知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
▶ ナショナル ユニバーシティ オブ シンガポールの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-04-14
(54)【発明の名称】エンジニアリングされた免疫細胞
(51)【国際特許分類】
C12N 5/0783 20100101AFI20220407BHJP
C12N 15/85 20060101ALI20220407BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20220407BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220407BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20220407BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20220407BHJP
C12N 15/62 20060101ALN20220407BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20220407BHJP
【ＦＩ】
C12N5/0783 ZNA
C12N15/85 Z
A61K35/17 Z
A61P35/00
C12N15/09 110
C12N15/12
C12N15/62 Z
C12N15/13
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021549233
(86)(22)【出願日】2020-02-27
(85)【翻訳文提出日】2021-10-20
(86)【国際出願番号】 SG2020050090
(87)【国際公開番号】W WO2020180243
(87)【国際公開日】2020-09-10
(31)【優先権主張番号】10201901875X
(32)【優先日】2019-03-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】SG
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】509034605
【氏名又は名称】ナショナル ユニバーシティ オブ シンガポール
(74)【代理人】
【識別番号】100079108
【弁理士】
【氏名又は名称】稲葉 良幸
(74)【代理人】
【識別番号】100109346
【弁理士】
【氏名又は名称】大貫 敏史
(74)【代理人】
【識別番号】100117189
【弁理士】
【氏名又は名称】江口 昭彦
(74)【代理人】
【識別番号】100134120
【弁理士】
【氏名又は名称】内藤 和彦
(72)【発明者】
【氏名】ウ，リン
(72)【発明者】
【氏名】ガスコイン，ニコラス ロバート ジョン
(72)【発明者】
【氏名】ブジョステク，ジョアンナ
【テーマコード（参考）】
4B065
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065BB25
4B065BC03
4B065BC07
4B065CA44
4C087AA01
4C087AA02
4C087AA03
4C087BB37
4C087NA05
4C087NA14
4C087ZB26
(57)【要約】
本開示は、一般に免疫学の分野に関する。特に、本開示は、ＣＡＲを発現する免疫細胞に関し、この免疫細胞は、ＬＣＫの発現及び／又は機能が低下又は消失するように改変されている。本開示はまた、対象における疾患を処置するための方法に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する免疫細胞であって、前記ＣＡＲは、リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ（ＬＣＫ）の非存在下で機能する細胞内シグナル伝達ドメイン又は断片を含み、
前記免疫細胞は、ＬＣＫの発現及び／又は機能が低下又は消失するように改変されている、免疫細胞。
【請求項2】
前記細胞内シグナル伝達ドメインが、ＬＣＫの非存在下で機能するＣＤ２８タンパク質のシグナル伝達ドメイン又は断片を含む、請求項１に記載の免疫細胞。
【請求項3】
前記免疫細胞がＴ細胞又はＮＫ細胞である、請求項１に記載の免疫細胞。
【請求項4】
前記免疫細胞が、ＬＣＫの阻害剤を含むか、又は前記ＬＣＫの阻害剤と接触されている、請求項１に記載の免疫細胞。
【請求項5】
前記ＬＣＫの阻害剤が、遺伝子発現をダウンレギュレート若しくは消失させる、又はＬＣＫの機能を改変することができる核酸配列である、請求項４に記載の免疫細胞。
【請求項6】
ＬＣＫの遺伝子発現をダウンレギュレートできる前記核酸が、アンチセンスＲＮＡ、アンタゴミールＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ系、ジンクフィンガーヌクレアーゼ系、及び転写活性化因子様エフェクターベースのヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）系からなる群から選択される、請求項５に記載の免疫細胞。
【請求項7】
前記ＬＣＫの阻害剤がＬＣＫタンパク質の阻害剤である、請求項４に記載の免疫細胞。
【請求項8】
前記ＬＣＫの阻害剤が、アミノキナゾリン、Ａ－４２０９８３、Ａ７７００４１、ダサチニブ、サラクチニブ、及びマサチニブからなる群から選択される、請求項７に記載の免疫細胞。
【請求項9】
前記免疫細胞が、前記ＣＡＲをコードする核酸を含むベクターを含む、請求項１に記載の免疫細胞。
【請求項10】
前記免疫細胞が、遺伝子発現をダウンレギュレート若しくは消失させる、又はＬＣＫの機能を改変することができるＬＣＫの阻害剤をコードする核酸を含むベクターを含む、請求項１に記載の免疫細胞。
【請求項11】
前記免疫細胞が、前記ＣＡＲをコードする核酸と、ＬＣＫの遺伝子発現をダウンレギュレート若しくは消失させることができるＬＣＫの阻害剤をコードする核酸とを含むベクターを含む、請求項１に記載の免疫細胞。
【請求項12】
前記ＣＡＲが、細胞外抗原結合ドメインを含む、請求項１に記載の免疫細胞。
【請求項13】
前記細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ζ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＦｃＲγ、ＦｃεＲＩβ、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＦｃγＲＩＩａ、ＤＡＰ１０、又はＤＡＰ１２から選択されるタンパク質の機能的シグナル伝達ドメインを含む一次シグナル伝達ドメインをさらに含む、請求項１に記載の免疫細胞。
【請求項14】
前記細胞内シグナル伝達ドメインが、ＤＡＰ１０、ＣＤ２８、ＣＡＲＤ１１、ＳＬＡＭＦ１、ＬＣＫ１、ＬＣＫ３、ＬＡＴ、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、及び４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）からなる群から選択されるタンパク質の機能的シグナル伝達ドメインを含む共刺激ドメインをさらに含む、請求項１に記載の免疫細胞。
【請求項15】
ＬＣＫの発現及び／又は機能が低下又は消失するように改変されていない細胞と比較して、ＰＤ－１の発現が低下している、請求項１に記載の免疫細胞。
【請求項16】
ＣＡＲを発現する免疫細胞であって、ＬＣＫ遺伝子の発現又は機能が破壊されるように改変されている、免疫細胞。
【請求項17】
請求項１に記載の免疫細胞を製造する方法であって、ＬＣＫの発現及び／又は機能を低下又は消失させるのに十分な時間及び条件下で、免疫細胞をＬＣＫの阻害剤と接触させることを含む、方法。
【請求項18】
前記ＬＣＫの阻害剤が、ＬＣＫの遺伝子発現をダウンレギュレートすることができる核酸配列である、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
前記ＬＣＫの阻害剤がＣＲＩＳＰＲ系である、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
ＣＡＲをコードする核酸を前記免疫細胞に導入することをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項21】
１）ＬＣＫの阻害剤をコードする核酸配列を含むベクター、及び２）ＣＡＲをコードする核酸配列を含むベクターを含むベクター系。
【請求項22】
ＬＣＫの阻害剤をコードする核酸配列及びＣＡＲをコードする核酸配列を含むベクター。
【請求項23】
前記ＣＡＲをコードする核酸配列がＬＣＫの阻害剤である、請求項２２に記載のベクター。
【請求項24】
細胞療法におけるＣＡＲ発現免疫細胞の有効性を改善する方法であって、ＬＣＫの発現及び／又は機能を低下又は消失させるのに十分な時間及び条件下で、前記ＣＡＲ発現免疫細胞をＬＣＫの阻害剤と接触させることを含む、方法。
【請求項25】
前記ＣＡＲ発現免疫細胞がＣＡＲＴ細胞である、請求項２４に記載の方法。
【請求項26】
前記ＣＡＲ発現免疫細胞のオフターゲット効果が減少されている、請求項２４に記載の方法。
【請求項27】
前記ＣＡＲ発現細胞における消耗表現型が減少している、請求項２４に記載の方法。
【請求項28】
前記ＣＡＲ発現免疫細胞のメモリーが改善されている、請求項２４に記載の方法。
【請求項29】
それを必要とする対象を処置する方法であって、前記対象を処置するのに十分な時間及び条件下で、請求項１～１６のいずれか一項に記載の免疫細胞を投与することを含む、方法。
【請求項30】
前記対象が、腫瘍抗原の発現に関連する疾患（例えば、増殖性疾患、前癌状態、癌、及び腫瘍抗原の発現に関連する非癌関連の徴候）を有する、請求項２９に記載の方法。
【請求項31】
それを必要とする対象の処置における使用のための、請求項１～１６のいずれか一項に記載の免疫細胞。
【請求項32】
必要とする対象を処置するための薬剤の製造における、請求項１～１６のいずれか一項に記載の免疫細胞の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
分野
本開示は、一般に免疫学の分野に関する。特に、本開示は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する免疫細胞及び対象の疾患を処置するための方法に関する。
本開示は、一般に免疫学の分野に関する。特に、本開示は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する免疫細胞及び対象の疾患を処置するための方法に関する。
【背景技術】
【0002】
背景
免疫療法は、近年、癌患者の処置において前例のない進歩を遂げた。養子Ｔ細胞療法では、単離されたヒトＴ細胞が、キメラ抗原受容体の発現などによって、特定の腫瘍抗原に対するその特異性を高めるために遺伝子改変される。キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）を必要とする養子Ｔ細胞療法は、免疫腫瘍学パイプラインの主要な部分である。現在までに、３世代のＣＡＲ－Ｔ技術が開発され、Ｂ細胞悪性腫瘍及び多発性骨髄腫を含むいくつかの癌の臨床試験で使用されている。
免疫療法は、近年、癌患者の処置において前例のない進歩を遂げた。養子Ｔ細胞療法では、単離されたヒトＴ細胞が、キメラ抗原受容体の発現などによって、特定の腫瘍抗原に対するその特異性を高めるために遺伝子改変される。キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）を必要とする養子Ｔ細胞療法は、免疫腫瘍学パイプラインの主要な部分である。現在までに、３世代のＣＡＲ－Ｔ技術が開発され、Ｂ細胞悪性腫瘍及び多発性骨髄腫を含むいくつかの癌の臨床試験で使用されている。
【0003】
癌治療としてのその絶大な有用性にもかかわらず、ＣＡＲ－Ｔ細胞による養子免疫療法は、細胞表面での内因性Ｔ細胞受容体の発現によって部分的に制限されている。内因性Ｔ細胞受容体を発現するＣＡＲ－Ｔ細胞は、同種異系患者への投与後に主要及び副組織適合抗原を認識し得る。これは、非特異的な効果を有し、患者に移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の発症をもたらし得る。
【0004】
ＣＡＲ－Ｔ細胞によるＴ細胞養子免疫療法のもう１つの制限は、患者への再灌流後、ＣＡＲ－Ｔ細胞が、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、及びＴＩＧＩＴなどの阻害性受容体の発現による「消耗」表現型を示し始め、Ｔ細胞エフェクター機能が失われる。これは、これらの阻害性受容体のリガンド（ＰＤ－１に対するＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２など）を発現することが多い固形腫瘍の特定の問題であり、固形腫瘍に対するＣＡＲ－Ｔ療法の有用性を制限している。
【0005】
従って、上記言及された問題の１つ又は複数を克服する、又は少なくとも軽減する必要がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0006】
発明の概要
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する免疫細胞を本明細書で提供する。
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する免疫細胞を本明細書で提供する。
【0007】
一態様では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する免疫細胞が提供され、このＣＡＲは、リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ（ＬＣＫ）の非存在下で機能する細胞内シグナル伝達ドメイン又は断片を含み、この免疫細胞は、ＬＣＫの発現及び／又は機能が低下又は消失するように改変されている。
【0008】
一実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメイン又は断片は、機能不全ＬＣＫの存在下で機能する。
【0009】
一態様では、ＣＡＲを発現する免疫細胞が提供され、この免疫細胞は、ＬＣＫ遺伝子の発現又は機能が破壊されるように改変されている。
【0010】
一態様では、本明細書で定義される免疫細胞を製造する方法が提供され、この方法は、ＬＣＫの発現及び／又は機能を低下又は消失させるのに十分な時間及び条件下で免疫細胞をＬＣＫの阻害剤と接触させることを含む。
【0011】
一態様では、１）ＬＣＫの阻害剤をコードする核酸配列を含むベクター、及び２）ＣＡＲをコードする核酸配列を含むベクターを含むベクター系が提供される。
【0012】
一態様では、ＬＣＫの阻害剤をコードする核酸配列及びＣＡＲをコードする核酸配列を含むベクターが提供される。
【0013】
一態様では、細胞療法におけるＣＡＲ発現免疫細胞の有効性を改善する方法が提供され、この方法は、ＬＣＫの発現及び／又は機能を低下又は消失させるのに十分な時間及び条件下でＣＡＲ発現免疫細胞をＬＣＫの阻害剤と接触させることを含む。
【0014】
一態様では、それを必要とする対象を処置する方法が提供され、この方法は、対象を処置するのに十分な時間及び条件下で、本明細書で定義される免疫細胞を投与することを含む。
【0015】
一態様では、それを必要とする対象の処置における使用のための、本明細書で定義される免疫細胞が提供される。
【0016】
一態様では、必要とする対象を処置するための薬剤の製造における本明細書で定義される免疫細胞の使用が提供される。
【0017】
図面の簡単な説明
ここで、本発明のいくつかの実施形態を、添付の図面を参照して、単なる非限定的な例として説明する。
ここで、本発明のいくつかの実施形態を、添付の図面を参照して、単なる非限定的な例として説明する。
【図面の簡単な説明】
【0018】
【図1】ＣＨＯ細胞を提示する人工抗原は、ＣＡＲ及びＴＣＲ Ｔ細胞刺激のための抗原を提供する。（Ａ）ＣＡＲ構築物の概略図。ＭｙｃタグはＣＡＲの発現の検出に使用される。（Ｂ）Ｊｕｒｋａｔ ７６のレンチウイルス形質導入後のＬＭＰ２Ａペプチド（Ｌ２）特異的ＣＡＲ又はＴＣＲの発現。ＣＡＲ構築物は、抗Ｍｙｃ抗体を使用して染色され、ＴＣＲの発現が抗ＣＤ３抗体によって同定された。（Ｃ）この研究で使用された３つのＴ細胞株での内因性ＴＣＲの発現。この研究の主要な細胞株としてＪｕｒｋａｔ ７６細胞株が主に使用された。（Ｄ）モノペプチド系として共有結合で融合されたペプチド配列を有する一本鎖ＨＬＡ構築物の概略図が上のパネルに示されている。左下のパネルは、特異的抗原ＨＬＡ－Ａ２－Ｌ２又は非関連抗原ＨＬＡ－Ａ２－ＧＡＧを発現する各ＣＨＯ－ＡＰＣ上のＬ２特異的ＴＣＲ様Ａｂを使用した染色を示す。右下のパネルは、モノペプチド系における特異的ペプチド又は非関連ペプチドに対するＬ２特異的ＣＡＲ－Ｔの応答性を示す。データは、少なくとも３回の実験から得られた、技術的な３連の平均±ＳＤとしてプロットされている。（Ｅ）マルチペプチド系として共有結合で融合されたペプチド配列を含まない一本鎖ＨＬＡ構築物の概略図が上のパネルに示されている。左下のパネルは、溝が開いたＨＬＡ－Ａ２でパルスされ、対応する特異的ＴＣＲ様Ａｂによって染色された様々なペプチドを示す。右下のパネルは、マルチペプチド系でパルスされた又はパルスされていない各特異的ペプチドに対するＥＢＮＡ１ペプチド（Ｅｌ）、ＬＭＰ１ペプチド（Ｌ１）、又はＬＭＰ２Ａペプチド（Ｌ２）特異的ＣＡＲ－Ｔの応答性を示す。データは、少なくとも３つの独立した実験を表し、技術的な３連の平均±ＳＤとしてプロットされている。（＊、ｐ＜０．０５、有意でない（ＮＳ）、ｐ＞０．０５）
【図2】ＴＣＲ様ＣＡＲの活性化は、ＣＤ８によって増強されず、ＬＣＫなしでＴ細胞シグナル伝達を伝達する。（Ａ）全反射顕微鏡（ＴＩＲＦＭ）を使用したＣＤ８の動員。ＣＤ８αは、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光タンパク質で標識され、一本鎖ＨＬＡは、Ｃｌｏｖｅｒ蛍光タンパク質と共有結合で融合された。左のパネルは、イメージングデータを表している。右のパネルは、バックグラウンド補正された平均蛍光強度の定量化データである。データは、平均±ＳＤ、ｎ＞８０細胞コンジュゲート（＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１）としてプロットされ、２つの独立した実験が行われた。（Ｂ）ＣＤ８を伴う又は伴わないＣＡＲ－Ｔ及びＴＣＲ－Ｔのカルシウム流出。曲線は、Flowjoの動的プログラムによってシミュレートされる。データは、少なくとも３つの独立した実験を表している。（Ｃ）ＣＤ８補助受容体を伴う又は伴わないＣＡＲ及びＴＣＲの応答性。モノペプチド系で提示されるＧＡＧの特異的ペプチドＬ２又は非関連ペプチドエピトープはそれぞれ、ＣＨＯ－Ｌ２又はＣＨＯ－ＧＡＧとして標識されている。データは、少なくとも３回の独立した実験から、技術的な３連の平均±ＳＤ（＊＊＊、ｐ＜０．００１、有意性なし（ＮＳ）、ｐ＞０．０５）としてプロットされている。（Ｄ）ＣＡＲ又はＴＣＲ－Ｊｃａｍ１．６細胞におけるＬＣＫ又はＦＹＮの発現のウエスタンブロット検出（左パネル）。ＬＣＫ欠損細胞株Ｊｃａｍ１．６におけるＣＡＲ又はＴＣＲの応答性（右パネル）。データは、少なくとも３つの独立した実験を表し、技術的な３連の平均±ＳＤとしてプロットされている。（Ｅ）ＣＡＲ－Ｊｃａｍ細胞のカルシウム流出。曲線は、Flowjoの動的プログラムによってシミュレートされる。データは、少なくとも３つの独立した実験を表している。
【図3】ＬＣＫ非依存性ＣＡＲシグナル伝達には、ＣＤ２８共刺激ドメインが必要である。（Ａ）抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖの細胞外認識ドメインを含むＣＡＲ構築物の概略図。この構築物の応答性が右に示されている。（Ｂ）ＣＤ３ζドメインが欠失したＣＡＲ構築物の概略図。この構築物の応答性が右に示されている。（Ｃ）共刺激ドメインが変更されたＣＡＲ構築物：ＣＤ２８欠失（ＣＡＲ－１）、ＣＤ１３７細胞内領域で置換（ＣＤ１３７－ＣＡＲ）、及びＣＤ２８とＣＤ１３７の両方からの細胞内シグナル伝達ドメインを含む第３世代ＣＡＲ構築物（ＣＤ２８／ＣＤ１３７－ＣＡＲ）の概略図。構築物の応答性が右に示されている。（Ｄ）ＣＤ２８細胞内ドメインは、ＹＭＮＭ又はＰＹＡＰモチーフでの欠失又は変異のいずれかによって突然変異していた。（Ｅ）共刺激因子ＣＤ８０及びＣＤ８６と共に特異的抗原ＨＬＡ－Ａ２－Ｌ２を発現する、ＣＨＯ－Ｌ２／ＣＤ８０－ＣＤ８６細胞によるＪＣａｍ１．６Ｔ細胞上のＣＡＲ１のＣＤ２８共刺激の概略図である。Ｊｃａｍ１．６細胞におけるＣＤ２８での共刺激に対するＣＡＲ１又はＴＣＲの応答性が右に示されている。この図のすべてのデータは、少なくとも３つの独立した実験を表し、技術的な３連の平均±ＳＤとしてプロットされている。
【図4】ＣＤ２８－ＣＡＲは、ダウンストリームシグナル伝達を伝達する際にＦＹＮに依存する。（Ａ）ＳＦＫ阻害剤ＰＰ２によるＣＡＲ及びＴＣＲ－Ｊｕｒｋａｔの応答性。技術的な３連の平均±ＳＤとしてプロットされている、少なくとも３回の実験の代表的なデータ。（Ｂ）異なる濃度（ｎＭ）での特異的ＬＣＫ又はＦＹＮ阻害剤、それぞれＡ７７００４１又はＳＵ６６５６の存在下でのＣＡＲ及びＴＣＲ－Ｊｕｒｋａｔの応答性。ＩＬ－２の産生は、対数（阻害剤濃度）に対する相対応答（％）として制御するように正規化され、データは技術的な３連の平均±ＳＤとしてプロットされている。（Ｃ）異なる時点でのＦＹＮのリン酸化（ｐＹ４２０）。ＡＰＣは、特異的ＣＨＯ－Ｌ２を意味する。以下に示される数値は、総ＦＹＮの強度値に対するｐＹ４２０バンドの強度値を計算することによって決定されたｐＹ４１６の相対バンド強度を示す。ｃＣＢＬ又はＰＬＣγ１はそれぞれ、ＣＤ２８－ＣＡＲ－Ｊｃａｍ又はＴＣＲ－Ｊｃａｍのローディング対照として示されている。（Ｄ）異なる時点でのＣＡＲ、ＴＣＲ、及びＣＡＲ－１によるＴＣＲシグナル伝達経路分子ＰＬＣγ１、Ｅｒｋ、及びＣＤ３ζのリン酸化。各リン酸化の相対バンド強度は、総ＰＬＣγ１、総Ｅｒｋ、又は総Ｅｒｋの強度値それぞれに対するｐＰＬＣγ１、ｐＥｒｋ１／２、又はｐＣＤ３ζの強度値を計算することによって決定された。（Ｅ）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９による遺伝子編集後のＬＣＫ又はＦＹＮノックアウトＪｕｒｋａｔにおけるＬＣＫ及びＦＹＮの発現。（Ｆ）ＬＣＫ又はＦＹＮノックアウトＪｕｒｋａｔにおけるＴＣＲ及びＣＡＲのＩＬ－２の産生。データは、少なくとも３つの独立した実験を表し、技術的な３連の平均±ＳＤ（＊、ｐ＜０．０５、及び＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１）としてプロットされている。
