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▶ タイジェニックス、ソシエダッド、アノニマ、ウニペルソナルの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-04-14
(54)【発明の名称】同種異系療法のための改良された幹細胞集団
(51)【国際特許分類】
C12N 5/0775 20100101AFI20220407BHJP
A61P 1/04 20060101ALI20220407BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20220407BHJP
A61P 15/00 20060101ALI20220407BHJP
A61P 17/02 20060101ALI20220407BHJP
A61P 19/00 20060101ALI20220407BHJP
A61P 19/02 20060101ALI20220407BHJP
A61P 19/08 20060101ALI20220407BHJP
A61P 21/00 20060101ALI20220407BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20220407BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20220407BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20220407BHJP
A61P 1/18 20060101ALI20220407BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220407BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20220407BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20220407BHJP
A61K 35/28 20150101ALI20220407BHJP
C07K 14/57 20060101ALN20220407BHJP
【ＦＩ】
C12N5/0775
A61P1/04
A61P9/00
A61P15/00
A61P17/02
A61P19/00
A61P19/02
A61P19/08
A61P21/00
A61P25/00
A61P27/02
A61P29/00
A61P1/18
A61P35/00
A61P35/02
A61P37/02
A61K35/28
C07K14/57
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021550077
(86)(22)【出願日】2020-02-26
(85)【翻訳文提出日】2021-09-22
(86)【国際出願番号】 EP2020055017
(87)【国際公開番号】W WO2020174002
(87)【国際公開日】2020-09-03
(31)【優先権主張番号】19382141.0
(32)【優先日】2019-02-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】507421463
【氏名又は名称】タイジェニックス、ソシエダッド、アノニマ、ウニペルソナル
【氏名又は名称原語表記】ＴＩＧＥＮＩＸ Ｓ．Ａ．Ｕ．
(74)【代理人】
【識別番号】100091487
【弁理士】
【氏名又は名称】中村 行孝
(74)【代理人】
【識別番号】100120031
【弁理士】
【氏名又は名称】宮嶋 学
(74)【代理人】
【識別番号】100120617
【弁理士】
【氏名又は名称】浅野 真理
(74)【代理人】
【識別番号】100126099
【弁理士】
【氏名又は名称】反町 洋
(72)【発明者】
【氏名】オルガ、デ、ラ、ローサ、モラレス
(72)【発明者】
【氏名】アルバロ、アビバル－バルデラス
【テーマコード（参考）】
4B065
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA93X
4B065AC12
4B065AC20
4B065BA24
4B065BA25
4B065CA44
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB64
4C087CA04
4C087NA05
4C087ZA01
4C087ZA02
4C087ZA33
4C087ZA36
4C087ZA66
4C087ZA68
4C087ZA81
4C087ZA89
4C087ZA94
4C087ZA96
4C087ZB07
4C087ZB11
4C087ZB26
4C087ZB27
4H045AA30
4H045DA18
(57)【要約】
本発明は、特に、前感作された患者の治療および再治療のための、同種異系幹細胞療法のための改良された幹細胞集団に関する。さらに、前記幹細胞集団を得る方法が提供される。さらに、本発明は、前記幹細胞集団を含んでなる医薬組成物および同種異系幹細胞療法におけるそれらの使用に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
特に、前感作された患者の治療または同種異系療法による患者の再治療のための、同種異系療法に好適な幹細胞（ＳＣ）集団を選択するｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、以下の工程：ａ）ＳＣ集団のサンプルを、前記ＳＣ集団において最大のＨＬＡ－クラスＩ発現を誘導することができるＩＦＮ－γ濃度の存在下で培養し（試験サンプル）、かつＳＣ集団のサンプルをＩＦＮ－γの非存在下で別に培養すること（対照サンプル）；
ｂ）ＨＬＡ－クラスＩ抗体が試験サンプルおよび対照サンプルにおいて発現したＨＬＡ－クラスＩに結合するような条件下で、ＨＬＡ－クラスＩ抗体の異なる濃度の範囲で試験サンプルと対照サンプルとを接触させること；
ｃ）結合したＨＬＡ－クラスＩ抗体が補体で飽和し、かつ補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）が誘導されるように、補体を試験サンプルおよび対照サンプルに加えること；
ｄ）試験サンプルおよび対照サンプルにおいて誘導された細胞溶解を測定することにより、ＨＬＡ－クラスＩ抗体の異なる濃度の範囲に関してＣＤＣを決定すること；
ｅ）試験サンプルおよび対照サンプルにおける最大のＣＤＣの５０％（ＥＣ５０値）を誘導するＨＬＡ－クラスＩ抗体の濃度を決定すること；ならびに
ｆ１）試験サンプルのＥＣ５０値に対する対照サンプルのＥＣ５０値の比が、１．２５未満、好ましくは、１．０未満、より好ましくは、０．５未満；特に好ましくは、０．２５未満である場合、同種異系療法のためのＳＣ集団を選択すること；または
ｆ２）試験サンプルのＥＣ５０値が、ＨＬＡ－クラスＩ抗体の少なくとも３．５ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、少なくとも９ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、少なくとも１５ｎｇ／ｍｌ、特に好ましくは、少なくとも２０ｎｇ／ｍｌである場合、同種異系療法のためのＳＣ集団を選択すること
を含んでなる、方法。
【請求項2】
前記方法が、試験サンプルおよび対照サンプルにおけるＣＤ４６発現レベルを決定する工程；ならびに対照サンプルにおけるＣＤ４６発現に対する試験サンプルにおけるＣＤ４６発現の比が、２．０超、好ましくは、２．５超、特に好ましくは、３．０超である場合、同種異系療法のためのＳＣ集団を選択する工程をさらに含んでなる、請求項１に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
【請求項3】
前記ＳＣ集団が間葉系幹細胞（ＭＳＣ）集団、好ましくは、ヒトＭＳＣ集団であり、より好ましくは、前記間葉系幹細胞集団が骨髄由来幹細胞（ＢＭ－ＭＳＣ）集団であり、または前記間葉系幹細胞集団が脂肪組織由来幹細胞（ＡＳＣ）集団であり、さらにより好ましくは、前記ＡＳＣ集団がＣＤ２９、ＣＤ７３、ＣＤ９０および／もしくはＣＤ１０５を発現する、請求項１または２に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
【請求項4】
前記ＳＣ集団において最大のＨＬＡ－クラスＩ発現を誘導することができる前記ＩＦＮ－γ濃度が、約０．５～約３０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、約１～約１５ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、約２～約４ｎｇ／ｍｌであり、好ましくは、前記ＳＣ集団において最大のＨＬＡ－クラスＩ発現を誘導することができる前記ＩＦＮ－γ濃度が、好ましくは、４８時間の期間にわたり適用される、３ｎｇ ＩＦＮ－γ／ｍｌである、請求項１～３のいずれか一項に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
【請求項5】
前記ＨＬＡ－クラスＩ抗体が、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂおよび／またはＨＬＡ－Ｃに特異的に結合し、好ましくは、前記ＨＬＡ－クラスＩ抗体が、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－ＢおよびＨＬＡ－Ｃに特異的に結合し、より好ましくは、前記ＨＬＡ－クラスＩ抗体がマウスモノクローナル抗体であり、さらにより好ましくは、前記ＨＬＡ－クラスＩ抗体が、ＡＴＣＣ（指定番号：ＨＢ－９５）またはＥＣＡＣＣ（番号：８４１１２００３）から入手可能なハイブリドーマクローンｗ６／３２により産生される抗体と本質的に同じＨＬＡ－Ａに対する結合親和性を有し、最も好ましくは、前記抗体が、ＡＴＣＣ（指定番号：ＨＢ－９５）またはＥＣＡＣＣ（番号：８４１１２００３）から入手可能なハイブリドーマクローンｗ６／３２により産生される、請求項１～４のいずれか一項に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
【請求項6】
約１～約５０ｎｇ／ｍｌの範囲内の前記ＨＬＡ－クラスＩ抗体の２種類または３種類の異なる濃度が使用され、好ましくは、約１～約５０ｎｇ／ｍｌの範囲内の前記ＨＬＡ－クラスＩ抗体の４種類または５種類の異なる濃度が使用され、より好ましくは、約１～約５０ｎｇ／ｍｌの範囲内の前記ＨＬＡ－クラスＩ抗体の６種類または７種類の異なる濃度が使用され、さらにより好ましくは、約１～約５０ｎｇ／ｍｌの範囲内の前記ＨＬＡ－クラスＩ抗体の８種類または９種類の異なる濃度が使用され、最も好ましくは、前記ＨＬＡ－クラスＩ抗体の異なる濃度の範囲が、１ｎｇ／ｍｌ、３ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌおよび５０ｎｇ／ｍｌである、請求項１～５のいずれか一項に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
【請求項7】
請求項１の工程（ｃ）において使用される補体が血清由来であり、好ましくは、前記血清が熱で処理されておらず、より好ましくは、前記血清がウサギ、ヤギまたはヒツジ由来であり、最も好ましくは、前記血清がウサギ由来である、請求項１～６のいずれか一項に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
【請求項8】
前記補体が血清由来であり、得られた血清濃度が５０～８３．３３％（ｖ／ｖ）であり、好ましくは、得られた血清濃度が６６．６６～８３．３３％（ｖ／ｖ）である、請求項１～７のいずれか一項に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
【請求項9】
前記細胞溶解が、生細胞もしくは溶解細胞または溶解細胞から放出された放射性物質に対して選択的である化学発光色素または蛍光色素を測定することにより決定される、請求項１～８のいずれか一項に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
【請求項10】
特に、前感作された患者の治療または同種異系療法による再治療のための、同種異系療法に好適なＳＣ集団であって、以下の特性：ｉ）試験サンプルのＥＣ５０値に対する対照サンプルのＥＣ５０値の比が、１．２５未満、好ましくは、１．０未満、より好ましくは、０．５未満、特に好ましくは、０．２５未満であり、ここで、前記ＥＣ５０値は、請求項１に示されるように決定される；
ｉｉ）試験サンプルのＥＣ５０値が、少なくとも３．５ｎｇ／ｍｌ ＨＬＡ－クラスＩ抗体、好ましくは、少なくとも９ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、少なくとも１５ｎｇ／ｍｌ、特に好ましくは、少なくとも２０ｎｇ／ｍｌ ＨＬＡ－クラスＩ抗体であり、ここで、前記ＥＣ５０値は、請求項１に示されるように決定される；および／または
ｉｉｉ）対照サンプルにおけるＣＤ４６発現に対する試験サンプルにおけるＣＤ４６発現の比が、２．０超、好ましくは、２．５超、特に好ましくは、３．０超であり、ここで、前記ＣＤ４６発現は、請求項２に示されるように決定される、
のうちいずれかを有する、ＳＣ集団。
【請求項11】
前記ＳＣ集団が、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法により選択され、好ましくは、前記ＳＣ集団が間葉系幹細胞（ＭＳＣ）集団であり、より好ましくは、前記ＳＣ集団がＢＭ－ＭＳＣ集団またはＡＳＣ集団であり、さらにより好ましくは、前記ＳＣ集団がヒトＢＭ－ＭＳＣ集団またはヒトＡＳＣ集団である、請求項１０に記載のＳＣ集団。
【請求項12】
請求項１０または１１に記載のＳＣ集団と場合により薬学上許容可能な担体とを含んでなる、医薬組成物。
【請求項13】
医薬組成物を調製する方法であって、以下の工程：ａ）請求項１～９のいずれか一項に記載の方法を行うこと；ならびに
ｂ）少なくとも１つの薬学上許容可能な担体とともに選択されたＳＣ集団を処方すること
を含んでなる、方法。
【請求項14】
それを必要とする患者における、好ましくは、前感作された患者または再治療を受けている患者における、同種異系幹細胞療法における使用のための請求項１０または１１に記載のＳＣ集団であって、好ましくは、それを必要とする前記患者が、瘻孔、白血病、リンパ腫、神経変性疾患、脳損傷および脊髄損傷、心疾患、盲目および視力障害、膵ベータ細胞機能喪失、軟骨修復、変形性関節症、筋骨格系疾患、創傷、不妊症、自己免疫疾患および炎症性疾患、例えば、炎症性腸疾患から選択される疾患に罹患しており、より好ましくは、前記疾患が瘻孔であり、さらにより好ましくは、前記疾患が複雑肛門周囲瘻である、ＳＣ集団。
【請求項15】
それを必要とする患者に対して、好ましくは、前感作された患者または再治療を受けている患者において、請求項１０または１１に記載のＳＣ集団を投与することを含んでなる同種異系幹細胞療法の方法であって、好ましくは、それを必要とする前記患者が、白血病、リンパ腫、神経変性疾患、脳損傷および脊髄損傷、心疾患、盲目および視力障害、膵ベータ細胞機能喪失、軟骨修復、変形性関節症、筋骨格系疾患、創傷、不妊症、自己免疫疾患および炎症性疾患、例えば、炎症性腸疾患から選択される疾患に罹患しており、より好ましくは、前記疾患が瘻孔であり、さらにより好ましくは、前記疾患が複雑肛門周囲瘻である、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、特に、前感作された患者の治療および再治療のための、同種異系幹細胞療法のための改良された幹細胞集団に関する。さらに、前記幹細胞集団を得る方法が提供される。さらに、本発明は、前記幹細胞集団を含んでなる医薬組成物および同種異系幹細胞療法におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【0002】
発明の背景
研究および医学的適用における使用のための幹細胞は、胚性組織、胎児組織または成体組織に由来し得、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、臍帯幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）および異なる源からの成体幹細胞が含まれる。瘻孔、白血病、リンパ腫、神経変性疾患、脳損傷および脊髄損傷、心疾患、盲目および視力障害、膵ベータ細胞機能喪失、軟骨修復、変形性関節症、筋骨格系疾患、創傷、不妊症、自己免疫疾患および炎症性疾患、例えば、炎症性腸疾患の治療に関して、多数の臨床試験が現在進行中であるか、または成功裏に完了している。異なる種類の幹細胞に関する現在の医学的適用の概要は、Mahla RS, International Journal of Cell Biology. 2016 (7): 1-24において見出され得る。
研究および医学的適用における使用のための幹細胞は、胚性組織、胎児組織または成体組織に由来し得、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、臍帯幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）および異なる源からの成体幹細胞が含まれる。瘻孔、白血病、リンパ腫、神経変性疾患、脳損傷および脊髄損傷、心疾患、盲目および視力障害、膵ベータ細胞機能喪失、軟骨修復、変形性関節症、筋骨格系疾患、創傷、不妊症、自己免疫疾患および炎症性疾患、例えば、炎症性腸疾患の治療に関して、多数の臨床試験が現在進行中であるか、または成功裏に完了している。異なる種類の幹細胞に関する現在の医学的適用の概要は、Mahla RS, International Journal of Cell Biology. 2016 (7): 1-24において見出され得る。
【0003】
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、骨芽細胞、軟骨細胞、筋細胞および脂肪細胞を含む種々の細胞型に分化することができる多能性間質細胞である。
【0004】
種々の病態を治療するための自己ＭＳＣおよび同種異系ＭＳＣの使用が、数件の臨床試験において評価されており（Galipeau and Sensebe, (2018), Cell Stem Cell 22, 824-833、特に表Ｓ１）、損傷した消化管、敗血症および移植片対宿主病ならびにいくつかの自己免疫疾患および炎症性疾患の治療に焦点を当てたものが含まれる。
【0005】
成体ＭＳＣは、ほぼ総ての組織において認められ得、主に血管周囲微小環境に位置している。大多数の臨床試験が骨髄ＭＳＣ（ＢＭ－ＭＳＣ）を使用して実施されているが、脂肪組織などの他の源からのＭＳＣを使用する試験の数が増加している。ＢＭ－ＭＳＣおよび脂肪由来間葉系幹細胞（ＡＳＣ）は、類似した潜在能力および複製比を共有する。しかしながら、ＡＳＣは、より容易に回収され、培養のためのサンプル中に大量に存在する（ＢＭ組織と比較して、脂肪組織１グラム中に１００倍多く存在する）という利点を有する。
【0006】
標準的な免疫学のドグマは、いかなる異組織も生物体において免疫反応を誘発するということを抱えている。この概念は、積極的な免疫抑制が同種移植片を拒絶反応から保護するために標準である実質臓器移植および造血移植において明らかに顕著である。移植片拒絶反応における抗体の役割に関する最も強力な証拠は、主に血管柄付きの臓器、例えば、腎臓および心臓の超急性拒絶反応である。これらの反応を示すレシピエントにおいて、高力価の抗ドナー抗体が示され得る。これらの抗体は、内皮細胞上のＨＬＡ抗原と結合し、その後、補体結合および多形核細胞の蓄積が生じる。次に、おそらく多形核白血球から放出された酵素の結果として、内皮損傷が生じ、次いで血小板が蓄積し、血栓が生じ、その結果、腎皮質壊死または心筋梗塞が生じる。この抗ＨＬＡ抗体媒介反応を回避するために、ドナーとレシピエントとを移植拒絶反応を回避するためにできる限り密接に適合させるために、ＨＬＡタイピングが臨床臓器および組織移植において行われる。
【0007】
細胞ベースの療法の分野が発展するにつれ、種々の細胞型（間葉系幹細胞（ＭＳＣ）が原型である）が、免疫系を回避および／または抑制する能力を有し得ることが明らかとなってきており、その結果、いくつかの試験において、ＭＳＣが免疫抑制を伴うことなく適用されている。
【0008】
Griffin et al., Immunol. & Cell Biol. (2012), 1-12は、アロＭＳＣの「免疫特権」状態を支持する良好なｉｎ ｖｉｖｏの証拠が存在するかどうかを決定するために、実験データをレビューしている。この著者らは、炎症刺激による活性化の後または分化の後のアロＭＳＣの免疫原性に関する公表済みの試験を検討した。この著者らは、これらの試験の大部分が、非操作ＩＦＮ－γ活性化および分化アロＭＳＣの投与後のドナー抗原に対する特異的な細胞性（Ｔ細胞）免疫応答および液性（Ｂ細胞／抗体）免疫応答を考証しており、その後の同種異系移植の急速拒絶反応が認められ、ドナー特異的寛容が明らかに促進されることを要約している。これらの試験のいくつかにおいて、移植片または投与されたＭＳＣの急速拒絶反応（Griffin et al.の表１および２参照）が認められた。この著者らは、アロＭＳＣの免疫特権の性質の概念を再検討すること、およびアロＭＳＣにより誘発される抗ドナー免疫応答の臨床的意味の範囲をより正確に検討することを推奨した。したがって、抗ドナー免疫応答は、ヒトおよび動物の同種異系療法におけるアロＭＳＣのクリアランスの改善に起因する有効性および／または有害作用に対する意味を有し得る。
【0009】
