＡＧＧＵＡＡＧＵＡ－３’（配列番号１）；５’－ＣＡＧＧＵＡＡＧＵＡＵ－３’（配列番号４）；５’－ＧＣＣＡＧＧＵＡＡＧＵＡＵ－３’（配列番号５）を含む。特定の実施形態では、Ｕ１ドメインは、配列５’－ＣＡＧＧＵＡＡＧＵＡ－３’（配列番号１）を含む。特定の実施形態では、Ｕ１ドメインは、配列５’－ＧＣＣＡＧＧＵＡＡＧＵＡＵ－３’（配列番号５）を含む。別の実施形態では、Ｕ１ドメインは、配列番号１、配列番号４、または配列番号５に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、より特に少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％の同一性を有する。Ｕ１ドメインは、配列番号１、配列番号４、または配列番号５に対する追加のヌクレオチド５’または３’を含んでもよい。例えば、Ｕ１ドメインは、配列番号１、配列番号４、または配列番号５に対して、少なくとも１、２、３、４、５、または最大で１０もしくは２０ヌクレオチド５’または３’を含んでもよい。実際、Ｕ１ドメインの長さを増加させて基部１への塩基対合および／またはＵ１ ｓｎＲＮＡの位置１への塩基対合を含むことで、Ｕ１アダプターのＵ１ ｓｎＲＮＰへの親和性が向上する。エフェクタードメインは、約８ヌクレオチドから約３０ヌクレオチド、約１０ヌクレオチドから約２０ヌクレオチド、または約１０ヌクレオチドから約１５ヌクレオチドの長さであってもよい。例えば、エフェクタードメインは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチドの長さであってもよい。

【0019】

Ｕ１ドメインへの点変異の挿入、すなわち、コンセンサス配列の配列番号１、配列番号４、または配列番号５から逸脱することで、サイレンシングを緩和することができる。実際、コンセンサス配列を変更すると、Ｕ１ ｓｎＲＮＡに対して異なる強度および親和性のＵ１ドメインが生成され、それによって異なるレベルのサイレンシングが導かれる。したがって、目的の遺伝子に対してアニーリングドメインが決定されると、異なる強度の異なるＵ１ドメインをアニーリングドメインに取り付けて、目的の遺伝子の異なるレベルのサイレンシングをもたらすことができる。例えば、ｇＡＧＧＵＡＡＧＵＡ（配列番号３）は、配列番号１よりもＵ１ ｓｎＲＮＰにより弱く結合し、したがって、より低いレベルのサイレンシングを生じるであろう。上述したように、ヌクレオチドアナログは、内因性Ｕ１ ｓｎＲＮＰへの親和性を高めるためにＵ１ドメインに含めることができる。ヌクレオチドアナログの追加は、ヌクレオチドアナログが置換されたヌクレオチドと同じヌクレオチドに結合する場合、点変異とみなされなくてもよい。

【0020】

Ｕ１ＡＯは、ヌクレアーゼに対して耐性となるように改変されうる。特定の実施形態では、Ｕ１ＡＯは、少なくとも１つの非天然ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログを含んでもよい。ヌクレオチドアナログは、アニーリング親和性、特異性、細胞および生物におけるバイオアベイラビリティ、細胞および／もしくは核の輸送、安定性、ならびに／または分解に対する耐性を高めるために使用されうる。例えば、オリゴヌクレオチド内にロックド核酸（ＬＮＡ）塩基を含むことで、オリゴヌクレオチドのそのターゲティング部分へのアニーリングの親和性および特異性が高まることは十分に確立されている（Ｋａｕｐｐｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ Ｔｅｃｈ．，２：２８７－２９０；Ｏｒｕｍ ｅｔ ａｌ，（２００４） Ｌｅｔｔｅｒｓ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｃｉ．，１０：３２５－３３４）。ＲＮＡｉおよびＲＮａｓｅ Ｈベースのサイレンシング技術とは異なり、Ｕ１ＡＯの阻害は酵素活性を含まない。そのため、ＲＮＡｉおよびＲＮａｓｅ Ｈベースのサイレンシング技術のオリゴと比較して、Ｕ１ＡＯに用いることができる許容されるヌクレオチドアナログには、かなり大きな柔軟性がある。

【0021】

ヌクレオチドアナログとしては、限定されないが、１つまたはそれ以上のホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホジエステル、メチルホスホネート、ホスホロアミデート、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロアリデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｒｉｄａｔｅ）、モルホリノ、アミデートカルバメート、カルボキシメチル、アセトアミデート、ポリアミド、スルホネート、スルホンアミド、スルファメート、ホルムアセタール（ｆｏｒｍａｃｅｔａｌ）、チオホルムアセタール（ｔｈｉｏｆｏｒｍａｃｅｔａｌ）、および／またはアルキルシリル置換を含むリン酸塩修飾を有するヌクレオチド（例えば、Ｈｕｎｚｉｋｅｒ ａｎｄ Ｌｅｕｍａｎｎ（１９９５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ｉｎ Ｍｏｄｅｒｎ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ，ＶＣＨ，３３１－４１７；Ｍｅｓｍａｅｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｎｏｖｅｌ Ｂａｃｋｂｏｎｅ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，ｉｎ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＡＣＳ，２４－３９参照）；修飾された糖を有するヌクレオチド（例えば、米国特許出願公開第２００５／０１１８６０５号参照）ならびに２’－Ｏ－メチル（２’－Ｏ－メチルヌクレオチド）、２’－Ｏ－メチルオキシエトキシ、および２’－ハロ（例えば、２’－フルオロ）などの糖修飾を有するヌクレオチド；ならびに、限定されないが、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノ核酸、シクロヘキセニル核酸、アンヒドロヘキシトール核酸、グリコール核酸、トレオース核酸、およびロックド核酸（ＬＮＡ）などのヌクレオチド模倣物（例えば、米国特許出願公開第２００５／０１１８６０５号を参照）が挙げられる。また、他のヌクレオチド修飾は、米国特許第５，８８６，１６５号；同第６，１４０，４８２号；同第５，６９３，７７３号；同第５，８５６，４６２；同第５，９７３，１３６号；同第５，９２９，２２６号；同第６，１９４，５９８号；同第６，１７２，２０９号；同第６，１７５，００４号；同第６，１６６，１９７号；同第６，１６６，１８８号；同第６，１６０，１５２号；同第６，１６０，１０９号；同第６，１５３，７３７号；６，１４７，２００号；同第６，１４６，８２９号；同第６，１２７，５３３号；および同第６，１２４，４４５号に記載されている。特定の実施形態において、Ｕ１ＡＯは、少なくとも１つのロックド核酸を含む。特定の実施形態において、アニーリングドメインは、少なくとも１つのロックド核酸を含む（場合により、エフェクタードメインがロックド核酸を含まない場合）。特定の実施形態では、Ｕ１ＡＯ、特にアニーリングドメインは、２～４ヌクレオチド、特に３ヌクレオチドの間隔をおいてロックド核酸を有する。

【0022】

特に、エフェクタードメインがｍＲＮＡのターゲティング部分またはターゲティング部分のすぐに隣接する部位に大きな親和性を有するＵ１アダプターを設計しないように注意する必要がある。言い換えれば、エフェクタードメインと、標的プレ－ｍＲＮＡ、特にアニーリング部位の上流に隣接する部分との塩基対合可能性が最小になるように、ターゲティング部分を選択する必要がある。

【0023】

また、Ｕ１ＡＯのサイレンシング能力を高めるために、Ｕ１ＡＯは、単一のＵ１アダプター内でのヘアピンの形成、および／または、２つまたはそれ以上のＵ１アダプター間でのホモダイマーもしくはホモポリマーの形成を防ぐように、自己アニーリングが低くなるように設計する必要がある。

