特表 2022-521510 ホスホノアセテートギャップマー型オリゴヌクレオチド

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-04-08

(54)【発明の名称】ホスホノアセテートギャップマー型オリゴヌクレオチド

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/113 20100101AFI20220401BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20220401BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20220401BHJP

   A61K 31/712 20060101ALI20220401BHJP

   A61K 31/7125 20060101ALI20220401BHJP

【ＦＩ】

C12N15/113 Z ZNA

A61K48/00

A61P9/00

A61K31/712

A61K31/7125

【審査請求】未請求

【予備審査請求】有

(21)【出願番号】P 2021548662

(86)(22)【出願日】2020-02-20

(85)【翻訳文提出日】2021-10-04

(86)【国際出願番号】 EP2020054409

(87)【国際公開番号】W WO2020169695

(87)【国際公開日】2020-08-27

(31)【優先権主張番号】19158296.4

(32)【優先日】2019-02-20

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】515129320

【氏名又は名称】ロシュ イノベーション センター コペンハーゲン エーエス

(74)【代理人】

【識別番号】100102978

【弁理士】

【氏名又は名称】清水 初志

(74)【代理人】

【識別番号】100102118

【弁理士】

【氏名又は名称】春名 雅夫

(74)【代理人】

【識別番号】100160923

【弁理士】

【氏名又は名称】山口 裕孝

(74)【代理人】

【識別番号】100119507

【弁理士】

【氏名又は名称】刑部 俊

(74)【代理人】

【識別番号】100142929

【弁理士】

【氏名又は名称】井上 隆一

(74)【代理人】

【識別番号】100148699

【弁理士】

【氏名又は名称】佐藤 利光

(74)【代理人】

【識別番号】100128048

【弁理士】

【氏名又は名称】新見 浩一

(74)【代理人】

【識別番号】100129506

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 智彦

(74)【代理人】

【識別番号】100205707

【弁理士】

【氏名又は名称】小寺 秀紀

(74)【代理人】

【識別番号】100114340

【弁理士】

【氏名又は名称】大関 雅人

(74)【代理人】

【識別番号】100121072

【弁理士】

【氏名又は名称】川本 和弥

(72)【発明者】

【氏名】ブライヒャー コンラッド

(72)【発明者】

【氏名】バスティアン ジェシカ マリーヌ オーロール

【テーマコード（参考）】

4C084

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C084AA13

4C084NA14

4C084ZA36

4C086AA01

4C086AA02

4C086AA03

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA04

4C086NA14

4C086ZA36

(57)【要約】

本発明は、式（Ｉ）：

の少なくとも１つのジヌクレオシドを含む、一本鎖アンチセンスギャップマー型オリゴヌクレオチドであって、式中、（Ａ^１）、（Ａ^２）、およびＡは、本明細書および特許請求の範囲に記載した通りである、一本鎖アンチセンスギャップマー型オリゴヌクレオチドに関する。本発明に記載のオリゴヌクレオチドは、医薬として使用することができる。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

式（Ｉ）：

の少なくとも１つのジヌクレオシドを含む、一本鎖アンチセンスギャップマー型オリゴヌクレオチドまたはその薬学的に許容され得る塩であって、
式中、（Ａ^１）および（Ａ^２）の一方は糖修飾ヌクレオシドであり、他方は糖修飾ヌクレオシドまたはＤＮＡヌクレオシドであり、Ａは酸素または硫黄である、
一本鎖アンチセンスギャップマー型オリゴヌクレオチドまたはその薬学的に許容され得る塩。

【請求項2】

（Ａ^１）および（Ａ^２）の一方が糖修飾ヌクレオシドであり、他方がＤＮＡである、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。

【請求項3】

（Ａ^１）および（Ａ^２）が両方とも同時に糖修飾ヌクレオシドである、請求項１または２に記載のオリゴヌクレオチド。

【請求項4】

前記糖修飾ヌクレオシドが、独立して、２’糖修飾ヌクレオシドである、請求項１～３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。

【請求項5】

前記２’糖修飾ヌクレオシドが、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、特に２’－メトキシ－ＲＮＡ、２’－アルコキシアルコキシ－ＲＮＡ、特に２’－メトキシエトキシ－ＲＮＡ、２’－アミノ－ＤＮＡ、２’－フルオロ－ＲＮＡ、または２’－フルオロ－ＡＮＡから独立して選択される、請求項４に記載のオリゴヌクレオチド。

【請求項6】

前記２’糖修飾ヌクレオシドがＬＮＡヌクレオシドである、請求項４に記載のオリゴヌクレオチド。

【請求項7】

前記ＬＮＡヌクレオシドが、β－Ｄ－オキシＬＮＡ、６’－メチル－β－Ｄ－オキシＬＮＡ、およびＥＮＡから独立して選択され、特にβ－Ｄ－オキシＬＮＡである、請求項６に記載のオリゴヌクレオチド。

【請求項8】

ホスホジエステルヌクレオシド間結合、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合および請求項１に記載のヌクレオシド間結合から選択されるさらなるヌクレオシド間結合を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。

【請求項9】

ホスホロチオエートヌクレオシド間結合および請求項１に記載のヌクレオシド間結合から選択されるさらなるヌクレオシド間結合を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。

【請求項10】

１～１５個、特に１～５個、より詳細には１、２、３、４、または５個の、請求項１に記載の式（Ｉ）のジヌクレオシドを含む、請求項１～９のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。

【請求項11】

前記さらなるヌクレオシド間結合が、全て、式－Ｐ（＝Ｓ）（ＯＲ）Ｏ_２－のホスホロチオエートヌクレオシド間結合であり、式中、Ｒが水素またはリン酸保護基である、請求項１～１０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。

【請求項12】

ＤＮＡヌクレオシド、ＲＮＡヌクレオシド、および糖修飾ヌクレオシドから選択されるさらなるヌクレオシドを含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。

【請求項13】

１つまたは複数のヌクレオシドが、５－メチルシトシン核酸塩基を含むヌクレオシドなどの、核酸塩基修飾ヌクレオシドである、請求項１～１２のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。

【請求項14】

請求項１に記載の式（Ｉ）の少なくとも１つのジヌクレオシドが、前記アンチセンスギャップマー型オリゴヌクレオチドのフランキング領域中にあるか、または前記アンチセンスギャップマー型オリゴヌセオチドのギャップ領域とフランキング領域との間に位置する、請求項１～１３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。

【請求項15】

前記ギャップマー型オリゴヌクレオチドが、ＬＮＡギャップマー、混合ウイングギャップマー、または２’－置換ギャップマー、特に２’－Ｏ－メトキシエチルギャップマーである、請求項１～１４のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。

【請求項16】

前記アンチセンスギャップマー型オリゴヌクレオチドが、式５’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’－３’の連続するヌクレオチド配列を含み、式中、Ｇが、ＲＮａｓｅＨを動員することができる５～１８ヌクレオシドの領域であり、前記領域Ｇは、５’および３’がそれぞれフランキング領域ＦおよびＦ’によって隣接されており、領域ＦおよびＦ’が、独立して、１～７つの２’－糖修飾ヌクレオチドを含むかまたはそれからなり、領域Ｇに隣接する領域Ｆのヌクレオシドが２’－糖修飾ヌクレオシドであり、領域Ｇに隣接する領域Ｆ’のヌクレオシドが２’－糖修飾ヌクレオシドである、請求項１～１５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。

【請求項17】

請求項１に記載の式（Ｉ）の前記少なくとも１つのジヌクレオシドが、領域ＦもしくはＦ’中に、または領域Ｇと領域Ｆとの間に、または領域Ｇと領域Ｆ’との間に位置する、請求項１６に記載のオリゴヌクレオチド。

【請求項18】

領域Ｆもしくは領域Ｆ’、または領域ＦおよびＦ’の両方における前記２’－糖修飾ヌクレオシドが、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、特に２’－メトキシ－ＲＮＡ、２’－アルコキシアルコキシ－ＲＮＡ、特に２’－メトキシエトキシ－ＲＮＡ、２’－アミノ－ＤＮＡ、２’－フルオロ－ＲＮＡ、２’－フルオロ－ＡＮＡ、およびＬＮＡヌクレオシドから独立して選択される、請求項１６または１７に記載のオリゴヌクレオチド。

【請求項19】

領域Ｆもしくは領域Ｆ’、または領域ＦおよびＦ’の両方における全ての前記２’－糖修飾ヌクレオシドが、ＬＮＡヌクレオシドである、請求項１６～１８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。

【請求項20】

領域Ｆもしくは領域Ｆ’、または領域ＦおよびＦ’の両方が、少なくとも１つのＬＮＡヌクレオシドおよび少なくとも１つのＤＮＡヌクレオシドを含む、請求項１６～１９のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。

【請求項21】

領域Ｆもしくは領域Ｆ’、または領域ＦおよびＦ’の両方が、少なくとも１つのＬＮＡヌクレオシドおよび少なくとも１つの非ＬＮＡ２’－糖修飾ヌクレオシド、例えば少なくとも１つの２’－メトキシエトキシ－ＲＮＡヌクレオシドを含む、請求項１６～２０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。

【請求項22】

前記ギャップ領域Ｇが、５～１６個、特に８～１６個、より詳細には８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個の連続するＤＮＡヌクレオシドを含む、請求項１６～２１のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。

【請求項23】

領域Ｆおよび領域Ｆ’が、独立して、１、２、３、４、５、６、７、または８ヌクレオシド長である、請求項１６～２２のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。

【請求項24】

領域Ｆおよび領域Ｆ’が、それぞれ独立して、１、２、３、または４つのＬＮＡヌクレオシドを含む、請求項１６～２３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。

【請求項25】

前記ＬＮＡヌクレオシドが、β－Ｄ－オキシＬＮＡ、６’－メチル－β－Ｄ－オキシＬＮＡ、およびＥＮＡから独立して選択される、請求項１６～２４のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。

【請求項26】

前記ＬＮＡヌクレオシドがβ－Ｄ－オキシＬＮＡである、請求項１６～２５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。

【請求項27】

前記オリゴヌクレオチドまたはその連続するヌクレオチド配列（Ｆ－Ｇ－Ｆ’）が、１０～３０ヌクレオチド長、特に１２～２２、より詳細には１４～２０オリゴヌクレオチド長である、請求項１６～２６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。

【請求項28】

前記ギャップマー型オリゴヌクレオチドが、式５’－Ｄ’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’－Ｄ’’－３’の連続するヌクレオチド配列を含み、式中、Ｆ、Ｇ、およびＦ’は、請求項１７～２８のいずれか一項に記載の通りであり、領域Ｄ’およびＤ’’は、それぞれ独立して、０～５つのヌクレオチド、特に２、３、または４つのヌクレオチド、特にＤＮＡヌクレオチド、例えばホスホジエステル結合したＤＮＡヌクレオシドからなる、請求項１６～２７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。

【請求項29】

各フランキング領域ＦおよびＦ’が、独立して、１、２、３、４、５、６、または７つ、特に１つの、請求項１に記載のジヌクレオシドを含む、請求項１６～２８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。

【請求項30】

請求項１に記載のジヌクレオシドを合計で１つ含む、請求項１６～２９のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。

【請求項31】

請求項１に記載のジヌクレオシドが、領域Ｆ’中、または領域Ｇと領域Ｆ’との間に位置する、請求項３０に記載のアンチセンスギャップマー型オリゴヌクレオチド。

【請求項32】

前記オリゴヌクレオチドが、ヒトＲＮａｓｅＨ１を動員することができる、請求項１～３２のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。

【請求項33】

特にナトリウム、カリウム塩、またはアンモニウム塩である、請求項１～３２のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドの薬学的に許容され得る塩。

【請求項34】

請求項１～３３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドまたは薬学的に許容され得る塩と、
任意選択的にリンカー部分を介して、前記オリゴヌクレオチドまたは前記薬学的に許容され得る塩に共有結合した、少なくとも１つのコンジュゲート部分と
を含む、コンジュゲート。

【請求項35】

請求項１～３４のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド、薬学的に許容され得る塩、またはコンジュゲートと、治療的に不活性な担体とを含む、薬学的組成物。

【請求項36】

治療的に活性な物質としての使用のための、請求項１～３５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド、薬学的に許容され得る塩、またはコンジュゲート。

【請求項37】

本明細書に記述した通りの発明。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、特に、式（Ｉ）：

（式中、（Ａ^１）および（Ａ^２）の一方は糖修飾ヌクレオシドであり、他方は糖修飾ヌクレオシドまたはＤＮＡヌクレオシドであり、Ａは酸素または硫黄である）
の少なくとも１つのジヌクレオシドを含む、一本鎖アンチセンスギャップマー型オリゴヌクレオチドまたはその薬学的に許容され得る塩に関する。

【0002】

本発明はまた、特に、本発明に記載のアンチセンスギャップマー型オリゴヌクレオチドの調製に有用な新規のホスホロアミダイトに関する。

【背景技術】

【0003】

治療剤としての合成オリゴヌクレオチドは、近年著しい進歩を遂げており、ＲＮａｓｅＨ活性化ギャップマー、スプライススイッチングオリゴヌクレオチド、マイクロＲＮＡ阻害剤、ｓｉＲＮＡ、またはアプタマーを含む多様な機構によって作用する臨床的に検証された分子の幅広いポートフォリオをもたらしている（Ｓ．Ｔ．Ｃｒｏｏｋｅ編、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｄｒｕｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、第２版、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、ＦＬ：ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、２００８（非特許文献１））。天然オリゴヌクレオチドは、生体系における核酸分解に対して本質的に不安定である。さらに、それらは非常に好ましくない薬物動態学的挙動を示す。これらの欠点を改善するために、近年、多種多様な化学修飾が研究されている。ほぼ間違いなく、最も成功した修飾の１つは、非架橋リン酸の酸素原子の１個が硫黄原子で置き換えられたホスホロチオエート結合の導入である（Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２００９、１０、１１７～１２１（非特許文献２））。そのようなホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドは、タンパク質結合の増加、および核酸分解に対する明らかに高い安定性、したがってそれらの非修飾ホスホジエステルアナログよりも血漿、組織および細胞における十分に高い半減期を示す。これらの重要な特徴は、第一世代のオリゴヌクレオチド治療薬の開発を可能にし、ロックド核酸（ＬＮＡ）などの後の世代の修飾によるそれらのさらなる改善に道を拓いた。

【0004】

驚くべきことに、本発明に記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、耐性が高いことが見出された。これらは、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合のみを含む参照オリゴヌクレオチドとインビトロで少なくとも同程度に強力であり、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合のみを含む参照オリゴヌクレオチドよりもインビボで強力であった。驚くべきことに、本発明に記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、心臓細胞株（インビトロ）および心臓組織（インビボ）において特に強力であった。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】Ｓ．Ｔ．Ｃｒｏｏｋｅ編、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｄｒｕｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、第２版、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、ＦＬ：ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、２００８

【非特許文献2】Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２００９、１０、１１７～１２１

【図面の簡単な説明】

【0006】

【図1】図１は、ヒトＨｅＬａ細胞株におけるＭＡＬＡＴ１ ｍＲＮＡを標的とする本発明に記載のオリゴヌクレオチドの用量反応曲線を示す。

【図2】図２は、ヒトＡ５４９細胞株におけるＭＡＬＡＴ１ ｍＲＮＡを標的とする本発明に記載のオリゴヌクレオチドの用量反応曲線を示す。

【図3】図３は、ヒトＨｅＬａ細胞株におけるＨＩＦ１Ａ ｍＲＮＡを標的とする本発明に記載のオリゴヌクレオチドの用量反応曲線を示す。

【図4】図４は、ヒトＡ５４９細胞株におけるＨＩＦ１Ａ ｍＲＮＡを標的とする本発明に記載のオリゴヌクレオチドの用量反応曲線を示す。

【図5】図５は、マウス初代肝細胞におけるＡｐｏＢ ｍＲＮＡを標的とする本発明に記載のオリゴヌクレオチドの用量反応曲線を示す。

【図6】図６は、本発明に記載のオリゴヌクレオチドで処置した動物の心臓におけるＭａｌａｔ１ ｍＲＮＡレベルの量を示す。

【発明を実施するための形態】

【0007】

本明細書では、用語「アルキル」は、単独または組合せで、１～８個の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖アルキル基、特に１～６個の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖アルキル基、より詳細には１～４個の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖アルキル基を意味する。直鎖および分岐鎖Ｃ_１－Ｃ_８アルキル基の例は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、異性化ペンチル、異性化ヘキシル、異性化ヘプチルおよび異性化オクチル、特にメチル、エチル、プロピル、ブチルおよびペンチルである。アルキルの具体的な例は、メチル、エチル、およびプロピルである。

【0008】

用語「シクロアルキル」は、単独または組合せで、３～８個の炭素原子を有するシクロアルキル環、特に３～６個の炭素原子を有するシクロアルキル環を意味する。シクロアルキルの例は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、およびシクロオクチル、より詳細にはシクロプロピルおよびシクロブチルである。「シクロアルキル」の具体的な例は、シクロプロピルである。

【0009】

用語「アルコキシ」は、単独または組合せで、式アルキル－Ｏ－の基を意味し、ここで、用語「アルキル」は、前に付与した意味、例えばメトキシ、エトキシ、ｎ－プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ－ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ－ブトキシおよびｔｅｒｔ－ブトキシを意味する。具体的な「アルコキシ」は、メトキシおよびエトキシである。メトキシエトキシは、「アルコキシアルコキシ」の具体的な例である。

【0010】

用語「オキシ」は、単独または組合せで、－Ｏ－基を意味する。

【0011】

用語「アルケニル」は、単独または組合せで、オレフィン結合と、８個まで、好ましくは６個まで、特に好ましくは４個までの炭素原子とを含む直鎖または分岐炭化水素残基を意味する。アルケニル基の例は、エテニル、１－プロペニル、２－プロペニル、イソプロペニル、１－ブテニル、２－ブテニル、３－ブテニルおよびイソブテニルである。

【0012】

用語「アルキニル」は、単独または組合せで、三重結合と、８個まで、特に２個の炭素原子とを含む直鎖または分岐炭化水素残基を意味する。

【0013】

用語「ハロゲン」または「ハロ」は、単独または組合せで、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素、特にフッ素、塩素または臭素、より詳細にはフッ素を意味する。用語「ハロ」は、別の基と組み合わせて、少なくとも１個のハロゲン、特に１～５個のハロゲンで置換された、特に１～４個のハロゲン、すなわち１、２、３または４個のハロゲンで置換された前記基の置換を表す。

【0014】

用語「ハロアルキル」は、単独または組合せで、少なくとも１個のハロゲンで置換された、特に１～５個のハロゲンで置換された、特に１～３個のハロゲンで置換されたアルキル基を表す。ハロアルキルの例には、モノフルオロ－、ジフルオロ－またはトリフルオロ－メチル、－エチルまたは－プロピル、例えば３，３，３－トリフルオロプロピル、２－フルオロエチル、２，２，２－トリフルオロエチル、フルオロメチルまたはトリフルオロメチルが含まれる。フルオロメチル、ジフルオロメチルおよびトリフルオロメチルは、具体的な「ハロアルキル」である。

【0015】

用語「ハロシクロアルキル」は、単独または組合せで、少なくとも１個のハロゲンで置換された、特に１～５個のハロゲンで置換された、特に１～３個のハロゲンで置換された、上に定義したシクロアルキル基を表す。「ハロシクロアルキル」の具体的な例は、ハロシクロプロピル、特にフルオロシクロプロピル、ジフルオロシクロプロピルおよびトリフルオロシクロプロピルである。

【0016】

用語「ヒドロキシル」および「ヒドロキシ」は、単独または組合せで、－ＯＨ基を意味する。

【0017】

用語「チオヒドロキシル」および「チオヒドロキシ」は、単独または組合せで、－ＳＨ基を意味する。

【0018】

用語「カルボニル」は、単独または組合せで、－Ｃ（Ｏ）－基を意味する。

【0019】

用語「カルボキシ」または「カルボキシル」は、単独または組合せで、－ＣＯＯＨ基を意味する。

【0020】

用語「アミノ」は、単独または組合せで、第一級アミノ基（－ＮＨ_２）、第二級アミノ基（－ＮＨ－）、または第三級アミノ基（－Ｎ－）を意味する。

【0021】

用語「アルキルアミノ」は、単独または組合せで、１つまたは２つの上に定義したアルキル基で置換された、上に定義したアミノ基を意味する。

【0022】

用語「スルホニル」は、単独または組合せで、－ＳＯ_２基を意味する。

【0023】

用語「スルフィニル」は、単独または組合せで、－ＳＯ－基を意味する。

【0024】

用語「スルファニル」は、単独または組合せで、－Ｓ－基を意味する。

【0025】

用語「シアノ」は、単独または組合せで、－ＣＮ基を意味する。

【0026】

用語「アジド」は、単独または組合せで、－Ｎ_３基を意味する。

【0027】

用語「ニトロ」は、単独または組合せで、ＮＯ_２基を意味する。

【0028】

用語「ホルミル」は、単独または組合せで、－Ｃ（Ｏ）Ｈ基を意味する。

【0029】

用語「カルバモイル」は、単独または組合せで、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２基を意味する。

【0030】

用語「カバミド」は、単独または組合せで、－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ_２基を意味する。

【0031】

用語「アリール」は、単独または組合せで、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニルおよびホルミルから独立して選択される１～３つの置換基で任意に置換された６～１０個の炭素環原子を含む、一価の芳香族炭素環式単環または二環式環系を表す。アリールの例には、フェニルおよびナフチル、特にフェニルが含まれる。

【0032】

用語「ヘテロアリール」は、単独または組合せで、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１、２、３または４個のヘテロ原子を含み、残りの環原子は、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニルおよびホルミルから独立して選択される１～３つの置換基で任意に置換された炭素である、５～１２個の環原子の一価の芳香族複素環式単環または二環式環系を表す。ヘテロアリールの例には、ピロリル、フラニル、チエニル、イミダゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、トリアゾニル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、テトラゾリル、ピリジニル、ピラジニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピリミジニル、トリアジニル、アゼピニル、ジアゼピニル、イソオキサゾリル、ベンゾフラニル、イソチアゾリル、ベンゾチエニル、インドリル、イソインドリル、イソベンゾフラニル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾイソオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾイソチアゾリル、ベンゾオキサジアゾリル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾトリアゾリル、プリニル、キノリニル、イソキノリニル、キナゾリニル、キノキサリニル、カルバゾリルまたはアクリジニルが含まれる。

【0033】

用語「ヘテロシクリル」は、単独または組合せで、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１、２、３または４個の環ヘテロ原子を含み、残りの環原子は、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニルおよびホルミルから独立して選択される１～３つの置換基で任意に置換された炭素である、４～１２個、特に４～９個の環原子の一価の飽和または部分不飽和の単環式または二環式環系を意味する。単環式飽和ヘテロシクリルの例は、アゼチジニル、ピロリジニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロ－チエニル、ピラゾリジニル、イミダゾリジニル、オキサゾリジニル、イソオキサゾリジニル、チアゾリジニル、ピペリジニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、ピペラジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、１，１－ジオキソ－チオモルホリン－４－イル、アゼパニル、ジアゼパニル、ホモピペラジニル、またはオキサゼパニルである。二環式飽和ヘテロシクロアルキルの例は、８－アザ－ビシクロ［３．２．１］オクチル、キヌクリジニル、８－オキサ－３－アザ－ビシクロ［３．２．１］オクチル、９－アザ－ビシクロ［３．３．１］ノニル、３－オキサ－９－アザ－ビシクロ［３．３．１］ノニル、または３－チア－９－アザ－ビシクロ［３．３．１］ノニルである。部分不飽和ヘテロシクロアルキルの例は、ジヒドロフリル、イミダゾリニル、ジヒドロ－オキサゾリル、テトラヒドロ－ピリジニルまたはジヒドロピラニルである。

【0034】

用語「薬学的に許容され得る塩」は、生物学的にも別様にも望ましくないものではない、遊離塩基または遊離酸の生物学的有効性および特性を保持している塩を指す。塩は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸、特に塩酸、および酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、サリチル酸、Ｎ－アセチルシステインなどの有機酸で形成される。加えて、これらの塩は、無機塩基または有機塩基を遊離酸に添加することにより調製され得る。無機塩基に由来する塩には、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム塩が含まれるがこれらに限定されない。有機塩基に由来する塩には、第一級、第二級、および第三級アミン、天然に存在する置換アミンを含む置換アミン、環式アミンおよび塩基性イオン交換樹脂、例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、リジン、アルギニン、Ｎ－エチルピペリジン、ピペリジン、ポリアミン樹脂の塩が含まれるがこれらに限定されない。本発明のオリゴヌクレオチドは、双性イオンの形態で存在することもできる。本発明の特に好ましい薬学的に許容され得る塩は、ナトリウム、リチウム、カリウムおよびトリアルキルアンモニウム塩である。

【0035】

用語「保護基」は、単独または組合せで、化学反応が他の非保護の反応性部位で選択的に行われることができるように、多官能化合物の反応性部位を選択的にブロックする基を意味する。保護基を、除去することができる。例示的な保護基は、アミノ保護基、カルボキシ保護基またはヒドロキシ保護基である。

【0036】

「リン酸保護基」は、リン酸基の保護基である。リン酸保護基の例は、２－シアノエチルおよびメチルである。リン酸保護基の具体的な例は、２－シアノエチルである。

【0037】

「ヒドロキシル保護基」は、ヒドロキシル基の保護基であり、チオール基を保護するためにも使用される。ヒドロキシル保護基の例は、アセチル（Ａｃ）、ベンゾイル（Ｂｚ）、ベンジル（Ｂｎ）、β－メトキシエトキシメチルエーテル（ＭＥＭ）、ジメトキシトリチル（またはビス－（４－メトキシフェニル）フェニルメチル）（ＤＭＴ）、トリメトキシトリチル（またはトリス－（４－メトキシフェニル）フェニルメチル）（ＴＭＴ）、メトキシメチルエーテル（ＭＯＭ）、メトキシトリチル［（４－メトキシフェニル）ジフェニルメチル（ＭＭＴ）、ｐ－メトキシベンジルエーテル（ＰＭＢ）、メチルチオメチルエーテル、ピバロイル（Ｐｉｖ）、テトラヒドロピラニル（ＴＨＰ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、トリチルまたはトリフェニルメチル（Ｔｒ）、シリルエーテル（例えば、トリメチルシリル（ＴＭＳ）、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）、トリ－イソ－プロピルシリルオキシメチル（ＴＯＭ）およびトリイソプロピルシリル（ＴＩＰＳ）エーテル）、メチルエーテルおよびエトキシエチルエーテル（ＥＥ）である。ヒドロキシル保護基の具体的な例は、ＤＭＴおよびＴＭＴ、特にＤＭＴである。