【図5】ＬＣＫ欠損ＣＡＲ－Ｔは活性化閾値をリセットし、ＣＡＲとＴＣＲの両方を発現するＴ細胞でのＣＡＲトリガーのみを選択的に可能にする。（Ａ）非パルスＨＬＡ－Ａ２ ＣＨＯ ＡＰＣ又は特異的ペプチドパルスＨＬＡ－Ａ２ＣＨＯ ＡＰＣに応答するＣＡＲの発現量が異なるＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔ細胞。左と中央のパネルは、ソーティング後のＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔ細胞でのＣＡＲの発現を示す。右のパネルは、特異的ペプチドパルス又は非パルスＣＨＯ－ＨＬＡ－Ａ２に対するＣＡＲの発現量が異なるＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔの応答性を示す。データは、３つの独立した実験からの技術的な３連の平均±ＳＤとしてプロットされている。（Ｂ）ＣＡＲ－Ｊｃａｍ、ＣＡＲ－ＪＥ６－１、及びＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔ ７６のＣＡＲ活性化特異性の比較。データは、３つの独立した実験からの技術的な３連の平均±ＳＤ（＊、ｐ＜０．０５、＊＊、ｐ＜０．０１、及び＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１）としてプロットされている。（Ｃ）外因性ＬＣＫを含む又は含まないＣＡＲ－Ｊｃａｍ細胞の特異性。左のパネルは、ウエスタンブロットによる形質導入後のＬＣＫの発現を示す。ＦＹＮ染色を対照として使用した。右のパネルは、非パルスＨＬＡ－Ａ２ ＣＨＯ ＡＰＣ又は特異的ペプチドパルスＨＬＡ－Ａ２ ＣＨＯ ＡＰＣに対するＬＣＫ形質導入又は非形質導入ＣＡＲ－Ｊｃａｍ細胞の応答性を示す。データは、３つの独立した実験からの技術的な３連の平均±ＳＤ（＊＊、ｐ＜０．０１、及び＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１）としてプロットされている。（Ｄ）ＬＣＫ十分又は欠損Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞でのＴＣＲ及びＣＡＲ応答性の選択性。上のパネルは、ＬＣＫ十分又は欠損Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞で発現したＥ１８３ペプチド特異的ＴＣＲ又はＬＭＰ２ペプチド特異的ＣＡＲの概略図を示す。下のパネルは、ＣＨＯ－Ｅ１８３又はＣＨＯ－Ｌ２それぞれに対する各群の応答性を示す。ＣＨＯ－Ｅ１８３は、Ｅ１８３ペプチドのみを提示するモノペプチドＣＨＯ ＡＰＣである。同様に、ＣＨＯ－Ｌ２は、Ａ２－ＬＭＰ２ペプチドのみを提示する。データは、少なくとも３つの独立した実験を表し、技術的な３連の平均±ＳＤとしてプロットされている。
【図6】ＬＣＫ欠損ＣＡＲ－Ｔ細胞は、刺激後に、ＰＤ－１の発現が減少し、ＣＡＲのダウンレギュレーションの低下を示す。（Ａ）ＣＨＯ－Ｌ２によるＬ２特異的ＣＡＲ－Ｔの１８時間の刺激後のＰＤ－１アップレギュレーション。ＣＡＲ又はＴＣＲの量はそれぞれ、抗Ｍｙｃタグ抗体又は抗ＣＤ３抗体によって検出された。下のパネルは、上のドットプロットに対応するＰＤ－１及びＣＡＲ又はＣＤ３の発現のヒストグラムである。データは、少なくとも３つの独立した実験を表している。（Ｂ）ＣＡＲ－Ｔ及びＴＣＲ－Ｔでの連続刺激実験の概略図。ＣＡＲ－Ｔ及びＴＣＲ－Ｔは、１８時間目、４２時間目、及び６６時間目に分析のために特異的ＣＨＯ－ＡＰＣで分離され、サンプリングされた。６時間の静置後、ＣＡＲ－Ｔ及びＴＣＲ－Ｔは、２４時間目及び４８時間目に再刺激された。（Ｃ）連続刺激後のＰＤ－１の発現。ＰＤ－１ ＭＦＩは、ＰＤ－１陽性集団の測定によって決定された。データは、技術的な３連の平均±ＳＤ（＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１）としてプロットされている。（Ｄ）連続刺激後のＣＡＲ又はＴＣＲのダウンレギュレーション。パーセンテージは、刺激前の合計ＣＡＲ又はＣＤ３ ＭＦＩに対する刺激後の合計ＣＡＲ又はＣＤ３ＭＦＩの比率によって決定された。データは、技術的な３連の平均±ＳＤ（＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１）としてプロットされている。
【図7】ＣＡＲ－Ｔ及びＴＣＲ－ＴのＣＤ８の動員及び機能的影響。（Ａ）ＣＡＲ－Ｔ及びＴＣＲ－ＴへのＣＤ８α－ｍＣｈｅｒｒｙの形質導入。（Ｂ）蛍光顕微鏡におけるシナプス及びＣＤ８の動員。左のパネルは、代表的な画像グラフ（ｎ≧５）であり、ＧＦＰチャネルは、ＣＨＯ－ＡＰＣＣＤ１９の存在を検出し、ｍＣｈｅｒｒｙは、ＣＤ８α－ｍＣｈｅｒｒｙの局在を検出した。右のパネルは、外部シナプスのｍＣｈｅｒｒｙＭＦＩに対するシナプスのｍＣｈｅｒｒｙＭＦＩによって計算された、平均蛍光強度（ＭＦＩ）比の定量化データである。カットオフ値（１．５）は、青い破線でマークされている。データは、平均±ＳＤ、ｎ≧５細胞コンジュゲート（ｎｓ、ｐ＞０．０５）としてプロットされている。（Ｃ）ＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔ又はＴＣＲ－Ｊｕｒｋａｔ細胞へのＣＤ８α及びＣＤ８β構築物の同時形質導入。ＣＤ８α及びＣＤ８β構築物は、異なるレンチウイルス上にあり、ＣＡＲ又はＴＣＲ－Ｊｕｒｋａｔ細胞に同時形質導入された。（Ｄ）ＣＤ８α及びＣＤ８βの同時形質導入後のＣＡＲ及びＴＣＲの発現。ＨＬＡ－Ａ２－Ｌ２テトラマーが、ＣＡＲ－Ｔ及びＴＣＲ－Ｔ染色に使用された。ＴＣＲの発現は、抗ＣＤ３抗体によっても検出された。合計ＭＦＩは、各グラフの右側に示されている。
【図8】細胞株のＣＨＯ－ＡＰＣ－ＣＤ８０／ＣＤ８６の発現。（Ａ）Ｄａｕｄｉ又はＪｕｒｋａｔ細胞でのＣＤ１９の発現。（Ｂ）Ｊｕｒｋａｔ又はＪｃａｍ１．６細胞株でのＣＤ２８の発現。（Ｃ）ＣＨＯ－Ｌ２ＡＰＣでのＣＤ８０及びＣＤ８６の共発現。ＣＤ８０及びＣＤ８６は、Ｐ２Ａ切断可能リンカーによって連結されていた。ＣＤ８０－Ｐ２Ａ－ＣＤ８６構築物は、１つのレンチウイルスベクター上にあった。
【図9】ＣＡＲ－Ｔ及びＴＣＲ－Ｔに対するＳＲＣファミリーキナーゼ、ＬＣＫ及びＦＹＮの影響。（Ａ）ＳＦＫＰＰ２を含む又は含まないＣＡＲ－Ｊｃａｍ細胞のＩＬ－２の産生。データは、技術的な３連の平均±ＳＤとしてプロットされている（２回以上の実験の代表）。（Ｂ）ＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔ又はＴＣＲ Ｊｕｒｋａｔ細胞に対するＬＣＫ又はＦＹＮ特異的阻害剤のＩＣ５０。左のグラフは、ＬＣＫ阻害剤を使用したものであり、右のグラフは、ＦＹＮ阻害剤を使用したものである。（Ｃ）特異的ＨＬＡ－Ａ２－Ｌ２テトラマーが培地に添加された後のＣＡＲ２－Ｊｃａｍ又はＣＡＲ１－Ｊｃａｍのカルシウム流出。Ｊｃａｍ１．６細胞におけるＣＤ２８共刺激ドメインを有する第２世代ＣＡＲは、ＣＡＲ２－Ｊｃａｍとして標識され、Ｊｃａｍ１．６細胞における第１世代ＣＡＲは、ＣＡＲ１－Ｊｃａｍとして標識された（３回以上の実験の代表）。（Ｄ）ＬＣＫ ＫＯ及びＦＹＮ ＫＯ単一クローンの選択。ＬＣＫ ＫＯにおけるクローン２０がＪｕｒｋａｔ ＬＣＫ ＫＯ細胞として選択され、ＦＹＮ ＫＯにおけるクローン８がＪｕｒｋａｔ ＦＹＮ ＫＯ細胞として選択された。（Ｅ）ＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔ ＦＹＮ ＫＯ及びＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔ、又はＴＣＲ－Ｊｕｒｋａｔ ＦＹＮ ＫＯ及びＴＣＲ－ＪｕｒｋａｔでのＣＡＲ又はＴＣＲの発現の検出。ＣＤ３が、ＴＣＲの発現の指標として使用された。（Ｆ）ＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔ ＦＹＮ ＫＯ及びＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔ、又はＴＣＲ－Ｊｕｒｋａｔ ＦＹＮ ＫＯ及びＴＣＲ－ＪｕｒｋａｔでのＦＹＮ及びＬＣＫの発現。ｃ－ＣＢＬが、内部対照として使用された。
【図10】ＬＣＫ欠損ＣＡＲ－Ｔの特異性及び受容体の選択。（Ａ）ＬＣＫを含む又は含まないＣＡＲ－ＪｃａｍによるＩＬ－２の産生。技術的な３連の平均±ＳＤとしてプロットされている、少なくとも３回の実験からの代表的なデータ。（Ｂ）ＪｕｒｋａｔでのＣＡＲ又はＴＣＲの発現。ＴＣＲは、ＨＢ抗原、Ｅ１８３のペプチドエピトープに特異的である。ＣＡＲは、上記のような特異性を有し、ＬＭＰ２Ａタンパク質のペプチドエピトープ（Ｌ２）であった。
【図11】ＣＡＲシグナル伝達を試験するための系。（Ａ）Ｊｕｒｋａｔ ７６、Ｊｃａｍ１．６、及びＪＥ６．１のＣＤ８及びＣＤ４の発現。（Ｂ）Ｅｌ－ＣＡＲ、Ｌ１－ＣＡＲ、及びＬ２－ＣＡＲのエレクトロポレーション及び１８時間後のそれらの発現（ｎ≧３）。（Ｃ）マルチペプチドＣＨＯ－ＡＰＣ系におけるＨＬＡ－Ａ２及び特異的ペプチドＬ２の提示。ペプチドは、培地中で異なる濃度で３時間パルスされた。次いで、ＣＨＯ－ＡＰＣがトリプシン処理され、抗ＨＬＡ－Ａ２抗体（ＢＢ７．２）又はＬ２特異的ＴＣＲ様抗体のいずれかで染色された（ｎ≧３）。
【図12】連続刺激後のＣＡＲ又はＴＣＲの発現。ＣＡＲ又はＴＣＲの発現は、抗ｍｙｃ又は抗ＣＤ３抗体によって検出された（３回以上の実験の代表）。
【図13】ＣＡＲの標的をＬＣＫ遺伝子座にすると、初代ＣＤ８＋ Ｔ細胞がより多くのメモリーＴ細胞とより少ない消耗表現型に変わり、インビボでの有効性が向上する。（Ａ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９標的ＣＡＲのＬＣＫ遺伝子座への組み込みの概略図。上側、ＬＣＫ遺伝子座。下側、左右の相同アームの１ｋｂフランキング領域を有するＣＡＲカセットを含むＤＮＡドナーのデザイン。（Ｂ）ＬＣＫ－遺伝子座ＣＡＲ－Ｔ、従来のＣＡＲ－Ｔ、及び対照ＣＤ８＋ Ｔ細胞の標的としてのＣＤ１９発現Ｄａｕｄｉ及びＲａｊｉ細胞の細胞毒性アッセイ。細胞毒性（％）は、式（ＬＤＨ放出－陰性）／（ＬＤＨ放出 最大－陰性）によって計算された。データは、３つの独立した実験の代表であり、技術的な３連の平均±ＳＤ（ＮＳ、ｐ＞０．０５）としてプロットされている。（Ｃ）休止状態（ソーティング及びフィーダー細胞による再刺激後５日目）のＴ細胞におけるＣＡＲマーカー、消耗マーカー、及びメモリーマーカーの発現のＦＡＣＳ分析。２人のドナーの代表。（Ｄ）異なるＥ：Ｔ比で標的細胞に接触した後のＴ細胞における消耗マーカー及びメモリーマーカーの発現のレーダーチャートの概要。軸は、Ｔ細胞での発現のパーセンテージである。データは、２つの独立した実験の代表である。（Ｅ）インビボ動物モデルの概略図。癌細胞投与は０日目として指定された。（Ｆ）マウスの生存のカプランマイヤー分析。Ｎ＝５匹のマウス／群、ログランクMantel-Cox検定。（Ｇ、Ｈ）Ｒａｊｉ保有マウスは、５×１０６のＣＡＲ－Ｔ細胞で処置された。１１日目及び１８日目にマウスが安楽死させられた。骨髄ＣＡＲ－Ｔ細胞が分析され、１１日目及び１８日目にメモリーＴ細胞（ＣＤ４５ＲＯ＋）の割合がＦＡＣＳによって検出された。１１日目に消耗マーカーの発現が分析された。Ｎ＝４匹のマウス／群、ドット＝１匹のマウス、ＣＡＲ－Ｔ＝青い四角形のドット、ＬＣＫ－遺伝子座ＣＡＲ－Ｔ＝赤い丸のドット。すべてのデータは平均±ＳＤ（ＮＳ、ｐ＞０．０５、＊、ｐ＜０．０５、及び＊＊、ｐ＜０．０１）である。
【図14】ＬＣＫ遺伝子座ＣＡＲ標的初代ＣＡＲ－Ｔ細胞。（Ａ）ＬＣＫ遺伝子座標的ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集後のＣＤ８＋ＣＡＲ＋ＣＡＲ－Ｔ細胞のパーセンテージ。少なくとも３回の実験からの代表的なデータ。（Ｂ）ソートされたＬＣＫ遺伝子座ＣＡＲ－Ｔ細胞のＬＣＫタンパク質の発現。左側、従来のＣＡＲ－Ｔとの比較。右側、ＬＣＫ遺伝子座ＣＡＲ－Ｔ細胞における切断型ＬＣＫの存在。少なくとも３回の実験からの代表的なデータ。（Ｃ）ＬＣＫ遺伝子の標的部位の遺伝子型決定。フォワードプライマー：5’-AGGGAGAGGTGGTGAAACATTA-3’、リバースプライマー：5’-GAATGGAGTAGGGCATTGAAAG-3’（Ｄ）ＬＣＫ遺伝子座ＣＡＲ－ＴのＣＤ１９＋ Ｄａｕｄｉ細胞及びＣＤ１９－ Ｊｕｒｋａｔ細胞に対する細胞毒性。データは、技術的な３連の平均±ＳＤ（＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１、ＮＳ、ｐ＞０．０５）としてプロットされている。（Ｅ）様々なＥ：Ｔ比で標的細胞に接触した後の従来のＣＡＲ－Ｔ細胞における消耗マーカー及びメモリーマーカーの発現。データは２つの独立した実験の代表である。（Ｆ）５×１０６のＬＣＫ遺伝子座ＣＡＲ－Ｔ細胞群における生存マウスの多臓器における抗ヒトＣＤ２０抗体染色。（Ｇ）ＣＡＲ－Ｔ細胞（ＣＤ８＋／生）及び癌（ＣＤ２０＋／生）細胞は、ＦＡＣＳによって骨髄で検出されてカウントされた。Ｎ＝４匹のマウス／群（ＮＳ、ｐ＞０．０５）。
【発明を実施するための形態】
【0019】
詳細な説明
一態様では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する免疫細胞が提供され、このＣＡＲは、リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ（ＬＣＫ）の非存在下で機能する細胞内シグナル伝達ドメイン又は断片を含み、この免疫細胞は、ＬＣＫの発現及び／又は機能が低下又は消失するように改変されている。
一態様では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する免疫細胞が提供され、このＣＡＲは、リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ（ＬＣＫ）の非存在下で機能する細胞内シグナル伝達ドメイン又は断片を含み、この免疫細胞は、ＬＣＫの発現及び／又は機能が低下又は消失するように改変されている。
【0020】
一実施形態では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する免疫細胞が提供され、このＣＡＲは、ＬＣＫの非存在下又は機能不全ＬＣＫの存在下で機能する細胞内シグナル伝達ドメイン又は断片を含み、この免疫細胞は、ＬＣＫの発現及び／又は機能が低下又は消失するように改変されている。
【0021】
理論に拘束されることなく、本発明者らは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）シグナル伝達における重要なシグナル伝達キナーゼであるＳＲＣファミリーキナーゼＬＣＫがＣＡＲシグナル伝達に重要ではない可能性があることを見出した。ＬＣＫは、ＴＣＲを介したシグナル伝達に極めて重要であるため、ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＬＣＫを欠失させる又は阻害することにより、ＣＡＲによる抗原認識のみがＴ細胞の活性化をもたらすことを確認することができる。これにより、オフターゲット効果が減少し、ＣＡＲ技術の安全性が向上し得る。これはまた、内因性ＴＣＲによって引き起こされる自己免疫の発生を回避し、同種異系ＣＡＲ－Ｔ細胞の移植片対宿主病の可能性を低下させるのに役立ち得る。
【0022】
「キメラ抗原受容体」又は「ＣＡＲ」という語は、免疫エフェクター細胞内にある場合、細胞に標的細胞、典型的には癌細胞に対する特異性、及び細胞内シグナル生成を提供する一連のポリペプチドを指し得る。ＣＡＲは、少なくとも細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び以下に定義される一次シグナル伝達ドメイン及び／又は共刺激ドメインに由来する機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞質シグナル伝達ドメイン（本明細書では「細胞内シグナル伝達ドメイン」とも呼ばれる）を含み得る。一連のポリペプチドは、互いに隣接し得る。いくつかの実施形態では、一連のポリペプチドは、二量化分子が存在すると、ポリペプチドを互いに結合させることができ、例えば、抗原結合ドメインを細胞内シグナル伝達ドメインに結合させることができる二量化スイッチを含む。
【0023】
一実施形態では、ＣＡＲは、表１に示されるように核酸又はアミノ酸配列を有する。
【0024】
一実施形態では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する免疫細胞が提供され、このＣＡＲは、ＬＣＫの非存在下で機能する細胞内シグナル伝達ドメイン又は断片を含み、この免疫細胞は、ＬＣＫの発現及び／又は機能がノックアウト又はノックダウンされるように改変されている。
【0025】
本明細書で使用される「細胞内シグナル伝達ドメイン」という語は、分子の細胞内部分を指す。細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲ含有細胞、例えば、ＣＡＲＴ細胞の免疫エフェクター機能を促進するシグナルを生成する。例えばＣＡＲＴ細胞における免疫エフェクター機能の例には、サイトカインの分泌を含む、細胞溶解活性及びヘルパー活性が含まれる。
【0026】
一実施形態では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する免疫細胞が提供され、このＣＡＲは、ＬＣＫの非存在下で機能するＣＤ２８又はＣＤ２８の断片を含み、この免疫細胞は、ＬＣＫの発現及び／又は機能がノックアウト又はノックダウンされるように改変されている。
【0027】
細胞内シグナル伝達ドメイン又は断片は、ＬＣＫの非存在下又は機能不全ＬＣＫの存在下で機能するものであり得る。ＬＣＫの非存在下又は機能不全ＬＣＫの存在下で機能する細胞内シグナル伝達ドメイン又は断片は、ＦＹＮと相互作用し、及び／又はＦＹＮによってリン酸化され、従ってＬＣＫ非依存性シグナル伝達を引き起こすことができるものであり得る。細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、ＡＤＤ２、ＢＣＡＲ１、ｃ－Ｒａｆ、ＣＢＬＣ、ＣＤ２８、ＣＤ３６、ＣＤ４４、ＣＤＨ１、ＣＨＲＮＡ７、ＣＴＮＮＤ１、ＣＢＬ、ＣＳＦ１Ｒ、ＤＬＧ４、ジストログリカン、ＥＰＨＡ８、ＦＹＢ、ＦＡＳＬＧ、ＧＮＢ２Ｌ１、ＧＲＩＮ２Ａ、ＩＴＫ、ヤーヌスキナーゼ２、ＫＨＤＲＢＳ１、ＬＫＢ１、ネフリン、ＰＡＧ１、ＰＩＫ３Ｒ２、ＰＲＫＣＱ、ＰＴＫ２Ｂ、ＰＴＫ２、ＰＴＰＲＴ、ＵＮＣ１１９、ＲＩＣＳ、ＳＨ２Ｄ１Ａ、ＳＫＡＰ１、Ｓｙｋ、ＴＮＫ２、ＴＲＰＣ６、タウタンパク質、ＴｒｋＢ、ＴＹＫ２、ＴＵＢＡ３Ｃ、ＷＡＳ、又はＺＡＰ－７０のシグナル伝達ドメイン又は断片を含み得る。ＬＣＫの非存在下又は機能不全ＬＣＫの存在下で機能する細胞内シグナル伝達ドメイン又は断片は、ＬＣＫ非依存性シグナル伝達を誘発することができるＣＤ２８又はＣＤ２８の断片であり得る。一実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＬＣＫの非存在下又は機能不全ＬＣＫの存在下で機能するＣＤ２８タンパク質のシグナル伝達ドメイン又は断片を含む。
【0028】
一実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＰＹＡＰモチーフを有するＣＤ２８タンパク質のシグナル伝達ドメイン又は断片を含む。一実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS（配列番号１）の配列を含む。
【0029】
一実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、共通ＦｃＲγ、ＦｃεＲＩβ、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＦｃγＲＩＩａ、ＤＡＰ１０、又はＤＡＰ１２から選択されるタンパク質の機能的シグナル伝達ドメインを含む一次シグナル伝達ドメインをさらに含む。細胞内シグナル伝達ドメインは、以下に定義されるように、少なくとも１つの共刺激ドメインに由来する１つ又は複数の機能的シグナル伝達ドメインをさらに含み得る。一実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＤＡＰ１０、ＣＤ２８、ＣＡＲＤ１１、ＳＬＡＭＦ１、ＬＣＫ１、ＬＣＫ３、ＬＡＴ、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、及び４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）からなる群から選択されるタンパク質の機能的シグナル伝達ドメインを含む共刺激ドメインを含む。
【0030】
一実施形態では、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメインを含む。抗原結合ドメインは、例えば、抗体又は抗体断片であり得る。抗原結合ドメインはまた、Ｂリンパ球上の自己抗原特異的Ｂ細胞受容体によって認識され得る自己抗原であり得、従って、抗体媒介性自己免疫疾患において自己反応性Ｂリンパ球を特異的に標的化して殺すようにＴ細胞を誘導する。抗原結合ドメインはまた、ペプチド又はタンパク質リガンドであり得る。
【0031】
本明細書で使用される「抗体」という語は、抗原と特異的に結合する免疫グロブリン分子に由来するタンパク質又はポリペプチド配列を指し得る。抗体は、ポリクローナル若しくはモノクローナル、多鎖若しくは単鎖、又は無傷の免疫グロブリンであり得、天然源若しくは組換え源に由来し得る。
【0032】
「抗体断片」という語は、抗原のエピトープと特異的に相互作用する能力を保持する抗体の少なくとも一部を指し得る。抗体断片の例には、限定されるものではないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ抗体断片、ジスルフィド連結Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、ＶＨ及びＣＨＩドメインからなるＦｄ断片、線状抗体、ｓｄＡｂ（ＶＬ又はＶＨのいずれか）などの単一ドメイン抗体、ラクダＶＨＨドメイン、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片などの抗体断片から形成された多重特異的抗体、及び単離されたＣＤＲ又は抗体の他のエピトープ結合断片が含まれる。抗原結合断片は、単一ドメイン抗体、マキシボディ、ミニボディ、ナノボディ、イントラボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ｖ－ＮＡＲ、及びｂｉｓ－ｓｃＦｖに組み込むこともできる。
【0033】
一実施形態では、「抗体断片」は、ｓｃＦＶである。
【0034】
「ｓｃＦｖ」という語は、軽鎖の可変領域を含む少なくとも１つの抗体断片、及び重鎖の可変領域を含む少なくとも１つの抗体断片を含み、軽鎖及び重鎖の可変領域が、例えば、合成リンカー、例えば、短い柔軟なポリペプチドリンカーを介して隣接して連結され、単鎖ポリペプチドとして発現することができる融合タンパク質を指し、ｓｃＦｖは、それが由来する無傷の抗体の特異性を保持する。特に明記しない限り、本明細書で使用されるｓｃＦｖは、例えば、ポリペプチドのＮ末端及びＣ末端に関して、ＶＬ及びＶＨ可変領域をいずれかの順序で有し得、ｓｃＦｖは、ＶＬ－リンカー－ＶＨを含んでもよいし、又はＶＨ－リンカー－ＶＬを含んでもよい。
