特表 2022-520886 第ＶＩＩ因子療法のための組成物、デバイス及び方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-04-01

(54)【発明の名称】第ＶＩＩ因子療法のための組成物、デバイス及び方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/12 20060101AFI20220325BHJP

   A61P 7/04 20060101ALI20220325BHJP

   A61K 35/30 20150101ALI20220325BHJP

   A61K 9/48 20060101ALI20220325BHJP

   A61K 38/36 20060101ALI20220325BHJP

   A61K 47/42 20170101ALI20220325BHJP

   A61K 47/36 20060101ALI20220325BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20220325BHJP

   C12N 15/14 20060101ALI20220325BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20220325BHJP

   C12N 15/113 20100101ALI20220325BHJP

【ＦＩ】

C12N15/12

A61P7/04

A61K35/30

A61K9/48

A61K38/36

A61K47/42

A61K47/36

C12N5/10 ZNA

C12N15/14

C12N15/62 Z

C12N15/113 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021557393

(86)(22)【出願日】2020-03-27

(85)【翻訳文提出日】2021-11-17

(86)【国際出願番号】 US2020025511

(87)【国際公開番号】W WO2020198695

(87)【国際公開日】2020-10-01

(31)【優先権主張番号】62/824,963

(32)【優先日】2019-03-27

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/907,386

(32)【優先日】2019-09-27

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】519118164

【氏名又は名称】シギロン セラピューティクス， インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＳＩＧＩＬＯＮ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ， ＩＮＣ．

(74)【代理人】

【識別番号】100107456

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 成人

(74)【代理人】

【識別番号】100162352

【弁理士】

【氏名又は名称】酒巻 順一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100123995

【弁理士】

【氏名又は名称】野田 雅一

(72)【発明者】

【氏名】バーニー， ローレン エミリー

(72)【発明者】

【氏名】ボウレガード， マイケル

(72)【発明者】

【氏名】カルモナ， ギヨーム

(72)【発明者】

【氏名】ゴンザレス， フランシスコ キャバレロ

(72)【発明者】

【氏名】ハイデブレクト， リチャード

(72)【発明者】

【氏名】ジョンストン， エリカ エレン

(72)【発明者】

【氏名】ミラー， ロバート ジェームズ

(72)【発明者】

【氏名】オコナー， オーウェン

(72)【発明者】

【氏名】オベルリ， マティアス アレクサンダー

(72)【発明者】

【氏名】ペリット， デイビッド

(72)【発明者】

【氏名】スウェル， ジャレッド エー．

(72)【発明者】

【氏名】スミス， デヴィン マッキンリー

(72)【発明者】

【氏名】ヴィーシャ， オミッド

(72)【発明者】

【氏名】ウォットン， ポール ケヴィン

(72)【発明者】

【氏名】イン， ゾエ

【テーマコード（参考）】

4B065

4C076

4C084

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AB01

4B065BA02

4B065BD06

4B065BD50

4B065CA44

4C076AA09

4C076AA53

4C076CC14

4C076EE36H

4C076EE41H

4C076FF68

4C084AA01

4C084CA53

4C084DC14

4C084MA37

4C084NA10

4C084ZA541

4C084ZA542

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB56

4C087BB65

4C087CA04

4C087MA37

4C087MA67

4C087NA10

4C087ZA53

(57)【要約】

ＦＶＩＩタンパク質を分泌するように組み換えられたＲＰＥ細胞、並びに組み換えＲＰＥ細胞を含む組成物、医薬製剤、及び移植可能なデバイス、並びに血友病若しくはＦＶＩＩ欠乏症を処置するためにそれらを作製及び使用する方法が本明細書に記載される。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＦＶＩＩタンパク質を発現及び分泌することができる、組み換えＲＰＥ細胞であって、前記細胞は、前記ＦＶＩＩタンパク質のコード配列を含む外因性ヌクレオチド配列を含み、前記コード配列は、
（ｉ）配列番号３、
（ｉｉ）配列番号３と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同一のヌクレオチド配列、
（ｉｉｉ）配列番号４、及び
（ｉｖ）配列番号４と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同一のヌクレオチド配列
からなる群から選択される前駆体ＦＶＩＩコード配列を含む、組み換えＲＰＥ細胞。

【請求項2】

前記外因性ヌクレオチド配列は、前記コード配列に動作可能に連結されたプロモーターであって、前記プロモーターは、任意選択により、配列番号１０又は配列番号２１と同一又は実質的に同一であるヌクレオチド配列から本質的になるか、又はそれからなる、プロモーターをさらに含む、請求項１に記載のＲＰＥ組み換え細胞。

【請求項3】

前記コード配列は、配列番号３を含み、前記プロモーターは、配列番号１０又は配列番号２１からなる、請求項２に記載の組み換えＲＰＥ細胞。

【請求項4】

前記ＦＶＩＩタンパク質は、ＦＶＩＩ融合タンパク質であり、任意選択により、前記ＦＶＩＩ融合タンパク質は、配列番号１１又は配列番号１２を含む、請求項１に記載の組み換えＲＰＥ細胞。

【請求項5】

前記コード配列は、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７又は配列番号１８を含む、請求項４に記載の組み換えＲＰＥ細胞。

【請求項6】

配列番号２３、配列番号２４又は配列番号２５を含む、請求項１に記載の組み換えＲＰＥ細胞。

【請求項7】

配列番号２２を含む、請求項１に記載の組み換えＲＰＥ細胞。

【請求項8】

前記外因性ヌクレオチド配列は、染色体外発現ベクターを含むか、又は前記ＲＰＥ細胞内の少なくとも１つの染色体位置に組み込まれている、請求項１に記載のＲＰＥ組み換え細胞。

【請求項9】

ＡＲＰＥ－１９細胞に由来する、請求項１に記載の組み換えＲＰＥ細胞。

【請求項10】

請求項１に記載の組み換えＲＰＥ細胞を含む組成物。

【請求項11】

ポリクローナル細胞培養物又はモノクローナル細胞株の培養物である、請求項１０に記載の組成物。

【請求項12】

配列番号３、配列番号４、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４又は配列番号２５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、単離された二本鎖ＤＮＡ分子。

【請求項13】

配列番号２２から本質的になる、請求項１２に記載の単離されたＤＮＡ分子。

【請求項14】

請求項１に記載の組み換えＲＰＥ細胞を含む少なくとも１つの細胞含有区画と、デバイスが対象に移植される場合の異物反応（ＦＢＲ）を軽減するための少なくとも１つの手段とを含む、移植可能なデバイス。

【請求項15】

前記少なくとも１つの細胞含有区画が、前記複数の組み換えＲＰＥ細胞をカプセル化するポリマー組成物を含み、任意選択により少なくとも１つの細胞結合物質（ＣＢＳ）を含む、請求項１４に記載の移植可能なデバイス。

【請求項16】

前記細胞含有区画は、アルギン酸塩ヒドロゲル、及び任意選択により、バリア区画の外面に配置された式（Ｉ）の化合物を含む、前記バリア区画で取り囲まれている、請求項１４に記載の移植可能なデバイス。

【請求項17】

前記ポリマー組成物はペプチドで共有結合的に修飾されたアルギン酸塩を含み、前記ペプチドはＧＲＧＤＳＰ（配列番号４９）又はＧＧＲＧＤＳＰ（配列番号５１）から本質的になるか、又はそれからなり、前記バリア区画は、

【化1】

で修飾されたアルギン酸塩又はその薬学的に許容可能な塩を含む、請求項１５に記載の移植可能なデバイス。

【請求項18】

ヒドロゲルカプセルであって、
（ａ）第１のポリマー組成物中でカプセル化された、請求項１に記載の組み換え細胞を含む内側区画であって、前記第１のポリマー組成物は、ヒドロゲル形成ポリマーを含む、内側区画；及び
（ｂ）前記内側区画を取り囲み且つ第２のポリマー組成物を含むバリア区画であって、前記第２のポリマー組成物は、以下の表に示されている化合物１００、化合物１０１、化合物１１０、化合物１１２、化合物１１３、及び化合物１１４からなる群から選択される少なくとも１種の化合物で共有結合的に修飾されたアルギン酸塩を含む、バリア区画

【表1】

又は前記化合物の薬学的に許容可能な塩を含む、ヒドロゲルカプセル。

【請求項19】

前記選択された化合物は、

【化2】

である、請求項１８に記載のヒドロゲルカプセル。

【請求項20】

前記内側区画は、請求項１に記載の複数の組み換え細胞を含み、任意選択により、前記内側区画内の前記組み換え細胞の濃度は、前記第１のポリマー組成物１ｍｌあたり少なくとも４０００万個の細胞である、請求項１８に記載のヒドロゲルカプセル。

【請求項21】

前記組み換え細胞は、ＡＲＰＥ－１９細胞に由来し、配列番号２５を含む、請求項１８に記載のヒドロゲルカプセル。

【請求項22】

請求項１８に記載の複数のヒドロゲルカプセルを含む組成物。

【請求項23】

請求項１４に記載のデバイス、請求項１８に記載のヒドロゲルカプセル、又は請求項２２に記載の組成物を、患者に投与することを含む、ＦＶＩＩ療法剤を、それを必要とする患者に送達する方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

［優先権の主張］
本出願は、２０１９年３月２７日に出願された米国仮特許出願第６２／８２４，９６３号；及び２０１９年９月２７日に出願された米国仮特許出願第６２／９０７，３８６号に対する優先権を主張するものである。上記の仮出願のそれぞれの開示内容は、全体が参照により本明細書に援用される。

【0002】

［配列表］
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出され、全体が参照により本明細書に援用される配列表を含む。２０２０年５月２５日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、Ｓ２２２５－７０２９ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、サイズは１２２，６９８バイトである。

【背景技術】

【0003】

第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）は、血漿不活性チモーゲンが活性酵素に変換され、不溶性のフィブリン血餅を形成する一連の反応である血液凝固において、極めて重要な役割を果たす。ＦＶＩＩの不活性型は肝臓で発現し、単鎖チモーゲンとして血中に分泌される。血管が損傷すると、組織因子（ＴＦ）は循環ＦＶＩＩにさらされ、ＴＦと複合体を形成すると、ＦＶＩＩはいくつかの異なるプロテアーゼによってＦＶＩＩａに活性化され、ＦＶＩＩａ因子：ＴＦ複合体は第ＩＸ因子（ＦＩＸ）及び第Ｘ因子（ＦＸ）の両方をそれぞれ活性化形態のＦＩＸａ及びＦＸａの変換を触媒し、これにより、トロンビンが生成され、続いてフィブリン血餅が形成される。

【0004】

第ＶＩＩ因子欠乏症は、ＦＶＩＩの欠乏症又は活性低下を特徴とする希少な出血性障害であり、推定発生率は３００，０００人に１人から５００，０００に１人である。先天性ＦＶＩＩ欠乏症は、Ｆ７遺伝子の変異によって引き起こされる。後天性ＦＶＩＩ欠乏症は、重度の肝疾患、敗血症又はビタミンＫ欠乏症、及びワルファリンなどの特定の薬物に起因し得る。

【0005】

組み換え活性化ＦＶＩＩタンパク質（ｒＦＶＩＩａ）は、ＦＶＩＩＩ及びＦＩＸに対する抗体阻害剤を有する血友病の個体、後天性血友病の患者、及び先天性ＦＶＩＩ欠乏症の患者の止血を促進することにつき承認されている。しかしながら、ｒＦＶＩＩａは半減期が短いため、血友病患者の活性出血エピソードを管理するには、短期間に複数回の投与が必要である。したがって、さらなるＦＶＩＩ療法が望ましい。

【発明の概要】

【0006】

［概要］
ＦＶＩＩを発現及び分泌するように組み換えられた網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞、及び組み換えＲＰＥ細胞を含む組成物、医薬品、医療デバイス、並びにそれらを作製及び使用する方法が本明細書に記載される。いくつかの実施形態において、組み換えＲＰＥ細胞を含む組成物、製品、及びデバイスは、哺乳動物対象に投与、例えば、その内部に配置された場合に、異物反応を軽減するように構成される。

【0007】

一態様において、本開示は、前駆体ＦＶＩＩコード配列に動作可能に連結されたプロモーターを含む単離されたポリヌクレオチドを特徴とする。実施形態において、プロモーター配列は、配列番号１０（図６Ｂに示される配列のヌクレオチド３３７～２０６９）と同一であるか、又は実質的に同一であるヌクレオチド配列から本質的になる。実施形態において、前駆体又はＦＶＩＩコード配列は、哺乳動物細胞における発現のためにコドン最適化されている。実施形態において、前駆体ＦＶＩＩコード配列は、ＦＶＩＩ融合タンパク質をコードする。実施形態において、ＦＶＩＩ融合タンパク質は、ＦＶＩＩアミノ酸配列のＣ末端に動作可能に連結された非ＦＶＩＩポリペプチドをコードするアミノ酸配列を含む。実施形態において、非ＦＶＩＩポリペプチドは、融合タンパク質に有益な特性を付与し、例えば、発現及び／又は分泌されるタンパク質の量を増加させ、又はインビボでの半減期を延長する。実施形態において、ＦＶＩＩ融合タンパク質は、ペプチドリンカーを介してＦＶＩＩアミノ酸配列のＣ末端に接続されている、哺乳動物アルブミン、例えば、ヒトアルブミンのアミノ酸配列を含む。実施形態において、ペプチドリンカーは、タンパク質分解的に切断可能である。実施形態において、前駆体ＦＶＩＩコドン最適化コード配列は、配列番号３又は配列番号４である。実施形態において、コドン最適化ＦＶＩＩ配列（例えば、配列番号３又は配列番号４）は、配列番号６又は配列番号８に動作可能に連結されている。実施形態において、単離されたポリヌクレオチドは、二本鎖ＤＮＡ分子、例えば発現ベクターの鎖の１つとして提供される。

【0008】

別の態様において、本開示は、前駆体ＦＶＩＩコード配列に動作可能に連結されたプロモーター配列を含む外因性ヌクレオチド配列を含む組み換えＲＰＥ細胞を提供する。実施形態において、外因性ヌクレオチド配列は、染色体外発現ベクターを含む。実施形態において、外因性ヌクレオチド配列は、ＲＰＥ細胞、例えば、ＡＲＰＥ－１９細胞のゲノム内の少なくとも１つの位置に組み込まれる。

【0009】

さらに別の態様において、本開示は、本明細書に記載の組み換えＲＰＥ細胞又は複数のそのような細胞を含む、少なくとも１つの細胞含有区画を含むデバイスを提供する。いくつかの実施形態において、組成物、製品、及びデバイスは、組み換えＲＰＥ細胞をカプセル化するポリマー組成物を含む。実施形態において、カプセル化ポリマー組成物は、少なくとも１つの細胞結合物質（ＣＢＳ）、例えば、細胞結合ペプチド、例えば、ＲＧＤ（配列番号３３）又はＲＧＤＳＰ（配列番号４８）である。実施形態において、カプセル化ポリマー組成物は、ＧＲＧＤＳＰ（配列番号４９）で共有結合的に修飾されたアルギン酸塩を含む。いくつかの実施形態において、デバイスは、デバイスが対象の内部に配置された場合に異物反応（ＦＢＲ）を軽減するための少なくとも１つの手段をさらに含む。実施形態において、ＦＢＲを軽減するための手段は、デバイスの外面上に及び／又は細胞含有区画を取り囲むバリア区画内に配置された、本明細書で定義されるような抗線維性化合物を含む。ある実施形態において、この抗線維性化合物は、式（Ｉ）：

【化1】

の化合物、又はその薬学的に許容可能な塩であり、式中、変数Ａ、Ｌ^１、Ｍ、Ｌ^２、Ｐ、Ｌ^３、及びＺ、並びに関連するサブ変数は、本明細書で定義されている。いくつかの実施形態において、式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容可能な塩（例えば、式（Ｉ－ａ）、（Ｉ－ｂ）、（Ｉ－ｃ）、（Ｉ－ｄ）、（Ｉ－ｅ）、（Ｉ－ｆ）、（ＩＩ）、（ＩＩ－ａ）、（ＩＩＩ）、（ＩＩＩ－ａ）、（ＩＩＩ－ｂ）、（ＩＩＩ－ｃ）、又は（ＩＩＩ－ｄ））は、本明細書で説明されている化合物であり、例えば、本明細書の表３で示されている化合物の内の１つが挙げられる。ある実施形態において、この抗線維性化合物は、表３で示されている化合物１００、化合物１０１、又は化合物１０２である。

【0010】

一態様において、本開示のデバイスは、２区画ヒドロゲルカプセル（例えば、マイクロカプセル（直径が１ｍｍ未満）又はミリカプセル（ｍｉｌｌｉｃａｐｓｕｌｅ）（直径が少なくとも１ｍｍ））であり、この２区画ヒドロゲルカプセルでは、複数の組み換え生ＲＰＥ細胞（及び任意選択により１つ又は複数の細胞結合物質）を含む細胞含有区画（例えば内側区画）が、抗線維性ポリマーを含むバリア区画（例えば外側区画）で取り囲まれている。ある実施形態において、抗線維性化合物は、式（Ｉ）の化合物である。実施形態において、ヒドロゲルカプセルは球形カプセルである。

【0011】

別の態様において、本開示は、本明細書で説明されている複数（３個、６個、１２個、２５個、５０個、又はそれ以上のうちの少なくともいずれか）のＲＰＥ細胞含有デバイスを含む調製物（例えば組成物）を特徴とする。いくつかの実施形態において、この調製物は、薬学的に許容可能な組成物である。

【0012】

別の態様において、本開示は、ＦＶＩＩを発現及び分泌するように組み換えられた複数のＲＰＥ細胞を含むデバイスを作製又は製造する方法を特徴とする。いくつかの実施形態において、方法は、複数の組み換えＲＰＥ細胞を提供し、複数のＲＰＥ細胞を、封入構成要素、例えば、本明細書に記載のデバイスの細胞含有区画内に配置することを含む。いくつかの実施形態において、封入成分は、可撓性ポリマー（例えば、ＰＬＡ、ＰＬＧ、ＰＥＧ、ＣＭＣ、又は多糖、例えば、アルギン酸塩）を含む。いくつかの実施形態において、封入成分は、非可撓性ポリマー又は金属ハウジングを含む。いくつかの実施形態において、デバイスの表面は、例えば本明細書に記載の式（Ｉ）の化合物で、化学的に修飾されている。

【0013】

別の態様において、本開示は、本明細書で説明されている組み換えＲＰＥ細胞又はデバイスを評価する方法を特徴とする。いくつかの実施形態において、方法は、組み換えＲＰＥ細胞又はデバイスを提供し、ＲＰＥ細胞又はデバイスの構造的又は機能的パラメータを評価することを含む。いくつかの実施形態において、方法は、組み換えＲＰＥ細胞又はデバイスを、ａ）細胞生存率及びｂ）生成されたＦＶＩＩの量の１つ又は複数について評価することを含む。いくつかの実施形態において、この評価を、（ｉ）デバイス（若しくはデバイスの調製物）の形成後又は（ｉｉ）対象へのデバイス（若しくはデバイスの調製物）の投与後少なくとも１、５、１０、２０、３０、６０、９０、又は１２０日で実施する。ある実施形態において、この評価は、対象への投与後少なくとも３０、６０、９０、又は１２０日でデバイス（又は調製物内のデバイス）の線維化の量及び／又は構造的完全性を評価することをさらに含む。いくつかの実施形態において、この対象は、哺乳動物（例えば、マウス、ヒト）である。

【0014】

別の態様において、本開示は、本明細書に記載されるように、ＦＶＩＩを発現及び分泌するように組み換えられたＲＰＥ細胞を含むデバイス又はデバイス調製物を対象に投与することを含む、ＦＶＩＩ補充療法を必要とする対象（例えば、ＦＶＩＩ欠乏症の患者、ＦＶＩＩＩ及び／又はＦＩＸに対する阻害剤を有する血友病の患者）を処置する方法を特徴とする。いくつかの実施形態において、投与する工程は、複数のデバイスを含む薬学的に許容可能な調製物を対象内に配置することを含み、これらのデバイスの各々は、ＦＶＩＩを産生する能力を有する。いくつかの実施形態において、デバイス又はデバイス調製物は、中枢神経系、脳、脊柱、眼、又は網膜以外の部位に投与、配置、又は提供される。いくつかの実施形態において、移植可能な要素は、対象の腹膜腔（例えば、膜嚢）、大網、又は皮下脂肪に、投与、配置、又は注射される。実施形態において、方法は、対象から取り出された組織サンプル、例えば、血液サンプルから分離された血漿、肝生検に存在するＦＶＩＩの量又は活性を測定することをさらに含む。実施形態において、組織サンプルは、１５、３０、６０又は１２０日で取り出される。いくつかの実施形態において、対象はヒトである。

【0015】

本開示の１つ又は複数の実施形態の詳細が本明細書において記載されている。本開示の他の特徴、対象及び利点は、発明を実施するための形態、図面、実施例及び特許請求の範囲から明らかであろう。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1A】本開示の例示的な組み換えヒトＲＰＥ細胞によって発現される野生型ヒト前駆体ＦＶＩＩタンパク質のアミノ酸配列（図１Ａ、配列番号１）を示す。下線はＦＶＩＩシグナルペプチドのアミノ酸及びコード配列を示す。

【図1B】本開示の例示的な組み換えヒトＲＰＥ細胞によって発現される野生型ヒト前駆体ＦＶＩＩタンパク質のヌクレオチドコード配列（図１Ｂ、配列番号２）を示す。下線はＦＶＩＩシグナルペプチドのアミノ酸及びコード配列を示す。

【図2】図１に示される野生型前駆体ヒトＦＶＩＩタンパク質をコードする例示的なコドン最適化ヌクレオチド配列（配列番号３）を示す。下線はＦＶＩＩシグナルペプチドのコード配列を示す。

【図3】図１に示される野生型前駆体ヒトＦＶＩＩタンパク質をコードする別の例示的なコドン最適化ヌクレオチド配列（配列番号４）を示す。下線はＦＶＩＩシグナルペプチドのコード配列を示す。

【図4A】本開示の例示的な組み換えヒトＲＰＥ細胞によって発現される例示的なＦＶＩＩ融合タンパク質のアルブミン部分のアミノ酸配列（図４Ａ、配列番号５）を示す。太字はリンカーペプチドのアミノ酸及びヌクレオチドコード配列を示す。

【図4B】本開示の例示的な組み換えヒトＲＰＥ細胞によって発現される例示的なＦＶＩＩ融合タンパク質のアルブミン部分のヌクレオチドコード配列（図４Ｂ、配列番号６）を示す。太字はリンカーペプチドのアミノ酸及びヌクレオチドコード配列を示す。

【図5A】本開示の例示的な組み換えヒトＲＰＥ細胞によって発現される別の例示的なＦＶＩＩ融合タンパク質のタンパク質分解的に切断可能なアルブミン部分のアミノ酸配列（図５Ａ、配列番号７）を示す。太字はリンカーペプチドのアミノ酸及びヌクレオチド配列を示す。

【図5B】本開示の例示的な組み換えヒトＲＰＥ細胞によって発現される別の例示的なＦＶＩＩ融合タンパク質のタンパク質分解的に切断可能なアルブミン部分のヌクレオチドコード配列（図５Ｂ、配列番号８）を示す。太字はリンカーペプチドのアミノ酸及びヌクレオチド配列を示す。

【図6A】本明細書に記載のＦＶＩＩタンパク質を発現する組み換えＲＰＥ細胞を生成するのに有用な例示的なＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン発現ベクターを示す。図６Ａは、ベクターマップを示す。

【図6B-1】本明細書に記載のＦＶＩＩタンパク質を発現する組み換えＲＰＥ細胞を生成するのに有用な例示的なＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン発現ベクターを示す。図６Ｂは、ベクターのヌクレオチド配列（配列番号９）を示し、プロモーター配列に下線が引かれている（配列番号１０）。

【図6B-2】本明細書に記載のＦＶＩＩタンパク質を発現する組み換えＲＰＥ細胞を生成するのに有用な例示的なＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン発現ベクターを示す。図６Ｂは、ベクターのヌクレオチド配列（配列番号９）を示し、プロモーター配列に下線が引かれている（配列番号１０）。

【図7】Ｃｂｈプロモーター（配列番号２１）のヌクレオチド配列を示す。

【図8】本開示の例示的な２区画ヒドロゲルカプセルを示し、線は下記を示す：ヒドロゲル形成ポリマーと、細胞結合ペプチドに共有結合的に付着したヒドロゲル形成ポリマーとの混合物から形成された第１の内側区画中でカプセル化された組み換えＲＰＥ細胞；第２の区画；並びに第２の区画内及びこのカプセルの表面上の両方に配置された抗線維性化合物。図８は、配列番号４９として「ＧＲＧＤＳＰ」を開示する。

【図9】本明細書に記載の８つの異なるＦＶＩＩ発現コンストラクトの１つで組み換えられた例示的なＲＰＥ細胞によってインビトロで分泌されたＦＶＩＩタンパク質の量（ピコグラム／細胞／日（ｙ軸）として定量化）を示す棒グラフである。

【図10】本明細書に記載のＦＶＩＩ発現コンストラクトの１つで組み換えられたＲＰＥ細胞を含む例示的な２区画ヒドロゲルカプセルの移植後１３日でのヌードマウスにおけるＦＶＩＩタンパク質の血漿レベル（１つの群当たり２匹又は３匹のマウス）を示す棒グラフである。図１０は、配列番号４９として「ＧＲＧＤＳＰ」を開示する。

【図11】本明細書に記載の２つの異なるＦＶＩＩ発現ベクターの１つを用いて組み換えられたＲＰＥ細胞を含む例示的な２区画ヒドロゲルカプセルの移植後６日でのヌードマウスにおけるＦＶＩＩタンパク質の血漿レベル（１つの群当たり４匹のマウス）を示す棒グラフである。

【発明を実施するための形態】

【0017】

［詳細な説明］
本開示は、ＦＶＩＩを発現及び分泌するように組み換えられた網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞、並びにその組成物、そのような組み換えＲＰＥ細胞を含むデバイス、及びそれを含むデバイス調製物を特徴とする。いくつかの実施形態において、デバイスは、細胞結合物質及び組み換えＲＰＥ細胞を含む、細胞含有区画を含む。いくつかの実施形態において、デバイスは、対象、例えば、ヒト対象の内部に配置された場合にＦＢＲを軽減するように構成される。いくつかの実施形態において、組み換えＲＰＥ細胞、組成物、及びデバイスは、それを必要とする対象、例えば、ＦＶＩＩ欠乏症の患者又はｒＦＶＩＩａ療法の別の適応がある対象に、ＦＶＩＩ補充療法を提供するために有用である。

【0018】

［略語及び定義］
本開示の詳細な説明及び実施例の全体を通して、下記の略語が使用される。
ＣＢＰ：細胞結合ペプチド
ＣＢＰＰ：細胞結合ポリペプチド
ＣＢＰ－ポリマー：リンカーを介してＣＢＰで共有結合的に修飾されたポリマー
ＣＢＳ：細胞結合物質
ＣＭ－Ａｌｇ：化学修飾アルギン酸塩
ＣＭ－ＬＭＷ－Ａｌｇ：化学修飾された、低分子量アルギン酸塩
ＣＭ－ＬＭＷ－Ａｌｇ－１０１：表３に示される化合物１０１で化学修飾された、低分子量アルギン酸塩
ＣＭ－ＨＭＷ－Ａｌｇ：化学修飾された、高分子量アルギン酸塩
ＣＭ－ＨＭＷ－Ａｌｇ－１０１：表３に示される化合物１０１で化学修飾された、高分子量アルギン酸塩
ＣＭ－ＭＭＷ－Ａｌｇ：化学修飾された、中間分子量アルギン酸塩
ＣＭ－ＭＭＷ－Ａｌｇ－１０１：表３に示される化合物１０１で化学修飾された、中間分子量アルギン酸塩
ＨＭＷ－Ａｌｇ：高分子量アルギン酸塩
ＭＭＷ－Ａｌｇ：中間分子量アルギン酸塩
ＲＧＤ－アルギン酸塩：アミノ酸配列ＲＧＤ（配列番号３３として開示された「ＲＧＤ」）を含むペプチドで共有結合的に修飾されたアルギン酸塩
Ｕ－Ａｌｇ：非修飾アルギン酸塩
ＲＰＥ：網膜色素上皮細胞
Ｕ－ＨＭＷ－Ａｌｇ：非修飾高分子量アルギン酸塩
Ｕ－ＬＭＷ－Ａｌｇ：非修飾低分子量アルギン酸塩
Ｕ－ＭＭＷ－Ａｌｇ：非修飾中間分子量アルギン酸塩
７０：３０のＣＭ－Ａｌｇ：Ｕ－Ａｌｇ：化学修飾アルギン酸塩及び非修飾アルギン酸塩の７０：３０混合物（Ｖ：Ｖ）、例えば、下記の実施例に記載のとおり

【0019】

本開示が、より容易に理解され得るように、本明細書において使用されるいくつかの専門用語及び科学用語が、以下に具体的に定義される。本明細書において他の箇所に特に定義されない限り、本明細書において使用される全ての他の専門用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。

【0020】

添付の特許請求の範囲を含め、本明細書において用いられるところ、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」などの単数形の用語は、文脈上特に明記されない限り、それらの対応する複数の指示対象を含む。

【0021】

「約」又は「おおよそ」は、数値として定義されたパラメータ（例えば、ＲＰＥ細胞によって分泌されたＦＶＩＩの量、デバイス（例えばヒドロゲルカプセル）の物理的性質、例えば、直径、球形度、このカプセル中でカプセル化された細胞の数、調製物中のデバイスの数）を修飾するために本明細書で使用される場合には、引用された数値が、当業者により決定された場合に、定義されたパラメータの許容可能な機能的範囲内であることを意味し、この機能的範囲は、この数値がどのように測定されるか又は決定されるかに部分的に依存し、例えば、この測定システムの許容可能な誤差範囲等の測定システムの限界に部分的に依存する。例えば、「約」は、引用された数値の２０％上下の範囲を意味し得る。非限定的な例として、直径が約１．５ミリメートル（ｍｍ）であり且つ約５００万（Ｍ）個の細胞をカプセル化すると定義されたデバイスは、直径が１．２～１．８ｍｍであり得、且つ４Ｍ～６Ｍ個の細胞をカプセル化し得る。別の非限定的な例として、約１００個のデバイス（例えばヒドロゲルカプセル）の調製物として８０～１２０個のデバイスを有する調製物が挙げられる。いくつかの実施形態において、用語「約」は、修飾されたパラメータが、このパラメータに関して述べられた数値の１５％、１０％、又は５％上下だけ変動し得ることを意味する。或いは、特に、本明細書で説明されているデバイスのある特定の特性（例えば、細胞産生性、又はＣＢＰ若しくは抗線維性化合物の密度）に関して、用語「約」は、引用された値の一桁内（例えば、５倍、４倍、３倍、２倍、又は１倍以内）の上下を意味し得る。

【0022】

本明細書において用いられるところ、「取得する（Ａｃｑｕｉｒｅ）」又は「取得している（ａｃｑｕｉｒｉｎｇ）」は、値又は物理的エンティティを「直接的に取得する」又は「間接的に取得する」ことによる、値（例えば数値若しくはイメージ）、又は、物理的エンティティ（例えばサンプル）の入手を達成することを指す。「直接的に取得する」とは、プロセスを実施（例えば分析方法又はプロトコルの実施）して、値又は物理的エンティティを得ることを意味する。「間接的に取得する」とは、他の団体又は提供者（例えば、物理的エンティティ又は値を直接的に取得した第三者の実験室）から値又は物理的エンティティを受け取ることを指す。値又は物理的エンティティを直接的に取得するステップは、物理的な物質における物理的な変更、又は、機器若しくはデバイスの使用を含むプロセスの実施を含む。値を直接的に取得するステップの例としては、ヒト対象からのサンプルの入手が挙げられる。値を直接的に取得するステップは、例えば、蛍光顕微鏡データを取得する蛍光顕微鏡の使用といった、機器又はデバイスを使用するプロセスの実施を含む。

【0023】

「投与する（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒ）」、「投与する（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ）」、又は「投与」は、本明細書で使用される場合、本明細書で説明されている実体（例えば、デバイス、若しくはデバイスの調製物）を対象に移植するか、吸収させるか、摂取させるか、注射するか、配置するか、若しくは別の方法で導入することを指すか、又は投与のためにそのような実体を対象に提供することを指す。

【0024】

「抗線維性」は、本明細書で使用される場合、異物反応（ＦＢＲ）を軽減する化合物又は物質を意味する。例えば、抗線維性化合物を含むデバイス（例えばヒドロゲルカプセル）（例えば、表３で列挙される化合物で共有結合的に修飾されたポリマーを含むヒドロゲルカプセル）の組織への移植により誘発される生体組織中でのＦＢＲの量は、抗線維性なしの参照デバイス（即ち、あらゆる抗線維性化合物を欠くが、組成（例えば、同一のＣＢＰ－ポリマー、同一の細胞型）及び構造（例えば、サイズ、形状、区画の数）が実質的に同一のデバイス）の移植により誘発されるＦＢＲと比べて少ない。実施形態において、ＦＢＲの程度は、例えば、国際公開第２０１７／０７５６３０号パンフレットに記載される当該技術分野において公知のアッセイを用いて、又はＶｅｇａｓ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（上掲）に記載されるアッセイ／方法（例えば、移植されたカプセルの皮下カテプシン測定、組織切片のマッソンのトリクローム（ＭＴ）、ヘマトキシリン又はエオジン染色、コラーゲン密度の定量化、マクロファージ（ＣＤ６８又はＦ４／８０）細胞染色及び共焦点顕微鏡検査、筋線維芽細胞（α平滑筋アクチン（ａｌｐｈａ－ｍｕｓｃｌｅ ａｃｔｉｎ）、ＳＭＡ）又は一般的な細胞付着、公知の炎症因子及び免疫細胞マーカーの７９ＲＮＡ配列の定量化、又は好適な被験体、例えば、免疫応答性マウスの腹腔内で１４日後に回収されたデバイス（例えば、カプセル）におけるマクロファージ及び好中球についてのＦＡＣＳ分析のうちの１つ又は複数を用いて、例えば、タンパク質吸着、マクロファージ、多核異物巨細胞、線維芽細胞、及び血管新生を含み得る移植されたデバイス（例えば、ヒドロゲルカプセル）を含む組織における免疫応答によって評価される。実施形態において、ＦＢＲは、免疫応答の１つ又は複数のバイオマーカー、例えば、カテプシン、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１３、ＩＬ－６、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－４、ＣＣＬ２、又はＣＣＬ４の移植を含む組織におけるレベルを測定することによって評価される。いくつかの実施形態において、本発明のデバイス（例えば、外面上に配置された抗線維性化合物を含むヒドロゲルカプセル）により誘発されたＦＢＲは、ＦＢＲなしの参照デバイス（例えば、ＦＢＲを軽減するための手段を欠く以外は試験デバイス又は特許請求されているデバイスと実質的に同一であるデバイス（例えば、抗線維性化合物を含まないが、それ以外は特許請求されているカプセルと実質的に同一であるヒドロゲルカプセル））により誘発されたＦＢＲと比べて少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、又は約１００％低い。いくつかの実施形態において、ＦＢＲ（例えば、バイオマーカーのレベル）は、約３０分、約１時間、約６時間、約１２時間、約１日、約２日、約３日、約４日、約１週間、約２週間、約１ヶ月、約２ヶ月、約３ヶ月、約６ヶ月、又は約より長い後に測定されている。

【0025】

「細胞」は、本明細書で使用される場合、組み換えられた細胞を指すか、又は組み換えられていない細胞を指す。ある実施形態において、細胞は、不死化細胞であるか、又は不死化細胞に由来する組み換え細胞である。ある実施形態において、細胞は、生細胞であり、例えば、本明細書で説明されているか又は当該技術分野で既知の任意の技術により測定した場合に生存している。

【0026】

「細胞結合ペプチド（ＣＢＰ）」は、本明細書で使用される場合、細胞付着分子（ＣＡＭ）（例えば、細胞－マトリックス接合又は細胞－細胞接合を媒介するＣＡＭ）のリガンドの細胞結合ドメインに由来するアミノ酸配列を含む直鎖状又は環状のペプチドを意味する。ＣＢＰは、５０個、４０個、３０個、２５個、２０個、１５個、又は１０個未満のアミノ酸の長さである。ある実施形態において、ＣＢＰは、３～１２個のアミノ酸であるか、４～１０個のアミノ酸の長さであるか、又は３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、若しくは１０個のアミノ酸の長さである。ＣＢＰのアミノ酸配列は、天然に存在する結合ドメイン配列と同一であってもよいし、その保存的に置換された変異体であってもよい。ある実施形態において、ＣＡＭリガンドは、哺乳動物タンパク質である。ある実施形態において、ＣＡＭリガンドは、下記の表１で列挙されているタンパク質の群から選択されるヒトタンパク質である。ある実施形態において、ＣＢＰは、下記の表１で列挙されている細胞結合配列、又はその保存的に置換された変異体を含むか、又はそれから本質的になるか、若しくはそれからなる。ある実施形態において、ＣＢＰは、ＲＧＤペプチドであり、これは、このペプチドが、アミノ酸配列ＲＧＤ（配列番号３３）を含み、任意選択的に、Ｎ末端及びＣ末端の内の一方又は両方に位置する１つ又は複数の追加のアミノ酸を含むことを意味する。ある実施形態において、ＣＢＰは、ＲＧＤを含む環状ペプチドであり、例えば、Ｖｉｌａｃａ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ７０（３５）：５４２０－５４２７（２０１４）で説明されている環状ＲＧＤペプチド（配列番号３３）の内の１つである。ある実施形態において、ＣＢＰは、ＲＧＤ（配列番号３３）を含む直鎖状ペプチドであり、且つ６個未満のアミノ酸の長さである。ある実施形態において、ＣＢＰは、ＲＧＤ（配列番号３３）又はＲＧＤＳＰ（配列番号４８）から本質的になる直鎖状ペプチドである。

【0027】

【表1】

【0028】

「ＣＢＰ－ポリマー」は、本明細書で使用される場合、ポリマーであって、リンカーを介してこのポリマーに共有結合的に付着している少なくとも１つの細胞結合ペプチド分子を含むポリマーを意味する。ある実施形態において、ＣＢＰ－ポリマー中のポリマーは、ペプチドでもポリペプチドでもない。ある実施形態において、ＣＢＰ－ポリマー中のポリマーは、合成の又は天然に存在する多糖であり、例えばアルギン酸塩であり、例えばアルギン酸ナトリウムである。ある実施形態において、リンカーは、アミノ酸リンカーであり（即ち、単一のアミノ酸から本質的になるか、又はいくつかの同一の若しくは異なるアミノ酸のペプチドから本質的になり）、このアミノ酸リンカーは、ＣＢＰのＮ末端又はＣ末端に結合したペプチドを介して連結されている。ある実施形態において、アミノ酸リンカーのＣ末端は、ＣＢＰのＮ末端に連結されており、アミノ酸リンカーのＮ末端は、アミド結合を介して多糖中の少なくとも１つのペンダントカルボキシル基に連結されている。ある実施形態において、リンカー－ＣＢＰの構造は、リンカーが１個、２個、３個、又は４個のグリシン残基を有することを意味するＧ（１～４）－ＣＢＰと表される。ある実施形態において、ＣＢＰ－多糖、例えばＣＢＰ－アルギン酸塩）中の単糖部分の内の１つ又は複数は、ＣＢＰで修飾されておらず、例えば、この非修飾部分は、遊離カルボキシル基を有するか、又は修飾可能なペンダントカルボキシル基を欠いている。ある実施形態において、ＣＢＰが共有結合的に付着している多糖部分の数は、下記の値の内のいずれか未満である：９９％、９５％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、１％。

【0029】

ある実施形態において、ＣＢＰ－ポリマー中のＣＢＰ修飾の密度は、例えば下記の実施例で説明されているように、窒素パーセントに関する燃焼分析により推定される。ある実施形態において、ＣＢＰ－ポリマーは、ＲＧＤ－ポリマー（例えばＲＧＤ－アルギン酸塩）であり、このＲＧＤ－ポリマーは、リンカーＲＧＤ分子（例えば、ＧＲＧＤ（配列番号５０）又はＧＲＧＤＳＰ（配列番号４９）から本質的になるペプチド）で共有結合的に修飾されたポリマー（例えばアルギン酸塩）であり、リンカー－ＲＧＤ分子との修飾の密度は、本明細書で説明されているアッセイを使用して決定した場合に、約０．０５％の窒素（Ｎ）～１．００％のＮ、約０．１０％のＮ～約０．７５％のＮ、約０．２０％のＮ～約０．５０％のＮ、又は約０．３０％のＮ～約０．４０％のＮである。ある実施形態において、ＲＧＤ－アルギン酸塩（例えば、ＧＲＧＤＳＰ（配列番号４９）で共有結合的に修飾されたＭＭＷアルギン酸塩）中のリンカー－ＲＧＤ修飾のコンジュゲーション密度は、ポリマーにコンジュゲートされたペプチドの量を定量し得る任意のアッセイ（例えば、本明細書で説明されている定量的ペプチドコンジュゲーションアッセイ）により決定した場合に、粘度が８０～１２０ｃＰである溶液（例えば生理食塩水）中のＲＧＤ－ポリマー１ｇ当たりリンカー－ＲＧＤ部分０．２～２．０、０．２～１．５、０．２～１．０、０．３～０．７、０．３～０．６、又は０．４～０．６マイクロモルである。別途明示的に述べられていない限り、又は文脈から明らかでない限り、ＣＢＰ－ポリマー組成物中のＣＢＰに関する具体的に列挙された数値濃度、濃度範囲、密度、又は密度範囲は、ＣＢＰ－ポリマー組成物中のコンジュゲートしたＣＢＰ分子の濃度を指し、即ち、ＣＢＰ－ポリマー中に存在し得るいかなる残留遊離（例えばコンジュゲートしていない）ＣＢＰも含まない。

【0030】

「細胞結合ポリペプチド（ＣＢＰＰ）」は、本明細書で使用される場合、少なくとも５０個、少なくとも７５個、又は少なくとも１００個のアミノ酸の長さであり且つＣＡＭリガンドの細胞結合ドメインのアミノ酸配列又はその保存的に置換された変異体を含むポリペプチドを意味する。ある実施形態において、ＣＡＭリガンドは、哺乳動物タンパク質である。ある実施形態において、ＣＢＰＰアミノ酸は、完全長ＣＡＭリガンドの天然に存在するアミノ酸配列を含み、例えば、表１で列挙されているタンパク質の内の１つ又はその保存的に置換されている変異体を含む。

【0031】

「ＣＢＰ密度」は、本明細書で使用される場合、別途本明細書で明示的に述べられていない限り、ＣＢＰ－ポリマー組成物（例えば、Ｇ１～３ＲＧＤ（配列番号５３）又はＧ１～３ＲＧＤＳＰ（配列番号５４）で修飾されたアルギン酸塩）中のリンカー－ＣＢＰ部分の濃度を指す。

【0032】

「細胞結合物質（ＣＢＳ）」は、本明細書で使用される場合、細胞－マトリックス接合若しくは細胞－細胞接合又は他のレセプター媒介シグナル伝達を媒介する細胞付着分子（ＣＡＭ）又は他の細胞表面分子のリガンドの少なくとも１種の活性を模倣し得るあらゆる化学物質、生物学的物質、又は他のタイプの物質（例えば、小有機化合物、ペプチド、ポリペプチド）を意味する。ある実施形態において、生細胞をカプセル化するポリマー組成物中に存在する場合には、ＣＢＳは、１つ又は複数の細胞との一過性の又は永続的な結合又は接触を形成し得る。ある実施形態において、ＣＢＳは、ポリマー組成物中でカプセル化された２個以上の生細胞間の相互作用を促進する。ある実施形態において、複数の細胞（例えば生細胞）をカプセル化するポリマー組成物中のＣＢＳの存在は、カプセル化された細胞が試験対象（例えばマウス）に移植された場合の細胞産生性（例えば、治療薬の発現）の増加、及び細胞の生存率の増加の内の一方又他は両方と相関する。ある実施形態において、ＣＢＳは、ポリマー組成物中の１つ又は複数のポリマー分子に物理的に付着している。ある実施形態において、ＣＢＳは、本明細書で定義されているように、細胞結合ペプチド又は細胞結合ポリペプチドである。

