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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-04-20
(54)【発明の名称】ＣＤ４０に結合する抗体およびその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20220413BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20220413BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20220413BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20220413BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20220413BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20220413BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20220413BHJP
C07K 16/46 20060101ALI20220413BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20220413BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220413BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20220413BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20220413BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20220413BHJP
A61K 35/12 20150101ALI20220413BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13 ZNA
C12N15/63 Z
C12N15/62 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C07K16/46
C07K16/28
A61P35/00
A61P35/02
A61K39/395 T
A61K31/7088
A61K35/12
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021550175
(86)(22)【出願日】2019-10-10
(85)【翻訳文提出日】2021-10-19
(86)【国際出願番号】 CN2019110316
(87)【国際公開番号】W WO2020177321
(87)【国際公開日】2020-09-10
(31)【優先権主張番号】16/290,980
(32)【優先日】2019-03-04
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】519439209
【氏名又は名称】ベイジン マブワークス バイオテック カンパニー リミテッド
(71)【出願人】
【識別番号】321002400
【氏名又は名称】ベイジン マブリッジ バイオファーマスーティカル カンパニー リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110000877
【氏名又は名称】龍華国際特許業務法人
(72)【発明者】
【氏名】フ、ウェンキ
(72)【発明者】
【氏名】リ、ジアンメイ
(72)【発明者】
【氏名】リ、フェン
【テーマコード（参考）】
4B065
4C085
4C086
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA01X
4B065AA57X
4B065AA72X
4B065AA87X
4B065AB01
4B065BA02
4B065CA44
4C085AA14
4C085BB31
4C085CC23
4C085EE01
4C085GG01
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZB26
4C086ZB27
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB63
4C087CA12
4C087NA14
4C087ZB26
4C087ZB27
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045DA76
4H045EA28
4H045FA74
(57)【要約】
【要約】
ヒトＣＤ４０に特異的に結合する単離モノクローナル抗体。抗体をエンコードする核酸分子、発現ベクター、宿主細胞、および、抗体を発現するための方法も提供される。本開示は更に、抗体を含む二重特異性分子および医薬組成物、ならびに、開示の抗ＣＤ４０抗体を使用する治療方法を提供する。
【選択図】なし
ヒトＣＤ４０に特異的に結合する単離モノクローナル抗体。抗体をエンコードする核酸分子、発現ベクター、宿主細胞、および、抗体を発現するための方法も提供される。本開示は更に、抗体を含む二重特異性分子および医薬組成物、ならびに、開示の抗ＣＤ４０抗体を使用する治療方法を提供する。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
重鎖ＣＤＲ１領域、重鎖ＣＤＲ２領域、および重鎖ＣＤＲ３領域を含む重鎖可変領域、ならびに、軽鎖ＣＤＲ１領域、軽鎖ＣＤＲ２領域、および軽鎖ＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変領域を備え、前記重鎖ＣＤＲ１領域、前記重鎖ＣＤＲ２領域、および前記重鎖ＣＤＲ３領域、ならびに、前記軽鎖ＣＤＲ１領域、前記軽鎖ＣＤＲ２領域、および前記軽鎖ＣＤＲ３領域は、（１）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、８、１５、２１、２７および３１；（２）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、９、１５、２１、２７および３１；（３）それぞれ２、９、１５、２１、２７および３１；（４）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１０、１６、２２、２８および３２；（５）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、１１、１７、２３、２９および３３；（６）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、１２、１８、２４、２７および３４；（７）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、１３、１９、２５、２７および３５；または（８）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、１４、２０、２６、３０および３６のアミノ酸配列を含む、
腫瘍壊死因子受容体ＣＤ４０に結合する単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
【請求項2】
前記重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項3】
前記軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０または６１に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項4】
前記重鎖可変領域および前記軽鎖可変領域は、（１）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７および５１：（２）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８および５２：（３）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９および５３：（４）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０および５４：（５）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１および５５：（６）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４および５８：（７）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５および５９：（８）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６および６０：（９）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６および６１：（１０）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７および６０：（１１）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７および６１：（１２）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８および５９：（１３）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９および６０：（１４）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９および６１：（１５）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０および６０：または（１６）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０および６１に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項5】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２、６３、または６４に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖可変領域に連結された重鎖定常領域、および／または、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５または６６に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％ ９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域に連結された軽鎖定常領域を備える、請求項１から４のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項6】
（ａ）ヒトまたはサルＣＤ４０に結合し、（ｂ）マウスＣＤ４０に結合せず、（ｃ）ヒトＣＤ４０‐ヒトＣＤ４０Ｌ相互作用をブロックまたは促進し、（ｄ）ＣＤ４０シグナル伝達を活性化し、（ｅ）ＤＣ細胞成熟を促進し、（ｆ）ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞増殖を促進する、請求項１から５のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項7】
請求項１から６のいずれか一項に記載の抗体、またはその抗原結合断片を備える二重特異性分子。
【請求項8】
請求項１から６のいずれか一項に記載の抗体、またはその抗原結合断片をエンコードするポリヌクレオチド。
【請求項9】
請求項１から６のいずれか一項に記載の抗体、またはその抗原結合断片を備える発現ベクター。
【請求項10】
請求項８に記載のポリヌクレオチド、または、請求項９に記載の発現ベクターを備える宿主細胞。
【請求項11】
請求項１から６のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部分、請求項８に記載のポリヌクレオチド、請求項９に記載の発現ベクター、または、請求項１０に記載の宿主細胞、および、薬学的に許容される担体を備える医薬組成物。
【請求項12】
癌の治療において使用するための、請求項１から６のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項13】
前記癌は固形または非固形腫瘍である、請求項１２に記載の、癌の治療において使用するための抗体またはその抗原結合部分。
【請求項14】
前記癌は、Ｂ細胞リンパ腫、慢性リンパ球性白血病、多発性骨髄腫、黒色腫、結腸腺癌、膵臓癌、大腸癌、胃腸癌、前立腺癌、膀胱癌、腎臓癌、卵巣癌、子宮頸癌、乳癌、肺癌、および鼻咽頭癌から成る群から選択される、請求項１２または１３に記載の、癌の治療において使用するための抗体またはその抗原結合部分。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、ヒトＣＤ４０に特異的に結合する、抗体またはその抗原結合部分、その調製および使用に関し、特に、癌、炎症性疾患、感染症、アテローム血栓症、呼吸器疾患など、ＣＤ４０に関連するヒトの疾患の治療における使用に関する。
【背景技術】
【0002】
腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバ５またはＴＮＦＲ５とも呼ばれるＣＤ４０は、Ｂ細胞、マクロファージ、樹状細胞などの抗原提示細胞で発現する膜貫通型共刺激タンパク質である。このタンパク質が、活性化されたＴリンパ球および血小板によって主に発現される主要なリガンドであるＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）に結合すると、抗原提示細胞が活性化し、免疫細胞活性化および増殖、サイトカインおよびケモカインの産生、細胞および免疫機能の強化を含む、様々な下流シグナル伝達が引き起こされる（Ａｒａ Ａ ｅｔ ａｌ，． （２０１８） Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｓ Ｔｈｅｒ ７： ５５－６１）。
【0003】
他方、ＣＤ４０はまた、非免疫細胞および腫瘍上でも見られ（Ｃｏｓｔｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．， （１９９９） Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ ２０（１１）： ４８８－４９３； Ｔｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， （２００３） Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １０（１）： １－１３； Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， （２０１４） Ｃｕｒｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ １４（７）： ６１０－６２０； Ａｒａ Ａ ｅｔ ａｌ，．（２０１８）上記）、自己免疫疾患、アテローム血栓症、癌、および呼吸器疾患を含む、複数の炎症性疾患の病理に関与していると報告されている。例えば、ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ発現は、アテローム関連細胞においてアップレギュレートされた。ＣＤ４０は、ほぼすべてのＢ細胞悪性腫瘍および最大７０％の固形腫瘍において見られ、特定のＢ細胞悪性腫瘍におけるＣＤ４０の係合は、アポトーシス剤によって誘導されたアポトーシスから細胞を保護する多くの因子の発現を増加させた（（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， （１９９９） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９６：９１３６－９１４１））。
【0004】
腫瘍増殖に対するＣＤ４０の複雑な作用にもかかわらず、複数の抗ＣＤ４０抗体が、潜在的な腫瘍治療のために開発されたい。ファイザー（登録商標）によって開発された完全ヒトＩｇＧ２ ＣＤ４０アゴニスト抗体であるＣＰ－８７０，８９３は、樹状細胞を活性化でき、進行した癌を有する患者の多くの事例において臨床的有効性を示した（Ｖｏｎｄｅｒｈｅｉｄｅ ｅｔ ａｌ．， （２００７） Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２５（７）： ８７６－８８３； Ｇｌａｄｕｅ ｅｔ ａｌ．， （２０１１） Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ６０（７）： １００９－１０１７； Ｂｅａｔｔｙ ｅｔ ａｌ．， （２０１３） Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ １７（２）： １７５－１８６； Ｖｏｎｄｅｒｈｅｉｄｅ ｅｔ ａｌ．， （２０１３） Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２（１）： ｅ２３０３３； Ｎｏｗａｋ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ Ｏｎｃｏｌ ２６（１２）： ２４８３－２４９０； ２０１５年米国特許第７，３３８，６６０号）。シアトルジェネティクス（登録商標）によって開発されたヒト化ＩｇＧ１アゴニスト抗ＣＤ４０抗体である、ＳＧＮ－４０としても知られるダセツズマブも、毎週静脈内投与されたときに、特にびまん性大Ｂ細胞型リンパ腫の患者において抗腫瘍活性を示した。前臨床データはまた、抗ＣＤ２０ｍＡｂリツキシマブなど、他の薬剤とのダセツズマブの相乗作用を示した（Ｌａｐａｌｏｍｂｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．， （２００９） Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ １４４（６）： ８４８－８５５； Ｈｕｓｓｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， （２０１０） Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ ９５（５）： ８４５－８４８； ｄｅ Ｖｏｓ ｅｔ ａｌ．， （２０１４） Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ ７： ４４）。英国王立癌研究基金によって開発された別のキメラ抗ヒトＩｇＧ１アゴニスト抗ＣＤ４０抗体であるＣｈｉ Ｌｏｂ ７／４は、初期の臨床試験を受けている。２１名の患者のうち１１名は、完全または部分的な奏効が無い安定的な疾患を示した（Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ ｅｔ ａｌ．， （２０１４） Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ ２（３）： ２２９－２４０）。更に、ヒト多発性骨髄腫および慢性リンパ球性白血病に対する抗腫瘍活性について、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体が試験された（Ｂｅｎｓｉｎｇｅｒ Ｗ ｅｔ ａｌ．， （２０１２） Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ．１５９（１）： ５８－６６； Ｍｏｈａｍｍａｄ Ｌｕｑｍａｎ ｅｔ ａｌ．， （２００８） Ｂｌｏｏｄ １１２： ７１１－７２０）。
【0005】
薬学的特性が改善された、更なるＣＤ４０抗体の需要がまだある。
【発明の概要】
【0006】
