特表 2022-521486 トランスポゾンに基づく免疫細胞の改変

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-04-08

(54)【発明の名称】トランスポゾンに基づく免疫細胞の改変

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/12 20060101AFI20220401BHJP

   C12N 15/867 20060101ALI20220401BHJP

   C12N 15/85 20060101ALI20220401BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20220401BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20220401BHJP

   C12Q 1/6869 20180101ALI20220401BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALN20220401BHJP

   C12N 5/0781 20100101ALN20220401BHJP

   C12N 15/62 20060101ALN20220401BHJP

【ＦＩ】

C12N15/12 ZNA

C12N15/867 Z

C12N15/85 Z

C12N5/10

C12Q1/02

C12Q1/6869 Z

C12N5/0783

C12N5/0781

C12N15/62 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021547309

(86)(22)【出願日】2020-02-07

(85)【翻訳文提出日】2021-10-07

(86)【国際出願番号】 US2020017283

(87)【国際公開番号】W WO2020163755

(87)【国際公開日】2020-08-13

(31)【優先権主張番号】62/803,142

(32)【優先日】2019-02-08

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】521354019

【氏名又は名称】ディーエヌエイ ツーポイント インコーポレイテッド

(71)【出願人】

【識別番号】599124736

【氏名又は名称】ザ・ジエネラル・ホスピタル・コーポレーシヨン

(74)【代理人】

【識別番号】110000855

【氏名又は名称】特許業務法人浅村特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】コボールド、マーク

(72)【発明者】

【氏名】リー、マギー

(72)【発明者】

【氏名】ミンシュル、ジェレミー

(72)【発明者】

【氏名】シー、フェン

(72)【発明者】

【氏名】シュイ、イーファン

【テーマコード（参考）】

4B063

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B063QA08

4B063QA13

4B063QA17

4B063QQ08

4B063QQ53

4B063QR08

4B063QR58

4B063QR62

4B063QR80

4B063QS05

4B063QS24

4B063QX02

4B065AA92X

4B065AA92Y

4B065AA94X

4B065AA94Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA01

4B065CA24

4B065CA44

(57)【要約】

本発明は、免疫細胞の安定した遺伝子修飾のための方法および組成物を提供する。遺伝子修飾は、治療目的用または診断目的用の免疫細胞を作製するために使用することができる。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

免疫細胞内でのタンパク質の発現に有効な異種調節配列に作動可能に連結されたタンパク質をコードする核酸を含み、それにより前記免疫細胞の生存を増強する、免疫細胞生存増強遺伝子を含む、ポリヌクレオチド。

【請求項2】

前記免疫細胞生存増強遺伝子が、活性化突然変異を含む天然に存在するタンパク質をコードする、請求項１に記載のポリヌクレオチド。

【請求項3】

前記免疫細胞生存増強遺伝子が、活性化突然変異を含むＳＴＡＴ３、ＣＤ２８、ＲｈｏＡ、ＰＬＣＧ、ＳＴＡＴ５ＢまたはＣＣＮＤ１から選択されるタンパク質をコードする、請求項２に記載のポリヌクレオチド。

【請求項4】

前記免疫細胞生存増強遺伝子がＳＴＡＴ３をコードし、前記ＳＴＡＴ３が以下の活性化突然変異、すなわち、Ｆ１７４Ｓ、Ｈ４１０Ｒ、Ｓ６１４Ｒ、Ｅ６１６Ｋ、Ｇ６１８Ｒ、Ｙ６４０Ｆ、Ｎ６４７Ｉ、Ｅ６５２Ｋ、Ｋ６５８Ｙ、Ｋ６５８Ｒ、Ｋ６５８Ｎ、Ｋ６５８Ｍ、Ｋ６５８Ｒ、Ｋ６５８Ｈ、Ｋ６５８Ｎ、Ｄ６６１ＹまたはＤ６６１Ｖのうちの１つ以上を含む、請求項３に記載のポリヌクレオチド。

【請求項5】

前記免疫細胞生存増強遺伝子がＣＤ２８をコードし、前記ＣＤ２８が以下の活性化突然変異、すなわち、Ｄ１２４Ｅ、Ｄ１２４Ｖ、Ｔ１９５ＩまたはＴ１９５Ｐのうちの１つ以上を含む、請求項３に記載のポリヌクレオチド。

【請求項6】

前記免疫細胞生存増強遺伝子がＲｈｏＡをコードし、前記ＲｈｏＡが以下の活性化突然変異、すなわち、Ｇ１７ＶまたはＫ１８Ｎのうちの１つ以上を含む、請求項３に記載のポリヌクレオチド。

【請求項7】

前記免疫細胞生存増強遺伝子がＰＬＣＧをコードし、前記ＰＬＧＣが以下の活性化突然変異、すなわち、Ｓ３４５Ｆ、Ｓ５２０ＦまたはＲ７０７Ｑのうちの１つを含む、請求項３に記載のポリヌクレオチド。

【請求項8】

前記免疫細胞生存増強遺伝子がＳＴＡＴ５Ｂをコードし、前記ＳＴＡＴ５Ｂが以下の活性化突然変異、すなわち、Ｎ６４２Ｈ、Ｔ６４８Ｓ、Ｓ６５２Ｙ、Ｙ６６５ＦまたはＰ２６７Ａのうちの１つ以上を含む、請求項３に記載のポリヌクレオチド。

【請求項9】

前記免疫細胞生存増強遺伝子がＣＣＮＤ１をコードし、前記ＣＣＮＤ１が以下の活性化突然変異、すなわち、Ｅ３６Ｇ、Ｅ３６Ｑ、Ｅ３６Ｋ、Ａ３９Ｓ、Ｓ４１Ｌ、Ｓ４１Ｐ、Ｓ４１Ｔ、Ｖ４２Ｅ、Ｖ４２Ａ、Ｖ４２Ｌ、Ｖ４２Ｍ、Ｙ４４Ｓ、Ｙ４４Ｄ、Ｙ４４Ｃ、Ｙ４４Ｈ、Ｋ４６Ｔ、Ｋ４６Ｒ、Ｋ４６Ｎ、Ｋ４６Ｅ、Ｃ４７Ｇ、Ｃ４７Ｒ、Ｃ４７Ｓ、Ｃ４７Ｗ、Ｐ１９９Ｒ、Ｐ１９９Ｓ、Ｐ１９９Ｌ、Ｓ２０１Ｆ、Ｔ２８５Ｉ、Ｔ２８５Ａ、Ｐ２８６Ｌ、Ｐ２８６Ｈ、Ｐ２８６Ｓ、Ｐ２８６ＴまたはＰ２８６Ａのうちの１つ以上を含む、請求項３に記載のポリヌクレオチド。

【請求項10】

前記免疫細胞生存増強遺伝子が、天然に存在するヒトタンパク質をコードする、請求項１に記載のポリヌクレオチド。

【請求項11】

前記免疫細胞生存増強遺伝子が、サバイビン、Ｂｃｌ２、Ｂｃｌ６またはＢｃｌ－ＸＬから選択されるタンパク質をコードする、請求項１０に記載のポリヌクレオチド。

【請求項12】

前記免疫細胞生存増強遺伝子がアポトーシス阻害剤をコードする、請求項１に記載のポリヌクレオチド。

【請求項13】

前記異種プロモーターが、ＥＦ１プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰＤＨプロモーター、ＥＥＦ２プロモーター、ユビキチンプロモーター、ＳＶ４０プロモーターまたはＨＳＶＴＫプロモーターから選択される、請求項１に記載のポリヌクレオチド。

【請求項14】

前記異種プロモーターが配列番号９４～１５４から選択される、請求項１２に記載のポリヌクレオチド。

【請求項15】

配列番号６および配列番号７、または配列番号１４および配列暗号１５、または配列番号１８および配列番号１９、または配列番号２０および配列番号２１、または配列番号２６および配列番号２７、または配列番号３９９および配列番号４００から選択される１対の配列をさらに含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。

【請求項16】

そのゲノムが前記ポリヌクレオチドを含む免疫細胞の半減期が、そのゲノムが前記ポリヌクレオチドを含まない免疫細胞の半減期と比較して少なくとも２５％長くなっている、請求項１に記載のポリヌクレオチド。

【請求項17】

そのゲノムが前記ポリヌクレオチドを含む免疫細胞の最長寿命が、そのゲノムが前記ポリヌクレオチドを含まない免疫細胞の最長寿命と比較して少なくとも２５％長くなっている、請求項１に記載のポリヌクレオチド。

【請求項18】

そのゲノムが前記ポリヌクレオチドを含まない免疫細胞の倍加時間が、そのゲノムが前記ポリヌクレオチドを含む免疫細胞の倍加時間と比較して少なくとも２５％長い、請求項１に記載のポリヌクレオチド。

【請求項19】

そのゲノムが前記ポリヌクレオチドを含む免疫細胞の増殖速度が、そのゲノムが前記ポリヌクレオチドを含まない免疫細胞の増殖速度と比較して少なくとも２５％高くなっている、請求項１に記載のポリヌクレオチド。

【請求項20】

そのゲノムが前記ポリヌクレオチドを含むＴ細胞の抗原チャレンジの反復の際の生存が、そのゲノムが前記ポリヌクレオチドを含まない免疫細胞の生存と比較して少なくとも２５％高くなっている、請求項１に記載のポリヌクレオチド。

【請求項21】

請求項１～２０のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む、トランスポゾン。

【請求項22】

請求項１～２０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む、レンチウイルスベクター。

【請求項23】

異種プロモーターに作動可能に連結された、アポトーシス阻害剤をコードするポリヌクレオチドを、免疫細胞内へと導入することを含む、改変された免疫細胞を作製するための方法。

【請求項24】

前記ポリヌクレオチドがトランスポゾン末端をさらに含み、かつ前記方法が、前記アポトーシス阻害剤をコードする前記ポリヌクレオチドが前記免疫細胞のゲノム内へと転位するように、対応するトランスポザーゼを前記免疫細胞内へと導入することをさらに含む、請求項２３に記載の方法。

【請求項25】

前記トランスポザーゼが、前記トランスポザーゼをコードする核酸として導入される、請求項２４に記載の方法。

【請求項26】

前記核酸がｍＲＮＡである、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

前記トランスポザーゼをコードする前記核酸が、前記免疫細胞において活性のあるプロモーターに作動可能に連結されている、請求項２５に記載の方法。

【請求項28】

前記トランスポゾンおよび前記トランスポザーゼが同じ時点で前記免疫細胞内へと導入される、請求項２４に記載の方法。

【請求項29】

前記トランスポゾンおよび前記トランスポザーゼが異なる時点で前記免疫細胞内へと導入される、請求項２４に記載の方法。

【請求項30】

前記免疫細胞がＴ細胞であり、前記方法が、抗原に結合することができる受容体をコードする遺伝子を前記免疫細胞内へと導入することをさらに含み、前記抗原をその表面に提示する標的細胞への前記受容体の結合が、前記Ｔ細胞に前記標的細胞を死滅させる、請求項２３に記載の方法。

【請求項31】

前記アポトーシス阻害剤が、サバイビン、Ｂｃｌ２、Ｂｃｌ６、Ｂｃｌ－ＸＬまたはＣａｓｐ３、Ｃａｓｐ７、Ｃａｓｐ８、Ｃａｓｐ９もしくはＣａｓｐ１０のドミナントネガティブ突然変異体から選択される、請求項２３に記載の方法。

【請求項32】

改変された免疫細胞を作製するための方法であって、前記方法が、ＳＴＡＴ３、ＣＤ２８、ＲｈｏＡ、ＰＬＣＧ、ＳＴＡＴ５ＢまたはＣＣＮＤ１から選択されるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを免疫細胞内へと導入することを含み、前記タンパク質が、異種プロモーターに作動可能に連結された活性化突然変異を含む、方法。

【請求項33】

改変された免疫細胞を作製するための方法であって、
ａ．阻害シグナルを免疫細胞に正常に伝達する受容体の細胞外ドメインに由来する配列
ｂ．刺激シグナルを免疫細胞に伝達する受容体の細胞内ドメインの細胞内ドメインに由来する配列
ｃ．膜貫通ドメイン
を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを免疫細胞内へと導入することを含み、
前記ポリペプチドがＣＤ３ゼータ細胞内ドメインを含まない、方法。

【請求項34】

前記細胞外ドメインが、配列番号３２２～配列番号３４０から選択される配列を含む、請求項３３に記載の方法。

【請求項35】

前記細胞内ドメインが、配列番号３４１～配列番号３６４から選択される配列を含む、請求項３３に記載の方法。

【請求項36】

前記ポリペプチドが、配列番号２７４～配列番号３１８から選択される配列を含む、請求項３３に記載の方法。

【請求項37】

そのゲノムが請求項１に記載のポリヌクレオチドを含む、免疫細胞。

【請求項38】

前記免疫細胞の半減期が、そのゲノムが請求項１に記載のポリヌクレオチドを含まない免疫細胞の半減期と比較して少なくとも２５％長くなっている、請求項３７に記載の免疫細胞。

【請求項39】

前記免疫細胞の最長寿命が、そのゲノムが請求項１に記載のポリヌクレオチドを含まない免疫細胞の最長寿命と比較して少なくとも２５％長くなっている、請求項３７に記載の免疫細胞。

【請求項40】

そのゲノムが請求項１に記載のポリヌクレオチドを含まない免疫細胞の倍加時間が、そのゲノムが請求項１に記載のポリヌクレオチドを含む免疫細胞の半減期と比較して少なくとも２５％長くなっている、請求項３７に記載の免疫細胞。

【請求項41】

前記免疫細胞の増殖速度が、そのゲノムが請求項１に記載のポリヌクレオチドを含まない免疫細胞の増殖速度と比較して少なくとも２５％高くなっている、請求項３７に記載の免疫細胞。

【請求項42】

そのゲノムが前記ポリヌクレオチドを含むＴ細胞の、抗原チャレンジの反復の際の生存が、そのゲノムが前記ポリヌクレオチドを含まない免疫細胞の生存と比較して少なくとも２５％高くなっている、請求項３７に記載の免疫細胞。

【請求項43】

前記免疫細胞がＴ細胞である、請求項３７に記載の免疫細胞。

【請求項44】

前記免疫細胞がＢ細胞である、請求項３７に記載の免疫細胞。

【請求項45】

前記免疫細胞がヒト細胞である、請求項３７に記載の免疫細胞。

【請求項46】

前記免疫細胞が霊長類細胞、齧歯類細胞、ネコ細胞、イヌ細胞またはウマ細胞である、請求項３７に記載の免疫細胞。

【請求項47】

前記免疫細胞生存増強遺伝子がシグナル伝達増強受容体（ＥＳＲ）をコードし、前記ＥＳＲが
ａ．阻害シグナルを免疫細胞に正常に伝達する受容体の細胞外ドメインに由来する配列
ｂ．刺激シグナルを免疫細胞に伝達する受容体の細胞内ドメインの細胞内ドメインに由来する配列
ｃ．膜貫通ドメイン
を含み、かつ前記ＥＳＲがＣＤ３ゼータ細胞内ドメインを含まない、請求項１に記載のポリヌクレオチド。

【請求項48】

前記細胞外ドメイン（ａ）が、ＴＮＦＲＳＦ３（ＬＴＲβ）、ＴＮＦＲＳＦ６（Ｆａｓ）、ＴＮＦＲＳＦ８（ＣＤ３０）、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ（ＤＲ４）、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ（ＤＲ５）、ＴＮＦＲＳＦ１９（ＴＲＯＹ）、ＴＮＦＲＳＦ２１（ＤＲ６）およびＣＴＬＡ４から選択されるヒトタンパク質に由来する、請求項４７に記載のポリヌクレオチド。

【請求項49】

前記ＥＳＲが、配列番号３２２～３４０から選択される配列と少なくとも９０％同一である配列を含む、請求項４７に記載のポリヌクレオチド。

【請求項50】

前記細胞内ドメイン（ｂ）が、ＴＮＦＲＳＦ４（ＯＸ４０）、ＴＮＦＲＳＦ５（ＣＤ４０）、ＴＮＦＲＳＦ７（ＣＤ２７）、ＴＮＦＲＳＦ９（４－１ＢＢ）、ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ（ＲＡＮＫ）、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ（ＴＡＣＩ）、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ（ＢＡＦＦ－Ｒ）、ＴＮＦＲＳＦ１４（ＨＶＥＭ）、ＴＮＦＲＳＦ１７（ＣＤ２６９）、ＴＮＦＲＳＦ１８（ＧＩＴＲ）、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｈ（ＴＭＩＧＤ２）、誘導性Ｔ細胞共刺激因子（ＩＣＯＳ／ＣＤ２７８）、ＤＮＡＸアクセサリー分子１（ＤＮＡＭ－１／ＣＤ２２６）、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭ／ＣＤ１５０）、Ｔ細胞免疫グロブリン・ムチンドメイン（ＴＩＭ－１／ＨＡＶｃｒ－１）、インターフェロン受容体α鎖（ＩＦＮＡＲ１）、インターフェロン受容体β鎖ＩＦＮＡＲ２）、インターロイキン２受容体βサブユニット（ＩＬ２ＲＢ）、インターロイキン２受容体γサブユニット（ＩＬ２ＲＧ）、腫瘍壊死因子スーパーファミリー１４（ＴＮＦＳＦ１４／ＬＩＧＨＴ）、ナチュラルキラーグループ２メンバーＤ（ＮＫＧ２Ｄ／ＣＤ３１４）およびＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）から選択されるヒトタンパク質に由来する、請求項４７に記載のポリヌクレオチド。

【請求項51】

前記ＥＳＲが、その配列が配列番号３４１～配列番号３６４から選択される配列と少なくとも９０％同一であるポリペプチドを含む、請求項４７に記載のポリヌクレオチド。

【請求項52】

前記ＥＳＲが、その配列が配列番号３６５～配列番号３９６から選択される配列と少なくとも９０％同一であるポリペプチドを含む、請求項４７に記載のポリヌクレオチド。

【請求項53】

前記ＥＳＲが、その配列が配列番号２７４～配列番号３１８から選択される配列と少なくとも９０％同一であるポリペプチドを含む、請求項４５に記載のポリヌクレオチド。

【請求項54】

前記ポリヌクレオチドが異種プロモーターに作動可能に連結された、アポトーシス阻害剤をコードするセグメントをさらに含む、請求項４７に記載のポリヌクレオチド。

【請求項55】

そのゲノムが請求項４７に記載のポリヌクレオチドを含む、免疫細胞。

【請求項56】

前記免疫細胞ゲノムが、異種プロモーターに作動可能に連結された、アポトーシス阻害剤をコードするセグメントをさらに含む、請求項５５に記載の免疫細胞。

【請求項57】

改変された免疫細胞を作製するための方法であって、
ａ．請求項４７に記載のポリヌクレオチドを前記免疫細胞内へと導入すること
ｂ．異種プロモーターに作動可能に連結された、アポトーシス阻害剤をコードするポリヌクレオチドを、前記免疫細胞内へと導入することを含む、方法。

【請求項58】

前記２つのポリヌクレオチドが同じ時点で前記免疫細胞内へと導入される、請求項５７に記載の方法。

【請求項59】

免疫細胞の生存を増強するタンパク質を同定する方法であって、
癌性免疫細胞由来のタンパク質をコードする核酸を配列決定して、突然変異を有するタンパク質をコードする核酸を同定することと、
前記突然変異を有するタンパク質をコードする核酸を用いて免疫細胞を形質転換することと、前記免疫細胞が生存を増強したかどうかを判定することとを含む、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年２月８日出願の第６２／８０３，１４２号からの優先権を主張し、その全体はすべての目的のために参照により組み込まれる。

【0002】

配列表の参照
本出願は、参照により組み込まれる２０２０年１月２８日作成の８８９，０００バイトのＳＴ２５＿２０２００１２８という名称のｔｘｔファイルに開示されている配列を指す。

【背景技術】

【0003】

免疫細胞の遺伝子修飾を使用して、免疫細胞の特性を改変することができる。遺伝子修飾可能な免疫細胞特性には、免疫細胞によって認識される分子、免疫細胞内での細胞応答、ある特定の環境条件下で免疫細胞が生存する能力、および免疫細胞によって産生されるタンパク質が含まれる。免疫細胞の遺伝子修飾は、疾患を標的指向する応答を改善するために使用してよい。特定の免疫細胞の機能を増強することによって、例えば、長期持続性の癌退縮を達成するために、免疫応答を増強してよい。

【0004】

免疫細胞の安定した遺伝子修飾は、異種ポリヌクレオチドを免疫細胞のゲノム内へと組み込むことによって行うことができる。異種ＤＮＡは、裸のプラスミドＤＮＡを移入することによって、免疫細胞を感染させるために使用されるウイルス粒子内へと該ＤＮＡをパッケージングすることによって、または免疫細胞内へとトランスポゾンおよびその同族トランスポザーゼを導入することによって、種々の方法で免疫細胞内へと導入してよい。

【0005】

プラスミドＤＮＡをはじめとする非ウイルスベクター系は一般に、非効率的な細胞送達、顕著な細胞毒性、および移入した細胞集団においてゲノム挿入がないことならびに結果として生じるベクターの分解および／または希釈に起因する、導入遺伝子発現の持続時間の制限を被る。ウイルス以外でのアプローチによって送達される導入遺伝子は、ヘテロクロマチン形成による転写サイレンシングに対する標的である長い反復アレイ（コンカテマー）を形成することがよくある。

【0006】

ウイルスパッケージングは一般に、ウイルスベクター内へと挿入することができるＤＮＡのサイズに制限を課す。いくつかのウイルス（ＡＡＶなど）は、複製されていないエピソームとして保有され、それゆえ細胞が分裂するにつれて希釈される。ゲノムを標的細胞ゲノム内へと組み込むウイルスについては、ウイルス組み込み部位に関する安全性の懸念がある。すべてのウイルス送達方法について、ウイルスの製造経費およびウイルス構成要素の潜在的な免疫原性に関する懸念がある。

【0007】

トランスポゾンは、裸のＤＮＡのように製造が単純で非免疫原性であるが、標的細胞ゲノム内へと組み込むのに非常に効率的である代替送達系を提供する。トランスポゾンは、トランスポザーゼによって認識される２つの末端を含む。トランスポザーゼは、あるＤＮＡ分子からトランスポゾンを切り出し、別のＤＮＡ分子内へと組み込むために、トランスポゾンに作用する。この過程は、転位と称される。２つのトランスポゾン末端間のＤＮＡは、トランスポゾン末端と共にトランスポザーゼによって転位される。トランスポザーゼによって認識されおよび転位するように、一対のトランスポゾン末端が隣接する異種ＤＮＡは、本明細書では合成トランスポゾンと称される。合成トランスポゾンおよび対応するトランスポザーゼを真核細胞の核内へと導入することは、細胞のゲノムへのトランスポゾンの転位をもたらすことができる。トランスポゾン／トランスポザーゼ遺伝子送達プラットフォームは、裸のＤＮＡおよびウイルスを送達することに関する制限を克服する可能性を有する。特に、ｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、該トランスポゾンの遺伝子荷役容量が無制限であるので、魅力的である。

【0008】

細胞のゲノム内へと組み込まれたポリヌクレオチド上にコードされる遺伝子の発現レベルは、ポリヌクレオチド内での配列要素の立体配置に依存する。組込みの効率、したがって各ゲノム内へと組み込まれたポリヌクレオチドのコピー数、および組込みが起こるゲノム遺伝子座はまた、ポリヌクレオチド上にコードされる遺伝子の発現レベルにも影響を及ぼす。ポリヌクレオチドを標的細胞のゲノム内へと組み込むことができる効率は、該ポリヌクレオチドをトランスポゾン内へと置き換えることによって上昇することができることはよくある。

【0009】

ｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼによる転位は完全に可逆的である。トランスポゾンは、レシピエントＤＮＡ分子内の組込み標的配列に組み込まれ、その間、該標的配列は、トランスポゾン逆方向末端反復塩基配列（ＩＴＲ）の各末端で複製される。それに続く転位は、該トランスポゾンを除去し、該標的配列の複製および該トランスポゾンが除去された状態で、レシピエントＤＮＡをその以前の配列へと復元する。しかしながら、このことは、トランスポゾンが第１の組込み標的配列から切り出されるが、ゲノム中の第２の組込み標的配列内へと組み込まれる可能性が高いので、トランスポゾンがゲノム内に組み込まれた該ゲノムからトランスポゾンを除去するのに十分ではない。一方、組込み機能が欠損しているトランスポザーゼは、トランスポゾンを第１の標的配列から切り出すことはできるが、第２の標的配列内へと組み込むことはできない。したがって、組込み欠損トランスポザーゼは、トランスポゾンのゲノム組込みを逆転させるのに有用である。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0010】

免疫細胞のゲノムを安定して修飾することができるトランスポゾンは、本発明の一態様である。免疫細胞を改変してその機能を増強する上で有利である遺伝子は、本発明の一態様である。免疫細胞を改変してその機能を増強するための方法は、本発明の一態様である。

【0011】

免疫細胞のゲノムを修飾するための方法を説明する。免疫細胞には、Ｔ細胞およびＢ細胞などのリンパ球ならびにナチュラルキラー細胞、Ｔヘルパー細胞、抗原提示細胞、樹状細胞、好中球およびマクロファージが含まれる。修飾には、免疫細胞がある特定の条件下またはある特定の環境で生存および／または増殖する能力を増強すること、免疫細胞表面に発現するタンパク質の量または種類を変化させること、ならびに免疫細胞と接触するタンパク質または小分子に対する該細胞の応答を変化させることが含まれる。免疫細胞のゲノム修飾をもたらすためのポリヌクレオチド構築物の配列が提供されており、本発明の一態様である。

【0012】

ヒトＴ細胞の機能、持続性および増殖を増強する能力は、癌免疫療法のための現在の支障である。Ｔ細胞の性能、増殖および遺伝子操作の改善を可能にする技術が強く求められている。Ｔ細胞を制御するおよび増殖させる能力は、以下を含む多くの応用を有する。（ｉ）例えば、ＣＡＲ－Ｔと組み合わせて、より大きな有効性および／または安全性のためにＴ細胞療法の機能を改善すること。（ｉｉ）Ｔ細胞の枯渇および／または腫瘍浸潤Ｔ細胞の再刺激誘導性細胞死を逆転させ、Ｔ細胞が腫瘍微小環境内で生存するおよび機能することを可能にすること。（ｉｉｉ）前臨床試験（インビボ）のためのマウスにおけるヒトＴ細胞の生存を改善すること。（ｉｖ）抗原特異的Ｔ細胞の同定およびインビトロでのＴ細胞受容体のクローン化。（ｖ）エクスビボで維持することができ、Ｔ細胞の生物学的機能（細胞死滅など）を依然として行うＴ細胞株を開発すること。

【0013】

免疫細胞生存増強遺伝子には、サバイビン、Ｂｃｌ２、Ｂｃｌ６、Ｂｃｌ－ＸＬなどの抗アポトーシス遺伝子、およびＣａｓｐ３、Ｃａｓｐ７、Ｃａｓｐ８、Ｃａｓｐ９またはＣａｓｐ１０のドミナントネガティブ突然変異体などのドミナントネガティブ効果を発揮する正常なアポトーシス経路の突然変異体をコードする遺伝子が含まれる。免疫細胞生存増強遺伝子にはまた、以下の突然変異、すなわちＦ１７４Ｓ、Ｈ４１０Ｒ、Ｓ６１４Ｒ、Ｅ６１６Ｋ、Ｇ６１８Ｒ、Ｙ６４０Ｆ、Ｎ６４７Ｉ、Ｅ６５２Ｋ、Ｋ６５８Ｙ、Ｋ６５８Ｒ、Ｋ６５８Ｎ、Ｋ６５８Ｍ、Ｋ６５８Ｒ、Ｋ６５８Ｈ、Ｋ６５８Ｎ、Ｄ６６１ＹまたはＤ６６１Ｖのうちの１つを含むＳＴＡＴ３突然変異体を含む、ＳＴＡＴ３の活性化突然変異体も含まれる。免疫細胞生存増強遺伝子にはまた、以下の突然変異、すなわちＤ１２４Ｅ、Ｄ１２４Ｖ、Ｔ１９５ＩまたはＴ１９５Ｐのうちの１つを含むＣＤ２８突然変異体を含む、ＣＤ２８の活性化突然変異体も含まれる。免疫細胞生存増強遺伝子にはまた、以下の突然変異、すなわちＧ１７ＶまたはＫ１８Ｎのうちの１つを含むＲｈｏＡ突然変異体を含む、ＲｈｏＡの活性化突然変異体も含まれる。免疫細胞生存増強遺伝子には、以下の突然変異、すなわちＳ３４５Ｆ、Ｓ５２０ＦまたはＲ７０７Ｑのうちの１つを含むホスホリパーゼＣガンマ突然変異体を含む、ホスホリパーゼＣγの活性化突然変異体も含まれる。免疫細胞生存増強遺伝子にはまた、以下の突然変異、すなわちＮ６４２Ｈ、Ｔ６４８Ｓ、Ｓ６５２Ｙ、Ｙ６６５ＦまたはＰ２６７Ａのうちの１つを含むＳＴＡＴ５Ｂ突然変異体を含む、ＳＴＡＴ５Ｂの活性化突然変異体も含まれる。免疫細胞生存増強遺伝子にはまた、以下の突然変異、すなわち：Ｅ３６Ｇ、Ｅ３６Ｑ、Ｅ３６Ｋ、Ａ３９Ｓ、Ｓ４１Ｌ、Ｓ４１Ｐ、Ｓ４１Ｔ、Ｖ４２Ｅ、Ｖ４２Ａ、Ｖ４２Ｌ、Ｖ４２Ｍ、Ｙ４４Ｓ、Ｙ４４Ｄ、Ｙ４４Ｃ、Ｙ４４Ｈ、Ｋ４６Ｔ、Ｋ４６Ｒ、Ｋ４６Ｎ、Ｋ４６Ｅ、Ｃ４７Ｇ、Ｃ４７Ｒ、Ｃ４７Ｓ、Ｃ４７Ｗ、Ｐ１９９Ｒ、Ｐ１９９Ｓ、Ｐ１９９Ｌ、Ｓ２０１Ｆ、Ｔ２８５Ｉ、Ｔ２８５Ａ、Ｐ２８６Ｌ、Ｐ２８６Ｈ、Ｐ２８６Ｓ、Ｐ２８６ＴまたはＰ２８６Ａのうちの１つを含むＣＣＮＤ１突然変異体を含む、ＣＣＮＤ１の活性化突然変異体も含まれる。

【0014】

免疫細胞生存増強遺伝子はまた、増強されたシグナル伝達受容体（ＥＳＲ）も含み、この中で、ＥＳＲは、通常、免疫細胞に阻害シグナルを伝達する受容体の細胞外ドメインに由来する配列と、刺激シグナルを免疫細胞に伝達する受容体の細胞内ドメインの細胞内ドメインに由来する配列と、膜貫通ドメインとを含む。例示的な細胞外ドメインとしては、配列番号３２２～３４０などのＴＮＦＲＳＦ３（ＬＴＲβ）、ＴＮＦＲＳＦ６（Ｆａｓ）、ＴＮＦＲＳＦ８（ＣＤ３０）、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ（ＤＲ４）、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ（ＤＲ５）、ＴＮＦＲＳＦ１９（ＴＲＯＹ）、ＴＮＦＲＳＦ２１（ＤＲ６）およびＣＴＬＡ４から選択されるヒトタンパク質がある。例示的な細胞内ドメインとしては、配列番号３４１～３６４などのＴＮＦＲＳＦ４（ＯＸ４０）、ＴＮＦＲＳＦ５（ＣＤ４０）、ＴＮＦＲＳＦ７（ＣＤ２７）、ＴＮＦＲＳＦ９（４－１ＢＢ）、ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ（ＲＡＮＫ）、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ（ＴＡＣＩ）、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ（ＢＡＦＦ－Ｒ）、ＴＮＦＲＳＦ１４（ＨＶＥＭ）、ＴＮＦＲＳＦ１７（ＣＤ２６９）、ＴＮＦＲＳＦ１８（ＧＩＴＲ）、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｈ（ＴＭＩＧＤ２）、誘導性Ｔ細胞共刺激因子（ＩＣＯＳ／ＣＤ２７８）、ＤＮＡＸアクセサリー分子１（ＤＮＡＭ－１／ＣＤ２２６）、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭ／ＣＤ１５０）、Ｔ細胞免疫グロブリン・ムチンドメイン（ＴＩＭ－１／ＨＡＶｃｒ－１）、インターフェロン受容体α鎖（ＩＦＮＡＲ１）、インターフェロン受容体β鎖ＩＦＮＡＲ２）、インターロイキン２受容体βサブユニット（ＩＬ２ＲＢ）、インターロイキン２受容体γサブユニット（ＩＬ２ＲＧ）、腫瘍壊死因子スーパーファミリー１４（ＴＮＦＳＦ１４／ＬＩＧＨＴ）、ナチュラルキラーグループ２メンバーＤ（ＮＫＧ２Ｄ／ＣＤ３１４）およびＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）から選択されるヒトタンパク質がある。例示的な膜貫通ドメインとしては、３６５～３９６から選択されるヒトタンパク質がある。例示的な増強されたシグナル伝達受容体としては、配列番号２７４～３１８から選択される配列を含む配列がある。

【0015】

好ましくは、免疫細胞生存増強遺伝子は、トランスポゾンベクターを使用して免疫細胞に提供される。トランスポゾンは、対応するトランスポザーゼによって免疫細胞ゲノム内へと効率的に組み込まれる。いくつかの異なるクラスのトランスポゾンは、遺伝子を免疫細胞のゲノム内へと組み込むのに有用である。配列番号１８および１９を含むＩＴＲ配列を含むシャクガ（ｌｏｏｐｅｒ ｍｏｔｈ）ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン、または配列番号２０および２１を含むＩＴＲ配列を含むｐｉｇｇｙＢａｔトランスポゾン、または配列番号６および７を含むＩＴＲ配列を含むゼノパス属（Ｘｅｎｏｐｕｓ）ｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾン、または配列番号１４および１５を含むＩＴＲ配列を含むカイコガ属（Ｂｏｍｂｙｘ）ｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンなどのｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンはすべて、対応するトランスポザーゼによって免疫細胞ゲノム内へと転位することができる。また、配列番号２６および２７を含むＩＴＲを含むＳｌｅｅｐｉｎｇ ＢｅａｕｔｙなどのＭａｒｉｎｅｒ型トランスポゾンは、対応するトランスポザーゼによって免疫細胞ゲノム内へと転位することができる。また、配列番号３９９および４００を含むＩＴＲを含むＴｃＢｕｓｔｅｒなどのｈＡＴ型トランスポゾンは、対応するトランスポザーゼによって免疫細胞ゲノム内へと転位することができる。これらのトランスポゾンのいずれも、生存増強遺伝子を免疫細胞ゲノム内へと組み込むために使用することができる。トランスポゾンは、対応するトランスポザーゼを用いて免疫細胞内へと導入することができる。トランスポザーゼは、タンパク質として、または該トランスポザーゼをコードする配列が、免疫細胞内で発現可能なプロモーターに作動可能に連結されたｍＲＮＡ分子もしくはＤＮＡ分子など、トランスポザーゼをコードする核酸として提供することができる。他の遺伝子もまた、その機能を改変するために免疫細胞内へと導入することができる。例えば、免疫細胞が標的細胞の表面上の抗原に結合することを可能にする受容体をコードする遺伝子を導入することができる。免疫細胞を死滅させるために使用することができる遺伝子もまた導入することができる。トランスポゾンを使用して遺伝子の組み合わせを免疫細胞に送達する利点は、トランスポザーゼが、典型的には、トランスポゾンＩＴＲ間のＤＮＡをすべて、免疫細胞のゲノム内へと組み込むことである。したがって、複数の遺伝子を同時に導入することができる。

【0016】

免疫細胞の生存遺伝子を幹細胞などの免疫細胞前駆細胞のゲノム内へと組み込んだ後、免疫細胞前駆細胞を免疫細胞へと分化させることは実現可能である。このような操作は、明示的に企図されている。免疫細胞の生存を増強するために、生存増強遺伝子は、生存増強遺伝子が免疫細胞において発現可能であるように、プロモーターに作動可能に連結されるものとする。例示的なプロモーターとしては、配列番号９４～１５４から選択されるプロモーターなどのＥＦ１プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰＤＨプロモーター、ＥＥＦ２プロモーター、ユビキチンプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、またはＨＳＶＴＫプロモーターがある。

【0017】

改変されたヒト免疫細胞は、本発明の一態様である。加えて、生存または増殖を増強するように改変された動物免疫細胞は、実験モデルおよび動物治療薬としても価値がある。霊長類、齧歯類、ネコ、イヌおよびウマを含む哺乳動物由来の改変された免疫細胞は、本発明の一態様である。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1】ゼノパス属（Ｘｅｎｏｐｕｓ）またはカイコガ属（Ｂｏｍｂｙｘ）のｐｉｇｇｙＢａｃ様遺伝子移入系を移入したＪｕｒｋａｔヒトＴ細胞株のＦＡＣＳ分析。ヒトＪｕｒｋａｔ細胞に、トランスポザーゼ、および第６．１．１節に説明するＣＤ１９遺伝子を含む対応するトランスポゾンを移入した。７０日後、ＦＡＣＳソーターを使用してＣＤ１９発現細胞を選択し、培養においてさらに８５日間成長させた。次いで、細胞をＣＤ１９について染色し、ＦＡＣＳで分析した。パネルＡ：配列番号２２３によって与えられる配列を有するトランスポゾンを元々移入しておいた細胞を、ＣＤ１９（ｙ軸）およびＧＦＰ（ｘ軸）について分析した。パネルＢ：配列番号２２４によって与えられる配列を有するトランスポゾンを元々移入しておいた細胞を、ＣＤ１９（ｙ軸）およびＲＦＰ（ｘ軸）について分析した。

【0019】

【図2】突然変異したＳＴＡＴ３をコードする遺伝子を移入した初代Ｔ細胞のＦＡＣＳ分析。トランスポザーゼ、およびＳＴＡＴ３：ＳＴＡＴ３－Ｙ６４０Ｆの突然変異版をコードする遺伝子と緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子とを含む対応するトランスポゾンを、ヒト初代Ｔ細胞に同時移入した。パネルＡ：細胞を様々な時間培養し（上部に表示）、その後、試料を採取し、蛍光標識抗ＣＤ８抗体で標識し、蛍光活性化セルソーターを用いて分析した。Ｔ細胞の表面上に発現したＣＤ８をｙ軸に示し、ＧＦＰ（ＳＴＡＴ３ Ｙ６４０Ｆ遺伝子を含むトランスポゾンの存在を示す）をｘ軸に沿って示す。パネルＢ：ＧＦＰ蛍光を示すＣＤ８＋細胞の分率を、パネルＡに示されるデータから計算した。

【0020】

【図3】移入した初代Ｔ細胞とＪＹ Ｂ細胞株由来の細胞との混合物のＦＡＣＳ分析。トランスポザーゼ、および配列番号２２９によって与えられる配列を有するキメラ抗原受容体をコードする遺伝子と第６．２．１．３節に説明されているＧＦＰレポーターとを含む３つの対応するトランスポゾンのうちの１つを、ヒト初代Ｔ細胞に同時移入した。１つのトランスポゾンは、さらなる遺伝子を含まず（パネルＡおよびパネルＤ）、１つのトランスポゾンは、サバイビンをコードする遺伝子をさらに含み（パネルＢおよびパネルＥ）、１つのトランスポゾンは、ＣＤ２８－Ｄ１２４Ｅ－Ｔ１９５Ｐをコードする遺伝子をさらに含んでいた（パネルＣおよびパネルＦ）。細胞をおおよそ５週間培養し、その時点で、Ｔ細胞のおおよそ１０％が発現性ＧＦＰであった。その時点で、２００，０００個のＴ細胞（＝２０，０００個のＧＦＰ発現Ｔ細胞）をＪＹ形質転換Ｂ細胞株の２００，０００個の細胞と混合した。混合の３日後（パネルＡ、パネルＣおよびパネルＥ）または７日後（パネルＢ、パネルＤおよびパネルＦ）に、蛍光標識した抗ＣＤ８抗体および抗ＣＤ１９抗体で細胞を標識し、蛍光活性化セルソーターを用いて分析した。Ｔ細胞の表面上に発現したＣＤ８をｙ軸に、ＪＹ細胞の表面上に発現したＣＤ１９をｘ軸に示す。

【0021】

【図4】Ｂｃｌ－２およびＢｃｌ－６をコードする遺伝子を移入した初代Ｔ細胞のＦＡＣＳ分析。トランスポザーゼ、およびＢｃｌ２およびＢｃｌ６をコードする遺伝子と緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子とを含む対応するトランスポゾンを、ヒト初代Ｔ細胞に同時移入した。パネルＡ：細胞を様々な時間培養し（上部に表示）、その後、試料を採取し、蛍光標識抗ＣＤ８抗体で標識し、蛍光活性化セルソーターを用いて分析した。Ｔ細胞の表面上に発現したＣＤ８をｙ軸に示し、ＧＦＰ（Ｂｃｌ２－２Ａ－Ｂｃｌ６遺伝子を含むトランスポゾンの存在を示す）をｘ軸に沿って示す。パネルＢ：ＧＦＰ蛍光を示すＣＤ８＋細胞の分率を、パネルＡに示されるデータから計算した。

【0022】

【図5】Ｂｃｌ－ＸＬをコードする遺伝子を移入した３つのドナー由来の初代Ｔ細胞のＦＡＣＳ分析。トランスポザーゼ、およびＢｃｌ－ＸＬをコードする遺伝子と緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子とを含む対応するトランスポゾンを、ヒト初代Ｔ細胞に同時移入した。細胞を培養において２４０日間成長させ、ヒトＣＤ８に対する蛍光標識抗体で染色し、フローサイトメーターで分析した。パネルＡ：ドナー８１、パネルＡ：ドナー８２、パネルＡ：ドナー８４。Ｔ細胞の表面上に発現するＣＤ８をｙ軸に示し、ＧＦＰ（Ｂｃｌ－ＸＬ遺伝子を含むトランスポゾンの存在を示す）をｘ軸に沿って示す。

【発明を実施するための形態】

【0023】

５．１ 定義
「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」という単数形の使用は、文脈上他に明確に指示されない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「ポリヌクレオチド」に対する指示対象は複数のポリヌクレオチドを含み、「基質」に対する指示対象は複数のこのような基質を含み、「変異体」に対する指示対象は複数の変異体を含むなどである。

【0024】

「結合した」、「付着した」、「連結された」、および「共役した」などの用語は、本明細書では相互交換可能に使用され、文脈上他に明確に指示されない限り、直接的および間接的な結合、付着、連結または共役を包含する。値の範囲が列挙されている場合、該範囲の列挙された上限と下限との間の各介在する整数値およびその各分数もまた、このような値の間の各部分範囲と共に具体的に開示されていることは理解されるべきである。何らかの範囲の上限および下限は、該範囲に独立して含まれることができ、または該範囲から除外されることができ、いずれかの限界を含むか、いずれの限界も含まないか、またはいずれの限界も含む各範囲もまた本発明内に包含される。論議されている値が固有の限界を有する場合、例えば、構成要素が０～１００％の濃度で存在することができる場合、または水溶液のｐＨが１～１４の範囲であることができる場合、それらの固有の限界が具体的に開示される。値が明示的に列挙されている場合、列挙された値とほぼ同じ数量または量の値もまた本発明の範囲内であることは理解されるべきである。組み合わせが開示されている場合、該組み合わせの要素の各部分組み合わせもまた具体的に開示されており、本発明の範囲内である。逆に、異なる要素または要素群が個別に開示される場合、それらの組み合わせもまた開示される。本発明の何らかの要素が複数の代替形態を有するものとして開示される場合、各代替形態が単独で、または他の代替形態との何らかの組み合わせで除外される本発明の例もまた本明細書によって開示され、本発明の２つ以上の要素がこのような除外を有することができ、このような除外を有する要素のすべての組み合わせが本明細書により開示される。

【0025】

本明細書で他に定義されない限り、本明細書で使用するすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９４）、およびＨａｌｅ＆Ｍａｒｈａｍ，Ｔｈｅ Ｈａｒｐｅｒ Ｃｏｌｌｉｎｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈａｒｐｅｒ Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ，ＮＹ，１９９１は、当業者に、本発明で使用する用語の多くの一般的な辞書を提供する。本明細書に説明されるものと類似のまたは同等のいかなる方法および材料もまた、本発明の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法および材料を説明する。他に示されない限り、核酸は、５’から３’への向きに左から右へと書かれ、アミノ酸配列は、それぞれアミノからカルボキシへの向きに左から右に書かれている。すぐ下に定義される用語は、全体として本明細書に対する参照によってより完全に定義される。

