特表2022-522023カンジダ・アルビカンス感染をコントロールするためのアンチセンスオリゴマー
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-04-13
(54)【発明の名称】カンジダ・アルビカンス感染をコントロールするためのアンチセンスオリゴマー
(51)【国際特許分類】
C12N 15/113 20100101AFI20220406BHJP
A61K 31/712 20060101ALI20220406BHJP
A61L 31/10 20060101ALI20220406BHJP
A61L 15/20 20060101ALI20220406BHJP
A61P 31/10 20060101ALI20220406BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20220406BHJP
【ＦＩ】
C12N15/113 Z ZNA
A61K31/712
A61L31/10
A61L15/20
A61P31/10
A61P43/00 105
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021550293
(86)(22)【出願日】2020-02-24
(85)【翻訳文提出日】2021-10-08
(86)【国際出願番号】 IB2020051552
(87)【国際公開番号】W WO2020174366
(87)【国際公開日】2020-09-03
(31)【優先権主張番号】115346
(32)【優先日】2019-02-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】PT
(31)【優先権主張番号】115349
(32)【優先日】2019-03-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】PT
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】516116507
【氏名又は名称】ユニベルズィダード ドゥ ミンホ
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＤＡＤＥ ＤＯ ＭＩＮＨＯ
(74)【代理人】
【識別番号】100147485
【弁理士】
【氏名又は名称】杉村 憲司
(74)【代理人】
【識別番号】230118913
【弁護士】
【氏名又は名称】杉村 光嗣
(74)【代理人】
【識別番号】100181847
【弁理士】
【氏名又は名称】大島 かおり
(72)【発明者】
【氏名】ソニア カリーナ モライス ダ シルバ
(72)【発明者】
【氏名】ダニエラ エイラ アラウージョ
(72)【発明者】
【氏名】ヌーノ ミゲル モライス アゼベド
(72)【発明者】
【氏名】マリアナ コンテンテ ランゲル エンリケス
(72)【発明者】
【氏名】カリーナ マヌエラ フェルナンデス アルメイダ
【テーマコード（参考）】
4C081
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C081AA02
4C081AA12
4C081AB23
4C081AB35
4C081AC08
4C081AC10
4C081BA14
4C081CE01
4C081DA01
4C081DA05
4C081DC03
4C086AA01
4C086AA02
4C086AA03
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086MA11
4C086MA70
4C086NA14
4C086ZB21
4C086ZB35
(57)【要約】
本開示は、カンジダ・アルビカンス感染症の治療または療法におけるアンチセンスオリゴマーの使用に関する。本開示はさらに、酵母から糸状型へのカンジダ・アルビカンスの形態転移を阻害するためのアンチセンス療法におけるアンチセンスオリゴマーの使用を記載する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号７、配列番号８、配列番号９、またはそれらの組み合わせ、からなるリストから選択される少なくとも１つの配列、または、カンジダ・アルビカンス糸状型化ブロッカーとして、前記配列のすべてのヌクレオチドの同一性に基づいて、前記選択された配列と少なくとも９５％同一である前記配列の変異体、
を含む、単離オリゴマー。
【請求項2】
配列番号７、配列番号８、配列番号９、またはそれらの組み合わせ、からなるリストから選択される少なくとも１つの配列、または、医薬品に使用するための、前記配列のすべてのヌクレオチドの同一性に基づいて、前記選択された配列と少なくとも９５％同一である前記配列の変異体、
