(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-04-19
(54)【発明の名称】間葉系幹細胞の血管新生能を改善する方法
(51)【国際特許分類】
A61K 35/28 20150101AFI20220412BHJP
A61K 9/19 20060101ALI20220412BHJP
A61P 9/02 20060101ALI20220412BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20220412BHJP
C12N 5/0775 20100101ALI20220412BHJP
【ＦＩ】
A61K35/28
A61K9/19
A61P9/02
A61P9/00
C12N5/0775
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021550684
(86)(22)【出願日】2020-02-21
(85)【翻訳文提出日】2021-10-22
(86)【国際出願番号】 AU2020050151
(87)【国際公開番号】W WO2020172700
(87)【国際公開日】2020-09-03
(31)【優先権主張番号】2019900659
(32)【優先日】2019-02-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】AU
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＰＬＵＲＯＮＩＣ
(71)【出願人】
【識別番号】521381783
【氏名又は名称】サイナータ セラピューティクス リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100080791
【弁理士】
【氏名又は名称】高島 一
(74)【代理人】
【識別番号】100136629
【弁理士】
【氏名又は名称】鎌田 光宜
(74)【代理人】
【識別番号】100125070
【弁理士】
【氏名又は名称】土井 京子
(74)【代理人】
【識別番号】100121212
【弁理士】
【氏名又は名称】田村 弥栄子
(74)【代理人】
【識別番号】100174296
【弁理士】
【氏名又は名称】當麻 博文
(74)【代理人】
【識別番号】100137729
【弁理士】
【氏名又は名称】赤井 厚子
(74)【代理人】
【識別番号】100151301
【弁理士】
【氏名又は名称】戸崎 富哉
(72)【発明者】
【氏名】キリアン、クリストファー
(72)【発明者】
【氏名】ロマナッゾ、サラ
【テーマコード（参考）】
4B065
4C076
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AC20
4B065BC41
4B065CA44
4C076AA12
4C076AA29
4C076CC11
4C076FF36
4C076FF63
4C076GG06
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB64
4C087CA04
4C087MA17
4C087MA44
4C087MA66
4C087NA05
4C087NA14
4C087ZA36
(57)【要約】
本発明は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の血管新生能を改善する方法であって、約１ｋＰａ～１００ｋＰａの硬度を有し、マトリクスタンパク質でコーティングされた基質上で該ＭＳＣを培養することを含み、該ＭＳＣが、約１ｋＰａ～１００ｋＰａの硬度を有し、マトリクスタンパク質でコーティングされていない基質上で培養しなかったことを除いて同一の条件下で培養したＭＳＣと比較して、改善された血管新生能を有する方法に関する。また、本発明は、該方法によって改善されたときに血管新生能を有するＭＳＣ、及び冠動脈疾患（ＣＡＤ）又は末梢動脈疾患（ＰＡＤ）を有する対象におけるＣＡＤ又はＰＡＤを治療するための改善されたＭＳＣの治療的使用に関する。
【選択図】図５
【選択図】図５
【特許請求の範囲】
【請求項1】
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の血管新生能を改善する方法であって、約１ｋＰａ～１００ｋＰａの硬度を有し、マトリクスタンパク質でコーティングされた基質上で前記ＭＳＣを培養することを含み、前記ＭＳＣが、約１ｋＰａ～１００ｋＰａの硬度を有し、マトリクスタンパク質でコーティングされていない基質上で培養しなかったことを除いて同一の条件下で培養したＭＳＣと比較して、改善された血管新生能を有する方法。
【請求項2】
前記硬度が、約１ｋＰａ、約１０ｋＰａ、又は約４０ｋＰａである、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記マトリクスタンパク質が、コラーゲン、フィブロネクチン、又はラミニンである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
前記基質が、約１０ｋＰａの硬度を有し、フィブロネクチンでコーティングされている、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記基質が、約１ｋＰａ又は約１０ｋＰａの硬度を有し、フィブロネクチン及びコラーゲンでコーティングされている、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記基質が、約２５μｇ／ｍＬのマトリクスタンパク質でコーティングされている、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記基質が、ポリアクリルアミドを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記ＭＳＣが、国際公開第２０１７／１５６５８０号に従って生成される、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記基質上で前記ＭＳＣを培養した後、前記ＭＳＣを凍結保存することを更に含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
