特表 2022-521512 新規ホスホルアミダイト

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-04-08

(54)【発明の名称】新規ホスホルアミダイト

(51)【国際特許分類】

   C07H 19/067 20060101AFI20220401BHJP

   C07H 19/167 20060101ALI20220401BHJP

【ＦＩ】

C07H19/067 CSP

C07H19/167 ZNA

【審査請求】未請求

【予備審査請求】有

(21)【出願番号】P 2021548670

(86)(22)【出願日】2020-02-20

(85)【翻訳文提出日】2021-10-12

(86)【国際出願番号】 EP2020054410

(87)【国際公開番号】W WO2020169696

(87)【国際公開日】2020-08-27

(31)【優先権主張番号】19158303.8

(32)【優先日】2019-02-20

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】515129320

【氏名又は名称】ロシュ イノベーション センター コペンハーゲン エーエス

(74)【代理人】

【識別番号】100102978

【弁理士】

【氏名又は名称】清水 初志

(74)【代理人】

【識別番号】100102118

【弁理士】

【氏名又は名称】春名 雅夫

(74)【代理人】

【識別番号】100160923

【弁理士】

【氏名又は名称】山口 裕孝

(74)【代理人】

【識別番号】100119507

【弁理士】

【氏名又は名称】刑部 俊

(74)【代理人】

【識別番号】100142929

【弁理士】

【氏名又は名称】井上 隆一

(74)【代理人】

【識別番号】100148699

【弁理士】

【氏名又は名称】佐藤 利光

(74)【代理人】

【識別番号】100128048

【弁理士】

【氏名又は名称】新見 浩一

(74)【代理人】

【識別番号】100129506

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 智彦

(74)【代理人】

【識別番号】100205707

【弁理士】

【氏名又は名称】小寺 秀紀

(74)【代理人】

【識別番号】100114340

【弁理士】

【氏名又は名称】大関 雅人

(74)【代理人】

【識別番号】100121072

【弁理士】

【氏名又は名称】川本 和弥

(72)【発明者】

【氏名】ブライヒャー コンラッド

(72)【発明者】

【氏名】バスティアン ジェシカ マリーヌ オロール

【テーマコード（参考）】

4C057

【Ｆターム（参考）】

4C057AA17

4C057BB02

4C057CC03

4C057DD03

4C057LL10

4C057LL11

4C057LL17

4C057LL18

4C057LL29

4C057LL30

4C057LL36

4C057LL39

4C057LL41

(57)【要約】

本発明は、式（ＩＩ）の化合物であって、式中、Ｘ、Ｙ、Ｒ^５、Ｒ^ｘ、Ｒ^ｙ、及びＮｕは、明細書及び特許請求の範囲で定義されているとおりである、化合物に関する。式（ＩＩ）の化合物は、医薬の製造に使用することができる。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

式（Ｉ－ａ）の化合物、又はその薬学的に許容される塩（alt）：

式中、
Ｒ^２は、アルコキシ、アルコキシアルコキシ、又はアミノであり；かつ
Ｒ^４は水素であるか；又は
Ｒ^４及びＲ^２は一緒にＸ－Ｙを形成し；
Ｘは、酸素、硫黄、－ＣＲ^ａＲ^ｂ－、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｃ（Ｒ^ｂ）－、－Ｃ（＝ＣＲ^ａＲ^ｂ）－、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｎ－、－Ｓｉ（Ｒ^ａ）_２－、－ＳＯ_２－、－ＮＲ^ａ－；－Ｏ－ＮＲ^ａ－、－ＮＲ^ａ－Ｏ－、－Ｃ（＝Ｊ）－、Ｓｅ、－Ｏ－ＮＲ^ａ－、－ＮＲ^ａ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－、－Ｎ（Ｒ^ａ）－Ｏ－、又は－Ｏ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－であり；
Ｙは、酸素、硫黄、－（ＣＲ^ａＲ^ｂ）_ｎ－、－ＣＲ^ａＲ^ｂ－Ｏ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｃ（Ｒ^ｂ）－、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｎ－、－Ｓｉ（Ｒ^ａ）_２－、－ＳＯ_２－、－ＮＲ^ａ－、－Ｃ（＝Ｊ）－、Ｓｅ、－Ｏ－ＮＲ^ａ－、－ＮＲ^ａ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－、－Ｎ（Ｒ^ａ）－Ｏ－、又は－Ｏ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－であり；
ただし、－Ｘ－Ｙ－は、－Ｏ－Ｏ－、Ｓｉ（Ｒ^ａ）_２－Ｓｉ（Ｒ^ａ）_２－、－ＳＯ_２－ＳＯ_２－、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｃ（Ｒ^ｂ）－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｃ（Ｒ^ｂ）、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｎ－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｎ－、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｎ－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｃ（Ｒ^ｂ）、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｃ（Ｒ^ｂ）－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｎ－、又は－Ｓｅ－Ｓｅ－ではないことを条件とし；
Ｊは、酸素、硫黄、＝ＣＨ_２又は＝Ｎ（Ｒ^ａ）であり；
Ｒ^ａ及びＲ^ｂは、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、チオヒドロキシル、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルコキシアルキル、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、ヘテロシクリル、アミノ、アルキルアミノ、カルバモイル、アルキルアミノカルボニル、アミノアルキルアミノカルボニル、アルキルアミノアルキルアミノカルボニル、アルキルカルボニルアミノ、カルバミド、アルカノイルオキシ、スルホニル、アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、チオヒドロキシルスルフィドアルキルスルファニル、アリールオキシカルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシカルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、－ＯＣ（＝Ｘ^ａ）Ｒ^ｃ、－ＯＣ（＝Ｘ^ａ）ＮＲ^ｃＲ^ｄ、及び－ＮＲ^ｅＣ（＝Ｘ^ａ）ＮＲ^ｃＲ^ｄから独立して選択され；
又は、２つのジェミナルなＲ^ａ及びＲ^ｂが一緒になって、置換されていてもよいメチレンを形成するか；
又は、２つのジェミナルなＲ^ａ及びＲ^ｂが、それらが結合している炭素原子と一緒になって、－Ｘ－Ｙ－の炭素原子を１つだけ有するシクロアルキル又はハロシクロアルキルを形成し；
ここで、置換アルキル、置換アルケニル、置換アルキニル、置換アルコキシ、及び置換メチレンは、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、ホルミル、ヘテロシクリル（heterocylyl）、アリール、及びヘテロアリールから独立して選択される１から３個の置換基で置換されたアルキル、アルケニル、アルキニル、及びメチレンであり；
Ｘ^ａは、酸素、硫黄、又は－ＮＲ^ｃであり；
Ｒ^ｃ、Ｒ^ｄ及びＲ^ｅは、水素及びアルキルから独立して選択され；
Ｒ^５はヒドロキシル保護基であり；
Ｒ^ｘはシアノアルキル又はアルキルであり；
Ｒ^ｙはジアルキルアミノ又はピロリジニルであり；
Ｎｕは、核酸塩基又は保護された核酸塩基であり；かつ
ｎは、１、２、又は３である。

【請求項2】

式（ＩＩ）の、請求項１に記載の化合物、又はその薬学的に許容される塩（alt）：

式中、
Ｘは、酸素、硫黄、－ＣＲ^ａＲ^ｂ－、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｃ（Ｒ^ｂ）－、－Ｃ（＝ＣＲ^ａＲ^ｂ）－、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｎ－、－Ｓｉ（Ｒ^ａ）_２－、－ＳＯ_２－、－ＮＲ^ａ－；－Ｏ－ＮＲ^ａ－、－ＮＲ^ａ－Ｏ－、－Ｃ（＝Ｊ）－、Ｓｅ、－Ｏ－ＮＲ^ａ－、－ＮＲ^ａ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－、－Ｎ（Ｒ^ａ）－Ｏ－、又は－Ｏ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－であり；
Ｙは、酸素、硫黄、－（ＣＲ^ａＲ^ｂ）_ｎ－、－ＣＲ^ａＲ^ｂ－Ｏ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｃ（Ｒ^ｂ）－、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｎ－、－Ｓｉ（Ｒ^ａ）_２－、－ＳＯ_２－、－ＮＲ^ａ－、－Ｃ（＝Ｊ）－、Ｓｅ、－Ｏ－ＮＲ^ａ－、－ＮＲ^ａ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－、－Ｎ（Ｒ^ａ）－Ｏ－、又は－Ｏ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－であり；
ただし、－Ｘ－Ｙ－は、－Ｏ－Ｏ－、Ｓｉ（Ｒ^ａ）_２－Ｓｉ（Ｒ^ａ）_２－、－ＳＯ_２－ＳＯ_２－、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｃ（Ｒ^ｂ）－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｃ（Ｒ^ｂ）、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｎ－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｎ－、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｎ－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｃ（Ｒ^ｂ）、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｃ（Ｒ^ｂ）－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｎ－、又は－Ｓｅ－Ｓｅ－ではないことを条件とし；
Ｊは、酸素、硫黄、＝ＣＨ_２又は＝Ｎ（Ｒ^ａ）であり；
Ｒ^ａ及びＲ^ｂは、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、チオヒドロキシル、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルコキシアルキル、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、ヘテロシクリル、アミノ、アルキルアミノ、カルバモイル、アルキルアミノカルボニル、アミノアルキルアミノカルボニル、アルキルアミノアルキルアミノカルボニル、アルキルカルボニルアミノ、カルバミド、アルカノイルオキシ、スルホニル、アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、チオヒドロキシルスルフィドアルキルスルファニル、アリールオキシカルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシカルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、－ＯＣ（＝Ｘ^ａ）Ｒ^ｃ、－ＯＣ（＝Ｘ^ａ）ＮＲ^ｃＲ^ｄ、及び－ＮＲ^ｅＣ（＝Ｘ^ａ）ＮＲ^ｃＲ^ｄから独立して選択され；
又は、２つのジェミナルなＲ^ａ及びＲ^ｂが一緒になって、置換されていてもよいメチレンを形成するか；
又は、２つのジェミナルなＲ^ａ及びＲ^ｂが、それらが結合している炭素原子と一緒になって、－Ｘ－Ｙ－の炭素原子を１つだけ有するシクロアルキル又はハロシクロアルキルを形成し；
ここで、置換アルキル、置換アルケニル、置換アルキニル、置換アルコキシ、及び置換メチレンは、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、ホルミル、ヘテロシクリル（heterocylyl）、アリール、及びヘテロアリールから独立して選択される１から３個の置換基で置換されたアルキル、アルケニル、アルキニル、及びメチレンであり；
Ｘ^ａは、酸素、硫黄、又は－ＮＲ^ｃであり；
Ｒ^ｃ、Ｒ^ｄ及びＲ^ｅは、水素及びアルキルから独立して選択され；
Ｒ^５はヒドロキシル保護基であり；
Ｒ^ｘはシアノアルキル又はアルキルであり；
Ｒ^ｙはジアルキルアミノ又はピロリジニルであり；
Ｎｕは、核酸塩基又は保護された核酸塩基であり；かつ
ｎは、１、２、又は３である。

【請求項3】

式（ＶＩ）の、請求項１に記載の化合物：

式中、Ｒ^２、Ｒ^５、Ｒ^ｘ、Ｒ^ｙ、及びＮｕは、請求項１に記載のとおりである。

【請求項4】

－Ｘ－Ｙ－が、－ＣＨ_２－Ｏ－、－ＣＨ（ＣＨ_３）－Ｏ－、又は－ＣＨ_２ＣＨ_２－Ｏ－である、請求項１又は２に記載の化合物。

【請求項5】

式（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、又は（ＶＩＩ）の、請求項１～４のいずれか一項に記載の化合物：

式中、Ｒ^５、Ｒ^ｘ、Ｒ^ｙ、及びＮｕは、請求項１に記載のとおりである。

【請求項6】

Ｒ^ｘが２－シアノ－１，１－ジメチル－エチルである、請求項１～５のいずれか一項に記載の化合物。

【請求項7】

Ｒ^ｙがジイソプロピルアミノ又はピロリジニルである、請求項１～６のいずれか一項に記載の化合物。

【請求項8】

Ｒ^ｙがジアルキルアミノである、請求項１～７のいずれか一項に記載の化合物。

【請求項9】

Ｒ^ｙがジイソプロピルアミノである、請求項１～８のいずれか一項に記載の化合物。

【請求項10】

式（Ｖ）又は（ＶＩＩＩ）の、請求項１～８のいずれか一項に記載の化合物：

式中、Ｒ^５及びＮｕは、請求項１に記載のとおりである。

【請求項11】

Ｎｕが、チミン、保護されたチミン、アデノシン、保護されたアデノシン、シトシン、保護されたシトシン、５－メチルシトシン、保護された５－メチルシトシン、グアニン、保護されたグアニン、ウラシル、又は保護されたウラシルである、請求項１～１０のいずれか一項に記載の化合物。

【請求項12】

以下：

から選択される、請求項１～１１のいずれか一項に記載の化合物。

【請求項13】

請求項１～１２のいずれか一項に記載の式（Ｉ－ａ）の化合物の製造方法であって、式（Ｅ）：

の化合物と、式Ｐ（Ｒ^ｙ）_２（ＣＨ_２）ＣＯＯ（Ｒ^ｘ）の化合物との、カップリング剤の存在下での反応を含み、
式中、Ｘ、Ｙ、Ｒ^５、Ｎｕ、Ｒ^ｘ、及びＲ^ｙは、請求項１～１２のいずれか一項に記載されるとおりである、
製造方法。

【請求項14】

式（Ｃ）又は（Ｄ）：

の化合物と、式Ｐ（Ｒ^ｙ）_２（ＣＨ_２）ＣＯＯ（Ｒ^ｘ）の化合物との、カップリング剤の存在下での反応を含み、
式中、Ｘ、Ｙ、Ｒ^５、Ｎｕ、Ｒ^ｘ、及びＲ^ｙは、請求項１～１２のいずれか一項に記載されるとおりである、
請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

カップリング剤が、１Ｈ－テトラゾール、５－エチルチオ－１Ｈ－テトラゾール、２－ベンジルチオテトラゾール、又は４，５－ジシアノイミダゾール（ＤＣＩ）である、請求項１３又は１４に記載の方法。

【請求項16】

オリゴヌクレオチドの製造における、請求項１～１２のいずれか一項に記載の化合物の使用。

【請求項17】

本明細書に記述したとおりの発明。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、特に、一本鎖アンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドであって、式（Ｉ）：

［式中、（Ａ^１）及び（Ａ^２）の一方は糖修飾ヌクレオシドであり、他方は、糖修飾ヌクレオシド又はＤＮＡヌクレオシドであり、Ａは、酸素又は硫黄である］
の少なくとも１つのジヌクレオシドを含む、一本鎖アンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩に関する。

【0002】

本発明はまた、特に、本発明によるアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドの調製に有用な新規ホスホルアミダイトにも関する。

【背景技術】

【0003】

治療剤としての合成オリゴヌクレオチドは、近年目覚ましい進歩を遂げ、ＲＮａｓｅ Ｈ活性化ギャップマー、スプライススイッチングオリゴヌクレオチド、マイクロＲＮＡ阻害剤、ｓｉＲＮＡ、又はアプタマーを含む多様な機構によって作用する、臨床的に検証された分子の幅広いポートフォリオをもたらしている（S. T. Crooke, Antisense drug technology: principles, strategies, and applications, 2nd ed. ed., Boca Raton, FL: CRC Press, 2008（非特許文献１））。天然のオリゴヌクレオチドは、生物学的システムにおける核酸分解に対して本質的に不安定である。さらには、それらは非常に好ましくない薬物動態学的挙動を示す。これらの欠点を改善するために、過去数十年間にわたり多種多様な化学修飾が調査されてきた。ほぼ間違いなく、最も成功した修飾の１つは、非架橋のリン酸酸素原子の１つが硫黄原子に置き換えられた、ホスホロチオエート結合の導入である（F. Eckstein, Antisense and Nucleic Acid Drug Development 2009, 10, 117-121（非特許文献２））。このようなホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドは、タンパク質結合の増加、並びに核酸分解に対する明らかに高い安定性を示し、したがって、血漿、組織、及び細胞において、それらの未修飾ホスホジエステルアナログよりも実質的に高い半減期を示す。これらの重要な特徴は、第１世代のオリゴヌクレオチド治療薬の開発を可能にするとともに、ロック核酸（ＬＮＡ）などの後の世代の修飾によるさらなる改善への道を開いた。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0004】

【非特許文献1】S. T. Crooke, Antisense drug technology: principles, strategies, and applications, 2nd ed. ed., Boca Raton, FL: CRC Press, 2008

【非特許文献2】F. Eckstein, Antisense and Nucleic Acid Drug Development 2009, 10, 117-121

【発明の概要】

【0005】

驚くべきことに、本発明による一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは良好な耐容性を示すことが見出された。それらは、少なくとも、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてホスホロチオエートヌクレオシド間結合のみを含む参照オリゴヌクレオチドと同じくらい効力があり、ｉｎ ｖｉｖｏでは、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合のみを含む参照オリゴヌクレオチドよりも効力があった。驚くべきことに、本発明による一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、特に、心臓細胞株（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）において、及び心臓組織（hear tiussue）（ｉｎ ｖｉｖｏ）において効力があった。

【図面の簡単な説明】

【0006】

【図1】ヒトＨｅＬａ細胞株におけるＭＡＬＡＴ１ ｍＲＮＡを標的とする本発明によるオリゴヌクレオチドの用量反応曲線を示す。

【図2】ヒトＡ５４９細胞株におけるＭＡＬＡＴ１ ｍＲＮＡを標的とする本発明によるオリゴヌクレオチドの用量反応曲線を示す。

【図3】ヒトＨｅＬａ細胞株におけるＨＩＦ１Ａ ｍＲＮＡを標的とする本発明によるオリゴヌクレオチドの用量反応曲線を示す。

【図4】ヒトＡ５４９細胞株におけるＨＩＦ１Ａ ｍＲＮＡを標的とする本発明によるオリゴヌクレオチドの用量反応曲線を示す。

【図5】マウス初代肝細胞におけるＡｐｏＢ ｍＲＮＡを標的とする本発明によるオリゴヌクレオチドの用量反応曲線を示す。

【図6】本発明によるオリゴヌクレオチドで処置された動物の心臓におけるＭａｌａｔ１ ｍＲＮＡレベルの量を示す。

【発明を実施するための形態】

【0007】

本明細書において、用語「アルキル」は、単独で又は組み合わせて、１から８個の炭素原子を有する直鎖又は分岐鎖アルキル基、特に１から６個の炭素原子を有する直鎖又は分岐鎖アルキル基、より具体的には１から４個の炭素原子を有する直鎖又は分岐鎖アルキル基を意味する。直鎖及び分岐鎖Ｃ_１－Ｃ_８アルキル基の例は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、異性体ペンチル、異性体ヘキシル、異性体ヘプチル、及び異性体オクチル、特に、メチル、エチル、プロピル、ブチル、及びペンチルである。アルキルの特定の例は、メチル、エチル、及びプロピルである。

【0008】

用語「シクロアルキル」は、単独で又は組み合わせて、３から８個の炭素原子を有するシクロアルキル環、特に３から６個の炭素原子を有するシクロアルキル環を意味する。シクロアルキルの例は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル及びシクロオクチル、より具体的には、シクロプロピル及びシクロブチルである。「シクロアルキル」の特定の例は、シクロプロピルである。

【0009】

用語「アルコキシ」は、単独で又は組み合わせて、式アルキル－Ｏ－の基（ここで、用語「アルキル」は、以前に与えられた意味を有する）、例えばメトキシ、エトキシ、ｎ－プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ－ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ－ブトキシ、及びｔｅｒｔ－ブトキシを意味する。特定の「アルコキシ」は、メトキシ及びエトキシである。メトキシエトキシは、「アルコキシアルコキシ」の特定の例である。

【0010】

用語「オキシ」は、単独で又は組み合わせて、－Ｏ－基を意味する。

【0011】

用語「アルケニル」は、単独で又は組み合わせて、オレフィン結合と、最大８個、好ましくは最大６個、特に好ましくは最大４個の炭素原子とを含む、直鎖又は分岐鎖炭化水素残基を意味する。アルケニル基の例は、エテニル、１－プロペニル、２－プロペニル、イソプロペニル、１－ブテニル、２－ブテニル、３－ブテニル、及びイソブテニルである。

【0012】

用語「アルキニル」は、単独で又は組み合わせて、三重結合と、最大８個、特に、２個の炭素原子とを含む、直鎖又は分岐鎖炭化水素残基を意味する。

【0013】

用語「ハロゲン」又は「ハロ」は、単独で又は組み合わせて、フッ素、塩素、臭素、又はヨウ素を意味し、特に、フッ素、塩素、又は臭素、より具体的にはフッ素を意味する。用語「ハロ」は、別の基と組み合わせて、少なくとも１つのハロゲン、特に、１つから５つのハロゲンで置換された、特に、１つから４つのハロゲン、すなわち、１つ、２つ、３つ、又は４つのハロゲン置換された前記基の置換を意味する。

【0014】

用語「ハロアルキル」は、単独で又は組み合わせて、少なくとも１つのハロゲンで置換された、特に１つから５つのハロゲン、特に１つから３つのハロゲンで置換されたアルキル基を意味する。ハロアルキルの例には、モノフルオロ－、ジフルオロ－、又はトリフルオロ－メチル、－エチル、又は－プロピル、例えば、３，３，３－トリフルオロプロピル、２－フルオロエチル、２，２，２－トリフルオロエチル、フルオロメチル、又はトリフルオロメチルが含まれる。フルオロメチル、ジフルオロメチル、及びトリフルオロメチルは、特定の「ハロアルキル」である。

【0015】

用語「ハロシクロアルキル」は、単独で又は組み合わせて、少なくとも１つのハロゲンで置換された、特に１つから５つのハロゲン、特に１つから３つのハロゲンで置換された上記定義されたシクロアルキル基を意味する。用語「ハロシクロアルキル」の特定の例は、ハロシクロプロピル、特に、フルオロシクロプロピル、ジフルオロシクロプロピル、及びトリフルオロシクロプロピルである。

【0016】

用語「ヒドロキシル」及び「ヒドロキシ」は、単独で又は組み合わせて、－ＯＨ基を意味する。

【0017】

用語「チオヒドロキシル」及び「チオヒドロキシ」は、単独で又は組み合わせて、－ＳＨ基を意味する。

【0018】

用語「カルボニル」は、単独で又は組み合わせて、－Ｃ（Ｏ）－基を意味する。

【0019】

用語「カルボキシ」又は「カルボキシル」は、単独で又は組み合わせて、－ＣＯＯＨ基を意味する。

【0020】

用語「アミノ」は、単独で又は組み合わせて、第一級アミノ基（－ＮＨ_２）、第二級アミノ基（－ＮＨ－）、又は第三級アミノ基（－Ｎ－）を意味する。

【0021】

用語「アルキルアミノ」は、単独で又は組み合わせて、１つ又は２つの上記定義されたアルキル基で置換された、上記定義されたアミノ基を意味する。

【0022】

用語「スルホニル」は、単独で又は組み合わせて、－ＳＯ_２基を意味する。

【0023】

用語「スルフィニル」は、単独で又は組み合わせて、－ＳＯ－基を意味する。

【0024】

用語「スルファニル」は、単独で又は組み合わせて、－Ｓ－基を意味する。

【0025】

用語「シアノ」は、単独で又は組み合わせて、－ＣＮ基を意味する。

【0026】

用語「アジド」は、単独で又は組み合わせて、－Ｎ_３基を意味する。

【0027】

用語「ニトロ」は、単独で又は組み合わせて、ＮＯ_２基を意味する。

【0028】

用語「ホルミル」は、単独で又は組み合わせて、－Ｃ（Ｏ）Ｈ基を意味する。

【0029】

用語「カルバモイル」は、単独で又は組み合わせて、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２基を意味する。

【0030】

用語「カバミド」は、単独で又は組み合わせて、－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ_２基を意味する。

【0031】

用語「アリール」は、単独で又は組み合わせて、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、及びホルミルから独立して選択される１から３個の置換基で置換されていてもよい、６から１０個の炭素環原子を含む、一価芳香族炭素環式単環又は二環式環系を示す。アリールの例には、フェニル及びナフチル、特にフェニルが含まれる。

【0032】

用語「ヘテロアリール」は、単独で又は組み合わせて、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択された１つ、２つ、３つ、又は４つのヘテロ原子を含み、残りの環原子が、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、及びホルミルから独立して選択される１から３個の置換基で置換されていてもよい、炭素である、５から１２個の環原子の一価芳香族複素環式単環又は二環式環系を示す。ヘテロアリールの例には、ピロリル、フラニル、チエニル、イミダゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、トリアゾニル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、テトラゾリル、ピリジニル、ピラジニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピリミジニル、トリアジニル、アゼピニル、ジアゼピニル、イソオキサゾリル、ベンゾフラニル、イソチアゾリル、ベンゾチエニル、インドリル、イソインドリル、イソベンゾフラニル、ベンズイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾイソオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾイソチアゾリル、ベンゾオキサジアゾリル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾトリアゾリル、プリニル、キノリニル、イソキノリニル、キナゾリニル、キノキサリニル、カルバゾリル、又はアクリジニルが含まれる。

【0033】

用語「ヘテロシクリル」は、単独で又は組み合わせて、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１、２、３又は４個の環ヘテロ原子を含み、残りの環原子が、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、及びホルミルから独立して選択される１から３個の置換基で置換されていてもよい、炭素である４から１２個、特に４から９個の環原子の一価飽和又は部分不飽和単環又は二環式環系を意味する。単環式飽和ヘテロシクリルの例は、アゼチジニル、ピロリジニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロ－チエニル、ピラゾリジニル、イミダゾリジニル、オキサゾリジニル、イソオキサゾリジニル、チアゾリジニル、ピペリジニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、ピペラジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、１，１－ジオキソ－チオモルホリン－４－イル、アゼパニル、ジアゼパニル、ホモピペラジニル、又はオキサゼパニルである。二環式飽和ヘテロシクロアルキルの例は、８－アザ－ビシクロ［３．２．１］オクチル、キヌクリジニル、８－オキサ－３－アザ－ビシクロ［３．２．１］オクチル、９－アザ－ビシクロ［３．３．１］ノニル、３－オキサ－９－アザ－ビシクロ［３．３．１］ノニル、又は３－チア－９－アザ－ビシクロ［３．３．１］ノニルである。部分不飽和ヘテロシクロアルキルの例は、ジヒドロフリル、イミダゾリニル、ジヒドロ－オキサゾリル、テトラヒドロ－ピリジニル、又はジヒドロピラニルである。

【0034】

用語「薬学的に許容される塩」は、生物学的に又はそれ以外の点で望ましくないものではない、遊離塩基又は遊離酸の生物学的な有効性及び特性を保持する塩を指す。塩は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸、特に塩酸、並びに、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、サリチル酸、Ｎ－アセチルシステインなどの有機酸と共に形成される。加えて、これらの塩は、無機塩基又は有機塩基を遊離酸に加えることによって調製することができる。無機塩基から誘導される塩には、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウムの塩が含まれるがこれらに限定されない。有機塩基から誘導される塩には、第一級、第二級、及び第三級アミン、天然に存在する置換アミンを含む置換アミン、環式アミン及び塩基性イオン交換樹脂、例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、リジン、アルギニン、Ｎ－エチルピペリジン、ピペリジン、ポリアミン樹脂の塩が含まれるが、これらに限定されない。本発明のオリゴヌクレオチドは、双性イオンの形態で存在することもありうる。特に、本発明の特に好ましい薬学的に許容される塩は、ナトリウム、リチウム、カリウム、及びトリアルキルアンモニウムの塩である。

【0035】

用語「保護基」は、単独で又は組み合わせて、化学反応が別の保護されていない反応性部位で選択的に行われうるように、多官能性化合物の反応性部位を選択的に遮断する基を意味する。保護基は、除去することができる。例示的な保護基は、アミノ保護基、カルボキシ保護基、又はヒドロキシ保護基である。

【0036】

「リン酸保護基」は、リン酸基の保護基である。リン酸保護基の例は、２－シアノエチル及びメチルである。リン酸保護基の特定の例は、２－シアノエチルである。

【0037】

「ヒドロキシル保護基」は、ヒドロキシル基の保護基であり、チオール基を保護するためにも用いられる。ヒドロキシル保護基の例は、アセチル（Ａｃ）、ベンゾイル（Ｂｚ）、ベンジル（Ｂｎ）、β－メトキシエトキシメチルエーテル（ＭＥＭ）、ジメトキシトリチル（又はビス－（４－メトキシフェニル）フェニルメチル）（ＤＭＴ）、トリメトキシトリチル（又はトリス－（４－メトキシフェニル）フェニルメチル）（ＴＭＴ）、メトキシメチルエーテル（ＭＯＭ）、メトキシトリチル［（４－メトキシフェニル）ジフェニルメチル（ＭＭＴ）、ｐ－メトキシベンジルエーテル（ＰＭＢ）、メチルチオメチルエーテル、ピバロイル（Ｐｉｖ）、テトラヒドロピラニル（ＴＨＰ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、トリチル又はトリフェニルメチル（Ｔｒ）、シリルエーテル（例えば、トリメチルシリル（ＴＭＳ）、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）、トリ－イソ－プロピルシリルオキシメチル（ＴＯＭ）及びトリイソプロピルシリル（ＴＩＰＳ）エーテル）、メチルエーテル、及びエトキシエチルエーテル（ＥＥ）である。ヒドロキシル保護基の特定の例は、ＤＭＴ及びＴＭＴ、特にＤＭＴである。

【0038】

「チオヒドロキシル保護基」は、チオヒドロキシル基の保護基である。チオヒドロキシル保護基の例は、「ヒドロキシル保護基」のものである。

【0039】

本発明の出発物質又は化合物のうちの１つが、１つ以上の反応ステップの反応条件下で安定でないか又は反応性である１つ以上の官能基を含む場合、適切な保護基（例えば、“Protective Groups in Organic Chemistry” by T. W. Greene and P. G. M. Wuts, 3^rd Ed., 1999, Wiley, New Yorkに記載されているもの）を、当該技術分野でよく知られている重要なステップ適用方法の前に導入することができる。このような保護基は、文献に記載されている標準的な方法を用いて、合成の後の段階において除去することができる。保護基の例は、ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、９－フルオレニルメチルカルバメート（Ｆｍｏｃ）、２－トリメチルシリルエチルカルバメート（Ｔｅｏｃ）、カルボベンジルオキシ（Ｃｂｚ）、及びｐ－メトキシベンジルオキシカルボニル（Ｍｏｚ）である。