【0024】

また、Ｕ１ＡＯのアニーリングドメインおよびエフェクタードメインは、エフェクタードメインがアニーリングドメインの５’末端および／または３’末端にあるように連結されうる。さらに、アニーリングドメインとエフェクタードメインは、リンカードメインを介して作動可能に連結されうる。リンカードメインは、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、最大１５、最大２０、または最大２５のヌクレオチドを含んでもよい。

【0025】

Ｕ１ＡＯは、リボヌクレオチドおよび／またはデオキシヌクレオチドを含んでもよい。本明細書で提供される配列に関して、ウラシル塩基とチミジン塩基とは、交換されうる。特定の実施形態では、Ｕ１ＡＯは、２’－Ｏ－メチルヌクレオチド、２’－Ｏ－メチルオキシエトキシヌクレオチド、２’－ハロ（例えば、２’－フルオロ）、および／またはロックド核酸を含む。特定の実施形態では、Ｕ１ＡＯは、２’－Ｏ－メチルヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、Ｕ１ＡＯは、ホスホロチオエート（例えば、ホスホロチオエートは、２～４ヌクレオチド、特に３ヌクレオチドの間隔を空けてもよい）を含む。

【0026】

特定の実施形態では、Ｕ１ＡＯは、図７Ａ～７Ｂまたは８Ａ～８Ｃに提供されるＵ１ＡＯ（特にＲＮＡ）を含む。特定の実施形態では、Ｕ１ＡＯは以下を含む：
ＡＵＣＣＣＡＡＵＧＡＣＡＣＣＡＣＡＡＧＣＧＣＣＡＧＧＵＡＡＧＵＡＵ（配列番号９）または
ＵＧＣＣＣＡＡＧＵＣＡＵＣＵＣＧＵＵＵＣＧＣＣＡＧＧＵＡＡＧＵＡＵ（配列番号１０）。

【0027】

別の実施形態では、Ｕ１ＡＯは、図７Ａ～７Ｂもしくは８Ａ～８Ｃまたは配列番号９もしくは配列番号１０、特に配列番号９で提供されるＵ１ＡＯ配列と、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、さらに特に少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％またはそれ以上の同一性を有する。本明細書で提供される配列に関しては、ウラシル塩基とチミジン塩基とは、交換されうる。特定の実施形態では、Ｕ１ＡＯは、少なくとも１つまたはすべてのヌクレオチドアナログを含む。特定の実施形態では、Ｕ１ＡＯは、２’－Ｏ－メチルヌクレオチド、２’－Ｏ－メチルオキシエトキシヌクレオチド、２’－ハロ（例えば、２’－フルオロ）、および／またはロックド核酸を含む。特定の実施形態では、Ｕ１ＡＯは、２’－Ｏ－メチルヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、Ｕ１ＡＯは、ホスホロチオエート（例えば、ホスホロチオエートは、２～４ヌクレオチド、特に３ヌクレオチドで間隔を空けてもよい）を含む。特定の実施形態では、Ｕ１ＡＯは、実施例に記載されたように修飾される。

【0028】

本発明の別の実施形態では、目的の遺伝子（ＳＯＤ）を対象とする複数のＵ１ＡＯを用いて発現を調節してもよい。同じプレｍＲＮＡ中の異なる配列への複数のＵ１ＡＯのターゲティング（アニーリング）は、強化された阻害を提供することができる。本発明の組成物は、ＳＯＤ遺伝子を対象とする複数のＵ１ＡＯ（例えば、ＳＯＤ遺伝子内の異なる標的）を含んでもよい。

【0029】

さらに別の実施形態では、Ｕ１ＡＯは、目的の遺伝子の発現を調節する他の方法と組み合わせることができる。例えば、Ｕ１ＡＯは、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどの他の阻害性核酸分子またはＲＮａｓｅ Ｈベースの方法、ＲＮＡｉ、ｍｉＲＮＡ、およびモルフォリノベースの方法と連携して使用して、阻害を強化することができる。Ｕ１ＡＯは、これらの他のアプローチとは異なる機構を利用しているため、組み合わせた使用では、単一の阻害剤の単独での使用と比較して、遺伝子発現の阻害が強化されることになる。実際、Ｕ１ＡＯは核内の生合成ステップを標的としているのに対し、ＲＮＡｉおよびある種のアンチセンスアプローチは、一般的に細胞質での安定性または既存のｍＲＮＡプールの翻訳性を標的としている。

【0030】

本発明の別の態様では、Ｕ１アダプターのエフェクタードメインは、遺伝子発現を調節する多数の核因子のいずれか１つの結合部位と置き換えることができる。例えば、ポリピリミジン管結合タンパク質（ＰＴＢ）の結合部位は短く、ＰＴＢはポリ（Ａ）部位を阻害することが知られている。したがって、エフェクタードメインを親和性の高いＰＴＢ結合部位で置き換えることで、標的遺伝子の発現も抑制することができる。

【0031】

本明細書において上記された標準的なＵ１ ｓｎＲＮＡとは配列が変化したＵ１ ｓｎＲＮＡ遺伝子が存在する。これらのＵ１ ｓｎＲＮＡ遺伝子は、総称してＵ１変異体遺伝子と呼ぶことができる。いくつかのＵ１変異体遺伝子は、ジェンバンク受入番号Ｌ７８８１０、ＡＣ０２５２６８、ＡＣ０２５２６４およびＡＬ５９２２０７ならびにＫｙｒｉａｋｏｐｏｕｌｏｕら（ＲＮＡ（２００６）１２：１６０３－１１）に記載されており、これはヒトゲノム中に２００個近くの潜在的なＵ１ ｓｎＲＮＡ様遺伝子を同定している。これらのＵ１変異体のいくつかは、標準的なＵ１ ｓｎＲＮＡとは異なる５’末端配列を有するため、一つの妥当な機能は、プレｍＲＮＡスプライシングの際に代替スプライスシグナルを認識することである。したがって、本発明のＵ１ＡＯのＵ１ドメインは、本明細書に記載されたように、標準的なＵ１ ｓｎＲＮＡとハイブリダイズするように設計されたＵ１ドメインと同じ方法で、Ｕ１変異体ｓｎＲＮＡの５’末端とハイブリダイズするように設計されうる。次いで、Ｕ１変異体にハイブリダイズするＵ１ＡＯを用いて、目的の遺伝子の発現を調節してもよい。

【0032】

Ｕ１アダプターの技術は、他の既存のサイレンシング技術に比べて多くの利点がある。これらの利点のいくつかは、以下のとおりである。第一に、Ｕ１ＡＯは２つの独立したドメイン：（１）アニーリング（ターゲティング）活性および（２）阻害活性に分かれており、それによって、阻害活性に影響を与えることなくアニーリングを最適化することができ、その逆も同様である。第二に、他の技術と比較して、同じ遺伝子を標的にする２つのＵ１ＡＯを使用すると、相加的、さらに相乗的な阻害が得られる。第三に、Ｕ１ＡＯは新規の阻害機構を有している。したがって、他の方法と組み合わせて使用したときに、適合性があるであろう。第四に、Ｕ１ＡＯは、ポリ（Ａ）テイル付加（３’末端処理とも呼ばれる）という重要でほぼ普遍的なプレｍＲＮＡの成熟ステップを阻害することによって、ｍＲＮＡの生合成を阻害する。

【0033】

本発明の組成物は、本発明の少なくとも１つのＵ１ＡＯと、少なくとも１つの薬学的に許容される担体とを含む。組成物は、目的の遺伝子（ＳＯＤ）の発現を阻害する少なくとも１つの他の薬剤をさらに含んでもよい。例えば、組成物は、目的の遺伝子（ＳＯＤ）に対して向けられた少なくとも１つのｓｉＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドをさらに含んでもよい。