【0033】

本明細書において用いられるところ、「保存的に修飾された変異体」又は保存的置換」は、そのアミノ酸配列中に１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有することを除いて、参照分子と同一である参照ペプチド又はポリペプチドの変異体を指す。実施形態において、保存的に修飾された変異体は、参照アミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％同一のアミノ酸配列からなる。保存的アミノ酸置換は、同様の特徴（例えば、電荷、側鎖サイズ、疎水性／親水性、骨格構造及び剛性など）を有し、且つ得られる置換ペプチド又はポリペプチドの生物活性に最小限の影響を与えるアミノ酸による、アミノ酸の置換を指す。機能的に類似したアミノ酸の保存的置換の表は、当該技術分野において周知であり、機能的特徴によって分類された例示的な置換が、以下の表２に記載されている。

【0034】

【表2】

【0035】

本明細書及び特許請求の範囲を通して用いられるところの「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」、及び「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」又は「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」などの変化形は、任意の記載される要素又は要素の群の包含、及び規定の分子、組成物、デバイス、又は方法の基本的又は新規な性質を実質的に変化させない、記載される要素と類似の又は異なる性質の他の要素の任意選択の包含を示す。非限定的な例として、列挙されたアミノ酸配列から本質的になる細胞結合ペプチド又はＦＶＩＩタンパク質はまた、この細胞結合ペプチド又はＦＶＩＩタンパク質の関連する生物学的活性にそれぞれ実質的に影響を及ぼさない１つ又は複数のアミノ酸残基の列挙されたアミノ酸配列中の置換を含む、１つ又は複数のアミノ酸も含み得る。

【0036】

「に由来する」は、細胞に関して本明細書で使用される場合、組織、細胞株、又は細胞から得られる細胞を指し、この細胞は、次いで任意選択的に、例えば、培養され、継代され、不死化され、分化され、及び／又は誘導されて、由来細胞を生じる。

【0037】

「デバイス」は、本明細書で使用される場合、あらゆる移植可能な物体（例えば、粒子、ヒドロゲルカプセル、移植片、医療機器）を指し、この物体は、このデバイスの移植後にＦＶＩＩタンパク質を発現及び分泌し得る、生きた組み換えＲＰＥ細胞を含み、且つこのデバイスに細胞栄養素が入ることを可能にすることにより、このＲＰＥ細胞の生存率を支える構造を有する。いくつかの実施形態において、このデバイスは、生細胞により生成された代謝副産物のこのデバイスからの放出が可能である。

【0038】

本明細書において用いられるところ、「差分体積」は、別の区画に占有される空間を除く、本明細書に記載のデバイス内の１つの区画の体積を指す。例えば、内側及び外側区画を有する２区画デバイス中の第２の（例えば、外側）区画の差分体積は、第１（内側）の区画に占有される空間を除く、第２の区画内の体積を指す。

【0039】

本明細書で使用される「有効量」は、以下のいずれかの量を指す：望ましい生物学的反応を引き出すのに十分な、ＦＶＩＩを分泌する組み換えＲＰＥ細胞、そのようなＦＶＩＩ分泌細胞を含有するデバイス組成物若しくはデバイス調製物、又はデバイスの構成要素（例えば、デバイス内の組み換えＲＰＥ細胞の数、デバイス内のＣＢＳ及び／又は非線維性化合物の量）。いくつかの実施形態において、用語「有効量」は、デバイスの成分の量を指し、例えば、このデバイス中の細胞の数、このデバイスの表面上に及び／又はバリア区画中に配置された抗線維性化合物の密度、細胞含有区画中のＣＢＳの密度を指す。実施形態において、所望の生物学的応答は、組み換えＲＰＥ細胞、デバイス、又はそのような細胞を含むデバイス調製物で処置された（例えば、移植された）対象から取り出された組織サンプルにおけるＦＶＩＩレベルの増加である。当業者に認識されるように、有効量は、所望される生物学的エンドポイント、分泌されたＦＶＩＩの薬物動態、組成物又はデバイス、処置される状態、投与様式、並びに対象の年齢及び健康状態等の因子に応じて変動し得る。有効量は、治療的処置及び予防的処置を包含する。実施形態において、デバイス上又はデバイス内に配置された式（Ｉ）の化合物の有効量は、参照デバイスと比較して、移植されたデバイスに対するＦＢＲを減少させる、例えば、移植されたデバイス上又はその近くの線維症又は線維性組織の量を減少させる、量である。実施形態において、細胞含有区画内に組み換えＲＰＥ細胞とともに配置されたＣＢＳの有効量は、参照デバイスと比較して細胞の生存率（例えば、生細胞の数）を増強する、及び／又は参照デバイスと比較してＲＰＥ細胞によるＦＶＩＩの産生を増加させる（例えば、デバイスを移植した対象の血漿中のＦＶＩＩレベルの増加）量である。デバイス、組成物、又は成分（例えば、抗線維性化合物、ＣＢＳ、組み換え細胞）の有効量は、当該技術分野で既知であるか又は本明細書で説明されている任意の技術により決定され得る。

【0040】

ある実施形態において、細胞含有区画中のＣＢＳ（例えば、ＲＧＤペプチドで修飾されたアルギン酸塩、例えば、ＧＲＧＤＳＰ－アルギン酸塩（配列番号４９））は、本明細書において下記で定義されているＣＢＳなしの参照デバイスと比較して、デバイスが免疫無防備動物又は免疫適格性動物（例えば、免疫適格性マウス（例えば、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ ＵＳＡから入手可能なＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス株））に移植された後の時点で細胞の生存率を増加させるのに及び／又は細胞の産生性を増加させるのに有効な量で存在する。ある実施形態において、細胞の生存率及び／又は産生性の増加は、移植後の所望の時点で検出可能であり、例えば、１日、３日、５日、１週間、２週間、４週間、８週間、１２週間、２４週間、３６週間、及び４８週間の内の１つ又は複数で検出可能である。ある実施形態において、ＣＢＳの有効量は、（ｉ）移植後１週間、２週間、４週間、又は１２週間で測定した場合の細胞生存率の少なくとも１０％、２５％、５０％、又は１００％の増加、及び（ｉｉ）移植後１週間、２週間、４週間、又は１２週間で測定した場合の細胞産生性の少なくとも１．２５倍、１．５倍、２倍、５倍、８倍、又は１０倍の増加の内の一方又は両方をもたらす。ある実施形態において、細胞含有区画中のＣＢＳの有効量は、最小有効量と、ＣＢＳなしの参照デバイスと比較して又は細胞含有区画中のＣＢＳの最大有効量（例えば最適量）を含むデバイスと比較して細胞の生存率及び／又は産生性が低下しているより高い量との間の範囲内である。ある実施形態において、細胞含有区画中のＣＢＳの量は、最適量（例えば、ＣＢＳなしの参照デバイスと比較して細胞の生存率及び／又は産生性の最大の増加をもたらす量）を５０％、２５％、１０％、又は５％以下上回るか、又は下回る。

【0041】

本明細書で説明されているデバイス中の生存細胞（及び任意選択的な死滅細胞）の数を、当該技術分野で既知の任意の技術（例えば、２種の蛍光色素で生細胞及び死滅細胞を別個に標識し、続いて蛍光顕微鏡を使用して標識細胞を検出して任意選択的に定量するアッセイ）を使用して推定し得る。細胞生存率を、他の細胞生存率の指標を評価する（例えば、エステラーゼ活性を測定するか、又は細胞中のＡＴＰの量を定量する）ことによっても評価し得る。

【0042】

ある実施形態において、細胞産生性の移植後の増加を、インビボで細胞により発現されたか又はエクスビボで細胞により発現された（例えば、デバイスを動物から回収した後の細胞発現）ＦＶＩＩタンパク質のレベルに関してアッセイすることにより検出する。ＦＶＩＩの発現を、細胞外ではあるがデバイス内部で測定し得、及び／又はデバイスの外部（例えば、本明細書で説明されているデバイス又はデバイス調製物で処置された動物（例えば非ヒト動物）から摘出された組織サンプル中）で測定し得る。ある実施形態において、細胞産生性は、投与されたデバイスの数（例えば、動物中に配置されたカプセルの数）で除算され、及び／又は投与された組み換えＲＰＥ細胞の数（例えば、投与されたカプセル調製物中の１個のカプセル当たりのおおよその数）で除算された、ＦＶＩＩタンパク質又はＦＶＩＩ活性の測定量として表される。ある実施形態において、ＦＶＩＩの決定された量又は活性を、目的の２つの時点の間の時間（例えば、投与と測定との間の時間、例えば、数時間、数日、又は数週間）で除算することにより、細胞産生性の増加をさらに正規化する。ある実施形態では、動物から摘出された組織サンプル（例えば、動物から採取された血液サンプルから分離された血漿）中のＦＶＩＩタンパク質の量及び／又は活性を測定し、この測定された量及び／又は活性を、投与されたデバイスの数（例えば、移植された２区画カプセルの数）で除算し、任意選択的に、この結果を、投与と組織サンプルの摘出との間の日数で除算することにより、産生性の増加を決定する。

【0043】

本明細書において用いられるところ、「内因性の核酸」とは、対象の細胞内で自然に生じる核酸である。

【0044】

本明細書において用いられるところ、「内因性のポリペプチド」とは、対象の細胞内で自然に生じるポリペプチドである。

【0045】

本明細書において用いられるところ、「組み換えＲＰＥ細胞」とは、天然のものではない改変を有するＲＰＥ細胞であり、典型的には、同様の条件下で組み換えがなされていない他の同様のＲＰＥ細胞中に存在していない（又は、異なるレベルで存在する）核酸配列（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）又はポリペプチドを含む（外因性の核酸配列）。実施形態において、組み換えＲＰＥ細胞は、ＦＶＩＩタンパク質をコードする外因性の核酸を含む（例えば、ベクター又は改変染色体配列）。実施形態において、組み換えＲＰＥ細胞は、ヒト野生型ＦＶＩＩアミノ酸配列又はその変異体を含むＦＶＩＩタンパク質を分泌する。実施形態において、外因性の核酸配列は、染色体性であるか（例えば、外因性の核酸配列は、内因性の染色体配列中に配置された外因性の配列である）、又は染色体外性（例えば、非組み込み型発現ベクター）である。実施形態において、外因性の核酸配列は、ＲＮＡ配列、例えば、ｍＲＮＡを含む。実施形態において、外因性の核酸配列は、ＲＮＡとして発現される配列、例えばｍＲＮＡ又は調節ＲＮＡを含む染色体性又は染色体外性の外因性の核酸配列を含む。実施形態において、外因性の核酸配列は、第２の核酸配列、例えば、ＦＶＩＩコード配列の立体構造又は発現を調節する第１の染色体性又は染色体外性の外因性の核酸配列を含み、ここで、第２のアミノ酸配列は外因性又は内因性であることが可能である。例えば、組み換えＲＰＥ細胞は、内因性の配列の発現を制御する外因性の核酸を含んでいることが可能である。実施形態において、組み換えＲＰＥ細胞は、ＦＶＩＩをコードし、天然に存在するＦＶＩＩコード配列よりも高いＦＶＩＩの発現を達成する、コドン最適化配列を含む外因性核酸配列を含む。このコドン最適化配列は、市販のアルゴリズムを使用して生成され得、例えば、ＧｅｎｅＯｐｔｉｍｉｚｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＯｐｔｉｍｕｍＧｅｎｅ（商標）（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ ＵＳＡ）、ＧｅｎｅＧＰＳ（登録商標）（ＡＴＵＭ，Ｎｅｗａｒｋ，ＣＡ ＵＳＡ）、又はＪａｖａ Ｃｏｄｏｎ Ａｄａｐａｔａｔｉｏｎ Ｔｏｏｌ（ＪＣａｔ，ｗｗｗ．ｊｃａｔ．ｄｅ，Ｇｒｏｔｅ、Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ ３３，Ｉｓｓｕｅ ｓｕｐｐｌ＿２，ｐｐ．Ｗ５２６－Ｗ５３１（２００５）を使用して生成され得る。ある実施形態において、組み換えＲＰＥ細胞（例えば組み換えＡＲＰＥ－１９細胞）は、安定的にトランスフェクトされた細胞の集団から培養されるか、又はモノクローナル細胞株から培養される。

【0046】

「外因性の核酸」とは、本明細書で使用される場合、対象細胞中に天然には存在しない核酸のことである。

【0047】

「外因性のポリペプチド」とは、本明細書で使用される場合、対象細胞（例えば組み換え細胞）中に天然には存在しないポリペプチドのことである。特定の配列のアミノ酸位置への言及は、（別途述べられていない限り）参照アミノ酸配列（例えば、完全長の成熟（シグナルペプチド開裂後）野生型タンパク質の配列）中での前記アミノ酸の位置を意味しており、且つ参照アミノ酸配列中の他の位置での変異（例えば、欠失、挿入、及び／又は置換）の存在を排除しない。

【0048】

本明細書において用いられるところ、「第ＶＩＩ因子タンパク質」又は「ＦＶＩＩタンパク質」は、別段の定めがある場合を除き、当該技術分野において認識されているアッセイによって決定される際、ＦＶＩＩ生物活性、例えば、血液凝固の促進を有する、天然の第ＶＩＩ因子タンパク質又はその変異体のアミノ酸配列を含むポリペプチドを意味する。天然のＦＶＩＩは、一本鎖酵素前駆体、酵素前駆体様の二本鎖ポリペプチド及び完全に活性化された二本鎖形態（ＦＶＩＩａ）として存在する。本明細書に記載の組み換えＲＰＥ細胞によって生成され得るＦＶＩＩタンパク質は、野生型霊長類（例えば、ヒト）、ブタ、イヌ、及びマウスタンパク質、並びに１つ又は複数のアミノ酸置換及び／又は欠失を有する断片、突然変異体、変異体を含む、このような野生型タンパク質の変異体を含む。ヒトＦＶＩＩはリーダー配列で発現し、成熟循環単鎖チモーゲンは４０６アミノ酸を含む。ヒト第ＶＩＩ因子の活性化第ＶＩＩａ因子への変換は、Ａｒｇ１５２とＩｌｅ１５３の間の結合のセリンプロテアーゼ切断によるものである。ヒトＦＶＩＩａは、ガンマ－カルボキシグルタミン酸残基を持つ２０ｋＤの１５２残基の軽鎖、及び３０ｋＤの２５４残基の重鎖からなり、これは、触媒ドメインを含む。軽鎖及び重鎖はジスルフィド結合によって結合している。いくつかの実施形態において、ＦＶＩＩへの言及は、酵素前駆体様及びＦＶＩＩａを含む、その一本鎖及び二本鎖形態を含む。いくつかの実施形態において、変異体ＦＶＩＩタンパク質は、野生型第ＶＩＩａ因子の活性の少なくとも５０％、７５％、９０％又はそれ以上（＞１００％を含む）を有する完全に活性化された二本鎖形態（第ＶＩＩａ因子）へと活性化されることが可能である。ＦＶＩＩ及びＦＶＩＩａの変異体は公知であり、例えば、マルゼプタコグアルファ（ｍａｒｚｅｐｔａｃｏｇ ａｌｆａ）（活性化）（ＭａｒｚＡＡ）並びに欧州特許第１３７３４９３号明細書、米国特許第７７７１９９６号明細書、米国特許第９４７６０３７号明細書及び米国特許出願公開第２００８００５８２５５号明細書に記載されている変異体である。

【0049】

「ＦＶＩＩ欠乏症」、「Ｆ７欠乏症」、「アレクサンダー病」、「低プロコンバーチン血症」、「プロコンバーチン欠乏症」、「プロトロンビン変換促進剤欠乏症」、及び「血清プロトロンビン変換促進剤欠乏症」は、互換的に使用することができ、正常なＦＶＩＩレベルよりも低い、且つ／又は正常なＦＶＩＩ活性よりも低いことを特徴とする、先天性又は後天性の状態を指す。ＦＶＩＩ欠乏症の症状は、機能的なＦＶＩＩのレベルに応じて、軽度から重度まで異なり得る。軽度の症状には、打撲及び軟部組織の出血、傷又は抜歯による長期間の出血、関節の出血、鼻血、歯茎の出血、重い月経期間を含み得る。より重度のＦＶＩＩ欠乏症を有する患者は、出血エピソード及び腸、胃、筋肉又は頭の出血による、関節軟骨の破壊を経験し得る。乳児は、頭蓋内出血などの中枢神経系、又は消化管の出血を持続した後、生後６か月以内にＦＶＩＩ欠乏症と診断される場合が多い。第ＶＩＩ因子欠乏症の診断は、特徴的な症状の特定、詳細な患者の病歴、詳細な臨床評価及び血液が凝固するのにかかる時間を測定する凝固検査、すなわち活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）検査及びプロトロンビン時間（ＰＴ）検査に基づく。ＦＶＩＩ欠乏症の個体は、正常なａＰＴＴ及び延長されたＰＴを有する。ＦＶＩＩ診断を確認するためのさらなる検査には、血中のＦＶＩＩ活性を測定するためのＦＶＩＩアッセイが含まれる。

【0050】

本明細書において用いられるところ、「ＦＶＩＩ欠乏症患者」は、ＦＶＩＩ欠乏症と診断されたか、又はその疑いがある個体を指す。実施形態において、ＦＶＩＩ欠乏症患者は、変異したＦ７遺伝子を有する。ヒトＦ７遺伝子は９つのエクソンを含み、染色体１３ｑ３４上で約１２．８ｋｂに及ぶ。

【0051】

「ポリマー組成物」とは、本明細書で使用される場合、１種又は複数種のポリマーを含む組成物（例えば、溶液、混合物）のことである。クラスとして、「ポリマー」は、ホモポリマー、ヘテロポリマー、コポリマー、ブロックポリマー、ブロックコポリマーを含み、天然及び合成の両方であり得る。ホモポリマーは、１種類のビルディングブロック（即ちモノマー）を含むが、コポリマーは、複数種類のモノマーを含む。

【0052】

本明細書において用いられるところ、「ポリペプチド」は、ペプチド結合を介して結合されたアミノ酸残基を含み、少なくとも２、いくつかの実施形態において、少なくとも３、４、５、１０、５０、７５、１００、１５０又は２００のアミノ酸残基を有するポリマーを指す。

【0053】

本明細書において用いられるところ、「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」、「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」、及び「予防している（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」は、ＦＶＩＩ補充療法剤の投与又は適用を含む処置であって、例えば、組み換えＲＰＥ細胞を封入するデバイスの組成物（例えば、本明細書に記載のもの）を、ＦＶＩＩ欠乏症の１つ又は複数の症状の発症の前に、症状に係る物理的徴候を妨げるために投与するステップを含む処置を指す。いくつかの実施形態において、「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」、「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」及び「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」は、ＦＶＩＩ欠乏症の兆候又は症状が未だ発生していないか、又は、実測されていないことが必要とされる。いくつかの実施形態において、処置は予防を含み、他の実施形態においては含まない。

【0054】

「参照デバイス」は、特許請求されているデバイス（例えばヒドロゲルカプセル）に関して本明細書で使用される場合、（ｉ）特許請求されたデバイスの特定の特徴（例えば、特定の外因性ヌクレオチド配列、例えば、ｍＲＮＡ又はタンパク質発現を増強する要素、例えば、プロモーター配列、シグナルペプチド配列）、ＦＢＲ軽減手段（例えば、抗線維性化合物（本明細書で定義されている）、又はＣＢＳ（本明細書で定義されている）（例えばＲＧＤポリマー）を含むバリア区画）を欠き、（ｉｉ）特許請求されているデバイス中と同一の細胞型のほぼ同量の細胞を細胞含有区画中でカプセル化し、（ｉｉｉ）特定の特徴（例えば抗線維性化合物又はＣＢＳ）を欠く以外は、特許請求されているデバイス中と実質的に同様のポリマー組成及び構造を有するデバイス（例えばヒドロゲルカプセル）を意味する。ある実施形態において、参照デバイスの細胞含有区画中の生きた組み換えＲＰＥ細胞の数は、特許請求されているデバイスの細胞含有区画中の生きた組み換えＲＰＥ細胞の数の８０～１２０％以内であるか、又は９０％～１１０％以内である。ある実施形態において、参照デバイス中の組み換え細胞及び特許請求されているデバイス中の組み換え細胞は、同一の細胞培養物から得られる。ある実施形態において、実質的に同様のポリマー組成は、参照デバイス中の及び特許請求されているデバイス中の全てのポリマー（例えば、任意のＣＢＰ－ポリマー及び抗線維性ポリマーのポリマー成分）が、該当する場合には、化学クラス及び分子量クラスが同一である（例えば、Ｇ含有量が高く且つ分子量範囲が同一であるアルギン酸塩）ことを意味する。例えば、ある実施形態において、ＣＢＰなしの参照デバイスの細胞含有区画は、特許請求されているデバイスの細胞含有区画を形成するために使用されるＣＢＰ－ポリマー中のポリマー（例えばアルギン酸塩）の非修飾バージョンから形成されている。特許請求されている２区画ヒドロゲルミリカプセルが、（ｉ）複数の細胞をカプセル化するＣＢＰ－ポリマーから形成された内側区画と、（ｉｉ）化学的に修飾されたポリマー（例えば、本明細書で説明されているＣＭ－ＬＭＷ－アルギン酸塩）及び非修飾ポリマー（例えば、本明細書で説明されているＵ－ＨＭＷ－アルギン酸塩）の混合物から形成された外側区画とを有するいくつかの実施形態において、参照カプセル及び特許請求されているカプセルの外側区画は、同一のポリマー混合物から形成されているが、参照カプセルの内側区画は、外側区画のために使用された同一のポリマー混合物中の細胞の懸濁液から形成される。ある実施形態において、実質的に同様の構造は、参照デバイスと特許請求されているデバイスとが、同数の区画（例えば、１個、２個、３個等）並びにほほ同一のサイズ及び形状を有することを意味する。

【0055】

「ＲＰＥ細胞」は、本明細書で使用される場合、下記の特徴の内の１つ又は複数を有する細胞を指す：ａ）網膜色素上皮細胞（ＲＰＥ）（例えば、ＡＲＰＥ－１９細胞株（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－２３０２（商標））を使用して培養される）、又は、例えば、ＦＶＩＩタンパク質をコードする外因性の配列で、ＡＲＰＥ－１９細胞株から培養された細胞を安定的にトランスフェクトすることによるか、又は別の方法で、そのように培養されたＡＲＰＥ－１９細胞を、ＦＶＩＩタンパク質を発現するように組み換えることによる、このＲＰＥに由来するか又は組み換えられた細胞、ＲＰＥ細胞の初代細胞培養物に由来する細胞、（例えば、ヒト又は他の哺乳動物からの）天然に存在するＲＰＥ細胞から直接単離された細胞（長期の培養を伴わない、例えば、単離から５又は１０回未満の継代又はラウンドの細胞分裂）、形質転換されたか、不死化されたか、又は長期（例えば、５若しくは１０回超の継代若しくはラウンドの細胞分裂）にわたるＲＰＥ細胞培養物に由来する細胞を含む；ｂ）低分化細胞から得られている細胞、例えば、ＲＰＥ細胞へと発生したか、プログラムされたか、若しくは（例えばインビトロで）再プログラムされた細胞、又は、任意の遺伝子組み換えを除いて、１種若しくは複数種の天然に存在するＲＰＥ細胞と実質的に同様である細胞、又はＲＰＥ細胞の初代培養物若しくは長期培養物からの細胞（例えば、この細胞は、ＩＰＳ細胞から由来し得る）；又はｃ）下記の特性の内の１つ又は複数を有する細胞：ｉ）バイオマーカーＣＲＡＬＢＰ、ＲＰＥ－６５、ＲＬＢＰ、ＢＥＳＴ１、若しくはαＢ－クリスタリンの内の１つ若しくは複数を発現するか；ｉｉ）バイオマーカーＣＲＡＬＢＰ、ＲＰＥ－６５、ＲＬＢＰ、ＢＥＳＴ１、若しくはαＢ－クリスタリンの内の１つ若しくは複数を発現しないか；ｉｉｉ）網膜中に天然に見出され、且つブルッフ膜中の脈絡膜血管上に単一層を形成するか；ｉｖ）網膜における上皮輸送、光吸収、分泌、及び免疫調節に関与するか、又はｖ）不死化ＲＰＥ細胞株（例えば、ＡＲＰＥ－１９細胞株（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－２３０２（商標）））と同一の若しくは実質的に同一の遺伝的内容、及び任意選択的に同一の若しくは実質的に同一の後成的内容を有するように、合成により生成されているか、若しくは天然に存在する細胞から修飾されている。ある実施形態において、本明細書で説明されているＲＰＥは、例えば新たな特性を有するように組み換えられており、例えば、この細胞は、ＦＶＩＩを発現及び分泌するように組み換えられている。他の実施形態において、ＲＰＥ細胞は組み換えられていない。

【0056】

「生理食塩水」は、本明細書で使用される場合、別途明記されない限り、通常の生理食塩水を意味しており、即ち、０．９％ＮａＣｌを含む水を意味する。

【0057】

「配列同一性」又は「パーセント同一」は、本明細書において、２つのヌクレオチド配列又は２つのアミノ酸配列を指すために用いられる場合、２つの配列が比較され、比較ウィンドウ（ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｎｄｏｗ）又は指定される領域にわたって最大の一致のために整列される場合、２つの配列が規定の領域内で同じであるか、又は規定の領域内のヌクレオチド又はアミノ酸位置の規定のパーセンテージの同じヌクレオチド又はアミノ酸を有することを意味する。配列同一性は、限定されないが、米国特許出願公開第２０１７／０２３３４４５５Ａ１号明細書に記載されているアルゴリズムのいずれかを含む、当該技術分野において公知の標準的な技術を用いて決定され得る。実施形態において、同一のヌクレオチド又はアミノ酸位置の規定のパーセンテージは、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上である。

【0058】

「球状」は、本明細書で使用される場合、例えば表面上で波及び起状を有する場合がある球体（例えば、完全に円形の球）又は球体様の形状を形成する曲面を有するデバイス（例えば、ヒドロゲルカプセル又は他の粒子）を意味する。球体及び球体様の物体は、３つの垂直軸、ａ、ｂ、及びｃのそれぞれの周りの円、楕円、又は組み合わせの回転によって数学的に定義され得る。球体については、３つの軸が同じ長さである。一般に、球体様の形状は、互いに１０％、又は５％、又は２．５％以内である半主軸（ｓｅｍｉ－ｐｒｉｎｃｉｐａｌ ａｘｅｓ）を有する楕円体（その平均面について）である。球体又は球体様の形状の直径は、半主軸の平均などの平均直径である。

【0059】

「スフェロイド」は、この用語が、デバイス（例えば、ヒドロゲルカプセル又は他の粒子）を指すために本明細書で使用される場合、このデバイスが、（ｉ）完全な若しくは古典的な扁平スフェロイド若しくは扁長スフェロイドの形状を有するか又は（ｉｉ）スフェロイドを大まかに形成する表面を有し、例えば、波及び起状を有し得、及び／又は半主軸が互いに１００％内である楕円体（平均的な表面）であり得ることを意味する。

【0060】

本明細書において用いられるところ、「対象」は、ヒト又は非ヒト動物を指す。実施形態において、対象は、例えば任意の年齢群のヒト（すなわち、男性又は女性）、例えば、小児科のヒト対象（例えば乳児、小児、青年）又は成人ヒト対象（例えば、若年成人、中年成人、又は老人）である。実施形態において、対象は、非ヒト動物、例えば哺乳動物（例えば、マウス、イヌ、霊長類（例えばカニクイザル又はアカゲザル）である。実施形態において、対象は、（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、又はイヌ）の商業的に関連する哺乳動物）又は鳥類（例えば、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、又はシチメンチョウなどの商業的に関連する鳥類）である。一定の実施形態において、動物は哺乳動物である。動物は、オス又はメスであり得、任意の成長段階であり得る。非ヒト動物は遺伝子組み換え動物であり得る。

【0061】

本明細書において用いられるところ、「総体積」は、別の区画に占有される空間を含む多区画デバイスの１つの区画内の体積を指す。例えば、２区画デバイスの第２の（例えば、外側）区画の総体積は、第１の区画に占有される空間を含む第２の区画内の体積を指す。

【0062】

「転写ユニット」は、例えば、外因性核酸に存在し、コード配列に動作可能に連結された少なくとも１つのプロモーター配列を含み、コード配列のＲＮＡ分子への転写又はＲＮＡ分子のポリペプチド分子への翻訳を制御又は増強する１つ又は複数の追加の要素も含み得る、ＤＮＡ配列を意味する。いくつかの実施形態において、転写ユニットはまた、ポリアデニル化（ポリＡ）シグナル配列及びポリＡ部位を含む。実施形態において、転写ユニットは、例えば、図６に示されるように、外因性の染色体外性発現ベクターに存在するか、又は本明細書に記載の組み換えＲＰＥ細胞の染色体に組み込まれた外因性配列として存在する。

【0063】

本明細書において用いられるところ、「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」、「処置する（ｔｒｅａｔ）」、及び「処置している（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、ＦＶＩＩ欠乏症の発症の低減、逆転、緩和、遅延の１つ又は複数、又は疾病、障害、若しくは状態の症状、兆候、若しくは基礎原因の１つ又は複数の進行の阻害を指す。実施形態において、処置は、ＦＶＩＩ欠乏症に関連する症状又は状態の低減、逆転、緩和、発症の遅延、又は進行の阻害を含む。実施形態において、処置は、それを必要とする対象におけるＦＶＩＩ血漿レベルの増加を含む。いくつかの実施形態において、「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」、「処置する（ｔｒｅａｔ）」及び「処置している（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、ＦＶＩＩ欠乏症に関連する兆候又は症状が発生しているか、又は、実測されていることを必要とする。他の実施形態において、処置は、ＦＶＩＩ欠乏症の兆候又は症状が不在でも、例えば予防的処置で投与されてもよい。例えば、処置は、症状の発症（例えば、症状の履歴を鑑みて、及び／又は、遺伝的又は他の感受性要因に照らして）の前に感受性の個体に投与され得る。処置はまた、例えば再発を遅延又は予防するために、症状が回復した後も継続してもよい。いくつかの実施形態において、処置は予防を含み、他の実施形態においては含まない。

【0064】

選択される化学的定義
特定の官能基及び化学用語の定義を以下により詳細に記載する。化学元素は、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃｓ，７５ｔｈ Ｅｄ．の内表紙のＰｅｒｉｏｄｏｉｃ Ｔａｂｌｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ，ＣＡＳ ｖｅｒｓｉｏｎに従って識別し、特定の官能基は、ここに記載されているとおり通常どおり定義している。また、有機化学の一般原則、並びに特定の官能基部分及び反応性は、Ｔｈｏｍａｓ Ｓｏｒｒｅｌｌ，Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｂｏｏｋｓ，Ｓａｕｓａｌｉｔｏ、１９９９；Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｍａｒｃｈ，Ｍａｒｃｈ’ｓ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２００１；Ｌａｒｏｃｋ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８９；及びＣａｒｒｕｔｈｅｒｓ，Ｓｏｍｅ Ｍｏｄｅｒｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，１９８７に記載されている。

【0065】

本明細書で用いている略語は、化学及び生物学の技術分野におけるその従来の意味を有する。本明細書に記載の化学構造及び式は、化学技術分野において既知である化学原子価に係る標準的な規則に従って構成されている。

【0066】

値の範囲が列挙されている場合、範囲中の各値及び部分範囲が包含されることが意図されている。例えば「Ｃ１～Ｃ６アルキル」は、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ１～Ｃ６、Ｃ１～Ｃ５、Ｃ１～Ｃ４、Ｃ１～Ｃ３、Ｃ１～Ｃ２、Ｃ２～Ｃ６、Ｃ２～Ｃ５、Ｃ２～Ｃ４、Ｃ２～Ｃ３、Ｃ３～Ｃ６、Ｃ３～Ｃ５、Ｃ３～Ｃ４、Ｃ４～Ｃ６、Ｃ４～Ｃ５、及びＣ５～Ｃ６アルキルを包含することが意図されている。

【0067】

本明細書において用いられるところ、「アルキル」は、１～２４個の炭素原子（「Ｃ１～Ｃ２４アルキル」）を有する直鎖又は分岐飽和炭化水素基のラジカルを指す。いくつかの実施形態において、アルキル基は、１～１２個の炭素原子（「Ｃ１～Ｃ１２アルキル」）、１～１０個の炭素原子（「Ｃ１～Ｃ１０アルキル」）、１～８個の炭素原子（「Ｃ１～Ｃ８アルキル」）、１～６個の炭素原子（「Ｃ１～Ｃ６アルキル」）、１～５個の炭素原子（「Ｃ１～Ｃ５アルキル」）、１～４個の炭素原子（「Ｃ１～Ｃ４アルキル」）、１～３個の炭素原子（「Ｃ１～Ｃ３アルキル」）、１～２個の炭素原子（「Ｃ１～Ｃ２アルキル」）、又は１個の炭素原子を有する（「Ｃ１アルキル」）。いくつかの実施形態において、アルキル基は、２～６個の炭素原子を有する（「Ｃ２～Ｃ６アルキル」）。Ｃ１～Ｃ６アルキル基の例としては、メチル（Ｃ１）、エチル（Ｃ２）、ｎ－プロピル（Ｃ３）、イソプロピル（Ｃ３）、ｎ－ブチル（Ｃ４）、ｔｅｒｔ－ブチル（Ｃ４）、ｓｅｃ－ブチル（Ｃ４）、イソ－ブチル（Ｃ４）、ｎ－ペンチル（Ｃ５）、３－ペンタニル（Ｃ５）、アミル（Ｃ５）、ネオペンチル（Ｃ５）、３－メチル－２－ブタニル（Ｃ５）、第三級アミル（Ｃ５）、及びｎ－ヘキシル（Ｃ６）が挙げられる。アルキル基の追加の例としては、ｎ－ヘプチル（Ｃ７）、ｎ－オクチル（Ｃ８）などが挙げられる。アルキル基の各実例は独立して任意選択により置換され得、すなわち、非置換であるか（「非置換アルキル」）又は１個以上の置換基（例えば、実例として、１～５個の置換基、１～３個の置換基、又は１個の置換基）で置換されている（「置換アルキル」）。

【0068】

本明細書において用いられるところ、「アルケニル」は、２～２４個の炭素原子、１つ又は複数の炭素－炭素二重結合を有し、及び三重結合を有さない直鎖又は分岐炭化水素基のラジカル（「Ｃ２～Ｃ２４アルケニル」）を指す。いくつかの実施形態において、アルケニル基は、２～１２個の炭素原子（「Ｃ２～Ｃ１２アルケニル」）、２～１０個の炭素原子（「Ｃ２～Ｃ１０アルケニル」）、２～８個の炭素原子（「Ｃ２～Ｃ８アルケニル」）、２～６個の炭素原子（「Ｃ２～Ｃ６アルケニル」）、２～５個の炭素原子（「Ｃ２～Ｃ５アルケニル」）、２～４個の炭素原子（「Ｃ２～Ｃ４アルケニル」）、２～３個の炭素原子（「Ｃ２～Ｃ３アルケニル」）、又は２個の炭素原子を有する（「Ｃ２アルケニル」）。１つ又は複数の炭素－炭素二重結合は、中間（２－ブテニルにおけるものなど）又は末端（１－ブテニルにおけるものなど）であることが可能である。Ｃ２～Ｃ４アルケニル基の例としては、エテニル（Ｃ２）、１－プロペニル（Ｃ３）、２－プロペニル（Ｃ３）、１－ブテニル（Ｃ４）、２－ブテニル（Ｃ４）、ブタジエニル（Ｃ４）などが挙げられる。Ｃ２～Ｃ６アルケニル基の例としては、前述のＣ２～４アルケニル基並びにペンテニル（Ｃ５）、ペンタジエニル（Ｃ５）、ヘキセニル（Ｃ６）などが挙げられる。アルケニル基の各実例は独立して任意選択により置換され得、すなわち、非置換であるか（「非置換アルケニル」）又は１個以上の置換基（例えば、実例として、１～５個の置換基、１～３個の置換基、又は１個の置換基）で置換されている（「置換アルケニル」）。

【0069】

本明細書において用いられるところ、「アルキニル」という用語は、２～２４個の炭素原子、１つ又は複数の炭素－炭素三重結合を有する直鎖又は分岐炭化水素基のラジカル（「Ｃ２～Ｃ２４アルケニル」）を指す。いくつかの実施形態において、アルキニル基は、２～１２個の炭素原子（「Ｃ２～Ｃ１２アルキニル」）、２～１０個の炭素原子（「Ｃ２～Ｃ１０アルキニル」）、２～８個の炭素原子（「Ｃ２～Ｃ８アルキニル」）、２～６個の炭素原子（「Ｃ２～Ｃ６アルキニル」）、２～５個の炭素原子（「Ｃ２～Ｃ５アルキニル」）、２～４個の炭素原子（「Ｃ２～Ｃ４アルキニル」）、２～３個の炭素原子（「Ｃ２～Ｃ３アルキニル」）、又は２個の炭素原子を有する（「Ｃ２アルキニル」）。１つ又は複数の炭素－炭素三重結合は、中間（２－ブチニルにおけるものなど）又は末端（１－ブチニルにおけるものなど）であることが可能である。Ｃ２～Ｃ４アルキニル基の例としては、エチニル（Ｃ２）、１－プロピニル（Ｃ３）、２－プロピニル（Ｃ３）、１－ブチニル（Ｃ４）、２－ブチニル（Ｃ４）などが挙げられる。アルキニル基の各実例は独立して任意選択により置換され得、すなわち、非置換であるか（「非置換アルキニル」）又は１個以上の置換基（例えば、実例として、１～５個の置換基、１～３個の置換基、又は１個の置換基）で置換されている（「置換アルキニル」）。

【0070】

本明細書において用いられるところ、「ヘテロアルキル」という用語は、非環式の安定な直鎖若しくは分岐鎖、又はこれらの組み合わせであって、少なくとも１個の炭素原子と、Ｏ、Ｎ、Ｐ、Ｓｉ、及びＳからなる群から選択される少なくとも１個のヘテロ原子とを含むものを指し、ここで、窒素原子及び硫黄原子は任意選択により酸化されていてもよく、窒素ヘテロ原子は任意選択により四級化されていてもよい。ヘテロ原子Ｏ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、及びＳｉは、ヘテロアルキル基の任意の位置に配置されていてもよい。例示的なヘテロアルキル基としては、これらに限定されないが：－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ３、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＨ３、－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ３、－ＣＨ２－Ｓ－ＣＨ２－ＣＨ３、－ＣＨ２－ＣＨ２、－Ｓ（Ｏ）－ＣＨ３、－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｓ（Ｏ）２－ＣＨ３、－ＣＨ＝ＣＨ－Ｏ－ＣＨ３、－Ｓｉ（ＣＨ３）３、－ＣＨ２－ＣＨ＝Ｎ－ＯＣＨ３、－ＣＨ＝ＣＨ－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ３、－Ｏ－ＣＨ３、及び－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ３が挙げられる。２個又は３個以下のヘテロ原子が連続していてもよい（例えば－ＣＨ２－ＮＨ－ＯＣＨ３及び－ＣＨ２－Ｏ－Ｓｉ（ＣＨ３）３など）。「ヘテロアルキル」が引用され、続いて、特定のヘテロアルキル基が引用されている場合（－ＣＨ２Ｏ、－ＮＲＣＲＤなど）、用語ヘテロアルキル及び－ＣＨ２Ｏ又は－ＮＲＣＲＤは、重複していないか、又は相互に排他的ではないことが理解されるであろう。むしろ、特定のヘテロアルキル基が追加的な明確さのために引用されている。それ故、「ヘテロアルキル」という用語は、－ＣＨ２Ｏ、－ＮＲＣＲＤなどの特定のヘテロアルキル基を排除していると本明細書において解釈されるべきではない。ヘテロアルキル基の各実例は、独立して任意選択により置換され得、すなわち、非置換であるか（「非置換ヘテロアルキル」）又は例えば１個以上の置換基、例えば１～５個の置換基、１～３個の置換基、若しくは１個の置換基で置換されている（「置換ヘテロアルキル」）。

【0071】

「アルキレン」、「アルケニレン」、「アルキニレン」、又は「ヘテロアルキレン」という用語は、単独で、又は他の置換基の一部として、別段の定めがある場合を除き、それぞれ、アルキル、アルケニル、アルキニル、又はヘテロアルキルから誘導される二価ラジカルを意味する。アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、又はヘテロアルキレン基は、例えば、Ｃ１～Ｃ６員アルキレン、Ｃ２～Ｃ６員アルケニレン、Ｃ２～Ｃ６員アルキニレン、又はＣ１～Ｃ６員ヘテロアルキレンと記載され得、ここで、「員」という用語は、部分中の非水素原子を指す。ヘテロアルキレン基の場合、ヘテロ原子は、鎖終端の一方又は両方を占有することも可能である（例えば、アルキレンオキシ、アルキレンジオキシ、アルキレンアミノ、アルキレンジアミノなど）。さらに、アルキレン及びヘテロアルキレン連結基について、連結基の式が書かれている方向によって連結基の向きは示唆されていない。例えば、式－Ｃ（Ｏ）２Ｒ’－は、－Ｃ（Ｏ）２Ｒ’－及び－Ｒ’Ｃ（Ｏ）２－の両方を表し得る。

【0072】

本明細書において用いられるところ、「アリール」は、６～１４個の環炭素原子及びゼロ個のヘテロ原子を芳香族環系中に有する（「Ｃ６～Ｃ１４アリール」）、単環式又は多環式（例えば、二環式又は三環式）４ｎ＋２芳香族環系（例えば、環式アレイにおいて共有される６、１０、又は１４個のπ電子を有する）のラジカルを指す。いくつかの実施形態において、アリール基は６個の環炭素原子を有する（「Ｃ６アリール」；例えば、フェニル）。いくつかの実施形態において、アリール基は１０個の環炭素原子を有する（「Ｃ１０アリール」；例えば、１－ナフチル及び２－ナフチルなどのナフチル）。いくつかの実施形態において、アリール基は１４個の環炭素原子を有する（「Ｃ１４アリール」；例えば、アントラシル）。アリール基は、例えば、Ｃ６～Ｃ１０員アリールと記載され得、ここで、「員」という用語は、部分中の非水素環原子を指す。アリール基としては、フェニル、ナフチル、インデニル、及びテトラヒドロナフチルが挙げられる。アリール基の各実例は独立して任意選択により置換され得、すなわち、非置換であるか（「非置換アリール」）又は１個以上の置換基で置換されている（「置換アリール」）。

【0073】

本明細書において用いられるところ、「ヘテロアリール」は、環炭素原子及び１～４個の環ヘテロ原子を芳香族環系中に有する５～１０員単環式又は二環式４ｎ＋２芳香族環系（例えば、環式アレイにおいて共有される６又は１０個のπ電子を有する）のラジカルを指し、ここで、各ヘテロ原子は、窒素、酸素及び硫黄から独立して選択される（「５～１０員ヘテロアリール」）。１個以上の窒素原子を含有するヘテロアリール基において、結合点は、原子価的に許容されるとおり、炭素又は窒素原子であることが可能である。ヘテロアリール二環系は、１個以上のヘテロ原子を一方又は両方の環中に含んでいることが可能である。「ヘテロアリール」はまた、上記に定義されているヘテロアリール環が、１個以上のアリール基と縮合しており、結合点がアリール又はヘテロアリール環のいずれかにある環系を含み、このような実例において、環員の数は、縮合（アリール／ヘテロアリール）環系中の環員の数を示す。一方の環がヘテロ原子を含有しない二環式ヘテロアリール基（例えば、インドリル、キノリニル、カルバゾリルなど）において、結合点は、いずれかの環にあることが可能であり、すなわち、結合点は、ヘテロ原子を有する環（例えば、２－インドリル）又はヘテロ原子を含有しない環（例えば、５－インドリル）のいずれかにあることが可能である。ヘテロアリール基は、例えば６～１０員ヘテロアリールと記載され得、ここで、「員」という用語は、部分中の非水素環原子を指す。

