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特表2022-521502脆弱Ｘ精神遅滞タンパク質干渉オリゴヌクレオチドおよびその使用方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-04-08
(54)【発明の名称】脆弱Ｘ精神遅滞タンパク質干渉オリゴヌクレオチドおよびその使用方法
(51)【国際特許分類】
A61K 31/7088 20060101AFI20220401BHJP
C12N 15/113 20100101ALI20220401BHJP
A61P 1/00 20060101ALI20220401BHJP
A61P 1/04 20060101ALI20220401BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220401BHJP
A61P 35/04 20060101ALI20220401BHJP
A61K 31/7115 20060101ALI20220401BHJP
A61K 31/7125 20060101ALI20220401BHJP
A61K 31/712 20060101ALI20220401BHJP
A61K 31/713 20060101ALI20220401BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20220401BHJP
【ＦＩ】
A61K31/7088
C12N15/113 ZNA
A61P1/00
A61P1/04
A61P35/00
A61P35/04
A61K31/7115
A61K31/7125
A61K31/712
A61K31/713
A61P43/00 111
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021547879
(86)(22)【出願日】2020-02-26
(85)【翻訳文提出日】2021-10-14
(86)【国際出願番号】 EP2020055071
(87)【国際公開番号】W WO2020174023
(87)【国際公開日】2020-09-03
(31)【優先権主張番号】62/810,697
(32)【優先日】2019-02-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】511134621
【氏名又は名称】ノグラ ファーマ リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100082072
【弁理士】
【氏名又は名称】清原 義博
(72)【発明者】
【氏名】ヴィティ フランチェスカ
(72)【発明者】
【氏名】ベリンヴィア サルバトーレ
【テーマコード（参考）】
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086MA16
4C086MA55
4C086MA56
4C086MA57
4C086MA60
4C086MA66
4C086NA14
4C086ZA66
4C086ZA68
4C086ZB26
4C086ZC19
(57)【要約】
【解決手段】脆弱Ｘ精神遅滞タンパク質（ＦＭＲＰ）に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド配列、ならびに、ＦＭＲＰの活性または発現の上昇に関連した大腸癌および炎症性腸疾患（例えば、クローン病および潰瘍性大腸炎）などの腸疾患を処置するためのその使用方法が、本明細書に開示される。また、腸疾患の処置に有用なＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有する医薬組成物、ならびに、腸疾患の処置で使用される、開示されるＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有する薬剤の製造が、本明細書に開示される。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
必要とする患者の腸疾患を処置する方法であって、該方法は、脆弱Ｘ精神遅滞タンパク質（ＦＭＲＰ）発現を阻害する有効量のアンチセンスオリゴヌクレオチドを前記患者に投与する工程を含む、方法。
【請求項2】
前記腸疾患は大腸癌である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記腸疾患は炎症性腸疾患である、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記炎症性腸疾患はクローン病または潰瘍性大腸炎である、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
必要とする患者の固形腫瘍、腫瘍浸潤または腫瘍転移を処置する方法であって、該方法は、脆弱Ｘ精神遅滞タンパク質（ＦＭＲＰ）発現を阻害する有効量のアンチセンスオリゴヌクレオチドを前記患者に投与する工程を含む、方法。
【請求項6】
必要とする患者の腫瘍浸潤または腫瘍転移を予防または改善する方法であって、該方法は、脆弱Ｘ精神遅滞タンパク質（ＦＭＲＰ）発現を阻害する有効量のアンチセンスオリゴヌクレオチドを前記患者に投与する工程を含む、方法。
【請求項7】
必要とする患者の大腸癌腫瘍浸潤または大腸癌腫瘍転移を予防または改善する方法であって、該方法は、脆弱Ｘ精神遅滞タンパク質（ＦＭＲＰ）発現を阻害する有効量のアンチセンスオリゴヌクレオチドを前記患者に投与する工程を含む、方法。
【請求項8】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ネクロプトーシスを誘導する、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項9】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’－ＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣＣＡ－３’（配列番号１）、
５’－ＣＴＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴ－３’（配列番号２）、
５’－ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣＣ－３’（配列番号３）、
５’－ＣＴＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣ－３’（配列番号４）、および
５’－ＴＣＡＣＣＣＴＴＴＡＴＣＡＴＣＣＴＣ－３’（配列番号５）からなる群から選択される配列、あるいはその補体を含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項10】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’－ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣＣＡＴ－３’（配列番号６）、
５’－ＡＣＴＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣ－３’（配列番号７）、
５’－ＴＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣＣＡ－３’（配列番号８）、
５’－ＡＣＴＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴ－３’（配列番号９）、および
５’－ＣＴＣＡＣＣＣＴＴＴＡＴＣＡＴＣＣＴＣＡ－３’（配列番号１０）からなる群から選択される配列、あるいはその補体を含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項11】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１つ以上のリボヌクレオチドを含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項12】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１つ以上のデオキシリボヌクレオチドを含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項13】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドの混合物を含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項14】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５－メチルシチジン、５－メチル－２’－デオキシシチジン、デオキシシチジン、５－メチル－２’－デオキシシチジン５’－モノホスフェート、および５－メチル－２’－デオキシシチジン－５’－モノホスホロチオエートからなる群から選択される１つ以上の修飾ヌクレオシドを含む、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項15】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチルシチジン、２’－Ｏ－メチルグアノシン、２’－Ｏ－メチルチミジン、２’－Ｏ－メチルウリジン、および２’－Ｏ－メチルアデノシンからなる群から選択される１つ以上の修飾ヌクレオシドを含む、請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項16】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５－メチルシトシンおよび５－メチルグアニンからなる群から選択される１つ以上の修飾ヌクレオチドを含む、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項17】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）ヌクレオシド、２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオシド、および２’－フルオロ－β－Ｄ－アラビノヌクレオシドからなる群から選択される１つ以上の修飾ヌクレオシドを含む、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項18】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、架橋核酸、ロックド核酸（ＬＮＡ）、拘束エチル（ｃＥＴ）核酸、トリシクロＤＮＡ（ｔｃＤＮＡ）、２’－Ｏ，４’－Ｃ－エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）から選択される群の１つ以上を含む、請求項１～１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項19】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、ホスホトリエステル結合、アルキルホスホネート結合、アミノアルキルホスホトリエステル結合、アルキレンホスホネート結合、ホスフィネート結合、ホスホロアミデート結合、ホスホロモルホリデート結合、ホスホロピペラジデート結合、アミノアルキルホスホロアミデート結合、チオホスホロアミデート結合、チオノアルキルホスホネート結合、チオノアルキルホスホトリエステル結合、チオホスフェート結合、セレノホスフェート結合およびボラノホスフェート結合からなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオシド間結合を含む、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項20】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含む、請求項１～１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項21】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドの全てのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である、請求項１～２０のいずれか１つに記載の方法。
【請求項22】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのメチルホスホネート結合を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項23】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、２０～４０ヌクレオチドの長さである、請求項１～２２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項24】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、２０～２４ヌクレオチドの長さである、請求項１～２３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項25】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’－ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣＣＡＴ－３’（配列番号６）、
５’－ＡＣＴＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣ－３’（配列番号７）、
５’－ＴＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣＣＡ－３’（配列番号８）、
５’－ＡＣＴＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴ－３’（配列番号９）、および
５’－ＣＴＣＡＣＣＣＴＴＴＡＴＣＡＴＣＣＴＣＡ－３’（配列番号１０）からなる群から選択される配列、あるいはその補体からなる、請求項１～２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項26】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項27】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドの全てのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である、請求項２５または２６に記載の方法。
【請求項28】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのメチルホスホネート結合を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項29】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、受容体相互作用タンパク質キナーゼ１（ＲＩＰＫ１）、受容体相互作用タンパク質キナーゼ３（ＲＩＰＫ３）、および混合系統キナーゼドメイン様タンパク質（ＭＬＫＬ）からなる群から選択される１つ以上のキナーゼの活性の上昇をもたらす、請求項８に記載の方法。
【請求項30】
前記アンチセンスリゴヌクレオチドは、前記患者に経腸投与または非経口投与される、請求項１～２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項31】
経腸投与は、経口投与、舌下投与、胃投与または直腸投与である、請求項３０に記載の方法。
【請求項32】
非経口投与は、静脈内投与、腫瘍内投与、空腸内投与、回腸内投与、結腸内投与または直腸内投与である、請求項３０に記載の方法。
【請求項33】
前記患者は、ヒトである、請求項１～３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項34】
アンチセンスオリゴヌクレオチドであって、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’－ＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣＣＡ－３’（配列番号１）、
５’－ＣＴＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴ－３’（配列番号２）、
５’－ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣＣ－３’（配列番号３）、
５’－ＣＴＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣ－３’（配列番号４）、および
５’－ＴＣＡＣＣＣＴＴＴＡＴＣＡＴＣＣＴＣ－３’（配列番号５）からなる群から選択される配列、あるいはその補体を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項35】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’－ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣＣＡＴ－３’（配列番号６）、
５’－ＡＣＴＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣ－３’（配列番号７）、
５’－ＴＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣＣＡ－３’（配列番号８）、
５’－ＡＣＴＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴ－３’（配列番号９）、および
５’－ＣＴＣＡＣＣＣＴＴＴＡＴＣＡＴＣＣＴＣＡ－３’（配列番号１０）からなる群から選択される配列、あるいはその補体を含む、請求項３４に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項36】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１つ以上のリボヌクレオチドを含む、請求項３４または３５に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項37】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１つ以上のデオキシリボヌクレオチドを含む、請求項３４～３６のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項38】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドの混合物を含む、請求項３４～３７のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項39】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５－メチルシチジン、５－メチル－２’－デオキシシチジン、デオキシシチジン、５－メチル－２’－デオキシシチジン５’－モノホスフェート、および５－メチル－２’－デオキシシチジン－５’－モノホスホロチオエートからなる群から選択される１つ以上の修飾ヌクレオシドを含む、請求項３４～３８のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項40】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチルシチジン、２’－Ｏ－メチルグアノシン、２’－Ｏ－メチルチミジン、２’－Ｏ－メチルウリジン、および２’－Ｏ－メチルアデノシンからなる群から選択される１つ以上の修飾ヌクレオシドを含む、請求項３４～３９のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項41】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５－メチルシトシンおよび５－メチルグアニンからなる群から選択される１つ以上の修飾ヌクレオチドを含む、請求項３４～４０のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項42】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）ヌクレオシド、２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオシド、および２’－フルオロ－β－Ｄ－アラビノヌクレオシドからなる群から選択される１つ以上の修飾ヌクレオシドを含む、請求項３４～４１のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項43】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、架橋核酸、ロックド核酸（ＬＮＡ）、拘束エチル（ｃＥＴ）核酸、トリシクロＤＮＡ（ｔｃＤＮＡ）、２’－Ｏ，４’－Ｃ－エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）から選択される群の１つ以上を含む、請求項３４～４２のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項44】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、ホスホトリエステル結合、アルキルホスホネート結合、アミノアルキルホスホトリエステル結合、アルキレンホスホネート結合、ホスフィネート結合、ホスホロアミデート結合、ホスホロモルホリデート結合、ホスホロピペラジデート結合、アミノアルキルホスホロアミデート結合、チオホスホロアミデート結合、チオノアルキルホスホネート結合、チオノアルキルホスホトリエステル結合、チオホスフェート結合、セレノホスフェート結合およびボラノホスフェート結合からなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオシド間結合を含む、請求項３４～４３のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項45】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含む、請求項３４～４４のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項46】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドの全てのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である、請求項３４～４５のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項47】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのメチルホスホネート結合を含む、請求項３４～４４のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドの配列。
【請求項48】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、２０～４０ヌクレオチドの長さである、請求項３４～４７のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項49】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、２０～２４ヌクレオチドの長さである、請求項３４～４８のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項50】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’－ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣＣＡＴ－３’（配列番号６）、
５’－ＡＣＴＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣ－３’（配列番号７）、
５’－ＴＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣＣＡ－３’（配列番号８）、
５’－ＡＣＴＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴ－３’（配列番号９）、および
５’－ＣＴＣＡＣＣＣＴＴＴＡＴＣＡＴＣＣＴＣＡ－３’（配列番号１０）からなる群から選択される配列、あるいはその補体からなる、請求項３４～４９のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項51】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含む、請求項５０に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項52】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドの全てのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である、請求項５０または５１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項53】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのメチルホスホネート結合を含む、請求項５０に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項54】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＦＭＲＰ ｓｉＲＮＡ、あるいはその薬学的に許容可能な塩である、請求項３４または３５に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項55】
前記ＦＭＲＰ ｓｉＲＮＡは、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、ホスホトリエステル結合、アルキルホスホネート結合、アミノアルキルホスホトリエステル結合、アルキレンホスホネート結合、ホスフィネート結合、ホスホロアミデート結合、ホスホロモルホリデート結合、ホスホロピペラジデート結合、アミノアルキルホスホロアミデート結合、チオホスホロアミデート結合、チオノアルキルホスホネート結合、チオノアルキルホスホトリエステル結合、チオホスフェート結合、セレノホスフェート結合およびボラノホスフェート結合からなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオシド間結合を含む、請求項５４に記載のＦＭＲＰ ｓｉＲＮＡ。
【請求項56】
前記ＦＭＲＰ ｓｉＲＮＡは、少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含む、請求項５４または５５に記載のＦＭＲＰ ｓｉＲＮＡ。
【請求項57】
前記ＦＭＲＰ ｓｉＲＮＡの全てのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である、請求項５４～５６のいずれか１項に記載のＦＭＲＰ ｓｉＲＮＡ。
【請求項58】
前記ＦＭＲＰ ｓｉＲＮＡの少なくとも１つのシチジンは、５－メチルシチジンで置換される、請求項５４～５７のいずれか１項に記載のＦＭＲＰ ｓｉＲＮＡ。
【請求項59】
前記ＦＭＲＰ ｓｉＲＮＡは、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、２０～４０、または２０～２４ヌクレオチドの長さである、請求項５４～５８のいずれか１項に記載のＦＭＲＰ ｓｉＲＮＡ。
【請求項60】
前記ＦＭＲＰ ｓｉＲＮＡは、２０～４０ヌクレオチドの長さである、請求項５４～５９のいずれか１項に記載のＦＭＲＰ ｓｉＲＮＡ。
【請求項61】
前記ＦＭＲＰ ｓｉＲＮＡは、２０～２４ヌクレオチドの長さである、請求項５４～６０のいずれか１項に記載のＦＭＲＰ ｓｉＲＮＡ。
【請求項62】
請求項３２～５４のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは請求項５５～６１のいずれか１項に記載のＦＭＲＰ ｓｉＲＮＡと、薬学的に許容可能な担体とを含む薬学的に許容可能な組成物。
【請求項63】