を含む、単離オリゴマー。
【請求項3】
カンジダ・アルビカンス関連感染症の治療または療法に使用するための、請求項２に記載の単離オリゴマー。
【請求項4】
膣感染症および／または口腔感染症の治療または療法に使用するための、請求項２に記載の単離オリゴマー。
【請求項5】
前記配列のすべてのヌクレオチドの同一性に基づいて、前記配列が、前記選択された配列と少なくとも９６％同一である、好ましくは９７％、９８％、９９％同一である、または同一である、請求項１～４のいずれかに記載の単離オリゴマー。
【請求項6】
配列番号７、配列番号８、配列番号９、またはそれらの組み合わせ、からなるリストから選択される少なくとも１つの配列、または、制御カンジダ・アルビカンス糸状型化ブロッカーとして、前記配列のすべてのヌクレオチドの同一性に基づいて、前記選択された配列と少なくとも９５％同一である前記配列の変異体、
を含む、
少なくとも２つの単離されたオリゴマーの組み合わせを含む組成物。
【請求項7】
前記配列のすべてのヌクレオチドの同一性に基づいて、前記配列が、前記選択された配列と少なくとも９６％同一である、好ましくは９７％、９８％、９９％同一である、または同一である、請求項６に記載の組成物。
【請求項8】
前記単離されたオリゴマーの組み合わせが、以下の組み合わせ：配列番号７および配列番号８、
配列番号７および配列番号９、
配列番号８および配列番号９、
配列番号７、配列番号８および配列番号９
から選択される、請求項６または７に記載の組成物。
【請求項9】
前記組成物がコーティング組成物である、請求項６～８のいずれかに記載の組成物。
【請求項10】
請求項６～９のいずれかに記載の組成物、好ましくはコーティング組成物を含む物品。
【請求項11】
前記物品が、医療デバイス、特にパッチ、カテーテル、ステント、コンタクトレンズまたはペースメーカーである、請求項１０に記載の物品。
【請求項12】
前記物品が、膣内タンポン、生理用ナプキン、またはパンティライナーである、請求項１０に記載の物品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、カンジダ・アルビカンス感染症の処置または治療におけるアンチセンスオリゴマーの使用に関する。特に、酵母から糸状型（糸状形態）へのカンジダ・アルビカンスの形態的転移に関与する特定の遺伝子を標的とするためのアンチセンスオリゴマーの使用。
【0002】
本開示はさらに、酵母から糸状型へのカンジダ・アルビカンスの形態転移を阻害するためのアンチセンス療法におけるアンチセンスオリゴマーの使用を記載する。
【背景技術】
【0003】
カンジダ種は通常、共生微生物として存在するが、表在性および全身性感染症を引き起こす能力を有する日和見病原体としても作用しうる。高齢者人口の増加や免疫不全患者の増加、並びに留置医療機器の普及などにより、ここ数年でカンジダ感染症の発生率は著しく増加している。カンジダ・アルビカンス感染症は、依然として全カンジダ種感染症の中で最も多くみられ、全カンジダ感染症の約４７％はカンジダ・アルビカンスが原因である。
【0004】
二形性真菌として、カンジダ・アルビカンスが共生菌から病原菌に変化する能力は、主として、酵母型と菌糸型の間の形態学的スイッチ能力である、ヒトの生体組織に侵入し、宿主の免疫系から逃れる能力を中心とする特性に起因する。この能力はその病原性に強く寄与する。カンジダ・アルビカンスは毎年約４００，０００人の死因となっており、その最も問題となる病原性因子の１つは糸（フィラメント／繊維）を発達させる能力である。
【0005】
ここ数年、重要な技術的進歩により、カンジダ・アルビカンスの酵母から糸状型への形態学的転移の分子生物学の研究が促進された。これらの進歩には、カンジダ・アルビカンスの二型性に関与する遺伝子の同定および特徴づけに必須のゲノムおよびトランスクリプトーム配列データの利用可能性が含まれる。いくつかの研究により、EFG１、HWP１およびHYR１遺伝子がカンジダ・アルビカンスフィラメント形成（糸状型化）のインデューサーとして重要であることが実証されている［１］。
【0006】
新しい治療戦略の開発に専念した広範な研究にもかかわらず、表在性および侵襲性カンジダ感染と闘うために利用できる薬物は限られている。実際、３つの別個真菌代謝経路を標的とする４つの分子クラスのみが、現在、カンジダ関連全身感染症の治療に診療所で使用されている：ポリエン、アゾール、エキノカンジン。モルホリンやアリルアミンのようないくつかの他のクラスは、全身的に投与した場合、効果不良または重度の有害作用のいずれかのために、局所薬としてのみ使用される［２］。カンジダ多剤耐性の増加、新薬の不足、カンジダ種の共生真菌から病原真菌への転移スイッチの可塑性の高さが、カンジダ症の症例数の増加につながっている。この数年間の治療法の進歩にもかかわらず、抗真菌薬の開発速度は真菌感染症の速度より遅れ続けている。さらに、これらの化合物のほとんどは、毒性の問題のため、全身性薬剤としての可能性が限られている。
