▶ フンダシオン インスティチュート デ インベスティガシオン サニタリア フンダシオン ヒメネス ディアスの特許一覧 ▶ ウニベルシダ アウトノマ デ マドリードの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-04-06
(54)【発明の名称】化学的スカルペル
(51)【国際特許分類】
A61K 38/47 20060101AFI20220330BHJP
A61K 31/407 20060101ALI20220330BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220330BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20220330BHJP
A61K 9/08 20060101ALI20220330BHJP
A61K 9/10 20060101ALI20220330BHJP
【ＦＩ】
A61K38/47
A61K31/407
A61P35/00
A61P43/00 121
A61K9/08
A61K9/10
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021548639
(86)(22)【出願日】2020-02-19
(85)【翻訳文提出日】2021-10-12
(86)【国際出願番号】 ES2020070121
(87)【国際公開番号】W WO2020169868
(87)【国際公開日】2020-08-27
(31)【優先権主張番号】19382118.8
(32)【優先日】2019-02-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】518158123
【氏名又は名称】フンダシオン インスティチュート デ インベスティガシオン サニタリア フンダシオン ヒメネス ディアス
(71)【出願人】
【識別番号】518320797
【氏名又は名称】ウニベルシダ アウトノマ デ マドリード
(74)【代理人】
【識別番号】110000796
【氏名又は名称】特許業務法人三枝国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】グアダラハラ ラバホ エクトル
(72)【発明者】
【氏名】ガルシア アランス マリアーノ
(72)【発明者】
【氏名】ガルシア オルモ ダミアン
(72)【発明者】
【氏名】バランビオ ブエンディア ハビエル ヘスス
(72)【発明者】
【氏名】コルテス ギラル デリア
(72)【発明者】
【氏名】オルメディリャス ロペス スザナ
(72)【発明者】
【氏名】ヴェーガ クレメンテ マリア ルース
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C076AA11
4C076AA22
4C076BB11
4C076CC27
4C076CC29
4C084AA02
4C084AA03
4C084BA44
4C084DC22
4C084MA16
4C084MA23
4C084MA65
4C084NA05
4C084ZB261
4C084ZB262
4C084ZC75
4C086AA01
4C086AA02
4C086CB03
4C086MA02
4C086MA04
4C086MA65
4C086NA05
4C086ZB26
4C086ZC75
(57)【要約】
本発明は、固形腹膜腫瘍の治療において細胞傷害性薬物の増強治療又は補助治療として使用するため、所定の時間にわたって所定の濃度の溶液で洗浄することにより、腹膜腫瘍を覆う組織のプレコンディショニングを行う液体コラゲナーゼ溶液に関する。本発明の溶液は、中間層又は内層を損傷することなく、腸管を覆う中皮層の減少をもたらす濃度及び時間で、腫瘍に直接投与又は灌注するために使用される。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
溶液又は懸濁液中にコラゲナーゼを含む、固形腹膜腫瘍の治療における細胞傷害性薬物増強治療用又は補助治療用の組成物であって、コラゲナーゼを含む前記組成物が、細胞傷害性治療に先立って投与され、腫瘍に直接投与又は灌注され、前記細胞傷害性薬物がマイトマイシンである、組成物。
【請求項2】
前記細胞傷害性薬物が前記腫瘍に直接投与又は灌注され、コラゲナーゼを含む前記組成物が細胞傷害性治療に先立って投与され、前記腫瘍に直接投与又は灌注される、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
前記組成物が、いかなる器官の関与もなしに腫瘍組織の露出を引き起こすような濃度及び時間で、前記腫瘍に直接投与又は灌注される、請求項２に記載の組成物。
【請求項4】
前記コラゲナーゼの作用が、前記細胞傷害性薬物の投与に先立って、前記腫瘍に直接投与又は灌注されるコラーゲン等のコラゲナーゼ阻害剤によって阻害される、請求項２又は３に記載の組成物。
【請求項5】
腫瘍が腹膜腺癌又は腹膜癌腫からなる群より選択される、請求項１～４のいずれかに記載の組成物。
【請求項6】
前記組成物が、中間層又は内層の関与なしに腸管を覆う中皮層の菲薄化を引き起こすような濃度及び時間で前記腫瘍に直接投与又は灌注される、請求項５に記載の組成物。
【請求項7】
前記組成物が、３７Ｕ／ｍＬ（１ミリリットル当たりの単位）～１４８Ｕ／ｍＬのコラゲナーゼ溶液を含む、請求項１～６のいずれかに記載の組成物。
【請求項8】
前記コラゲナーゼを、前記細胞傷害性薬物の投与に先立って、前記コラゲナーゼ阻害剤を使用する前に、腫瘍に直接投与又は灌注し、２分間～４５分間作用させたままにする、請求項７に記載の組成物。
【請求項9】
１０００立方センチメートル～１００００立方センチメートルのコラゲナーゼ溶液を平均温度３６．５℃～３９℃でヒト被験体の腹腔に注入するのに適した装置であって、さらに、該装置が前記溶液を、好ましくは１Ｌ／分の速度で再循環させるのに適していることを特徴とする、装置。
【請求項10】
固形腹膜腫瘍の治療における細胞傷害性薬物増強治療用又は補助治療用のキットであって、ａ．１０００立方センチメートル～１００００立方センチメートルのコラゲナーゼ溶液を平均温度３６．５℃～３９℃でヒト被験体の腹腔に注入するのに適した装置であって、さらに、前記装置が前記溶液を、好ましくは１Ｌ／分の速度で再循環させるのに適していることを特徴とする、装置を備え、
ｂ．前記キットが、ヒト被験体の腹腔内の前記腫瘍を１０００ｃｃ～１００００ｃｃの容量で２分間～４５分間直接灌注するとき、いかなる器官の関与もなしに前記腫瘍組織の露出を引き起こすような濃度の任意に凍結乾燥されたコラゲナーゼ組成物を更に備え、
コラゲナーゼを含む前記組成物が、前記細胞傷害性治療に先立って投与され、前記腫瘍に直接投与又は灌注され、前記細胞傷害性薬物がマイトマイシンである、キット。
【請求項11】
溶液中の前記再水和コラゲナーゼ組成物又はコラゲナーゼ組成物が、１０００ｃｃ～１００００ｃｃの容量で３７Ｕ／ｍＬ（１ミリリットル当たりの単位）～１４８Ｕ／ｍＬの濃度である、請求項１０に記載のキット。
【請求項12】
前記装置に、３７Ｕ／ｍＬ（１ミリリットル当たりの単位）～１４８Ｕ／ｍＬの濃度で３０００ｃｃ～５０００ｃｃのコラゲナーゼ溶液を含む組成物が事前に装填されていることを特徴とする、請求項１０に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、医療分野、特に固形腫瘍の治療における細胞傷害性薬物増強治療用又は補助治療用の、溶液中にコラゲナーゼを含む組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
本発明は、主に癌性腹膜炎の治療における臨床結果を改善することを意図している。腹腔内化学療法は、これらの進行癌のほとんどの病期を治療するための最良の方法である。無症候期間及び生存率の点で良好な結果を得るには、複雑な外科的処置によって完全な細胞切除（全ての癌性腫瘤の摘出）を達成することが不可欠である。しかしながら、外科医は、手術後に発生する可能性のある微視的腫瘍インプラントを検出できない場合がある。時々、微視的腫瘍インプラントは、アクセスして検出するのが非常に難しい位置にある。さらに、これらの微視的インプラントは通常、腹膜中皮細胞の層で覆われている場合があり、化学療法が腫瘍塊に効果的に到達できずに、無効となる可能性がある。
【発明の概要】
【0003】
本発明は、固形腫瘍の治療における細胞傷害性薬物増強治療用又は補助治療用の、溶液中にコラゲナーゼを含む組成物を提案することによって、この問題に対処する。
【図面の簡単な説明】
【0004】
【図1】培養し、９６時間にコラゲナーゼでｉｎ ｖｉｔｒｏ処理した患者生検試料を起源とする腫瘍組織から得られた細胞を示す図である。Ａ）皿上の移植試料；Ｂ）組織が３０分間消化される際にコラゲナーゼによって解放される中皮細胞の例；Ｃ）組織がコラゲナーゼで２４時間消化される際に解放される細胞の例、腫瘍形態を有する細胞及び高度に屈折性の中皮細胞（細胞が培養皿から脱離し、おそらく死にかけている兆候）の解放が観察される。
【図2】癌性腹膜炎動物モデル（ラット）の例を示す図である。動物の腹腔内に様々な腫瘍結節が観察される。
【図3】癌性腹膜炎動物モデルにおけるコラゲナーゼによる治療の一般図である。動物を麻酔にかけ、播種性腫瘍塊を含む腹腔を露出したら、腔がいっぱいになるまでコラゲナーゼで洗浄を行い、次いでコラゲナーゼを含む溶液を制御された速度及び温度で再循環させ、最後に溶液を除去し、腹膜を乳酸リンゲル溶液で洗浄し、腹膜を分析した後、追跡のために動物の腹部を再び閉じる。
【図4】癌性腹膜炎動物モデルの腹膜洗浄液中のコラゲナーゼ濃度及び曝露時間を微調整するために行った試験中のヘマトキシリン及びエオシン染色による組織学的試料分析を示す図である。図示されるように、腸切片の剥離細胞の増加は、ラット３及びラット５の場合にのみ観察される（それぞれ３５Ｕ／ｍＬ及び８７．５Ｕ／ｍＬ）。それにもかかわらず、腸の内層（粘膜下組織、粘膜、及び上皮）は全く影響を受けないが、８７．５Ｕ／ｍＬの濃度は腸陰窩に影響を与えることなく、粘膜下組織を局所的に破壊する。群２及び群４からのラット（８．７５Ｕ／ｍＬ及び乳酸リンゲル溶液）の場合、腹膜洗浄及び低酵素濃度に関連する外筋層の剥離は事実上存在せず、それらの濃度及び選択した時間で悪影響が生じていないことを示す。
【図5】癌性腹膜炎動物モデルでの試験中の種々の治療群の剖検を示す図である。 図５Ａ． １週間の追跡後にマイトマイシン５ｍｇ治療を行った群からの健康なラットの剖検例。主な所見として、全ての腹部器官が弛緩して収縮した状態（腎臓が壊死しているように見え、肝臓がつぶれているように見える）にあり、接触すると大網が破裂し、大腸が閉塞する可能性があることが観察される。 図５Ｂ． ２ヶ月の追跡後にマイトマイシン０．１ｍｇ治療を行った群からの健康なラットの剖検例。主な所見として、腸及び大網が血性（hematic）であることが観察される。 図５Ｃ． コラゲナーゼ７４Ｕ／ｍＬで治療され、２ヶ月後に屠殺された健康なラットの剖検例。主な所見として、腹部器官及び大網の非関与が見られる。 図５Ｄ． １週間の追跡後のコラゲナーゼ３７Ｕ／ｍＬ＋マイトマイシン０．５ｍｇ治療を行った群からの腹膜癌を有するラットの剖検例。主な所見として、器官はよく保存されており、大網は正常に見えることが観察され得る。 図５Ｅ． １ヶ月の追跡後のＤＨＤ処理を行った群からの腹膜癌を有するラットの剖検例。大網及び腹壁に関連する幾つかの腫瘍塊を、腹水を伴う腸に見ることができる。 図５Ｆ． 腹膜癌及びコラゲナーゼの例。微調整を行う際に群Ｆを分析したところ、結果は群Ｅの結果と同様であった（表３を参照されたい）。
【図6】デジタルＰＣＲによる変異型及び非変異型のＫＲＡＳ癌遺伝子検出を表すグラフである。Ａ）陽性対照の例、腹膜癌（皮下ＤＨＤ）のラットからの血漿；Ｂ）５ｍｇ／動物のマイトマイシンＣで治療された腹膜癌（皮下ＤＨＤ）のラットからの血漿、唯一血漿中に正の変異型ＫＲＡＳ値をもたらすのもの。変異型ＫＲＡＳ（ｉ）；変異型ＫＲＡＳ＋非変異型ＫＲＡＳ（ｉｉ）；陰性対照（ｉｉｉ）；非変異型ＫＲＡＳ（ｉｖ）。
【発明を実施するための形態】
【0005】
定義
本発明の文脈では、「ダブルノックアウト」マウスは、それらの遺伝子が不活性化されるように遺伝子工学によって改変されたマウスであり、そのため標的遺伝子の発現又は活性化が遮断されると理解される。
本発明の文脈では、「ダブルノックアウト」マウスは、それらの遺伝子が不活性化されるように遺伝子工学によって改変されたマウスであり、そのため標的遺伝子の発現又は活性化が遮断されると理解される。
【0006】