この点を考慮して、患者の同種異系療法に好適な手段であって、前記手段が、前感作された患者におけるおよび／または再治療のための同種異系療法において低減した免疫原性および／または向上した適合性を示す、手段の必要性が存在する。さらに、それらを得る方法およびそれらの医学的使用も提供されるものとする。
【発明の概要】
【0010】
本発明の根底にある技術的課題は、特許請求の範囲において定義される主題の提供により解決される。
【0011】
第１の側面によれば、特に、前感作された患者の治療または同種異系療法による患者の再治療のための、同種異系療法に好適な幹細胞（ＳＣ）集団を選択するｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、以下の工程：
ａ）ＳＣ集団のサンプルを、前記ＳＣ集団において最大のＨＬＡ－クラスＩ発現を誘導することができるＩＦＮ－γ濃度の存在下で培養し（試験サンプル）、かつＳＣ集団のサンプルをＩＦＮ－γの非存在下で別に培養すること（対照サンプル）；
ｂ）ＨＬＡ－クラスＩ抗体が試験サンプルおよび対照サンプルにおいて発現したＨＬＡ－クラスＩに結合するような条件下で、ＨＬＡ－クラスＩ抗体の異なる濃度の範囲で試験サンプルと対照サンプルとを接触させること；
ｃ）結合したＨＬＡ－クラスＩ抗体が補体で飽和し、かつ補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）が誘導されるように、補体を試験サンプルおよび対照サンプルに加えること；
ｄ）試験サンプルおよび対照サンプルにおいて誘導された細胞溶解を測定することにより、ＨＬＡ－クラスＩ抗体の異なる濃度の範囲に関してＣＤＣを決定すること；
ｅ）最大のＣＤＣの５０％（ＥＣ５０値）を誘導する試験サンプルおよび対照サンプルにおけるＨＬＡ－クラスＩ抗体の濃度を決定すること；ならびに
ｆ１）試験サンプルのＥＣ５０値に対する対照サンプルのＥＣ５０値の比が、１．２５未満、好ましくは、１．０未満、より好ましくは、０．５未満；特に好ましくは、０．２５未満である場合、同種異系療法のためのＳＣ集団を選択すること；または
ｆ２）試験サンプルのＥＣ５０値が、ＨＬＡ－クラスＩ抗体の少なくとも３．５ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、少なくとも９ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、少なくとも１５ｎｇ／ｍｌ、特に好ましくは、少なくとも２０ｎｇ／ｍｌである場合、同種異系療法のためのＳＣ集団を選択すること
を含んでなる方法が提供される。
ａ）ＳＣ集団のサンプルを、前記ＳＣ集団において最大のＨＬＡ－クラスＩ発現を誘導することができるＩＦＮ－γ濃度の存在下で培養し（試験サンプル）、かつＳＣ集団のサンプルをＩＦＮ－γの非存在下で別に培養すること（対照サンプル）；
ｂ）ＨＬＡ－クラスＩ抗体が試験サンプルおよび対照サンプルにおいて発現したＨＬＡ－クラスＩに結合するような条件下で、ＨＬＡ－クラスＩ抗体の異なる濃度の範囲で試験サンプルと対照サンプルとを接触させること；
ｃ）結合したＨＬＡ－クラスＩ抗体が補体で飽和し、かつ補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）が誘導されるように、補体を試験サンプルおよび対照サンプルに加えること；
ｄ）試験サンプルおよび対照サンプルにおいて誘導された細胞溶解を測定することにより、ＨＬＡ－クラスＩ抗体の異なる濃度の範囲に関してＣＤＣを決定すること；
ｅ）最大のＣＤＣの５０％（ＥＣ５０値）を誘導する試験サンプルおよび対照サンプルにおけるＨＬＡ－クラスＩ抗体の濃度を決定すること；ならびに
ｆ１）試験サンプルのＥＣ５０値に対する対照サンプルのＥＣ５０値の比が、１．２５未満、好ましくは、１．０未満、より好ましくは、０．５未満；特に好ましくは、０．２５未満である場合、同種異系療法のためのＳＣ集団を選択すること；または
ｆ２）試験サンプルのＥＣ５０値が、ＨＬＡ－クラスＩ抗体の少なくとも３．５ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、少なくとも９ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、少なくとも１５ｎｇ／ｍｌ、特に好ましくは、少なくとも２０ｎｇ／ｍｌである場合、同種異系療法のためのＳＣ集団を選択すること
を含んでなる方法が提供される。
【0012】
第２の側面によれば、特に、前感作された患者の治療または同種異系療法による再治療のための、同種異系療法に好適なＳＣ集団であって、以下の特性：
ｉ）試験サンプルのＥＣ５０値に対する対照サンプルのＥＣ５０値の比が、１．２５未満、好ましくは、１．０未満、より好ましくは、０．５未満、特に好ましくは、０．２５未満であり、ここで、前記ＥＣ５０値は、本発明に係る方法に示されるように決定される；
ｉｉ）試験サンプルのＥＣ５０値が、少なくとも３．５ｎｇ／ｍｌ ＨＬＡ－クラスＩ抗体、好ましくは、少なくとも９ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、少なくとも１５ｎｇ／ｍｌ、特に好ましくは、少なくとも２０ｎｇ／ｍｌ ＨＬＡ－クラスＩ抗体であり、ここで、前記ＥＣ５０値は、本発明に係る方法に示されるように決定される；および／または
ｉｉｉ）対照サンプルにおけるＣＤ４６発現に対する試験サンプルにおけるＣＤ４６発現の比が、２．０超、好ましくは、２．５超、特に好ましくは、３．０超であり、ここで、前記ＣＤ４６発現は、本発明の方法に示されるように決定される、
のうちいずれかを有するＳＣ集団が提供される。
ｉ）試験サンプルのＥＣ５０値に対する対照サンプルのＥＣ５０値の比が、１．２５未満、好ましくは、１．０未満、より好ましくは、０．５未満、特に好ましくは、０．２５未満であり、ここで、前記ＥＣ５０値は、本発明に係る方法に示されるように決定される；
ｉｉ）試験サンプルのＥＣ５０値が、少なくとも３．５ｎｇ／ｍｌ ＨＬＡ－クラスＩ抗体、好ましくは、少なくとも９ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、少なくとも１５ｎｇ／ｍｌ、特に好ましくは、少なくとも２０ｎｇ／ｍｌ ＨＬＡ－クラスＩ抗体であり、ここで、前記ＥＣ５０値は、本発明に係る方法に示されるように決定される；および／または
ｉｉｉ）対照サンプルにおけるＣＤ４６発現に対する試験サンプルにおけるＣＤ４６発現の比が、２．０超、好ましくは、２．５超、特に好ましくは、３．０超であり、ここで、前記ＣＤ４６発現は、本発明の方法に示されるように決定される、
のうちいずれかを有するＳＣ集団が提供される。
【0013】
第３の側面によれば、本発明に係るＳＣ集団と場合により薬学上許容可能な担体とを含んでなる医薬組成物が提供される。
【0014】
第４の側面によれば、医薬組成物を調製する方法であって、以下の工程：
ａ）本発明に係る方法を行うこと；ならびに
ｂ）少なくとも１つの薬学上許容可能な担体とともに選択されたＳＣ集団を処方すること
を含んでなる方法が提供される。
ａ）本発明に係る方法を行うこと；ならびに
ｂ）少なくとも１つの薬学上許容可能な担体とともに選択されたＳＣ集団を処方すること
を含んでなる方法が提供される。
【0015】
第５の側面によれば、それを必要とする患者における、好ましくは、前感作された患者または再治療を受けている患者における、同種異系幹細胞療法における本発明に係るＳＣ集団の使用が提供される。
【0016】
第６の側面によれば、それを必要とする患者に対して、好ましくは、前感作された患者または再治療を受けている患者において、本発明に係るＳＣ集団を投与することを含んでなる同種異系幹細胞療法の方法が提供される。
【0017】
本発明者らは、ＡＳＣ集団が、クローン病および治療抵抗性の排液性複雑肛門周囲瘻に罹患している患者に投与された場合（ここで、ＡＳＣ集団は同種異系非ＨＬＡ適合レシピエントに病変内投与される）、アロ感作が生じるかどうかを検討した。時点０では、４例の患者のみがＨＬＡ－クラスＩ分子に対する抗体反応性を示したが、治療の１２週後は、２２例の患者がこの抗体反応性を示したことが認められた。対照群では、６例の患者（時点０）から１２週後の９例の患者への反応性の増大のみが認められた。その後、異なるドナー由来のＡＳＣ細胞集団を検討した。前感作された患者および抗ＨＬＡクラスＩ反応性を示す患者由来の血漿サンプルは、異なるドナー由来のＩＦＮ－γ誘導ＡＳＣ集団におけるそれらの結合挙動およびそれらの補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を誘導する能力において有意に異なっていたことが認められた。これらの所見に基づき、本発明者らは、異なるドナー由来のＳＣ集団は、それらのＨＬＡ－クラスＩ結合、および古典的補体経路の活性化（抗体／補体複合体の形成）に起因する細胞溶解に対するそれらの感受性において有意に異なっており、ここで、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてアロ反応性に対してより抵抗性であるＳＣ集団が、同種異系療法の目的では好ましい、ということをさらに決定した。このことは、特に、患者が、例えば早期妊娠によりＨＬＡ－クラスＩ抗原に前感作されている状況、または同じドナーＳＣ集団が同じ患者に複数回投与される再治療の場合の状況に当てはまる。本発明者らは、アロ反応性に対する抵抗性の増大はＣＤ４６発現により媒介されること、およびＡＳＣ細胞におけるＣＤ４６発現の阻害はＣＤＣ感受性の亢進と相関することをさらに決定した。
【図面の簡単な説明】
【0018】
【図1】図１は、ＡＤＭＩＲＥ ＣＤ１におけるＤＳＡ産生のキャラクタリゼーションを示す。Ａ．試験のプラセボ（下のチャート）群およびＣｘ６０１（上のチャート）群の両方における指定の来院：治療前（ベースライン）、Ｗ１２およびＷ５２に関するＬａｂｓｃｒｅｅｎ Ｍｉｘｅｄ／Ｌａｂｓｃｒｅｅｎ Ｓｉｎｇｌｅ Ａｎｔｉｇｅｎ（ＬＳＭ／ＬＳＡ）(Tait et al. (2013), Transplantation 95: 19-47)の結果の分布。計５例（Ｃｘ６０１群）および１２例（プラセボ群）の患者が試験中止となったため、ＬＳＭ／ＬＳＡデータを入手できなかった。Ｂ．指定の時点においてＬＳＭアッセイで測定された各マイクロスフェアからの平均蛍光強度の和（ΣＭＦＩ）として表された抗ＨＬＡ Ａｂ力価を示す動態曲線。各グラフにおける点線は、陽性を判定するために使用したＭＦＩ ３，０００超の閾値を示す。右上のパネルにおける円は、患者９２（Ｐａｔ９２）を示す。Ｃ．各患者とＡＳＣとの間のＨＬＡ不適合を表すグラフ。不適合の相関に関して、ＤＳＡを産生した者のパーセンテージを、ミスマッチエプレット（座位において認められる多型残基の非共有の独特の鎖）(Duquesnoy (2002) Hum. Immunol. 63: 339-352)の数（範囲）に対してプロットした。線形回帰に関して、ピアソン検定（ｒ２）を適用した。Ｐ値は、スチューデントのｔ検定により決定した。
【図2】図２は、ＡＳＣにおけるＨＬＡ発現およびｉｎ ｖｉｔｒｏでの抗ＨＬＡ Ａｂ結合を示す。Ａ．ＭＦＩ増加と、未処理（黒色の円）ＡＳＣおよびＩＦＮγによる前活性化（白色の四角）ＡＳＣに対して指向するクラスＩ ＨＬＡ（Ｗ６／３２）ＡｂおよびクラスＩＩ ＨＬＡ（Ｌ２４３）Ａｂの各濃度との間の相関を示すグラフ。Ｂ．陰性対照（アイソタイプ）、陽性対照（過免疫サンプル、ＨＩプール）および患者９２（Ｐａｔ９２、新規ＤＳＡを産生した未治療患者）血清を表すＦｃＴｏｘ（フローサイトメトリーアッセイによる補体依存性細胞傷害）のプロット。左下のパネルは、アイソタイプ対照（淡灰色）、過免疫血清（暗灰色）またはＰａｔ９２血清（中暗灰色）を使用したＦＡＣＳ結合強度定量化（ＩｇＧ＋細胞の総数）を示す。右下のパネルは、対照条件（ウサギ補体なし、淡灰色）、過免疫血清またはＰａｔ９２血清（中暗灰色）におけるＦＡＣＳ細胞死定量化（７－ＡＡＤ＋細胞の総数）を示す。Ｐ値はスチューデントのｔ検定により決定し、ｒ２はピアソン検定により決定した。
【図3】図３は、ＡＤＭＩＲＥ ＣＤ１血漿サンプルが、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＡＳＣにおいて低い細胞傷害死を誘導することを示す。Ａ．指定の時点（Ｗ０治療前およびＷ１２治療後）での１０例の前感作された患者（上のパネル）および１７例の新規ＤＳＡ＋患者（下のパネル）のＨＬＡ－Ｉ結合の正規化パーセント値を示すグラフ。結合アッセイの前に、ＤｏｎＡ（ＡＤＭＩＲＥ ＣＤ１試験において投与されたドナー）およびＤｏｎＢのＡＳＣを通常の（基本）条件または３ｎｇ／ｍＬ ＩＦＮγの存在下で４８時間成長させた。Ｂ．指定の時点での１０例の前感作された患者（上のパネル）および１７例の新規ＤＳＡ＋患者（下のパネル）の７－ＡＡＤ陽性ＡＳＣの正規化パーセント値を示すグラフ。Ｐ値は、スチューデントのｔ検定により決定した。
【図4】図４は、ＡＳＣが高レベルのｍＣＲＰを発現することを示す。Ａ．ＦＡＣＳ分析による７例のＡＳＣドナー（黒色のバー）および１例のＢＭ－ＭＳＣドナー（白色のバー）におけるＣＤ４６、ＣＤ５５およびＣＤ５９のＭＦＩ値を示すグラフ。細胞は、３ｎｇ／ｍＬ（ＩＦＮγ）の存在下で４８時間成長させたか、または未処理のままとした（基本）。Ｂ．ＦＡＣＳ分析により決定された７例のＡＳＣドナーにおけるＣＤ４６、ＣＤ５５およびＣＤ５９の異なるＭＦＩ値を示すグラフ。細胞は、３ｎｇ／ｍＬ ＩＦＮγの存在下で４８時間成長させたか（ＩＦＮγ）、または未処理のままとした（基本）。Ｃ．基本条件下（左側のパネル）およびＩＦＮγとともに（右側のパネル）培養したドナーＤｏｎＡ、ＤｏｎＢ、ＤｏｎＣ、ＤｏｎＤ、ＤｏｎＥ、ＤｏｎＦおよびＤｏｎＧ由来のＡＳＣに関する抗体濃度に依存した抗体結合（上のパネル）および細胞死（下のパネル）を示すグラフ。Ｐ値は、スチューデントのｔ検定により決定した。右下のパネルから、ＥＣ５０値を決定することができる。
【図5】図５は、ＣＤ４６がＡＳＣにおいて補体細胞傷害性を媒介することを示す。Ａ．Ｗ６／３２ Ａｂの増加した濃度レベルに対する７－ＡＡＤ陽性親ＡＳＣおよびＣＤ４６ＫＯ ＤｏｎＢ ＡＳＣのパーセンテージを示すグラフ。分析の前に、親ＡＳＣおよびＣＤ４６ＫＯ ＤｏｎＢ ＡＳＣを、３ｎｇ／ｍＬ ＩＦＮγの存在下で４８時間成長させたか（ＩＦＮγ）、または未処理のままとした（基本）。Ｂ．Ｗ６／３２ Ａｂの濃度（線形からｌｏｇ１０に変換）に対する７－ＡＡＤ陽性親ＡＳＣおよびＣＤ４６ＫＯ ＡＳＣのパーセンテージを示すシグモイド曲線。Ｐ値は、二元配置分散分析検定から決定した。
【図6】図６Ａ～Ｂは、３ｎｇ／ｍＬ ＩＦＮγの存在下で４８時間成長させた（白色の四角）、または基本条件下で成長させた（黒色の円）ＡＳＣドナーのＷ６／３２（Ａ）ならびにＣＤ４６、ＣＤ５５およびＣＤ５９（Ｂ）のＭＦＩ値の相関に関する。Ｐ値は、線形回帰からの傾きの有意性を示す。ＣＤ４６およびＣＤ５５（Ｂ）に関するＩＦＮγ条件における傾きの有意性に関するＲ－２乗値は、それぞれ０．７４および０．７１であった。Ｃ．親（白色のバー）ＡＳＣならびにＣＤ４６ＫＯ（黒色および灰色のバー）ＡＳＣにおけるＣＤ４６ ＭＦＩ値を示すグラフ。分析の前に、親ＡＳＣおよびＣＤ４６ＫＯ ＡＳＣを、３ｎｇ／ｍＬ ＩＦＮγで４８時間成長させたか（ＩＦＮγ）、または未処理とした（基本）。Ｐ値は、スチューデントのｔ検定により決定した。
【発明を実施するための形態】
【0019】
発明の詳細な説明
用語「含んでなる(comprise)」または「含んでなる(comprising)」が本明細書および特許請求の範囲において使用される場合、それは、他の要素または工程を排除しない。本発明の目的で、用語「からなる」は、用語「含んでなる(comprising of)」の任意選択の実施形態であるとみなされる。以下で群が少なくとも特定の数の実施形態を含んでなるように定義される場合、これは、任意選択でこれらの実施形態のみからなる群を開示するものとも理解されるべきである。
用語「含んでなる(comprise)」または「含んでなる(comprising)」が本明細書および特許請求の範囲において使用される場合、それは、他の要素または工程を排除しない。本発明の目的で、用語「からなる」は、用語「含んでなる(comprising of)」の任意選択の実施形態であるとみなされる。以下で群が少なくとも特定の数の実施形態を含んでなるように定義される場合、これは、任意選択でこれらの実施形態のみからなる群を開示するものとも理解されるべきである。
【0020】
単数名詞に言及する際に、不定冠詞または定冠詞、例えば、「ａ」または「ａｎ」、「ｔｈｅ」が使用される場合、これは、特に断りのない限り、その名詞の複数形を含む。逆に、名詞の複数形が使用される場合、それは単数形も指す。
【0021】
さらに、本明細書および特許請求の範囲における第１、第２、第３または（ａ）、（ｂ）、（ｃ）などの用語は、類似した要素を区別するために使用され、必ずしも逐次的または経時的な順序を記載するために使用されるわけではない。そのように使用される用語は、適当な状況下で互換的であり、本明細書に記載の本発明の実施形態は、本明細書に記載されるまたは示される順序以外の順序において作用できるものと理解されるべきである。
【0022】
本発明の文脈において、示されるいずれの数値も、当業者が問題の特徴の技術的効果が依然として保証されると理解する正確度の間隔と一般に関連する。本明細書で使用する場合、示される数値からの偏差は、±１０％、好ましくは、±５％の範囲である。±１０％、好ましくは、±５％という示された数値間隔からの前述の偏差は、数値に関して本明細書で使用される「約」および「およそ」という用語によっても示される。
【0023】
第１の側面によれば、特に、前感作された患者の治療または同種異系療法による患者の再治療のための、同種異系療法に好適な幹細胞（ＳＣ）集団を選択するｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、以下の工程：
ａ）ＳＣ集団のサンプルを、前記ＳＣ集団において最大のＨＬＡ－クラスＩ発現を誘導することができるＩＦＮ－γ濃度の存在下で培養し（試験サンプル）、かつＳＣ集団のサンプルをＩＦＮ－γの非存在下で別に培養すること（対照サンプル）；
ｂ）ＨＬＡ－クラスＩ抗体が試験サンプルおよび対照サンプルにおいて発現したＨＬＡ－クラスＩに結合するような条件下で、ＨＬＡ－クラスＩ抗体の異なる濃度の範囲で試験サンプルと対照サンプルとを接触させること；
ｃ）結合したＨＬＡ－クラスＩ抗体が補体で飽和し、かつ補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）が誘導されるように、補体を試験サンプルおよび対照サンプルに加えること；
ｄ）試験サンプルおよび対照サンプルにおいて誘導された細胞溶解を測定することにより、ＨＬＡ－クラスＩ抗体の異なる濃度の範囲に関してＣＤＣを決定すること；
ｅ）最大のＣＤＣの５０％（ＥＣ５０値）を誘導する試験サンプルおよび対照サンプルにおけるＨＬＡ－クラスＩ抗体の濃度を決定すること；ならびに
ｆ１）試験サンプルのＥＣ５０値に対する対照サンプルのＥＣ５０値の比が、１．２５未満、好ましくは、１．０未満、より好ましくは、０．５未満；特に好ましくは、０．２５未満である場合、同種異系療法のためのＳＣ集団を選択すること；または
ｆ２）試験サンプルのＥＣ５０値が、ＨＬＡ－クラスＩ抗体の少なくとも３．５ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、少なくとも９ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、少なくとも１５ｎｇ／ｍｌ、特に好ましくは、少なくとも２０ｎｇ／ｍｌである場合、同種異系療法のためのＳＣ集団を選択すること
を含んでなる方法が提供される。
ａ）ＳＣ集団のサンプルを、前記ＳＣ集団において最大のＨＬＡ－クラスＩ発現を誘導することができるＩＦＮ－γ濃度の存在下で培養し（試験サンプル）、かつＳＣ集団のサンプルをＩＦＮ－γの非存在下で別に培養すること（対照サンプル）；
ｂ）ＨＬＡ－クラスＩ抗体が試験サンプルおよび対照サンプルにおいて発現したＨＬＡ－クラスＩに結合するような条件下で、ＨＬＡ－クラスＩ抗体の異なる濃度の範囲で試験サンプルと対照サンプルとを接触させること；
ｃ）結合したＨＬＡ－クラスＩ抗体が補体で飽和し、かつ補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）が誘導されるように、補体を試験サンプルおよび対照サンプルに加えること；
ｄ）試験サンプルおよび対照サンプルにおいて誘導された細胞溶解を測定することにより、ＨＬＡ－クラスＩ抗体の異なる濃度の範囲に関してＣＤＣを決定すること；
ｅ）最大のＣＤＣの５０％（ＥＣ５０値）を誘導する試験サンプルおよび対照サンプルにおけるＨＬＡ－クラスＩ抗体の濃度を決定すること；ならびに
ｆ１）試験サンプルのＥＣ５０値に対する対照サンプルのＥＣ５０値の比が、１．２５未満、好ましくは、１．０未満、より好ましくは、０．５未満；特に好ましくは、０．２５未満である場合、同種異系療法のためのＳＣ集団を選択すること；または
ｆ２）試験サンプルのＥＣ５０値が、ＨＬＡ－クラスＩ抗体の少なくとも３．５ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、少なくとも９ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、少なくとも１５ｎｇ／ｍｌ、特に好ましくは、少なくとも２０ｎｇ／ｍｌである場合、同種異系療法のためのＳＣ集団を選択すること
を含んでなる方法が提供される。
【0024】
「幹細胞（ＳＣ）集団」は、本明細書において、胚性多能性幹細胞（ＥＳＣ）、胎児幹細胞および成体幹細胞を含む任意の幹細胞を意味する。前記集団は、初代細胞培養物、細胞株またはクローン由来のいずれかであり得る。
【0025】