腸疾患を処置するための薬剤の製造における、請求項３２～５４のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは請求項５５～６１のいずれか１項に記載のＦＭＲＰ ｓｉＲＮＡの使用。
【請求項64】
前記腸疾患は大腸癌である、請求項６３に記載の使用。
【請求項65】
前記腸疾患は炎症性腸疾患である、請求項６３に記載の使用。
【請求項66】
前記炎症性腸疾患はクローン病または潰瘍性大腸炎である、請求項６５に記載の使用。
【請求項67】
前記薬剤は、患者に経腸投与または非経口投与される、請求項６３～６６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項68】
経腸投与は、経口投与、舌下投与、胃投与または直腸投与である、請求項６７に記載の使用。
【請求項69】
非経口投与は、静脈内投与、腫瘍内投与、空腸内投与、回腸内投与、結腸内投与または直腸内投与である、請求項６７に記載の使用。
【請求項70】
前記薬剤は、ヒトの腸疾患を処置するためのものである、請求項６３～６９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項71】
固形腫瘍、腫瘍浸潤または腫瘍転移を処置するための薬剤の製造における、請求項３２～５４のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは請求項５５～６１のいずれか１項に記載のＦＭＲＰ ｓｉＲＮＡの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年２月２６日に出願された米国仮特許出願第６２／８１０，６９７号の利益および優先権を主張するものであり、その開示は、全ての目的のために全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１９年２月２６日に出願された米国仮特許出願第６２／８１０，６９７号の利益および優先権を主張するものであり、その開示は、全ての目的のために全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0002】
ＲＮＡ結合タンパク質（ＲＢＰ）は、転写後制御プロセスの全てのステップに事実上関与しており、細胞の各転写産物に関する運命および機能を指令して、細胞のホメオスタシスを維持する。ＲＢＰは、タンパク質ならびにコーディングＲＮＡおよびノンコーディングＲＮＡとの高度に動的な相互作用を確立し、ＲＮＡスプライシング、ポリアデニル化、安定化、局在化、翻訳および分解を制御するリボ核タンパク質複合体と呼ばれる機能単位を作成する。
【0003】
ＲＢＰは、様々な種類の癌において制御不全になっており、腫瘍形成促進タンパク質および腫瘍抑制タンパク質ならびに炎症性メディエーターの発現および機能に影響することが、現在明らかになっている。いくつかの研究から、癌では、隣接している正常組織に比べてＲＢＰが異常に発現し、この発現が患者の予後と相関するという証拠が得られている。近年、脆弱Ｘ精神遅滞タンパク質（ＦＭＲＰ）は、多くの様々な種類のヒトの癌の発症・増殖を制御するのに極めて重要であると認知されつつある。ＦＭＲＰが突然変異または欠失することで、最も頻度が高い、ヒトの遺伝性知的障害の形態である脆弱Ｘ症候群（ＦＸＳ）を引き起こす。ＦＭＲＰは、ＲＮＡ代謝の複数のステップに関与しているＲＢＰである。脳において、ＦＭＲＰが機能的に欠失することで、シナプスにおける細胞骨格の構成や受容体の移動性の欠損に起因したシナプス可塑性を引き起こす。標的ｍＲＮＡの同一性、ノンコーディングＲＮＡの存在、および／または、細胞状況に応じて、ＦＭＲＰは、翻訳の負の制御因子として機能するか、ｍＲＮＡの安定性を調節するか、ｍＲＮＡ輸送を制御するか、あるいは、ＲＮＡ編集に影響し得る。注目すべきは、ＦＭＲＰ制御ｍＲＮＡは、癌の進行や転移を制御するいくつかの機構に関与している。
【0004】
ＦＭＲＰは様々な種類の癌において関与していることが、収束証拠によって強調されており、ＦＭＲＰをコードするＦＭＲ１遺伝子は、様々な組織や癌細胞型で発現し、ＦＭＲ１の常染色体パラログや、相互作用するＦＸＲ１は、トリプルネガティブ乳癌の遠隔転移の予測因子として近年認識され、また、いくつかのＦＭＲＰ ｍＲＮＡ標的は、癌の進行に関与している。さらに、一般集団における割合と比較して、ＦＳＸ患者における癌の標準化発生率は大幅に低く、ＦＳＸ患者は、特定の形態の癌に対して防御されている可能性がある。
【0005】
大腸癌（ＣＲＣ）は、世界で最も一般的な癌の１つであり、毎年５０万を超える死亡者が出ている。ＣＲＣ腫瘍形成のモデルは、癌の発症および進行に必要とされるいくつかの遺伝子変化を含む。これらの変化は、腫瘍形成シグナル伝達経路および／または腫瘍抑制シグナル伝達経路によって大部分は指令され、正常粘膜から腺腫様ポリープ、その後癌腫に進行する原因となる。結腸腫瘍細胞は、内因性・細胞外のシグナルに応じてタンパク質発現レベルを素早く安定した適応することができる転写後の機構をハイジャックし、細胞が局所微小環境に適応することに結びつくことが明らかになった。
【0006】
疫学／遺伝学研究はまた、拡張したトリヌクレオチド（ＣＧＧ）反復要素を含むＦＭＲ１の前突然変異対立遺伝子を保有する女性において、免疫関連疾患（例えば、甲状腺炎、関節リウマチ、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデスおよび多発性硬化症）を頻繁に発症することを報告している。このようなＦＭＲＰ遺伝子変化が免疫病態に対する素因を引き起こすという基本的機構は不明なままであるものの、２つの最近の研究では、ＦＳＸを有している小児において、サイトカインプロファイルが変更されることを報告している。
【0007】
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、アメリカ合衆国で約１４０万名の患者が患っている消化管の慢性炎症性疾患である。これは、アメリカ合衆国で最も蔓延している５つの消化器疾患負荷のうちの１つであり、その医療費全体は、１７億ドルを超えるものである。アメリカ合衆国では毎年、ＩＢＤは、７００，０００件を超える受診、１００，０００件を超える入院、１１９，０００名の患者における障害の原因となっている。現在のところ、医学的治癒は存在せず、したがって、疾患管理には、生涯にわたるケアが必要となる。
【0008】
ＩＢＤの２つの最も一般的な形態は、クローン病および潰瘍性大腸炎である。クローン病は、消化管全体に影響を及ぼす可能性もあるが、主に回腸（小腸の遠位部または下部）および大腸に影響を及ぼす。潰瘍性大腸炎は、主に結腸および直腸に影響を及ぼす。炎症性腸疾患の病因は完全には理解されていないが、環境因子および遺伝因子の両方が当該疾患において役割を果たしていると考えられる。環境構成成分は、摂取された食物および薬物への曝露の影響を受ける腸の細菌叢の変化を含み得る。
【0009】
ＩＢＤは、腹痛、嘔吐、下痢、直腸出血、激しい痙攣、筋痙攣、体重減少、栄養失調、発熱、および貧血を伴う。ＩＢＤを有している患者は、皮膚病変、関節痛、眼炎、および肝障害を患う可能性があり、潰瘍性大腸炎を患っている小児は、成長欠陥を患う可能性がある。死に至ることは稀であるが、これらの症状は患者の生活の質を低下させるものである。
【0010】
したがって、ＣＲＣおよびＩＢＤなどの腸疾患を処置する確実な方法を開発する必要に迫られている。広範囲の患者にわたって症状を効果的かつ恒久的に軽減し、負の副作用や、寛解および／または炎症の周期を伴わない処置方法を特定するさらなる必要がある。
【発明の概要】
【0011】
本明細書には、脆弱Ｘ精神遅滞タンパク質（ＦＭＲＰ）発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびその使用方法が記載されている。いくつかの実施形態では、本開示は、必要とする患者の腸疾患を処置する方法を提供し、該方法は、ＦＭＲＰの発現を阻害する有効量のアンチセンスオリゴヌクレオチドを患者に投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、腸疾患は、大腸癌、あるいはクローン病または潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患であってもよい。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドはネクロトーシスを誘導する。
【0012】
いくつかの実施形態では、本開示は、必要とする患者の固形腫瘍、腫瘍浸潤または腫瘍転移を処置する方法を提供し、該方法は、ＦＭＲＰ発現を阻害する有効量のアンチセンスオリゴヌクレオチドを患者に投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、本開示は、腫瘍浸潤または腫瘍転移を予防または改善する方法を提供する。ある実施形態では、本開示は、大腸癌腫瘍浸潤または大腸癌腫瘍転移を予防または改善する方法を提供する。
【0013】
いくつかの実施形態では、ＦＭＲＰ発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、
５’－ＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣＣＡ－３’（配列番号１）、
５’－ＣＴＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴ－３’（配列番号２）、
５’－ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣＣ－３’（配列番号３）、
５’－ＣＴＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣ－３’（配列番号４）、および
５’－ＴＣＡＣＣＣＴＴＴＡＴＣＡＴＣＣＴＣ－３’（配列番号５）からなる群から選択される配列、あるいはその補体を含む。
５’－ＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣＣＡ－３’（配列番号１）、
５’－ＣＴＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴ－３’（配列番号２）、
５’－ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣＣ－３’（配列番号３）、
５’－ＣＴＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣ－３’（配列番号４）、および
５’－ＴＣＡＣＣＣＴＴＴＡＴＣＡＴＣＣＴＣ－３’（配列番号５）からなる群から選択される配列、あるいはその補体を含む。
【0014】
さらなる実施形態では、ＦＭＲＰ発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、
５’－ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣＣＡＴ－３’（配列番号６）、
５’－ＡＣＴＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣ－３’（配列番号７）、
５’－ＴＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣＣＡ－３’（配列番号８）、
５’－ＡＣＴＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴ－３’（配列番号９）、および
５’－ＣＴＣＡＣＣＣＴＴＴＡＴＣＡＴＣＣＴＣＡ－３’（配列番号１０）からなる群から選択される配列、あるいはその補体を含む。
５’－ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣＣＡＴ－３’（配列番号６）、
５’－ＡＣＴＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣ－３’（配列番号７）、
５’－ＴＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣＣＡ－３’（配列番号８）、
５’－ＡＣＴＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴ－３’（配列番号９）、および
５’－ＣＴＣＡＣＣＣＴＴＴＡＴＣＡＴＣＣＴＣＡ－３’（配列番号１０）からなる群から選択される配列、あるいはその補体を含む。
【0015】
いくつかの実施形態では、ＦＭＲＰ発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、
５’－ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣＣＡＴ－３’（配列番号６）、
５’－ＡＣＴＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣ－３’（配列番号７）、
５’－ＴＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣＣＡ－３’（配列番号８）、
５’－ＡＣＴＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴ－３’（配列番号９）、および
５’－ＣＴＣＡＣＣＣＴＴＴＡＴＣＡＴＣＣＴＣＡ－３’（配列番号１０）からなる群から選択される配列、あるいはその補体からなる。
５’－ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣＣＡＴ－３’（配列番号６）、
５’－ＡＣＴＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣ－３’（配列番号７）、
５’－ＴＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣＣＡ－３’（配列番号８）、
５’－ＡＣＴＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴ－３’（配列番号９）、および
５’－ＣＴＣＡＣＣＣＴＴＴＡＴＣＡＴＣＣＴＣＡ－３’（配列番号１０）からなる群から選択される配列、あるいはその補体からなる。
【0016】
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列の少なくとも１つのヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、ホスホトリエステル結合、アルキルホスホネート結合、アミノアルキルホスホトリエステル結合、アルキレンホスホネート結合、ホスフィネート結合、ホスホロアミデート結合、ホスホロモルホリデート結合、ホスホロピペラジデート結合、アミノアルキルホスホロアミデート結合、チオホスホロアミデート結合、チオノアルキルホスホネート結合、チオノアルキルホスホトリエステル結合、チオホスフェート結合、セレノホスフェート結合またはボラノホスフェート結合であるアンチセンスオリゴヌクレオチドであってもよい。特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド配列の少なくとも１つのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド配列の全てのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である。いくつかの実施形態では、配列の少なくとも１つのヌクレオシド結合は、メチルホスホネート結合である。
【0017】
本明細書に記載のＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドに含まれるヌクレオチドの数は変動してもよい。例えば、いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、２０～４０ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、２０～２４ヌクレオチドの長さである。
【0018】
いくつかの実施形態では、ＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドは、受容体相互作用タンパク質キナーゼ１（ＲＩＰ１またはＲＩＰＫ１）－受容体相互作用タンパク質キナーゼ３（ＲＩＰ３またはＲＩＰＫ３）－混合系統キナーゼドメイン様タンパク質（ＭＬＫＬ）複合体の活性化を介してネクロトーシスを誘導する。例えば、ＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＲＩＰＫ１発現を増加させる可能性がある。
【0019】
いくつかの実施形態では、ＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドは、１つ以上のリボヌクレオチド、１つ以上のデオキシリボヌクレオチド、あるいはリボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドの混合物を含む。
【0020】
いくつかの実施形態では、ＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドは、１つ以上の修飾ヌクレオシド、例えば、５－メチルシチジン、５－メチル－２’－デオキシシチジン、デオキシシチジン、５－メチル－２’－デオキシシチジン５’－モノホスフェート、または５－メチル－２’－デオキシシチジン－５’－モノホスホロチオエートを含む。ある実施形態では、ＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドは、１つ以上の修飾ヌクレオシド、例えば、２’－Ｏ－メチルシチジン、２’－Ｏ－メチルグアノシン、２’－Ｏ－メチルチミジン、２’－Ｏ－メチルウリジン、または２’－Ｏ－メチルアデノシンを含む。いくつかの実施形態では、ＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドは、１つ以上の修飾ヌクレオチド、例えば、５－メチルシトシンまたは５－メチルグアニンを含む。いくつかの実施形態では、ＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドは、１つ以上の修飾ヌクレオチド、例えば、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）ヌクレオシド、２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオシド、または２’－フルオロ－β－Ｄ－アラビノヌクレオシドを含む。
【0021】
いくつかの実施形態では、ＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドは、架橋型核酸、ロックド核酸（ＬＮＡ）、拘束エチル（ｃＥＴ）核酸、トリシクロＤＮＡ（ｔｃＤＮＡ）、２’－Ｏ，４’－Ｃ－エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）、またはペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む。
【0022】
いくつかの実施形態では、ＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＦＭＲＰ ｓｉＲＮＡ、あるいはその薬学的に許容可能な塩である。
【0023】
いくつかの実施形態では、ＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドは、患者に経腸投与または非経口投与される。例えば、いくつかの実施形態では、ＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドは、患者に経口投与、舌下投与、経胃投与または直腸投与される。他の実施形態では、患者へのＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与は、静脈内投与、腫瘍内投与、空腸内投与、回腸内投与、結腸内投与、または直腸内投与である。
【0024】
特定の実施形態では、本開示のＦＲＭＰアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒト患者の腸疾患を処置するためのものである。
【0025】
また、本明細書では、本明細書に記載のＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび薬学的に許容可能な担体を含む薬学的に許容可能な組成物が記載されている。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、経口投与、舌下投与、胃投与または直腸投与に適したものである。他の実施形態では、医薬組成物は、静脈内投与、腫瘍内投与、空腸内投与、回腸内投与、結腸内投与または直腸内投与に適したものである。
【0026】
また、本明細書には、腸疾患の処置のための薬剤の製造におけるＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用が記載されている。いくつかの実施形態では、腸疾患は、ＣＲＣ、あるいはクローン病または潰瘍性大腸炎などのＩＢＤである。他の実施形態では、薬剤は、患者に経腸投与または非経口投与される。例えば、いくつかの実施形態では、薬剤は、経口投与、舌下投与、胃投与または直腸投与に適したものである。いくつかの実施形態では、薬剤は、静脈内投与、腫瘍内投与、空腸内投与、回腸内投与、結腸内投与または直腸内投与に適したものである。いくつかの実施形態では、薬剤は、ヒトの腸疾患を処置するためのものである。
【0027】
いくつかの実施形態では、本開示は、固形腫瘍、腫瘍浸潤または腫瘍転移の処置のための薬剤の製造におけるＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0028】
【図1A】ヒトＣＲＣ試料のＦＭＲＰの染色を示す免疫組織像である（ＩｇＧ＝アイソタイプ対照、ＮＣ＝正常対照の結腸試料、Ｐ＝腫瘍周囲試料、Ｔ＝腫瘍試料）。
【図1B】ＲＴ－ＰＣＲ分析によって求められた、腫瘍周囲試料（Ｐ）およびＣＲＣ腫瘍試料（Ｔ）におけるＦＭＲＰ ｍＲＮＡ発現レベルを示す線グラフである（＊＊ｐ＜０．０１）。
【図1C】ＣＲＣ患者のペアの腫瘍周囲試料（Ｐ）およびＣＲＣ腫瘍試料（Ｔ）におけるＦＭＲＰタンパク質発現を示すウエスタンブロットである。
【図1D】ウエスタンブロット分析の定量できる濃度測定によって測定された、ペアの腫瘍周囲試料（Ｐ）およびＣＲＣ腫瘍試料（Ｔ）におけるβ－アクチン発現と比較したＦＭＲＰタンパク質発現を示すグラフである（相対的発現は任意の単位（ａ．ｕ．）で示される）。
【図2A】無処置の野生型（ＷＴ）マウスおよびＦＭＲ１ノックアウト（ＫＯ）マウス、あるいはアゾキシメタン（ＡＯＭ）の腹腔内注射の２１週間後のマウスの結腸の内視鏡画像である。
【図2B】ＡＯＭの腹腔内注射の２１週間後のＷＴマウスおよびＦＭＲ１ ＫＯマウスの結腸における腫瘍負荷（左）および腫瘍サイズ（右）を示す棒グラフである（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）。
【図2C】ＡＯＭを腹腔内注射したＷＴマウスおよびＦＭＲ１ ＫＯマウスの生存率を示すグラフである。
【図2D】ＷＴマウスおよびＦＭＲ１ ＫＯマウスにおけるＡＯＭ誘導腫瘍から調製した試料のヘマトキシリン・エオジン（Ｈ＆Ｅ）染色を示す組織像である。
【図2E】無処置のＷＴマウスおよびＡＯＭで処置したマウス（Ｐ＝腫瘍周囲試料、Ｔ＝ＣＲＣ腫瘍試料）から調製した結腸試料におけるＦＭＲＰおよびβ－アクチン（ローディング対照）タンパク質発現を示すウエスタンブロットである。
【図2F】ＷＴマウスおよびＦＭＲ１ ＫＯマウスにおけるＡＯＭ誘導腫瘍から調製した試料のＴＵＮＥＬ染色を示す組織像である。
【図2G】ＷＴマウスおよびＦＭＲ１ ＫＯマウスのＡＯＭ誘導腫瘍試料におけるＫｉ６７染色を示す免疫組織像である。
【図3A】ＤＬＤ－１およびＨＣＴ－１１６ヒト結腸癌細胞株、およびＨＣＥＣ－１ｃｔ非癌性ヒト結腸上皮細胞株におけるＦＭＲＰおよびβ－アクチン（ローディング対照）タンパク質発現を示す代表的なウエスタンブロットである。
【図3B】図３Ａに記載のウエスタンブロットの濃度測定分析によって求められた、ＤＬＤ－１細胞株、ＨＣＴ－１１６細胞株およびＨＣＥＣ－１ｃｔ細胞株におけるβ－アクチン発現と比較したＦＭＲＰタンパク質発現を示すグラフである（相対的発現は任意の単位（ａ．ｕ．）で示される）（＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図3C】ＦＭＲＰ発現に対して染色したＤＬＤ－１細胞、ＨＣＴ－１１６細胞およびＨＣＥＣ－１ｃｔ細胞を示す免疫蛍光画像である。
【図3D】センスＦＭＲＰオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスＦＭＲＰオリゴヌクレオチド（Ｕ＝無処置、Ｓ＝センス、ＡＳ＝アンチセンス）で４８時間処置したＤＬＤ－１細胞におけるＦＭＲＰおよびβ－アクチン（ローディング対照）タンパク質発現を示すウエスタンブロットである。
【図3E】センスＦＭＲＰオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスＦＭＲＰオリゴヌクレオチド（Ｎｅｇ＝陰性の染色対照、Ｕ＝無処置、Ｓ＝センス、ＡＳ＝アンチセンス）で処置し、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）およびＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ（ＡｎｎＶ）で染色したＤＬＤ－１細胞におけるフローサイトメトリードットプロットを示す。
【図3G】センスＦＭＲＰオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスＦＭＲＰオリゴヌクレオチド（Ｕ＝無処置、Ｓ＝センス、ＡＳ＝アンチセンス）で４８時間処置したＨＣＴ－１１６細胞におけるＦＭＲＰおよびβ－アクチン（ローディング対照）タンパク質発現を示すウエスタンブロットである。
【図3H】センスＦＭＲＰオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスＦＭＲＰオリゴヌクレオチド（Ｎｅｇ＝陰性の染色対照、Ｕ＝無処置、Ｓ＝センス、ＡＳ＝アンチセンス）で処置し、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）およびＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ（ＡｎｎＶ）で染色したＨＣＴ－１１６細胞におけるフローサイトメトリードットプロットを示す。
【図3I】センスＦＭＲＰオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスＦＭＲＰオリゴヌクレオチド（Ｕ＝無処置、Ｓ＝センス、ＡＳ＝アンチセンス）で４８時間処置したＨＣＥＣ－１ｃｔ細胞におけるＦＭＲＰおよびβ－アクチン（ローディング対照）タンパク質発現を示すウエスタンブロットである。
【図3J】センスＦＭＲＰオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスＦＭＲＰオリゴヌクレオチド（Ｎｅｇ＝陰性の染色対照、Ｕ＝無処置、Ｓ＝センス、ＡＳ＝アンチセンス）で処置し、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）およびＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ（ＡｎｎＶ）で染色したＨＣＥＣ－１ｃｔ細胞におけるフローサイトメトリードットプロットを示す。
【図4A】無処置のＣＲＣ細胞（Ｕ）、センスＦＭＲＰオリゴヌクレオチドで処置したＣＲＣ細胞（Ｓ）、アンチセンスＦＭＲＰオリゴヌクレオチドで処置したＣＲＣ細胞（ＡＳ）、あるいはスタウロスポリンで処置したＣＲＣ細胞（Ｓｔａｕｒｏ）におけるカスパーゼ８およびカスパーゼ３の染色を示すフローサイトメトリーヒストグラムである。
【図4C】ＰＩ染色したＣＲＣ細胞およびＡｎｎＶ染色したＣＲＣ細胞のフローサイトメトリーで分析することによって求められた、相対的細胞死を示す棒グラフである。ＣＲＣ細胞は、センスＦＭＲＰオリゴヌクレオチド（Ｓ）、アンチセンスＦＭＲＰオリゴヌクレオチド（ＡＳ）、またはスタウロスポリン（Ｓｔａｕｒｏ）で処置する前に前処置を施されなかったか、あるいは汎カスパーゼ阻害剤（Ｃａｓ ｉｎ）で前処置した。
【図4D】無処置のＤＬＤ－１細胞（Ｕ）、あるいはセンスＦＭＲＰオリゴヌクレオチド（Ｓ）またはアンチセンスＦＭＲＰオリゴヌクレオチド（ＡＳ）で処置したＤＬＤ－１細胞のＢｒｄｕ染色およびＰＩ染色を示すフローサイトメトリードットプロットである。
【図4F】３６時間のＢｒｄＵ取り込みアッセイ（Ｕ＝無処置、Ｓ＝センス、ＡＳ＝アンチセンス）によって評価したＨＣＴ－１１６細胞増殖を示す棒グラフである。