【0038】

「チオヒドロキシル保護基」は、チオヒドロキシル基の保護基である。チオヒドロキシル保護基の例は、「ヒドロキシル保護基」のものである。

【0039】

本発明の出発物質または出発化合物の１つが、１つまたは複数の反応工程の反応条件下で安定でないか、または反応性である１つまたは複数の官能基を含む場合、適切な保護基（例えば、Ｔ．Ｗ．ＧｒｅｅｎｅおよびＰ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓによる「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」第３^版、１９９９、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記載されているもの）を、当技術分野で周知の方法を適用する重要な工程の前に導入することができる。このような保護基は、文献に記載の標準的な方法を使用して、合成の後の段階で除去することができる。保護基の例は、ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、９－フルオレニルメチルカルバメート（Ｆｍｏｃ）、２－トリメチルシリルエチルカルバメート（Ｔｅｏｃ）、カルボベンジルオキシ（Ｃｂｚ）およびｐ－メトキシベンジルオキシカルボニル（Ｍｏｚ）である。

【0040】

本明細書に記載の化合物は、数個の不斉中心を含み得、光学的に純粋なエナンチオマー、例えばラセミ体などのエナンチオマーの混合物、ジアステレオ異性体の混合物、ジアステレオ異性体ラセミ体またはジアステレオ異性体ラセミ体の混合物として存在し得る。

【0041】

オリゴヌクレオチド
本明細書で使用される用語「オリゴヌクレオチド」は、当業者に一般的に理解されているように、共有結合した２つ以上のヌクレオシドを含む分子として定義される。このような共有結合したヌクレオシドは、核酸分子またはオリゴマーとも称され得る。オリゴヌクレオチドは、通常、固相化学合成と、その後の精製によって研究室内で調製される。オリゴヌクレオチドの配列に言及する場合、共有結合したヌクレオチドまたはヌクレオシドの、核酸塩基部分の配列もしくは順序、またはその修飾に対して言及される。本発明のオリゴヌクレオチドは、人工であり、化学的に合成され、通常は精製または単離される。本発明のオリゴヌクレオチドは、１つまたは複数の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含んでよい。

【0042】

アンチセンスオリゴヌクレオチド
本明細書で使用される用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、標的核酸、特に標的核酸上の連続する配列にハイブリダイズすることによって、標的遺伝子の発現を調節することができるオリゴヌクレオチドとして定義される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは本質的に二本鎖ではなく、したがってｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡではない。好ましくは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは一本鎖である。本発明の一本鎖オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの全長にわたって内部（ｉｎｔｒａ）または相互（ｉｎｔｅｒ）の自己相補性の程度が５０％未満である限り、ヘアピンまたは分子間二重鎖構造（同じオリゴヌクレオチドの２分子間の二重鎖）を形成できることが理解される。

【0043】

連続するヌクレオチド配列
用語「連続するヌクレオチド配列」は、標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチドの領域を指す。この用語は、本明細書中で用語「連続する核酸塩基配列」および用語「オリゴヌクレオチドモチーフ配列」と互換的に使用される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの全てのヌクレオチドは、連続するヌクレオチド配列を構成する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、連続するヌクレオチド配列、例えばＦ－Ｇ－Ｆ’ギャップマー領域を含み、任意に、さらなるヌクレオチド（複数可）、例えば、官能基を連続するヌクレオチド配列に結合するのに使用され得るヌクレオチドリンカー領域を含んでもよい。ヌクレオチドリンカー領域は、標的核酸に相補的であっても、相補的でなくてもよい。

【0044】

ヌクレオチド
ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの構成要素であり、本発明の目的のためには、天然に存在するヌクレオチドおよび非天然のヌクレオチドの両方を含む。天然では、ＤＮＡヌクレオチドおよびＲＮＡヌクレオチドなどのヌクレオチドは、リボース糖部分、核酸塩基部分、および１つまたは複数のリン酸基（ヌクレオシドには存在しない）を含む。ヌクレオシドおよびヌクレオチドはまた、「単位」または「モノマー」と互換的に称され得る。

【0045】

修飾ヌクレオシド
本明細書で使用される用語「修飾ヌクレオシド」または「ヌクレオシド修飾」は、等価のＤＮＡヌクレオシドまたはＲＮＡヌクレオシドと比較して、糖部分または（核酸）塩基部分の１つまたは複数の修飾の導入によって修飾されたヌクレオシドを指す。好ましい実施形態では、修飾ヌクレオシドは、修飾された糖部分を含む。修飾ヌクレオシドという用語はまた、本明細書で用語「ヌクレオシドアナログ」または修飾された「単位」または修飾された「モノマー」と互換的に使用され得る。非修飾ＤＮＡまたはＲＮＡ糖部分を有するヌクレオシドは、本明細書でＤＮＡヌクレオシドまたはＲＮＡヌクレオシドと称される。ＤＮＡヌクレオシドまたはＲＮＡヌクレオシドの塩基領域に修飾を有するヌクレオシドは、Ｗａｔｓｏｎ Ｃｒｉｃｋ塩基対形成が可能であれば、依然として一般にＤＮＡまたはＲＮＡと称される。

【0046】

修飾ヌクレオシド間結合
用語「修飾ヌクレオシド間結合」は、２つのヌクレオシドを互いに共有結合する、ホスホジエステル（ＰＯ）結合以外の結合として、当業者に一般的に理解されているように定義される。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオシド間結合を含み得る。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル結合と比較して、オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を増大させる。天然に存在するオリゴヌクレオチドの場合、ヌクレオシド間結合は、隣接するヌクレオシド間でホスホジエステル結合を形成するリン酸基を含む。修飾ヌクレオシド間結合は、インビボ使用のためのオリゴヌクレオチドの安定化に特に有用であり、本発明のオリゴヌクレオチドのＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオシドの領域、例えばギャップマー型オリゴヌクレオチドのギャップ領域内、ならびに領域ＦおよびＦ’などの修飾ヌクレオシドの領域中でヌクレアーゼ切断から保護する役割を果たし得る。

【0047】

ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、天然のホスホジエステルから修飾された１つまたは複数のヌクレオシド間結合、例えばヌクレアーゼ攻撃に対してより耐性となるような１つまたは複数の修飾ヌクレオシド間結合を含む。ヌクレアーゼ耐性は、オリゴヌクレオチドを血清中でインキュベートすることにより、またはヌクレアーゼ耐性アッセイ（例えばヘビ毒ホスホジエステラーゼ（ＳＶＰＤ））を使用することにより判定することができ、これらは両方とも当技術分野で周知である。オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を増強することができるヌクレオシド間結合は、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオシド間結合と称される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドまたはその連続するヌクレオチド配列の少なくとも５０％のヌクレオシド間結合が修飾され、オリゴヌクレオチドまたはその連続するヌクレオチド配列の例えば少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、または例えば少なくとも９０％のヌクレオシド間結合が、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオシド間結合である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドまたはその連続するヌクレオチド配列のヌクレオシド間結合は全て、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオシド間結合である。いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドを非ヌクレオチド官能基、例えばコンジュゲートに結合するヌクレオシドは、ホスホジエステルであり得ることが認識されるであろう。

【0048】

本発明のオリゴヌクレオチドで使用するための好ましい修飾ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートである。

【0049】

ホスホロチオエートヌクレオシド間結合は、ヌクレアーゼ耐性、有益な薬物動態および製造の容易さのために特に有用である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドまたはその連続するヌクレオチド配列の少なくとも５０％のヌクレオシド間結合がホスホロチオエートであり、オリゴヌクレオチドまたはその連続するヌクレオチド配列の例えば少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、または例えば少なくとも９０％のヌクレオシド間結合がホスホロチオエートである。いくつかの実施形態では、ホスホロトリチオエートヌクレオシド間結合以外、オリゴヌクレオチドまたはその連続するヌクレオチド配列のヌクレオシド間結合の全てがホスホロチオエートである。いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、ホスホロトリチオエート結合（複数可）に加えて、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合と少なくとも１つのホスホジエステル結合、例えば２、３または４つのホスホジエステル結合の両方を含む。ギャップマー型オリゴヌクレオチドでは、ホスホジエステル結合は、存在する場合、ギャップ領域Ｇ内の連続するＤＮＡヌクレオシド間には当然配置されない。

【0050】

ホスホロチオエート結合などのヌクレアーゼ耐性結合は、標的核酸と二重鎖を形成するときにヌクレアーゼを動員することができるオリゴヌクレオチド領域、例えばギャップマーの領域Ｇにおいて特に有用である。しかしながら、ホスホロチオエート結合は、非ヌクレアーゼ動員領域および／または親和性増強領域、例えばギャップマーの領域ＦおよびＦ’においても有用であり得る。ギャップマー型オリゴヌクレオチドは、いくつかの実施形態では、領域ＦもしくはＦ’、または領域ＦおよびＦ’の両方に１つまたは複数のホスホジエステル結合を含んでもよく、領域Ｇのヌクレオシド間結合は、完全にホスホロチオエートであってもよい。

【0051】

有利には、オリゴヌクレオチドの連続するヌクレオチド配列中の全ヌクレオシド間結合、またはオリゴヌクレオチドの全ヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエート結合である。

【0052】

ＥＰ２７４２１３５に開示されているように、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、他のヌクレオシド間結合（ホスホジエステルおよびホスホロチオエート以外）、例えばアルキルホスホネート／メチルホスホネートヌクレオシド間を含んでもよいことが認識されており、これはＥＰ２７４２１３５によれば、例えば、別のＤＮＡホスホロチオエートギャップ領域内で耐性であり得る。

【0053】

立体的にランダムなホスホロチオエート結合
ホスホロチオエート結合は、非架橋酸素の１個が硫黄で置換されているヌクレオシド間リン酸結合である。非架橋酸素の１個を硫黄で置換することにより、キラル中心が導入され、したがって単一のホスホロチオエートオリゴヌクレオチド内で、各ホスホロチオエートヌクレオシド間結合はＳ（Ｓｐ）またはＲ（Ｒｐ）立体アイソフォームのいずれかになる。このようなヌクレオシド間結合は、「キラルヌクレオシド間結合」と称される。それと比較して、ホスホジエステルヌクレオシド間結合は、２個の非末端酸素原子を有しているため、非キラルである。

【0054】

立体中心のキラリティーの指定は、Ｃａｈｎ，Ｒ．Ｓ．；Ｉｎｇｏｌｄ，Ｃ．Ｋ．；Ｐｒｅｌｏｇ，Ｖ．（１９６６）「Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｈｉｒａｌｉｔｙ」Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ ５（４）：３８５～４１５．ｄｏｉ：１０．１００２／ａｎｉｅ．１９６６０３８５１．で最初に公開された標準的なＣａｈｎ－Ｉｎｇｏｌｄ－Ｐｒｅｌｏｇ則（ＣＩＰ順位則）によって決定される。

【0055】

標準的なオリゴヌクレオチド合成中、カップリングとそれに続く硫化の立体選択性は制御されない。このため、各ホスホロチオエートヌクレオシド間結合の立体化学はランダムにＳｐまたはＲｐであり、したがって従来のオリゴヌクレオチド合成によって生成されたホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、実際には２^Ｘもの異なるホスホロチオエートジアステレオ異性体として存在し得、ここで、Ｘは、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合の数である。このようなオリゴヌクレオチドは、本明細書では立体的にランダムなホスホロチオエートオリゴヌクレオチドと称され、いずれの立体的に規定されたヌクレオシド間結合も含まない。したがって、立体的にランダムなホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、立体的に規定されていない合成に由来する個々のジアステレオ異性体の混合物である。これに関連して、混合物は最大２^Ｘの異なるホスホロチオエートジアステレオ異性体として定義される。

【0056】

立体的に規定されたヌクレオシド間結合
立体的に規定されたヌクレオシド間結合は、その２つのジアステレオ異性形態であるＲｐまたはＳｐの一方に対してジアステレオ異性体過剰率を有するキラルなヌクレオシド間結合である。

【0057】

当技術分野で使用される立体選択的オリゴヌクレオチド合成法は、典型的には、各キラルなヌクレオシド間結合において少なくとも約９０％または少なくとも約９５％のジアステレオ選択性を提供することが認識されるものとし、したがってオリゴヌクレオチド分子の最大約１０％、例えば約５％が別のジアステレオ異性形態を有し得る。

【0058】

いくつかの実施形態では、立体的に規定されたキラルな各ヌクレオシド間結合のジアステレオ異性体比は、少なくとも約９０：１０である。いくつかの実施形態では、キラルな各ヌクレオシド間結合のジアステレオ異性体比は、少なくとも約９５：５である。

【0059】

立体的に規定されたホスホロチオエート結合は、立体的に規定されたヌクレオシド間結合の具体的な例である。

【0060】

立体的に規定されたホスホロチオエート結合
立体的に規定されたホスホロチオエート結合は、その２つのジアステレオ異性形態であるＲｐまたはＳｐの一方に対してジアステレオマー過剰率を有するホスホロチオエート結合である。

【0061】

ホスホロチオエートヌクレオシド間結合のＲｐ配置およびＳｐ配置を以下に示す：

式中、３’Ｒ基は、隣接するヌクレオシド（５’ヌクレオシド）の３’位を表し、５’Ｒ基は、隣接するヌクレオシド（３’ヌクレオシド）の５’位を表す。

【0062】

本明細書では、Ｒｐヌクレオシド間結合はｓｒＰとして表され得、Ｓｐヌクレオシド間結合はｓｓＰとして表され得る。

【0063】

特定の実施形態では、立体的に規定された各ホスホロチオエート結合のジアステレオマー比は、少なくとも約９０：１０または少なくとも９５：５である。

【0064】

いくつかの実施形態では、立体的に規定された各ホスホロチオエート結合のジアステレオマー比は、少なくとも約９７：３である。いくつかの実施形態では、立体的に規定された各ホスホロチオエート結合のジアステレオマー比は、少なくとも約９８：２である。いくつかの実施形態では、立体的に規定された各ホスホロチオエート結合のジアステレオマー比は、少なくとも約９９：１である。

【0065】

いくつかの実施形態では、立体的に規定されたヌクレオシド間結合は、オリゴヌクレオチド分子の集団中に存在するオリゴヌクレオチド分子の少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、または（本質的に）全てが同じジアステレオマー形態（ＲｐまたはＳｐ）である。

【0066】

ジアステレオマーの純度は、アキラルな骨格（すなわち、ホスホジエステル）のみを有するモデル系で測定することができる。各モノマーのジアステレオマーの純度は、例えば、立体的に規定するヌクレオシド間結合を有するモノマーを以下のモデル系「５’ｔ－ｐｏ－ｔ－ｐｏ－ｔ－ｐｏ３’」にカップリングすることによって測定することができる。そして、この結果は、ＨＰＬＣを使用して分離することができる、５’ＤＭＴｒ－ｔ－ｓｒｐ－ｔ－ｐｏ－ｔ－ｐｏ－ｔ－ｐｏ３’または５’ＤＭＴｒ－ｔ－ｓｓｐ－ｔ－ｐｏ－ｔ－ｐｏ－ｔ－ｐｏ３’となる。ジアステレオマーの純度は、２つの可能なジアステレオ異性体からのＵＶシグナルを積分し、これらの比、例えば９８：２、９９：１または＞９９：１を与えることによって決定される。

【0067】

具体的な単一のジアステレオ異性体（単一の立体的に規定されたオリゴヌクレオチド分子）のジアステレオマーの純度は、各ヌクレオシド間位置での定義された立体中心に対するカップリング選択性、および導入されるべき立体的に規定されたヌクレオシド間結合の数の関数であることが理解されるであろう。例として、各位置でのカップリング選択性が９７％である場合、１５個の立体的に規定されたヌクレオシド間結合を有する立体的に規定されたオリゴヌクレオチドの結果として生じる純度は、０．９７^１５となり、すなわち、他のジアステレオ異性体の３７％に対して、所望のジアステレオ異性体は６３％である。定義されたジアステレオ異性体の純度は、合成後、例えば、イオン交換クロマトグラフィーまたは逆相クロマトグラフィーなどのＨＰＬＣによる精製によって改善することができる。

【0068】

いくつかの実施形態では、立体的に規定されたオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの集団であって、該集団の少なくとも約４０％、例えば少なくとも約５０％が所望のジアステレオ異性体である、集団を指す。

【0069】

別様に記載すると、いくつかの実施形態では、立体的に規定されたオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの集団であって、該集団の少なくとも約４０％、例えば少なくとも約５０％が所望の（特定の）立体的に規定されたヌクレオシド間結合モチーフ（立体的に規定されたモチーフとも称される）からなる、集団を指す。

【0070】

立体的にランダムなおよび立体的に規定されたヌクレオシド間キラル中心の両方を含む立体的に規定されたオリゴヌクレオチドの場合、立体的に規定されたオリゴヌクレオチドの純度は、所望の立体的に規定されたヌクレオシド間結合モチーフ（複数可）を保有するオリゴヌクレオチドの集団での％に関して決定され、立体的にランダムな結合は計算上無視される。

【0071】

核酸塩基
核酸塩基という用語は、ヌクレオシドおよびヌクレオチドに存在する、プリン（例えば、アデニンおよびグアニン）およびピリミジン（例えば、ウラシル、チミンおよびシトシン）部分を含み、これらは核酸ハイブリダイゼーションにおいて水素結合を形成する。本発明の文脈において、核酸塩基という用語は、天然に存在する核酸塩基とは異なり得るが、核酸ハイブリダイゼーションの際に機能的である修飾核酸塩基も包含する。この文脈において、「核酸塩基」は、天然に存在する核酸塩基、例えばアデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル、キサンチンおよびヒポキサンチンと、非天然のバリアントとの両方を指す。このようなバリアントは、例えばＨｉｒａｏら（２０１２）Ａｃｃｏｕｎｔｓ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第４５巻、第２０５５頁およびＢｅｒｇｓｔｒｏｍ（２００９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ 付録３７ １．４．１に記載されている。

【0072】

いくつかの実施形態では、核酸塩基部分は、プリンまたはピリミジンを修飾プリンまたはピリミジン、例えば置換プリンまたは置換ピリミジン、例えばイソシトシン、シュードイソシトシン、５－メチルシトシン、５－チアゾロ－シトシン、５－プロピニル－シトシン、５－プロピニル－ウラシル、５－ブロモウラシル、５－チアゾロ－ウラシル、２－チオ－ウラシル、２’－チオ－チミン、イノシン、ジアミノプリン、６－アミノプリン、２－アミノプリン、２，６－ジアミノプリンおよび２－クロロ－６－アミノプリンから選択される核酸塩基に変えることにより修飾される。

【0073】

核酸塩基部分は、各々の対応する核酸塩基の文字コード、例えばＡ、Ｔ、Ｇ、ＣまたはＵにより示すことができ、各文字は、等価の機能の修飾核酸塩基を任意に含むことができる。例えば、例示的なオリゴヌクレオチドにおいて、核酸塩基部分は、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、および５－メチルシトシンから選択される。任意に、ＬＮＡギャップマーについて、５－メチルシトシンＬＮＡヌクレオシドが使用され得る。

【0074】

修飾オリゴヌクレオチド
修飾オリゴヌクレオチドという用語は、１つまたは複数の糖修飾ヌクレオシドおよび／または修飾ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドを表す。用語「キメラ」オリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオシドを有するオリゴヌクレオチドを表すために文献で使用されている用語である。

【0075】

立体的に規定されたオリゴヌクレオチド
立体的に規定されたオリゴヌクレオチドは、ヌクレオシド間結合の少なくとも１つが立体的に規定されたヌクレオシド間結合である、オリゴヌクレオチドである。

【0076】

立体的に規定されたホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、ヌクレオシド間結合の少なくとも１つが立体的に規定されたホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、オリゴヌクレオチドである。

【0077】

相補性
用語「相補性」は、ヌクレオシド／ヌクレオチドのＷａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ塩基対形成の能力を表す。Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ塩基対は、グアニン（Ｇ）－シトシン（Ｃ）およびアデニン（Ａ）－チミン（Ｔ）／ウラシル（Ｕ）である。オリゴヌクレオチドは修飾核酸塩基を有するヌクレオシドを含んでもよく、例えば、５－メチルシトシンは多くの場合シトシンの代わりに使用され、したがって相補性という用語は、非修飾核酸塩基と修飾核酸塩基との間のＷａｔｓｏｎ Ｃｒｉｃｋ塩基対形成を包含することが理解されよう（例えば、Ｈｉｒａｏら（２０１２）Ａｃｃｏｕｎｔｓ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第４５巻、第２０５５頁およびＢｅｒｇｓｔｒｏｍ（２００９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ 付録３７ １．４．１を参照されたい）。

【0078】

本明細書で使用される用語「相補性％」は、所与の位置において、別個の核酸分子（例えば、標的核酸）の所与の位置における連続するヌクレオチド配列に相補的な（すなわち、Ｗａｔｓｏｎ Ｃｒｉｃｋ塩基対を形成する）、核酸分子（例えば、オリゴヌクレオチド）中の連続するヌクレオチド配列におけるヌクレオチドの割合を指す。百分率は、（標的配列５’－３’とオリゴヌクレオチド配列３’－５’を整列させたとき）２つの配列間で対を形成する整列した塩基の数を計数し、その数をオリゴヌクレオチド中のヌクレオチドの総数で除し、１００を乗じることにより計算される。このような比較において、整列（塩基対を形成）しない核酸塩基／ヌクレオチドは、ミスマッチと称される。好ましくは、挿入および欠失は、連続するヌクレオチド配列の相補性％の計算において許容されない。

【0079】

「完全に相補的な」という用語は、１００％の相補性を指す。

【0080】

同一性
本明細書で使用される用語「同一性」は、所与の位置において、別個の核酸分子（例えば標的核酸）の所与の位置における連続するヌクレオチド配列と同一である（すなわち、相補的なヌクレオシドとＷａｔｓｏｎ Ｃｒｉｃｋ塩基対を形成する核酸分子の能力において）、核酸分子（例えば、オリゴヌクレオチド）中の連続するヌクレオチド配列におけるパーセント表記でのヌクレオチドの数を指す。百分率は、２つの配列間で同一である整列した塩基の数を計数し、オリゴヌクレオチド中のヌクレオチドの総数で除し、１００を乗じることにより計算される。同一性パーセント＝（マッチ×１００）／整列した領域の長さ。好ましくは、挿入および欠失は、連続するヌクレオチド配列の相補性％の計算において許容されない。

【0081】

ハイブリダイゼーション
本明細書で使用される用語「ハイブリダイズしている」または「ハイブリダイズする」は、２つの核酸鎖（例えば、オリゴヌクレオチドおよび標的核酸）が対向する鎖上の塩基対との間で水素結合を形成することにより二重鎖を形成することとして理解されるべきである。２つの核酸鎖間の結合の親和性は、ハイブリダイゼーションの強度である。これは、多くの場合、オリゴヌクレオチドの半分が標的核酸と二重鎖を形成する温度として定義される融解温度（Ｔ_ｍ）によって表される。生理学的条件では、Ｔ_ｍは親和性に厳密には比例しない（ＭｅｒｇｎｙおよびＬａｃｒｏｉｘ、２００３、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ１３：５１５～５３７）。標準状態でのギブスの自由エネルギーΔＧ°は、結合親和性をより正確に表しており、ΔＧ°＝－ＲＴｌｎ（Ｋ_ｄ）によって反応の解離定数（Ｋ_ｄ）と関連付けられており、ここで、Ｒは気体定数であり、Ｔは絶対温度である。したがって、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間の反応の非常に低いΔＧ°は、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間の強いハイブリダイゼーションを反映している。ΔＧ°は、水溶液濃度が１Ｍ、ｐＨが７、温度が３７℃で、ある反応に関連したエネルギーである。標的核酸に対するオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、自発的反応であり、自発的反応の場合のΔＧ°は、ゼロ未満である。ΔＧ°は、例えば、Ｈａｎｓｅｎら、１９６５、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．３６～３８およびＨｏｌｄｇａｔｅら、２００５、Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙに記載されているような等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）の使用により、実験的に測定することができる。当業者は、ΔＧ°測定のために市販の装置が入手可能であることを知るであろう。ΔＧ°は、ＳａｎｔａＬｕｃｉａ、１９９８、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．９５：１４６０～１４６５に記載されているように、Ｓｕｇｉｍｏｔｏら、１９９５、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３４：１１２１１～１１２１６およびＭｃＴｉｇｕｅら、２００４、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ４３：５３８８～５４０５に記載されている適切に得られた熱力学パラメータを使用した最近接モデルを使用することにより、数値的に概算することもできる。その意図した核酸標的をハイブリダイゼーションによって調節する可能性を確保するために、本発明のオリゴヌクレオチドは、１０～３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドに対して－１０ｋｃａｌ未満の概算ΔＧ°値で標的核酸にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーションの程度または強度は、標準状態でのギブスの自由エネルギーΔＧ°により測定される。オリゴヌクレオチドは、８～３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドに対して－１０ｋｃａｌの範囲未満、例えば－１５ｋｃａｌ未満、例えば－２０ｋｃａｌ未満、および例えば－２５ｋｃａｌ未満の概算ΔＧ°値で標的核酸にハイブリダイズすることができる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、－１０～－６０ｋｃａｌ、例えば－１２～－４０、例えば－１５～－３０ｋｃａｌ、または－１６～－２７ｋｃａｌ、例えば－１８～－２５ｋｃａｌの概算ΔＧ°値で標的核酸にハイブリダイズする。

【0082】

糖修飾
本発明のオリゴマーは、修飾された糖部分、すなわち、ＤＮＡおよびＲＮＡに見られるリボース糖部分と比較した場合に糖部分の修飾を有する、１つまたは複数のヌクレオシドを含み得る。

【0083】

リボース糖部分の修飾を有する多数のヌクレオシドが、親和性および／またはヌクレアーゼ耐性などのオリゴヌクレオチドのある特定の特性を改善することを主な目的として作製されている。

