(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-04-12
(54)【発明の名称】抗ＢＡＧ２抗体および癌を治療する方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20220405BHJP
C07K 16/18 20060101ALI20220405BHJP
C07K 16/46 20060101ALI20220405BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20220405BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20220405BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20220405BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20220405BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20220405BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20220405BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220405BHJP
A61P 35/04 20060101ALI20220405BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20220405BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20220405BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20220405BHJP
A61K 38/20 20060101ALI20220405BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20220405BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13
C07K16/18 ZNA
C07K16/46
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12P21/08
A61P35/00
A61P35/04
A61P35/02
A61P43/00 121
A61K45/00
A61K38/20
A61K39/395 N
A61K39/395 D
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021547311
(86)(22)【出願日】2020-02-12
(85)【翻訳文提出日】2021-10-05
(86)【国際出願番号】 IB2020051136
(87)【国際公開番号】W WO2020165794
(87)【国際公開日】2020-08-20
(31)【優先権主張番号】10-2019-0016347
(32)【優先日】2019-02-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(31)【優先権主張番号】10-2019-0016359
(32)【優先日】2019-02-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＢＲＩＪ
(71)【出願人】
【識別番号】521355289
【氏名又は名称】メドパクト，インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100114775
【弁理士】
【氏名又は名称】高岡 亮一
(74)【代理人】
【識別番号】100121511
【弁理士】
【氏名又は名称】小田 直
(74)【代理人】
【識別番号】100202751
【弁理士】
【氏名又は名称】岩堀 明代
(74)【代理人】
【識別番号】100208580
【弁理士】
【氏名又は名称】三好 玲奈
(74)【代理人】
【識別番号】100191086
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 香元
(72)【発明者】
【氏名】キム，セオン ジン
(72)【発明者】
【氏名】カン，ドン ウー
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4C084
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG26
4B064AG27
4B064CA19
4B064CC24
4B064CE12
4B064DA01
4B065AA01X
4B065AA57X
4B065AA83X
4B065AA87X
4B065AA87Y
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065AB02
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA25
4B065CA44
4C084AA01
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4C084AA19
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4C084DA14
4C084DA15
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4C084MA23
4C084MA24
4C084MA31
4C084MA35
4C084MA37
4C084MA52
4C084MA55
4C084MA56
4C084MA58
4C084MA59
4C084MA60
4C084MA66
4C084NA05
4C084NA14
4C084ZB072
4C084ZB261
4C084ZB262
4C084ZB271
4C084ZB272
4C084ZC751
4C085AA13
4C085AA14
4C085BB11
4C085CC23
4C085EE01
4C085EE03
4C085GG01
4C085GG02
4C085GG03
4C085GG04
4C085GG05
4C085GG06
4C085GG08
4H045AA10
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA40
4H045DA75
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA74
4H045GA26
(57)【要約】
本出願は、ＢＡＧ２ポリペプチドまたはそのフラグメントに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント、およびその癌を処置する方法を開示する。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＢＡＧ２ポリペプチドまたはそのフラグメントに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項2】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３のアミノ酸配列からなる相補性決定領域（ＶＨ－ＣＤＲ）１と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９のアミノ酸配列からなるＶＨ－ＣＤＲ２と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５のアミノ酸配列からなるＶＨ－ＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１のアミノ酸配列からなる相補性決定領域（ＶＬ－ＣＤＲ）１と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７のアミノ酸配列からなるＶＬ－ＣＤＲ２と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３のアミノ酸配列からなるＶＬ－ＣＤＲ３とを含む軽鎖可変領域、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４のアミノ酸配列からなるＶＨ－ＣＤＲ１と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０のアミノ酸配列からなるＶＨ－ＣＤＲ２と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６のアミノ酸配列からなるＶＨ－ＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２のアミノ酸配列からなるＶＬ－ＣＤＲ１と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８のアミノ酸配列からなるＶＬ－ＣＤＲ２と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４のアミノ酸配列からなるＶＬ－ＣＤＲ３とを含む軽鎖可変領域、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５のアミノ酸配列からなるＶＨ－ＣＤＲ１と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１のアミノ酸配列からなるＶＨ－ＣＤＲ２と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７のアミノ酸配列からなるＶＨ－ＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３のアミノ酸配列からなるＶＬ－ＣＤＲ１と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９のアミノ酸配列からなるＶＬ－ＣＤＲ２と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５のアミノ酸配列からなるＶＬ－ＣＤＲ３とを含む軽鎖可変領域、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６のアミノ酸配列からなるＶＨ－ＣＤＲ１と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２のアミノ酸配列からなるＶＨ－ＣＤＲ２と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８のアミノ酸配列からなるＶＨ－ＣＤＲ３と、を含む重鎖可変領域、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４のアミノ酸配列からなるＶＬ－ＣＤＲ１と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０のアミノ酸配列からなるＶＬ－ＣＤＲ２と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６のアミノ酸配列からなるＶＬ－ＣＤＲ３と、を含む軽鎖可変領域、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７のアミノ酸配列からなるＶＨ－ＣＤＲ１と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３のアミノ酸配列からなるＶＨ－ＣＤＲ２と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９のアミノ酸配列からなるＶＨ－ＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５のアミノ酸配列からなるＶＬ－ＣＤＲ１と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１のアミノ酸配列からなるＶＬ－ＣＤＲ２と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７のアミノ酸配列からなるＶＬ－ＣＤＲ３とを含む軽鎖可変領域、ならびに
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８のアミノ酸配列からなるＶＨ－ＣＤＲ１と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４のアミノ酸配列からなるＶＨ－ＣＤＲ２と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０のアミノ酸配列からなるＶＨ－ＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６のアミノ酸配列からなるＶＬ－ＣＤＲ１と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２のアミノ酸配列からなるＶＬ－ＣＤＲ２と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８のアミノ酸配列からなるＶＬ－ＣＤＲ３とを含む軽鎖可変領域、
を含む、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項3】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１～２６から選択される任意の１種のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７～３２から選択される任意の１種のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
を含む、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項4】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１の重鎖可変領域およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７の軽鎖可変領域；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２の重鎖可変領域およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８の軽鎖可変領域；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３の重鎖可変領域およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９の軽鎖可変領域；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４の重鎖可変領域およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０の軽鎖可変領域；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５の重鎖可変領域およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１の軽鎖可変領域；もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６の重鎖可変領域およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２の軽鎖可変領域；またはそれらの組み合わせである、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項5】
モノクローナル抗体である、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項6】
検出可能な標識または検出可能なシグナルを発することができる標識を付けられる、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項7】
前記抗体が、ヒト化される、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項8】
ホットスポットが、前記抗体のＣＤＲの外部および内部で操作される（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｏｕｔ ｉｎ）、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項9】
前記モノクローナル抗体が、一価、Ｆａｂ、または一本鎖可変領域フラグメント抗体（ｓｃＦｖ）である、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項10】
前記モノクローナル抗体が、二価、二重特異性、または三重特異性である、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項11】
前記モノクローナル抗体が、化学物質またはタンパク質に融合される、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項12】
前記モノクローナル抗体が、毒素またはサイトカインに融合される、請求項１１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項13】
アクセッション番号ＫＣＴＣ １３７３７ＢＰ、ＫＣＴＣ １３７３８ＢＰ、ＫＣＴＣ １３７３９ＢＰ、ＫＣＴＣ １３７４０ＢＰ、ＫＣＴＣ １３７４１ＢＰ、ＫＣＴＣ １３７４２ＢＰ、ＫＣＴＣ １３７４３ＢＰ、ＫＣＴＣ １３７４４ＢＰ、ＫＣＴＣ １３７４５ＢＰおよびＫＣＴＣ １３７４６ＢＰで寄託されたハイブリドーマ細胞から選択されるハイブリドーマ細胞により生成される、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項14】
複数の抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項15】
請求項１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントをコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド。
【請求項16】
ベクターである、請求項１５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項17】
検出可能な標識または検出可能なシグナルを発することができる標識が、前記ポリヌクレオチドとコンジュゲートされる、請求項１６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項18】
請求項１５に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
【請求項19】
請求項１８に記載の宿主細胞を培養すること；および前記得られた培養物から抗体またはその抗原結合フラグメントを分離すること、
を含む、抗体またはその抗原結合フラグメントを生成する方法。
【請求項20】
前記抗体またはその抗原結合フラグメントを印付けることをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
個体における原発または転移癌である癌を処置するための方法であって、請求項１に記載の抗ＢＡＧ２またはその抗原結合フラグメントをそれを必要とする前記個体に投与することを含む、方法。
【請求項22】
既存の治療薬を共投与することまたは連続で投与することを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
前記既存の治療が、癌免疫療法薬である、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
前記免疫療法薬が、免疫チェックポイント分子への阻害薬である、請求項２３に記載の方法。
【請求項25】
前記免疫チェックポイント分子が、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、またはＣＴＬＡ－４である、請求項２４に記載の方法。
【請求項26】
前記免疫療法薬が、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、インターロイキン２（ＩＬ－２）、インターロイキン３（ＩＬ－３）、インターロイキン１２（ＩＬ－１２）、インターロイキン１５（ＩＬ－１５）、Ｂ７－１（ＣＤ８０）、Ｂ７－２（ＣＤ８６）、４－１ＢＢリガンド、ＧＩＴＲＬ、ＯＸ－４０Ｌ、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２７抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＧＩＴＲ抗体、抗ＯＸ－４０抗体、抗４－１ＢＢ抗体、抗ＬＡＧ－３抗体、および抗ＴＩＭ－３抗体からなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項27】
前記癌が、例えば、乳癌、大腸癌、頭頸部癌、結腸癌、皮膚癌、膵臓癌、肺癌、胃癌、前立腺癌、膀胱癌、尿道癌、肝臓癌、腎臓癌、淡明細胞肉腫、黒色腫、脳脊髄腫瘍、脳癌、胸腺、中皮腫、食道癌、胆管癌、精巣癌、胚細胞腫瘍、甲状腺癌、副甲状腺癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、リンパ腫、骨髄異形成症候群（ＭＯＳ）、骨髄線維症、急性白血病、慢性白血病、多発性骨髄腫、ホジキン病、内分泌癌、および肉腫から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項28】
前記癌が、乳癌、肺癌、黒色腫、大腸癌、または膵臓癌である、請求項２７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
発明の背景
１．発明の分野
本開示は、ＢＡＧ２ポリペプチドまたはそのフラグメントに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。本出願はまた、本発明の組成物を用いた抗癌治療薬に関する。
１．発明の分野
本開示は、ＢＡＧ２ポリペプチドまたはそのフラグメントに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。本出願はまた、本発明の組成物を用いた抗癌治療薬に関する。
【背景技術】
【0002】
２．一般的背景および最新技術
コシャペロンＢｃｌ－２関連アタノジーン（ＢＡＧ）タンパク質ファミリーは、細胞内タンパク質フォールディング、ストレス応答、神経細胞分化、アポトーシス、および細胞増殖を含む種々の生理学的プロセスを媒介し、様々な協調的タンパク質に機能的に結合する。抗アポトーシス活性を有するＢＡＧドメインファミリーのメンバーの１種であるＢＡＧ２は、シャペロン関連ユビキチンリガーゼであるＨｓｃ７０相互作用タンパク質のＣ－末端（ＣＨＩＰ）の負の調節因子である。ＣＨＩＰ活性の阻害を通したタンパク質調節におけるＢＡＧ２の主な役割は、ＰＩＮＫ１およびＣＦＴＲなどのシャペロンに関係するタンパク質の安定化を通して神経変性疾患および常染色体劣性遺伝疾患に関連する。ＢＡＧ２の発現がプロテアソーム阻害剤に誘導されたアポトーシスを増加させ、甲状腺癌細胞がプロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２に暴露されるとＢＡＧ２ノックダウンがアポトーシスを部分的に阻害する、というように、ＢＡＧ２がアポトーシス促進活性を有することが報告されている。ＢＡＧタンパク質は、ＢＡＧ２－Ｈｓｐ７０複合体の形成とは別に、種々の結合パートナーと機能的に相互作用し、ストレスシグナル伝達、細胞分裂、アポトーシスおよび細胞分化などの様々な細胞プロセスを調節する。様々な変異体Ｋ－Ｒａｓに誘導された腫瘍において、ＢＡＧ２の過剰発現が強力な腫瘍遺伝子であるＳＴＫ３３タンパク質の安定化を促進し、これにより腫瘍の発達を促進することも、報告されている。加えて、ＢＡＧ２タンパク質の発現および場所が、乳癌の進行または転移の間に癌細胞の組織病理学的および分子遺伝子学的病態に応じて変動し得ることが、示唆されている。ＢＡＧ２タンパク質が、腫瘍形成の間に、タンパク質分解酵素であるカテプシンＢとの相互作用により細胞から分泌されることが見出されており、かつＢＡＧ２タンパク質の損失が、乳癌の動物モデルにおいて癌形成および肺への転移を完全に阻害することが、確認されている。結果として、ＢＡＧ２タンパク質阻害剤の開発は、癌患者の処置および生存に寄与するであろう。
コシャペロンＢｃｌ－２関連アタノジーン（ＢＡＧ）タンパク質ファミリーは、細胞内タンパク質フォールディング、ストレス応答、神経細胞分化、アポトーシス、および細胞増殖を含む種々の生理学的プロセスを媒介し、様々な協調的タンパク質に機能的に結合する。抗アポトーシス活性を有するＢＡＧドメインファミリーのメンバーの１種であるＢＡＧ２は、シャペロン関連ユビキチンリガーゼであるＨｓｃ７０相互作用タンパク質のＣ－末端（ＣＨＩＰ）の負の調節因子である。ＣＨＩＰ活性の阻害を通したタンパク質調節におけるＢＡＧ２の主な役割は、ＰＩＮＫ１およびＣＦＴＲなどのシャペロンに関係するタンパク質の安定化を通して神経変性疾患および常染色体劣性遺伝疾患に関連する。ＢＡＧ２の発現がプロテアソーム阻害剤に誘導されたアポトーシスを増加させ、甲状腺癌細胞がプロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２に暴露されるとＢＡＧ２ノックダウンがアポトーシスを部分的に阻害する、というように、ＢＡＧ２がアポトーシス促進活性を有することが報告されている。ＢＡＧタンパク質は、ＢＡＧ２－Ｈｓｐ７０複合体の形成とは別に、種々の結合パートナーと機能的に相互作用し、ストレスシグナル伝達、細胞分裂、アポトーシスおよび細胞分化などの様々な細胞プロセスを調節する。様々な変異体Ｋ－Ｒａｓに誘導された腫瘍において、ＢＡＧ２の過剰発現が強力な腫瘍遺伝子であるＳＴＫ３３タンパク質の安定化を促進し、これにより腫瘍の発達を促進することも、報告されている。加えて、ＢＡＧ２タンパク質の発現および場所が、乳癌の進行または転移の間に癌細胞の組織病理学的および分子遺伝子学的病態に応じて変動し得ることが、示唆されている。ＢＡＧ２タンパク質が、腫瘍形成の間に、タンパク質分解酵素であるカテプシンＢとの相互作用により細胞から分泌されることが見出されており、かつＢＡＧ２タンパク質の損失が、乳癌の動物モデルにおいて癌形成および肺への転移を完全に阻害することが、確認されている。結果として、ＢＡＧ２タンパク質阻害剤の開発は、癌患者の処置および生存に寄与するであろう。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0003】
しかし、これらの知見にもかかわらず、癌の進行および転移におけるＢＡＧ２の役割は、明確には知られていない。加えて、詳細な試験は、ＢＡＧ２モノクローナル抗体で実行されていない。したがって、ＢＡＧ２ポリペプチドまたはそのフラグメントに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを開発する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【0004】
発明の概要
本発明のこれらおよび他の目的は、本発明の以下の記載、それに付属の参照図面および添付の特許請求の範囲からより完全に理解されよう。
本発明のこれらおよび他の目的は、本発明の以下の記載、それに付属の参照図面および添付の特許請求の範囲からより完全に理解されよう。
【0005】
一態様は、ＢＡＧ２ポリペプチドまたはそのフラグメントに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
【0006】
別の態様は、抗体またはその抗原結合フラグメントをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【0007】
別の態様は、このポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する。
【0008】
別の態様は、この抗体またはその抗原結合フラグメントを生成する方法を提供する。
【0009】
追加の態様は、一部は以下の記載に表され、一部は以下の記載から明白となるか、または本開示で提示された実施形態の実践により学習され得る。
【0010】
一態様は、ＢＡＧ２ポリペプチドまたはそのフラグメントに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
【0011】