前記幹細胞の集団は、多能性幹細胞の集団であってもよいし、または間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、例えば、骨髄由来、臍帯組織由来、血液由来（臍帯血由来を含む）、月経血由来、歯髄由来、胎盤由来または脂肪由来ＭＳＣの集団であってもよい（Huang et al., J Dent. Res. (2009) 88(9): 792-806; Carvalho et al., Curr. Stem Cell Res. Ther. (2011) 6(3): 221-8; Harris et al., Curr Stem Cell Res Ther. (2013) 8(5): 394-9; Li et al., Ann. N YAcad. Sci. (2016) 1370(1): 109-18）。好ましい実施形態において、前記幹細胞はヒト幹細胞（例えば、ヒトＡＳＣ）である。本発明の好ましい複数の実施形態において、前記幹細胞の集団は脂肪由来間質幹細胞（ＡＳＣ）である。前記ＡＳＣは、ＡＳＣの拡大集団であってもよい。
【0026】
幹細胞の集団を作製および培養する方法は、周知である。
【0027】
前記幹細胞の集団は、実質的に純粋であり得る。幹細胞の集団（例えば、ＡＳＣの集団などのＭＳＣ集団）に関連した用語「実質的に純粋」は、少なくとも約７５％、一般に、少なくとも約８５％、より一般に、少なくとも約９０％、最も一般に、少なくとも約９５％均一である幹細胞集団を指す。均一性は、形態および／または細胞表面マーカープロファイルにより評価することができる。形態および細胞表面マーカープロファイルを評価するための技法は、本明細書に開示されている。
【0028】
前記幹細胞は、未分化状態におけるそれらの自己再生能力および特殊化された細胞型に分化するそれらの能力を特徴とする。ＥＳＣは、クローンから公的に入手可能である。成体幹細胞は、造血幹細胞、乳腺幹細胞、腸幹細胞、間葉系幹細胞、神経幹細胞、嗅覚成体幹細胞、神経堤幹細胞および精巣細胞を含む未分化細胞である。好ましくは、前記ＳＣ集団は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、より好ましくは、ヒトＭＳＣ集団である。
【0029】
多能性幹細胞
多能性幹細胞の源は２つ存在する。第１に、胚性幹細胞（ＥＳＣ）は、着床前胚盤胞の内部細胞塊に由来し、多能性は、コア転写因子であるオクタマー結合転写因子４（ＯＣＴ４）、性決定領域Ｙ－ｂｏｘ２（ＳＯＸ２）、およびＮａｎｏｇホメオボックス（ＮＡＮＯＧ）の内因性調節ネットワークにより制御される。第２に、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は、体細胞における多能性の誘導に必須の４つの転写因子、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、クルッペル様因子４（ＫＬＦ４）、およびＭＹＣ癌原遺伝子（Ｃ－ＭＹＣ）の異所性発現または高度発現により誘導される。
多能性幹細胞の源は２つ存在する。第１に、胚性幹細胞（ＥＳＣ）は、着床前胚盤胞の内部細胞塊に由来し、多能性は、コア転写因子であるオクタマー結合転写因子４（ＯＣＴ４）、性決定領域Ｙ－ｂｏｘ２（ＳＯＸ２）、およびＮａｎｏｇホメオボックス（ＮＡＮＯＧ）の内因性調節ネットワークにより制御される。第２に、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は、体細胞における多能性の誘導に必須の４つの転写因子、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、クルッペル様因子４（ＫＬＦ４）、およびＭＹＣ癌原遺伝子（Ｃ－ＭＹＣ）の異所性発現または高度発現により誘導される。
【0030】
ヒト胚性幹細胞などの胚性幹細胞の安定（未分化）培養物を単離するための技法は、十分確立されている（例えば、US 5,843,780; Thomson et al., Science (1998) 282: 1145-1147; Turksen K. (編) Human Embryonic Stem Cell Protocols. Methods in Molecular Biology, 第331巻, Humana PressにおけるTurksen & Troy (2006) Human Embryonic Stem Cells; Sevilla et al., Stem Cell Research (2017) 25: 217-220; およびTurksen K. (編) Human Embryonic Stem Cell Protocols. Methods in Molecular Biology, 第331巻, Humana PressにおけるMitalipova & Palmarini (2006) Isolation and Characterization of Human Embryonic Stem Cells）。
【0031】
ｉＰＳＣを作製するための技法は、２００７年に山中のグループによりそれらが発見されて以降、十分確立されている（例えば、Takahashi et al., Cell (2007) 131(5): 861-72）。それ以降、非組込みおよびフィーダーフリーの方法ならびに自動ハイスループット誘導を含む、ｉＰＳＣ作製のための新たな改善された方法が開発されている（Paull et al., Nature Methods (2015) 12(9): 885 892）。
【0032】
ｉＰＳＣは、一連の多能性マーカー：ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ１－８１、ＴＲＡ１－６０の発現、および系列特異的マーカーの欠如を特徴とする。ｉＰＳＣの多能性は、免疫組織化学による三胚葉由来分化マーカーＴｕｊ１（外胚葉マーカー）、ＳＭＡ（中胚葉マーカー）およびＳＯＸ１７（内胚葉マーカー）の事後分析を用いた胚様体アッセイにおける三胚葉に分化するそれらの能力により示される（Paull et al., Nature Methods (2015) 12(9): 885 892）。
【0033】
人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は、体細胞における多能性の誘導に必須の４つの転写因子、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、クルッペル様因子４（ＫＬＦ４）、およびＭＹＣ癌原遺伝子（Ｃ－ＭＹＣ）の異所性発現または高度発現により誘導される。
【0034】
ＭＳＣ
「間葉系幹細胞」（本明細書において「ＭＳＣ」ともいう）は、多能性間質細胞である。それらは、一般に結合組織に由来し、非造血細胞である。ＭＳＣの集団は（Dominici et al. (2006), Cytotherapy 8(4): 315-317によれば）、（１）標準的な培養条件下（例えば、最小必須培地＋２０％ウシ胎仔血清）でプラスチックに接着し得；（２）ＣＤ１０５、ＣＤ９０、ＣＤ７３およびＣＤ４４を発現し得（すなわち、ＭＳＣの集団の８０％以上）；（３）ＣＤ４５、ＣＤ１４またはＣＤ１１ｂ、ＣＤ７９０ＬまたはＣＤ１９、およびＨＬＡ－ＤＲ（ＨＬＡクラスＩＩ）の発現を欠如し得（例えば、ＭＳＣ集団の５％以下）；（４）骨芽細胞、脂肪細胞および軟骨芽細胞に分化する能力を有し得る。
「間葉系幹細胞」（本明細書において「ＭＳＣ」ともいう）は、多能性間質細胞である。それらは、一般に結合組織に由来し、非造血細胞である。ＭＳＣの集団は（Dominici et al. (2006), Cytotherapy 8(4): 315-317によれば）、（１）標準的な培養条件下（例えば、最小必須培地＋２０％ウシ胎仔血清）でプラスチックに接着し得；（２）ＣＤ１０５、ＣＤ９０、ＣＤ７３およびＣＤ４４を発現し得（すなわち、ＭＳＣの集団の８０％以上）；（３）ＣＤ４５、ＣＤ１４またはＣＤ１１ｂ、ＣＤ７９０ＬまたはＣＤ１９、およびＨＬＡ－ＤＲ（ＨＬＡクラスＩＩ）の発現を欠如し得（例えば、ＭＳＣ集団の５％以下）；（４）骨芽細胞、脂肪細胞および軟骨芽細胞に分化する能力を有し得る。
【0035】
ＭＳＣは、例えば、骨髄、臍帯組織および血液、月経血、歯髄、臍帯血、胎盤および脂肪組織から、標準的な方法を使用して得ることができる。異なる組織から得られるＭＳＣは類似しているが、それらは表現型的特徴および機能的特徴にいくつかの違いを有する。例えば、細胞表面マーカーＣＤ５４およびＣＤ１０６の発現レベルは、ＭＳＣの源／起源に応じて異なり得る。これらは、フローサイトメトリーにより測定することができる。ＳＯＸ２、ＩＬ１アルファ、ＩＬ１ベータ、ＩＬ６およびＩＬ８などのいくつかの遺伝子のｍＲＮＡレベルは、異なる組織由来のＭＳＣにより差次的に発現し得、常法により測定することができる。ＩＬ６およびＰＧＥ２分泌も、異なる起源のＭＳＣ間で異なり得、このため、細胞は異なる調節能を有し得る（例えば、Yang et al. PLoS ONE (2013) 8(3) e59354参照）。
【0036】
骨髄由来ＭＳＣ（ＢＭＳＣ）
骨髄間葉系幹細胞（ＢＭ－ＭＳＣ）は、他の組織源からのＭＳＣと類似している。しかしながら、それらは、他の組織起源のＭＳＣ、例えば、臍帯ＭＳＣ、胎盤ＭＳＣ、歯髄ＭＳＣ、および月経血ＭＳＣと比較して、表現型的特徴および機能的特徴においていくつかの違いを有する。プラスチックに接着するそれらの能力、最小限の表面同一性マーカーならびに骨、軟骨、腱および脂肪組織に分化する能力を含め、それらの最小限のキャラクタリゼーション基準は共通であるが、それらは総て、いくつかのわずかな違いを有する。これらの特性には、ＣＤ１０５などのいくつかの表面マーカーの異なる発現レベル、それらの免疫調節能および再生能に関連付けられる分泌可溶性因子の異なるレベル、ならびに一般に、それぞれの源または起源を特定の治療適応症にさらに好適とし得るわずかに異なる機能特性が含まれる（Miura et al., Int J Hematology (2016) 103(2): 122-128; Wuchter et al., Cytotherapy (2015) 17(2): 128-139; Wright et al., Stem Cells (2011) 29(2): 169-178）。
骨髄間葉系幹細胞（ＢＭ－ＭＳＣ）は、他の組織源からのＭＳＣと類似している。しかしながら、それらは、他の組織起源のＭＳＣ、例えば、臍帯ＭＳＣ、胎盤ＭＳＣ、歯髄ＭＳＣ、および月経血ＭＳＣと比較して、表現型的特徴および機能的特徴においていくつかの違いを有する。プラスチックに接着するそれらの能力、最小限の表面同一性マーカーならびに骨、軟骨、腱および脂肪組織に分化する能力を含め、それらの最小限のキャラクタリゼーション基準は共通であるが、それらは総て、いくつかのわずかな違いを有する。これらの特性には、ＣＤ１０５などのいくつかの表面マーカーの異なる発現レベル、それらの免疫調節能および再生能に関連付けられる分泌可溶性因子の異なるレベル、ならびに一般に、それぞれの源または起源を特定の治療適応症にさらに好適とし得るわずかに異なる機能特性が含まれる（Miura et al., Int J Hematology (2016) 103(2): 122-128; Wuchter et al., Cytotherapy (2015) 17(2): 128-139; Wright et al., Stem Cells (2011) 29(2): 169-178）。
【0037】
臍帯由来および歯髄由来ＭＳＣ
Huang et al. (J. Dent. Res. (2009) 88(9): 792-806)は、歯髄由来ＭＳＣを考察し、それらの特徴を他の源からのＭＳＣと比較している。Carvalho et al. (Curr Stem Cell Res Ther. (2011) 6(3): 221-228)およびHarris et al. (Curr Stem Cell Res Ther. (2013) 8(5): 394-399)は、臍帯由来ＭＳＣ、それらのキャラクタリゼーション（表現型およびセクレトームを含む）ならびにそれらの適用を考察している。
Huang et al. (J. Dent. Res. (2009) 88(9): 792-806)は、歯髄由来ＭＳＣを考察し、それらの特徴を他の源からのＭＳＣと比較している。Carvalho et al. (Curr Stem Cell Res Ther. (2011) 6(3): 221-228)およびHarris et al. (Curr Stem Cell Res Ther. (2013) 8(5): 394-399)は、臍帯由来ＭＳＣ、それらのキャラクタリゼーション（表現型およびセクレトームを含む）ならびにそれらの適用を考察している。
【0038】
ＡＳＣ
脂肪由来ＭＳＣ（ＡＳＣ）は、通常、皮下脂肪組織から単離され、それにより、ＡＳＣを多数獲得することが可能となる。ＡＳＣは、高い細胞活性をもって急速に増殖し、その結果、ＡＳＣがＭＳＣを得るための理想的な源となる。
脂肪由来ＭＳＣ（ＡＳＣ）は、通常、皮下脂肪組織から単離され、それにより、ＡＳＣを多数獲得することが可能となる。ＡＳＣは、高い細胞活性をもって急速に増殖し、その結果、ＡＳＣがＭＳＣを得るための理想的な源となる。
【0039】
「脂肪組織」とは、任意の脂肪組織を意味する。脂肪組織は、皮下組織、大網／内臓組織、乳腺組織、生殖腺組織、または他の脂肪組織部位に由来する褐色または白色の脂肪組織であり得る。一般に、脂肪組織は、皮下白色脂肪組織である。このような細胞は、初代細胞培養物または不死化細胞株を含んでなってもよい。脂肪組織は、脂肪組織を有する任意の生物体由来であってもよい。一般に、脂肪組織は哺乳動物のものであり、最も一般に、脂肪組織はヒトのものである。脂肪組織の好都合な源は、脂肪吸引術からのものであるが、脂肪組織の源または脂肪組織の単離の方法は、本発明にとって重要なものではない。
【0040】
好ましいＡＳＣは、製品「Ｄａｒｖａｄｓｔｒｏｃｅｌ」（商品名「Ａｌｏｆｉｓｅｌ（登録商標））において認可されているヒト同種異系脂肪由来幹細胞（ヒトｅＡＳＣ）である。これらの拡大ＡＳＣは、細胞表面マーカーＣＤ２９、ＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５を発現する。前記細胞は、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、トランスフォーミング成長因子－ベータ１（ＴＧＦ－β１）、インターロイキン６（ＩＬ－６）、マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤－１（ＴＩＭＰ－１）およびインターフェロン－ガンマ（ＩＦＮ－γ）および誘導性インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）などの因子を発現することができる。このため、ＡＳＣの集団は、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％；少なくとも約７０％；少なくとも約８０％；少なくとも約８５％；少なくとも約９０％または少なくとも約９５％以上が、ＣＤ２９、ＣＤ７３、ＣＤ９０および／またはＣＤ１０５のうち１つ以上を発現することを特徴とし得る。前記ＡＳＣの集団は、前記細胞の集団の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％；少なくとも約７０％；少なくとも約８０％；少なくとも約８５％；少なくとも約９０％または少なくとも約９５％が、ＣＤ２９、ＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５の総てを発現することを特徴とし得る。一般に、前記ＡＳＣの集団は、前記細胞の集団の少なくとも約８０％が、ＣＤ２９、ＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５の総てを発現することを特徴とし得る。
【0041】
Bourin et al. (Cytotherapy (2013) 15(6): 641-648)によれば、ＡＳＣの集団は、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５の発現に対して陽性であり、かつＣＤ３１およびＣＤ４５の発現に対して陰性であると定義され得る。前記ＡＳＣの集団において、前記細胞の集団の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％；少なくとも約７０％；少なくとも約８０％；少なくとも約８５％；少なくとも約９０％または少なくとも約９５％が、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５を発現し得、前記ＡＳＣの集団の約５％、約４％、約３％または約２％未満が、ＣＤ３１およびＣＤ４５を発現し得る。一般に、前記ＡＳＣの集団において、前記細胞の集団の少なくとも約８０％が、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５を発現し得、前記ＡＳＣの集団の約５％未満が、ＣＤ３１およびＣＤ４５を発現し得る。
【0042】
ＡＳＣは、標準的な培養条件下でプラスチックに接着し得る。拡大ＡＳＣ（ｅＡＳＣ）は、培養下で線維芽細胞様の形態を示す。具体的には、これらの細胞は巨大であり、長く薄い細胞突起がほとんどない浅い細胞体という形態的特徴を有する。核は、巨大かつ円形であり、顕著な核小体を有し、これが核を鮮明な外観にしている。ｅＡＳＣのほとんどはこの紡錘形の形態を示すが、前記細胞のいくつかは多角形の形態を獲得することが通常である(Zuk et al. Tissue Eng (2001) 7(2): 211-228)。
【0043】
ＡＳＣは、表面マーカーＨＬＡＩ、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ５９、ＣＤ７３、ＣＤ９０、およびＣＤ１０５に対して陽性であり得る。いくつかの実施形態において、前記ＡＳＣの集団は、前記ＡＳＣの集団の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％；少なくとも約９０％または少なくとも約９５％が、表面マーカーＨＬＡ－Ｉ、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ５９、ＣＤ７３、ＣＤ９０、およびＣＤ１０５を発現することを特徴とし得る。一般に、ｅＡＳＣの少なくとも約８０％が、表面マーカーＨＬＡ１、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ５９、ＣＤ７３、ＣＤ９０、およびＣＤ１０５を発現する。
【0044】
ＡＳＣは、表面マーカーＨＬＡＩＩ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ４５、ＣＤ３１、ＣＤ８０およびＣＤ８６に対して陰性であり得る。いくつかの実施形態において、前記ＡＳＣの集団は、前記ＡＳＣの集団の約５％未満が、表面マーカーＨＬＡＩＩ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ４５、ＣＤ３１、ＣＤ８０およびＣＤ８６を発現することを特徴とし得る。より一般に、前記ＡＳＣの集団の約４％、３％または２％未満が、表面マーカーＨＬＡＩＩ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ４５、ＣＤ３１、ＣＤ８０およびＣＤ８６を発現する。一つの実施形態において、前記ＡＳＣの集団の約１％未満が、表面マーカーＨＬＡＩＩ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ４５、ＣＤ３１、ＣＤ８０およびＣＤ８６を発現する。
【0045】
いくつかの例において、ＡＳＣの集団において、前記細胞の集団の少なくとも約８０％が、ＣＤ２９、ＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５の総てを発現し、前記ＡＳＣの集団の約５％未満が、表面マーカーＨＬＡＩＩ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ４５、ＣＤ３１、ＣＤ８０およびＣＤ８６を発現する。
【0046】
いくつかの実施形態において、前記ＡＳＣの集団は、ＨＬＡＩ、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ５９、ＣＤ７３、ＣＤ９０、およびＣＤ１０５のうち１個以上（例えば、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個または７個）を発現し得る。いくつかの実施形態において、ｅＡＳＣは、ＨＬＡＩＩ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ４５、ＣＤ３１、ＣＤ８０のうち１個以上（例えば、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個または８個）を発現しなくてもよい。いくつかの実施形態において、ｅＡＳＣは、ＨＬＡＩ、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ５９、ＣＤ７３、ＣＤ９０、およびＣＤ１０５のうち４個以上を発現し、ＨＬＡＩＩ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ４５、ＣＤ３１、ＣＤ８０のうち４個以上を発現しない。
【0047】
ＣＤ３４の発現は、陰性または低レベルであり得、例えば、前記ＡＳＣの集団の０～約３０％により発現され得る。このため、いくつかの例において、上記のＡＳＣは、低レベルで、例えば、前記集団の約５～約３０％においてＣＤ３４を発現し得る。あるいは、他の例において、上記のＡＳＣはＣＤ３４を発現せず、例えば、前記ＡＳＣの集団の約５％未満が、ＣＤ３４を発現する。
【0048】