【0074】

いくつかの実施形態において、ヘテロアリール基は、環炭素原子及び１～４個の環ヘテロ原子を芳香族環系中に有する５～１０員芳香族環系であり、ここで、各ヘテロ原子は窒素、酸素、及び硫黄から独立して選択される（「５～１０員ヘテロアリール」）。いくつかの実施形態において、ヘテロアリール基は、環炭素原子及び１～４個の環ヘテロ原子を芳香族環系中に有する５～８員芳香族環系であり、ここで、各ヘテロ原子は窒素、酸素、及び硫黄から独立して選択される（「５～８員ヘテロアリール」）。いくつかの実施形態において、ヘテロアリール基は、環炭素原子及び１～４個の環ヘテロ原子を芳香族環系中に有する５～６員芳香族環系であり、ここで、各ヘテロ原子は窒素、酸素、及び硫黄から独立して選択される（「５～６員ヘテロアリール」）。いくつかの実施形態において、５～６員ヘテロアリールは、窒素、酸素、及び硫黄から選択される１～３個の環ヘテロ原子を有する。いくつかの実施形態において、５～６員ヘテロアリールは、窒素、酸素、及び硫黄から選択される１～２個の環ヘテロ原子を有する。いくつかの実施形態において、５～６員ヘテロアリールは、窒素、酸素、及び硫黄から選択される１個の環ヘテロ原子を有する。ヘテロアリール基の各実例は独立して任意選択により置換され得、すなわち、非置換であるか（「非置換ヘテロアリール」）又は１個以上の置換基で置換されている（「置換ヘテロアリール」）。

【0075】

１個のヘテロ原子を含有する例示的な５員ヘテロアリール基としては、限定されないが、ピロリル、フラニル及びチオフェニルが挙げられる。２個のヘテロ原子を含有する例示的な５員ヘテロアリール基としては、限定されないが、イミダゾリル、ピラゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル、及びイソチアゾリルが挙げられる。３個のヘテロ原子を含有する例示的な５員ヘテロアリール基としては、限定されないが、トリアゾリル、オキサジアゾリル、及びチアジアゾリルが挙げられる。４個のヘテロ原子を含有する例示的な５員ヘテロアリール基としては、限定されないが、テトラゾリルが挙げられる。１個のヘテロ原子を含有する例示的な６員ヘテロアリール基としては、限定されないが、ピリジニルが挙げられる。２個のヘテロ原子を含有する例示的な６員ヘテロアリール基としては、限定されないが、ピリダジニル、ピリミジニル、及びピラジニルが挙げられる。３又は４個のヘテロ原子を含有する例示的な６員ヘテロアリール基としては、限定されないが、それぞれトリアジニル及びテトラジニルが挙げられる。１個のヘテロ原子を含有する例示的な７員ヘテロアリール基としては、限定されないが、アゼピニル、オキセピニル、及びチエピニルが挙げられる。例示的な５，６－二環式ヘテロアリール基としては、限定されないが、インドリル、イソインドリル、インダゾリル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾチオフェニル、イソベンゾチオフェニル、ベンゾフラニル、ベンゾイソフラニル、ベンズイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンズイソキサゾリル、ベンゾオキサジアゾリル、ベンズチアゾリル、ベンズイソチアゾリル、ベンズチアジアゾリル、インドリジニル、及びプリニルが挙げられる。例示的な６，６－二環式ヘテロアリール基としては、限定されないが、ナフチリジニル、プテリジニル、キノリニル、イソキノリニル、シンノリニル、キノキサリニル、フタラジニル、及びキナゾリニルが挙げられる。他の例示的なヘテロアリール基としては、ヘム及びヘム誘導体が挙げられる。

【0076】

本明細書において用いられるところ、「アリーレン」及び「ヘテロアリーレン」という用語は、単独で、又は他の置換基の一部として、それぞれ、アリール及びヘテロアリールから誘導される二価ラジカルを意味する。

【0077】

本明細書において用いられるところ、「シクロアルキル」は、３～１０個の環炭素原子（「Ｃ３～Ｃ１０シクロアルキル」）及びゼロ個のヘテロ原子を非芳香族環系中に有する非芳香族環状炭化水素基のラジカルを指す。いくつかの実施形態において、シクロアルキル基は、３～８個の環炭素原子（「Ｃ３～Ｃ８シクロアルキル」）、３～６個の環炭素原子（「Ｃ３～Ｃ６シクロアルキル」）、又は５～１０個の環炭素原子を有する（「Ｃ５～Ｃ１０シクロアルキル」）。シクロアルキル基は、例えば、Ｃ４～Ｃ７員シクロアルキルと記載され得、ここで、「員」という用語は、部分中の非水素環原子を指す。例示的なＣ３～Ｃ６シクロアルキル基としては、限定されないが、シクロプロピル（Ｃ３）、シクロプロペニル（Ｃ３）、シクロブチル（Ｃ４）、シクロブテニル（Ｃ４）、シクロペンチル（Ｃ５）、シクロペンテニル（Ｃ５）、シクロヘキシル（Ｃ６）、シクロヘキセニル（Ｃ６）、シクロヘキサジエニル（Ｃ６）などが挙げられる。例示的なＣ３～Ｃ８シクロアルキル基としては、限定されないが、前述のＣ３～Ｃ６シクロアルキル基並びにシクロヘプチル（Ｃ７）、シクロヘプテニル（Ｃ７）、シクロヘプタジエニル（Ｃ７）、シクロヘプタトリエニル（Ｃ７）、シクロオクチル（Ｃ８）、シクロオクテニル（Ｃ８）、クバニル（Ｃ８）、ビシクロ［１．１．１］ペンタニル（Ｃ５）、ビシクロ［２．２．２］オクタニル（Ｃ８）、ビシクロ［２．１．１］ヘキサニル（Ｃ６）、ビシクロ［３．１．１］ヘプタニル（Ｃ７）などが挙げられる。例示的なＣ３～Ｃ１０シクロアルキル基としては、限定されないが、前述のＣ３～Ｃ８シクロアルキル基並びにシクロノニル（Ｃ９）、シクロノネニル（Ｃ９）、シクロデシル（Ｃ１０）、シクロデセニル（Ｃ１０）、オクタヒドロ－１Ｈ－インデニル（Ｃ９）、デカヒドロナフタレニル（Ｃ１０）、スピロ［４．５］デカニル（Ｃ１０）などが挙げられる。前述の例に例示されているとおり、一定の実施形態において、シクロアルキル基は、単環式（「単環式シクロアルキル」）であるか、又は二環系などの縮合、架橋若しくはスピロ環系を含有し（「二環式シクロアルキル」）、また、飽和であることが可能であり、又は部分不飽和であることが可能である。「シクロアルキル」はまた、上記に定義されているシクロアルキル環が、１個以上のアリール基と縮合しており、結合点がシクロアルキル環にある環系を含み、このような実例において、炭素の数は引き続きシクロアルキル環系中の炭素の数を示す。シクロアルキル基の各実例は独立して任意選択により置換され得、すなわち、非置換であるか（「非置換シクロアルキル」）又は１個以上の置換基で置換されている（「置換シクロアルキル」）。

【0078】

本明細書において用いられるところ、「ヘテロシクリル」は、環炭素原子及び１～４個の環ヘテロ原子を有する３～１０員非芳香族環系のラジカルを指し、ここで、各ヘテロ原子は、窒素、酸素、硫黄、ホウ素、リン、及びケイ素から独立して選択される（「３～１０員ヘテロシクリル」）。１個以上の窒素原子を含有するヘテロシクリル基において、結合点は、原子価的に許容されるとおり、炭素又は窒素原子であることが可能である。ヘテロシクリル基は、単環式（「単環式ヘテロシクリル」）又は二環系などの縮合、架橋若しくはスピロ環系（「二環式ヘテロシクリル」）であることが可能であり、また、飽和であることが可能であり、又は部分不飽和であることが可能である。ヘテロシクリル二環系は、１個以上のヘテロ原子を一方又は両方の環中に含んでいることが可能である。「ヘテロシクリル」はまた、上記に定義されているヘテロシクリル環が、１個以上のシクロアルキル基と縮合しており、結合点がシクロアルキル又はヘテロシクリル環のいずれかにある環系、又は上記に定義されているヘテロシクリル環が、１個以上のアリール又はヘテロアリール基と縮合しており、結合点がヘテロシクリル環にある環系を含み、このような実例において、環員の数は引き続きヘテロシクリル環系中の環員の数を示す。ヘテロシクリル基は、例えば、３～７員ヘテロシクリルと記載され得、ここで、「員」という用語は、部分中における、非水素環原子、すなわち、炭素、窒素、酸素、硫黄、ホウ素、リン、及びケイ素を指す。ヘテロシクリルの各実例は独立して任意選択により置換され得、すなわち、非置換であるか（「非置換ヘテロシクリル」）又は１個以上の置換基で置換されている（「置換ヘテロシクリル」）。一定の実施形態において、ヘテロシクリル基は非置換３～１０員ヘテロシクリルである。一定の実施形態において、ヘテロシクリル基は置換３～１０員ヘテロシクリルである。

【0079】

いくつかの実施形態において、ヘテロシクリル基は、環炭素原子及び１～４個の環ヘテロ原子を有する５～１０員非芳香族環系であり、ここで、各ヘテロ原子は、窒素、酸素、硫黄、ホウ素、リン、及びケイ素から独立して選択される（「５～１０員ヘテロシクリル」）。いくつかの実施形態において、ヘテロシクリル基は、環炭素原子及び１～４個の環ヘテロ原子を有する５～８員非芳香族環系であり、ここで、各ヘテロ原子は、窒素、酸素、及び硫黄から独立して選択される（「５～８員ヘテロシクリル」）。いくつかの実施形態において、ヘテロシクリル基は、環炭素原子及び１～４個の環ヘテロ原子を有する５～６員非芳香族環系であり、ここで、各ヘテロ原子は、窒素、酸素、及び硫黄から独立して選択される（「５～６員ヘテロシクリル」）。いくつかの実施形態において、５～６員ヘテロシクリルは、窒素、酸素、及び硫黄から選択される１～３個の環ヘテロ原子を有する。いくつかの実施形態において、５～６員ヘテロシクリルは、窒素、酸素、及び硫黄から選択される１～２個の環ヘテロ原子を有する。いくつかの実施形態において、５～６員ヘテロシクリルは、窒素、酸素、及び硫黄から選択される１個の環ヘテロ原子を有する。

【0080】

１個のヘテロ原子を含有する例示的な３員ヘテロシクリル基としては、限定されないが、アジルジニル（ａｚｉｒｄｉｎｙｌ）、オキシラニル、チオレニル（ｔｈｉｏｒｅｎｙｌ）が挙げられる。１個のヘテロ原子を含有する例示的な４員ヘテロシクリル基としては、限定されないが、アゼチジニル、オキセタニル及びチエタニルが挙げられる。１個のヘテロ原子を含有する例示的な５員ヘテロシクリル基としては、限定されないが、テトラヒドロフラニル、ジヒドロフラニル、テトラヒドロチオフェニル、ジヒドロチオフェニル、ピロリジニル、ジヒドロピロリル及びピロリル－２，５－ジオンが挙げられる。２個のヘテロ原子を含有する例示的な５員ヘテロシクリル基としては、限定されないが、ジオキソラニル、オキサスルフラニル、ジスルフラニル、及びオキサゾリジン－２－オンが挙げられる。３個のヘテロ原子を含有する例示的な５員ヘテロシクリル基としては、限定されないが、トリアゾリニル、オキサジアゾリニル、及びチアジアゾリニルが挙げられる。１個のヘテロ原子を含有する例示的な６員ヘテロシクリル基としては、限定されないが、ピペリジニル、ピペラジニル、テトラヒドロピラニル、ジヒドロピリジニル、及びチアニルが挙げられる。２個のヘテロ原子を含有する例示的な６員ヘテロシクリル基としては、限定されないが、ピペラジニル、モルホリニル、ジチアニル、ジオキサニルが挙げられる。２個のヘテロ原子を含有する例示的な６員ヘテロシクリル基としては、限定されないが、トリアジナニル又はチオモルホリニル－１，１－ジオキシドが挙げられる。１個のヘテロ原子を含有する例示的な７員ヘテロシクリル基としては、限定されないが、アゼパニル、オキセパニル及びチエパニルが挙げられる。１個のヘテロ原子を含有する例示的な８員ヘテロシクリル基としては、限定されないが、アゾカニル、オキセカニル及びチオカニルが挙げられる。Ｃ６アリール環に縮合した例示的な５員ヘテロシクリル基（本明細書において、５，６－二環式複素環とも称される）としては、限定されないが、インドリニル、イソインドリニル、ジヒドロベンゾフラニル、ジヒドロベンゾチエニル、ベンゾオキサゾリノニルなどが挙げられる。アリール環に縮合した例示的な６員ヘテロシクリル基（本明細書において、６，６－二環式複素環とも称される）としては、限定されないが、テトラヒドロキノリニル、テトラヒドロイソキノリニルなどが挙げられる。

【0081】

本明細書において用いられるところ、「アミノ」は、ラジカル－ＮＲ７０Ｒ７１を指し、ここで、Ｒ７０及びＲ７１は各々独立して、水素、Ｃ１～Ｃ８アルキル、Ｃ３～Ｃ１０シクロアルキル、Ｃ４～Ｃ１０ヘテロシクリル、Ｃ６～Ｃ１０アリール、及びＣ５～Ｃ１０ヘテロアリールである。いくつかの実施形態において、アミノはＮＨ２を指す。

【0082】

本明細書において用いられるところ、「シアノ」はラジカル－ＣＮを指す。

【0083】

本明細書において用いられるところ、「ハロ」又は「ハロゲン」は、独立して、又は他の置換基の一部として、別段の定めがある場合を除き、フッ素（Ｆ）、塩素（Ｃｌ）、臭素（Ｂｒ）、又はヨウ素（Ｉ）原子を意味する。

【0084】

本明細書において用いられるところ、「ヒドロキシ」はラジカル－ＯＨを指す。

【0085】

本明細書において定義されるところ、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、及びヘテロアリール基は、任意選択により置換されている（例えば、「置換」若しくは「非置換」アルキル、「置換」若しくは「非置換」アルケニル、「置換」若しくは「非置換」アルキニル、「置換」若しくは「非置換」ヘテロアルキル、「置換」若しくは「非置換」シクロアルキル、「置換」若しくは「非置換」ヘテロシクリル、「置換」若しくは「非置換」アリール又は「置換」若しくは「非置換」ヘテロアリール基）。一般に、「置換されている」という用語は、用語「任意選択により」が先行しているか否かに関わらず、ある基（例えば炭素又は窒素原子）に存在する少なくとも１個の水素が許容される置換基で置き換えられることを意味し、この置換基は、例えば、置換により安定な化合物（例えば、再配列、環化、脱離、又は他の反応などによって自発的な変換を起こさない化合物）をもたらすものである。別段の定めがある場合を除き、「置換されている」基は、その基の１つ又は複数の置換可能な位置に置換基を有し、また、いずれかの所与の構造における２つ以上の位置が置換されている場合、この置換基は各位置において同一であるか又は異なる。「置換されている」という用語は、安定な化合物が形成される本明細書に記載の置換基のいずれかなどの、有機化合物の全ての許容可能な置換基による置換を含むことが想定される。本開示は、安定な化合物を得るためのあらゆるこのような組み合わせを想定する。本開示の目的のために、窒素などのヘテロ原子は、ヘテロ原子の原子価を満たすと共に、安定な部分の形成をもたらす、水素置換基及び／又は本明細書に記載のいずれかの好適な置換基を有し得る。

【0086】

２個以上の置換基は、任意選択により結合されて、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、又はヘテロシクリル基を形成し得る。このようないわゆる環形成置換基は、典型的には、必須ではないが、環基礎構造に結合して見出される。一実施形態において、環形成置換基は基礎構造の隣接する構成員に結合している。例えば、環基礎構造の隣接する構成員に結合する２個の環形成置換基が、縮合環構造を形成する。他の実施形態において、環形成置換基は、基礎構造の単一の構成員に結合している。例えば、環基礎構造の単一の構成員に結合する２個の環形成置換基が、スピロ環式構造を形成する。さらに他の実施形態において、環形成置換基は、基礎構造の隣接していない構成員に結合している。

【0087】

本明細書に記載の式（Ｉ）の化合物は１つ又は複数の不斉中心を含んでいることが可能であり、それ故、例えば、鏡像異性体及び／又はジアステレオマーといった種々の異性形態で存在することが可能である。例えば、本明細書に記載の化合物は個々の鏡像異性体、ジアステレオマー若しくは幾何異性体の形態であることが可能であり、又はラセミ混合物及び１種以上の立体異性体が富化された混合物を含む立体異性体の混合物の形態であることが可能である。異性体は、キラル高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、並びにキラル塩の形成及び結晶化を含む当業者に公知の方法によって混合物から単離可能であり；又は好ましい異性体は、不斉合成により調製可能である。例えば、Ｊａｃｑｕｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｓ，Ｒａｃｅｍａｔｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｓ（Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８１）；Ｗｉｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ３３：２７２５（１９７７）；Ｅｌｉｅｌ，Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｃａｒｂｏｎ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ（ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ，ＮＹ，１９６２）；及びＷｉｌｅｎ，Ｔａｂｌｅｓ ｏｆ Ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ｐ．２６８（Ｅ．Ｌ．Ｅｌｉｅｌ，Ｅｄ．，Ｕｎｉｖ．ｏｆ Ｎｏｔｒｅ Ｄａｍｅ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｏｔｒｅ Ｄａｍｅ，ＩＮ １９７２）を参照のこと。本開示はさらに、他の異性体を実質的に含まない個々の異性体として、及び代わりに、種々の異性体の混合物として、本明細書に記載の化合物を含む。

【0088】

本明細書において用いられるところ、純粋な鏡像異性化合物は、化合物の他の鏡像異性体又は立体異性体を実質的に含まない（すなわち鏡像体過剰量である）。換言すると、「Ｓ」形態の化合物は「Ｒ」形態の化合物を実質的に含まず、それ故、「Ｒ」形態が鏡像体過剰量である。「鏡像異性体的に純粋な」又は「純粋な鏡像異性体」という用語は、化合物が、７５重量％超、８０重量％超、８５重量％超、９０重量％超、９１重量％超、９２重量％超、９３重量％超、９４重量％超、９５重量％超、９６重量％超、９７重量％超、９８重量％超、９９重量％超、９９．５重量％超、又は９９．９重量％超の鏡像異性体を含むことを示す。一定の実施形態において、重量は、化合物の全ての鏡像異性体又は立体異性体の総重量に基づく。

【0089】

本明細書に記載の式（Ｉ）の化合物はまた、１つ又は複数の同位体置換を含んでいてもよい。例えば、Ｈは、１Ｈ、２Ｈ（Ｄ又は重水素）、及び３Ｈ（Ｔ又は三重水素）を含むいずれかの同位体形態であり得；Ｃは、１２Ｃ、１３Ｃ、及び１４Ｃを含むいずれかの同位体形態であり得；Ｏは、１６Ｏ及び１８Ｏなどを含むいずれかの同位体形態であり得る。

【0090】

「薬学的に許容可能な塩」という用語は、本明細書に記載の化合物に見出される特定の置換基に応じて、比較的無毒の酸又は塩基を伴って調製される有効な化合物の塩を含むことを意味する。本開示のデバイスの提供において使用される式（Ｉ）の化合物が比較的酸性の官能基を含有する場合、塩基付加塩は、このような中性型の化合物を、十分な量の所望の塩基と、そのまま、又は好適な不活性溶剤中において接触させることにより得ることが可能である。薬学的に許容可能な塩基付加塩の例としては、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウム、有機アミノ、若しくはマグネシウム塩、又は同様の塩が挙げられる。本開示において使用される化合物が比較的塩基性の官能基を含有する場合、酸付加塩は、このような中性型の化合物を、十分な量の所望の酸と、そのまま、又は好適な不活性溶剤中において接触させることにより得ることが可能である。薬学的に許容可能な酸付加塩の例としては、塩酸、臭化水素酸、硝酸、炭酸、一水素炭酸、リン酸、一水素リン酸、二水素リン酸、硫酸、一水素硫酸、ヨウ化水素酸、又は亜リン酸などのような無機酸から誘導されるものが挙げられ、並びに酢酸、プロピオン酸、イソ酪酸、マレイン酸、マロン酸、安息香酸、コハク酸、スベリン酸、フマル酸、乳酸、マンデル酸、フタル酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ－トリルスルホン酸、クエン酸、酒石酸、メタンスルホン酸などのような有機酸から誘導される塩が挙げられる。また、アルギニン酸塩などのアミノ酸の塩、及びグルクロン酸又はガラクツロン酸などのような有機酸の塩が含まれる（例えば、Ｂｅｒｇｅ ｅｔ ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ６６：１－１９（１９７７）を参照のこと）。一定の特定の本開示のデバイスにおいて使用される化合物（例えば、粒子、ヒドロゲルカプセル）は、塩基又は酸付加塩への化合物の転換を可能とする塩基性及び酸性官能基の両方を含有する。これらの塩は、当業者に公知の方法によって調製され得る。当業者に公知である他の薬学的に許容可能なキャリアが本開示において使用するのに好適である。

【0091】

本開示のデバイスは、プロドラッグ形態の式（Ｉ）の化合物を含み得る。プロドラッグは、生理学的状態で化学変化を容易に生起して本開示のデバイスに対するＦＢＲを軽減するために使用される化合物を提供する化合物である。さらに、プロドラッグは、エキソビボ環境における化学的又は生化学的方法によって式（Ｉ）の有用な化合物に転換されることが可能である。

【0092】

一定の式（Ｉ）の化合物は、非溶媒和形態、並びに水和物形態を含む溶媒和形態で存在することが可能である。一般に、溶媒和形態は非溶媒和形態と同等であり、本開示の範囲内に包含される。一定の式（Ｉ）の化合物は、多数の結晶性又はアモルファス形態で存在し得る。一般に、全ての物理的形態が本開示によって想定される使用について同等であり、本開示の範囲内であることが意図されている。

【0093】

「溶媒和物」という用語は、通常は加溶剤分解反応による、溶剤に付随する化合物の形態を指す。この物理的な付随は水素結合を含み得る。従来の溶剤としては、水、メタノール、エタノール、酢酸、ＤＭＳＯ、ＴＨＦ、ジエチルエーテルなどが挙げられる。本明細書に記載の化合物は、例えば結晶形態で調製され得、溶媒和され得る。好適な溶媒和物としては、薬学的に許容可能な溶媒和物が挙げられ、さらに、化学量論的溶媒和物及び非化学量論的溶媒和物の両方が挙げられる。

【0094】

「水和物」という用語は、水に付随している化合物を指す。典型的には、化合物の水和物に含有される水分子の数は、水和物中の化合物分子の数に対する確定された割合である。したがって、化合物の水和物は、例えば一般式Ｒ・ｘ Ｈ２Ｏ（式中、Ｒは化合物であり、ｘは０超の数字である）によって表され得る。

【0095】

「互変異性体」という用語は、本明細書において用いられるところ、化合物構造の相互変換可能な形態であって、水素原子及び電子の変位が様々である化合物を指す。それ故、２つの構造が、π電子及び原子（通常はＨ）の移動を介して平衡状態にあり得る。例えば、酸又は塩基のいずれかを伴う処理によって急速に相互変換されるため、エノール及びケトンは互変異性体である。互変異性体は、対象となる化合物の最適な化学反応性及び生物活性の獲得と関連性があり得る。

【0096】

本明細書において用いられるところ、記号

【化2】

は、エンティティ、例えば、ポリマー（例えば、アルギン酸塩などのヒドロゲル形成ポリマー）又は移植可能な要素（例えば、粒子、デバイス（例えば、ヒドロゲルカプセル）若しくは物質）の表面への結合を指す。

【化3】

によって表される結合は、エンティティ、例えば、ポリマー又は移植可能な要素（例えば、デバイス）への直接結合を指し得、又は結合基を介したエンティティへの連結を指し得る。本明細書において用いられるところ、「結合基」は、エンティティ（例えば、本明細書に記載のポリマー又は移植可能な要素）への式（Ｉ）の化合物の連結のための部分を指し、当該技術分野において公知であるいずれかの結合化学を含み得る。例示的な結合基の列挙は、本明細書において参照によりその全体が援用される、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（３ｒｄ ｅｄ，Ｇｒｅｇ Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｉｎｃ，２０１３）に概説されている。いくつかの実施形態において、結合基は、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、－Ｃ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｎ（ＲＣ）－、－Ｎ（ＲＣ）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＣ）－、－Ｎ（ＲＣ）Ｎ（ＲＤ）－、－ＮＣＮ－、－Ｃ（＝Ｎ（ＲＣ）（ＲＤ））Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓ（Ｏ）ｘ－、－ＯＳ（Ｏ）ｘ－、－Ｎ（ＲＣ）Ｓ（Ｏ）ｘ－、－Ｓ（Ｏ）ｘＮ（ＲＣ）－、－Ｐ（ＲＦ）ｙ－、－Ｓｉ（ＯＲＡ）２－、－Ｓｉ（ＲＧ）（ＯＲＡ）－、－Ｂ（ＯＲＡ）－、又は金属を含み、ここで、ＲＡ、ＲＣ、ＲＤ、ＲＦ、ＲＧ、ｘ及びｙの各々は、独立して本明細書に記載されているとおりである。いくつかの実施形態において、結合基は、アミン、ケトン、エステル、アミド、アルキル、アルケニル、アルキニル、又はチオールを含む。いくつかの実施形態において、結合基は架橋剤である。いくつかの実施形態において、結合基は－Ｃ（Ｏ）（Ｃ１～Ｃ６－アルキレン）－であり、ここで、アルキレンはＲ１で置換され、Ｒ１は本明細書に記載されているとおりである。いくつかの実施形態において、結合基は－Ｃ（Ｏ）（Ｃ１～Ｃ６－アルキレン）－であり、ここで、アルキレンは、１～２個のアルキル基（例えば、１～２個のメチル基）で置換される。いくつかの実施形態において、結合基は－Ｃ（Ｏ）Ｃ（ＣＨ３）２－である。いくつかの実施形態において、結合基は－Ｃ（Ｏ）（メチレン）－であり、ここで、アルキレンは、１～２個のアルキル基（例えば、１～２個のメチル基）で置換される。いくつかの実施形態において、結合基は－Ｃ（Ｏ）ＣＨ（ＣＨ３）－である。いくつかの実施形態において、結合基は－Ｃ（Ｏ）Ｃ（ＣＨ３）－である。

【0097】

［ＦＶＩＩ発現コンストラクト］
本開示は、ヒトＦＶＩＩ前駆体タンパク質又はその変異体、例えば、ＦＶＩＩ融合タンパク質、をコードするヌクレオチド配列に動作可能に連結されたプロモーターを含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。実施形態において、ポリヌクレオチドは、二本鎖ポリヌクレオチドである。

【0098】

実施形態において、プロモーターは、ヒトＦＶＩＩ遺伝子のプロモーターに動作可能に連結された同じＦＶＩＩコード配列と比較して、ＲＰＥ細胞（例えば、ＡＲＰＥ－１９細胞）においてＦＶＩＩ ｍＲＮＡのより高い発現を達成するように選択される。実施形態において、プロモーターは、配列番号１０、又は配列番号１０と実質的に同一である、例えば、配列番号１０と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくはそれ以上同一である、ヌクレオチド配列から本質的になるか、又はそれからなる。実施形態において、プロモーターは配列番号１０からなる。

【0099】

実施形態において、プロモーターは、配列番号２１、又は配列番号２１と実質的に同一である、例えば、配列番号１０と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくはそれ以上同一である、ヌクレオチド配列から本質的になるか、又はそれからなる。実施形態において、プロモーターは配列番号２１からなる。

【0100】

実施形態において、ＦＶＩＩ前駆体タンパク質は、野生型ヒトＦＶＩＩタンパク質、例えば、配列番号１、又はその保存的に置換された変異体からの成熟アミノ酸配列を含む。実施形態において、保存的に置換された変異体は、１０個以下、９つ以下、８つ以下、７つ以下、６つ以下、５つ以下、４つ以下、３つ以下、２つ以下又は１つ以下の保存的置換を有する。実施形態において、ＦＶＩＩ前駆体タンパク質は、配列番号１からなる。

【0101】

実施形態において、前駆体ＦＶＩＩタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、哺乳動物細胞におけるＦＶＩＩ発現のためにコドン最適化されている。実施形態において、コドン最適化配列は、配列番号３、又は配列番号３と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくはそれ以上同一のヌクレオチド配列である。実施形態において、コドン最適化配列は、配列番号４、又は配列番号４と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくはそれ以上同一のヌクレオチド配列である。

【0102】

実施形態において、ヌクレオチド配列は、ＦＶＩＩ融合タンパク質をコードする。実施形態において、ＦＶＩＩ融合タンパク質は、非ＦＶＩＩポリペプチドをコードするアミノ酸配列に動作可能に連結された前駆体ヒトＦＶＩＩ又はその保存的に置換された変異体のアミノ酸配列を含む。非ＦＶＩＩポリペプチドは、融合タンパク質により長い半減期又は他の所望の特性を付与する任意のタンパク質又はタンパク質ドメイン、例えば、アルブミン、ＩｇＧ Ｆｃ、ＩｇＧ軽鎖からの定常ドメイン、ＩｇＧ重鎖の定常ドメインの１つ、２つ若しくは３つ、ナノボディ、トランスフェリン、ＣＴＰ（４つのＯ－グリカンを含むヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）の２８アミノ酸Ｃ末端ペプチド（ＣＴＰ））、ＸＴＥＮ、ホモアミノ酸ポリマー（ＨＡＰ）、プロリン－アラニン－セリン（ＰＡＳ）、又はそれらの任意の組み合わせであり得る。

【0103】

実施形態において、ＦＶＩＩ－アルブミン融合タンパク質のアルブミン部分は、配列番号５、配列番号７、又は配列番号５又は配列番号７の保存的に置換された変異体から本質的になるか、又はそれからなる。実施形態において、配列番号５又は配列番号７の保存的に置換された変異体は、１０個以下、９つ以下、８つ以下、７つ以下、６つ以下、５つ以下、４つ以下、３つ以下、２つ以下又は１つ以下の保存的置換を有し、リンカーペプチドに置換を有しない。実施形態において、ＦＶＩＩ融合タンパク質は、アミノ酸配列の以下の組み合わせ：
ｉ）配列番号１及び配列番号５（本明細書において配列番号１１と呼ばれる）又は
ｉｉ）配列番号１及び配列番号７（本明細書において配列番号１２と呼ばれる）
の１つを含む。

【0104】

実施形態において、ＦＶＩＩ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、ＦＶＩＩ及びアルブミンコード配列の以下の組み合わせ：
ｉ）配列番号３及び配列番号６（本明細書において配列番号１３と呼ばれる）；
ｉｉ）配列番号３及び配列番号８（本明細書において配列番号１４と呼ばれる）；
ｉｉｉ）配列番号４及び配列番号６（本明細書において配列番号１５と呼ばれる）；
ｉｖ）配列番号４及び配列番号８（本明細書において配列番号１６と呼ばれる）；
ｖ）配列番号２及び配列番号６（本明細書において配列番号１７と呼ばれる）；及び
ｖｉ）配列番号２及び配列番号８（本明細書において配列番号１８と呼ばれる）
の１つを含む。

【0105】

実施形態において、単離されたポリヌクレオチドは、ポリペプチドコード配列のＡＴＧ開始コドンのすぐ上流にあるＫｏｚａｋ翻訳配列をさらに含む転写ユニットを含む。実施形態において、Ｋｏｚａｋ翻訳配列は、配列番号９のヌクレオチド２０９４－２０９９（本明細書において配列番号１９と呼ばれる）、又は配列番号１９と実質的に同一である（例えば、配列番号１９と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくはそれ以上同一である）、ヌクレオチド配列から本質的になるか、又はそれからなる。実施形態において、転写ユニットは、配列番号９のヌクレオチド２１６３－２６８４（本明細書において配列番号２０と呼ばれる）、又は配列番号２０と実質的に同一である（例えば、配列番号２０と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくはそれ以上同一である）、ヌクレオチド配列から本質的になるか、又はそれからなる、ポリＡ配列をさらに含む。実施形態において、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号２、３、４、１３、１４、１５、１６、１７、若しくは１８のいずれかに動作可能に連結されたプロモーターとしての配列番号１０又は配列番号２１を含む。実施形態において、単離されたポリヌクレオチドは、プロモーターとＫｏｚａｋ翻訳配列との間に位置するＵＴＲ配列を含む。実施形態において、ＵＴＲ配列は、配列番号２２のヌクレオチド２０９４～２３７５から本質的になるか、又はそれからなる。実施形態において、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号９のヌクレオチド２１００と２１０１の間に挿入された配列番号２、３、４、１３、１４、１５、１６、１７又は１８のいずれかを含む。実施形態において、転写ユニットは、逆位末端反復配列の対の間、例えば５’ＩＴＲ（例えば、配列番号９のヌクレオチド１～３１３）と３’ＩＴＲ（例えば、配列番号９のヌクレオチド２８９４～３１２８）の間に配置されている。実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号２３又は配列番号２４を含む。

【0106】

実施形態において、単離されたポリヌクレオチドは、２つ、３つ、又はそれ以上の転写ユニットを含む。実施形態において、各転写ユニットは、同じ又は異なるＦＶＩＩコード配列に動作可能に連結された異なるプロモーターを有し、これは、任意選択により、非ＦＶＩＩコード配列に融合される。実施形態において、ポリヌクレオチドは、プロモーター以外の点では同一である２つの転写ユニットを含む。実施形態において、ポリヌクレオチドは、プロモーター及び前駆体ＦＶＩＩタンパク質をコードするヌクレオチド配列以外の点では同一である２つの転写ユニットを含む。実施形態において、転写ユニットは、逆位末端反復配列の対の間、例えば５’ＩＴＲと３’ＩＴＲの間に、タンデムに配置されている。

【0107】

実施形態において、単離されたポリヌクレオチドは、プロモーター及びＦＶＩＩコード配列を含む上流転写ユニットと、プロモーター及びＦＶＩＩコード配列を含む下流転写ユニットとの組み合わせを含み、ここで、組み合わせは、以下からなる群から選択される：
ｉ）上流：配列番号２、３、４、１３、１４、１５、１６、１７及び１８のいずれかに１つに動作可能に連結された配列番号１０
下流：配列番号２、３、４、１３、１４、１５、１６、１７及び１８のいずれかに１つに動作可能に連結された配列番号２１；
ｉｉ）上流：配列番号２、３、４、１３、１４、１５、１６、１７及び１８のいずれかに１つに動作可能に連結された配列番号２１
下流：配列番号２、３、４、１３、１４、１５、１６、１７及び１８のいずれかに１つに動作可能に連結された配列番号１０；
ｉｉｉ）上流：配列番号２に動作可能に連結された配列番号１０；
下流：配列番号３に動作可能に連結された配列番号２１；
ｉｖ）上流：配列番号３に動作可能に連結された配列番号１０；
下流：配列番号２に動作可能に連結された配列番号２１；
ｖ）上流：配列番号２に動作可能に連結された配列番号１０；
下流：配列番号４に動作可能に連結された配列番号２１；
ｖｉ）上流：配列番号３に動作可能に連結された配列番号１０；
下流：配列番号２に動作可能に連結された配列番号２１；
ｖｉｉ）上流：配列番号３に動作可能に連結された配列番号１０；
下流：配列番号３に動作可能に連結された配列番号２１。

【0108】

実施形態において、単離されたポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号２５又は（ｂ）配列番号２２を含む。

【0109】

［組み換えＲＰＥ細胞］
上記の単離されたポリヌクレオチドは、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞、又はＦＶＩＩタンパク質を発現及び分泌するように組み換えられたＲＰＥ細胞に由来する細胞を生成するのに有用である。実施形態において、組み換え（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）（例えば、組み換え（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ））ＲＰＥ細胞は、配列番号２、３、４、１３、１４、１５、１６、１７及び１８の１つ若しくは複数を含む。実施形態において、組み換えＲＰＥ細胞は、染色体外性発現ベクターに存在するか、又は細胞核の１つ又は複数の染色体部位に組み込まれ得る、本明細書に記載の転写ユニットを含む。実施形態において、組み換え細胞は、細胞核内の同じゲノム部位にタンデムに組み込まれている転写ユニットの２つ、３つ、４つ、又はより多くのコピーを含む。

【0110】

本明細書に記載の組み換えＲＰＥ細胞は、様々な株のいずれかに由来し得る。ＲＰＥ細胞の例示的な株には、ＡＲＰＥ－１９細胞、ＡＲＰＥ－１９－ＳＥＡＰ－２－ｎｅｏ細胞、ＲＰＥ－Ｊ細胞、及びｈＴＥＲＴＲＰＥ－１細胞が含まれる。いくつかの実施形態において、組み換え細胞は、ＡＲＰＥ－１９（ＡＴＣＣ ＣＲＬ（登録商標）－２３０２（商標））細胞株に由来する。いくつかの実施形態において、組み換えＲＰＥ（例えば、ＡＲＰＥ－１９）細胞は、モノクローナル細胞株から増殖される。

【0111】

実施形態において、本明細書に記載の組み換え細胞は、ＲＰＥ細胞、例えば、天然に存在するＲＰＥ細胞に特徴的なバイオマーカー、例えば、抗原を発現する。いくつかの実施形態において、バイオマーカー（例えば、抗原）はタンパク質である。例示的なバイオマーカーには、ＣＲＡＬＢＰ、ＲＰＥ－６５、ＲＬＢＰ、ＢＥＳＴ１、又はαＢ－クリスタリンが含まれる。実施形態において、組み換え細胞は、ＣＲＡＬＢＰ、ＲＰＥ－６５、ＲＬＢＰ、ＢＥＳＴ１、又はαＢ－クリスタリンの少なくとも１つを発現する。実施形態において、組み換え細胞は、ＣＲＡＬＢＰ及びＲＰＥ－６５の少なくとも１つを発現する。

【0112】

例えば、ヒドロゲルカプセルに含有されるか又はその中にカプセル化された複数の組み換え細胞として、本明細書に記載のデバイス、組成物及び方法における使用のための組み換えＲＰＥ細胞は、細胞周期の様々な段階にあり得る。いくつかの実施形態において、複数の組み換え細胞のうちの少なくとも１つの組み換え細胞は、細胞分裂を起こしている。細胞分裂は、例えば、ＤｅＦａｚｉｏ Ａ ｅｔ ａｌ（１９８７）Ｊ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ ３５：５７１－５７７及びＤｏｌｂｅａｒｅ Ｆ ｅｔ ａｌ（１９８３）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８０：５５７３－５５７７（これらはそれぞれ、その全体が参照により組み込まれる）に記載されているように、当該技術分野における任意の既知の方法を使用して測定され得る。実施形態において、細胞の少なくとも１、２、３、４、５、１０、又は２０％が、例えば、５－エチニル－２’デオキシウリジン（ＥｄＵ）アッセイ又は５－ブロモ－２’－デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）アッセイによって決定されるように、細胞分裂を起こしている。いくつかの実施形態において、細胞増殖は、顕微鏡検査（例えば、蛍光顕微鏡検査（例えば、タイムラプス又は紡錘体形成の評価））又はフローサイトメトリーによって視覚化又は定量化される。いくつかの実施形態において、複数の組み換え細胞内の組み換え細胞はいずれも、細胞分裂を起こしておらず、静止状態である。実施形態において、細胞の１、２、３、４、５、１０、又は２０％未満が、細胞分裂を起こしており、５－エチニル－２’デオキシウリジン（ＥｄＵ）アッセイ、５－ブロモ－２’－デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）アッセイ、顕微鏡検査（例えば、蛍光顕微鏡検査（例えば、タイムラプス又は紡錘体形成の評価））又はフローサイトメトリー。

【0113】

実施形態において、複数の組み換えＲＰＥ細胞の少なくとも１、２、３、４、５、１０、２０、４０、又は８０％が生存可能である。細胞生存率は、例えば、Ａｓｓａｙ Ｇｕｉｄａｎｃｅ Ｍａｎｕａｌ（Ｓｉｔｔａｐａｌａｍ，Ｇ．Ｓ．ｅｔ ａｌ，編）のＲｉｓｓ，Ｔ．ｅｔ ａｌ（２０１３）“Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙｓ”に記載されるように、当技術分野で既知の任意の方法を使用して測定され得る。例えば、細胞生存率は、ＡＴＰアッセイ、５－エチニル－２’デオキシウリジン（ＥｄＵ）アッセイ、５－ブロモ－２’－デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）アッセイによって測定又は定量化され得る。いくつかの実施形態において、細胞生存率は、顕微鏡検査（例えば、蛍光顕微鏡検査（例えば、タイムラプス又は紡錘体形成の評価））又はフローサイトメトリーによって視覚化又は定量化される。実施形態において、複数のＲＰＥ細胞の少なくとも１、２、３、４、５、１０、２０、４０又は８０％が、例えばＡＴＰアッセイ、５－エチニル－２’デオキシウリジン（ＥｄＵ）アッセイ、５－ブロモ－２’－デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）アッセイ、顕微鏡検査（例えば、蛍光顕微鏡検査（例えば、タイムラプス又は紡錘体形成の評価））又はフローサイトメトリーによって決定されるように、生存可能である。

【0114】

本明細書に記載のパラメータはいずれも、組織学的検査、顕微鏡検査、及び様々な機能アッセイなどの、当業者の１人に知られている標準的な技術を使用して評価することができる。

【0115】

［ＦＶＩＩ活性の測定］
本明細書に記載の組み換え細胞又はデバイスによって分泌されるＦＶＩＩの活性は、当該技術分野で既知の又は下記の実施例に記載される直接的又は間接的なＦＶＩＩ活性アッセイによって測定され得る。

【0116】

例えば、生体液、例えば、血漿のサンプルのＦＶＩＩ生物活性は、（ｉ）脂質膜及び第Ｘ因子に埋め込まれたＴＦを含むシステムにおいて生成された第Ｘａ因子の量を測定すること（Ｐｅｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１９９１９－１９９２４，１９９７）；（ｉｉ）水性系における第Ｘ因子加水分解を測定すること；（ｉｉｉ）表面プラズモン共鳴に基づいて機器を用いて組織因子（ＴＦ）へのその物理的結合を測定すること（Ｐｅｒｓｓｏｎ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｓ．４１３：３５９－３６３，１９９７）；又は（ｉｖ）合成基質の加水分解を測定すること；及び／又は（ｖ）ＴＦ非依存性インビトロ系におけるトロンビンの生成を測定することによって定量化され得る。実施形態において、ＦＶＩＩ活性は、市販の発色アッセイ（ＢＩＯＰＨＥＮ ＦＶＩＩ，ＨＹＰＨＥＮ ＢｉｏＭｅｄ Ｎｅｕｖｉｌｌｅ ｓｕｒ Ｏｉｓｅ，Ｆｒａｎｃｅ）によって評価され、ここで、ＦＶＩＩを含有する生体サンプルが、トロンボプラスチンカルシウム、第Ｘ及びＳＸａ－１１因子（第Ｘａ因子に特異的な発色性基質と混合される。

【0117】

［デバイス］
本明細書に記載の組み換えＲＰＥ細胞又は複数のそのような細胞は、ＦＶＩＩタンパク質を、対象、例えば、出血障害を有する患者、例えば、ＦＶＩＩＩの阻害剤又はＦＩＸ補充療法剤を有する血友病患者、ＦＶＩＩ欠乏症の患者に提供する際に使用するための移植可能なデバイスに組み込まれ得る。

