(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-04-08
(54)【発明の名称】ＣＤ４４標的化マルチアームコンジュゲート
(51)【国際特許分類】
A61K 47/60 20170101AFI20220401BHJP
C07K 7/06 20060101ALI20220401BHJP
A61K 47/58 20170101ALI20220401BHJP
A61K 47/59 20170101ALI20220401BHJP
A61K 47/61 20170101ALI20220401BHJP
A61K 47/66 20170101ALI20220401BHJP
A61K 31/4745 20060101ALI20220401BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220401BHJP
C07D 491/22 20060101ALN20220401BHJP
【ＦＩ】
A61K47/60
C07K7/06 ZNA
A61K47/58
A61K47/59
A61K47/61
A61K47/66
A61K31/4745
A61P35/00
C07D491/22
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021549200
(86)(22)【出願日】2020-02-17
(85)【翻訳文提出日】2021-08-19
(86)【国際出願番号】 CN2020075578
(87)【国際公開番号】W WO2020169004
(87)【国際公開日】2020-08-27
(31)【優先権主張番号】201910131331.1
(32)【優先日】2019-02-22
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】516355265
【氏名又は名称】博瑞生物医薬（蘇州）股▲分▼有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＢＲＩＧＨＴＧＥＮＥ ＢＩＯ－ＭＥＤＩＣＡＬ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＣＯ．， ＬＴＤ．
【住所又は居所原語表記】ＢＵＩＬＤＩＮＧ Ｃ２５， ＮＯ．２１８， ＸＩＮＧＨＵ ＳＴＲＥＥＴ， ＢＩＯ－ＢＡＹ， ＳＵＺＨＯＵ ＩＮＤＵＳＴＲＩＡＬ ＰＡＲＫ， ＳＵＺＨＯＵ， ＪＩＡＮＧＳＵ ２１５１２３， ＰＥＯＰＬＥ’Ｓ ＲＥＰＵＢＬＩＣ ＯＦ ＣＨＩＮＡ
(74)【代理人】
【識別番号】100129702
【弁理士】
【氏名又は名称】上村 喜永
(74)【代理人】
【識別番号】100094248
【弁理士】
【氏名又は名称】楠本 高義
(74)【代理人】
【識別番号】100121441
【弁理士】
【氏名又は名称】西村 竜平
(74)【代理人】
【識別番号】100154704
【弁理士】
【氏名又は名称】齊藤 真大
(72)【発明者】
【氏名】袁建棟
(72)【発明者】
【氏名】黄仰青
(72)【発明者】
【氏名】宋云松
【テーマコード（参考）】
4C050
4C076
4C086
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C050AA01
4C050AA07
4C050BB04
4C050CC07
4C050DD02
4C050EE02
4C050FF02
4C050GG03
4C050HH01
4C050HH04
4C076AA95
4C076CC27
4C076CC41
4C076EE09
4C076EE11
4C076EE16
4C076EE23
4C076EE24
4C076EE30
4C076EE41
4C076EE59
4C076FF32
4C076FF34
4C086AA01
4C086AA02
4C086CB22
4C086FA06
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA05
4C086NA14
4C086ZB26
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA15
4H045DA83
4H045EA28
4H045FA51
(57)【要約】
ＣＤ４４を特異的に標的化する能力を有する多分岐薬物コンジュゲートのクラスが開示される。この化合物のクラスは、ＣＤ４４に特異的に結合し、且つＣＤ４４の高発現を有する腫瘍細胞及び組織を標的化し得、それにより、標的組織中のコンジュゲートの濃度が高く、その臨床治療効果が改善され、且つ毒性が低減される。本発明の化合物は、限定はされないが、胃癌、膵癌、小細胞肺癌、結腸癌、乳癌、肺腺癌、肝癌、上咽頭癌、悪性神経膠腫、リンパ腫、腎癌、卵巣癌、頭頸部癌、扁平上皮癌などを含む、ＣＤ４４の高発現を有するあらゆる腫瘍の治療に好適である。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
構造式（Ｉ）：【化48】
【化49】
によって表されるカンプトテシン系薬物であり；及び
Ｔは、ＣＤ４４標的化ポリペプチドである）
の多分岐薬物コンジュゲート又はその薬学的に許容可能な塩。
【請求項2】
請求項１に記載の多分岐薬物コンジュゲート又はその薬学的に許容可能な塩【化50】
【化51】
によって表されるカンプトテシン系薬物であり；及び
Ｔは、ＣＤ４４標的化ポリペプチドである）。
【請求項3】
ＰＯＬＹは、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（メタクリル酸ヒドロキシアルキルアミン）、ポリ（メタクリル酸ヒドロキシアルキル）、ポリ（サッカライド）、ポリ（α－ヒドロキシ酸）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（酢酸ビニル）、ポリホスファジン、ポリオキサゾリン又はポリ（Ｎ－アクリロイルモルホリン）である、請求項１又は２に記載の多分岐薬物コンジュゲート又はその薬学的に許容可能な塩。
【請求項4】
ＰＯＬＹは、【化52】
である、請求項３に記載の多分岐薬物コンジュゲート又はその薬学的に許容可能な塩。
【請求項5】
【化53】
【請求項6】
前記多価リンカーＬは、【化54】
好ましくは、ｌは、５であり、ｍは、３であり、及びｎは、４である）
である、請求項５に記載の多分岐薬物コンジュゲート又はその薬学的に許容可能な塩。
【請求項7】
Ｄは、イリノテカン又はＳＮ３８である、請求項６に記載の多分岐薬物コンジュゲート又はその薬学的に許容可能な塩。
【請求項8】
Ｔは、Ａｃ－ＫＰＳＳＰＰＥＥ－ＮＨ２、Ａｃ－ＮＡＳＡＰＰＥＥ－ＮＨ２、ヒアルロン酸（ＨＡ）、オステオポンチン（ＯＰＮ）、セルグリシン、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、コンドロイチン硫酸Ｃ（ＣＳＣ）、ヘパラン硫酸（ＨＳ）、アンキリン、ガレクチン－３、Ｌ－セレクチン、Ｐ－セレクチン、Ｃ型レクチン又はアドレシンである、請求項１～７のいずれか一項に記載の多分岐薬物コンジュゲート又はその薬学的に許容可能な塩。
【請求項9】
Ｔは、Ａｃ－ＫＰＳＳＰＰＥＥ－ＮＨ２又はＡｃ－ＮＡＳＡＰＰＥＥ－ＮＨ２並びにその置換変異体、付加変異体及び化学修飾誘導体である、請求項１～７のいずれか一項に記載の多分岐薬物コンジュゲート又はその薬学的に許容可能な塩。
【請求項10】
【化55】
【化56】
である、請求項８に記載の多分岐薬物コンジュゲート又はその薬学的に許容可能な塩。
【請求項11】
【化57】
【化58】
【請求項12】
化合物ａ、化合物ｂ、化合物ｃ及び化合物ｄの塩酸塩であって、各分岐鎖は、それぞれ塩酸の１つ又は２つの分子に結合されている、塩酸塩；又は化合物ａ、化合物ｂ、化合物ｃ及び化合物ｄの酢酸塩であって、各分岐鎖は、それぞれ酢酸の１つ又は２つの分子に結合されている、酢酸塩である、請求項１１に記載の多分岐薬物コンジュゲート又はその薬学的に許容可能な塩。
【請求項13】
ＣＤ４４の高発現を有する腫瘍を治療するための薬物の調製における、請求項１～１２のいずれか一項に記載の多分岐薬物コンジュゲートの使用。
【請求項14】
前記ＣＤ４４の高発現を有する腫瘍は、胃癌、膵癌、小細胞肺癌、結腸癌、乳癌、肺腺癌、肝癌、上咽頭癌、悪性神経膠腫、リンパ腫、腎癌、卵巣癌、頭頸部癌及び扁平上皮癌から選択される、請求項１３に記載の使用。
【請求項15】
請求項１～１２のいずれか一項に記載の多分岐薬物コンジュゲート又は薬学的に許容可能な塩と、薬学的に許容可能な賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項16】
ＣＤ４４の高発現を有する腫瘍を治療するための薬物の調製における、請求項１５に記載の組成物の使用。
【請求項17】
前記ＣＤ４４の高発現を有する腫瘍は、胃癌、膵癌、小細胞肺癌、結腸癌、乳癌、肺腺癌、肝癌、上咽頭癌、悪性神経膠腫、リンパ腫、腎癌、卵巣癌、頭頸部癌及び扁平上皮癌から選択される、請求項１６に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、概して、マルチアームターゲティングコンジュゲートに関する。詳細には、本発明は、ＣＤ４４を標的にする分子と抗癌剤とが相乗効果を付与する、マルチアームコンジュゲートに関する。
【背景技術】
【0002】
近年、悪性腫瘍は、死亡率及び罹患率の両方が明らかな上昇傾向を見せており、ヒトの健康にとって深刻な脅威となっている。
【0003】
ＣＤ４４は、広範に分布する様々な分子型の内在性膜糖タンパク質の群であり、細胞外領域と、膜貫通領域と、膜近位領域とを含む。ＣＤ４４は、Ｉ型膜貫通糖タンパク質であり、初めにヒアルロン酸に結合して細胞内シグナル伝達経路を惹起し、次にシェディング、転移及び浸潤を含めた一連の細胞応答を引き起こす。細胞接着分子ファミリーのメンバーであるＣＤ４４は、組織構造の完全性の維持に極めて重要な細胞間及び細胞と細胞外マトリックスとの間の接着及び結合の調節において重要な役割を果たす。ＣＤ４４は、細胞内シグナルを伝達し、乳癌細胞及び結腸直腸癌細胞などの腫瘍細胞の発生、活性等を調節することもできる。現在、多くの研究が明らかにしているところによれば、ＣＤ４４は、腫瘍の発生、発達、浸潤及び転移に密接に関連し、多くの場合に腫瘍発生の初期に発現して、腫瘍の発達に伴って発現の差が大きくなり、及び例えばＣＤ４４が一部の前癌病変で発現する。
【0004】
用語「ＣＤ４４標的化ポリペプチド」は、ＣＤ４４を標的として結合する能力を有するポリペプチドを指す。典型的には、「ＣＤ４４標的化ポリペプチド」は、以下の構造：Ａｃ－ＫＰＳＳＰＰＥＥ－ＮＨ２及びＡｃ－ＮＡＳＡＰＰＥＥ－ＮＨ２を有するポリペプチドを含む。上述の２つのポリペプチドは、ＣＤ４４の連結ドメインの一部と一定の配列相同性を有し、ＣＤ４４を標的として結合する能力を有する。
【0005】
具体的には、Ａｃ－ＫＰＳＳＰＰＥＥ－ＮＨ２の構造を有するポリペプチドはＡ６ポリペプチドとも称され、Ａ６の構造は、以下：