【0034】

本発明のＵ１ＡＯは、裸のポリヌクレオチドとして、単独で、細胞または動物およびヒトを含む生物に投与されうる。Ｕ１ＡＯは、細胞によるその取り込みを促進する薬剤と共に投与されうる。特定の実施形態では、Ｕ１ＡＯは、リポソーム、ナノ粒子、またはポリマー組成物の中に含まれうる。

【0035】

別の実施形態では、Ｕ１ＡＯは、プラスミドまたはウイルスベクターなどの発現ベクターで、細胞またはヒトもしくはイヌを含む動物に送達されうる。例えば、Ｕ１ＡＯは、プラスミドまたはウイルスのようなベクターから発現させることができる。このような短いＲＮＡをプラスミドまたはウイルスから発現させることは常套手段になっており、Ｕ１ＡＯの発現に容易に適応させることができる。ＲＮＡ分子を発現させるための発現ベクターは、構成的または制御されうる強力なプロモーターを使用してもよい。このようなプロモーターは、当技術分野でよく知られており、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、およびＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターＵ６およびＨ１が含まれるが、これらに限定されない。ウイルスを介した送達には、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルス、レンチウイルス、ポリオウイルス、およびヘルペスウイルスなどに基づくベクターの使用が含まれるが、これらに限定されない。

【0036】

本発明の医薬組成物は、任意の適切な経路で投与することができ、例えば、注射（例えば、静脈内、脳室内、および筋肉内）、経口、肺、鼻、直腸、または他の投与方法によって投与することができる。本組成物は、ＳＯＤのダウンレギュレーションによって処置することができる疾患または障害（例えば、ＤＭまたはＡＬＳなどの神経変性疾患）の処置のために投与することができる。本組成物は、インビトロ、インビボ、および／またはエクスビボで使用することができる。エクスビボでの使用に関しては、本発明のＵ１ＡＯ（またはそれを含む組成物）は、自己細胞に送達され（場合により、対象から細胞を得るステップを含む）、その後、対象に再導入されてもよい。また、本発明の組成物、Ｕ１ＡＯ、および／またはベクターは、キットに含まれうる。

【0037】

また、本発明は、対象における疾患または障害（例えば、ＤＭまたはＡＬＳなどの神経変性疾患）を処置、阻害（遅らせるまたは減らす）、および／または予防する方法を包含する。特定の実施形態において、本方法は、治療上有効な量の本発明の少なくとも１つの組成物を、それを必要とする対象（例えば、動物（例えば、イヌ）またはヒト）に投与することを含む。特定の実施形態では、組成物は、本発明の少なくとも１つのＵ１ＡＯと、少なくとも１つの薬学的に許容される担体とを含む。

【0038】

本方法は、標的ＳＯＤ遺伝子の発現を阻害する少なくとも１つの他の薬剤を投与することをさらに含んでもよい。例えば、この方法は、ＳＯＤ遺伝子に対して向けられた少なくとも１つのｓｉＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与をさらに含んでもよい。また、方法は、少なくとも１つの他の治療薬（例えば、疾患または障害（例えば、ＤＭまたはＡＬＳなどの神経変性疾患）に対する症状緩和治療薬（例えば、エダラボン（ラジカヴァ（登録商標））および／またはリルゾール（リルテック（登録商標））））の投与を含んでもよい。特定の実施形態では、治療薬はＵ１ＡＯに結合している（例えば、直接またはリンカーを介して；例えば、３’末端および／または５’末端で）。治療薬は、別々の組成物（例えば、少なくとも１つの薬学的に許容される担体と一緒に）または同じ組成物で投与してもよい。治療薬は、Ｕ１ＡＯと同時におよび／または連続的に投与してもよい。

【0039】

本明細書で述べたように、本発明のＵ１ＡＯは、単独で（裸のポリヌクレオチドとして）投与してもよいし、または細胞によるその取り込みを強化する薬剤と一緒に投与してもよい。特定の実施形態では、Ｕ１ＡＯは、ミセル、リポソーム、ナノ粒子、またはポリマー組成物などの送達ビヒクル内に含まれうる。特定の実施形態では、Ｕ１ＡＯは、デンドリマー、特にポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）デンドリマーおよびポリプロピレンイミン（ＰＰＩ）デンドリマー（例えば、第２世代、第３世代、第４世代、または第５世代）などのカチオン性デンドリマーと複合体形成される（例えば、その中に含まれる、またはそれによってカプセル化される）。特定の実施形態では、Ｕ１ＡＯは、ＰＰＩ－Ｇ２と複合体形成される。

【0040】

特定の実施形態では、Ｕ１ＡＯは、特定の細胞タイプ（例えば、ニューロン）に標的化される。特定の実施形態では、Ｕ１ＡＯは、少なくとも１つのターゲティング部分に共有結合される（例えば、直接またはリンカーを介して）。ターゲティング部分は、５’末端、３’末端、もしくは両末端に、または内部ヌクレオチドに作動可能に連結されうる。特定の実施形態では、１つまたはそれ以上のターゲティング部分が、Ｕ１ＡＯの１つの末端に（例えば、単一のリンカーを介して）結合される。特定の実施形態では、Ｕ１ＡＯを含む複合体（例えば、デンドリマー、ミセル、リポソーム、ナノ粒子、またはポリマー組成物）は、少なくとも１つのターゲティング部分に共有結合される（例えば、直接またはリンカーを介して）。

【0041】

一般に、リンカーは、共有結合またはターゲティング部分などの２つの化合物をＵ１ＡＯまたは複合体に共有結合させる原子の鎖を含む化学的部分である。リンカーは、ターゲティング部分とＵ１ＡＯまたは複合体（ビヒクル）の合成上可能な任意の位置に連結することができる。特定の実施形態では、リンカーは、アミン基および／またはスルフヒドリル／チオール基、特にスルフヒドリル／チオール基を介して、ターゲティング部分とＵ１ＡＯまたは複合体とを連結する。例えば、Ｕ１ＡＯは、１つまたはそれ以上のアミノ基またはチオ基で（例えば、５’末端で）誘導体化されうる。特定の実施形態では、リンカーは、ターゲティング部分またはＵ１ＡＯの活性をブロックすることを回避する位置に取り付けられる。特定の実施形態では、リンカーは、内部ヌクレオチド、５’末端、および／または３’末端に取り付けられる。例示的なリンカーは、少なくとも１つの場合により置換された；飽和または不飽和の；直鎖状、分岐状または環状のアルキル基、または場合により置換されたアリール基を含みうる。また、リンカーは、ポリペプチド（例えば、約１から約２０個のアミノ酸もしくはそれ以上、または１から約５個）であってもよい。リンカーは、生理的環境または条件下で生分解性（切断可能（例えば、ジスルフィド結合を含む））であってもよい。特定の実施形態では、リンカーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（単独または別のリンカーと組み合わせて）を含む。特定の実施形態では、リンカーは、ＬＣ－ＳＰＤＰ（スクシンイミジル６－（３－［２－ピリジルジチオ］－プロピオンアミド）ヘキサノエート）などのＳＰＤＰ（Ｎ－スクシンイミジル３－（２－ピリジルジチオ）－プロピオナート）リンカー、またはＬＣ－ＳＭＣＣ（スクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシ－（６－アミドカプロエート））などのＳＭＣＣ（スクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート）リンカーである。また、リンカーは、非分解性（切断不可能）であってもよく、共有結合または生理的な環境もしくは条件下で実質的に切断されない、もしくは全く切断されない他の化学構造であってもよい。