【0026】

ポリヌクレオチドの「立体配置」とは、ポリヌクレオチド内での機能的配列要素、ならびに該要素の順序および向きを意味する。

【0027】

「対応するトランスポゾン」および「対応するトランスポザーゼ」という用語は、トランスポザーゼとトランスポゾンとの間の活性の関連性を示すために使用される。トランスポザーゼは、その対応するトランスポゾンをトランスポザーゼ処理する。

【0028】

「対抗選択可能マーカー」という用語は、宿主細胞に選択的欠点を付与するポリヌクレオチド配列を意味する。対抗選択戒能マーカーの例としては、ｓａｃＢ、ｒｐｓＬ、ｔｅｔＡＲ、ｐｈｅＳ、ｔｈｙＡ、ｇａｔａ－１、ｃｃｄＢ、ｋｉｄおよびｂａｒｎａｓｅ（Ｂｅｒｎａｒｄ，１９９５，雑誌／Ｇｅｎｅ，１６２：１５９－１６０、Ｂｅｒｎａｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９９４．雑誌／Ｇｅｎｅ，１４８：７１－７４、Ｇａｂａｎｔ ｅｔ ａｌ．，１９９７，雑誌／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２３：９３８－９４１、Ｇａｂａｂｔ ｅｔ ａｌ．，１９９８，雑誌／Ｇｅｎｅ，２０７：８７－９２、Ｇａｂａｂｔ ｅｔ ａｌ．，２０００，雑誌／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２８：７８４－７８８、Ｇａｌｖａｏ ａｎｄ ｄｅ Ｌｏｒｅｎｚｏ，２００５，雑誌／Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，７１：８８３－８９２、Ｈａｒｔｚｏｇ ｅｔ ａｌ．，２００５，雑誌／Ｙｅａｔ，２２：７８９－７９８、Ｋｎｉｐｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９７，雑誌／Ｐｌａｓｍｉｄ，３７：１２９－１４０、Ｒｅｙｒａｔ ｅｔ ａｌ．，１９９８，雑誌／Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ，６６：４０１１－４０１７、Ｓｏｄｅｒｈｏｌｍ ｅｔ ａｌ．，２００１，雑誌／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，３１：３０６－３１０，３１２、Ｔａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，２００５，雑誌／Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，７１：５８７－５９０、Ｙａｚｙｎｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９，雑誌／ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ，４５２：３５１－３５４）がある。対抗選択可能マーカーは、特定の状況下で該マーカーの選択的欠点を付与することが多い。例えば、該マーカーは、宿主細胞の環境に添加することが可能である化合物に対する感受性を付与することができるか、または該マーカーは、ある遺伝子型を有する宿主を死滅させることはできるが、別の遺伝子型を有する宿主を死滅させることはできない。対抗選択可能マーカーを担持しない細胞に選択的欠点を付与しない条件は、「許容がある」と説明される。対抗選択可能マーカーを担持する細胞に選択的欠点を付与する条件は、「制限がある」と説明される。

【0029】

「カップリング要素」または「翻訳カップリング要素」という用語は、第１のポリペプチドの発現を第２のポリペプチドの発現に連結することを可能にするＤＮＡ配列を意味する。内部リボソーム進入部位要素（ＩＲＥＳ要素）およびシス作用性加水分解酵素要素（ＣＨＹＳＥＬ要素）は、カップリング要素の例である。

【0030】

「ＤＮＡ配列」、「ＲＮＡ配列」または「ポリヌクレオチド配列」という用語は、連なっている核酸配列を意味する。該配列は、何千もの塩基対のうちの何千または何百もの完全長ゲノム配列に対して長さ２～２０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドであることができる。

【0031】

「増強されたシグナル伝達受容体」（または「ＥＳＲ」）という用語は、免疫細胞に阻害シグナルを伝達する受容体の細胞外／リガンド結合ドメインが、刺激シグナルを伝達する受容体の細胞内ドメインに融合したタンパク質を意味する。

【0032】

「発現コンストラクト」という用語は、ＲＮＡを転写するように設計された何らかのポリヌクレオチドを意味する。例えば、下流の遺伝子、コード領域、またはポリヌクレオチド配列（例えば、ポリペプチドもしくはタンパク質をコードするｃＤＮＡ断片もしくはゲノムＤＮＡ断片、またはＲＮＡエフェクター分子、例えば、アンチセンスＲＮＡ、三重鎖形成ＲＮＡ、リボザイム、人為的に選択された高親和性ＲＮＡリガンド（アプタマー）、二本鎖ＲＮＡ、例えばステム－ループ二本鎖ＲＮＡもしくはヘアピン二本鎖ＲＮＡ、または二本指もしくは多数指の二本鎖ＲＮＡもしくはマイクロＲＮＡを含むＲＮＡ分子、または何らかのＲＮＡ）に作動可能に連結されているか、または連結されることができる少なくとも１つのプロモーターを含有するコンストラクトである。「発現ベクター」とは、第２のポリヌクレオチドに作動可能に連結されることができるプロモーターを含むポリヌクレオチドである。レシピエント細胞内への発現コンストラクトの移入または形質転換は、該細胞が、ＲＮＡエフェクター分子、該発現コンストラクトによってコードされるポリペプチド、またはタンパク質を発現することを可能にする。発現コンストラクトは、遺伝子操作されたプラスミド、ウイルス、組換えウイルス、または例えば、バクテリオファージ、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルスもしくはヘルペスウイルスに由来する人為染色体であってよい。このような発現ベクターは、細菌、ウイルスまたはファージに由来の配列を含むことができる。このようなベクターには、染色体、エピソームおよびウイルスに由来のベクター、例えば、細菌プラスミド、バクテリオファージ、酵母エピソーム、酵母染色体要素、およびウイルスに由来するベクター、ならびにこれらの組み合わせに由来するベクター、例えば、プラスミドおよびバクテリオファージの遺伝要素、コスミド、ならびにファージミドに由来するものなどが含まれる。発現コンストラクトは、生細胞内で複製することができ、または合成で作製することができる。本出願の目的のために、「発現コンストラクト」、「発現ベクター」、「ベクター」、および「プラスミド」という用語は、一般的な実例としての意味で本発明の適用を実証するために相互交換可能に使用されており、本発明を特定の種類の発現コンストラクトに限定することを意図していない。

【0033】

「発現ポリペプチド」という用語は、発現コンストラクト上の遺伝子によってコードされるポリペプチドを意味する。

【0034】

「発現系」という用語は、ポリヌクレオチドによってコードされる１つ以上の遺伝子産物を産生するために使用される何らかのインビボまたはインビトロの生物系を意味する。

【0035】

「遺伝子移入系」は、ベクターもしくは遺伝子移入ベクター、またはベクター内へとクローン化された移入予定の遺伝子を含むポリヌクレオチド（「遺伝子移入ポリヌクレオチド」または「遺伝子移入コンストラクト」）を含む。遺伝子移入系はまた、遺伝子移入の過程を促進するための他の特徴を含んでよい。例えば、遺伝子移入系は、第１のポリヌクレオチドが細胞に入ることを可能にするためのベクターおよび脂質またはウイルスパッケージングミックスを含んでよく、またはトランスポゾンを含むポリヌクレオチドと、トランスポゾンの生産的ゲノム組込みを増強するための対応するトランスポザーゼをコードする第２のポリヌクレオチド配列とを含んでよい。遺伝子移入系のトランスポザーゼおよびトランスポゾンは、同じ核酸分子上または異なる核酸分子上にあってよい。遺伝子移入系のトランスポザーゼは、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドとして提供されてよい。

【0036】

２つの要素は、天然に関係していない場合、互いに「異種」である。例えば、異種プロモーターに連結されたタンパク質をコードする核酸配列は、該タンパク質の発現を天然に駆動するプロモーター以外のプロモーターを意味する。トランスポゾン末端またはＩＴＲに隣接する異種核酸は、該トランスポゾン末端またはＩＴＲに天然に隣接しない異種核酸、例えば、抗体の重鎖または軽鎖をはじめとする、トランスポザーゼ以外のポリペプチドをコードする核酸などを意味する。核酸は、細胞内に天然には認められない場合、または細胞内に天然に認められるが説明される位置とは異なる位置（例えば、エピソームまたは異なるゲノムの位置）にある場合、細胞に対して異種である。

【0037】

「宿主」という用語は、核酸のレシピエントであることができる何らかの原核生物または真核生物を意味する。「宿主」は、この用語が本明細書で使用される場合、遺伝子操作されることができる原核生物または真核生物を含む。このような宿主の例については、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８２）を参照されたい。本明細書で使用される場合、「宿主」、「宿主細胞、」、「宿主系」および「発現宿主」という用語は相互互換可能に使用することができる。

【0038】

「ＩＲＥＳ」または「内部リボソーム進入部位」は、キャップ構造とは無関係に、リボソーム結合を直接的に促進する特化した配列を意味する。

【0039】

「単離された」ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、その自然環境から取り出されたか、組換え技術を使用して産生されたか、または化学的にもしくは酵素で合成された、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを意味する。本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、精製することができ、すなわち、何らかの他のポリペプチドまたはポリヌクレオチドおよび関係する細胞産物または他の不純物を本質的に非含有であることができる。

【0040】

「ヌクレオシド」および「ヌクレオチド」という用語は、公知のプリン塩基およびピリミジン塩基だけでなく、修飾された他の複素環塩基も含有する、ヌクレオシドおよびヌクレオチドの部分を含む。このような修飾としては、メチル化プリンもしくはメチル化ピリミジン、アシル化プリンもしくはアシル化ピリミジン、または他の複素環がある。修飾ヌクレオシドまたは修飾ヌクレオチドはまた、例えば、ヒドロキシル基の１つ以上がハロゲン、脂肪族基で置き換えられ、またはエーテル、アミンなどとして官能化されている、糖部分の修飾を含むことができる。「ヌクレオチド単位」という用語は、ヌクレオシドおよびヌクレオチドを包含することを意図している。

【0041】

「オープンリーディングフレーム」または「ＯＲＦ」は、アミノ酸へと翻訳されたとき、終止コドンを含有しないポリヌクレオチドの一部を意味する。遺伝暗号は、３塩基の対の群でＤＮＡ配列を読み取るが、これは、二本鎖ＤＮＡ分子が、順方向に３つ、逆方向に３つの、６つの可能ないかなるリーディングフレームにおいても読み取ることができることを意味する。ＯＲＦは、典型的には、翻訳を開始することができる開始コドンも含む。

【0042】

「作動可能に連結された」という用語は、１つの配列がもう１つの配列の挙動を改変するような、２つの配列間の機能的連結を指す。例えば、核酸発現制御配列（プロモーター、ＩＲＥＳ配列、エンハンサーまたは転写因子結合部位アレイ）を含む第１のポリヌクレオチド、および第２のポリヌクレオチドは、第１のポリヌクレオチドが第２のポリヌクレオチドの転写および／または翻訳に影響を及ぼす場合に作動可能に連結されている。同様に、分泌シグナル、または細胞内局在化シグナルを含む第１のアミノ酸配列と、第２のアミノ酸配列とは、第１のアミノ酸配列が第２のアミノ酸配列を分泌させるかまたは細胞内位置に局在させる場合に作動可能に連結されている。

【0043】

「オーバーハング」または「ＤＮＡオーバーハング」という用語は、二本鎖ＤＮＡ分子の末端にある一本鎖部分を意味する。相補的なオーバーハングとは、互いに塩基対合することになるオーバーハングである。

【0044】

「ｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼ」は、イラクサキンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）（配列番号３０）由来のｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼに対するＴＢＬＡＳＴＮアルゴリズムを使用して同定されるように、およびＳａｋａｒ，Ａ．ｅｔ．ａｌ．，（２００３）．Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２７０：１７３－１８０．「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄ ｐｉｇｇｙＢａｃ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ ｆａｍｉｌｙ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ’ｄｏｍｅｓｔｉｃａｔｅｄ’ ｓｐｅｃｉｅｓ」においてより完全に説明されるように、少なくとも２０％の配列同一性を有するトランスポザーゼを意味し、最大アラインメント時のイラクサキンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼのＤ２６８、Ｄ３４６、およびＤ４４７に対応する位置にアスパラギン酸残基により、ＤＤＥ様ＤＤＤモチーフをさらに特徴とする。ｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼはまた、該トランスポザーゼがトランスポゾンを高頻度で正確に切除する能力も特徴とする。「ｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾン」は、ｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼをコードする天然に存在するトランスポゾンのトランスポゾン末端と同じである、または該トランスポゾン末端と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０、９５、９６、９７、９８または９９％同一である、トランスポゾン末端を有するトランスポゾンを意味する。ｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、各末端におおよそ１２～１６塩基の逆方向末端反復塩基配列（ＩＴＲ）の配列を含む。これらの反復塩基配列は、２つの末端において同一であってよく、または２つの末端における反復塩基配列は、２つのＩＴＲにおいて１もしくは２もしくは３もしくは４の位置において異なっていてよい。トランスポゾンには、トランスポゾン組込みの際に複製する組込み標的配列（標的部位複製または標的配列複製またはＴＳＤ）に対応する４塩基配列が両側から隣接している。

【0045】

「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」および「核酸分子」および「遺伝子」という用語は、何らかの長さのヌクレオチドのポリマー形態を指すために相互互換可能に使用されており、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、これらの類似体、またはそれらの混合物を含むことができる。この用語は、該分子の一次構造のみを指す。したがって、該用語は、三本鎖、二本鎖および一本鎖のデオキシリボ核酸（「ＤＮＡ」）、ならびに三本鎖、二本鎖および一本鎖のリボ核酸（「ＲＮＡ」）を含む。該用語にはまた、例えばアルキル化によって、および／またはキャッピングによって修飾された形態、および修飾されていない形態のポリヌクレオチドも含まれる。より詳細には、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」および「核酸分子」という用語は、ポリデオキシリボヌクレオチド（２－デオキシ－Ｄ－リボースを含有する）、スプライシングされているか否かにかかわらずｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ，ｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡおよびｍＲＮＡをはじめとするポリリボヌクレオチド（Ｄ－リボースを含有する）、プリン塩基もしくはピリミジン塩基のＮ－グリコシドもしくはＣ－グリコシドである何らかの他の種類のポリヌクレオチド、ならびに非ヌクレオチド骨格を含有する他のポリマー、例えば、ポリアミド（例えば、ペプチド核酸（「ＰＮＡ」））ポリマーおよびポリモルホリノ（ＮｅｕｇｅｎｅとしてＡｎｔｉ－Ｖｉｒａｌｓ，Ｉｎｃ．，オレゴン州コーバリス市より市販）ポリマー、ならびにＤＮＡおよびＲＮＡにおいて認められるものなど、塩基対合および塩基積層を可能にする立体配置においてポリマーが核酸塩基を含有することを条件とする他の合成配列特異的核酸ポリマーを含む。「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」および「核酸分子」という用語間の長さに意図された区別はなく、これらの用語は、本明細書において相互互換可能に使用される。これらの用語は、該分子の一次構造のみを指す。したがって、これらの用語には、例えば、３’－デオキシ－２’，５’－ＤＮＡ、オリゴデオキシリボヌクレオチドＮ３’Ｐ５’ホスホラミダート、２’－Ｏ－アルキル置換ＲＮＡ、二本鎖および一本鎖のＤＮＡ、ならびに二本鎖および一本鎖のＲＮＡ、ならびに例えばＤＮＡとＲＮＡとの間またはＰＮＡとＤＮＡもしくはＲＮＡとの間の複合体をはじめとするこれらの複合体が含まれ、また、公知の種類の修飾、例えば、標識、アルキル化、「キャッピング」、ヌクレオチドのうちの１つ以上の類似体との置換、ヌクレオチド間修飾、例えば、負に帯電した結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を有する非帯電結合を有するもの（例えば、メチルホスホナート、ホスホトリエステル、ホスホルアミダート、カルバマートなど）、および正に帯電した結合を有するもの（例えば、アミノアルキルホスホルアミダート、アミノアルキルホスホトリエステル）、例えば、タンパク質（酵素（ヌクレアーゼ）、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ－Ｌ－リジンなどをはじめとする）などのペンダント部分を含有するもの、挿入剤（例えば、アクリジン、プソラレンなど）を有するもの、（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属などの）キレートを含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された結合を有するもの（例えば、αアノマー核酸など）、ならびに該ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの修飾されていない形態も含まれる。

【0046】

「プロモーター」は、作動可能に連結された核酸分子の転写を指令するのに十分な核酸配列を意味する。プロモーターは、プロモーター依存性遺伝子発現を細胞型特異的、組織特異的、もしくは時間特異的な様式で制御可能にするのに十分である、または外部シグナルもしくは作用薬によって誘導可能である、他の転写制御エレメント（例えば、エンハンサー）と共に使用することができ、このようなエレメントは、遺伝子の３’領域内でまたはイントロン内で存在してよい。望ましくは、プロモーターは、核酸配列、例えばｃＤＮＡもしくは遺伝子配列、またはエフェクターＲＮＡコード配列に、核酸配列の発現を可能にするような方法で作動可能に連結されており、またはプロモーターは、転写予定の選択された核酸配列が都合よく挿入されることのできる発現カセットに提供される。

【0047】

「選択可能マーカー」という用語は、多くの場合、特定の条件下で、それを含有する分子もしくは細胞について選択することまたは該分子もしくは細胞を選択しないことを可能にするポリヌクレオチドセグメントを意味する。これらのマーカーは、限定されないが、ＲＮＡ、ペプチド、もしくはタンパク質の産生などの活性をコードすることができ、またはＲＮＡ、ペプチド、タンパク質、無機および有機の化合物もしくは組成物に対して結合部位を提供することができる。選択可能マーカーの例としては、以下があるが、これらに限定されない。すなわち、（１）他では毒性のある化合物（例えば、抗生物質）に対する耐性を提供する生成物をコードするＤＮＡセグメント、（２）他ではレシピエント細胞内で欠けている生成物（例えば、ｔＲＮＡ遺伝子、栄養素要求性マーカー）をコードするＤＮＡセグメント、（３）遺伝子産物の活性を抑制する生成物をコードするＤＮＡセグメント、（４）容易に同定することができる生成物をコードするＤＮＡセグメント（例えば、βガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、および細胞表面タンパク質などの表現型マーカー）、（５）細胞の生存および／もしくは機能に他では有害である産物を結合するＤＮＡセグメント、（６）先の１～５に説明するＤＮＡセグメントのうちのいずれかの活性を他では阻害するＤＮＡセグメント（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）、（７）基質を修飾する産物（例えば、制限エンドヌクレアーゼ）を結合するＤＮＡセグメント、（８）所望の分子（例えば、特異的タンパク質結合部位）を単離するために使用することができるＤＮＡセグメント、（９）他では機能しない可能性がある特異的ヌクレオチド配列（例えば、分子の亜集団のＰＣＲ増幅用）をコードするＤＮＡセグメント、ならびに／または（１０）存在しないとき、特定の化合物に対して感受性を直接的にもしくは間接的に付与するＤＮＡセグメント、である。

【0048】

配列同一性は、既定のギャップパラメータを用いて、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ Ｒｅｌｅａｓｅ ７．０，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，ウィスコンシン州マディソン市）におけるＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡなどのアルゴリズムを使用して配列を整列させることによって、または検査、および最良の整列（すなわち、比較ウィンドウにわたる配列類似性の最大の百分率をもたらす）によって決定することができる。配列同一性の百分率は、比較ウィンドウにわたる２つの最適に整列した配列を比較すること、両配列において同一の残基が生じる位置の数を決定してマッチした位置の数を得ること、マッチした位置の数を、比較ウィンドウ内のギャップを計数しないマッチした位置とミスマッチした位置との総数（すなわち、ウィンドウの大きさ）によって除算すること、およびその結果に１００を乗算して配列同一性の百分率を得ることによって計算される。他に示されない限り、２つの配列間の比較のウィンドウは、該２つの配列のうちの短い方の完全長によって定義される。

【0049】

Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼとは、配列番号２８と少なくとも９０、９５、９９または１００％同一の配列を有する、左端の配列が配列番号２４で右端の配列が配列番号２５であるトランスポゾンを宿主細胞のゲノム内へと転位することができる、Ｍａｒｉｎｅｒ型トランスポザーゼである。Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンは、配列番号２６と少なくとも９０、９５、９９または１００％同一である左ＩＴＲと、配列番号２７と９０％同一である右ＩＴＲとを含む。Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンは、配列番号２４と少なくとも９０、９５、９９、または１００％同一であるトランスポゾン末端（ＩＴＲを含む）と、配列番号２５と少なくとも９０、９５、９９、または１００％同一であり、かつ配列番号２８のＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼによって宿主細胞のゲノム内へと転位することができる右トランスポゾン末端（ＩＴＲを含む）とを含んでよい。

【0050】

「標的核酸」は、トランスポゾンが挿入されるべき核酸である。このような標的は、染色体、エピソームまたはベクターの一部であってよい。

【0051】

トランスポザーゼについての「組込み標的配列」または「標的配列」または「標的部位」は、トランスポザーゼによってトランスポゾンを挿入することができる標的ＤＮＡ分子内の部位または配列である。イラクサキンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）由来のｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼは、そのトランスポゾンを主として標的配列５’－ＴＴＡＡ－３’へと挿入する。ｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼは、カットアンドペースト機序を使用してそれらのトランスポゾンを転位し、ＤＮＡ分子への挿入の際にそれらの４塩基対標的配列の重複をもたらす。したがって、標的配列は、組み込まれたｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンの各側に認められる。

【0052】

「翻訳」という用語は、ポリペプチドが、ポリヌクレオチドの配列を「読み取る」リボソームによって合成される過程を指す。

【0053】

「トランスポザーゼ」とは、対応するトランスポゾンのドナーポリヌクレオチド、例えばベクターからの切除と、（該トランスポザーゼが組込み欠損ではないことを条件として）その後のトランスポゾンの標的核酸への組込みと、を触媒するポリペプチドである。トランスポザーゼは、ｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼまたはＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙなどのマリナー型トランスポザーゼであってよい。

【0054】

「転位」という用語は、本明細書では、トランスポザーゼが１つのポリヌクレオチドからトランスポゾンを切り出し、次いで同じポリヌクレオチド内の異なる部位内または第２のポリヌクレオチド内のいずれかへと該トランスポゾンを組み込む上での作用を意味するために使用される。

【0055】

「トランスポゾン」という用語は、対応するトランス作用性トランスポザーゼの作用によって、第１のポリヌクレオチド、例えばベクターから切り出され、同じポリヌクレオチド内の第２の位置へと、または第２のポリヌクレオチド、例えば細胞のゲノムＤＮＡもしくは染色体外ＤＮＡ内へと組み込まれることができるポリヌクレオチドを意味する。トランスポゾンは、トランスポザーゼによって認識されおよび転位するポリヌクレオチド配列である、第１のトランスポゾン末端と第２のトランスポゾン末端とを含む。トランスポゾンは通常、トランスポザーゼの作用によって第１のポリヌクレオチド配列が２つのトランスポゾン末端と共に転位するように、２つのトランスポゾン末端の間に第１のポリヌクレオチド配列をさらに含む。天然トランスポゾンは、トランスポゾンに作用するトランスポザーゼをコードするＤＮＡをよく含む。本発明のトランスポゾンは、２つのトランスポゾン末端間の並置によって転位可能である異種ポリヌクレオチド配列を含む「合成トランスポゾン」である。トランスポゾンは、ｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンまたはＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙなどのマリナー型トランスポゾンであってよい。

【0056】

「トランスポゾン末端」という用語は、対応するトランスポザーゼによる認識および転位に十分であるシス作用性ヌクレオチド配列を意味する。ｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンのトランスポゾン末端は、２つのトランスポゾン末端におけるそれぞれの反復が互いに逆相補であるように完全なまたは不完全な反復を含む。これらは、逆方向末端反復（ＩＴＲ）または末端の逆方向反復（ＴＩＲ）と称される。トランスポゾン末端は、転位を促進するまたは増強するＩＴＲに近位の追加の配列を含んでも含まなくてもよい。

【0057】

「ベクター」または「ＤＮＡベクター」または「遺伝子移入ベクター」という用語は、別のポリヌクレオチドについて「担持する」機能を実施するために使用されるポリヌクレオチドを指す。例えば、ベクターは、ポリヌクレオチドを生細胞内で増殖させることを可能にするために、またはポリヌクレオチドを細胞への送達のためにパッケージングすることを可能にするために、またはポリヌクレオチドを細胞のゲノムＤＮＡ内へと組み込むことを可能にするために使用されることが多い。ベクターは、追加の機能的要素をさらに含むことができ、例えば、トランスポゾンを含むことができる。

【0058】

免疫細胞は、適応免疫系および先天免疫系の細胞を含む、ならびに骨髄起源またはリンパ系起源の細胞を含む免疫系の何らかの細胞を指すことができる。免疫細胞の例としては、白血球、リンパ球、マクロファージ、好中球、樹状細胞、リンパ系細胞、マスト細胞好酸球好塩基球およびナチュラルキラー細胞がある。リンパ球には、Ｂリンパ球およびＴリンパ球が含まれる。Ｔリンパ球には、キラーＴ細胞、ヘルパーＴ細胞およびγδＴ細胞が含まれる。免疫細胞は、対象体から単離された初代細胞であってよいか、または細胞株の形態をはじめとするさらなる培養の結果であってよい。免疫細胞は、本明細書に説明するものに加えて、遺伝子工学の題目、例えば、ＣＡＲ－Ｔ受容体の発現であってよい。

【0059】

本開示は、いくつかのタンパク質の野生型ヒト配列を表す例示的な配列番号を提供する該タンパク質を指す。文脈から明らかでない限り、タンパク質に対する参照は、例示された配列番号、ならびにそれと少なくとも９０、９５、または９９％の同一性を有するその対立遺伝子、種および誘導変異体を含むと理解されるものとする。対立遺伝子変異体および種変異体の例は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔおよび他のデータベースにおいて認めることができる。該タンパク質についての何らかのこのような配列は、本明細書にさらに説明するタンパク質を発現する免疫細胞の生存の増強を付与するために、本明細書に説明する活性化突然変異のうちの１つ以上を含むように修飾することができる。

【0060】

突然変異は、ＸｎＹの形態で称されることがあり、式中、Ｘは野生型アミノ酸であり、ｎは野生型配列中のＸのアミノ酸位置であり、Ｙは置換アミノ酸である。突然変異が、野生型配列とは異なる数のアミノ酸を有する配列において生じる場合、それぞれの配列が最大限に整列したとき、該突然変異は、野生型配列における位置ｎと整列した配列における位置に存在する。

【0061】

核酸が特定のタンパク質の活性化突然変異体をコードするといわれる場合、核酸が活性化突然変異を含むタンパク質をコードすることを意味する。

【0062】

アポトーシス阻害剤は、プログラム細胞死（アポトーシス）の過程を妨害する物質である。アポトーシスは、細胞内カスパーゼプロテアーゼの活性化によって細胞死が誘導される高度に調節された過程である。アポトーシス阻害剤には、天然の機能がアポトーシスに対抗するタンパク質、および天然の機能がアポトーシスに関与するが、アポトーシスを妨害する突然変異を含むタンパク質がある。

【0063】

アポトーシスアッセイは、カスパーゼ活性化、ホスファチジルセリン（ＰＳ）の細胞表面曝露およびＤＮＡ断片化をはじめとする、プログラム細胞死と関係する細胞事象を検出しおよび定量する。開始因子カスパーゼおよび作動体カスパーゼは、細胞におけるアポトーシスを検出するための特に良好な標的である。カスパーゼ活性アッセイは、カスパーゼによって開裂するペプチド基質か、または生細胞において活性化カスパーゼに結合する同様の基質のいずれかを用いる（ＭｃＳｔａｙ ｅｔ ａｌ．，２０１４ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ：Ｃａｓｐａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ａｎｄ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｓｓａｙｓ、Ｎｉｌｅｓ ｅｔ ａｌ，２００８，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．，４１４：１３７－５０）。アポトーシス阻害を測定するための例示的なアッセイは、段落[００６４]において本明細書に説明するルシフェラーゼを使用する生物発光アッセイである。蛍光または発光のいずれかの読み取り値を使用するいくつかのカスパーゼアッセイキットが市販されており、例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ製カスパーゼ－Ｇｌｏ（登録商標）アッセイは、発光性カスパーゼ８テトラペプチド基質（Ｚ－ＬＥＴＤ－アミノルシフェリン）、カスパーゼ９テトラペプチド基質（Ｚ－ＬＥＨＤ－アミノルシフェリン）、カスパーゼ３／７基質（Ｚ－ＤＥＶＤ－アミノルシフェリン）、カスパーゼ６基質（Ｚ－ＶＥＩＤ－アミノルシフェリン）、またはカスパーゼ２基質（Ｚ－ＶＤＶＡＤ－アミノルシフェリン）と、安定したルシフェラーゼを専用緩衝液中で使用する。活性のあるカスパーゼの非存在またはカスパーゼの阻害の下では、カスパーゼ基質はルシフェラーゼのための基質として作用せず、したがって光を生じない。それぞれのカスパーゼによる基質の開裂の際に、アミノルシフェリンが遊離し、発光反応における光の発生に寄与することができる。得られた発光シグナルは、試料中に存在するカスパーゼ活性の量に正比例する。カスパーゼ３のための蛍光基質Ｎ－アセチルＡｓｐ－Ｇｌｕ－Ｖａｌ－Ａｓｐ－７－アミノ－４－メチルクマリンまたはＡｃ－ＤＥＶＤＡＭＣを使用するカスパーゼ活性アッセイキットの例は、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製のカスパーゼ３活性アッセイキットである。活性化カスパーゼ３は、ＤＥＶＤとＡＭＣとの間でこの基質を開裂させ、蛍光リーダーを使用して検出することができる非常に蛍光性のあるＡＭＣを生成し、３８０ｎｍで励起し、４２０～４６０ｎｍで発光する。基質の開裂は、アポトーシス細胞の溶解物中でのみ起こり、それゆえ、産生されるＡＭＣの量は、試料中のアポトーシス細胞の数に比例する。

【0064】

５．２ 免疫細胞における発現に有用な遺伝要素
５．２．１ トランスポゾン要素
異種ポリヌクレオチドが宿主細胞のゲノム内へと組み込まれる場合、免疫細胞における異種ポリヌクレオチド由来の遺伝子の発現の一貫性を改善することができる。ポリヌクレオチドの宿主細胞のゲノム内への組込みはまた、ゲノムＤＮＡの複製および分裂を確実にするのと同じ機序に供することによって、一般に、該ポリヌクレオチドを安定して遺伝可能にする。このような安定した遺伝力は、長い成長期間にわたって良好かつ一貫した発現を達成するために望ましい。免疫細胞の安定した改変のために、特に治療用途のために、該改変の安定性および発現レベルの一貫性が重要である。

【0065】

異種ポリヌクレオチドは、トランスポゾンの一部である場合、例えばトランスポザーゼによって組み込まれることができるように、標的ゲノム内へとより効率的に組み込まれることができる。トランスポゾンの特定の利点は、トランスポゾンＩＴＲ間のポリヌクレオチド全体が組み込まれることである。このことは、真核細胞内へと導入されたポリヌクレオチドが細胞内でしばしば無作為に断片化され、ポリヌクレオチドの一部のみが通常は低頻度で標的ゲノム内へと組み込まれる任意組込みとは対照的である。ｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾン内へと組み込まれた異種ポリヌクレオチドは、免疫細胞、ならびに、肝細胞、神経細胞、筋肉細胞、血液細胞、胚性幹細胞、体性幹細胞、造血細胞、胚、接合体および精子細胞（これらのいくつかは、インビトロ設定において操作されるために開放されている）内へと組み込まれることができる。好ましい細胞はまた、多能性細胞（その子孫が造血幹細胞または他の幹細胞などのいくつかの制限された細胞型へと分化することができる細胞）または全能性細胞（すなわち、その子孫が生物においていかなる細胞型にもなることができる細胞、例えば、胚性幹細胞）でもあってよい。

【0066】

好ましい遺伝子移入系は、トランスポゾンをトランスポザーゼ処理する対応するトランスポザーゼタンパク質、または対応するトランスポザーゼタンパク質をコードし、標的細胞において発現可能である核酸と組み合わせて、トランスポゾンを含む。ｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、いくつかの理由のため、レンチウイルスベクターと比較して、本明細書に説明する用途のための遺伝子移入系として有利である。レンチウイルスは、ある特定のサイズを超えると効率的にパッケージングされず、レンチウイルスのＤＮＡのかなりの量は、ウイルスの合成、組み立ておよびパッケージングに必要な配列で既に占有されている。レンチウイルスベクターを経て組み込まれた遺伝子は、プロモーターサイレンシングにより、非常に可変的な発現を示すことができる（Ａｎｔｏｎｉｏｕ ｅｔ ａｌ．，２０１３．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２４，３６３－３７４．「Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｆｏｒ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ」）。サイレンシングは、コピー数を増加させることによって、または組み込むポリヌクレオチド内へとインスレーターを組み込むことによって低減させることができる（Ｅｍｅｒｙ，２０１１．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２２，７６１－７７４．「Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｉｎｓｕｌａｔｏｒｓ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｓａｆｅｔｙ ｏｆ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｖｅｃｔｏｒｓ」。）。レンチウイルスコンストラクト内にインスレーターを含めることは、サイズの制限という理由、ならびにウイルスのパッケージングおよび力価に対するインスレーターの配列を含める効果という理由から、かなりの労力を要する可能性がある。対照的に、ｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンを標的ゲノム内へと、その対応するトランスポザーゼによって効率的に組み込むことは、トランスポゾンのサイズを増すことによって乱されない。それゆえ、免疫細胞の特性の改変のために、複数の遺伝子を単一のトランスポゾン内へと、隣接するインスレーターとともに、対応するトランスポザーゼの能力を損なうことなく含めて、トランスポゾンを免疫細胞のゲノム内へと組み込むことは可能である。ヒトの内部へと配置予定の細胞のゲノムを修飾するとき、安全性も重要な懸念事項である。それゆえ、腫瘍細胞を死滅させる能力を増強し、生存しおよび増殖する能力を改善するために、Ｔ細胞などの免疫細胞の改変を行うとき、改変された免疫細胞を死滅させる手段を提供する遺伝子を細胞のゲノム内へと組み込むこともできることが有用である。このような「死滅スイッチ」の例としては、既存の治療薬によって効率的に認識される抗原（例えば、通常はＢ細胞上にのみ認められ、リツキシマブ薬によって認識され処置されるＣＤ２０、または通常はＢ細胞上にのみ認められ、ブリノツモマブ薬によって認識され処置されるＣＤ１９などの表面発現抗原）および誘導性カスパーゼ９自殺スイッチの発現がある（Ｓｔｒａａｔｈｏｆ ｅｔ．ａｌ．，２００５．Ｂｌｏｏｄ １０５，４２４７－４２５４．’’Ａｎ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｃａｓｐａｓｅ ９ ｓａｆｅｔｙ ｓｗｉｔｃｈ ｆｏｒ Ｔ－ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ’’）。死滅スイッチが有用であるためには、該スイッチは、改変されたあらゆる細胞のゲノム内に存在しなければならない。キメラ抗原受容体に対する遺伝子と、ＣＤ１９選択可能マーカーをコードする配列および死滅スイッチとしての誘導性カスパーゼ９をコードする配列とを保有するレンチウイルスベクターにおいてこのことを行う試行の一例が、Ｂｕｄｄｅら（ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ８（１２）：ｅ８２７４２．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００８２７４２．ｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ２０１３．「Ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ ａ ＣＤ２０ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｄ ａｎ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｃａｓｐａｓｅ ９ ｓｕｉｃｉｄｅ ｓｗｉｔｃｈ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅ ｅｆｆｉｃａｃｙ ａｎｄ ｓａｆｅｔｙ ｏｆ Ｔ ｃｅｌｌ ａｄｏｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｌｙｍｐｈｏｍａ。」）によって説明されている。死滅スイッチをキメラ抗原受容体遺伝子と組み合わせるために、本著者らは、ウイルスＣＨＹＳＬ／２Ａ配列を使用して、キメラ抗原受容体を含むポリペプチドを誘導性カスパーゼ９から分離しなければならず、ＣＤ１９遺伝子を切断しなければならなかった。このカーゴおよび発現用調節要素は、レンチウイルスベクターの能力の本質的に全体を占め、インスレーターの付加のための、またはＴ細胞の生存もしくは増殖もしくは機能を増強するための遺伝子などの他の遺伝子のための、追加の空間が残っていなかった。したがって、ｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンとその対応するトランスポザーゼとを含む遺伝子移入系は、キメラ抗原受容体をコードする遺伝子をはじめとする遺伝子を、Ｔ細胞をはじめとする免疫細胞のゲノム内へと組み込むのに有利である。