本発明の文脈では、液体コラゲナーゼ溶液に言及しており、これは、所定の時間で所定の濃度の上記溶液で洗浄することによって、腹膜腫瘍を覆う組織のプレコンディショニングをもたらす。本発明を通して、上記溶液は、中間層又は内層の関与なしに腸管を覆う中皮層の菲薄化を引き起こすような濃度及び時間で、腫瘍に直接投与又は灌注するために使用される。本発明の文脈では、上記コラゲナーゼ溶液は、特定の濃度範囲内で規定され、好ましくは生理食塩水中に希釈されることに留意されたい。
【0007】
本発明の文脈では、「ＤＨＤ細胞」は、ラットにおける結腸転移を研究し、偽粘液腫（粘液性腹腔内腫瘍の存在を特徴とする腹腔癌）を生じさせるために使用される上皮形態を有するラット結腸癌細胞株であると理解される。
【0008】
本発明の文脈では、「同系ＢＤＩＸラット」は、１９３７年にH. Druckrey博士（Druckrey H., Landschutz C., and Ivankovic S.(1970) Transplacentare Erzeugnung maligner Tumoren des Nervensystems. II. Athyl-nitrosoharnstoff an 10 genetisch definierten Ratten-stammen. Z. Krebsforsch. 73, 371-386）によって、同じ遺伝子及び組織を有する兄弟姉妹ラットＢＤＩとＢＤＶＩＩＩとの交配から作製されたラットの系統であると理解され、兄弟姉妹ラット間の同系交配はそれ以来維持されている。言及される研究チームによって開発されたこのモデルは、特に解剖病理学レベルで、ラットにおけるヒト癌性腹膜炎又は偽粘液腫を再現するための進行時間及び注入される細胞の濃度を知ることを可能にする。
【0009】
本発明の文脈では、「いかなる器官の関与もなしに腫瘍組織の露出を引き起こすような濃度及び時間で腫瘍に直接投与又は灌注される液体コラゲナーゼ溶液を含む組成物」は、制御された条件下及び濃度で腹膜をコラゲナーゼで洗浄して、腫瘍塊を取り巻く中皮組織を破壊し、局所投与された化学療法剤によるその後の治療を可能にすることを意味すると理解される。隣接する器官の非関与を分析するために、器官の組織学的非関与及びそれらの正常な機能的活動を実証する解剖学的機能データを、提案された治療後に分析する。
【0010】
本発明の文脈では、「中間層又は内層の関与なしに、腸管を覆う中皮層の菲薄化を引き起こすような濃度及び時間での上記の腫瘍への直接投与又は灌注」は、腸管がいかなる解剖学的機能障害も受けておらず、機能が正常な器官活動と規定されることを意味すると理解される。
【0011】
本発明の文脈では、「固形腫瘍」は、一般に嚢胞又は液体を伴う領域を含まない異常な組織塊であると理解される。固形腫瘍は、良性（非癌性）又は悪性（癌性）の場合がある。様々な種類の固形腫瘍の名称は、それらを形成する細胞の種類に由来する。肉腫、癌腫、及びリンパ腫は固形腫瘍の例である。
【0012】
本発明の文脈では、コラゲナーゼ溶液に関して「化学療法処置の前に投与される」とは、腫瘍塊を取り囲む組織を調整し、その後投与される細胞増殖抑制剤へのアクセスを容易にする目的で制御された方法でコラゲナーゼによって固形腫瘍又は微小腫瘍を含む腹膜領域を洗浄することを意味すると理解される。細胞傷害性薬物又は化学療法薬の投与の前に、コラゲナーゼ溶液を阻害することが好ましいことに留意しなければならない。
【0013】
本発明の文脈では、「固形腫瘍の治療における細胞傷害性薬物増強治療又は補助治療」は、細胞傷害性薬物の腫瘍へのより良いアクセスを可能にし、腫瘍組織に対する細胞傷害性薬物の作用を集中させることによって、隣接組織の保護を可能にする治療を意味すると理解される。
【0014】
本発明の文脈では、ドットは、整数部分を小数部分から分離するために使用される。
【0015】
本発明の文脈では、酵素単位（記号Ｕ）は、最適な酵素条件下で毎分１μｍｏｌの基質を変換することを担う触媒活性として定義される。また、酵素単位を他の単位（Ｕ／ｍｇタンパク質又はＵ／ｍＬ）と組み合わせて使用して、それぞれ特定の酵素活性又は酵素活性濃度を示す。
【0016】
本発明の文脈では、溶液は、２つ以上の物質の均一な混合物である。溶解した物質を溶質と呼び、溶質を溶解する物質を溶媒と呼ぶ。
【0017】
本発明の文脈では、懸濁液は、液体媒体（分散相）に分散される粉末化された固体又は小さな不溶性粒子（分散相）によって形成される不均一な混合物である。
【0018】
細胞傷害性薬物増強治療又は補助治療は、細胞傷害性薬物で治療する前にコラゲナーゼで前処理することにより、疾患の経過を改善し、腫瘍細胞を腹腔内化学療法の作用に曝露することによって実際の化学療法効果を増強し、化学療法処置自体によって示される毒性に対する保護効果を提供することを意味すると理解される。
【0019】
説明
まず、本発明は、癌性腹膜炎を治療する目的でコラゲナーゼ酵素溶液を用いて腹膜洗浄を行うことからなる新たな治療方法論を説明し、該腹膜洗浄は、化学療法の腹腔内適用の前に、好ましくはアクセス可能な固形腫瘍の外科的摘出（細胞切除）後に行われなければならない。この意味で、本特許明細書の実施例（実施例１を参照されたい）に示されている実験に基づいて、好ましくは、３０００ｃｃ～５０００ｃｃ（立方センチメートル）の溶液、３７Ｕ／ｍＬ（１ミリリットル当たりの単位）～１４８Ｕ／ｍＬの濃度、５分～４５分の時間間隔、及び３６．５℃～３９℃の平均温度のコラゲナーゼ溶液を用いて癌性腹膜炎に冒されたヒト被験体において腹膜洗浄を行うことは、腹膜表面からの中皮細胞、及び手術中に行われる細胞切除の後に残る可能性のある微視的腫瘍インプラントの完全な剥離を可能にすると結論付けることができる。これにより、全ての腫瘍細胞が腹腔内化学療法の作用に曝露される。さらに、この形態の前処理は、腹膜癒着に作用して、「細胞シェルター」空間にアクセスできるようにするという該前処理の追加の利点を有する。
まず、本発明は、癌性腹膜炎を治療する目的でコラゲナーゼ酵素溶液を用いて腹膜洗浄を行うことからなる新たな治療方法論を説明し、該腹膜洗浄は、化学療法の腹腔内適用の前に、好ましくはアクセス可能な固形腫瘍の外科的摘出（細胞切除）後に行われなければならない。この意味で、本特許明細書の実施例（実施例１を参照されたい）に示されている実験に基づいて、好ましくは、３０００ｃｃ～５０００ｃｃ（立方センチメートル）の溶液、３７Ｕ／ｍＬ（１ミリリットル当たりの単位）～１４８Ｕ／ｍＬの濃度、５分～４５分の時間間隔、及び３６．５℃～３９℃の平均温度のコラゲナーゼ溶液を用いて癌性腹膜炎に冒されたヒト被験体において腹膜洗浄を行うことは、腹膜表面からの中皮細胞、及び手術中に行われる細胞切除の後に残る可能性のある微視的腫瘍インプラントの完全な剥離を可能にすると結論付けることができる。これにより、全ての腫瘍細胞が腹腔内化学療法の作用に曝露される。さらに、この形態の前処理は、腹膜癒着に作用して、「細胞シェルター」空間にアクセスできるようにするという該前処理の追加の利点を有する。
【0020】
この方法は「化学的腹膜切除」と呼ばれ、本発明は、ＨＩＰＥＣ（腹腔内温熱化学療法）又はＰＩＰＡＣ（加圧腹腔内エアロゾル化学療法）（ＨＩＰＥＣ、ＰＩＰＡＣ等）を含む全ての形態の腹腔内化学療法に対してプレコンディショニングと同じものを使用することを提案する。
【0021】
癌性腹膜炎を治療するために行われた実験から得られた結果では、化学療法処置のプレコンディショニングとしてのコラゲナーゼの使用（実施例の表３の群Ｄを参照されたい）が細胞傷害性効果、したがって腹腔内化学療法の治療効果を高めるだけでなく、化学療法処置自体によって示される毒性に対する、この場合はマイトマイシンＣによって示される高い毒性に対する保護効果も提供する。０．１ｍｇのマイトマイシンＣのみで治療された対照群である群Ｂ２の治療を表す表３から導き出されるように、多くの癒着だけでなく壁が菲薄化した血性の器官が観察されることを考えると、これは重要である。さらに、５ｍｇのマイトマイシンのみで治療された対照群である群Ｂ１の剖検では、多くの刺激性及び血性の癒着、並びに薄い器官壁及び血管が観察される。さらに、群Ｅの全ての動物が死亡したことがわかる。言い換えれば、高いマイトマイシンＣ濃度は動物を殺傷し、約０．１ｍｇのマイトマイシンＣの低いマイトマイシンＣ濃度でさえ、多くの癒着だけでなく、菲薄化した血性の壁をもたらす。このデータとは全く対照的に、０．５ｍｇ又は０．１ｍｇのマイトマイシンＣでの治療前にコラゲナーゼによるプレコンディショニングを行った群Ｄの剖検は、全ての動物の生存を示し、癒着はないが、癌腫症は主に腸で高度に局在化して、筋肉及び腎臓にも影響を及ぼすことが観察された。言い換えれば、表３の群Ｂ、群Ｅ、及び群Ｄのデータを比較すると、コラゲナーゼで動物をプレコンディショニングすることで、疾患の経過を改善できるだけでなく、実際の化学療法効果を高めることが観察できるため、コラゲナーゼは、主に癌性腹膜炎を治療する目的で、補助治療又はマイトマイシンＣ等の化学療法処置を増強する治療として、及び化学療法処置自体、この場合はマイトマイシンＣによって示される毒性に対する保護剤として作用する。
【0022】
これらの結果に基づいて、本発明の第１の態様は、固形腫瘍の治療における細胞傷害性薬物増強治療又は補助治療として使用される、溶液又は懸濁液中、任意に凍結乾燥コラゲナーゼを含む組成物を再水和した結果として生じる懸濁液又は溶液中にコラゲナーゼを含む組成物に関し、コラゲナーゼを含む上記組成物は細胞傷害性治療の前に投与され、コラゲナーゼを含む上記溶液又は懸濁液は腫瘍に直接投与又は灌注される。好ましくは、上記細胞傷害性薬物は腫瘍に直接投与又は灌注され、コラゲナーゼを含む上記組成物は細胞傷害性治療の前に投与される。
【0023】
本発明の第１の態様の好ましい実施形態において、固形腫瘍は、好ましくは腹膜腫瘍から、より好ましくは胃腺癌又は癌性腹膜炎からなる群より選択される。
【0024】
本発明の第１の態様の別の好ましい実施形態又はその好ましい実施形態のいずれかにおいて、上記細胞傷害性薬物は、抗生物質（マイトマイシン若しくはマイトマイシンＣ、アントラサイクリン、ブレオマイシン、又はミトラマイシン等）、アルキル化剤、代謝拮抗剤（５－フルオロウラシル等）、プラチナ誘導体（シスプラチン又はカルボプラチン等）、ホルモン（アンドロゲン、抗アンドロゲン薬、及びエストロゲン等）、ドキソルビシン、又はパクリタキセル、インターフェロン、インターロイキン、及びモノクローナル抗体からなる群より選択される。好ましくは、細胞傷害性薬物はマイトマイシン、より好ましくはマイトマイシンＣである。
【0025】
「腫瘍に直接投与又は灌注される」とは、腫瘍が位置する生物の領域又は腔を洗浄することを意味すると理解されることに留意されたい。
【0026】
本発明の第１の態様の別の好ましい実施形態又はその好ましい実施形態のいずれかにおいて、上記組成物は、いかなる器官の関与もなしに腫瘍組織の露出を引き起こすような濃度及び時間で、腫瘍に直接投与又は灌注される。いかなる器官の関与もなしに腫瘍組織の露出を引き起こすような濃度及び時間での上記の腫瘍への直接投与又は灌注は、好ましくは、任意に１０００ｃｃ～１００００ｃｃ、好ましくは３０００ｃｃ～５０００ｃｃの容量で、３７Ｕ／ｍＬ～１４８Ｕ／ｍＬ、好ましくは３７Ｕ／ｍＬ～７４Ｕ／ｍＬのコラゲナーゼ溶液を用いて細胞傷害性薬物の投与に先立って、コラーゲン等のコラゲナーゼ阻害剤を使用する前の２分～４５分間、好ましくは７分～１２分間上記溶液を作用させて行われることに留意されたい。
【0027】
本発明の第１の態様の別の好ましい実施形態又はその好ましい実施形態のいずれかにおいて、上記固形腫瘍は腹膜腫瘍であり、上記組成物は、中間層又は内部層の関与なしに腸管を覆う中皮層の菲薄化を引き起こすような濃度及び時間で腫瘍に直接投与又は灌注される。
【0028】
中間層又は内層の関与なしに、腸管を覆う中皮層の菲薄化を引き起こすような濃度及び時間での上記の腫瘍への直接投与又は灌注は、好ましくは、任意に１０００ｃｃ～１００００ｃｃ、好ましくは３０００ｃｃ～５０００ｃｃの容量で、３７Ｕ／ｍＬ～１４８Ｕ／ｍＬ、好ましくは３７Ｕ／ｍＬ～７４Ｕ／ｍＬのコラゲナーゼ溶液を用いて、細胞傷害性薬物の投与に先立って、コラーゲン等のコラゲナーゼ阻害剤を使用する、又は乳酸リンゲル溶液等の溶液に基づく阻害の前の２分～４５分、好ましくは７分～１２分間上記溶液を作用させて行われることに再度留意されたい。
【0029】
本発明の第２の態様は、１０００ｃｃ～１００００ｃｃ、好ましくは３０００ｃｃ～５０００ｃｃのコラゲナーゼ溶液を平均温度３６．５℃～３９℃でヒト被験体の腹腔に注入するのに適した装置であって、さらに、上記装置が溶液を、好ましくは１Ｌ／分の速度で再循環させるのに適していることを特徴とする、装置に関する。