ＢＡＧ２ポリペプチドは、哺乳動物に由来してよい。哺乳動物は、ヒト（ホモ・サピエンス）、マウス（ハツカネズミ）、サル、ウシ、またはウマであってよい。ＢＡＧ２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９のアミノ酸配列を含んでよい。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９のアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ参照ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：ＮＭ＿００４２８２．４に対応する配列である。ＢＡＧ２タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９のアミノ酸配列と生物学的に同等の活性を有する変異体を含むが、それらのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９のアミノ酸配列と一致しない場合がある。ＢＡＧ２ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９の配列に対して少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでよい。ＢＡＧ２タンパク質は、少なくとも１つのアミノ酸残基、少なくとも２つのアミノ酸残基、少なくとも３つのアミノ酸残基、少なくとも４つのアミノ酸残基、少なくとも５つのアミノ酸残基、少なくとも６つのアミノ酸残基、または少なくとも７つのアミノ酸残基以外は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９と同じ配列を有するポリペプチドであってよい。本明細書において、「ポリペプチド」は、「タンパク質」と互換的に用いられてよい。
【0012】
抗体は、抗原性部位に対する特異的免疫グロブリンを指す。抗体は、ＢＡＧ２ポリペプチドまたはそのフラグメントに特異的に結合するポリペプチドまたはポリペプチドの組み合わせを指す。抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、または組換え抗体、例えばＳｃＦｖフラグメント、ダイアボディ、一本鎖抗体および同様のものを包含してよく、全ての免疫グロブリン抗体を包含してよい。抗体は、２つの完全長軽鎖および２つの完全長重鎖を有する抗体の完全形態を包含してよく、かつ２つの軽鎖および２つの重鎖を有する完全形態のインタクト抗体の構造が存在しないにもかかわらず、特異的抗原結合部位、即ち結合ドメインを有することの包含により、抗原結合機能を保持する抗体分子の機能的フラグメントを含んでもよい。
【0013】
抗原結合フラグメントは、免疫グロブリンの全構造のフラグメントであり、それに抗原が結合できる部分を含むポリペプチドの部分を指す。例えば、その抗原結合フラグメントは、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ＦｖＦ（ａｂ’）２、またはそれらの組み合わせであってよい。
【0014】
５種の重鎖γ、δ、α、μおよびεが存在し、重鎖は、抗体の型を決定してよい。αおよびγはそれぞれ、４５０のアミノ酸を含み、μおよびεはそれぞれ、５５０のアミノ酸を含む。重鎖は、２つの領域、即ち、可変領域および定常領域を有する。
【0015】
２種の軽鎖カッパおよびラムダが存在し、約２１１のアミノ酸～約２１７のアミノ酸を含んでよい。軽鎖は、定常領域および可変領域を有してよい。
【0016】
抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３のアミノ酸配列からなる相補性決定領域（ＶＨ－ＣＤＲ）１と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９のアミノ酸配列からなるＶＨ－ＣＤＲ２と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５のアミノ酸配列からなるＶＨ－ＣＤＲ３、を含む重鎖可変領域、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１のアミノ酸配列からなる相補性決定領域（ＶＬ－ＣＤＲ）１と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７のアミノ酸配列からなるＶＬ－ＣＤＲ２と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３のアミノ酸配列からなるＶＬ－ＣＤＲ３、を含む軽鎖可変領域；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４のアミノ酸配列からなるＶＨ－ＣＤＲ１と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０のアミノ酸配列からなるＶＨ－ＣＤＲ２と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６のアミノ酸配列からなるＶＨ－ＣＤＲ３、を含む重鎖可変領域、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２のアミノ酸配列からなるＶＬ－ＣＤＲ１と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８のアミノ酸配列からなるＶＬ－ＣＤＲ２と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４のアミノ酸配列からなるＶＬ－ＣＤＲ３、を含む軽鎖可変領域；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５のアミノ酸配列からなるＶＨ－ＣＤＲ１と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１のアミノ酸配列からなるＶＨ－ＣＤＲ２と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７のアミノ酸配列からなるＶＨ－ＣＤＲ３、を含む重鎖可変領域、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３のアミノ酸配列からなるＶＬ－ＣＤＲ１と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９のアミノ酸配列からなるＶＬ－ＣＤＲ２と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５のアミノ酸配列からなるＶＬ－ＣＤＲ３、を含む軽鎖可変領域；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６のアミノ酸配列からなるＶＨ－ＣＤＲ１と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２のアミノ酸配列からなるＶＨ－ＣＤＲ２と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８のアミノ酸配列からなるＶＨ－ＣＤＲ３、を含む重鎖可変領域、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４のアミノ酸配列からなるＶＬ－ＣＤＲ１と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０のアミノ酸配列からなるＶＬ－ＣＤＲ２と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６のアミノ酸配列からなるＶＬ－ＣＤＲ３、を含む軽鎖可変領域；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７のアミノ酸配列からなるＶＨ－ＣＤＲ１と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３のアミノ酸配列からなるＶＨ－ＣＤＲ２と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９のアミノ酸配列からなるＶＨ－ＣＤＲ３、を含む重鎖可変領域、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５のアミノ酸配列からなるＶＬ－ＣＤＲ１と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１のアミノ酸配列からなるＶＬ－ＣＤＲ２と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７のアミノ酸配列からなるＶＬ－ＣＤＲ３、を含む軽鎖可変領域；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８のアミノ酸配列からなるＶＨ－ＣＤＲ１と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４のアミノ酸配列からなるＶＨ－ＣＤＲ２と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０のアミノ酸配列からなるＶＨ－ＣＤＲ３、を含む重鎖可変領域、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６のアミノ酸配列からなるＶＬ－ＣＤＲ１と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２のアミノ酸配列からなるＶＬ－ＣＤＲ２と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８のアミノ酸配列からなるＶＬ－ＣＤＲ３、を含む軽鎖可変領域；またはそれらの組み合わせを含んでよい。
【0017】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９中の６番目および７番目のＸａａは、グリシン（Ｇｌｙ）またはアラニン（Ａｌａ）であってよい。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５中の２番目のＸａａは、チロシン（Ｔｙｒ）またはヒスチジン（Ｈｉｓ）であってよい。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１中の８番目のＸａａは、セリン（Ｓｅｒ）またはトレオニン（Ｔｈｒ）であってよい。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７中の１２番目のＸａａは、チロシン（Ｔｙｒ）またはヒスチジン（Ｈｉｓ）であってよい。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３中の３番目のＸａａは、メチオニン（Ｍｅｔ）またはイソロイシン（ｌｉｅ）であってよい。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９中の２番目のＸａａは、ＡｌａまたはＳｅｒであってよい。
【0018】
抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１～２６から選択される任意の１種のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７～３２から選択される任意の１種のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；またはその重鎖可変領域およびその軽鎖可変領域を含んでよい。
【0019】
抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１の重鎖可変領域およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７の軽鎖可変領域；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２の重鎖可変領域およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８の軽鎖可変領域；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３の重鎖可変領域およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９の軽鎖可変領域；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４の重鎖可変領域およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０の軽鎖可変領域；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５の重鎖可変領域およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１の軽鎖可変領域；もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６の重鎖可変領域およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２の軽鎖可変領域；またはそれらの組み合わせを含んでよい。
【0020】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１中の５６番目のＸａａおよび５７番目のＸａａは、それぞれＧｌｙまたはＡｌａであってよい。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３において、１番目のＸａａは、グルタミン（Ｇｉｎ）またはグルタミン酸（Ｇｌｕ）であってよく、７番目のＸａａは、Ｓｅｒまたはプロリン（ｐｒａｌｉｎｅ）（Ｐｒｏ）であってよく、１２番目のＸａａは、バリン（Ｖａｌ）またはアラニン（Ａｌａ）であってよく、２７番目のＸａａは、ＴｙｒまたはＨｉｓであってよく、５８番目のＸａａは、ＳｅｒまたはＴｈｒであってよく、６１番目のＸａａは、アスパラギン（Ａｓｎ）またはＳｅｒであってよく、７４番目のＸａａは、アルギニン（Ａｒｇ）またはリシン（Ｌｙｓ）であってよく、８３番目のＸａａは、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）またはロイシン（Ｌｅｕ）であってよく、９２番目のＸａａは、ＧｌｙまたはＡｌａであってよく、１０８番目のＸａａは、ＨｉｓまたはＴｙｒであってよい。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７における５３番目のＸａａは、ｌｉｅまたはＰｈｅであってよい。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９において、２３番目のＸａａは、Ｍｅｔまたはｌｉｅであってよく、４５番目のＸａａは、ＡｌａまたはＳｅｒであってよく、７３番目のＸａａは、Ｇｌｕまたはアスパラギン酸（Ａｓｐ）であってよく、１００番目のＸａａは、Ｍｅｔまたはｌｉｅであってよい。
【0021】
抗体またはその抗原結合フラグメントは、複数の抗体またはその抗原結合フラグメントを包含し、Ｎｏ．１の組の１つおよびＮｏ．２の組の１つ；Ｎｏ．１の組の１つおよびＮｏ．３の組の１つ；ならびにＮｏ．２の組の１つおよびＮｏ．３の組の１つ、から選択される抗体の組み合わせであってよい。Ｎｏ．１の組は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１のＶＨおよびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７のＶＬ、ならびにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２のＶＨおよびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８のＶＬを含む、ＢＡＧ２タンパク質の中央領域に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントであってよい。Ｎｏ．２の組は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３のＶＨおよびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９のＶＬ、ならびにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４のＶＨおよびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０のＶＬを含む、ＢＡＧ２タンパク質のＮ－末端領域に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントであってよい。Ｎｏ．３の組は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５のＶＨおよびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１のＶＬ、ならびにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６のＶＨおよびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２のＶＬを含む、ＢＡＧ２タンパク質のＣ－末端領域に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントであってよい。
【0022】
抗体またはその抗原結合フラグメントは、モノクローナル抗体であってよい。
【0023】
抗体またはその抗原結合フラグメントは、検出可能な標識、または検出可能なシグナルを発することができる標識でマーキングされてよい。標識は、抗体に直接的または間接的にコンジュゲートされて標識された抗体またはその抗原結合フラグメントを生成する検出可能な化合物または組成物を指す。標識は、それ自体が検出可能であってよく、検出可能な基質化合物または組成物の化学修飾を触媒してよい。
【0024】
標識は、免疫蛍光標識、化学発光標識、リン光標識、放射性標識、エピトープタグ、アビジン／ビオチン、コロイド金粒子、着色粒子、磁気粒子、クロモフォア標識、ＥＣＬ標識、酵素、または同様のものであってよい。
【0025】
抗体またはその抗原結合フラグメントは、アクセッション番号ＫＣＴＣ １３７３７８Ｐ、ＫＣＴＣ １３７３８８Ｐ、ＫＣＴＣ １３７３９８Ｐ、ＫＣＴＣ １３７４０８Ｐ、ＫＣＴＣ １３７４１８Ｐ、ＫＣＴＣ １３７４２８Ｐ、ＫＣＴＣ １３７４３８Ｐ、ＫＣＴＣ １３７４４８Ｐ、ＫＣＴＣ １３７４５８ＰおよびＫＣＴＣ １３７４６８Ｐで寄託されたハイブリドーマ細胞から選択されるハイブリドーマ細胞により生成されてよい。
【0026】
ハイブリドーマ細胞は、２種の細胞の人工的融合による腫瘍形成能を有するハイブリッド細胞を指し、一般に、Ｂ細胞と免疫化された対象から単離された形質細胞腫細胞とを融合させることにより抗体を連続的に生成するために用いられてよい。本明細書において、ハイブリドーマ細胞はまた、ハイブリッド細胞または融合細胞と称される場合がある。
【0027】
本発明者らは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１のＶＨおよびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７のＶＬ（２Ａ１１、４Ｃ２、８Ｃ４）；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２のＶＨおよびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８のＶＬ（３Ｂ５）；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３のＶＨおよびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９のＶＬ（９Ｂ３、９Ｂ１２、３Ｂ１０）；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４のＶＨおよびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０のＶＬ（１０Ｈ７）；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５のＶＨおよびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１のＶＬ（３Ｇ８）；ならびにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６のＶＨおよびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２のＶＬ（３Ｆ１２）を含む抗ＢＡＧ２抗体、およびそれを生成するハイブリドーマ細胞を同定した。同定された抗ＢＡＧ２抗体は乳癌細胞において抗原－抗体反応を示すことが、確認された。
【0028】
別の態様は、抗体またはその抗原結合フラグメントをコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを提供する。
【0029】
ポリヌクレオチドは、重鎖可変領域をコードするＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～１０からなる群から選択される任意の１つのヌクレオチド配列、および軽鎖可変領域をコードするＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１～２０からなる群から選択される任意の１つのヌクレオチド配列であってよい。
【0030】
ポリヌクレオチドは、ベクターであってよい。ベクターは、細胞内でポリヌクレオチドを複製および／または発現させることにより得られてよい。細胞は、真核細胞または原核細胞であってよい。真核細胞は、哺乳動物細胞、植物細胞、酵母細胞、または昆虫細胞であってよい。哺乳動物は、ヒト、サル、ウサギ、ラット、ハムスターまたはマウスであってよい。原核細胞は、バクテリア細胞であってよい。バクテリアは、Ｅ．コリであってよい。ベクターは、発現ベクターであってよい。発現ベクターにおいて、ポリヌクレオチドは、適当な調節領域に動作可能に連結され、そのためポリヌクレオチドは、宿主細胞中で発現される。調節領域は、プロモーター、エンハンサー、またはターミネーターであってよい。ベクターはまた、選択マーカも含んでよい。ベクターは、ファージ、プラスミド、コスミド、ミニ染色体、ウイルス、またはレトロウイルスベクターであってよい。ベクターは、抗体の重鎖可変領域もしくは軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドを含んでよく、または重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドおよび軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドの両方を含んでよい。
【0031】
ポリヌクレオチドは、検出可能な標識または検出可能なシグナルを発することが可能な標識でコンジュゲートされていてよい。標識は、蛍光色素、リン光色素、放射性同位体、クロモフォア、量子ドット、クエンチャー、磁気ビーズナノ粒子、金ナノ粒子、ナノ蛍光体、ケイ素ナノ粒子、発光特性を有する半導体微粒子、および同様のものであってよい。例えば蛍光色素は、シアニン（シアニン２）、アミドメチルクマリン、フルオロセイン、インドカルボシアニン（シアニン３）、シアニン３．５、テトラメチルローダミン、ローダミンレッド、テキサスレッド、インディアンカルボシアニン（シアニン５）、シアニン５．５、シアニン７、Ｏｙｓｔｅｒおよび同様のものであってよい。例えば、半導体微粒子は、セレン化カドミウム（ｃａｄｍｉｕｍ ｓｅｌｅｎｉｕｍ）（ＣｄＳｅ）、テルル化カドミウム（ｃａｄｍｉｕｍ ｔｅｌｌｕｒｉｕｍ）（ＣｄＴｅ）、インジウムガリウムリン（ＩｎＧａＰ）、銀インジウム亜鉛硫化物（ｓｉｌｖｅｒ ｉｎｄｉｕｍ ｚｉｎｃ ｓｕｌｆｉｄｅ）（ＡｇＩｎＺｎＳ）、または同様のものであってよい。標識とのコンジュゲーション方法は、標識物質をポリヌクレオチド３’末端に結合させる方法、標識物質を５’末端に結合させる方法、または標識物質が結合されたヌクレオチドをポリヌクレオチド中に含める方法であってよい。３’末端または５’末端への標識のコンジュゲーティングは、酵素反応により実施されてよく、酵素は、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ、末端トランスフェラーゼ、ポリＡポリメラーゼ、または同様のものであってよい。標識は、蛍光顕微鏡、走査電子顕微鏡、透過電子顕微鏡、コンピュータ断層撮影、磁気共鳴画像法、または同様のものであってよい。
【0032】
別の態様は、ポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する。
【0033】
ポリヌクレオチドは、上記と同じである。
【0034】
宿主細胞は、それぞれがポリヌクレオチドを含有する、バクテリア細胞、酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞、動物細胞または植物細胞であってよい。バクテリア細胞は、エシェリヒア・コリ（Ｅ．コリ）、ストレプトマイセス属、またはサルモネラ・ティフィムリウムであってよい。酵母細胞は、ピキア・パストリスであってよい。昆虫細胞は、ドロソフィラ、またはスポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｆｔｅｒｒａ）Ｓｆ９細胞であってよい。動物細胞は、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、マウス骨髄腫（ＳＰ２／０）、ヒトリンパ芽球様、ＣＯＳ、マウス骨髄腫（ＮＳＯ）、２９３Ｔ、ウシ（ｂｏｗ）黒色腫細胞、ＨＴ－１０８０、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、ヒト胎児腎臓細胞（ＨＥＫ）、またはＰＥＲＣ．６（ヒト網膜細胞）であってよい。
【0035】
ポリヌクレオチドは、宿主細胞中に導入されてよい。導入は、抗体をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターを宿主細胞に送達する方法を指す。そのような導入は、リン酸カルシウム－ＤＮＡ共沈法、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介トランスフェクション、ポリブレン媒介トランスフェクション、電気ショック、マイクロインジェクション、リポソーム融合、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅおよびプロトプラスト融合を含む、当該技術分野で公知の様々な方法により実行されてよい。加えて、形質導入は、感染によるウイルス粒子を用いた細胞内への標的生成物の送達を指す。加えて、ベクターは、遺伝子ボンバードメントまたは同様のものにより宿主細胞内に導入されてよい。導入はまた、形質転換と称される場合がある。
【0036】
別の態様は、抗体またはその抗原結合フラグメントを生成する方法を提供する。
【0037】
方法は、宿主細胞を培養すること；および得られた培養物から抗体またはその抗原結合フラグメントを分離すること、を含んでいてよい。
【0038】
宿主細胞は、上記のものと同じである。
【0039】
培養は、当該技術分野で公知の適切な培地および培養条件に従って実施されてよい。当業者は、選択された微生物に応じた培地および培養条件を容易に制御し得る。培養方法は、例えばバッチ、連続およびフェドバッチ培養を包含してよい。
【0040】
培地は、様々な炭素供給源、窒素供給源、および微量元素の構成成分を含んでいてよい。
【0041】
炭素供給源は、例えばグルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、デンプン、もしくはセルロースなどの炭水化物；大豆油、ひまわり油、ひまし油もしくはココナッツ油などの脂肪；パルミチン酸、ステアリン酸およびリノール酸などの脂肪酸グリセロール；エタノールなどのアルコール；酢酸などの有機酸；またはそれらの組み合わせであってよい。窒素供給源は、例えばペプトン、酵母エキス、肉エキス、麦芽エキス、コーンスティープリカー（ＣＳＬ）、および大豆小麦（Ｓｏｙｂｅａｎ ｗｈｅａｔ）などの無機窒素供給源、尿素、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムおよび窒素アンモニウムなどの有機窒素供給源、またはそれらの組み合わせを包含してよい。リンの供給源としての培地は、例えばリン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウムおよび対応するナトリウム含有塩、またはマグネシウム抗酸化剤もしくは鉄抗酸化剤などの金属塩を含んでよい。加えて、アミノ酸、ビタミン、適当な前駆体および同様のものが、培地に含まれてよい。培地または個々の構成成分が、培養物にバッチ方式または連続で添加されてよい。
【0042】
加えて、宿主細胞が培養される期間の間、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア、リン酸および硫酸などの化合物が、適切な手法で細菌培養物に添加されて、培養物のｐＨを調整してよい。加えて、宿主細胞の培養の間、脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤を用いて、泡の形成を抑制してよい。
【0043】
細胞は、好気的、微好気的、または嫌気的条件で培養されてよい。微好気的条件は、大気中の酸素レベルより低いレベルの酸素が培地中に溶解されている培養条件を指す。低レベルの酸素は、例えば約０．１％～約１０％、約１％～約９％、約２％～約８％、約３％～約７％、または約４％～約６％であってよい。加えて、微好気的条件は、培地中に溶解された酸素の濃度が、約０．９ｐｐｍ～約３．６ｐｐｍの範囲である条件を包含してよい。培養温度は、例えば、約２０℃～約４５℃、または約２５℃～約４０℃であってよい。インキュベーションは、所望の量の抗体またはその抗原結合フラグメントが標的レベルに達するまで、継続されてよい。
【0044】