【0035】
ＣＡＲは、抗原結合ドメインとも呼ばれる標的特異的結合要素を含み得る。部分の選択は、標的細胞の表面を定義するリガンドの種類及び数に依存する。例えば、抗原結合ドメインは、特定の病状に関連する標的細胞上の細胞表面マーカーとして作用するリガンドを認識するように選択することができる。従って、ＣＡＲの抗原部分ドメインのリガンドとして作用し得る細胞表面マーカーの例には、ウイルス、細菌、及び寄生虫感染、自己免疫疾患、並びに癌細胞に関連するものが含まれる。
【0036】
ＣＡＲは、腫瘍細胞上の抗原に特異的に結合する所望の抗原結合ドメインをエンジニアリングすることによって、目的の腫瘍抗原を標的とするようにエンジニアリングすることができる。本発明の文脈において、「腫瘍抗原」又は「過剰増殖性障害抗原」又は「過剰増殖性障害に関連する抗原」は、癌などの特定の過剰増殖性障害に共通する抗原を指す。本明細書で論じられる抗原は、単なる例として含められている。このリストは、排他的であることを意図しておらず、さらなる例は、当業者には容易に明らかになるであろう。
【0037】
腫瘍抗原は、免疫応答、特にＴ細胞媒介性免疫応答を誘発する腫瘍細胞によって産生されるタンパク質である。本発明の抗原結合ドメインの選択は、処置される特定の種類の癌に依存する。腫瘍抗原は、当技術分野で周知であり、例えば、神経膠腫関連抗原、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、β－ヒト絨毛性ゴナドトロピン、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、レクチン反応性ＡＦＰ、サイログロブリン、ＲＡＧＥ－１、ＭＮ－ＣＡ ＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、腸カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２、Ｍ－ＣＳＦ、プロスターゼ、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＥ－１ａ、ｐ５３、プロスタイン、ＰＳＭＡ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、サバイビン及びテロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原－１（ＰＣＴＡ－１）、ＭＡＧＥ、ＥＬＦ２Ｍ、好中球エラスターゼ、エフリンＢ２、ＣＤ２２、インスリン成長因子（ＩＧＦ）－Ｉ、ＩＧＦ－ＩＩ、ＩＧＦ－Ｉ受容体、葉酸受容体（ＦＲａ）、及びメソテリンが含まれる。好ましい実施形態では、腫瘍抗原は、葉酸受容体（ＦＲａ）、メソテリン、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＩＬ－１３Ｒａ、ＥＧＦＲ、ＣＡ－ＩＸ、ＭＵＣ１、ＨＥＲ２、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。一実施形態では、第１のＣＡＲは、メソテリンに結合する抗原結合ドメインを含み、第２のＣＡＲは、ＦＲａに結合する抗原結合ドメインを含む。一実施形態では、ＣＡＲは、ＨＥＲ２に結合する抗原結合ドメインを含む。
【0038】
一実施形態では、腫瘍抗原は、悪性腫瘍に関連する１つ又は複数の抗原性癌エピトープを含む。悪性腫瘍は、免疫攻撃の標的抗原として機能し得るいくつかのタンパク質を発現する。これらの分子には、限定されるものではないが、黒色腫におけるＭＡＲＴ－１、チロシナーゼ、及びＧＰ １００などの組織特異的抗原、並びに前立腺癌における前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）及び前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）が含まれる。他の標的分子は、癌遺伝子ＨＥＲ－２／Ｎｅｕ／ＥｒｂＢ－２などの形質転換関連分子の群に属する。標的抗原のさらに別の群は、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）などの腫瘍胎児性抗原である。Ｂ細胞リンパ腫では、腫瘍特異的イディオタイプ免疫グロブリンは、個々の腫瘍に特有の真に腫瘍特異的な免疫グロブリン抗原を構成する。ＣＤ１９、ＣＤ２０、及びＣＤ３７などのＢ細胞分化抗原は、Ｂ細胞リンパ腫の標的抗原の他の候補である。これらの抗原のいくつか（ＣＥＡ、ＨＥＲ－２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、イディオタイプ）は、モノクローナル抗体を用いる受動免疫療法の標的として使用されてきたが、成功は限定されている。
【0039】
本発明で言及される腫瘍抗原のタイプはまた、腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）又は腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）であり得る。ＴＳＡは、腫瘍細胞に特有であり、体内の他の細胞では発生しない。ＴＡＡ関連抗原は、腫瘍細胞に特有ではなく、それどころか、抗原に対する免疫寛容の状態を誘発できない条件下で正常細胞でも発現する。腫瘍上での抗原の発現は、免疫系が抗原に応答することを可能にする条件下で起こり得る。ＴＡＡは、免疫系が未成熟で応答できない胎児の発育中に正常細胞に発現する抗原である場合もあるし、又は正常細胞では極端に低いレベルで通常存在するが、腫瘍細胞でははるかに高いレベルで発現する抗原である場合もある。
【0040】
ＴＳＡ又はＴＡＡ抗原の非限定的な例には、以下が含まれる：ＭＡＲＴ－１／ＭｅｌａｎＡ（ＭＡＲＴ－Ｉ）、ｇｐ１００（Ｐｍｅｌ １７）、チロシナーゼ、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２などの分化抗原、及びＭＡＧＥ－１、ＭＡＧＥ－３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ－１、ＧＡＧＥ－２、ｐｌ５などの腫瘍特異的多系統抗原；ＣＥＡなどの過剰発現した胚性抗原；過剰発現癌遺伝子及びｐ５３、Ｒａｓ、ＨＥＲ－２／ｎｅｕなどの変異腫瘍抑制遺伝子；染色体転座に起因する特有の腫瘍抗原；ＢＣＲ－ＡＢＬ、Ｅ２Ａ－ＰＲＬ、Ｈ４－ＲＥＴ、ＩＧＨ－ＩＧＫ、ＭＹＬ－ＲＡＲなど；並びにエプスタインバーウイルス抗原ＥＢＶＡ、ＬＭＰ２（例えば、ＬＭＰ２Ａ又はＬＭＰ２Ｂ）及びヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原Ｅ６及びＥ７などのウイルス抗原。他の大きなタンパク質ベースの抗原には、ＴＳＰ－１８０、ＭＡＧＥ－４、ＭＡＧＥ－５、ＭＡＧＥ－６、ＲＡＧＥ、ＮＹ－ＥＳＯ、ｐ１８５ｅｒｂＢ２、ｐ１８０ｅｒｂＢ－３、ｃ－ｍｅｔ、ｎｍ－２３Ｈ１、ＰＳＡ、ＴＡＧ－７２、ＣＡ １９－９、ＣＡ ７２－４、ＣＡＭ １７．１、ＮｕＭａ、Ｋ－ｒａｓ、β－カテニン、ＣＤＫ４。Ｍｕｍ－１、ｐ １５、ｐ １６、４３－９Ｆ、５Ｔ４、７９１Ｔｇｐ７２、α－フェトプロテイン、β－ＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ １２５、ＣＡ Ｉ５－３＼ＣＡ ２７．２９＼ＢＣＡＡ、ＣＡ １９５、ＣＡ ２４２、ＣＡ－５０、ＣＡＭ４３、ＣＤ６８＼Ｐ１、ＣＯ－０２９、ＦＧＦ－５、Ｇ２５０、Ｇａ７３３＼ＥｐＣＡＭ、ＨＴｇｐ－１７５、Ｍ３４４、ＭＡ－５０、ＭＧ７－Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ／７０Ｋ、ＮＹ－ＣＯ－１、ＲＣＡＳ１、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ－９０＼Ｍａｃ－２結合タンパク質＼シクロフィリンＣ関連タンパク質、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰ、及びＴＰＳが含まれる。
【0041】
一実施形態では、ｓｃＦＶは、抗ＣＤ１９ ｓｃＦＶドメインである。抗ＣＤ１９ ｓｃＦＶドメインは、例えば、（ａ）
の配列を有し得る。
【化1】
の配列を有し得る。
【0042】
一実施形態では、ｓｃＦＶは、ＬＭＰ２Ａタンパク質ペプチドの１つを提示するペプチド－ＭＨＣ複合体に結合することができるｓｃＦＶＣである。ｓｃＦＶは、例えば、（ａ）
の配列を有し得る。
【化2】
の配列を有し得る。
【0043】
一実施形態では、ｓｃＦＶは、抗ＬＭＰ２ ｓｃＦＶドメインである。
【0044】
「抗体断片」は、標的とされる抗原に応じて、当技術分野で公知の他の抗体の抗体断片配列を含み得る。
【0045】
一実施形態では、キメラ抗原受容体は、シグナルペプチドをさらに含む。シグナルペプチドは、例えば、MALPVTALLLPLALLLHAARP（配列番号４）の配列を有し得る。
【0046】
ＣＡＲは、表１に示されるようなタンパク質配列を有するＣＡＲであり得る。
【0047】
一実施形態では、免疫細胞は組換え免疫細胞である。「組換え」という語は、異種核酸の導入によって改変された細胞、又はそのような方法で改変されているが、意図的な人的介入なしに発生する事象などの自然に発生する事象（例えば、自発的突然変異、自然形質転換、自然形質導入、自然転位）による細胞の改変を含まない細胞に由来する細胞への言及を含む。組換え免疫細胞は、自然に発生しない細胞であり得る。組換え免疫細胞はまた、エンジニアリングされた細胞であり得る。一実施形態では、組換え免疫細胞は、エンジニアリングされたＴ細胞又はエンジニアリングされたＮＫ細胞などのエンジニアリングされた免疫細胞である。一実施形態では、組換え免疫細胞は、単離された免疫細胞である。
【0048】
一実施形態では、免疫細胞は、Ｔ細胞又はＮＫ細胞である。
【0049】
本明細書で言及される「免疫細胞」という語は、造血起源であり、免疫応答において役割を果たす細胞を含む。免疫細胞には、Ｂ細胞やＴ細胞などのリンパ球；ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞；単球、マクロファージ、樹状細胞、好酸球、肥満細胞、好塩基球、及び顆粒球などの骨髄細胞が含まれる。
【0050】
一実施形態では、免疫細胞は、免疫エフェクター細胞である。本明細書で使用される「免疫エフェクター細胞」という語は、免疫応答、例えば、免疫エフェクター応答の促進に関与する細胞を指す。免疫エフェクター細胞の例には、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、肥満細胞、及び骨髄由来食細胞が含まれる。
【0051】
本明細書で使用される「免疫エフェクター機能又は免疫エフェクター応答」という語は、例えば免疫エフェクター細胞の、標的細胞の免疫攻撃を増強又は促進する機能又は応答を指す。例えば、免疫エフェクターの機能又は応答は、標的細胞の死滅又は成長若しくは増殖の阻害を促進するＴ細胞又はＮＫ細胞の特性を指す。Ｔ細胞の場合、一次刺激及び共刺激は、免疫エフェクターの機能又は応答の例である。
【0052】
「刺激」という語は、刺激性分子（例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体又はＣＡＲ）とその同族リガンド（又はＣＡＲの場合は腫瘍抗原）と結合し、それによって、限定されるものではないが、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介したシグナル伝達、又は適切なＮＫ受容体若しくはＣＡＲのシグナル伝達ドメインを介したシグナル伝達などのシグナル伝達事象を媒介することによって誘導される一次応答を指す。刺激は、特定の分子の発現の変化を媒介することができる。
【0053】
本明細書で使用される「Ｔ細胞」という語は、ＣＤ４＋ Ｔ細胞及びＣＤ８＋ Ｔ細胞を含む。Ｔ細胞という語はまた、Ｔヘルパー１型Ｔ細胞及びＴヘルパー２型Ｔ細胞の両方、並びにＴｈ－ＩＬ １７細胞も含む。
【0054】
一実施形態では、免疫細胞は、ＬＣＫの発現及び／又は機能が低下又は消失するように改変されている。免疫細胞は、例えば、ＬＣＫノックアウト又はノックダウンを得るために改変することができる。「ノックアウト」という語は、遺伝子又は遺伝子の発現の消失を指し得る。例えば、遺伝子は、リーディングフレームの破壊につながるヌクレオチド配列の欠失又は付加のいずれかによってノックアウトすることができる。別の例として、遺伝子は、その一部を非関連配列で置き換えることによってノックアウトすることができる。他方、「ノックダウン」という語は、遺伝子又はその遺伝子産物の発現の低下を指し得る。遺伝子ノックダウンの結果として、タンパク質の活性又は機能が弱められ得るか、タンパク質レベルが低下又は消失し得る。
【0055】
一実施形態では、免疫細胞は、ＬＣＫの阻害剤を含むか、又はそれと接触する。
【0056】
ＬＣＫの阻害剤は、ＬＣＫの遺伝子発現をダウンレギュレート若しくは消失させる、又はＬＣＫの機能を改変することができる核酸配列であり得る。
【0057】
核酸は、ＬＣＫの遺伝子発現をダウンレギュレート若しくは消失させる、又はＬＣＫの機能を改変することができる核酸であり得、アンチセンスＲＮＡ、アンタゴミールＲＮＡ（antagomir RNA）、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ系、ジンクフィンガーヌクレアーゼ系、及び転写活性化因子様エフェクターベースのヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）系からなる群から選択される。一実施形態では、核酸は、ＬＣＫを分解するか、又は間接的に細胞内のＬＣＫの分解をもたらすプロテアーゼと結合した細胞内抗体をコードする。
【0058】
部位特異的ヌクレアーゼを使用して生細胞のゲノムのＤＮＡ切断を行うことが可能であり、そのようなＤＮＡ切断が、変異原性非相同末端結合（ＮＨＥＪ）修復を介して、又はトランスジェニックＤＮＡ配列での相同組換えを介して、ゲノムの恒久的な改変をもたらし得ることは当技術分野で公知である。ＮＨＥＪは、切断部位で突然変異誘発を引き起こして、対立遺伝子の不活性化をもたらし得る。ＮＨＥＪ関連突然変異誘発は、早期終止コドンの生成、異常な非機能性タンパク質を生成するフレームシフト突然変異を介して対立遺伝子を不活性化し得るか、又はナンセンス媒介ｍＲＮＡ分解などのメカニズムを引き起こし得る。ＮＨＥＪを介して突然変異誘発を誘導するためのヌクレアーゼの使用は、野生型対立遺伝子に存在する特定の突然変異又は配列を標的にするために利用することができる。標的遺伝子座に二本鎖切断を誘導するためのヌクレアーゼの使用は、相同組換え修復（ＨＤＲ）、特にゲノム標的に相同な配列に隣接するトランスジェニックＤＮＡ配列が刺激されることが知られている。このようにして、外因性の核酸配列を標的遺伝子座に挿入することができる。そのような外因性核酸は、例えば、キメラ抗原受容体、外因性ＴＣＲ、又は任意の目的の配列若しくはポリペプチドをコードすることができる。
【0059】
異なる実施形態では、様々な異なるタイプのヌクレアーゼが本発明を実施するために有用である。一実施形態では、本発明は、組換えメガヌクレアーゼを使用して実施することができる。別の実施形態では、本発明は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを使用して実施することができる。所定のＤＮＡ部位を認識するＣＲＩＳＰＲを作製するための方法は当技術分野で公知である。別の実施形態では、本発明は、ＴＡＬＥＮ又はＣｏｍｐａｃｔ ＴＡＬＥＮを使用して実施することができる。さらなる実施形態では、本発明は、メガＴＡＬを使用して実施することができる。
【0060】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系に基づいてエンジニアリングされたエンドヌクレアーゼも当技術分野で公知である。ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼは、２つの成分：（１）カスパーゼエフェクターヌクレアーゼ、典型的には微生物Ｃａｓ９；及び（２）ヌクレアーゼをゲノム内の目的の位置に誘導するヌクレオチド標的配列を含む短い「ガイドＲＮＡ」を含む。
【0061】
「ＣＲＩＳＰＲ」という語は、Ｃａｓ９などのカスパーゼと、ゲノムＤＮＡの認識部位にハイブリダイズすることによってカスパーゼのＤＮＡ切断を誘導するガイドＲＮＡとを含むカスパーゼベースのエンドヌクレアーゼを指す。ノックアウト用のガイドＲＮＡは、表２に示されるガイドＲＮＡであり得る。一実施形態では、ガイドＲＮＡは、細胞におけるＬＣＫ遺伝子の発現をノックダウンするために配列番号４３と共に使用される。一実施形態では、ガイドＲＮＡは配列番号１０である。
【0062】
一実施形態では、ＬＣＫの阻害剤は、ＬＣＫタンパク質の阻害剤である。ＬＣＫの阻害剤は、ＬＣＫキナーゼ活性の阻害剤であり得る。ＬＣＫの阻害剤は、アミノキナゾリン、Ａ－４２０９８３、Ａ７７００４１、ダサチニブ、サラクチニブ（Saractinib）、及びマサチニブ（Masatinib）からなる群から選択することができる。
【0063】
一実施形態では、免疫細胞は、ＬＣＫの発現及び／又は機能が低下又は消失するように改変されていない細胞と比較して、ＰＤ－１の発現が低下している。これにより、Ｔ細胞が消耗する傾向が減少し得る。これはまた、固形腫瘍に対するＣＡＲ－Ｔ細胞応答を改善し得る。
【0064】
一実施形態では、免疫細胞は、ＣＡＲをコードする核酸を含むベクターを含む。一実施形態では、免疫細胞は、ＬＣＫの遺伝子発現をダウンレギュレート又は消失させることができるＬＣＫの阻害剤をコードする核酸を含むベクターを含む。一実施形態では、免疫細胞は、ＣＡＲをコードする核酸と、ＬＣＫの遺伝子発現をダウンレギュレート又は消失させることができるＬＣＫの阻害剤をコードする核酸とを含むベクターを含む。
【0065】
「ベクター」又は「発現構築物」という語は、特定の細胞における動作可能に連結されたコード配列（例えば、産物をコードする挿入配列）の発現に必要な所望のコード配列及び適切な核酸配列を含む核酸分子を指し得る。発現ベクター構築物は、発現のための十分なシス作用要素を含み得；発現のための他の要素は、宿主細胞によって、又はインビトロ発現系において供給することができる。発現ベクター構築物には、コスミド、プラスミド（例えば、裸又はリポソームに含められた）、及び組換えポリヌクレオチドを取り込んだウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス）を含む、当技術分野で公知であるすべてのものが含まれる。
【0066】
「ベクター」はまた、単離された核酸を含み、単離された核酸を細胞の内部に送達するために使用することができる組成物を指す「導入ベクター」であり得る。限定されるものではないが、線状ポリヌクレオチド、イオン性又は両親媒性化合物に関連するポリヌクレオチド、プラスミド、及びウイルスを含む、多数のベクターが当技術分野で公知である。従って、「導入ベクター」という語は、自律的に複製するプラスミド又はウイルスを含む。この語はまた、例えば、ポリリジン化合物及びリポソームなどの、細胞への核酸の導入を容易にする非プラスミド及び非ウイルス化合物をさらに含むと解釈されるべきである。ウイルス導入ベクターの例には、限定されるものではないが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、及びレンチウイルスベクターなどが含まれる。
【0067】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲ配列は、レトロウイルス又はレンチウイルスベクターを使用して細胞に送達される。ＣＡＲ発現レトロウイルス及びレンチウイルスベクターは、形質導入細胞を担体として使用するか、又はカプセル化、結合、若しくは裸のベクターの無細胞局所若しくは全身送達を使用して、様々なタイプの真核細胞、並びに組織及び生物全体に送達することができる。使用する方法は、安定した発現が必要又は十分であるあらゆる目的に使用することができる。
【0068】
「発現」という語は、プロモーターによって駆動される特定のヌクレオチド配列の転写及び／又は翻訳を指し得る。
【0069】
「コードする（encode）」又は「コードしている（encoding）」という語は、転写及び／又は翻訳の意味で他のヌクレオチド又はアミノ酸に対応するヌクレオチド及び／又はアミノ酸への言及を含む。
【0070】
「核酸」という語は、一本鎖又は二本鎖形態のいずれかのデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドポリマーを含み、特段の限定がない限り、天然に存在するヌクレオチドと同様の方法で核酸にハイブリダイズする天然ヌクレオチドの既知の類似体を包含する。「核酸」、「核酸分子」、「核酸配列」、及び「ポリヌクレオチド」という語は、文脈が別段の指示をしない限り、本明細書では同義に使用される。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子又は遺伝子断片（例えば、プローブ、プライマー、ＥＳＴ、又はＳＡＧＥタグ）、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡｉ剤、及びプライマー。ポリヌクレオチドは、本明細書に記載又は当技術分野で公知の様々な改変又は置換のいずれかを用いて、１つ又は複数の塩基、糖、及び／又はリン酸で改変又は置換することができる。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド及びヌクレオチド類似体などの改変ヌクレオチドを含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造の改変は、ポリマーの構築の前又は後に付与することができる。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断することができる。ポリヌクレオチドは、標識成分との結合などによって、重合後にさらに改変することができる。この語はまた、二本鎖分子と一本鎖分子の両方を指す。特段の指定又は要求がない限り、ポリヌクレオチドである本発明の任意の実施形態は、二本鎖形態と、二本鎖形態を構成することが公知であるか又は予測される２つの相補的な一本鎖形態のそれぞれとの両方を包含する。いくつかの文脈において、「核酸」又は「ポリヌクレオチド」などの語は、たとえ厳密にヌクレオチド（糖、塩基、及びリン酸からなる）で構成されていなくても、遺伝情報を伝達するか、又は核酸又はポリヌクレオチドの機能を実行する（例えば、タンパク質に翻訳されるか、又はＲＮＡｉ剤として作用し得る）任意の物質を包含し；そのような遺伝物質は、非限定的な例として、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、モルホリノヌクレオチド、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、アラビノース核酸（ＡＮＡ）、２’－フルオロアラビノース核酸（ＦＡＮＡ）、シクロヘキセン核酸（ＣｅＮＡ）、アンヒドロヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、及び／又はアンロックド核酸（ＵＮＡ）を含み得る。