【図4G】センスＦＭＲＰオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスＦＭＲＰオリゴヌクレオチド（Ｕ＝無処置、Ｓ＝センス、ＡＳ＝アンチセンス）で３６時間処置したＨＣＴ－１１６細胞における細胞周期分布を示す棒グラフである。
【図5A】ヒトＣＲＣ細胞溶解物のＲＮＡ免疫沈降を示す。ヒトＣＲＣ細胞溶解物のＲＮＡ免疫沈降のために使用されるＦＭＲＰ抗体の特異性を確認するウエスタンブロットである。
【図5B】ヒトＣＲＣ細胞溶解物のＲＮＡ免疫沈降を示す。アクチン、Ｅ－カドヘリン、ＲＩＰＫ３およびＲＩＰＫ１に特異的なプライマーを使用したＲＴ－ＰＣＲ分析によって求められた、ＦＭＲＰと共沈降したｍＲＮＡの濃縮を示す棒グラフである。
【図5C】ヒトＣＲＣ細胞溶解物のＲＮＡ免疫沈降を示す。アクチン、ビメンチン、ＲＩＰＫ３およびＲＩＰＫ１に特異的なプライマーを使用したＲＴ－ＰＣＲ分析によって求められた、ＣＲＣ細胞株溶解物のＦＭＲＰと共沈降したｍＲＮＡの濃縮を示す棒グラフである。
【図6A】無処置のヒト結腸細胞株（Ｕ）、ＦＭＲＰセンスオリゴヌクレオチドで処置したヒト結腸細胞株（Ｓ）、あるいはＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置したヒト結腸細胞株（ＡＳ）におけるＦＭＲＰ、リン酸化ＲＩＰＫ１（ｐＲＩＰＫ１）、ＲＩＰＫ１、リン酸化ＲＩＰＫ３（ｐＲＩＰＫ３）、ＲＩＰＫ３、リン酸化ＭＬＫＬ（ｐＭＬＫＬ）、ＭＬＫＬおよびβ－アクチン（ローディング対照）のタンパク質／リン酸化タンパク質発現を示す代表的なウエスタンブロットである。
【図6E】ＲＩＰＫ１の特異的阻害剤（ＮＥＣ１）、ならびにセンスＦＭＲＰオリゴヌクレオチド（Ｓ）またはアンチセンスＦＭＲＰオリゴヌクレオチド（ＡＳ）のいずれかで処置した、ＰＩ染色したヒトＣＲＣ細胞株およびＡｎｎＶ染色したヒトＣＲＣ細胞株のフローサイトメトリーで分析することによって求められた、相対的細胞死を示す棒グラフである。
【図6F】ＭＬＫＬの特異的阻害剤（ＮＳＡ）、ならびにセンスＦＭＲＰオリゴヌクレオチド（Ｓ）またはアンチセンスＦＭＲＰオリゴヌクレオチド（ＡＳ）のいずれかで処置した、ＰＩ染色したヒトＣＲＣ細胞株およびＡｎｎＶ染色したヒトＣＲＣ細胞株をフローサイトメトリーで分析することによって求められた、相対的細胞死を示す棒グラフである。
【図6G】無処置のＨＣＥＣ－１ｃｔ細胞、ＦＭＲＰセンスオリゴヌクレオチドで処置したＨＣＥＣ－１ｃｔ細胞（Ｓ）、またはＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置したＨＣＥＣ－１ｃｔ細胞（ＡＳ）におけるＦＭＲＰ、ｐＲＩＰＫ１、ＲＩＰＫ１、ｐＲＩＰＫ３、ＲＩＰＫ３、ｐＭＬＫＬ、ＭＬＫＬおよびβ－アクチン（ローディング対照）のタンパク質／リン酸化タンパク質発現を示す代表的なウエスタンブロットである。
【図7A】腫瘍周囲試料（Ｐ）およびＣＲＣ腫瘍試料（Ｔ）におけるＣＲＥＢ ｍＲＮＡ発現レベルのＲＴ－ＰＣＲ分析を示す線グラフである（＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図7B】ＣＲＣ患者のマッチドペアの腫瘍周囲試料（Ｐ）およびＣＲＣ腫瘍試料（Ｔ）におけるＣＲＥＢ、ＦＭＲＰおよびβ－アクチン（ローディング対照）のタンパク質発現を示す代表的なウエスタンブロットである。
【図7D】無処置のＣＲＣ細胞株（Ｕ）、ＦＭＲＰセンスオリゴヌクレオチドで処置したＣＲＣ細胞株（Ｓ）、あるいはＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置したＣＲＣ細胞株（ＡＳ）におけるＣＲＥＢ、ＦＭＲＰおよびβ－アクチン（ローディング対照）タンパク質発現を示す代表的なウエスタンブロットである。
【図7E】図７Ｄに記載のウエスタンブロットの濃度測定分析によって求められた、β－アクチンと比較したＣＲＥＢタンパク質発現を示す棒グラフである（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図7F】図７Ｄに記載のウエスタンブロットの濃度測定分析によって求められた、β－アクチンと比較したＦＭＲＰタンパク質発現を示す棒グラフである（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図8A】センスＦＭＲＰオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスＦＭＲＰオリゴヌクレオチドで処置し（Ｕ＝無処置、Ｓ＝センス、ＡＳ＝アンチセンス）、ｉｂｉｄｉ（登録商標）製のカルチャーインサートの各側に播種した、インサートの取り外し時（Ｔ０）、２４時間および４８時間のインキュベート後（それぞれ、Ｔ２４およびＴ４８）のＨＣＴ－１１６細胞の細胞遊走を示す顕微鏡画像である。
【図8B】図８Ａの顕微鏡画像に対応した、細胞で覆われた面積の割合を示す棒グラフである（Ｔ２４：Ｕ ｖｓ ＡＳ、＊＊ｐ＜０．０１、Ｓ ｖｓ ＡＳ、＊ｐ＜０．０５、Ｔ４８：Ｕ ｖｓ ＡＳ および Ｓ ｖｓ ＡＳ、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図8C】センスＦＭＲＰオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスＦＭＲＰオリゴヌクレオチドで処置した（Ｕ＝無処置、Ｓ＝センス、ＡＳ＝アンチセンス）、４８時間のインキュベート後のＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）をコーティングしたＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）製のインサートを遊走するＨＣＴ－１１６細胞の顕微鏡画像である。
【図8D】センスＦＭＲＰオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスＦＭＲＰオリゴヌクレオチドで処置した（Ｕ＝無処置、Ｓ＝センス、ＡＳ＝アンチセンス）、４８時間のインキュベート後のＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）をコーティングしたＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）製のインサートを遊走するＨＣＴ－１１６細胞の対応する細胞数棒グラフである（＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
【図8E】センスＦＭＲＰオリゴヌクレオチド（Ｓ）またはアンチセンスＦＭＲＰオリゴヌクレオチド（ＡＳ）で４８時間処置したＨＣＴ－１１６細胞におけるＦＭＲＰ、Ｅ－カドヘリン、β－カテニンおよびβ－アクチン（ローディング対照）タンパク質発現を示す代表的なウエスタンブロットである。
【図8F】図８Ｅに記載のウエスタンブロットの濃度測定分析によって求められた、ＨＣＴ－１１６細胞におけるβ－アクチン発現と比較したＥ－カドヘリンタンパク質発現を示す棒グラフである（＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図8G】図８Ｅに記載のウエスタンブロットの濃度測定分析によって求められた、ＨＣＴ－１１６細胞におけるβ－アクチン発現と比較したβ－カテニンタンパク質発現を示す棒グラフである（＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図9A】無処置のＨＣＴ－１１６細胞（Ｕ）、あるいはセンスオリゴヌクレオチド（Ｓ）またはアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳ）で４８時間処置したＨＣＴ－１１６細胞におけるＦＭＲＰ、ＭＣＣおよびβ－アクチン（ローディング対照）タンパク質発現を示す代表的なウエスタンブロットである。
【図9C】無処置のＨＣＴ－１１６細胞（Ｕ）、あるいはセンスオリゴヌクレオチド（Ｓ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳ）および／または対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ Ｃｔｒｌ）もしくはＭＣＣに特異的なｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ ＭＣＣ）で４８時間処置したＨＣＴ－１１６細胞におけるＭＣＣ、ＦＭＲＰ、ｅ－カドヘリン、β－カテニンおよびβ－アクチン（ローディング対照）タンパク質発現を示す代表的なウエスタンブロットである。
【図9D】図９Ｃに記載のウエスタンブロットの濃度測定分析によって求められた、ＨＣＴ－１１６細胞におけるβ－アクチン発現と比較したＥ－カドヘリンタンパク質発現を示す棒グラフである（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）。
【図9E】図９Ｃに記載のウエスタンブロットの濃度測定分析によって求められた、ＨＣＴ－１１６細胞におけるβ－アクチン発現と比較したβ－カテニンタンパク質発現を示す棒グラフである（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）。
【図9F】センスＦＭＲＰオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスＦＭＲＰオリゴヌクレオチド（Ｕ＝無処置、Ｓ＝センス、ＡＳ＝アンチセンス）、および／または、ｓｉＲＮＡ ＣｔｒｌもしくはｓｉＲＮＡ ＭＣＣで処置し、ｉｂｉｄｉ（登録商標）製のカルチャーインサートの各側に播種した、インサートの取り外し時（Ｔ０）、２４時間および４８時間のインキュベート後（それぞれ、Ｔ２４およびＴ４８）のＨＣＴ－１１６細胞の細胞遊走を示す顕微鏡画像である。
【発明を実施するための形態】
【0029】
ＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチド
「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、本明細書で使用される場合、標的タンパク質（例えばＦＭＲＰ）をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）と相補的な短い合成オリゴヌクレオチド配列を指す。アンチセンスオリゴヌクレオチド配列は、ｍＲＮＡにハイブリダイゼーションし、それにより、二本鎖分子を認識して分解するヌクレアーゼの活性化をもたらし得る二本鎖分子を生成し、したがって、ｍＲＮＡの翻訳を防止する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド、小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ならびに、２’－Ｏ－アルキル、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）およびモルホリノオリゴマーといった化学物質を含むがこれに限らない修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドを含んでもよい。
「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、本明細書で使用される場合、標的タンパク質（例えばＦＭＲＰ）をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）と相補的な短い合成オリゴヌクレオチド配列を指す。アンチセンスオリゴヌクレオチド配列は、ｍＲＮＡにハイブリダイゼーションし、それにより、二本鎖分子を認識して分解するヌクレアーゼの活性化をもたらし得る二本鎖分子を生成し、したがって、ｍＲＮＡの翻訳を防止する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド、小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ならびに、２’－Ｏ－アルキル、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）およびモルホリノオリゴマーといった化学物質を含むがこれに限らない修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドを含んでもよい。
【0030】
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡと相補的である（例えばＦＭＲＰ）ヌクレオチド配列を含む一本鎖核酸分子であってもよい。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＦＭＲＰ ｍＲＮＡと相補的な配列を有する一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドであってもよい。ＦＲＭＰアンチセンスオリゴヌクレオチドの標的ｍＲＮＡへのハイブリダイゼーションは、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド鎖を認識して分解するＲＮａｓｅ Ｈなどの偏在するヌクレアーゼの活性化をもたらし得る二本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを生成し、したがって、標的タンパク質（例えばＦＭＲＰ）の翻訳を防止する。
【0031】
あるいは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、二本鎖であってもよい。二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、自己相補的なセンス領域およびアンチセンス領域を有する一本鎖オリゴヌクレオチドで構成されてもよい。他の実施形態では、二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、２つの別々のオリゴヌクレオチドで構成されてもよく、ここで、一方のオリゴヌクレオチドはセンス鎖であり、他方のオリゴヌクレオチドはアンチセンス鎖であり、アンチセンス鎖は標的ｍＲＮＡ（例えばＦＭＲＰ）と相補的なヌクレオチド配列を有する。
【0032】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、各アンチセンスオリゴヌクレオチドの組み込まれたヌクレオチド配列の標的部分が、ＦＭＲＰ ｍＲＮＡ配列と完全にまたはほぼ完全に相補的になるように設計されていてもよい。このような相補的なまたはほぼ相補的なヌクレオチド配列を組み込むことにより、所与の標的に対する特異性の程度が高いアンチセンスオリゴヌクレオチドを操作することが可能になる。特異性は、解離定数などのパラメータの測定、あるいはタンパク質またはＲＮＡの発現レベルの変化などの他の判定基準、あるいはＦＭＲＰ活性または発現を測定する他のアッセイによって評価してもよい。
【0033】
本開示は、ＦＭＲＰ ｍＲＮＡを分解の標的とすること、ｍＲＮＡスプライシングに干渉すること、あるいはＦＭＲＰ遺伝子発現またはタンパク質の翻訳を防止することが可能なＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドを患者に投与する工程を含む方法を提供する。本開示のＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトＦＭＲＰ ｍＲＮＡの様々な領域を結合の標的としてもよい。ヒトＦＭＲＰ ｍＲＮＡは、ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅの配列である、ＮＭ＿００１１８５０７５（配列番号１８）、ＮＭ＿００１１８５０７６（配列番号１９）、ＮＭ＿００１１８５０８１（配列番号２０）、ＮＭ＿００１１８５０８２（配列番号２１）、またはＮＭ＿００２０２４（配列番号２２）を有する。
【0034】
本明細書に開示されているようなＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドは、５～１００ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチド配列であってもよく、例えば、１０～４０ヌクレオチドの長さ、例えば、１４～４０ヌクレオチドの長さ、例えば、１０～３０ヌクレオチドの長さ、例えば、１４～３０ヌクレオチドの長さ、例えば、１４～２５ヌクレオチドの長さ、例えば、１５～２２オリゴヌクレオチドの長さ、例えば、１８～４０ヌクレオチドの長さ、例えば、１８～２４ヌクレオチドの長さ、例えば、２０～４０ヌクレオチドの長さ、または例えば、２０～２４ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチド配列であってもよい。いくつかの実施形態では、ＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０ヌクレオチドの長さであってもよい。ＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＦＭＲＰ ｍＲＮＡ配列の１つ以上の部分と相補的なオリゴヌクレオチド配列を含んでもよい。
【0035】
いくつかの実施形態では、本開示のＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドは、小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、モルホリノオリゴマー、マイクロＲＮＡ、ならびに、これらの化合物を含む組成物、例えば、薬学的に許容可能な賦形剤を含む組成物であってもよいがこれに限らない。
【0036】
本開示のいくつかの実施形態では、ＦＭＲＰを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、
５’－ＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣＣＡ－３’（配列番号１）、
５’－ＣＴＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴ－３’（配列番号２）、
５’－ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣＣ－３’（配列番号３）、
５’－ＣＴＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣ－３’（配列番号４）、および
５’－ＴＣＡＣＣＣＴＴＴＡＴＣＡＴＣＣＴＣ－３’（配列番号５）のいずれか１つから選択される配列または配列の一部（例えば、長さにわたって９０％、９５％または９９％の同一性を有する配列を含む）、あるいはその補体を含む。
５’－ＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣＣＡ－３’（配列番号１）、
５’－ＣＴＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴ－３’（配列番号２）、
５’－ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣＣ－３’（配列番号３）、
５’－ＣＴＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣ－３’（配列番号４）、および
５’－ＴＣＡＣＣＣＴＴＴＡＴＣＡＴＣＣＴＣ－３’（配列番号５）のいずれか１つから選択される配列または配列の一部（例えば、長さにわたって９０％、９５％または９９％の同一性を有する配列を含む）、あるいはその補体を含む。
【0037】
さらなる実施形態では、ＦＭＲＰを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、
５’－ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣＣＡＴ－３’（配列番号６）、
５’－ＡＣＴＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣ－３’（配列番号７）、
５’－ＴＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣＣＡ－３’（配列番号８）、
５’－ＡＣＴＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴ－３’（配列番号９）、および
５’－ＣＴＣＡＣＣＣＴＴＴＡＴＣＡＴＣＣＴＣＡ－３’（配列番号１０）のいずれか１つから選択される配列または配列の一部（例えば、長さにわたって９０％、９５％または９９％の同一性を有する配列を含む）、あるいはその補体を含む。
５’－ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣＣＡＴ－３’（配列番号６）、
５’－ＡＣＴＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣ－３’（配列番号７）、
５’－ＴＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣＣＡ－３’（配列番号８）、
５’－ＡＣＴＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴ－３’（配列番号９）、および
５’－ＣＴＣＡＣＣＣＴＴＴＡＴＣＡＴＣＣＴＣＡ－３’（配列番号１０）のいずれか１つから選択される配列または配列の一部（例えば、長さにわたって９０％、９５％または９９％の同一性を有する配列を含む）、あるいはその補体を含む。
【0038】
いくつかの実施形態では、本開示のＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドは、１つ以上のリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、あるいは、リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドの混合物を含む。
【0039】
いくつかの実施形態では、本開示のＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドは、５－メチルシチジン、５－メチル－２’－デオキシシチジン、デオキシシチジン、５－メチル－２’－デオキシシチジン５’－モノホスフェート、および５－メチル－２’－デオキシシチジン－５’－モノホスホロチオエートからなる群から選択される１つ以上の修飾ヌクレオシドを含む。
【0040】
ある実施形態では、本開示のＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチルシチジン、２’－Ｏ－メチルグアノシン、２’－Ｏ－メチルチミジン、２’－Ｏ－メチルウリジン、および２’－Ｏ－メチルアデノシンからなる群から選択される１つ以上の修飾ヌクレオシドを含む。
【0041】
いくつかの実施形態では、本開示のＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドは、５－メチルシトシンおよび５－メチルグアニンからなる群から選択される１つ以上の修飾ヌクレオチドを含む。
【0042】
いくつかの実施形態では、本開示のＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドは、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）ヌクレオシド、２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオシド、および２’－フルオロ－β－Ｄ－アラビノヌクレオシドから選択される１つ以上の修飾ヌクレオシドを含む。
【0043】
ある実施形態では、本開示のＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドは、架橋核酸、ロックド核酸（ＬＮＡ）、拘束エチル（ｃＥＴ）核酸、トリシクロＤＮＡ（ｔｃＤＮＡ）、２’－Ｏ，４’－Ｃ－エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）から選択される群の１つ以上を含む。
【0044】
いくつかの実施形態では、開示されるＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、ホスホトリエステル結合、アルキルホスホネート結合、アミノアルキルホスホトリエステル結合、アルキレンホスホネート結合、ホスフィネート結合、ホスホロアミデート結合、ホスホロモルホリデート結合、ホスホロピペラジデート結合、アミノアルキルホスホロアミデート結合、チオホスホロアミデート結合、チオノアルキルホスホネート結合、チオノアルキルホスホトリエステル結合、チオホスフェート結合、セレノホスフェート結合および／またはボラノホスフェート結合などの修飾結合を有していてもよい。例えば、いくつかの実施形態では、開示されるＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドの１つまたは２つ以上、例えば、全てのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合であってもよい。他の実施形態では、開示されるＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドの１つまたは２つ以上、例えば、全てのヌクレオシド間結合は、メチルホスホネート結合であってもよい。
【0045】
例えば、一実施形態では、ＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’－ＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣＣＡ－３’（配列番号１）の配列を含む、ＦＭＲＰに対するホスホチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、ここで、アンチセンスオリゴヌクレオチドの各ヌクレオチド間結合は、ホスホロチオエート結合である。いくつかの実施形態では、ＦＭＲＰに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’－ＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣＣＡ－３’（配列番号１）の配列を含むホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、ここで、アンチセンスオリゴヌクレオチドの１つ以上のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である。
【0046】
別の実施形態では、ＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’－ＣＴＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴ－３’（配列番号２）の配列を含む、ＦＭＲＰに対するホスホチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、ここで、アンチセンスオリゴヌクレオチドの各ヌクレオチド間結合は、ホスホロチオエート結合である。
いくつかの実施形態では、ＦＭＲＰに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’－ＣＴＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴ－３’（配列番号２）の配列を含むホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、ここで、アンチセンスオリゴヌクレオチドの１つ以上のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である。
いくつかの実施形態では、ＦＭＲＰに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’－ＣＴＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴ－３’（配列番号２）の配列を含むホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、ここで、アンチセンスオリゴヌクレオチドの１つ以上のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である。
【0047】
別の実施形態では、ＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’－ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣＣ－３’（配列番号３）の配列を含む、ＦＭＲＰに対するホスホチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、ここで、アンチセンスオリゴヌクレオチドの各ヌクレオチド間結合は、ホスホロチオエート結合である。いくつかの実施形態では、ＦＭＲＰに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’－ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣＣ－３’（配列番号３）の配列を含むホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、ここで、アンチセンスオリゴヌクレオチドの１つ以上のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である。