【0040】

本明細書に記載される化合物は、数個の不斉中心を含むことができ、光学的に純粋なエナンチオマー、例えばラセミ体などのエナンチオマーの混合物、ジアステレオ異性体の混合物、ジアステレオ異性体のラセミ体、又はジアステレオ異性体ラセミ体の混合物の形態で存在することができる。

【0041】

オリゴヌクレオチド
本明細書で用いられる「オリゴヌクレオチド」という用語は、２つ以上の共有結合したヌクレオシドを含む分子として当業者に一般に理解されるように定義される。このような共有結合したヌクレオシドはまた、核酸分子又はオリゴマーとも称されうる。オリゴヌクレオチドは、通常、固相化学合成と、その後の精製によって研究室内で作製される。オリゴヌクレオチドの配列に言及する場合には、共有結合したヌクレオチド又はヌクレオシドの核酸塩基部分の配列又は順序、若しくはその修飾が言及される。本発明のオリゴヌクレオチドは、人工のものであり、化学的に合成され、通常は精製又は単離される。本発明のオリゴヌクレオチドは、１つ以上の修飾ヌクレオシド又はヌクレオチドを含みうる。

【0042】

アンチセンスオリゴヌクレオチド
本明細書で用いられる「アンチセンスオリゴヌクレオチド」という用語は、標的核酸、特に標的核酸上の連続配列にハイブリダイズすることによって標的遺伝子の発現を調節することができるオリゴヌクレオチドとして定義される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、本質的に二本鎖ではなく、したがってｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡではない。好ましくは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは一本鎖である。本発明の単鎖オリゴヌクレオチドは、自己内又は自己間の相補性の程度がオリゴヌクレオチドの全長にわたって５０％未満である限り、ヘアピン又は分子間二重構造（同じオリゴヌクレオチドの２つの分子間の二重鎖）を形成することができるものと理解される。

【0043】

連続ヌクレオチド配列
「連続ヌクレオチド配列」という用語は、標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチドの領域を指す。この用語は、本明細書で「連続核酸塩基配列」という用語及び「オリゴヌクレオチドモチーフ配列」という用語と互換的に用いられる。幾つかの実施態様では、オリゴヌクレオチドのすべてのヌクレオチドが連続ヌクレオチド配列を構成する。幾つかの実施態様では、オリゴヌクレオチドは、連続ヌクレオチド配列、例えばＦ－Ｇ－Ｆ’ギャップマー領域を含み、場合によっては、（一又は複数の）さらなるヌクレオチド、例えば、官能基を連続ヌクレオチド配列に結合するのに用いられうるヌクレオチドリンカー領域を含みうる。ヌクレオチドリンカー領域は、標的核酸に相補的であっても相補的でなくてもよい。

【0044】

ヌクレオチド
ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドの構成要素であり、本発明の目的では、天然に存在するヌクレオチド及び天然に存在しないヌクレオチドの両方を含む。本来、ＤＮＡヌクレオチド及びＲＮＡヌクレオチドなどのヌクレオチドは、リボース糖部分、核酸塩基部分、及び１つ以上のリン酸基（ヌクレオシドには存在しない）を含む。ヌクレオシド及びヌクレオチドはまた、互換的に「単位」又は「モノマー」と呼ぶことができる。

【0045】

修飾ヌクレオシド
本明細書で用いられる「修飾ヌクレオシド」又は「ヌクレオシド修飾」という用語は、糖部分又は（核酸）塩基部分の１つ以上の修飾の導入によって、同等のＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドと比較して修飾されたヌクレオシドを指す。好ましい実施態様では、修飾ヌクレオシドは、修飾された糖部分を含む。修飾ヌクレオシドという用語はまた、本明細書では、「ヌクレオシドアナログ」又は修飾「単位」又は修飾「モノマー」という用語と互換的に使用することもできる。非修飾ＤＮＡ又はＲＮＡ糖部分を有するヌクレオシドは、本明細書ではＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドと称される。ＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドの塩基領域に修飾を有するヌクレオシドは、それらがワトソン・クリック塩基対合可能な場合には、依然として一般的にＤＮＡ又はＲＮＡと称される。

【0046】

修飾ヌクレオシド間結合
「修飾ヌクレオシド間結合」という用語は、２つのヌクレオシドを共に共有結合する、ホスホジエステル（ＰＯ）結合以外の結合として当業者に一般的に理解されるように定義される。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオシド間結合を含みうる。幾つかの実施態様では、修飾ヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル結合と比較して、オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を増加させる。天然に存在するオリゴヌクレオチドでは、ヌクレオシド間結合は、隣接するヌクレオシド間のホスホジエステル結合を生成するリン酸基を含む修飾ヌクレオシド間結合は、ｉｎ ｖｉｖｏでの使用のためのオリゴヌクレオチドの安定化に特に有用であり、本発明のオリゴヌクレオチドのＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドの領域、例えばギャップマーオリゴヌクレオチドのギャップ領域内、並びに領域Ｆ及びＦ’などの修飾ヌクレオシドの領域における、ヌクレアーゼ切断から保護する役割を果たすことができる。

【0047】

一実施態様では、オリゴヌクレオチドは、１つ以上の修飾ヌクレオシド間結合が、例えばヌクレアーゼ攻撃に対してより耐性になるように、天然のホスホジエステルから修飾された１つ以上のヌクレオシド間結合を含む。ヌクレアーゼ耐性は、オリゴヌクレオチドを血清中でインキュベートすることによって、又はヌクレアーゼ耐性アッセイ（例えば、ヘビ毒ホスホジエステラーゼ（ＳＶＰＤ））を使用することによって決定することができ、これらの両方は当該技術分野でよく知られている。オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を向上させることができるヌクレオシド間結合は、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオシド間結合と呼ばれる。幾つかの実施態様では、オリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列におけるヌクレオシド間結合の少なくとも５０％が修飾され、例えばオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列におけるヌクレオシド間結合の少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、又は例えば少なくとも９０％が、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオシド間結合である。幾つかの実施態様では、オリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列のヌクレオシド間結合のすべてが、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオシド間結合である。幾つかの実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチドを例えばコンジュゲートなどの非ヌクレオチド官能基に結合するヌクレオシドは、ホスホジエステルでありうることが認識されよう。

【0048】

本発明のオリゴヌクレオチドで用いるための好ましい修飾ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートである。

【0049】

ホスホロチオエートヌクレオシド間結合は、ヌクレアーゼ耐性、有益な薬物動態、及び製造の容易さに起因して、特に有用である。幾つかの実施態様では、オリゴヌクレオチド、又はその連続ヌクレオチド配列の少なくとも５０％のヌクレオシド間結合がホスホロチオエートであり、例えばオリゴヌクレオチド、又はその連続ヌクレオチド配列の例えば少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、又は例えば少なくとも９０％のヌクレオシド間結合がホスホロチオエートである。幾つかの実施態様では、ホスホロトリチオエートヌクレオシド間結合以外に、オリゴヌクレオチド、又はその連続ヌクレオチド配列のヌクレオシド間結合のすべてがホスホロチオエートである。幾つかの実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは、（一又は複数の）ホスホロトリチオエート結合に加えて、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合と、少なくとも１つのホスホジエステル結合、例えば、２つ、３つ、又は４つのホスホジエステル結合の両方を含む。ギャップマーオリゴヌクレオチドでは、ホスホジエステル結合は、存在する場合には、ギャップ領域Ｇ内の連続ＤＮＡヌクレオシド間に適切に位置していない。

【0050】

ホスホロチオエート結合などのヌクレアーゼ耐性結合は、標的核酸と二重鎖を形成するときにヌクレアーゼを動員することができるオリゴヌクレオチド領域、例えばギャップマーの領域Ｇにおいて特に有用である。しかしながら、ホスホロチオエート結合は、非ヌクレアーゼ動員領域及び／又は親和性増強領域、例えばギャップマーの領域Ｆ及びＦ’においても有用でありうる。ギャップマーオリゴヌクレオチドは、幾つかの実施態様では、領域Ｆ又はＦ’、若しくは領域Ｆ及びＦの両方に１つ以上のホスホジエステル結合を含んでもよく、領域Ｇのヌクレオシド間結合は、完全にホスホロチオエートでありうる。

【0051】

有利には、オリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列のすべてのヌクレオシド間結合、又はオリゴヌクレオチドのすべてのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である。

【0052】

欧州特許第２７４２１３５号に開示されているように、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、他のヌクレオシド間結合（ホスホジエステル及びホスホロチオエート以外）、例えばアルキルホスホネート／メチルホスホネートヌクレオシド間結合を含んでもよいことが認識され、これは欧州特許第２７４２１３５号によれば、例えば、別のＤＮＡホスホロチオエートのギャップ領域内で耐性でありうる。

【0053】

立体不規則性ホスホロチオエート結合
ホスホロチオエート結合は、非架橋酸素の１つが硫黄で置換されているヌクレオシド間リン酸結合である。非架橋酸素の１つを硫黄で置換すると、キラル中心が導入され、したがって単一のホスホロチオエートオリゴヌクレオチド内において、各ホスホロチオエートヌクレオシド間結合はＳ（Ｓｐ）又はＲ（Ｒｐ）ステレオアイソフォームのいずれかになる。このようなヌクレオシド間結合は、「キラルなヌクレオシド間結合」と呼ばれる。比較すると、ホスホジエステルヌクレオシド間結合は、２つの非末端酸素原子を有しているため、非キラルである。

【0054】

立体中心のキラリティーの指定は、Cahn, R.S.; Ingold, C.K.; Prelog, V. (1966) “Specification of Molecular Chirality” Angewandte Chemie International Edition 5 (4): 385-415. doi:10.1002/anie.196603851において最初に公開された、標準的なカーン・インゴルド・プレローグ順位則（ＣＩＰ順位則）によって決定される。

【0055】

標準的なオリゴヌクレオチド合成中、カップリングの立体選択性と、それに続く硫化は制御されていない。このため、各ホスホロチオエートヌクレオシド間結合の立体化学は不規則的にＳｐ又はＲｐになり、したがって従来のオリゴヌクレオチド合成によって生成されたホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、実際には２^Ｘもの異なるホスホロチオエートジアステレオ異性体に存在する可能性があり、ここで、Ｘは、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合の数である。このようなオリゴヌクレオチドは、本明細書では立体不規則性ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドと呼ばれ、任意の立体的に規定されたヌクレオシド間結合を含まない。したがって、立体不規則性ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、立体的に規定されていない合成に由来する個々のジアステレオ異性体の混合物である。これに関連して、混合物は、最大で２^Ｘの異なるホスホロチオエートジアステレオ異性体として定義される。

【0056】

立体的に規定されたヌクレオシド間結合
立体的に規定されたヌクレオシド間結合は、その２つのジアステレオマー形態であるＲｐ又はＳｐの一方に対してジアステレオ異性体過剰を有するキラルなヌクレオシド間結合である。

【0057】

当該技術分野で用いられる立体選択的オリゴヌクレオチド合成法は、典型的には、各キラルヌクレオシド間結合において少なくとも約９０％又は少なくとも約９５％のジアステレオ選択性を提供し、したがってオリゴヌクレオチド分子の最大約１０％、例えば約５％が代替ジアステレオ異性体の形態を有していてもよいことが認識されるべきである。

【0058】

幾つかの実施態様では、各立体的に規定されたキラルなヌクレオシド間結合のジアステレオ異性体比は、少なくとも約９０：１０である。幾つかの実施態様では、各キラルヌクレオシド間結合のジアステレオ異性体比は、少なくとも約９５：５である。

【0059】

立体的に規定されたホスホロチオエート結合は、立体的に規定されたヌクレオシド間結合の特定の例である。

【0060】

立体的に規定されたホスホロチオエート結合
立体的に規定されたホスホロチオエート結合は、その２つのジアステレオマー形態であるＲｐ又はＳｐの一方に対してジアステレオマー過剰を有するホスホロチオエート結合である。

【0061】

ホスホロチオエートヌクレオシド間結合のＲｐ及びＳｐ配置を以下に示す：

式中、３’Ｒ基は、隣接するヌクレオシド（５’ヌクレオシド）の３’位を表し、５’Ｒ基は、隣接するヌクレオシド（３’ヌクレオシド）の５’位を表す。

【0062】

本明細書では、Ｒｐヌクレオシド間結合はｓｒＰとして表される場合があり、Ｓｐヌクレオシド間結合はｓｓＰとして表される場合がある。

【0063】

特定の実施態様では、各立体的に規定されたホスホロチオエート結合のジアステレオマー比は、少なくとも約９０：１０、又は少なくとも９５：５である。

【0064】

幾つかの実施態様では、各立体的に規定されたホスホロチオエート結合のジアステレオマー比は、少なくとも約９７：３である。幾つかの実施態様では、各立体的に規定されたホスホロチオエート結合のジアステレオマー比は、少なくとも約９８：２である。幾つかの実施態様では、各立体的に規定されたホスホロチオエート結合のジアステレオマー比は、少なくとも約９９：１である。

【0065】

幾つかの実施態様では、立体的に規定されたヌクレオシド間結合は、オリゴヌクレオチド分子の集団に存在するオリゴヌクレオチド分子の少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、又は（本質的に）すべてが、同じジアステレオマー形態（Ｒｐ又はＳｐ）である。

【0066】

ジアステレオマーの純度は、アキラルな骨格（すなわち、ホスホジエステル）のみを有するモデルシステムにおいて測定することができる。各モノマーのジアステレオマー純度は、例えば、立体的に規定されたヌクレオシド間結合を有するモノマーを次のモデルシステム「５’ｔ－ｐｏ－ｔ－ｐｏ－ｔ－ｐｏ３’」にカップリングすることによって測定することができる。この結果は次のようになる：５’ＤＭＴｒ－ｔ－ｓｒｐ－ｔ－ｐｏ－ｔ－ｐｏ－ｔ－ｐｏ３’又は５’ＤＭＴｒ－ｔ－ｓｓｐ－ｔ－ｐｏ－ｔ－ｐｏ－ｔ－ｐｏ３’、これは、ＨＰＬＣを使用して分離することができる。ジアステレオマー純度は、２つの可能なジアステレオ異性体からのＵＶ信号を積分し、例えば、９８：２、９９：１、又は＞９９：１のこれらの比率を得ることによって決定される。

【0067】

特定の単一のジアステレオ異性体（単一の立体的に規定されたオリゴヌクレオチド分子）のジアステレオマー純度は、各ヌクレオシド間位置での規定された立体中心に対するカップリング選択性、及び導入されるべき立体的に規定されたヌクレオシド間結合の数の関数であることが理解されよう。例として、各位置でのカップリング選択性が９７％である場合、１５の立体的に規定されたヌクレオシド間結合を有する立体的に規定されたオリゴヌクレオチドの結果として生じる純度は、０．９７^１５であり、すなわち、他のジアステレオ異性体の３７％と比較して、所望のジアステレオ異性体の６３％である。規定されたジアステレオ異性体の純度は、合成後に、例えば、イオン交換クロマトグラフィ又は逆相クロマトグラフィなどのＨＰＬＣによる精製によって改善することができる。

【0068】

幾つかの実施態様では、立体的に規定されたオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの集団であって、当該集団の少なくとも約４０％、例えば少なくとも約５０％が所望のジアステレオ異性体であるものを指す。

【0069】

別の言い方をすれば、幾つかの実施態様では、立体的に規定されたオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの集団であって、当該集団の少なくとも約４０％、例えば少なくとも約５０％が所望の（特定の）立体的に規定されたヌクレオシド間結合モチーフ（立体的に規定されたモチーフとも称される）からなるものを指す。

【0070】

立体不規則性及び立体的に規定されたヌクレオシド間キラル中心の両方を含む立体的に規定されたオリゴヌクレオチドでは、立体的に規定されたオリゴヌクレオチドの純度は、（一又は複数の）所望の立体的に規定されたヌクレオシド間結合モチーフを保持するオリゴヌクレオチドの集団の％を参照して決定され、立体不規則性結合は計算上無視される。

【0071】

核酸塩基
核酸塩基という用語は、ヌクレオシド及びヌクレオチドに存在するプリン（例えば、アデニン及びグアニン）並びにピリミジン（例えば、ウラシル、チミン、及びシトシン）部分を含み、これらは核酸ハイブリダイゼーションにおいて水素結合を形成する。本発明の文脈において、核酸塩基という用語はまた、天然に存在する核酸塩基とは異なっていてもよいが、核酸ハイブリダイゼーション中に機能する修飾核酸塩基も包含する。この文脈において、「核酸塩基」とは、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル、キサンチン、及びヒポキサンチンなどの天然に存在する核酸塩基と、天然に存在しない変異体との両方を指す。このような変異体は、例えば、Hirao et al (2012) Accounts of Chemical Research vol 45 page 2055及びBergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 37 1.4.1に記載されている。

【0072】

幾つかの実施態様では、核酸塩基部分は、プリン又はピリミジンを修飾プリン又はピリミジンに、例えば置換プリン又は置換ピリミジンに、例えば、イソシトシン、シュードイソシトシン、５－メチルシトシン、５－チオゾロ（thiozolo）－シトシン、５－プロピニル－シトシン、５－プロピニル－ウラシル、５－ブロモウラシル５－チアゾロ－ウラシル、２－チオ－ウラシル、２’チオ－チミン、イノシン、ジアミノプリン、６－アミノプリン、２－アミノプリン、２，６－ジアミノプリン、及び２－クロロ－６－アミノプリンから選択される核酸塩基に変えることにより、修飾される。

【0073】

核酸塩基部分は、各々の対応する核酸塩基の文字コード、例えば、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、又はＵで示すことができ、ここで、各文字は、場合によっては、同等の機能の修飾核酸塩基を含みうる。例えば、例示したオリゴヌクレオチドにおいて、核酸塩基部分は、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、及び５－メチルシトシンから選択される。場合によっては、ＬＮＡギャップマーでは、５－メチルシトシンＬＮＡヌクレオシドが用いられうる。

【0074】

修飾オリゴヌクレオチド
修飾オリゴヌクレオチドという用語は、１つ以上の糖－修飾ヌクレオシド及び／又は修飾ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドを説明するものである。「キメラ」オリゴヌクレオチドという用語は、修飾ヌクレオシドを有するオリゴヌクレオチドを説明するために、文献で用いられている用語である。

【0075】

立体的に規定されたオリゴヌクレオチド
立体的に規定されたオリゴヌクレオチドは、ヌクレオシド間結合の少なくとも１つが立体的に規定されたヌクレオシド間結合であるオリゴヌクレオチドである。

【0076】

立体的に規定されたホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、ヌクレオシド間結合の少なくとも１つが立体的に規定されたホスホロチオエートヌクレオシド間結合であるオリゴヌクレオチドである。

【0077】

相補性
「相補性」という用語は、ヌクレオシド／ヌクレオチドのワトソン・クリック塩基対合能力を説明する。ワトソン・クリック塩基対は、グアニン（Ｇ）－シトシン（Ｃ）及びアデニン（Ａ）－チミン（Ｔ）／ウラシル（Ｕ）である。オリゴヌクレオチドは修飾核酸塩基を有するヌクレオシドを含んでいてもよく、例えば５－メチルシトシンは、しばしばシトシンの代わりに用いられ、したがって、相補性という用語は、非修飾核酸塩基と修飾核酸塩基との間のワトソン・クリック塩基対合を包含することが理解されよう（例えば、Hirao et al (2012) Accounts of Chemical Research vol 45 page 2055 and Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 37 1.4.1を参照されたい）。

【0078】

本明細書で用いられる用語「％相補性」は、所与の位置において、別個の核酸分子（例えば、標的核酸）の所与の位置における連続ヌクレオチド配列に相補的な（すなわち、ワトソン・クリック塩基対を形成する）、核酸分子（例えば、オリゴヌクレオチド）中の連続ヌクレオチド配列におけるヌクレオチドの割合を指す。百分率は、２つの配列間で対を形成する（標的配列５’－３’とオリゴヌクレオチド配列３’－５’とを整列させたとき）、整列された塩基の数をカウントし、オリゴヌクレオチド中のヌクレオチドの総数で割り、１００を掛けることによって計算される。このような比較において、整列（塩基対を形成）しない核酸塩基／ヌクレオチドは、ミスマッチと称される。好ましくは、挿入及び欠失は、連続ヌクレオチド配列の％相補性の計算において許容されない。

【0079】

「完全に相補的な」という用語は、１００％の相補性を指す。

【0080】

同一性
本明細書で用いられる用語「同一性」は、所与の位置において、別個の核酸分子（例えば標的核酸）の所与の位置における連続ヌクレオチド配列と同一な（すなわち、相補的なヌクレオシドとワトソン・クリック塩基対を形成するそれらの能力において）、核酸分子（例えば、オリゴヌクレオチド）中の連続ヌクレオチド配列におけるパーセントでのヌクレオチドの数を指す。百分率は、２つの配列間で同一である整列された塩基の数をカウントし、オリゴヌクレオチド中のヌクレオチドの総数で割り、１００を掛けることによって計算される。同一性パーセント＝（マッチ×１００）／整列された領域の長さ。好ましくは、挿入及び欠失は、連続ヌクレオチド配列の％相補性の計算において許容されない。

【0081】

ハイブリダイゼーション
本明細書で用いられる「ハイブリダイズ」又は「ハイブリダイズする」という用語は、２つの核酸鎖（例えば、オリゴヌクレオチド及び標的核酸）が対向する鎖上の塩基対間に水素結合を形成することにより二重鎖を形成することと理解されるべきである。２つの核酸鎖の間の結合の親和性は、ハイブリダイゼーションの強度である。これは、オリゴヌクレオチドの半分が標的核酸と二重鎖を形成する温度として定義される、融解温度（Ｔ_ｍ）によって説明されることが多い。生理学的条件では、Ｔ_ｍは親和性に厳密に比例しない（Mergny and Lacroix, 2003, Oligonucleotides 13:515-537）。標準状態ギブス自由エネルギーΔＧ°は、結合親和性のより正確な表現であり、ΔＧ°＝－ＲＴｌｎ（Ｋ_ｄ）によって反応の解離定数（Ｋ_ｄ）に関連付けられ、ここで、Ｒは気体定数であり、Ｔは絶対温度である。したがって、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間の反応の非常に低いΔＧ°は、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間の強いハイブリダイゼーションを反映している。ΔＧ°は、水性濃度が１Ｍ、ｐＨが７、温度が３７℃での反応に関連したエネルギーである。標的核酸に対するオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、自発的反応であり、自発的反応では、ΔＧ°はゼロ未満である。ΔＧ°は、例えば、Hansen et al., 1965, Chem. Comm. 36-38及びHoldgate et al. , 2005, Drug Discov Todayに記載されているように、例えば等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）法を使用することによって、実験的に測定することができる。当業者は、ΔＧ°測定のために市販の装置が入手可能であることを知るであろう。ΔＧ°はまた、Sugimoto et al., 1995, Biochemistry 34:11211-11216及びMcTigue et al., 2004, Biochemistry 43:5388-5405に記載された適切に導出された熱力学的パラメータを使用して、SantaLucia, 1998, Proc Natl Acad Sci USA. 95: 1460-1465に記載されているように、最近傍モデルを使用して数値的に推定することもできる。ハイブリダイゼーションによってその意図された核酸標的を調節する可能性を有するために、本発明のオリゴヌクレオチドは、１０－３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドについて－１０ｋｃａｌ未満の推定ΔＧ°値で標的核酸にハイブリダイズする。幾つかの実施態様では、ハイブリダイゼーションの程度又は強度は、標準状態でのギブスの自由エネルギーΔＧ°によって測定される。オリゴヌクレオチドは、８－３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドでは、－１０ｋｃａｌの範囲未満、例えば－１５ｋｃａｌ未満、例えば－２０ｋｃａｌ未満、及び例えば－２５ｋｃａｌ未満の推定ΔＧ°値で、標的核酸にハイブリダイズしうる。幾つかの実施態様では、オリゴヌクレオチドは、－１０から－６０ｋｃａｌ、例えば－１２から－４０、例えば－１５から－３０ｋｃａｌ、又は－１６から－２７ｋｃａｌ、例えば－１８から－２５ｋｃａｌの推定ΔＧ°値で、標的核酸にハイブリダイズする。

【0082】

糖修飾
本発明のオリゴマーは、修飾された糖部分、すなわち、ＤＮＡ及びＲＮＡに見られるリボース糖部分と比較して、糖部分が修飾された１つ以上のヌクレオシドを含みうる。

【0083】

リボース糖部分の修飾を有する数多くのヌクレオシドは、親和性及び／又はヌクレアーゼ耐性などのオリゴヌクレオチドのある特定の性質を改善することを主な目的として作製されてきた。

【0084】

このような修飾には、例えば、ヘキソース環（ＨＮＡ）、又は典型的にはリボース環（ＬＮＡ）上のＣ２炭素とＣ４炭素との間にビラジカル架橋を有する二環式環、又は典型的にはＣ２炭素とＣ３炭素との間の結合を欠く非結合リボース環（例えば、ＵＮＡ）で置き換えることにより、リボース環構造が修飾されているものが含まれる。他の糖修飾ヌクレオシドには、例えば、ビシクロヘキソース核酸（国際公開第２０１１／０１７５２１号）又は三環式核酸（国際公開第２０１３／１５４７９８号）が含まれる。修飾ヌクレオシドにはまた、糖部分が例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）又はモルホリノ核酸の場合には非糖部分で置き換えられているヌクレオシドが含まれる。

【0085】

糖修飾にはまた、リボース環上の置換基を、水素以外の基、又はＤＮＡ及びＲＮＡヌクレオシド中に天然に存在する２’－ＯＨ基に変更することによってなされる修飾も含まれる。置換基は、例えば、２’、３’、４’、又は５’位で導入されうる。

【0086】

２’糖修飾ヌクレオシド
２’糖修飾ヌクレオシドは、２’位にＨ又は－ＯＨ以外の置換基を有するか（２’置換ヌクレオシド）、又は２’炭素とリボース環上の第２の炭素との間に架橋を形成することができる２’結合ビラジカルを含むヌクレオシド、例えばＬＮＡ（２’－４’ビラジカル架橋）ヌクレオシドである。

【0087】

実際、２’置換ヌクレオシドの開発には多くの注目が集まっており、多くの２’置換ヌクレオシドが、オリゴヌクレオチドに組み込まれる場合に有益な特性を有することが見出されている。例えば、２’修飾糖は、高められた結合親和性及び／又は増大されたヌクレアーゼ耐性をオリゴヌクレオチドにもたらすことができる。２’置換修飾ヌクレオシドの例は、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ（ＭＯＥ）、２’－アミノ－ＤＮＡ、２’－フルオロ－ＲＮＡ、及び２’－Ｆ－ＡＮＡヌクレオシドである。さらなる例については、例えば、Freier & Altmann; Nucl.Acid Res., 1997, 25, 4429-4443及びUhlmann; Curr.Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213及びDeleavey and Damha, Chemistry and Biology 2012, 19, 937に見出すことができる。以下は、幾つかの２’置換修飾ヌクレオシドの例示である。

【0088】

本発明に関連して、２’置換は、ＬＮＡのような２’架橋分子を含まない。

【0089】

ロックされた核酸ヌクレオシド（ＬＮＡヌクレオシド）
「ＬＮＡヌクレオシド」は、前記ヌクレオシドのリボース糖環のＣ２’及びＣ４’を結合するビラジカル結合（「２’－４’架橋」とも呼ばれる）を含む、２’－修飾ヌクレオシドであり、これはリボース環の立体配座を制限又は固定する。これらのヌクレオシドはまた、文献において、架橋核酸又は二環式核酸（ＢＮＡ）とも称されている。リボースの立体配座の固定は、ＬＮＡが相補的ＲＮＡ又はＤＮＡ分子のオリゴヌクレオチドに組み込まれる場合、ハイブリダイゼーションの親和性の向上（二重鎖の安定化）に関連している。これは、オリゴヌクレオチド／相補二重鎖の融解温度を測定することによって、日常的に決定されうる。

【0090】

非限定的な、例示的なＬＮＡヌクレオシドは、国際公開第９９／０１４２２６号、国際公開第００／６６６０４号、国際公開第９８／０３９３５２号、国際公開第２００４／０４６１６０号、国際公開第００／０４７５９９号、国際公開第２００７／１３４１８１号、国際公開第２０１０／０７７５７８号、国際公開第２０１０／０３６６９８号、国際公開第２００７／０９００７１号、国際公開第２００９／００６４７８号、国際公開第２０１１／１５６２０２号、国際公開第２００８／１５４４０１号、国際公開第２００９／０６７６４７号、国際公開第２００８／１５０７２９号、Morita et al., Bioorganic & Med.Chem. Lett. 12, 73-76, Seth et al. J. Org. Chem. 2010, Vol 75(5) pp. 1569-81、及びMitsuoka et al., Nucleic Acids Research 2009, 37(4), 1225-1238に開示されている。

【0091】

２’－４’架橋は、２から４個の架橋原子を含み、特に式－Ｘ－Ｙ－であって、ＸはＣ４’に結合し、ＹはＣ２’に結合しており、
式中、
Ｘは、酸素、硫黄、－ＣＲ^ａＲ^ｂ－、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｃ（Ｒ^ｂ）－、－Ｃ（＝ＣＲ^ａＲ^ｂ）－、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｎ－、－Ｓｉ（Ｒ^ａ）_２－、－ＳＯ_２－、－ＮＲ^ａ－；－Ｏ－ＮＲ^ａ－、－ＮＲ^ａ－Ｏ－、－Ｃ（＝Ｊ）－、Ｓｅ、－Ｏ－ＮＲ^ａ－、－ＮＲ^ａ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－、－Ｎ（Ｒ^ａ）－Ｏ－、又は－Ｏ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－であり；
Ｙは、酸素、硫黄、－（ＣＲ^ａＲ^ｂ）_ｎ－、－ＣＲ^ａＲ^ｂ－Ｏ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｃ（Ｒ^ｂ）－、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｎ－、－Ｓｉ（Ｒ^ａ）_２－、－ＳＯ_２－、－ＮＲ^ａ－、－Ｃ（＝Ｊ）－、Ｓｅ、－Ｏ－ＮＲ^ａ－、－ＮＲ^ａ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－、－Ｎ（Ｒ^ａ）－Ｏ－、又は－Ｏ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－であり；
ただし、－Ｘ－Ｙ－は、－Ｏ－Ｏ－、Ｓｉ（Ｒ^ａ）_２－Ｓｉ（Ｒ^ａ）_２－、－ＳＯ_２－ＳＯ_２－、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｃ（Ｒ^ｂ）－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｃ（Ｒ^ｂ）、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｎ－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｎ－、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｎ－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｃ（Ｒ^ｂ）、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｃ（Ｒ^ｂ）－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｎ－、又は－Ｓｅ－Ｓｅ－ではないことを条件とし；
Ｊは、酸素、硫黄、＝ＣＨ_２又は＝Ｎ（Ｒ^ａ）であり；
Ｒ^ａ及びＲ^ｂは、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、チオヒドロキシル、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルコキシアルキル、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、ヘテロシクリル、アミノ、アルキルアミノ、カルバモイル、アルキルアミノカルボニル、アミノアルキルアミノカルボニル、アルキルアミノアルキルアミノカルボニル、アルキルカルボニルアミノ、カルバミド、アルカノイルオキシ、スルホニル、アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、チオヒドロキシルスルフィドアルキルスルファニル、アリールオキシカルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシカルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、－ＯＣ（＝Ｘ^ａ）Ｒ^ｃ、－ＯＣ（＝Ｘ^ａ）ＮＲ^ｃＲ^ｄ、及び－ＮＲ^ｅＣ（＝Ｘ^ａ）ＮＲ^ｃＲ^ｄから独立して選択され；
又は、２つのジェミナルなＲ^ａ及びＲ^ｂが一緒になって、置換されていてもよいメチレンを形成するか；
又は、２つのジェミナルなＲ^ａ及びＲ^ｂが、それらが結合している炭素原子と一緒になって、－Ｘ－Ｙ－の炭素原子を１つだけ有するシクロアルキル又はハロシクロアルキルを形成し；
ここで、置換アルキル、置換アルケニル、置換アルキニル、置換アルコキシ、及び置換メチレンは、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、ホルミル、ヘテロシクリル（heterocylyl）、アリール、及びヘテロアリールから独立して選択される１から３個の置換基で置換されたアルキル、アルケニル、アルキニル、及びメチレンであり；
Ｘ^ａは、酸素、硫黄、又は－ＮＲ^ｃであり；
Ｒ^ｃ、Ｒ^ｄ、及びＲ^ｅは、水素及びアルキルから独立して選択され；かつ
ｎは、１、２、又は３である。

