特表 2022-522019 単一塩基編集による非標的な単一ヌクレオチド変異及び当該変異を避ける高特異性オフターゲットのない単一塩基遺伝子編集ツール

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-04-13

(54)【発明の名称】単一塩基編集による非標的な単一ヌクレオチド変異及び当該変異を避ける高特異性オフターゲットのない単一塩基遺伝子編集ツール

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/90 20060101AFI20220406BHJP

   C12N 9/78 20060101ALI20220406BHJP

   C12N 15/55 20060101ALI20220406BHJP

   C12Q 1/68 20180101ALI20220406BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20220406BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20220406BHJP

【ＦＩ】

C12N15/90 Z ZNA

C12N9/78

C12N15/55

C12Q1/68 100Z

C12Q1/02

C12N15/09 100

C12N15/09 110

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021550263

(86)(22)【出願日】2019-11-21

(85)【翻訳文提出日】2021-09-07

(86)【国際出願番号】 CN2019119842

(87)【国際公開番号】W WO2020173150

(87)【国際公開日】2020-09-03

(31)【優先権主張番号】201910153546.3

(32)【優先日】2019-02-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(31)【優先権主張番号】201910494323.3

(32)【優先日】2019-06-09

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】521339278

【氏名又は名称】中国科学院脳科学与智能技術卓越創新中心

(74)【代理人】

【識別番号】110001807

【氏名又は名称】特許業務法人磯野国際特許商標事務所

(72)【発明者】

【氏名】楊 輝

(72)【発明者】

【氏名】左 二偉

【テーマコード（参考）】

4B050

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B050CC04

4B050DD11

4B050KK11

4B050LL05

4B063QA01

4B063QQ02

4B063QQ08

4B063QQ42

4B063QS36

4B063QX02

(57)【要約】

【要約】
本発明は、高い特異性、オフターゲットがない単一塩基遺伝子編集ツールに関する。単一塩基エディターのオフターゲット効果を低減する方法を開示した。本発明は、遺伝子編集ツールまたは遺伝子編集操作のターゲティング効果を分析する方法（ＧＯＴＩ）も開示した。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

単一塩基エディターのオフターゲット効果を低減する方法であって、単一塩基エディターシステムでは、シチジンデアミナーゼ酵素を修飾し、そのＤＮＡと結合する能力を弱化させることを含む方法。

【請求項2】

上記の修飾は、シトシンデアミナーゼのＤＮＡ結合領域に対する修飾である；好ましくに、上記のＤＮＡ結合領域は、そのＤＮＡと結合するドメインであることを特徴とする請求項１に記載された方法。

【請求項3】

上記の修飾は、遺伝子変異、標的的なブロッキング、干渉を含むことを特徴とする請求項２に記載された方法。

【請求項4】

上記の単一塩基エディターは、ＢＥ３ゲノムエディターである；または
上記のＤＮＡは一本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＤＮＡである
ことを特徴とする請求項１に記載された方法。

【請求項5】

上記のシトシンデアミナーゼは、ＡＩＤ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、ＡＰＯＢＥＣ１、ＡＰＯＢＥＣＡ３Ａ、ＣＤＡ１から選べられる酵素を含むが、これらに限定されないことを特徴とする請求項１に記載された方法。

【請求項6】

上記のシトシンデアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ１である；好ましくは、上記の修飾は、当該酵素の１２６のアミノ酸を修飾することである；より好ましくは、上記の修飾は、位置１２６のＲをＥに変異させることであることを特徴とする請求項５に記載された方法。

【請求項7】

ＡＰＯＢＥＣ１の修飾は、さらに、ＡＰＯＢＥＣ１酵素の９０位のアミノ酸を修飾することを含む；好ましくに、上記の修飾は、その９０位をＦに突然変異させることであることを特徴とする請求項６に記載された方法。

【請求項8】

上記のシトシンデアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣＡ３Ａである；上記の修飾は、当該酵素の１３０のアミノ酸を修飾することである；好ましくは、上記の修飾は、その１３０位のＹをＦに突然変異させることであることを特徴とする請求項５に記載された方法。

【請求項9】

そのＤＮＡ結合領域に修飾が起こり、当該修飾より、それとＤＮＡとの結合を弱化し、上記のＤＮＡは、例えば一本鎖ＤＮＡである；好ましくに、上記のシトシンデアミナーゼは、ＡＩＤ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、ＡＰＯＢＥＣ１、ＡＰＯＢＥＣＡ３Ａ、ＣＤＡ１から選べられる酵素を含むが、これらに限定されないシトシンデアミナーゼの突然変異体。

【請求項10】

上記の酵素は、ＡＰＯＢＥＣ１である；好ましくに、上記の修飾が、当該ドメインの１２６位またはそれと隣接する位置に起こる；より好ましくに、上記の修飾は、その１２６位のＲをＥに突然変異することであることを特徴とする請求項９に記載された突然変異体。

【請求項11】

上記の修飾は、さらに、ＡＰＯＢＥＣ１酵素の９０位のアミノ酸にある；好ましくに、上記の修飾は、その９０位をＹに突然変異することであることを特徴とする請求項９に記載された突然変異体。

【請求項12】

上記の酵素は、ＡＰＯＢＥＣＡ３Ａである；好ましくに、上記の修飾が、当該酵素の１３０位またはそれと隣接する位置に起こる；より好ましくに、上記の修飾は、その１３０位のＹをＦに突然変異することであることを特徴とする請求項９に記載された突然変異体。

【請求項13】

請求項９－１２のいずれか一つに記載された突然変異体をコードすることを特徴とする単離されたポリヌクレオチド。

【請求項14】

請求項９－１２のいずれか一つに記載されたシトシンデアミナーゼの突然変異体を含む；好ましくはＢＥ３単一塩基エディターであることを特徴とする単一塩基エディター。

【請求項15】

ゲノムエディターのオフターゲット効果を低減する為に、単一塩基エディターシステムに基づく遺伝子編集に関与することを特徴とする請求項９－１３のいずれか一つに記載されたシトシンデアミナーゼ突然変異体の用途。

【請求項16】

（１）候補物質でシトシンデアミナーゼまたはそのＤＮＡ結合ドメイン、及びＤＮＡ相互作用（結合）システムを処理すること；及び
（２）上記のシステムにおけるシトシンデアミナーゼＤＮＡ結合ドメインとＤＮＡとの相互作用状況を検測すること；ただし、上記の候補物質が、シトシンデアミナーゼまたはそのＤＮＡ結合ドメインとＤＮＡとの相互作用を抑制、ブロッキングまたはダウンレギュレーションすると、当該候補物質は、ＢＥ３ゲノムエディターのオフターゲット効果の低減に有用な物質であることを示す；
を含むことを特徴とする単一塩基エディターのオフターゲット効果の低減に有用な物質をスクリーニングする方法。

【請求項17】

（１）ｎ細胞期の胚を取得し、１からｎ－１個の細胞で遺伝子編集操作を行うこと；ただし、上記のｎは、２～１０の正の整数である；
（２）胚発生の下流段階での遺伝子編集の発生を観察すること；
を含むことを特徴とする単一塩基遺伝子編集ツールまたは遺伝子編集操作のターゲティング効果を分析する方法。

【請求項18】

ステップ（１）には、上記のｎは、２～８、２～６または２～４の正の整数である；好ましくに、上記のｎは、２であることを特徴とする請求項１７に記載された方法。

【請求項19】

上記の方法は、インビトロ培養法またはインビボ培養法であることを特徴とする請求項１７に記載された方法。

【請求項20】

ステップ（２）には、上記の胚発生の下流段階は、胚発生の原腸陥入段階から出生前段階まで、またはインビボで子宮内での胚着床から出生前段階までであることを特徴とする請求項１７に記載された方法。

【請求項21】

上記の胚は、マウスの胚であり、上記の胚発生の下流段階は、胚発生の８～２０目日（Ｅ８－Ｅ２０段階）であり、好ましくに、胚発生の９．５～１８．５目日（Ｅ９．５－Ｅ１８．５段階）であり、より好ましくに、胚発生の１２～１６目日（Ｅ１１－Ｅ１６段階、例えばＥ１４．５）であることを特徴とする請求項１７に記載された方法。

【請求項22】

胚発育の卵割段階において、胚に遺伝子編集された割球と遺伝子編集されていない割球は分けられ、レシピエントに移植し、成体に成長することを特徴とする請求項１７に記載された方法。

【請求項23】

遺伝子編集された割球と編集されない割球を、別々の胚を形成し、異なるレシピエントまたは同じレシピエントに移植し、またはインビトロで胚性幹細胞株を確立することを特徴とする請求項２２に記載された方法。

【請求項24】

上記の遺伝子編集操作は、ＣＲＩＳＰＲを介した遺伝子編集、Ｂａｓｅ Ｅｄｉｔｏｒ（塩基エディター）を介した遺伝子編集、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰを介した遺伝子編集、Ｐｒｉｍｅ ｅｄｉｔｏｒを含むが、これらに限定されないことを特徴とする請求項１７に記載された方法。

【請求項25】

上記のＣＲＩＳＰＲを介した遺伝子編集は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を介した遺伝子編集、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ｎを介した遺伝子編集、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１３（例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１３ａ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１３ｄ）を介した遺伝子編集、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓＲｘを介した遺伝子編集を含むが、これらに限定されないことを特徴とする請求項２４に記載された方法。

【請求項26】

上記のＢａｓｅ Ｅｄｉｔｏｒは、ＢＥ１、ＢＥ２、ＢＥ３、ＢＥ４、ＢＥ４－Ｍａｘを含むことを特徴とする請求項２４に記載された方法。

【請求項27】

上記のアデニン塩基エディターは、ＡＢＥ７．１０、ＡＢＥ ６．３、ＡＢＥ ７．８、ＡＢＥ ７．９、Ｐｒｉｍｅ Ｅｄｉｔｉｎｇを含むことを特徴とする請求項２４に記載された方法。

【請求項28】

ステップ（１）には、遺伝子編集のために、核酸（ＤＮＡなど）の標的サイトを切断するために使用される酵素（Ｃａｓ ｍＲＮＡ、Ｃｒｅ ｍＲＮＡなど）および対応するガイド配列（ｓｇＲＮＡなど）を、１つの上記の細胞に導入することが含まれることを特徴とする請求項１７に記載された方法。

【請求項29】

上記の核酸（例えばＤＮＡ）の標的サイトを切断するために使用される酵素は、Ｃａｓ９、Ｃａｓ９ｎ、Ｃａｓ１３ａ、ＣａｓＲｘ、ＢＥ１、ＢＥ２、ＢＥ３、ＢＥ４、ＡＢＥ７．１０、ＡＢＥ ６．３、ＡＢＥ ７．８、ＡＢＥ ７．９から選べられるが、これらに限定されないことを特徴とする請求項２９に記載された方法。

【請求項30】

ステップ（１）には、検出可能なマーカーで、上記の遺伝子編集操作をマークし、１からｎ－１細胞に遺伝子編集操作を実行し、検出可能なマーカーを設置することを特徴とする請求項１７に記載された方法。

【請求項31】

上記の検出可能なマーカーは、染色マーカー、蛍光シグナル分子、レポーター遺伝子を含むが、これらに限定されない；より好ましくに、上記の検出可能なマーカーは、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ＥＧＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＧＦＰ、ｄｓｒｅｄであることを特徴とする請求項３０に記載された方法。

【請求項32】

ステップ（２）には、遺伝子編集の発生状況の観察は、以下のことを含む：
遺伝子編集を発生した細胞及び遺伝子編集を発生しない細胞を選別する；
シーケンシング分析を実行する；
単一ヌクレオチド変異分析ツールおよび／またはインデル分析ツールで分析を行う；
編集を発生した細胞と編集を発生しない細胞を比較し、ターゲティング効果またはオフターゲット効果を鑑定し、当該鑑定には、ＳＮＶとインデルの検出を含む；
ことを特徴とする請求項１７に記載された方法。

【請求項33】

上記の単一ヌクレオチド変異分析ツールは、Ｍｕｔｅｃｔ２、ＬｏｆｒｅｑとＳｔｒｅｌｋａまたはその組み合わせを含むが、これらに限定されない；または、上記のインデル分析ツールは、Ｍｕｔｅｃｔ２、Ｓｃａｌｐｅｌ、Ｓｔｒｅｌｋａまたはその組み合わせを含むが、これらに限定されないことを特徴とする請求項３２に記載された方法。

【請求項34】

上記の胚は、非ヒト哺乳類を含む哺乳類から由来することを特徴とする請求項１７に記載された方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、遺伝子編集分野に属し、より具体的に、本発明は、単一塩基編集による非標的な単一ヌクレオチド変異の現象に関し、さらに当該変異を避ける高特異性オフターゲットない単一塩基遺伝子編集ツールに関する。

【背景技術】

【0002】

ゲノム編集技術を世に問ったから、高く評価された。ＣＲＩＳＰＲはクラスター化され、規則的に間隔が空いている短い回文の反復配列の略語であり、ＣａｓはＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質の略語である。ＣＲＩＳＰＲ ／ Ｃａｓはもともとバクテリアで発見され、バクテリアの、バクテリオファージやその他の病原体の侵入を認識・破壊するための防御システムである。ＣＲＩＳＰＲ ／ Ｃａｓ９システムでは、酵素Ｃａｓ９がＤＮＡ標的サイトに切断する。Ｃａｓ９とｓｇＲＮＡを合わせてＣａｓ９－ｓｇＲＮＡシステムと呼ぶ。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術は、疾患モデルの確立、創薬ターゲットのスクリーニングに適用され、新世代の遺伝子治療法になる。

【0003】

しかし、ＣＲＩＳＰＲ ／ Ｃａｓ９とベースエディター（ｂａｓｅ ｅｄｉｔｏｒｓ）を介した遺伝子編集法が開発され、病原性変異によって引き起こされる遺伝病の治療に大きな期待が寄せられている。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集または塩基編集に基づく臨床アプリケーションでは、有害な変異のリスクを低減するために、オフターゲット効果の総合的な分析が必要である。ゲノム全体の遺伝子編集細胞のオフターゲット活性を検出するために、この分野でさまざまな方法が開発され、ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＨＴＧＴＳ）、ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ， ｕｎｂｉａｓｅｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＳＢｓ ｅｎａｂｌｅｄ ｂｙ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑ）、およびｃｉｒｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ ｏｆ ｃｌｅａｖａｇｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｂｙ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＣＩＲＣＬＥ－ｓｅｑ）を含む。ただし、これらの方法のいずれも、単一ヌクレオチド変異（ＳＮＶ）を効果的に検出することはできない。これまでのところ、この分野でＳＮＶを検出する効果的な方法がない。