【0118】

例示的な移植可能なデバイスは、金属、金属合金、セラミック、ポリマー、繊維、不活性材料、及びこれらの組み合わせ等の材料を含む。デバイス（例えば粒子）は、意図された標的位置への移植後にカプセル化細胞の生存率及び産生性を支持するのに適した任意の構成及び形状を有し得る。いくつかの実施形態において、デバイスは、ヒドロゲルカプセル、例えば、ミリカプセル又はマイクロカプセル（例えば、ヒドロゲルミリカプセル又はヒドロゲルマイクロカプセル）である。デバイス（例えば、カプセル、粒子）は、組み換えＲＰＥ細胞により発現されない１種又は複数種の外因性の薬剤を含み得（且つ任意選択により放出するように構成され）、この薬剤として、例えば、核酸（例えばＲＮＡ若しくはＤＮＡ分子）、タンパク質（例えば、ホルモン、酵素（例えば、グルコースオキシダーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、オキシゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ、レダクターゼ）、抗体、抗体断片、抗原、若しくはエピトープ））、小分子、脂質、薬物、ワクチン、又はこれらの任意の誘導体、小分子、タンパク質若しくはポリペプチドの活性な若しくは不活性な断片が挙げられ得る。いくつかの実施形態において、デバイスは、異物反応（ＦＢＲ）を軽減するための（例えば、このデバイスが対象中に移植されたか対象上に移植された場合にＦＢＲを軽減するための）少なくとも１つの手段を含む。

【0119】

本明細書で説明されているデバイスは、対象への移植用か又は投与用の調製物又は組成物（即ち、デバイス調製物又はデバイス組成物）として提供され得る。いくつかの実施形態において、デバイス調製物又はデバイス組成物は、少なくとも２個、４個、８個、１６個、３２個、６４個、又はより多くのデバイスを含み、この調製物中の又は組成物中のデバイスの少なくとも２０％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％は、本明細書で説明されている特徴（例えば、平均カプセル直径、又は細胞含有区画中の細胞数）を有する。

【0120】

デバイス、デバイス調製物、又はデバイス組成物は、身体の任意の部位又は部分の内部又はその上へのインプラント、又は移植又は配置のために構成され得る。いくつかの実施形態において、移植可能なデバイス又はデバイス調製物は、腹腔（例えば、網嚢（ｏｍｅｎｔａｌ ｂｕｒｓａ）又は網嚢（ｂｕｒｓａｌｉｓ ｏｍｅｎｔｕｍ）としても知られる網嚢（ｌｅｓｓｅｒ ｓａｃ））内への移植のために構成される。デバイス、デバイス調製物、又はデバイス組成物は、腹膜腔（例えば、網、例えば、網嚢）内に移植されるか、又は注入若しくはカテーテルによって腹膜腔（例えば、網、例えば、網嚢）内の表面に配置され得る。網（例えば、網嚢）内へのデバイス、デバイス調製物、又はデバイス組成物のインプラント又は配置についてのさらなる検討が、Ｍ．Ｐｅｌｌｉｃｃｉａｒｏ ｅｔ ａｌ．（２０１７）ＣｅｌｌＲ４ ５（３）：ｅ２４１０に示されている。

【0121】

いくつかの実施形態において、移植可能なデバイスは、ポリマー組成物によってカプセル化された複数の生細胞を含む少なくとも１つの細胞含有区画を含む。ある実施形態において、デバイスは、２個、３個、４個、又はより多くの細胞含有区画を含む。各細胞含有区画は、複数の生細胞を含み、これらの区画の内の少なくとも１個中の細胞は、デバイスが対象に移植された場合にＦＶＩＩタンパク質を発現及び分泌し得る。

【0122】

いくつかの実施形態において、細胞含有区画内のポリマー組成物は、多糖又は他のヒドロゲル形成ポリマー（例えば、アルギン酸塩、ヒアルロン酸塩又はコンドロイチン）を含む。いくつかの実施形態において、ポリマーはアルギン酸塩であり、これは、β－Ｄ－マンヌロン酸（Ｍ）及びα－Ｌ－グルロン酸（Ｇ）から構成される多糖である。いくつかの実施形態において、アルギン酸塩は、低分子量（例えば、おおよその分子量７５ｋＤ未満）且つＧ：Ｍ比≧１．５を有するか、（ｉｉ）中分子量のアルギン酸、例えば、おおよその分子量７５～１５０ｋＤａ且つＧ：Ｍ比≧１．５を有するもの、（ｉｉ）高分子量のアルギン酸、例えば、おおよそのＭＷ１５０～２５０ｋＤａ且つＧ：Ｍ比≧１．５を有するもの、（ｉｖ）又はこれらのアルギン酸塩の２つ以上のブレンドである。

【0123】

いくつかの実施形態において、細胞含有区画は、少なくとも１つの細胞結合物質（ＣＢＳ）、例えば、細胞結合ペプチド（ＣＢＰ）又は細胞結合ポリペプチド（ＣＢＰＰ）をさらに含む。ある実施形態において、ＣＢＳは、リンカーを介してポリマー組成物中のポリマー分子に共有結合的に付着したＣＢＰ（「ＣＢＰ－ポリマー」）を含む。実施形態において、ＣＢＰポリマー中のポリマーは、多糖（例えば、アルギン酸塩）又は他のヒドロゲル形成ポリマーである。本明細書では、本開示のデバイスでの使用のための様々な細胞結合ペプチドが説明されている。ある実施形態において、この細胞結合ペプチドは、２５個以下（例えば、２０個、１５個、１０個、若しくはより少ない）のアミノ酸の長さであり、且つ細胞付着分子（ＣＡＭ）のリガンドの細胞結合配列を含む。ある実施形態において、この細胞結合ペプチドは、本明細書の表１で示されている細胞結合配列から本質的になる。ある実施形態において、この細胞結合配列は、ＲＧＤ（配列番号３３）又はＲＧＤＳＰ（配列番号４８）である。ある実施形態において、この細胞結合ペプチドのアミノ末端は、アミノ酸リンカーを介してポリマーに共有結合的に付着している。ある実施形態において、このアミノ酸リンカーは、１～３個のグリシン残基から本質的になる。ある実施形態において、この細胞結合ペプチドは、ＲＧＤ（配列番号３３）又はＲＧＤＳＰ（配列番号４８）から本質的になり、このリンカーは、単一のグリシン残基から本質的になる。

【0124】

実施形態において、細胞含有区画（例えば、２区画ヒドロゲルカプセルの内側区画）に存在する各ＣＢＰポリマーは、少なくとも０．０５％、０．１％、０．２％、又は０．３％であるが、４％、３％、２％、又は１％未満である、細胞結合ペプチド密度（本明細書の実施例に記載される燃焼分析によって決定される％窒素）を有する。実施形態において、細胞含有区画内のリンカーＣＢＰの総密度は、定量的ペプチドコンジュゲーションアッセイ（例えば、本明細書で説明されているアッセイ）により決定した場合に、溶液中のＣＢＰ－ポリマー（例えば、ＧＲＧＤ（配列番号５０）若しくはＧＲＧＤＳＰ（配列番号４９）で共有結合的に修飾されたＭＭＷ－アルギン酸塩）１ｇ当たりＣＢＰ約０．１～約１．０マイクロモルである。ある実施形態において、ＣＢＰはＲＧＤＳＰ（配列番号４８）であり、リンカーはＧであり、ポリマーは、分子量が７５ｋＤａ～１５０ｋＤａであり且つＧ：Ｍ比が１．５以上であるアルギン酸塩である。ある実施形態において、細胞含有区画はまた、ＣＢＰ－ポリマー中のポリマーと同一であるか又は異なる非修飾ヒドロゲル形成ポリマーも含む。ある実施形態において、ＣＢＰ－ポリマー及び非修飾ポリマー中のポリマーは、分子量が７５ｋＤａ～１５０ｋＤａであり且つＧ：Ｍ比が１．５以上であるアルギン酸塩である。

【0125】

ある実施形態において、定量的ペプチドコンジュゲーションアッセイは、ＣＰＢ－ポリマーのサンプルを酸性加水分解に供して、コンジュゲートペプチド（及びＣＢＰ－ポリマー中の任意の残留非コンジュゲートペプチド）から個々のアミノ酸を生成すること、これら個々のアミノ酸を定量すること、各アミノ酸のモル濃度を平均化すること、並びにサンプル中の総ペプチド濃度を算出することを含む。ある実施形態において、定量的ペプチドコンジュゲーションアッセイを、本明細書の下記の実施例で説明されているプロセスと実質的に同様に実施する。ある実施形態において、定量的ペプチドコンジュゲーションアッセイはまた、総ペプチド濃度からサンプル中の任意の残留非コンジュゲートペプチドの濃度を減算することも含む。ＣＢＰ－ポリマー組成物中の非コンジュゲートペプチドの濃度を、当該技術分野で既知の任意の適切なアッセイを使用して決定し得、例えば、本明細書の下記の実施例で説明されているＬＣ－ＭＳにより決定し得る。典型的には、定量的ペプチドコンジュゲーションアッセイを、デバイスを調製するために使用されるＣＢＰ－ポリマーの生理食塩水溶液のサンプルに対して実施するが、ＣＢＰ－ポリマーの凍結乾燥サンプルに対して実施してもよい。

【0126】

いくつかの実施形態において、デバイスは、異物反応（ＦＢＲ）を軽減するための（例えば、このデバイスが対象中に移植されたか対象上に移植された場合にＦＢＲを軽減するための）少なくとも１つの手段をさらに含む。デバイスのＦＢＲを軽減するための様々な手段が本明細書に記載されているが、参照デバイスと比較してデバイスに対するＦＢＲを低減することができる任意の生物学的、化学的又は物理的要素が本明細書で企図される。

【0127】

例えば、本明細書で開示されているデバイスにおけるＦＢＲを軽減するための手段は、半透過性の生体適合膜であって、細胞の生存及び機能に重要な酸素及び他の分子がこの半透膜を通って移動することを可能にするが、免疫細胞が孔を通過することを防止するように選択されている孔径を有する半透過性の生体適合膜で細胞を取り囲むことを含み得る。ある実施形態において、この半透膜は、分子量カットオフが１０００ｋＤ未満であるか、又は５０～７００ｋＤ、７０～３００ｋＤ、若しくは７０～１５０ｋＤ、若しくは７０～１３０ｋＤである。

【0128】

別のＦＢＲ軽減手段は、細胞フリー生体適合材料から形成されたバリア区画で細胞含有区画を取り囲むことを含む（例えば、Ｍａ，Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ．Ｈｅａｌｔｈｃ Ｍａｔｅｒ．，２（５）：６６７－６７２（２０１２）で説明されているコア－シェルマイクロカプセル）。そのようなバリア区画は、半透膜手段とともに使用されるか又は半透膜手段なしで使用される可能性がある。ＦＢＲ軽減手段は、例えば米国特許第９，８６７，７８１号明細書で説明されているように、ＦＢＲを阻害するために、移植されたデバイスから放出される抗炎症剤をこのデバイス上に又はこのデバイス内に配置することを含み得る。他のＦＢＲ軽減手段は、国際公開第２０１７／１７６７９２号パンフレット及び同第２０１７／１７６８０４号パンフレットで説明されているように、デバイス表面上に配置されているか又はデバイス内にカプセル化されているＣＳＦ－１Ｒ阻害剤を用いる。他のＦＢＲ軽減手段は、Ｖｅｉｓｅｈ，Ｏ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ １４：６４３－６５２（２０１５）で説明されているように、直径が１ｍｍ超である球状の形状にデバイスを構成することを用いる。いくつかの実施形態において、ＦＢＲを軽減するための手段は、デバイスの外面上に及び／又は細胞含有区画を取り囲むバリア区画内に抗線維性化合物を配置することを含む。例示的な抗線維性化合物としては、本明細書の下記で説明する式（Ｉ）の化合物が挙げられる。いくつかの実施形態において、デバイスは、上記ＦＢＲ軽減手段の内の２つ以上の組み合わせを含み得る。

【0129】

いくつかの実施形態において、デバイスは、２個のヒドロゲル区画を有し、これら２個のヒドロゲル区画では、内側の細胞含有区画が、第２の外側の（例えばバリア）区画で完全に取り囲まれている。ある実施形態において、第２の区画の内側の境界は、例えば図９で示されているように、第１の区画の外側の境界と界面を形成する。そのような実施形態において、第２の（外側）区画の厚さは、第２の区画の外側の境界と、これら２個の区画の間の界面との平均距離を意味する。いくつかの実施形態において、外側区画の厚さは、約１０ナノメートル（ｎｍ）超であり、好ましくは１００ｎｍ以上であり、１ミリメートル（ｍｍ）と同程度であり得る。例えば、本明細書で説明されているヒドロゲルカプセルデバイス中の外側区画の厚さは、１０ｎｍ～１ｍｍ、１００ｎｍ～１ｍｍ、５００ｎｍ～１ミリメートル、１マイクロメータ（μｍ）～１ｍｍ、１μｍ～１ｍｍ、１μｍ～５００μｍ、１μｍ～２５０μｍ、１μｍ～１ｍｍ、５μｍ～５００μｍ、５μｍ～２５０μｍ、１０μｍ～１ｍｍ、１０μｍ～５００μｍ、又は１０μｍ～２５０μｍであり得る。いくつかの実施形態において、外側区画の厚さは、１００ｎｍ～１ｍｍ、１μｍ～１ｍｍ、１μｍ～５００μｍ、又は５μｍ～１ｍｍである。いくつかの実施形態において、外側区画の厚さは、約５０μｍ～約１００μｍである。

【0130】

いくつかの実施形態において、デバイス中の１つ又は複数の区画は、抗線維性ポリマーを含み、例えば、ＣＢＰ－ポリマー中のポリマーと同一であるか又は異なるポリマーに共有結合的に付着した式（Ｉ）の抗線維性化合物を含む。ある実施形態において、この抗線維性ポリマー中の一部又は全てのモノマーは、式（Ｉ）の同一の化合物で修飾されている。いくつかの実施形態において、この抗線維性ポリマー中の一部又は全てのモノマーは、式（Ｉ）の様々な化合物で修飾されている。デバイスが２区画ヒドロゲルカプセルであるいくつかの実施形態において、この抗線維性ポリマーは、外面を含む外側のバリア区画中にのみ存在する。

【0131】

デバイス中の１つ又は複数の区画は、ＣＢＰ－ポリマー中のポリマー及びこのデバイス中に存在する任意の抗線維性ポリマー中のポリマーと同一か又は異なる非修飾ポリマーを含み得る。ある実施形態において、デバイス中の第１の区画、第２の区画、又は全ての区画は、非修飾ポリマーを含む。いくつかの実施形態において、非修飾ポリマーは非修飾アルギン酸塩である。ある実施形態において、非修飾アルギン酸塩は、分子量が１５０ｋＤａ～２５０ｋＤａであり、且つＧ：Ｍ比が≧１．５である。

【0132】

いくつかの実施形態において、抗線維性ポリマーは、式（Ｉ）の化合物で化学的に修飾されたアルギン酸塩を含む。この抗線維性ポリマー中のアルギン酸塩は、デバイス中に存在する任意の非修飾アルギン酸塩と同一であってもよいし異なっていてもよい。いくつかの実施形態において、式（Ｉ）の化合物（例えば、表３中の化合物１０１）は、以下の実施例に記載される窒素パーセントの燃焼分析によって決定した際に、少なくとも２．０％且つ９．０％未満の窒素、又は２．０％～５％の窒素、３．０～８．０％の窒素、５～８．０％の窒素、４．０～７．０％の窒素、５．０％～７．０％の窒素、又は約６．０％～約７．０％の窒素又は約６．８％の窒素のコンジュゲーション密度で、アルギン酸塩（例えば、おおよそのＭＷ＜７５ｋＤａ、Ｇ：Ｍ比≧１．５を有するアルギン酸塩）に共有結合される。実施形態において、化合物１０１の量は、約０．５％～２％、２％～４％のＮ、約４％～６％のＮ、約６％～８％、又は約８％～１０％のＮ）の、（非修飾アルギン酸塩と比した）％Ｎの増加をもたらし、ここで、％ Ｎは、燃焼分析によって決定され、修飾アルギン酸塩中の化合物１０１の量に相当する。

【0133】

他の実施形態において、抗線維性アルギン酸塩中の式（Ｉ）の化合物（例えば化合物１０１）の密度（例えば濃度）は、ｗ／ｗ％として定義され、例えば、適切な定量的アミンコンジュゲーションアッセイ（例えば、本明細書で説明されているアッセイ）により決定した場合のアミンの重量／溶液（例えば生理食塩水）中の抗線維性アルギン酸塩の量の％として定義され、一定の実施形態において、式（Ｉ）の化合物（例えば化合物１０１）の密度は、約１．０ｗ／ｗ％～約３．０ｗ／ｗ％、約１．３ｗ／ｗ％～約２．５ｗ／ｗ％、又は約１．５ｗ／ｗ％～２．２ｗ／ｗ％である。ある実施形態において、定量的アミンコンジュゲーションアッセイは、化学修飾ポリマー（例えば、式（Ｉ）の化合物で修飾されたアルギン酸塩、例えばＣＭ－ＬＭＷ－Ａｌｇ－１０１）のサンプルを酸性加水分解に供して遊離アミンを生成すること、及びサンプル中の全遊離アミンを定量することを含む。ある実施形態において、定量的アミンコンジュゲーションアッセイはまた、総アミン濃度から、非加水分解サンプル中の非コンジュゲートアミン（例えば、式（Ｉ）の化合物）の濃度を減算することも含む。定量的アミンコンジュゲーションアッセイを、典型的には、デバイスを調製するために使用される化学修飾アルギン酸塩の生理食塩水溶液のサンプルに対して実施するが、化学修飾アルギン酸塩の凍結乾燥サンプルに対して実施してもよい。ある実施形態において、定量的アミンコンジュゲーションアッセイを、本明細書の実施例９で説明されているプロセスと実質的に同様に実施する。ある実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、表３で示されている化合物１０１である。

【0134】

抗線維性ポリマー中のアルギン酸塩は、当該技術分野において公知の任意の好適な方法を用いて、式（Ｉ）の化合物で化学修飾され得る。例えば、アルギン酸塩カルボン酸部分は、式（Ｉ）の化合物で修飾されたアルギン酸塩を得るために、１つ又は複数のアミン官能化化合物への結合のために活性化され得る。アルギン酸塩ポリマーは、水（ポリマーのグラム当たり３０ｍＬ）に溶解され、２－クロロ－４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン（０．５当量）及びＮ－メチルモルホリン（１当量）で処理され得る。この混合物に、アセトニトリル（０．３Ｍ）中の式（Ｉ）の化合物の溶液が加えられ得る。反応物が、例えば、１６時間にわたって５５℃に温められ、次に、室温に冷却され、回転蒸発によって徐々に濃縮され得る。次に、残渣が、例えば水に溶解され得る。次に、混合物は、例えば、シアノ修飾シリカゲル（Ｓｉｌｉｃｙｃｌｅ）の床に通してろ過され得、ろ過ケーキが水で洗浄され得る。次に、得られた溶液が、２４時間にわたって水に対して透析され得（１０，０００ ＭＷＣＯ膜）、例えば、水を２回交換する。得られた溶液が、例えば、凍結乾燥によって濃縮されて、所望の化学修飾アルギン酸塩が得られる。

【0135】

［式（Ｉ）の化合物］
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のデバイスは、式（Ｉ）：

【化4】

の化合物又はその薬学的に許容可能な塩を含み、式中、
Ａは、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｎ（ＲＣ）－、－Ｎ（ＲＣ）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＣ）－、－Ｎ（ＲＣ）Ｃ（Ｏ）（Ｃ１～Ｃ６－アルキレン）－、－Ｎ（ＲＣ）Ｃ（Ｏ）（Ｃ１～Ｃ６－アルケニレン）－、－Ｎ（ＲＣ）Ｎ（ＲＤ）－、－ＮＣＮ－、－Ｃ（＝Ｎ（ＲＣ）（ＲＤ））Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓ（Ｏ）ｘ－、－ＯＳ（Ｏ）ｘ－、－Ｎ（ＲＣ）Ｓ（Ｏ）ｘ－、－Ｓ（Ｏ）ｘＮ（ＲＣ）－、－Ｐ（ＲＦ）ｙ－、－Ｓｉ（ＯＲＡ）２－、－Ｓｉ（ＲＧ）（ＯＲＡ）－、－Ｂ（ＯＲＡ）－、又は金属であり、これらの各々は、結合基（例えば、本明細書に記載の結合基）に任意選択により結合され、１個以上のＲ１で任意選択により置換されており；
Ｌ１及びＬ３の各々は独立して、結合、アルキル、又はヘテロアルキルであり、ここで、アルキル及びヘテロアルキルの各々は、１個以上のＲ２で任意選択により置換されており；
Ｌ２は結合であり；
Ｍは、不在であるか、各々が１個以上のＲ３で任意選択により置換されている、アルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、又はヘテロアリールであり；
Ｐは、不在であるか、各々が１個以上のＲ４で任意選択により置換されている、シクロアルキル、ヘテロシクリル、又はヘテロアリールであり；
Ｚは、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、－ＯＲＡ、－Ｃ（Ｏ）ＲＡ、－Ｃ（Ｏ）ＯＲＡ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＣ）（ＲＤ）、－Ｎ（ＲＣ）Ｃ（Ｏ）ＲＡ、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、又はヘテロアリールであり、ここで、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、及びヘテロアリールの各々は、１個以上のＲ５で任意選択により置換されており；
ＲＡ、ＲＢ、ＲＣ、ＲＤ、ＲＥ、ＲＦ、及びＲＧの各々は独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ハロゲン、アジド、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、又はヘテロアリールであり、ここで、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、及びヘテロアリールの各々は、１個以上のＲ６で任意選択により置換されており；
又はＲＣ及びＲＤは、これらが結合している窒素原子と一緒になって、１個以上のＲ６で任意選択により置換されている環（例えば５～７員環）を形成し；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６の各々は独立して、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ハロゲン、シアノ、アジド、オキソ、－ＯＲＡ１、－Ｃ（Ｏ）ＯＲＡ１、－Ｃ（Ｏ）ＲＢ１、－ＯＣ（Ｏ）ＲＢ１、－Ｎ（ＲＣ１）（ＲＤ１）、－Ｎ（ＲＣ１）Ｃ（Ｏ）ＲＢ１、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＣ１）、ＳＲＥ１、Ｓ（Ｏ）ｘＲＥ１、－ＯＳ（Ｏ）ｘＲＥ１、－Ｎ（ＲＣ１）Ｓ（Ｏ）ｘＲＥ１、－Ｓ（Ｏ）ｘＮ（ＲＣ１）（ＲＤ１）、－Ｐ（ＲＦ１）ｙ、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリールであり、ここで、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、及びヘテロアリールの各々は、１個以上のＲ７で任意選択により置換されており；
ＲＡ１、ＲＢ１、ＲＣ１、ＲＤ１、ＲＥ１、及びＲＦ１の各々は独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、又はヘテロアリールであり、ここで、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリールの各々は、１個以上のＲ７で任意選択により置換されており；
各Ｒ７は独立して、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ハロゲン、シアノ、オキソ、ヒドロキシル、シクロアルキル、又はヘテロシクリルであり；
ｘは１又は２であり；
ｙは２、３、又は４である。

【0136】

いくつかの実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、式（Ｉ－ａ）：

【化5】

の化合物又はその薬学的に許容可能な塩であり、式中、
Ａは、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｎ（ＲＣ）－、－Ｎ（ＲＣ）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＣ）－、－Ｎ（ＲＣ）Ｎ（ＲＤ）－、－ＮＣＮ－、－Ｎ（ＲＣ）Ｃ（Ｏ）（Ｃ１～Ｃ６－アルキレン）－、－Ｎ（ＲＣ）Ｃ（Ｏ）（Ｃ１～Ｃ６－アルケニレン）－、－Ｃ（＝Ｎ（ＲＣ）（ＲＤ））Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓ（Ｏ）ｘ－、－ＯＳ（Ｏ）ｘ－、－Ｎ（ＲＣ）Ｓ（Ｏ）ｘ－、－Ｓ（Ｏ）ｘＮ（ＲＣ）－、－Ｐ（ＲＦ）ｙ－、－Ｓｉ（ＯＲＡ）２－、－Ｓｉ（ＲＧ）（ＯＲＡ）－、－Ｂ（ＯＲＡ）－、又は金属であり、これらの各々は、結合基（例えば、本明細書に記載の結合基）に任意選択により結合され、１個以上のＲ１で任意選択により置換されており；
Ｌ１及びＬ３の各々は独立して、結合、アルキル、又はヘテロアルキルであり、ここで、アルキル及びヘテロアルキルの各々は、１個以上のＲ２で任意選択により置換されており；
Ｌ２は結合であり；
Ｍは、不在であるか、各々が１個以上のＲ３で任意選択により置換されている、アルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、又はヘテロアリールであり；
Ｐは、１個以上のＲ４で任意選択により置換されているヘテロアリールであり；
Ｚは、各々が１個以上のＲ５で任意選択により置換されている、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、又はヘテロアリールであり；
ＲＡ、ＲＢ、ＲＣ、ＲＤ、ＲＥ、ＲＦ、及びＲＧの各々は独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ハロゲン、アジド、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、又はヘテロアリールであり、ここで、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、及びヘテロアリールの各々は、１個以上のＲ６で任意選択により置換されており；
又はＲＣ及びＲＤは、これらが結合している窒素原子と一緒になって、１個以上のＲ６で任意選択により置換されている環（例えば５～７員環）を形成し；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６の各々は独立して、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ハロゲン、シアノ、アジド、オキソ、－ＯＲＡ１、－Ｃ（Ｏ）ＯＲＡ１、－Ｃ（Ｏ）ＲＢ１、－ＯＣ（Ｏ）ＲＢ１、－Ｎ（ＲＣ１）（ＲＤ１）、－Ｎ（ＲＣ１）Ｃ（Ｏ）ＲＢ１、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＣ１）、ＳＲＥ１、Ｓ（Ｏ）ｘＲＥ１、－ＯＳ（Ｏ）ｘＲＥ１、－Ｎ（ＲＣ１）Ｓ（Ｏ）ｘＲＥ１、－Ｓ（Ｏ）ｘＮ（ＲＣ１）（ＲＤ１）、－Ｐ（ＲＦ１）ｙ、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリールであり、ここで、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、及びヘテロアリールの各々は、１個以上のＲ７で任意選択により置換されており；
ＲＡ１、ＲＢ１、ＲＣ１、ＲＤ１、ＲＥ１、及びＲＦ１の各々は独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、又はヘテロアリールであり、ここで、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリールの各々は、１個以上のＲ７で任意選択により置換されており；
各Ｒ７は独立して、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ハロゲン、シアノ、オキソ、ヒドロキシル、シクロアルキル、又はヘテロシクリルであり；
ｘは１又は２であり；
ｙは２、３、又は４である。

【0137】

いくつかの実施形態において、式（Ｉ）又は（Ｉ－ａ）について、Ａは、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｎ（ＲＣ）Ｃ（Ｏ）－、－Ｎ（ＲＣ）Ｃ（Ｏ）（Ｃ１～Ｃ６－アルキレン）－、－Ｎ（ＲＣ）Ｃ（Ｏ）（Ｃ１～Ｃ６－アルケニレン）－、又は－Ｎ（ＲＣ）－である。いくつかの実施形態において、Ａは、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）－、又は－Ｎ（ＲＣ）－である。いくつかの実施形態において、Ａは、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ－、又は－Ｎ（ＲＣ）－である。いくつかの実施形態において、Ａは、アルキル、－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）、又は－Ｎ（ＲＣ）－である。いくつかの実施形態において、Ａは、－Ｎ（ＲＣ）Ｃ（Ｏ）－、－Ｎ（ＲＣ）Ｃ（Ｏ）（Ｃ１～Ｃ６－アルキレン）－、又は－Ｎ（ＲＣ）Ｃ（Ｏ）（Ｃ１～Ｃ６－アルケニレン）－である。いくつかの実施形態において、Ａは－Ｎ（ＲＣ）－である。いくつかの実施形態において、Ａは－Ｎ（ＲＣ）－であり、ＲＣ及びＲＤは独立して、水素又はアルキルである。いくつかの実施形態において、Ａは－ＮＨ－である。いくつかの実施形態において、Ａは－Ｎ（ＲＣ）Ｃ（Ｏ）（Ｃ１～Ｃ６－アルキレン）－であり、ここで、アルキレンはＲ１で置換されている。いくつかの実施形態において、Ａは－Ｎ（ＲＣ）Ｃ（Ｏ）（Ｃ１～Ｃ６－アルキレン）－であり、Ｒ１はアルキル（例えば、メチル）である。いくつかの実施形態において、Ａは－ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ（ＣＨ３）２－である。いくつかの実施形態において、Ａは－Ｎ（ＲＣ）Ｃ（Ｏ）（メチレン）－であり、Ｒ１はアルキル（例えば、メチル）である。いくつかの実施形態において、Ａは－ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ（ＣＨ３）－である。いくつかの実施形態において、Ａは－ＮＨＣ（Ｏ）Ｃ（ＣＨ３）－である。

【0138】

いくつかの実施形態において、式（Ｉ）又は（Ｉ－ａ）について、Ｌ１は結合、アルキル、又はヘテロアルキルである。いくつかの実施形態において、Ｌ１は結合又はアルキルである。いくつかの実施形態において、Ｌ１は結合である。いくつかの実施形態において、Ｌ１はアルキルである。いくつかの実施形態において、Ｌ１はＣ１～Ｃ６アルキルである。いくつかの実施形態において、Ｌ１は、－ＣＨ２－、－ＣＨ（ＣＨ３）－、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２、又は－ＣＨ２ＣＨ２－である。いくつかの実施形態において、Ｌ１は、－ＣＨ２－又は－ＣＨ２ＣＨ２－である。

【0139】

いくつかの実施形態において、式（Ｉ）又は（Ｉ－ａ）について、Ｌ３は結合、アルキル、又はヘテロアルキルである。いくつかの実施形態において、Ｌ３は結合である。いくつかの実施形態において、Ｌ３はアルキルである。いくつかの実施形態において、Ｌ３はＣ１～Ｃ１２アルキルである。いくつかの実施形態において、Ｌ３はＣ１～Ｃ６アルキルである。いくつかの実施形態において、Ｌ３は－ＣＨ２－である。いくつかの実施形態において、Ｌ３はヘテロアルキルである。いくつかの実施形態において、Ｌ３は、１個以上のＲ２（例えば、オキソ）で任意選択により置換されているＣ１～Ｃ１２ヘテロアルキルである。いくつかの実施形態において、Ｌ３は、１個以上のＲ２（例えば、オキソ）で任意選択により置換されているＣ１～Ｃ６ヘテロアルキルである。いくつかの実施形態において、Ｌ３は、－Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ２－、－ＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）２－、－ＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）３－、ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－、又は－ＣＨ２Ｏ－である。いくつかの実施形態において、Ｌ３は－ＣＨ２Ｏ－である。

【0140】

いくつかの実施形態において、式（Ｉ）又は（Ｉ－ａ）について、Ｍは、不在、アルキル、ヘテロアルキル、アリール、又はヘテロアリールである。いくつかの実施形態において、Ｍはヘテロアルキル、アリール、又はヘテロアリールである。いくつかの実施形態において、Ｍは不在である。いくつかの実施形態において、Ｍはアルキル（例えば、Ｃ１～Ｃ６アルキル）である。いくつかの実施形態において、Ｍは－ＣＨ２－である。いくつかの実施形態において、Ｍはヘテロアルキル（例えば、Ｃ１～Ｃ６ヘテロアルキル）である。いくつかの実施形態において、Ｍは（－ＯＣＨ２ＣＨ２－）ｚであり、ここで、ｚは、１～１０から選択される整数である。いくつかの実施形態において、ｚは、１～５から選択される整数である。いくつかの実施形態において、Ｍは、－ＯＣＨ２ＣＨ２－、（－ＯＣＨ２ＣＨ２－）２、（－ＯＣＨ２ＣＨ２－）３、（－ＯＣＨ２ＣＨ２－）４、又は（－ＯＣＨ２ＣＨ２－）５である。いくつかの実施形態において、Ｍは、－ＯＣＨ２ＣＨ２－、（－ＯＣＨ２ＣＨ２－）２、（－ＯＣＨ２ＣＨ２－）３、又は（－ＯＣＨ２ＣＨ２－）４である。いくつかの実施形態において、Ｍは（－ＯＣＨ２ＣＨ２－）３である。いくつかの実施形態において、Ｍはアリールである。いくつかの実施形態において、Ｍはフェニルである。いくつかの実施形態において、Ｍは非置換フェニルである。いくつかの実施形態において、Ｍは

【化6】

である。いくつかの実施形態において、Ｍは、Ｒ７（例えば、１個のＲ７）で置換されているフェニルである。いくつかの実施形態において、Ｍは

【化7】

である。いくつかの実施形態において、Ｒ７はＣＦ３である。

【0141】

いくつかの実施形態において、式（Ｉ）又は（Ｉ－ａ）について、Ｐは、不在、ヘテロシクリル、又はヘテロアリールである。いくつかの実施形態において、Ｐは不在である。いくつかの実施形態において、式（Ｉ）及び（Ｉ－ａ）について、Ｐは、三環式、二環式、又は単環式ヘテロアリールである。いくつかの実施形態において、Ｐは単環式ヘテロアリールである。いくつかの実施形態において、Ｐは窒素含有ヘテロアリールである。いくつかの実施形態において、Ｐは、単環式、窒素含有ヘテロアリールである。いくつかの実施形態において、Ｐは５員ヘテロアリールである。いくつかの実施形態において、Ｐは５員窒素含有ヘテロアリールである。いくつかの実施形態において、Ｐは、テトラゾリル、イミダゾリル、ピラゾリル、又はトリアゾリル、ピロリル、オキサゾリル、又はチアゾリルである。いくつかの実施形態において、Ｐは、テトラゾリル、イミダゾリル、ピラゾリル、又はトリアゾリル、又はピロリルである。いくつかの実施形態において、Ｐはイミダゾリルである。いくつかの実施形態において、Ｐは

【化8】

である。いくつかの実施形態において、Ｐはトリアゾリルである。いくつかの実施形態において、Ｐは１，２，３－トリアゾリルである。いくつかの実施形態において、Ｐは

【化9】

である。

【0142】

いくつかの実施形態において、Ｐはヘテロシクリルである。いくつかの実施形態において、Ｐは、５員ヘテロシクリル又は６員ヘテロシクリルである。いくつかの実施形態において、Ｐはイミダゾリジノニル（ｉｍｉｄａｚｏｌｉｄｉｎｏｎｙｌ）である。いくつかの実施形態において、Ｐは

【化10】

である。

【0143】

いくつかの実施形態において、Ｐはチオモルホリニル－１，１－ジオキシジルである。いくつかの実施形態において、Ｐは

【化11】

である。

【0144】

いくつかの実施形態において、式（Ｉ）又は（Ｉ－ａ）について、Ｚは、アルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、又はヘテロアリールである。いくつかの実施形態において、Ｚはヘテロシクリルである。いくつかの実施形態において、Ｚは、単環式又は二環式ヘテロシクリルである。いくつかの実施形態において、Ｚは、酸素含有ヘテロシクリルである。いくつかの実施形態において、Ｚは、４員ヘテロシクリル、５員ヘテロシクリル、又は６員ヘテロシクリルである。いくつかの実施形態において、Ｚは６員ヘテロシクリルである。いくつかの実施形態において、Ｚは、６員酸素含有ヘテロシクリルである。いくつかの実施形態において、Ｚはテトラヒドロピラニルである。いくつかの実施形態において、Ｚは

【化12】

である。いくつかの実施形態において、Ｚは、４員酸素含有ヘテロシクリルである。いくつかの実施形態において、Ｚは

【化13】

である。

【0145】

いくつかの実施形態において、Ｚは、二環式酸素含有ヘテロシクリルである。いくつかの実施形態において、Ｚは無水フタル酸（ｐｈｔｈａｌｉｃ ａｎｈｙｄｒｉｄｙｌ）である。いくつかの実施形態において、Ｚは、硫黄含有ヘテロシクリルである。いくつかの実施形態において、Ｚは、６員硫黄含有ヘテロシクリルである。いくつかの実施形態において、Ｚは、窒素原子及び硫黄原子を含有する６員ヘテロシクリルである。いくつかの実施形態において、Ｚはチオモルホリニル－１，１－ジオキシジルである。いくつかの実施形態において、Ｚは

【化14】

である。いくつかの実施形態において、Ｚは窒素含有ヘテロシクリルである。いくつかの実施形態において、Ｚは６員窒素含有ヘテロシクリルである。いくつかの実施形態において、Ｚは

【化15】

である。

【0146】

いくつかの実施形態において、Ｚは二環式ヘテロシクリルである。いくつかの実施形態において、Ｚは、１個以上のＲ５で任意選択により置換されている二環式窒素含有ヘテロシクリルである。いくつかの実施形態において、Ｚは２－オキサ－７－アザスピロ［３．５］ノナニルである。いくつかの実施形態において、Ｚは

【化16】

である。いくつかの実施形態において、Ｚは１－オキサ－３，８－ジアザスピロ［４．５］デカン－２－オンである。いくつかの実施形態において、Ｚは

【化17】

である。

【0147】

いくつかの実施形態において、式（Ｉ）又は（Ｉ－ａ）について、Ｚはアリールである。いくつかの実施形態において、Ｚは単環式アリールである。いくつかの実施形態において、Ｚはフェニルである。いくつかの実施形態において、Ｚは単置換フェニル（例えば、１個のＲ５により）である。いくつかの実施形態において、Ｚは単置換フェニルであり、ここで、１個のＲ５は窒素含有基である。いくつかの実施形態において、Ｚは単置換フェニルであり、ここで、１個のＲ５はＮＨ２である。いくつかの実施形態において、Ｚは単置換フェニルであり、ここで、１個のＲ５は酸素含有基である。いくつかの実施形態において、Ｚは単置換フェニルであり、ここで、１個のＲ５は酸素含有ヘテロアルキルである。いくつかの実施形態において、Ｚは単置換フェニルであり、ここで、１個のＲ５はＯＣＨ３である。いくつかの実施形態において、Ｚは単置換フェニルであり、ここで、１個のＲ５はオルト位にある。いくつかの実施形態において、Ｚは単置換フェニルであり、ここで、１個のＲ５はメタ位にある。いくつかの実施形態において、Ｚは単置換フェニルであり、ここで、１個のＲ５はパラ位にある。

【0148】

いくつかの実施形態において、式（Ｉ）又は（Ｉ－ａ）について、Ｚはアルキルである。いくつかの実施形態において、ＺはＣ１～Ｃ１２アルキルである。いくつかの実施形態において、ＺはＣ１～Ｃ１０アルキルである。いくつかの実施形態において、ＺはＣ１～Ｃ８アルキルである。いくつかの実施形態において、Ｚは、１～５個のＲ５で置換されたＣ１～Ｃ８アルキルである。いくつかの実施形態において、Ｚは、１個のＲ５で置換されたＣ１～Ｃ８アルキルである。いくつかの実施形態において、Ｚは、１個のＲ５で置換されたＣ１～Ｃ８アルキルであり、ここで、Ｒ５は、アルキル、ヘテロアルキル、ハロゲン、オキソ、－ＯＲＡ１、－Ｃ（Ｏ）ＯＲＡ１、－Ｃ（Ｏ）ＲＢ１、－ＯＣ（Ｏ）ＲＢ１、又は－Ｎ（ＲＣ１）（ＲＤ１）である。いくつかの実施形態において、Ｚは、１個のＲ５で置換されたＣ１～Ｃ８アルキルであり、ここで、Ｒ５は、－ＯＲＡ１又は－Ｃ（Ｏ）ＯＲＡ１である。いくつかの実施形態において、Ｚは、１個のＲ５で置換されたＣ１～Ｃ８アルキルであり、ここで、Ｒ５は、－ＯＲＡ１又は－Ｃ（Ｏ）ＯＨである。いくつかの実施形態において、Ｚは－ＣＨ３である。

【0149】

いくつかの実施形態において、式（Ｉ）又は（Ｉ－ａ）について、Ｚはヘテロアルキルである。いくつかの実施形態において、ＺはＣ１～Ｃ１２ヘテロアルキルである。いくつかの実施形態において、ＺはＣ１～Ｃ１０ヘテロアルキルである。いくつかの実施形態において、ＺはＣ１～Ｃ８ヘテロアルキルである。いくつかの実施形態において、ＺはＣ１～Ｃ６ヘテロアルキルである。いくつかの実施形態において、Ｚは、１個以上のＲ５で任意選択により置換された窒素含有ヘテロアルキルである。いくつかの実施形態において、Ｚは、１～５個のＲ５で置換された窒素及び硫黄含有ヘテロアルキルである。いくつかの実施形態において、Ｚは、Ｎ－メチル－２－（メチルスルホニル）エタン－１－アミニルである。

【0150】

いくつかの実施形態において、Ｚは、－ＯＲＡ又は－Ｃ（Ｏ）ＯＲＡである。いくつかの実施形態において、Ｚは、－ＯＲＡ（例えば、－ＯＨ又は－ＯＣＨ３）である。いくつかの実施形態において、Ｚは、ＯＣＨ３である。いくつかの実施形態において、Ｚは、－Ｃ（Ｏ）ＯＲＡ（例えば、－Ｃ（Ｏ）ＯＨ）である。

【0151】

いくつかの実施形態において、Ｚは水素である。

【0152】

いくつかの実施形態において、Ｌ２は結合であり、Ｐ及びＬ３は独立して、不在である。いくつかの実施形態において、Ｌ２は結合であり、Ｐはヘテロアリールであり、Ｌ３は結合であり、Ｚは水素である。いくつかの実施形態において、Ｐはヘテロアリールであり、Ｌ３はヘテロアルキルであり、Ｚはアルキルである。

【0153】

いくつかの実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、式（Ｉ－ｂ）：

【化18】

の化合物又はその塩であり、式中、環Ｍ１は、各々が１～５個のＲ３で任意選択により置換されている、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、又はヘテロアリールであり；環Ｚ１は、１～５個のＲ５で任意選択により置換されている、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール又はヘテロアリールであり；Ｒ２ａ、Ｒ２ｂ、Ｒ２ｃ、及びＲ２ｄの各々は独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ハロ、シアノ、ニトロ、アミノ、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、又はヘテロアリールであり、又はＲ２ａ及びＲ２ｂ又はＲ２ｃ及びＲ２ｄの各々は一緒になってオキソ基を形成し；Ｘは、不在、Ｎ（Ｒ１０）（Ｒ１１）、Ｏ、又はＳであり；ＲＣは、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、又はヘテロアリールであり、ここで、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、又はヘテロアリールの各々は、１～６個のＲ６で任意選択により置換されており；Ｒ３、Ｒ５、及びＲ６の各々は独立して、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ハロゲン、シアノ、アジド、オキソ、－ＯＲＡ１、－Ｃ（Ｏ）ＯＲＡ１、－Ｃ（Ｏ）ＲＢ１、－ＯＣ（Ｏ）ＲＢ１、－Ｎ（ＲＣ１）（ＲＤ１）、－Ｎ（ＲＣ１）Ｃ（Ｏ）ＲＢ１、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＣ１）、ＳＲＥ１、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、又はヘテロアリールであり；Ｒ１０及びＲ１１の各々は独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、－Ｃ（Ｏ）ＯＲＡ１、－Ｃ（Ｏ）ＲＢ１、－ＯＣ（Ｏ）ＲＢ１、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＣ１）、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、又はヘテロアリールであり；ＲＡ１、ＲＢ１、ＲＣ１、ＲＤ１、及びＲＥ１の各々は独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリールであり、ここで、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリールの各々は、１～６個のＲ７で任意選択により置換されており；各Ｒ７は独立して、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ハロゲン、シアノ、オキソ、ヒドロキシル、シクロアルキル、又はヘテロシクリルであり；各ｍ及びｎは独立して、１、２、３、４、５、又は６であり；