【0092】

さらなる本発明の特定の実施態様では、Ｘは、酸素、硫黄、－ＮＲ^ａ－、－ＣＲ^ａＲ^ｂ－、又は－Ｃ（＝ＣＲ^ａＲ^ｂ）－であり、特に、酸素、硫黄、－ＮＨ－、－ＣＨ_２－、又は－Ｃ（＝ＣＨ_２）－であり、より具体的には、酸素である。

【0093】

本発明の別の特定の実施態様では、Ｙは、－ＣＲ^ａＲ^ｂ－、－ＣＲ^ａＲ^ｂ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－、又は－ＣＲ^ａＲ^ｂ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－であり、特に、－ＣＨ_２－ＣＨＣＨ_３－、－ＣＨＣＨ_３－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、又は－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－である。

【0094】

本発明の特定の実施態様では、－Ｘ－Ｙ－は、－Ｏ－（ＣＲ^ａＲ^ｂ）_ｎ－、－Ｓ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－、－Ｎ（Ｒ^ａ）ＣＲ^ａＲ^ｂ－、－ＣＲ^ａＲ^ｂ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－、－Ｏ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－Ｏ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－、－ＣＲ^ａＲ^ｂ－Ｏ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－、－Ｃ（＝ＣＲ^ａＲ^ｂ）－ＣＲ^ａＲ^ｂ－、－Ｎ（Ｒ^ａ）ＣＲ^ａＲ^ｂ－、－Ｏ－Ｎ（Ｒ^ａ）－ＣＲ^ａＲ^ｂ－、又は－Ｎ（Ｒ^ａ）－Ｏ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－である。

【0095】

本発明の特定の実施態様では、Ｒ^ａ及びＲ^ｂは、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキル、及びアルコキシアルキルからなる群、特に、水素、ハロゲン、アルキル、及びアルコキシアルキルからなる群より独立して選択される。

【0096】

本発明の別の実施態様では、Ｒ^ａ及びＲ^ｂは、水素、フルオロ、ヒドロキシル、メチル、及び－ＣＨ_２－Ｏ－ＣＨ_３からなる群、特に、水素、フルオロ、メチル、及び－ＣＨ_２－Ｏ－ＣＨ_３からなる群より独立して選択される。

【0097】

有利には、－Ｘ－Ｙ－のＲ^ａ及びＲ^ｂの一方は上記定義されたとおりであり、他方はすべて同時に水素である。

【0098】

さらなる本発明の特定の実施態様では、Ｒ^ａは、水素又はアルキル、特に、水素又はメチルである。

【0099】

本発明の別の特定の実施態様では、Ｒ^ｂは、水素又は又はアルキル、特に、水素又はメチルである。

【0100】

本発明の特定の実施態様では、Ｒ^ａ及びＲ^ｂの一方又は両方が水素である。

【0101】

本発明の特定の実施態様では、Ｒ^ａ及びＲ^ｂの一方のみが水素である。

【0102】

１つの本発明の特定の実施態様では、Ｒ^ａ及びＲ^ｂの一方はメチルであり、他方は水素である。

【0103】

本発明の特定の実施態様では、Ｒ^ａ及びＲ^ｂは両方とも同時にメチルである。

【0104】

本発明の特定の実施態様では、－Ｘ－Ｙ－は、－Ｏ－ＣＨ_２－、－Ｓ－ＣＨ_２－、－Ｓ－ＣＨ（ＣＨ_３）－、－ＮＨ－ＣＨ_２－、－Ｏ－ＣＨ_２ＣＨ_２－、－Ｏ－ＣＨ（ＣＨ_２－Ｏ－ＣＨ_３）－、－Ｏ－ＣＨ（ＣＨ_２ＣＨ_３）－、－Ｏ－ＣＨ（ＣＨ_３）－、－Ｏ－ＣＨ_２－Ｏ－ＣＨ_２－、－Ｏ－ＣＨ_２－Ｏ－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－Ｏ－ＣＨ_２－、－Ｃ（＝ＣＨ_２）ＣＨ_２－、－Ｃ（＝ＣＨ_２）ＣＨ（ＣＨ_３）－、－Ｎ（ＯＣＨ_３）ＣＨ_２－、又は－Ｎ（ＣＨ_３）ＣＨ_２－である。

【0105】

本発明の特定の実施態様では、－Ｘ－Ｙ－は－Ｏ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－であり、ここで、Ｒ^ａ及びＲ^ｂは、水素、アルキル、及びアルコキシアルキルからなる群、特に、水素、メチル、及び－ＣＨ_２－Ｏ－ＣＨ_３からなる群より独立して選択される。

【0106】

特定の実施態様では、－Ｘ－Ｙ－は、－Ｏ－ＣＨ_２－、又は－Ｏ－ＣＨ（ＣＨ_３）－、特に、－Ｏ－ＣＨ_２－である。

【0107】

２’－４’架橋は、それぞれ式（Ａ）及び式（Ｂ）に示されるように、リボース環の平面よりも下（β－Ｄ－構成）、又は環平面よりも上（α－Ｌ－構成）に配置されうる。

【0108】

本発明によるＬＮＡヌクレオシドは、特に、式（Ｂ１）又は（Ｂ２）

であり、式中、
Ｗは、酸素、硫黄、－Ｎ（Ｒ^ａ）－、又は－ＣＲ^ａＲ^ｂ－、特に、酸素であり；
Ｂは、核酸塩基又は修飾核酸塩基であり；
Ｚは、隣接するヌクレオシド又は５’－末端基へのヌクレオシド間結合であり；
Ｚ＊は、隣接するヌクレオシド又は３’－末端基へのヌクレオシド間結合であり；
Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５及びＲ^５＊は、水素、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、アルキニル、ヒドロキシ、アルコキシ、アルコキシアルキル、アジド、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、ホルミル、及びアリールから独立して選択され；かつ
Ｘ、Ｙ、Ｒ^ａ及びＲ^ｂは、上記定義されたとおりである。

【0109】

特定の実施態様では、－Ｘ－Ｙ－の定義において、Ｒ^ａは、水素又はアルキル、特に、水素又はメチルである。別の特定の実施態様では、－Ｘ－Ｙ－の定義において、Ｒ^ｂは、水素又はアルキル、特に、水素又はメチルである。さらなる特定の実施態様では、－Ｘ－Ｙ－の定義において、Ｒ^ａ及びＲ^ｂの一方又は両方が水素である。特定の実施態様では、－Ｘ－Ｙ－の定義において、Ｒ^ａ及びＲ^ｂの一方のみが水素である。１つの特定の実施態様では、－Ｘ－Ｙ－の定義において、Ｒ^ａ及びＲ^ｂの一方がメチルであり、他方は水素である。特定の実施態様では、－Ｘ－Ｙ－の定義において、Ｒ^ａ及びＲ^ｂは両方とも同時にメチルである。

【0110】

さらなる特定の実施態様では、Ｘの定義において、Ｒ^ａは、水素又はアルキル、特に、水素又はメチルである。別の特定の実施態様では、Ｘの定義において、Ｒ^ｂは、水素又はアルキル、特に、水素又はメチルである。特定の実施態様では、Ｘの定義において、Ｒ^ａ及びＲ^ｂの一方又は両方が水素である。特定の実施態様では、Ｘの定義において、Ｒ^ａ及びＲ^ｂの一方のみが水素である。１つの特定の実施態様では、Ｘの定義において、Ｒ^ａ及びＲ^ｂの一方がメチルであり、他方は水素である。特定の実施態様では、Ｘの定義において、Ｒ^ａ及びＲ^ｂは両方とも同時にメチルである。

【0111】

さらなる特定の実施態様では、Ｙの定義において、Ｒ^ａは、水素又はアルキル、特に、水素又はメチルである。別の特定の実施態様では、Ｙの定義において、Ｒ^ｂは、水素又はアルキル、特に、水素又はメチルである。特定の実施態様では、Ｙの定義において、Ｒ^ａ及びＲ^ｂの一方又は両方が水素である。特定の実施態様では、Ｙの定義において、Ｒ^ａ及びＲ^ｂの一方のみが水素である。１つの特定の実施態様では、Ｙの定義において、Ｒ^ａ及びＲ^ｂの一方がメチルであり、他方は水素である。特定の実施態様では、Ｙの定義において、Ｒ^ａ及びＲ^ｂは両方とも同時にメチルである。

【0112】

本発明の特定の実施態様では、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５、及びＲ^５＊は、水素及びアルキル、特に、水素及びメチルから独立して選択される。

【0113】

本発明のさらなる特定の有利な実施態様では、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５、及びＲ^５＊は、すべて同時に水素である。

【0114】

本発明の別の特定の実施態様では、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３は、すべて同時に水素であり、Ｒ^５、及びＲ^５＊の一方は水素であり、他方は上記定義されたとおりであり、特に、アルキル、より具体的には、メチルである。

【0115】

本発明の特定の実施態様では、Ｒ^５及びＲ^５＊は、水素、ハロゲン、アルキル、アルコキシアルキル、及びアジドから、特に、水素、フルオロ、メチル、メトキシエチル、及びアジドから独立して選択される。本発明の特定の有利な実施態様では、Ｒ^５及びＲ^５＊の一方が水素であり、他方はアルキル、特に、メチル、ハロゲン、特に、フルオロ、アルコキシアルキル、特に、メトキシエチル又はアジドであるか；又は、Ｒ^５及びＲ^５＊は両方とも同時に水素又はハロゲンであり、特に両方とも同時にフルオロの水素である。このような特定の実施態様では、Ｗは、有利には酸素であってよく、－Ｘ－Ｙ－は、有利には－Ｏ－ＣＨ_２－でありうる。

【0116】

本発明の特定の実施態様では、－Ｘ－Ｙ－は－Ｏ－ＣＨ_２－であり、Ｗは酸素であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５、及びＲ^５＊は、すべて同時に水素である。このようなＬＮＡヌクレオシドは、参照することによって本明細書に組み込まれる国際公開第９９／０１４２２６号、国際公開第００／６６６０４号、国際公開第９８／０３９３５２号、及び国際公開第２００４／０４６１６０号に開示されており、当該技術分野でβ－Ｄ－オキシＬＮＡ及びα－Ｌ－オキシＬＮＡヌクレオシドとして一般的に知られているものを含む。

【0117】

本発明の別の特定の実施態様では、－Ｘ－Ｙ－は－Ｓ－ＣＨ_２－であり、Ｗは酸素であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５、及びＲ^５＊は、すべて同時に水素である。このようなチオＬＮＡヌクレオシドは、参照することによって本明細書に組み込まれる、国際公開第９９／０１４２２６及び国際公開第２００４／０４６１６０号に開示されている。

【0118】

本発明の別の特定の実施態様では、－Ｘ－Ｙ－は－ＮＨ－ＣＨ_２－であり、Ｗは酸素であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５、及びＲ^５＊は、すべて同時に水素である。このようなアミノＬＮＡヌクレオシドは、参照することによって本明細書に組み込まれる、国際公開第９９／０１４２２６号及び国際公開第２００４／０４６１６０号に開示されている。

【0119】

本発明の別の特定の実施態様では、－Ｘ－Ｙ－は－Ｏ－ＣＨ_２ＣＨ_２－又は－ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２－であり、Ｗは酸素であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５、及びＲ^５＊は、すべて同時に水素である。このようなＬＮＡヌクレオシドは、参照することによって本明細書に組み込まれる、国際公開第００／０４７５９９号、及びMorita et al., Bioorganic & Med.Chem.Lett.12, 73-76に開示されており、当該技術分野において２’－Ｏ－４’Ｃ－エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）として一般に知られているものを含む。

【0120】

本発明の別の特定の実施態様では、－Ｘ－Ｙ－は－Ｏ－ＣＨ_２－であり、Ｗは酸素であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３は、すべて同時に水素であり、Ｒ^５及びＲ^５＊の一方が水素であり、他方は水素ではなく、例えばメチルなどのアルキルである。このような５’置換ＬＮＡヌクレオシドは、参照することによって本明細書に組み込まれる、国際公開第２００７／１３４１８１号に開示されている。

【0121】

本発明の別の特定の実施態様では、－Ｘ－Ｙ－は－Ｏ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－であり、ここで、Ｒ^ａ及びＲ^ｂの一方又は両方が水素ではなく、特にメチルなどのアルキルであり、Ｗは酸素であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３は、すべて同時に水素であり、Ｒ^５及びＲ^５＊の一方が水素であり、他方は水素ではなく、特に、例えばメチルなどのアルキルである。このようなビス修飾ＬＮＡヌクレオシドは、参照することによって本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１０／０７７５７８号に開示されている。

【0122】

本発明の別の特定の実施態様では、－Ｘ－Ｙ－は－Ｏ－ＣＨＲ^ａ－であり、Ｗは酸素であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５、及びＲ^５＊は、すべて同時に水素である。このような６’－置換ＬＮＡヌクレオシドは、参照することによって両方が本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１０／０３６６９８号及び国際公開第２００７／０９００７１号に開示されている。このような６’－置換ＬＮＡヌクレオシドでは、Ｒ^ａは、特に、メチルなどのＣ_１－Ｃ_６アルキルである。

【0123】

本発明の別の特定の実施態様では、－Ｘ－Ｙ－は、－Ｏ－ＣＨ（ＣＨ_２－Ｏ－ＣＨ_３）－（「２’Ｏ－メトキシエチル二環式核酸」、Seth et al. J. Org.Chem.2010, Vol 75(5) pp. 1569-81）である。

【0124】

本発明の別の特定の実施態様では、－Ｘ－Ｙ－は－Ｏ－ＣＨ（ＣＨ_２ＣＨ_３）－である。

【0125】

本発明の別の特定の実施態様では、－Ｘ－Ｙ－は－Ｏ－ＣＨ（ＣＨ_２－Ｏ－ＣＨ_３）－であり、Ｗは酸素であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５、及びＲ^５＊は、すべて同時に水素である。このようなＬＮＡヌクレオシドはまた、当該技術分野において環状ＭＯＥ（ｃＭＯＥ）としても知られており、国際公開第２００７／０９００７１号に開示されている。

【0126】

本発明の別の特定の実施態様では、－Ｘ－Ｙ－は、－Ｏ－ＣＨ（ＣＨ_３）－（「２’Ｏ－エチル二環式核酸」、Seth at al., J. Org.Chem.2010, Vol 75(5) pp. 1569-81）である。

【0127】

本発明の別の特定の実施態様では、－Ｘ－Ｙ－は、－Ｏ－ＣＨ_２－Ｏ－ＣＨ_２－（前掲したSeth et al., J. Org.Chem 2010）である。

【0128】

本発明の別の特定の実施態様では、－Ｘ－Ｙ－は－Ｏ－ＣＨ（ＣＨ_３）－であり、Ｗは酸素であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５、及びＲ^５＊は、すべて同時に水素である。このような６’－メチルＬＮＡヌクレオシドは、当該技術分野においてｃＥＴヌクレオシドとしても知られており、参照することによって両方が本明細書に組み込まれる、国際公開第２００７／０９００７１号（β－Ｄ）及び国際公開第２０１０／０３６６９８号（α－Ｌ）に開示される（Ｓ）－ｃＥＴ又は（Ｒ）－ｃＥＴジアステレオ異性体のいずれかでありうる。

【0129】

本発明の別の特定の実施態様では、－Ｘ－Ｙ－は－Ｏ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－であり、ここで、Ｒ^ａ及びＲ^ｂのいずれも水素ではなく、Ｗは酸素であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５、及びＲ^５＊は、すべて同時に水素である。特定の実施態様では、Ｒ^ａ及びＲ^ｂは、両方とも同時にアルキルであり、特に、両方とも同時にメチルである。このような６’－二置換ＬＮＡヌクレオシドは、参照することによって本明細書に組み込まれる、国際公開第２００９／００６４７８号に開示されている。

【0130】

本発明の別の特定の実施態様では、－Ｘ－Ｙ－は－Ｓ－ＣＨＲ^ａ－であり、Ｗは酸素であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５、及びＲ^５＊は、すべて同時に水素である。このような６’－置換チオＬＮＡヌクレオシドは、参照することによって本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１１／１５６２０２号に開示されている。このような６’－置換チオＬＮＡの特定の実施態様では、Ｒ^ａは、アルキル、特にメチルである。

【0131】

本発明の特定の実施態様では、－Ｘ－Ｙ－は、－Ｃ（＝ＣＨ_２）Ｃ（Ｒ^ａＲ^ｂ）－、－Ｃ（＝ＣＨＦ）Ｃ（Ｒ^ａＲ^ｂ）－、又は－Ｃ（＝ＣＦ_２）Ｃ（Ｒ^ａＲ^ｂ）－であり、Ｗは酸素であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５、及びＲ^５＊は、すべて同時に水素である。Ｒ^ａ及びＲ^ｂは、有利には、水素、ハロゲン、アルキル、及びアルコキシアルキルから、特に、水素、メチル、フルオロ、及びメトキシメチルから独立して選択される。Ｒ^ａ及びＲ^ｂは、特に、両方とも同時に水素又はメチルであるか、又はＲ^ａ及びＲ^ｂの一方が水素であり、他方はメチルである。このようなビニルカルボＬＮＡヌクレオシドは、参照することによって両方が本明細書に組み込まれる、国際公開第２００８／１５４４０１号及び国際公開第２００９／０６７６４７号に開示されている。

【0132】

本発明の特定の実施態様では、－Ｘ－Ｙ－は－Ｎ（ＯＲ^ａ）－ＣＨ_２－であり、Ｗは酸素であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５、及びＲ^５＊は、すべて同時に水素である。特定の実施態様では、Ｒ^ａはメチルなどのアルキルである。このようなＬＮＡヌクレオシドは、Ｎ置換ＬＮＡとしても知られており、参照することによって本明細書に組み込まれる、国際公開第２００８／１５０７２９号に開示されている。

【0133】

本発明の特定の実施態様では、－Ｘ－Ｙ－は、－Ｏ－Ｎ（Ｒ^ａ）－、－Ｎ（Ｒ^ａ）－Ｏ－、－ＮＲ^ａ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－、又は－ＮＲ^ａ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－であり、Ｗは酸素であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５、及びＲ^５＊は、すべて同時に水素である。Ｒ^ａ及びＲ^ｂは、有利には、水素、ハロゲン、アルキル、及びアルコキシアルキルから、特に、水素、メチル、フルオロ、及びメトキシメチルから独立して選択される。特定の実施態様では、Ｒ^ａはメチルなどのアルキルであり、Ｒ^ｂは、水素又はメチル、特に、水素（前掲のSeth et al., J. Org.Chem 2010）である。

【0134】

本発明の特定の実施態様では、－Ｘ－Ｙ－は、－Ｏ－Ｎ（ＣＨ_３）－（前掲のSeth et al., J. Org.Chem 2010）である。

【0135】

本発明の特定の実施態様では、Ｒ^５及びＲ^５＊は、両方とも同時に水素である。本発明の別の特定の実施態様では、Ｒ^５及びＲ^５＊の一方が水素であり、他方はメチルなどのアルキルである。このような実施態様では、Ｒ^１、Ｒ^２、及びＲ^３は、特に、水素であってよく、－Ｘ－Ｙ－は、特に、－Ｏ－ＣＨ_２－又は－Ｏ－ＣＨＣ（Ｒ^ａ）_３－、例えば－Ｏ－ＣＨ（ＣＨ_３）－でありうる。

【0136】

本発明の特定の実施態様では、－Ｘ－Ｙ－は、－ＣＲ^ａＲ^ｂ－Ｏ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－、例えば－ＣＨ_２－Ｏ－ＣＨ_２－であり、Ｗは酸素であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５、及びＲ^５＊は、すべて同時に水素である。このような特定の実施態様では、Ｒ^ａは、特に、メチルなどのアルキルであってよく、Ｒ^ｂは、水素又はメチル、特に水素でありうる。このようなＬＮＡヌクレオシドはまた、立体配座的に制限されたヌクレオチド（ＣＲＮ）として知られており、参照することによって本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１３／０３６８６８号に開示されている。

【0137】

本発明の特定の実施態様では、－Ｘ－Ｙ－は、－Ｏ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－Ｏ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－、例えば－Ｏ－ＣＨ_２－Ｏ－ＣＨ_２－であり、Ｗは酸素であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５、及びＲ^５＊は、すべて同時に水素である。Ｒ^ａ及びＲ^ｂは、有利には、水素、ハロゲン、アルキル、及びアルコキシアルキルから、特に、水素、メチル、フルオロ、及びメトキシメチルから独立して選択される。このような特定の実施態様では、Ｒ^ａは、特に、メチルなどのアルキルであってよく、Ｒ^ｂは、水素又はメチル、特に水素でありうる。このようなＬＮＡヌクレオシドは、ＣＯＣヌクレオチドとしても知られており、参照することによって本明細書に組み込まれる、Mitsuoka et al., Nucleic Acids Research 2009, 37(4), 1225-1238に開示されている。

【0138】

特に明記されていない限り、ＬＮＡヌクレオシドはβ－Ｄ又はα－Ｌステレオアイソフォームでありうることが認識されるであろう。

【0139】

本発明のＬＮＡヌクレオシドの特定の例がスキーム１に示されている（ここで、Ｂは上記定義されたとおりである）。

【0140】

特定のＬＮＡヌクレオシドは、β－Ｄ－オキシ－ＬＮＡ、６’－メチル－β－Ｄ－オキシＬＮＡ、例えば、（Ｓ）－６’－メチル－β－Ｄ－オキシ－ＬＮＡ（（Ｓ）－ｃＥＴ）、及びＥＮＡである。

【0141】

ＲＮａｓｅ Ｈの活性及び動員
アンチセンスオリゴヌクレオチドのＲＮａｓｅ Ｈ活性は、相補的ＲＮＡ分子と二重鎖を形成するときにＲＮａｓｅ Ｈを動員する、その能力を指す。国際公開第０１／２３６１３号には、ＲＮａｓｅＨを動員する能力の決定に使用することができる、ＲＮａｓｅＨ活性を決定するためのｉｎ ｖｉｔｒｏの方法が提供されている。典型的には、オリゴヌクレオチドが、相補的標的核酸配列が提供された場合に、被験修飾オリゴヌクレオチドと同じ塩基配列を有するが、オリゴヌクレオチドの全モノマー間にホスホロチオエート結合を有するＤＮＡモノマーのみを含むオリゴヌクレオチドを使用し、かつ、国際公開第０１／２３６１３号（参照することによって本明細書に組み込まれる）の実施例９１－９５によって提供される方法論を使用して決定された初期速度の少なくとも５％、例えば少なくとも１０％、又は２０％超の、ｐｍｏｌ／ｌ／分で測定した初期速度を有する場合に、このオリゴヌクレオチドはＲＮａｓｅ Ｈを動員することができると見なされる。ＲＨａｓｅ Ｈ活性の決定に使用するために、組換えヒトＲＮａｓｅ Ｈ１が、スイス国ルツェルン所在のＬｕｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＧｍｂＨから入手可能である。

【0142】

ギャップマー
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はその連続ヌクレオチド配列は、ギャップマーでありうる。アンチセンスギャップマーは、通常、ＲＮａｓｅ Ｈ媒介分解を介した標的核酸の阻害に用いられる。ギャップマーオリゴヌクレオチドは、少なくとも３つの区別される構造領域、５’－フランク、ギャップ、及び３’－フランク、Ｆ－Ｇ－Ｆ’を、５’－＞３’配向で含む。「ギャップ」領域（Ｇ）は、オリゴヌクレオチドがＲＮａｓｅ Ｈの動員を可能にする連続ＤＮＡヌクレオチドのストレッチを含む。ギャップ領域は、１つ以上の糖修飾ヌクレオシド、有利には高親和性糖修飾ヌクレオシドを含む５’フランキング領域（Ｆ）と、１つ以上の糖修飾ヌクレオシド、有利には高親和性糖修飾ヌクレオシドを含む３’フランキング領域（Ｆ’）とが隣接している。領域Ｆ及びＦ’の１つ以上の糖修飾ヌクレオシドは、標的核酸に対するオリゴヌクレオチドの親和性を高める（すなわち、親和性を高める糖修飾ヌクレオシドである）。幾つかの実施態様では、領域Ｆ及びＦ’の１つ以上の糖修飾ヌクレオシドは、例えばＬＮＡ及び２’－ＭＯＥから独立して選択される、例えば高親和性の２’糖修飾など、２’糖修飾ヌクレオシドである。

【0143】

ギャップマー設計において、ギャップ領域の最も５’及び３’のヌクレオシドはＤＮＡヌクレオシドであり、それぞれ、５’（Ｆ）又は３’（Ｆ’）領域の糖修飾ヌクレオシドに隣接して配置されている。フランクはさらに、ギャップ領域から最も遠い端、すなわち、５’フランクの５’末端及び３’フランクの３’末端に、少なくとも１つの糖修飾ヌクレオシドを有することによって定義されうる。

【0144】

領域Ｆ－Ｇ－Ｆ’は、連続ヌクレオチド配列を形成する。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はその連続ヌクレオチド配列は、式Ｆ－Ｇ－Ｆ’のギャップマー領域を含みうる。

【0145】

ギャップマー設計Ｆ－Ｇ－Ｆ’の全長は、例えば１２から３２ヌクレオシド、例えば１３から２４、例えば１４から２２ヌクレオシド、例えば１４から１７、例えば１６から１８ヌクレオシドでありうる。

【0146】

例として、本発明のギャップマーオリゴヌクレオチドは、以下の式によって表すことができる：
Ｆ_１－８－Ｇ_５－１６－Ｆ’_１－８、例えば
Ｆ_１－８－Ｇ_７－１６－Ｆ’_２－８
ただし、ギャップマー領域Ｆ－Ｇ－Ｆ’の全長は、少なくとも１２、例えば少なくとも１４ヌクレオチド長であることを条件とする。

【0147】

領域Ｆ、Ｇ、及びＦ’は、以下にさらに定義され、Ｆ－Ｇ－Ｆ’式に組み込むことができる。

【0148】

ギャップマー－領域Ｇ
ギャップマーの領域Ｇ（ギャップ領域）は、オリゴヌクレオチドがＲＮａｓｅＨ、例えばヒトＲＮａｓｅ Ｈ１の動員を可能にするヌクレオシド、典型的にはＤＮＡヌクレオシドの領域である。ＲＮａｓｅＨは、ＤＮＡとＲＮＡとの間の二重鎖を認識し、ＲＮＡ分子を酵素的に切断する細胞性酵素である。適切なギャップマーは、少なくとも５又は６の連続ＤＮＡヌクレオシド長、例えば５－１６の連続ＤＮＡヌクレオシド長、例えば６－１５の連続ＤＮＡヌクレオシド長、例えば７－１４の連続ＤＮＡヌクレオシド長、例えば８－１２の連続ＤＮＡヌクレオチド長、例えば８－１２の連続ＤＮＡヌクレオチド長のギャップ領域（Ｇ）を有しうる。ギャップ領域Ｇは、幾つかの実施態様では、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、又は１６の連続ＤＮＡヌクレオシドで構成されてもよい。ギャップ領域のシトシン（Ｃ）ＤＮＡは、場合によってはメチル化されていてもよく、このような残基は、５－メチル－シトシン（^ｍｅＣ又はｃの代わりにｅ）としてアノテーションされている。ギャップ内のシトシンＤＮＡのメチル化は、ｃｇジヌクレオチドがギャップ内に存在して潜在的な毒性を低減する場合に有利であり、この修飾はオリゴヌクレオチドの有効性に大きな影響を与えない。

【0149】

幾つかの実施態様では、ギャップ領域Ｇは、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、又は１６の連続ホスホロチオエート結合ＤＮＡヌクレオシドで構成されてもよい。幾つかの実施態様では、ギャップ内のヌクレオシド間結合はすべて、ホスホロチオエート結合である。

【0150】

従来のギャップマーはＤＮＡギャップ領域を有するが、ギャップ領域内で用いられる場合にＲＮａｓｅＨの動員を可能にする修飾ヌクレオシドの例が数多く存在する。ギャップ領域内に含まれる場合にＲＮａｓｅＨの動員が可能であるとして報告されている修飾ヌクレオシドには、例えば、α－Ｌ－ＬＮＡ、Ｃ４’アルキル化ＤＮＡ（両方が参照することによって本明細書に組み込まれる、国際出願第ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５０３４９号、及びVester et al., Bioorg. Med. Chem.Lett.18 (2008) 2296 - 2300に記載されている）、ＡＮＡ及び２’Ｆ－ＡＮＡのようなアラビノース由来のヌクレオシド（Mangos et al. 2003 J. AM. CHEM. SOC. 125, 654-661）、ＵＮＡ（アンロック核酸）（参照することによって本明細書に組み込まれる、Fluiter et al., Mol.Biosyst., 2009, 10, 1039に記載される）が含まれる。ＵＮＡは、典型的には、リボースのＣ２とＣ３の間の結合が解除され、ロックされていない「糖」残基を形成している、アンロック核酸である。このようなギャップマーに用いられている修飾ヌクレオシドは、ギャップ領域内に導入される際に２’エンド（endo）（ＤＮＡ様）構造をとる（すなわち、ＲＮａｓｅＨの動員を可能にする修飾）ヌクレオシドでありうる。幾つかの実施態様では、本明細書に記載されるＤＮＡギャップ領域（Ｇ）は、場合によっては、ギャップ領域内に導入される際に２’エンド（ＤＮＡ様）構造をとる１から３の糖修飾ヌクレオシドを含んでいてもよい。