凍結保存されたＭＳＣを解凍することを更に含み、改善された血管新生能が、凍結保存及び解凍後も持続する、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記改善された血管新生能が、管形成アッセイを用いて測定される、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法によって改善されたときに血管新生能を有する間葉系幹細胞（ＭＳＣ）。
【請求項13】
約１ｋＰａ～１００ｋＰａの硬度を有し、マトリクスタンパク質でコーティングされた基質上で間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を培養することを含む方法によって調製されたときの前記ＭＳＣを含む組成物であって、前記ＭＳＣが、約１ｋＰａ～１００ｋＰａの硬度を有し、マトリクスタンパク質でコーティングされていない基質上で培養しなかったことを除いて同一の条件下で培養したＭＳＣと比較して、改善された血管新生能を有する組成物。
【請求項14】
薬学的に許容し得る担体、希釈剤、及び／又は賦形剤を含む医薬組成物である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項15】
請求項１２に記載のＭＳＣ、又は請求項１３若しくは１４に記載の組成物を含む容器。
【請求項16】
請求項１２に記載のＭＳＣ、請求項１３若しくは１４に記載の組成物、又は請求項１５に記載の容器を含むキット。
【請求項17】
冠動脈疾患（ＣＡＤ）又は末梢動脈疾患（ＰＡＤ）を治療する方法であって、ＣＡＤ又はＰＡＤを有する対象に、請求項１２に記載のＭＳＣ又は請求項１３若しくは１４に記載の組成物を投与することを含む方法。
【請求項18】
冠動脈疾患（ＣＡＤ）又は末梢動脈疾患（ＰＡＤ）を有する対象におけるＣＡＤ又はＰＡＤを治療するための医薬の製造における、請求項１２に記載のＭＳＣ又は請求項１３若しくは請求項１４に記載の組成物の使用。
【請求項19】
冠動脈疾患（ＣＡＤ）又は末梢動脈疾患（ＰＡＤ）を有する対象におけるＣＡＤ又はＰＡＤを治療する方法において使用するための、請求項１２に記載のＭＳＣ又は請求項１３若しくは請求項１４に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の栄養性及び免疫調節性の分泌の性質を通して、冠動脈疾患（ＣＡＤ）及び末梢動脈疾患（ＰＡＤ）を治療するためのＭＳＣの使用に関する。また、本発明は、基質コーティングがＭＳＣからの血管新生促進性分泌を誘導する細胞工学の方法の開発に関する。
【背景技術】
【0002】
冠動脈疾患（ＣＡＤ）及び末梢動脈疾患（ＰＡＤ）は、最も一般的な種類の心臓疾患であり、大部分の心臓発作の原因となる。例えば、ＣＡＤはオーストラリアにおける死因の第１位であり、２７分に１人のオーストラリア人が亡くなっている。
【0003】
傷害部位にサイトカインを直接送達する等の既存の血管新生療法は、望ましくない副作用に悩まされることが多い。更に、重度の不可能なＣＡＤ患者には、心臓移植という唯一の選択肢しか残されていないが、これは、適切なドナーが不足していることによって制限されている。
【0004】
可能性のある代替治療として幹細胞ベースの療法が浮上したが、これら細胞が宿主に取り込まれる能力に関する制約がある。微小血管の密度の増大（血管新生）、その後、大血管のリモデリング（動脈新生）を刺激することによるＣＡＤの治療について、標的遺伝子及び細胞ベースの療法が研究されている。
【0005】
しかし、心血管損傷後の機能を改善するためにＭＳＣを用いる臨床試験は、細胞死が多く、微小環境に対する細胞応答が不均一であったことから、それほど成功していない。ＭＳＣには再生医療において大きな期待が寄せられているが、組織培養ポリスチレン上で長期培養（増幅）すると分泌活性が妨げられるため、臨床試験ではかなりのばらつきがあった。
【0006】
従って、ＭＳＣの生存率及びＭＳＣの均一性を改善する必要がある。
【0007】
本明細書において何らかの先行技術の刊行物を参照する場合、このような参照は、その刊行物がオーストラリア又は任意の他の国における当技術分野の技術常識の一部を形成することを認めるものではないことを理解されたい。
【発明の概要】
【0008】
本開示は、タンパク質のコンジュゲートしているヒドロゲルマトリクスを細胞培養基質として使用して、血管新生促進性になるようにＭＳＣからのＭＳＣ分泌プロファイルを正常化すること（「プライミング」）に関する。その際、本開示は、ＣＡＤ及びＰＡＤの治療についてのＭＳＣの治療有効性を改善する、改善された細胞培養マトリクスに関する。
【0009】
本開示では、内皮細胞の管形成を含むモデルアッセイによって判定したときの、ＭＳＣからの血管新生促進性因子の分泌を最大化するマトリクス条件を同定する。驚くべきことに、開示されるマトリクス上で培養したＭＳＣは、液体窒素下で凍結保存することができ、解凍後もプライミングされた血管新生促進性表現型を維持することができる。
【0010】
基質の特性のみを通して所望の細胞活性を誘導することは、低酸素又は成長因子処理を用いる方法に比べて、製造が単純であること及び細胞資源の改変が最小限で済むことを含む多くの利点を有する。
【0011】
本開示に従って生成されたＭＳＣは、血管新生促進性セクレトームを有し、ＣＡＤ及びＰＡＤの治療において有用である。
【0012】
