特表 2022-521268 腫瘍溶解性アデノウイルスベクター及び使用法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-04-06

(54)【発明の名称】腫瘍溶解性アデノウイルスベクター及び使用法

(51)【国際特許分類】

   C12N 7/01 20060101AFI20220330BHJP

   C12N 15/861 20060101ALI20220330BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20220330BHJP

   A61K 35/761 20150101ALI20220330BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20220330BHJP

   A61P 15/00 20060101ALI20220330BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20220330BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20220330BHJP

   A61K 38/19 20060101ALI20220330BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20220330BHJP

【ＦＩ】

C12N7/01

C12N15/861 Z ZNA

C12Q1/02

A61K35/761

A61P35/00

A61P15/00

A61K45/00

A61P43/00 121

A61K38/19

A61P37/04

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021549176

(86)(22)【出願日】2020-02-21

(85)【翻訳文提出日】2021-10-19

(86)【国際出願番号】 US2020019179

(87)【国際公開番号】W WO2020172509

(87)【国際公開日】2020-08-27

(31)【優先権主張番号】62/808,694

(32)【優先日】2019-02-21

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】521366827

【氏名又は名称】アンリーシュ イミュノ オンカリティクス，インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110000338

【氏名又は名称】特許業務法人ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ

(72)【発明者】

【氏名】キュリエル，デヴィッド ティー．

(72)【発明者】

【氏名】ポッドアイセル，オスヴァルド

(72)【発明者】

【氏名】ロペス，マリア ベロニカ

【テーマコード（参考）】

4B063

4B065

4C084

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B063QA20

4B063QQ08

4B063QR39

4B063QR79

4B063QR80

4B063QS38

4B063QS40

4B065AA95X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA01

4B065CA44

4C084AA01

4C084AA02

4C084AA19

4C084BA01

4C084BA08

4C084BA44

4C084CA17

4C084DA01

4C084MA17

4C084MA56

4C084MA65

4C084MA66

4C084NA05

4C084NA14

4C084ZA81

4C084ZB09

4C084ZB26

4C084ZC75

4C087AA01

4C087AA02

4C087BC83

4C087MA17

4C087MA56

4C087MA65

4C087MA66

4C087NA05

4C087NA14

4C087ZA81

4C087ZB09

4C087ZB26

4C087ZC75

(57)【要約】

本明細書中提供されるのは、低酸素及び炎症に反応するプロモーターの制御下で変異Ｅ１Ａタンパク質を発現し及び腫瘍特異的プロモーターの制御下で１つまたは複数の免疫モジュレーターを発現する条件的複製５型アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターである。アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、３型の繊維及びヘキソンタンパク質も含む。同じく提供されるのは、本アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターを含有する組成物を用いて腫瘍細胞で細胞傷害性を誘導する方法である。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ａ）低酸素及び炎症に反応する第一プロモーターと機能的に連結された変異Ｅ１Ａタンパク質をコードする核酸配列、
（ｂ）アデノウイルスゲノムのＥ１Ｂ領域の全部または一部の欠失、
（ｃ）１つまたは複数の非天然核酸配列、前記非天然核酸配列はそれぞれ、免疫モジュレーターをコードし、及び腫瘍細胞で活性である第二プロモーターと機能的に連結されている、
（ｄ）３型アデノウイルス繊維ノブドメインを含む繊維タンパク質、ならびに
（ｅ）１つまたは複数の３型超可変領域（ＨＶＲ）を含むヘキソンタンパク質
を含む、５型アデノウイルスまたはアデノウイルスベクター。

【請求項2】

前記アデノウイルスゲノムのＥ３領域の全部もしくは一部及び／または前記アデノウイルスゲノムのＥ４領域の全部もしくは一部の欠失を含む、請求項１に記載のアデノウイルスまたはアデノウイルスベクター。

【請求項3】

前記１つまたは複数の非天然核酸配列は、前記アデノウイルスゲノムの前記欠失したＥ１Ｂ、Ｅ３、及び／またはＥ４領域に位置する、請求項２に記載のアデノウイルスまたはアデノウイルスベクター。

【請求項4】

前記１つまたは複数の非天然核酸配列は、前記欠失したＥ１Ｂ領域に位置する、請求項３に記載のアデノウイルスまたはアデノウイルスベクター。

【請求項5】

変異Ｅ１Ａタンパク質をコードする前記核酸配列は、前記Ｅ１Ａタンパク質の網膜芽細胞腫（Ｒｂ）タンパク質結合領域内に１５ヌクレオチドの欠失を含む、請求項１から４のいずれか１項に記載のアデノウイルスまたはアデノウイルスベクター。

【請求項6】

前記第一プロモーターは、１つまたは複数の低酸素反応性配列要素（ＨＲＥ）及び１つまたは複数の核内因子カッパＢ（ＮＦ－κＢ）炎症反応性配列要素（κＢＲＥ）を含む分泌型酸性高システインタンパク質（ＳＰＡＲＣ）プロモーターである、請求項１から５のいずれか１項に記載のアデノウイルスまたはアデノウイルスベクター。

【請求項7】

ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）をコードする外来核酸配列及び４－１ＢＢリガンド（４－１ＢＢＬ）をコードする外来核酸配列を含む、請求項１から６のいずれか１項に記載のアデノウイルスまたはアデノウイルスベクター。

【請求項8】

前記第二プロモーターは、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）プロモーターである、請求項１から７のいずれか１項に記載のアデノウイルスまたはアデノウイルスベクター。

【請求項9】

（ａ）１つまたは複数の低酸素反応性配列要素（ＨＲＥ）及び１つまたは複数の核内因子カッパＢ（ＮＦ－κＢ）炎症反応性配列要素（κＢＲＥ）を含む分泌型酸性高システインタンパク質（ＳＰＡＲＣ）プロモーターと機能的に連結された変異Ｅ１Ａタンパク質をコードする核酸配列、
（ｂ）アデノウイルスゲノムのＥ１Ｂ領域の全部または一部の欠失、
（ｃ）ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）をコードする第一外来核酸配列及び４－１ＢＢリガンド（４－１ＢＢＬ）をコードする第二外来核酸配列、前記第一及び前記第二外来核酸配列は、（ｉ）配列内リボソーム新入部位（ＩＲＥＳ）で隔てられており、かつ（ｉｉ）ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）プロモーターと機能的に連結されている、
（ｄ）繊維ノブと置き換わった単鎖ラクダ科抗体アミノ酸配列を含む繊維タンパク質、前記ラクダ科抗体は、ＣＤ２７６タンパク質に特異的に結合する、ならびに
（ｅ）１つまたは複数の３型超可変領域（ＨＶＲ）を含むヘキソンタンパク質
を含む、５型アデノウイルスまたはアデノウイルスベクター。

【請求項10】

請求項１から９のいずれか１項に記載のアデノウイルスまたはアデノウイルスベクター及び薬学上許容されるキャリアを含む、組成物。

【請求項11】

前記アデノウイルスまたは前記アデノウイルスベクターのウイルス粒子（ｖｐ）を約１×１０^９～約１×１０^１４個含む、請求項１０に記載の組成物。

【請求項12】

前記アデノウイルスまたは前記アデノウイルスベクターのｖｐを約１×１０^１０～約１×１０^１２個含む、請求項１１に記載の組成物。

【請求項13】

腫瘍細胞における細胞傷害性の誘導法であって、前記腫瘍細胞を、請求項１０から１２のいずれか１項に記載の組成物と接触させることを含み、その際、前記変異Ｅ１Ａタンパク質及び前記外来核酸配列が前記腫瘍細胞で発現し、及び前記細胞傷害性が誘導される、前記方法。

【請求項14】

前記腫瘍細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにある、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

前記腫瘍細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏにある、請求項１３に記載の方法。

【請求項16】

前記腫瘍細胞は、哺乳類中にある、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

前記哺乳類は、ヒトである、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

前記腫瘍細胞は、卵巣細胞である、請求項１３から１７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項19】

さらに、前記腫瘍細胞を化学療法剤で処置することを含む、請求項１３から１８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項20】

さらに、前記腫瘍細胞をサイトカインまたはチェックポイント阻害剤（ＣＩ）で処置することを含む、請求項１３から１９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項21】

哺乳類における腫瘍細胞の処置のための、請求項１０から１２のいずれか１項に記載の組成物の使用。

【発明の詳細な説明】

【発明の詳細な説明】

【0001】

［技術分野］
関連出願の相互参照
本出願は、米国仮出願第６２／８０８，６９４号、出願日２０１９年２月２１日、の優先権を主張し、その開示は、本明細書中参照として援用される。

【0002】

電子提出された資料の参照による組み込み
本明細書とともに同時に提出されたコンピュータ読み取り可能なヌクレオチド／アミノ酸配列表は、そのまま全体が本明細書中参照により組み込まれ、この配列表は、以下のとおり特定される：ファイル数１、２，３７１バイトのＡＳＣＩＩ（テキスト）ファイル、ファイル名「２０２０－０２－２１＿３７３９４－６０１＿ＳＱＬ＿ＳＴ２５．ＴＸＴ」、作成日２０２０年２月２１日。
［背景技術］

【0003】

腫瘍溶解性ウイルス療法（ＯＶ）は、がん治療の将来有望かつ刺激的な新規アプローチである。腫瘍溶解性ウイルスとは、がん細胞で選択的に複製を行い、正常組織を傷つけることなくがん細胞を殺傷する、遺伝子操作されたまたは天然のウイルスである。細胞殺傷という主要効果に加えて、ＯＶは、免疫系も刺激することができる。腫瘍溶解性ウイルス免疫療法には、免疫系細胞、例えば、樹状細胞及びＴ細胞なども活性化させる腫瘍溶解性ウイルスの使用が関係し、がん免疫療法の有望な作用剤となっている。現在のＯＶ方法は、多種多様なウイルス、例えば、アデノウイルス、ニューカッスル病ウイルス、単純ヘルペスウイルス、レオウイルス、パルボウイルス、及び麻疹ウイルスなどを利用する。腫瘍溶解性ウイルスの１種、タリモジンラヘルパレプベク、すなわちＴ－ＶＥＣ（ＩＭＬＹＧＩＣ（商標））は、黒色腫の患者で最初の手術後に再発した切除不能な皮膚病変、皮下病変、及び結節病変の局所療法用に、ＦＤＡにより承認された。腫瘍溶解性ウイルス免疫療法は、多種多様ながん、例えば、膀胱癌、前立腺癌、結腸直腸癌、卵巣癌、肺癌、乳癌、及び多発性骨髄腫などに関して、現在臨床試験で研究中である。

【0004】

ＯＶの急速な発展とともに、腫瘍溶解性ウイルスの安全性及び効力を改善する方法も開発されており、そのような方法として、例えば、腫瘍選択性の改善、腫瘍細胞への感染性及び腫瘍細胞中の条件的複製の向上、ならびに細胞傷害性の向上または宿主免疫刺激のための導入遺伝子発現の最大化が挙げられる（例えば、Ｌａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，３６：１４１９－１４２７（２０１８）、Ｆｏｒｓｙｔｈ ａｎｄ Ａｂａｔｅ－Ｄａｇａ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，３６：１４４０－１４４２（２０１８）、Ｄｅｓｊａｒｄｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，ＮＥＪＭ，Ｅｐｕｂ Ｊｕｎｅ ２６，２０１８、及びＬｏｎｇｏ ａｎｄ Ｂａｄｅｎ，ＮＥＪＭ，Ｅｐｕｂ Ｊｕｎｅ ２６，２０１８を参照）。

【0005】

アメリカがん協会（ＡＣＳ）によれば、卵巣癌は、女性におけるがんによる死亡原因の第５位であり、女性生殖器系の他のどのがんよりも多く死因を占めている。女性が卵巣癌になる生涯リスクは、約７８分の１であり、卵巣癌で亡くなる生涯チャンスは、約１０８分の１である。ＡＣＳは、２０１８年の間に、２２，０００例を超える卵巣癌が診断され、卵巣癌関連死は１４，０００例を超えると推定している。卵巣癌の大部分は、かなり後期のステージで検出され、軽い症候を示す（例えば、股関節痛）。卵巣癌の治療選択肢、例えば、細胞切除手術及び細胞傷害性化学療法は改善されてきているものの、より有効な治療法、特に進行疾患用の治療法が依然として必要とされている。腫瘍溶解性アデノウイルスは、第Ｉ相臨床試験で卵巣癌を標的とする見込みがあることを示した（例えば、Ｋｉｍｂａｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１６（２１）：５２７７－８７（２０１０）、Ｃｅｒｕｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，７０（１１）：４２９７－３０９（２０１０）、及びＫｏｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１８（１０）：１８７４－８４（２０１０）を参照）。しかしながら、こうした治療の臨床応答は、依然として不透明であり、宿主二次免疫応答により、それらの効力が阻害される可能性がある。

【0006】

腫瘍選択性、抗腫瘍活性、及び腫瘍特異的宿主免疫応答の改善を示す腫瘍溶解性ウイルス療法の組成物及び方法が依然として必要とされている。本開示は、そのような組成物及び方法を提供する。
［発明の概要］

【0007】

本開示は、以下を含む５型アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターを提供する：（ａ）低酸素及び炎症に反応する第一プロモーターと機能的に連結された変異Ｅ１Ａタンパク質をコードする核酸配列、（ｂ）アデノウイルスゲノムのＥ１Ｂ領域の全部または一部の欠失、（ｃ）１つまたは複数の外来核酸配列、当該核酸配列はそれぞれ、免疫モジュレーターをコードし、腫瘍細胞で活性である第二プロモーターと機能的に連結されている、（ｄ）３型アデノウイルス繊維ノブドメインを含む繊維タンパク質、ならびに（ｅ）１つまたは複数の３型超可変領域（ＨＶＲ）を含むヘキソンタンパク質。

【0008】

本開示は、以下を含む５型アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターも提供する：（ａ）分泌型酸性高システインタンパク質（ＳＰＡＲＣ）プロモーターと機能的に連結された変異Ｅ１Ａタンパク質をコードする核酸配列、当該プロモーターは、１つまたは複数の低酸素反応性配列要素（ＨＲＥ）及び１つまたは複数の核内因子カッパＢ（ＮＦ－κＢ）炎症反応性配列要素（κＢＲＥ）を含む、（ｂ）アデノウイルスゲノムのＥ１Ｂ領域の全部または一部の欠失、（ｃ）ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）をコードする第一の非天然核酸配列及び４－１ＢＢリガンド（４－１ＢＢＬ）をコードする第二の非天然核酸配列、ただし、第一及び第二非天然核酸配列は、（ｉ）配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）で隔てられており、及び（ｉｉ）ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）プロモーターと機能的に連結されている、（ｄ）繊維ノブに挿入された単鎖ラクダ科抗体アミノ酸配列を含む繊維タンパク質、ただしラクダ科抗体は、ＣＤ２７６タンパク質に特異的に結合する、ならびに（ｅ）１つまたは複数の３型超可変領域（ＨＶＲ）を含むヘキソンタンパク質。

【0009】

本開示は、上記アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターのいずれかを含む組成物、ならびに当該組成物を用いて腫瘍またはがん細胞に細胞傷害性を誘導する方法も、提供する。
［図面の簡単な説明］