【0151】

領域Ｇ－「ギャップブレーカー」
代替的に、幾つかのＲＮａｓｅＨ活性を保持しつつ、ギャップマーのギャップ領域に３’エンド配座を付与する修飾ヌクレオシドの挿入について、多くの報告が存在する。１つ以上の３’エンド修飾ヌクレオシドを含むギャップ領域を有するこのようなギャップマーは、「ギャップブレーカー」又は「ギャップ破壊」ギャップマーと称される。例えば、国際公開第２０１３／０２２９８４号を参照されたい。ギャップブレーカーオリゴヌクレオチドは、ＲＮａｓｅＨの動員を可能にするために、ギャップ領域内にＤＮＡヌクレオシドの十分な領域を保持する。ギャップブレーカーオリゴヌクレオチド設計がＲＮａｓｅＨを動員する能力は、典型的には、配列又は化合物固有である－Rukov et al. 2015 Nucl. Acids Res. Vol. 43 pp. 8476-8487を参照されたい。この文献には、場合によっては標的ＲＮＡのより特異的な切断をもたらす、ＲＮａｓｅＨを動員する「ギャップブレーカー」オリゴヌクレオチドが開示されている。ギャップブレーカーオリゴヌクレオチドのギャップ領域内で用いられる修飾ヌクレオシドは、例えば、３’エンド配座を付与する修飾ヌクレオシド、例えば２’－Ｏ－メチル（ＯＭｅ）又は２’－Ｏ－ＭＯＥ（ＭＯＥ）ヌクレオシド、若しくはβ－Ｄ ＬＮＡヌクレオシド（ヌクレオシドのリボース糖環のＣ２’とＣ４’の間の架橋は、β配座である）、例えばβ－Ｄ－オキシＬＮＡ又はＳｃＥＴヌクレオシドでありうる。

【0152】

上述した領域Ｇを含むギャップマーと同様に、ギャップブレーカー又はギャップ破壊ギャップマーのギャップ領域は、ギャップの５’末端に（領域Ｆの３’ヌクレオシドに隣接して）ＤＮＡヌクレオシドを有し、ギャップの３’末端に（領域Ｆの５’ヌクレオシドに隣接して）ＤＮＡヌクレオシドを有する。破壊されたギャップを含むギャップマーは、典型的には、ギャップ領域の５’末端又は３’末端のいずれかに少なくとも３つ又は４つの連続ＤＮＡヌクレオシドの領域を保持する。

【0153】

ギャップブレーカーオリゴヌクレオチドの例示的な設計は、
Ｆ_１－８－［Ｄ_３－４－Ｅ_１－Ｄ_３－４］_－Ｆ’_１－８
Ｆ_１－８－［Ｄ_１－４－Ｅ_１－Ｄ_３－４］－Ｆ’_１－８
Ｆ_１－８－［Ｄ_３－４－Ｅ_１－Ｄ_１－４］－Ｆ’_１－８
を含み、領域Ｇは、角括弧［Ｄ_ｎ－Ｅ_ｒ－Ｄ_ｍ］内にあり、Ｄは、ＤＮＡヌクレオシドの連続配列であり、Ｅは、修飾ヌクレオシド（ギャップブレーカー又はギャップ破壊ヌクレオシド）であり、Ｆ及びＦ’は、本明細書に定義されたフランキング領域であるが、ただし、ギャップマー領域Ｆ－Ｇ－Ｆ’の全長が少なくとも１２、例えば少なくとも１４ヌクレオチド長であることを条件とする。

【0154】

幾つかの実施態様では、ギャップ破壊されたギャップマーの領域Ｇは、少なくとも６ＤＮＡヌクレオシド、例えば、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、又は１６ＤＮＡヌクレオシドを含む。上述したように、ＤＮＡヌクレオシドは連続的であってもよく、あるいは、場合によっては１つ以上の修飾ヌクレオシドが散在してもよいが、ただし、ギャップ領域ＧがＲＮａｓｅＨの動員を媒介することができることを条件とする。

【0155】

ギャップマー－フランキング領域Ｆ及びＦ’
領域Ｆは、領域Ｇの５’ＤＮＡヌクレオシドのすぐ隣に配置されている。領域Ｆの最も３’のヌクレオシドは、糖修飾ヌクレオシド、例えば高親和性糖修飾ヌクレオシド、例えば２’置換ヌクレオシド、例えばＭＯＥヌクレオシド、又はＬＮＡヌクレオシドである。

【0156】

領域Ｆ’は、領域Ｇの３’ＤＮＡヌクレオシドのすぐ隣に配置されている。領域Ｆ’の最も５’のヌクレオシドは、糖修飾ヌクレオシド、例えば高親和性糖修飾ヌクレオシド、例えば２’置換ヌクレオシド、例えばＭＯＥヌクレオシド、又はＬＮＡヌクレオシドである。

【0157】

領域Ｆは、１－８の連続ヌクレオチド長、例えば２－６、例えば３－４の連続ヌクレオチド長である。有利には、領域Ｆの最も５’のヌクレオシドは、糖修飾ヌクレオシドである。幾つかの実施態様では、領域Ｆの２つの最も５’のヌクレオシドは、糖修飾ヌクレオシドである。幾つかの実施態様では、領域Ｆの最も５’のヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシドである。幾つかの実施態様では、領域Ｆの２つの最も５’のヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシドである。幾つかの実施態様では、領域Ｆの２つの最も５’のヌクレオシドは、２’置換ヌクレオシドヌクレオシド、例えば、２つの３’ＭＯＥヌクレオシドである。幾つかの実施態様では、領域Ｆの最も５’のヌクレオシドは、２’置換ヌクレオシド、例えばＭＯＥヌクレオシドである。

【0158】

領域Ｆ’は、２－８連続ヌクレオチド長、例えば３－６、例えば４－５連続ヌクレオチド長である。有利には、実施態様では、領域Ｆ’の最も３’のヌクレオシドは、糖修飾ヌクレオシドである。幾つかの実施態様では、領域Ｆ’の２つの最も３’のヌクレオシドは、糖修飾ヌクレオシドである。幾つかの実施態様では、領域Ｆ’の２つの最も３’のヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシドである。幾つかの実施態様では、領域Ｆ’の最も３’のヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシドである。幾つかの実施態様では、領域Ｆ’の２つの最も３’のヌクレオシドは、２’置換ヌクレオシドヌクレオシド、例えば、２つの３’ＭＯＥヌクレオシドである。幾つかの実施態様では、領域Ｆ’の最も３’のヌクレオシドは、２’置換ヌクレオシド、例えば、ＭＯＥヌクレオシドである。

【0159】

領域Ｆ又はＦ’の長さが１である場合、それは有利なことには、ＬＮＡヌクレオシドであることに留意するべきである。

【0160】

幾つかの実施態様では、領域Ｆ及びＦ’は、独立して、糖修飾ヌクレオシドの連続配列からなるか、又はそれを含む。幾つかの実施態様では、領域Ｆの糖修飾ヌクレオシドは、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ単位、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アミノ－ＤＮＡ単位、２’－フルオロ－ＤＮＡ単位、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、ＭＯＥ単位、ＬＮＡ単位、アラビノ核酸（ＡＮＡ）単位、及び２’－フルオロ－ＡＮＡ単位から独立して選択されうる。

【0161】

幾つかの実施態様では、領域Ｆ及びＦ’は、独立して、ＬＮＡと２’置換修飾ヌクレオシドの両方を含む（混合ウィング設計）。

【0162】

幾つかの実施態様では、領域Ｆ及びＦ’は、１タイプのみの糖修飾ヌクレオシド、例えばＭＯＥのみ、又はβ－Ｄ－オキシＬＮＡのみ、又はＳｃＥＴのみからなる。このような設計は、均一フランク又は均一ギャップマー設計とも呼ばれる。

【0163】

幾つかの実施態様では、領域Ｆ又はＦ’の全ヌクレオシド、若しくはＦ及びＦ’は、例えばβ－Ｄ－オキシＬＮＡ、ＥＮＡ、又はＳｃＥＴヌクレオシドから独立して選択される、ＬＮＡヌクレオシドである。幾つかの実施態様では、領域Ｆは、１－５、例えば２－４、例えば３－４、例えば１、２、３、４、又は５の連続ＬＮＡヌクレオシドからなる。幾つかの実施態様では、領域Ｆ及びＦ’の全ヌクレオシドがβ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドである。

【0164】

幾つかの実施態様では、領域Ｆ又はＦ’の全ヌクレオシド、又はＦ及びＦ’は、２’置換ヌクレオシド、例えば、ＯＭｅ又はＭＯＥヌクレオシドである。幾つかの実施態様では、領域Ｆは、１、２、３、４、５、６、７、又は８の連続ＯＭｅ又はＭＯＥヌクレオシドからなる。幾つかの実施態様では、フランキング領域の１つのみが、２’置換ヌクレオシド、例えばＯＭｅ又はＭＯＥヌクレオシドで構成されうる。幾つかの実施態様では、ＯＭｅ又はＭＯＥヌクレオシドなどの２’置換ヌクレオシドからなるのが５’（Ｆ）フランキング領域であるのに対し、３’（Ｆ’）フランキング領域は、少なくとも１つのＬＮＡヌクレオシド、例えばβ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシド又はｃＥＴヌクレオシドを含む。幾つかの実施態様では、ＯＭｅ又はＭＯＥヌクレオシドなどの２’置換ヌクレオシドからなるのが３’（Ｆ’）フランキング領域であるのに対し、５’（Ｆ）フランキング領域は、少なくとも１つのＬＮＡヌクレオシド、例えばβ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシド又はｃＥＴヌクレオシドを含む。

【0165】

幾つかの実施態様では、領域Ｆ及びＦ’の全修飾ヌクレオシドが、例えばβ－Ｄ－オキシＬＮＡ、ＥＮＡ、又はＳｃＥＴヌクレオシドから独立して選択されるＬＮＡヌクレオシドであり、領域Ｆ又はＦ’、若しくはＦ及びＦ’は、場合によってはＤＮＡヌクレオシド（交互フランク、より詳細にはこれらの定義を参照されたい）を含んでいてもよい。幾つかの実施態様では、領域Ｆ及びＦ’の全修飾ヌクレオシドがβ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドであり、ここで、領域Ｆ又はＦ’、若しくはＦ及びＦ’は、場合によってはＤＮＡヌクレオシド（交互フランク、より詳細にはこれらの定義を参照されたい）を含んでいてもよい。

【0166】

幾つかの実施態様では、領域Ｆ及びＦ’の最５’及び最も３’のヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシド、例えばβ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシド又はＳｃＥＴヌクレオシドである。

【0167】

幾つかの実施態様では、領域Ｆと領域Ｇの間のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。幾つかの実施態様では、領域Ｆ’と領域Ｇの間のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。幾つかの実施態様では、領域Ｆ又はＦ’、Ｆ及びＦ’のヌクレオシド間のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。

【0168】

さらなるギャップマー設計は、参照することによって本明細書に組み込まれる、国際公開第２００４／０４６１６０号、国際公開第２００７／１４６５１１号、及び国際公開第２００８／１１３８３２号に開示されている。

【0169】

ＬＮＡギャップマー
ＬＮＡギャップマーは、領域Ｆ及びＦ’の一方又は両方に、ＬＮＡヌクレオシドを含むか、若しくはそれからなるギャップマーである。β－Ｄ－オキシギャップマーは、領域Ｆ及びＦ’の一方又は両方に、β－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドを含むか、若しくはそれからなるギャップマーである。

【0170】

幾つかの実施態様では、ＬＮＡギャップマーは、式：［ＬＮＡ］_１－５－［領域Ｇ］－［ＬＮＡ］_１－５のものであり、領域Ｇはギャップマー領域Ｇの定義で定義したとおりである。

【0171】

ＭＯＥギャップマー
ＭＯＥギャップマーは、領域Ｆ及びＦ’がＭＯＥヌクレオシドからなるギャップマーである。幾つかの実施態様では、ＭＯＥギャップマーは、設計［ＭＯＥ］_１－８－［領域Ｇ］－［ＭＯＥ］_１－８、例えば［ＭＯＥ］_２－７－［領域Ｇ］_５－１６－［ＭＯＥ］_２－７、例えば［ＭＯＥ］_３－６－［領域Ｇ］－［ＭＯＥ］_３－６のものであり、領域Ｇはギャップマーの定義において定義したとおりである。５－１０－５設計（ＭＯＥ－ＤＮＡ－ＭＯＥ）を有するＭＯＥギャップマーは、当該技術分野で広く使用されている。

【0172】

混合ウィングギャップマー
混合ウィングギャップマーは、ＬＮＡギャップマーであり、領域Ｆ及びＦ’の一方又は両方が、２’置換ヌクレオシド、例えば、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ単位、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アミノ－ＤＮＡ単位、２’－フルオロ－ＤＮＡ単位、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、ＭＯＥ単位、アラビノ核酸（ＡＮＡ）単位、及び２’－フルオロ－ＡＮＡ単位からなる群より独立して選択される２’置換ヌクレオシド、例えばＭＯＥヌクレオシドを含む。領域Ｆ及びＦ’の少なくとも一方、又は領域Ｆ及びＦ’の両方が少なくとも１つのＬＮＡヌクレオシドを含む幾つかの実施態様では、領域Ｆ及びＦ’の残りのヌクレオシドは、ＭＯＥ及びＬＮＡからなる群より独立して選択される。領域Ｆ及びＦ’の少なくとも一方、又は領域Ｆ及びＦ’の両方が少なくとも２つのＬＮＡヌクレオシドを含む幾つかの実施態様では、領域Ｆ及びＦ’の残りのヌクレオシドは、ＭＯＥ及びＬＮＡからなる群より独立して選択される。幾つかの混合ウィングの実施態様では、領域Ｆ及びＦ’の一方又は両方が、１つ以上のＤＮＡヌクレオシドをさらに含んでもよい。

【0173】

混合ウィングギャップマー設計は、両方が参照することによって本明細書に組み込まれる、国際公開第２００８／０４９０８５号及び国際公開第２０１２／１０９３９５号に開示されている。

【0174】

交互フランクギャップマー
フランキング領域は、ＬＮＡとＤＮＡヌクレオシドの両方を含んでよく、それらはＬＮＡ－ＤＮＡ－ＬＮＡヌクレオシドの交互のモチーフを含むことから、「交互フランク」と呼ばれる。このような交互フランクを含むギャップマーは、「交互フランクギャップマー」と呼ばれる。したがって、「交互フランクギャップマー」は、フランクの少なくとも一方（Ｆ又はＦ’）がＬＮＡヌクレオシドに加えてＤＮＡを含む、ＬＮＡギャップマーオリゴヌクレオチドである。幾つかの実施態様では、領域Ｆ又はＦ’の少なくとも一方、若しくは領域Ｆ及びＦ’の両方が、ＬＮＡヌクレオシド及びＤＮＡヌクレオシドの両方を含む。このような実施態様では、フランキング領域Ｆ又はＦ’、若しくはＦ及びＦ’の両方が少なくとも３つのヌクレオシドを含み、Ｆ及び／又はＦ’領域の最も５’及び３’のヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシドである。

【0175】

交互フランクＬＮＡギャップマーは、国際公開第２０１６／１２７００２号に開示されている。

【0176】

交互フランク領域は、最大３の連続ＤＮＡヌクレオシド、例えば、１から２、若しくは１又は２又は３の連続ＤＮＡヌクレオシドを含みうる。

【0177】

交互フランク（flak）は、例えば、ＬＮＡヌクレオシド（Ｌ）の数に続いてＤＮＡヌクレオシド（Ｄ）の数を表す、一連の整数としてアノテーションすることができ、例えば：
［Ｌ］_１－３－［Ｄ］_１－４－［Ｌ］_１－３
［Ｌ］_１－２－［Ｄ］_１－２－［Ｌ］_１－２－［Ｄ］_１－２－［Ｌ］_１－２
である。

【0178】

オリゴヌクレオチド設計では、これらは、２－２－１が５’［Ｌ］_２－［Ｄ］_２－［Ｌ］３’を表し、１－１－１－１－１が５’［Ｌ］－［Ｄ］－［Ｌ］－［Ｄ］－［Ｌ］３’を表すような数字として表されることが多い。交互フランクを有するオリゴヌクレオチドのフランク（領域Ｆ及びＦ’）の長さは、独立して、３から１０ヌクレオシド、例えば４から８、例えば５から６ヌクレオシド、例えば４、５、６又は７修飾ヌクレオシドでありうる。幾つかの実施態様では、ギャップマーオリゴヌクレオチドの一方のフランクのみが交互になっており、他方はＬＮＡヌクレオチドで構成されている。追加のエキソヌクレアーゼ耐性を付与するために、３’フランク（Ｆ’）の３’末端に少なくとも２つのＬＮＡヌクレオシドを有することが有利でありうる。交互フランクを有するオリゴヌクレオチドの幾つかの例は次のとおりである：
［Ｌ］_１－５－［Ｄ］_１－４－［Ｌ］_１－３－［Ｇ］_５－１６－［Ｌ］_２－６
［Ｌ］_１－２－［Ｄ］_１－２－［Ｌ］_１－２－［Ｄ］_１－２－［Ｌ］_１－２－［Ｇ］_５－１６－［Ｌ］_１－２－［Ｄ］_１－３－［Ｌ］_２－４
［Ｌ］_１－５－［Ｇ］_５－１６－［Ｌ］－［Ｄ］－［Ｌ］－［Ｄ］－［Ｌ］_２
ただし、ギャップマーの全長は、少なくとも１２、例えば少なくとも１４ヌクレオチド長であることを条件とする。

【0179】

オリゴヌクレオチドにおける領域Ｄ’又はＤ”
本発明のオリゴヌクレオチドは、幾つかの実施態様では、ギャップマー Ｆ－Ｇ－Ｆ’などの標的核酸と、さらなる５’及び／又は３’ヌクレオシドとに相補的である、オリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含むか、又はそれからなりうる。さらなる５’及び／又は３’ヌクレオシドは、標的核酸に完全に相補的であっても、完全に相補的でなくてもよい。このようなさらなる５’及び／又は３’ヌクレオシドは、本明細書では領域Ｄ’及びＤと呼ばれうる。

【0180】

領域Ｄ’又はＤ”の追加は、連続ヌクレオチド配列、例えばギャップマーをコンジュゲート部分又は別の官能基に連結する目的で用いられうる。連結に用いられる場合、コンジュゲート部分を有する連続ヌクレオチド配列は、生体切断可能なリンカーとしての役割を果たしうる。あるいは、それはエキソヌクレアーゼ保護を提供するために、若しくは合成又は製造を容易にするために使用されてもよい。

【0181】

領域Ｄ’及びＤ”は、各々、領域Ｆの５’末端又は領域Ｆ’の３’末端に結合されて、以下の式Ｄ’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’、Ｆ－Ｇ－Ｆ’－Ｄ”、又はＤ’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’－Ｄ”の設計を生成することができる。この場合、Ｆ－Ｇ－Ｆ’はオリゴヌクレオチドのギャップマー部分であり、領域Ｄ’又はＤ”は、オリゴヌクレオチドの別個の部分を構成する。

【0182】

領域Ｄ’又はＤ”は、独立して、１、２、３、４、又は５の追加のヌクレオチドを含むか、又はそれからなり、これは、標的核酸に相補的であっても、相補的でなくてもよい。Ｆ又はＦ’領域に隣接するヌクレオチドは、ＤＮＡ又はＲＮＡなどの糖修飾ヌクレオチドではなく、若しくはこれらの塩基修飾バージョンでもない。Ｄ’又はＤ’領域は、ヌクレアーゼ感受性の生体切断可能なリンカーとしての役割を果たしうる（リンカーの定義を参照されたい）。幾つかの実施態様では、追加の５’及び／又は３’末端ヌクレオチドは、ホスホジエステル結合で連結されており、かつ、ＤＮＡ又はＲＮＡである。領域Ｄ’又はＤ”としての使用に適したヌクレオチドベースの生体切断可能なリンカーは、国際公開第２０１４／０７６１９５号に開示されており、例としてホスホジエステル結合ＤＮＡジヌクレオチドを含む。ポリオリゴヌクレオチド構築物における生体切断可能なリンカーの使用は、国際公開第２０１５／１１３９２２号に開示されており、それらは単一のオリゴヌクレオチド内で複数のアンチセンス構築物（例えば、ギャップマー領域）を結合するのに用いられている。

【0183】

一実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは、ギャップマーを構成する連続ヌクレオチド配列に加えて、領域Ｄ’及び／又はＤ”を含む。

【0184】

幾つかの実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは、以下の式によって表すことができる：
Ｆ－Ｇ－Ｆ’、特に、Ｆ_１－８－Ｇ_５－１６－Ｆ’_２－８
Ｄ’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’、特に、Ｄ’_１－３－Ｆ_１－８－Ｇ_５－１６－Ｆ’_２－８
Ｆ－Ｇ－Ｆ’－Ｄ”、特に、Ｆ_１－８－Ｇ_５－１６－Ｆ’_２－８－Ｄ”_１－３
Ｄ’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’－Ｄ”、特に、Ｄ’_１－３－Ｆ_１－８－Ｇ_５－１６－Ｆ’_２－８－Ｄ”_１－３。

【0185】

幾つかの実施態様では、領域Ｄ’と領域Ｆの間に位置するヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル結合である。幾つかの実施態様では、領域Ｆ’と領域Ｄ”の間に位置するヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル結合である。

【0186】

トータルマー（Totalmers）
幾つかの実施態様では、オリゴヌクレオチド、又はその連続ヌクレオチド配列のヌクレオシドのすべてが糖修飾ヌクレオシドである。このようなオリゴヌクレオチドは、本明細書ではトータルマーと呼ばれる。

【0187】

幾つかの実施態様では、トータルマーの糖修飾ヌクレオシドのすべてが同じ糖修飾を含み、例えば、それらは、すべてＬＮＡヌクレオシドであっても、すべて２’Ｏ－ＭＯＥヌクレオシドであってもよい。幾つかの実施態様では、トータルマーの糖修飾ヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシド及び２’置換ヌクレオシド、例えば、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ（ＭＯＥ）、２’－アミノ－ＤＮＡ、２’－フルオロ－ＲＮＡ、及び２’－Ｆ－ＡＮＡヌクレオシドからなる群より選択される２’置換ヌクレオシドから独立して選択されうる。幾つかの実施態様では、オリゴヌクレオチドは、ＬＮＡヌクレオシドと２’置換ヌクレオシド、例えば、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ（ＭＯＥ）、２’－アミノ－ＤＮＡ、２’－フルオロ－ＲＮＡ、及び２’－Ｆ－ＡＮＡヌクレオシドからなる群より選択される２’置換ヌクレオシドとの両方を含む。幾つかの実施態様では、オリゴヌクレオチドは、ＬＮＡヌクレオシド及び２’－Ｏ－ＭＯＥヌクレオシドを含む。幾つかの実施態様では、オリゴヌクレオチドは、（Ｓ）ｃＥＴ ＬＮＡヌクレオシド及び２’－Ｏ－ＭＯＥヌクレオシドを含む。幾つかの実施態様では、オリゴヌクレオチドの各ヌクレオシド単位は、２’置換ヌクレオシドである。幾つかの実施態様では、オリゴヌクレオチドの各ヌクレオシド単位は、２’－Ｏ－ＭＯＥヌクレオシドである。

【0188】

幾つかの実施態様では、オリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列のすべてのヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシド、例えばβ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡヌクレオシド及び／又は（Ｓ）ｃＥＴヌクレオシドである。幾つかの実施態様では、このようなＬＮＡトータルマーオリゴヌクレオチドは、７－１２の間のヌクレオシド長である（例えば、国際公開第２００９／０４３３５３号を参照されたい）。このような短い完全ＬＮＡオリゴヌクレオチドは、マイクロＲＮＡの阻害に特に有効である。

【0189】

さまざまなトータルマー化合物は、治療用オリゴマーとして、特にマイクロＲＮＡを標的とする場合（ａｎｔｉｍｉＲ）、又はスプライススイッチングオリゴマー（ＳＳＯ）として、非常に効果的である。

【0190】

幾つかの実施態様では、トータルマーは、反復配列ＸＹＸ又はＹＸＹなどの少なくとも１つのＸＹＸ又はＹＸＹ配列モチーフを含むか、又はそれからなり、ここで、ＸはＬＮＡであり、Ｙは、２’－ＯＭｅＲＮＡ単位及び２’－フルオロＤＮＡ単位などの代替（すなわち、非ＬＮＡ）ヌクレオチドアナログである。上記の配列モチーフは、幾つかの実施態様では、例えば、ＸＸＹ、ＸＹＸ、ＹＸＹ、又はＹＹＸでありうる。

【0191】

幾つかの実施態様では、トータルマーは、７から２４ヌクレオチドの間、例えば、７、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、又は２３ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含むか、又はそれで構成されうる。

【0192】

幾つかの実施態様では、トータルマー（totolmer）の連続ヌクレオチド配列は、ＬＮＡ単位を少なくとも３０％、例えば少なくとも４０％、例えば少なくとも５０％、例えば少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば９５％、例えば１００％含む。完全なＬＮＡ化合物では、例えば７－１０など、１２ヌクレオチド長未満であることが有利である。

【0193】

残りの単位は、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ単位、２’－ＯＭｅ－ＲＮＡ単位、２’－アミノ－ＤＮＡ単位、２’－フルオロ－ＤＮＡ単位、ＬＮＡ単位、ＰＮＡ単位、ＨＮＡ単位、ＩＮＡ単位、及び２’ＭＯＥ ＲＮＡ単位からなる群、又は２’－ＯＭｅＲＮＡ単位及び２’－フルオロＤＮＡ単位の群から選択されるものなど、本明細書で言及される非ＬＮＡヌクレオチドアナログから選択されうる。

【0194】

ミックスマー（Mixmers）
用語「ミックスマー」は、ＲＮａｓｅＨを動員するには連続ＤＮＡヌクレオシド長が不十分な、ＤＮＡヌクレオシドと糖修飾ヌクレオシドの両方を含むオリゴマーを指す。適切なミックスマーは、最大３つ又は最大４つの連続ＤＮＡヌクレオシドを含みうる。幾つかの実施態様では、ミックスマーは、糖修飾ヌクレオシドとＤＮＡヌクレオシドとの交互領域を含む。オリゴヌクレオチドに組み込まれたときにＲＮＡ様（３’ｅｎｄｏ）立体構造を形成する糖修飾ヌクレオシドの領域と、ＤＮＡヌクレオシドの短い領域とを交互に配置することにより、非ＲＮａｓｅＨ動員オリゴヌクレオチドを生成することができる。有利には、糖修飾ヌクレオシドは、親和性を高める糖修飾ヌクレオシドである。

【0195】

オリゴヌクレオチドミックスマーは、スプライスモジュレーター又はマイクロＲＮＡ阻害剤などの標的遺伝子の占有ベースの調節を提供するために用いられることが多い。

【0196】

幾つかの実施態様では、ミックスマー中の糖修飾ヌクレオシド、又はその連続ヌクレオチド配列は、ＬＮＡヌクレオシド、例えば（Ｓ）ｃＥＴ又はβ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドを含むか、又はすべてそれらである。

【0197】

幾つかの実施態様では、ミックスマーの糖修飾ヌクレオシドのすべてが同じ糖修飾を含み、例えば、それらは、すべてＬＮＡヌクレオシドであっても、すべて２’Ｏ－ＭＯＥヌクレオシドであってもよい。幾つかの実施態様では、ミックスマーの糖修飾ヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシドと、２’置換ヌクレオシド、例えば、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ（ＭＯＥ）、２’－アミノ－ＤＮＡ、２’－フルオロ－ＲＮＡ、及び２’－Ｆ－ＡＮＡヌクレオシドからなる群より選択される２’置換ヌクレオシドから独立して選択されうる。幾つかの実施態様では、オリゴヌクレオチドは、ＬＮＡヌクレオシドと２’置換ヌクレオシド、例えば、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ（ＭＯＥ）、２’－アミノ－ＤＮＡ、２’－フルオロ－ＲＮＡ、及び２’－Ｆ－ＡＮＡヌクレオシドからなる群より選択される２’置換ヌクレオシドとの両方を含む。幾つかの実施態様では、オリゴヌクレオチド（oligonucleoitide）は、ＬＮＡヌクレオシド及び２’－Ｏ－ＭＯＥヌクレオシドを含む。幾つかの実施態様では、オリゴヌクレオチドは、（Ｓ）ｃＥＴ ＬＮＡヌクレオシド及び２’－Ｏ－ＭＯＥヌクレオシドを含む。

【0198】

幾つかの実施態様では、ミックスマー、又はその連続ヌクレオチド配列は、例えば８－２４の間のヌクレオシド長でありうる、ＬＮＡミックスマーオリゴヌクレオチドなどのＬＮＡ及びＤＮＡヌクレオシドのみを含む（例えば、マイクロＲＮＡのＬＮＡ ａｎｔｍｉＲ阻害剤が開示されている国際公開第２００７／１１２７５４号）。

【0199】

さまざまなミックスマー化合物は、治療用オリゴマーとして、特にマイクロＲＮＡを標的とする場合（ａｎｔｉｍｉＲ）、又はスプライススイッチングオリゴマー（ＳＳＯ）として、非常に効果的である。

【0200】

幾つかの実施態様では、ミックスマーは、次のモチーフを含む：
…［Ｌ］ｍ［Ｄ］ｎ［Ｌ］ｍ［Ｄ］ｎ［Ｌ］ｍ…又は
…［Ｌ］ｍ［Ｄ］ｎ［Ｌ］ｍ［Ｄ］ｎ［Ｌ］ｍ［Ｄ］ｎ［Ｌ］ｍ…又は
…［Ｌ］ｍ［Ｄ］ｎ［Ｌ］ｍ［Ｄ］ｎ［Ｌ］ｍ［Ｄ］ｎ［Ｌ］ｍ［Ｄ］ｎ［Ｌ］ｍ…又は
…［Ｌ］ｍ［Ｄ］ｎ［Ｌ］ｍ［Ｄ］ｎ［Ｌ］ｍ［Ｄ］ｎ［Ｌ］ｍ［Ｄ］ｎ［Ｌ］ｍ［Ｄ］ｎ［Ｌ］ｍ…
ここで、Ｌは、ＬＮＡ又は２’置換ヌクレオシド（例えば、２’－Ｏ－ＭＯＥ）などの糖修飾ヌクレオシドを表し、Ｄは、ＤＮＡクレオシドを表し、各ｍは、１－６から独立して選択され、各ｎは、１、２、３、及び４、例えば１－３から独立して選択される。幾つかの実施態様では、各ＬはＬＮＡヌクレオシドである。幾つかの実施態様では、少なくとも１つのＬはＬＮＡヌクレオシドであり、少なくとも１つのＬは２’－Ｏ－ＭＯＥヌクレオシドである。幾つかの実施態様では、各Ｌは、ＬＮＡ及び２’－Ｏ－ＭＯＥヌクレオシドから独立して選択される。