分離は、抗体を分離するための当該技術分野で公知の方法により実施されてよい。分離は、遠心分離、濾過、抽出、噴霧、乾燥、蒸発、沈殿、結晶化、電気泳動、分別溶解、およびクロマトグラフィーから選択される１種または複数の工程を実施することを包含してよい。
【0045】
方法は、分離された抗体またはその抗原結合フラグメントを標識することをさらに含んでよい。標識は、免疫蛍光標識、化学発光標識、リン光標識、放射性標識、エピトープタグ、アビジン／ビオチン、金コロイド粒子、着色粒子、磁気粒子、クロモフォア標識、ＥＣＬ標識、酵素、または同様のものであってよい。
【0046】
一態様において、本発明は、個体において原発または転移癌のどちらかである癌を処置するための方法であって、先に議論された抗ＢＡＧ２またはその抗原結合フラグメントを、それを必要とする個体に投与することを含む、方法を対象とする。方法は、既存の治療薬を共投与することまたは連続で投与することを含んでよい。既存の治療は、癌免疫療法薬であってよく、それは、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、またはＣＴＬＡ４などの、免疫チェックポイント分子への阻害剤を含んでよい。免疫療法薬は、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、インターロイキン２（ＩＬ－２）、インターロイキン３（ＩＬ－３）、インターロイキン１２（ＩＬ－１２）、インターロイキン１５（ＩＬ－１５）、Ｂ７－１（ＣＤ８０）、Ｂ７－２（ＣＤ８６）、４－１ＢＢリガンド、ＧＩＴＲＬ、ＯＸ－４０Ｌ、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２７抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＧＩＴＲ抗体、抗ＯＸ－４０抗体、抗４－１ＢＢ抗体、抗ＬＡＧ－３抗体、および抗ＴＩＭ－３抗体であってよい。癌は、乳癌、大腸癌、頭頸部癌、結腸癌、皮膚癌、膵臓癌、肺癌、胃癌、前立腺癌、膀胱癌、尿道癌、肝臓癌、腎臓癌、淡明細胞肉腫、黒色腫、脳脊髄腫瘍、脳癌、胸腺、中皮腫、食道癌、胆管癌、精巣癌、胚細胞腫瘍、甲状腺癌、副甲状腺癌、子宮頸癌、卵巣癌、子宮内膜癌、リンパ腫、骨髄異形成症候群（ＭＯＳ）、骨髄線維症、急性白血病、慢性白血病、多発性骨髄腫、ホジキン病、内分泌癌、および肉腫であってよい。
【0047】
本特許または出願ファイルは、有色で実行された少なくとも１つの図面を含む。有色の図面を有する本特許または特許出願公開のコピーは、要求に応じて、必要な料金の支払いを受けて、特許事務所により提供されよう。
【0048】
本発明は、本明細書の以下に与えられた詳細な記載および添付の図面からより完全に理解され、添付の図面は、例示に過ぎず、このため本発明を限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【0049】
【図1】１０種のマウスハイブリドーマ細胞から生成された抗ＢＡＧ２抗体のウェスタンブロッティングの結果を示す。
【図2A】抗ＢＡＧ２抗体またはそのフラグメントの完全長ＢＡＧ２ポリペプチドについてのウェスタンブロッティングの結果を示す。
【図2B】抗ＢＡＧ２抗体またはそのフラグメントの完全長ＢＡＧ２ポリペプチドについてのウェスタンブロッティングの結果を示す。
【図3】各抗ＢＡＧ２抗体と反応するＢＡＧ２ドメインを示す。
【図4A】乳癌モデルにおける抗ＰＤ－Ｌ１抗体と組み合わせた抗ＢＡＧ２抗体の治療有効性を示す。（ａ）ＢＡＬＢ／ｃマウスに、２×１０５のＥＭＴ６細胞を注射した。腫瘍細胞注射後１２日目から、いくらかのマウスに、抗ＢＡＧ２抗体３Ｂ１０（２００μｇ／マウス）またはアイソタイプ対照抗体を２日に１回、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。１４日目から、いくらかのマウスは、抗ＰＤ－Ｌ１抗体（１００μｇ／マウスｉ．ｐ．）またはアイソタイプ対照抗体の単独注射を２日に１回受けた。実験計画を表す。ｔ検定：データは全て、平均±ＳＥＭ（平均の標準誤差）として表している。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１（対照マウスＩｇＧ２ａ投与群との対比）。
【図4B】乳癌モデルにおける抗ＰＤ－Ｌ１抗体と組み合わせた抗ＢＡＧ２抗体の治療有効性を示す。（ｂおよびｃ）対照マウス（黒色の線、ｎ＝５）、抗ＢＡＧ２抗体３Ｂ１０のみで処置されたマウス（緑色の線、ｎ＝５）、抗ＰＤ－Ｌ１抗体のみで処置されたマウス（青色の線、ｎ＝５）、ならびに３Ｂ１０および抗ＰＤ－Ｌ１抗体の両方で処置されたマウス（赤色の線、ｎ＝５）の腫瘍体積。腫瘍の成長を、モニタリングし、腫瘍体積を、電子キャリパーで１２、１４、１６、１８、２０、２２、および２４日目に測定した。２５日目に、マウスを殺処分した。（ｂ）群内の個々のマウスの腫瘍体積。ｔ検定：データは全て、平均±ＳＥＭ（平均の標準誤差）として表している。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１（対照マウスＩｇＧ２ａ投与群との対比）。
【図4C】乳癌モデルにおける抗ＰＤ－Ｌ１抗体と組み合わせた抗ＢＡＧ２抗体の治療有効性を示す。（ｂおよびｃ）対照マウス（黒色の線、ｎ＝５）、抗ＢＡＧ２抗体３Ｂ１０のみで処置されたマウス（緑色の線、ｎ＝５）、抗ＰＤ－Ｌ１抗体のみで処置されたマウス（青色の線、ｎ＝５）、ならびに３Ｂ１０および抗ＰＤ－Ｌ１抗体の両方で処置されたマウス（赤色の線、ｎ＝５）の腫瘍体積。腫瘍の成長を、モニタリングし、腫瘍体積を、電子キャリパーで１２、１４、１６、１８、２０、２２、および２４日目に測定した。２５日目に、マウスを殺処分した。（ｃ）４つの処置群の平均腫瘍成長。ｔ検定：データは全て、平均±ＳＥＭ（平均の標準誤差）として表している。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１（対照マウスＩｇＧ２ａ投与群との対比）。
【図4D】乳癌モデルにおける抗ＰＤ－Ｌ１抗体と組み合わせた抗ＢＡＧ２抗体の治療有効性を示す。（ｄ）全群のＥＭＴ６腫瘍微小環境（ＴＭＥ）におけるＣＤ３＋／ＣＤ８＋ Ｔ細胞のプロファイル。フローサイトメトリーデータは、２回の独立した実験の平均である。ｔ検定：データは全て、平均±ＳＥＭ（平均の標準誤差）として表している。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１（対照マウスＩｇＧ２ａ投与群との対比）。
【図5A】肺癌モデルにおける抗ＰＤ－Ｌ１抗体と組み合わせた抗ＢＡＧ２抗体の治療有効性を示す。（ａ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、５×１０５のＬＬＣ細胞を注射した。約８日後、平均腫瘍サイズが約６０～８０ｍｍ３に達したら、マウスを、全群の平均腫瘍サイズが類似するように群（ｎ＝５）に選別し、ｉ．ｐ．注射による処置を開始した。腫瘍細胞注射後８日目から、いくらかのマウスに、抗ＢＡＧ２抗体３Ｂ１０（２００μｇ／マウス）、抗ＰＤ－Ｌ１抗体（１００μｇ／マウス）、抗ＰＤ－Ｌ１抗体と３Ｂ１０の組み合わせ、またはアイソタイプ対照抗体を、試験終了まで３日に１回、ｉ．ｐ．注射した。実験計画を表す。ｔ検定：データは全て、平均±ＳＥＭ（平均の標準誤差）として表している。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１（対照マウスＩｇＧ２ａ投与群との対比）。
【図5B】肺癌モデルにおける抗ＰＤ－Ｌ１抗体と組み合わせた抗ＢＡＧ２抗体の治療有効性を示す。（ｂおよびｃ）対照マウス（黒色の線、ｎ＝５）、抗ＢＡＧ２抗体３Ｂ１０のみで処置されたマウス（緑色の線、ｎ＝５）、抗ＰＤ－Ｌ１抗体のみで処置されたマウス（青色の線、ｎ＝５）、ならびに抗ＢＡＧ２および抗ＰＤ－Ｌ１抗体の両方で処置されたマウス（赤色の線、ｎ＝５）の腫瘍体積。腫瘍の成長を、モニタリングし、腫瘍体積を、電子キャリパーで８、１１、１４、１７および２０日目に測定した。２０日目に、マウスを殺処分した。（ｂ）群内の個々のマウスの腫瘍体積。ｔ検定：データは全て、平均±ＳＥＭ（平均の標準誤差）として表している。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１（対照マウスＩｇＧ２ａ投与群との対比）。
【図5C】肺癌モデルにおける抗ＰＤ－Ｌ１抗体と組み合わせた抗ＢＡＧ２抗体の治療有効性を示す。（ｂおよびｃ）対照マウス（黒色の線、ｎ＝５）、抗ＢＡＧ２抗体３Ｂ１０のみで処置されたマウス（緑色の線、ｎ＝５）、抗ＰＤ－Ｌ１抗体のみで処置されたマウス（青色の線、ｎ＝５）、ならびに抗ＢＡＧ２および抗ＰＤ－Ｌ１抗体の両方で処置されたマウス（赤色の線、ｎ＝５）の腫瘍体積。腫瘍の成長を、モニタリングし、腫瘍体積を、電子キャリパーで８、１１、１４、１７および２０日目に測定した。２０日目に、マウスを殺処分した。（ｃ）４つの処置群の平均腫瘍成長。ｔ検定：データは全て、平均±ＳＥＭ（平均の標準誤差）として表している。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１（対照マウスＩｇＧ２ａ投与群との対比）。
【図5D】肺癌モデルにおける抗ＰＤ－Ｌ１抗体と組み合わせた抗ＢＡＧ２抗体の治療有効性を示す。（ｄ）全群のＬＬＣ腫瘍微小環境（ＴＭＥ）におけるＣＤ３＋／ＣＤ８＋ Ｔ細胞のプロファイル。フローサイトメトリーデータは、２回の独立した実験の平均である。ｔ検定：データは全て、平均±ＳＥＭ（平均の標準誤差）として表している。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１（対照マウスＩｇＧ２ａ投与群との対比）。
【図6A】黒色腫の肺転移モデルにおける抗ＰＤ－Ｌ１抗体と組み合わせた抗ＢＡＧ２抗体の治療有効性を示す。（ａ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、２×１０５のＢ１６－Ｆ１０－Ｌｕｃ２細胞を静脈内注射した。ＢＬＩを実施する場合、マウスは、Ｄ－ルシフェリンの腹腔内（ｉ．ｐ．）注射を受け、それらのＢＬＩシグナルをバックグランドとした。黒色腫肺転移腫瘍の成長を、ＢＬＩシグナルにより１４、２０、２６、３２および３８日目にモニタリングし、マウスを、４群の平均ＢＬＩシグナルが類似するように、群（ｎ＝４）に選別した。腫瘍細胞注射後１５日目から、いくらかのマウスに、抗ＢＡＧ２抗体３Ｆ１２（２００μｇ／マウス）またはアイソタイプ対照抗体を４日に１回、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。２３日目から、いくらかのマウスは、抗ＰＤ－Ｌ１（１００μｇ／マウスｉ．ｐ．）またはアイソタイプ対照抗体の単独注射を試験終了まで４日に１回受けた。３９日目に、マウスを殺処分した。実験計画を表す。ｔ検定：データは全て、平均±ＳＥＭ（平均の標準誤差）として表している。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１（対照マウスＩｇＧ２ａ投与群との対比）。
【図6B】黒色腫の肺転移モデルにおける抗ＰＤ－Ｌ１抗体と組み合わせた抗ＢＡＧ２抗体の治療有効性を示す。（ｂ）３８日目に、対照マウス（ｎ＝４）、抗ＰＤ－Ｌ１抗体のみで処置されたマウス（ｎ＝４）、抗ＢＡＧ２抗体３Ｆ１２のみで処置されたマウス（ｎ＝４）、ならびに抗ＢＡＧ２抗体３Ｆ１２および抗ＰＤ－Ｌ１抗体の両方で処置されたマウス（ｎ＝４）の代表的なＢＬＩシグナル。ｔ検定：データは全て、平均±ＳＥＭ（平均の標準誤差）として表している。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１（対照マウスＩｇＧ２ａ投与群との対比）。
【図6C】黒色腫の肺転移モデルにおける抗ＰＤ－Ｌ１抗体と組み合わせた抗ＢＡＧ２抗体の治療有効性を示す。（ｃ）４つの処置群の腫瘍のＢＬＩシグナルの定量。ｔ検定：データは全て、平均±ＳＥＭ（平均の標準誤差）として表している。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１（対照マウスＩｇＧ２ａ投与群との対比）。
【図7A】大腸癌モデルにおける抗ＰＤ－１抗体と組み合わせた抗ＢＡＧ２抗体の治療有効性を示す。（ａ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、５×１０５のＭＣ３８細胞を注射した。約８日後、平均腫瘍サイズが約３０ｍｍ３に達したら、マウスを、全群の平均腫瘍サイズが類似するように群（ｎ＝６）に選別し、ｉ．ｐ．注射による処置を開始した。腫瘍細胞注射後８日目から、いくらかのマウスを、抗ＢＡＧ２抗体３Ｂ１０（２００μｇ／マウス）、抗ＰＤ－１抗体（５０μｇ／マウス）、抗ＰＤ－１抗体と３Ｂ１０の組み合わせ、またはアイソタイプ対照抗体で、試験終了まで４日に１回処置した。実験計画を表す。ｔ検定：データは全て、平均±ＳＥＭ（平均の標準誤差）として表している。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１（対照マウスＩｇＧ２ａ投与群との対比）。
【図7B】大腸癌モデルにおける抗ＰＤ－１抗体と組み合わせた抗ＢＡＧ２抗体の治療有効性を示す。（ｂおよびｃ）対照マウス（黒色の線、ｎ＝６）、抗ＢＡＧ２抗体３Ｂ１０のみで処置されたマウス（緑色の線、ｎ＝６）、抗ＰＤ－１抗体のみで処置されたマウス（青色の線、ｎ＝６）、ならびに抗ＢＡＧ２および抗ＰＤ－１抗体の両方で処置されたマウス（赤色の線、ｎ＝６）の腫瘍体積。腫瘍の成長を、モニタリングし、腫瘍体積を、電子キャリパーで８、１０、１２、１４、１６、１８、および２０日目に測定した。２０日目に、マウスを殺処分した。（ｂ）群内の個々のマウスの腫瘍体積。ｔ検定：データは全て、平均±ＳＥＭ（平均の標準誤差）として表している。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１（対照マウスＩｇＧ２ａ投与群との対比）。
【図7C】大腸癌モデルにおける抗ＰＤ－１抗体と組み合わせた抗ＢＡＧ２抗体の治療有効性を示す。（ｂおよびｃ）対照マウス（黒色の線、ｎ＝６）、抗ＢＡＧ２抗体３Ｂ１０のみで処置されたマウス（緑色の線、ｎ＝６）、抗ＰＤ－１抗体のみで処置されたマウス（青色の線、ｎ＝６）、ならびに抗ＢＡＧ２および抗ＰＤ－１抗体の両方で処置されたマウス（赤色の線、ｎ＝６）の腫瘍体積。腫瘍の成長を、モニタリングし、腫瘍体積を、電子キャリパーで８、１０、１２、１４、１６、１８、および２０日目に測定した。２０日目に、マウスを殺処分した。（ｃ）４つの処置群の平均腫瘍成長。ｔ検定：データは全て、平均±ＳＥＭ（平均の標準誤差）として表している。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１（対照マウスＩｇＧ２ａ投与群との対比）。
【図7D】大腸癌モデルにおける抗ＰＤ－１抗体と組み合わせた抗ＢＡＧ２抗体の治療有効性を示す。（ｄ）全群のＭＣ３８腫瘍微小環境（ＴＭＥ）におけるＣＤ３＋／ＣＤ８＋ Ｔ細胞のプロファイル。フローサイトメトリーデータは、２回の独立した実験の平均である。ｔ検定：データは全て、平均±ＳＥＭ（平均の標準誤差）として表している。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１（対照マウスＩｇＧ２ａ投与群との対比）。
【図8A】肺癌モデルにおける抗ＰＤ－Ｌ１抗体と組み合わせた抗ＢＡＧ２抗体の治療有効性を示す。（ａ）ＢＡＬＢ／ｃマウスに、３×１０５のＣＴ２６細胞を注射した。約１１日後、平均腫瘍サイズが約７０ｍｍ３に達したら、マウスを、全群の平均腫瘍サイズが類似するように群（ｎ＝７）に選別し、ｉ．ｐ．注射による処置を開始した。腫瘍細胞注射後１１日目から、いくつかのマウスを、抗ＢＡＧ２抗体３Ｂ１０（２５０μｇまたは７５０μｇ／マウス）、抗ＰＤ－Ｌ１抗体（２００μｇ／マウス）、抗ＰＤ－Ｌ１抗体と３Ｂ１０（２５０μｇまたは７５０μｇ／マウス）の組み合わせ、またはアイソタイプ対照抗体で、試験終了まで２日に１回処置した。実験計画を表す。ｔ検定：データは全て、平均±ＳＥＭ（平均の標準誤差）として表している。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１（対照マウスＩｇＧ２ａ投与群との対比）。
【図8B】肺癌モデルにおける抗ＰＤ－Ｌ１抗体と組み合わせた抗ＢＡＧ２抗体の治療有効性を示す。（ｂおよびｃ）対照マウス（黒色の線、ｎ＝７）、３Ｂ１０のみで処置されたマウス（２５０μｇ、緑色の線、ｎ＝７）、３Ｂ１０のみで処置されたマウス（７５０μｇ、褐色の線、ｎ＝７）、抗ＰＤ－Ｌ１抗体のみで処置されたマウス（青色の線、ｎ＝７）、３Ｂ１０（２５０μｇ）および抗ＰＤ－Ｌ１抗体の両方で処置されたマウス（赤色の線、ｎ＝７）、ならびに３Ｂ１０（７５０μｇ）および抗ＰＤ－Ｌ１抗体の両方で処置されたマウス（紫色の線、ｎ＝７）の腫瘍体積。腫瘍の成長を、モニタリングし、腫瘍体積を、電子キャリパーで１１、１３、１５、１７、１９、２１および２３日目に測定した。２０日目に、マウスを殺処分した。（ｂ）群内の個々のマウスの腫瘍体積。ｔ検定：データは全て、平均±ＳＥＭ（平均の標準誤差）として表している。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１（対照マウスＩｇＧ２ａ投与群との対比）。
【図8C】肺癌モデルにおける抗ＰＤ－Ｌ１抗体と組み合わせた抗ＢＡＧ２抗体の治療有効性を示す。（ｂおよびｃ）対照マウス（黒色の線、ｎ＝７）、３Ｂ１０のみで処置されたマウス（２５０μｇ、緑色の線、ｎ＝７）、３Ｂ１０のみで処置されたマウス（７５０μｇ、褐色の線、ｎ＝７）、抗ＰＤ－Ｌ１抗体のみで処置されたマウス（青色の線、ｎ＝７）、３Ｂ１０（２５０μｇ）および抗ＰＤ－Ｌ１抗体の両方で処置されたマウス（赤色の線、ｎ＝７）、ならびに３Ｂ１０（７５０μｇ）および抗ＰＤ－Ｌ１抗体の両方で処置されたマウス（紫色の線、ｎ＝７）の腫瘍体積。腫瘍の成長を、モニタリングし、腫瘍体積を、電子キャリパーで１１、１３、１５、１７、１９、２１および２３日目に測定した。２０日目に、マウスを殺処分した。（ｃ）４つの処置群の平均腫瘍成長。ｔ検定：データは全て、平均±ＳＥＭ（平均の標準誤差）として表している。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１（対照マウスＩｇＧ２ａ投与群との対比）。
【図8D】肺癌モデルにおける抗ＰＤ－Ｌ１抗体と組み合わせた抗ＢＡＧ２抗体の治療有効性を示す。（ｄ）全群のＭＣ３８腫瘍微小環境（ＴＭＥ）におけるＣＤ３＋／ＣＤ８＋ Ｔ細胞のプロファイル。フローサイトメトリーデータは、２回の独立した実験の平均である。ｔ検定：データは全て、平均±ＳＥＭ（平均の標準誤差）として表している。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１（対照マウスＩｇＧ２ａ投与群との対比）。
【図9A】膵臓癌モデルにおける抗ＰＤ－１抗体または抗ＣＴＬＡ４抗体と組み合わせた抗ＢＡＧ２抗体の治療有効性を示す。（ａ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、２×１０６のＰＡＮＣ０２－Ｌｕｃ細胞を同所性注射した。約１５日後に、ＢＬＩを実施する場合、マウスは、Ｄ－ルシフェリンの腹腔内（ｉ．ｐ．）注射を受け、それらのＢＬＩシグナルをバックグランドとした。原発膵臓腫瘍の成長を、ＢＬＩシグナルによりモニタリングし、マウスを、１５群の平均ＢＬＩシグナルが類似するように、群（ｎ＝６～７）に選別した。マウスを、２００μｇ（低用量）／マウス（１６日目～３２日目に８回）および４００μｇ（高用量）／マウス（３５日目～３９日目に３回）の４種の抗ＢＡＧ２抗体（３Ｂ１０、３Ｆ１２、３Ｂ５、および３Ｇ８）、またはアイソタイプ対照抗体で試験終了まで週３回処置した。インプラント後２８日目から、マウスを、抗ＰＤ－１抗体（７５μｇ／マウス）もしくは抗ＣＴＬＡ４抗体（２００μｇ／マウス）、またはアイソタイプ対照抗体で試験終了まで週３回処置した。４０日目に、マウスを殺処分した。実験計画を表す。ｔ検定：データは全て、平均±ＳＥＭ（平均の標準誤差）として表している。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１（対照マウスＩｇＧ２ａ投与群との対比）。ｎ．ｓ．（非有意性）。腫瘍特異性リンパ球（ＣＤ３＋／ＣＤ８＋ Ｔ細胞およびＣＤ４５＋／ＣＤ３－／ＣＤ１９＋ Ｂ細胞）；腫瘍特異性ＮＫ細胞（ＣＤ４５＋／ＣＤ３－／ＣＤ４９ｂ＋）；腫瘍特異性骨髄細胞（ＣＤ４５＋／ＣＤ１１ｂ＋／Ｇｒ１－／Ｆ４／８０＋ マクロファージ、ＣＤ４５＋／ＣＤ１１ｂ＋／Ｇｒ１＋ ＭＤＳＣ）；腫瘍特異性間質細胞（ＣＤ４５－／ＣＤ９０．２＋）。
【図9B】膵臓癌モデルにおける抗ＰＤ－１抗体または抗ＣＴＬＡ４抗体と組み合わせた抗ＢＡＧ２抗体の治療有効性を示す。（ｂ）腫瘍成長を、インプラント後１５、２７、および３９日目にＢＬＩシグナルのＩＶＩＳ画像によりモニタリングした。４種の抗ＢＡＧ２抗体のみ（３Ｂ１０、３Ｆ１２、３Ｂ５、および３Ｇ８）またはアイソタイプ対照抗体で処置されたマウス（白色のバー、ｎ＝７／群）、追加的に抗ＰＤ－１抗体で処置されたマウス（黒色のバー、ｎ＝６／群）、および追加的に抗ＣＴＬＡ４抗体で処置されたマウス（灰色のバー、ｎ＝４／群）のＢＬＩシグナル。ｔ検定：データは全て、平均±ＳＥＭ（平均の標準誤差）として表している。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１（対照マウスＩｇＧ２ａ投与群との対比）。ｎ．ｓ．（非有意性）。腫瘍特異性リンパ球（ＣＤ３＋／ＣＤ８＋ Ｔ細胞およびＣＤ４５＋／ＣＤ３－／ＣＤ１９＋ Ｂ細胞）；腫瘍特異性ＮＫ細胞（ＣＤ４５＋／ＣＤ３－／ＣＤ４９ｂ＋）；腫瘍特異性骨髄細胞（ＣＤ４５＋／ＣＤ１１ｂ＋／Ｇｒ１－／Ｆ４／８０＋ マクロファージ、ＣＤ４５＋／ＣＤ１１ｂ＋／Ｇｒ１＋ ＭＤＳＣ）；腫瘍特異性間質細胞（ＣＤ４５－／ＣＤ９０．２＋）。
【図9C】膵臓癌モデルにおける抗ＰＤ－１抗体または抗ＣＴＬＡ４抗体と組み合わせた抗ＢＡＧ２抗体の治療有効性を示す。（ｃ）４０日目の、群内の個々のマウスの原発腫瘍重量（ｍｇ）。ｔ検定：データは全て、平均±ＳＥＭ（平均の標準誤差）として表している。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１（対照マウスＩｇＧ２ａ投与群との対比）。ｎ．ｓ．（非有意性）。腫瘍特異性リンパ球（ＣＤ３＋／ＣＤ８＋ Ｔ細胞およびＣＤ４５＋／ＣＤ３－／ＣＤ１９＋ Ｂ細胞）；腫瘍特異性ＮＫ細胞（ＣＤ４５＋／ＣＤ３－／ＣＤ４９ｂ＋）；腫瘍特異性骨髄細胞（ＣＤ４５＋／ＣＤ１１ｂ＋／Ｇｒ１－／Ｆ４／８０＋ マクロファージ、ＣＤ４５＋／ＣＤ１１ｂ＋／Ｇｒ１＋ ＭＤＳＣ）；腫瘍特異性間質細胞（ＣＤ４５－／ＣＤ９０．２＋）。
【図9D】膵臓癌モデルにおける抗ＰＤ－１抗体または抗ＣＴＬＡ４抗体と組み合わせた抗ＢＡＧ２抗体の治療有効性を示す。（ｄ）１５の処置群における肝臓（左）、胸膜（中央）および横隔膜（右）への平均転移。ｔ検定：データは全て、平均±ＳＥＭ（平均の標準誤差）として表している。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１（対照マウスＩｇＧ２ａ投与群との対比）。ｎ．ｓ．（非有意性）。腫瘍特異性リンパ球（ＣＤ３＋／ＣＤ８＋ Ｔ細胞およびＣＤ４５＋／ＣＤ３－／ＣＤ１９＋ Ｂ細胞）；腫瘍特異性ＮＫ細胞（ＣＤ４５＋／ＣＤ３－／ＣＤ４９ｂ＋）；腫瘍特異性骨髄細胞（ＣＤ４５＋／ＣＤ１１ｂ＋／Ｇｒ１－／Ｆ４／８０＋ マクロファージ、ＣＤ４５＋／ＣＤ１１ｂ＋／Ｇｒ１＋ ＭＤＳＣ）；腫瘍特異性間質細胞（ＣＤ４５－／ＣＤ９０．２＋）。
【図9E】膵臓癌モデルにおける抗ＰＤ－１抗体または抗ＣＴＬＡ４抗体と組み合わせた抗ＢＡＧ２抗体の治療有効性を示す。（ｅ）全群のＰＡＮＣ０２－Ｌｕｃ腫瘍微小環境（ＴＭＥ）におけるリンパ球細胞、ＮＫ細胞、骨髄細胞、間質細胞集団のプロファイル。腫瘍特異性ＣＤ４５＋／ＣＤ１１ｂ＋／Ｇｒ１－／Ｆ４／８０＋マクロファージ、ＣＤ４５＋／ＣＤ１１ｂ＋／Ｇｒ１＋ ＭＤＳＣ、およびＣＤ４５－／ＣＤ９０．２＋ 間質細胞。フローサイトメトリーデータは、２回の独立した実験の平均である。ｔ検定：データは全て、平均±ＳＥＭ（平均の標準誤差）として表している。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１（対照マウスＩｇＧ２ａ投与群との対比）。ｎ．ｓ．（非有意性）。腫瘍特異性リンパ球（ＣＤ３＋／ＣＤ８＋ Ｔ細胞およびＣＤ４５＋／ＣＤ３－／ＣＤ１９＋ Ｂ細胞）；腫瘍特異性ＮＫ細胞（ＣＤ４５＋／ＣＤ３－／ＣＤ４９ｂ＋）；腫瘍特異性骨髄細胞（ＣＤ４５＋／ＣＤ１１ｂ＋／Ｇｒ１－／Ｆ４／８０＋ マクロファージ、ＣＤ４５＋／ＣＤ１１ｂ＋／Ｇｒ１＋ ＭＤＳＣ）；腫瘍特異性間質細胞（ＣＤ４５－／ＣＤ９０．２＋）。
【発明を実施するための形態】
【0050】
好ましい実施形態の詳細な記載
定義
本出願において、「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」は、単数および複数の両方の物体を指すために用いられる。
定義
本出願において、「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」は、単数および複数の両方の物体を指すために用いられる。
【0051】
本明細書で用いられる「約」または「実質的に」は一般に、厳密な数への限定からの許容量を提供する。例えば、ポリペプチド配列の長さの文脈で用いられる「約」または「実質的に」は、ポリペプチドが列挙されたアミノ酸数に限定されないことを示す。Ｎ－末端またはＣ－末端に加えられる、またはそれから引かれる２、３個のアミノ酸が、結合活性などの機能的活性が存在する限り、含まれてよい。
【0052】
本明細書で用いられる、１種または複数のさらなる治療薬「と組み合わせた」投与は、任意の順序で同時の（同時発生の）および連続の投与を包含する。
【0053】
本明細書で用いられる、相補性決定領域内の配列に関係する「ホットスポット」は、抗原結合領域にとって不安定性を引き起こすアミノ残基の存在を意味し、したがってそのようなモチーフは、より良好な結合効率のために置き換えられるべきである。典型的に置き換えられるアミノ酸のリストは存在しないが、ＣＤＲ上のアミノ酸残基を置き換えることを考慮する一方法は、生殖系保存および抗体配列構造を考慮し、アミノ酸を選択し類似構造で置き換えることである。例えば、両方のアミノ酸の構造が類似しているため、ＮＧは、ＮＡに変異され得る。そのような修飾は、ＢＡＧ２へのＣＤＲのより大きな結合効率を可能にする。
【0054】
本明細書で用いられる「アミノ酸」および「複数のアミノ酸」は、全てが天然由来のＬ－α－アミノ酸を指す。この定義は、ノルロイシン、オルニチン、およびホモシステインを包含することを意味する。
【0055】
一般に本明細書で用いられる用語「アミノ酸配列変異体」は、参照（たとえば、ネイティブ配列）ポリペプチドに比較して、アミノ酸配列中に幾つかの差を有する分子を指す。アミノ酸改変は、ネイティブアミノ酸配列における置換、挿入、欠失またはそのような変更の任意の所望の組み合わせであってよい。
【0056】
置換変異体は、除去されたネイティブ配列における少なくとも１つのアミノ酸残基と、同じ位置で代わりに挿入された異なるアミノ酸を有するものである。置換は単一であってよく、その場合、分子における唯一のアミノ酸が置換されており、または置換は複数であってよく、その場合、２つ以上のアミノ酸が同じ分子中で置換されている。
【0057】
配列内のアミノ酸の置換は、アミノ酸が属する分類の他のメンバーから選択されてよい。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが挙げられる。極性中性アミノ酸としては、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが挙げられる。正電荷（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リシンおよびヒスチジンが挙げられる。負電荷（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。本発明の範囲にまた含まれるのは、同様または類似の生物活性を呈するタンパク質またはそのフラグメントもしくは誘導体、および例えばグリコシル化、タンパク質分解切断、抗体分子または他の細胞リガンドへの連結などにより、翻訳の間または翻訳後に差次的に修飾された誘導体である。
【0058】
挿入変異体は、ネイティブアミノ酸配列内の固有の場所でアミノ酸に直接隣接する位置に挿入された１つまたは複数のアミノ酸を有するものである。アミノ酸に直接隣接する、は、アミノ酸のα－カルボキシまたはα－アミノ官能基のどちらかにつながれることを意味する。
【0059】
欠失変異体は、ネイティブアミノ酸配列中の１つまたは複数のアミノ酸が除去されたものである。普通、欠失変異体は、分子の固有の領域中に欠失された１つまたは２つのアミノ酸を有するであろう。
【0060】
本明細書で用いられる「フラグメント」または「機能的誘導体」は、本発明のポリペプチドの生物活性アミノ酸配列またはフラグメント、ならびに有機誘導体化剤との反応、翻訳語修飾により得られた誘導体、非タンパク質性ポリマーとの誘導体、および免疫接着剤を含む、共有結合の修飾を指す。
【0061】