【0042】

本発明のターゲティング部分は、関連する組織（例えば、神経）または器官（例えば、脳）に優先的に結合する。特定の実施形態では、ターゲティング部分は、標的細胞上で特異的に（例えば、唯一）発現するマーカー、または他の細胞と比較して標的細胞上でアップレギュレートされるマーカーに特異的に結合する。特定の実施形態では、ターゲティング部分は、標的細胞上の表面タンパク質、または標的細胞上で他の細胞、組織、もしくは器官よりも高いレベルで（またはより高い密度で）発現する表面タンパク質に対して免疫学的に特異的な抗体または抗体断片である。また、抗体または抗体断片は、治療用抗体（例えば、それ自体が治療効果を有するもの）であってもよい。特定の実施形態では、ターゲティング部分は、標的細胞上の細胞表面受容体に対するリガンドまたはその結合断片である。特定の実施形態では、ターゲティング部分はアプタマーである。

【0043】

本発明のＵ１ＡＯは、さらに他の望ましい化合物にコンジュゲートしてもよい。例えば、Ｕ１ＡＯは、検出可能な薬剤、治療薬（例えば、モノクローナル抗体、ペプチド、タンパク質、阻害性核酸分子、小分子、化学療法剤など）、キャリアタンパク質、ならびにバイオアベイラビリティ、安定性、および／または吸収を改善する薬剤（例えば、ＰＥＧ）に（直接または上述のリンカーを介して）さらにコンジュゲートしてもよい。追加の化合物は、Ｕ１ＡＯの合成上可能ないずれかの位置に取り付けてもよい（または（例えば、Ｕ１アダプター（例えば、末端または内部ヌクレオチドのいずれか）またはターゲティング部分にコンジュゲートさせる）。あるいは、ターゲティング部分およびＵ１ＡＯは、それぞれ個別に追加の化合物（例えば、キャリアタンパク質）に結合される（このように、追加の化合物は、Ｕ１ＡＯとターゲティング部分との間のリンカーとして機能すると考えることができる）。特定の実施形態では、Ｕ１ＡＯは、一方の末端でターゲティング部分（例えば、ニューロンターゲティング部分）に、そして場合により、もう一方で治療剤にコンジュゲートさせる。好ましくは、追加の化合物の付加は、Ｕ１ＡＯまたはターゲティング部分の活性に著しく影響しない。検出可能な薬剤は、直接的または間接的に、特に直接的に検定することができる任意の化合物またはタンパク質でありうる。検出可能な薬剤としては、例えば、化学発光性、生物発光性、および／または蛍光性の化合物またはタンパク質、イメージング剤、コントラスト剤、放射性核種、常磁性または超常磁性イオン、同位体（例えば、放射性同位体（例えば、^３Ｈ（トリチウム）および^１４Ｃ）または安定同位体（例えば、^２Ｈ（重水素）、^１１Ｃ、^１３Ｃ、^１７Ｏおよび^１８Ｏ））、光学剤、および蛍光剤などが挙げられる。

【0044】

キャリアタンパク質には、アルブミン、血清アルブミン（例えば、ウシ、ヒト）、オバルブミン、およびキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、キャリアタンパク質はヒト血清アルブミンである。キャリアタンパク質（ならびに他のタンパク質またはペプチド）は、任意の合成上可能な位置で（例えば、直接または上述のリンカーを介して）Ｕ１ＡＯ（または複合体）にコンジュゲートされてもよい。例えば、リンカー（例えば、ＰＥＧまたはＬＣ－ＳＰＤＰ）をキャリアタンパク質のリジンに見られる遊離のアミノ基に結合させ、次いで、Ｕ１ＡＯおよびターゲティング部分をリンカーにコンジュゲートさせてもよい。あらゆる未反応のリンカーは、システインでブロックして不活性化してもよい。特定の実施形態では、キャリアタンパク質（例えば、アルブミン）は、ＰＥＧリンカーを介してＵ１ＡＯに結合される。

【0045】

本発明のＵ１ＡＯは、Ｕ１ＡＯを所望の細胞タイプに標的化する、および／またはＵ１ＡＯの細胞取り込みを促進する（例えば、細胞透過性部分）化合物（例えば、抗体、ペプチド、タンパク質、核酸分子、小分子など）に（例えば、直接またはリンカーを介して）コンジュゲートされうる。ターゲティング部分は、５’末端、３’末端、もしくは両末端、または内部ヌクレオチドに作動可能に連結されうる。特定の実施形態では、ターゲティング部分および／または細胞透過性部分は、５’末端および／または３’末端にコンジュゲートされる。特定の実施形態では、ターゲティング部分および／または細胞透過性部分は、５’末端にコンジュゲートされる。特定の実施形態では、Ｕ１ＡＯは、ターゲティング部分および細胞透過性部分の両方にコンジュゲートされる。本明細書では、「細胞透過剤」または「細胞透過性部位」という用語は、細胞外空間から細胞内への化合物の移動を媒介する化合物または官能基を指す。特定の実施形態では、Ｕ１ＡＯはアプタマーにコンジュゲートされる。アプタマーは、所望の細胞タイプの表面化合物またはタンパク質（例えば、受容体）に標的化されうる（例えば、表面化合物またはタンパク質は、標的とする細胞タイプの表面で優先的または排他的に発現されうる）。特定の実施形態では、アプタマーは、細胞透過性アプタマー（例えば、Ｃ１またはＯｔｔｅｒ（例えば、Ｂｕｒｋｅ，Ｄ．Ｈ．（２０１２）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２０：２５１－２５３））参照）である。特定の実施形態では、Ｕ１ＡＯは、細胞透過性ペプチド（例えば、Ｔａｔペプチド（例えば、ＹＧＲＫＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ；配列番号６（場合によりＮ末端でアセチル化されている））、ペネトラチン（例えば、ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＧＧ；配列番号７）、短い両親媒性ペプチド（例えば、Ｐｅｐ－およびＭＰＧ－ファミリーから）、オリゴアルギニン（例えば、４～１２個の連続したアルギニン）、オリゴリジン（例えば、４～１２個の連続したリジン））コンジュゲートされる。特定の実施形態では、Ｕ１ＡＯは、ビオチン（ターゲティング抗体の一部として）または非極性蛍光基（例えば、Ｃｙ３またはＣｙ５などのシアニン）などの小分子、または他の細胞透過性剤にコンジュゲートされる。

【0046】

特定の実施形態では、Ｕ１ＡＯの３’末端および５’末端の少なくとも１つは、遊離ＳＨ基を含む。

【0047】

本明細書に記載されたＵ１ＡＯ（それを含むビヒクルを含む）は、一般に、医薬製剤として患者に投与される。本明細書で使用される用語「患者」および「対象」には、ヒトおよび動物が含まれる。これらのＵ１アダプターは、医師または獣医師の指導の下、治療的に用いることができる。

【0048】

本発明のＵ１ＡＯを含む組成物は、任意の薬学的に許容される担体と共に投与するために都合よく製剤化されうる。例えば、Ｕ１ＡＯは、水、緩衝生理食塩水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、油、洗剤、懸濁剤、またはそれらの適切な混合物などの許容されうる媒体と共に製剤化されうる。選択された媒体中のＵ１ＡＯの濃度は変えてもよく、媒体は、医薬製剤の望ましい投与経路に基づいて選択しうる。なんらかの従来の媒体または薬剤が投与されるＵ１ＡＯと相容れない場合を除き、医薬製剤中のそれらの使用が考えられる。