【0201】

幾つかの実施態様では、ミックスマーは、１０から２４の間のヌクレオチド、例えば、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、又は２３のヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含むか、又はそれで構成されうる。

【0202】

幾つかの実施態様では、ミックスマーの連続ヌクレオチド配列は、ＬＮＡ単位を、少なくとも３０％、例えば少なくとも４０％、例えば少なくとも５０％含む。

【0203】

幾つかの実施態様では、ミックスマーは、ヌクレオチドアナログと天然に存在するヌクレオチドとの繰り返しパターンの連続ヌクレオチド配列、若しくはあるタイプのヌクレオチドアナログと第２のタイプのヌクレオチドアナログを含むか、又はそれらからなる。繰り返しパターンは、例えば、次のものでありうる：１つおき又は２つおきのヌクレオチドが、ＬＮＡなどのヌクレオチドアナログであり、残りのヌクレオチドは、ＤＮＡなどの天然に存在するヌクレオチドであるか、又は本明細書で言及される２’フルオロアナログの２’ＭＯＥなどの２’置換ヌクレオチドアナログであるか、又は幾つかの実施態様では、本明細書で言及されるヌクレオチドアナログの群から選択されたものである。ＬＮＡ単位などのヌクレオチドアナログの繰り返しパターンは、固定位置、例えば５’末端又は３’末端でヌクレオチドアナログと組み合わせることができることが認識されている。

【0204】

幾つかの実施態様では、３’末端から数えて、オリゴマーの第１のヌクレオチドは、ＬＮＡヌクレオチド又は２’－Ｏ－ＭＯＥヌクレオシドなどのヌクレオチドアナログである。

【0205】

同じであっても異なっていてもよい幾つかの実施態様では、３’末端から数えて、オリゴマーの第２のヌクレオチドは、ＬＮＡヌクレオチド又は２’－Ｏ－ＭＯＥヌクレオシドなどのヌクレオチドアナログである。

【0206】

同じであっても異なっていてもよい幾つかの実施態様では、オリゴマーの５’末端は、ＬＮＡヌクレオチド又は２’－Ｏ－ＭＯＥヌクレオシドなどのヌクレオチドアナログである。

【0207】

幾つかの実施態様では、ミックスマーは、少なくとも２つの連続するヌクレオチドアナログ単位、例えば少なくとも２つの連続するＬＮＡ単位を含む少なくともある領域を含む。

【0208】

幾つかの実施態様では、ミックスマーは、少なくとも３つの連続するヌクレオチドアナログ単位、例えば少なくとも３つの連続するＬＮＡ単位を含む少なくともある領域を含む。

【0209】

コンジュゲート
本明細書で用いられるコンジュゲートという用語は、非ヌクレオチド部分（コンジュゲート部分又は領域Ｃ又は第３の領域）に共有結合したオリゴヌクレオチドを指す。

【0210】

１つ以上の非ヌクレオチド部分に対する本発明のオリゴヌクレオチドのコンジュゲーションは、例えば、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、細胞取込み、又は安定性に影響を及ぼすことにより、オリゴヌクレオチドの薬理学を改善することができる。幾つかの実施態様では、コンジュゲート部分は、オリゴヌクレオチドの細胞分布、生物学的利用能、代謝、排泄、浸透性、及び／又は細胞取り込みを改善することによって、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を調節又は向上させる。特に、コンジュゲートは、オリゴヌクレオチドを特定の器官、組織、又は細胞型に標的化し、それによって、その器官、組織、又は細胞型におけるオリゴヌクレオチドの有効性を高めることができる。同時に、コンジュゲートは、標的ではない細胞型、組織、又は器官におけるオリゴヌクレオチドの活性、例えば、オフターゲット活性、若しくは標的ではない細胞型、組織、又は器官内の活性を低下させるのに役立ちうる。

【0211】

国際公開第９３／０７８８３号及び国際公開第２０１３／０３３２３０号は適切なコンジュゲート部分を提供し、これらは、参照することによって本明細書に組み込まれる。さらなる適切なコンジュゲート部分は、アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）に結合することができるものである。特に、三価Ｎ－アセチルガラクトサミンのコンジュゲート部分は、ＡＳＧＰＲへの結合に適しており、例えば、国際公開第２０１４／０７６１９６号、国際公開第２０１４／２０７２３２号、及び国際公開第２０１４／１７９６２０号（参照することによって本明細書に組み込まれる）を参照されたい。このようなコンジュゲートは、肝臓へのオリゴヌクレオチドの取り込みを促進する一方で、腎臓におけるその存在を減少させるのに役立ち、それによって、同じオリゴヌクレオチドの非コンジュゲートバージョンと比較して、コンジュゲートされたオリゴヌクレオチドの肝臓／腎臓比を増加させる。

【0212】

オリゴヌクレオチドコンジュゲート及びそれらの合成については、その各々全体が参照することによって本明細書に組み込まれる、Manoharan in Antisense Drug Technology, Principles, Strategies, and Applications, S.T.Crooke, ed., Ch. 16, Marcel Dekker, Inc., 2001、及びManoharan, Antisense and Nucleic Acid Drug Development, 2002, 12, 103による包括的なレビューでも報告されている。

【0213】

一実施態様では、非ヌクレオチド部分（コンジュゲート部分）は、炭水化物、細胞表面受容体リガンド、原体、ホルモン、親油性物質、ポリマー、タンパク質、ペプチド、毒素（例えば、細菌毒素）、ビタミン、ウイルスタンパク質（例えば、カプシド）、又はそれらの組合せからなる群より選択される。

【0214】

リンカー
結合又はリンカーは、１つ以上の共有結合を介して目的の１つの化学基又はセグメントを目的の別の化学基又はセグメントに連結する、２つの原子間の接続である。コンジュゲート部分は、直接又は連結部分（例えば、リンカー又はテザー）を介してオリゴヌクレオチドに結合させることができる。リンカーは、第３の領域、例えばコンジュゲート部分（領域Ｃ）を、第１の領域、例えば、標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列（領域Ａ）に共有結合する役割を果たす。

【0215】

本発明の幾つかの実施態様では、本発明のコンジュゲート又はオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、場合によっては、標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列（領域Ａ又は第１の領域）と、コンジュゲート部分（領域Ｃ又は第３の領域）との間に位置するリンカー領域（第２の領域又は領域Ｂ及び／又は領域Ｙ）を含みうる。

【0216】

領域Ｂは、哺乳動物の体内で通常遭遇する又は遭遇するものに類似した条件下で切断可能である生理学的に不安定な結合を含むか、又はそれからなる生体切断可能なリンカーを指す。生理学的に不安定なリンカーが化学的変換（例えば、切断）を受ける条件には、ｐＨ、温度、酸化又は還元条件、若しくは薬剤などの化学条件、並びに哺乳動物の細胞で見られる又は遭遇するものに類似した塩濃度が含まれる。哺乳動物の細胞内条件には、タンパク質分解酵素又は加水分解酵素又はヌクレアーゼなどの哺乳動物細胞に通常存在する酵素活性の存在も含まれる。一実施態様では、生体切断可能なリンカーは、Ｓ１ヌクレアーゼ切断の影響を受けやすい。好ましい実施態様では、ヌクレアーゼ感受性リンカーは、少なくとも２つの連続したホスホジエステル結合、例えば、少なくとも３つ又は４つ又は５つの連続したホスホジエステル結合を含む、１から１０の間のヌクレオシド、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０のヌクレオシド、より好ましくは２から６の間のヌクレオシド、最も好ましくは２から４の間の結合したヌクレオシドを含む。好ましくは、ヌクレオシドは、ＤＮＡ又はＲＮＡである。ホスホジエステルを含む生体切断可能なリンカーは、国際公開第２０１４／０７６１９５号（参照することによって本明細書に組み込まれる）により詳細に記載されている。

【0217】

領域Ｙは、必ずしも生体切断可能ではないが、主にコンジュゲート部分（領域Ｃ又は第３の領域）をオリゴヌクレオチド（領域Ａ又は第１の領域）に共有結合させるのに役立つリンカーを指す。領域Ｙリンカーは、エチレングリコール、アミノ酸単位、又はアミノアルキル基などの繰り返し単位の鎖構造又はオリゴマーを含みうる。本発明のオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、次の領域要素Ａ－Ｃ、Ａ－Ｂ－Ｃ、Ａ－Ｂ－Ｙ－Ｃ、Ａ－Ｙ－Ｂ－Ｃ、又はＡ－Ｙ－Ｃから構築することができる。幾つかの実施態様では、リンカー（領域Ｙ）は、例えばＣ６からＣ１２アミノアルキル基を含む、Ｃ２－Ｃ３６アミノアルキル基などのアミノアルキルである。好ましい実施態様では、リンカー（領域Ｙ）は、Ｃ６アミノアルキル基である。

【0218】

したがって、本発明は、特に次のものに関する。

【0219】

（Ａ^１）及び（Ａ^２）の一方が糖修飾ヌクレオシドであり、他方がＤＮＡである、本発明によるオリゴヌクレオチド。

【0220】

（Ａ^１）及び（Ａ^２）が両方とも同時に糖修飾ヌクレオシドである、本発明によるオリゴヌクレオチド。

【0221】

糖修飾ヌクレオシドが、独立して２’糖修飾ヌクレオシドである、本発明によるオリゴヌクレオチド。

【0222】

２’糖修飾ヌクレオシドが、独立して、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、特に、２’－メトキシ－ＲＮＡ、２’－アルコキシアルコキシ－ＲＮＡ、特に、２’－メトキシエトキシ－ＲＮＡ、２’－アミノ－ＤＮＡ、２’－フルオロ－ＲＮＡ、又は２’－フルオロ－ＡＮＡから選択される、本発明によるオリゴヌクレオチド。

【0223】

２’糖修飾ヌクレオシドが、２’－アルコキシアルコキシ－ＲＮＡ、特に、２’－メトキシエトキシ－ＲＮＡである、本発明によるオリゴヌクレオチド。

【0224】

２’糖修飾ヌクレオシドがＬＮＡヌクレオシドである、本発明によるオリゴヌクレオチド。

【0225】

ＬＮＡヌクレオシドが、β－Ｄ－オキシＬＮＡ、６’－メチル－β－Ｄ－オキシＬＮＡ、及びＥＮＡ、特に、β－Ｄ－オキシＬＮＡから独立して選択される、本発明によるオリゴヌクレオチド。

【0226】

ホスホジエステルヌクレオシド間結合、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合、及び式（Ｉ）で定義されるヌクレオシド間結合から選択される、さらなるヌクレオシド間結合を含む、本発明によるオリゴヌクレオチド。

【0227】

ホスホロチオエートヌクレオシド間結合、及び式（Ｉ）で定義されるヌクレオシド間結合から選択される、さらなるヌクレオシド間結合を含む、本発明によるオリゴヌクレオチド。

【0228】

式（Ｉ）で定義される、式（Ｉ）の１から１５の間、特に、１から５の間、より具体的には、１、２、３、４、又は５のジヌクレオシドを含む、本発明によるオリゴヌクレオチド。

【0229】

さらなるヌクレオシド間結合がすべて、式－Ｐ（＝Ｓ）（ＯＲ）Ｏ_２－のホスホロチオエートヌクレオシド間結合であり、式中、Ｒは、水素又はリン酸保護基である、本発明によるオリゴヌクレオチド。

【0230】

ＤＮＡヌクレオシド、ＲＮＡヌクレオシド、及び糖修飾ヌクレオシドから選択されるさらなるヌクレオシドを含む、本発明によるオリゴヌクレオチド。

【0231】

１つ以上のヌクレオシドが、核酸塩基修飾ヌクレオシド、例えば、５－メチルシトシン核酸塩基を含むヌクレオシドである、本発明によるオリゴヌクレオチド。

【0232】

式（Ｉ）の少なくとも１つのジヌクレオシドが、アンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドのフランキング領域にあるか、又はアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドのギャップ領域とフランキング領域その間に位置している、すなわち、（Ａ^１）及び（Ａ^２）が両方とも同時に糖修飾ヌクレオシドであるか、あるいは（Ａ^１）及び（Ａ^２）の一方がＤＮＡヌクレオシド又はＲＮＡヌクレオシドであり、他方が糖修飾ヌクレオシドである、本発明によるオリゴヌクレオチド。

【0233】

ギャップマーオリゴヌクレオチドが、ＬＮＡギャップマー、混合ウィングギャップマー、又は２’－置換ギャップマー、特に、２’－Ｏ－メトキシエチルギャップマーである、本発明によるオリゴヌクレオチド。

【0234】

Ａが硫黄である、本発明によるオリゴヌクレオチド。

【0235】

ギャップマーオリゴヌクレオチドが式５’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’－３’の連続ヌクレオチド配列を含み、ここで、Ｇは、ＲＮａｓｅＨを動員することができる５から１８ヌクレオシドの領域であり、前記領域Ｇは、５’及び３’がそれぞれフランキング領域Ｆ及びＦ’によって隣接されており、該領域Ｆ及びＦ’は、独立して、１から７の２’－糖修飾ヌクレオチドを含むか、又はそれからなり、領域Ｇに隣接する領域Ｆのヌクレオシドは２’－糖修飾ヌクレオシドであり、領域Ｇに隣接する領域Ｆ’のヌクレオシドは２’－糖修飾ヌクレオシドである、本発明によるオリゴヌクレオチド。

【0236】

式（Ｉ）の前記少なくとも１つのジヌクレオシドが、領域Ｆ又はＦ’に、若しくは領域Ｇと領域Ｆの間に、若しくは領域Ｇと領域Ｆ’の間に配置される、本発明によるオリゴヌクレオチド。

【0237】

領域Ｆ又は領域Ｆ’における、若しくは領域Ｆ及びＦ’の両方における２’－糖修飾ヌクレオシドが、独立して、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、特に、２’－メトキシ－ＲＮＡ、２’－アルコキシアルコキシ－ＲＮＡ、特に、２’－メトキシエトキシ－ＲＮＡ、２’－アミノ－ＤＮＡ、２’－フルオロ－ＲＮＡ、２’－フルオロ－ＡＮＡ、及びＬＮＡヌクレオシドから選択される、本発明によるオリゴヌクレオチド。

【0238】

領域Ｆ又は領域Ｆ’における、若しくは領域Ｆ及びＦ’の両方におけるすべての２’－糖修飾ヌクレオシドが、ＬＮＡヌクレオシドである、本発明によるオリゴヌクレオチド。

【0239】

領域Ｆ又は領域Ｆ’における、若しくは領域Ｆ及びＦ’の両方における２’－糖修飾ヌクレオシドが、すべて２’－アルコキシ－ＲＮＡ、特に、２’－メトキシ－ＲＮＡ、すべて２’－アルコキシアルコキシ－ＲＮＡ、特に、２’－メトキシエトキシ－ＲＮＡ、すべて２’－アミノ－ＤＮＡ、すべて２’－フルオロ－ＲＮＡ、すべて２’－フルオロ－ＡＮＡ、又はすべてＬＮＡヌクレオシドである、本発明によるオリゴヌクレオチド。

【0240】

領域Ｆ又は領域Ｆ’、若しくは領域Ｆ及びＦ’の両方が、少なくとも１つのＬＮＡヌクレオシド及び少なくとも１つのＤＮＡヌクレオシドを含む、本発明によるオリゴヌクレオチド。

【0241】

領域Ｆ又は領域Ｆ’、若しくは領域Ｆ及びＦ’の両方が、少なくとも１つのＬＮＡヌクレオシド及び少なくとも１つの非ＬＮＡ２’－糖修飾ヌクレオシド、例えば、少なくとも１つの２’－メトキシエトキシ－ＲＮＡヌクレオシドを含む、本発明によるオリゴヌクレオチド。

【0242】

ギャップ領域Ｇが、５から１６、特に、８から１６、より具体的には、８、９、１０、１１、１２、１３、又は１４の連続ＤＮＡヌクレオシドを含む、本発明によるオリゴヌクレオチド。

【0243】

領域Ｆ及び領域Ｆ’が、独立して、１、２、３、４、５、６、７、又は８ヌクレオシド長である、本発明によるオリゴヌクレオチド。

【0244】

領域Ｆ及び領域Ｆ’が、各々、独立して、１つ、２つ、３つ、又は４つのＬＮＡヌクレオシドを含む、本発明によるオリゴヌクレオチド。

【0245】

ＬＮＡヌクレオシドが、β－Ｄ－オキシＬＮＡ、６’－メチル－β－Ｄ－オキシＬＮＡ、及びＥＮＡから独立して選択される、本発明によるオリゴヌクレオチド。

【0246】

ＬＮＡヌクレオシドがβ－Ｄ－オキシＬＮＡである、本発明によるオリゴヌクレオチド。

【0247】

オリゴヌクレオチド、又はその連続ヌクレオチド配列（Ｆ－Ｇ－Ｆ’）が、１０から３０ヌクレオチド長、特に１２から２２、より具体的には１４から２０オリゴヌクレオチド長のものである、本発明によるオリゴヌクレオチド。

【0248】

ギャップマーオリゴヌクレオチドが、式５’－Ｄ’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’－Ｄ”－３’の連続ヌクレオチド配列を含み、ここで、Ｆ、Ｇ、及びＦ’は、請求項１７から２８のいずれか一項に記載されているものであり、領域Ｄ’及びＤ”は、各々、独立して、０から５のヌクレオチド、特に、２、３、又は４のヌクレオチド、特に、ホスホジエステル結合ＤＮＡヌクレオシドなどのＤＮＡヌクレオチドからなる、本発明によるオリゴヌクレオチド。

【0249】

各フランキング領域Ｆ及びＦ’が、独立して、１、２、３、４、５、６、又は７、特に１つの式（Ｉ）のジヌクレオシドを含む、請求項１７から２９のいずれか一項に記載オリゴヌクレオチド。

【0250】

合計１つの式（Ｉ）のジヌクレオシド、特に、１つの領域Ｆ’に配置された、又は領域Ｇと領域Ｆ’との間に配置された式（Ｉ）のジヌクレオシドを含む、本発明によるオリゴヌクレオチド。

【0251】

オリゴヌクレオチドがヒトＲＮａｓｅＨ１を動員することができる、本発明によるオリゴヌクレオチド。

【0252】

本発明によるオリゴヌクレオチドの薬学的に許容される塩、特に、ナトリウム塩、カリウム塩、又はアンモニウム塩。

【0253】

本発明によるオリゴヌクレオチド又は薬学的に許容される塩と、場合によってはリンカー部分を介して、前記オリゴヌクレオチド又は前記薬学的に許容される塩に共有結合した少なくとも１つのコンジュゲート部分とを含む、コンジュゲート。

【0254】

本発明によるオリゴヌクレオチド、薬学的に許容される塩、又はコンジュゲート、及び治療的に不活性な担体を含む、薬学的組成物。

【0255】

治療的活性物質として使用するための本発明によるオリゴヌクレオチド、薬学的に許容される塩、又はコンジュゲート。

【0256】

本発明は、特に、式（Ｉ－ａ）：

の化合物に関し、式中、
Ｒ^２は、アルコキシ、アルコキシアルコキシ、又はアミノであり；かつ
Ｒ^４は水素であるか；又は
Ｒ^４及びＲ^２は一緒にＸ－Ｙを形成し；
Ｘは、酸素、硫黄、－ＣＲ^ａＲ^ｂ－、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｃ（Ｒ^ｂ）－、－Ｃ（＝ＣＲ^ａＲ^ｂ）－、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｎ－、－Ｓｉ（Ｒ^ａ）_２－、－ＳＯ_２－、－ＮＲ^ａ－；－Ｏ－ＮＲ^ａ－、－ＮＲ^ａ－Ｏ－、－Ｃ（＝Ｊ）－、Ｓｅ、－Ｏ－ＮＲ^ａ－、－ＮＲ^ａ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－、－Ｎ（Ｒ^ａ）－Ｏ－、又は－Ｏ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－であり；
Ｙは、酸素、硫黄、－（ＣＲ^ａＲ^ｂ）_ｎ－、－ＣＲ^ａＲ^ｂ－Ｏ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｃ（Ｒ^ｂ）－、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｎ－、－Ｓｉ（Ｒ^ａ）_２－、－ＳＯ_２－、－ＮＲ^ａ－、－Ｃ（＝Ｊ）－、Ｓｅ、－Ｏ－ＮＲ^ａ－、－ＮＲ^ａ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－、－Ｎ（Ｒ^ａ）－Ｏ－、又は－Ｏ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－であり；
ただし、－Ｘ－Ｙ－は、－Ｏ－Ｏ－、Ｓｉ（Ｒ^ａ）_２－Ｓｉ（Ｒ^ａ）_２－、－ＳＯ_２－ＳＯ_２－、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｃ（Ｒ^ｂ）－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｃ（Ｒ^ｂ）、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｎ－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｎ－、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｎ－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｃ（Ｒ^ｂ）、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｃ（Ｒ^ｂ）－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｎ－、又は－Ｓｅ－Ｓｅ－ではないことを条件とし；
Ｊは、酸素、硫黄、＝ＣＨ_２又は＝Ｎ（Ｒ^ａ）であり；
Ｒ^ａ及びＲ^ｂは、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、チオヒドロキシル、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルコキシアルキル、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、ヘテロシクリル、アミノ、アルキルアミノ、カルバモイル、アルキルアミノカルボニル、アミノアルキルアミノカルボニル、アルキルアミノアルキルアミノカルボニル、アルキルカルボニルアミノ、カルバミド、アルカノイルオキシ、スルホニル、アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、チオヒドロキシルスルフィドアルキルスルファニル、アリールオキシカルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシカルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、－ＯＣ（＝Ｘ^ａ）Ｒ^ｃ、－ＯＣ（＝Ｘ^ａ）ＮＲ^ｃＲ^ｄ、及び－ＮＲ^ｅＣ（＝Ｘ^ａ）ＮＲ^ｃＲ^ｄから独立して選択され；
又は、２つのジェミナルなＲ^ａ及びＲ^ｂが一緒になって、置換されていてもよいメチレンを形成するか；
又は、２つのジェミナルなＲ^ａ及びＲ^ｂが、それらが結合している炭素原子と一緒になって、－Ｘ－Ｙ－の炭素原子を１つだけ有するシクロアルキル又はハロシクロアルキルを形成し；
ここで、置換アルキル、置換アルケニル、置換アルキニル、置換アルコキシ、及び置換メチレンは、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、ホルミル、ヘテロシクリル（heterocylyl）、アリール、及びヘテロアリールから独立して選択される１から３個の置換基で置換されたアルキル、アルケニル、アルキニル、及びメチレンであり；
Ｘ^ａは、酸素、硫黄、又は－ＮＲ^ｃであり；
Ｒ^ｃ、Ｒ^ｄ及びＲ^ｅは、水素及びアルキルから独立して選択され；
Ｒ^５はヒドロキシル保護基であり；
Ｒ^ｘはシアノアルキル又はアルキルであり；
Ｒ^ｙはジアルキルアミノ又はピロリジニルであり；
Ｎｕは、核酸塩基又は保護された核酸塩基であり；かつ
ｎは、１、２、又は３である。

【0257】

本発明によるオリゴヌクレオチドは、例えば、次のスキームに従って調製することができる。

【0258】

スキーム２では、Ｂ１及びＢ２は核酸塩基であり、Ａは上記定義されたとおりである。

【0259】

ホスホノアセテート又はチオホスホノアセテート修飾を含むオリゴヌクレオチドは、固相オリゴヌクレオチド化学を使用して合成することができる。ＤＭＴで保護されたデオキシリボヌクレオシド３’－Ｏ－ジイソプロピルアミノホスフィノ酢酸 ジメチル－β－シアノエチルエステルは、固体支持体に結合したデオキシリボヌクレオシドに縮合する。次に、ホスフィナイト結合を、例えば、低酸化剤試薬（ＴＨＦ／ピリジン／Ｈ_２Ｏ：８８／１０／２中、０．０２ＭのＩ_２）を使用して酸化するか、又は例えば、アセトニトリル／ピリジン中、３－アミノ－１，２，４－ジチアゾール－５－チオンの０．１Ｍ溶液を使用して硫化する。無水酢酸でキャッピングし、ジクロロ酢酸で処理して５’－Ｏ－ジメトキシトリイル（dimethoxytriyl）基を除去した後、このサイクルを適切な回数繰り返して、ホスホノアセテート修飾を含むオリゴヌクレオチドを得る。

【0260】

本発明によるオリゴヌクレオチドの製造に有用なモノマー構成ブロックは、例えば、次のスキームに従って調製することができる。

【0261】

ジメチルシアノエチルブロモアセテートは、ブロモアセチルブロミドをトルエン中の３－ヒドロキシ－３－メチルブチロニトリルと一晩還流下で縮合させることにより合成される。次に、リンエステル誘導体は、ジイソプロピルアミノクロロホスフィンとのレフォルマトスキー反応を介して調製される。テトラゾールを使用してこの反応物を保護された２’－デオキシヌクレオシドとさらに縮合させると、ＬＮＡ ＰＡＣＥホスホルアミダイトが生成される。

【0262】

スキーム３では、Ｒ^５、Ｒ^ｘ、Ｒ^ｙ、及びＮｕは、上記定義されたとおりである。

【0263】

モノマーは、特に、上記の手順を追従する次のスキームに従って調製することができる。

【0264】

スキーム４では、Ｎｕは上記定義されたとおりである。

【0265】

したがって、本発明は、式（ＩＩ）：

の化合物、又はその薬学的に許容される塩（alt）に関し、式中、
Ｘは、酸素、硫黄、－ＣＲ^ａＲ^ｂ－、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｃ（Ｒ^ｂ）－、－Ｃ（＝ＣＲ^ａＲ^ｂ）－、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｎ－、－Ｓｉ（Ｒ^ａ）_２－、－ＳＯ_２－、－ＮＲ^ａ－；－Ｏ－ＮＲ^ａ－、－ＮＲ^ａ－Ｏ－、－Ｃ（＝Ｊ）－、Ｓｅ、－Ｏ－ＮＲ^ａ－、－ＮＲ^ａ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－、－Ｎ（Ｒ^ａ）－Ｏ－、又は－Ｏ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－であり；
Ｙは、酸素、硫黄、－（ＣＲ^ａＲ^ｂ）_ｎ－、－ＣＲ^ａＲ^ｂ－Ｏ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｃ（Ｒ^ｂ）－、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｎ－、－Ｓｉ（Ｒ^ａ）_２－、－ＳＯ_２－、－ＮＲ^ａ－、－Ｃ（＝Ｊ）－、Ｓｅ、－Ｏ－ＮＲ^ａ－、－ＮＲ^ａ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－、－Ｎ（Ｒ^ａ）－Ｏ－、又は－Ｏ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－であり；
ただし、－Ｘ－Ｙ－は、－Ｏ－Ｏ－、Ｓｉ（Ｒ^ａ）_２－Ｓｉ（Ｒ^ａ）_２－、－ＳＯ_２－ＳＯ_２－、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｃ（Ｒ^ｂ）－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｃ（Ｒ^ｂ）、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｎ－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｎ－、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｎ－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｃ（Ｒ^ｂ）、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｃ（Ｒ^ｂ）－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｎ－、又は－Ｓｅ－Ｓｅ－ではないことを条件とし；
Ｊは、酸素、硫黄、＝ＣＨ_２又は＝Ｎ（Ｒ^ａ）であり；
Ｒ^ａ及びＲ^ｂは、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、チオヒドロキシル、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルコキシアルキル、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、ヘテロシクリル、アミノ、アルキルアミノ、カルバモイル、アルキルアミノカルボニル、アミノアルキルアミノカルボニル、アルキルアミノアルキルアミノカルボニル、アルキルカルボニルアミノ、カルバミド、アルカノイルオキシ、スルホニル、アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、チオヒドロキシルスルフィドアルキルスルファニル、アリールオキシカルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシカルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、－ＯＣ（＝Ｘ^ａ）Ｒ^ｃ、－ＯＣ（＝Ｘ^ａ）ＮＲ^ｃＲ^ｄ、及び－ＮＲ^ｅＣ（＝Ｘ^ａ）ＮＲ^ｃＲ^ｄから独立して選択され；
又は、２つのジェミナルなＲ^ａ及びＲ^ｂが一緒になって、置換されていてもよいメチレンを形成するか；
又は、２つのジェミナルなＲ^ａ及びＲ^ｂが、それらが結合している炭素原子と一緒になって、－Ｘ－Ｙ－の炭素原子を１つだけ有するシクロアルキル又はハロシクロアルキルを形成し；
ここで、置換アルキル、置換アルケニル、置換アルキニル、置換アルコキシ、及び置換メチレンは、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、ホルミル、ヘテロシクリル（heterocylyl）、アリール、及びヘテロアリールから独立して選択される１から３個の置換基で置換されたアルキル、アルケニル、アルキニル、及びメチレンであり；
Ｘ^ａは、酸素、硫黄、又は－ＮＲ^ｃであり；
Ｒ^ｃ、Ｒ^ｄ及びＲ^ｅは、水素及びアルキルから独立して選択され；
Ｒ^５はヒドロキシル保護基であり；
Ｒ^ｘは、シアノアルキル又はアルキル、特にシアノアルキルであり；
Ｒ^ｙはジアルキルアミノ又はピロリジニルであり；
Ｎｕは、核酸塩基又は保護された核酸塩基であり；かつ
ｎは、１、２、又は３である。