本明細書で用いられる「担体」は、用いられる投与量および濃度で暴露される細胞または哺乳動物にとって非毒性である医薬的に許容できる担体、賦形剤または安定化剤を包含する。多くの場合、医薬的に許容できる担体は、水性ｐＨ緩衝溶液である。医薬的に許容できる担体の例としては、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチンもしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンもしくはリシンなどのアミノ酸；グルコース、マンノースもしくはデキストロースを含む単糖類、二糖類および他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのクレート化剤；マンニトールもしくはソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成対イオン；ならびに／またはＴＷＥＥＮ（登録商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）などの非イオン性界面活性剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【0062】
本明細書で用いられる「医薬的に許容できる担体および／または希釈剤」は、あらゆる溶媒、分散媒、コーティング抗菌剤および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤、ならびに同様のものを包含する。医薬的活性物質のためのそのような媒体および薬剤の使用は、当該技術分野で周知である。任意の従来の媒体または薬剤が有効成分と不適合である場合を除き、治療組成物中のそれらの使用が企図される。補助的有効成分もまた、組成物に組み入れられ得る。
【0063】
投与の容易さおよび投与量の均一性のために、非経口組成物を投与単位剤形で配合することは、特に有利である。本明細書で用いられる投与単位剤形は、処置される哺乳動物対象のために単一投与量として適する物理的に分離した単位を指し；各単位は、必要とされる医薬担体に関連して所望の治療効果を生成するために計算された活性材料の所定の量を含有する。本発明の投与単位剤形についての仕様は、（ａ）活性材料の特有の特徴および実現される固有の治療効果、ならびに（ｂ）身体の健康が損なわれる疾患状態を有する生存する対象における疾患の処置のためのそのような活性材料を化合することの当該技術分野に内在する制限、により定められ、それらに直接依存する。
【0064】
主たる有効成分は、投与単位剤形において適切な医薬的に許容できる担体と有効量での簡便かつ効果的投与のために化合される。単位投与剤形は、例えば、主たる活性化合物を０．５μｇ～約２０００ｍｇの範囲の量で含有し得る。割合で表すと、活性化合物は一般に、約０．５μｇ／ｍｌの担体の中に存在する。補助的有効成分を含有する組成物の例では、投与量は、上記成分の通常の用量および投与方式を参照することにより決定される。
【0065】
本明細書で用いられる「ベクター」、「ポリヌクレオチドベクター」、「構築物」および「ポリヌクレオチド構築物」は、本明細書において互換的に用いられる。本発明のポリヌクレオチドベクターは、非限定的に、レトロウイルスコート中にカプセル化されたＲＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アデノウイルスコート中にカプセル化されたＤＮＡ、別のウイルスまたはウイルス様形態（単純ヘルペスおよびポリアミドなどのアデノ構造など）にパッケージングされたＤＮＡを含む、複数の形態のいずれかで存在してよい。
【0066】
本明細書で用いられる「宿主細胞」は、本発明のベクターのレシピエントであり得る、またはレシピエントであった個々の細胞または細胞培養物を包含する。宿主細胞としては、単一宿主細胞の子孫が挙げられ、子孫は、自然な、偶発的な、または故意の突然変異および／または変化による本来の親細胞と必ずしも完全に同一（形態学的に、または相補的な総ＤＮＡにおいて）でなくてよい。
【0067】
本明細書で用いられる「対象」は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。
【0068】
本明細書で用いられる、処置の目的での「哺乳動物」は、ヒト、家畜および農用動物、ならびに動物園用、競技用、または愛玩動物、例えばイヌ、ネコ、畜牛、ウマ、ヒツジ、ブタなどを含む、哺乳動物として分類される任意の動物を指す。好ましくは哺乳動物は、ヒトである。
【0069】
本明細書で用いられる、障害または病気を「予防する」治療薬は、統計標本において、非処置対照試料に相対的に処置試料中で障害もしくは病気の発生を低減する、または非処置対照試料に相対的に障害もしくは病気の１つもしくは複数の症状の開始を遅延させる、または障害もしくは病気の重症度を低減させる化合物を指す。
【0070】
用語「減少する」、「低減された」、「低減」、または「阻害する」は全て、統計学的に有意な量による特性、レベルまたは他のパラメータの減少または低下を意味するために本明細書で用いられる。幾つかの実施形態において、「低減する」、「低減」または「減少させる」または「阻害する」は典型的には、参照レベル（例えば、所与の処置の非存在）に比較して少なくとも１０％の減少を意味し、例えば少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、またはより多くの減少を包含し得る。本明細書で用いられる「低減」または「阻害」は、参照レベルに比較した完全な阻害または低減を含まない。「完全な阻害」は、参照レベルに比較した１００％阻害である。減少は、好ましくは所与の障害を有しない個体にとって正常範囲内として受け入れられるレベルへの降下であり得る。
【0071】
用語「増加された」、「増加する」または「増強する」または「活性化する」は全て、一般には統計学的に有意な量での特性、レベルまたは他のパラメータの増加を意味するために本明細書で用いられ、いずれかの疑念を回避するために、用語「増加された」、「増加する」または「増強する」または「活性化する」は、参照レベルに比較した少なくとも１０％の増加、例えば参照レベルに比較した少なくとも２０％、もしくは少なくとも３０％、もしくは少なくとも４０％、もしくは少なくとも５０％、もしくは少なくとも６０％、もしくは少なくとも７０％、もしくは少なくとも８０％、もしくは少なくとも９０％、もしくは１００％を含むそれ以下の増加、もしくは１０～１００％の間の任意の増加を意味するか、または参照レベルに比較して少なくとも約２倍の増加、もしくは少なくとも約３倍の増加、もしくは少なくとも約４倍の増加、もしくは少なくとも約５倍の増加、もしくは少なくとも約１０倍の増加、もしくは少なくとも約２０倍の増加、もしくは少なくとも約５０倍の増加、もしくは少なくとも約１００倍の増加、もしくは少なくとも約１０００倍、またはより多くの増加を意味する。
【0072】
本明細書で用いられる「癌」または「腫瘍」は、身体臓器および身体組織の正常機能と干渉する細胞の非制御な成長を指す。癌または腫瘍を有する対象は、対象の体内に存在する客観的に測定可能な癌細胞を有する対象である。この定義に含まれるのは、良性および悪性の癌、ならびに休眠状態の腫瘍または微小転移である。本来の場所から遊走して重要な臓器に播種した癌は、最終的に罹患した臓器の機能的壊滅を通して対象の死をもたらす可能性がある。癌の例としては、Ｂ細胞リンパ腫（ホジキンリンパ腫および／または非ホジキンリンパ腫）、脳腫瘍、乳癌、結腸癌、肺癌、肝細胞癌、胃癌、膵臓癌、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、尿路の癌、甲状腺癌、腎臓癌、癌腫、黒色腫、頭頸部癌、膠芽腫などの脳癌、ならびに非限定的にアンドロゲン依存性前立腺癌およびアンドロゲン非依存性前立腺癌を含む、前立腺癌が挙げられるが、これらに限定されない。
【0073】
本明細書で用いられる用語「有効量」または「治療有効量」は、疾患または障害の少なくとも１つまたはより多くの症状を減少させるための、本明細書に開示された１種または複数の抗ＢＡＧ２抗体もしくはそのフラグメントの量、または１種または複数の抗ＢＡＧ２抗体もしくはそのフラグメントを含む医薬組成物の量を指し、所望の効果を提供するための薬理学的組成物の充分量に関する。本明細書で用いられる語句「治療有効量」は、任意の医学的処置に適用可能な合理的利益／リスク比で障害を処置するための組成物の充分量を意味する。
【0074】
本明細書で用いられる用語「投与すること」は、所望の部位での薬剤または組成物の少なくとも部分的な局在化をもたらす方法または経路による、対象への本明細書に開示された薬剤または組成物の配置を指す。「投与経路」は、非限定的に、経口、外用、エアロゾル、鼻孔、吸入を介した、肛門、肛門内、肛門周囲、経粘膜、経皮、非経口、腸内または局所を含む、当該技術分野で公知の任意の投与経路を指し得る。「非経口」は、腫瘍内、頭蓋内、脳室内、髄腔内、硬膜外、硬膜内、眼窩内、輸液、嚢内、心内、皮内、筋肉内、腹腔内、肺内、脊髄内、胸骨内、髄腔内、血管内、静脈内、動脈内、クモ膜下、被膜下、皮下、経粘膜、または経気管を含む、一般に注射に関連する投与経路を指す。非経口経路を介し、薬剤または組成物は、輸液もしくは注射のための溶液もしくは懸濁液の形態、または凍結乾燥粉末としてであってよい。腸内経路を介し、薬剤または組成物は、制御放出を可能にするカプセル、ゲルカプセル、錠剤、糖衣錠、シロップ、懸濁液、溶液、粉末、顆粒、エマルジョン、マイクロスフェアもしくはナノスフェア、または脂質小胞もしくはポリマー小胞の形態であり得る。外用経路を介し、薬剤または組成物は、エアロゾル、ローション、クリーム、ゲル、軟膏、懸濁液、溶液またはエマルジョンの形態であり得る。一実施形態において、薬剤または組成物は、粉末形態で提供され、水などの液体と混合されて、飲料を形成してよい。本発明によれば、「投与すること」は、自己投与であり得る。例えば、対象が本明細書に開示された組成物を消費することは、「投与すること」と見なされる。
【0075】
本明細書で用いられる「対象」は、ヒトまたは動物を意味する。通常、動物は、霊長類、げっ歯類、家畜または狩猟動物などの脊椎動物である。霊長類としては、チンパンジー、カニクイザル、クモザル、およびマカク、例えばアカゲザルが挙げられる。げっ歯類としては、マウス、ラット、ウッドチャック、フェレット、ウラギおよびハムスターが挙げられる。家畜および狩猟動物としては、ウシ、ウマ、ブタ、シカ、バイソン、バッファロー、ネコ科の種、例えば家ネコ、およびイヌ科の種、例えばイヌ、キツネ、オオカミが挙げられる。用語「患者」、「個体」および「対象」は、本明細書では互換的に用いられる。一実施形態において、対象は、哺乳動物である。哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマまたはウシであり得るが、これらの例に限定されない。加えて、本明細書に記載された方法は、家畜および／またはペットを処置するために用いられ得る。一実施形態において、対象は、ヒトである。
【0076】
本明細書で用いられる「哺乳動物」は、非限定的にチンパンジーおよび他の類人猿およびサルの種などのヒトおよび非ヒト霊長類；畜牛、ヒツジ、ブタ、ヤギおよびウマなどの農用動物；イヌおよびネコなどの家畜哺乳動物；マウス、ラットおよびモルモットなどのげっ歯類を含む実験動物、ならびに同様のものを含む、哺乳綱の任意のメンバーを指す。この用語は、固有の年齢を表さない。したがって成体および新生児対象、ならびに胎児が、この用語の範囲内に含まれるものとする。
【0077】
対象は、処置を必要とする病気（例えば、癌または自己免疫疾患）または病気に関係する１つもしくは複数の合併症に罹患している、または病気を有すると過去に診断または同定されたことがあるもの、かつ場合により病気または病気に関係する１つもしくは複数の合併症への処置を既に受けたものであり得る。あるいは対象は、病気、または病気に関係する１つもしくは複数の合併症を有すると過去に診断されたことのないものであってもよい。例えば、対象は、病気、または病気に関係する１つもしくは複数の合併症の１つまたは複数のリスクを呈するもの、あるいは危険因子を呈さない対象であり得る。例えば対象は、病気、または病気に関係する１つもしくは複数の合併症の１または複数の症状を呈するもの、あるいは症状を呈さない対象であり得る。固有の病気のための診断または処置を「必要とする対象」は、その病気を有することが疑われる対象、その病気を有すると診断された対象、その病気を既に処置されたか、もしくは処置される対象、その病気を処置されない対象、またはその病気を発症するリスクがある対象であり得る。
【0078】
「リスクがある」は、正常対象に比較して、または対照群、例えば患者集団に比較して増加したリスクを意味するものとする。したがって、固有のマーカを担持する対象は、特異的疾患または障害について増加したリスクを有してよく、さらなるテストを必要とすると同定されてよい。「増加したリスク」または「上昇したリスク」は、例えば対象が障害を有する確率の、任意の統計学的に有意な増加を意味する。リスクは、比較が行われる対照群よりも好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、さらにより好ましくは少なくとも５０％増加される。
【0079】
用語「統計学的に有意な」または「有意に」は、統計学的有意性を指し、一般に参照レベルから少なくとも２標準偏差（２ＳＤ）離れていることを意味する。この用語は、差が存在することの統計学的証拠を指す。それは、帰無仮説が実際に真実である場合に、帰無仮説を拒絶することを決意する確率と定義される。
【0080】
本明細書で用いられる用語「共投与する」は、例えば臨床処置レジメンの一部として、互いに２４時間以内の２種以上の治療、または２種以上の治療薬（例えば、抗ＢＡＧ２抗体および追加的な抗癌治療）の投与を指す。他の実施形態において、「共投与する」は、互いに１２時間以内、６時間以内、５時間以内、４時間以内、３時間以内、２時間以内、１時間以内、４５以内、３０分以内、２０以内、１５分以内、１０分以内、または５分以内の投与を指す。他の実施形態において、「共投与する」は、単一配合剤の一部として、または同じもしくは異なる経路により投与される複数の配合剤として、のいずれかでの同時の投与を指す。例えば、抗ＢＡＧ２抗体および追加の抗癌治療が、異なる医薬組成物中で、または異なる時間に投与される場合、投与経路は、同じであるか異なり得る。
【0081】
本明細書で用いられる「処置」は、有益な、または所望の臨床結果を得るためのアプローチである。本発明の目的では、有益な、または所望の臨床結果としては、検出可能または検出不能にかかわらず、症状の緩和、疾患の程度の減弱、疾患の安定化した（即ち、増悪していない）状態、疾患進行の遅延または緩徐化、疾患状態の好転または軽減、および寛解（部分または完全のどちらかにかかわらず）が挙げられるが、これらに限定されない。「処置」はまた、処置を受けない場合に予測される生存に比較して長期化した生存を意味し得る。「処置」は、治療的処置および防護的または予防的手段の両方を指す。処置を必要とするものとしては、障害を既に有するもの、ならびに障害が予防されるべきものが挙げられる。疾患を「軽減すること」は、処置のない状況に比較して、疾患状態の程度および／もしくは望ましくない臨床症状発現が減少されること、ならびに／または進行の時間経過が緩徐化もしくは延長されること、を意味する。
【0082】
本明細書で用いられる用語「キメラ」抗体は、ラットまたはマウス抗体などの非ヒト免疫グロブリン由来の可変配列と、典型的にはヒト免疫グロブリンテンプレートから選択される、ヒト免疫グロブリン定常領域とを有する抗体を指す。キメラ抗体を生成するための方法は、当該技術分野で公知である。例えばＭｏｒｒｉｓｏｎ， １９８５， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９（４７１９）：１２０２－７；Ｏｉ ｅｔ ａｌ．， １９８６， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４－２２１；Ｇｉｌｌｉｅｓ ｅｔ ａｌ．， １９８５， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ １２５：１９１－２０２；米国特許第５，８０７，７１５号；同第４，８１６，５６７号；および同第４，８１６，３９７号を参照されたい。
【0083】
非ヒト（例えば、ネズミ）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含有するキメラ免疫グロブリンである。一般にヒト化抗体は、実質的に全ての、または少なくとも１つの、かつ典型的には２つの可変ドメインを含み、そこではＣＤＲ領域の全てまたは実質的に全ては、非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ領域の全てまたは実質的に全ては、ヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものを含み得る。抗体ヒト化の方法は、当該技術分野で公知である。例えばＲｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， １９８８， Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－７； Ｑｕｅｅｎらへの米国特許第５，５３０，１０１号；同第５，５８５，０８９号；同第５，６９３，７６１号；同第５，６９３，７６２号；および同第６，１８０，３７０号; 欧州特許第２３９４００号；ＰＣＴ公開ＷＯ９１／０９９６７号；米国特許第５，２２５，５３９号；欧州特許第５９２１０６号；欧州特許第５１９５９６号；Ｐａｄｌａｎ， １９９１， Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ２８：４８９－４９８；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｐｒｏｔ． Ｅｎｇ． ７：８０５－８１４；Ｒｏｇｕｓｋａ ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９１：９６９－９７３；ならびに米国特許第５，５６５，３３２号を参照されたい。
【0084】
「ヒト抗体」は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を包含し、１種または複数のヒト免疫グロブリンのためのヒト免疫グロブリンライブラリから、またはトランスジェニックの動物から単離され、内在性免疫グロブリンを発現しない抗体を包含する。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列由来の抗体ライブラリを用いたファージディスプレイ法を含む当該技術分野で公知の種々の方法により作製され得る。米国特許第４，４４４，８８７号および同第４，７１６，１１１号；ならびにＰＣＴ公開ＷＯ９８／４６６４５号；ＷＯ９８／５０４３３号；ＷＯ９８／２４８９３号；ＷＯ９８／１６６５４号；ＷＯ９６／３４０９６号；ＷＯ９６／３３７３５号；およびＷＯ９１／１０７４１号を参照されたい。ヒト抗体はまた、機能的な内在性免疫グロブリンを発現できないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現できるトランスジェニックマウスを用いて生成され得る。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９８／２４８９３号；ＷＯ９２／０１０４７号；ＷＯ９６／３４０９６号；ＷＯ９６／３３７３５号；米国特許第５，４１３，９２３号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６６１，０１６号；同第５，５４５，８０６号；同第５，８１４，３１８号；同第５，８８５，７９３号；同第５，９１６，７７１号；および同第５，９３９，５９８号を参照されたい。加えて、ＬａｋｅＰｈａｒｍａ， Ｉｎｃ．（カリフォルニア州ベルモント）またはＣｒｅａｔｉｖｅ ＢｉｏＬａｂｓ（ニューヨーク州シャーリー）などの会社は、上記のものと類似の技術を利用して選択された抗原に対するヒト抗体を提供することに従事し得る。選択されたエピトープを認識する全てヒトの抗体は、「ガイデッドセレクション」と称される技術を利用して作製され得る。このアプローチでは、選択された非ヒトモノクローナル抗体、例えばマウス抗体が、同じエピトープを認識する完全にヒトの抗体の選択を案内するのに用いられる（Ｊｅｓｐｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， １９８８， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：８９９－９０３参照）。
【0085】
本明細書で用いられる用語「抗体様」は、抗体の一部を含有するように遺伝子操作され得るが本質的に天然由来の抗体ではない、分子を意味する。例としては、ＣＡＲ（キメラ抗原受容体）Ｔ細胞技術およびＹｌａｎｔｈｉａ（登録商標）技術が挙げられるが、これらに限定されない。ＣＡＲ技術は、身体の免疫系が特異的な標的タンパク質または細胞を攻撃することに向けられるように、Ｔ細胞の一部に融合された抗体エピトープを利用する。Ｙｌａｎｔｈｉａ（登録商標）技術は、合成ヒトｆａｂの収集物であり後に標的タンパク質からのペプチドエピトープへの結合についてスクリーニングされる、「抗体様」ライブラリからなる。選択されたＦａｂ領域はその後、それらが抗体に似るように、足場またはフレームワーク中に操作され得る。
【0086】
本明細書で用いられる「免疫療法薬」または「免疫調整物質」は、免疫応答を誘発もしくは増幅するように、またはその応答を低減もしくは抑制するように設計された薬剤である。
【0087】
本明細書で用いられる「高い相同性」は、任意の２つのポリペプチドの間の設計された重複領域において少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９７％の同一性があると見なされる。
【0088】
ホットスポットの除去
製造、貯蔵の間および生体内で、治療抗体は、多くの経路を介する分解のリスクがある。とりわけ、タンパク質で最も頻繁に発生する分解反応は、ＡｓｎおよびＡｓｐ残基の化学分解である。これらの反応は、最終的な薬物物質および薬物製品の適当な貯蔵および配合条件により抑制され得るが、発酵、下流の加工の間、および生体内での分解は多くの場合、充分に制御され得ない。ＡｓｎおよびＡｓｐ残基が抗原認識に関与する場合、それらの化学的改変は、重度の能力損失をもたらす可能性がある。複数の例で、これらの分解事象が、長期ｍＡｂ機能を妨害することが報告された。生体内では、タンパク質分解事象は、タンパク質の経年変化と、アポトーシスを惹起することによる癌と、または他の生物学的機能に及ぼす重度の影響、例えばヒト水晶体ベータＡ３クリスタリンの安定性減少、異常なＭＡＰＫシグナル伝達、Ａベータ生成過程の潜在的ベータセクレターゼ有効性および特異性の改変、またはバクテリア細胞に対するリゾチーム溶解活性の増加、と関連して記載される。分解を受け易い薬物候補の同定は、理想的には薬物開発工程の早期に実施され、それに応じて製造および配合工程を調整するか、または問題となる候補を再度操作して、そのようなホットスポットを除去する。
製造、貯蔵の間および生体内で、治療抗体は、多くの経路を介する分解のリスクがある。とりわけ、タンパク質で最も頻繁に発生する分解反応は、ＡｓｎおよびＡｓｐ残基の化学分解である。これらの反応は、最終的な薬物物質および薬物製品の適当な貯蔵および配合条件により抑制され得るが、発酵、下流の加工の間、および生体内での分解は多くの場合、充分に制御され得ない。ＡｓｎおよびＡｓｐ残基が抗原認識に関与する場合、それらの化学的改変は、重度の能力損失をもたらす可能性がある。複数の例で、これらの分解事象が、長期ｍＡｂ機能を妨害することが報告された。生体内では、タンパク質分解事象は、タンパク質の経年変化と、アポトーシスを惹起することによる癌と、または他の生物学的機能に及ぼす重度の影響、例えばヒト水晶体ベータＡ３クリスタリンの安定性減少、異常なＭＡＰＫシグナル伝達、Ａベータ生成過程の潜在的ベータセクレターゼ有効性および特異性の改変、またはバクテリア細胞に対するリゾチーム溶解活性の増加、と関連して記載される。分解を受け易い薬物候補の同定は、理想的には薬物開発工程の早期に実施され、それに応じて製造および配合工程を調整するか、または問題となる候補を再度操作して、そのようなホットスポットを除去する。
【0089】
ＡｓｎおよびＡｓｐ残基は、環状スクシンイミド中間体の形成を介して進行する分解経路を共有する。スクシンイミドは、Ａｓｎ／Ａｓｐ側鎖γ－カルボニル基上の連続するアミノ酸の骨格窒素の求核攻撃によるＡｓｎの脱アミド化またはＡｓｐの脱水から生じる。転移可能な環状イミドは、加水分解条件および立体構造の制限に応じて、２つのカルボニル基のどちらか一方で加水分解して、異なる比率でアスパルチルまたはイソアスパルチル結合を形成し得る。加えて、環状イソイミドを形成する骨格カルボニル酸素による求核攻撃、またはＡｓｎからＡｓｐへの直接的加水分解などのＡｓｎの代替的分解メカニズムが、提案された。複数の分析法、ほとんどはイオン交換クロマトグラフィーなどの電荷感受性の方法、または等電点電気泳動が、分解産物、即ちスクシンイミド、ＡｓｐまたはイソＡｓｐのいずれかを検出するために記載された。タンパク質中の分解部位の定量および定位に最も適するのは、液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）による分析である。ｄｏｉ： １０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１００７３６として２０１４年６月２４日にオンラインで公開された参考資料Ｓｙｄｏｗ ｅｔ ａｌ．， “Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－Ｂａｓｅｄ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ ａｎｄ Ａｓｐａｒｔａｔｅ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ Ｓｉｔｅｓ ｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｒｅｇｉｏｎｓ”， ＰＬｏＳ Ｏｎｅ． ２０１４； ９（６）：ｅ１００７３６は、抗体の抗原結合領域上のホットスポットの存在と、タンパク質により多くの安定性を提供するためにそのようなホットスポットモチーフを置き換えることの好適性とのよく確立された知識の開示について、全体として参照により本明細書に組み入れられる。
【0090】
ホットスポットの検出および置き換えのそのような一例は、抗体３Ｂ５で認められ得る。ＶＨ ＣＤＲ２は、ＹＩＤＰＹＮＧＧＮＴＹＮＲＫＦＫＧであるが、ホットスポットが「ＮＧ」の存在により検出され、ホットスポットが除去された配列がＹＩＤＰＹＮＡＧＮＴＹＮＲＫＦＫＧであるように、このホットスポットが除去され「ＮＡ」で置き換えられる。ＣＤＲ２の始点のＹの存在がＣＤＲ２の一部とみなされなければならないことに、本出願者は留意している。ＣＤＲ配列は、Ｎ－末端またはＣ－末端でいくつかの配列が２、３個のアミノ酸だけ短縮されているか短くなっているとしても、結合活性を維持することが、当該技術分野で一般に認められている。活性を保持するためのＣＤＲの長さは充分に、決定するための合理的実験の範囲内であると考えられる。
【0091】
抗体のヒト化
抗体をヒト化する工程は、周知であり、したがって従来の技術を用いて、ヒト化抗体を作製してよい。１つの例証されたプロトコルが、以下の通りであってよい：
抗体をヒト化する工程は、周知であり、したがって従来の技術を用いて、ヒト化抗体を作製してよい。１つの例証されたプロトコルが、以下の通りであってよい：
【0092】
マウスモノクローナル抗体を、ＣＤＲグラフティングによりヒト化し、親マウス抗体フレームワークの重要な残基を、同定し、ヒト化配列に導入する。その後、ヒト化ＶＨ／ＶＬを、完全長ｈＩｇＧ１形式に変換する。変異体を、一過性トランスフェクションにより発現し、アフィニティークロマトグラフィーにより精製する。精製された抗体を、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ＥＬＩＳＡ、およびＢｉａｃｏｒｅ（親和性の特徴づけ）により特徴づける。親和性および能力の損失が３倍以下である最良の候補を、選択する。
【0093】
５つの相が、抗体ヒト化工程に含まれてよい。最初に、抗体のヒト化設計（ホットスポット除去の実行可能性および抗体ヒト化の設計）を、完了する。
【0094】
ＶＨ／ＶＬ ＣＤＲ残基を、決定し、Ｋａｂａｔナンバリングシステムでアノテーションする。配列解析を適用して、ＣＤＲ内の不対合システイン残基、Ｎ－グリコシル化部位、および脱アミノ化部位を含む主要な危険性のあるホットスポットを同定する。遺伝子操作の作業を適用して、有害なホットスポットモチーフを除去してよい。ＣＤＲ中にホットスポットが存在するならば、ホットスポット除去の実行可能性を、チェックし、実行する。
【0095】
ホットスポットの除去を設計し、相対的なマウスＶＨおよびマウスＶＬを、複数のキメラ抗体に組み合わせる。各キメラ抗体を、１００ｍＬの２９３細胞で一過的に発現させ、上清を、Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ ＰｒｉｓｍＡ（ＧＥ、１７５４９８０１）により捕捉および精製し、アフィニティー精製の収率を記録する。精製されたキメラ抗体を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびＨＰＬＣ－ＳＥＣによりテストした後、ＥＬＩＳＡまたはＢｉａｃｏｒｅにより親和性を確認する。キメラ抗体の親和性ランキングを実施して、ホットスポット除去の実行可能性を確認する。
【0096】
そのようなヒト化配列は、以下の抗体に関して以下の通りであってよい；
【0097】
３Ｂ５サブクローン１：ＶＨ領域；下線は、ホットスポットをチェックした後のＣＤＲ領域である。