【0007】
これらの因子は臨床的問題を構成し、高い罹患率と死亡率（３０～３７％）並びに患者の長期入院に関連するより高い経済的コストをもたらす。入院患者におけるカンジダ血症に関連する平均費用は、１エピソードあたり５７００～８５０００ユーロである。これらのエビデンスは、カンジダ・アルビカンス感染を管理するための新たな戦略の必要性を強調している。
【0008】
アンチセンス療法（AST）は多くのヒト疾患の治療に非常に有望である。ASTの基礎となる概念は比較的簡単である：後の発現を阻害し、DNAのタンパク質への翻訳の「遮断」を誘導することができる特定のmRNAに対する相補的配列の使用。アンチセンスオリゴマー（ASO）は標的mRNAに相補的な核酸の短鎖である［１６］。ASOは、一般に、遺伝子特異的である未修飾または化学修飾分子の１３～２５ヌクレオチドを有する短い配列からなる。さらに、近年、ASO化学修飾は、ヌクレアーゼ耐性を増強し、組織半減期、親和性および効力を延長し、特異的毒性を低減するために開発されている。現在、ASOには３つの世代がある。第一世代はホスホロチオエート背骨修飾を含み、非架橋リン酸素を硫黄原子で置換することを特徴とする。第２世代は、ヌクレアーゼ抵抗性を増強し、標的mRNAに対する結合親和性を増加させるために開発された。この２’－O－メチルおよび２’－O－メトキシエチル糖修飾は、ヌクレオチドの２’位のOH基に付加される。多数の研究により、標的ヒト蛋白質を研究するための生化学的ツールとしてのASTの使用が記載されている［３］。この方法論は、細菌感染症の抗生物質治療の代替法として提案されている。S－オリゴであるホミビルセン（ブランド名ビタールベン）は、米国食品医薬品局が承認した微生物を標的とする唯一のアンチセンス治療薬である。ホミビルセンは、サイトメガロウイルスによる網膜炎の治療薬として１９９８年に承認された。バクテリアを標的とした初期の研究では、改変ASOがSalmonella、Listeria、Brucella、Pseudomonas、Staphylococcus、StreptococcusおよびEscherichia種の成長を阻害することがわかった［４］。バクテリアの成長を制御するために使用するためのASOの開発が過去10年間続いているという事実にもかかわらず、カンジダ・アルビカンスの増殖を制御するために使用するアンチセンスベースのアプリケーションはほとんどなく、十分に活用されていない［５］。
【0009】
文献WO2014144024(A1)は、Candida細胞Hyhr１表面タンパク質のフラグメントを産生する方法を開示している。この文献はさらに、真菌感染症に対する療法および免疫化のためのこのタンパク質の使用を開示している。
【0010】
文献AU2016244238(A1)は、免疫化（能動および受動）のための標的として、および播種性カンジダ症の予防療法としてのHyhr１表面タンパク質の使用を開示している。
【0011】
文献US2019030141(A1)は、免疫化に使用するための、Candida細胞表面タンパク質Als３およびHyr１のフラグメント並びにそれらの組み合わせを開示している。
【0012】
文献CN107304429(A)は、毒性因子関連遺伝子（ALS３、HWP１および／またはECE１遺伝子発現）を阻害するNuo２タンパク質または遺伝子をダウンレギュレートするための低分子化合物などの阻害剤の使用を開示している。
【0013】
文献US2017298349(A1)は、カンジダのHWP１およびALS３の発現を調節する遺伝子間非コードRNA分子を開示している。本文献はさらに、HWP１またはALS３の発現を調節する際の非コードRNA分子およびその相補的分子の使用、並びにカンジダの密着性、酵母から菌糸への転移、またはバイオフィルムの発達を調節することを開示している。その目的はカンジダ症を予防または治療することである。
【0014】
文献US2005244861(A1)は、カンジダ・アルビカンスにおけるHWP１発現の調節に必要な核酸、およびHWP１の式を阻害する薬剤を同定する際のこれらの核酸の使用を開示している。
【0015】
文献CN1730654(A)は、カンジダ・アルビカンス感染に対して使用するためのASO配列の使用を開示している。具体的には、本文献は、カンジダ・アルビカンス型Iイントロンリボザイムのコアシュードノットに対するASO配列を開示し、したがって、カンジダ・アルビカンスのせん断反応性を強く抑制する。