【0084】

このような修飾には、例えば、ヘキソース環（ＨＮＡ）もしくは二環式環との置換えによってリボース環構造が修飾されたものであって、通常リボース環上のＣ２とＣ４炭素との間にビラジカル架橋を有するもの（ＬＮＡ）であるか、または通常Ｃ２とＣ３炭素との間の結合を欠いている非結合リボース環（例えば、ＵＮＡ）が含まれる。他の糖修飾ヌクレオシドには、例えばビシクロヘキソース核酸（ＷＯ２０１１／０１７５２１）または三環式核酸（ＷＯ２０１３／１５４７９８）が含まれる。修飾ヌクレオシドにはまた、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、またはモルホリノ核酸の場合には、糖部分が非糖部分で置き換えられたヌクレオシドも含まれる。

【0085】

糖修飾にはまた、リボース環上の置換基を水素以外の基、またはＤＮＡヌクレオシドおよびＲＮＡヌクレオシド内に天然に見られる２’－ＯＨ基に変化させることを介して行われる修飾も含まれる。置換基は、例えば、２’、３’、４’または５’位で導入され得る。

【0086】

２’糖修飾ヌクレオシド
２’糖修飾ヌクレオシドは、２’位にＨもしくは－ＯＨ以外の置換基を有するヌクレオシド（２’置換ヌクレオシド）、または２’炭素とリボース環の第２の炭素との間に架橋を形成することができる２’結合ビラジカルを含むヌクレオシド、例えばＬＮＡ（２’－４’ビラジカル架橋）ヌクレオシドである。

【0087】

実際、２’置換ヌクレオシドの開発には多くの注目が集まっており、多くの２’置換ヌクレオシドが、オリゴヌクレオチドに取り込まれた際に有益な特性を有することが見出されている。例えば、２’修飾糖は、結合親和性の向上および／またはヌクレアーゼ耐性の増大をオリゴヌクレオチドにもたらすことができる。２’置換修飾ヌクレオシドの例は、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ（ＭＯＥ）、２’－アミノ－ＤＮＡ、２’－フルオロ－ＲＮＡおよび２’－Ｆ－ＡＮＡヌクレオシドである。さらなる例については、例えば、Ｆｒｅｉｅｒ＆Ａｌｔｍａｎｎ；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．、１９９７、２５、４４２９～４４４３ならびにＵｈｌｍａｎｎ；Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、２０００、３（２）、２９３～２１３ならびにＤｅｌｅａｖｅｙおよびＤａｍｈａ、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２０１２、１９、９３７に見出すことができる。以下に、いくつかの２’置換修飾ヌクレオシドを例示する。

【0088】

本発明の関連では、２’置換は、ＬＮＡのような２’架橋分子を含まない。

【0089】

ロックド核酸ヌクレオシド（ＬＮＡヌクレオシド）
「ＬＮＡヌクレオシド」は、ヌクレオシドのリボース糖環のＣ２’とＣ４’とを結合させるビラジカル（「２’－４’架橋」とも称される）を含む２’修飾ヌクレオシドであり、これはリボース環の立体配座を制限または固定する。これらのヌクレオシドは、文献にて架橋核酸または二環式核酸（ＢＮＡ）とも称されている。リボースの立体配座の固定は、ＬＮＡが相補的ＲＮＡまたはＤＮＡ分子のオリゴヌクレオチドに取り込まれる場合、ハイブリダイゼーションの親和性の向上（二重鎖安定化）に関連している。これは通常、オリゴヌクレオチド／相補的二重鎖の融解温度を測定することにより決定され得る。

【0090】

非限定的で例示的なＬＮＡヌクレオシドは、ＷＯ９９／０１４２２６、ＷＯ００／６６６０４、ＷＯ９８／０３９３５２、ＷＯ２００４／０４６１６０、ＷＯ００／０４７５９９、ＷＯ２００７／１３４１８１、ＷＯ２０１０／０７７５７８、ＷＯ２０１０／０３６６９８、ＷＯ２００７／０９００７１、ＷＯ２００９／００６４７８、ＷＯ２０１１／１５６２０２、ＷＯ２００８／１５４４０１、ＷＯ２００９／０６７６４７、ＷＯ２００８／１５０７２９、Ｍｏｒｉｔａら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１２、７３～７６、Ｓｅｔｈら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２０１０、第７５巻（５）、第１５６９～８１頁およびＭｉｔｓｕｏｋａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００９、３７（４）、１２２５～１２３８に開示されている。

【0091】

２’－４’架橋は、２～４個の架橋原子を含み、特に式－Ｘ－Ｙ－（ここで、ＸはＣ４’に結合し、ＹはＣ２’に結合している）であり、
式中、
Ｘは、酸素、硫黄、－ＣＲ^ａＲ^ｂ－、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｃ（Ｒ^ｂ）－、－Ｃ（＝ＣＲ^ａＲ^ｂ）－、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｎ－、－Ｓｉ（Ｒ^ａ）_２－、－ＳＯ_２－、－ＮＲ^ａ－；－Ｏ－ＮＲ^ａ－、－ＮＲ^ａ－Ｏ－、－Ｃ（＝Ｊ）－、Ｓｅ、－Ｏ－ＮＲ^ａ－、－ＮＲ^ａ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－、－Ｎ（Ｒ^ａ）－Ｏ－または－Ｏ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－であり、
Ｙは、酸素、硫黄、－（ＣＲ^ａＲ^ｂ）_ｎ－、－ＣＲ^ａＲ^ｂ－Ｏ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｃ（Ｒ^ｂ）－、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｎ－、－Ｓｉ（Ｒ^ａ）_２－、－ＳＯ_２－、－ＮＲ^ａ－、－Ｃ（＝Ｊ）－、Ｓｅ、－Ｏ－ＮＲ^ａ－、－ＮＲ^ａ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－、－Ｎ（Ｒ^ａ）－Ｏ－または－Ｏ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－であり、
但し、－Ｘ－Ｙ－は、－Ｏ－Ｏ－、Ｓｉ（Ｒ^ａ）_２－Ｓｉ（Ｒ^ａ）_２－、－ＳＯ_２－ＳＯ_２－、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｃ（Ｒ^ｂ）－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｃ（Ｒ^ｂ）、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｎ－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｎ－、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｎ－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｃ（Ｒ^ｂ）、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｃ（Ｒ^ｂ）－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｎ－または－Ｓｅ－Ｓｅ－ではなく、
Ｊは、酸素、硫黄、＝ＣＨ_２または＝Ｎ（Ｒ^ａ）であり、
Ｒ^ａおよびＲ^ｂは、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、チオヒドロキシル、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルコキシアルキル、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、ヘテロシクリル、アミノ、アルキルアミノ、カルバモイル、アルキルアミノカルボニル、アミノアルキルアミノカルボニル、アルキルアミノアルキルアミノカルボニル、アルキルカルボニルアミノ、カルバミド、アルカノイルオキシ、スルホニル、アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、チオヒドロキシルスルフィドアルキルスルファニル、アリールオキシカルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシカルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、－ＯＣ（＝Ｘ^ａ）Ｒ^ｃ、－ＯＣ（＝Ｘ^ａ）ＮＲ^ｃＲ^ｄおよび－ＮＲ^ｅＣ（＝Ｘ^ａ）ＮＲ^ｃＲ^ｄから独立して選択されるか、
または、２つのジェミナルなＲ^ａおよびＲ^ｂは、一緒になって、任意に置換されたメチレンを形成するか、
または、２つのジェミナルなＲ^ａおよびＲ^ｂは、それらが結合している炭素原子と共に、－Ｘ－Ｙ－の炭素原子を１個だけ有するシクロアルキルまたはハロシクロアルキルを形成し、
ここで、置換アルキル、置換アルケニル、置換アルキニル、置換アルコキシおよび置換メチレンは、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、ホルミル、ヘテロシリル、アリールおよびヘテロアリールから独立して選択される１～３つの置換基で置換されたアルキル、アルケニル、アルキニルおよびメチレンであり、
Ｘ^ａは、酸素、硫黄または－ＮＲ^ｃであり、
Ｒ^ｃ、Ｒ^ｄおよびＲ^ｅは、水素およびアルキルから独立して選択され、
ｎは、１、２または３である。

【0092】

本発明のさらに詳しい実施形態では、Ｘは、酸素、硫黄、－ＮＲ^ａ－、－ＣＲ^ａＲ^ｂ－、または－Ｃ（＝ＣＲ^ａＲ^ｂ）－、特に酸素、硫黄、－ＮＨ－、－ＣＨ_２－または－Ｃ（＝ＣＨ_２）－、より詳細には酸素である。

【0093】

本発明の別の特定の実施形態では、Ｙは、－ＣＲ^ａＲ^ｂ－、－ＣＲ^ａＲ^ｂ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－または－ＣＲ^ａＲ^ｂ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－、特に－ＣＨ_２－ＣＨＣＨ_３－、－ＣＨＣＨ_３－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－または－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－である。

【0094】

本発明の特定の実施形態では、－Ｘ－Ｙ－は、－Ｏ－（ＣＲ^ａＲ^ｂ）_ｎ－、－Ｓ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－、－Ｎ（Ｒ^ａ）ＣＲ^ａＲ^ｂ－、－ＣＲ^ａＲ^ｂ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－、－Ｏ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－Ｏ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－、－ＣＲ^ａＲ^ｂ－Ｏ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－、－Ｃ（＝ＣＲ^ａＲ^ｂ）－ＣＲ^ａＲ^ｂ－、－Ｎ（Ｒ^ａ）ＣＲ^ａＲ^ｂ－、－Ｏ－Ｎ（Ｒ^ａ）－ＣＲ^ａＲ^ｂ－または－Ｎ（Ｒ^ａ）－Ｏ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－である。

【0095】

本発明の特定の実施形態では、Ｒ^ａおよびＲ^ｂは、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキル、およびアルコキシアルキル、特に水素、ハロゲン、アルキル、およびアルコキシアルキルからなる群から独立して選択される。

【0096】

本発明の別の実施形態では、Ｒ^ａおよびＲ^ｂは、水素、フルオロ、ヒドロキシル、メチル、および－ＣＨ_２－Ｏ－ＣＨ_３、特に水素、フルオロ、メチルおよび－ＣＨ_２－Ｏ－ＣＨ_３からなる群から独立して選択される。

【0097】

有利には、－Ｘ－Ｙ－のＲ^ａおよびＲ^ｂの一方は上に定義した通りであり、他方は全て同時に水素である。

【0098】

本発明のさらに特定の実施形態では、Ｒ^ａは、水素またはアルキル、特に水素またはメチルである。

【0099】

本発明の別の特定の実施形態では、Ｒ^ｂは、水素またはアルキル、特に水素またはメチルである。

【0100】

本発明の特定の実施形態では、Ｒ^ａおよびＲ^ｂの一方または両方は、水素である。

【0101】

本発明の特定の実施形態では、Ｒ^ａおよびＲ^ｂの一方のみが、水素である。

【0102】

本発明の１つの特定の実施形態では、Ｒ^ａおよびＲ^ｂの一方はメチルであり、他方は水素である。

【0103】

本発明の特定の実施形態では、Ｒ^ａおよびＲ^ｂは、両方とも同時にメチルである。

【0104】

本発明の特定の実施形態では、－Ｘ－Ｙ－は、－Ｏ－ＣＨ_２－、－Ｓ－ＣＨ_２－、－Ｓ－ＣＨ（ＣＨ_３）－、－ＮＨ－ＣＨ_２－、－Ｏ－ＣＨ_２ＣＨ_２－、－Ｏ－ＣＨ（ＣＨ_２－Ｏ－ＣＨ_３）－、－Ｏ－ＣＨ（ＣＨ_２ＣＨ_３）－、－Ｏ－ＣＨ（ＣＨ_３）－、－Ｏ－ＣＨ_２－Ｏ－ＣＨ_２－、－Ｏ－ＣＨ_２－Ｏ－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－Ｏ－ＣＨ_２－、－Ｃ（＝ＣＨ_２）ＣＨ_２－、－Ｃ（＝ＣＨ_２）ＣＨ（ＣＨ_３）－、－Ｎ（ＯＣＨ_３）ＣＨ_２－または－Ｎ（ＣＨ_３）ＣＨ_２－である。

【0105】

本発明の特定の実施形態では、－Ｘ－Ｙ－は、－Ｏ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－であり、式中、Ｒ^ａおよびＲ^ｂは、水素、アルキルおよびアルコキシアルキル、特に水素、メチルおよび－ＣＨ_２－Ｏ－ＣＨ_３からなる群から独立して選択される。

【0106】

特定の実施形態では、－Ｘ－Ｙ－は、－Ｏ－ＣＨ_２－または－Ｏ－ＣＨ（ＣＨ_３）－、特に－Ｏ－ＣＨ_２－である。

【0107】

２’－４’架橋は、それぞれ式（Ａ）および式（Ｂ）に示すように、リボース環の平面の下（β－Ｄ－立体配置）または該環の平面の上（α－Ｌ－立体配置）のいずれかに位置し得る。

【0108】

本発明に記載のＬＮＡヌクレオシドは、特に式（Ｂ１）または（Ｂ２）：

（式中、
Ｗは、酸素、硫黄、－Ｎ（Ｒ^ａ）－または－ＣＲ^ａＲ^ｂ－、特に酸素であり、
Ｂは、核酸塩基または修飾核酸塩基であり、
Ｚは、隣接するヌクレオシドまたは５’末端基へのヌクレオシド間結合であり、
Ｚ＊は、隣接するヌクレオシドまたは３’末端基へのヌクレオシド間結合であり、
Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５、およびＲ^５＊は、水素、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、アルキニル、ヒドロキシ、アルコキシ、アルコキシアルキル、アジド、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、ホルミル、およびアリールから独立して選択され、
Ｘ、Ｙ、Ｒ^ａ、およびＲ^ｂは、上に定義した通りである）
である。

【0109】

特定の実施形態では、－Ｘ－Ｙ－の定義において、Ｒ^ａは、水素またはアルキル、特に水素またはメチルである。別の特定の実施形態では、－Ｘ－Ｙ－の定義において、Ｒ^ｂは、水素またはアルキル、特に水素またはメチルである。さらなる特定の実施形態では、－Ｘ－Ｙ－の定義において、Ｒ^ａおよびＲ^ｂの一方または両方は、水素である。特定の実施形態では、－Ｘ－Ｙ－の定義において、Ｒ^ａおよびＲ^ｂの一方のみが、水素である。１つの特定の実施形態では、－Ｘ－Ｙ－の定義において、Ｒ^ａおよびＲ^ｂの一方はメチルであり、他方は水素である。特定の実施形態では、－Ｘ－Ｙ－の定義において、Ｒ^ａおよびＲ^ｂは、両方とも同時にメチルである。

【0110】

さらなる特定の実施形態では、Ｘの定義において、Ｒ^ａは、水素またはアルキル、特に水素またはメチルである。別の特定の実施形態では、Ｘの定義において、Ｒ^ｂは、水素またはアルキル、特に水素またはメチルである。特定の実施形態では、Ｘの定義において、Ｒ^ａおよびＲ^ｂの一方または両方は、水素である。特定の実施形態では、Ｘの定義において、Ｒ^ａおよびＲ^ｂの一方のみが、水素である。１つの特定の実施形態では、Ｘの定義において、Ｒ^ａおよびＲ^ｂの一方はメチルであり、他方は水素である。特定の実施形態では、Ｘの定義において、Ｒ^ａおよびＲ^ｂは、両方とも同時にメチルである。

【0111】

さらなる特定の実施形態では、Ｙの定義において、Ｒ^ａは、水素またはアルキル、特に水素またはメチルである。別の特定の実施形態では、Ｙの定義において、Ｒ^ｂは、水素またはアルキル、特に水素またはメチルである。特定の実施形態では、Ｙの定義において、Ｒ^ａおよびＲ^ｂの一方または両方は、水素である。特定の実施形態では、Ｙの定義において、Ｒ^ａおよびＲ^ｂの一方のみが、水素である。１つの特定の実施形態では、Ｙの定義において、Ｒ^ａおよびＲ^ｂの一方はメチルであり、他方は水素である。特定の実施形態では、Ｙの定義において、Ｒ^ａおよびＲ^ｂは、両方とも同時にメチルである。

【0112】

本発明の特定の実施形態では、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５、およびＲ^５＊は、水素およびアルキル、特に水素およびメチルから独立して選択される。

【0113】

本発明のさらなる特定の有利な実施形態では、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５、およびＲ^５＊は、全て同時に水素である。

【0114】

本発明の別の特定の実施形態では、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３は全て同時に水素であり、Ｒ^５およびＲ^５＊の一方は水素であり、他方は上に定義した通り、特にアルキル、より詳細にはメチルである。

【0115】

本発明の特定の実施形態では、Ｒ^５およびＲ^５＊は、水素、ハロゲン、アルキル、アルコキシアルキル、およびアジドから、特に水素、フルオロ、メチル、メトキシエチルおよびアジドから独立して選択される。特に、本発明の有利な実施形態では、Ｒ^５およびＲ^５＊の一方は水素であり、他方はアルキル、特にメチル、ハロゲン、特にフルオロ、アルコキシアルキル、特にメトキシエチルまたはアジドであるか、またはＲ^５およびＲ^５＊は両方とも同時に水素またはハロゲンであり、特に両方とも同時にフルオロの水素である。このような特定の実施形態では、Ｗは有利には酸素であり得、－Ｘ－Ｙ－は有利には－Ｏ－ＣＨ_２－であり得る。

【0116】

本発明の特定の実施形態では、－Ｘ－Ｙ－は－Ｏ－ＣＨ_２－であり、Ｗは酸素であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５およびＲ^５＊は、全て同時に水素である。このようなＬＮＡヌクレオシドは、ＷＯ９９／０１４２２６、ＷＯ００／６６６０４、ＷＯ９８／０３９３５２およびＷＯ２００４／０４６１６０に開示され、これらは全て参照により本明細書に組み込まれ、β－Ｄ－オキシＬＮＡおよびα－Ｌ－オキシＬＮＡヌクレオシドとして当技術分野で一般的に公知のものを含む。

【0117】

本発明の別の特定の実施形態では、－Ｘ－Ｙ－は－Ｓ－ＣＨ_２－であり、Ｗは酸素であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５およびＲ^５＊は、全て同時に水素である。このようなチオＬＮＡヌクレオシドは、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ９９／０１４２２６およびＷＯ２００４／０４６１６０に開示されている。

【0118】

本発明の別の特定の実施形態では、－Ｘ－Ｙ－は－ＮＨ－ＣＨ_２－であり、Ｗは酸素であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５およびＲ^５＊は、全て同時に水素である。このようなアミノＬＮＡヌクレオシドは、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ９９／０１４２２６およびＷＯ２００４／０４６１６０に開示されている。

【0119】

本発明の別の特定の実施形態では、－Ｘ－Ｙ－は－Ｏ－ＣＨ_２ＣＨ_２－または－ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２－であり、Ｗは酸素であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５およびＲ^５＊は、全て同時に水素である。このようなＬＮＡヌクレオシドは、ＷＯ００／０４７５９９およびＭｏｒｉｔａら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１２、７３～７６に開示され、これらは参照により本明細書に組み込まれ、２’－Ｏ－４’Ｃ－エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）として当技術分野で一般に公知なものを含む。

【0120】

本発明の別の特定の実施形態では、－Ｘ－Ｙ－は－Ｏ－ＣＨ_２－であり、Ｗは酸素であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３は全て同時に水素であり、Ｒ^５およびＲ^５＊の一方は水素であり、他方はアルキル、例えばメチルなどで水素ではない。このような５’置換ＬＮＡヌクレオシドは、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２００７／１３４１８１に開示されている。

【0121】

本発明の別の特定の実施形態では、－Ｘ－Ｙ－は－Ｏ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－であり、ここで、Ｒ^ａおよびＲ^ｂの一方または両方は水素ではなく、特にメチルなどのアルキルであり、Ｗは酸素であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３は全て同時に水素であり、Ｒ^５およびＲ^５＊の一方は水素であり、他方は水素ではなく、特にアルキル、例えばメチルである。このようなビス修飾ＬＮＡヌクレオシドは、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１０／０７７５７８に開示されている。

【0122】

本発明の別の特定の実施形態では、－Ｘ－Ｙ－は－Ｏ－ＣＨＲ^ａ－であり、Ｗは酸素であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５およびＲ^５＊は、全て同時に水素である。このような６’－置換ＬＮＡヌクレオシドは、ＷＯ２０１０／０３６６９８およびＷＯ２００７／０９００７１に開示されており、これらは両方とも参照により本明細書に組み込まれる。このような６’－置換ＬＮＡヌクレオシドにおいて、Ｒ^ａは、特に、メチルなどのＣ_１－Ｃ_６アルキルである。

【0123】

本発明の別の特定の実施形態では、－Ｘ－Ｙ－は、－Ｏ－ＣＨ（ＣＨ_２－Ｏ－ＣＨ_３）－（「２’Ｏ－メトキシエチル二環式核酸」、Ｓｅｔｈら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２０１０、第７５巻（５）、第１５６９～８１頁）である。

【0124】

本発明の別の特定の実施形態では、－Ｘ－Ｙ－は－Ｏ－ＣＨ（ＣＨ_２ＣＨ_３）－である。

【0125】

本発明の別の特定の実施形態では、－Ｘ－Ｙ－は－Ｏ－ＣＨ（ＣＨ_２－Ｏ－ＣＨ_３）－であり、Ｗは酸素であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５およびＲ^５＊は、全て同時に水素である。このようなＬＮＡヌクレオシドは、当技術分野では環状ＭＯＥ（ｃＭＯＥ）としても公知であり、ＷＯ２００７／０９００７１に開示されている。

【0126】

本発明の別の特定の実施形態では、－Ｘ－Ｙ－は－Ｏ－ＣＨ（ＣＨ_３）－である（「２’Ｏ－エチル二環式核酸」、Ｓｅｔｈら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２０１０、第７５巻（５）、第１５６９～８１頁）。

【0127】

本発明の別の特定の実施形態では、－Ｘ－Ｙ－は－Ｏ－ＣＨ_２－Ｏ－ＣＨ_２－である（Ｓｅｔｈら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ、２０１０、前掲）。

【0128】

本発明の別の特定の実施形態では、－Ｘ－Ｙ－は－Ｏ－ＣＨ（ＣＨ_３）－であり、Ｗは酸素であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５およびＲ^５＊は、全て同時に水素である。このような６’－メチルＬＮＡヌクレオシドは、当技術分野ではｃＥＴヌクレオシドとしても公知であり、両方とも参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２００７／０９００７１（β－Ｄ）およびＷＯ２０１０／０３６６９８（α－Ｌ）に開示されているように、（Ｓ）－ｃＥＴまたは（Ｒ）－ｃＥＴジアステレオ異性体のいずれかであり得る。

【0129】

本発明の別の特定の実施形態では、－Ｘ－Ｙ－は－Ｏ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－であり、ここで、Ｒ^ａもＲ^ｂも水素ではなく、Ｗは酸素であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５およびＲ^５＊は、全て同時に水素である。特定の実施形態では、Ｒ^ａおよびＲ^ｂは両方とも同時にアルキル、特に両方とも同時にメチルである。このような６’－ジ－置換ＬＮＡヌクレオシドは、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２００９／００６４７８に開示されている。

【0130】

本発明の別の特定の実施形態では、－Ｘ－Ｙ－は－Ｓ－ＣＨＲ^ａ－であり、Ｗは酸素であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５およびＲ^５＊は、全て同時に水素である。このような６’－置換チオＬＮＡヌクレオシドは、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１１／１５６２０２に開示されている。このような６’－置換チオＬＮＡの特定の実施形態では、Ｒ^ａはアルキル、特にメチルである。

【0131】

本発明の特定の実施形態では、－Ｘ－Ｙ－は－Ｃ（＝ＣＨ_２）Ｃ（Ｒ^ａＲ^ｂ）－、－Ｃ（＝ＣＨＦ）Ｃ（Ｒ^ａＲ^ｂ）－または－Ｃ（＝ＣＦ_２）Ｃ（Ｒ^ａＲ^ｂ）－であり、Ｗは酸素であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５およびＲ^５＊は、全て同時に水素である。Ｒ^ａおよびＲ^ｂは、有利には、水素、ハロゲン、アルキルおよびアルコキシアルキル、特に水素、メチル、フルオロおよびメトキシメチルから独立して選択される。Ｒ^ａおよびＲ^ｂは特に両方とも同時に水素またはメチルであるか、またはＲ^ａおよびＲ^ｂの一方が水素であり、他方がメチルである。このようなビニルカルボＬＮＡヌクレオシドは、ＷＯ２００８／１５４４０１およびＷＯ２００９／０６７６４７に開示されており、これらは両方とも参照により本明細書に組み込まれる。

【0132】

本発明の特定の実施形態では、－Ｘ－Ｙ－は－Ｎ（ＯＲ^ａ）－ＣＨ_２－であり、Ｗは酸素であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５およびＲ^５＊は、全て同時に水素である。特定の実施形態では、Ｒ^ａは、メチルなどのアルキルである。このようなＬＮＡヌクレオシドはまた、Ｎ置換ＬＮＡとしても公知であり、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２００８／１５０７２９に開示されている。

【0133】

本発明の特定の実施形態では、－Ｘ－Ｙ－は－Ｏ－Ｎ（Ｒ^ａ）－、－Ｎ（Ｒ^ａ）－Ｏ－、－ＮＲ^ａ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－または－ＮＲ^ａ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－であり、Ｗは酸素であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５およびＲ^５＊は、全て同時に水素である。Ｒ^ａおよびＲ^ｂは、有利には、水素、ハロゲン、アルキルおよびアルコキシアルキル、特に水素、メチル、フルオロおよびメトキシメチルから独立して選択される。特定の実施形態では、Ｒ^ａはアルキル、例えばメチルであり、Ｒ^ｂは水素またはメチル、特に水素である（Ｓｅｔｈら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ、２０１０、前掲）。

【0134】

本発明の特定の実施形態では、－Ｘ－Ｙ－は－Ｏ－Ｎ（ＣＨ_３）－である（Ｓｅｔｈら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ、２０１０、前掲）。

【0135】

本発明の特定の実施形態では、Ｒ^５およびＲ^５＊は、両方とも同時に水素である。本発明の別の特定の実施形態では、Ｒ^５およびＲ^５＊の一方は水素であり、他方はメチルなどのアルキルである。このような実施形態では、Ｒ^１、Ｒ^２およびＲ^３は、特に水素であり得、－Ｘ－Ｙ－は、特に－Ｏ－ＣＨ_２－または－Ｏ－ＣＨＣ（Ｒ^ａ）_３－、例えば－Ｏ－ＣＨ（ＣＨ_３）－であり得る。