のとおりであり、及びＡｃ－ＮＡＳＡＰＰＥＥ－ＮＨ２の構造を有するポリペプチドは、以下：
のとおりである。
【化1】
【化2】
【0006】
国際公開第２００５０２８５３９号パンフレット、国際公開第２０１００１９２３３号パンフレット、国際公開第２０１１０６３１５６号パンフレット及び国際公開第２０１１０６３１５８号パンフレットは、臨床第３相開発段階にある、主に転移性乳癌に使用されるＮｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓからの薬物ｎｋｔｒ－１０２を開示している。この薬物は、水溶性の多分岐ポリマープロドラッグであり、以下の構造を有して薬物負荷量の向上を実現する。
【化3】
【0007】
この化合物は、マルチアームＰＥＧがイリノテカンに連結していることにより、抗癌効果が影響を受けることなく、水溶性の増加、薬物負荷量の向上、副作用の低下を呈し得る。しかしながら、この薬物には、なおも欠点があり、例えば、これは、ターゲティング能力が低くて特異的癌細胞に作用することができず、また、これは、癌細胞の殺傷時に正常細胞の特性にも影響を及ぼし得るため、比較的高い有害作用発生率につながる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
中国特許出願公開第１０８７２７５８３ Ａ号明細書は、マルチアームのポリマー修飾されたターゲティング抗癌コンジュゲートを開示しており、これは、高い負荷能力を呈する化合物のクラスであり、且つターゲティング能力を有するため、標的組織中のコンジュゲート濃度が高くなる。しかしながら、悪性腫瘍細胞の構造、機能及び代謝が異常であることに起因して、そうした細胞は、無秩序な方法で無限に分裂及び増殖することができ、従って除去が極めて困難である。従って、医薬品研究開発では、より良好な治療効果を有する抗癌薬を引き続き開発する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明は、ターゲティング多分岐薬物コンジュゲートを開示し、このコンジュゲートは、３つ以上の分岐鎖を有し、以下の式：
（式中、Ｒは、有機コアであり、ＰＯＬＹは、ポリマーであり、Ｌは、多価リンカーであり、Ｔは、ターゲティング分子であり、Ｄは、活性薬剤であり、及びｑは、３～８の任意の整数である）
によって表され得る。
【化4】
によって表され得る。
【0010】
有機コア、「Ｒ」
構造式（Ｉ）において、「Ｒ」は、１～１００個の原子を有する有機コア基である。好ましくは、Ｒは、３～５０個の原子を含有し、より好ましくは、Ｒは、約３～３０個の原子を含有する。Ｒは、全ての原子が炭素原子であるコア基であり得るか、又は使用される具体的な中心分子に応じて、Ｏ、Ｓ、Ｎ及びＰなど、１個以上のヘテロ原子を選択的に含有し得る。Ｒは、直鎖、分枝又は環状コア基であり得、少なくとも３つの独立したポリマー分岐鎖を有する。構造式（Ｉ）において、「ｑ」は、「Ｒ」のポリマー分岐鎖の数に対応する数である。
構造式（Ｉ）において、「Ｒ」は、１～１００個の原子を有する有機コア基である。好ましくは、Ｒは、３～５０個の原子を含有し、より好ましくは、Ｒは、約３～３０個の原子を含有する。Ｒは、全ての原子が炭素原子であるコア基であり得るか、又は使用される具体的な中心分子に応じて、Ｏ、Ｓ、Ｎ及びＰなど、１個以上のヘテロ原子を選択的に含有し得る。Ｒは、直鎖、分枝又は環状コア基であり得、少なくとも３つの独立したポリマー分岐鎖を有する。構造式（Ｉ）において、「ｑ」は、「Ｒ」のポリマー分岐鎖の数に対応する数である。
【0011】
一部の詳細な実施形態において、「Ｒ」は、３つのポリマー分岐鎖を有し、「Ｒ」は、好ましくは、
である。
【化5】
【0012】
一部の詳細な実施形態において、「Ｒ」は、４つのポリマー分岐鎖を有し、「Ｒ」は、好ましくは、
である。
【化6】
【0013】
一部の詳細な実施形態において、「Ｒ」は、６つのポリマー分岐鎖を有し、「Ｒ」は、好ましくは、
である。
【化7】
【0014】
一部の詳細な実施形態において、「Ｒ」は、８つのポリマー分岐鎖を有し、「Ｒ」は、好ましくは、
である。
【化8】
【0015】
ポリマー、「ＰＯＬＹ」
構造式（Ｉ）において、「ＰＯＬＹ」は、ポリマー、好ましくは水溶性ポリマーであり、本発明のコンジュゲートの形成には、任意の水溶性ポリマーを使用することができる。本発明のポリマーは、任意の幾何学的形状又は形態であり得る。代表的なポリマーとしては、限定はされないが、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（メタクリル酸ヒドロキシアルキルアミン）、ポリ（メタクリル酸ヒドロキシアルキル）、ポリ（サッカライド）、ポリ（α－ヒドロキシ酸）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（酢酸ビニル）、ポリホスファジン、ポリオキサゾリン及びポリ（Ｎ－アクリロイルモルホリン）が挙げられる。
構造式（Ｉ）において、「ＰＯＬＹ」は、ポリマー、好ましくは水溶性ポリマーであり、本発明のコンジュゲートの形成には、任意の水溶性ポリマーを使用することができる。本発明のポリマーは、任意の幾何学的形状又は形態であり得る。代表的なポリマーとしては、限定はされないが、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（メタクリル酸ヒドロキシアルキルアミン）、ポリ（メタクリル酸ヒドロキシアルキル）、ポリ（サッカライド）、ポリ（α－ヒドロキシ酸）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（酢酸ビニル）、ポリホスファジン、ポリオキサゾリン及びポリ（Ｎ－アクリロイルモルホリン）が挙げられる。
【0016】
典型的な化合物において、「ＰＯＬＹ」は、ポリエチレングリコールであり、これは、線状、分岐状及びフォーク状の形状又は形態を含む任意の幾何学的形状又は形態であり得；好ましくは、本発明の好ましい「ＰＯＬＹ」は、線状ポリエチレングリコールであり、これは、典型的には、以下のとおりの構造を有する：
は、原子間の結合を表し、及び「＆」を付された酸素原子は、有機コア「Ｒ」に結合された原子であり、ｋは、約５～５００、最も好ましくは５０～２００、好ましくは１０１～１２５の範囲であり、より好ましくは、ｋは、１１３である）。ポリマーの分野では、ｋは、ポリマーの重合度、即ちポリマーの分子量に応じてポリマーの高分子鎖に含まれる繰り返し単位の平均数を表すことが当業者に公知のはずである。例えば、ｋが１１３であるとき、高分子鎖に含まれる繰り返し単位の平均数は、１１３である。ポリマーの高分子鎖に含まれる繰り返し単位の平均数が１１３であるとき、ポリマーの分子鎖は、実際には異なる数の繰り返し単位を含み得る。例えば、ポリマーの異なる分子鎖は、実際には例えば１００～１３０個の繰り返し単位を含み得る。
【化9】
【0017】
ｒは、１～１０の任意の整数であり；より好ましくは、本発明の「ＰＯＬＹ」は、
である。
【化10】
【0018】
本発明のＰＯＬＹは、
等でもあり得る。
【化11】
【0019】
本発明の詳細な実施形態において、「Ｒ」は、５個の炭素原子を有する有機コア基であり、各分岐鎖が線状ポリエチレングリコール連結アームを含む４つのポリマー分岐鎖に結合され得る。
【0020】
構造式（Ｉ）の多分岐薬物コンジュゲートの詳細な調製では、所要のマルチアームポリマー、即ちｑ本のポリマーアームに結合するＲ
は、予め調製又は購入することができる。
【化12】
【0021】
詳細な実施形態において、マルチアームポリマー
は、３アームＰＥＧ２０Ｋ－ＳＣＭ、４アームＰＥＧ２０Ｋ－ＳＣＭ又は８アームＰＥＧ２０Ｋ－ＳＣＭであり得、ここで、
は、好ましくは、約２０ｋＤａの分子量を有する。表現「約２０ｋＤａ」は、２００００±２０００の間の分子量を指す。
【化13】
【化14】
【0022】
本発明の例で使用される４アーム－ＰＥＧ２０Ｋ－ＳＣＭは、以下のとおりの構造を有する。
【化15】
【0023】
本発明の好ましい実施形態において、「ＰＯＬＹ」は、線状ポリエチレングリコール連結アームであり、即ち、本発明のコンジュゲートは、好ましくは、以下のとおりの化合物である。
【化16】
【0024】
本発明において、多価リンカーＬは、好ましくは、
であり、式中、記号「＊」は、多価リンカーＬのターゲティング分子Ｔへの結合点を表し；「＃」は、多価リンカーＬの活性薬剤Ｄへの結合点を表し；及び「％」は、多価リンカーＬのＰＯＬＹへの結合点を表し、ｍは、１～２０の任意の整数であり、且つｌ及びｎは、独立に、１～１０の任意の整数である。最も好ましくは、ｌは、５であり、ｍは、３であり、及びｎは、４であり、即ち、本発明の好ましい多価リンカーＬは、
である。
【化17】
【化18】
【0025】
Ｄは、以下の式：
によって表されるカンプトテシン系薬物である。Ｒ１～Ｒ５は、互いに独立に、以下の基：水素、ハロゲン、アシル、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヒドロキシ、シアノ、ニトロ、アジド、アミド、ヒドラジン、アミン、置換アミン、ヒドロキシカルボニル、アルコキシカルボニル、アルコキシカルボニルオキシ、任意選択で置換されたカルバモイルオキシ、アリールスルホニルオキシ、アルキルスルホニルオキシ及びＲ９Ｃ（Ｏ）Ｏ－（ここで、Ｒ９は、ハロゲン、アミノ、置換アミノ、ヘテロ環又は置換ヘテロ環である）から選択され；Ｒ６は、Ｈ又はＯＲ８であり；Ｒ８は、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、ハロアルキル又はヒドロキシアルキルであり；Ｒ７は、ヒドロキシ、アミノ又はチオールである。
【化19】
【0026】
ヘテロ環は、好ましくは、含窒素ヘテロ環、より好ましくは５～６員含窒素ヘテロ環である。置換基を有する上述の基に関して、その置換基は、ヒドロキシ、シアノ、Ｃ１～Ｃ５直鎖又は分枝アルキル、Ｃ３～Ｃ７シクロアルキル、Ｃ１～Ｃ５直鎖又は分枝アルコキシ、５～６員環ヘテロシクリル、５～１２員環アリール又は５～１２員環ヘテロアリールから選択され得、好ましくは、５～１２員環ヘテロアリール及び５～６員環ヘテロシクリルのヘテロ原子は、窒素原子である。ヘテロ環は、例えば、ピロール、ピペリジン等であり得、５～６員環ヘテロシクリルは、例えば、ピロリル又はピペリジニルであり得；アリールは、フェニル、ナフチル、ビフェニル及びその類似体を含む。
【0027】
加えて、置換カルバモイルオキシに関して、その置換基は、それが結合するＮ原子と一緒になって６員環を形成することもでき、この６員環も上述の置換基を有することができる。
【0028】
好ましくは、Ｄは、イリノテカン又はＳＮ３８である。
【0029】
イリノテカンは、以下のとおりの構造を有する。
【化20】
【0030】
ＳＮ３８は、以下のとおり構造を有する。
【化21】
【0031】
Ｔは、ターゲティング分子であり、これは、ＣＤ４４への結合能を有する「ＣＤ４４標的化ポリペプチド」である。典型的には、「ＣＤ４４標的化ポリペプチド」は、以下の配列を有するポリペプチドを含む：