【0016】
これらの事実は、本開示によって対処される技術的問題を説明するために開示される。
【発明の概要】
【0017】
本開示では、酵母から糸状型へのカンジダ・アルビカンスの形態的転移に関与する特定の遺伝子を標的とするためのASOの使用について述べる。本開示は、さらに、酵母から糸状型へのカンジダ・アルビカンスの形態学的転移を阻害するためのASTにおけるASOの使用を記載する。
【0018】
ASOは、特定の遺伝子の発現をサイレンスさせる合成オリゴマーである。この特異性は、他の共生カンジダ種への非意図的な影響を回避し、交差耐性の可能性を最小限にすることにより、広域スペクトル抗真菌薬を上回る利点を与える。さらに、配列特異性およびASOの短い長さもまた、ヒト遺伝子発現にほとんどリスクを与えない。このアプローチのもう１つの重要な利点は、新規抗真菌薬を発見するのに必要な時間をほぼ排除するか、または有意に短縮する能力であり、したがって、任意の酵母、例えば、カンジダ・アルビカンス中の既知の塩基配列を有する任意の遺伝子に対して、潜在的に利用可能な標的の範囲を広げることである。
【0019】
これまでのところ、カンジダ・アルビカンスの病原性に必要な非必須遺伝子、すなわち酵母から糸状型への形態学的転移に関与する遺伝子を標的とするASOの同定、設計および合成は行われていない。カンジダ・アルビカンス歪みの最も問題となる毒素因子の１つに関与する遺伝子群に対するASOの適用により、この問題のある酵母に特異的な新規ナノ薬剤の開発のみならず、カンジダ症を制御する新たな戦略の開発が可能となる。本開示は、カンジダ・アルビカンス糸状化（繊維化）の３つの重要な調節遺伝子（EFG１、HWP１およびHYR１）のmRNAと特異的にハイブリダイズし、その分子機能をブロックすることができる短い配列ASOを同定することを意図している。これにより、カンジダ・アルビカンスの侵襲性および病原性を制御するために、単独または併用で使用されるナノ薬物の開発が可能になる。
【0020】
本開示の態様は、以下の配列からなるリストから選択される配列を少なくとも含む単離されたオリゴマーに関する：
配列番号７‐EFG１について：5’-mG mG mC mA TACCGTTA mU mU mG mU-3’；
配列番号８‐HWP１について：5' mUmGATAACATGTAATAAGmCmG 3'；
配列番号９‐HYR１について：5' mGmGmU TGA GAG TAmA mGmC 3'；またはそれらの組み合わせ；またはカンジダ・アルビカンス糸状型化ブロッカーとしての前記配列のすべてのヌクレオチドの同一性に基づいて、選択された配列と少なくとも９５％同一である前記配列の変異体。
配列番号７‐EFG１について：5’-mG mG mC mA TACCGTTA mU mU mG mU-3’；
配列番号８‐HWP１について：5' mUmGATAACATGTAATAAGmCmG 3'；
配列番号９‐HYR１について：5' mGmGmU TGA GAG TAmA mGmC 3'；またはそれらの組み合わせ；またはカンジダ・アルビカンス糸状型化ブロッカーとしての前記配列のすべてのヌクレオチドの同一性に基づいて、選択された配列と少なくとも９５％同一である前記配列の変異体。
【0021】
本開示の別の態様は、好ましくはカンジダ・アルビカンス関連感染症の処置または療法に使用するための、医薬品において使用するための、配列番号７、配列番号８、配列番号９、またはそれらの組合せからなるリストから選択される配列、または該配列のすべてのヌクレオチドの同一性に基づいて、選択された配列と少なくとも９５％同一である該配列の変異体を少なくとも含む単離されたオリゴマーに関する。特に、膣感染症および／または口腔感染症の処置または療法に使用するために。
【0022】
一実施形態によると、配列は、前記配列のすべてのヌクレオチドの同一性に基づいて、選択された配列と少なくとも９６％、好ましくは９７％、９８％、９９％または同一である。
【0023】
本開示の別の態様は、以下の配列：配列番号７、配列番号８、配列番号９、もしくはそれらの組み合わせからなるリストから選択される配列、または、該配列のすべてのヌクレオチドの同一性に基づいて、選択された配列と少なくとも９５％同一である前記配列の変異体を、制御カンジダ・アルビカンス糸状型化ブロッカーとして、含む、少なくとも２つの単離されたオリゴマーの組み合わせを含む組成物に関する。
【0024】
一実施形態では、配列は、前記配列のすべてのヌクレオチドの同一性に基づいて、選択された配列と少なくとも９６％、好ましくは９７％、９８％、９９％または同一である。
【0025】
一実施形態では、単離されたオリゴマーの組み合わせは、以下の組み合わせから選択される：