第１の態様は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の血管新生能を改善する方法であって、約１ｋＰａ～１００ｋＰａの硬度を有し、マトリクスタンパク質でコーティングされた基質上で該ＭＳＣを培養することを含み、該ＭＳＣが、約１ｋＰａ～１００ｋＰａの硬度を有し、マトリクスタンパク質でコーティングされていない基質上で培養しなかったことを除いて同一の条件下で培養したＭＳＣと比較して、改善された血管新生能を有する方法を提供する。
【0013】
また、改善された血管新生能を有する間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を調製する方法であって、約１ｋＰａ～１００ｋＰａの硬度を有し、マトリクスタンパク質でコーティングされた基質上で該ＭＳＣを培養することを含み、該ＭＳＣが、約１ｋＰａ～１００ｋＰａの硬度を有し、マトリクスタンパク質でコーティングされていない基質上で培養しなかったことを除いて同一の条件下で培養したＭＳＣと比較して、改善された血管新生能を有する方法も開示される。
【0014】
方法は、インビトロであってよい。
【0015】
一実施形態では、硬度は、約１ｋＰａ、約１０ｋＰａ、又は約４０ｋＰａである。
【0016】
一実施形態では、マトリクスタンパク質は、コラーゲン、フィブロネクチン、又はラミニンである。
【0017】
一実施形態では、基質は約１０ｋＰａの硬度を有し、フィブロネクチンでコーティングされている。
【0018】
一実施形態では、基質は、約１ｋＰａ又は約１０ｋＰａの硬度を有し、フィブロネクチン及びコラーゲンでコーティングされている。
【0019】
一実施形態では、基質は、約２５μｇ／ｍＬのマトリクスタンパク質でコーティングされている。
【0020】
一実施態様では、基質は、ポリアクリルアミドを含む。
【0021】
一実施形態では、ＭＳＣは、国際公開第２０１７／１５６５８０号に従って生成される。
【0022】
一実施形態では、方法は、基質上でＭＳＣを培養した後、ＭＳＣを凍結保存することを更に含む。
【0023】
一実施形態では、方法は、凍結保存されたＭＳＣを解凍することを更に含み、改善された血管新生能は、凍結保存及び解凍後も持続する。
【0024】
一実施形態では、改善された血管新生能は、管形成アッセイを用いて測定される。
【0025】
第２の態様は、第１の態様の方法によって改善されたときに血管新生能を有する間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を提供する。
【0026】
第３の態様は、約１ｋＰａ～１００ｋＰａの硬度を有し、マトリクスタンパク質でコーティングされた基質上で間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を培養することを含む方法によって調製されたときの該ＭＳＣを含む組成物であって、該ＭＳＣが、約１ｋＰａ～１００ｋＰａの硬度を有し、マトリクスタンパク質でコーティングされていない基質上で培養しなかったことを除いて同一の条件下で培養したＭＳＣと比較して、改善された血管新生能を有する組成物を提供する。
【0027】
一実施形態では、第３の態様の組成物は、薬学的に許容し得る担体、希釈剤、及び／又は賦形剤を含む医薬組成物である。
【0028】
第４の態様は、第２の態様のＭＳＣ又は第３の態様の組成物を含む容器を提供する。
【0029】
第５の態様は、第２の態様のＭＳＣ又は第３の態様の組成物又は第４の態様の容器を含むキットを提供する。
【0030】
第６の態様は、冠動脈疾患（ＣＡＤ）又は末梢動脈疾患（ＰＡＤ）を治療する方法であって、ＣＡＤ又はＰＡＤを有する対象に第２の態様のＭＳＣを投与することを含む方法を提供する。
【0031】
更に又はあるいは、第６の態様は、冠動脈疾患（ＣＡＤ）又は末梢動脈疾患（ＰＡＤ）を有する対象におけるＣＡＤ又はＰＡＤを治療するための医薬の製造における、第２の態様のＭＳＣの使用を提供する。
【0032】
更に又はあるいは、第６の態様は、冠動脈疾患（ＣＡＤ）又は末梢動脈疾患（ＰＡＤ）を有する対象におけるＣＡＤ又はＰＡＤを治療する方法において使用するための、第２の態様のＭＳＣを提供する。
【図面の簡単な説明】
【0033】
【図1】幹細胞の血管新生促進におけるマトリクスの生物学的及び物理的な組成の影響を調べる実験計画の概略図である。
【図2】凍結保存後のプライミングされたＭＳＣにおける血管新生促進効果の持続性を試験する実験計画の概略図である。
【図3】管形成アッセイ分析の概略図である。マスターセグメントは、黄色で示されており、マスタージャンクションと呼ばれる、１本の分枝にのみ関与するもののない２つのジャンクションによって範囲が定められた木の片で構成される。マスタージャンクションは、少なくとも３つのマスターセグメントを連結させるジャンクションである。任意で、２つの近接したマスタージャンクションが融合して、単一のマスタージャンクションになる場合もある。マスタージャンクションは、赤で示されている。メッシュは、セグメント又はマスターセグメントで囲まれた領域である。メッシュは、青で示されている。
【図4】マトリクスの生物学的及び物理的な組成がＭＳＣの形態に影響を与えることを示す顕微鏡写真である。異なるコーティングを施したポリアクリルアミドゲル上で培養したＭＳＣは、基質の硬度（左１ｋＰａ、中１０ｋＰａ、及び右４０ｋＰａ）及び各基質にコンジュゲートしているＥＣＭタンパク質（上、コラーゲン；中、フィブロネクチン；下、ラミニン）に応じて異なる細胞の形状及びアクチンフィラメントの構築（赤）を示した。核をＤＡＰＩ（４－６－ジアミジノ－２－フェニルインドール）で対比染色した。
【図5】様々な硬度のヒドロゲル及びマトリクスタンパク質組成にわたって培養したＭＳＣからの馴化培地でＨＭＶＥＣを処理した、管形成を測定する管形成アッセイの結果を示す棒グラフである。Ａ マスターセグメントの全長；Ｂ 分枝の全長；Ｃ 全長；Ｄ セグメントの全長。