Ａｃ－ＫＰＳＳＰＰＥＥ－ＮＨ２；Ａｃ－ＮＡＳＡＰＰＥＥ－ＮＨ２；ＱＥＴＷＦＱＮＧＷＱＧＫＮＰ；ＫＥＫＷＦＥＮＥＷＱＧＫＮＰ；ＫＥＱＷＦＧＮＲＷＨＥＧＹＲ；及びＱＩＲＱＱＰＲＤＰＰＴＥＴＬＥＬＥＶＳＰＤＰＡＳ。
Ａｃ－ＫＰＳＳＰＰＥＥ－ＮＨ２；Ａｃ－ＮＡＳＡＰＰＥＥ－ＮＨ２；ＱＥＴＷＦＱＮＧＷＱＧＫＮＰ；ＫＥＫＷＦＥＮＥＷＱＧＫＮＰ；ＫＥＱＷＦＧＮＲＷＨＥＧＹＲ；及びＱＩＲＱＱＰＲＤＰＰＴＥＴＬＥＬＥＶＳＰＤＰＡＳ。
【0032】
上述のポリペプチドの置換変異体、付加変異体及び化学修飾誘導体も含まれる。
【0033】
Ｔは、国際公開第９９／０５２６３号パンフレットに開示されるポリペプチド、即ち以下の配列：Ｌｙｓ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ（ＫＰＳＳＰＰＥＥ）及びＡｓｎ－Ａｌａ－Ｓｅｒ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ（ＮＡＳＡＰＰＥＥ）を有するポリペプチド又はその置換変異体、付加変異体及び化学修飾誘導体でもあり得る。加えて、Ｔは、国際公開第２００７１４１５３３号パンフレットに開示されるＦＫＢＰ－Ｌポリペプチドであり得る。
【0034】
ターゲティング分子Ｔは、ＣＤ４４への結合能を有するモノクローナル抗体又はその天然リガンドでもあり得る。ＣＤ４４への結合能を有する天然リガンドとしては、限定はされないが、ヒアルロン酸（ＨＡ）、オステオポンチン（ＯＰＮ）、セルグリシン、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、コンドロイチン硫酸Ｃ（ＣＳＣ）、ヘパラン硫酸（ＨＳ）、アンキリン、ガレクチン－３、Ｌ－セレクチン、Ｐ－セレクチン、Ｃ型レクチン及びアドレシンが挙げられる。
【0035】
本発明のターゲティング分子Ｔは、好ましくは、Ａｃ－ＫＰＳＳＰＰＥＥ－ＮＨ２又はＡｃ－ＮＡＳＡＰＰＥＥ－ＮＨ２－であり、これらの２つのポリペプチドは、末端基のＮＨ２端を介して多価リンカーＬに連結される。
【0036】
本発明の詳細な実施形態において、構造式（Ｉ）の多分岐薬物コンジュゲートは、以下のとおりの化合物Ａ、化合物Ｂ、化合物Ｃ及び化合物Ｄ：
（式中、化合物Ａ、化合物Ｂ、化合物Ｃ及び化合物Ｄの分子構造中の各ｋは、独立に、１０１～１２５であり、好ましくは、各ｋは、独立に、１１３である）
を含む。
【化22】
【化23】
を含む。
【0037】
本発明の詳細な実施形態において、構造式（Ｉ）の多分岐薬物コンジュゲートは、
（化合物ａにおいて、Ｄは、イリノテカンであり、及びＴは、Ａ６、即ちＡｃ－ＫＰＳＳＰＰＥＥ－ＮＨ２である）；
（化合物ｂにおいて、Ｄは、イリノテカンであり、及びＴは、Ａｃ－ＮＡＳＡＰＰＥＥ－ＮＨ２である）；
（化合物ｃにおいて、Ｄは、ＳＮ３８であり、及びＴは、Ａ６、即ちＡｃ－ＫＰＳＳＰＰＥＥ－ＮＨ２である）；
（化合物ｄにおいて、Ｄは、ＳＮ３８であり、及びＴは、Ａｃ－ＮＡＳＡＰＰＥＥ－ＮＨ２である）
である。
【化24】
【化25】
【化26】
【化27】
である。
【0038】
本発明のある実施形態において、構造式（Ｉ）の多分岐薬物コンジュゲート又はその薬学的に許容可能な塩を調製する方法は、
活性薬剤Ｄを多価リンカーＬに連結してＤ－Ｌ部分を得ること；
Ｄ－Ｌ部分をマルチアームポリマー
に連結して、
を得ること；及び
をターゲティング分子Ｔに連結すること
を含む。
活性薬剤Ｄを多価リンカーＬに連結してＤ－Ｌ部分を得ること；
Ｄ－Ｌ部分をマルチアームポリマー
【化28】
【化29】
【化30】
を含む。
【0039】
本発明は、マルチアームポリマーで修飾されたターゲティング抗癌コンジュゲートに関し、ここで、水溶性ポリマーによる修飾は、コンジュゲートの水溶性を増強し、従って薬物負荷量を増加させることができ；及びターゲティング分子は、ターゲティング能力が向上するため、標的組織中のコンジュゲートの濃度が高くなり；Ｌは、第一にターゲティング分子を抗癌薬に連結し、次にターゲティング分子及び抗癌薬をポリマーアームに連結する機能を有する任意の連結リンカーであるため、コンジュゲート全体が有機的統一体を形成することになる。本発明のコンジュゲートは、典型的には、プロドラッグであり、活性薬剤Ｄは、加水分解又は酵素性分解によって親から放出及び分離されて、生理学的活性を発揮する。非コンジュゲート化薬物と比較すると、本発明のコンジュゲートは、一層強力な効果を示し、ヒト又は他の動物の体内で一層高濃度化する。
【0040】
本発明のコンジュゲートの薬学的に許容可能な塩は、無機塩類及び有機塩類を含み、典型的には硝酸塩、硫酸塩、リン酸塩、フッ化水素塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、ギ酸塩、乳酸塩、安息香酸塩、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、ジクロロ酢酸塩、トリクロロ酢酸塩、混合クロロフルオロ酢酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩、スルホン酸塩、メシル酸塩、トリフルオロメシル酸塩、ヘプタンスルホン酸塩等、好ましくは塩酸塩及び酢酸塩を含み、ここで、これらの塩は、医薬品化学の分野における従来手段により調製することができる。
【0041】
本発明の詳細な実施形態において、化合物Ａ、化合物Ｂ、化合物Ｃ及び化合物Ｄの塩は、典型的には、塩酸塩及び酢酸塩を含み、ここで、塩酸塩は、典型的には、各分岐鎖がそれぞれ塩酸の１つ又は２つの分子に結合されている、塩酸塩であり、酢酸塩は、典型的には、各分岐鎖がそれぞれ酢酸の１つ又は２つの分子に結合されている、酢酸塩である。
【0042】
化合物ａ、化合物ｂ、化合物ｃ及び化合物ｄの塩酸塩は、典型的には、各分岐鎖がそれぞれ塩酸の１つ又は２つの分子に結合されている、塩酸塩であり、このコンジュゲートは、好ましくは、４つ又は８つの分子を含む塩酸塩である。
【0043】
化合物ａ、化合物ｂ、化合物ｃ及び化合物ｄの酢酸塩は、典型的には、各分岐鎖がそれぞれ酢酸の１つ又は２つの分子に結合されている、酢酸塩であり、このコンジュゲートは、好ましくは、４つ又は８つの分子を含む酢酸塩である。
【0044】
本発明の化合物は、ＣＤ４４への特異的結合能を有し、且つＣＤ４４の高発現を有する腫瘍細胞及び組織を標的とし得、それにより、標的組織中のコンジュゲートの濃度が高く、その臨床治療効果が改善され、且つ毒性が低減される。
【0045】
本発明の化合物は、限定はされないが、胃癌、膵癌、小細胞肺癌、結腸癌、乳癌、肺腺癌、肝癌、上咽頭癌、悪性神経膠腫、リンパ腫、腎癌、卵巣癌、頭頸部癌、扁平上皮癌などを含む、ＣＤ４４の高発現を有するあらゆる腫瘍の治療に好適である。
【0046】
本発明は、ＣＤ４４の高発現を有する腫瘍を治療する方法も提供し、この方法は、ＣＤ４４の高発現を有する腫瘍に罹患している哺乳類に、治療有効量の、本発明によって提供される構造式（Ｉ）の多分岐薬物コンジュゲート又はその薬学的に許容可能な塩を投与することを含み、ここで、哺乳類は、ヒトを含む。
【0047】
本発明は、ＣＤ４４の高発現を有する腫瘍を治療する方法も提供し、この方法は、ＣＤ４４の高発現を有する腫瘍に罹患している哺乳類に治療有効量の医薬組成物を投与することを含み、ここで、哺乳類は、ヒトを含み、及びこの医薬組成物は、構造式（Ｉ）の多分岐薬物コンジュゲート又はその薬学的に許容可能な塩と、薬学的に許容可能な賦形剤とを含む。
【発明を実施するための形態】
【0048】
本発明を以下に詳細に記載する。しかしながら、本発明は、多くの異なる形態で特別に具体化され得、本明細書に記載される例に限定されるべきでなく、これらの例は、本開示をより完全で徹底したものとするために提供される。使用される試薬及び原材料は、その調製方法が提供されるものを除いて、市販のものである。４アームＰＥＧ２０Ｋ－ＳＣＭは、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｊｅｎｋｅｍ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入され、分子量が約２０ｋＤａである。特に定義しない限り、本明細書における全ての科学技術用語は、特許請求の範囲の主題が関係する技術分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。
【0049】
４アーム－ＰＥＧ２０Ｋ－ＳＣＭは、以下のとおりの構造を有する。
【化31】
【0050】
【表1】
【実施例】
【0051】
実施例１
１．ＢＰ１０３ａの調製
２５０ｍｌ三つ口フラスコに１８．２０ｇの化合物ＢＰ１０３ａ０５及び１００ｍｌのＥＡを加え；この化合物を撹拌しながら溶解させて、次に混合物を０℃に冷却し；１５０ｍｌのＨＣｌ／ＥＡ（３．５Ｍ）を加え、温度を０℃に維持し；ＴＬＣにより反応が完了したことが検出された後、反応液を濃縮乾固し、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルを加えることによりスラリー化してろ過し；及びろ過ケーキをＴＢＭＥで洗浄し、真空乾燥させて、１０．４０ｇのＢＰ１０３ａを白色固体として得た。
【化32】
２５０ｍｌ三つ口フラスコに１８．２０ｇの化合物ＢＰ１０３ａ０５及び１００ｍｌのＥＡを加え；この化合物を撹拌しながら溶解させて、次に混合物を０℃に冷却し；１５０ｍｌのＨＣｌ／ＥＡ（３．５Ｍ）を加え、温度を０℃に維持し；ＴＬＣにより反応が完了したことが検出された後、反応液を濃縮乾固し、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルを加えることによりスラリー化してろ過し；及びろ過ケーキをＴＢＭＥで洗浄し、真空乾燥させて、１０．４０ｇのＢＰ１０３ａを白色固体として得た。
【0052】
２．ＢＰ１０３ａ０７の調製
１００ｍＬフラスコに３．００ｇのＢＰ１０３ａ（１．０当量）、４．０２ｇ（１．０当量）のＢＰ１０２ｃ０７、４０ｍｌのＤＣＭ及び４．０ｍｌのＤＩＥＡ（２．０当量）を加え、この混合物を室温で撹拌し；ＴＬＣにより反応が完了したことが検出された後、有機溶媒を蒸発除去し；及び残渣をカラムクロマトグラフィーに供して６．４ｇのＢＰ１０３ａ０７を油として得た。
１００ｍＬフラスコに３．００ｇのＢＰ１０３ａ（１．０当量）、４．０２ｇ（１．０当量）のＢＰ１０２ｃ０７、４０ｍｌのＤＣＭ及び４．０ｍｌのＤＩＥＡ（２．０当量）を加え、この混合物を室温で撹拌し；ＴＬＣにより反応が完了したことが検出された後、有機溶媒を蒸発除去し；及び残渣をカラムクロマトグラフィーに供して６．４ｇのＢＰ１０３ａ０７を油として得た。
【0053】
３．ＢＰ１０３ａ０８の調製