いくつかの実施形態において、前記ＡＳＣの集団（例えば、前記細胞の集団の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％；少なくとも約９０％または少なくとも約９５％）は、マーカーＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ４９Ａ、ＣＤ５１、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤ９０およびＣＤ１０５のうち１個以上（例えば、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、または１０個以上（例えば、最大１３個））を発現し得る。例えば、ＡＳＣは、マーカーＣＤ２９、ＣＤ５９、ＣＤ９０およびＣＤ１０５のうち１個以上（例えば、２個、３個または総て）、例えば、ＣＤ５９および／またはＣＤ９０を発現し得る。
【0049】
いくつかの実施形態において、前記ＡＳＣの集団は、マーカー第ＶＩＩＩ因子、アルファ－アクチン、デスミン、Ｓ－１００、ケラチン、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ４５、ＨＬＡＩＩ、ＣＤ３１、ＣＤ４５、ＳＴＲＯ－１およびＣＤ１３３のうち１個以上（例えば、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、または１０個以上（例えば、最大１５個））を発現しなくてもよく、例えば、ＡＳＣは、マーカーＣＤ４５、ＣＤ３１およびＣＤ１４のうち１個以上（例えば、２個、３個または総て）、例えば、ＣＤ３１および／またはＣＤ４５を発現しない。
【0050】
特定の複数の実施形態において、上記のＡＳＣは、（ｉ）抗原提示細胞（ＡＰＣ）に特異的なマーカーを発現せず；（ｉｉ）ＩＤＯを構成的に発現せず；かつ／または（ｉｉｉ）ＭＨＣＩＩを構成的に有意に発現しない。一般に、ＩＤＯまたはＭＨＣＩＩの発現は、ＩＦＮ－γによる刺激により誘導され得る。特定の複数の実施形態において、上記のＡＳＣは、Ｏｃｔ４を発現しない。
【0051】
ＡＳＣの集団を調製する方法
ｅＡＳＣおよび本発明の幹細胞の集団を提供するためのＡＳＣの単離および培養の方法、ならびに本発明の幹細胞の集団を含んでなる組成物は、当技術分野で公知である。ＡＳＣは、一般に、脂肪組織の間質画分から調製され、好適な表面、例えば、プラスチックへの接着性により選択される。このため、本明細書に開示される幹細胞の凍結保存の方法は、（ｉ）患者から得られた脂肪組織の間質画分からＡＳＣの集団を単離すること、および（ｉｉ）前記ＡＳＣの集団を培養すること、という初期工程（前記方法のいずれか１つの工程（ａ）の前）を含んでなってもよい。ＡＳＣは、場合により、好適な表面、例えば、プラスチックへの接着性に関する工程（ｉ）において選択することができる。場合により、ＡＳＣの表現型は、培養工程（ｉｉ）の間および／またはその後に評価してもよい。
ｅＡＳＣおよび本発明の幹細胞の集団を提供するためのＡＳＣの単離および培養の方法、ならびに本発明の幹細胞の集団を含んでなる組成物は、当技術分野で公知である。ＡＳＣは、一般に、脂肪組織の間質画分から調製され、好適な表面、例えば、プラスチックへの接着性により選択される。このため、本明細書に開示される幹細胞の凍結保存の方法は、（ｉ）患者から得られた脂肪組織の間質画分からＡＳＣの集団を単離すること、および（ｉｉ）前記ＡＳＣの集団を培養すること、という初期工程（前記方法のいずれか１つの工程（ａ）の前）を含んでなってもよい。ＡＳＣは、場合により、好適な表面、例えば、プラスチックへの接着性に関する工程（ｉ）において選択することができる。場合により、ＡＳＣの表現型は、培養工程（ｉｉ）の間および／またはその後に評価してもよい。
【0052】
ＡＳＣの集団を調製する方法
ｅＡＳＣおよび本発明の幹細胞の集団を提供するためのＡＳＣの単離および培養の方法、ならびに本発明の幹細胞の集団を含んでなる組成物は、当技術分野で公知である。ＡＳＣは、一般に、脂肪組織の間質画分から調製され、好適な表面、例えば、プラスチックへの接着性により選択される。このため、本明細書に開示される幹細胞の凍結保存の方法は、（ｉ）患者から得られた脂肪組織の間質画分からＡＳＣの集団を単離すること、および（ｉｉ）前記ＡＳＣの集団を培養すること、という初期工程（前記方法のいずれか１つの工程（ａ）の前）を含んでなってもよい。ＡＳＣは、場合により、好適な表面、例えば、プラスチックへの接着性に関する工程（ｉ）において選択することができる。場合により、ＡＳＣの表現型は、培養工程（ｉｉ）の間および／またはその後に評価してもよい。
ｅＡＳＣおよび本発明の幹細胞の集団を提供するためのＡＳＣの単離および培養の方法、ならびに本発明の幹細胞の集団を含んでなる組成物は、当技術分野で公知である。ＡＳＣは、一般に、脂肪組織の間質画分から調製され、好適な表面、例えば、プラスチックへの接着性により選択される。このため、本明細書に開示される幹細胞の凍結保存の方法は、（ｉ）患者から得られた脂肪組織の間質画分からＡＳＣの集団を単離すること、および（ｉｉ）前記ＡＳＣの集団を培養すること、という初期工程（前記方法のいずれか１つの工程（ａ）の前）を含んでなってもよい。ＡＳＣは、場合により、好適な表面、例えば、プラスチックへの接着性に関する工程（ｉ）において選択することができる。場合により、ＡＳＣの表現型は、培養工程（ｉｉ）の間および／またはその後に評価してもよい。
【0053】
ＡＳＣは、当技術分野において標準的な任意の手段により得ることができる。一般に、前記細胞は、源の組織（例えば、脂肪吸引組織または脂肪組織）から、一般に、前記組織をコラゲナーゼなどの消化酵素で処理することにより、前記細胞を分離することにより得られる。次いで、消化された組織物質は、一般に、約２０ミクロン～１ｍｍのフィルターで濾過される。次いで、細胞を単離し（一般に、遠心分離により）、接着表面（一般に、組織培養プレートまたはフラスコ）で培養する。このような方法は、当技術分野で公知であり、例えば、米国特許第６，７７７，２３１号に開示されている。
【0054】
この方法によれば、脂肪吸引組織は脂肪組織から得られ、細胞はそれに由来する。この方法の最中に、細胞を、好ましくはＰＢＳで洗浄して、汚染デブリおよび赤血球を除去してもよい。細胞を、ＰＢＳ中のコラゲナーゼで消化する（例えば、３７℃で３０分間、０．０７５％コラゲナーゼ；Ｉ型、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールスバッド、カリフォルニア州）。残存する赤血球を除去するために、消化サンプルを洗浄し（例えば、１０％ウシ胎仔血清で）、１６０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮＨ４Ｃｌで処理し、最後にＤＭＥＭ完全培地（１０％ＦＢＳ、２ｍＭグルタミンおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ）に懸濁させることができる。細胞は、４０μｍナイロンメッシュで濾過することができる。
【0055】
培養ヒトＡＳＣは、DelaRosa et al. (Tissue Eng Part A. (2009) 15(10): 2795-806), Lopez-Santalla et al. (Stem cells (2015) 33: 3493-3503)において記載されている。一つの実施形態において（上記で引用したLopez-Santalla et al. (2015)に記載の通りに）、健常ドナー由来のヒト脂肪吸引組織を、リン酸緩衝食塩水で２回洗浄し、０．０７５％コラゲナーゼ（Ｉ型；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で消化した。消化サンプルを１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）で洗浄し、１６０ｍＭ ＮＨ４Ｃｌで処理して残存する赤血球を除去し、培養培地（１０％ＦＢＳを含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ））に懸濁させた。細胞を組織培養フラスコに播種し（２～３×１０４個／ｃｍ２）、３～４日毎に培養培地を交換しながら培養した（３７℃、５％ＣＯ２）。細胞が９０％コンフルエンスに達した場合、細胞を新しいフラスコに移した（１０３個／ｃｍ２）。細胞を最大１２～１４回重複して拡大し、凍結させた。
【0056】
別の実施形態において（DelaRosa et al. (2009), Tissue Eng Part A 15(10): 2795-806による記載の通りに）、健常成人ドナー由来のヒト脂肪組織から得られた脂肪吸引組織をＰＢＳで２回洗浄し、１８Ｕ／ｍＬのＰＢＳ中Ｉ型コラゲナーゼで３７℃にて３０分間消化した。１単位のコラゲナーゼが、３７℃、ｐＨ７．５にて５時間でコラーゲンから１ｍＭのＬ－ロイシン当量を遊離させた（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールスバッド、カリフォルニア州）。消化サンプルを１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）で洗浄し、１６０ｍＭ ＮＨ４Ｃｌで処理し、培養培地（１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ）に懸濁させ、４０ｍｍナイロンメッシュで濾過した。細胞を組織培養フラスコに播種し（２～３×１０４個／ｃｍ２）、７日毎に培養培地を交換しながら、３７℃および５％ＣＯ２で拡大した。培養物が９０％のコンフルエンスに達した場合、細胞を新しい培養フラスコに移した。細胞は、軟骨形成系列、骨形成系列、および脂肪生成系列に分化するそれらの能力により表現型的に特徴付けられた。
【0057】
ＡＳＣを、ＡＳＣの接着に好適な表面、例えば、プラスチックを含んでなる好適な組織培養容器中で培養する。非接着細胞は、例えば、好適な緩衝液中で洗浄することにより除去して、接着間質細胞（例えば、ＡＳＣ）の単離集団を得る。このように単離した細胞は、組織培養フラスコに播種し（好ましくは、２～３×１０４個／ｃｍ２）、３～４日毎に培養培地を交換しながら、３７℃および５％ＣＯ２で拡大することができる。培養物がおよそ９０％のコンフルエンスに達した場合、細胞を好ましくは接着表面から剥がし（例えば、トリプシンにより）、新しい培養フラスコ（１，０００個／ｃｍ２）に移す（「継代する」）。
【0058】
ＡＳＣは、少なくとも約１５日間、少なくとも約２０日間、少なくとも約２５日間、または少なくとも約３０日間培養され得る。一般に、培養下での細胞の拡大は、実質的に純粋な集団が得られるように、集団における細胞表現型の均一性を改善する。
【0059】
いくつかの実施形態において、ＡＳＣは、少なくとも３培養継代、培養下で拡大される、または「少なくとも３回継代される」。他の複数の実施形態において、前記細胞は、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、少なくとも９回、または少なくとも１０回継代される。細胞は、細胞集団における細胞表現型の均一性を改善するために、３回超継代されることが好ましい。実際に、前記細胞は、細胞表現型の均一性が改善され、分化能が維持される限り、無期限に培養下で拡大され得る。
【0060】
いくつかの実施形態において、ＡＳＣは、少なくとも３回集団倍加させるために培養下で増殖され、例えば、前記細胞は、少なくとも４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１５回または２０回集団倍加させるために、培養下で拡大される。いくつかの実施形態において、前記細胞は、７回、８回、９回、１０回、１５回または２０回未満集団倍加させるために、培養下で拡大される。特定の複数の実施形態において、前記細胞は、約５～１０回集団倍加させるために、培養下で拡大される。特定の複数の実施形態において、前記細胞は、約１０～１５回集団倍加させるために、培養下で拡大される。特定の複数の実施形態において、前記細胞は、約１５～２０回集団倍加、例えば、約１６回集団倍加させるために、培養下で拡大される。ＡＳＣの単離は、好ましくは、無菌条件下またはＧＭＰ条件下で行われる。
【0061】
「同種異系療法」は、本明細書において、ドナーが細胞のレシピエントと異なる者である、細胞ベースの療法を意味する。好ましくは、同種異系療法は、ドナーとレシピエントとの間のＨＬＡ適合が関与しない。医薬品の製造において、ＨＬＡ不適合同種異系療法は「既製」製品の基礎を形成し得るため、同種異系方法は有望である。
【0062】
「前感作」は、本明細書において、患者が、ＳＣ集団の実際の投与前に特定のＳＣ集団に対して既存免疫を示すことを意味する。既存免疫は、ドナー特異的抗体（ＤＳＡ）、特に、ＨＬＡ－クラスＩ分子に対して特異的であるＤＳＡの存在と関連し得る。これは、当技術分野で公知の方法、例えば、分光光度フローサイトメトリークロスマッチ（ＦＣＸＭ）、蛍光または発光アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法））（ここで、ＨＬＡ－クラスＩ分子はプレートに結合する）により決定することができる。既存免疫は、例えば、早期輸血に起因し得るか、または女性においては早期妊娠に起因し得る。
【0063】
「再治療」は、本明細書において、患者に対する第１のドナー由来の第１のＳＣ集団の第１の用量の投与後、前記患者が、第１のドナー由来の第１のＳＣ集団の別の用量または第２のドナー由来の第２のＳＣ集団の用量のいずれかの投与を受けることを意味する。再治療は、単一用量投与後と比較して治療有効性を増大させるために必要であり得る。
【0064】
「ＳＣ集団のサンプルを培養すること」は、本明細書において、ＳＣ集団が、ＳＣ集団の生存率を維持するために好適な細胞培養培地に含まれることを意味する。好適な細胞培養培地は、ＳＣ集団にとって必須の栄養素、例えば、アミノ酸、炭水化物、ビタミンおよび／または塩を含有し得る。ｐＨは、緩衝液の使用により好適な条件に適合される。好ましくは、細胞培養培地は、ＲＰＭＩ（Ｇｉｂｃｏ社から入手可能）またはＤＭＥＭ（例えば、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社から入手可能）から選択される。
【0065】
「前記ＳＣ集団において最大のＨＬＡ－クラスＩ発現を誘導することができるＩＦＮ－γ濃度」は、本明細書において、前記ＳＣ集団の表面上のＨＬＡ－クラスＩ分子の最大の量を提供することができるＩＦＮ－γ濃度を意味する。前記ＳＣ集団の表面上のＨＬＡ－クラスＩ分子の量は、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）により、または発色団もしくはフルオロフォアに直接結合する、もしくは標識二次抗体に間接的に結合するＨＬＡ－クラスＩ抗体を使用したサンドイッチアッセイ形式などのＥＬＩＳＡアッセイ形式において、決定することができる。
【0066】
細胞がより高いＩＦＮ－γ濃度で処理される際にＨＬＡ－クラスＩの発現がさらに増大しない場合、最大のＨＬＡ－クラスＩ発現が誘導される。
【0067】
ＩＦＮ－γは、ＨＬＡ－クラスＩ分子の発現および提示を増大させることで知られる。好ましい実施形態によれば、前記ＳＣ集団において最大のＨＬＡ－クラスＩ発現を誘導することができるＩＦＮ－γ濃度は、約０．５～約３０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、約１～約１５ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、約２～約４ｎｇ／ｍｌ、最も好ましくは、３ｎｇ／ｍｌである。好ましくは、ＩＦＮ－γは、１２～７２時間の期間、好ましくは、２４～６０時間の期間、より好ましくは、３０～５４時間の期間、最も好ましくは、４８時間の期間、ＳＣ集団とインキュベートされる。最も好ましくは、前記ＳＣ集団において最大のＨＬＡ－クラスＩ発現を誘導することができるＩＦＮ－γ濃度は、３ｎｇ ＩＦＮ－γ／ｍｌであり、ＩＦＮ－γは、４８時間の期間、ＳＣ集団とインキュベートされる。
【0068】
「ＨＬＡ－クラスＩ抗体」は、本明細書において、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂおよび／またはＨＬＡ－Ｃに特異的に結合することができる抗体を意味する。この文脈における「特異的に」は、結合が非特異的ではないことを意味するものとする。用語「特異的に」は、関連抗原に対する抗体の交差反応性も可能にするエピトープを共有する抗原に対する結合を含む。前記抗体は、ＩｇＧおよびＩｇＭを含む任意のサブタイプであり得る。前記抗体は、任意の源からのものであってもよく、好ましくは、前記抗体は、マウス、ウサギ、ヒツジまたはヤギ抗体、好ましくは、マウス抗体である。前記抗体は、好ましくは、補体系のタンパク質と相互作用することができる定常領域（Ｆｃ領域）を含む。
【0069】
好ましい実施形態において、前記ＨＬＡ－クラスＩ抗体は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－ＢおよびＨＬＡ－Ｃに特異的に結合する。したがって、前記抗体が、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－ＢおよびＨＬＡ－Ｃ重鎖において保存されるエピトープを認識するｐａｎ－ＨＬＡ－クラスＩ抗体であることが好ましい。
【0070】
さらに好ましい実施形態において、前記ＨＬＡ－クラスＩ抗体は、ＡＴＣＣ（指定番号：ＨＢ－９５）またはＥＣＡＣＣ（番号：８４１１２００３）から入手可能なハイブリドーマクローンｗ６／３２により産生される抗体と本質的に同じＨＬＡ－Ａ、好ましくは、ＨＬＡ－Ａ２、最も好ましくは、ＨＬＡ－Ａ＊０２０１に対する結合親和性を有する。好ましくは、結合親和性は、ＥＬＩＳＡ法を使用することにより決定される。「本質的に同じ結合親和性」は、ハイブリドーマクローンｗ６／３２により産生される抗体の結合親和性と１０％未満、好ましくは、８％未満、より好ましくは、５％未満異なるＨＬＡ－クラスＩ抗体の結合親和性を意味する。
【0071】
さらにより好ましい実施形態において、前記抗体は、ハイブリドーマクローンｗ６／３２により産生される。このハイブリドーマクローンは、ＡＴＣＣ（指定番号：ＨＢ－９５）またはＥＣＡＣＣ（番号：８４１１２００３）から入手可能である。
【0072】
「ＨＬＡ－クラスＩ抗体の異なる濃度の範囲」は、本明細書において、試験サンプルおよび対照サンプルを異なる濃度のＨＬＡ－クラスＩ抗体で処理して、細胞溶解により決定される異なるＣＤＣ値が得られることを意味する。前記異なるＣＤＣ値は、ＨＬＡ－クラスＩ抗体の濃度に依存した試験曲線において示され得る。
【0073】
一つの実施形態において、ＨＬＡ－クラスＩ抗体の異なる濃度は、約１～約５０ｎｇ／ｍｌの範囲内である。一つの実施形態において、約１～約５０ｎｇ／ｍｌの範囲内のＨＬＡ－クラスＩ抗体の２種類または３種類の異なる濃度が使用される。一つの実施形態において、約１～約５０ｎｇ／ｍｌの範囲内のＨＬＡ－クラスＩ抗体の４種類または５種類の異なる濃度が使用される。一つの実施形態において、約１～約５０ｎｇ／ｍｌの範囲内のＨＬＡ－クラスＩ抗体の６種類または７種類の異なる濃度が使用される。一つの実施形態において、約１～約５０ｎｇ／ｍｌの範囲内のＨＬＡ－クラスＩ抗体の８種類または９種類の異なる濃度が使用される。
【0074】
一つの実施形態において、ハイブリドーマクローンｗ６／３２により産生されるＨＬＡ－クラスＩ抗体の異なる濃度は、約１～約５０ｎｇ／ｍｌの範囲内である。一つの実施形態において、約１～約５０ｎｇ／ｍｌの範囲内のハイブリドーマクローンｗ６／３２により産生されるＨＬＡ－クラスＩ抗体の２種類または３種類の異なる濃度が使用される。一つの実施形態において、約１～約５０ｎｇ／ｍｌの範囲内のハイブリドーマクローンｗ６／３２により産生されるＨＬＡ－クラスＩ抗体の４種類または５種類の異なる濃度が使用される。一つの実施形態において、約１～約５０ｎｇ／ｍｌの範囲内のハイブリドーマクローンｗ６／３２により産生されるＨＬＡ－クラスＩ抗体の６種類または７種類の異なる濃度が使用される。一つの実施形態において、約１～約５０ｎｇ／ｍｌの範囲内のハイブリドーマクローンｗ６／３２により産生されるＨＬＡ－クラスＩ抗体の８種類または９種類の異なる濃度が使用される。
【0075】
さらに好ましい実施形態において、前記ＨＬＡ－クラスＩ抗体の異なる濃度の範囲は、１ｎｇ／ｍｌ、３ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌおよび５０ｎｇ／ｍｌから選択される少なくとも２種類または３種類、好ましくは、４種類または５種類、より好ましくは、６種類または７種類、最も好ましくは、７種類または８種類の濃度である。
【0076】
「ＨＬＡ－クラスＩ抗体が試験サンプルおよび対照サンプルにおいて発現したＨＬＡ－クラスＩに結合するような条件下」は、本明細書において、試験サンプルおよび対照サンプルのＳＣ集団が、幹細胞に対する抗体の結合を可能にする好適な培地に含まれることを意味する。したがって、培地は、抗体および／または細胞を変性させないｐＨおよび塩濃度を有する。好ましくは、培地は、ヒト血液中の生理的ｐＨ（ｐＨ７．３５～７．４５）と類似したｐＨを提供するための好適な緩衝系を含有する。より好ましくは、培地は、ｐＨ７．４を有し、かつ１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１．８ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４を含有するリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）溶液である。
【0077】