【0048】
別の実施形態では、ＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’－ＣＴＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣ－３’（配列番号４）の配列を含む、ＦＭＲＰに対するホスホチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、ここで、アンチセンスオリゴヌクレオチドの各ヌクレオチド間結合は、ホスホロチオエート結合である。いくつかの実施形態では、ＦＭＲＰに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’－ＣＴＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣ－３’（配列番号４）の配列を含むホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、ここで、アンチセンスオリゴヌクレオチドの１つ以上のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である。
【0049】
別の実施形態では、ＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’－ＴＣＡＣＣＣＴＴＴＡＴＣＡＴＣＣＴＣ－３’（配列番号５）の配列を含む、ＦＭＲＰに対するホスホチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、ここで、アンチセンスオリゴヌクレオチドの各ヌクレオチド間結合は、ホスホロチオエート結合である。いくつかの実施形態では、ＦＭＲＰに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’－ＴＣＡＣＣＣＴＴＴＡＴＣＡＴＣＣＴＣ－３’（配列番号５）の配列を含むホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、ここで、アンチセンスオリゴヌクレオチドの１つ以上のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である。
【0050】
別の実施形態では、ＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’－ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣＣＡＴ－３’（配列番号６）の配列を含む、ＦＭＲＰに対するホスホチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、ここで、アンチセンスオリゴヌクレオチドの各ヌクレオチド間結合は、ホスホロチオエート結合である。いくつかの実施形態では、ＦＭＲＰに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’－ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣＣＡＴ－３’（配列番号６）の配列を含むホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、ここで、アンチセンスオリゴヌクレオチドの１つ以上のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である。
【0051】
別の実施形態では、ＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’－ＡＣＴＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣ－３’（配列番号７）の配列を含む、ＦＭＲＰに対するホスホチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、ここで、アンチセンスオリゴヌクレオチドの各ヌクレオチド間結合は、ホスホロチオエート結合である。いくつかの実施形態では、ＦＭＲＰに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’－ＡＣＴＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣ－３’（配列番号７）の配列を含むホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、ここで、アンチセンスオリゴヌクレオチドの１つ以上のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である。
【0052】
別の実施形態では、ＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’－ＴＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣＣＡ－３’（配列番号８）の配列を含む、ＦＭＲＰに対するホスホチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、ここで、アンチセンスオリゴヌクレオチドの各ヌクレオチド間結合は、ホスホロチオエート結合である。いくつかの実施形態では、ＦＭＲＰに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’－ＴＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣＣＡ－３’（配列番号８）の配列を含むホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、ここで、アンチセンスオリゴヌクレオチドの１つ以上のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である。
【0053】
別の実施形態では、ＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’－ＡＣＴＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴ－３’（配列番号９）の配列を含む、ＦＭＲＰに対するホスホチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、ここで、アンチセンスオリゴヌクレオチドの各ヌクレオチド間結合は、ホスホロチオエート結合である。いくつかの実施形態では、ＦＭＲＰに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’－ＡＣＴＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴ－３’（配列番号９）の配列を含むホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、ここで、アンチセンスオリゴヌクレオチドの１つ以上のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である。
【0054】
別の実施形態では、ＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’－ＣＴＣＡＣＣＣＴＴＴＡＴＣＡＴＣＣＴＣＡ－３’（配列番号１０）の配列を含む、ＦＭＲＰに対するホスホチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、ここで、アンチセンスオリゴヌクレオチドの各ヌクレオチド間結合は、ホスホロチオエート結合である。いくつかの実施形態では、ＦＭＲＰに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’－ＣＴＣＡＣＣＣＴＴＴＡＴＣＡＴＣＣＴＣＡ－３’（配列番号１０）の配列を含むホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、ここで、アンチセンスオリゴヌクレオチドの１つ以上のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である。
【0055】
いくつかの実施形態では、ＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１～１０のいずれか１つのヌクレオチド配列、あるいはその薬学的に許容可能な塩を含むｓｉＲＮＡである。
例えば、
５’－ＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣＣＡ－３’（配列番号１）、
５’－ＣＴＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴ－３’（配列番号２）、
５’－ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣＣ－３’（配列番号３）、
５’－ＣＴＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣ－３’（配列番号４）、
５’－ＴＣＡＣＣＣＴＴＴＡＴＣＡＴＣＣＴＣ－３’（配列番号５）、
５’－ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣＣＡＴ－３’（配列番号６）、
５’－ＡＣＴＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣ－３’（配列番号７）、
５’－ＴＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣＣＡ－３’（配列番号８）、
５’－ＡＣＴＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴ－３’（配列番号９）、および
５’－ＣＴＣＡＣＣＣＴＴＴＡＴＣＡＴＣＣＴＣＡ－３’（配列番号１０）のいずれか１つの配列、あるいは配列番号１～１０のいずれか１つの配列を含むＦＭＲＰ ｓｉＲＮＡの薬学的に許容可能な塩を含んでもよい。
例えば、
５’－ＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣＣＡ－３’（配列番号１）、
５’－ＣＴＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴ－３’（配列番号２）、
５’－ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣＣ－３’（配列番号３）、
５’－ＣＴＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣ－３’（配列番号４）、
５’－ＴＣＡＣＣＣＴＴＴＡＴＣＡＴＣＣＴＣ－３’（配列番号５）、
５’－ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣＣＡＴ－３’（配列番号６）、
５’－ＡＣＴＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣ－３’（配列番号７）、
５’－ＴＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣＣＡ－３’（配列番号８）、
５’－ＡＣＴＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴ－３’（配列番号９）、および
５’－ＣＴＣＡＣＣＣＴＴＴＡＴＣＡＴＣＣＴＣＡ－３’（配列番号１０）のいずれか１つの配列、あるいは配列番号１～１０のいずれか１つの配列を含むＦＭＲＰ ｓｉＲＮＡの薬学的に許容可能な塩を含んでもよい。
【0056】
いくつかの実施形態では、ＦＭＲＰ ｓｉＲＮＡは、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、ホスホトリエステル結合、アルキルホスホネート結合、アミノアルキルホスホトリエステル結合、アルキレンホスホネート結合、ホスフィネート結合、ホスホロアミデート結合、ホスホロモルホリデート結合、ホスホロピペラジデート結合、アミノアルキルホスホロアミデート結合、チオホスホロアミデート結合、チオノアルキルホスホネート結合、チオノアルキルホスホトリエステル結合、チオホスフェート結合、セレノホスフェート結合およびボラノホスフェート結合からなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオシド間結合を含む。
ある実施形態では、ＦＭＲＰ ｓｉＲＮＡの少なくとも１つのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である。例えば、いくつかの実施形態では、ＦＭＲＰ ｓｉＲＮＡの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、１～５、１～１０、１～１４、１～１５、１～１６、１～１９、５～１０、５～１４、５～１５、５～１９、１０～１４、１０～１５または１０～１９のヌクレオシド間結合は、ホスホチオエート結合である。
ある実施形態では、ＦＭＲＰ ｓｉＲＮＡの少なくとも１つのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である。例えば、いくつかの実施形態では、ＦＭＲＰ ｓｉＲＮＡの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、１～５、１～１０、１～１４、１～１５、１～１６、１～１９、５～１０、５～１４、５～１５、５～１９、１０～１４、１０～１５または１０～１９のヌクレオシド間結合は、ホスホチオエート結合である。
【0057】
いくつかの実施形態では、ＦＭＲＰ ｓｉＲＮＡの全てのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である。様々な実施形態では、開示されるＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、ＦＭＲＰ ｓｉＲＮＡ）は、随意に、配列に、少なくとも１つの修飾核酸塩基、例えば、５－メチルシトシン、および／または、少なくとも１つのメチルホスホネートヌクレオチドを有していてもよく、これは、例えば、５’末端もしくは３’末端の一方のみ、または５’末端および３’末端の両方、またはオリゴヌクレオチド配列に沿ってのいずれかに配置される。
【0058】
ＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、ＦＭＲＰ ｓｉＲＮＡ）は、随意に、少なくとも１つの修飾糖を含んでもよい。例えば、オリゴヌクレオチドを構成する少なくとも１つのヌクレオチドの糖部分は、２’－ＯＨ基がＯＲ、Ｒ、Ｒ’ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＲ２、Ｎ３、ＣＮ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩからなる群から選択されるいずれか１つによって置換されてもよいリボースであってもよい（ここで、Ｒはアルキルまたはアリールであり、Ｒ’はアルキレンである）。
【0059】
いくつかの実施形態では、ある開示されたヌクレオチドは、修飾されても、変異を有してもよく、例えば、開示されるＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、ＦＭＲＰ ｓｉＲＮＡ）内のあるシチジンは、例えば、５－メチル－２’－デオキシシチジン５’－モノホスフェート、および５－メチル－２’－デオキシシチジン－５’－モノホスホロチオエートを含むがこれに限らない５－メチル－２’－デオキシシチジンであってもよい。
【0060】
ある実施形態では、ＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、ＦＭＲＰ ｓｉＲＮＡ）は、化学修飾ヌクレオシド、例えば、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）リボヌクレオシド、例えば、２’－Ｏ－メチルシチジン、２’－Ｏ－メチルグアノシン、２’－Ｏ－メチルチミジン、２’－Ｏ－メチルウリジン、および／または２’－Ｏ－メチルアデノシンを含んでもよい。本明細書に記載のＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、ＦＭＲＰ ｓｉＲＮＡ）はまた、５－メチルピリミジン、例えば、５－メチルシトシン、および／または、５メチルプリン、例えば、５－メチルグアニンを含む１つ以上の化学修飾塩基を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、ＦＭＲＰ ｓｉＲＮＡ）には、１つ以上の２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）ヌクレオシド、２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオシド、２’－フルオロ－β－Ｄ－アラビノヌクレオシド、架橋核酸、ロックド核酸（ＬＮＡ）、拘束エチル（ｃＥＴ）核酸、トリシクロＤＮＡ（ｔｃＤＮＡ）、２’－Ｏ，４’－Ｃ－エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）、および／またはペプチド核酸（ＰＮＡ）が含まれてもよい。
【0061】
いくつかの実施形態は、企図されるアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、ＦＭＲＰ ｓｉＲＮＡ）のヌクレオチド間結合の少なくとも一つは、Ｏ，Ｏ－結合ホスホロチオエートである。例えば、配列番号１～１０のヌクレオチド間結合はそれぞれ、Ｏ，Ｏ－結合ホスホロチオエートであってもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物は、薬学的に許容可能な塩、例えば、随意に、１～２４以上のＯ，Ｏ－結合ホスホチオエートのヌクレオチド間結合を含んでもよい、開示される配列のアンチセンスオリゴヌクレオチドのナトリウム塩を含んでもよい。企図されるオリゴヌクレオチドの塩には、完全中和塩が含まれ、例えば、各ホスホロチオエート結合がＮａ＋などのイオンと結合する。オリゴヌクレオチドは、天然に存在する核酸塩基、糖、および共有結合性ヌクレオシド間（骨格）結合ならびに非天然に存在する部分を含んでもよい。
【0062】
また、本明細書には、開示されるアンチセンスオリゴヌクレオチドの同位体分子、それを含有する医薬組成物、およびそれを使用する方法が提供される。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書には、複数の水素（Ｈ）を含み、ここで、複数の水素の１つ以上の水素が重水素（Ｄ）によって置換される、配列番号１～１０の重水素化アンチセンスオリゴヌクレオチドが提供される。
【0063】
腸疾患
本開示は、腸疾患の処置および／または予防のためのオリゴヌクレオチドを提供する。本明細書で使用される場合、「腸疾患」は、胃の次にある消化管部分、すなわち小腸、大腸、結腸および直腸に影響を及ぼす任意の疾患、障害および／または症候群を指す。例えば、腸疾患には、結腸癌、炎症性腸疾患、家族性腺腫性ポリポーシス、ガードナー症候群、ターコット症候群、リンチ症候群、セリアック病、胃腸カルチノイド腫瘍、小腸癌（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ ｃａｎｃｅｒ）、十二指腸癌、小腸癌（ｓｍａｌｌ ｂｏｗｅｌ ｃａｎｃｅｒ）および消化管間質腫瘍が含まれてもよいがこれに限らない。例えば、本明細書には、腸疾患を患っている患者を処置する方法が提供され、該方法は、有効量の開示されるアンチセンスオリゴヌクレオチドを患者に投与する工程を含む。
本開示は、腸疾患の処置および／または予防のためのオリゴヌクレオチドを提供する。本明細書で使用される場合、「腸疾患」は、胃の次にある消化管部分、すなわち小腸、大腸、結腸および直腸に影響を及ぼす任意の疾患、障害および／または症候群を指す。例えば、腸疾患には、結腸癌、炎症性腸疾患、家族性腺腫性ポリポーシス、ガードナー症候群、ターコット症候群、リンチ症候群、セリアック病、胃腸カルチノイド腫瘍、小腸癌（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ ｃａｎｃｅｒ）、十二指腸癌、小腸癌（ｓｍａｌｌ ｂｏｗｅｌ ｃａｎｃｅｒ）および消化管間質腫瘍が含まれてもよいがこれに限らない。例えば、本明細書には、腸疾患を患っている患者を処置する方法が提供され、該方法は、有効量の開示されるアンチセンスオリゴヌクレオチドを患者に投与する工程を含む。
【0064】
大腸癌
「大腸癌」とは、本明細書で使用される場合、結腸および／または直腸に影響を及ぼす任意の癌を指す。大腸癌は、結腸上皮細胞または直腸上皮細胞における腫瘍抑制遺伝子を減弱化し、癌遺伝子を活性化する遺伝子変化および／またはエピジェネティック変化の進行性蓄積を引き起こす任意の１つ以上の環境因子および遺伝因子によって引き起こされ得る。大腸腫瘍は、多くの場合、ゲノム安定性および／またはエピゲノム安定性の喪失を伴い、それにより、悪性形質転換が加速される。
「大腸癌」とは、本明細書で使用される場合、結腸および／または直腸に影響を及ぼす任意の癌を指す。大腸癌は、結腸上皮細胞または直腸上皮細胞における腫瘍抑制遺伝子を減弱化し、癌遺伝子を活性化する遺伝子変化および／またはエピジェネティック変化の進行性蓄積を引き起こす任意の１つ以上の環境因子および遺伝因子によって引き起こされ得る。大腸腫瘍は、多くの場合、ゲノム安定性および／またはエピゲノム安定性の喪失を伴い、それにより、悪性形質転換が加速される。
【0065】
大腸癌に存在する特定の遺伝子突然変異には、大幅な不均一性が存在し、これには、ＡＰＣ、ＣＴＮＮＢ１、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＳＭＡＤ４、ＴＧＦＢＲ２、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＡＲＩＤ１Ａ、ＳＯＸ９、ＦＡＭ１２３ＢおよびＥＲＢＢ２の変化が含まれるがこれらに限らない。大腸癌は、多くの場合、突然変異によって開始し、Ｗｎｔシグナル伝達の制御不全をもたらし、また、ＲＡＳ－ＲＡＦ－ＭＡＰＫ、ＴＧＦβおよびＰＩ３Ｋ－ＡＫＴ経路を含む他のシグナル伝達経路のさらなる制御不全に伴い腫瘍の進行をもたらす。開示される配列は、Ｗｎｔ、ＲＡＳ－ＲＡＦ－ＭＡＰＫ、ＴＧＦβおよびＰＩ３Ｋ－ＡＫＴ経路の全てにおける癌遺伝子、腫瘍抑制因子、および重要なシグナル伝達タンパク質の発現を転写後に制御してもよい。本明細書には、大腸癌を患っている患者を処置する方法が提供され、該方法は、開示されるアンチセンスオリゴヌクレオチドを患者に投与する工程を含む。
【0066】
炎症性腸疾患
「炎症性腸疾患」は、本明細書で使用される場合、クローン病、潰瘍性大腸炎、胃十二指腸クローン病、クローン（肉芽腫性）大腸炎、膠原性大腸炎、リンパ球性大腸炎、虚血性大腸炎、空置大腸炎、ベーチェット病、顕微鏡的大腸炎、潰瘍性直腸炎、直腸Ｓ状結腸炎、空回腸炎、左側大腸炎、汎大腸炎、回結腸炎、回腸炎、および鑑別が困難な大腸炎を含む、多くの慢性炎症性疾患を指す。クローン病および潰瘍性大腸炎は、炎症性腸疾患の２つの最も一般的な形態である。炎症性腸疾患は、消化器系の自己免疫疾患である。クローン病は、回腸末端部を含む消化管の任意の部分に限局され得、消化管の全ての細胞型に影響を及ぼし得る。潰瘍性大腸炎は、結腸および直腸に局在し、粘膜の細胞のみに影響を及ぼす。本明細書には、炎症性腸疾患を患っている患者を処置する方法が提供され、該方法は、開示されるアンチセンスオリゴヌクレオチドを患者に投与する工程を含む。
「炎症性腸疾患」は、本明細書で使用される場合、クローン病、潰瘍性大腸炎、胃十二指腸クローン病、クローン（肉芽腫性）大腸炎、膠原性大腸炎、リンパ球性大腸炎、虚血性大腸炎、空置大腸炎、ベーチェット病、顕微鏡的大腸炎、潰瘍性直腸炎、直腸Ｓ状結腸炎、空回腸炎、左側大腸炎、汎大腸炎、回結腸炎、回腸炎、および鑑別が困難な大腸炎を含む、多くの慢性炎症性疾患を指す。クローン病および潰瘍性大腸炎は、炎症性腸疾患の２つの最も一般的な形態である。炎症性腸疾患は、消化器系の自己免疫疾患である。クローン病は、回腸末端部を含む消化管の任意の部分に限局され得、消化管の全ての細胞型に影響を及ぼし得る。潰瘍性大腸炎は、結腸および直腸に局在し、粘膜の細胞のみに影響を及ぼす。本明細書には、炎症性腸疾患を患っている患者を処置する方法が提供され、該方法は、開示されるアンチセンスオリゴヌクレオチドを患者に投与する工程を含む。
【0067】
炎症性腸疾患は、腹痛、嘔吐、下痢、直腸出血、激しい痙攣、筋痙攣、体重減少、栄養失調、発熱、貧血、皮膚病変、関節痛、眼炎、肝疾患、関節炎、壊疽性膿皮症、原発性硬化性胆管炎、および非甲状腺疾患症候群を含む症状を伴い、実施形態ではまた、開示されるアンチセンス化合物を使用してこれらの症状を処置すること、例えば、潰瘍性大腸炎を患い、成長欠陥を患う可能性もある小児を処置することが企図されている。いくつかの実施形態では、例えば、有効量の開示されるアンチセンスオリゴヌクレオチドを患者に投与することによって、このような症状を改善または処置する方法が本明細書で企図されている。
【0068】
「ネクロトーシス」は、本明細書で使用される場合、制御されたカスパーゼ非依存性細胞死を指し、アポトーシス耐性癌細胞を排除するための代替方法となり得る。受容体相互作用タンパク質キナーゼ１（ＲＩＰ１またはＲＩＰＫ１）－受容体相互作用タンパク質キナーゼ３（ＲＩＰ３またはＲＩＰＫ３）-混合系統キナーゼドメイン様タンパク質（ＭＬＫＬ）複合体からなる、中核をなすネクロトーシス経路は、「ネクロソーム」とも呼ばれる。ネクロソームは、活性酸素種（ＲＯＳ）のバーストの生成、原形質膜の透過性化、および細胞質ゾルのＡＴＰの減少などの下流エフェクターの機能を開始し、それにより、不可逆的なネクロトーシス実行機構をさらに駆動する。本明細書には、ネクロトーシスを調節することによって患者を処置する方法が提供され、該方法は、開示されるアンチセンスオリゴヌクレオチドを患者に投与する工程を含む。
【0069】
「必要とする患者」は、本明細書で使用される場合、腸疾患の症状または兆候のいずれかを患っている患者、腸疾患の症状または兆候のいずれかを患う可能性がある患者、あるいは腸疾患を処置するための本開示の方法から利益を受ける可能性がある任意の患者を指す。必要とする患者には、腸疾患を発症するリスクがあると診断された患者、過去に腸疾患を患った患者、あるいは以前に腸疾患の処置を受けた患者が含まれてもよい。特に関連があるのは、ＦＭＲＰの発現レベルまたは活性レベルの上昇を伴う腸疾患を患っている個体である。
【0070】
「処置する（ｔｒｅａｔ）」、「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」、「処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」などの用語は、本明細書において、概して、所望の薬理学的効果および／または生理学的効果を得ることを意味するために使用される。効果は、疾患またはその症状を完全にまたは部分的に予防するという点で予防的なものであってもよく、および／または、疾患および／または疾患に起因した有害作用を部分的にまたは完全に治癒するという点で治療的であってもよい。「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語は、本明細書で使用される場合、哺乳動物、特にヒトにおける疾患のあらゆる処置を包含し、（ａ）疾患にかかりやすい可能性があるが、まだ疾患を有していると診断されていない被験体において、疾患が生じるのを予防すること、（ｂ）疾患を抑制すること、すなわち、疾患の重症度または範囲が上昇するのを予防すること、（ｃ）疾患を軽減すること、すなわち、疾患を部分的にまたは完全に改善すること、あるいは（ｄ）疾患の再発を防止すること、すなわち、以前の疾患の症状の処置の成功後または疾患の処置後に疾患が活性状態に戻るのを予防することが含まれる。
【0071】
「有効量」は、本明細書で使用される場合、患者に投与したときに疾病の症状を少なくとも部分的に処置または改善するのに十分な薬剤の量を指す。有効量は、疾病の重症度、構成成分の投与経路、および処置する患者の年齢、体重などに応じて変動する。したがって、開示されるＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドの有効量は、患者の腸疾患を処置するのに必要なＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドの量であり、これにより、薬剤を患者に投与することにより、被験体において腸疾患が生じるのを予防し、腸疾患が進行するのを予防し（例えば、直腸出血、貧血、または胃腸炎などの腸疾患の症状の発症または重症度の上昇を予防し）、あるいは腸疾患に伴う全ての症状を軽減または完全に改善し、すなわち、疾患の退行を引き起こす。