２００ｍｌ三つ口フラスコに９．００ｇのＢＰ１０３ａ０７（１．０当量）、３．９６ｇのＨＯＳＵ（１．５３当量）、９０ｍｌのＤＣＭ及び６．６０ｇのＥＤＣ・ＨＣｌ（１．５３当量）を加え、室温で２時間反応させ；及びＴＬＣにより反応が完了したことが検出された後、混合物をＤＣＭで希釈し、次に５０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸二水素カリウム水溶液で２回洗浄し、飽和ブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して、５．９３ｇのＢＰ１０３ａ０８を無色の油として得た。
２００ｍｌ三つ口フラスコに９．００ｇのＢＰ１０３ａ０７（１．０当量）、３．９６ｇのＨＯＳＵ（１．５３当量）、９０ｍｌのＤＣＭ及び６．６０ｇのＥＤＣ・ＨＣｌ（１．５３当量）を加え、室温で２時間反応させ；及びＴＬＣにより反応が完了したことが検出された後、混合物をＤＣＭで希釈し、次に５０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸二水素カリウム水溶液で２回洗浄し、飽和ブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して、５．９３ｇのＢＰ１０３ａ０８を無色の油として得た。
【0054】
４．ＢＰ１０３ａ３０の調製
２００ｍＬフラスコに２．９３ｇの化合物ＮＨ２－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯＨ・ＨＣｌ（１．０当量）、６０ｍｌの水及び２．００ｇのＮａＨＣＯ３（２．０当量）を加え；６０ｍｌのＤＭＥ中５．９１ｇのＢＰ１０３ａ０８（１．０当量）の溶液を撹拌しながら滴下して加え；６０ｍｌのＴＨＦを補足し；この混合物を一晩撹拌し；ＴＬＣにより反応が完了したことが検出された後、有機溶媒を蒸発除去し；及び残渣を希塩酸でｐＨ≒３に調整し、ＥＡで抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して、４．５０ｇのＢＰ１０３ａ３０を無色の油として得た。
２００ｍＬフラスコに２．９３ｇの化合物ＮＨ２－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯＨ・ＨＣｌ（１．０当量）、６０ｍｌの水及び２．００ｇのＮａＨＣＯ３（２．０当量）を加え；６０ｍｌのＤＭＥ中５．９１ｇのＢＰ１０３ａ０８（１．０当量）の溶液を撹拌しながら滴下して加え；６０ｍｌのＴＨＦを補足し；この混合物を一晩撹拌し；ＴＬＣにより反応が完了したことが検出された後、有機溶媒を蒸発除去し；及び残渣を希塩酸でｐＨ≒３に調整し、ＥＡで抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して、４．５０ｇのＢＰ１０３ａ３０を無色の油として得た。
【0055】
５．ＢＰ１０３ａ３１の調製
１００ｍｌ三つ口フラスコに５．００ｇのＢＰ１０３ａ３０（１．０当量）、１．４０ｇのＨＯＳＵ（１．５３当量）、５０ｍｌのＤＣＭ及び２．３３ｇのＥＤＣ・ＨＣｌ（１．５３当量）を加え、室温で２時間反応させ；及びＴＬＣにより反応が完了したことが検出された後、混合物をＤＣＭで希釈し、次に５０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸二水素カリウム水溶液で２回洗浄し、飽和ブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して、４．８９ｇのＢＰ１０３ａ３１を無色の油として得た。
１００ｍｌ三つ口フラスコに５．００ｇのＢＰ１０３ａ３０（１．０当量）、１．４０ｇのＨＯＳＵ（１．５３当量）、５０ｍｌのＤＣＭ及び２．３３ｇのＥＤＣ・ＨＣｌ（１．５３当量）を加え、室温で２時間反応させ；及びＴＬＣにより反応が完了したことが検出された後、混合物をＤＣＭで希釈し、次に５０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸二水素カリウム水溶液で２回洗浄し、飽和ブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して、４．８９ｇのＢＰ１０３ａ３１を無色の油として得た。
【0056】
実施例２ 中間体Ａｃ－ＫＰＳＳＰＰＥＥＣ－ＮＨ２の合成
当業者に周知のＦｍｏｃ固相合成法を用いてＡｃ－ＫＰＳＳＰＰＥＥＣ－ＮＨ２を合成し；Ｆｍｏｃは、Ｒｉｎｋアミド樹脂及び２０％のピペリジン／ＤＭＦを使用することにより除去し；カップリング試薬としてＨＯＢＴ／ＤＩＣを使用し、反応溶媒としてＤＭＦを使用し；反応は、ニンヒドリン検出法によりモニタし；以下の保護されているアミノ酸を樹脂に順次カップリングし：Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｐｒｏ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｐｒｏ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｐｒｏ－ＯＨ及びＦｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯＨ；得られた生成物を無水酢酸及びピリジンでアセチル化し、次にＤＭＦ、メタノール及びＤＣＭで洗浄し、乾燥させ；溶解試薬（ＴＦＡ：チオアニソール：フェノール：ＴＩＳ＝８５：５：５：５）を加え；２時間反応させた後、氷冷ＴＢＭＥを用いて混合物を沈殿させて遠心すると、粗製Ａｃ－ＫＰＳＳＰＰＥＥＣ－ＮＨ２が得られ、これを分取ＨＰＬＣにより精製し、次に凍結乾燥させて、純粋な生成物を得た。
【化33】
【0057】
実施例３ 中間体Ａｃ－ＮＡＳＡＰＰＥＥＣ－ＮＨ２の合成
当業者に周知のＦｍｏｃ固相合成法を用いてＡｃ－ＮＡＳＡＰＰＥＥＣ－ＮＨ２を合成し；Ｆｍｏｃは、Ｒｉｎｋアミド樹脂及び２０％のピペリジン／ＤＭＦを使用することにより除去し；カップリング試薬としてＨＯＢＴ／ＤＩＣを使用し、反応溶媒としてＤＭＦを使用し；反応は、ニンヒドリン検出法によりモニタし；以下の保護されているアミノ酸を樹脂に順次カップリングし：Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｐｒｏ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｐｒｏ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｌａ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｌａ－ＯＨ及びＦｍｏｃ－Ａｓｎ（Ｔｒｔ）－ＯＨ；得られた生成物を無水酢酸及びピリジンでアセチル化し、次にＤＭＦ、メタノール及びＤＣＭで洗浄し、乾燥させ；溶解試薬（ＴＦＡ：チオアニソール：フェノール：ＴＩＳ＝８５：５：５：５）を加え；２時間反応させた後、氷冷ＴＢＭＥを用いて混合物を沈殿させて遠心すると、粗製Ａｃ－ＮＡＳＡＰＰＥＥＣ－ＮＨ２が得られ、これを分取ＨＰＬＣにより精製し、次に凍結乾燥させて、純粋な生成物を得た。
【化34】
【0058】
実施例４
１．ＢＰ１４３ｂ０２の調製
２５０ｍＬ丸底フラスコに３．５０ｇの塩酸イリノテカン三水和物（１．０当量）及び５２．５ｍｌのＤＭＦを加え、６０℃に加熱してそれを溶解させ；５～１０分後、ＤＭＦを減圧下で蒸発除去し；３００ｍｌのｎ－ヘプタンを加え、混合物を減圧下で３回蒸留し、ロータリーエバポレーターにかけ；次に、１０５ｍｌのＤＣＭ、１．０８ｇのＢｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ（１．２当量）及び６３ｍｇのＤＭＡＰ（０．１当量）を加え；１０ｍｌのＤＣＭ中１．５９ｇのＤＣＣ（１．５当量）の溶液を滴下して加え、混合物を２０℃で４時間反応させ；ＴＬＣにより反応が完了したことが検出された後、混合物をろ過し、元の容積の２５％に濃縮し、１２０ｍｌのＩＰＡを加え；溶媒の７５％を蒸発除去し；及び１５０ｍｌのｎ－ヘプタンを加え、混合物を室温で１時間撹拌し、ろ過し、ｎ－ヘプタンで２回洗浄し、乾燥させて、４．０２ｇのＢＰ１４３ｂ０２を淡黄色固体として得た。
【化35】
２５０ｍＬ丸底フラスコに３．５０ｇの塩酸イリノテカン三水和物（１．０当量）及び５２．５ｍｌのＤＭＦを加え、６０℃に加熱してそれを溶解させ；５～１０分後、ＤＭＦを減圧下で蒸発除去し；３００ｍｌのｎ－ヘプタンを加え、混合物を減圧下で３回蒸留し、ロータリーエバポレーターにかけ；次に、１０５ｍｌのＤＣＭ、１．０８ｇのＢｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ（１．２当量）及び６３ｍｇのＤＭＡＰ（０．１当量）を加え；１０ｍｌのＤＣＭ中１．５９ｇのＤＣＣ（１．５当量）の溶液を滴下して加え、混合物を２０℃で４時間反応させ；ＴＬＣにより反応が完了したことが検出された後、混合物をろ過し、元の容積の２５％に濃縮し、１２０ｍｌのＩＰＡを加え；溶媒の７５％を蒸発除去し；及び１５０ｍｌのｎ－ヘプタンを加え、混合物を室温で１時間撹拌し、ろ過し、ｎ－ヘプタンで２回洗浄し、乾燥させて、４．０２ｇのＢＰ１４３ｂ０２を淡黄色固体として得た。
【0059】
２．ＢＰ１４３ｂ０３の調製
１００ｍｌ三つ口フラスコに４．０２ｇのＢＰ１４３ｂ０２及び５０ｍｌのＤＣＭを加え、この化合物を撹拌しながら溶解させ；次に１１．６ｍｌのＴＦＡを滴下して加え、混合物を室温で２時間反応させ；ＴＬＣにより反応が完了したことが検出された後、１５０ｍｌのアセトニトリルを加え；１２０ｍｌの溶媒を減圧下で留去し、残渣を３２０ｍｌのＴＢＭＥ溶液に注入し；この混合物を３０分間撹拌し、ろ過し；及びろ過ケーキをＴＢＭＥで洗浄して、４．００ｇのＢＰ１４３ｂ０３を淡黄色固体として得た。
１００ｍｌ三つ口フラスコに４．０２ｇのＢＰ１４３ｂ０２及び５０ｍｌのＤＣＭを加え、この化合物を撹拌しながら溶解させ；次に１１．６ｍｌのＴＦＡを滴下して加え、混合物を室温で２時間反応させ；ＴＬＣにより反応が完了したことが検出された後、１５０ｍｌのアセトニトリルを加え；１２０ｍｌの溶媒を減圧下で留去し、残渣を３２０ｍｌのＴＢＭＥ溶液に注入し；この混合物を３０分間撹拌し、ろ過し；及びろ過ケーキをＴＢＭＥで洗浄して、４．００ｇのＢＰ１４３ｂ０３を淡黄色固体として得た。
【0060】
３．ＢＰ１４３ｂ０４の調製
２００ｍｌ三つ口フラスコに３．６９ｇのＢＰ１４３ｂ０３、１００ｍｌのＤＣＭ、３．２１ｇ（１．０５当量）のＢＰ１０３ａ３０、２．７ｍｌのＤＩＥＡ（３．０当量）及び１．２ｍｌのＤＥＰＣ（１．５当量）を加え、室温で１時間反応させ；ＴＬＣにより反応が完了したことが検出された後、混合物をＤＣＭで希釈し、次に水で２回洗浄し、飽和ブラインで１回洗浄し、乾燥させて、濃縮し、ＨＰＬＣにより精製し、次に凍結乾燥して、１．８５ｇのＢＰ１４３ｂ０４を淡黄色固体として得た。
２００ｍｌ三つ口フラスコに３．６９ｇのＢＰ１４３ｂ０３、１００ｍｌのＤＣＭ、３．２１ｇ（１．０５当量）のＢＰ１０３ａ３０、２．７ｍｌのＤＩＥＡ（３．０当量）及び１．２ｍｌのＤＥＰＣ（１．５当量）を加え、室温で１時間反応させ；ＴＬＣにより反応が完了したことが検出された後、混合物をＤＣＭで希釈し、次に水で２回洗浄し、飽和ブラインで１回洗浄し、乾燥させて、濃縮し、ＨＰＬＣにより精製し、次に凍結乾燥して、１．８５ｇのＢＰ１４３ｂ０４を淡黄色固体として得た。