本開示は、ＣＤ４０（例えば、ヒトＣＤ４０およびサルＣＤ４０）に結合する単離モノクローナル抗体、例えば、マウス、ヒト、キメラまたはヒト化モノクローナル抗体を提供する。それは、ＣＤ４０シグナル伝達を活性化するアゴニストＣＤ４０抗体であり得る。
【0007】
本開示の抗体は、ＣＤ４０タンパク質の検出、癌、炎症性疾患、感染症、アテローム血栓症および呼吸器疾患などのＣＤ４０関連疾患の治療および予防を含む様々な用途に使用できる。
【0008】
従って、一態様において、本開示は、ＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域およびＣＤＲ３領域を含む重鎖可変領域を有する、ＣＤ４０に結合する単離モノクローナル抗体（例えば、ヒト化抗体）、または、その抗原結合部分に関連し、ＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域は、（１）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、８および１５；（２）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、９および１５；（３）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、９および１５；（４）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１０および１６；（５）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、１１および１７；（６）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、１２および１８；（７）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、１３および１９；または（８）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、１４および２０と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するか、または、それらに記載されるアミノ酸配列を含み、抗体またはその抗原結合断片は、ＣＤ４０に結合する。
【0009】
一態様において、本開示の単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するか、または、それらに記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、抗体またはその抗原結合断片はＣＤ４０に結合する。
【0010】
一態様において、本開示の単離モノクローナル抗体、または、その抗原結合部分は、ＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変領域を含み、ＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域は、（１）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１、２７および３１；（２）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２、２８および３２；（３）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３、２９および３３；（４）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４、２７および３４；（５）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５、２７および３５；または（６）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６、３０および３６と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するか、または、それらに記載されているアミノ酸配列を含み、抗体またはその抗原結合断片はＣＤ４０に結合する。
【0011】
一態様において、本開示の単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、または６１と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するか、または、それに記載されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、抗体またはその抗原結合断片はＣＤ４０に結合する。
【0012】
一態様において、本開示の単離モノクローナル抗体、または、その抗原結合部分は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域（各々がＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域およびＣＤＲ３領域を含む）を含み、重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３、ならびに、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３は、（１）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、８、１５、２１、２７および３１；（２）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、９、１５、２１、２７および３１；（３）それぞれ２、９、１５、２１、２７および３１；（４）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１０、１６、２２、２８および３２；（５）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、１１、１７、２３、２９および３３；（６）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、１２、１８、２４、２７および３４；（７）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、１３、１９、２５、２７および３５；または（８）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、１４、２０ ２６、３０および３６と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するか、または、それらに記載されているアミノ酸配列を含み、抗体またはその抗原結合断片はＣＤ４０に結合する。
【0013】
一実施形態において、本開示の単離モノクローナル抗体、または、その抗原結合部分は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、（１）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７および５１；（２）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８および５２；（３）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９および５３；（４）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０および５４；（５）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１および５５；（６）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４および５８；（７）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５および５９；（８）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６および６０；（９）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６および６１；（１０）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７および６０；（１１）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７および６１；（１２）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８および５９；（１３）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９および６０；（１４）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９および６１；（１５）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０および６０；または（１６）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０および６１と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するか、または、それらに記載されたアミノ酸配列を含み、抗体またはその抗原結合断片はＣＤ４０に結合する。
【0014】
一実施形態において、本開示の単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分は、重鎖および軽鎖を含み、重鎖は重鎖可変領域および重鎖定常領域を含み、軽鎖は軽鎖可変領域および軽鎖定常領域を含み、重鎖定常領域は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：６２、６３または６４と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％ ９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するか、または、それらに記載されているアミノ酸配列を含み、軽鎖定常領域は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：６５または６６と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％ ９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するか、または、それらに記載されているアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、上に説明されたアミノ酸配列お含み、抗体またはその抗原結合断片はＣＤ４０に結合する。
【0015】
いくつかの実施形態において、本開示の抗体は、ジスルフィド結合によって接続された２つの重鎖および２つの軽鎖を含むか、または、それらから成り、各重鎖は重鎖定常領域、重鎖可変領域、または上述のＣＤＲ配列を含み、各軽鎖は、軽鎖定常領域、軽鎖可変領域、または、上述のＣＤＲ配列を含み、重鎖可変領域のＣ末端は重鎖定常領域のＮ末端に連結され、軽鎖可変領域のＣ末端は軽鎖定常領域のＮ末端に連結され、抗体はＣＤ４０に結合する。開示の抗体は、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４アイソタイプの完全長抗体であり得る。開示の抗体はカッパ定常領域を含み得る。他の実施形態における本開示の抗体は、一本鎖抗体であり得るか、または、ＦａｂもしくはＦａｂ'２断片などの抗体断片から成り得る。
【0016】
本開示の例示的な抗体または抗原結合断片は、ヒトおよびサルＣＤ４０に特異的に結合し、ＣＤ４０‐ＣＤ４０Ｌ相互作用をブロックまたは促進する。ＣＤ４０シグナル伝達を活性化して樹状細胞などの免疫細胞の成熟を促進することが可能な本開示の例示的なアゴニストＣＤ４０抗体は、従来技術の抗ＣＤ４０アゴニスト抗体と同等であるか、またはそれより優れたｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍作用を有し、毒性は同じか、またはより低い。抗体投与段階の後でも、腫瘍は増殖しないか、または、更には完全に消失する。
【0017】
開示はまた、第２の機能部分（例えば、第２の抗体）に連結された、開示の抗体またはその抗原結合部分を含む二重特異性分子を提供し、第２の機能部分は、上記の抗体またはその抗原結合部分とは異なる結合特異性を有する。
【0018】
開示の抗体またはその抗原結合部分、または二重特異性分子を含む組成物、および、薬学的に許容される担体も提供される。
【0019】
開示の抗体またはその抗原結合部分をエンコードする核酸分子、ならびに、そのような核酸を含む発現ベクター、および、そのような発現ベクターを含む宿主細胞も開示に包含される。発現ベクターを含む宿主細胞を使用して抗ＣＤ４０抗体を調製するための方法も提供され、（ｉ）抗体を宿主細胞において発現する段階と、（ｉｉ）抗体を宿主細胞またはその細胞培養から単離する段階とを含む。
【0020】
別の態様において、開示は、治療有効量の開示の抗体またはその抗原結合部分を対象に投与する段階を備える、対象における免疫反応を強化するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、方法は、開示の組成物または二重特異性分子を投与する段階を備える。
【0021】
別の態様において、開示は、必要とする対象における炎症性疾患、感染症、アテローム血栓症、または呼吸器疾患を治療するための方法を提供し、当該方法は、治療有効量の開示の抗体またはその抗原結合部分を対象に投与する段階を備える。いくつかの実施形態において、方法は、本開示の組成物または二重特異性分子を投与する段階を備える。いくつかの実施形態において、抗炎症剤および抗微生物剤などの追加の薬剤が開示の抗体またはその抗原結合部分と共に投与され得る。いくつかの実施形態において、炎症性疾患は自己免疫疾患を含む。
【0022】
更に別の態様において、開示は、対象における癌疾患を予防、治療、または緩和するための方法を提供し、当該方法は、治療有効量の開示の抗体またはその抗原結合部分を対象に投与する段階を備える。癌は固形または非固形腫瘍であり得、Ｂ細胞リンパ腫、慢性リンパ球性白血病、多発性骨髄腫、黒色腫、結腸腺癌、膵臓癌、大腸癌、胃腸癌、前立腺癌、膀胱癌、腎臓癌、卵巣癌、子宮頸癌、乳癌、肺癌および鼻咽頭癌を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、方法は、開示の組成物または二重特異性分子を投与する段階を備える。いくつかの実施形態において、抗ＶＩＳＴＡ抗体（Ｔ細胞活性化のタンパク質Ｖドメイン免疫グロブリン（Ｉｇ）サプレッサ（ＶＩＳＴＡ、ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ １ホモログ、ＰＤ１Ｈ、ＰＤ‐１Ｈ）に対する抗体）、抗ＰＤ‐１抗体、抗ＰＤ‐Ｌ１抗体、抗ＬＡＧ‐３抗体、および／または抗ＣＴＬＡ－４抗体などの少なくとも１つの追加の抗癌抗体が、開示の抗体またはその抗原結合部分と共に投与され得る。更に別の実施形態において、開示の抗体、または、その抗原結合部分は、サイトカイン（例えば、ＩＬ‐２および／またはＩＬ‐２１）または共刺激抗体（例えば、抗ＣＤ１３７および／または抗ＧＩＴＲ抗体）と共に投与される。別の実施形態において、開示の抗体またはその抗原結合部分は、エピルビシン、オキサリプラチンおよび／または５‐フルオロウラシル（５‐ＦＵ）などの細胞毒性剤であり得る化学療法剤と共に投与される。本開示の抗体は例えば、マウス、ヒト、キメラ、またはヒト化抗体であり得る。
【0023】
本開示の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および例から明らかであるが、これは限定として解釈されるべきでない。本出願全体において引用されるすべての参考文献、Ｇｅｎｂａｎｋエントリ、特許および特許出願公開の内容は、参照によって本明細書に明示的に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【0024】
【図1】１０８のハイブリドーマクローンのアゴニスト活性ランキングを示す。
【0025】
【図2】ＣＤ４０‐ＣＤ４０Ｌ相互作用に対する抗ＣＤ４０抗体の促進または阻害作用を示し、抗体１６Ａ、７Ｂ４および１３Ａは、ＣＤ４０‐ＣＤ４０Ｌ相互作用を促進し（Ａ）、抗体９２Ｆ６は、ＣＤ４０‐ＣＤ４０Ｌ相互作用（Ｂ）を阻害した。
【0026】
【図3】抗ＣＤ４０抗体のアゴニスト活性を示す。
【0027】
【図4】ＣＤ８６（Ａ）、ＣＤ８０（Ｂ）およびＣＤ８３（Ｃ）を染色することによって測定される、樹状細胞成熟における抗ＣＤ４０抗体の関与を示す。
【0028】
【図5】ＨＥＫ２９３Ａ細胞で発現されるヒトＣＤ‐４０（Ａ）またはサルＣＤ４０（Ｂ）に対するキメラ抗ＣＤ４０抗体の結合能力を示す。
【0029】
【図6】キメラ抗ＣＤ４０抗体のアゴニスト活性を示す。
【0030】
【図7】ＣＤ８６の染色によって測定される、樹状細胞成熟における抗ＣＤ４０抗体の関与を示す。
【0031】
【図8】ヒトまたはサルＣＤ４０に対するキメラおよびヒト化抗ＣＤ４０抗体の結合能力を示し、キメラおよびヒト化１３Ａ２抗体（Ａ）およびヒト化７Ｂ４抗体（Ｂ）はヒトＣＤ４０に結合し、キメラおよびヒト化１３Ａ２抗体（Ｃ）およびヒト化７Ｂ４抗体（Ｄ）はサルＣＤ４０に結合される。
【0032】
【図9】キメラおよびヒト化７Ｂ４抗体（Ａ）ならびにキメラおよびヒト化１３Ａ２抗体（Ｂ）のアゴニスト活性を示す。
【0033】
【図10】ＣＤ８６（Ａ）、ＣＤ８０（Ｂ）およびＣＤ８３（Ｃ）の染色によって測定される、ドナー１からの樹状細胞の成熟における抗ＣＤ４０抗体の関与を示す。
【0034】
【図11】ＣＤ８６（Ａ）およびＣＤ８０（Ｂ）の染色によって測定される、ドナー２からの樹状細胞の成熟における抗ＣＤ４０抗体の関与を示す。
【0035】
【図12】ＣＤ８６（Ａ）、ＣＤ８０（Ｂ）およびＩＬ‐１２（Ｃ）の染色によって測定される、ドナー３からの樹状細胞の成熟に関与する抗ＣＤ４０抗体を示す。
【0036】
【図13】ＳＰＲによって測定される、ヒトＣＤ４０に対するキメラおよびヒト化抗ＣＤ４０抗体７Ｂ４（Ａ）、７Ｂ４－ＶＨ０ＶＬ０（Ｂ）、７Ｂ４－ＶＨ２ＶＬ２（Ｃ）、７Ｂ４－ＶＨ２ＶＬ３（Ｄ）、７Ｂ４－ＶＨ３ＶＬ２（Ｅ）、７Ｂ４－ＶＨ３ＶＬ３（Ｆ）、１３Ａ２（Ｇ）、１３Ａ２－ＶＨ０ＶＬ０（Ｈ）、１３Ａ２－ＶＨ２ＶＬ２（Ｉ）、１３Ａ２－ＶＨ２ＶＬ３（Ｊ）、１３Ａ２－ＶＨ３ＶＬ２（Ｋ）および１３Ａ２－ＶＨ３ＶＬ３（Ｌ）、ならびに、参照抗体ＲＯ７００９７８９（Ｍ）およびＡＤＣ１０１３（Ｎ）の結合親和性を示す。
【0037】
【図14】完全長ＣＤ４０‐ＥＣＤまたはその欠失体（Ａ）に対する、および、完全長ＣＤ４０‐ＥＣＤまたはその変異体（Ｂ）に対するキメラおよびヒト化抗ＣＤ４０抗体の結合能力を示す。
【0038】
【図15】ヒトＣＤ４０に対するヒト化抗ＣＤ４０抗体７Ｂ４－ＶＨ２ＶＬ２（Ａ）および１３Ａ２－ＶＨ３ＶＬ３（Ｂ）の結合特異性を示す。
【0039】
【図16】ＣＤ８６（Ａ）、ＣＤ８０（Ｂ）、およびＣＤ８３（Ｃ）の染色によって測定される、樹状細胞成熟における操作された抗ＣＤ４０抗体の関与を示す。
【0040】
【図17】各群における平均腫瘍体積（Ａ）、および、ビヒクルと共に投与された群における個々の腫瘍体積（Ｂ）、７Ｂ４ＶＨ２ＶＬ２（Ｃ）、３Ａ２ＶＨ３ＶＬ３（Ｄ）、ＲＯ７００９７８９（Ｅ）またはＡＰＸ００５（Ｆ）を示す。
【0041】
【図18】開示のヒト化抗ＣＤ４０抗体または対照薬剤を投与された群における動物の平均体重を示す。
【0042】
【図19】腫瘍浸潤ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞（Ａ）およびＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞（Ｂ）の増殖に対するヒト化抗ＣＤ４０抗体のｉｎ ｖｉｖｏ作用を示す。
【0043】
【図20】ＣＤ８６、ＣＤ８０、およびＣＤ８３の染色によって測定される、腫瘍浸潤樹状細胞（ＣＤ４５陽性およびＣＤ１１ｃ陽性細胞）の成熟に対するヒト化抗ＣＤ４０抗体のｉｎ ｖｉｖｏ作用を示す。