【0030】
第３の態様は、本発明の第２の態様による装置を備えるキットに関し、該キットは、ヒト被験体の腹腔内で１０００ｃｃ～１００００ｃｃ、好ましくは３０００ｃｃ～５０００ｃｃの容量で２分～４５分間直接腫瘍を灌注する際に、いかなる器官の関与もなしに、腫瘍組織の露出を引き起こすような濃度の任意に凍結乾燥されたコラゲナーゼ組成物を更に備える。好ましくは、溶液中又は懸濁液中の上記再水和コラゲナーゼ組成物又はコラゲナーゼ組成物は、１０００ｃｃ～１００００ｃｃ、好ましくは３０００ｃｃ～５０００ｃｃの容量で、３７Ｕ／ｍＬ～１４８Ｕ／ｍＬ、好ましくは３７Ｕ／ｍＬ～７４Ｕ／ｍＬである。
【0031】
本発明の第４の態様において、本発明の第２又は第３の態様の装置は、該装置に、１０００ｃｃ～１００００ｃｃ、好ましくは３０００ｃｃ～５０００ｃｃの容量で２分～４５分間ヒト被験体の腹腔内で直接腫瘍を灌注する際に、いかなる器官の関与もなしに腫瘍組織の露出を引き起こすような濃度のコラゲナーゼ溶液が事前に装填されていることを特徴とする。好ましくは、上記コラゲナーゼ溶液は、３７Ｕ／ｍＬ～１４８Ｕ／ｍＬ、好ましくは３７Ｕ／ｍＬ～７４Ｕ／ｍＬの濃度の３０００ｃｃ～５０００ｃｃのコラゲナーゼ溶液を含む。
【0032】
本発明の第５の態様は、前述の態様のいずれかによる装置又はキットに関し、上記装置は、本発明の第１の態様又はその好ましい実施形態のいずれかで指定される治療方法論において使用される。
【0033】
先の詳細な態様に加えて、実施例２は、後の使用のためにラットにおける腹膜癒着のモデルを設計するためのアッセイを示す。この目的のため、２つの異なる可能性を、いずれも雄性のＷｉｓｔａｒラットで試験し、４匹の対照（手術していないラット）を使用した。上記２つの場合には、低密度ポリプロピレンメッシュ等の日常の診療で癒着を引き起こすことが証明されている異物を適用することによって癒着を作り出す可能性を検討した。使用したコラゲナーゼの濃度はＰＢＳ中０．０５％、適用時間２０分、容量２０ｍｌ、及びサーマルブランケット内で温度３７℃であり、事前に薬剤をテンパリング（tempering）した。
【0034】
上記アッセイの結果により、コラゲナーゼの使用は癒着の解放に有利であると判断され、さらに、ポリプロピレンメッシュ等の腹膜組織に密接に癒着する既知の能力を有する異質要素の無害な取り出しが達成される。
【0035】
したがって、本発明の第６の態様は、癒着、好ましくは腹部、腹膜若しくは腸の癒着、又は組織間の任意のタイプの術後癒着の解放を支持する治療として使用される溶液又は懸濁液中にコラゲナーゼを含む組成物に関する。本発明の第６の態様の代替の実施形態は、動物又はヒトの組織に密接に癒着する能力を有するメッシュ、特にポリプロピレンメッシュ等の異質要素を、動物又はヒトの体から取り出すことを支持する治療として使用される溶液又は懸濁液中にコラゲナーゼを含む組成物に関する。より詳しくは、手術で使用され、その後組織間に残される材料（メッシュ、縫合糸、プロテーゼ、カテーテル、心臓弁、ペースメーカー等）によって引き起こされる全てのそれらの癒着を取り出し、治療するための組成物である。
【0036】
本発明の第６の態様の特定の実施形態において、コラゲナーゼは、０．０１％～０．１％、より好ましくは０．０４％～０．０６％、更により好ましくは約０．０５％の濃度である。本発明の第６の態様の特定の実施形態において、コラゲナーゼを含む上記組成物を、癒着に直接投与又は灌注する。本発明の第６の態様の別の特定の実施形態において、コラゲナーゼを含む上記組成物は、１０００立方センチメートル～１００００立方センチメートルのコラゲナーゼ溶液を平均温度３６．５℃～３９℃でヒト被験体の腹腔に注入するように適合された装置を介して投与又は灌注され、さらに、上記装置は、好ましくは１Ｌ／分の速度で溶液を再循環するように適合されることを特徴とする。
【0037】
本発明を以下の実施例において解説する。この実施例は本発明を限定するものではないことに留意されたい。
【実施例】
【0038】
実施例１
材料及び方法
ｉｎ ｖｉｔｒｏ研究
Fundacion Jimenez Diazの医薬品研究委員会から承認（ＰＩＣ７５／２０１６＿ＦＪＤ）を得た後、同意書に署名した癌性腹膜炎の患者に由来する組織を収集した。組織片をマルチウェルプレートに入れ、３５Ｕ／ｍＬのコラゲナーゼで３０分間又は２４時間処理した後、培養物を洗浄し、酵素処理から得られた細胞を分析した。着想は、中皮細胞が単独で得られたのか、腫瘍細胞も得られたのかを様々な時間に確認することであった（図１）。
材料及び方法
ｉｎ ｖｉｔｒｏ研究
Fundacion Jimenez Diazの医薬品研究委員会から承認（ＰＩＣ７５／２０１６＿ＦＪＤ）を得た後、同意書に署名した癌性腹膜炎の患者に由来する組織を収集した。組織片をマルチウェルプレートに入れ、３５Ｕ／ｍＬのコラゲナーゼで３０分間又は２４時間処理した後、培養物を洗浄し、酵素処理から得られた細胞を分析した。着想は、中皮細胞が単独で得られたのか、腫瘍細胞も得られたのかを様々な時間に確認することであった（図１）。
【0039】
ｉｎ ｖｉｖｏ研究
アジュバントとしてのコラゲナーゼによる用量／容量／時間の調整に関する研究：
微調整：
マウスに対するコラゲナーゼによる腹膜洗浄の第１の試験：
リポカリン－２遺伝子（好中球動員に影響を与える）及びＡｐｏＥ遺伝子（マウスがアテローム性動脈硬化症を発症する可能性を高める）が除去された５週齢のダブルノックアウト雌性マウス（ＬＩＰＤＫＯ）６匹を使用した。コラゲナーゼの濃度が異なる３本のチューブ：滅菌ＰＢＳ（緩衝液）中、３５０Ｕ／ｍＬ、８７．５Ｕ／ｍＬ、及び３５Ｕ／ｍＬを調製した。各濃度を、体重に応じて２匹のマウスに注射した。
アジュバントとしてのコラゲナーゼによる用量／容量／時間の調整に関する研究：
微調整：
マウスに対するコラゲナーゼによる腹膜洗浄の第１の試験：
リポカリン－２遺伝子（好中球動員に影響を与える）及びＡｐｏＥ遺伝子（マウスがアテローム性動脈硬化症を発症する可能性を高める）が除去された５週齢のダブルノックアウト雌性マウス（ＬＩＰＤＫＯ）６匹を使用した。コラゲナーゼの濃度が異なる３本のチューブ：滅菌ＰＢＳ（緩衝液）中、３５０Ｕ／ｍＬ、８７．５Ｕ／ｍＬ、及び３５Ｕ／ｍＬを調製した。各濃度を、体重に応じて２匹のマウスに注射した。
【0040】
ラットに対するコラゲナーゼによる腹膜洗浄の第１の試験：
腔の容積及び最適な治療時間を微調整して、腔内の器官が損傷を受けないようにする目的で、体重２５０グラムの６週齢のＷｉｓｔａｒラットを２０匹使用し、臨床使用のための３５Ｕ／ｍＬのコラゲナーゼ及び３７Ｕ／ｍＬのコラゲナーゼの種々の濃度で試験した。これまでは全ての研究を実験用途のコラゲナーゼを用いて行ってきたが、製造業者から要求された効力当量計算を考慮して、ここからは臨床使用が許可されたコラゲナーゼを使用することを選択した。次いで、コラゲナーゼによる２分～３０分の種々の治療時間（３０分、２０分、１５分、１０分、５分、及び２分）を使用して研究を実施し、４つの中間時間でｎ＝２を使用した。
腔の容積及び最適な治療時間を微調整して、腔内の器官が損傷を受けないようにする目的で、体重２５０グラムの６週齢のＷｉｓｔａｒラットを２０匹使用し、臨床使用のための３５Ｕ／ｍＬのコラゲナーゼ及び３７Ｕ／ｍＬのコラゲナーゼの種々の濃度で試験した。これまでは全ての研究を実験用途のコラゲナーゼを用いて行ってきたが、製造業者から要求された効力当量計算を考慮して、ここからは臨床使用が許可されたコラゲナーゼを使用することを選択した。次いで、コラゲナーゼによる２分～３０分の種々の治療時間（３０分、２０分、１５分、１０分、５分、及び２分）を使用して研究を実施し、４つの中間時間でｎ＝２を使用した。
【0041】
微調整試験の簡単な概要：
本発明の方法論を微調整するため、種々のコラゲナーゼ酵素用量（３５０Ｕ／ｍＬ、１７５Ｕ／ｍＬ、８７．５Ｕ／ｍＬ、７０Ｕ／ｍＬ、３５Ｕ／ｍＬ、１７．５Ｕ／ｍＬ、８．７５Ｕ／ｍＬ、３．５Ｕ／ｍＬ、及び０％）を、１０分間の腹膜洗浄によってＬＩＰＤＫＯマウスで試験した。培養皿で増殖させた洗浄から得られた細胞、及び種々の濃度で洗浄した後の腹膜組織の形態を分析した。最も適切な用量は３５Ｕ／ｍＬのコラゲナーゼであると決定した。
本発明の方法論を微調整するため、種々のコラゲナーゼ酵素用量（３５０Ｕ／ｍＬ、１７５Ｕ／ｍＬ、８７．５Ｕ／ｍＬ、７０Ｕ／ｍＬ、３５Ｕ／ｍＬ、１７．５Ｕ／ｍＬ、８．７５Ｕ／ｍＬ、３．５Ｕ／ｍＬ、及び０％）を、１０分間の腹膜洗浄によってＬＩＰＤＫＯマウスで試験した。培養皿で増殖させた洗浄から得られた細胞、及び種々の濃度で洗浄した後の腹膜組織の形態を分析した。最も適切な用量は３５Ｕ／ｍＬのコラゲナーゼであると決定した。
【0042】
酵素用量を選択したら、４０分、３０分、２０分、１０分、及び５分の試験によって、同じ方法で同じモデルで操作時間を決定した。この微調整法全体を通して、洗浄液を収集し、完全培地で培養して得られた細胞を分析し、動物の種々の器官も同時に収集して、任意の器官損傷の存在を任意の場面（濃度／時間）に確認し、そして腹膜組織の状態を確認した。
【0043】
最後に、継続的な外部アクセスによる腹膜洗浄（開放洗浄）又は灌流ポンプを備えた閉鎖システムの使用と、手術室で使用されるものと同様の温度制御との間の比較研究を行った。洗浄液の灌流速度及びこの閉鎖システムを備えた収集システムで様々な試験を行った。
【0044】
腹膜発癌モデル
癌性腹膜炎モデルは、同系ＢＤＩＸラットへのＤＨＤ細胞の腹腔内注射によって、２００１年にGarcia Olmo博士らによって微調整された（The site of injection of tumor cells in rats does not influence the subsequent distribution of metastases. Garcia-Olmo DC, Garcia-Rivas M, Garcia-Olmo D, Ontanon J. Oncol Rep. 2003;10(4):903-7.；Orthotopic implantation of colon carcinoma cells provides an experimental model in the rat that replicates the regional spreading pattern of human colorectal cancer. Garcia-Olmo D, Garcia-Rivas M, Garcia-Olmo DC, Atienzar M Cancer Lett. 1998; 23;132(1-2):127-33）。本明細書の図２に見られるように、このモデルは、ヒト偽粘液腫（癌性腹膜炎の一種）を確実に再現する。
癌性腹膜炎モデルは、同系ＢＤＩＸラットへのＤＨＤ細胞の腹腔内注射によって、２００１年にGarcia Olmo博士らによって微調整された（The site of injection of tumor cells in rats does not influence the subsequent distribution of metastases. Garcia-Olmo DC, Garcia-Rivas M, Garcia-Olmo D, Ontanon J. Oncol Rep. 2003;10(4):903-7.；Orthotopic implantation of colon carcinoma cells provides an experimental model in the rat that replicates the regional spreading pattern of human colorectal cancer. Garcia-Olmo D, Garcia-Rivas M, Garcia-Olmo DC, Atienzar M Cancer Lett. 1998; 23;132(1-2):127-33）。本明細書の図２に見られるように、このモデルは、ヒト偽粘液腫（癌性腹膜炎の一種）を確実に再現する。
【0045】
癌腫症を有するラットに対するコラゲナーゼの安全性／有効性試験
「ｉｎ ｖｉｖｏ」モデルの開発。癌性腹膜炎のラットでの第Ｉ相（微調整）
「ｉｎ ｖｉｖｏ」モデルの開発のため、６匹のＢＤＩＸラットで癌腫症を引き起こし、治療を４週間後に提案した。治療は腹膜洗浄によって異なる濃度（３７０Ｕ／ｍＬ、２×１４８Ｕ／ｍＬ、７４Ｕ／ｍＬ、３７Ｕ／ｍＬ、０）のコラゲナーゼを使用することからなり、３匹の動物に対して開放システムで灌流ポンプを使用し、他の３匹の動物にはいかなる灌流ポンプも使用せずに行った（図３）。コラゲナーゼの用量選択は、群の以前の研究によって決定された（微調整中のマウス及びラットでの第１の試験）。接種された６匹の動物のうち、４匹は非常に広範な癌腫症を示し、２匹は軽度の癌腫症を示し、１匹は皮下注射領域の腫瘍のみを示した。腹膜洗浄の方法は、動物に吸入麻酔を与えた後、腹腔を縦切開で露出させ、腹腔を上記の種々の濃度に希釈したコラゲナーゼで満たすことからなった。次いで、腹膜の連続洗浄（乳酸リンゲル溶液のみ）を行い、動物はそれぞれの場合に無作為に選択し、治療を全ての動物で１０分間継続した。