【図6】（Ａ）ポリアクリルアミドゲルの作製及びコンジュゲーション（Ｂ） 様々な硬度のヒドロゲル及びリガンド組成にわたって培養したＭＳＣからの馴化培地で処理した後のヒト微小血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ）の平均管面積。（Ｃ）陽性対照及び陰性対照下のＨＭＶＥＣの画像。（Ｃ）（上）それぞれフィブロネクチン０．５、１０、及び４０ｋＰａの条件の培地下で培養したＨＭＶＥＣ、（下）基質の硬度は、ＭＳＣ細胞伸展特性を変化させ、その分泌プロファイルに影響を与える。＊は、ｐ＜０．０５を示す。
【図7】フィブロネクチンとＩ型コラーゲンとの組み合わせ（左）、１ｋＰａコラーゲン（中央）、及び１０ｋＰａフィブロネクチン（右）による標準組織培養プレート（ＴＣＰＳ）コーティングからの培地によるＨＭＶＥＣ培養物の位相差顕微鏡写真、並びに３つの条件を定量した棒グラフである。＊ｐ＜０．０５。
【図8】凍結乾燥の前（左）及び後（右）の様々な硬度のヒドロゲル及びマトリクスタンパク質組成にわたって培養したＭＳＣからの馴化培地で処理したＨＭＶＥＣにおけるマスターセグメントの全長を測定する管形成アッセイの結果を示す棒グラフである。プライミングされたＭＳＣは、凍結保存後も管形成を誘導する能力を維持していた。左、＊ｐ＜０．０５。右、一元配置分散分析によってｐ＜０．０５。
【図9】２つのマトリクスタンパク質でコーティングされたヒドロゲル上でＭＳＣを培養した後の管腔形成アッセイの概略図、管腔形成アッセイの定量、及び管腔形成を示す各条件の位相差顕微鏡写真を提供する。ＭＳＣ培養の前に、ヒドロゲルをフィブロネクチン１２．５μｇ／ｍＬとコラーゲン１２．５μｇ／ｍＬとの組み合わせでコーティングした。２つのマトリクスタンパク質の組み合わせによって、凍結保存後のＭＳＣの血管新生能が増大した。
【発明を実施するための形態】
【0034】
「冠動脈疾患」又は「ＣＡＤ」は、冠動脈が狭くなり、心臓への血流、ひいては酸素供給が減少することを指す。ＣＡＤは、「冠状動脈心疾患」又は「ＣＨＤ」と呼ばれることもある。
【0035】
「末梢動脈疾患」又は「ＰＡＤ」とは、手足に血液、ひいては酸素を供給する動脈が狭くなることを指す。
【0036】
「動脈硬化」は、ＣＡＤとＰＡＤの両方を包含するので、本開示は、動脈硬化の治療にも関連する。
【0037】
本明細書で使用するとき、「間葉系幹細胞」又は「ＭＳＣ」とは、骨髄、脂肪組織（脂肪）、胎盤、及び臍帯血を含む広範な組織から単離することができる特定の種類の幹細胞を指す。ＭＳＣは、「間葉系間質細胞」としても知られている。
【0038】
ＭＳＣは、サイトカイン、ケモカイン、及び成長因子等の生物活性分子を分泌し、そして、免疫系を調節することができる。ＭＳＣは、生着に依存することなく、再生及び免疫系に対する効果を促進することが示されている。言い換えれば、ＭＳＣ自体が必ずしも宿主に組み込まれる訳ではなく、むしろ、ＭＳＣは、短期間でその効果を発揮し、次いで、排出される。しかし、ＭＳＣが生着してもよい。
【0039】
治療用ＭＳＣは、「自己」であっても「同種」であってもよい。本明細書で使用するとき、「自己」とは、例えば骨髄又は脂肪組織から単離した自身の細胞で患者を治療することを意味し、一方、「同種」とは、ドナー由来の細胞を使用して他のヒトを治療することを意味する。同種ＭＳＣは、人工多能性幹細胞又はｉＰＳＣを介してドナーから得ることができる。あるいは、同種ＭＳＣは、胚幹細胞又はＥＳＣに由来するものであってもよい。その他、同種ＭＳＣは、例えばドナーの骨髄、脂肪組織、臍帯の組織若しくは血液、又は下顎第三大臼歯の発生中の歯芽等の臼歯細胞を含む、他の供給源に由来するものであってもよい。
【0040】
同種ＭＳＣは、他のヒトにおいて免疫反応を引き起こすことが示されていないため、ドナーのレシピエントに対する免疫マッチングを必要としない。これは、重要な商業的利点を有する。
【0041】
本明細書で使用するとき、「多能性幹細胞」又は「ＰＳＣ」とは、それ自体無限に再生し、任意の他の細胞型に分化する能力を有する細胞を指す。主に２種の多能性幹細胞が存在する：胚幹細胞（ＥＳＣ）及び人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）。
【0042】
本明細書で使用するとき、「胚幹細胞」又は「ＥＳＣ」とは、体外受精療法を終了し、余剰胚を有する患者によって同意を得て提供された５～７日齢胚から単離された細胞を指す。ＥＳＣの使用は、ヒト胚由来の細胞の採取についての倫理上の問題がある程度妨げとなっている。
【0043】
好適なヒトＰＳＣは、Ｈ１及びＨ９のヒト胚幹細胞（ｈＥＳＣ）を含む。Ｈ１及びＨ９ ｈＥＳＣは、例えば、ＷｉＣｅｌｌ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ ５３７１９ ＵＳＡ）から入手可能である。
【0044】
本明細書で使用するとき、「人工多能性幹細胞」又は「ｉＰＳＣ」とは、成人細胞に由来するＥＳＣ様細胞を指す。ｉＰＳＣは、ＥＳＣと非常によく似た特徴を有するが、ｉＰＳＣは胚に由来していないので、ＥＳＣに関連する倫理上の問題が回避される。その代わり、ｉＰＳＣは、典型的には、「初期化」されて多能性状態に戻された、完全に分化した成人細胞に由来している。
【0045】
好適なヒトｉＰＳＣとしては、線維芽細胞に由来するｉＰＳＣ １９－９－７Ｔ、ＭＩＲＪＴ６ｉ－ｍＮＤ１－４、及びＭＩＲＪＴ７ｉ－ｍＮＤ２－０が挙げられるが、これらに限定されず、骨髄単核細胞に由来するｉＰＳＣ ＢＭ１１９－９は、例えば、ＷｉＣｅｌｌ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ ５３７１９ ＵＳＡ）から入手可能である。他の好適なｉＰＳＣは、Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）から入手することができる。
【0046】
本開示の一実施形態によれば、ＭＳＣは、間葉血管芽細胞（ＭＣＡ）能を有するＥＭＨｌｉｎ－ＫＤＲ＋ＡＰＬＮＲ＋ＰＤＧＦＲａｌｐｈａ＋原始中胚葉細胞から形成され、国際公開第２０１７／１５６５８０号に従って生成することができる。国際公開第２０１７／１５６５８０号は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【0047】