【0004】

さらに、ＣＲＩＳＰＲ ／ Ｃａｓ９が適用される場合、相同性を介した修復の編集効率が低いという欠陥がある。当業者は、１６塩基長のＸＴＥＮリンカー（ＸＴＥＮ linker）を使用し、シチジンデアミナーゼＡＰＯＢＥＣ１およびｄＣａｓ９を連結して、第１世代の塩基エディター（ＢＥ１）を構築した。インビボでの編集の効率を高めるために、塩基エディター（ＢＥ２）システムは、シチジンデアミナーゼをｄＣａｓ９と連結することに加えて、塩基除去修復阻害剤とするＵＧＩをｄＣａｓ９と融合することにより、編集効率を３倍、最大約２０％にも向上させた。

【0005】

塩基編集の効率を改善するために、当業者は、ミスマッチ修復をシミュレートするためにｄＣａｓ９をＣａｓ９ｎに置き換え、それにより、第３世代の塩基エディター（ＢＥ３）を構築した。ＢＥ３は非相補的ＤＮＡ鎖にニックを作成し、細胞はウラシル（Ｕ）を含むＤＮＡ鎖をテンプレートとして使用して修復することで、こんな塩基編集を複製した。ヒト細胞株のさまざまな標的遺伝子の中で、こんなＢＥ３システムは塩基編集効率を大幅に改善し、その平均インデル（ｉｎｄｅｌ、ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ－ｄｅｌｅｔｉｏｎ、挿入－削除）発生率はわずか１．１％である。これらのテストされたの標的遺伝子にとって、これらの数値はＣａｓ９を介したＨＤＲの大幅な改善を表している；ＨＤＲを介した平均編集頻度はわずか０．５％であり、以前の単一塩基編集と比較して、より多くのインデルが観察された。複数の細胞分裂において、ＣＲＩＳＰＲ塩基編集は引き続き存在し、この方法が安定した塩基編集を生み出すことを示している。ただし、こんなＢＥ３システムは、オフターゲット編集にも悩まされている。

【0006】

ゲノム編集は、病原性変異によって引き起こされる遺伝病を治療する大きな可能性があり、そしてその実用性のために、遺伝子編集のオフターゲット効果の総合分析が非常に必要である。同時に、当分野には、オフターゲット問題を解決する方法をさらに見つける必要がある。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0007】

【非特許文献1】Ｇ．Ｊ．Ｋｎｏｔｔ， Ｊ．Ａ．Ｄｏｕｄｎａ， ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｇｕｉｄｅｓ ｔｈｅ ｆｕｔｕｒｅ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６１， ８６６－８６９（２０１８）．

【非特許文献2】Ｓ．Ｑ．Ｔｓａｉ， Ｊ．Ｋ．Ｊｏｕｎｇ， Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍ－ｗｉｄｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ． Ｎａｔ ＲＥｖ Ｇｅｎｅｔ １７， ３００ （２０１６）．

【非特許文献3】Ｃ．Ｒ．Ｌａｚｚａｒｏｔｔｏ ｅｔ ａｌ．， Ｄｅｆｉｎｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｎｕｃｌｅａｓｅ ａｃｉｔｉｖｉｔｉｅｓ ｗｉｔｈ ＣＩＲＣＬＥ－ｓｅｑ． Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ １３ ２６１５－２６４２（２０１８）．

【非特許文献4】Ｋ．Ｒ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， ＣＲＩＳＰＲ ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｒａｔｓ ａｎｄ ｍｉｃｅ． Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １５， ５１２－５１４（２０１８）．

【非特許文献5】Ｄ．Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ， Ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｔａｒｇｅｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅｓ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３５， ４７５－４８０（２０１７）．

【非特許文献6】Ｔ．Ｉ．Ｃｏｒｎｕ， Ｃ．Ｍｕｓｓｏｌｉｎｏ， Ｔ．Ｃａｔｈｏｍｅｎ， Ｒｅｆｉｎｉｎｇ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｔｏ ｔｒａｎｓｌａｔｅ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｃｌｉｎｉｃ． Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２３， ４１５－４２３（２０１７）．

【非特許文献7】Ｈ．Ａ．Ｒｅｅｓ， Ｄ．Ｒ． Ｌｉｕ，Ｂａｓｅ ｅｄｉｔｉｎｇ： ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｎ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅ ａｎｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ｏｆ ｌｉｖｉｎｇ ｃｅｌｌｓ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ， （２０１８）．

【非特許文献8】Ｎ．Ｍ．Ｇａｕｄｅｌｌｉ ｅｔａｌ．， Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｂａｓｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ Ａ＊Ｔ ｔｏ Ｇ＊Ｃ ｉｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｗｉｔｈｏｕｔ ＤＮＡ Ｃｌｅａｖａｇｅ． Ｎａｔｕｒｅ ５５１， ４６４－４７１（２０１７）．

【非特許文献9】Ｌ．Ｍａｄｉｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ａ ｒｏｂｕｓｔ ａｎｄ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｃｒｅ ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｔｈｅ ｗｈｏｌｅ ｍｏｕｓｅ ｂｒａｉｎ． Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １３， １３３－１４０（２０１０）．

【非特許文献10】Ｌ．Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ｏｎｅ ｂｌａｓｔｏｍｅｒｅ ｏｆ ｔｗｏ－ｃｅｌｌ ｅｍｂｒｙｏｓ ｒｅｖｅａｌｓ ａ ｎｏｖｅｌ Ｔｅｔ３ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ｒｅｏｃｏｒｔｉｃａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ． Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ ２７， ８１５－８２９（２０１７）．

【非特許文献11】Ｋ．Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．， Ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｎｔ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ｂａｓｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｓ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３５， ４３５－４３７（２０１７）．

【非特許文献12】Ｊ．Ｗ．Ｄｒａｋｅ， Ｂ．Ｃｈａｒｌｅｓｗｏｒｔｈ， Ｄ．Ｃｈａｒｌｅｓｗｏｒｔｈ， Ｊ．Ｆ．Ｃｒｏｗ， Ｒａｔｅｓ ｏｆ ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｍｕｔａｔｉｏｎ． Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １４８， １６６７－１６８６（１９９８）．

【非特許文献13】Ａ．Ｃ．Ｋｏｍｏｒ， Ｙ．Ｂ．Ｋｉｍ， Ｍ．Ｓ．Ｐａｃｋｅｒ， Ｊ．Ａ．Ｚｕｒｉｓ， Ｄ．Ｒ．Ｌｉｕ， Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ ａ ｔａｒｇｅｔ ｂａｓｅ ｉｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｗｉｔｈｏｕｔ ｄｏｕｂｌ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ ｃｌｅａｖａｇｅ． Ｎａｔｕｒｅ ５３３， ４２０－４２４（２０１６）．

【非特許文献14】Ｒ．Ｓ．Ｈａｒｒｉｓ， Ｓ．Ｋ．Ｐｅｔｅｒｓｅｎ－Ｍａｈｒｔ， Ｍ．Ｓ．Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ， ＲＮＡ ｅｄｉｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ ＡＰＯＢＥＣ１ ａｎｄ ｓｏｍｅ ｏｆ ｉｔｓ ｈｏｍｏｌｏｇｓ ｃａｎ ａｃｔ ａｓ ＤＮＡ ｍｕｔａｔｏｒｓ． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ １０， １２４７－１２５３（２００２）．

【非特許文献15】Ｓ．Ｒｅｂｈａｎｄｌ， Ｍ．Ｈｕｅｍｅｒ， Ｒ．Ｇｒｅｉｌ， Ｒ．Ｇｅｉｓｂｅｒｇｅｒ， ＡＩＤ／ＡＰＯＢＥＣ ｄｅａｍｉｎａｓｅｓ ａｎｄ ｃａｎｃｅｒ． Ｏｎｃｏｓｃｉｅｎｃｅ ２， ３２０－３３３（２０１５）．

【非特許文献16】Ｌ．Ｂ．Ａｌｅｘａｎｄｒｏｖ ｅｔ ａｌ．， Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ ｏｆ ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃａｎｃｅｒ． Ｎａｔｕｒｅ ５００， ４１５－４２１（２０１３）．

【非特許文献17】Ｈ．Ｃ．Ｌｏｓｅｙ， Ａ．Ｊ．Ｒｕｔｈｅｎｂｕｒｇ， Ｇ．Ｌ．Ｖｅｒｄｉｎｅ， Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ｔＲＮＡ ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ ＴａｄＡ ｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｗｉｔｈ ＲＮＡ． Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １３， １５３－１５９（２００６）．

【非特許文献18】Ｓ．Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｙｔｏｓｉｎｅ， ｂｕｔ ｎｏｔ ａｄｅｎｉｎｅ， ｂａｓｅ ｅｄｉｔｏｒｓ ｉｎｄｕｃｅ ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｒｉｃｅ． Ｓｃｉｅｎｃｅ， ｉｎ ｐｒｅｓｓ （２０１９）．

【非特許文献19】Ｙ．Ｂ．Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅ－ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｃｏｐｅ ａｎｄ ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｏｆ ｂａｓｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｗｉｔｈ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｃａｓ９－ｃｙｔｉｄｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ ｆｕｓｉｏｎｓ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３５， ３７１－３７６（２０１７）．

【非特許文献20】Ｘ．Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｂａｓｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ｒｅｇｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ａｈｕｍａｎ ＡＰＯＢＥＣ３Ａ－ｃａｓ９ ｆｕｓｉｏｎ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３６， ９４６－９４９（２０１８）．

【非特許文献21】Ｊ．Ｍ．Ｇｅｈｒｋｅ ｅｔ ａｌ．， Ａｎ ＡＰＯＢＥＣ３Ａ－Ｃａｓ９ ｂａｓｅ ｅｄｉｔｏｒ ｗｉｔｈ ｍｉｎｉｍｉｚｅｄ ｂｙｓｔａｎｄｅｒ ａｎｄ ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３６， ９７７－９８２（２０１８）．

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

本発明の目的としては、単一塩基編集による非標的な単一ヌクレオチド変異の現象を研究し、高特異性オフターゲットない単一塩基遺伝子編集ツールを提供する。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明の第一の様態では、単一塩基エディターのオフターゲット効果を低減する方法を提供し、単一塩基エディターシステムでは、シチジンデアミナーゼ酵素（ｃｙｔｉｄｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ ｅｎｚｙｍｅ（ｓ））を修飾し、そのＤＮＡと結合する能力を弱化させることを含む。

【0010】

一つの好ましい例では、上記の修飾は、シトシンデアミナーゼのＤＮＡ結合領域に対する修飾である；好ましくに、上記のＤＮＡ結合領域は、そのＤＮＡ（例えばｓｓＤＮＡ）と結合するドメインである。

【0011】

別の好ましい例では、上記の修飾は、遺伝子変異、標的的なブロッキング（例えば、結合タンパク質または抗体によるブロッキング、または競合結合分子によるブロッキング）、干渉を含むが、これらに限定されない。

【0012】

別の好ましい例では、上記の単一塩基エディターシステムは、ＢＥ３ゲノムエディターシステムである。

【0013】

別の好ましい例では、上記のＤＮＡは一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）または二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）である。

【0014】

別の好ましい例では、上記のシトシンデアミナーゼは、ＡＩＤ （例えば、ヒトＡＩＤ）、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ （例えば、ヒトＡＰＯＢＥＣ３Ｇ）、ＡＰＯＢＥＣ１、ＡＰＯＢＥＣＡ３Ａ、ＣＤＡ１ （例えば、ｌａｍｐｒｅｙ ＣＤＡ１）から選べられる酵素を含むが、これらに限定されない。

【0015】

別の好ましい例では、上記の弱化は、著しい弱化であり、例えば、当該弱化により、シトシンデアミナーゼとＤＮＡ（好ましくに、ｓｓＤＮＡ）との結合能力が１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上、または１００％低下する。

【0016】

別の好ましい例では、上記のシトシンデアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ１である；好ましくに、上記の修飾は、当該酵素の１２６位のアミノ酸を修飾することである；より好ましくに、上記の修飾は、その１２６位のＲを、Ｅに突然変異することである。

【0017】

別の好ましい例では、上記の修飾は、さらに、ＡＰＯＢＥＣ１酵素の１３２位のアミノ酸を修飾することを含む；好ましくに、上記の修飾は、その１３２位をＥに突然変異することである。

【0018】

別の好ましい例では、上記の修飾は、さらに、ＡＰＯＢＥＣ１酵素の９０位のアミノ酸を修飾することを含む；好ましくに、上記の修飾は、その９０位をＹに突然変異することである。

【0019】

別の好ましい例では、上記の修飾は、さらに、ＡＰＯＢＥＣ１酵素の９０位のアミノ酸を修飾することを含む；好ましくに、上記の修飾は、その９０位をＦに突然変異することである。

【0020】

別の好ましい例では、上記の修飾は、さらに、ＡＰＯＢＥＣ１酵素の９０位のアミノ酸と１２６位のアミノ酸を合わせて、Ｗ９０ＹとＲ１２６Ｅに修飾することを含む。

【0021】

別の好ましい例では、上記の修飾は、さらに、ＡＰＯＢＥＣ１酵素の９０位のアミノ酸と１２６位のアミノ酸を合わせて、Ｗ９０ＦとＲ１２６Ｅに修飾することを含む。

【0022】

別の好ましい例では、上記のシトシンデアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣＡ３Ａである；好ましくは、上記の修飾は、当該酵素の１３０位のアミノ酸を修飾することである；より好ましくは、上記の修飾は、その１３０位のＹを、Ｆに突然変異することである。

【0023】

本発明のもう一つの様態では、シトシンデアミナーゼの突然変異体を提供し、そのＤＮＡ結合領域に修飾が起こり、当該修飾より、それとＤＮＡとの結合を弱化し、上記のＤＮＡは、例えば、一本鎖ＤＮＡである。

【0024】

一つの好ましい例では、上記のシトシンデアミナーゼは、ＡＩＤ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、ＡＰＯＢＥＣ１、ＡＰＯＢＥＣＡ３Ａ、ＣＤＡ１から選べられる酵素を含むが、これらに限定されない。

【0025】

別の好ましい例では、上記の酵素は、ＡＰＯＢＥＣ１である；好ましくに、上記の修飾が、当該ドメインの１２６位またはそれと隣接する位置に起こる；より好ましくに、上記の修飾は、その１２６位のＲをＥに突然変異することである。

【0026】

別の好ましい例では、上記の酵素は、ＡＰＯＢＥＣ１である；好ましくに、上記の修飾が、当該ドメインの１３２位またはそれと隣接する位置に起こる；より好ましくに、上記の修飾は、その１３２位のＲをＥに突然変異することである。

【0027】

別の好ましい例では、上記の修飾は、さらに、ＡＰＯＢＥＣ１酵素の９０位のアミノ酸に起こる；好ましくに、上記の修飾は、その９０位をＹに突然変異することである。

【0028】

別の好ましい例では、上記の酵素は、ＡＰＯＢＥＣＡ３Ａであり、上記の修飾が、当該酵素の１３０位のアミノ酸またはそれと隣接する位置に起こる；好ましくに、上記の修飾は、その１３０位のＹをＦに突然変異することである。