【0067】

ゼノパス属（Ｘｅｎｏｐｕｓ）トランスポゾンは、免疫細胞のゲノムを修飾するのに有利なｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンであり、配列が配列番号６によって与えられたＩＴＲと、転位予定の異種ポリヌクレオチドと、配列が配列番号７によって与えられた第２のＩＴＲとを含む。トランスポゾンはさらに、ＩＴＲのすぐ近くであって、異種ポリヌクレオチドの遠位にある、テトラヌクレオチド５’－ＴＴＡＡ－３’のコピーに両側から隣接していてもよい。トランスポゾンはさらに、ＩＴＲのすぐ近くであって、異種ポリヌクレオチドの片側、好ましくは左側において配列番号１または配列番号２と少なくとも９５％同一である異種ポリヌクレオチドに対して近位の配列と、ＩＴＲのすぐ近くであって、異種ポリヌクレオチドのもう片方の側、好ましくは右側において配列番号４または配列番号５と少なくとも９５％同一である異種ポリヌクレオチドに対して近位の配列とを含むことができる。このトランスポゾンは、配列番号３１または配列番号３２によって与えられる配列と少なくとも９０％同一の配列、例えば配列番号３３～６３のうちのいずれかを含むトランスポザーゼによって転位することができる。好ましくは、トランスポザーゼは、天然に存在するトランスポザーゼの機能亢進型変異体である。好ましくは、機能亢進型変異体トランスポザーゼは、配列番号３１の配列と比較して以下のアミノ酸変化のうちの１つを含む。すなわち、Ｙ６Ｌ、Ｙ６Ｈ、Ｙ６Ｖ、Ｙ６Ｉ、Ｙ６Ｃ、Ｙ６Ｇ、Ｙ６Ａ、Ｙ６Ｓ、Ｙ６Ｆ、Ｙ６Ｒ、Ｙ６Ｐ、Ｙ６Ｄ、Ｙ６Ｎ、Ｓ７Ｇ、Ｓ７Ｖ、Ｓ７Ｄ、Ｅ９Ｗ、Ｅ９Ｄ、Ｅ９Ｅ、Ｍ１６Ｅ、Ｍ１６Ｎ、Ｍ１６Ｄ、Ｍ１６Ｓ、Ｍ１６Ｑ、Ｍ１６Ｔ、Ｍ１６Ａ、Ｍ１６Ｌ、Ｍ１６Ｈ、Ｍ１６Ｆ、Ｍ１６Ｉ、Ｓ１８Ｃ、Ｓ１８Ｙ、Ｓ１８Ｍ、Ｓ１８Ｌ、Ｓ１８Ｑ、Ｓ１８Ｇ、Ｓ１８Ｐ、Ｓ１８Ａ、Ｓ１８Ｗ、Ｓ１８Ｈ、Ｓ１８Ｋ、Ｓ１８Ｉ、Ｓ１８Ｖ、Ｓ１９Ｃ、Ｓ１９Ｖ、Ｓ１９Ｌ、Ｓ１９Ｆ、Ｓ１９Ｋ、Ｓ１９Ｅ、Ｓ１９Ｄ、Ｓ１９Ｇ、Ｓ１９Ｎ、Ｓ１９Ａ、Ｓ１９Ｍ、Ｓ１９Ｐ、Ｓ１９Ｙ、Ｓ１９Ｒ、Ｓ１９Ｔ、Ｓ１９Ｑ、Ｓ２０Ｇ、Ｓ２０Ｍ、Ｓ２０Ｌ、Ｓ２０Ｖ、Ｓ２０Ｈ、Ｓ２０Ｗ、Ｓ２０Ａ、Ｓ２０Ｃ、Ｓ２０Ｑ、Ｓ２０Ｄ、Ｓ２０Ｆ、Ｓ２０Ｎ、Ｓ２０Ｒ、Ｅ２１Ｎ、Ｅ２１Ｗ、Ｅ２１Ｇ、Ｅ２１Ｑ、Ｅ２１Ｌ、Ｅ２１Ｄ、Ｅ２１Ａ、Ｅ２１Ｐ、Ｅ２１Ｔ、Ｅ２１Ｓ、Ｅ２１Ｙ、Ｅ２１Ｖ、Ｅ２１Ｆ、Ｅ２１Ｍ、Ｅ２２Ｃ、Ｅ２２Ｈ、Ｅ２２Ｒ、Ｅ２２Ｌ、Ｅ２２Ｋ、Ｅ２２Ｓ、Ｅ２２Ｇ、Ｅ２２Ｍ、Ｅ２２Ｖ、Ｅ２２Ｑ、Ｅ２２Ａ、Ｅ２２Ｙ、Ｅ２２Ｗ、Ｅ２２Ｄ、Ｅ２２Ｔ、Ｆ２３Ｑ、Ｆ２３Ａ、Ｆ２３Ｄ、Ｆ２３Ｗ、Ｆ２３Ｋ、Ｆ２３Ｔ、Ｆ２３Ｖ、Ｆ２３Ｍ、Ｆ２３Ｎ、Ｆ２３Ｐ、Ｆ２３Ｈ、Ｆ２３Ｅ、Ｆ２３Ｃ、Ｆ２３Ｒ、Ｆ２３Ｙ、Ｓ２４Ｌ、Ｓ２４Ｗ、Ｓ２４Ｈ、Ｓ２４Ｖ、Ｓ２４Ｐ、Ｓ２４Ｉ、Ｓ２４Ｆ、Ｓ２４Ｋ、Ｓ２４Ｙ、Ｓ２４Ｄ、Ｓ２４Ｃ、Ｓ２４Ｎ、Ｓ２４Ｇ、Ｓ２４Ａ、Ｓ２６Ｆ、Ｓ２６Ｈ、Ｓ２６Ｖ、Ｓ２６Ｑ、Ｓ２６Ｙ、Ｓ２６Ｗ、Ｓ２８Ｋ、Ｓ２８Ｙ、Ｓ２８Ｃ、Ｓ２８Ｍ、Ｓ２８Ｌ、Ｓ２８Ｈ、Ｓ２８Ｔ、Ｓ２８Ｑ、Ｖ３１Ｌ、Ｖ３１Ｔ、Ｖ３１Ｉ、Ｖ３１Ｑ、Ｖ３１Ｋ、Ａ３４Ｌ、Ａ３４Ｅ、Ｌ６７Ａ、Ｌ６７Ｔ、Ｌ６７Ｍ、Ｌ６７Ｖ、Ｌ６７Ｃ、Ｌ６７Ｈ、Ｌ６７Ｅ、Ｌ６７Ｙ、Ｇ７３Ｈ、Ｇ７３Ｎ、Ｇ７３Ｋ、Ｇ７３Ｆ、Ｇ７３Ｖ、Ｇ７３Ｄ、Ｇ７３Ｓ、Ｇ７３Ｗ、Ｇ７３Ｌ、Ａ７６Ｌ、Ａ７６Ｒ、Ａ７６Ｅ、Ａ７６Ｉ、Ａ７６Ｖ、Ｄ７７Ｎ、Ｄ７７Ｑ、Ｄ７７Ｙ、Ｄ７７Ｌ、Ｄ７７Ｔ、Ｐ８８Ａ、Ｐ８８Ｅ、Ｐ８８Ｎ、Ｐ８８Ｈ、Ｐ８８Ｄ、Ｐ８８Ｌ、Ｎ９１Ｄ、Ｎ９１Ｒ、Ｎ９１Ａ、Ｎ９１Ｌ、Ｎ９１Ｈ、Ｎ９１Ｖ、Ｙ１４１Ｉ、Ｙ１４１Ｍ、Ｙ１４１Ｑ、Ｙ１４１Ｓ、Ｙ１４１Ｅ、Ｙ１４１Ｗ、Ｙ１４１Ｖ、Ｙ１４１Ｆ、Ｙ１４１Ａ、Ｙ１４１Ｃ、Ｙ１４１Ｋ、Ｙ１４１Ｌ、Ｙ１４１Ｈ、Ｙ１４１Ｒ、Ｎ１４５Ｃ、Ｎ１４５Ｍ、Ｎ１４５Ａ、Ｎ１４５Ｑ、Ｎ１４５Ｉ、Ｎ１４５Ｆ、Ｎ１４５Ｇ、Ｎ１４５Ｄ、Ｎ１４５Ｅ、Ｎ１４５Ｖ、Ｎ１４５Ｈ、Ｎ１４５Ｗ、Ｎ１４５Ｙ、Ｎ１４５Ｌ、Ｎ１４５Ｒ、Ｎ１４５Ｓ、Ｐ１４６Ｖ、Ｐ１４６Ｔ、Ｐ１４６Ｗ、Ｐ１４６Ｃ、Ｐ１４６Ｑ、Ｐ１４６Ｌ、Ｐ１４６Ｙ、Ｐ１４６Ｋ、Ｐ１４６Ｎ、Ｐ１４６Ｆ、Ｐ１４６Ｅ、Ｐ１４８Ｍ、Ｐ１４８Ｒ、Ｐ１４８Ｖ、Ｐ１４８Ｆ、Ｐ１４８Ｔ、Ｐ１４８Ｃ、Ｐ１４８Ｑ、Ｐ１４８Ｈ、Ｙ１５０Ｗ、Ｙ１５０Ａ、Ｙ１５０Ｆ、Ｙ１５０Ｈ、Ｙ１５０Ｓ、Ｙ１５０Ｖ、Ｙ１５０Ｃ、Ｙ１５０Ｍ、Ｙ１５０Ｎ、Ｙ１５０Ｄ、Ｙ１５０Ｅ、Ｙ１５０Ｑ、Ｙ１５０Ｋ、Ｈ１５７Ｙ、Ｈ１５７Ｆ、Ｈ１５７Ｔ、Ｈ１５７Ｓ、Ｈ１５７Ｗ、Ａ１６２Ｌ、Ａ１６２Ｖ、Ａ１６２Ｃ、Ａ１６２Ｋ、Ａ１６２Ｔ、Ａ１６２Ｇ、Ａ１６２Ｍ、Ａ１６２Ｓ、Ａ１６２Ｉ、Ａ１６２Ｙ、Ａ１６２Ｑ、Ａ１７９Ｔ、Ａ１７９Ｋ、Ａ１７９Ｓ、Ａ１７９Ｖ、Ａ１７９Ｒ、Ｌ１８２Ｖ、Ｌ１８２Ｉ、Ｌ１８２Ｑ、Ｌ１８２Ｔ、Ｌ１８２Ｗ、Ｌ１８２Ｒ、Ｌ１８２Ｓ、Ｔ１８９Ｃ、Ｔ１８９Ｎ、Ｔ１８９Ｌ、Ｔ１８９Ｋ、Ｔ１８９Ｑ、Ｔ１８９Ｖ、Ｔ１８９Ａ、Ｔ１８９Ｗ、Ｔ１８９Ｙ、Ｔ１８９Ｇ、Ｔ１８９Ｆ、Ｔ１８９Ｓ、Ｔ１８９Ｈ、Ｌ１９２Ｖ、Ｌ１９２Ｃ、Ｌ１９２Ｈ、Ｌ１９２Ｍ、Ｌ１９２Ｉ、Ｓ１９３Ｐ、Ｓ１９３Ｔ、Ｓ１９３Ｒ、Ｓ１９３Ｋ、Ｓ１９３Ｇ、Ｓ１９３Ｄ、Ｓ１９３Ｎ、Ｓ１９３Ｆ、Ｓ１９３Ｈ、Ｓ１９３Ｑ、Ｓ１９３Ｙ、Ｖ１９６Ｌ、Ｖ１９６Ｓ、Ｖ１９６Ｗ、Ｖ１９６Ａ、Ｖ１９６Ｆ、Ｖ１９６Ｍ、Ｖ１９６Ｉ、Ｓ１９８Ｇ、Ｓ１９８Ｒ、Ｓ１９８Ａ、Ｓ１９８Ｋ、Ｔ２００Ｃ、Ｔ２００Ｉ、Ｔ２００Ｍ、Ｔ２００Ｌ、Ｔ２００Ｎ、Ｔ２００Ｗ、Ｔ２００Ｖ、Ｔ２００Ｑ、Ｔ２００Ｙ、Ｔ２００Ｈ、Ｔ２００Ｒ、Ｓ２０２Ａ、Ｓ２０２Ｐ、Ｌ２１０Ｈ、Ｌ２１０Ａ、Ｆ２１２Ｙ、Ｆ２１２Ｎ、Ｆ２１２Ｍ、Ｆ２１２Ｃ、Ｆ２１２Ａ、Ｎ２１８Ｖ、Ｎ２１８Ｒ、Ｎ２１８Ｔ、Ｎ２１８Ｃ、Ｎ２１８Ｇ、Ｎ２１８Ｉ、Ｎ２１８Ｐ、Ｎ２１８Ｄ、Ｎ２１８Ｅ、Ａ２４８Ｓ、Ａ２４８Ｌ、Ａ２４８Ｈ、Ａ２４８Ｃ、Ａ２４８Ｎ、Ａ２４８Ｉ、Ａ２４８Ｑ、Ａ２４８Ｙ、Ａ２４８Ｍ、Ａ２４８Ｄ、Ｌ２６３Ｖ、Ｌ２６３Ａ、Ｌ２６３Ｍ、Ｌ２６３Ｒ、Ｌ２６３Ｄ、Ｑ２７０Ｖ、Ｑ２７０Ｋ、Ｑ２７０Ａ、Ｑ２７０Ｃ、Ｑ２７０Ｐ、Ｑ２７０Ｌ、Ｑ２７０Ｉ、Ｑ２７０Ｅ、Ｑ２７０Ｇ、Ｑ２７０Ｙ、Ｑ２７０Ｎ、Ｑ２７０Ｔ、Ｑ２７０Ｗ、Ｑ２７０Ｈ、Ｓ２９４Ｒ、Ｓ２９４Ｎ、Ｓ２９４Ｇ、Ｓ２９４Ｔ、Ｓ２９４Ｃ、Ｔ２９７Ｃ、Ｔ２９７Ｐ、Ｔ２９７Ｖ、Ｔ２９７Ｍ、Ｔ２９７Ｌ、Ｔ２９７Ｄ、Ｅ３０４Ｄ、Ｅ３０４Ｈ、Ｅ３０４Ｓ、Ｅ３０４Ｑ、Ｅ３０４Ｃ、Ｓ３０８Ｒ、Ｓ３０８Ｇ、Ｌ３１０Ｒ、Ｌ３１０Ｉ、Ｌ３１０Ｖ、Ｌ３３３Ｍ、Ｌ３３３Ｗ、Ｌ３３３Ｆ、Ｑ３３６Ｙ、Ｑ３３６Ｎ、Ｑ３３６Ｍ、Ｑ３３６Ａ、Ｑ３３６Ｔ、Ｑ３３６Ｌ、Ｑ３３６Ｉ、Ｑ３３６Ｇ、Ｑ３３６Ｆ、Ｑ３３６Ｅ、Ｑ３３６Ｖ、Ｑ３３６Ｃ、Ｑ３３６Ｈ、Ａ３５４Ｖ、Ａ３５４Ｗ、Ａ３５４Ｄ、Ａ３５４Ｃ、Ａ３５４Ｒ、Ａ３５４Ｅ、Ａ３５４Ｋ、Ａ３５４Ｈ、Ａ３５４Ｇ、Ｃ３５７Ｑ、Ｃ３５７Ｈ、Ｃ３５７Ｗ、Ｃ３５７Ｎ、Ｃ３５７Ｉ、Ｃ３５７Ｖ、Ｃ３５７Ｍ、Ｃ３５７Ｒ、Ｃ３５７Ｆ、Ｃ３５７Ｄ、Ｌ３５８Ａ、Ｌ３５８Ｆ、Ｌ３５８Ｅ、Ｌ３５８Ｒ、Ｌ３５８Ｑ、Ｌ３５８Ｖ、Ｌ３５８Ｈ、Ｌ３５８Ｃ、Ｌ３５８Ｍ、Ｌ３５８Ｙ、Ｌ３５８Ｋ、Ｌ３５８Ｎ、Ｌ３５８Ｉ、Ｄ３５９Ｎ、Ｄ３５９Ａ、Ｄ３５９Ｌ、Ｄ３５９Ｈ、Ｄ３５９Ｒ、Ｄ３５９Ｓ、Ｄ３５９Ｑ、Ｄ３５９Ｅ、Ｄ３５９Ｍ、Ｌ３７７Ｖ、Ｌ３７７Ｉ、Ｖ４２３Ｎ、Ｖ４２３Ｐ、Ｖ４２３Ｔ、Ｖ４２３Ｆ、Ｖ４２３Ｈ、Ｖ４２３Ｃ、Ｖ４２３Ｓ、Ｖ４２３Ｇ、Ｖ４２３Ａ、Ｖ４２３Ｒ、Ｖ４２３Ｌ、Ｐ４２６Ｌ、Ｐ４２６Ｋ、Ｐ４２６Ｙ、Ｐ４２６Ｆ、Ｐ４２６Ｔ、Ｐ４２６Ｗ、Ｐ４２６Ｖ、Ｐ４２６Ｃ、Ｐ４２６Ｓ、Ｐ４２６Ｑ、Ｐ４２６Ｈ、Ｐ４２６Ｎ、Ｋ４２８Ｒ、Ｋ４２８Ｑ、Ｋ４２８Ｎ、Ｋ４２８Ｔ、Ｋ４２８Ｆ、Ｓ４３４Ａ、Ｓ４３４Ｔ、Ｓ４３８Ｑ、Ｓ４３８Ａ、Ｓ４３８Ｍ、Ｔ４４７Ｓ、Ｔ４４７Ａ、Ｔ４４７Ｃ、Ｔ４４７Ｑ、Ｔ４４７Ｎ、Ｔ４４７Ｇ、Ｌ４５０Ｍ、Ｌ４５０Ｖ、Ｌ４５０Ａ、Ｌ４５０Ｉ、Ｌ４５０Ｅ、Ａ４６２Ｍ、Ａ４６２Ｔ、Ａ４６２Ｙ、Ａ４６２Ｆ、Ａ４６２Ｋ、Ａ４６２Ｒ、Ａ４６２Ｑ、Ａ４６２Ｈ、Ａ４６２Ｅ、Ａ４６２Ｎ、Ａ４６２Ｃ、Ｖ４６７Ｔ、Ｖ４６７Ｃ、Ｖ４６７Ａ、Ｖ４６７Ｋ、Ｉ４６９Ｖ、Ｉ４６９Ｎ、Ｉ４７２Ｖ、Ｉ４７２Ｌ、Ｉ４７２Ｗ、Ｉ４７２Ｍ、Ｉ４７２Ｆ、Ｌ４７６Ｉ、Ｌ４７６Ｖ、Ｌ４７６Ｎ、Ｌ４７６Ｆ、Ｌ４７６Ｍ、Ｌ４７６Ｃ、Ｌ４７６Ｑ、Ｐ４８８Ｅ、Ｐ４８８Ｈ、Ｐ４８８Ｋ、Ｐ４８８Ｑ、Ｐ４８８Ｆ、Ｐ４８８Ｍ、Ｐ４８８Ｌ、Ｐ４８８Ｎ、Ｐ４８８Ｄ、Ｑ４９８Ｖ、Ｑ４９８Ｌ、Ｑ４９８Ｇ、Ｑ４９８Ｈ、Ｑ４９８Ｔ、Ｑ４９８Ｃ、Ｑ４９８Ｅ、Ｑ４９８Ｍ、Ｌ５０２Ｉ、Ｌ５０２Ｍ、Ｌ５０２Ｖ、Ｌ５０２Ｇ、Ｌ５０２Ｆ、Ｅ５１７Ｍ、Ｅ５１７Ｖ、Ｅ５１７Ａ、Ｅ５１７Ｋ、Ｅ５１７Ｌ、Ｅ５１７Ｇ、Ｅ５１７Ｓ、Ｅ５１７Ｉ、Ｐ５２０Ｗ、Ｐ５２０Ｒ、Ｐ５２０Ｍ、Ｐ５２０Ｆ、Ｐ５２０Ｑ、Ｐ５２０Ｖ、Ｐ５２０Ｇ、Ｐ５２０Ｄ、Ｐ５２０Ｋ、Ｐ５２０Ｙ、Ｐ５２０Ｅ、Ｐ５２０Ｌ、Ｐ５２０Ｔ、Ｓ５２１Ａ、Ｓ５２１Ｈ、Ｓ５２１Ｃ、Ｓ５２１Ｖ、Ｓ５２１Ｗ、Ｓ５２１Ｔ、Ｓ５２１Ｋ、Ｓ５２１Ｆ、Ｓ５２１Ｇ、Ｎ５２３Ｗ、Ｎ５２３Ａ、Ｎ５２３Ｇ、Ｎ５２３Ｓ、Ｎ５２３Ｐ、Ｎ５２３Ｍ、Ｎ５２３Ｑ、Ｎ５２３Ｌ、Ｎ５２３Ｋ、Ｎ５２３Ｄ、Ｎ５２３Ｈ、Ｎ５２３Ｆ、Ｎ５２３Ｃ、Ｉ５３３Ｍ、Ｉ５３３Ｖ、Ｉ５３３Ｔ、Ｉ５３３Ｓ、Ｉ５３３Ｆ、Ｉ５３３Ｇ、Ｉ５３３Ｅ、Ｄ５３４Ｅ、Ｄ５３４Ｑ、Ｄ５３４Ｌ、Ｄ５３４Ｒ、Ｄ５３４Ｖ、Ｄ５３４Ｃ、Ｄ５３４Ｍ、Ｄ５３４Ｎ、Ｄ５３４Ａ、Ｄ５３４Ｇ、Ｄ５３４Ｆ、Ｄ５３４Ｔ、Ｄ５３４Ｈ、Ｄ５３４Ｋ、Ｄ５３４Ｓ、Ｆ５７６Ｌ、Ｆ５７６Ｋ、Ｆ５７６Ｖ、Ｆ５７６Ｄ、Ｆ５７６Ｗ、Ｆ５７６Ｍ、Ｆ５７６Ｃ、Ｆ５７６Ｒ、Ｆ５７６Ｑ、Ｆ５７６Ａ、Ｆ５７６Ｙ、Ｆ５７６Ｎ、Ｆ５７６Ｇ、Ｆ５７６Ｉ、Ｆ５７６Ｅ、Ｋ５７７Ｌ、Ｋ５７７Ｇ、Ｋ５７７Ｄ、Ｋ５７７Ｒ、Ｋ５７７Ｈ、Ｋ５７７Ｙ、Ｋ５７７Ｉ、Ｋ５７７Ｅ、Ｋ５７７Ｖ、Ｋ５７７Ｎ、Ｉ５８２Ｖ、Ｉ５８２Ｋ、Ｉ５８２Ｒ、Ｉ５８２Ｍ、Ｉ５８２Ｇ、Ｉ５８２Ｎ、Ｉ５８２Ｅ、Ｉ５８２Ａ、Ｉ５８２Ｑ、Ｙ５８３Ｌ、Ｙ５８３Ｃ、Ｙ５８３Ｆ、Ｙ５８３Ｄ、Ｙ５８３Ｑ、Ｌ５８７Ｆ、Ｌ５８７Ｄ、Ｌ５８７Ｒ、Ｌ５８７Ｉ、Ｌ５８７Ｐ、Ｌ５８７Ｎ、Ｌ５８７Ｅ、Ｌ５８７Ｓ、Ｌ５８７Ｙ、Ｌ５８７Ｍ、Ｌ５８７Ｑ、Ｌ５８７Ｇ、Ｌ５８７Ｗ、Ｌ５８７ＫまたはＬ５８７Ｔである。

【0068】

カイコガ属（Ｂｏｍｂｙｘ）トランスポゾンは、免疫細胞のゲノムを修飾するのに有利なｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンであり、配列が配列番号１４によって与えられたＩＴＲと、転位予定の異種ポリヌクレオチドと、配列が配列番号１５によって与えられた第２のＩＴＲとを含む。トランスポゾンはさらに、ＩＴＲのすぐ近くであって、異種ポリヌクレオチドの遠位にある、テトラヌクレオチド５’－ＴＴＡＡ－３’のコピーに両側から隣接していてもよい。トランスポゾンはさらに、ＩＴＲのすぐ近くであって、異種ポリヌクレオチドの片側、好ましくは左側において配列番号１２と少なくとも９５％同一である異種ポリヌクレオチドに対して近位の配列と、ＩＴＲのすぐ近くであって、異種ポリヌクレオチドのもう片方の側、好ましくは右側において配列番号１３と少なくとも９５％同一である異種ポリヌクレオチドに対して近位の配列とを含むことができる。このトランスポゾンは、配列番号６４によって与えられる配列と少なくとも９０％同一の配列、例えば配列番号６５～８６のうちのいずれかを含むトランスポザーゼによって転位することができる。好ましくは、トランスポザーゼは、天然に存在するトランスポザーゼの機能亢進型変異体である。好ましくは、機能亢進型変異体トランスポザーゼは、配列番号ＢＭ－Ｔｐアーゼ１の配列と比較して、以下のアミノ酸変化のうちの１つを含む。すなわち、Ｑ８５Ｅ、Ｑ８５Ｍ、Ｑ８５Ｋ、Ｑ８５Ｈ、Ｑ８５Ｎ、Ｑ８５Ｔ、Ｑ８５Ｆ、Ｑ８５Ｌ、Ｑ９２Ｅ、Ｑ９２Ａ、Ｑ９２Ｐ、Ｑ９２Ｎ、Ｑ９２Ｉ、Ｑ９２Ｙ、Ｑ９２Ｈ、Ｑ９２Ｆ、Ｑ９２Ｒ、Ｑ９２Ｄ、Ｑ９２Ｍ、Ｑ９２Ｗ、Ｑ９２Ｃ、Ｑ９２Ｇ、Ｑ９２Ｌ、Ｑ９２Ｖ、Ｑ９２Ｔ、Ｖ９３Ｐ、Ｖ９３Ｋ、Ｖ９３Ｍ、Ｖ９３Ｆ、Ｖ９３Ｗ、Ｖ９３Ｌ、Ｖ９３Ａ、Ｖ９３Ｉ、Ｖ９３Ｑ、Ｐ９６Ａ、Ｐ９６Ｔ、Ｐ９６Ｍ、Ｐ９６Ｒ、Ｐ９６Ｇ、Ｐ９６Ｖ、Ｐ９６Ｅ、Ｐ９６Ｑ、Ｐ９６Ｃ、Ｆ９７Ｑ、Ｆ９７Ｋ、Ｆ９７Ｈ、Ｆ９７Ｔ、Ｆ９７Ｃ、Ｆ９７Ｗ、Ｆ９７Ｖ、Ｆ９７Ｅ、Ｆ９７Ｐ、Ｆ９７Ｄ、Ｆ９７Ａ、Ｆ９７Ｒ、Ｆ９７Ｇ、Ｆ９７Ｎ、Ｆ９７Ｙ、Ｈ１６５Ｅ、Ｈ１６５Ｇ、Ｈ１６５Ｑ、Ｈ１６５Ｔ、Ｈ１６５Ｍ、Ｈ１６５Ｖ、Ｈ１６５Ｌ、Ｈ１６５Ｃ、Ｈ１６５Ｎ、Ｈ１６５Ｄ、Ｈ１６５Ｋ、Ｈ１６５Ｗ、Ｈ１６５Ａ、Ｅ１７８Ｓ、Ｅ１７８Ｈ、Ｅ１７８Ｙ、Ｅ１７８Ｆ、Ｅ１７８Ｃ、Ｅ１７８Ａ、Ｅ１７８Ｑ、Ｅ１７８Ｇ、Ｅ１７８Ｖ、Ｅ１７８Ｄ、Ｅ１７８Ｌ、Ｅ１７８Ｐ、Ｅ１７８Ｗ、Ｃ１８９Ｄ、Ｃ１８９Ｙ、Ｃ１８９Ｉ、Ｃ１８９Ｗ、Ｃ１８９Ｔ、Ｃ１８９Ｋ、Ｃ１８９Ｍ、Ｃ１８９Ｆ、Ｃ１８９Ｐ、Ｃ１８９Ｑ、Ｃ１８９Ｖ、Ａ１９６Ｇ、Ｌ２００Ｉ、Ｌ２００Ｆ、Ｌ２００Ｃ、Ｌ２００Ｍ、Ｌ２００Ｙ、Ａ２０１Ｑ、Ａ２０１Ｌ、Ａ２０１Ｍ、Ｌ２０３Ｖ、Ｌ２０３Ｄ、Ｌ２０３Ｇ、Ｌ２０３Ｅ、Ｌ２０３Ｃ、Ｌ２０３Ｔ、Ｌ２０３Ｍ、Ｌ２０３Ａ、Ｌ２０３Ｙ、Ｎ２０７Ｇ、Ｎ２０７Ａ、Ｌ２１１Ｇ、Ｌ２１１Ｍ、Ｌ２１１Ｃ、Ｌ２１１Ｔ、Ｌ２１１Ｖ、Ｌ２１１Ａ、Ｗ２１５Ｙ、Ｔ２１７Ｖ、Ｔ２１７Ａ、Ｔ２１７Ｉ、Ｔ２１７Ｐ、Ｔ２１７Ｃ、Ｔ２１７Ｑ、Ｔ２１７Ｍ、Ｔ２１７Ｆ、Ｔ２１７Ｄ、Ｔ２１７Ｋ、Ｇ２１９Ｓ、Ｇ２１９Ａ、Ｇ２１９Ｃ、Ｇ２１９Ｈ、Ｇ２１９Ｑ、Ｑ２３５Ｃ、Ｑ２３５Ｎ、Ｑ２３５Ｈ、Ｑ２３５Ｇ、Ｑ２３５Ｗ、Ｑ２３５Ｙ、Ｑ２３５Ａ、Ｑ２３５Ｔ、Ｑ２３５Ｅ、Ｑ２３５Ｍ、Ｑ２３５Ｆ、Ｑ２３８Ｃ、Ｑ２３８Ｍ、Ｑ２３８Ｈ、Ｑ２３８Ｖ、Ｑ２３８Ｌ、Ｑ２３８Ｔ、Ｑ２３８Ｉ、Ｒ２４２Ｑ、Ｋ２４６Ｉ、Ｋ２５３Ｖ、Ｍ２５８Ｖ、Ｆ２６１Ｌ、Ｓ２６３Ｋ、Ｃ２７１Ｓ、Ｎ３０３Ｃ、Ｎ３０３Ｒ、Ｎ３０３Ｇ、Ｎ３０３Ａ、Ｎ３０３Ｄ、Ｎ３０３Ｓ、Ｎ３０３Ｈ、Ｎ３０３Ｅ、Ｎ３０３Ｒ、Ｎ３０３Ｋ、Ｎ３０３Ｌ、Ｎ３０３Ｑ、Ｉ３１２Ｆ、Ｉ３１２Ｃ、Ｉ３１２Ａ、Ｉ３１２Ｌ、Ｉ３１２Ｔ、Ｉ３１２Ｖ、Ｉ３１２Ｇ、Ｉ３１２Ｍ、Ｆ３２１Ｈ、Ｆ３２１Ｒ、Ｆ３２１Ｎ、Ｆ３２１Ｙ、Ｆ３２１Ｗ、Ｆ３２１Ｄ、Ｆ３２１Ｇ、Ｆ３２１Ｅ、Ｆ３２１Ｍ、Ｆ３２１Ｋ、Ｆ３２１Ａ、Ｆ３２１Ｑ、Ｖ３２３Ｉ、Ｖ３２３Ｌ、Ｖ３２３Ｔ、Ｖ３２３Ｍ、Ｖ３２３Ａ、Ｖ３２４Ｎ、Ｖ３２４Ａ、Ｖ３２４Ｃ、Ｖ３２４Ｉ、Ｖ３２４Ｌ、Ｖ３２４Ｔ、Ｖ３２４Ｋ、Ｖ３２４Ｙ、Ｖ３２４Ｈ、Ｖ３２４Ｆ、Ｖ３２４Ｓ、Ｖ３２４Ｑ、Ｖ３２４Ｍ、Ｖ３２４Ｇ、Ａ３３０Ｋ、Ａ３３０Ｖ、Ａ３３０Ｐ、Ａ３３０Ｓ、Ａ３３０Ｃ、Ａ３３０Ｔ、Ａ３３０Ｌ、Ｑ３３３Ｐ、Ｑ３３３Ｔ、Ｑ３３３Ｍ、Ｑ３３３Ｈ、Ｑ３３３Ｓ、Ｐ３３７Ｗ、Ｐ３３７Ｅ、Ｐ３３７Ｈ、Ｐ３３７Ｉ、Ｐ３３７Ａ、Ｐ３３７Ｍ、Ｐ３３７Ｎ、Ｐ３３７Ｄ、Ｐ３３７Ｋ、Ｐ３３７Ｑ、Ｐ３３７Ｇ、Ｐ３３７Ｓ、Ｐ３３７Ｃ、Ｐ３３７Ｌ、Ｐ３３７Ｖ、Ｆ３６８Ｙ、Ｌ３７３Ｃ、Ｌ３７３Ｖ、Ｌ３７３Ｉ、Ｌ３７３Ｓ、Ｌ３７３Ｔ、Ｖ３８９Ｉ、Ｖ３８９Ｍ、Ｖ３８９Ｔ、Ｖ３８９Ｌ、Ｖ３８９Ａ、Ｒ３９４Ｈ、Ｒ３９４Ｋ、Ｒ３９４Ｔ、Ｒ３９４Ｐ、Ｒ３９４Ｍ、Ｒ３９４Ａ、Ｑ３９５Ｐ、Ｑ３９５Ｆ、Ｑ３９５Ｅ、Ｑ３９５Ｃ、Ｑ３９５Ｖ、Ｑ３９５Ａ、Ｑ３９５Ｈ、Ｑ３９５Ｓ、Ｑ３９５Ｙ、Ｓ３９９Ｎ、Ｓ３９９Ｅ、Ｓ３９９Ｋ、Ｓ３９９Ｈ、Ｓ３９９Ｄ、Ｓ３９９Ｙ、Ｓ３９９Ｇ、Ｓ３９９Ｑ、Ｓ３９９Ｒ、Ｓ３９９Ｔ、Ｓ３９９Ａ、Ｓ３９９Ｖ、Ｓ３９９Ｍ、Ｒ４０２Ｙ、Ｒ４０２Ｋ、Ｒ４０２Ｄ、Ｒ４０２Ｆ、Ｒ４０２Ｇ、Ｒ４０２Ｎ、Ｒ４０２Ｅ、Ｒ４０２Ｍ、Ｒ４０２Ｓ、Ｒ４０２Ｑ、Ｒ４０２Ｔ、Ｒ４０２Ｃ、Ｒ４０２Ｌ、Ｒ４０２Ｖ、Ｔ４０３Ｗ、Ｔ４０３Ａ、Ｔ４０３Ｖ、Ｔ４０３Ｆ、Ｔ４０３Ｌ、Ｔ４０３Ｙ、Ｔ４０３Ｎ、Ｔ４０３Ｇ、Ｔ４０３Ｃ、Ｔ４０３Ｉ、Ｔ４０３Ｓ、Ｔ４０３Ｍ、Ｔ４０３Ｑ、Ｔ４０３Ｋ、Ｔ４０３Ｅ、Ｄ４０４Ｉ、Ｄ４０４Ｓ、Ｄ４０４Ｅ、Ｄ４０４Ｎ、Ｄ４０４Ｈ、Ｄ４０４Ｃ、Ｄ４０４Ｍ、Ｄ４０４Ｇ、Ｄ４０４Ａ、Ｄ４０４Ｑ、Ｄ４０４Ｌ、Ｄ４０４Ｐ、Ｄ４０４Ｖ、Ｄ４０４Ｗ、Ｄ４０４Ｆ、Ｎ４０８Ｆ、Ｎ４０８Ｉ、Ｎ４０８Ａ、Ｎ４０８Ｅ、Ｎ４０８Ｍ、Ｎ４０８Ｓ、Ｎ４０８Ｄ、Ｎ４０８Ｙ、Ｎ４０８Ｈ、Ｎ４０８Ｃ、Ｎ４０８Ｑ、Ｎ４０８Ｖ、Ｎ４０８Ｗ、Ｎ４０８Ｌ、Ｎ４０８Ｐ、Ｎ４０８Ｋ、Ｓ４０９Ｈ、Ｓ４０９Ｙ、Ｓ４０９Ｎ、Ｓ４０９Ｉ、Ｓ４０９Ｄ、Ｓ４０９Ｆ、Ｓ４０９Ｔ、Ｓ４０９Ｃ、Ｓ４０９Ｑ、Ｎ４４１Ｆ、Ｎ４４１Ｒ、Ｎ４４１Ｍ、Ｎ４４１Ｇ、Ｎ４４１Ｃ、Ｎ４４１Ｄ、Ｎ４４１Ｌ、Ｎ４４１Ａ、Ｎ４４１Ｖ、Ｎ４４１Ｗ、Ｇ４４８Ｗ、Ｇ４４８Ｙ、Ｇ４４８Ｈ、Ｇ４４８Ｃ、Ｇ４４８Ｔ、Ｇ４４８Ｖ、Ｇ４４８Ｎ、Ｇ４４８Ｑ、Ｅ４４９Ａ、Ｅ４４９Ｐ、Ｅ４４９Ｔ、Ｅ４４９Ｌ、Ｅ４４９Ｈ、Ｅ４４９Ｇ、Ｅ４４９Ｃ、Ｅ４４９Ｉ、Ｖ４６９Ｔ、Ｖ４６９Ａ、Ｖ４６９Ｈ、Ｖ４６９Ｃ、Ｖ４６９Ｌ、Ｌ４７２Ｋ、Ｌ４７２Ｑ、Ｌ４７２Ｍ、Ｃ４７３Ｇ、Ｃ４７３Ｑ、Ｃ４７３Ｔ、Ｃ４７３Ｉ、Ｃ４７３Ｍ、Ｒ４８４Ｈ、Ｒ４８４Ｋ、Ｔ５０７Ｒ、Ｔ５０７Ｄ、Ｔ５０７Ｓ、Ｔ５０７Ｇ、Ｔ５０７Ｋ、Ｔ５０７Ｉ、Ｔ５０７Ｍ、Ｔ５０７Ｅ、Ｔ５０７Ｃ、Ｔ５０７Ｌ、Ｔ５０７Ｖ、Ｇ５２３Ｑ、Ｇ５２３Ｔ、Ｇ５２３Ａ、Ｇ５２３Ｍ、Ｇ５２３Ｓ、Ｇ５２３Ｃ、Ｇ５２３Ｉ、Ｇ５２３Ｌ、Ｉ５２７Ｍ、Ｉ５２７Ｖ、Ｙ５２８Ｎ、Ｙ５２８Ｗ、Ｙ５２８Ｍ、Ｙ５２８Ｑ、Ｙ５２８Ｋ、Ｙ５２８Ｖ、Ｙ５２８Ｉ、Ｙ５２８Ｇ、Ｙ５２８Ｄ、Ｙ５２８Ａ、Ｙ５２８Ｅ、Ｙ５２８Ｒ、Ｙ５４３Ｃ、Ｙ５４３Ｗ、Ｙ５４３Ｉ、Ｙ５４３Ｍ、Ｙ５４３Ｑ、Ｙ５４３Ａ、Ｙ５４３Ｒ、Ｙ５４３Ｈ、Ｅ５４９Ｋ、Ｅ５４９Ｃ、Ｅ５４９Ｉ、Ｅ５４９Ｑ、Ｅ５４９Ａ、Ｅ５４９Ｈ、Ｅ５４９Ｃ、Ｅ５４９Ｍ、Ｅ５４９Ｓ、Ｅ５４９Ｆ、Ｅ５４９Ｌ、Ｋ５５０Ｒ、Ｋ５５０Ｍ、Ｋ５５０Ｑ、Ｓ５５６Ｇ、Ｓ５５６Ｖ、Ｓ５５６Ｉ、Ｐ５５７Ｗ、Ｐ５５７Ｔ、Ｐ５５７Ｓ、Ｐ５５７Ａ、Ｐ５５７Ｑ、Ｐ５５７Ｋ、Ｐ５５７Ｄ、Ｐ５５７Ｇ、Ｐ５５７Ｎ、Ｐ５５７Ｌ、Ｐ５５７Ｖ、Ｈ５５９Ｋ、Ｈ５５９Ｓ、Ｈ５５９Ｃ、Ｈ５５９Ｉ、Ｈ５５９Ｗ、Ｖ５６０Ｆ、Ｖ５６０Ｐ、Ｖ５６０Ｉ、Ｖ５６０Ｈ、Ｖ５６０Ｙ、Ｖ５６０Ｋ、Ｎ５６１Ｐ、Ｎ５６１Ｑ、Ｎ５６１Ｇ、Ｎ５６１Ａ、Ｖ５６２Ｙ、Ｖ５６２Ｉ、Ｖ５６２Ｓ、Ｖ５６２Ｍ、Ｖ５６７Ｉ、Ｖ５６７Ｈ、Ｖ５６７Ｎ、Ｓ５８３Ｍ、Ｅ６０１Ｖ、Ｅ６０１Ｆ、Ｅ６０１Ｑ、Ｅ６０１Ｗ、Ｅ６０５Ｒ、Ｅ６０５Ｗ、Ｅ６０５Ｋ、Ｅ６０５Ｍ、Ｅ６０５Ｐ、Ｅ６０５Ｙ、Ｅ６０５Ｃ、Ｅ６０５Ｈ、Ｅ６０５Ａ、Ｅ６０５Ｑ、Ｅ６０５Ｓ、Ｅ６０５Ｖ、Ｅ６０５Ｉ、Ｅ６０５Ｇ、Ｄ６０７Ｖ、Ｄ６０７Ｙ、Ｄ６０７Ｃ、Ｄ６０７Ｎ、Ｄ６０７Ｗ、Ｄ６０７Ｔ、Ｄ６０７Ａ、Ｄ６０７Ｈ、Ｄ６０７Ｑ、Ｄ６０７Ｅ、Ｄ６０７Ｌ、Ｄ６０７Ｋ、Ｄ６０７Ｇ、Ｓ６０９Ｒ、Ｓ６０９Ｗ、Ｓ６０９Ｈ、Ｓ６０９Ｖ、Ｓ６０９Ｑ、Ｓ６０９Ｇ、Ｓ６０９Ｔ、Ｓ６０９Ｋ、Ｓ６０９Ｎ、Ｓ６０９Ｙ、Ｌ６１０Ｔ、Ｌ６１０Ｉ、Ｌ６１０Ｋ、Ｌ６１０Ｇ、Ｌ６１０Ａ、Ｌ６１０Ｗ、Ｌ６１０Ｄ、Ｌ６１０Ｑ、Ｌ６１０Ｓ、Ｌ６１０ＦまたはＬ６１０Ｎである。

【0069】

ｐｉｇｇｙＢａｔトランスポゾンは、免疫細胞のゲノムを修飾するのに有利なｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンであり、配列が配列番号２０によって与えられたＩＴＲと、転位予定の異種ポリヌクレオチドと、配列が配列番号２１によって与えられた第２のＩＴＲとを含む。トランスポゾンはさらに、ＩＴＲのすぐ近くであって、異種ポリヌクレオチドの遠位にある、テトラヌクレオチド５’－ＴＴＡＡ－３’のコピーに両側から隣接していてもよい。トランスポゾンはさらに、ＩＴＲのすぐ近くであって、異種ポリヌクレオチドの片側、好ましくは左側において配列番号２２と少なくとも９５％同一である異種ポリヌクレオチドに対して近位の配列と、ＩＴＲのすぐ近くであって、異種ポリヌクレオチドのもう片方の側、好ましくは右側において配列番号２３と少なくとも９５％同一である異種ポリヌクレオチドに対して近位の配列とを含むことができる。このトランスポゾンは、配列番号２９と少なくとも９０％同一の配列を含むトランスポザーゼによって転位することができる。好ましくは、トランスポザーゼは、天然に存在するトランスポザーゼの機能亢進型変異体である。好ましくは、機能亢進型変異体トランスポザーゼは、配列番号２９の配列と比較して、以下のアミノ酸変化のうちの１つを含む。すなわち、：Ａ１４Ｖ、Ｄ４７５Ｇ、Ｐ４９１Ｑ、Ａ５６１Ｔ、Ｔ５４６Ｔ、Ｔ３００Ａ、Ｔ２９４Ａ、Ａ５２０Ｔ、Ｇ２３９Ｓ、Ｓ５Ｐ、Ｓ８Ｆ、Ｓ５４Ｎ、Ｄ９Ｎ、Ｄ９Ｇ、１３４５Ｖ、Ｍ４８１Ｖ、ＥＩ ｌＧ、Ｋ１３０Ｔ、Ｇ９Ｇ、Ｒ４２７Ｈ、Ｓ８Ｐ、Ｓ３６Ｇ、ＤｌＯＧ、Ｓ３６Ｇである。

【0070】

免疫細胞のゲノムを修飾するのに有利なｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、配列が配列番号１６によって与えられたＩＴＲと、転位予定の異種ポリヌクレオチドと、配列が配列番号１７によって与えられた第２のＩＴＲとを含む。トランスポゾンはさらに、ＩＴＲのすぐ近くであって、異種ポリヌクレオチドの遠位にある、テトラヌクレオチド５’－ＴＴＡＡ－３’のコピーに両側から隣接していてもよい。トランスポゾンはさらに、ＩＴＲのすぐ近くであって、異種ポリヌクレオチドの片側、好ましくは左側において配列番号１８と少なくとも９５％同一である異種ポリヌクレオチドに対して近位の配列と、ＩＴＲのすぐ近くであって、異種ポリヌクレオチドのもう片方の側、好ましくは右側において配列番号１９と少なくとも９５％同一である異種ポリヌクレオチドに対して近位の配列とを含むことができる。このトランスポゾンは、配列番号３０と少なくとも９０％同一の配列を含むトランスポザーゼによって転位することができる。好ましくは、トランスポザーゼは、天然に存在するトランスポザーゼの機能亢進型変異体である。好ましくは、機能亢進型変異体トランスポザーゼは、配列番号３０の配列と比較して、以下のアミノ酸変化のうちの１つを含む。すなわち、Ｇ２Ｃ、Ｑ４０Ｒ、Ｉ３０Ｖ、Ｇ１６５Ｓ、Ｔ４３Ａ、Ｓ６１Ｒ、Ｓ１０３Ｐ、Ｓ１０３Ｔ、Ｍ１９４Ｖ、Ｒ２８１Ｇ、Ｍ２８２Ｖ、Ｇ３１６Ｅ、Ｉ４２６Ｖ、Ｑ４９７Ｌ、Ｎ５０５Ｄ、Ｑ５７３Ｌ、Ｓ５０９Ｇ、Ｎ５７０Ｓ、Ｎ５３８Ｋ、Ｑ５９１Ｐ、Ｑ５９１Ｒ、Ｆ５９４Ｌ、Ｍ１９４Ｖ、Ｉ３０Ｖ、Ｓ１０３Ｐ、Ｇ１６５Ｓ、Ｍ２８２Ｖ、Ｓ５０９Ｇ、Ｎ５３８Ｋ、Ｎ５７１Ｓ、Ｃ４１Ｔ、Ａ１４２４Ｇ、Ｃ１４７２Ａ、Ｇ１６８１Ａ、Ｔ１５０Ｃ、Ａ３５１Ｇ、Ａ２７９Ｇ、Ｔ１６３８Ｃ、Ａ８９８Ｇ、Ａ８８０Ｇ、Ｇ１５５８Ａ、Ａ６８７Ｇ、Ｇ７１５Ａ、Ｔ１３Ｃ、Ｃ２３Ｔ、Ｇ１６１Ａ、Ｇ２５Ａ、Ｔ１０５０Ｃ、Ａ１３５６Ｇ、Ａ２６Ｇ、Ａ１０３３Ｇ、Ａ１４４１Ｇ、Ａ３２Ｇ、Ａ３８９Ｃ、Ａ３２Ｇ、Ａ３８９Ｃ、Ａ３２Ｇ、Ｔ１５７２Ａ、Ｇ４５６Ａ、Ｔ１６４１Ｃ、Ｔｌ １５５Ｃ、Ｇ１２８０Ａ、Ｔ２２Ｃ、Ａ１０６Ｇ、Ａ２９Ｇ、Ｃ１３７Ｔ、Ａ１４Ｖ、Ｄ４７５Ｇ、Ｐ４９１Ｑ、Ａ５６１Ｔ、Ｔ５４６Ｔ、Ｔ３００Ａ、Ｔ２９４Ａ、Ａ５２０Ｔ、Ｇ２３９Ｓ、Ｓ５Ｐ、Ｓ８Ｆ、Ｓ５４Ｎ、Ｄ９Ｎ、Ｄ９Ｇ、１３４５Ｖ、Ｍ４８１Ｖ、Ｅ１ＬＧ、Ｋ１３０Ｔ、Ｇ９Ｇ、Ｒ４２７Ｈ、Ｓ８Ｐ、Ｓ３６Ｇ、ＤＬ０Ｇ、Ｓ３６Ｇ、Ａ５１Ｔ、Ｃ１５３Ａ、Ｃ２７７Ｔ、Ｇ２０１Ａ、Ｇ２０２Ａ、Ｔ２３６Ａ、Ａ１０３Ｔ、Ａ１０４Ｃ、Ｔ１４０Ｃ、Ｇ１３８Ｔ、Ｔ１１８Ａ、Ｃ７４Ｔ、Ａ１７９Ｃ、Ｓ３Ｎ、Ｉ３０Ｖ、Ａ４６Ｓ、Ａ４６Ｔ、Ｉ８２Ｗ、Ｓ１０３Ｐ、Ｒ１１９Ｐ、Ｃ１２５Ａ、Ｃ１２５Ｌ、Ｇ１６５Ｓ、Ｙ１７７Ｋ、Ｙ１７７Ｈ、Ｆ１８０Ｌ、Ｆ１８０Ｉ、Ｆ１８０Ｖ、Ｍ１８５Ｌ、Ａ１８７Ｇ、Ｆ２００Ｗ、Ｖ２０７Ｐ、Ｖ２０９Ｆ、Ｍ２２６Ｆ、Ｌ２３５Ｒ、Ｖ２４０Ｋ、Ｆ２４１Ｌ、Ｐ２４３Ｋ、Ｎ２５８Ｓ、Ｍ２８２Ｑ、Ｌ２９６Ｗ、Ｌ２９６Ｙ、Ｌ２９６Ｆ、Ｍ２９８Ｖ、Ｍ２９８Ａ、Ｍ２９８Ｌ、Ｐ３１１Ｖ、Ｐ３１１Ｉ、Ｒ３１５Ｋ、Ｔ３１９Ｇ、Ｙ３２７Ｒ、Ｙ３２８Ｖ、Ｃ３４０Ｇ、Ｃ３４０Ｌ、Ｄ４２１Ｈ、Ｖ４３６Ｉ、Ｍ４５６Ｙ、Ｌ４７０Ｆ、Ｓ４８６Ｋ、Ｍ５０３Ｉ、Ｍ５０３Ｌ、Ｖ５５２Ｋ、Ａ５７０Ｔ、Ｑ５９１Ｐ、Ｑ５９１Ｒ、Ｒ６５Ａ、Ｒ６５Ｅ、Ｒ９５Ａ、Ｒ９５Ｅ、Ｒ９７Ａ、Ｒ９７Ｅ、Ｒ１３５Ａ、Ｒ１３５Ｅ、Ｒ１６１Ａ、Ｒ１６１Ｅ、Ｒ１９２Ａ、Ｒ１９２Ｅ、Ｒ２０８Ａ、Ｒ２０８Ｅ、Ｋ１７６Ａ、Ｋ１７６Ｅ、Ｋ１９５Ａ、Ｋ１９５Ｅ、Ｓ１７１Ｅ、Ｍ１４Ｖ、Ｄ２７０Ｎ、Ｉ３０Ｖ、Ｇ１６５Ｓ、Ｍ２８２Ｌ、Ｍ２８２Ｉ、Ｍ２８２ＶまたはＭ２８２Ａである。

【0071】

免疫細胞のゲノムを修飾するのに有利なＭａｒｉｎｅｒ型トランスポゾンは、配列番号２６の配列を有するＩＴＲと、異種ポリヌクレオチドと、配列番号２７の配列を有する第２のＩＴＲとを含むＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンである。ＩＴＲは、より長いトランスポゾン末端配列の一部であってよく、例えば、トランスポゾンは、配列番号２４と少なくとも９５％同一の配列を有する左端と、配列番号２５と少なくとも９５％同一の配列を有する右端とを含んでよい。このトランスポゾンは、その機能亢進型変異体を含む、配列番号２８と少なくとも９０％同一の配列を含むトランスポザーゼによって転位することができる。

