特表 2022-522573 Ｌ７１８及び／又はＬ７９２変異型治療抵抗性ＥＧＦＲ阻害剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-04-20

(54)【発明の名称】Ｌ７１８及び／又はＬ７９２変異型治療抵抗性ＥＧＦＲ阻害剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/519 20060101AFI20220413BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20220413BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20220413BHJP

   G01N 33/574 20060101ALI20220413BHJP

   C12Q 1/6869 20180101ALN20220413BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20220413BHJP

   C12Q 1/68 20180101ALN20220413BHJP

【ＦＩ】

A61K31/519 ZNA

A61P35/00

A61P43/00 111

G01N33/574 Z

C12Q1/6869 Z

C12N15/12

C12Q1/68 100Z

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021530234

(86)(22)【出願日】2019-12-27

(85)【翻訳文提出日】2021-05-27

(86)【国際出願番号】 JP2019051377

(87)【国際公開番号】W WO2020138400

(87)【国際公開日】2020-07-02

(31)【優先権主張番号】P 2018247131

(32)【優先日】2018-12-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】000207827

【氏名又は名称】大鵬薬品工業株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110000796

【氏名又は名称】特許業務法人三枝国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】羽迫 真一

(72)【発明者】

【氏名】宇野 貴夫

【テーマコード（参考）】

4B063

4C086

【Ｆターム（参考）】

4B063QA13

4B063QA17

4B063QA19

4B063QQ08

4B063QQ28

4B063QQ42

4B063QQ52

4B063QQ62

4B063QR08

4B063QR32

4B063QR35

4B063QR42

4B063QR66

4B063QR77

4B063QS03

4B063QS25

4B063QS34

4B063QS36

4B063QX02

4C086AA01

4C086AA02

4C086CB05

4C086GA16

4C086MA01

4C086MA04

4C086NA14

4C086ZB26

4C086ZC20

(57)【要約】

本発明は、（Ｓ）－Ｎ－（４－アミノ－６－メチル－５－（キノリン－３－イル）－８，９－ジヒドロピリミド［５，４－ｂ］インドリジン－８－イル）アクリルアミド（以下、「化合物Ａ」とも称する）又はその塩を含有する、エクソン１８のＬ７１８Ｘ変異及びエクソン２０のＬ７９２Ｘ変異からなる群から選択される少なくとも１つの変異を有するＥＧＦＲを発現している悪性腫瘍患者を治療するための抗腫瘍剤を提供するものである。［Ｘは任意のアミノ酸残基を示す。］
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

（Ｓ）－Ｎ－（４－アミノ－６－メチル－５－（キノリン－３－イル）－８，９－ジヒドロピリミド［５，４－ｂ］インドリジン－８－イル）アクリルアミド（以下、「化合物Ａ」とも称する）又はその塩を含有する、エクソン１８のＬ７１８Ｘ変異及びエクソン２のＬ７９２Ｘ変異からなる群から選択される少なくとも１つの変異を有するＥＧＦＲを発現している悪性腫瘍患者を治療するための抗腫瘍剤。
［Ｘは任意のアミノ酸残基を示す。］

【請求項2】

更に、エクソン１９欠失変異、Ｌ８５８Ｒ、Ｌ８６１Ｑ、Ｇ７１９Ｘ、Ｅ７０９Ｘ及びエクソン２０挿入変異からなる群から選択される少なくとも１つの変異を有する請求項１に記載の抗腫瘍剤。

【請求項3】

更に、Ｔ７９０Ｍ変異を有する請求項２に記載の抗腫瘍剤。

【請求項4】

Ｌ７１８Ｘ変異が、Ｌ７１８Ｑ変異である、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗腫瘍剤。

【請求項5】

Ｌ７９２Ｘ変異が、Ｌ７９２Ｈ、Ｌ７９２Ｆ、又はＬ７９２Ｙである、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗腫瘍剤。

【請求項6】

エクソン１８のＬ７１８Ｘ変異及びエクソン２０のＬ７９２Ｘ変異からなる群から選択される少なくとも１つの変異を有するＥＧＦＲを発現している悪性腫瘍患者に（Ｓ）－Ｎ－（４－アミノ－６－メチル－５－（キノリン－３－イル）－８，９－ジヒドロピリミド［５，４－ｂ］インドリジン－８－イル）アクリルアミド又はその塩を投与する工程を含む、悪性腫瘍患者の治療方法。

【請求項7】

エクソン１８のＬ７１８Ｘ変異及びエクソン２０のＬ７９２Ｘ変異からなる群から選択される少なくとも１つの変異を有するＥＧＦＲを発現している悪性腫瘍患者を治療するための、（Ｓ）－Ｎ－（４－アミノ－６－メチル－５－（キノリン－３－イル）－８，９－ジヒドロピリミド［５，４－ｂ］インドリジン－８－イル）アクリルアミド又はその塩。

【請求項8】

（Ｓ）－Ｎ－（４－アミノ－６－メチル－５－（キノリン－３－イル）－８，９－ジヒドロピリミド［５，４－ｂ］インドリジン－８－イル）アクリルアミド又はその塩の、エクソン１８のＬ７１８Ｘ変異及びエクソン２０のＬ７９２Ｘ変異からなる群から選択される少なくとも１つの変異を有するＥＧＦＲを発現している悪性腫瘍患者を治療するための使用。

【請求項9】

（Ｓ）－Ｎ－（４－アミノ－６－メチル－５－（キノリン－３－イル）－８，９－ジヒドロピリミド［５，４－ｂ］インドリジン－８－イル）アクリルアミド又はその塩の、エクソン１８のＬ７１８Ｘ変異及びエクソン２０のＬ７９２Ｘ変異からなる群から選択される少なくとも１つの変異を有するＥＧＦＲを発現している悪性腫瘍患者を治療するための医薬を製造するための使用。

【請求項10】

（Ｓ）－Ｎ－（４－アミノ－６－メチル－５－（キノリン－３－イル）－８，９－ジヒドロピリミド［５，４－ｂ］インドリジン－８－イル）アクリルアミド又はその塩及び薬学的に許容できる担体を含む、エクソン１８のＬ７１８Ｘ変異及びエクソン２０のＬ７９２Ｘ変異からなる群から選択される少なくとも１つの変異を有するＥＧＦＲを発現してい悪性腫瘍患者を治療するための、医薬組成物。
［Ｘは任意のアミノ酸残基を示す。］

【請求項11】

下記工程（１）～（２）を含む、悪性腫瘍患者における（Ｓ）－Ｎ－（４－アミノ－６－メチル－５－（キノリン－３－イル）－８，９－ジヒドロピリミド［５，４－ｂ］インドリジン－８－イル）アクリルアミド又はその塩を有効成分とする抗腫瘍剤を用いた化学療法の治療効果を予測する方法：
（１）当該患者から採取された生体試料に含まれるＥＧＦＲ遺伝子の変異の有無を検出する工程、及び
（２）上記工程（１）における検出の結果、ＥＧＦＲ遺伝子がエクソン１８のＬ７１８Ｘ変異及びエクソン２０のＬ７９２Ｘ変異からなる群から選択される少なくとも１つの変異を有している場合、当該患者に対する当該化学療法が十分な治療効果を示す可能性が高いと予測する工程。
［Ｘは任意のアミノ酸残基を示す。］

【請求項12】

下記工程（１）～（３）を含む、悪性腫瘍患者の治療方法：
（１）当該患者から採取された生体試料に含まれるＥＧＦＲ遺伝子の変異の有無を検出する工程、及び
（２）上記工程（１）における検出の結果、ＥＧＦＲ遺伝子がエクソン１８のＬ７１８Ｘ変異及びエクソン２０のＬ７９２Ｘ変異からなる群から選択される少なくとも１つの変異を有している場合、当該患者に対する（Ｓ）－Ｎ－（４－アミノ－６－メチル－５－（キノリン－３－イル）－８，９－ジヒドロピリミド［５，４－ｂ］インドリジン－８－イル）アクリルアミド又はその塩を有効成分とする抗腫瘍剤を用いた化学療法が十分な治療効果を示す可能性が高いと予測する工程、及び
（３）上記工程（２）において（Ｓ）－Ｎ－（４－アミノ－６－メチル－５－（キノリン－３－イル）－８，９－ジヒドロピリミド［５，４－ｂ］インドリジン－８－イル）アクリルアミド又はその塩を有効成分とする抗腫瘍剤を用いた化学療法が十分な治療効果を示す可能性が高いと予測された悪性腫瘍患者に、（Ｓ）－Ｎ－（４－アミノ－６－メチル－５－（キノリン－３－イル）－８，９－ジヒドロピリミド［５，４－ｂ］インドリジン－８－イル）アクリルアミド又はその塩を投与する工程。
［Ｘは任意のアミノ酸残基を示す。］