【0029】

本発明のもう一つの様態では、単離されたポリヌクレオチドを提供し、上記のポリヌクレオチドが、上記の突然変異体をコードする。

【0030】

本発明のもう一つの様態では、上記のポリヌクレオチドを含有するベクターを提供する。

【0031】

本発明のもう一つの様態では、遺伝子操作された宿主細胞を提供し、その宿主細胞が、上記のベクターを含有し、またはその宿主細胞のゲノムに上記のポリヌクレオチドが組み込まれた。

【0032】

本発明のもう一つの様態では、上記のシトシンデアミナーゼの突然変異体を含む単一塩基エディターを提供する；好ましくに、上記のエディターは、ＢＥ３単一塩基エディターである。

【0033】

本発明のもう一つの様態では、上記のシトシンデアミナーゼの突然変異体を生産する方法を提供し、それが、以下のステップを含む：（１）上記の宿主細胞を培養し、培養物を得る；及び（２）培養物から上記のシトシンデアミナーゼ突然変異体を単離する。

【0034】

本発明のもう一つの様態では、ゲノムエディターのオフターゲット効果を低減する為に、単一塩基エディターシステムに基づく遺伝子編集に関与する、上記のシトシンデアミナーゼ突然変異体の用途を提供する。

【0035】

一つの好ましい例では、上記のシトシンデアミナーゼ突然変異体の用途は、非治療性の用途であっても良い。

【0036】

本発明のもう一つの様態では、単一塩基エディターのオフターゲット効果の低減に有用な物質をスクリーニングする方法を提供し、当該方法が、以下を含む：（１）候補物質でシトシンデアミナーゼまたはそのＤＮＡ結合ドメイン、及びＤＮＡ（例えばｓｓＤＮＡ）相互作用（結合）システムを処理すること；及び（２）上記のシステムにおけるシトシンデアミナーゼＤＮＡ結合ドメインとＤＮＡとの相互作用状況を検測すること；ただし、上記の候補物質が、シトシンデアミナーゼまたはそのＤＮＡ結合ドメインとＤＮＡとの相互作用を抑制、ブロッキングまたはダウンレギュレーションすると、当該候補物質は、ゲノムエディターのオフターゲット効果の低減に有用な物質であることを示す。

【0037】

一つの好ましい例では、上記の候補物質は、小分子化合物、シトシンデアミナーゼまたはそのＤＮＡ結合ドメインまたはそのコード化核酸用に設計された結合分子（例えば抗体またはリガンド）、ブロッキング分子（例えば、アミノ酸の修飾の基づくブロッキング剤）、干渉分子、遺伝子編集試薬、核酸阻害物を含むが、これらに限定されない。

【0038】

別の好ましい例では、上記のシステムは、細胞システム（例えば、シトシンデアミナーゼまたはそのＤＮＡ結合ドメインを発現し、ＤＮＡ（例えばｓｓＤＮＡ）を含む細胞）（または細胞培養物システム）、細胞下システム、溶液システム、組織システム、臓器システムまたは動物システムを含むが、これらに限定されない。

【0039】

本発明のもう一つの様態では、単一塩基遺伝子編集ツールのターゲティング効果を分析する方法（ＧＯＴＩ）を提供し、上記の方法は、以下を含む：（１）ｎ細胞期の胚を取得し、１からｎ－１個の細胞で遺伝子編集操作を行う；遺伝子編集なしで少なくとも１つまたはいくつかの細胞を保持する；ただし、上記のｎは、２～１０の正の整数である；（２）胚発生の下流段階での遺伝子編集の発生状況を観察する。

【0040】

一つの好ましい例では、ステップ（１）には、上記のｎは、２～８、２～６または２～４の正の整数である；好ましくに、上記のｎは、２である。

【0041】

別の好ましい例では、上記の方法は、インビトロ培養法またはインビボ培養法である。

【0042】

別の好ましい例では、発育の卵割段階において、同じ胚における遺伝子編集された割球と遺伝子編集されていない割球は分けられ、その後、レシピエント（マウスなど）に移植し、別々に成体に成長する。

【0043】

別の好ましい例では、ステップ（２）には、上記の胚発生の下流段階は、胚発生の原腸陥入段階から出生前段階まで、またはインビボで子宮内での胚着床から出生前段階までである。

【0044】

別の好ましい例では、上記の胚は、マウスの胚であり、上記の胚発生の下流段階は、胚発生の８～２０目日（Ｅ８－Ｅ２０段階）であり、好ましくに、胚発生の９．５～１８．５目日（Ｅ９．５－Ｅ１８．５段階）であり、より好ましくに、胚発生の１２～１６目日（Ｅ１１－Ｅ１６段階、例えばＥ１４．５）である。

【0045】

別の好ましい例では、上記の遺伝子編集操作は、ＣＲＩＳＰＲを介した遺伝子編集、Ｂａｓｅ Ｅｄｉｔｏｒ（塩基エディター）を介した遺伝子編集、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰを介した遺伝子編集、アデニン塩基エディターを介した遺伝子編集を含むが、これらに限定されない。

【0046】

別の好ましい例では、上記のＣＲＩＳＰＲを介した遺伝子編集は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を介した遺伝子編集、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ｎを介した遺伝子編集、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１３（例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１３ａ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１３ｄ）を介した遺伝子編集、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓＲｘを介した遺伝子編集を含むが、これらに限定されない。

【0047】

別の好ましい例では、上記のＢａｓｅ Ｅｄｉｔｏｒは、ＢＥ１、ＢＥ２、ＢＥ３、ＢＥ４、ＢＥ４－Ｍａｘを含む。

【0048】

別の好ましい例では、上記のアデニン塩基エディターは、ＡＢＥ７．１０、ＡＢＥ ６．３、ＡＢＥ ７．８、ＡＢＥ ７．９、Ｐｒｉｍｅ Ｅｄｉｔｉｎｇを含む。

【0049】

一つの好ましい例では、ステップ（１）には、遺伝子編集のために、核酸（例えばＤＮＡ）の標的サイトを切断するために使用される酵素（Ｃａｓ ｍＲＮＡ、Ｃｒｅ ｍＲＮＡなど）および対応するガイド配列（例えばｓｇＲＮＡ）を、１つの上記の細胞に導入することが含まれる。

【0050】

別の好ましい例では、上記の核酸（例えばＤＮＡ）の標的サイトを切断するために使用される酵素は、Ｃａｓ９、Ｃａｓ９ｎ、Ｃａｓ１３ａ、ＣａｓＲｘ、ＢＥ１、ＢＥ２、ＢＥ３、ＢＥ４、ＢＥ４－Ｍａｘ、ＡＢＥ７．１０、ＡＢＥ ６．３、ＡＢＥ ７．８、ＡＢＥ ７．９、Ｐｒｉｍｅ Ｅｄｉｔｉｎｇから選べられるが、これらに限定されない。

【0051】

別の好ましい例では、ステップ（１）には、検出可能なマーカーで、上記の遺伝子編集操作をマークし、１からｎ－１細胞に遺伝子編集操作を実行し、検出可能なマーカーを設置する。

【0052】

別の好ましい例では、上記の検出可能なマーカーは、染色マーカー、蛍光シグナル分子、レポーター遺伝子を含むが、これらに限定されない；より好ましくに、上記の検出可能なマーカーは、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ＥＧＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＧＦＰ、ｄｓｒｅｄであるが、これらに限定されない。

【0053】

別の好ましい例では、ステップ（２）中、遺伝子編集の発生状況の観察は、以下のことを含む：
遺伝子編集を発生した細胞（例えばｔｄＴｏｍａｔｏ陽性細胞）及び遺伝子編集を発生しない細胞（例えばｔｄＴｏｍａｔｏ陰性細胞）を選別する；

【0054】

別の好ましい例では、発育の卵割段階において、同じ胚における遺伝子編集された割球と遺伝子編集されていない割球は分けられ、その後、レシピエント（マウスなど）に移植し、別々に成体に成長し、フローサイトメトリーでの選別を行わない。

【0055】

シーケンシング分析（例えばＷＧＳ分析）を実行する；
単一ヌクレオチド変異（ＳＮＶ）分析ツールおよび／またはインデル分析ツールで分析を行う；
編集を発生した細胞と編集を発生しない細胞を比較し、ターゲティング効果またはオフターゲット効果を鑑定し、当該鑑定には、ＳＮＶとインデルの検出を含む。

【0056】

別の好ましい例では、上記のＳＮＶ分析ツールは、Ｍｕｔｅｃｔ２、ＬｏｆｒｅｑとＳｔｒｅｌｋａまたはその組み合わせを含むが、これらに限定されない；または、上記のインデル分析ツールは、Ｍｕｔｅｃｔ２、Ｓｃａｌｐｅｌ、Ｓｔｒｅｌｋａまたはその組み合わせを含むが、これらに限定されない。

【0057】

別の好ましい例では、フローサイトメトリーで遺伝子編集を発生した細胞（例えばｔｄＴｏｍａｔｏ陽性細胞）及び遺伝子編集を発生しない細胞（例えばｔｄＴｏｍａｔｏ陰性細胞）を選別する。

【0058】

別の好ましい例では、上記の単一塩基遺伝子編集ツールのターゲティング効果を分析する方法（ＧＯＴＩ）は、非治療性の方法であっても良い。

【0059】

別の好ましい例では、上記の単一塩基遺伝子編集ツールのターゲティング効果を分析する方法は、インビトロ方法であっても良い。

【0060】

別の好ましい例では、上記の胚は、哺乳類から由来し、非ヒト哺乳類、例えばマウス、ウサギ、ヒツジ、ウシ、サルなどを含むが、これらに限定されない。

【0061】

本文に開示された内容に基づき、当業者にとって、本発明の他の面は自明なものである。

【図面の簡単な説明】

【0062】

【図1】ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９、ＢＥ３またはＡＢＥ７．１０を介した遺伝子編集を、２－ｃｅｌｌ段階胚の一つの割球へ注入した。（Ａ）実験計画：Ｃｒｅ、Ｃａｓ９／ＢＥ３、およびｓｇＲＮＡの混合物を２－ｃｅｌｌ胚の一つの割球に注入し、当該胚は、Ａｉ９オスマウスと野生型メスマウスの交配から由来したものである。Ｃｒｅの作用は、キメラ胚を生成する見込みがあり、その半分の細胞はｔｄＴｏｍａｔｏ（赤）とマークされた。フローサイトメトリーは、ｔｄＴｏｍａｔｏ ＋とｔｄＴｏｍａｔｏ－細胞をＥ１４．５キメラ胚から単離し、それらを全ゲノムシーケンスに使用した。ｔｄＴｏｍａｔｏ ＋細胞とｔｄＴｏｍａｔｏ－細胞を比較することにより、３つの異なる呼び出しアルゴリズムを使用し、オフターゲットのＳＮＶとインデルを認識した（ＳＮＶはＭｕｔｅｃｔ２、Ｌｏｆｒｅｑ、Ｓｔｒｅｌｋａを使用し、インデルはＭｕｔｅｃｔ２、Ｓｃａｌｐｅｌ、Ｓｔｒｅｌｋａを使用した）。ＳＮＶとインデルは色付きの点と十字でマークされた。（Ｂ）指定された胚におけるＦＡＣＳ分析。（Ｃ）ＷＧＳに基づくｔｄＴｏｍａｔｏ ＋とｔｄＴｏｍａｔｏ－細胞のターゲティング効率。ｔｄＴｏｍａｔｏ ＋細胞におけるＣａｓ９、ＢＥ３、とＡＢＥ７．１０のターゲティング効率は、６６％＋ ／－１２％の挿入または削除（ＳＥＭ、ｎ ＝ ５）、８３％＋ ／－１０％（ＳＥＭ、ｎ ＝ ４）、４７％以上のそれぞれ約１８％（ＳＥＭ、ｎ ＝ ２）の単一塩基編集である。（Ｄ）Ｃａｓ９－Ｔｙｒ－Ａ、Ｃａｓ９－Ｔｙｒ－Ｂ、ＢＥ３－Ｔｙｒ－Ｃ、およびＢＥ３－Ｔｙｒ－Ｄで処理されたＥ１４．５胚のフローサイトメトリー分析；注入されていない胚のフローサイトメトリー分析を図Ｓ１ｂに示した。（Ｅ）全ゲノムシーケンスに基づくｔｄＴｏｍａｔｏ ＋細胞（左）とｔｄＴｏｍａｔｏ－細胞（右）のターゲティング効率；同じ方法で処理された細胞は同じ色で示された。（Ｆ）Ｃａｓ９－Ｔｙｒ－Ａ、Ｃａｓ９－Ｔｙｒ－Ｂ、ＢＥ３－Ｔｙｒ－Ｃ、およびＢＥ３－Ｔｙｒ－Ｄで処理されたＥ１４．５胚のＴＡクローンシーケンシングオンターゲット分析；各列の数字は、分析されたクローンの総数を表す。

【図2】ＢＥ３で処理されたマウス胚で生成された多数のオフターゲットＳＮＶ。（Ａ）検出されたオフターゲットＳＮＶの総数の比較。 Ｃｒｅ－、Ｃａｓ９－、ＢＥ３－およびＡＢＥ７．１０で処理された胚のＳＮＶの数は１４ ＋／－ １２（ＳＥＭ、ｎ＝２）、１２ ＋／－ ４（ＳＥＭ、ｎ ＝ １１）、２８３ ＋／それぞれに－３２（ＳＥＭ、ｎ ＝ ６）と１０ ＋／－ ５ＳＮＶ（ＳＥＭ、ｎ ＝ ４）である。（Ｂ）突然変異タイプの分布。各細胞における数字は、すべての突然変異の中で特定の突然変異の割合を示す。（Ｃ）Ｃ＞ＴとＧの比＞Ｃｒｅ、Ｃａｓ９とＢＥ３のＡ変異、およびＡＢＥ７．１０のＴ＞ ＣとＡ＞ Ｇ突然変異。２つのＣｒｅ、１１つのＣａｓ９、６つのＢＥ３、および４つのＡＢＥ７．１０サンプルが分析された。（Ａ）と（Ｂ）のＰ値は、ｔｗｏ－ｓｉｄｅｄ Ｗｉｌｃｏｘｏｎで処理された。

【図3】ＢＥ３によって誘導されたオフターゲットＳＮＶの特性。（Ａ）ランダムな並べと比較して、オフターゲット遺伝子ＳＮＶはゲノムの転写領域に集中している。（Ｂ）オフターゲットＳＮＶを含む遺伝子の発現は、４細胞胚におけるランダム模倣遺伝子の発現よりも有意に高かった。（Ｃ）各胚から同定されたＳＮＶはオーバーラップしていない。（Ｄ）ＧＯＴＩによって検出されたＳＮＶと、Ｃａｓ－ＯＦＦｉｎｄｅｒおよびＣＲＩＳＰＯＲによって予測されたオフターゲットとの間のオーバーラップ。（Ａ）と（Ｂ）のＰ値は、ｔｗｏ－ｓｉｄｅｄ Ｗｉｌｃｏｘｏｎで処理された。