【0072】

免疫細胞のゲノムを修飾するのに有利なｈＡＴ型トランスポゾンは、配列番号３９９の配列を有するＩＴＲと、異種ポリヌクレオチドと、配列番号４００の配列を有する第２のＩＴＲとを含むＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾンである。ＩＴＲは、より長いトランスポゾン末端配列の一部であってよく、例えば、トランスポゾンは、配列番号３９７と少なくとも９５％同一の配列を有する左端と、配列番号３９８と少なくとも９５％同一の配列を有する右端とを含んでよい。このトランスポゾンは、その機能亢進型変異体を含む、配列番号４０１と少なくとも９０％同一の配列を含むトランスポザーゼによって転位することができる。

【0073】

トランスポザーゼタンパク質は、タンパク質として、またはトランスポザーゼをコードする核酸として、例えば細胞の翻訳機構によって認識されるｍＲＮＡもしくは何らかのポリヌクレオチドをはじめとするリボ核酸として、ＤＮＡとして、例えばエピソームＤＮＡをはじめとする染色体外ＤＮＡとして、プラスミドＤＮＡとして、またはウイルス核酸として、細胞内へと導入することができる。さらに、トランスポザーゼタンパク質をコードする核酸は、プラスミドなどの核酸ベクターとして、またはウイルスベクターをはじめとする遺伝子発現ベクターとして、細胞内へと移入することができる。核酸は、環状または線状であってよい。トランスポザーゼタンパク質をコードするＤＮＡは、構成性発現または誘導性発現のために細胞のゲノム内へとまたはベクター内へと安定して挿入することができる。トランスポザーゼタンパク質が細胞内へと移入されるかまたはＤＮＡとしてベクター内へと挿入される場合、トランスポザーゼコード配列は、好ましくは異種プロモーターに作動可能に連結されている。構成性プロモーター、組織特異的プロモーター、誘導性プロモーターなどをはじめとする、使用することができる様々なプロモーターがある。ｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼタンパク質をコードするＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列はすべて、明示的に企図されている。あるいは、トランスポザーゼは、例えば細胞透過性ペプチドを用いて（例えば、Ｒａｍｓｅｙ ａｎｄ Ｆｌｙｎｎ（２０１５）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．１５４：７８－８６「Ｃｅｌｌ－ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｉｎｔｏ ｃｅｌｌｓ」において説明されているように）、塩＋プロパンベタインをはじめとする小分子（例えば、Ａｓｔｏｌｆｏ ｅｔ ａｌ（２０１５）Ｃｅｌｌ １６１：６７４－６９０において説明されているように）、または電気穿孔法（Ｍｏｒｇａｎ ａｎｄ Ｄａｙ（１９９５）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４８：６３－７１「Ｔｈｅ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎｔｏ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ」）を用いて、タンパク質として細胞内へと直接導入することができる。

【0074】

５．２．２ 遺伝子移入系
遺伝子移入系は、宿主細胞に導入予定のポリヌクレオチドを含む。遺伝子移入系は、本明細書に説明するトランスポゾンもしくはトランスポザーゼのいずれかを含むことができるか、またはトランスポザーゼもしくはトランスポゾンを必要とせずに効率的な遺伝子移入を容易にする他の特徴を有する１つ以上のポリヌクレオチドを含むことができる。

【0075】

遺伝子移入系の複数の構成要素、例えば、標的細胞における発現のための遺伝子を含む、および場合によりトランスポゾン末端とトランスポザーゼ（タンパク質としてまたは核酸によってコードされるかのいずれかで提供することができる）とを含む、１つ以上のポリヌクレオチドがあるとき、これらの構成要素は、同じ時点でまたは異なる時点で細胞内へと移入することができる。例えば、トランスポザーゼタンパク質またはそのコード核酸は、対応するトランスポゾンの移入の前に、移入と同時に、または移入に続いて、細胞内へと移入することができる。加えて、遺伝子移入系のいずれかの構成要素の投与は、例えば、この構成要素の少なくとも２用量を投与することによって、繰り返し行うことができる。

【0076】

トランスポザーゼタンパク質は、ＲＮＡまたはＤＮＡを含むポリヌクレオチドによってコードすることができる。トランスポザーゼがＤＮＡ内でコードされた遺伝子として提供される場合、トランスポザーゼは、好ましくは、標的細胞において活性のあるプロモーターに作動可能に連結されているものとする。好ましいＲＮＡ分子としては、細胞に対する毒性効果を低減するための適切な置換を有するもの、例えばウリジンのプソイドウリジンへの置換、およびシトシンの５－メチルシトシンへの置換を有するものがある。同様に、本発明のトランスポゾンまたはトランスポザーゼをコードする核酸は、プラスミドとしてまたは組換えウイルスＤＮＡとしてのいずれかで、線状断片としてまたは環状断片として、細胞内へと移入することができる。

【0077】

遺伝子移入系の構成要素は、粒子衝突、電気穿孔法、微量注射、構成要素を脂質ナノ粒子またはカチオン性脂質小胞などの脂質含有小胞と組み合わせること、ＤＮＡ濃縮試薬（例えば、リン酸カルシウム、ポリリジンまたはポリエチレンイミン）、またはその構成要素（すなわち、核酸）をウイルスベクター内へと挿入すること、およびウイルスベクターを細胞と接触させることなどの技術によって、１つ以上の細胞内へと移入することができる。ウイルスベクターを使用する場合、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルスベクターからなる群から選択されるウイルスベクターをはじめとする、当技術分野で公知の様々なウイルスベクターのうちのいずれかを含むことができる。遺伝子移入系は、当技術分野で公知の適切な様式で、または医薬組成物もしくはキットとして配分することができる。

【0078】

５．２．３ プロモーター要素
免疫細胞においてポリペプチドを発現するための遺伝子移入系は、宿主細胞に移入予定のポリヌクレオチドを含む。ポリヌクレオチドは、免疫細胞において活性のあるプロモーターを含む。例としては、哺乳動物グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）遺伝子（例えば、配列番号９７～１０７によって与えられる配列）、哺乳動物ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）遺伝子（例えば、配列番号１１５～１１８によって与えられる配列）、哺乳動物伸長因子１ａ（ＥＦ１ａ）遺伝子（例えば、配列番号９４、９６および１２８～１４６によって与えられる配列）、哺乳動物伸長因子２（ＥＥＦ２）遺伝子（例えば、配列番号１１０８、１０９、１１４および１４７～１５４によって与えられる配列）およびユビキチン遺伝子（例えば、配列番号９５または１２５～１２７によって与えられる配列）をはじめとする構成的に発現する遺伝子由来のプロモーターがある。これらの遺伝子は、それらの天然のイントロン配列をはじめとするイントロン配列とともに、またはそれなしで、使用することができる。例示的なイントロン配列は、配列番号１５５～１５９として与えられている。

【0079】

５．２．４ ポリアデニル化要素
遺伝子移入系は、発現のための遺伝子を真核細胞内へと導入するのに有用である。動物細胞および高等植物細胞をはじめとする多くの真核細胞は、遺伝子発現の間に転写されたｍＲＮＡをプロセシングする。タンパク質をコードする遺伝子は、しばしばポリアデニル化され、細胞内のｍＲＮＡを安定化する。ポリアデニル化シグナルはまた、転写を終結させるのにも役立つことができる。このことは、２つのプロモーター間の干渉を低減させるのに役立つので、２つ以上のオープンリーディングフレームがポリヌクレオチドから発現予定であるときに特に有用である可能性がある。１つのプロモーターからの転写を終結させ、それによって第１のプロモーターの３’に位置する第２のプロモーターとの干渉を低減させるのに有効であるポリアデニル化配列は、合成で設計することができる。配列番号１６０～配列番号２１７の配列はすべて、転写された配列のポリアデニル化を開始するために、および転写を終結させる上で有用である。配列番号１６０～配列番号２１７のポリアデニル化配列は、脊椎動物または無脊椎動物の細胞をはじめとする動物細胞における遺伝子の発現のための遺伝子移入系のポリヌクレオチドに含まれることができる。配列番号１６０～配列番号２１７のポリアデニル化配列は、ラット、マウス、およびハムスターなどの齧歯類、ウシ、ヤギまたはヒツジなどの有蹄動物、ブタをはじめとする哺乳動物に由来の細胞、ヒト組織およびヒト幹細胞に由来の細胞をはじめとする脊椎動物細胞において遺伝子を発現させるのに有用である。配列番号１６０～配列番号２１７のポリアデニル化配列は、免疫細胞、リンパ球、肝細胞、神経細胞、筋肉細胞、血液細胞、胚性幹細胞、体性幹細胞、造血細胞、胚、接合体および精子細胞（これらのいくつかは、インビトロ設定において操作されるために開放されている）をはじめとする種々の細胞型において有用である。配列番号１６０～配列番号２１７のポリアデニル化配列は、多能性細胞（その子孫が造血幹細胞または他の幹細胞などのいくつかの制限された細胞型へと分化することができる細胞）または全能性細胞（すなわち、その子孫が生物においていかなる細胞型にもなることができる細胞、例えば、胚性幹細胞）において遺伝子を発現させるのに有用である。配列番号１６０～配列番号２１７のポリアデニル化配列は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはヒト胎児由来腎（ＨＥＫ２９３）細胞などの培養細胞において遺伝子を発現させるのに有用である。

【0080】

配列番号１６０～配列番号２１７のポリアデニル化配列は、ｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾン、もしくはＳｌｅｅｐｉｎｇ ＢｅａｕｔｙトランスポゾンなどのＭａｒｉｎｅｒ型トランスポゾン、またはＴｃＢｕｓｔｅｒなどのｈＡＴ型トランスポゾン内へと、または非トランスポゾンに基づく遺伝子送達ポリヌクレオチドに組み込むことができる。配列番号１６０～配列番号２１７のポリアデニル化配列は、好ましくは、発現予定のオープンリーディングフレームの３’末端までポリヌクレオチド内へと組み込まれる。配列番号１６０～配列番号２１７のポリアデニル化配列は、発現予定の２つの遺伝子の間に配置されると、第１のプロモーターからの転写を終結させプロモーター干渉を低減させるのに有用である。有利な遺伝子移入系は、配列番号１６０～配列番号２１７のいずれかと少なくとも８０％または９０％または９５％または９６％または９７％または９８％または９９％または１００％同一の配列を含む。

【0081】

５．２．５ インスレーター要素
異種ポリヌクレオチドが免疫細胞のゲノム内へと組み込まれるとき、異種ポリヌクレオチド内の遺伝要素が内在性免疫細胞遺伝子の発現に影響を及ぼすのを防止することがしばしば望ましい。同様に、異種ポリヌクレオチド内の遺伝子が免疫細胞ゲノム内の要素によって影響を及ぼされること、例えばヘテロクロマチン内への組み込みによってサイレンシングされること、を防止することはしばしば望ましい。インスレーター要素は、エンハンサー遮断活性（異種ポリヌクレオチド内の遺伝子が内在性免疫細胞遺伝子の発現に影響を及ぼすのを防止するのに役立つ）およびバリア活性（異種ポリヌクレオチド内の遺伝子がヘテロクロマチンへの組み込みによってサイレンシングされるのを防止するのに役立つ）を有することが公知である。エンハンサー遮断活性は、転写抑制体ＣＴＣＦタンパク質の結合からもたらすことができる。バリア活性は、ＵＳＦ１およびＶＥＺＦ１などの脊椎動物バリアタンパク質の結合からもたらすことができる。有用なインスレーター配列は、ＣＴＣＦ、ＵＳＦ１またはＶＥＺＦ１に対する結合部位を含む。有利な遺伝子移入系は、ＣＴＣＦ、ＵＳＦ１またはＶＥＺＦ１に対する結合部位を含むインスレーター配列を含むポリヌクレオチドを含む。より好ましくは、遺伝子移入系は、各々がＣＴＣＦ、ＵＳＦ１またはＶＥＺＦ１に対する結合部位を含む２つのインスレーター配列を含むポリヌクレオチドを含み、該２つのインスレーター配列は、異種ポリヌクレオチド内の何らかのプロモーターまたはエンハンサーに隣接する。インスレーター配列の有利な例は、配列番号８７～配列番号９３として与えられている。

【0082】

プロモーターまたはエンハンサーを含む異種ポリヌクレオチドがインスレーター配列なしで免疫細胞のゲノム内へと組み込まれる場合、異種ポリヌクレオチド内のプロモーター要素もしくはエンハンサー要素のいずれかが内在性免疫細胞遺伝子（例えば、癌遺伝子）の発現に影響を及ぼすというリスク、または異種ポリヌクレオチド内のプロモーター要素もしくはエンハンサー要素がヘテロクロマチン内への組み込みによってサイレンシングされるというリスクがある。異種ポリヌクレオチドが無作為な断片化の後に標的ゲノム内へと組み込まれるとき、いくつかの遺伝要素がしばしば失われ、他の遺伝要素が再構成されることがある。したがって、異種ポリヌクレオチドがエンハンサー要素およびプロモーター要素に隣接するインスレーター要素を含む場合、インスレーター要素が再構成されるまたは喪失されることがあり、エンハンサー要素およびプロモーター要素は、それらが組み込まれるゲノム環境に影響を及ぼし、影響を及ぼされる可能性があることがあるという重大なリスクがある。それゆえ、２つのトランスポゾンＩＴＲ間の配列全体が再構成なしに免疫細胞ゲノム内へと組み込まれるトランスポゾン遺伝子移入系を使用することが有利である。したがって、免疫細胞ゲノム内へと組み込むための有利な遺伝子移入系は、要素が以下の順序で配置されたトランスポゾンを含む。すなわち、左トランスポゾン末端、第１のインスレーター配列、免疫細胞内での発現のための配列、第２のインスレーター配列、右トランスポゾン末端、である。免疫細胞内での発現のための配列には、何らかの数のオープンリーディングフレームに作動可能に連結された何らかの数の調節配列を含めることができる。トランスポゾン末端は、好ましくは、ｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンまたはＳｌｅｅｐｉｎｇ ＢｅａｕｔｙトランスポゾンなどのＭａｒｉｎｅｒ型トランスポゾン、またはＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾンなどのｈＡＴ型トランスポゾンのものである。

【0083】

５．３ 免疫細胞の生存を増強するのに有用な遺伝要素
免疫細胞が身体に対する脅威に適切に応答するためには、免疫細胞は、それらの標的を攻撃するのに十分長く生存することができなければならない。免疫細胞のエクスビボ操作を必要とする療法および研究には、免疫細胞が増殖することが有利である。しかしながら、エクスビボ培養条件も、ある特定のインビボ環境（例えば、固形腫瘍内の環境）も、免疫細胞の成長にとって最適ではない。例えば、かなり前処置されたリンパ腫患者に由来のＴ細胞は、抗ＣＤ１９キメラ抗原受容体で操作されたとき、未処置患者に由来のＴ細胞よりも低いエクスビボ拡大速度および臨床応答を示す。それゆえ、特に免疫細胞に対して自然に敵対的である条件下では、ヒト免疫細胞の機能、持続性および増殖を増強する方法が必要とされている。

【0084】

５．３．１ Ｔ細胞形質転換要素
ヒト免疫細胞の持続性および増殖を増強するための１つのアプローチは、成長および／または生存を高めるための遺伝要素を免疫細胞のゲノム内へと組み込むことである。免疫細胞の生存を増強するための候補遺伝要素には、免疫細胞癌において突然変異することがわかっている遺伝子がある。しかしながら、細胞から癌細胞への形質転換は、典型的には、一連の突然変異を必要とすると考えられており、各突然変異の役割は、細胞の生存または成長に直接関連していないことがある。例えば、多くの突然変異は、追加の突然変異が起こる可能性を単に高めることが公知である。したがって、ある特定の遺伝子における突然変異が免疫細胞癌においてしばしば生じる相関が存在する可能性があるとしても、一般に、その同じ突然変異した遺伝子を免疫細胞内へと導入することがその細胞の成長または生存を増強するということにはならない。それゆえ、天然に存在する突然変異を含む遺伝子を含む異種ポリヌクレオチドの、免疫細胞のゲノム内への組み込みがその細胞の生存および増殖を高めるかどうかを判定するために試験を行うことができる。

【0085】

本発明者らは、免疫細胞に成長または生存利益を付与するために、異種ポリヌクレオチド上に提供され、免疫細胞のゲノム内へと組み込まれることができる遺伝子を同定しようと探索した。これを行うために、本発明者らは、免疫細胞におけるタンパク質の発現に有効な異種プロモーターに作動可能に連結された活性化突然変異をはじめとする天然に存在する突然変異体ヒトタンパク質をコードする配列を有する遺伝子を含むポリヌクレオチドを合成し、これらの異種ポリヌクレオチドをＴ細胞のゲノム内へと組み込んだ。次に、本発明者らは、第６．２節において説明するように、エクスビボ培養におけるこれらのＴ細胞の成長および生存を測定した。

【0086】

５．３．１．１ ＳＴＡＴ３
ＳＴＡＴ３（転写のシグナル伝達因子および活性化因子３）をコードする遺伝子は、大顆粒リンパ球性白血病において突然変異していることがしばしば認められる。これらの活性化突然変異は、ＳＴＡＴ３のＳＨ２ドメインに頻繁に存在し、Ｓ６１４Ｒ、Ｅ６１６Ｋ、Ｇ６１８Ｒ、Ｙ６４０Ｆ、Ｎ６４７Ｉ、Ｅ６５２Ｋ、Ｋ６５８Ｙ、Ｋ６５８Ｒ、Ｋ６５８Ｎ、Ｋ６５８Ｍ、Ｋ６５８Ｒ、Ｋ６５８Ｈ、Ｋ６５８Ｎ、Ｄ６６１ＹおよびＤ６６１Ｖを含む。ＳＴＡＴ３における活性化突然変異はまた、ＳＨ２ドメインの外側でも認められており、例えば、Ｆ１７４ＳおよびＨ４１０Ｒである。第６．２．１．１節および第６．２．１．５節において説明するように、本発明者らは、ＳＴＡＴ３タンパク質の活性化突然変異体をコードする異種ポリヌクレオチドが、免疫細胞の生存または免疫細胞の増殖を増強するために免疫細胞内へと導入されることができることを実証しており、ＳＴＡＴ３の活性化突然変異体をコードする遺伝子は、第６．２節において説明するような免疫細胞生存増強遺伝子および免疫細胞増殖増強遺伝子である。その配列がＦ１７４Ｓ、Ｈ４１０Ｒ、Ｓ６１４Ｒ、Ｅ６１６Ｋ、Ｇ６１８Ｒ、Ｙ６４０Ｆ、Ｎ６４７Ｉ、Ｅ６５２Ｋ、Ｋ６５８Ｙ、Ｋ６５８Ｒ、Ｋ６５８Ｎ、Ｋ６５８Ｍ、Ｋ６５８Ｒ、Ｋ６５８Ｈ、Ｋ６５８Ｎ、Ｄ６６１ＹおよびＤ６６１Ｖから選択される１つ以上の突然変異を含む、ＳＴＡＴ３の修飾版を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチド、例えば、配列番号２３２）は、本発明の一実施形態である。突然変異した例示的なＳＴＡＴ３タンパク質としては、配列番号２４６～配列番号２５０がある。好ましい実施形態は、活性化突然変異を含むＳＴＡＴ３タンパク質をコードする核酸を含むポリヌクレオチドを含み、該核酸は異種プロモーターに作動可能に連結されている。ＳＴＡＴ３の活性化突然変異体をコードする核酸に作動可能に連結されることができる例示的な異種プロモーターとしては、ＥＦ１プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰＤＨプロモーター、ＥＥＦ２プロモーター、ユビキチンプロモーター、ＳＶ４０プロモーターまたはＨＳＶＴＫプロモーター、例えば配列番号９４～配列番号１５４から選択される配列がある。好ましい実施形態は、ＳＴＡＴ３の活性化突然変異体をコードする核酸を含むポリヌクレオチドを含み、該核酸は、異種ポリアデニル化シグナル、例えば哺乳動物細胞を感染させるウイルスに由来のポリアデニル化シグナル、哺乳動物ＥＦ１ポリアデニル化シグナル、哺乳動物成長ホルモンポリアデニル化シグナルまたは哺乳動物グロビンポリアデニル化シグナル、例えば配列番号１６０～配列番号２１７から選択される配列に作動可能に連結されている。好ましい実施形態は、ＳＴＡＴ３の活性化突然変異体をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドであって、配列番号６および配列番号７を有する配列、または配列番号１４および配列番号１５を有する配列、または配列番号１８および配列番号１９を有する配列、または配列番号２０および配列番号２１を有する配列をさらに含む、ｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンの一部である、ポリヌクレオチドを含む。好ましい実施形態は、ＳＴＡＴ３の活性化突然変異体をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドであって、配列番号２４と９０％同一である配列と、配列番号２５と９０％同一である配列とをさらに含む、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ ＢｅａｕｔｙトランスポゾンなどのＭａｒｉｎｅｒ型トランスポゾンの一部である、ポリヌクレオチドを含む。好ましい実施形態は、ＳＴＡＴ３の活性化突然変異体をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドであって、配列番号３９７と９０％同一である配列と、配列番号３９８と９０％同一である配列とをさらに含む、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾンなどのｈＡＴ型トランスポゾンの一部である、ポリヌクレオチドを含む。ＳＴＡＴ３の活性化突然変異体をコードするポリヌクレオチドを含むトランスポゾンは、対応するトランスポザーゼまたは対応するトランスポザーゼをコードするポリヌクレオチドと共に免疫細胞内へと導入することができる。好ましい実施形態は、ＳＴＡＴ３の活性化突然変異体をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドであって、レンチウイルスベクターの一部であるポリヌクレオチドを含む。突然変異したＳＴＡＴ３タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクターは、パッケージングされ、免疫細胞を感染させるために使用することができる。免疫細胞は、好ましくはＴ細胞である。

【0087】

本発明の一態様は、そのゲノムが、活性化突然変異を有するＳＴＡＴ３タンパク質をコードする遺伝子を含む異種ポリヌクレオチドを含む、免疫細胞である。いくつかの実施形態では、異種ポリヌクレオチドは、レンチウイルスベクター、またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾン、またはＳｌｅｅｐｉｎｇ ＢｅａｕｔｙトランスポゾンなどのＭａｒｉｎｅｒ型トランスポゾン、またはＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾンなどのｈＡＴ型トランスポゾンを含む。いくつかの実施形態では、免疫細胞ゲノムは、３コピーのＳＴＡＴ３遺伝子と、２つの内在性コピーと、１つの異種突然変異体コピーとを含む。

【0088】

５．３．１．２ ＣＤ２８
ＣＤ２８（分化クラスター２８）遺伝子はしばしば、末梢Ｔ細胞リンパ腫において突然変異していることが認められる。最も一般的な活性化突然変異は、Ｄ１２４Ｅ、Ｄ１２４Ｖ、Ｔ１９５ＩおよびＴ１９５Ｐである。第６．２．１．２節および第６．２．１．３節において説明するように、本発明者らは、ＣＤ２８タンパク質の活性化突然変異体をコードする異種ポリヌクレオチドが、免疫細胞の生存または免疫細胞の増殖を増強するために、および再刺激誘導性細胞死を低減させるために免疫細胞内へと導入されることができることを実証しており、ＣＤ２８の活性化突然変異体をコードする遺伝子は、第６．２節において説明するような免疫細胞生存増強遺伝子および免疫細胞増殖増強遺伝子である。その配列がＤ１２４Ｅ、Ｄ１２４Ｖ、Ｔ１９５ＩおよびＴ１９５Ｐから選択される１つ以上の突然変異を含む、ＣＤ２８の修飾版を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチド（例えば、配列番号２３３）は、本発明の一実施形態である。突然変異した例示的なＣＤ２８タンパク質は、配列番号２５１として与えられている。突然変異したＣＤ２８は、配列番号２３３の最初の１８アミノ酸における分泌シグナルを別の機能活性のある分泌シグナルで置き換えることをさらに含むことができる。好ましい実施形態は、ＣＤ２８の活性化突然変異体をコードする核酸を含むポリヌクレオチドを含み、該核酸は異種プロモーターに作動可能に連結されている。突然変異したＣＤ２８をコードする核酸に作動可能に連結されることができる例示的な異種プロモーターとしては、ＥＦ１プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰＤＨプロモーター、ＥＥＦ２プロモーター、ユビキチンプロモーター、ＳＶ４０プロモーターまたはＨＳＶＴＫプロモーター、例えば配列番号９４～配列番号１５４から選択される配列がある。好ましい実施形態は、ＣＤ２８の活性化突然変異体をコードする核酸を含むポリヌクレオチドを含み、該核酸は、異種ポリアデニル化シグナル、例えば哺乳動物細胞を感染させるウイルスに由来のポリアデニル化シグナル、哺乳動物ＥＦ１ポリアデニル化シグナル、哺乳動物成長ホルモンポリアデニル化シグナルまたは哺乳動物グロビンポリアデニル化シグナル、例えば配列番号１６０～配列番号２１７から選択される配列に作動可能に連結されている。好ましい実施形態は、ＣＤ２８の活性化突然変異体をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドであって、配列番号６および配列番号７を有する配列、または配列番号１４および配列番号１５を有する配列、または配列番号１８および配列番号１９を有する配列、または配列番号２０および配列番号２１を有する配列をさらに含む、ｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンの一部である、ポリヌクレオチドを含む。好ましい実施形態は、ＣＤ２８の活性化突然変異体をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドであって、配列番号２４と９０％同一である配列と、配列番号２５と９０％同一である配列とをさらに含む、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ ＢｅａｕｔｙトランスポゾンなどのＭａｒｉｎｅｒ型トランスポゾンの一部である、ポリヌクレオチドを含む。好ましい実施形態は、ＣＤ２８の活性化突然変異体をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドであって、配列番号３９７と９０％同一である配列と、配列番号３９８と９０％同一である配列とをさらに含む、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾンなどのｈＡＴ型トランスポゾンの一部である、ポリヌクレオチドを含む。ＣＤ２８の活性化突然変異体をコードするポリヌクレオチドを含むトランスポゾンは、対応するトランスポザーゼまたは対応するトランスポザーゼをコードするポリヌクレオチドと共に免疫細胞内へと導入されることができる。好ましい実施形態は、ＣＤ２８の活性化突然変異体をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドであって、レンチウイルスベクターの一部であるポリヌクレオチドを含む。ＣＤ２８の活性化突然変異体をコードするポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクターは、パッケージングされ、免疫細胞を感染させるために使用することができる。免疫細胞は、好ましくはＴ細胞である。

【0089】

本発明の一態様は、そのゲノムが、活性化突然変異を有するＣＤ２８タンパク質をコードする遺伝子を含む異種ポリヌクレオチドを含む、免疫細胞である。いくつかの実施形態では、異種ポリヌクレオチドは、レンチウイルスベクター、またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾン、またはＳｌｅｅｐｉｎｇ ＢｅａｕｔｙトランスポゾンなどのＭａｒｉｎｅｒ型トランスポゾン、またはＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾンなどのｈＡＴ型トランスポゾンを含む。いくつかの実施形態では、免疫細胞ゲノムは、３コピーのＣＤ２８遺伝子と、２つの内在性コピーと、１つの異種突然変異体コピーとを含む。

【0090】

５．３．１．３ ＲｈｏＡ
ＲｈｏＡ小型ＧＴＰアーゼは、末梢Ｔ細胞リンパ腫において頻繁に突然変異している。リンパ腫と関係する最も一般的な突然変異は、Ｇ１７ＶおよびＫ１８Ｎである。ＲｈｏＡタンパク質の活性化突然変異体は、免疫細胞の生存または免疫細胞の増殖を増強するために免疫細胞内へと導入されることができ、ＲｈｏＡの活性化突然変異体をコードする遺伝子は、第６．２節において説明するような免疫細胞生存増強遺伝子および免疫細胞増殖増強遺伝子である。その配列がＧ１７ＶおよびＫ１８Ｎまたはこれらの組み合わせから選択される突然変異を含む、ＲｈｏＡの修飾版を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチド、例えば、配列番号２３４は、本発明の一実施形態である。突然変異した例示的なＲｈｏＡタンパク質は、配列番号２５２および配列番号２５３として与えられている。好ましい実施形態は、突然変異したＲｈｏＡタンパク質をコードする核酸を含むポリヌクレオチドを含み、該核酸は異種プロモーターに作動可能に連結されている。突然変異したＲｈｏＡをコードする遺伝子に作動可能に連結されることができる例示的な異種プロモーターとしては、ＥＦ１プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰＤＨプロモーター、ＥＥＦ２プロモーター、ユビキチンプロモーター、ＳＶ４０プロモーターまたはＨＳＶＴＫプロモーター、例えば配列番号９４～配列番号１５４から選択される配列がある。好ましい実施形態は、突然変異したＲｈｏＡタンパク質をコードする核酸を含むポリヌクレオチドを含み、該核酸は、異種ポリアデニル化シグナル、例えば哺乳動物細胞を感染させるウイルスに由来のポリアデニル化シグナル、哺乳動物ＥＦ１ポリアデニル化シグナル、哺乳動物成長ホルモンポリアデニル化シグナルまたは哺乳動物グロビンポリアデニル化シグナル、例えば配列番号１６０～配列番号２１７から選択される配列に作動可能に連結されている。好ましい実施形態は、突然変異したＲｈｏＡタンパク質をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドであって、配列番号６および配列番号７を有する配列、または配列番号１４および配列番号１５を有する配列、または配列番号１８および配列番号１９を有する配列、または配列番号２０および配列番号２１を有する配列をさらに含む、ｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンの一部である、ポリヌクレオチドを含む。好ましい実施形態は、突然変異したＲｈｏＡタンパク質をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドであって、配列番号２４と９０％同一である配列と、配列番号２５と９０％同一である配列とをさらに含む、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ ＢｅａｕｔｙトランスポゾンなどのＭａｒｉｎｅｒ型トランスポゾンの一部である、ポリヌクレオチドを含む。好ましい実施形態は、突然変異したＲｈｏＡタンパク質をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドであって、配列番号３９７と９０％同一である配列と、配列番号３９８と９０％同一である配列とをさらに含む、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾンなどのｈＡＴ型トランスポゾンの一部である、ポリヌクレオチドを含む。突然変異したＲｈｏＡタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むトランスポゾンは、対応するトランスポザーゼをコードするポリヌクレオチドと共に免疫細胞内へと導入することができる。好ましい実施形態は、突然変異したＲｈｏＡタンパク質をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドであって、レンチウイルスベクターの一部であるポリヌクレオチドを含む。突然変異したＲｈｏＡタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクターは、パッケージングされ、免疫細胞を感染させるために使用することができる。免疫細胞は、好ましくはＴ細胞である。

【0091】

本発明の一態様は、そのゲノムが、活性化突然変異を有するＲｈｏＡタンパク質をコードする遺伝子を含む異種ポリヌクレオチドを含む、免疫細胞である。いくつかの実施形態では、異種ポリヌクレオチドは、レンチウイルスベクター、またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾン、またはＳｌｅｅｐｉｎｇ ＢｅａｕｔｙトランスポゾンなどのＭａｒｉｎｅｒ型トランスポゾン、またはＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾンなどのｈＡＴ型トランスポゾンを含む。いくつかの実施形態では、免疫細胞ゲノムは、３コピーのＲｈｏＡ遺伝子と、２つの内在性コピーと、１つの異種突然変異体コピーとを含む。

【0092】

５．３．１．４ ホスホリパーゼＣのγ１
活性化ホスホリパーゼＣγ（ＰＬＣＧ）突然変異は、皮膚Ｔ細胞リンパ腫と関係している。リンパ腫と関係する最も一般的な活性化突然変異は、Ｓ３４５Ｆ、Ｓ５２０ＦおよびＲ７０７Ｑである。第６．２．１．５節において説明するように、本発明者らは、ＰＬＣＧタンパク質の活性化突然変異体をコードする異種ポリヌクレオチドが、免疫細胞の生存または免疫細胞の増殖を増強するために免疫細胞内へと導入されることができることを実証しており、ＰＬＣＧの活性化突然変異体をコードする遺伝子は、第６．２節において説明するような免疫細胞生存増強遺伝子および免疫細胞増殖増強遺伝子である。その配列がＳ３４５Ｆ、Ｓ５２０ＦおよびＲ７０７Ｑから選択される１つ以上の突然変異を含む、ＰＬＣＧの修飾版を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチド、例えば、配列番号２３５は、本発明の一実施形態である。突然変異した例示的なＰＬＣＧタンパク質は、配列番号２５４として与えられている。好ましい実施形態は、ＰＬＣＧの活性化突然変異体をコードする核酸を含むポリヌクレオチドを含み、該核酸は異種プロモーターに作動可能に連結されている。突然変異したＰＬＣＧをコードする遺伝子に作動可能に連結されることができる例示的な異種プロモーターとしては、ＥＦ１プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰＤＨプロモーター、ＥＥＦ２プロモーター、ユビキチンプロモーター、ＳＶ４０プロモーターまたはＨＳＶＴＫプロモーター、例えば配列番号９４～配列番号１５４から選択される配列がある。好ましい実施形態は、ＰＬＣＧの活性化突然変異体をコードする核酸を含むポリヌクレオチドを含み、該核酸は、異種ポリアデニル化シグナル、例えば哺乳動物細胞を感染させるウイルスに由来のポリアデニル化シグナル、哺乳動物ＥＦ１ポリアデニル化シグナル、哺乳動物成長ホルモンポリアデニル化シグナルまたは哺乳動物グロビンポリアデニル化シグナル、例えば配列番号１６０～配列番号２１７から選択される配列に作動可能に連結されている。好ましい実施形態は、ＰＬＣＧの活性化突然変異体をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドであって、配列番号６および配列番号７を有する配列、または配列番号１４および配列番号１５を有する配列、または配列番号１８および配列番号１９を有する配列、または配列番号２０および配列番号２１を有する配列をさらに含む、ｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンの一部である、ポリヌクレオチドを含む。好ましい実施形態は、ＰＬＣＧの活性化突然変異体をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドであって、配列番号２４と９０％同一である配列と、配列番号２５と９０％同一である配列とをさらに含む、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ ＢｅａｕｔｙトランスポゾンなどのＭａｒｉｎｅｒ型トランスポゾンの一部である、ポリヌクレオチドを含む。好ましい実施形態は、突然変異したＰＬＣＧタンパク質をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドであって、配列番号３９７と９０％同一である配列と、配列番号３９８と９０％同一である配列とをさらに含む、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾンなどのｈＡＴ型トランスポゾンの一部である、ポリヌクレオチドを含む。突然変異したＰＬＣＧタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むトランスポゾンは、対応するトランスポザーゼまたは対応するトランスポザーゼをコードするポリヌクレオチドと共に免疫細胞内へと導入することができる。好ましい実施形態は、突然変異したＰＬＣＧタンパク質をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドであって、レンチウイルスベクターの一部であるポリヌクレオチドを含む。突然変異したＰＬＣＧタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクターは、パッケージングされ、免疫細胞を感染させるために使用することができる。免疫細胞は、好ましくはＴ細胞である。

【0093】

本発明の一態様は、そのゲノムが、活性化突然変異を有するＰＬＣＧタンパク質をコードする遺伝子を含む異種ポリヌクレオチドを含む、免疫細胞である。いくつかの実施形態では、異種ポリヌクレオチドは、レンチウイルスベクター、またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾン、またはＳｌｅｅｐｉｎｇ ＢｅａｕｔｙトランスポゾンなどのＭａｒｉｎｅｒ型トランスポゾン、またはＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾンなどのｈＡＴ型トランスポゾンを含む。いくつかの実施形態では、免疫細胞ゲノムは、３コピーのＰＬＣＧ遺伝子と、２つの内在性コピーと、１つの異種突然変異体コピーとを含む。

【0094】

５．３．１．５ ＳＴＡＴ５Ｂ
ＳＴＡＴ５Ｂ（転写のシグナル伝達因子および活性化因子５Ｂ）をコードする遺伝子は、Ｔ細胞白血病において突然変異していることが時折認められる。白血病と関係する最も一般的な活性化突然変異は、ＳＨ２ドメイン内のＮ６４２Ｈである。Ｔ細胞癌と関係する他のＳＴＡＴ５Ｂ活性化突然変異には、ＳＨ２ドメイン突然変異Ｔ６４８Ｓ、Ｓ６５２ＹおよびＹ６６５Ｆ、ならびにＳＨ２ドメイン外のＰ２６７Ａがある。ＳＴＡＴ５Ｂタンパク質の活性化突然変異体をコードする異種ポリヌクレオチドは、免疫細胞の生存または免疫細胞の増殖を増強するために免疫細胞内へと導入されることができ、ＳＴＡＴ５Ｂの活性化突然変異体をコードする遺伝子は、第６．２節において説明するような免疫細胞生存増強遺伝子および免疫細胞増殖増強遺伝子である。その配列がＮ６４２Ｈ、Ｔ６４８Ｓ、Ｓ６５２Ｙ、Ｙ６６５ＦおよびＰ２６７Ａから選択される１つ以上の突然変異を含む、ＳＴＡＴ５Ｂの修飾版を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチド（例えば、配列番号２３６）は、本発明の一実施形態である。突然変異した例示的なＳＴＡＴ５Ｂタンパク質は、配列番号２５５として与えられている。好ましい実施形態は、突然変異したＳＴＡＴ５Ｂタンパク質をコードする核酸を含むポリヌクレオチドを含み、該核酸は異種プロモーターに作動可能に連結されている。突然変異したＳＴＡＴ５Ｂをコードする遺伝子に作動可能に連結されることができる例示的な異種プロモーターとしては、ＥＦ１プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰＤＨプロモーター、ＥＥＦ２プロモーター、ユビキチンプロモーター、ＳＶ４０プロモーターまたはＨＳＶＴＫプロモーター、例えば配列番号９４～配列番号１５４から選択される配列がある。好ましい実施形態は、突然変異したＳＴＡＴ５Ｂタンパク質をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドを含み、該遺伝子は、異種ポリアデニル化シグナル、例えば哺乳動物細胞を感染させるウイルスに由来のポリアデニル化シグナル、哺乳動物ＥＦ１ポリアデニル化シグナル、哺乳動物成長ホルモンポリアデニル化シグナルまたは哺乳動物グロビンポリアデニル化シグナル、例えば配列番号１６０～配列番号２１７から選択される配列に作動可能に連結されている。好ましい実施形態は、突然変異したＳＴＡＴ５Ｂタンパク質をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドであって、配列番号６および配列番号７を有する配列、または配列番号１４および配列番号１５を有する配列、または配列番号１８および配列番号１９を有する配列、または配列番号２０および配列番号２１を有する配列をさらに含む、ｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンの一部である、ポリヌクレオチドを含む。好ましい実施形態は、ＳＴＡＴ５Ｂの活性化突然変異体をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドであって、配列番号２４と９０％同一である配列と、配列番号２５と９０％同一である配列とをさらに含む、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ ＢｅａｕｔｙトランスポゾンなどのＭａｒｉｎｅｒ型トランスポゾンの一部である、ポリヌクレオチドを含む。好ましい実施形態は、突然変異したＳＴＡＴ５Ｂタンパク質をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドであって、配列番号３９７と９０％同一である配列と、配列番号３９８と９０％同一である配列とをさらに含む、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾンなどのｈＡＴ型トランスポゾンの一部である、ポリヌクレオチドを含む。突然変異したＳＴＡＴ５Ｂタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むトランスポゾンは、対応するトランスポザーゼまたは対応するトランスポザーゼをコードするポリヌクレオチドと共に免疫細胞内へと導入することができる。好ましい実施形態は、突然変異したＳＴＡＴ５Ｂタンパク質をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドであって、レンチウイルスベクターの一部であるポリヌクレオチドを含む。突然変異したＳＴＡＴ５Ｂタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクターは、パッケージングされ、免疫細胞を感染させるために使用することができる。免疫細胞は、好ましくはＴ細胞である。

【0095】

本発明の一態様は、そのゲノムが、活性化突然変異を有するＳＴＡＴ５Ｂタンパク質をコードする遺伝子を含む異種ポリヌクレオチドを含む、免疫細胞である。いくつかの実施形態では、異種ポリヌクレオチドは、レンチウイルスベクター、またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾン、またはＳｌｅｅｐｉｎｇ ＢｅａｕｔｙトランスポゾンなどのＭａｒｉｎｅｒ型トランスポゾン、またはＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾンなどのｈＡＴ型トランスポゾンを含む。いくつかの実施形態では、免疫細胞ゲノムは、３コピーのＳＴＡＴ５Ｂ遺伝子と、２つの内在性コピーと、１つの異種突然変異体コピーとを含む。

【0096】

５．３．１．６ サバイビン
サバイビン（タンパク質のアポトーシス阻害剤ファミリーのメンバー）をコードする遺伝子は、Ｔ細胞白血病において上方調節されることが時折認められる。第６．２．１．３節において説明するように、本発明者らは、異種プロモーターに作動可能に連結されたサバイビン遺伝子をコードする異種ポリヌクレオチドが、免疫細胞の生存または免疫細胞の増殖を増強するために、および再刺激誘導性細胞死を低減させるために免疫細胞内へと導入されることができることを実証しており、異種プロモーターに作動可能に連結されたサバイビン遺伝子は、第６．２節において説明するような免疫細胞生存増強遺伝子および免疫細胞増殖増強遺伝子である。異種プロモーターに作動可能に連結された、配列番号２３７を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、本発明の一実施形態である。サバイビンをコードする遺伝子に作動可能に連結されることができる例示的な異種プロモーターとしては、ＥＦ１プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰＤＨプロモーター、ＥＥＦ２プロモーター、ユビキチンプロモーター、ＳＶ４０プロモーターまたはＨＳＶＴＫプロモーター、例えば配列番号９４～配列番号１５４から選択される配列がある。好ましい実施形態は、サバイビンをコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドを含み、該遺伝子は、異種ポリアデニル化シグナル、例えば哺乳動物細胞を感染させるウイルスに由来のポリアデニル化シグナル、哺乳動物ＥＦ１ポリアデニル化シグナル、哺乳動物成長ホルモンポリアデニル化シグナルまたは哺乳動物グロビンポリアデニル化シグナル、例えば配列番号１６０～配列番号２１７から選択される配列に作動可能に連結されている。好ましい実施形態は、サバイビンをコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドであって、配列番号６および配列番号７を有する配列、または配列番号１４および配列番号１５を有する配列、または配列番号１８および配列番号１９を有する配列、または配列番号２０および配列番号２１を有する配列をさらに含む、ｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンの一部である、ポリヌクレオチドを含む。好ましい実施形態は、サバイビンをコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドであって、配列番号２４と９０％同一である配列と、配列番号２５と９０％同一である配列とをさらに含む、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ ＢｅａｕｔｙトランスポゾンなどのＭａｒｉｎｅｒ型トランスポゾンの一部である、ポリヌクレオチドを含む。好ましい実施形態は、サバイビンをコードする遺伝子をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドであって、配列番号３９７と９０％同一である配列と、配列番号３９８と９０％同一である配列とをさらに含む、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾンなどのｈＡＴ型トランスポゾンの一部である、ポリヌクレオチドを含む。サバイビンをコードするポリヌクレオチドを含むトランスポゾンは、対応するトランスポザーゼまたは対応するトランスポザーゼをコードするポリヌクレオチドと共に免疫細胞内へと導入することができる。好ましい実施形態は、サバイビンをコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドであって、レンチウイルスベクターの一部であるポリヌクレオチドを含む。サバイビンをコードするポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクターは、パッケージングされ、免疫細胞を感染させるために使用することができる。免疫細胞は、好ましくはＴ細胞またはＢ細胞である。

【0097】

本発明の一態様は、そのゲノムが、サバイビンをコードする遺伝子を含む、かつレンチウイルスベクター、またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾン、またはＳｌｅｅｐｉｎｇ ＢｅａｕｔｙトランスポゾンなどのＭａｒｉｎｅｒ型トランスポゾン、またはＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾンなどのｈＡＴ型トランスポゾンをさらに含む、異種ポリヌクレオチドを含む、免疫細胞である。いくつかの実施形態では、免疫細胞ゲノムは、３コピーのサバイビン遺伝子と、２つの内在性コピーと、異種プロモーターに作動可能に連結された１つの異種コピーとを含む。