【発明を実施するための形態】
【0044】
本開示がより容易に理解され得ることを保証するべく、特定の用語をまず定義する。追加の定義は、詳細な説明全体を通して記載される。
【0045】
「ＣＤ４０」という用語は腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバ５を指す。「ＣＤ４０」という用語は、バリアント、アイソフォーム、ホモログ、オーソログ、およびパラログを含む。例えば、ヒトＣＤ４０タンパク質に特異的な抗体は、特定の場合において、サルなど、ヒト以外の種のＣＤ４０タンパク質と交差反応し得る。他の実施形態において、ヒトＣＤ４０タンパク質に特異的な抗体は、ヒトＣＤ４０タンパク質に完全に特異的であり得、他の種または他のタイプに対して交差反応性を示さないことがあり得、または、すべての他の種ではないが特定の他の種のＣＤ４０と交差反応し得る。
【0046】
「ヒトＣＤ４０」という用語は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１２４１．１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８）を有するヒトＣＤ４０のアミノ酸配列など、ヒトのアミノ酸配列を有するＣＤ４０タンパク質を指す。「サルまたはアカゲザルＣＤ４０」および「マウスＣＤ４０」という用語はそれぞれ、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１２５２７９１．１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：７０）およびＮＰ＿０３５７４１．２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：７２）をそれぞれ有するアミノ酸配列を有するものなどのサルおよびマウスＣＤ４０配列を指す。
【0047】
本明細書において言及される「抗体」という用語は、全抗体および任意の抗原結合断片（すなわち、「抗原結合部分」）またはその一本鎖を含む。全抗体は、ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽鎖（Ｌ）を含む糖タンパク質である。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書においてＶＨと略記される）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つのドメイン、すなわち、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書においてＶＬと略記される）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は１つのドメインＣＬを含む。ＶＨおよびＶＬ領域は更に、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域に細分化でき、フレームワーク領域（ＦＲ）と称される、より保存的な領域が点在する。各ＶＨおよびＶＬは、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成され、アミノ末端からカルボキシ末端まで、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順に配置される。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）、および、古典的補体経路の第１成分（Ｃ１ｑ）を含む、宿主の組織または因子に対する免疫グロブリンの結合を媒介できる。
【0048】
本明細書において使用される場合、抗体の「抗原結合部分」（または単に「抗体部分」）という用語は、抗原（例えばＣＤ４０タンパク質）に特異的に結合する能力を保持する抗体の１または複数の断片を指す。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体の断片によって実行され得ることが示された。抗体の「抗原結合部分」という用語に包含される結合断片の例は、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインから成る一価断片であるＦａｂ断片、（ｉｉ）ヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ'）２断片、（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインから成るＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインから成るＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインから成るｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．， （１９８９） Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４－５４６）、（ｖｉ）隔離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、および、（ｖｉｉｉ）単一の可変ドメインおよび２つの定常ドメインを含む重鎖可変領域であるナノボディを含む。更に、Ｆｖ断片の２つのドメインであるＶＬおよびＶＨは、別の遺伝子によってコードされるが、組み換えの方法を使用することにより、合成リンカによって連結することができ、ＶＬおよびＶＨ領域が対合して一価分子（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られ、例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．， （１９８８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６； ａｎｄ Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， （１９８８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３）を参照されたい）を形成する単一タンパク質鎖となることが可能となる。そのような一本鎖抗体はまた、抗体の「抗原結合部分」という用語に包含されることが意図される。これらの抗体断片は、当業者に知られている従来の技法を使用して取得され、断片は、完全な抗体と同じ方式で、使用性に関してスクリーニングされる。
【0049】
本明細書において使用される場合、「単離抗体」とは、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指すことが意図される（例えば、ＣＤ４０タンパク質に特異的に結合する単離抗体は、ＣＤ４０タンパク質以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。しかしながら、ヒトＣＤ４０タンパク質に特異的に結合する単離抗体は他の種のＣＤ４０タンパク質など、他の抗原に対する交差反応性を有し得る。更に、単離抗体は、他の細胞材料および／または化学物質を実質的に含まないことがあり得る。
【0050】
本明細書において使用される場合、「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、単一分子組成物の抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対して、単一結合特異性および親和性を示す。
【0051】
本明細書において使用される場合、「マウス抗体」という用語は、フレームワークおよびＣＤＲ領域の両方がマウス生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する抗体を含むことが意図される。更に、抗体が定常領域を含む場合、定常領域も、マウス生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する。開示のマウス抗体は、マウス生殖細胞系免疫グロブリン配列によってエンコードされないアミノ酸残基（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏのランダムまたは部位特異的変異誘発、または、ｉｎ ｖｉｖｏの体細胞変異によって導入される変異）を含み得る。しかしながら、本明細書において使用される場合、「マウス抗体」という用語は、別の哺乳類種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がマウスのフレームワーク配列に移植された抗体を含むことが意図されない。
【0052】
「キメラ抗体」という用語は、非ヒトの供給元からの遺伝物質をヒトの遺伝物質と組み合わせることによって作られる抗体を指す。または、より一般に、キメラ抗体は、別の種の遺伝物質を有する特定の種の遺伝物質を有する抗体である。
【0053】
本明細書において使用される場合、「ヒト化抗体」という用語は、ヒトにおいて天然に産生される抗体バリアントとの類似性を増加させるように改変されたタンパク質配列を有する非ヒト種の抗体を指す。
【0054】
「抗原を認識する抗体」および「抗原に特異的な抗体」という語句は、本明細書において、「抗原に特異的に結合する抗体」という用語と交換可能に使用される。
【0055】
本明細書において使用される場合、「ヒトＣＤ４０に特異的に結合する抗体」とは、ヒトＣＤ４０タンパク質（および、場合によっては、１または複数の非ヒト種からのＣＤ４０タンパク質）に結合するが、非ＣＤ４０タンパク質に実質的に結合しない抗体を指すことが意図される。好ましくは、抗体は、「高親和性」で、すなわち、ＫＤ５．０×１０－８Ｍ以下、より好ましくは、１．０×１０－８Ｍ以下、より好ましくは、５．０×１０－９以下でヒトＣＤ４０タンパク質に結合する。
【0056】
本明細書において使用される場合、タンパク質または細胞に「実質的に結合しない」という用語は、タンパク質または細胞に結合しない、または、高親和性で結合しない、すなわち、１．０×１０－６Ｍ以上、より好ましくは１．０×１０－５Ｍ以上、より好ましくは１．０×１０－４Ｍ以上、より好ましくは１．０×１０－３Ｍ以上、更により好ましくは１．０×１０－２Ｍ以上のＫＤでタンパク質または細胞に結合することを意味する。
【0057】
ＩｇＧ抗体に対する「高親和性」という用語は、標的抗原に対して、１．０×１０－６Ｍ以下、より好ましくは５．０×１０－８Ｍ以下、更により好ましくは１．０×１０－８Ｍ以下、更により好ましくは５．０×１０－９Ｍ以下、更により好ましくは１．０×１０－９Ｍ以下のＫＤを有する抗体を指す。しかしながら、「高親和性」結合は、他の抗体アイソタイプに対して変動し得る。例えば、ＩｇＭアイソタイプに対する「高親和性」結合は、１０－６Ｍ以下、より好ましくは１０－７Ｍ以下、更により好ましくは１０－８Ｍ以下のＫＤを有する抗体を指す。
【0058】
本明細書において使用される場合、「Ｋａｓｓｏｃ」または「Ｋａ」という用語は、特定の抗体‐抗原相互作用の会合速度を指すことを意図し、本明細書において使用される場合、「Ｋｄｉｓ」または「Ｋｄ」という用語は、特定の抗体‐抗原相互作用の解離速度を指すことを意図する。本明細書において使用される場合、「ＫＤ」という用語は、Ｋａに対するＫｄの比（すなわち、Ｋｄ／Ｋａ）から取得される解離定数を指すことを意図し、モル濃度（Ｍ）で表現される。抗体のＫＤ値は、本技術分野において十分に確立された方法を使用して決定され得る。抗体のＫＤを決定するための好ましい方法は、表面プラズモン共鳴を使用する、好ましくは、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムなどのバイオセンサシステムを使用することによるものである。
【0059】
半数効果濃度としても知られる「ＥＣ５０」という用語は、指定された曝露時間後のベースラインと最大値との間の中間の応答を誘導する抗体の濃度を指す。
【0060】
「対象」という用語は、任意のヒトまたは非ヒト動物を含む。「非ヒト動物」という用語は、すべての脊椎動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ニワトリ、両生類、および爬虫類など、哺乳類および非哺乳類を含むが、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマなどの哺乳類が好ましい。
【0061】
「アゴニストＣＤ４０抗体」または「アゴニスト抗ＣＤ４０抗体」という用語は、ＣＤ４０に結合してＣＤ４０シグナル伝達を活性化または誘導し、免疫細胞活性化および増殖、ならびにサイトカインおよびケモカイン産生を促進する抗ＣＤ４０抗体を指す。「アンタゴニストＣＤ４０抗体」という用語は、ＣＤ４０Ｌの係合によって誘導され得るＣＤ４０シグナル伝達をブロックまたは阻害する抗ＣＤ４０抗体を指す。
【0062】
「治療有効量」という用語は、疾患または病状（癌など）に関連する症状を予防または緩和する、および／または、疾患または病状の重篤度を低減するのに十分な本開示の抗体の量を意味する。治療有効量は、治療される病状の文脈に沿うものと理解され、実際の有効量は、当業者によって容易に認識される。
【0063】
開示の様々な態様が、以下のサブセクションで更に詳細に説明される。
【0064】
ヒトＣＤ４０に対する結合特異性を有する抗ＣＤ４０抗体、および、その有利な機能特性
【0065】
開示の例示的な抗体またはその抗原結合部分は、高親和性、例えば、１×１０－８Ｍ以下のＫＤでヒトＣＤ４０に特異的に結合する。抗体はまた、サルＣＤ４０との交差反応性を有するが、マウスＣＤ４０とは結合しない。
【0066】
開示の例示的な抗体は、ＣＤ４０シグナル伝達を活性化または誘導するアゴニストＣＤ４０抗体であり、従って、免疫細胞活性化および増殖、ならびにサイトカインおよびケモカイン産生に関与する。
【0067】
開示の例示的な抗体またはその抗原結合部分は、従来技術のアゴニスト抗ＣＤ４０抗体と同等か、それ以上のｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍作用を有し、毒性はそれと同じか、またはより低い。抗体投与が停止した後でも、腫瘍は増殖しないか、または、更には完全に消失する。
【0068】
好ましくは、開示の抗体はモノクローナル抗体である。追加的または代替的に、抗体は例えば、マウス、キメラ、または、ヒト化モノクローナル抗体であり得る。
【0069】
モノクローナル抗ＣＤ４０抗体
【0070】
開示の例示的な抗体は、下および以下の例において説明されるような構造的および化学的な特徴を有するモノクローナル抗体である。例示的な抗ＣＤ４０抗体のＶＨアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０に記載される。例示的な抗ＣＤ４０抗体のＶＬアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、または６１に示される。例示的な抗体の重鎖／軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、下の表１にまとめられている。いくつかのクローンは同じＶＨまたはＶＬを共有する。これらの例示的な抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２、６３または６４に記載される重鎖定常領域、および、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５または６６に記載される軽鎖定常領域を含み得、重鎖可変領域のＣ末端は重鎖定常領域のＮ末端に連結され得、軽鎖可変領域のＣ末端は、軽鎖定常領域のＮ末端に連結され得る。
【0071】
表１における重鎖可変領域ＣＤＲおよび軽鎖可変領域ＣＤＲは、Ｋａｂａｔナンバリングシステムによって定義された。しかしながら、本技術分野においてよく知られるように、ＣＤＲ領域は、重鎖／軽鎖可変領域配列に基づいて、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＩＭＧＴ、ＡｂＭ、またはＣｏｎｔａｃｔナンバリングシステム／方法など、他のシステムによっても決定できる。
【0072】
ヒトＣＤ４０に結合する他の抗ＣＤ４０抗体のＶＨおよびＶＬ配列（またはＣＤＲ配列）は、本開示の抗ＣＤ４０抗体のＶＨおよびＶＬ配列（またはＣＤＲ配列）と組み合わされ得る。好ましくは、ＶＨおよびＶＬ鎖（またはそのような鎖の中のＣＤＲ）が組み合わされるとき、特定のＶＨ／ＶＬペアからのＶＨ配列は、構造的に同様のＶＨ配列と置き換えられる。同様に、好ましくは、特定のＶＨ／ＶＬペアからのＶＬ配列は、構造的に同様のＶＬ配列と置き換えられる。
【0073】
従って、一実施形態において、開示の抗体またはその抗原結合部分は、以下を含む。
（ａ）表１において上に列挙されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および、
（ｂ）表１において上に列挙されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または、別の抗ＣＤ４０抗体のＶＬ（抗体はヒトＣＤ４０に特異的に結合する）
（ａ）表１において上に列挙されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および、
（ｂ）表１において上に列挙されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または、別の抗ＣＤ４０抗体のＶＬ（抗体はヒトＣＤ４０に特異的に結合する）
【0074】
別の実施形態において、開示の抗体またはその抗原結合部分は、以下を含む。
（ａ）表１において上に列挙された重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域、ならびに、
（ｂ）表１において上に列挙された軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域、または、別の抗ＣＤ４０抗体のＣＤＲ（抗体はヒトＣＤ４０に特異的に結合する）
（ａ）表１において上に列挙された重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域、ならびに、
（ｂ）表１において上に列挙された軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域、または、別の抗ＣＤ４０抗体のＣＤＲ（抗体はヒトＣＤ４０に特異的に結合する）
【0075】
更に別の実施形態において、抗体またはその抗原結合部分は、ヒトＣＤ４０に結合する他の抗体のＣＤＲ、例えば、重鎖可変領域からのＣＤＲ１および／またはＣＤＲ３、および／または、異なる抗ＣＤ４０抗体の軽鎖可変領域からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３と組み合わされた抗ＣＤ４０抗体の重鎖可変ＣＤＲ２領域を含む。
表１
重鎖／軽鎖可変領域のアミノ酸配列
表１
重鎖／軽鎖可変領域のアミノ酸配列
【表1】
【0076】