【0136】

本発明の特定の実施形態では、－Ｘ－Ｙ－は－ＣＲ^ａＲ^ｂ－Ｏ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－、例えば－ＣＨ_２－Ｏ－ＣＨ_２－であり、Ｗは酸素であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５およびＲ^５＊は、全て同時に水素である。このような特定の実施形態では、Ｒ^ａは、特にアルキル、例えばメチルであり、Ｒ^ｂは水素またはメチル、特に水素であり得る。このようなＬＮＡヌクレオシドはまた、立体配座制限ヌクレオチド（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｌｙ ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ：ＣＲＮ）としても公知であり、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１３／０３６８６８に開示されている。

【0137】

本発明の特定の実施形態では、－Ｘ－Ｙ－は－Ｏ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－Ｏ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－、例えば－Ｏ－ＣＨ_２－Ｏ－ＣＨ_２－であり、Ｗは酸素であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５およびＲ^５＊は、全て同時に水素である。Ｒ^ａおよびＲ^ｂは、有利には、水素、ハロゲン、アルキルおよびアルコキシアルキル、特に水素、メチル、フルオロおよびメトキシメチルから独立して選択される。このような特定の実施形態では、Ｒ^ａは、特にアルキル、例えばメチルであり、Ｒ^ｂは水素またはメチル、特に水素であり得る。このようなＬＮＡヌクレオシドはまた、ＣＯＣヌクレオチドとしても公知であり、参照により本明細書に組み込まれるＭｉｔｓｕｏｋａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００９、３７（４）、１２２５～１２３８に開示されている。

【0138】

特に指定しない限り、ＬＮＡヌクレオシドは、β－Ｄまたはα－Ｌ立体アイソフォームであり得ると認識される。

【0139】

本発明のＬＮＡヌクレオシドの具体的な例をスキーム１に提示する（式中、Ｂは上に定義した通りである）。

【0140】

具体的なＬＮＡヌクレオシドは、β－Ｄ－オキシ－ＬＮＡ、６’－メチル－β－Ｄ－オキシＬＮＡ、例えば（Ｓ）－６’－メチル－β－Ｄ－オキシ－ＬＮＡ（（Ｓ）ｃＥＴ）およびＥＮＡである。

【0141】

ＲＮａｓｅＨ活性および動員
アンチセンスオリゴヌクレオチドのＲＮａｓｅＨ活性は、相補的ＲＮＡ分子と二重鎖を形成する場合にＲＮａｓｅＨを動員する、その能力を指す。ＷＯ０１／２３６１３は、ＲＮａｓｅＨ活性を決定するためのインビトロ方法を提供し、ＲＮａｓｅＨを動員する能力の決定に使用することができる。典型的には、オリゴヌクレオチドは、相補的標的核酸配列が提供されたときに、被験修飾オリゴヌクレオチドと同じ塩基配列を有するが、オリゴヌクレオチドの全モノマー間にホスホロチオエート結合を有するＤＮＡモノマーのみを含むオリゴヌクレオチドを使用し、ＷＯ０１／２３６１３（参照により本明細書に組み込まれる）の実施例９１～９５により提供される方法論を使用して決定された初期速度（ｐｍｏｌ／ｌ／分で測定）の少なくとも５％、例えば少なくとも１０％または２０％超の初期速度を有する場合に、このオリゴヌクレオチドはＲＮａｓｅＨを動員することができるとみなされる。ＲＨａｓｅＨ活性の決定に使用するために、組換えヒトＲＮａｓｅＨ１が、Ｌｕｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＧｍｂＨ、Ｌｕｃｅｒｎｅ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄから入手可能である。

【0142】

ギャップマー
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続するヌクレオチド配列は、ギャップマーであってもよい。アンチセンスギャップマーは、通常、ＲＮａｓｅＨ媒介性分解を介して標的核酸を阻害するために使用される。ギャップマー型オリゴヌクレオチドは、少なくとも３つの別個の構造領域、５’－フランク、ギャップおよび３’－フランク、Ｆ－Ｇ－Ｆ’を５’→３’方向で含む。「ギャップ」領域（Ｇ）は、オリゴヌクレオチドがＲＮａｓｅＨを動員することを可能にする、連続するＤＮＡヌクレオチドのストレッチを含む。ギャップ領域は、１つまたは複数の糖修飾ヌクレオシド、有利には高親和性糖修飾ヌクレオシドを含む５’フランキング領域（Ｆ）と、１つまたは複数の糖修飾ヌクレオシド、有利には高親和性糖修飾ヌクレオシドを含む３’フランキング領域（Ｆ’）が隣接する。領域ＦおよびＦ’の１つまたは複数の糖修飾ヌクレオシドは、標的核酸に対するオリゴヌクレオチドの親和性を向上させる（すなわち、親和性向上糖修飾ヌクレオシドである）。いくつかの実施形態では、領域ＦおよびＦ’の１つまたは複数の糖修飾ヌクレオシドは、例えばＬＮＡおよび２’－ＭＯＥから独立して選択される、高親和性２’糖修飾などの２’糖修飾ヌクレオシドである。

【0143】

ギャップマー設計において、ギャップ領域の最も５’および３’のヌクレオシドはＤＮＡヌクレオシドであり、それぞれ、５’（Ｆ）または３’（Ｆ’）領域の糖修飾ヌクレオシドに隣接して配置されている。フランクはさらに、ギャップ領域から最も遠い端、すなわち、５’フランクの５’末端および３’フランクの３’末端に少なくとも１つの糖修飾ヌクレオシドを有することによって定義されてもよい。

【0144】

領域Ｆ－Ｇ－Ｆ’は、連続するヌクレオチド配列を形成する。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続するヌクレオチド配列は、式Ｆ－Ｇ－Ｆ’のギャップマー領域を含み得る。

【0145】

ギャップマー設計Ｆ－Ｇ－Ｆ’の全長は、例えば１２～３２ヌクレオシド、例えば１３～２４、例えば１４～２２ヌクレオシド、例えば１４～１７、例えば１６～１８ヌクレオシドであり得る。

【0146】

例として、本発明のギャップマー型オリゴヌクレオチドは、以下の式により表すことができる：
Ｆ_１－８－Ｇ_５－１６－Ｆ’_１－８、例えば
Ｆ_１－８－Ｇ_７－１６－Ｆ’_２－８
但し、ギャップマー領域Ｆ－Ｇ－Ｆ’の全長は、少なくとも１２、例えば少なくとも１４ヌクレオチド長であることを条件とする。

【0147】

領域Ｆ、Ｇ、およびＦ’は、さらに以下に定義され、Ｆ－Ｇ－Ｆ’式に組み込むことができる。

【0148】

ギャップマー－領域Ｇ
ギャップマーの領域Ｇ（ギャップ領域）は、オリゴヌクレオチドがＲＮａｓｅＨ、例えばヒトＲＮａｓｅＨ１を動員することを可能にするヌクレオシド、典型的にはＤＮＡヌクレオシドの領域である。ＲＮａｓｅＨは、ＤＮＡとＲＮＡとの間の二重鎖を認識し、ＲＮＡ分子を酵素的に切断する細胞性酵素である。適切なギャップマーは、少なくとも５または６連続するＤＮＡヌクレオシド、例えば５～１６連続するＤＮＡヌクレオシド、例えば６～１５連続するＤＮＡヌクレオシド、例えば７～１４連続するＤＮＡヌクレオシド、例えば８～１２連続するＤＮＡヌクレオチド、例えば８～１２連続ＤＮＡヌクレオチド長のギャップ領域（Ｇ）を有し得る。ギャップ領域Ｇは、いくつかの実施形態では、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６連続するＤＮＡヌクレオシドからなっていてもよい。ギャップ領域のシトシン（Ｃ）ＤＮＡは、場合によってはメチル化されていてもよく、このような残基は、５－メチルシトシン（^ｍｅＣまたはｃの代わりにｅ）として注記される。ギャップ内のシトシンＤＮＡのメチル化は、ｃｇジヌクレオチドがギャップ内に存在して潜在的な毒性を低減させる場合に有利であり、この修飾はオリゴヌクレオチドの有効性に有意な影響を与えない。

【0149】

いくつかの実施形態では、ギャップ領域Ｇは、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６連続するホスホロチオエート結合ＤＮＡヌクレオシドからなっていてもよい。いくつかの実施形態では、ギャップ内の全ヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエート結合である。

【0150】

従来のギャップマーはＤＮＡギャップ領域を有するが、ギャップ領域内で使用される場合にＲＮａｓｅＨ動員を可能にする修飾ヌクレオシドの例が多数存在する。ギャップ領域内に含まれる場合にＲＮａｓｅＨの動員が可能であるとして報告されている修飾ヌクレオシドには、例えば、α－Ｌ－ＬＮＡ、Ｃ４’アルキル化ＤＮＡ（両方とも参照により本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５０３４９およびＶｅｓｔｅｒら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１８（２００８）２２９６～２３００に記載されている通り）、ＡＮＡおよび２’Ｆ－ＡＮＡのようなアラビノース由来ヌクレオシド（Ｍａｎｇｏｓら２００３Ｊ．ＡＭ．ＣＨＥＭ．ＳＯＣ．１２５、６５４～６６１）、ＵＮＡ（アンロックド核酸）（参照により本明細書に組み込まれるＦｌｕｉｔｅｒら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｓｙｓｔ．、２００９、１０、１０３９に記載されている通り）が含まれる。ＵＮＡは、典型的には、リボースのＣ２とＣ３との間の結合が除去され、アンロックド「糖」残基を形成するアンロックド核酸である。このようなギャップマーに使用されている修飾ヌクレオシドは、ギャップ領域内に導入された場合に２’エンド（ｅｎｄｏ）（ＤＮＡ様）構造を採用する（すなわち、ＲＮａｓｅＨ動員を可能にする修飾）ヌクレオシドであってもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＤＮＡギャップ領域（Ｇ）は、任意に、ギャップ領域内に導入された際に２’エンド（ＤＮＡ様）構造を採用する１～３つの糖修飾ヌクレオシドを含んでもよい。

【0151】

領域Ｇ－「ギャップブレーカー」
一方、いくつかのＲＮａｓｅＨ活性を保持しながら、ギャップマーのギャップ領域に３’エンド立体配座を付与する修飾ヌクレオシドの挿入についての多くの報告が存在する。１つまたは複数の３’エンド修飾ヌクレオシドを含むギャップ領域を有するこのようなギャップマーは、「ギャップブレーカー」または「ギャップ破壊」ギャップマーと称され、例えば、ＷＯ２０１３／０２２９８４を参照されたい。ギャップブレーカーオリゴヌクレオチドは、ＲＮａｓｅＨ動員を可能にするために、ギャップ領域内にＤＮＡヌクレオシドの十分な領域を保持する。ＲＮａｓｅＨを動員するためのギャップブレーカーオリゴヌクレオチド設計の能力は、典型的には、配列特異的、または化合物特異的でさえある（Ｒｕｋｏｖら２０１５ Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．第４３巻、第８４７６～８４８７頁を参照されたい）。当該文献は、いくつかの場合、標的ＲＮＡのより特異的な切断を提供するＲＮａｓｅＨを動員する「ギャップブレーカー」オリゴヌクレオチドを開示している。ギャップブレーカーオリゴヌクレオチドのギャップ領域内で使用される修飾ヌクレオシドは、例えば、３’エンドコンファメーションを付与する修飾ヌクレオシド、例えば２’－Ｏ－メチル（ＯＭｅ）もしくは２’－Ｏ－ＭＯＥ（ＭＯＥ）ヌクレオシド、またはβ－Ｄ ＬＮＡヌクレオシド（ヌクレオシドのリボース糖環のＣ２’とＣ４’との間の架橋が、β立体配座である）、例えばβ－Ｄ－オキシＬＮＡまたはＳｃＥＴヌクレオシドであり得る。

【0152】

上述した領域Ｇを含むギャップマーと同様に、ギャップブレーカーまたはギャップ破壊ギャップマーのギャップ領域は、ギャップの５’末端に（領域Ｆの３’ヌクレオシドに隣接して）ＤＮＡヌクレオシドを有し、ギャップの３’末端に（領域Ｆ’の５’ヌクレオシドに隣接して）ＤＮＡヌクレオシドを有する。破壊ギャップを含むギャップマーは、典型的には、ギャップ領域の５’末端または３’末端のいずれかに少なくとも３または４連続するＤＮＡヌクレオシドの領域を保持する。

【0153】

ギャップブレーカーオリゴヌクレオチドの例示的な設計は、
Ｆ_１－８－［Ｄ_３－４－Ｅ_１－Ｄ_３－４］－Ｆ’_１－８
Ｆ_１－８－［Ｄ_１－４－Ｅ_１－Ｄ_３－４］－Ｆ’_１－８
Ｆ_１－８－［Ｄ_３－４－Ｅ_１－Ｄ_１－４］－Ｆ’_１－８
を含み、領域Ｇは角括弧［Ｄ_ｎ－Ｅ_ｒ－Ｄ_ｍ］内であり、ＤはＤＮＡヌクレオシドの連続する配列であり、Ｅは修飾ヌクレオシド（ギャップブレーカーまたはギャップ破壊ヌクレオシド）であり、ＦおよびＦ’は本明細書に定義したフランキング領域であるが、但し、ギャップマー領域Ｆ－Ｇ－Ｆ’の全長は、少なくとも１２、例えば１４ヌクレオチド長であることを条件とする。

【0154】

いくつかの実施形態では、ギャップ破壊ギャップマーの領域Ｇは、少なくとも６つのＤＮＡヌクレオシド、例えば６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６個のＤＮＡヌクレオシドを含む。上記のように、ＤＮＡヌクレオシドは連続であってもよく、任意に、１つまたは複数の修飾ヌクレオシドが散在してもよいが、但し、ギャップ領域Ｇが、ＲＮａｓｅＨ動員を媒介できることを条件とする。

【0155】

ギャップマー－フランキング領域、ＦおよびＦ’
領域Ｆは、領域Ｇの５’ＤＮＡヌクレオシドにすぐ隣接して位置する。領域Ｆの最も３’のヌクレオシドは、糖修飾ヌクレオシド、例えば高親和性糖修飾ヌクレオシド、例えば２’置換ヌクレオシド、例えばＭＯＥヌクレオシド、またはＬＮＡヌクレオシドである。

【0156】

領域Ｆ’は、領域Ｇの３’ＤＮＡヌクレオシドにすぐ隣接して位置する。領域Ｆ’の最も５’のヌクレオシドは、糖修飾ヌクレオシド、例えば高親和性糖修飾ヌクレオシド、例えば２’置換ヌクレオシド、例えばＭＯＥヌクレオシド、またはＬＮＡヌクレオシドである。

【0157】

領域Ｆは、１～８つの連続するヌクレオチド長、例えば２～６つ、例えば３～４つの連続するヌクレオチド長である。有利には、領域Ｆの最も５’のヌクレオシドは、糖修飾ヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、領域Ｆの２つの最も５’のヌクレオシドは、糖修飾ヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、領域Ｆの最も５’のヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、領域Ｆの２つの最も５’のヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、領域Ｆの２つの最も５’のヌクレオシドは、２’置換ヌクレオシドヌクレオシド、例えば２つの３’ＭＯＥヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、領域Ｆの最も５’のヌクレオシドは、２’置換ヌクレオシド、例えばＭＯＥヌクレオシドである。

【0158】

領域Ｆ’は、２～８つの連続するヌクレオチド長、例えば３～６つ、例えば４～５つの連続するヌクレオチド長である。有利には、実施形態領域Ｆ’の最も３’のヌクレオシドは、糖修飾ヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、領域Ｆ’の２つの最も３’のヌクレオシドは、糖修飾ヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、領域Ｆ’の２つの最も３’のヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、領域Ｆ’の最も３’のヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、領域Ｆ’の２つの最も３’のヌクレオシドは、２’置換ヌクレオシドヌクレオシド、例えば２つの３’ＭＯＥヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、領域Ｆ’の最も３’のヌクレオシドは、２’置換ヌクレオシド、例えばＭＯＥヌクレオシドである。

【0159】

領域ＦまたはＦ’の長さが１である場合、それは、有利には、ＬＮＡヌクレオシドであることに留意するべきである。

【0160】

いくつかの実施形態では、領域ＦおよびＦ’は、独立して、糖修飾ヌクレオシドの連続する配列からなるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、領域Ｆの糖修飾ヌクレオシドは、独立して、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ単位、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アミノ－ＤＮＡ単位、２’－フルオロ－ＤＮＡ単位、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、ＭＯＥ単位、ＬＮＡ単位、アラビノ核酸（ＡＮＡ）単位および２’－フルオロ－ＡＮＡ単位から選択されてもよい。

【0161】

いくつかの実施形態では、領域ＦおよびＦ’は、独立して、ＬＮＡおよび２’置換修飾ヌクレオシドの両方を含む（混合ウイング設計）。

【0162】

いくつかの実施形態では、領域ＦおよびＦ’は、１種類のみの糖修飾ヌクレオシド、例えばＭＯＥのみ、またはβ－Ｄ－オキシＬＮＡのみ、またはＳｃＥＴのみからなる。このような設計は、均一フランクまたは均一ギャップマー設計とも称される。

【0163】

いくつかの実施形態では、領域ＦもしくはＦ’、またはＦおよびＦ’の全ヌクレオシドは、例えばβ－Ｄ－オキシＬＮＡ、ＥＮＡまたはＳｃＥＴヌクレオシドから独立して選択されるような、ＬＮＡヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、領域Ｆは、１～５つ、例えば２～４つ、例えば３～４つ、例えば１、２、３、４または５つの連続するＬＮＡヌクレオシドからなる。いくつかの実施形態では、領域ＦおよびＦ’の全ヌクレオシドは、β－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドである。

【0164】

いくつかの実施形態では、領域ＦもしくはＦ’、またはＦおよびＦ’の全ヌクレシドは、２’置換ヌクレオシド、例えばＯＭｅまたはＭＯＥヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、領域Ｆは、１、２、３、４、５、６、７または８つの連続するＯＭｅまたはＭＯＥヌクレオシドからなる。いくつかの実施形態では、フランキング領域の一方のみが、２’置換ヌクレオシド、例えばＯＭｅまたはＭＯＥヌクレオシドからなり得る。いくつかの実施形態では、２’置換ヌクレオシド、例えばＯＭｅまたはＭＯＥヌクレオシドからなるのは５’（Ｆ）フランキング領域であり、一方、３’（Ｆ’）フランキング領域は、少なくとも１つのＬＮＡヌクレオシド、例えばβ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドまたはｃＥＴヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、２’置換ヌクレオシド、例えばＯＭｅまたはＭＯＥヌクレオシドからなるのは３’（Ｆ’）フランキング領域であり、一方、５’（Ｆ）フランキング領域は、少なくとも１つのＬＮＡヌクレオシド、例えばβ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドまたはｃＥＴヌクレオシドを含む。

【0165】

いくつかの実施形態では、領域ＦおよびＦ’の全修飾ヌクレオシドは、例えばβ－Ｄ－オキシＬＮＡ、ＥＮＡまたはＳｃＥＴヌクレオシドから独立して選択されるようなＬＮＡヌクレオシドであり、領域ＦもしくはＦ’、またはＦおよびＦ’は、任意に、ＤＮＡヌクレオシドを含んでもよい（交互フランク、より詳細にはこれらの定義を参照されたい）。いくつかの実施形態では、領域ＦおよびＦ’の全修飾ヌクレオシドはβ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドであり、一方、領域ＦもしくはＦ’、またはＦおよびＦ’は、任意に、ＤＮＡヌクレオシドを含んでもよい（交互フランク、より詳細にはこれらの定義を参照されたい）。

【0166】

いくつかの実施形態では、領域ＦおよびＦ’の最も５’および最も３’のヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシド、例えばβ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドまたはＳｃＥＴヌクレオシドである。

【0167】

いくつかの実施形態では、領域Ｆと領域Ｇとの間のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。いくつかの実施形態では、領域Ｆ’と領域Ｇとの間のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。いくつかの実施形態では、領域ＦまたはＦ’、ＦおよびＦ’のヌクレオシド間のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。

【0168】

さらなるギャップマー設計は、ＷＯ２００４／０４６１６０、ＷＯ２００７／１４６５１１およびＷＯ２００８／１１３８３２に開示されており、これらは参照により本明細書に組み込まれる。

【0169】

ＬＮＡギャップマー
ＬＮＡギャップマーは、領域ＦおよびＦ’のいずれか一方または両方が、ＬＮＡヌクレオシドを含むか、またはそれからなるギャップマーである。β－Ｄ－オキシギャップマーは、領域ＦおよびＦ’のいずれか一方または両方が、β－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドを含むか、またはそれからなるギャップマーである。

【0170】

いくつかの実施形態では、ＬＮＡギャップマーは、式：［ＬＮＡ］_１－５－［領域Ｇ］－［ＬＮＡ］_１－５のものであり、領域Ｇはギャップマー領域Ｇの定義に規定した通りである。

【0171】

ＭＯＥギャップマー
ＭＯＥギャップマーは、領域ＦおよびＦ’がＭＯＥヌクレオシドからなるギャップマーである。いくつかの実施形態では、ＭＯＥギャップマーは、設計［ＭＯＥ］_１－８－［領域Ｇ］－［ＭＯＥ］_１－８、例えば［ＭＯＥ］_２－７－［領域Ｇ］_５－１６－［ＭＯＥ］_２－７、例えば［ＭＯＥ］_３－６－［領域Ｇ］－［ＭＯＥ］_３－６のものであり、領域Ｇはギャップマーの定義に規定した通りである。５－１０－５設計（ＭＯＥ－ＤＮＡ－ＭＯＥ）を有するＭＯＥギャップマーは、当技術分野で広く使用されている。

【0172】

混合ウイングギャップマー
混合ウイングギャップマーは、領域ＦおよびＦ’の一方または両方が、２’置換ヌクレオシド、例えば２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ単位、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アミノ－ＤＮＡ単位、２’－フルオロ－ＤＮＡ単位、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、ＭＯＥ単位、アラビノ核酸（ＡＮＡ）単位および２’－フルオロ－ＡＮＡ単位から独立して選択される２’置換ヌクレオシド、例えばＭＯＥヌクレオシドを含むＬＮＡギャップマーである。領域ＦおよびＦ’の少なくとも一方、または領域ＦおよびＦ’の両方が少なくとも１つのＬＮＡヌクレオシドを含むいくつかの実施形態では、領域ＦおよびＦ’の残りのヌクレオシドは、ＭＯＥおよびＬＮＡからなる群から独立して選択される。領域ＦおよびＦ’の少なくとも一方、または領域ＦおよびＦ’の両方が少なくとも２つのＬＮＡヌクレオシドを含むいくつかの実施形態では、領域ＦおよびＦ’の残りのヌクレオシドは、ＭＯＥおよびＬＮＡからなる群から独立して選択される。いくつかの混合ウイング実施形態では、領域ＦおよびＦ’の一方または両方が、１つまたは複数のＤＮＡヌクレオシドをさらに含んでもよい。

【0173】

混合ウイングギャップマー設計は、ＷＯ２００８／０４９０８５およびＷＯ２０１２／１０９３９５に開示されており、これらは両方とも参照により本明細書に組み込まれる）。

【0174】

交互フランクギャップマー
フランキング領域は、ＬＮＡおよびＤＮＡヌクレオシドの両方を含み得、それらがＬＮＡ－ＤＮＡ－ＬＮＡヌクレオシドの交互モチーフを含むので、「交互フランク」と称される。このような交互フランクを含むギャップマーは、「交互フランクギャップマー」と称される。したがって、「代替フランクギャップマー」は、フランク（ＦまたはＦ’）の少なくとも一方がＬＮＡヌクレオシド（複数可）に加えてＤＮＡを含む、ＬＮＡギャップマー型オリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、領域ＦもしくはＦ’の少なくとも一方、または領域ＦおよびＦ’の両方は、ＬＮＡヌクレオシドおよびＤＮＡヌクレオシドの両方を含む。このような実施形態では、フランキング領域ＦもしくはＦ’、またはＦおよびＦ’の両方は、少なくとも３つのヌクレオシドを含み、Ｆおよび／またはＦ’領域の最も５’および３’のヌクレオシドが、ＬＮＡヌクレオシドである。

【0175】

交互フランクＬＮＡギャップマーは、ＷＯ２０１６／１２７００２に開示されている。

【0176】

交互フランク領域は、１～２つ、または１つ、または２つ、または３つの連続するＤＮＡヌクレオシドなどの最大３つの連続するＤＮＡヌクレオシドを含み得る。

【0177】

交互フラック（ｆｌａｋ）は、いくつかのＬＮＡヌクレオシド（Ｌ）、それに続くいくつかのＤＮＡヌクレオシド（Ｄ）の数を表す、例えば、
［Ｌ］_１－３－［Ｄ］_１－４－［Ｌ］_１－３
［Ｌ］_１－２－［Ｄ］_１－２－［Ｌ］_１－２－［Ｄ］_１－２－［Ｌ］_１－２の一連の整数として注記することができる。

【0178】

オリゴヌクレオチド設計では、これらは、２－２－１が５’［Ｌ］_２－［Ｄ］_２－［Ｌ］３’を表し、１－１－１－１－１が５’［Ｌ］－［Ｄ］－［Ｌ］－［Ｄ］－［Ｌ］３’を表すような数として表されることが多い。交互フランクを有するオリゴヌクレオチドにおけるフランクの長さ（領域ＦおよびＦ’）は、独立して、３～１０ヌクレオシド、例えば４～８、例えば５～６ヌクレオシド、例えば４、５、６、または７個の修飾ヌクレオシドであり得る。いくつかの実施形態では、ギャップマー型オリゴヌクレオチド中のフランクの一方のみが交互であるが、他方はＬＮＡヌクレオチドから構成される。さらなるエキソヌクレアーゼ耐性を付与するために、３’フランク（Ｆ’）の３’末端に少なくとも２つのＬＮＡヌクレオシドを有することが有利であり得る。交互フランクを有するオリゴヌクレオチドのいくつかの例は：
［Ｌ］_１－５－［Ｄ］_１－４－［Ｌ］_１－３－［Ｇ］_５－１６－［Ｌ］_２－６
［Ｌ］_１－２－［Ｄ］_１－２－［Ｌ］_１－２－［Ｄ］_１－２－［Ｌ］_１－２－［Ｇ］_５－１６－［Ｌ］_１－２－［Ｄ］_１－３－［Ｌ］_２－４
［Ｌ］_１－５－［Ｇ］_５－１６－［Ｌ］－［Ｄ］－［Ｌ］－［Ｄ］－［Ｌ］_２であり、
但し、ギャップマーの全長は、少なくとも１２、例えば少なくとも１４ヌクレオチド長であることを条件とする。