【0098】

５．３．１．７ Ｂｃｌ－ＸＬ
Ｂｃｌ－ＸＬ（抗アポトーシスタンパク質）をコードする遺伝子は、Ｂ細胞リンパ腫において上方調節されることが時折認められる。第６．２．１．５節および第６．２．１．６節において説明するように、本発明者らは、異種プロモーターに作動可能に連結されたＢｃｌ－ＸＬ遺伝子をコードする異種ポリヌクレオチドが、免疫細胞の生存または免疫細胞の増殖を増強するために、および再刺激誘導性細胞死を低減させるために免疫細胞内へと導入されることができることを実証しており、異種プロモーターに作動可能に連結されたＢｃｌ－ＸＬ遺伝子は、第６．２節において説明するような免疫細胞生存増強遺伝子および免疫細胞増殖増強遺伝子である。異種プロモーターに作動可能に連結された、配列番号２３８を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、本発明の一実施形態である。Ｂｃｌ－ＸＬをコードする核酸に作動可能に連結されることができる例示的な異種プロモーターとしては、ＥＦ１プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰＤＨプロモーター、ＥＥＦ２プロモーター、ユビキチンプロモーター、ＳＶ４０プロモーターまたはＨＳＶＴＫプロモーター、例えば配列番号９４～配列番号１５４から選択される配列がある。好ましい実施形態は、Ｂｃｌ－ＸＬをコードする核酸を含むポリヌクレオチドを含み、該核酸は、異種ポリアデニル化シグナル、例えば哺乳動物細胞を感染させるウイルスに由来のポリアデニル化シグナル、哺乳動物ＥＦ１ポリアデニル化シグナル、哺乳動物成長ホルモンポリアデニル化シグナルまたは哺乳動物グロビンポリアデニル化シグナル、例えば配列番号１６０～配列番号２１７から選択される配列に作動可能に連結されている。好ましい実施形態は、Ｂｃｌ－ＸＬをコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドであって、配列番号６および配列番号７を有する配列、または配列番号１４および配列番号１５を有する配列、または配列番号１８および配列番号１９を有する配列、または配列番号２０および配列番号２１を有する配列をさらに含む、ｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンの一部である、ポリヌクレオチドを含む。好ましい実施形態は、Ｂｃｌ－ＸＬをコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドであって、配列番号２４と９０％同一である配列と、配列番号２５と９０％同一である配列とをさらに含む、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ ＢｅａｕｔｙトランスポゾンなどのＭａｒｉｎｅｒ型トランスポゾンの一部である、ポリヌクレオチドを含む。好ましい実施形態は、Ｂｃｌ－ＸＬをコードする遺伝子をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドであって、配列番号３９７と９０％同一である配列と、配列番号３９８と９０％同一である配列とをさらに含む、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾンなどのｈＡＴ型トランスポゾンの一部である、ポリヌクレオチドを含む。Ｂｃｌ－ＸＬをコードするポリヌクレオチドを含むトランスポゾンは、対応するトランスポザーゼをコードするポリヌクレオチドと共に免疫細胞内へと導入することができる。好ましい実施形態は、Ｂｃｌ－ＸＬをコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドであって、レンチウイルスベクターの一部であるポリヌクレオチドを含む。Ｂｃｌ－ＸＬをコードするポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクターは、パッケージングされ、免疫細胞を感染させるために使用することができる。免疫細胞は、好ましくはＴ細胞またはＢ細胞である。

【0099】

本発明の一態様は、そのゲノムが、Ｂｃｌ－ＸＬをコードする遺伝子を含む、かつレンチウイルスベクター、またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾン、またはＳｌｅｅｐｉｎｇ ＢｅａｕｔｙトランスポゾンなどのＭａｒｉｎｅｒ型トランスポゾン、またはＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾンなどのｈＡＴ型トランスポゾンをさらに含む、異種ポリヌクレオチドを含む、免疫細胞である。いくつかの実施形態では、免疫細胞ゲノムは、３コピーのＢｃｌ－ＸＬ遺伝子と、２つの内在性コピーと、異種プロモーターに作動可能に連結された１つの異種コピーとを含む。

【0100】

５．３．１．８ ＣＣＮＤ１
ＣＣＮＤ１（サイクリンＤ１）をコードする遺伝子は、白血病において突然変異していることが時折認められる。癌と関係するＣＣＮＤ１突然変異には、Ｅ３６Ｇ、Ｅ３６Ｑ、Ｅ３６Ｋ、Ａ３９Ｓ、Ｓ４１Ｌ、Ｓ４１Ｐ、Ｓ４１Ｔ、Ｖ４２Ｅ、Ｖ４２Ａ、Ｖ４２Ｌ、Ｖ４２Ｍ、Ｙ４４Ｓ、Ｙ４４Ｄ、Ｙ４４Ｃ、Ｙ４４Ｈ、Ｋ４６Ｔ、Ｋ４６Ｒ、Ｋ４６Ｎ、Ｋ４６Ｅ、Ｃ４７Ｇ、Ｃ４７Ｒ、Ｃ４７Ｓ、Ｃ４７Ｗ、Ｐ１９９Ｒ、Ｐ１９９Ｓ、Ｐ１９９Ｌ、Ｓ２０１Ｆ、Ｔ２８５Ｉ、Ｔ２８５Ａ、Ｐ２８６Ｌ、Ｐ２８６Ｈ、Ｐ２８６Ｓ、Ｐ２８６ＴおよびＰ２８６Ａがある。ＣＣＮＤ１タンパク質の活性化突然変異体をコードする異種ポリヌクレオチドは、免疫細胞の生存または免疫細胞の増殖を増強するために免疫細胞内へと導入されることができ、ＣＣＮＤ１の活性化突然変異体をコードする遺伝子は、第６．２節において説明するような免疫細胞生存増強遺伝子および免疫細胞増殖増強遺伝子である。その配列がＥ３６Ｇ、Ｅ３６Ｑ、Ｅ３６Ｋ、Ａ３９Ｓ、Ｓ４１Ｌ、Ｓ４１Ｐ、Ｓ４１Ｔ、Ｖ４２Ｅ、Ｖ４２Ａ、Ｖ４２Ｌ、Ｖ４２Ｍ、Ｙ４４Ｓ、Ｙ４４Ｄ、Ｙ４４Ｃ、Ｙ４４Ｈ、Ｋ４６Ｔ、Ｋ４６Ｒ、Ｋ４６Ｎ、Ｋ４６Ｅ、Ｃ４７Ｇ、Ｃ４７Ｒ、Ｃ４７Ｓ、Ｃ４７Ｗ、Ｐ１９９Ｒ、Ｐ１９９Ｓ、Ｐ１９９Ｌ、Ｓ２０１Ｆ、Ｔ２８５Ｉ、Ｔ２８５Ａ、Ｐ２８６Ｌ、Ｐ２８６Ｈ、Ｐ２８６Ｓ、Ｐ２８６ＴおよびＰ２８６Ａから選択される１つ以上の突然変異を含む、ＣＣＮＤ１の修飾版を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチド（例えば、配列番号２３９）は、本発明の一実施形態である。突然変異した例示的なＣＣＮＤ１タンパク質は、配列番号２５６として与えられている。好ましい実施形態は、突然変異したＣＣＮＤ１タンパク質をコードする核酸を含むポリヌクレオチドを含み、該核酸は異種プロモーターに作動可能に連結されている。突然変異したＣＣＮＤ１をコードする核酸に作動可能に連結されることができる例示的な異種プロモーターとしては、ＥＦ１プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰＤＨプロモーター、ＥＥＦ２プロモーター、ユビキチンプロモーター、ＳＶ４０プロモーターまたはＨＳＶＴＫプロモーター、例えば配列番号９４～配列番号１５４から選択される配列がある。好ましい実施形態は、突然変異したＣＣＮＤ１タンパク質をコードする核酸を含むポリヌクレオチドを含み、該核酸は、異種ポリアデニル化シグナル、例えば哺乳動物細胞を感染させるウイルスに由来のポリアデニル化シグナル、哺乳動物ＥＦ１ポリアデニル化シグナル、哺乳動物成長ホルモンポリアデニル化シグナルまたは哺乳動物グロビンポリアデニル化シグナル、例えば配列番号１６０～配列番号２１７から選択される配列に作動可能に連結されている。好ましい実施形態は、突然変異したＣＣＮＤ１タンパク質をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドであって、配列番号６および配列番号７を有する配列、または配列番号１４および配列番号１５を有する配列、または配列番号１８および配列番号１９を有する配列、または配列番号２０および配列番号２１を有する配列をさらに含む、ｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンの一部である、ポリヌクレオチドを含む。好ましい実施形態は、ＣＣＮＤ１の活性化突然変異体をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドであって、配列番号２４と９０％同一である配列と、配列番号２５と９０％同一である配列とをさらに含む、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ ＢｅａｕｔｙトランスポゾンなどのＭａｒｉｎｅｒ型トランスポゾンの一部である、ポリヌクレオチドを含む。好ましい実施形態は、ＣＣＮＤ１の活性化突然変異体をコードする遺伝子をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドであって、配列番号３９７と９０％同一である配列と、配列番号３９８と９０％同一である配列とをさらに含む、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾンなどのｈＡＴ型トランスポゾンの一部である、ポリヌクレオチドを含む。突然変異したＣＣＮＤ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むトランスポゾンは、対応するトランスポザーゼをコードするポリヌクレオチドと共に免疫細胞内へと導入することができる。好ましい実施形態は、突然変異したＣＣＮＤ１タンパク質をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドであって、レンチウイルスベクターの一部であるポリヌクレオチドを含む。突然変異したＣＣＮＤ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクターは、パッケージングされ、免疫細胞を感染させるために使用することができる。免疫細胞は、好ましくはＴ細胞またはＢ細胞である。

【0101】

本発明の一態様は、そのゲノムが、活性化突然変異を有するＣＣＮＤ１タンパク質をコードする遺伝子を含む異種ポリヌクレオチドを含む、免疫細胞である。いくつかの実施形態では、異種ポリヌクレオチドは、レンチウイルスベクター、またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾン、またはＳｌｅｅｐｉｎｇ ＢｅａｕｔｙトランスポゾンなどのＭａｒｉｎｅｒ型トランスポゾン、またはＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾンなどのｈＡＴ型トランスポゾンを含む。いくつかの実施形態では、免疫細胞ゲノムは、３コピーのＣＣＮＤ１遺伝子と、２つの内在性コピーと、１つの異種突然変異体コピーとを含む。

【0102】

５．３．１．９ Ｂｃｌ２
Ｂｃｌ２（抗アポトーシスタンパク質）をコードする遺伝子は、Ｂ細胞リンパ腫において上方調節されることが時折認められる。第６．２．１．４節において説明するように、本発明者らは、異種プロモーターに作動可能に連結されたＢｃｌ２遺伝子をコードする異種ポリヌクレオチドが、免疫細胞の生存または免疫細胞の増殖を増強するために、免疫細胞内へと導入されることができることを実証しており、異種プロモーターに作動可能に連結されたＢｃｌ２遺伝子は、第６．２節において説明するような免疫細胞生存増強遺伝子および免疫細胞増殖増強遺伝子である。異種プロモーターに作動可能に連結された、配列番号ｖ２７０または２７２を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、本発明の一実施形態である。Ｂｃｌ２をコードする核酸に作動可能に連結されることができる例示的な異種プロモーターとしては、ＥＦ１プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰＤＨプロモーター、ＥＥＦ２プロモーター、ユビキチンプロモーター、ＳＶ４０プロモーターまたはＨＳＶＴＫプロモーター、例えば配列番号９４～配列番号１５４から選択される配列がある。好ましい実施形態は、Ｂｃｌ２をコードする核酸を含むポリヌクレオチドを含み、該核酸は、異種ポリアデニル化シグナル、例えば哺乳動物細胞を感染させるウイルスに由来のポリアデニル化シグナル、哺乳動物ＥＦ１ポリアデニル化シグナル、哺乳動物成長ホルモンポリアデニル化シグナルまたは哺乳動物グロビンポリアデニル化シグナル、例えば配列番号１６０～配列番号２１７から選択される配列に作動可能に連結されている。好ましい実施形態は、Ｂｃｌ２をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドであって、配列番号６および配列番号７を有する配列、または配列番号１４および配列番号１５を有する配列、または配列番号１８および配列番号１９を有する配列、または配列番号２０および配列番号２１を有する配列をさらに含む、ｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンの一部である、ポリヌクレオチドを含む。好ましい実施形態は、Ｂｃｌ２をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドであって、配列番号２４と９０％同一である配列と、配列番号２５と９０％同一である配列とをさらに含む、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ ＢｅａｕｔｙトランスポゾンなどのＭａｒｉｎｅｒ型トランスポゾンの一部である、ポリヌクレオチドを含む。好ましい実施形態は、Ｂｃｌ２をコードする遺伝子をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドであって、配列番号３９７と９０％同一である配列と、配列番号３９８と９０％同一である配列とをさらに含む、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾンなどのｈＡＴ型トランスポゾンの一部である、ポリヌクレオチドを含む。Ｂｃｌ２をコードするポリヌクレオチドを含むトランスポゾンは、対応するトランスポザーゼをコードするポリヌクレオチドと共に免疫細胞内へと導入することができる。好ましい実施形態は、Ｂｃｌ２をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドであって、レンチウイルスベクターの一部であるポリヌクレオチドを含む。Ｂｃｌ２をコードするポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクターは、パッケージングされ、免疫細胞を感染させるために使用することができる。免疫細胞は、好ましくはＴ細胞またはＢ細胞である。

【0103】

本発明の一態様は、そのゲノムが、Ｂｃｌ２をコードする遺伝子を含む、かつレンチウイルスベクター、またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾン、またはＳｌｅｅｐｉｎｇ ＢｅａｕｔｙトランスポゾンなどのＭａｒｉｎｅｒ型トランスポゾン、またはＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾンなどのｈＡＴ型トランスポゾンをさらに含む、異種ポリヌクレオチドを含む、免疫細胞である。いくつかの実施形態では、免疫細胞ゲノムは、３コピーのＢｃｌ２遺伝子と、２つの内在性コピーと、異種プロモーターに作動可能に連結された１つの異種コピーとを含む。

【0104】

５．３．１．１０ Ｂｃｌ６
Ｂｃｌ６（抗アポトーシスタンパク質）をコードする遺伝子は、Ｂ細胞リンパ腫において上方調節されることが時折認められる。第６．２．１．４節において説明するように、本発明者らは、異種プロモーターに作動可能に連結されたＢｃｌ６遺伝子をコードする異種ポリヌクレオチドが、免疫細胞の生存または免疫細胞の増殖を増強するために、免疫細胞内へと導入されることができることを実証しており、異種プロモーターに作動可能に連結されたＢｃｌ６遺伝子は、第６．２節において説明するような免疫細胞生存増強遺伝子および免疫細胞増殖増強遺伝子である。異種プロモーターに作動可能に連結された、配列番号２７１または配列番号２７２を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、本発明の一実施形態である。Ｂｃｌ６をコードする核酸に作動可能に連結されることができる例示的な異種プロモーターとしては、ＥＦ１プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰＤＨプロモーター、ＥＥＦ２プロモーター、ユビキチンプロモーター、ＳＶ４０プロモーターまたはＨＳＶＴＫプロモーター、例えば配列番号９４～配列番号１５４から選択される配列がある。好ましい実施形態は、Ｂｃｌ６をコードする核酸を含むポリヌクレオチドを含み、該核酸は、異種ポリアデニル化シグナル、例えば哺乳動物細胞を感染させるウイルスに由来のポリアデニル化シグナル、哺乳動物ＥＦ１ポリアデニル化シグナル、哺乳動物成長ホルモンポリアデニル化シグナルまたは哺乳動物グロビンポリアデニル化シグナル、例えば配列番号１６０～配列番号２１７から選択される配列に作動可能に連結されている。好ましい実施形態は、Ｂｃｌ６をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドであって、配列番号６および配列番号７を有する配列、または配列番号１４および配列番号１５を有する配列、または配列番号１８および配列番号１９を有する配列、または配列番号２０および配列番号２１を有する配列をさらに含む、ｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンの一部である、ポリヌクレオチドを含む。好ましい実施形態は、Ｂｃｌ６をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドであって、配列番号２４と９０％同一である配列と、配列番号２５と９０％同一である配列とをさらに含む、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ ＢｅａｕｔｙトランスポゾンなどのＭａｒｉｎｅｒ型トランスポゾンの一部である、ポリヌクレオチドを含む。好ましい実施形態は、Ｂｃｌ６をコードする遺伝子をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドであって、配列番号３９７と９０％同一である配列と、配列番号３９８と９０％同一である配列とをさらに含む、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾンなどのｈＡＴ型トランスポゾンの一部である、ポリヌクレオチドを含む。Ｂｃｌ６をコードするポリヌクレオチドを含むトランスポゾンは、対応するトランスポザーゼまたは対応するトランスポザーゼをコードするポリヌクレオチドと共に免疫細胞内へと導入することができる。好ましい実施形態は、Ｂｃｌ６をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドであって、レンチウイルスベクターの一部であるポリヌクレオチドを含む。Ｂｃｌ６をコードするポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクターは、パッケージングされ、免疫細胞を感染させるために使用することができる。免疫細胞は、好ましくはＴ細胞またはＢ細胞である。

【0105】

本発明の一態様は、そのゲノムが、Ｂｃｌ６をコードする遺伝子を含む、かつレンチウイルスベクターまたはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンをさらに含む異種ポリヌクレオチドを含む、免疫細胞である。いくつかの実施形態では、免疫細胞ゲノムは、３コピーのＢｃｌ６遺伝子と、２つの内在性コピーと、異種プロモーターに作動可能に連結された１つの異種コピーとを含む。

【0106】

５．３．２．増強型シグナル伝達受容体
Ｔ細胞などの免疫細胞は、天然リガンドおよび合成リガンドに結合する細胞外ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達経路と相互作用する細胞内ドメインとを含む、膜タンパク質を発現する。本発明者らは、第１のタンパク質に由来する細胞外ドメインと、膜貫通ドメインと、刺激シグナルまたは共刺激シグナルを免疫細胞に伝達する受容体に由来する細胞内ドメインとを含む、増強型シグナル伝達受容体（ＥＳＲ）と呼ばれるキメラ受容体のセットを設計、合成および試験した。しかしながら、キメラ抗原受容体とは異なり、ＥＳＲは、ＣＤ３ゼータ鎖の細胞内部分を含む配列を含まない。ＥＳＲの１つの機能は、免疫細胞の生存を増強することである。ＥＳＲの別の機能は、例えば阻害性受容体に作用する腫瘍細胞によるＴ細胞阻害経路の関与を打ち消すことである（Ｔａｙ ｅｔ ａｌ，２０１７．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ９，１３３９－１３４９）。ＥＳＲが有効に機能するためには、腫瘍微小環境内に提示されている阻害性リガンドについて天然の阻害性受容体と競合するのに十分高いレベルで発現しなければならない。

【0107】

一実施形態では、ＥＳＲの細胞外ドメインは、免疫細胞に阻害シグナルを自然に伝達する受容体の細胞外リガンド結合ドメインに由来する可能性があり、この場合、ＥＳＲは、通常、阻害シグナルとして解釈されるものを受け取り、それを刺激シグナルとして伝達する。例えば、ＥＳＲの細胞外ドメインは、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＴＮＦＲＳＦ３（ＬＴＲβ）、ＴＮＦＲＳＦ６（Ｆａｓ）、ＴＮＦＲＳＦ８（ＣＤ３０）、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ（ＤＲ４）、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ（ＤＲ５）、ＴＮＦＲＳＦ１９（ＴＲＯＹ）、ＴＮＦＲＳＦ２１（ＤＲ６）およびＣＴＬＡ４から選択されるタンパク質の細胞外ドメインに由来する配列を含むことができ、好ましくは、細胞外ドメインはヒトタンパク質に由来する。本発明のいくつかの実施形態では、ＥＳＲの細胞外ドメインは、その配列が配列番号３２２～配列番号３３０から選択される配列と少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％同一、または少なくとも９６％同一、または少なくとも９７％同一、または少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％または１００％同一であるポリペプチドを含む。

【0108】

別の実施形態では、ＥＳＲの細胞外ドメインは、免疫細胞の表面上に発現するタンパク質、好ましくはその正常な機能が免疫機能を刺激することであるタンパク質に結合するタンパク質に由来する可能性がある。この場合、ＥＳＲは、刺激シグナルを別の免疫細胞に伝達し、刺激シグナルを、該ＥＳＲが発現する免疫細胞に導入する。例えば、ＥＳＲ細胞外ドメインは、ＴＮＦＲＳＦ４（ＯＸ４０）、ＴＮＦＲＳＦ５（ＣＤ４０）、ＴＮＦＲＳＦ７（ＣＤ２７）、ＴＮＦＲＳＦ９（４－１ＢＢ）、ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ（ＲＡＮＫ）、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ（ＴＡＣＩ）、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ（ＢＡＦＦ－Ｒ）、ＴＮＦＲＳＦ１４（ＨＶＥＭ）、ＴＮＦＲＳＦ１７（ＣＤ２６９）、ＴＮＦＲＳＦ１８（ＧＩＴＲ）、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｈ（ＴＭＩＧＤ２）、誘導性Ｔ細胞共刺激因子（ＩＣＯＳ／ＣＤ２７８）、ＤＮＡＸアクセサリー分子１（ＤＮＡＭ－１／ＣＤ２２６）、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭ／ＣＤ１５０）、Ｔ細胞免疫グロブリン・ムチンドメイン（ＴＩＭ－１／ＨＡＶｃｒ－１）、インターフェロン受容体α鎖（ＩＦＮＡＲ１）、インターフェロン受容体β鎖ＩＦＮＡＲ２）、インターロイキン２受容体βサブユニット（ＩＬ２ＲＢ）およびインターロイキン２受容体γサブユニット（ＩＬ２ＲＧ）から選択されるタンパク質の細胞外ドメインに結合する抗体、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体、ナノボディ、Ｖ_ＨＨ断片またはＶ_ＮＡＲ断片の可変ドメインを含むことができる。例示的な一本鎖抗ＣＤ２８抗体は、配列番号３４０のＴＧＮ１４１２である。

【0109】

別の実施形態では、ＥＳＲの細胞外ドメインは、免疫細胞の表面上に発現する受容体、好ましくはその正常な機能が免疫細胞において刺激シグナルまたは共刺激シグナルを伝達することである受容体に結合するリガンドに由来する可能性がある。この場合、ＥＳＲは、刺激シグナルを別の免疫細胞に伝達し、該ＥＳＲが発現する免疫細胞に刺激シグナルを導入する。例えば、ＥＳＲ細胞外ドメインは、ＴＮＦＳＦ４（ＯＸ４０リガンド）、ＴＮＦＳＦ５（ＣＤ４０リガンド）、ＴＮＦＳＦ９（４－１ＢＢリガンド）、ＴＮＦＳＦ１１（ＲＡＮＫＬ）、ＴＮＦＳＦ１４（ＨＶＥＭリガンド）、ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＩＣＯＳリガンドから選択されるタンパク質の細胞外ドメインに由来する配列を含むことができ、好ましくは、細胞外ドメインはヒトタンパク質に由来する。本発明のいくつかの実施形態では、ＥＳＲの細胞外ドメインは、その配列が配列番号３３１～配列番号３３９から選択される配列と少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％同一、または少なくとも９６％同一、または少なくとも９７％同一、または少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一であるポリペプチドを含む。

【0110】

本発明のいくつかの実施形態では、増強型シグナル伝達受容体は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）のメンバーの細胞内ドメインに由来する配列、または通常は刺激シグナルを免疫細胞に伝達する別の免疫細胞受容体に由来する配列を含み、本発明のいくつかの実施形態では、ＥＳＲは、ＴＮＦＲＳＦ４（ＯＸ４０）、ＴＮＦＲＳＦ５（ＣＤ４０）、ＴＮＦＲＳＦ７（ＣＤ２７）、ＴＮＦＲＳＦ９（４－１ＢＢ）、ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ（ＲＡＮＫ）、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ（ＴＡＣＩ）、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ（ＢＡＦＦ－Ｒ）、ＴＮＦＲＳＦ１４（ＨＶＥＭ）、ＴＮＦＲＳＦ１７（ＣＤ２６９）、ＴＮＦＲＳＦ１８（ＧＩＴＲ）、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｈ（ＴＭＩＧＤ２）、誘導性Ｔ細胞共刺激因子（ＩＣＯＳ／ＣＤ２７８）、ＤＮＡＸアクセサリー分子１（ＤＮＡＭ－１／ＣＤ２２６）、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭ／ＣＤ１５０）、Ｔ細胞免疫グロブリン・ムチンドメイン（ＴＩＭ－１／ＨＡＶｃｒ－１）、インターフェロン受容体α鎖（ＩＦＮＡＲ１）、インターフェロン受容体β鎖ＩＦＮＡＲ２）、インターロイキン２受容体βサブユニット（ＩＬ２ＲＢ）、インターロイキン２受容体γサブユニット（ＩＬ２ＲＧ）、腫瘍壊死因子スーパーファミリー１４（ＴＮＦＳＦ１４／ＬＩＧＨＴ）、ナチュラルキラーグループ２メンバーＤ（ＮＫＧ２Ｄ／ＣＤ３１４）およびＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）から選択されるタンパク質の細胞内ドメインに由来する配列を含み、好ましくは、細胞内ドメインはヒトタンパク質のものである。本発明のいくつかの実施形態では、ＥＳＲは、その配列が配列番号３４１～配列番号３６４から選択される配列と少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％同一、または少なくとも９６％同一、または少なくとも９７％同一、または少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％または１００％同一であるポリペプチドを含む。

【0111】

本発明のいくつかの実施形態において、増強型シグナル伝達受容体は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）のメンバーの膜貫通ドメインに由来する配列、または通常は阻害シグナルまたは刺激シグナルを免疫細胞に伝達する別の免疫細胞受容体に由来する配列を含み、本発明のいくつかの実施形態では、ＥＳＲは、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ３（ＬＴＲβ）、ＴＮＦＲＳＦ６（Ｆａｓ）、ＴＮＦＲＳＦ８（ＣＤ３０）、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ（ＤＲ４）、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ（ＤＲ５）、ＴＮＦＲＳＦ１９（ＴＲＯＹ）、ＴＮＦＲＳＦ２１（ＤＲ６）、ＣＴＬＡ４、ＴＮＦＲＳＦ４（ＯＸ４０）、ＴＮＦＲＳＦ５（ＣＤ４０）、ＴＮＦＲＳＦ７（ＣＤ２７）、ＴＮＦＲＳＦ９（４－１ＢＢ）、ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ（ＲＡＮＫ）、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ（ＴＡＣＩ）、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ（ＢＡＦＦ－Ｒ）、ＴＮＦＲＳＦ１４（ＨＶＥＭ）、ＴＮＦＲＳＦ１７（ＣＤ２６９）、ＴＮＦＲＳＦ１８（ＧＩＴＲ）、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｈ（ＴＭＩＧＤ２）、誘導性Ｔ細胞共刺激因子（ＩＣＯＳ／ＣＤ２７８）、ＤＮＡＸアクセサリー分子１（ＤＮＡＭ－１／ＣＤ２２６）、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭ／ＣＤ１５０）、Ｔ細胞免疫グロブリン・ムチンドメイン（ＴＩＭ－１／ＨＡＶｃｒ－１）、インターフェロン受容体α鎖（ＩＦＮＡＲ１）、インターフェロン受容体β鎖ＩＦＮＡＲ２）、インターロイキン２受容体βサブユニット（ＩＬ２ＲＢ）、インターロイキン２受容体γサブユニット（ＩＬ２ＲＧ）、腫瘍壊死因子スーパーファミリー１４（ＴＮＦＳＦ１４／ＬＩＧＨＴ）、ナチュラルキラーグループ２メンバーＤ（ＮＫＧ２Ｄ／ＣＤ３１４）およびＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインに由来する配列を含み、好ましくは、膜貫通ドメインはヒトタンパク質のものであり、本発明のいくつかの実施形態では、ＥＳＲは、その配列が配列番号３６５～配列番号３９６から選択される配列と少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％同一、または少なくとも９６％同一、または少なくとも９７％同一、または少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一、または１００％同一であるポリペプチドを含む。

【0112】

本発明のいくつかの実施形態では、増強型シグナル伝達受容体は、配列番号２７４～配列番号３１８から選択される配列と少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％同一、または少なくとも９６％同一、または少なくとも９７％同一、または少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％または１００％同一の配列を含む。これらの配列は、Ｎ末端分泌シグナルを含む（例えば、ＭＬＧＩＷＴＬＬＰＬＶＬＴＳＶＡＲＬＳＳＫＳＶＮＡ、ＭＥＱＲＰＲＧＣＡＡＶＡＡＡＬＬＬＶＬＬＧＡＲＡＱＧ、ＭＧＬＳＴＶＰＤＬＬＬＰＬＶＬＬＥＬＬＶＧＩＹＰＳＧＶＩＧ、ＭＧＴＳＰＳＳＳＴＡＬＡＳＣＳＲＩＡＲＲＡＴＡＴＭＩＡＧＳＬＬＬＬＧＦＬＳＴＴＴＡ、ＭＥＱＲＧＱＮＡＰＡＡＳＧＡＲＫＲＨＧＰＧＰＲＥＡＲＧＡＲＰＧＰＲＶＰＫＴＬＶＬＶＶＡＡＶＬＬＬＶＳＡＥＳおよびＭＡＶＭＡＰＲＴＬＶＬＬＬＳＧＡＬＡＬＴＱＴＷＡは、これらのＥＳＲについてのシグナル配列である）。シグナル配列は、ＥＳＲを膜内へと転移させるように機能する。ＥＳＲのシグナル配列はシグナルペプチダーゼによって取り出され、最終受容体の一部を形成しないので、ＥＳＲの活性を変化させることなく、何らかの機能的分泌シグナルを別の機能的分泌シグナルによって置き換えてよい。このような置き換えは、明示的に企図される。増強型シグナル伝達受容体は、配列番号２７４～配列番号３１８から選択される配列の非シグナル配列部と少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％同一、または少なくとも９６％同一、または少なくとも９７％同一、または少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％または１００％同一の配列を含む。

【0113】

本発明のいくつかの実施形態では、ＥＳＲをコードする遺伝子は、免疫細胞、例えばＴ細胞において発現し、免疫細胞の生存もしくは増殖、または腫瘍微小環境内で細胞を死滅させるＴ細胞の能力を高める。そのゲノムが、免疫細胞の生存もしくは増殖、または腫瘍微小環境内で細胞を死滅させるＴ細胞の能力を高めるＥＳＲをコードする遺伝子を含む免疫細胞は、本発明の一態様である。

【0114】

好ましい実施形態は、ＥＳＲをコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドを含み、該遺伝子は、異種プロモーターに作動可能に連結されている。ＥＳＲをコードする遺伝子に作動可能に連結されることができる例示的な異種プロモーターとしては、ＥＦ１プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰＤＨプロモーター、ＥＥＦ２プロモーター、ユビキチンプロモーター、ＳＶ４０プロモーターまたはＨＳＶＴＫプロモーター、例えば配列番号９４～配列番号１５４から選択される配列がある。好ましい実施形態は、ＥＳＲをコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドを含み、該遺伝子は、異種ポリアデニル化シグナル、例えば哺乳動物細胞を感染させるウイルスに由来のポリアデニル化シグナル、哺乳動物ＥＦ１ポリアデニル化シグナル、哺乳動物成長ホルモンポリアデニル化シグナルまたは哺乳動物グロビンポリアデニル化シグナル、例えば配列番号１６０～配列番号２１７から選択される配列に作動可能に連結されている。いくつかの実施形態は、ＥＳＲをコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドであって、レンチウイルスベクターの一部であるポリヌクレオチドを含む。ＥＳＲをコードするポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクターは、パッケージングされ、免疫細胞を感染させるために使用することができる。より好ましくは、ＥＳＲは、ｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンの一部である遺伝子移入ポリヌクレオチド、例えば、配列番号６および配列番号７を有する配列、または配列番号１４および配列番号１５を有する配列、または配列番号１８および配列番号１９を有する配列、または配列番号２０および配列番号２１を有する配列をさらに含むポリヌクレオチド上にコードされる。ＥＳＲは、配列番号２４と９０％同一である配列と、配列番号２５と９０％同一である配列とをさらに含む、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ ＢｅａｕｔｙトランスポゾンなどのＭａｒｉｎｅｒ型トランスポゾンの一部である、遺伝子移入ポリヌクレオチド上にコードされることができる。ＥＳＲは、配列番号３９７と９０％同一である配列と、配列番号３９８と９０％同一である配列とをさらに含む、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾンなどのｈＡＴ型トランスポゾンの一部である、遺伝子移入ポリヌクレオチド上にコードされることができる。トランスポゾンとＥＳＲをコードするポリヌクレオチドとを含む遺伝子移入ポリヌクレオチドは、キメラ抗原受容体をコードする遺伝子をさらに含むことができる。遺伝子移入ポリヌクレオチドは、トランスポザーゼをコードするポリヌクレオチドとして提供されることができる対応するトランスポザーゼと共に免疫細胞内へと導入することができる。免疫細胞は、好ましくはＴ細胞である。

【0115】

本発明の一態様は、そのゲノムが、ＥＳＲをコードする遺伝子を含む異種ポリヌクレオチドを含む、免疫細胞である。いくつかの実施形態では、異種ポリヌクレオチドは、レンチウイルスベクター、またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾン、またはＳｌｅｅｐｉｎｇ ＢｅａｕｔｙトランスポゾンなどのＭａｒｉｎｅｒ型トランスポゾン、またはＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾンなどのｈＡＴ型トランスポゾンを含む。

【0116】

いくつかの実施形態では、免疫細胞において発現する第２の遺伝子は、免疫細胞の生存または増殖を高めるＥＳＲの効果を増強する。そのゲノムが、ＥＳＲをコードする遺伝子と、免疫細胞の生存または増殖を高める上でＥＳＲの活性を増強する第２の遺伝子（ＥＳＲ強遺伝子）とを含む、免疫細胞は、本発明の一態様である。いくつかの実施形態では、第２の遺伝子は、異種プロモーターに作動可能に連結されており、いくつかの実施形態では、第２の遺伝子は、アポトーシス経路の阻害剤をコードし、いくつかの実施形態では、アポトーシス経路の阻害剤は、カスパーゼ経路におけるドミナントネガティブ遺伝子、例えばカスパーゼ３、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ９、カスパーゼ１０またはＣＡＳＰ８・ＦＡＤＤ様アポトーシス調節因子（ＣＦＬＡＲ）のドミナントネガティブ突然変異体であり、いくつかの実施形態では、アポトーシス経路の阻害剤は、配列番号２４０～２４５のうちから選択される配列のドミナントネガティブ突然変異体を含み、いくつかの実施形態では、アポトーシス経路の阻害剤は、配列番号２３７、２３８または２６１～２７２のうちから選択される配列を含む。

【0117】

好ましくは、ＥＳＲおよびＥＳＲ増強遺伝子を発現させている免疫細胞の半減期は、免疫細胞生存増強遺伝子を発現させていない免疫細胞の半減期と比較して、少なくとも５％、または少なくとも１０％、または少なくとも１５％、または少なくとも２０％、または少なくとも２５％、または少なくとも３０％、または少なくとも３５％、または少なくとも４０％、または少なくとも４５％、または少なくとも５０％、または少なくとも５５％、または少なくとも６０％、または少なくとも６５％、または少なくとも７０％、または少なくとも７５％、または少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも１００％長くなっている。好ましくは、ＥＳＲおよびＥＳＲ増強遺伝子を発現させている免疫細胞の最長寿命は、免疫細胞生存増強遺伝子を発現させていない免疫細胞の最長寿命と比較して、少なくとも５％、または少なくとも１０％、または少なくとも１５％、または少なくとも２０％、または少なくとも２５％、または少なくとも３０％、または少なくとも３５％、または少なくとも４０％、または少なくとも４５％、または少なくとも５０％、または少なくとも５５％、または少なくとも６０％、または少なくとも６５％、または少なくとも７０％、または少なくとも７５％、または少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも１００％長くなっている。好ましくは、ＥＳＲおよびＥＳＲ増強遺伝子を発現させていない免疫細胞の倍加時間は、ＥＳＲおよびＥＳＲ増強遺伝子を発現させている免疫細胞の倍加時間と比較して、少なくとも５％、または少なくとも１０％、または少なくとも１５％、または少なくとも２０％、または少なくとも２５％、または少なくとも３０％、または少なくとも３５％、または少なくとも４０％、または少なくとも４５％、または少なくとも５０％、または少なくとも５５％、または少なくとも６０％、または少なくとも６５％、または少なくとも７０％、または少なくとも７５％、または少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも１００％長い。好ましくは、ＥＳＲおよびＥＳＲ増強遺伝子を発現させている免疫細胞の増殖速度は、ＥＳＲおよびＥＳＲ増強遺伝子を発現させていない免疫細胞の増殖速度と比較して、少なくとも５％、または少なくとも１０％、または少なくとも１５％、または少なくとも２０％、または少なくとも２５％、または少なくとも３０％、または少なくとも３５％、または少なくとも４０％、または少なくとも４５％、または少なくとも５０％、または少なくとも５５％、または少なくとも６０％、または少なくとも６５％、または少なくとも７０％、または少なくとも７５％、または少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも１００％高くなっている。

【0118】

好ましい実施形態は、アポトーシス阻害剤をコードする核酸を含むポリヌクレオチドを含み、該核酸は、異種プロモーターに作動可能に連結されている。アポトーシス阻害剤をコードする遺伝子に作動可能に連結されることができる例示的な異種プロモーターとしては、ＥＦ１プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰＤＨプロモーター、ＥＥＦ２プロモーター、ユビキチンプロモーター、ＳＶ４０プロモーターまたはＨＳＶＴＫプロモーター、例えば配列番号９４～配列番号１５４から選択される配列がある。好ましい実施形態は、アポトーシス阻害剤をコードする核酸を含むポリヌクレオチドを含み、該核酸は、異種ポリアデニル化シグナル、例えば哺乳動物細胞を感染させるウイルスに由来のポリアデニル化シグナル、哺乳動物ＥＦ１ポリアデニル化シグナル、哺乳動物成長ホルモンポリアデニル化シグナルまたは哺乳動物グロビンポリアデニル化シグナル、例えば配列番号１６０～配列番号２１７から選択される配列に作動可能に連結されている。好ましい実施形態は、アポトーシス阻害剤をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドであって、配列番号６および配列番号７を有する配列、または配列番号１４および配列番号１５を有する配列、または配列番号１８および配列番号１９を有する配列、または配列番号２０および配列番号２１を有する配列をさらに含む、ｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンの一部である、ポリヌクレオチドを含む。好ましい実施形態は、アポトーシス阻害剤をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドであって、配列番号２４と９０％同一である配列と、配列番号２５と９０％同一である配列とをさらに含む、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ ＢｅａｕｔｙトランスポゾンなどのＭａｒｉｎｅｒ型トランスポゾンの一部である、ポリヌクレオチドを含む。好ましい実施形態は、アポトーシス阻害剤をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドであって、配列番号３９７と９０％同一である配列と、配列番号３９８と９０％同一である配列とをさらに含む、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾンなどのｈＡＴ型トランスポゾンの一部である、ポリヌクレオチドを含む。アポトーシス阻害剤をコードするポリヌクレオチドを含むｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、対応するトランスポザーゼをコードするポリヌクレオチドと共に免疫細胞内へと導入することができる。好ましい実施形態は、アポトーシス阻害剤をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドであって、レンチウイルスベクターの一部であるポリヌクレオチドを含む。アポトーシス阻害剤をコードするポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクターは、パッケージングされ、免疫細胞を感染させるために使用することができる。免疫細胞は、好ましくはＴ細胞またはＢ細胞である。

【0119】

本発明の一態様は、そのゲノムが、アポトーシス阻害剤をコードする遺伝子を含む異種ポリヌクレオチドを含む、免疫細胞である。いくつかの実施形態では、異種ポリヌクレオチドは、レンチウイルスベクター、またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾン、またはＳｌｅｅｐｉｎｇ ＢｅａｕｔｙトランスポゾンなどのＭａｒｉｎｅｒ型トランスポゾン、またはＴｃＢｕｓｔｅトランスポゾンなどのｈＡＴ型トランスポゾンを含む。

【0120】

場合により、ＥＳＲをコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドは、異種プロモーターに作動可能に連結された、アポトーシス阻害剤をコードする第２の遺伝子をさらに含む。

【0121】

５．３．２．１ ＦＡＳ／４－１ＢＢ
阻害性受容体の細胞外ドメインが共刺激受容体の細胞内ドメインに融合した例示的なＥＳＲとして、本発明者らは、ＴＮＦＲＳＦ６（Ｆａｓ）の細胞外ドメイン（配列番号３２３）を含み、さらにＴＮＦＲＳＦ６（Ｆａｓ）の膜貫通ドメイン（配列番号３８７）を含み、さらにＴＮＦＲＳＦ９（４－１ＢＢ）の細胞内ドメイン（配列番号３４４）を含む、ＥＳＲを設計した。配列番号２７４を含むこのＥＳＲ（Ｆａｓ／４－１ＢＢ）は、第６．２節に説明するような免疫細胞生存増強遺伝子および免疫細胞増殖増強遺伝子である。
Ｆａｓ／４－１ＢＢの活性は、アポトーシス阻害剤Ｃａｓｐ７：Ｃａｓｐ７－ＤＮのドミナントネガティブ版（配列番号２６２）によって増強される。免疫細胞の生存および免疫細胞の増殖を増強させる上でのＦａｓ／４－１ＢＢ＋Ｃａｓｐ７－ＤＮの有効性は、第６．２．１．２節および第６．２．２．２節に示されている。

【0122】

Ｆａｓ／４－１ＢＢをコードする遺伝子を含むポリヌクレオチド（配列番号２７４）は、本発明の一態様である。そのゲノムが、Ｆａｓ／４－１ＢＢをコードする遺伝子を含む免疫細胞は、本発明の一態様である。Ｆａｓ／４－１ＢＢをコードする遺伝子を含み、アポトーシス阻害剤をコードする遺伝子をさらに含むポリヌクレオチドは、本発明の一態様であり、いくつかの実施形態では、アポトーシス阻害剤は、Ｃａｓｐ７のドミナントネガティブ突然変異体、例えば配列番号２６２である。好ましくは、ポリヌクレオチドはトランスポゾンである。そのゲノムが、Ｆａｓ／４－１ＢＢとアポトーシスのドミナントネガティブ阻害剤とをコードする遺伝子を含む免疫細胞は、本発明の一態様である。このような免疫細胞は、細胞培養におけるエクスビボ成長に特に有利である。

【0123】

５．３．２．２ 抗ＣＤ２８／ＯＸ４０は、増殖増強活性を有するＥＳＲである
細胞外ドメインが、共刺激受容体の細胞内ドメインに融合した抗体由来の結合ドメインを含む例示的なＥＳＲとして、本発明者らは、その細胞外ドメインが、ＴＮＦＲＳＦ４（ＯＸ４０）についての膜貫通ドメイン（配列番号３７３）とＴＮＦＲＳＦ４（ＯＸ４０）の細胞内ドメイン（配列番号３４１）とに融合したＣＤ２８アゴニスト抗体ＴＧＮ１４１２（配列番号３４０）の結合ドメインを含むＥＳＲを設計した。抗ＣＤ２８／ＯＸ４０ ＥＳＲの配列は、（配列番号３０７）として与えられている。Ｔ細胞増殖を促進する上でのこのＥＳＲの有効性は、第６．２．２．１において説明されている。

【0124】

抗ＣＤ２８／ＯＸ４０ ＥＳＲをコードする遺伝子を含むポリヌクレオチド（例えば、配列番号ＥＳＲ３４）は、本発明の一態様である。そのゲノムが、抗ＣＤ２８／ＯＸ４０ ＥＳＲをコードする遺伝子を含む免疫細胞は、本発明の一態様である。このような免疫細胞は、細胞培養におけるエクスビボ成長に特に有利である。

【0125】

５．４ キット
本発明はまた、タンパク質としてのもしくは核酸によってコードされたトランスポザーゼ、および／またはトランスポゾンを含む、キット、あるいはタンパク質としてのまたは本明細書に説明するような核酸によってコードされたトランスポザーゼを、トランスポゾンと組み合わせて、場合により医薬として許容され得る担体、アジュバントまたはビヒクルと共に、場合により使用のための説明書と共に含む、本明細書に説明するような遺伝子移入系も特徴とする。本発明のキットの構成要素のいずれもが、立て続けにまたは併行して細胞内へと投与および／または移入することができ、例えば、トランスポザーゼタンパク質またはそのコード核酸は、トランスポゾンの投与および／もしくは移入の前に、該投与および／もしくは移入と同時に、または該投与および／もしくは移入の後に、先に定義した細胞内へと投与および／または移入することができる。あるいは、トランスポザーゼタンパク質またはそのコード核酸の移入の前に、該移入と同時に、または該移入の後に、トランスポゾンは、先に定義した細胞内へと移入することができる。併行して移入する場合、好ましくは、移入の前の転位を回避するために、いずれの構成要素も別個の製剤で提供され、および／または移入の直前に互いに混合される。加えて、キットの少なくとも１つの構成要素の投与および／または移入は、例えば、この構成要素の複数回用量を投与することによって、時間差モードで行うことができる。