「ｉｎ ｖｉｖｏ」モデルの開発。癌性腹膜炎のラットでの第Ｉ相（微調整）
「ｉｎ ｖｉｖｏ」モデルの開発のため、６匹のＢＤＩＸラットで癌腫症を引き起こし、治療を４週間後に提案した。治療は腹膜洗浄によって異なる濃度（３７０Ｕ／ｍＬ、２×１４８Ｕ／ｍＬ、７４Ｕ／ｍＬ、３７Ｕ／ｍＬ、０）のコラゲナーゼを使用することからなり、３匹の動物に対して開放システムで灌流ポンプを使用し、他の３匹の動物にはいかなる灌流ポンプも使用せずに行った（図３）。コラゲナーゼの用量選択は、群の以前の研究によって決定された（微調整中のマウス及びラットでの第１の試験）。接種された６匹の動物のうち、４匹は非常に広範な癌腫症を示し、２匹は軽度の癌腫症を示し、１匹は皮下注射領域の腫瘍のみを示した。腹膜洗浄の方法は、動物に吸入麻酔を与えた後、腹腔を縦切開で露出させ、腹腔を上記の種々の濃度に希釈したコラゲナーゼで満たすことからなった。次いで、腹膜の連続洗浄（乳酸リンゲル溶液のみ）を行い、動物はそれぞれの場合に無作為に選択し、治療を全ての動物で１０分間継続した。
【0046】
全ての場合に、組織学的研究のために、洗浄した組織試料及び器官を収集した（図４）。
【0047】
癌腫症を有するラットに対するコラゲナーゼ＋化学療法剤の安全性に関する試験
化学療法剤のコアジュバントとしてのコラゲナーゼの用量の調整
参照される本発明の実施例に記載される実験を行う前に、本発明を実施するため、規定の時間及び用量でのコラゲナーゼによる治療の安全性を作業の第１段階で試験した。
化学療法剤のコアジュバントとしてのコラゲナーゼの用量の調整
参照される本発明の実施例に記載される実験を行う前に、本発明を実施するため、規定の時間及び用量でのコラゲナーゼによる治療の安全性を作業の第１段階で試験した。
【0048】
その後、規定の用量、濃度、及び時間のコラゲナーゼ溶液で、主に癌性腹膜炎を治療する目的で、マイトマイシンＣによる化学療法処置のコアジュバント又は増強剤としての治療の安全性を試験した。今日、術中化学療法処置の間に腹膜洗浄を行うため、様々な細胞傷害剤が使用されているが、マイトマイシンＣが最も一般的に使用される細胞傷害性薬物であり、最も高い有効性を示すという証明がなされている。
【0049】
この意味で、全ての動物にＤＨＤ細胞を接種した後、したがって腹膜に固形腫瘍（癌性腹膜炎）を誘発した後、様々な作業群においてマイトマイシンＣによる化学療法処置のコアジュバント又は増強剤としてコラゲナーゼを使用するための安全性の観点でコラゲナーゼの最適な用量を決定した。
【0050】
対照群：乳酸リンゲル溶液のみで洗浄。中胚葉は容易に分離し、洗浄は非血性である。緻密な大網。
群１：３７０Ｕ／ｍＬのコラゲナーゼ。血性洗浄液、大網及び中胚葉の破壊。洗浄液中の腫瘍片。
群２：１４８Ｕ／ｍＬのコラゲナーゼ。わずかに血性の洗浄液、容易に分離可能な大網及び中胚葉。洗浄液中に固形腫瘍片が観察される。
群３：７４Ｕ／ｍＬのコラゲナーゼ。非血性洗浄液、容易に分離可能な大網及び中胚葉。洗浄液にはインプラントはほとんど観察されないが、中胚葉及び大網の腫瘍インプラントのアクセス可能性は絶対的である。
群４：３７Ｕ／ｍＬのコラゲナーゼ。非血性洗浄液、容易に分離可能な大網及び中胚葉。洗浄液には腫瘍インプラントは観察されないが、中胚葉及び大網の両方で完全に露出しているように見える。
群１：３７０Ｕ／ｍＬのコラゲナーゼ。血性洗浄液、大網及び中胚葉の破壊。洗浄液中の腫瘍片。
群２：１４８Ｕ／ｍＬのコラゲナーゼ。わずかに血性の洗浄液、容易に分離可能な大網及び中胚葉。洗浄液中に固形腫瘍片が観察される。
群３：７４Ｕ／ｍＬのコラゲナーゼ。非血性洗浄液、容易に分離可能な大網及び中胚葉。洗浄液にはインプラントはほとんど観察されないが、中胚葉及び大網の腫瘍インプラントのアクセス可能性は絶対的である。
群４：３７Ｕ／ｍＬのコラゲナーゼ。非血性洗浄液、容易に分離可能な大網及び中胚葉。洗浄液には腫瘍インプラントは観察されないが、中胚葉及び大網の両方で完全に露出しているように見える。
【0051】
この段階での外科的処置は、ＤＨＤ細胞を腹膜に注射し、腹部触診により腹膜における腫瘍塊の存在を確認するまで、６週間～８週間経過させた腹膜癌誘発の第１の方法、及び動物に吸入麻酔を与えた後、腹腔を腹部の縦切開によって露出させ、３７℃で（各動物が対応する群に応じて）試験対象の種々の濃度のコラゲナーゼ溶液で腹腔を満たして、腹膜を手で１０分間穏やかに振蕩し続けながら連続的に洗浄した第２の治療法からなった（動物はそれぞれの場合に無作為に選択された）。
【0052】
異なる治療に関する癌腫症を有するラットの生存の分析
この段階の間、マイトマイシンＣ等の化学療法剤による腹膜腫瘍の治療におけるコラゲナーゼのコアジュバント又は増強の役割について学ぶために、様々な作業群及びサブグループで一連の生存実験を確立した。
この段階の間、マイトマイシンＣ等の化学療法剤による腹膜腫瘍の治療におけるコラゲナーゼのコアジュバント又は増強の役割について学ぶために、様々な作業群及びサブグループで一連の生存実験を確立した。
【0053】
【表1】
【0054】
この段階での外科的処置は、動物に吸入麻酔を与えた後、腹腔を縦切開で露出させること、（各動物が対応する群に応じて）３７℃で、乳酸リンゲル溶液で希釈された３７Ｕ／ｍＬのコラゲナーゼ溶液、又は乳酸リンゲル溶液若しくはマイトマイシンＣ溶液で腹腔を満たすこと、及び手で穏やかに振蕩し続けながら腹膜を連続的に洗浄することからなり、動物はそれぞれの場合に無作為に選択され、治療は全ての動物で１０分間継続した。
【0055】
手順は、ＴＣＱ群で２回行われ、１回目はコラゲナーゼを用い、２分後、試験対象の種々の濃度のマイトマイシンＣで腹膜洗浄を繰り返した。全ての場合に、組織学的研究のため、洗浄した組織試料及び器官を収集した。また、動物を屠殺する前に全ての動物から血液を収集し、取り出した後１時間以内に血液を処理して血漿を得て、一方で変異型ＫＲＡＳ癌遺伝子（ＤＨＤ細胞により発現されるエクソン１のコドン１２中の変異）の存在、もう一方で腹膜洗浄後の血液中のコラゲナーゼ痕跡又は残留物の存在を分析した。ＫＲＡＳ癌遺伝子局在化研究にはデジタルＰＣＲを使用した。コラゲナーゼ痕跡研究のため、匿名化された試料を、特異的抗ＭＭＰ－１及び抗ＭＭＰ－２ ＥＬＩＳＡの実施のためLyposmol研究所に送った。
【0056】
各群は当初、６匹のラット（２×３）からなった。初期設計では、１５日後に３匹の動物を屠殺し、残りは動物が屠殺する必要がある状態になるまで（皮下腫瘍の成長が直径０．５ｃｍ超）、又は最大２ヶ月間放置した。行った試験は、データ収集表に従った毎日の動物管理；屠殺時の血漿を得るための採血；及び腹壁、小腸、大腸（上行、横行、及び下行）、肝臓、脾臓、腎臓、及び大網の組織学的研究からなった。それにもかかわらず、残念ながら、ＤＨＤを注射した全ての動物が癌腫症を引き起こしたわけではなく、全ての動物が提案された時間を生き延びたわけではなかったため、全ての群で初期設計に従うことはできなかった。
【0057】
結果
これまで、以下の重大な結果が得られた。
これまで、以下の重大な結果が得られた。
【0058】
マウスに対するコラゲナーゼによる腹膜洗浄の第１の試験：
「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」の結果から、コラゲナーゼは、３５Ｕ／ｍＬの濃度で組織の端部を破壊し、中皮細胞を解放して、腫瘍の血管新生を制限すると推定された。より長い酵素時間は、より多くの細胞の解放及びより大きな組織損傷につながる。さらに、時間が４５分を超えると組織が損傷し、取り出された細胞の生存率が阻害されることが観察された（図１）。
「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」の結果から、コラゲナーゼは、３５Ｕ／ｍＬの濃度で組織の端部を破壊し、中皮細胞を解放して、腫瘍の血管新生を制限すると推定された。より長い酵素時間は、より多くの細胞の解放及びより大きな組織損傷につながる。さらに、時間が４５分を超えると組織が損傷し、取り出された細胞の生存率が阻害されることが観察された（図１）。
【0059】
幾つかの「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」試験の後に到達した主な結論は、コラゲナーゼの最適濃度は３５Ｕ／ｍＬであり、最適時間は３０分であるということである。時間又は濃度のかなりの増加は、「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」で細胞に高い割合で損傷を引き起こす。
【0060】
下の表に示すように、種々の用量のコラゲナーゼを投与してから３０分後のマウスでの第Ｉ段階（微調整）の間の「ｉｎ ｖｉｖｏ」の結果から、マウス５及びマウス６（最も高い用量を受けた）は無気力であり、痛みの兆候を示し、取り扱いに対する反応が非常に低下したことを観察することができる。腹壁が脱離しているのも肉眼で確認できた。さらに、３５Ｕ／ｍＬのコラゲナーゼを受けたマウスの１匹は、取り扱いによく反応したが、痛みの兆候を示した。最高用量のコラゲナーゼを用いたマウスは１時間以内に死亡した。鎮痛剤を用いて残りの動物を２４時間放置した。
【0061】
【表2】
【0062】
微調整段階の剖検の結果を以下に要約する：
コラゲナーゼ８７．５Ｕ／ｍＬの用量を用いたマウス：皮膚から完全に剥がれ、触れると自然に破裂する、血液性で実質的に透明な腹壁。腹膜洗浄はＰＳＳ（生理食塩水、０．９％塩化ナトリウム）で行い、洗浄した生成物をＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１％Ｐ／Ｓが入ったペトリ皿（Ｐ１００）に播種する。６時間後に顕微鏡下で皿を観察すると、細胞が皿に付着しているのが見られ、大量の赤血球も見られる。全ての腹部器官を摘除する。器官をつなぐ全ての構造が弱くなったか、又は存在しなかったかのように、摘除の際に器官は非常に簡単に互いに分離することがわかる。
コラゲナーゼ３５Ｕ／ｍＬの用量を用いたマウス：自然に破裂する非常に薄い血性腹壁。非常に容易な器官の摘除。
１７．５Ｕ／ｍＬ及び８．７５Ｕ／ｍＬの用量を用いたマウス：マウスの１匹は、菲薄化が最も少ない、幾分血性の腹壁を示す。腸腫瘤全体が固定されており、切除するのにより多くの労力が必要である。もう一方のマウスは、正常な外観及び色の腹壁を持つ。腸腫瘤はしっかりと固定されている。摘除した全ての器官（腹膜、膀胱、子宮、大腸、小腸、胃、脾臓、肝臓、腎臓、及び大血管）を、その後の解剖病理学研究のためにホルムアルデヒド中に保管する。
コラゲナーゼ８７．５Ｕ／ｍＬの用量を用いたマウス：皮膚から完全に剥がれ、触れると自然に破裂する、血液性で実質的に透明な腹壁。腹膜洗浄はＰＳＳ（生理食塩水、０．９％塩化ナトリウム）で行い、洗浄した生成物をＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１％Ｐ／Ｓが入ったペトリ皿（Ｐ１００）に播種する。６時間後に顕微鏡下で皿を観察すると、細胞が皿に付着しているのが見られ、大量の赤血球も見られる。全ての腹部器官を摘除する。器官をつなぐ全ての構造が弱くなったか、又は存在しなかったかのように、摘除の際に器官は非常に簡単に互いに分離することがわかる。
コラゲナーゼ３５Ｕ／ｍＬの用量を用いたマウス：自然に破裂する非常に薄い血性腹壁。非常に容易な器官の摘除。
１７．５Ｕ／ｍＬ及び８．７５Ｕ／ｍＬの用量を用いたマウス：マウスの１匹は、菲薄化が最も少ない、幾分血性の腹壁を示す。腸腫瘤全体が固定されており、切除するのにより多くの労力が必要である。もう一方のマウスは、正常な外観及び色の腹壁を持つ。腸腫瘤はしっかりと固定されている。摘除した全ての器官（腹膜、膀胱、子宮、大腸、小腸、胃、脾臓、肝臓、腎臓、及び大血管）を、その後の解剖病理学研究のためにホルムアルデヒド中に保管する。
【0063】
ラットに対するコラゲナーゼによる腹膜洗浄の第１の試験：
ラットでの「ｉｎ ｖｉｖｏ」微調整試験の当初の結果から、３５Ｕ／ｍＬのコラゲナーゼの濃度が提案された目的に理想的であり、最良の治療時間は１０分～１５分であると推定され、その後、腸及び大網を覆う中皮細胞の除去が観察されるが、腸管を含むいかなる器官も関与していない。上記の濃度及び時間での組織学的研究は、中間層又は内層の関与なしに腸管を覆う中皮層の菲薄化を実証し、これは、いかなる器官の関与もなしに腫瘍組織を露出することと同等であると理解される。腹腔と相互作用した残りの器官は影響を受けず、腹腔壁の菲薄化は１つの研究でのみ観察されたが、動物を損なうことなくその後の生存率が確認された（図４）。