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明はエクソン１８及び／又はエクソン２０治療抵抗性変異型上皮成長因子受容体（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ、以下、「ＥＧＦＲ」とも称する）を有する癌に対する抗腫瘍剤に関する。

【背景技術】

【0002】

ＥＧＦＲは受容体チロシンキナーゼであり、正常組織においてはリガンドである上皮成長因子（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ、以下「ＥＧＦ」とも称する）と結合することで生理機能を発揮し、上皮組織において増殖やアポトーシス阻害に寄与している（非特許文献１）。また、ＥＧＦＲ遺伝子の体細胞変異は癌の原因遺伝子として知られており、例えばＥＧＦＲのエクソン１９のコドン７４６～７５０が欠失したもの（以下、「エクソン１９欠失変異」とも称する）やエクソン２１のコドン８５８がコードするロイシンがアルギニンへ変異したもの（以下、「Ｌ８５８Ｒ変異」とも称する）はＥＧＦ非依存的なキナーゼ活性を恒常的に誘導し、癌細胞の増殖や生存に寄与する（非特許文献２）。これらの変異は、東アジアにおいては、例えば非小細胞肺癌の３０～５０％で認められ、また、欧米においても非小細胞肺癌のおよそ１０％で認められると報告されており、癌の原因因子の１つとして考えられている（非特許文献３）。

【0003】

そのため、ＥＧＦＲ阻害剤の抗腫瘍剤としての研究開発は従来から活発に行われており、各種のＥＧＦＲ変異陽性肺癌の治療に導入されている（非特許文献２、４）。ゲフィチニブ、エルロチニブ、及びアファチニブは、ＥＧＦＲ変異の９０％を占めるエクソン１９欠失変異型及びＬ８５８Ｒ変異型ＥＧＦＲ陽性肺癌に対する治療薬として用いられている。また、これらの治療継続中に獲得耐性が生じることが知られており、その原因の５０％はエクソン２０のコドン７９０がスレオニンからメチオニンへ変異した（以下、「Ｔ７９０Ｍ変異」とも称する）耐性変異型ＥＧＦＲである。この変異を有する肺癌に対してはオシメルチニブが治療薬として用いられている。従って、主要なＥＧＦＲ変異を有する肺癌患者に対して、ＥＧＦＲ阻害剤を用いた治療が確立されつつある。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】ＷＯ２０１５／１７５６３２Ａ１号公報

【特許文献2】ＷＯ２０１５／０２５９３６Ａ１号公報

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ，ｖｏｌ．６，ｐｐ８０３－８１２（２００６）

【非特許文献2】Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｖｏｌ．１９，ｐｐ１３８９－１４００（２０１３）

【非特許文献3】Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｃａｎｃｅｒ，ｖｏｌ．７，ｐｐ１６９－１８１（２００７）

【非特許文献4】Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．２４，ｐｐ３０９７－３１０７（２０１８）

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

主要なＥＧＦＲ変異を有する肺癌患者に対して、ＥＧＦＲ阻害剤を用いた治療が確立されつつある。一方、オシメルチニブ治療抵抗性を示す患者の存在も知られており、その原因の一部はＥＧＦＲ遺伝子の変異であることが報告されている（非特許文献４）。例えばｄｅ ｎｏｖｏ変異であるエクソン１９欠失変異又はＬ８５８Ｒ変異と獲得耐性変異であるＴ７９０Ｍ変異に加えて、エクソン１８のコドン７１８がコードするロイシンが任意のアミノ酸に置換した点変異（以下、「Ｌ７１８Ｘ変異」とも称する）や、エクソン２０のコドン７９２がコードするロイシンが任意のアミノ酸に置換した点変異（以下、「Ｌ７９２Ｘ変異」とも称する）を併せ持つ肺癌は、オシメルチニブ治療に対して抵抗性を示すことが確認されている。Ｌ７１８Ｘ変異やＬ７９２Ｘ変異によっておこるアミノ酸置換は立体障害および疎水性結合の減弱を誘導することでオシメルチニブとＥＧＦＲの結合を妨げることが提唱されている（非特許文献４）。このためにｄｅ ｎｏｖｏの活性型変異とＴ７９０Ｍ獲得耐性変異、及びＬ７１８Ｘ変異又はＬ７９２Ｘ変異の複合変異を有するＥＧＦＲに対して高い阻害活性を有する阻害剤の開発が望まれる。

【0007】

従って、Ｌ７１８Ｘ又はＬ７９２Ｘを含む複合変異を有するＥＧＦＲに対して高い阻害活性を有する薬剤の開発は、オシメルチニブ治療抵抗性を示す肺癌に対して抗腫瘍効果を示すことが可能となることが予想され、治療法の確立されていない変異型ＥＧＦＲ陽性癌患者の延命やＱＯＬ向上に貢献することが期待される。更に、ＥＧＦＲ阻害剤治療に対する獲得耐性変異であるＴ７９０Ｍに対しても高い阻害活性を有する薬剤であれば、ｄｅ ｎｏｖｏ変異であるエクソン１９やエクソン２１の変異型ＥＧＦＲに対するＥＧＦＲ阻害剤治療に際し、獲得耐性の発現頻度を減少させる可能性が予想され、がん患者の延命に貢献することが期待される。

【0008】

このような状況の下、本発明の課題は、従来のＥＧＦＲ阻害剤で治療効果が十分ではない、オシメルチニブ治療抵抗性変異であるL７１８及びL７９２変異型ＥＧＦＲへの阻害活性が高い阻害剤を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明者らは、鋭意研究の結果、従来治療に導入されているＥＧＦＲ阻害剤が、活性型変異及びＴ７９０Ｍ獲得耐性変異に加え、Ｌ７１８及びＬ７９２変異を含む複合変異型ＥＧＦＲに対する阻害活性が乏しいことを見いだした。更に、本発明者らは、化合物の共結晶構造の比較を端緒として、鋭意研究した結果、本発明化合物は、Ｌ７１８及びＬ７９２変異を有するＥＧＦＲに対する優れた阻害活性を示すことを見いだし、更に上記複合変異型ＥＧＦＲにも優れた阻害活性を示すことを見いだし、本発明を完成するに至った。

【0010】

本発明は以下の態様を包含する。

【0011】

項１．
（Ｓ）－Ｎ－（４－アミノ－６－メチル－５－（キノリン－３－イル）－８，９－ジヒドロピリミド［５，４－ｂ］インドリジン－８－イル）アクリルアミド（以下、「化合物Ａ」とも称する）又はその塩を含有する、エクソン１８のＬ７１８Ｘ変異及びエクソン２０のＬ７９２Ｘ変異からなる群から選択される少なくとも１つの変異を有するＥＧＦＲを発現している悪性腫瘍患者を治療するための抗腫瘍剤。［Ｘは任意のアミノ酸残基を示す。］

【0012】

項２．
更に、エクソン１９欠失変異、Ｌ８５８Ｒ、Ｌ８６１Ｑ、Ｇ７１９Ｘ、Ｅ７０９Ｘ及びエクソン２０挿入変異からなる群から選択される少なくとも１つの変異を有する項１に記載の抗腫瘍剤。

【0013】

項３．
更に、Ｔ７９０Ｍ変異を有する項２に記載の抗腫瘍剤。

【0014】

項４．
Ｌ７１８Ｘ変異が、Ｌ７１８Ｑ変異である、項１～３のいずれか一項に記載の抗腫瘍剤。

【0015】

項５．
Ｌ７９２Ｘ変異が、Ｌ７９２Ｈ、Ｌ７９２Ｆ、又はＬ７９２Ｙである、項１～４のいずれか一項に記載の抗腫瘍剤。

【0016】

項６．
エクソン１８のＬ７１８Ｘ変異及びエクソン２０のＬ７９２Ｘ変異からなる群から選択される少なくとも１つの変異を有するＥＧＦＲを発現している悪性腫瘍患者に（Ｓ）－Ｎ－（４－アミノ－６－メチル－５－（キノリン－３－イル）－８，９－ジヒドロピリミド［５，４－ｂ］インドリジン－８－イル）アクリルアミド又はその塩を投与する工程を含む、悪性腫瘍患者の治療方法。