【0061】
４．ＢＰ１４３ｂ０５の調製
５０ｍＬ丸底フラスコに１．２０ｇのＢＰ１４３ｂ０４及び１０ｍｌの１０％ＴＦＡ／ＤＣＭを加え、室温で反応させ；ＴＬＣにより反応が完了したことが検出された後、得られた生成物をＴＢＭＥに注入し、この混合物を遠心し、乾燥させて、２１０ｍｇの化合物ＢＰ１４３ｂ０５を淡黄色固体として得た。
５０ｍＬ丸底フラスコに１．２０ｇのＢＰ１４３ｂ０４及び１０ｍｌの１０％ＴＦＡ／ＤＣＭを加え、室温で反応させ；ＴＬＣにより反応が完了したことが検出された後、得られた生成物をＴＢＭＥに注入し、この混合物を遠心し、乾燥させて、２１０ｍｇの化合物ＢＰ１４３ｂ０５を淡黄色固体として得た。
【0062】
５．ＢＰ１４３ｂ０６の調製
１０ｍＬ丸底フラスコに５１ｍｇのＢＰ１４３ｂ０５（４．０当量）、２ｍｌのＤＣＭ、１１ｕｌのＴＥＡ（８．０当量）及び２０１ｍｇの４アームＰＥＧ２０Ｋ－ＳＣＭ（１．０当量）を加え、室温で一晩反応させて濃縮し；得られた生成物をＴＢＭＥに加え、混合物を遠心し、分取ＨＰＬＣにより精製し、凍結乾燥して、８５ｍｇの化合物ＢＰ１４３ｂ０６を黄色がかった緑色の固体として得た。
１０ｍＬ丸底フラスコに５１ｍｇのＢＰ１４３ｂ０５（４．０当量）、２ｍｌのＤＣＭ、１１ｕｌのＴＥＡ（８．０当量）及び２０１ｍｇの４アームＰＥＧ２０Ｋ－ＳＣＭ（１．０当量）を加え、室温で一晩反応させて濃縮し；得られた生成物をＴＢＭＥに加え、混合物を遠心し、分取ＨＰＬＣにより精製し、凍結乾燥して、８５ｍｇの化合物ＢＰ１４３ｂ０６を黄色がかった緑色の固体として得た。
【0063】
実施例５
１．ＢＰ１４９ａ０１の調製
１００ｍｌ三つ口フラスコに１０．００ｇの化合物ＳＮ３８（１．０当量）及び１１０ｍｌのＤＭＳＯを加え；化合物が溶解して澄明な溶液が生じた後、５．５６ｇの（Ｂｏｃ）２Ｏ（１．０当量）及び９．８２ｇのＤＩＥＡ（３．０当量）を加え、混合物を２時間反応させ；ＴＬＣにより反応が完了したことが検出された後、反応液を精製水に注入し、この混合物を酢酸エチルで３回抽出し；有機相を合わせ、精製水及び飽和ブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させると、オフホワイトの固体が得られ、これを、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルを加えることによりスラリー化し、ろ過し、乾燥させて、７．９５ｇの化合物ＢＰ１４９ａ０１をオフホワイトの固体として得た。
【化36】
１００ｍｌ三つ口フラスコに１０．００ｇの化合物ＳＮ３８（１．０当量）及び１１０ｍｌのＤＭＳＯを加え；化合物が溶解して澄明な溶液が生じた後、５．５６ｇの（Ｂｏｃ）２Ｏ（１．０当量）及び９．８２ｇのＤＩＥＡ（３．０当量）を加え、混合物を２時間反応させ；ＴＬＣにより反応が完了したことが検出された後、反応液を精製水に注入し、この混合物を酢酸エチルで３回抽出し；有機相を合わせ、精製水及び飽和ブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させると、オフホワイトの固体が得られ、これを、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルを加えることによりスラリー化し、ろ過し、乾燥させて、７．９５ｇの化合物ＢＰ１４９ａ０１をオフホワイトの固体として得た。
【0064】
２．ＢＰ１４９ａ０２の調製
２５０ｍＬ丸底フラスコに７．９５ｇの化合物ＢＰ１４９ａ０１（１．０当量）、２．８３ｇのＢｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ（１．０当量）、８０ｍｌのジクロロメタン及び３９０ｍｇのＤＭＡＰ（０．２当量）を加え；２０ｍｌのＤＣＭ中５．００ｇのＤＣＣ（１．５当量）の溶液を滴下して加え、混合物を室温で１時間反応させ；ＴＬＣにより反応が完了したことが検出された後、混合物をろ過し、液体が全て蒸発するまで濃縮し；３０ｍｌのＩＰＡを加えて溶解させることにより澄明な溶液を生じさせ、次に２００ｍｌのｎ－ヘプタンを加え；及びこの混合物を３０分間撹拌してスラリー化し、ろ過し、ｎ－ヘプタンで２回洗浄し、乾燥させて、８．７３ｇの化合物ＢＰ１４９ａ０２を淡黄色固体として得た。
２５０ｍＬ丸底フラスコに７．９５ｇの化合物ＢＰ１４９ａ０１（１．０当量）、２．８３ｇのＢｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ（１．０当量）、８０ｍｌのジクロロメタン及び３９０ｍｇのＤＭＡＰ（０．２当量）を加え；２０ｍｌのＤＣＭ中５．００ｇのＤＣＣ（１．５当量）の溶液を滴下して加え、混合物を室温で１時間反応させ；ＴＬＣにより反応が完了したことが検出された後、混合物をろ過し、液体が全て蒸発するまで濃縮し；３０ｍｌのＩＰＡを加えて溶解させることにより澄明な溶液を生じさせ、次に２００ｍｌのｎ－ヘプタンを加え；及びこの混合物を３０分間撹拌してスラリー化し、ろ過し、ｎ－ヘプタンで２回洗浄し、乾燥させて、８．７３ｇの化合物ＢＰ１４９ａ０２を淡黄色固体として得た。
【0065】
３．ＢＰ１４９ａ０３の調製
１００ｍｌ三つ口フラスコに８．７３ｇの化合物ＢＰ１４９ａ０２及び４０ｍｌのＤＣＭを加え；この化合物を撹拌しながら溶解させて、次に混合物を０℃に冷却し；４０ｍｌのＴＦＡを滴下して加え、混合物を室温で２時間反応させ；ＴＬＣにより反応が完了したことが検出された後、反応液を８００ｍｌのＴＢＭＥ溶液に注入し、この混合物を３０分間撹拌し、ろ過し；及びろ過ケーキをＴＢＭＥで洗浄し、真空乾燥させて、４．９５ｇのＢＰ１４９ａ０３を淡黄色固体として得た。
１００ｍｌ三つ口フラスコに８．７３ｇの化合物ＢＰ１４９ａ０２及び４０ｍｌのＤＣＭを加え；この化合物を撹拌しながら溶解させて、次に混合物を０℃に冷却し；４０ｍｌのＴＦＡを滴下して加え、混合物を室温で２時間反応させ；ＴＬＣにより反応が完了したことが検出された後、反応液を８００ｍｌのＴＢＭＥ溶液に注入し、この混合物を３０分間撹拌し、ろ過し；及びろ過ケーキをＴＢＭＥで洗浄し、真空乾燥させて、４．９５ｇのＢＰ１４９ａ０３を淡黄色固体として得た。
【0066】
４．ＢＰ１４９ｂ０１の調製
２００ｍｌ三つ口フラスコに２．３ｇの化合物ＢＰ１４９ａ０３、４５ｍｌのＤＣＭ、３．１９６ｇの化合物ＢＰ１０３ａ３１（１．０５当量）及び１．７５ｍｌのＴＥＡ（３．０当量）を加え、室温で４時間反応させ；ＴＬＣにより反応が完了したことが検出された後、混合物をＤＣＭで希釈し、希塩酸で１回洗浄し、水で２回洗浄し、飽和ブラインで１回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させて濃縮すると、粗製生成物が得られ、これを分取ＨＰＬＣにより精製し、ＤＣＭで抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させて、濃縮し、乾燥させて、２．２０ｇのＢＰ１４９ｂ０１を淡黄色固体として得た。
２００ｍｌ三つ口フラスコに２．３ｇの化合物ＢＰ１４９ａ０３、４５ｍｌのＤＣＭ、３．１９６ｇの化合物ＢＰ１０３ａ３１（１．０５当量）及び１．７５ｍｌのＴＥＡ（３．０当量）を加え、室温で４時間反応させ；ＴＬＣにより反応が完了したことが検出された後、混合物をＤＣＭで希釈し、希塩酸で１回洗浄し、水で２回洗浄し、飽和ブラインで１回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させて濃縮すると、粗製生成物が得られ、これを分取ＨＰＬＣにより精製し、ＤＣＭで抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させて、濃縮し、乾燥させて、２．２０ｇのＢＰ１４９ｂ０１を淡黄色固体として得た。
【0067】
５．ＢＰ１４９ｂ０２の調製
２００ｍｌ三つ口フラスコに２．０ｇの化合物ＢＰ１４９ｂ０１及び４０ｍｌの１０％ＴＦＡ／ＤＣＭを加え、室温で反応させ；ＴＬＣにより反応が完了したことが検出された後、得られた生成物をＴＢＭＥに注入し、この混合物を遠心し、乾燥させて、１．７５ｇのＢＰ１４９ｂ０２を淡黄色固体として得た。
２００ｍｌ三つ口フラスコに２．０ｇの化合物ＢＰ１４９ｂ０１及び４０ｍｌの１０％ＴＦＡ／ＤＣＭを加え、室温で反応させ；ＴＬＣにより反応が完了したことが検出された後、得られた生成物をＴＢＭＥに注入し、この混合物を遠心し、乾燥させて、１．７５ｇのＢＰ１４９ｂ０２を淡黄色固体として得た。
【0068】
６．ＢＰ１４９ｂ０３の調製
２００ｍｌ三つ口フラスコに４．０８ｇの化合物ＢＰ１４９ｂ０２（５．０当量）、１００ｍｌのＤＭＦ、１．９６ｇのＤＩＥＡ（２０当量）及び１６．０５ｇの４アームＰＥＧ２０Ｋ－ＳＣＭ（１．０当量）を加え、室温で２時間反応させて、得られた生成物を１Ｌのメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルに注入し；この混合物を３０分間撹拌し、次にろ過し、乾燥させると、２０．５０ｇの粗製生成物がオフホワイトの固体として得られ、これを分取ＨＰＬＣにより精製し、凍結乾燥して、１２．３６ｇの純粋なＢＰ１４９ｂ０３を得た。
２００ｍｌ三つ口フラスコに４．０８ｇの化合物ＢＰ１４９ｂ０２（５．０当量）、１００ｍｌのＤＭＦ、１．９６ｇのＤＩＥＡ（２０当量）及び１６．０５ｇの４アームＰＥＧ２０Ｋ－ＳＣＭ（１．０当量）を加え、室温で２時間反応させて、得られた生成物を１Ｌのメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルに注入し；この混合物を３０分間撹拌し、次にろ過し、乾燥させると、２０．５０ｇの粗製生成物がオフホワイトの固体として得られ、これを分取ＨＰＬＣにより精製し、凍結乾燥して、１２．３６ｇの純粋なＢＰ１４９ｂ０３を得た。
【0069】
実施例６
室温において、１００ｍｌ三つ口反応フラスコに２．００ｇ（１．０当量）のＢＰ１４３ｂ０６及び３５ｍｌのｐＨ＝７．０のＰＢＳ溶液を加え、撹拌しながら溶解させることにより、澄明な溶液を生じさせ；０．４５ｇ（５．０当量）のターゲティングポリペプチド１（Ａｃ－ＫＰＳＳＰＰＥＥＣ－ＮＨ２）を３０ｍｌの精製水に溶解させ、この混合物を重炭酸ナトリウム溶液でｐＨ≒６．５に調整し、次に反応フラスコに加え；０．５時間後、ＨＰＬＣにより反応が完了したことが検出され、得られた生成物を分取ＨＰＬＣにより精製し、凍結乾燥して、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦにより検出して分子量が２８８１０．７３の、１．６５ｇの純粋な化合物ａを得た。
【化37】
【0070】
実施例７