【0049】

特定の対象への投与に適した本発明によるＵ１ＡＯの用量および投与レジメンは、対象の年齢、性別、体重、一般的な医学的状態、ならびにＵ１ＡＯが投与される特定の状態およびその重症度を考慮して、医師または獣医師が決定することができる。また、医師または獣医師は、投与経路、医薬担体、およびＵ１ＡＯの生物学的活性を考慮してもよい。

【0050】

また、適切な医薬製剤の選択は、選択された投与方法にも依存する。例えば、本発明のＵ１ＡＯは、所望の部位（例えば、脳）への直接注射によって投与されうる。この場合、医薬製剤は、注射部位に適合する媒体中に分散されたＵ１ＡＯを含む。本発明のＵ１ＡＯは、あらゆる方法によって投与することができる。例えば、本発明のＵ１ＡＯは、非経口的に、皮下に、経口的に、局所的に、肺に、直腸に、膣に、静脈内に、脳室内に、頭蓋内に、腹腔内に、髄腔内に、大脳内に、硬膜外に、筋肉内に、皮内に、または頸動脈内に投与することができるが、これらに制限されない。特定の実施形態では、投与方法は、直接注射（例えば、ＣＮＳ、脊椎または脳への）または髄腔内投与である。注射用の医薬製剤は当技術分野で知られている。Ｕ１ＡＯを投与する方法として注射を選択した場合、生物学的効果を発揮するために十分な量の分子または細胞が標的細胞に確実に到達するように手順を踏む必要がある。

【0051】

本発明のＵ１ＡＯを有効成分として薬学的に許容される担体との密接な混合物中の医薬組成物は、従来の医薬配合技術に従って調製することができる。担体は、投与が望まれる製剤の形態、例えば、静脈内、経口、直接注射、頭蓋内、脳室内、髄腔内、および硝子体内の多様な形態をとることができる。

【0052】

本発明の医薬製剤は、投与を容易にし、用量を均一にするために、用量単位形態で製剤化することができる。本明細書で使用する用量単位形態とは、処置を受ける患者に適した医薬製剤の物理的に離散した単位を意味する。各用量は、選択された医薬担体と共同して所望の効果をもたらすように計算された活性成分の量を含まなければならない。適切な用量を決定するための手順は、当業者によく知られている。

【0053】

用量単位は、患者の体重に基づいて比例的に増加または減少させることができる。特定の病理学的状態の緩和のための適切な濃度は、当技術分野で知られているように、用量濃度曲線の計算によって決定されうる。

【0054】

本発明に従って、Ｕ１ＡＯの投与のための適切な用量単位は、動物モデルにおける分子または細胞の毒性を評価することによって決定されうる。医薬製剤中の様々な濃度のＵ１ＡＯをマウスに投与し、処置の結果として観察された有益な結果および副作用に基づいて、最小および最大用量が決定されうる。また、他の標準的な薬物と組み合わせたＵ１ＡＯ処置の有効性を評価することによって、適切な用量単位が決定されうる。Ｕ１ＡＯの用量単位は、検出された効果に応じて個別に、または各処置と組み合わせて決定されうる。

【0055】

Ｕ１ＡＯを含む医薬製剤は、適切な間隔で、例えば、病的な症状が軽減または緩和されるまで、少なくとも１日２回またはそれ以上投与し、その後、用量を維持レベルまで減少させてもよい。適切な間隔は、通常、患者の状態によって異なる。

【0056】

定義
単数形の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上明らかに別のことを示す場合を除き、複数形の言及を含む。

【0057】

本明細書で使用される「核酸」または「核酸分子」とは、一本鎖または二本鎖のいずれかのあらゆるＤＮＡまたはＲＮＡ分子、および一本鎖の場合、直鎖状または環状形態のいずれかの相補的配列の分子を指す。核酸分子を議論する際、特定の核酸分子の配列または構造は、５’から３’方向に配列を提供する通常の慣例に従って、本明細書に記載することができる。本発明の核酸については、用語「単離された核酸」が用いられることがある。この用語は、ＤＮＡに適用される場合、それが起源となった生物の自然発生的なゲノム中で直接的に隣接する配列から分離されたＤＮＡ分子を意味する。例えば、「単離された核酸」は、プラスミドもしくはウイルスベクターなどのベクターに挿入された、または原核細胞もしくは真核細胞もしくは宿主生物のゲノムＤＮＡに組み込まれたＤＮＡ分子を含んでもよい。

【0058】

ＲＮＡに適用される場合、用語「単離された核酸」は、上記で定義された単離されたＤＮＡ分子によってコードされたＲＮＡ分子を指すことがある。あるいは、この用語は、自然な状態（すなわち、細胞または組織内）で会合している他の核酸から十分に分離されたＲＮＡ分子を指すこともある。単離された核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）は、さらに、生物学的または合成的手段によって直接生成され、その生成中に存在する他の成分から分離された分子を表すこともある。

【0059】

「ベクター」とは、プラスミド、コスミド、バクミド、ファージ、ウイルスなどの遺伝因子であり、これに別の遺伝子配列または遺伝因子（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）を取り付けてもよい。ベクターは、取り付けた配列または因子の複製をもたらすように、レプリコンであってもよい。

【0060】

「発現オペロン」とは、プロモーター、エンハンサー、翻訳開始シグナル（例えば、ＡＴＧまたはＡＵＧコドン）、ポリアデニル化シグナル、ターミネーターなどの転写および翻訳制御配列を有していて、宿主細胞または生物における核酸またはポリペプチドコード配列の発現を促進することができる核酸セグメントのことである。「発現ベクター」とは、宿主細胞または生物における核酸またはポリペプチドコード配列の発現を促進するベクターのことである。

【0061】

本明細書で使用する用語「オリゴヌクレオチド」は、本発明の核酸配列、プライマー、およびプローブのことであり、２つまたはそれ以上のリボまたはデオキシリボヌクレオチド、好ましくは３つより多いリボまたはデオキシリボヌクレオチドで構成される核酸分子として定義される。オリゴヌクレオチドの正確なサイズは、様々な要因ならびにオリゴヌクレオチドの特定の用途および使用方法によって異なる。

【0062】

語句「低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）」とは、短い（典型的には３０ヌクレオチド未満の長さ、より典型的には約２１～約２５ヌクレオチドの長さ）二本鎖ＲＮＡ分子のことである。典型的には、ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡが標的とする遺伝子の発現を調節する。「低分子ヘアピン型ＲＮＡ」または「ｓｈＲＮＡ」という用語は、ｓｉＲＮＡと、少なくとも１つ、典型的には１～１０ヌクレオチドの一本鎖ループ部分を含むヘアピン構造に折り畳まれた単一のＲＮＡ分子であるｓｉＲＮＡ前駆体のことである。

【0063】

用語「ＲＮＡ干渉」または「ＲＮＡｉ」は、一般に、二本鎖ＲＮＡを介して標的分子（例えば、標的遺伝子、タンパク質またはＲＮＡ）がダウンレギュレートされる、配列特異的または選択的なプロセスのことである。典型的にＲＮＡｉ活性を促進する二本鎖ＲＮＡ構造は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、およびＲＮＡ干渉によって標的転写物の発現を阻害する低分子ＲＮＡ種を得るために処理することができる他の二本鎖構造である。

【0064】

用語「アンチセンス」は、ワトソン－クリック塩基対によってＲＮＡ中の標的配列にハイブリダイズして、標的配列、典型的にはｍＲＮＡと共にＲＮＡ：オリゴヌクレオチドヘテロ二本鎖を形成する配列を有するオリゴヌクレオチドのことである。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的配列に対して正確な配列相補性または近い相補性を有してもよい。これらのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡの翻訳をブロックまたは阻害し、および／または、ｍＲＮＡの処理を変更してｍＲＮＡのスプライスバリアントを生成することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、典型的には、約５～約１００ヌクレオチドの長さであり、より典型的には、約７～約５０ヌクレオチドの長さであり、さらに典型的には、約１０ヌクレオチド～約３０ヌクレオチドの長さである。