【0266】

本発明はさらに、特に、次のものに関する。

【0267】

－Ｘ－Ｙ－が、－ＣＨ_２－Ｏ－、－ＣＨ（ＣＨ_３）－Ｏ－、又は－ＣＨ_２ＣＨ_２－Ｏ－である、本発明による化合物。

【0268】

式（ＩＩＩ）又は（ＩＶ）：

［式中、Ｒ^５、Ｒ^ｘ、Ｒ^ｙ、及びＮｕは、上記定義されたとおりである］
の、本発明による化合物。

【0269】

Ｒ^ｘが、２－シアノ－１，１－ジメチル－エチル、メチル、エチル、プロピル、又はｔｅｒｔ－ブチルである、本発明による化合物。

【0270】

Ｒ^ｘが、２－シアノ－１，１－ジメチル－エチルである、本発明による化合物。

【0271】

Ｒ^ｙが、ジイソプロピルアミノ又はピロリジニルである、本発明による化合物。

【0272】

Ｒ^ｙがジアルキルアミノである、本発明による化合物。

【0273】

Ｒ^ｙがジイソプロピルアミノである、請求項１から６のいずれか一項に記載の化合物。

【0274】

式（Ｖ）：

［式中、Ｒ^５及びＮｕは、上記定義されたとおりである］
の、本発明による化合物。

【0275】

Ｎｕが、チミン、保護されたチミン、アデノシン、保護されたアデノシン、シトシン、保護されたシトシン、５－メチルシトシン、保護された５－メチルシトシン、グアニン、保護されたグアニン、ウラシル、又は保護されたウラシルである、本発明による化合物。

【0276】

以下：

から選択される、本発明による化合物。

【0277】

本発明による式（ＩＩ）の化合物の製造プロセスであって、式（Ｃ）：

の化合物と、式Ｐ（Ｒ^ｙ）_２（ＣＨ_２）ＣＯＯ（Ｒ^ｘ）の化合物との、カップリング剤及び塩基の存在下での反応を含み、式中、Ｘ、Ｙ、Ｒ^５、Ｎｕ、Ｒ^ｘ、及びＲ^ｙは、上記定義されたとおりである、製造プロセス。

【0278】

カップリング剤が、１Ｈ－テトラゾール、５－エチルチオ－１Ｈ－テトラゾール、２－ベンジルチオテトラゾール、又は４，５－ジシアノイミダゾール（ＤＣＩ）、特にテトラゾールである、本発明によるプロセス。

【0279】

オリゴヌクレオチドの製造における、本発明による化合物の使用。

【0280】

本発明のプロセスは、塩基、例えば、トリエチルアミン、ピリジン、ジイソプロピルアミン、又はＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンで好都合にクエンチすることができる。

【0281】

本発明による、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、特に、２’－メトキシ－ＲＮＡ、２’－アルコキシアルコキシ－ＲＮＡ、特に、２’－メトキシエトキシ－ＲＮＡを含むオリゴヌクレオチドは、次の手順に従って合成することができる。

【0282】

スキーム５では、Ｂ１及びＢ２は核酸塩基であり、Ａは上記定義されたとおりである。

【0283】

ＭＯＥ（又は他の２’置換基）ホスホノアセテート又はチオホスホノアセテート修飾を含むオリゴヌクレオチドは、固相オリゴヌクレオチド化学を使用して合成することができる。ＤＭＴで保護されたデオキシリボヌクレオシド３’－Ｏ－ジイソプロピルアミノホスフィノ酢酸 ジメチル－β－シアノエチルエステルは、固体支持体に結合したデオキシリボヌクレオシドに縮合する。次に、ホスフィナイト結合を、例えば、低酸化剤試薬（ＴＨＦ／ピリジン／Ｈ_２Ｏ：８８／１０／２中、０．０２ＭのＩ_２）を使用して酸化するか、又は例えば、アセトニトリル／ピリジン中、３－アミノ－１，２，４－ジチアゾール－５－チオンの０．１Ｍ溶液を使用して硫化する。無水酢酸でキャッピングし、ジクロロ酢酸で処理して５’－Ｏ－ジメトキシトリイル（ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｙｌ）基を除去した後、このサイクルを適切な回数繰り返して、ホスホノアセテート修飾を含むオリゴヌクレオチドを得る。

【0284】

本発明によるオリゴヌクレオチドの製造に有用なモノマー構成ブロックは、例えば、次のスキームに従って調製することができる。

【0285】

ジメチルシアノエチルブロモアセテートは、ブロモアセチルブロミドをトルエン中の３－ヒドロキシ－３－メチルブチロニトリルと一晩還流下で縮合させることにより合成される。次に、リンエステル誘導体は、ジイソプロピルアミノクロロホスフィンとのレフォルマトスキー反応を介して調製される。４，５－ＤＣＩを使用してこの反応物を保護された２’－デオキシヌクレオシドとさらに縮合させると、ＭＯＥ ＰＡＣＥホスホルアミダイトが生成される。

【0286】

スキーム６では、Ｒ^５、Ｒ^ｘ、Ｒ^ｙ、及びＮｕは、上記定義されたとおりである。

【0287】

モノマーは、特に、上記の手順を追従する次のスキームに従って調製することができる。

【0288】

スキーム７では、Ｎｕは上記定義されたとおりである。

【0289】

したがって、本発明は、式（ＶＩ）：

の化合物、又はその薬学的に許容される塩（alt）に関し、式中、
Ｒ^２は、アルコキシ、アルコキシアルコキシ、又はアミノ、特に、アルコキシ又はアルコキシアルコキシであり；
Ｒ^５はヒドロキシル保護基であり；
Ｒ^ｘは、シアノアルキル又はアルキル、特にシアノアルキルであり；
Ｒ^ｙはジアルキルアミノ又はピロリジニルであり；
Ｎｕは、核酸塩基又は保護された核酸塩基である。

【0290】

本発明はさらに、特に、次のものに関する。

【0291】

Ｒ^２が、メトキシ、メトキシエトキシ又はアミノ、特に、メトキシ又はメトキシエトキシである、本発明による化合物。

【0292】

式（ＶＩＩ）：

［式中、Ｒ^５、Ｒ^ｘ、Ｒ^ｙ、及びＮｕは、上記定義されたとおりである］
の、本発明による化合物。

【0293】

Ｒ^ｘが、２－シアノ－１，１－ジメチル－エチル、メチル、エチル、プロピル、又はｔｅｒｔ－ブチルである、本発明による化合物。

【0294】

Ｒ^ｘが、２－シアノ－１，１－ジメチル－エチルである、本発明による化合物。

【0295】

Ｒ^ｙが、ジイソプロピルアミノ又はピロリジニルである、本発明による化合物。

【0296】

Ｒ^ｙがジアルキルアミノである、本発明による化合物。

【0297】

Ｒ^ｙがジイソプロピルアミノである、請求項１から６のいずれか一項に記載の化合物。

【0298】

式（ＶＩＩＩ）：

［式中、Ｒ^５及びＮｕは、上記定義されたとおりである］
の、本発明による化合物。

【0299】

Ｎｕが、チミン、保護されたチミン、アデノシン、保護されたアデノシン、シトシン、保護されたシトシン、５－メチルシトシン、保護された５－メチルシトシン、グアニン、保護されたグアニン、ウラシル、又は保護されたウラシルである、本発明による化合物。

【0300】

以下：

から選択される、本発明による化合物。

【0301】

本発明による式（ＶＩ）の化合物の製造プロセスであって、式（Ｄ）：

の化合物と、式Ｐ（Ｒ^ｙ）_２（ＣＨ_２）ＣＯＯ（Ｒ^ｘ）の化合物との、カップリング剤及び塩基の存在下での反応を含み、式中、Ｒ^２、Ｒ^５、Ｎｕ、Ｒ^ｘ、及びＲ^ｙは、上記定義されたとおりである、製造プロセス。

【0302】

カップリング剤が、１Ｈ－テトラゾール、５－エチルチオ－１Ｈ－テトラゾール、２－ベンジルチオテトラゾール、４，５－ジシアノイミダゾール（ＤＣＩ）、特に、ＤＣＩである、本発明によるプロセス。

【0303】

オリゴヌクレオチドの製造における本発明による化合物の使用。

【0304】

本発明のプロセスは、塩基、例えば、トリエチルアミン、ピリジン、ジイソプロピルアミン、又はＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンで好都合にクエンチすることができる。

【0305】

これより、本発明を、限定的な特徴を有しない以下の実施例によって説明する。

【実施例】

【0306】

略語：
Ａ アデニン
Ｇ グアニン
ｍＣ メチルシトシン
Ｔ チミン
ＬＮＡ ロックされた核酸
ＲＮＡ リボ核酸
ＤＭＴ ジメトキシトリチル（Dimetoxytrityl）
ＤＣＡ ジクロロ酢酸
ＤＣＭ ジクロロメタン
ＴＨＦ テトラヒドロフラン
Ａｎｈ． 無水
ＴＬＣ 薄層クロマトグラフィ
ＮＭＲ 核磁気共鳴
ＣＰＧ 制御された細孔ガラス
ＲＴ 逆転写
ｑＰＣＲ 定量的ポリメラーゼ連鎖反応
ｄｓ 二本鎖
Ｔｍ 熱融解

【0307】

実施例１：モノマー合成
１．１． １－シアノ－２－メチルプロパン－２－イル２－ブロモアセテート

トルエン（６７．２ｍＬ）中、２－ブロモアセチルブロミド（１４．７ｇ、６．３１ｍＬ、７２．６ｍｍｏｌ、１．２当量）の溶液に、３－ヒドロキシ－３－メチルブタンニトリル（６ｇ、６．２８ｍｌ、６０．５ｍｍｏｌ、１当量）を攪拌しながらゆっくりと加えた。丸底フラスコは、Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈのコンデンサと酸トラップ（ＮａＯＨ水溶液を含む）に通気された乾燥管とを備えていた。反応混合物を加熱して一晩還流させた。反応を室温まで冷却し、次に混合物を減圧濃縮して無色の油を得た。粗生成物を、酢酸エチル／ヘキサンを勾配として使用するコンビフラッシュクロマトグラフィによって精製し、生成物をヘキサン中の３０％酢酸エチルで溶出して、１－シアノ－２－メチルプロパン－２－イル２－（ビス（ジイソプロピルアミノ）ホスファネイル）アセテートを得た（８．１４ｇ、３７ｍｍｏｌ、収率５８％）。^１Ｈ ＮＭＲ（クロロホルム－ｄ，３００ＭＨｚ）δ３．８（ｓ，２Ｈ），２．９（ｓ，２Ｈ），１．６（ｓ，６Ｈ）。

【0308】

１．２． １－シアノ－２－メチルプロパン－２－イル２－（ビス（ジイソプロピルアミノ）ホスファネイル）アセテート

１－クロロ－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトライソプロピルホスファンジアミン（７．７５ｇ、２９ｍｍｏｌ、１当量）を無水ＴＨＦ（６９．４ｍｌ）に溶解した。別の４１．６ｍｌの無水ジエチルエーテルを加えた。無水ＴＨＦ（３４．７ｍｌ）中、１－シアノ－２－メチルプロパン－２－イル２－ブロモアセテート（７．０３ｇ、３２ｍｍｏｌ、１．１当量）を丸底フラスコに入れた。亜鉛（２．８５ｇ、４３．６ｍｍｏｌ、１．５当量）、無水ジエチルエーテル（２２．２ｍｌ）、及びマグネティックスターラーを、Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈのコンデンサを備えた５００ｍＬの３つ口丸底フラスコに入れた。ホスフィン（３６ｍＬ）及びブロモアセテート溶液（１０ｍＬ）を同時に、３つ口丸底フラスコに非常にゆっくりと加えた。次に、反応混合物を、発熱反応が顕著になるまで還流下で加熱した（わずかに曇った無色の反応が透明になり、わずかに黄色になった）。ホスフィン及びブロモアセテート溶液の残りを加えることによって、反応を還流下で続けた。添加が完了したら、反応を、加熱により４５分間還流状態に保ち、室温まで冷却し、^３１Ｐ ＮＭＲで分析して完了を確認した。δ＝１３５ｐｐｍの出発物質は、δ＝４８ｐｐｍの単一の生成物に変換された。冷却した反応混合物を減圧濃縮して、粘稠な油を得た。得られた物質を無水ヘプタン及び少量のアセトニトリルで溶解して、粗生成物を完全に溶解させた。この溶液を無水ヘプタンで２回抽出した。アセトニトリル層を^３１Ｐ ＮＭＲで分析して、δ＝４８ｐｐｍで生成物が存在しないことを確認し、捨てた。すべてのヘプタン画分を合わせ、減圧濃縮して、わずかに黄色い油を得た。次に、これを高真空下で一晩乾燥させて、白色の固体を得た（７．０９６ｇ、１９ｍｍｏｌ、収率６２％）。^１Ｈ ＮＭＲ（クロロホルム－ｄ，３００ＭＨｚ）δ３．３－３．５（ｍ，４Ｈ），２．９（ｓ，２Ｈ），２．７（ｄ，２Ｈ），１．６０（ｓ，６Ｈ），１．３（ｍ，２４Ｈ）。

【0309】

１．３． （１－シアノ－２－メチルプロパン－２－イル）２－［［ジ（プロパン－２－イル）アミノ］－［［ｒａｃ－（１Ｒ，３Ｒ）－１－［［ビス（４－メトキシフェニル）－フェニルメトキシ］メチル］－３－（５－メチル－２，４－ジオキソピリミジン－１－イル）－２，５－ジオキサビシクロ［２．２．１］ヘプタン－７－イル］オキシ］ホスファニル］アセテート

１－［（１Ｒ，４Ｒ，６Ｒ，７Ｓ）－４－［［ビス（４－メトキシフェニル）－フェニル－メトキシ］メチル］－７－ヒドロキシ－２，５－ジオキサビシクロ［２．２．１］ヘプタン－６－イル］－５－メチル－ピリミジン－２，４－ジオン（０．７ｇ、１．２２ｍｍｏｌ、１当量）を無水ＤＣＭ（１５．３ｍｌ）に溶解し、次いで１－シアノ－２－メチルプロパン－２－イル２－（ビス（ジイソプロピルアミノ）ホスファネイル）アセテート（５４５ｍｇ、１．４７ｍｍｏｌ、１．２当量）を反応混合物に加えた。反応成分が完全に溶解したら、テトラゾール（２．１７ｍｌ、９７８μｍｏｌ、０．８当量）を、無水ＣＨ_３ＣＮ中の０．４５Ｍ溶液として反応混合物に加えた。次に、反応混合物をアルゴン下、室温で一晩撹拌し、^３１Ｐ ＮＭＲ及びシリカゲルＴＬＣ（酢酸エチルで溶出）で分析した。ＴＬＣにおけるより速く溶出する生成物へのスポット・ツー・スポット変換によって及び酢酸ホスフィノジアマイト（phosphinodiamite）の^３１Ｐ ＮＭＲシグナルの完全な喪失によって、反応の完了を決定した。完了したら、トリエチルアミン（９９ｍｇ、１３６μｌ、９７８μｍｏｌ、０．８当量）を加えて反応を停止させた。５分後、反応混合物を減圧濃縮して、粘稠な無色の油を得た。生成物を最小量の酢酸エチルに再溶解し、カラムクロマトグラフィ（８０／２０：酢酸エチル／ヘプタン）によって精製した。生成物を含む画分を合わせて濃縮し、泡状にし、これを最小量の無水ＤＣＭに再溶解した。ヘプタンを滴下して加え、急速攪拌した。固体沈殿物を濾過により単離し、減圧下で一晩乾燥させて、７４３ｍｇの標的化合物を白色固体として得た（７４３ｍｇ、０．８８ｍｍｏｌ、収率６９％）。^３１Ｐ ＮＭＲ（クロロホルム－ｄ，１２１ＭＨｚ）δ１２６．９１（ｓ，１Ｐ），１２２．２５（ｓ，１Ｐ）。^１Ｈ ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，アセトニトリル－ｄ３）δ ｐｐｍ ８．８９－９．２２（ｍ，１Ｈ），７．５７－７．５９（ｍ，１Ｈ），７．５０（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．３３－７．３９（ｍ，３Ｈ），７．３３－７．３７（ｍ，２Ｈ），７．２６－７．３１（ｍ，１Ｈ），６．８８－６．９５（ｍ，４Ｈ），５．５８（ｓ，１Ｈ），４．６２（ｓ，１Ｈ），４．１４（ｄＪ，＝６．８Ｈｚ，１Ｈ），３．７９－３．８１（ｍ，５Ｈ），３．７９－３．８５（ｍ，２Ｈ），３．４７－３．５０（ｍ，２Ｈ），３．４２－３．５０（ｍ，１Ｈ），２．９２－２．９５（ｍ，１Ｈ），２．６７－２．７１（ｍ，１Ｈ），２．６１－２．６６（ｍ，１Ｈ），１．７２（ｓ，２Ｈ），１．５２（ｄ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，４Ｈ），１．０９（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，４Ｈ），１．０１（ｂｒ ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，４Ｈ）。ＬＣＭＳ（ＥＳ＋）実測値：８４３．３７ｇ／ｍｏｌ。

【0310】

１．４． （１－シアノ－２－メチルプロパン－２－イル）２－［［ジ（プロパン－２－イル）アミノ］－［［ｒａｃ－（１Ｒ，３Ｒ）－３－（６－ベンズアミドプリン－９－イル）－１－［［ビス（４－メトキシフェニル）－フェニルメトキシ］メチル］－２，５－ジオキサビシクロ［２．２．１］ヘプタン－７－イル］オキシ］ホスファニル］アセテート

Ｎ－［９－［（１Ｒ，４Ｒ，６Ｒ，７Ｓ）－４－［［ビス（４－メトキシフェニル）－フェニル－メトキシ］メチル］－７－ヒドロキシ－２，５－ジオキサビシクロ［２．２．１］ヘプタン－６－イル］プリン－６－イル］ベンズアミド（３ｇ、４．３７ｍｍｏｌ、１当量）を、無水ＤＣＭ（５４．７ｍｌ）に溶解し、次に、１－シアノ－２－メチルプロパン－２－イル２－（ビス（ジイソプロピルアミノ）ホスファネイル）アセテート（１．９５ｇ、５．２５ｍｍｏｌ、１．２当量）を反応混合物に加えた。反応成分が完全に溶解したら、テトラゾール（７．７８ｍｌ、３．５ｍｍｏｌ、０．８当量）を、無水ＣＨ_３ＣＮ中の０．４５Ｍ溶液として反応混合物に加えた。反応混合物をアルゴン下、室温で一晩撹拌し、^３１Ｐ ＮＭＲ及びシリカゲルＴＬＣ（酢酸エチルで溶出）で分析した。ＴＬＣにおけるより速く溶出する生成物へのスポット・ツー・スポット変換によって及び酢酸ホスフィノジアマイトの^３１Ｐ ＮＭＲシグナルの完全な喪失によって、反応の完了を決定した。完了したら、トリエチルアミン（３５４ｍｇ、４８８μｌ、３．５ｍｍｏｌ、０．８当量）を加えて反応を停止させた。５分後、反応混合物を減圧濃縮して、粘稠な無色の油を得た。生成物を最小量の酢酸エチルに再溶解し、カラムクロマトグラフィ（８０／２０：酢酸エチル／ヘプタン）によって精製した。生成物を含む画分を合わせて濃縮し、泡状にし、これを最小量の無水ＤＣＭに再溶解した。ヘプタンを滴下して加え、急速攪拌した。固体沈殿物を濾過により単離し、減圧下で一晩乾燥させて、１．８６ｇの標的化合物を白色固体として得た（１．８６ｇ、１．９ｍｍｏｌ、収率４５％）。^３１Ｐ ＮＭＲ（アセトニトリル－ｄ_３，１２１ＭＨｚ）δ１２５．２（ｓ，１Ｐ），１２０．９（ｓ，１Ｐ）。ＬＣＭＳ（ＥＳ＋）実測値：９５６．４０ｇ／ｍｏｌ。

【0311】

１．５． （１－シアノ－２－メチルプロパン－２－イル）２－［［ジ（プロパン－２－イル）アミノ］－［［ｒａｃ－（１Ｒ，３Ｒ）－３－（４－ベンズアミド－５－メチル－２－オキソピリミジン－１－イル）－１－［［ビス（４－メトキシフェニル）－フェニルメトキシ］メチル］－２，５－ジオキサビシクロ［２．２．１］ヘプタン－７－イル］オキシ］ホスファニル］アセテート

Ｎ－［１－［（１Ｒ，４Ｒ，６Ｒ，７Ｓ）－４－［［ビス（４－メトキシフェニル）－フェニル－メトキシ］メチル］－７－ヒドロキシ－２，５－ジオキサビシクロ［２．２．１］ヘプタン－６－イル］－５－メチル－２－オキソ－ピリミジン－４－イル］ベンズアミド（２．８ｇ、４．１４ｍｍｏｌ、１当量）を無水ＤＣＭ（５９．２ｍｌ）に溶解し、次に、１－シアノ－２－メチルプロパン－２－イル２－（ビス（ジイソプロピルアミノ）ホスファネイル）アセテート（１．８５ｇ、４．９７ｍｍｏｌ、１．２当量）を反応混合物に加えた。反応成分が完全に溶解したら、テトラゾール（７．３７ｍｌ、３．３１ｍｍｏｌ、０．８当量）を、無水ＣＨ_３ＣＮ中の０．４５Ｍ溶液として反応混合物に加えた。反応混合物をアルゴン下、室温で一晩撹拌し、^３１Ｐ ＮＭＲ及びシリカゲルＴＬＣ（酢酸エチルで溶出）で分析した。ＴＬＣにおけるより速く溶出する生成物へのスポット・ツー・スポット変換によって及び酢酸ホスフィノジアマイトの^３１Ｐ ＮＭＲシグナルの完全な喪失によって、反応の完了を決定した。完了したら、トリエチルアミン（３３５ｍｇ、４６２μｌ、３．３１ｍｍｏｌ、０．８当量）を加えて反応を停止させた。５分後、反応混合物を減圧濃縮して、粘稠なわずかに黄色の油を得た。生成物を最小量の酢酸エチルに再溶解し、カラムクロマトグラフィ（５０／５０：酢酸エチル／ヘプタン）によって精製した．生成物を含む画分を合わせて濃縮し、泡状にし、これを最小量の無水ＤＣＭに再溶解した。ヘプタンを滴下して加え、急速攪拌した。固体沈殿物を濾過により単離し、減圧下で一晩乾燥させて、２．３５ｇの標的化合物を淡黄色の個体として得た（２．３５ｇ、２．２２ｍｍｏｌ、収率４６％）。^３１Ｐ ＮＭＲ（アセトニトリル－ｄ_３，１２１ＭＨｚ）δ１２６．７８（ｓ，１Ｐ），１２２．７３（ｓ，１Ｐ）。ＬＣＭＳ（ＥＳ＋）実測値：９４７．４１ｇ／ｍｏｌ。

【0312】

１．６． （１－シアノ－２－メチルプロパン－２－イル）２－［［ジ（プロパン－２－イル）アミノ］－［［ｒａｃ－（１Ｒ，３Ｒ）－１－［［ビス（４－メトキシフェニル）－フェニルメトキシ］メチル］－３－［２－（２－メチルプロパノイルアミノ）－６－オキソ－１Ｈ－プリン－９－イル］－２，５－ジオキサビシクロ［２．２．１］ヘプタン－７－イル］オキシ］ホスファニル］アセテート

Ｎ’－［９－［（１Ｒ，４Ｒ，６Ｒ，７Ｓ）－４－［［ビス（４－メトキシフェニル）－フェニル－メトキシ］メチル］－７－ヒドロキシ－２，５－ジオキサビシクロ［２．２．１］ヘプタン－６－イル］－６－オキソ－１Ｈ－プリン－２－イル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－ホルムアミジン（２．６ｇ、３．８９ｍｍｏｌ、１当量）を、無水ＤＣＭ（５５．６ｍｌ）に溶解し、次に、１－シアノ－２－メチルプロパン－２－イル２－（ビス（ジイソプロピルアミノ）ホスファネイル）アセテート（１．７４ｇ、４．６７ｍｍｏｌ、１．２当量）を反応混合物に加えた。反応成分が完全に溶解したら、テトラゾール（６．９２ｍｌ、３．１２ｍｍｏｌ、当量：０．８）を無水ＣＨ_３ＣＮ中の０．４５Ｍ溶液として反応混合物に加えた。反応混合物をアルゴン下、室温で一晩撹拌し、^３１Ｐ ＮＭＲ及びシリカゲルＴＬＣ（酢酸エチルで溶出）で分析した。ＴＬＣにおけるより速く溶出する生成物へのスポット・ツー・スポット変換によって及び酢酸ホスフィノジアマイトの^３１Ｐ ＮＭＲシグナルの完全な喪失によって、反応の完了を決定した。完了したら、トリエチルアミン（３１５ｍｇ、４３４μｌ、３．１２ｍｍｏｌ、０．８当量）を加えて反応を停止させた。５分後、反応混合物を減圧濃縮して、粘稠な無色の油を得た。生成物を最小量の酢酸エチルに再溶解し、カラムクロマトグラフィ（１００％酢酸エチル）によって精製した。生成物を含む画分を合わせて濃縮し、泡状にし、これを最小量の無水ＤＣＭに再溶解した。ヘプタンを滴下して加え、急速攪拌した。固体沈殿物を濾過により単離し、減圧下で一晩乾燥させて、１．４ｇの標的化合物を白色固体として得た（１．４ｇ、１．４ｍｍｏｌ、収率３８％）。^３１Ｐ ＮＭＲ（アセトニトリル－ｄ_３，１２１ＭＨｚ）δ１２６．４８（ｓ，１Ｐ），１２１．３（ｓ，１Ｐ）。ＬＣＭＳ（ＥＳ＋）実測値：９３８．４２ｇ／ｍｏｌ。

【0313】

実施例２：オリゴヌクレオチド合成
ＢｉｏａｕｔｏｍａｔｉｏｎによるＭｅｒＭａｄｅ１２自動ＤＮＡシンセサイザーを使用して、オリゴヌクレオチドを合成した。合成は、ユニバーサルリンカーを備えた制御された細孔ガラス支持体（５００Å）を使用して１μｍｏｌスケールで実施した。

【0314】

標準的なＤＮＡ及びＬＮＡホスホルアミダイトのカップリングの標準的なサイクル手順において、２３０μＬを３回、１０５秒の適用で、ＣＨ_２Ｃｌ_２中の３％（ｗ／ｖ）ジクロロ酢酸を使用して、ＤＭＴの脱保護を実施した。それぞれのホスホルアミダイトを、アセトニトリル（又は、ＬＮＡ－^ＭｅＣ構成要素ではアセトニトリル／ＣＨ_２Ｃｌ_２ １：１）中、０．１Ｍ溶液９５μＬ及び活性化因子としての５－［３，５－ビス（トリフルオロメチル）フェニル］－２Ｈ－テトラゾールの０．２５Ｍ溶液１１０μＬと３回カップリングし、カップリング時間は１８０秒であった。硫化は、アセトニトリル／ピリジン中、３－アミノ－１，２，４－ジチアゾール－５－チオンの０．１Ｍ溶液を使用して、２００μＬを１回、３分間の適用で実施した。酸化は、ＴＨＦ／ｐｙｒ／Ｈ_２Ｏ：８８／１０／２中、０．０２ＭのＩ_２を使用して、１回、３分間の適用で実施した。キャッピングは、ＴＨＦ／ルチジン／Ａｃ_２Ｏ ８：１：１（ＣａｐＡ、７５μｍｏｌ）及びＴＨＦ／Ｎ－メチルイミダゾール８：２（ＣａｐＢ、７５μｍｏｌ）を使用して、７０秒間実施した。

【0315】

ＰＡＣＥ ＬＮＡを導入するための合成サイクルは、２３０μＬを３回、１０５秒の適用で、ＣＨ_２Ｃｌ_２中、３％（ｗ／ｖ）のジクロロ酢酸を使用したＤＭＴの脱保護を含んでいた。新たに調製したＬＮＡ ＰＡＣＥを、アセトニトリル中、０．１Ｍ溶液９５μＬ及び活性化因子としての５－［３，５－ビス（トリフルオロメチル）フェニル］－２Ｈ－テトラゾールの０．２５Ｍ溶液１１０μＬと２回カップリングし、カップリング時間は１５分であった。硫化は、アセトニトリル／ピリジン中、３－アミノ－１，２，４－ジチアゾール－５－チオンの０．１Ｍ溶液を使用して、１回、３分間の適用で実施した。酸化は、ＴＨＦ／ｐｙｒ／Ｈ_２Ｏ：８８／１０／２中、０．０２ＭのＩ_２を使用して、１回、３分間の適用で実施した。キャッピングは、ＴＨＦ／ルチジン／Ａｃ_２Ｏ ８：１：１（ＣａｐＡ、７５μｍｏｌ）及びＴＨＦ／Ｎ－メチルイミダゾール８：２（ＣａｐＢ、７５μｍｏｌ）を使用して、７０秒間実施した。

【0316】

合成後、無水ＣＨ_３ＣＮ中、１．５％のＤＢＵの溶液を注意深くカラムに数回通して、ジメチルシアノエチル保護基を脱保護し、脱保護中の塩基のアルキル化を防いだ。次に、それを室温で６０分間放置した。次に、溶液を捨て、カラムを２－３ｍＬの無水ＣＨ_３ＣＮですすいだ。次に、それをアルゴン流下で乾燥させた。次に、ＣＰＧを４ｍＬのバイアルに注意深く移し、ＭｅＯＨ中、７ＮのＮＨ_３１ｍＬを加え、５５℃で２４時間撹拌したままにした。

【0317】

粗ＤＭＴ－ｏｎオリゴヌクレオチドを、Ｃ１８カラムを使用してＲＰ－ＨＰＬＣで精製し、続いて８０％酢酸水溶液及びエタノール沈殿で又はカートリッジ精製によってＤＭＴを除去した。ＰＡＣＥ ＬＮＡホスホルアミダイトは、バーゼル内で合成した。通常のホスホルアミダイトは、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、並びに固相合成で用いられるすべての試薬から注文した。

【0318】

上記手順に従って、以下の分子を調製した。

*隣接するヌクレオチド間のPACEホスホロチオエート修飾。
A、G、^mC、TはLNAヌクレオチドを表している。
a、g、c、tはDNAヌクレオチドを表している。
他のすべての結合はホスホロチオエートとして調製した。

【0319】

実施例３：用量反応曲線のための異なる濃度でのヒトＨｅＬａ及びＡ５４９細胞におけるＨＩＦ１ａ ｍＲＮＡを標的とするオリゴヌクレオチドのｉｎ ｖｉｔｒｏでの有効性
ＨｅＬａ及びＡ５４９細胞株はＡＴＣＣから購入し、供給業者による推奨のとおりに、３７℃、５％ＣＯ_２の加湿インキュベーター内で維持した。アッセイでは、３０００細胞／ウェル（ＨｅＬａ）及び３５００細胞／ウェル（Ａ５４９）を培地中の９６マルチウェルプレートに播種した。ＰＢＳに溶解したオリゴヌクレオチドを添加する前に、細胞を２４時間インキュベートした。オリゴヌクレオチドの濃度範囲：最高濃度２５μＭ、８段階で１：１希釈。オリゴヌクレオチドの添加の３日後に、細胞を回収した。ＲＮＡは、製造元の指示に従ってＰｕｒｅＬｉｎｋ Ｐｒｏ ９６ ＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して抽出し、５０μｌの水で溶出した。続いてＲＮＡをＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅフリー水（Ｇｉｂｃｏ）で１０倍に希釈し、９０℃で１分間加熱した。