国際公開第２０１７／１５６５８０号に従って生成され、任意で国際公開第２０１８／０９００８４号に従ってアッセイされたヒトＭＳＣを、本開示に従って血管新生プライミングに供してよい。当業者に公知の他のＭＳＣを、本開示に従って血管新生プライミングに供してもよい。
【0048】
マトリクスタンパク質は、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）タンパク質を含み得る。マトリクスタンパク質は、ラミニン；コラーゲン、例えば、Ｉ型コラーゲン又はＩＶ型コラーゲン；フィブロネクチン；エラスチン；プロテオグリカン、例えば、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、又はケラタン硫酸を含み得る。マトリクスタンパク質は、哺乳類であってもよい。マトリクスタンパク質は、ヒト又は非ヒト哺乳類であってもよい。当業者であれば、これらマトリクスタンパク質及び他のマトリクスタンパク質について承知しているであろう。
【0049】
基質又はヒドロゲルは、２つ以上のマトリクスタンパク質でコーティングされていてもよい。
【0050】
基質又はヒドロゲルは、約１、２、２．５、３、４、５、６、７、７．５、８、９、１０、１１、１２、１２．５、１３、１４、１５、１６、１７、１７．５、１８、１９、２０、２１、２２、２２．５、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、若しくは１００μｇ／ｍＬ、又は１、２、２．５、３、４、５、６、７、７．５、８、９、１０、１１、１２、１２．５、１３、１４、１５、１６、１７、１７．５、１８、１９、２０、２１、２２、２２．５、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、若しくは１００μｇ／ｍＬ±１０％のマトリクスタンパク質でコーティングされていてもよい。一実施形態では、１２．５μｇ／ｍＬのコラーゲンを基質又はヒドロゲルにコーティングする。一実施形態では、１２．５μｇ／ｍＬのフィブロネクチンを基質又はヒドロゲルにコーティングする。
【0051】
培養中のＭＳＣのプライミングには、約１ｋＰａ～１００ｋＰａ又は１ｋＰａ～１００ｋＰａ±１０％に及ぶ硬度を有する基質又はヒドロゲルの製剤を使用してよい。例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９ ２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５若しくは１００ｋＰａ又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９ ２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５若しくは１００ｋＰａ±１０％のヒドロゲル製剤。１ｋＰａ～１００ｋＰａの硬度は、正常及び病的な心臓組織の硬度の範囲に及ぶ。
【0052】
基質又はヒドロゲルは、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸ナトリウム、多数の親水性基を有するアクリレートポリマー及びコポリマー、又はアガロース、メチルセルロース、ヒアルロナン、若しくはエラスチン様ポリペプチド等の天然ヒドロゲルを含み得る。一実施態様では、ヒドロゲルは、ポリアクリルアミドを含む。
【0053】
一実施形態では、基質又はヒドロゲルは、約１ｋＰａ又は１ｋＰａ±１０％の硬度を有し、コラーゲンでコーティングされている。別の実施形態では、ヒドロゲルは、約１０ｋＰａ又は１０ｋＰａ±１０％の硬度を有し、フィブロネクチンでコーティングされている。別の実施形態では、ヒドロゲルは、約１ｋＰａ～１０ｋＰａ、１ｋＰａ、若しくは１０ｋＰａ又は１ｋＰａ～１０ｋＰａ、１ｋＰａ、若しくは１０ｋＰａ±１０％の硬度を有し、フィブロネクチン及びコラーゲンでコーティングされている。
【0054】
ＭＳＣは、マトリクスタンパク質でコーティングされた基質上で、例えば、およそ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、若しくは１４日間又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、若しくは１４日間±１０％培養してよい。一実施形態では、ＭＳＣは、マトリクスタンパク質でコーティングされた基質上で、およそ２日間又は２日間±１０％培養される。
【0055】
「血管新生」とは、既存の静脈、動脈、及び毛細血管の内皮細胞（ＥＣ）から新しい血管が形成されることを指す。
【0056】
従って、「血管新生能」とは、ＭＳＣが血管新生を促進する潜在能又は能力を指すということになる。
【0057】
本明細書で使用するとき、「改善された」血管新生能とは、約１ｋＰａ～１００ｋＰａの硬度を有し、マトリクスタンパク質でコーティングされていない基質上で培養されていないことを除いて同一の条件下で培養したＭＳＣ、例えば、参照又は対照のＭＳＣと比較したときに、血管新生を促進するＭＳＣ、例えば、本開示に従って生成された試験ＭＳＣの潜在能又は能力が増大したことを指し、該試験ＭＳＣ及び該参照ＭＳＣの血管新生能は、血管新生アッセイを使用して客観的に測定される。言い換えれば、本開示のＭＳＣは、その参照又は対照のＭＳＣと比較して改善された血管新生能を有する。用語「参照」及び「対照」は、当業者には理解されるであろう。
【0058】