【0071】
「タンパク質」及び「ポリペプチド」という語は、同義に使用され、ペプチド結合又は改変ペプチド結合を介して連結されたアミノ酸の任意のポリマー（ジペプチド以上）を指し得る。約１０～２０個未満のアミノ酸残基のポリペプチドは、一般に「ペプチド」と呼ばれる。本発明のポリペプチドは、炭水化物群などの非ペプチド成分を含み得る。炭水化物及び他の非ペプチド置換基は、ポリペプチドが産生される細胞によってポリペプチドに付加することができ、細胞の種類によって異なる。ポリペプチドは、それらのアミノ酸骨格構造に関して本明細書で定義され；炭水化物群などの置換基は、一般的には特定されないが、それでも存在し得る。
【0072】
ＣＡＲを発現する免疫細胞が本明細書で提供され、この免疫細胞は、ＬＣＫ遺伝子が破壊されるように改変されている。ＣＡＲを発現する免疫細胞が本明細書で提供され、この免疫細胞は、ＬＣＫ遺伝子の発現又は機能が破壊されるように改変されている。一実施形態では、ＬＣＫ遺伝子が破壊されているＣＡＲＴ細胞が提供される。一実施形態では、ＬＣＫ遺伝子の発現又は機能が破壊されているＣＡＲＴ細胞が提供される。一実施形態では、ＣＡＲＴ細胞又はＣＡＲを発現する免疫細胞においてＬＣＫ遺伝子を破壊する方法が提供される。一実施形態では、ＣＡＲＴ細胞又はＣＡＲを発現する免疫細胞におけるＬＣＫ遺伝子の発現又は機能を破壊する方法が提供される。
【0073】
「破壊」及び「破壊された」という語は、本明細書では同義に使用され、核酸又はその発現産物の発現及び／又は機能的活性を低下又は消失させる任意の遺伝子改変を指す。例えば、遺伝子の破壊は、その範囲内に、遺伝子の発現及び／又は対応する遺伝子産物（例えば、ｍＲＮＡ及び／又はタンパク質）の機能的活性を低下又は消失させる任意の遺伝子改変を含む。遺伝子改変には、核酸（例えば、遺伝子）の完全又は部分的な不活性化、抑制、欠失、中断、遮断、又はダウンレギュレーションが含まれる。例示的な遺伝子改変には、限定されるものではないが、遺伝子ノックアウト、不活性化、突然変異（例えば、遺伝子産物の発現又は活性を破壊する挿入、欠失、点、又はフレームシフト突然変異）、又は阻害性核酸の使用（例えば、センス又はアンチセンスＲＮＡなどの阻害性ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなどのＲＮＡ干渉を媒介する分子）、阻害性ポリペプチド（例えば、抗体、ポリペプチド結合パートナー、ドミナントネガティブポリペプチド、酵素など）、又はＬＣＫ遺伝子の活性若しくはＬＣＫ遺伝子の発現産物のレベル若しくは機能的活性を阻害するその他の分子が含まれる。
【0074】
一態様では、本明細書で定義される免疫細胞を製造（又は調製）する方法が提供され、この方法は、ＬＣＫの発現及び／又は機能を低下又は消失させるのに十分な時間及び条件下で、免疫細胞をＬＣＫの阻害剤と接触させることを含む。ＬＣＫの阻害剤は、遺伝子発現をダウンレギュレート又は消失させる、又はＬＣＫの機能を改変することができる核酸配列であり得る。一実施形態では、ＬＣＫの阻害剤はＣＲＩＳＰＲ系である。この方法は、ＣＡＲをコードする核酸を免疫細胞に導入することをさらに含み得る。この方法は、患者から免疫細胞を採取する事前の工程を含み得る。
【0075】
一実施形態では、ＬＣＫの阻害剤をコードする核酸が提供される。一実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸が提供される。一実施形態では、ＬＣＫの阻害剤をコードする核酸及びＣＡＲをコードする核酸を含む核酸が提供される。
【0076】
一態様では、１）ＬＣＫの阻害剤をコードする核酸配列を含むベクター、及び２）ＣＡＲをコードする核酸配列を含むベクターを含むベクター系が提供される。
【0077】
一態様では、ＬＣＫの阻害剤をコードする核酸配列及びＣＡＲをコードする核酸配列を含むベクターが提供される。
【0078】
一実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸配列はＬＣＫの阻害剤でもある。
【0079】
一実施形態では、本発明は、本明細書に記載の免疫細胞又はベクター、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
【0080】
「薬学的に許容される担体」とは、動物、好ましくはヒトを含む哺乳動物への局所又は全身投与において安全に使用することができる固体又は液体の充填剤、希釈剤、又は封入物質を意味する。代表的な薬学的に許容される担体には、当業者には公知であろう、ありとあらゆる溶媒、分散媒体、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、防腐剤（例えば、抗菌剤、抗真菌剤）、等張剤、吸収遅延剤、塩、防腐剤、薬物、薬物安定剤、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味剤、香味剤、染料、このような物質など、及びそれらの組み合わせが含まれる（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990, pp. 1289-1329を参照されたい）。どの従来の担体も活性成分と不適合である場合を除いて、医薬組成物におけるその使用が企図されている。
【0081】
一態様では、細胞療法におけるＣＡＲ発現免疫細胞の有効性を改善する方法が提供され、この方法は、ＬＣＫの発現及び／又は機能を低下又は消失させるのに十分な時間及び条件下で、ＣＡＲ発現免疫細胞をＬＣＫの阻害剤と接触させることを含む。
【0082】
一実施形態では、ＣＡＲ発現免疫細胞はＣＡＲＴ細胞である。
【0083】
一実施形態では、ＣＡＲ発現免疫細胞のオフターゲット効果が減少する。一実施形態では、ＣＡＲ発現細胞における消耗表現型が減少している。一実施形態では、ＣＡＲ発現免疫細胞のメモリーが改善される。
【0084】
細胞療法におけるＣＡＲ発現免疫細胞のオフターゲット効果を減少する方法が本明細書で開示され、この方法は、ＬＣＫの発現及び／又は機能を低下又は消失させるのに十分な時間及び条件下で、ＣＡＲ発現免疫細胞をＬＣＫの阻害剤と接触させることを含む。
【0085】
細胞療法においてＣＡＲ発現免疫細胞の消耗表現型を減少する方法が本明細書で開示され、この方法は、ＬＣＫの発現及び／又は機能を低下又は消失させるのに十分な時間及び条件下で、ＣＡＲ発現免疫細胞をＬＣＫの阻害剤と接触させることを含む。
【0086】
細胞療法においてＣＡＲ発現免疫細胞のメモリーを改善する方法が本明細書で開示され、この方法は、ＬＣＫの発現及び／又は機能を低下又は消失させるのに十分な時間及び条件下で、ＣＡＲ発現免疫細胞をＬＣＫの阻害剤と接触させることを含む。
【0087】
一態様では、それを必要とする対象を処置する方法が提供され、この方法は、対象を処置するのに十分な時間及び条件下で、本明細書で定義される免疫細胞を投与することを含む。
【0088】
一実施形態では、対象は、腫瘍抗原の発現に関連する疾患（例えば、増殖性疾患、前癌状態、癌、及び腫瘍抗原の発現に関連する非癌関連の徴候）を有する。
【0089】
「本明細書に記載の腫瘍抗原の発現に関連する疾患」という句は、限定されるものではないが、例えば、癌若しくは悪性腫瘍などの増殖性疾患、又は骨髄異形成、骨髄異形成症候群、若しくは前白血病などの前癌状態；又は本明細書に記載の腫瘍抗原を発現する細胞に関連する非癌関連の徴候を含む、本明細書に記載の腫瘍抗原の発現に関連する疾患、又は本明細書に記載の腫瘍抗原を発現する細胞に関連する状態を含む。一態様では、本明細書に記載の腫瘍抗原の発現に関連する癌は血液癌である。一態様では、本明細書に記載の腫瘍抗原の発現に関連する癌は固形癌である。本明細書に記載の腫瘍抗原の発現に関連するさらなる疾患には、限定されるものではないが、例えば、非定型及び／又は非古典的癌、悪性腫瘍、前癌状態、又は本明細書に記載の腫瘍抗原の発現に関連する増殖性疾患が含まれる。本明細書に記載の腫瘍抗原の発現に関連する非癌関連の徴候には、限定されるものではないが、例えば、自己免疫疾患（例えば、狼瘡）、炎症性障害（アレルギー及び喘息）、及び移植が含まれる。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原発現細胞は、腫瘍抗原をコードするｍＲＮＡを発現する、又はいかなる時も発現した。一実施形態では、腫瘍抗原発現細胞は、腫瘍抗原タンパク質（例えば、野生型又は突然変異体）を産生し、腫瘍抗原タンパク質は、正常レベル又は低下したレベルで存在し得る。一実施形態では、腫瘍抗原発現細胞は、ある時点で検出可能なレベルの腫瘍抗原タンパク質を産生し、その後、検出可能な腫瘍抗原タンパク質を実質的に産生しなかった。一実施形態では、腫瘍抗原発現細胞は、腫瘍抗原タンパク質を過剰発現する。
【0090】
「過剰発現された」腫瘍抗原又は腫瘍抗原の「過剰発現」という語は、患者の特定の組織又は器官の正常細胞における発現のレベルと比較して、その組織又は器官内の固形腫瘍のような疾患領域の細胞における腫瘍抗原の異常なレベルの発現を示すことを意図している。固形腫瘍又は腫瘍抗原の過剰発現を特徴とする血液悪性腫瘍を有する患者は、当技術分野で公知である標準的なアッセイによって決定することができる。
【0091】
一実施形態では、対象は感染症に罹患している。感染症は、本発明の免疫細胞によって標的とされ得る感染細胞の表面上の１つ又は複数の感染マーカー（細菌マーカー又はウイルスマーカーなど）の発現をもたらし得る。感染症は、例えば、エプスタインバーウイルスによる感染症であり得る。
【0092】
一実施形態では、対象は、関節リウマチ、乾癬、又は全身性エリテマトーデスなどの自己免疫疾患に罹患している。
【0093】
本明細書で使用される「自己免疫疾患」という語は、自己免疫応答に起因する障害として定義される。自己免疫疾患は、自己抗原に対する不適切で過剰な反応の結果である。自己免疫疾患の例には、限定されるものではないが、特に、アジソン病、円形脱毛症、強直性脊椎炎、自己免疫性肝炎、自己免疫性耳下腺炎、クローン病、糖尿病（Ｉ型）、栄養障害型表皮水疱症、精巣上体炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギランバレー症候群、橋本病、溶血性貧血、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、重力筋無力症、尋常性天疱瘡、乾癬、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、脊椎関節症、甲状腺炎、血管炎、白斑、粘液水腫、悪性貧血、潰瘍性大腸炎が含まれる。
【0094】
「癌」及び「癌性」という語は、典型的には、部分的に無秩序な細胞成長を特徴とする哺乳動物の生理学的状態を指す、又は説明する。本明細書で使用される「癌」という語は、初期段階及び末期段階の癌を含む、非転移性及び転移性の癌を指す。「前癌性」という語は、典型的には癌に先行するか、又は癌に発展する状態又は成長を指す。「非転移性」とは、良性である癌か、又は原発部位に留まり、リンパ系若しくは血管系若しくは原発部位以外の組織に浸潤していない癌を意味する。一般に、非転移性癌は、ステージ０、Ｉ、又はＩＩの癌であるあらゆる癌であり、場合によってはステージＩＩＩの癌である。「早期癌」とは、侵襲性でも転移性でもない癌、又はステージ０、Ｉ、若しくはＩＩの癌と分類される癌を意味する。「末期癌」という語は、一般に、ステージＩＩＩ又はステージＩＶの癌を指すが、ステージＩＩの癌又はステージＩＩの癌のサブステージを指す場合もある。当業者であれば、ステージＩＩの癌の初期段階の癌又は末期段階の癌のいずれかへの分類が特定の癌の種類によって決まることを理解されよう。
【0095】
「癌」という語には、限定されるものではないが、乳癌、大腸癌、肺癌、小細胞肺癌、胃（gastric（stomach））癌、肝臓癌、血液癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭部若しくは頸部癌、皮膚若しくは眼内黒色腫、子宮肉腫、卵巣癌、直腸若しくは結腸直腸癌、肛門癌、結腸癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、外陰癌、扁平上皮癌、膣癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、食道癌、小腸癌、内分泌癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部組織腫瘍、尿道癌、陰茎癌、前立腺癌、慢性若しくは急性白血病、リンパ球性リンパ腫、膀胱癌、腎臓癌、尿管癌、腎細胞癌、腎盂癌、ＣＮＳ腫瘍、神経膠腫、星状細胞腫、多形性膠芽腫、原発性ＣＮＳリンパ腫、骨髄腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、ブドウ膜黒色腫（眼内黒色腫としても知られる）、精巣癌、口腔癌、咽頭癌、又はそれらの組み合わせが含まれる。
【0096】
処置できる癌には、血管新生されていない、又はまだ実質的に血管新生されていない腫瘍、並びに血管新生された腫瘍が含まれる。癌は、非固形腫瘍（例えば、白血病及びリンパ腫などの血液系腫瘍）又は固形腫瘍を含み得る。本発明のＣＡＲで処置されるべき癌の種類には、限定されるものではないが、癌腫、芽細胞腫、及び肉腫、並びに特定の白血病又は悪性リンパ腫、良性及び悪性の腫瘍、並びに悪性腫瘍、例えば、肉腫、癌腫、及び黒色腫が含まれる。成人の腫瘍／癌及び小児の腫瘍／癌も含まれる。
【0097】
血液癌は、血液又は骨髄の癌である。血液（又は血行性）癌の例には、急性白血病（急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病（acute myelocytic leukemia）、急性骨髄性白血病（acute myelogenous leukemia）、骨髄芽球性、並びに前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、及び赤白血病など）、慢性白血病（慢性骨髄性（顆粒球）白血病、慢性骨髄性白血病、及び慢性リンパ性白血病など）、バーキットリンパ腫、真性赤血球増加症、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫（無痛性及び高悪性度）、多発性骨髄腫、ウォルデンストレームマクログロブリン血症、重鎖病、骨髄異形成症候群、ヘアリー細胞白血病、及び骨髄異形成を含む白血病が含まれる。
【0098】
固形腫瘍は、通常は嚢胞や液体領域を含まない異常な組織の塊である。固形腫瘍は、良性又は悪性であり得る。様々な種類の固形腫瘍（肉腫、癌腫、リンパ腫など）は、それらを形成する細胞の種類に因んで名付けられている。肉腫及び癌腫などの固形腫瘍の例には、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、及び他の肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、悪性リンパ腫、膵臓癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、肝細胞癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髄様癌、甲状腺乳頭状癌、褐色細胞腫皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝細胞腫、胆管癌、絨毛腫、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、精上皮腫、膀胱癌、黒色腫、及びＣＮＳ腫瘍（神経膠腫（脳幹神経膠腫及び混合性神経膠腫など）、膠芽細胞腫（多形性膠芽腫としても知られる）星状細胞腫、ＣＮＳリンパ腫、胚細胞腫、髄芽腫、シュワン細胞腫 頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、神経膠芽腫、網膜芽腫、及び脳転移など）が含まれる。
【0099】
一実施形態では、対象を疾患に対して免疫する方法が提供され、この方法は、対象を免疫するのに十分な時間及び条件下で、本明細書で定義される免疫細胞を投与することを含む。
【0100】
「投与する」という語は、本発明の組成物を対象に接触させる、適用する、注射する、輸血する、又は提供することを指す。
【0101】
本明細書で使用される「処置する」という語は、（１）障害の１つ又は複数の症状の出現を予防又は遅延させること；（２）障害の発症又は障害の１つ又は複数の症状を阻害すること；（３）障害を緩和すること、即ち、障害の退行又は障害の少なくとも１つ又は複数の症状を引き起こすこと；及び／又は（４）障害の１つ又は複数の症状の重症度の低下を引き起こすことを指し得る。
【0102】
本明細書全体で使用される「対象」という語は、ヒトを意味する、又は家畜又はペットであり得ることを理解されたい。本発明の方法は、ヒトの処置のためのものであることが特に企図されているが、このような方法は、イヌ及びネコなどのペット、並びにウマ、ウシ、及びヒツジなどの家畜、又は霊長類、ネコ科の動物、イヌ科の動物、ウシ科の動物、有蹄動物などの動物園の動物の処置を含む獣医療にも適用可能である。「対象」は、人、患者、又は個体を含み得、そして任意の年齢又は性別であり得る。
【0103】
本明細書で定義される方法は、必要とする対象に有効量の免疫細胞を投与することを含み得る。本明細書で定義される「有効量」という語は、単回投与又は一連の投与の一部として、その誘発、処置、又は予防に有効である量の薬剤の、それを必要とする個体への投与を意味する。有効量は、処置を受ける個体の健康及び体調、処置される個体の分類学群、組成物の製剤化、医学的状況の評価、及びその他の関連因子によって異なる。その量は、定期的な試験を通じて決定できる比較的広い範囲に収まると予想される。
【0104】
一態様では、それを必要とする対象の処置における使用のための、本明細書で定義される免疫細胞が提供される。
【0105】
一態様では、必要とする対象を処置するための薬剤の製造における、本明細書で定義される免疫細胞の使用が提供される。
【0106】
本発明の免疫細胞は、単独で、或いは希釈剤及び／又はＩＬ－２又は他のサイトカイン又は細胞集団などの他の成分と組み合わせた医薬組成物として投与することができる。簡単に説明すると、本発明の医薬組成物は、１つ又は複数の薬学的又は生理学的に許容される担体、希釈剤、又は賦形剤と組み合わせた、本明細書に記載の標的細胞集団を含み得る。そのような組成物は、中性緩衝生理食塩水及びリン酸緩衝生理食塩水などの緩衝液；グルコース、マンノース、スクロース、又はデキストラン、マンニトールなどの炭水化物；タンパク質；ポリペプチド又はグリシンなどのアミノ酸；抗酸化剤；ＥＤＴＡ又はグルタチオンなどのキレート剤；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；及び防腐剤を含み得る。本発明の組成物は、好ましくは、静脈内投与用に製剤化される。
【0107】
本発明の医薬組成物は、処置（又は予防）される疾患に適切な方法で投与することができる。投与の量及び頻度は、患者の状態、患者の病気の種類及び重症度などの因子によって決定されるが、適切な投与量は、臨床試験によって決定してもよい。
【0108】
エクスビボ手順は当技術分野で周知であり、以下でより詳しく議論される。簡単に説明すると、細胞が、哺乳動物（例えば、ヒト）から単離され、本明細書に開示されるＣＡＲを発現するベクターで遺伝子改変（即ち、インビトロで形質導入又はトランスフェクト）される。ＣＡＲ改変細胞は、治療上の利益を提供するために哺乳動物レシピエントに投与することができる。哺乳動物レシピエントはヒトであり得、ＣＡＲ改変細胞は、レシピエントに関して自己由来であり得る。別法では、細胞は、レシピエントに関して同種異系、同系、又は異種であり得る。エクスビボ免疫化に関して細胞ベースのワクチンを使用することに加えて、本明細書に記載の方法には、患者の抗原に対する免疫応答を誘発するインビボ免疫化のための組成物及び方法も含まれる。
【0109】
本明細書で定義される免疫細胞の使用が本明細書で提供される。
【0110】
当業者であれば、本明細書に記載の発明が、具体的に説明されているもの以外の変形及び改変が可能であることを理解されよう。本発明は、精神及び範囲内に収まるそのようなすべての変形及び改変を含むことを理解されたい。本発明はまた、個別に又は集合的に、本明細書で言及又は示されるすべての工程、特徴、組成物、及び化合物、並びに前記工程又は特徴の任意の２つ以上のありとあらゆる組み合わせを含む。
【0111】
本出願で使用される単数形の「１つの（a）」、「１つの（an）」、及び「その（the）」には、文脈で明確に別段の指示がない限り、複数形の参照が含まれる。例えば、「薬剤」という語は、それらの混合物を含む複数の薬剤を含む。
【0112】
本明細書及び以下の特許請求の範囲を通じて、文脈で別段の指示がない限り、「含む（comprise）」という語、並びに「含む（comprises）」及び「含んでいる（comprising）」などの変形は、規定された完全体若しくは工程又は完全体若しくは工程の群を含むが、その他の完全体若しくは工程又は完全体若しくは工程の群を排除しないことを意味すると理解されたい。
【0113】
本明細書におけるあらゆる先行出版物（又はそれから派生した情報）又はあらゆる既知の事項への言及は、その先行出版物（又はそれから派生した情報）又は既知の事項が、本明細書に関連する努力傾注分野における一般的な一般知識の一部を構成することの承認又は了解又はいかなる形式の提案として解釈されるものでも、解釈されるべきものでもない。
【0114】
本発明の特定の実施形態は、単に例示を目的とするものであり、前述の本明細書の一般性の範囲を限定することは意図していない以下の実施例を参照して説明する。
【実施例】
【0115】
実施例
材料及び方法
プラスミド及び配列
レンチウイルスベクター及びそれに関連するパッケージングプラスミドをVectorbuilderから購入した。ＣＤ２８及びＣＤ１３７共刺激配列を有するキメラ抗原受容体を合成し、Vectorbuilderによってレンチウイルスベクターにクローニングした。ヒトＣＤ８Ａ、ＣＤ８Ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、及びＬＣＫ遺伝子を、社内のヒトｃＤＮＡライブラリーからクローニングした。ＴＣＲ様抗体のｓｃＦｖ構築物は、Paul A. Macaryの研究室（ＮＵＳ）で作製され、ペプチドＬＭＰ２Ａ４２６－４３４（ＥＢＶから）を有するＨＬＡ－Ａ＊０２：０１に特異的なＴＣＲ及びペプチドＥ１８３－９１（ＨＢＶから）を有するＡ＊０２：０１に特異的なＴＣＲはそれぞれ、Hans Stauss（University College London）及びAntonio Bertoletti（Duke-NUS Medical School)からの寛大な贈り物であった。一本鎖三量体ＧＡＧ－ＨＬＡ－Ａ２は、Keith Gould（Imperial College London）からの贈り物であった。ペプチド突然変異誘発：ＧＡＧ（ＳＬＹＮＴＶＡＴＬ）からＬＭＰ２Ａ４２６－４３４（ＣＬＧＧＬＬＴＭＶ）（Ｌ２）、ＬＭＰ１１２５－１３３（ＹＬＬＥＭＬＷＲＬ）（Ｌ１）、ＥＢＮＡ１５６２－５７０（ＦＭＶＦＬＱＴＨＩ）（Ｅｌ）、Ｅ１８３－９１（ＦＬＬＴＲＩＬＴＩ）（Ｅ１８３）、又は一本鎖三量体ＧＡＧ－ＨＬＡ－Ａ２の欠失；ＣＤ２８ Ｙ１７０Ｆ、Ｐ１８７、１９０Ａ、及び細胞内ドメイン欠失突然変異はすべて、Ｑ５変異誘発キット（New England Biolabs）を使用して行った。すべての分子クローニング作業は、In-Fusion HDクローニングキット（Clontech）を使用して行い、人工抗原提示ＣＨＯ細胞を作製するために、一本鎖三量体ＭＨＣ構築物をｐｃＤＮＡ３－Ｃｌｏｖｅｒ（Addgene plasmid #40259）にクローニングした。