【0320】

遺伝子発現解析では、Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＴ－ｑＰＣＲを、二重鎖セットアップで、ｑＳｃｒｉｐｔ（商標）ＸＬＴ Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ ＲＴ－ｑＰＣＲ ＴｏｕｇｈＭｉｘ（登録商標）、Ｌｏｗ ＲＯＸ（商標）（Ｑｕａｎｔａｂｉｏ）を使用して実施した。次のＴａｑＭａｎプライマーアッセイをｑＰＣＲに使用した：ＨＩＦ１Ａ、Ｈｓ００９３６３６８＿ｍ１と、内因性対照のＧＵＳＢ、Ｈｓ９９９９９９０８＿ｍ１（ＶＩＣ－ＭＧＢ）。すべてのプライマーセットは、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社から購入した。ＨＩＦ１Ａ ｍＲＮＡの相対発現レベルは、対照（ＰＢＳ処理細胞）のパーセントとして示されており、ＩＣ_５０値は、ｎ＝２の生物学的複製からのデータにおいてＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ７を使用して決定している。

【0321】

結果を以下の表及び図１に示す。

【0322】

図１のプロットに示されているデータが以下の表に報告されている。

【0323】

HeLaにおけるHIF1Aの発現(生物学的反復の平均)

【0324】

A549におけるHIF1Aの発現(生物学的反復の平均)

【0325】

実施例４：用量反応曲線のための異なる濃度でのヒトＨｅＬａ及びＡ５４９細胞におけるＭＡＬＡＴ１ ｍＲＮＡを標的とするオリゴヌクレオチドのｉｎ ｖｉｔｒｏでの効力及び有効性
ＨｅＬａ及びＡ５４９細胞株はＡＴＣＣから購入し、供給業者による推奨のとおりに、３７℃、５％ＣＯ_２の加湿インキュベーター内で維持した。アッセイでは、３０００細胞／ウェル（ＨｅＬａ）及び３５００細胞／ウェル（Ａ５４９）を培地中の９６マルチウェルプレートに播種した。ＰＢＳに溶解したオリゴヌクレオチドを添加する前に、細胞を２４時間インキュベートした。オリゴヌクレオチドの濃度範囲：最高濃度２５μＭ、８段階で１：１希釈。オリゴヌクレオチドの添加の３日後に、細胞を回収した。ＲＮＡは、製造元の指示に従ってＰｕｒｅＬｉｎｋ Ｐｒｏ ９６ ＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して抽出し、５０μｌの水で溶出した。続いてＲＮＡをＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅフリー水（Ｇｉｂｃｏ）で１０倍に希釈し、９０℃で１分間加熱した。

【0326】

遺伝子発現解析では、Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＴ－ｑＰＣＲを、二重鎖セットアップで、ｑＳｃｒｉｐｔ（商標）ＸＬＴ Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ ＲＴ－ｑＰＣＲ ＴｏｕｇｈＭｉｘ（登録商標）、Ｌｏｗ ＲＯＸ（商標）（Ｑｕａｎｔａｂｉｏ）を使用して実施した。次のＴａｑＭａｎプライマーアッセイをｑＰＣＲに使用した：ＭＡＬＡＴ１、Ｈｓ００２７３９０７＿ｓ１（ＦＡＭ－ＭＧＢ）と、内因性対照のＧＡＰＤＨ。すべてのプライマーセットは、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社から購入した。ＭＡＬＡＴ１ ｍＲＮＡの相対発現レベルは、対照（ＰＢＳ処理細胞）のパーセントとして示されており、ＩＣ_５０値は、ｎ＝２の生物学的複製からのデータにおいてＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ７を使用して決定している。

【0327】

結果を以下の表及び図２に示す。

【0328】

図２のプロットに示されているデータが以下の表に報告されている。

【0329】

HeLaにおけるMALAT1の発現(生物学的反復の平均)：

【0330】

A549HeLaにおけるMALAT1の発現(生物学的反復の平均)

【0331】

実施例５：マウス初代肝細胞におけるＡｐｏＢ ｍＲＮＡを標的とするオリゴヌクレオチドのｉｎ ｖｉｔｒｏでの効力及び有効性
初代マウス肝細胞は、文献に従い、２段階の灌流プロトコルの後にペントバルビタールで麻酔したＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの肝臓から単離した（Berry and Friend,1969,J. Cell Biol; Paterna et al.,1998,Toxicol.Appl.Pharmacol）。最初のステップは、ＨＢＳＳ＋１５ｍＭ ＨＥＰＥＳ＋０．４ｍＭ ＥＧＴＡで５分間、続いて、ＨＢＳＳ＋２０ｍＭ ＮａＨＣＯ３＋０．０４％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ＃Ａ７９７９）＋４ｍＭ ＣａＣＬ２（Ｓｉｇｍａ＃２１１１５）＋０，２ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼタイプ２（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ＃４１７６）で１２分間であった。肝細胞は、氷上で、５ｍｌの冷ウィリアムズ培地Ｅ（ＷＭＥ）（Ｓｉｇｍａ＃Ｗ１８７８、１×ペニシリン／ストレプトマイシン／グルタミン、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ（ＡＴＣＣ ＃３０－２０３０）で補完）に捕捉した。粗細胞懸濁液を、７０μｍ、続いて４０μｍのセルストレーナー（Ｆａｌｃｏｎ＃３５２３５０及び＃３５２３４０）に通して濾過し、最大２５ｍｌまでＷＭＥで満たし、室温、５０ｘｇで５分間遠心分離して、肝細胞をペレット化した。上清を除去し、肝細胞を２５ｍｌのＷＭＥに再懸濁した。２５ｍｌの９０％パーコール溶液（Ｓｉｇｍａ＃Ｐ４９３７；ｐＨ＝８．５－９．５）を加え、２５℃、５０ｘｇで１０分間遠心分離した後、上清と浮遊細胞を除去した。残りのパーコールを除去するために、ペレットを再び５０ｍＬのＷＭＥ培地に再懸濁し、２５℃、５０ｘｇで３分間遠心分離し、上清を捨てた。細胞ペレットを２０ｍＬのＷＭＥに再懸濁し、細胞数及び生存率を決定し（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃｅｌｌｃｏｕｎｔ）、２５０，０００細胞／ｍｌに希釈した。２５，０００細胞／ウェルを、コラーゲンでコーティングされた９６ウェルプレート（ＰＤ Ｂｉｏｃｏａｔ Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｉ ＃３５６４０７）に播種し、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。３時間後、細胞をＷＭＥで洗浄して付着していない細胞を除去し、培地を交換した。播種の２４時間後、オリゴヌクレオチドをさまざまな濃度で添加した：最高濃度３，１２５μＭ、８段階でｈａｌｆ－ｌｏｇ希釈。オリゴヌクレオチドの添加の３日後に、細胞を回収した。ＲＮＡは、製造元の指示に従ってＰｕｒｅＬｉｎｋ Ｐｒｏ ９６ ＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して抽出し、５０μｌの水で溶出した。続いてＲＮＡをＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅフリー水（Ｇｉｂｃｏ）で１０倍に希釈し、９０℃で１分間加熱した。

【0332】

遺伝子発現解析では、Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＴ－ｑＰＣＲを、二重鎖セットアップで、ｑＳｃｒｉｐｔ（商標）ＸＬＴ Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ ＲＴ－ｑＰＣＲ ＴｏｕｇｈＭｉｘ（登録商標）、Ｌｏｗ ＲＯＸ（商標）（Ｑｕａｎｔａｂｉｏ）を使用して実施した。次のＴａｑＭａｎプライマーアッセイをｑＰＣＲに使用した：Ａｐｏｂ Ｍｍ＿０１５４５１５０＿ｍ１（ＦＡＭ－ＭＧＢ）と、内因性対照のＧａｐｄｈ、Ｍｍ９９９９９９１５＿ｇ１（ＶＩＣ－ＭＧＢ）。すべてのプライマーセットは、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社から購入した。ＡｐｏＢ ｍＲＮＡの相対発現レベルは、対照（ＰＢＳ処理細胞）のパーセントとして示されており、ＩＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ７を使用して決定している。

【0333】

結果を以下の表及び図３に示す。

【0334】

図３のプロットに示されているデータが以下の表に報告されている。

【0335】

初代マウス肝細胞におけるApoB mRNAの相対発現

【0336】

実施例６：ＲＮＡ及びＤＮＡにハイブリダイズしたホスホノ酢酸ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドの熱融解（Ｔｍ）
ｄｓＬＮＡ／ＤＮＡ又はｄｓＬＮＡ／ＲＮＡ ヘテロ二重鎖（熱融解＝Ｔｍ）の変性点は、次の手順に従って測定した：

【0337】

等モル量のＲＮＡ又はＤＮＡとＬＮＡオリゴヌクレオチドとの溶液（ＡｐｏＢでは２０μＭ、Ｍａｌａｔ－１では１０μＭ）は、バッファー中に１０μＭのｄｓオリゴヌクレオチド（ＡｐｏＢ）及び５μＭのｄｓオリゴヌクレオチド（Ｍａｌａｔ－１）をもたらす（１３７ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４、ｐＨ７．４）。溶液を９５℃まで２分間加熱し（ハイブリダイゼーション）、次に室温まで１５分間冷却した。２６０ｎｍでのＵＶ吸光度は、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＥｖｏｌｕｔｉｏｎ６００ ＵＶ－Ｖｉｓ分光光度計（加熱速度１℃／分、読み取り速度２０／分）を使用して記録した。変性点（すなわち、融点、Ｔｍ）を決定するために、融解転移をＬＯＷＥＳＳ曲線に適合させ、変曲点（＝Ｔｍ）を記述的適合の一次導関数のピーク位置によって特定した。

【0338】

ＡｐｏＢオリゴヌクレオチドのＴｍの測定値（ＲＮＡ及びＤＮＡ）を次の表に示す。

【0339】

本発明による化合物は、対照のＲＮＡ及びＤＮＡに対する高い親和性を保持している。

【0340】

実施例７：ＬＴＫ細胞（線維芽細胞）におけるＭＡＬＡＴ１ ｍＲＮＡを標的とする選択されたオリゴヌクレオチドのｉｎ ｖｉｔｒｏでの効力及び有効性
以下のオリゴヌクレオチドが生成し、それに応じて試験した：

* 隣接するヌクレオチド間のPACEホスホロチオエート修飾。
° 隣接するヌクレオチド間のPACEホスホロジエステル修飾。
A、G、^mC、TはLNAヌクレオチドを表している。
a、g、c、tはDNAヌクレオチドを表している。
他のすべての結合はホスホロチオエートとして調製した。

【0341】

【0342】

標的Ｍａｌａｔ－１を標的とする上記化合物を、化合物の効力（ＩＣ５０）を決定するために、７２時間のギムノティックな取り込みを使用して、さまざまな濃度でマウス線維芽細胞（ＬＴＫ細胞）において試験した。
ＬＴＫ細胞の濃度範囲：５０μＭ、１／２ｌｏｇ希釈、８濃度。

【0343】

Ｍａｌａｔ１のＲＮＡレベルを、ｑＰＣＲ（ＧＡＰＤＨレベルに正規化）を使用して定量化し、ＩＣ５０値を決定した。

【0344】

ＩＣ５０の結果は上の表に示されており、この化学修飾が標的のノックダウンに関して良好な耐容性を示すことを示唆している（本明細書では疾患関連の骨格筋細胞で例証されている）。

【0345】

実施例８：１５ｍｇ／ｋｇの用量を用いた心臓における標的ｍＲＮＡレベル（Ｍａｌａｔ１）の測定
マウス（Ｃ５７／ＢＬ６）に、オリゴヌクレオチドを１５ｍｇ／ｋｇ、１、２、及び３日目に３回皮下投与した（ｎ＝５）。８日後にマウスを屠殺し、ＭＡＬＡＴ－１ ＲＮＡの低減を心臓について測定した。親化合物を３×１５ｍｇ／ｋｇ及び３×３０ｍｇ／ｋｇで２回投与した。

【0346】

結果が図４に示されている。

【0347】

ｉｎ ｖｉｖｏの結果は、チオ－ＰＡＣＥ修飾化合物＃２４が心臓のＭＡＬＡＴ－１のノックダウンにおいて、参照化合物の約２倍強力の効力があることを示している（１５ｍｇ／ｋｇで、３０ｍｇ／ｋｇ投与の参照と同じ有効性）。１２位に追加のチオ－ＰＡＣＥ修飾が導入された化合物＃２５は、＃２４より低い有効性を示すが、それでもなお、参照よりも良好である。対応するＯｘｏ－ＰＡＣＥアナログ（＃２６）は、活性の実質的な低下を示している。

【0348】

本発明による一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて、有効性に対する主要な影響をｉｎ ｖｉｖｏで観察した。本発明によるオリゴヌクレオチドの用量は、参照用量のわずか５０％であることに留意されたい。

【0349】

実施例９：ＭＯＥ ＰＡＣＥモノマーの合成
９．１．１－シアノ－２－メチルプロパン－２－イル２－ブロモアセテート

２－ブロモアセチルブロミド（１４．７ｇ、６．３１ｍＬ、７２．６ｍｍｏｌ、当量：１．２）の溶液を、トルエン（６７．２ｍＬ）を含む２５０ｍＬの丸底フラスコに加えた。３－ヒドロキシ－３－メチルブタンニトリル（６ｇ、６．２８ｍｌ、６０．５ｍｍｏｌ、当量：１）を、攪拌しながらゆっくりと加えた。丸底フラスコは、Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈのコンデンサと酸トラップ（ＮａＯＨ水溶液を含む）に通気された乾燥管とを備えていた。反応混合物加熱還流し、一晩還流した。反応を室温まで冷却し、次に混合物を減圧濃縮して油を得た。粗生成物を、酢酸エチル／ヘキサンを勾配として使用するコンビフラッシュクロマトグラフィによって精製し、生成物をヘキサン中の３０％酢酸エチルで溶出して、１－シアノ－２－メチルプロパン－２－イル２－（ビス（ジイソプロピルアミノ）ホスファネイル）アセテートを得た（８．１４ｇ、３７ｍｍｏｌ、収率５８％）。^１Ｈ ＮＭＲ（クロロホルム－ｄ，３００ＭＨｚ）δ３．８（ｓ，２Ｈ）、２．９（ｓ，２Ｈ），１．６（ｓ，６Ｈ）。

【0350】

９．２．１－シアノ－２－メチルプロパン－２－イル２－（ビス（ジイソプロピルアミノ）ホスファネイル）アセテート

無水ＴＨＦ（６９．４ｍｌ）、１－クロロ－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトライソプロピルホスファンジアミン（７．７５ｇ、２９ｍｍｏｌ、当量：１）及びマグネティックスターラーを、栓をした２５０ｍＬの丸底フラスコに加え、ホスフィンが溶解するまで溶液を攪拌した。溶解後、無水ジエチルエーテル（４１．６ｍｌ）を加えた。１－シアノ－２－メチルプロパン－２－イル２－ブロモアセテート（７．０３ｇ、３２ｍｍｏｌ、当量：１．１）を１００ｍＬの丸底フラスコに入れ、無水ＴＨＦ（３４．７ｍｌ）を加えた。亜鉛（２．８５ｇ、４３．６ｍｍｏｌ、当量：１．５）、無水ジエチルエーテル（２２．２ｍｌ）及びマグネティックスターラーを、Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈのコンデンサを備えた、５００ｍＬの３つ口丸底フラスコに入れた。ホスフィン（３６ｍＬ）及びブロモアセテート溶液（１０ｍＬ）を３つ口丸底フラスコに加えた。次に、反応混合物を、発熱反応が顕著になるまで還流下で加熱した（わずかに曇った無色の反応が透明になり、わずかに黄色になった）。ホスフィン及びブロモアセテート溶液の残りを加えることによって、反応を還流下で続けた。添加が完了したら、反応を、加熱により４５分間還流状態に保ち、室温まで冷却し、^３１Ｐ ＮＭＲで分析して完了を確認した。δ＝１３５ｐｐｍの出発物質は、δ＝４８ｐｐｍの単一の生成物に変換された。冷却した反応混合物を減圧濃縮して粘稠な油とした。得られた粘稠な油を無水ヘプタンで溶解した。次に、形成された固体をアセトニトリルに溶解し、この溶液を無水ヘプタンで２回抽出した。アセトニトリル溶液を^３１Ｐ ＮＭＲで分析して、δ＝４８ｐｐｍで生成物が存在しないことを確認し、捨てた。すべてのヘプタン画分（上層）を合わせ、減圧濃縮して、わずかに黄色い油を得た。次に、これを高真空下で乾燥させた。一晩乾燥した後、得られた生成物は、きれいな白色の固体であった（７．０９６ｇ、１９ｍｍｏｌ、収率６２％）。^１Ｈ ＮＭＲ（クロロホルム－ｄ，３００ＭＨｚ）δ３．３－３．５（ｍ，４Ｈ），２．９（ｓ，２Ｈ），２．７（ｄ，２Ｈ），１．６０（ｓ，６Ｈ），１．３（ｍ，２４Ｈ）。

【0351】

９．３． （１－シアノ－２－メチルプロパン－２－イル）２－［［ジ（プロパン－２－イル）アミノ］－［ｒａｃ－（２Ｒ，５Ｒ）－２－［［ビス（４－メトキシフェニル）－フェニルメトキシ］メチル］－４－（２－メトキシエトキシ）－５－（５－メチル－２，４－ジオキソピリミジン－１－イル）オキソラン－３－イル］オキシホスファニル］アセテート

５－メチル－１－［ｒａｃ－（２Ｒ，５Ｒ）－４－ヒドロキシ－３－（２－メトキシエトキシ）－５－［［ｒａｃ－（２Ｅ）－１，１－ビス（４－メトキシフェニル）－２－［ｒａｃ－（Ｚ）－プロパ－１－エニル］ペンタ－２，４－ジエノキシ］メチル］オキソラン－２－イル］ピリミジン－２，４－ジオン（８００ｍｇ、１．２９ｍｍｏｌ、当量：１）を無水ＤＣＭ（１６．２ｍｌ）に溶解し、次に１－シアノ－２－メチルプロパン－２－イル２－（ビス（ジイソプロピルアミノ）ホスファネイル）アセテート（７２１ｍｇ、１．９４ｍｍｏｌ、当量：１．５）を反応混合物に加えた。反応成分が完全に溶解したら、４，５－ＤＣＩ（１２２ｍｇ、１．０３ｍｍｏｌ、当量：０．８）を反応混合物に加えた。次に、反応混合物をアルゴン下、室温で一晩撹拌し、^３１Ｐ ＮＭＲ及びシリカゲルＴＬＣ（酢酸エチルで溶出）によって反応の程度について分析した。ＴＬＣにおけるより速く溶出する生成物へのスポット・ツー・スポット変換によって及び酢酸ホスフィノジアマイトの^３１Ｐ ＮＭＲシグナルの完全な喪失によって、反応の完了を決定した。完了したら、トリエチルアミン（１０５ｍｇ、１４４μｌ、１．０３ｍｍｏｌ、当量：０．８）を加えて反応を停止させた。５分後、反応混合物を、ロータリーエバポレータを使用して減圧下で濃縮し、粘稠な油とした。粘稠な油を、最小量の酢酸エチルに再溶解し、８０／２０：酢酸エチル／ヘプタンで事前に平衡化したシリカゲルカラムの上部に加えて、生成物を収集した。生成物を含む画分を合わせ、ロータリーエバポレータ上で減圧濃縮して泡状にし、最小量の無水ＤＣＭに再溶解し、急速攪拌している無水ヘプタンに滴下して加えた。固体沈殿物を濾過により単離し、減圧下で一晩乾燥させて、７３６ｍｇの標的化合物を白色固体として得た（７３６ｍｇ、収率６１％）。ＬＣＭＳ（ＥＳ＋）実測値：８８９．５ｇ／ｍｏｌ。

【0352】

９．４． （１－シアノ－２－メチルプロパン－２－イル）２－［［ジ（プロパン－２－イル）アミノ］－［ｒａｃ－（２Ｒ，５Ｒ）－５－（６－ベンズアミドプリン－９－イル）－２－［［ビス（４－メトキシフェニル）－フェニルメトキシ］メチル］－４－（２－メトキシエトキシ）オキソラン－３－イル］オキシホスファニル］アセテート

Ｒａｃ－Ｎ－（９－（（２Ｒ，５Ｒ）－５－（（ビス（４－メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）メチル）－４－ヒドロキシ－３－（２－メトキシエトキシ）テトラヒドロフラン－２－イル）－９Ｈ－プリン－６－イル）ベンズアミド（６００ｍｇ、０．８２ｍｍｏｌ、当量：１）を無水ＤＣＭ（１０．２ｍｌ）に溶解し、次に、１－シアノ－２－メチルプロパン－２－イル２－（ビス（ジイソプロピルアミノ）ホスファネイル）アセテート（４５７ｍｇ、１．２３ｍｍｏｌ、当量：１．５）を反応混合物に加えた。反応成分が完全に溶解したら、４，５－ＤＣＩ（７７．５ｍｇ、０．６６ｍｍｏｌ、当量：０．８）を反応混合物に加えた。次に、反応混合物をアルゴン下、室温で一晩撹拌し、^３１Ｐ ＮＭＲ及びシリカゲルＴＬＣ（酢酸エチルで溶出）によって反応の程度について分析した。ＴＬＣにおけるより速く溶出する生成物へのスポット・ツー・スポット変換によって及び酢酸ホスフィノジアマイトの^３１Ｐ ＮＭＲシグナルの完全な喪失によって、反応の完了を決定した。完了したら、トリエチルアミン（６６．４ｍｇ、９１．４μｌ、０．６５ｍｍｏｌ、当量：０．８）を加えて反応を停止させた。５分後、反応混合物を、ロータリーエバポレータを使用して減圧下で濃縮し、粘稠な油とした。粘稠な油を、最小量の酢酸エチルに再溶解し、８０／２０：酢酸エチル／ヘプタンで事前に平衡化したシリカゲルカラムの上部に加えて、生成物を収集した。生成物を含む画分を合わせ、ロータリーエバポレータ上で減圧濃縮して泡状にし、最小量の無水ＤＣＭに再溶解し、急速攪拌している無水ヘプタンに滴下して加えた。固体沈殿物を濾過により単離し、減圧下で一晩乾燥させて、２６０ｍｇの標的化合物を白色固体として得た（２６０ｍｇ、収率３２％）。ＬＣＭＳ（ＥＳ＋）実測値：１００２．５ｇ／ｍｏｌ。

【0353】

９．５． （１－シアノ－２－メチルプロパン－２－イル）２－［［ジ（プロパン－２－イル）アミノ］－［ｒａｃ－（２Ｒ，５Ｒ）－２－［［ビス（４－メトキシフェニル）－フェニルメトキシ］メチル］－４－（２－メトキシエトキシ）－５－［２－（２－メチルプロパノイルアミノ）－６－オキソ－１Ｈ－プリン－９－イル］オキソラン－３－イル］オキシホスファニル］アセテート

２－メチル－Ｎ－［６－オキソ－９－［ｒａｃ－（２Ｒ，５Ｒ）－５－［［ビス（４－メトキシフェニル）－フェニルメトキシ］メチル］－４－ヒドロキシ－３－（２－メトキシエトキシ）オキソラン－２－イル］－１Ｈ－プリン－２－イル］プロパンアミド（７００ｍｇ、０．９８ｍｍｏｌ、当量：１）を無水ＤＣＭ（１２．３ｍｌ）に溶解し、次に１－シアノ－２－メチルプロパン－２－イル２－（ビス（ジイソプロピルアミノ）ホスファネイル）アセテート（５４６ｍｇ、１．４７ｍｍｏｌ、当量：１．５）を反応混合物に加えた。反応成分が完全に溶解したら、４，５－ＤＣＩ（９３ｍｇ、０．７９ｍｍｏｌ、当量：０．８）を反応混合物に加えた。次に、反応混合物をアルゴン下、室温で一晩撹拌し、^３１Ｐ ＮＭＲ及びシリカゲルＴＬＣ（酢酸エチルで溶出）によって反応の程度について分析した。ＴＬＣにおけるより速く溶出する生成物へのスポット・ツー・スポット変換によって及び酢酸ホスフィノジアマイトの^３１Ｐ ＮＭＲシグナルの完全な喪失によって、反応の完了を決定した。完了したら、トリエチルアミン（８０ｍｇ、１０９μｌ、０．７９ｍｍｏｌ、当量：０．８）を加えて反応を停止させた。５分後、反応混合物を、ロータリーエバポレータを使用して減圧下で濃縮し、粘稠な油とした。粘稠な油を、最小量の酢酸エチルに再溶解し、酢酸エチルで事前に平衡化したシリカゲルカラムの上部に加えて、生成物を収集した。生成物を含む画分を合わせ、ロータリーエバポレータ上で減圧濃縮して泡状にし、最小量の無水ＤＣＭに再溶解し、急速攪拌している無水ヘプタンに滴下して加えた。固体沈殿物を濾過により単離し、減圧下で一晩乾燥させて、５２０ｍｇの標的化合物を白色固体として得た（５２０ｍｇ、収率４９％）。ＬＣＭＳ（ＥＳ＋）実測値：９８４．５ｇ／ｍｏｌ。

【0354】

９．６． （１－シアノ－２－メチルプロパン－２－イル）２－［［ジ（プロパン－２－イル）アミノ］－［ｒａｃ－（２Ｒ，５Ｒ）－５－（４－ベンズアミド－５－メチル－２－オキソピリミジン－１－イル）－２－［［ビス（４－メトキシフェニル）－フェニルメトキシ］メチル］－４－（２－メトキシエトキシ）オキソラン－３－イル］オキシホスファニル］アセテート

Ｎ－［５－メチル－２－オキソ－１－［ｒａｃ－（２Ｒ，５Ｒ）－５－［［ビス（４－メトキシフェニル）－フェニルメトキシ］メチル］－４－ヒドロキシ－３－（２－メトキシエトキシ）オキソラン－２－イル］ピリミジン－４－イル］ベンズアミド（９５０ｍｇ、１．３２ｍｍｏｌ、当量：１）を無水ＤＣＭ（１６．５ｍｌ）に溶解し、次に１－シアノ－２－メチルプロパン－２－イル２－（ビス（ジイソプロピルアミノ）ホスファネイル）アセテート（７３３ｍｇ、１．９７ｍｍｏｌ、当量：１．５）を反応混合物に加えた。反応成分が完全に溶解したら、４，５－ＤＣＩ（１２４ｍｇ、１．０５ｍｍｏｌ、当量：０．８）を反応混合物に加えた。次に、反応混合物をアルゴン下、室温で一晩撹拌し、^３１Ｐ ＮＭＲ及びシリカゲルＴＬＣ（酢酸エチルで溶出）によって反応の程度について分析した。ＴＬＣにおけるより速く溶出する生成物へのスポット・ツー・スポット変換によって及び酢酸ホスフィノジアマイトの^３１Ｐ ＮＭＲシグナルの完全な喪失によって、反応の完了を決定した。完了したら、トリエチルアミン（１０７ｍｇ、１４７μｌ、１．０５ｍｍｏｌ、当量：０．８）を加えて反応を停止させた。５分後、反応混合物を、ロータリーエバポレータを使用して減圧下で濃縮し、粘稠な油とした。粘稠な油を、最小量の酢酸エチルに再溶解し、８０／２０：酢酸エチル／ヘプタンで事前に平衡化したシリカゲルカラムの上部に加えて、生成物を収集した。生成物を含む画分を合わせ、ロータリーエバポレータ上で減圧濃縮して泡状にし、最小量の無水ＤＣＭに再溶解し、急速攪拌している無水ヘプタンに滴下して加えた。固体沈殿物を濾過により単離し、減圧下で一晩乾燥させて、７２２ｍｇの標的化合物を淡黄色の固体として得た（７２２ｍｇ、収率５５％）。ＬＣＭＳ（ＥＳ＋）実測値：９９２．４ｇ／ｍｏｌ。

【0355】

実施例１０：オリゴヌクレオチド合成
ＢｉｏａｕｔｏｍａｔｉｏｎによるＭｅｒＭａｄｅ１２自動ＤＮＡシンセサイザーを使用して、オリゴヌクレオチドを合成した。合成は、ユニバーサルリンカーを備えた制御された細孔ガラス支持体（５００Å）を使用して１μｍｏｌスケールで実施した。

【0356】

標準的なＤＮＡ及びＬＮＡホスホルアミダイトのカップリングの標準的なサイクル手順において、２３０μＬを３回、１０５秒の適用で、ＣＨ_２Ｃｌ_２中の３％（ｗ／ｖ）ジクロロ酢酸を使用して、ＤＭＴの脱保護を実施した。それぞれのホスホルアミダイトを、アセトニトリル（又は、ＬＮＡ－^ＭｅＣ構成要素ではアセトニトリル／ＣＨ_２Ｃｌ_２ １：１）中、０．１Ｍ溶液９５μＬ及び活性化因子としての５－［３，５－ビス（トリフルオロメチル）フェニル］－２Ｈ－テトラゾールの０．２５Ｍ溶液１１０μＬと３回カップリングし、カップリング時間は１８０秒であった。硫化は、アセトニトリル／ピリジン中、３－アミノ－１，２，４－ジチアゾール－５－チオンの０．１Ｍ溶液を使用して、２００μＬを１回、３分間の適用で実施した。酸化は、ＴＨＦ／ｐｙｒ／Ｈ_２Ｏ：８８／１０／２中、０．０２ＭのＩ_２を使用して、１回、３分間の適用で実施した。キャッピングは、ＴＨＦ／ルチジン／Ａｃ_２Ｏ ８：１：１（ＣａｐＡ、７５μｍｏｌ）及びＴＨＦ／Ｎ－メチルイミダゾール８：２（ＣａｐＢ、７５μｍｏｌ）を使用して、７０秒間実施した。