【図4】ＢＥ３オフターゲット評価によって構築されたＢＥ２システム。（ａ）プラスミドマップ。（ｂ）ＷＧＳデータからのＲ１２６Ｅ突然変異のＢＥ３のターゲティング効率。（ｃ）検出されたオフターゲットＳＮＶの総数の比較。

【図5】Ａｐｏｂｅｃ１の点突然変異は、ＢＥ３のＤＮＡおよびＲＮＡのオフターゲットを除去できる。（ａ）ＢＥ３システムにおけるＡＰＯＢＥＣ１；（ｂ）ＢＥ３の使用量（ＢＥ３マイクロインジェクション濃度）とターゲティング効率の相関関係；（ｃ）シーケンシングでターゲティング効率を確認する；（ｄ）異なる突然変異体のオフターゲット状況を比較する。ＢＥ３^{Ｒ１２６Ｅ}、ＢＥ３^{Ｒ１２６Ｅ＋Ｗ９０Ｙ}ＤＮＡのオフターゲットが、著しくに低減された；（ｅ）突然変異体とオフターゲット効果の間の相関分析。

【図6】さまざまな混合処理を行ったＥ１４．５胚のフローサイトメトリー分析。（ａ）Ｃａｓ９－Ｔｙｒ－Ａ遺伝子ターゲティング胚の代表的な図。上部：４細胞胚、下部：散在する８細胞胚。赤い矢印はｔｄＴｏｍａｔｏ＋割球を示す。スケールバー：１００μｍ。（ｂ）左から右へ、上から下へ：注入されない、Ｃｒｅ－＃１， Ｃｒｅ－＃２、Ｃｒｅ＋Ｃａｓ９－＃１、Ｃｒｅ＋Ｃａｓ９－＃２、Ｃｒｅ＋Ｃａｓ９＋ＬａｃＺ－＃１、Ｃｒｅ＋Ｃａｓ９＋ＬａｃＺ－＃２， Ｃｒｅ＋Ｃａｓ９＋Ｐｄｅ６ｂ－＃１とＣｒｅ＋Ｃａｓ９＋Ｐｄｅ６ｂ－＃２。（ｃ）Ｔｙｒ遺伝子をターゲティングとする８細胞胚の遺伝子型。単一のｔｄＴｏｍａｔｏ ＋およびｔｄＴｏｍａｔｏ－細胞は、４つのＣａｓ９－Ｔｙｒ－Ａおよび４つのＣａｓ９－Ｔｙｒ－Ｂ遺伝子ターゲティング胚盤胞から単離された。数：分析された胚盤胞の総数。ＷＴ：野生型対立遺伝子。Ｍｕｔａｎｔ：Ｔｙｒ対立遺伝子突然変異。

【図7】ｓｇＲＮＡの切断効率は、ＤＮＡインビトロ切断法によって測定された。左から右へのアガロースゲル電気泳動は、それぞれＣａｓ９－Ｔｙｒ－Ａ、Ｃａｓ９－Ｔｙｒ－Ｂ、Ｃａｓ９－ＬａｃＺ、Ｃａｓ９－Ｐｄｅ６ｂを示す。各遺伝子のｓｇＲＮＡ標的サイトの両側のゲノム領域または構造に対して、ＰＣＲ増幅を行い、ＰＣＲ産物をＣａｓ９リボヌクレオプロテインおよびｓｇＲＮＡと３時間インキュベートした。

【図8】ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９とＢＥ３で処理されたキメラ胚の発生と遺伝子型。（ａ）異なるｍｉｘを注入した後のｔｄＴｏｍａｔｏ ＋胚盤胞のパーセンテージ。数：胚盤胞または胚の総数。（ｂ）異なるｍｉｘを注入した後のＥ１４．５胚の生存率。数：計算された胚の総数または移植の総数。（ｃ）ｔｄＴｏｍａｔｏ ＋胚盤胞のパーセンテージ及びＥ１４．５胚におけるＴｙｒ突然変異のパーセンテージ。数：分析された胚盤胞または胚の総数。

【図9】ｔｄＴｏｍａｔｏ ＋およびｔｄＴｏｍａｔｏ－細胞の全ゲノムをシーケンシングすることによって得られたオンターゲット配列。ＷＴおよび突然変異配列の全遺伝子シーケンシング結果は、ＷＴおよびＭＵＴを示し、スラッシュの前の数字はＷＴまたは突然変異配列を示し、合計数はスラッシュの後に表示される。突然変異配列は下線でハイライトされ、最後の３位であるＴＧＧ、ＣＧＧ、ＧＧＧはＰＡＭである。

【図10】指定されたソフトウェアツールを使用し、各胚にＷＧＳデータで検出されたＳＮＶのベン図。（ａ）ＣｒｅまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９で処理されたサンプルで検出されたＳＮＶ。（ｂ）ＢＥ３で処理された胚において同定されたＳＮＶ。これからの分析から、対立遺伝子頻度が１０％未満の反復ＳＮＶは排除された。

【図11】代表的なサンガーシーケンシングピークマップが、全ゲノムシーケンシングよりＣｒｅまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９で処理された胚の突然変異を検出する状況を示す。（ａ）示されたサンプルにＰＣＲ増幅を行い、サンガーシーケンシングを実行した。緑の矢印：野生型；赤の矢印：ヌクレオチドが挿入されている。赤い点線：ヌクレオチドが欠落している。（ｂ）示されるサンプルのＳＮＶは、サンガーシーケンシングによって検証された。緑の矢印：野生型ヌクレオチド；赤の矢印：突然変異ヌクレオチド。プライマーを表Ｓ１６に示す。

【図12】ＣｒｅおよびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９で処理された胚において、ＷＧＳデータから検出されたＳＮＶの数。同じグループの胚は同じ色で表される。右側のヒストグラムシミュレーション－自然突然変異の数の分布。

【図13】ＣｒｅおよびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９で処理された胚から同定されたオフターゲットＳＮＶおよびインデル。（ａ）ＣｒｅまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を注入した各胚から同定されたｓｎｖは、相互に排他的である。（ｂ）ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ９で処理された胚から検出されたＳＮＶは、Ｃａｓ－ＯＦＦｉｎｄｅｒとＣＲＩＳＰＯＲによって予測されたオフターゲットサイトと一致する。（ｃ）上位１０の予測されたＣａｓ９－Ｔｙｒ－ＡおよびＣａｓ９－Ｔｙｒ－Ｂオフターゲット配列アラインメント、およびＷＧＳデータから検出されたＣａｓ９－Ｔｙｒ－ＡおよびＣａｓ９－Ｔｙｒ－Ｂ突然変異。

【図14】同じ胚から由来のｔｄＴｏｍａｔｏ－細胞とｔｄＴｏｍａｔｏ ＋細胞を比較することにより、ＷＧＳデータからのリバースコールの変数をまとめる。（ａ）Ｃｒｅ－およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９で処理されたサンプルから、逆の変数を呼び出す。（ｂ）ＢＥ３で処理されたサンプルから、逆の結果を呼び出す。

【図15】この研究で同定された各胚の突然変異タイプ。各セルの数は、特定の突然変異タイプの割合を示し、色が濃いほど突然変異タイプの割合が高いことを示す。

【図16】４つのＣｉｓｔｒｏｍｅデータセットから、認識されたｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔピークの有無を比較する。各バーの上部にある数字は、アプリケーションデータセットのＧＥＯアクセッションを表す。Ｐ値は、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ ｒａｎｋ ｓｕｍ ｔｅｓｔによって計算される。

【発明を実施するための形態】

【0063】

ゲノム編集は、病気の原因となる突然変異を修正することが期待されている。ただし、異なる個体の単一ヌクレオチド多型のため、遺伝子編集のオフターゲット効果を確定することは困難である。そのようなオフターゲット効果を研究するために、本発明者らは、ＧＯＴＩと名付けられた、２細胞または複数細胞（好ましくは２細胞）の胚注入による全ゲノムオフターゲットを分析する方法を開発した。本発明の方法は、ＣＲＩＳＰＲを介した遺伝子編集、Ｂａｓｅ Ｅｄｉｔｏｒ（塩基エディター）を介した遺伝子編集、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰを介した遺伝子編集、アデニン塩基エディターを介した遺伝子編集後の追跡分析に適し、ターゲティング効果／効率を検測する。

【0064】

本発明が、単一塩基遺伝子編集ツールのターゲティング効果を分析する方法（ＧＯＴＩ）を提供し、上記の方法は、以下を含む：（１）ｎ細胞期の胚を取得し、１からｎ－１個の細胞で遺伝子編集操作を行う；ただし、上記のｎは、２～１０の正の整数である；（２）胚発生の下流段階での遺伝子編集の発生を観察する。一部の好ましい実施形態において、上記のｎは、２～８、２～６または２～４の正の整数である。本発明の好ましい実施形態では、好ましくに、上記のｎは、２である。

【0065】

本発明の方法は、インビトロ状態での胚培養、例えば、試験管または他の胚培養容器での胚培養に適している。本発明の方法はまた、インビボでの胚培養にも適している；例えば、本発明の方法の処理がインビトロで行われた後、発生中の細胞を、体内に移植し、例えば、動物の卵管に移植し、胚はそれ自体で子宮へ泳ぐ；或いは、動物の子宮に移植する。

【0066】

本発明の方法は、インビトロ状態での胚培養、例えば、試験管または他の胚培養容器での胚培養に適している。

【0067】

本発明の方法は、インビトロ状態での胚培養に適し、胚培養を、胚培養容器内で行い、胚性幹細胞株を確立する。

【0068】

本発明の方法は、インビトロ状態での胚培養に適し、胚培養を、胚培養容器内で行い、編集された割球と編集されない割球が、それぞれに、胚性幹細胞株を確立する。

【0069】

本発明の方法は、同じ胚において編集された割球および編集されない割球を分けて、２つの胚を形成し、これらはそれぞれ異なるレシピエントマウスに移植するか、またはインビトロで胚性幹細胞株を確立することに適する。

【0070】

本発明の方法は、同じ胚において編集された割球および編集されない割球を分けて、２つの胚を形成し、これらはそれぞれ同じレシピエントマウスに移植するか、またはインビトロで胚性幹細胞株を確立することに適する。

【0071】

本発明の方法はまた、インビボでの胚培養にも適している；例えば、本発明の方法の処理がインビトロで行われた後、発生中の細胞を、体内に移植し、例えば、動物の卵管に移植し、胚はそれ自体で子宮へ泳ぐ；或いは、動物の子宮に移植する。

【0072】

本発明の好ましい形態では、上記の胚発生の下流段階は、胚発生の原腸陥入段階から出生前段階まで、またはインビボで子宮内での胚着床から出生前段階までである。発明者は、胚発生中の「適切な時期」に、細胞を選別し、及び遺伝子編集の効果を測定することが理想的であることを発見した。一般に、上記の「適切な時間」とは、胚が、酵素によって単一の細胞に分解されるのに適した段階に成長する段階である。例えば、上記のｎ－細胞段階の胚は、マウスの胚であり、上記の胚発生の下流段階は、胚発生の８～２０目日（Ｅ８－Ｅ２０段階）であり、好ましくに、胚発生の９．５～１８．５目日（Ｅ９．５－Ｅ１８．５段階）であり、より好ましくに、胚発生の１２～１６目日（Ｅ１１－Ｅ１６段階、例えばＥ１４．５）である。

【0073】

本発明の方法は、様々な単一塩基遺伝子編集方法に適用可能である。本発明の方法は、ＤＮＡ標的部位を切断する様々な酵素が関与する遺伝子編集に採用することができる。上記のＤＮＡ標的サイトを切断する酵素は、当業者によく知られているこの過程に関与する様々な酵素であっても良く、例えば、Ｃａｓ９、Ｃａｓ９ｎ、Ｃａｓ１３ａ、ＣａｓＲｘ、ＢＥ１、ＢＥ２、ＢＥ３、ＢＥ４、ＡＢＥ７．１０、ＡＢＥ ６．３、ＡＢＥ ７．８、ＡＢＥ ７．９、Ｐｒｉｍｅ Ｅｄｉｔｉｎｇであっても良いが、これらに限定されない。

【0074】

上記のＧＯＴＩ法では、検出可能なマーカーを使用して上記の遺伝子編集操作をマークすることができ、検出可能なマーカーは、色素マーカー、蛍光シグナル分子、レポーター遺伝子を含むが、これらに限定されない。本発明の実施形態では、好ましい実施形態として、ｔｄＴｏｍａｔｏを使用するが、他のマーカーも本発明に適用することができる。

【0075】

本発明の好ましい形態として、遺伝子編集の発生状況の観察は、以下のことを含む：遺伝子編集を発生した細胞（例えばｔｄＴｏｍａｔｏ陽性細胞）及び遺伝子編集を発生しない細胞（例えばｔｄＴｏｍａｔｏ陰性細胞）を選別する；シーケンシング分析（例えばＷＧＳ分析）を実行する；ＳＮＶ分析ツールおよび／またはインデル分析ツールで分析を行う；編集を発生した細胞と編集を発生しない細胞を比較し、オフターゲットＳＮＶとインデルを同定する。シーケンシングツール及び分析ツールは、上記および本発明の実施形態に列挙されたものに限定されず、他のいくつかのシーケンシングツール及び分析ツールも本発明に適用できることを理解される。細胞選別には、当技術分野で公知される様々な方法（例えば磁気ビーズ法、フローサイトメトリーなどを含むが、これらに限定されない）を使用することができる。

【0076】

本発明において、上記の「動物」とは、ヒト、非ヒト霊長類（サル、オランウータン）、家畜および農業動物（例えば豚、羊、牛）、ネズミ（マウス）、およびげっ歯類（たとえば、マウス、ラット、ウサギ）を含む哺乳動物を指す。上記の動物は人間を含まない動物である；限られた状況または特別な状況では、上記の動物はヒトであっても良いが、これは「ヒトの胚の商業的応用」を含まないカテゴリーにのみ適用される。

【0077】

本発明の特定の実施形態において、編集された割球子孫細胞と編集されていない割球子孫細胞の間のＥ１４．５の全ゲノム配列の比較は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９またはアデニン単一塩基編集の胚では、単一ヌクレオチド変異（ＳＮＶ）のオフターゲットがまれであり、頻度は自然突然変異率に近いことを示す。これに対して、シトシンの単一塩基編集は、２０倍を超えるオフターゲット単一ヌクレオチド変異を誘導した。

【0078】

臨床応用の前に、哺乳類細胞に全ゲノムオフターゲットがないことが必要があるが、個人のヌクレオチド多型のために、オフターゲット効果の程度を決定することは困難である。本発明に開発されたＧＯＴＩ（２細胞胚注入の全ゲノムオフターゲット分析）法は、この現状を変化させ、ＳＮＰに干渉することなくオフターゲット突然変異を検出し、そしてターゲティング効果の分析を正確かつ効果的に実現することができる。