【0179】

オリゴヌクレオチド内の領域Ｄ’またはＤ’’
本発明のオリゴヌクレオチドは、いくつかの実施形態では、標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチドの連続するヌクレオチド配列、例えばギャップマーＦ－Ｇ－Ｆ’、ならびにさらに５’および／または３’ヌクレオシドを含むか、またはそれからなり得る。さらなる５’および／または３’ヌクレオシドは、標的核酸に完全に相補的であっても、完全に相補的でなくてもよい。このようなさらなる５’および／または３’ヌクレオシドは、本明細書では領域Ｄ’およびＤ’’と称され得る。

【0180】

領域Ｄ’またはＤ’’の付加は、連続するヌクレオチド配列、例えばギャップマーをコンジュゲート部分または別の官能基に連結する目的のために使用され得る。連続するヌクレオチド配列をコンジュゲート部分と連結するために使用する場合、生体切断可能なリンカーとしての役割を果たし得る。あるいは、それはエキソヌクレアーゼ保護をもたらすために、または合成もしくは製造を容易にするために使用され得る。

【0181】

領域Ｄ’およびＤ’’は、それぞれ、領域Ｆの５’末端または領域Ｆ’の３’末端に結合して、以下の式Ｄ’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’、Ｆ－Ｇ－Ｆ’－Ｄ’’またはＤ’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’－Ｄ’’の設計を生成することができる。この場合、Ｆ－Ｇ－Ｆ’はオリゴヌクレオチドのギャップマー部分であり、領域Ｄ’またはＤ’’は、オリゴヌクレオチドの別個の部分を構成する。

【0182】

領域Ｄ’またはＤ’’は、独立して、１、２、３、４または５個の追加のヌクレオチドを含むか、またはそれからなり、標的核酸に相補的であっても、相補的でなくてもよい。ＦまたはＦ’領域に隣接するヌクレオチドは、糖修飾ヌクレオチドではなく、例えばＤＮＡもしくはＲＮＡまたはこれらの塩基修飾バージョンである。Ｄ’またはＤ’領域は、ヌクレアーゼ感受性の生体切断可能なリンカーとしての役割を果たし得る（リンカーの定義を参照されたい）。いくつかの実施形態では、追加の５’および／または３’末端ヌクレオチドは、ホスホジエステル結合で結合されており、ＤＮＡまたはＲＮＡである。領域Ｄ’およびＤ’’としての使用に適切なヌクレオチドベースの生体切断可能なリンカーは、ＷＯ２０１４／０７６１９５に開示されており、これは例としてホスホジエステルで結合されたＤＮＡジヌクレオチドを含む。ポリオリゴヌクレオチドコンストラクトにおける生体切断可能なリンカーの使用は、ＷＯ２０１５／１１３９２２に開示されており、それらは複数のアンチセンスコンストラクト（例えば、ギャップマー領域）を単一のオリゴヌクレオチド内で結合するのに使用されている。

【0183】

一実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、ギャップマーを構成する連続するヌクレオチド配列に加えて、領域Ｄ’および／またはＤ’’を含む。

【0184】

いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、以下の式により表すことができる：
Ｆ－Ｇ－Ｆ’、特にＦ_１－８－Ｇ_５－１６－Ｆ’_２－８
Ｄ’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’、特にＤ’_１－３－Ｆ_１－８－Ｇ_５－１６－Ｆ’_２－８
Ｆ－Ｇ－Ｆ’－Ｄ’’、特にＦ_１－８－Ｇ_５－１６－Ｆ’_２－８－Ｄ’’_１－３
Ｄ’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’－Ｄ’’、特にＤ’_１－３－Ｆ_１－８－Ｇ_５－１６－Ｆ’_２－８－Ｄ’’_１－３。

【0185】

いくつかの実施形態では、領域Ｄ’と領域Ｆとの間に位置するヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル結合である。いくつかの実施形態では、領域Ｆ’と領域Ｄ’’との間に位置するヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル結合である。

【0186】

トータルマー（ｔｏｔａｌｍｅｒ）
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドまたはその連続するヌクレオチド配列のヌクレオシドの全てが糖修飾ヌクレオシドである。このようなオリゴヌクレオチドは、本明細書ではトータルマーと称される。

【0187】

いくつかの実施形態では、トータルマーの糖修飾ヌクレオシドの全ては、同じ糖修飾を含み、例えば、それらは全てＬＮＡヌクレオシドであってもよく、全て２’Ｏ－ＭＯＥヌクレオシドであってもよい。いくつかの実施形態では、トータルマーの糖修飾ヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシドおよび２’置換ヌクレオシドであって、例えば、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ（ＭＯＥ）、２’－アミノ－ＤＮＡ、２’－フルオロ－ＲＮＡ、および２’－Ｆ－ＡＮＡヌクレオシドからなる群から選択される、２’置換ヌクレオシドから独立して選択されてもよい。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＬＮＡヌクレオシドおよび２’置換ヌクレオシドであって、例えば、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ（ＭＯＥ）、２’－アミノ－ＤＮＡ、２’－フルオロ－ＲＮＡ、および２’－Ｆ－ＡＮＡヌクレオシドからなる群から選択される、２’置換ヌクレオシドの両方を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＬＮＡヌクレオシドおよび２’－Ｏ－ＭＯＥヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、（Ｓ）ｃＥＴ ＬＮＡヌクレオシドおよび２’－Ｏ－ＭＯＥヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの各ヌクレオシド単位は、２’置換ヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの各ヌクレオシド単位は、２’－Ｏ－ＭＯＥヌクレオシドである。

【0188】

いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドまたはその連続するヌクレオチド配列の全てのヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシド、例えば、β－Ｄ－オキシ－ＬＮＡヌクレオシドおよび／または（Ｓ）ｃＥＴヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、このようなＬＮＡトータルマーオリゴヌクレオチドは、７～１２ヌクレオシド長である（例えば、ＷＯ２００９／０４３３５３を参照されたい）。このような短い完全ＬＮＡオリゴヌクレオチドは、マイクロＲＮＡの阻害に特に有効である。

【0189】

さまざまなトータルマー化合物は、特にマイクロＲＮＡを標的とするときの治療用オリゴマー（ａｎｔｉｍｉＲ）として、またはスプライススイッチングオリゴマー（ＳＳＯ）として非常に有効である。

【0190】

いくつかの実施形態では、トータルマーは、反復配列ＸＹＸまたはＹＸＹなどの少なくとも１つのＸＹＸまたはＹＸＹ配列モチーフを含むか、またはそれからなり、ここで、ＸはＬＮＡであり、Ｙは２’－ＯＭｅ ＲＮＡ単位および２’－フルオロＤＮＡ単位などの代替（すなわち、非ＬＮＡ）ヌクレオチドアナログである。上記の配列モチーフは、いくつかの実施形態では、例えば、ＸＸＹ、ＸＹＸ、ＹＸＹまたはＹＹＸであり得る。

【0191】

いくつかの実施形態では、トータルマーは、７～２４ヌクレオチド、例えば、７、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２もしくは２３ヌクレオチドの連続するヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなってもよい。

【0192】

いくつかの実施形態では、トートルマーの連続するヌクレオチド配列は、少なくとも３０％、例えば少なくとも４０％、例えば少なくとも５０％、例えば少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば９５％、例えば１００％のＬＮＡ単位を含む。完全なＬＮＡ化合物の場合、１２ヌクレオチド長未満、例えば７～１０であることが有利である。

【0193】

残りの単位は、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ単位、２’－ＯＭｅ－ＲＮＡ単位、２’－アミノ－ＤＮＡ単位、２’－フルオロ－ＤＮＡ単位、ＬＮＡ単位、ＰＮＡ単位、ＨＮＡ単位、ＩＮＡ単位、および２’－ＭＯＥ ＲＮＡ単位からなる群、または２’－ＯＭｅ ＲＮＡ単位および２’－フルオロＤＮＡ単位群から選択されるものなど、本明細書で言及される非ＬＮＡヌクレオチドアナログから選択されてもよい。

【0194】

ミックスマー
用語「ミックスマー」は、ＤＮＡヌクレオシドと糖修飾ヌクレオシドとの両方を含むオリゴマーを指し、ＲＮａｓｅＨを動員するには連続するＤＮＡヌクレオシド長が不十分である。適切なミックスマーは、最大３つまたは最大４つの連続するＤＮＡヌクレオシドを含み得る。いくつかの実施形態では、ミックスマーは、糖修飾ヌクレオシドとＤＮＡヌクレオシドとの交互領域を含む。オリゴヌクレオチドに取り込まれたときにＲＮＡ様（３’エンド）立体配座を形成する糖修飾ヌクレオシドの領域と、ＤＮＡヌクレオシドの短い領域と交互に配置することにより、非ＲＮａｓｅＨ動員オリゴヌクレオチドを作製することができる。有利には、糖修飾ヌクレオシドは、親和性増強糖修飾ヌクレオシドである。

【0195】

オリゴヌクレオチドミックスマーは、スプライスモジュレーターまたはマイクロＲＮＡ阻害剤などの標的遺伝子の役割に基づく調節をもたらすために使用されることが多い。

【0196】

いくつかの実施形態では、ミックスマー中の糖修飾ヌクレオシド、またはその連続するヌクレオチド配列は、ＬＮＡヌクレオシド、例えば（Ｓ）ｃＥＴもしくはβ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドを含むか、または全てそれらである。

【0197】

いくつかの実施形態では、ミックスマーの糖修飾ヌクレオシドの全ては、同じ糖修飾を含み、例えば、それらは、全てＬＮＡヌクレオシドであっても、全て２’Ｏ－ＭＯＥヌクレオシドであってもよい。いくつかの実施形態では、ミックスマーの糖修飾ヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシドおよび２’置換ヌクレオシドであって、例えば、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ（ＭＯＥ）、２’－アミノ－ＤＮＡ、２’－フルオロ－ＲＮＡ、および２’－Ｆ－ＡＮＡヌクレオシドからなる群から選択される、２’置換ヌクレオシドから独立して選択されてもよい。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＬＮＡヌクレオシドおよび２’置換ヌクレオシドであって、例えば、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ（ＭＯＥ）、２’－アミノ－ＤＮＡ、２’－フルオロ－ＲＮＡ、および２’－Ｆ－ＡＮＡヌクレオシドからなる群から選択される、２’置換ヌクレオシドの両方を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオイチドは、ＬＮＡヌクレオシドおよび２’－Ｏ－ＭＯＥヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、（Ｓ）ｃＥＴ ＬＮＡヌクレオシドおよび２’－Ｏ－ＭＯＥヌクレオシドを含む。

【0198】

いくつかの実施形態では、ミックスマーまたはその連続するヌクレオチド配列は、ＬＮＡおよびＤＮＡヌクレオシドのみを含み、このようなＬＮＡミックスマーオリゴヌクレオチドは、例えば、８～２４ヌクレオシド長であり得る（例えば、マイクロＲＮＡのＬＮＡ ａｎｔｍｉＲ阻害剤を開示するＷＯ２００７／１１２７５４を参照されたい）。

【0199】

さまざまなミックスマー化合物は、特にマイクロＲＮＡを標的とするときの治療用オリゴマー（ａｎｔｉｍｉＲ）として、またはスプライススイッチングオリゴマー（ＳＳＯ）として非常に有効である。

【0200】

いくつかの実施形態では、ミックスマーは、次のモチーフを含む：
．．．［Ｌ］ｍ［Ｄ］ｎ［Ｌ］ｍ［Ｄ］ｎ［Ｌ］ｍ．．．、または
．．．［Ｌ］ｍ［Ｄ］ｎ［Ｌ］ｍ［Ｄ］ｎ［Ｌ］ｍ［Ｄ］ｎ［Ｌ］ｍ．．．、または
．．．［Ｌ］ｍ［Ｄ］ｎ［Ｌ］ｍ［Ｄ］ｎ［Ｌ］ｍ［Ｄ］ｎ［Ｌ］ｍ［Ｄ］ｎ［Ｌ］ｍ．．．、または
．．．［Ｌ］ｍ［Ｄ］ｎ［Ｌ］ｍ［Ｄ］ｎ［Ｌ］ｍ［Ｄ］ｎ［Ｌ］ｍ［Ｄ］ｎ［Ｌ］ｍ［Ｄ］ｎ［Ｌ］ｍ．．．

【0201】

ここで、ＬはＬＮＡまたは２’置換ヌクレオシド（例えば２’－Ｏ－ＭＯＥ）などの糖修飾ヌクレオシドを表し、ＤはＤＮＡヌクレオシドを表し、各ｍは１～６から独立して選択され、各ｎは１、２、３および４、例えば１～３から独立して選択される。いくつかの実施形態では、各Ｌは、ＬＮＡヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＬはＬＮＡヌクレオシドであり、少なくとも１つのＬは２’－Ｏ－ＭＯＥヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、各Ｌは、ＬＮＡおよび２’－Ｏ－ＭＯＥヌクレオシドから独立して選択される。

【0202】

いくつかの実施形態では、ミックスマーは、１０～２４ヌクレオチド、例えば、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２もしくは２３ヌクレオチドの連続するヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなってもよい。

【0203】

いくつかの実施形態では、ミックスマーの連続するヌクレオチド配列は、少なくとも３０％、例えば少なくとも４０％、例えば少なくとも５０％のＬＮＡ単位を含む。

【0204】

いくつかの実施形態では、ミックスマーは、ヌクレオチドアナログと天然に存在するヌクレオチドとの、またはあるタイプのヌクレオチドアナログと第２のタイプのヌクレオチドアナログとの繰返しパターンの連続するヌクレオチド配列を含むか、またはそれらからなる。繰返しパターンは、例えば、次のようになり得る：１つ置きもしくは２つ置きのヌクレオチドは、ＬＮＡなどのヌクレオチドアナログであり、残りのヌクレオチドは、ＤＮＡなどの天然に存在するヌクレオチドであるか、または本明細書で言及される２’フルオロアナログの２’ＭＯＥなどの２’置換ヌクレオチドアナログ、またはいくつかの実施形態では、本明細書で言及されるヌクレオチドアナログの群から選択されるものである。ＬＮＡ単位などのヌクレオチドアナログの繰返しパターンは、固定した位置、例えば５’末端または３’末端でヌクレオチドアナログと組み合わせられ得ることが認識されている。

【0205】

いくつかの実施形態では、３’末端から数えて、オリゴマーの１番目のヌクレオチドは、ＬＮＡヌクレオチドまたは２’－Ｏ－ＭＯＥヌクレオシドなどのヌクレオチドアナログである。

【0206】

同じであっても異なっていてもよいいくつかの実施形態では、３’末端から数えて、オリゴマーの２番目のヌクレオチドは、ＬＮＡヌクレオチドまたは２’－Ｏ－ＭＯＥヌクレオシドなどのヌクレオチドアナログである。

【0207】

同じであっても異なっていてもよいいくつかの実施形態では、オリゴマーの５’末端は、ＬＮＡヌクレオチドまたは２’－Ｏ－ＭＯＥヌクレオシドなどのヌクレオチドアナログである。

【0208】

いくつかの実施形態では、ミックスマーは、少なくとも２つの連続するヌクレオチドアナログ単位、例えば少なくとも２つの連続するＬＮＡ単位を含む領域を少なくとも含む。

【0209】

いくつかの実施形態では、ミックスマーは、少なくとも３つの連続するヌクレオチドアナログ単位、例えば少なくとも３つの連続するＬＮＡ単位を含む領域を少なくとも含む。

【0210】

コンジュゲート
本明細書で使用されるコンジュゲートという用語は、非ヌクレオチド部分（コンジュゲート部分または領域Ｃまたは第３の領域）に共有結合したオリゴヌクレオチドを指す。

【0211】

１つまたは複数の非ヌクレオチド部分に対する本発明のオリゴヌクレオチドのコンジュゲーションは、例えば、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、細胞取込み、または安定性に影響を及ぼすことにより、オリゴヌクレオチドの薬効薬理を改善し得る。いくつかの実施形態では、コンジュゲート部分は、オリゴヌクレオチドの細胞分布、バイオアベイラビリティ、代謝、排出、浸透性、および／または細胞取込みを改善することにより、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を調節または増強する。特に、コンジュゲートは、オリゴヌクレオチドを特定の器官、組織または細胞型に標的化し、それにより、その器官、組織または細胞型におけるオリゴヌクレオチドの有効性を増強し得る。同時に、コンジュゲートは、非標的細胞型、組織または器官内のオリゴヌクレオチドの活性を低下させるのに役立ち得る（例えば、非標的細胞型、組織または器官におけるオフターゲット活性または活性）。

【0212】

ＷＯ９３／０７８８３およびＷＯ２０１３／０３３２３０は、適切なコンジュゲート部分を提供し、これらは参照により本明細書に組み込まれる。さらに適切なコンジュゲート部分は、アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）に結合することができる部分である。特に、三価のＮ－アセチルガラクトサミンのコンジュゲート部分は、ＡＳＧＰＲへの結合に適しており、例えば、ＷＯ２０１４／０７６１９６、ＷＯ２０１４／２０７２３２およびＷＯ２０１４／１７９６２０（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。このようなコンジュゲートは、肝臓へのオリゴヌクレオチドの取込みを増強するよう機能する一方で、腎臓におけるその存在を低減させ、それにより、コンジュゲートしたオリゴヌクレオチドの肝臓／腎臓比を、同じオリゴヌクレオチドの未コンジュゲートバージョンと比較して上昇させる。

【0213】

オリゴヌクレオチドコンジュゲートとその合成については、ＭａｎｏｈａｒａｎによるＡｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｄｒｕｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｓ．Ｔ．Ｃｒｏｏｋｅ編、第１６章、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、２００１およびＭａｎｏｈａｒａｎ、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、２００２、１２、１０３の包括的なレビューでも報告されており、これらそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0214】

ある実施形態では、非ヌクレオチド部分（コンジュゲート部分）は、炭水化物、細胞表面受容体リガンド、原薬、ホルモン、親油性物質、ポリマー、タンパク質、ペプチド、毒素（例えば、細菌毒素）、ビタミン、ウイルスタンパク質（例えば、キャプシド）またはそれらの組合せからなる群から選択される。

【0215】

リンカー
結合またはリンカーは、１つまたは複数の共有結合を介して、ある目的の化学基またはセグメントを別の目的の化学基またはセグメントに結合する、２個の原子間の接続である。コンジュゲート部分は、直接、または結合部分（例えば、リンカーまたはテザー）を介してオリゴヌクレオチドに結合させることができる。リンカーは、例えばコンジュゲート部分などの第３の領域（領域Ｃ）を、例えば標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチドまたは連続するヌクレオチド配列などの第１の領域（領域Ａ）に共有結合させるよう機能する。

【0216】

本発明のいくつかの実施形態では、本発明のコンジュゲートまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、任意に、標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチドまたは連続するヌクレオチド配列（領域Ａまたは第１の領域）と、コンジュゲート部分（領域Ｃまたは第３の領域）との間に位置するリンカー領域（第２の領域または領域Ｂおよび／または領域Ｙ）を含み得る。

【0217】

領域Ｂは、哺乳動物の体内で通常見られる条件下、または見られるものに類似した条件下で切断可能である生理学的に不安定な結合を含むか、またはそれからなる生体切断可能なリンカーを指す。生理学的に不安定なリンカーが化学的変換（例えば、切断）を受ける条件には、哺乳動物細胞で見られる、または見られるものに類似した、ｐＨ、温度、酸化もしくは還元条件または酸化もしくは還元剤、および塩濃度などの化学的条件が含まれる。哺乳動物の細胞内条件には、タンパク質分解酵素または加水分解酵素またはヌクレアーゼなどに由来する、哺乳動物細胞に通常存在する酵素活性の存在も含まれる。一実施形態では、生体切断可能なリンカーは、Ｓ１ヌクレアーゼ切断の影響を受けやすい。好ましい実施形態では、ヌクレアーゼ感受性リンカーは、１～１０個のヌクレオシド、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のヌクレオシドを含み、より好ましくは２～６個のヌクレオシドを含み、最も好ましくは２～４個の結合したヌクレオシドを含み、これは少なくとも３または４または５つの連続するホスホジエステル結合などの少なくとも２つの連続するホスホジエステル結合を含む。好ましくは、ヌクレオシドは、ＤＮＡまたはＲＮＡである。ホスホジエステルを含む生体切断可能なリンカーは、ＷＯ２０１４／０７６１９５（参照により本明細書に組み込まれる）においてより詳細に記載されている。

【0218】

領域Ｙは、必ずしも生体切断可能ではないが、主にコンジュゲート部分（領域Ｃまたは第３の領域）をオリゴヌクレオチド（領域Ａまたは第１の領域）に共有結合する役割を果たすリンカーを指す。領域Ｙリンカーは、鎖構造、またはエチレングリコール、アミノ酸単位もしくはアミノアルキル基などの繰返し単位のオリゴマーを含み得る。本発明のオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、以下の局所要素Ａ－Ｃ、Ａ－Ｂ－Ｃ、Ａ－Ｂ－Ｙ－Ｃ、Ａ－Ｙ－Ｂ－ＣまたはＡ－Ｙ－Ｃから構築することができる。いくつかの実施形態では、リンカー（領域Ｙ）は、例えばＣ６～Ｃ１２アミノアルキル基を含むＣ２～Ｃ３６アミノアルキル基などのアミノアルキルである。好ましい実施形態では、リンカー（領域Ｙ）は、Ｃ６アミノアルキル基である。