【0065】

用語「実質的に純粋」とは、所定の物質（核酸、オリゴヌクレオチド、タンパク質など）を少なくとも５０～６０重量％含む調製物のことである。より好ましくは、調製物は、所定の化合物を少なくとも７５重量％、最も好ましくは９０～９５重量％含む。純度は、所定の化合物に適した方法（例えば、クロマトグラフィー法、アガロースまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＨＰＬＣ分析など）によって測定される。

【0066】

用語「単離された」は、それが自然に会合している他の化合物から十分に分離された化合物または複合体のことでありうる。「単離された」とは、他の化合物もしくは物質との人工的もしくは合成的な混合物、または基本的な活性もしくはその後のアッセイを妨げない、例えば、不完全な精製もしくは安定剤の添加のために存在しうる不純物の存在を排除することを意味するわけではない。

【0067】

用語「遺伝子」は、エクソンおよび（場合により）イントロン配列の両方を含むポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む核酸のことである。また、核酸は、プロモーター配列またはエンハンサー配列などの非コーディング配列を含むこともありうる。用語「イントロン」とは、タンパク質に翻訳されずに、一般的にエクソンの間に見出される特定の遺伝子中に存在するＤＮＡ配列のことである。

【0068】

本明細書に使用する場合、用語「アプタマー」は、ワトソン－クリック塩基対合以外の相互作用により、タンパク質などの標的に特異的に結合する核酸のことである。特定の実施形態では、アプタマーは、サンプル中の他の分子を全般的に除外して、１つまたはそれ以上の標的（例えば、タンパク質またはタンパク質複合体）に特異的に結合する。アプタマーは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、修飾核酸、またはそれらの混合物などの核酸であってもよい。また、アプタマーは、直鎖状または環状の核酸であってもよく、一本鎖または二本鎖であってもよい。アプタマーは、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０またはそれ以上の長さのオリゴヌクレオチドを含んでもよい。アプタマーは、最大４０、最大６０、最大８０、最大１００、最大１５０、最大２００またはそれ以上のヌクレオチドの長さの配列を含んでもよい。アプタマーは、約５～約１５０ヌクレオチド、約１０～約１００ヌクレオチド、または約２０～約７５ヌクレオチドの長さであってもよい。本明細書では、アプタマーは核酸分子（例えば、オリゴヌクレオチド）アプタマーとして議論するが、ペプチドアプタマーなど、核酸アプタマーの代わりにアプタマー等価物を使用することもできる。

【0069】

本明細書で使用される語句「作動可能に連結された」は、別の核酸配列と機能的な関係に置かれた核酸配列のことでありうる。作動可能に連結されうる核酸配列の例としては、プロモーター、転写ターミネーター、エンハンサーまたはアクチベーター、および転写され、適切な場合、翻訳されたときに、タンパク質、リボザイムまたはＲＮＡ分子などの機能的産物を産生する異種遺伝子が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。

【0070】

「薬学的に許容される」とは、連邦政府または州政府の規制当局による承認を示す。「薬学的に許容される」薬剤は、米国薬局方または他の一般に認められた薬局方において、動物、より詳しくはヒトへの使用について記載されてもよい。

【0071】

「担体」とは、例えば、本発明の活性剤が投与される希釈剤、防腐剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバント、賦形剤、補助剤またはビヒクルのことである。このような医薬用担体は、水および油などの無菌液体であることができ、ピーナッツ油、ダイズ油、鉱物油、ゴマ油などの石油、動物、植物、合成由来のものを含む。また、水または生理食塩水、デキストロースおよびグリセロール水溶液は、担体として用いることができる。適当な医薬用担体は、例えば、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎの「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載されている。

【0072】

「抗体」または「抗体分子」とは、特定の抗原に結合する抗体およびその断片（例えば、免疫学的に特異的な断片）を含む、あらゆる免疫グロブリンである。本明細書で使用する場合、抗体または抗体分子は、無傷の免疫グロブリン分子、免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分の融合体を企図している。この用語には、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、シングルドメイン（Ｄａｂ）、および二重特異性抗体が含まれる。本明細書で使用する場合、抗体または抗体分子は、組換え生成された無傷の免疫グロブリン分子ならびに限定されるわけではないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ｖ）、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ２、およびｓｃＦｖ－Ｆｃなどの免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分を企図している。

【0073】

抗体に関しては、用語「免疫学的に特異的」とは、目的のタンパク質または化合物の１つまたはそれ以上のエピトープに結合するが、抗原性生物学的分子の混合集団を含む試料中の他の分子を実質的に認識および結合しない抗体のことである。

【0074】

用語「処置する」とは、化合物が患者の疾患を緩和、軽減、および／または進行を遅らせる能力のことである。言い換えれば、用語「処置する」は、疾患の進行を抑制および／または逆転させることである。

【0075】

以下の実施例は、本発明を実施する例示的な方法を説明するものであり、本発明の範囲をいかなる形でも限定することを意図していない。

【0076】

実施例１
ここでは、Ｕ１アダプターオリゴヌクレオチド（Ｕ１ＡＯ）技術を用いて、イヌにおける中枢神経系（ＣＮＳ）のＳＯＤ１発現を、髄腔内投与後にサイレンシングした。

【0077】

強力な抗ＳＯＤ１ Ｕ１ＡＯを同定するための予備的なｉｎ ｖｉｔｒｏ研究を行った。インビトロ試験には、メイディン－ダービーイヌ腎臓（Ｍａｄｉｎ－Ｄａｒｂｙ Ｃａｎｉｎｅ Ｋｉｄｎｅｙ）（ＭＤＣＫ）細胞を用いた。ＭＤＣＫ細胞は、正常な成体メスのコッカースパニエルの腎臓に由来する、広く使用されている不死化イヌ細胞株である。図２は、イヌＳＯＤ１に関するＭＤＣＫ細胞の定量的逆転写ＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）分析を提供する。図２に示す結果は、ＳＯＤ１のサイレンシングを検出できる十分なレベルでＳＯＤ１のｍＲＮＡがＭＤＣＫ細胞で発現していることを示しており、ＲＴ－ｑＰＣＲ法はＳＯＤ１遺伝子の発現レベルの定量的評価を提供する。

【0078】

図３は、２つの抗ＳＯＤ１ Ｕ１ＡＯが、未処置（１００％に設定）およびコントロール処置したＭＤＣＫ細胞と比較して、イヌのＳＯＤ１発現を約２５％までサイレンシングすることを示している。簡潔には、２×１０^５個のＭＤＣＫ細胞を、２０ｎＭコントロールＵ１ＡＯ、５ｎＭ ｃＳＯＤ１－１、または２０ｎＭ ｃＳＯＤ１－２でモックトランスフェクション（ｍｏｃｋ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔ）またはトランスフェクションした。トランスフェクションの２４時間後、イヌＳＯＤ１ ｍＲＮＡ発現に関してＲＴ－ｑＰＣＲ分析を行った。発現をイヌＨＰＲＴ１に対して規格化した。図３に見られるように、ｃＳＯＤ１－１はｃＳＯＤ１－２よりも強力／効果的であった。

【0079】

ｃＳＯＤ１－１ Ｕ１ＡＯの配列は、
ＡＵＣＣＣＡＡＵＧＡＣＡＣＣＡＣＡＡＧＣＧＣＣＡＧＧＵＡＡＧＵＡＵ（配列番号９）であり、ここで、すべてが２’Ｏ－メチル修飾を有するＲＮＡ塩基である。