血管新生アッセイを使用して、血管新生能を評価することができる。血管新生アッセイは、インビトロであってもインビボであってもよい。一般に、インビトロアッセイは、血管新生プロセスにおける特定の段階をモニタリングする。血管新生アッセイでは、増殖（例えば、細胞計数、比色分析、又はＤＮＡ合成を含む）、遊走（例えば、創傷治癒、ヒト皮膚微小血管内皮細胞（ＨＤＭＥＣ）の発芽、マトリクス分解、ボイデン室、細胞運動追跡（phagokinetic track）を含む）；管形成（例えば、ＭＡＴＲＩＧＥＬ、共培養を含む）；胸大動脈リング；網膜モデル；ニワトリ絨毛尿膜；ゼブラフィッシュ；角膜血管新生；異種移植；又はＭＡＴＲＩＧＥＬプラグを評価することができる。血管新生アッセイは市販されている。
【0059】
当業者には理解される通り、本明細書で使用する管形成アッセイは、血管新生を示すインビトロアッセイとして当技術分野で受け入れられている。アッセイにおける管形成は、例えば、およそ１、２、４、８、若しくは１６時間又は１、２、４、８、若しくは１６時間±１０％で定量してよい。
【0060】
例えば、用語「基質」、「マトリクス」、及び「ヒドロゲル」は、本明細書では互換的に使用され、逆のことが明確に意図されていない限り、限定するものであるとみなされるべきではない。
【0061】
例えば、用語「硬度」（又は「硬い」）及び「剛性」（又は「剛い」）は、本明細書では互換的に使用され、限定するものであるとみなされるべきではない。
【0062】
本開示のＭＳＣ又は本開示のＭＳＣを含む組成物は、非経口的な経路（例えば、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、筋肉内、又は経皮）によって投与することができる。一実施形態では、ＭＳＣ又は医薬組成物は、静脈内又は動脈内に投与される。
【0063】
本開示のＭＳＣ又は本開示のＭＳＣを含む医薬組成物は、単独で、又は薬学的に許容し得る担体、希釈剤、及び／若しくは賦形剤と組み合わせて、単回又は複数回投与で対象に投与してよい。
【0064】
本開示の医薬組成物は、当技術分野で周知の方法によって調製することができ（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ ｅｄ．（２００５），Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ）、本明細書に開示されているＭＳＣと、１つ以上の薬学的に許容し得る担体、希釈剤、及び／又は賦形剤とを含む。
【0065】
また、本開示のＭＳＣ又は本開示のＭＳＣを含む医薬組成物を含む容器を含む製品及び／又はキットも提供される。容器は、本開示のＭＳＣ又は任意で単位剤形の本開示のＭＳＣを含む医薬組成物を含む瓶、バイアル、又はシリンジであってよい。例えば、本開示のＭＳＣ又は本開示のＭＳＣを含む医薬組成物は、使い捨ての容器、任意でシリンジで注入可能であってよい。製品及び／又はキットは、本明細書に開示される方法に従って対象の治療を指示する指示書及び／又はラベル等を印刷したものを更に含んでいてもよい。
【0066】
「単位剤形」は、投与及び投与量の均一化を容易にするために作製してよく、治療される対象への単回投与に適した物理的に別個の単位を指し、必要な医薬用賦形剤、担体、及び／又は希釈剤と併せて治療有効量の本開示のＭＳＣ又は本開示のＭＳＣを含む医薬組成物を含む。一実施形態では、単位剤形は密封容器であり、無菌状態である。
【0067】
用語「治療有効量」とは、対象におけるＣＡＤ又はＰＡＤを治療するのに有効な本開示のＭＳＣ又は本開示のＭＳＣを含む医薬組成物の量を指す。
【0068】
用語「治療する」、「治療している」、又は「治療」とは、治療的処理と予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）又は防止的（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）手段とをいずれも指し、その目的は、対象におけるＣＡＤ若しくはＰＡＤを予防、低減、若しくは回復するか、又は対象におけるＣＡＤ若しくはＰＡＤの進行を減速（緩和）することである。治療を必要とする対象としては、ＣＡＤ又はＰＡＤを既に有しているものに加えて、ＣＡＤ又はＰＡＤを予防又は回復すべきものが挙げられる。
【0069】
用語「予防している」、「予防」、「防止的」、又は「予防的」とは、ＣＡＤ又はＰＡＤの発生を食い止める若しくは妨げる、又は該発生から防御する若しくは保護することを指す。予防を必要とする対象は、ＣＡＤ又はＰＡＤを発症しやすい可能性がある。
【0070】
用語「回復する」又は「回復」とは、ＣＡＤ又はＰＡＤの減少、低減、又は排除を指す。
【0071】
本明細書で使用するとき、用語「対象」は、哺乳類を指し得る。哺乳類は、霊長類、特にヒトであってもよく、又は家畜、動物園の動物、若しくはコンパニオンアニマルであってもよい。本明細書に開示されるＭＳＣ、組成物、及び方法はヒトの医学的治療に好適であることが特に意図されるが、ウマ、ウシ、及びヒツジ等の家畜、イヌ及びネコ等のコンパニオンアニマル、又はネコ科、イヌ科、ウシ科、及び有蹄動物等の動物園の動物の治療を含む獣医学的治療にも適用可能である。
【0072】
本明細書で特に定義しない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって及び公開されている文書を参照することによって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
【0073】
続く特許請求の範囲及び発明の説明では、言語表現又は必然的な関連性から文脈上他の意味に解すべき場合を除いて、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、又は「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」若しくは「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」等の変形は、包括的な意味で、すなわち、記載されている特徴の存在を特定するために使用され、本発明の様々な実施形態における更なる特徴の存在又は追加を排除するために使用されるものではない。