室温において、１００ｍｌ三つ口反応フラスコに２．００ｇ（１．０当量）のＢＰ１４３ｂ０６及び３５ｍｌのｐＨ＝７．０のＰＢＳ溶液を加え、撹拌しながら溶解させることにより、澄明な溶液を生じさせ；０．３８ｇ（５．０当量）のターゲティングポリペプチド２（Ａｃ－ＮＡＳＡＰＰＥＥＣ－ＮＨ２）を３０ｍｌの精製水に溶解させ、この混合物を重炭酸ナトリウム溶液でｐＨ≒６．５に調整し、次に反応フラスコに加え；０．５時間後、ＨＰＬＣにより反応が完了したことが検出され、得られた生成物を分取ＨＰＬＣにより精製し、凍結乾燥して、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦにより検出して分子量が２８９３１．５２の、１．４２ｇの純粋な化合物ｂを得た。
【化38】
【0071】
実施例８
室温において、１００ｍｌ三つ口反応フラスコに２．００ｇ（１．０当量）のＢＰ１４９ｂ０３及び３５ｍｌのｐＨ＝７．０のＰＢＳ溶液を加え、撹拌しながら溶解させることにより、澄明な溶液を生じさせ；０．４６ｇ（５．０当量）のターゲティングポリペプチド１（Ａｃ－ＫＰＳＳＰＰＥＥＣ－ＮＨ２）を３０ｍｌの精製水に溶解させ、この混合物を重炭酸ナトリウム溶液でｐＨ≒６．５に調整し、次に反応フラスコに加え；０．５時間後、ＨＰＬＣにより反応が完了したことが検出され、得られた生成物を分取ＨＰＬＣにより精製し、凍結乾燥して、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦにより検出して分子量が２８１９１．６３の、１．４５ｇの純粋な化合物ｃを得た。
【化39】
【0072】
実施例９
室温において、１００ｍｌ三つ口反応フラスコに２．００ｇ（１．０当量）のＢＰ１４９ｂ０３及び３５ｍｌのｐＨ＝７．０のＰＢＳ溶液を加え、撹拌しながら溶解させることにより、澄明な溶液を生じさせ；０．３９ｇ（５．０当量）のターゲティングポリペプチド２（Ａｃ－ＮＡＳＡＰＰＥＥＣ－ＮＨ２）を３０ｍｌの精製水に溶解させ、この混合物を重炭酸ナトリウム溶液でｐＨ≒６．５に調整し、次に反応フラスコに加え；０．５時間後、ＨＰＬＣにより反応が完了したことが検出され、得られた生成物を分取ＨＰＬＣにより精製し、凍結乾燥して、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦにより検出して分子量が２７９８２．３２の、１．５３ｇの純粋な化合物ｄを得た。
【化40】
【0073】
実施例１０ ビオチン標識ターゲティングポリペプチド３の合成
当業者に周知のＦｍｏｃ固相合成法を用いてビオチン標識ターゲティングポリペプチド３を合成し；Ｆｍｏｃは、Ｒｉｎｋアミド樹脂及び２０％のピペリジン／ＤＭＦを使用することにより除去し；カップリング試薬としてＨＯＢＴ／ＤＩＣを使用し、反応溶媒としてＤＭＦを使用し；反応は、ニンヒドリン検出法によりモニタし；以下の保護されているアミノ酸を樹脂に順次カップリングし：Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｐｒｏ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｐｒｏ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｐｒｏ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｄｄｅ）－ＯＨ；Ｆｍｏｃの保護を除去した後、得られた生成物を無水酢酸及びピリジンでアセチル化し；ＤＭＦ中のヒドラジン水和物の溶液を加え、Ｄｄｅ保護基を除去し；得られた生成物をＦｍｏｃ－ＰＥＧ３－ＯＨ及びビオチンに順次カップリングし、次にＤＭＦ、メタノール及びＤＣＭで洗浄し、乾燥させ；溶解試薬（ＴＦＡ：チオアニソール：フェノール：ＥＤＴ＝８２．５：５：５：２．５：５）を加え；２時間反応させた後、氷冷ＴＢＭＥを用いて混合物を沈殿させ、遠心すると、粗製生成物が得られ、これを分取ＨＰＬＣにより精製し、次に凍結乾燥させて、純粋な生成物を得た。
【化41】
【0074】
実施例１１ ビオチン標識ターゲティングポリペプチド４の合成
当業者に周知のＦｍｏｃ固相合成法を用いてビオチン標識ターゲティングポリペプチド４を合成し；Ｆｍｏｃは、Ｒｉｎｋアミド樹脂及び２０％のピペリジン／ＤＭＦを使用することにより除去し；カップリング試薬としてＨＯＢＴ／ＤＩＣを使用し、反応溶媒としてＤＭＦを使用し；反応は、ニンヒドリン検出法によりモニタし；以下の保護されているアミノ酸を樹脂に順次カップリングし：Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｄｄｅ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｐｒｏ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｐｒｏ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｌａ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ及びＦｍｏｃ－Ａｌａ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｎ（Ｔｒｔ）－ＯＨ；Ｆｍｏｃの保護を除去した後、得られた生成物を無水酢酸及びピリジンでアセチル化し；ＤＭＦ中のヒドラジン水和物の溶液を加え、Ｄｄｅ保護基を除去し；得られた生成物をＦｍｏｃ－ＰＥＧ３－ＯＨ及びビオチンに順次カップリングし、次にＤＭＦ、メタノール及びＤＣＭで洗浄し、乾燥させ；溶解試薬（ＴＦＡ：チオアニソール：フェノール：ＥＤＴ＝８２．５：５：５：２．５：５）を加え；２時間反応させた後、氷冷ＴＢＭＥを用いて混合物を沈殿させ、遠心すると、粗製生成物が得られ、これを分取ＨＰＬＣにより精製し、次に凍結乾燥させて、純粋な生成物を得た。
【化42】
【0075】
実施例１２ 化合物ａ－ビオチンコンジュゲートの調製
室温において、１００ｍｌ三つ口反応フラスコに２．００ｇ（１．０当量）のＢＰ１４３ｂ０６及び３５ｍｌのｐＨ＝７．０のＰＢＳ溶液を加え、撹拌しながら溶解させることにより、澄明な溶液を生じさせ；０．５７ｇ（５．０当量）のビオチン標識ターゲティングポリペプチド３を３０ｍｌの精製水に溶解させ、この混合物を重炭酸ナトリウム溶液でｐＨ≒６．５に調整し、次に反応フラスコに加え；０．５時間後、ＨＰＬＣにより反応が完了したことが検出され、得られた生成物を分取ＨＰＬＣにより精製し、凍結乾燥して、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦにより検出して分子量が３０３２５．５１の、１．２４ｇの純粋な生成物を得た。
【化43】
【0076】
実施例１３ 化合物ｂ－ビオチンコンジュゲートの調製
室温において、１００ｍｌ三つ口反応フラスコに２．００ｇ（１．０当量）のＢＰ１４３ｂ０６及び３５ｍｌのｐＨ＝７．０のＰＢＳ溶液を加え、撹拌しながら溶解させることにより、澄明な溶液を生じさせ；０．６０ｇ（５．０当量）のビオチン標識ターゲティングポリペプチド４を３０ｍｌの精製水に溶解させ、この混合物を重炭酸ナトリウム溶液でｐＨ≒６．５に調整し、次に反応フラスコに加え；０．５時間後、ＨＰＬＣにより反応が完了したことが検出され、得られた生成物を分取ＨＰＬＣにより精製し、凍結乾燥して、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦにより検出して分子量が３０５９６．５６の、１．３３ｇの純粋な生成物を得た。
【化44】
【0077】
実施例１４ 化合物ｃ－ビオチンコンジュゲートの調製
室温において、１００ｍｌ三つ口反応フラスコに２．００ｇ（１．０当量）のＢＰ１４９ｂ０３及び３５ｍｌのｐＨ＝７．０のＰＢＳ溶液を加え、撹拌しながら溶解させることにより、澄明な溶液を生じさせ；０．５５ｇ（５．０当量）のビオチン標識ターゲティングポリペプチド３を３０ｍｌの精製水に溶解させ、この混合物を重炭酸ナトリウム溶液でｐＨ≒６．５に調整し、次に反応フラスコに加え；０．５時間後、ＨＰＬＣにより反応が完了したことが検出され、得られた生成物を分取ＨＰＬＣにより精製し、凍結乾燥して、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦにより検出して分子量が３０２２３．２５の、１．２６ｇの純粋な生成物を得た。
【化45】
【0078】
実施例１５ 化合物ｄ－ビオチンコンジュゲートの調製
室温において、１００ｍｌ三つ口反応フラスコに２．００ｇ（１．０当量）のＢＰ１４９ｂ０３及び３５ｍｌのｐＨ＝７．０のＰＢＳ溶液を加え、撹拌しながら溶解させることにより、澄明な溶液を生じさせ；０．５８ｇ（５．０当量）のビオチン標識ターゲティングポリペプチド４を３０ｍｌの精製水に溶解させ、この混合物を重炭酸ナトリウム溶液でｐＨ≒６．５に調整し、次に反応フラスコに加え；０．５時間後、ＨＰＬＣにより反応が完了したことが検出され、得られた生成物を分取ＨＰＬＣにより精製し、凍結乾燥して、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦにより検出して分子量が３０４９１．１８の、１．３３ｇの純粋な生成物を得た。
【化46】
【0079】
実施例１６ ＣＤ４４に特異的に結合する本発明の化合物
１．材料及び方法
１．１ 本発明の化合物のビオチン標識コンジュゲート
化合物ａ－ビオチンコンジュゲート、化合物ｂ－ビオチンコンジュゲート、化合物ｃ－ビオチンコンジュゲート及び化合物ｄ－ビオチンコンジュゲートは、実験ではそれぞれコンジュゲートａ、コンジュゲートｂ、コンジュゲートｃ及びコンジュゲートｄと称され、その構造及びその調製方法は、実施例１０～１５に示されるとおりである。
１．材料及び方法
１．１ 本発明の化合物のビオチン標識コンジュゲート
化合物ａ－ビオチンコンジュゲート、化合物ｂ－ビオチンコンジュゲート、化合物ｃ－ビオチンコンジュゲート及び化合物ｄ－ビオチンコンジュゲートは、実験ではそれぞれコンジュゲートａ、コンジュゲートｂ、コンジュゲートｃ及びコンジュゲートｄと称され、その構造及びその調製方法は、実施例１０～１５に示されるとおりである。
【0080】
１．２ 細胞培養
ＳＫＯＶ３細胞をＭｃＣｏｙ ５Ａ培養液で培養した。細胞培養液に１０％のＦＢＳ、１０００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン及び４ｍｍｏｌ／Ｌ Ｌ－グルタミンを補足した。
ＳＫＯＶ３細胞をＭｃＣｏｙ ５Ａ培養液で培養した。細胞培養液に１０％のＦＢＳ、１０００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン及び４ｍｍｏｌ／Ｌ Ｌ－グルタミンを補足した。
【0081】
１．３ ＳＫＯＶ３細胞へのコンジュゲートの結合