【0080】

ｃＳＯＤ１－２ Ｕ１ＡＯの配列は、
ＵＧＣＣＣＡＡＧＵＣＡＵＣＵＣＧＵＵＵＣＧＣＣＡＧＧＵＡＡＧＵＡＵ－（ＰＥＧ_１２）－アルブミン（配列番号１０）であり、ここで、全てが２’Ｏ－メチル修飾を有するＲＮＡ塩基である。

【0081】

図４は、ｃＳＯＤ１－１またはｃＳＯＤ１－２を用いた用量反応グラフである。簡潔には、ＭＤＣＫ細胞を２０ｎＭコントロールＵ１ＡＯまたは様々な量のｃＳＯＤ１－１もしくはｃＳＯＤ１－２でモックトランスフェクションまたはトランスフェクションした。トランスフェクションの２４時間後、イヌＳＯＤ１ ｍＲＮＡの発現についてＲＴ－ｑＰＣＲ分析を行った。発現をイヌＨＰＲＴ１で規格化し、未処置の発現を１００％に設定した。図４に見られるように、ｃＳＯＤ１－１またはｃＳＯＤ１－２のいずれかの量を増加させると、イヌＳＯＤ１ ｍＲＮＡのサイレンシングにおいて用量依存的に増加した。

【0082】

図５は、ｃＳＯＤ１－１またはｃＳＯＤ１－２を用いたさらなる用量反応グラフを提供する。簡潔には、ＭＤＣＫ細胞をモックトランスフェクションするか、さまざまな量のコントロールＵ１ＡＯ、ｃＳＯＤ１－１、またはｃＳＯＤ１－２をトランスフェクションした。トランスフェクションの２４時間後、イヌＳＯＤ１ ｍＲＮＡの発現についてＲＴ－ｑＰＣＲ分析を行った。発現をイヌのＨＰＲＴ１で規格化し、未処置の発現を１００％に設定した。図５に見られるように、ｃＳＯＤ１－１またはｃＳＯＤ１－２のいずれかの量を減少させると、最終的に、イヌＳＯＤ１ ｍＲＮＡの有意なサイレンシングが失われた。

【0083】

図３－５に示したデータに基づき、ホスホロチオエート基を用いたインビトロ分析のためにｃＳＯＤ１－１を選択し、元のｃＳＯＤ１－１と区別するために、抗ＳＯＤ１ Ｕ１ＡＯと再命名した。抗ＳＯＤ１ Ｕ１ＡＯを、適切な量および純度で製造し、エンドトキシンを含まないことを保証してから、以下に述べるようにイヌで使用した。ホスホロチオエートを加えることで、生体内で使用するときにヌクレアーゼ耐性が向上する。抗ＳＯＤ１ Ｕ１ＡＯの配列は、
Ａ^＊Ｕ^＊ＣＣＣＡ^＊ＡＵＧＡ^＊ＣＡＣＣ^＊ＡＣＡＡ^＊ＧＣＧＣ^＊ＣＡＧＧ^＊ＵＡＡＧ^＊Ｕ^＊Ａ^＊Ｕ（配列番号９）であり、ここで、全てが２’Ｏ－メチル修飾されたＲＮＡ塩基であり、^＊はホスホロチオエートを示す。Ｕ１ＡＯは、その３’末端で－（ＰＥＧ_１２）－アルブミンにコンジュゲートされうる。

【0084】

体重６～８ｋｇの若い健康なビーグル６匹（オス３匹、メス３匹）に、理学的および神経学的検査を行い、常用の血清生化学パネルおよび全血球計算を実施した。一度に２匹のイヌを評価し、次の２匹に移る前に完全なデータ解析により、結果に基づいて投与量およびプロトコルの調整を確実にできるようにした。イヌに麻酔をかけ、腰椎５／６間隙で腰椎穿刺を行い、常用ＣＳＦ分析のため脳脊髄液（ＣＳＦ）サンプルを採取した。５日後にイヌを屠殺した。

【0085】

最初の２匹では、一方のイヌにはビヒクルを、もう一方のイヌには１０ｍｇの抗ＳＯＤ１ Ｕ１ＡＯをゆっくり注入するために小児硬膜外カテーテルを腰椎穿刺部位から髄腔内に留置した。両方のイヌでは、注入された量は２ｍＬであり、さらに０．６ｍＬが注入装置で失われた。これらの小さなカテーテルのねじれの問題のため、それらを引き抜き、２０ゲージの脊髄針から１０分間かけて注射を行った。イヌは、麻酔から回復し、実行に戻った。イヌを１日２回評価（理学的および神経学的検査）し、血液検査を２日後、そして５日目の人道的な安楽死の時に再び繰り返した。腰部、胸部および頸部の脊髄ならびに脳を直ちに解剖し、ＲＮＡｌａｔｅｒ（登録商標） ＲＮＡ Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）に入れた。また、肝臓、腎臓および脾臓のサンプルも入手した。凍結したサンプルは、後にＳＯＤ１およびヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１（ＨＰＲＴ１；ハウスキーピング遺伝子）についてＲＴ－ｑＰＣＲによって分析した。残りの組織を１０％ホルマリンに入れ，３～５日後にパラフィン包埋するためにトリミングし、切片にし、ヘマトキシリン－エオシンで染色して、病理組織学的検査を行った。これらの２匹のイヌは、臨床的にも、血液検査においても、または病理組織学的にも、処置による顕著な影響を受けなかった。コントロールイヌと比較すると、脊髄でのＳＯＤ１の発現レベルは４５％に減少したが、脳での発現には変化がなかった。

【0086】

次の２匹のイヌでは、同じプロトコルを繰り返したが（コントロール１匹、Ｕ１ＡＯ１匹）、投与方法を改良して、シリンジおよびカテーテルからＵ１ＡＯをより効率的に髄腔内に流すことができた。簡潔には、２０ゲージの脊髄注射針を短い器具に取り付け、これを次にフィルターおよび三方活栓に取り付けた。Ｕ１ＡＯを三方活栓に装着した一方のシリンジに入れ、リン酸緩衝生理食塩水を三方活栓に装着した別のシリンジに入れた。このリン酸緩衝生理食塩水により、すべての治療薬を髄腔内の空間に注入することができた。注入後、イヌは頭を下にして約３０°の角度で１５分間傾け、重力によって脳脊髄軸に沿って薬物が広がるようにした。この処置は、各イヌに２．６ｍＬ（治療薬を投与したイヌにおいて１３ｍｇのＵ１ＡＯ）投与されたことを意味する。再び、この処置は、副作用がなく、極めて高い耐用性を示し、新たな注入プロトコルでは、脊髄に沿って３５％、小脳では５５％、海馬では７４％の発現レベルまでサイレンシングが改善された。

【0087】

これらの結果を受けて、最後の２匹のイヌの両方には、改良されたプロトコルを用いて１０ｍｇの抗ＳＯＤ１ Ｕ１ＡＯを投与した。両者ともに有害事象はなく、病理組織学的にも正常であった。達成されたＳＯＤ１サイレンシングのレベルは、改良された方法を用いた以前のイヌと同等であった。

【0088】

図６は、抗ＳＯＤ１ Ｕ１ＡＯで処置したすべてのイヌのＳＯＤ１発現データをまとめたものである。脊髄に沿った平均ＳＯＤ１サイレンシングは、脳脊髄軸において吻側に移行してサイレンシングのレベルが徐々に低下し、３０～４０％から、頭頂皮質では８０％の範囲であった。病理は主に脊髄に集中しているので（Ｂｒａｕｎｄ，ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．（１９７８）３９（８）：１３０９－１３１５；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｓｍａｌｌ Ａｎｉｍ．Ｐｒａｃｔ．（１９７５）１６（８）：４６１－４７１；Ｍａｒｃｈ ｅｔ ａｌ．，（２００９）Ｖｅｔ Ｐａｔｈｏｌ．４６（２）：２４１－２５０）、二次的に脳幹核（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｖｅｔ．Ｒｅｃ．（２０００）１４６（２２）：６２９－６３３）、臨床的に関連するＳＯＤ１のサイレンシングが生成された。