【0074】
【0075】
図は、マトリクスの生物学的及び物理的な組成がＭＳＣの形態に影響を与えたことを示す。ＭＳＣは、ゲルの硬度及び各基質にコンジュゲートしているタンパク質に応じて、細胞の形状及びアクチンフィラメントの構築の点で異なるようにみえた（図４）。細胞は全ての条件で丸い形態を示し、１ｋＰａフィブロネクチン群ではより顕著な細胞の凝集を示した（図４、左中）。より硬度の高いゲルでは、ＭＳＣが拡散した。特に、１０ｋＰａのフィブロネクチン基質上に播種した細胞は、互いに整列することができた（図４、中線、中心）。コラーゲンでコーティングした表面上で培養した細胞は、より剛性の高い基質でも細胞の凝集が維持された。
【0076】
また、図は、特定の基質硬度とマトリクスタンパク質との組み合わせによって管形成が刺激されることも示す。ヒドロゲル上で２日間培養した後、各条件から細胞培養培地を回収し、管形成アッセイを実施するために使用した。８時間後に管形成を評価した。結果は、全てのコラーゲン及びフィブロネクチンでコーティングされた表面が、通常の組織培養プレート（ＴＣＰＳ）並びにフィブロネクチン及びＩ型コラーゲンの組み合わせでコーティングされたＴＣＰＳよりも管形成を誘導できたことを示した。更に、１０ｋＰａのコラーゲンからの馴化培地は、陽性対照よりも多くの管形成を示した（図５）。フィブロネクチン及びコラーゲンの両方を様々な硬度のゲルにコーティングした場合、１ｋＰａ及び１０ｋＰａが最も良好な管形成を示した（図９）。
【実施例】
【0077】
実施例１
国際公開第２０１７／１５６５８０号に従って生成され、任意で国際公開第２０１８／０９００８４号に従ってアッセイされたヒトＭＳＣを使用した。
国際公開第２０１７／１５６５８０号に従って生成され、任意で国際公開第２０１８／０９００８４号に従ってアッセイされたヒトＭＳＣを使用した。
【0078】
ヒドロゲルのコンジュゲーションについては、ポリアクリルアミド上に酸化タンパク質を印刷するために、フォトリソグラフィーを用いてポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）スタンプを作製した。１～４０ｋＰａに及ぶヒドロゲル製剤について調べ、ナノインデンテーションによってヒドロゲルの機械的特性を確認した。マトリクスタンパク質であるラミニン、Ｉ型コラーゲン、及びフィブロネクチンを酸化させ、単独で及び組み合わせて基質上にパターニングした。ヨウ素化を用いてタンパク質の表面密度を確認した。
【0079】
２日後にＭＳＣから馴化培地を回収した。ヒト微小血管内皮細胞（ｈＭＶＥＣ）を含有する成長因子枯渇マトリゲルに馴化培地を添加したインビトロ管形成アッセイを用いて、血管新生作用を調べた。８時間後に管形成の画像を収集し、ＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）を用いて定量した。
【0080】
凍結保存の前後の活性化状態の持続性について、血管新生促進状態をプライミングした条件を調べた。
【0081】
実施例２
管形成を促進するＭＳＣ馴化培地は、市販のサイトカインアレイを用いて、血管新生促進性サイトカインのパネルをプロファイリングする。
管形成を促進するＭＳＣ馴化培地は、市販のサイトカインアレイを用いて、血管新生促進性サイトカインのパネルをプロファイリングする。
【0082】
マトリクスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）分解性ペプチドで架橋されたポリ（エチレングリコール）ジアクリレート（ＰＥＧＤＡ）ヒドロゲル内にＭＳＣを封入する。血管新生性セクレトームを促進する、スクリーニングで同定されたタンパク質を、材料内に組み込むためにアクリル化する。機械的特性を、ＰＥＧＤＡの分子量を通して調整し、ナノインデンテーションで評価する。抗体アレイ及びＨＭＶＥＣのインビトロ管形成を用いて、封入されたＭＳＣからの分泌を評価する。
【0083】
実施例３－ヒトＰＳＣをＭＳＣに分化させるためのプロトコル
【0084】
【表1】
【0085】
表１に列挙した試薬は、当業者に公知であり、例えば、ＩＭＤＭ及びハムＦ１２等の認められている組成を有する。ＧＬＵＴＡＭＡＸは、通常０．８５％ＮａＣｌ中２００ｍＭで供給されるＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンジペプチドを含む。ＧＬＵＴＡＭＡＸは、培養されている細胞によってジペプチド結合が切断されたときにＬ－グルタミンを放出する。既知組成脂質濃縮物は、２ｍｇ／Ｌ アラキドン酸、２２０ｍｇ／Ｌ コレステロール、７０ｍｇ／Ｌ ＤＬ－アルファ－トコフェロール酢酸エステル、１０ｍｇ／Ｌ リノール酸、１０ｍｇ／Ｌ リノレン酸、１０ｍｇ／Ｌ ミリスチン酸、１０ｍｇ／Ｌ オレイン酸、１０ｍｇ／Ｌ パルミチン酸、１０ｍｇ／Ｌ パルミトレイン酸、９０ｇ／Ｌ ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－６８、１０ｍｇ／Ｌ ステアリン酸、２．２ｇ／Ｌ ＴＷＥＥＮ ８０（登録商標）、及びエチルアルコールを含む。Ｈ－１１５２及びＹ２７６３２は、非常に強力で細胞透過性である選択的ＲＯＣＫ（Ｒｈｏ結合コイルドコイル形成タンパク質セリン／トレオニンキナーゼ）阻害剤である。
【0086】
【表2】
【0087】
【表3】
【0088】
【表4】
【0089】
【表5】
【0090】
【表6】
【0091】
プロトコル
１． ビトロネクチンでコーティングされた（０．５μｇ／ｃｍ２）プラスチックの器において、Ｅ８完全培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２基本培地＋Ｅ８サプリメント）＋１μＭ Ｈ１１５２中でｉＰＳＣを解凍した。３７℃、５％ＣＯ２、２０％Ｏ２（正常酸素圧）で、プレーティングしたｉＰＳＣをインキュベートした。