加えて、本技術分野において、ＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２ドメインから独立のＣＤＲ３ドメインは単独で、類似の抗原に対する抗体の結合特異性を決定できること、ならびに、共通のＣＤＲ３配列に基づいて同じ結合特異性を有する複数の抗体を予測的に生成できることが知られている。例えば、Ｋｌｉｍｋａ ｅｔ ａｌ．，， Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊ． ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ ８３（２）：２５２－２６０ （２０００）； Ｂｅｉｂｏｅｒ ｅｔ ａｌ．，， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２９６：８３３－８４９ （２０００）； Ｒａｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９５：８９１０－８９１５ （１９９８）； Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．，， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１６：２１６１－２１６２ （１９９４）； Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．，， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９２：２５２９－２５３３ （１９９５）； Ｄｉｔｚｅｌ ｅｔ ａｌ．，， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５７：７３９－７４９ （１９９６）； Ｂｅｒｅｚｏｖ ｅｔ ａｌ．，， ＢＩＡｊｏｕｒｎａｌ ８： Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｖｉｅｗ ８ （２００１）； Ｉｇａｒａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，， Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ （Ｔｏｋｙｏ） １１７：４５２－７ （１９９５）； Ｂｏｕｒｇｅｏｉｓ ｅｔ ａｌ．，， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ ７２：８０７－１０ （１９９８）； Ｌｅｖｉ ｅｔ ａｌ．，， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９０：４３７４－８ （１９９３）； Ｐｏｌｙｍｅｎｉｓ ａｎｄ Ｓｔｏｌｌｅｒ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５２：５２１８－５３２９ （１９９４） ａｎｄ Ｘｕ ａｎｄ Ｄａｖｉｓ， Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １３：３７－４５ （２０００）を参照されたい。また、米国特許第６，９５１，６４６号；第６，９１４，１２８号；第６，０９０，３８２号；第６，８１８，２１６号；第６，１５６，３１３号；第６，８２７，９２５号；第５，８３３，９４３号；第５，７６２，９０５号および第５，７６０，１８５号を参照されたい。これらの参照の各々は、全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【0077】
従って、別の実施形態において、開示の抗体は、抗ＣＤ４０抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ２、および、抗ＣＤ４０抗体の重鎖および／または軽鎖可変領域の少なくともＣＤＲ３、または、別の抗ＣＤ４０抗体の重鎖および／または軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含み、抗体はヒトＣＤ４０に特異的に結合可能である。これらの抗体は好ましくは、（ａ）ＣＤ４０に結合するために競合し、（ｂ）機能的特性を保持し、（ｃ）同じエピトープに結合し、および／または、（ｄ）本開示の抗ＣＤ４０抗体と同様の結合親和性を有する。更に別の実施形態において、抗体は更に、抗ＣＤ４０抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ２、または、別の抗ＣＤ４０抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ２を含み得、抗体はヒトＣＤ４０に特異的に結合可能である。別の実施形態において、開示の抗体は、抗ＣＤ４０抗体の重鎖および／または軽鎖可変領域のＣＤＲ１、または、別の抗ＣＤ４０抗体の重鎖および／または軽鎖可変領域のＣＤＲ１を含み得、抗体はヒトＣＤ４０に特異的に結合可能である。
【0078】
保存的改変
【0079】
別の実施形態において、開示の抗体は、１または複数の保存的改変によって、本開示の抗ＣＤ４０抗体とは異なる、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列の重鎖および／または軽鎖可変領域配列を含む。本技術分野において、抗原結合を排除しない特定の保存的配列改変が行われ得ることが理解される。例えば、Ｂｒｕｍｍｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， （１９９３） Ｂｉｏｃｈｅｍ ３２：１１８０－８； ｄｅ Ｗｉｌｄｔ ｅｔ ａｌ．， （１９９７） Ｐｒｏｔ． Ｅｎｇ． １０：８３５－４１； Ｋｏｍｉｓｓａｒｏｖ ｅｔ ａｌ．， （１９９７） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：２６８６４－２６８７０； Ｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．， （１９９２） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４９：１６０５－１２； Ｋｅｌｌｅｙ ａｎｄ Ｏ'Ｃｏｎｎｅｌｌ （１９９３） Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：６８６２－３５； Ａｄｉｂ－Ｃｏｎｑｕｙ ｅｔ ａｌ．， （１９９８） Ｉｎｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：３４１－６ ａｎｄ Ｂｅｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， （２０００） Ｃｌｉｎ． Ｃａｎ． Ｒｅｓ． ６：２８３５－４３を参照されたい。
【0080】
従って、一実施形態において、抗体は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域、および／または、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を備え、（ａ）重鎖可変領域ＣＤＲ１配列は、上の表１に列挙される配列、および／または、その保存的改変を含み、および／または、（ｂ）重鎖可変領域ＣＤＲ２配列は、上の表１に列挙される配列、および／または、その保存的改変を含み、（ｃ）重鎖可変領域ＣＤＲ３配列は、上の表１に列挙された配列、および、その保存的改変を含み、および／または、（ｄ）軽鎖可変領域ＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３配列は、上の表１に列挙された配列、および／または、その保存的改変を含み、（ｅ）抗体はヒトＣＤ４０に特異的に結合する。
【0081】
本開示の抗体は、ヒトＣＤ４０に対する高親和性結合など、上に記載れた以下の機能特性の１または複数を保有する。
【0082】
様々な実施形態において、抗体は例えば、マウス、ヒト、ヒト化、またはキメラ抗体であり得る。
【0083】
本明細書において使用される場合、「保存的配列改変」という用語は、アミノ酸配列を含む抗体の結合特性に著しく影響しない、または、それを変更しないアミノ酸改変を指すことを意図する。そのような保存的改変はアミノ酸置換、追加および欠失を含む。部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介変異誘発など、本技術分野において知られている標準的な技法によって、開示の抗体に改変が導入され得る。保存的アミノ酸置換とは、アミノ酸残基が、同様の側鎖を有するアミノ酸残基に置き換えられることである。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリが本技術分野において定義されている。これらのファミリは、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、極性無電荷側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。したがって、開示の抗体のＣＤＲ領域における１または複数のアミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリからの他のアミノ酸残基に置き換えられ得、変更された抗体は、本明細書において記載された機能的アッセイを使用して、保持された機能（すなわち、上に記載された機能）について試験され得る。
【0084】
操作および改変された抗体
【0085】
開示の抗体は、改変された抗体を操作するために、本開示の抗ＣＤ４０抗体のＶＨ／ＶＬ配列の１または複数を有する抗体を出発材料として使用して調製され得る。抗体は、一方または両方の可変領域（すなわち、ＶＨおよび／またはＶＬ）、例えば、１または複数のＣＤＲ領域、および／または、１または複数のフレームワーク領域における１または複数の残基を改変することによって操作され得る。追加的または代替的に、例えば抗体のエフェクター機能を変更するために、抗体は、定常領域内の残基を改変することによって操作され得る。
【0086】
特定の実施形態において、抗体の可変領域を操作するために、ＣＤＲ移植が使用され得る。抗体は、主に６の重鎖および軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）に位置するアミノ酸残基を通じて標的抗原と相互作用する。この理由から、ＣＤＲ内のアミノ酸配列は、ＣＤＲの外部の配列より、個別の抗体間の多様性が高い。ＣＤＲ配列は、大部分の抗体抗原相互作用を担うので、異なる特性を有する異なる抗体からのフレームワーク配列に移植された、特定の天然に発生する抗体からのＣＤＲ配列を含む発現ベクターを構築することによって、特定の天然に発生する抗体の特性を模倣する組み換え抗体を発現させることが可能である（例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， （１９９８） Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－３２７； Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， （１９８６） Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２－５２５； Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．， （１９８９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．を参照されたい、また、Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：１００２９－１００３３、米国特許第５，２２５，５３９号；第５，５３０，１０１号；第５，５８５，０８９号；第５，６９３，７６２号および第６，１８０，３７０号を参照されたい）。
【0087】
従って、開示の別の実施形態は、上に記載された本開示の配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域、および／または、上に記載された本開示の配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を備える単離モノクローナル抗体、または、その抗原結合部分に関連する。これらの抗体は本開示のモノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬ ＣＤＲ配列を含むが、異なるフレームワーク配列を含み得る。
【0088】
そのようなフレームワーク配列は、公共のＤＮＡデータベース、または、生殖系列抗体遺伝子配列を含む公開されている参考文献から取得できる。例えば、ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子の生殖系列ＤＮＡ配列は、「ＶＢａｓｅ」ヒト生殖系列配列データベース（インターネットで入手可能ｗｗｗ．ｍｒｃ－ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｖｂａｓｅ）、ならびに、上記で引用されるＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．， （１９９１）；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， （１９９２） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２７：７７６－７９８；およびＣｏｘ ｅｔ ａｌ．， （１９９４） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２４：８２７－８３６で見つけることができる。これらの各々の内容は、参照によって本明細書に明示的に組み込まれる。別の例として、ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子の生殖系列ＤＮＡ配列はＧｅｎｂａｎｋデータベースで見ることができる。例えば、ＨＣｏ７ ＨｕＭＡｂマウスにおいて見られる以下の重鎖生殖系列配列は、添付のＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号１－６９（ＮＧ－－００１０１０９、ＮＴ－－０２４６３７＆ＢＣ０７０３３３）、３－３３（ＮＧ－－００１０１０９＆ＮＴ－－０２４６３７）および３－７（ＮＧ－－００１０１０９＆ＮＴ－－０２４６３７）において入手可能である。別の例として、ＨＣｏ１２ ＨｕＭＡｂマウスにおいて見られる以下の重鎖生殖系列配列は、添付のＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号１‐６９（ＮＧ－－００１０１０９、ＮＴ－－０２４６３７＆ＢＣ０７０３３３）、５－５１（ＮＧ－－００１０１０９ ＆ＮＴ－－０２４６３７）、４－３４（ＮＧ－－００１０１０９＆ＮＴ－－０２４６３７）、３－３０．３（ＣＡＪ５５６６４４）＆３－２３（ＡＪ４０６６７８）において利用可能である。
【0089】
抗体タンパク質配列は、当業者に知られている、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ （上記のＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９７））と呼ばれる配列類似性検索方法の１つを使用して、まとめられたタンパク質配列データベースと比較される。
【0090】
開示の抗体において使用される好ましいフレームワーク配列は、開示の抗体によって使用されるフレームワーク配列と同様の構造である。ＶＨ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列は、生殖系列免疫グロブリン遺伝子において見られるものと同一の配列を有するフレームワーク領域に移植され得るか（フレームワーク配列は生殖系列免疫グロブリン遺伝子に由来する）、または、ＣＤＲ配列は、生殖系列配列と比較して１または複数の変異を含むフレームワーク領域に移植され得る。例えば、特定の場合において、抗体の抗原結合能力を維持または強化するために、フレームワーク領域内の残基を変異させることが有益であることが分かった（例えば、米国特許第５，５３０，１０１号；第５，５８５，０８９号；第５，６９３，７６２号および第６，１８０，３７０号を参照されたい）。
【0091】
別のタイプの可変領域改変は、ＶＨおよび／またはＶＬ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３領域におけるアミノ酸残基を変異させ、これによって、目的の抗体の１または複数の結合特性（例えば親和性）を改善することである。変異を導入するために、部位特異的変異誘発またはＰＣＲ媒介変異誘発が実行され得、抗体結合に対する影響、または、他の目的の機能特性が、本技術分野において知られているように、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏアッセイで評価され得る。好ましくは、保存的改変（本技術分野において知られている）が導入される。変異は、アミノ酸置換、追加、または欠失であり得るが、好ましくは置換である。更に、典型的には、ＣＤＲ領域内の１、２、３、４または５以下の残基が変更される。
【0092】
従って、別の実施形態において、開示は、（ａ）本開示の配列、または、１、２、３、４もしくは５つのアミノ酸置換、欠失、もしくは追加を有するアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ１領域、（ｂ）本開示の配列、または、１、２、３、４、もしくは５つのアミノ酸置換、欠失、もしくは追加を有するアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ２領域、（ｃ）本開示の配列、または、１、２、３、４、もしくは５つのアミノ酸置換、欠失、もしくは追加を有するアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ３領域、（ｄ）本開示の配列、または、１、２、３、４、もしくは５つのアミノ酸置換、欠失、もしくは追加を有するアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ１領域、（ｅ）本開示の配列、または、１、２、３、４、もしくは５つのアミノ酸置換、欠失、もしくは追加を有するアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ２領域、および（ｆ）本開示の配列、または、１、２、３、４、もしくは５つのアミノ酸置換、欠失、もしくは追加を有するアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ３領域を備える重鎖可変領域を備える、単離された抗ＣＤ４０モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。
【0093】
操作された開示の抗体は、例えば、抗体の特性を改善するために、ＶＨおよび／またはＶＬ内のフレームワーク残基に改変が行われたものを含む。典型的には、そのようなフレームワーク改変は、抗体の免疫原性を減少させるために行われる。例えば、１つのアプローチは、１または複数のフレームワーク残基を、対応する生殖系列配列に「復帰変異」させることである。より具体的には、体細胞変異を経験した抗体は、抗体の由来元である生殖系列配列とは異なるフレームワーク残基を含み得る。そのような残基は、抗体フレームワーク配列を、抗体の由来元である生殖系列配列と比較することによって識別され得る。
【0094】
別のタイプのフレームワーク改変は、Ｔ細胞エピトープを除去するために、フレームワーク領域内、または、更には１または複数のＣＤＲ領域内の１または複数の残基を変異させ、これによって、抗体の潜在的な免疫原性を低減することを伴う。このアプローチは、「脱免疫化」とも呼ばれ、米国特許出願公開第２００３０１５３０４３号に更に詳細に記載されている。
【0095】
フレームワークまたはＣＤＲ領域内で行われる改変に加えて、または替えて、開示の抗体は、典型的には、血中半減期、補体結合、Ｆｃ受容体結合、および／または、抗原依存的細胞毒性など、抗体の１または複数の機能的特性を変更するために、Ｆｃ領域内の改変を含むように操作され得る。更に、開示の抗体は、化学的に改変され得る（例えば、１または複数の化学的部分が抗体に取り付けられ得る）か、または、そのグリコシル化を変更するために改変され得、これにより、同様に抗体の１または複数の機能的特性が変更される。
【0096】
一実施形態において、ＣＨ１のヒンジ領域は、ヒンジ領域におけるシステイン残基の数が変更されるように、例えば、増加または減少するように改変される。このアプローチは米国特許第５，６７７，４２５号に更に記載される。ＣＨ１のヒンジ領域におけるシステイン残基の数は、例えば、軽鎖および重鎖の組み立てを促進するために、または、抗体の安定性を増加または減少させるために変更される。
【0097】
別の実施形態において、抗体のＦｃヒンジ領域は、抗体の生物学的半減期を減少させるために、変異される。より具体的には、ネイティブのＦｃヒンジドメインのスタフィロコッカスタンパク質Ａ（ＳｐＡ）結合と比べて弱いＳｐＡ結合を抗体が有するように、１または複数のアミノ酸変異が、Ｆｃヒンジ断片のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインインタフェース領域に導入される。このアプローチは、米国特許第６，１６５，７４５号に更に詳細に記載されている。