【0089】

実施例２
図６で使用された抗ＳＯＤ１ Ｕ１ＡＯは、自然に発生した変性性脊髄症を有するペット所有されたイヌに安全に投与することができるかどうかを確立するために、前向きの第１相臨床試験を行った。本試験では、抗ＳＯＤ１ Ｕ１ＡＯを月１回髄腔内に（ＩＴ）投与したが、２ヶ月に１回の頻度で２倍の用量のＩＴに変更する選択肢があった。全体的な目的は、臨床徴候、血液検査およびＣＳＦパラメータならびに明らかな変化をモニタリングし、疾患の進行をモニタリングすることによって、この処置の安全性を判断することであった。

【0090】

本研究では、以下のパラメータに基づいて募集した４匹のイヌを含んだ。イヌは＞８歳であり、臨床的に局所性脊髄症の所見がない（脊髄痛または皮膚リンパ本幹反射カットオフ（ｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｔｒｕｎｃｉ ｒｅｆｌｅｘ ｃｕｔ ｏｆｆ）がない）不全対麻痺であり、血液検査および胸部Ｘ線写真が正常で、変性性脊髄症に関連するＳＯＤ１変異の検査が陽性であった。また、イヌが同様の臨床症状を呈する可能性のある脊髄新生物、脊髄炎、椎間板疾患を併発していないことを確認するために、イヌにＭＲＩおよびＣＳＦ分析を行った。さらに、各飼い主は、ＩＴ処置の前日にイヌを病院に連れて行き、処置の間は病院にいて、次いで処置の翌日にイヌを退院させるために、月に数日の時間を割く必要があった。

【0091】

試験のエンドポイントは、飼い主が個人的な理由でやめるか、または病気の進行により同情的な理由でイヌを安楽死させるかのいずれかを選択したときであった。飼い主は、入院、処置、分析、抗ＳＯＤ１ Ｕ１ＡＯ試験化合物を含む、試験のあらゆる態様に関わる費用を負担しなかった。

【0092】

本研究を通じて、副作用のエビデンスに関して、理学的および神経学的検査、血清生化学パネル、全血球計算ならびにＣＳＦ分析によって月に１回イヌをモニターした。その神経学的機能は、確立され順序付けられた歩行運動および固有受容性感覚方法論を用いて月１回評価した。飼い主が病気の進行により個人的または同情的な理由で安楽死を選択した場合は、組織および血清を分析し、１）ＲＴ－ｑＰＣＲ（図６の生理食塩水のイヌを１００％に設定した）および免疫組織化学を用いたＳＯＤ１発現の定量化、および２）ノーザンブロット分析を用いた組織および血清中の抗ＳＯＤ１ Ｕ１ＡＯの量の決定、を含むＰＫ／ＰＤデータを得ることになった。

【0093】

月１回投与では、投与された量は、１．５ｍｇの抗ＳＯＤ１ Ｕ１ＡＯ／体重ｋｇであった。２カ月に１回の投与では、用量を２倍の３．０ｍｇの抗ＳＯＤ１ Ｕ１ＡＯ／ｋｇ体重にした。ＩＴ処置は、実施例１に記載したプロトコルに従った。

【0094】

最初に、ＤＭを有する２匹のイヌを募集し、Ｄｏｇ－７３ＡおよびＤｏｇ－７３Ｂと名付けた。Ｄｏｇ－７３Ａ（約１１ｋｇ、コーギー、オス）は、６ヶ月間の処置の後、２ヶ月間の間隔で２倍の用量の処置を受けた。個人的な理由により、飼い主はＤｏｇ－７３Ａを安楽死させることを選択し、これは最終処置の約１０週間後に行った。組織を採取し、ＰＫ／ＰＤ分析を行い、結果を図９にまとめた。

【0095】

Ｄｏｇ－７３Ｂ（約３２ｋｇ、ジャーマンシェパード、オス）は６ヶ月間の処置を受け、その後、現在まで２ヶ月間隔で２倍用量の処置を受けている。Ｄｏｇ－７３Ｂは、現在、処置の１６ヶ月目にいる。

【0096】

Ｄｏｇ－７３Ａおよび７３Ｂの両方では、有害事象は発生せず、両イヌの神経学的徴候はゆっくりと進行している。

【0097】

投与量および安全性に関する十分なデータを得て、必要に応じて投与速度および投与間隔を調整する目的で、Ｄｏｇ－７３ＡおよびＤｏｇ－７３Ｂと比べて、Ｄｏｇ－７３ＥおよびＤｏｇ－７３Ｆと称する２匹のイヌの募集を遅らせた。

【0098】

Ｄｏｇ－７３Ｅ（約１０ｋｇ、ジャックラッセルミックス、メス）は、３０日間隔で２回処置した後、２ヶ月間隔で２回の２倍用量処置を行った。個人的な理由により、飼い主はＤｏｇ－７３Ｅを安楽死させることを選択し、最終処置の約９週間後に行った。組織を採取し、ＰＫ／ＰＤ解析を行い、結果を図１０にまとめた。

【0099】

Ｄｏｇ－７３Ｆ（約２２ｋｇ、イヌ種非公表、オス）は、１ヶ月間隔の治療を２回行った後、現在まで２ヶ月間隔で２倍用量の処置を行っている。Ｄｏｇ－７３Ｆは、現在、処置の９ヶ月目である。

【0100】

４匹すべてのイヌについて、有害事象は観察されず、イヌの神経学的徴候はゆっくりと進行した。Ｄｏｇ－７３ＢおよびＤｏｇ－７３Ｆは、動き回るために後四半身のサポートを必要とする疾患のステージ２のままで、どちらも臨床症状のゆるやかな進行のみを示した。疾患の進行は、処置を受けていない典型的なイヌに比べて著しく遅く、それらは、この間に少なくともステージ３まで進行すると予想されていた。また、Ｄｏｇ－７３ＡおよびＤｏｇ－７３Ｅは、安楽死までの処置期間中、疾患のステージ２のままであった。

【0101】

上記に加えて、ほぼ完全に麻痺した末期のＤＭイヌ（ステージ４）を用いて、飼い主が５日間の単回投与によるＰＫ／ＰＤ試験に同意した別の単回イヌ試験、Ｄｏｇ－７３Ｃ（約２１ｋｇ、イヌ種非公表、オス）を実施した。ＰＫ／ＰＤデータに加えて、この試験では、この処置が末期のイヌに使用しても安全であるかどうかを評価することができた。１．５ｍｇ／ｋｇ体重の用量での単回ＩＴ処置後、有害事象は発生せず、５日間の継続後、Ｄｏｇ－７３Ｃを安楽死させ、組織を採取し、ＰＫ／ＰＤの結果を図１１にまとめた。

【0102】

本発明の好ましい実施形態の一部を説明し、具体的に例示してきたが、本発明がこのような実施形態に限定することを意図するものではない。以下の特許請求の範囲に記載されているように、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、様々な変更をそれに加えることができる。

【0103】

本発明が関連する当技術分野の状態をより十分に説明するために、いくつかの出版物および特許文書が前述の明細書に引用されている。これらの引用文献のそれぞれの開示内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7A】

【図7B】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図9】

【図10】

【図11】

【配列表】

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【国際調査報告】