【0010】

［図１］Ａ～Ｆは、本開示が包含する複数の異なるアデノウイルス実施形態を図解する概略図である。詳細には、Ｂは、実施例１に記載のＵＩＯ－５２３アデノウイルスの概略図である。
［図２Ａ］ＳＫＯＶ３細胞中のＣＤ４０Ｌのｉｎ ｖｉｔｒｏ発現を実証するフローサイトメトリーデータのプロットであり、アイソタイプの対照（明灰色）、ＭＯＩが１００のＵＩＯ－５２３（中間の灰色、３３．２％陽性）、及びＭＯＩが１０００のＵＩＯ－５２３（暗灰色、７４．８％陽性）である。
［図２Ｂ］Ａ５４９細胞中のＣＤ４０Ｌのｉｎ ｖｉｔｒｏ発現を実証するフローサイトメトリーデータのプロットであり、アイソタイプの対照（明灰色）、ＭＯＩが１００のＵＩＯ－５２３（中間の灰色、８９．６％陽性）、及びＭＯＩが１０００のＵＩＯ－５２３（暗灰色、９０％陽性）である。
［図３Ａ］ＳＫＯＶ３細胞（図３Ａ）における、ＡＦ２０１１及びＵＩＯ－５２３ ｈＨ５ベクターの溶解活性を図解するグラフである。ＡＲ２０１１－ｌｕｃは、非複製対照ベクターである。
［図３Ｂ］ＣＴ２６細胞（図３Ｂ）における、ＡＦ２０１１及びＵＩＯ－５２３ ｈＨ５ベクターの溶解活性を図解するグラフである。ＡＲ２０１１－ｌｕｃは、非複製対照ベクターである。
［図３Ｃ］ＰＡ１細胞に対するＵＩＯ－５２３ ｈＨ５、ＵＩＯ－５２３ ｈＨ３、及びＵＩＯ－５２３ ｍＨ３の溶解活性を図解するグラフである。
［図４］は、実施例２に記載のとおりに処置したマウスから得られた腫瘍のタンパク質抽出物における、ＣＤ４０Ｌの発現を示す画像である。
［図５Ａ］ＰＢＳ（図５Ａ）、ＡＲ２０１１（図５Ｂ）、及びＵＩＯ－５２３（図５Ｃ）で処置した卵巣癌の皮下異種移植片マウスモデルにおける腫瘍体積を図解するグラフである。
［図５Ｂ］ＰＢＳ（図５Ａ）、ＡＲ２０１１（図５Ｂ）、及びＵＩＯ－５２３（図５Ｃ）で処置した卵巣癌の皮下異種移植片マウスモデルにおける腫瘍体積を図解するグラフである。
［図５Ｃ］ＰＢＳ（図５Ａ）、ＡＲ２０１１（図５Ｂ）、及びＵＩＯ－５２３（図５Ｃ）で処置した卵巣癌の皮下異種移植片マウスモデルにおける腫瘍体積を図解するグラフである。
［図５Ｄ］ＰＢＳ（図５Ｄ）、ＡＲ２０１１（図５Ｅ）、及びＵＩＯ－５２３（図５Ｆ）で処置したマウスの代表的な腫瘍の画像である。
［図５Ｅ］ＰＢＳ（図５Ｄ）、ＡＲ２０１１（図５Ｅ）、及びＵＩＯ－５２３（図５Ｆ）で処置したマウスの代表的な腫瘍の画像である。
［図５Ｆ］ＰＢＳ（図５Ｄ）、ＡＲ２０１１（図５Ｅ）、及びＵＩＯ－５２３（図５Ｆ）で処置したマウスの代表的な腫瘍の画像である。
［図６］卵巣癌腫症の腹腔内マウスモデルにおける播種性腫瘍に対するＵＩＯ－５２３及びＡＲ２０１１のｉｎ ｖｉｖｏ溶解活性を図解するグラフである。
［図７］ＰＢＳ対照（上段パネル）、ＡＲ２０１１（中段パネル）、またはＵＩＯ－５２３ｈＨ５（下段パネル）で処置したＳＫＯＶ３腹腔内異種移植片モデルマウスから切除した腫瘍の画像である。
［図８］ＰＢＳ対照、ＡＲ２０１１、またはＵＩＯ－５２３ｈＨ５で処置したＳＫＯＶ３腹腔内異種移植片モデルマウス由来の腫瘍における、Ｅ４コピー数／μｇＤＮＡを示すグラフである。
［図９］Ａ～Ｆは、ヒト（ＣＨＯ－ｈＣ３）またはマウス（ＣＨＯ－ｍＣ３）ＣＤ２７６を表面で発現するように改変したＣＨＯ細胞で、繊維修飾したＡｄ．ＣＭＶ－ＧＦＰ．Ｈ３．Ｆ（ＣＤ２７６）（Ｄ～Ｆ）またはＡｄ．ＣＭＶ－ＧＦＰ．Ｈ３．Ｆ（３）（Ａ～Ｃ）を形質移入した後の、免疫蛍光画像である。未改変ＣＨＯ細胞は、対照としての役目を担った。
［図１０］Ａ及びＢは、Ａｄ．ＣＭＶ－ＧＦＰ．Ｈ３．Ｆ（３）（Ａ）及びＡｄ．ＣＭＶ－ＧＦＰ．Ｈ３．Ｆ（ＣＤ２７６）（Ｂ）を感染させた横紋筋肉腫細胞の免疫蛍光画像である。
［発明を実施するための形態］

【0011】

本開示は、少なくとも部分的に、腫瘍関連間質細胞で選択的に複製を行い、免疫モジュレータータンパク質を発現する条件的複製性アデノウイルス（ＣＲＡｄ）の開発に立脚している。ＣＲＡｄは、腫瘍溶解性免疫療法用途で、特に化学療法及び／またはチェックポイント阻害剤療法の補助として、使用可能である。

【0012】

アデノウイルスは、約３６キロベース（ｋｂ）の二本鎖ＤＮＡを含有する中程度の大きさ（９０～１００ｎｍ）の無エンベロープ正二十面体ウイルスである。アデノウイルスカプシドは、細胞のウイルス感染の初期段階における重要な相互作用に介在し、アデノウイルス生活環の最後でアデノウイルスゲノムをパッケージ化するのに必要である。カプシドは、２５２のカプソメアを含み、これには、２４０のヘキソントリマー、１２のペントン塩基ペンタマータンパク質、及び１２のトリマー繊維が含まれる（Ｇｉｎｓｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２８：７８２－８３（１９６６））。ヘキソンは、３つの同一タンパク質を含み、このタンパク質はポリペプチドＩＩと呼ばれる（Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３２：１１４８－５１（１９８６））。ペントン塩基は、５つの同一タンパク質を含み、トリマー繊維は、３つの同一タンパク質を含む。タンパク質ＩＩＩａ、ＶＩ、及びＩＸは、アデノウイルスコートに存在しており、ウイルスカプシドを安定化させると考えられる（Ｓｔｅｗａｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，６７：１４５－５４（１９９１）、及びＳｔｅｗａｒｔ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯＪ．，１２（７）：２５８９－９９（１９９３））。カプシドタンパク質の発現は、ｐＩＸを除いて、アデノウイルスポリメラーゼタンパク質に依存する。したがって、アデノウイルス粒子の主要構成要素は、ポリメラーゼタンパク質遺伝子が存在し、かつ発現する場合にのみ、ゲノムから発現する。

【0013】

アデノウイルスのいくつかの特長が、それらを、治療用途（例えば、遺伝子治療、免疫療法、またはワクチンとして）のため遺伝子材料を細胞に移送するための理想的なビヒクルにしている。例えば、アデノウイルスは、高力価（例えば、約１０^１３粒子単位（ｐｕ））で製造可能であり、非複製及び複製細胞に遺伝子材料を移送することができる。アデノウイルスゲノムは、大量の外来ＤＮＡ（最高で約８ｋｂ）を保有するように操作することができ、アデノウイルスカプシドは、さらに長い配列の移送を増強することができる（Ｃｕｒｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，３：１４７－１５４（１９９２））。さらに、アデノウイルスは、一般に、宿主細胞染色体に組み込まれず、そうではなくて直鎖エピソームとして維持され、それにより、組換えアデノウイルスが正常細胞機能に干渉する可能性を最小限にする。

【0014】

アデノウイルスは、５０を超える血清型が同定されており、それらは、サブグループＡ（例えば、１２型、１８型、及び３１型）、サブグループＢ（例えば、３型、７型、１１型、１４型、１６型、２１型、３４型、３５型、５０型、及び５５型）、サブグループＣ（例えば、１型、２型、５型、及び６型）、サブグループＤ（例えば、８型、９型、１０型、１３型、１５型、１７型、１９型、２０型、２２～３０型、３２型、３３型、３６～３９型、及び４２～４９型、５１型、５３型、５４型、５６型）、サブグループＥ（例えば、４型）、サブグループＦ（例えば、４０型及び４１型）、サブグループＧ（例えば、５２型）に分類されている。様々な血清型のアデノウイルスが、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ．）から入手可能である。

【0015】

１つの実施形態において、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、５型アデノウイルスまたはアデノウイルスベクター（「Ａｄ５」）である。「アデノウイルス」という用語は、本明細書中使用される場合、アデノウイルス生活環に関与する能力を保持し、物理的に不活性化されていない、例えば、破壊（例えば、超音波処理）、変性（例えば、加熱もしくは溶媒を使用）、または架橋（例えば、ホルマリン架橋による）によリ不活性化されていない、アデノウイルスを示す。「アデノウイルス生活環」は、（１）ウイルスの結合及び細胞への進入、（２）アデノウイルスゲノムの転写及びアデノウイルスタンパク質の翻訳、（３）アデノウイルスゲノムの複製、ならびに（４）ウイルス粒子組立て、を含む（例えば、Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｋｎｉｐｅ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．（２００６）を参照）。「アデノウイルスベクター」という用語は、本明細書中使用される場合、アデノウイルスゲノムが操作されて、当該アデノウイルスゲノムに関して非天然である核酸配列を収容している、アデノウイルスを示す。典型的には、アデノウイルスベクターの生成は、非天然核酸配列、例えば、遺伝子移送用のものの挿入がアデノウイルスに提供されているように、１つまたは複数の変異（例えば、欠失、挿入、または置換）をアデノウイルスのアデノウイルスゲノムに導入することによる。

【0016】

実施形態によっては、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、キメラである。「キメラ」アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、２種以上（例えば、２種、３種、４種など）の異なる血清型のアデノウイルスに由来するアデノウイルスゲノムを含む場合がある。実施形態によっては、キメラアデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、２種以上の異なる血清型のアデノウイルスそれぞれのゲノムをほぼ等しい量で含むことができる。キメラアデノウイルスまたはアデノウイルスベクターゲノムが２種の異なる血清型のアデノウイルスのゲノムで構成される場合、キメラアデノウイルスベクターゲノムは、好ましくは、一方の血清型アデノウイルスのゲノムを約９５％以下（例えば、約９０％、約８５％、約８０％、約７５％、約７０％、約６５％、約６０％、約５５％、約５０％、約４５％、または約４０％以下）で含み、キメラアデノウイルスゲノムの残部は、他方の血清型アデノウイルスのゲノムから得られるまたはそれに由来するものである。１つの実施形態において、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターのゲノムの大半（すなわち、５０％超）は、５型アデノウイルスから得られるまたはそれに由来するものである。

【0017】

上記で検討されるとおり、本明細書中開示されるアデノウイルス及びアデノウイルスベクターは、条件的に複製を行う。条件的複製アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターとは、予め定めた条件下で複製を行うように操作されたアデノウイルスまたはアデノウイルスベクターである。例えば、複製に必須の遺伝子機能、例えば、アデノウイルス初期領域がコードする遺伝子機能を、誘導的、抑制可能な、または組織特異的プロモーターと作動的に連結させることができる。そのような実施形態において、複製は、プロモーターを活性化または抑制する特定因子の存在または不在を必要とする。条件的複製アデノウイルスベクターは、例えば、米国特許第５，９９８，２０５号、同第６，８２４，７７１号にさらに記載される。アデノウイルス複製に必須である遺伝子産物は、アデノウイルスゲノムのＥ１、Ｅ２、及びＥ４領域にコードされる。Ｅ１領域は、Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂサブ領域を含み、一方、Ｅ２領域は、Ｅ２Ａ及びＥ２Ｂサブ領域を含む。Ｅ４領域は、複数のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含み、それらのうちＯＲＦ６が、及び場合によってはＯＲＦ３も、アデノウイルス複製に必須である。アデノウイルスゲノムのＥ３領域は、複製に必須の遺伝子機能を何も含まない。

【0018】

初期領域１Ａ及び１Ｂ（Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂ）遺伝子は、増殖性アデノウイルス溶解サイクルに必要なタンパク質をコードする（Ｆｉｅｌｄｓ、既出）。Ｅ１Ａは、感染後最初に転写されるウイルス遺伝子であり、２種の関連タンパク質、２４３Ｒ及び２８９Ｒを生成する。２４３Ｒ及び２８９Ｒは、その他の初期ウイルス遺伝子領域の転写を誘導するとともに、感染細胞を刺激して細胞周期のＳ期に入らせる。Ｅ１Ｂ領域は、２種の主要タンパク質、Ｅ１Ｂ１９Ｋ及びＥ１Ｂ５５Ｋをコードする。Ｅ１Ｂ５５Ｋタンパク質は、細胞腫瘍抑制因子ｐ５３に結合して、ｐ５３が介在するアポトーシスならびにウイルス及び細胞複製の阻害をブロックすることができる。Ｅ１Ｂ１９Ｋタンパク質は、Ｂａｘと相互作用しアポトーシスを阻害するＢｃｌ－２ホモログであり、ウイルスがより長く複製することを可能にする（Ｓｕｎｄａｒａｒａｊａｎ，Ｒ．ａｎｄ Ｗｈｉｔｅ，Ｅ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７５：７５０６－７５１６（２００１））。最近になって、Ｅ１Ｂタンパク質が腫瘍溶解性アデノウイルスの複製に必須ではない可能性が実証された（Ｌｏｐｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２０：２２２２－２２３３（２０１２）、及びＶｉａｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１３３（１１）：２５７６－２５８４（２０１３））。Ｅ１Ａタンパク質は、ｐ３００／ＣＢＰまたは網膜芽細胞腫（Ｒｂ）タンパク質と会合することにより、感染細胞でＳ期を誘導することが示されている（Ｈｏｗｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：５８８３－５８８７（１９９０）、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１１：４２５３－４２６５（１９９１）、Ｈｏｗｅ，Ｊ．Ａ．ａｎｄ Ｂａｙｌｅｙ，Ｓ．Ｔ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１８６：１５－２４（１９９２））。Ｒｂ及びｐ３００は、Ｅ２Ｆ転写因子の活性を調節し、Ｅ２Ｆ転写因子は、細胞周期の進行に必要な細胞遺伝子の発現を調和させている（Ｈｅｌｉｎ，Ｋ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．，８：２８－３５（１９９８））。したがって、Ｅ１Ａ遺伝子産物は、部分的には、Ｅ２Ｆ転写因子を網膜芽細胞腫タンパク質（ｐＲｂ）腫瘍抑制因子から取り除くことにより、無活動細胞が細胞周期に入るように駆動することでウイルスゲノム複製において役割を果たす（Ｌｉｕ，Ｘ．ａｎｄ Ｍａｒｍｏｒｓｔｅｉｎ，Ｒ．，Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖ．， ２１：２７１１－２７１６（２００７））。

【0019】

ある種の腫瘍細胞で条件的に複製を行うアデノウイルスは、典型的には、以下のアプローチのうち１つまたはそれらの組み合わせを用いて製造される：（１）Ｅ１Ａの発現を駆動する組織特異的プロモーターの使用、それにより、Ｅ１Ａ駆動型ウイルス複製を特定の組織または腫瘍に限定する（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５７：２５５９－２５６３（１９９７）、Ａｌｅｍａｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，６：２１－２５（１９９９）、Ｈａｌｌｅｎｂｅｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１０：１７２１－１７３３（１９９９）、及びＨｏｗｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２（５）：４８５－４９５（２０００））、（２）ｐ５３またはＲｂいずれかとのウイルスタンパク質相互作用を抑制する変異をＥ１領域内で発生させて、これらの遺伝子産物を欠いた腫瘍細胞を標的とする、及び／または（３）天然アデノウイルス指向性の修飾（Ｊｏｕｎａｉｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ，７（３）：２８５－３０１（２００７））。１つの実施形態において、本明細書中記載されるアデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、変異Ｅ１Ａタンパク質をコードする核酸配列を含む。アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、任意の適切な変異Ｅ１Ａタンパク質をコードする核酸配列を含むことができるが、望ましくは、変異Ｅ１Ａタンパク質は、網膜芽細胞腫タンパク質との結合の障害または消失を呈する。変異Ｅ１Ａタンパク質をコードする核酸配列は、１つまたは複数のヌクレオチドに欠失、挿入、または置換を有することにより、この核酸配列にコードされるＥ１Ａタンパク質を、Ｒｂ結合欠陥性にしている。Ｒｂに結合しない、または低下した親和性でＲｂと結合する変異Ｅ１Ａタンパク質は、当該分野で既知であり（例えば、米国特許第５，８０１，０２９号、同第５，８５６，１８１号、及び同第５，９７２，７０６号を参照）、本開示のアデノウイルスまたはアデノウイルスベクターと合わせて使用することができる。１つの実施形態において、変異Ｅ１Ａタンパク質をコードする核酸配列は、Ｅ１ＡのＲｂタンパク質結合ドメインに１つまたは複数のヌクレオチド（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のヌクレオチド）の欠失を有する。ある特定の実施形態において、変異Ｅ１Ａタンパク質をコードする核酸配列は、１０～２０ヌクレオチド（すなわち、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチド）の欠失を有する。例えば、変異Ｅ１Ａタンパク質をコードする核酸配列は、配列番号１の核酸配列を含む場合があり、この核酸配列は、Ｅ１ＡのＲｂタンパク質結合ドメインに１５ヌクレオチドの欠失を有していて、その結果、Ｅ１ＡのＲｂタンパク質結合ドメインのアミノ酸１２３番～１２７番が欠失している（ＴＣＨＥＡ）。