「補体」は、本明細書で使用する場合、血漿または血清を含む血液の任意の源に由来する補体を意味する。補体は、精製または合成された補体タンパク質の混合物しても使用され得る。補体系は、肝臓により合成され、不活性前駆体として循環する血液中に認められる多数の低分子タンパク質からなる。いくつかのトリガーのうちの１つにより刺激されると、系におけるプロテアーゼが特異タンパク質を切断して、サイトカインを放出し、さらなる切断の増幅カスケードを開始させる。この補体活性化または補体結合カスケードの最終結果は、異物および損傷物質を除去するための食細胞の刺激、さらなる食細胞を誘引するための炎症、ならびに攻撃された細胞の細胞溶解をもたらす細胞を死滅させる膜侵襲複合体（ＭＡＣ）の活性化である。同種異系認識中、古典的経路の開始メディエーターであるＣ１ｑが、ＨＬＡクラス－Ｉ抗原結合抗体のＦｃ部分に結合し、Ｃ１ｑの活性化およびその後の補体カスケードシグナル伝達が生じた場合に、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）が開始される。
【0078】
「補体で飽和した」は、本明細書において、本発明に係る方法において加えられる補体の量が、ＩＦＮ－γ誘導ＳＣ集団（試験サンプル）の表面に結合したＨＬＡ－クラスＩ抗体の量に対してモル過剰であることを意味する。補体での飽和は、異なる濃度の補体を使用したアッセイを行うことにより、実験的に決定することができる。一度ＣＤＣ活性がその最大に達し、より高濃度の補体の添加によりもはや増加することができなくなると、飽和が達成される。
【0079】
好ましい実施形態において、請求項１の工程（ｃ）において使用される補体は、血清由来である。好ましくは、前記血清は、熱で処理されていない。熱不活化は、補体タンパク質を変性させ得、それにより、それらがＭＡＣ複合体を形成することをできなくさせる。また、好ましくは、前記血清は、ウシ胎仔血清ではない。より好ましくは、前記血清は、ウサギ、ヤギまたはヒツジ由来である。最も好ましくは、前記血清は、ウサギ由来である。このような血清は、Ｏｎｅ Ｌａｍｂｄａ社から入手可能である。
【0080】
好ましい実施形態において、補体での結合ＨＬＡ－Ｉ抗体の飽和をもたらす血清濃度は、５０～８３．３３％（ｖ／ｖ）であり、好ましくは、補体での結合ＨＬＡ－Ｉ抗体の飽和をもたらす血清濃度は、６６．６６～８３．３３％（ｖ／ｖ）であり、より好ましくは、補体での結合ＨＬＡ－Ｉ抗体の飽和をもたらす血清濃度は、７５～８３．３３％（ｖ／ｖ）であり、最も好ましくは、補体での結合ＨＬＡ－Ｉ抗体の飽和をもたらす血清濃度は、８３．３３％（ｖ／ｖ）である。
【0081】
「補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）」は、ＩｇＧおよびＩｇＭ抗体のエフェクター機能である。それらが表面抗原に結合すると、古典的補体経路が惹起され、膜侵襲複合体（ＭＡＣ）の形成および標的の細胞溶解がもたらされる。本発明の文脈において、ＣＤＣは、ＳＣ集団上に発現したＨＬＡクラスＩ分子に対するＨＬＡ－クラスＩ抗体の結合によりＳＣ集団において誘導された細胞溶解を測定することにより、決定される。
【0082】
好ましい実施形態において、前記細胞溶解は、生細胞もしくは溶解細胞または溶解細胞から放出された放射性物質に対して選択的である化学発光色素または蛍光色素を測定することにより決定される。インタクトな細胞膜を有する生細胞は、異なる種類の剤を使用した当技術分野で公知の方法により、溶解細胞と区別され得る。
【0083】
生細胞を死細胞と区別するための放射性方法として、クロムリリースアッセイが確立されている。放射性アッセイの代替として、蛍光色素が開発されている。例えば、ヨウ化プロピジウム、ＤＡＰＩ、７－アミノアクチノマイシンＤ（７－ＡＡＤ）、ＴＯ－ＰＲＯ－３などのＤＮＡ結合に対する非固定可能生存率色素が使用され得る。サンプルの固定が必要な場合、固定前に生細胞と死細胞とを識別するために、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のアミン反応性色素またはｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社のＦｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅｓ（ｅＦｌｕｏｒ４５０、ｅＦｌｕｏｒ６６０、ｅＦｌｕｏｒ７８０）またはＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社のＶｉｏｌｅｔ固定可能色素（ＢＤ Ｈｏｒｉｚｏｎ ＶＤ４５０）をサンプルに加えることができる。エステラーゼ活性を必要とする色素（例えば、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＣａｌｃｅｉｎ ＡＭ）またはミトコンドリアにおいて蓄積する色素（ＪＣ－１、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ １２３）など、細胞の機能性による細胞生存率の評価に好適なさらなる色素が利用可能である。
【0084】
さらなる代替として、化学発光ベースのアッセイまたは生物発光ベースのアッセイが開発されている（例えば、メナジオン触媒Ｈ２Ｏ２産生）。それらの総てが、細胞溶解を測定することによりＣＤＣを決定するために、本発明により企図される。好ましい実施形態において、ＣＤＣ活性は、実施例においてさらに説明するように、ＦＡＣＳ分析における色素としての７－アミノアクチノマイシンＤを使用することにより、決定される。
【0085】
特許請求の範囲において定義される「ＥＣ５０値」は、試験サンプルおよび対照サンプルにおける最大のＣＤＣの５０％（ＥＣ５０値）を誘導するＨＬＡ－クラスＩ抗体の濃度である。「ＥＣ５０値を決定すること」は、異なるＨＬＡ－クラスＩ抗体濃度に関する決定されたＣＤＣ値を使用して、視覚的に行ってもよいし、または生物学的データ分析用の市販のソフトウェアを用いて行ってもよい。線形回帰分析が可能なソフトウェアを使用してもよい。好適なソフトウェアは、ＦＣＳ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｖｅｒｓｉｏｎ ５（ＤｅＮｏｖｏ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社）であり得る。
【0086】
好ましい実施形態において、同種異系療法のためのＳＣ集団は、試験サンプルのＥＣ５０値に対する対照サンプルのＥＣ５０値の比が、約０．１～約１．２５、好ましくは、約０．１～約１．０、より好ましくは、約０．１～約０．５、特に好ましくは、約０．１～約０．２５である場合、工程ｆ１）に従って選択される。
【0087】
さらに好ましい実施形態において、同種異系療法のためのＳＣ集団は、試験サンプルのＥＣ５０値が、ＨＬＡ－クラスＩ抗体の約３．５ｎｇ／ｍｌ～約３０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、約９ｎｇ／ｍｌ～約２５ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、約１０ｎｇ／ｍｌ～約２０ｎｇ／ｍｌである場合、工程ｆ２）に従って選択される。
【0088】
「ＣＤ４６発現レベル」は、ノーザンブロットおよびＲＴ－ｑＰＣＲなどの当技術分野における標準的な技法により、核酸レベルに対して決定され得る。ＣＤ４６ ｍＲＮＡ配列は、公開データベースから入手可能である（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００２３８９．４）。好適なプライマーは、当技術分野において公知の方法により調製され得る。ＣＤ４６発現レベルは、タンパク質レベルに対しても決定され得る。好適な方法としては、標識ＨＬＡ－クラスＩ抗体分子を使用したウエスタンブロットおよびＦＡＣＳ分析が挙げられる。
【0089】
さらなる側面によれば、特に、前感作された患者の治療または同種異系療法による再治療のための、同種異系療法に好適なＳＣ集団であって、以下の特性：
ｉ）試験サンプルのＥＣ５０値に対する対照サンプルのＥＣ５０値の比が、１．２５未満、好ましくは、１．０未満、より好ましくは、０．５未満、特に好ましくは、０．２５未満であり、ここで、前記ＥＣ５０値は、本発明に従って決定される；
ｉｉ）試験サンプルのＥＣ５０値が、少なくとも３．５ｎｇ／ｍｌ ＨＬＡ－クラスＩ抗体、好ましくは、少なくとも９ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、少なくとも１５ｎｇ／ｍｌ、特に好ましくは、少なくとも２０ｎｇ／ｍｌ ＨＬＡ－クラスＩ抗体であり、ここで、前記ＥＣ５０値は、本発明に従って決定される；または
ｉｉｉ）対照サンプルにおけるＣＤ４６発現に対する試験サンプルにおけるＣＤ４６発現の比が、２．０超、好ましくは、２．５超、特に好ましくは、３．０超であり、ここで、前記ＣＤ４６発現は、本発明に従って決定される、
のうちいずれかを有するＳＣ集団が提供される。
ｉ）試験サンプルのＥＣ５０値に対する対照サンプルのＥＣ５０値の比が、１．２５未満、好ましくは、１．０未満、より好ましくは、０．５未満、特に好ましくは、０．２５未満であり、ここで、前記ＥＣ５０値は、本発明に従って決定される；
ｉｉ）試験サンプルのＥＣ５０値が、少なくとも３．５ｎｇ／ｍｌ ＨＬＡ－クラスＩ抗体、好ましくは、少なくとも９ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、少なくとも１５ｎｇ／ｍｌ、特に好ましくは、少なくとも２０ｎｇ／ｍｌ ＨＬＡ－クラスＩ抗体であり、ここで、前記ＥＣ５０値は、本発明に従って決定される；または
ｉｉｉ）対照サンプルにおけるＣＤ４６発現に対する試験サンプルにおけるＣＤ４６発現の比が、２．０超、好ましくは、２．５超、特に好ましくは、３．０超であり、ここで、前記ＣＤ４６発現は、本発明に従って決定される、
のうちいずれかを有するＳＣ集団が提供される。
【0090】
好ましい実施形態において、前記ＳＣ集団は、本発明に係る方法により選択される。また、好ましくは、前記ＳＣ集団は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）集団、好ましくは、ＢＭ－ＭＳＣ集団またはＡＳＣ集団、好ましくは、ヒトＢＭ－ＭＳＣまたはヒトＡＳＣである。
【0091】
さらなる側面によれば、本発明に係るＳＣ集団と場合により薬学上許容可能な担体とを含んでなる医薬組成物が提供される。
【0092】
用語「薬学上許容可能な担体」は、本明細書において、ＳＣ細胞集団の生存率または有効性に悪影響を及ぼさない当技術分野で公知の任意の薬学上許容可能な担体を意味する。前記薬学上許容可能な担体は、アミノ酸、塩およびビタミンを含有する細胞培養培地であり得る。好ましくは、前記細胞培養培地は、ＲＰＭＩまたはＤＭＥＭであり、より好ましくは、前記細胞培養培地はＤＭＥＭである。前記細胞培養培地は、約５％（ｖ／ｖ）～約３０％（ｖ／ｖ）の濃度のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を補充してもよく、より好ましくは、ＨＳＡ濃度は２０％（ｖ／ｖ）であり得る。一つの実施形態において、前記薬学上許容可能な担体は、２０％（ｖ／ｖ）ＨＳＡを含有するＤＭＥＭである。
【0093】
前記医薬組成物は、注射用懸濁液の形態であり得る。前記懸濁液中のＳＣ集団の濃度は、１×１０５～８×１０６個／ｍｌ、好ましくは、１×１０６～６×１０６個／ｍｌの範囲であり得る。最も好ましくは、前記濃度は５×１０６個／ｍｌである。前記医薬組成物は、注射により投与してもよい。
【0094】
さらなる側面によれば、医薬組成物を調製する方法であって、以下の工程：
ａ）本発明に係る方法を行うこと；並びに
ｂ）少なくとも１つの薬学上許容可能な担体とともに選択されたＳＣ集団を処方すること
を含んでなる方法が提供される。
ａ）本発明に係る方法を行うこと；並びに
ｂ）少なくとも１つの薬学上許容可能な担体とともに選択されたＳＣ集団を処方すること
を含んでなる方法が提供される。
【0095】
さらなる側面において、本発明に係るＳＣ集団は、それを必要とする患者における、好ましくは、前感作された患者または再治療を受けている患者における、同種異系幹細胞療法における使用のために提供される。さらに好ましい実施形態において、それを必要とする前記患者は、瘻孔、白血病、リンパ腫、神経変性疾患、脳損傷および脊髄損傷、心疾患、盲目および視力障害、膵ベータ細胞機能喪失、軟骨修復、変形性関節症、筋骨格系疾患、創傷、不妊症、自己免疫疾患および炎症性疾患、例えば、炎症性腸疾患から選択される疾患に罹患しており、好ましくは、前記疾患は瘻孔であり、より好ましくは、前記疾患は複雑肛門周囲瘻である。
【0096】
さらなる側面によれば、それを必要とする患者に対して、好ましくは、前感作された患者または再治療を受けている患者において、本発明に係るＳＣ集団を投与することを含んでなる同種異系幹細胞療法の方法が提供される。前記患者は、上記の疾患のいずれかに罹患し得る。
【0097】
一つの実施形態において、本発明は、特に、前感作された患者の治療または同種異系療法による患者の再治療のための、同種異系療法に好適な幹細胞（ＳＣ）集団を選択するｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、以下の工程：
ａ）ＳＣ集団のサンプルを、前記ＳＣ集団において最大のＨＬＡ－クラスＩ発現を誘導することができるＩＦＮ－γ濃度の存在下で培養し（試験サンプル）、かつＳＣ集団のサンプルをＩＦＮ－γの非存在下で別に培養すること（対照サンプル）、ここで、前記ＳＣ集団はＡＳＣ集団であり、前記ＩＦＮ－γ濃度は、４８時間の期間にわたり適用される３ｎｇ／ｍｌである；
ｂ）ＨＬＡ－クラスＩ抗体が試験サンプルおよび対照サンプルにおいて発現したＨＬＡ－クラスＩに結合するような条件下で、ＨＬＡ－クラスＩ抗体の異なる濃度の範囲で試験サンプルと対照サンプルとを接触させること、ここで、前記ＨＬＡ－クラスＩ抗体はｗ６／３２であり、ここで、抗体濃度は、１ｎｇ／ｍｌ、３ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌおよび５０ｎｇ／ｍｌである；
ｃ）結合したＨＬＡ－クラスＩ抗体が補体で飽和し、かつ補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）が誘導されるように、補体を試験サンプルおよび対照サンプルに加えること、ここで、前記補体は、ウサギ血清の形態で加えられる；
ｄ）試験サンプルおよび対照サンプルにおいて誘導された細胞溶解を測定することにより、ＨＬＡ－クラスＩ抗体の異なる濃度の範囲に関してＣＤＣを決定すること；
ｅ）試験サンプルおよび対照サンプルにおける最大のＣＤＣの５０％（ＥＣ５０値）を誘導するＨＬＡ－クラスＩ抗体の濃度を決定すること；ならびに
ｆ１）試験サンプルのＥＣ５０値に対する対照サンプルのＥＣ５０値の比が、１．２５未満、好ましくは、１．０未満、より好ましくは、０．５未満；特に好ましくは、０．２５未満である場合、同種異系療法のためのＳＣ集団を選択すること；または
ｆ２）試験サンプルのＥＣ５０値が、ＨＬＡ－クラスＩ抗体の少なくとも３．５ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、少なくとも９ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、少なくとも１５ｎｇ／ｍｌ、特に好ましくは、少なくとも２０ｎｇ／ｍｌである場合、同種異系療法のためのＳＣ集団を選択すること
を含んでなる方法に関する。
ａ）ＳＣ集団のサンプルを、前記ＳＣ集団において最大のＨＬＡ－クラスＩ発現を誘導することができるＩＦＮ－γ濃度の存在下で培養し（試験サンプル）、かつＳＣ集団のサンプルをＩＦＮ－γの非存在下で別に培養すること（対照サンプル）、ここで、前記ＳＣ集団はＡＳＣ集団であり、前記ＩＦＮ－γ濃度は、４８時間の期間にわたり適用される３ｎｇ／ｍｌである；
ｂ）ＨＬＡ－クラスＩ抗体が試験サンプルおよび対照サンプルにおいて発現したＨＬＡ－クラスＩに結合するような条件下で、ＨＬＡ－クラスＩ抗体の異なる濃度の範囲で試験サンプルと対照サンプルとを接触させること、ここで、前記ＨＬＡ－クラスＩ抗体はｗ６／３２であり、ここで、抗体濃度は、１ｎｇ／ｍｌ、３ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌおよび５０ｎｇ／ｍｌである；
ｃ）結合したＨＬＡ－クラスＩ抗体が補体で飽和し、かつ補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）が誘導されるように、補体を試験サンプルおよび対照サンプルに加えること、ここで、前記補体は、ウサギ血清の形態で加えられる；
ｄ）試験サンプルおよび対照サンプルにおいて誘導された細胞溶解を測定することにより、ＨＬＡ－クラスＩ抗体の異なる濃度の範囲に関してＣＤＣを決定すること；
ｅ）試験サンプルおよび対照サンプルにおける最大のＣＤＣの５０％（ＥＣ５０値）を誘導するＨＬＡ－クラスＩ抗体の濃度を決定すること；ならびに
ｆ１）試験サンプルのＥＣ５０値に対する対照サンプルのＥＣ５０値の比が、１．２５未満、好ましくは、１．０未満、より好ましくは、０．５未満；特に好ましくは、０．２５未満である場合、同種異系療法のためのＳＣ集団を選択すること；または
ｆ２）試験サンプルのＥＣ５０値が、ＨＬＡ－クラスＩ抗体の少なくとも３．５ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、少なくとも９ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、少なくとも１５ｎｇ／ｍｌ、特に好ましくは、少なくとも２０ｎｇ／ｍｌである場合、同種異系療法のためのＳＣ集団を選択すること
を含んでなる方法に関する。
【0098】
一つの実施形態において、本発明は、特に、前感作された患者の治療または同種異系療法による患者の再治療のための、同種異系療法に好適な幹細胞（ＳＣ）集団を選択するｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、以下の工程：
ａ）ＳＣ集団のサンプルを、前記ＳＣ集団において最大のＨＬＡ－クラスＩ発現を誘導することができるＩＦＮ－γ濃度の存在下で培養し（試験サンプル）、かつＳＣ集団のサンプルをＩＦＮ－γの非存在下で別に培養すること（対照サンプル）、ここで、前記ＳＣ集団はＡＳＣ集団であり、前記ＩＦＮ－γ濃度は、４８時間の期間にわたり適用される３ｎｇ／ｍｌである；
ｂ）ＨＬＡ－クラスＩ抗体が試験サンプルおよび対照サンプルにおいて発現したＨＬＡ－クラスＩに結合するような条件下で、ＨＬＡ－クラスＩ抗体の異なる濃度の範囲で試験サンプルと対照サンプルとを接触させること、ここで、前記ＨＬＡ－クラスＩ抗体はｗ６／３２であり、ここで、抗体濃度は、１ｎｇ／ｍｌ、３ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌおよび５０ｎｇ／ｍｌである；
ｃ）結合したＨＬＡ－クラスＩ抗体が補体で飽和し、かつ補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）が誘導されるように、補体を試験サンプルおよび対照サンプルに加えること、ここで、前記補体は、ウサギ血清の形態で加えられる；
ｄ）試験サンプルおよび対照サンプルにおいて誘導された細胞溶解を測定することにより、ＨＬＡ－クラスＩ抗体の異なる濃度の範囲に関してＣＤＣを決定すること；
ｅ）試験サンプルおよび対照サンプルにおける最大のＣＤＣの５０％（ＥＣ５０値）を誘導するＨＬＡ－クラスＩ抗体の濃度を決定すること；ならびに
ｆ１）試験サンプルのＥＣ５０値に対する対照サンプルのＥＣ５０値の比が、約０．１～約１．２５、好ましくは、約０．１～約１．０、より好ましくは、約０．１～約０．５、特に好ましくは、約０．１～約０．２５である場合、同種異系療法のためのＳＣ集団を選択すること；または
ｆ２）試験サンプルのＥＣ５０値が、ＨＬＡ－クラスＩ抗体の約３．５ｎｇ／ｍｌ～約３０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、約９ｎｇ／ｍｌ～約２５ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、約１０ｎｇ／ｍｌ～約２０ｎｇ／ｍｌである場合、同種異系療法のためのＳＣ集団を選択すること
を含んでなる方法に関する。
ａ）ＳＣ集団のサンプルを、前記ＳＣ集団において最大のＨＬＡ－クラスＩ発現を誘導することができるＩＦＮ－γ濃度の存在下で培養し（試験サンプル）、かつＳＣ集団のサンプルをＩＦＮ－γの非存在下で別に培養すること（対照サンプル）、ここで、前記ＳＣ集団はＡＳＣ集団であり、前記ＩＦＮ－γ濃度は、４８時間の期間にわたり適用される３ｎｇ／ｍｌである；
ｂ）ＨＬＡ－クラスＩ抗体が試験サンプルおよび対照サンプルにおいて発現したＨＬＡ－クラスＩに結合するような条件下で、ＨＬＡ－クラスＩ抗体の異なる濃度の範囲で試験サンプルと対照サンプルとを接触させること、ここで、前記ＨＬＡ－クラスＩ抗体はｗ６／３２であり、ここで、抗体濃度は、１ｎｇ／ｍｌ、３ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌおよび５０ｎｇ／ｍｌである；
ｃ）結合したＨＬＡ－クラスＩ抗体が補体で飽和し、かつ補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）が誘導されるように、補体を試験サンプルおよび対照サンプルに加えること、ここで、前記補体は、ウサギ血清の形態で加えられる；
ｄ）試験サンプルおよび対照サンプルにおいて誘導された細胞溶解を測定することにより、ＨＬＡ－クラスＩ抗体の異なる濃度の範囲に関してＣＤＣを決定すること；
ｅ）試験サンプルおよび対照サンプルにおける最大のＣＤＣの５０％（ＥＣ５０値）を誘導するＨＬＡ－クラスＩ抗体の濃度を決定すること；ならびに
ｆ１）試験サンプルのＥＣ５０値に対する対照サンプルのＥＣ５０値の比が、約０．１～約１．２５、好ましくは、約０．１～約１．０、より好ましくは、約０．１～約０．５、特に好ましくは、約０．１～約０．２５である場合、同種異系療法のためのＳＣ集団を選択すること；または