【化19】

は、本明細書に記載の結合基又はポリマーに対する結合を指す。いくつかの実施形態において、各Ｒ３及びＲ５について、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、又はヘテロアリールの各々は、ハロゲン、オキソ、シアノ、シクロアルキル、又はヘテロシクリルで任意選択により及び独立して置換されている。

【0154】

いくつかの実施形態において、式（Ｉ－ｂ）の化合物は、式（Ｉ－ｂ－ｉ）：

【化20】

の化合物又はその薬学的に許容可能な塩であり、式中、環Ｍ２は、１個以上のＲ３で任意選択により置換されている、アリール又はヘテロアリールであり；環Ｚ２は、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、又はヘテロアリールであり；Ｒ２ａ、Ｒ２ｂ、Ｒ２ｃ、及びＲ２ｄの各々は独立して、水素、アルキル、又はヘテロアルキルであり、又はＲ２ａ及びＲ２ｂ又はＲ２ｃ及びＲ２ｄの各々は一緒になってオキソ基を形成し；Ｘは、不在、Ｏ、又はＳであり；各Ｒ３及びＲ５は独立して、アルキル、ヘテロアルキル、ハロゲン、オキソ、－ＯＲＡ１、－Ｃ（Ｏ）ＯＲＡ１、又は－Ｃ（Ｏ）ＲＢ１であり、ここで、アルキル及びヘテロアルキルの各々は、ハロゲンで任意選択により置換されており；又は２個のＲ５は一緒になって、環Ｚ２に縮合した５～６員環を形成し；各ＲＡ１及びＲＢ１は独立して、水素、アルキル、又はヘテロアルキルであり；ｍ及びｎは各々独立して、１、２、３、４、５、又は６であり；ｐは、０、１、２、３、４、５、又は６であり；

【化21】

は、本明細書に記載の結合基又はポリマーに対する結合を指す。

【0155】

いくつかの実施形態において、式（Ｉ－ｂ－ｉ）の化合物は、式（Ｉ－ｂ－ｉｉ）：

【化22】

の化合物又はその薬学的に許容可能な塩であり、式中、環Ｚ２は、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール又はヘテロアリールであり；Ｒ２ｃ及びＲ２ｄの各々は独立して、水素、アルキル、又はヘテロアルキルであり、又はＲ２ｃ及びＲ２ｄは一緒になってオキソ基を形成し；各Ｒ３及びＲ５は独立して、アルキル、ヘテロアルキル、ハロゲン、オキソ、－ＯＲＡ１、－Ｃ（Ｏ）ＯＲＡ１、又は－Ｃ（Ｏ）ＲＢ１であり、ここで、アルキル及びヘテロアルキルの各々は、ハロゲンで任意選択により置換されており；各ＲＡ１及びＲＢ１は独立して、水素、アルキル、又はヘテロアルキルであり；ｐ及びｑは各々独立して、０、１、２、３、４、５、又は６であり；

【化23】

は、本明細書に記載の結合基又はポリマーに対する結合を指す。

【0156】

いくつかの実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、式（Ｉ－ｃ）：

【化24】

の化合物又はその薬学的に許容可能な塩であり、式中、環Ｚ２は、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール又はヘテロアリールであり；Ｒ２ｃ及びＲ２ｄの各々は独立して、水素、アルキル、又はヘテロアルキルであり、又はＲ２ｃ及びＲ２ｄは一緒になってオキソ基を形成し；各Ｒ３及びＲ５は独立して、アルキル、ヘテロアルキル、ハロゲン、オキソ、－ＯＲＡ１、－Ｃ（Ｏ）ＯＲＡ１、又は－Ｃ（Ｏ）ＲＢ１であり、ここで、アルキル及びヘテロアルキルの各々は、ハロゲンで任意選択により置換されており；各ＲＡ１及びＲＢ１は独立して、水素、アルキル、又はヘテロアルキルであり；ｍは、１、２、３、４、５、又は６であり；ｐ及びｑは各々独立して、０、１、２、３、４、５、又は６であり；

【化25】

は、本明細書に記載の結合基又はポリマーに対する結合を指す。

【0157】

いくつかの実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、式（Ｉ－ｄ）：

【化26】

の化合物又はその薬学的に許容可能な塩であり、式中、環Ｚ２は、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール又はヘテロアリールであり；Ｘは、不在、Ｏ、又はＳであり；Ｒ２ａ、Ｒ２ｂ、Ｒ２ｃ、及びＲ２ｄの各々は独立して、水素、アルキル、又はヘテロアルキルであり、又はＲ２ａ及びＲ２ｂ又はＲ２ｃ及びＲ２ｄの各々は一緒になってオキソ基を形成し；各Ｒ５は独立して、アルキル、ヘテロアルキル、ハロゲン、オキソ、－ＯＲＡ１、－Ｃ（Ｏ）ＯＲＡ１、又は－Ｃ（Ｏ）ＲＢ１であり、ここで、アルキル及びヘテロアルキルの各々は、ハロゲンで任意選択により置換されており；各ＲＡ１及びＲＢ１は独立して、水素、アルキル、又はヘテロアルキルであり；ｍ及びｎは各々独立して、１、２、３、４、５、又は６であり；ｐは、０、１、２、３、４、５、又は６であり；

【化27】

は、本明細書に記載の結合基又はポリマーに対する結合を指す。

【0158】

いくつかの実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、式（Ｉ－ｅ）：

【化28】

の化合物又はその薬学的に許容可能な塩であり、式中、環Ｚ２は、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール又はヘテロアリールであり；Ｘは、不在、Ｏ、又はＳであり；Ｒ２ａ、Ｒ２ｂ、Ｒ２ｃ、及びＲ２ｄの各々は独立して、水素、アルキル、又はヘテロアルキルであり、又はＲ２ａ及びＲ２ｂ又はＲ２ｃ及びＲ２ｄの各々は一緒になってオキソ基を形成し；各Ｒ５は独立して、アルキル、ヘテロアルキル、ハロゲン、オキソ、－ＯＲＡ１、－Ｃ（Ｏ）ＯＲＡ１、又は－Ｃ（Ｏ）ＲＢ１であり；各ＲＡ１及びＲＢ１は独立して、水素、アルキル、又はヘテロアルキルであり；ｍ及びｎは各々独立して、１、２、３、４、５、又は６であり；ｐは、０、１、２、３、４、５、又は６であり；

【化29】

は、本明細書に記載の結合基又はポリマーに対する結合を指す。

【0159】

いくつかの実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、式（Ｉ－ｆ）：

【化30】

の化合物又はその薬学的に許容可能な塩であり、式中、Ｍは、１個以上のＲ３で任意選択により置換されているアルキルであり；環Ｐは、１個以上のＲ４で任意選択により置換されているヘテロアリールであり；Ｌ３は、１個以上のＲ２で任意選択により置換されている、アルキル又はヘテロアルキルであり；Ｚは、各々が１個以上のＲ５で任意選択により置換されている、アルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、又はヘテロアリールであり；Ｒ２ａ及びＲ２ｂの各々は独立して、水素、アルキル、又はヘテロアルキルであり、又はＲ２ａ及びＲ２ｂは一緒になってオキソ基を形成し；Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５の各々は独立して、アルキル、ヘテロアルキル、ハロゲン、オキソ、－ＯＲＡ１、－Ｃ（Ｏ）ＯＲＡ１、又は－Ｃ（Ｏ）ＲＢ１であり；各ＲＡ１及びＲＢ１は独立して、水素、アルキル、又はヘテロアルキルであり；ｎは独立して、１、２、３、４、５、又は６であり；

【化31】

は、本明細書に記載の結合基又はポリマーに対する結合を指す。

【0160】

いくつかの実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩ）：

【化32】

の化合物又はその薬学的に許容可能な塩であり、式中、Ｍは、結合、アルキル又はアリールであり、ここで、アルキル及びアリールは、１個以上のＲ３で任意選択により置換されており；Ｌ３は、１個以上のＲ２で任意選択により置換されている、アルキル又はヘテロアルキルであり；Ｚは、水素、アルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール又は－ＯＲＡであり、ここで、アルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、及びヘテロアリールは、１個以上のＲ５で任意選択により置換されており；ＲＡは水素であり；Ｒ２ａ及びＲ２ｂの各々は独立して、水素、アルキル、又はヘテロアルキルであり、又はＲ２ａ及びＲ２ｂは一緒になってオキソ基を形成し；Ｒ２、Ｒ３、及びＲ５の各々は独立して、アルキル、ヘテロアルキル、ハロゲン、オキソ、－ＯＲＡ１、－Ｃ（Ｏ）ＯＲＡ１、又は－Ｃ（Ｏ）ＲＢ１であり；各ＲＡ１及びＲＢ１は独立して、水素、アルキル、又はヘテロアルキルであり；ｎは独立して、１、２、３、４、５、又は６であり；

【化33】

は、本明細書に記載の結合基又はポリマーに対する結合を指す。

【0161】

いくつかの実施形態において、式（ＩＩ）の化合物は、式（ＩＩ－ａ）：

【化34】

の化合物又はその薬学的に許容可能な塩であり、式中、Ｌ３は、各々が１個以上のＲ２で任意選択により置換されている、アルキル又はヘテロアルキルであり；Ｚは、水素、アルキル、ヘテロアルキル、又は－ＯＲＡであり、ここで、アルキル及びヘテロアルキルは、１個以上のＲ５で任意選択により置換されており；Ｒ２ａ及びＲ２ｂの各々は独立して、水素、アルキル、又はヘテロアルキルであり、又はＲ２ａ及びＲ２ｂは一緒になってオキソ基を形成し；Ｒ２、Ｒ３、及びＲ５の各々は独立して、アルキル、ヘテロアルキル、ハロゲン、オキソ、－ＯＲＡ１、－Ｃ（Ｏ）ＯＲＡ１、又は－Ｃ（Ｏ）ＲＢ１であり；ＲＡは水素であり；各ＲＡ１及びＲＢ１は独立して、水素、アルキル、又はヘテロアルキルであり；ｎは独立して、１、２、３、４、５、又は６であり；

【化35】

は、本明細書に記載の結合基又はポリマーに対する結合を指す。

【0162】

いくつかの実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩＩ）：

【化36】

の化合物又はその薬学的に許容可能な塩であり、式中、Ｚ１は、各々が１～５個のＲ５で任意選択により置換されている、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、又はヘテロアリールであり；Ｒ２ａ、Ｒ２ｂ、Ｒ２ｃ、及びＲ２ｄの各々は独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ハロ、シアノ、ニトロ、アミノ、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、又はヘテロアリールであり；又はＲ２ａ及びＲ２ｂ又はＲ２ｃ及びＲ２ｄは一緒になってオキソ基を形成し；ＲＣは、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、又はヘテロアルキルであり、ここで、アルキル、アルケニル、アルキニル、又はヘテロアルキルの各々は、１～６個のＲ６で任意選択により置換されており；Ｒ３、Ｒ５、及びＲ６の各々は独立して、アルキル、ヘテロアルキル、ハロゲン、オキソ、－ＯＲＡ１、－Ｃ（Ｏ）ＯＲＡ１、又は－Ｃ（Ｏ）ＲＢ１であり；各ＲＡ１及びＲＢ１は独立して、水素、アルキル、又はヘテロアルキルであり；ｍ及びｎは各々独立して、１、２、３、４、５、又は６であり；ｑは、０～２５の整数であり；

【化37】

は、本明細書に記載の結合基又はポリマーに対する結合を指す。

【0163】

いくつかの実施形態において、式（ＩＩＩ）の化合物は、式（ＩＩＩ－ａ）：

【化38】

の化合物又はその薬学的に許容可能な塩であり、式中、環Ｚ２は、各々が１～５個のＲ５で任意選択により置換されている、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、又はヘテロアリールであり；Ｒ２ａ、Ｒ２ｂ、Ｒ２ｃ、及びＲ２ｄの各々は独立して、水素、アルキル、ヘテロアルキル、ハロであり；又はＲ２ａ及びＲ２ｂ又はＲ２ｃ及びＲ２ｄは一緒になってオキソ基を形成し；Ｒ３及びＲ５の各々は独立して、アルキル、ヘテロアルキル、ハロゲン、オキソ、－ＯＲＡ１、－Ｃ（Ｏ）ＯＲＡ１、又は－Ｃ（Ｏ）ＲＢ１であり；各ＲＡ１及びＲＢ１は独立して、水素、アルキル、又はヘテロアルキルであり；ｍ及びｎは各々独立して、１、２、３、４、５、又は６であり；ｏ及びｐは各々独立して、０、１、２、３、４、又は５であり；ｑは、０～２５の整数であり；

【化39】

は、本明細書に記載の結合基又はポリマーに対する結合を指す。

【0164】

いくつかの実施形態において、式（ＩＩＩ－ａ）の化合物は、式（ＩＩＩ－ｂ）：

【化40】

の化合物又はその薬学的に許容可能な塩であり、式中、環Ｚ２は、各々が１～５個のＲ５で任意選択により置換されている、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、又はヘテロアリールであり；Ｒ２ａ、Ｒ２ｂ、Ｒ２ｃ、及びＲ２ｄの各々は独立して、水素、アルキル、ヘテロアルキル、ハロであり；又はＲ２ａ及びＲ２ｂ又はＲ２ｃ及びＲ２ｄは一緒になってオキソ基を形成し；Ｒ３及びＲ５の各々は独立して、アルキル、ヘテロアルキル、ハロゲン、オキソ、－ＯＲＡ１、－Ｃ（Ｏ）ＯＲＡ１、又は－Ｃ（Ｏ）ＲＢ１であり；各ＲＡ１及びＲＢ１は独立して、水素、アルキル、又はヘテロアルキルであり；ｍ及びｎは各々独立して、１、２、３、４、５、又は６であり；ｏ及びｐは各々独立して、０、１、２、３、４、又は５であり；ｑは、０～２５の整数であり；

【化41】

は、本明細書に記載の結合基又はポリマーに対する結合を指す。

【0165】

いくつかの実施形態において、式（ＩＩＩ－ａ）の化合物は、式（ＩＩＩ－ｃ）：

【化42】

の化合物又はその薬学的に許容可能な塩であり、式中、Ｘは、Ｃ（Ｒ’）（Ｒ”）、Ｎ（Ｒ’）、又はＳ（Ｏ）ｘであり；Ｒ’及びＲ”の各々は独立して、水素、アルキル、ハロゲン、又はシクロアルキルであり；Ｒ２ａ、Ｒ２ｂ、Ｒ２ｃ、及びＲ２ｄの各々は独立して、水素、アルキル、ヘテロアルキル、又はハロであり；又はＲ２ａ及びＲ２ｂ又はＲ２ｃ及びＲ２ｄは一緒になってオキソ基を形成し；Ｒ３及びＲ５の各々は独立して、アルキル、ヘテロアルキル、ハロゲン、オキソ、－ＯＲＡ１、－Ｃ（Ｏ）ＯＲＡ１、又は－Ｃ（Ｏ）ＲＢ１であり；各ＲＡ１及びＲＢ１は独立して、水素、アルキル、又はヘテロアルキルであり；ｍ及びｎは各々独立して、１、２、３、４、５、又は６であり；ｐは、０、１、２、３、４、又は５であり；ｑは、０～２５の整数であり；ｘは、０、１、又は２であり；

【化43】

は、本明細書に記載の結合基又はポリマーに対する結合を指す。

【0166】

いくつかの実施形態において、式（ＩＩＩ－ｃ）の化合物は、式（ＩＩＩ－ｄ）：

【化44】

の化合物又はその薬学的に許容可能な塩であり、式中、Ｘは、Ｃ（Ｒ’）（Ｒ”）、Ｎ（Ｒ’）、又はＳ（Ｏ）ｘであり；Ｒ’及びＲ”の各々は独立して、水素、アルキル、ハロゲン、又はシクロアルキルであり；Ｒ２ａ、Ｒ２ｂ、Ｒ２ｃ、及びＲ２ｄの各々は独立して、水素、アルキル、ヘテロアルキル、又はハロであり；又はＲ２ａ及びＲ２ｂ又はＲ２ｃ及びＲ２ｄは一緒になってオキソ基を形成し；Ｒ３及びＲ５の各々は独立して、アルキル、ヘテロアルキル、ハロゲン、オキソ、－ＯＲＡ１、－Ｃ（Ｏ）ＯＲＡ１、又は－Ｃ（Ｏ）ＲＢ１であり；各ＲＡ１及びＲＢ１は独立して、水素、アルキル、又はヘテロアルキルであり；ｍ及びｎは各々独立して、１、２、３、４、５、又は６であり；ｐは、０、１、２、３、４、又は５であり；ｑは、０～２５の整数であり；ｘは、０、１、又は２であり；

【化45】

は、本明細書に記載の結合基又はポリマーに対する結合を指す。

【0167】

いくつかの実施形態において、化合物は、式（Ｉ）の化合物である。いくつかの実施形態において、Ｌ２は結合であり、Ｐ及びＬ３は独立して、不在である。

【0168】

いくつかの実施形態において、化合物は、式（Ｉ－ａ）の化合物である。式（ＩＩ－ａ）のいくつかの実施形態において、Ｌ２は結合であり、Ｐはヘテロアリールであり、Ｌ３は結合であり、Ｚは水素である。いくつかの実施形態において、Ｐはヘテロアリールであり、Ｌ３はヘテロアルキルであり、Ｚはアルキルである。いくつかの実施形態において、Ｌ２は結合であり、Ｐ及びＬ３は独立して、不在である。いくつかの実施形態において、Ｌ２は結合であり、Ｐはヘテロアリールであり、Ｌ３は結合であり、Ｚは水素である。いくつかの実施形態において、Ｐはヘテロアリールであり、Ｌ３はヘテロアルキルであり、Ｚはアルキルである。

【0169】

いくつかの実施形態において、化合物は、式（Ｉ－ｂ）の化合物である。いくつかの実施形態において、Ｐは不在であり、Ｌ１は－ＮＨＣＨ２であり、Ｌ２は結合であり、Ｍはアリール（例えば、フェニル）であり、Ｌ３は－ＣＨ２Ｏであり、Ｚはヘテロシクリル（例えば、窒素含有ヘテロシクリル、例えば、チオモルホリニル－１，１－ジオキシド）である。いくつかの実施形態において、式（Ｉ－ｂ）の化合物は、化合物１１６である。

【0170】

式（Ｉ－ｂ）のいくつかの実施形態において、Ｐは不在であり、Ｌ１は－ＮＨＣＨ２であり、Ｌ２は結合であり、Ｍは不在であり、Ｌ３は結合であり、Ｚはヘテロシクリル（例えば、酸素含有ヘテロシクリル、例えば、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロフラニル、オキセタニル、又はオキシラニル）である。いくつかの実施形態において、式（Ｉ－ｂ）の化合物は、化合物１０５である。

【0171】

いくつかの実施形態において、化合物は、式（Ｉ－ｂ－ｉ）の化合物である。式（Ｉ－ｂ－ｉ）のいくつかの実施形態において、Ｒ２ａ及びＲ２ｂの各々は独立して、水素又はＣＨ３であり、Ｒ２ｃ及びＲ２ｄの各々は独立して、水素であり、ｍは１又は２であり、ｎは１であり、ＸはＯであり、ｐは０であり、Ｍ２は、１個以上のＲ３で任意選択により置換されているフェニルであり、Ｒ３は－ＣＦ３であり、Ｚ２はヘテロシクリル（例えば、酸素含有ヘテロシクリル、例えば、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロフラニル、オキセタニル、又はオキシラニル）である。いくつかの実施形態において、式（Ｉ－ｂ－ｉ）の化合物は、化合物１００、化合物１０６、化合物１０７、化合物１０８、化合物１０９、又は化合物１１１である。

【0172】

いくつかの実施形態において、化合物は、式（Ｉ－ｂ－ｉｉ）の化合物である。式（Ｉ－ｂ－ｉｉ）のいくつかの実施形態において、Ｒ２ａ、Ｒ２ｂ、Ｒ２ｃ、及びＲ２ｄの各々は独立して、水素であり、ｑは０であり、ｐは０であり、ｍは１であり、Ｚ２はヘテロシクリル（例えば、酸素含有ヘテロシクリル、例えば、テトラヒドロピラニル）である。いくつかの実施形態において、式（Ｉ－ｂ－ｉｉ）の化合物は、化合物１００である。

【0173】

いくつかの実施形態において、化合物は、式（Ｉ－ｃ）の化合物である。式（Ｉ－ｃ）のいくつかの実施形態において、Ｒ２ｃ及びＲ２ｄの各々は独立して、水素であり、ｍは１であり、ｐは１であり、ｑは０であり、Ｒ５は－ＣＨ３であり、Ｚはヘテロシクリル（例えば、窒素含有ヘテロシクリル、例えば、ピペラジニル）である。いくつかの実施形態において、式（Ｉ－ｃ）の化合物は、化合物１１３である。

【0174】

いくつかの実施形態において、化合物は、式（Ｉ－ｄ）の化合物である。式（Ｉ－ｄ）のいくつかの実施形態において、Ｒ２ａ、Ｒ２ｂ、Ｒ２ｃ、及びＲ２ｄの各々は独立して、水素であり、ｍは１であり、ｎは３であり、ＸはＯであり、ｐは０であり、Ｚはヘテロシクリル（例えば、酸素含有ヘテロシクリル、例えば、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロフラニル、オキセタニル、又はオキシラニル）である。いくつかの実施形態において、式（Ｉ－ｄ）の化合物は、化合物１１０又は化合物１１４である。

【0175】

いくつかの実施形態において、化合物は、式（Ｉ－ｆ）の化合物である。式（Ｉ－ｆ）のいくつかの実施形態において、Ｒ２ａ及びＲ２ｂの各々は独立して、水素であり、ｎは１であり、Ｍは－ＣＨ２－であり、Ｐは、窒素含有ヘテロアリール（例えば、イミダゾリル）であり、Ｌ３は－Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ２－であり、ＺはＣＨ３である。いくつかの実施形態において、式（Ｉ－ｆ）の化合物は、化合物１１５である。

【0176】

いくつかの実施形態において、化合物は、式（ＩＩ－ａ）の化合物である。式（ＩＩ－ａ）のいくつかの実施形態において、Ｒ２ａ及びＲ２ｂの各々は独立して、水素であり、ｎは１であり、ｑは０であり、Ｌ３は－ＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）２であり、Ｚは－ＯＣＨ３である。いくつかの実施形態において、式（ＩＩ－ａ）の化合物は、化合物１１２である。

【0177】

式（ＩＩ－ａ）のいくつかの実施形態において、Ｒ２ａ及びＲ２ｂの各々は独立して、水素であり、ｎは１であり、Ｌ３は結合又は－ＣＨ２であり、Ｚは水素又は－ＯＨである。いくつかの実施形態において、式（ＩＩ－ａ）の化合物は、化合物１０３又は化合物１０４である。

【0178】

いくつかの実施形態において、化合物は、式（ＩＩＩ）の化合物である。式（ＩＩＩ）のいくつかの実施形態において、Ｒ２ａ、Ｒ２ｂ、Ｒ２ｃ、及びＲ２ｄの各々は独立して、水素であり、ｍは１であり、ｎは２であり、ｑは３であり、ｐは０であり、ＲＣは水素であり、Ｚ１は、Ｒ５（例えば、－Ｎ（ＣＨ３）（ＣＨ２ＣＨ２）Ｓ（Ｏ）２ＣＨ３）で任意選択により置換されているヘテロアルキルである。いくつかの実施形態において、式（ＩＩＩ）の化合物は、化合物１２０である。

【0179】

いくつかの実施形態において、化合物は、式（ＩＩＩ－ｂ）の化合物である。式（ＩＩＩ－ｂ）のいくつかの実施形態において、Ｒ２ａ、Ｒ２ｂ、Ｒ２ｃ、及びＲ２ｄの各々は独立して、水素であり、ｍは０であり、ｎは２であり、ｑは３であり、ｐは０であり、Ｚ２は、１個のＲ５（例えば、－ＮＨ２）で置換されたアリール（例えば、フェニル）である。いくつかの実施形態において、式（ＩＩＩ－ｂ）の化合物は、化合物１０２である。

【0180】

いくつかの実施形態において、化合物は、式（ＩＩＩ－ｂ）の化合物である。式（ＩＩＩ－ｂ）のいくつかの実施形態において、Ｒ２ａ、Ｒ２ｂ、Ｒ２ｃ、及びＲ２ｄの各々は独立して、水素であり、ｍは１であり、ｎは２であり、ｑは３であり、ｐは０であり、ＲＣは水素であり、Ｚ２はヘテロシクリル（例えば、窒素含有ヘテロシクリル、例えば、窒素含有スピロヘテロシクリル、例えば、２－オキサ－７－アザスピロ［３．５］ノナニル）である。いくつかの実施形態において、式（ＩＩＩ－ａ）の化合物は、化合物１２１である。

【0181】

いくつかの実施形態において、化合物は、式（ＩＩＩ－ｄ）の化合物である。式（ＩＩＩ－ｄ）のいくつかの実施形態において、Ｒ２ａ、Ｒ２ｂ、Ｒ２ｃ、及びＲ２ｄの各々は独立して、水素であり、ｍは１であり、ｎは２であり、ｑは、１、２、３、又は４であり、ｐは０であり、ＸはＳ（Ｏ）２である。式（ＩＩＩ－ｄ）のいくつかの実施形態において、Ｒ２ａ及びＲ２ｂの各々は独立して、水素であり、ｍは１であり、ｎは２であり、ｑは、１、２、３、又は４であり、ｐは０であり、ＸはＳ（Ｏ）２である。いくつかの実施形態において、式（ＩＩＩ－ｄ）の化合物は、化合物１０１、化合物１１７、化合物１１８、又は化合物１１９である。

【0182】

いくつかの実施形態において、化合物は、式（Ｉ－ｂ）、（Ｉ－ｄ）、又は（Ｉ－ｅ）の化合物である。いくつかの実施形態において、化合物は、式（Ｉ－ｂ）、（Ｉ－ｄ）、又は（ＩＩ）の化合物である。いくつかの実施形態において、化合物は、式（Ｉ－ｂ）、（Ｉ－ｄ）、又は（Ｉ－ｆ）の化合物である。いくつかの実施形態において、化合物は、式（Ｉ－ｂ）、（Ｉ－ｄ）、又は（ＩＩＩ）の化合物である。

【0183】

いくつかの実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、国際公開第２０１２／１１２９８２号パンフレット、国際公開第２０１２／１６７２２３号パンフレット、国際公開第２０１４／１５３１２６号パンフレット、国際公開第２０１６／０１９３９１号パンフレット、国際公開第２０１７／０７５６３０号パンフレット、米国特許出願公開第２０１２－０２１３７０８号明細書、米国特許出願公開第２０１６－００３０３５９号明細書又は米国特許出願公開第２０１６－００３０３６０号明細書に開示されている化合物でない。

【0184】

いくつかの実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、表３で示されている化合物又はその薬学的に許容可能な塩を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で説明されているデバイス内の外面及び／又は１個若しくは複数個の区画は、表３で示されている小分子化合物又はその薬学的に許容可能な塩を含む。

【0185】

【表3】

【0186】

【表4】

【0187】

【表5】

【0188】

いくつかの実施形態において、この化合物は、式（Ｉ）（例えば、式（Ｉ－ａ）、（Ｉ－ｂ）、（Ｉ－ｃ）、（Ｉ－ｄ）、（Ｉ－ｅ）、（Ｉ－ｆ）、（ＩＩ）、（ＩＩ－ａ）、（ＩＩＩ）、（ＩＩＩ－ａ）、（ＩＩＩ－ｂ）、（ＩＩＩ－ｃ）、若しくは（ＩＩＩ－ｄ））の化合物又はその薬学的に許容可能な塩であり、並びに

【化46】

、又は前記化合物のいずれかの薬学的に許容可能な塩から選択される。

【0189】

いくつかの実施形態において、本明細書で説明されているデバイスは、

【化47】

の化合物、又はいずれかの化合物の薬学的に許容可能な塩を含む。

【0190】

実施形態において、本明細書に記載のデバイスは、アルギン酸塩ポリマーに共有結合した式（Ｉ）の化合物（例えば、表３に示される化合物）を含む。実施形態において、本明細書に記載の粒子は、アルギン酸塩ポリマー中の１つ又は複数のグルロン酸及び／又はマンヌロン酸モノマーに、例えばアミド結合により、共有結合した式（Ｉ）の化合物（例えば、表３に示される化合物、例えば、化合物１０１）を含む。

【0191】

いくつかの実施形態において、式（Ｉ）の化合物（例えば、表３中の化合物１０１）は、以下の実施例に記載される窒素パーセントの燃焼分析によって決定した際に、少なくとも２．０％且つ９．０％未満の窒素、又は２．０％～５％の窒素、３．０～８．０％の窒素、５～８．０％の窒素、４．０～７．０％の窒素、５．０％～７．０％の窒素、又は６．０％～７．０％の窒素又は約６．８％の窒素のコンジュゲーション密度で、アルギン酸塩（例えば、おおよそのＭＷ＜７５ｋＤａ、Ｇ：Ｍ比≧１．５を有するアルギン酸塩）に共有結合される。

【0192】

［処置方法］
本明細書に記載のＦＶＩＩタンパク質を発現及び分泌することができる複数の組み換えＲＰＥ細胞の投与又は移植によって対象の出血性障害を予防又は処置するための方法が本明細書に記載される。実施形態において、複数のＲＰＥ細胞は、本明細書に記載の移植可能なデバイスに含まれる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、出血性障害の少なくとも１つの症状を直接的又は間接的に低減又は軽減するか、又は障害の発症を予防するか又は遅らせる。実施形態において、方法は、内側区画に本明細書に記載の組み換えＲＰＥ細胞及び細胞結合ポリマーを含み、式（Ｉ）の化合物、例えば、化合物１０１を、カプセルの外側表面上に、及び任意選択により外側区画内に含む、有効量の２区画アルギン酸塩ヒドロゲルカプセルの組成物を投与すること（例えば、移植すること）を含む。

【0193】

［列挙される例示的な実施形態］
１．第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）タンパク質コード配列を含む、単離されたポリヌクレオチドであって、ポリヌクレオチドは、以下の特徴：
（ａ）コード配列に動作可能に連結されたプロモーターであって、プロモーターは、配列番号１０又は配列番号２１と同一又は実質的に同一であるヌクレオチド配列から本質的になるか、又はそれからなる、プロモーター；
（ｂ）以下からなる群から選択される前駆体ＦＶＩＩコード配列を含む、コード配列
（ｉ）配列番号３、
（ｉｉ）配列番号３と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同一のヌクレオチド配列、
（ｉｉｉ）配列番号４、及び
（ｉｖ）配列番号４と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同一のヌクレオチド配列

【0194】

２．前駆体ＦＶＩＩコード配列は、配列番号３又は配列番号４を含む、実施形態１に記載の単離されたポリヌクレオチド。

【0195】

３．前駆体ＦＶＩＩコード配列に動作可能に連結されたプロモーターとして、配列番号１０を含む、実施形態２に記載の単離されたポリヌクレオチド。

【0196】

４．ＦＶＩＩタンパク質は、ＦＶＩＩ融合タンパク質である、実施形態１～３のいずれか一つに記載の単離されたポリヌクレオチド。

【0197】

５．ＦＶＩＩ融合タンパク質は、配列番号１１又は配列番号１２を含む、実施形態４に記載の単離されたポリヌクレオチド。

【0198】

６．コード配列は、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７若しくは配列番号１８を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる、実施形態５に記載の単離されたポリヌクレオチド。

【0199】

７．上流転写ユニット及び下流転写ユニットを含む単離されたポリヌクレオチドであって、上流転写ユニットは、配列番号３に動作可能に連結された配列番号１０を含み、下流転写ユニットは、配列番号３に動作可能に連結された配列番号２１を含む、単離されたポリヌクレオチド。

【0200】

８．単離された二本鎖ＤＮＡ分子、例えば発現ベクターとして提供される、上記の実施形態のいずれか一つの単離されたポリヌクレオチド。

【0201】

９．ＦＶＩＩタンパク質（例えば、ヒトＦＶＩＩタンパク質又はその変異体）を発現及び分泌することができる、複数の組み換えＲＰＥ細胞であって、複数の各細胞は、ＦＶＩＩタンパク質のコード配列を含む外因性ヌクレオチド配列を含み、外因性ヌクレオチド配列は、以下の特徴：
（ａ）コード配列に動作可能に連結されたプロモーターであって、プロモーターは、配列番号１０又は配列番号２１と同一又は実質的に同一であるヌクレオチド配列から本質的になるか、又はそれからなる、プロモーター；
（ｂ）以下からなる群から選択される前駆体ＦＶＩＩコード配列を含む、コード配列
（ｉ）配列番号３、
（ｉｉ）配列番号３と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同一のヌクレオチド配列、
（ｉｉｉ）配列番号４、及び
（ｉｖ）配列番号４と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同一のヌクレオチド配列
の少なくとも１つ又は複数を有する、組み換えＲＰＥ細胞。

【0202】

１０．前駆体ＦＶＩＩコード配列は、配列番号３又は配列番号４を含む、実施形態９に記載の複数の組み換えＲＰＥ細胞。

【0203】

１１．外因性ヌクレオチド配列は、ＦＶＩＩコード配列に動作可能に連結されたプロモーターとして配列番号１０又は配列番号２１を含む少なくとも１つの転写ユニットを含む、実施形態９又は１０に記載の複数の組み換えＲＰＥ細胞。

【0204】

１２．ＦＶＩＩタンパク質は、ＦＶＩＩ融合タンパク質である、実施形態９～１１のいずれか一つに記載の複数の組み換えＲＰＥ細胞。

【0205】

１３．ＦＶＩＩ融合タンパク質は、配列番号１１又は配列番号１２を含む、実施形態１２に記載の複数の組み換えＲＰＥ細胞。

【0206】

１４．外因性ヌクレオチド配列は、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７又は配列番号１８を含む、実施形態９～１３のいずれか一つに記載の複数の組み換えＲＰＥ細胞。

【0207】

１５．外因性ヌクレオチド配列は、染色体外発現ベクターを含むか、又はＲＰＥ細胞の核ゲノム内の少なくとも１つの位置に組み込まれている、実施形態９～１４のいずれか一つに記載の複数の組み換えＲＰＥ細胞。

【0208】

１６．実施形態１～８のいずれか一つに記載の単離ポリヌクレオチドでトランスフェクトされたＡＲＰＥ－１９細胞に由来する、実施形態９～１５のいずれか一つに記載の複数の組み換えＲＰＥ細胞。

【0209】

１７．ポリクローナル細胞培養物として、又はモノクローナル細胞株培養物として提供される、実施形態９～１６のいずれか一つに記載の複数の組み換えＲＰＥ細胞。

【0210】

１８．複数が以下の特徴：
ａ）少なくとも５日間、少なくとも１０日間、少なくとも１か月、又は少なくとも２か月間、例えば、インビトロ細胞培養において、又は対象に移植された場合（例えば、本明細書に記載の参照方法によって評価される場合）に、ＦＶＩＩタンパク質を分泌する；又は
ｂ）前駆体ＦＶＩＩをコードする野生型ヒトヌクレオチド配列でトランスフェクトされた参照の複数の組み換えＲＰＥ細胞よりも少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、又は１０倍多い量のＦＶＩＩタンパク質を分泌する
の１つ又は複数を示す、実施形態８～１７のいずれか一つに記載の複数の組み換えＲＰＥ細胞。

【0211】

１９．実施形態９～１８のいずれかに記載の複数の組み換えＲＰＥ細胞を含む少なくとも１つの細胞含有区画と、デバイスが対象に移植される場合の異物反応（ＦＢＲ）を軽減するための少なくとも１つの手段とを含む、移植可能なデバイス。

【0212】

２０．少なくとも１つの細胞含有区画が、複数の組み換えＲＰＥ細胞をカプセル化するポリマー組成物を含み、任意選択により少なくとも１つの細胞結合物質（ＣＢＳ）を含む、実施形態１９に記載のデバイス。

【0213】

２１．細胞含有区画が、アルギン酸ヒドロゲルを含み、且つバリア区画で取り囲まれており、バリア区画は、アルギン酸塩ヒドロゲルを含み、任意選択により、バリア区画の外面に配置された式（Ｉ）の化合物、例えば、表３の化合物１０１を含む、実施形態１９又は２０に記載のデバイス。

【0214】

２２．ポリマー組成物はペプチドで共有結合的に修飾されたアルギン酸塩を含み、ペプチドはＧＲＧＤＳＰ（配列番号４９）、ＧＧＲＧＤＳＰ（配列番号５１）、又はＧＧＧＲＧＤＳＰ（配列番号５２）から本質的になるか、又はそれからなる、実施形態２０又は２１に記載のデバイス。

【0215】

２３．バリア区画が、未修飾のアルギン酸塩と化合物１０１で修飾されたアルギン酸塩との混合物を含み、
（ａ）非修飾アルギン酸塩は、分子量が１５０ｋＤａ～２５０ｋＤａであり、且つＧ：Ｍ比が１．５以上であり、
（ｂ）修飾アルギン酸塩におけるアルギン酸塩は、分子量が７５ｋＤａ未満であり、且つＧ：Ｍ比が１．５以上である、
実施形態２１又は２２に記載のデバイス。

【0216】

２４．修飾アルギン酸塩における化合物１０１のコンジュゲーション密度が、例えば本明細書の下記の実施例９で説明されている、定量的遊離アミン分析により決定され、決定されたコンジュゲーション密度は、１．０ｗ／ｗ％～３．０ｗ／ｗ％、１．３ｗ／ｗ％～２．８ｗ／ｗ％、１．３ｗ／ｗ％～２．６ｗ／ｗ％、１．５ｗ／ｗ％～２．４ｗ／ｗ％、１．５ｗ／ｗ％～２．２ｗ／ｗ％、若しくは１．７ｗ／ｗ％～２．２ｗ／ｗ％である、によって決定される、実施形態２３のデバイス。

【0217】

２５．ヒドロゲルカプセルであって、
（ａ）第１のＲＧＤ－ポリマーを含む第１のポリマー組成物中でカプセル化された、実施形態８～１７のいずれか一つに記載の複数の組み換え細胞を含む内側細胞含有区画であって、任意選択により、複数の細胞の濃度は、第１のポリマー組成物１ｍｌあたり４０００万細胞；第１のポリマー組成物１ｍｌあたり４０００万～１億細胞、若しくは１ｍｌあたり６０００万～１億細胞、又は１ｍｌあたり８０００万～１億細胞のいずれかである、内側細胞含有区画；及び
（ｂ）細胞含有区画を取り囲み且つ第２のポリマー組成物を含むバリア区画であって、第２のポリマー組成物は、非修飾アルギン酸塩と、表３で示されている化合物１００、化合物１０１、化合物１１０、化合物１１２、化合物１１３、及び化合物１１４からなる群から選択される少なくとも１種の化合物で共有結合的に修飾されたアルギン酸塩との混合物を含む、バリア区画
を含み、ヒドロゲルカプセルは、球状の形状であり、且つ直径が０．５ミリメートル～５ミリメートルであり、任意選択的に、バリア区画の平均厚は、約１０～約３００ミクロン、約２０～約１５０ミクロン、又は約４０～約７５ミクロンである、ヒドロゲルカプセル。

【0218】

２６．第ＶＩＩ因子タンパク質の分泌の増加に有効な量の第１のＲＧＤ－ポリマーを含み、第１のＲＧＤ－ポリマーは、リンカーを介してＲＧＤペプチドで共有結合的に修飾されたアルギン酸塩から本質的になり、細胞含有区画は、あらゆる抗線維性化合物を実質的に含まず、バリア区画は、細胞及びＲＧＤペプチドを実質的に含まず、任意選択的に、ＲＧＤ－ポリマーの有効量は、最適な量である、実施形態２５に記載のヒドロゲルカプセル。

【0219】

２７．ＲＧＤペプチドは、ＲＧＤ（配列番号３３）又はＲＧＤＳＰ（配列番号４８）のアミノ酸配列から本質的になり、リンカーは、ＲＧＤペプチドのＮ末端に付着している単一のグリシン残基又は単一のベータ－アラニン残基である、実施形態２５又は２６に記載のヒドロゲルカプセル。

【0220】

２８．
（ａ）第１のＲＧＤ－ポリマー中のポリマーは、アルギン酸塩であり、分子量が１５０～２５０ｋＤａであり且つＧ：Ｍ比が１．５以上であり、任意選択的に、細胞含有区画は、約９０ｃＰと、約２３０ｃＰ～約３００、３５０、若しくは４００ｃＰとの間、又は約８０～約１２０ｃＰの粘度のアルギン酸塩溶液から形成されており；
（ｂ）バリア区画中における共有結合的に修飾されたアルギン酸塩中のアルギン酸塩は、分子量が＜７５ｋＤａであり、且つＧ：Ｍ比が１．５以上であり；
（ｃ）バリア区画中の非修飾アルギン酸塩は、分子量が１５０ｋＤａ～２５０ｋＤａであり、且つＧ：Ｍ比が１．５以上であり、
（ｄ）任意選択的に、バリア区画は、共有結合的に修飾されたアルギン酸塩と非修飾アルギン酸塩との混合物を含み且つ粘度が２５０～３５０ｃＰであるアルギン酸塩溶液から形成されている、
実施形態２５ ～２７のいずれか一つに記載に記載のヒドロゲルカプセル。

【0221】

２９．
（ａ）カプセルは、直径が約１．０ミリメートル～２．０ミリメートルであり；
（ｂ）アルギン酸塩上のＲＧＤペプチドのコンジュゲーション密度は、一定量に凍結乾燥されているＲＧＤ－ポリマー（配列番号３３）の燃焼分析（例えば、本明細書の実施例１Ｂで説明されている）により決定された窒素パーセントであり、決定された窒素パーセントは、約０．１０％の窒素（Ｎ）～１．００％のＮ、約０．２０％のＮ～約０．８０％のＮ、約０．３０％のＮ～約０．６０％のＮ、約０．３０％～約０．５０％、又は０．３３％のＮ～０．４６％のＮであり；
（ｃ）バリア区画中の共有結合的に修飾されたアルギン酸塩は、化合物１０１のみで修飾されており、共有結合的に修飾されたアルギン酸塩中の化合物１０１の密度は、例えば本明細書の実施例１Ａで説明されている、一定量に凍結乾燥されている共有結合的に修飾されたアルギン酸塩の燃焼分析により決定された窒素パーセントであり、決定された窒素パーセントは、少なくとも２．０％及び９．０％未満であるか、又は３．０％～８．０％、４．０％～７．０％、５．０％～７．０％、若しくは６．０％～７．０％であるか、又は約６．８％である、
実施形態２８に記載のヒドロキシカプセル。

【0222】

３０．
（ａ）カプセルは、直径が約１．５ミリメートルであり；
（ｂ）ＲＧＤペプチドは、ＲＧＤＳＰ（配列番号４８）のアミノ酸配列から本質的になり、及びリンカーは、単一のグリシン残基であり；
（ｃ）アルギン酸塩上のＲＧＤペプチドのコンジュゲーション密度は、
（ｉ）例えば本明細書で説明されているアッセイにより決定した場合に、組み換えＲＰＥ細胞の生存率を増加させるのに十分な量；
（ｉｉ）例えば本明細書で説明されているアッセイにより決定した場合に、組み換えＲＰＥ細胞の産生性を増加させるのに十分な量；
（ｉｉｉ）一定重量に凍結乾燥されているＲＧＤ－ポリマーの燃焼分析（例えば本明細書の実施例１Ｂで説明されている）により決定され、約０．１０％の窒素（Ｎ）～１．００％のＮ、約０．２０％のＮ～約０．８０％のＮ、約０．３０％のＮ～約０．６０％のＮ、約０．３０％～約０．５０％、又は０．３３％のＮ～０．４６％のＮである決定した窒素パーセント；
（ｉｖ）例えば本明細書の実施例７及び任意選択的に実施例８で説明されているように、溶液中のＲＧＤ－ポリマー１グラム当たりＧＲＧＤＳＰ（配列番号４９）０．１～１．０、０．２～０．８、０．３～０．７、又は０．３～０．６マイクロモル；
並びに
（ｖ）ｃ（ｉ）、ｃ（ｉｉ）、ｃ（ｉｉｉ）、及びｃ（ｉｖ）の内の２つ以上の任意の組み合わせ
からなる群から選択され、
（ｄ）バリア区画中の共有結合的に修飾されたアルギン酸塩は、化合物１０１のみで修飾されており、共有結合的に修飾されたアルギン酸塩中の化合物１０１の密度は、
（ｉ）例えば本明細書の実施例１Ａで説明されている、一定量に凍結乾燥されている共有結合的に修飾されたアルギン酸塩の燃焼分析により決定された窒素パーセントであり、決定された窒素パーセントは、少なくとも２．０％及び９．０％未満であるか、又は３．０％～８．０％、４．０％～７．０％、５．０％～７．０％、若しくは６．０％～７．０％であるか、又は約６．８％であるか；
又は
（ｉｉ）例えば本明細書の実施例９で説明されている、定量的遊離アミン分析により決定された重量／重量ベースの％アミンであり、決定された密度は、１．０ｗ／ｗ％～３．０ｗ／ｗ％、１．３ｗ／ｗ％～２．８ｗ／ｗ％、１．３ｗ／ｗ％～２．６ｗ／ｗ％、１．５ｗ／ｗ％～２．４ｗ／ｗ％、１．５ｗ／ｗ％～２．２ｗ／ｗ％、又は１．７ｗ／ｗ％～２．２ｗ／ｗ％である、
実施形態２９に記載のヒドロゲルカプセル。