【0017】

項７．
エクソン１８のＬ７１８Ｘ変異及びエクソン２０のＬ７９２Ｘ変異からなる群から選択される少なくとも１つの変異を有するＥＧＦＲを発現している悪性腫瘍患者を治療するための、（Ｓ）－Ｎ－（４－アミノ－６－メチル－５－（キノリン－３－イル）－８，９－ジヒドロピリミド［５，４－ｂ］インドリジン－８－イル）アクリルアミド又はその塩。

【0018】

項８．
（Ｓ）－Ｎ－（４－アミノ－６－メチル－５－（キノリン－３－イル）－８，９－ジヒドロピリミド［５，４－ｂ］インドリジン－８－イル）アクリルアミド又はその塩の、エクソン１８のＬ７１８Ｘ変異及びエクソン２０のＬ７９２Ｘ変異からなる群から選択される少なくとも１つの変異を有するＥＧＦＲを発現している悪性腫瘍患者を治療するための使用。

【0019】

項９．
（Ｓ）－Ｎ－（４－アミノ－６－メチル－５－（キノリン－３－イル）－８，９－ジヒドロピリミド［５，４－ｂ］インドリジン－８－イル）アクリルアミド又はその塩の、エクソン１８のＬ７１８Ｘ変異及びエクソン２０のＬ７９２Ｘ変異からなる群から選択される少なくとも１つの変異を有するＥＧＦＲを発現している悪性腫瘍患者を治療するための医薬を製造するための使用。

【0020】

項１０.
（Ｓ）－Ｎ－（４－アミノ－６－メチル－５－（キノリン－３－イル）－８，９－ジヒドロピリミド［５，４－ｂ］インドリジン－８－イル）アクリルアミド又はその塩及び薬学的に許容できる担体を含む、エクソン１８のＬ７１８Ｘ変異及びエクソン２０のＬ７９２Ｘ変異からなる群から選択される少なくとも１つの変異を有するＥＧＦＲを発現している悪性腫瘍患者を治療するための、医薬組成物。
［Ｘは任意のアミノ酸残基を示す。］

【0021】

項１１．
下記工程（１）～（２）を含む、悪性腫瘍患者における（Ｓ）－Ｎ－（４－アミノ－６－メチル－５－（キノリン－３－イル）－８，９－ジヒドロピリミド［５，４－ｂ］インドリジン－８－イル）アクリルアミド又はその塩を有効成分とする抗腫瘍剤を用いた化学療法の治療効果を予測する方法：
（１）当該患者から採取された生体試料に含まれるＥＧＦＲ遺伝子の変異の有無を検出する工程、及び
（２）上記工程（１）における検出の結果、ＥＧＦＲ遺伝子がエクソン１８のＬ７１８Ｘ変異及びエクソン２０のＬ７９２Ｘ変異からなる群から選択される少なくとも１つの変異を有している場合、当該患者に対する当該化学療法が十分な治療効果を示す可能性が高いと予測する工程。
［Ｘは任意のアミノ酸残基を示す。］

【0022】

項１２．
下記工程（１）～（３）を含む、悪性腫瘍患者の治療方法：
（１）当該患者から採取された生体試料に含まれるＥＧＦＲ遺伝子の変異の有無を検出する工程、及び
（２）上記工程（１）における検出の結果、ＥＧＦＲ遺伝子がエクソン１８のＬ７１８Ｘ変異及びエクソン２０のＬ７９２Ｘ変異からなる群から選択される少なくとも１つの変異を有している場合、当該患者に対する（Ｓ）－Ｎ－（４－アミノ－６－メチル－５－（キノリン－３－イル）－８，９－ジヒドロピリミド［５，４－ｂ］インドリジン－８－イル）アクリルアミド又はその塩を有効成分とする抗腫瘍剤を用いた化学療法が十分な治療効果を示す可能性が高いと予測する工程、及び
（３）上記工程（２）において（Ｓ）－Ｎ－（４－アミノ－６－メチル－５－（キノリン－３－イル）－８，９－ジヒドロピリミド［５，４－ｂ］インドリジン－８－イル）アクリルアミド又はその塩を有効成分とする抗腫瘍剤を用いた化学療法が十分な治療効果を示す可能性が高いと予測された悪性腫瘍患者に、（Ｓ）－Ｎ－（４－アミノ－６－メチル－５－（キノリン－３－イル）－８，９－ジヒドロピリミド［５，４－ｂ］インドリジン－８－イル）アクリルアミド又はその塩を投与する工程。
［Ｘは任意のアミノ酸残基を示す。］

【発明の効果】

【0023】

本発明に係る抗腫瘍剤は、Ｌ７１８及びＬ７９２変異を有するＥＧＦＲへの高い阻害活性を示す。したがって、Ｌ７１８及びＬ７９２変異を有するＥＧＦＲを発現している悪性腫瘍患者に対する優れた治療効果を発揮する抗腫瘍剤を提供するものとして有用である。

【0024】

本発明はまた、Ｌ７１８及びＬ７９２変異を有するＥＧＦＲを発現している悪性腫瘍患者の治療方法を提供するものとして有用である。

【0025】

従来のＥＧＦＲ阻害剤は、エクソン２０領域の獲得耐性変異であるＴ７９０Ｍ変異存在下、もしくはＬ７１８及びＬ７９２変異存在下においてＥＧＦＲ阻害活性が著しく低下するため、十分な治療効果を発揮することが困難であった。一方、本発明に係る抗腫瘍剤は、Ｌ７１８及び／又はＬ７９２変異を有し、かつＥｘ１９ｄｅｌ又はＬ８５８Ｒ変異等の活性変異を有するＥＧＦＲへの阻害活性が高いため、これらの変異を複合的に有するＥＧＦＲを発現している悪性腫瘍患者に対して優れた治療効果を発揮することができる。本発明に係る抗腫瘍剤は上記変異に加えて、Ｔ７９０Ｍ変異を有していても、Ｌ７１８及び／又はＬ７９２変異を有するＥＧＦＲへの阻害活性が高いため、これらの変異を複合的に有するＥＧＦＲを発現している悪性腫瘍患者に対して優れた治療効果を発揮することができる。

【0026】

更に、本発明に係る抗腫瘍剤は、エクソン２０領域の獲得耐性変異であるＴ７９０Ｍ変異の存在下においても、エクソン１８及びエクソン２０治療抵抗性変異型ＥＧＦＲに対して、高い阻害活性を有するため、ｄｅ ｎｏｖｏ変異であるエクソン１８やエクソン２１の変異型ＥＧＦＲに対するＥＧＦＲ阻害剤治療に際し、獲得耐性の発現頻度を減少させうる点で有用である。

【図面の簡単な説明】

【0027】

【図1】ＨＥＫ２９３細胞を用いた変異型ＥＧＦＲ強制発現系におけるリン酸化評価結果（阻害活性）を示す。

【発明を実施するための形態】

【0028】

明細書の上記又は下記記載において、本発明範囲に含まれる様々な定義の好適例を、下記で詳細に説明する。

【0029】

本明細書において「ＥＧＦＲ」とは、ヒト上皮成長因子受容体（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）タンパク質を示す。ＥＧＦＲは、ＥｒｂＢ－１又はＨＥＲ１とも呼ばれている。

【0030】

本明細書において「野生型ＥＧＦＲ」とは、体細胞変異を有していないＥＧＦＲを示し、具体的には配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿００５２１９．２）。

【0031】

本明細書において「エクソン１８」とは、野生型ＥＧＦＲのアミノ酸配列（配列番号１）における６８８－７２８の領域を示す。

【0032】

本明細書において「エクソン１８治療抵抗性変異」とは、野生型ＥＧＦＲ（配列番号１）のエクソン１８領域のアミノ酸における点変異又は欠失変異を示す。好ましくは、エクソン１８治療抵抗性変異としては、エクソン１８領域の１のアミノ酸が置換された点変異であり、より好ましくは、エクソン１８のコドン７１８にコードされるロイシンが任意のアミノ酸に置換した点変異であるＬ７１８Ｘである（Ｘは、遺伝情報にコードされるタンパク質を構成するアミノ酸のうち、ロイシン以外の任意のアミノ酸残基を示す。）。具体的には、Ｌ７１８Ｘとしては、エクソン１８領域のコドン７１８にコードされるロイシンがグルタミンに置換した点変異であるＬ７１８Ｑ、コドン７１８にコードされるロイシンがバリンに置換した点突然変異であるＬ７１８Ｖが挙げられ、これらが好ましい。