配列番号７および配列番号８；
配列番号７および配列番号９；
配列番号８および配列番号９；
配列番号７、配列番号８、および、配列番号９。
配列番号７および配列番号８；
配列番号７および配列番号９；
配列番号８および配列番号９；
配列番号７、配列番号８、および、配列番号９。
【0026】
一実施形態では、組成物はコーティング組成物であってもよい。
【0027】
本開示の別の態様は、単離されたオリゴマーまたは本願の主題に記載される組成物、好ましくは被覆組成物を含む物品に関する。
【0028】
一実施形態では、物品は、とりわけ医療装置、特にパッチ、カテーテル、ステント、コンタクトレンズまたはペースメーカーであってもよい。
【0029】
一実施形態では、物品は、膣内タンポン、生理用ナプキン、またはパンティライナーであってもよい。
【0030】
一実施形態では、侵襲性を付与し、カンジダ・アルビカンス病原性を増加させるものなどの、毒性に必要な非必須遺伝子を標的とするASOが合成された。病原性微生物において、特定の遺伝子の遺伝配列が感染の決定因子として知られており、それが産生され、不活性化されるmRNAに結合するであろう核酸のストランドを合成し、そのタンパク質への翻訳において、その毒性を制御することが可能であろうと考えられる。
【0031】
別の実施形態では、カンジダ・アルビカンスの酵母から糸状形態への形態的変化を制御することができるASTに基づくポテンシャルASOのカクテルが生成され、このようにして、この微生物の侵襲性が制御された。
【0032】
一実施形態では、ASOとカンジダ・アルビカンス細胞とのハイブリダイゼーション能力を機能的に分析した。ターゲット遺伝子の発現を阻害するASOの能力および異なるヒト体液におけるカンジダ・アルビカンスのフィラメント形成を減少させるそれらの能力もまた、機能的に分析した。これらの分析は、個々のASOとASOの組み合わせを用いて行った。
【0033】
以下の図は、説明を説明するための好ましい実施形態を提供するものであり、本発明の範囲を限定するものと見なされるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【0034】
【発明を実施するための形態】
【0035】
本開示は、酵母から糸状型へのカンジダ・アルビカンスの形態学的転移に関与する特定の遺伝子を標的とするためのASOの使用に関する。
【0036】
本開示は、さらに、酵母から糸状型へのカンジダ・アルビカンスの形態学的転移を阻害するためのASTにおけるASOの使用を記載する。
【0037】
一実施形態では、３つの異なる遺伝子を標的とするASOを設計し、合成して、カンジダ・アルビカンスフィラメント形成の全遮断を確実にした。標的領域は、カンジダ・アルビカンスゲノムに対するその高い特異性およびホモ・サピエンスゲノムに対するより低い特異性を考慮に入れて、各遺伝子から選択した。選択された領域は、EFG１、HWP１およびHYR１についてそれぞれ（5’-ACAATAACGGTATGCC-3’）、（5' CGCTTATTACATGTTATCA 3'）および（5' GCTTACTCTCAACC 3'）であった。
【0038】
一実施形態では、メチル化のために選択された標的領域は、：
配列番号１‐EFG１について：5’-47ACAATAACGGTATGCC62-3’；
配列番号２‐HWP１について：5' 33CGCTTATTACATGTTATCA51 3'；
配列番号３‐HYR１について：5' 36GCTTACTCTCAACC49 3'
である。
配列番号１‐EFG１について：5’-47ACAATAACGGTATGCC62-3’；
配列番号２‐HWP１について：5' 33CGCTTATTACATGTTATCA51 3'；
配列番号３‐HYR１について：5' 36GCTTACTCTCAACC49 3'
である。
【0039】
一実施形態では、選択された標的領域の各配列について、それぞれのASOを設計するために、逆相補体を決定した。決定された配列は、EFG１、HWP１およびHYR１について、それぞれ（5’ GGCATACCGTTATTGT 3’）、（5'TGATAACATGTAATAAGCG3’）および(5'GGTTGAGAGTAAGC 3`)であった。
【0040】
メチル化のために決定された逆相補配列は：
配列番号４‐EFG１について：5' GGCATACCGTTATTGT 3'；
配列番号５‐HWP１について：5' TGATAACATGTAATAAGCG 3'；
配列番号６‐HYR１について：5' GGTTGAGAGTAAGC 3'
であった。
配列番号４‐EFG１について：5' GGCATACCGTTATTGT 3'；