【0223】

３１．ＲＧＤ－ポリマー中のアルギン酸塩上のＲＧＤペプチドのコンジュゲーション密度は、溶液中のＲＧＤ－ポリマー１グラム当たりＧＲＧＤＳＰ（配列番号４９）０．３～０．６マイクロモルである、実施形態３０に記載のヒドロゲルカプセル。

【0224】

３２．デバイスの調製物であって、調製物中の各デバイスは、実施形態１８～２３のいずれか一項に記載のデバイスである、デバイスの調製物。

【0225】

３３．複数のヒドロゲルカプセルを含む組成物であって、組成物中の各カプセルは、実施形態２５～３１のいずれか一つに記載のヒドロゲルカプセルである、組成物。

【0226】

３４．各カプセルは、直径が０．５ミリメートル～２ミリメートル；０．７ミリメートル～１．８ミリメートル、１．０ミリメートル～１．８ミリメートル；１．２ミリメートル～１．７ミリメートル；１．３ミリメートル～１．７ミリメートル；及び１．４～１．６ミリメートルからなる群から選択される球状のヒドロゲルカプセルである、実施形態３３に記載の組成物。

【0227】

３５．薬学的に許容可能な組成物である、実施形態３３又は３４の組成物。

【0228】

３６．ＦＶＩＩ療法剤を、それを必要とする患者に送達する方法であって、実施形態３２に記載のデバイスの調製物又は実施形態３３～３５のいずれか一つに記載の組成物の有効量を患者に投与することを含む方法。

【0229】

３７．患者が血友病を有する、実施形態３６に記載の方法。

【0230】

３８．患者は、先天性ＦＶＩＩ欠乏症又は後天性ＦＶＩＩ欠乏症を有すると診断されている、実施形態３７に記載の方法。

【0231】

３９．実施形態１～８のいずれか一つで定義されるようなポリヌクレオチドでＲＰＥ細胞を安定的にトランスフェクトすること、及び任意選択により、ＦＶＩＩタンパク質を発現するモノクローナル細胞株を単離することを含む、本明細書に記載の特性を有するＦＶＩＩタンパク質（例えば、ヒトＦＶＩＩタンパク質又はその変異体）を産生するように複数のＲＰＥ細胞を組み換える方法。

【0232】

４０．複数のＲＰＥ細胞は、ＡＲＰＥ－１９細胞に由来する、実施形態３９の方法。

【0233】

４１．ＦＶＩＩタンパク質を発現及び分泌することができる、組み換えＲＰＥ細胞であって、細胞は、ＦＶＩＩタンパク質のコード配列を含む外因性ヌクレオチド配列を含み、コード配列は、（ｉ）配列番号３、（ｉｉ）配列番号３と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同一のヌクレオチド配列、（ｉｉｉ）配列番号４、及び（ｉｖ）配列番号４と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同一のヌクレオチド配列からなる群から選択される前駆体ＦＶＩＩコード配列を含む、組み換えＲＰＥ細胞。

【0234】

４２．外因性ヌクレオチド配列は、コード配列に動作可能に連結されたプロモーターであって、プロモーターは、任意選択により、配列番号１０又は配列番号２１と同一又は実質的に同一であるヌクレオチド配列から本質的になるか、又はそれからなる、プロモーターをさらに含む、実施形態４１に記載のＲＰＥ組み換え細胞。

【0235】

４３．コード配列は配列番号３を含み、プロモーターは配列番号１０又は配列番号２１からなる、実施形態４２に記載の組み換えＲＰＥ細胞。

【0236】

４４．ＦＶＩＩタンパク質は、ＦＶＩＩ融合タンパク質であり、任意選択により、ＦＶＩＩ融合タンパク質は、配列番号１１又は配列番号１２を含む、実施形態４１に記載の組み換えＲＰＥ細胞。

【0237】

４５．コード配列は、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、又は配列番号１８を含む、実施形態４４に記載の組み換えＲＰＥ細胞。

【0238】

４６．配列番号２３、配列番号２４、又は配列番号２５を含む、実施形態４１に記載の組み換えＲＰＥ細胞。

【0239】

４７．配列番号２２を含む、実施形態４１に記載の組み換えＲＰＥ細胞。

【0240】

４８．染色体外発現ベクターを含むか、又はＲＰＥ細胞の少なくとも１つの染色体位置に組み込まれている、実施形態４１～４７のいずれか一つに記載の組み換えＲＰＥ細胞。

【0241】

４９．ＡＲＰＥ－１９細胞に由来する、実施形態４１～４８のいずれか一つに記載の組み換えＲＰＥ細胞。

【0242】

５０．実施形態４１～４９のいずれか一つに記載の組み換えＲＰＥ細胞を含む組成物。

【0243】

５１．ポリクローナル細胞培養物又はモノクローナル細胞株の培養物である、実施形態５０に記載の組成物。

【0244】

５２．配列番号３、配列番号４、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、又は配列番号２５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、単離された二本鎖ＤＮＡ分子。

【0245】

５３．配列番号２２から本質的になる、実施形態５２に記載の単離されたＤＮＡ分子。

【0246】

５４．実施形態４１～４９のいずれか一つに記載の組み換えＲＰＥ細胞を含む少なくとも１つの細胞含有区画と、デバイスが対象に移植される場合の異物反応（ＦＢＲ）を軽減するための少なくとも１つの手段とを含む、移植可能なデバイス。

【0247】

５５．少なくとも１つの細胞含有区画が、複数の組み換えＲＰＥ細胞をカプセル化するポリマー組成物を含み、任意選択により少なくとも１つの細胞結合物質（ＣＢＳ）を含む、実施形態５４に記載の移植可能なデバイス。

【0248】

５６．細胞含有区画は、アルギン酸塩ヒドロゲル、及び任意選択により、バリア区画の外面に配置された式（Ｉ）の化合物を含む、バリア区画で取り囲まれている、実施形態５４又は５５に記載の移植可能なデバイス。

【0249】

５７．ポリマー組成物はペプチドで共有結合的に修飾されたアルギン酸塩を含み、ペプチドはＧＲＧＤＳＰ（配列番号４９）又はＧＧＲＧＤＳＰ（配列番号５１）から本質的になるか、又はそれからなり、バリア区画は、

【化48】

で修飾されたアルギン酸塩又はその薬学的に許容可能な塩を含む、実施形態５５又は５６に記載の移植可能なデバイス。

【0250】

５８．ヒドロゲルカプセルであって、
（ａ）第１のポリマー組成物中でカプセル化された、実施形態４１～４９のいずれか一つに記載の組み換え細胞を含む内側区画であって、第１のポリマー組成物は、ヒドロゲル形成ポリマーを含む、内側区画；及び
（ｂ）内側区画を取り囲み且つ第２のポリマー組成物を含むバリア区画であって、第２のポリマー組成物は、表３で示されている化合物１００、化合物１０１、化合物１１０、化合物１１２、化合物１１３、及び化合物１１４からなる群から選択される少なくとも１種の化合物で共有結合的に修飾されたアルギン酸塩を含む、バリア区画
を含む、ヒドロゲルカプセル。

【0251】

５９．選択された化合物は、

【化49】

である、実施形態５８に記載のヒドロゲルカプセル。

【0252】

６０．内側区画は、実施形態４１～４９のいずれか一つに記載の複数の組み換え細胞を含み、任意選択により、内側区画内の組み換え細胞の濃度は、第１のポリマー組成物１ｍｌあたり少なくとも４０００万個の細胞である、実施形態５８又は５９に記載のヒドロゲルカプセル。

【0253】

６１．組み換え細胞は、ＡＲＰＥ－１９細胞に由来し、配列番号２５を含む、実施形態５８～６０のいずれか一つに記載のヒドロゲルカプセル。

【0254】

６２．実施形態１９～２２のいずれか一つの複数のヒドロゲルカプセルを含む組成物。

【0255】

６３．実施形態５４～５７のいずれか一つに記載の移植可能なデバイス、実施形態５８若しくは５９のいずれか一つに記載のヒドロゲルカプセル、又は実施形態６２に記載の組成物を投与することを含む、ＦＶＩＩ療法剤を、それを必要とする患者に送達する方法。

【0256】

［実施例］
本明細書に記載の本開示がより完全に理解され得るよう、以下の実施例が記載されている。本出願に記載されている実施例は、本明細書において提供されている組み換えＲＰＥ細胞、移植可能なデバイス、及び組成物及び方法を例示するために提供されており、如何様にもその範囲を限定すると解釈されるべきではない。

【0257】

［実施例１：例示的な組み換えＡＲＰＥ－１９細胞の生成及び培養］
ＦＶＩＩ分泌細胞は、図８に示される発現ベクターを使用して作成され、ここで、前駆体ＦＶＩＩタンパク質をコードする外因性ヌクレオチド配列は、標準的なクローニング方法を使用して挿入された。これを達成するために、ＡＲＰＥ－１９細胞をＦＶＩＩ発現ベクターとともにトランスポザーゼプラスミドを含むＰｉｇｇｙＢａｃでコトランスフェクトし、安定的にトランスフェクトされた細胞を、ピューロマイシンを含む完全成長培地で培養した。ＦＶＩＩ発現ベクターは、５’ＩＴＲと３’ＩＴＲの間に１つ又は２つの転写ユニットが挿入されていることを除き、図６のベクターと同一であった。プロモーター配列及び挿入されたＦＶＩＩコード配列又はＦＶＩＩ－アルブミン融合配列を除き、各転写ユニットの骨格配列は、図６Ａ及び図６Ｂに示される対応する配列と同一であり、例えば、各転写ユニットは、同じＫｏｚａｋ配列及び同じｒＢＧ ｐＡ配列を有していた。ＦＶＩＩ発現ベクターに存在するプロモーターとＦＶＩＩコード配列との組み合わせを以下に列挙する。

【0258】

ＦＶＩＩ－１ベクター：野生型、ヒト前駆体ＦＶＩＩのコドン最適化コード配列である配列番号３に動作可能に連結されたプロモーター（配列番号１０）を含む、単一の転写ユニット。

【0259】

ＦＶＩＩ－２ベクター：野生型、ヒト前駆体ＦＶＩＩのコドン最適化コード配列である配列番号４に動作可能に連結されたプロモーター（配列番号１０）を含む、単一の転写ユニット。

【0260】

ＦＶＩＩ－３ベクター：野生型、ヒト前駆体ＦＶＩＩの野生型コード配列である配列番号２に動作可能に連結されたプロモーター（配列番号１０）を含む、単一の転写ユニット。

【0261】

ＦＶＩＩ－４ベクター：上流ユニットは配列番号２に動作可能に連結されたプロモーター（配列番号１０）を含み、下流ユニットは配列番号３に融合した配列番号２１を含む、２つの転写ユニット。

【0262】

ＦＶＩＩ－５ベクター：配列番号８に融合した配列番号３に動作可能に連結されたプロモーター（配列番号１０）を含む、単一の転写ユニット。配列番号８は、成熟ヒト血清アルブミンタンパク質のコドン最適化コード配列に融合された切断可能なリンカーペプチドからなる。

【0263】

ＦＶＩＩ－６ベクター：配列番号６に融合した配列番号３に動作可能に連結されたプロモーター（配列番号１０）を含む、単一の転写ユニット。配列番号６は、ＦＶＩＩ－５ベクターで使用される成熟ヒト血清アルブミンタンパク質の同じコドン最適化コード配列に融合されたグリシンセリンリンカーペプチドからなる。

【0264】

ＦＶＩＩ－７ベクター：上流ユニットは配列番号３に動作可能に連結されたプロモーター（配列番号１０）を含み、下流ユニットは配列番号２に動作可能に連結された異なるプロモーター（配列番号２１）を含む、２つの転写ユニット。

【0265】

ＦＶＩＩ－８ベクター：上流は配列番号８に融合した配列番号３に動作可能に連結されたプロモーター（配列番号１０）を含み、下流ユニットは配列番号８に融合した配列番号３に対し動作可能に配列番号２１を含む、２つの転写ユニット。

【0266】

得られた、安定的にトランスフェクトされたＡＲＰＥ－１９細胞を、以下のプロトコルに従って培養した。細胞は、１５０ｃｍ２の細胞培養フラスコ内の完全成長培地（１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ：Ｆ１２）で成長させた。細胞を継代するために、培養フラスコ内の培地を吸引し、細胞層をリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、８ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、及び２ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、Ｇｉｂｃｏ）で短時間すすいだ。５～１０ｍＬの０．０５％（ｗ／ｖ）トリプシン／０．５３ｍＭ ＥＤＴＡ溶液（「ＴｒｙｐｓｉｎＥＤＴＡ」）を、フラスコに添加し、細胞を、細胞層が分散されるまで、通常、３～５分間、倒立顕微鏡で観察した。凝集を避けるために、細胞を慎重に取り扱い、分散期間中フラスコをぶつけたり又は振ったりするのを最小限に抑えた。細胞が脱離しなかった場合、フラスコを３７℃に置いて、分散を促進した。細胞が分散したら、１０ｍＬの完全成長培地を添加し、細胞を、穏やかなピペッティングによって吸引した。細胞懸濁液を遠心分離管に移し、５～１０分間にわたって約１２５×ｇで遠沈して、ＴｒｙｐｓｉｎＥＤＴＡを除去した。上清を廃棄し、細胞を新鮮な成長培地に再懸濁させた。適切な分量の細胞懸濁液を新たな培養容器に添加し、これを３７℃でインキュベートした。培地は毎週取り替えた。

【0267】

［実施例２：例示的な組み換えＡＲＰＥ－１９細胞からのＦＶＩＩの分泌］
細胞からのＦＶＩＩタンパク質分泌を定量化するために、実施例１に記載の様々なＦＶＩＩ発現コンストラクトで組み換えられたＡＲＰＥ－１９細胞のポリクローナル集団を上記のようにトリプシン処理し、２ｍｌの増殖培地中、５００，０００個の細胞を６ウェル組織培養皿の単一ウェルに播種した。組み換え細胞は、成長培地を新鮮な培養培地と交換する前に、３～４時間沈降させ、皿に付着させた。培地交換の１日（２４時間）後に、分泌されたＦＶＩＩを含む成長培地を回収し、氷上に置いた。細胞を前述のようにリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、０．０５％トリプシンＥＤＴＡでトリプシン処理した。細胞を採取し、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ ＩＩセルアナライザーでトリパンブルーを使用してカウントした。ＦＶＩＩタンパク質レベルは、上記の組み換え細胞からの馴化成長培地を使用して決定され、市販のＦＶＩＩ ＥＬＩＳＡキット（Ａｂｃａｍ＃１９０８１０）で実行される。総タンパク質分泌は、細胞の総数（ピコグラム／細胞／日）に対して正規化され、結果は図９に示される。

【0268】

［実施例３：式（Ｉ）の例示的な化合物の合成］
［一般的なプロトコル］
以下の手順は、本明細書に記載の移植可能なデバイスを調製するための例示的な化合物を調製する方法を説明する。本明細書で提供される化合物は、当業者に周知である、以下に記載される特定の合成プロトコルへの改変を使用して、容易に入手可能な出発物質から調製することができる。典型的又は好ましいプロセス条件（すなわち、反応温度、時間、反応物のモル比、溶媒、圧力など）が与えられている場合、特に明記しない限り、他のプロセス条件も使用できることが理解されよう。最適な反応条件は、使用される特定の反応物又は溶媒によって異なり得るが、そのような条件は、当業者が日常的な最適化手順によって決定することができる。

【0269】

さらに、当業者には明らかであるように、特定の官能基が望ましくない反応を受けるのを防ぐために、従来の保護基が必要とされ得る。特定の官能基に適した保護基の選択、並びに保護及び脱保護に適した条件は、当該技術分野で周知である。例えば、多数の保護基、及びそれらの導入及び除去は、Ｇｒｅｅｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１及びそこに引用されている参考文献に記載されている。

【0270】

［１，４－置換トリアゾールを得るためのヒュスゲン環化付加］
銅触媒によるヒュスゲン［３＋２］環化付加反応を使用して、トリアゾールベースの化合物及びその組成物、デバイス、及び材料を調製した。範囲及び典型的なプロトコルは、多くのレビューの対象となっている（例えば、Ｍｅｌｄａｌ，Ｍ．及びＴｏｒｎｏｅ，Ｃ．Ｗ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．（２００８）１０８：２９５２－３０１５；Ｈｅｉｎ，Ｊ．Ｅ．及びＦｏｋｉｎ，Ｖ．Ｖ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．（２０１０）３９（４）：１３０２－１３１５；これらは両方とも参照により本明細書に組み込まれる）。

【化50】

【0271】

上記の例では、アジドは結合エレメントＡを含む断片の反応性部分であり、アルキンはペンダント基Ｚの反応性成分である。以下に示すように、これらの機能性ハンドルを交換して、構造的に関連するトリアゾール製品を生成できる。これらの代替物の調製は類似しており、特別な考慮は不要である。

【化51】

【0272】

ヨウ化物から出発する典型的なヒュスゲン環化付加手順の概要を以下に示す。いくつかの場合において、安全のために反応の過程でヨウ化物がアジドに変換される。

【化52】

【0273】

メタノール溶液（１．０Ｍ、限定試薬）中のアジ化ナトリウム（１．１当量）、アスコルビン酸ナトリウム（０．１当量）、トランス－Ｎ，Ｎ’－ジメチルシクロヘキサン－１，２－ジアミン（０．２５当量）、ヨウ化銅（Ｉ）の溶液を、バブリング窒素で脱気し、アセチレン（１当量）及びヨウ化アリール（１．２当量）で処理した。この混合物を室温で５分間撹拌し、次に５５℃まで１６時間温めた。次に、反応物を室温に冷却し、漏斗を通してろ過し、ろ過ケーキをメタノールで洗浄した。合わせたろ液を濃縮し、ジクロロメタン中のシリカゲル（１２０ｇシリカ、０～４０％の勾配（３％水酸化アンモニウム水溶液、２２％メタノール、残りはジクロロメタン）でのフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、所望の標的物質を得た。

【0274】

アジドから出発する典型的なヒュスゲン環化付加手順の概要を以下に示す。

【化53】

【0275】

メタノール（０．４Ｍ、限定試薬）中のトリス［（１－ベンジル－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－４－イル）メチル］アミン（０．２当量）、トリエチルアミン（０．５当量）、ヨウ化銅（Ｉ）（０．０６当量）の溶液をアセチレン（１．０当量）で処理し、０℃に冷却した。反応物を３０分かけて室温まで温め、次に５５℃まで１６時間加熱した。反応物を室温に冷却し、濃縮し、ジクロロメタン中のＨＰＬＣ（Ｃ１８カラム、０～１００％の勾配（３％水酸化アンモニウム水溶液、２２％メタノール、残りはジクロロメタン）で精製して、所望の標的材料を得た。

【0276】

［１，５－置換トリアゾールを得るためのヒュスゲン環化付加］
ヒュスゲン［３＋２］環化付加もルテニウム触媒を用いて実施されて、１，５－二置換生成物が優先的に得られた（例えば、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２００５，１２７，１５９９８－１５９９９；Ｂｏｒｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２００８，１３０，８９２３－８９３０に記載されるとおりであり、これらはそれぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。

【化54】

【0277】

前述のように、アジド基とアルキン基を交換して、以下に示すものと同様のトリアゾールを形成することができる。

【化55】

【0278】

典型的な手順は次の通りである：ジオキサン（０．８Ｍ）中のアルキン（１当量）及びアジド（１当量）の溶液を、ジオキサン（０．１６Ｍ）中のペンタメチルシクロペンタジエニルビス（トリフェニルホスフィン）塩化ルテニウム（ＩＩ）（０．０２当量）の溶液に滴下して加えた。バイアルを窒素でパージし、密封し、混合物を６０℃まで１２時間加熱した。得られた混合物を濃縮し、シリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、必要な化合物を得た。

【0279】

［（４－（４－（（４－メチルピペラジン－１－イル）メチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）フェニル）メタンアミン（３）の実験手順］

【化56】

メタノール（９ｍＬ）及び水（１ｍＬ）中の（４－ヨードフェニル）メタンアミン（１、８４３ｍｇ、３．６２ｍｍｏｌ、１．０当量）、（１Ｓ，２Ｓ）－Ｎ１，Ｎ２－ジメチルシクロヘキサン－１，２－ジアミン（７４μＬ、０．４７ｍｍｏｌ、０．１３当量）、アスコルビン酸ナトリウム（７２ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ、０．１当量）、ヨウ化銅（６９ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ、０．１当量）、アジ化ナトリウム（４７０ｍｇ、７．２４ｍｍｏｌ、２．０当量）、及び１－メチル－４－（プロプ－２－イン－１－イル）ピペラジン（２、０．５ｇ、３．６２ｍｍｏｌ、１．０当量）の混合物を、窒素で５分間パージし、５５℃まで一晩加熱した。反応混合物を室温に冷却し、減圧下で濃縮し、褐色がかったスラリーをジクロロメタンで抽出した。合わせたジクロロメタン相にセライトを加え、溶媒を減圧下で除去した。粗生成物を、移動相としてジクロロメタン／（１２％（ｖ／ｖ）水酸化アンモニウム水溶液を含有するメタノール）を使用してシリカゲル（８０ｇ）で精製した。（１２％（ｖ／ｖ）水酸化アンモニウム水溶液を含むメタノール）の濃度を０％から７．５％に徐々に増加させて、（４－（４－（（４－メチルピペラジン－１－イル）メチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）フェニル）メタンアミン（３、０．４５ｇ、４３％）を得た。ＬＣＭＳ ｍ／ｚ：［Ｍ＋Ｈ］＋ Ｃ１５Ｈ２２Ｎ６の計算値２８７．２；測定値２８７．１。

【0280】

［Ｎ－（４－（４－（（４－メチルピペラジン－１－イル）メチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）ベンジル）メタクリルアミド（４）の実験手順］

【化57】

ＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍＬ）中の（４－（４－（（４－メチルピペラジン－１－イル）メチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）フェニル）メタンアミン（３、１．２ｇ、４．１９ｍｍｏｌ、１．０当量）及びトリエチルアミン（０．７０ｍＬ、５．０３ｍｍｏｌ、１．２当量）の溶液を、氷浴で０°Ｃに冷却し、塩化メタクリロイル（５ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２中０．４３ｍＬ、４．４０ｍｍｏｌ、１．０５ｅｑ）を加えた。氷浴で冷却しながら、反応物を１日撹拌した。１０グラムのセライトを加え、溶媒を減圧下で除去した。残留物を、移動相としてジクロロメタン／（１２％（ｖ／ｖ）水酸化アンモニウム水溶液を含有するメタノール）を使用して、シリカゲルクロマトグラフィー（８０ｇ）によって精製した。（１２％（ｖ／ｖ）水酸化アンモニウム水溶液を含有するメタノール）の濃度を０％から７．５％に徐々に増加させた。溶媒を減圧下で除去し、得られた固体をジエチルエーテルで粉砕し、ろ過し、ジエチルエーテルで複数回洗浄して、Ｎ－（４－（４－（（４－メチルピペラジン－１－イル）メチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）ベンジル）メタクリルアミド（４、０．４１ｇ、２８％収率）を白色の固体として得た。ＬＣＭＳ ｍ／ｚ：［Ｍ＋Ｈ］＋ Ｃ１９Ｈ２６Ｎ６Ｏの計算値３５５．２；測定値３５５．２。

【0281】

［（４－（４－（（２－（２－メトキシエトキシ）エトキシ）メチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）フェニル）メタンアミン（６）の実験手順］

【化58】

メタノール（４０ｍＬ）及び水（４ｍＬ）中の（４－ヨードフェニル）メタンアミン（１、２．９５ｇ、１２．６４ｍｍｏｌ、１．０当量）、（１Ｓ，２Ｓ）－Ｎ１，Ｎ２－ジメチルシクロヘキサン－１，２－ジアミン（２５９μＬ、１．６４ｍｍｏｌ、０．１３当量）、アスコルビン酸ナトリウム（２５０ｍｇ、１．２６ｍｍｏｌ、０．１当量）、ヨウ化銅（２４１ｍｇ、１．２６ｍｍｏｌ、０．１当量）、アジ化ナトリウム（１．６４ｇ、２５．２９ｍｍｏｌ、２．０当量）、及び１－メチル－４－（プロプ－２－イン－１－イル）ピペラジン（５、２．０ｇ、１２．６４ｍｍｏｌ、１．０当量）の混合物を窒素で５分間パージし、５５°Ｃで一晩加熱した。反応混合物を室温に冷却し、減圧下で濃縮した。残留物をジクロロメタンに溶解し、ろ過し、セライト（１０ｇ）で濃縮した。粗生成物を、移動相としてジクロロメタン／（１２％（ｖ／ｖ）水酸化アンモニウム水溶液を含有するメタノール）を使用して、シリカゲルクロマトグラフィー（２２０ｇ）によって精製した。（１２％（ｖ／ｖ）水酸化アンモニウム水溶液を含むメタノール）の濃度を０％から６．２５％まで徐々に増加させて、（４－（４－（（２－（２－メトキシエトキシ）エトキシ）メチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）フェニル）メタンアミン（６、１．３７ｇ、３５％）を得た。ＬＣＭＳ ｍ／ｚ：［Ｍ＋Ｈ］＋ Ｃ１５Ｈ２２Ｎ４Ｏ３の計算値３０７．２；測定値３０７．０。

【0282】

［Ｎ－（４－（４－（（２－（２－メトキシエトキシ）エトキシ）メチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）ベンジル）メタクリルアミド（７）の実験手順］

【化59】

ＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍＬ）中の４－（４－（（２－（２－メトキシエトキシ）エトキシ）メチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）フェニル）メタンアミン（６、１．６９ｇ、５．５２ｍｍｏｌ、１．０当量）及びトリエチルアミン（０．９２ｍＬ、６．６２ｍｍｏｌ、１．２当量）の溶液を氷浴で０℃に冷却し、塩化メタクリロイル（０．５７ｍＬ、５．７９ｍｍｏｌ、１．０５当量）を滴下して加えた。反応物を室温で４時間撹拌した。１０グラムのセライトを加え、溶媒を減圧下で除去した。残留物を、移動相としてジクロロメタン／（１２％（ｖ／ｖ）水酸化アンモニウム水溶液を含有するメタノール）を使用して、シリカゲル（８０ｇ）クロマトグラフィーによって精製した。（１２％（ｖ／ｖ）水酸化アンモニウム水溶液を含むメタノール）の濃度を０％から１．２５％に徐々に増加させて、Ｎ－（４－（４－（（２－（２－メトキシエトキシ）エトキシ）メチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）ベンジル）メタクリルアミド（７、１．７６ｇ、８５％収率）を白色の固体として得た。ＬＣＭＳ ｍ／ｚ：［Ｍ＋Ｈ］＋ Ｃ１９Ｈ２６Ｎ４Ｏ４の計算値３７５．２；測定値３７５．０。

【0283】

［３－（プロプ－２－イン－１－イルオキシ）オキセタン（９）の実験手順］

【化60】

ＴＨＦ（２００ｍＬ）中の水素化ナトリウム（２７．０ｇ、６７５ｍｍｏｌ、純度６０％）の懸濁液を氷浴で冷却した。オキセタン（ｏｅｘｅｔａｎ）－３－オール（８、２５ｇ、３３７ｍｍｏｌ）を滴下し、０℃で３０分間撹拌した。次に、３－ブロモプロプ１－イン（９、４１．２ｍＬ、３７１ｍｍｏｌ、純度８０％）を滴下して加えた。室温まで温めながら、混合物を一晩撹拌した。混合物をセライトでろ過し、ＴＨＦで洗浄し、減圧下で、セライトで濃縮した。粗生成物をシリカゲル（２２０ｇ）で精製し、ヘキサン／ＥｔＯＡｃで溶出した。移動相中のＥｔＯＡｃの濃度を０から２５％に増加させて、（９、１８．２５ｇ ４８％）の黄色の油を得た。

【0284】

［３－（４－（（オキセタン－３－イルオキシ）メチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）プロパン－１－アミン（１１）の実験手順］

【化61】

メタノール（８０ｍＬ）中の３－（プロプ－２－イン－１－イルオキシ）オキセタン（９、７．９６ｇ、７１ｍｍｏｌ、１．０当量）、３－アジドプロパン－１－アミン（１０、７．８２ｇ、７８ｍｍｏｌ、１．１当量）の混合物、トリス［（１－ベンジル－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－４－イル）メチル］－アミン（８．２９ｇ、１５．６ｍｍｏｌ、０．２２当量）、ヨウ化銅（１．３５ｇ、７．１ｍｍｏｌ、０．１当量）、及びトリエチルアミン（２．４７ｍＬ、１７．８ｍｍｏｌ、０．２５当量）を５５℃まで温め、窒素雰囲気下で一晩撹拌した。反応混合物を室温に冷却し、セライト（２０ｇ）を加え、減圧下で濃縮した。粗生成物を、移動相としてジクロロメタン／（１２％（ｖ／ｖ）水酸化アンモニウム水溶液を含有するメタノール）を使用してシリカゲル（２２０ｇ）で精製した。（１２％（ｖ／ｖ）水酸化アンモニウム水溶液を含むメタノール）の濃度を０％から１５％に徐々に増加させて、３－（４－（（オキセタン－３－イルオキシ）メチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）プロパン－１－アミン（１１、１１．８５ｇ、７９％）を黄色の油として得た。ＬＣＭＳ ｍ／ｚ：［Ｍ＋Ｈ］＋ Ｃ９Ｈ１６Ｎ４Ｏ２の計算値２１３．１；測定値２１３．０。

【0285】

［Ｎ－（３－（４－（（オキセタン－３－イルオキシ）メチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）プロピル）メタクリルアミド（１２）の実験手順］

【化62】

ＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）中の３－（４－（（オキセタン－３－イルオキシ）メチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）プロパン－１－アミン（１１、３．９４ｇ、１８．５６ｍｍｏｌ、１．０当量）及びトリエチルアミン（３．１ｍＬ、２２．２８ｍｍｏｌ、１．２当量）の溶液を氷浴で０℃に冷却し、塩化メタクリロイル（１．９９ｍＬ、２０．４２ｍｍｏｌ、１．１当量）を滴下して加えた。室温まで温めながら、反応物を一晩撹拌した。２０グラムのセライトを加え、溶媒を減圧下で除去した。残留物を、移動相としてジクロロメタン／メタノールを使用して、シリカゲルクロマトグラフィー（２２０ｇ）によって精製した。メタノールの濃度を０％から５％に徐々に増加させて、Ｎ－（３－（４－（（オキセタン－３－イルオキシ）メチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）プロピル）メタクリルアミド（１２、３．２２ｇ、６２％収率）を固体として得た。ＬＣＭＳ ｍ／ｚ：［Ｍ＋Ｈ］＋ Ｃ１３Ｈ２０Ｎ４Ｏ３の計算値２８１．２；測定値２８１．０。

【0286】

［Ｎ－（４－（１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）ベンジル）メタクリルアミド（１４）の実験手順］

【化63】

ＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）中の（４－（１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）フェニル）メタンアミン（１３、ＷｕＸｉから入手、１．２ｇ、５．７０ｍｍｏｌ、１．０当量）及びトリエチルアミン（１５ｍＬ、１０７．５５ｍｍｏｌ、１８．９当量）の溶液に塩化メタクリロイル（８９３ｍｇ、８．５４ｍｍｏｌ、１．５当量）をゆっくりと滴下して加えた。反応物を一晩撹拌した。２０グラムのセライトを加え、溶媒を減圧下で除去した。残留物を、移動相としてジクロロメタン／（１２％（ｖ／ｖ）水酸化アンモニウム水溶液を含有するメタノール）を使用して、シリカゲルクロマトグラフィーによって精製した。（１２％（ｖ／ｖ）水酸化アンモニウム水溶液を含むメタノール）の濃度を０％から１．２５％に徐々に増加させて、Ｎ－（４－（１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）ベンジル）メタクリルアミド（１４、１．３８ｇ、４０％収率）を得た。

【0287】

［（４－（４－（（（テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－イル）オキシ）メチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）フェニル）メタンアミン（１５）の実験手順］

【化64】

メタノール（５０ｍＬ）及び水（１２ｍＬ）中の（４－ヨードフェニル）メタンアミン塩酸塩（５．０ｇ、１８．５５ｍｍｏｌ、１．０当量）、（１Ｓ，２Ｓ）－Ｎ１，Ｎ２－ジメチルシクロヘキサン－１，２－ジアミン（０．５９ｍＬ、３．７１ｍｍｏｌ、０．２当量）、アスコルビン酸ナトリウム（３６８ｍｇ、１．８６ｍｍｏｌ、０．１当量）、ヨウ化銅（５３０ｍｇ、２．７８ｍｍｏｌ、０．１５当量）、アジ化ナトリウム（２．４１ｇ、３７．１ｍｍｏｌ、２．０当量）、Ｅｔ３Ｎ（３．１１ｍＬ、２２．２６ｍｍｏｌ、１．２当量）及び２－（プロプ－２－イン－１－イルオキシ）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン（２．６ｇ、１８．５５ｍｍｏｌ、１．０当量）の混合物を、窒素で５分間パージし、５５℃まで一晩加熱した。反応混合物を室温に冷却し、４１３ろ紙を通してろ過した。セライトを加え、溶媒を減圧下で除去し、残留物を、移動相としてジクロロメタン／（１２％（ｖ／ｖ）水酸化アンモニウム水溶液を含有するメタノール）を使用してシリカゲル（１２０ｇ）で精製した。（１２％（ｖ／ｖ）水酸化アンモニウム水溶液を含むメタノール）の濃度を０％から６．２５％まで徐々に増加させて、（４－（４－（（（テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－イル）オキシ）メチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）フェニル）メタンアミン（１５、３．５４ｇ、６６％）を白色の固体として得た。ＬＣＭＳ ｍ／ｚ：［Ｍ＋Ｈ］＋ Ｃ１５Ｈ２０Ｎ４Ｏ２の計算値２８９．２；測定値２８９．２。

【0288】

［Ｎ－（４－（４－（（（テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－イル）オキシ）メチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）ベンジル）メタクリルアミド（１６）の実験手順］

【化65】

ＣＨ２Ｃｌ２（４０ｍＬ）中の（４－（４－（（（テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－イル）オキシ）メチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）フェニル）メタンアミン（１５、３．４６ｇ、１２．００ｍｍｏｌ、１．０当量）及びトリエチルアミン（２．０１ｍＬ、１４．４０ｍｍｏｌ、１．２当量）の溶液を、氷浴で０℃まで冷却し、塩化メタクリロイル（１．２３ｍＬ、１２．６０ｍｍｏｌ、１．０５当量、５ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２中に希釈）を滴下して加えた。冷却浴を取り外し、反応物を４時間撹拌した。２０グラムのセライトを加え、溶媒を減圧下で除去した。残留物を、移動相としてジクロロメタン／（１２％（ｖ／ｖ）水酸化アンモニウム水溶液を含有するメタノール）を使用して、シリカゲルクロマトグラフィー（８０ｇ）によって精製した。（１２％（ｖ／ｖ）水酸化アンモニウム水溶液を含むメタノール）の濃度を０％から３．７５％に徐々に増加させて、Ｎ－（４－（４－（（（テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－イル）オキシ）メチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）ベンジル）メタクリルアミド（１６、２．７４ｇ、６４％収率）を白色固体として得た。ＬＣＭＳ ｍ／ｚ：［Ｍ＋Ｈ］＋ Ｃ１９Ｈ２４Ｎ４Ｏ３の計算値３５７．２；測定値３５７．３。

【0289】

［Ｎ－（４－（４－（ヒドロキシメチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）ベンジル）メタクリルアミド（１７）の実験手順］

【化66】

Ｎ－（４－（４－（ヒドロキシメチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）ベンジル）メタクリルアミド（１６、１．２ｇ、３．３７ｍｍｏｌ、１．０当量）の溶液を、メタノール（６ｍＬ）及びＨＣｌ（１Ｎ、水溶液、９ｍＬ）中に室温で一晩溶解させた。セライトを加え、溶媒を減圧下で除去した。粗生成物を、移動相としてジクロロメタン／（１２％（ｖ／ｖ）水酸化アンモニウム水溶液を含有するメタノール）を使用して、シリカゲルクロマトグラフィー（２４ｇ）で精製した。（１２％（ｖ／ｖ）水酸化アンモニウム水溶液を含むメタノール）の濃度を０％から１２．５％に徐々に増加させて、Ｎ－（４－（４－（ヒドロキシメチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）ベンジル）メタクリルアミド（１７、０．８５ｇ、９２％収率）を白色の固体として得た。ＬＣＭＳ ｍ／ｚ：［Ｍ＋Ｈ］＋ Ｃ１４Ｈ１６Ｎ４Ｏ２の計算値２７３．１；測定値２７３．１。

【0290】

［（４－（（（テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－イル）オキシ）メチル）ベンジル）カルバメート（１９）の実験手順］

【化67】

ジクロロメタン（１００ｍＬ）中のベンジル（４－（ヒドロキシメチル）ベンジル）カルバメート（２．７１ｇ、１０ｍｍｏｌ、１当量）、３，４－ジヒドロ－２Ｈ－ピラン（１．８１ｍＬ、２０ｍｍｏｌ、２当量）、ｐ－トルエンスルホン酸一水和物（２８５ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ、０．１５当量）を室温で一晩撹拌した。セライトを加え、溶媒を減圧下で除去した。粗生成物を、溶離液としてヘキサン／ＥｔＯＡｃを使用して、１００％ヘキサンで開始し、ＥｔＯＡｃの濃度を１００％まで徐々に増加させてシリカゲル（２４ｇ）で精製して、ベンジル（４－（（（テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－イル）オキシ）メチル）ベンジル）－カルバメート（１９、２．４ｇ、６８％）を無色の油として得た。ＬＣＭＳ ｍ／ｚ：［Ｍ＋Ｎａ］＋ Ｃ２１Ｈ２５ＮＯ４の計算値３７８．１７；測定値３７８．１７。

【0291】

［（４－（（（テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－イル）オキシ）メチル）－フェニル）メタンアミン（２０）の実験手順］

【化68】

ＥｔＯＨ中の（４－（（（テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－イル）オキシ）メチル）ベンジル）カルバメート（１９、１．５ｇ、４．２ｍｍｏｌ、１当量）、パラジウム炭素（１６０ｍｇ、１０重量％）を短時間排気し、次にバルーンで水素を加え、混合物を室温で１時間撹拌した。セライトを加え、溶媒を減圧下で除去した。粗生成物を、移動相としてジクロロメタン／（１２％（ｖ／ｖ）水酸化アンモニウム水溶液を含有するメタノール）を使用してシリカゲル（１２ｇ）で精製した。（１２％（ｖ／ｖ）水酸化アンモニウム水溶液を含むメタノール）の濃度を０％から２５％まで徐々に増加させて、（４－（（（テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－イル）オキシ）メチル）フェニル）メタンアミン（２０、８９０ｍｇ、９５％）を無色の油として得た。ＬＣＭＳ ｍ／ｚ：［Ｍ＋Ｈ］＋ Ｃ１３Ｈ１９ＮＯ２の計算値２２２．１５；測定値２２２．１４。

【0292】

［Ｎ－（４－（（（テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－イル）オキシ）メチル）ベンジル）－メタクリルアミド（２１）の実験手順］

【化69】

ＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）中の（４－（（（テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－イル）オキシ）メチル）フェニル）メタンアミン（２０、０．５ｇ、２．２６ｍｍｏｌ、１．０当量）及びトリエチルアミン（０．４７ｍＬ、３．３９ｍｍｏｌ、１．５当量）の溶液を短時間排気し、窒素でフラッシュした。塩化メタクリロイル（０．３３ｍＬ、３．３９ｍｍｏｌ、１．５当量）を滴下して加えた。反応混合物を室温で一晩撹拌した。１０グラムのセライトを加え、溶媒を減圧下で除去した。残留物を、溶離液としてヘキサン／ＥｔＯＡｃを使用するシリカゲルクロマトグラフィー（１２ｇ）により、１００％ヘキサンから開始し、ＥｔＯＡｃの濃度を徐々に１００％に増加させて、Ｎ－（４－（（（テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－イル）オキシ）メチル）ベンジル）メタクリルアミド（２１、０．４７ｇ、７２％収率）を無色の固体として得た。ＬＣＭＳ ｍ／ｚ：［Ｍ＋Ｎａ］＋ Ｃ１７Ｈ２３ＮＯ３の計算値３１２．１６；測定値３１２．１７。

【0293】

［（４－（４－（２－（（テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－イル）オキシ）エチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）フェニル）メタンアミン（２２）の実験手順］

【化70】

メタノール（２０ｍＬ）及び水（５ｍＬ）中の（４－ヨードフェニル）メタンアミン（５．０ｇ、２１．４５ｍｍｏｌ、１．０当量）、（１Ｓ，２Ｓ）－Ｎ１，Ｎ２－ジメチルシクロヘキサン－１，２－ジアミン（０．４４ｍＬ、２．７９ｍｍｏｌ、０．１３当量）、アスコルビン酸ナトリウム（４２５ｍｇ、２．１５ｍｍｏｌ、０．１当量）、ヨウ化銅（４０９ｍｇ、２．１５ｍｍｏｌ、０．１当量）、アジ化ナトリウム（２．７９ｇ、４２．９１ｍｍｏｌ、２．０当量）、及び２－（ブト－３－イン－１－イルオキシ）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン（３．３６ｍＬ、２１．４５ｍｍｏｌ、１．０当量）の混合物を、窒素で５分間パージし、５５°Ｃで一晩加熱した。反応混合物を室温に冷却し、４１３ろ紙を通してろ過した。セライト（１０ｇ）を加え、溶媒を減圧下で除去し、残留物を、移動相としてジクロロメタン／（１２％（ｖ／ｖ）水酸化アンモニウム水溶液を含有するメタノール）を使用してシリカゲル（２２０ｇ）で精製した。（１２％（ｖ／ｖ）水酸化アンモニウム水溶液を含むメタノール）の濃度を０％から５％に徐々に増加させて、（４－（４－（２－（（テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－イル）オキシ）エチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）フェニル）メタンアミン（２２、３．１５ｇ、４９％）を固体として得た。ＬＣＭＳ ｍ／ｚ：［Ｍ＋Ｈ］＋ Ｃ１６Ｈ２２Ｎ４Ｏ２の計算値３０３．１８；測定値３０３．１８。

【0294】

［Ｎ－（４－（４－（２－（（テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－イル）オキシ）エチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）ベンジル）メタクリルアミド（２３）の実験手順］