【0126】

６．例
以下の例は、本明細書に開示される方法、組成物およびキットを例示するものであり、いかなる方法においても限定するものと解釈されないものとする。様々な同等物が以下の例から明らかになるであろうが、このような同等物もまた、本明細書に開示される本発明の一部であるよう企図される。

【0127】

６．１ 免疫細胞における発現のための遺伝子移入系要素
６．１．１ ヒトＴ細胞株におけるトランスポゾン要素
Ｊｕｒｋａｔ細胞は、ヒトＴ細胞の不死化株であり、該細胞は、ヒト免疫細胞、特にＴ細胞における該細胞の有効性について遺伝子移入系を試験するために有用である。本発明者らは、ゼノパス属（Ｘｅｎｏｐｕｓ）およびカイコガ属（Ｂｏｍｂｙｘ）のｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼがそれらの対応するトランスポゾンをＪｕｒｋａｔヒトＴ細胞株のゲノム内へと転位させる能力を試験した。

【0128】

ゼノパス属（Ｘｅｎｏｐｕｓ）トランスポゾンを含むポリヌクレオチド（ＣＤ１９－ＧＦＰ－ＬＰＮ１、ヌクレオチド配列は配列番号２２３によって付与）を構築し、この中で、ＣＤ１９をコードする核酸（アミノ酸配列は配列番号２２８によって付与）を、配列番号９４によって配列が与えられたＥＦ１プロモーターと、配列番号１７４を有するウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル配列とに作動可能に連結していた。ＣＤ１９遺伝子には、片側でＨＳ４インスレーター（配列番号９２）が、もう片方の側でＤ４Ｚ４インスレーター（配列番号８８）が隣接していた。遺伝子移入ポリヌクレオチドは、１つのインスレーターの遠位側に、標的配列５’－ＴＴＡＡ－３’を、直後に続く配列番号ＩＴＲ８のｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾン逆方向末端反復配列（これは配列番号６の実施形態である）を、直後に続く配列番号１を有する追加のトランスポゾン末端配列をさらに含んでいた。遺伝子移入ポリヌクレオチドは、もう１つのインスレーターの遠位側に、配列番号４を有する追加のトランスポゾン末端配列を、直後に続く配列番号９のｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾン逆方向末端反復配列（これは配列番号７の実施形態である）を、直後に続く標的配列５’－ＴＴＡＡ－３’をさらに含んでいた。トランスポゾンは、ＣＭＶプロモーターと、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル配列とに作動可能に連結されたＧＦＰをコードするポリヌクレオチドをさらに含んでいた。ｐｉｇｇｙＢａｃ様ゼノパス属（Ｘｅｎｏｐｕｓ）トランスポゾンの対応するトランスポザーゼによる該トランスポゾンの転位が、ＣＤ１９遺伝子を転位させるが、プラスミド内にＧＦＰ遺伝子を残すように、ＣＤ１９遺伝子およびＧＦＰ遺伝子を配置した。

【0129】

カイコガ属（Ｂｏｍｂｙｘ）トランスポゾンを含むポリヌクレオチド（ＣＤ１９－ＲＦＰ－ＬＰＮ２、ヌクレオチド配列は配列番号２２４によって付与）を構築し、この中で、ＣＤ１９（配列番号２２８）をコードする遺伝子を、配列番号９４によって配列が与えられたＥＦ１プロモーターと、配列番号１７４を有するウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル配列とに作動可能に連結していた。ＣＤ１９遺伝子には、片側でＨＳ４インスレーター（配列番号９２）が、もう片方の側でＤ４Ｚ４インスレーター（配列番号８８）が隣接していた。遺伝子移入ポリヌクレオチドは、１つのインスレーターの遠位側に、標的配列５’－ＴＴＡＡ－３’を、直後に続く配列番号１４のｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾン逆方向末端反復配列を、直後に続く配列番号１２を有する追加のトランスポゾン末端配列をさらに含んでいた。遺伝子移入ポリヌクレオチドは、もう１つのインスレーターの遠位側に、配列番号１３を有する追加のトランスポゾン末端配列を、直後に続く配列番号１５のｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾン逆方向末端反復配列の直後に続く標的配列５’－ＴＴＡＡ－３’をさらに含んでいた。トランスポゾンは、ＣＭＶプロモーターと、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル配列とに作動可能に連結されたＲＦＰをコードするポリヌクレオチドをさらに含んでいた。ｐｉｇｇｙＢａｃ様カイコガ属（Ｂｏｍｂｙｘ）トランスポゾンの対応するトランスポザーゼによる該トランスポゾンの転位が、ＣＤ１９遺伝子を転位させるが、プラスミド内にＲＦＰ遺伝子を残すように、ＣＤ１９遺伝子およびＲＦＰ遺伝子を配置した。

【0130】

Ｊｕｒｋａｔ細胞の１つの試料（１回の移入あたり２００，０００個の細胞）に、製造元の説明書により、Ｎｅｏｎエレクトロポレーターを使用して、１μｇのＣＤ１９－ＧＦＰ－ＬＰＮ１プラスミドＤＮＡおよび配列番号３７によって配列が与えられたゼノパス属（Ｘｅｎｏｐｕｓ）トランスポザーゼをコードする１００ｎｇのトランスポザーゼｍＲＮＡを移入した。Ｊｕｒｋａｔ細胞の第２の試料（１回の移入あたり２００，０００個の細胞）に、製造元の説明書により、Ｎｅｏｎエレクトロポレーターを使用して、１μｇのＣＤ１９－ＲＦＰ－ＬＰＮ２プラスミドＤＮＡおよび配列番号６８によって配列が与えられたトランスポザーゼをコードする１００ｎｇのカイコガ属（Ｂｏｍｂｙｘ）トランスポザーゼｍＲＮＡを移入した。様々な時間の後、細胞を抗ＣＤ１９抗体で標識し、ＣＤ１９を発現する細胞の百分率をフローサイトメトリーによって決定した。結果を表１に示す。最初に、移入した細胞の約８５％がＣＤ１９発現を示した（表１の第１の行）。これは、細胞内へと取り込まれたプラスミドからの発現と、Ｔ細胞株ゲノム内へと安定して組み込まれたトランスポゾンからの発現との組み合わせに相当する。次の１０日間にわたって、ＣＤ１９を発現する細胞の百分率は、ゼノパス属（Ｘｅｎｏｐｕｓ）ｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンを移入した細胞では１８％まで、カイコガ属（Ｂｏｍｂｙｘ）ｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンを移入した細胞では２７％まで落ち込んだ（表１の第３の行）。これは、ＣＤ１９遺伝子がゲノム内へと組み込まれなかった細胞からの発現の喪失に相当する。移入約１５日後から移入の少なくとも５５日後まで、ＣＤ１９を発現する細胞の百分率はおおよそ一定のままであった（表１の第３～６の行）。この間ずっと、細胞は成長しており、分裂していた。プラスミドは、ヒト細胞において複製する方法がないので、細胞がＣＤ１９を発現し続ける唯一の方法は、ＣＤ１９遺伝子がゲノム内へと組み込まれ、次いで、ゲノムの残りの部分と共に各細胞分裂でＣＤ１９遺伝子を複製する場合である。無作為な断片化を経た組込みの割合は非常に低い。細胞の０．０１～１％が移入ＤＮＡを組み込むと予想することができる。ＣＤ１９遺伝子を組み込んだ細胞の百分率は、無作為な組込みから生じると予想される頻度よりもはるかに高かったが、転位から予想することができる頻度と一致していた。細胞をまたＧＦＰおよびＲＦＰの発現についても分析した。５５日後までに、検出可能なＧＦＰまたはＲＦＰの発現はなかった。先に説明したように、ＧＦＰ遺伝子およびＲＦＰ遺伝子を、トランスポザーゼによって転位することができなかった遺伝子移入プラスミドの一部に配置した。それゆえ、遺伝子移入プラスミドが無作為な断片化および組込みによって細胞ゲノム内へと組み込まれたかどうかについてＧＦＰおよびＲＦＰの発現が予想されるであろう。しかしながら、転位の結果として組み込まれたＣＤ１９遺伝子の場合、ＧＦＰ遺伝子またはＲＦＰ遺伝子はプラスミド内に残され、経時的に徐々に分解されるであろう。高いゲノム組込み頻度および転移不可能な遺伝子の発現の欠如によって、本発明者らが、ゼノパス属（Ｘｅｎｏｐｕｓ）およびカイコガ属（Ｂｏｍｂｙｘ）のｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾン系に基づく遺伝子移入系が両方とも、ポリヌクレオチドをヒトＴ細胞内へと組み込むことができると結論付けることにつながる。

【0131】

移入の７０日後、本発明者らは、蛍光標示式細胞分取法を使用して、ＣＤ１９を発現している細胞を、ＣＤ１９を発現していない細胞と選別した。次いで、これらの細胞を液体培養において２４０日間にわたって維持し、様々な時点で分析して組込みの安定性を評価した。図１は、移入の１５５日後およびＦＡＣＳ分取法の８５日後のＣＤ１９の発現をｙ軸に、蛍光タンパク質の発現をｘ軸に示す。細胞は本質的にすべて、依然としてＣＤ１９を発現しており、いずれの細胞も蛍光タンパク質を発現していなかった。移入の２４０日後に同一の結果が得られた。本発明者らは、ゼノパス属（Ｘｅｎｏｐｕｓ）およびカイコガ属（Ｂｏｍｂｙｘ）ｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンが、選択圧がない場合でさえ、少なくとも２４０日間安定して維持されると結論付ける。本発明者らはまた、発現の維持は、トランスポゾン上にコードされた遺伝子が２００を超える細胞世代の間にサイレンシングされていなかったことを示すことも注記する。したがって、ゼノパス属（Ｘｅｎｏｐｕｓ）およびカイコガ属（Ｂｏｍｂｙｘ）ｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾン系に基づく遺伝子移入系は両方とも、発現のための遺伝子をヒトＴ細胞内へと送達するのに有用である。

【0132】

６．１．２ Ｔ細胞におけるプロモーター要素
６．１．２．１ Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるプロモーター試験
Ｊｕｒｋａｔ細胞は、ヒトＴ細胞の不死化株であり、該細胞は、ヒト免疫細胞、特にＴ細胞における該細胞の有効性について遺伝子移入系を試験するために有用である。

【0133】

配列番号２１８によって配列が与えられた第一のポリヌクレオチドと配列番号２１９によって配列が与えられた第二のポリヌクレオチドとの間に、場合によりイントロン要素と組み合わされたプロモーター要素を導入することによって、ヒトＣＤ１９の発現のためのトランスポゾン内へと、該プロモーター要素をクローン化して、配列が配列番号９０によって与えられたインスレーター配列と、配列が配列番号９３によって与えられたインスレーター配列とを含み、一対のトランスポゾン末端が隣接しており、片方が配列番号６の実施形態である配列番号８を含み、もう片方が配列番号７の実施形態である配列番号９を含む、環状プラスミドを生成した。Ｊｕｒｋａｔ細胞（１回の移入あたり２００，０００個の細胞）に、製造元の説明書により、Ｎｅｏｎエレクトロポレーターを使用して、１μｇのプラスミドＤＮＡと、配列番号３７のアミノ酸配列を有するゼノパス属（Ｘｅｎｏｐｕｓ）トランスポザーゼをコードする１００ｎｇのトランスポザーゼｍＲＮＡとを移入した。

【0134】

移入後の様々な時点でＦＡＣＳ分析のために試料を採取し、生細胞に関してＣＤ１９を発現する生細胞の割合を計数したので、表２に示す。表２は、ＣＤ１９がＥＦ１（例えば、配列番号９４および配列番号１３２）およびＥＥＦ２（例えば、配列番号１０８）に作動可能に連結された細胞が、ＣＤ１９発現細胞の高い初期百分率を示した（Ｄ列）が、これは持続されなかった（例えば、Ｆ列およびＧ列）ことを示す。例えば、ラットＥＦ１駆動性ＣＤ１９を発現する細胞の百分率は、２日後と２３日後との間で８７％から２５％まで落ち込み、同様に、ヒトＥＦ１駆動性ＣＤ１９を発現する細胞の百分率は、２日後と２３日後との間で７６％から３７％まで落ち込んだ。対照的に、ＣＤ１９がＧＡＰＤＨ、ユビキチンおよびＰＧＫプロモーターに作動可能に連結されたとき、細胞は、２日後と２３日後との間の各試料時点で、ＣＤ１９を発現する細胞の約５０％で、はるかに一貫して発現レベルを持続させていたことを示した（Ｄ列～Ｇ列）。Ｈ列は、２日後と２３日後との間のＣＤ１９発現細胞の低下率を示す。

【0135】

ＣＤ１９は、細胞表面上に発現する分子である。膜貫通タンパク質の実質的な過剰発現は毒性である可能性がある。それゆえ、本発明者らは、ＣＤ１９発現細胞の最も劇的な喪失を示したプロモーターが、最も強い発現を駆動していたものであるかもしれないと推論した。プロモーター強度を評価するために、本発明者らは、各プロモーターを、ＧＦＰをコードする遺伝子に作動可能に連結し、該遺伝子をＨＥＫ細胞内へと三つ組で移入した。２日後、蛍光光度計で蛍光を測定した。平均蛍光値を表２のＩ列に示す。最も強いプロモーターはＥＦ１およびＥＥＦ２（Ｉ列の第１、第２および第６の行）であり、これらはＣＤ１９発現細胞の百分率の最も実質的な低下を示した同じプロモーターであった（表２のＨ列）。対照的に、ＰＧＫ、ＧＡＰＤＨおよびユビキチンプロモーターは、最も強いＥＦ１プロモーターの８．６％、２８％および２２％しか活性がなかったが、これらのプロモーターに作動可能に連結されたＣＤ１９を発現する細胞の百分率は維持された。したがって、中程度に活性のあるプロモーターは、毒性を引き起こすことなく機能を達成するのに十分に高レベルの膜貫通タンパク質を産生するので、Ｔ細胞における膜貫通タンパク質をコードする遺伝子の発現にとって非常に活性のあるプロモーターよりも有利であるようである。膜貫通タンパク質としては、Ｔ細胞受容体、キメラ抗原受容体および増強型シグナル伝達受容体がある。中程度に活性のあるプロモーターとしては、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素プロモーターおよびユビキチンプロモーターがある。中程度に活性のあるプロモーターにはまた、例えば、減弱したＥＦ１プロモーターまたは減弱したＥＥＦ２プロモーターなど、イントロンの除去またはプロモーターの部分的欠失によって減弱した高度に活性のあるプロモーターが含まれてもよい。

【0136】

これは予想外の結果である。キメラ抗原受容体を発現する際の最新の研究は、ＣＭＶプロモーターまたはＥＦ１プロモーターなどの強力な活性のあるプロモーターを用いて行われる。対照的に、本書で本発明者らは、このような高度に活性のあるプロモーターが、膜貫通タンパク質に作動可能に連結されている時に不利であることを発見した。Ｔ細胞における膜貫通タンパク質をコードする遺伝子の発現に有利な遺伝子移入系は、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素プロモーターユビキチンプロモーター、減弱したＥＦ１プロモーターまたは減弱したＥＥＦ２プロモーターから選択されるプロモーターに作動可能に連結された膜貫通タンパク質をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドを含む。例示的なホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター配列は、配列番号１１５～１１８として与えられる。例示的なグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素プロモーター配列は、配列番号９７～１０７として与えられる。例示的なユビキチンプロモーター配列は、配列番号９５および１２５～１２７として与えられる。該ポリヌクレオチドはさらに、配列番号８７～９３から選択されるインスレーター配列を含んでもよい。好ましくは、遺伝子移入ポリヌクレオチドは、トランスポゾン末端が、対応するトランスポザーゼによって認識されおよび転位し、このような転位がプロモーターおよびその作動可能に連結された遺伝子をＴ細胞などの免疫細胞のゲノム内へと挿入することができるように、トランスポゾン末端を含む。該ポリヌクレオチドは、配列番号６および配列番号７を有する配列、または配列番号１４および配列番号１５を有する配列、または配列番号１８および配列番号１９を有する配列、または配列番号２０および配列番号２１を有する配列をさらに含む、ｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンの一部であってよい。該ポリヌクレオチドは、配列番号２４と９０％同一である配列と、配列番号２５と９０％同一である配列とをさらに含む、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ ＢｅａｕｔｙトランスポゾンなどのＭａｒｉｎｅｒ型トランスポゾンの一部であってよい。該ポリヌクレオチドは、配列番号３９７と９０％同一である配列と、配列番号３９８と９０％同一である配列とをさらに含む、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾンなどのｈＡＴ型トランスポゾンの一部であってよい。実験を繰り返し、８日後、細胞を抗ＣＤ１９抗体で標識し、８日後にＣＤ１９を発現する細胞の平均蛍光強度をフローサイトメトリーによって測定した。平均蛍光強度値を表３のＤ列に示す。比較のために、ＣＤ１９を天然に発現するヒトＢ細胞を細胞１個あたり約２２，０００分子で標識し、平均蛍光強度を測定した。Ｂ細胞の平均蛍光強度を使用して、表３のＥ列に示すように、Ｊｕｒｋａｔ細胞の表面上に発現したＣＤ１９分子の数を計算した。試験したプロモーターすべてについて、各細胞の表面上のＣＤ１９分子の数は、Ｂ細胞上に天然に認められる数の２～５倍であった。ＥＦ１プロモーターに作動可能に連結されたＣＤ１９を移入した細胞の平均蛍光強度は、例えば、表２のＩ列、第５および第６の行に示されるように、ＰＧＫプロモーターがＥＦ１プロモーターよりもはるかに活性が低いことが公知であるにもかかわらず、ＰＧＫプロモーターに作動可能に連結されたＣＤ１９を移入した細胞の値の２０％以内であった（表３の第５および第６の行を比較されたい）。本発明者らはこのことを、ＣＤ１９の発現がＢ細胞の表面に通常見られる数の約５倍を超える細胞が毒性を受けるからであると解釈している。ＥＦ１はより強力なプロモーターであるので、ＥＦ１プロモーターに作動可能に連結されたＣＤ１９を移入した、より高い割合の細胞は、この毒性限界を超えて死滅する。このことは、表２の第６の行において２日後から８日後の間に観察されたＣＤ１９発現細胞の喪失をもたらす。したがって、中程度に活性のあるプロモーターは、膜貫通タンパク質の高レベルの発現を生じさせることはできるが、そのレベルは、毒性であるほど高いという可能性は低い。このことは、キメラ抗原受容体などの膜貫通タンパク質のＴ細胞への移入の上で有利である。

【0137】

表３は、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９８、配列番号１０８、配列番号１１５および配列番号１３２によって配列が与えられたプロモーターが、Ｊｕｒｋａｔ不死化Ｔ細胞における高レベルのＣＤ１９発現を駆動する上ですべて有効であったことを示す。Ｔ細胞における遺伝子の発現に有利な遺伝子移入系は、配列番号９４、９５、９８、１０８、１１５および１３２から選択される配列を有するプロモーターを含むポリヌクレオチドを含む。Ｔ細胞における遺伝子の発現に有利な遺伝子移入系は、配列番号８７～９１から選択されるインスレーター配列と、配列番号９２および９３から選択されるインスレーター配列とを含むポリヌクレオチドを含む。Ｔ細胞における遺伝子の発現に有利な遺伝子移入系は、配列番号６の配列を含むトランスポゾン末端と、配列番号７の配列を含むトランスポゾン末端とを含むポリヌクレオチドを含む。

【0138】

６．１．２．２ 初代Ｔ細胞におけるプロモーター試験
配列番号２２０によって配列が与えられた第一のポリヌクレオチドと配列番号２２１によって配列が与えられた第二のポリヌクレオチドとの間に、プロモーター要素を導入することによって、ヒトＣＤ１９の発現のためのトランスポゾン内へと、該プロモーター要素をクローン化して、配列が配列番号８８によって与えられたインスレーター配列と、配列が配列番号９２によって与えられたインスレーター配列とを含み、一対のトランスポゾン末端が隣接しており、片方が標的部位５’－ＴＴＡＡ－３’、直後に続く配列番号８の配列、および直後に続く配列番号１を含み、もう片方が配列番号４、直後に続く配列番号９の配列、および直後に続く標的部位５’－ＴＴＡＡ－３’を含む、環状プラスミドを生成した。初代Ｔ細胞（１回の移入あたり２００，０００個の細胞）に、製造元の説明書により、Ｎｅｏｎエレクトロポレーターを使用して、１μｇのプラスミドＤＮＡと、配列番号３７のポリペプチド配列を有するゼノパス属（Ｘｅｎｏｐｕｓ）トランスポザーゼをコードする１００ｎｇのトランスポザーゼｍＲＮＡとを移入した。１１日後、細胞を抗ＣＤ１９抗体で標識し、平均蛍光強度をフローサイトメトリーによって測定した。

【0139】

表４は、配列番号９７、配列番号９８および配列番号１０８～配列番号１１４によって配列が与えられたプロモーターが、初代Ｔ細胞における高レベルのＣＤ１９発現を駆動する上ですべて有効であったことを示す。さらに、表４は、異なるプロモーターを使用することによって、異なる発現レベルを達成することができることを示す。Ｔ細胞における遺伝子の発現に有利な遺伝子移入系は、配列番号９７、９８および１０８～１１４から選択される配列を有するプロモーターを含むポリヌクレオチドを含む。Ｔ細胞における遺伝子の発現に有利な遺伝子移入系は、配列番号８の配列の直後に配列番号１の配列を含むトランスポゾン末端と、配列番号４の直後に配列番号９の配列を含むトランスポゾン末端とを含むポリヌクレオチドを含む。

【0140】

６．２ 免疫細胞の生存および有効性を増強するための要素
本発明の一態様は、免疫細胞の生存、増殖または拡大を増強するために使用することができる配列の開示である。

【0141】

細胞生存は、集団中の細胞の半分だけが生存したままであるのにかかる時間の長さ（半減期）、または集団中の細胞がすべて死滅するのにかかる時間の長さ（最長寿命）として測定することができる。免疫細胞生存増強遺伝子を発現する免疫細胞は、免疫細胞生存増強遺伝子を発現していない免疫細胞よりも長く生存したままである。この効果を測定する１つの方法は、異種ポリヌクレオチドを免疫細胞のゲノム内へと組み込むことであって、該異種ポリヌクレオチドは、免疫細胞内で発現する調節配列に作動可能に連結された免疫細胞生存増強遺伝子を含み、言い換えれば、免疫細胞における発現に有効である。異種ポリヌクレオチドは、選択可能マーカー、例えば蛍光タンパク質または細胞表面タンパク質などの容易に同定されることができるものをコードする遺伝子をさらに含む。そのゲノムが異種ポリヌクレオチドを含む細胞は、免疫細胞生存増強遺伝子を発現し、該細胞は選択可能マーカーの存在によって同定することができる。生存の増強は、免疫細胞生存増強遺伝子を発現していない免疫細胞と比較した、免疫細胞生存増強遺伝子を発現している免疫細胞の半減期の延長として測定することができる。免疫細胞生存増強遺伝子を発現させている免疫細胞の半減期は、免疫細胞生存増強遺伝子を発現させていない免疫細胞の半減期と比較して、少なくとも５％、または少なくとも１０％、または少なくとも１５％、または少なくとも２０％、または少なくとも２５％、または少なくとも３０％、または少なくとも３５％、または少なくとも４０％、または少なくとも４５％、または少なくとも５０％、または少なくとも５５％、または少なくとも６０％、または少なくとも６５％、または少なくとも７０％、または少なくとも７５％、または少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも１００％長くなっている。この延長は、生存増強遺伝子を有する特定の免疫細胞の生存と生存増強遺伝子を有しない特定の免疫細胞の生存とを等しいサイズの集団において比較することによって測定することができる。免疫細胞生存増強遺伝子を発現させている免疫細胞の最長寿命は、免疫細胞生存増強遺伝子を発現させていない免疫細胞の最長寿命と比較して、少なくとも５％、または少なくとも１０％、または少なくとも１５％、または少なくとも２０％、または少なくとも２５％、または少なくとも３０％、または少なくとも３５％、または少なくとも４０％、または少なくとも４５％、または少なくとも５０％、または少なくとも５５％、または少なくとも６０％、または少なくとも６５％、または少なくとも７０％、または少なくとも７５％、または少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも１００％長くなっている。最長寿命の変化率は、生存増強遺伝子を有する特定の免疫細胞と生存増強遺伝子を有さない特定の免疫細胞との等しいサイズの集団を比較することによって測定することができる。

【0142】

細胞増殖は、集団中の細胞の数が２倍になるのにかかる時間の長さ（倍加時間）として、または細胞集団が単位時間内に大きくなる割合（増殖速度）として測定することができる。免疫細胞増殖増強遺伝子を発現する免疫細胞は、免疫細胞増殖増強遺伝子を発現していない免疫細胞よりも、長く分裂することができるか、または迅速に分裂することができる。この効果を測定する１つの方法は、異種ポリヌクレオチドを免疫細胞のゲノム内へと組み込むことであって、該異種ポリヌクレオチドは、免疫細胞内で発現する調節配列に作動可能に連結された免疫細胞増殖増強遺伝子を含む。異種ポリヌクレオチドは、選択可能マーカー、例えば蛍光タンパク質または細胞表面タンパク質などの容易に同定されることができるものをコードする遺伝子をさらに含む。そのゲノムが異種ポリヌクレオチドを含む細胞は、免疫細胞増殖増強遺伝子を発現し、該細胞は選択可能マーカーの存在によって同定することができる。増殖の増強は、免疫細胞増殖増強遺伝子を発現していない免疫細胞と比較した、免疫細胞増殖増強遺伝子を発現している免疫細胞の倍加時間の短縮として測定することができる。免疫細胞増殖増強遺伝子を発現させていない免疫細胞の倍加時間は、免疫細胞増殖増強遺伝子を発現させている免疫細胞の倍加時間と比較して、少なくとも５％、または少なくとも１０％、または少なくとも１５％、または少なくとも２０％、または少なくとも２５％、または少なくとも３０％、または少なくとも３５％、または少なくとも４０％、または少なくとも４５％、または少なくとも５０％、または少なくとも５５％、または少なくとも６０％、または少なくとも６５％、または少なくとも７０％、または少なくとも７５％、または少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも１００％長い。免疫細胞増殖増強遺伝子を発現させていない免疫細胞の増殖速度は、免疫細胞増殖増強遺伝子を発現させている免疫細胞の増殖速度と比較して、少なくとも５％、または少なくとも１０％、または少なくとも１５％、または少なくとも２０％、または少なくとも２５％、または少なくとも３０％、または少なくとも３５％、または少なくとも４０％、または少なくとも４５％、または少なくとも５０％、または少なくとも５５％、または少なくとも６０％、または少なくとも６５％、または少なくとも７０％、または少なくとも７５％、または少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも１００％高い。増殖速度または倍加時間は、免疫細胞が免疫細胞増殖増強遺伝子を発現し始めた後の様々な時点で測定することができる。免疫細胞増殖増強遺伝子を発現する免疫細胞の増殖速度は、異種ポリヌクレオチドが免疫細胞のゲノム内へと組み込まれた、または免疫細胞が免疫細胞増殖促進遺伝子を発現し始めた、または免疫細胞が免疫細胞増殖増局遺伝子を発現し始めた５日後、または１０日後、または１５日後、または２０日後、または２５日後、または３０日後、または３５日後、または４０日後、または４５日後、または５０日後、または５５日後、または６０日後に、免疫細胞増殖増強遺伝子を発現していない同じ免疫細胞の増殖速度と比較して高い可能性がある。

【0143】

本発明の別の態様は、正常な免疫細胞の有効性を低減させる条件下で免疫細胞が有効なままであることができる時間の長さを延長するために使用することができる配列の開示である。正常なＴ細胞は、抗原に繰り返し曝露されるとアポトーシスを起こし（「再刺激誘導性細胞死」）、死滅しないＴ細胞は、抗原を発現する細胞を死滅させることができなくなる（Ｖｏｓｓ ｅｔ．，ａｌ．（２０１７）Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ．４０８：１９０－１９６．「Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ａｎｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ：ｄｅｆｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｃｏｎｔｏｕｒｓ ｏｆ ａ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ」）。このことは自己免疫を低減させるのに役立つが、Ｔ細胞が固形腫瘍と有効に戦うのを妨げる上で寄与する因子であった。したがって、これらの状況下では、免疫細胞機能を保持し、抗原曝露の反復中の再刺激誘導性細胞死を防ぐことが望ましい。再刺激誘導性細胞死は、抗原、例えば腫瘍細胞上の抗原への２回、３回、４回またはそれより多数回の曝露後に生存するＴ細胞の数を計数することによって測定することができる。再刺激誘導性細胞死を防ぐための異種発現配列の能力は、該配列を発現するＴ細胞の生存を、該配列を発現していないＴ細胞の生存と、両方の集団が同じ程度および頻度の抗原曝露を有するときに比較することによって測定することができる。生存の増強は、抗原への曝露の反復の際に免疫細胞生存増強遺伝子を発現していない免疫細胞と比較した、免疫細胞生存増強遺伝子を発現している残りの免疫細胞の数の増加として測定することができる。例えば、腫瘍細胞において発現した抗原に対する曝露の反復の際に免疫細胞生存増強遺伝子を発現させていない生存中の免疫細胞の数と比較した、免疫細胞生存増強遺伝子を発現させている生存中の免疫細胞の数は、少なくとも１０％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも１００％、または少なくとも１５０％、または少なくとも２００％、または少なくとも２５０％、または少なくとも３００％、または少なくとも３５０％、または少なくとも４００％、または少なくとも４５０％、または少なくとも５００％増加している。

【0144】

再刺激誘導性細胞死に対する抵抗性および免疫細胞の有効性の持続は、腫瘍細胞への２回、３回、４回またはそれより多数回の曝露後に腫瘍細胞などの細胞を死滅させるＴ細胞の能力を計数することによって測定することができる。免疫細胞機能を持続させる異種発現配列の能力は、該配列を発現しているＴ細胞および該配列を発現していないＴ細胞の両方の集団が、抗原曝露の同じ程度および頻度を有するとき、該Ｔ細胞の死滅活性を比較することによって測定することができる。Ｔ細胞有効性増強遺伝子を発現させるＴ細胞の細胞死滅活性は、腫瘍細胞への曝露の反復の際にＴ細胞有効性増強遺伝子を発現させていない生存中の免疫細胞の数と比較して、少なくとも１０％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも１００％、または少なくとも１５０％、または少なくとも２００％、または少なくとも２５０％、または少なくとも３００％、または少なくとも３５０％、または少なくとも４００％、または少なくとも４５０％、または少なくとも５００％上昇する。

【0145】

６．２．１ Ｔ細胞形質転換要素
６．２．１．１ 初代Ｔ細胞における突然変異したＳＴＡＴ３の発現
ＳＴＡＴ３：ＳＴＡＴ３－Ｙ６４０Ｆの突然変異型をコードする遺伝子を、配列番号１１５によって配列が与えられたＰＧＫプロモーターと、配列番号１８２の配列を有するウサギグロビンポリアデニル化シグナルとに作動可能に連結し、遺伝子移入ポリヌクレオチドへとクローン化した。遺伝子移入ポリヌクレオチドは、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）プロモーターとウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル配列とに作動可能に連結されたＤａｓｈｅｒＧＦＰをコードする遺伝子を含むＧＦＰレポーター（配列番号２２２の配列を有する）をさらに含んでいだ。２つのオープンリーディングフレームを、多様に転写するように構成した（２つのプロモーターは互いに隣接し、反対方向に転写された）。２つのオープンリーディングフレームには、片方の側からＨＳ４インスレーター（配列番号９２の配列を有する）が、もう片方の側からＤ４Ｚ４インスレーター（配列番号８８の配列を有する）が隣接していた。遺伝子移入ポリヌクレオチドは、１つのインスレーターの遠位側に、標的配列５’－ＴＴＡＡ－３’を、直後に続く配列番号１０のｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾン逆方向末端反復配列（これは配列番号６の実施形態である）を、直後に続く配列番号３を有する追加のトランスポゾン末端配列（これは、配列番号１と＞９５％同一である）をさらに含んでいた。遺伝子移入ポリヌクレオチドは、もう１つのインスレーターの遠位側に、配列番号５の追加のトランスポゾン末端配列（配列番号４と＞９５％同一である）を、直後に続く配列番号１１のｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾン逆方向末端反復配列（これは配列番号７の実施形態である）を、直後に続く標的配列５’－ＴＴＡＡ－３’をさらに含んでいた。

【0146】

Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＥａｓｙＳｅｐ Ｈｕｍａｎ ＣＤ８陽性選別キットを製造元の説明書により使用して、Ｔ細胞を正常ドナー末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から調製した。Ｔ細胞を、放射線照射されたフィーダー細胞とのインキュベーションによって２～３日間刺激して、分泌されたＣＤ３、ＣＤ２８、ＩＬ－２、ＩＬ－７およびＩＬ－１５を提供した。おおよそ１００，０００個のＴ細胞に、製造元の説明書により、Ｎｅｏｎエレクトロポレーターを使用して、１μｇのトランスポゾンＤＮＡと、配列番号３７のポリペプチド配列を有するトランスポザーゼをコードする１００ｎｇのｍＲＮＡとを移入した。移入したＴ細胞をフィーダー細胞と混合し、３７℃でインキュベートした。移入後の様々な時点で試料を採取し、蛍光標識した抗ＣＤ８抗体とともにインキュベートし、ＣＤ８およびＤａｓｈｅｒ ＧＦＰについて蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）で分析した。

【0147】

図２は、細胞染色の経時的な分布を示す。ＣＤ８染色は、ＣＤ８＋Ｔ細胞についてのマーカーとして使用され、パネルＡに示される各ＦＡＣＳプロットのｙ軸に示されている。ＧＦＰ蛍光は、各ＦＡＣＳプロットのｘ軸に示されている。ＧＦＰ蛍光は、細胞がＧＦＰを発現していることを示しており、本書では、細胞内の遺伝子移入ポリヌクレオチドの存在を示すためのマーカーとしても使用される。１４日後に、細胞のおおよそ９７．８％は、強いＣＤ８染色を示し（すなわち、該細胞はＦＡＣＳプロットの上半分にある）、分析した細胞のおおよそ９．８％がいずれもＣＤ８＋であり、ＧＦＰ蛍光を示した。ＣＤ８を発現しかつＧＦＰ蛍光を呈する細胞の割合は、経時的に上昇した。すなわち、２８日後で２３．９％、３４日後で４１．１％、４１日後で６２．４％および４８日後で７９．３％であった。ＧＦＰを発現しているＴ細胞集団の割合の上昇は、そのゲノムが遺伝子移入ポリヌクレオチドを含むＴ細胞が、そのゲノムが遺伝子移入ポリヌクレオチドを含まないＴ細胞と比較して生存の利点を有することを示しているか、またはそのゲノムが遺伝子移入ポリヌクレオチドを含むＴ細胞が、そのゲノムが遺伝子移入ポリヌクレオチドを含まないＴ細胞と比較して増殖の利点を有することを示している。このような生存または増殖の利点は、ＧＦＰの発現ではなく（本発明者らは、ＧＦＰ発現が生存または増殖の利点と相関していない多くの例をみている）、ＳＴＡＴ３－Ｙ６４０Ｆの発現に由来する。本発明者らは、Ｔ細胞におけるＳＴＡＴ３－Ｙ６４０Ｆの発現が、Ｔ細胞に生存または増殖の利点を提供する、およびＳＴＡＴ３の活性化突然変異体をコードする遺伝子が、第５．３．１．１節において説明するような免疫細胞生存増強遺伝子および免疫細胞増殖増強遺伝子である、と結論付ける。

【0148】

６．２．１．２ 初代Ｔ細胞におけるＴ細胞形質転換要素およびＥＳＲの発現
Ｔ細胞形質転換要素と増強型シグナル伝達受容体とのセットをコードする遺伝子を、別々の遺伝子移入ポリヌクレオチド内へと個別にクローン化した。各場合では、該遺伝子を、配列が配列番号１１５によって与えられたＰＧＫプロモーターと、配列番号１８２の配列を有するウサギグロビンポリアデニル化シグナルとに作動可能に連結し、遺伝子移入ポリヌクレオチド内へとクローン化した。遺伝子移入ポリヌクレオチドは、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）プロモーターとウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル配列とに作動可能に連結されたＤａｓｈｅｒＧＦＰをコードする遺伝子を含むＧＦＰレポーター（配列番号２２２の配列を有する）をさらに含んでいだ。２つのオープンリーディングフレームを、多様に転写するように構成した（２つのプロモーターは互いに隣接し、反対方向に転写された）。２つのオープンリーディングフレームには、片方の側からＨＳ４インスレーター（配列番号９２の配列を有する）が、もう片方の側からＤ４Ｚ４インスレーター（配列番号８８の配列を有する）が隣接していた。遺伝子移入ポリヌクレオチドは、１つのインスレーターの遠位側に、標的配列５’－ＴＴＡＡ－３’を、直後に続く配列番号１０のｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾン逆方向末端反復配列（これは配列番号６の実施形態である）を、直後に続く配列番号３を有する追加のトランスポゾン末端配列（これは、配列番号１と＞９５％同一である）をさらに含んでいた。遺伝子移入ポリヌクレオチドは、もう１つのインスレーターの遠位側に、配列番号５の追加のトランスポゾン末端配列（配列番号４と＞９５％同一である）を、直後に続く配列番号１１のｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾン逆方向末端反復配列（これは配列番号７の実施形態である）を、直後に続く標的配列５’－ＴＴＡＡ－３’をさらに含んでいた。

【0149】

Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＥａｓｙＳｅｐ Ｈｕｍａｎ ＣＤ８陽性選別キットを製造元の説明書により使用して、Ｔ細胞を正常ドナー末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から調製した。Ｔ細胞を、放射線照射されたフィーダー細胞とのインキュベーションによって２～３日間刺激して、分泌されたＣＤ３、ＣＤ２８、ＩＬ－２、ＩＬ－７およびＩＬ－１５を提供した。おおよそ１００，０００個のＴ細胞に、製造元のプロトコルにより、Ｎｅｏｎエレクトロポレーターを使用して、１μｇのトランスポゾンＤＮＡと、配列番号３７のポリペプチド配列を有するトランスポザーゼをコードする１００ｎｇのｍＲＮＡとを移入した。移入したＴ細胞をフィーダー細胞と混合し、３７℃でインキュベートした。移入２４日後に試料を採取し、蛍光標識した抗ＣＤ８抗体とともにインキュベートし、ＣＤ８およびＤａｓｈｅｒ ＧＦＰについて蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）で分析した。データを表５に示す。

【0150】

第６．２．１．１節に説明されているように、ＧＦＰを発現するＣＤ８＋細胞の濃度は、第５．３．１．１節にも説明されているように、遺伝子移入ポリヌクレオチドが、Ｔ細胞に生存または増殖の利点を付与する遺伝子を含む、という指標である。この遺伝子移入ポリヌクレオチドのセットでは、Ｔ細胞生存に影響を及ぼさないと予想される細胞表面マーカーとしてＣＤ１９が含まれており、それゆえ、本発明者らは、ＣＤ１９を移入した細胞におけるＧＦＰ発現細胞の百分率（３％、表５の第１０の行を参照されたい）を、推定される生存増強遺伝子を基準と比較して測定するためのレベルとして使用した。２つの活性化突然変異Ｄ１２４ＥおよびＴ１９５Ｐを有するＣＤ２８をコードする遺伝子を移入したＴ細胞は、ＣＤ１９を移入した細胞の１０倍を超える数のＧＦＰ発現細胞を有していた（表５の第１の行）。ＣＤ３ｅまたはＣＤ３ｄに融合した表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を認識する抗体断片をコードする遺伝子は、ＣＤ１９と比較してＧＦＰ発現細胞の百分率の４倍増を付与するように見えた（それぞれ表５の第２および第３の行）が、本発明者らは、ＣＤ３ｄ融合の第２の測定がはるかに低いＧＦＰ発現率を示したことを注記する（表５の第１５の行）。天然のサバイビン遺伝子は、ＣＤ１９と比較してＧＦＰ発現の３倍増を付与するようであった（表５の第４および第５の行）。２つのＥＳＲもまた示されている。ＣＤ２８膜貫通ドメイン（配列番号３９５の配列を有する）とＴ１９５Ｐ活性化突然変異を含むＣＤ２８細胞内ドメイン（配列番号３５２の配列を有する）とに融合した抗ＣＤ２８抗体（配列番号３４０の配列を有する）を含む第１のものにより、ＧＦＰ発現細胞の数が約２倍増加した（表５の第６および第７の行）。ＴＮＦＲＳＦ１Ａ細胞外ドメイン（配列番号３３０の配列を有する）と、膜貫通ドメイン（配列番号３９４の配列を有する）と、４－１ＢＢ細胞内ドメイン（配列番号３４４の配列を有する）とを含む第２のＥＳＲは、ＧＦＰ発現細胞の数の２倍増をわずかに下回った（表５の第８および第９の行）。２つの同時移入は、ＧＦＰ発現細胞の百分率を上昇させるのに特に有効であった。表５の第１６の行に示される１つの同時移入は、Ｆａｓ受容体（ＴＮＦＲＳＦ６）の細胞外ドメインおよび膜貫通ドメイン（それぞれ配列番号３２３および配列番号３８７の配列を有する）と、４－１ＢＢ（ＴＮＦＲＳＦ９）の細胞内ドメイン（配列番号３４４の配列を有する）とを含むＥＳＲ（第５．３．２．１節においても説明）をコードする第１の遺伝子、ならびにカスパーゼ７のドミナントネガティブ突然変異体をコードする第２の遺伝子（配列番号２６２の配列を有する）を含んでいた。表５の第１７の行に示す第２の同時移入は、ＳＴＡ３－Ｙ６４０Ｆをコードする第１の遺伝子（配列番号２４６の配列を有する）と、ＰＩＫ３ＣＡ－Ｌ１００１Ｐをコードする第２の遺伝子（配列番号２５７の配列を有する）とを含んでいた。これらの同時移入は、２４日後にＧＦＰ発現細胞のそれぞれ５１％および４６％をもたらした。

【0151】

本発明者らは、Ｔ細胞におけるＣＤ２８－Ｄ１２４Ｅ－Ｔ１９５Ｐの発現、またはＥＳＲ Ｆａｓ／４－１ＢＢ＋Ｃａｓｐ７－ＤＮの共発現、またはＳＴＡＴ３－Ｙ６４０Ｆ＋ＰＩＫ３ＣＡ－Ｌ１００１Ｐの共発現が、Ｔ細胞に生存または増殖の利点を提供し、これらの遺伝子または遺伝子の組み合わせが、第５．３．１．１節に説明されているような免疫細胞生存増強遺伝子および免疫細胞増殖増強遺伝子であると結論付ける。

【0152】

６．２．１．３ サバイビンとＣＤ２８の活性化突然変異体とはＴ細胞機能を増強する
本発明者らは、第６．２．１．２節および表５に示されるように、Ｔ細胞の成長／生存および／または増殖を増強する、サバイビンまたはＣＤ２８のＤ１２４Ｅ／Ｔ１９５Ｐ活性化二重突然変異体の発現を発見した。これらの遺伝子がまたＴ細胞の挙動性能も増強することができるかどうかを試験するために、本発明者らは、該遺伝子を、Ｂ細胞上にのみ天然に認められるエピトープであるＣＤ１９を標的とするキメラ抗原受容体と共にＴ細胞のゲノム内へと組み込み、改変Ｔ細胞が形質転換Ｂ細胞株の細胞を死滅させる能力を試験した。