【0020】

腫瘍細胞または腫瘍関連細胞におけるアデノウイルスの優先的複製を実現させるため、変異Ｅ１Ａタンパク質をコードする核酸配列を、腫瘍細胞で活性であるが、正常細胞では活性ではないプロモーターと機能的に連結させることができる。そのようなプロモーターを、本明細書中、「腫瘍特異的」、「組織特異的」、「細胞特異的」、「がん特異的」プロモーターと称する。本明細書中使用される場合、「プロモーター」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼの結合を指示し、それによりＲＮＡ合成を促進するＤＮＡ配列を示す。プロモーターが、核酸配列の転写を指示することができる場合、その核酸配列は、そのプロモーターと「作動的に連結され」または「機能的に連結され」ている。プロモーターは、作動的もしくは機能的に連結された核酸配列に対して、天然または非天然であることが可能である。配列を作動的に連結して一緒にする技法は、当該分野で周知である。腫瘍特異的またはがん特異的プロモーターは、核酸配列を発現させようとする標的組織または腫瘍細胞型に基づいて選択することができる。広範囲にわたる腫瘍特異的プロモーターが、条件的複製アデノウイルス構築物に使用されてきており、そのどれでも、本開示の文脈において使用可能である。そのようなプロモーターとして、例えば、α－胎児タンパク質プロモーター（Ｈａｌｌｅｎｂｅｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１０（１０）：１７２１－３３（１９９９））、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）プロモーター（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５７（１３）：２５５９－６３（１９９７））、ＭＵＣ１／ＤＦ３プロモーター（Ｋｕｒｉｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．，１０６：７６３－７７１（２０００））、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）プロモーター（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．，２８７（３９）：３２４９４－３２５１１（２０１２））、及びＥ２Ｆプロモーター（Ｔｓｕｋｕｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６２：３４３８－３４４７（２００２））が挙げられる。

【0021】

実施形態によっては、プロモーターは、それ自身、腫瘍細胞またはがん細胞において優先的に活性である場合があるが、他の実施形態では、腫瘍特異的またはがん特異的プロモーターには、腫瘍またはがんに関連した細胞（本明細書中、「腫瘍関連細胞」または「がん関連細胞」と称する）において優先的に活性であるプロモーターが含まれる。実際、腫瘍微小環境は、腫瘍塊及び腫瘍細胞が近くの内在宿主間質から動員させた支援（または「間質」）細胞からなる、異種細胞集団であることが、わかるだろう。腫瘍関連間質細胞（ＴＡＳＣ）として、血管内皮細胞、周皮細胞、脂肪細胞、線維芽細胞、及び骨髄間葉系間質細胞が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態において、変異Ｅ１Ａタンパク質をコードする核酸配列は、低酸素及び炎症に反応するプロモーターと機能的に連結されており、低酸素及び炎症は両方とも、腫瘍細胞及び腫瘍関連間質細胞の一般的な特徴である（例えば、Ｌａｉｔａｌａ，Ａ．ａｎｄ Ｊ．Ｔ．Ｅｒｌｅｒ，Ｆｒｏｎｔ．Ｏｎｃｏｌ．，８：１８９（２０１８）、Ｐｅｔｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅｓｉｓ，７：１０（２０１８）、Ｃａｓａｚｚａ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，３３（１４）：１７４３－１７５４（２０１４）を参照）。実際、ＴＡＳＣは、多くの炎症促進性因子、例えば、ＩＬ－６、ＩＬ－８、間質由来因子１アルファ、ＶＥＧＦ、テネイシン－Ｃ、及びマトリクスメタロプロテイナーゼなどを分泌することが知られている（Ｆｉｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｓｃｏｖ．Ｍｅｄ．，７（３７）：２０－２６（２００７）、及びＢｕｓｓａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１８：８４（２０１６））。低酸素及び炎症に反応するプロモーターは、１つまたは複数の低酸素反応性配列要素（ＨＲＥ）及び１つまたは複数の炎症反応性配列要素を組み込むことにより、操作されたものである場合がある。これに関して、プロモーターは、低酸素誘導因子１（ＨＩＦ－１）との結合を介して低酸素に反応するＨＲＥを１つまたは複数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）及びＮＦ－ｋＢ炎症反応性配列要素（ｋＢＲＥ）を１つまたは複数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）含むことができ、ＨＩＦ－１は、酸素欠乏に対する細胞反応において重要な役割を果たす転写因子である。

【0022】

１つの実施形態において、プロモーターは、分泌型酸性高システインタンパク質（ＳＰＡＲＣ）プロモーターである。ＳＰＡＲＣは、オステオネクチンまたはＢＭ－４０としても知られているが、これは、多くの細胞型で発現し、組織修復、創傷治癒、形態発生、細胞分化、細胞遊走、及び血管新生に関連する多角形分泌型糖タンパク質である。ＳＰＡＲＣは、腫瘍及び様々ながんのその周囲間質において発現の仕方が異なる。ＳＰＡＲＣの発現レベルが高くなることが、乳癌、黒色腫、及び神経膠芽細胞腫で報告されている。ＳＰＡＲＣの発現レベルが低くなることが、他の種類の癌、例えば、卵巣癌、結腸直腸癌、膵癌、及び急性骨髄性白血病でわかっており、これは主に、プロモーターメチル化による（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ，４：７０３５（２０１４）、及びＴａｉ Ｉ．Ｔ．＆ Ｔａｎｇ Ｍ．Ｊ．，Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｉｓｔ Ｕｐｄａｔ．，１１：２３１－４６（２００８））。本開示の文脈において、ＳＰＡＲＣプロモーターは、上記のとおり、腫瘍関連間質細胞においてプロモーターと機能的に連結された核酸配列の発現を指示するように、１つまたは複数の低酸素反応性配列要素（ＨＲＥ）及び１つまたは複数の核内因子カッパＢ（ＮＦ－κＢ）炎症反応性配列要素（κＢＲＥ）を含むように改変される。本開示のアデノウイルスまたはアデノウイルスベクターで使用するのに適したＳＰＡＲＣプロモーターは、例えば、米国特許第８，４３６，１６０号に記載されている。

【0023】

他の実施形態において、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、血管内皮細胞（ＥＣ）、特に、腫瘍関連血管内皮細胞で優先的に複製を行うことが望ましい場合がある。血管内皮細胞（ＥＣ）は、腫瘍溶解性ウイルス免疫療法の理想的標的である場合がある。なぜなら、それらは、広く拡散した、組織へのアクセスを提供し、静脈内ベクター投与後に最初に接触する表面だからである。したがって、変異Ｅ１Ａタンパク質をコードする核酸配列は、内皮細胞で主にまたは排他的に活性であるプロモーター（すなわち、「内皮細胞特異的プロモーター」）と機能的に連結されている場合がある。当該分野で既知の任意の適切な内皮細胞特異的プロモーターが使用可能であり、そのようなプロモーターとして、ＩＣＡＭ－２プロモーター、エンドグリンプロモーター、Ｆｌｔ－１プロモーター、ラウンドアバウト４（ＲＯＢＯ４）プロモーター、またはＴｉｅ１プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。実施形態によっては、変異Ｅ１Ａタンパク質をコードする核酸配列は、ＲＯＢＯ４プロモーター（米国特許出願公開第２０１６／０１４５６４３号及び同第２０１７／０１５９０７２号、Ｏｋａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ．，１００：１７１２－１７２２（２００７）、ならびにＬｕ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ ＯＮＥ，８（１２）：ｅ８３９３３（２０１３）に記載）、またはＴｉｅ１プロモーター（例えば，Ｋｏｒｈｏｎｅｎ，Ｂｌｏｏｄ，８６（５）：１８２８－１８３５（１９９５）に記載）と機能的に連結されている。

【0024】

実施形態によっては、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、アデノウイルスゲノムの１つまたは複数の領域において、その全部または一部の欠失を有する場合がある。実施形態によっては、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、遺伝子の機能を消失させるまたは障害する（例えば、遺伝子産物の機能が少なくとも約２倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、または５０倍低下する）のに十分な、アデノウイルスゲノム遺伝子材料の欠失を有し、その核酸配列は、全部または一部が破壊（例えば、削除）されてしまっている。アデノウイルスゲノムに１つまたは複数の非天然核酸配列（または「導入遺伝子」）に十分な空間を提供する目的で、１つまたは複数の遺伝子領域の大部分を除去することが望ましい場合がある。これに関して、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、アデノウイルス初期領域（例えば、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、及びＥ４領域）、後期領域（例えば、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、及びＬ５領域）、ウイルスパッケージ化に関与する遺伝子（例えば、ＩＶａ２遺伝子）、及び／またはウイルス関連ＲＮＡ（例えば、ＶＡ－ＲＮＡ－１及び／またはＶＡ－ＲＮＡ－２）のいずれかの全部または一部の欠失を有する場合がある。１つの実施形態において、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、アデノウイルスゲノムのＥ１Ｂ領域の全部または一部の欠失、アデノウイルスゲノムのＥ３領域の全部または一部の欠失、及び／またはアデノウイルスゲノムのＥ４領域の全部または一部の欠失を含む。欠失の大きさは、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターのゲノムが最適ゲノムパッケージ寸法との近接な一致を維持するように、調節することができる。欠失が大きいほど、アデノウイルスまたはアデノウイルスゲノムはより大きな非天然核酸配列の挿入を収容できるようになる。

【0025】

アデノウイルスゲノムのある特定領域、例えば、アデノウイルスゲノムのＥ１Ｂ、Ｅ３、及び／またはＥ４領域の全部または一部を除去することにより、得られるアデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、アデノウイルスカプシド中にパッケージ化される能力を維持したままで、外来非天然核酸配列の挿入を受け入れ可能になる。したがって、別の実施形態において、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、１つまたは複数の非天然核酸配列を含む。非天然核酸配列は、挿入がアデノウイルスまたはアデノウイルスベクター粒子の形成を許容するかぎり、アデノウイルスゲノムの任意の位置に挿入することができる。「非天然」核酸配列とは、天然に生じる位置で天然に生じるアデノウイルス核酸配列ではない任意の核酸配列（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはｃＤＮＡ配列）である。すなわち、非天然核酸配列は、アデノウイルスで天然に見つかる可能性があるが、アデノウイルスゲノム内の非天然の位置にある、及び／または非天然プロモーターと作動的に連結している可能性がある。「非天然核酸配列」、「異種核酸配列」、及び「外来核酸配列」という用語は、同義であり、本開示の文脈において互換使用することができる。非天然核酸配列は、好ましくは、ＤＮＡであり、好ましくは、タンパク質をコードする（例えば、１つまたは複数の核酸配列が１つまたは複数のタンパク質をコードする）。「導入遺伝子」という用語は、本明細書中、非天然核酸配列が発現してＲＮＡまたはタンパク質（例えば、調節ＲＮＡ配列、ペプチド、またはポリペプチド）を生成できるように、適切な調節配列要素（例えば、プロモーター）と作動的に連結された、非天然核酸配列と定義される。調節配列要素（例えば、プロモーター）は、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターに対して天然または非天然のものが可能である。

【0026】

１つまたは複数の非天然核酸配列はそれぞれ、望ましくは、免疫モジュレーターをコードする。「免疫モジュレーター（ｉｍｍｕｎｅ ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）」、「免疫モジュレータータンパク質」、「免疫モジュレーター（ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒ）」という用語は、本明細書中同義で使用され、生物の正常な免疫機能に影響を及ぼす物質またはタンパク質を示す。実施形態によっては、免疫モジュレーターは、免疫応答を活性化、賦活、または復元するなどにより、生物の免疫機能を刺激する。他の実施形態において、免疫モジュレーターは、既存免疫応答を減弱するまたは免疫応答の刺激を予防するなどにより、免疫機能に負の効果を発揮する場合がある。免疫モジュレーターは、天然物質（例えば、タンパク質）の場合もあれば、合成化合物の場合もある。天然免疫モジュレーターの例として、サイトカイン、ケモカイン、及びインターロイキンが挙げられるが、これらに限定されない。サイトカインとは、典型的には、活性化刺激に反応して様々な細胞型から放出され、特異的受容体との結合を通じて反応を誘導する、小タンパク質（約２５ｋＤａ）である。サイトカインの例として、インターフェロン（すなわち、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦ－α）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）－βファミリーメンバー（例えば、ＴＧＦ－β１及びＴＧＦ－β２）が挙げられるが、これらに限定されない。ケモカインとは、走化性因子性質を有するサイトカインの１つのクラスであり、適切な受容体を持つ細胞を、ケモカイン源に向かって遊走するように誘導する。ケモカインは、大きくは２つのグループに分けられる：アミノ末端近くに２つの隣接システインを有するＣＣケモカイン、または２つの等価なシステイン残基が別のアミノ酸で隔てられているＣＸＣケモカインである。ＣＣケモカインとして、ケモカインリガンド（ＣＣＬ）１～２８が挙げられるが、これらに限定されない。ＣＸＣケモカインとして、ＣＸＣリガンド（ＣＸＣＬ）１～１７が挙げられるが、これらに限定されない。インターロイキンは、病原に反応してマクロファージから分泌される構造的に多様なサイトカインからなるグループであり、インターロイキンとして、例えば、インターロイキン－１（ＩＬ－１）、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、及びＩＬ－８が挙げられる。他のサイトカイン、ケモカイン、及びンターロイキンも、当該分野で既知であり、例えば、Ｃａｍｅｒｏｎ Ｍ．Ｊ．，ａｎｄ ＫｅｌｖｉｎＤ．Ｊ．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ，Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｉｎ：Ｍａｄａｍｅ Ｃｕｒｉｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｄａｔａｂａｓｅ，Ａｕｓｔｉｎ（ＴＸ）：Ｌａｎｄｅｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ；２０００－２０１３に記載されており、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｏｏｋｓ／ＮＢＫ６２９４／から入手可能である。他の実施形態において、免疫モジュレーターは、合成により製造されたものでも、組換えにより製造されたものでもよい。例えば、免疫モジュレーターは、融合タンパク質、キメラタンパク質、または天然の免疫モジュレーターの任意の改変版である場合がある。最近、オルソポックスウイルス主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ様タンパク質（ＯＭＣＰ）として知られるＮＫＧ２Ｄリガンドと及びＩＬ－２Ｒαに対する親和性が乏しい変異型ＩＬ－２とで構成された組換え融合タンパク質が開発されており、これは、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターに使用される可能性がある。この融合タンパク質（「ＯＭＣＰ－ｍｕｔＩＬ－２」と称する）は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などのＮＫＧ２Ｄ保有細胞でのみ、ＩＬ－２シグナル伝達を強力かつ選択的に活性化し、ＩＬ－２Ｒα保有細胞を広く活性化することがない（Ｇｈａｓｅｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，７，Ａｒｔｉｃｌｅ Ｎｏ：１２８７８（２０１６））。