ｆ２）試験サンプルのＥＣ５０値が、ＨＬＡ－クラスＩ抗体の約３．５ｎｇ／ｍｌ～約３０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、約９ｎｇ／ｍｌ～約２５ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、約１０ｎｇ／ｍｌ～約２０ｎｇ／ｍｌである場合、同種異系療法のためのＳＣ集団を選択すること
を含んでなる方法に関する。
【0099】
本発明のいくつかの実施形態は、以下に関する：
１．特に、前感作された患者の治療または同種異系療法による患者の再治療のための、同種異系療法に好適な幹細胞（ＳＣ）集団を選択するｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、以下の工程：
ａ）ＳＣ集団のサンプルを、前記ＳＣ集団において最大のＨＬＡ－クラスＩ発現を誘導することができるＩＦＮ－γ濃度の存在下で培養し（試験サンプル）、かつＳＣ集団のサンプルをＩＦＮ－γの非存在下で別に培養すること（対照サンプル）；
ｂ）ＨＬＡ－クラスＩ抗体が試験サンプルおよび対照サンプルにおいて発現したＨＬＡ－クラスＩに結合するような条件下で、ＨＬＡ－クラスＩ抗体の異なる濃度の範囲で試験サンプルと対照サンプルとを接触させること；
ｃ）結合したＨＬＡ－クラスＩ抗体が補体で飽和し、かつ補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）が誘導されるように、補体を試験サンプルおよび対照サンプルに加えること；
ｄ）試験サンプルおよび対照サンプルにおいて誘導された細胞溶解を測定することにより、ＨＬＡ－クラスＩ抗体の異なる濃度の範囲に関してＣＤＣを決定すること；
ｅ）試験サンプルおよび対照サンプルにおける最大のＣＤＣの５０％（ＥＣ５０値）を誘導するＨＬＡ－クラスＩ抗体の濃度を決定すること；ならびに
ｆ１）試験サンプルのＥＣ５０値に対する対照サンプルのＥＣ５０値の比が、１．２５未満、好ましくは、１．０未満、より好ましくは、０．５未満；特に好ましくは、０．２５未満である場合、同種異系療法のためのＳＣ集団を選択すること；または
ｆ２）試験サンプルのＥＣ５０値が、ＨＬＡ－クラスＩ抗体の少なくとも３．５ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、少なくとも９ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、少なくとも１５ｎｇ／ｍｌ、特に好ましくは、少なくとも２０ｎｇ／ｍｌである場合、同種異系療法のためのＳＣ集団を選択すること
を含んでなる、方法。
１．特に、前感作された患者の治療または同種異系療法による患者の再治療のための、同種異系療法に好適な幹細胞（ＳＣ）集団を選択するｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、以下の工程：
ａ）ＳＣ集団のサンプルを、前記ＳＣ集団において最大のＨＬＡ－クラスＩ発現を誘導することができるＩＦＮ－γ濃度の存在下で培養し（試験サンプル）、かつＳＣ集団のサンプルをＩＦＮ－γの非存在下で別に培養すること（対照サンプル）；
ｂ）ＨＬＡ－クラスＩ抗体が試験サンプルおよび対照サンプルにおいて発現したＨＬＡ－クラスＩに結合するような条件下で、ＨＬＡ－クラスＩ抗体の異なる濃度の範囲で試験サンプルと対照サンプルとを接触させること；
ｃ）結合したＨＬＡ－クラスＩ抗体が補体で飽和し、かつ補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）が誘導されるように、補体を試験サンプルおよび対照サンプルに加えること；
ｄ）試験サンプルおよび対照サンプルにおいて誘導された細胞溶解を測定することにより、ＨＬＡ－クラスＩ抗体の異なる濃度の範囲に関してＣＤＣを決定すること；
ｅ）試験サンプルおよび対照サンプルにおける最大のＣＤＣの５０％（ＥＣ５０値）を誘導するＨＬＡ－クラスＩ抗体の濃度を決定すること；ならびに
ｆ１）試験サンプルのＥＣ５０値に対する対照サンプルのＥＣ５０値の比が、１．２５未満、好ましくは、１．０未満、より好ましくは、０．５未満；特に好ましくは、０．２５未満である場合、同種異系療法のためのＳＣ集団を選択すること；または
ｆ２）試験サンプルのＥＣ５０値が、ＨＬＡ－クラスＩ抗体の少なくとも３．５ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、少なくとも９ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、少なくとも１５ｎｇ／ｍｌ、特に好ましくは、少なくとも２０ｎｇ／ｍｌである場合、同種異系療法のためのＳＣ集団を選択すること
を含んでなる、方法。
【0100】
２．前記方法が、試験サンプルおよび対照サンプルにおけるＣＤ４６発現レベルを決定する工程；ならびに対照サンプルにおけるＣＤ４６発現に対する試験サンプルにおけるＣＤ４６発現の比が、２．０超、好ましくは、２．５超、特に好ましくは、３．０超である場合、同種異系療法のためのＳＣ集団を選択する工程をさらに含んでなる、項目１に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
【0101】
３．前記ＳＣ集団が、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）集団、好ましくは、ヒトＭＳＣ集団である、項目１または２に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
【0102】
４．前記間葉系幹細胞集団が骨髄由来幹細胞（ＢＭ－ＭＳＣ）集団である、項目３に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
【0103】
５．前記間葉系幹細胞集団が脂肪組織由来幹細胞（ＡＳＣ）集団である、項目３に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
【0104】
６．前記ＡＳＣ集団が、ＣＤ２９、ＣＤ７３、ＣＤ９０および／またはＣＤ１０５を発現する、項目５に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
【0105】
７．前記ＳＣ集団において最大のＨＬＡ－クラスＩ発現を誘導することができるＩＦＮ－γ濃度が、約０．５～約３０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、約１～約１５ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、約２～約４ｎｇ／ｍｌである、項目１～６のいずれか一項に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
【0106】
８．前記ＳＣ集団において最大のＨＬＡ－クラスＩ発現を誘導することができるＩＦＮ－γ濃度が、好ましくは、４８時間の期間にわたり適用される、３ｎｇ ＩＦＮ－γ／ｍｌである、項目７に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
【0107】
９．前記ＨＬＡクラスＩ抗体が、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂおよび／またはＨＬＡ－Ｃに特異的に結合する、項目１～８のいずれか一項に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
【0108】
１０．前記ＨＬＡクラスＩ抗体が、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－ＢおよびＨＬＡ－Ｃに特異的に結合し、好ましくは、前記ＨＬＡクラスＩ抗体がマウスモノクローナル抗体である、項目９に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
【0109】
１１．前記ＨＬＡ－クラスＩ抗体が、ＡＴＣＣ（指定番号：ＨＢ－９５）またはＥＣＡＣＣ（番号：８４１１２００３）から入手可能なハイブリドーマクローンｗ６／３２により産生される抗体と本質的に同じＨＬＡ－Ａに対する結合親和性を有する、項目９または１０に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
【0110】
１２．前記抗体が、ＡＴＣＣ（指定番号：ＨＢ－９５）またはＥＣＡＣＣ（番号：８４１１２００３）から入手可能なハイブリドーマクローンｗ６／３２により産生される、項目９～１１のいずれか一項に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
【0111】
１３．約１～約５０ｎｇ／ｍｌの範囲内の前記ＨＬＡ－クラスＩ抗体の２種類または３種類の異なる濃度が使用され、好ましくは、約１～約５０ｎｇ／ｍｌの範囲内の前記ＨＬＡ－クラスＩ抗体の４種類または５種類の異なる濃度が使用され、より好ましくは、約１～約５０ｎｇ／ｍｌの範囲内の前記ＨＬＡ－クラスＩ抗体の６種類または７種類の異なる濃度が使用され、さらにより好ましくは、約１～約５０ｎｇ／ｍｌの範囲内の前記ＨＬＡ－クラスＩ抗体の８種類または９種類の異なる濃度が使用される、項目１～１２のいずれか一項に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
【0112】
１４．前記ＨＬＡ－クラスＩ抗体の異なる濃度の範囲が、１ｎｇ／ｍｌ、３ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌおよび５０ｎｇ／ｍｌである、項目１３に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
【0113】
１５．請求項１の工程（ｃ）において使用される補体が、血清由来である、項目１～１４のいずれか一項に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
【0114】
１６．前記血清が、熱で処理されていない、請求項１５に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
【0115】
１７．前記血清が、ウサギ、ヤギまたはヒツジ由来、好ましくは、ウサギ由来である、請求項１５または１６に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
【0116】
１８．血清濃度が５０～８３．３３％（ｖ／ｖ）であり、好ましくは、血清濃度が６６．６６～８３．３３％（ｖ／ｖ）である、請求項１５～１７のいずれか一項に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
【0117】
１９．前記細胞溶解が、生細胞もしくは溶解細胞または溶解細胞から放出された放射性物質に対して選択的である化学発光色素または蛍光色素を測定することにより決定される、項目１～１８のいずれか一項に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
【0118】
２０．特に、前感作された患者の治療または同種異系療法による再治療のための、同種異系療法に好適なＳＣ集団であって、以下の特性：
ｉ）試験サンプルのＥＣ５０値に対する対照サンプルのＥＣ５０値の比が、１．２５未満、好ましくは、１．０未満、より好ましくは、０．５未満、特に好ましくは、０．２５未満であり、ここで、前記ＥＣ５０値は、項目１に示されるように決定される；
ｉｉ）試験サンプルのＥＣ５０値が、少なくとも３．５ｎｇ／ｍｌ ＨＬＡ－クラスＩ抗体、好ましくは、少なくとも９ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、少なくとも１５ｎｇ／ｍｌ、特に好ましくは、少なくとも２０ｎｇ／ｍｌ ＨＬＡ－クラスＩ抗体であり、ここで、前記ＥＣ５０値は、項目１に示されるように決定される；および／または
ｉｉｉ）対照サンプルにおけるＣＤ４６発現に対する試験サンプルにおけるＣＤ４６発現の比が、２．０超、好ましくは、２．５超、特に好ましくは、３．０超であり、ここで、前記ＣＤ４６発現は、項目２に示されるように決定される、
のうちいずれかを有する、ＳＣ集団。
ｉ）試験サンプルのＥＣ５０値に対する対照サンプルのＥＣ５０値の比が、１．２５未満、好ましくは、１．０未満、より好ましくは、０．５未満、特に好ましくは、０．２５未満であり、ここで、前記ＥＣ５０値は、項目１に示されるように決定される；
ｉｉ）試験サンプルのＥＣ５０値が、少なくとも３．５ｎｇ／ｍｌ ＨＬＡ－クラスＩ抗体、好ましくは、少なくとも９ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、少なくとも１５ｎｇ／ｍｌ、特に好ましくは、少なくとも２０ｎｇ／ｍｌ ＨＬＡ－クラスＩ抗体であり、ここで、前記ＥＣ５０値は、項目１に示されるように決定される；および／または
ｉｉｉ）対照サンプルにおけるＣＤ４６発現に対する試験サンプルにおけるＣＤ４６発現の比が、２．０超、好ましくは、２．５超、特に好ましくは、３．０超であり、ここで、前記ＣＤ４６発現は、項目２に示されるように決定される、
のうちいずれかを有する、ＳＣ集団。
【0119】
２１．前記ＳＣ集団が、項目１～１９のいずれか一項に記載の方法により選択される、項目２０に記載のＳＣ集団。
【0120】
２２．前記ＳＣ集団が、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）集団、好ましくは、ＢＭ－ＭＳＣ集団またはＡＳＣ集団、好ましくは、ヒトＢＭ－ＭＳＣまたはヒトＡＳＣである、項目２１または２２に記載のＳＣ集団。
【0121】
２３．項目２０～２２のいずれか一項に記載のＳＣ集団と場合により薬学上許容可能な担体とを含んでなる、医薬組成物。
【0122】
２４．医薬組成物を調製する方法であって、以下の工程：
ａ）項目１～１９のいずれか一項に記載の方法を行うこと；ならびに
ｂ）少なくとも１つの薬学上許容可能な担体とともに選択されたＳＣ集団を処方すること
を含んでなる、方法。
ａ）項目１～１９のいずれか一項に記載の方法を行うこと；ならびに
ｂ）少なくとも１つの薬学上許容可能な担体とともに選択されたＳＣ集団を処方すること
を含んでなる、方法。
【0123】
２５．それを必要とする患者における、好ましくは、前感作された患者または再治療を受けている患者における、同種異系幹細胞療法における使用のための、項目２０～２２のいずれか一項に記載のＳＣ集団。
【0124】
２６．それを必要とする前記患者が、瘻孔、白血病、リンパ腫、神経変性疾患、脳損傷および脊髄損傷、心疾患、盲目および視力障害、膵ベータ細胞機能喪失、軟骨修復、変形性関節症、筋骨格系疾患、創傷、不妊症、自己免疫疾患および炎症性疾患、例えば、炎症性腸疾患から選択される疾患に罹患しており、好ましくは、前記疾患が瘻孔であり、より好ましくは、前記疾患が複雑肛門周囲瘻である、項目２５に記載の使用のためのＳＣ集団。
【0125】
２７．それを必要とする患者に対して、好ましくは、前感作された患者または再治療を受けている患者において、項目２０～２２のいずれか一項に記載のＳＣ集団を投与することを含んでなる、同種異系幹細胞療法の方法。
【0126】
２８．それを必要とする前記患者が、白血病、リンパ腫、神経変性疾患、脳損傷および脊髄損傷、心疾患、盲目および視力障害、膵ベータ細胞機能喪失、軟骨修復、変形性関節症、筋骨格系疾患、創傷、不妊症、自己免疫疾患および炎症性疾患、例えば、炎症性腸疾患から選択される疾患に罹患しており、好ましくは、前記疾患が瘻孔であり、より好ましくは、前記疾患が複雑肛門周囲瘻である、項目２７に記載の同種異系幹細胞療法の方法。
【0127】
本発明を以下の実施例においてさらに説明するが、これらの実施例は、単に本発明の特定の実施形態を説明する目的のものであり、決して本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきでものでもない。
【実施例】
【0128】
材料と方法
ＡＤＭＩＲＥ ＣＤ１におけるＤＳＡ産生のモニタリング
患者
無作為化二重盲検並行群間プラセボ対照試験ＡＤＭＩＲＥ ＣＤ１からの１２３例の患者のサブグループ(Panes et al. (2016), Lancet 388, 1281-1290)。簡単に述べれば、全例が、ＣＤおよび治療抵抗性の排液性複雑肛門周囲瘻を有する成人患者（１８歳以上）であり、１億２，０００万個のＡＳＣまたは２４ｍＬ生理食塩水（プラセボ）の単回病変内注射を受けるように選択された。計６０例および６３例の患者が、それぞれプラセボまたはＡＳＣの注入を受け、そのうち１０５例（ＡＳＣ５８例、プラセボ４７例）が、投与後最大５２週まで追跡に成功した。
ＡＤＭＩＲＥ ＣＤ１におけるＤＳＡ産生のモニタリング
患者
無作為化二重盲検並行群間プラセボ対照試験ＡＤＭＩＲＥ ＣＤ１からの１２３例の患者のサブグループ(Panes et al. (2016), Lancet 388, 1281-1290)。簡単に述べれば、全例が、ＣＤおよび治療抵抗性の排液性複雑肛門周囲瘻を有する成人患者（１８歳以上）であり、１億２，０００万個のＡＳＣまたは２４ｍＬ生理食塩水（プラセボ）の単回病変内注射を受けるように選択された。計６０例および６３例の患者が、それぞれプラセボまたはＡＳＣの注入を受け、そのうち１０５例（ＡＳＣ５８例、プラセボ４７例）が、投与後最大５２週まで追跡に成功した。
【0129】
ＡＳＣドナー
健常ドナー由来のヒト脂肪吸引組織を、他所に記載の通りに処理した（上記で引用したLopez-Santalla et al., 2015）。本試験では、７例の異なるドナー由来のＡＳＣを使用し、ＤｏｎＡが、ＡＤＭＩＲＥ ＣＤ１臨床試験で使用されたドナーであった。ＤｏｎＡおよびＤｏｎＢは、ＡＤＭＩＲＥ ＣＤ２臨床試験（ＮＣＴ０３２７９０８１）（この試験は、２例の異なるドナーを使用した）からのものであった。さらに、ドナーＤｏｎＣ、ＤｏｎＤ、ＤｏｎＥ、ＤｏｎＦおよびＤｏｎＧ由来のＡＳＣを分析した。総てのＡＳＣドナーが、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ａｄｉｐｏｓｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓおよび国際細胞治療学会(International Society for Cellular Therapy)により設定された同一性および純度基準に適合した(Bourin et al., (2013), Cytotherapy (2013) 15(6): 641-648)。ＡＳＣの培養は、他所に記載されている（上記で引用したDelaRosa et al., 2009）。
健常ドナー由来のヒト脂肪吸引組織を、他所に記載の通りに処理した（上記で引用したLopez-Santalla et al., 2015）。本試験では、７例の異なるドナー由来のＡＳＣを使用し、ＤｏｎＡが、ＡＤＭＩＲＥ ＣＤ１臨床試験で使用されたドナーであった。ＤｏｎＡおよびＤｏｎＢは、ＡＤＭＩＲＥ ＣＤ２臨床試験（ＮＣＴ０３２７９０８１）（この試験は、２例の異なるドナーを使用した）からのものであった。さらに、ドナーＤｏｎＣ、ＤｏｎＤ、ＤｏｎＥ、ＤｏｎＦおよびＤｏｎＧ由来のＡＳＣを分析した。総てのＡＳＣドナーが、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ａｄｉｐｏｓｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓおよび国際細胞治療学会(International Society for Cellular Therapy)により設定された同一性および純度基準に適合した(Bourin et al., (2013), Cytotherapy (2013) 15(6): 641-648)。ＡＳＣの培養は、他所に記載されている（上記で引用したDelaRosa et al., 2009）。
【0130】
抗ＨＬＡの検出
ベースライン時ならびにプラセボまたはＡＳＣの投与後１２および５２週において全患者から採取した、エチレンジアミン四酢酸を含有する末梢血チューブ（Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標）スプレーコートＫ２ＥＤＴＡチューブ、ＢＤ社）の遠心分離により、血漿サンプルを得た。製造業者の説明書に従ってＬａｂｓｃｒｅｅｎＭｉｘｅｄ（商標）キット（Ｏｎｅ Ｌａｍｂｄａ Ｉｎｃ．（登録商標）カノガパーク、カリフォルニア州、米国）を使用して、Ｌｕｍｉｎｅｘプラットフォームにおいて抗ＨＬＡ抗体を検出した。蛍光強度（ＭＦＩ）の中央値の８００単位超のシグナルを有する全サンプルを陽性とみなし、ＨＬＡ抗体の特異性を、Ｌａｂｓｃｒｅｅｎ Ｓｉｎｇｌｅ Ａｎｔｉｇｅｎ（商標）キット（Ｏｎｅ Ｌａｍｂｄａ Ｉｎｃ．（登録商標）カノガパーク、カリフォルニア州、米国）を使用して決定した。全シグナルをＱｕａｎｔｉｐｌｅｘ（商標）ビーズ蛍光に従って正規化し、２０，０００超の標準蛍光強度単位を関連ありとみなした。定性的に、ＨＬＡ抗体価を、Ｌａｂｓｃｒｅｅｎ Ｍｉｘｅｄキットに含まれるＨＬＡクラスＩ分子からの全決定因子ビーズの得られたＭＦＩ和と定義した。これにより、提示された抗ＨＬＡ特異性とは独立に、液性応答の生じたレベルを比較することが可能となった。