材料及び方法
プラスミド及び配列
レンチウイルスベクター及びそれに関連するパッケージングプラスミドをVectorbuilderから購入した。ＣＤ２８及びＣＤ１３７共刺激配列を有するキメラ抗原受容体を合成し、Vectorbuilderによってレンチウイルスベクターにクローニングした。ヒトＣＤ８Ａ、ＣＤ８Ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、及びＬＣＫ遺伝子を、社内のヒトｃＤＮＡライブラリーからクローニングした。ＴＣＲ様抗体のｓｃＦｖ構築物は、Paul A. Macaryの研究室（ＮＵＳ）で作製され、ペプチドＬＭＰ２Ａ４２６－４３４（ＥＢＶから）を有するＨＬＡ－Ａ＊０２：０１に特異的なＴＣＲ及びペプチドＥ１８３－９１（ＨＢＶから）を有するＡ＊０２：０１に特異的なＴＣＲはそれぞれ、Hans Stauss（University College London）及びAntonio Bertoletti（Duke-NUS Medical School)からの寛大な贈り物であった。一本鎖三量体ＧＡＧ－ＨＬＡ－Ａ２は、Keith Gould（Imperial College London）からの贈り物であった。ペプチド突然変異誘発：ＧＡＧ（ＳＬＹＮＴＶＡＴＬ）からＬＭＰ２Ａ４２６－４３４（ＣＬＧＧＬＬＴＭＶ）（Ｌ２）、ＬＭＰ１１２５－１３３（ＹＬＬＥＭＬＷＲＬ）（Ｌ１）、ＥＢＮＡ１５６２－５７０（ＦＭＶＦＬＱＴＨＩ）（Ｅｌ）、Ｅ１８３－９１（ＦＬＬＴＲＩＬＴＩ）（Ｅ１８３）、又は一本鎖三量体ＧＡＧ－ＨＬＡ－Ａ２の欠失；ＣＤ２８ Ｙ１７０Ｆ、Ｐ１８７、１９０Ａ、及び細胞内ドメイン欠失突然変異はすべて、Ｑ５変異誘発キット（New England Biolabs）を使用して行った。すべての分子クローニング作業は、In-Fusion HDクローニングキット（Clontech）を使用して行い、人工抗原提示ＣＨＯ細胞を作製するために、一本鎖三量体ＭＨＣ構築物をｐｃＤＮＡ３－Ｃｌｏｖｅｒ（Addgene plasmid #40259）にクローニングした。
【0116】
【表1】
【0117】
【表2】
【0118】
【表3】
【0119】
【表4】
【0120】
細胞株及び細胞培養
ヒトＴ細胞Ｊｕｒｋａｔ細胞株、内因性ＴＣＲ、及び補助受容体欠損Ｊｕｒｋａｔ ７６は、Dr. Heemskerk MHからの親切な贈り物であり、野生型Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６－１（ＴＩＢ－１５２）、ＬＣＫ欠損Ｊｕｒｋａｔ ｃａｍ１．６（ＣＲＬ－２０６３）、Ｄａｕｄｉ細胞（ＣＣＬ－２１３）は、American Type Culture Collectionから入手した。細胞を、３７℃の加湿５％ＣＯ２インキュベーターにおいて、１０％ウシ胎児血清（Hyclone）、２ｍＭ Ｌ－グルタミン（Gibco）、及びＭＥＭ非必須アミノ酸（Gibco）が添加されたＲＰＭＩ－１６４０培地（Hyclone）で維持した。ヒト胎児腎臓上皮細胞（ＨＥＫ２９３）を、１０％ウシ胎児血清（Hyclone）、２ｍＭ Ｌ－グルタミン（Gibco）、及びＭＥＭ非必須アミノ酸（Gibco）が添加されたＤＭＥＭ（Hyclone）で培養した。テトラサイクリン調節発現（Ｔ－ＲＥｘ）ＣＨＯ細胞株を、Invitrogenから購入し、人工抗原提示細胞株の作製に使用した。ＣＨＯ細胞を、１０％ウシ胎児血清（Hyclone）、２ｍＭ Ｌ－グルタミン（Gibco）、及びＭＥＭ非必須アミノ酸（Gibco）を含むHam’s F-12（Gibco）培地で培養した。一本鎖三量体ＭＨＣ構築物のＣＨＯへのトランスフェクションは、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）法を使用して行った。トランスフェクション後、薬物（Hycloneからの１．０ｍｇ／ｍｌのＧ４１８硫酸塩）の添加によって細胞を選択した。次いで、単一細胞ソーティングを適用して、適切なＨＬＡ発現クローンを選択した。ｐＭＨＣ複合体発現を、フローサイトメトリーによって定期的にチェックした。
ヒトＴ細胞Ｊｕｒｋａｔ細胞株、内因性ＴＣＲ、及び補助受容体欠損Ｊｕｒｋａｔ ７６は、Dr. Heemskerk MHからの親切な贈り物であり、野生型Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６－１（ＴＩＢ－１５２）、ＬＣＫ欠損Ｊｕｒｋａｔ ｃａｍ１．６（ＣＲＬ－２０６３）、Ｄａｕｄｉ細胞（ＣＣＬ－２１３）は、American Type Culture Collectionから入手した。細胞を、３７℃の加湿５％ＣＯ２インキュベーターにおいて、１０％ウシ胎児血清（Hyclone）、２ｍＭ Ｌ－グルタミン（Gibco）、及びＭＥＭ非必須アミノ酸（Gibco）が添加されたＲＰＭＩ－１６４０培地（Hyclone）で維持した。ヒト胎児腎臓上皮細胞（ＨＥＫ２９３）を、１０％ウシ胎児血清（Hyclone）、２ｍＭ Ｌ－グルタミン（Gibco）、及びＭＥＭ非必須アミノ酸（Gibco）が添加されたＤＭＥＭ（Hyclone）で培養した。テトラサイクリン調節発現（Ｔ－ＲＥｘ）ＣＨＯ細胞株を、Invitrogenから購入し、人工抗原提示細胞株の作製に使用した。ＣＨＯ細胞を、１０％ウシ胎児血清（Hyclone）、２ｍＭ Ｌ－グルタミン（Gibco）、及びＭＥＭ非必須アミノ酸（Gibco）を含むHam’s F-12（Gibco）培地で培養した。一本鎖三量体ＭＨＣ構築物のＣＨＯへのトランスフェクションは、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）法を使用して行った。トランスフェクション後、薬物（Hycloneからの１．０ｍｇ／ｍｌのＧ４１８硫酸塩）の添加によって細胞を選択した。次いで、単一細胞ソーティングを適用して、適切なＨＬＡ発現クローンを選択した。ｐＭＨＣ複合体発現を、フローサイトメトリーによって定期的にチェックした。
【0121】
抗体及び化学物質
この研究では、次の抗体を使用した：ＭｙｃタグマウスｍＡｂ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（９Ｂ１１）、抗ｐＳｒｃファミリー（ｐＹ４１６）、抗ｐＰＬＣγ１、抗ｐ４４／４２ Ｅｒｋ１／２、抗Ｅｒｋ１／２（すべてCell Signaling Technologyから）；ウサギ抗ヒトＦＹＮ（ＦＹＮ－５９）、抗ヒトＣＤ２８ Ａｌｅｘａ ４８８（ＣＤ２８．２）、抗ヒトＣＤ８０ ＰＥ（２Ｄ１０）、抗ヒトＣＤ１９ ＦＩＴＣ、抗ヒトＣＤ８６ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ４２１（ＢＵ６３）、抗－ヒトＣＤ３ ＡＰＣ、抗ヒトＣＤ２７９（ＰＤ－１）ＰＥ（すべてBiolegendから）；抗ｐＣＤ３ζ（ｐＹ１４２）、マウス抗ヒトｃ－ＣＢＬ、抗ＰＬＣγ１（すべてBecton Dickinsonから）；抗ヒトＨＬＡ－Ａ２ ＡＰＣ（ＢＢ７．２）、抗ヒトＣＤ８Ａ ＡＰＣ、抗ヒトＣＤ８Ｂ ＰＥ－Ｃｙ７（すべてeBioscienceから）；マウス抗ヒトＬＣＫ（３Ａ５、Santa Cruz Biotechnology）；ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（Thermo Fisher Scientific）；特定のＨＬＡ／Ａ２－Ｌ２、ＨＬＡ／Ａ２－Ｌ１。ＨＬＡ／Ａ２－Ｅ１ ＴＣＲ様抗体は、記載されているように作製した（Sim et al., 2013）。この研究で使用した化学物質について：ＳＲＣファミリーキナーゼ（ＳＦＫ）阻害剤ＰＰ２はSigma-Aldrichから購入し；特定のＬＣＫ又はＦＹＮ阻害剤（それぞれＡ７７００４１又はＳＵ６６５６）はそれぞれ、MedChemExpress又はSelleckChemから入手し；カルシウム染料Ｉｎｄｏ－１、ＡＭは、Thermo Fisher Scientificから入手した。
この研究では、次の抗体を使用した：ＭｙｃタグマウスｍＡｂ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（９Ｂ１１）、抗ｐＳｒｃファミリー（ｐＹ４１６）、抗ｐＰＬＣγ１、抗ｐ４４／４２ Ｅｒｋ１／２、抗Ｅｒｋ１／２（すべてCell Signaling Technologyから）；ウサギ抗ヒトＦＹＮ（ＦＹＮ－５９）、抗ヒトＣＤ２８ Ａｌｅｘａ ４８８（ＣＤ２８．２）、抗ヒトＣＤ８０ ＰＥ（２Ｄ１０）、抗ヒトＣＤ１９ ＦＩＴＣ、抗ヒトＣＤ８６ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ４２１（ＢＵ６３）、抗－ヒトＣＤ３ ＡＰＣ、抗ヒトＣＤ２７９（ＰＤ－１）ＰＥ（すべてBiolegendから）；抗ｐＣＤ３ζ（ｐＹ１４２）、マウス抗ヒトｃ－ＣＢＬ、抗ＰＬＣγ１（すべてBecton Dickinsonから）；抗ヒトＨＬＡ－Ａ２ ＡＰＣ（ＢＢ７．２）、抗ヒトＣＤ８Ａ ＡＰＣ、抗ヒトＣＤ８Ｂ ＰＥ－Ｃｙ７（すべてeBioscienceから）；マウス抗ヒトＬＣＫ（３Ａ５、Santa Cruz Biotechnology）；ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（Thermo Fisher Scientific）；特定のＨＬＡ／Ａ２－Ｌ２、ＨＬＡ／Ａ２－Ｌ１。ＨＬＡ／Ａ２－Ｅ１ ＴＣＲ様抗体は、記載されているように作製した（Sim et al., 2013）。この研究で使用した化学物質について：ＳＲＣファミリーキナーゼ（ＳＦＫ）阻害剤ＰＰ２はSigma-Aldrichから購入し；特定のＬＣＫ又はＦＹＮ阻害剤（それぞれＡ７７００４１又はＳＵ６６５６）はそれぞれ、MedChemExpress又はSelleckChemから入手し；カルシウム染料Ｉｎｄｏ－１、ＡＭは、Thermo Fisher Scientificから入手した。
【0122】
レンチウイルスの生産及び形質導入
ウェル当たり合計６．５×１０５個のＨＥＫ２９３細胞を、トランスフェクションの前日に６枚のウェルプレートに播種し、５％ＣＯ２、３７℃でインキュベートした。次いで、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を使用して、細胞をパッケージングプラスミド及びレンチウイルスベクターでトランスフェクトし、１２時間後に培地を交換した。ウイルス上清を、次の２日間に２回回収した。回収したウイルス上清を滴定し、０．４５μｍメンブレンフィルター（Millipore）でろ過し、超遠心管（Millipore）で１００倍に濃縮した。レンチウイルスの形質導入のために、１ｍｌ中、ウェル当たり１×１０６個のＪｕｒｋａｔ細胞で、ポリブレン及びＨＥＰＥＳをそれぞれ８～１０μｇ／ｍｌ及び１０ｍＭで添加し、続いて２，５００ｒｐｍでスピノキュレーション（spinoculation）を２時間行った。ＣＨＯ細胞の形質導入のために、ウイルス溶液をスピノキュレーションなしで細胞に直接加えた。２４時間後、細胞とウイルス溶液を分離し、細胞を維持培地で培養した。さらに４８時間の培養期間後、フローサイトメトリー分析を行って、構築物の発現をチェックした。
ウェル当たり合計６．５×１０５個のＨＥＫ２９３細胞を、トランスフェクションの前日に６枚のウェルプレートに播種し、５％ＣＯ２、３７℃でインキュベートした。次いで、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を使用して、細胞をパッケージングプラスミド及びレンチウイルスベクターでトランスフェクトし、１２時間後に培地を交換した。ウイルス上清を、次の２日間に２回回収した。回収したウイルス上清を滴定し、０．４５μｍメンブレンフィルター（Millipore）でろ過し、超遠心管（Millipore）で１００倍に濃縮した。レンチウイルスの形質導入のために、１ｍｌ中、ウェル当たり１×１０６個のＪｕｒｋａｔ細胞で、ポリブレン及びＨＥＰＥＳをそれぞれ８～１０μｇ／ｍｌ及び１０ｍＭで添加し、続いて２，５００ｒｐｍでスピノキュレーション（spinoculation）を２時間行った。ＣＨＯ細胞の形質導入のために、ウイルス溶液をスピノキュレーションなしで細胞に直接加えた。２４時間後、細胞とウイルス溶液を分離し、細胞を維持培地で培養した。さらに４８時間の培養期間後、フローサイトメトリー分析を行って、構築物の発現をチェックした。
【0123】
エレクトロポレーション
Amaxa cell line nucleofectorキット（ＶＣＡ－１００３）の指示に基づいてエレクトロポレーションを行った。簡単に説明すると、各試料の１０６個の細胞を調製し、９０×ｇで１０分間スピンダウンした。細胞を１００μｌのnucleofector溶液で再懸濁し、２μｇのＤＮＡと組み合わせた。エレクトロポレーションプログラムＸ－０５（高効率）をNucleofector（登録商標）2b Deviceに適用した。構築物の発現は、１８時間後にフローサイトメーターによって検出した。
Amaxa cell line nucleofectorキット（ＶＣＡ－１００３）の指示に基づいてエレクトロポレーションを行った。簡単に説明すると、各試料の１０６個の細胞を調製し、９０×ｇで１０分間スピンダウンした。細胞を１００μｌのnucleofector溶液で再懸濁し、２μｇのＤＮＡと組み合わせた。エレクトロポレーションプログラムＸ－０５（高効率）をNucleofector（登録商標）2b Deviceに適用した。構築物の発現は、１８時間後にフローサイトメーターによって検出した。
【0124】
イメージング
全内部反射蛍光顕微鏡（ＴＩＲＦＭ）の場合、特定のｐＭＨＣ及びその他のアンカータンパク質を含む脂質二重層を前述のように調製した。簡単に説明すると、０．２ｍｏｌ％のリポソームを調製し、３７℃、Ｎ２下で蒸発させ、超音波処理して４ｍＭの脂質ストックを得た。ガラス８ウェルチャンバーＬａｂＴｅｋＩＩチャンバースライド（Fisher Scientific）を２時間、６ＭのＮａＯＨで洗浄し、脂質を加える前にｄｄＨ２Ｏですすいだ。脂質をＰＢＳで１０倍に希釈し、きれいなチャンバースライドに加え、３０分間インキュベートした。過剰なリポソームを１２ｍｌのＰＢＳで洗い流した。二重層を２ｍｇ／ｍｌのＢＳＡで３０分間ブロックした。５μｇ／ｍｌのストレプトアビジンを加え、３０分間インキュベートした。過剰なストレプトアビジンを洗浄した後、ビオチン化ＨＬＡ／Ａ２－Ｌ２単量体、組換えヒトＩＣＡＭ１タンパク質、ｈＩｇＧ１－Ｆｃ．Ｈｉｓタグ（Thermo Fisher Scientific）を二重層に３０分間添加した。洗浄後、二重層を使用する準備が整った。ＣＤ８α－ｍＣｈｅｒｒｙを含む１００μｌ当たり１０５個のＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔ又はＴＣＲ－Ｊｕｒｋａｔ細胞を、３７℃で１０分間チャンバーの１つのウェルに添加した。次いで、１００μｌの８％パラホルムアルデヒドを加えて細胞を固定し、刺激を停止した。ＴＩＲＦ顕微鏡検査を、後に４レーザーＴＩＲＦモジュールを備えたOlympus IX83倒立顕微鏡で行った。４０倍／１．４９ＮＡ油浸レンズを使用して画像を得た。１００－ｎｍのエバネッセント場内で励起された蛍光を、Hamamatsu ORCA Flash 4.0カメラで記録した。定期的な蛍光イメージングのために、ＣＤ８α－ｍＣｈｅｒｒｙを含む１０５個のＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔ又はＴＣＲ－Ｊｕｒｋａｔ細胞を、チャンバーの１つのウェルの１００μｌのＲＰＭＩ培地で、１０５個の細胞特異的ＣＨＯ－ＡＰＣと１０分間混合した。これに続いて、１００μｌの８％パラホルムアルデヒドを添加した。ＣＤ８の動員を、後に通常のモジュールのOlympus IX83倒立顕微鏡で検出した。２０倍～４０倍／１．４９ＮＡ油浸レンズを使用して画像を得た。
全内部反射蛍光顕微鏡（ＴＩＲＦＭ）の場合、特定のｐＭＨＣ及びその他のアンカータンパク質を含む脂質二重層を前述のように調製した。簡単に説明すると、０．２ｍｏｌ％のリポソームを調製し、３７℃、Ｎ２下で蒸発させ、超音波処理して４ｍＭの脂質ストックを得た。ガラス８ウェルチャンバーＬａｂＴｅｋＩＩチャンバースライド（Fisher Scientific）を２時間、６ＭのＮａＯＨで洗浄し、脂質を加える前にｄｄＨ２Ｏですすいだ。脂質をＰＢＳで１０倍に希釈し、きれいなチャンバースライドに加え、３０分間インキュベートした。過剰なリポソームを１２ｍｌのＰＢＳで洗い流した。二重層を２ｍｇ／ｍｌのＢＳＡで３０分間ブロックした。５μｇ／ｍｌのストレプトアビジンを加え、３０分間インキュベートした。過剰なストレプトアビジンを洗浄した後、ビオチン化ＨＬＡ／Ａ２－Ｌ２単量体、組換えヒトＩＣＡＭ１タンパク質、ｈＩｇＧ１－Ｆｃ．Ｈｉｓタグ（Thermo Fisher Scientific）を二重層に３０分間添加した。洗浄後、二重層を使用する準備が整った。ＣＤ８α－ｍＣｈｅｒｒｙを含む１００μｌ当たり１０５個のＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔ又はＴＣＲ－Ｊｕｒｋａｔ細胞を、３７℃で１０分間チャンバーの１つのウェルに添加した。次いで、１００μｌの８％パラホルムアルデヒドを加えて細胞を固定し、刺激を停止した。ＴＩＲＦ顕微鏡検査を、後に４レーザーＴＩＲＦモジュールを備えたOlympus IX83倒立顕微鏡で行った。４０倍／１．４９ＮＡ油浸レンズを使用して画像を得た。１００－ｎｍのエバネッセント場内で励起された蛍光を、Hamamatsu ORCA Flash 4.0カメラで記録した。定期的な蛍光イメージングのために、ＣＤ８α－ｍＣｈｅｒｒｙを含む１０５個のＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔ又はＴＣＲ－Ｊｕｒｋａｔ細胞を、チャンバーの１つのウェルの１００μｌのＲＰＭＩ培地で、１０５個の細胞特異的ＣＨＯ－ＡＰＣと１０分間混合した。これに続いて、１００μｌの８％パラホルムアルデヒドを添加した。ＣＤ８の動員を、後に通常のモジュールのOlympus IX83倒立顕微鏡で検出した。２０倍～４０倍／１．４９ＮＡ油浸レンズを使用して画像を得た。
【0125】
カルシウム流出アッセイ
細胞試料を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に１ｍｌ当たり１０×１０６個の細胞密度で懸濁し、２μＭ Ｉｎｄｏ－１ ＡＭを３７℃のインキュベーターで３０分間ロードし、続いて培養ＲＰＭＩで２回洗浄した。分析前に細胞を３７℃に１０分間予熱し、事象回収中は培養ＲＰＭＩで３７℃に維持した。細胞刺激のために、ＨＬＡ／Ａ２－Ｌ２単量体を事前にリフォールディングし、ビオチン化し、ストレプトアビジンＡｌｅｘａ ６４７（Thermo Fisher）で架橋して、抗原四量体を形成した。次いで、細胞を四量体で刺激した。Ｉｎｄｏ－１ ｈｉｇｈ（ＢＵＶ３９５）／Ｉｎｄｏ－１ ｌｏｗ（ＤＡＰＩ）の平均蛍光比を、動力学プログラムによってFlowJoを使用して計算した。
細胞試料を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に１ｍｌ当たり１０×１０６個の細胞密度で懸濁し、２μＭ Ｉｎｄｏ－１ ＡＭを３７℃のインキュベーターで３０分間ロードし、続いて培養ＲＰＭＩで２回洗浄した。分析前に細胞を３７℃に１０分間予熱し、事象回収中は培養ＲＰＭＩで３７℃に維持した。細胞刺激のために、ＨＬＡ／Ａ２－Ｌ２単量体を事前にリフォールディングし、ビオチン化し、ストレプトアビジンＡｌｅｘａ ６４７（Thermo Fisher）で架橋して、抗原四量体を形成した。次いで、細胞を四量体で刺激した。Ｉｎｄｏ－１ ｈｉｇｈ（ＢＵＶ３９５）／Ｉｎｄｏ－１ ｌｏｗ（ＤＡＰＩ）の平均蛍光比を、動力学プログラムによってFlowJoを使用して計算した。
【0126】
Ｔ細胞刺激アッセイ
人工抗原提示ＣＨＯ細胞（ＡＰＣ－ＣＨＯ）を、ウェル当たり２～３×１０４個で９６ウェル平板に１日前に播種した。ペプチドパルスを必要とするＡＰＣ－ＣＨＯの場合、ペプチドを４μＭで３時間添加し、次いでＣＡＲ－Ｔ又はＴＣＲ－Ｔ細胞を添加する前に洗い流した。各ＣＡＲ－Ｔ細胞又はＴＣＲ Ｔ細胞試料をカウントし、ＲＰＭＩ培地の培養で１ｍｌ当たり１０６個の濃度で懸濁した。次いで、ウェル当たり２００μｌの細胞懸濁液をＡＰＣ－ＣＨＯ事前播種プレートに加えた。阻害剤実験のために、阻害剤を細胞混合物に適宜加えた。すべての実験は、技術的な３連で行った。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で１８時間インキュベートした。インキュベーション後、製造業者のプロトコル（Invitrogen）に従って行ったヒトＩＬ－２ＥＬＩＳＡアッセイ用に上清を回収した。Ｔ細胞ペレットを、表面染色のために再懸濁するか、又は上記の方法を繰り返すことによって刺激の別の回に使用した。
人工抗原提示ＣＨＯ細胞（ＡＰＣ－ＣＨＯ）を、ウェル当たり２～３×１０４個で９６ウェル平板に１日前に播種した。ペプチドパルスを必要とするＡＰＣ－ＣＨＯの場合、ペプチドを４μＭで３時間添加し、次いでＣＡＲ－Ｔ又はＴＣＲ－Ｔ細胞を添加する前に洗い流した。各ＣＡＲ－Ｔ細胞又はＴＣＲ Ｔ細胞試料をカウントし、ＲＰＭＩ培地の培養で１ｍｌ当たり１０６個の濃度で懸濁した。次いで、ウェル当たり２００μｌの細胞懸濁液をＡＰＣ－ＣＨＯ事前播種プレートに加えた。阻害剤実験のために、阻害剤を細胞混合物に適宜加えた。すべての実験は、技術的な３連で行った。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で１８時間インキュベートした。インキュベーション後、製造業者のプロトコル（Invitrogen）に従って行ったヒトＩＬ－２ＥＬＩＳＡアッセイ用に上清を回収した。Ｔ細胞ペレットを、表面染色のために再懸濁するか、又は上記の方法を繰り返すことによって刺激の別の回に使用した。
【0127】
ウエスタンブロッティング
合計１０６個の細胞試料をＮＰ－４０溶解緩衝液で溶解した。細胞残屑をペレット化し、上清を回収し、還元タンパク質ローディング緩衝液（Thermo Fisher Scientific）で加熱した。刺激後のリン酸化を検出するために、ウェル当たり１０５個のＡＰＣ－ＣＨＯ細胞を、刺激の１日前に２４ウェルプレートに播種した。１０６個のＣＡＲ－Ｔ又はＴＣＲ－Ｔ細胞を各ウェルに加え、３７℃、５％ＣＯ２で指定された期間インキュベートした。刺激されたＣＡＲ－Ｔ又はＴＣＲ－Ｔ細胞を回収し、上記のように調製した。試料を４～１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ勾配ゲル（NuPAGE、Invitrogen）にロードし、ＰＶＤＦ膜（Immobilon-FL Transfer Membrane, Millipore）に転写した。次いで、ブロッキング緩衝液（Odyssey, LI-COR）を使用して、膜を室温で１時間ブロックした。続いて、膜を様々な一次抗体でプローブした。使用した二次抗体は、ＩＲＤｙｅ ８００ＣＷヤギ抗マウスＩｇＧ２ｂ（Cat# 926-32352, LI-COR）及びＩＲＤｙｅ ６８０ＬＴヤギ抗ウサギ（Cat#926-68021）であった。ＬＩ－ＣＯＲ Ｏｄｙｓｓｅｙ赤外線イメージングシステムによってブロッティングを定量化した。