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＤＹＴＦＹＷＶＲＱＡＰＧＱＲＬＥＷＩＧＹＩＤＰＹＮＡＧＮＴＹＮＲＫＦＫＧＲＶＴＩＴＶＤＫＳＡＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＹＹＲＹＧＧＧＧＤＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＤＹＴＦＹＷＶＲＱＡＰＧＱＲＬＥＷＩＧＹＩＤＰＹＮＡＧＮＴＹＮＲＫＦＫＧＲＶＴＩＴＶＤＫＳＡＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＹＹＲＹＧＧＧＧＤＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５）
【0098】
３Ｂ５サブクローン１：ＶＬ領域；下線は、ホットスポットをチェックした後のＣＤＲ領域である。
ＤＶＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＬＧＱＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＧＮＴＹＬＨＷＦＱＱＲＰＧＱＳＰＲＬＬＩＨＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＳＱＮＴＨＩＰＰＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６）
ＤＶＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＬＧＱＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＧＮＴＹＬＨＷＦＱＱＲＰＧＱＳＰＲＬＬＩＨＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＳＱＮＴＨＩＰＰＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６）
【0099】
３Ｂ５サブクローン２：ＶＨ領域；下線は、ホットスポットをチェックした後のＣＤＲ領域である。
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＤＹＴＦＹＷＶＲＱＡＰＧＱＲＬＥＷＩＧＹＩＤＰＹＮＡＧＮＴＹＮＲＫＦＫＧＫＶＴＩＴＶＤＫＳＡＳＴＡＹＭＥＬＮＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＹＹＲＹＧＧＧＧＤＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＤＹＴＦＹＷＶＲＱＡＰＧＱＲＬＥＷＩＧＹＩＤＰＹＮＡＧＮＴＹＮＲＫＦＫＧＫＶＴＩＴＶＤＫＳＡＳＴＡＹＭＥＬＮＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＹＹＲＹＧＧＧＧＤＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７）
【0100】
３Ｂ５サブクローン２：ＶＬ領域；下線は、ホットスポットをチェックした後のＣＤＲ領域である。
ＤＶＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＬＧＱＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＧＮＴＹＬＨＷＦＱＱＲＰＧＱＳＰＲＬＬＩＨＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＳＱＮＴＨＩＰＰＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８）
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【0101】
３Ｂ１０サブクローン１：ＶＨ領域；下線は、ホットスポットをチェックした後のＣＤＲ領域である。
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＨＡＦＴＮＹＭＩＥＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＶＩＮＰＧＳＧＧＴＹＮＳＥＫＶＫＧＲＶＴＬＴＡＤＲＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＲＩＹＧＮＹＫＧＹＦＤＨＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９）
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【0102】
３Ｂ１０サブクローン１：ＶＬ領域；下線は、ホットスポットをチェックした後のＣＤＲ領域である。
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＤＭＮＳＹＬＳＷＦＱＱＫＰＧＫＡＰＫＳＬＩＹＲＳＮＲＬＶＤＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＮＤＥＦＰＦＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０）
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【0103】
３Ｂ１０サブクローン２：ＶＨ領域；下線は、ホットスポットをチェックした後のＣＤＲ領域である。
ＱＶＱＬＶＱＳＧＳＥＬＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＫＹＧＭＮＷＶＫＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＴＮＴＧＥＡＴＹＧＥＥＶＫＧＲＦＶＦＳＬＤＴＳＶＳＴＡＹＬＱＩＳＳＬＫＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＬＧＬＲＹＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８１）
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【0104】
３Ｂ１０サブクローン２：ＶＬ領域；下線は、ホットスポットをチェックした後のＣＤＲ領域である。
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＫＳＶＳＴＳＤＹＳＹＭＨＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＬＡＳＮＬＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＨＮＲＥＬＰＰＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８２）
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【0105】
３Ｇ８サブクローン１：ＶＨ領域；下線は、ホットスポットをチェックした後のＣＤＲ領域である。
ＱＶＱＬＶＱＳＧＳＥＬＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＫＹＧＭＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＴＮＴＧＥＡＴＹＧＥＥＶＫＧＲＦＶＦＳＬＤＴＳＶＳＴＡＹＬＱＩＳＳＬＫＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＬＧＬＲＹＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８３）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＳＥＬＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＫＹＧＭＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＴＮＴＧＥＡＴＹＧＥＥＶＫＧＲＦＶＦＳＬＤＴＳＶＳＴＡＹＬＱＩＳＳＬＫＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＬＧＬＲＹＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８３）
【0106】
３Ｇ８サブクローン１：ＶＬ領域；下線は、ホットスポットをチェックした後のＣＤＲ領域である。
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＫＳＶＳＴＳＤＹＳＹＭＨＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＬＡＳＮＬＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＨＮＲＥＬＰＰＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８４）
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【0107】
３Ｇ８サブクローン２：ＶＨ領域；下線は、ホットスポットをチェックした後のＣＤＲ領域である。
ＱＶＱＬＶＱＳＧＳＥＬＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＫＹＧＭＮＷＶＫＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＴＮＴＧＥＡＴＹＧＥＥＶＫＧＲＦＶＦＳＬＤＴＳＶＳＴＡＹＬＱＩＳＳＬＫＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＬＧＬＲＹＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８５）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＳＥＬＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＫＹＧＭＮＷＶＫＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＴＮＴＧＥＡＴＹＧＥＥＶＫＧＲＦＶＦＳＬＤＴＳＶＳＴＡＹＬＱＩＳＳＬＫＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＬＧＬＲＹＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８５）
【0108】
３Ｇ８サブクローン２：ＶＬ領域；下線は、ホットスポットをチェックした後のＣＤＲ領域である。
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＫＳＶＳＴＳＤＹＳＹＭＨＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＬＡＳＮＬＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＨＮＲＥＬＰＰＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８６）
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【0109】
癌の処置のための抗Ｂａｇ２抗体の使用
癌の成長またはより転移性の状態への移行を阻害するそれらの抗体を、抗癌治療薬としての使用のために選択し、癌の処置または予防のために患者に投与してよい。選択された抗体は、例えばヒトキメラ抗体または完全なヒト抗体を遺伝子操作または作製することにより、さらに最適化されてよい。このアプローチの有効性を実証するために、
癌の成長またはより転移性の状態への移行を阻害するそれらの抗体を、抗癌治療薬としての使用のために選択し、癌の処置または予防のために患者に投与してよい。選択された抗体は、例えばヒトキメラ抗体または完全なヒト抗体を遺伝子操作または作製することにより、さらに最適化されてよい。このアプローチの有効性を実証するために、
【0110】
患者試料中のＢａｇ２のレベル上昇の検出は、癌の存在、またはより攻撃的もしくは転移性の状態への進行の診断である。患者試料中のＢＡＧ２種のレベル上昇の検出は、患者が癌を有すること、または癌を発症するリスクがあることの指標であろう。ＢＡＧ２種のレベルは、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーションスキーム、サイクリングプローブ技術、ＦＩＳＨ、免疫細胞化学、ＩＨＣ、ウェスタンブロット、免疫沈降法、サンドイッチアッセイ、ＥＬＩＳＡアッセイおよび同様のものにより測定または評定され得る。患者試料は、流体試料、血液試料、乳、尿、細胞、液体生検、生検および同様のものであってよい。癌と診断された患者において、ＢＡＧ２のレベル上昇は、転移の潜在能力増加の指標である。ＢＡＧ２のレベル上昇は、前立腺癌の指標である。本発明の抗体は、ＢＡＧ２を検出するために用いられ、診断ツールとして用いられる。
【0111】
細胞および組織は通常ＢＡＧ２を分泌しないため、癌を診断するため、またはより攻撃的もしくは転移性の形態を診断するため、またはより攻撃的形態へのシフトを診断するための効果的方法は、健常試料中のＢＡＧ２レベルに比較して、または健常成人細胞もしくは組織の中に存在することが知られるＢＡＧ２のレベルに比較して、患者からの、細胞もしくは組織の採取物からの、または培養細胞からの試料中のＢＡＧ２のレベルを測定することである。ＢＡＧ２のレベル上昇は、癌の存在、転移癌の存在または転移の開始を示す。ＢＡＧ２の存在についてアッセイされる試料は、患者からの培養細胞株もしくは細胞であり得る細胞の採取物、体液、血液試料、組織標本、または生検標本であってよい。それゆえ、癌の存在または癌の進行を検出する診断アッセイは、１）癌を有する患者または癌を発症するリスクがある患者からの試料を得るステップと；２）ＢＡＧ２を検出することまたはＢＡＧ２のレベルを測定することが可能なアッセイにその試料を供するステップと；３）テスト試料中の測定されたＢＡＧ２タンパク質のレベルを対照患者または対照細胞中のレベルに比較するステップと；４）ＢＡＧ２のレベルが対照に比較して上昇されることを決定するステップと；５）試験物を比較した対照が、予め癌と診断されたドナーからのものであれば、テスト試料のドナーが癌を有する、または癌の進行を有していると結論づけるステップ、を含む。
【0112】
このアッセイにおいて、テスト試料を比較する対照試料は、非癌性細胞、培養細胞、健常ドナーからの試料、ドナーからの非癌性試料、またはテスト試料のドナーからの試料であり得、対照試料は、過去の時点でドナーから回収されている。そのような試料の供給源は、体液、脳脊髄液、骨髄試料、血液、組織、細胞、生検組織または細胞、患者細胞由来の培養細胞および同様のものを含む、癌の存在または進行についてテストされる患者から採取された任意の標本であり得る。テスト試料を比較する試料の供給源は、体液、脳脊髄液、骨髄試料、血液、組織、細胞、生検組織もしくは細胞、または健常ドナーもしくはテスト患者に由来し得る培養細胞であり得、試料は、過去の時点で回収されている。テスト試料を比較する測定レベルは、予め記録されたデータからのものおよびテスト試料への比較のためにリストに編集されたものであってよい。
【0113】
併用療法
第一の薬剤は、別の薬剤と併せて投与される。「～と併せて」は、同じ個体への抗ＢＡＧ２抗体またはそのフラグメントの投与に加えた、本明細書に記載された免疫調整物質の投与などの、別の処置モダリティーに加えた１つの処置モダリティーの投与を指す。そのため、「～と併せて」は、個体への他の処置モダリティーの送達前、送達の間、または送達後の１つの処置モダリティーの投与を指す。そのような組み合わせは、単一処置レジメンまたはレジメの一部と見なされる。
第一の薬剤は、別の薬剤と併せて投与される。「～と併せて」は、同じ個体への抗ＢＡＧ２抗体またはそのフラグメントの投与に加えた、本明細書に記載された免疫調整物質の投与などの、別の処置モダリティーに加えた１つの処置モダリティーの投与を指す。そのため、「～と併せて」は、個体への他の処置モダリティーの送達前、送達の間、または送達後の１つの処置モダリティーの投与を指す。そのような組み合わせは、単一処置レジメンまたはレジメの一部と見なされる。
【0114】
免疫調整剤
免疫調整剤または免疫療法薬は大まかに、４種のカテゴリー：チェックポイント阻害剤、サイトカイン、アゴニスト、およびアジュバント、に分別できる。チェックポイント阻害剤は、免疫応答をシャットダウンし腫瘍自体を防護するために腫瘍が頻繁に操作する免疫チェックポイント、即ち免疫系の「ブレーキ」を遮断することにより作用する。その結果、チェックポイント阻害剤は、癌に対する新しい免疫応答を引き出し、ならびに既存の応答を増強して癌細胞の排除を促進できる。２０２０年現在で、チェックポイント阻害剤は、おそらくこれまで開発された中で最も周知され、最も広く成功した免疫調整物質であろう。
免疫調整剤または免疫療法薬は大まかに、４種のカテゴリー：チェックポイント阻害剤、サイトカイン、アゴニスト、およびアジュバント、に分別できる。チェックポイント阻害剤は、免疫応答をシャットダウンし腫瘍自体を防護するために腫瘍が頻繁に操作する免疫チェックポイント、即ち免疫系の「ブレーキ」を遮断することにより作用する。その結果、チェックポイント阻害剤は、癌に対する新しい免疫応答を引き出し、ならびに既存の応答を増強して癌細胞の排除を促進できる。２０２０年現在で、チェックポイント阻害剤は、おそらくこれまで開発された中で最も周知され、最も広く成功した免疫調整物質であろう。
【0115】
例えば、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１免疫チェックポイント経路は、癌標的化Ｔ細胞をシャットダウンし得る。しかし、チェックポイント阻害剤がＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１経路を遮断すると、それらは、Ｔ細胞に癌細胞を排除させることができる。
【0116】
サイトカインは、免疫細胞の成熟、成長、および応答性を調節するメッセンジャー分子である。現在、腎臓癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、および肉腫の患者のサブセットの処置のための、４種のＦＤＡ認可されたサイトカイン免疫療法薬が存在する。
【0117】
アゴニストは、癌細胞を直接攻撃する「キラー」Ｔ細胞の活性化を支援すること、または樹状細胞のような自然免疫細胞の活性を刺激すること、のどちらかにより適応免疫応答を促進する経路を活性化し、それは癌マーカを提示することおよびＴ細胞活性を増強することにより癌に対する全体的免疫応答を協調させる。
【0118】
アジュバントは、全般的な免疫応答を刺激し究極的に適応免疫応答を促進し得る自然免疫系に関与する経路を活性化する。１種のＦＤＡ認可された補助的免疫療法は現在、皮膚癌の１種である扁平上皮癌の患者のサブセットの処置に利用可能である。
【0119】
そのような免疫調整物質の例は、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、インターロイキン２（ＩＬ－２）、インターロイキン３（ＩＬ－３）、インターロイキン１２（ＩＬ－１２）、インターロイキン１５（ＩＬ－１５）、Ｂ７－１（ＣＤ８０）、Ｂ７－２（ＣＤ８６）、４－１ＢＢリガンド、ＧＩＴＲＬ、ＯＸ－４０Ｌ、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２７抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＧＩＴＲ抗体、抗ＯＸ－４０抗体、抗４－１ＢＢ抗体、抗ＬＡＧ－３抗体、および抗ＴＩＭ－３抗体である。
【0120】
補助療法
抗ＢＡＧ２抗体は、抗癌特性を有する他の薬剤または処置の補助として、またはそれと共に用いられてよい。抗ＢＡＧ２抗体および他の薬剤（複数可）は、補助的に用いられる場合、単一の併用薬物配合剤として一緒に配合されてよく、または単一の協調的投与レジメンで、もしくは異なる投与レジメンで、別個に配合および投与されてよい。抗ＢＡＧ２抗体へ補助的に、または抗体と共に投与される薬剤は典型的には、抗ＢＡＧ２抗体への補足的活性を有し、そのため抗体または他の薬剤は、互いに有害に影響しない。
抗ＢＡＧ２抗体は、抗癌特性を有する他の薬剤または処置の補助として、またはそれと共に用いられてよい。抗ＢＡＧ２抗体および他の薬剤（複数可）は、補助的に用いられる場合、単一の併用薬物配合剤として一緒に配合されてよく、または単一の協調的投与レジメンで、もしくは異なる投与レジメンで、別個に配合および投与されてよい。抗ＢＡＧ２抗体へ補助的に、または抗体と共に投与される薬剤は典型的には、抗ＢＡＧ２抗体への補足的活性を有し、そのため抗体または他の薬剤は、互いに有害に影響しない。
【0121】
抗ＣＤ４０抗体へ補助的に、または抗体と共に投与され得る薬剤としては、アルキル化剤、血管新生阻害剤、抗体、代謝拮抗剤、抗有糸分裂薬、抗増殖剤、抗ウイルス薬、オーロラキナーゼ阻害剤、細胞死受容体経路の活性化剤、Ｂｃｒ－Ａｂｌキナーゼ阻害剤、ＢｉＴＥ（Ｂｉ特異性Ｔ細胞エンゲージャー）抗体、抗体薬物コンジュゲート、生体応答調節剤、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤、細胞周期阻害剤、シクロオキシゲナーゼ－２阻害剤、ＤＶＤ、白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＥｒｂＢ２）受容体阻害剤、成長因子阻害剤、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）－９０阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤、ホルモン療法、免疫剤（ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｓ）、アポトーシスタンパク質の阻害剤（ＩＡＰ）、挿入性抗生物質、キナーゼ阻害剤、キネシン阻害剤、Ｊａｋ２阻害剤、哺乳動物ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴｏｒ）の阻害剤、マイクロＲＮＡ、マイトジェン活性化細胞外シグナル調節キナーゼ阻害剤、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、ポリＡＤＰ（アデノシン二リン酸）－リボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）阻害剤、白金化学療法薬、ブルトン型チロシンキナーゼ（ＢＴＫ）阻害剤（例えば、イブルチニブ、アカラブルチニブ）、ポロ様キナーゼ（ＰｌＫ）阻害剤、ホスホイノシチド－３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤、プロテアソーム阻害剤、プリン類似体、ピリミジン類似体、受容体チロシンキナーゼ阻害剤、レチノイド／デルトイド植物アルカロイド、低分子阻害性リボ核酸（ｓｍａｌｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ）（ｓｉＲＮＡ）、トポイソメラーゼ阻害剤、ユビキチンリガーゼ阻害剤および同様のもの、ならびにこれらの薬剤の１種または複数の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【0122】
免疫剤の例としては、インターフェロン、免疫チェックポイント阻害薬、および他の免疫増強剤が挙げられるが、これらに限定されない。インターフェロンとしては、インターフェロンアルファ、インターフェロンアルファ－２ａ、インターフェロンアルファ－２ｂ、インターフェロンベータ、インターフェロンガンマ－１ａ、インターフェロンγ－１ｂ、またはインターフェロンγ－ｎｌ、それらの組み合わせおよび同様のものが挙げられる。免疫チェックポイント阻害薬としては、ＰＤ－１（例えば、ペムブロリズマブおよびニボルマブ）、ＰＤ－Ｌ１（例えば、デュルバルマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、ＭＥＤＩ４７３６、ＭＳＢ００１０７１８ＣおよびＭＰＤＬ３２８０Ａ）、およびＣＴＬＡ４（細胞障害性リンパ球抗原４；例えば、イピリムマブ、トレメリムマブ）を標的とする抗体が挙げられる。免疫増強剤としては、Ｔ細胞を活性化する抗ＯＸ４０アゴニスト抗体が挙げられる。
【0123】
抗ＢＡＧ２抗体はまた、放射線療法の有効性を増強するために用いられてよい。放射線療法の例としては、体外照射療法、体内照射療法（即ち、ブラキテラピー）、および全身照射療法が挙げられる。
【0124】
セラノスティクス
分泌されたＢＡＧ２タンパク質のレベル上昇を有すると診断された患者はその後、ＢＡＧ２に特異的に結合する治療薬で処置される。それゆえ、ＢＡＧ２の分泌レベル上昇と診断された患者は、ＢＡＧ２を阻害する治療薬での処置から利益を享受するであろう。したがって、癌処置と、癌の処置または予防のための治療薬の有効量の投与との適切性を評定することは、１）癌を有することが疑われる患者、または癌を発症するリスクがある患者、または転移癌を発症するリスクがある患者から試料を得るステップと；２）分泌されたＢＡＧ２の量を測定するステップであって、測定されたレベルが、対照試料中で測定されたものを有意に上回る、ステップと；３）患者が癌を有すること、またはより攻撃的な癌もしくは転移癌を発症していることを決定するステップと；４）ＢＡＧ２の発現を抑制する治療薬の有効量を患者に投与するステップ、からなる。
分泌されたＢＡＧ２タンパク質のレベル上昇を有すると診断された患者はその後、ＢＡＧ２に特異的に結合する治療薬で処置される。それゆえ、ＢＡＧ２の分泌レベル上昇と診断された患者は、ＢＡＧ２を阻害する治療薬での処置から利益を享受するであろう。したがって、癌処置と、癌の処置または予防のための治療薬の有効量の投与との適切性を評定することは、１）癌を有することが疑われる患者、または癌を発症するリスクがある患者、または転移癌を発症するリスクがある患者から試料を得るステップと；２）分泌されたＢＡＧ２の量を測定するステップであって、測定されたレベルが、対照試料中で測定されたものを有意に上回る、ステップと；３）患者が癌を有すること、またはより攻撃的な癌もしくは転移癌を発症していることを決定するステップと；４）ＢＡＧ２の発現を抑制する治療薬の有効量を患者に投与するステップ、からなる。
【0125】
化学修飾ペプチド
ポリペプチドまたは抗体治療薬は、短い循環半減期およびタンパク質分解および低溶解度の影響を被る可能性がある。本発明のバイオ医薬の薬物動態および薬力学特性を改善するために、アミノ酸配列の操作などの方法を行って、免疫原性を低下または上昇させ、タンパク質分解切断を減少させてよく、免疫グロブリンおよびアルブミンなどの血清蛋白質へのペプチドの融合またはコンジュゲーションを行ってよく；防護および徐放のための本発明のペプチドおよび抗体などのバイオ医薬のための薬物送達ビヒクルへの組み込みもまた行ってよく；天然または合成ポリマーへのコンジュゲーティングもまた企図される。詳細には、合成ポリマーコンジュゲーションのために、ペグ化、またはアシル化、例えばＮ－アシル化、Ｓ－アシル化なども、企図される。
ポリペプチドまたは抗体治療薬は、短い循環半減期およびタンパク質分解および低溶解度の影響を被る可能性がある。本発明のバイオ医薬の薬物動態および薬力学特性を改善するために、アミノ酸配列の操作などの方法を行って、免疫原性を低下または上昇させ、タンパク質分解切断を減少させてよく、免疫グロブリンおよびアルブミンなどの血清蛋白質へのペプチドの融合またはコンジュゲーションを行ってよく；防護および徐放のための本発明のペプチドおよび抗体などのバイオ医薬のための薬物送達ビヒクルへの組み込みもまた行ってよく；天然または合成ポリマーへのコンジュゲーティングもまた企図される。詳細には、合成ポリマーコンジュゲーションのために、ペグ化、またはアシル化、例えばＮ－アシル化、Ｓ－アシル化なども、企図される。
【0126】
核酸構築物
また提供されるのは、本明細書に記載された本発明の核酸分子を含む発現ベクターであり、ここで核酸分子は、発現制御配列に動作可能に連結される。また提供されるのは、ポリペプチドの発現に適した宿主細胞に導入された本発明の発現ベクターを含むポリペプチドの生成のための宿主－ベクター系である。適切な宿主細胞は、Ｅ．コリなどのバクテリア細胞、ピキア・パストリスなどの酵母細胞、スポドプテラ・フルギペルダなどの昆虫細胞、またはＣＯＳ、ＨＥＫもしくはＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞であってよい。
また提供されるのは、本明細書に記載された本発明の核酸分子を含む発現ベクターであり、ここで核酸分子は、発現制御配列に動作可能に連結される。また提供されるのは、ポリペプチドの発現に適した宿主細胞に導入された本発明の発現ベクターを含むポリペプチドの生成のための宿主－ベクター系である。適切な宿主細胞は、Ｅ．コリなどのバクテリア細胞、ピキア・パストリスなどの酵母細胞、スポドプテラ・フルギペルダなどの昆虫細胞、またはＣＯＳ、ＨＥＫもしくはＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞であってよい。
【0127】
本発明はまた、本発明のポリペプチドの生成を可能にする条件下で、本明細書に記載された宿主－ベクター系の細胞を生育すること、およびそのように生成されたポリペプチドを回収すること、により本発明のポリペプチドを生成する方法を提供する。本発明を実践するのに有用なポリペプチドは、原核生物または真核生物発現系における発現により調製されてよい。
【0128】