【0072】
いくつかの実施形態では、開示される方法は、少なくとも１μｇ、少なくとも５μｇ、少なくとも１０μｇ、少なくとも２０μｇ、少なくとも３０μｇ、少なくとも４０μｇ、少なくとも５０μｇ、少なくとも６０μｇ、少なくとも７０μｇ、少なくとも８０μｇ、少なくとも９０μｇ、または少なくとも１００μｇのアンチセンスオリゴヌクレオチドを患者に投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、本開示の方法は、３５ｍｇ～５００ｍｇ、１ｍｇ～１０ｍｇ、１０ｍｇ～２０ｍｇ、２０ｍｇ～３０ｍｇ、３０ｍｇ～４０ｍｇ、４０ｍｇ～５０ｍｇ、５０ｍｇ～６０ｍｇ、６０ｍｇ～７０ｍｇ、７０ｍｇ～８０ｍｇ、８０ｍｇ～９０ｍｇ、９０ｍｇ～１００ｍｇ、１００ｍｇ～１５０ｍｇ、１５０ｍｇ～２００ｍｇ、２００ｍｇ～２５０ｍｇ、２５０ｍｇ～３００ｍｇ、３００ｍｇ～３５０ｍｇ、３５０ｍｇ～４００ｍｇ、４００ｍｇ～４５０ｍｇ、４５０ｍｇ～５００ｍｇ、５００ｍｇ～６００ｍｇ、６００ｍｇ～７００ｍｇ、７００ｍｇ～８００ｍｇ、８００ｍｇ～９００ｍｇ、９００ｍｇ～１ｇ、１ｍｇ～５０ｍｇ、２０ｍｇ～４０ｍｇ、または１ｍｇ～５００ｍｇのアンチセンスオリゴヌクレオチドを患者に投与する工程を含む。
【0073】
処置の有効性は、腸疾患に伴う総体症状の評価、組織の組織学分析、生化学アッセイ、例えば、磁気共鳴画像法などの画像法、または他の公知の方法によって評価してもよい。例えば、処置の有効性は、開示されるＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドを腸疾患を患っている患者に投与した後の、腹痛、嘔吐、下痢、直腸出血、痙攣、筋痙縮、体重減少、栄養不良、発熱、貧血または腸疾患に伴う肉眼病理の他の態様の変化などの疾患の総体症状を分析することによって評価してもよい。
【0074】
処置の有効性はまた、組織レベルまたは細胞レベルで評価してもよく、例えば、組織生検（例えば、腫瘍または消化管組織生検）を得て、肉眼的組織または細胞形態または染色性を評価することによって評価してもよい。処置の有効性を評価するために、タンパク質またはＲＮＡの発現を検査する生化学アッセイを使用してもよい。例えば、ＦＭＲＰ、カスパーゼ（例えば、カスパーゼ３またはカスパーゼ８）、ＲＩＰＫ１、リン酸化ＲＩＰＫ１、ＲＩＰＫ３、リン酸化ＲＩＰＫ３、ＭＬＫＬ、リン酸化ＭＬＫＬ、ＣＲＥＢ、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＴＮＦ－α、または、大腸癌、ネクロトーシス、炎症性腸疾患もしくは炎症性サイトカイン生産を示す別のタンパク質もしくは遺伝子産物のレベルを、免疫細胞化学法、免疫組織化学法、ウエスタンブロット法またはノーザンブロット法、あるいは、定量もしくは半定量できるポリメラーゼ連鎖反応などのＲＮＡレベルを評価するのに有用な方法によって評価してもよい。また、糞便、血漿または血清において見られる有用なバイオマーカーの存在または発現レベルを評価して、病態および処置の有効性を評価してもよい。
【0075】
処置の有効性を評価する上で、確実に有効に評価をできるようにするために、適切な対照を選択してもよい。例えば、腸疾患を有している患者において、開示されるＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドを患者に投与した後に評価した症状と、同患者において、処置する前または処置する過程の早期の時点に評価した症状とを比較しても、あるいは腸疾患と診断されていない別の患者において評価した症状とを比較してもよい。あるいは、開示されるＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドを患者に投与した後の腸組織の生化学分析または組織学分析の結果と、同患者、あるいは腸疾患と診断されていない個体、あるいはＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドを患者に投与する前の同患者の腸組織の生化学分析または組織学分析の結果とを比較してもよい。さらに、ＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドを患者に投与した後の血液、血清、細胞または糞便試料と、腸疾患と診断されていない個体、またはＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与する前の同患者の同等の試料とを比較してもよい。
【0076】
ＦＭＲＰ阻害の妥当性は、ＦＭＲＰの発現レベルまたは活性を直接または間接的に評価することによって求められてもよい。例えば、ＦＭＲＰタンパク質またはＲＮＡ発現を測定する生化学アッセイを使用して、総体的なＦＭＲＰ阻害を評価してもよい。例えば、腸組織におけるＦＭＲＰタンパク質レベルをウエスタンブロットによって測定して、総体的なＦＭＲＰレベルを評価してもよい。また、ＦＭＲＰ ｍＲＮＡレベルをノーザンブロットまたは定量できるポリメラーゼ連鎖反応によって測定して、総体的なＦＭＲＰ阻害を求められてもよい。解離細胞、非解離組織もしくは糞便における、ＦＭＲＰタンパク質レベルまたはＦＭＲＰ活性／発現を示す別のタンパク質レベルを、免疫細胞化学法または免疫組織化学法によって評価してもよい。
【0077】
ＦＭＲＰ阻害は、ネクロトーシスに伴うＲＩＰＫ１発現の亢進および／またはＲＩＰＫ１－ＲＩＰＫ３－ＭＬＫＬ複合体の活性化などのパラメータを測定することによって間接的に評価してもよい。例えば、腸組織におけるリン酸化ＲＩＰＫ１、リン酸化ＲＩＰＫ３またはリン酸化ＭＬＫＬのレベルをウエスタンブロットによって測定してもよい。
【0078】
また、ＦＭＲＰのダウンレギュレーションは、ＣＲＥＢ発現などのパラメータを測定することによって間接的に評価してもよい。例えば、ＣＲＥＢタンパク質またはＲＮＡ発現を測定する生化学アッセイを使用して、総体的なＦＭＲＰ阻害を評価してもよい。例えば、腸組織におけるＣＲＥＢタンパク質レベルをウエスタンブロットによって測定してもよい。また、ＣＲＥＢ ｍＲＮＡレベルをノーザンブロットまたは定量できるポリメラーゼ連鎖反応によって測定して、総体的なＦＭＲＰ阻害を求められてもよい。解離細胞、非解離組織もしくは糞便における、ＣＲＥＢタンパク質レベルまたはＣＲＥＢ活性／発現を示す別のタンパク質レベルを、免疫細胞化学法または免疫組織化学法によって評価してもよい。
【0079】
本開示は、結腸癌を処置するための方法を提供する。結腸癌の処置は、例えば、疾患の完全な改善、腫瘍の数および／またはグレードの低下、転移の低下、再発の低下、ならびに、症状（例えば、下痢、便秘、血便、直腸出血、腹痛、衰弱、疲労および体重減少）の発症または重症度の低下のうちの１つ以上をもたらすことが企図されている。
【0080】
本開示はまた、ＩＢＤ（例えば、クローン病および潰瘍性大腸炎）を処置するための方法を提供する。ＩＢＤの処置は、例えば、疾患の完全な改善、免疫細胞の炎症性サイトカイン生産の低下および消化管浸潤の低下を含む炎症の低下、消化管構築／粘膜構築の回復、再発の低下、ならびに、症状（例えば、下痢、便秘、血便、出血、腹痛、衰弱、疲労および体重減少）の発症または重症度の低下のうちの１つ以上をもたらすことが企図されている。「炎症性サイトカイン産生」は、炎症性サイトカイン応答を開始および／または促進するサイトカインの発現を指す。「炎症性サイトカイン応答」は、顆粒球動員、リンパ球動員、全身性炎症（特に消化管またはその一部分（複数可）の炎症）、発熱、組織破壊、ショックおよび／または死亡によって特徴付けられ得る免疫応答を指す。炎症性サイトカイン応答は、個々のサイトカインとそれらの細胞表面受容体と、ならびに、その後の細胞機能および遺伝子発現を変化させる細胞内シグナル伝達のカスケードによって特徴付けられ得る。炎症性サイトカインは、ＩＬ－１、ＩＬ－６、ＩＬ－８およびＴＮＦαを含むがこれに限らない。炎症性サイトカイン発現は、例えば、マクロファージ、単球、粘膜固有層単核球、または、消化管の他の細胞もしくは免疫系の細胞において生じ得る。炎症性サイトカイン産生を阻害する方法は、炎症性腸疾患を患っている患者において炎症性サイトカインの一部または全ての発現レベルを低下させる方法を含む。炎症性サイトカイン産生を阻害する方法はまた、炎症性疾患を患っている患者の細胞において炎症性サイトカインの一部または全ての発現レベルを低下させる方法を含む。
【0081】
本開示はまた、腸疾患を患っている患者の細胞におけるＦＭＲＰを阻害する方法を提供する。ＦＭＲＰは、消化管、免疫系および血液の細胞を含む、ＦＭＲＰ発現または活性が生じる任意の細胞において阻害してもよい。消化管の細胞（胃、十二指腸、空腸、回腸、結腸、直腸および肛門管の細胞を含む）には、円柱上皮細胞、粘膜上皮細胞、酵素原細胞、頚部粘液細胞、壁細胞、ガストリン細胞、杯細胞、パネート細胞、オリゴ粘液（ｏｌｉｇｏｍｕｃｕｓ）細胞および絨毛吸収細胞が含まれる。免疫系の細胞には、白血球、食細胞（例えば、マクロファージ、好中球および樹状細胞）、単球、肥満細胞、好酸球、好塩基球、ナチュラルキラー細胞、自然細胞、リンパ球、Ｂ細胞およびＴ細胞が含まれる。
血液の細胞には、赤血球細胞（赤血球）および白血球細胞（白血球、単球および血小板）が含まれる。
血液の細胞には、赤血球細胞（赤血球）および白血球細胞（白血球、単球および血小板）が含まれる。
【0082】
腫瘍浸潤および腫瘍転移
腫瘍浸潤は、癌細胞の増殖および腫瘍サイズの増加を指し、癌細胞の伸展、破損、浸透、および、周辺組織への拡散をもたらす。腫瘍転移は、癌細胞が原発巣から離脱し、血液またはリンパを通って移動し、体内の他の器官および組織に新たな腫瘍遺伝子座を形成したときに生じる。
腫瘍浸潤は、癌細胞の増殖および腫瘍サイズの増加を指し、癌細胞の伸展、破損、浸透、および、周辺組織への拡散をもたらす。腫瘍転移は、癌細胞が原発巣から離脱し、血液またはリンパを通って移動し、体内の他の器官および組織に新たな腫瘍遺伝子座を形成したときに生じる。
【0083】
いくつかの実施形態では、有効量の本開示のＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドを必要とする患者に投与して、固形腫瘍、腫瘍浸潤または腫瘍転移を処置することができる。いくつかの実施形態では、有効量の本開示のＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して、腫瘍浸潤または腫瘍転移を予防または改善することができる。ある実施形態では、有効量の本開示のＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して、大腸癌腫瘍浸潤または大腸癌腫瘍転移を予防または改善することができる。
【0084】
医薬組成物および投与経路
本開示はまた、開示されるＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物を患者に投与することによって腸疾患を処置するための方法を提供する。別の態様では、本開示は、腸疾患の処置に使用するための医薬組成物を提供する。医薬組成物は、開示される、ＦＭＲＰを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドと、薬学的に許容可能な担体とで構成されてもよい。本明細書で使用される場合、「医薬組成物」という用語は、例えば、腸疾患を処置するために、哺乳動物、例えば、ヒトに投与される、薬学的に許容可能な担体中に指定量の治療化合物、例えば、有効量の治療化合物を含有する混合物を意味する。いくつかの実施形態では、開示されるＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドと、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物が本明細書で企図されている。別の態様では、本開示は、炎症性疾患を処置するための薬剤の製造における、開示されるＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用を提供する。「薬剤」は、本明細書で使用される場合、「医薬組成物」という用語と本質的に同じ意味を有する。
本開示はまた、開示されるＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物を患者に投与することによって腸疾患を処置するための方法を提供する。別の態様では、本開示は、腸疾患の処置に使用するための医薬組成物を提供する。医薬組成物は、開示される、ＦＭＲＰを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドと、薬学的に許容可能な担体とで構成されてもよい。本明細書で使用される場合、「医薬組成物」という用語は、例えば、腸疾患を処置するために、哺乳動物、例えば、ヒトに投与される、薬学的に許容可能な担体中に指定量の治療化合物、例えば、有効量の治療化合物を含有する混合物を意味する。いくつかの実施形態では、開示されるＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドと、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物が本明細書で企図されている。別の態様では、本開示は、炎症性疾患を処置するための薬剤の製造における、開示されるＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用を提供する。「薬剤」は、本明細書で使用される場合、「医薬組成物」という用語と本質的に同じ意味を有する。
【0085】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容可能な担体」とは、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を伴わずにヒトおよび動物の組織と接触させて使用するのに適し、妥当なリスク・ベネフィット比に見合った緩衝液、担体および賦形剤を意味する。担体（複数可）は、製剤の他の成分と適合性があり、レシピエントにとって有害ではないという意味で「許容可能」なものとする。薬学的に許容可能な担体には、医薬投与と適合性がある緩衝液、溶媒、分散媒、コーティング剤、等張化剤および吸収遅延剤などが含まれる。医薬活性物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は、当該技術分野において公知である。一実施形態では、医薬組成物は、患者に経口投与され、消化器系または腸内における内包物質の吸収部位を制御するのに適切な腸溶コーティングを含む。例えば、腸溶コーティングには、アクリル酸エチル－メタクリル酸共重合体が含まれてもよい。
【0086】
いくつかの実施形態では、開示されるＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびその任意の医薬組成物は、経腸送達または非経口送達、あるいは腫瘍内注射を含む１つまたはいくつかの経路によって患者に投与してもよい。本明細書中で使用される場合、経腸投与または経腸送達は、開示されるＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドを消化管を介して患者に投与することを指し、これには、経口送達、舌下送達、胃送達および直腸送達が含まれてもよい。本明細書で使用される場合、非経口投与は、開示されるＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドを消化管以外の経路を介して患者に投与することを指し、これには、腫瘍内注射または注入、鼻腔内注射または注入、経皮注射または注入、皮下注射または注入、筋肉内注射または注入、腹腔内注射または注入、腸内注射または注入（例えば、空腸内、回腸内）、結腸内注射または注入、あるいは直腸内注射または注入が含まれるがこれに限らない。
【0087】
例えば、開示されるＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドを患者、被験体に皮下投与してもよい。ある実施例では、開示されるＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドを被験体に経口投与してもよい。様々な実施例では、開示されるＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドを、非経口投与を介して患者の消化管系、または消化管系の特定の領域（例えば、空腸、回腸、結腸または直腸）に直接投与してもよい。
【0088】
本明細書に開示されているものなどの開示されるＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有する医薬組成物は、投薬単位の剤形で提示されてもよく、任意の適した方法によって調製してもよい。医薬組成物は、その意図される投与経路に適合するように製剤化されるものとする。有用な製剤は、薬学技術分野において周知の方法によって調製してもよい。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １８ｔｈ ｅｄ． （Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， １９９０）を参照されたい。
【0089】
医薬製剤は、例えば、無菌である。滅菌は、例えば、滅菌濾過膜を通して濾過することによって達成してもよい。組成物が凍結乾燥されている場合、凍結乾燥および再構成の前またはその後に濾過滅菌を行ってもよい。
【0090】
非経口投与
本開示の医薬組成物は、非経口投与するために製剤化されてもよく、例えば、静脈内経路、腫瘍内経路、筋肉内経路、皮下経路、病巣内経路、腸内経路（例えば、 空腸内経路、回腸内経路）、結腸内経路または直腸内経路または腹腔内経路を介して注射するために製剤化されてもよい。開示されるＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有する水性医薬組成物などの水性組成物の調製は、本開示に鑑みて当業者に公知であろう。概して、このような組成物は、液体溶液または懸濁液のいずれかとしての注射剤として調製してもよく、注射前に液体を添加して溶液または懸濁液を調製するために使用するのに適切な固体形態も調製してもよく、製剤を乳化してもよい。
本開示の医薬組成物は、非経口投与するために製剤化されてもよく、例えば、静脈内経路、腫瘍内経路、筋肉内経路、皮下経路、病巣内経路、腸内経路（例えば、 空腸内経路、回腸内経路）、結腸内経路または直腸内経路または腹腔内経路を介して注射するために製剤化されてもよい。開示されるＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有する水性医薬組成物などの水性組成物の調製は、本開示に鑑みて当業者に公知であろう。概して、このような組成物は、液体溶液または懸濁液のいずれかとしての注射剤として調製してもよく、注射前に液体を添加して溶液または懸濁液を調製するために使用するのに適切な固体形態も調製してもよく、製剤を乳化してもよい。
【0091】
注射用途に適切な医薬形態には、無菌水溶液または分散液、ゴマ油、落花生油または含水プロピレングリコールを含む製剤、および無菌注射溶液または分散液を即座に調製するための無菌粉末が含まれる。全ての場合において、当該形態は無菌でなければならず、容易に注射可能な程度の流動性を有さなければならない。当該形態は、製造条件および保管条件下で安定したものでなければならず、細菌および真菌などの微生物の混入作用から保護されていなければならない。
【0092】
遊離塩基または薬理学的に許容可能な塩としての活性化合物の溶液を、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合した水中で調製してもよい。また、分散液は、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物中、ならびに油中で調製してもよい。さらに、無菌の不揮発性油を溶媒または懸濁媒として使用してもよい。この目的のために、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含む、任意の無刺激の不揮発性油を使用してもよい。さらに、オレイン酸などの脂肪酸を注射剤の調製において使用してもよい。無菌注射用製剤は、例えば、１，３－ブタンジオールの溶液として非毒性の非経口で許容可能な希釈剤または溶媒の無菌注射溶液、懸濁液またはエマルジョンであってもよい。使用することができる許容可能なビヒクルおよび溶媒は、水、リンゲル液、ＵＳＰおよび等張塩化ナトリウム溶液である。一実施形態では、開示されるＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドを１％（ｗ／ｖ）のカルボキシメチルセルロースナトリウムおよび０．１％（ｖ／ｖ）のＴＷＥＥＮ（商標）８０を含む液体担体に懸濁されてもよい。通常の保管条件および使用条件下で、これらの製剤は、微生物の増殖を防止するために防腐剤を含有する。
【0093】
注射用製剤、例えば、無菌注射用水性懸濁液または油性懸濁液は、適切な分散剤または湿潤剤および懸濁化剤を使用して、公知の技術に従って製剤化してもよい。概して、分散液は、様々な滅菌済みの活性成分を、基礎分散媒および以上に列挙されているものから必要とされる他の成分を含有する無菌ビヒクルに組み入れることによって調製する。本開示の無菌注射液は、開示されるＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドを、必要量の適切な溶媒に、必要に応じて以上に列挙されている様々な量の他の成分と共に組み入れ、その後、濾過滅菌を行うことによって調製してもよい。無菌注射液を調製するための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥技術および凍結乾燥技術であり、それにより、予め滅菌濾過したその溶液から活性成分と任意のさらなる所望の成分からなる粉末を生じさせる。注射用製剤は、例えば、バクテリア保留フィルターを通して濾過することによって滅菌してもよい。
【0094】
筋肉内注射するために、さらにまたは高度に濃縮された溶液を調製することも企図されている。この点について、溶媒としてＤＭＳＯを使用することが好ましく、これは、非常に素早く透過して、開示されるＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドを高濃度で小さな面積に送達するからである。
【0095】
そのような溶液に使用するための適切な防腐剤には、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、クロロブタノール、チメロサールなどが含まれる。適切な緩衝液には、約ｐＨ６～ｐＨ８の間、および例えば、約ｐＨ７～ｐＨ７．５の間にｐＨを維持するのに十分な量のホウ酸、炭酸水素ナトリウムおよび炭酸水素カリウム、ホウ酸ナトリウムおよびホウ酸カリウム、１０炭酸ナトリウムおよび１０炭酸カリウム、酢酸ナトリウム、リン酸二水素ナトリウムなどが含まれる。適切な等張化剤は、溶液の塩化ナトリウムの同等物が０．９プラスまたはマイナス０．２％の範囲になるようなデキストラン４０、デキストラン７０、デキストロース、グリセリン、塩化カリウム、プロピレングリコール、塩化ナトリウムなどである。適切な抗酸化剤および安定剤には、亜硫酸水素ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、チオ亜硫酸ナトリウム、チオ尿素などが含まれる。適切な湿潤剤および清澄剤には、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、ポロキサマー２８２およびチロキサポールが含まれる。適切な増粘剤には、デキストラン４０、デキストラン７０、ゼラチン、グリセリン、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシメチルプロピルセルロース、ラノリン、メチルセルロース、ペトロラタム、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースなどが含まれる。
【0096】
経腸投与
いくつかの実施形態では、開示されるＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドの経口送達、舌下送達、胃送達または直腸送達に適した組成物が本明細書で企図されている。
いくつかの実施形態では、開示されるＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドの経口送達、舌下送達、胃送達または直腸送達に適した組成物が本明細書で企図されている。
【0097】
例えば、開示されるＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む組成物は、経口送達に適したものであってもよく、組成物がＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドを、例えば、患者の消化管に送達することができるように、例えば、腸溶コーティング、例えば、胃耐性コーティングを含む錠剤であってもよい。例えば、このように患者に投与することにより、ＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドを患者の消化管の影響を受けている部分に直接、実質的に局所的に適用して、局所的な効果をもたらすことができる。このように患者に投与することにより、いくつかの実施形態では、ＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドの望ましくない全身吸収を実質的に回避することができる。
【0098】
例えば、開示されるＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチド、例えば、配列番号１～１０のいずれか１つで表されるアンチセンスオリゴヌクレオチドと、薬学的に許容可能な賦形剤とを含む顆粒を含む（例えば、顆粒から少なくとも部分的に形成される）、経口投与するための錠剤が提供される。このような錠剤は、腸溶コーティングでコーティングされていてもよい。企図される錠剤は、充填剤、結合剤、崩壊剤、および／または潤滑剤、ならびに、着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味剤、ウィンターグリーン、オレンジ、キシリトール、ソルビトール、フルクトースおよびマルトデキストリンなどの香味剤、および、香料、防腐剤および／または抗酸化剤などの薬学的に許容可能な賦形剤を含んでもよい。
【0099】
いくつかの実施形態では、企図される医薬製剤は、開示されるＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチド、例えば、配列番号１～１０で表されるアンチセンスオリゴヌクレオチド、薬学的に許容可能な塩、および／または、薬学的に許容可能な充填剤を含む粒内相を含む。例えば、開示されるＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび充填剤に、随意に、他の賦形剤を配合し、顆粒を形成してもよい。いくつかの実施形態では、粒内相は、湿式造粒法を使用して形成してもよく、例えば、配合したＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物および充填剤に液体（例えば、水）を添加し、次いで、この組み合わせを乾燥し、粉砕し、および／またはふるいにかけて顆粒をもたらす。粒内相を実現するために他の処理を使用してもよいことが当業者に理解されよう。
【0100】
いくつかの実施形態では、企図される製剤は、粒外相を含み、当該粒外相は、１つ以上の薬学的に許容可能な賦形剤を含んでもよく、当該粒外相に粒内相を配合して、開示される製剤を形成してもよい。
【0101】
開示される製剤は、充填剤を含む粒内相を含んでもよい。例示的な充填剤には、セルロース、ゼラチン、リン酸カルシウム、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、ソルビトール、結晶セルロース、ペクチン、ポリアクリレート、デキストロース、酢酸セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、部分アルファー化デンプン、炭酸カルシウム、およびこれらの組み合わせを含むその他が含まれるがこれに限らない。
【0102】
いくつかの実施形態では、開示される製剤は、概して医薬製剤の成分を共に保持するように機能し得る結合剤を含む粒内相および／または粒外相を含んでよい。本開示の例示的な結合剤には、ヒドロキシプロピルセルロース、ラクトース、アルファー化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、エチルセルロース、糖アルコール、およびこれらの組み合わせを含むその他などのデンプン、糖、セルロースまたは修飾セルロースが含まれてもよいがこれに限らない。