【化71】

ＣＨ２Ｃｌ２（５５ｍＬ）中の（４－（４－（２－（（テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－イル）オキシ）エチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）フェニル）メタンアミン（２２、３．１０ｇ、１０．２５ｍｍｏｌ、１．０当量）及びトリエチルアミン（１．７１ｍＬ、１２．３０ｍｍｏｌ、１．２当量）の溶液を、氷浴で０℃まで冷却し、塩化メタクリロイル（１．０５ｍＬ、１２．３０ｍｍｏｌ、１．２当量、５ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２中に希釈）を滴下して加えた。冷却浴を取り外し、反応物を４時間撹拌した。８グラムのセライトを加え、溶媒を減圧下で除去した。残留物を、移動相としてジクロロメタン／（１２％（ｖ／ｖ）水酸化アンモニウム水溶液を含有するメタノール）を使用して、シリカゲルクロマトグラフィー（８０ｇ）によって精製した。（１２％（ｖ／ｖ）水酸化アンモニウム水溶液を含むメタノール）の濃度を０％から２．５％まで徐々に増加させて、Ｎ－（４－（４－（２－（（テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－イル）オキシ）エチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）ベンジル）メタクリルアミド（２３、２．０６ｇ、５４％収率）を白色の固体として得た。ＬＣＭＳ ｍ／ｚ：［Ｍ＋Ｈ］＋ Ｃ２０Ｈ２６Ｎ４Ｏ３の計算値３７１．２０７８；測定値３７１．２０８５。

【0295】

［（４－（１－（２－（（テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－イル）オキシ）エチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－４－イル）フェニル）メタンアミン（２４）の実験手順］

【化72】

メタノール（２４ｍＬ）及び水（６ｍＬ）中の（４－エチニルフェニル）メタンアミン（２．３６ｇ、１８．００ｍｍｏｌ、１．０当量）、（１Ｓ，２Ｓ）－Ｎ１，Ｎ２－ジメチルシクロヘキサン－１，２－ジアミン（０．５６ｍＬ、３．６０ｍｍｏｌ、０．２当量）、アスコルビン酸ナトリウム（３５７ｍｇ、１．８０ｍｍｏｌ、０．１当量）、ヨウ化銅（５１４ｍｇ、２．７０ｍｍｏｌ、０．１５当量）、及び２－（２－アジドエトキシ）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン（３．０８、１８．００ｍｍｏｌ、１．０当量）の混合物を、窒素で５分間パージし、５５℃まで一晩加熱した。反応混合物を室温に冷却し、セライトでろ過し、ＭｅＯＨ（３×５０ｍＬ）ですすいだ。溶媒を減圧下で除去し、残留物をジクロロメタンに再溶解し、セライト（２０ｇ）を加え、溶媒を減圧下で除去し、残留物を、移動相としてジクロロメタン／（１２％（ｖ／ｖ）水酸化アンモニウム水溶液を含有するメタノール）を使用してシリカゲル（１２０ｇ）で精製した。（１２％（ｖ／ｖ）水酸化アンモニウム水溶液を含むメタノール）の濃度を０％から２５％に徐々に増加させて、（４－（１－（２－（（テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－イル）オキシ）エチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－４－イル）フェニル）メタンアミン（２４、３．５１ｇ、６４％）を黄色がかった油として得た。ＬＣＭＳ ｍ／ｚ：［Ｍ＋Ｈ］＋ Ｃ１６Ｈ２２Ｎ４Ｏ２の計算値３０３．１８１６；測定値３０３．１８１４。

【0296】

［Ｎ－（４－（１－（２－（（テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－イル）オキシ）エチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－４－イル）ベンジル）メタクリルアミド（２５）の実験手順］

【化73】

ＣＨ２Ｃｌ２（３０ｍＬ）中の（４－（１－（２－（（テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－イル）オキシ）エチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－４－イル）フェニル）メタンアミン（２４、１．５ｇ、４．９６ｍｍｏｌ、１．０当量）及びトリエチルアミン（１．０４ｍＬ、７．４４ｍｍｏｌ、１．５当量）の溶液を短時間排気し、窒素でフラッシュした。塩化メタクリロイル（０．７２ｍＬ、７．４４ｍｍｏｌ、１．５当量）を滴下して加えた。反応混合物を室温で２時間撹拌した。１０グラムのセライトを加え、溶媒を減圧下で除去した。残留物を、溶離液としてヘキサン／ＥｔＯＡｃを使用するシリカゲルクロマトグラフィー（４０ｇ）により、１００％ヘキサンから開始し、ＥｔＯＡｃの濃度を徐々に１００％に増加させて、Ｎ－（４－（１－（２－（（テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－イル）オキシ）エチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－４－イル）ベンジル）メタクリルアミド（２５、０．９ｇ、４９％収率）を無色の固体として得た。ＬＣＭＳ ｍ／ｚ：［Ｍ＋Ｎａ］＋ Ｃ２０Ｈ２６Ｎ４Ｏ３の計算値３７１．２０７８；測定値３７１．２０７６。

【0297】

［１－（４－（４－（（（テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－イル）オキシ）メチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）フェニル）エタン－１－アミン（２６）の実験手順］

【化74】

メタノール（９ｍＬ）及び水（１ｍＬ）中の１－（４－ヨードフェニル）エタン－１－アミン塩酸塩（１．０ｇ、４．０５ｍｍｏｌ、１．０当量）、（１Ｓ，２Ｓ）－Ｎ１，Ｎ２－ジメチルシクロヘキサン－１，２－ジアミン（０．０８ｍＬ、０．５３ｍｍｏｌ、０．１３当量）、アスコルビン酸ナトリウム（８０ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ、０．１当量）、ヨウ化銅（７７ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ、０．１当量）、アジ化ナトリウム（５２６ｇ、８．０９ｍｍｏｌ、２．０当量）、及び２－（プロプ－２－イン－１－イルオキシ）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン（０．５７ｇ、４．０５ｍｍｏｌ、１．０当量）の混合物を、窒素で５分間パージし、５５℃まで一晩加熱した。反応混合物を室温に冷却し、溶媒を減圧下で除去した。残留物をジクロロメタンに再溶解し、セライトのプラグでろ過した。ろ液にセライトを加え、減圧下で溶媒を除去した。残留物を、移動相としてジクロロメタン／（１２％（ｖ／ｖ）水酸化アンモニウム水溶液を含有するメタノール）を使用してシリカゲル（４０ｇ）で精製した。（１２％（ｖ／ｖ）水酸化アンモニウム水溶液を含むメタノール）の濃度を０％から５％に徐々に増加させて、１－（４－（４－（（（テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－イル）オキシ）メチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）フェニル）エタン－１－アミン（２６、０．６２ｇ、５１％）を黄色がかった固体として得た。ＬＣＭＳ ｍ／ｚ：［Ｍ＋Ｈ］＋ Ｃ１６Ｈ２２Ｎ４Ｏ２の計算値３０３．２；測定値３０３．２。

【0298】

［Ｎ－（１－（４－（４－（（（テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－イル）オキシ）メチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）フェニル）エチル）メタクリルアミド（２７）の実験手順］

【化75】

ＣＨ２Ｃｌ２（１１ｍＬ）中の１－（４－（４－（（（テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－イル）オキシ）メチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）フェニル）エタン－１－アミン（２６、０．５２ｇ、１．７ｍｍｏｌ、１．０当量）及びトリエチルアミン（０．２９ｍＬ、２．１ｍｍｏｌ、１．２当量）の溶液を、氷浴で０℃まで冷却し、塩化メタクリロイル（０．１８ｍＬ、１．８ｍｍｏｌ、１．０５当量、１１ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２中に希釈）を滴下して加えた。冷却浴を取り外し、反応物を４時間撹拌した。５グラムのセライトを加え、溶媒を減圧下で除去した。残留物を、移動相としてジクロロメタン／（１２％（ｖ／ｖ）水酸化アンモニウム水溶液を含有するメタノール）を使用して、シリカゲルクロマトグラフィー（４０ｇ）によって精製した。（１２％（ｖ／ｖ）水酸化アンモニウム水溶液を含むメタノール）の濃度を０％から２．５％まで徐々に増加させて、Ｎ－（１－（４－（４－（（（テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－イル）オキシ）メチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）フェニル）エチル）メタクリルアミド（２７、０．４９ｇ、７６％収率）を白色の固体として得た。ＬＣＭＳ ｍ／ｚ：［Ｍ＋Ｈ］＋ Ｃ２０Ｈ２６Ｎ４Ｏ３の計算値３７１．２０７８；測定値３７１．２０８７。

【0299】

［（４－（４－（（（テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－イル）オキシ）メチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）－２－（トリフルオロメチル）フェニル）メタンアミン（２８）の実験手順］

【化76】

メタノール（２４ｍＬ）及び水（６ｍＬ）中の（４－ヨード－２－（トリフルオロメチル）フェニル）メタンアミン（３．０ｇ、９．９７ｍｍｏｌ、１．０当量）、（１Ｓ，２Ｓ）－Ｎ１，Ｎ２－ジメチルシクロヘキサン－１，２－ジアミン（０．３１ｍＬ、１．９９ｍｍｏｌ、０．２当量）、アスコルビン酸ナトリウム（１９７ｍｇ、１．００ｍｍｏｌ、０．１当量）、ヨウ化銅（２８５ｍｇ、１．４９ｍｍｏｌ、０．１５当量）、アジ化ナトリウム（１．３０ｇ、１９．９３ｍｍｏｌ、２．０当量）、Ｅｔ３Ｎ（１．６７ｍＬ、１１．９６ｍｍｏｌ、１．２当量）及び２－（プロプ－２－イン－１－イルオキシ）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン（１．４０ｇ、９．９７ｍｍｏｌ、１．０当量）の混合物を、窒素で５分間パージし、５５℃まで一晩加熱した。反応混合物を室温に冷却し、セライトのプラグを通してろ過し、メタノール（３×５０ｍＬ）ですすいだ。ろ液にセライトを加え、減圧下で溶媒を除去した。残留物を、移動相としてジクロロメタン／（１２％（ｖ／ｖ）水酸化アンモニウム水溶液を含有するメタノール）を使用してシリカゲル（１２０ｇ）で精製した。（１２％（ｖ／ｖ）水酸化アンモニウム水溶液を含むメタノール）の濃度を０％から２５％まで徐々に増加させて、（４－（４－（（（テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－イル）オキシ）メチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）－２－（トリフルオロメチル）フェニル）メタンアミン（２８、２．５３ｇ、７１％）を緑色の油として得た。ＬＣＭＳ ｍ／ｚ：［Ｍ＋Ｈ］＋ Ｃ１６Ｈ１９Ｎ４Ｏ２Ｆ３の計算値３５７．２；測定値３５７．１。

【0300】

［Ｎ－（４－（４－（（（テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－イル）オキシ）メチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）－２（トリフルオロメチル）ベンジル）メタクリルアミド（２９）の実験手順］

【化77】

ＣＨ２Ｃｌ２（２５ｍＬ）中の（４－（４－（（（テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－イル）オキシ）メチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）－２－（トリフルオロメチル）フェニル）メタンアミン（２８、１．０ｇ、２．８１ｍｍｏｌ、１．０当量）及びトリエチルアミン（０．５９ｍＬ、４．２１ｍｍｏｌ、１．５当量）の溶液を短時間排気し、窒素でフラッシュした。塩化メタクリロイル（０．４１ｍＬ、４．２１ｍｍｏｌ、１．５当量）を滴下して加えた。反応混合物を室温で６時間撹拌した。１０グラムのセライトを加え、溶媒を減圧下で除去した。残留物を、溶離液としてヘキサン／ＥｔＯＡｃを使用するシリカゲルクロマトグラフィー（４０ｇ）により、１００％ヘキサンから開始し、ＥｔＯＡｃの濃度を徐々に１００％に増加させて、Ｎ－（４－（４－（（（テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－イル）オキシ）メチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）－２（トリフルオロメチル）ベンジル）メタクリルアミド（２９、０．６５ｇ、５５％収率）を無色の固体として得た。ＬＣＭＳ ｍ／ｚ：［Ｍ＋Ｈ］＋ Ｃ２０Ｈ２３Ｎ４Ｏ３Ｆ３の計算値４２５．２；測定値４２５．１。

【0301】

［３－（４－（（（テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－イル）オキシ）メチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）プロパン－１－アミン（３０）の実験手順］

【化78】

メタノール（５０ｍＬ）及び水（６ｍＬ）中の３－アジドプロパン－１－アミン塩酸塩（１．５ｇ、１４．９８ｍｍｏｌ、１．０当量）、トリス［（１－ベンジル－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－４－イル）メチル］－アミン（１．９９ｇ、３．７５ｍｍｏｌ、０．２５当量）、ヨウ化銅（０．２９ｇ、１．５０ｍｍｏｌ、０．１当量）、及びトリエチルアミン（０．５２ｍＬ、３．７５ｍｍｏｌ、０．２５当量）の混合物を、窒素で５分間パージし、０℃まで冷却した。２－（プロプ－２－イン－１－イルオキシ）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン（２．１０ｇ、１４．９８ｍｍｏｌ、１．０当量）を加え、反応混合物を５５℃に温め、窒素雰囲気下で一晩撹拌した。反応混合物を室温に冷却し、セライトのプラグでろ過し、メタノール（３×５０ｍＬ）ですすいだ。ろ液にセライト（２０ｇ）を加え、減圧下で溶媒を除去した。残留物を、移動相としてジクロロメタン／（１２％（ｖ／ｖ）水酸化アンモニウム水溶液を含有するメタノール）を使用してシリカゲル（１２０ｇ）で精製した。（１２％（ｖ／ｖ）水酸化アンモニウム水溶液を含むメタノール）の濃度を０％から２０％まで徐々に増加させて、３－（４－（（（テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－イル）オキシ）メチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）プロパン－１－アミン（３０、２．３６ｇ、６６％）を得た。ＬＣＭＳ ｍ／ｚ：［Ｍ＋Ｈ］＋ Ｃ１１Ｈ２０Ｎ４Ｏ２の計算値２４１．２；測定値２４１．２。

【0302】

［Ｎ－（３－（４－（（（テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－イル）オキシ）メチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）プロピル）メタクリルアミド（３１）の実験手順］

【化79】

ＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）中の３－（４－（（（テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－イル）オキシ）メチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）プロパン－１－アミン（３０、１．０ｇ、４．１６ｍｍｏｌ、１．０当量）及びトリエチルアミン（０．５８ｍＬ、４．１６ｍｍｏｌ、１．０当量）の溶液を短時間排気し、窒素でフラッシュした。塩化メタクリロイル（０．４０ｍＬ、４．１６ｍｍｏｌ、１．０当量）を滴下して加えた。反応混合物を室温で一晩撹拌した。１０グラムのセライトを加え、溶媒を減圧下で除去した。残留物を、移動相としてジクロロメタン／（１２％（ｖ／ｖ）水酸化アンモニウム水溶液を含有するメタノール）を使用して、シリカゲルクロマトグラフィー（４０ｇ）によって精製した。（１２％（ｖ／ｖ）水酸化アンモニウム水溶液を含むメタノール）の濃度を０％から２０％まで徐々に増加させて、Ｎ－（３－（４－（（（テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－イル）オキシ）メチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）プロピル）メタクリルアミド（３１、０．９６ｇ、７５％収率）を無色の油として得た。ＬＣＭＳ ｍ／ｚ：［Ｍ＋Ｈ］＋ Ｃ１５Ｈ２４Ｎ４Ｏ３の計算値３０９．２；測定値３０９．４。

【0303】

［（４－（４－（（オキセタン－３－イルオキシ）メチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）フェニル）メタンアミン（３２）の実験手順］

【化80】

メタノール（２４ｍＬ）及び水（６ｍＬ）中の（４－ヨードフェニル）メタンアミン塩酸塩（２．６４ｇ、９．８０ｍｍｏｌ、１．０当量）、（１Ｓ，２Ｓ）－Ｎ１，Ｎ２－ジメチルシクロヘキサン－１，２－ジアミン（０．３１ｍＬ、１．９６ｍｍｏｌ、０．２当量）、アスコルビン酸ナトリウム（１９８ｍｇ、０．９８ｍｍｏｌ、０．１当量）、ヨウ化銅（２７９ｍｇ、１．４７ｍｍｏｌ、０．１５当量）、アジ化ナトリウム（１．２７ｇ、１９．５９ｍｍｏｌ、２．０当量）、Ｅｔ３Ｎ（１．６４ｍＬ、１１．７５ｍｍｏｌ、１．２当量）及び３－（プロプ－２－イン－１－イルオキシ）オキセタン（９、１．１０ｇ、９．８０ｍｍｏｌ、１．０当量）の混合物を、窒素で５分間パージし、５５℃まで一晩加熱した。反応混合物を室温に冷却し、セライトのプラグを通してろ過し、メタノール（３×５０ｍＬ）ですすいだ。ろ液にセライトを加え、減圧下で溶媒を除去した。残留物を、移動相としてジクロロメタン／（１２％（ｖ／ｖ）水酸化アンモニウム水溶液を含有するメタノール）を使用してシリカゲル（１２０ｇ）で精製した。（１２％（ｖ／ｖ）水酸化アンモニウム水溶液を含むメタノール）の濃度を０％から２５％まで徐々に増加させて、（４－（４－（（オキセタン－３－イルオキシ）メチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）フェニル）メタンアミン（３２、１．４３ｇ、５６％）を油として得た。ＬＣＭＳ ｍ／ｚ：［Ｍ＋Ｈ］＋ Ｃ１３Ｈ１６Ｎ４Ｏ２の計算値２６１．１３４６；測定値２６１．１３４２。

【0304】

［Ｎ－（４－（４－（（オキセタン－３－イルオキシ）メチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）ベンジル）メタクリルアミド（３３）の実験手順］

【化81】

ＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）中の（４－（４－（（オキセタン－３－イルオキシ）メチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）フェニル）メタンアミン（３２、０．５８ｇ、２．２３ｍｍｏｌ、１．０当量）及びトリエチルアミン（０．４７ｍＬ、３．３４ｍｍｏｌ、１．５当量）の溶液を短時間排気し、窒素でフラッシュした。塩化メタクリロイル（０．３２ｍＬ、３．３４ｍｍｏｌ、１．５当量）を滴下して加えた。反応混合物を室温で６時間撹拌した。１０グラムのセライトを加え、溶媒を減圧下で除去した。残留物を、溶離液としてヘキサン／ＥｔＯＡｃを使用するシリカゲルクロマトグラフィー（２４ｇ）により、１００％ヘキサンから開始し、ＥｔＯＡｃの濃度を徐々に１００％に増加させて、Ｎ－（４－（４－（（オキサタン－３－イルオキシ）メチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）ベンジル）メタクリルアミド（３３、０．４８ｇ、６６％収率）を無色の固体として得た。ＬＣＭＳ ｍ／ｚ：［Ｍ＋Ｈ］＋ Ｃ１７Ｈ２０Ｎ４Ｏ３の計算値３２９．１６０８；測定値３２９．１６１１。

【0305】

［１－（２－メタクリルアミドエチル）－１Ｈ－イミダゾール－４－カルボン酸エチル（３５）の実験手順］

【化82】

ＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）中の１－（２－アミノエチル）－１Ｈ－イミダゾール－４－カルボン酸エチル（３４、２．０ｇ、１０．９１ｍｍｏｌ、１．０当量）及びトリエチルアミン（３．８０ｍＬ、２７．２９ｍｍｏｌ、２．５当量）の溶液を短時間排気し、窒素でフラッシュした。塩化メタクリロイル（１．６０ｍＬ、１６．３７ｍｍｏｌ、１．５当量）を滴下して加えた。反応混合物を室温で３時間撹拌した。１５グラムのセライトを加え、溶媒を減圧下で除去した。残留物を、移動相としてジクロロメタン／（１２％（ｖ／ｖ）水酸化アンモニウム水溶液を含有するメタノール）を使用して、シリカゲルクロマトグラフィー（４０ｇ）によって精製した。（１２％（ｖ／ｖ）水酸化アンモニウム水溶液を含むメタノール）の濃度を０％から２５％まで徐々に増加させて、エチル１－（２－メタクリルアミドエチル）－１Ｈ－イミダゾール－４－カルボキシレート（３５、１．２８ｇ、４７％収率）を無色の固体として得た。ＬＣＭＳ ｍ／ｚ：［Ｍ＋Ｈ］＋ Ｃ１２Ｈ１７Ｎ３Ｏ３の計算値２５２．１；測定値２５２．１。

【0306】

［Ｎ－（４－（１，１－ジオキシドチオモルホリノ）ベンジル）メタクリルアミド（３７）の実験手順］

【化83】

ＣＨ２Ｃｌ２（８０ｍＬ）中の４－（４－（アミノメチル）フェニル）チオモルホリン１，１－ジオキシド塩酸塩（３６、１．１５ｇ、４．１５ｍｍｏｌ、１．０当量）及びトリエチルアミン（１．３９ｍＬ、９．９７ｍｍｏｌ、２．４当量）の溶液に、塩化メタクリロイルの溶液（ＣＨ２Ｃｌ２、５ｍＬ中、０．４３ｍＬ、４．３６ｍｍｏｌ、１．０５当量）を滴下して加えた。反応混合物を室温で２２時間撹拌した。８グラムのセライトを加え、溶媒を減圧下で除去した。残留物を、移動相としてジクロロメタン／（１２％（ｖ／ｖ）水酸化アンモニウム水溶液を含有するメタノール）を使用して、シリカゲルクロマトグラフィー（８０ｇ）によって精製した。（１２％（ｖ／ｖ）水酸化アンモニウム水溶液を含むメタノール）の濃度を０％から３．７５％まで徐々に増加させて、Ｎ－（４－（１，１－ジオキシドチオモルホリノ）ベンジル）メタクリルアミド（３７、０．３２ｇ、２５％収率）を固体として得た。

【0307】

［Ｎ－メチル－Ｎ－（２－（メチルスルホニル）エチル）プロプ－２－イン－１－アミン（３８）の実験手順］

【化84】

１－メチルスルホニルエチレン（４．９９ｇ、４７．０３ｍｍｏｌ、４．１３ｍＬ）及びＡｍｂｅｒｌｙｓｔ－１５（（３０％ｗ／ｗ））の混合物に、Ｎ－メチルプロプ－２－イン－１－アミン（２．６ｇ、３７．６２ｍｍｏｌ）を滴下して加えた。混合物を室温で１２時間撹拌した。触媒をろ過により除去し、ろ液を減圧下で濃縮して、Ｎ－メチル－Ｎ－（２－（メチルスルホニル）エチル）プロプ－２－イン－１－アミン（３８、６．４３ｇ、９８％）を油として得た。ＬＣＭＳ ｍ／ｚ：［Ｍ＋Ｈ］＋ Ｃ７Ｈ１３ＮＳＯ２の計算値１７６．１１；測定値１７６．１。

【0308】

［Ｎ－（（１－（２－（２－（２－（２－アミノエトキシ）エトキシ）エトキシ）エチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－４－イル）メチル）－Ｎ－メチル－２－（メチルスルホニル）エタン－１－アミン（４０）の実験手順］

【化85】

メタノール（５０ｍＬ）及び水（６ｍＬ）中のＮ－メチル－Ｎ－（２－（メチルスルホニル）エチル）プロプ－２－イン－１－アミン（３８、５．０２ｇ、２８．６４ｍｍｏｌ、１．２５当量）、トリス［（１－ベンジル－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－４－イル）メチル］－アミン（３．０４ｇ、５．７３ｍｍｏｌ、０．２５当量）、ヨウ化銅（４３６ｍｇ、２．２９ｍｍｏｌ、０．１当量）、及びトリエチルアミン（０．８ｍＬ、５．７ｍｍｏｌ、０．２５当量）の混合物を排気し、窒素でフラッシュし（３回）、氷浴で冷却した。２－（２－（２－（２－アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）エタン－１－アミン（３９、５．０２ｇ、２２．９１ｍｍｏｌ、１．０当量）を滴下して加え、冷却浴を取り除き、混合物を５分間撹拌した。反応物を５５℃に温め、窒素雰囲気下で一晩撹拌した。反応混合物を室温に冷却し、セライト（２０ｇ）を加え、減圧下で濃縮した。粗生成物を、移動相としてジクロロメタン／（１２％（ｖ／ｖ）水酸化アンモニウム水溶液を含有するメタノール）を使用してシリカゲル（２２０ｇ）で精製した。（１２％（ｖ／ｖ）水酸化アンモニウム水溶液を含むメタノール）の濃度を０％から２５％まで徐々に増加させて、Ｎ－（（１－（２－（２－（２－（２－アミノエトキシ）エトキシ）エトキシ）エチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－４－イル）メチル）－Ｎ－メチル－２－（メチルスルホニル）エタン－１－アミン（４０、４．９８ｇ、５５％）を油として得た。ＬＣＭＳ ｍ／ｚ：［Ｍ＋Ｈ］＋ Ｃ１５Ｈ３１Ｎ５Ｏ５Ｓの計算値３９４．２；測定値３９４．２。

【0309】

［Ｎ－（２－（２－（２－（２－（４－（（メチル（２－（メチルスルホニル）エチル）アミノ）メチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）エトキシ）エトキシ）エトキシ）エチル）メタクリルアミド（４１）の実験手順］

【化86】

ＣＨ２Ｃｌ２（１５ｍＬ）中のＮ－（（１－（２－（２－（２－（２－アミノエトキシ）エトキシ）エトキシ）エチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－４－イル）メチル）－Ｎ－メチル－２－（メチルスルホニル）エタン－１－アミン（４０、１．０ｇ、２．５４ｍｍｏｌ、１．０当量）及びトリエチルアミン（０．４３ｍＬ、３．０５ｍｍｏｌ、１．２当量）の溶液に、塩化メタクリロイル（０．３０ｍＬ、３．０５ｍｍｏｌ、１．５当量）の溶液を滴下して加えた。反応混合物を室温で５時間撹拌した。セライトを加え、溶媒を減圧下で除去した。残留物を、移動相としてジクロロメタン／（１２％（ｖ／ｖ）水酸化アンモニウム水溶液を含有するメタノール）を使用して、シリカゲルクロマトグラフィー（４０ｇ）によって精製した。（１２％（ｖ／ｖ）水酸化アンモニウム水溶液を含むメタノール）の濃度を０％から１２．５％に徐々に増加させて、Ｎ－（２－（２－（２－（２－（４－（（メチル（２－（メチルスルホニル）エチル）アミノ）メチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）エトキシ）エトキシ）エトキシ）エチル）メタクリルアミド（４１、０．８６ｇ、７３％収率）を油として得た。ＬＣＭＳ ｍ／ｚ：［Ｍ＋Ｈ］＋ Ｃ１９Ｈ３５Ｎ５Ｏ６Ｓの計算値４６２．２；測定値４６２．２。

【0310】

［７－（プロプ－２－イン－１－イル）－２－オキサ－７－アザスピロ［３．５］ノナン（４２）の実験手順］

【化87】

３－ブロモプロプ－１－イン（４．４ｍＬ、３９．３２ｍｍｏｌ １．０ 当量）を、メタノール（２００ｍＬ）中の２－オキサ－７－アザスピロ［３．５］ノナン（８．５４ｇ、３９．３２ｍｍｏｌ、１．０当量）、炭酸カリウム（１７．９ｇ、１２９．７ｍｍｏｌ、３．３当量）の混合物に加え、室温で一晩撹拌した。混合物をろ過し、セライトを加え、溶媒を減圧下で除去した。残留物を、移動相としてジクロロメタン／メタノールを使用して、シリカゲルクロマトグラフィー（２２０ｇ）によって精製した。メタノールの濃度を０％から５％に徐々に増加させて、７－（プロプ－２－イン－１－イル）－２－オキサ－７－アザスピロ［３．５］ノナン（４２、４．４４ｇ、６８％）を油として得た。

【0311】

［２－（２－（２－（２－（４－（（２－オキサ－７－アザスピロ［３．５］ノナン－７－イル）メチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）エトキシ）エトキシ）エトキシ）エタン－１－アミン（４３）の実験手順］

【化88】

メタノール（５０ｍＬ）中の７－（プロプ－２－イン－１－イル）－２－オキサ－７－アザスピロ［３．５］ノナン（４２、２．５ｇ、１５．１３ｍｍｏｌ、１．０当量）、トリス［（１－ベンジル－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－４－イル）メチル］－アミン（１．７７ｇ、３．３３ｍｍｏｌ、０．２２当量）、ヨウ化銅（２８８ｍｇ、１．５１ｍｍｏｌ、０．１当量）、及びトリエチルアミン（０．５３ｍＬ、３．８ｍｍｏｌ、０．２５当量）の混合物を氷浴で冷却した。２－（２－（２－（２－アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）エタン－１－アミン（３９、３．８６ｇ、１７．７０ｍｍｏｌ、１．１７当量）を滴下して加え、冷却浴を取り除き、混合物を５分間撹拌した。反応物を５５℃に温め、窒素雰囲気下で一晩撹拌した。反応混合物を室温に冷却し、セライト（１０ｇ）を加え、減圧下で濃縮した。粗生成物を、移動相としてジクロロメタン／（１２％（ｖ／ｖ）水酸化アンモニウム水溶液を含有するメタノール）を使用してシリカゲル（２２０ｇ）で精製した。（１２％（ｖ／ｖ）水酸化アンモニウム水溶液を含むメタノール）の濃度を０％から１０％に徐々に増加させて、２－（２－（２－（２－（４－（（２－オキサ－７－アザスピロ［３．５］ノナン－７－イル）メチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）エトキシ）エトキシ）エトキシ）エタン－１－アミン（４３、４．７６ｇ、８２％）を油として得た。ＬＣＭＳ ｍ／ｚ：［Ｍ＋Ｈ］＋ Ｃ１８Ｈ３３Ｎ５Ｏ４の計算値３８４．３；測定値３８４．２。

【0312】

［Ｎ－（２－（２－（２－（２－（４－（（２－オキサ－７－アザスピロ［３．５］ノナン－７－イル）メチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）エトキシ）エトキシ）エトキシ）エチル）メタクリルアミド（４４）の実験手順］

【化89】

ＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）中の２－（２－（２－（２－（４－（（２－オキサ－７－アザスピロ［３．５］ノナン－７－イル）メチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）エトキシ）エトキシ）エトキシ）エタン－１－アミン（４３、２．６５ｇ、６．９１ｍｍｏｌ、１．０当量）及びトリエチルアミン（１．１６ｍＬ、８．２９ｍｍｏｌ、１．２当量）の溶液を、窒素雰囲気下、氷浴で冷却した。塩化メタクリロイル（０．７４ｍＬ、７．６ｍｍｏｌ、１．１当量）を滴下して加えた。冷却浴を取り外し、反応混合物を室温で４時間撹拌した。１０グラムのセライトを加え、溶媒を減圧下で除去した。残留物を、移動相としてジクロロメタン／メタノールを使用して、シリカゲルクロマトグラフィー（１２０ｇ）によって精製した。メタノールの濃度を０％から１０％まで徐々に増加させて、Ｎ－（２－（２－（２－（２－（４－（（２－オキサ－７－アザスピロ［３．５］ノナン－７－イル）メチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）エトキシ）エトキシ）エトキシ）エチル）メタクリルアミド（４４、１．５０ｇ、４８％収率）を無色の油として得た。ＬＣＭＳ ｍ／ｚ：［Ｍ＋Ｈ］＋ Ｃ２２Ｈ３７Ｎ５Ｏ５の計算値４５２．２９；測定値４５２．２５。

【0313】

［４－（（１－（２－（２－アミノエトキシ）エチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－４－イル）メチル）チオモルホリン１，１－ジオキシド（４５）の実験手順］

【化90】

メタノール（２０ｍＬ）中の４－（プロプ－２－イン－１－イル）チオモルホリン１，１－ジオキシド（１．１４ｇ、６．５８ｍｍｏｌ、１．０当量）、トリス［（１－ベンジル－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－ ４－イル）メチル］－アミン（７６８ｍｇ、１．４５ｍｍｏｌ、０．２２当量）、ヨウ化銅（１２５ｍｇ、０．６６ｍｍｏｌ、０．１当量）、及びトリエチルアミン（０．２３ｍＬ、１．６５ｍｍｏｌ、０．２５当量）の混合物を氷浴で冷却した。２－（２－アジドエトキシ）エタン－１－アミン（１．００ｇ、７．７０ｍｍｏｌ、１．１７当量）を滴下して加え、冷却浴を取り除き、混合物を５分間撹拌した。反応物を５５℃に温め、窒素雰囲気下で一晩撹拌した。反応混合物を室温に冷却し、セライト（１０ｇ）を加え、減圧下で濃縮した。粗生成物を、移動相としてジクロロメタン／（１２％（ｖ／ｖ）水酸化アンモニウム水溶液を含有するメタノール）を使用してシリカゲル（４０ｇ）で精製した。（１２％（ｖ／ｖ）水酸化アンモニウム水溶液を含むメタノール）の濃度を０％から９．５％に徐々に増加させて、４－（（１－（２－（２－アミノエトキシ）エチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－４－イル）メチル）チオモルホリン１，１－ジオキシド（４５、１．８６ｇ、９３％）を白色の固体として得た。ＬＣＭＳ ｍ／ｚ：［Ｍ＋Ｈ］＋ Ｃ１１Ｈ２１Ｎ５Ｏ４Ｓの計算値３０４．１４３８；測定値３０４．１４４５。

【0314】

［Ｎ－（２－（２－（４－（（１，１－ジオキシドチオモルホリノ）メチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）エトキシ）エチル）メタクリルアミド（４６）の実験手順］

【化91】

ＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）中の４－（（１－（２－（２－アミノエトキシ）エチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－４－イル）メチル）チオモルホリン１，１－ジオキシド（４５、１．３２ｇ、４．３５ｍｍｏｌ、１．０当量）及びトリエチルアミン（０．７３ｍＬ、５．２２ｍｍｏｌ、１．２当量）の溶液を、窒素雰囲気下、氷浴で冷却した。塩化メタクリロイル（０．４７ｍＬ、４．８ｍｍｏｌ、１．１当量）を滴下して加えた。冷却浴を取り外し、反応混合物を室温で４時間撹拌した。１０グラムのセライトを加え、溶媒を減圧下で除去した。残留物を、移動相としてジクロロメタン／（１２％（ｖ／ｖ）水酸化アンモニウム水溶液を含有するメタノール）を使用して、シリカゲルクロマトグラフィー（１２０ｇ）によって精製した。（１２％（ｖ／ｖ）水酸化アンモニウム水溶液を含むメタノール）の濃度を０％から１．２５％に徐々に増加させて、Ｎ－（２－（２－（４－（（１，１－ジオキシドチオモルホリノ）メチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）エトキシ）エチル）－メタクリルアミド（４６、０．９０ｇ、５６％収率）を無色の油として得た。ＬＣＭＳ ｍ／ｚ：［Ｍ＋Ｈ］＋ Ｃ１５Ｈ２５Ｎ５Ｏ４Ｓの計算値３７２．１７；測定値３７２．１５。

【0315】

［４－（（１－（２－（２－（２－アミノエトキシ）エトキシ）エチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－４－イル）メチル）チオモルホリン１，１－ジオキシド（４７）の実験手順］

【化92】

メタノール（８０ｍＬ）中の４－（プロプ－２－イン－１－イル）チオモルホリン１，１－ジオキシド（４．６ｇ、２６．５５ｍｍｏｌ、１．０当量）、トリス［（１－ベンジル－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－ ４－イル）メチル］－アミン（３．１ｇ、５．８４ｍｍｏｌ、０．２２当量）、ヨウ化銅（５０６ｍｇ、２．６６ｍｍｏｌ、０．１当量）、及びトリエチルアミン（０．９３ｍＬ、６．６４ｍｍｏｌ、０．２５当量）の混合物を氷浴で冷却した。２－（２－（２－アジドエトキシ）エトキシ）エタン－１－アミン（５．００ｇ、２８．６８ｍｍｏｌ、１．０８当量）を滴下して加え、冷却浴を取り除き、混合物を５分間撹拌した。反応物を５５℃に温め、窒素雰囲気下で一晩撹拌した。反応混合物を室温に冷却し、セライトを加え、減圧下で濃縮した。粗生成物を、移動相としてジクロロメタン／（１２％（ｖ／ｖ）水酸化アンモニウム水溶液を含有するメタノール）を使用してシリカゲル（２２０ｇ）で精製した。（１２％（ｖ／ｖ）水酸化アンモニウム水溶液を含むメタノール）の濃度を０％から１０％に徐々に増加させて、４－（（１－（２－（２－（２－アミノエトキシ）エトキシ）エチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－４－イル）メチル）チオモルホリン１，１－ジオキシド（４７、５．２６ｇ、５７％）を黄色がかった油として得た。ＬＣＭＳ ｍ／ｚ：［Ｍ＋Ｈ］＋ Ｃ１３Ｈ２５Ｎ５Ｏ４Ｓの計算値３４８．１７００；測定値３４８．１７００。

【0316】

［Ｎ－（２－（２－（２－（４－（（１，１－ジオキシドチオモルホリノ）メチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）エトキシ）エトキシ）エチル）メタクリルアミド（４８）の実験手順］

【化93】

ＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍＬ）中の４－（（１－（２－（２－（２－アミノエトキシ）エトキシ）エチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－４－イル）メチル）チオモルホリン１，１－ジオキシド（４７、１．４９ｇ、４．２９ｍｍｏｌ、１．０当量）及びトリエチルアミン（０．７２ｍＬ、５．１５ｍｍｏｌ、１．２当量）の溶液を、窒素雰囲気下、氷浴で冷却した。塩化メタクリロイル（０．４６ｍＬ、４．７ｍｍｏｌ、１．１当量）を滴下して加えた。冷却浴を取り外し、反応混合物を室温で４時間撹拌した。１０グラムのセライトを加え、溶媒を減圧下で除去した。残留物を、移動相としてジクロロメタン／メタノールを使用して、シリカゲルクロマトグラフィー（８０ｇ）によって精製した。メタノールの濃度を０％から５％に徐々に増加させて、Ｎ－（２－（２－（２－（４－（（１，１－ジオキシドチオモルホリノ）メチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）エトキシ）エトキシ）エチル）－メタクリルアミド（４８、０．６７ｇ、３８％収率）を無色の油として得た。ＬＣＭＳ ｍ／ｚ：［Ｍ＋Ｈ］＋ Ｃ１７Ｈ２９Ｎ５Ｏ５Ｓの計算値４１６．２０；測定値４１６．２０。

【0317】

［４－（（１－（１４－アミノ－３，６，９，１２－テトラオキサテトラデシル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－４－イル）メチル）チオモルホリン１，１－ジオキシド（４９）の実験手順］

【化94】

メタノール（９０ｍＬ）中の４－（プロプ－２－イン－１－イル）チオモルホリン１，１－ジオキシド（５．０ｇ、２８．８６ｍｍｏｌ、１．０当量）、トリス［（１－ベンジル－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－４－イル）メチル］－アミン（３．３７ｇ、６．３５ｍｍｏｌ、０．２２当量）、ヨウ化銅（５５０ｍｇ、２．８９ｍｍｏｌ、０．１当量）、及びトリエチルアミン（１．０１ｍＬ、７．２２ｍｍｏｌ、０．２５当量）の混合物を氷浴で冷却した。１４－アジド－３，６，９，１２－テトラオキサテトラデカン－１－アミン（８．８６ｇ、３３．７７ｍｍｏｌ、１．１７当量）を滴下して加え、冷却浴を取り除き、混合物を５分間撹拌した。反応物を５５℃に温め、窒素雰囲気下で一晩撹拌した。反応混合物を室温に冷却し、セライト（１５ｇ）を加え、減圧下で濃縮した。粗生成物を、移動相としてジクロロメタン／（１２％（ｖ／ｖ）水酸化アンモニウム水溶液を含有するメタノール）を使用してシリカゲル（２２０ｇ）で精製した。（１２％（ｖ／ｖ）水酸化アンモニウム水溶液を含むメタノール）の濃度を０％から１０％に徐々に増加させて、４－（（１－（１４－アミノ－３，６，９，１２－テトラオキサテトラデシル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－４－イル）メチル）チオモルホリン１，１－ジオキシド（４９、７．５６ｇ、６０％）を油として得た。ＬＣＭＳ ｍ／ｚ：［Ｍ＋Ｈ］＋ Ｃ１７Ｈ３３Ｎ５Ｏ６Ｓの計算値４３６．２２２４；測定値４３６．２２２８。

【0318】

［Ｎ－（１４－（４－（（１，１－ジオキシドチオモルホリノ）メチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）－３，６，９，１２－テトラオキサテトラデシル）メタクリルアミド（５０）の実験手順］

【化95】

ＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍＬ）中の４－（（１－（１４－アミノ－３，６，９，１２－テトラオキサテトラデシル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－４－イル）メチル）チオモルホリン１，１－ジオキシド（４９、１．９５ｇ、４．７９ｍｍｏｌ、１．０当量）及びトリエチルアミン（０．８０ｍＬ、５．７４ｍｍｏｌ、１．２当量）の溶液を、窒素雰囲気下、氷浴で冷却した。塩化メタクリロイル（０．５１ｍＬ、５．２６ｍｍｏｌ、１．１当量）を滴下して加えた。冷却浴を取り外し、反応混合物を室温で４時間撹拌した。１０グラムのセライトを加え、溶媒を減圧下で除去した。残留物を、移動相としてジクロロメタン／メタノールを使用して、シリカゲルクロマトグラフィー（８０ｇ）によって精製した。メタノールの濃度を０％から５％に徐々に増加させて、Ｎ－（１４－（４－（（１，１－ジオキシドチオモルホリノ）メチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）－３，６，９，１２－テトラオキサテトラデシル）メタクリルアミド（５０、０．７６ｇ、３２％収率）を無色の油として得た。ＬＣＭＳ ｍ／ｚ：［Ｍ＋Ｈ］＋ Ｃ２１Ｈ３７Ｎ５Ｏ７Ｓの計算値５０４．２５；測定値５０４．２０。

【0319】

［実施例４Ａ：例示的な修飾ポリマーの調製］
１Ａ．化学修飾ポリマー。ポリマー材料を、本明細書で説明されているデバイス（例えばヒドロゲルカプセル）の形成前に、式（Ｉ）の化合物（又はその薬学的に許容可能な塩）で化学的に修飾し得る。ポリマー材料を修飾するための例示的な化合物の合成プロトコルは、上記の実施例３に概説されている。これらの化合物又は他の化合物は、任意のポリマー材料を化学的に修飾するために使用され得る。

【0320】

例えば、アルギン酸塩の場合、アルギン酸塩カルボン酸が、抗線維化化合物（ａｆｉｂｒｏｔｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）、例えば、式（Ｉ）の化合物で修飾されたアルギン酸塩を得るために１つ又は複数のアミン官能化化合物に対するカップリングのために活性化される。アルギン酸塩ポリマーを、水（３０ｍＬ／グラムポリマー）に溶解させ、２－クロロ－４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン（０．５当量）Ｎ－メチルモルホリン（１当量）で処理する。この混合物に、アセトニトリル（０．３Ｍ）中の対象とする化合物（例えば、表３に示される化合物１０１）の溶液を添加する。

【0321】

添加される化合物及びカップリング試薬の量は、アルギン酸塩に結合される化合物の所望の濃度、例えば、コンジュゲーション密度に応じて決まる。化合物１０１の中程度のコンジュゲーション密度は、典型的には２％～５％Ｎの範囲であり、一方、化合物１０１の高いコンジュゲーション密度は、典型的には５．１％～８％Ｎの範囲である。ＣＭ－ＬＭＷ－Ａｌｇ－１０１－Ｍｅｄｉｕｍポリマー溶液を調製するために、溶解された非修飾低分子量アルギン酸塩（およその分子量＜７５ｋＤａ、Ｇ：Ｍ比≧１．５）を、２－クロロ－４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン（５．１ｍｍｏｌ／ｇアルギン酸塩）及びＮ－メチルモルホリン（１０．２ｍｍｏｌ／ｇアルギン酸塩）及び化合物１０１（５．４ｍｍｏｌ／ｇアルギン酸塩）で処理する。ＣＭ－ＬＭＷ－Ａｌｇ－１０１－Ｈｉｇｈポリマー溶液を調製するために、溶解された非修飾低分子量アルギン酸塩（およその分子量＜７５ｋＤａ、Ｇ：Ｍ比≧１．５）を、２－クロロ－４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン（５．１ｍｍｏｌ／ｇアルギン酸塩）及びＮ－メチルモルホリン（１０．２ｍｍｏｌ／ｇアルギン酸塩）及び化合物１０１（１０．５ｍｍｏｌ／ｇアルギン酸塩）で処理する。