【0033】

本明細書において「エクソン１８活性型変異」とは、野生型ＥＧＦＲ（配列番号１）のエクソン１８領域のアミノ酸における点変異又は欠失変異を示す。好ましくは、エクソン１８活性型変異としては、エクソン１８領域の１のアミノ酸が置換された点変異であり、エクソン１８のコドン７０９にコードされるグルタミン酸が任意のアミノ酸に置換した点変異であるＥ７０９Ｘ、及びエクソン１８のコドン７１９によりコードされるグリシンが任意のアミノ酸に置換した点変異であるＧ７１９Ｘである。具体的には、Ｅ７０９Ｘとしては、エクソン１８領域のコドン７０９にコードされるグルタミン酸がリシンに置換した点変異であるＥ７０９Ｋ、エクソン１８領域のコドン７０９にコードされるグルタミン酸がアラニンに置換した点変異であるＥ７０９Ａが挙げられ、これらが好ましい。Ｇ７１９Ｘとしては、エクソン１８領域のコドン７１９にコードされるグリシンがアラニンに置換した点変異であるＧ７１９Ａ、エクソン１８領域のコドン７１９にコードされるグリシンがセリンに置換した点変異であるＧ７１９Ｓ、又はエクソン１８領域のコドン７１９にコードされるグリシンがシステインに置換した点変異であるＧ７１９Ｃが挙げられ、これらが好ましい。

【0034】

本発明において「エクソン２０」とは、野生型ＥＧＦＲのアミノ酸配列（配列番号１）における８２４－８７５の領域を示す。

【0035】

本明細書において「エクソン２０治療抵抗性変異」とは、野生型ＥＧＦＲ（配列番号１）のエクソン２０領域のアミノ酸における点変異を示す。好ましくは、エクソン２０変異としては、エクソン２０領域の１のアミノ酸が置換された点変異であり、より好ましくは、エクソン２０領域のコドン７９２にコードされるロイシンが任意のアミノ酸に置換した点変異であるＬ７９２Ｘである（Ｘは、遺伝情報にコードされるタンパク質を構成するアミノ酸のうち、ロイシン以外の任意のアミノ酸残基を示す。）。具体的には、エクソン２０領域のコドン７９２によりコードされるロイシンがヒスチジンに置換した点変異であるＬ７９２Ｈ、コドン７９２によりコードされるロイシンがフェニルアラニンに置換した点変異であるＬ７９２Ｆ、コドン７９２によりコードされるロイシンがチロシンに置換した点変異であるＬ７９２Ｙ、コドン７９２によりコードされるロイシンがアルギニンに置換した点変異であるＬ７９２Ｒ、コドン７９２によりコードされるロイシンがバリンに置換した点変異であるＬ７９２Ｖ、コドン７９２によりコードされるロイシンがプロリンに置換した点変異であるＬ７９２Ｐが挙げられ、このうち、Ｌ７９２Ｆ、Ｌ７９２Ｈ及びＬ７９２Ｙが好ましい。

【0036】

本明細書において「エクソン２０挿入変異」とは、ＥＧＦＲのエクソン２０領域（配列番号１における７６１～８２３番のアミノ酸配列）に１つ以上（好ましくは１～７つ、より好ましくは１～４つ）のアミノ酸が挿入された変異を示し、好ましくは、エクソン２０領域の７６３番アラニンから７６４番チロシンの間にアミノ酸配列ＦＱＥＡ（Ｎ末側から順番にフェニルアラニン、グルタミン、グルタミン酸、アラニン）が挿入された変異（Ａ７６３＿Ｙ７６４ｉｎｓＦＱＥＡ）、エクソン２０領域の７６９番バリンから７７０番アスパラギン酸の間にアミノ酸配列ＡＳＶ（Ｎ末側から順番にアラニン、セリン、バリン）が挿入された変異（Ｖ７６９＿Ｄ７７０ｉｎｓＡＳＶ）、エクソン２０領域の７７０番アスパラギン酸から７７１番アスパラギンの間にアミノ酸配列ＳＶＤ（Ｎ末側から順番にセリン、バリン、アスパラギン酸）が挿入された変異（Ｄ７７０＿Ｎ７７１ｉｎｓＳＶＤ）、エクソン２０領域の７７０番アスパラギン酸から７７１番アスパラギンの間にアミノ酸配列ＮＰＧ（Ｎ末側から順番にアスパラギン、プロリン、グリシン）が挿入された変異（Ｄ７７０＿Ｎ７７１ｉｎｓＮＰＧ）、エクソン２０領域の７７０番アスパラギン酸から７７１番アスパラギンの間にアミノ酸Ｇ（グリシン）が挿入された変異（Ｄ７７０＿Ｎ７７１ｉｎｓＧ）、エクソン２０領域の７７０番アスパラギン酸が欠失し替わりにアミノ酸配列ＧＹ（Ｎ末側から順にグリシン、チロシン）が挿入された変異（Ｄ７７０＞ＧＹ）、エクソン２０領域の７７１番アスパラギンから７７２番プロリンの間にアミノ酸Ｎ（アスパラギン）が挿入された変異（Ｎ７７１＿Ｐ７７２ｉｎｓＮ）、エクソン２０領域の７７２番プロリンから７７３番ヒスチジンの間にアミノ酸配列ＰＲ（Ｎ末側から順にプロリン、アルギニン）が挿入された変異（Ｐ７７２＿Ｒ７７３ｉｎｓＰＲ）、エクソン２０領域の７７３番ヒスチジンから７７４番バリンの間にアミノ酸配列ＮＰＨ（Ｎ末側から順番にアスパラギン、プロリン、ヒスチジン）が挿入された変異（Ｈ７７３＿Ｖ７７４ｉｎｓＮＰＨ）、エクソン２０領域の７７３番ヒスチジンから７７４番バリンの間にアミノ酸配列ＰＨ（Ｎ末側から順番にプロリン、ヒスチジン）が挿入された変異（Ｈ７７３＿Ｖ７７４ｉｎｓＰＨ）、エクソン２０領域の７７３番ヒスチジンから７７４番バリンの間にアミノ酸配列ＡＨ（Ｎ末側から順番にアラニン、ヒスチジン）が挿入された変異（Ｈ７７３＿Ｖ７７４ｉｎｓＡＨ）、エクソン２０領域の７７３番ヒスチジンから７７４番バリンの間にアミノ酸Ｈ（ヒスチジン）が挿入された変異（Ｈ７７３＿Ｖ７７４ｉｎｓＨ）、エクソン２０領域の７７４番バリンから７７５番システインの間にアミノ酸配列ＨＶ（Ｎ末側から順番にヒスチジン、バリン）が挿入された変異（Ｖ７７４＿Ｃ７７４ｉｎｓＨＶ）、エクソン２０領域の７６１番アラニンから７６２番グルタミン酸の間にアミノ酸配列ＥＡＦＱ（Ｎ末側から順番にグルタミン酸、アラニン、フェニルアラニン、グルタミン）が挿入された変異（Ａ７６１＿Ｅ７６２ｉｎｓＥＡＦＱ）等が挙げられる。より好ましくはエクソン２０領域の７６９番バリンから７７０番アスパラギン酸の間にアミノ酸配列ＡＳＶ（Ｎ末側から順番にアラニン、セリン、バリン）が挿入された変異（Ｖ７６９＿Ｄ７７０ｉｎｓＡＳＶ）、エクソン２０領域の７７０番アスパラギン酸から７７１番アスパラギンの間にアミノ酸配列ＳＶＤ（Ｎ末側から順番にセリン、バリン、アスパラギン酸）が挿入された変異（Ｄ７７０＿Ｎ７７１ｉｎｓＳＶＤ）、エクソン２０領域の７７０番アスパラギン酸から７７１番アスパラギンの間にアミノ酸Ｇ（グリシン）が挿入された変異（Ｄ７７０＿Ｎ７７１ｉｎｓＧ）、エクソン２０領域の７７３番ヒスチジンから７７４番バリンの間にアミノ酸配列ＮＰＨ（Ｎ末側から順番にアスパラギン、プロリン、ヒスチジン）が挿入された変異（Ｈ７７３＿Ｖ７７４ｉｎｓＮＰＨ）、エクソン２０領域の７７３番ヒスチジンから７７４番バリンの間にアミノ酸配列ＰＨ（Ｎ末側から順番にプロリン、ヒスチジン）が挿入された変異（Ｈ７７３＿Ｖ７７４ｉｎｓＰＨ）が挙げられる。特に好ましくはエクソン２０領域の７６３番アラニンから７６４番チロシンの間にアミノ酸配列ＦＱＥＡ（Ｎ末側から順番にフェニルアラニン、グルタミン、グルタミン酸、アラニン）が挿入された変異（Ａ７６３＿Ｙ７６４ｉｎｓＦＱＥＡ）、エクソン２０領域の７６９番バリンから７７０番アスパラギン酸の間にアミノ酸配列ＡＳＶ（Ｎ末側から順番にアラニン、セリン、バリン）が挿入された変異（Ｖ７６９＿Ｄ７７０ｉｎｓＡＳＶ）、エクソン２０領域の７７０番アスパラギン酸から７７１番アスパラギンの間にアミノ酸配列ＳＶＤ（Ｎ末側から順番にセリン、バリン、アスパラギン酸）が挿入された変異（Ｄ７７０＿Ｎ７７１ｉｎｓＳＶＤ）、エクソン２０領域の７７０番アスパラギン酸から７７１番アスパラギンの間にアミノ酸Ｇ（グリシン）が挿入された変異（Ｄ７７０＿Ｎ７７１ｉｎｓＧ）エクソン２０領域の７７３番ヒスチジンから７７４番バリンの間にアミノ酸配列ＮＰＨ（Ｎ末側から順番にアスパラギン、プロリン、ヒスチジン）が挿入された変異（Ｈ７７３＿Ｖ７７４ｉｎｓＮＰＨ）、及びエクソン２０領域の７７３番ヒスチジンから７７４番バリンの間にアミノ酸配列ＰＨ（Ｎ末側から順番にプロリン、ヒスチジン）が挿入された変異（Ｈ７７３＿Ｖ７７４ｉｎｓＰＨ）等が挙げられる。