【0103】
製剤、例えば、粒内相および／または粒外相を含む製剤は、デンプン、セルロース、架橋ポリビニルピロリドン、デンプングリコール酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、アルギネート、トウモロコシデンプン、クロスメロースナトリウム、架橋カルボキシメチルセルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、アカシア、およびこれらの組み合わせを含むその他などの崩壊剤が含まれてもよいがこれに限らない。例えば、粒内相および／または粒外相が崩壊剤を含んでもよい。
【0104】
いくつかの実施形態では、企図される製剤は、開示されるＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチド、ならびに、マンニトール、結晶セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースおよびデンプングリコール酸ナトリウムまたはこれらの組み合わせから選択される賦形剤を含む粒内相と、結晶セルロース、デンプングリコール酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウムまたはこれらの混合物のうちの１つ以上を含む粒外相とを含む。
【0105】
いくつかの実施形態では、製剤は、潤滑剤を含んでもよく、例えば、粒外相が潤滑剤を含有してもよい。潤滑剤には、タルク、シリカ、脂肪、ステアリン、ステアリン酸マグネシウム、リン酸カルシウム、二酸化ケイ素、ケイ酸カルシウム、リン酸カルシウム、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸金属塩、水素添加植物油、トウモロコシデンプン、安息香酸ナトリウム、ポリエチレングリコール、酢酸ナトリウム、ステアリン酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム、タルクおよびステアリン酸が含まれるがこれに限らない。
【0106】
いくつかの実施形態では、医薬製剤は、腸溶コーティングを含む。概して、腸溶コーティングにより、消化管に沿って薬物が吸収される場所を制御する、経口薬剤に対するバリアを生成する。腸溶コーティングは、ｐＨに応じて異なる速度で崩壊する重合体を含んでもよい。腸溶コーティングには、例えば、酢酸フタル酸セルロース、アクリル酸メチル－メタクリル酸共重合体、酢酸コハク酸セルロース、フタル酸ヒドロキシルプロピルメチルセルロース、メタクリル酸メチル－メタクリル酸共重合体、アクリル酸エチル－メタクリル酸共重合体、メタクリル酸共重合体Ｃ型、ポリビニルアセテートフタレートおよび酢酸フタル酸セルロースが含まれてもよい。
【0107】
例示的な腸溶コーティングには、Ｏｐａｄｒｙ（登録商標）ＡＭＢ、Ａｃｒｙｌ－ＥＺＥ（登録商標）、Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）のグレードのものが含まれる。いくつかの実施形態では、腸溶コーティングは、意図される錠剤の約５重量％～約１０重量％、約５重量％～約２０重量％、８重量％～約１５重量％、約８重量％～約２０重量％、約１０重量％～約２０重量％、または約１２重量％～約２０重量％、または約１８重量％を構成してもよい。
【0108】
例えば、腸溶コーティングには、アクリル酸エチル－メタクリル酸共重合体が含まれてもよい。例えば、企図される実施形態では、約０．５重量％～約７０重量％、例えば、約０．５重量％～約１０重量％、または約１重量％～約２０重量％の開示されるＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチド、あるいはその薬学的に許容可能な塩を含むか、または本質的にこれからなる錠剤が提供される。このような錠剤は、例えば、約０．５重量％～約６０重量％のマンニトール、例えば、約３０重量％～約５０重量％のマンニトール、例えば、約４０重量％のマンニトール、および／または、約２０重量％～約４０重量％の結晶セルロースもしくは約１０重量％～約３０重量％の結晶セルロースを含んでもよい。
例えば、開示される錠剤は、約３０重量％～約６０重量％、例えば、約４５重量％～約６５重量％、あるいは約５重量％～約１０％重量の開示されるＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチド、約３０重量％～約５０重量％、あるいは約５重量％～約１５重量％のマンニトール、約５重量％～約１５重量％の結晶セルロース、約０重量％～約４重量％、または約１重量％～約７重量％のヒドロキシプロピルメチルセルロース、および約０重量％～約４重量％、例えば、約２重量％～約４重量％のデンプングリコール酸ナトリウムを含む粒内相を含んでもよい。
例えば、開示される錠剤は、約３０重量％～約６０重量％、例えば、約４５重量％～約６５重量％、あるいは約５重量％～約１０％重量の開示されるＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチド、約３０重量％～約５０重量％、あるいは約５重量％～約１５重量％のマンニトール、約５重量％～約１５重量％の結晶セルロース、約０重量％～約４重量％、または約１重量％～約７重量％のヒドロキシプロピルメチルセルロース、および約０重量％～約４重量％、例えば、約２重量％～約４重量％のデンプングリコール酸ナトリウムを含む粒内相を含んでもよい。
【0109】
様々な実施形態では、開示されるＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドを経口投与するための医薬錠剤製剤は、粒内相を含み、粒内相は、開示されるＦＭＲＰアンチセンス、あるいはその薬学的に許容可能な塩（ナトリウム塩など）、ならびに、薬学的に許容可能な充填剤を含み、当該医薬錠剤製剤はまた、崩壊剤などの薬学的に許容可能な賦形剤を含んでもよい粒外相を含んでもよい。粒外相は、結晶セルロース、ステアリン酸マグネシウム、およびそれらの混合物から選択される構成成分を含んでもよい。医薬組成物はまた、錠剤の約１２重量％～２０重量％の腸溶コーティングを含んでもよい。例えば、経口使用するための薬学的に許容可能な錠剤は、約０．５重量％～１０重量％の開示されるＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドを含んでもよく、例えば、開示されるＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチド、あるいはその薬学的に許容可能な塩、約３０重量％～５０重量％のマンニトール、約１０重量％～３０重量％の結晶セルロース、および、エチルアクリル酸－メタクリル酸共重合体を含む腸溶コーティングを含んでもよい。
【0110】
いくつかの実施例では、経口使用するための薬学的に許容可能な錠剤は、約５重量％～約１０重量％の開示されるＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチド、例えば、開示されるＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチド、あるいはその薬学的に許容可能な塩、約４０重量％のマンニトール、約８重量％の結晶セルロース、約５重量％のヒドロキシプロピルメチルセルロース、ならびに、約２重量％のデンプングリコール酸ナトリウムを含む粒内相と、約１７重量％の結晶セルロース、約２重量％のデンプングリコール酸ナトリウム、約０．４重量％のステアリン酸マグネシウムを含む粒外相と、錠剤を覆う、アクリル酸エチル－メタクリル酸共重合体を含む腸溶コーティングとを含んでもよい。
【0111】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、約１３重量％または約１５重量％、１６重量％、１７重量％もしくは１８重量％の、例えば、Ａｃｒｙｌ－ＥＺＥ（登録商標）（例えば、全体が参照によって本明細書に組み込まれる国際公開第２０１０／０５４８２６号パンフレットを参照）を含む腸溶コーティングを含有してもよい。
【0112】
当該コーティングが溶解し、活性成分が放出される点での率が溶解率である。いくつかの実施形態では、錠剤は、例えば、ＵＳＰ／ＥＰ２型機器（パドル）において、ｐＨ７．２のリン酸緩衝液で、１００ｒｐｍ、３７℃で試験すると、約１２０分～約２４０分後、例えば、１８０分後に約５０％～約１００％のＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドが放出されるという溶解プロファイルを有してもよい。ある実施形態では、錠剤は、例えば、ＵＳＰ／ＥＰ２型機器（パドル）において、ｐＨ１．０の希釈ＨＣｌ中で、１００ｒｐｍ、３７℃で試験すると、１２０分後にＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドが実質的に放出されないという溶解プロファイルを有してもよい。錠剤は、いくつかの実施形態では、例えば、ＵＳＰ／ＥＰ２型機器（パドル）において、ｐＨ６．６のリン酸緩衝液で、１００ｒｐｍ、３７℃で試験すると、３０分後に約１０％～約３０％、または約５０％以下のＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドが放出されるという溶解プロファイルを有してもよい。
【0113】
製剤、例えば、錠剤は、いくつかの実施形態では、患者に経口投与したときに、患者におけるＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドの血漿中濃度が最低になり得る。別の実施形態では、開示される製剤は、患者に経口投与したときに、患者の結腸または直腸、例えば、患者の影響を受けている部位または疾患にかかっている部位に局所的に送達される。
【0114】
開示されるＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドを患者に投与するのは、直腸様式を介して行われてもよい。直腸投与するための医薬組成物には、泡沫剤、溶液（注腸剤）、および坐剤が含まれる（Ｂｌｏｃｋ， Ｃｈａｐｔｅｒ ８７ Ｉｎ： Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １８ｔｈ Ｅｄ．， Ｇｅｎｎａｒｏ， ｅｄ．， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， Ｐａ．， １９９０）。
【0115】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、本明細書に開示される疾患および障害を処置することを対象とした少なくとも１つの他の薬剤を患者に投与する工程をさらに含んでもよい。いくつかの実施形態では、企図される他の薬剤を患者に共投与（例えば、逐次または同時）してもよい。
【0116】
例えば、このような薬剤には、ダウノルビシン、ダウノマイシン、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、エソルビシン、ブレオマイシン、マフォスファミド、イホスファミド、シトシンアラビノシド、ビスクロロエチルニトロソ尿素、ブスルファン、マイトマイシンＣ、アクチノマイシンＤ、ミトラマイシン、プレドニゾン、ヒドロキシプロゲステロン、テストステロン、タモキシフェン、ダカルバジン、プロカルバジン、ヘキサメチルメラミン、ペンタメチルメラミン、ミトキサントロン、アムサクリン、クロラムブシル、メチルシクロヘキシルニトロソ尿素、ナイトロジェンマスタード、メルファラン、シクロホスファミド、６－メルカプトプリン、６－チオグアニン、シタラビン（ＣＡ）、５－アザシチジン、ヒドロキシ尿素、デオキシコホルマイシン、４－ヒドロキシペルオキシシクロホスホラミド、５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）、５－フルオロデオキシウリジン（５－ＦＵｄＲ）、メトトレキサート（ＭＴＸ）、コルヒチン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド、トリメトレキサート、テニポシド、シスプラチンおよびジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）などの化学療法剤が含まれるがこれに限らない。
【0117】
薬剤にはまた、グルココルチコイド、細胞増殖抑制剤、抗体、イムノフィリンに作用する薬剤、インターフェロン、オピオイド、ＴＮＦ結合タンパク質、ミコフェノール酸および微小生物学的製剤を含む免疫抑制剤が含まれる。例えば、企図される免疫抑制剤には、タクロリムス、シクロスポリン、ピメクロリムス、シロリムス、エベロリムス、ミコフェノール酸、フィンゴリモド、デキサメタゾン、フルダラビン、シクロホスファミド、メトトレキサート、アザチオプリン、レフルノミド、テリフルノミド、アナキンラ、抗胸腺細胞グロブリン、抗リンパ球グロブリン、ムロモナブ－ＣＤ３、アフツズマブ、リツキシマブ、テプリズマブ、エファリズマブ、ダクリズマブ、バシリキシマブ、アダリムマブ、インフリキシマブ、セルトリズマブペゴル、ナタリズマブおよびエタネルセプトが含まれるがこれに限らない。他の薬剤には、抗生物質、止瀉薬、緩下剤、鎮痛剤、鉄補給剤、および、カルシウム補給剤またはビタミンＤ補給剤もしくはビタミンＢ１２補給剤が含まれる。
【0118】
投与量および投与回数
例示的な製剤は、約３５ｍｇ～約５００ｍｇの開示されるＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むか、または本質的にこれからなる剤形を含む。例えば、約３５ｍｇ、４０ｍｇ、５０ｍｇ、６０ｍｇ、７０ｍｇ、８０ｍｇ、９０ｍｇ、１００ｍｇ、１１０ｍｇ、１２０ｍｇ、１３０ｍｇ、１４０ｍｇ、１５０ｍｇ、１６０ｍｇ、１７０ｍｇ、１８０ｍｇ、１９０ｍｇ、２００ｍｇ、または２５０ｍｇの開示されるＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む製剤が本明細書で企図されている。一実施形態では、製剤は、約４０ｍｇ、８０ｍｇ、または１６０ｍｇの開示されるＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドを含んでもよい。いくつかの実施形態では、製剤は、少なくとも１００μｇの開示されるＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドを含んでもよい。例えば、製剤は、約０．１ｍｇ、０．２ｍｇ、０．３ｍｇ、０．４ｍｇ、０．５ｍｇ、１ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、１５ｍｇ、２０ｍｇ、または２５ｍｇの開示されるＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドを含んでもよい。患者に投与する量は、処置する対象の疾患または適応症の種類および程度、患者の健康全般および大きさ、ＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドのｉｎ ｖｉｖｏ効力、医薬製剤、ならびに、投与経路などの変数に応じるものとする。所望の血中レベルまたは組織中レベルを素早く実現するために、初回投与量を上限を超えるまで増加させてもよい。初回投与量を最適量よりも少なくしてもよく、処置の過程で投与量を徐々に増加させてもよい。ヒトへの投与量は、例えば、４０ｍｇ～１６０ｍｇまで実施するように設計された従来の第Ｉ相用量漸増試験において最適化してもよい。投与回数は、投与経路、投与量および処置する疾患などの因子に応じて変動してもよい。例示的な投与回数は、１日１回、１週間１回、および２週間毎１回である。いくつかの実施形態では、投薬は、７日間にわたり１日１回である。
例示的な製剤は、約３５ｍｇ～約５００ｍｇの開示されるＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むか、または本質的にこれからなる剤形を含む。例えば、約３５ｍｇ、４０ｍｇ、５０ｍｇ、６０ｍｇ、７０ｍｇ、８０ｍｇ、９０ｍｇ、１００ｍｇ、１１０ｍｇ、１２０ｍｇ、１３０ｍｇ、１４０ｍｇ、１５０ｍｇ、１６０ｍｇ、１７０ｍｇ、１８０ｍｇ、１９０ｍｇ、２００ｍｇ、または２５０ｍｇの開示されるＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む製剤が本明細書で企図されている。一実施形態では、製剤は、約４０ｍｇ、８０ｍｇ、または１６０ｍｇの開示されるＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドを含んでもよい。いくつかの実施形態では、製剤は、少なくとも１００μｇの開示されるＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドを含んでもよい。例えば、製剤は、約０．１ｍｇ、０．２ｍｇ、０．３ｍｇ、０．４ｍｇ、０．５ｍｇ、１ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、１５ｍｇ、２０ｍｇ、または２５ｍｇの開示されるＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドを含んでもよい。患者に投与する量は、処置する対象の疾患または適応症の種類および程度、患者の健康全般および大きさ、ＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドのｉｎ ｖｉｖｏ効力、医薬製剤、ならびに、投与経路などの変数に応じるものとする。所望の血中レベルまたは組織中レベルを素早く実現するために、初回投与量を上限を超えるまで増加させてもよい。初回投与量を最適量よりも少なくしてもよく、処置の過程で投与量を徐々に増加させてもよい。ヒトへの投与量は、例えば、４０ｍｇ～１６０ｍｇまで実施するように設計された従来の第Ｉ相用量漸増試験において最適化してもよい。投与回数は、投与経路、投与量および処置する疾患などの因子に応じて変動してもよい。例示的な投与回数は、１日１回、１週間１回、および２週間毎１回である。いくつかの実施形態では、投薬は、７日間にわたり１日１回である。
【0119】
診断方法
本開示はまた、患者の１つ以上の生体試料におけるＦＭＲＰ発現シグナルレベルの検出に基づいた、腸疾患を有している患者を診断する方法を提供する。本明細書で使用される場合、「ＦＭＲＰ発現シグナル」という用語は、ＦＭＲ１遺伝子発現、ＦＭＲ１遺伝子産物またはＦＭＲＰ活性の任意の指標を指し得る。ＦＭＲ１遺伝子産物は、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）、ペプチドおよびタンパク質（例えば、ＦＭＲＰ、変異体、類似体および／またはその一部）を含む。評価することができるＦＭＲ１遺伝子発現の指標には、ＦＭＲ１遺伝子またはクロマチンの状態、ＦＭＲ１遺伝子と遺伝子発現を制御する細胞構成成分との相互作用、ＦＭＲ１遺伝子産物の発現レベル（例えば、ＦＭＲＰ ＲＮＡ発現レベル、ＦＭＲＰタンパク質発現レベル）、あるいはＦＭＲＰ ＲＮＡまたはタンパク質と転写機構、翻訳機構または翻訳後プロセシング機構との相互作用が含まれるがこれに限らない。ＦＭＲＰ活性の指標には、ＲＩＰＫ／ＭＬＫＬ経路活性の評価（例えば、ＲＩＰＫ１、ＲＩＰＫ３および／またはＭＬＫＬリン酸化の評価）およびＣＲＥＢ発現（例えば、ｍＲＮＡおよびタンパク質発現）の評価が含まれるがこれに限らない。
本開示はまた、患者の１つ以上の生体試料におけるＦＭＲＰ発現シグナルレベルの検出に基づいた、腸疾患を有している患者を診断する方法を提供する。本明細書で使用される場合、「ＦＭＲＰ発現シグナル」という用語は、ＦＭＲ１遺伝子発現、ＦＭＲ１遺伝子産物またはＦＭＲＰ活性の任意の指標を指し得る。ＦＭＲ１遺伝子産物は、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）、ペプチドおよびタンパク質（例えば、ＦＭＲＰ、変異体、類似体および／またはその一部）を含む。評価することができるＦＭＲ１遺伝子発現の指標には、ＦＭＲ１遺伝子またはクロマチンの状態、ＦＭＲ１遺伝子と遺伝子発現を制御する細胞構成成分との相互作用、ＦＭＲ１遺伝子産物の発現レベル（例えば、ＦＭＲＰ ＲＮＡ発現レベル、ＦＭＲＰタンパク質発現レベル）、あるいはＦＭＲＰ ＲＮＡまたはタンパク質と転写機構、翻訳機構または翻訳後プロセシング機構との相互作用が含まれるがこれに限らない。ＦＭＲＰ活性の指標には、ＲＩＰＫ／ＭＬＫＬ経路活性の評価（例えば、ＲＩＰＫ１、ＲＩＰＫ３および／またはＭＬＫＬリン酸化の評価）およびＣＲＥＢ発現（例えば、ｍＲＮＡおよびタンパク質発現）の評価が含まれるがこれに限らない。
【0120】
ＦＭＲＰ発現シグナルの検出は、ｉｎ ｖｉｖｏ法、ｉｎ ｖｉｔｒｏ法またはｅｘ ｖｉｖｏ法によって達成してもよい。好ましい実施形態では、本開示の方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで実施してもよい。検出方法は、患者の血液、血清、糞便、組織または細胞における検出を伴ってもよい。検出は、全組織、組織外植片、細胞培養物、解離細胞、細胞抽出物、あるいは血液または血清を含む体液におけるＦＭＲＰ発現シグナルを測定することによって実現してもよい。企図される検出方法には、ＦＭＲ１遺伝子産物発現レベルを測定するアッセイ、例えば、ウエスタンブロット、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、他の定量できる結合アッセイ、細胞増殖アッセイまたは組織増殖アッセイ、ノーザンブロット、定量もしくは半定量できるポリメラーゼ連鎖反応、医療用画像撮影法（例えば、ＭＲＩ）または免疫染色法（例えば、免疫組織化学または免疫細胞化学）が含まれる。
【0121】
実施例
以下の実施例によって本開示をさらに例示する。実施例は、単に例示目的のために提示でされ、本開示の範囲または内容をいかなる形でも限定するものと解釈してはならない。
以下の実施例によって本開示をさらに例示する。実施例は、単に例示目的のために提示でされ、本開示の範囲または内容をいかなる形でも限定するものと解釈してはならない。
【0122】
実施例１：ＦＭＲＰは、ヒト大腸癌においてアップレギュレーションされる
ＣＲＣ腫瘍形成におけるＦＭＲＰの役割を調べるために、ヒトＣＲＣ試料におけるＦＭＲＰ ｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルを分析した。この実施例では、ヒトＣＲＣ試料におけるＦＭＲＰ発現の増加を実証する。
ＣＲＣ腫瘍形成におけるＦＭＲＰの役割を調べるために、ヒトＣＲＣ試料におけるＦＭＲＰ ｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルを分析した。この実施例では、ヒトＣＲＣ試料におけるＦＭＲＰ発現の増加を実証する。
【0123】
患者および試料
Ｔｏｒ Ｖｅｒｇａｔａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ（イタリア、ローマ）で、散発的ＣＲＣに対して結腸切除術を受けた患者４８名から、ヒトＣＲＣ腫瘍と、明らかな影響を受けていない、隣接している領域とのマッチドペア（ｍａｔｃｈ－ｐａｉｒｅｄ）試料を採取した。どの患者も手術前に放射線療法も化学療法も受けていなかった。
Ｔｏｒ Ｖｅｒｇａｔａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ（イタリア、ローマ）で、散発的ＣＲＣに対して結腸切除術を受けた患者４８名から、ヒトＣＲＣ腫瘍と、明らかな影響を受けていない、隣接している領域とのマッチドペア（ｍａｔｃｈ－ｐａｉｒｅｄ）試料を採取した。どの患者も手術前に放射線療法も化学療法も受けていなかった。
【0124】
免疫組織化学
ＣＲＣ患者から得た、ホルマリン固定パラフィン包埋した正常組織切片および腫瘍試料と腫瘍周囲試料とのペア試料に免疫組織化学を実施した。キシレンおよびエタノールを使用して結腸切片を脱パラフィンおよび脱水し、９８℃の恒温槽にあるＴｒｉｓ－ＥＤＴＡクエン酸緩衝液（ｐＨ７．８）で３０分間抗原の賦活化を行った（Ｄａｋｏ Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、デンマーク、グロストルプ）。ヒトＦＭＲＰに対するモノクローナル抗体（最終希釈１：５００、ＬｉｆｅＳｐａｎ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）を使用して免疫組織化学染色を実施し、室温で１時間インキュベートし、その後、３，３’ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を色原体として用いてビオチンフリーＨＲＰポリマー検出法を実施した（ＭＡＣＨ ４（商標） Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＨＲＰ－Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｋｉｔ、Ｂｉｏｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ、カリフォルニア州パチェコ）。切片は、ヘマトキシリンを用いて対比染色し、脱水してマウントした。以上に記載されるものと同一の免疫組織化学条件下であるが、一次抗体を精製マウス正常ＩｇＧ対照抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州ミネアポリス）に変えて、アイソタイプ対照ＩｇＧ染色切片を調製した。
ＣＲＣ患者から得た、ホルマリン固定パラフィン包埋した正常組織切片および腫瘍試料と腫瘍周囲試料とのペア試料に免疫組織化学を実施した。キシレンおよびエタノールを使用して結腸切片を脱パラフィンおよび脱水し、９８℃の恒温槽にあるＴｒｉｓ－ＥＤＴＡクエン酸緩衝液（ｐＨ７．８）で３０分間抗原の賦活化を行った（Ｄａｋｏ Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、デンマーク、グロストルプ）。ヒトＦＭＲＰに対するモノクローナル抗体（最終希釈１：５００、ＬｉｆｅＳｐａｎ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）を使用して免疫組織化学染色を実施し、室温で１時間インキュベートし、その後、３，３’ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を色原体として用いてビオチンフリーＨＲＰポリマー検出法を実施した（ＭＡＣＨ ４（商標） Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＨＲＰ－Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｋｉｔ、Ｂｉｏｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ、カリフォルニア州パチェコ）。切片は、ヘマトキシリンを用いて対比染色し、脱水してマウントした。以上に記載されるものと同一の免疫組織化学条件下であるが、一次抗体を精製マウス正常ＩｇＧ対照抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州ミネアポリス）に変えて、アイソタイプ対照ＩｇＧ染色切片を調製した。
【0125】
ヒトＣＲＣ腫瘍と隣接している領域とのマッチドペア試料から採取した切片（ｎ＝４０）、ならびに、正常対照（ＮＣ）の結腸から採取した試料におけるＦＭＲＰ発現を分析した。図１Ａに示されるように、ＣＲＣ腫瘍試料（Ｔ）では、腫瘍周囲領域（Ｐ）およびＮＣと比較してＦＭＲＰタンパク質発現が大幅に増加した。約６１％（２４／４０）のＣＲＣ試料で発現したＦＭＲＰのレベルは大きく、これと比較して、隣接している非腫瘍領域およびＮＣで発現したＦＭＲＰのレベルは比較的小さかった。
【0126】
ＦＭＲＰ ｍＲＮＡ発現
ＰｕｒｅＬｉｎｋ（登録商標）ｍＲＮＡ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、アメリカ合衆国、マサチューセッツ州ウォルサム）を使用して、製造業者の指示に従って、ヒトＣＲＣ腫瘍と、明らかな影響を受けていない、隣接している領域とのマッチドペア試料からＲＮＡを抽出した。一定量のＲＮＡ（試料当たり１μｇ）を相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に逆転写し、これを以下の条件、すなわち、９５℃で１分間の熱変性、ヒトＦＭＲＰに対して５９℃で、ヒト／マウスβ－アクチンに対して６０℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で３０秒間の伸長という条件を使用して増幅した。ハウスキーピング遺伝子としてβ－アクチンを使用した。遺伝子発現は、ΔΔＣｔアルゴリズムを使用して計算した。プライマー配列は、ヒトＦＭＲＰ（フォワード ５’－ＧＴＴＧＡＧＣＧＧＣＣＧＡＧＴＴＴＧＴＣＡＧ－３’（配列番号１１）、リバース ５’－ＣＣＣＡＣＴＧＧＧＡＧＡＧＧＡＴＴＡＴＴＴＧＧＧ－３’（配列番号１２））、ヒトβ－アクチンおよびマウスβ－アクチン（フォワード ５’－ＡＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＴＣＡＴＧＴＴＴＧＡＧＡＣＣ－３’（配列番号１３）、リバース ５’－ＡＧＣＣＡＧＴＣＣＡＧＡＣＧＣＡＧＧＡＴ－３’（配列番号１４））であった。