ベースライン時ならびにプラセボまたはＡＳＣの投与後１２および５２週において全患者から採取した、エチレンジアミン四酢酸を含有する末梢血チューブ（Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標）スプレーコートＫ２ＥＤＴＡチューブ、ＢＤ社）の遠心分離により、血漿サンプルを得た。製造業者の説明書に従ってＬａｂｓｃｒｅｅｎＭｉｘｅｄ（商標）キット（Ｏｎｅ Ｌａｍｂｄａ Ｉｎｃ．（登録商標）カノガパーク、カリフォルニア州、米国）を使用して、Ｌｕｍｉｎｅｘプラットフォームにおいて抗ＨＬＡ抗体を検出した。蛍光強度（ＭＦＩ）の中央値の８００単位超のシグナルを有する全サンプルを陽性とみなし、ＨＬＡ抗体の特異性を、Ｌａｂｓｃｒｅｅｎ Ｓｉｎｇｌｅ Ａｎｔｉｇｅｎ（商標）キット（Ｏｎｅ Ｌａｍｂｄａ Ｉｎｃ．（登録商標）カノガパーク、カリフォルニア州、米国）を使用して決定した。全シグナルをＱｕａｎｔｉｐｌｅｘ（商標）ビーズ蛍光に従って正規化し、２０，０００超の標準蛍光強度単位を関連ありとみなした。定性的に、ＨＬＡ抗体価を、Ｌａｂｓｃｒｅｅｎ Ｍｉｘｅｄキットに含まれるＨＬＡクラスＩ分子からの全決定因子ビーズの得られたＭＦＩ和と定義した。これにより、提示された抗ＨＬＡ特異性とは独立に、液性応答の生じたレベルを比較することが可能となった。
【0131】
ＨＬＡタイピング
各患者において発現したＨＬＡアレルの割り当てを、ｃｈｅｍａｇｉｃ ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ２５０ ＫＩＴ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）を使用して、末梢血サンプルから得たＤＮＡサンプルから決定した。Ａ２６０／２８０吸光度比を調べることにより純度を確認した後、２０ｎｇ／μＬ以上のＤＮＡ濃度を有する全サンプルを、製造業者の説明書に従って、ＨＬＡの座位Ａ、ＢおよびＣに対して特異的なＬＡＢＴｙｐｅ（登録商標）ＳＳＯアッセイ（Ｏｎｅ Ｌａｍｂｄａ社、カノガパーク、カリフォルニア州）を使用して試験した。患者ＡＳＣとドナーＡＳＣとの間の不適合のキャラクタリゼーションを、アルゴリズムＨＬＡマッチメーカーを使用して、多型残基の非共有の独特の鎖と定義した（以下、エプレットという）（Duquesnoy (2002), Hum Immunol 63, 339-352）。
各患者において発現したＨＬＡアレルの割り当てを、ｃｈｅｍａｇｉｃ ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ２５０ ＫＩＴ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）を使用して、末梢血サンプルから得たＤＮＡサンプルから決定した。Ａ２６０／２８０吸光度比を調べることにより純度を確認した後、２０ｎｇ／μＬ以上のＤＮＡ濃度を有する全サンプルを、製造業者の説明書に従って、ＨＬＡの座位Ａ、ＢおよびＣに対して特異的なＬＡＢＴｙｐｅ（登録商標）ＳＳＯアッセイ（Ｏｎｅ Ｌａｍｂｄａ社、カノガパーク、カリフォルニア州）を使用して試験した。患者ＡＳＣとドナーＡＳＣとの間の不適合のキャラクタリゼーションを、アルゴリズムＨＬＡマッチメーカーを使用して、多型残基の非共有の独特の鎖と定義した（以下、エプレットという）（Duquesnoy (2002), Hum Immunol 63, 339-352）。
【0132】
組換え抗ＨＬＡ抗体（ｒＨＬＡ）とのフローサイトメトリークロスマッチ（ＦＣＸＭ）結合の標準化
標準曲線
クラスＩおよびクラスＩＩ ＨＬＡ発現のレベルを、基本条件下でＤｏｎＡおよびＤｏｎＢ（クラスＩ）、ならびにＤｏｎＡ（クラスＩＩ）由来のＡＳＣにおいて決定し、ＡＳＣを、インターフェロンＩＦＮγ（３ｎｇ／ｍＬで４８時間）を使用して前活性化した。５０，０００個のＡＳＣを、増加させた濃度（クローンＷ６／３２は０～１５ｎｇ／ｍＬ、クローンＬ２４３は０～３ｎｇ／ｍＬ）のＰＥ（フィコエリトリン）標識抗ヒトクラスＩ ＨＬＡ Ａｂ（クローンＷ６／３２）およびＰｅｒＣＰ（ペリジニン－クロロフィル－タンパク質）標識抗ヒトクラスＩＩ ＨＬＡ Ａｂ（クローンＬ２４３）（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社、フランクリン・レイクス、ニュージャージー州、米国）で染色し、暗所にて室温で３０分間インキュベートした。
標準曲線
クラスＩおよびクラスＩＩ ＨＬＡ発現のレベルを、基本条件下でＤｏｎＡおよびＤｏｎＢ（クラスＩ）、ならびにＤｏｎＡ（クラスＩＩ）由来のＡＳＣにおいて決定し、ＡＳＣを、インターフェロンＩＦＮγ（３ｎｇ／ｍＬで４８時間）を使用して前活性化した。５０，０００個のＡＳＣを、増加させた濃度（クローンＷ６／３２は０～１５ｎｇ／ｍＬ、クローンＬ２４３は０～３ｎｇ／ｍＬ）のＰＥ（フィコエリトリン）標識抗ヒトクラスＩ ＨＬＡ Ａｂ（クローンＷ６／３２）およびＰｅｒＣＰ（ペリジニン－クロロフィル－タンパク質）標識抗ヒトクラスＩＩ ＨＬＡ Ａｂ（クローンＬ２４３）（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社、フランクリン・レイクス、ニュージャージー州、米国）で染色し、暗所にて室温で３０分間インキュベートした。
【0133】
血漿サンプルのＦＣＸＭ結合強度
先に５６℃で３０分間非働化し、磁気活性化セルソーティング（ＭＡＣＳ）緩衝液で１回洗浄したＡＳＣを投与された全患者からの治療前１２週（Ｗ１２）および５２週（Ｗ５２）の血漿サンプルを試験した。５０μＬの非働化血漿を、５０，０００個のＡＳＣ（最終容量は１００μＬ）と室温にて３０分間インキュベートした。ＦＡＣＳ－Ｆｏｒｔｅｓｓａ Ｘ２０セルアナライザーを使用して、サンプルあたりＰ１ゲート（ＡＳＣの総集団）における１０，０００イベントを取得することにより、ＨＬＡ－クラスＩおよびＨＬＡ－クラスＩＩのＭＦＩを決定した。分析には、ＢＤ ＦａｃｓＤｉｖａ（商標）ソフトウェア（ＢＤ社）を使用した。
先に５６℃で３０分間非働化し、磁気活性化セルソーティング（ＭＡＣＳ）緩衝液で１回洗浄したＡＳＣを投与された全患者からの治療前１２週（Ｗ１２）および５２週（Ｗ５２）の血漿サンプルを試験した。５０μＬの非働化血漿を、５０，０００個のＡＳＣ（最終容量は１００μＬ）と室温にて３０分間インキュベートした。ＦＡＣＳ－Ｆｏｒｔｅｓｓａ Ｘ２０セルアナライザーを使用して、サンプルあたりＰ１ゲート（ＡＳＣの総集団）における１０，０００イベントを取得することにより、ＨＬＡ－クラスＩおよびＨＬＡ－クラスＩＩのＭＦＩを決定した。分析には、ＢＤ ＦａｃｓＤｉｖａ（商標）ソフトウェア（ＢＤ社）を使用した。
【0134】
血漿サンプルのＣＤＣアッセイ
細胞傷害性の測定のために、補体抗ヒトクラスＩ ＨＬＡ（ＣＡＢＣ－１Ｄ、Ｏｎｅ Ｌａｍｂｄａ Ｉｎｃ（登録商標）カノガパーク、カリフォルニア州、米国）の源としての２５０μＬのウサギ血清を細胞に１時間加えた。次いで、細胞を２回洗浄し、２０分以内に２０μＬ ＦＩＴＣ抗ヒトＩｇＧとインキュベートした。最後に、洗浄後、ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター（ＢＤ社）における取得による５μＬの７－アミノアクチノマイシンＤ（７－ＡＡＤ）生存率色素の添加後、細胞傷害性を決定した。
細胞傷害性の測定のために、補体抗ヒトクラスＩ ＨＬＡ（ＣＡＢＣ－１Ｄ、Ｏｎｅ Ｌａｍｂｄａ Ｉｎｃ（登録商標）カノガパーク、カリフォルニア州、米国）の源としての２５０μＬのウサギ血清を細胞に１時間加えた。次いで、細胞を２回洗浄し、２０分以内に２０μＬ ＦＩＴＣ抗ヒトＩｇＧとインキュベートした。最後に、洗浄後、ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター（ＢＤ社）における取得による５μＬの７－アミノアクチノマイシンＤ（７－ＡＡＤ）生存率色素の添加後、細胞傷害性を決定した。
【0135】
ＦＡＣＳによるｍＣＲＰ定量化
ＡＳＣを、通常条件または３ｎｇ／ｍＬＩＦＮγ条件のいずれかで４８時間成長させた。次いで、ＡＳＣをトリプシン処理し、計数した。計５０，０００個の細胞を１００μＬ ＭＡＣＳ緩衝液に再懸濁させた。染色のために、本発明者らは、ＣＤ４６（カタログ番号５６４２５３、ＢＤ社）、ＣＤ５５（ＭＣＡ１６１４ＰＥ、Ｓｅｒｏｔｅｃ社）およびＣＤ５９（ＢＲＡ－１０Ｇ、Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社）Ａｂ、ならびに対照としてのそれらのそれぞれのアイソタイプ（ＢＤ社のＩｇＧ２ａ－ＡＰＣ、ＩｇＧ１－ＰＥおよびＩｇＧ２ｂ－ＰＥ）を使用した。２０分間の氷上でのインキュベーション後、ＡＳＣをＭＡＣＳで洗浄し、１，５００ｒｐｍで４分間遠心分離した。最後に、ＡＳＣを１００μＬ ＭＡＣＳに再懸濁させ、サイトメトリーチューブに移し、ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター（ＢＤ社）において取得し、ＢＤ ＦａｃｓＤｉｖａ（商標）（ＢＤ社）を使用して分析した。
ＡＳＣを、通常条件または３ｎｇ／ｍＬＩＦＮγ条件のいずれかで４８時間成長させた。次いで、ＡＳＣをトリプシン処理し、計数した。計５０，０００個の細胞を１００μＬ ＭＡＣＳ緩衝液に再懸濁させた。染色のために、本発明者らは、ＣＤ４６（カタログ番号５６４２５３、ＢＤ社）、ＣＤ５５（ＭＣＡ１６１４ＰＥ、Ｓｅｒｏｔｅｃ社）およびＣＤ５９（ＢＲＡ－１０Ｇ、Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社）Ａｂ、ならびに対照としてのそれらのそれぞれのアイソタイプ（ＢＤ社のＩｇＧ２ａ－ＡＰＣ、ＩｇＧ１－ＰＥおよびＩｇＧ２ｂ－ＰＥ）を使用した。２０分間の氷上でのインキュベーション後、ＡＳＣをＭＡＣＳで洗浄し、１，５００ｒｐｍで４分間遠心分離した。最後に、ＡＳＣを１００μＬ ＭＡＣＳに再懸濁させ、サイトメトリーチューブに移し、ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター（ＢＤ社）において取得し、ＢＤ ＦａｃｓＤｉｖａ（商標）（ＢＤ社）を使用して分析した。
【0136】
ＣＤ４６ノックアウト細胞株の産生
以下の公開ゲノムツール：www.genome.ucsc.eduおよびwww.www.ncbi.nlm.nih.gov/geneを使用して、ガイドＲＮＡを、ＣＤ４６エクソン３を標的とするように設計した。ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）送達のために、Ａｌｔ－Ｒ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ Ｓｙｓｔｅｍ（ＩＤＴ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を製造業者の説明書に従って使用した。簡単に述べれば、ＡＳＣを解凍し、一晩放置した。この後、リボ核タンパク質複合体混合物を調製し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ社）を使用して送達した。ｃｒＲＮＡおよびトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を、最終オリゴ二本鎖作業濃度１μＭの無菌微量遠心管内にて等モル濃度で混合した。混合物を、室温で２０分間インキュベートした。この後、トランスフェクション複合体を培養プレートに加えた後、ＡＳＣ懸濁液を加えた。２４時間後、ＡＳＣ培地を交換し、蛍光ｔｒａｃｒＲＮＡ－ＡＴＴＯ５５０を使用して顕微鏡下でリポフェクションの有効性を確認した。
以下の公開ゲノムツール：www.genome.ucsc.eduおよびwww.www.ncbi.nlm.nih.gov/geneを使用して、ガイドＲＮＡを、ＣＤ４６エクソン３を標的とするように設計した。ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）送達のために、Ａｌｔ－Ｒ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ Ｓｙｓｔｅｍ（ＩＤＴ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を製造業者の説明書に従って使用した。簡単に述べれば、ＡＳＣを解凍し、一晩放置した。この後、リボ核タンパク質複合体混合物を調製し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ社）を使用して送達した。ｃｒＲＮＡおよびトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を、最終オリゴ二本鎖作業濃度１μＭの無菌微量遠心管内にて等モル濃度で混合した。混合物を、室温で２０分間インキュベートした。この後、トランスフェクション複合体を培養プレートに加えた後、ＡＳＣ懸濁液を加えた。２４時間後、ＡＳＣ培地を交換し、蛍光ｔｒａｃｒＲＮＡ－ＡＴＴＯ５５０を使用して顕微鏡下でリポフェクションの有効性を確認した。
【0137】
結果
ＡＤＭＩＲＥ ＣＤ１治療患者における長期のＤＳＡの存在
ベースライン時および治療投与後１２週において、Panes, J. et al. (2016), Lancet 388, 1281-1290において報告されたＡＤＭＩＲＥ ＣＤ１試験の１２３例の患者から血液サンプルを採取し、そのうち６３例がＡＳＣ、６０例がプラセボであった。治療投与後５２週において、１０５例の患者（ＡＳＣ５８例およびプラセボ４７例）が、血液サンプルを提供した（図１Ａ）。Ｌｕｍｉｎｅｘ技術を使用した固相アッセイによる分析で、２３例の患者が治療後１２週にＤＳＡを産生したことが明らかにされた。予想されたように、プラセボの投与を受けた患者は、ＤＳＡを含有するサンプルを産生しなかった（図１Ａ、右のチャート）。さらに、結果は、ＡＳＣ患者の１６％（１０／６３例）およびプラセボ患者の１５％（９／６０例）が、ベースライン時に前感作されたことを示した。５３例の未治療患者のうち、１７例がＷ１２においてＡＳＣ ＤＳＡを産生し、１０例の前感作された患者のうち６例が、Ｗ１２においてＡＳＣ ＤＳＡを産生した（図１Ａ、左のチャート）。全例において、ＤＳＡの特異性は、ＨＬＡクラスＩ分子に対してのみ検出され、ＨＬＡクラスＩＩ分子に対しては検出されなかった。長期追跡調査により、Ｗ５２においてＤＳＡのさらなる産生は検出されず、この時点において患者の３０％（７／２３例）がＤＳＡを除去していたことが明らかにされた。興味深いことに、Ｗ１２においてＤＳＡを産生した未治療患者の群は、３５％（６／１７例）のクリアランス率を示したのに対し、Ｗ１２においてＤＳＡを産生した前感作された患者は、Ｗ５２において１７％（１／６例）のクリアランス率を示した。興味深いことに、前感作された患者は、Ｗ５２において持続した液性応答を示す傾向があった。対照的に、ＤＳＡを産生した未治療患者は、それらの基礎ＤＳＡレベルに戻る傾向を示した。要約すると、上記の観察所見は、これらのＡＤＭＩＲＥ ＣＤ１患者におけるＡＳＣに対する応答は、一次免疫応答動態に従うことを示唆するものである。
ＡＤＭＩＲＥ ＣＤ１治療患者における長期のＤＳＡの存在
ベースライン時および治療投与後１２週において、Panes, J. et al. (2016), Lancet 388, 1281-1290において報告されたＡＤＭＩＲＥ ＣＤ１試験の１２３例の患者から血液サンプルを採取し、そのうち６３例がＡＳＣ、６０例がプラセボであった。治療投与後５２週において、１０５例の患者（ＡＳＣ５８例およびプラセボ４７例）が、血液サンプルを提供した（図１Ａ）。Ｌｕｍｉｎｅｘ技術を使用した固相アッセイによる分析で、２３例の患者が治療後１２週にＤＳＡを産生したことが明らかにされた。予想されたように、プラセボの投与を受けた患者は、ＤＳＡを含有するサンプルを産生しなかった（図１Ａ、右のチャート）。さらに、結果は、ＡＳＣ患者の１６％（１０／６３例）およびプラセボ患者の１５％（９／６０例）が、ベースライン時に前感作されたことを示した。５３例の未治療患者のうち、１７例がＷ１２においてＡＳＣ ＤＳＡを産生し、１０例の前感作された患者のうち６例が、Ｗ１２においてＡＳＣ ＤＳＡを産生した（図１Ａ、左のチャート）。全例において、ＤＳＡの特異性は、ＨＬＡクラスＩ分子に対してのみ検出され、ＨＬＡクラスＩＩ分子に対しては検出されなかった。長期追跡調査により、Ｗ５２においてＤＳＡのさらなる産生は検出されず、この時点において患者の３０％（７／２３例）がＤＳＡを除去していたことが明らかにされた。興味深いことに、Ｗ１２においてＤＳＡを産生した未治療患者の群は、３５％（６／１７例）のクリアランス率を示したのに対し、Ｗ１２においてＤＳＡを産生した前感作された患者は、Ｗ５２において１７％（１／６例）のクリアランス率を示した。興味深いことに、前感作された患者は、Ｗ５２において持続した液性応答を示す傾向があった。対照的に、ＤＳＡを産生した未治療患者は、それらの基礎ＤＳＡレベルに戻る傾向を示した。要約すると、上記の観察所見は、これらのＡＤＭＩＲＥ ＣＤ１患者におけるＡＳＣに対する応答は、一次免疫応答動態に従うことを示唆するものである。
【0138】
方法（抗ＨＬＡの検出の項）において述べたように、特定のサンプルに対するＤＳＡ陽性のレベルは、単一抗原結果の最も制限的な閾値を使用して、すなわち、カテゴリー値（特定のカットオフより上か下か）に従って選択した。しかしながら、精製ＨＬＡコートビーズ（Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）技術において使用されるマイクロスフェア）上に存在する総抗原と比較した結合した抗体の量は、ＭＦＩ ＨＬＡクラスＩ ＬＳＭ（最小二乗平均）マイクロスフェアの和として定量化することもできる。期間（治療前および治療後１２～５２週）を通じて血漿ＤＳＡ力価を測定した経時的曲線を算出し、応答動態を示し、減少するＤＳＡレベルの尤度を決定した（図１Ｂ）。患者を、ＤＳＡの存在に基づいて以下の群にクラスター化した：ＤＳＡを産生しなかった未治療患者（これらの患者からのベースラインレベルを比較に使用した）；アロＡＳＣ投与後にＤＳＡを産生した未治療患者；投与されたドナーＡＳＣの特異性を有する前感作された患者；および使用されたドナー細胞に対する特異性を有さない前感作された患者。予想されたように、ＤＳＡを産生しなかった未治療患者は、試験の全過程を通じてＨＬＡクラスＩ抗体を示さなかった（図１Ｂ、左上のパネル）。対照的に、ＤＳＡを産生した未治療患者は、増加した抗体価を示した。さらに、ベースラインからＷ１２のＭＦＩの変化は、全患者間で類似しておらず、実際に、特定の患者において、応答は他者よりも強力であるように思われ、患者９２（Ｐａｔ９２）が最もアロ応答性であった（図１Ｂ、円）。しかしながら、Ｗ５２においてＭＦＩは全例において減少したことが明らかとなり、これは、ブースター効果後に抗体価の増加が減少する古典的一次応答の抗体プロファイルと一致している。ＡＳＣと特異性を共有する前感作された患者の群において、二次応答または記憶応答に一致するプロファイルが認められ、抗体価は、Ｗ１２およびＷ５２の両方でベースラインレベルを上回っていた（図１Ｂ、左下のパネル）。これらの患者は、この場合、持続時間および強度が制限される傾向にあるブースター応答のプロファイルを有する。興味深いことに、未治療患者群、および非応答プロファイルを意味するベースライン時にＡＳＣ特異性を示さなかった前感作された患者（図１Ｂ、右下のパネル）において、類似した動態が確認された。
【0139】
ドナー－患者ＨＬＡ適合グレードとＤＳＡを産生する確率との間の関連性の可能性を検討した。患者において欠いていたＡＳＣドナーのＨＬＡ型（エプレット）に存在する多型残基を同定することにより、同種異系認識の前駆体を同定することを目的とした。各患者のエプレットを、ミスマッチ定量化のためにＡＳＣドナーのＨＬＡアレルと整列させた。本試験では、アロ感作は、主にＨＬＡクラスＩに対して生じ、したがって、ＨＬＡクラスＩの座位ＡおよびＢを特徴付けることに焦点を当てた。エプレットの総数は、ＤＳＡを産生する患者の感受性と相関していた（図１Ｃ）。線形回帰分析は、エプレットミスマッチと投与後１２週における患者のＤＳＡ産生との間の有意な相関を示さなかった。
【0140】
ＡＳＣに対する抗ＨＬＡ抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ結合
異なる組織に認められるＭＳＣは、免疫調節特性または同一性マーカーを含む共通の特徴を共有するが、異なる免疫原性応答がｉｎ ｖｉｖｏモデルにおいて報告されている。ＡＳＣの免疫原性応答を特徴付けるためのＦＡＣＳ分析を使用して、ＡＳＣ上のＨＬＡ－クラスＩおよびＨＬＡ－クラスＩＩ分子の発現、ならびに患者の抗ＨＬＡ Ａｂに結合するそれらの能力を定量化することを目的とした（図２Ａ）。蛍光標識ＨＬＡ－クラスＩ（６週および３２週）またはＨＬＡ－クラスＩＩ（Ｌ２４３）組換えＡｂの濃度を増加させながら、ＩＦＮγによる予備刺激ありまたはなしで、ＡＳＣをインキュベートし、染色後のＭＦＩを定量化した。予想されたように、ＡＳＣは、基礎レベルでＨＬＡ－クラスＩを発現し、ＩＦＮγ刺激後に強力な過剰発現を示した（図２Ａ）。逆に、ＨＬＡ－クラスＩＩレベルは、ベースライン時に陰性であり、ＩＦＮγ刺激後に中程度に増加した。
異なる組織に認められるＭＳＣは、免疫調節特性または同一性マーカーを含む共通の特徴を共有するが、異なる免疫原性応答がｉｎ ｖｉｖｏモデルにおいて報告されている。ＡＳＣの免疫原性応答を特徴付けるためのＦＡＣＳ分析を使用して、ＡＳＣ上のＨＬＡ－クラスＩおよびＨＬＡ－クラスＩＩ分子の発現、ならびに患者の抗ＨＬＡ Ａｂに結合するそれらの能力を定量化することを目的とした（図２Ａ）。蛍光標識ＨＬＡ－クラスＩ（６週および３２週）またはＨＬＡ－クラスＩＩ（Ｌ２４３）組換えＡｂの濃度を増加させながら、ＩＦＮγによる予備刺激ありまたはなしで、ＡＳＣをインキュベートし、染色後のＭＦＩを定量化した。予想されたように、ＡＳＣは、基礎レベルでＨＬＡ－クラスＩを発現し、ＩＦＮγ刺激後に強力な過剰発現を示した（図２Ａ）。逆に、ＨＬＡ－クラスＩＩレベルは、ベースライン時に陰性であり、ＩＦＮγ刺激後に中程度に増加した。
【0141】