【0219】

したがって、本発明は、特に次のものに関する：
（Ａ^１）および（Ａ^２）の一方が糖修飾ヌクレオシドであり、他方がＤＮＡである、本発明に記載のオリゴヌクレオチド；
（Ａ^１）および（Ａ^２）が両方とも同時に糖修飾ヌクレオシドである、本発明に記載のオリゴヌクレオチド；
糖修飾ヌクレオシドが、独立して２’糖修飾ヌクレオシドである、本発明に記載のオリゴヌクレオチド；
２’糖修飾ヌクレオシドが、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、特に２’－メトキシ－ＲＮＡ、２’－アルコキシアルコキシ－ＲＮＡ、特に２’－メトキシエトキシ－ＲＮＡ、２’－アミノ－ＤＮＡ、２’－フルオロ－ＲＮＡ、または２’－フルオロ－ＡＮＡから独立して選択される、本発明に記載のオリゴヌクレオチド；
２’糖修飾ヌクレオシドが、２’－アルコキシアルコキシ－ＲＮＡ、特に２’－メトキシエトキシ－ＲＮＡである、本発明に記載のオリゴヌクレオチド；
２’糖修飾ヌクレオシドがＬＮＡヌクレオシドである、本発明に記載のオリゴヌクレオチド；
ＬＮＡヌクレオシドが、β－Ｄ－オキシＬＮＡ、６’－メチル－β－Ｄ－オキシＬＮＡ、およびＥＮＡから独立して選択され、特にβ－Ｄ－オキシＬＮＡである、本発明に記載のオリゴヌクレオチド；
ホスホジエステルヌクレオシド間結合、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合および式（Ｉ）に定義されたヌクレオシド間結合から選択されるさらなるヌクレオシド間結合を含む、本発明に記載のオリゴヌクレオチド；
ホスホロチオエートヌクレオシド間結合および式（Ｉ）に定義されたヌクレオシド間結合から選択されるさらなるヌクレオシド間結合を含む、本発明に記載のオリゴヌクレオチド；
１～１５個、特に１～５個、より詳細には１、２、３、４、または５個の、式（Ｉ）に定義された式（Ｉ）のジヌクレオシドを含む、本発明に記載のオリゴヌクレオチド；
さらなるヌクレオシド間結合が全て、式－Ｐ（＝Ｓ）（ＯＲ）Ｏ_２－（式中、Ｒは、水素またはリン酸保護基）のホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、本発明に記載のオリゴヌクレオチド；
ＤＮＡヌクレオシド、ＲＮＡヌクレオシド、および糖修飾ヌクレオシドから選択されるさらなるヌクレオシドを含む、本発明に記載のオリゴヌクレオチド；
１つまたは複数のヌクレオシドが、５－メチルシトシン核酸塩基を含むヌクレオシドなどの、核酸塩基修飾ヌクレオシドである、本発明に記載のオリゴヌクレオチド；
式（Ｉ）の少なくとも１つのジヌクレオシドが、アンチセンスギャップマー型オリゴヌクレオチドのフランキング領域中にあるか、またはアンチセンスギャップマー型オリゴヌクレオチドのギャップ領域とフランキング領域との間に位置する、すなわち、（Ａ^１）および（Ａ^２）が両方とも同時に糖修飾ヌクレオシドであるか、または（Ａ^１）および（Ａ^２）の一方がＤＮＡヌクレオシドもしくはＲＮＡヌクレオシドであり、他方が糖修飾ヌクレオシドである、本発明に記載のオリゴヌクレオチド；
ギャップマー型オリゴヌクレオチドが、ＬＮＡギャップマー、混合ウイングギャップマーまたは２’－置換ギャップマー、特に２’－Ｏ－メトキシエチルギャップマーである、本発明に記載のオリゴヌクレオチド；
Ａが硫黄である、本発明に記載のオリゴヌクレオチド。
アンチセンスギャップマー型オリゴヌクレオチドが、式５’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’－３’の連続するヌクレオチド配列を含み、式中、Ｇは、ＲＮａｓｅＨを動員することができる５～１８個のヌクレオシドの領域であり、前記領域Ｇは、５’および３’がそれぞれフランキング領域ＦおよびＦ’によって隣接されており、領域ＦおよびＦ’は、独立して、１～７つの２’－糖修飾ヌクレオチドを含むか、またはそれからなり、領域Ｇに隣接する領域Ｆのヌクレオシドは２’－糖修飾ヌクレオシドであり、領域Ｇに隣接する領域Ｆ’のヌクレオシドは２’－糖修飾ヌクレオシドである、本発明に記載のオリゴヌクレオチド；
式（Ｉ）の少なくとも１つのジヌクレオシドが、領域ＦもしくはＦ’中に、または領域Ｇと領域Ｆとの間に、または領域Ｇと領域Ｆ’との間に位置する、本発明に記載のオリゴヌクレオチド；
領域Ｆもしくは領域Ｆ’、または領域ＦおよびＦ’の両方における２’－糖修飾ヌクレオシドが、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、特に２’－メトキシ－ＲＮＡ、２’－アルコキシアルコキシ－ＲＮＡ、特に２’－メトキシエトキシ－ＲＮＡ、２’－アミノ－ＤＮＡ、２’－フルオロ－ＲＮＡ、２’－フルオロ－ＡＮＡ、およびＬＮＡヌクレオシドから独立して選択される、本発明に記載のオリゴヌクレオチド；
領域Ｆもしくは領域Ｆ’、または領域ＦおよびＦ’の両方における全ての２’－糖修飾ヌクレオシドが、ＬＮＡヌクレオシドである、本発明に記載のオリゴヌクレオチド；
領域Ｆもしくは領域Ｆ’、または領域ＦおよびＦ’の両方における２’－糖修飾ヌクレオシドが、全て２’－アルコキシ－ＲＮＡ、特に２’－メトキシ－ＲＮＡ、全て２’－アルコキシアルコキシ－ＲＮＡ、特に２’－メトキシエトキシ－ＲＮＡ、全て２’－アミノ－ＤＮＡ、全て２’－フルオロ－ＲＮＡ、全て２’－フルオロ－ＡＮＡまたは全てＬＮＡヌクレオシドである、本発明に記載のオリゴヌクレオチド；
領域Ｆもしくは領域Ｆ’、または領域ＦおよびＦ’の両方が、少なくとも１つのＬＮＡヌクレオシドおよび少なくとも１つのＤＮＡヌクレオシドを含む、本発明に記載のオリゴヌクレオチド；
領域Ｆもしくは領域Ｆ’、または領域ＦおよびＦ’の両方が、少なくとも１つのＬＮＡヌクレオシドおよび少なくとも１つの非ＬＮＡ２’－糖修飾ヌクレオシド、例えば少なくとも１つの２’－メトキシエトキシ－ＲＮＡヌクレオシドを含む、本発明に記載のオリゴヌクレオチド；
ギャップ領域Ｇが、５～１６個、特に８～１６個、より詳細には８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個の連続するＤＮＡヌクレオシドを含む、本発明に記載のオリゴヌクレオチド；
領域Ｆおよび領域Ｆ’が、独立して、１、２、３、４、５、６、７、または８ヌクレオシド長である、本発明に記載のオリゴヌクレオチド；
領域Ｆおよび領域Ｆ’が、それぞれ独立して、１、２、３、または４つのＬＮＡヌクレオシドを含む、本発明に記載のオリゴヌクレオチド；
ＬＮＡヌクレオシドが、β－Ｄ－オキシＬＮＡ、６’－メチル－β－Ｄ－オキシＬＮＡ、およびＥＮＡから独立して選択される、本発明に記載のオリゴヌクレオチド；
ＬＮＡヌクレオシドがβ－Ｄ－オキシＬＮＡである、本発明に記載のオリゴヌクレオチド；
オリゴヌクレオチドまたはその連続するヌクレオチド配列（Ｆ－Ｇ－Ｆ’）が、１０～３０ヌクレオチド長、特に１２～２２、より詳細には１４～２０オリゴヌクレオチド長である、本発明に記載のオリゴヌクレオチド；
ギャップマー型オリゴヌクレオチドが、式５’－Ｄ’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’－Ｄ’’－３’の連続するヌクレオチド配列を含み、式中、Ｆ、Ｇ、およびＦ’は、請求項１７から２８のいずれか一項に記載される通りであり、領域Ｄ’およびＤ’’は、それぞれ独立して、０～５つのヌクレオチド、特に２、３、または４つのヌクレオチド、特にＤＮＡヌクレオチド、例えばホスホジエステル結合したＤＮＡヌクレオシドからなる、本発明に記載のオリゴヌクレオチド；
各フランキング領域ＦおよびＦ’が独立して、１、２、３、４、５、６、または７つ、特に、式（Ｉ）の１つのジヌクレオシドを含む、請求項１７から２９のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド；
式（Ｉ）の、合計で１つのジヌクレオシド、特に領域Ｆ’または領域Ｇと領域Ｆ’との間に位置する、式（Ｉ）の１つのジヌクレオシドを含む、本発明に記載のオリゴヌクレオチド。
オリゴヌクレオチドがヒトＲＮａｓｅＨ１を動員することができる、本発明に記載のオリゴヌクレオチド；
本発明に記載のオリゴヌクレオチドの薬学的に許容され得る塩、特にナトリウム、カリウム塩、またはアンモニウム塩；
本発明に記載のオリゴヌクレオチドまたは薬学的に許容され得る塩と、任意選択的にリンカー部分を介して、前記オリゴヌクレオチドまたは前記薬学的に許容され得る塩に共有結合した、少なくとも１つのコンジュゲート部分とを含む、コンジュゲート；
本発明に記載のオリゴヌクレオチド、薬学的に許容され得る塩、またはコンジュゲートと、治療的に不活性な担体とを含む、薬学的組成物；ならびに
治療的に活性な物質として使用するための、本発明に記載のオリゴヌクレオチド、薬学的に許容され得る塩、またはコンジュゲート。

【0220】

本発明は、特に、式（Ｉ－ａ）：

（式中、
Ｒ^２は、アルコキシ、アルコキシアルコキシまたはアミノであり、
Ｒ^４は、水素であるか、または
Ｒ^４およびＲ^２は、一緒になって、Ｘ－Ｙを形成し、
Ｘは、酸素、硫黄、－ＣＲ^ａＲ^ｂ－、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｃ（Ｒ^ｂ）－、－Ｃ（＝ＣＲ^ａＲ^ｂ）－、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｎ－、－Ｓｉ（Ｒ^ａ）_２－、－ＳＯ_２－、－ＮＲ^ａ－；－Ｏ－ＮＲ^ａ－、－ＮＲ^ａ－Ｏ－、－Ｃ（＝Ｊ）－、Ｓｅ、－Ｏ－ＮＲ^ａ－、－ＮＲ^ａ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－、－Ｎ（Ｒ^ａ）－Ｏ－または－Ｏ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－であり、
Ｙは、酸素、硫黄、－（ＣＲ^ａＲ^ｂ）_ｎ－、－ＣＲ^ａＲ^ｂ－Ｏ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｃ（Ｒ^ｂ）－、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｎ－、－Ｓｉ（Ｒ^ａ）_２－、－ＳＯ_２－、－ＮＲ^ａ－、－Ｃ（＝Ｊ）－、Ｓｅ、－Ｏ－ＮＲ^ａ－、－ＮＲ^ａ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－、－Ｎ（Ｒ^ａ）－Ｏ－または－Ｏ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－であり、
但し、－Ｘ－Ｙ－は、－Ｏ－Ｏ－、Ｓｉ（Ｒ^ａ）_２－Ｓｉ（Ｒ^ａ）_２－、－ＳＯ_２－ＳＯ_２－、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｃ（Ｒ^ｂ）－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｃ（Ｒ^ｂ）、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｎ－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｎ－、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｎ－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｃ（Ｒ^ｂ）、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｃ（Ｒ^ｂ）－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｎ－または－Ｓｅ－Ｓｅ－ではなく、
Ｊは、酸素、硫黄、＝ＣＨ_２または＝Ｎ（Ｒ^ａ）であり、
Ｒ^ａおよびＲ^ｂは、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、チオヒドロキシル、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルコキシアルキル、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、ヘテロシクリル、アミノ、アルキルアミノ、カルバモイル、アルキルアミノカルボニル、アミノアルキルアミノカルボニル、アルキルアミノアルキルアミノカルボニル、アルキルカルボニルアミノ、カルバミド、アルカノイルオキシ、スルホニル、アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、チオヒドロキシルスルフィドアルキルスルファニル、アリールオキシカルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシカルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、－ＯＣ（＝Ｘ^ａ）Ｒ^ｃ、－ＯＣ（＝Ｘ^ａ）ＮＲ^ｃＲ^ｄおよび－ＮＲ^ｅＣ（＝Ｘ^ａ）ＮＲ^ｃＲ^ｄから独立して選択されるか、
または、２つのジェミナルなＲ^ａおよびＲ^ｂは、一緒になって、任意に置換されたメチレンを形成するか、
または、２つのジェミナルなＲ^ａおよびＲ^ｂは、それらが結合している炭素原子と共に、－Ｘ－Ｙ－の炭素原子を１個だけ有するシクロアルキルまたはハロシクロアルキルを形成し、
ここで、置換アルキル、置換アルケニル、置換アルキニル、置換アルコキシおよび置換メチレンは、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、ホルミル、ヘテロシリル、アリールおよびヘテロアリールから独立して選択される１～３つの置換基で置換されたアルキル、アルケニル、アルキニルおよびメチレンであり、
Ｘ^ａは、酸素、硫黄または－ＮＲ^ｃであり、
Ｒ^ｃ、Ｒ^ｄおよびＲ^ｅは、水素およびアルキルから独立して選択され、
Ｒ^５は、ヒドロキシル保護基であり、
Ｒ^ｘは、シアノアルキルまたはアルキルであり、
Ｒ^ｙは、ジアルキルアミノまたはピロリジニルであり、
Ｎｕは、核酸塩基または保護された核酸塩基であり、
ｎは、１、２または３である）
の化合物に関する。

【0221】

本発明に記載のオリゴヌクレオチドは、例えば、以下のスキームに従って調製することができる。

【0222】

スキーム２では、Ｂ_１およびＢ_２は核酸塩基であり、Ａは上に定義した通りである。

【0223】

ホスホノアセテートまたはチオホスホノアセテート修飾を含むオリゴヌクレオチドは、固相オリゴヌクレオチド化学を使用して合成することができる。ＤＭＴ保護デオキシリボヌクレオシド３’－Ｏ－ジイソプロピルアミノホスフィノ酢酸ジメチル－β－シアノエチルエステルを、固体支持体に連結したデオキシリボヌクレオシドに縮合させる。次いで、ホスフィナイト結合を、例えば、低酸化剤試薬（ＴＨＦ／ピリジン／Ｈ_２Ｏ：８８／１０／２中の０．０２Ｍ Ｉ_２）を使用して酸化するか、または例えば、アセトニトリル／ピリジン中の３－アミノ－１，２，４－ジチアゾール－５－チオンの０．１Ｍ溶液を使用して硫化する。無水酢酸でキャッピングし、ジクロロ酢酸で処理して５’－Ｏ－ジメトキシトリイル基を除去した後、サイクルを適切な回数繰り返して、ホスホノアセテート修飾を含むオリゴヌクレオチドを得る。

【0224】

本発明に記載のオリゴヌクレオチドの製造に有用なモノマー構成要素は、例えば、以下のスキームに従って調製することができる。

【0225】

ジメチルシアノエチルブロモアセテートを、ブロモアセチルブロミドをトルエン中で３－ヒドロキシ－３－メチルブチロニトリルと還流下で一晩縮合させることによって合成する。次いで、亜リン酸エステル誘導体を、ジイソプロピルアミノクロロホスフィンとのレフォルマトスキー反応を介して調製する。テトラゾールを使用して、この反応物を保護された２’－デオキシヌクレオシドとさらに縮合させて、ＬＮＡ ＰＡＣＥホスホロアミダイトを得る。

【0226】

スキーム３では、Ｒ^５、Ｒ^ｘ、Ｒ^ｙおよびＮｕは、上に定義した通りである。

【0227】

モノマーは、特に、上記の手順に従う以下のスキームに従って調製することができる。

【0228】

スキーム４では、Ｎｕは上に定義した通りである。

【0229】

したがって、本発明はまた、式（ＩＩ）：

（式中、
Ｘは、酸素、硫黄、－ＣＲ^ａＲ^ｂ－、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｃ（Ｒ^ｂ）－、－Ｃ（＝ＣＲ^ａＲ^ｂ）－、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｎ－、－Ｓｉ（Ｒ^ａ）_２－、－ＳＯ_２－、－ＮＲ^ａ－；－Ｏ－ＮＲ^ａ－、－ＮＲ^ａ－Ｏ－、－Ｃ（＝Ｊ）－、Ｓｅ、－Ｏ－ＮＲ^ａ－、－ＮＲ^ａ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－、－Ｎ（Ｒ^ａ）－Ｏ－または－Ｏ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－であり、
Ｙは、酸素、硫黄、－（ＣＲ^ａＲ^ｂ）_ｎ－、－ＣＲ^ａＲ^ｂ－Ｏ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｃ（Ｒ^ｂ）－、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｎ－、－Ｓｉ（Ｒ^ａ）_２－、－ＳＯ_２－、－ＮＲ^ａ－、－Ｃ（＝Ｊ）－、Ｓｅ、－Ｏ－ＮＲ^ａ－、－ＮＲ^ａ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－、－Ｎ（Ｒ^ａ）－Ｏ－または－Ｏ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－であり、
但し、－Ｘ－Ｙ－は、－Ｏ－Ｏ－、Ｓｉ（Ｒ^ａ）_２－Ｓｉ（Ｒ^ａ）_２－、－ＳＯ_２－ＳＯ_２－、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｃ（Ｒ^ｂ）－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｃ（Ｒ^ｂ）、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｎ－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｎ－、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｎ－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｃ（Ｒ^ｂ）、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｃ（Ｒ^ｂ）－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｎ－または－Ｓｅ－Ｓｅ－ではなく、
Ｊは、酸素、硫黄、＝ＣＨ_２または＝Ｎ（Ｒ^ａ）であり、
Ｒ^ａおよびＲ^ｂは、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、チオヒドロキシル、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルコキシアルキル、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、ヘテロシクリル、アミノ、アルキルアミノ、カルバモイル、アルキルアミノカルボニル、アミノアルキルアミノカルボニル、アルキルアミノアルキルアミノカルボニル、アルキルカルボニルアミノ、カルバミド、アルカノイルオキシ、スルホニル、アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、チオヒドロキシルスルフィドアルキルスルファニル、アリールオキシカルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシカルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、－ＯＣ（＝Ｘ^ａ）Ｒ^ｃ、－ＯＣ（＝Ｘ^ａ）ＮＲ^ｃＲ^ｄおよび－ＮＲ^ｅＣ（＝Ｘ^ａ）ＮＲ^ｃＲ^ｄから独立して選択されるか、
または、２つのジェミナルなＲ^ａおよびＲ^ｂは、一緒になって、任意に置換されたメチレンを形成するか、
または、２つのジェミナルなＲ^ａおよびＲ^ｂは、それらが結合している炭素原子と共に、－Ｘ－Ｙ－の炭素原子を１個だけ有するシクロアルキルまたはハロシクロアルキルを形成し、
ここで、置換アルキル、置換アルケニル、置換アルキニル、置換アルコキシおよび置換メチレンは、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、ホルミル、ヘテロシリル、アリールおよびヘテロアリールから独立して選択される１～３つの置換基で置換されたアルキル、アルケニル、アルキニルおよびメチレンであり、
Ｘ^ａは、酸素、硫黄または－ＮＲ^ｃであり、
Ｒ^ｃ、Ｒ^ｄおよびＲ^ｅは、水素およびアルキルから独立して選択され、
Ｒ^５は、ヒドロキシル保護基であり、
Ｒ^ｘは、シアノアルキルまたはアルキル、特にシアノアルキルであり、
Ｒ^ｙは、ジアルキルアミノまたはピロリジニルであり、
Ｎｕは、核酸塩基または保護された核酸塩基であり、
ｎは、１、２または３である）
の化合物またはその薬学的に許容され得る塩に関する。

【0230】

本発明は、さらに特に次のものに関する：
－Ｘ－Ｙ－が－ＣＨ_２－Ｏ－、－ＣＨ（ＣＨ_３）－Ｏ－または－ＣＨ_２ＣＨ_２－Ｏ－である、本発明に記載の化合物；
本発明に記載の、式（ＩＩＩ）または（ＩＶ）：

（式中、Ｒ^５、Ｒ^ｘ、Ｒ^ｙおよびＮｕは上に定義した通りである）
の化合物；
Ｒ^ｘが２－シアノ－１，１－ジメチル－エチル、メチル、エチル、プロピルまたはｔｅｒｔ－ブチルである、本発明に記載の化合物；
Ｒ^ｘが２－シアノ－１，１－ジメチル－エチルである、本発明に記載の化合物；
Ｒ^ｙがジイソプロピルアミノまたはピロリジニルである、本発明に記載の化合物；
Ｒ^ｙがジアルキルアミノである、本発明に記載の化合物；
Ｒ^ｙがジイソプロピルアミノである、請求項１から６のいずれか一項に記載の化合物；
本発明に記載の、式（Ｖ）：

（式中、Ｒ^５およびＮｕは、上に定義した通りである）
の化合物；
Ｎｕがチミン、保護されたチミン、アデノシン、保護されたアデノシン、シトシン、保護されたシトシン、５－メチルシトシン、保護された５－メチルシトシン、グアニン、保護されたグアニン、ウラシルまたは保護されたウラシルである、本発明に記載の化合物。

【0231】

以下：

から選択される、本発明に記載の化合物。

【0232】

本発明に記載の式（ＩＩ）の化合物を製造するためのプロセスであって、カップリング剤および塩基の存在下で、式（Ｃ）：

の化合物と、式Ｐ（Ｒ^ｙ）_２（ＣＨ_２）ＣＯＯ（Ｒ^ｘ）の化合物との反応を含む（式中、Ｘ、Ｙ、Ｒ^５、Ｎｕ、Ｒ^ｘおよびＲ^ｙは上に定義した通りである）、プロセス；
カップリング剤が１Ｈ－テトラゾール、５－エチルチオ－１Ｈ－テトラゾール、２－ベンジルチオテトラゾールまたは４，５－ジシアノイミダゾール（ＤＣＩ）、特にテトラゾールである、本発明に記載のプロセス；ならびに
オリゴヌクレオチドの製造における本発明に記載の化合物の使用。

【0233】

本発明のプロセスは、塩基、例えばトリエチルアミン、ピリジン、ジイソプロピルアミンまたはＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンで簡便にクエンチすることができる。

【0234】

本発明に記載の２’－アルコキシ－ＲＮＡ、特に２’－メトキシ－ＲＮＡ、２’－アルコキシアルコキシ－ＲＮＡ、特に２’－メトキシエトキシ－ＲＮＡを含むオリゴヌクレオチドは、以下の手順に従って合成することができる。

【0235】

スキーム５では、Ｂ_１およびＢ_２は核酸塩基であり、Ａは上に定義した通りである。

【0236】

ＭＯＥ（または他の２’置換基）ホスホノアセテートまたはチオホスホノアセテート修飾を含むオリゴヌクレオチドは、固相オリゴヌクレオチド化学を使用して合成することができる。ＤＭＴ保護デオキシリボヌクレオシド３’－Ｏ－ジイソプロピルアミノホスフィノ酢酸ジメチル－β－シアノエチルエステルを、固体支持体に連結したデオキシリボヌクレオシドに縮合させる。次いで、ホスフィナイト結合を、例えば、低酸化剤試薬（ＴＨＦ／ピリジン／Ｈ_２Ｏ：８８／１０／２中の０．０２Ｍ Ｉ_２）を使用して酸化するか、または例えば、アセトニトリル／ピリジン中の３－アミノ－１，２，４－ジチアゾール－５－チオンの０．１Ｍ溶液を使用して硫化する。無水酢酸でキャッピングし、ジクロロ酢酸で処理して５’－Ｏ－ジメトキシトリイル基を除去した後、サイクルを適切な回数繰り返して、ホスホノアセテート修飾を含むオリゴヌクレオチドを得る。

【0237】

本発明に記載のオリゴヌクレオチドの製造に有用なモノマー構成要素は、例えば、以下のスキームに従って調製することができる。

【0238】

ジメチルシアノエチルブロモアセテートを、ブロモアセチルブロミドをトルエン中で３－ヒドロキシ－３－メチルブチロニトリルと還流下で一晩縮合させることによって合成する。次いで、亜リン酸エステル誘導体を、ジイソプロピルアミノクロロホスフィンとのレフォルマトスキー反応を介して調製する。４，５－ＤＣＩを使用して、この反応物を保護された２’－デオキシヌクレオシドとさらに縮合させて、ＭＯＥ ＰＡＣＥホスホロアミダイトを得る。

【0239】

スキーム６では、Ｒ^５、Ｒ^ｘ、Ｒ^ｙおよびＮｕは、上に定義した通りである。

【0240】

モノマーは、特に、上記の手順に従う以下のスキームに従って調製することができる。

【0241】

スキーム７では、Ｎｕは上に定義した通りである。

【0242】

したがって、本発明はまた、式（ＶＩ）：

（式中、
Ｒ^２は、アルコキシ、アルコキシアルコキシまたはアミノ、特にアルコキシまたはアルコキシアルコキシであり、
Ｒ^５は、ヒドロキシル保護基であり、
Ｒ^ｘは、シアノアルキルまたはアルキル、特にシアノアルキルであり、
Ｒ^ｙは、ジアルキルアミノまたはピロリジニルであり、
Ｎｕは、核酸塩基または保護された核酸塩基である）
の化合物またはその薬学的に許容され得る塩に関する。

【0243】

本発明は、さらに特に次のものに関する：
Ｒ^２がメトキシ、メトキシエトキシまたはアミノ、特にメトキシまたはメトキシエトキシである、本発明に記載の化合物；
本発明に記載の、式（ＶＩＩ）：

（式中、Ｒ^５、Ｒ^ｘ、Ｒ^ｙおよびＮｕは上に定義した通りである）
の化合物；
Ｒ^ｘが２－シアノ－１，１－ジメチル－エチル、メチル、エチル、プロピルまたはｔｅｒｔ－ブチルである、本発明に記載の化合物；
Ｒ^ｘが２－シアノ－１，１－ジメチル－エチルである、本発明に記載の化合物；
Ｒ^ｙがジイソプロピルアミノまたはピロリジニルである、本発明に記載の化合物；
Ｒ^ｙがジアルキルアミノである、本発明に記載の化合物；
Ｒ^ｙがジイソプロピルアミノである、請求項１から６のいずれか一項に記載の化合物；
本発明に記載の、式（ＶＩＩＩ）：

（式中、Ｒ^５およびＮｕは、上に定義した通りである）
の化合物；
Ｎｕがチミン、保護されたチミン、アデノシン、保護されたアデノシン、シトシン、保護されたシトシン、５－メチルシトシン、保護された５－メチルシトシン、グアニン、保護されたグアニン、ウラシルまたは保護されたウラシルである、本発明に記載の化合物。

【0244】

以下：

から選択される、本発明に記載の化合物。

【0245】

本発明に記載の式（ＶＩ）の化合物を製造するためのプロセスであって、カップリング剤および塩基の存在下で、式（Ｄ）：

の化合物と、式Ｐ（Ｒ^ｙ）_２（ＣＨ_２）ＣＯＯ（Ｒ^ｘ）の化合物との反応を含む（式中、Ｒ^２、Ｒ^５、Ｎｕ、Ｒ^ｘおよびＲ^ｙは上に定義した通りである）、プロセス；
カップリング剤が１Ｈ－テトラゾール、５－エチルチオ－１Ｈ－テトラゾール、２－ベンジルチオテトラゾール、４，５－ジシアノイミダゾール（ＤＣＩ）、特にＤＣＩである、本発明に記載のプロセス；ならびに
オリゴヌクレオチドの製造における本発明に記載の化合物の使用。

【0246】

本発明のプロセスは、塩基、例えばトリエチルアミン、ピリジン、ジイソプロピルアミンまたはＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンで簡便にクエンチすることができる。

【0247】

次に、本発明を、限定的な特徴を有しない以下の実施例によって例示する。

【実施例】

【0248】

略語：
Ａ アデニン
Ｇ グアニン
_ｍＣ メチルシトシン
Ｔ チミン
ＬＮＡ ロックド核酸
ＲＮＡ リボ核酸
ＤＭＴ ジメトキシトリチル
ＤＣＡ ジクロロ酢酸
ＤＣＭ ジクロロメタン
ＴＨＦ テトラヒドロフラン
Ａｎｈ．無水
ＴＬＣ 薄層クロマトグラフィー
ＮＭＲ 核磁気共鳴
ＣＰＧ 制御された細孔ガラス
ＲＴ 逆転写
ｑＰＣＲ 定量的ポリメラーゼ連鎖反応
ｄｓ 二本鎖
Ｔｍ 熱融解

【0249】

実施例１：モノマー合成
１．１． １－シアノ－２－メチルプロパン－２－イル２－ブロモアセテート

２－ブロモアセチルブロミド（１４．７ｇ、６．３１ｍＬ、７２．６ｍｍｏｌ、１．２当量）のトルエン（６７．２ｍＬ）溶液に、撹拌しながら３－ヒドロキシ－３－メチルブタンニトリル（６ｇ、６．２８ｍｌ、６０．５ｍｍｏｌ、１当量）をゆっくり添加した。丸底フラスコにフリードリッヒ冷却器および酸トラップ（ＮａＯＨ水溶液を含有）に通気した乾燥管を取り付けた。反応混合物を一晩加熱還流した。反応物を室温に冷却し、次いで、混合物を真空中で濃縮して無色油状物を得た。粗生成物を、酢酸エチル／ヘキサンを勾配として使用するコンビフラッシュクロマトグラフィーによって精製し、生成物をヘキサン中の３０％酢酸エチルで溶出して、１－シアノ－２－メチルプロパン－２－イル２－（ビス（ジイソプロピルアミノ）ホスファネイル）アセテート（８．１４ｇ、３７ｍｍｏｌ、収率５８％）を得た。