【0027】

１つの実施形態において、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、サイトカインＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）をコードする非天然核酸配列及びサイトカイン４－１ＢＢリガンド（４－１ＢＢＬ）をコードする非天然核酸配列を含む。ＣＤ４０Ｌは、ＣＤ１５４としても知られるが、これは、活性化Ｔ細胞で主に発現するＴＮＦタンパク質スーパーファミリーの一員である。ＣＤ４０Ｌ－ＣＤ４０相互作用は、ＡＰＣによるＩＬ－１２分泌の刺激を介したＴｈ１ Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏプライミングにとって重要である（Ｇｒｅｗａｌ，Ｉ．Ｓ．ａｎｄ Ｆｌａｖｅｌｌ，Ｒ．Ａ．，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１６：１１１－１３５（１９９８））。実施形態によっては、ＣＤ４０Ｌをコードする核酸配列は、変異している場合がある。例えば、非天然核酸配列は、ＣＤ４０Ｌ発現が細胞膜で保持されるように、メタロプロテイナーゼ切断に対して抵抗性であるＣＤ４０Ｌをコードする場合がある（例えば、Ｅｌｍｅｔｗａｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｎｃｅｒ，９：５２（２０１０）に記載されるとおり）。４－１ＢＢリガンドは、ＣＤ１３７リガンド及びＴＮＦＳＦ９としても知られるが、これは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）リガンドファミリーに属する膜貫通サイトカインである。４－１ＢＢＬは、ＴＮＦＲＳＦ９に対するリガンドとして作用する双方向性シグナルトランスデューサーであり、ＴＮＦＲＳＦ９は、Ｔリンパ球の共刺激受容体分子である。４－１ＢＢＬは、活性化Ｂ細胞、マクロファージ、樹状細胞、活性化Ｔ細胞、ニューロン、及び星状細胞により発現され、４－１ＢＢＬとＴＮＦＲＳＦ９の相互作用は、抗原提示発生及び細胞傷害性Ｔ細胞の生成において役割を果たす。４－１ＢＢＲは、静止Ｔリンパ球には存在しないが、抗原刺激を受けると急速に発現する。４－１ＢＢＬは、がん細胞株で発現するので、Ｔ細胞腫瘍細胞相互作用に関与すると考えられる。４－１ＢＢＬをコードする非天然核酸配列も、変異したものである場合がある。ＣＤ４０Ｌ及び４－１ＢＢＬをコードする核酸配列は、公的に入手可能であり、本開示のアデノウイルスまたはアデノウイルスベクターで使用可能である（例えば、Ｓｅｙａｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ．，９７（２）：１８０－５（１９９６）、Ａｌｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒｏｐ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．，２４：２２１９－２２２７，１９９４、ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＮＧ＿００７２８０．１、及びＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＮＭ＿００３８１１．４を参照）。

【0028】

他の実施形態において、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）の活性を阻害するタンパク質をコードする非天然核酸配列を含む場合がある。固形腫瘍におけるマクロファージ浸潤は、多くの腫瘍において、予後不良及び化学療法耐性と関連している。がんのマウスモデルにおいて、マクロファージは、がんの開始及び悪性進行を促進し、転移性部位では、マクロファージは、腫瘍細胞の血管外遊走、生存、及び成長を促進する。そのため、ＴＡＭは、抗がん療法の潜在的標的として研究されている（Ｃａｓｓｅｔｔａ，Ｌ．，ａｎｄ Ｊ．Ｗ．Ｐｏｌｌａｒｄ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，１７：８８７－９０４（２０１８））。１つの実施形態において、非天然核酸配列は、コロニー刺激因子１受容体（ＣＳＦ１Ｒ）に結合し、ＣＳＦ１Ｒが介在するシグナル伝達を阻害するタンパク質またはペプチドをコードする場合がある。ＣＳＦ１Ｒは、マクロファージが発現するカノニカルマーカーである。例えば、非天然核酸配列は、ＣＳＦ１Ｒに結合しその活性を阻害する抗体、またはその抗原結合断片をコードする場合がある。ＣＳＦ１Ｒに特異的に結合しその活性を阻害する抗体は、当該分野で複数知られており、非天然核酸配列によりコードされる場合があり、そのようなものとして、例えば、エマクツズマブ（ｅｍａｃｔｕｚｕｍａｂ）が挙げられる（ＲＧ－７１５５とも称する、例えば、ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ ＮＣＴ０２７６０７９７，‘‘Ａ Ｓｔｕｄｙ ｏｆ Ｅｍａｃｔｕｚｕｍａｂ ａｎｄ ＲＯ７００９７８９ Ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ ｉｎ Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ Ｐａｒｔｉｃｉｐａｎｔｓ ｗｉｔｈ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｓｏｏｌｉｄ Ｔｕｍｏｒｓ’’を参照）。腫瘍関連マクロファージが発現するＣＳＦ１Ｒ以外の他の受容体は、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターによる標的となる可能性がある。

【0029】

１つまたは複数の非天然核酸配列は、理想的には、腫瘍細胞で活性である第二プロモーターと機能的に連結されている。腫瘍細胞またはがん細胞において転写を指示することができる任意の適切なプロモーターを使用することができる。例えば、プロモーターは、構成的プロモーター、例えば、ＣＭＶ、ＲＳＶ、ＳＶ４０、ＥＦ２、または同様なウイルスもしくは哺乳類プロモーターが可能である。より好ましくは、プロモーターは、本明細書中記載されるとおり、「腫瘍特異的」プロモーターである。１つまたは複数の非天然核酸配列は、当該分野で既知である任意の腫瘍特異的プロモーター、例えば本明細書中記載されるものと、機能的に連結することができる。前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）プロモーター、シクロオキシゲナーゼ－２（Ｃｏｘ２）プロモーター、及びヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）プロモーターは、標的組織に対する選択的ウイルス複製をもたらすために使用可能なプロモーター配列の例である。１つの実施形態において、１つまたは複数の非天然核酸配列は、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）プロモーターと機能的に連結されている。複数の研究から、その他のテロメラーゼサブユニットは正常細胞及びがん細胞の両方で常時発現するものの、ｈＴＥＲＴ発現は、がん細胞に対して高度に特異的であり、テロメラーゼ活性と密接に関連していることが実証されている（Ｔａｋａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ；５８：１５５８－６１（１９９８）、Ｋｙｏ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ Ｃａｎｃｅｒ，８０：６０－３（１９９９）、Ｋａｎａｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ，７８：５３９－４３（１９９８）、Ｋｙｏ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ Ｃａｎｃｅｒ，８０：８０４－９（１９９９）、Ｋｙｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ，９９（８）：１５２８－１５３８（２００８）、及びＺｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．，２８７（３９）：３２４９４－３２５１１（２０１２））。ｈＴＥＲＴ遺伝子の５’プロモーター領域は、複数のグループにより特性決定されており（例えば，Ｔａｋａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５９：５５１－７（１９９９）、Ｈｏｒｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５９：８２６－３０（１９９９）、及びＣｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ；８：１３７－４２（１９９９）を参照）、プロモーターの欠失解析から、がん特異的転写活性化に必須の２６０ｂｐのコアプロモーター領域が同定された。コアプロモーター領域内には、Ｅボックス（ＣＡＣＧＴＧ）及びＧＣボックス（ＧＧＧＣＧＧ）を含む、複数の別個の転写因子結合部位が存在する。

【0030】

アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターが２つ以上の非核酸配列を含む実施形態において、２つ以上の非天然核酸配列は、１つの同じプロモーターと機能的に連結されている（例えば、「二シストロン性」、「複シストロン性」、または「多シストロン性」配列を形成するため）場合もあれば、２つ以上の非天然核酸配列が、別個の同一なプロモーターと機能的に連結されている場合もあれば、２つ以上の非天然核酸配列が、別個の異なるプロモーターと機能的に連結されている場合もある。アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターがＣＤ４０Ｌをコードする非天然核酸配列及び４－１ＢＢＬをコードする非天然核酸配列を含む場合、両方の核酸配列が、１つの同じ腫瘍特異的プロモーターと機能的に連結されている場合がある。２つ以上の核酸配列が単一プロモーターと機能的に連結されている場合、核酸配列は、望ましくは、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）または２Ａペプチド（または２Ａペプチド様）配列で隔てられている。ＩＲＥＳは、各コード配列の翻訳の脱共役を可能にし、それにより不活性タンパク質の生成及び不正確な細胞内標的指向を回避する。プロモーター干渉または抑制も、ＩＲＥＳの使用を通じて緩和される（例えば、Ｖａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｒｅｐ．，２：８９３－８９８（２００１）を参照）。２Ａ自己切断ペプチドは、ピコルナウイルスファミリーの一部のメンバーにおいて、２つのタンパク質の間に位置するオリゴペプチド（通常、１９～２２のアミノ酸）として、ピコルナウイルスで最初に同定された。２Ａペプチドは、それ以降、他のウイルスでも同定されてきている。複シストロン性遺伝子発現のため２Ａペプチドを使用することの利点として、例えば、２Ａペプチドの寸法が小さいこと、及び２Ａペプチドの間に配置されいている遺伝子の効率的な同時発現を可能にすることが挙げられる。実際、異なる２Ａペプチド配列の下流に配置された遺伝子は、ＩＲＥＳに比べた場合、それより高い発現レベルを誘導することができる（例えば、Ｓｚｙｍｃｚａｋ，Ａ．Ｌ．＆ Ｖｉｇｎａｌｉ，Ｄ．Ａ．，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ．，５：６２７－６３８（２００５）を参照）。

【0031】

ある特定の実施形態において、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、少なくとも１つの修飾カプシドタンパク質を含む。アデノウイルスカプシドは、細胞のウイルス感染の初期段階で重要な相互作用に介在し、アデノウイルス生活環の最後でアデノウイルスゲノムをパッケージ化するのに必要である。カプシドは、２５２のカプソメアを含み、これには、２４０のヘキソン、１２のペントン塩基タンパク質、及び１２の繊維が含まれる（Ｇｉｎｓｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２８：７８２－８３（１９６６））。１つの実施形態において、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターの１つまたは複数のカプシドタンパク質（本明細書中、「コート」タンパク質とも称する）を操作して、潜在的宿主細胞の受容体に関してウイルスまたはベクターの結合特異性または識別を改変することができる。静脈内投与のほぼ直後に、アデノウイルスベクターが肝臓により主に隔離され、Ａｄ５の血流からのクリアランス及び肝臓への集積は、投与から数分以内に生じることは、当該分野で周知である（Ａｌｅｍａｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，８１：２６０５－２６０９（２０００））。アデノウイルスの肝臓隔離は、主に、肝細胞における天然のコクサッキー及びアデノウイルス受容体（ＣＡＲ）の多さによる。すなわち、カプシドタンパク質の操作は、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターが感染する細胞の範囲を広げることもできれば、アデノウイルスベクターが特定の細胞型を標的とすることを可能にすることもできる。例えば、１つまたは複数のカプシドタンパク質は、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクタータンパク質が、腫瘍細胞または腫瘍関連細胞を標的とするように、操作することができる。そのような操作として、繊維、ヘキソン、及び／またはペントンタンパク質の削除（全部または一部）、様々な天然または非天然リガンドをカプシドタンパク質の各箇所に挿入するなどを挙げることができる。

【0032】

実施形態によっては、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、修飾繊維タンパク質を含む。アデノウイルス繊維タンパク質は、アデノウイルスポリペプチドＩＶの同種三量体であり、アデノウイルスポリペプチドＩＶは、３つのドメイン、テイル、シャフト、及びノブを有する。（Ｄｅｖａｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．，２１５：５６７－８８（１９９０），Ｙｅｈ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．，３３：１７９－９８（１９９１））。繊維タンパク質は、主に、ウイルスと細胞表面の受容体とのノブドメイン及びシャフトドメインを介した結合に介在する（Ｈｅｎｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６８（８）：５２３９－４６（１９９４））。三量化のためのアミノ酸配列は、ノブに位置しており、これは、繊維のアミノ末端（テイル）がペントン塩基と適切に会合するために必要であるように思われる（Ｎｏｖｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１８５：３６５－７６（１９９１））。繊維は、細胞受容体を認識し、ペントン塩基と結合することに加えて、血清型の固有性にも寄与している。血清型の異なるアデノウイルス由来の繊維タンパク質は、顕著に異なっている（例えば、Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯＪ．，２：１３５７－６５（１９８３）、Ｃｈｒｏｂｏｃｚｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１８６：２８０－８５（１９９２）、及びＳｉｇｎａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，５３：６７２－７８（１９８５）を参照）。すなわち、繊維タンパク質は、アデノウイルスの生活環に重要である機能を複数有している。

【0033】

上記繊維タンパク質は、５型アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターの野生型繊維アミノ酸配列に加えてまたはそれに代えて、非天然アミノ酸配列を含むという点で「修飾」されている。５型アデノウイルスの細胞への侵入は、その一次受容体であるコクサッキー・アデノウイルス受容体（ＣＡＲ）への最初の結合ステップによって媒介される。但し、ＣＡＲは多くの腫瘍細胞の表面上で発現の低下を示す。対照的に、ほとんどの細胞は、３型アデノウイルスに対する受容体であるＣＤ４６及びデスモグレイン２（ＤＳＧ－２）を高レベルで発現する。したがって、５型アデノウイルスの繊維タンパク質の修飾によって、ヒト腫瘍細胞に対する感染力が実質的に向上することが明らかになっている。一実施形態において、開示される５型アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターの野生型繊維タンパク質の少なくとも一部（例えば、繊維テイル、繊維シャフト、繊維ノブ、または繊維タンパク質全体）が除去され、且つ異なる血清型のアデノウイルス（本明細書に記載のものなど）由来の繊維タンパク質の対応する部分で置換される。一実施形態において、開示される５型アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターの繊維タンパク質のノブドメインが除去され、且つ異なるアデノウイルス血清型の対応する繊維ノブドメインで置換される。例えば、５型アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターの繊維タンパク質は、３型アデノウイルス由来のノブドメインを含んでいてもよい。５型アデノウイルスの繊維タンパク質の他の領域（すなわち、シャフト及び／またはテイルドメイン）を削除し、他のアデノウイルス血清型（例えば３型）由来の対応する領域で置換してもよい。一実施形態において、５型アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターの野生型繊維タンパク質全体が、３型アデノウイルスの繊維タンパク質全体で置換される。５型アデノウイルスの繊維タンパク質の領域を対応する３型の領域と交換することが、例えば、米国特許５，８４６，７８２及び７，２９７，５４２に記載されている。３型アデノウイルスの繊維タンパク質のアミノ酸配列はキャラクタライズされ、公開されている（例えば、Ｓｉｇｎａｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．，５３（２）：６７２－６７８（１９８５）、及びＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ 受入番号Ｐ０４５０１）。

【0034】

別の実施形態において、開示される５型アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターの野生型繊維タンパク質の少なくとも一部が除去され、且つ非アデノウイルス（すなわち、異種性）アミノ酸配列で置換される。例えば、５型アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターの繊維タンパク質のノブドメインを除去し、且つ合成によりもしくは組換えにより生成させたアミノ酸配列またはモチーフで置換してもよい。オリゴリシン、ＦＬＡＧ、ＲＧＤ－４Ｃ ＲＧＳ（Ｈｉｓ）６、及びＨＡエピトープを含む少数の異種性ペプチドが繊維ノブドメイン中に導入され、アデノウイルスを再標的化している。しかしながら、繊維ノブドメインのかなり複雑な構造に起因して、繊維ノブ中に導入されるいずれの異種性ペプチドまたはアミノ酸配列も、この繊維を不安定化させることがあってはならず、不安定化が起これば該繊維が三量化できなくなり、したがって機能しなくなる。したがって、上記繊維タンパク質が三量化することができる限り、任意且つ適宜の異種性アミノ酸配列を繊維ノブドメイン中に組み込むことができる。一実施形態において、本明細書に記載のアデノウイルスまたはアデノウイルスベクターの繊維ノブが除去され、且つ三量化モチーフ及び受容体結合リガンドで置換される。例えば、米国特許６，８１５，２００及びＫｒａｓｎｙｋｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７５（９）：４１７６－４１８３（２００１）に記載されるように、本明細書に記載のアデノウイルスまたはアデノウイルスベクターの繊維ノブが除去され、且つトランケートされた形態のバクテリオファージＴ４フィブリチンタンパク質と遺伝子組み換えにより融合されたＡｄ５繊維タンパク質のテイル及びシャフトドメインの２つのアミノ末端リピートを含む異種性タンパク質及びリガンドで置換される。アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターの繊維ノブ領域を置換することができる異種性タンパク質の他の例としては、イソロイシン三量化モチーフ及びヒト肺サーファクタントＤ由来のネック領域ペプチドが挙げられる。