配列番号５‐HWP１について：5' TGATAACATGTAATAAGCG 3'；
配列番号６‐HYR１について：5' GGTTGAGAGTAAGC 3'
であった。
【0041】
一実施形態では、ASOヒット率を増加させるために、セカンドジェネレーションの核酸模倣設計（２’－O－メチル）に基づいて、選択された各配列に属するオリゴヌクレオチドの一部を化学的に修飾した。
【0042】
別の実施形態において、核酸模倣の各端部に２つ以上の修飾を含めることが、ヒト血清中でのその安定性を増加させることが実証されると、アンチセンスオリゴマーを設計し、合成した。
【0043】
一実施形態では、抗EFG１オリゴマーを設計し、４つの２’－O－メチル化学修飾（5'-mG mG mC mA TACCGTTA mU mU mG mU-3'）で合成した。抗HWP１オリゴマーを設計し、２つの化学修飾（5' mUmGATAACATGTAATAAGmCmG 3'）で合成した。抗HYR１オリゴマーを設計し、３つの化学修飾（5' mGmGmU TGA GAG TAmA mGmC 3'）で合成した。
【0044】
実施形態では、メチル化配列は、：
配列番号７‐EFG１について：5'-mG mG mC mA TACCGTTA mU mU mG mU-3'；
配列番号８‐HWP１について：5' mUmGATAACATGTAATAAGmCmG 3'；
配列番号９‐HYR１について：5' mGmGmU TGA GAG TAmA mGmC 3'
であった。
配列番号７‐EFG１について：5'-mG mG mC mA TACCGTTA mU mU mG mU-3'；
配列番号８‐HWP１について：5' mUmGATAACATGTAATAAGmCmG 3'；
配列番号９‐HYR１について：5' mGmGmU TGA GAG TAmA mGmC 3'
であった。
【0045】
比較のための配列のアラインメントのための方法は、当技術分野で周知であり、このような方法は、BLASTおよびFASTAを含む。BLASTアルゴリズム（Altschul et al. (1990) J Mol Biol 215: 403-10）は、パーセント配列同一性を計算し、２つの配列間の類似性の統計解析を行う。BLAST分析を実施するためのソフトウェアは、National Centre for Biotechnology Information (NCBI)を通じて公開されている。発明特定事項においてパーセンテージとして示されている配列同一性値は、BLASTを用いて、既定のパラメータと共に全アミノ酸配列にわたって決定された。
【0046】
一実施形態では、図１は、カンジダ・アルビカンスのEFG１（抗EFG１）、HWP１（抗HWP１）およびHYR１（抗HYR１）遺伝子のためのASO配列、並びにそれぞれの２’－O－メチル化学修飾挿入を示す。図１Bは、３つのASO配列のサイズ、融解温度およびグアニンとシトシン（GC）のパーセンテージの特性をサマライズしたものである。
【0047】
一実施形態では、図２は、蛍光in situハイブリダイゼーションアッセイによって決定されたカンジダ種に対する抗EFG１および抗HWP１オリゴマーの感度および特異性を示す。図２Aは、試験した異なるカンジダ種について、３７℃での２時間のハイブリダイゼーション後に得られた蛍光強度をサマライズしたものである。図２Bは、赤色フルオレセイン（５６－FAM）および緑色フルオレセイン（TYE５６３）で標識した抗EFG１および抗HWP１とのカンジダ種ハイブリダイゼーションの蛍光画像を示す。
【0048】
一実施形態では、図３は、３T３細胞株（線維芽細胞、胚組織、CCL３由来のマウス、American Type Culture Collection)に対する抗EFG１、抗HWP１および抗HYR１オリゴマーの４０nMの細胞毒性効果を示す。これらはMTSキット（CellTiter 96（登録商標）Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega）を用いて測定した。エラーバーは標準偏差を表す。
【0049】
一実施形態では、図４は、カンジダ・アルビカンスフィラメント形成に対する抗EFG１、抗HWP１および抗HYR１オリゴマーの効果を示す。図４Aは、各オリゴマーの４０nMの効果を、カンジダ・アルビカンスフィラメント形成阻害のパーセンテージで示している。図４Bは、ASOで２４時間処理した場合のカンジダ・アルビカンスフィラメント形成低減の蛍光画像を示す。コントロールは、オリゴマーの非存在下で同じ条件で培養したカンジダ・アルビカンスに関連している。エラーバーは標準偏差を表す。検定した異なる時間の統計的差異（P＜０．０５）に＊印を付ける。
【0050】