コンジュゲートａ、コンジュゲートｂ、コンジュゲートｃ及びコンジュゲートｄ（それぞれ１００μｍｏｌ／Ｌの濃度が実現するように氷冷ＰＢＳに溶解させた）に５ｍｍｏｌ／Ｌのスベリン酸ビス（スルホスクシンイミド）を加えて、コンジュゲートをＳＫＯＶ３細胞に結合させた。Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００溶解緩衝液を加え；細胞を溶解させて、次に遠心し；及び上清をポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜に転写し、ウエスタンブロット分析に供した。ＰＶＤＦ膜を西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートストレプトアビジン（ＨＲＰ－ＳＡ）と共にインキュベートし、コンジュゲートと架橋したタンパク質を検出した。抗ＣＤ４４モノクローナル抗体ＤＦ１４８５及びペルオキシダーゼ標識ロバ抗マウス免疫グロブリンを使用したウエスタンブロットによりＣＤ４４を検出した。検出には、配合したての化学発光試薬及びＨｙｐｅｒｍａｘ ＥＣＬフィルム露光を用いた。
コンジュゲートａ、コンジュゲートｂ、コンジュゲートｃ及びコンジュゲートｄ（それぞれ１００μｍｏｌ／Ｌの濃度が実現するように氷冷ＰＢＳに溶解させた）に５ｍｍｏｌ／Ｌのスベリン酸ビス（スルホスクシンイミド）を加えて、コンジュゲートをＳＫＯＶ３細胞に結合させた。Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００溶解緩衝液を加え；細胞を溶解させて、次に遠心し；及び上清をポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜に転写し、ウエスタンブロット分析に供した。ＰＶＤＦ膜を西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートストレプトアビジン（ＨＲＰ－ＳＡ）と共にインキュベートし、コンジュゲートと架橋したタンパク質を検出した。抗ＣＤ４４モノクローナル抗体ＤＦ１４８５及びペルオキシダーゼ標識ロバ抗マウス免疫グロブリンを使用したウエスタンブロットによりＣＤ４４を検出した。検出には、配合したての化学発光試薬及びＨｙｐｅｒｍａｘ ＥＣＬフィルム露光を用いた。
【0082】
１．４ コンジュゲート標識タンパク質の免疫沈降
コンジュゲートと架橋したＳＫＯＶ３細胞をＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００によって溶解し、プロテインＡセファロースと共に室温で２時間インキュベートし、予洗し；１００μｇの洗浄後の溶解緩衝液を、２μｇのＤＦ１４８５（抗ＣＤ４４抗体）又はマウスＩｇＧ１を補足した２０μＬのプロテインＡセファロースと共に室温で一晩インキュベートした。溶解緩衝液で５回洗浄した後、混合物をＳＤＳ－ＰＡＧＥ負荷緩衝液中で煮沸し、免疫沈降したタンパク質をプロテインＡセファロースから溶出させた。溶出した材料及び５μｇの初期材料をＳＤＳ－ＰＡＧＥに加え、ＰＶＤＦ膜に転写し、次にＨＲＰ－ＳＡで染色した。
コンジュゲートと架橋したＳＫＯＶ３細胞をＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００によって溶解し、プロテインＡセファロースと共に室温で２時間インキュベートし、予洗し；１００μｇの洗浄後の溶解緩衝液を、２μｇのＤＦ１４８５（抗ＣＤ４４抗体）又はマウスＩｇＧ１を補足した２０μＬのプロテインＡセファロースと共に室温で一晩インキュベートした。溶解緩衝液で５回洗浄した後、混合物をＳＤＳ－ＰＡＧＥ負荷緩衝液中で煮沸し、免疫沈降したタンパク質をプロテインＡセファロースから溶出させた。溶出した材料及び５μｇの初期材料をＳＤＳ－ＰＡＧＥに加え、ＰＶＤＦ膜に転写し、次にＨＲＰ－ＳＡで染色した。
【0083】
２．結果
ＳＫＯＶ３細胞は、コンジュゲートに結合する。この細胞から調製したライセートをＤＦ１４８５で免疫沈降させた。溶出したタンパク質及び初期ライセートをＰＡＧＥ／ブロッティングに供し、ここで、それぞれＨＲＰ－ＳＡ染色を用いてビオチン標識を検出し、ＤＦ１４８５染色を用いてＣＤ４４を検出した。
ＳＫＯＶ３細胞は、コンジュゲートに結合する。この細胞から調製したライセートをＤＦ１４８５で免疫沈降させた。溶出したタンパク質及び初期ライセートをＰＡＧＥ／ブロッティングに供し、ここで、それぞれＨＲＰ－ＳＡ染色を用いてビオチン標識を検出し、ＤＦ１４８５染色を用いてＣＤ４４を検出した。
【0084】
反応系に初期ライセート、コンジュゲート及びＨＲＰ－ＳＡが含まれたとき、０～２５０ｋＤａの範囲に多くの非特異的バンドが現れ；反応系に初期ライセート及びＨＲＰ－ＳＡが含まれたとき、０～２５０ｋＤａの範囲にバンドが現れなかったことから、従ってＨＲＰ－ＳＡがコンジュゲート標識タンパク質を特異的に染色したことが示された。反応系に免疫沈降タンパク質、コンジュゲート及びＨＲＰ－ＳＡが含まれたとき、８５ｋＤａに特異的バンドが現れ；反応系に免疫沈降タンパク質及びＨＲＰ－ＳＡが含まれたとき、０～２５０ｋＤａの範囲にバンドが現れなかったことから、従って約８５ｋＤａのコンジュゲート標識タンパク質がＤＦ１４８５によって特異的に沈降したことが示された。初期ライセートと比較すると、免疫沈降したタンパク質のバンドの染色強度は、一層明確であったことから、抗ＣＤ４４免疫沈降によってこのタンパク質が大幅に濃縮されたことが示される。
【0085】
反応系に初期ライセート、コンジュゲート及びＤＦ１４８５が含まれたとき、８５ｋＤａに特異的バンドが現れ；反応系に初期ライセート及びＤＦ１４８５が含まれたとき、８５ｋＤａに特異的バンドが現れ；反応系に免疫沈降タンパク質、コンジュゲート及びＤＦ１４８５が含まれたとき、８５ｋＤａに特異的バンドが現れ；反応系に免疫沈降タンパク質及びＤＦ１４８５が含まれたとき、８５ｋＤａに特異的バンドが現れたことから、従って８５ｋＤａのバンドがＣＤ４４であり、全ての試料中にＣＤ４４が存在したことが示された。
【0086】
上記の結果から、本発明の化合物は、ＣＤ４４に特異的に結合し、且つＣＤ４４の高発現を有する腫瘍細胞及び組織を標的とし得、それにより、標的組織中のコンジュゲートの濃度が高く、その臨床治療効果が改善され、且つ毒性が低減されることが示される。
【0087】
実施例１７～２１において、全ての動物実験操作は、動物の使用及び管理に関する要求事項を厳守する。腫瘍関連パラメータの計算に関して、中国ＣＦＤＡからの
を参照することができ、ここで、％Ｔ／Ｃ≦４０％及び統計的分析によるＰ＜０．０５は、有効であることの指標である。相対腫瘍増殖速度が低いほど、抗腫瘍効果が高い。
【0088】
腫瘍容積（ＴＶ）の計算式は、ＴＶ（ｍｍ３）＝ｌ×ｗ２／２であり、式中、ｌは、腫瘍の長径（ｍｍ）を表し；及びｗは、腫瘍の短径（ｍｍ）を表す。
【0089】
相対腫瘍容積（ＲＴＶ）の計算式は、ＲＴＶ＝ＴＶｔ／ＴＶｉｎｉｔｉａｌであり、式中、ＴＶｉｎｉｔｉａｌは、群分け及び投与時に測定された腫瘍容積を表し、及びＴＶｔは、投与中の各測定時の腫瘍容積を表す。
【0090】
相対腫瘍増殖速度（％Ｔ／Ｃ）の計算式は、％Ｔ／Ｃ＝１００％×（ＲＴＶＴ／ＲＴＶＣ）であり、式中、ＲＴＶＴは、治療群のＲＴＶを表し、及びＲＴＶＣは、溶媒対照群のＲＴＶを表す。
【0091】
腫瘍成長抑制率ＴＧＩ（％）の計算式は、ＴＧＩ＝１００％×［１－（ＴＶｔ（Ｔ）－ＴＶｉｎｉｔｉａｌ（Ｔ））／（ＴＶｔ（Ｃ）－ＴＶｉｎｉｔｉａｌ（Ｃ））］であり、式中、ＴＶｔ（Ｔ）は、各測定時の治療群の腫瘍容積を表し；ＴＶｉｎｉｔｉａｌ（Ｔ）は、群分け及び投与時の治療群の腫瘍容積を表し；ＴＶｔ（Ｃ）は、各測定時の溶媒対照群の腫瘍容積を表し；及びＴＶｉｎｉｔｉａｌ（Ｃ）は、群分け及び投与時の溶媒対照群の腫瘍容積を表す。
【0092】
動物体重の減少率の計算式は、動物体重の減少率＝１００％×（ＢＷｉｎｉｔｉａｌ－ＢＷｔ）／ＢＷｉｎｉｔｉａｌであり、式中、ＢＷｔは、投与中の各測定時の動物の体重を表し；及びＢＷｉｎｉｔｉａｌは、群分け及び投与時の動物の体重を表す。
【0093】
腫瘍重量抑制率ＩＲ（％）の計算式は、ＩＲ（％）＝１００％×（ＷＣ－ＷＴ）／ＷＣであり、式中、ＷＣは、対照群の腫瘍重量を表し、及びＷＴは、治療群の腫瘍重量を表す。
【0094】
試験データは、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｏｆｆｉｃｅ Ｅｘｃｅｌ ２００７ソフトウェアで計算し、関係する統計処理にかけた。特に指定されない限り、データは、平均値±標準誤差（平均値±ＳＥ）として表し；群間のデータの比較には、ｔ検定を用い；及びＰ＜０．０５を統計的に有意と見なした。
【0095】
実験動物：雌ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（６～８週齢）を約１週間にわたり通常どおり飼育し；獣医による診察後、この実験用のために、良好な身体的徴候を有するマウスを選択した。群分け前、マウスの尾の基部にマーカーを使用して印を付けて群分けし、次に各マウスの耳をカットして印を付けた。
【0096】
化合物Ｍ、化合物ａ及び化合物ｂの投与製剤の調製：薬物は、各投与前に正確に秤量し；２．５ｍＬの生理食塩水を加え、ボルテックスを実施して薬物を完全に溶解させ；及び溶液中のイリノテカンの有効濃度は、４．０ｍｇ・ｍＬ－１であった。
【0097】
化合物ｃ及び化合物ｄの投与製剤の調製：薬物は、各投与前に正確に秤量し；２．５ｍＬの生理食塩水を加え、ボルテックスを実施して薬物を完全に溶解させ；及び溶液中のＳＮ３８の有効濃度は、４．０ｍｇ・ｍＬ－１であった。
【0098】
無作為化群分け：マウスに腫瘍細胞を接種し、腫瘍容積が１００～３００ｍｍ３に達したところで、マウスを、乱塊法に基づき、各群６匹のマウスの、群間で腫瘍容積及び体重を均一とした６群に分けた。各群の平均腫瘍容積と全ての実験動物の平均腫瘍容積との間の差は、±１０％以下であった。
【0099】
実験の開始後、腫瘍径を週２回測定して腫瘍容積を計算し、且つ体重も秤量し、記録した。
【0100】
実施例１７～２０におけるマウスへの投与は、群分け当日の初回投与を含む。第１の群は、溶媒対照群であり、ここで、尾静脈注射によって生理食塩水を投与した。群２～６にそれぞれ試験試料：化合物Ｍ、化合物ａ、化合物ｂ、化合物ｃ及び化合物ｄを尾静脈注射によって投与した。
【0101】
実験の完了後、体重の秤量後にマウスを安楽死させ（ＣＯ２）、腫瘍径を測定した。腫瘍組織を剥ぎ取って秤量し、ＲＴＶ及び％Ｔ／Ｃを計算した。
【0102】
実施例に関わる対照試験試料化合物Ｍは、中国特許出願公開第１０８７２７５８３ Ａ号明細書に開示されたものであり、以下のとおりの構造を有する。
【化47】
【0103】
実施例１７ ヌードマウスにおけるヒト乳癌ＭＤＡ－ＭＢ－２３１の異種移植片腫瘍に対する本発明の化合物の抗腫瘍薬力学実験
試験試料：化合物Ｍ、化合物ａ、化合物ｂ、化合物ｃ及び化合物ｄ。
試験試料：化合物Ｍ、化合物ａ、化合物ｂ、化合物ｃ及び化合物ｄ。
【0104】
試薬：ＤＭＥＭ培養液、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、トリプシン、ペニシリン－ストレプトマイシン二重抗体及び生理食塩水。
【0105】