【0037】

本発明において「エクソン２１」とは、野生型ＥＧＦＲのアミノ酸配列（配列番号１）における８２４－８７５の領域を示す。

【0038】

本明細書において「エクソン２１活性型変異」とは、野生型ＥＧＦＲ（配列番号１）のエクソン２１領域のアミノ酸における点変異を示す。好ましくは、エクソン２１活性型変異としては、エクソン２１領域の１のアミノ酸が置換された点変異であり、より好ましくは、エクソン２１領域のコドン８５８にコードされるロイシンが任意のアミノ酸に置換した点変異であるＬ８５８Ｘ、及びエクソン２１領域のコドン８６１にコードされるロイシンが任意のアミノ酸に置換した点変異であるＬ８６１Ｘである（Ｘは、遺伝情報にコードされるタンパク質を構成するアミノ酸のうち、ロイシン以外の任意のアミノ酸残基を示す。）。具体的には、エクソン２１領域のコドン８５８にコードされるロイシンがアルギニンへ変異した点突然変異であるＬ８５８Ｒ及びエクソン２１領域のコドン８６１によりコードされるロイシンがグルタミンに置換した点変異であるＬ８６１Ｑが挙げられ、これらが好ましい。

【0039】

本発明において、「エクソン１８及び／又はエクソン２０治療抵抗性変異」は、「エクソン１８治療抵抗性変異」「エクソン２０治療抵抗性変異」、「エクソン１８及びエクソン２０治療抵抗性変異」を包含する。

【0040】

本発明において、「点変異」とは、１又は複数（例えば、１～１０個程度、好ましくは１～５程度個、より好ましくは１、２又は３個程度）のアミノ酸残基の置換、挿入又は欠失をもたらす変異を示し、核酸としてのインフレーム挿入及び／又は欠失変異も含みうる。

【0041】

「エクソン１８及び／又はエクソン２０治療抵抗性変異を有するＥＧＦＲ」は、「エクソン１８治療抵抗性変異を有するＥＧＦＲ」、「エクソン２０治療抵抗性変異を有するＥＧＦＲ」及び「エクソン１８及びエクソン２０治療抵抗性変異を有するＥＧＦＲ」を包含する。

【0042】

本明細書において「エクソン１８治療抵抗性変異を有するＥＧＦＲ」とは、エクソン１８治療抵抗性変異として少なくとも上記エクソン１８のＬ７１８Ｘ変異を有するＥＧＦＲ示し、当該ＥＧＦＲはＬ７１８Ｘ以外の他のエクソン１８変異さらに有してもよいが、好ましくはエクソン１８治療抵抗性変異としてＬ７１８Ｘ変異１つを有するものである。また、当該ＥＧＦＲはエクソン１８治療抵抗性変異以外の変異（例えば、エクソン１９欠失変異、Ｌ８５８Ｒ変異、Ｌ７９０Ｍ変異など）を有していても良い。

【0043】

本明細書において「エクソン２０治療抵抗性変異を有するＥＧＦＲ」とは、エクソン２０治療抵抗性変異として少なくとも上記エクソン２０のＬ７９２Ｘ変異を有するＥＧＦＲを示し、当該ＥＧＦＲはＬ７９２Ｘ以外の他の変異を有してもよいが、好ましくはエクソン治療抵抗性２０変異としてＬ７１８Ｘ変異１つを有するものである。また、当該ＥＧＦＲはエクソン２０治療抵抗性変異以外の変異（例えば、エクソン１９欠失変異、Ｌ８５８Ｒ変異、Ｌ７９０Ｍ変異など）を有していても良い。

【0044】

本明細書において「エクソン１９」とは、野生型ＥＧＦＲのアミノ酸配列（配列番号１）における７２９－８２３の領域を示す。

【0045】

本明細書において「エクソン１９欠失変異」とは、野生型ＥＧＦＲ（配列番号１）のエクソン１９領域において１つ以上のアミノ酸を欠失した変異を示す。当該領域の欠失に加えて１又は複数の任意のアミノ酸が挿入された変異も包含する。エクソン１９欠失変異としては、エクソン１９領域の７４６番グルタミン酸から７５０番アラニンの５アミノ酸が欠失した変異（Ｄｅｌ Ｅ７４６－Ａ７５０）、エクソン１９領域の７４７番ロイシンから７５３番プロリンの７アミノ酸が欠失後にセリンが挿入された変異（Ｄｅｌ ７４７―Ｐ７５３ｉｎｓＳ）、エクソン１９領域の７４７番ロイシンから７５１番トレオニンの５アミノ酸が欠失した変異（Ｄｅｌ Ｌ７４７－Ｔ７５１）、エクソン１９領域の７４７番ロイシンから７５０番アラニンの４アミノ酸が欠失後にプロリンが挿入された変異（Ｄｅｌ ７４７―Ａ７５０ｉｎｓＰ）等を示す。好ましくは、エクソン１９領域の７４６番グルタミン酸から７５０番アラニンの５アミノ酸が欠失した変異（Ｄｅｌ Ｅ７４６－Ａ７５０）が挙げられる。