【0098】
更に別の実施形態において、抗体のグリコシル化は改変される。例えば、グリコシル化された抗体が作られ得る（すなわち、抗体はグリコシル化を有しない）。グリコシル化は、例えば、抗原に対する抗体の親和性を増加させるために変更され得る。そのような炭化水素改変は、例えば、抗体配列内のグリコシル化の１または複数の部位を変更することによって達成され得る。例えば、１または複数の可変領域フレームワークグリコシル化部位の除去をもたらす１または複数のアミノ酸置換が行われ得、これによって、当該部位のグリコシル化を除去する。そのようなアグリコシル 化により、抗原に対する抗体の親和性が増加し得る。例えば、米国特許第５，７１４，３５０号および第６，３５０，８６１号を参照されたい。
【0099】
追加的または代替的に、フコシル残基の量が低減された低フコシル化抗体、または、二分ＧｌｃＮａｃ構造を増加させた抗体など、グリコシル化のタイプが変更された抗体が作られ得る。そのような変更されたグリコシル化パターンは、抗体のＡＤＣＣ能力を増加させることが実証された。そのような炭化水素改変は、例えば、グリコシル化機構を変更した宿主細胞において、抗体を発現させることによって達成され得る。グリコシル化機構を変更した細胞が本技術分野において説明され、開示の組み換え抗体を発現させるための宿主細胞として使用され得、これによって、グリコシル化が変更された抗体が産生される。例えば、細胞株Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５、およびＭｓ７０９は、Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５、およびＭｓ７０９細胞株において発現する抗体がそれらの炭化水素上にフコースを有しないように、フコシルトランスフェラーゼ遺伝子ＦＵＴ８（α（１，６）‐フコシルトランスフェラーゼ）を有しない。Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５、およびＭｓ７０９ ＦＵＴ８‐／‐細胞株が、２つの置換ベクターを使用して、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞におけるＦＵＴ８遺伝子の標的化された破壊によって作成された（米国特許出願公開第２００４０１１０７０４号およびＹａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ．， （２００４） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ８７：６１４－２２を参照されたい）。別の例として、ＥＰ１，１７６，１９５は、フコシルトランスフェラーゼをエンコードする、機能的に破壊されたＦＵＴ８遺伝子を有する細胞株を記載し、そのような細胞株において発現する抗体は、α－１，６結合関連酵素を低減または除去することによって低フコシル化を示す。ＥＰ１，１７６，１９５はまた、抗体のＦｃ領域に結合するＮ‐セチルグルコサミンにフコースを追加するための酵素活性が低い、または、酵素活性を有さない細胞株、例えば、ラット骨髄腫細胞株ＹＢ２／０ （ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６６２）を記載する。ＰＣＴ公開ＷＯ０３／０３５８３５は、フコースをＡｓｎ（２９７）連結炭化水素に取り付ける能力が低減したバリアントＣＨＯ細胞株、Ｌｅｃ１３細胞を記載する。この結果、その宿主細胞において発現する抗体の低フコシル化も生じる（Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．， （２００２） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７７：２６７３３－２６７４０も参照されたい）。改変されたグリコシル化プロファイルを有する抗体はまた、ＰＣＴ公開ＷＯ０６／０８９２３１に記載されるように、ニワトリの卵において産生され得る。代替的に、改変されたグリコシル化プロファイルを有する抗体が、アオウキクサなどの植物細胞において産生さ得る。植物系における抗体産生のための方法が、２００６年８月１１日に出願されたＡｌｓｔｏｎ ＆ Ｂｉｒｄ ＬＬＰ ａｔｔｏｒｎｅｙ ｄｏｃｋｅｔ Ｎｏ． ０４０９８９／３１４９１１に対応する米国特許出願において開示されている。ＰＣＴ公開ＷＯ９９／５４３４２は、グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、β（１，４）‐Ｎ‐アセチルグルコサミントランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））を改変する糖タンパク質を発現するように操作された細胞株を記載する。それにより、操作された細胞株において発現する抗体は、抗体のＡＤＣＣ活性の増加をもたらす二分ＧｌｃＮａｃ構造の増加を示す（Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ．， （１９９９） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． １７：１７６－１８０も参照されたい）。代替的に、抗体のフコース残基は、フコシダーゼ酵素を使用して切断され得る。例えば、フコシダーゼα‐Ｌ‐フコシダーゼは、フコシル残基を抗体から除去する（Ｔａｒｅｎｔｉｎｏ ｅｔ ａｌ．， （１９７５） Ｂｉｏｃｈｅｍ． １４：５５１６－２３）。
【0100】
本開示によって想定される本明細書の抗体の別の改変はＰＥＧ化である。抗体は、例えば、抗体の生物学的（例えば、血中）半減期を増加させるためにＰＥＧ化され得る。抗体をＰＥＧ化するために、抗体またはその断片は典型的には、１または複数のＰＥＧ基が抗体または抗体断片に取り付けられる条件下において、ＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体などのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と反応される。好ましくは、ＰＥＧ化は、反応性ＰＥＧ分子（または、類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応を介して実行される。本明細書において使用される場合、「ポリエチレングリコール」という用語は、モノ（Ｃ１‐Ｃ１０）アルコキシまたはアリールオキシ‐ポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコール‐マレイミドなど、他のタンパク質を誘導体化するために使用されるＰＥＧの任意の形態を包含することが意図される。特定の実施形態において、ＰＥＧ化される抗体は、アグリコシル化抗体である。タンパク質をＰＥＧ化するための方法が本技術分野において知られ、開示の抗体に適用され得る。例えば、ＥＰＯ １５４ ３１６およびＥＰ ０ ４０１ ３８４を参照されたい。
【0101】
抗体の物理的特性
【0102】
開示の抗体は、その異なるクラスを検出および／または区別するための様々な物理的特性を特徴とし得る。
【0103】
例えば、抗体は、軽鎖または重鎖可変領域のいずれにおける１または複数のグリコシル化部位を含み得る。そのようなグリコシル化部位は、変更された抗原結合に起因して、抗体の免疫原性の増加、または、抗体のｐＫの変更をもたらし得る（Ｍａｒｓｈａｌｌ ｅｔ ａｌ （１９７２） Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ４１：６７３－７０２； Ｇａｌａ ａｎｄ Ｍｏｒｒｉｓｏｎ （２００４） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７２：５４８９－９４； Ｗａｌｌｉｃｋ ｅｔ ａｌ （１９８８） Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １６８：１０９９－１０９； Ｓｐｉｒｏ （２００２） Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １２：４３Ｒ－５６Ｒ； Ｐａｒｅｋｈ ｅｔ ａｌ （１９８５） Ｎａｔｕｒｅ ３１６：４５２－７； Ｍｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．， （２０００） Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３７：６９７－７０６）。グリコシル化は、Ｎ‐Ｘ‐Ｓ／Ｔ配列を含むモチーフにおいて発生することが知られている。いくつかの場合において、可変領域グリコシル化を含まない抗ＣＤ４０抗体を有することが好ましい。これは、可変領域においてグリコシル化モチーフを含まない抗体を選択すること、または、グリコシル化領域内の残基を変異させることのいずれによって達成され得る。
【0104】
好ましい実施形態において、抗体はアスパラギン異性部位を含まない。アスパラギンの脱アミド化は、Ｎ‐ＧまたはＤ‐Ｇ配列で発生し、ポリペプチド鎖にねじれを導入して安定性を減少させる（イソアスパラギン酸作用）イソアスパラギン酸残基の作成をもたらし得る。
【0105】
各抗体は、一般に６～９．５のｐＨ範囲に収まる固有の等電点（ｐＩ）を有する。ＩｇＧ１抗体のｐＩは典型的には、７～９．５のｐＨ範囲に収まり、ＩｇＧ４抗体のｐＩは、典型的には、６～８のｐＨ範囲に収まる。正常範囲外のｐＩを有する抗体は、ｉｎ ｖｉｖｏ条件下において、いくらかのアンフォールディングおよび不安定性を有し得ると考えられる。したがって、正常範囲に収まるｐＩ値を含む抗ＣＤ４０抗体を有することが好ましい。これは、正常範囲におけるｐＩを有する抗体を選択すること、または、荷電表面残基を変異させることのいずれかによって達成できる。
【0106】
開示の抗体をエンコードする核酸分子
【0107】
別の態様において、開示は、開示の抗体の重鎖および／または軽鎖可変領域またはＣＤＲをエンコードする核酸分子を提供する。核酸は、全細胞、細胞溶解液において、または、部分的に精製された、もしくは実質的に純粋な形態で存在し得る。核酸は、標準的な技法によって、他の細胞成分または他の混入物質、例えば、他の細胞核酸またはタンパク質などから精製されるとき、「単離」される、または、「実質的に純粋」になる。開示の核酸は、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得、イントロン配列を含んでも含まなくてもよい。好ましい実施形態において、核酸はｃＤＮＡ分子である。
【0108】
開示の核酸は、標準的な分子生物学の技法を使用して取得され得る。ハイブリドーマ（例えば、下で更に説明される、ヒト免疫グロブリン遺伝子を保有する遺伝子組み換えマウスから調製されたハイブリドーマ）によって発現される抗体については、ハイブリドーマによって作られる抗体の軽鎖および重鎖をエンコードするｃＤＮＡは、標準的なＰＣＲ増幅またはｃＤＮＡクローン技法によって取得され得る。免疫グロブリン遺伝子ライブラリから（例えば、ファージディスプレイ技法を使用して）取得される抗体については、そのような抗体をエンコードする核酸は、遺伝子ライブラリから回収され得る。
【0109】
好ましくは、開示の核酸分子は、ＣＤ４０モノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬ配列またはＣＤＲをエンコードするものを含む。ＶＨおよびＶＬセグメントをエンコードするＤＮＡ断片が取得されると、これらのＤＮＡ断片は、例えば、可変領域遺伝子を完全長抗体鎖遺伝子、Ｆａｂ断片遺伝子、またはｓｃＦｖ遺伝子に変換するために、標準的な組み換えＤＮＡ技法によって更に操作され得る。これらの操作において、ＶＬまたはＶＨをエンコードするＤＮＡ断片は、抗体定常領域またはフレキシブルリンカなどの、別のタンパク質をエンコードする別のＤＮＡ断片に作動可能に連結される。この文脈において使用される場合、「作動可能に連結される」という用語は、２つのＤＮＡ断片によってエンコードされるアミノ酸配列がインフレームに留まるように、２つのＤＮＡ断片が結合されることを意味するように意図される。
【0110】
ＶＨ領域をエンコードする単離ＤＮＡは、ＶＨをエンコードするＤＮＡを、重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３）をエンコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することによって、完全長重鎖遺伝子に変換され得る。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は、本技術分野において知られ、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は標準的なＰＣＲ増幅によって取得され得る。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、またはＩｇＤ定常領域であり得るが、もっとも好ましくは、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４定常領域である。Ｆａｂ断片重鎖遺伝子については、ＶＨをエンコードするＤＮＡは、重鎖ＣＨ１定常領域のみをエンコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結され得る。
【0111】
ＶＬ領域をエンコードする単離ＤＮＡは、ＶＬをエンコードするＤＮＡを、軽鎖定常領域ＣＬをエンコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することによって、完全長軽鎖遺伝子（ならびにＦａｂ軽鎖遺伝子）に変換され得る。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は、本技術分野において知られ、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は標準的なＰＣＲ増幅によって取得され得る。好ましい実施形態において、軽鎖定常領域は、カッパまたはラムダ定常領域であり得る。
【0112】
ｓｃＦｖ遺伝子を作成するために、ＶＨおよびＶＬをエンコードするＤＮＡ断片が、フレキシブルリンカをエンコードする、例えば、アミノ酸配列（Ｇｌｙ４－Ｓｅｒ）３をエンコードする別の断片に作動可能に連結される。その結果、ＶＨおよびＶＬ配列は、ＶＬおよびＶＨ領域がフレキシブルリンカによって結合された、連続する一本鎖タンパク質として発現され得る（例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．， （１９８８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６； Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， （１９８８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３； ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，， （１９９０） Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２－５５４を参照されたい）。
【0113】
開示のモノクローナル抗体の産生
【0114】
本開示のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ （１９７５） Ｎａｔｕｒｅ ２５６： ４９５の周知の体細胞ハイブリダイゼーション（ハイブリドーマ）技法を使用して産生され得る。モノクローナル抗体を産生するための他の実施形態は、Ｂリンパ球のウイルスまたは発癌性形質転換、および、ファージディスプレイ技法を含む。キメラまたはヒト化抗体も本技術分野において周知である。例えば、米国特許第４，８１６，５６７号；第５，２２５，５３９号；第５，５３０，１０１号；第５，５８５，０８９号；第５，６９３，７６２号および第６，１８０，３７０号を参照されたい。これらの内容は、全体として参照によって本明細書に具体的に組み込まれる。
【0115】
開示のモノクローナル抗体を生成するトランスフェクトーマの産生
【0116】
開示の抗体はまた、本技術分野において周知のように、例えば、組み換えＤＮＡ技法および遺伝子トランスフェクション方法（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， Ｓ． （１９８５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２）の組み合わせを使用して、宿主細胞トランスフェクトーマによって産生され得る。一実施形態において、標準的な分子生物学的技法によって取得される部分的または完全長軽鎖および重鎖をエンコードするＤＮＡは、１または複数の発現ベクターに挿入される。その結果、遺伝子は、転写および翻訳制御配列に作動可能に連結される。この文脈において、「作動可能に連結される」という用語は、ベクター内の転写および翻訳制御配列が、抗体遺伝子の転写および翻訳を制御する意図される機能を担うように、抗体遺伝子がベクターにライゲーションされることを意味するように意図される。
【0117】
「制御配列」という用語は、プロモータ、エンハンサ、および、抗体遺伝子の転写または翻訳を制御する他の発現制御要素（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことが意図される。そのような制御配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌに記載される（Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆ． （１９９０））。哺乳類宿主細胞発現のための好ましい制御配列は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウィルスに由来するプロモータおよび／またはエンハンサ、例えば、アデノウイルス主要後期プロモータ（ＡｄＭＬＰ）およびポリオーマなど、哺乳類細胞において高レベルのタンパク質発現を指令するウイルス要素を含む。代替的に、ユビキチンプロモータまたはβグロブリンプロモータなど、非ウイルス性制御配列が使用され得る。なお更に、ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型のＳＶ４０初期プロモータおよび長い末端反復からの配列を含むＳＲαプロモータシステムなどの異なる由来の配列から構成される制御要素（Ｔａｋｅｂｅ ｅｔ ａｌ．， （１９８８） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ８：４６６－４７２）も使用され得る。発現ベクターおよび発現対照配列は、使用される発現宿主細胞に適合するように選択される。
【0118】
抗体軽鎖遺伝子および抗体重鎖遺伝子は、同じ、または別個の発現ベクターに挿入され得る。好ましい実施形態において、任意の抗体アイソタイプの完全長抗体遺伝子を作成するために可変領域が使用される。それらは、所望のアイソタイプの重鎖定常領域および軽鎖定常領域を既にエンコードしている発現ベクターに挿入される。その結果、ＶＨセグメントは、ベクター内のＣＨセグメントに作動可能に連結され、ＶＬセグメントは、ベクター内のＣＬセグメントに作動可能に連結される。追加的または代替的に、組み換え発現ベクタは、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをエンコードし得る。抗体鎖遺伝子は、シグナルペプチドが抗体鎖遺伝子のアミノ末端にインフレームに連結されるように、ベクターにクローニングされ得る。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチド、または、異種混合のシグナルペプチド（すなわち、非免疫グロブリンタンパク質からのシグナルペプチド）であり得る。
【0119】