ラットでの「ｉｎ ｖｉｖｏ」微調整試験の当初の結果から、３５Ｕ／ｍＬのコラゲナーゼの濃度が提案された目的に理想的であり、最良の治療時間は１０分～１５分であると推定され、その後、腸及び大網を覆う中皮細胞の除去が観察されるが、腸管を含むいかなる器官も関与していない。上記の濃度及び時間での組織学的研究は、中間層又は内層の関与なしに腸管を覆う中皮層の菲薄化を実証し、これは、いかなる器官の関与もなしに腫瘍組織を露出することと同等であると理解される。腹腔と相互作用した残りの器官は影響を受けず、腹腔壁の菲薄化は１つの研究でのみ観察されたが、動物を損なうことなくその後の生存率が確認された（図４）。
【0064】
試料の解剖病理学レポート：
ラット１。菲薄化は外筋壁で観察され、幾つかの局所的な最小の損傷が或る特定の領域で観察される。腸を取り巻く脂肪細胞は確かに破壊されている。
ラット２。腸壁は幾分薄いが、損傷は見らない。
ラット４。正常に見える。
ラット５。最も損傷を受けたラット。外筋層には、損傷及び糜爛の幾つかの病巣ポイントがある。
ラット１。菲薄化は外筋壁で観察され、幾つかの局所的な最小の損傷が或る特定の領域で観察される。腸を取り巻く脂肪細胞は確かに破壊されている。
ラット２。腸壁は幾分薄いが、損傷は見らない。
ラット４。正常に見える。
ラット５。最も損傷を受けたラット。外筋層には、損傷及び糜爛の幾つかの病巣ポイントがある。
【0065】
図２に見られるように、腸切片における剥離細胞の増加は、ラット３及びラット５（それぞれ７０Ｕ／ｍＬ及び８７．５Ｕ／ｍＬ）の場合にのみ観察され、それにもかかわらず腸の内層（粘膜下組織、粘膜、及び上皮）は全く影響を受けないが、８７．５Ｕ／ｍＬの濃度は、腸陰窩に影響を与えることなく、実際に粘膜下組織を局所的に破壊し、群２及び群４（８．７５Ｕ／ｍＬ及びリンゲル液）のラットの場合、外筋層の剥離は事実上存在せず、それらの濃度及び選択した時間で影響が生じないことを示している。
【0066】
ラットに対するこの微調整法の第２の評定可能な結果は、製造業者の指示に従って、解剖病理学的研究、並びに動物及びそれらの腹膜器官の巨視的研究で得られた同一の結果を考慮して、実験用コラゲナーゼ及び臨床用コラゲナーゼの間の同等性を計算及び検証したことである。
【0067】
癌性腹膜炎を発生させるためのモデル：
癌性腹膜炎モデルを微調整するための研究において、同系ＢＤＩＸラットにＤＨＤ細胞を注射した後の癌性腹膜炎の発生は、全ての場合で８０％成功した。
癌性腹膜炎モデルを微調整するための研究において、同系ＢＤＩＸラットにＤＨＤ細胞を注射した後の癌性腹膜炎の発生は、全ての場合で８０％成功した。
【0068】
異なる治療に関する癌腫症を有するラットの生存分析
濃度及び癌腫症モデルを生成したら、上記の表１に列挙された群に従って、コラゲナーゼによる治療とマイトマイシンＣによる治療とを関連付けることにより安全性研究を実施した。文献では同等性は５ｍｇ／動物のマイトマイシンＣの用量を推奨しているが、本著者らによって行われた最初の試験が、エンドポイント基準に達し、適切な鎮痛プロトコルにもかかわらず屠殺しなければならなかった動物の数が多かったことを指摘することは重要である。この理由で、群Ｄでは用量を０．５ｍｇ／動物及び０．１ｍｇ／動物に下げた。このようにして、適切な鎮痛プロトコルを用いると、動物は場合によっては２週間まで生存することができた。
濃度及び癌腫症モデルを生成したら、上記の表１に列挙された群に従って、コラゲナーゼによる治療とマイトマイシンＣによる治療とを関連付けることにより安全性研究を実施した。文献では同等性は５ｍｇ／動物のマイトマイシンＣの用量を推奨しているが、本著者らによって行われた最初の試験が、エンドポイント基準に達し、適切な鎮痛プロトコルにもかかわらず屠殺しなければならなかった動物の数が多かったことを指摘することは重要である。この理由で、群Ｄでは用量を０．５ｍｇ／動物及び０．１ｍｇ／動物に下げた。このようにして、適切な鎮痛プロトコルを用いると、動物は場合によっては２週間まで生存することができた。
【0069】
表３に示すように、種々の治療に関連する巨視的及び生存の結果。
【0070】
【表3】
【0071】
以下は、表３に列挙されている結果の概要と見なすことができる。
群Ａ（コラゲナーゼ）：５匹中４匹が生存し、１匹は内臓摘出のために手術後に死亡した。
群Ｂ（種々の用量のマイトマイシン）。大量の連続鎮痛（トラマドールＳＣ／１２時間で２日間、ブプレクス＋ミダゾラムＳＣ／１２時間で１週間）にもかかわらず、動物は高用量（５ｍｇ／動物）では２週間を超えて生存することができず、動物は常に無気力であり、ほとんど活動を示さない。低用量（０．１ｍｇ／動物）では、高用量の動物と比較するために１週目に１匹の動物を屠殺するが、残りは試験が終了するまで生存する。この低用量群の１週目に大量の鎮痛剤が必要であることを指摘しなければならない。
群Ｃ（ＤＨＤ）：文献のデータによる通常の動物の進行があり、動物を適切な時期に屠殺する。
群Ｄ（ＤＨＤ＋コラゲナーゼ＋マイトマイシン）：２つの濃度（０．５ｍｇ／動物及び０．１ｍｇ／動物）のマイトマイシンを使用し、最初の動物を１週間後の適切な時間に屠殺し、残りを２週間後に屠殺する。これらの屠殺時間は、動物の状態が悪化しているためではなく、腸の構造を群Ｂの動物と比較する必要があるために選択される。
群Ｅ（ＤＨＤ＋マイトマイシン５ｍｇ／動物）。この群は生成された最初の動物群であり、追跡期間全体を通して大量の鎮痛剤が使用されたにもかかわらず、エンドポイント基準のために全ての動物を屠殺しなければならなかった。動物の半数は、おそらく５ｍｇの用量での腹腔内マイトマイシンの影響のために、手術後の最初の夜に死んでいるのが発見された。
群Ｆ（ＤＨＤ＋コラゲナーゼ）：異なる動物を１ヶ月後及び２ヶ月後に屠殺する（動物モニタリングプロトコルによると痛みの兆候は観察されない）。
群Ａ（コラゲナーゼ）：５匹中４匹が生存し、１匹は内臓摘出のために手術後に死亡した。
群Ｂ（種々の用量のマイトマイシン）。大量の連続鎮痛（トラマドールＳＣ／１２時間で２日間、ブプレクス＋ミダゾラムＳＣ／１２時間で１週間）にもかかわらず、動物は高用量（５ｍｇ／動物）では２週間を超えて生存することができず、動物は常に無気力であり、ほとんど活動を示さない。低用量（０．１ｍｇ／動物）では、高用量の動物と比較するために１週目に１匹の動物を屠殺するが、残りは試験が終了するまで生存する。この低用量群の１週目に大量の鎮痛剤が必要であることを指摘しなければならない。
群Ｃ（ＤＨＤ）：文献のデータによる通常の動物の進行があり、動物を適切な時期に屠殺する。
群Ｄ（ＤＨＤ＋コラゲナーゼ＋マイトマイシン）：２つの濃度（０．５ｍｇ／動物及び０．１ｍｇ／動物）のマイトマイシンを使用し、最初の動物を１週間後の適切な時間に屠殺し、残りを２週間後に屠殺する。これらの屠殺時間は、動物の状態が悪化しているためではなく、腸の構造を群Ｂの動物と比較する必要があるために選択される。
群Ｅ（ＤＨＤ＋マイトマイシン５ｍｇ／動物）。この群は生成された最初の動物群であり、追跡期間全体を通して大量の鎮痛剤が使用されたにもかかわらず、エンドポイント基準のために全ての動物を屠殺しなければならなかった。動物の半数は、おそらく５ｍｇの用量での腹腔内マイトマイシンの影響のために、手術後の最初の夜に死んでいるのが発見された。
群Ｆ（ＤＨＤ＋コラゲナーゼ）：異なる動物を１ヶ月後及び２ヶ月後に屠殺する（動物モニタリングプロトコルによると痛みの兆候は観察されない）。
【0072】
このデータに基づいて、化学療法処置のためのプレコンディショニングとしてコラゲナーゼを使用することが（群Ｄ）、どのようにして使用する化学療法剤（この場合はマイトマイシンＣ）の濃度を大幅に下げて同様の解剖病理学的結果を得るのか注目される。０．１ｍｇのマイトマイシンを用いる群Ｂ２の治療を表す表３に見られるように、多くの癒着だけでなく菲薄化した血性の壁を有する器官が観察されることを考えると、これは非常に重要である。さらに、５ｍｇのマイトマイシンで治療された群Ｂ１の剖検では、多くの刺激性及び血性の癒着、並びに薄い器官壁及び血管が観察される。さらに、群Ｅの全ての動物が死亡したことがわかる。言い換えれば、高いマイトマイシン濃度は動物を殺傷し、０．１ｍｇのマイトマイシンＣの濃度は、多くの癒着だけでなく、菲薄化した血性の壁をもたらす。このデータとは全く対照的に、０．５ｍｇのマイトマイシンでの治療前にコラゲナーゼによるプレコンディショニングを行った群Ｄの剖検は、全ての動物の生存を示し、癒着はないが、癌腫症は主に腸で高度に局在化して、筋肉及び腎臓にも影響を及ぼすことが観察された。言い換えれば、表３のＢ及びＤのデータを比較すると、コラゲナーゼで動物をプレコンディショニングすることで、疾患の経過を改善できるだけでなく、実際の化学療法効果を高めることが観察できるため、コラゲナーゼは、主に癌性腹膜炎を治療する目的で、マイトマイシンＣ等の化学療法処置の補助治療として、及び化学療法処置自体、この場合はマイトマイシンＣによって示される毒性に対する保護剤として作用する。
【0073】
さらに、異なる群の動物から得られた血漿試料を分析した。
【0074】
収集される血漿及びその状態を表４に示す。
【0075】
【表4】
【0076】
デジタルＰＣＲによって異なる群の血液中の変異型ＫＲＡＳの存在を分析するために、製造業者のデータに従ってＱＩＡａｍｐ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄキットにより少なくとも２ｍｌの血漿／群からＤＮＡを抽出し、結果は表４に収載されているものである。図６は、群Ｃ（陽性対照）並びに種々の治療のうち血漿中に陽性の変異型ＫＲＡＳがあると見なすことができる唯一の群である群Ｅについて得られたグラフを示す。
【0077】
【表5】
【0078】
治療及び追跡期間後に動物の血液中にコラゲナーゼ残留物が残っているかどうかを確認するためのＥＬＩＳＡの結果は、ＭＭＰ－１及びＭＭＰ－２の両方についていずれも陰性であった。
【0079】
結論：
設計された方法は、実行可能で、安全で、再現性がある。
生成された製品は、化学的／酵素的なスカルペル（手術用ナイフ）として示される。
研究で開発された最適な濃度及び時間では、組織学的に器官又は組織の障害は観察されない。
治療後に生き残った唯一の動物は、障害も疼痛も示さなかった。
設計された方法は、実行可能で、安全で、再現性がある。
生成された製品は、化学的／酵素的なスカルペル（手術用ナイフ）として示される。
研究で開発された最適な濃度及び時間では、組織学的に器官又は組織の障害は観察されない。
治療後に生き残った唯一の動物は、障害も疼痛も示さなかった。
【0080】
実施例２
癒着の除去におけるコラゲナーゼの有効性
このアッセイの目的は、後で使用するためにラットの腹膜癒着のモデルを設計することであった。そのため、いずれも雄性のＷｉｓｔａｒラットで２つの異なる可能性を試験した。４匹の対照（手術されていないラット）を使用した。
癒着の除去におけるコラゲナーゼの有効性
このアッセイの目的は、後で使用するためにラットの腹膜癒着のモデルを設計することであった。そのため、いずれも雄性のＷｉｓｔａｒラットで２つの異なる可能性を試験した。４匹の対照（手術されていないラット）を使用した。
【0081】
上記２つの場合には、低密度ポリプロピレンメッシュ等の日常の診療で癒着を引き起こすことが証明されている異物を適用することによって癒着を作り出す可能性を検討した。使用したコラゲナーゼの濃度はＰＢＳ中０．０５％、適用時間２０分、容量２０ｍｌ、及びサーマルブランケット内で温度３７℃であり、事前に薬剤をテンパリングした。
【0082】
このデータで、わずかに引っ張ると癒着を解放する際のコラゲナーゼの有効性を見ることができた。他の関連する知見は、治療の適用時に現れる膵臓反応である。
【0083】
実験の第１段階
低密度ポリプロピレンメッシュの小片の適用
最初の群（群１）に属する合計１０匹のラットのうち５匹の６週齢のＷｉｓｔａｒラットの介入。フォーレンによる事前の吸入麻酔、動物の剃毛、及び無菌対策を実施し、皮膚及び腹壁に最小限の開口部を作り、正中線の両側に５つずつ、ポリプロピレンメッシュの小片を１０個移植する。ポリプロピレンメッシュは、事前にｐｓｓ（生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ））で湿らせた０．５ｃｍ２の小片に切断されている。