【0046】

また、エクソン１８及び／又はエクソン２０治療抵抗性変異を有するＥＧＦＲは、更に、エクソン１９欠失変異、Ｌ８５８Ｒ、Ｌ８６１Ｑ、Ｇ７１９Ｘ、Ｅ７０９Ｘ及びエクソン２０挿入変異からなる群から選択される少なくとも１つの変異を有していてもよい。具体的には、エクソン１９欠失変異を更に有するエクソン１８領域のＬ７１８Ｘ変異を有するＥＧＦＲ、エクソン１９欠失変異を更に有するエクソン２０領域のＬ７９２Ｘ変異を有するＥＧＦＲ、Ｌ８５８Ｒを更に有するエクソン１８領域のＬ７１８Ｘ変異を有するＥＧＦＲ、Ｌ８５８Ｒを更に有するエクソン２０領域のＬ７９２Ｘ変異を有するＥＧＦＲ、Ｌ８６１Ｑを更に有するエクソン１８領域のＬ７１８Ｘ変異を有するＥＧＦＲ、Ｌ８６１Ｑを更に有するエクソン２０領域のＬ７９２Ｘ変異を有するＥＧＦＲ、Ｇ７１９Ｘを更に有するエクソン１８領域のＬ７１８Ｘ変異を有するＥＧＦＲ、Ｇ７１９Ｘを更に有するエクソン２０領域のＬ７９２Ｘ変異を有するＥＧＦＲ、Ｅ７０９Ｘを更に有するエクソン１８領域のＬ７１８Ｘ変異を有するＥＧＦＲ、Ｅ７０９Ｘを更に有するエクソン２０領域のＬ７９２Ｘ変異を有するＥＧＦＲ、エクソン２０挿入変異を更に有するエクソン１８領域のＬ７１８Ｘ変異を有するＥＧＦＲ、エクソン２０挿入変異を更に有するエクソン２０領域のＬ７９２Ｘ変異を有するＥＧＦＲを示す。このうち、エクソン１９欠失変異を更に有するエクソン１８領域のＬ７１８Ｘ変異を有するＥＧＦＲ、エクソン１９欠失変異を更に有するエクソン２０領域のＬ７９２Ｘ変異を有するＥＧＦＲ、Ｌ８５８Ｒを更に有するエクソン１８領域のＬ７１８Ｘ変異を有するＥＧＦＲ、Ｌ８５８Ｒを更に有するエクソン２０領域のＬ７９２Ｘ変異を有するＥＧＦＲが好ましい。

【0047】

また、エクソン１８及び／又はエクソン２０治療抵抗性変異を有するＥＧＦＲは、上記エクソン１９欠失変異、Ｌ８５８Ｒ、Ｌ８６１Ｑ、Ｇ７１９Ｘ、Ｅ７０９Ｘ及びエクソン２０挿入変異に加えて、更にＴ７９０Ｍ変異を有していてもよい。Ｔ７９０Ｍはエクソン２０領域の獲得耐性変異であり、既存のＥＧＦＲ阻害剤を使用することによって生ずることが知られている。Ｔ７９０Ｍの獲得により、悪性腫瘍患者に対して既存の薬剤の効果が低くなる場合が多い。

【0048】

本発明において、Ｔ７９０Ｍ変異を更に有するエクソン１９欠失変異を有するエクソン１８領域のＬ７１８Ｘ変異を有するＥＧＦＲ、Ｔ７９０Ｍ変異を更に有するエクソン１９欠失変異を有するエクソン２０領域のＬ７９２Ｘ変異を有するＥＧＦＲ、Ｔ７９０Ｍ変異を更に有するＬ８５８Ｒを有するエクソン１８領域のＬ７１８Ｘ変異を有するＥＧＦＲ、Ｔ７９０Ｍ変異を更に有するＬ８５８Ｒを有するエクソン２０領域のＬ７９２Ｘ変異を有するＥＧＦＲ、Ｔ７９０Ｍ変異を更に有するＬ８６１Ｑを有するエクソン１８領域のＬ７１８Ｘ変異を有するＥＧＦＲ、Ｔ７９０Ｍ変異を更に有するＬ８６１Ｑを有するエクソン２０領域のＬ７９２Ｘ変異を有するＥＧＦＲ、Ｔ７９０Ｍ変異を更に有するＧ７１９Ｘを有するエクソン１８領域のＬ７１８Ｘ変異を有するＥＧＦＲ、Ｔ７９０Ｍ変異を更に有するＧ７１９Ｘを有するエクソン２０領域のＬ７９２Ｘ変異を有するＥＧＦＲ、Ｔ７９０Ｍ変異を更に有するＥ７０９Ｘを有するエクソン１８領域のＬ７１８Ｘ変異を有するＥＧＦＲ、Ｔ７９０Ｍ変異を更に有するＥ７０９Ｘを有するエクソン２０領域のＬ７９２Ｘ変異を有するＥＧＦＲ、Ｔ７９０Ｍ変異を更に有するエクソン２０挿入変異を有するエクソン１８領域のＬ７１８Ｘ変異を有するＥＧＦＲ、Ｔ７９０Ｍ変異を更に有するエクソン２０挿入変異を有するエクソン２０領域のＬ７９２Ｘ変異を有するＥＧＦＲを示す。このうち、Ｔ７９０Ｍ変異を更に有するエクソン１９欠失変異を有するエクソン１８領域のＬ７１８Ｘ変異を有するＥＧＦＲ、Ｔ７９０Ｍ変異を更に有するエクソン１９欠失変異を有するエクソン２０領域のＬ７９２Ｘ変異を有するＥＧＦＲ、Ｔ７９０Ｍ変異を更に有するＬ８５８Ｒを有するエクソン１８領域のＬ７１８Ｘ変異を有するＥＧＦＲ、Ｔ７９０Ｍ変異を更に有するＬ８５８Ｒを有するエクソン２０領域のＬ７９２Ｘ変異を有するＥＧＦＲが好ましい。

【0049】

上記複合変異を有するＥＧＦＲにおいて、エクソン１８領域ではＬ７１８Ｑ変異を有するＥＧＦＲ、エクソン２０領域ではＬ７９２Ｆ変異を有するＥＧＦＲ、Ｌ７９２Ｈ変異を有するＥＧＦＲ、及びＬ７９２Ｙ変異を有するＥＧＦＲが特に好ましい。

【0050】

本発明において、悪性腫瘍患者が発現しているＥＧＦＲが変異を有することの検出方法としては、上記の変異が検出できれば特に制限されず、公知の検出方法を使用することができる。

【0051】

ＥＧＦＲ変異の検出に供する試料としては、悪性腫瘍患者由来の生体試料、特に悪性腫瘍患者から採取したものであり悪性腫瘍細胞を含む試料であれば特に限定されない。生体試料としては、例えば体液（血液、尿等）、組織、その抽出物及び採取した組織の培養物などが例示できる。また、生体試料の採取方法は、生体試料の種類に応じ適宜選択することができる。

【0052】

生体試料は、測定方法に応じて、適切な処理をされることにより調製される。また、検出に用いられるプライマー又はプローブを含む試薬は、これらの測定方法に応じて、慣用される方法により調整することができる。

【0053】

本発明の1つの態様において、抗腫瘍剤の悪性腫瘍患者への投与の前に、悪性腫瘍患者が発現しているＥＧＦＲが本発明に係る変異を有することの検出する工程を行うことができる。

【0054】

なお、悪性腫瘍は異なる２種以上の悪性腫瘍細胞を含む場合がある。また、一人の患者において２以上の複数の悪性腫瘍が発生する場合がある。そのため、一人の患者が、ＥＧＦＲの異なる変異（例えば、エクソン１８変異が、Ｌ７１８Ｑ及びＬ７１８Ｖのエクソン１８変異；エクソン２０変異が、Ｌ７９２Ｆ、Ｌ７９２Ｈ、Ｌ７９２Ｙ、Ｌ７９２Ｒ、Ｌ７９２Ｖ及びＬ７９２Ｐのエクソン２０変異が挙げられるがこれらに限定されない。）を同時に有する場合がある。

【0055】

本発明の抗腫瘍剤は、（Ｓ）－Ｎ－（４－アミノ－６－メチル－５－（キノリン－３－イル）－８，９－ジヒドロピリミド［５，４－ｂ］インドリジン－８－イル）アクリルアミド（化合物Ａ）又はその塩を有効成分として含有する。化合物Ａは、下記化学式で表される。

【0056】

【化1】

【0057】

次に、本発明に係る化合物の製造法について説明する：
本発明化合物Ａは、例えば、ＷＯ２０１５／０２５９３６Ａ１号公報に記載された製造法又は実施例に示す方法等により製造することができる。ただし、本発明化合物の製造法はこれら反応例に限定されるものではない。

【0058】

本発明化合物Ａが、光学異性体、立体異性体、互変異性体等の異性体を有する場合には、特に明記しない限り、いずれの異性体も混合物も本発明化合物に包含される。例えば、本発明化合物に光学異性体が存在する場合には、特に明記しない限り、ラセミ体及びラセミ体から分割された光学異性体も本発明化合物に包含される。