【0035】

上記リガンドは、天然のアデノウイルス受容体ではない細胞表面タンパク質を特異的に認識する任意且つ適宜の分子またはペプチドであってよい。好適なリガンドの例としては、生理学的リガンド、抗受容体抗体、及び細胞特異的ペプチドが挙げられるが、これらに限定はされない。一実施形態において、上記リガンドは、抗体、抗体断片、または抗体の誘導体である。一実施形態において、上記リガンドは抗体断片である。抗体断片の例としては、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、及びＣＨドメインからなる一価断片であるＦａｂ断片、（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片、（ｉｉｉ）抗体のシングルアームのＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｉｖ）穏やかな還元条件を使用してＦ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋を切断することによって生成するＦａｂ’断片、（ｖ）ジスルフィド安定化Ｆｖ断片（ｄｓＦｖ）、及び（ｖｉ）抗原に特異的に結合する抗体の単一の可変領域ドメイン（ＶＨまたはＶＬ）ポリペプチドである単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）が挙げられるが、これらに限定はされない。一実施形態において、上記リガンドは、ラクダ科動物（すなわち、ラクダ及びアルパカ）によって産生される抗体に由来する単一ドメイン抗体である。ラクダ科動物は、抗原（Ａｇ）の認識及び抗原への結合の基盤としての２本の重鎖のみから構成される（軽鎖なし）非古典的抗体を産生し、これらの抗体は、アデノウイルス媒介性の遺伝子治療に利用されている（Ｒｅｖｅｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．，５：１１１－１２４（２００５））。ラクダ科動物ｓｄＡｂは、アデノウイルスカプシド中への機能的な取り込みを可能にする細胞質ゾルの安定性や、標的細胞特異性を可能にするファージバイオパニングによる選択との適合性などの、アデノウイルスの再標的化にとって理想的な特性を備えている（Ｂｅａｔｔｙ，Ｍ．Ｓ．ａｎｄ Ｄ．Ｔ．Ｃｕｒｉｅｌ，Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１１５：３９－６７（２０１２））。実際に、ラクダ科動物ｓｄＡｂ断片は、アデノウイルスベクターを標的化するための強力なリガンドであることが実証されている（例えば、Ｋａｌｉｂｅｒｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ．，９４（８）：８９３－９０５（２０１４）、ｖａｎ Ｅｒｐ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃｓ，２：１５００１（２０１５）、及び米国特許出願公開２０１７／００４４２６９を参照のこと）。修飾繊維ノブドメインにおいて使用されるラクダ科動物単一ドメイン抗体の選択は、アデノウイルス標的化の対象の所望の細胞型に依存することになることが理解されよう。本明細書に記載されるように、上記アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターが腫瘍またはがん細胞に向けて標的化される場合、上記ラクダ科動物ｓｄＡｂは、理想的には、腫瘍またはがん細胞の表面に異常に発現される受容体（「腫瘍特異的」または「がん特異的」受容体とも呼ばれる）に特異的に結合する。多数の腫瘍またはがん細胞特異的な細胞表面受容体が当技術分野で公知であり、これらの受容体としては、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、エストロゲン受容体、ビオチン受容体、ｃ（ＲＧＤ－Ｋ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、エンドセリン受容体Ｂ、線維芽細胞成長因子受容体（ＦＧＦＲ）、ソマトスタチン受容体、血管作用性腸ペプチド（ＶＩＰ）受容体、コレシストキニン（ＣＣＫ）受容体、ボンベシン／ガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）受容体、ニューロテンシン受容体、サブスタンスＰ、ニューロペプチドＹ、α－メラニン細胞刺激ホルモン（α－ＭＳＨ）、カルシトニン、エンドセリン、がん胎児抗原（ＣＥＡ）、及びＣＤ２７６（Ｂ７－Ｈ３）が挙げられるが、これらに限定はされない。

【0036】

一実施形態において、上記ラクダ科動物単一ドメイン抗体は、ＣＤ２７６タンパク質に特異的に結合する。ＣＤ２７６はＢ７及びＣＤ２８ファミリーの免疫チェックポイントメンバーであり、その発現は抗原提示細胞上で誘導される。ＣＤ２７６は、Ｔ細胞機能の阻害に重要な役割を果たし、広範囲のヒト固形がん上で高度に過剰発現しており、多くの場合、患者の予後不良及び臨床転帰不良の両方と相関している（Ｐｉｃａｒｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，２２（１４）：３４２５－３４３１（２０１６））。ＣＤ２７６の腫瘍特異的発現によって、正常な細胞（すなわち、非がん性細胞）の感染を回避しながら、ＣＤ２７６を標的とするアデノウイルスまたはアデノウイルスベクターを全身投与することができる可能性がある。さらに、ＣＤ２７６はＡ５４９細胞の表面上で発現し、当技術分野ではこれを用いて、条件的複製アデノウイルスを産生している。

【0037】

他の実施形態において、上記繊維タンパク質は、αｖβ３、αｖβ５、またはαｖβ６インテグリンに結合する非天然アミノ酸配列を含む。ＲＧＤモチーフなどのαｖβ３インテグリンに特異的なリガンドを表示するアデノウイルスは、細胞表面上により多数のαｖβ３インテグリン部分を有する細胞に、インテグリンをかかる程度まで発現しない細胞と比較して感染し、それによってこのベクターが目的の特定の細胞に向けて標的化される。例えば、上記アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、ＣＲＧＤＣ（配列番号２）、ＣＸＣＲＧＤＣＸＣ（配列番号３）（但し、Ｘは任意のアミノ酸を表す）、及びＣＤＣＲＧＤＣＦＣ（配列番号４）を含む、但しこれらに限定されないＲＧＤモチーフを含む非天然アミノ酸配列を含むキメラ繊維タンパク質を含んでいてもよい。上記ＲＧＤモチーフは、アデノウイルス繊維ノブ領域中、好ましくは、ＨＩループなどの当該アデノウイルスノブの露出したループ中に挿入することができる。

【0038】

５型アデノウイルスの繊維タンパク質の他の領域（すなわち、シャフト及び／またはテイルドメイン）を除去し、且つ他のアデノウイルス血清型または非アデノウイルスペプチド由来の対応する領域で置換してもよい。開示される５型アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターの野生型繊維タンパク質の任意且つ適宜のアミノ酸残基（複数可）を、ウイルスカプシド集合が妨げられない限り、修飾するまたは除去することができる。同様に、上記繊維タンパク質が三量化する能力を保持している限り、上記繊維タンパク質にアミノ酸を付加することができる。かかる修飾繊維タンパク質は、２種の異なるアデノウイルス血清型から得られるまたはそれらに由来するアミノ酸配列を含むことから、「キメラ」繊維タンパク質とも呼ばれる。

【0039】

いくつかの実施形態において、上記アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは修飾ヘキソンタンパク質を含む。上記アデノウイルスヘキソンタンパク質は、アデノウイルスカプシドの中で最大であり、且つ最も多量に存在するタンパク質である。上記ヘキソンタンパク質は、ウイルスカプシド集合、カプシドの正２０面体対称性の決定（延いては、カプシド容積及びＤＮＡパッケージングのサイズの限度を画定する）、及びカプシドの完全性にとって必須である。さらに、ヘキソンタンパク質は、アデノウイルスベクターの中和を低減するための修飾の主要な標的である（例えば、Ｇａｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７２：１０２６０－２６４（１９９８）、及びＲｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７７（１７）：９５５３－９５６６（２００３）を参照のこと）。ヘキソンタンパク質の主要な構造的特徴は血清型を跨いだアデノウイルス間で共有されてはいるが、該ヘキソンタンパク質のサイズ及び免疫学的特性は血清型間で異なる（Ｊｏｒｎｖａｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５６（１２）：６１８１－６１８６（１９８１））。１５種のアデノウイルスヘキソンタンパク質を比較したところ、該ヘキソンタンパク質の主要な抗原領域及び血清型特異的領域がループ１及び２（すなわち、それぞれＬＩまたはｌ１、及びＬＩＩまたはｌ２）中に存在し、その内部に、アデノウイルス血清型間で長さ及び配列が異なる、７～９の分散した超可変領域（ＨＶＲ１～ＨＶＲ７またはＨＶＲ９）が存在すると思われることが明らかになった（Ｃｒａｗｆｏｒｄ－Ｍｉｋｓｚａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０（３）：１８３６－１８４４（１９９６）、及びＢｒｕｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ ＯＮＥ，７（４）：ｅ３３９２０（２０１２））。

【0040】

ヘキソンタンパク質は、５型アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターの野生型ヘキソンアミノ酸配列に加えて、またはそれに代えて非天然アミノ酸配列を含むという点で「修飾」されている。上記Ａｄ５ヘキソンタンパク質は上記ウイルスの肝臓隔離（ｌｉｖｅｒ ｓｅｑｕｅｓｔｒａｔｉｏｎ）を媒介し（Ｗａｄｄｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１３２：３９７－４０９（２００８）、Ｖｉｇａｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１６：１４７４－１４８０（２００８）、及びＫａｌｙｕｚｈｎｉｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０５：５４８３－５４８８（２００８））、ヘキソンタンパク質の修飾、特に超可変５（ＨＶＲ５）及び超可変７（ＨＶＲ７）領域内での上記修飾は、５型アデノウイルス粒子の内因性肝臓隔離を軽減することが示されている（例えば、Ａｌｂａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１１４：９６５－９７１（２００９）、Ｓｈａｓｈｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１７：２１２１－２１３０（２００９）、及びＳｈｏｒｔ ｅｔ ｅｌ．，Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．，９（９）：２５３６－２５４４（２０１０）を参照のこと）。一実施形態において、開示される５型アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターの野生型ヘキソンタンパク質の少なくとも一部（例えば、ヘキソンタンパク質全体）は、望ましくは除去され、且つ異なる血清型のアデノウイルス（本明細書に記載されるものなど）由来のヘキソンタンパク質の対応する部分で置換される。一実施形態において、５型アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターのヘキソンタンパク質は、異なる血清型のアデノウイルス由来の１つ以上の超可変領域（ＨＶＲ）を含む。例えば、５型アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターのヘキソンタンパク質は、３型または１１型アデノウイルス由来の１つ以上の（例えば、１、２、３、４、５、６個、または７個すべて）の超可変領域（ＨＶＲ）を含む。換言すれば、開示される５型アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターのヘキソンタンパク質の１つ以上のＨＶＲを除去し、且つ３型または１１型アデノウイルス由来の１つ以上の対応するＨＶＲで置換してもよい。一実施形態において、５型アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターの野生型ヘキソンタンパク質全体は、３型または１１型アデノウイルスのヘキソンタンパク質全体で置換されている。

【0041】

３型アデノウイルスの複数の株のヘキソンタンパク質アミノ酸配列がキャラクタライズされ、公開されている（例えば、Ｈａｑｕｅ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ ＯＮＥ，１３（４）：ｅ０１９６２６３．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１９６２６３（２０１８）を参照のこと）。しかしながら、開示される５型アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターの野生型ヘキソンタンパク質の任意且つ適宜のアミノ酸残基（複数可）は、ウイルスカプシド集合が妨げられない限り、修飾または除去することができる。同様に、カプシドの構造的完全性が維持される限り、ヘキソンタンパク質にアミノ酸を付加することができる。かかる修飾ヘキソンタンパク質は、２種の異なるアデノウイルス血清型から得られるまたはそれらに由来するアミノ酸配列を含むことから、「キメラ」ヘキソンタンパク質とも呼ばれる。

【0042】

本開示の文脈において、当技術分野で公知の修飾（例えば、キメラ）アデノウイルスヘキソン及び繊維タンパク質の産生方法を使用することができる。かかる方法は、例えば、米国特許５，５４３，３２８、５，５５９，０９９、５，７１２，１３６、５，７３１，１９０、５，７５６，０８６、５，７７０，４４２、５，８４６，７８２、５，８７１，７２７、５，８８５，８０８、５，９２２，３１５、５，９６２，３１１、５，９６５，５４１、６，０５７，１５５、６，１２７，５２５、６，１５３，４３５、６，３２９，１９０、６，４５５，３１４、６，４６５，２５３、６，５７６，４５６、６，６４９，４０７、６，７４０，５２５、及び６，８１５，２００に記載される。

【0043】

本明細書に記載のアデノウイルスまたはアデノウイルスは、例えば、ＫＢ細胞、ＨｅＬａ細胞、及びＡ５４９細胞を含む、条件的複製アデノウイルスの増殖に適した細胞株中で産生させることができる（例えば、Ｌａｗｒｅｎｃｅ ａｎｄ Ｇｉｎｓｂｅｒｇ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１：８５１－８６７（１９６７）、Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｐｉｎａ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２０：１９９－２０７（１９６３）、Ｗｏｌｄ，Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ）（１９９９）を参照のこと）。アデノウイルス及びアデノウイルスベクターの産生及び精製方法は、例えば、米国特許６，１９４，１９１及び国際特許出願公開ＷＯ９９／５４４４１、ＷＯ９８／２２５８８、ＷＯ９８／００５２４、ＷＯ９６／２７６７７、及びＷＯ２００３／０７８５９２に記載されている。

【0044】

プロモーター、非天然核酸配列、アデノウイルスゲノム欠失、キメラヘキソンタンパク質、及びキメラ繊維タンパク質の種々の組み合わせを含む種々のアデノウイルスまたはアデノウイルスベクターが本開示に包含される一方で、特定の実施形態は、以下、すなわち、（１）（ａ）低酸素及び炎症に応答性の、本明細書に記載の、遺伝子操作されたＳＰＡＲＣプロモーターに機能的に連結された変異体Ｅ１Ａタンパク質をコードする核酸配列、（ｂ）アデノウイルスゲノムのＥ１Ｂ領域の全てもしくは一部の欠失、（ｃ）ｈＴＥＲＴプロモーターに機能的に連結された（５’－３’もしくは３’－５’方向）、ＣＤ４０Ｌをコードする核酸配列及び４－１ＢＢＬをコードする核酸配列、（ｄ）３型アデノウイルス繊維ノブドメインを含む繊維タンパク質、及び（ｅ）１つ以上の３型超可変領域（ＨＶＲ）を含むヘキソンタンパク質（図１Ａ及び図１Ｂを参照のこと）、（２）（ａ）低酸素及び炎症に応答性の、本明細書に記載の、遺伝子操作されたＳＰＡＲＣプロモーターに機能的に連結された変異体Ｅ１Ａタンパク質をコードする核酸配列、（ｂ）アデノウイルスゲノムのＥ１Ｂ領域の全てもしくは一部の欠失、（ｃ）ｈＴＥＲＴプロモーターに機能的に連結された、ＣＤ４０Ｌをコードする核酸配列及び４－１ＢＢＬをコードする核酸配列、（ｄ）非天然繊維ノブドメイン及び上記繊維ノブドメイン中に挿入されたＣＤ２７６特異的一本鎖ラクダ科動物抗体核酸配列を含む繊維タンパク質、及び（ｅ）１つ以上の３型超可変領域（ＨＶＲ）を含むヘキソンタンパク質（図１Ｃを参照のこと）、（３）（ａ）ＲＯＢＯ４もしくはＴｉｅ１プロモーターに機能的に連結された変異体Ｅ１Ａタンパク質をコードする核酸配列、（ｂ）アデノウイルスゲノムのＥ３領域の欠失、（ｃ）繊維ノブドメイン中に挿入されたＲＧＤペプチドを含む繊維タンパク質、及び（ｄ）１つ以上の３型超可変領域（ＨＶＲ）を含むヘキソンタンパク質（図１Ｄを参照のこと）、（４）（ａ）Ｔｉｅ１プロモーターに機能的に連結された変異体Ｅ１Ａタンパク質をコードする核酸配列、（ｂ）アデノウイルスゲノムのＥ３領域の欠失、（ｃ）ＣＭＶプロモーターに機能的に連結された、抗ＰＤ１タンパク質（例えば、抗体）をコードする核酸配列及びＯＭＰＣ－ＩＬ２をコードする核酸配列、（ｄ）繊維ノブドメイン中に挿入されたＲＧＤペプチドを含む繊維タンパク質、及び（ｅ）１つ以上の３型超可変領域（ＨＶＲ）を含むヘキソンタンパク質（図１Ｅを参照のこと）、ならびに（５）（ａ）Ｔｉｅ１プロモーターに機能的に連結された変異体Ｅ１Ａタンパク質をコードする核酸配列、（ｂ）アデノウイルスゲノムのＥ３領域の欠失、（ｃ）ＣＭＶプロモーターに機能的に連結された、抗ＰＤ１タンパク質（例えば、抗体）をコードする核酸配列及びＯＭＰＣ－ＩＬ２をコードする核酸配列、（ｄ）非天然繊維ノブドメイン及び上記繊維ノブドメイン中に挿入されたＣＤ２７６特異的一本鎖ラクダ科動物抗体核酸配列を含む繊維タンパク質、及び（ｅ）１つ以上の３型超可変領域（ＨＶＲ）を含むヘキソンタンパク質（図１Ｆを参照のこと）を含む、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターを含む。