【0153】

３つの遺伝子移入ポリヌクレオチドを、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）プロモーターとウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル配列とに作動可能に連結されたＤａｓｈｅｒＧＦＰをコードする遺伝子を含むＧＦＰレポーター（配列番号２２２の配列）を各々含んで構築した。ＧＦＰ遺伝子には、片側でＨＳ４インスレーター（配列番号９２）が、もう片側でＤ４Ｚ４インスレーター（配列番号８８）が隣接していた。遺伝子移入ポリヌクレオチドは、１つのインスレーターの遠位側に、標的配列５’－ＴＴＡＡ－３’を、直後に続く配列番号１０のｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾン逆方向末端反復配列（これは配列番号６の実施形態である）を、直後に続く配列番号３の追加のトランスポゾン末端配列（これは、配列番号１と＞９５％同一である）をさらに含んでいた。遺伝子移入ポリヌクレオチドは、もう１つのインスレーターの遠位側に、配列番号５の追加のトランスポゾン末端配列（配列番号４と＞９５％同一である）を、直後に続く配列番号１１のｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾン逆方向末端反復配列（これは配列番号７の実施形態である）を、直後に続く標的配列５’－ＴＴＡＡ－３’をさらに含んでいた。遺伝子移入ポリヌクレオチドは、第６．１．２節に説明され、表３に示されるようにＴ細胞において同等に活性があるようであるプロモーターであるＰＧＫプロモーターまたはＧＡＰＤＨプロモーターのいずれかに作動可能に連結された、配列が配列番号２２９によって付与されたポリペプチドであるＣＤ１０結合キメラ抗原受容体をコードする遺伝子をさらに含んでいた。キメラ抗原受容体遺伝子は、該遺伝子がＤａｓｈｅｒ ＧＦＰ遺伝子から分岐して転写され、トランスポザーゼによって転位可能である遺伝子移入ポリヌクレオチドの一部にあるように、遺伝子移入ポリヌクレオチド中に存在した。第１の遺伝子移入ポリヌクレオチド（配列番号２２５によって与えられる配列を有する３４６４６３は、追加の転位可能な遺伝子を含んでいなかった。第２の遺伝子移入ポリヌクレオチド（配列番号２２６によって与えられる配列を有する３４６７７６）は、キメラ抗原受容体と同じ向きで転写され、またトランスポザーゼによって転位可能である遺伝子移入ポリヌクレオチドの一部においても転写される、ＰＧＫプロモーターに作動可能に連結されたサバイビンをコードするオープンリーディングフレームをさらに含んでいた。第３の遺伝子移入ポリヌクレオチド（配列番号２２７によって与えられる配列を有する３４６７７７）は、キメラ抗原受容体を含んでおり、キメラ抗原受容体と同じ向きで転写され、またトランスポザーゼによって転位可能である遺伝子移入ポリヌクレオチドの一部においても転写される、ＰＧＫプロモーターに作動可能に連結されたＣＤ２８－Ｄ１２４Ｅ－Ｔ１９５Ｐをコードするオープンリーディングフレームをさらに含んでいた。

【0154】

６．２．１．３ａ サバイビンおよび活性化ＣＤ２８増強型エクスビボＣＡＲ細胞死滅試験１
Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＥａｓｙＳｅｐ Ｈｕｍａｎ ＣＤ８陽性選別キットを製造元の説明書により使用して、Ｔ細胞を、２つの異なる正常ドナー由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から調製した。Ｔ細胞を、放射線照射されたフィーダー細胞とのインキュベーションによって２～３日間刺激して、分泌されたＣＤ３、ＣＤ２８、ＩＬ－２、ＩＬ－７およびＩＬ－１５を提供した。おおよそ２００，０００個のＴ細胞に、製造元のプロトコルにより、Ｎｅｏｎエレクトロポレーターを使用して、１μｇのトランスポゾンＤＮＡと、配列番号３７のトランスポザーゼをコードする１００ｎｇのｍＲＮＡとを移入した。移入したＴ細胞をフィーダー細胞と混合し、３７℃でインキュベートした。細胞を培養でおおよそ５週間成長させ、おおよそ５週間の時点で、各遺伝子移入ポリヌクレオチドを移入した細胞の約１０％がＧＦＰを発現していた。次いで、Ｔ細胞（２００，０００）の試料を同数のＪＹ細胞と混合した。ＪＹは、ＣＤ１９を発現し、したがって抗ＣＤ１９キメラ抗原受容体についての標的であるエプスタイン・バーウイルス不死化Ｂ細胞リンパ芽球様株である。細胞の試料を混合３日後および７日後に細胞混合物から採取し、抗ＣＤ８抗体および抗ＣＤ１９抗体で染色した（それぞれＴ細胞およびＪＹ細胞を標識するため）。結果を図３および表６に示す。混合３日後までに、キメラ抗原受容体のみを発現するＴ細胞は、ＪＹ腫瘍細胞に圧倒されてほとんど消失していた。検出可能な細胞の８％のみがＣＤ８を発現していたのに対し、８９％はＣＤ１９を発現していた（図３のパネルＡ、表６のＡ列、第３および第４の行）。混合７日後までに、細胞の２．３％のみがＣＤ８発現Ｔ細胞であった（図３のパネルＤ、表６のＡ列、第５および第６の行）。対照的に、キメラ受容体＋サバイビンまたはＣＤ２８－Ｄ１２４Ｅ－Ｔ１９５Ｐのいずれかを発現するＴ細胞は、ＪＹ腫瘍細胞の存在下で生存することができた。３日後、図３のパネルＢおよびパネルＣならびに表６のＢ列およびＣ列、第３および第４の行に示されるように、細胞の４０～５０％がＣＤ８（Ｔ細胞マーカー）を発現しており、２３～２９％のみがＣＤ１９（腫瘍細胞マーカー）を発現していた。７日後までに、腫瘍細胞は有効に排除され、全細胞のおおよそ９０％がＣＤ８を発現していた（図３のパネルＥおよびパネルＦ、ならびに表６のＢ列およびＣ列、第５および第６の行）。本発明者らは、サバイビンまたは、ＣＤ２８のＤ１２４Ｅ／Ｔ１９５Ｐ活性化二重突然変異体の発現が、Ｔ細胞の成長／生存および／または増殖を増強するだけでなく、Ｔ細胞が腫瘍細胞の存在下で生存することができ、腫瘍細胞を死滅させるために活性があるままであることができることによってＴ細胞の挙動もまた増強することができると結論付ける。

【0155】

６．２．１．３ｂ サバイビンおよび活性化ＣＤ２８増強型インビボＣＡＲ細胞の死滅
移入したＴ細胞の第２の試料を、ＦＡＣＳを使用して選別して、ＧＦＰ（トランスポゾンのＴ細胞ゲノムにおける存在の指標である）発現細胞を選択した。選択した細胞を培養でさらに１週間成長させ、インビボでＪＹ腫瘍細胞を死滅させる能力について試験した。１００万個のＪＹ細胞をＮＳＧ免疫不全マウスに腹腔内注射によって投与した。７日後、１００万個のＧＦＰ発現Ｔ細胞を、ＪＹ処理マウスへの腹腔内注射によって投与した。２匹のマウスに、Ｔ細胞の代わりにリン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）の不活性対照処理を行った。表７に示すように、ＰＢＳを投与したマウスは、ＪＹ細胞注射後２４日間または２５日間生存した（表７の第１および第２の行）。キメラ抗原受容体を発現するＴ細胞の投与は、ＪＹ注射後５～６日間から３０日間まで生存を延長した（表７の第３の行）。キメラ抗原受容体＋サバイビンまたはＣＤ２８－Ｄ１２４Ｅ－Ｔ１９５Ｐを発現するＴ細胞の投与は、ＪＹ注射後さらに４日間から３４日間まで生存を延長した（表７の第４および第５の行）。本発明者らは、サバイビンまたは、ＣＤ２８のＤ１２４Ｅ／Ｔ１９５Ｐ活性化二重突然変異体の発現が、Ｔ細胞のエクスビボでの成長／生存および／または増殖を増強するだけでなく、Ｔ細胞が腫瘍細胞の存在下で生存することができ、腫瘍細胞を死滅させるために活性があるままであることができることによってＴ細胞のインビボでの挙動もまた増強することができると結論付ける。

【0156】

６．２．１．３ｃ サバイビンおよび活性化ＣＤ２８増強型エクスビボＣＡＲ細胞死滅試験２
本発明者らはまた、抗ＣＤ１９キメラ抗原受容体のみ、またはサバイビンもしくはＣＤ２８－Ｄ１２４Ｅ－Ｔ１９５Ｐと共発現するキメラ抗原受容体、のいずれかを発現するＴ細胞に対する腫瘍再負荷試験も行った。標準的な単回負荷エクスビボ腫瘍溶解アッセイは、比較的短い共培養時間および高いＴ細胞対腫瘍比により、Ｔ細胞の真の抗腫瘍能をしばしば過大評価する。生存増強遺伝子（この場合、サバイビンおよびＣＤ２８－Ｄ１２４Ｅ－Ｔ１９５Ｐ）がＴ細胞機能も増強することができるかどうかを決定するために、本発明者らは、Ｔ細胞の生存を困難にする周囲の腫瘍微小環境をよりよく模倣するために再発性腫瘍細胞多量負荷を使用した。総量２００μｌのマイクロタイタープレートウェル内で、１、２、３、４または５連続用量の１００，０００個のＮＡＬＭ６（ＣＤ１９＋、ＣＤ２０－、ＣＤ２１－である）のいずれかをＴ細胞（１００，０００）に負荷した。各１００，０００個の細胞のＮＡＬＭ６用量は、４８時間間隔とした。各再負荷について、１００μｌの上清を抜去し、１００，０００個のＮＡＬＭ６細胞を含有する１００μｌの新鮮な培地を添加した。試料に対する最後の負荷の２４時間後、ＮＡＬＭ６細胞死を生物発光の低減として、製造元の説明書によるＤ－ルシフェリンの添加およびＢｉｏＴｅｋシナジーＮｅｏ２ハイブリッドマイクロプレートリーダーを用いて発光を測定することによって測定した（例えば、Ｋａｒｉｍｉ ｅｔ ａｌ．，（２０１４）Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｂｙ Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｏｕｔｐｅｒｆｏｒｍｓ ｔｈｅ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｃｈｒｏｍｉｕｍ－５１ Ｒｅｌｅａｓｅ Ａｓｓａｙ．ＰＬｏＳ ＯＮＥ ９（２）：ｅ８９３５７を参照されたい）。

【0157】

第６．２．１．３ａ節に説明するように、抗ＣＤ１９ ＣＡＲと、場合によりサバイビンをコードする遺伝子またはＣＤ２８における活性化突然変異をコードする遺伝子とを含むトランスポゾンを移入した細胞を、エクスビボで１０か月間培養した。この時点までに、細胞は＞９５％がＧＦＰを発現していた（推論により、ＣＡＲ、および存在する場合は生存増強遺伝子も発現していた。Ｔ細胞がエクスビボ培養で１０か間生存することはまれである。生存遺伝子を発現するＴ細胞について、本発明者らは、この寿命がサバイビンまたはＣＤ２８－Ｄ１２４Ｅ－Ｔ１９５Ｐの発現に起因すると考える。しかしながら、本発明者らはまた、キメラ抗原受容体のみを発現するＴ細胞のこの長期生存も観察しているが、該Ｔ細胞は生存遺伝子も発現する細胞よりも緩徐に成長した。本発明者らは、このことは、キメラ抗原受容体をコードする遺伝子がＰＧＫプロモーターまたはＧＡＰＤＨプロモーターまたは同等の発現レベルを駆動するプロモーターに作動可能に連結されているとき、最適なＣＡＲレベルの発現に起因すると考える。長期のエクスビボ培養が、腫瘍細胞を死滅させるＴ細胞の能力を低下させた場合、本発明者らは、異なるドナー由来のＴ細胞内への、第６．２．１．３ａ節に説明する移入を反復し、該細胞をエクスビボで４か月培養した後、腫瘍再負荷アッセイを用いて該細胞を試験した。ＮＡＬＭ６細胞死の結果を表８に示す。

【0158】

表８の第１の行は、Ｔ細胞にＮＡＬＭ６細胞を負荷した回数を示す。表８の第２～第４の行は、エクスビボで１０か月間成長させた抗ＣＤ１９キメラ抗原受容体を発現するＴ細胞集団によるＮＡＬＭ６の死滅を示す。Ｔ細胞はまた、サバイビン（第３の行）またはＣＤ２８－Ｄ１２４Ｅ－Ｔ１９５Ｐ（第４の行）のいずれかも発現していた。キメラ抗原受容体のみを発現する細胞は、第１の負荷で１００％のＮＡＬＭ６細胞を死滅させたが、その後の負荷では死滅効率が落ち込んだ。第２の負荷の後のＮＡＬＭ６の８５％、第３の後の４７％、第４の後の２３％が、および第５の負荷の後では１０％のみを死滅させた（表８の第２の行を参照されたい）。対照的に、サバイビンも発現する細胞は、第５の負荷で７６％のＮＡＬＭ６細胞を死滅させることができ（表８の第３の行）、ＣＤ２８－Ｄ１２４Ｅ－Ｔ１９５Ｐも発現する細胞は、第５の負荷で８２％のＮＡＬＭ６細胞を死滅させることができた（表８の第４の行）。同様のパターンの死滅が、エクスビボでわずか４か月間培養された細胞において見られたが、死滅の効率は一般に高かった（表８の第５～第７の行）。キメラ抗原受容体のみを発現する細胞は、第１および第２の負荷で１００％のＮＡＬＭ６細胞を死滅させたが、その後の負荷では死滅効率が落ち込んだ。第３の負荷の後のＮＡＬＭ６の５１％、第４の後の２８％、および第５の負荷の後では２７％を死滅させた（表８の第５の行を参照されたい）。対照的に、サバイビンも発現する細胞は、第５の負荷で９０％のＮＡＬＭ６細胞を死滅させることができ（表８の第６の行）、ＣＤ２８－Ｄ１２４Ｅ－Ｔ１９５Ｐも発現する細胞は、第５の負荷で９１％のＮＡＬＭ６細胞を死滅させることができた（表８の第７の行）。

【0159】

このことは、キメラ抗原受容体を発現するＴ細胞によるサバイビンまたはＣＤ２８－Ｄ１２４Ｅ－Ｔ１９５Ｐの発現が、該細胞による標的細胞死滅を増強し、細胞が疲労する速度を低減させることを示している。腫瘍細胞を死滅させるのに有利なＴ細胞は、発現可能なサバイビン遺伝子またはＣＤ２８－Ｄ１２４Ｅ－Ｔ１９５Ｐ遺伝子を含む異種ポリヌクレオチドを含む。

【0160】

６．２．１．４ 初代Ｔ細胞におけるＢｃｌ２およびＢｃｌ６の発現
ウイルスＣＨＹＳＬ（２Ａ）配列（完全なオープンリーディングフレームＢｃｌ２－２Ａ－Ｂｃｌ６の配列は配列番号２７２として与えられる）によって分離されたＢｃｌ２およびＢｃｌ６をコードするオープンリーディングフレームを、配列番号１１５によって与えられた配列を有するＰＧＫプロモーターと配列番号１８２の配列を有するウサギグロビンポリアデニル化シグナルとに作動可能に連結し、遺伝子移入ポリヌクレオチド内へとクローン化した。遺伝子移入ポリヌクレオチドは、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）プロモーターとウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル配列とに作動可能に連結されたＤａｓｈｅｒＧＦＰをコードする遺伝子を含むＧＦＰレポーター（配列番号２２２の配列）をさらに含んでいだ。２つのオープンリーディングフレームを、多様に転写するように構成した（すなわち、２つのプロモーターは互いに隣接し、反対方向に転写された）。２つのオープンリーディングフレームには、片方の側からＨＳ４インスレーター（配列番号９２の配列）が、もう片方の側からＤ４Ｚ４インスレーター（配列番号８８の配列）が隣接していた。遺伝子移入ポリヌクレオチドは、１つのインスレーターの遠位側に、標的配列５’－ＴＴＡＡ－３’を、直後に続く配列番号１０のｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾン逆方向末端反復配列（これは配列番号６の実施形態である）を、直後に続く配列番号３の追加のトランスポゾン末端配列（これは、配列番号１と＞９５％同一である）をさらに含んでいた。遺伝子移入ポリヌクレオチドは、もう１つのインスレーターの遠位側に、配列番号５の追加のトランスポゾン末端配列（配列番号４と＞９５％同一である）を、直後に続く配列番号１１のｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾン逆方向末端反復配列（これは配列番号７の実施形態である）を、直後に続く標的配列５’－ＴＴＡＡ－３’をさらに含んでいた。

【0161】

Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＥａｓｙＳｅｐ Ｈｕｍａｎ ＣＤ８陽性選別キットを製造元の説明書により使用して、Ｔ細胞を正常ドナー末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から調製した。Ｔ細胞を、放射線照射されたフィーダー細胞とのインキュベーションによって２～３日間刺激して、分泌されたＣＤ３、ＣＤ２８、ＩＬ－２、ＩＬ－７およびＩＬ－１５を提供した。おおよそ１００，０００個のＴ細胞に、製造元のプロトコルにより、Ｎｅｏｎエレクトロポレーターを使用して、１μｇのトランスポゾンＤＮＡと、配列番号３７の配列を有するトランスポザーゼをコードする１００ｎｇのｍＲＮＡとを移入した。移入したＴ細胞をフィーダー細胞と混合し、３７℃でインキュベートした。移入後の様々な時点で試料を採取し、蛍光標識した抗ＣＤ８抗体とともにインキュベートし、ＣＤ８およびＤａｓｈｅｒ ＧＦＰについて蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）で分析した。

【0162】

図４は、細胞染色の経時的な分布を示す。ＣＤ８染色は、ＣＤ８＋Ｔ細胞についてのマーカーとして使用され、パネルＡに示される各ＦＡＣＳプロットのｙ軸に示されている。ＧＦＰ蛍光は、各ＦＡＣＳプロットのｘ軸に示されている。ＧＦＰ蛍光は、細胞がＧＦＰを発現していることを示しており、ＧＦＰ蛍光は、本書では、細胞内の遺伝子移入ポリヌクレオチドの存在を示すためのマーカーとしても使用される。パネルＢは、ＧＦＰも発現しているＣＤ８発現Ｔ細胞の百分率を示すグラフである。移入１日後に、ＣＤ８発現細胞のおおよそ２６％もまたＧＦＰを発現していた。１０日後までに、細胞の８８．７％が強いＣＤ８染色を示したが、ＧＦＰ発現は示さず、ＣＤ８発現細胞の１１．３％もまたＧＦＰを発現し、該ＣＤ８発現細胞がまた遺伝子移入ポリヌクレオチドも含有していたことを示した。ＧＦＰ蛍光も呈するＣＤ８発現細胞の割合は、経時的に上昇した。１９日後で２９．４％、４２日後で８０％であった。ＧＦＰを発現しているＴ細胞集団の割合の上昇は、そのゲノムが遺伝子移入ポリヌクレオチドを含むＴ細胞が、そのゲノムが遺伝子移入ポリヌクレオチドを含まないＴ細胞と比較して生存の利点を有することを示しているか、またはそのゲノムが遺伝子移入ポリヌクレオチドを含むＴ細胞が、そのゲノムが遺伝子移入ポリヌクレオチドを含まないＴ細胞と比較して増殖の利点を有することを示している。本発明者らは、Ｔ細胞におけるＢｃｌ２およびＢｃｌ６の発現が、Ｔ細胞に生存または増殖の利点を提供する、ならびにＢｃｌ２およびＢｃｌ６をコードする遺伝子が、第５．３．１．１節において説明するような免疫細胞生存増強遺伝子および免疫細胞増殖増強遺伝子である、と結論付ける。

【0163】

６．２．１．５ 初代Ｔ細胞におけるＴ細胞形質転換要素およびＥＳＲの発現
Ｔ細胞形質転換要素と増強型シグナル伝達受容体とのセットをコードする遺伝子を、別々の遺伝子移入ポリヌクレオチド内へと個別にクローン化した。各場合では、該遺伝子を、配列が配列番号１１５によって与えられたＰＧＫプロモーターと、配列番号１８２の配列を有するウサギグロビンポリアデニル化シグナルとに作動可能に連結した。遺伝子移入ポリヌクレオチドは、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）プロモーターとウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル配列とに作動可能に連結されたＤａｓｈｅｒＧＦＰをコードする遺伝子を含むＧＦＰレポーター（配列番号２２２の配列）をさらに含んでいだ。２つのオープンリーディングフレームを、多様に転写するように構成した（すなわち、２つのプロモーターは互いに隣接し、反対方向に転写された）。２つのオープンリーディングフレームには、片方の側からＨＳ４インスレーター（配列番号９２の配列）が、もう片方の側からＤ４Ｚ４インスレーター（配列番号８８の配列）が隣接していた。遺伝子移入ポリヌクレオチドは、１つのインスレーターの遠位側に、標的配列５’－ＴＴＡＡ－３’を、直後に続く配列番号１０のｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾン逆方向末端反復配列（これは配列番号６の実施形態である）を、直後に続く配列番号３を有する追加のトランスポゾン末端配列（これは、配列番号１と＞９５％同一である）をさらに含んでいた。遺伝子移入ポリヌクレオチドは、もう１つのインスレーターの遠位側に、配列番号５の追加のトランスポゾン末端配列（配列番号４と＞９５％同一である）を、直後に続く配列番号１１のｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾン逆方向末端反復配列（これは配列番号７の実施形態である）を、直後に続く標的配列５’－ＴＴＡＡ－３’をさらに含んでいた。

【0164】

Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＥａｓｙＳｅｐ Ｈｕｍａｎ ＣＤ８陽性選別キットを製造元の説明書により使用して、Ｔ細胞を２ドナーの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から調製した。Ｔ細胞を、放射線照射されたフィーダー細胞とのインキュベーションによって２～３日間刺激して、分泌されたＣＤ３、ＣＤ２８、ＩＬ－２、ＩＬ－７およびＩＬ－１５を提供した。おおよそ１００，０００個のＴ細胞に、製造元の説明書により、Ｎｅｏｎエレクトロポレーターを使用して、１μｇのトランスポゾンＤＮＡと、配列番号３７のトランスポザーゼをコードする１００ｎｇのｍＲＮＡとを移入した。移入したＴ細胞をフィーダー細胞と混合し、３７℃でインキュベートした。移入後の様々な時点で試料を採取し、蛍光標識した抗ＣＤ８抗体とともにインキュベートし、ＣＤ８およびＤａｓｈｅｒ ＧＦＰについて蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）で分析した。データを表９に示す。

【0165】

第６．２．１．１節に説明されているように、ＧＦＰを発現するＣＤ８＋細胞の濃度は、第５．３．１．１節に説明されているように、遺伝子移入ポリヌクレオチドが、Ｔ細胞に生存または増殖の利点を付与する遺伝子を含む、という指標である。この遺伝子移入ポリヌクレオチドのセットでは、Ｔ細胞生存に対して影響を及ぼさないと予想される対照遺伝子としてＨＳＶ－ＴＫを含めた。それゆえ、本発明者らは、ＨＳＶ－ＴＫを移入した細胞におけるＧＦＰ発現細胞の百分率を、推定される生存増強遺伝子を基準と比較して測定するためのレベルとして使用した。表９に見られるように、２ドナー由来のＴ細胞の２つの独立した移入は、７．５％～１５．３％の細胞において最初のＧＦＰ発現（移入効率を示す）をもたらした（表９の第７および第８の行）。１４日後までに、これらの百分率は有意に落ち込み、その後の時点で、ＧＦＰを発現する細胞の百分率はおおよそ一定のままであるかまたは低下した。このことは、予想通り、ＨＳＶ－ＴＫがＴ細胞に成長の利点または増殖の利点を提供しないことを示している。対照的に、ＳＴＡＴ３：ＳＴＡＴ３－Ｄ６６１ＹおよびＳＴＡＴ３－Ｓ６１４Ｒ－Ｙ６４０Ｆの突然変異体をコードする遺伝子を含む試験した遺伝子移入ポリヌクレオチドのうちの２つは、両ドナーにおいてＧＦＰ発現細胞の百分率の漸増を示し（表９の第１および第３の行）、これらの遺伝子が、第６．２．１．１節のＳＴＡ３－Ｙ６４０Ｆについて見られたものと同様の成長の利点または増殖の利点をＴ細胞に提供することを示した。本発明者らは、Ｔ細胞におけるＳＴＡＴ３－Ｄ６６１ＹおよびＳＴＡ３－Ｓ６１４Ｒ－Ｙ６４０Ｆを含む活性化ＳＴＡＴ３突然変異体の発現が、該Ｔ細胞に生存または増殖の利点を提供する、およびＳＴＡＴ３の活性化突然変異体をコードする遺伝子が、第５．３．１．１節において説明するような免疫細胞生存増強遺伝子および免疫細胞増殖増強遺伝子である、と結論付ける。

【0166】

試験した遺伝子移入ポリヌクレオチドのうちの１つは、アポトーシス阻害剤Ｂｃｌ－ＸＬをコードする遺伝子を含んでいた。これらの細胞は、両ドナーにおいてＧＦＰを発現する細胞の百分率の漸増を示し（表９の第２の行）、Ｂｃｌ－ＸＬの発現がＴ細胞に成長または増殖の利点を提供する、およびＢｃｌ－ＸＬをコードする遺伝子が、第５．３．１．１節に説明されるような免疫細胞生存増強遺伝子および免疫細胞増殖増強遺伝子であることを示した。

【0167】

試験した遺伝子移入ポリヌクレオチドの１つは、ホスホリパーゼＣ：ＰＬＣＧ１－Ｓ３４５Ｆの活性化突然変異をコードする遺伝子を含んでいた。これらの細胞は、両ドナーにおいてＧＦＰを発現する細胞の百分率の漸増を示し（表９の第６の行）、ＰＬＣＧ１－Ｓ３４５Ｆの発現がＴ細胞に成長または増殖の利点を提供する、およびＰＬＣＧ１－Ｓ３４５Ｆをコードする遺伝子が、第５．３．１．１節に説明されるような免疫細胞生存増強遺伝子および免疫細胞増殖増強遺伝子であることを示した。

【0168】

本実験では、２つのＥＳＲも試験した。１つのＴＮＦＲ１／ＣＤ２７（配列は配列番号３０１によって付与）は、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ由来の細胞外ドメイン（配列は配列番号３３０によって付与）と、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ由来の膜貫通ドメイン（配列は配列番号３９４によって付与）と、ＣＤ２７由来の細胞内ドメイン（配列は配列番号３４３によって付与）とを含んでいた。第２のＴＮＦＲ１／４－１ＢＢ（配列は配列番号３０２によって付与）は、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ由来の細胞外ドメイン（配列は配列番号３３０によって付与）と、この場合、４－１ＢＢ由来の細胞内ドメイン（配列は配列番号３４４によって付与）に融合したＴＮＦＲＳＦ１Ａ由来の膜貫通ドメイン（配列は配列番号３９４によって付与）とを含んでいた。ＥＳＲ ＴＮＦＲ１／ＣＤ２７およびＥＳＲ ＴＮＦＲ１／４－１ＢＢは両方とも、ドナーのうちの１個体においてＧＦＰ発現細胞の高い百分率をもたらし（表９の第４の行）、ＥＳＲ ＴＮＦＲ１／ＣＤ２７またはＥＳＲ ＴＮＦＲ１／４－１ＢＢの発現が、Ｔ細胞に成長または増殖の利点を提供することができる、およびＥＳＲ ＴＮＦＲ１／ＣＤ２７またはＥＳＲ ＴＮＦＲ１／４－１ＢＢをコードする遺伝子が、第５．３．１．１節に説明するような免疫細胞生存増強遺伝子および免疫細胞増殖増強遺伝子であることを示した。

【0169】

６．２．１．６ 初代Ｔ細胞による腫瘍細胞死滅に対するＢｃｌ－ＸＬの効果
６．２．１．６ａ Ｂｃｌ－ＸＬ増強型エクスビボＢｉＴＥ細胞死滅試験
Ｂｃｌ－ＸＬ（ポリペプチド配列は配列番号２３８によって付与）をコードする遺伝子を遺伝子移入ポリヌクレオチド内へとクローン化した。該遺伝子を、配列が配列番号１１５によって与えられたＰＧＫプロモーターと、配列番号１８２の配列を有するウサギグロビンポリアデニル化シグナルとに作動可能に連結した。遺伝子移入ポリヌクレオチドは、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）プロモーターとウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル配列とに作動可能に連結されたＤａｓｈｅｒＧＦＰをコードする遺伝子を含むＧＦＰレポーター（配列番号２２２の配列）をさらに含んでいだ。２つのオープンリーディングフレームを、多様に転写するように構成した（すなわち、２つのプロモーターは互いに隣接し、反対方向に転写された）。２つのオープンリーディングフレームには、片方の側からＨＳ４インスレーター（配列番号９２の配列を有する）が、もう片方の側からＤ４Ｚ４インスレーター（配列番号８８の配列を有する）が隣接していた。遺伝子移入ポリヌクレオチドは、１つのインスレーターの遠位側に、標的配列５’－ＴＴＡＡ－３’を、直後に続く配列番号１０のｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾン逆方向末端反復配列（これは配列番号６の実施形態である）を、直後に続く配列番号３を有する追加のトランスポゾン末端配列（これは、配列番号１と＞９５％同一である）をさらに含んでいた。遺伝子移入ポリヌクレオチドは、もう１つのインスレーターの遠位側に、配列番号５の追加のトランスポゾン末端配列（配列番号４と＞９５％同一である）を、直後に続く配列番号１１のｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾン逆方向末端反復配列（これは配列番号７の実施形態である）を、直後に続く標的配列５’－ＴＴＡＡ－３’をさらに含んでいた。

【0170】

Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＥａｓｙＳｅｐ Ｈｕｍａｎ ＣＤ８陽性選別キットを製造元の説明書に従って使用して、Ｔ細胞を３ドナーの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から調製した。Ｔ細胞を、放射線照射されたフィーダー細胞とのインキュベーションによって２～３日間刺激して、分泌されたＣＤ３、ＣＤ２８、ＩＬ－２、ＩＬ－７およびＩＬ－１５を提供した。おおよそ１００，０００個のＴ細胞に、製造元のプロトコルにより、Ｎｅｏｎエレクトロポレーターを使用して、１μｇのトランスポゾンＤＮＡと、配列番号３７のトランスポザーゼをコードする１００ｎｇのｍＲＮＡとを移入した。移入したＴ細胞をフィーダー細胞と混合し、３７℃でインキュベートした。

【0171】

細胞をＴ細胞培地中で２４０日間培養して成長させた。第６．２．１．６節および表９において説明されるように、Ｂｃｌ－ＸＬは、Ｔ細胞に対する選択的利点を提供する。本発明者らがこれらの細胞を８か月間培養することができたことは、Ｔ細胞におけるＢｃｌ－ＸＬ遺伝子の発現がエクスビボで該Ｔ細胞の生存を増強することを実証している。生存に加えて、本発明者らは、これらのＴ細胞が該Ｔ細胞を腫瘍細胞株と混合することによって該Ｔ細胞の細胞毒性を保有しているかどうかを試験した。細胞毒性を試験する前に、本発明者らは、Ｔ細胞ゲノム内へと組み込まれた同じトランスポゾンから発現するＧＦＰを測定することによって、Ｂｃｌ＿Ｘｌを発現する細胞の割合を決定した。図５は、該Ｔ細胞に形質移入した２４０日後の３個体の異なるドナー由来のＴ細胞のフローサイトメトリー分析を示し、ｘ軸はＧＦＰを、ｙ軸はＴ細胞マーカーＣＤ８についての染色である。パネルＡは、ドナー８１由来のＴ細胞の９０％超がＧＦＰを発現したことを示し、パネルＢは、ドナー８２由来のＴ細胞の９９％超がＧＦＰを発現したことを示し、パネルＣは、ドナー８４由来のＴ細胞の９８％超がＧＦＰを発現したことを示す。したがって、２４０日後に、各ドナー由来のＴ細胞の大部分はＧＦＰを、推論によりＢｃｌ－ＸＬを発現していた。

【0172】

細胞毒性を測定するために、本発明者らは、１００，０００個のＴ細胞を、ルシフェラーゼをコードするゲノムに組み込まれた遺伝子を含有する１００，０００個のＢ細胞腫瘍株であるＮＡＬＭ６（ＣＤ１９＋、ＣＤ２０－、ＣＤ２１－である）と混合した。Ｔ細胞を腫瘍標的細胞に運ぶために、ＣＤ３（Ｔ細胞表面上）およびＣＤ１９（ＮＡＬＭ６表面上）に対する結合ドメインを有する二重特異性Ｔ細胞結合剤（ＢｉＴＥ）をいくつかの反応に含めた。翌日、本発明者らは、生物発光アッセイ（例えば、Ｋａｒｉｍｉ ｅｔ．ａｌ．，（２０１４）Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｂｙ Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｏｕｔｐｅｒｆｏｒｍｓ ｔｈｅ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｃｈｒｏｍｉｕｍ－５１ Ｒｅｌｅａｓｅ Ａｓｓａｙ．ＰＬｏＳ ＯＮＥ ９（２）：ｅ８９３５７を参照されたい）を用いて、溶解したＮＡＬＭ６細胞の割合を決定した。

【0173】

細胞毒性試験を腫瘍再負荷として行った。標準的な単回負荷エクスビボ腫瘍溶解アッセイは、比較的短い共培養時間および高いＴ細胞対腫瘍比により、Ｔ細胞の真の抗腫瘍能をしばしば過大評価する。生存増強遺伝子（この場合、Ｂｃｌ－ＸＬ）がＴ細胞機能も増強することができるかどうかを決定するために、本発明者らは、Ｔ細胞の生存を困難にする周囲の腫瘍微小環境をよりよく模倣するために再発性腫瘍細胞多量負荷を使用した。総量２００μｌのマイクロタイタープレートウェル内で、１、２、３、４または５連続用量の１００，０００個のＮＡＬＭ６をＴ細胞（１００，０００）に負荷した。各１００，０００個の細胞のＮＡＬＭ６用量は、４８時間間隔とした。各再負荷について、１００μｌの上清を抜去し、１００，０００個のＮＡＬＭ６細胞を含有する１００μｌの新鮮な培地を添加した。試料に対する最後の負荷の２４時間後、Ｄ－ルシフェリンを添加し、ＢｉｏＴｅｋシナジーＮｅｏ２ハイブリッドマイクロプレートリーダーを製造元の説明書により使用して発光を測定することによって、生物発光の低減としてＮＡＬＭ６細胞死を測定した。ＮＡＬＭ６細胞死の結果を表１０に示す。

【0174】

表１０の第１の行は、Ｔ細胞にＮＡＬＭ６細胞を負荷した回数を示す。表１０の第２～第５の行は、あらゆるＢｉＴＥの非存在下での４つの異なるＴ細胞集団によるＮＡＬＭ６の死滅を示す。これらの条件下での細胞死滅は、一般的な異質遺伝子的死滅を反映しており、腫瘍抗原に対する特異的なターゲティングはない。Ｂｃｌ－ＸＬを発現する３つのＴ細胞集団によって達成される死滅（表１０の第２～第４の行）は、ナイーブＴ細胞によって達成された死滅（表１０の第５の行）と非常に同等であった。注目すべきは、８か月間培養したＢｃｌ－ＸＬ発現Ｔ細胞とは対照的に、ナイーブＴ細胞を本実験で使用する前に数週間のみ培養したという事実である。このことは、Ｂｃｌ－ＸＬ発現が、Ｔ細胞の細胞毒性を保有しながら培養で８か月間成長させておくことができることを示す。

【0175】

第２のセットの負荷を、ＮＡＬＭ６細胞の表面上のＣＤ１９抗原を標的とするＢｉＴＥの存在下で行った。表１０の第９の行は、ＢｉＴＥの存在下でナイーブＴ細胞によってもたらされるＮＡＬＭ６の死滅を示す。第１および第２の負荷後の死滅は、ＢｉＴＥを用いない場合よりもはるかに効率的であった。第１の負荷の際には８８％のＮＡＬＭ６細胞が死滅し、第２の負荷の後では９７％が死滅した。次いで、死滅の効率が低下した。７２％のＮＡＬＭ６細胞は、第３の負荷の後に、６２％が第４の負荷の後に、および５９％が第５の負荷の後に死滅した。この低下は、長期腫瘍再負荷後に見られるＴ細胞有効性の喪失を象徴している（例えば、Ｖｏｓｓ ｅｔ．，ａｌ．（２０１７）Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ．４０８：１９０－１９６．「Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ａｎｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ：ｄｅｆｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｃｏｎｔｏｕｒｓ ｏｆ ａ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ」を参照されたい）。Ｂｃｌ－ＸＬを発現する３つのＴ細胞集団は、ナイーブＴ細胞と同様に、ＢｉＴＥの存在下で１回または２回の負荷後にＮＡＬＭ６を死滅させるのに有効であった（表１０の第６～第８の行）。ナイーブＴ細胞とは異なり、Ｂｃｌ－ＸＬ発現Ｔ細胞のＮＡＬＭ６死滅効率率は、連続的な負荷の際に低下しなかった。第５の負荷の後、Ｂｃｌ－ＸＬ発現Ｔ細胞集団のうちの２つ（ドナー８１およびドナー８４由来）は、ナイーブＴ細胞についての５９％の死滅と比較して、９５％のＮＡＬＭ６細胞を死滅させ（表１０の第６および第８の行）、第３の集団（ドナー８２由来）は、９４％のＮＡＬＭ６細胞を死滅させた（表１０の第７の行）。このことは、８か月間エクスビボで成長させたＢｃｌ－ＸＬを発現するＴ細胞だけでなく、数週間培養しただけのナイーブＴ細胞も依然として腫瘍細胞を死滅させることができることを示し、該ナイーブＴ細胞はまた、腫瘍抗原への曝露の反復後にＴ細胞有効性を低減させる因子の影響も受けにくいようである。

【0176】

６．２．１．６ｂ Ｂｃｌ－ＸＬ増強型エクスビボＣＡＲ細胞死滅試験
本発明者らは、第６．２．１．３ｃ節に説明されているような抗ＣＤ１９キメラ抗原受容体を発現するＴ細胞に対して腫瘍再負荷試験を行った。サバイビンまたはＣＤ２８－Ｄ１２４Ｅ－Ｔ１９５Ｐと共発現したキメラ抗原受容体を含んでいるトランスポゾンは、第６．２．１．３節において説明されるとおりであり、Ｂｃｌ－ＸＬと共発現したキメラ抗原受容体を含む追加のトランスポゾンを生成した。生存増強遺伝子（この場合、サバイビン、ＣＤ２８－Ｄ１２４Ｅ－Ｔ１９５ＰおよびＢｃｌ－ＸＬ）がＴ細胞機能も増強することができるかどうかを決定するために、本発明者らは、Ｔ細胞の生存を困難にする周囲の腫瘍微小環境をよりよく模倣するために再発性腫瘍細胞多量負荷を使用した。総量２００μｌのマイクロタイタープレートウェル内で、１、２、３、４、５または６連続用量の１００，０００個のＮＡＬＭ６（ＣＤ１９＋、ＣＤ２０－、ＣＤ２１－である）のいずれかをＴ細胞（１００，０００）に負荷した。各１００，０００個の細胞のＮＡＬＭ６用量は、４８時間間隔とした。各再負荷について、１００μｌの上清を抜去し、１００，０００個のＮＡＬＭ６細胞を含有する１００μｌの新鮮な培地を添加した。試料に対する最後の負荷の２４時間後、Ｄ－ルシフェリンを添加し、ＢｉｏＴｅｋシナジーＮｅｏ２ハイブリッドマイクロプレートリーダーを製造元の説明書により使用して発光を測定することによって、生物発光の低減としてＮＡＬＭ６細胞死を測定した（例えば、Ｋａｒｉｍｉ ｅｔ．ａｌ．，（２０１４）Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｂｙ Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｏｕｔｐｅｒｆｏｒｍｓ ｔｈｅ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｃｈｒｏｍｉｕｍ－５１ Ｒｅｌｅａｓｅ Ａｓｓａｙ．ＰＬｏＳ ＯＮＥ ９（２）：ｅ８９３５７を参照されたい）。

【0177】

抗ＣＤ１９ ＣＡＲと、場合によりサバイビンをコードする遺伝子またはＣＤ２８における活性化突然変異をコードする遺伝子、またはＢｃｌ－ＸＬをコードする遺伝子を含むトランスポゾンを移入した細胞を、エクスビボで４か月間培養した。この時点までに、細胞は＞９５％がＧＦＰを発現していた（推論により、ＣＡＲ、および存在する場合は生存増強遺伝子も発現していた。ＮＡＬＭ６細胞死の結果を表１１に示す。

【0178】

表１１の第１の行は、Ｔ細胞にＮＡＬＭ６細胞を負荷した回数を示す。表１１の第２の行は、抗ＣＤ１９キメラ抗原受容体を発現するＴ細胞集団によるＮＡＬＭ６の死滅を示す。Ｔ細胞はまた、サバイビン（第３の行）、ＣＤ２８－Ｄ１２４Ｅ－Ｔ１９５Ｐ（第４の行）、またはＢｃｌ－ＸＬ（第５の行）のいずれかも発現していた。キメラ抗原受容体を有しない細胞を第６の行に示す。キメラ抗原受容体のみを発現する細胞は、第１の負荷で７０％のＮＡＬＭ６細胞を死滅させ、死滅効率は第２の負荷で９７％まで上昇したが、次いで、その後の負荷では再度落ち込んだ。第３の負荷の後で６９％、第４の後で５９％、第５の際に５８％、および第６の負荷の後では５３％のＮＡＬＭ６細胞が死滅した（表１１の第２の行を参照されたい）。対照的に、サバイビンも発現した細胞は、第６の負荷で８５％のＮＡＬＭ６細胞を死滅させることができ（表１１の第３の行）、ＣＤ２８－Ｄ１２４Ｅ－Ｔ１９５Ｐも発現した細胞は、第６の負荷で８５％のＮＡＬＭ ６細胞を死滅させることができ（表１１の第４の行）、Ｂｃｌ－ＸＬも発現した細胞は、第６の負荷で９４％のＮＡＬＭ６細胞を死滅させることができた（表１１の第５の行）。このことは、キメラ抗原受容体を発現するＴ細胞によるサバイビンまたはＣＤ２８－Ｄ１２４Ｅ－Ｔ１９５ＰまたはＢｃｌ－ＸＬの発現が、該細胞による標的細胞死滅を増強し、細胞が腫瘍細胞を死滅させることができなくなる速度を低減させることを示している。腫瘍細胞を死滅させるのに有利なＴ細胞は、キメラ抗原受容体をコードする遺伝子と、発現可能なサバイビン遺伝子またはＣＤ２８－Ｄ１２４Ｅ－Ｔ１９５Ｐ遺伝子またはＢｃｌ－ＸＬ遺伝子を含む異種ポリヌクレオチドとを含む。

【0179】

アポトーシス阻害剤であるサバイビン、Ｂｃｌ－ＸＬ、Ｂｃｌ２およびＢｃｌ６はすべて、本書では免疫細胞生存遺伝子として作用することが示されている。カスパーゼ経路におけるドミナントネガティブ遺伝子、例えばカスパーゼ３、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ９、カスパーゼ１０またはＣＡＳＰ８のドミナントネガティブ突然変異体およびＦＡＤＤ様アポトーシス調節因子（ＣＦＬＡＲ）は、同様の効果を有すると予想される。本発明のいくつかの実施形態では、免疫細胞は、配列番号２４０～２４５のうちから選択される配列のドミナントネガティブ突然変異体を含むアポトーシス経路のドミナントネガティブ阻害剤をコードする遺伝子を含み、いくつかの実施形態では、アポトーシス経路の阻害剤は、配列番号２３７、２３８または２６１～２７２のうちから選択される配列を含む。

【0180】

６．２．２ 増強型シグナル伝達受容体
６．２．２．１ 抗ＣＤ２８／ＯＸ４０は増殖増強活性を有するＥＳＲである
ＴＮＦＲＳＦ４についての膜貫通ドメイン（ＯＸ４０）（配列は配列番号３７３によって付与）とＴＮＦＲＳＦ４についての細胞内ドメイン（ＯＸ４０）（配列は配列番号３４１によって付与）とに融合した抗ＣＤ２８抗体ＴＧＮ１４１２（配列は配列番号３４０によって付与）を含む抗ＣＤ２８／ＯＸ４０ ＥＳＲ（配列は配列番号３０７によって付与）をコードするよう遺伝子を設計した。該遺伝子を、配列が配列番号１１５によって与えられたＰＧＫプロモーターと、配列番号１８２を有するウサギグロビンポリアデニル化シグナル配列とに作動可能に連結した。遺伝子移入ポリヌクレオチドは、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）プロモーターとウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル配列とに作動可能に連結されたＤａｓｈｅｒＧＦＰをコードする遺伝子を含むＧＦＰレポーター（配列番号２２２の配列を有する）をさらに含んでいだ。２つのオープンリーディングフレームを、多様に転写するように構成した（２つのプロモーターは互いに隣接し、反対方向に転写された）。２つのオープンリーディングフレームには、片方の側からＨＳ４インスレーター（配列番号９２の配列を有する）が、もう片方の側からＤ４Ｚ４インスレーター（配列番号８８の配列を有する）が隣接していた。遺伝子移入ポリヌクレオチドは、１つのインスレーターの遠位側に、標的配列５’－ＴＴＡＡ－３’を、直後に続く配列番号１０のｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾン逆方向末端反復配列（これは配列番号６の実施形態である）を、直後に続く配列番号３を有する追加のトランスポゾン末端配列（これは、配列番号１と＞９５％同一である）をさらに含んでいた。遺伝子移入ポリヌクレオチドは、もう１つのインスレーターの遠位側に、配列番号５の追加のトランスポゾン末端配列（配列番号４と＞９５％同一である）を、直後に続く配列番号１１のｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾン逆方向末端反復配列（これは配列番号７の実施形態である）を、直後に続く標的配列５’－ＴＴＡＡ－３’をさらに含んでいた。