抗体鎖遺伝子および制御配列に加えて、開示の組み換え発現ベクタは、宿主細胞におけるベクターの複製を制御する配列（例えば、複製起点）および選択可能マーカ遺伝子など、追加の配列を保有し得る。選択可能マーカ遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞の選択を容易にする（例えば、米国特許第４，３９９，２１６号、第４，６３４，６６５号および第５，１７９，０１７号を参照）。例えば、選択可能マーカ遺伝子は典型的には、ベクターが導入された宿主細胞に対して、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、またはメトトレキサートなどの薬剤に対する抵抗性を付与する。好ましい選択可能マーカ遺伝子は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキサート選択／増幅と共に、ｄｈｆｒ宿主細胞において使用）およびｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択用）を含む。
【0120】
軽鎖および重鎖の発現のために、重鎖および軽鎖をエンコードする発現ベクターが、標準的な技法によって宿主細胞にトランスフェクトされる。「トランスフェクション」という用語の様々な形態は、外来性ＤＮＡを原核生物または真核生物の宿主細胞に導入するために一般に使用される幅広い様々な技法、例えば、電気穿孔法、りん酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥデキストラントランスフェクションなどを包含することが意図される。開示の抗体を原核生物または真核生物のいずれの宿主細胞において発現することも理論的に可能であるが、真核細胞（哺乳類宿主細胞がもっとも好ましい）における抗体の発現がもっとも好ましい。なぜなら、そのような真核細胞、特に哺乳類細胞は、原核生物の細胞と比較して、適切に折り畳まれた、免疫活性抗体を組み立てて分泌する可能性が高いからである。
【0121】
好ましくは、開示の組み換え抗体を発現するための哺乳類宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）（Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ， （１９８０） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７：４２１６－４２２０に記載されるｄｈｆｒ－ＣＨＯ細胞を含み、例えばＲ． Ｊ． Ｋａｕｆｍａｎ ａｎｄ Ｐ． Ａ． Ｓｈａｒｐ （１９８２） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １５９：６０１－６２１に記載されるようにＤＨＦＲ選択可能マーカーと共に使用される）、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞およびＳＰ２細胞を含む。特に、ＮＳＯ骨髄腫細胞と共に使用するための別の好ましい発現系は、ＷＯ８７／０４４６２、ＷＯ８９／０１０３６およびＥＰ３３８，８４１において開示されるＧＳ遺伝子発現系である。抗体遺伝子をエンコードする組み換え発現ベクタが哺乳類宿主細胞に導入されるとき、抗体は、宿主細胞における抗体の発現、または、より好ましくは、宿主細胞が増殖する培養培地への抗体の分泌を可能にするのに十分な期間にわたって宿主細胞を培養することによって産生される。抗体は、標準的なタンパク質精製方法を使用して培養培地から回収され得る。
【0122】
二重特異性分子
【0123】
別の態様において、本開示は、少なくとも２つの異なる結合部位または標的分子に結合する二重特異性分子を生成するために、少なくとも１つの他の機能性分子、例えば、別のペプチドまたはタンパク質（例えば、受容体に対する別の抗体またはリガンド）に連結された１または複数の開示の抗体を含む二重特異性分子を特徴とする。したがって、本明細書において使用される場合、「二重特異性分子」は、３以上の特異性を有する分子を含む。
【0124】
実施形態において、二重特異性分子は、抗Ｆｃ結合特異性および抗ＣＤ４０結合特異性に加えて、第３の特異性を有する。第３の特異性は、抗増強因子（ＥＦ）、例えば、細胞毒性活性に関与する表面タンパク質に結合する分子に対するものであり得、これによって標的細胞に対する免疫反応を増加させる。例えば、抗増強因子は、（例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ４０、またはＩＣＡＭ‐１を介して）細胞毒性Ｔ細胞または他の免疫細胞に結合し得、標的細胞に対する免疫反応の増加をもたらす。
【0125】
二重特異性分子には多くの異なるフォーマットおよびサイズがあり得る。サイズの範囲の一端では、二重特異性分子は、従来の抗体フォーマットを保持するが、同一の特異性の２つの結合アームを有する代わりに、異なる特異性を各々が有する２つの結合アームを有する。他端は、ペプチド鎖によって連結される２つの一本鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）から成る二重特異性分子、いわゆるＢｓ（ｓｃＦｖ）２コンストラクトである。中サイズの二重特異性分子は、ペプチジルリンカによって連結される２つの異なるＦ（ａｂ）断片を含む。これらのフォーマットおよび他のフォーマットの二重特異性分子は、遺伝子操作、体細胞ハイブリダイゼーション、または化学的方法によって調製され得る。例えば、上記で引用されるＫｕｆｅｒ ｅｔ ａｌ； Ｃａｏ ａｎｄ Ｓｕｒｅｓｈ， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ９ （６）， ６３５－６４４ （１９９８）； ａｎｄ ｖａｎ Ｓｐｒｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ， ２１ （８）， ３９１－３９７ （２０００）およびそこで挙げられる参考文献を参照されたい。
【0126】
医薬組成物
【0127】
別の態様において、本開示は、薬学的に許容される担体と共に製剤化される本開示の１または複数の抗体を含む医薬組成物を提供する。組成物は任意で、別の抗体、または、抗ＶＩＳＴＡ抗体などの薬剤など、１または複数の追加の薬学的な活性成分を含み得る。開示の医薬組成物はまた、例えば、別の抗癌剤、別の抗炎症剤または抗微生物剤などとの併用療法において投与され得る。
【0128】
医薬組成物は任意の数の賦形剤を含み得る。使用できる賦形剤として、担体、表面活性剤、増粘剤、乳化剤、固体結合剤、分散助剤、懸濁助剤、可溶化剤、着色剤、着香剤、コーティング、崩壊剤、潤滑剤、甘味料、保存料、等張剤、およびそれらの組み合わせが挙げられる。好適な賦形剤の選択および使用は、Ｇｅｎｎａｒｏ， ｅｄ．， Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ， ２０ｔｈ Ｅｄ． （Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ ２００３）において教示され、その開示は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【0129】
医薬組成物は、好ましくは（例えば注射または注入による）静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄または表皮投与に好適である。投与経路に応じて、活性成分を材料でコーティングして、酸の作用およびそれを不活性化し得る他の自然条件から保護することができる。本明細書において使用される「非経口投与」という語句は、通常は注射による、経腸および局所投与以外の投与様式を意味し、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、被膜内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、気管内、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内の注射および注入を含むが、これらに限定されない。代替的に、本開示の抗体は、局所、表皮または粘膜の投与経路、例えば、鼻腔内、経口、膣、直腸、舌下または局所などの非経口経路を介して投与され得る。
【0130】
医薬組成物は、無菌水溶液または分散系の形態であり得る。また、それらはマイクロエマルション、リポソーム、または、高い薬剤濃度に好適な他の規則構造で製剤化され得る。
【0131】
単回投与形態を生成するために担体物質と組み合わせることができる活性成分の量は、治療される対象、および、特定の投与方法に応じて変動し、一般的に、治療効果を生じさせる組成物の量である。一般に、この量の範囲は、薬学的に許容される担体と組み合わされた、１００％中、約０．０１％から約９９％の活性成分、好ましくは、約０．１％から約７０％、もっとも好ましくは、約１％から約３０％の活性成分である。
【0132】
最適な所望の反応（例えば治療反応）を提供するように投与計画が調整される。例えば、単回ボーラスを投与でき、いくつかの分割された用量を経時的に投与でき、または、治療状況の緊急事態による指示に応じて用量を比例的に低減または増加させることができる。投与を容易にするために、および、投与量を統一するために、単位用量形態で非経口組成物を製剤化することは特に有利である。本明細書において使用される単位用量形態とは、治療される対象のための単位投与量として好適な物理的に別個の単位を指す。各単位は、必要な医薬担体と組み合わせて所望の治療効果を生じさせるために算出された活性成分の予め定められた量を含む。抗体は代替的に、徐放性製剤として投与できる。この場合、必要な投与頻度が少ない。
【0133】
抗体の投与については、投与量は、宿主の体重の約０．０００１～１００ｍｇ／ｋｇ、より一般的には、０．０１～５ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。例えば、投与量は、０．３ｍｇ／ｋｇ体重、１ｍｇ／ｋｇ体重、３ｍｇ／ｋｇ体重、５ｍｇ／ｋｇ体重、または１０ｍｇ／ｋｇ体重、または、１～１０ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。例示的な治療計画は、１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、１か月に１回、３か月に１回、または、３～６か月に１回の投与を伴う。開示の抗ＣＤ４０抗体の好ましい投与計画は、経静脈投与を介して１ｍｇ／ｋｇ体重、または、３ｍｇ／ｋｇ体重を含み、抗体は、以下の投与スケジュール、すなわち、（ｉ）６回の投与は４週間ごと、その後３か月ごと、（ｉｉ）３週間ごと、（ｉｉｉ）３ｍｇ／ｋｇ体重を１回、その後、１ｍｇ／ｋｇ体重を３週間ごとのうち１つを使用して提供される。いくつかの方法において、約１～１０００μｇ／ｍｌ（いくつかの方法において、約２５～３００μｇ／ｍｌ）の血漿抗体濃度を達成するように、投与量が調整される。
【0134】
開示の抗ＣＤ４０抗体の「治療有効投与量」は、好ましくは、疾患症状の重症度の減少、無疾患症状期間の頻度および期間の増加、または、疾患の苦痛に起因する機能障害または能力障害の予防を引き起こす。例えば、担癌の対象を治療する場合、「治療有効投与量」は好ましくは、未治療の対象と比較して、腫瘍増殖を少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約４０％、さらに好ましくは少なくとも約６０％、なお更に好ましくは少なくとも約８０％阻害する。治療抗体の治療有効量は、腫瘍サイズを低減でき、または、そうでなければ、典型的にはヒトである、または別の哺乳類であり得る対象における症状を緩和する。
【0135】
医薬組成物は、インプラント、経皮パッチ、およびマイクロカプセル化送達システムを含む、放出制御製剤であり得る。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、ポリ乳酸など、生分解性、生体適合性ポリマーを使用できる。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｊ． Ｒ． Ｒｏｂｉｎｓｏｎ， ｅｄ．， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９７８を参照されたい。
【0136】
治療用組成物は、（１）無針皮下注射装置（例えば、米国特許第５，３９９，１６３； ５，３８３，８５１； ５，３１２，３３５； ５，０６４，４１３； ４，９４１，８８０； ４，７９０，８２４；および４，５９６，５５６号）、（２）マイクロ注入ポンプ（米国特許第４，４８７，６０３号）、（３）経皮装置（米国特許第４，４８６，１９４号）、（４）注入機器（米国特許第４，４４７，２３３および４，４４７，２２４号）、（５）浸透圧装置（米国特許第４，４３９，１９６および４，４７５，１９６号）などの医療装置を介して投与され得る。これらの開示は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【0137】
特定の実施形態において、開示のモノクローナル抗体は、ｉｎ ｖｉｖｏの適切な分散を確実にするために製剤化され得る。例えば、開示の治療抗体が血液脳関門を超えることを確実にするために、それらは、特定の細胞または臓器への選択的輸送を強化する標的化部分を追加的に含み得るリポソームにおいて製剤化され得る。例えば、米国特許第４，５２２，８１１号；第５，３７４，５４８号；第５，４１６，０１６号；第５，３９９，３３１号；Ｖ． Ｖ． Ｒａｎａｄｅ （１９８９） Ｊ． Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２９：６８５； Ｕｍｅｚａｗａ ｅｔ ａｌ．，， （１９８８） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． １５３：１０３８； Ｂｌｏｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．， （１９９５） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３５７：１４０； Ｍ． Ｏｗａｉｓ ｅｔ ａｌ．， （１９９５） Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ３９：１８０； Ｂｒｉｓｃｏｅ ｅｔ ａｌ．， （１９９５） Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． １２３３：１３４； Ｓｃｈｒｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， （１９９４） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９：９０９０； Ｋｅｉｎａｎｅｎ ａｎｄ Ｌａｕｋｋａｎｅｎ （１９９４） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ３４６：１２３；およびＫｉｌｌｉｏｎ ａｎｄ Ｆｉｄｌｅｒ （１９９４） Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ ４：２７３を参照されたい。
【0138】
開示の使用および方法
【0139】
本開示の抗体またはその抗原結合部分（組成物、二重特異性）は、例えば、癌、炎症性疾患または感染症の治療および／または防止に関与する、多くのｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの用途を有する。抗体は、腫瘍増殖を阻害するために、例えばｉｎ ｖｉｖｏでヒトの対象に投与され得る。
【0140】
癌細胞の増殖および生存を阻害する、開示の抗ＣＤ４０抗体の能力を考慮すると、開示は、腫瘍の増殖が対象において阻害されるように、開示の抗体を対象に投与する段階を含む、対象における腫瘍細胞の増殖を阻害するための方法を提供する。開示の抗体によって治療することができる腫瘍の非限定的な例には、原発性および／または転移性のＢ細胞リンパ腫、慢性リンパ球性白血病、多発性骨髄腫、黒色腫、結腸腺癌、膵臓癌、大腸癌、胃腸癌、前立腺癌、膀胱癌、腎臓癌、卵巣癌、子宮頸癌、乳癌、肺癌、および鼻咽頭癌が含まれるが、これらに限定されない。追加的に、難治性または再発性の悪性腫瘍の増殖が、開示の抗体を使用して阻害され得る。
【0141】
別の態様において、開示は、治療有効量の開示の抗体またはその抗原結合部分を対象に投与する段階を含む、対象における炎症性疾患、感染症、アテローム血栓症、または呼吸器疾患を治療するための方法を提供する。追加の抗炎症剤、抗微生物剤、または他の治療剤が、開示の抗体、または、その抗原結合部分と共に投与され得る。
【0142】
一般に、開示の抗体は、対象における免疫反応を強化するために使用され得る。
【0143】
開示のこれらの方法および他の方法は下で更に詳細に説明される。
【0144】
併用療法
【0145】
別の態様において、開示は、本開示の抗ＣＤ４０抗体（またはその抗原結合部分）が、対象における腫瘍増殖の阻害において有効である１または複数の追加の抗体と共に同時投与される併用療法の方法を提供する。一実施形態において、開示は、抗ＣＤ４０抗体、ならびに、抗ＶＩＳＴＡ抗体、抗ＬＡＧ‐３抗体、抗ＰＤ‐Ｌ１抗体、および抗ＰＤ‐１抗体、および／または抗ＣＴＬＡ－４抗体などの１または複数の追加の抗体を対象に投与する段階を含む、対象における腫瘍増殖を阻害するための方法を提供する。特定の実施形態において、対象はヒトである。
【0146】
ＣＤ４０シグナル伝達活性化は更に、標準的な癌治療とも組み合わされ得る。例えば、ＣＤ４０シグナル伝達活性化が、ＣＴＬＡ‐４および／またはＬＡＧ‐３および／またはＰＤ‐１ブロック、また、化学療法計画と組み合わされ得る。例えば、化学療法剤が、細胞毒性剤であり得る抗ＣＤ４０抗体と共に投与され得る。例えば、エピルビシン、オキサリプラチン、５‐ＦＵが、抗ＣＤ４０療法を受ける患者に投与される。
【0147】
任意で、抗ＣＤ４０および１または複数の追加の抗体（例えば、抗ＣＴＬＡ‐４および／または抗ＬＡＧ‐３および／または抗ＰＤ‐１抗体）の組み合わせが更に、癌細胞、精製された腫瘍抗原（組換えタンパク質、ペプチド、および炭化水素分子を含む）、および、免疫刺激サイトカインをエンコードする遺伝子でトランスフェクトされた細胞などを含む免疫原と組み合わされ得る（Ｈｅ ｅｔ ａｌ．， （２００４） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １７３：４９１９－２８）。使用され得る腫瘍ワクチンの非限定的な例は、ｇｐ１００、ＭＡＧＥ抗原、Ｔｒｐ－２、ＭＡＲＴ１および／またはチロシナーゼのペプチドなど、黒色腫抗原のペプチド、または、サイトカインＧＭ－ＣＳＦを発現するようにトランスフェクトされた腫瘍細胞を含む。
【0148】
抗ＣＤ４０抗体と組み合わされ得る他の療法は、インターロイキン２（ＩＬ‐２）投与、放射線、手術、またはホルモン抑制を含むが、これらに限定されない。
【0149】
本明細書において説明される治療剤の組み合わせは、薬学的に許容される担体における単一の組成物として同時に投与され得るか、または、薬学的に許容される担体における各薬剤と共に別個の組成物として同時に投与され得る。別の実施形態において、治療剤の組み合わせは、順次に投与され得る。
【0150】
更に、併用療法の１より多くの用量が順次に投与される場合、順次投与の順序は、投与の各時点において、逆になり得、または、同じ順序に維持され得、順次の投与は、同時の投与、または、それらの任意の組み合わせと組み合わされ得る。
【0151】
本開示は以下の例において更に図示されるが、これは、更なる限定として解釈されるべきでない。本出願全体において引用される、すべての図面およびすべての参考文献、Ｇｅｎｂａｎｋ配列、特許および特許出願公開の内容は、参照によって本明細書に明示的に組み込まれる。
【0152】
例
【0153】
例１ ヒト、アカゲザルまたはマウスＣＤ４０を安定的に発現するＨＥＫ２９３Ａ細胞株の構築
【0154】