一実施形態によると、図５Aは、２４時間のインキュベーション後のカンジダ・アルビカンスフィラメント形成能に対する４０nMの抗EFG１の効果を示す。EFG１遺伝子発現に対する効果は、qRT－PCR（図５Bに示すように）およびナノLC－MS／MS分析（図５Cに示すように）によって得られたefg１p翻訳によって測定される。エラーバーは標準偏差を表す。抗EFG１オリゴマーで処理したカンジダ・アルビカンスと未処理（P＜０．０５）の間の統計的差は＊でマークされる。
【0051】
一実施形態によると、図６は、４０nMの各オリゴマー（抗EFG１、抗HWP１および抗HYR１）との異なる組み合わせに関する結果を示す。図６Aは、３T３細胞株に対する細胞毒性効果を示す。これはMTSキットを用いて測定される。図６Bは、カンジダ・アルビカンスフィラメント形成に対する効果（抑制の％）を示す。図６Cは、インキュベーションの８時間および２４時間でのカンジダ・アルビカンスフィラメント形成の低下の蛍光画像を示す。エラーバーは標準偏差（derivation）を表す。混合ASOで処理したカンジダ・アルビカンスと未処理のカンジダ・アルビカンスの間の統計的差異（P＜０．０５）に＊印を付ける。
【0052】
一実施形態では、図７は、ヒトの体液（AS‐人工唾液；AU‐人工尿および血液）に対する抗EFG１オリゴマーの性能を示す。図７Aは、カンジダ・アルビカンスフィラメント形成に対する抗EFG１オリゴマー効果を示す。図７Bは、EFG１遺伝子発現に対する抗EFG１オリゴマー効果を示す。
【0053】
以上説明した実施形態は組み合わせ可能である。
【0054】
本文書で使用される場合は常に、「含む」という用語は、述べられた特徴、整数、工程、構成要素の存在を示すことを意図しているが、１つ以上の他の特徴、整数、工程、構成要素またはそれらのグループの存在または追加を排除するものではない。
【0055】
以下の特許請求の範囲は、本開示の特定の実施形態をさらに記載する。
参考文献
Huang, G. (2012) Regulation of phenotypic transitions in the fungal pathogen Candida albicans. Virulence 3, 251－261
Silva, S. et al. (2017) Candida Species Biofilms’ Antifungal Resistance. J. Fungi 3, 8
DeVos, S.L. and Miller, T.M. (2013) Antisense Oligonucleotides: Treating Neurodegeneration at the Level of RNA. Neurotherapeutics DOI: 10.1007/s13311-013-0194-5
Potaczek, D.P. et al. (2016) Antisense molecules: A new class of drugs. J. Allergy Clin. Immunol. 137, 1334－1346
Ecker et al., (1995). OLigonucleotides inhibiting Candida germ tube formation. US00569141A
参考文献
Huang, G. (2012) Regulation of phenotypic transitions in the fungal pathogen Candida albicans. Virulence 3, 251－261
Silva, S. et al. (2017) Candida Species Biofilms’ Antifungal Resistance. J. Fungi 3, 8
DeVos, S.L. and Miller, T.M. (2013) Antisense Oligonucleotides: Treating Neurodegeneration at the Level of RNA. Neurotherapeutics DOI: 10.1007/s13311-013-0194-5
Potaczek, D.P. et al. (2016) Antisense molecules: A new class of drugs. J. Allergy Clin. Immunol. 137, 1334－1346
Ecker et al., (1995). OLigonucleotides inhibiting Candida germ tube formation. US00569141A
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6-1】
【図6-2】
【図7】
【配列表】
【国際調査報告】