【0322】

反応を５５℃に１６時間温め、次いで室温に冷却し、ロータリー蒸発で穏やかに濃縮し、次いで、残渣を水に溶解させる。混合物をシアノ修飾シリカゲル（Ｓｉｌｉｃｙｃｌｅ）ベッドを通してろ過し、ろ過ケーキを水で洗浄する。次いで、得られる溶液を、十分に透析し（１０，０００ＭＷＣＯメンブラン）、アルギン酸塩溶液を、凍結乾燥によって濃縮して、所望の化学修飾アルギン酸塩を固体として得るか、又は２５ｃＰ～３５ｃＰの粘度を有する化学修飾アルギン酸塩溶液を生成するのに好適な任意の技術を用いて濃縮する。

【0323】

化学修飾アルギン酸塩の結合密度を、窒素パーセントの燃焼分析によって測定する。化学修飾アルギン酸塩の溶液を、水に対して２４時間透析し（１０，０００ＭＷＣＯメンブラン）、水を２回交換した後、一定重量になるまで凍結乾燥することによって、サンプルを調製する。

【0324】

上記の組み換えＡＲＰＥ－１９細胞をカプセル化する例示的なヒドロゲルカプセルの生成に使用するために、化学修飾アルギン酸塩ポリマーを、窒素パーセントに関する燃焼分析により決定した場合に中程度（２％～５％のＮ）密度又は高（５．１％～８％のＮ）密度で低分子量アルギン酸塩（約ＭＷ＜７５ｋＤａ、Ｇ：Ｍ比≧１．５）にコンジュゲートした化合物１０１（表３で示されている）で調製し、本明細書ではＣＭ－ＬＭＷ－Ａｌｇ－１０１－Ｍｅｄｉｕｍ及びＣＭ－ＬＭＷ－Ａｌｇ－１０１－Ｈｉｇｈと称する。

【0325】

１Ｂ．ＣＢＰ－アルギン酸塩。当該技術分野で既知の方法を使用して、ポリマー材料を、本明細書で説明されているデバイス（例えば、本明細書で説明されているヒドロゲルカプセル）の形成前に、細胞結合ペプチドで共有結合的に修飾し得る（例えば、Ｊｅｏｎ Ｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ Ｐａｒｔ Ａ．１６：２９１５－２９２５（２０１０）及びＲｏｗｌｅｙ，Ｊ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２０：４５－５３（１９９９）を参照されたい）。

【0326】

例えば、アルギン酸塩の場合には、ｐＨ６．５にて、０．５Ｍ ＮａＣｌを含む５０ｍＭの２－（Ｎ－モルホリノ）－エタンスルホン酸水和物緩衝溶液で、アルギン酸塩溶液（１％、ｗ／ｖ）を調製し、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド及び１－エチル－３－［３－（ジメチルアミノ）プロピル］カルボジイミド（ＥＤＣ）と順次混合する。Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド対ＥＤＣのモル比は、０．５：１．０である。このアルギン酸塩溶液に、目的のペプチドを添加する。添加するペプチド及びカップリング試薬の量は、アルギン酸塩に結合するペプチドの所望の濃度（例えば、ペプチドコンジュゲーション密度）に依存する。ペプチド及びカップリング試薬の量を増加させることにより、より高いコンジュゲーション密度を得ることができる。２４時間にわたる反応後、この反応を、３日にわたる超高純度脱イオン水（ｄｉＨ２Ｏ）（ＭＷＣＯ ３５００）に対する透析により精製し、３０分にわたり活性炭で処理し、ろ過し（０．２２ｍｍフィルタ）、所望の粘度まで濃縮する。

【0327】

ペプチド修飾アルギン酸塩のコンジュゲーション密度を、窒素パーセントに関する燃焼分析で測定する。２４時間にわたり水に対して化学的修飾アルギン酸塩の溶液を透析し（１０，０００ ＭＷＣＯ膜）、水を２回交換し、続いて一定重量まで凍結乾燥させることにより、サンプルを調製する。

【0328】

別の実施形態において、ペプチド修飾アルギン酸塩のコンジュゲーション密度を、実施例７及び任意選択的に実施例８で説明されている定量的ペプチドコンジュゲーションアッセイを使用して測定する。

【0329】

［実施例４Ｂ：ヒドロゲルカプセルを作成するための例示的なアルギン酸塩溶液の調製］
化学修飾及び非修飾アルギン酸塩の７０：３０混合物。低分子量アルギン酸塩（ＰＲＯＮＯＶＡ（商標）ＶＬＶＧアルギン酸塩、ＮｏｖａＭａｔｒｉｘ、Ｓａｎｄｖｉｋａ、Ｎｏｒｗａｙ、ｃａｔ．＃４２００５０６、おおよその分子量＜７５ｋＤａ；Ｇ：Ｍ比≧１．５）を、表２中の化合物１０１で化学修飾して、上記のような２５ｃｐ～３５ｃＰの粘度、及び窒素パーセントに関する燃焼分析により決定した場合に５．１％～８％Ｎのコンジュゲーション密度を有する化学修飾低分子量アルギン酸塩（ＣＭ－ＬＭＷ－Ａｌｇ－１０１）溶液を生成する。高分子量非修飾アルギン酸塩（Ｕ－ＨＭＷ－Ａｌｇ）の溶液を、０．９％の生理食塩水に重量体積比３％で非修飾アルギン酸塩（ＰＲＯＮＯＶＡ（商標）ＳＬＧ１００，ＮｏｖａＭａｔｒｉｘ，Ｓａｎｄｖｉｋａ，Ｎｏｒｗａｙ，ｃａｔ．＃４２０２１０６、１５０ｋＤａ～２５０ｋＤａのおおよその分子量）を溶解させることによって調製する。ＣＭ－ＬＭＷ－Ａｌｇ溶液を、７０％のＣＭ－ＬＭＷ－Ａｌｇ対３０％のＵ－ＨＭＷ－Ａｌｇの体積比のＵ－ＨＭＷ－Ａｌｇ溶液（本明細書において７０：３０のＣＭ－Ａｌｇ：ＵＭ－Ａｌｇ溶液と呼ばれる）と混合する。

【0330】

非修飾アルギン酸塩溶液。非修飾中間分子量アルギン酸塩（ＳＬＧ２０，ＮｏｖａＭａｔｒｉｘ，Ｓａｎｄｖｉｋａ，Ｎｏｒｗａｙ，ｃａｔ．＃４２０２００６、７５～１５０ｋＤａのおおよその分子量）を、０．９％の生理食塩水に重量体積比１．４％で溶解させて、Ｕ－ＭＭＷ－Ａｌｇ溶液を調製する。

【0331】

細胞結合部位を含むアルギン酸塩溶液。ＳＬＧ２０アルギン酸塩の溶液をＧＲＧＤＳＰ（配列番号４９）からなるペプチドで修飾し、上記の実施例４Ａに説明されているように約１００ｃＰの粘度に濃縮する。実施形態において、使用されるＧＲＧＤＳＰペプチド（配列番号４９）及びカップリング試薬の量は、上記の実施例４Ａに記載の燃焼分析によって測定されるように、約０．２～０．３の標的ペプチドコンジュゲーション密度を達成するように選択される。別の実施形態において、使用される中分子量アルギン酸塩（おおよその分子量７５～１５０ｋＤａ、Ｇ：Ｍ比１．５以上）、ＧＲＧＤＳＰペプチド（配列番号４９）及びカップリング試薬の量は、８０～１２０ｃＰの粘度を有する生理食塩水中のＧＲＧＤＳＰ－ＭＭＷ－Ａｌｇ（「ＧＲＧＤＳＰ」は、配列番号４９として開示される）のグラムあたり０．３～０．６マイクロモルのＧＲＧＤＳＰ（配列番号４９）の標的ペプチドコンジュゲーション密度を有するＧＲＧＤＳＰ－ＭＭＷ－Ａｌｇ溶液（「ＧＲＧＤＳＰ」は配列番号４９として開示される）を調製するために選択される。

【0332】

［実施例５：例示的な２区画ヒドロゲルカプセルの形成］
組み換えＡＲＰＥ－１９細胞の懸濁液は、以下に説明するプロトコルに従って、２区画ヒドロゲルカプセル内の単一細胞としてカプセル化される。

【0333】

カプセル化の直前に、組み換えＡＲＰＥ－１９細胞を、１分にわたり１，４００ｒ．ｐ．ｍで遠心分離し、カルシウムフリーＫｒｅｂｓ－Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ（ＫＨ）緩衝液（４．７ｍＭ ＫＣｌ、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１．２ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１．２ｍＭ ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ、１３５ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ≒７．４、約２９０ｍＯｓｍ）で洗浄する。洗浄後、この細胞を再度遠心分離し、上清の全てを吸引する。次に、細胞ペレットを、実施例４Ｂに記載のＧＲＧＤＳＰ修飾アルギン酸塩溶液（「ＧＲＧＤＳＰ」は、配列番号４９として開示される）に、所望の細胞密度（例えば、アルギン酸塩溶液１ｍｌあたり約５千万～１億５千万個の懸濁単一細胞の密度）で再懸濁する。

【0334】

ヒドロゲルカプセルの作製の前に、緩衝液及びアルギン酸塩溶液を、無菌プロセスを使用して０．２μｍフィルタに通すろ過により滅菌する。

【0335】

約１．５ｍｍの直径の２区画ヒドロゲルミリカプセルとして構成される粒子を調製するために、静電液滴生成装置を下記のように設定する：ＥＳシリーズ０～１００ｋＶ、２０ワット高電圧発電機（ＥＱ ｓｅｒｉｅｓ，Ｍａｔｓｕｓａｄａ，ＮＣ，ＵＳＡ）を、同心針（２２Ｇの内腔、１８Ｇの外腔、Ｒａｍｅ－Ｈａｒｔ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏ．，Ｓｕｃｃａｓｕｎｎａ，ＮＪ，ＵＳＡ）の上部及び下部に連結する。内腔を、ＢＤ Ｌｕｅｒ－Ｌｏｃｋシリンジ（ＢＤ，ＮＪ，ＵＳＡ）を備えた第１のＢＤ使い捨て５ｍｌシリンジに取り付け、このシリンジを、垂直に配向されたシリンジポンプ（Ｐｕｍｐ １１ Ｐｉｃｏ Ｐｌｕｓ，Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ，Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）に接続する。外腔を、第２の５ｍｌ Ｌｕｅｒ－ｌｏｃｋシリンジにｌｕｅｒカップリングを介して接続し、このシリンジを、水平に配向された第２のシリンジポンプ（Ｐｕｍｐ １１ Ｐｉｃｏ Ｐｌｕｓ）に接続する。ＧＲＧＤＳＰ修飾アルギン酸塩溶液（「ＧＲＧＤＳＰ」は配列番号４９として開示される）中に懸濁された組み換えＦＶＩＩ－ＡＲＰＥ－１９細胞（単一細胞として）を含む第１のアルギン酸塩溶液を、第１のシリンジに入れ、化学的に修飾されたアルギン酸塩及び未修飾のアルギン酸塩の混合物を含む無細胞アルギン酸塩溶液を第２のシリンジに入れる。２個のシリンジポンプは、第１及び第２のアルギン酸塩溶液を、同心針の両方の腔を通ってシリンジから移動させ、両方のアルギン酸塩溶液を含む単一の液滴が、針から、架橋溶液が入っているガラス皿へと押し出される。各Ｐｉｃｏ Ｐｌｕｓシリンジポンプの設定は、１２．０６ｍｍの直径であり、各ポンプの流量を、２種のアルギン酸塩溶液に関して１：１の流量比を達成するように調整する。そのため、１０ｍｌ／時で設定された総流量で、各アルギン酸塩溶液の流量は、約５ｍｌ／時であった。内部構成要素に使用するアルギン酸塩溶液が細胞を含まない溶液であること以外は同様にして、対照の（空の）カプセルを作製する。

【0336】

アルギン酸塩溶液の所望の体積の押し出しの後、アルギン酸塩液滴を、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液、２０ｍＭのＢａＣｌ２、０．２Ｍのマンニトール、及び０．０１％のポロキサマー１８８を含有する架橋溶液中で５分間にわたって架橋させる。架橋容器の底に落下するカプセルを、コニカルチューブ中にピペッティングすることによって収集する。カプセルがチューブ中で沈降して後、架橋緩衝液を除去し、カプセルを洗浄する。細胞を含まないカプセルを、ＨＥＰＥＳ緩衝液（ＮａＣｌ １５．４２８ｇ、ＫＣｌ ０．７０ｇ、ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ ０．４８８ｇ、２リットルの脱イオン水中の０ｍｌのＨＥＰＥＳ（１Ｍ）緩衝液（Ｇｉｂｃｏ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ））で４回洗浄し、使用するまで４℃で貯蔵してもよい。細胞をカプセル化するカプセルを、ＨＥＰＥＳ緩衝液で４回、０．９％の生理食塩水で２回、及び培養培地で２回洗浄し、３７℃で培養器中に貯蔵してもよい。

【0337】

２区画の構成のカプセルの品質を調べることができる。例えば、少なくとも２００個のカプセルを含有するアリコートを組成物から取り出し、ウェルプレートに移し、全体から球形カプセルの数を数えることによって、アリコート全体が光学顕微鏡検査によって品質について検査される。

【0338】

［実施例６Ａ：ＦＶＩＩタンパク質を送達するための例示的なカプセル］
ＦＶＩＩタンパク質（ＡＲＰＥ１９：ＦＶＩＩ）をコードする転写ユニットで安定的にトランスフェクトされたＡＲＰＥ－１９細胞をカプセル化する２区画ヒドロゲルミリカプセルの組成物を、実質的に実施例５に記載されるように、同心針を通して第１及び第２のアルギン酸塩溶液を押し出すことにより調製した。第２の（外側）区画は、７０：３０ ＣＭ－ＬＭＷ－Ａｌｇ－１０１－培地：Ｕ－ＨＭＷ－Ａｌｇ溶液から形成され（実施例４Ｂ）、第１の（内側）区画は、Ｕ－ＭＭＷ－Ａｌｇ溶液（実施例４Ｂ）又はＧＲＧＤＳＰ－ＭＭＷ－Ａｌｇ溶液（「ＧＲＧＤＳＰ」は配列番号４９として開示される）から形成され、粘度は８０～１２０ｃＰであり、ＧＲＧＤＳＰ（配列番号４９）のコンジュゲーション結合密度は、ＧＲＧＤＳＰ－ＭＭＷ－Ａｌｇ（「ＧＲＧＤＳＰ」は配列番号４９として開示される）１グラムあたり０．１２～１．９８マイクロモル（μｍｏｌ）のＧＲＧＤＳＰ（配列番号４９）の範囲である（実施例４Ｂ）。内側区画を形成するために使用される未修飾及びＧＲＧＤＳＰ－アルギン酸塩溶液（「ＧＲＧＤＳＰ」は配列番号４９として開示される）のそれぞれは、アルギン酸塩溶液１ｍｌあたり約４０００万細胞のＡＲＰＥ１９：ＦＶＩＩ細胞の懸濁液を含んでいた。

【0339】

各カプセル組成物の０．５ｍＬアリコートを、ヌードマウスのＩＰ空間に移植した（１種の組成物当たり２匹又は３匹のマウス）。移植後１３日で、動物を屠殺し、各マウスから血液サンプルを採取した。これらのサンプルにおけるＦＶＩＩの血漿レベルをＥＬＩＳＡで測定し、結果を図１０に示す。

【0340】

ＦＶＩＩの血漿レベルは、未修飾アルギン酸塩又は結合密度が０．１２又は０．２１μｍｏｌ／ｇのＧＲＧＤＳＰ－アルギン酸塩（配列番号４９）を含有するカプセルを移植されたマウスよりも、コンジュゲーション密度が０．３８～１．９８μｍｏｌ／ｇのＧＲＧＤＳＰ－アルギン酸塩（配列番号４９）を含有するカプセルを移植されたマウスの方が高かった。

【0341】

［実施例６Ｂ：異なる例示的なＦＶＩＩ発現ベクターで組み換えられたカプセル化ＡＲＰＥ－１９細胞の移植後のインビボＦＶＩＩ発現］
ＦＶＩＩ分泌細胞は、ＡＲＰＥ－１９細胞をＦＶＩＩ発現ベクターとともにトランスポザーゼプラスミドを含むＰｉｇｇｙＢａｃでコトランスフェクトすることによって生成し、安定的にトランスフェクトされた細胞（ＡＲＰＥ１９：ＦＶＩＩ細胞）を、ピューロマイシンを含む完全成長培地で培養した。ＦＶＩＩ発現ベクターは、上記の実施例１に記載されたＦＶＩＩ－７発現ベクター又は以下の表４に記載されたＦＶＩＩ－９発現ベクターのいずれかであった。ＦＶＩＩ－９発現ベクターは、上流転写ユニット（５’ＩＴＲに対し）のプロモーターがＣＡＧプロモーター（配列番号１０）、下流転写ユニットのプロモーターがＣＢｈプロモーター（配列番号２１）からなることを除き、同一のヌクレオチド配列を持つ２つのタンデム転写ユニットを有する。

【0342】

【表6】

【0343】

ＡＲＰＥ１９：ＦＶＩＩ－７細胞又はＡＲＰＥ１９：ＦＶＩＩ－９細胞をカプセル化する２区画ヒドロゲルミリカプセルの組成物を、実質的に実施例５に記載されるように、同心針を通して第１及び第２のアルギン酸塩溶液を押し出すことにより調製した。第２の（外側）区画は、７０：３０ ＣＭ－ＬＭＷ－Ａｌｇ－１０１－培地：Ｕ－ＨＭＷ－Ａｌｇ溶液から形成され（実施例４Ｂ）、第１の（内側）区画は、Ｕ－ＭＭＷ－Ａｌｇ溶液（実施例４Ｂ）又はＧＲＧＤＳＰ－ＭＭＷ－Ａｌｇ溶液（「ＧＲＧＤＳＰ」は配列番号４９として開示される）から形成され、粘度は８０～１２０ｃＰであり、ＧＲＧＤＳＰ（配列番号４９）のコンジュゲーション結合密度は、ＧＲＧＤＳＰ－ＭＭＷ－Ａｌｇ（「ＧＲＧＤＳＰ」は配列番号４９として開示される）１グラムあたり０．４４マイクロモル（μｍｏｌ）のＧＲＧＤＳＰ（配列番号４９）である（実施例４Ｂ）。内側区画を形成するために使用されるＧＲＧＤＳＰ－アルギン酸塩溶液（「ＧＲＧＤＳＰ」は配列番号４９として開示される）は、アルギン酸塩溶液１ｍｌあたり約４０００万細胞のＡＲＰＥ１９：ＦＶＩＩ細胞の懸濁液を含んでいた。

【0344】

各カプセル組成物の０．２５０ｍＬアリコートを、ヌードマウスのＩＰ空間に移植した（１種の組成物当たり４匹のマウス）。移植後６日で、動物を屠殺し、各マウスから血液サンプルを採取した。これらのサンプルにおけるＦＶＩＩの血漿レベルをＥＬＩＳＡで測定し、結果を図１１に示す。

【0345】

ＦＶＩＩの血漿レベルは、ＦＶＩＩ－７発現ベクターでトランスフェクトされたＡＲＰＥ－１９細胞を含有するカプセルを移植されたマウスよりも、ＦＶＩＩ－９発現ベクターでトランスフェクトされたＡＲＰＥ－１９細胞を含有するカプセルを移植されたマウスの方が高かった。

【0346】

［実施例７：例示的な定量的ペプチドコンジュゲーションアッセイ］
このアッセイでは、ＣＢＰ－ポリマーのサンプルを、ＣＢＰを個々のアミノ酸として開裂する酸性加水分解にかけることにより、ＣＢＰ－ポリマー中のペプチドの量が決定される。この加水分解サンプル中の個々のアミノ酸を分離し、プレカラムオンライン誘導体化と逆相液体クロマトグラフィー－紫外線蛍光（ＬＣ－ＵＶ－ＦＬＲ）とにより、アミノ酸基準を使用して定量する（出典：Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏｃｏｌｕｍｎｓ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ“Ｈｏｗ－Ｔｏ”Ｇｕｉｄｅ，Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，５９９１－７６９４ＥＮ，２０１８年３月１日刊行）。一次ＡＡ（例えば、２０種の標準的なＬ－アルファアミノ酸の内のプロリンを除く全て）を、オルト－フタルアルデヒド（ＯＰＡ）で誘導体化し、二次ＡＡ（例えばプロリン）を、９－フルオレニルメチルクロロホルメート（ＦＭＯＣ）で誘導体化する。次いで、各アミノ酸のモル濃度を平均化して、サンプル中の全ペプチドの濃度を算出する。例えば実施例８で説明されている任意の適切な分析技術を使用して、ＣＢＰ－ポリマーの非加水分解サンプル中のペプチドの量を決定し、この量を全ペプチド量から減算することにより、ＣＢＰ－ポリマー中の任意の残留する非コンジュゲートＣＢＰの存在に関して、この濃度を補正し得る。

【0347】

このアッセイを、ＧＲＧＤＳＰ－アルギン酸塩（配列番号４９）中のペプチドコンジュゲーション密度を決定するために適用されるとして下記でさらに説明するが、当業者は、非修飾ポリマーがいかなるアミノ酸も含まない場合には、ＧＲＧＤＳＰ－アルギン酸塩（配列番号４９）又は他のペプチド修飾ポリマー中のペプチド濃度を決定するために、このアッセイを容易に変更し得る。同様に、当業者は、下記に示す任意の機器、器具、又は化学物質を、このアッセイにおいて実質的に同一の機能又は役割を実施し得るか又は果たし得る別の機器、器具、又は化学物質に容易に置き換え得る。

【0348】

【表7】

【0349】

［機器、器具、及び化学物質］
［機器］
・ Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０ ＬＣシステム
・ Ａｇｉｌｅｎｔダイオードアレイ検出器（Ｇ１３１５Ｄ）：１３μＬ／１０ｍｍ フローセル
・ Ａｇｉｌｅｎｔ蛍光検出器（Ｇ１３２１Ｂ）
・ ＡｄｖａｎｃｅＢｉｏ ＡＡ ＬＣカラム、２．７μｍ、４．６×１００ｍｍ、Ａｇｉｌｅｎｔ ６５５９５０－８０
・ ＡｄｖａｎｃｅＢｉｏ ＡＡＡガードカラム、２．７μｍ、４．６×５ｍｍ、Ａｇｉｌｅｎｔ ８２０７５０－９３１

【0350】

【表8】

【0351】

［手順］
ＬＣ／ＭＳ手順で使用するために、１０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４／Ｎａ２Ｂ４Ｏ７／ｐＨ８．２（水性移動相）溶液及び４５／４５／１０ ＡＣＮ／ＭｅＯＨ／水（有機移動相）を調製する。

【0352】

［例示的な凍結乾燥ペプチド－アルギン酸塩コンジュゲートのサンプルの酸性加水分解］
・ 凍結乾燥させたペプチド－アルギン酸コンジュゲート１２～１６ｍｇを、マイクロ波反応バイアルに秤量し、サンプルが撹拌されないようにする。
・ 下記の工程３．３．２～３．３．１９に従って加水分解する

【0353】

［生理食塩水中のペプチド－アルギン酸塩コンジュゲートの例示的なサンプルの酸性加水分解］
・ 生理食塩水中のペプチド－アルギン酸コンジュゲート溶液１０００±５０ｍｇを、マイクロ波反応バイアルに秤量する
・ １０ｍＬトランスファーピペット又は容積測定ピペット及び撹拌子を使用して、６Ｎ ＨＣｌ １０．０ｍＬをサンプル添加し、クリンパによりＰＴＦＥ裏打ちキャップを密封する。
・ 各サンプルバイアルを熱／撹拌プレートの対応するヒートブロックに入れる
・ １２０℃で加熱し、４００ｒｐｍで６時間撹拌する
・ 熱源から取り出し、周囲温度まで冷却する
・ キャップを外し、使い捨てトランスファーピペットにより、溶液全体を反応バイアルから２０ｍＬメスフラスコに移す
・ 空になった反応バイアルにＬＣＭＳグレードの水 ２ｍＬをピペットし、同一の使い捨てトランスファーピペットで内壁を十分にすすぎ、このすすぎ液を同一の２０ｍＬメスフラスコに完全に移す
・ 上記の工程を２回繰り返す
・ ＬＣＭＳグレードの水でメスフラスコの目盛りに合わせる
・ このフラスコをキャップして複数回反転させて、十分に混合する
・ ５０ｍＬ遠心分離管に完全に移す
・ １０分にわたり５０００ｒｐｍで遠心分離する
・ 上清 １ｍＬをＬＣバイアルに正確にピペットし、乾燥するまで（例えば翌日まで）２～８℃で貯蔵する（必要に応じて、任意の再検査のために、残余の上清を２～８℃で貯蔵する）
・ 上清 １ｍＬを、６０℃にて窒素下で完全に乾燥させ、針が、サンプルに触れないがサンプルを素早く乾燥させるために十分に低いかを確かめる
・ 乾燥したサンプルが入ったバイアルに、０．１μｍｏｌ／ｍＬの内部標準混合物 ０．２５ｍＬをピペットする
・ 徹底的にボルテックスする
・ ＬＣバイアルインサートが入ったＬＣバイアルに、ピペットで移す
・ ＨＰＬＣ分析まで２～８℃で貯蔵する（工程３．６）

【0354】

［標準調製］
［ＡＡ標準ストック溶液：１０μｍｏｌ／ｍＬ］
・ 各ＡＡに関して、ＭＷに基づいて、１０μｍｏｌ／ｍＬストック溶液を調製するのに必要な重量を算出する
・ 下記の例を参照されたい：

【0355】

【表9】

【0356】

・ 算出した重量を、５０ｍＬメスフラスコに秤量する
・ ０．１Ｎ ＨＣｌで溶解させて目盛りに合わせる
・ キャップして反転させるか又はボルテックスすることにより、十分に混合する
・ ＨＰＬＣ分析まで２～８℃で貯蔵する（工程３．６）

【0357】

［内部標準混合物：１μｍｏｌ／ｍＬ］
・ 同一の１０ｍＬメスフラスコに、ノルバリンストック溶液（１０μｍｏｌ／ｍＬ）１．０ｍＬ及びサルコシンストック溶液（１０μｍｏｌ／ｍＬ）１．０ｍＬを正確にピペットする
・ ０．１Ｎ ＨＣｌで目盛りに合わせる
・ キャップして反転させるか又はボルテックスすることにより、十分に混合する
・ ＨＰＬＣ分析まで２～８℃で貯蔵する（工程３．６）

【0358】

［内部標準混合物：０．１μｍｏｌ／ｍＬ］
注記：この溶液は、乾燥後のサンプルの再構成用である
・ １０ｍＬメスフラスコに、内部標準混合物（１μｍｏｌ／ｍＬ）１．０ｍＬを正確にピペットする
・ ０．１Ｎ ＨＣｌで目盛りに合わせる
・ キャップして反転させるか又はボルテックスすることにより、十分に混合する
・ ＨＰＬＣ分析まで２～８℃で貯蔵する（工程３．６）

【0359】

［５ＡＡ混合物（＋ｉＳＴＤ０．１）：０．０２５／０．１／０．２５μｍｏｌ／ｍＬ］
・ 同一の１０ｍＬメスフラスコに、Ｄ、Ｓ、Ｇ、Ｒ、Ｎ－ｉＳＴＤ、Ｓ－ｉＳＴＤ、及びＰ（１０μｍｏｌ／ｍＬ）溶液 ｘｘμＬ（下記の表を参照されたい）を正確にピペットする
・ ０．１Ｎ ＨＣｌで目盛りに合わせる
・ キャップして反転させるか又はボルテックスすることにより、十分に混合する
・ ＨＰＬＣ分析まで２～８℃で貯蔵する（工程３．６）

【0360】

【表10】

【0361】

［１７ＡＡ標準（＋ｉＳＴＤ０．１）混合物：０．１μｍｏｌ／ｍＬ］
・ ０．１μｍｏｌ／ｍＬ １７ＡＡ標準溶液のアンプルを開封する
・ このＡＡ標準混合物 ０．９ｍＬをＬＣバイアルに正確にピペットする
・ 同一のＬＣバイアルに、ｉＳＴＤ混合物（１μｍｏｌ／ｍＬ）１００μＬを正確にピペットする
・ ボルテックスすることにより十分に混合する
・ ＬＣバイアルインサートが入ったＬＣバイアルに１００μＬアリコートＮＬＴを分注する
・ ＨＰＬＣ分析まで２～８℃で貯蔵する（工程３．６）

【0362】

【表11】

【0363】

【表12】

【0364】

［システムの適合性の基準］
定量に使用した目的の各ＡＡ（Ｄ／Ｓ／Ｇ／Ｒ）並びに標準の注入（ＵＶ及びＦＬＲの両方）での内部標準（ノルバリン及びサルコシン）の保持時間及びピーク面積を分析する。

【0365】

【表13】

【0366】

［データ解析－システムの適合性が合格した場合にのみサンプルを分析する］
［目的のＡＡの同定］
・ 目的のＡＡ及び１７ＡＡ（＋ｉＳＴＤ）標準混合物中の内部標準のＲＴは、５ＡＡ（＋ｉＳＴＤ）標準混合物のＲＴと一致するべきである
・ 各サンプル中のＡＡのＲＴは、標準（ＵＶ／ＦＬＲ）のＲＴと一致するべきである
相対面積（Ｄ、Ｓ、Ｇ、Ｒ）＝面積（Ｄ、Ｓ、Ｇ、Ｒ）／面積（ノルバリン）
相対面積（Ｐ）＝面積（Ｐ）／面積（サルコシン）

【0367】

［標準較正曲線］
・ 分析証明書で報告されている値を使用するか、又は標準調製中の希釈係数で調整した実重量を使用して、標準溶液の濃度を算出する。
・ 下記の標準の注入からの目的の各ＡＡの濃度に対して、平均面積又は平均相対面積をプロットする：０．０２５、０．１、及び０．２５μｍｏｌ／ｍＬ。線形回帰を実施する。
濃度＝ｍ＊面積又は相対面積＋ｂ
（式中、ｍは、線形近似曲線の傾きであり、ｂは、線形近似曲線のＹ切片である）
・ ＲＳＱは、０．９９以上であるべきである。
・ 線形性が損なわれる場合には、新たな誘導体化試薬／標準溶液を調製し、システムの異常を解決して試験を繰り返す。

【0368】

［サンプル分析］
・ ＵＶ及びＦＬＲの両方により定量を行ない得る
・ 相対面積（内部標準に対する面積比）を使用して定量を行なう
・ 線形近似標準曲線を使用して、各サンプル中のＡＡ：Ｇ、Ｒ、Ｄ、Ｓの濃度を算出する：
濃度、ＡＡ（μｍｏｌ／ｍＬ）＝（ｍ＊面積又は相対面積＋ｂ）
・ 各ＡＡの濃度を平均化することにより、全ＧＲＧＤＳＰ（配列番号４９）の濃度を算出する：
濃度、全ＧＲＧＤＳＰ（配列番号４９）（μｍｏｌ／ｍＬ）＝（濃度、Ｇ／２＋濃度、Ｒ＋濃度、Ｄ＋濃度、Ｓ＋濃度、Ｐ）／５
μｍｏｌ（全ＧＲＧＤＳＰ）（配列番号４９）／ｇ（コンジュゲート）＝濃度、全ＧＲＧＤＳＰ（配列番号４９）（μｍｏｌ／ｍＬ）×０．２５ｍＬ／１．０ｍＬ×２０ｍＬ／重量（ｇ）
μｍｏｌ（コンジュゲートＧＲＧＤＳＰ（配列番号４９））／ｇ（コンジュゲート）＝μｍｏｌ（全ＧＲＧＤＳＰ（配列番号４９））／ｇ（コンジュゲート）－μｍｏｌ（残留遊離ＧＲＧＤＳＰ（配列番号４９））／ｇ（コンジュゲート）

【0369】

［実施例８：ＣＢＰ－ポリマー組成物中の残留遊離ペプチドを決定するための例示的なアッセイ］
このアッセイは、液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ－ＭＳ）を使用して、例えば、典型的には、１つ又は複数の精製工程を実施して、非コンジュゲートペプチドの相対な割合（例えば、９５％超、９８％、９９％、又はより多く）を除去した後の、ペプチド－ポリマーコンジュゲートを含む組成物中の残留非コンジュゲートペプチドの量を決定する。簡潔には、生理食塩水中のコンジュゲートのサンプルを、ペプチドの分子量と比べて高い分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有するＭＷＣＯチューブに入れ、このチューブを遠心分離して、このコンジュゲートから残留ペプチドを分離し、既知の濃度の同一ペプチドを含む参照組成物を標準として使用するＬＣ－ＭＳにより、ペプチドの量を定量する。

【0370】

［実施例９：式（Ｉ）の化合物で修飾された抗線維性ポリマー中のアミンコンジュゲーション密度を決定するための例示的な定量的アミンアッセイ］
このアッセイにより、アミン化合物で化学的に修飾されたポリマー中のアミン含有化合物（例えば式Ｉの化合物、例えば表３中の化合物１０１）の量が決定される。化学修飾ポリマーのサンプルを酸性加水分解に供し、この酸性加水分解によりコンジュゲートアミンが開裂され、加水分解サンプル中の全アミンの重量％を、標準として非コンジュゲートアミン化合物を使用して、紫外線検出を備える逆相液体クロマトグラフィー（ＬＣ－ＵＶ）により定量する。ＬＣピークの同一性を、質量分析によりさらに確認し得る。全アミンの重量％を、化学修飾ポリマー中のアミン化合物の％コンジュゲーションとして使用し得る。任意の適切な方法（例えば下記で説明する方法）を使用して、化学修飾ポリマーの非加水分解サンプル中の任意の残留する非コンジュゲートアミン化合物の量を決定し、この量を全ペプチド量から減算することにより、より正確な結果を得ることができる。

【0371】

このアッセイを、化合物１０１で化学的に修飾されたアルギン酸塩（即ち、ＣＭ－ＬＭＷ－Ａｌｇ－１０１）中の％コンジュゲーション密度を決定するために適用されるとして下記でさらに説明するが、当業者は、アミンを含まない多糖（例えばアルギン酸塩）又は別のポリマーを化学的に修飾するために使用される任意の式Ｉの化合物のコンジュゲーション密度を決定するために、このアッセイを容易に変更し得る。同様に、当業者は、下記に示す任意の機器、器具、又は化学物質を、このアッセイにおいて実質的に同一の機能又は役割を実施し得るか又は果たし得る別の機器、器具、又は化学物質に容易に置き換え得る。

【0372】

【表14】

【0373】

［機器］
・ Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０ ＬＣシステム（ＤＡＤ：１３μＬ／１０ｍｍフローセル）
・ Ａｇｉｌｅｎｔ ＳＱ ＭＳ検出器（Ｇ１９５６Ｂ）
・ ＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ１８、２．５μｍ、４．６×５０ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ １８６００６０３７
・ 小分子参照物質（表３の化合物１０１の非コンジュゲート、遊離アミンバージョン；純度９８．０％超）

【0374】

［手順］
ＬＣ手順で使用するために、水溶液中の０．１％アンモニア（水性移動相）及びＡＣＮ溶液中の０．１％アンモニア（有機移動相）を調製する。

【0375】

［例示的な固体小分子アルギン酸塩コンジュゲートサンプルの酸加水分解］
・ 凍結乾燥させた小分子－アルギン酸コンジュゲート固体５０±５ｍｇを、マイクロ波反応バイアルに秤量し、サンプルが撹拌されないようにする。
・ １０ｍＬトランスファーピペット又は容積測定ピペット及び撹拌子を使用して、２Ｎ ＨＣｌ １０．０ｍＬを添加し、クリンパによりＰＴＦＥ裏打ちキャップを密封する。
・ 各サンプルバイアルを熱／撹拌プレートの対応するヒートブロックに入れ、１２０℃で加熱し、４００ｒｐｍで１２０分間撹拌する。
・ 熱源から取り出し、周囲温度まで冷却する
・ 使い捨てトランスファーピペットにより、溶液全体を反応バイアルから２５ｍＬメスフラスコに移す
・ 空になった反応バイアルにＬＣＭＳグレードの水５ｍＬをピペットし、同一の使い捨てトランスファーピペットで内壁を十分にすすぎ、このすすぎ液を同一の２５ｍＬメスフラスコに完全に移す
・ 上記の工程を２回繰り返す
・ ＬＣＭＳグレードの水でメスフラスコの目盛りに合わせる
・ ５０ｍＬ遠心分離管に完全に移す
・ １０分にわたり３０００ｒｐｍで遠心分離する
・ 上清をＨＰＬＣ分析にかける
・ ２～８℃で貯蔵する

【0376】

［生理食塩水中の例示的小分子アルギン酸コンジュゲートのサンプルの酸性加水分解］
・ 小分子アルギン酸コンジュゲートの生理食塩水溶液１０００±５０ｍｇを、マイクロ波反応バイアルに秤量する
・ １０ｍＬトランスファーピペット又は容積測定ピペット及び撹拌子を使用して、２Ｎ ＨＣｌ １０．０ｍＬを添加し、クリンパによりＰＴＦＥ裏打ちキャップを密封する
・ 各サンプルバイアルを、ホット／撹拌プレート上の適合する加熱ブロックに入れる
・ １２０分にわたり、１２０℃で加熱し、４００ｒｐｍで撹拌する
・ 熱源から取り出し、周囲温度まで冷却する
・ 使い捨てトランスファーピペットにより、溶液全体を反応バイアルから２５ｍＬメスフラスコに移す
・ 空になった反応バイアルにＬＣＭＳグレードの水５ｍＬをピペットし、同一の使い捨てトランスファーピペットで内壁を十分にすすぎ、このすすぎ液を同一の２５ｍＬメスフラスコに完全に移す
・ 上記の工程を２回繰り返す
・ ＬＣＭＳグレードの水でメスフラスコの目盛りに合わせる
・ ５０ｍＬ遠心分離管に完全に移す
・ １０分にわたり３０００ｒｐｍで遠心分離する
・ 上清をＨＰＬＣ分析にかける
・ ２～８℃で貯蔵する

【0377】

［固体小分子アルギン酸コンジュゲート中の残留遊離アミンのサンプル調製］
凍結乾燥させた小分子アルギン酸コンジュゲート固体５０±５ｍｇを、シンチレーションバイアルに秤量する
このシンチレーションバイアルに、生理食塩水５．０ｍＬをピペットする
１０分にわたり振盪させたりボルテックスしたりすることにより、完全に溶解させる
ＭＷＣＯチューブに完全に移す
６０分にわたり５０００ｒｐｍで遠心分離する
このＭＷＣＯチューブの上部を取り除いて廃棄する
底部のサンプルを５ｍＬメスフラスコに完全に移す
水又は生理食塩水で目盛りに合わせ、反転させて十分に混合する
シンチレーションバイアルに移して２～８℃で貯蔵する
アリコートをＨＰＬＣ分析に移す

【0378】

［生理食塩水中における小分子アルギン酸コンジュゲート中の残留遊離アミンのサンプル調製］
生理食塩水中の小分子アルギン酸コンジュゲート（又は非修飾アルギン酸塩とのブレンド）１０００±５０ｍｇを、ＷＭＣＯチューブに秤量する
このＭＷＣＯチューブに生理食塩水４．０ｍＬをピペットする
このチューブを、５回か又は溶液が十分に混合されるまで反転させたりボルテックスしたりして、遊離アミンを完全に抽出する
９０分にわたり５０００ｒｐｍで遠心分離する
このＭＷＣＯチューブの上部を取り除いて廃棄する
底部のサンプルを５ｍＬメスフラスコに完全に移す
水で目盛りに合わせ、反転させて十分に混合する
シンチレーションバイアルに移して２～８℃で貯蔵する
アリコートをＨＰＬＣ分析に移す

【0379】

［標準調製］
［標準溶液：１ｍｇ／ｍＬ］
小分子参照物質標準５０．００±５．００ｍｇを、シンチレーションバイアルに秤量する
ＬＣＭＳグレードの水約１０ｍＬを添加し、振盪させたりボルテックスしたりして固体を完全に溶解させる
使い捨てトランスファーピペットを使用して、このシンチレーションバイアルをＬＣＭＳグレードの水で２回すすぐことにより、５０ｍＬメスフラスコに完全に移す
ＬＣＭＳグレードの水で体積を合わせ、十分に混合する
２～８℃で貯蔵する

【0380】

［標準溶液：０．０１ｍｇ／ｍＬ］
・ １０ｍＬメスフラスコに、この１ｍｇ／ｍＬ溶液１００μＬをピペットする
・ ＬＣＭＳグレードの水で体積を合わせる
・ 反転させることにより十分に混合する
・ ２～８℃で貯蔵する

【0381】

【表15】

【0382】

【表16】

【0383】

［データ解析－システムの適合性が合格した場合にのみサンプルを分析する］
［アミンの同定］
・ （任意選択）各サンプル中の遊離アミンピークのｍ／ｚは、３９２．１±０．５内であるべきである。
・ 各サンプルにおけるＵＶでのアミンピークのＲＴは、標準のＲＴと一致する。
濃度、標準（ｍｇ／ｍＬ）＝
重量（ｍｇ）／５０ｍＬ／希釈係数、
ここで、１．０ｍｇ／ｍＬ標準の場合には、希釈係数＝１；
０．０１ｍｇ／ｍＬ標準の場合には、希釈係数＝１００
濃度、遊離アミン（ｍｇ／ｍＬ）＝
面積、非加水分解サンプル／面積、０．０１標準×濃度、０．０１標準
％残留遊離アミン＝
濃度、遊離アミン（ｍｇ／ｍＬ）×５ｍＬ／
重量、非加水分解コンジュゲート（ｍｇ）×１００
濃度、全アミン（ｍｇ／ｍＬ）＝
面積、加水分解サンプル／面積、１．０標準×濃度、１．０標準
％全アミン＝
濃度、全アミン（ｍｇ／ｍＬ）×２５ｍＬ／重量、加水分解コンジュゲート（ｍｇ）×１００

【0384】

［均等物及び範囲］
本出願は、それらの全体が参照により本明細書において援用されている、種々の発行された特許、公開された特許出願、学術記事、書籍、マニュアル及び他の刊行物を参照する。援用された文献のいずれかと、本明細書との間に齟齬が存在する場合、本明細書が優先されるべきである。加えて、従来技術に属する本開示の特定の実施形態のいずれかは、いずれかの１つ又は複数の請求項からは明示的に除外され得る。このような実施形態は技術分野における当業者に公知であるとみなされるため、これらは、本明細書において明示的に除外されていない場合においても除外され得る。本開示の特定の実施形態のいずれかは、従来技術の存在に関連しているかに関係なく、いかなる理由によってもいずれかの請求項から除外可能である。

【0385】

当業者は、多くのルーチン的な実験を行うことなく、本明細書に記載の特定の実施形態の均等物を認識又は確認可能である。本明細書に記載の本実施形態の範囲が上記の明細書、図面又は実施例に限定されることは意図されておらず、添付の特許請求の範囲に記載されているとおりであることが意図されている。当業者は、以下の特許請求の範囲において定義されているとおり、本開示の趣旨又は範囲を逸脱することなく、本記載に対する種々の変更及び修正が可能であり得ることを認めるであろう。

【図1A】

【図1B】

【図2】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図5A】

【図5B】

【図6A】

【図6B-1】

【図6B-2】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【配列表】

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【国際調査報告】