ヒト、アカゲザルまたはマウスＣＤ４０を過剰発現する安定的な細胞株は、ＨＥＫ２９３Ａ細胞（Ｃｏｂｉｏｅｒ、ＮＪ、中国）を使用して構築されたい。簡潔に説明すると、ヒト、アカゲザル、またはマウスＣＤ４０のｃＤＮＡ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８、７０、７２にそれぞれ記載されているアミノ酸配列をエンコードするＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７、６９、７１）が合成され、次に、ＥｃｏＲＩ 部位とＢａｍＨＩ 部位との間で、ｐＬＶ－ＥＧＦＰ（２Ａ）－Ｐｕｒｏベクターにサブクローニングされた。レンチウイルスが、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）の指示に従って、ｐＬＶ－ＥＧＦＰ（２Ａ）－Ｐｕｒｏ－ＣＤ４０、ｐｓＰＡＸおよびｐＭＤ２．Ｇプラスミドの共トランスフェクションによってＨＥＫ－２９３Ｔ細胞（Ｃｏｂｉｏｅｒ、ＮＪ、中国）において生成された。共トランスフェクションの３日後、レンチウイルスは、それぞれのＨＥＫ－２９３Ｔ細胞の細胞培養培地（１０％ＦＢＳ（Ｃａｔ＃：ＦＮＤ５００、Ｅｘｃｅｌｌ）を有するＤＭＥＭ培地（Ｃａｔ＃：ＳＨ３００２２．０１、Ｇｉｂｃｏ））から採取された。最後に、ＨＥＫ２９３Ａ細胞にレンチウイルスを感染させ、ヒト、アカゲザル、またはマウスＣＤ４０を安定的に発現するＨＥＫ２９３Ａ細胞株、すなわち、ＨＥＫ２９３Ａ／ヒトＣＤ４０、ＨＥＫ２９３Ａ／アカゲザルＣＤ４０またはＨＥＫ２９３Ａ／マウスＣＤ４０細胞を生成した。次に、トランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ａ細胞を、０．２μｇ／ｍｌのピューロマイシン（Ｃａｔ ＃：Ａ１１１３８－０３、Ｇｉｂｃｏ）を含む培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）において７日間培養した。ヒトＣＤ４０およびアカゲザルＣＤ４０の発現は、市販の抗ヒトＣＤ４０抗体（ＰＥ‐抗ヒトＣＤ４０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、米国、Ｃａｔ＃：３１３００６）を使用して、ＦＡＣＳによって確認された。同様に、マウスＣＤ４０の発現は、市販の抗マウスＣＤ４０抗体（ＰＥ‐抗マウスＣＤ４０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、米国、Ｃａｔ＃：１２４６０９）を使用して、ＦＡＣＳによって確認された。
【0155】
例２：ヒトＣＤ４０に対するモノクローナルマウス抗体を生成する例示的なハイブリドーマ細胞株の産生
【0156】
いくつかの改変を有する従来のハイブリドーマ融合技術を使用して、ネズミ抗ヒトＣＤ４０モノクローナル抗体（ｍＡｂ）が生成された。
【0157】
免疫化
【0158】
下の表２におけるスキームに従って、１３匹のＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｖｉｔａｌ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ，、北京、中国）に、組み換えヒトＣＤ４０ （ＥＣＤ）－ｈｉｓ （Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，中国，Ｃａｔ＃：１０７７４－Ｈ０８Ｈ）および／または組み換えアカゲザルＣＤ４０（ＥＣＤ）－ｈＦｃ （Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，中国，Ｃａｔ＃：９００９７－Ｃ０２Ｈ）を注射した。ヒトＣＤ４０（ＥＣＤ）‐ｈｉｓおよびアカゲザルＣＤ４０（ＥＣＤ）‐ｈＦｃは、等しい体積の完全フロイントアジュバント（ＳＩＧＭＡ、米国、Ｃａｔ＃：Ｆ５８８１－１０＊１０ＭＬ）、不完全フロイントアジュバント（ＳＩＧＭＡ、米国、Ｃａｔ＃：Ｆ５５０６－６＊１０ＭＬ）、またはＰＢＳを用いて、超音波処理によって乳化された。
表２
免疫化スキーム
表２
免疫化スキーム
【表2】
【0159】
各追加免疫の１週間後、組み換えヒトＣＤ４０（ＥＣＤ）‐ｈＦｃ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、中国、Ｃａｔ＃：１０７７４－Ｈ０２Ｈ）およびアカゲザルＣＤ４０（ＥＣＤ）‐ｈＦｃ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、中国、Ｃａｔ＃：９００９７－Ｃ０２Ｈ）を使用して、ＥＬＩＳＡによる力価測定のために、５０μｌのネズミ血清が各マウスから採取された。力価測定はまた、例１において調製された、ＨＥＫ２９３Ａ過剰発現ヒトＣＤ４０、アカゲザルＣＤ４０、またはマウスＣＤ４０を使用して、ＦＡＣＳによって行われた。
【0160】
最終追加免疫後のＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳ分析結果に基づいて、最高の血清力価を有する７匹のマウスがハイブリドーマ細胞株生成のために選択された。
【0161】
ハイブリドーマ細胞株の生成
【0162】
小さい改変を有する従来のハイブリドーマ融合技術を使用して、ハイブリドーマ細胞株が生成された。
【0163】
最終追加免疫の４日後、マウスを犠牲にし、脾臓を採取して、ＰＢＳにおいて単一の細胞懸濁液として調製した。ＤＭＥＭ培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｃａｔ＃：ＳＨ３０２４３．０１Ｂ）を用いて、脾臓細胞を３回洗浄した。対数期における生存骨髄腫細胞ＳＰ２／０ （ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－１５８１）を、ネズミ脾臓細胞と１：４の比で混合した。次に細胞を２回洗浄し、次に、ＰＥＧ（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ＃：Ｐ７１８１）との細胞融合を実行した。ＤＭＥＭ培地を用いて、融合後の細胞を３回洗浄し、１０％ＦＢＳおよび１Ｘ ＨＡＴ（Ｓｉｇｍａ、Ｈ０２６２）が添加された細胞増殖培地（ＲＰＭＩ培地１６４０（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ＃：Ｃ２２４００５００ＣＰ））に懸濁した。細胞懸濁液を９６ウェル細胞培養プレートにおいて、ウェルあたり２００μｌ（５×１０４細胞／ウェル）で平板培養し、３７℃の加湿した５％ＣＯ２インキュベータにおいて７日間にわたってインキュベートした。次に、増殖培地を、１０％ＦＢＳ＋１Ｘ ＨＴ（Ｓｉｇｍａ、Ｈ０１３７）が添加された新鮮な増殖培地で置き換えた。２～３日後、ハイブリドーマ細胞をＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳによってスクリーニングした。
【0164】
ＥＬＩＳＡによるハイブリドーマ細胞株のスクリーニング
【0165】
最初にハイスループットＥＬＩＳＡ結合アッセイを使用して、ヒトＣＤ４０に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンについてスクリーニングした。ヒトＣＤ４０に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンを、アカゲザルまたはマウスＣＤ４０と交差反応する能力について、更に試験した。
【0166】
ＥＬＩＳＡアッセイのために、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを１００μｌ／ウェルのヒトＣＤ４０（ＥＣＤ）‐ｈｉｓ（０．５μｇ／ｍｌ、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、中国、Ｃａｔ＃：１０７７４－Ｈ０８Ｈ）、アカゲザルＣＤ４０（ＥＣＤ）‐ｈＦｃ（０．５μｇ／ｍｌ、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、中国、Ｃａｔ＃：９００９７－Ｃ０２Ｈ）、または、ネズミＣＤ４０‐Ｈｉｓ（０．５μｇ／ｍｌ、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、中国、Ｃａｔ＃５０３２４－Ｍ０３Ｈ）で、室温において一晩コーティングした。プレートをＰＢＳＴ緩衝液（ＰＢＳ＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄し、２００μｌのブロック緩衝液（１％ＢＳＡ、１％ヤギ血清、および、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）で、室温において２時間ブロックし、ＰＢＳＴで３回洗浄した。次に、ハイブリドーマ細胞培養液の上清を、希釈緩衝液（１％ＢＳＡ、１％ヤギ血清、および、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）で１０倍希釈し、ウェルあたり１００μｌとなるようにプレートに添加した。室温で１時間インキュベートした後、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、次に、１００μｌのヤギ抗マウスＦｃ‐ＨＲＰ（１：５０００、Ｓｉｇｍａ、米国、Ｃａｔ＃：Ａ９３０９－１ｍｌ）を各ウェルに添加した。室温で１時間インキュベートした後に、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、次に、８０μｌのＴＭＢを各ウェルに添加した。５～１０分後、８０μｌの０．１６Ｍ硫酸を各ウェルに添加し、次に、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘＲ ｉ３Ｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｅｓ、米国）でＯＤ４５０を読んだ。
【0167】
ＥＬＩＳＡアッセイによって、２３４のハイブリドーマクローンがヒトおよびアカゲザルＣＤ４０の両方に特異的に結合することが識別された。
【0168】
ＦＡＣＳによるハイブリドーマ細胞株のスクリーニング
【0169】
２３４のハイブリドーマクローンが、ＨＥＫ２９３Ａ細胞上で発現するヒト、アカゲザル、またはマウスＣＤ４０に対する結合能力について更にスクリーニングされた。簡潔に説明すると、例１において調製された１００，０００個のＨＥＫ２９３ＡヒトＣＤ４０細胞、ＨＥＫ２９３Ａ／アカゲザルＣＤ４０細胞、または、ＨＥＫ２９３Ａ／マウスＣＤ４０細胞が、９６ウェルプレートの各ウェルに播種され、希釈緩衝液（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ、１％ヤギ血清、および０．０１％ Ｔｗｅｅｎ２０）で１０倍に希釈されたハイブリドーマ細胞培養上清をプレートに添加した（１００μｌ／ウェル）。４℃で１時間インキュベートした後に、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。次に、５００倍に希釈されたＡＰＣヤギ抗マウスＩｇＧ（ＢｉｏＬｅｇｅｎ、米国、Ｃａｔ＃：４０５３０８）と共に、細胞がプレートに添加された。４℃で１時間インキュベートした後に、プレートをＰＢＳで３回洗浄し、次に、ＦＡＣＳマシン（ＢＤ）を使用して細胞蛍光をモニタリングした。
【0170】
ＦＡＣＳスクリーニングに基づいて、ＨＥＫ２９３Ａ／ヒトＣＤ４０およびＨＥＫ２９３Ａ／アカゲザルＣＤ４０細胞の両方に対する高い結合能力を示した１６２の陽性クローンが取得された。
【0171】
抗ＣＤ４０抗体を産生するハイブリドーマクローンのサブクローニング
【0172】
１６２のハイブリドーマクローンが２回のサブクローニングを受けた。サブクローニングの間、各親クローンからの複数のサブクローン（ｎ＞３）が選択され、上に記載されるように、ＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳアッセイによって確認された。このプロセスを通じて選択されたサブクローンは、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞として定義された。最後に、ヒトおよびサルＣＤ４０の両方に対する高い結合能力を有する１０８のサブクローン（各親クローンから１サブクローン）が取得された。
【0173】
ＨＥＫ Ｂｌｕｅ活性アッセイによるハイブリドーマ細胞株のスクリーニング
【0174】
１０８のサブクローンを９６ウェルプレートに拡げ、次に、５日間培養した。ヒトＣＤ４０に対するアゴニスト活性を有するＣＤ４０抗体を識別するためのＨＥＫ－Ｂｌｕｅ活性アッセイのために上清を採取した。
【0175】
簡潔に説明すると、ヒトＣＤ４０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８）を発現する安定的なＨＥＫ－Ｂｌｕｅレポータ細胞株（ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ／ＣＤ４０と呼ばれる）が、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅヌル１＿ｖ細胞（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、サンディエゴ、カリフォルニア州）にＣＤ４０発現レンチウイルス（例１において生成）を感染させることによって確立され、その後、１０μｇ／ｍｌのピューロマイシンで選択された。
【0176】
ＨＥＫ－Ｂｌｕｅレポータアッセイのために、２００μｌの培養培地（ＤＭＥＭ培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ、米国、Ｃａｔ＃：ＳＨ３０２４３．０１）＋１０％ＦＢＳ（Ｅｘｃｅｌｌ、中国、Ｃａｔ＃：ＦＮＤ５００）＋１０μｇ／ｍｌピューロマイシン（ＧＩＢＣＯ、米国、Ｃａｔ＃：Ａ１１１３８－０３）＋１００μｇ／ｍｌノルモイシン（登録商標）（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ，米国，Ｃａｔ＃：ａｎｔ－ｎｒ－２）、１００μｇ／ｍｌゼオシン（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ，米国，Ｃａｔ＃：ａｎｔ－Ｚｎ－５））に再懸濁された４００００のＨＥＫ－Ｂｌｕｅ／ＣＤ４０細胞を９６ウェルプレートにおいて平板培養し、３７℃で一晩培養した。２日目に、２００μｌのＤＭＥＭ培地を各ウェルに添加し、培養培地と置き換えた。７時間後、ウェルにおけるＤＭＥＭ培地は、１００μｌ／ウェルのＨＥＫ Ｂｌｕｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；米国；Ｃａｔ＃：ｈｂ－ｄｅｔ３）および１００μｌ／ウェルのハイブリドーマ細胞培養上清で置き換えた。結果として生じた混合物を、適切な青色が現れるまで、５％のＣＯ２の存在下で、３７℃でインキュベートした。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘマイクロプレートリーダ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、米国、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘＲ ｉ３Ｘ）を使用してＯＤ６３０が測定された。抗ＨＥＬ抗体（ＬｉｆｅＴｅｉｎ， ＬＬＣ、米国、Ｃａｔ．＃：ＬＴ１２０３１）をネガティブコントロールとして使用し、ＲＯ７００９７８９（ヒトＩｇＧ２／カッパ定常領域を有する、ＵＳ７３３８６６０Ｂ２において開示されたアミノ酸配列を使用して調製されたアゴニスト抗体）、および、ＣＤ４０の天然のリガンドおよび活性化因子であるＣＤ４０Ｌ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、中国、Ｃａｔ：１０２３９－Ｈ０８Ｅ）をポジティブコントロールとして使用した。
【0177】
図１に示されるように、３８のクローンは、異なるレベルのＣＤ４０アゴニスト活性を示し、他はアゴニスト活性を示さなかった。
【0178】
例３ マウス抗ＣＤ４０モノクローナル抗体の精製
【0179】
上述のＨＥＫ－Ｂｌｕｅアッセイに基づいて、高いＨＥＫ－Ｂｌｕｅ活性を有する２０のクローン（下の表３を参照されたい）を、更なる特性評価について選択した。２０の選択されたクローンからのモノクローナルマウス抗体を精製した。簡潔に説明すると、１％ＨＴ（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ＃：１１０６７－０３０）が添加された１００ｍｌの新鮮な無血清培地（Ｇｉｂｃｏ、米国、Ｃａｔ＃：１２０４５－０７６）を各々が有するＴ１７５細胞培養フラスコにおいて各サブクローンのハイブリドーマ細胞を増殖させた。３７℃の５％ＣＯ２を有するインキュベータに細胞培養液を１０日間置いた。細胞培養液を採取後、３５００ｒｐｍ、５分間の遠心分離を行い、次に、０．２２μｍカプセルを使用して濾過を行い、細胞片を除去した。次に、前平衡タンパク質Ａアフィニティカラム（ＧＥ、米国、Ｃａｔ＃：１７０４０５０１）を使用してモノクローナルマウス抗体を精製し、溶出緩衝液（２０ｍＭクエン酸、ｐＨ３．０～ｐＨ３．５）で溶出した。次に、抗体をＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．０）で維持し、ＮａｎｏＤｒｏｐ計器を使用して、その濃度を決定した。
【0180】
精製された各抗体のアイソタイプは、製造者のマニュアルに従って、Ｒａｐｉｄ Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ Ｋｉｔ ｗｉｔｈ Ｋａｐｐａ ａｎｄ Ｌａｍｂｄａ－Ｍｏｕｓｅ（Ｔｈｅｒｍａｌ、米国、Ｃａｔ＃：２６１７９）およびＭｏｕｓｅ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ｓｉｇｍａ、米国、Ｃａｔ＃：ＩＳ０２－１ＫＴ）を使用することによって決定された。アイソタイプ決定の結果および選択された上位２０クローンの発現力価を表３にまとめた。
表３
抗ＯＤ４０抗体クローンのアイソタイプおよび発現力価
表３
抗ＯＤ４０抗体クローンのアイソタイプおよび発現力価
【表3】
【0181】
例４ ヒトおよびサルＣＤ４０に結合された精製マウス抗ＣＤ４０モノクローナル抗体
【0182】
精製マウス抗ＣＤ４０モノクローナル抗体はまず、ＥＬＩＳＡアッセイによって特性評価され、組み換えヒト、サル、またはマウスＣＤ４０タンパク質に対する結合親和性を決定した。
【0183】
ＥＬＩＳＡプレートを、５００ｎｇ／ｍｌヒトＣＤ４０（ＥＣＤ）‐ｈｉｓ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、中国、Ｃａｔ＃：１０７７４－Ｈ０８Ｈ）でコーティングし、４℃で一晩放置した。２００μｌのブロック緩衝液（１％ＢＳＡ、１％ヤギ血清および０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）でウェルをブロックし、室温で２時間放置し、次に、１００μｌの連続希釈した抗ＣＤ４０抗体（４００００ｎｇ／ｍｌから開始）を各ウェルに添加して、室温で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０）で３回洗浄し、５０００倍希釈したヤギ抗マウスＩｇＧ‐ＨＲＰ（Ｓｉｍｇａ、米国、Ｃａｔ＃：Ａ９３０９－１ｍｌ）を添加し、室温で１時間にわたってインキュベートした。新しく調製したＵｌｔｒａ－ＴＭＢ（ＢＤ、米国、Ｃａｔ＃：５５５２１４）を用いて、プレートを室温で５分間現像した。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標） ｉ３Ｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｅｓ、米国）で４５０ｎｍの吸光度を読んだ。
【0184】
サルまたはマウスＣＤ４０に対する２０のＣＤ４０ ｍＡｂの種交差反応性を、ダイレクトＥＬＩＳＡによって更に評価した。簡潔に説明すると、５００ｎｇ／ｍｌサルＣＤ４０（ＥＣＤ）‐ｈＦｃ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、中国、Ｃａｔ＃：９００９７－Ｃ０２Ｈ）またはマウスＣＤ４０‐ｈＦｃ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、中国、Ｃａｔ＃：５０３２４－Ｍ０３Ｈ）を９６ウェルＥＬＩＳＡプレート上にコーティングし、その後、連続希釈された１００μｌの抗ＣＤ４０抗体（４００００ｎｇ／ｍｌから開始）と共にインキュベートした。その後、ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ、米国、Ｃａｔ＃：Ａ９３０９－１ｍｌ）と結合されたヤギ抗マウスＩｇＧを使用した。抗ＣＤ４０抗体ＲＯ７００９７８９およびＡＤＣ１０１３（ヒトＩｇＧ１／カッパ定常領域を有する、ＵＳ２０１６／０３１１９１６Ａ１において開示されたアミノ酸配列を使用して調製した）を参照として使用した。