【0059】

化合物Ａの塩とは、薬学的に許容される塩を意味し、塩基付加塩又は酸付加塩を挙げることができる。

【0060】

該塩基付加塩としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；例えばカルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩；例えばアンモニウム塩；例えばトリメチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、エタノールアミン塩、ジエタノールアミン塩、トリエタノールアミン塩、プロカイン塩、Ｎ，Ｎ’－ジベンジルエチレンジアミン塩等の有機アミン塩等が挙げられる。

【0061】

該酸付加塩としては、例えば塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、過塩素酸塩等の無機酸塩；例えば酢酸塩、ギ酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、アスコルビン酸塩、トリフルオロ酢酸塩等の有機酸塩；例えばメタンスルホン酸塩、イセチオン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩等のスルホン酸塩等が挙げられる。

【0062】

本発明化合物又はその塩には、そのプロドラッグも含まれる。プロドラッグは、生体内における生理条件下で酵素や胃酸等による反応により本発明化合物又はその塩に変換する化合物、即ち酵素的に酸化、還元、加水分解等を起こして本発明化合物又はその塩に変化する化合物、胃酸等により加水分解等を起こして本発明化合物又はその塩に変化する化合物をいう。また、広川書店１９９０年刊「医薬品の開発」第７巻分子設計１６３頁から１９８頁に記載されているような生理的条件で本発明化合物又はその塩に変化するものであってもよい。

【0063】

［疾患の記載］
本発明の対象となる腫瘍は特に制限はされないが、例えば、頭頚部癌、消化器癌（食道癌、胃癌、十二指腸癌、肝臓癌、胆道癌（胆嚢・胆管癌等）、膵臓癌、結腸直腸癌（結腸癌、直腸癌等）等）、肺癌（非小細胞肺癌、小細胞肺癌、中皮腫等）、乳癌、生殖器癌（卵巣癌、子宮癌（子宮頚癌、子宮体癌等）等）、泌尿器癌（腎癌、膀胱癌、前立腺癌、精巣腫瘍等）、造血器腫瘍（白血病、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫等）、骨・軟部腫瘍、皮膚癌、脳腫瘍等が挙げられる。好ましくは、肺癌、乳癌、頭頸部癌、脳腫瘍、子宮癌、消化器癌、造血器腫瘍、又は皮膚癌であり、特に好ましくは肺癌である。

【0064】

本発明化合物又はその塩は医薬として用いるにあたっては、必要に応じて薬学的担体を配合し、予防又は治療目的に応じて各種の投与形態を採用可能であり、該形態としては、例えば、経口剤、注射剤、坐剤、軟膏剤、貼付剤等のいずれでもよく、好ましくは、経口剤が採用される。これらの投与形態は、各々当業者に公知慣用の製剤方法により製造できる。

【0065】

薬学的に許容できる担体としては、製剤素材として慣用の各種有機或いは無機担体物質が用いられ、固形製剤における賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤等として配合される。また、必要に応じて防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤、安定化剤等の製剤添加物を用いることもできる。

【0066】

経口用固形製剤を調製する場合は、本発明化合物に賦形剤、必要に応じて賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味・矯臭剤等を加えた後、常法により錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等を製造することができる。

【0067】

賦形剤としては、乳糖、白糖、Ｄ－マンニトール、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、微結晶セルロース、無水ケイ酸等が挙げられる。結合剤としては、水、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、α－デンプン液、ゼラチン液、Ｄ－マンニトール、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドン等が挙げられる。崩壊剤としては、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、乳糖等が挙げられる。滑沢剤としては、精製タルク、ステアリン酸塩ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、ホウ砂、ポリエチレングリコール等が挙げられる。着色剤としては、酸化チタン、酸化鉄等が挙げられる。矯味・矯臭剤としては白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸等が挙げられる。

【0068】

経口用液体製剤を調製する場合は、本発明化合物に矯味剤、緩衝剤、安定化剤、矯臭剤等を加えて常法により内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤等を製造することができる。

【0069】

注射剤を調製する場合は、本発明化合物にｐＨ調節剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤等を添加し、常法により皮下、筋肉内及び静脈内用注射剤を製造することができる。

【0070】

ｐＨ調節剤及び緩衝剤としては、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム等が挙げられる。安定化剤としては、ピロ亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、チオグリコール酸、チオ乳酸等が挙げられる。局所麻酔剤としては、塩酸プロカイン、塩酸リドカイン等が挙げられる。等張化剤としては、塩化ナトリウム、ブドウ糖、Ｄ－マンニトール、グリセリン等が挙げられる。

【0071】

坐剤を調製する場合は、化合物Ａに当業界において公知の製剤用担体、例えば、ポリエチレングリコール、ラノリン、カカオ脂、脂肪酸トリグリセリド等を、更に必要に応じてＴｗｅｅｎ８０（登録商標）のような界面活性剤等を加えた後、常法により製造することができる。

【0072】

軟膏剤を調製する場合は、化合物Ａに通常使用される基剤、安定剤、湿潤剤、保存剤等が必要に応じて配合され、常法により混合、製剤化される。

【0073】

基剤としては、流動パラフィン、白色ワセリン、サラシミツロウ、オクチルドデシルアルコール、パラフィン等が挙げられる。

【0074】

保存剤としては、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル等が挙げられる。

【0075】

貼付剤を調製する場合は、通常の支持体に前記軟膏、クリーム、ゲル、ペースト等を常法により塗布すればよい。

【0076】

支持体としては、綿、スフ、化学繊維からなる織布、不織布や軟質塩化ビニル、ポリエチレン、ポリウレタン等のフィルム或いは発泡体シートが適当である。

【0077】

上記の各投与単位形態中に配合されるべき化合物Ａの量は、これを適用すべき患者の症により、或いはその剤形等により一定ではないが、一般に投与単位形態あたり、経口剤では０．０５－１０００ｍｇ、注射剤では０．０１－５００ｍｇ、坐剤では１－１０００ｍｇとするのが望ましい。

【0078】

また、上記投与形態を有する薬剤の１日あたりの投与量は、患者の症状、体重、年齢、性別等によって異なり一概には決定できないが、本発明化合物として通常成人（体重５０ｋｇ）１日あたり０．０５－５０００ｍｇ、好ましくは０．１－１０００ｍｇとすればよく、これを１日１回又は２－３回程度に分けて投与するのが好ましい。

【0079】

本発明はまた、エクソン１８及び／又はエクソン２０治療抵抗性変異を有するＥＧＦＲを発現している悪性腫瘍患者に化合物Ａ又はその塩を投与する工程を含む、悪性腫瘍患者の治療方法を提供する。

【0080】

本発明はまた、エクソン１８及び／又はエクソン２０治療抵抗性変異を有するＥＧＦＲを発現している悪性腫瘍患者を治療するための、化合物Ａ又はその塩を提供する。

【0081】

本発明はまた、化合物Ａ又はその塩の、エクソン１８及び／又はエクソン２０治療抵抗性変異を有するＥＧＦＲを発現している悪性腫瘍患者を治療するための使用を提供する。

【0082】

本発明はまた、化合物Ａ又はその塩の、エクソン１８及び／又はエクソン２０治療抵抗性変異を有するＥＧＦＲを発現している悪性腫瘍患者を治療するための医薬を製造するための使用を提供する。

【0083】

本発明はまた、下記工程（１）～（２）を含む、悪性腫瘍患者における化合物Ａ又はその塩を有効成分とする抗腫瘍剤を用いた化学療法の治療効果を予測する方法を提供する。
（１）当該患者から採取された生体試料に含まれるＥＧＦＲ遺伝子の変異の有無を検出する工程、及び
（２）上記工程（１）における検出の結果、ＥＧＦＲ遺伝子がエクソン１８及び／又はエクソン２０治療抵抗性変異を有している場合、当該患者に対する当該化学療法が十分な治療効果を示す可能性が高いと予測する工程。