【0079】

本発明者らは、単一塩基編集におけるオフターゲット効果（単一ヌクレオチドオフターゲット突然変異など）の原因をさらに研究した。単一塩基編集ツールＢＥ３が多数の単一ヌクレオチドオフターゲット突然変異（ＳＮＶ）を引き起こすことを観察した後、本発明者らは、多くの研究を行い、最終的に、これらのオフターゲット突然変異が、ＡＰＯＢＥＣ１の過剰発現およびそのＤＮＡ（例えばｓｓＤＮＡ）への結合によって引き起こされることを確認した。特定の実施形態において、本発明は、Ｒ１２６Ｅ、Ｒ１３２Ｅ、Ｗ９０Ｆ、Ｗ９０Ｙ、Ｗ９０Ｆ／Ｒ１２６Ｅ、Ｗ９０Ｙ／Ｒ１２６Ｅ突然変異などの突然変異を、ＡＰＯＢＥＣ１上で実行することによって、ＢＥ３によって誘導されたオフターゲット効果を解決する実施形態を開示した。

【0080】

上記に基づいて、本発明は、単一塩基エディターのオフターゲット効果を低減することに有用な方法を確定し、それが、単一塩基エディターシステムでは、シチジンデアミナーゼ酵素を修飾し、そのＤＮＡと結合する能力を弱化させることを含む。好ましくに、上記の修飾は、シトシンデアミナーゼのＤＮＡ結合領域に対する修飾である；より好ましくに、上記のＤＮＡ結合領域は、そのＤＮＡと結合するドメインである。上記の単一塩基エディターは、例えば、ＢＥ３ゲノムエディターである。

【0081】

弱化する作用が発揮できる限り、シトシンデアミナーゼに対する様々な修飾方法が利用可能である。いくつかの代替形態として、上記の修飾は、遺伝子変異、標的的なブロッキング（例えば、結合タンパク質または抗体によるブロッキング、または競合結合分子によるブロッキング）、干渉などであっても良い。

【0082】

単一塩基エディターシステムに適用可能な様々なシトシンデアミナーおよびそれと同じ機能を有する酵素はいずれも、本発明の方法によって修飾して、それらが存在する単一塩基エディターシステムのオフターゲット効果を低減することができる。例えば、上記のシトシンデアミナーゼは、ＡＩＤ （例えば、ヒトＡＩＤ）、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ （例えば、ヒトＡＰＯＢＥＣ３Ｇ）、ＡＰＯＢＥＣ１、ＣＤＡ１ （例えば、ｌａｍｐｒｅｙ ＣＤＡ１）から選べられる酵素を含むが、これらに限定されない。

【0083】

本発明において、上記の「弱化」とは、シトシンデアミナーゼとＤＮＡとの相互作用（結合）能力が、ダウンレギュレーションまたは排除されることを意味する。例えば、該弱化は、シトシンデアミナーゼとＤＮＡの結合能力を１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上、または１００％低下させる。

【0084】

本発明の好ましい形態として、一つの具体的なシトシンデアミナーゼＡＰＯＢＥＣ１（野生型の配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示し、その一つの変異体はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示す）を提供し、そのＤＮＡ結合領域を修飾した後に、それが関与する単一塩基エディターシステムの編集結果も非常に大幅に変更され、オフターゲット効果は大幅に減少した。好ましくは、この修飾は、酵素の１２６のアミノ酸を修飾することである；より好ましくは、修飾は、位置１２６のＲをＥに変異させることである。

【0085】

より好ましい形態では、ＡＰＯＢＥＣ１の対するするの修飾は、さらに、ＡＰＯＢＥＣ１酵素の９０位のアミノ酸にある；好ましくに、上記の修飾は、その９０位をＹに突然変異することである。

【0086】

より好ましい形態では、ＡＰＯＢＥＣ１の対するするの修飾は、さらに、ＡＰＯＢＥＣ１酵素の９０位のアミノ酸にある；好ましくに、上記の修飾は、その９０位をＹに突然変異することである。

【0087】

本発明のもう一つの好ましい形態として、具体的なシトシンデアミナーゼＡＰＯＢＥＣＡ３Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３７）を提供し、ＡＰＯＢＥＣＡ３Ａに対する修飾が、当該酵素の１３０位のアミノ酸にまたはそれと隣接する位置に起こる；好ましくに、上記の修飾は、その（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３７）１３０位をＹに突然変異する。

【0088】

発明者の新しい発現によって、さらに、ＢＥ３ゲノムエディターのオフターゲット効果の低減に有用な物質をスクリーニングする方法を提供し、当該方法が、以下を含む：（１）候補物質でシトシンデアミナーゼまたはそのＤＮＡ結合ドメイン、及びＤＮＡ相互作用（結合）システムを処理すること；及び（２）上記のシステムにおけるシトシンデアミナーゼＤＮＡ結合ドメインとＤＮＡとの相互作用状況を検測すること；ただし、上記の候補物質が、シトシンデアミナーゼまたはそのＤＮＡ結合ドメインとＤＮＡとの相互作用を抑制、ブロッキングまたはダウンレギュレーションすると、当該候補物質は、ＢＥ３ゲノムエディターのオフターゲット効果の低減に有用な物質であることを示す。

【0089】

本発明の好ましい形態では，スクリーニングを行う際に、シトシンデアミナーゼまたはそのＤＮＡ結合ドメインの変化とＤＮＡ相互作用（結合）をより簡単に観察するために、コントロールグループを設定することもできる；コントロールグループは、候補物質を添加しないシトシンデアミナーゼ、またはそのＤＮＡ結合ドメインおよびＤＮＡ相互作用（結合）システムであっても良い。

【0090】

本発明の好ましい形態として、上記の方法は、さらに、得られた潜在物質に対してさらなる細胞実験および／または動物実験を実施して、２つの間の相互作用（組み合わせ）を調節するのに本当に有用な物質をさらに選択および確定することを含む。

【0091】

以下、具体的な実施例を参照して、本発明をさらに説明する。これらの実施例は、本発明の範囲を限定するものではなく、本発明の単なる例示であることが理解されるべく。以下の実施例における特定の条件を特定しない実験方法は、通常に、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｅｓｓ、２００２に記載された通常条件に従って実施され、或いはメーカーが推奨する条件に従って実施される。

【実施例】

【0092】

材料と方法

【0093】

１．ＧＯＴＩ方法を含む実験計画
Ｃｒｅ、Ｃａｓ９ ／ ＢＥ３ ／ ＡＢＥ７．１０ ｍＲＮＡおよびｓｇＲＮＡの混合物をそれぞれ、野生型雌マウスＸＡｉ９雄マウスから由来する２細胞期胚の割球に注入した。Ｃｒｅの作用により、キメラ胚が生成され、ただし、注入された細胞は、ｔｄＴｏｍａｔｏ（赤）でマークされ、ｔｄＴｏｍａｔｏ陽性は編集されたことを示し、ｔｄＴｏｍａｔｏ陰性は、編集されないことを示す。ＦＡＣＳによってＥ１４．５でキメラ胚から、ＴｄＴｏｍａｔｏ陽性細胞とｔｄＴｏｍａｔｏ陰性細胞を単離し、それぞれＷＧＳ分析に使用された。オフターゲットＳＮＶとインデルは、３つのアルゴリズム（ＳＮＶはＭｕｔｅｃｔ２、Ｌｏｆｒｅｑ、Ｓｔｒｅｌｋａを使用し、インデルはＭｕｔｅｃｔ２、Ｓｃａｌｐｅｌ、Ｓｔｒｅｌｋａを使用した）を使用し、ｔｄＴｏｍａｔｏ ＋細胞とｔｄＴｏｍａｔｏ－細胞を比較することによって同定された。ＳＮＶとインデルは、図１Ａでは色付きの点と十字で表される。Ｃｒｅ タンパク質配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２に示され、Ｃａｓ９タンパク質配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３に示される。

【0094】

２．動物と看護
雌のＣ５７ＢＬ／６マウス（４週齢）とヘテロ接合体のＡｉ９（Ｂ６．Ｃｇ－Ｇｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒｔｍ９ （ＣＡＧ－ｔｄ－Ｔｏｍａｔｏ）Ｈｚｅ／Ｊ；ＪＡＸ ｓｔｒａｉｎ ００７９０９）雄マウスを胚の収集に使用した。ＩＣＲ雌マウスをレシピエントとして使用した。動物の使用と世話は、中国科学アカデミーの上海生物科学研究所の生物医学研究倫理委員会のガイドラインに準拠する。

【0095】

３．Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ、ＢＥ３ ｍＲＮＡ、ＡＢＥ７．１０ ｍＲＮＡ、Ｃｒｅ ｍＲＮＡとｓｇＲＮＡ
プライマーＣａｓ９ＦおよびＲを使用し、ｐｘ２６０プラスミドから、Ｃａｓ９タンパク質コード領域を増幅した。Ｔ７－Ｃａｓ９ ＰＣＲ産物を精製し、ｍＭＥＳＳＡＧＥ ｍＭＡＣＨＩＮＥ Ｔ７ＵＬＴＲＡを使用し、ｍＲＮＡを転写した。ｐｘ３３０プラスミドからＴ７－ｓｇＲＮＡ ＰＣＲを増幅し、ＭＥＧＡ Ｓｈｏｒｔｃｒｉｐｔ Ｔ７キット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用し、インビトロでＲＮＡに転写した。ＰＣＲ増幅によって、Ｔ７プロモーターをＣｒｅテンプレートに追加し、Ｔ７－Ｃｒｅ ＰＣＲ産物を精製し、ｍＭＥＳＳＡＧＥ ｍＭＡＣＨＩＮＥ Ｔ７ ＵＬＴＲＡキット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用し、インビトロでｍＲＮＡに転写した。ＭＥＧＡ ｃｌｅａｒキット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用し、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ、Ｃｒｅ ｍＲＮＡ、およびｓｇＲＮＡを精製し、ＲＮａｓｅフリー水で溶出した。
ｓｇＲＮＡ配列（上から下への配列番号：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５－１１）

【表9】

プライマー配列（上から下への配列番号：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２－２６）

【表10】

【0096】

４． ２細胞注入、胚培養および胚移植
過剰排卵したＣ５７ＢＬ／６雌（４週齢）をヘテロ接合体のＡｉ９（Ｂ６．Ｃｇ－Ｇｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒｔｍ９（ＣＡＧ－ｔｄ－Ｔｏｍａｔｏ）Ｈｚｅ／Ｊ；ＪＡＸ ｓｔｒａｉｎ ００７９０９）雄と交配させ、ｈＣＧ注射の２３時間後に、卵管から受精卵を採取した。２細胞編集の場合、５μｇ／ ｍｌサイトカラシンＢ（ＣＢ）を含むＨＥＰＥＳ－ＣＺＢ培地の液滴におけるＣａｓ９ ｍＲＮＡ（５０ ｎｇ／μｌ），ＢＥ３ ｍＲＮＡ（５０ ｎｇ／μｌ）或ＡＢＥ７．１０ ｍＲＮＡ（５０ ｎｇ ／μｌ），ｓｇＲＮＡ（５０ ｎｇ／μｌ）とＣｒｅ ｍＲＮＡ（２ ｎｇ／μｌ）の混合物を、定常流量のＦｅｍｔｏＪｅｔマイクロシリンジ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を使用し、ｈＣＧ注入した後の４８時間後、２細胞胚の一つの割球の細胞質に注入した。 注入された胚を、アミノ酸を含むＫＳＯＭ培地に、３７℃、５％ＣＯ_２の空気で２時間培養した後、偽妊娠したＩＣＲ雌の卵管に移植した。

【0097】

５．単一細胞ＰＣＲ分析
解剖顕微鏡下で、自製のガラスキャピラリーを使用し、８－ｃｅｌｌ段階のマウス胚を酸性タイロード溶液で消化し、透明帯を除去し、次に胚を０．２５％トリプシンに移し、穏やかにピペッティングし、個々の割球を分離した。最後に、割球をＫＳＯＭで７から１０回洗浄し、ＰＣＲチューブに移した。次に、０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００および４μｇ／ ｍｌプロテイナーゼＫを含む１．５μｌの溶解バッファーをチューブへピペッティングした。混合を促進するために、各チューブを遠心した。溶解液を５６℃で３０分間インキュベートし、次に９５℃で５分間インキュベートした。溶解プロセスの産物を、ネストＰＣＲ分析のテンプレートとして使用した。すべての操作には、サンプルの汚染を避けた。
Ｎｅｓｔ ＰＣＲプライマー（上から下への配列番号：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７－３０）

【表11】

【0098】

６．Ｔベクターのクローニングと遺伝子型の検出
ＰＣＲ産物を精製し、ｐＭＤ１８－Ｔベクターにライゲートし、コンピテントな大腸菌株ＤＨ５αに形質転換した。３７℃で一晩培養した後、ランダムに選択したクローンをサンガー法でシーケンシングした。突然変異体Ｅ１４．５胚の遺伝子型を、細胞から抽出されたゲノムＤＮＡのＰＣＲによって確定した。ＥｘＴａｑは９５℃で３分間活性化され、ＰＣＲは３４サイクルで実行された：９５℃で３０秒間、６２℃で３０秒間、７２℃で１分間、最後に７２℃で５分間延長した。胚に対して、ＫＳＯＭで６回洗浄した後、単一の胚を、１．５μｌの胚溶解バッファー（０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００および４μｇ／ ｍｌプロテイナーゼＫ）を含むＰＣＲチューブに直接移し、３０分間インキュベートした。５６℃である際に、９５℃で１０分間不活性化した。ＰＣＲ増幅に、ネストプライマーセットを使用した。 ＥｘＴａｑは９５℃で３分間活性化され、ＰＣＲは３４サイクルで実行された：９５℃で３０秒間、６２℃で３０秒間、７２℃で１分間、最後に７２℃で５分間延長した。０．５μｇの１回目のＰＣＲ産物と内部プライマーを使用し、２回目のＰＣＲを行った。 ＰＣＲは同じ反応混合物で実行された。ｐＭＤ－１９ｔクローニングキット（Ｔａｋａｒａ）を使用し、製造元の指示に従って、ＰＣＲ産物をゲル精製し、クローニングした。各回の形質転換からコロニーを選択し、そしてサンガーシーケンシングを行って変異を検出した。
プライマー配列（上から下への配列番号：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１－３６）

【表12】

【0099】

７．フローサイトメトリー選別（ＦＡＣＳ）
細胞を単離するために、シュレッドされた組織を５ ｍＬのトリプシン－ＥＤＴＡ（０．０５％）溶液中で、３７℃で３０分間酵素的に加水分解した。１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む５ｍｌのＤＭＥＭ培地を加えることにより消化を停止させた。次に、１ｍｌのピペットチップを使用し、３０～４０回繰り返し吹き、胎児組織をホモジェナイズした。細胞懸濁液を６分間（８００ｒｐｍ）遠心分離し、沈殿物を１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地に再懸濁した。最後に、細胞懸濁液を４０μｍセルストレーナーでろ過し、ｔｄｔｏｍａｔｏ ＋ ／ ｔｄｔｏｍａｔｏ－細胞をＦＡＣＳで単離した。二回目のフローサイトメトリーと蛍光顕微鏡で分析・評価し、サンプル純度が９５％を超えると、合格と判断した。