【0250】

１．２． １－シアノ－２－メチルプロパン－２－イル２－（ビス（ジイソプロピルアミノ）ホスファネイル）アセテート

１－クロロ－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトライソプロピルホスファンジアミン（７．７５ｇ、２９ｍｍｏｌ、１当量）を無水ＴＨＦ（６９．４ｍｌ）に溶解した。さらに４１．６ｍｌの無水ジエチルエーテルを添加した。無水ＴＨＦ（３４．７ｍｌ）中の１－シアノ－２－メチルプロパン－２－イル２－ブロモアセテート（７．０３ｇ、３２ｍｍｏｌ、１．１当量）を丸底フラスコに入れた。亜鉛（２．８５ｇ、４３．６ｍｍｏｌ、１．５当量）、無水ジエチルエーテル（２２．２ｍｌ）および磁気撹拌子を、フリードリッヒ冷却器を取り付けた５００ｍＬの三口丸底フラスコに入れた。ホスフィン（３６ｍＬ）およびブロモアセテート溶液（１０ｍＬ）を三口丸底フラスコに同時に非常にゆっくりと添加した。次いで、発熱反応が顕著になる（わずかに濁った無色の反応が透明でわずかに黄色になる）まで、反応混合物を還流下で加熱した。ホスフィンおよびブロモアセテート溶液の残りを添加することにより、反応を還流下で継続した。添加が完了したら、反応物を加熱により４５分間還流を維持し、室温に冷却し、^３１Ｐ ＮＭＲによって完了について分析した。δ＝１３５ｐｐｍの出発物質をδ＝４８ｐｐｍの単一生成物に変換した。冷却した反応混合物を真空中で濃縮して、粘稠な油状物を得た。得られた物質を無水ヘプタンおよび少量のアセトニトリルで溶解して、粗生成物を完全に溶解した。この溶液を無水ヘプタンで２回抽出した。アセトニトリル層を、δ＝４８ｐｐｍの生成物が存在しないことについて^３１Ｐ ＮＭＲによって分析し、廃棄した。全てのヘプタン画分を合わせ、真空中で濃縮して、わずかに黄色の油状物を得た。次いで、これを高真空下で一晩乾燥させて、白色固体（７．０９６ｇ、１９ｍｍｏｌ、収率６２％）を得た。

【0251】

１．３． （１－シアノ－２－メチルプロパン－２－イル）２－［［ジ（プロパン－２－イル）アミノ］－［［ｒａｃ－（１Ｒ，３Ｒ）－１－［［ビス（４－メトキシフェニル）－フェニルメトキシ］メチル］－３－（５－メチル－２，４－ジオキソピリミジン－１－イル）－２，５－ジオキサビシクロ［２．２．１］ヘプタン－７－イル］オキシ］ホスファニル］アセテート

１－［（１Ｒ，４Ｒ，６Ｒ，７Ｓ）－４－［［ビス（４－メトキシフェニル）－フェニル－メトキシ］メチル］－７－ヒドロキシ－２，５－ジオキサビシクロ［２．２．１］ヘプタン－６－イル］－５－メチル－ピリミジン－２，４－ジオン（０．７ｇ、１．２２ｍｍｏｌ、１当量）を無水ＤＣＭ（１５．３ｍｌ）に溶解し、次いで、１－シアノ－２－メチルプロパン－２－イル２－（ビス（ジイソプロピルアミノ）ホスファネイル）アセテート（５４５ｍｇ、１．４７ｍｍｏｌ、１．２当量）を反応混合物に添加した。反応成分が完全に溶解したら、テトラゾール（２．１７ｍｌ、９７８μｍｏｌ、０．８当量）を無水ＣＨ_３ＣＮ中の０．４５Ｍ溶液として反応混合物に添加した。次いで、反応混合物をアルゴン下、室温で一晩撹拌し、^３１Ｐ ＮＭＲおよびシリカゲルＴＬＣ（酢酸エチルで溶出）によって分析した。ＴＬＣ上でのより速い溶出生成物へのスポット間転換および酢酸ホスフィノジアマイト^３１Ｐ ＮＭＲシグナルの完全喪失によって、反応が完了したと判断した。完了したら、トリエチルアミン（９９ｍｇ、１３６μｌ、９７８μｍｏｌ、０．８当量）を添加することによって反応をクエンチした。５分後、反応混合物を真空中で濃縮して、粘稠な無色油状物を得た。生成物を最小体積の酢酸エチルに再溶解し、カラムクロマトグラフィー（８０／２０：酢酸エチル／ヘプタン）を介して精製した。生成物を含有する画分を合わせ、濃縮して、泡状物を得、最小量の無水ＤＣＭに再溶解した。ヘプタンを滴下添加して速く撹拌した。固体沈殿物を濾過によって単離し、真空中で一晩乾燥させて、７４３ｍｇの標的化合物を白色固体として得た（７４３ｍｇ、０．８８ｍｍｏｌ、収率６９％）。

【0252】

１．４． （１－シアノ－２－メチルプロパン－２－イル）２－［［ジ（プロパン－２－イル）アミノ］－［［ｒａｃ－（１Ｒ，３Ｒ）－３－（６－ベンズアミドプリン－９－イル）－１－［［ビス（４－メトキシフェニル）－フェニルメトキシ］メチル］－２，５－ジオキサビシクロ［２．２．１］ヘプタン－７－イル］オキシ］ホスファニル］アセテート

Ｎ－［９－［（１Ｒ，４Ｒ，６Ｒ，７Ｓ）－４－［［ビス（４－メトキシフェニル）－フェニル－メトキシ］メチル］－７－ヒドロキシ－２，５－ジオキサビシクロ［２．２．１］ヘプタン－６－イル］プリン－６－イル］ベンズアミド（３ｇ、４．３７ｍｍｏｌ、１当量）を無水ＤＣＭ（５４．７ｍｌ）に溶解し、次いで、１－シアノ－２－メチルプロパン－２－イル２－（ビス（ジイソプロピルアミノ）ホスファネイル）アセテート（１．９５ｇ、５．２５ｍｍｏｌ、１．２当量）を反応混合物に添加した。反応成分が完全に溶解したら、テトラゾール（７．７８ｍｌ、３．５ｍｍｏｌ、０．８当量）を無水ＣＨ_３ＣＮ中の０．４５Ｍ溶液として反応混合物に添加した。反応混合物をアルゴン下、室温で一晩撹拌し、^３１Ｐ ＮＭＲおよびシリカゲルＴＬＣ（酢酸エチルで溶出）によって分析した。ＴＬＣ上でのより速い溶出生成物へのスポット間転換および酢酸ホスフィノジアマイト^３１Ｐ ＮＭＲシグナルの完全喪失によって、反応が完了したと判断した。完了したら、トリエチルアミン（３５４ｍｇ、４８８μｌ、３．５ｍｍｏｌ、０．８当量）を添加することによって反応をクエンチした。５分後、反応混合物を真空中で濃縮して、粘稠な無色油状物を得た。生成物を最小体積の酢酸エチルに再溶解し、カラムクロマトグラフィー（８０／２０：酢酸エチル／ヘプタン）を介して精製した。生成物を含有する画分を合わせ、濃縮して、泡状物を得、最小量の無水ＤＣＭに再溶解した。ヘプタンを滴下添加して速く撹拌した。固体沈殿物を濾過によって単離し、真空中で一晩乾燥させて、１．８６ｇの標的化合物を白色固体として得た（１．８６ｇ、１．９ｍｍｏｌ、収率４５％）。

【0253】

１．５． （１－シアノ－２－メチルプロパン－２－イル）２－［［ジ（プロパン－２－イル）アミノ］－［［ｒａｃ－（１Ｒ，３Ｒ）－３－（４－ベンズアミド－５－メチル－２－オキソピリミジン－１－イル）－１－［［ビス（４－メトキシフェニル）－フェニルメトキシ］メチル］－２，５－ジオキサビシクロ［２．２．１］ヘプタン－７－イル］オキシ］ホスファニル］アセテート

Ｎ－［１－［（１Ｒ，４Ｒ，６Ｒ，７Ｓ）－４－［［ビス（４－メトキシフェニル）－フェニル－メトキシ］メチル］－７－ヒドロキシ－２，５－ジオキサビシクロ［２．２．１］ヘプタン－６－イル］－５－メチル－２－オキソ－ピリミジン－４－イル］ベンズアミド（２．８ｇ、４．１４ｍｍｏｌ、１当量）を無水ＤＣＭ（５９．２ｍｌ）に溶解し、次いで、１－シアノ－２－メチルプロパン－２－イル２－（ビス（ジイソプロピルアミノ）ホスファネイル）アセテート（１．８５ｇ、４．９７ｍｍｏｌ、１．２当量）を反応混合物に添加した。反応成分が完全に溶解したら、テトラゾール（７．３７ｍｌ、３．３１ｍｍｏｌ、０．８当量）を無水ＣＨ_３ＣＮ中の０．４５Ｍ溶液として反応混合物に添加した。反応混合物をアルゴン下、室温で一晩撹拌し、^３１Ｐ ＮＭＲおよびシリカゲルＴＬＣ（酢酸エチルで溶出）によって分析した。ＴＬＣ上でのより速い溶出生成物へのスポット間転換および酢酸ホスフィノジアマイト^３１Ｐ ＮＭＲシグナルの完全喪失によって、反応が完了したと判断した。完了したら、トリエチルアミン（３３５ｍｇ、４６２μｌ、３．３１ｍｍｏｌ、０．８当量）を添加することによって反応をクエンチした。５分後、反応混合物を真空中で濃縮して、粘稠なわずかに黄色の油状物を得た。生成物を最小体積の酢酸エチルに再溶解し、カラムクロマトグラフィー（５０／５０：酢酸エチル／ヘプタン）を介して精製した。生成物を含有する画分を合わせ、濃縮して、泡状物を得、最小量の無水ＤＣＭに再溶解した。ヘプタンを滴下添加して速く撹拌した。固体沈殿物を濾過によって単離し、真空中で一晩乾燥させて、２．３５ｇの標的化合物を淡黄色固体として得た（２．３５ｇ、２．２２ｍｍｏｌ、収率４６％）。

【0254】

１．６． （１－シアノ－２－メチルプロパン－２－イル）２－［［ジ（プロパン－２－イル）アミノ］－［［ｒａｃ－（１Ｒ，３Ｒ）－１－［［ビス（４－メトキシフェニル）－フェニルメトキシ］メチル］－３－［２－（２－メチルプロパノイルアミノ）－６－オキソ－１Ｈ－プリン－９－イル］－２，５－ジオキサビシクロ［２．２．１］ヘプタン－７－イル］オキシ］ホスファニル］アセテート

Ｎ’－［９－［（１Ｒ，４Ｒ，６Ｒ，７Ｓ）－４－［［ビス（４－メトキシフェニル）－フェニル－メトキシ］メチル］－７－ヒドロキシ－２，５－ジオキサビシクロ［２．２．１］ヘプタン－６－イル］－６－オキソ－１Ｈ－プリン－２－イル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－ホルムアミジン（２．６ｇ、３．８９ｍｍｏｌ、１当量）を無水ＤＣＭ（５５．６ｍｌ）に溶解し、次いで、１－シアノ－２－メチルプロパン－２－イル２－（ビス（ジイソプロピルアミノ）ホスファネイル）アセテート（１．７４ｇ、４．６７ｍｍｏｌ、１．２当量）を反応混合物に添加した。反応成分が完全に溶解したら、テトラゾール（６．９２ｍｌ、３．１２ｍｍｏｌ、０．８当量）を無水ＣＨ_３ＣＮ中の０．４５Ｍ溶液として反応混合物に添加した。反応混合物をアルゴン下、室温で一晩撹拌し、^３１Ｐ ＮＭＲおよびシリカゲルＴＬＣ（酢酸エチルで溶出）によって分析した。ＴＬＣ上でのより速い溶出生成物へのスポット間転換および酢酸ホスフィノジアマイト^３１Ｐ ＮＭＲシグナルの完全喪失によって、反応が完了したと判断した。完了したら、トリエチルアミン（３１５ｍｇ、４３４μｌ、３．１２ｍｍｏｌ、０．８当量）を添加することによって反応をクエンチした。５分後、反応混合物を真空中で濃縮して、粘稠な無色油状物を得た。生成物を最小体積の酢酸エチルに再溶解し、カラムクロマトグラフィー（１００％酢酸エチル）を介して精製した。生成物を含有する画分を合わせ、濃縮して、泡状物を得、最小量の無水ＤＣＭに再溶解した。ヘプタンを滴下添加して速く撹拌した。固体沈殿物を濾過によって単離し、真空中で一晩乾燥させて、１．４ｇの標的化合物を白色固体として得た（１．４ｇ、１．４ｍｍｏｌ、収率３８％）。

【0255】

実施例２：オリゴヌクレオチドの合成
Ｂｉｏａｕｔｏｍａｔｉｏｎ社のＭｅｒＭａｄｅ １２自動ＤＮＡ合成装置を使用して、オリゴヌクレオチドを合成した。合成は、ユニバーサルリンカーを備えた制御された細孔ガラス支持体（５００Å）を使用して１μｍｏｌスケールで行った。

【0256】

標準的なＤＮＡとＬＮＡホスホロアミダイトのカップリングのための標準サイクル手順において、ＤＭＴの脱保護化を、ＣＨ_２Ｃｌ_２中の３％（ｗ／ｖ）ジクロロ酢酸を用いて２３０μＬの３回の適用で１０５秒間行った。それぞれのホスホロアミダイトを、アセトニトリル（またはＬＮＡ－^ＭｅＣ構成要素に対してはアセトニトリル／ＣＨ_２Ｃｌ_２ １：１）中の０．１Ｍ溶液９５μＬおよび活性化剤としての５－［３，５－ビス（トリフルオロメチル）フェニル］－２Ｈ－テトラゾールの０．２５Ｍ溶液１１０μＬと、１８０秒のカップリング時間で３回カップリングさせた。３－アミノ－１，２，４－ジチアゾール－５－チオンのアセトニトリル／ピリジン中０．１Ｍ溶液を使用して、２００μＬを１回の適用で３分間硫化を行った。酸化は、ＴＨＦ／ｐｙｒ／Ｈ_２Ｏ：８８／１０／２中の０．０２Ｍ Ｉ_２を使用して１回の適用で３分間行った。ＴＨＦ／ルチジン／Ａｃ_２Ｏ ８：１：１（ＣａｐＡ、７５μｍｏｌ）およびＴＨＦ／Ｎ－メチルイミダゾール ８：２（ＣａｐＢ、７５μｍｏｌ）を使用して、キャッピングを７０秒間行った。

【0257】

ＰＡＣＥ ＬＮＡを導入するための合成サイクルは、ＣＨ_２Ｃｌ_２中の３％（ｗ／ｖ）ジクロロ酢酸を２３０μＬの３回の適用で１０５秒間使用するＤＭＴ脱保護化を含んだ。新たに調製したＬＮＡ ＰＡＣＥを、９５μＬのアセトニトリル中０．１Ｍ溶液および０．２５Ｍ溶液１１０μＬの活性化剤としての５－［３，５－ビス（トリフルオロメチル）フェニル］－２Ｈ－テトラゾールと、１５分のカップリング時間で２回カップリングさせた。アセトニトリル／ピリジン １：１中の３－アミノ－１，２，４－ジチアゾール－５－チオン０．１Ｍ溶液を使用して、１回の適用で３分間硫化を行った。酸化は、ＴＨＦ／ｐｙｒ／Ｈ_２Ｏ：８８／１０／２中の０．０２Ｍ Ｉ_２を使用して１回の適用で３分間行った。ＴＨＦ／ルチジン／Ａｃ_２Ｏ ８：１：１（ＣａｐＡ、７５μｍｏｌ）およびＴＨＦ／Ｎ－メチルイミダゾール ８：２（ＣａｐＢ、７５μｍｏｌ）を使用して、キャッピングを７０秒間行った。

【0258】

合成後、無水ＣＨ_３ＣＮ中の１．５％ＤＢＵ溶液を慎重に数回カラムに通して、ジメチルシアノエチル保護基を脱保護化し、脱保護中の塩基のアルキル化を防止した。次いで、室温で６０分間放置した。次いで、溶液を廃棄し、カラムを２～３ｍＬの無水ＣＨ_３ＣＮですすいだ。次いで、これをアルゴン流下で乾燥させた。次いで、ＣＰＧを４ｍＬバイアルに慎重に移し、ＭｅＯＨ中１ｍｌの７Ｎ ＮＨ_３を添加し、５５℃で２４時間撹拌したままにした。

【0259】

オリゴヌクレオチド上の粗ＤＭＴを、Ｃ１８カラムを使用するＲＰ－ＨＰＬＣ精製、続いて８０％酢酸水溶液およびエタノール沈殿によるＤＭＴ除去またはカートリッジ精製によって精製した。ＰＡＣＥ ＬＮＡホスホロアミダイトを、Ｂａｓｅｌで合成した。通常のホスホロアミダイト、および固相合成に使用した全ての試薬は、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから注文した。

【0260】

上記手順に従って、以下の分子を調製した。

＊隣接ヌクレオチド間のＰＡＣＥホスホロチオエート修飾。
Ａ、Ｇ、^ｍＣ、Ｔは、ＬＮＡヌクレオチドを表す。
ａ、ｇ、ｃ、ｔは、ＤＮＡヌクレオチドを表す。
他の結合は全て、ホスホロチオエートとして調製した。

【0261】

実施例３：用量反応曲線のための異なる濃度でのヒトＨｅＬａおよびＡ５４９細胞におけるＨＩＦ１ａ ｍＲＮＡを標的とするオリゴヌクレオチドのインビトロ有効性
ＨｅＬａおよびＡ５４９細胞株をＡＴＣＣから購入し、サプライヤーの推奨に従って、３７℃、５％ＣＯ_２の加湿インキュベータで維持した。アッセイのために、３０００細胞／ウェル（ＨｅＬａ）および３５００細胞／ウェル（Ａ５４９）を９６マルチウェルプレートの培養培地中に播種した。細胞を２４時間インキュベートした後、ＰＢＳに溶解したオリゴヌクレオチドを添加した。オリゴヌクレオチドの濃度範囲：８段階の最高濃度２５μＭ、１：１希釈。オリゴヌクレオチドを添加した３日後、細胞を採取した。ＲＮＡを、製造者の説明書に従い、ＰｕｒｅＬｉｎｋ Ｐｒｏ ９６ ＲＮＡ精製キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して抽出し、５０μｌの水に溶出した。その後、ＲＮＡをＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅフリーの水（Ｇｉｂｃｏ）で１０倍希釈し、９０℃に１分間加熱した。

【0262】

遺伝子発現解析のために、二重鎖セットアップにおいてｑＳｃｒｉｐｔ（商標）ＸＬＴ Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ ＲＴ－ｑＰＣＲ ＴｏｕｇｈＭｉｘ（登録商標）、Ｌｏｗ ＲＯＸ（商標）（Ｑｕａｎｔａｂｉｏ）を使用してＯｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＴ－ｑＰＣＲを行った。ｑＰＣＲには、以下のＴａｑＭａｎプライマーアッセイを使用した：ＨＩＦ１Ａ、内因性対照ＧＵＳＢを有するＨｓ００９３６３６８＿ｍ１、Ｈｓ９９９９９９０８＿ｍ１（ＶＩＣ－ＭＧＢ）。全てのプライマーセットは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。ＨＩＦ１Ａ ｍＲＮＡの相対的発現レベルを対照（ＰＢＳ処理細胞）のパーセントとして示し、ＩＣ_５０値を、ｎ＝２の生物学的複製物からのデータに対してＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７を使用して決定した。

【0263】

結果を、以下の表および図１に示す。

【0264】

図１のプロットに示されるデータを、以下の表に報告する。

【0265】

ＨｅＬａにおけるＨＩＦ１Ａ発現（生物学的複製物の平均）

【0266】

Ａ５４９におけるＨＩＦ１Ａ発現（生物学的複製物の平均）

【0267】

実施例４：用量反応曲線のための異なる濃度でのヒトＨｅＬａおよびＡ５４９細胞におけるＭＡＬＡＴ１ ｍＲＮＡを標的とするオリゴヌクレオチドのインビトロ効力および有効性
ＨｅＬａおよびＡ５４９細胞株をＡＴＣＣから購入し、サプライヤーの推奨に従って、３７℃、５％ＣＯ_２の加湿インキュベータで維持した。アッセイのために、３０００細胞／ウェル（ＨｅＬａ）および３５００細胞／ウェル（Ａ５４９）を９６マルチウェルプレートの培養培地中に播種した。細胞を２４時間インキュベートした後、ＰＢＳに溶解したオリゴヌクレオチドを添加した。オリゴヌクレオチドの濃度範囲：８段階の最高濃度２５μＭ、１：１希釈。オリゴヌクレオチドを添加した３日後、細胞を採取した。ＲＮＡを、製造者の説明書に従い、ＰｕｒｅＬｉｎｋ Ｐｒｏ ９６ ＲＮＡ精製キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して抽出し、５０μｌの水に溶出した。その後、ＲＮＡをＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅフリーの水（Ｇｉｂｃｏ）で１０倍希釈し、９０℃に１分間加熱した。

【0268】

遺伝子発現解析のために、二重鎖セットアップにおいてｑＳｃｒｉｐｔ（商標）ＸＬＴ Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ ＲＴ－ｑＰＣＲ ＴｏｕｇｈＭｉｘ（登録商標）、Ｌｏｗ ＲＯＸ（商標）（Ｑｕａｎｔａｂｉｏ）を使用してＯｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＴ－ｑＰＣＲを行った。ｑＰＣＲには、以下のＴａｑＭａｎプライマーアッセイを使用した：ＭＡＬＡＴ１、内因性対照ＧＡＰＤＨを有するＨｓ００２７３９０７＿ｓ１（ＦＡＭ－ＭＧＢ）。全てのプライマーセットは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。ＭＡＬＡＴ１ ｍＲＮＡの相対的発現レベルを対照（ＰＢＳ処理細胞）のパーセントとして示し、ＩＣ_５０値を、ｎ＝２の生物学的複製物からのデータに対してＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７を使用して決定した。

【0269】

結果を、以下の表および図２に示す。

【0270】

図２のプロットに示されるデータを、以下の表に報告する。

【0271】

ＨｅＬａにおけるＭＡＬＡＴ１発現（生物学的複製物の平均）：

【0272】

Ａ５４９ＨｅＬａにおけるＭＡＬＡＴ１発現（生物学的複製物の平均）

【0273】

実施例５：マウス初代肝細胞におけるＡｐｏＢ ｍＲＮＡを標的とするオリゴヌクレオチドのインビトロ効力および有効性
初代マウス肝細胞を、文献（ＢｅｒｒｙおよびＦｒｉｅｎｄ、１９６９、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ；Ｐａｔｅｒｎａら、１９９８、Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．）に従って、２段階灌流プロトコルの後にペントバルビタールで麻酔したＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの肝臓から単離した。第１の工程は、ＨＢＳＳ＋１５ｍＭ ＨＥＰＥＳ＋０．４ｍＭ ＥＧＴＡで５分間、続いてＨＢＳＳ＋２０ｍＭ ＮａＨＣＯ_３＋０．０４％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ ＃Ａ７９７９）＋４ｍＭ ＣａＣＬ_２（Ｓｉｇｍａ ＃２１１１５）＋０．２ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼ２型（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ ＃４１７６）で１２分間行った。肝細胞を氷上で５ｍｌの冷Ｗｉｌｌｉａｍｓ培地Ｅ（ＷＭＥ）（Ｓｉｇｍａ＃Ｗ１８７８、１×Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ／グルタミン、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ（ＡＴＣＣ＃３０－２０３０）で補完）に捕捉した。粗細胞懸濁液を７０μｍ、続いて４０μｍセルストレーナー（Ｆａｌｃｏｎ＃３５２３５０および＃３５２３４０）でフィルタにかけ、ＷＭＥを２５ｍｌまで充填し、室温で５分間、５０×ｇで遠心分離して肝細胞をペレット化した。上清を除去し、肝細胞を２５ｍｌのＷＭＥに再懸濁した。２５ｍｌの９０％パーコール（Ｐｅｒｃｏｌｌ）溶液（Ｓｉｇｍａ＃Ｐ４９３７、ｐＨ＝８．５～９．５）を添加し、１０分間２５℃で、５０×ｇで遠心分離した後、上清および浮遊細胞を除去した。残りのパーコールを除去するために、ペレットを５０ｍＬのＷＭＥ培地に改めて再懸濁し、３分間２５℃で、５０×ｇで遠心分離し、上清を廃棄した。細胞ペレットを２０ｍＬのＷＭＥに再懸濁し、細胞数および生存率を決定し（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃｅｌｌｃｏｕｎｔ）、２５０，０００細胞／ｍｌに希釈した。２５，０００細胞／ウェルをコラーゲン被覆９６ウェルプレート（ＰＤ Ｂｉｏｃｏａｔ Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｉ ＃３５６４０７）に播種し、３７℃、５％ ＣＯ_２でインキュベートした。３時間後、細胞をＷＭＥで洗浄して、付着していない細胞を除去し、培地を置き換えた。播種の２４時間後、オリゴヌクレオチドをある範囲の濃度で添加した：最高濃度３，１２５μＭ、８段階のハーフログ希釈。オリゴヌクレオチドを添加した３日後、細胞を採取した。ＲＮＡを、製造者の説明書に従い、ＰｕｒｅＬｉｎｋ Ｐｒｏ ９６ ＲＮＡ精製キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して抽出し、５０μｌの水に溶出した。その後、ＲＮＡをＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅフリーの水（Ｇｉｂｃｏ）で１０倍希釈し、９０℃に１分間加熱した。

【0274】

遺伝子発現解析のために、二重鎖セットアップにおいてｑＳｃｒｉｐｔ（商標）ＸＬＴ Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ ＲＴ－ｑＰＣＲ ＴｏｕｇｈＭｉｘ（登録商標）、Ｌｏｗ ＲＯＸ（商標）（Ｑｕａｎｔａｂｉｏ）を使用してＯｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＴ－ｑＰＣＲを行った。ｑＰＣＲには、以下のＴａｑＭａｎプライマーアッセイを使用した：内因性対照Ｇａｐｄｈを有するＡｐｏｂ Ｍｍ＿０１５４５１５０＿ｍ１（ＦＡＭ－ＭＧＢ）、Ｍｍ９９９９９９１５＿ｇ１（ＶＩＣ－ＭＧＢ）。全てのプライマーセットは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。ＡｐｏＢ ｍＲＮＡの相対的発現レベルを対照（ＰＢＳ処理細胞）のパーセントとして示し、ＩＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７を使用して決定した。