ＰｕｒｅＬｉｎｋ（登録商標）ｍＲＮＡ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、アメリカ合衆国、マサチューセッツ州ウォルサム）を使用して、製造業者の指示に従って、ヒトＣＲＣ腫瘍と、明らかな影響を受けていない、隣接している領域とのマッチドペア試料からＲＮＡを抽出した。一定量のＲＮＡ（試料当たり１μｇ）を相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に逆転写し、これを以下の条件、すなわち、９５℃で１分間の熱変性、ヒトＦＭＲＰに対して５９℃で、ヒト／マウスβ－アクチンに対して６０℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で３０秒間の伸長という条件を使用して増幅した。ハウスキーピング遺伝子としてβ－アクチンを使用した。遺伝子発現は、ΔΔＣｔアルゴリズムを使用して計算した。プライマー配列は、ヒトＦＭＲＰ（フォワード ５’－ＧＴＴＧＡＧＣＧＧＣＣＧＡＧＴＴＴＧＴＣＡＧ－３’（配列番号１１）、リバース ５’－ＣＣＣＡＣＴＧＧＧＡＧＡＧＧＡＴＴＡＴＴＴＧＧＧ－３’（配列番号１２））、ヒトβ－アクチンおよびマウスβ－アクチン（フォワード ５’－ＡＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＴＣＡＴＧＴＴＴＧＡＧＡＣＣ－３’（配列番号１３）、リバース ５’－ＡＧＣＣＡＧＴＣＣＡＧＡＣＧＣＡＧＧＡＴ－３’（配列番号１４））であった。
【0127】
図１Ｂで見られるように、ＲＴ－ＰＣＲによって、免疫組織化学分析を確認し、ヒトＣＲＣ腫瘍試料（Ｔ）では、同患者の明らかな影響を受けていない領域から採取した腫瘍周囲試料（Ｐ）と比較してＦＭＲＰ ｍＲＮＡが大幅にアップレギュレートされたことを認めた。
【0128】
ＦＭＲＰタンパク質発現
総タンパク質をヒト結腸組織から抽出し、緩衝液にて氷上で溶解した。当該緩衝液は、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ［ｐＨ７．９］、１０ｍＭのＫＣｌ、０．１ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、０．２ｍＭのエチレングリコール－ビス（β－アミノエチルエーテル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸（ＥＧＴＡ）および０．５％のＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０を含有し、１ｍＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ）、１０ｍｇ／ｍｌのアプロチニン、１０ｍｇ／ｍｌのロイペプチン、１ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）、１ｍＭのＮａ３ＶＯ４、および１ｍＭのＮａＦが補足されている。溶解物を遠心分離して清澄化し、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）－ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって分離した。ブロットを、ＦＭＲＰ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、マサチューセッツ州ダンバース）に対する抗体を用いてインキュベートし、その後、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（Ｄａｋｏ、イタリア、ミラノ）に結合させた二次抗体を用いてインキュベートした。分析後に、各ブロットを剥離し、マウス抗ヒトモノクローナルβ－アクチン抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いてインキュベートして、レーンの同等の負荷を確認した。
総タンパク質をヒト結腸組織から抽出し、緩衝液にて氷上で溶解した。当該緩衝液は、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ［ｐＨ７．９］、１０ｍＭのＫＣｌ、０．１ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、０．２ｍＭのエチレングリコール－ビス（β－アミノエチルエーテル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸（ＥＧＴＡ）および０．５％のＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０を含有し、１ｍＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ）、１０ｍｇ／ｍｌのアプロチニン、１０ｍｇ／ｍｌのロイペプチン、１ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）、１ｍＭのＮａ３ＶＯ４、および１ｍＭのＮａＦが補足されている。溶解物を遠心分離して清澄化し、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）－ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって分離した。ブロットを、ＦＭＲＰ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、マサチューセッツ州ダンバース）に対する抗体を用いてインキュベートし、その後、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（Ｄａｋｏ、イタリア、ミラノ）に結合させた二次抗体を用いてインキュベートした。分析後に、各ブロットを剥離し、マウス抗ヒトモノクローナルβ－アクチン抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いてインキュベートして、レーンの同等の負荷を確認した。
【0129】
図１Ｃおよび図１Ｄで見られるように、ウエスタンブロット解析によって、免疫組織化学を確認し、ＲＴ－ＰＣＲ解析によって、ヒトＣＲＣ腫瘍試料（Ｔ）では、同患者の明らかな影響を受けていない領域から採取した腫瘍周囲試料（Ｐ）と比較してＦＭＲＰタンパク質が大幅にアップレギュレートされたことを認めた。
【0130】
実施例２：ＦＭＲ１ノックアウトマウスは、アゾキシメタン誘導腫瘍形成に対して耐性を示す
ＣＲＣにおけるＦＭＲＰの役割を解明するために，アゾキシメタン（ＡＯＭ）によって誘導された散発性ＣＲＣのマウスモデルを使用した。この実施例では、ＡＯＭ誘導ＣＲＣモデルにおけるＦＭＲ１ノックアウトマウスの腫瘍耐性表現型について説明する。
ＣＲＣにおけるＦＭＲＰの役割を解明するために，アゾキシメタン（ＡＯＭ）によって誘導された散発性ＣＲＣのマウスモデルを使用した。この実施例では、ＡＯＭ誘導ＣＲＣモデルにおけるＦＭＲ１ノックアウトマウスの腫瘍耐性表現型について説明する。
【0131】
ＣＲＣのＡＯＭ誘導
野生型（ＷＴ）およびＦＭＲ１ノックアウト（ＫＯ）マウスに、アルキル化剤であるＡＯＭ（１０ｍｇ／ｋｇ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、イタリア、ミラノ）を５週間にわたり週１回腹腔内注射して、腫瘍形成を誘導した。マウスの腫瘍形成をモニタリングし、高解像度内視鏡システムを使用して内視鏡検査によってスクリーニングし、その７日後に屠殺した。２２週目に子宮頸部脱臼によってマウスを屠殺し、解析のために結腸組織を回収した。
野生型（ＷＴ）およびＦＭＲ１ノックアウト（ＫＯ）マウスに、アルキル化剤であるＡＯＭ（１０ｍｇ／ｋｇ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、イタリア、ミラノ）を５週間にわたり週１回腹腔内注射して、腫瘍形成を誘導した。マウスの腫瘍形成をモニタリングし、高解像度内視鏡システムを使用して内視鏡検査によってスクリーニングし、その７日後に屠殺した。２２週目に子宮頸部脱臼によってマウスを屠殺し、解析のために結腸組織を回収した。
【0132】
高解像度マウス内視鏡システムを使用して結腸内視鏡検査を盲検的に実施し、腫瘍形成をモニタリングした。２１週目に実施した内視鏡検査中に腫瘍を検出した。処置終了後に、腫瘍を計数して結腸病変の総数を求めた。全ての腫瘍をそのサイズに基づいて評価し、Ｂｅｃｋｅｒ Ｃ． ｅｔ ａｌ．， Ｇｕｔ． ２００５；５４（７）：９５０－４．に記載のプロトコールを使用してスコアを付けた。当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。簡単に説明すると、腫瘍を、グレード１（非常に小さいが検出可能な腫瘍）、グレード２（結腸周囲の最大８分の１を覆う腫瘍）、グレード３（結腸周囲の最大４分の１を覆う腫瘍）、グレード４（結腸周囲の最大半分を覆う腫瘍）、およびグレード５（結腸周囲の半分を超えて覆う腫瘍）にグレード分けした。
【0133】
図２Ａおよび図２Ｂで見られるように、ＡＯＭで処置したＷＴマウスは複数の大きな腫瘍を発症したが、ＡＯＭで処置したＦＭＲ１ ＫＯマウスでは、腫瘍の数およびサイズは大幅に減少した。これらの結果は、２２週目に屠殺したマウスの腫瘍を直接評価することによって確認した（データは示さず）。図２Ｃに示されるように、ＡＯＭで処置したＷＴマウスでは、ＡＯＭで処置したＦＭＲ１ ＫＯ動物と比較して生存能力が２０％低下したことを示した。
【0134】
免疫組織化学
ヘマトキシリン・エオジン（Ｈ＆Ｅ）染色後に、ＷＴおよびＦＭＲ１ ＫＯマウスの腫瘍および腫瘍周囲領域から採取したマウス凍結切片に組織学分析を実施した。キシレンおよびエタノールを使用して結腸切片を脱パラフィンおよび脱水し、９８℃の恒温槽にあるｔｒｉｓ－ＥＤＴＡクエン酸緩衝液（ｐＨ７．８）で３０分間抗原の賦活化を行った（Ｄａｋｏ Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，グロストルプ，デンマーク）。ヒトＦＭＲＰに対するモノクローナル抗体（最終希釈１：５００、ＬｉｆｅＳｐａｎ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）を使用して免疫組織化学染色を実施し、室温で１時間インキュベートし、その後、３，３’ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を色原体として用いてビオチンフリーＨＲＰポリマー検出法を実施した（ＭＡＣＨ ４（商標） Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＨＲＰ－Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｋｉｔ、Ｂｉｏｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ、カリフォルニア州パチェコ）。切片は、ヘマトキシリンを用いて対比染色し、脱水してマウントした。以上に記載されるものと同一の免疫組織化学条件下であるが、一次抗体を精製マウス正常ＩｇＧ対照抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州ミネアポリス）に変えて、アイソタイプ対照ＩｇＧ染色切片を調製した。
ヘマトキシリン・エオジン（Ｈ＆Ｅ）染色後に、ＷＴおよびＦＭＲ１ ＫＯマウスの腫瘍および腫瘍周囲領域から採取したマウス凍結切片に組織学分析を実施した。キシレンおよびエタノールを使用して結腸切片を脱パラフィンおよび脱水し、９８℃の恒温槽にあるｔｒｉｓ－ＥＤＴＡクエン酸緩衝液（ｐＨ７．８）で３０分間抗原の賦活化を行った（Ｄａｋｏ Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，グロストルプ，デンマーク）。ヒトＦＭＲＰに対するモノクローナル抗体（最終希釈１：５００、ＬｉｆｅＳｐａｎ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）を使用して免疫組織化学染色を実施し、室温で１時間インキュベートし、その後、３，３’ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を色原体として用いてビオチンフリーＨＲＰポリマー検出法を実施した（ＭＡＣＨ ４（商標） Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＨＲＰ－Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｋｉｔ、Ｂｉｏｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ、カリフォルニア州パチェコ）。切片は、ヘマトキシリンを用いて対比染色し、脱水してマウントした。以上に記載されるものと同一の免疫組織化学条件下であるが、一次抗体を精製マウス正常ＩｇＧ対照抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州ミネアポリス）に変えて、アイソタイプ対照ＩｇＧ染色切片を調製した。
【0135】
ＡＯＭ処置を行わない場合、ＦＭＲＰ－ＫＯマウスの腸は正常であり、ＷＴマウスと比較して明らかな異常はなかった（データは示さず）。しかし、図２Ｄに示されるように、ＡＯＭ処置後２２週目に摘出した腫瘍は、ＷＴマウスでは広汎異形成を伴う腫瘍を発症していたのに対し、ＦＭＲ１ ＫＯ動物は異形成領域に隣接して正常な粘膜組織構築を維持していたことを認めた。
【0136】
ＦＭＲＰタンパク質発現
総タンパク質をマウス結腸組織から抽出し、緩衝液にて氷上で溶解した。当該緩衝液は、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ［ｐＨ７．９］、１０ｍＭのＫＣｌ、０．１ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、０．２ｍＭのエチレングリコール－ビス（β－アミノエチルエーテル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸（ＥＧＴＡ）および０．５％のＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０を含有し、１ｍＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ）、１０ｍｇ／ｍｌのアプロチニン、１０ｍｇ／ｍｌのロイペプチン、１ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）、１ｍＭのＮａ３ＶＯ４、および１ｍＭのＮａＦが補足されている。溶解物を遠心分離して清澄化し、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）－ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で分離した。ブロットを、ＦＭＲＰ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、マサチューセッツ州ダンバース）に対する抗体を用いてインキュベートし、その後、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（Ｄａｋｏ、イタリア、ミラノ）に結合させた二次抗体を用いてインキュベートした。分析後に、各ブロットを剥離し、マウス抗ヒトモノクローナルβ－アクチン抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いてインキュベートして、レーンの同等の負荷を確認した。
総タンパク質をマウス結腸組織から抽出し、緩衝液にて氷上で溶解した。当該緩衝液は、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ［ｐＨ７．９］、１０ｍＭのＫＣｌ、０．１ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、０．２ｍＭのエチレングリコール－ビス（β－アミノエチルエーテル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸（ＥＧＴＡ）および０．５％のＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０を含有し、１ｍＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ）、１０ｍｇ／ｍｌのアプロチニン、１０ｍｇ／ｍｌのロイペプチン、１ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）、１ｍＭのＮａ３ＶＯ４、および１ｍＭのＮａＦが補足されている。溶解物を遠心分離して清澄化し、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）－ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で分離した。ブロットを、ＦＭＲＰ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、マサチューセッツ州ダンバース）に対する抗体を用いてインキュベートし、その後、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（Ｄａｋｏ、イタリア、ミラノ）に結合させた二次抗体を用いてインキュベートした。分析後に、各ブロットを剥離し、マウス抗ヒトモノクローナルβ－アクチン抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いてインキュベートして、レーンの同等の負荷を確認した。
【0137】
図２Ｅに示されるように、ヒトＣＲＣ試料と一致して、ＡＯＭで処置したＷＴマウスの粘膜腫瘍（Ｔ）では、同動物の隣接している腫瘍周囲領域（Ｐ）と比較してＦＭＲＰタンパク質発現が増加した。
【0138】
ＴＵＮＥＬ染色およびＫｉ６７染色
ＦＭＲ１ ＫＯ動物で観察された腫瘍形成の減少が細胞死の増加によるのか、腫瘍細胞増殖の減少によるのかを求めるために、ＴＵＮＥＬ染色およびＫｉ６７による免疫組織化学染色を実施した。ＷＴおよびＦＭＲ１ ＫＯマウスから採取したマウス凍結切片では、ＴＵＮＥＬ法によるｉｎ ｓｉｔｕ細胞死検出キット（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して、製造業者の指示に従ってアポトーシス細胞を検出した。３－アミノ－９－エチルカルバゾールをクロモゲンとして使用し、切片はヘマトキシリンを用いて対比染色した。青紫色の背景に対して、アポトーシス細胞核が赤色染色構造として現れた。
ＦＭＲ１ ＫＯ動物で観察された腫瘍形成の減少が細胞死の増加によるのか、腫瘍細胞増殖の減少によるのかを求めるために、ＴＵＮＥＬ染色およびＫｉ６７による免疫組織化学染色を実施した。ＷＴおよびＦＭＲ１ ＫＯマウスから採取したマウス凍結切片では、ＴＵＮＥＬ法によるｉｎ ｓｉｔｕ細胞死検出キット（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して、製造業者の指示に従ってアポトーシス細胞を検出した。３－アミノ－９－エチルカルバゾールをクロモゲンとして使用し、切片はヘマトキシリンを用いて対比染色した。青紫色の背景に対して、アポトーシス細胞核が赤色染色構造として現れた。
【0139】
免疫組織化学切片はまた、マウスＫｉ６７に対するマウスモノクローナル抗体（ｃｌｏｎｅ ＭＩＢ－５、最終希釈１：１００、ＤａＫｏ、Ａｇｉｌｅｎｔ、アメリカ合衆国、カリフォルニア州サンタクララ）を用いて、室温で３０分間インキュベートし、その後、３，３’ジアミノベンジジンを色原体（ＤａＫｏ、Ａｇｉｌｅｎｔ）として用いてビオチンフリーＨＲＰポリマー検出法を実施した（Ｕｌｔｒａｖｉｓｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、アメリカ合衆国、マサチューセッツ州ウォルサム）。切片は、ヘマトキシリンを用いて対比染色し、脱水してマウントした。
【0140】
図２Ｆに示されるように、ＴＵＮＥＬ染色により、ＴＵＮＥＬ染色は、ＡＯＭで処置したＦＭＲ１ ＫＯマウスでは、ＡＯＭを処置したＷＴ動物と比較してＤＮＡ断片化レベルが上昇したことを示したことが明らかになった。しかし、図２Ｇで見られるように、Ｋｉ６７陽性細胞の数において差は観察されなかった。これらの結果は併せて、ＦＭＲＰが腫瘍の細胞死耐性の増加に関連していることを示唆している。
【0141】
実施例３：ＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＣＲＣ細胞株において細胞死を誘導する
ＦＭＲＰがＣＲＣの生存にいかに影響を及ぼすかを求めるために、ヒトＣＲＣ上皮細胞株において細胞死を特異的ＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置した。この実施例では、ＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドが、アポトーシスに依存しない機構を介してＣＲＣ細胞株において細胞死を誘導してもよいことを実証する。
ＦＭＲＰがＣＲＣの生存にいかに影響を及ぼすかを求めるために、ヒトＣＲＣ上皮細胞株において細胞死を特異的ＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置した。この実施例では、ＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドが、アポトーシスに依存しない機構を介してＣＲＣ細胞株において細胞死を誘導してもよいことを実証する。
【0142】
大腸癌細胞培養物におけるＦＭＲＰ発現
ヒトＣＲＣ細胞株であるＤＬＤ－１およびＨＣＴ－１１６は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ、バージニア州マナサス）から入手し、ＲＰＭＩ１６４０（ＤＬＤ－１）およびマッコイ５Ａ（ＨＣＴ－１１６）培地でそれぞれ培養した。全ての培地に、１０％のウシ胎児血清、１％のペニシリン／ストレプトマイシン（両方ともＬｏｎｚａ、ベルギー、ヴェルヴィエから入手）を補足した。ヒト正常結腸上皮細胞株（ＨＣＥＣ－１ｃｔ）は、ＥＶＥＲＣＹＴＥ ＧｍｂＨ（オーストリア、ウィーン）から入手し、ＣｏｌｏＵｐ（登録商標）培地（ＥＶＥＲＣＹＴＥ ＧｍｂＨ）で培養した。細胞は、３７℃、５％ＣＯ２の十分に加湿したインキュベーターで維持した。細胞株溶解物を調製し、実施例２に先に記載されるような方法を使用して、ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動法／免疫ブロット法によって分析した。免疫蛍光染色のために、細胞株を３．７％のホルムアルデヒドを用いて、４℃で１０分間固定し、０．１％のトリトンを用いて、室温で１０分間透過処理し、室温で１時間ブロッキングした（１％のウシ血清アルブミン、０．１％のＴｗｅｅｎ、２％のグリシン）。固定し、ブロッキングした細胞を、抗ＦＭＲＰモノクローナル抗体（１：５００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、マサチューセッツ州ダンバース）を用いて、４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳを用いて洗浄した後に、二次抗体であるヤギ抗ウサギＡｌｅｘａ４８８（１：２０００、Ａ１１００８、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を室温で１時間適用した。スライドは、ＰＢＳを用いて洗浄し、４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドールを含むＰｒｏｌｏｎｇ ｇｏｌｄ（登録商標）退色防止試薬（Ｐ３６９３１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してマウントして、Ｌｅｉｃａ ＤＭＩ４０００ Ｂ顕微鏡によってＬｅｉｃａ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｓｕｉｔｅソフトウェア（Ｖ４．６．２）を用いて分析した。
ヒトＣＲＣ細胞株であるＤＬＤ－１およびＨＣＴ－１１６は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ、バージニア州マナサス）から入手し、ＲＰＭＩ１６４０（ＤＬＤ－１）およびマッコイ５Ａ（ＨＣＴ－１１６）培地でそれぞれ培養した。全ての培地に、１０％のウシ胎児血清、１％のペニシリン／ストレプトマイシン（両方ともＬｏｎｚａ、ベルギー、ヴェルヴィエから入手）を補足した。ヒト正常結腸上皮細胞株（ＨＣＥＣ－１ｃｔ）は、ＥＶＥＲＣＹＴＥ ＧｍｂＨ（オーストリア、ウィーン）から入手し、ＣｏｌｏＵｐ（登録商標）培地（ＥＶＥＲＣＹＴＥ ＧｍｂＨ）で培養した。細胞は、３７℃、５％ＣＯ２の十分に加湿したインキュベーターで維持した。細胞株溶解物を調製し、実施例２に先に記載されるような方法を使用して、ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動法／免疫ブロット法によって分析した。免疫蛍光染色のために、細胞株を３．７％のホルムアルデヒドを用いて、４℃で１０分間固定し、０．１％のトリトンを用いて、室温で１０分間透過処理し、室温で１時間ブロッキングした（１％のウシ血清アルブミン、０．１％のＴｗｅｅｎ、２％のグリシン）。固定し、ブロッキングした細胞を、抗ＦＭＲＰモノクローナル抗体（１：５００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、マサチューセッツ州ダンバース）を用いて、４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳを用いて洗浄した後に、二次抗体であるヤギ抗ウサギＡｌｅｘａ４８８（１：２０００、Ａ１１００８、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を室温で１時間適用した。スライドは、ＰＢＳを用いて洗浄し、４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドールを含むＰｒｏｌｏｎｇ ｇｏｌｄ（登録商標）退色防止試薬（Ｐ３６９３１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してマウントして、Ｌｅｉｃａ ＤＭＩ４０００ Ｂ顕微鏡によってＬｅｉｃａ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｓｕｉｔｅソフトウェア（Ｖ４．６．２）を用いて分析した。
【0143】
【0144】
大腸癌細胞培養物におけるＦＭＲＰノックダウン
ヒトＦＭＲＰと相補的であるホスホロチオエート一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド［５’－ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣＣＡＴ－３’（配列番号６）］、および一本鎖センスオリゴヌクレオチド ［５’－ＡＴＧＧＡＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡ－３’（配列番号１５）］ を合成した。ＣＲＣ細胞株およびＨＣＥＣ－１ｃｔ細胞は、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地およびｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、アメリカ合衆国、マサチューセッツ州ウォルサム）を使用して、製造業者の指示に従って、ＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳ）（最終濃度０．５～１００ｎＭ）またはＦＭＲＰセンスオリゴヌクレオチド（Ｓ）（最終濃度１００ｎＭ）のどちらかを用いて、２４時間および４８時間トランスフェクトした。