【0045】

本開示は、本明細書に記載のアデノウイルスまたはアデノウイルスベクター及びそのためのキャリア（例えば、薬学上許容されるキャリア）を含む組成物を提供する。本組成物は、望ましくは、生理学的に許容される（例えば、薬学上許容される）組成物であり、この生理学的に許容される組成物は、キャリア、好ましくは生理学的に（例えば、薬学上）許容されるキャリア、及び本アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターを含む。本開示の文脈内では、任意且つ適宜のキャリアを使用することができ、かかるキャリアは当技術分野で周知である。キャリアの選択は、ある程度は、本組成物の個々の使用（例えば、動物への投与）及び本組成物を投与するために使用される個々の方法によって決定されることとなる。いくつかの実施形態において、本医薬組成物は無菌であってもよい。

【0046】

好適な組成物としては、抗酸化剤、緩衝剤、及び静菌剤を含んでいてもよい、水性及び非水性等張滅菌溶液剤、ならびに懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、及び防腐剤を含んでいてもよい水性及び非水性滅菌懸濁液剤が挙げられる。本組成物は、アンプル及びバイアルなどの単位用量または複数回用量の密封容器中で提供してもよく、使用の直前に滅菌液体キャリア、例えば水を添加するだけでよい、凍結乾燥した（ｆｒｅｅｚｅ－ｄｒｉｅｄ）（凍結乾燥した（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ））状態で保存してもよい。使用直前に調製する溶液剤及び懸濁液剤は、滅菌された粉末剤、顆粒剤、及び錠剤から調製することができる。上記キャリアは、緩衝生理食塩水であることが好ましい。本アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、該アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターを投与前の損傷から保護するように製剤化された組成物の一部であることがより好ましい。例えば、本組成物は、ガラス器具、注射器、もしくは針などの、本アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターを調製、保存、または投与するために使用される器具上での該アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターの損耗を低減するように製剤化してもよい。本組成物は、本アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターの光感受性及び／または温度感受性を低減するように製剤化してもよい。この目的のために、本組成物は、例えば、上記のものなどの薬学上許容される液体キャリア、ならびに、ポリソルベート８０、Ｌ－アルギニン、ポリビニルピロリドン、トレハロース、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される安定剤を含んでいてもよい。かかる組成物を使用することによって、本アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターの有効期間が延長され、且つその投与が容易になることとなる。アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターを含有する組成物の製剤は、例えば、米国特許６，２２５，２８９、６，５１４，９４３、及び７，４５６，００９、ならびに国際特許出願公開ＷＯ２０００／０３４４４４にさらに記載される。

【0047】

また、当業者は、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターが、他の治療的または生物学的活性剤と共に組成物に存在し得ることを理解する。例えば、イブプロフェンまたはステロイドなどの炎症を制御する要素が、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターのｉｎ ｖｉｖｏ投与に関連する腫れ及び炎症を減少させるために組成物の一部であり得る。抗生物質、すなわち、殺菌剤及び防かび剤が、既存の感染症を処置するため及び／または将来の感染症、例えば、ウイルス投与に関連する感染症のリスクを減少させるために存在し得る。

【0048】

組成物に存在するアデノウイルスまたはアデノウイルスベクターの用量は、意図された標的組織、任意の副作用の程度、特定の投与経路などを含む多数の要素に依存する。用量は、理想的には、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターの「有効量」、すなわち、レシピエント（例えば、ヒト）における所望の反応を引き起こすアデノウイルスまたはアデノウイルスベクターの用量を含む。望ましくは、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターの単回用量は、少なくとも約１×１０^７粒子（アデノウイルスベクターの粒子単位（ｐｕ）またはウイルス粒子（ｖｐ）とも称される）を含む。用量は、少なくとも約１×１０^８粒子（例えば、約１×１０^９～１×１０^１４粒子）、好ましくは少なくとも約１×１０^１０粒子、（例えば、約１×１０^１０～１×１０^１２粒子）のアデノウイルスまたはアデノウイルスベクターである。代替的には、用量は、約１×１０^１４粒子以下、好ましくは約１×１０^１３粒子以下、より好ましくは約１×１０^１２粒子以下を含む。すなわち、アデノウイルスベクターの単回用量は、例えば、約１×１０^７ウイルス粒子、２×１０^７ｖｐ、４×１０^７ｖｐ、１×１０^８ｖｐ、２×１０^８ｖｐ、４×１０^８ｖｐ、１×１０^９ｖｐ、２×１０^９ｖｐ、４×１０^９ｖｐ、１×１０^１０ｖｐ、２×１０^１０ｖｐ、４×１０^１０ｖｐ、１×１０^１１ｖｐ、２×１０^１１ｖｐ、４×１０^１１ｖｐ、１×１０^１２ｖｐ、２×１０^１２ｖｐ、４×１０^１２ｖｐ、１×１０^１３ｖｐ、２×１０^１３ｖｐ、４×１０^１３ｖｐ、または１×１０^１４ｖｐのアデノウイルスまたはアデノウイルスベクターを含み得る。

【0049】

本開示はまた、腫瘍細胞における細胞傷害性を誘導する方法であって、腫瘍細胞を上述した組成物と接触させることを含む、方法を提供する。用語「腫瘍」は、本明細書で使用される場合、細胞が、それがするはずのものよりも多く分裂し、またはそれがすべきときに死滅しない場合に生じる異常な組織の塊を指す。本開示の文脈では、腫瘍という用語は、腫瘍細胞及び腫瘍関連間質細胞（上述したとおり）を指し得る。腫瘍は、それらが近くの組織に侵入しない場合、または生物の他の部分に広がらない場合、良性及び非がん性であり得る。対照的に、用語「悪性腫瘍」、「がん」、及び「がん細胞」は、本明細書で互換的に使用され得、制御不能に分裂し、近くの組織に侵入し得る細胞を含む腫瘍を指す。がん細胞はまた、血液及びリンパ系を介して身体の他の部分に広がり、または「転移」し得る。開示される方法は、理想的には、悪性腫瘍細胞またはがん細胞における細胞傷害性を誘導する。悪性腫瘍細胞またはがん細胞は、がん（上皮細胞から発生するがん）、肉腫（骨及び軟部組織から発生するがん）、リンパ腫（リンパ球から発生するがん）、血液癌（例えば、骨髄腫または白血病）、黒色腫、または脳及び脊髄腫瘍からのものであり得る。悪性腫瘍またはがん細胞は、口腔（例えば、舌及び口の組織）及び咽頭、消化器系、呼吸器系、骨及び関節（例えば、骨転移）、軟部組織、皮膚（例えば、黒色腫）、乳房、生殖系、泌尿器系、眼及び眼窩、脳及び神経系（例えば、神経膠腫）、または内分泌系（例えば、甲状腺）に位置し得、必ずしも原発腫瘍ではない。より具体的には、消化器系のがんは、食道、胃、小腸、結腸、直腸、肛門、肝臓、胆嚢、及び膵臓に影響を及ぼし得る。呼吸器系のがんは、喉頭、肺、及び気管支に影響を及ぼし得、例えば、非小細胞肺癌を含む。生殖器系のがんは、子宮頸部、子宮体部、卵巣、外陰、膣、前立腺、精巣、及び陰茎に影響を及ぼし得る。泌尿器系のがんは、膀胱、腎臓、腎盂、及び尿管に影響を及ぼし得る。がん細胞はまた、リンパ腫（例えば、ホジキン病及び非ホジキンリンパ腫）、多発性骨髄腫、または白血病（例えば、急性リンパ球性白血病、慢性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病など）に関連し得る。一実施形態では、腫瘍細胞は、卵巣細胞、例えば、卵巣癌細胞である。

【0050】

薬剤は、「細胞傷害性」であり、薬剤（例えば、本明細書に記載のアデノウイルスまたはアデノウイルスベクター）が、細胞、特にがん細胞の成長を殺傷または阻害する場合、「細胞傷害性」を誘導する。いくつかの実施形態では、例えば、細胞傷害性は、がん細胞の分裂及び成長を防止すること、ならびに腫瘍またはがんのサイズを減少させることを含む。腫瘍細胞の細胞傷害性は、例えば、細胞溶解、細胞膜漏損、及びアポトーシスを測定するアッセイなどの当該技術分野で知られている任意の好適な細胞生存アッセイを使用して測定され得る。例えば、トリパンブルーアッセイ、ヨウ化プロピジウムアッセイ、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）アッセイ、テトラゾリウム還元アッセイ、レサズリン還元アッセイ、プロテアーゼマーカーアッセイ、５－ブロモ－２′－デオキシ－ウリジン（ＢｒｄＵ）アッセイ、及びＡＴＰ検出を含むがこれらに限定されない方法が使用され得る。市販の細胞生存性アッセイシステムもまた使用され得、例えば、ＣＥＬＬＴＩＴＥＲ－ＧＬＯ（登録商標）２．０（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ＶＩＶＡＦＩＸ（商標）５８３／６０３細胞生存性アッセイ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）、及びＣＹＴＯＴＯＸ－ＦＬＵＯＲ（商標）細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を含み得る。

【0051】

理想的には、開示される方法は、哺乳動物（例えば、ヒト）ががんについて処置されるように、腫瘍細胞増殖の阻害、腫瘍細胞の根絶、及び／または少なくとも１つの腫瘍のサイズの減少を促進する。「がんの処置」は、がんの全体的または部分的な緩和を意味する。一実施形態では、開示される方法は、腫瘍のサイズを少なくとも約２０％（例えば、少なくとも約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％）減少させる。理想的には、腫瘍は、完全に取り除かれる。

【0052】

腫瘍細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでアデノウイルス組成物と接触され得る。用語「ｉｎ ｖｉｖｏ」は、それらの正常でインタクトな状態の生存生物内で行われる方法を指し、「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」方法は、その通常の生物学的状況から単離された生物の成分を使用して行われる。細胞がｉｎ ｖｉｔｒｏで組成物と接触される場合、細胞は、任意の好適な原核生物または真核細胞であり得る。細胞がｉｎ ｖｉｖｏで組成物と接触される場合、組成物は、標準的な投与技術及び経路を使用して、動物、例えば、哺乳動物、特にヒトに投与され得る。好適な投与経路には、経口、静脈内、腹腔内、皮下、肺、経皮、筋肉内、鼻腔内、口腔内、舌下、または座剤投与が含まれるがこれらに限定されない。組成物は、好ましくは、非経口投与に好適である。用語「非経口」には、本明細書で使用される場合、静脈内、筋肉内、皮下、直腸、膣、及び腹腔内投与が含まれる。他の実施形態では、組成物は、静脈内、筋肉内、腹腔内、または皮下注射によって全身送達を使用して哺乳動物に投与され得る。

【0053】

アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターの単回用量の投与は、組成物の単回適用（例えば、標的組織への単回注射）を介して達成され得るのに対し、他の実施形態では、単回用量は、組成物の複数の投与を介して標的腫瘍の異なる点に投与され得、またはアデノウイルスまたはアデノウイルスベクターの複数の用量は、特定の用量の繰り返し投与を介して投与され得る。投与の回数は、処置期間にわたって約２回～約５０回の投与またはそれ以上（２～５０の間のすべての整数を含む）であり得る。投与の回数は、腫瘍位置、腫瘍サイズ、腫瘍タイプなどに依存する。

【0054】

開示される方法は、患者における所望の生物学的効果を達成するために他の治療方法と組み合わせて実施され得る。理想的には、開示される方法は、１つ以上のがんの処置を含み得、またはそれと併せて実施され得る。開示される方法と組み合わせて使用されるがんの処置の選択は、がん／腫瘍タイプ、腫瘍またはがんのステージ及び／またはグレード、患者の年齢などを含む多様な要素に依存する。用いられ得る好適ながんの処置には、手術、化学療法、放射線療法、免疫療法、ホルモン療法、及び幹細胞移植が含まれるがこれらに限定されない。一実施形態では、開示される方法は、腫瘍細胞を化学療法剤で処置することをさらに含む。例えば、アドリアマイシン、アスパラギナーゼ、ブレオマイシン、ブスルファン、シスプラチン、カルボプラチン、カルムスチン、カペシタビン、クロラムブシル、シタラビン、シクロホスファミド、カンプトテシン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デクスラゾキサン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エトポシド、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロムスチン、メクロレタミン、メルカプトプリン、メルファラン、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ニトロスレア、パクリタキセル、パミドロネート、ペントスタチン、プリカマイシン、プロカルバジン、リツキシマブ、ストレプトゾシン、テニポシド、チオグアニン、チオテパ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、タキソール、トランス白金、抗血管内皮成長因子化合物（「抗ＶＥＧＦ」）、抗上皮成長因子受容体化合物（「抗ＥＧＦＲ」）、５－フルオロウラシルなどを含む任意の好適な化学療法剤が、開示される方法において使用され得る。開示される方法において使用される化学療法剤のタイプ及び数は、特定の腫瘍タイプのための標準的な化学療法レジメンに依存する。

【0055】

他の実施形態では、開示される方法は、腫瘍またはがん細胞をサイトカイン、例えば、本明細書に開示されるサイトカインのいずれかで処置することをさらに含み得る。理想的には、サイトカインは、がんに対して治療的有効性を示す（例えば、ＩＬ－２及びＩＦＮ－α）（例えば、Ｌｅｅ，Ｓ．ａｎｄ Ｋ．Ｍａｒｇｏｌｉｎ，Ｃａｎｃｅｒｓ（Ｂａｓｅｌ），３（４）：３８５６－３８９３（２０１１）、及びＡｒｄｏｌｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ，６（２３）：１９３４６－１９３４７（２０１５）参照）。