【0084】

本発明はまた、下記工程（１）～（３）を含む、悪性腫瘍患者の治療方法を提供する。
（１）当該患者から採取された生体試料に含まれるＥＧＦＲ遺伝子の変異の有無を検出する工程、及び
（２）上記工程（１）における検出の結果、ＥＧＦＲ遺伝子がエクソン１８及び／又はエクソン２０治療抵抗性変異を有している場合、当該患者に対する（Ｓ）－Ｎ－（４－アミノ－６－メチル－５－（キノリン－３－イル）－８，９－ジヒドロピリミド［５，４－ｂ］インドリジン－８－イル）アクリルアミド又はその塩を有効成分とする抗腫瘍剤を用いた化学療法が十分な治療効果を示す可能性が高いと予測する工程、及び
（３）上記工程（２）において（Ｓ）－Ｎ－（４－アミノ－６－メチル－５－（キノリン－３－イル）－８，９－ジヒドロピリミド［５，４－ｂ］インドリジン－８－イル）アクリルアミド又はその塩を有効成分とする抗腫瘍剤を用いた化学療法が十分な治療効果を示す可能性が高いと予測された悪性腫瘍患者に、（Ｓ）－Ｎ－（４－アミノ－６－メチル－５－（キノリン－３－イル）－８，９－ジヒドロピリミド［５，４－ｂ］インドリジン－８－イル）アクリルアミド又はその塩を投与する工程。

【0085】

ＥＧＦＲ遺伝子の塩基配列は公知である。ｃＤＮＡの塩基配列のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号は、ＮＭ＿００５２２８．４である。

【0086】

なお、「治療効果」は、腫瘍縮小効果、再発抑制効果、延命効果などにより評価することができ、再発抑制効果は無再発生存期間の延長や再発率の改善の程度、延命効果は全生存期間や無増悪生存期間の中央値の延長の程度などにより表すことができる。化合物Ａ又はその塩を有効成分として含有する抗腫瘍剤を用いた化学療法が「十分な治療効果を示す」とは、化合物Ａ又はその塩を有効成分として含有する抗腫瘍剤を投与することにより、非投与の場合と比較して、生存期間を延長させたり、再発を抑制させたりするような優れた治療効果をいう。

【実施例】

【0087】

以下に試験例を示し、本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれら実施例(試験例)に制限されるものではない。

【0088】

試験例１ Ｉｎ ｖｉｔｒｏ 薬効試験
ＨＥＫ２９３細胞を用いた変異型ＥＧＦＲ強制発現系における細胞内リン酸化評価結果
（阻害活性）
化合物の細胞内標的阻害活性は、Ｊｕｍｐ－Ｉｎ（商標） Ｇｒｉｐ（商標） ＨＥＫ２９３細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）（以下、「ＨＥＫ２９３細胞」とも称す）を用いた変異型ＥＧＦＲ強制発現系における細胞内ＥＧＦＲリン酸化を指標に評価した。ＨＥＫ２９３細胞は、１０％ 透析 ウシ胎児血清（ｄｉａｌｙｚｅｄ ＦＢＳ）を含むＤ－ＭＥＭ ｗｉｔｈ ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）－Ｉ（Ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）にて維持した。ＨＥＫ２９３細胞を９６ウェル平底マイクロプレートの各ウェルに１ウェルあたりの細胞数が１０，０００個になるように播種し、５％炭酸ガス含有の培養器中３７℃で１晩培養した後、ヒトＥＧＦＲ遺伝子（Ｄｅｌ Ｅ７４６－Ａ７５０（Ｅｘ１９ｄｅｌとも称す）、Ｅｘ１９ｄｅｌ＋Ｔ７９０Ｍ（＋は両方の変異を有することを示す）、Ｅｘ１９ｄｅｌ＋Ｔ７９０Ｍ＋Ｌ７１８Ｑ、Ｅｘ１９ｄｅｌ＋Ｔ７９０Ｍ＋Ｌ７９２Ｈ、Ｅｘ１９ｄｅｌ＋Ｔ７９０Ｍ＋Ｌ７９２Ｆ、Ｅｘ１９ｄｅｌ＋Ｔ７９０Ｍ＋Ｌ７９２Ｙ、Ｌ８５８Ｒ、Ｌ８５８Ｒ＋Ｔ７９０Ｍ、Ｌ８５８Ｒ＋Ｔ７９０Ｍ＋Ｌ７１８Ｑ、Ｌ８５８Ｒ＋Ｔ７９０Ｍ＋Ｌ７９２Ｈ、Ｌ８５８Ｒ＋Ｔ７９０Ｍ＋Ｌ７９２Ｆ、Ｌ８５８Ｒ＋Ｔ７９０Ｍ＋Ｌ７９２Ｙ）をコードしたｐｃＤＮＡ^ＴＭ６．２／Ｖ５―ＤＥＳＴベクターをＯｐｔｉ－ＭＥＭ（商標） Ｉ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）と共にＶｉａＦｅｃｔ（商標） Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（プロメガ株式会社）を用いて導入し、再び５％炭酸ガス含有の培養器中３７℃で１晩培養した。翌日、化合物Ａ、エルロチニブ、アファチニブ及びオシメルチニブ（エルロチニブ、アファチニブ及びオシメルチニブを各々、以下、「比較化合物」とも称する）をＤＭＳＯに溶解し、ＤＭＳＯもしくは培地を用いて希釈し、これを細胞の培養プレートの各ウェルに加え、５％炭酸ガス含有の培養器中３７℃で６時間培養した。培養後、２０％ 中性緩衝ホルマリン液（和光純薬工業株式会社）を用いて細胞を固定し、ＯＤＹＳＳＥＹ（商標） Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（ＰＢＳ）（Ｍ＆Ｓ ＴｅｃｈｎｏＳｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）により細胞をブロッキングした後、ＯＤＹＳＳＥＹ（商標） Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（ＰＢＳ）を用いて２００分の１に希釈した一次抗体（ＥＧＦＲ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｃｋｔａｉｌ＃ＡＨＲ５０６２（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）及びＰｈｏｓｐｈｏ－ＥＧＦＲ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（Ｔｙｒ１０６８）Ａｎｔｉｂｏｄｙ＃２２３４Ｌ（ＣＳＴ））に反応させ４℃で一晩静置した。翌日、ＯＤＹＳＳＥＹ（商標） Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（ＰＢＳ）を用いて８００分の１に希釈した二次抗体（ＩＲＤye ８００ＣＷ Ｇｏａｔ ａＲａｂｂｉｔ＃９２６－３２２１１及びＩＲＤye ６８０ＲＤ Ｇｏａｔ ａＭｏｕｓｅ＃９２６－６８０７０（Ｍ＆Ｓ ＴｅｃｈｎｏＳｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．））に反応させ室温で１時間静置した。蛍光強度（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ：以下「ＦＩ」とも称す）の検出は、Ｏｄｙｓｓａｙ（商標） ＣＬｘ Ｉｎｆｒａｒｅｄ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ＬＩ－ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ） を用いて、蛍光波長８００ｎｍ及び７００ｎｍで測定した。

【0089】

蛍光波長８００ｎｍ及び７００ｎｍで検出したＦＩ値から一次抗体を含まないウェルのＦＩ値を差し引いた数値をそれぞれ、ＦＩ（８００，ＥＧＦＲ）－Ｂｌａｎｋ、ＦＩ（７００，ｐ－ＥＧＦＲ）－Ｂｌａｎｋとする。各ウェルのＦＩ（７００，ｐ－ＥＧＦＲ）－ＢｌａｎｋからＦＩ（８００，ＥＧＦＲ）－Ｂｌａｎｋを除した値をＦＩ（ｐ－ＥＧＦＲ／ＥＧＦＲ）値とする。以下の式よりリン酸化ＥＧＦＲ率を算出し、ＥＧＦＲを５０％リン酸化することのできる被検化合物の濃度（ＩＣ_５０（μＭ））を求めた。結果を表１に示す。

【0090】

リン酸化ＥＧＦＲ率（％）＝Ｔ ／ Ｃ ×１００
Ｔ：被検化合物を添加したウェルのＦＩ（ｐ－ＥＧＦＲ／ＥＧＦＲ）
Ｃ：被検化合物を添加しなかったウェルのＦＩ（ｐ－ＥＧＦＲ／ＥＧＦＲ）。

【0091】

表１から明らかなとおり、化合物ＡはＬ７１８Ｑ及びＬ７９２Ｘを含む複合変異型ＥＧＦＲに対して高い細胞内リン酸化阻害活性を示し、その活性はエルロチニブ、アファチニブ、オシメルチニブに比して高かった。

【0092】

【表1】

【図1】

【配列表】

2022522573000001.app

【国際調査報告】