ヒトＦＭＲＰと相補的であるホスホロチオエート一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド［５’－ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣＣＡＴ－３’（配列番号６）］、および一本鎖センスオリゴヌクレオチド ［５’－ＡＴＧＧＡＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡ－３’（配列番号１５）］ を合成した。ＣＲＣ細胞株およびＨＣＥＣ－１ｃｔ細胞は、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地およびｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、アメリカ合衆国、マサチューセッツ州ウォルサム）を使用して、製造業者の指示に従って、ＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳ）（最終濃度０．５～１００ｎＭ）またはＦＭＲＰセンスオリゴヌクレオチド（Ｓ）（最終濃度１００ｎＭ）のどちらかを用いて、２４時間および４８時間トランスフェクトした。
【0145】
図３Ｄ、図３Ｇおよび図３Ｉで見られるように、ＤＬＤ－１細胞（図３Ｃ）、ＨＣＴ－１１６細胞（図３Ｇ）およびＨＣＥＣ－１ｃｔ細胞（図３Ｉ）をＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳ）で処置することによって、ＦＭＲＰ発現が大幅に阻害されたが、センスオリゴヌクレオチドで処置した細胞では、大幅な阻害は観察されなかった。
【0146】
ＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置した細胞における細胞死。
細胞は、ＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳ）（最終濃度０．５ｎＭおよび１００ｎＭ）またはＦＭＲＰセンスオリゴヌクレオチド（Ｓ）（最終濃度１００ｎＭ）のどちらかを用いてトランスフェクトした。２４時間後（図３Ｅ、図３Ｆ、図３Ｊおよび図３Ｋ）または４８時間後（図３Ｈ）に、細胞を回収し、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ（ＡＶ）緩衝液で２回洗浄し、ＦＩＴＣ－ＡｎｎｅｘｉｎＶ（最終希釈１：１ ０ ０、Ｉｍｍｕｎｏｔｏｏｌｓ、ドイツ、フリーゾイテ）を用いて、製造業者の指示に従って染色し、５ｍｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を用いて、４℃で３０分間インキュベートした。細胞はまた、ＦＭＲＰセンスオリゴヌクレオチドまたはＦＭＲＰ ＡＳオリゴヌクレオチド（最終濃度１００ｎＭ）のどちらかを用いて、３６時間トランスフェクトし、カスパーゼ３およびカスパーゼ８が活性化されるかを分析した。陽性対照および陰性対照として、細胞は、それぞれ、スタウロスポリン（最終濃度１μＭ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、イタリア、ミラノ）またはＱ－ＶＤ－ＯＰｈ（汎カスパーゼ阻害剤、最終濃度１μＭ）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ、ミネソタ州ミネアポリス）で処置した。さらに、トランスフェクトした３６時間後（図４Ｆおよび図４Ｇ）または４８時間後（図４Ｄおよび図４Ｅ）、細胞に１０Ｍのブロモデオキシウリジンを６０分間パルスし、７０％の冷エタノールで固定し、－２０℃で少なくとも３時間保存した。次いで、細胞は、２ＭのＨｃｌで変性させ、抗ブロモデオキシウリジンモノクローナル抗体（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ、フランス、マルセイユ）を用いて染色し、その後、フルオレセインイソチオシアネート結合二次抗マウス免疫グロブリンＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、イタリア、ミラノ）および１００ｇ／ｍｌのＰＩを用いて染色した。蛍光を、Ｇａｌｌｉｏｓ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ （Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、アメリカ合衆国、カリフォルニア州パサデナ） を使用して測定し、Ｋａｌｕｚａソフトウェア（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して分析した。生存細胞はＡＶ－／ＰＩ－細胞とみなした。
細胞は、ＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳ）（最終濃度０．５ｎＭおよび１００ｎＭ）またはＦＭＲＰセンスオリゴヌクレオチド（Ｓ）（最終濃度１００ｎＭ）のどちらかを用いてトランスフェクトした。２４時間後（図３Ｅ、図３Ｆ、図３Ｊおよび図３Ｋ）または４８時間後（図３Ｈ）に、細胞を回収し、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ（ＡＶ）緩衝液で２回洗浄し、ＦＩＴＣ－ＡｎｎｅｘｉｎＶ（最終希釈１：１ ０ ０、Ｉｍｍｕｎｏｔｏｏｌｓ、ドイツ、フリーゾイテ）を用いて、製造業者の指示に従って染色し、５ｍｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を用いて、４℃で３０分間インキュベートした。細胞はまた、ＦＭＲＰセンスオリゴヌクレオチドまたはＦＭＲＰ ＡＳオリゴヌクレオチド（最終濃度１００ｎＭ）のどちらかを用いて、３６時間トランスフェクトし、カスパーゼ３およびカスパーゼ８が活性化されるかを分析した。陽性対照および陰性対照として、細胞は、それぞれ、スタウロスポリン（最終濃度１μＭ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、イタリア、ミラノ）またはＱ－ＶＤ－ＯＰｈ（汎カスパーゼ阻害剤、最終濃度１μＭ）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ、ミネソタ州ミネアポリス）で処置した。さらに、トランスフェクトした３６時間後（図４Ｆおよび図４Ｇ）または４８時間後（図４Ｄおよび図４Ｅ）、細胞に１０Ｍのブロモデオキシウリジンを６０分間パルスし、７０％の冷エタノールで固定し、－２０℃で少なくとも３時間保存した。次いで、細胞は、２ＭのＨｃｌで変性させ、抗ブロモデオキシウリジンモノクローナル抗体（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ、フランス、マルセイユ）を用いて染色し、その後、フルオレセインイソチオシアネート結合二次抗マウス免疫グロブリンＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、イタリア、ミラノ）および１００ｇ／ｍｌのＰＩを用いて染色した。蛍光を、Ｇａｌｌｉｏｓ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ （Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、アメリカ合衆国、カリフォルニア州パサデナ） を使用して測定し、Ｋａｌｕｚａソフトウェア（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して分析した。生存細胞はＡＶ－／ＰＩ－細胞とみなした。
【0147】
図３Ｅおよび図３Ｆに示されるように、ＤＬＤ－１細胞をＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置することで、ＡｎｎｅｘｉｎＶ＋またはＡｎｎｅｘｉｎＶ＋ＰＩ＋の細胞数の増加をもたらしたが、これは、これらのＣＲＣ細胞が自発的アポトーシスまたはネクロトーシスを起こしていたことを示している。しかし、図３Ｈ、図３Ｊおよび図３Ｋに示されるように、ＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置したＨＣＴ－１１６細胞およびＨＣＲＣ－１ｃｔ細胞は共に、ＡｎｎｅｘｉｎＶ＋またはＡｎｎｅｘｉｎＶ＋ＰＩ＋の細胞数の増加を示すことはなかった。細胞株にトランスフェクトした特異的ＦＭＲＰ ｓｉＲＮＡを使用して、同様の結果が観察された（データは示さず）。
【0148】
ＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導性細胞死の機構を解明するために、プロアポトーシスであるカスパーゼ８およびカスパーゼ３の活性化に対するＦＭＲＰノックダウンの効果を分析した。図４Ａおよび図４Ｂに示されるように、ＣＲＣ細胞をＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置することで、活性化カスパーゼ３陽性細胞の割合または活性化カスパーゼ８陽性細胞の割合を変化させることはなかった。想定されるように、スタウロスポリン（Ｓｔａｕｒｏ）は、活性化カスパーゼ３陽性細胞の割合を大幅に増加させた。
【0149】
図４Ｃで見られるように、細胞を汎カスパーゼ阻害剤（Ｑ－ＶＤ－ＯＰｈ、Ｃａｓ ｉｎ）で前処理することで、ＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導細胞死を変化させることはなかった。さらに、ＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導細胞死が、細胞の増殖停止に続発したものかを確認するために、ＤＬＤ－１細胞株における細胞周期進行を分析した。図４Ｄ～図４Ｇに示されるように、ＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞死を誘導する前のＧ２／Ｍ期、Ｓ期、またはＧ０／Ｇ１期の細胞周期相において細胞の相対的割合に影響を及ぼすことはなかった。これらの発見を合わせると、ＦＭＲＰは、細胞周期に影響を及ぼすことがない、アポトーシスに依存しない経路を介してＣＲＣ細胞死に影響することを示唆している。
【0150】
実施例４：ＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ネクロトーシスを誘導する
癌細胞は、プログラム細胞死を免れるために様々な機構を展開させてきた。ネクロトーシスは、制御された、カスパーゼに依存しない細胞死経路であり、アポトーシス耐性細胞を排除するための代替機構である。この実施例では、ＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドが、ネクロトーシス経路の活性化を介してＣＲＣ細胞において細胞死を誘導することを実証する。
癌細胞は、プログラム細胞死を免れるために様々な機構を展開させてきた。ネクロトーシスは、制御された、カスパーゼに依存しない細胞死経路であり、アポトーシス耐性細胞を排除するための代替機構である。この実施例では、ＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドが、ネクロトーシス経路の活性化を介してＣＲＣ細胞において細胞死を誘導することを実証する。
【0151】
ＦＭＲＰは、ネクロトーシス経路に関連したｍＲＮＡに関連する
ヒトＣＲＣ試料およびＣＲＣ細胞株からのＦＭＲＰを、それに関連したＲＮＡと共に、ＦＭＲＰ特異的抗体（図５Ａ）を使用して免疫沈降させ、リアルタイムＰＣＲによって結合転写物を識別した。陰性対照としてβ－アクチンを使用し、陽性対照としてＥ－カドヘリンおよびビメンチンを使用した。図５Ｂおよび図５Ｃに示されるように、ＲＩＰＫ３ ｍＲＮＡは、ヒトＣＲＣ試料またはＣＲＣ細胞株のＦＭＲＰと共免疫沈降しない。一方、ＲＩＰＫ１ ｍＲＮＡは、ＩｇＧアイソタイプ対照と比較して、大幅なレベルでＦＭＲＰと共免疫沈降した。
ヒトＣＲＣ試料およびＣＲＣ細胞株からのＦＭＲＰを、それに関連したＲＮＡと共に、ＦＭＲＰ特異的抗体（図５Ａ）を使用して免疫沈降させ、リアルタイムＰＣＲによって結合転写物を識別した。陰性対照としてβ－アクチンを使用し、陽性対照としてＥ－カドヘリンおよびビメンチンを使用した。図５Ｂおよび図５Ｃに示されるように、ＲＩＰＫ３ ｍＲＮＡは、ヒトＣＲＣ試料またはＣＲＣ細胞株のＦＭＲＰと共免疫沈降しない。一方、ＲＩＰＫ１ ｍＲＮＡは、ＩｇＧアイソタイプ対照と比較して、大幅なレベルでＦＭＲＰと共免疫沈降した。
【0152】
ＦＭＲＰがネクロトーシス経路の構成成分に関連していることを確認するために、細胞を処理しないままにするか、あるいはＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチド（最終濃度０．５ｎＭおよび１００ｎＭ）またはＦＭＲＰセンスオリゴヌクレオチド（最終濃度１００ｎＭ）のどちらかを用いてトランスフェクトし、ｐＭＬＫＬ阻害剤（スルホンアミド、ＮＳＡ、最終濃度１μＭ）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）またはｐＲＩＰＫ１阻害剤（ネクロスタチン１、ＮＥＣ１、最終濃度１０μＭ）（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、アメリカ合衆国、ミシガン州アナーバー）を用いてインキュベートした。２４時間後に、細胞を回収し、実施例１～３に先に記載されるように、ウエスタンブロットによって分析するか、あるいはＦＩＴＣ－Ａｎｎｅｘｉｎ ＶおよびＰＩを用いて染色し、フローサイトメトリーで分析した。
【0153】
図６Ａ～図６Ｄに示されるように、ＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置することで、ヒトＣＲＣ細胞株においてＲＩＰＫ１の総タンパク質発現レベルを増加させた。ＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置することで、さらに、ＲＩＰＫ１、ＲＩＰＫ３およびＭＬＫＬのリン酸化の増加をもたらした。しかし、図６Ｇで見られるように、ＦＭＲＰアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置したＨＣＥＣ－１ｃｔ細胞では、同様のリン酸化の増加は観察されなかった。
【0154】
図６Ｅおよび図６Ｆに示されるように、ＲＩＰＫ１特異的阻害剤、ネクロスタチン１（ＮＥＣ１）、およびＭＬＫＬ特異的阻害剤、ネクロスルホンアミド（ＮＳＡ）を用いてインキュベートしたヒトＣＲＣ細胞株は、ＦＭＲＰアンチセン誘導細胞死から保護されていた。これらの結果は併せて、ＦＭＲＰがＲＩＰＫ１シグナル伝達カスケードを阻害し、それによって、ネクロトーシスを抑制することによって、ＣＲＣ細胞においてネクロトーシスを抑止することを示唆している。
【0155】
実施例５：ＦＭＲＰ発現は、ＣＲＥＢによって制御される
例えば、ｍＴＯＲおよびＭＡＰＫなどのいくつかの細胞内タンパク質キナーゼ、ならびに、例えば、ＣＲＥＢなどの転写因子は、ＦＭＲＰ発現を正に制御することが報告されている。この実施例では、ＦＭＲＰ発現がＣＲＥＢ転写因子によって正に制御されることを実証する。
例えば、ｍＴＯＲおよびＭＡＰＫなどのいくつかの細胞内タンパク質キナーゼ、ならびに、例えば、ＣＲＥＢなどの転写因子は、ＦＭＲＰ発現を正に制御することが報告されている。この実施例では、ＦＭＲＰ発現がＣＲＥＢ転写因子によって正に制御されることを実証する。
【0156】
ＣＲＥＢ ｍＲＮＡ発現およびタンパク質発現
ＣＲＥＢがＦＭＲＰ発現を制御するかを評価するために、ＣＲＣ細胞株を、ＣＲＥＢアンチセンス（ＡＳｃ）（５’－ＧＣＡＴＣＴＣＣＡＣＴＣＴＧＣＴＧＧＴＴ－３’）（配列番号１６）またはＣＲＥＢセンス（Ｓｓ）（５’－ＡＡＣＣＡＧＣＡＧＡＧＴＧＧＡＧＡＴＧＣ－３’）（配列番号１７）（最終濃度２００ｎＭ）のどちらかを用いて、２４時間または４８時間トランスフェクトした。ｍＲＮＡおよび総タンパク質溶解物を調製し、実施例１～３に先に記載されるように、ＲＴ－ＰＣＲおよびウエスタンブロットによってそれぞれ分析した。
ＣＲＥＢがＦＭＲＰ発現を制御するかを評価するために、ＣＲＣ細胞株を、ＣＲＥＢアンチセンス（ＡＳｃ）（５’－ＧＣＡＴＣＴＣＣＡＣＴＣＴＧＣＴＧＧＴＴ－３’）（配列番号１６）またはＣＲＥＢセンス（Ｓｓ）（５’－ＡＡＣＣＡＧＣＡＧＡＧＴＧＧＡＧＡＴＧＣ－３’）（配列番号１７）（最終濃度２００ｎＭ）のどちらかを用いて、２４時間または４８時間トランスフェクトした。ｍＲＮＡおよび総タンパク質溶解物を調製し、実施例１～３に先に記載されるように、ＲＴ－ＰＣＲおよびウエスタンブロットによってそれぞれ分析した。
【0157】
図７Ａに示すように、ヒトＣＲＣ腫瘍（Ｔ）は、腫瘍周囲試料（Ｐ）のレベルと比較して大幅に高いレベルのＣＲＥＢ ｍＲＮＡ転写物を有していた。同様に、図７Ｂおよび図７Ｃに示されるように、ヒトＣＲＣ腫瘍（Ｔ）では、腫瘍周囲組織試料（Ｐ）と比較してＣＲＥＢタンパク質発現が大幅に高い。
【0158】
ＣＲＥＢがＣＲＣ細胞株においてＦＭＲＰ発現を制御するかを調べるために、特異的ＡＳオリゴヌクレオチドを使用してＣＲＥＢ発現を阻害した。図７Ｄ～図７Ｆに示されるように、ＣＲＥＢアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置したヒトＣＲＣ細胞株は、無処置の細胞またはセンスオリゴヌクレオチド対照で処置した細胞と比較してＣＲＥＢタンパク質発現を低下させた。さらに，ＣＲＥＢアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置することで，付随して、ＦＭＲＰタンパク質発現の低下をもたらした。これらの発見は、ヒトＣＲＣでは、ＣＲＥＢがＦＭＲＰ発現を正に制御することを示唆している。
【0159】
実施例６：ＦＭＲＰレベルは、ＣＲＣ遊走およびＣＲＣ浸潤に影響する
ＣＲＣ遊走およびＣＲＣ浸潤におけるＦＭＲＰの役割を調べるために、創傷閉鎖および細胞浸潤のｉｎ ｖｉｔｒｏモデルを使用した。この実施例では、ＦＭＲＰが、Ｅ－カドヘリン、β－カテニン、および大腸癌変異遺伝子（ｍｕｔａｔｅｄ ｉｎ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ）（ＭＣＣ）を含む、細胞遊走および細胞浸潤に関連したタンパク質を制御することを説明する。ＭＣＣは、大腸癌において、特に、リンパ節転移が増加した患者において、その遺伝子がプロモーターのメチル化によってサイレンシングされる腫瘍抑制因である。
ＣＲＣ遊走およびＣＲＣ浸潤におけるＦＭＲＰの役割を調べるために、創傷閉鎖および細胞浸潤のｉｎ ｖｉｔｒｏモデルを使用した。この実施例では、ＦＭＲＰが、Ｅ－カドヘリン、β－カテニン、および大腸癌変異遺伝子（ｍｕｔａｔｅｄ ｉｎ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ）（ＭＣＣ）を含む、細胞遊走および細胞浸潤に関連したタンパク質を制御することを説明する。ＭＣＣは、大腸癌において、特に、リンパ節転移が増加した患者において、その遺伝子がプロモーターのメチル化によってサイレンシングされる腫瘍抑制因である。
【0160】
ＦＭＲＰレベルは、Ｅ－カドヘリンおよびβ－カテニンを制御することによってＣＲＣ細胞遊走およびＣＲＣ細胞浸潤に影響を及ぼす
腫瘍細胞遊走および腫瘍細胞浸潤におけるＦＭＲＰの役割を調べるために、ＨＣＴ－１１６細胞をｉｂｉｄｉ（登録商標）製のカルチャーインサートの各側に播種し、コンフルエントまで増殖させ、次いで、細胞を処理しないままにするか（Ｕ）、あるいはセンスＦＭＲＰオリゴヌクレオチド（Ｓ）（最終濃度０．５ｎＭ）またはアンチセンスＦＭＲＰオリゴヌクレオチド（ＡＳ）（最終濃度０．５ｎＭ）を用いてトランスフェクトした。さらに、ＨＣＴ－１１６細胞を、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）を事前にコーティングしたＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）製のインサートに播種し、細胞を処置しないままにするか（Ｕ）、あるいはセンスＦＭＲＰオリゴヌクレオチド（Ｓ）（最終濃度１００ｎＭ）またはアンチセンスＦＭＲＰオリゴヌクレオチド（ＡＳ）（最終濃度０．５ｎＭ）を用いて、４８時間トランスフェクトするかのどちらかとした。
腫瘍細胞遊走および腫瘍細胞浸潤におけるＦＭＲＰの役割を調べるために、ＨＣＴ－１１６細胞をｉｂｉｄｉ（登録商標）製のカルチャーインサートの各側に播種し、コンフルエントまで増殖させ、次いで、細胞を処理しないままにするか（Ｕ）、あるいはセンスＦＭＲＰオリゴヌクレオチド（Ｓ）（最終濃度０．５ｎＭ）またはアンチセンスＦＭＲＰオリゴヌクレオチド（ＡＳ）（最終濃度０．５ｎＭ）を用いてトランスフェクトした。さらに、ＨＣＴ－１１６細胞を、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）を事前にコーティングしたＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）製のインサートに播種し、細胞を処置しないままにするか（Ｕ）、あるいはセンスＦＭＲＰオリゴヌクレオチド（Ｓ）（最終濃度１００ｎＭ）またはアンチセンスＦＭＲＰオリゴヌクレオチド（ＡＳ）（最終濃度０．５ｎＭ）を用いて、４８時間トランスフェクトするかのどちらかとした。
【0161】
図８Ａおよび図８Ｂで示されるように、ＨＣＴ－１１６細胞をアンチセンスＦＭＲＰオリゴヌクレオチドを用いてトランスフェクトすることで、無処置の細胞またはセンスオリゴヌクレオチドを用いてトランスフェクトした細胞と比較して疑似「創傷」を覆う細胞の割合を大幅に低下させた。グラフは、３つの別々の実験における細胞で覆われた面積の平均比率±標準偏差を示す。
【0162】
同様に、図８Ｃおよび図８Ｄに示されるように、アンチセンスＦＭＲＰオリゴヌクレオチドを用いてトランスフェクトしたＨＣＴ－１１６細胞は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）をコーティングしたＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）製のインサート全体にわたって、無処置の細胞またはセンスオリゴヌクレオチドを用いてトランスフェクトした細胞と比較して遊走を大幅に低下させたことを示した。グラフは、独立した３つの実験における遊走細胞の平均数±標準偏差を示す。
【0163】
ＦＭＲＰが、細胞接着、骨格再構築、ならびに、腫瘍遊走および腫瘍浸潤の阻害に関連した鍵となるタンパク質であるＥ－カドヘリンレベルおよび／またはβ－カテニンレベルを制御するかを求めるために、細胞を処置しないままにするか（Ｕ）、あるいはＦＭＲＰセンス（Ｓ）オリゴヌクレオチド（最終濃度０．５ｎＭ）またはＦＭＲＰアンチセンス（ＡＳ）オリゴヌクレオチド（最終濃度０．５ｎＭ）のどちらかを用いて、４８時間トランスフェクトした。
【0164】
図８Ｅ～図８Ｇで示されるように、ＨＣＴ－１１６細胞をアンチセンスＦＭＲＰオリゴヌクレオチドを用いてトランスフェクトすることで、無処置の細胞またはセンスオリゴヌクレオチドを用いてトランスフェクトした細胞と比較してＥ－カドヘリン発現およびβ－カテニン発現を大幅に増加させた。図８Ｆおよび図８Ｇは、値を任意の単位（ａ．ｕ．）で表しており、３つの別々の実験における平均±標準偏差を示す。
【0165】
ＦＭＲＰは、Ｅ－カドヘリン発現およびβ－カテニン発現を制御するタンパク質であるＭＣＣをダウンレギュレートする。
ＦＭＲＰが、Ｅ－カドヘリン／β－カテニン複合体と相互作用することが公知のタンパク質であるＭＣＣを制御するかを調べるために、ＨＣＴ－１１６細胞を処置しないままにするか（Ｕ）、あるいはセンスＦＭＲＰオリゴヌクレオチド（Ｓ）（最終濃度０．５ｎＭ）またはアンチセンスＦＭＲＰオリゴヌクレオチド（ＡＳ）（最終濃度０．５ｎＭ）を用いて、４８時間トランスフェクトした。
ＦＭＲＰが、Ｅ－カドヘリン／β－カテニン複合体と相互作用することが公知のタンパク質であるＭＣＣを制御するかを調べるために、ＨＣＴ－１１６細胞を処置しないままにするか（Ｕ）、あるいはセンスＦＭＲＰオリゴヌクレオチド（Ｓ）（最終濃度０．５ｎＭ）またはアンチセンスＦＭＲＰオリゴヌクレオチド（ＡＳ）（最終濃度０．５ｎＭ）を用いて、４８時間トランスフェクトした。
【0166】
図９Ａおよび図９Ｂに示されるように、アンチセンスＦＭＲＰオリゴヌクレオチドを用いてトランスフェクトしたＨＣＴ－１１６細胞は、無処置の細胞またはセンスＦＭＲＰオリゴヌクレオチドを用いてトランスフェクトした細胞と比較してＭＣＣ発現が大幅に増加したことを示した。
【0167】
最近の研究では、大腸細胞におけるＥ－カドヘリン／β－カテニン複合体を介した細胞間接着を制御する上でＭＣＣの新規な腫瘍抑制機能について説明している。アンチセンスＦＭＲＰオリゴヌクレオチドを用いてトランスフェクトしたＨＣＴ－１１６細胞において観察されたＥ－カドヘリン発現およびβ－カテニン発現の増加（例えば、図８Ｅ～図８Ｇ）は、ＭＣＣが媒介しているかを調べるために、細胞を処置しないままにするか（Ｕ）、あるいはセンスＦＭＲＰオリゴヌクレオチド（最終濃度０．５ｎＭ）もしくはアンチセンスＦＭＲＰオリゴヌクレオチド（最終濃度０．５ｎＭ）、および／または、対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ Ｃｔｒｌ）もしくはＭＣＣに特異的なｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ ＭＣＣ）を用いて、４８時間トランスフェクトした。
【0168】
代表的なウエスタンブロット（図９Ｃ）および対応する定量できる分析（図９Ｄおよび図９Ｅ）に示されるように、ｓｉＲＮＡ ＭＣＣが存在することで、アンチセンスＦＭＲＰオリゴヌクレオチド単独でトランスフェクトした細胞においてＥ－カドヘリン発現およびβ－カテニン発現のアップレギュレーションを抑止した。
【0169】
大腸細胞株遊走および大腸細胞株浸潤において観察された阻害は（例えば、図８Ａおよび図８Ｂ）、ＭＣＣがＥ－カドヘリン／β－カテニン複合体を制御する必要があるのかを調べるために、ＨＣＴ－１１６細胞をｉｂｉｄｉ（登録商標）製のカルチャーインサートの各側に播種し、コンフルエントまで増殖させ、次いで、細胞を処理しないままにするか（Ｕ）、あるいはセンスオリゴヌクレオチド（Ｓ）（最終濃度０．５ｎＭ）もしくはアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳ）（最終濃度０．５ｎＭ）、および／または、ｓｉＲＮＡ ＣｔｒｌもしくはｓｉＲＮＡ ＭＣＣを用いてトランスフェクトした。
【0170】
図９Ｆおよび図９Ｇに示されるように、ＭＣＣに特異的なｓｉＲＮＡが存在することで、大腸癌細胞株遊走および大腸癌細胞浸潤においてアンチセンスＦＭＲＰオリゴヌクレオチドを介した阻害を大幅に低下させた。これらのデータを合わせると、ＦＭＲＰは、ＭＣＣ／Ｅ－カドヘリン／β－カテニン複合体を制御することによって、結腸癌細胞における細胞間接着を調節することを示唆している。
【0171】
参照による組み込み
本明細書で引用される特許文献および科学論文のそれぞれの開示全体は、全ての目的のために参照により組み込まれる。
本明細書で引用される特許文献および科学論文のそれぞれの開示全体は、全ての目的のために参照により組み込まれる。
【0172】
等価物
本開示は、その本質的な特性から逸脱することなく他の特定の形態で具体化してもよい。したがって、前述の実施形態は、本明細書に記載される開示に限定するのではなく、例示的なものとみなされるべきである。本開示の範囲は、前述の説明ではなく添付の特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と同等の意味および範囲内に入る変更は全て特許請求の範囲に包含されるものとする。
本開示は、その本質的な特性から逸脱することなく他の特定の形態で具体化してもよい。したがって、前述の実施形態は、本明細書に記載される開示に限定するのではなく、例示的なものとみなされるべきである。本開示の範囲は、前述の説明ではなく添付の特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と同等の意味および範囲内に入る変更は全て特許請求の範囲に包含されるものとする。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図2E】
【図2F】
【図2G】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図3E】
【図3F】
【図3G】
【図3H】
【図3I】
【図3J】
【図3K】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図4E】
【図4F】
【図4G】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図6E】
【図6F】
【図6G】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図7D】
【図7E】
【図7F】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図8D】
【図8E】
【図8F】
【図8G】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図9D】
【図9E】
【図9F】
【図9G】
【配列表】
【国際調査報告】