合計１０６個の細胞試料をＮＰ－４０溶解緩衝液で溶解した。細胞残屑をペレット化し、上清を回収し、還元タンパク質ローディング緩衝液（Thermo Fisher Scientific）で加熱した。刺激後のリン酸化を検出するために、ウェル当たり１０５個のＡＰＣ－ＣＨＯ細胞を、刺激の１日前に２４ウェルプレートに播種した。１０６個のＣＡＲ－Ｔ又はＴＣＲ－Ｔ細胞を各ウェルに加え、３７℃、５％ＣＯ２で指定された期間インキュベートした。刺激されたＣＡＲ－Ｔ又はＴＣＲ－Ｔ細胞を回収し、上記のように調製した。試料を４～１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ勾配ゲル（NuPAGE、Invitrogen）にロードし、ＰＶＤＦ膜（Immobilon-FL Transfer Membrane, Millipore）に転写した。次いで、ブロッキング緩衝液（Odyssey, LI-COR）を使用して、膜を室温で１時間ブロックした。続いて、膜を様々な一次抗体でプローブした。使用した二次抗体は、ＩＲＤｙｅ ８００ＣＷヤギ抗マウスＩｇＧ２ｂ（Cat# 926-32352, LI-COR）及びＩＲＤｙｅ ６８０ＬＴヤギ抗ウサギ（Cat#926-68021）であった。ＬＩ－ＣＯＲ Ｏｄｙｓｓｅｙ赤外線イメージングシステムによってブロッティングを定量化した。
【0128】
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集
Ｃａｓ９プラスミドをAddgene（#52961）から入手した。ＦＹＮ及びＬＣＫのｇＲＮＡ配列を、http://chopchop.cbu.uib.no/で検索し、表２に示す。Ｃａｓ９配列を、Ｐ２Ａ切断可能リンカーによってｍＴａｇＢＦＰに連結し、次いで、ｇＲＮＡ配列と共にレンチウイルスベクターにクローニングした。Ｊｕｒｋａｔ細胞に形質導入した後、単一細胞ソーティングの後にｍＴａｇＢＦＰ蛍光マーカーを使用した。クローンのスクリーニングのために細胞内染色及びウエスタンブロッティングを行った。
Ｃａｓ９プラスミドをAddgene（#52961）から入手した。ＦＹＮ及びＬＣＫのｇＲＮＡ配列を、http://chopchop.cbu.uib.no/で検索し、表２に示す。Ｃａｓ９配列を、Ｐ２Ａ切断可能リンカーによってｍＴａｇＢＦＰに連結し、次いで、ｇＲＮＡ配列と共にレンチウイルスベクターにクローニングした。Ｊｕｒｋａｔ細胞に形質導入した後、単一細胞ソーティングの後にｍＴａｇＢＦＰ蛍光マーカーを使用した。クローンのスクリーニングのために細胞内染色及びウエスタンブロッティングを行った。
【0129】
【表5】
【0130】
フローサイトメトリー及び細胞ソーティング
フローサイトメトリー実験を、BD LSR Fortessa X-20（Becton Dickinson）で行った。細胞ソーティングは、Flow Cytometry Laboratory, Immunology Programme, National University of Singaporeによって、Ｍｏ－ｆｌｏ ＸＤＰ（Beckman Coulter, Inc.）又はＳＹ３２００（Sony Biotechnology Inc.）のいずれかで行った。データ分析をFlowJoで行った。
フローサイトメトリー実験を、BD LSR Fortessa X-20（Becton Dickinson）で行った。細胞ソーティングは、Flow Cytometry Laboratory, Immunology Programme, National University of Singaporeによって、Ｍｏ－ｆｌｏ ＸＤＰ（Beckman Coulter, Inc.）又はＳＹ３２００（Sony Biotechnology Inc.）のいずれかで行った。データ分析をFlowJoで行った。
【0131】
統計情報及びデータ分析
両側スチューデントのｔ検定又は双方向ＡＮＯＶＡ分析を、GraphPad Prism 7を使用して、列データ又は曲線データそれぞれについて行った。データは、検定の前提条件を満たしている。分散は、比較されたグループ間で類似している。
両側スチューデントのｔ検定又は双方向ＡＮＯＶＡ分析を、GraphPad Prism 7を使用して、列データ又は曲線データそれぞれについて行った。データは、検定の前提条件を満たしている。分散は、比較されたグループ間で類似している。
【0132】
実施例１
人工抗原提示ＣＨＯ細胞は、ＣＡＲ及びＴＣＲ Ｔ細胞刺激のための抗原を提供する
ＣＡＲとＴＣＲとの間の分子認識を詳細に比較するために、同じペプチド－ＭＨＣ特異性を有するＣＡＲ及びＴＣＲを発現するＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞を作製した。ＣＡＲ構築物を、ＣＤ２８共刺激ドメインが説明された以前のレポートに基づいて作製した（図１Ａ）。ＣＡＲ上のｓｃＦｖは、ＨＬＡ－Ａ２によって提示されたエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）からの潜在膜タンパク質２Ａ（ＬＭＰ２Ａ）タンパク質のペプチドエピトープを認識するＴＣＲ様抗体から構築した。ＣＡＲという語は、ＣＤ２８膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを使用するこの第２世代ＣＡＲを指し得る。次いで、レンチウイルスを適用して、内因性ＴＣＲα及びβ鎖が欠如しているがＣＤ３サブユニットのフルセットを含むＪｕｒｋａｔ ７６Ｔ細胞にＣＡＲを送達した。レンチウイルス形質導入は、ＣＡＲ又はＣＡＲと同じペプチド－ＭＨＣ複合体に特異的なＴＣＲの両方で効率的であった（図１Ｂ）。ＣＡＲ又はＴＣＲ発現Ｊｕｒｋａｔ細胞をソートして、安定したＣＡＲ又はＴＣＲ－Ｊｕｒｋａｔ細胞を作製した。Ｔ細胞シグナル伝達研究に利用できる様々なヒトＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞株がある。ここでは、３つのＪｕｒｋａｔ由来細胞株、Ｊｕｒｋａｔ ７６、ＪＥ６．１、及びＪｃａｍ１．６を使用した。Ｊｕｒｋａｔ ７６は、大部分の実験に使用したため、特段の記載がない限り、Ｊｕｒｋａｔと呼ばれる。Ｊｕｒｋａｔ ７６のみがＣＤ３を表面に発現しなかったが、ＪＥ６．１及びＪｃａｍ１．６は異なる量のＣＤ３を発現した（図１Ｃ）。これらの３つの細胞株はいずれも、ＣＤ８又はＣＤ４を発現しない（図１１Ａ）。加えて、異種ＣＨＯ細胞における一本鎖形態のヒトＭＨＣクラスＩの発現に基づく人工抗原提示系もエンジニアリングした。この抗原提示細胞（ＡＰＣ）系は、選択したペプチドがβ２－ミクログロブリンと重鎖に共有結合するモノペプチド系（図１Ｄ）と、ＨＬＡ－Ａ２のペプチド溝が開いており、複数のペプチドを細胞にパルスしてＭＨＣ－Ｉ分子に結合させることができるマルチペプチド系（図１Ｅ）との２つの型に構築した。両方の系は、特異的ペプチド提示が、非関連ペプチド提示とは対照的に特異的なＴＣＲ様抗体によってそれぞれ有意に検出されたことが観察されたように、ペプチドを効率的に提示した（図１Ｄ、図１Ｅ）。それにもかかわらず、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、図１Ｄ及び図１Ｅに見られるように、これらの系による刺激に対して異なって反応した。ＬＭＰ２Ａ（Ｌ２）ペプチド特異的ＣＡＲ－Ｔは、ＣＨＯ－Ｌ２に特異的に応答するが、非関連ＣＨＯ－ＧＡＧには応答しない。しかしながら、ＴＣＲ様ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＨＬＡ－Ａ２を発現する非パルスＣＨＯ細胞に対していくつかの非特異的な応答を示した（図１Ｅ）。この非特異的活性化は、ＥＢＮＡ１ペプチド標的Ｅ１－ＣＡＲ又はＬＭＰ１ペプチド標的Ｌ１－ＣＡＲのような他の特異性を有するＴＣＲ様ＣＡＲでも見られた。異なるペプチド濃度での抗ＨＬＡ－Ａ２（ＢＢ７．２）によって検出されるように、ＨＬＡ－Ａ２構築物は、ペプチドをＣＨＯ－ＡＰＣに意図的にパルスすることなく発現される（図１１Ｃ）。従って、ＣＨＯ細胞からの様々な未知のペプチドがマルチペプチド系に提示される。いくつかのペプチド配列は、特異的ペプチドに類似し、非特異的なトリガーを引き起こす可能性がある。
人工抗原提示ＣＨＯ細胞は、ＣＡＲ及びＴＣＲ Ｔ細胞刺激のための抗原を提供する
ＣＡＲとＴＣＲとの間の分子認識を詳細に比較するために、同じペプチド－ＭＨＣ特異性を有するＣＡＲ及びＴＣＲを発現するＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞を作製した。ＣＡＲ構築物を、ＣＤ２８共刺激ドメインが説明された以前のレポートに基づいて作製した（図１Ａ）。ＣＡＲ上のｓｃＦｖは、ＨＬＡ－Ａ２によって提示されたエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）からの潜在膜タンパク質２Ａ（ＬＭＰ２Ａ）タンパク質のペプチドエピトープを認識するＴＣＲ様抗体から構築した。ＣＡＲという語は、ＣＤ２８膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを使用するこの第２世代ＣＡＲを指し得る。次いで、レンチウイルスを適用して、内因性ＴＣＲα及びβ鎖が欠如しているがＣＤ３サブユニットのフルセットを含むＪｕｒｋａｔ ７６Ｔ細胞にＣＡＲを送達した。レンチウイルス形質導入は、ＣＡＲ又はＣＡＲと同じペプチド－ＭＨＣ複合体に特異的なＴＣＲの両方で効率的であった（図１Ｂ）。ＣＡＲ又はＴＣＲ発現Ｊｕｒｋａｔ細胞をソートして、安定したＣＡＲ又はＴＣＲ－Ｊｕｒｋａｔ細胞を作製した。Ｔ細胞シグナル伝達研究に利用できる様々なヒトＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞株がある。ここでは、３つのＪｕｒｋａｔ由来細胞株、Ｊｕｒｋａｔ ７６、ＪＥ６．１、及びＪｃａｍ１．６を使用した。Ｊｕｒｋａｔ ７６は、大部分の実験に使用したため、特段の記載がない限り、Ｊｕｒｋａｔと呼ばれる。Ｊｕｒｋａｔ ７６のみがＣＤ３を表面に発現しなかったが、ＪＥ６．１及びＪｃａｍ１．６は異なる量のＣＤ３を発現した（図１Ｃ）。これらの３つの細胞株はいずれも、ＣＤ８又はＣＤ４を発現しない（図１１Ａ）。加えて、異種ＣＨＯ細胞における一本鎖形態のヒトＭＨＣクラスＩの発現に基づく人工抗原提示系もエンジニアリングした。この抗原提示細胞（ＡＰＣ）系は、選択したペプチドがβ２－ミクログロブリンと重鎖に共有結合するモノペプチド系（図１Ｄ）と、ＨＬＡ－Ａ２のペプチド溝が開いており、複数のペプチドを細胞にパルスしてＭＨＣ－Ｉ分子に結合させることができるマルチペプチド系（図１Ｅ）との２つの型に構築した。両方の系は、特異的ペプチド提示が、非関連ペプチド提示とは対照的に特異的なＴＣＲ様抗体によってそれぞれ有意に検出されたことが観察されたように、ペプチドを効率的に提示した（図１Ｄ、図１Ｅ）。それにもかかわらず、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、図１Ｄ及び図１Ｅに見られるように、これらの系による刺激に対して異なって反応した。ＬＭＰ２Ａ（Ｌ２）ペプチド特異的ＣＡＲ－Ｔは、ＣＨＯ－Ｌ２に特異的に応答するが、非関連ＣＨＯ－ＧＡＧには応答しない。しかしながら、ＴＣＲ様ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＨＬＡ－Ａ２を発現する非パルスＣＨＯ細胞に対していくつかの非特異的な応答を示した（図１Ｅ）。この非特異的活性化は、ＥＢＮＡ１ペプチド標的Ｅ１－ＣＡＲ又はＬＭＰ１ペプチド標的Ｌ１－ＣＡＲのような他の特異性を有するＴＣＲ様ＣＡＲでも見られた。異なるペプチド濃度での抗ＨＬＡ－Ａ２（ＢＢ７．２）によって検出されるように、ＨＬＡ－Ａ２構築物は、ペプチドをＣＨＯ－ＡＰＣに意図的にパルスすることなく発現される（図１１Ｃ）。従って、ＣＨＯ細胞からの様々な未知のペプチドがマルチペプチド系に提示される。いくつかのペプチド配列は、特異的ペプチドに類似し、非特異的なトリガーを引き起こす可能性がある。
【0133】
ＴＣＲ様ＣＡＲの活性化は、ＣＤ８によって増強されず、ＬＣＫなしでＴ細胞シグナル伝達を伝達することができる
このＴＣＲ様ＣＡＲは、ペプチドＭＨＣに対してＴＣＲと同じ特異性を有しているため、Ｔ細胞活性化に対するＣＤ８補助受容体の寄与を明らかにすることは非常に興味深いことである。ＣＤ８補助受容体が、接触面での事象を検出するために使用された全内部反射蛍光顕微鏡（ＴＩＲＦＭ）を使用して、ＴＣＲ－Ｔ細胞と同様にＣＡＲ－Ｔ細胞によって動員できることが最初に示された（図２Ａ）。ＣＤ８αは、蛍光タンパク質ｍＣｈｅｒｒｙでキメラとして標識した。ＣＡＲ－ＴとＴＣＲ－Ｔの両方が表面にＣＤ８α－ｍＣｈｅｒｒｙを発現した（図７Ａ）。ＴＩＲＦＭの場合、支持された脂質二重層をガラスプレート上で調製し、インテグリンリガンドＩＣＡＭ－１を添加してＣＡＲ－Ｔ又はＴＣＲ－Ｔを検出表面に固定した。ＣＤ８α－ｍＣｈｅｒｒｙを発現するＣＡＲ－Ｔ又はＴＣＲ－Ｔ細胞を、特異的なｐＭＨＣを含む又は含まない二重層に１０分間添加した後、平均蛍光強度（ＭＦＩ）が、ｐＭＨＣが追加された両方の群で有意に増加した。ＣＡＲ－Ｔ及びＴＣＲ－Ｔと二重層との接触面内でのＣＤ８α－ｍＣｈｅｒｒｙのクラスター化は明らかであった。免疫シナプスの内側と外側とのＭＦＩ比を、通常の広視野蛍光顕微鏡を使用して計算した（図７Ｂ）。ＣＤ８α－ｍＣｈｅｒｒｙを用いたＣＡＲ－ＴとＴＣＲ－Ｔとの間に有意差は検出されず、両方のＭＦＩ比が、本発明者らの免疫シナプス形成のカットオフ比の定義１．５を超えており、ＣＤ８α－ｍＣｈｅｒｒｙがＣＡＲ－Ｔ及びＴＣＲ－Ｔの両方で動員されたことを実証した。次に、ＣＤ８を動員できることを前提として、ＣＤ８がＣＡＲ－Ｔに機能的に寄与するか否かを明らかにすることが求められた。ＣＤ８α及びＣＤ８βをＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔ細胞及びＴＣＲ－Ｊｕｒｋａｔ細胞の両方に同時形質導入した後、ＣＡＲ又はＴＣＲの発現量は類似していることが示され（図７Ｃ、図７Ｄ）、予想通り、ＣＤ８αβ補助受容体を保有するＴＣＲ－Ｊｕｒｋａｔの反応性が有意に増加したことが分かった。ＣＤ８を有するＴＣＲ－Ｔは、ＣＤ８を有していないＴＣＲ－Ｔよりも速くて強力なカルシウム流出を示した（図２Ｂ）。ＣＤ８補助受容体を有するＴＣＲ－Ｔによって産生されたＩＬ－２は、ＣＤ８補助受容体を有していない場合よりもほぼ３倍高かった（図２Ｃ）。しかしながら、ＣＤ８を保有するＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔの反応性は、ＣＤ８を欠如している細胞よりも増強されなかった（図２Ｂ、図２Ｃ）。ＣＤ８を有するＣＡＲ－ＴとＣＤ８を有していないＣＡＲ－Ｔのカルシウム流出は同等であり、ＣＤ８を有するＣＡＲ－Ｔでは、ＩＬ－２の産生の有意な増加は検出されなかった。ＣＤ８は、ＬＣＫを免疫シナプスに導入することによってＴＣＲシグナル伝達を増強する上で重要であると考えられている。次いで、少なくともＣＤ８結合ＬＣＫに関しては、ＬＣＫはＣＡＲシグナル伝達にそれほど重要ではないであろうという仮説が立てられた。驚いたことに、ＣＡＲ－Ｔは、ＬＣＫ欠損Ｊｕｒｋａｔ細胞株Ｊｃａｍ１．６を使用したときに観察されたように（図２Ｄ、図２Ｅ）、ＬＣＫが存在しなくてもＴＣＲシグナル伝達を活性化することさえできた。ＣＡＲ－Ｊｃａｍ細胞は、ＩＬ－２を産生することでき、カルシウムを正常に流出させたが、ＴＣＲ－Ｊｃａｍ細胞は、抗原による刺激時にＩＬ－２を産生できなかった。
このＴＣＲ様ＣＡＲは、ペプチドＭＨＣに対してＴＣＲと同じ特異性を有しているため、Ｔ細胞活性化に対するＣＤ８補助受容体の寄与を明らかにすることは非常に興味深いことである。ＣＤ８補助受容体が、接触面での事象を検出するために使用された全内部反射蛍光顕微鏡（ＴＩＲＦＭ）を使用して、ＴＣＲ－Ｔ細胞と同様にＣＡＲ－Ｔ細胞によって動員できることが最初に示された（図２Ａ）。ＣＤ８αは、蛍光タンパク質ｍＣｈｅｒｒｙでキメラとして標識した。ＣＡＲ－ＴとＴＣＲ－Ｔの両方が表面にＣＤ８α－ｍＣｈｅｒｒｙを発現した（図７Ａ）。ＴＩＲＦＭの場合、支持された脂質二重層をガラスプレート上で調製し、インテグリンリガンドＩＣＡＭ－１を添加してＣＡＲ－Ｔ又はＴＣＲ－Ｔを検出表面に固定した。ＣＤ８α－ｍＣｈｅｒｒｙを発現するＣＡＲ－Ｔ又はＴＣＲ－Ｔ細胞を、特異的なｐＭＨＣを含む又は含まない二重層に１０分間添加した後、平均蛍光強度（ＭＦＩ）が、ｐＭＨＣが追加された両方の群で有意に増加した。ＣＡＲ－Ｔ及びＴＣＲ－Ｔと二重層との接触面内でのＣＤ８α－ｍＣｈｅｒｒｙのクラスター化は明らかであった。免疫シナプスの内側と外側とのＭＦＩ比を、通常の広視野蛍光顕微鏡を使用して計算した（図７Ｂ）。ＣＤ８α－ｍＣｈｅｒｒｙを用いたＣＡＲ－ＴとＴＣＲ－Ｔとの間に有意差は検出されず、両方のＭＦＩ比が、本発明者らの免疫シナプス形成のカットオフ比の定義１．５を超えており、ＣＤ８α－ｍＣｈｅｒｒｙがＣＡＲ－Ｔ及びＴＣＲ－Ｔの両方で動員されたことを実証した。次に、ＣＤ８を動員できることを前提として、ＣＤ８がＣＡＲ－Ｔに機能的に寄与するか否かを明らかにすることが求められた。ＣＤ８α及びＣＤ８βをＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔ細胞及びＴＣＲ－Ｊｕｒｋａｔ細胞の両方に同時形質導入した後、ＣＡＲ又はＴＣＲの発現量は類似していることが示され（図７Ｃ、図７Ｄ）、予想通り、ＣＤ８αβ補助受容体を保有するＴＣＲ－Ｊｕｒｋａｔの反応性が有意に増加したことが分かった。ＣＤ８を有するＴＣＲ－Ｔは、ＣＤ８を有していないＴＣＲ－Ｔよりも速くて強力なカルシウム流出を示した（図２Ｂ）。ＣＤ８補助受容体を有するＴＣＲ－Ｔによって産生されたＩＬ－２は、ＣＤ８補助受容体を有していない場合よりもほぼ３倍高かった（図２Ｃ）。しかしながら、ＣＤ８を保有するＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔの反応性は、ＣＤ８を欠如している細胞よりも増強されなかった（図２Ｂ、図２Ｃ）。ＣＤ８を有するＣＡＲ－ＴとＣＤ８を有していないＣＡＲ－Ｔのカルシウム流出は同等であり、ＣＤ８を有するＣＡＲ－Ｔでは、ＩＬ－２の産生の有意な増加は検出されなかった。ＣＤ８は、ＬＣＫを免疫シナプスに導入することによってＴＣＲシグナル伝達を増強する上で重要であると考えられている。次いで、少なくともＣＤ８結合ＬＣＫに関しては、ＬＣＫはＣＡＲシグナル伝達にそれほど重要ではないであろうという仮説が立てられた。驚いたことに、ＣＡＲ－Ｔは、ＬＣＫ欠損Ｊｕｒｋａｔ細胞株Ｊｃａｍ１．６を使用したときに観察されたように（図２Ｄ、図２Ｅ）、ＬＣＫが存在しなくてもＴＣＲシグナル伝達を活性化することさえできた。ＣＡＲ－Ｊｃａｍ細胞は、ＩＬ－２を産生することでき、カルシウムを正常に流出させたが、ＴＣＲ－Ｊｃａｍ細胞は、抗原による刺激時にＩＬ－２を産生できなかった。
【0134】
実施例２
ＬＣＫ非依存性ＣＡＲシグナル伝達はＣＤ２８共刺激ドメインを必要とする
どのドメインがＬＣＫの非存在下でＣＡＲの非標準的なＴ細胞シグナル伝達をトリガーするかを特定するために、体系的なドメイン置換を、ＣＤ２８を保有する第２世代ＣＡＲに対して行った。まず、ＬＣＫ非依存性シグナル伝達が細胞外ドメインの抗原特異性に起因するか否かを試験した。ＴＣＲ様ｓｃＦｖをＣＤ１９－ｓｃＦｖに交換し、ＣＤ１９発現Ｄａｕｄｉ細胞株を標的細胞として使用した（図８Ａ）。ＣＤ１９特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＬＣＫの存在下又は非存在下でＣＤ１９発現Ｄａｕｄｉ細胞によって活性化され、ＬＣＫ非依存性ＣＡＲシグナル伝達が、細胞外ＣＡＲドメインの抗原特異性とは非依存性であることを示唆している（図３Ａ）。ＣＤ３ζドメインの重要性を判断するために、ＣＤ３ζ細胞内ドメインを欠失させると、ＩＬ－２の産生は確認されず、ＣＡＲ－Ｔシグナル伝達におけるＣＤ３ζＩＴＡＭの必要不可欠性を実証している（図３Ｂ）。次いで、１）共刺激ＣＤ２８ドメインを欠失させて第１世代ＣＡＲを作製すること、２）ＣＤ２８をＣＤ１３７（４－１ＢＢ）細胞内ドメインに置き換える、又はＣＤ１３７ドメインを追加して第３世代ＣＡＲを作製することによって、ＬＣＫ非依存性ＣＡＲトリガーの媒介における共刺激シグナル伝達ドメインの役割を決定しようとした（図３Ｃ）。共刺激ドメインを含まない第１世代ＣＡＲ－１はＴＣＲのように振る舞い、ＣＡＲ－１がＬＣＫ欠損Ｊｃａｍ１．６細胞に導入されたときにシグナル伝達が停止した。ＣＤ１３７－ＣＡＲを構築した。結果は、第２世代ＣＡＲの場合、ＣＤ２８共刺激ドメインを含むデザインでのみ、ＬＣＫ非依存的にシグナル伝達したことを示す。それにもかかわらず、ＣＤ２８ドメイン及びＣＤ１３７ドメインの両方を含む第３世代ＣＡＲでは、抗原に応答したＣＡＲ－Ｔの活性化が、ＬＣＫ欠損条件下で観察されたが、ＬＣＫの非存在下では、ＣＤ２８細胞内ドメインのみを含むＣＡＲほど強くはなかった（図３Ｃ）。ＣＤ２８シグナル伝達経路の関与は、ＣＤ２８細胞内ドメインの機能的結合モチーフの突然変異によって実証された。ＰＩ３Ｋ結合モチーフ及びプロリンリッチ領域は、ＣＤ２８シグナル伝達に極めて重要であると報告されているため試験した（図３Ｄ）。３つの突然変異をＣＡＲ構築物に生じさせた；細胞内ドメインの欠失；ＰＩ３Ｋ結合モチーフＹＭＮＭがＦＭＮＭに突然変異した；プロリンリッチ領域ＰＹＡＰのプロリンがアラニンに置き換えられた。次いで、これら３つすべての突然変異を、Ｊｃａｍ１．６細胞株に形質導入した。ＩＬ－２の産生は、ＣＤ２８細胞内ドメインなしでは完全に抑制された。ＩＬ－２の産生の低下は、ＦＭＮＭ及びＡＹＡＡ突然変異体の両方で観察され、ＡＹＡＡ突然変異体は、ＦＭＮＭ突然変異体よりも活性化を減少させた。ＬＣＫ非依存性シグナル伝達におけるＣＤ２８シグナル伝達の影響をさらに試験するために、ＣＤ８０及びＣＤ８６をＣＨＯ－Ｌ２に同時形質導入して、ＣＤ２８シグナル伝達を活性化した。内因性ＣＤ２８の発現が、Ｊｕｒｋａｔ及びＪｃａｍ１．６の両方で確認された（図８Ｂ、図８Ｃ）。驚いたことに、ＣＡＲ－１－Ｊｃａｍ及びＴＣＲ－Ｊｃａｍ細胞は、ＣＤ８０及びＣＤ８６発現ＣＨＯ－Ｌ２細胞を使用してＣＡＲ－１－Ｊｃａｍ又はＴＣＲ－Ｊｃａｍ細胞を刺激すると、ＩＬ－２の産生の回復を示した。これらの結果は、ＬＣＫ非依存性ＣＡＲシグナル伝達には、第２世代ＣＡＲに存在するＣＤ２８細胞内ドメイン又は第１世代ＣＡＲ若しくはＴＣＲを使用したときの内因性ＣＤ２８分子のいずれかからの、ＹＭＮＭ及びＰＹＡＰモチーフを介して少なくとも部分的に媒介されるＣＤ２８共刺激シグナルが必要であることを示す。