血漿サンプル、Ｐａｔ９２（図１Ｂ、円）は、治療後の最大のＤＳＡ力価を有していた。基本条件において、ＤＳＡの結合強度、または補体依存性毒性アッセイにおける有意な増大は検出されなかった。しかしながら、ＡＳＣをＩＦＮγで刺激した場合、陽性対照（過免疫サンプルのプール、ＨＩプール）およびＰａｔ９２サンプル（図２Ｂ、左下のパネル）の両方におけるＡＳＣ結合強度の有意なアップレギュレーションが認められた。結合の増大は、Ｐａｔ９２において高いパーセンテージの細胞傷害死（３４％）を伴った（図２Ｂ、淡灰色）。このパーセンテージは、試験した他の２２例の患者において定量化された死滅のパーセンテージ（３．３～９．３％の範囲）より有意に高く、Ｐａｔ９２が最もアロ応答性であるサンプルであったことが確認された。興味深いことに、Ｐａｔ９２は、投与されたＡＳＣとの最高レベルのミスマッチを示した１つのサンプルであったが、Ｗ５２において抗体クリアランスを示した。同種異系ＡＳＣ療法の安全性および免疫原性毒性を理解することは、再治療の実現可能性を評価する助けとなるであろう。さらに、それは、前感作された患者および／または新規ＤＳＡ産生が悪化した患者（例えば、Ｐａｔ９２）におけるそれらの潜在的な影響を決定する助けとなるであろう。
【0142】
血漿ＤＳＡはＡＳＣに結合し、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて中等度の死滅を誘導する
上記の結果において、６３例のＡＤＭＩＲＥ ＣＤ１患者のコホートのうち、１０例が既存のＨＬＡ－クラスＩ Ａｂを有し、１７例が新規ＤＳＡを産生したことが示された。ＡＳＣは、ＨＬＡ－クラスＩ抗原を発現し、ｒＨＬＡ－クラスＩ Ａｂに結合することも実証されたが、しかしながら、患者のＤＳＡが、結合し、引き続きＡＳＣの細胞傷害死を誘導する能力を有するかどうかは不明である。このことを試験するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＡＳＣに対するＨＬＡクラスＩ抗原の結合に関する前感作群および新規ＤＳＡ陽性（ＤＳＡ＋）群の異なる親和性を定量化することを目的とした。最初のドナーＤｏｎＡ（ＡＤＭＩＲＥ ＣＤ１試験において投与された）に加え、追加のドナーＤｏｎＢを、それが患者に投与されなかったため、ＤＳＡ特異性に関する対照として機能するように含めた（図３Ａ）。ベースラインおよびＷ１２におけるサンプルを、基本条件下で培養された、またはＩＦＮγで予備刺激されたＡＳＣに対するＨＬＡ－Ｉ結合強度に関して、ＦＣＸＭにより測定した（図３Ａ、上のパネル）。ドナーＡＳＣにおける前感作された患者または新規ＤＳＡ＋患者のいずれかに由来するサンプルにおいて、高い結合能は基本条件下で認められなかった。ＡＳＣをＩＦＮγで予備刺激した場合、前感作された患者は、ＤｏｎＡのみで、０週（Ｗ０）および１２週（Ｗ１２）の両方の来院時に高い同等の結合親和性を有していたことが認められた（図３Ａ、上のパネル）。基本条件およびしたがってＡＳＣドナーの膜における低いＨＬＡ－Ｉ抗原発現は、ＤｏｎＡおよびＤｏｎＢの両方における低い結合親和性と相関していた（図３Ａ、下のパネル）。注目すべきことに、新規ＤＳＡ＋サンプルにおけるＷ１２とベースラインとの間のＤｏｎＡに由来する患者のサンプルの比較において、結合親和性の有意な増大が認められた（図３Ａ、下のパネル）。上記のデータは、基本ＡＳＣにおけるＨＬＡの濃度は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＤＳＡの有意な結合を示すのに十分ではないことを示唆している。さらに、大部分の患者におけるＤＳＡの濃度は、非活性化ＡＳＣまたは活性化ＡＳＣの両方において、有意な結合強度を示すのに十分であるとは思えない。これらの結果は、ドナーと免疫特異性も共有する高いＤＳＡレベルを有する患者のみが、有意なＨＬＡ－クラスＩ結合をもたらした、臓器移植試験の実質臓器移植フローサイトメトリークロスマッチング観察所見と一致している。
上記の結果において、６３例のＡＤＭＩＲＥ ＣＤ１患者のコホートのうち、１０例が既存のＨＬＡ－クラスＩ Ａｂを有し、１７例が新規ＤＳＡを産生したことが示された。ＡＳＣは、ＨＬＡ－クラスＩ抗原を発現し、ｒＨＬＡ－クラスＩ Ａｂに結合することも実証されたが、しかしながら、患者のＤＳＡが、結合し、引き続きＡＳＣの細胞傷害死を誘導する能力を有するかどうかは不明である。このことを試験するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＡＳＣに対するＨＬＡクラスＩ抗原の結合に関する前感作群および新規ＤＳＡ陽性（ＤＳＡ＋）群の異なる親和性を定量化することを目的とした。最初のドナーＤｏｎＡ（ＡＤＭＩＲＥ ＣＤ１試験において投与された）に加え、追加のドナーＤｏｎＢを、それが患者に投与されなかったため、ＤＳＡ特異性に関する対照として機能するように含めた（図３Ａ）。ベースラインおよびＷ１２におけるサンプルを、基本条件下で培養された、またはＩＦＮγで予備刺激されたＡＳＣに対するＨＬＡ－Ｉ結合強度に関して、ＦＣＸＭにより測定した（図３Ａ、上のパネル）。ドナーＡＳＣにおける前感作された患者または新規ＤＳＡ＋患者のいずれかに由来するサンプルにおいて、高い結合能は基本条件下で認められなかった。ＡＳＣをＩＦＮγで予備刺激した場合、前感作された患者は、ＤｏｎＡのみで、０週（Ｗ０）および１２週（Ｗ１２）の両方の来院時に高い同等の結合親和性を有していたことが認められた（図３Ａ、上のパネル）。基本条件およびしたがってＡＳＣドナーの膜における低いＨＬＡ－Ｉ抗原発現は、ＤｏｎＡおよびＤｏｎＢの両方における低い結合親和性と相関していた（図３Ａ、下のパネル）。注目すべきことに、新規ＤＳＡ＋サンプルにおけるＷ１２とベースラインとの間のＤｏｎＡに由来する患者のサンプルの比較において、結合親和性の有意な増大が認められた（図３Ａ、下のパネル）。上記のデータは、基本ＡＳＣにおけるＨＬＡの濃度は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＤＳＡの有意な結合を示すのに十分ではないことを示唆している。さらに、大部分の患者におけるＤＳＡの濃度は、非活性化ＡＳＣまたは活性化ＡＳＣの両方において、有意な結合強度を示すのに十分であるとは思えない。これらの結果は、ドナーと免疫特異性も共有する高いＤＳＡレベルを有する患者のみが、有意なＨＬＡ－クラスＩ結合をもたらした、臓器移植試験の実質臓器移植フローサイトメトリークロスマッチング観察所見と一致している。
【0143】
次に、既存のＨＬＡ－Ｉ抗体および同種異系投与後に産生されたＤＳＡが、補体を固定し、したがって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＣＤＣを惹起することができたかどうかを理解することを目的とした。フローサイトメトリー分析（ＦＣｔｏｘ）によるＣＤＣアッセイを最適化し、７－ＡＡＤの取り込みを細胞死の読み出し情報として確立した。ＤｏｎＡおよびＤｏｎＢ ＡＳＣを含有する前感作された患者および新規ＤＳＡ＋患者（ベースライン～Ｗ１２）由来の血漿サンプルを、基本条件下またはＩＦＮγ刺激前のいずれかで、ウサギＣ３補体の存在下でインキュベートした。前感作された患者のコホートにおいて、Ｗ１２サンプルは、基本条件およびＩＦＮγ条件の両方において、ＤｏｎＢにおける中程度の細胞傷害死（０～５％ ７－ＡＤＤ＋細胞）を誘導した。ＤｏｎＡ ＡＳＣにおいて認められるように、同じサンプルのインキュベーションは、基本（２例の患者）条件およびＩＦＮγ（３例の患者）条件においてより高い細胞傷害死を誘導した（図３Ｂ）。新規ＤＳＡ＋Ｗ１２サンプルは、基本条件下で補体を固定し、細胞傷害死を誘導することもできた。予想されたように、ＩＦＮγで刺激した場合、より高いパーセンテージの細胞死がＤｏｎＡ ＡＳＣにおいてのみ得られた（図３Ｂ）。これらのデータは、既存のＨＬＡ－クラスＩ ＡｂおよびＤＳＡは、ＡＳＣに結合し、ＤｏｎＡ ＡＳＣにおいて特異的に中程度のＣＤＣを誘導することができることを示唆している。興味深いことに、前感作コホートまたは新規ＤＳＡ＋コホートのいずれにおいても、ＤｏｎＢは、有意な細胞傷害性のパーセンテージを誘導しなかったが、ベースラインと比較してＷ１２において細胞死が増加する傾向が認められた。このことに対する１つの考えられる説明は、この試験において使用された２例のドナー間で共有されたＨＬＡ多型アレルの存在であり得る。ＨＬＡタイピングを行い、ＤｏｎＢがＤｏｎＡと共通のアレルを共有することが見出された。
【0144】
ＤｏｎＡおよびＤｏｎＢ由来のＤＮＡを精製し、ＨＬＡアレルキャラクタリゼーションのためにＬＡＢＴｙｐｅ（登録商標）ＳＳＯアッセイにより試験した。太字で、ＤｏｎＡおよびＤｏｎＢにより共有されるＨＬＡ－Ａアレルを示す（表１参照）。
【0145】
【表1】
【0146】
この共有されたＨＬＡアレルは、ＤｏｎＢにおけるＷ１２サンプルにおける細胞傷害性レベルが増大する傾向の原因である可能性がある。
【0147】
ＡＳＣにおけるｍＣＲＰの高発現
ＤＳＡにより影響されるＡＳＣの中等度の死滅を理解するために、ＡＳＣが細胞傷害死に対処する、かつ／またはそれを回避することを可能にし得る補体阻害戦略を同定することを目的とした。補体シグナル伝達阻害に関する１つの古典的機序は、ｍＣＲＰ ＣＤ４６、ＣＤ５５およびＣＤ５９の誘導である(Gancz and Fishelson, 2009;Ricklin et al., 2010;Tegla et al., 2011)。ＭＳＣは低レベルのＣＤ４６およびＣＤ５５、ならびに高レベルのＣＤ５９を発現することを示している著者らがいる一方で、ＭＳＣは中レベルの全ｍＣＲＰを発現することを示唆している著者らもいる。この論争に立ち向かうために、ＣＤ４６、ＣＤ５５およびＣＤ５９の発現レベルを、ＩＦＮγで刺激したＡＳＣまたは刺激しなかったＡＳＣのパネルにおいて分析し、市販のＢＭ－ＭＳＣと発現レベルを比較した（図４Ａ）。ＣＤ４６、ＣＤ５５およびＣＤ５９の基礎レベルは、ＢＭ－ＭＳＣと比較してＡＳＣにおいて高かったことが認められた。この生理学的に意義のあるシナリオを反復するために、ｍＣＲＰレベルを、ＡＳＣ免疫調節応答の重要なメディエーターであるＩＦＮγの存在下（炎症促進環境）で試験した。ＢＭ－ＭＳＣにおけるｍＣＲＰの有意な調節は認められなかったが、ＡＳＣは、ＩＦＮγ刺激後に強力にｍＣＲＰを誘導するように思われた。ＣＤ４６誘導は、ＡＳＣにおいて特に顕著であり、ＢＭ－ＭＳＣと比較しておよそ２．１４倍であった。上記の結果は、ＡＳＣは基本条件下でｍＣＲＰを強力に発現し、発現はＩＦＮγの存在下でさらに増強されることを示唆するものである。このことは、ＣＤＣの負の調節におけるｍＣＲＰの重要な役割を示唆するものであり、ＤＳＡ誘導細胞傷害性に対処するためのＡＳＣにおける細胞保護機序をほのめかすものであろう。このことは、ＤＳＡにより課せられる中等度の死滅レベルを説明できる可能性がある。
ＤＳＡにより影響されるＡＳＣの中等度の死滅を理解するために、ＡＳＣが細胞傷害死に対処する、かつ／またはそれを回避することを可能にし得る補体阻害戦略を同定することを目的とした。補体シグナル伝達阻害に関する１つの古典的機序は、ｍＣＲＰ ＣＤ４６、ＣＤ５５およびＣＤ５９の誘導である(Gancz and Fishelson, 2009;Ricklin et al., 2010;Tegla et al., 2011)。ＭＳＣは低レベルのＣＤ４６およびＣＤ５５、ならびに高レベルのＣＤ５９を発現することを示している著者らがいる一方で、ＭＳＣは中レベルの全ｍＣＲＰを発現することを示唆している著者らもいる。この論争に立ち向かうために、ＣＤ４６、ＣＤ５５およびＣＤ５９の発現レベルを、ＩＦＮγで刺激したＡＳＣまたは刺激しなかったＡＳＣのパネルにおいて分析し、市販のＢＭ－ＭＳＣと発現レベルを比較した（図４Ａ）。ＣＤ４６、ＣＤ５５およびＣＤ５９の基礎レベルは、ＢＭ－ＭＳＣと比較してＡＳＣにおいて高かったことが認められた。この生理学的に意義のあるシナリオを反復するために、ｍＣＲＰレベルを、ＡＳＣ免疫調節応答の重要なメディエーターであるＩＦＮγの存在下（炎症促進環境）で試験した。ＢＭ－ＭＳＣにおけるｍＣＲＰの有意な調節は認められなかったが、ＡＳＣは、ＩＦＮγ刺激後に強力にｍＣＲＰを誘導するように思われた。ＣＤ４６誘導は、ＡＳＣにおいて特に顕著であり、ＢＭ－ＭＳＣと比較しておよそ２．１４倍であった。上記の結果は、ＡＳＣは基本条件下でｍＣＲＰを強力に発現し、発現はＩＦＮγの存在下でさらに増強されることを示唆するものである。このことは、ＣＤＣの負の調節におけるｍＣＲＰの重要な役割を示唆するものであり、ＤＳＡ誘導細胞傷害性に対処するためのＡＳＣにおける細胞保護機序をほのめかすものであろう。このことは、ＤＳＡにより課せられる中等度の死滅レベルを説明できる可能性がある。
【0148】
異なるＡＳＣドナーにおけるｍＣＲＰの発現パターンは同等であったが、一部のドナーは、特定のｍＣＲＰの特異的発現を示した（図４Ｂ）。具体的には、ＤｏｎＣは、他のドナーと比較して高いＣＤ４６およびＣＤ５５レベルを示し、ＤｏｎＥおよびＤｏｎＦは、ＣＤ５５を優先的に過剰発現した。ｍＣＲＰの差次的発現がＣＤＣに対する感受性差に影響を及ぼし得るかどうかをさらに検討した。この答えを出すために、ＨＬＡ－Ｉ抗原発現の動態およびこのパネルのＡＳＣドナー間のその結合親和性を検討した。これを試験するために、ＡＳＣドナーを増加した濃度のｒＨＬＡ－クラスＩ Ｗ６／３２に供した。次に、それらの結合親和性をＦＡＣＳにより測定した（図４Ｃ）。基本条件下でのドナー間の異なる結合親和性（すなわち、１０ｎｇ／ｍＬ Ｗ６／３２でＤｏｎＣをＤｏｎＧと比較した場合、１２倍の差）が認められた。ＩＦＮγ刺激後、Ｗ６／３２結合の増大により示されるように、ＨＬＡ－Ｉ抗原がＡＳＣドナーにおいて誘導された（図４Ｃ）。また、ドナー間の異なる結合親和性（ＤｏｎＢをＤｏｎＧと比較した場合、１０ｎｇ／ｍＬで６．２５倍の差）が認められた。並行して、ＣＤＣアッセイに対する異なるＡＳＣドナーの感受性を試験した。基本条件下で、ＤｏｎＥは最高Ｗ６／３２濃度において約２５％の細胞死を示し、残りのドナーにおいては、これはおよそ１５％であったが、ＤｏｎＤおよびＤｏｎＧは例外で、より低いパーセンテージを示した（図４Ｃ）。予測されたように、ＩＦＮγ刺激後、ＣＤＣ感受性レベルは全ＡＳＣドナーにおいて劇的に増加したが、ＣＤＣ媒介細胞死に対して比較的抵抗性のままであったＤｏｎＢおよびＤｏｎＣにおいてはより少ない程度で増加した（図４Ｃ）。
【0149】
次に、高いＷ６／３２結合親和性がＣＤＣ感受性の亢進と相関したかどうかを決定することを目的とした。この相関分析を行うために、Ｗ６／３２濃度を１０ｎｇ／ｍＬに設定したが、その理由は、この値は、（指数関数後およびプラトー前の）曲線の移行相を誘発するＡｂ量であったからである。基本条件またはＩＦＮγ刺激シナリオのいずれにおいても有意な相関は認められなかった（図６Ａ）。注目すべきことに、本発明者らは、比較的低いＷ６／３２ Ａｂ ＭＦＩレベル（低結合）を発現しているにもかかわらず、ＣＤＣに対する高い感受性を示したＡＳＣドナーの群を同定した。このことは、Ｗ６／３２ Ａｂ結合とＣＤＣに対する感受性との間には絶対的な相関はないことを示唆するものである。３つのｍＣＲＰのうちどれがＡＳＣのＣＤＣ阻害に対する寄与因子であるかを決定するために、本発明者らは、１０ｎｇ／ｍＬのＷ６／３２で達成された細胞死レベルを、基本条件およびＩＦＮγ条件の両方におけるＭＦＩ発現レベルと相関させた（図６Ｂ）。試験したｍＣＲＰ分子のいずれでも、基本条件下で正の相関は認められなかった。しかしながら、ＩＦＮγ刺激後、より低いＣＤ４６およびＣＤ５５レベルが、より高い細胞死レベルと有意に相関していたことが認められた。最後に、ＣＤ４６の傾きの有意性は、ＣＤ５５と比較してわずかに高かった。
【0150】
ＣＤ４６枯渇はｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＡＳＣのＣＤＣ感受性を増加させる
ＣＤ５５またはＣＤ５９と比較したＩＦＮγ刺激後のＣＤ４６の頑強な誘導、およびＣＤ５５と比較したＣＤ４６のドナー間変動の減少とともに細胞傷害性相関の高い有意性により促され、本発明者らは、ＣＤ４６およびＡＳＣにおけるＣＤＣ感受性におけるその潜在的影響の徹底的な分析を行った。公開ゲノムブラウザを使用して、ＣＤ４６をノックダウンするためのトップｇＲＮＡ配列(ncbi.nlm.nih.gov/gene and crispr.mit.edu)を同定した。最適なガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）配列を、２つのパラメーター：高特異性および低いオフターゲットスコアに基づいて選択した。エクソン３を標的とする２つの最適なｃｒＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ１およびｃｒＲＮＡ２）を、有効性スクリーニングのために選択した。ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ－ＡＴＴＯ５５０：Ｃａｓ９複合体の送達を、顕微鏡下で調べた。リポトランスフェクションの２４時間後、大多数のＡＳＣが、高いＣａｓ９媒介二本鎖切断事象と相関していたリボ核タンパク質複合体を取り込んでいたことが認められた（図６Ｃ）。ＣＲＩＳＰＲ媒介ノックダウンの有効性を確認するために、ＡＳＣをＩＦＮγの存在下または非存在下で培養し、ＦＡＣＳによりＣＤ４６発現を分析した。ｃｒＲＮＡ１の有効性は、通常条件下およびＩＦＮγ条件下の両方でｃｒＲＮＡ２と同等であり、このため、本発明者らは、ＡＳＣｓ－ＣＤ４６ＫＯクローンの産生のためにｃｒＲＮＡ１を選択した（図６Ｄ）。
ＣＤ５５またはＣＤ５９と比較したＩＦＮγ刺激後のＣＤ４６の頑強な誘導、およびＣＤ５５と比較したＣＤ４６のドナー間変動の減少とともに細胞傷害性相関の高い有意性により促され、本発明者らは、ＣＤ４６およびＡＳＣにおけるＣＤＣ感受性におけるその潜在的影響の徹底的な分析を行った。公開ゲノムブラウザを使用して、ＣＤ４６をノックダウンするためのトップｇＲＮＡ配列(ncbi.nlm.nih.gov/gene and crispr.mit.edu)を同定した。最適なガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）配列を、２つのパラメーター：高特異性および低いオフターゲットスコアに基づいて選択した。エクソン３を標的とする２つの最適なｃｒＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ１およびｃｒＲＮＡ２）を、有効性スクリーニングのために選択した。ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ－ＡＴＴＯ５５０：Ｃａｓ９複合体の送達を、顕微鏡下で調べた。リポトランスフェクションの２４時間後、大多数のＡＳＣが、高いＣａｓ９媒介二本鎖切断事象と相関していたリボ核タンパク質複合体を取り込んでいたことが認められた（図６Ｃ）。ＣＲＩＳＰＲ媒介ノックダウンの有効性を確認するために、ＡＳＣをＩＦＮγの存在下または非存在下で培養し、ＦＡＣＳによりＣＤ４６発現を分析した。ｃｒＲＮＡ１の有効性は、通常条件下およびＩＦＮγ条件下の両方でｃｒＲＮＡ２と同等であり、このため、本発明者らは、ＡＳＣｓ－ＣＤ４６ＫＯクローンの産生のためにｃｒＲＮＡ１を選択した（図６Ｄ）。
【0151】
ノックダウン特異性を確認した後、低いＣＤＣ感受性を有する１例のドナーを選択し、ＣＤ４６の選択的枯渇がそれを細胞傷害死に対して感作させ得るかどうかを試験した。ＤｏｎＢを選択し、基本条件およびＩＦＮγ条件におけるＷ６／３２媒介細胞傷害性アッセイ（図５Ａ）を行った。ＣＤ４６ノックダウンは、基本条件下で細胞傷害死の中程度の増大を誘導し（図５Ａ、左のグラフ）、これはおそらく、低いＨＬＡ－Ｉ結合およびその後の補体結合に起因するものであった。ＩＦＮγ刺激後、親ＡＳＣにおける細胞傷害死のパーセンテージの有意な増加が認められ、これは、ＣＤ４６ＫＯ ＡＳＣにおいてさらに増強された（図５Ａ、右のグラフ）。１０ｎｇ／ｍＬ Ｗ６／３２の生理学的用量において、親ＡＳＣにおいて約５０％の７－ＡＡＤ陽性細胞が認められ、ＣＤ４６ノックダウンは、最大約９５％まで死滅のパーセンテージを増加させ、ＣＤ４６は、少なくともＤｏｎＢにおいて、細胞傷害死の予防における重要な機能を果たすことが示唆された。
【0152】
ＣＤ４６細胞傷害性阻害機能が他のＡＳＣドナーにおいて有効であるかどうかを試験するため、細胞傷害性分析を７例のドナーのパネルにおいて行い、基本条件（図５Ｂ、左のグラフ）からＡＳＣ ＩＦＮγ刺激前（図５Ｂ、右のグラフ）の平均曲線をプロットした。両方の試験条件下で、ＣＤ４６ＫＯ ＡＳＣドナーは、親対照と比較してＣＤＣに対する感受性の亢進を示した。半数効果濃度（ＥＣ５０）曲線の左側へのシフトは、Ｗ６／３２ Ａｂの濃度の減少がＣＤＣを誘導するために必要であることを意味し、これは、ＣＤＣに対する感受性の亢進と相関している。次に、曲線のシフトを定量化するために、本発明者らは、Ｗ６／３２ ＡｂのＥＣ５０を計算した（図５Ｃ）。
【0153】
以下の表２は、基本条件およびＩＦＮγ条件における７例の親ＡＳＣおよび対応するＣＤ４６ＫＯ ＡＳＣのＷ６／３２ Ａｂ（ｎｇ／ｍＬ）の半数効果濃度を示す。列４および７において、倍率変化の差（ＣＤ４６ＫＯ ＥＣ５０／親ＥＣ５０）を計算した。
【0154】
【表2】
【0155】
基本条件下で、ＣＤ４６ＫＯドナーは、親ドナーと比較して減少したＥＣ５０を示し、Ｗ６／３２に対するより高い感受性が示唆された（図５Ｃ、４番目の列）。ＩＦＮγ条件下で同様の効果が認められ（図５Ｃ、７番目の列）、ＣＤ４６発現はｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＡＳＣに対してＣＤＣ抵抗性を与えることが確認された。このデータは、ＣＤ４６はＣＤＣを媒介し、ＡＳＣにおけるその枯渇は、ＣＤＣ感受性の亢進と相関することを確認するものである。
【図1A-1】
【図1A-2】
【図1B】
【図1C】
【図2A】
【図2B】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【国際調査報告】