【0100】

８．全ゲノムシーケンシングとデータ分析
製造元の指示に従って、ＤＮｅａｓｙ血液および組織キット（カタログ番号６９５０４、Ｑｉａｇｅｎ）を使用し、細胞からゲノムＤＮＡを抽出した。イルミナＨｉＳｅｑ Ｘ Ｔｅｎによって、５０倍の平均カバレッジ率で、ＷＧＳを実行した。 ＢＷＡ（ｖ０．７．１２）は、合格したシーケンシングリードを参照ゲノム（ｍｍ１０）にマッピングするために使用された。次に、Ｐｉｃａｒｄツール（ｖ２．３．０）を使用し、マッピングされたＢＡＭファイルの重複項を並べ替え、マークした。高い信頼性でｄｅｎｏｖｏゲノムワイド変異を同定するために、発明者らは３つのアルゴリズム（Ｍｕｔｅｃｔ２（ｖ３．５）、Ｌｏｆｒｅｑ（ｖ２．１．２）、およびＳｔｒｅｌｋａ（ｖ２．７．１））を使用し、単一ヌクレオチド変異（２５－２７）分析を行った。同時に、それぞれに、Ｍｕｔｅｃｔ２（ｖ３．５）、Ｓｃａｌｐｅｌ（ｖ０．５．３）、Ｓｔｒｅｌｋａ（ｖ２．７．１）を実行し、全ゲノム配列を検出した。３つのＳＮＶまたはインデルアルゴリズムのオーバーラップは、真のバリアントと見なされた。ｔｄＴｏｍａｔｏ ＋サンプルのロケーションＢＡＭファイルでバリアントを同定し、ただし、ｔｄＴｏｍａｔｏ－サンプルは、コントロールと同じ胚にあり、ｔｄＴｏｍａｔｏ＋サンプルの突然変異バリアントのみを同定できる。たとえば、ＷＴ対立遺伝子が、特定の座標でＧである場合に、ｔｄＴｏｍａｔｏ ＋細胞はＡを持ち、ｔｄＴｏｍａｔｏ－細胞はＧを持ち、突然変異体Ａはｄｅｎｏｖｏ突然変異と呼ばれた。ただし、ｔｄＴｏｍａｔｏ－細胞がＡを持っている場合、突然変異体を同定することはできない。オフターゲットＳＮＶがｔｄＴｏｍａｔｏ ＋サンプルでのみ同定されたことをさらに確認するには、発明者はまた、ｔｄＴｏｍａｔｏ－サンプルの突然変異体と、同じ胚におけるｔｄＴｏｍａｔｏ ＋サンプルとを対照として使用し、ただし、バリアントのみが、ｔｄＴｏｍａｔｏ－細胞で変異するが、ＷＴでは、ｔｄＴｏｍａｔｏ ＋細胞を認識できる。

【0101】

ＷＧＳ分析は、Ｃａｓ９－Ｔｙｒ－ＡおよびＣａｓ９－Ｔｙｒ－ＢグループのｔｄＴｏｍａｔｏ－細胞の低レベルのターゲット編集範囲が０から６．３％であることを示し、これは、偽陰性のＦＡＣＳ選別が原因である可能性がある（低レベルで発生することが知られた）。したがって、本発明者らは、対立遺伝子頻度が１０％を超えるバリアントは、その後の分析において信頼できると考えている。本発明者らはまた、ｄｂＳＮＰ（ｖ１３８）およびＭＧＰ（ｖ３）データベースに存在する可能性があるＵＣＳＣリピート領域およびマイクロサテライト配列とオーバーラップするバリアントをマークした。すべてのシーケンシングデータはＮＣＢＩ（ＳＲＡ）に保存された。

【0102】

標的効率を検証するために、発明者らは、ＢＡＭファイルを、ｅ値が０．０００１に設定されたオンターゲットと比較した。既存の２つのアルゴリズムを使用し、オンターゲットの潜在的なオフターゲットを予測した（Ｃａｓ－ＯＦＦｉｎｄｅｒ （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｇｅｎｏｍｅ．ｎｅｔ／ｃａｓ－ｏｆｆｉｎｄｅｒ／）とＣＲＩＳＰＯＲ （ｈｔｔｐ：／／ｃｒｉｓｐｏｒ．ｔｅｆｏｒ．ｎｅｔ／） ）。

【0103】

ＲｅｆＳｅｑデータベースを使用し、ａｎｎｏｖａｒ（バージョン２０１６－０２－０１）で、ＳＮＶとインデルに注釈を付けた。癌原遺伝子と腫瘍抑制遺伝子を、ＵｎｉｐｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔデータベース（２０１８－０９）から検索した。発明者らは、ＣｉｓｔｒｏｍｅＤＢデータベースから５つのＡＴＡＣ－ｓｅｑファイルをダウンロードし、生物学的ソースは胚であり、かつすべての品質管理に合格している。得られた５つのデータセットは、ＣｉｓｔｒｏｍｅＤＢ ＩＤ「７９８７７」（ＧＳＭ２５５１６５９）、「７９９７６」（ＧＳＭ２５５１６７７）、「８０４９３」（ＧＳＭ２５３５４７０）、「８１０４９」（ＧＳＭ２５５１６６４）、および「８１０５２」（ＧＳＭ２５５１６６７）を含む。染色体の位置に基づいて、オフターゲットサイトが、各ファイルのピーク領域に配置され、オフターゲットの有るピーク領域とオフターゲットの無いピーク領域は、両側ウィルコクソン順位和検定によって相互に比較された。

【0104】

９．胚発生中の自然突然変異のシミュレート
２細胞期からＥ１４．５期までの自然突然変異の数を推定するために、平均シーケンスカバレッジが４０で、対立遺伝子頻度のしきい値が１０％であることを考慮し、コンピューターシミュレーションで単一ヌクレオチド突然変異が見つかった。各ラウンドのシミュレーションには、１．８ｘ１０^－１０の突然変異率とマウスの核ゲノムのサイズ（２，７８５，４９０，２２０ｂｐ）に基づき、本発明者らは、２細胞段階から１６細胞段階までの複製過程を検討し、対立遺伝子頻度を考慮すると、１６段階細胞以降に発生した突然変異は検出できない。各複製の間に、各細胞は突然変異しても良く、突然変異しなくても良いが、突然変異が発生すると、分裂した細胞が変異を継承する。そして、累積変異とその野生型対立遺伝子をランダムに選択し、深さ４０で、選択された変異を、各ラウンドの自然突然変異の数に合計し、同じプロセスを１０，０００回繰り返した。

【0105】

１０．Ｄｉｇｅｎｏｍｅ－ｓｅｑ分析
上記のように（３２）、Ｃａｓ９－ＬａｃＺ、Ｃａｓ９－Ｐｄｅ６ｂ、Ｃａｓ９－Ｔｙｒ－Ａ、Ｃａｓ９－Ｔｙｒ－Ｂを含む複数のＤｉｇｅｎｏｍｅ－ｓｅｑを実行した。具体的には、製造元の指示に従って、ＴＩＡＮａｍｐ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ キット（Ｔｉａｎｇｅｎ）を使用し、マウスの尾からゲノムＤＮＡを精製した。各遺伝子のｓｇＲＮＡ標的サイト（隣接するゲノム領域を含む）を、ＰＣＲによって増幅し、ＰＣＲ増幅産物を、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ キット（Ｔｉａｎｇｅｎ）を使用し、製造元の指示に従って精製した。Ｃａｓ９タンパク質（１μｇ）とｓｇＲＮＡ（１μｇ）を、室温で１０分間プレインキュベートし、ＲＮＰ複合体を形成した。ＤＮＡ（４μｇ）とＲＮＰ複合体を、反応バッファー中で３７℃で３時間インキュベートした。次にＲＮａｓｅ Ａ（１００μｇ／ ｍｌ）を加え、ｓｇＲＮＡを除去した後に、消化したＤＮＡをＵｎｉｖｅｒｓａｌ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ キット（Ｔｉａｎｇｅｎ）で再度精製した。

【0106】

イルミナＨｉＳｅｑＸ Ｔｅｎシーケンサーを使用し、ライブラリーに対してＷＧＳを実行し、３０倍から４０倍のシーケンス深さで、ＷＧＳを実行した。Ｄｉｇｅｎｏｍｅ－ｓｅｑ２（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｃｈｉｚｋｓｈ／ｄｉｇｅｎｏｍｅ－ｔｏｏｌｋｉｔ２）を使用し、ＤＮＡ切断サイトを計算・同定した。距離を編集することにより、Ｒパッケージの「Ｂｉｏｓｔｒｉｎｇｓ」によって、同定されたインビトロでの切断サイトを分類し、リストした。

【0107】

１１．統計分析
本研究には、Ｒバージョン３．５．１（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．Ｒ－ｐｒｏｉｅｃｔ．ｏｒｇ／）を使用し、すべての統計分析を行った。すべての検定は両側検定であり、Ｐ＜０．０５であると、差が統計的に有意であることを示す。

【0108】

実施例１．３つの遺伝子編集ツールの評価

【0109】

ＧＯＴＩ法を使用し、一般的に使用される３つの遺伝子編集ツールであるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９、シトシン塩基エディター３（ＢＥ３、ｒＡＰＯＢＥＣ１－ｎＣａｓ９－ＵＧＩ）、およびアデニン塩基エディター７．１０（ＡＢＥ７．１０、ＴａｄＡ－ＴａｄＡ ＊ －ｎＣａｓ９）によって誘発されるオフターゲット効果を評価した（参考文献６～８）。

【0110】

本発明者らは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９、ＢＥ３またはＡＢＥ７．１０を、Ｃｒｅ ｍＲＮＡ及び対応するｓｇＲＮＡとともに、Ａｉ９マウスから由来の２細胞胚の一つの割球に注入し（参考文献９－１０）（図１Ａ）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９またはＢＥ３遺伝子編集を使用し、Ｃｒｅ ｍＲＮＡと組み合わせて編集を行った。遺伝子編集細胞におけるｔｄＴｏｍａｔｏの発現に従って、娘細胞群内における編集された細胞と編集されない細胞を、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）によって選別した。ｔｄＴｏｍａｔｏ＋とｔｄＴｏｍａｔｏ－に対して、それぞれに、全ゲノムシーケンシングを行った。

【0111】

フローサイトメトリーソーティング（ＦＡＣＳ）を使用し、Ｅ１４．５日の胚を分離し、細胞内のｔｄＴｏｍａｔｏに従って選別し、この時点で、胚全体を簡単に消化し、十分な単一細胞を得られた（図１Ｂ）。Ｃａｓ９－Ｔｙｒ－Ａ、Ｃａｓ９－Ｔｙｒ－Ｂ、ＢＥ３－Ｔｙｒ－Ｃ、およびＢＥ３－Ｔｙｒ－Ｄで処理されたＥ１４．５胚のフローサイトメトリー分析は、図１Ｄに示された；注入されていない胚のフローサイトメトリー分析を図６ｂに示した。Ｃａｓ９－Ｔｙｒ－Ａ、Ｃａｓ９－Ｔｙｒ－Ｂ、ＢＥ３－Ｔｙｒ－Ｃ、およびＢＥ３－Ｔｙｒ－Ｄで処理されたＥ１４．５胚の場合、ＴＡクローンシーケンシングのオンターゲット分析を図１Ｅに示した。本発明における全ゲノムシーケンシングに基づくｔｄＴｏｍａｔｏ ＋細胞（左）およびｔｄＴｏｍａｔｏ－細胞（右）のターゲティング効率を図１Ｆに示す。

【0112】

本発明者らはさらに、ＣｒｅおよびＣａｓ９／ＢＥ３システムで処理された編集された細胞が、編集されない細胞から効果的に分離され得ることを実証した。Ｃｒｅを介した組換えプロセスでは、胚細胞の約５０％がｔｄＴｏｍａｔｏを発現した。図６ａ－ｂに示すように、蛍光顕微鏡下での４細胞期または８細胞期の観察、またはＥ１４．５日細胞のフローサイトメトリー分析により、この点が確認された。なお、本発明者らはまた、ＣＲＩＳＰＲ ／ Ｃａｓ９を使用して髪の色の遺伝子チロシナーゼを編集することにより（方法は、２細胞胚の一つの割球にいずれかのｓｇＲＮＡ（Ｃａｓ９－Ｔｙｒ－Ａ、Ｃａｓ９－Ｔｙｒ－Ｂ）を注入する）、高効率のターゲティング編集が達成されることを発見した。Ｔｙｒ遺伝子のシーケンシングにより、１３個（Ｃａｓ９－Ｔｙｒ－Ａ）および１５個（Ｃａｓ９－Ｔｙｒ－Ｂ）のｔｄＴｏｍａｔｏ ＋細胞を、４つの散在する８細胞胚から収集し、細胞の８５％および８０％には、Ｔｙｒ対立遺伝子変異が含まれることを示した。逆に、収集された１６個（Ｃａｓ９－Ｔｙｒ－Ａ）および１５個（Ｃａｓ９－Ｔｙｒ－Ｂ）のｔｄＴｏｍａｔｏ－細胞には、図６ｃに示すようにＴｙｒ対立遺伝子変異がなかった。

【0113】

単離されたｔｄＴｏｍａｔｏ ＋およびｔｄＴｏｍａｔｏ－細胞に対して、全ゲノムシーケンシング（ＷＧＳ）を行い、３つのアルゴリズムを使用し、ｔｄＴｏｍａｔｏ＋サンプルに対して、ＳＮＶとインデルを同定し、同じ胚から由来のｔｄＴｏｍａｔｏ－サンプルを参照として使用した。

【0114】

本発明者らはまた、Ｔｙｒ遺伝子をターゲティングする際の、本方法の編集効率を検証した。全ゲノムシーケンシングにより胚注入の方法を探求するために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集用に４つのｓｇＲＮＡが設計された：ＴｙｒをターゲティングするＣａｓ９－Ｔｙｒ－Ａ、Ｃａｓ９－Ｔｙｒ－Ｂ；Ｃ５７マウスのゲノムに切断サイトのないＬａｃＺをターゲティングするコントロールｓｇＲＮＡ；Ｐｄｅ６ｂをターゲティングするｓｇＲＮＡ、それは、Ｃ５７マウスゲノムとのミスマッチがあり、かつ以前の報告では大量のＳＮＶが生成される可能性がある。ＤＮＡ切断実験を通じて、本発明者らは、これらのｓｇＲＮＡの切断効率をインビトロで検証した。結果を図７に示し、これは、効果的な切断が行われたことを示した。