【0056】

別の実施形態では、開示される方法は、腫瘍またはがん細胞を免疫チェックポイント調節剤で処置することをさらに含み得る。免疫チェックポイントは、免疫系の活動を刺激するために活性化または阻害されなければならない免疫細胞上の分子である。腫瘍は、そのようなチェックポイントを使用して免疫系による攻撃を回避し得る。免疫チェックポイント調節剤は、阻害性チェックポイントを遮断する「チェックポイント阻害剤」とも称される免疫細胞の阻害性シグナルのアンタゴニスト（すなわち、免疫反応を正常に阻害する分子）であり得る。例えば、免疫チェックポイント調節剤は、Ａ２ＡＲ、ＢＴＬＡ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＣＴＬＡ４、ＧＡＬ９、ＩＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＰＤ－１、ＴＤＯ、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３及び／またはＶＩＳＴＡのアンタゴニストであり得る。そのため、チェックポイント阻害剤療法は、阻害性チェックポイントを遮断し、免疫系機能を回復し得る。現在承認されているチェックポイント阻害剤は、分子ＣＴＬＡ４、ＰＤ－１、及びＰＤ－Ｌ１を標的とし、イピリムマブ（ＹＥＲＶＯＹ（登録商標））、ニボルマブ（ＯＰＤＩＶＯ（登録商標））、ペムブロリズマブ（ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標））、アテゾリズマブ（ＴＥＣＥＮＴＲＩＱ（登録商標））、アベルマブ（ＢＡＶＥＮＣＩＯ（登録商標））、及びデュルバルマブ（ＩＭＦＩＮＺＩ（登録商標））を含む。例えば、Ｋｙｉ，Ｃ．ａｎｄ Ｍ．Ａ．Ｐｏｓｔｏｗ，Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，８（７）：８２１－３７（２０１６）、Ｃｏｌｌｉｎ，Ｍ．，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｔｈｅｒ Ｐａｔ．，２６（５）：５５５－６４（２０１６）、Ｐａｒｄｏｌｌ，Ｄ．Ｍ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ，１２（４）：２５２－６（２０１２）、及びＧｕｂｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，５１５（７５２８）：５７７－８１（２０１４））に記載されているものなどの任意の好適なチェックポイント阻害剤が、開示される方法と組み合わせて使用され得る。他の実施形態では、免疫チェックポイント調節剤は、免疫細胞刺激性受容体のアゴニスト、例えば、ＢＡＦＦＲ、ＢＣＭＡ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ１２２、ＣＤ１３７、ＣＤ２２６、ＣＲＴＡＭ、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＩＣＯＳ、ＤＲ３、ＬＴＢＲ、ＴＡＣＩ及び／またはＯＸ４０のアゴニストであり得る。免疫チェックポイント調節剤は、望ましくは、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターを含む組成物または製剤とは別個の組成物または製剤で投与されるのに対し、いくつかの実施形態では、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、免疫チェックポイント調節剤をコードする核酸配列を含む。例えば、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、ＰＤ－１阻害剤、例えば、抗ＰＤ－１抗体（例えば、ペムブロリズマブ（ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標））、ニボルマブ（ＯＰＤＩＶＯ（登録商標））、またはセミプリマブ（ＬＩＢＴＡＹＯ（登録商標）））をコードする核酸配列を含み得る。

【0057】

以下の実施例は、本発明をさらに説明するが、当然ながら、どのようにもその範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
［実施例］

【0058】

実施例１
本実施例は、本開示に係る５型アデノウイルスの構築及び特性評価について記載する。

【0059】

ＵＩＯ－５２３（米国仮出願第６２／８０８，６９４号ではＡｄＳΔ１５－４０Ｌ．ＢＢＬ－ＨＶ５／３－Ｆ５／３とも、ＵＩＯ－５２２ＯＰとも称される）は、３個の低酸素症応答エレメント（ＨＲＥ）及び１２個の核内因子カッパＢ（ＮＦκＢ）応答エレメント（κＢＲＥ）を含むように改変されたＳＰＡＲＣプロモーターのＤＮＡ配列を含有するヒト５型条件的複製性デノウイルス（ＣＲＡｄ）ベクター（Δ１５Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ－、Ｅ３＋、ＨＶ５／３、Ｆ５／３）である。ＨＲＥは低酸素環境に対する調節因子としての役割を果たし、他方、κＢＲＥは炎症の誘因としての役割を果たす。低酸素症及び炎症は腫瘍微小環境に特徴的である。ＳＰＡＲＣプロモーターは、悪性細胞区画に密接しているがん関連線維芽細胞及び内皮細胞において高度に発現する。改変されたＳＰＡＲＣプロモーターは、上述される網膜芽細胞腫（Ｒｂ）結合性が欠損したタンパク質をコードする突然変異型Ｅ１Ａ遺伝子を働かせる。ウイルスゲノムの５’末端は、β－グロブリン遺伝子座（ｃＨＳ４）由来のクロマチンインスレーター配列を含むように操作されており、これは、異種クロマチンの抑制作用及び／またはエンハンサーの活性化作用を遮断するその能力によって、差別的に発現する遺伝子座を機能的に分離する、天然に存在するＤＮＡエレメントである。ここでは、インスレーター配列は、改変されたＳＰＡＲＣプロモーターに対するウイルスＩＴＲの作用を遮断することによってベクターからのバックグラウンド発現のレベルを低減する。

【0060】

ＵＩＯ－５２３のＥ３遺伝子領域のほとんどはそのままであり、５型繊維ノブは型３型ノブ（Ｆ５／３）で置き換えられている。ＵＩＯ－５２３はまた、ヘキソンタンパク質も含有し、これは対応する３型配列に取り替えられており、全身送達時の軽減された肝臓取込みを可能にする。ＵＩＯ－５２３ベクターは、サイトカインの腫瘍特異的発現をもたらすものであるがん特異的及び幹細胞特異的ｈＴＥＲＴプロモーターの制御下で免疫モジュレーター遺伝子ＣＤ４０Ｌ及び４－１ＢＢＬも発現させる。ＵＩＯ－５２２ＯＰゲノムのＥ１Ｂ領域のほとんどまたは全ては取り除かれて、元のＥ１Ｂ転写方向に比べて逆配向になったｈＴＥＲＴ－ＣＤ４０Ｌ／４－１ＢＢカセットで置き換えられて、Ｅ１Ａ遺伝子転写による干渉を回避するためのＳＶ４０ポリＡ配列で遮断されている。ＵＩＯ－５２３は図１Ｂに模式的に表される。

【0061】

ＵＩＯ－５２３が細胞に感染してＣＤ４０Ｌ及び４－１ＢＢＬ遺伝子産物を生成することができることを実証するために、Ａ５４９ヒト肺癌細胞及びＳＫＯＶ３ヒト卵巣癌細胞をマルチウェル組織培養プレートで２４時間成長させ、１００または１０００の多重感染度（ＭＯＩ）でＵＩＯ－５２３に感染させた。３０時間後、細胞を採取し、ヒトＣＤ４０Ｌをフローサイトメトリーによって評価した。これらの試験の結果を図２Ａ及び２Ｂに示すが、これらは、ＵＩＯ－５２３ががん細胞を溶解させサイトカインを生成して樹状細胞（ＤＣ）ならびに新たなＴ細胞及び新たなＴ細胞の波を刺激することができるということを実証している。

【0062】

アデノウイルスベクターの試験管内での細胞傷害性を評価するために、ヒト卵巣癌細胞ＳＫＯＶ３．Ｌｕｃ、マウス大腸癌ＣＴ２６細胞、及びＰＡ１ヒト卵巣癌細胞を使用した。試験したウイルスは、ＡＲ２０１１（非命名ウイルス）、ヒトＣＤ４０Ｌ及び４－１ＢＢＬで武装した天然５型ヘキソンタンパク質を有するＵＩＯ－５２３（ＵＩＯ－５２３ ｈＨ５）、５型ヘキソンが３型ヘキソンに取り替えられヒトまたはマウスＣＤ４０Ｌ及び４－１ＢＢＬで武装されたＵＩＯ－５２３（ＵＩＯ－５２３ ｈＨ３またはＵＩＯ－５２３ ｍＨ３）、ならびにＡＲ２０１１－ｌｕｃ（非複製性対照）を含んでいた。ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存性細胞酸化還元酵素の細胞代謝活性を測定するＭＴＴアッセイによって細胞生存能を監視した。この分析の結果を図３Ａ～３Ｄに示す。対照ＡＲ２０１１ウイルスは標的細胞に対する溶解作用を有さず、ヒト及びマウス細胞上にヒトサイトカインを発現させるヘキソン５を有するＵＩＯ－５２３の活性と同程度となり（図３Ａ及び３Ｂ参照）、結果として、サイトカインを加えることがウイルスの溶解活性に影響を及ぼさないことが実証された。加えて、ヘキソン５をヘキソン３に取り替えることは、ＰＡ１細胞上にヒトまたはマウスサイトカインのどちらかを発現させるＵＩＯ－５２３の溶解活性に影響を及ぼさなかった（図３Ｃ及び３Ｄ）参照。

【0063】

実施例２
本実施例は、ヒトＳＫＯＶ３卵巣癌異種移植モデルにおける生体内でのＣＤ４０Ｌ及び４１ＢＢＬの発現について記載する。

【0064】

６～８週齢のヌードマウスに４．５×１０^６個のＳＫＯＶ３．Ｌｕｃ細胞を投与した。腫瘍が平均１５０ｍｍ^３に達した時点でマウスに、マウス１匹あたり１×１０^１０ｖ．ｐ．または同体積のＰＢＳ（３０μｌ）を腫瘍内（ｉ．ｔ．）注射した。

【0065】

２４時間後、腫瘍を取り出し、タンパク質抽出物を調製した。１００μｇのタンパク質抽出物を１２％のＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離させ、ニトロセルロース膜（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に転写した。膜に抗ｈ４－１－ＢＢＬ抗体（ａｂ６８１８５ Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）または抗ＣＤ４０Ｌ抗体（ａｂ２３９１ Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）をプローブとして使用した。抗βーアクチン抗体（Ａ４７００、Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）及び抗αチューブリン（１２ｇ１０ ＤＳＨＢ）をローディングコントロールとして使用した。強化型化学発光試薬を製造者の指示に従って使用して信号を検出した（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ，ＵＫ）。ＣＤ４０Ｌ発現を図４に示す。４１ＢＢＬ発現の評価は現在進行中である。

【0066】

実施例３
本実施例は、卵巣癌の皮下異種移植片マウスモデルにおけるＵＩＯ－５２３の薬理学的試験について記載する。

【0067】

ヒト卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ３の皮下（ｓ．ｃ．）移植に基づく卵巣癌のマウス異種移植モデルを使用して、（ヒトＣＤ４０Ｌ及び４－１ＢＢＬで武装された）ＵＩＯ－５２３を評価した。５×１０^６個のＳＫＯＶ３細胞／２００μＬを６～８週齢のヌードマウス（ｎ＝１０マウス／群）の側腹部に注射することによって皮下腫瘍を樹立した。腫瘍が樹立された１０日目に、５×１０^１０ｖｐのＡＲ２０１１またはＵＩＯ－５２３を含んだ４００μＬのＰＢＳを腫瘍内（ｉ．ｔ．）注射した。ＰＢＳ投与は陰性対照としての役割を果たした。記載がなされているように（Ｌｏｐｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，２０：２２２２－３３（２０１２））、腫瘍を樹立してから１、３及び５日後にウイルスを注射した。処置前の－１日目、及びその後実験終了まで週に１回、腫瘍撮像を実施した。マウスに餌及び水を自由に摂らせ、いかなる食べ散らかしの兆候または他の視認可能な毒性の兆候も防ぐために綿密に観察した。マウスを４５日目に屠殺した。撮像及び動物生存率による腫瘍退縮の直接分析を用いて治療的有効性を評価した。図５Ａ～５Ｆに示すように、ＵＩＯ－５２３で処置したマウスに完全な腫瘍根絶が認められた。

【0068】

実施例４
本実施例は、マウスモデルにおける播種性腫瘍に対するＵＩＯ－５２３の溶解活性を実証する。

【0069】

ヒト卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ３の腹腔内（ｉ．ｐ．）移植に基づく卵巣癌のマウス異種移植モデルを使用して、（ヒトＣＤ４０Ｌ及び４－１ＢＢＬで武装された）ＵＩＯ－５２３ ｈＨ５を評価した。６×１０^６個のＳＫＯＶ３細胞を６～８週齢のヌードマウス（ｎ＝１０マウス／群）に注射することによって腹腔内腫瘍を樹立した。７日後に、５×１０^１０ｖｐのＡＲ２０１１またはＵＩＯ－５２３を含んだ４００μＬのＰＢＳをｉ．ｐ．注射した。ＰＢＳ投与（同じく４００μＬ）は陰性対照としての役割を果たした。１、４及び７日後にウイルスを注射した（Ｌｏｐｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，２０：２２２２－３３（２０１２））。マウスに餌及び水を自由に摂らせ、いかなる食べ散らかしの兆候または他の視認可能な毒性の兆候も防ぐために綿密に観察した。マウスを細胞移植の５４日後に屠殺した。ＵＩＯ－５２３で処置した数匹のマウスにおいて、腫瘍サイズに統計的に有意な差が認められ（図６参照）、腹腔内腫瘍が全く存在しないことが認められた。具体的には、ＰＢＳを注射したどのマウスも、無腫瘍とならなかった。ＵＩＯ－５２３ ｈＨ５で処置した１０匹のマウスのうち、３匹は無腫瘍となり、１匹は０．１グラム以下の腫瘍を有していた。ＡＲ２０１１を注射した１０匹のマウスのうち、４匹は０．１グラム以下の腫瘍を有しており、１０匹のマウスの中に無腫瘍のマウスはいなかった。処置及び対照動物から摘出された腫瘍を図７に示す。

【0070】

ウイルス分布を評価するために、全ＤＮＡを抽出し、ウイルス粒子の代理マーカーとしてＥ４ウイルスレベルを評価した（上記Ｌｏｐｅｚ ｅｔ ａｌ．）。３回目のウイルス投与の１日後（図８の「１０日」を参照されたい）か、実験終了時（図８の「５４日」を参照されたい）かのどちらかに腫瘍を摘出した。ウイルスＤＮＡは実験終了時に未だ存在しており、ＵＩＯ－５２３で処置された腫瘍は、それらの腫瘍重量がより小さいという事実にもかかわらず、より高いＥ４レベル／μｇ ＤＮＡを示した。

【0071】

本実験の結果は、ＡＲ２０１１及びＵＩＯ－５３２ ｈＨ５がＳＫＯＶ３腹腔内マウスモデルにおいて有意な腫瘍成長抑制を発揮したことを実証している。

【0072】

実施例５
本実施例は、繊維除去による条件的複製アデノウイルスベクターの指向先変更を実証する。

【0073】

本明細書中で述べているように、標的指向性モチーフの遺伝子組込みによって繊維タンパク質を改変することによってアデノウイルスベクターの向性を変更して細胞特異的遺伝子送達を実現するためのいくつかの方策が開発された。ここでは、重鎖（ＶＨＨ）ラクダファミリーの抗体に由来する抗ＣＤ２７６一本鎖可変ドメインを作製して腫瘍特異的なアデノウイルスベクター遺伝子移入を成し遂げた。

【0074】

抗ＣＤ２７６ＶＨＨを得るために、Ｋａｌｉｂｅｒｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，９４：８９３－９０５（２０１４）に記載されているようにＣＤ２７６抗原に対する免疫応答のピーク時のアルパカの末梢血リンパ球ＲＮＡからＶＨＨ提示ライブラリーを生成した。３型ヒトアデノウイルスの繊維タンパク質を取り除いてハイブリッドフィブリチン－抗ＣＤ２７６ ＶＨＨ断片で置き換えて、ベクターの指向先をＣＤ２７６受容体に変更した（上記Ｋａｌｉｂｅｒｏｖ ｅｔ ａｌ．に記載のとおり）。また、ベクターのＥ１領域を欠失させて、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現させるＣＭＶプロモーターで置き換え、その結果、構築物Ａｄ．ＣＭＶ－ＧＦＰ．Ｈ３．Ｆ（ＣＤ２７６）及びＡｄ．ＣＭＶ－ＧＦＰ．Ｈ３．Ｆ（３）が得られた。表面にヒトまたはマウスＣＤ２７６が発現するように操作されたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞にＡｄ．ＣＭＶ－ＧＦＰ．Ｈ３．Ｆ（ＣＤ２７６）及びＡｄ．ＣＭＶ－ＧＦＰ．Ｈ３．Ｆ（３）をトランスフェクトした。未改変ＣＨＯ細胞は対照としての役割を果たした。図９Ａ～９Ｆに示すように、Ａｄ．ＣＭＶ－ＧＦＰ．Ｈ３．Ｆ（ＣＤ２７６）は、ＣＨＯ細胞の表面に発現したＣＤ２７６に対する選択的指向を示した。Ａｄ．ＣＭＶ－ＧＦＰ．Ｈ３．Ｆ（ＣＤ２７６）は、アデノウイルス内在化受容体、αｖインテグリンが発現するが主要なアデノウイルス結合受容体、コクサッキーウイルス－アデノウイルス受容体（ＣＡＲ）が低いまたは検出可能なレベルで発現するものであるヒト横紋筋肉腫細胞に感染することもできた（Ｃｒｉｐｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６１：２９５３－２９６０（２００１））（図１０Ａ及び１０Ｂ参照）