低密度ポリプロピレンメッシュの小片の適用
最初の群（群１）に属する合計１０匹のラットのうち５匹の６週齢のＷｉｓｔａｒラットの介入。フォーレンによる事前の吸入麻酔、動物の剃毛、及び無菌対策を実施し、皮膚及び腹壁に最小限の開口部を作り、正中線の両側に５つずつ、ポリプロピレンメッシュの小片を１０個移植する。ポリプロピレンメッシュは、事前にｐｓｓ（生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ））で湿らせた０．５ｃｍ２の小片に切断されている。
【0084】
手術の前に、トラマドール５ｍｇ／ｋｇ及びセファゾリン３０ｍｇ／ｋｇを投与する。適切な容量を投与するために希釈を行う必要がある。
【0085】
毎日の体重管理及び皮下トラマドール投与の追跡。
【0086】
その後（最初の介入の２日後）、群１の残りの５匹のＷｉｓｔａｒラットに介入を行い、体重及び創傷の進行を同じように追跡し、次の７２時間にわたり鎮痛剤を投与する。
【0087】
約１ヶ月後、第２の群（群ＩＩ）に属する６匹の追加の６週齢のＷｉｓｔａｒラットに介入を行う。フォーレンによる吸入麻酔、動物の剃毛、及び無菌対策の実施後、開腹術を行い、正中線の両側に２つずつ、腹腔内に４つのポリプロピレンメッシュを移植する。移植前に、メッシュをｐｓｓで濡らす。
【0088】
２４時間ごとに７２時間皮下トラマドールを投与して、翌日にラットの追跡を行う。
【0089】
実験の第２段階
腹腔内プロテーゼの適用から４ヶ月後、実験の最終段階のため動物を再び手術する。その前に採血する。まず、群１に属するラットで実験を行う。研究をペア及び単盲検（研究者）で無作為化する。検査技師は使用された溶液を知っているが、それが何であるかについては述べない。次に、手術したラットのそれぞれで得られた結果を収集する：
腹腔内プロテーゼの適用から４ヶ月後、実験の最終段階のため動物を再び手術する。その前に採血する。まず、群１に属するラットで実験を行う。研究をペア及び単盲検（研究者）で無作為化する。検査技師は使用された溶液を知っているが、それが何であるかについては述べない。次に、手術したラットのそれぞれで得られた結果を収集する：
【0090】
１． Ｒ１３、２９５ｇ：ディクテーション：「肉眼ではメッシュは見られない。盲腸の腸間膜及び回腸末端には、折り返された領域があり、明らかにメッシュ小片を含む。腹壁の閉鎖への癒着なし。非外傷性エントリ。」
未知の溶液（ＰＢＳ）を３７℃で２０分間投与。
ディクテーション：「腹腔を四分円で体系的に確認し、そこに触診によって判断したメッシュ片を含む脂肪凝集体が見つかる。アクセス可能なメッシュが見つからず、内臓損傷のリスクがあるため、試料を取り出さない。」
未知の溶液（ＰＢＳ）を３７℃で２０分間投与。
ディクテーション：「腹腔を四分円で体系的に確認し、そこに触診によって判断したメッシュ片を含む脂肪凝集体が見つかる。アクセス可能なメッシュが見つからず、内臓損傷のリスクがあるため、試料を取り出さない。」
【0091】
２． Ｒ１４、２６８ｇ：ディクテーション：「脾臓の腹膜に癒着した２つのメッシュと、大網及び卵巣脂肪（左腸骨窩）に癒着したメッシュが認められる。回腸末端及び結腸にはない。小腸の相互及び肝臓へのしっかりとした癒着、おそらくメッシュに続発するものであるが、肝臓の出血リスクにより取り出すことができないため、確認できない。右腸骨窩には、その内部にメッシュが付いた丸まった卵巣脂肪がある。別のメッシュによる卵巣脂肪の壁へのしっかりとした癒着。」
未知の溶液（ＰＢＳ）を３７℃で２０分間投与する。
ディクテーション：「メッシュは、損傷を与えることなく穏やかに引っ張ると解放できないことが認められるため、試料を収集しない。」
未知の溶液（ＰＢＳ）を３７℃で２０分間投与する。
ディクテーション：「メッシュは、損傷を与えることなく穏やかに引っ張ると解放できないことが認められるため、試料を収集しない。」
【0092】
３． Ｒ１１、２９４ｇ；ディクテーション：「非外傷性エントリ。壁への癒着なし。右季肋部には、メッシュ片を含む大網を伴う腸ループの球がある。その領域で少なくとも２つの球が観察される。盲腸は折り返されて拡張している。左季肋部にはない。メッシュは骨盤脂肪に含まれる。」
２０ｍｌの未知の溶液（ＰＢＳ中の０．０５％コラゲナーゼ）を２０分間加える。
ディクテーション：季肋部ループの球の１つをわずかに引っ張ると壊れて、メッシュ（３）の幾つかの断片が解放され、これをホルマリンに導入する。
２０ｍｌの未知の溶液（ＰＢＳ中の０．０５％コラゲナーゼ）を２０分間加える。
ディクテーション：季肋部ループの球の１つをわずかに引っ張ると壊れて、メッシュ（３）の幾つかの断片が解放され、これをホルマリンに導入する。
【0093】
４． Ｒ１２、２８４ｇ：ディクテーション：「非外傷性エントリ。壁への癒着なし。右季肋部には、治療を加える前に摘除された、汚染されたように見えるメッシュ片がある。その手触りにより、メッシュを含む可能性のある圧縮された脂肪が下腹部で観察される。腔の残りの部分ではメッシュ片は観察されない。」
２０ｍｌの未知の溶液（ＰＢＳ中の０．０５％コラゲナーゼ）を２０分間加える。
ディクテーション：「洗浄後、大網に見られるメッシュはわずかに引っ張るとすぐに解放される。恥骨上脂肪の別のメッシュは、脂肪凝集体を損傷することなく切り離され（dissected and released）、６片のメッシュがデジタル解剖で出血することなく解放される。」
２０ｍｌの未知の溶液（ＰＢＳ中の０．０５％コラゲナーゼ）を２０分間加える。
ディクテーション：「洗浄後、大網に見られるメッシュはわずかに引っ張るとすぐに解放される。恥骨上脂肪の別のメッシュは、脂肪凝集体を損傷することなく切り離され（dissected and released）、６片のメッシュがデジタル解剖で出血することなく解放される。」
【0094】
５． Ｒ１５、３０９ｇ：ディクテーション：「非外傷性エントリ。右季肋部にはメッシュの残留物は見られない。露出したメッシュのない脂肪凝集体は、卵巣及び子宮内膜に隣接して見られる。左季肋部では、盲腸及び小腸に隣接して脂肪凝集体がある。大網に付着した２つの部分的に露出したメッシュを見ることができる。下腹部の脂肪には、露出していない、該脂肪に含まれるメッシュが見られる。」
２０ｍｌの未知の溶液（ＰＢＳ）を２０分間加える。
ディクテーション：「右季肋部では、露出したメッシュは見られない。メッシュは、ループを損傷することなく、わずかに引っ張ると脱離する。以前に見られた脂肪凝集体が見つかり、弱く引っ張って分離しようとしたが、メッシュは見られなかった。出血の開始に応じて、左季肋部に切り替えた。盲腸に隣接する前述のメッシュは、実際には完全に解放されることなく、強く引っ張ると幾らかは脱離する。より大きな力で引っ張ることにより、メッシュを取り出した。腸のループに折り返されたメッシュを弱く引っ張って解放しようとする。脂肪が壊れてメッシュが解放される。３つ目のメッシュは盲腸及び回腸末端の凝集体から解放される。下腹部に、強く引っ張ると外れる１つ目のメッシュを確認した。２つ目のメッシュがその領域に見られ、これも解放されるが、多くの力を加えなくてはならない。」
２０ｍｌの未知の溶液（ＰＢＳ）を２０分間加える。
ディクテーション：「右季肋部では、露出したメッシュは見られない。メッシュは、ループを損傷することなく、わずかに引っ張ると脱離する。以前に見られた脂肪凝集体が見つかり、弱く引っ張って分離しようとしたが、メッシュは見られなかった。出血の開始に応じて、左季肋部に切り替えた。盲腸に隣接する前述のメッシュは、実際には完全に解放されることなく、強く引っ張ると幾らかは脱離する。より大きな力で引っ張ることにより、メッシュを取り出した。腸のループに折り返されたメッシュを弱く引っ張って解放しようとする。脂肪が壊れてメッシュが解放される。３つ目のメッシュは盲腸及び回腸末端の凝集体から解放される。下腹部に、強く引っ張ると外れる１つ目のメッシュを確認した。２つ目のメッシュがその領域に見られ、これも解放されるが、多くの力を加えなくてはならない。」
【0095】
６． Ｒ１６、２５７ｇ：ディクテーション：「非外傷性エントリ。腹腔にアクセスすると、脾臓の側面に大網に含まれたメッシュが見られる。右季肋部にはメッシュの残留物は見られず、脂肪にメッシュの残留物が含まれている可能性もない。左側腹部には、目に見える少なくとも１つのメッシュを含むループの球が観察される。ループの奥深くにメッシュがある可能性がある。下腹部では、卵巣脂肪と共にループの球が見られ、少なくとも１つの目に見えるメッシュが含まれている。左腸骨窩には、メッシュが見えない脂肪凝集体がある。下腹部には、ループの球を形成する少なくとも２つのメッシュがある。」
２０ｍｌの未知の溶液（ＰＢＳ）を２０分間加える。
ディクテーション：「大網に依存するメッシュは、わずかに引っ張ると解放される。下腹部のメッシュは、わずかに中程度の強さで引っ張っても解放されない。下腹部の球は、わずかに引っ張っても解放されない。球の２番目のメッシュを中程度の強さで引っ張って脱離しようとしたが、成功しなかった。」
２０ｍｌの未知の溶液（ＰＢＳ）を２０分間加える。
ディクテーション：「大網に依存するメッシュは、わずかに引っ張ると解放される。下腹部のメッシュは、わずかに中程度の強さで引っ張っても解放されない。下腹部の球は、わずかに引っ張っても解放されない。球の２番目のメッシュを中程度の強さで引っ張って脱離しようとしたが、成功しなかった。」
【0096】
７． Ｒ１７、２４９ｇ：ディクテーション：「非外傷性エントリ。腸は正中線に沿って２つの堅い球に集まり、これらは共に動く。ループの球に癒着した脾臓大網にメッシュがある。右季肋部にはメッシュは見られない。脂肪は左季肋部に集まっているが、目に見えるメッシュはない。下腹部には、内部にメッシュのある脂肪凝集体がある。」
２０ｍｌの未知の溶液（ＰＢＳ中の０．０５％コラゲナーゼ）を２０分間加える。
ディクテーション：「洗浄後、脾臓大網のメッシュは自己限定的な出血の兆候を示す。メッシュは完全に上皮化され、高度に血管新生されている。中程度に繰り返し引っ張ると、脂肪はその構造を失うが、メッシュは強制的に取り出さない。回腸末端の球に含まれるメッシュの１つは、わずかに引っ張ると完全に分離する。メッシュを取り除いた後、組織は幾分壊れやすい。中程度の強さの引っ張りで解放される堅い恥骨上脂肪（tense suprapubic fat）のメッシュへの回腸末端の癒着がある。恥骨上脂肪組織からメッシュを解放する試みがなされ、強く引っ張ったが成功しなかった。デジタル鈍的切開を試みたがメッシュの取り出しは成功しなかった。２回目の試みでは、メッシュが脾臓の大網から解放され、隣接する組織が壊れやすくなる。ループの集合体からメッシュを解放しようとしたが、成功しなかった。腹腔内出血のため、腹腔内洗浄を閉じる前に行う。」
２０ｍｌの未知の溶液（ＰＢＳ中の０．０５％コラゲナーゼ）を２０分間加える。
ディクテーション：「洗浄後、脾臓大網のメッシュは自己限定的な出血の兆候を示す。メッシュは完全に上皮化され、高度に血管新生されている。中程度に繰り返し引っ張ると、脂肪はその構造を失うが、メッシュは強制的に取り出さない。回腸末端の球に含まれるメッシュの１つは、わずかに引っ張ると完全に分離する。メッシュを取り除いた後、組織は幾分壊れやすい。中程度の強さの引っ張りで解放される堅い恥骨上脂肪（tense suprapubic fat）のメッシュへの回腸末端の癒着がある。恥骨上脂肪組織からメッシュを解放する試みがなされ、強く引っ張ったが成功しなかった。デジタル鈍的切開を試みたがメッシュの取り出しは成功しなかった。２回目の試みでは、メッシュが脾臓の大網から解放され、隣接する組織が壊れやすくなる。ループの集合体からメッシュを解放しようとしたが、成功しなかった。腹腔内出血のため、腹腔内洗浄を閉じる前に行う。」
【0097】
８． Ｒ１８、２５６ｇ：ディクテーション：「腹腔に侵入しない少量の筋肉出血を伴うエントリ。盲腸は大きい。回腸末端には襞があり、白っぽい膜で覆われた盲腸から数ｃｍのところに２つの屈曲がある。腸の残りの部分にはない。盲腸に隣接する右側腹部には、脂肪が含まれているループの球があり、取り出すことができず、引っ張ると非常に壊れやすい。少なくとも２つのメッシュの肝周囲脂肪内のメッシュ。下腹部には、壁に接触している２つのメッシュで結合された脂肪。」
２０ｍｌの未知の溶液（ＰＢＳ中の０．０５％コラゲナーゼ）を２０分間加える。
ディクテーション：「盲腸は同じ外観で、慢性炎症の兆候がある。同じ位置に屈曲があり、それらは容易に分離されない。デジタルプル（digital pulling）ではメッシュでは感じられない。肝臓では、これまで見られなかったメッシュが観察され、強く引っ張っても分離せず、出血のリスクがあるため手技を停止する。メッシュはわずかに引っ張ると肝大網から分離する（メッシュは２つあり、そのうちの１つは簡単に分離することができない）。下腹部では、壁と接触しているメッシュの１つが分離され、２つ目のより深いメッシュは分離されない。腹腔内出血のためｐｓｓによる洗浄を行う。」