任意の数の方法を利用して、組換え遺伝子を発現させ、ポリペプチドを精製してよい。遺伝子は、例えば非限定的にｐＺＥｒＯなどの、バクテリア発現ベクターにサブクローニングされてよい。
【0129】
ポリペプチドは、その後の安定な生物活性タンパク質の形成を可能にする任意の技術により精製されてよい。例えば、かつ限定ではなく、因子を、可溶性タンパク質または封入体のどちらかとして細胞から回収してよく、それらを８Ｍグアニジン塩酸塩および透析により定量的に抽出してよい。因子をさらに精製するために、非限定的に、従来のイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、異なる糖クロマトグラフィー（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｕｇａｒ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）、疎水性相互作用クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーまたはゲル濾過を含む、任意の数の精製方法が、用いられてよい。
【0130】
ベクターへのＤＮＡフラグメントの挿入のための当業者に知られる方法のいずれかが、適当な転写／翻訳制御シグナル、およびタンパク質コード配列を用いて本発明のポリペプチドをコードする発現ベクターを構築するために用いられてよい。これらの方法は、インビトロ組換えＤＮＡおよび合成技術、ならびにインビボ組換え（遺伝子組換え）を包含してよい。ポリペプチドをコードする核酸配列の発現は、本発明のポリペプチドが組換えＤＮＡ分子を形質転換された宿主の中で発現されるように、第二の核酸配列により調節されてよい。例えば、本明細書に記載されたポリペプチドの発現は、当該技術分野で公知の任意のプロモーター／エンハンサーエレメントにより制御されてよい。ポリペプチドの発現を制御するために用いられ得るプロモーターとしては、Ｓｑｕｉｎｔｏ ｅｔ ａｌ．，（１９９１， Ｃｅｌｌ ６５：１－２０）に記載されたロングターミナルリピート；ＳＶ４０初期プロモーター領域（Ｂｅｒｎｏｉｓｔ ａｎｄ Ｃｈａｍｂｏｎ， １９８１， Ｎａｔｕｒｅ ２９０：３０４－３１０）、ＣＭＶプロモーター、Ｍ－ＭｕＬＶ ５’ターミナルリピート、ラウス肉腫ウイルスの３’ロングターミナルリピートの中に含有されるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏ， ｅｔ ａｌ．， １９８０， Ｃｅｌｌ ２２：７８７－７９７）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８１， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ７８：１４４－１４４５）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８２， Ｎａｔｕｒｅ ２９６：３９－４２）；β－ラクタマーゼプロモーターなどの原核生物発現ベクター（Ｖｉｌｌａ－Ｋａｍａｒｏｆｆ， ｅｔ ａｌ．， １９７８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ７５：３７２７－３７３１）、またはｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒ， ｅｔ ａｌ．， １９８３， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８０：２１－２５）、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ， １９８０， ２４２：７４－９４の中の“Ｕｓｅｆｕｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｂａｃｔｅｒｉａ”も参照；Ｇａｌ４プロモーター、ＡＤＨ（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、ＰＧＫ（ホスホグリセロールキナーゼ）プロモーター、アルカリホスファターゼプロモーターなどの酵母または他の真菌からのプロモーターエレメント、ならびに組織特異性を呈し、トランスジェニック動物内で利用されてきた以下の動物転写制御領域：膵臓腺房細胞内で活性のエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Ｓｗｉｆｔ ｅｔ ａｌ．， １９８４， Ｃｅｌｌ ３８：６３９－６４６； Ｏｒｎｉｔｚ ｅｔ ａｌ．， １９８６， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ． Ｑｕａｎｔ． Ｂｉｏｌ． ５０：３９９－４０９； ＭａｃＤｏｎａｌｄ， １９８７， Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ７：４２５－５１５）；膵臓ベータ細胞内で活性のインスリン遺伝子制御領域（Ｈａｎａｈａｎ， １９８５， Ｎａｔｕｒｅ ３１５：１１５－１２２）、リンパ細胞内で活性の免疫グロブリン遺伝子制御領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌ ｅｔ ａｌ．， １９８４， Ｃｅｌｌ ３８：６４７－６５８； Ａｄａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．， １９８５， Ｎａｔｕｒｅ ３１８：５３３－５３８； Ａｌｅｘａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８７， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ７：１４３６－１４４４）、精巣、乳房、リンパおよび肥満細胞（Ｌｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８６， Ｃｅｌｌ ４５：４８５－４９５）、センダイウイルス、レンチウイルス内で活性のマウス哺乳動物腫瘍ウイルス制御領域、肝臓内で活性のアルブミン遺伝子制御領域（Ｐｉｎｋｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， １９８７， Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ． １：２６８－２７６）、肝臓内で活性のアルファ－フェトプロテイン遺伝子制御領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆ ｅｔ ａｌ．， １９８５， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ５：１６３９－１６４８； Ｈａｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８７， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３５：５３－５８）；肝臓内で活性のアルファ１－アンチトリプシン遺伝子制御領域（Ｋｅｌｓｅｙ ｅｔ ａｌ．， １９８７， Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ． １：１６１－１７１）、骨髄細胞内で活性のベータ－グロブリン遺伝子制御領域（Ｍｏｇｒａｍ ｅｔ ａｌ．， １９８５， Ｎａｔｕｒｅ ３１５：３３８－３４０； Ｋｏｌｌｉａｓ ｅｔ ａｌ．， １９８６， Ｃｅｌｌ ４６：８９－９４）；脳内の乏突起膠細胞内で活性のミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Ｒｅａｄｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．， １９８７， Ｃｅｌｌ ４８：７０３－７１２）；骨格筋内で活性のミオシン軽鎖－２遺伝子制御領域（Ｓｈａｎｉ， １９８５， Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２８３－２８６）、および視床下部内で活性のゴナドトロピン放出ホルモン遺伝子制御領域（Ｍａｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９８６， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３４：１３７２－１３７８）が挙げられるが、これらに限定されない。
【0131】
したがって、本発明によれば、本明細書に記載されたポリペプチドをコードする核酸を含むバクテリアまたは真核生物宿主において複製され得る発現ベクターを用いて、宿主をトランスフェクトし、それによりそのような核酸の発現を指揮してポリペプチドを生成し、それがその後、生物活性形態で回収されてよい。本明細書で用いられる生物活性形態は、関連の受容体に結合すること、および分化された機能を引き起こすこと、および／または受容体を発現する細胞の表現型に影響を及ぼすことが可能な形態を包含する。
【0132】
核酸挿入物を含有する発現ベクターは、非限定的に、少なくとも３種の一般的アプローチ：（ａ）ＤＮＡ－ＤＮＡハイブリダイゼーション、（ｂ）「マーカ」遺伝子機能の存在または非存在、および（ｃ）挿入された配列の発現、により同定され得る。第一のアプローチにおいて、発現ベクター内に挿入された外来核酸の存在が、挿入された核酸配列に相同的な配列を含むプローブを用いるＤＮＡ－ＤＮＡハイブリダイゼーションにより検出され得る。第二のアプローチにおいて、組換えベクター／宿主系が、ベクター内の外来核酸配列の挿入により引き起こされる特定の「マーカ」遺伝子機能（例えば、チミジンキナーゼ活性、抗生物質への耐性、形質転換表現型、バキュロウイルス内の包埋体形成ほか）の存在または非存在に基づいて同定および選択され得る。例えば、ｅｆｌ核酸配列が、ベクターのマーカ遺伝子配列内に挿入されるなら、挿入部を含有する組換え体が、マーカ遺伝子機能の非存在により同定され得る。第三のアプローチにおいて、組換え発現ベクターが、組換え構築物により発現された外来核酸生成物をアッセイすることにより同定され得る。そのようなアッセイは、例えばリガンドの、例えば検出可能な抗体もしくはその一部でタグづけられ得る受容体もしくはその一部への結合、または該当するタンパク質もしくはその一部に対して生成された抗体への結合による、該当する核酸生成物の物理的または機能的特性に基づき得る。
【0133】
特に本発明の修飾された、ポリペプチドは、一過的に、構成的にまたは恒久的に宿主細胞で発現されてよい。
【0134】
本出願内で示された疾患または障害を処置するために有用な有効用量は、当業者に公知の方法を用いて決定されてよい（例えば、Ｆｉｎｇｌ， ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ， ｅｄｓ． Ｍａｃｍｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐｐ． １－４６ （１９７５）参照）。本発明による使用のための医薬組成物は、インビボ投与に先立ち、担体もしくは標的分子（例えば、抗体、ホルモン、成長因子ほか）に連結され、かつ／またはリポソーム、マイクロカプセルおよび制御放出調製物内に組み込まれる、薬理学的に許容できる液体、固体または半固体担体の中に先に記載されたポリペプチドを含む。例えば、医薬組成物は、滅菌水、生理食塩水、リン酸緩衝液またはデキストロース溶液などの水性溶液中にポリペプチドを含んでよい。あるいは活性剤は、そのような処置を必要とする患者にインプラントされ得る固体（例えば、ワックス）または半固体（例えば、ゼラチン性）配合剤の中に含まれてよい。投与経路は、非限定的に、静脈内、髄腔内、皮下、子宮内、関与する組織への注射による、動脈内、鼻内、経口、またはインプラントデバイス経由を含む、当該技術分野で公知の任意の投与様式であってよい。
【0135】
投与は、体全体への、または局所エリアへの本発明の活性剤の分布をもたらし得る。例えば、神経系の離れた領域を含む幾つかの条件において、薬剤の静脈内または髄腔内投与が、望ましいかもしれない。幾つかの状況において、活性剤を含有するインプラントが、病巣エリアに、またはその付近に配置されてよい。適切なインプラントとしては、ゲルフォーム、ワックス、スプレー、またはマイクロ粒子に基づくインプラントが挙げられるが、これらに限定されない。
【0136】
本発明はまた、薬理学的に許容できるビヒクル中に本明細書に記載されたポリペプチドを含む医薬組成物を提供する。組成物は、全身または局所投与されてよい。非限定的に静脈内、髄腔内、動脈内、鼻内、経口、皮下、腹腔内、または局所注射もしくは外科インプラントを含む、当該技術分野で知られる任意の適当な投与様式が、用いられてよい。徐放性配合剤もまた、提供される。
【0137】
遺伝子療法
遺伝子療法は、発現されたまたは発現可能な核酸の対象への投与により実施される治療を指す。本発明のこの実施形態において、核酸は、治療効果を媒介するそれらのコード化タンパク質を生成する。
遺伝子療法は、発現されたまたは発現可能な核酸の対象への投与により実施される治療を指す。本発明のこの実施形態において、核酸は、治療効果を媒介するそれらのコード化タンパク質を生成する。
【0138】
当該技術分野で利用可能な遺伝子療法のための方法のいずれかが、本発明により用いられ得る。例示的方法を、以下に記載する。
【0139】
遺伝子療法の方法の一般的レビューについては、Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ １２：４８８－５０５ （１９９３）； Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ， Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ３：８７－９５ （１９９１）； Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｏｘｉｃｏｌ． ３２：５７３－５９６ （１９９３）； Ｍｕｌｌｉｇａｎ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６－９３２ （１９９３）；およびＭｏｒｇａｎ ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６２：１９１－２１７ （１９９３）； Ｍａｙ， ＴＩＢＴＥＣＨ １１（５）：１５５－２１５ （１９９３）を参照されたい。用いられ得る組換えＤＮＡ技術の当該技術分野で一般に知られる方法は、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ．）、 Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， ＮＹ （１９９３）；およびＫｒｉｅｇｌｅｒ， Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ （１９９０）に記載される。
【0140】
患者への核酸の送達は、直接的であってよく、その場合、患者は核酸もしくは核酸を担持したベクターに直接暴露され、または間接的であってよく、その場合、細胞は最初に、インビトロで核酸で形質転換され、その後患者に移植される。これらの２つのアプローチは、それぞれインビボまたはエクスビボ遺伝子療法として知られる。
【0141】
具体的実施形態において、核酸配列は、インビボで直接投与され、そこで発現されてコード化生成物を生成する。これは、当該技術分野で公知の数多くの方法のいずれかにより、例えば核酸配列を適当な核酸発現ベクターの一部として構築すること、および核酸配列が細胞内になるようにベクターを投与することにより、例えば欠損もしくは弱毒レトロウイルスもしくは他のウイルスベクターを用いる感染により、またはネイキッドＤＮＡの直接注射、または脂質もしくは細胞表面受容体もしくはトランスフェクション剤でコーティングすること、またはリポソーム、マイクロ粒子もしくはマイクロカプセル中のカプセル化により、または核に進入することが知られるペプチドに連結されたそれらを投与することにより、受容体介在性エンドサイトーシスを受けたリガンドに連結されたそれを投与すること（例えば、Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６２：４４２９－４４３２（１９８７）参照）（これは、受容体を特異的に発現する細胞型を標的にするために用いられ得る）などにより、遂行され得る。別の実施形態において、核酸－リガンド複合体が形成され得、その中でリガンドは、エンドソームを破壊するために融合性ウイルスペプチドを含み、核酸にリソゾーム分解を回避させる。さらに別の実施形態において、核酸は、特異性受容体を標的にすることにより、細胞特異性の取り込みおよび発現のためにインビボで標的にされ得る。あるいは、核酸は、相同組換えにより、細胞内に導入され発現のために宿主細胞ＤＮＡ内に組み込まれ得る（Ｋｏｌｌｅｒ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈｉｅｓ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６：８９３２－８９３５ （１９８９）； Ｚｉｊｌｓｔｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３４２：４３５－４３８（１９８９））。
【0142】
具体的実施形態において、ポリペプチドをコードする核酸配列を含有するウイルスベクターが、用いられる。遺伝子療法に用いられるポリペプチドをコードする核酸配列が、１種または複数のベクター中にクローニングされ、それは患者への遺伝子送達を容易にする。レトロウイルスベクターなどのレンチウイルスベクター、ならびにアデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスなどの他のベクターが、用いられ得るウイルスベクターの例である。レトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムの正しいパッケージングおよび宿主細胞ＤＮＡへの取り込みに必要な構成成分を含有する。
【0143】
アデノウイルスは、それらが呼吸器上皮に自然に感染して軽度の疾患を引き起こすため、呼吸器上皮に遺伝子を送達するための特に魅力的なビヒクルである。アデノウイルスに基づく送達システムのための他の標的は、肝臓、中枢神経系、内皮細胞、および筋肉である。アデノウイルスは、非分裂細胞に感染できるという利点を有する。加えて、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）もまた、遺伝子療法における使用に提案されてきた。
【0144】
遺伝子療法の別のアプローチは、電気穿孔、リポフェクション、リン酸カルシウムを介したトランスフェクション、またはウイルス感染のような方法により組織培養物中の細胞に遺伝子を移入することを含む。通常、移入の方法は、細胞への選択マーカの移入を含む。細胞をその後、選択下に置いて、移入された遺伝子を取り込んで発現しているそれらの細胞を単離する。それらの細胞をその後、患者に送達する。
【0145】
この実施形態において、核酸は、得られた組換え細胞のインビボ投与に先立ち、細胞内に導入される。そのような導入は、非限定的にトランスフェクション、電気穿孔、マイクロインジェクション、核酸配列を含有するウイルスまたはバクテリオファージベクターでの感染、細胞融合、染色体を媒介した遺伝子移入、マイクロセルを介した遺伝子移入、スフェロプラスト融合などを含む、当該技術分野で公知の任意方法により実行され得る。数多くの技術が、細胞内への外来遺伝子の導入のために、当該技術分野で知られており、レシピエント細胞の必要な発達および生理学的機能が破壊されないことを条件に、本発明により用いられてよい。その技術は、核酸が細胞により発現可能であるように、好ましくは細胞子孫により継承可能かつ発現可能であるように、細胞への核酸の安定な移入を提供しなければならない。
【0146】
その中に核酸が遺伝子療法の目的で導入され得る細胞は、任意の望ましい利用可能な細胞型を包含し、上皮細胞、内皮細胞、角化細胞、線維芽細胞、筋肉細胞、肝細胞；Ｔリンパ球、Ｂ－リンパ球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球などの血液細胞；様々な幹細胞または前駆細胞、特に、例えば骨髄、臍帯血、末梢血、胎児肝臓などから得られるような、造血幹細胞または前駆細胞を含むが、これらに限定されない。
【0147】
好ましい実施形態において、遺伝子療法に用いられる細胞は、患者に対し自己である。
【0148】
組換え細胞が遺伝子療法に用いられる実施形態において、ポリペプチドをコードする核酸配列は、細胞またはその子孫により発現可能になるように細胞に導入され、組換え細胞はその後、治療効果のためにインビボ投与される。具体的実施形態において、幹細胞または前駆細胞が、用いられる。単離されてインビトロで維持され得る任意の幹細胞および／または前駆細胞が潜在的に、本発明のこの実施形態により用いられ得る。
【0149】
具体的実施形態において、遺伝子療法の目的で導入される核酸は、転写の適当な誘導物質の存在または非存在を制御することにより核酸の発現が制御可能になるように、コード領域に動作可能に連結された誘導型プロモーターを含む。
【0150】
治療組成物
治療化合物の配合剤は、当該技術分野で一般に知られており、簡便にはＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １７ｔｈ ｅｄ．， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， Ｐａ．， ＵＳＡで参照され得る。例えば、約０．０５ｎｇ～約２０ｍｇ／キログラム体重／日が、投与されてよい。投与レジメンは、最適な治療応答を提供するように調整されてよい。例えば複数の分割用量が、連日投与されてよく、または用量は、治療状況の急迫性により示される通り、比例して低減されてよい。活性化合物は、経口、静脈内（水溶性なら）、筋肉内、皮下、鼻内、眼内、皮内もしくは坐剤経路による、または埋め込み（例えば、腹腔内経路により徐放性分子を用いて、またはインビトロで感作されてレシピエントに養子移入された細胞、例えば単球もしくは樹状細胞を用いることにより）によるなどの、簡便な手法で投与されてよい。投与経路に応じて、ペプチドは、上記成分を不活性化し得る酵素、酸および他の自然条件の作用から防護するために材料でコートされることが必要とされてよい。
治療化合物の配合剤は、当該技術分野で一般に知られており、簡便にはＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １７ｔｈ ｅｄ．， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， Ｐａ．， ＵＳＡで参照され得る。例えば、約０．０５ｎｇ～約２０ｍｇ／キログラム体重／日が、投与されてよい。投与レジメンは、最適な治療応答を提供するように調整されてよい。例えば複数の分割用量が、連日投与されてよく、または用量は、治療状況の急迫性により示される通り、比例して低減されてよい。活性化合物は、経口、静脈内（水溶性なら）、筋肉内、皮下、鼻内、眼内、皮内もしくは坐剤経路による、または埋め込み（例えば、腹腔内経路により徐放性分子を用いて、またはインビトロで感作されてレシピエントに養子移入された細胞、例えば単球もしくは樹状細胞を用いることにより）によるなどの、簡便な手法で投与されてよい。投与経路に応じて、ペプチドは、上記成分を不活性化し得る酵素、酸および他の自然条件の作用から防護するために材料でコートされることが必要とされてよい。
【0151】
例えば、ペプチドの低い親油性は、ペプチド結合を切断できる酵素により消化管内で、および酸加水分解により胃内で、ペプチドを破壊させるであろう。非経口投与以外によりペプチドを投与するために、それらは、不活性化を予防する材料によりコートされるか、または材料と共に投与されるであろう。例えばペプチドは、アジュバント中で投与されても、酵素阻害剤と共投与されても、またはリポソーム中にあってもよい。本明細書で企図されるアジュバントとしては、レゾリシノール、ポリオキシエチレンオレイルエーテルなどの非イオン性界面活性剤、およびｎ－ヘキサデシルポリエチレンエーテルが挙げられる。酵素阻害剤としては、膵トリプシン阻害剤、ジイソプロピルフルオロリン酸（ＤＥＰ）およびトラシロールが挙げられる。リポソームとしては、水中油中水ＣＧＦエマルジョンおよび従来のリポソームが挙げられる。
【0152】
活性化合物はまた、非経口または腹腔内投与されてよい。分散体もまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール（ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｌｉｑｕｉｄ ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌｓ）、およびそれらの混合物中、ならびに油中で調製され得る。貯蔵および使用の通常条件下では、これらの調製物は、微生物の生育を予防する防腐剤を含有する。
【0153】
注射可能な使用に適した医薬形態としては、滅菌水性溶液（水溶性ならば）または分散液、および滅菌注射可能溶液または分散液の即時調製のための滅菌粉末が挙げられる。全ての例で、その形態は、滅菌されていなければならず、容易な注入可能性（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度に流動的でなければならない。これは、製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、バクテリアおよび真菌などの微生物の汚染作用から防御されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールおよび同様のもの）、それらの適切な混合物、および植物油を含有する溶媒または分散媒であり得る。適正な流動性は、例えば、レシチン等のコーティングの使用により、分散液の場合には要求される粒子サイズの維持により、および界面活性剤の使用により、維持され得る。微生物の作用の予防は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えばクロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、テオメルサール（ｔｈｅｏｍｅｒｓａｌ）および同様のものによりもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。注射可能な組成物の持続的吸収は、組成物中での吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によりもたらされ得る。
【0154】
滅菌注射可能溶液は、先に列挙され様々な他の成分と共に適当な溶媒に必要量の活性化合物を組み込むこと、必要に応じて次に濾過滅菌することにより、調製され得る。一般的に分散液は、基本的な分散媒と、先に列挙された成分からの必要とされる他の成分とを含有する滅菌ビヒクル中に様々な滅菌有効成分を組み込むことにより調製される。滅菌注射可能溶液を調製するための滅菌粉末の例では、好ましい調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥の技術であり、これらは、予め濾過滅菌されたその溶液から、有効成分および任意の追加の所望の成分の粉末を生じる。
【0155】
ペプチドが、先に記載された通り適切に防護される場合、活性化合物は、例えば不活性希釈剤もしくは同化可能な食用担体と共に経口投与されてよく、またはそれは、硬もしくは軟ゼラチンカプセルの中に封入されてよく、または打錠されてよく、または直接食事の食物と組み込まれてよい。経口治療投与では、活性化合物は、賦形剤と組み込まれ、摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、ウェハースおよび同様のものの形態で用いられてよい。そのような組成物および調製物は、少なくとも１重量％の活性化合物を含有しなければならない。組成物および調製物の割合％は、もちろん変動してよく、簡便には約５～約８０重量％の間の単位であってよい。そのような治療有用性組成物中の活性化合物の量は、適切な投与量が得られるようなものである。本発明による好ましい組成物または調製物は、経口投与単位剤形が約０．１μｇ～約２０００ｍｇの間の活性化合物を含有するように調製される。
【0156】
錠剤、丸薬、カプセルおよび同様のものもまた、以下のものを含有してよい：トラガカントガム、アラビアゴム、コーンスターチもしくはゼラチンなどの結合剤；リン酸二カルシウムなどの賦形剤；コーンスターチ、じゃがいもデンプン、アルギン酸および同様のものなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤；ならびにスクロース、ラクトースもしくはサッカリンなどの甘味剤、またはペパーミント、ウィンターグリーンオイル、もしくはサクランボフレーバなどの香味剤が、添加されてよい。投与単位剤形がカプセルである場合、それは、上記タイプの材料に加え、液体担体を含有してよい。様々な他の材料が、コーティングとして、または他の方法で投与単位の物理的形態を改良するために、存在してよい。例えば錠剤、丸薬、またはカプセルが、シェラック、糖、またはその両方でコーティングされてよい。シロップまたはエリキシルが、活性化合物、甘味剤としてのスクロース、防腐剤としてのメチルおよびプロピルパラベン、サクランボまたはオレンジフレーバなどの色素および香料を含有してよい。もちろん、任意の投与単位剤形を調製する際に用いられる任意の材料は、医薬的に純粋であり、用いられる量で実質的に非毒性でなければならない。加えて、活性化合物は、徐放性調製物および配合剤中に組み込まれてよい。