【0181】

Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＥａｓｙＳｅｐ Ｈｕｍａｎ ＣＤ８陽性選別キットを製造元の説明書により使用して、Ｔ細胞を、２つの異なる正常ドナー由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から調製した。Ｔ細胞を、放射線照射されたフィーダー細胞とのインキュベーションによって２～３日間刺激して、分泌されたＣＤ３、ＣＤ２８、ＩＬ－２、ＩＬ－７およびＩＬ－１５を提供した。おおよそ１００，０００個のＴ細胞に、製造元のプロトコルにより、Ｎｅｏｎエレクトロポレーターを使用して、１μｇのトランスポゾンＤＮＡと、配列番号３７の配列を有するトランスポザーゼをコードする１００ｎｇのｍＲＮＡとを移入した。移入したＴ細胞をフィーダー細胞と混合し、３７℃でインキュベートした。移入１日後、１４日後および２８日後に試料を採取し、蛍光標識した抗ＣＤ８抗体とともにインキュベートし、ＣＤ８およびＤａｓｈｅｒ ＧＦＰについて蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）で分析した。データを表１２に示す。

【0182】

第６．２．１．１節に説明されているように、ＧＦＰを発現するＣＤ８＋細胞の濃度は、第５．３．１．１節に説明されているように、遺伝子移入ポリヌクレオチドが、Ｔ細胞に生存または増殖の利点を付与する遺伝子を含む、という指標である。抗ＣＤ２８／ＯＸ４０ ＥＳＲ遺伝子を移入したＴ細胞は、ＧＦＰの極めて急速な蓄積を示した。１個体のドナー由来の細胞では、９４％のＣＤ８＋細胞が１４日以内にＧＦＰ＋であった。第２のドナー由来の細胞では、９８％の細胞が２８日以内にＧＦＰ＋であった。対照遺伝子を移入した対照細胞では、ＨＳＶ－ＴＫは、同等の最初（１日後）のＧＦＰレベルを示したが、該ＧＦＰレベルはＧＦＰ発現細胞が濃縮されるのではなく減少した。このデータは、抗ＣＤ２８／ＯＸ４０ ＥＳＲの発現が、ＥＳＲを発現するＴ細胞に非常に有意な成長／増殖の利点を提供したことを示している。

【0183】

６．２．２．２ ＥＳＲ Ｆａｓ／４－１ＢＢはＣａｓｐ７－ＤＮの存在下で増殖を刺激する
ＴＮＦＲＳＦ６（Ｆａｓ）の細胞外ドメイン（配列は配列番号３２３によって付与）を含み、さらにＴＮＦＲＳＦ６（Ｆａｓ）の膜貫通ドメイン（配列は配列番号３８７によって付与）をさらに含み、ＴＮＦＲＳＦ９（４－１ＢＢ）の細胞内ドメイン（配列が配列番号３４４によって付与）をさらに含むＥＳＲをコードするように遺伝子を設計した。このＥＳＲ（Ｆａｓ／４－１ＢＢ）は、配列番号２７４の配列を含んでいた。アポトーシス阻害剤であるＣａｓｐ７：Ｃａｓｐ７－ＤＮのドミナントネガティブ版（配列は配列番号２６２によって付与）をコードする第２の遺伝子も設計した。

【0184】

ＥＳＲおよびＣａｓｐ７－ＤＮを、トランスポゾンに基づく遺伝子移入ベクター内へと別々にクローン化した。各遺伝子を、配列が配列番号１１５によって与えられたＰＧＫプロモーターと、配列が配列番号１８２によって与えられたウサギグロビンポリアデニル化シグナル配列とに作動可能に連結した。各遺伝子移入ポリヌクレオチドは、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）プロモーターとウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル配列とに作動可能に連結されたＤａｓｈｅｒＧＦＰをコードする遺伝子を含むＧＦＰレポーター（配列番号２２２の配列を有する）をさらに含んでいだ。２つのオープンリーディングフレームを、多様に転写するように構成した（２つのプロモーターは互いに隣接し、反対方向に転写された）。２つのオープンリーディングフレームには、片方の側からＨＳ４インスレーター（配列番号９２の配列を有する）が、もう片方の側からＤ４Ｚ４インスレーター（配列番号８８の配列を有する）が隣接していた。遺伝子移入ポリヌクレオチドは、１つのインスレーターの遠位側に、標的配列５’－ＴＴＡＡ－３’を、直後に続く配列番号１０のｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾン逆方向末端反復配列（これは配列番号６の実施形態である）を、直後に続く配列番号３を有する追加のトランスポゾン末端配列（これは、配列番号１と＞９５％同一である）をさらに含んでいた。遺伝子移入ポリヌクレオチドは、もう１つのインスレーターの遠位側に、配列番号５の追加のトランスポゾン末端配列（配列番号４と＞９５％同一である）を、直後に続く配列番号１１のｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾン逆方向末端反復配列（これは配列番号７の実施形態である）を、直後に続く標的配列５’－ＴＴＡＡ－３’をさらに含んでいた。

【0185】

Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＥａｓｙＳｅｐ Ｈｕｍａｎ ＣＤ８陽性選別キットを製造元の説明書により使用して、Ｔ細胞を、２つの異なる正常ドナー由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から調製した。Ｔ細胞を、放射線照射されたフィーダー細胞とのインキュベーションによって２～３日間刺激して、分泌されたＣＤ３、ＣＤ２８、ＩＬ－２、ＩＬ－７およびＩＬ－１５を提供した。おおよそ１００，０００個のＴ細胞に、製造元のプロトコルにより、Ｎｅｏｎエレクトロポレーターを使用して、０．５μｇの各トランスポゾンＤＮＡと、配列番号３７の配列を有するトランスポザーゼをコードする１００ｎｇのｍＲＮＡとを移入した。移入したＴ細胞をフィーダー細胞と混合し、３７℃でインキュベートした。移入１日後、７日後、２８日後、４８日後および５４日後に試料を採取し、蛍光標識した抗ＣＤ８抗体とともにインキュベートし、ＣＤ８およびＤａｓｈｅｒ ＧＦＰについて蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）で分析した。データを表１３に示す。

【0186】

第６．２．１．１節に説明されているように、ＧＦＰを発現するＣＤ８＋細胞の濃度は、第５．３．１．１節に説明されているように、遺伝子移入ポリヌクレオチドが、Ｔ細胞に生存または増殖の利点を付与する遺伝子を含む、という指標である。ＥＳＲ Ｆａｓ／４－１ＢＢ＋Ｃａｓｐ７－ＤＮをコードする遺伝子を同時移入したＴ細胞は、ＧＦＰ発現細胞の百分率の上昇を経時的に示した。トランスフェクションの翌日、４．５％のＣＤ８＋細胞もまたＧＦＰを発現した。７日後、１．９％のＣＤ８＋細胞はＧＦＰを発現しており、２％未満のＣＤ８＋Ｔ細胞が遺伝子移入ポリヌクレオチドを該Ｔ細胞の核内へと組み込んだことを示した。移入の２８日後までに、３１％のＣＤ８＋細胞もまたＧＦＰを発現しており、遺伝子移入ポリヌクレオチド上の遺伝子によってレシピエント細胞がより良好に生存することができるかまたはより迅速に増殖することができることを示した。移入の４８日後までに、５０．４％のＣＤ８＋細胞もまたＧＦＰを発現しており、移入の５４日後までに９７％超のＣＤ８＋Ｔ細胞もまたＧＦＰを発現していた。このデータは、ＥＳＲ Ｆａｓ／４－１ＢＢ＋抗アポトーシス遺伝子Ｃａｓｐ７－ＤＮの発現が、有意な生存／増殖の利点を提供したことを示している。

【0187】

表の簡単な説明
表１．ヒトＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞株におけるゼノパス属（Ｘｅｎｏｐｕｓ）およびカイコガ属（Ｂｏｍｂｙｘ）のｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾン

【0188】

ｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンを含む配列番号２２３および配列番号２２４によって配列が付与された遺伝子移入ポリヌクレオチドを、第６．１．１節において説明されるとおり構築した。Ｊｕｒｋａｔ細胞（１回の移入あたり２００，０００個の細胞）に、製造元の説明書により、Ｎｅｏｎエレクトロポレーターを使用して、１μｇのプラスミドＤＮＡと、トランスポザーゼをコードする対応する１００ｎｇのトランスポザーゼｍＲＮＡとを移入した。様々な時間（Ａ列に示す）の後、細胞を抗ＣＤ１９抗体で標識し、細胞の集団をＦＡＣＳによって分析して、ＣＤ１９を発現する細胞集団の百分率を決定した。Ｂ列は、配列番号２２３の遺伝子移入ポリヌクレオチド内に含有されるゼノパス属（Ｘｅｎｏｐｕｓ）トランスポゾンについての百分率を示し、Ｃ列は、配列番号２２４によって配列が付与された遺伝子移入ポリヌクレオチド内に含有されるカイコガ属（Ｂｏｍｂｙｘ）トランスポゾンについての百分率を示す。

【0189】

表２．Ｊｕｒｋａｔ細胞における異種プロモーター活性の持続時間

【0190】

Ａ列に命名され、配列がＢ列に示される配列番号によって付与されたプロモーターと、場合によりＣ列に示される配列番号によって配列が付与されたイントロンとを含み、配列がプロモーターの５’に対して配列番号２１８によって付与されたポリヌクレオチドと、配列が３’に対して配列番号２１９によって付与されたポリヌクレオチドとをさらに含むプラスミドを、第６．１．２．１節において説明するようなＪｕｒｋａｔ細胞内へと移入した。細胞を抗ＣＤ１９抗体で蛍光標識し、移入後の様々な時点でフローサイトメトリーによって分析した。表面上にＣＤ１９を発現する細胞の百分率を、２日後（Ｄ列）、８日後（Ｅ列）、１６日後（Ｆ列）および２３日後（Ｇ列）に示す。Ｈ列は、２日後と２３日後との間のＣＤ１９発現細胞の低下率を示す。同じプロモーターおよびイントロンもまた、ＧＦＰをコードする遺伝子に作動可能に連結し、ヒト胎児腎（ＨＥＫ）細胞内へと三つ組で一過性に移入した。細胞を移入の４８時間後に蛍光光度計で計数した。３つの読み取り値からの平均蛍光強度をＩ列に示す。

【0191】

表３．Ｊｕｒｋａｔ細胞における異種プロモーター活性

【0192】

Ａ列に命名され、配列がＢ列に示される配列番号によって付与されたプロモーターと、場合によりＣ列に示される配列番号によって配列が付与されたイントロンとを含み、配列がプロモーターの５’に対して配列番号２１８によって付与されたポリヌクレオチドと、配列が３’に対して配列番号２１９によって付与されたポリヌクレオチドとをさらに含むプラスミドを、第６．１．２．１節において説明するようなＪｕｒｋａｔ細胞内へと移入した。８日後、細胞を抗ＣＤ１９抗体で蛍光標識し、フローサイトメトリーによって分析した。Ｄ列は平均蛍光強度を示す。Ｅ列は、Ｊｕｒｋａｔ細胞の表面上のＣＤ１９分子の計算された平均数を示す。

【0193】

表４．初代Ｔ細胞における異種プロモーター活性

【0194】

Ａ列に命名され、配列がＢ列に示される配列番号によって付与されたプロモーターと、配列が５’に対して配列番号２１８によって付与されたポリヌクレオチドと、配列がプロモーターの３’に対して配列番号２１９によって付与されたポリヌクレオチドとをさらに含むプラスミドを、第６．１．２．２節において説明するような初代Ｔ細胞内へと移入した。１１日後、細胞を抗ＣＤ１９抗体で蛍光標識し、フローサイトメトリーによって分析した。Ｃ列は平均蛍光強度を示す。

【0195】

表５．初代Ｔ細胞の生存の増強

【0196】

ｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンを含む遺伝子移入ポリヌクレオチドを、第６．２．１．２節において説明されるとおり構築した。各トランスポゾンは、１つの推定上の生存増強遺伝子を含んでいた。単一トランスポゾンの１μｇのＤＮＡと、配列が配列番号３７によって付与されたトランスポザーゼをコードする１００ｎｇのｍＲＮＡとの同時移入によって、ヒト初代Ｔ細胞の１５個の試料を調製した（第１～第１５の行）。遺伝子の名称をＡ列に付与し、遺伝子の配列番号をＢ列に示す。２つの異なるトランスポゾンの０．５μｇのＤＮＡ（推定生存増強遺伝子の配列においてのみ異なる）と、配列が配列番号３７によって付与されたトランスポザーゼをコードする１００ｎｇのｍＲＮＡとの同時移入によって、ヒト初代Ｔ細胞の８つの試料を調製した（第１６～第２３の行）。第一の遺伝子の名称をＡ列に付与し、第一の遺伝子の配列番号をＢ列に付与し、第二の遺伝子の名称をＣ列に付与し、第二の遺伝子の配列番号をＤ列に付与する。細胞を２４日間培養した後、Ｔ細胞マーカーとしてのＣＤ８の存在、およびＴ細胞のゲノム内の遺伝子移入ポリヌクレオチドの存在の指標としてのＧＦＰの発現についてＦＡＣＳによって分析した。Ｅ列はリンパ球である分析された細胞の百分率を示し、Ｆ列は生存している分析された細胞の百分率を示し、Ｇ列は表面上にＣＤ８を発現した生細胞の百分率を示し、Ｈ列はＧＦＰを発現しているＣＤ８＋細胞の百分率を示す。

【0197】

表６．サバイビンとＣＤ２８－Ｄ１２４Ｅ－Ｔ１９５Ｐとを発現する初代Ｔ細胞のエクスビボ抗腫瘍活性

【0198】

抗ＣＤ１９キメラ抗原受容体をコードする遺伝子移入ポリヌクレオチドを、第６．２．１．３節において説明するようなｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾン上に構築した。トランスポザーゼ、および配列番号２２９によって与えられる配列を有するキメラ抗原受容体をコードする遺伝子と第６．２．１．３節に説明されているＧＦＰレポーターとを含む３つの対応するトランスポゾンのうちの１つを、ヒト初代Ｔ細胞に同時移入した。１つのトランスポゾンは、さらなる遺伝子を含まず（Ａ列）、１つのトランスポゾンは、サバイビンをコードする遺伝子をさらに含み（Ｂ列）、１つのトランスポゾンは、ＣＤ２８－Ｄ１２４Ｅ－Ｔ１９５Ｐをコードする遺伝子をさらに含んでいた（Ｃ列）。遺伝子移入ポリヌクレオチドの配列は、第１の行に示される配列番号として与えられる。細胞をおおよそ５週間培養し、その時点で、ＧＦＰ発現Ｔ細胞の百分率をＦＡＣＳを用いて測定した（第２の行）。その時点で、２００，０００個のＴ細胞（約２０，０００個のＧＦＰ発現Ｔ細胞）をＪＹ形質転換Ｂ細胞株の２００，０００個の細胞と混合した。混合の３日後（第３および第４の行）または７日後（第５および第６の行）を蛍光標識した抗ＣＤ８抗体および抗ＣＤ１９抗体で標識し、蛍光活性化セルソーターを用いて分析した。ＣＤ８発現細胞の百分率を第４および第６の行に示し、ＣＤ１９発現細胞の百分率を第３および第５の行に示す。

【0199】

表７．サバイビンとＣＤ２８－Ｄ１２４Ｅ－Ｔ１９５Ｐとを発現する初代Ｔ細胞のインビボ抗腫瘍活性

【0200】

ヒト初代Ｔ細胞を、トランスポザーゼと、第６．２．１．３節および表６において説明されるように構築したトランスポゾンを含む３つの対応する遺伝子移入ポリヌクレオチドのうちの１つとを同時移入した。トランスポゾンの名称をＡ列に示し、遺伝子移入ポリヌクレオチドの配列をＢ列に配列番号として示す。細胞を移入後おおよそ５週間培養し、次いでＦＡＣＳを用いて選別して、トランスポゾンのＴ細胞ゲノム内の存在の指標であるＧＦＰ発現細胞を選択した。選択した細胞をさらに１週間成長させ、次いで、１００万個の細胞を、７日前に１００万個のＪＹ細胞の腹腔内注射を受けたマウスに腹腔内注射によって投与した。ＪＹ細胞の投与後にマウスが生存した時間の長さ（日）をＣ列に示す。第１および第２の行では、Ｔ細胞を投与されなかったが、代わりにリン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）の対照注射が行われた。

【0201】

表８．サバイビンとＣＤ２８－Ｄ１２４Ｅ－Ｔ１９５Ｐとを発現する初代Ｔ細胞の活性の増強

【0202】

ｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンを含む遺伝子移入ポリヌクレオチドを、第６．２．１．３節において説明されるとおり構築し、異なる２ドナー由来のＴ細胞内へと移入した。片方のドナー由来の細胞をエクスビボで１０か月間培養し、第２のドナー由来の細胞をエクスビボで４か月間培養した。ＧＦＰ発現ＣＤ８＋Ｔ細胞をＦＡＣＳによって選別し、次いで、第６．２．１．３節において説明されるように、ＮＡＬＭ６ Ｂ細胞腫瘍株を負荷した。Ａ列は、エクスビボ培養時間を示し、Ｂ列は、細胞が異種ポリヌクレオチド上にコードされたサバイビン遺伝子を発現していたかどうかを示し、Ｃ列は、細胞が異種ポリヌクレオチド上にコードされたＣＤ２８－Ｄ１２４Ｅ－Ｔ１９５Ｐ遺伝子を発現していたかどうかを示す。Ｄ列～Ｈ列は、発光アッセイを使用して観察されたＮＡＬＭ６の死滅の％を示す。Ｄ列：０日後にＮＡＬＭ６を負荷し、１日後に死滅を測定された細胞。Ｅ列：０日後および２日後にＮＡＬＭ６を負荷し、３日後に死滅を測定された細胞。Ｆ列：０日後、２日後および４日後にＮＡＬＭ６を負荷し、５日後に死滅を測定された細胞。Ｇ列：０日後、２日後、４日後および６日後にＮＡＬＭ６を負荷し、７日後に死滅を測定された細胞。Ｈ列：０日後、２日後、４日後、６日後および８日後にＮＡＬＭ６を負荷し、９日後に死滅を測定された細胞。

【0203】

表９．初代Ｔ細胞の生存の増強

【0204】

ｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンを含む遺伝子移入ポリヌクレオチドを、第６．２．１．５節において説明されるとおり構築した。各トランスポゾンは、１つの推定上の生存増強遺伝子、ＥＳＲ遺伝子または対照遺伝子を含んでいた。ドナー１からのヒト初代Ｔ細胞の８つの試料（Ｃ列～Ｆ列）とドナー２からのヒト初代Ｔ細胞の８つの試料（Ｇ列～Ｊ列）を、単一トランスポゾンの１μｇのＤＮＡと、配列が配列番号３７によって付与されたトランスポザーゼをコードする１００ｎｇのｍＲＮＡとの同時移入によって調製した。遺伝子の名称をＡ列に付与し、遺伝子の配列番号をＢ列に示す。細胞を４２日間培養し、移入後の様々な時点で、Ｔ細胞マーカーとしてのＣＤ８の存在と、Ｔ細胞のゲノム内の遺伝子移入ポリヌクレオチドの存在の指標としてのＧＦＰの発現とのＦＡＣＳによる分析のために、試料を採取した。Ｃ列～Ｊ列は、移入１日後（Ｃ列およびＧ列）、１４日後（Ｄ列およびＨ列）、２８日後（Ｅ列およびＩ列）および４２日後（Ｆ列およびＪ列）にＧＦＰも発現している、表面上にＣＤ８を発現する分析された細胞（すなわち、ＣＤ８＋Ｔ細胞）の百分率を示した。

【0205】

表１０．Ｂｃｌ－ＸＬを発現する初代Ｔ細胞の活性の増強

【0206】

ｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンを含む遺伝子移入ポリヌクレオチドを、第６．２．１．６節において説明されるとおり構築し、異なる３ドナー由来のＴ細胞内へと移入した。２４０日後に、第６．２．１．６節において説明されるように、細胞にＮＡＬＭ６ Ｂ細胞腫瘍株を負荷した。Ａ列はドナーＩＤを示し、Ｂ列は細胞がＢｃｌ－ＸＬをコードする遺伝子を含むトランスポゾンを含有していたかどうかを示し、Ｃ列は培養物がＣＤ３／ＣＤ１９結合ＢｉＴＥも含有していたかどうかを示す。Ｄ列～Ｈ列は、発光アッセイを使用して観察されたＮＡＬＭ６の死滅の％を示す。Ｄ列：０日後にＮＡＬＭ６を負荷し、１日後に死滅を測定された細胞。Ｅ列：０日後および２日後にＮＡＬＭ６を負荷し、３日後に死滅を測定された細胞。Ｆ列：０日後、２日後および４日後にＮＡＬＭ６を負荷し、５日後に死滅を測定された細胞。Ｇ列：０日後、２日後、４日後および６日後にＮＡＬＭ６を負荷し、７日後に死滅を測定された細胞。Ｈ列：０日後、２日後、４日後、６日後および８日後にＮＡＬＭ６を負荷し、９日後に死滅を測定された細胞。

【0207】

表１１．サバイビンとＣＤ２８－Ｄ１２４Ｅ－Ｔ１９５Ｐとを発現する初代Ｔ細胞の活性の増強

【0208】

ｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンを含む遺伝子移入ポリヌクレオチドを、第６．２．１．６ｂ節において説明されるとおり構築し、Ｔ細胞内へと移入した。ＧＦＰ発現ＣＤ８＋Ｔ細胞をＦＡＣＳによって選別し、次いで、第６．２．１．６ｂ節において説明されるように、ＮＡＬＭ６ Ｂ細胞腫瘍株を負荷した。Ａ列は、細胞が異種ポリヌクレオチド上にコードされたサバイビン遺伝子を発現していたかどうかを示し、Ｂ列は、細胞が異種ポリヌクレオチド上にコードされたＣＤ２８－Ｄ１２４Ｅ－Ｔ１９５Ｐ遺伝子を発現していたかどうかを示し、Ｃ列は、細胞が異種ポリヌクレオチド上にコードされたＢｃｌ－ＸＬ遺伝子を発現していたかどうかを示す。Ｄ列～Ｉ列は、発光アッセイを使用して観察されたＮＡＬＭ６の死滅の％を示す。Ｄ列：０日後にＮＡＬＭ６を負荷し、１日後に死滅を測定された細胞。Ｅ列：０日後および２日後にＮＡＬＭ６を負荷し、３日後に死滅を測定された細胞。Ｆ列：０日後、２日後および４日後にＮＡＬＭ６を負荷し、５日後に死滅を測定された細胞。Ｇ列：０日後、２日後、４日後および６日後にＮＡＬＭ６を負荷し、７日後に死滅を測定された細胞。Ｈ列：０日後、２日後、４日後、６日後および８日後にＮＡＬＭ６を負荷し、９日後に死滅を測定された細胞。Ｉ列：０日後、２日後、４日後、６日後、８日後および１０日後にＮＡＬＭ６を負荷し、１１日後に死滅を測定された細胞。

【0209】

表１２．抗ＣＤ２８／ＯＸ４０ ＥＳＲによって刺激された初代Ｔ細胞の増殖

【0210】

ｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾン上にコードされた抗ＣＤ２８／ＯＸ４０ ＥＳＲを含む遺伝子移入ポリヌクレオチドを、第６．２．２．１節において説明するように構築した。対照トランスポゾンは、ＥＳＲの代わりに単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫ）遺伝子を含んでいた。トランスポゾンの１μｇのＤＮＡと、配列が配列番号３７によって付与されたトランスポザーゼをコードする１００ｎｇのｍＲＮＡとの同時移入によって、２ドナー由来のヒト初代Ｔ細胞の試料を調製した。細胞を、Ａ列に示される日数の間培養した後、Ｔ細胞マーカーとしてのＣＤ８の存在、およびＴ細胞のゲノム内の遺伝子移入ポリヌクレオチドの存在の指標としてのＧＦＰの発現についてＦＡＣＳによって分析した。ＧＦＰも発現したＣＤ８発現細胞の百分率をＢ列～Ｅ列に示す。抗ＣＤ２８／ＯＸ４０ ＥＳＲを移入したドナー１の細胞（Ｂ列）、ＨＳＶ－ＴＫを移入したドナー１の細胞（Ｂ列）、抗ＣＤ２８／ＯＸ４０ ＥＳＲを移入したドナー２の細胞（Ｃ列）、ＨＳＶ－ＴＫを移入したドナー２の細胞（Ｄ列）。ＮＤ＝未実施。

【0211】

表１３．ＥＳＲ ＦＡＳ／４－１ＢＢ＋Ｃａｓｐ７－ＤＮによって刺激された初代Ｔ細胞の増殖

【0212】

ＦＡＳの細胞外ドメインを４－１ＢＢの膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインと融合させたＥＳＲをコードする遺伝子移入ポリヌクレオチドを、第６．２．２．２節において説明されるようなｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾン上に構築した。アポトーシスのドミナントネガティブ阻害剤Ｃａｓｐ７－ＤＮをコードする第２の遺伝子移入ポリヌクレオチドを、第６．２．２．２節において説明するような第２のｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾン上に構築した。各トランスポゾンの０．５μｇのＤＮＡと、配列が配列番号３７によって付与されたトランスポザーゼをコードする１００ｎｇのｍＲＮＡとの同時移入によって、２ドナー由来のヒト初代Ｔ細胞の試料を調製した。細胞をＡ列に示される日数の間培養した後、Ｔ細胞マーカーとしてのＣＤ８の存在、およびＴ細胞のゲノム内の遺伝子移入ポリヌクレオチドの存在の指標としてのＧＦＰの発現について、ＦＡＣＳによって分析した。Ｂ列は、ＧＦＰも発現したＣＤ８発現細胞の百分率を示す。
表

【表1】

【表2】

【表3】

【表4】

【表5】

【表6】

【表7】

【表8】

【表9】

【表10】

【表11】

【表12】

【表13】

本発明は、以下の番号が付けられた実施形態を含む。
１． 免疫細胞内でのタンパク質の発現に有効な異種調節配列に作動可能に連結されたタンパク質をコードする核酸を含み、それにより前記免疫細胞の生存を増強する、免疫細胞生存増強遺伝子を含む、ポリヌクレオチド。
２． 前記免疫細胞生存増強遺伝子が、活性化突然変異を含む天然に存在するタンパク質をコードする、実施形態１に記載のポリヌクレオチド。
３． 前記免疫細胞生存増強遺伝子が、活性化突然変異を含むＳＴＡＴ３、ＣＤ２８、ＲｈｏＡ、ＰＬＣＧ、ＳＴＡＴ５ＢまたはＣＣＮＤ１から選択されるタンパク質をコードする、実施形態１または２に記載のポリヌクレオチド。
４． 前記免疫細胞生存増強遺伝子がＳＴＡＴ３をコードし、前記ＳＴＡＴ３が以下の活性化突然変異、すなわち、Ｆ１７４Ｓ、Ｈ４１０Ｒ、Ｓ６１４Ｒ、Ｅ６１６Ｋ、Ｇ６１８Ｒ、Ｙ６４０Ｆ、Ｎ６４７Ｉ、Ｅ６５２Ｋ、Ｋ６５８Ｙ、Ｋ６５８Ｒ、Ｋ６５８Ｎ、Ｋ６５８Ｍ、Ｋ６５８Ｒ、Ｋ６５８Ｈ、Ｋ６５８Ｎ、Ｄ６６１ＹまたはＤ６６１Ｖのうちの１つ以上を含む、実施形態３に記載のポリヌクレオチド。
５． 前記免疫細胞生存増強遺伝子がＣＤ２８をコードし、前記ＣＤ２８が以下の活性化突然変異、すなわち、Ｄ１２４Ｅ、Ｄ１２４Ｖ、Ｔ１９５ＩまたはＴ１９５Ｐのうちの１つ以上を含む、実施形態３に記載のポリヌクレオチド。
６． 前記免疫細胞生存増強遺伝子がＲｈｏＡをコードし、前記ＲｈｏＡが以下の活性化突然変異、すなわち、Ｇ１７ＶまたはＫ１８Ｎのうちの１つ以上を含む、実施形態３に記載のポリヌクレオチド。
７． 前記免疫細胞生存増強遺伝子がＰＬＣＧをコードし、前記ＰＬＧＣが以下の活性化突然変異、すなわち、Ｓ３４５Ｆ、Ｓ５２０ＦまたはＲ７０７Ｑのうちの１つを含む、実施形態３に記載のポリヌクレオチド。
８． 前記免疫細胞生存増強遺伝子がＳＴＡＴ５Ｂをコードし、前記ＳＴＡＴ５Ｂが以下の活性化突然変異、すなわち、Ｎ６４２Ｈ、Ｔ６４８Ｓ、Ｓ６５２Ｙ、Ｙ６６５ＦまたはＰ２６７Ａのうちの１つ以上を含む、実施形態３に記載のポリヌクレオチド。
９． 前記免疫細胞生存増強遺伝子がＣＣＮＤ１をコードし、前記ＣＣＮＤ１が以下の活性化突然変異、すなわち、Ｅ３６Ｇ、Ｅ３６Ｑ、Ｅ３６Ｋ、Ａ３９Ｓ、Ｓ４１Ｌ、Ｓ４１Ｐ、Ｓ４１Ｔ、Ｖ４２Ｅ、Ｖ４２Ａ、Ｖ４２Ｌ、Ｖ４２Ｍ、Ｙ４４Ｓ、Ｙ４４Ｄ、Ｙ４４Ｃ、Ｙ４４Ｈ、Ｋ４６Ｔ、Ｋ４６Ｒ、Ｋ４６Ｎ、Ｋ４６Ｅ、Ｃ４７Ｇ、Ｃ４７Ｒ、Ｃ４７Ｓ、Ｃ４７Ｗ、Ｐ１９９Ｒ、Ｐ１９９Ｓ、Ｐ１９９Ｌ、Ｓ２０１Ｆ、Ｔ２８５Ｉ、Ｔ２８５Ａ、Ｐ２８６Ｌ、Ｐ２８６Ｈ、Ｐ２８６Ｓ、Ｐ２８６ＴまたはＰ２８６Ａのうちの１つ以上を含む、実施形態３に記載のポリヌクレオチド。
１０． 前記免疫細胞生存増強遺伝子が、天然に存在するヒトタンパク質をコードする、実施形態１に記載のポリヌクレオチド。
１１． 前記免疫細胞生存増強遺伝子が、サバイビン、Ｂｃｌ２、Ｂｃｌ６またはＢｃｌ－ＸＬから選択されるタンパク質をコードする、実施形態１０に記載のポリヌクレオチド。
１２． 前記免疫細胞生存増強遺伝子がアポトーシス阻害剤をコードする、実施形態１に記載のポリヌクレオチド。
１３． 前記異種プロモーターが、ＥＦ１プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰＤＨプロモーター、ＥＥＦ２プロモーター、ユビキチンプロモーター、ＳＶ４０プロモーターまたはＨＳＶＴＫプロモーターから選択される、実施形態１～１２のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
１４． 前記異種プロモーターが配列番号９４～１５４から選択される、実施形態１～１２のいずれか一つに記載のポリヌクレオチド。
１５． 配列番号６および配列番号７、または配列番号１４および配列暗号１５、または配列番号１８および配列番号１９、または配列番号２０および配列番号２１、または配列番号２６および配列番号２７、または配列番号３９９および配列番号４００から選択される１対の配列をさらに含む、実施形態１～１４のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
１６． そのゲノムが前記ポリヌクレオチドを含む免疫細胞の半減期が、そのゲノムが前記ポリヌクレオチドを含まない免疫細胞の半減期と比較して少なくとも２５％長くなっている、実施形態１～１５のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
１７． そのゲノムが前記ポリヌクレオチドを含む免疫細胞の最長寿命が、そのゲノムが前記ポリヌクレオチドを含まない免疫細胞の最長寿命と比較して少なくとも２５％長くなっている、実施形態１～１６のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
１８． そのゲノムが前記ポリヌクレオチドを含まない免疫細胞の倍加時間が、そのゲノムが前記ポリヌクレオチドを含む免疫細胞の倍加時間と比較して少なくとも２５％長い、実施形態１～１７のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
１９． そのゲノムが前記ポリヌクレオチドを含む免疫細胞の増殖速度が、そのゲノムが前記ポリヌクレオチドを含まない免疫細胞の増殖速度と比較して少なくとも２５％高くなっている、実施形態１～１８のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
２０． そのゲノムが前記ポリヌクレオチドを含むＴ細胞の抗原チャレンジの反復の際の生存が、そのゲノムが前記ポリヌクレオチドを含まない免疫細胞の生存と比較して少なくとも２５％高くなっている、実施形態１～１９のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
２１． 実施形態１～２０のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む、トランスポゾン。
２２． 実施形態１～２０のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドを含む、レンチウイルスベクター。
２３． 異種プロモーターに作動可能に連結された、アポトーシス阻害剤をコードするポリヌクレオチドを、免疫細胞内へと導入することを含む、改変された免疫細胞を作製するための方法。
２４． 前記ポリヌクレオチドがトランスポゾン末端をさらに含み、かつ前記方法が、前記アポトーシス阻害剤をコードする前記ポリヌクレオチドが前記免疫細胞のゲノム内へと転位するように、対応するトランスポザーゼを前記免疫細胞内へと導入することをさらに含む、実施形態２３に記載の方法。
２５． 前記トランスポザーゼが、前記トランスポザーゼをコードする核酸として導入される、実施形態２３または２４に記載の方法。
２６． 前記核酸がｍＲＮＡである、実施形態２５に記載の方法。
２７． 前記トランスポザーゼをコードする前記核酸が、前記免疫細胞において活性のあるプロモーターに作動可能に連結されている、実施形態２４または２５に記載の方法。
２８． 前記トランスポゾンおよび前記トランスポザーゼが同じ時点で前記免疫細胞内へと導入される、実施形態２４に記載の方法。
２９． 前記トランスポゾンおよび前記トランスポザーゼが異なる時点で前記免疫細胞内へと導入される、実施形態２４に記載の方法。
３０． 前記免疫細胞がＴ細胞であり、前記方法が、抗原に結合することができる受容体をコードする遺伝子を前記免疫細胞内へと導入することをさらに含み、前記抗原をその表面に提示する標的細胞への前記受容体の結合が、前記Ｔ細胞に前記標的細胞を死滅させる、実施形態２３～２９のいずれ一つに記載の方法。
３１． 前記アポトーシス阻害剤が、サバイビン、Ｂｃｌ２、Ｂｃｌ６、Ｂｃｌ－ＸＬまたはＣａｓｐ３、Ｃａｓｐ７、Ｃａｓｐ８、Ｃａｓｐ９もしくはＣａｓｐ１０のドミナントネガティブ突然変異体から選択される、実施形態２３～２９のいずれか一つに記載の方法。
３２． 改変された免疫細胞を作製するための方法であって、前記方法が、ＳＴＡＴ３、ＣＤ２８、ＲｈｏＡ、ＰＬＣＧ、ＳＴＡＴ５ＢまたはＣＣＮＤ１から選択されるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを免疫細胞内へと導入することを含み、前記タンパク質が、異種プロモーターに作動可能に連結された活性化突然変異を含む、方法。
３３． 改変された免疫細胞を作製するための方法であって、
ａ．阻害シグナルを免疫細胞に正常に伝達する受容体の細胞外ドメインに由来する配列
ｂ．刺激シグナルを免疫細胞に伝達する受容体の細胞内ドメインの細胞内ドメインに由来する配列
ｃ．膜貫通ドメイン
を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを免疫細胞内へと導入することを含み、
前記ポリペプチドがＣＤ３ゼータ細胞内ドメインを含まない、方法。
３４． 前記細胞外ドメインが、配列番号３２２～配列番号３４０から選択される配列を含む、実施形態３３に記載の方法。
３５． 前記細胞内ドメインが、配列番号３４１～配列番号３６４から選択される配列を含む、実施形態３３または３４に記載の方法。
３６． 前記ポリペプチドが、配列番号２７４～配列番号３１８から選択される配列を含む、実施形態３３に記載の方法。
３７． そのゲノムが実施形態１～２２いずれか一つに記載のポリヌクレオチドを含む、免疫細胞。
３８． 前記免疫細胞の半減期が、そのゲノムが実施形態１に記載のポリヌクレオチドを含まない免疫細胞の半減期と比較して少なくとも２５％長くなっている、実施形態３７に記載の免疫細胞。
３９． 前記免疫細胞の最長寿命が、そのゲノムが実施形態１に記載のポリヌクレオチドを含まない免疫細胞の最長寿命と比較して少なくとも２５％長くなっている、実施形態３７または３８に記載の免疫細胞。
４０． そのゲノムが実施形態１に記載のポリヌクレオチドを含まない免疫細胞の倍加時間が、そのゲノムが実施形態１に記載のポリヌクレオチドを含む免疫細胞の半減期と比較して少なくとも２５％長くなっている、実施形態３７～３９のいずれか一つに記載の免疫細胞。
４１． 前記免疫細胞の増殖速度が、そのゲノムが実施形態１に記載のポリヌクレオチドを含まない免疫細胞の増殖速度と比較して少なくとも２５％高くなっている、実施形態３７～４０のいずれか一つに記載の免疫細胞。
４２． そのゲノムが前記ポリヌクレオチドを含むＴ細胞の、抗原チャレンジの反復の際の生存が、そのゲノムが前記ポリヌクレオチドを含まない免疫細胞の生存と比較して少なくとも２５％高くなっている、実施形態３７～４１のいずれか一つに記載の免疫細胞。
４３． 前記免疫細胞がＴ細胞である、実施形態３７～４２のいずれか一つに記載の免疫細胞。
４４． 前記免疫細胞がＢ細胞である、実施形態３７～４２のいずれか一つに記載の免疫細胞。
４５． 前記免疫細胞がヒト細胞である、実施形態３７～４２のいずれか一つに記載の免疫細胞。
４６． 前記免疫細胞が霊長類細胞、齧歯類細胞、ネコ細胞、イヌ細胞またはウマ細胞である、実施形態３７～４２のいずれか一つに記載の免疫細胞。
４７． 前記免疫細胞生存増強遺伝子がシグナル伝達増強受容体（ＥＳＲ）をコードし、前記ＥＳＲが
ａ．阻害シグナルを免疫細胞に正常に伝達する受容体の細胞外ドメインに由来する配列
ｂ．刺激シグナルを免疫細胞に伝達する受容体の細胞内ドメインの細胞内ドメインに由来する配列
ｃ．膜貫通ドメイン
を含み、かつ前記ＥＳＲがＣＤ３ゼータ細胞内ドメインを含まない、実施形態１に記載のポリヌクレオチド。
４８． 前記細胞外ドメイン（ａ）が、ＴＮＦＲＳＦ３（ＬＴＲβ）、ＴＮＦＲＳＦ６（Ｆａｓ）、ＴＮＦＲＳＦ８（ＣＤ３０）、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ（ＤＲ４）、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ（ＤＲ５）、ＴＮＦＲＳＦ１９（ＴＲＯＹ）、ＴＮＦＲＳＦ２１（ＤＲ６）およびＣＴＬＡ４から選択されるヒトタンパク質に由来する、実施形態４７に記載のポリヌクレオチド。
４９． 前記ＥＳＲが、配列番号３２２～３４０から選択される配列と少なくとも９０％同一である配列を含む、実施形態４７に記載のポリヌクレオチド。
５０． 前記細胞内ドメイン（ｂ）が、ＴＮＦＲＳＦ４（ＯＸ４０）、ＴＮＦＲＳＦ５（ＣＤ４０）、ＴＮＦＲＳＦ７（ＣＤ２７）、ＴＮＦＲＳＦ９（４－１ＢＢ）、ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ（ＲＡＮＫ）、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ（ＴＡＣＩ）、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ（ＢＡＦＦ－Ｒ）、ＴＮＦＲＳＦ１４（ＨＶＥＭ）、ＴＮＦＲＳＦ１７（ＣＤ２６９）、ＴＮＦＲＳＦ１８（ＧＩＴＲ）、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｈ（ＴＭＩＧＤ２）、誘導性Ｔ細胞共刺激因子（ＩＣＯＳ／ＣＤ２７８）、ＤＮＡＸアクセサリー分子１（ＤＮＡＭ－１／ＣＤ２２６）、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭ／ＣＤ１５０）、Ｔ細胞免疫グロブリン・ムチンドメイン（ＴＩＭ－１／ＨＡＶｃｒ－１）、インターフェロン受容体α鎖（ＩＦＮＡＲ１）、インターフェロン受容体β鎖ＩＦＮＡＲ２）、インターロイキン２受容体βサブユニット（ＩＬ２ＲＢ）、インターロイキン２受容体γサブユニット（ＩＬ２ＲＧ）、腫瘍壊死因子スーパーファミリー１４（ＴＮＦＳＦ１４／ＬＩＧＨＴ）、ナチュラルキラーグループ２メンバーＤ（ＮＫＧ２Ｄ／ＣＤ３１４）およびＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）から選択されるヒトタンパク質に由来する、実施形態４７～４９のいずれか一つに記載のポリヌクレオチド。
５１． 前記ＥＳＲが、その配列が配列番号３４１～配列番号３６４から選択される配列と少なくとも９０％同一であるポリペプチドを含む、実施形態４７～５０のいずれか一つに記載のポリヌクレオチド。
５２． 前記ＥＳＲが、その配列が配列番号３６５～配列番号３９６から選択される配列と少なくとも９０％同一であるポリペプチドを含む、実施形態４７～５１のいずれか一つに記載のポリヌクレオチド。
５３． 前記ＥＳＲが、その配列が配列番号２７４～配列番号３１８から選択される配列と少なくとも９０％同一であるポリペプチドを含む、実施形態４５～５２のいずれか一つに記載のポリヌクレオチド。
５４． 前記ポリヌクレオチドが異種プロモーターに作動可能に連結された、アポトーシス阻害剤をコードするセグメントをさらに含む、実施形態４７～５３のいずれか一つに記載のポリヌクレオチド。
５５． そのゲノムが実施形態４７～５４のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドを含む、免疫細胞。
５６． 前記免疫細胞ゲノムが、異種プロモーターに作動可能に連結された、アポトーシス阻害剤をコードするセグメントをさらに含む、実施形態５５に記載の免疫細胞。
５７． 改変された免疫細胞を作製するための方法であって、
ａ．実施形態４７に記載のポリヌクレオチドを前記免疫細胞内へと導入すること
ｂ．異種プロモーターに作動可能に連結された、アポトーシス阻害剤をコードするポリヌクレオチドを、前記免疫細胞内へと導入することを含む、方法。
５８． 前記２つのポリヌクレオチドが同じ時点で前記免疫細胞内へと導入される、実施形態５７に記載の方法。
５９． 免疫細胞の生存を増強するタンパク質を同定する方法であって、
癌性免疫細胞由来のタンパク質をコードする核酸を配列決定して、突然変異を有するタンパク質をコードする核酸を同定することと、
前記突然変異を有するタンパク質をコードする核酸を用いて免疫細胞を形質転換することと、前記免疫細胞が生存を増強したかどうかを判定することとを含む、方法。

【0213】

７．参考文献
本明細書に引用された参考文献はすべて、あたかも各個々の公表物または特許もしくは特許出願がすべての目的のためにその全体が参照により組み込まれるように具体的かつ個別に示されているのと同程度に、その全体がすべての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。異なる内容が異なる時点での引用と関係している場合、本発明の優先日における引用と関係している内容を意味する。

【0214】

当業者には明らかなように、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、本発明の多くの改変および変形を行うことができる。本明細書に説明する具体的な実施形態は、例としてのみ提供されており、本発明は、添付の特許請求の範囲が権利を与えられた同等物の全範囲と共に、添付の特許請求の範囲の用語によってのみ制限されるものとする。

【配列表フリーテキスト】

【0215】

配列表１～４０１ ＜２２３＞未知の配列または合成配列

【図1A】

【図1B】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図3E】

【図3F】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【配列表】

2022521486000001.app

【国際調査報告】