【0115】

本発明者らはまた、ＢＥ３を介して、Ｔｙｒ遺伝子をターゲティングする２つのｓｇＲＮＡを試験した。コントロールグループとして、３つのグループの胚にＣｒｅ ｏｎｌｙ、ＣｒｅとＣａｓ９、およびＣｒｅとＢＥ３を注入した。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９またはＢＥ３、Ｃｒｅ ｍＲＮＡおよびｓｇＲＮＡの混合物を一つの割球に注入し、正常な胚盤胞率（図８ａ）および生存率（図８ｂ）で示されるように、胚発生は損傷を受けていないことがわかった。サンガーシーケンシングは、Ｃａｓ９－Ｔｙｒ－Ａ、Ｃａｓ９－Ｔｙｒ－Ｂ、ＢＥ３－Ｔｙｒ－Ｃ、およびＢＥ３－Ｔｙｒ－Ｄから検出されたすべての胚盤胞およびＥ１４．５胎児にＴｙｒ変異があることを示した（図８ｃ）。Ｔｙｒ遺伝子をターゲティングする編集効率を検証するために、本発明者は、Ｃａｓ９－Ｔｙｒ－ＡまたはＣａｓ９－Ｔｙｒ－Ｂで処理されたＥ１４．５胎児に対してＦＡＣＳ選別を実行し、約４００ｋ ｔｄＴｏｍａｔｏ ＋および４００ｋｔｄＴｏｍａｔｏ－細胞を収集し、ＴＡクローニングおよびシーケンシングを実行した。実験結果は、Ｃａｓ９－Ｔｙｒ－ＡおよびＣａｓ９－Ｔｙｒ－Ｂで編集されたｔｄＴｏｍａｔｏ ＋細胞に５０％および１００％の対立遺伝子突然変異があることを示した。２回目の繰り返し実験では、Ｃａｓ９－Ｔｙｒ－ＡおよびＣａｓ９－Ｔｙｒ－Ｂで編集されたｔｄＴｏｍａｔｏ ＋細胞には、５８％および５０％の対立遺伝子変異がある（３１および１４個のクローン）。逆に、Ｅ１４．５日の胚から収集されたｔｄＴｏｍａｔｏ－細胞が、Ｔｙｒ対立遺伝子突然変異を持っていなかった。同様に、ＢＥ３は編集効率が高く、ＢＥ３－Ｔｙｒ－Ｃには７１％の対立遺伝子変異と、ＢＥ３－Ｔｙｒ－Ｄには１００％の対立遺伝子変異があったが、対応するｔｄＴｏｍａｔｏ－細胞では約３％のＴｙｒ変異しかなかった。これらの結果は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９およびＢＥ３編集がｔｄＴｏｍａｔｏ＋には高効率のターゲット編集効率を得るが、基本的に、ｔｄＴｏｍａｔｏ－細胞では標的編集効率がないことを証明した。

【0116】

編集効率と潜在的な全ゲノムオフターゲット効果をさらに調査するために、本発明者らは、１８個のＥ１４．５胚および９個の処理から由来の３６個のサンプルに対して、平均深さ４７（４７ｘ）で全ゲノムシーケンシングを行った：Ｃｒｅ ｏｎｌｙ、ＣｒｅとＣａｓ９、ＣｒｅとＣａｓ９－ＬａｃＺ、ＣｒｅとＣａｓ９－Ｐｄｅ６ｂ、ＣｒｅとＣａｓ９－Ｔｙｒ－Ａ、ＣｒｅとＣａｓ９－Ｔｙｒ－Ｂ、ＣｒｅとＢＥ３、ＣｒｅとＢＥ３－Ｔｙｒ－Ｃ、ＣｒｅとＢＥ３ －Ｔｙｒ－Ｄ、ただし、Ｃａｓ９－Ｔｙｒ－Ａ、Ｃａｓ９－Ｔｙｒ－Ｂ、ＢＥ３－Ｔｙｒ－ＣおよびＢＥ３－Ｔｙｒ－ＤのみがＣ５７ゲノムに再編集サイトを持っている。Ｃａｓ９－Ｔｙｒ－ＡおよびＣａｓ９－Ｔｙｒ－Ｂのオンターゲット分析は、ｔｄＴｏｍａｔｏ ＋細胞にそれぞれ５６％および７２％のＴｙｒ対立遺伝子変異があることを示し、Ｔｙｒ遺伝子で高効率のオンターゲット効率を持つことを表す；同様に、ＢＥ３－Ｔｙｒ－ＣとＢＥ３－Ｔｙｒ－Ｄはどちらも、図９に示すように、ｔｄＴｏｍａｔｏ ＋細胞で効率的な編集を示した（Ｔｙｒ対立遺伝子突然変異は、それぞれ平均７５％と９２％である）。発明者はまた、他のｔｄＴｏｍａｔｏ＋胚のオンターゲット効率を分析したところ、すべての対照胚はオンターゲット効率を持っていなかった。ただし、全ゲノムシーケンシング分析では、Ｃａｓ９－Ｔｙｒ－ＡおよびＣａｓ９－Ｔｙｒ－Ｂで処理されたｔｄＴｏｍａｔｏ－細胞が、０から６．３％の低レベルのターゲット編集を持ち、これは、偽陰性のフローサイトメトリー選別が原因である可能性がある（低レベルで発生することが知られた）。したがって、以下の分析では、対立遺伝子頻度が１０％を超える突然変異のみが信頼できると認める。

【0117】

オフターゲット効果を評価するために、各胚で３つの異なる突然変異呼び出しアルゴリズムを同時に使用し、ｔｄＴｏｍａｔｏ ＋細胞とｔｄＴｏｍａｔｏ－細胞を比較し、発明者らは、全ゲノムのｄｅｎｏｖｏ突然変異を分析しており、３つのアルゴリズムによって定義された変数はすべて本当の変数である。合計９つのグループで０から４個のインデルのみが見つかり（図１０）、この結果は、サンガーシーケンシングによってさらに検証された（図１１）。同時に、Ｃｒｅ ｏｎｌｙの胚の中で、平均１４個のＳＮＶが観察され、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９で処理された胚（Ｃａｓ９、Ｃａｓ９－ＬａｃＺ、Ｃａｓ９－Ｐｄｅ６ｂ、Ｃａｓ９－Ｔｙｒ－ＡとＣａｓ９－Ｔｙｒ－Ｂ）では、各グループのＳＮＶがそれぞれ１２．５、５、０、１６、１９であり、「Ｃｒｅ－ｏｎｌｙ」グループと比較して、差は統計的に有意ではなかった。さらに、Ｃａｓ９－Ｐｄｅ６ｂで編集された胚ではＳＮＶが増加しないことが観察され、これは、以前の多くの研究と一致している（図１２）。ＣＲＩＳＰＲ ／ Ｃａｓ９で編集された胚で検出されたすべてのオフターゲットＳＮＶは、サンガーシーケンシングによって確認された。Ｃｒｅ－またはＣＲＩＳＰＲ ／ Ｃａｓ９で処理されたサンプルでのＳＮＶの検出は、遺伝子複製の過程には、自然突然変異によって引き起こされるものである可能性があるが、突然変異の数は自然突然変異の範囲内にある。さらに、発明者らの研究には、同じ突然変異が出現することがなく（図１３ａ）、Ｃａｓ－ＯＦＦｉｎｄｅｒ、ＣＲＩＳＰＯＲおよびＤｉｇｅｎｏｍｅ－ｓｅｑに推測されたオフターゲットサイトとのオーバーラップがない（図１３ｂ）。本発明者らはまた、認識されたＳＮＶ隣接配列が、標的サイト配列と類似性を有さないことを観察した（図１３ｃ）。

【0118】

さらに、逆の変数を呼び出すことにより、各胚のｔｄＴｏｍａｔｏ－サンプルとｔｄＴｏｍａｔｏ ＋サンプルを比較して、ＳＮＶの数が類似していることがわかり、これは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集が、オフターゲットを生成しなかったことを示し、本発明者らに観察されたＳＮＶは、自発突然変異から由来する（図１４）。

【0119】

本発明者らは、さらに、合計１２のグループを設計した：１つのＣｒｅグループ（Ｃｒｅのみ）、ｓｇＲＮＡを伴うまたは伴わない６つのＣａｓ９グループ（Ｃａｓ９、Ｃａｓ９－ＬａｃＺ、Ｃａｓ９－Ｐｄｅ６ｂ、Ｃａｓ９－Ｔｙｒ－Ａ、Ｃａｓ９－Ｔｙｒ－Ｂ、Ｃａｓ９－Ｔｙｒ－Ｃ）、ｓｇＲＮＡを伴うまたは伴わない３つのＢＥ３グループ（ＢＥ３、ＢＥ３－Ｔｙｒ－Ｃ、ＢＥ３－Ｔｙｒ－Ｄ）（参照文献１１）、およびｓｇＲＮＡを伴うまたは伴わない２つのＡＢＥグループ（ＡＢＥ７．１０、ＡＢＥ７．１０－Ｔｙｒ－Ｅ）。

【0120】

本発明者らは、サンガーシーケンシングにより、８細胞およびＥ１４．５段階での胚のターゲティン効率を検証した。標的サイトの編集効率および潜在的な全ゲノムのオフターゲット効果をさらに調査するために、本発明者らは、２３個のＥ１４．５胚から由来の４６個のサンプルに対して、平均深さ４７倍であるＷＧＳを実施した（表１）。

【表1】

【0121】

ｔｄＴｏｍａｔｏ ＋細胞におけるＣａｓ９、ＢＥ３、およびＡＢＥ７．１０の活性は、標的サイトの高いインデルおよび高いＳＮＶ比によって、確認された（図１Ｃ；表２－３）。

【表2】

【表3】

【0122】

オフターゲット効果について、本発明者らは、すべての１２個のグループから由来の胚には、０から４個のインデルしかなく（表２および４）、かつそれらがいずれも予測されたオフターゲット部位とオーバーラップがないことを発見した（表５）。

【表4】

【表5】

【0123】

すべてのＣａｓ９に編集された胚について、異なるＣａｓ９グループの間に、ＳＮＶに有意差はなく（平均１２個ＳＮＶ／胚）、「Ｃｒｅ」グループと比較しても、有意差がない（平均１４ 個ＳＮＶ／胚）（表２）。

【0124】

ＣｒｅまたはＣａｓ９で処理されたサンプルで検出されたＳＮＶは、発生中のゲノム複製の間に自然突然変異によって引き起こされた可能性があり、その理由としては、本発明者らによって検出されたＳＮＶの数は、シミュレートされた自然突然変異の範囲内にあり、且つ隣接配列と標的部位との間にも配列類似性はなかった（参考文献１２）。

【0125】

驚くべきことに、本発明者らは、ＢＥ３に編集された胚において、平均２８３個のＳＮＶ ／胚を発見し、これは、ＣｒｅまたはＣａｓ９で処理された胚で観察されたレベルより、少なくとも２０倍高かった（図２Ａおよび表２）。対照的に、ＡＢＥ７．１０は平均に１０個のＳＮＶ／胚しか生成せず、この頻度は自然突然変異率に近かった（図２Ａおよび表２）。本発明者らはさらに、「ＢＥ３ｏｎｌｙ」グループで同定されたオフターゲットサイトをＢＥ３－Ｔｙｒ－ＣまたはＢＥ３－Ｔｙｒ－Ｄのオフターゲットサイトと比較し、ｓｇＲＮＡの存在がより高いＳＮＶを誘導しないことを見出した（Ｐ ＝ ０．２１、Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定）。なお、これらの変異は、ｔｄＴｏｍａｔｏ－細胞ではなくｔｄＴｏｍａｔｏ ＋細胞で、特異的に同定された（方法、表６を参照）。

【表6】

【0126】

Ｅ３サンプルで検出されたオフターゲットは、各グループで重複しておらず、かつゲノム全体にランダムに分布している。そして、本発明者らは、これらのオフターゲット突然変異を、Ｃａｓ－ＯＦＦｉｎｄｅｒとＣＲＩＳＰＲＯＲソフトウェアによって予測されたすべての潜在的なオフターゲットサイトと比較した。予想外ではなく、これらの２つの予測ツールは、多数のオフターゲットサイトを予測したが、それらのサイトが、本発明者らに検出されたＳＮＶには現れなかった。さらに、同定されたＳＮＶ隣接配列とＢＥ３ ｓｇＲＮＡ標的サイトとの間に、配列類似性はなく、最もオフターゲットサイトを持つ予測サイトは、標的サイトＢＥ３配列と類似している。ＢＥ３編集によって生成されたＳＮＶは独特であるが、その突然変異タイプは、ＡＰＯＢＥＣ１の突然変異タイプと一致していることも、注目すべきである。

【0127】

ＢＥ３に編集された細胞で同定されたＳＮＶの９０％以上が、ＧからＡまたはＣからＴへの突然変異であり、Ｃｒｅ、Ｃａｓ９、またはＡＢＥ７．１０に処理された細胞では、突然変異の傾向が観察されなかったことを、注目すべきである（図２ＢおよびＣ、図１５）。こんな突然変異の傾向は、ＡＰＯＢＥＣ１自体の傾向と同じ（参考文献１３）、これらの突然変異は自発的ではなく、ＢＥ３編集によって誘発されるものであることを示した。以前の研究では、ＡＰＯＢＥＣファミリーのいくつかのメンバー（ＡＰＯＢＥＣ１を含む）が作用する際に、一本鎖ＤＮＡの存在を必要とすることが示された（参考文献１４－１６）。発明者の分析はまた、ＢＥ３に誘発されたＳＮＶが転写領域（図３Ａ）、特に高発現の遺伝子（図３Ｂ）で有意に偏在していることを示した。興味深いことに、オフターゲットサイトのいずれも、異なるＢＥ３に編集された胚の間で共有されておらず、或いは予測されたオフターゲットサイトと一致していない（図３ＣおよびＤ）。

【0128】

報告によると、ＤＮＡの結合可能性が、遺伝子編集の効率に関連している。したがって、本発明者らは、Ｃｉｓｔｒｏｍｅデータベース内のマウス胚細胞から由来のＡＴＡＣ－ｓｅｑデータセットを評価して、オフターゲットサイトが、オープンクロマチン領域に偏在しているかどうかを判定した。実際に、Ｃ５７ＢＬ６／ＤＢＡ２を混合するバックグラウンドを有するＥ８．５胚と、Ｃｉｓｔｒｏｍｅデータベースの４つの高品質データセットでは、オフターゲットサイトが著しく、結合性がより高い領域で大幅に偏在している（図１６）。

【0129】

さらに、オフターゲットサイトとターゲットサイトの間に配列類似性は観察されなかったが、コンピューターによって予測されたオフターゲットサイトは、ＢＥ３のターゲットサイトと高い配列類似性を示した。したがって、ＢＥ３オフターゲットＳＮＶは、ｓｇＲＮＡに依存せず、ＡＰＯＢＥＣ１の過剰発現によって引き起こされる可能性がある。

【0130】

ＢＥ３に誘導された１６９８個のＳＮＶのうち、２６個はエクソンに位置し、そのうちの１４個は非同義の変化を引き起こした。本発明者らは、ＰＣＲによって２０個を増幅し、サンガーシーケンシングによってそれらの存在を確認した（表７）。