ＬＣＫ非依存性ＣＡＲシグナル伝達はＣＤ２８共刺激ドメインを必要とする
どのドメインがＬＣＫの非存在下でＣＡＲの非標準的なＴ細胞シグナル伝達をトリガーするかを特定するために、体系的なドメイン置換を、ＣＤ２８を保有する第２世代ＣＡＲに対して行った。まず、ＬＣＫ非依存性シグナル伝達が細胞外ドメインの抗原特異性に起因するか否かを試験した。ＴＣＲ様ｓｃＦｖをＣＤ１９－ｓｃＦｖに交換し、ＣＤ１９発現Ｄａｕｄｉ細胞株を標的細胞として使用した（図８Ａ）。ＣＤ１９特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＬＣＫの存在下又は非存在下でＣＤ１９発現Ｄａｕｄｉ細胞によって活性化され、ＬＣＫ非依存性ＣＡＲシグナル伝達が、細胞外ＣＡＲドメインの抗原特異性とは非依存性であることを示唆している（図３Ａ）。ＣＤ３ζドメインの重要性を判断するために、ＣＤ３ζ細胞内ドメインを欠失させると、ＩＬ－２の産生は確認されず、ＣＡＲ－Ｔシグナル伝達におけるＣＤ３ζＩＴＡＭの必要不可欠性を実証している（図３Ｂ）。次いで、１）共刺激ＣＤ２８ドメインを欠失させて第１世代ＣＡＲを作製すること、２）ＣＤ２８をＣＤ１３７（４－１ＢＢ）細胞内ドメインに置き換える、又はＣＤ１３７ドメインを追加して第３世代ＣＡＲを作製することによって、ＬＣＫ非依存性ＣＡＲトリガーの媒介における共刺激シグナル伝達ドメインの役割を決定しようとした（図３Ｃ）。共刺激ドメインを含まない第１世代ＣＡＲ－１はＴＣＲのように振る舞い、ＣＡＲ－１がＬＣＫ欠損Ｊｃａｍ１．６細胞に導入されたときにシグナル伝達が停止した。ＣＤ１３７－ＣＡＲを構築した。結果は、第２世代ＣＡＲの場合、ＣＤ２８共刺激ドメインを含むデザインでのみ、ＬＣＫ非依存的にシグナル伝達したことを示す。それにもかかわらず、ＣＤ２８ドメイン及びＣＤ１３７ドメインの両方を含む第３世代ＣＡＲでは、抗原に応答したＣＡＲ－Ｔの活性化が、ＬＣＫ欠損条件下で観察されたが、ＬＣＫの非存在下では、ＣＤ２８細胞内ドメインのみを含むＣＡＲほど強くはなかった（図３Ｃ）。ＣＤ２８シグナル伝達経路の関与は、ＣＤ２８細胞内ドメインの機能的結合モチーフの突然変異によって実証された。ＰＩ３Ｋ結合モチーフ及びプロリンリッチ領域は、ＣＤ２８シグナル伝達に極めて重要であると報告されているため試験した（図３Ｄ）。３つの突然変異をＣＡＲ構築物に生じさせた；細胞内ドメインの欠失；ＰＩ３Ｋ結合モチーフＹＭＮＭがＦＭＮＭに突然変異した；プロリンリッチ領域ＰＹＡＰのプロリンがアラニンに置き換えられた。次いで、これら３つすべての突然変異を、Ｊｃａｍ１．６細胞株に形質導入した。ＩＬ－２の産生は、ＣＤ２８細胞内ドメインなしでは完全に抑制された。ＩＬ－２の産生の低下は、ＦＭＮＭ及びＡＹＡＡ突然変異体の両方で観察され、ＡＹＡＡ突然変異体は、ＦＭＮＭ突然変異体よりも活性化を減少させた。ＬＣＫ非依存性シグナル伝達におけるＣＤ２８シグナル伝達の影響をさらに試験するために、ＣＤ８０及びＣＤ８６をＣＨＯ－Ｌ２に同時形質導入して、ＣＤ２８シグナル伝達を活性化した。内因性ＣＤ２８の発現が、Ｊｕｒｋａｔ及びＪｃａｍ１．６の両方で確認された（図８Ｂ、図８Ｃ）。驚いたことに、ＣＡＲ－１－Ｊｃａｍ及びＴＣＲ－Ｊｃａｍ細胞は、ＣＤ８０及びＣＤ８６発現ＣＨＯ－Ｌ２細胞を使用してＣＡＲ－１－Ｊｃａｍ又はＴＣＲ－Ｊｃａｍ細胞を刺激すると、ＩＬ－２の産生の回復を示した。これらの結果は、ＬＣＫ非依存性ＣＡＲシグナル伝達には、第２世代ＣＡＲに存在するＣＤ２８細胞内ドメイン又は第１世代ＣＡＲ若しくはＴＣＲを使用したときの内因性ＣＤ２８分子のいずれかからの、ＹＭＮＭ及びＰＹＡＰモチーフを介して少なくとも部分的に媒介されるＣＤ２８共刺激シグナルが必要であることを示す。
【0135】
ＣＤ２８－ＣＡＲはＦＹＮに依存して下流のシグナル伝達を伝達する
次いで、本発明者らは、ＬＣＫの非存在下でのシグナル伝達中にＣＡＲのリン酸化に関与するキナーゼを特定しようとした。ＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔ又はＣＡＲ－ＪｃａｍのＩＬ－２の産生は、ＳＲＣファミリーキナーゼ（ＳＦＫ）阻害剤ＰＰ２が添加された後に完全に抑制され（図４Ａ、図９Ａ）、ＣＡＲシグナル伝達がＳＦＫに非常に依存していることを示している。ＬＣＫ及びＦＹＮがＴ細胞において最も顕著で関連性のあるＳＦＫであると考えて、ＬＣＫ及びＦＹＮをそれぞれ標的とする特異的な阻害剤Ａ７７００４１及びＳＵ６６５６を使用して、ＣＡＲ及びＴＣＲシグナル伝達におけるこれら２つのＳＦＫの相対的な役割を試験した。図４Ｂに示すように、ＴＣＲ－Ｊｕｒｋａｔは、ＬＣＫ阻害剤に対してＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔよりも感受性が高かった。逆に、ＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔは、ＦＹＮ阻害剤に対してＴＣＲ－Ｊｕｒｋａｔよりも感受性が高かった（図４Ｂ）。ＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔ又はＴＣＲ－Ｊｕｒｋａｔに対する阻害剤のＩＣ５０は、まったく異なる感受性をさらに実証し；ＬＣＫ阻害剤のＩＣ５０は、ＴＣＲ－Ｊｕｒｋａｔでは６．６ｎＭであったが、ＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔでは４７ｎＭであった。ＦＹＮ阻害剤の場合、ＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔ（３７６５ｎＭ）でのＩＣ５０は、ＴＣＲ－Ｊｕｒｋａｔに対するＩＣ５０（５５８３ｎＭ）よりも低かった（図９Ｂ）。ＬＣＫに依存するＴＣＲとは異なり、ＦＹＮを優先的に使用するＣＡＲのこの傾向は、ＦＹＮがＣＡＲからの下流シグナル伝達を活性化するキナーゼであり得ることを示唆した。ＬＣＫ非依存性シグナル伝達におけるＦＹＮ活性化の関与をさらに試験するために、ウエスタンブロットを行った。異なる時点でのＣＡＲ－ＪｃａｍのＦＹＮリン酸化の結果は、ＦＹＮの活性化部位Ｙ４２０が、ＴＣＲ－ＪｃａｍではなくＣＡＲ－Ｊｃａｍの特異的なＡＰＣへの結合の後にリン酸化されたことを示し（図４Ｃ）、３０分後にＦＹＮ Ｙ４２０リン酸化がほぼ２倍に増加した。リン酸化強度は、総ＦＹＮの強度に対するｐＹ４２０の強度によって計算した。下流の重要なシグナル伝達分子の活性化を、ＬＣＫ欠損ＣＡＲ－Ｊｃａｍでも調べた（図４Ｄ）。ＰＬＣγ１、Ｅｒｋ、及びＣＤ３ζのリン酸化は、ＣＡＲ－Ｊｃａｍの活性化後に検出されたが、ＣＡＲ１－ＪｃａｍではＥｒｋのみがリン酸化された。ＣＡＲ－ＪｃａｍとＣＡＲ１－Ｊｃａｍとの間の下流シグナル活性化の違いは、カルシウム流出実験にも反映されていた（図９Ｃ）。ＣＡＲ１－Ｊｃａｍ細胞ではなくＣＡＲ－Ｊｃａｍ細胞は、同族抗原に応答してカルシウム流入を示した。活性化後の異なる動態パターンは、ＣＡＲ－ＪｃａｍとＴＣＲ－Ｊｕｒｋａｔとの間でも見られた。ＰＬＣγ１、Ｅｒｋ、及びＣＤ３ζのリン酸化は、ＴＣＲのリン酸化よりもＣＡＲシグナル伝達後に安定していた。ＴＣＲの活性化は、各分子のリン酸化が３０分で上昇し、その後弱まったため、比較的短いパルスであった。
次いで、本発明者らは、ＬＣＫの非存在下でのシグナル伝達中にＣＡＲのリン酸化に関与するキナーゼを特定しようとした。ＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔ又はＣＡＲ－ＪｃａｍのＩＬ－２の産生は、ＳＲＣファミリーキナーゼ（ＳＦＫ）阻害剤ＰＰ２が添加された後に完全に抑制され（図４Ａ、図９Ａ）、ＣＡＲシグナル伝達がＳＦＫに非常に依存していることを示している。ＬＣＫ及びＦＹＮがＴ細胞において最も顕著で関連性のあるＳＦＫであると考えて、ＬＣＫ及びＦＹＮをそれぞれ標的とする特異的な阻害剤Ａ７７００４１及びＳＵ６６５６を使用して、ＣＡＲ及びＴＣＲシグナル伝達におけるこれら２つのＳＦＫの相対的な役割を試験した。図４Ｂに示すように、ＴＣＲ－Ｊｕｒｋａｔは、ＬＣＫ阻害剤に対してＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔよりも感受性が高かった。逆に、ＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔは、ＦＹＮ阻害剤に対してＴＣＲ－Ｊｕｒｋａｔよりも感受性が高かった（図４Ｂ）。ＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔ又はＴＣＲ－Ｊｕｒｋａｔに対する阻害剤のＩＣ５０は、まったく異なる感受性をさらに実証し；ＬＣＫ阻害剤のＩＣ５０は、ＴＣＲ－Ｊｕｒｋａｔでは６．６ｎＭであったが、ＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔでは４７ｎＭであった。ＦＹＮ阻害剤の場合、ＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔ（３７６５ｎＭ）でのＩＣ５０は、ＴＣＲ－Ｊｕｒｋａｔに対するＩＣ５０（５５８３ｎＭ）よりも低かった（図９Ｂ）。ＬＣＫに依存するＴＣＲとは異なり、ＦＹＮを優先的に使用するＣＡＲのこの傾向は、ＦＹＮがＣＡＲからの下流シグナル伝達を活性化するキナーゼであり得ることを示唆した。ＬＣＫ非依存性シグナル伝達におけるＦＹＮ活性化の関与をさらに試験するために、ウエスタンブロットを行った。異なる時点でのＣＡＲ－ＪｃａｍのＦＹＮリン酸化の結果は、ＦＹＮの活性化部位Ｙ４２０が、ＴＣＲ－ＪｃａｍではなくＣＡＲ－Ｊｃａｍの特異的なＡＰＣへの結合の後にリン酸化されたことを示し（図４Ｃ）、３０分後にＦＹＮ Ｙ４２０リン酸化がほぼ２倍に増加した。リン酸化強度は、総ＦＹＮの強度に対するｐＹ４２０の強度によって計算した。下流の重要なシグナル伝達分子の活性化を、ＬＣＫ欠損ＣＡＲ－Ｊｃａｍでも調べた（図４Ｄ）。ＰＬＣγ１、Ｅｒｋ、及びＣＤ３ζのリン酸化は、ＣＡＲ－Ｊｃａｍの活性化後に検出されたが、ＣＡＲ１－ＪｃａｍではＥｒｋのみがリン酸化された。ＣＡＲ－ＪｃａｍとＣＡＲ１－Ｊｃａｍとの間の下流シグナル活性化の違いは、カルシウム流出実験にも反映されていた（図９Ｃ）。ＣＡＲ１－Ｊｃａｍ細胞ではなくＣＡＲ－Ｊｃａｍ細胞は、同族抗原に応答してカルシウム流入を示した。活性化後の異なる動態パターンは、ＣＡＲ－ＪｃａｍとＴＣＲ－Ｊｕｒｋａｔとの間でも見られた。ＰＬＣγ１、Ｅｒｋ、及びＣＤ３ζのリン酸化は、ＴＣＲのリン酸化よりもＣＡＲシグナル伝達後に安定していた。ＴＣＲの活性化は、各分子のリン酸化が３０分で上昇し、その後弱まったため、比較的短いパルスであった。
【0136】
ＣＡＲ及びＴＣＲシグナル伝達におけるＬＣＫ及びＦＹＮの役割をより適切に検証するために、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集系を、ＬＣＫ又はＦＹＮをノックアウトするために導入した。ｇＲＮＡスクリーニング（表２）及びシングルクローンソーティング（図９Ｄ）の後、ＬＣＫノックアウトクローン２０及びＦＹＮノックアウトクローン８を、さらなる実験のためにＬＣＫ又はＦＹＮノックアウト系として選択した（図４Ｅ）。実験の前に、ＣＡＲ又はＴＣＲ形質導入ＬＣＫ又はＦＹＮノックアウトＴ細胞を、ＴＣＲとＣＡＲの発現が同等であるようにソートした。ＬＣＫノックアウトＪｕｒｋａｔ細胞では、ＴＣＲは、シグナル伝達を活性化してＩＬ－２を産生することができなかったが、ＣＡＲは依然として機能しており、Ｌｃｋ欠損Ｊｃａｍ１．６細胞株を使用して得られた以前の結果と一致していた（図４Ｆ）。しかしながら、ＦＹＮノックアウトＪｕｒｋａｔ細胞では、ＴＣＲは、野生型ＴＣＲ－Ｊｕｒｋａｔよりもわずかに多い量のＩＬ－２を産生した。しかしながら、ＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔ ＦＹＮ ＫＯ細胞のＩＬ－２の産生は、野生型ＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔと比較して劇的に減少した（図４Ｆ）。ＣＡＲ又はＴＣＲの発現は、ＦＹＮ ＫＯ Ｊｕｒｋａｔ細胞で同等であり、ＦＹＮの欠如が、ウエスタンブロッティングによってＣＡＲ又はＴＣＲ－Ｊｕｒｋａｔ ＦＹＮ ＫＯで確認された（図９Ｅ、図９Ｆ）。
【0137】
実施例３
ＬＣＫ欠損ＣＡＲ－Ｔは活性化閾値をリセットし、ＣＡＲとＴＣＲの両方を発現するＴ細胞でのＣＡＲトリガーのみを選択的に可能にする
次いで、これらの発見に基づいて、ＬＣＫ非依存性トリガーメカニズムの潜在的な機能的結果、及びＬＣＫ欠損ＣＡＲ－Ｔ細胞が実際に適用できるか否かを調べようとした。ＣＡＲ活性化閾値に対するＬＣＫの存在又は非存在の効果を最初に試験した。マルチペプチド提示系（図１Ｅ）のいくつかの非特異性は既に注記した。ＴＣＲ様ＣＡＲのこの非特異的活性化は以前に報告されており、ＴＣＲ様抗体の親和性が特定の閾値を超えると特異性が低下し得る。ＴＣＲ様ＣＡＲ－Ｔ細胞を異なる量のＣＡＲの発現についてソートした後、非パルスＨＬＡ－Ａ２又は特異的ペプチドパルスＨＬＡ－Ａ２に対して低発現から高発現のＣＡＲに分泌されるＩＬ－２の量の増加がまったく異なることが分かった（図５Ａ）。この違いは、ＴＣＲ様ＣＡＲが、非特異的結合と特異的結合に対して異なる親和性を有し得ることを示し、特異的結合の親和性は非特異的結合の親和性よりも高い。活性化キナーゼが各系で異なることを考えると、活性化閾値は、ＬＣＫ欠損ＣＡＲ－ＴとＬＣＫ十分ＣＡＲ－Ｔとの間で異なる可能性が高いという仮説が立てられた。従って、特異的及び非特異的抗原に対する応答は、ＬＣＫ欠損ＣＡＲ－Ｔにおいて区別することができる。ＣＡＲ－Ｊｃａｍ、ＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔ ７６、及びＣＡＲ－ＪＥ６－１の比較に見られるように、ＣＡＲ－ＪｃａｍによるＩＬ－２の産生は、陰性対照と同じくらい低く、非関連ペプチドＧＡＧを示したが、ＣＡＲ－ＪＥ６－１は、ＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔ ７６と同じ非特異的活性化を示した（図５Ｂ）。特に、ＪＥ６－１は、内因性ＴＣＲ様Ｊｃａｍ１．６を発現し（図１Ｃ）、従って、ＣＡＲによる非特異的活性化への内因性ＴＣＲの寄与を排除している。低親和性非特異的抗原に対するＴＣＲ様ＣＡＲ－Ｔ細胞の活性化の媒介におけるＬＣＫの役割をさらに検証するために、ＬＣＫをＪｃａｍ１．６細胞に形質導入して、ＬＣＫ陽性ＣＡＲ－Ｊｃａｍ細胞を作製した。この場合も、非パルスＨＬＡ－Ａ２ ＡＰＣは、ＬＣＫ陰性ＣＡＲ－Ｊｃａｍ細胞ではなく、ＬＣＫ陽性ＣＡＲ－Ｊｃａｍ細胞で強力なＩＬ－２の産生を誘導した（図５Ｃ）。抗原性ＣＨＯ－Ｌ２に対するＩＬ－２の産生は、ＬＣＫ陰性ＣＡＲ－Ｊｃａｍ細胞よりもＬＣＫ陽性ＣＡＲ－Ｊｃａｍで低いことも観察された（図１０Ａ）。さらに、ＬＣＫ欠損は、ＣＡＲとＴＣＲの両方を発現するＴ細胞において、ＴＣＲではなくＣＡＲの選択的トリガーを可能にすることが予測された。この仮説を試験するために、Ｌ２ペプチド特異的ＣＡＲ及びＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）由来Ｅ１８３－９１（ＦＬＬＴＲＩＬＴＩ）エピトープに対する特異性を有するＴＣＲ（従って、Ｅ１８３－ＴＣＲと呼ばれる）を、Ｊｕｒｋａｔ細胞又はＬＣＫノックアウトＪｕｒｋａｔ細胞に同時形質導入した（図１０Ｂ）。Ｊｕｒｋａｔ－ＴＣＲ＋ＣＡＲは、ＣＨＯ－Ｅ１８３又はＣＨＯ－Ｌ２によってＩＬ－２を産生するように誘導され、ＣＡＲとＴＣＲの活性化が、デュアルＣＡＲ＋ＴＣＲ系で損なわれていないことを示している。しかしながら、ＣＨＯ－Ｅ１８３ではなくＣＨＯ－Ｌ２は、ＣＡＲとＴＣＲを共発現するＬＣＫ欠損Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞でＩＬ－２の産生を誘導し、ＬＣＫ欠損が、ＴＣＲではなくＣＡＲの選択的トリガーのためのＴＣＲシグナル伝達経路の再構築を可能にすることを示している。
ＬＣＫ欠損ＣＡＲ－Ｔは活性化閾値をリセットし、ＣＡＲとＴＣＲの両方を発現するＴ細胞でのＣＡＲトリガーのみを選択的に可能にする
次いで、これらの発見に基づいて、ＬＣＫ非依存性トリガーメカニズムの潜在的な機能的結果、及びＬＣＫ欠損ＣＡＲ－Ｔ細胞が実際に適用できるか否かを調べようとした。ＣＡＲ活性化閾値に対するＬＣＫの存在又は非存在の効果を最初に試験した。マルチペプチド提示系（図１Ｅ）のいくつかの非特異性は既に注記した。ＴＣＲ様ＣＡＲのこの非特異的活性化は以前に報告されており、ＴＣＲ様抗体の親和性が特定の閾値を超えると特異性が低下し得る。ＴＣＲ様ＣＡＲ－Ｔ細胞を異なる量のＣＡＲの発現についてソートした後、非パルスＨＬＡ－Ａ２又は特異的ペプチドパルスＨＬＡ－Ａ２に対して低発現から高発現のＣＡＲに分泌されるＩＬ－２の量の増加がまったく異なることが分かった（図５Ａ）。この違いは、ＴＣＲ様ＣＡＲが、非特異的結合と特異的結合に対して異なる親和性を有し得ることを示し、特異的結合の親和性は非特異的結合の親和性よりも高い。活性化キナーゼが各系で異なることを考えると、活性化閾値は、ＬＣＫ欠損ＣＡＲ－ＴとＬＣＫ十分ＣＡＲ－Ｔとの間で異なる可能性が高いという仮説が立てられた。従って、特異的及び非特異的抗原に対する応答は、ＬＣＫ欠損ＣＡＲ－Ｔにおいて区別することができる。ＣＡＲ－Ｊｃａｍ、ＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔ ７６、及びＣＡＲ－ＪＥ６－１の比較に見られるように、ＣＡＲ－ＪｃａｍによるＩＬ－２の産生は、陰性対照と同じくらい低く、非関連ペプチドＧＡＧを示したが、ＣＡＲ－ＪＥ６－１は、ＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔ ７６と同じ非特異的活性化を示した（図５Ｂ）。特に、ＪＥ６－１は、内因性ＴＣＲ様Ｊｃａｍ１．６を発現し（図１Ｃ）、従って、ＣＡＲによる非特異的活性化への内因性ＴＣＲの寄与を排除している。低親和性非特異的抗原に対するＴＣＲ様ＣＡＲ－Ｔ細胞の活性化の媒介におけるＬＣＫの役割をさらに検証するために、ＬＣＫをＪｃａｍ１．６細胞に形質導入して、ＬＣＫ陽性ＣＡＲ－Ｊｃａｍ細胞を作製した。この場合も、非パルスＨＬＡ－Ａ２ ＡＰＣは、ＬＣＫ陰性ＣＡＲ－Ｊｃａｍ細胞ではなく、ＬＣＫ陽性ＣＡＲ－Ｊｃａｍ細胞で強力なＩＬ－２の産生を誘導した（図５Ｃ）。抗原性ＣＨＯ－Ｌ２に対するＩＬ－２の産生は、ＬＣＫ陰性ＣＡＲ－Ｊｃａｍ細胞よりもＬＣＫ陽性ＣＡＲ－Ｊｃａｍで低いことも観察された（図１０Ａ）。さらに、ＬＣＫ欠損は、ＣＡＲとＴＣＲの両方を発現するＴ細胞において、ＴＣＲではなくＣＡＲの選択的トリガーを可能にすることが予測された。この仮説を試験するために、Ｌ２ペプチド特異的ＣＡＲ及びＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）由来Ｅ１８３－９１（ＦＬＬＴＲＩＬＴＩ）エピトープに対する特異性を有するＴＣＲ（従って、Ｅ１８３－ＴＣＲと呼ばれる）を、Ｊｕｒｋａｔ細胞又はＬＣＫノックアウトＪｕｒｋａｔ細胞に同時形質導入した（図１０Ｂ）。Ｊｕｒｋａｔ－ＴＣＲ＋ＣＡＲは、ＣＨＯ－Ｅ１８３又はＣＨＯ－Ｌ２によってＩＬ－２を産生するように誘導され、ＣＡＲとＴＣＲの活性化が、デュアルＣＡＲ＋ＴＣＲ系で損なわれていないことを示している。しかしながら、ＣＨＯ－Ｅ１８３ではなくＣＨＯ－Ｌ２は、ＣＡＲとＴＣＲを共発現するＬＣＫ欠損Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞でＩＬ－２の産生を誘導し、ＬＣＫ欠損が、ＴＣＲではなくＣＡＲの選択的トリガーのためのＴＣＲシグナル伝達経路の再構築を可能にすることを示している。
【0138】
ＬＣＫ欠損ＣＡＲ－Ｔ細胞は、低レベルのＰＤ－１を発現し、刺激後にＣＡＲのダウンレギュレーションの低下を示す
遺伝子発現の多くの変化は、ＴＣＲシグナル伝達の後に起こる。重要な変化の１つは、癌免疫療法における消耗の重要なマーカーである共阻害分子ＰＤ－１のアップレギュレーションである（図６Ａ）。どちらの種類のＣＡＲ－Ｔ細胞でも、刺激前の細胞表面にはＰＤ－１は発現していなかった。それにもかかわらず、異なるＣＡＲ－Ｔ細胞の刺激後は、その違いは明らかであった。図６Ａに見られるように、ＬＣＫで形質導入されたＣＡＲ－Ｊｃａｍは、ＬＣＫ欠損ＣＡＲ－Ｊｃａｍよりも強くＰＤ－１をアップレギュレートした。加えて、ＰＤ－１の発現は、ＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔ細胞よりもＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔ ＬＣＫ ＫＯで低かった。しかしながら、ＴＣＲ－Ｊｕｒｋａｔは、これらの群の中で最大量のＰＤ－１を発現した。ＰＤ－１のアップレギュレーションにおけるこれらの違いは、数回の刺激が行われると、さらに一層顕著であった（図６Ｂ）。ＣＡＲ－Ｊｃａｍ＋ＬＣＫは、３回の刺激後にＣＡＲ－Ｊｃａｍよりもほぼ３倍高くＰＤ－１をアップレギュレートした。同じアップレギュレーション傾向がＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔ細胞試料で観察された。ＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔ ＬＣＫ ＫＯにおけるＰＤ－１の発現は、群の中で最も低く、ＴＣＲ－ＪｕｒｋａｔはＰＤ－１を最も強くアップレギュレートした。さらに、以前の研究で示されているように、ＣＡＲ又はＴＣＲは、ＬＣＫの存在下での抗原刺激後にダウンレギュレートされた。ＣＡＲは、Ｊｃａｍ又はＪｕｒｋａｔ ＬＣＫ ＫＯなどのＬＣＫ欠損細胞において、抗原依存性の受容体のダウンレギュレーションの低下を示した（図６Ａ、図６Ｄ）。刺激前のＣＡＲ又はＴＣＲの量と比較して、両方ともＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔ及びＴＣＲ－Ｊｕｒｋａｔでダウンレギュレートされ、ＴＣＲは劇的にダウンレギュレートされた。しかしながら、ＣＡＲの量は、ＣＡＲ－Ｊｃａｍ又はＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔ ＬＣＫ ＫＯに見られるように、ＬＣＫが存在しない限り、抗原刺激後により安定していた（図１２）。このＰＤ－１のアップレギュレーション及びＣＡＲのダウンレギュレーションの低下は、ＬＣＫ欠損ＣＡＲ－Ｔが、ＰＤ－１を介した抑制性シグナル伝達に抵抗性であり得、ＬＣＫ十分ＣＡＲ－Ｔと比較して「消耗」しにくいことを示唆した。