【0075】

実施例６
本実施例は、ＵＩＯ－５２３の同系ＩＤ８マウスモデルにおける薬理学試験について記載する。

【0076】

この試験は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいてマウス腫瘍細胞株（ＩＤ８）の腫瘍成長を阻害するＵＩＯ－５２３の有効性評価、及び抗腫瘍免疫応答を提供することになる。ヒトとマウスとのサイトカイン交差反応性が問題となる場合、目的遺伝子の生物学的応答を正確に決定することができるように、マウス形態の遺伝子によって代理ベクターを構築した。また、細胞株の感染性に応じてＦ５／３またはＲＧＤ繊維を使用することにする。この試験の必要性に応じてさらなる安全性読み値を構築することとする。

【0077】

マウス形態のＵＩＯ－５２３（ｍＵＩＯ－５２３）についても卵巣癌の同系免疫正常マウスモデルにおいて試験することになる。このモデルは、ＣＴ２６マウス大腸癌細胞株に基づいている。この場合、撮像分析を可能にするレポーター遺伝子をＩＤ８細胞株にタグ付けすることになる。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに５×１０^６個のＩＤ８－Ｆ３ｍＣｈｅｒｒｙＬｕｃ細胞／２００μＬ（ｎ＝１０マウス／群）を同所に生着させることになる。１週間後に動物を５×１０^９または５×１０^１０ｖｐのＵＩＯ－５２３でｉ．ｐ．に攻撃することになる。２つの異なる送達経路の比較のために、対応するマウスの群にｉ．ｖ．投与によってもウイルスを注射することになる。週１回の直接的な撮像分析は抗腫瘍作用の評価を可能にするであろう。加えて、ＥＬＩＳＰＯＴ技術による腹腔液及び脾臓に由来する免疫細胞の分析は、抗腫瘍免疫の誘導の判定を可能にするであろう。再現性のために、試験されているウイルスの範囲内で武装サイトカインのマウス代理を採用してこれらの遺伝子の全身発現レベルを測定することになる。試験は、動物の健康状態の変化を評価する臨床観察を定期的に行いながらおよそ６０日間行われることになる。主要な臓器（例えば、脳、肝臓、肺、腎臓、心臓）及び注射部位領域に対して組織病理学が行われることになる。

【0078】

実施例７
本実施例は、同系マウスモデルにおいてＵＩＯ－５２３及びチェックポイント阻害剤を投与する方法について記載する。

【0079】

Ｃ５７ＢＬ／６マウスに５×１０^６個のＩＤ８－Ｆ３ｍＣｈｅｒｒｙＬｕｃ細胞／２００μＬ（ｎ＝１０マウス／群）を同所に生着させることになる。１週間後に動物を５×１０^９または５×１０^１０ｖ．ｐ．のどちらかのＵＩＯ－５２３で攻撃することになる（ｉ．ｐ．またはｉ．ｖ．送達は、上記の単剤療法有効性試験において得られた結果によって決定されることになる）。８日目及び１３日目にマウスに２５μｇ／マウスの抗マウスＰＤＬ１モノクローナル抗体をｉ．ｖ．注射することになる。直接的な撮像分析は抗腫瘍作用の評価を可能にするであろう。加えて、ＥＬＩＳＰＯＴ技術による腹腔液及び脾臓に由来する免疫細胞の分析は、抗腫瘍免疫の誘導の判定を可能にするであろう。処置群の生存率をおよそ８０日間にわたって、または処置群中の全てのマウスが死亡するまで追跡評価することになる。

【0080】

実施例８
本実施例は、シリアンハムスターにおけるＵＩＯ－５２３毒性学及び生体内分布を調べる試験について記載する。

【0081】

免疫正常シリアンハムスターにおいて、表１に示すように提案された第Ｉ相卵巣臨床試験を模倣した用量漸増プロトコールを用いて、単一の優良試験所規範（ＧＬＰ）試験の中でＵＩＯ－５２３の安全性及び生体内分布を評価する実験を行うことになる。

【0082】

意図した臨床試験を模倣する投薬計画によって（例えば連続日数にわたって１日１回）、１×１０^９～１×１０^１１ｖｐ／ハムスターの範囲の用量のＵＩＯ－５２３をｉ．ｐ．に投与することになる。試験される最高用量は、計画される最高ヒト用量を体重１ｋｇ基準で少なくとも５０倍上回ることになる。試験は、卵巣適応ゆえに雌の動物においてのみ実施されることになり、５匹の動物／群／時点で行うこととする。

【表1】

【0083】

この生体内分布／毒性試験からの結論は、第Ｉ相試験へと移すのに安全である無副作用量（ＮＯＡＥＬ）でのウイルスの最高用量を同定するであろう。それはまた、ウイルスのｉ．ｐ．投与後にどの組織が最も高いレベルのアデノウイルス感染を有するのかをも同定し、各感染組織においてウイルス粒子の量の定量的評価を提供するであろう。

【0084】

実施例９
本実施例は、卵巣癌におけるＵＩＯ－５２３アデノウイルスのための第Ｉ相臨床試験について記載する。

【0085】

第Ｉ相卵巣癌（ＯＣ）試験は、局所進行性、再発性または転移性卵巣癌のための単剤療法として及び従来のチェックポイント阻害剤（ＣＩ）療法の補助としての、ＵＩＯ－５２３の非盲検用量漸増試験とする。およそ１８～３０名の患者がこの試験に登録されると予想される。

【0086】

第Ｉ相ＯＣ臨床試験の試験目的は、（１）様々な局部的に進行した及び／または転移したがんを有する患者におけるＵＩＯ－５２３の腹腔内（または静脈内）注射の、単独での、及びＣＩ療法と組み合わせた安全性及び実現可能性、（２）腫瘍でのＵＩＯ－５２３及びＣＩの部位特異的な最大耐量（ＭＴＤ）及び推奨される第ＩＩ相用量、（３）ＵＩＯ－５２３の腹腔内（または静脈内）注射とＣＩとを組み合わせることが局所制御に及ぼす潜在的影響、ならびに（４）投与部位において腫瘍細胞に効率的にトランスフェクトするＵＩＯ－５２３の能力を、評価／同定することであろう。第Ｉ／ＩＩ相試験の第１評価項目は、腫瘍応答及び手術転帰であろう。

【0087】

ＵＩＯ－５２３を試験する第Ｉ／ＩＩ相臨床試験は、以下の固形腫瘍及びがんについて検討中である：食道、前立腺、神経膠芽腫、頭頸部癌、肝細胞癌腫、膀胱癌、メラノーマ、大腸癌及び骨肉腫。手術不可能ながんを有する患者における腫瘍低減に向けた第一線としてのＣＩ治療（例えば、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１阻害剤）と組み合わせたＵＩＯ－５２３による食道癌の治療は、腫瘍の到達可能性及びこのがんの乏しい予後ゆえに魅力的である。前立腺癌は、直接注射技術を用いること、小線源療法との共施行の実現可能性、及び代理マーカーの存在ゆえに、可能性を有するもう１つの適応症であり、神経膠芽腫は、罹患患者が利用できる治療選択肢が限られていることゆえに、可能性を有する適応症である。

【0088】

ＵＩＯ－５２３は、腫瘍内または腹腔内注射液として固形腫瘍には少ない体積（２～５ｃｃ）で、またはＯＣにはより多い体積（１００ｃｃ）で投与されることになる。製品は腫瘍内または腹膜内に直接注射によって複数部位に（例えば、固形腫瘍には２～５回の注射、ＯＣには３回の注射）、注射の規定の幾何学的配置で投与されることになる。ＯＣ第Ｉ相試験は、コホート間を半対数漸増として５つの用量レベル（１×１０^１０～１×１０^１２ｖｐ、３回）からなることとする。用量レベル１つあたり３名の患者を登録することになる。用量制限毒性がある場合には、試験を次の用量レベルへと進めるのを許可する前に、追加で３名の患者をその用量で登録することになる。同様の用量漸増デザインを第Ｉ相固形腫瘍試験に用いることになる。

【0089】

本明細書中で引用される刊行物、特許出願及び特許を含めた全ての参考文献は、これをもって参照により、各参考文献を個別かつ具体的に参照により援用すると示しその全体を本明細書に明記した場合と同じ程度に援用される。

【0090】

本発明を記載する文脈（特に、以下の特許請求の範囲の文脈）において、「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」及び「少なくとも１つ」という用語ならびに同様の指示対象の使用は、単数形及び複数形の両方を包含すると解釈されるべきであり、但し、そうでないことが本明細書中に示されているかまたは文脈から明らかに矛盾する場合を除く。１つ以上の項目の列挙の後に続く「少なくとも１つ」という用語（例えば、「Ａ及びＢのうちの少なくとも１つ」）の使用は、列挙された項目から選択される１つの項目（ＡまたはＢ）、または列挙された項目のうちの２つ以上の任意の組合せ（ＡとＢ）を意味すると解釈されるべきであり、但し、そうでないことが本明細書中に示されているかまたは文脈から明らかに矛盾する場合を除く。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「含有する」という用語は、特に示されていない限り、開放型の用語（つまり、「含むがそれに限定されない」という意味）と解釈されるべきである。本明細書における値の範囲の列挙は、本明細書中で特に示していない限り、単に、範囲内に入る別個の各値に個別に言及する手短な方法として役立てることを意図したものであり、個別の各値は、あたかもそれを本明細書中で個別に挙げたかのように本明細書に組み込まれる。本明細書に記載の全ての方法は任意の好適な順序で実施されることができ、但し、そうでないことが本明細書中に示されているかあるいは文脈から明らかに矛盾する場合を除く。本明細書中で示されるありとあらゆる例または例示的な表現（例えば「など」）の使用は単に本発明をよりよく例示することを意図したものであり、特許請求の範囲に記載がない限り、本発明の範囲に限定を加えるものではない。本明細書中のいかなる表現も、特許請求の範囲に記載がない要素を本発明の実施に必須であると示すものと解釈されるべきでない。

【0091】

本発明を実施するための本発明者らに知られている最良の形態を含めた本発明の好ましい実施形態が本明細書に記載されている。それらの好ましい実施形態の変化形態は、上記の説明を読むことで当業者に明らかとなり得る。本発明者らは、当業者がそのような変化形態を必要に応じて採用することを企図し、本発明者らは本発明について、本明細書に具体的に記載されている以外の実施がなされることを意図する。したがって、本発明は、適用法令によって許可される、本明細書に添えて別記される特許請求の範囲の中で挙げられている主題のあらゆる改変形態及び均等物を含む。さらには、上記要素の任意の組合せがそのあらゆる可能な変化形態で本発明に包含され、但し、そうでないことが本明細書中に示されているかあるいは文脈から明らかに矛盾する場合を除く。

【図面の簡単な説明】

【0092】

【図1】Ａ～Ｆは、本開示が包含する複数の異なるアデノウイルス実施形態を図解する概略図である。詳細には、Ｂは、実施例１に記載のＵＩＯ－５２３アデノウイルスの概略図である。

【図2A】ＳＫＯＶ３細胞中のＣＤ４０Ｌのｉｎ ｖｉｔｒｏ発現を実証するフローサイトメトリーデータのプロットであり、アイソタイプの対照（明灰色）、ＭＯＩが１００のＵＩＯ－５２３（中間の灰色、３３．２％陽性）、及びＭＯＩが１０００のＵＩＯ－５２３（暗灰色、７４．８％陽性）である。

【図2B】Ａ５４９細胞中のＣＤ４０Ｌのｉｎ ｖｉｔｒｏ発現を実証するフローサイトメトリーデータのプロットであり、アイソタイプの対照（明灰色）、ＭＯＩが１００のＵＩＯ－５２３（中間の灰色、８９．６％陽性）、及びＭＯＩが１０００のＵＩＯ－５２３（暗灰色、９０％陽性）である。

【図3A】ＳＫＯＶ３細胞（図３Ａ）における、ＡＦ２０１１及びＵＩＯ－５２３ ｈＨ５ベクターの溶解活性を図解するグラフである。ＡＲ２０１１－ｌｕｃは、非複製対照ベクターである。

【図3B】ＣＴ２６細胞（図３Ｂ）における、ＡＦ２０１１及びＵＩＯ－５２３ ｈＨ５ベクターの溶解活性を図解するグラフである。ＡＲ２０１１－ｌｕｃは、非複製対照ベクターである。

【図3C】ＰＡ１細胞に対するＵＩＯ－５２３ ｈＨ５、ＵＩＯ－５２３ ｈＨ３、及びＵＩＯ－５２３ ｍＨ３の溶解活性を図解するグラフである。

【図4】は、実施例２に記載のとおりに処置したマウスから得られた腫瘍のタンパク質抽出物における、ＣＤ４０Ｌの発現を示す画像である。

【図5A】ＰＢＳ（図５Ａ）、ＡＲ２０１１（図５Ｂ）、及びＵＩＯ－５２３（図５Ｃ）で処置した卵巣癌の皮下異種移植片マウスモデルにおける腫瘍体積を図解するグラフである。

【図5B】ＰＢＳ（図５Ａ）、ＡＲ２０１１（図５Ｂ）、及びＵＩＯ－５２３（図５Ｃ）で処置した卵巣癌の皮下異種移植片マウスモデルにおける腫瘍体積を図解するグラフである。

【図5C】ＰＢＳ（図５Ａ）、ＡＲ２０１１（図５Ｂ）、及びＵＩＯ－５２３（図５Ｃ）で処置した卵巣癌の皮下異種移植片マウスモデルにおける腫瘍体積を図解するグラフである。

【図5D】ＰＢＳ（図５Ｄ）、ＡＲ２０１１（図５Ｅ）、及びＵＩＯ－５２３（図５Ｆ）で処置したマウスの代表的な腫瘍の画像である。

【図5E】ＰＢＳ（図５Ｄ）、ＡＲ２０１１（図５Ｅ）、及びＵＩＯ－５２３（図５Ｆ）で処置したマウスの代表的な腫瘍の画像である。

【図5F】ＰＢＳ（図５Ｄ）、ＡＲ２０１１（図５Ｅ）、及びＵＩＯ－５２３（図５Ｆ）で処置したマウスの代表的な腫瘍の画像である。

【図6】卵巣癌腫症の腹腔内マウスモデルにおける播種性腫瘍に対するＵＩＯ－５２３及びＡＲ２０１１のｉｎ ｖｉｖｏ溶解活性を図解するグラフである。

【図7】ＰＢＳ対照（上段パネル）、ＡＲ２０１１（中段パネル）、またはＵＩＯ－５２３ｈＨ５（下段パネル）で処置したＳＫＯＶ３腹腔内異種移植片モデルマウスから切除した腫瘍の画像である。

【図8】ＰＢＳ対照、ＡＲ２０１１、またはＵＩＯ－５２３ｈＨ５で処置したＳＫＯＶ３腹腔内異種移植片モデルマウス由来の腫瘍における、Ｅ４コピー数／μｇＤＮＡを示すグラフである。

【図9】Ａ～Ｆは、ヒト（ＣＨＯ－ｈＣ３）またはマウス（ＣＨＯ－ｍＣ３）ＣＤ２７６を表面で発現するように改変したＣＨＯ細胞で、繊維修飾したＡｄ．ＣＭＶ－ＧＦＰ．Ｈ３．Ｆ（ＣＤ２７６）（Ｄ～Ｆ）またはＡｄ．ＣＭＶ－ＧＦＰ．Ｈ３．Ｆ（３）（Ａ～Ｃ）を形質移入した後の、免疫蛍光画像である。未改変ＣＨＯ細胞は、対照としての役目を担った。

【図10】Ａ及びＢは、Ａｄ．ＣＭＶ－ＧＦＰ．Ｈ３．Ｆ（３）（Ａ）及びＡｄ．ＣＭＶ－ＧＦＰ．Ｈ３．Ｆ（ＣＤ２７６）（Ｂ）を感染させた横紋筋肉腫細胞の免疫蛍光画像である。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【図5E】

【図5F】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9A-9C】

【図9D-9F】

【図10A】

【図10B】

【配列表】

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【国際調査報告】