２． ビトロネクチンでコーティングされた（０．５μｇ／ｃｍ２）プラスチックの器において、Ｅ８完全培地（ＲＯＣＫ阻害剤を含まない）中で３回継代してｉＰＳＣを増幅し、３７℃、５％ＣＯ２、２０％Ｏ２（正常酸素圧）でインキュベートした後、分化プロセスを開始させた。
３． ｉＰＳＣを回収し、ＩＶ型コラーゲンでコーティングされた（０．５μｇ／ｃｍ２）プラスチックの器において、Ｅ８完全培地＋１０μＭ Ｙ２７６３２中に５×１０３細胞／ｃｍ２で単細胞／小コロニーとして播種し、３７℃、５％ＣＯ２、２０％Ｏ２（正常酸素圧）で２４時間インキュベートした。
４． Ｅ８完全培地＋１０μＭ Ｙ２７６３２を分化培地に交換し、３７℃、５％ＣＯ２、５％Ｏ２（低酸素）で４８時間インキュベートした。
５． 単細胞懸濁液として分化培地接着培養物からコロニー形成細胞を回収し、Ｍ－ＣＦＭ懸濁培養液に移し、３７℃、５％ＣＯ２、２０％Ｏ２（正常酸素圧）で１２日間インキュベートした。
６． コロニーを回収し、フィブロネクチン／Ｉ型コラーゲンでコーティングされた（０．６７μｇ／ｃｍ２ フィブロネクチン、１．２μｇ／ｃｍ２ Ｉ型コラーゲン）プラスチックの器において、Ｍ－ＳＦＥＭ中に播種し（継代数０）、３７℃、５％ＣＯ２、２０％Ｏ２（正常酸素圧）で３日間インキュベートした。
７． コロニーを回収し、フィブロネクチン／１型コラーゲンでコーティングされたプラスチックの器において、Ｍ－ＳＦＥＭ中に１．３×１０４細胞／ｃｍ２で単細胞として播種し（継代数１）、３７℃、５％ＣＯ２、２０％Ｏ２（正常酸素圧）で３日間インキュベートした。
８． 回収し、フィブロネクチン／１型コラーゲンでコーティングされたプラスチックの器において、Ｍ－ＳＦＥＭ中に１．３×１０４細胞／ｃｍ２で単細胞として播種し（継代数２）、３７℃、５％ＣＯ２、２０％Ｏ２（正常酸素圧）で３日間インキュベートした。
９． 回収し、フィブロネクチン／１型コラーゲンでコーティングされたプラスチックの器において、Ｍ－ＳＦＥＭ中に１．３×１０４細胞／ｃｍ２で単細胞として播種し（継代数３）、３７℃、５％ＣＯ２、２０％Ｏ２（正常酸素圧）で３日間インキュベートした。
１０． 回収し、フィブロネクチン／１型コラーゲンでコーティングされたプラスチックの器において、Ｍ－ＳＦＥＭ中に１．３×１０４細胞／ｃｍ２で単細胞として播種し（継代数４）、３７℃、５％ＣＯ２、２０％Ｏ２（正常酸素圧）で３日間インキュベートした。
１１． 回収し、フィブロネクチン／１型コラーゲンでコーティングされたプラスチックの器において、Ｍ－ＳＦＥＭ中に１．３×１０４細胞／ｃｍ２で単細胞として播種し（継代数５）、３７℃、５％ＣＯ２、２０％Ｏ２（正常酸素圧）で３日間インキュベートした。
１２． 単細胞として回収し、最終生成物を冷凍した。
１． ビトロネクチンでコーティングされた（０．５μｇ／ｃｍ２）プラスチックの器において、Ｅ８完全培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２基本培地＋Ｅ８サプリメント）＋１μＭ Ｈ１１５２中でｉＰＳＣを解凍した。３７℃、５％ＣＯ２、２０％Ｏ２（正常酸素圧）で、プレーティングしたｉＰＳＣをインキュベートした。
２． ビトロネクチンでコーティングされた（０．５μｇ／ｃｍ２）プラスチックの器において、Ｅ８完全培地（ＲＯＣＫ阻害剤を含まない）中で３回継代してｉＰＳＣを増幅し、３７℃、５％ＣＯ２、２０％Ｏ２（正常酸素圧）でインキュベートした後、分化プロセスを開始させた。
３． ｉＰＳＣを回収し、ＩＶ型コラーゲンでコーティングされた（０．５μｇ／ｃｍ２）プラスチックの器において、Ｅ８完全培地＋１０μＭ Ｙ２７６３２中に５×１０３細胞／ｃｍ２で単細胞／小コロニーとして播種し、３７℃、５％ＣＯ２、２０％Ｏ２（正常酸素圧）で２４時間インキュベートした。
４． Ｅ８完全培地＋１０μＭ Ｙ２７６３２を分化培地に交換し、３７℃、５％ＣＯ２、５％Ｏ２（低酸素）で４８時間インキュベートした。
５． 単細胞懸濁液として分化培地接着培養物からコロニー形成細胞を回収し、Ｍ－ＣＦＭ懸濁培養液に移し、３７℃、５％ＣＯ２、２０％Ｏ２（正常酸素圧）で１２日間インキュベートした。
６． コロニーを回収し、フィブロネクチン／Ｉ型コラーゲンでコーティングされた（０．６７μｇ／ｃｍ２ フィブロネクチン、１．２μｇ／ｃｍ２ Ｉ型コラーゲン）プラスチックの器において、Ｍ－ＳＦＥＭ中に播種し（継代数０）、３７℃、５％ＣＯ２、２０％Ｏ２（正常酸素圧）で３日間インキュベートした。
７． コロニーを回収し、フィブロネクチン／１型コラーゲンでコーティングされたプラスチックの器において、Ｍ－ＳＦＥＭ中に１．３×１０４細胞／ｃｍ２で単細胞として播種し（継代数１）、３７℃、５％ＣＯ２、２０％Ｏ２（正常酸素圧）で３日間インキュベートした。
８． 回収し、フィブロネクチン／１型コラーゲンでコーティングされたプラスチックの器において、Ｍ－ＳＦＥＭ中に１．３×１０４細胞／ｃｍ２で単細胞として播種し（継代数２）、３７℃、５％ＣＯ２、２０％Ｏ２（正常酸素圧）で３日間インキュベートした。
９． 回収し、フィブロネクチン／１型コラーゲンでコーティングされたプラスチックの器において、Ｍ－ＳＦＥＭ中に１．３×１０４細胞／ｃｍ２で単細胞として播種し（継代数３）、３７℃、５％ＣＯ２、２０％Ｏ２（正常酸素圧）で３日間インキュベートした。
１０． 回収し、フィブロネクチン／１型コラーゲンでコーティングされたプラスチックの器において、Ｍ－ＳＦＥＭ中に１．３×１０４細胞／ｃｍ２で単細胞として播種し（継代数４）、３７℃、５％ＣＯ２、２０％Ｏ２（正常酸素圧）で３日間インキュベートした。
１１． 回収し、フィブロネクチン／１型コラーゲンでコーティングされたプラスチックの器において、Ｍ－ＳＦＥＭ中に１．３×１０４細胞／ｃｍ２で単細胞として播種し（継代数５）、３７℃、５％ＣＯ２、２０％Ｏ２（正常酸素圧）で３日間インキュベートした。
１２． 単細胞として回収し、最終生成物を冷凍した。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【国際調査報告】