遺伝子発現の多くの変化は、ＴＣＲシグナル伝達の後に起こる。重要な変化の１つは、癌免疫療法における消耗の重要なマーカーである共阻害分子ＰＤ－１のアップレギュレーションである（図６Ａ）。どちらの種類のＣＡＲ－Ｔ細胞でも、刺激前の細胞表面にはＰＤ－１は発現していなかった。それにもかかわらず、異なるＣＡＲ－Ｔ細胞の刺激後は、その違いは明らかであった。図６Ａに見られるように、ＬＣＫで形質導入されたＣＡＲ－Ｊｃａｍは、ＬＣＫ欠損ＣＡＲ－Ｊｃａｍよりも強くＰＤ－１をアップレギュレートした。加えて、ＰＤ－１の発現は、ＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔ細胞よりもＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔ ＬＣＫ ＫＯで低かった。しかしながら、ＴＣＲ－Ｊｕｒｋａｔは、これらの群の中で最大量のＰＤ－１を発現した。ＰＤ－１のアップレギュレーションにおけるこれらの違いは、数回の刺激が行われると、さらに一層顕著であった（図６Ｂ）。ＣＡＲ－Ｊｃａｍ＋ＬＣＫは、３回の刺激後にＣＡＲ－Ｊｃａｍよりもほぼ３倍高くＰＤ－１をアップレギュレートした。同じアップレギュレーション傾向がＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔ細胞試料で観察された。ＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔ ＬＣＫ ＫＯにおけるＰＤ－１の発現は、群の中で最も低く、ＴＣＲ－ＪｕｒｋａｔはＰＤ－１を最も強くアップレギュレートした。さらに、以前の研究で示されているように、ＣＡＲ又はＴＣＲは、ＬＣＫの存在下での抗原刺激後にダウンレギュレートされた。ＣＡＲは、Ｊｃａｍ又はＪｕｒｋａｔ ＬＣＫ ＫＯなどのＬＣＫ欠損細胞において、抗原依存性の受容体のダウンレギュレーションの低下を示した（図６Ａ、図６Ｄ）。刺激前のＣＡＲ又はＴＣＲの量と比較して、両方ともＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔ及びＴＣＲ－Ｊｕｒｋａｔでダウンレギュレートされ、ＴＣＲは劇的にダウンレギュレートされた。しかしながら、ＣＡＲの量は、ＣＡＲ－Ｊｃａｍ又はＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔ ＬＣＫ ＫＯに見られるように、ＬＣＫが存在しない限り、抗原刺激後により安定していた（図１２）。このＰＤ－１のアップレギュレーション及びＣＡＲのダウンレギュレーションの低下は、ＬＣＫ欠損ＣＡＲ－Ｔが、ＰＤ－１を介した抑制性シグナル伝達に抵抗性であり得、ＬＣＫ十分ＣＡＲ－Ｔと比較して「消耗」しにくいことを示唆した。
【0139】
実施例３
方法
ＣＤ８＋ Ｔ細胞の活性化及び培養
血液試料を、ボランティアから採取し、ナイーブＣＤ８＋ Ｔ細胞を、RosetteSep（商標）ヒトＣＤ８＋ Ｔ細胞濃縮カクテル（Stemcell）及びFicoll（GE Healthcare Life Sciences）勾配遠心分離を使用して単離した。次いで、ナイーブＣＤ８＋ Ｔ細胞を、１００Ｕ／ｍｌ ＩＬ－２（R&D System）を含む４％のヒト血小板溶解物（Ultra-GRO（商標）－Advanced, AventaCell）が添加されたBiotarget培地（Biological Industry）で抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（ThermoFisher）によって刺激して、成熟細胞毒性ＣＤ８＋ Ｔ細胞を産生させた。４８時間の活性化後、成熟ＣＤ８＋ Ｔ細胞を、１００Ｕ／ｍｌ ＩＬ－２、１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－１５、及び１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－７（R&D System）を含む培地で培養した。培地を２日ごとに交換し、細胞を１ｍｌ当たり１０６個で再プレーティングした。Ｔ細胞を、ドナーからの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）であるフィーダー細胞によって再刺激した。ＰＢＭＣを、勾配遠心分離によって血液から新たに単離し、３０Ｇｙで照射した。ＰＢＭＣとＴ細胞を２：１の比率で同じ培地に再懸濁した。最終濃度１００Ｕ／ｍｌのＩＬ－２、最終濃度１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－７、最終濃度１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１５を培養物に添加した。インゲンマメ（Phaseolus vulgaris）（Sigma-Aldrich）由来のレクチンを１．５μｇ／ｍｌの濃度で培養物に添加した。ＮＵＳ ＩＲＢによって承認されたプロトコルの下で、血液を健康なボランティアから採取した。インフォームドコンセントをすべてのドナーから得た。
方法
ＣＤ８＋ Ｔ細胞の活性化及び培養
血液試料を、ボランティアから採取し、ナイーブＣＤ８＋ Ｔ細胞を、RosetteSep（商標）ヒトＣＤ８＋ Ｔ細胞濃縮カクテル（Stemcell）及びFicoll（GE Healthcare Life Sciences）勾配遠心分離を使用して単離した。次いで、ナイーブＣＤ８＋ Ｔ細胞を、１００Ｕ／ｍｌ ＩＬ－２（R&D System）を含む４％のヒト血小板溶解物（Ultra-GRO（商標）－Advanced, AventaCell）が添加されたBiotarget培地（Biological Industry）で抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（ThermoFisher）によって刺激して、成熟細胞毒性ＣＤ８＋ Ｔ細胞を産生させた。４８時間の活性化後、成熟ＣＤ８＋ Ｔ細胞を、１００Ｕ／ｍｌ ＩＬ－２、１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－１５、及び１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－７（R&D System）を含む培地で培養した。培地を２日ごとに交換し、細胞を１ｍｌ当たり１０６個で再プレーティングした。Ｔ細胞を、ドナーからの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）であるフィーダー細胞によって再刺激した。ＰＢＭＣを、勾配遠心分離によって血液から新たに単離し、３０Ｇｙで照射した。ＰＢＭＣとＴ細胞を２：１の比率で同じ培地に再懸濁した。最終濃度１００Ｕ／ｍｌのＩＬ－２、最終濃度１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－７、最終濃度１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１５を培養物に添加した。インゲンマメ（Phaseolus vulgaris）（Sigma-Aldrich）由来のレクチンを１．５μｇ／ｍｌの濃度で培養物に添加した。ＮＵＳ ＩＲＢによって承認されたプロトコルの下で、血液を健康なボランティアから採取した。インフォームドコンセントをすべてのドナーから得た。
【0140】
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集
ＬＣＫを標的とした相同組換え修復（ＨＤＲ）は既に説明されている。ＬＣＫ ｇＲＮＡ２、GCCGGGAAAAGTGATTCGAG（配列番号１０）を選択して化学的に改変した。簡単に説明すると、完全なＲＮＡ配列は
であった。アスタリスク（＊）は、２’－Ｏ－メチル３’ホスホロチオエートを表す。Ｃａｓ９－ＮＬＳタンパク質（New England Biology）とＬＣＫ ｇＲＮＡ２を１：２の分子比で、３７℃で３０分間インキュベートして、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成した。二本鎖ＤＮＡドナーを、ｌｋｂの相同アームが両側のＣＡＲ構築物に隣接するようにデザインした。１２０ｐｍｏｌのＲＮＰと２μｇのｄｓＤＮＡを、プログラムＥＨ１１５を介してAmaxa 4Dエレクトロポレーションシステム（Lonza）によって１００万個の活性化ＣＤ８＋ Ｔ細胞にエレクトロポレーションした。
ＬＣＫを標的とした相同組換え修復（ＨＤＲ）は既に説明されている。ＬＣＫ ｇＲＮＡ２、GCCGGGAAAAGTGATTCGAG（配列番号１０）を選択して化学的に改変した。簡単に説明すると、完全なＲＮＡ配列は
【化3】
であった。アスタリスク（＊）は、２’－Ｏ－メチル３’ホスホロチオエートを表す。Ｃａｓ９－ＮＬＳタンパク質（New England Biology）とＬＣＫ ｇＲＮＡ２を１：２の分子比で、３７℃で３０分間インキュベートして、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成した。二本鎖ＤＮＡドナーを、ｌｋｂの相同アームが両側のＣＡＲ構築物に隣接するようにデザインした。１２０ｐｍｏｌのＲＮＰと２μｇのｄｓＤＮＡを、プログラムＥＨ１１５を介してAmaxa 4Dエレクトロポレーションシステム（Lonza）によって１００万個の活性化ＣＤ８＋ Ｔ細胞にエレクトロポレーションした。
【0141】
細胞毒性アッセイ
ウェル当たり４０，０００個のＤａｕｄｉ又はＲａｊｉ細胞をＵ底９６ウェルプレートに播種し、続いてウェル当たり０．１：１～１０：１のエフェクターと標的（Ｅ：Ｔ）の比率でＣＡＲ－Ｔ又はＬＣＫ遺伝子座ＣＡＲ－Ｔ細胞を４，０００～４００，０００個追加した。細胞混合物を３７℃、５％ＣＯ２で１８時間インキュベートした。次いで、上清を回収し、CytoTox 96（登録商標）非放射性細胞毒性アッセイ（Promega）を使用して、死細胞からのＬＤＨの放出を検出した。細胞ペレットを懸濁し、抗体コンジュゲートで染色して、標的細胞に接触した後のＣＤ６２Ｌ、ＰＤ－１、ＴＩＭ－３、及びＬＡＧ－３の発現を検出した。
ウェル当たり４０，０００個のＤａｕｄｉ又はＲａｊｉ細胞をＵ底９６ウェルプレートに播種し、続いてウェル当たり０．１：１～１０：１のエフェクターと標的（Ｅ：Ｔ）の比率でＣＡＲ－Ｔ又はＬＣＫ遺伝子座ＣＡＲ－Ｔ細胞を４，０００～４００，０００個追加した。細胞混合物を３７℃、５％ＣＯ２で１８時間インキュベートした。次いで、上清を回収し、CytoTox 96（登録商標）非放射性細胞毒性アッセイ（Promega）を使用して、死細胞からのＬＤＨの放出を検出した。細胞ペレットを懸濁し、抗体コンジュゲートで染色して、標的細胞に接触した後のＣＤ６２Ｌ、ＰＤ－１、ＴＩＭ－３、及びＬＡＧ－３の発現を検出した。
【0142】
マウスモデル及びインビボ分析
６～８週齢のNOD/MrkBomT ac-Prkdcscid雌マウス（Taconic）を、NUS Institutional Animal Care and Use Committeeによって承認されたプロトコルの下で使用した。ＣＡＲ－Ｔ細胞を３日前に再刺激し、フィーダー細胞によって増殖させる。Ｒａｊｉ細胞を、マウス１匹当たり４００万個の尾静脈注射によって投与した。Ｒａｊｉ細胞は、非常に均一な腫瘍負荷を生成し、治療前に除外されたマウスはなかった。５×１０６、２．５×１０６、又は１×１０６の増殖ＣＡＲ－Ｔ細胞を、Ｒａｊｉ細胞投与後４日目に尾静脈から投与した。マウスを絶えず監視し、麻痺が観察されたときに安楽死させた。インビボ投与後のＣＡＲ－Ｔ細胞表現型検査のために、各マウスの骨髄を１１日目及び１８日目に抽出した。メモリー及び消耗表面マーカーを検出し、ＦＡＣＳによって分析した。
６～８週齢のNOD/MrkBomT ac-Prkdcscid雌マウス（Taconic）を、NUS Institutional Animal Care and Use Committeeによって承認されたプロトコルの下で使用した。ＣＡＲ－Ｔ細胞を３日前に再刺激し、フィーダー細胞によって増殖させる。Ｒａｊｉ細胞を、マウス１匹当たり４００万個の尾静脈注射によって投与した。Ｒａｊｉ細胞は、非常に均一な腫瘍負荷を生成し、治療前に除外されたマウスはなかった。５×１０６、２．５×１０６、又は１×１０６の増殖ＣＡＲ－Ｔ細胞を、Ｒａｊｉ細胞投与後４日目に尾静脈から投与した。マウスを絶えず監視し、麻痺が観察されたときに安楽死させた。インビボ投与後のＣＡＲ－Ｔ細胞表現型検査のために、各マウスの骨髄を１１日目及び１８日目に抽出した。メモリー及び消耗表面マーカーを検出し、ＦＡＣＳによって分析した。
【0143】
フローサイトメトリー及び細胞ソーティング
フローサイトメトリー実験を、BD LSR Fortessa X-20（Becton Dickinson）で行った。細胞ソーティングを、Flow Cytometry Laboratory, Immunology Programme, National University of SingaporeによってMo-Flo XDP（Beckman Coulter, Inc.）又はSY3200（Sony Biotechnology Inc.）のいずれかで行った。データ分析をFlowJoで行った。
フローサイトメトリー実験を、BD LSR Fortessa X-20（Becton Dickinson）で行った。細胞ソーティングを、Flow Cytometry Laboratory, Immunology Programme, National University of SingaporeによってMo-Flo XDP（Beckman Coulter, Inc.）又はSY3200（Sony Biotechnology Inc.）のいずれかで行った。データ分析をFlowJoで行った。
【0144】
統計情報及びデータ分析
GraphPad Prism 7を使用して、列データ又は曲線データそれぞれに対して両側スチューデントのｔ検定又は双方向ＡＮＯＶＡ分析を行った。データは試験の前提条件を満たしている。分散は、比較されたグループ間で類似している。
GraphPad Prism 7を使用して、列データ又は曲線データそれぞれに対して両側スチューデントのｔ検定又は双方向ＡＮＯＶＡ分析を行った。データは試験の前提条件を満たしている。分散は、比較されたグループ間で類似している。
【0145】
結果
次いで、本発明者らは、初代ヒトＣＤ８＋ Ｔ細胞におけるＪｕｒｋａｔ細胞からの発見の要約を試みた。この目的のために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を利用して相同組換え修復（ＨＤＲ）を実行し、ＣＤ２８－ＣＡＲ構築物をＬＣＫ遺伝子座に誘導してＬＣＫの１９６番目のアミノ酸の位置に挿入した（図１３Ａ）。ＨＤＲ後にＣＡＲ＋ＣＤ８＋ Ｔ細胞の明確な集団を検出した（図１４Ａ）。次いで、ＣＡＲ＋ＣＤ８＋ Ｔ細胞をソートしてＬＣＫタンパク質の発現を測定した。図１４Ｂに示されているように、ＬＣＫの発現は、従来のＣＡＲ－Ｔ細胞と比較して劇的に減少した。ＣＤ２８－ＣＡＲのＮ末端にＰ２Ａ切断可能配列が追加されたため、切断されたＬＣＫも観察された（図１４Ｂ）。この切断ＬＣＫは、アミノ酸１９６がＬＣＫのＳＨ２ドメインの端部に位置し、触媒ドメインの一部ではないことを考えると、機能不全変異体である。挿入部位での遺伝子型決定により、ＣＡＲ構築物がＬＣＫ遺伝子座に挿入されたことも確認された（図１４Ｃ）。２つのＣＤ１９発現細胞株、ＤａｕｄｉとＲａｊｉを使用して、Ｔ細胞の細胞毒性を試験した。従来のＣＡＲ－Ｔ及びＬＣＫ遺伝子座ＣＡＲ－Ｔはどちらも、同程度の細胞毒性を有していたが、Ｄａｕｄｉ細胞よりもＲａｊｉ細胞に対して低い細胞毒性も示した。Ｒａｊｉ細胞に対するこの低い細胞毒性は、Ｔ細胞の死滅に対するＲａｊｉ細胞の耐性メカニズムによって引き起こされ得る（図１３Ｂ）。対照ＣＤ８＋ Ｔ細胞はまた、高いＥ：Ｔ比でこれらの癌細胞に対してある程度の細胞毒性を示した。ＬＣＫ遺伝子座ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＤ１９陰性Ｊｕｒｋａｔ細胞ではなく、ＣＤ１９発現Ｄａｕｄｉ細胞のみを死滅させ得るため、ＬＣＫ遺伝子座ＣＡＲ－Ｔ細胞の特異性は、図１４Ｄに示されているように保持されていた。従来のＣＡＲ－ＴとＬＣＫ遺伝子座ＣＡＲ－Ｔとの違いを、消耗分子、ＰＤ－１、ＴＩＭ－３、ＬＡＧ－３、及びメモリーマーカーＣＤ６２Ｌの免疫型決定によって試験した。休止状態では、従来のＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＬＣＫ遺伝子座ＣＡＲ－Ｔ細胞よりもＴＩＭ－３の発現が高く（２５％）、ＣＤ６２Ｌの発現が低く（４９％）、ＬＣＫ遺伝子座ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＴＩＭ－３の発現が１４％であり、ＣＤ６２Ｌの発現が８５％である（図１３Ｃ）。異なるＥ：Ｔ比で標的細胞に接触した後、消耗分子及びメモリー分子の発現が変化した（図１４Ｅ）。低いＥ：Ｔ比では、消耗分子のより高い発現とより低いＣＤ６２Ｌの発現が観察された。レーダーチャートを使用して表面マーカーの発現を要約して異なる群で比較すると、これら２つのＣＡＲ－Ｔ細胞の違いがより明らかになった（図１３Ｄ）。従来のＣＡＲ－Ｔ細胞は、Ｅ：Ｔが減少するにつれて、より多くの消耗分子を発現し、ＣＤ６２Ｌの発現を低下させる傾向があった。しかしながら、ＬＣＫ遺伝子座ＣＡＲ－Ｔ細胞は、より持続性があり、ＰＤ－１、ＴＩＭ－３、及びＬＡＧ－３の発現は高いがＣＤ６２Ｌの発現は低い従来のＣＡＲ－Ｔ細胞ほど消耗マーカーをアップレギュレートする傾向はなかった。
次いで、本発明者らは、初代ヒトＣＤ８＋ Ｔ細胞におけるＪｕｒｋａｔ細胞からの発見の要約を試みた。この目的のために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を利用して相同組換え修復（ＨＤＲ）を実行し、ＣＤ２８－ＣＡＲ構築物をＬＣＫ遺伝子座に誘導してＬＣＫの１９６番目のアミノ酸の位置に挿入した（図１３Ａ）。ＨＤＲ後にＣＡＲ＋ＣＤ８＋ Ｔ細胞の明確な集団を検出した（図１４Ａ）。次いで、ＣＡＲ＋ＣＤ８＋ Ｔ細胞をソートしてＬＣＫタンパク質の発現を測定した。図１４Ｂに示されているように、ＬＣＫの発現は、従来のＣＡＲ－Ｔ細胞と比較して劇的に減少した。ＣＤ２８－ＣＡＲのＮ末端にＰ２Ａ切断可能配列が追加されたため、切断されたＬＣＫも観察された（図１４Ｂ）。この切断ＬＣＫは、アミノ酸１９６がＬＣＫのＳＨ２ドメインの端部に位置し、触媒ドメインの一部ではないことを考えると、機能不全変異体である。挿入部位での遺伝子型決定により、ＣＡＲ構築物がＬＣＫ遺伝子座に挿入されたことも確認された（図１４Ｃ）。２つのＣＤ１９発現細胞株、ＤａｕｄｉとＲａｊｉを使用して、Ｔ細胞の細胞毒性を試験した。従来のＣＡＲ－Ｔ及びＬＣＫ遺伝子座ＣＡＲ－Ｔはどちらも、同程度の細胞毒性を有していたが、Ｄａｕｄｉ細胞よりもＲａｊｉ細胞に対して低い細胞毒性も示した。Ｒａｊｉ細胞に対するこの低い細胞毒性は、Ｔ細胞の死滅に対するＲａｊｉ細胞の耐性メカニズムによって引き起こされ得る（図１３Ｂ）。対照ＣＤ８＋ Ｔ細胞はまた、高いＥ：Ｔ比でこれらの癌細胞に対してある程度の細胞毒性を示した。ＬＣＫ遺伝子座ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＤ１９陰性Ｊｕｒｋａｔ細胞ではなく、ＣＤ１９発現Ｄａｕｄｉ細胞のみを死滅させ得るため、ＬＣＫ遺伝子座ＣＡＲ－Ｔ細胞の特異性は、図１４Ｄに示されているように保持されていた。従来のＣＡＲ－ＴとＬＣＫ遺伝子座ＣＡＲ－Ｔとの違いを、消耗分子、ＰＤ－１、ＴＩＭ－３、ＬＡＧ－３、及びメモリーマーカーＣＤ６２Ｌの免疫型決定によって試験した。休止状態では、従来のＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＬＣＫ遺伝子座ＣＡＲ－Ｔ細胞よりもＴＩＭ－３の発現が高く（２５％）、ＣＤ６２Ｌの発現が低く（４９％）、ＬＣＫ遺伝子座ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＴＩＭ－３の発現が１４％であり、ＣＤ６２Ｌの発現が８５％である（図１３Ｃ）。異なるＥ：Ｔ比で標的細胞に接触した後、消耗分子及びメモリー分子の発現が変化した（図１４Ｅ）。低いＥ：Ｔ比では、消耗分子のより高い発現とより低いＣＤ６２Ｌの発現が観察された。レーダーチャートを使用して表面マーカーの発現を要約して異なる群で比較すると、これら２つのＣＡＲ－Ｔ細胞の違いがより明らかになった（図１３Ｄ）。従来のＣＡＲ－Ｔ細胞は、Ｅ：Ｔが減少するにつれて、より多くの消耗分子を発現し、ＣＤ６２Ｌの発現を低下させる傾向があった。しかしながら、ＬＣＫ遺伝子座ＣＡＲ－Ｔ細胞は、より持続性があり、ＰＤ－１、ＴＩＭ－３、及びＬＡＧ－３の発現は高いがＣＤ６２Ｌの発現は低い従来のＣＡＲ－Ｔ細胞ほど消耗マーカーをアップレギュレートする傾向はなかった。
【0146】
ＬＣＫ遺伝子座ＣＡＲ－Ｔ細胞のより持続的な表現型、即ちより多くのメモリー表現型及びより少ない消耗表現型は、それらが従来のＣＡＲ－Ｔ細胞よりも優れたインビボ抗癌有効性を示し得ることを示唆した。次いで、従来のＣＡＲ－Ｔ細胞及びＬＣＫ遺伝子座ＣＡＲ－Ｔ細胞を、マウスモデルでＲａｊｉ細胞にタックルするように暴露すると、Ｒａｊｉは、インビトロでＤａｕｄｉ細胞よりもＣＡＲ－Ｔ細胞毒性に耐性がある（図１３Ｂ）。これはまた、それらがインビボでより耐性がある可能性があることを示唆した。ＮＯＤ／ＳＣＩＤ免疫不全マウス系統を使用して、ＣＡＲ－Ｔ細胞を異なる用量で静脈内投与し、４日後にＲａｊｉ細胞を投与した（図１３Ｅ）。本発明者らの予想と一致して、従来のＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞と比較してインビボでの有効性の有意な改善を示さなかった。しかしながら、ＬＣＫ遺伝子座ＣＡＲ－Ｔ細胞は、１００万～５００万個の細胞の３つの用量すべてで有意に増強されたインビボ性能を示した（図１３Ｆ）。実験の終了時に、５００万個のＬＣＫ遺伝子座ＣＡＲ－Ｔ細胞で処置された群の１匹のマウスがまだ生存していた。このマウスから抽出された複数の臓器内に癌細胞は発見されなかった（図１４Ｆ）。Ｒａｊｉ細胞及びＴ細胞は、Ｒａｊｉ細胞注射後１１日目と１８日目にマウスの骨髄からさらに分析して、それらの数、並びにＴ細胞のメモリー及び消耗状態を確認した。１１日目と１８日目の従来のＣＡＲ－Ｔ細胞からのＴ細胞数及びＲａｊｉ細胞数とＬＣＫ遺伝子座ＣＡＲ－Ｔ細胞の群からのＴ細胞数及びＲａｊｉ細胞数は有意差を示さなかった（図１４Ｇ）。しかしながら、図１３Ｇに示されているように、ＬＣＫ遺伝子座ＣＡＲ－Ｔ細胞は、従来のＣＡＲ－Ｔ細胞と比較して、１１日目と１８日目のメモリーマーカーＣＤ４５ＲＯの両方で有意に高い発現を示した。加えて、従来のＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＬＣＫ遺伝子座ＣＡＲ－Ｔ細胞よりも消耗マーカーＰＤ－１、ＴＩＭ－３、及びＬＡＧ３をアップレギュレートした。これは、これらの消耗マーカーの３つすべてを共発現している細胞で特に顕著であった（図１３Ｈ）。従来のＣＡＲ－Ｔ細胞と比較して、ＬＣＫ遺伝子座ＣＡＲ－Ｔ細胞ではメモリー表現型がより多く、消耗表現型がより少ないため、それらの増強されたインビボ有効性を裏付けた。
【図1A-C】
【図1D-E】
【図2A-B】
【図2C-E】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図3E】
【図4A-C】
【図4D-F】
【図5A】
【図5B-C】
【図5D】
【図6A】
【図6B-D】
【図7A-B】
【図7C-D】
【図8A-B】
【図8C】
【図9A-C】
【図9D-E】
【図9F】
【図10A】
【図10B】
【図11A-B】
【図11C】
【図12】
【図13A-B】
【図13C】
【図13D】
【図13E-F】
【図13G-H】
【図14A-B】
【図14C-D】
【図14E】
【図14F】
【図14G】
【配列表】
【国際調査報告】