移植した腫瘍株：ヒト乳癌ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、中国科学院（ＣＡＳ）のＣｅｌｌ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅから得て、本発明者らの研究室で液体窒素中に凍結保存した。
【0106】
細胞培養：１０％ウシ胎仔血清ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ、ＵＳＡ）を含有するＤＭＥＭ培地（ＤＭＥＭ、ＵＳＡ）でＭＤＡ－ＭＢ－２３１株を培養し、インキュベーターにおいて３７℃、５％ＣＯ２で培養した。
【0107】
動物モデルの調製：細胞接種法を用いてヌードマウスに皮下移植腫瘍モデルを樹立し；対数増殖期の腫瘍細胞を収集し、カウントし、１×ＰＢＳに再懸濁して、細胞懸濁液の濃度を１×１０７細胞／ｍｌに調整した。１ｍｌシリンジ（４ゲージ針）を使用してヌードマウスの右背部に腫瘍細胞を皮下接種した（１×１０６細胞／マウス）。
【0108】
投与頻度及び投与量：各群について週１回、合計３回投与し（ＱＷ×３）、各投与量は、６ｍｇ・ｋｇ－１であった（イリノテカン又はＳＮ３８として計算した）。
【0109】
結果を表１に示す。
【0110】
【表2】
【0111】
これらの実験結果から、本発明の化合物がヌードマウスのヒト乳癌ＭＤＡ－ＭＢ－２３１の移植腫瘍に良好な阻害効果を及ぼすことが示され、この効果は、化合物Ｍよりも良好であった。
【0112】
実施例１８ 本発明の化合物がヌードマウスにおけるヒト胃癌ＮＣＩ－Ｎ８７細胞株の移植腫瘍モデルのインビボ腫瘍成長に及ぼす阻害効果
試験試料：化合物Ｍ、化合物ａ、化合物ｂ、化合物ｃ及び化合物ｄ。
試験試料：化合物Ｍ、化合物ａ、化合物ｂ、化合物ｃ及び化合物ｄ。
【0113】
試薬：ＲＰＭＩ－１６４０培養液、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、トリプシン、ペニシリン－ストレプトマイシン二重抗体及び生理食塩水。
【0114】
移植腫瘍株：ヒト胃癌ＮＣＩ－Ｎ８７、中国科学院（ＣＡＳ）のＣｅｌｌ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅから得て、本発明者らの研究室で液体窒素中に凍結保存した。
【0115】
細胞培養：５％ＣＯ２及び３７℃下、１０％ウシ胎仔血清を含有するＲＰＭＩ－１６４０培養液でＮＣＩ－Ｎ８７細胞を常法どおり培養し、０．２５％トリプシンによる消化に供し、継代し；細胞成長に応じて、細胞は、１：２～１：６の継代比で週１～２回継代した。
【0116】
動物モデルの調製：対数増殖期のＮＣＩ－Ｎ８７細胞を収集し、カウントし、無血清ＲＰＭＩ－１６４０培地に再懸濁して、細胞の濃度を５×１０７細胞／ｍＬに調整し；細胞をピペッティングにより均一に分散させ、次に５０ｍＬ遠心管に移し、次にそれをアイスボックスに置き；１ｍＬシリンジを使用して細胞懸濁液を吸引し、ヌードマウスの右腋窩前部に皮下注射し、各マウスに１００μＬ（５×１０６細胞／マウス）を接種することにより、ヌードマウスにＮＣＩ－Ｎ８７移植腫瘍モデルを樹立した。
【0117】
投与頻度及び投与量：各群について週１回、合計４回投与し（ＱＷ×４）、各投与量は、２００ｍｇ・ｋｇ－１であった。
【0118】
結果を表２に示す。
【0119】
【表3】
【0120】
これらの実験結果から、本発明の化合物がヌードマウスにおけるヒト胃癌ＮＣＩ－Ｎ８７細胞株の移植腫瘍モデルの腫瘍成長に良好な阻害効果を及ぼすことが示され、この効果は、化合物Ｍよりも良好であった。
【0121】
実施例１９ ヌードマウスにおけるＨＴ－２９移植腫瘍モデルのインビボ有効性評価
試験試料：化合物Ｍ、化合物ａ、化合物ｂ、化合物ｃ及び化合物ｄ。
試験試料：化合物Ｍ、化合物ａ、化合物ｂ、化合物ｃ及び化合物ｄ。
【0122】
試薬：ＭｃＣｏｙ ５Ａ培養液、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、トリプシン、ペニシリン－ストレプトマイシン二重抗体、注射用水、生理食塩水、乳酸及びソルビトール。
【0123】
移植腫瘍株：ヒト結腸癌ＨＴ－２９、中国科学院（ＣＡＳ）のＣｅｌｌ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅから得て、本発明者らの研究室で液体窒素中に凍結保存した。
【0124】
細胞培養：５％ＣＯ２及び３７℃下、１０％ウシ胎仔血清を含有するＭｃＣｏｙ ５Ａ培養液でＨＴ－２９細胞を常法どおり培養し、０．２５％トリプシンによる消化に供し、継代し；細胞成長に応じて、細胞は、１：４～１：６の継代比で週２～３回継代した。
【0125】
動物モデルの調製：対数増殖期のＨＴ－２９細胞を収集し、カウントし、無血清ＭｃＣｏｙ ５Ａ培地に再懸濁し、細胞の濃度を４×１０７細胞／ｍＬに調整し；細胞をピペッティングにより均一に分散させ、次に５０ｍＬ遠心管に移し、次にそれをアイスボックスに置き；１ｍＬシリンジを使用して細胞懸濁液を吸引し、ヌードマウスの右腋窩前部に皮下注射し、各マウスに１００μＬ（４×１０６細胞／マウス）を接種することにより、ヌードマウスにＨＴ－２９移植腫瘍モデルを樹立した。
【0126】
投与頻度及び投与量：各群について週１回、合計４回投与し（ＱＷ×４）、各投与量は、２００ｍｇ・ｋｇ－１であった。
【0127】
結果を表３に示す。
【0128】
【表4】
【0129】
これらの実験結果から、本発明の化合物がヌードマウスにおけるヒト結腸癌ＨＴ－２９細胞株の移植腫瘍モデルのインビボ腫瘍成長に良好な阻害効果を及ぼすことが示され、この効果は、化合物Ｍよりも良好であった。
【0130】
実施例２０ ヌードマウスにおけるヒト膵癌ＭＩＡ Ｐａｃａ－２の異種移植モデルに対する阻害効果
試験試料：化合物Ｍ、化合物ａ、化合物ｂ、化合物ｃ及び化合物ｄ。
試験試料：化合物Ｍ、化合物ａ、化合物ｂ、化合物ｃ及び化合物ｄ。
【0131】
移植腫瘍株：ヒト膵癌ＭＩＡ Ｐａｃａ－２、Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、中国科学院から購入した。
【0132】
細胞培養：１０％ウシ胎仔血清ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ、ＵＳＡ）及び２．５％ＨＳを含有するＤＭＥＭでＭＩＡ Ｐａｃａ－２細胞を培養し；及び細胞を５％ＣＯ２、３７℃のインキュベーターに置いた。
【0133】
動物モデルの調製：細胞接種法を用いてヌードマウスにヒト膵癌ＭＩＡ Ｐａｃａ－２の皮下移植腫瘍モデルを樹立し；対数増殖期の腫瘍細胞を収集し、カウントし、１×ＰＢＳに再懸濁して、細胞懸濁液の濃度を３×１０７細胞／ｍｌに調整した。１ｍｌシリンジ（４ゲージ針）を使用してヌードマウスの右背部に腫瘍細胞を皮下接種した（３×１０６細胞／０．１ｍｌ／マウス）。
【0134】
投与頻度及び投与量：各群について週１回、合計３回投与し（ＱＷ×３）、各投与量は、６ｍｇ・ｋｇ－１であった。
【0135】
結果を表４に示す。
【0136】
【表5】
【0137】
これらの実験結果から、本発明の化合物がヌードマウスにおけるヒト膵癌ＭＩＡ Ｐａｃａ－２の移植腫瘍に良好な阻害効果を及ぼすことが示され、この効果は、化合物Ｍよりも良好であった。
【0138】
実施例２１ ヌードマウスにおけるヒト小細胞肺癌細胞ＮＣＩ－Ｈ４４６の異種移植モデルに対する阻害効果
試験試料：イリノテカン、ｎｋｔｒ－１０２、化合物ａ、化合物ｂ、化合物ｃ及び化合物ｄ。
試験試料：イリノテカン、ｎｋｔｒ－１０２、化合物ａ、化合物ｂ、化合物ｃ及び化合物ｄ。
【0139】
イリノテカン（原薬）を購入した。ｎｋｔｒ－１０２の調製方法は、以下を含む。
【0140】
実施例４のＢＰ１４３ｂ０３（８２９ｍｇ、４．５当量）を２５０ｍＬ反応フラスコに加え；ＤＣＭ（５０ｍＬ）及びトリエチルアミン（２２１ｍｇ、９．０当量）を加え、溶解させ；及び次に４アーム－ＰＥＧ２０Ｋ－ＳＣＭ（５．００ｇ、１．０当量）を反応フラスコに加えた。反応に明らかな進行がなくなったことをＨＰＬＣによりモニタした後、約２０ｍＬのＤＣＭを減圧下で留去し；この溶液を３００ｍＬのＴＢＭＥに注入し、撹拌し、沈殿させて、ろ過すると、５．４ｇの粗製生成物が得られ、これを分取ＨＰＬＣにより精製し、脱塩し、希塩酸で約ｐＨ５～６に調整し、凍結乾燥して、２．７１ｇのｎｋｔｒ－１０２を淡緑色粉末として得た。
【0141】
イリノテカンの投与製剤の調製：１２．０ｍｇのイリノテカンを秤量し；０．１５ｍＬの１％乳酸を加え、ボルテックスを実施して薬物を完全に溶解させ；次に２．８５ｍＬの１％ソルビトール水溶液を加え、混合物をボルテックスして溶液を均一に混合し、ここで、１％乳酸と１％ソルビトール水溶液との比は、約５：９５（ｖ／ｖ）であり、及びイリノテカンの有効濃度は、４．０ｍｇ・ｍＬ－１であった。
【0142】
ｎｋｔｒ－１０２の投与製剤の調製：各投与前に１０１．５ｍｇのｎｋｔｒ－１０２を正確に秤量し；２．５ｍＬの生理食塩水を加え、ボルテックスを実施して薬物を完全に溶解させ；及び溶液中のイリノテカンの有効濃度は、４．０ｍｇ・ｍＬ－１であった。
【0143】
移植腫瘍株：小細胞肺癌細胞ＮＣＩ－Ｈ４４６、中国科学院のＣｅｌｌ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅから得た。
【0144】
細胞培養：５％ＣＯ２、３７℃及び飽和湿度下において、１０％ウシ胎仔血清を含有するＲＰＭＩ－１６４０培養液でＮＣＩ－Ｈ４４６細胞を常法どおり培養し、細胞成長に応じて、細胞を０．２５％トリプシンによる消化に供し、１：３～１：４の継代比で週２～４回継代した。
【0145】
動物モデルの調製：細胞接種法を用いてヌードマウスに皮下移植腫瘍モデルを樹立し；対数増殖期のＮＣＩ－Ｈ４４６細胞を収集し、カウントし、５０％のＲＰＭＩ－１６４０及び５０％のマトリゲルを含有する最少培地に再懸濁し；及び細胞の濃度を４×１０７細胞／ｍＬに調整し；細胞をピペッティングにより均一に分散させ、次に５０ｍＬ遠心管に移し、次にそれをアイスボックスに置き；好適なシリンジを使用して細胞懸濁液を吸引し、ヌードマウスの右腋窩前部に皮下注射し、各マウスに２００μＬ（８×１０６細胞／マウス）を接種することにより、ヌードマウスにＮＣＩ－Ｈ４４６移植腫瘍モデルを樹立した。
【0146】
マウスへの投与は、群分け当日の初回投与を含む。第１の群は、溶媒対照群であり、ここで、尾静脈注射によって生理食塩水を投与した。群２～７にそれぞれ試験試料：イリノテカン、ｎｋｔｒ１０２、化合物Ｍ、化合物ａ、化合物ｂ、化合物ｃ及び化合物ｄを尾静脈注射によって投与し；各群について週１回、合計３回投与し（ＱＷ×３）、各投与量は、６ｍｇ・ｋｇ－１であった。
【0147】
結果を表５に示す。
【0148】
【表6】
【0149】
これらの実験結果から、本発明の化合物がヌードマウスにおけるヒト小細胞肺癌ＮＣＩ－Ｈ４４６の移植腫瘍に良好な阻害効果を及ぼすことが示され、この効果は、イリノテカン及びｎｋｔｒ１０２よりも良好であった。
【配列表】
【国際調査報告】