【0157】
送達システム
様々な送達システム、例えばリポソーム中のカプセル化、マイクロ粒子、マイクロカプセル、化合物を発現することが可能な組換え細胞、受容体介在性エンドサイトーシス、レトロウイルスまたは他のベクターの一部としての核酸の構築など、が公知であり、本発明の化合物を投与するために用いられ得る。導入の方法としては、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻内、眼内、硬膜外、および経口経路が挙げられるが、これらに限定されない。化合物または組成物は、任意の簡便な経路により、例えば輸液またはボーラス注射により、上皮または皮膚粘膜ライニング(ｍｕｃｏｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｌｉｎｉｎｇ)(例えば、口腔粘膜、直腸および腸管粘膜ほか)を通した吸収により投与されてよく、および他の生物活性剤と一緒に投与されてよい。投与は、全身または局所であり得る。加えて、本発明の医薬化合物または組成物を、脳室内および髄腔内注射を含む、任意の適切な経路により中枢神経系に導入することが望ましく、脳室内注射は、例えばＯｍｍａｙａリザーバーなどのリザーバーに取り付けられた、脳室内カテーテルにより容易にされ得る。肺投与もまた、例えば吸入器またはネブライザーの使用、およびエアロゾル化剤の配合により、用いられ得る。
様々な送達システム、例えばリポソーム中のカプセル化、マイクロ粒子、マイクロカプセル、化合物を発現することが可能な組換え細胞、受容体介在性エンドサイトーシス、レトロウイルスまたは他のベクターの一部としての核酸の構築など、が公知であり、本発明の化合物を投与するために用いられ得る。導入の方法としては、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻内、眼内、硬膜外、および経口経路が挙げられるが、これらに限定されない。化合物または組成物は、任意の簡便な経路により、例えば輸液またはボーラス注射により、上皮または皮膚粘膜ライニング(ｍｕｃｏｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｌｉｎｉｎｇ)(例えば、口腔粘膜、直腸および腸管粘膜ほか)を通した吸収により投与されてよく、および他の生物活性剤と一緒に投与されてよい。投与は、全身または局所であり得る。加えて、本発明の医薬化合物または組成物を、脳室内および髄腔内注射を含む、任意の適切な経路により中枢神経系に導入することが望ましく、脳室内注射は、例えばＯｍｍａｙａリザーバーなどのリザーバーに取り付けられた、脳室内カテーテルにより容易にされ得る。肺投与もまた、例えば吸入器またはネブライザーの使用、およびエアロゾル化剤の配合により、用いられ得る。
【0158】
具体的実施形態において、本発明の医薬化合物または組成物を、処置を必要とするエリアに局所投与することが望ましく、これは、例えば限定ではなく、手術の間の局所輸液により、例えば手術後の創傷包帯と併せた、外用塗布により、注射により、カテーテルの手段により、坐剤の手段により、またはインプラントの手段により実現されてよく、上記インプラントは、Ｓｉａｌａｓｔｉｃ膜などの膜または繊維を含む、多孔質、非多孔質、またはゼラチン状材料である。好ましくは、本発明の抗体またはペプチドを含むタンパク質を投与する場合、タンパク質が吸収されない材料を使用することに、注意しなければならない。別の実施形態において、化合物または組成物は、小胞、特にリポソーム中で送達され得る。さらに別の実施形態において、化合物または組成物は、制御放出システム中で送達され得る。一実施形態において、ポンプが、用いられてよい。別の実施形態において、ポリマー材料が、用いられ得る。さらに別の実施形態において、制御放出システムが、治療ターゲットの付近に配置され得、これにより全身投与の一部のみを必要とする。
【0159】
以下の実施例は、本発明の例示として提供され、限定ではない。
【0160】
実施例
実施例１：抗ＢＡＧ２抗体の選択、シーケンシングおよび抗原－抗体反応
１．ＢＡＧ２を標的とするモノクローナル抗体の選択およびそのアミノ酸配列の解析
本発明者らは、ＢＡＧ２を標的とする抗体を選択し、それらのアミノ酸配列を解析し、抗体のそれぞれの相補性決定領域（ＣＤＲ）を決定した。
実施例１：抗ＢＡＧ２抗体の選択、シーケンシングおよび抗原－抗体反応
１．ＢＡＧ２を標的とするモノクローナル抗体の選択およびそのアミノ酸配列の解析
本発明者らは、ＢＡＧ２を標的とする抗体を選択し、それらのアミノ酸配列を解析し、抗体のそれぞれの相補性決定領域（ＣＤＲ）を決定した。
【0161】
詳細には、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９のアミノ酸配列からなるヒトＢＡＧ２タンパク質をコードするＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０のヌクレオチド配列からなる遺伝子を、ｐＣＡＧＧＳプラスミドにクローニングし直鎖状にし、直鎖状にされた構築物をその後、電気ショックをあてることにより、５匹の６週齢雌ＢＡＬＢ／ｃマウスの筋肉に接種した。この構築物を、３週間間隔で３回、筋肉内に接種し、それは１００μｌのＰＢＳ中の１００μｇのＤＮＡからなった。この時、対照群のプラスミドも同じ手法に供した。治療抗体および診断抗体を生成するために、タンパク質を基にした抗原注射よりも効率的な、ＤＮＡワクチンを基にした免疫方策を実施した。血液を、マウスの眼底大静脈または尾静脈から採取し、酵素免疫測定法により検査し血清抗体価を示し、脾臓を、充分な抗体価を示したマウスから、最後の免疫化の３日後に摘出した。Ｂリンパ球を、脾臓から単離し、単離されたＢリンパ球、即ちＡＴＣＣのＳＰ２／０－Ａｇ１４細胞株と培養された骨髄腫細胞による融合が続き、それにより融合された細胞を得た。融合された細胞を、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含有するＨＡＴ培地中で培養した後、骨髄腫およびＢリンパ球のみで融合されたハイブリドーマ細胞を、およそ１３０のクローンを選択することにより得た。免疫ブロッティングによる選択工程を通して得られたハイブリドーマ細胞から、ヒトＢＡＧ２タンパク質に特異的に結合する抗体を生成する１０種のハイブリドーマ細胞を、得た。
【0162】
抗Ｂａｇ２抗体の総ＲＮＡを、５×１０６ハイブリドーマ細胞から生成し、５’－ＲＡＣＥ－ｃＤＮＡを、製造業者の使用説明に従いＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いることにより、１００ｎｇの総ＲＮＡから生成した。重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードする領域を、ＰＣＲにより増幅し、増幅された遺伝子を、ｐＧＥＭ－Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）に挿入し、クローニングし、そのヌクレオチド配列を、自動遺伝子解析装置（ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３１０、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ Ｃｏ．）を用いることにより解析した。解析された遺伝子のヌクレオチド配列を、過去に報告されたヌクレオチド配列との比較により同定し、同定されたヌクレオチド配列を、相補性決定領域ＶＨ－ＣＤＲ１、－ＣＤＲ２、および－ＣＤＲ３、ならびにＶＬ－ＣＤＲ１、－ＣＤＲ２、および－ＣＤＲ３の配列を決定することにおける使用のために人工的に翻訳した。相補性決定領域の配列を決定することを、Ｋａｂａｔのデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／）を用いることにより実施した。
【0163】
結果として、ＢＡＧ２に特異的に結合する１０種の抗ＢＡＧ２抗体を、ハイブリドーマ細胞から得た。１０種の抗ＢＡＧ２抗体は、２Ａ１１、４Ｃ２、８Ｃ４、３Ｂ５、９Ｂ３、９Ｂ１２、３Ｂ１０、１０Ｈ７、３ＧＢ、および３Ｆ１２抗体であった。加えて、表１～３に示された重鎖可変領域、軽鎖可変領域およびそれらの相補性決定領域のアミノ酸配列、ならびに抗体をコードする遺伝子のヌクレオチド配列を、決定した。
【0164】
２Ａ１１、４Ｃ２、および８Ｃ４抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを含む。２Ａ１１抗体では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１の５６および５７番目のＸａａは、それぞれＧｌｙであり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７の５３番目のＸａａは、ｌｉｅである。４Ｃ２抗体では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１の５６番目のＸａａおよび５７番目のＸａａは、それぞれＧｌｙおよびＡｌａであり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７の５３番目のＸａａは、Ｐｈｅである。８Ｃ４抗体では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１の５６番目のＸａａおよび５７番目のＸａａは、それぞれＡｌａおよびＧｌｙであり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７の５３番目のＸａａは、Ｐｈｅである。
【0165】
２Ａ１１、４Ｃ２、および８Ｃ４抗体のＶＨ－ＣＤＲ１、－ＣＤＲ２および－ＣＤＲ３は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３、３９および４５のアミノ酸配列からなり、ＶＬ－ＣＤＲ１、－ＣＤＲ２および－ＣＤＲ３は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１、５７および６３のアミノ酸配列からなる。２Ａ１１抗体では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１の５６および５７番目のＸａａは、それぞれＧｌｙである。４Ｃ２抗体に関しては、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１では５６番目のＸａａは、Ｇｌｙであり、５７番目のＸａａは、Ａｌａである。８Ｃ４抗体に関しては、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１では５６番目のＸａａは、Ａｌａであり、５７番目のＸａａは、Ｇｌｙである。
【0166】
９Ｂ３、９Ｂ１２および３Ｂ１０抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを含む。９Ｂ３抗体に関しては、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３では１番目のＸａａは、Ｇｌｕであり、７番目のＸａａは、Ｓｅｒであり、１２番目のＸａａは、Ｖａｌであり、２７番目のＸａａは、Ｔｙｒであり、５８番目のＸａａは、Ｓｅｒであり、６１番目のＸａａは、Ａｓｎであり、７４番目のＸａａは、Ｌｙｓであり、８３番目のＸａａは、Ｐｈｅであり、９２番目のＸａａは、Ａｌａであり、１０８番目のＸａａは、Ｔｙｒである。９Ｂ３抗体に関しては、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９では２３番目のＸａａは、ｌｉｅであり、４５番目のＸａａは、Ａｌａであり、７３番目のＸａａは、Ｇｌｕであり、１００番目のＸａａは、ｌｉｅである。９Ｂ１２抗体に関しては、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３では１番目のＸａａは、Ｇｉｎであり、７番目のＸａａは、Ｓｅｒであり、１２番目のＸａａは、Ｖａｌであり、２７番目のＸａａは、Ｔｙｒであり、５８番目のＸａａは、Ｓｅｒであり、６１番目のＸａａは、Ａｓｎであり、７４番目のＸａａは、Ａｒｇであり、８３番目のＸａａは、Ｐｈｅであり、９２番目のＸａａは、Ｇｌｙであり、１０８番目のＸａａは、Ｈｉｓである。９Ｂ１２抗体に関しては、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９では２３番目のＸａａは、Ｍｅｔであり、４５番目のＸａａは、Ａｌａであり、７３番目のＸａａは、Ｇｌｕであり、１００番目のＸａａは、Ｍｅｔである。３Ｂ１０抗体に関しては、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３では１番目のＸａａは、Ｇｉｎであり、７番目のＸａａは、Ｐｒｏであり、１２番目のＸａａは、Ａｌａであり、２７番目のＸａａは、Ｈｉｓであり、５８番目のＸａａは、Ｔｈｒであり、６１番目のＸａａは、Ｓｅｒであり、７４番目のＸａａは、Ａｒｇであり、８３番目のＸａａは、Ｌｅｕであり、９２番目のＸａａは、Ｇｌｙであり、１０８番目のＸａａは、Ｈｉｓである。３Ｂ１０抗体に関しては、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９では２３番目ではＸａａは、Ｍｅｔであり、４５番目のＸａａは、Ｓｅｒであり、７３番目のＸａａは、Ａｓｐであり、１００番目のＸａａは、ｌｉｅである。
【0167】
９Ｂ３、９Ｂ１２および３Ｂ１０抗体に関しては、ＶＨ－ＣＤＲ１、－ＣＤＲ２、および－ＣＤＲ３は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯＳ：３５、４１、および４７のアミノ酸配列からなり、ＶＬ－ＣＤＲ１、－ＣＤＲ２、および－ＣＤＲ３は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯＳ：５３、５９、および６５のアミノ酸配列からなる。９Ｂ３抗体に関しては、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５の２番目のＸａａは、Ｔｙｒであり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１の８番目のＸａａは、Ｓｅｒであり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７の１２番目のＸａａは、Ｔｙｒであり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３の３番目のＸａａは、ｌｉｅであり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９の２番目のＸａａは、Ａｌａである。９Ｂ１２抗体に関しては、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５の２番目のＸａａは、Ｔｙｒであり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１の８番目のＸａａは、Ｓｅｒであり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７の１２番目のＸａａは、Ｈｉｓであり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３の３番目のＸａａは、Ｍｅｔであり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９の２番目のＸａａは、Ａｌａである。３Ｂ１０抗体に関しては、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５の２番目のＸａａは、Ｈｉｓであり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１の８番目のＸａａは、Ｔｈｒであり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７の１２番目のＸａａは、Ｈｉｓであり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３の３番目のＸａａは、Ｍｅｔであり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９の２番目のＸａａは、Ｓｅｒである。
【表1】
【表2】
【表3】
【0168】
２．乳癌細胞における抗ＢＡＧ２抗体の抗原－抗体応答の同定
図１は、１０種のマウスハイブリドーマ細胞から生成された抗ＢＡＧ２抗体の免疫ブロッティングの結果を示す。具体的には、ヒト乳癌細胞であるＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ（Ｗｅｌｇｅｎｅ）培地中にて、３７℃の温度で培養した。細胞を、ウェルから剥離し、ＰＢＳで洗浄し、１％ Ｂｒｉｊ９７、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．３、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、０．５ｍＭ ＮａＦ、１０μｇ／ｒｎｉ アプロチニン、０．２ｍＭオルトバナジン酸ナトリウムを含有する溶解緩衝溶液に溶解した。氷上での１５分のインキュベーション後に、核を、遠心分離により細胞から除去し、上清を、採取した。２０％グリセロール、４．６％ＳＯＳ、０．１２５Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ６．８、０．１％ブロモフェノールブルーからなる２Ｘ試料緩衝液を、適当な量の上清に添加した。１０μｇのタンパク質試料を、ｍｉｎｉ－Ｐｒｏｔｅａｎ ＩＩシステム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、カリフォルニア州ハーキュリーズ所在）を用いることによる、標準条件下の１２％ゲル上でのＳＯＳ－ＰＡＧＥ解析に供した。免疫ブロッティングのために、タンパク質を、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＰＶＤＦ膜の上に移した。ＴＢＳ中の０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０および５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）からなるブロッキング溶液を、１時間反応させた。次に一次抗体は、ハイブリドーマ細胞培養物から抽出された抗ＢＡＧ２抗体の１／２０００希釈液であり、二次抗体として用いられるヤギ抗マウスＨＲＰコンジュゲート（Ｄａｋｏ）を、１／５０００に希釈した。フィルム感光を、ＥＧＬ試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を基質として用い暗所で実施した。感光されたバンドを、標準の分子マーカと比較して、ＢＡＧ２のサイズに対応するバンドを同定した。
図１は、１０種のマウスハイブリドーマ細胞から生成された抗ＢＡＧ２抗体の免疫ブロッティングの結果を示す。具体的には、ヒト乳癌細胞であるＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ（Ｗｅｌｇｅｎｅ）培地中にて、３７℃の温度で培養した。細胞を、ウェルから剥離し、ＰＢＳで洗浄し、１％ Ｂｒｉｊ９７、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．３、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、０．５ｍＭ ＮａＦ、１０μｇ／ｒｎｉ アプロチニン、０．２ｍＭオルトバナジン酸ナトリウムを含有する溶解緩衝溶液に溶解した。氷上での１５分のインキュベーション後に、核を、遠心分離により細胞から除去し、上清を、採取した。２０％グリセロール、４．６％ＳＯＳ、０．１２５Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ６．８、０．１％ブロモフェノールブルーからなる２Ｘ試料緩衝液を、適当な量の上清に添加した。１０μｇのタンパク質試料を、ｍｉｎｉ－Ｐｒｏｔｅａｎ ＩＩシステム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、カリフォルニア州ハーキュリーズ所在）を用いることによる、標準条件下の１２％ゲル上でのＳＯＳ－ＰＡＧＥ解析に供した。免疫ブロッティングのために、タンパク質を、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＰＶＤＦ膜の上に移した。ＴＢＳ中の０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０および５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）からなるブロッキング溶液を、１時間反応させた。次に一次抗体は、ハイブリドーマ細胞培養物から抽出された抗ＢＡＧ２抗体の１／２０００希釈液であり、二次抗体として用いられるヤギ抗マウスＨＲＰコンジュゲート（Ｄａｋｏ）を、１／５０００に希釈した。フィルム感光を、ＥＧＬ試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を基質として用い暗所で実施した。感光されたバンドを、標準の分子マーカと比較して、ＢＡＧ２のサイズに対応するバンドを同定した。
【0169】
結果として図１に示す通り、陽性対照として用いた市販のポリクローナル抗ＢＡＧ２抗体であるａｂ５８６８２（Ａｂｅａｍ）と比較して、抗体２Ａ１１、３Ｂ５、３Ｂ１０、３Ｆ１２、３ＧＢ、４Ｃ２、８Ｃ４、９Ｂ３、９Ｂ１２および１０Ｈ７は、ＢＡＧ２を標的とする抗原－抗体反応を示した。
【0170】
次いで、それに対し１０種の抗体が先の第１節で同定されたＢＡＧ２抗原のドメインマッピングのために、約２６ｋＤａの分子量を有するＧＳＴ－エンプティベクター（ｐｃＤＮＡ３．１＋／ＧＳＴベクター、ＮｏｖｏＰｒｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．、中国）が導入された細胞を、陰性対照として用いた。それぞれがヒトＢＡＧ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドとＢＡＧ２タンパク質のフラグメントをコードするポリヌクレオチドを含む、ＧＳＴ－Ｂａｇ Ｆｕｌｌベクター、ＧＳＴ－Ｂａｇ Ｆ１ベクター、ＧＳＴ－Ｂａｇ Ｆ２ベクター、ＧＳＴ－Ｂａｇ Ｆ３ ベクター、およびＧＳＴ－Ｂａｇ Ｆ４ベクターを、細胞に導入し、ベクターが導入された細胞を、培養して遺伝子を発現させ、その後、細胞溶解物を得た。細胞溶解物のために、免疫ブロッティングを、１０種の抗体それぞれを用いて実施した。ヒトＢＡＧ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０のヌクレオチド配列を有する。ＧＳＴ－Ｂａｇ Ｆ１、－Ｂａｇ Ｆ２、－Ｂａｇ Ｆ３、および－Ｂａｇ Ｆ４ベクターは、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１～７４のヌクレオチド配列からなる。
【0171】
図２Ａおよび２Ｂは、抗ＢＡＧ２抗体またはそのフラグメントの完全長ＢＡＧ２ポリペプチドについての免疫ブロッティングの結果を示す。図２において、Ａは、ベクターおよびＢＡＧ２タンパク質およびそのフラグメントの図表を示し、Ｂは、免疫ブロッティングの結果を示す。詳細には、免疫ブロッティングを、以下のとおり実施した：ベクターのそれぞれを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅトランスフェクション（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｉｎｃ．、米国マサチューセッツ州ウォルサム所在）方法によりＨＥＫ２Ｔ細胞に導入し、得られた形質転換細胞を、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ（Ｗｅｌｇｅｎｅ）培地中にて３７℃の温度で３０時間培養し、その後、細胞を単離した。単離された細胞を、図１に関連して記載されたものと同じ方法を利用して破壊し、１２％ゲル上でＳＯＳ－ＰＡＧＥ解析に供した。免疫ブロッティングのために、図１に関連して記載されたものと同じブロッキング溶液で１時間反応させた後、２ｍｇ／ｍｌの濃度を有する１０種の精製抗ＢＡＧ２抗体のそれぞれを、１／１００００希釈して一次抗体として用い、細胞に結合させた。二次抗体として用いたヤギ抗マウスＨＲＰコンジュゲートを、１／５０００希釈濃度で用い、フィルム感光を、ＥＧＬ試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を基質として用いて暗所で実施した。標準の分子マーカサイズを発現させて、ＢＡＧ２のサイズを確認した。
【0172】
結果として、図２に示された通り、各抗ＢＡＧ２抗体は、完全長ＢＡＧ２ポリペプチドまたはそのフラグメントに差別的に結合した。特に、１０種の抗ＢＡＧ２抗体のそれぞれについて、シグナルが、ＧＳＴ－Ｂａｇ Ｆｕｌｌベクター導入細胞の溶解物において、約５０ＫＤａの位置で共通して検出された。この結果は、これらの抗体の全てが完全長ＢＡＧ２抗体に結合し得ることを示す。最後に、各ＢＡＧ２抗体が反応するＢＡＧ２のドメイン領域を、同定した。
【0173】
図３は、各抗ＢＡＧ２抗体と反応するＢＡＧ２ドメインを示す。図３に示された通り、９Ｂ３、９Ｂ１２、３Ｂ１０、および１０Ｈ７抗体を、ＢＡＧ２タンパク質のＮ－末端に結合させ、２Ａ１１、３Ｂ５、４Ｃ２および８Ｃ４抗体を、ＢＡＧ２タンパク質の中央領域に結合させ、３Ｆ１２および３ＧＢ抗体を、ＢＡＧ２タンパク質のＣ－末端に結合させた。Ｎ－末端は共通して、２１～６０アミノ酸のコイルドコイル領域を含み、中央領域は、１０９～１８９アミノ酸のＢＮＢ領域の一部に結合される。それゆえ、異なる部位に結合する一組の抗体を用いることにより、試料中に存在するＢＡＧ２タンパク質またはそのフラグメントを、高い感度および特異度で検出してよい。
【0174】
一態様によるＢＡＧ２ポリペプチドまたはそのフラグメントに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントは、様々な長さのＢＡＧ２ポリペプチドまたはそのフラグメントとの抗原－抗体反応を引き起こし得る。
【0175】
別の態様による抗体またはその抗原結合フラグメントをコードするポリヌクレオチド、およびそれを含む宿主細胞は、抗体またはその抗原結合フラグメントを生成するために用いられ得る。
【0176】
別の態様による抗体またはその抗原結合フラグメントを生成する方法によれば、抗体またはその抗原結合フラグメントは、効率的に生成され得る。
【0177】
実施例２．癌の処置方法のための薬物およびマウスモデルの調製
抗ＢＡＧ２の１０種のハイブリドーマ細胞株を、製造業者（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ）の使用説明に従いＳｅｐｈａｒｏｓｅタンパク質Ａ／Ｇカラムでのアフィニティークロマトグラフィーにより各培養上清から精製した。対照Ｍｕ－ＩｇＧ２ａ（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ－１６７（商標））を、アイソタイプ対照抗体として用い、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから得た。インビトロおよびインビボ試験で用いられた抗ＢＡＧ２マウス抗体およびアイソタイプ対照抗体を、Ｎａｎｏｔｏｏｌによりエンドトキシン不含条件（＜０．０１ＥＵ／ｕｇ）で生成した。
抗ＢＡＧ２の１０種のハイブリドーマ細胞株を、製造業者（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ）の使用説明に従いＳｅｐｈａｒｏｓｅタンパク質Ａ／Ｇカラムでのアフィニティークロマトグラフィーにより各培養上清から精製した。対照Ｍｕ－ＩｇＧ２ａ（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ－１６７（商標））を、アイソタイプ対照抗体として用い、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから得た。インビトロおよびインビボ試験で用いられた抗ＢＡＧ２マウス抗体およびアイソタイプ対照抗体を、Ｎａｎｏｔｏｏｌによりエンドトキシン不含条件（＜０．０１ＥＵ／ｕｇ）で生成した。
【0178】
抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体（ＢｉｏＸＣｅｌｌ、ｃａｔ， Ｎｏ．ＢＥ０１０１）、抗ＰＤ－１モノクローナル抗体 （ＢｉｏＸＣｅｌｌ、Ｃａｔ． Ｎｏ．ＢＥ００３３－２）、および抗ＣＴＬＡ４モノクローナル抗体（ＢｉｏＸＣｅｌｌ、Ｃａｔ． Ｎｏ．ＢＥ０１３１）を、製造業者の使用説明に従って調製した。
【0179】