２０ｍｌの未知の溶液（ＰＢＳ中の０．０５％コラゲナーゼ）を２０分間加える。
ディクテーション：「盲腸は同じ外観で、慢性炎症の兆候がある。同じ位置に屈曲があり、それらは容易に分離されない。デジタルプル（digital pulling）ではメッシュでは感じられない。肝臓では、これまで見られなかったメッシュが観察され、強く引っ張っても分離せず、出血のリスクがあるため手技を停止する。メッシュはわずかに引っ張ると肝大網から分離する（メッシュは２つあり、そのうちの１つは簡単に分離することができない）。下腹部では、壁と接触しているメッシュの１つが分離され、２つ目のより深いメッシュは分離されない。腹腔内出血のためｐｓｓによる洗浄を行う。」
【0098】
９． Ｒ１９、３３０ｇ：ディクテーション：「非外傷性エントリ。壁への癒着は見られない。小腸ループの凝集体があり、腸間膜においてメッシュで盲腸に隣接する。右季肋部には、メッシュが見られない正常な側面を持つループの球がある。肝大網に、そこに含まれるメッシュが認められる。肝臓と脾臓の大網の間には別のメッシュがある。恥骨上脂肪には幾つかのメッシュが感じられる。」
２０ｍｌの未知の溶液（ＰＢＳ中の０．０５％コラゲナーゼ）を２０分間加える。
ディクテーション：「腸間膜のメッシュは、わずかに引っ張るとすぐに解放される。肝大網のメッシュは完全に上皮化されているが、容易に解放される。また脾臓大網のメッシュも完全に上皮化されており、これも容易に解放される。壁への下腹部脂肪への癒着は容易に解放される。３つのメッシュがいかなる合併症及び出血もなしに恥骨上脂肪から解放される。」
２０ｍｌの未知の溶液（ＰＢＳ中の０．０５％コラゲナーゼ）を２０分間加える。
ディクテーション：「腸間膜のメッシュは、わずかに引っ張るとすぐに解放される。肝大網のメッシュは完全に上皮化されているが、容易に解放される。また脾臓大網のメッシュも完全に上皮化されており、これも容易に解放される。壁への下腹部脂肪への癒着は容易に解放される。３つのメッシュがいかなる合併症及び出血もなしに恥骨上脂肪から解放される。」
【0099】
１０． Ｒ２０、２６４ｇ：ディクテーション：「わずかに貫通する外傷、血液は腹腔に入らない。進入すると、正中線にループの球が見られ、小腸及び盲腸を冒している。小腸の腸間膜に幾つかのメッシュ片が２点で認められ、２つの回転領域を形成している。肝大網はメッシュの２つの群の１つにしっかりと癒着しており、右は腸間膜に依存している。脾臓の大網は盲腸の下でねじれており、最も遠位の部分に別のメッシュ群がある。左恥骨上脂肪のメッシュ片は、壁に結合及び癒着しており、少なくとも２つのメッシュ片を含み、小腸にも癒着している。」
２０ｍｌの未知の溶液（ＰＢＳ）を２０分間加える。
ディクテーション：「腸ループに癒着した大網メッシュは、操作すると壊れやすいことが示される。出血を伴う脂肪からの部分的な分離があり、停止する必要があった。脾臓の大網に癒着したメッシュは、中程度の強さの引っ張りでは解放されず、自己制限的な出血がある。同じ群で、別のメッシュを強く引っ張ると解放することができ、２つ目のメッシュを強く引っ張ると解放される。メッシュは、強く引っ張っても恥骨上脂肪から解放されない。」
２０ｍｌの未知の溶液（ＰＢＳ）を２０分間加える。
ディクテーション：「腸ループに癒着した大網メッシュは、操作すると壊れやすいことが示される。出血を伴う脂肪からの部分的な分離があり、停止する必要があった。脾臓の大網に癒着したメッシュは、中程度の強さの引っ張りでは解放されず、自己制限的な出血がある。同じ群で、別のメッシュを強く引っ張ると解放することができ、２つ目のメッシュを強く引っ張ると解放される。メッシュは、強く引っ張っても恥骨上脂肪から解放されない。」
【0100】
新たな血液検査を、第１群の１０匹のラットで行った。それぞれについて、手術の１５日後に採血した。コラゲナーゼ後のサイトカインを分析した。
【0101】
次に、群２に属するラットで実験を行った。この群のラットは手術を受け、それぞれ３匹のラットを含む２つの群に分けられ、１つ目の群には０．０５％のコラゲナーゼが投与され、もう１つの群にはプラセボ（ＰＢＳ）が投与された。その後、それらのラットを癒着引裂試験に供し、最大圧力及び癒着が裂ける曲線を測定した。そのために、３つの出口を備えた閉鎖剛性システムの圧力を測定する高精度のデジタル圧力計からなる癒着裂傷測定システムを使用した。１つは手動圧力ポンプであり、もう１つは、引っ張るためのクランプが取り付けられ、圧力計から圧力を奪う線形可動性のピストンであった。コラゲナーゼ群対対照群で生じた癒着の引裂きをもたらすのに必要な圧力をこのシステムで測定した。
【0102】
プロセスを、引裂きをもたらすのに必要な圧力曲線の分析を可能にするために記録した。
【0103】
１． Ｒ１、２４５ｇ：ディクテーション：「腸ループの重要な拡張。結腸は崩壊しており、糞便はほとんどない。ゲージの変化は骨盤で確認され、小腸及び壁に癒着したメッシュに関連する。腸閉塞。他のラットほど体重が増えておらず、尾に濃い茶色の斑点があり、脱水症状を示唆している。」
大きなメッシュが左の壁に癒着し、別のメッシュが右の大網に癒着しているのが見られる。
未知の溶液による治療：３７℃のＰＢＳで２０分間。
閉塞を解消するための機械的癒着剥離。縫合糸を設置して引張（ｍｍＨｇ単位の圧力（Ｐ））を実施する：
左上大網の引裂きＰ：２４３
左壁の引裂きＰ：２８６
左下部の引裂きＰ：２９８
右下部の引裂きＰ：２６９
大きなメッシュが左の壁に癒着し、別のメッシュが右の大網に癒着しているのが見られる。
未知の溶液による治療：３７℃のＰＢＳで２０分間。
閉塞を解消するための機械的癒着剥離。縫合糸を設置して引張（ｍｍＨｇ単位の圧力（Ｐ））を実施する：
左上大網の引裂きＰ：２４３
左壁の引裂きＰ：２８６
左下部の引裂きＰ：２９８
右下部の引裂きＰ：２６９
【0104】
２． Ｒ６、２９８ｇ：ディクテーション：「非外傷性エントリ。正常な側面を有するループ。盲腸が含まれるループの球、メッシュは全く見られない。２つのメッシュが胃肝大網及び恥骨上脂肪に癒着し、１つは右側に、もう１つは左側にある。第３のメッシュが左壁に固定されている。閉塞なし。」
未知の溶液による治療：ＰＢＳ（ｍｍＨｇ単位の圧力（Ｐ））：
右季肋部の引裂きＰ：２７５
左季肋部の引裂きＰ：３２０
左上側腹部の引裂きＰ：２８８
左下側腹部の引裂きＰ：３８０
右腸骨窩の引裂きＰ：３４０
左腸骨窩の引裂きＰ：３８０
＊引裂きＰ＝引裂き圧力
未知の溶液による治療：ＰＢＳ（ｍｍＨｇ単位の圧力（Ｐ））：
右季肋部の引裂きＰ：２７５
左季肋部の引裂きＰ：３２０
左上側腹部の引裂きＰ：２８８
左下側腹部の引裂きＰ：３８０
右腸骨窩の引裂きＰ：３４０
左腸骨窩の引裂きＰ：３８０
＊引裂きＰ＝引裂き圧力
【0105】
３． Ｒ７、２７３ｇ：ディクテーション：非外傷性エントリ。その中にメッシュのない接着したループ。メッシュは、肝大網から恥骨上脂肪までの右側腹部に見られる。別のメッシュは、脾臓、胃、及び左季肋部の壁に強く癒着している。左腸骨窩及び左側腹部のメッシュは、子宮、恥骨上脂肪、及び左壁に癒着していた。骨盤のメッシュは、膀胱及び恥骨上脂肪に癒着していた。
未知の溶液による治療：ＰＢＳ（ｍｍＨｇ単位の圧力（Ｐ））：
右季肋部の引裂きＰ：２６８
左季肋部の引裂きＰ：３１５
左季肋部２の引裂きＰ：３４４
左側腹部の引裂きＰ：３９３
左側腹部２の引裂きＰ：３７８
下腹部の引裂きＰ ３６０
右側腹部の引裂きＰ：４０１
未知の溶液による治療：ＰＢＳ（ｍｍＨｇ単位の圧力（Ｐ））：
右季肋部の引裂きＰ：２６８
左季肋部の引裂きＰ：３１５
左季肋部２の引裂きＰ：３４４
左側腹部の引裂きＰ：３９３
左側腹部２の引裂きＰ：３７８
下腹部の引裂きＰ ３６０
右側腹部の引裂きＰ：４０１
【0106】
４． Ｒ８、２６８ｇ：「非外傷性エントリ。中にメッシュのないループの球。左腸骨窩－左側腹部の３つのメッシュ、壁、子宮、及び恥骨上脂肪への癒着。４つ目のメッシュは右季肋部にあり、壁、大網、及び肝臓に癒着している。」
治療：０．０５％コラゲナーゼ（ｍｍＨｇ単位の圧力（Ｐ））：
右腰部（hyp）の引裂きＰ：３２０
右腰部の引裂きＰ：２６２
左腰部の引裂きＰ：２７６
左腰部２の引裂きＰ：１９８
左腰部３の引裂きＰ：２５３
左腰部４の引裂きＰ：１６８
左腰部の引裂きＰ：３４０
治療：０．０５％コラゲナーゼ（ｍｍＨｇ単位の圧力（Ｐ））：
右腰部（hyp）の引裂きＰ：３２０
右腰部の引裂きＰ：２６２
左腰部の引裂きＰ：２７６
左腰部２の引裂きＰ：１９８
左腰部３の引裂きＰ：２５３
左腰部４の引裂きＰ：１６８
左腰部の引裂きＰ：３４０
【0107】
５． Ｒ９、２７５ｇ：ディクテーション：「非外傷性エントリ。正常な分布の腸ループ。壁及び後腹膜脂肪に付着した右側腹部のメッシュ。左上側腹部のメッシュは、上皮化及び血管形成し、壁及び恥骨上脂肪に強く付着している。左腸骨窩のメッシュは、壁に強く付着していた。」
治療：０．０５％コラゲナーゼ（ｍｍＨｇ単位の圧力（Ｐ））：
右腰部の引裂きＰ：１７０
右腰部２の引裂きＰ：２９１
右腸骨窩の引裂きＰ：１４０
胃間膜の引裂きＰ：１２０
下腹部の引裂きＰ：１８０
左腸骨窩の引裂きＰ：１８４
左側腹部の引裂きＰ：１８１
左大網の引裂きＰ：１４５
左大網２の引裂きＰ：２０１
治療：０．０５％コラゲナーゼ（ｍｍＨｇ単位の圧力（Ｐ））：
右腰部の引裂きＰ：１７０
右腰部２の引裂きＰ：２９１
右腸骨窩の引裂きＰ：１４０
胃間膜の引裂きＰ：１２０
下腹部の引裂きＰ：１８０
左腸骨窩の引裂きＰ：１８４
左側腹部の引裂きＰ：１８１
左大網の引裂きＰ：１４５
左大網２の引裂きＰ：２０１
【0108】
６． Ｒ１０、２６０ｇ：ディクテーション：「非外傷性エントリ。正常な側面を有する腸ループ、盲腸の肥大を伴う。右腸骨窩では、後腹膜脂肪に沈み、下腹部及び後壁に部分的に癒着したメッシュが認められる。左側腹部には、互いに癒着した３つの部分的に上皮化したメッシュが見られる。上の２つは脾臓を含み、下の１つは卵巣と密接に接触しており、外観は黒色で肥大している。」
治療：０．０５％コラゲナーゼ（ｍｍＨｇ単位の圧力（Ｐ））：
肝臓の引裂きＰ：１３０
下部肝臓の引裂きＰ：２３０
右上季肋部の引裂きＰ：２７０
下部肝臓２の引裂きＰ：１２３
左側腹部の引裂きＰ：１２９
左側腹部２の引裂きＰ：１４４
盲腸の引裂きＰ：１２６
胃間膜の引裂きＰ：７９
胃間膜２の引裂きＰ：９１
右側腹部の引裂きＰ：１７２
右側腹部２の引裂きＰ：１６０
治療：０．０５％コラゲナーゼ（ｍｍＨｇ単位の圧力（Ｐ））：
肝臓の引裂きＰ：１３０
下部肝臓の引裂きＰ：２３０
右上季肋部の引裂きＰ：２７０
下部肝臓２の引裂きＰ：１２３
左側腹部の引裂きＰ：１２９
左側腹部２の引裂きＰ：１４４
盲腸の引裂きＰ：１２６
胃間膜の引裂きＰ：７９
胃間膜２の引裂きＰ：９１
右側腹部の引裂きＰ：１７２
右側腹部２の引裂きＰ：１６０
【0109】
２０１８年７月２６日に、第２の群の６匹のラット及び４匹の対照で新たな血液検査が行われる。コラゲナーゼ後のサイトカインを分析する。
【0110】
両群の安楽死
生化学及びサイトカインのために心臓内穿刺によって全てのラットから採血した。
生化学及びサイトカインのために心臓内穿刺によって全てのラットから採血した。
【0111】
群１（１０匹のラット、そのうち９匹が言及されている）
Ｒ１１、３５５ｇ
心臓内穿刺による採血の合併症。壁、横隔膜、腸間膜を含む小腸の試料を採取してホルマリンに導入した。
巨視的：中間領域のループの球。メッシュも癒着も見られない。
Ｒ１１、３５５ｇ
心臓内穿刺による採血の合併症。壁、横隔膜、腸間膜を含む小腸の試料を採取してホルマリンに導入した。
巨視的：中間領域のループの球。メッシュも癒着も見られない。
【0112】
Ｒ１２、３１０ｇ
生化学及びサイトカインのため心臓内穿刺によって採血する。組織をサンプリングする。
巨視的：壁への癒着、ループ間の癒着、目に見えるメッシュはない。
生化学及びサイトカインのため心臓内穿刺によって採血する。組織をサンプリングする。
巨視的：壁への癒着、ループ間の癒着、目に見えるメッシュはない。
【0113】
Ｒ１５、３３５ｇ
採血し、組織の試料を問題なく採取する。
巨視的：非常に肥大した盲腸は、ループの球と共に骨盤脂肪に付着している。
採血し、組織の試料を問題なく採取する。
巨視的：非常に肥大した盲腸は、ループの球と共に骨盤脂肪に付着している。
【0114】
Ｒ１３、３１３ｇ
採血し、組織の試料を問題なく採取する。