【表7】

【0131】

２６個のＳＮＶのうち、１４個が、コードされたタンパク質に非同義の変化を引き起こし、２個が、Ｔｒｉｍ２３およびＡｉｍ２遺伝子における早期終了を引き起こした。Ｔｒｉｍ２３は、Ｅ３ユビキチンリガーゼをコードし、その機能不全が、筋ジストロフィーにつながる可能性がある。以前の研究では、Ａｉｍ２遺伝子が自然免疫において重要な役割を果たし、ウイルス感染に抵抗する基礎であることが報告された。本発明者らは、また、１つのＳＮＶが癌原遺伝子上にあり、１３個のＳＮＶが腫瘍抑制遺伝子上にあることを発見し、これが、ＢＥ３編集の発癌リスクについて深刻な懸念を引き起こしている（図１６）。本発明者らは、また、１つのＳＮＶが癌原遺伝子上にあり、１３個のＳＮＶが腫瘍抑制遺伝子上にあることを発見し、これが、ＢＥ３編集の発癌リスクについて深刻な懸念を引き起こしている。本発明者らは、より少ない量のＢＥ３を発現させることによって、このリスクを低減できるかどうかを推測したが、より少量のＢＥ３を使用すると、標的サイトの編集効率が徐々に低下する（表８）。

【表8】

【0132】

本発明の方法の主な利点は、１匹の動物において、編集された細胞と編集されていない細胞を比較することができ、遺伝的背景の違いを排除できる。以前の研究で編集された動物と編集されていない動物を比較すると、遺伝的背景の違いにより混乱が生じた。実際、本発明者らは、公開されたデータセットにも本方法を使用し、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に編集されたマウスと編集されていないマウスに、平均で約１０００個のＳＮＶと約１００個のインデルがあることを発見した。この発見に基づいて、発明者らは、兄弟間の違いは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集の結果ではなく、遺伝的突然変異によるものであると考える。さらに、任意の２つの異なる胚の間の配列を比較すると、使用した胚が同じ親から由来のものではなかったため、ＳＮＶ（３７０６±５２３２）とインデル（５８３±７６２）（ｎ ＝ １８ペア）がより多く見つかった。これらの結果は、同じ親を持っていても、マウスの間に遺伝的変異が大量に存在するため、編集されたマウスと編集されないマウスを比較するためのオフターゲット分析には、完全なブランクコントロールを見つけることは困難であることを示した。

【0133】

つまり、本発明は、ＧＯＴＩが、遺伝子編集によって引き起こされるオフターゲット効果の研究（すなわち、同じ胚の娘細胞を使用し、全ゲノムシーケンシングを行うこと）における利点を証明した。本発明者らはまた、ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ９を介した遺伝子編集によって引き起こされる望ましくないオフターゲット突然変異が、マウス胚ではまれであることを発見し、これは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づくインビボ編集が、顕著なＳＮＶおよびインデルをもたらさないという以前の発見をサポートする。しかし、他の研究で報告されたほとんどの欠失、またはほとんどの染色体転座を除外することはできない。対照的に、本発明は、ＢＥ３編集によって引き起こされる多くの新しいＳＮＶを発見し、治療用途における基本的な編集方法の安全性を改善した。

【0134】

本発明者らは、ＢＥ３が多くの新しいＳＮＶを誘導することを発見したが、これは以前の研究では報告されていなかった。仮説の一つとしては、本発明のＧＯＴＩが、単一の遺伝子編集を有する割球から細胞群を検出できるのに対し、以前の研究では、多数の細胞プールを使用したが、その中で編集は同じではなく、母集団の平均により、ランダムなオフターゲットの信号が失われる。ＢＥ３とは異なり、ＡＢＥ７．１０に誘導されたＳＮＶが増加しなく、これは、ＴａｄＡがＤＮＡ結合能力を欠如するという原因からである可能性がある（参照文献１７）。ＢＥ３のオフターゲット効果は、ＡＰＯＢＥＣ１のＤＮＡ結合能力を低下させることや、さまざまな形態のシトシンデアミナーゼを使用することで解決できるかもしれない。要するに、ＧＯＴＩは異なる個体の間のＳＮＰ干渉がないように、さまざまな遺伝子編集ツールのオフターゲット効果を調べるために使用される。

【0135】

実施例２．オフターゲット効果に対するＡＰＯＢＥＣ１酵素の効果

【0136】

上記のように、単一塩基編集ツールＢＥ３は、多数の単一ヌクレオチドオフターゲット突然変異（ＳＮＶ）を引き起こす。本発明者らは、これらのオフターゲット突然変異が、ＡＰＯＢＥＣ１の過剰発現および一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）へのその結合によって引き起こされることを予想する。ただし、単一塩基遺伝子編集ツール（ＢＥ）は、単一塩基突然変異の研究で、広く使用されており、病原性変異を修正する可能性がある。本実施例では、本発明者らは、ＢＥ３のオフターゲット問題を解決する可能性を試験し、それにより、疾患に関連する標的Ｃｓを特異的に修正することができる。野生型ＡＰＯＢＥＣ１タンパク質配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される。

【0137】

ＢＥ３のオフターゲット評価用に構築されたＢＥ２システムを、図４ａに示し、これには、１６ＡＡ（配列はＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８））と４ＡＡ（配列はＳＧＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９））の２つのペプチドで接続されたＡｐｏｂｅｃ１、Ｓｐ ｎＣａｓ９酵素、およびＵＧＩ酵素を含む。

【0138】

本発明者らは、最初に、胚に注入されたＢＥ３ ｍＲＮＡの量を減らし、ＧＯＴＩを適用してオフターゲットバリアントを検出した。ＢＥ３の注入の減少につれて、標的サイトでの遺伝子編集の効率が相応に低下している（図４ｂ）。しかし、オフターゲットＳＮＶの数は大幅に減少しなかった（図４ｃ）。

【0139】

代わりの方法として、本発明者らは、Ａｐｏｂｅｃ１タンパク質上のｓｓＤＮＡ結合ドメインを突然変異させ、それがＡＰＯＢＥＣ１のオフターゲット活性を低下させることができるかどうかを観察した。本発明者らは、以前の研究に基づいて、対応するＢＥ３の対応するアミノ酸位置を突然変異させ、ＧＯＴＩ法を使用して、ターゲティン効率およびオフターゲット効果に対するそれらの効果を評価した（図４ａ）。

【0140】

本発明者らは、異なる突然変異についてのＴｙｒ－ＣおよびＴｙｒ－Ｄ標的サイトの遺伝子編集の効率を評価した。まず、ｓｇＲＮＡ－ＣおよびＤを使用し、変異体ＢＥ３、ＢＥ３－Ｗ９０Ａ（Ａｐｏｂｅｃ１タンパク質のアミノ酸配列の９０位で発生する）、ＢＥ３－Ｗ９０Ｆ、ＢＥ３－Ｒ１３２Ｅ（Ａｐｏｂｅｃ１タンパク質のアミノ酸配列の１３２位で発生する）、ＢＥ３－Ｒ１２６Ｅ（Ａｐｏｂｅｃ１タンパク質のアミノ酸配列の１２６位で発生する）、およびＢＥ３－Ｅ６３Ａ（Ａｐｏｂｅｃ１タンパク質のアミノ酸配列の６３位で発生する）の編集活性を評価した。結果は、２つの標的サイトでのＢＥ３－Ｒ１２６Ｅ突然変異の編集効率が、ＢＥ３のそれと類似していることを示した。変異体ＢＥ３－Ｒ１２６Ｅの活性は、ＷＧＳの高いターゲティング効率によっても確認された（図４ｂ）。ただし、ＢＥ３と比較して、Ｒ１２６Ｅ突然変異胚におけるオフターゲットＳＮＶの数が、著しく減少し、「Ｃｒｅのみ」と比較して、有意差は見られなかったことは注目すべきである（図４ｃ）。さらに、Ｒ１２６Ｅで処理された２つの胚の間に大きな違いがない。検出されたＳＮＶの数は自然突然変異率に近く、予測された潜在的なオフターゲットサイトとオーバーラップするＳＮＶがなく、これは、Ａｐｏｂｅｃ１１２６アルギニンをグルタミン酸への突然変異が、ＢＥ３に誘導されたオフターゲットＳＮＶを、著しく低減できることを示した。

【0141】

上記に基づいて、本発明者らは、ＡＰＯＢＥＣ１に突然変異を行う（例えばＲ１２６Ｅ突然変異を行う）ことにより、ＢＥ３に誘発されたオフターゲット効果を解決する技術案を初めて開示した。

【0142】

本発明で確立されたモジュール性は、ＧＯＴＩが、ＡＰＯＢＥＣ１の他の突然変異バージョン、またはシチジンデアミナーゼの新たにエンジニアリングされたバージョンの更なる技術案に適用することを示している。

【0143】

実施例３、突然変異の最適化研究

【0144】

まず、本発明者らは、異なる量のＢＥ３ ｍＲＮＡ（５０ｎｇ／μｌと１０ｎｇ／μｌ）を、ｓｇＲＮＡ－Ｔｙｒ－ＣまたはｓｇＲＮＡ－Ｔｙｒ－Ｄと一緒に胚に注入し、単一細胞サンガーシーケンシングによってターゲティング効率を評価した。

【0145】

本発明者らは、より少量のＢＥ３を使用すると、ターゲティング効率を著しく低下させる可能性があることを見出した（７２．６±５．３％、５０ｎｇ／μｌ；１２．６±２．９％、１０ｎｇ／μｌ）。

【0146】

次に、発明者らは、全ゲノムオフターゲット評価にＧＯＴＩ法を適用し、２細胞胚注入（ＧＯＴＩ）の実行で、全ゲノムオフターゲット分析を行い、ＢＥ３－Ｔｙｒ－Ｄで処理された胚のオフターゲットバリアントを検出し、結果としては、２つの異なるレベル（それぞれ５０ｎｇ／ｎｌと１０ｎｇ／ｎｌを注入した）のＢＥ３ｍＲＮＡによるオフターゲットＳＮＶの数は変化しないことがわかった。

【0147】

次に、本発明者らは、ＡＰＯＢＥＣ１のＤＮＡ結合ドメインでの点突然変異が、ＢＥ３のオフターゲット率を低下させるかどうかを確認した。以前の研究で提出されたＤＮＡ結合ドメインに基づいて、本発明者らは、さまざまな点突然変異を、ＢＥ３システムのＡＰＯＢＥＣ１の推定ＤＮＡ結合ドメインに導入し、ターゲティング効率およびオフターゲット率に対するそれらの影響を評価した（図５ａ）。点突然変異Ｅ６３Ａ、Ｒ１２６Ｅ、およびＲ１３２Ｅに対して、ＢＥ３の塩基編集効率は、Ｔｙｒ遺伝子の２つの部位での標的塩基編集で評価され、ただし、２細胞のマウス胚には、対応するｓｇＲＮＡ Ｔｙｒ－ＣおよびＴｙｒ－Ｄがある（図５ｂ）。本発明者らは、野生型ＢＥ３と比較して、ＴｙｒでのＢＥ３－Ｅ６３ＡまたはＢＥ３－Ｒ１３２Ｅの編集効率が著しく低下したが、ＢＥ３－Ｒ１２６Ｅが両方の標的サイトには、高い編集効率を維持することを見出した。本発明者らはさらに、ＢＥ３－Ｒ１２６ＥのＤＮＡターゲティング活性が、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の他の３つのサイトにおけるＢＥ３と類似していることを確認した。興味深いことは、ＢＥ３－Ｒ１２６Ｅの編集ウィンドウが縮小された。

【0148】

次に、本発明者らは、ＧＯＴＩを実施して、ｓｇＲＮＡを伴うまたは伴わない３つのグループ（ＢＥ３－Ｒ１２６Ｅ、ＢＥ３－Ｒ１２６Ｅ－Ｔｙｒ－ＣおよびＢＥ３－Ｒ１２６Ｅ－Ｔｙｒ－Ｄ）、ＢＥ３－Ｗ９０Ｙ ＋ Ｒ１２６Ｅ（ＹＥ１）－Ｔｙｒ－ＣおよびＢＥ３－Ｗ９０Ｆ ＋ Ｒ１２６Ｅ（ＦＥ１）－Ｔｙｒ－ＣにおけるＢＥ３－Ｒ１２６Ｅのターゲット効率とオフターゲット頻度を評価した。ターゲティング効率は、全ゲノムシーケンシングによって確認された（図５ｃ）。ＢＥ３－Ｒ１２６ＥおよびＢＥ３－Ｗ９０Ｙ＋Ｒ１２６Ｅ（ＹＥ１）で処理された胚におけるオフターゲットＳＮＶの数は、野生型ＢＥ３で処理された胚の２８３±２（ｎ ＝ ６）から２４±８に大幅に減少し、自然突然変異に近くなったことを注目すべきである（図５ｄ）。なお、本発明者らは、突然変異の逸脱を観察せず、予測されたオフターゲットサイトとオーバーラップするＳＮＶを観察せず、ＢＥ３Ｒ１２６Ｅに誘導されたオフターゲットＳＮＶが存在しないことを示している。

【0149】

本発明者らは、さらに、２９３Ｔ細胞上でＢＥ３－Ｗ９０Ｙ＋Ｒ１２６Ｅ（ＹＥ１）、ＢＥ３－Ｒ１２６Ｅのトランスクリプトームレベルでのオフターゲット状況を検出した。その結果、ＢＥ３－Ｒ１２６Ｅは、ＲＮＡのオフターゲットを著しく減らすことができることがわかった。ＢＥ３－Ｗ９０Ｙ＋Ｒ１２６Ｅ（ＹＥ１）は、ＲＮＡのオフターゲットを完全に排除できる（図５ｅ）。

【0150】

図５ｄ－ｅでは、ＢＥ３（ｈＡ３Ａ）は、ＢＥ３のａｐｏｂｅｃ１の代わりに、ヒトのＡＰＯＢＥＣＡ３Ａ（ヒトＡＰＯＢＥＣＡ３Ａ）を使用して、構築された新しいＢＥ３編集ツールである。ＢＥ３（ｈＡ３ＡＹ１３０Ｆ）は、ヒトＡＰＯＢＥＣＡ３ＡのＹ１３０がＦに変異して変換されたものであり、この突然変異により、オフターゲットＳＮＶの数が著しく減少することが観測された。

【0151】

つまり、ＧＯＴＩ法の適用で、オフターゲットＳＮＶの量を評価することにより、基本エディターのデアミナーゼの推定ｓｓＤＮＡ結合ドメインを突然変異させることで、シトシンベースエディターのＤＮＡとＲＮＡのレベルのオフターゲット効果を除去できることが証明できる。

【0152】

この結果は、基本エディターが、遺伝子編集と治療応用のために効果的で安全なツールとして設計されることを示した。

【0153】

本出願に言及されている全ての参考文献は、参照として単独に引用されるように、本出願に引用されて、参照になる。理解すべきは、本発明の上記の開示に基づき、当業者は、本発明を様々な変更または修正を行っても良い、これらの同等の形態も本出願に添付された請求の範囲に規定される範囲内に含まれる。

【0154】

【表13】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【配列表】

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【国際調査報告】