インビボ抗腫瘍効果を検証するために、雄５週齢ＳＰＦ Ｃ５７ＢＬ／６およびＢＡＬＢ／ｃマウスを、Ｋｏａｔｅｃｈ Ｃｏ．（韓国）から購入した。これらのマウスを、約２２℃の温度に制御された室内で飼育し、マウスに飼料および水を自由に供給した。１週間後に、マウスＥＭＴ６乳癌細胞株（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－２７５５（商標））２×１０５細胞、マウスルイス肺癌（ＬＬＣ）細胞株（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ１６４２（商標））５×１０５細胞、マウスＭＣ３８結腸癌細胞株（Ｋｅｒａｆａｓｔ、ＥＮＨ２０４－ＦＰ）５×１０５細胞、およびマウスＣＴ２６大腸癌細胞株（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ２６３８（商標））３×１０５細胞を、皮下注射によりこれらの６週齢マウスに注射した。７～８週齢マウスを、ＥＭＴ６、ＬＬＣ、ＭＣ３８、およびＣＴ２６細胞株の注射後８～１２日目に、実験に用いた。１週間後に、マウスＢ１６－Ｆ１０－Ｌｕｃ２皮膚黒色腫細胞株（ＡＴＣＣ， ＣＲＬ－６４７５－Ｌｕｃ２（商標））２×１０５細胞を、尾静脈内注射によりこれらの７週齢マウスに注射した。９週齢のマウスを、Ｂ１６－Ｆ１０－Ｌｕｃ２の注射後１５日目に、実験に用いた。１週間後に、マウスＰＡＮＣ０２－Ｌｕｃ膵臓腺癌細胞株（Ｐｒｏｆｅｓｓｏｒ Ｋｙｕ Ｌｉｍ、Ｃｈｕｎｇｎａｍ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、大韓民国）２×１０６細胞を、７週齢マウスの膵尾部に同所移植した。１０週齢のマウスを、ＰＡＮＣ０２－Ｌｕｃ細胞株の注射後１６日目に、実験に用いた。
【0180】
作用機序
腫瘍分泌ＢＡＧ２タンパク質は、腫瘍微小環境において、抗免疫性（適応または自然免疫）のためにリンパ、骨髄、および間質細胞に結合し得る。本発明者らは、ＢＡＧ２中和が、リンパ、骨髄、または間質に媒介された免疫抑制を標的とし、一方で免疫チェックポイント阻害薬が、アネルギー化された抗腫瘍Ｔ細胞の機能および骨髄細胞の抗炎症性を回復させると仮定した。
腫瘍分泌ＢＡＧ２タンパク質は、腫瘍微小環境において、抗免疫性（適応または自然免疫）のためにリンパ、骨髄、および間質細胞に結合し得る。本発明者らは、ＢＡＧ２中和が、リンパ、骨髄、または間質に媒介された免疫抑制を標的とし、一方で免疫チェックポイント阻害薬が、アネルギー化された抗腫瘍Ｔ細胞の機能および骨髄細胞の抗炎症性を回復させると仮定した。
【0181】
２．１．マウスモデルにおける乳癌処置の結果
結果は、以下を示す。
結果は、以下を示す。
【0182】
抗ＢＡＧ２抗体は単独で、マウス乳癌モデルにおいて抗腫瘍活性を有する。
【0183】
抗ＢＡＧ２抗体と抗ＰＤ－Ｌ１抗体の併用療法は、マウス乳癌モデルにおいて相乗的な抗腫瘍活性を有する。
【0184】
図４ａに示される通り、腫瘍接種の１２日後、ＥＭＴ６腫瘍担持ＢＡＬＢ／ｃマウスを、薬物投与を実行する前に腫瘍サイズにより無作為化した。腫瘍細胞注射後１２日目に、マウスを、抗ＢＡＧ２抗体３Ｂ１０で処置した。次に、１４日目に、マウスは抗ＰＤ－Ｌ１抗体の単独注射を受けた。
【0185】
図４ｂおよび４ｃに示された通り、２４日目に、抗ＰＤ－Ｌ１抗体投与群、抗ＢＡＧ２抗体３Ｂ１０投与群、および抗ＰＤ－Ｌ１抗体と３Ｂ１０の組み合わせ投与群の腫瘍体積は、アイソタイプ対照群の腫瘍体積に比較して、それぞれ約２０．２％、約３９．８％、および約７０．１％減少した。抗ＰＤ－１抗体での処置は、腫瘍成長に対してわずかな効果を有したが、３Ｂ１０と一緒での処置は、腫瘍成長を有意に阻害した。抗ＰＤ－Ｌ１抗体と３Ｂ１０の組み合わせでの処置は、どちらかの単独の薬剤より大きな度合いに腫瘍成長を阻害した。
【0186】
図４ｄに示された通り、抗ＰＤ－Ｌ１抗体投与群、抗ＢＡＧ２抗体３Ｂ１０投与群、および抗ＰＤ－Ｌ１抗体と３Ｂ１０の組み合わせ投与群の腫瘍特異性ＣＤ３＋／ＣＤ８＋ Ｔ細胞（癌細胞を殺傷する際のエフェクターメモリー細胞）は、アイソタイプ対照群のＣＤ３＋／ＣＤ８＋ Ｔ細胞の量に比較して、それぞれ約２．４倍、２．８倍および８．２倍増加した。抗ＰＤ－Ｌ１抗体と３Ｂ１０の組み合わせでの処置は、どちらかの単独の薬剤より大きな度合いに腫瘍特異性ＣＤ３＋／ＣＤ８＋ Ｔ細胞を活性化した。活性化は、直接的または間接的、即ちサプレッサ細胞の阻害であり得る。
【0187】
２．２．マウスモデルにおける肺癌処置の結果
結果は、以下を示す。
結果は、以下を示す。
【0188】
抗ＢＡＧ２抗体および免疫チェックポイント阻害薬の併用療法は、マウス肺癌モデルにおいて相乗的な抗腫瘍効果を有する。
【0189】
図５ａに示された通り、ＬＬＣ腫瘍担持Ｃ５７ＢＬ／６マウスを最初に、腫瘍細胞注射後８日目に抗ＢＡＧ２抗体３Ｂ１０で処置した。次に、１４日目に、マウスは、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の単独注射を受けた。
【0190】
図５ｂおよび５ｃに示された通り、２０日目に、抗ＰＤ－Ｌ１抗体投与群、抗ＢＡＧ２抗体３Ｂ１０投与群、および抗ＰＤ－Ｌ１抗体と３Ｂ１０の組み合わせ投与群の腫瘍体積は、アイソタイプ対照群の腫瘍体積に比較して、それぞれ約８．７％、約１７．８％、および約６２．２％減少した。抗ＰＤ－Ｌ１抗体と３Ｂ１０の組み合わせでの処置は、どちらかの単独の薬剤より大きな度合いに腫瘍成長を阻害した。
【0191】
図５ｄに示された通り、抗ＰＤ－Ｌ１抗体投与群、抗ＢＡＧ２抗体３Ｂ１０投与群、および抗ＰＤ－Ｌ１抗体と３Ｂ１０の組み合わせ投与群の腫瘍特異性ＣＤ３＋／ＣＤ８＋ Ｔ細胞（癌細胞を殺傷する際のエフェクターメモリー細胞）は、アイソタイプ対照群のＣＤ３＋／ＣＤ８＋ Ｔ細胞レベルに比較して、それぞれ約１．３倍、２．８倍および６．６倍増加した。抗ＰＤ－Ｌ１抗体と３Ｂ１０の組み合わせでの処置は、どちらかの単独の薬剤より大きな度合いに腫瘍特異性ＣＤ３＋／ＣＤ８＋ Ｔ細胞を活性化した。活性化は、直接的または間接的、即ちサプレッサ細胞の阻害であり得る。
【0192】
２．３．マウスモデルにおける黒色腫処置の結果
結果は、以下を示す。
結果は、以下を示す。
【0193】
抗ＢＡＧ２抗体は、マウス黒色腫の肺転移モデルにおいて抗腫瘍活性を有する。
【0194】
抗ＢＡＧ２抗体および抗ＰＤ－Ｌ１抗体の併用療法は、マウス黒色腫の肺転移モデルにおいて相乗的な抗腫瘍活性を有する。
【0195】
図６ａに示された通り、Ｂ１６－Ｆ１０－Ｌｕｃ２腫瘍担持Ｃ５７ＢＬ／６マウスを最初に、腫瘍細胞静脈内注射後１５日目に抗ＢＡＧ２抗体３Ｆ１２で処置した。次に、２３日目に、マウスは、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の単独注射を受けた。
【0196】
図６ｂおよび６ｃに示された通り、３８日目に、抗ＰＤ－Ｌ１抗体投与群、抗ＢＡＧ２抗体３Ｆ１２投与群、および抗ＰＤ－Ｌ１抗体と３Ｆ１２の組み合わせ投与群の腫瘍体積は、アイソタイプ対照群のＢＬＩシグナルに比較して、それぞれ約１９％、約５４％、および約９２％減少した。抗ＰＤ－１抗体での単独処置は、肺における黒色腫の腫瘍成長へのわずかな効果を有したが、抗ＢＡＧ２抗体３Ｆ１２は、肺における黒色腫の腫瘍成長を有意に阻害した。抗ＰＤ－Ｌ１抗体と３Ｆ１２の組み合わせでの処置は、どちらかの単独の薬剤より大きな度合いに腫瘍成長を阻害した。
【0197】
２．４．大腸癌の処置
背景
高頻度マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）の大腸癌（ＣＲＣ）は、ミスマッチ修復性（ＭＭＲ）の欠損、ならびにＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ－３およびＩＤＯのレベル増加を有し、抗プログラム細胞死（ＰＤ）療法に対し明確に応答する。臨床現場において腫瘍の大部分を構成する低頻度ＭＳＩまたはマイクロサテライト安定性（ＭＳＳ）ＣＲＣは、ＰＤ－１阻害によるいずれの利益も認めなかった。ＭＳＳ ＣＲＣは、ＭＳＩ ＣＲＣに比較してより高い割合のＫＲＡＳ発癌性変異を有する。抗ＢＡＧ２抗体と抗ＰＤ－１剤の併用療法を、Ｃ５７ＢＬ／６（ＭＣ３８；ＫＲＡＳｗｔ、ＭＳＩ）およびＢＡＬＢ／ｃ（ＣＴ２６；ＫＲＡＳｍｕｔ、ＭＳＳ）マウスの相乗性モデルにおいて試験した。
背景
高頻度マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）の大腸癌（ＣＲＣ）は、ミスマッチ修復性（ＭＭＲ）の欠損、ならびにＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ－３およびＩＤＯのレベル増加を有し、抗プログラム細胞死（ＰＤ）療法に対し明確に応答する。臨床現場において腫瘍の大部分を構成する低頻度ＭＳＩまたはマイクロサテライト安定性（ＭＳＳ）ＣＲＣは、ＰＤ－１阻害によるいずれの利益も認めなかった。ＭＳＳ ＣＲＣは、ＭＳＩ ＣＲＣに比較してより高い割合のＫＲＡＳ発癌性変異を有する。抗ＢＡＧ２抗体と抗ＰＤ－１剤の併用療法を、Ｃ５７ＢＬ／６（ＭＣ３８；ＫＲＡＳｗｔ、ＭＳＩ）およびＢＡＬＢ／ｃ（ＣＴ２６；ＫＲＡＳｍｕｔ、ＭＳＳ）マウスの相乗性モデルにおいて試験した。
【0198】
２．４．１．マウスモデルにおける大腸癌高頻度ＭＳＩ型の処置の結果
結果は、以下に示す。
結果は、以下に示す。
【0199】
抗ＢＡＧ２抗体単独は、高頻度ＭＳＩ型のマウス大腸癌モデルにおいて抗腫瘍活性を有する。抗ＢＡＧ２抗体および抗ＰＤ－１抗体の併用療法は、マウスＣＲＣモデルにおいて相乗性の抗腫瘍効果を有する。
【0200】
図７ａに示された通り、ＭＣ３８腫瘍担持Ｃ５７ＢＬ／６マウスを最初に、腫瘍細胞注射後８日目に抗ＢＡＧ２抗体３Ｂ１０で処置した。次に、１０日目に、マウスは、抗ＰＤ－１抗体の単独注射を受けた。
【0201】
図７ｂおよび７ｃに示された通り、２０日目に、抗ＰＤ－１抗体投与群、抗ＢＡＧ２抗体３Ｂ１０投与群、および抗ＰＤ－１抗体と３Ｂ１０の組み合わせ投与群の腫瘍体積は、アイソタイプ対照群の腫瘍体積に比較して、それぞれ約４３％、約４０．８％、および約８６．８％減少した。抗ＰＤ－１抗体または抗ＢＡＧ２抗体３Ｂ１０での単独処置は、腫瘍成長を有意に阻害した。抗ＰＤ－１抗体と３Ｂ１０の組み合わせでの処置は、どちらかの単独の薬剤より大きな度合いに腫瘍成長を阻害した。
【0202】
図７ｄに示された通り、抗ＰＤ－１抗体投与群、抗ＢＡＧ２抗体３Ｂ１０投与群、および抗ＰＤ－１抗体と３Ｂ１０の組み合わせ投与群の腫瘍特異性ＣＤ３＋／ＣＤ８＋ Ｔ細胞（癌細胞を殺傷する際のエフェクターメモリー細胞）は、アイソタイプ対照群のＣＤ３＋／ＣＤ８＋ Ｔ細胞に比較して、それぞれ約４．４倍、３．９倍および３６．２倍増加した。抗ＰＤ－１抗体と３Ｂ１０の組み合わせでの処置は、どちらかの単独の薬剤より大きな度合いに腫瘍特異性ＣＤ３＋／ＣＤ８＋ Ｔ細胞を活性化した。活性化は、直接的または間接的、即ちサプレッサ細胞の阻害であり得る。
【0203】
２．４．２．マウスモデルにおける大腸癌ＭＳＳ型の処置の結果
結果は、以下を示す。
結果は、以下を示す。
【0204】
抗ＢＡＧ２抗体単独は、マウスＭＳＳ型大腸癌モデルにおいて抗腫瘍活性を有する。
【0205】
抗ＢＡＧ２抗体および抗ＰＤ－Ｌ１抗体の併用療法は、マウスＭＳＳ型ＣＲＣモデルにおいて相乗的な抗腫瘍効果を有する。
【0206】
図８ａに示された通り、ＣＴ２６腫瘍担持ＢＡＬＢ／ｃマウスを、腫瘍細胞注射後１１日目に、２５０μｇ（低用量）または７５０μｇ（高用量）／マウスの抗ＢＡＧ２抗体３Ｂ１０、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、３Ｂ１０と抗ＰＤ－Ｌ１抗体の組み合わせ、または対照抗体で処置した。マウスに、試験終了まで２日に１回ｉ．ｐ．注射により投与した。腫瘍成長を、モニタリングし、腫瘍体積を、電子キャリパーで示されたタイムポイントで測定した。
【0207】
図８ｂおよび８ｃに示された通り、２３日目に、低用量３Ｂ１０投与群、高用量３Ｂ１０投与群、抗ＰＤ－Ｌ１抗体投与群、抗ＰＤ－Ｌ１抗体と低用量３Ｂ１０の組み合わせ投与群および抗ＰＤ－Ｌ１抗体と高用量３Ｂ１０の組み合わせ投与群の腫瘍体積は、アイソタイプ対照群の腫瘍体積に比較して、それぞれ約９．１％、約７８．８％、約１７．４％、約５２．２％、および約９５．１％減少した。高用量の３Ｂ１０での単独処置は、ＣＴ２６腫瘍の成長を強力に阻害した。抗ＰＤ－Ｌ１抗体での処置は、単独の薬剤として腫瘍成長阻害においてそれほど成功しなかった。抗ＰＤ－Ｌ１抗体と低用量３Ｂ１０の組み合わせでの処置は、どちらかの単独の薬剤より大きな度合いに腫瘍成長を阻害した。その上、抗ＰＤ－Ｌ１抗体と高用量３Ｂ１０での併用処置は、処置マウスの大部分において検出不能レベルに、個々の腫瘍の退縮を示した。
【0208】
図８ｄに示された通り、低用量３Ｂ１０投与群、高用量３Ｂ１０投与群、抗ＰＤ－Ｌ１抗体投与群、抗ＰＤ－Ｌ１抗体と低用量３Ｂ１０の組み合わせ投与群および抗ＰＤ－Ｌ１抗体と高用量３Ｂ１０の組み合わせ投与群の腫瘍特異性ＣＤ３＋／ＣＤ８＋ Ｔ細胞（癌細胞を殺傷する際のエフェクターメモリー細胞）は、アイソタイプ対照群のＣＤ３＋／ＣＤ８＋ Ｔ細胞レベルに比較して、それぞれ約１．４倍、３．８倍、－１．５倍、６．６倍および８．７倍増加した。抗ＰＤ－Ｌ１抗体と３Ｂ１０の組み合わせでの処置は、どちらかの単独の薬剤より大きな度合いに腫瘍特異性ＣＤ３＋／ＣＤ８＋ Ｔ細胞を活性化した。活性化は、直接的または間接的、即ちサプレッサ細胞の阻害であり得る。
【0209】
２．５．マウスモデルにおける膵臓癌処置の結果
結果は、以下を示す。
結果は、以下を示す。
【0210】
抗ＢＡＧ２抗体単独は、マウス膵臓癌モデルにおいて抗腫瘍効果を有する。
【0211】
抗ＢＡＧ２抗体と免疫チェックポイント阻害薬（抗ＰＤ－１抗体および抗ＣＴＬＡ４抗体）の併用療法は、マウス膵臓癌モデルにおいて相乗的な抗腫瘍活性を有する。
【0212】
図９ａに示される通り、ＰＡＮＣ０２－Ｌｕｃ腫瘍担持Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、腫瘍細胞注射後に２００μｇ（低用量）／マウス（１６日目～３２日目）および４００μｇ（高用量）／マウス（３５日目～３９日目に３回）の４種の抗ＢＡＧ２抗体（３Ｂ１０、３Ｆ１２、３Ｂ５、および３Ｇ８）または対照抗体で処置した。マウスに、試験終了まで週３回、ｉ．ｐ．注射により投与した。３０日目～３９日目に、マウスは、抗ＰＤ－１抗体または抗ＣＴＬＡ４抗体の注射を受けた。腫瘍成長を、インプラント後１５、２７および３９日目に生物発光（ＢＬＩ）シグナルのＩＶＩＳ画像によりモニタリングした。
【0213】
図９ｂに示された通り、４０日目に、抗ＢＡＧ２抗体を個別に投与された群である、３Ｂ１０投与群、３Ｆ１２投与群、３Ｂ５投与群、および３Ｇ８投与群のＢＬＩシグナルは、アイソタイプ対照群に比較して、それぞれ約７９．３％、約６８．４％、約２４．８％、および約８．３％減少した。抗ＰＤ－１抗体投与群、抗ＰＤ－１抗体と３Ｂ１０の組み合わせ投与群、抗ＰＤ－１抗体と３Ｆ１２の組み合わせ投与群、抗ＰＤ－１抗体と３Ｂ５の組み合わせ投与群および抗ＰＤ－１抗体と３Ｇ８の組み合わせ投与群のＢＬＩシグナル強度は、アイソタイプ対照群に比較して、それぞれ約－１４．７％、約９５．９％、約９２．８％、約６２．３％、および約－１０．９％減少した。抗ＣＴＬＡ４抗体単独の投与群、抗ＣＴＬＡ４抗体と３Ｂ１０の組み合わせ投与群、抗ＣＴＬＡ４抗体と３Ｆ１２の組み合わせ投与群、抗ＣＴＬＡ４抗体と３Ｂ５の組み合わせ投与群、および抗ＣＴＬＡ４抗体と３Ｇ８の組み合わせ投与群のＢＬＩシグナル強度は、アイソタイプ対照群に比較して、それぞれ約－１４．５％、約９１．１％、約８５．３％、約６６．３％、および約１０．９％減少した。
【0214】
図９ｃに示された通り、４０日目に、抗ＢＡＧ２抗体のみの３Ｂ１０投与群、３Ｆ１２投与群、３Ｂ５投与群、および３Ｇ８投与群の原発腫瘍重量は、アイソタイプ対照群に比較して、それぞれ約６３．８％、約５６．７％、約２７．８％、および約１８．９％減少した。抗ＰＤ－１抗体のみの投与群、抗ＰＤ－１抗体と３Ｂ１０の組み合わせ投与群、抗ＰＤ－１抗体と３Ｆ１２の組み合わせ投与群、抗ＰＤ－１抗体と３Ｂ５の組み合わせ投与群および抗ＰＤ－１抗体と３Ｇ８の組み合わせ投与群のＢＬＩシグナル強度は、アイソタイプ対照群に比較して、それぞれ約１７．８％、約８５．７％、約８７．４％、約５８．１％、および約－２４．８％減少した。抗ＣＴＬＡ４抗体のみの投与群、抗ＣＴＬＡ４抗体と３Ｂ１０の組み合わせ投与群、抗ＣＴＬＡ４抗体と３Ｆ１２の組み合わせ投与群、抗ＣＴＬＡ４抗体と３Ｂ５の組み合わせ投与群、および抗ＣＴＬＡ４抗体と３Ｇ８の組み合わせ投与群のＢＬＩシグナル強度は、アイソタイプ対照群に比較して、それぞれ約３．４％、約７６．１％、約７４．２％、約５４．８％、および約２９．７％減少した。
【0215】
図９ｂおよび９ｃに示された通り、３Ｂ１０および３Ｆ１２での単独処置は、ＢＬＩシグナル強度を強力に阻害し、ＰＡＮＣ０２－Ｌｕｃ腫瘍担持マウスの原発腫瘍重量を減少させたが、３Ｂ５および３Ｇ８は、ＢＬＩシグナル強度を有意に阻害せず、マウスの原発腫瘍重量を有意に低減しなかった。４種のクローンでの異なる現象は、マウスおよびヒトでの交差反応への親和性により引き起こされる可能性がある。
【0216】
抗ＰＤ－１抗体での処置は、単独薬剤として腫瘍成長阻害においてそれほど成功しなった。抗ＢＡＧ２抗体（３Ｂ１０、３Ｆ１２または３Ｂ５）と抗ＰＤ－１抗体または抗ＣＴＬＡ４抗体の組み合わせでの処置は、どちらかの単独の薬剤より大きな度合いに腫瘍成長を阻害した。その上、抗ＢＡＧ２抗体（３Ｂ１０、３Ｆ１２または３Ｂ５）と抗ＰＤ－１抗体または抗ＣＴＬＡ４抗体での併用処置は、どちらかの単独の薬剤に比較して肝臓、胸膜および横隔膜への転移発生を減少させた（図９ｄ）。
【0217】
図９ｅに示された通り、抗ＰＤ－１抗体投与群、３Ｆ１２投与群、抗ＰＤ－１抗体と３Ｆ１２の組み合わせ投与群の腫瘍特異性ＣＤ３＋／ＣＤ８＋ Ｔ細胞（癌細胞を殺傷する際のエフェクターメモリー細胞）は、アイソタイプ対照群に比較して、それぞれ約１．８倍、３．５倍、および１４．２倍増加した。
【0218】
図９ｅに示された通り、抗ＰＤ－１抗体投与群、３Ｆ１２投与群、抗ＰＤ－１抗体と３Ｆ１２の組み合わせ投与群の腫瘍特異性ＣＤ４５＋／ＣＤ３－／ＣＤ１９＋ Ｂ細胞は、アイソタイプ対照群に比較して、それぞれ約－１．１倍、－１．０５倍、および１．０４倍増加した。
【0219】
図９ｅに示された通り、抗ＰＤ－１抗体投与群、３Ｆ１２投与群、抗ＰＤ－１抗体と３Ｆ１２の組み合わせ投与群の腫瘍特異性ＣＤ４５＋／ＣＤ３－／ＣＤ４９ｂ＋ ＮＫ（ＮＫ細胞）細胞は、アイソタイプ対照群に比較して、それぞれ約１．３倍、２．１倍、および３．６倍増加した。
【0220】
図９ｅに示された通り、抗ＰＤ－１抗体投与群、３Ｆ１２投与群、抗ＰＤ－１抗体と３Ｆ１２の組み合わせ投与群の腫瘍特異性ＣＤ４５＋／ＣＤ１１ｂ＋／Ｇｒ１－／Ｆ４／８０＋ マクロファージは、アイソタイプ対照群に比較して、それぞれ約１．１倍、１．７倍、および２．７倍減少した。
【0221】
図９ｅに示された通り、抗ＰＤ－１抗体投与群、３Ｆ１２投与群、抗ＰＤ－１抗体と３Ｆ１２の組み合わせ投与群の腫瘍特異性ＣＤ４５＋／ＣＤ１１ｂ＋／Ｇｒ１＋ ＭＤＳＣ（骨髄由来サプレッサー細胞）は、アイソタイプ対照群に比較して、それぞれ約１．０７倍、１．１５倍、および１．９倍減少した。
【0222】
図９ｅに示された通り、抗ＰＤ－１抗体投与群、３Ｆ１２投与群、抗ＰＤ－１抗体と３Ｆ１２の組み合わせ投与群の腫瘍特異性ＣＤ４５－／ＣＤ９０．２＋ 間質細胞は、アイソタイプ対照群に比較して、それぞれ約－１．０６倍、１．３５倍、および１．８６倍減少した。
【0223】
抗ＰＤ－Ｌ１抗体と３Ｆ１２の組み合わせでの処置は、どちらかの単独の薬剤より大きな度合いに腫瘍特異性ＣＤ３＋／ＣＤ８＋ Ｔ細胞およびＣＤ４５＋／ＣＤ３－／ＣＤ４９ｂ＋ ＮＫ（ＮＫ細胞）細胞を活性化した。しかしＣＤ４５＋／ＣＤ３－／ＣＤ１９＋ Ｂ細胞集団は、増加しなかった。抗ＰＤ－Ｌ１抗体と３Ｆ１２の組み合わせでの処置は、どちらかの単独の薬剤より良好な度合いにＣＤ４５＋／ＣＤ１１ｂ＋／Ｇｒ１－／Ｆ４／８０＋ マクロファージ、ＣＤ４５＋／ＣＤ１１ｂ＋／Ｇｒ１＋ ＭＤＳＣ、およびＣＤ４５－／ＣＤ９０．２＋ 間質細胞を減少させた。
【0224】
活性化は、直接的または間接的、即ちサプレッサ細胞の阻害であり得る。
【0225】
したがって、１）抗ＢＡＧ２抗体は、アイソタイプ対照群に比較して有意な腫瘍成長および転移阻害効果を有することが見出された。２）免疫チェックポイント阻害薬としての抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＰＤ－１抗体、および抗ＣＴＬＡ４抗体と、抗ＢＡＧ２抗体の組み合わせは、マウス乳癌、肺癌、黒色腫、大腸癌および膵臓癌モデルにおいて、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＰＤ－１抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体および抗ＢＡＧ２抗体単独のそれぞれに比較して、有意な腫瘍阻害効果を有することが見出された。
【0226】
本明細書に記載された実施形態が記載のみの意味と見なされ、限定の目的とみなされるべきでないことが、理解されなければならない。各実施形態における特色または態様の記載が、典型的には他の実施形態の他の類似の特色または態様に利用可能と見なされなければならない。１種または複数の実施形態を、図面を参照して記載したが、以下の特許請求の範囲により定義される本開示の主旨および範囲を逸脱することなく形態および詳細の様々な変更が行われ得ることが、当業者に理解されよう。
【0227】
本明細書に記載された実施形態が記載のみの意味と見なされ、限定の目的とみなされるべきでないことが、理解されなければならない。各実施形態における特色または態様の記載が、典型的には他の実施形態の他の類似の特色または態様に利用可能と見なされなければならない。１種または複数の実施形態を、図面を参照して記載したが、以下の特許請求の範囲により定義される本開示の主旨および範囲を逸脱することなく形態および詳細の様々な変更が行われ得ることが、当業者に理解されよう。
【0228】
［アクセッション番号］
寄託：韓国生命工学研究院（Ｋｏｒｅａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）
アクセッション番号：ＫＣＴＣ１３７３７ＢＰ
寄託日：２０１８年１１月２８日
寄託：韓国生命工学研究院
アクセッション番号：ＫＣＴＣ１３７３８ＢＰ
寄託日：２０１８年１１月２８日
寄託：韓国生命工学研究院
アクセッション番号：ＫＣＴＣ１３７３９ＢＰ
寄託日：２０１８年１１月２８日
寄託：韓国生命工学研究院
アクセッション番号：ＫＣＴＣ１３７４０ＢＰ
寄託日：２０１８年１１月２８日
寄託：韓国生命工学研究院
アクセッション番号：ＫＣＴＣ１３７４１ＢＰ
寄託日：２０１８年１１月２８日
寄託：韓国生命工学研究院
アクセッション番号：ＫＣＴＣ１３７４２ＢＰ
寄託日：２０１８年１１月２８日
寄託：韓国生命工学研究院
アクセッション番号：ＫＣＴＣ１３７４３ＢＰ
寄託日：２０１８年１１月２８日
寄託：韓国生命工学研究院
アクセッション番号：ＫＣＴＣ１３７４４ＢＰ
寄託日：２０１８年１１月２８日
寄託：韓国生命工学研究院
アクセッション番号：ＫＣＴＣ１３７４５ＢＰ
寄託日：２０１８年１１月２８日
寄託：韓国生命工学研究院
アクセッション番号：ＫＣＴＣ１３７４６ＢＰ
寄託日：２０１８年１１月２８日
寄託：韓国生命工学研究院（Ｋｏｒｅａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）
アクセッション番号：ＫＣＴＣ１３７３７ＢＰ
寄託日：２０１８年１１月２８日
寄託：韓国生命工学研究院
アクセッション番号：ＫＣＴＣ１３７３８ＢＰ
寄託日：２０１８年１１月２８日
寄託：韓国生命工学研究院
アクセッション番号：ＫＣＴＣ１３７３９ＢＰ
寄託日：２０１８年１１月２８日
寄託：韓国生命工学研究院
アクセッション番号：ＫＣＴＣ１３７４０ＢＰ
寄託日：２０１８年１１月２８日
寄託：韓国生命工学研究院
アクセッション番号：ＫＣＴＣ１３７４１ＢＰ
寄託日：２０１８年１１月２８日
寄託：韓国生命工学研究院
アクセッション番号：ＫＣＴＣ１３７４２ＢＰ
寄託日：２０１８年１１月２８日
寄託：韓国生命工学研究院
アクセッション番号：ＫＣＴＣ１３７４３ＢＰ
寄託日：２０１８年１１月２８日
寄託：韓国生命工学研究院
アクセッション番号：ＫＣＴＣ１３７４４ＢＰ
寄託日：２０１８年１１月２８日
寄託：韓国生命工学研究院
アクセッション番号：ＫＣＴＣ１３７４５ＢＰ
寄託日：２０１８年１１月２８日
寄託：韓国生命工学研究院
アクセッション番号：ＫＣＴＣ１３７４６ＢＰ
寄託日：２０１８年１１月２８日
【0229】
本明細書に引用された参考資料は全て、全体として参照により組み入れられる。
【0230】
当業者は、日常的実験法を利用するだけで、本明細書に具体的に記載された発明の具体的実施形態の多くの均等物を認識する、または確かめることができるであろう。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図7D】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図8D】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図9D】
【図9E】
【手続補正書】
【提出日】2021-11-11
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0020】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１中の５６番目のＸａａおよび５７番目のＸａａは、それぞれＧｌｙまたはＡｌａであってよい。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３において、１番目のＸａａは、グルタミン（Ｇｌｎ）またはグルタミン酸（Ｇｌｕ）であってよく、７番目のＸａａは、Ｓｅｒまたはプロリン（Ｐｒｏ）であってよく、１２番目のＸａａは、バリン（Ｖａｌ）またはアラニン（Ａｌａ）であってよく、２７番目のＸａａは、ＴｙｒまたはＨｉｓであってよく、５８番目のＸａａは、ＳｅｒまたはＴｈｒであってよく、６１番目のＸａａは、アスパラギン（Ａｓｎ）またはＳｅｒであってよく、７４番目のＸａａは、アルギニン（Ａｒｇ）またはリシン（Ｌｙｓ）であってよく、８３番目のＸａａは、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）またはロイシン（Ｌｅｕ）であってよく、９２番目のＸａａは、ＧｌｙまたはＡｌａであってよく、１０８番目のＸａａは、ＨｉｓまたはＴｙｒであってよい。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７における５３番目のＸａａは、ＩｌｅまたはＰｈｅであってよい。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９において、２９番目のＸａａは、ＭｅｔまたはＩｌｅであってよく、５１番目のＸａａは、ＡｌａまたはＳｅｒであってよく、７９番目のＸａａは、Ｇｌｕまたはアスパラギン酸（Ａｓｐ）であってよく、１０６番目のＸａａは、ＭｅｔまたはＩｌｅであってよい。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0166】
９Ｂ３、９Ｂ１２および３Ｂ１０抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを含む。９Ｂ３抗体に関しては、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３では１番目のＸａａは、Ｇｌｕであり、７番目のＸａａは、Ｓｅｒであり、１２番目のＸａａは、Ｖａｌであり、２７番目のＸａａは、Ｔｙｒであり、５８番目のＸａａは、Ｓｅｒであり、６１番目のＸａａは、Ａｓｎであり、７４番目のＸａａは、Ｌｙｓであり、８３番目のＸａａは、Ｐｈｅであり、９２番目のＸａａは、Ａｌａであり、１０８番目のＸａａは、Ｔｙｒである。９Ｂ３抗体に関しては、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９では２９番目のＸａａは、Ｉｌｅであり、５１番目のＸａａは、Ａｌａであり、７９番目のＸａａは、Ｇｌｕであり、１０６番目のＸａａは、Ｉｌｅである。９Ｂ１２抗体に関しては、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３では１番目のＸａａは、Ｇｉｎであり、７番目のＸａａは、Ｓｅｒであり、１２番目のＸａａは、Ｖａｌであり、２７番目のＸａａは、Ｔｙｒであり、５８番目のＸａａは、Ｓｅｒであり、６１番目のＸａａは、Ａｓｎであり、７４番目のＸａａは、Ａｒｇであり、８３番目のＸａａは、Ｐｈｅであり、９２番目のＸａａは、Ｇｌｙであり、１０８番目のＸａａは、Ｈｉｓである。９Ｂ１２抗体に関しては、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９では２９番目のＸａａは、Ｍｅｔであり、５１番目のＸａａは、Ａｌａであり、７９番目のＸａａは、Ｇｌｕであり、１０６番目のＸａａは、Ｍｅｔである。３Ｂ１０抗体に関しては、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３では１番目のＸａａは、Ｇｌｎであり、７番目のＸａａは、Ｐｒｏであり、１２番目のＸａａは、Ａｌａであり、２７番目のＸａａは、Ｈｉｓであり、５８番目のＸａａは、Ｔｈｒであり、６１番目のＸａａは、Ｓｅｒであり、７４番目のＸａａは、Ａｒｇであり、８３番目のＸａａは、Ｌｅｕであり、９２番目のＸａａは、Ｇｌｙであり、１０８番目のＸａａは、Ｈｉｓである。３Ｂ１０抗体に関しては、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９では２９番目ではＸａａは、Ｍｅｔであり、５１番目のＸａａは、Ｓｅｒであり、７９番目のＸａａは、Ａｓｐであり、１０６番目のＸａａは、Ｉｌｅである。
【手続補正3】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
【国際調査報告】