巨視的：恥骨上脂肪及び胃大網への癒着、メッシュが含まれ、完全に脂肪で覆われている。
採血し、組織の試料を問題なく採取する。
巨視的：恥骨上脂肪及び胃大網への癒着、メッシュが含まれ、完全に脂肪で覆われている。
【0115】
Ｒ１４、２７６ｇ
採血し、組織の試料を問題なく採取する。
巨視的：壁への癒着又はループ間の癒着はない。メッシュなし。
採血し、組織の試料を問題なく採取する。
巨視的：壁への癒着又はループ間の癒着はない。メッシュなし。
【0116】
Ｒ１６、３０４ｇ
採血し、組織の試料を問題なく採取する。
巨視的：強く結合した小腸の腸ループの球、及び恥骨上脂肪へのループの癒着。メッシュを見ることはできない。
採血し、組織の試料を問題なく採取する。
巨視的：強く結合した小腸の腸ループの球、及び恥骨上脂肪へのループの癒着。メッシュを見ることはできない。
【0117】
Ｒ１７、２６５ｇ
採血し、組織の試料を問題なく採取する。
巨視的：ループの球が恥骨上脂肪に癒着し、その中にメッシュが含まれている。盲腸にも癒着している。
採血し、組織の試料を問題なく採取する。
巨視的：ループの球が恥骨上脂肪に癒着し、その中にメッシュが含まれている。盲腸にも癒着している。
【0118】
Ｒ１８、２７０ｇ
採血し、組織の試料を問題なく採取する。
巨視的：肥大した盲腸。肝大網内のメッシュ。腸ループ及び肉芽腫への堅い癒着。これを取り出し、後で分析するために印を付ける。
採血し、組織の試料を問題なく採取する。
巨視的：肥大した盲腸。肝大網内のメッシュ。腸ループ及び肉芽腫への堅い癒着。これを取り出し、後で分析するために印を付ける。
【0119】
Ｒ１９、３６８ｇ
採血し、組織の試料を問題なく採取する。
巨視的：ねじれた側面を有する、互いに癒着した腸ループ。左側壁脂肪（left parietal fat）への癒着。肥大した盲腸。
採血し、組織の試料を問題なく採取する。
巨視的：ねじれた側面を有する、互いに癒着した腸ループ。左側壁脂肪（left parietal fat）への癒着。肥大した盲腸。
【0120】
対照群（４匹のラット）
Ｒ２、３２８ｇ（対照）
採血し、組織の試料を問題なく採取する。
巨視的：対照ラット。病理学的所見なし。
Ｒ２、３２８ｇ（対照）
採血し、組織の試料を問題なく採取する。
巨視的：対照ラット。病理学的所見なし。
【0121】
Ｒ３、２８８ｇ（対照）
採血し、組織の試料を問題なく採取する。
巨視的：対照ラット。病理学的所見なし。
採血し、組織の試料を問題なく採取する。
巨視的：対照ラット。病理学的所見なし。
【0122】
Ｒ４、３２７ｇ（対照）
採血し、組織の試料を問題なく採取する。
巨視的：対照ラット。病理学的所見なし。
採血し、組織の試料を問題なく採取する。
巨視的：対照ラット。病理学的所見なし。
【0123】
Ｒ５、２９８ｇ
採血し、組織の試料を問題なく採取する。
巨視的：対照ラット。病理学的所見なし。
採血し、組織の試料を問題なく採取する。
巨視的：対照ラット。病理学的所見なし。
【0124】
群ＩＩ（６匹のラット）
Ｒ１、２５０ｇ
採血し、組織の試料を問題なく採取する。
巨視的：小腸を犠牲にして閉塞を伴う腸閉塞の注目すべき兆候。腹腔を開く前に閉塞の兆候が認められる。骨盤内のゲージの変化。骨盤、左壁、及び脾臓下大網に癒着したメッシュ。
Ｒ１、２５０ｇ
採血し、組織の試料を問題なく採取する。
巨視的：小腸を犠牲にして閉塞を伴う腸閉塞の注目すべき兆候。腹腔を開く前に閉塞の兆候が認められる。骨盤内のゲージの変化。骨盤、左壁、及び脾臓下大網に癒着したメッシュ。
【0125】
Ｒ６、３１２ｇ
１ｍｌの採血の合併症（生化学）
巨視的：恥骨上脂肪で覆われた骨盤内のメッシュ、及びそれに癒着して部分的に覆われたループの球内のメッシュが認められる。
１ｍｌの採血の合併症（生化学）
巨視的：恥骨上脂肪で覆われた骨盤内のメッシュ、及びそれに癒着して部分的に覆われたループの球内のメッシュが認められる。
【0126】
Ｒ７、２９６ｇ
採血し、組織の試料を問題なく採取する。
巨視的：肥大した盲腸。回腸中央部のレベルでの小腸のループのゲージの違い、閉塞の原因は認められない。小腸のループ間の癒着。子宮に癒着した左壁のメッシュ。左季肋部において別のメッシュが、胃及び大網脂肪及び卵巣に癒着していた。
採血し、組織の試料を問題なく採取する。
巨視的：肥大した盲腸。回腸中央部のレベルでの小腸のループのゲージの違い、閉塞の原因は認められない。小腸のループ間の癒着。子宮に癒着した左壁のメッシュ。左季肋部において別のメッシュが、胃及び大網脂肪及び卵巣に癒着していた。
【0127】
Ｒ８、２９１ｇ
採血し、組織の試料を問題なく採取する。
巨視的：肥大した盲腸。回腸の終末部－中間部のループの球。ループの球に付着した胃肝大網にあるメッシュの癒着。左腸骨窩のメッシュ。
採血し、組織の試料を問題なく採取する。
巨視的：肥大した盲腸。回腸の終末部－中間部のループの球。ループの球に付着した胃肝大網にあるメッシュの癒着。左腸骨窩のメッシュ。
【0128】
Ｒ９、３０１ｇ
採血し、組織の試料を問題なく採取する。
巨視的：メッシュを犠牲にした盲腸の癒着。小腸、恥骨上脂肪、及び右壁に癒着した骨盤内の２つのメッシュ。
採血し、組織の試料を問題なく採取する。
巨視的：メッシュを犠牲にした盲腸の癒着。小腸、恥骨上脂肪、及び右壁に癒着した骨盤内の２つのメッシュ。
【0129】
Ｒ１０、２５８ｇ
採血し、組織の試料を問題なく採取する。
巨視的：回腸末端レベル及び左壁に癒着した腸ループ。
採血し、組織の試料を問題なく採取する。
巨視的：回腸末端レベル及び左壁に癒着した腸ループ。
【0130】
実施した実験の表形式の概要を以下に示す。
【0131】
【表6】
【0132】
結論：
０．０５％の濃度のコラゲナーゼは、関連する死亡率がなく、マウスモデルでの腹腔内適用に安全である。コラゲナーゼを３７℃（コラゲナーゼの作用温度）で２０分間激しく洗浄することにより適用した。
組織学的研究は、メッシュを配置する前又はメッシュを除去する際のいずれかにおいてコラゲナーゼで治療した場合（腹膜洗浄により）、腹膜に小さなメッシュ又は側腹部に大きなメッシュを有する動物の組織は影響を受けないことを実証する。逆に、生理食塩水で洗浄すると、メッシュに関連する多数の癒着が発生し、メッシュの取り出しが困難になる。
対照の介入直後及び介入後の種々の時点の両方において使用したモデルで連続試験を行ったところ、対照群との有意差を見つけることができず、又は生化学的パラメーター若しくは血液学的パラメーターとの関連もなかった。アミラーゼは、おそらくモデルの解剖学的特徴に起因して、両方の研究群で増加する（ラットでは、膵臓は非常に可動性がある）。
両方の群（群１及び群２）のサイトカインは、特定の試験として両方の群で研究されており、治療したマウスの血漿中を循環するサイトカインから得られた結果は次のとおりである。
抗炎症性サイトカイン：コラゲナーゼで治療したマウスにおいて、ＰＢＳで治療したマウスと比較してＩＬ４及びＩＬ１０のわずかな増加
炎症性サイトカイン。コラゲナーゼで洗浄した動物におけるＴＮＦ－α及びＩＬ１２－ｐ７０の有意な増加（ｐ＜０．０１）。ＩＮＦ－γに違いはない。
調節性サイトカイン：コラゲナーゼで治療した群では、ＩＬ２及びＩＬ１８の有意な増加（ｐ＜０．０５）が観察される。ＩＬ１ａ、ＩＬ１ｂ、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ１３、及びＩＬ１７ａのレベルに両群間で違いはない。
ケモカイン：コラゲナーゼで治療した群では、ＶＥＧＦ及びＭＣＰ１のレベルの有意な増加が観察され、分析された残りのケモカインは、群間で違いを示さない（Ｍ－ＭＣＦ、ＭＩＰ３ａ、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、ＲＡＮＴＲＥＳ、ＫＣ、及びＭＩＰ１ａ）。
０．０５％の濃度のコラゲナーゼは、関連する死亡率がなく、マウスモデルでの腹腔内適用に安全である。コラゲナーゼを３７℃（コラゲナーゼの作用温度）で２０分間激しく洗浄することにより適用した。
組織学的研究は、メッシュを配置する前又はメッシュを除去する際のいずれかにおいてコラゲナーゼで治療した場合（腹膜洗浄により）、腹膜に小さなメッシュ又は側腹部に大きなメッシュを有する動物の組織は影響を受けないことを実証する。逆に、生理食塩水で洗浄すると、メッシュに関連する多数の癒着が発生し、メッシュの取り出しが困難になる。
対照の介入直後及び介入後の種々の時点の両方において使用したモデルで連続試験を行ったところ、対照群との有意差を見つけることができず、又は生化学的パラメーター若しくは血液学的パラメーターとの関連もなかった。アミラーゼは、おそらくモデルの解剖学的特徴に起因して、両方の研究群で増加する（ラットでは、膵臓は非常に可動性がある）。
両方の群（群１及び群２）のサイトカインは、特定の試験として両方の群で研究されており、治療したマウスの血漿中を循環するサイトカインから得られた結果は次のとおりである。
抗炎症性サイトカイン：コラゲナーゼで治療したマウスにおいて、ＰＢＳで治療したマウスと比較してＩＬ４及びＩＬ１０のわずかな増加
炎症性サイトカイン。コラゲナーゼで洗浄した動物におけるＴＮＦ－α及びＩＬ１２－ｐ７０の有意な増加（ｐ＜０．０１）。ＩＮＦ－γに違いはない。
調節性サイトカイン：コラゲナーゼで治療した群では、ＩＬ２及びＩＬ１８の有意な増加（ｐ＜０．０５）が観察される。ＩＬ１ａ、ＩＬ１ｂ、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ１３、及びＩＬ１７ａのレベルに両群間で違いはない。
ケモカイン：コラゲナーゼで治療した群では、ＶＥＧＦ及びＭＣＰ１のレベルの有意な増加が観察され、分析された残りのケモカインは、群間で違いを示さない（Ｍ－ＭＣＦ、ＭＩＰ３ａ、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、ＲＡＮＴＲＥＳ、ＫＣ、及びＭＩＰ１ａ）。
【0133】
４ヶ月で、２つの群間の全てのサイトカイン及びケモカインのレベルが正常化され、腹部手術を受けていない対照ラットのレベルに近づいた。
提案モデル（ポリプロピレンメッシュ）による癒着の発生は、ヒトにおける場合と同等である。このモデルは、堅い癒着と緩い癒着との両方を発生させ、それらが発生する期間（４ヶ月）の間に、８％～１０％閉塞及び偽腸閉塞の症例が観察され、これらは薬物の適用後に改善が見られた。
ペアで無作為化された群１の盲検研究では、１０個の小片を有するモデルにおいて薬物を適用すると、メッシュを取り出すことの有効性の結果４２％を提供するのに対し、希釈剤（ＰＢＳ）を使用する対照症例では８％である。
群２の盲検研究では、４つの大きなメッシュ片を有するモデルに薬物を適用すると、１８８．２６ミリバールの癒着引裂圧の結果を提供するのに対し、希釈剤（ＰＢＳ）を使用する対照の場合は３２５．７６ミリバールである。さらに、薬物で治療されたラットでは、薬物自体の癒着を解放する能力のため実施される引張の回数が多く、より大きな腹膜表面を露出させる。
薬物又はＰＢＳを使用してから２ヶ月後の安楽死の際のモデルの分析では、有意差は見られなかったが、薬物で治療したモデルでは、主観的に癒着が少なくなった。
提案モデル（ポリプロピレンメッシュ）による癒着の発生は、ヒトにおける場合と同等である。このモデルは、堅い癒着と緩い癒着との両方を発生させ、それらが発生する期間（４ヶ月）の間に、８％～１０％閉塞及び偽腸閉塞の症例が観察され、これらは薬物の適用後に改善が見られた。
ペアで無作為化された群１の盲検研究では、１０個の小片を有するモデルにおいて薬物を適用すると、メッシュを取り出すことの有効性の結果４２％を提供するのに対し、希釈剤（ＰＢＳ）を使用する対照症例では８％である。
群２の盲検研究では、４つの大きなメッシュ片を有するモデルに薬物を適用すると、１８８．２６ミリバールの癒着引裂圧の結果を提供するのに対し、希釈剤（ＰＢＳ）を使用する対照の場合は３２５．７６ミリバールである。さらに、薬物で治療されたラットでは、薬物自体の癒着を解放する能力のため実施される引張の回数が多く、より大きな腹膜表面を露出させる。
薬物又はＰＢＳを使用してから２ヶ月後の安楽死の際のモデルの分析では、有意差は見られなかったが、薬物で治療したモデルでは、主観的に癒着が少なくなった。
【0134】
最終結論：腹膜洗浄として３７℃で２０分間、３７ｍｇ／Ｋｇの濃度のコラゲナーゼを使用すると、ヒトモデルに匹敵するマウスモデルでの癒着の解放が支持される。さらに、ポリプロピレンメッシュ等の腹膜組織に密接に癒着する既知の能力を有する異質要素の無害な取り出しが達成される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5-1】
【図5-2】
【図6-1】
【図6-2】
【国際調査報告】