【0275】

結果を、以下の表および図３に示す。

【0276】

図３のプロットに示されるデータを、以下の表に報告する。

【0277】

初代マウス肝細胞におけるＡｐｏＢ ｍＲＮＡの相対的発現

【0278】

実施例６：ＲＮＡおよびＤＮＡにハイブリダイズしたホスホノ酢酸ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドの熱融解（Ｔｍ）
ｄｓＬＮＡ／ＤＮＡまたはｄｓＬＮＡ／ＲＮＡヘテロ二重鎖（熱融解＝Ｔｍ）の変性点を以下の手順に従って測定した：
等モル量のＲＮＡまたはＤＮＡおよびＬＮＡオリゴヌクレオチド（ＡｐｏＢについては２０μＭおよびＭａｌａｔ－１については１０μＭ）の溶液は、緩衝液（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、ｐＨ７．４）中で１０μＭのｄｓオリゴヌクレオチド（ＡｐｏＢ）および５μＭのｄｓオリゴヌクレオチド（Ｍａｌａｔ－１）をもたらす。溶液を９５℃に２分間加熱（ハイブリダイゼーション）し、次いで、１５分間室温に冷却した。２６０ｎｍでのＵＶ吸光度を、Ｔｈｅｒｍｏ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃからのＥｖｏｌｕｔｉｏｎ ６００ＵＶ－Ｖｉｓ分光光度計（加熱速度１℃／分、読取速度２０／分）を使用して記録した。変性点（すなわち、融点、Ｔｍ）の決定のために、融解転移をＬＯＷＥＳＳ曲線に適合させ、変曲点（＝Ｔｍ）を記述的適合の一次導関数のピーク位置によって同定した。

【0279】

ＡｐｏＢオリゴヌクレオチドのＴｍ測定（ＲＮＡおよびＤＮＡ）を以下の表に示す。

【0280】

本発明に記載の化合物は、対照のＲＮＡおよびＤＮＡに対して高い親和性を保持する。

【0281】

実施例７：ＬＴＫ細胞（線維芽細胞）におけるＭＡＬＡＴ１ ｍＲＮＡを標的とする選択されたオリゴヌクレオチドのインビトロ効力および有効性
以下のオリゴヌクレオチドを生成し、それに対して試験した：

＊隣接ヌクレオチド間のＰＡＣＥホスホロチオエート修飾。
°隣接ヌクレオチド間のＰＡＣＥホスホロジエステル修飾。
Ａ、Ｇ、^ｍＣ、Ｔは、ＬＮＡヌクレオチドを表す。
ａ、ｇ、ｃ、ｔは、ＤＮＡヌクレオチドを表す。
他の結合は全て、ホスホロチオエートとして調製した。

【0282】

【0283】

Ｍａｌａｔ－１を標的とする上記化合物を、自然な取込みを使用してマウス線維芽細胞（ＬＴＫ細胞）において７２時間、ある濃度範囲で試験して、化合物の効力（ＩＣ５０）を決定した。

【0284】

ＬＴＫ細胞に対する濃度範囲：５０μＭ、１／２対数希釈、８濃度。

【0285】

Ｍａｌａｔ１のＲＮＡレベルを、ｑＰＣＲ（ＧＡＰＤＨレベルに正規化）を使用して定量し、ＩＣ５０値を決定した。

【0286】

ＩＣ５０の結果を上記の表に示し、この化学修飾が標的ノックダウンに関して（疾患に関連する骨格筋細胞についてここで例示されるように）十分に許容されることを示している。

【0287】

実施例８：１５ｍｇ／ｋｇの用量を用いた心臓における標的ｍＲＮＡレベル（Ｍａｌａｔ１）の測定
マウス（Ｃ５７／ＢＬ６）に、オリゴヌクレオチドを１５ｍｇ／ｋｇ用量、１、２および３日目に３回用量で皮下投与した（ｎ＝５）。８日目にマウスを屠殺し、ＭＡＬＡＴ－１ ＲＮＡの低減を心臓に対して測定した。親化合物は、３×１５ｍｇ／ｋｇおよび３×３０ｍｇ／ｋｇの２回用量で投与した。

【0288】

結果を図４に示す。

【0289】

インビボ結果は、チオ－ＰＡＣＥ修飾化合物＃２４が、心臓におけるＭＡＬＡＴ－１のノックダウンにおいて参照化合物の約２倍強力であることを示している（１５ｍｇ／ｋｇでの有効性は、３０ｍｇ／ｋｇ投与での参照と同じである）。位置１２に導入された追加のチオ－ＰＡＣＥ修飾を有する化合物＃２５は、＃２４よりも低い有効性を示すが、依然として参照よりも良好である。対応するＯｘｏ－ＰＡＣＥアナログ（＃２６）は、実質的に低下した活性を示す。

【0290】

有効性に対する大きな影響が、本発明に記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いてインビボで観察されている。本発明に記載のオリゴヌクレオチドの用量は、参照用量のわずか５０％であることに留意すべきである。

【0291】

実施例９：ＭＯＥ ＰＡＣＥモノマーの合成
９．１． １－シアノ－２－メチルプロパン－２－イル２－ブロモアセテート

２－ブロモアセチルブロミド（１４．７ｇ、６．３１ｍＬ、７２．６ｍｍｏｌ、１．２当量）の溶液を、トルエン（６７．２ｍＬ）を含む２５０ｍＬ丸底フラスコに添加した。３－ヒドロキシ－３－メチルブタンニトリル（６ｇ、６．２８ｍｌ、６０．５ｍｍｏｌ、１当量）を撹拌しながらゆっくり添加した。丸底フラスコにフリードリッヒ冷却器および酸トラップ（ＮａＯＨ水溶液を含有）に通気した乾燥管を取り付けた。反応混合物を加熱還流し、一晩還流した。反応物を室温に冷却し、次いで、混合物を真空中で濃縮して油状物を得た。粗油状物を、酢酸エチル／ヘキサンを勾配として使用するコンビフラッシュクロマトグラフィーによって精製した：生成物をヘキサン中の３０％酢酸エチルで溶出し、１－シアノ－２－メチルプロパン－２－イル－２－（ビス（ジイソプロピルアミノ）ホスファネイル）アセテート（８．１４ｇ、３７ｍｍｏｌ、収率５８％）を得た。

【0292】

９．２． １－シアノ－２－メチルプロパン－２－イル２－（ビス（ジイソプロピルアミノ）ホスファネイル）アセテート

栓をした２５０ｍＬ丸底フラスコに無水ＴＨＦ（６９．４ｍｌ）、１－クロロ－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトライソプロピルホスファンジアミン（７．７５ｇ、２９ｍｍｏｌ、１当量）および磁気撹拌子を加え、ホスフィンが溶解するまで溶液を撹拌した。溶解後、無水ジエチルエーテル（４１．６ｍｌ）を添加した。１－シアノ－２－メチルプロパン－２－イル２－ブロモアセテート（７．０３ｇ、３２ｍｍｏｌ、１．１当量）を１００ｍＬ丸底フラスコに入れ、無水ＴＨＦ（３４．７ｍｌ）を添加した。亜鉛（２．８５ｇ、４３．６ｍｍｏｌ、１．５当量）、無水ジエチルエーテル（２２．２ｍｌ）および磁気撹拌子を、フリードリッヒ冷却器を取り付けた５００ｍＬの三口丸底フラスコに入れた。ホスフィン（３６ｍＬ）およびブロモアセテート溶液（１０ｍＬ）を三口丸底フラスコに添加した。次いで、発熱反応が顕著になる（わずかに濁った無色の反応が透明でわずかに黄色になる）まで、反応混合物を還流下で加熱した。ホスフィンおよびブロモアセテート溶液の残りを添加することにより、反応を還流下で継続した。添加が完了したら、反応物を加熱により４５分間還流を維持し、室温に冷却し、^３１Ｐ ＮＭＲによって完了について分析した。δ＝１３５ｐｐｍの出発物質をδ＝４８ｐｐｍの単一生成物に変換した。冷却した反応混合物を真空中で粘稠な油状物に濃縮した。得られた粘稠な油状物を、無水ヘプタンで溶解した。次いで、形成した固体をアセトニトリルに溶解し、この溶液を無水ヘプタンで２回抽出した。アセトニトリル溶液を、δ＝４８ｐｐｍの生成物が存在しないことについて^３１Ｐ ＮＭＲによって分析し、廃棄した。全てのヘプタン画分を合わせ（上層）、真空中で濃縮して、わずかに黄色の油状物を得た。次いで、これを高真空下で一晩乾燥させた。一晩乾燥させたところ、得られた生成物は良好な白色固体（７．０９６ｇ、１９ｍｍｏｌ、収率６２％）であった。

【0293】

９．３． （１－シアノ－２－メチルプロパン－２－イル）２－［［ジ（プロパン－２－イル）アミノ］－［ｒａｃ－（２Ｒ，５Ｒ）－２－［［ビス（４－メトキシフェニル）－フェニルメトキシ］メチル］－４－（２－メトキシエトキシ）－５－（５－メチル－２，４－ジオキソピリミジン－１－イル）オキソラン－３－イル］オキシホスファニル］アセテート

５－メチル－１－［ｒａｃ－（２Ｒ，５Ｒ）－４－ヒドロキシ－３－（２－メトキシエトキシ）－５－［［ｒａｃ－（２Ｅ）－１，１－ビス（４－メトキシフェニル）－２－［ｒａｃ－（Ｚ）－プロパ－１－エニル］ペンタ－２，４－ジエノキシ］メチル］オキソラン－２－イル］ピリミジン－２，４－ジオン（８００ｍｇ、１．２９ｍｍｏｌ、１当量）を無水ＤＣＭ（１６．２ｍｌ）に溶解し、次いで、１－シアノ－２－メチルプロパン－２－イル２－（ビス（ジイソプロピルアミノ）ホスファネイル）アセテート（７２１ｍｇ、１．９４ｍｍｏｌ、１．５当量）を反応混合物に添加した。反応成分が完全に溶解したら、４，５－ＤＣＩ（１２２ｍｇ、１．０３ｍｍｏｌ、０．８当量）を反応混合物に添加した。次いで、反応混合物をアルゴン下、室温で一晩撹拌し、^３１Ｐ ＮＭＲおよびシリカゲルＴＬＣ（酢酸エチルで溶出）によって反応の程度を分析した。ＴＬＣ上でのより速い溶出生成物へのスポット間転換および酢酸ホスフィノジアマイト^３１Ｐ ＮＭＲシグナルの完全喪失によって、反応が完了したと判断した。完了したら、トリエチルアミン（１０５ｍｇ、１４４μｌ、１．０３ｍｍｏｌ、０．８当量）を添加することによって反応をクエンチした。５分後、反応混合物を、ロータリーエバポレータを使用して真空中で粘稠な油状物に濃縮した。粘稠な油状物を最小体積の酢酸エチルに再溶解し、８０／２０：酢酸エチル／ヘプタンで予備平衡化したシリカゲルカラムの上部に添加して生成物を回収した。生成物を含有する画分を合わせ、ロータリーエバポレータで真空中で泡まで濃縮し、最小量の無水ＤＣＭに再溶解し、速く撹拌している無水ヘプタンに滴下添加した。固体沈殿物を濾過によって単離し、真空中で一晩乾燥させて、７３６ｍｇの標的化合物を白色固体として得た（７３６ｍｇ、収率６１％）。ＬＣＭＳ（ＥＳ＋）実測値：８８９．５ｇ／ｍｏｌ．

【0294】

９．４． （１－シアノ－２－メチルプロパン－２－イル）２－［［ジ（プロパン－２－イル）アミノ］－［ｒａｃ－（２Ｒ，５Ｒ）－５－（６－ベンズアミドプリン－９－イル）－２－［［ビス（４－メトキシフェニル）－フェニルメトキシ］メチル］－４－（２－メトキシエトキシ）オキソラン－３－イル］オキシホスファニル］アセテート

Ｒａｃ－Ｎ－（９－（（２Ｒ，５Ｒ）－５－（（ビス（４－メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）メチル）－４－ヒドロキシ－３－（２－メトキシエトキシ）テトラヒドロフラン－２－イル）－９Ｈ－プリン－６－イル）ベンズアミド（６００ｍｇ、０．８２ｍｍｏｌ、１当量）を、無水ＤＣＭ（１０．２ｍｌ）に溶解し、次いで、１－シアノ－２－メチルプロパン－２－イル２－（ビス（ジイソプロピルアミノ）ホスファネイル）アセテート（４５７ｍｇ、１．２３ｍｍｏｌ、１．５当量）を反応混合物に添加した。反応成分が完全に溶解したら、４，５－ＤＣＩ（７７．５ｍｇ、０．６６ｍｍｏｌ、０．８当量）を反応混合物に添加した。次いで、反応混合物をアルゴン下、室温で一晩撹拌し、^３１Ｐ ＮＭＲおよびシリカゲルＴＬＣ（酢酸エチルで溶出）によって反応の程度を分析した。ＴＬＣ上でのより速い溶出生成物へのスポット間転換および酢酸ホスフィノジアマイト^３１Ｐ ＮＭＲシグナルの完全喪失によって、反応が完了したと判断した。完了したら、トリエチルアミン（６６．４ｍｇ、９１．４μｌ、０．６５ｍｍｏｌ、０．８当量）を添加することによって反応をクエンチした。５分後、反応混合物を、ロータリーエバポレータを使用して真空中で粘稠な油状物に濃縮した。粘稠な油状物を最小体積の酢酸エチルに再溶解し、８０／２０：酢酸エチル／ヘプタンで予備平衡化したシリカゲルカラムの上部に添加して生成物を回収した。生成物を含有する画分を合わせ、ロータリーエバポレータで真空中で泡まで濃縮し、最小量の無水ＤＣＭに再溶解し、速く撹拌している無水ヘプタンに滴下添加した。固体沈殿物を濾過によって単離し、真空中で一晩乾燥させて、２６０ｍｇの標的化合物を白色固体として得た（２６０ｍｇ、収率３２％）。ＬＣＭＳ（ＥＳ＋）実測値：１００２．５ｇ／ｍｏｌ．

【0295】

９．５． （１－シアノ－２－メチルプロパン－２－イル）２－［［ジ（プロパン－２－イル）アミノ］－［ｒａｃ－（２Ｒ，５Ｒ）－２－［［ビス（４－メトキシフェニル）－フェニルメトキシ］メチル］－４－（２－メトキシエトキシ）－５－［２－（２－メチルプロパノイルアミノ）－６－オキソ－１Ｈ－プリン－９－イル］オキソラン－３－イル］オキシホスファニル］アセテート

２－メチル－Ｎ－［６－オキソ－９－［ｒａｃ－（２Ｒ，５Ｒ）－５－［［ビス（４－メトキシフェニル）－フェニルメトキシ］メチル］－４－ヒドロキシ－３－（２－メトキシエトキシ）オキソラン－２－イル］－１Ｈ－プリン－２－イル］プロパンアミド（７００ｍｇ、０．９８ｍｍｏｌ、１当量）を無水ＤＣＭ（１２．３ｍｌ）に溶解し、次いで、１－シアノ－２－メチルプロパン－２－イル２－（ビス（ジイソプロピルアミノ）ホスファネイル）アセテート（５４６ｍｇ、１．４７ｍｍｏｌ、１．５当量）を反応混合物に添加した。反応成分が完全に溶解したら、４，５－ＤＣＩ（９３ｍｇ、０．７９ｍｍｏｌ、０．８当量）を反応混合物に添加した。次いで、反応混合物をアルゴン下、室温で一晩撹拌し、^３１Ｐ ＮＭＲおよびシリカゲルＴＬＣ（酢酸エチルで溶出）によって反応の程度を分析した。ＴＬＣ上でのより速い溶出生成物へのスポット間転換および酢酸ホスフィノジアマイト^３１Ｐ ＮＭＲシグナルの完全喪失によって、反応が完了したと判断した。完了したら、トリエチルアミン（８０ｍｇ、１０９μｌ、０．７９ｍｍｏｌ、０．８当量）を添加することによって反応をクエンチした。５分後、反応混合物を、ロータリーエバポレータを使用して真空中で粘稠な油状物に濃縮した。粘稠な油状物を最小体積の酢酸エチルに再溶解し、酢酸エチルで予備平衡化したシリカゲルカラムの上部に添加して生成物を回収した。生成物を含有する画分を合わせ、ロータリーエバポレータで真空中で泡まで濃縮し、最小量の無水ＤＣＭに再溶解し、速く撹拌している無水ヘプタンに滴下添加した。固体沈殿物を濾過によって単離し、真空中で一晩乾燥させて、５２０ｍｇの標的化合物を白色固体として得た（５２０ｍｇ、収率４９％）。ＬＣＭＳ（ＥＳ＋）実測値：９８４．５ｇ／ｍｏｌ．

【0296】

９．６． （１－シアノ－２－メチルプロパン－２－イル）２－［［ジ（プロパン－２－イル）アミノ］－［ｒａｃ－（２Ｒ，５Ｒ）－５－（４－ベンズアミド－５－メチル－２－オキソピリミジン－１－イル）－２－［［ビス（４－メトキシフェニル）－フェニルメトキシ］メチル］－４－（２－メトキシエトキシ）オキソラン－３－イル］オキシホスファニル］アセテート

Ｎ－［５－メチル－２－オキソ－１－［ｒａｃ－（２Ｒ，５Ｒ）－５－［［ビス（４－メトキシフェニル）－フェニルメトキシ］メチル］－４－ヒドロキシ３－（２－メトキシエトキシ）オキソラン－２－イル］ピリミジン－４－イル］ベンズアミド（９５０ｍｇ、１．３２ｍｍｏｌ、１当量）を無水ＤＣＭ（１６．５ｍｌ）に溶解し、次いで、１－シアノ－２－メチルプロパン－２－イル２－（ビス（ジイソプロピルアミノ）ホスファネイル）アセテート（７３３ｍｇ、１．９７ｍｍｏｌ、１．５当量）を反応混合物に添加した。反応成分が完全に溶解したら、４，５－ＤＣＩ（１２４ｍｇ、１．０５ｍｍｏｌ、０．８当量）を反応混合物に添加した。次いで、反応混合物をアルゴン下、室温で一晩撹拌し、^３１Ｐ ＮＭＲおよびシリカゲルＴＬＣ（酢酸エチルで溶出）によって反応の程度を分析した。ＴＬＣ上でのより速い溶出生成物へのスポット間転換および酢酸ホスフィノジアマイト^３１Ｐ ＮＭＲシグナルの完全喪失によって、反応が完了したと判断した。完了したら、トリエチルアミン（１０７ｍｇ、１４７μｌ、１．０５ｍｍｏｌ、０．８当量）を添加することによって反応をクエンチした。５分後、反応混合物を、ロータリーエバポレータを使用して真空中で粘稠な油状物に濃縮した。粘稠な油状物を最小体積の酢酸エチルに再溶解し、８０／２０：酢酸エチル／ヘプタンで予備平衡化したシリカゲルカラムの上部に添加して生成物を回収した。生成物を含有する画分を合わせ、ロータリーエバポレータで真空中で泡まで濃縮し、最小量の無水ＤＣＭに再溶解し、速く撹拌している無水ヘプタンに滴下添加した。固体沈殿物を濾過によって単離し、真空中で一晩乾燥させて、７２２ｍｇの標的化合物を淡黄色固体として得た（７２２ｍｇ、収率５５％）。ＬＣＭＳ（ＥＳ＋）実測値：９９２．４ｇ／ｍｏｌ．

【0297】

実施例１０：オリゴヌクレオチドの合成
Ｂｉｏａｕｔｏｍａｔｉｏｎ社のＭｅｒＭａｄｅ １２自動ＤＮＡ合成装置を使用して、オリゴヌクレオチドを合成した。合成は、ユニバーサルリンカーを備えた制御された細孔ガラス支持体（５００Å）を使用して１μｍｏｌスケールで行った。

【0298】

標準的なＤＮＡとＬＮＡホスホロアミダイトのカップリングのための標準サイクル手順において、ＤＭＴの脱保護化を、ＣＨ_２Ｃｌ_２中の３％（ｗ／ｖ）ジクロロ酢酸を用いて２３０μＬの３回の適用で１０５秒間行った。それぞれのホスホロアミダイトを、アセトニトリル（またはＬＮＡ－^ＭｅＣ構成要素に対してはアセトニトリル／ＣＨ_２Ｃｌ_２ １：１）中の０．１Ｍ溶液９５μＬおよび活性化剤としての５－［３，５－ビス（トリフルオロメチル）フェニル］－２Ｈ－テトラゾールの０．２５Ｍ溶液１１０μＬと、１８０秒のカップリング時間で３回カップリングさせた。３－アミノ－１，２，４－ジチアゾール－５－チオンのアセトニトリル／ピリジン中０．１Ｍ溶液を使用して、２００μＬを１回の適用で３分間硫化を行った。酸化は、ＴＨＦ／ｐｙｒ／Ｈ_２Ｏ：８８／１０／２中の０．０２Ｍ Ｉ_２を使用して１回の適用で３分間行った。ＴＨＦ／ルチジン／Ａｃ_２Ｏ ８：１：１（ＣａｐＡ、７５μｍｏｌ）およびＴＨＦ／Ｎ－メチルイミダゾール ８：２（ＣａｐＢ、７５μｍｏｌ）を使用して、キャッピングを７０秒間行った。

【0299】

ＭＯＥ ＰＡＣＥを導入するための合成サイクルは、ＣＨ_２Ｃｌ_２中の３％（ｗ／ｖ）ジクロロ酢酸を２３０μＬの３回の適用で１０５秒間使用するＤＭＴ脱保護化を含んだ。新たに調製したＭＯＥ ＰＡＣＥホスホロアミダイトを、９５μＬのアセトニトリル中０．１Ｍ溶液および０．２５Ｍ溶液１１０μＬの活性化剤としての５－［３，５－ビス（トリフルオロメチル）フェニル］－２Ｈ－テトラゾールと、１５分のカップリング時間で２回カップリングさせた。アセトニトリル／ピリジン中の３－アミノ－１，２，４－ジチアゾール－５－チオン０．１Ｍ溶液を使用して、１回の適用で３分間硫化を行った。酸化は、ＴＨＦ／ｐｙｒ／Ｈ_２Ｏ：８８／１０／２中の０．０２Ｍ Ｉ_２を使用して１回の適用で３分間行った。ＴＨＦ／ルチジン／Ａｃ_２Ｏ ８：１：１（ＣａｐＡ、７５μｍｏｌ）およびＴＨＦ／Ｎ－メチルイミダゾール ８：２（ＣａｐＢ、７５μｍｏｌ）を使用して、キャッピングを７０秒間行った。

【0300】

合成後、無水ＣＨ_３ＣＮ中の１．５％ＤＢＵ溶液を慎重に数回カラムに通して、ジメチルシアノエチル保護基を脱保護化し、脱保護中の塩基のアルキル化を防止した。次いで、室温で６０分間放置した。次いで、溶液を廃棄し、カラムを２～３ｍＬの無水ＣＨ_３ＣＮですすいだ。次いで、これをアルゴン流下で乾燥させた。次いで、ＣＰＧを４ｍＬバイアルに慎重に移し、水中１ｍＬの４０％ＭｅＮＨ_２を添加し、５５℃で１５分間撹拌したままにした。

【0301】

オリゴヌクレオチド上の粗ＤＭＴを、Ｃ１８カラムを使用するＲＰ－ＨＰＬＣ精製、続いて８０％酢酸水溶液およびエタノール沈殿によるＤＭＴ除去またはカートリッジ精製によって精製した。ＭＯＥ ＰＡＣＥホスホロアミダイトを、Ｂａｓｅｌで合成した。通常のホスホロアミダイト、および固相合成に使用した全ての試薬は、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから注文した。

【0302】

実施例１１：用量反応曲線のための異なる濃度でのヒトＨｅＬａ細胞におけるＭＡＬＡＴ１ ｍＲＮＡを標的とするオリゴヌクレオチドのインビトロ効力および有効性
ＨｅＬａ細胞をＡＴＣＣから購入し、サプライヤーの推奨に従って、３７℃、５％ＣＯ_２の加湿インキュベータで維持した。アッセイのために、３０００細胞／ウェルを９６マルチウェルプレートの培養培地中に播種した。細胞を２４時間インキュベートした後、ＰＢＳに溶解したオリゴヌクレオチドを添加した。オリゴヌクレオチドの濃度範囲：８段階の最高濃度２５μＭ、１：１希釈。オリゴヌクレオチドを添加した３日後、細胞を採取した。ＲＮＡを、製造者の説明書に従い、ＰｕｒｅＬｉｎｋ Ｐｒｏ ９６ ＲＮＡ精製キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して抽出し、５０μｌの水に溶出した。その後、ＲＮＡをＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅフリーの水（Ｇｉｂｃｏ）で１０倍希釈し、９０℃に１分間加熱した。

【0303】

遺伝子発現解析のために、二重鎖セットアップにおいてｑＳｃｒｉｐｔ（商標）ＸＬＴ Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ ＲＴ－ｑＰＣＲ ＴｏｕｇｈＭｉｘ（登録商標）、Ｌｏｗ ＲＯＸ（商標）（Ｑｕａｎｔａｂｉｏ）を使用してＯｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＴ－ｑＰＣＲを行った。ｑＰＣＲには、以下のＴａｑＭａｎプライマーアッセイを使用した：ＭＡＬＡＴ１、内因性対照ＧＡＰＤＨを有するＨｓ００２７３９０７＿ｓ１（ＦＡＭ－ＭＧＢ）。全てのプライマーセットは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。ＭＡＬＡＴ１ ｍＲＮＡの相対的発現レベルを対照（ＰＢＳ処理細胞）のパーセントとして示し、ＩＣ_５０値を、ｎ＝２の生物学的複製物からのデータに対してＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７を使用して決定した。

【0304】

結果を下表に提供する。

太字ｔ、ａ、ｇ、ｃはＭＯＥ修飾を表す。
（ｐｓ）隣接ヌクレオチド間のホスホロチオエート修飾。
（ｐｏ）隣接ヌクレオチド間のホスホロジエステル修飾。
＊隣接ヌクレオチド間のＰＡＣＥホスホロチオエート修飾。
°隣接ヌクレオチド間のＰＡＣＥホスホロジエステル修飾。
Ａ、Ｇ、^ｍＣ、Ｔは、ＬＮＡヌクレオチドを表す。
ａ、ｇ、ｃ、ｔは、ＤＮＡヌクレオチドを表す。
他の結合は全て、ホスホロチオエートとして調製した。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【配列表】

2022521510000001.app

【国際調査報告】