【0357】

ＭＯＥ ＰＡＣＥを導入するための合成サイクルは、２３０μＬを３回、１０５秒の適用でのＣＨ_２Ｃｌ_２中、３％（ｗ／ｖ）のジクロロ酢酸を使用したＤＭＴの脱保護を含んでいた。新たに調製したＭＯＥ ＰＡＣＥホスホルアミダイトを、アセトニトリル中、０．１Ｍ溶液９５μＬ及び活性化因子としての５－［３，５－ビス（トリフルオロメチル）フェニル］－２Ｈ－テトラゾールの０．２５Ｍ溶液１１０μＬと２回カップリングし、カップリング時間は１５分であった。硫化は、アセトニトリル／ピリジン中、３－アミノ－１，２，４－ジチアゾール－５－チオンの０．１Ｍ溶液を使用して、１回、３分間の適用で実施した。酸化は、ＴＨＦ／ｐｙｒ／Ｈ_２Ｏ：８８／１０／２中、０．０２ＭのＩ_２を使用して、１回、３分間の適用で実施した。キャッピングは、ＴＨＦ／ルチジン／Ａｃ_２Ｏ ８：１：１（ＣａｐＡ、７５μｍｏｌ）及びＴＨＦ／Ｎ－メチルイミダゾール８：２（ＣａｐＢ、７５μｍｏｌ）を使用して、７０秒間実施した。

【0358】

合成後、無水ＣＨ_３ＣＮ中、１．５％のＤＢＵの溶液を注意深くカラムに数回通して、ジメチルシアノエチル保護基を脱保護し、脱保護中の塩基のアルキル化を防いだ。次に、それを室温で６０分間放置した。次に、溶液を捨て、カラムを２－３ｍＬの無水ＣＨ_３ＣＮですすいだ。次に、それをアルゴン流下で乾燥させた。次に、ＣＰＧを４ｍＬのバイアルに注意深く移し、水中、４０％ＭｅＮＨ_２１ｍＬを加え、５５℃で１５分間撹拌したままにした。

【0359】

粗ＤＭＴ－ｏｎオリゴヌクレオチドを、Ｃ１８カラムを使用してＲＰ－ＨＰＬＣで精製し、続いて８０％酢酸水溶液及びエタノール沈殿で又はカートリッジ精製によってＤＭＴを除去した。ＭＯＥ ＰＡＣＥホスホルアミダイトは、バーゼル内で合成した。通常のホスホルアミダイトは、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、並びに固相合成で用いられるすべての試薬から注文した。

【0360】

実施例１１：用量反応曲線のための異なる濃度でのヒトＨｅＬａ細胞におけるＭＡＬＡＴ１ ｍＲＮＡを標的とするオリゴヌクレオチドのｉｎ ｖｉｔｒｏでの効力及び有効性
ＨｅＬａ細胞株はＡＴＣＣから購入し、供給業者による推奨のとおりに、３７℃、５％ＣＯ_２の加湿インキュベーター内で維持した。アッセイでは、３０００細胞／ウェルを培地中の９６マルチウェルプレートに播種した。ＰＢＳに溶解したオリゴヌクレオチドを添加する前に、細胞を２４時間インキュベートした。オリゴヌクレオチドの濃度範囲：最高濃度２５μＭ、８段階で１：１希釈。オリゴヌクレオチドの添加の３日後に、細胞を回収した。ＲＮＡは、製造元の指示に従ってＰｕｒｅＬｉｎｋ Ｐｒｏ ９６ ＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して抽出し、５０μｌの水で溶出した。続いてＲＮＡをＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅフリー水（Ｇｉｂｃｏ）で１０倍に希釈し、９０℃で１分間加熱した。

【0361】

遺伝子発現解析では、Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＴ－ｑＰＣＲを、二重鎖セットアップで、ｑＳｃｒｉｐｔ（商標）ＸＬＴ Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ ＲＴ－ｑＰＣＲ ＴｏｕｇｈＭｉｘ（登録商標）、Ｌｏｗ ＲＯＸ（商標）（Ｑｕａｎｔａｂｉｏ）を使用して実施した。次のＴａｑＭａｎプライマーアッセイをｑＰＣＲに使用した：ＭＡＬＡＴ１、Ｈｓ００２７３９０７＿ｓ１（ＦＡＭ－ＭＧＢ）と、内因性対照のＧＡＰＤＨ。すべてのプライマーセットは、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社から購入した。ＭＡＬＡＴ１ ｍＲＮＡの相対発現レベルは、対照（ＰＢＳ処理細胞）のパーセントとして示されており、ＩＣ_５０値は、ｎ＝２の生物学的複製からのデータにおいてＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ７を使用して決定している。

【0362】

結果が次の表に示されている。

太字のt、a、g、cは、MOE修飾を表している。
(ps) 隣接するヌクレオチド間のホスホロチオエート修飾。
(po) 隣接するヌクレオチド間のホスホロジエステル修飾。
* 隣接するヌクレオチド間のPACEホスホロチオエート修飾。
° 隣接するヌクレオチド間のPACEホスホロジエステル修飾。
A、G、^mC、TはLNAヌクレオチドを表している。
a、g、c、tはDNAヌクレオチドを表している。
他のすべての結合はホスホロチオエートとして調製した。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【配列表】

2022521512000001.app

【手続補正書】

【提出日】2021-11-04

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

式（Ｉ－ａ）の化合物、又はその薬学的に許容される塩：

式中、
Ｒ^２は、メトキシエトキシであり；かつ
Ｒ^４は水素であるか；又は
Ｒ^４及びＲ^２は一緒にＸ－Ｙを形成し；
Ｘは、酸素、硫黄、－ＣＲ^ａＲ^ｂ－、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｃ（Ｒ^ｂ）－、－Ｃ（＝ＣＲ^ａＲ^ｂ）－、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｎ－、－Ｓｉ（Ｒ^ａ）_２－、－ＳＯ_２－、－ＮＲ^ａ－；－Ｏ－ＮＲ^ａ－、－ＮＲ^ａ－Ｏ－、－Ｃ（＝Ｊ）－、Ｓｅ、－Ｏ－ＮＲ^ａ－、－ＮＲ^ａ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－、－Ｎ（Ｒ^ａ）－Ｏ－、又は－Ｏ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－であり；
Ｙは、酸素、硫黄、－（ＣＲ^ａＲ^ｂ）_ｎ－、－ＣＲ^ａＲ^ｂ－Ｏ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｃ（Ｒ^ｂ）－、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｎ－、－Ｓｉ（Ｒ^ａ）_２－、－ＳＯ_２－、－ＮＲ^ａ－、－Ｃ（＝Ｊ）－、Ｓｅ、－Ｏ－ＮＲ^ａ－、－ＮＲ^ａ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－、－Ｎ（Ｒ^ａ）－Ｏ－、又は－Ｏ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－であり；
ただし、－Ｘ－Ｙ－は、－Ｏ－Ｏ－、Ｓｉ（Ｒ^ａ）_２－Ｓｉ（Ｒ^ａ）_２－、－ＳＯ_２－ＳＯ_２－、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｃ（Ｒ^ｂ）－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｃ（Ｒ^ｂ）、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｎ－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｎ－、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｎ－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｃ（Ｒ^ｂ）、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｃ（Ｒ^ｂ）－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｎ－、又は－Ｓｅ－Ｓｅ－ではないことを条件とし；
Ｊは、酸素、硫黄、＝ＣＨ_２又は＝Ｎ（Ｒ^ａ）であり；
Ｒ^ａ及びＲ^ｂは、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、チオヒドロキシル、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルコキシアルキル、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、ヘテロシクリル、アミノ、アルキルアミノ、カルバモイル、アルキルアミノカルボニル、アミノアルキルアミノカルボニル、アルキルアミノアルキルアミノカルボニル、アルキルカルボニルアミノ、カルバミド、アルカノイルオキシ、スルホニル、アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、チオヒドロキシルスルフィドアルキルスルファニル、アリールオキシカルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシカルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、－ＯＣ（＝Ｘ^ａ）Ｒ^ｃ、－ＯＣ（＝Ｘ^ａ）ＮＲ^ｃＲ^ｄ、及び－ＮＲ^ｅＣ（＝Ｘ^ａ）ＮＲ^ｃＲ^ｄから独立して選択され；
又は、２つのジェミナルなＲ^ａ及びＲ^ｂが一緒になって、置換されていてもよいメチレンを形成するか；
又は、２つのジェミナルなＲ^ａ及びＲ^ｂが、それらが結合している炭素原子と一緒になって、－Ｘ－Ｙ－の炭素原子を１つだけ有するシクロアルキル又はハロシクロアルキルを形成し；
ここで、置換アルキル、置換アルケニル、置換アルキニル、置換アルコキシ、及び置換メチレンは、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、ホルミル、ヘテロシクリル（heterocylyl）、アリール、及びヘテロアリールから独立して選択される１から３個の置換基で置換されたアルキル、アルケニル、アルキニル、及びメチレンであり；
Ｘ^ａは、酸素、硫黄、又は－ＮＲ^ｃであり；
Ｒ^ｃ、Ｒ^ｄ及びＲ^ｅは、水素及びアルキルから独立して選択され；
Ｒ^５はヒドロキシル保護基であり；
Ｒ^ｘはシアノアルキル又はアルキルであり；
Ｒ^ｙはジアルキルアミノ又はピロリジニルであり；
Ｎｕは、核酸塩基又は保護された核酸塩基であり；かつ
ｎは、１、２、又は３である。

【請求項2】

式（ＩＩ）の、請求項１に記載の化合物、又はその薬学的に許容される塩：

式中、
Ｘは、酸素、硫黄、－ＣＲ^ａＲ^ｂ－、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｃ（Ｒ^ｂ）－、－Ｃ（＝ＣＲ^ａＲ^ｂ）－、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｎ－、－Ｓｉ（Ｒ^ａ）_２－、－ＳＯ_２－、－ＮＲ^ａ－；－Ｏ－ＮＲ^ａ－、－ＮＲ^ａ－Ｏ－、－Ｃ（＝Ｊ）－、Ｓｅ、－Ｏ－ＮＲ^ａ－、－ＮＲ^ａ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－、－Ｎ（Ｒ^ａ）－Ｏ－、又は－Ｏ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－であり；
Ｙは、酸素、硫黄、－（ＣＲ^ａＲ^ｂ）_ｎ－、－ＣＲ^ａＲ^ｂ－Ｏ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｃ（Ｒ^ｂ）－、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｎ－、－Ｓｉ（Ｒ^ａ）_２－、－ＳＯ_２－、－ＮＲ^ａ－、－Ｃ（＝Ｊ）－、Ｓｅ、－Ｏ－ＮＲ^ａ－、－ＮＲ^ａ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－、－Ｎ（Ｒ^ａ）－Ｏ－、又は－Ｏ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－であり；
ただし、－Ｘ－Ｙ－は、－Ｏ－Ｏ－、Ｓｉ（Ｒ^ａ）_２－Ｓｉ（Ｒ^ａ）_２－、－ＳＯ_２－ＳＯ_２－、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｃ（Ｒ^ｂ）－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｃ（Ｒ^ｂ）、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｎ－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｎ－、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｎ－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｃ（Ｒ^ｂ）、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｃ（Ｒ^ｂ）－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｎ－、又は－Ｓｅ－Ｓｅ－ではないことを条件とし；
Ｊは、酸素、硫黄、＝ＣＨ_２又は＝Ｎ（Ｒ^ａ）であり；
Ｒ^ａ及びＲ^ｂは、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、チオヒドロキシル、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルコキシアルキル、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、ヘテロシクリル、アミノ、アルキルアミノ、カルバモイル、アルキルアミノカルボニル、アミノアルキルアミノカルボニル、アルキルアミノアルキルアミノカルボニル、アルキルカルボニルアミノ、カルバミド、アルカノイルオキシ、スルホニル、アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、チオヒドロキシルスルフィドアルキルスルファニル、アリールオキシカルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシカルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、－ＯＣ（＝Ｘ^ａ）Ｒ^ｃ、－ＯＣ（＝Ｘ^ａ）ＮＲ^ｃＲ^ｄ、及び－ＮＲ^ｅＣ（＝Ｘ^ａ）ＮＲ^ｃＲ^ｄから独立して選択され；
又は、２つのジェミナルなＲ^ａ及びＲ^ｂが一緒になって、置換されていてもよいメチレンを形成するか；
又は、２つのジェミナルなＲ^ａ及びＲ^ｂが、それらが結合している炭素原子と一緒になって、－Ｘ－Ｙ－の炭素原子を１つだけ有するシクロアルキル又はハロシクロアルキルを形成し；
ここで、置換アルキル、置換アルケニル、置換アルキニル、置換アルコキシ、及び置換メチレンは、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、ホルミル、ヘテロシクリル（heterocylyl）、アリール、及びヘテロアリールから独立して選択される１から３個の置換基で置換されたアルキル、アルケニル、アルキニル、及びメチレンであり；
Ｘ^ａは、酸素、硫黄、又は－ＮＲ^ｃであり；
Ｒ^ｃ、Ｒ^ｄ及びＲ^ｅは、水素及びアルキルから独立して選択され；
Ｒ^５はヒドロキシル保護基であり；
Ｒ^ｘはシアノアルキル又はアルキルであり；
Ｒ^ｙはジアルキルアミノ又はピロリジニルであり；
Ｎｕは、核酸塩基又は保護された核酸塩基であり；かつ
ｎは、１、２、又は３である。

【請求項3】

式（ＶＩ）の、請求項１に記載の化合物：

式中、Ｒ^２、Ｒ^５、Ｒ^ｘ、Ｒ^ｙ、及びＮｕは、請求項１に記載のとおりである。

【請求項4】

－Ｘ－Ｙ－が、－ＣＨ_２－Ｏ－、－ＣＨ（ＣＨ_３）－Ｏ－、又は－ＣＨ_２ＣＨ_２－Ｏ－である、請求項１又は２に記載の化合物。

【請求項5】

式（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、又は（ＶＩＩ）の、請求項１～４のいずれか一項に記載の化合物：

式中、Ｒ^５、Ｒ^ｘ、Ｒ^ｙ、及びＮｕは、請求項１に記載のとおりである。

【請求項6】

Ｒ^ｘが２－シアノ－１，１－ジメチル－エチルである、請求項１～５のいずれか一項に記載の化合物。

【請求項7】

Ｒ^ｙがジイソプロピルアミノ又はピロリジニルである、請求項１～６のいずれか一項に記載の化合物。

【請求項8】

Ｒ^ｙがジアルキルアミノである、請求項１～７のいずれか一項に記載の化合物。

【請求項9】

Ｒ^ｙがジイソプロピルアミノである、請求項１～８のいずれか一項に記載の化合物。

【請求項10】

式（Ｖ）又は（ＶＩＩＩ）の、請求項１～８のいずれか一項に記載の化合物：

式中、Ｒ^５及びＮｕは、請求項１に記載のとおりである。

【請求項11】

Ｎｕが、チミン、保護されたチミン、アデノシン、保護されたアデノシン、シトシン、保護されたシトシン、５－メチルシトシン、保護された５－メチルシトシン、グアニン、保護されたグアニン、ウラシル、又は保護されたウラシルである、請求項１～１０のいずれか一項に記載の化合物。

【請求項12】

以下：

から選択される、請求項１～１１のいずれか一項に記載の化合物。

【請求項13】

請求項１～１２のいずれか一項に記載の式（Ｉ－ａ）の化合物の製造方法であって、式（Ｅ）：

の化合物と、式Ｐ（Ｒ^ｙ）_２（ＣＨ_２）ＣＯＯ（Ｒ^ｘ）の化合物との、カップリング剤の存在下での反応を含み、
式中、Ｘ、Ｙ、Ｒ^５、Ｎｕ、Ｒ^ｘ、及びＲ^ｙは、請求項１～１２のいずれか一項に記載されるとおりである、
製造方法。

【請求項14】

式（Ｃ）又は（Ｄ）：

の化合物と、式Ｐ（Ｒ^ｙ）_２（ＣＨ_２）ＣＯＯ（Ｒ^ｘ）の化合物との、カップリング剤の存在下での反応を含み、
式中、Ｘ、Ｙ、Ｒ^５、Ｎｕ、Ｒ^ｘ、及びＲ^ｙは、請求項１～１２のいずれか一項に記載されるとおりである、
請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

カップリング剤が、１Ｈ－テトラゾール、５－エチルチオ－１Ｈ－テトラゾール、２－ベンジルチオテトラゾール、又は４，５－ジシアノイミダゾール（ＤＣＩ）である、請求項１３又は１４に記載の方法。

【請求項16】

オリゴヌクレオチドの製造における、請求項１～１２のいずれか一項に記載の化合物の使用。

【請求項17】

本明細書に記述したとおりの発明。

【手続補正2】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０００５

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0005】

驚くべきことに、本発明による一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは良好な耐容性を示すことが見出された。それらは、少なくとも、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてホスホロチオエートヌクレオシド間結合のみを含む参照オリゴヌクレオチドと同じくらい効力があり、ｉｎ ｖｉｖｏでは、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合のみを含む参照オリゴヌクレオチドよりも効力があった。驚くべきことに、本発明による一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、特に、心臓細胞株（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）において、及び心臓組織（hear tiussue）（ｉｎ ｖｉｖｏ）において効力があった。
[本発明1001]
式（Ｉ－ａ）の化合物、又はその薬学的に許容される塩（alt）：

式中、
Ｒ ² は、アルコキシ、アルコキシアルコキシ、又はアミノであり；かつ
Ｒ ⁴ は水素であるか；又は
Ｒ ⁴ 及びＲ ² は一緒にＸ－Ｙを形成し；
Ｘは、酸素、硫黄、－ＣＲ ^ａ Ｒ ^ｂ －、－Ｃ（Ｒ ^ａ ）＝Ｃ（Ｒ ^ｂ ）－、－Ｃ（＝ＣＲ ^ａ Ｒ ^ｂ ）－、－Ｃ（Ｒ ^ａ ）＝Ｎ－、－Ｓｉ（Ｒ ^ａ ） ₂ －、－ＳＯ ₂ －、－ＮＲ ^ａ －；－Ｏ－ＮＲ ^ａ －、－ＮＲ ^ａ －Ｏ－、－Ｃ（＝Ｊ）－、Ｓｅ、－Ｏ－ＮＲ ^ａ －、－ＮＲ ^ａ －ＣＲ ^ａ Ｒ ^ｂ －、－Ｎ（Ｒ ^ａ ）－Ｏ－、又は－Ｏ－ＣＲ ^ａ Ｒ ^ｂ －であり；
Ｙは、酸素、硫黄、－（ＣＲ ^ａ Ｒ ^ｂ ） _ｎ －、－ＣＲ ^ａ Ｒ ^ｂ －Ｏ－ＣＲ ^ａ Ｒ ^ｂ －、－Ｃ（Ｒ ^ａ ）＝Ｃ（Ｒ ^ｂ ）－、－Ｃ（Ｒ ^ａ ）＝Ｎ－、－Ｓｉ（Ｒ ^ａ ） ₂ －、－ＳＯ ₂ －、－ＮＲ ^ａ －、－Ｃ（＝Ｊ）－、Ｓｅ、－Ｏ－ＮＲ ^ａ －、－ＮＲ ^ａ －ＣＲ ^ａ Ｒ ^ｂ －、－Ｎ（Ｒ ^ａ ）－Ｏ－、又は－Ｏ－ＣＲ ^ａ Ｒ ^ｂ －であり；
ただし、－Ｘ－Ｙ－は、－Ｏ－Ｏ－、Ｓｉ（Ｒ ^ａ ） ₂ －Ｓｉ（Ｒ ^ａ ） ₂ －、－ＳＯ ₂ －ＳＯ ₂ －、－Ｃ（Ｒ ^ａ ）＝Ｃ（Ｒ ^ｂ ）－Ｃ（Ｒ ^ａ ）＝Ｃ（Ｒ ^ｂ ）、－Ｃ（Ｒ ^ａ ）＝Ｎ－Ｃ（Ｒ ^ａ ）＝Ｎ－、－Ｃ（Ｒ ^ａ ）＝Ｎ－Ｃ（Ｒ ^ａ ）＝Ｃ（Ｒ ^ｂ ）、－Ｃ（Ｒ ^ａ ）＝Ｃ（Ｒ ^ｂ ）－Ｃ（Ｒ ^ａ ）＝Ｎ－、又は－Ｓｅ－Ｓｅ－ではないことを条件とし；
Ｊは、酸素、硫黄、＝ＣＨ ₂ 又は＝Ｎ（Ｒ ^ａ ）であり；
Ｒ ^ａ 及びＲ ^ｂ は、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、チオヒドロキシル、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルコキシアルキル、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、ヘテロシクリル、アミノ、アルキルアミノ、カルバモイル、アルキルアミノカルボニル、アミノアルキルアミノカルボニル、アルキルアミノアルキルアミノカルボニル、アルキルカルボニルアミノ、カルバミド、アルカノイルオキシ、スルホニル、アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、チオヒドロキシルスルフィドアルキルスルファニル、アリールオキシカルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシカルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、－ＯＣ（＝Ｘ ^ａ ）Ｒ ^ｃ 、－ＯＣ（＝Ｘ ^ａ ）ＮＲ ^ｃ Ｒ ^ｄ 、及び－ＮＲ ^ｅ Ｃ（＝Ｘ ^ａ ）ＮＲ ^ｃ Ｒ ^ｄ から独立して選択され；
又は、2つのジェミナルなＲ ^ａ 及びＲ ^ｂ が一緒になって、置換されていてもよいメチレンを形成するか；
又は、2つのジェミナルなＲ ^ａ 及びＲ ^ｂ が、それらが結合している炭素原子と一緒になって、－Ｘ－Ｙ－の炭素原子を1つだけ有するシクロアルキル又はハロシクロアルキルを形成し；
ここで、置換アルキル、置換アルケニル、置換アルキニル、置換アルコキシ、及び置換メチレンは、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、ホルミル、ヘテロシクリル（heterocylyl）、アリール、及びヘテロアリールから独立して選択される1から3個の置換基で置換されたアルキル、アルケニル、アルキニル、及びメチレンであり；
Ｘ ^ａ は、酸素、硫黄、又は－ＮＲ ^ｃ であり；
Ｒ ^ｃ 、Ｒ ^ｄ 及びＲ ^ｅ は、水素及びアルキルから独立して選択され；
Ｒ ⁵ はヒドロキシル保護基であり；
Ｒ ^ｘ はシアノアルキル又はアルキルであり；
Ｒ ^ｙ はジアルキルアミノ又はピロリジニルであり；
Ｎｕは、核酸塩基又は保護された核酸塩基であり；かつ
ｎは、1、2、又は3である。
[本発明1002]
式（ＩＩ）の、本発明1001の化合物、又はその薬学的に許容される塩（alt）：

式中、
Ｘは、酸素、硫黄、－ＣＲ ^ａ Ｒ ^ｂ －、－Ｃ（Ｒ ^ａ ）＝Ｃ（Ｒ ^ｂ ）－、－Ｃ（＝ＣＲ ^ａ Ｒ ^ｂ ）－、－Ｃ（Ｒ ^ａ ）＝Ｎ－、－Ｓｉ（Ｒ ^ａ ） ₂ －、－ＳＯ ₂ －、－ＮＲ ^ａ －；－Ｏ－ＮＲ ^ａ －、－ＮＲ ^ａ －Ｏ－、－Ｃ（＝Ｊ）－、Ｓｅ、－Ｏ－ＮＲ ^ａ －、－ＮＲ ^ａ －ＣＲ ^ａ Ｒ ^ｂ －、－Ｎ（Ｒ ^ａ ）－Ｏ－、又は－Ｏ－ＣＲ ^ａ Ｒ ^ｂ －であり；
Ｙは、酸素、硫黄、－（ＣＲ ^ａ Ｒ ^ｂ ） _ｎ －、－ＣＲ ^ａ Ｒ ^ｂ －Ｏ－ＣＲ ^ａ Ｒ ^ｂ －、－Ｃ（Ｒ ^ａ ）＝Ｃ（Ｒ ^ｂ ）－、－Ｃ（Ｒ ^ａ ）＝Ｎ－、－Ｓｉ（Ｒ ^ａ ） ₂ －、－ＳＯ ₂ －、－ＮＲ ^ａ －、－Ｃ（＝Ｊ）－、Ｓｅ、－Ｏ－ＮＲ ^ａ －、－ＮＲ ^ａ －ＣＲ ^ａ Ｒ ^ｂ －、－Ｎ（Ｒ ^ａ ）－Ｏ－、又は－Ｏ－ＣＲ ^ａ Ｒ ^ｂ －であり；
ただし、－Ｘ－Ｙ－は、－Ｏ－Ｏ－、Ｓｉ（Ｒ ^ａ ） ₂ －Ｓｉ（Ｒ ^ａ ） ₂ －、－ＳＯ ₂ －ＳＯ ₂ －、－Ｃ（Ｒ ^ａ ）＝Ｃ（Ｒ ^ｂ ）－Ｃ（Ｒ ^ａ ）＝Ｃ（Ｒ ^ｂ ）、－Ｃ（Ｒ ^ａ ）＝Ｎ－Ｃ（Ｒ ^ａ ）＝Ｎ－、－Ｃ（Ｒ ^ａ ）＝Ｎ－Ｃ（Ｒ ^ａ ）＝Ｃ（Ｒ ^ｂ ）、－Ｃ（Ｒ ^ａ ）＝Ｃ（Ｒ ^ｂ ）－Ｃ（Ｒ ^ａ ）＝Ｎ－、又は－Ｓｅ－Ｓｅ－ではないことを条件とし；
Ｊは、酸素、硫黄、＝ＣＨ ₂ 又は＝Ｎ（Ｒ ^ａ ）であり；
Ｒ ^ａ 及びＲ ^ｂ は、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、チオヒドロキシル、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルコキシアルキル、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、ヘテロシクリル、アミノ、アルキルアミノ、カルバモイル、アルキルアミノカルボニル、アミノアルキルアミノカルボニル、アルキルアミノアルキルアミノカルボニル、アルキルカルボニルアミノ、カルバミド、アルカノイルオキシ、スルホニル、アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、チオヒドロキシルスルフィドアルキルスルファニル、アリールオキシカルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシカルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、－ＯＣ（＝Ｘ ^ａ ）Ｒ ^ｃ 、－ＯＣ（＝Ｘ ^ａ ）ＮＲ ^ｃ Ｒ ^ｄ 、及び－ＮＲ ^ｅ Ｃ（＝Ｘ ^ａ ）ＮＲ ^ｃ Ｒ ^ｄ から独立して選択され；
又は、2つのジェミナルなＲ ^ａ 及びＲ ^ｂ が一緒になって、置換されていてもよいメチレンを形成するか；
又は、2つのジェミナルなＲ ^ａ 及びＲ ^ｂ が、それらが結合している炭素原子と一緒になって、－Ｘ－Ｙ－の炭素原子を1つだけ有するシクロアルキル又はハロシクロアルキルを形成し；
ここで、置換アルキル、置換アルケニル、置換アルキニル、置換アルコキシ、及び置換メチレンは、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、ホルミル、ヘテロシクリル（heterocylyl）、アリール、及びヘテロアリールから独立して選択される1から3個の置換基で置換されたアルキル、アルケニル、アルキニル、及びメチレンであり；
Ｘ ^ａ は、酸素、硫黄、又は－ＮＲ ^ｃ であり；
Ｒ ^ｃ 、Ｒ ^ｄ 及びＲ ^ｅ は、水素及びアルキルから独立して選択され；
Ｒ ⁵ はヒドロキシル保護基であり；
Ｒ ^ｘ はシアノアルキル又はアルキルであり；
Ｒ ^ｙ はジアルキルアミノ又はピロリジニルであり；
Ｎｕは、核酸塩基又は保護された核酸塩基であり；かつ
ｎは、1、2、又は3である。
[本発明1003]
式（ＶＩ）の、本発明1001の化合物：

式中、Ｒ ² 、Ｒ ⁵ 、Ｒ ^ｘ 、Ｒ ^ｙ 、及びＮｕは、本発明1001のとおりである。
[本発明1004]
－Ｘ－Ｙ－が、－ＣＨ ₂ －Ｏ－、－ＣＨ（ＣＨ ₃ ）－Ｏ－、又は－ＣＨ ₂ ＣＨ ₂ －Ｏ－である、本発明1001又は1002の化合物。
[本発明1005]
式（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、又は（ＶＩＩ）の、本発明1001～1004のいずれかの化合物：

式中、Ｒ ⁵ 、Ｒ ^ｘ 、Ｒ ^ｙ 、及びＮｕは、本発明1001のとおりである。
[本発明1006]
Ｒ ^ｘ が2－シアノ－1，1－ジメチル－エチルである、本発明1001～1005のいずれかの化合物。
[本発明1007]
Ｒ ^ｙ がジイソプロピルアミノ又はピロリジニルである、本発明1001～1006のいずれかの化合物。
[本発明1008]
Ｒ ^ｙ がジアルキルアミノである、本発明1001～1007のいずれかの化合物。
[本発明1009]
Ｒ ^ｙ がジイソプロピルアミノである、本発明1001～1008のいずれかの化合物。
[本発明1010]
式（Ｖ）又は（ＶＩＩＩ）の、本発明1001～1008のいずれかの化合物：

式中、Ｒ ⁵ 及びＮｕは、本発明1001のとおりである。
[本発明1011]
Ｎｕが、チミン、保護されたチミン、アデノシン、保護されたアデノシン、シトシン、保護されたシトシン、5－メチルシトシン、保護された5－メチルシトシン、グアニン、保護されたグアニン、ウラシル、又は保護されたウラシルである、本発明1001～1010のいずれかの化合物。
[本発明1012]
以下：

から選択される、本発明1001～1011のいずれかの化合物。
[本発明1013]
本発明1001～1012のいずれかの式（Ｉ－ａ）の化合物の製造方法であって、式（Ｅ）：

の化合物と、式Ｐ（Ｒ ^ｙ ） ₂ （ＣＨ ₂ ）ＣＯＯ（Ｒ ^ｘ ）の化合物との、カップリング剤の存在下での反応を含み、
式中、Ｘ、Ｙ、Ｒ ⁵ 、Ｎｕ、Ｒ ^ｘ 、及びＲ ^ｙ は、本発明1001～1012のいずれかのとおりである、
製造方法。
[本発明1014]
式（Ｃ）又は（Ｄ）：

の化合物と、式Ｐ（Ｒ ^ｙ ） ₂ （ＣＨ ₂ ）ＣＯＯ（Ｒ ^ｘ ）の化合物との、カップリング剤の存在下での反応を含み、
式中、Ｘ、Ｙ、Ｒ ⁵ 、Ｎｕ、Ｒ ^ｘ 、及びＲ ^ｙ は、本発明1001～1012のいずれかのとおりである、
本発明1013の方法。
[本発明1015]
カップリング剤が、1Ｈ－テトラゾール、5－エチルチオ－1Ｈ－テトラゾール、2－ベンジルチオテトラゾール、又は4，5－ジシアノイミダゾール（ＤＣＩ）である、本発明1013又は1014の方法。
[本発明1016]
オリゴヌクレオチドの製造における、本発明1001～1012のいずれかの化合物の使用。
[本発明1017]
本明細書に記述したとおりの発明。

【国際調査報告】