【0185】
これらの結合試験のＥＣ５０値を表４にまとめる。５１Ｆ７を除く、２０の抗体すべては、明らかにサルＣＤ４０と交差反応したが、マウスＣＤ４０とは交差反応しなかったことが分かる。
表４
ヒト、サル、またはマウスＣＤ４０に対する２０のマウス抗ＣＤ４０ｍＡｂの結合能力
表４
ヒト、サル、またはマウスＣＤ４０に対する２０のマウス抗ＣＤ４０ｍＡｂの結合能力
【表4】
【0186】
例５ ＨＥＫ２９３Ａ細胞で発現した、ヒトおよびアカゲザルＣＤ４０に結合された例示的なマウス抗ＣＤ４０モノクローナル抗体
【0187】
抗ＣＤ４０抗体が、ＨＥＫ２９３Ａ細胞で発現するヒト、サル、またはマウスＣＤ４０に結合するかどうかを更に決定するために、例１において生成されたヒト、サル、またはマウスＣＤ４０をそれぞれ安定的に過剰発現するＨＥＫ２９３Ａ細胞を使用して、ＦＡＣＳによる細胞ベース結合アッセイを実行した。簡潔に説明すると、１０５のＨＥＫ２９３Ａ細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに播種し、連続希釈された抗ＣＤ４０抗体をプレートに添加した。４℃で１時間インキュベートした後に、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。次に、５００倍希釈されたＡＰＣ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＢｉｏＬｅｇｅｎ、米国、Ｃａｔ＃：４０５３０８）をプレートに添加した。４℃で１時間インキュベートした後に、プレートをＰＢＳで３回洗浄し、次に、ＦＡＣＳマシン（ＢＤ）を使用して細胞蛍光をモニタリングした。
【0188】
下の表５に示されるように、マウス抗ＣＤ４０モノクローナル抗体はすべて、ヒトおよびアカゲザルＣＤ４０の両方に対して高い結合能力を示したが、マウスＣＤ４０には結合しなかった（データは示していない）。
表５
ヒトおよびサルＣＤ４０に対するマウス抗ＯＸ‐４０抗体の結合親和性
表５
ヒトおよびサルＣＤ４０に対するマウス抗ＯＸ‐４０抗体の結合親和性
【表5】
【0189】
例６ マウス抗ＣＤ４０抗体がヒトＣＤ４０‐ＣＤ４０Ｌ相互作用を阻害または促進した
【0190】
ヒトＣＤ４０に対するヒトＣＤ４０Ｌの結合をブロックまたは促進する能力について、精製された抗ＣＤ４０抗体を更に解析した。簡潔に説明すると、５００ｎｇ／ｍｌのヒトＣＤ４０Ｌ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、中国、Ｃａｔ＃１０２３９－Ｈ０８Ｅ）で、９６ウェルのＥＬＩＳＡプレートを４℃で一晩コーティングした。２００μｌのブロック緩衝液（ＰＢＳ＋２％ＢＳＡ）を用いて、プレートを室温で２時間ブロックした。次に、連続希釈された抗ＣＤ４０抗体（４０μｇ／ｍｌから開始）を、２μｇ／ｍｌのヒトＣＤ４０‐ｈＦｃ（Ｓｉｎｏ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ， Ｃａｔ＃：１０７７４－Ｈ０２Ｈ）と混合し、３７℃で１時間インキュベートし、次に、この混合物をウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）を用いてプレートを３回洗浄し、抗ヒトＩｇＧ ＦＣ‐ＨＲＰ（１：５０００、Ｓｉｇｍａ、米国、Ｃａｔ＃：Ａ０１７０－１ＭＬ）を添加し、次に、室温で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、次に、８０μｌのＴＭＢを各ウェルに添加した。５～１０分後、８０μｌの０．１６Ｍ硫酸を各ウェルに添加し、次に、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘＲ ｉ３Ｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｅｓ、米国）でＯＤ４５０を測定した。
【0191】
興味深いことに、データは、６のマウス抗体（１３Ａ２、１６Ａ６、７Ｂ４、５０Ｆ６、１４２Ｆ７および１０１Ｃ１２）がヒトＣＤ４０‐ＣＤ４０Ｌ相互作用を促進し、別の３の抗体（２３Ｂ８、９２Ｆ６、８２Ｄ３）がＣＤ４０‐ＣＤ４０Ｌ相互作用をブロックしたことを示し、残りはＣＤ４０‐ＣＤ４０Ｌ相互作用に対する明確な影響を示さなかった。４の代表的な抗体の結果を図２に示す。
【0192】
例７ 例示的なマウス抗ＣＤ４０抗体のアゴニスト活性の決定
【0193】
選択されたマウス抗ＣＤ４０抗体がアゴニスト活性を有するかどうかを決定するために、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ活性アッセイが実行された。簡潔に説明すると、例２において生成されたＨＥＫ－Ｂｌｕｅ／ＣＤ４０細胞をＤＭＥＭ培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ、米国、Ｃａｔ＃：ＳＨ３０２４３．０１）＋１０％ＦＢＳ（Ｅｘｃｅｌｌ、中国、Ｃａｔ＃：ＦＮＤ５００）＋１０μｇ／ｍｌピューロマイシン（ＧＩＢＣＯ、米国、Ｃａｔ＃：Ａ１１１３８－０３）＋１００μｇ／ｍｌノルモシン（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、米国、Ｃａｔ＃：ａｎｔ－ｎｒ－２）＋１００μｇ／ｍｌゼオシン（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、米国、Ｃａｔ＃：ａｎｔ－Ｚｎ－５）においてインキュベートした。２００μｌの培養培地における４０，０００のＨＥＫ－Ｂｌｕｅ／ＣＤ４０細胞を、９６ウェルアッセイプレートの各ウェルに分注し、３７℃で培養した。一晩（約１２時間）インキュベートした後に、２００μｌの新鮮なＤＭＥＭ培地を使用して培養培地を置き換えた。７時間後、各ウェルにおけるＤＭＥＭ培地を、様々な濃度（１００μｇ／ｍｌ～０．０１ｎｇ／ｍｌ）で抗ＣＤ４０抗体を含む１００μＬ／ウェルのＨＥＫ Ｂｌｕｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ緩衝液（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ；米国；Ｃａｔ＃：ｈｂ－ｄｅｔ３）で置き換えた。適切な青色が現れるまで、細胞を３７℃でインキュベートした。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘマイクロプレートリーダ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、米国、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘＲ ｉ３Ｘ）を使用して、６３０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【0194】
ＥＣ５０値を下の表６にまとめた。代表的な曲線を図３に示した。見て分かるように、２０のマウス抗体はすべて、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅアッセイにおいて異なるアゴニスト活性を示し、ＣＤ４０下流シグナル伝達を刺激する能力を示唆した。
表６
抗ＣＤ４０抗体のアゴニスト活性
表６
抗ＣＤ４０抗体のアゴニスト活性
【表6】
【0195】
例８ エピトープビニング
【0196】
エピトープビニングのために、競合ＥＬＩＳＡアッセイを実行した。簡潔に説明すると、５μｇ／ｍｌのＲ０７００９７８９またはＡＤＣ１０１３を用いて、９６ウェルプレートを４℃で一晩コーティングした。２００μｌのブロック緩衝液（１％ＢＳＡ、１％ヤギ血清および０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）を用いて、ウェルを室温で２時間ブロックした。ヒトＣＤ４０（ＥＣＤ）‐Ｈｉｓ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、中国、Ｃａｔ＃：１０７７４-Ｈ０８Ｈ）を０．５μｇ／ｍｌに希釈し、プレートに添加し、次に室温で１時間インキュベートした。ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、次に、精製された抗体を１μｇ／ｍｌに希釈し、各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、次に、１：２００００で希釈された抗マウスＦｃ‐ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ、米国、Ｃａｔ＃：Ａ９３０９－１ＭＣ）を各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。新しく調製したＵｌｔｒａ‐ＴＭＢ（Ｈｕｚｈｏｕ Ｙｉｎｇｃｈｕａｎｇ、中国、Ｃａｔ＃： ＴＭＢ－Ｓ－００３）を用いて、プレートを室温で５分間現像し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘマイクロプレートリーダ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ；米国；ＳｐｅｃｔｒａＭａｘＲ ｉ３Ｘ）上で、４５０ｎｍの吸光度を測定した（ＯＤ４５０）。
【0197】
結果を表７にまとめた。７のマウス抗体（１０１Ｃ１２、１４２Ｆ７、８９Ｄ１１、１３Ａ２、１６Ａ６、７Ｂ４および５０Ｆ６）が両方の参照抗体と競合し、抗体９Ａ７、９２Ｆ６、１９Ｈ４、１６Ｆ４および５１Ｆ７は、いずれの参照抗体とも競合を示さなかった。残りの抗体は、２つの参照抗体のいずれかと競合した。
表７
競合ＥＬＩＳＡによるエピトープビニング
表７
競合ＥＬＩＳＡによるエピトープビニング
【表7】
【0198】
例９ 例示的なアゴニスト抗ＣＤ４０抗体が樹状細胞成熟を促進した
【0199】
マウス抗ＣＤ４０抗体のアゴニスト活性を更に決定するために樹状細胞成熟アッセイを実行した。簡潔に説明すると、１人の健康なヒトのドナーの血液試料からのＰＢＭＣを、密度勾配遠心分離によって採取し、次に、ＲＰＭＩ１６４０培地で再懸濁した。ＰＢＭＣを３７℃のインキュベータで２時間培養し、容器の壁に付着した細胞を単離単球として採取した。２４ウェルプレートにおける、１０％ＦＢＳが添加されたＲＰＭＩ１６４０培地において、１００ｎｇ／ｍｌの組み換えヒトＧＭ‐ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ、米国、Ｃａｔ＃：７９５４－ＧＭ）および１００ｎｇ／ｍｌの組み換えヒトＩＬ‐４（Ｒ＆Ｄ、米国、Ｃａｔ＃：６５０７‐ＩＬ）と共に単球を培養した。３日後、培地の半分を新鮮な培地で置き換えた。培養の６日目に、抗ＣＤ４０抗体（１０μｇ／ｍｌまたは１μｇ／ｍｌ）、または、対照の抗体（ＲＯ７００９７８９、ＡＤＣ１０１３、およびＨｅｌ（ＬｉｆｅＴｅｉｎ、米国、Ｃａｔ＃：ＬＴ１２０３１））を細胞に添加し、プレートを更に４８時間培養した。ＦＩＴＣマウス抗ヒトＣＤ８３（ＢＤ、米国、Ｃａｔ＃：５５６９１０）、ＰＥマウス抗ヒトＣＤ８６（ＢＤ、Ｃａｔ＃：５５５６５８）およびＢＶ６５０マウス抗ヒトＣＤ８０（ＢＤ、米国、Ｃａｔ＃：５６４１５８）を、ＦＡＣＳによるＤＣ活性化マーカーの染色のために使用した。
【0200】
代表的な抗体の結果を図４に示した。マウス抗ＣＤ４０抗体１６Ａ６、２９Ａ１０、７Ｂ４および１３Ａ２は、抗Ｈｅｌアイソタイプの対照と比較して、成熟した樹状細胞のバイオマーカーであるＣＤ８６の発現を増加させ、抗体１６Ａ６、２９Ａ１０、７Ｂ４および１３Ａ２は、両方とも共刺激分子であるＣＤ８０およびＣＤ８３の発現を著しくアップレギュレートした。
【0201】
例１０ 例示的なキメラ抗ＣＤ４０抗体の発現および精製
【0202】
８の抗体（１３Ａ２、１６Ａ６、７Ｂ４、２９Ａ１０、９２Ｆ６、７７Ｄ９、５０Ｆ６および１４２Ｆ７）が更なる試験のために選択された。文献（Ｊｕｓｔｅ ｅｔ ａｌ．， （２００６）， Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ． １；３４９（１）：１５９－６１）に記載された変性プライマーのセットと共に、標準的なＰＣＲ方法を使用して、選択された８の候補の抗体の可変領域配列をハイブリドーマ細胞からクローニングした。重鎖可変領域＋ヒトＩｇＧ２定常領域をエンコードする配列、または、軽鎖可変領域＋ヒトカッパ定常領域をエンコードする配列（それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３、６５において記載される重鎖定常領域および軽鎖定常領域のアミノ酸配列）をｐＣＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、米国）のＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩ制限部位に挿入することによって発現ベクターを構築した。重鎖可変領域のＣ末端は、ヒトＩｇＧ２定常領域のＮ末端に連結され、軽鎖可変領域のＣ末端は、ヒトカッパ定常領域のＮ末端に連結された。可変領域のアミノ酸ＳＥＱ ＩＤ番号を上の表１にまとめた。
【0203】
発現ベクターは、ＨＥＫ－２９３Ｆ細胞（Ｃｏｂｉｏｅｒ、ＮＪ、中国）にトランスフェクトされたＰＥＩである。特に、ＨＥＫ－２９３Ｆ細胞は、Ｆｒｅｅ Ｓｔｙｌｅ（登録商標）２９３発現培地（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ＃：１２３３８－０１８）において培養され、１：３のＤＮＡ：ＰＥＩ比でポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を使用して発現ベクターでトランスフェクトされた（ＤＮＡは細胞培地ミリリットルあたり１．５μｇ）。トランスフェクトされたＨＥＫ－２９３Ｆ細胞を、１２０ＲＰＭで振とうしながら、５％ＣＯ２下で、３７℃でインキュベータにおいて培養した。１０～１２日後、上清を採取し、モノクローナル抗体を例３において説明されたように精製した。
【0204】
例１１ ＨＥＫ２９３Ａ細胞で発現されたヒトまたはアカゲザルＣＤ４０に結合された例示的なキメラ抗ＣＤ４０モノクローナル抗体
【0205】
例５のプロトコルに従って、例１において生成されたＨＥＫ２９３Ａ／ヒトＣＤ４０細胞、ＨＥＫ２９３Ａ／アカゲザルＣＤ４０細胞、およびＨＥＫ２９３Ａ／マウスＣＤ４０細胞に結合する能力について、キメラ抗ＣＤ４０抗体を更に特性評価した。図５に示されるように、キメラ抗体は、ヒトおよびサルＣＤ４０の両方に対して高い結合親和性を有した。これらのキメラ抗体は、マウスＣＤ４０に結合しなかった（データは示されていない）。
【0206】
例１２ 例示的なキメラ抗ＣＤ４０モノクローナル抗体はアゴニスト活性を有し、樹状細胞成熟を促進した。
【0207】
例７および例９において説明されるプロトコルに従って、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅアッセイおよび樹状細胞成熟アッセイによって、ＣＤ４０シグナル伝達活性化に対する作用について、キメラ抗体を評価した。ＲＯ７００９７８９、ＡＰＸ００５（ヒトＩｇＧ１／カッパ定常領域を有するＷＯ２０１４／０７０９３４Ａ１において開示されるアミノ酸配列を使用して調製された）および／またはＡＤＣ１０１３を参照として使用した。
【0208】
図６において示される８のキメラ抗体は、親モノクローナル抗体と同様の機能活性を示した。図７は、すべての試験されたキメラ抗体が、成熟した樹状細胞のバイオマークであるＣＤ８６のアップレギュレーションによって示唆されるように、樹状細胞の成熟を促進したことを示した。
【0209】
例１３ 例示的な抗ＣＤ４０抗体のヒト化
【0210】
上で説明された特性評価およびアッセイに基づいて、２つの候補抗体７Ｂ４および１３Ａ２が、ヒト化および更なる調査のために選択された。ネズミ抗体のヒト化は、下で詳細に説明されるような、よく確立されたＣＤＲ移植方法（参照によって全体が本明細書に組み込まれる米国特許第５，２２５，５３９号）を使用して実行された。
【0211】
ネズミ抗体７Ｂ４および１３Ａ２のヒト化についてのアクセプタフレームワークを選択するために、７Ｂ４および１３Ａ２の軽鎖および重鎖可変領域配列をＮＣＢＩのウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ． ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ）におけるヒト免疫グロブリン遺伝子データベースに対してＢＬＡＳＴを行った。７Ｂ４および１３Ａ２に対して最高の相同性を有するヒト生殖系列ＩＧＶＨおよびＩＧＶＫをヒト化のアクセプタとして選択した。抗体７Ｂ４および１３Ａ２については、選択されたヒト重鎖アクセプタはＩＧＨＶ４－２８＊０６であり、選択されたヒト軽鎖アクセプタは、下の表８に列挙されたＩＧＫＶ２－３０＊０２である。
【0212】
ＣＤＲループ構造の支持において重要な役割を担い得る主なフレームワーク残基を識別するべく、７Ｂ４および１３Ａ２の可変ドメインについて、３次元構造をシミュレートし、それにより、ヒト化抗体における復帰変異を設計した。選択された構造テンプレートは、Ｌ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３、Ｈ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２およびＨ－ＣＤＲ３において、それぞれ７Ｂ４および１３Ａ２と同じクラスのカノニカルループ構造を有した。選択された構造テンプレートを使用して、ネズミのフレームワークを重鎖および軽鎖についてのヒトのアクセプタのフレームワークと置き換えることによって構造モデルを構築した。次に、３次元構造モデリングシミュレーションを実行し、ＣＤＲループ構造または重鎖および軽鎖のインタフェースを支持するのに重要であり得る主なフレームワーク残基を識別した。ネズミ抗体およびヒトアクセプタがフレームワークにおける特定の部位において同一の残基を共有するとき、ヒト生殖系列残基は維持された。他方、ネズミ抗体およびヒト生殖系列アクセプタがフレームワークにおける特定の部位において異なる残基を有するとき、この残基の重要性は、構造モデリングによって評価された。ネズミ抗体のフレームワークにおける残基がＣＤＲ残基と相互作用し、それに影響することが分かった場合、この残基は、ネズミ残基に復帰変異された。
表８
抗体構造シミュレーションにおいて使用された構造テンプレート
表８
抗体構造シミュレーションにおいて使用された構造テンプレート
【表8】
【0213】
上に説明された構造モデリングに基づいて、重鎖について５つの潜在的な復帰変異（Ｉ４９Ｍ、Ｖ６８Ｉ、Ｍ７０Ｉ、Ｋ４４Ｎ、Ｇ４５Ｋ）および１３Ａ２の軽鎖について５つの潜在的な復帰変異（Ｍ４Ｌ、Ｒ５１Ｌ、Ｆ７６Ｌ、Ｙ９２Ｆ、Ｑ１０５Ｓ）が識別された。７Ｂ４については、重鎖について５つの潜在的な復帰変異（Ｉ４９Ｍ、Ｖ６８Ｉ、Ｍ７０Ｉ、Ｋ４４Ｎ、Ｇ４５Ｋ）が識別され、軽鎖について４つの復帰変異（Ｍ４Ｌ、Ｒ５１Ｌ、Ｙ９２Ｆ、Ｑ１０５Ｓ）が識別された。
【0214】
表１にまとめられているように、合計５つのヒト化抗体を用いて、７Ｂ４および１３Ａ２の両方については、３つのヒト化重鎖可変領域および３つのヒト化軽鎖可変領域が設計された。
【0215】
ヒト化重鎖可変領域＋ヒトＩｇＧ２定常領域をエンコードする配列、および、軽鎖可変領域＋ヒトカッパ定常領域をエンコードする配列（それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３および６５に記載された重鎖定常領域および軽鎖定常領域のアミノ酸配列）を化学的に合成し、次に、それぞれＢａｍＨ ＩおよびＸｈｏ Ｉ制限部位を使用して、ｐＣＤＮＡ３．１（＋）ベースの発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）にサブクローニングした。重鎖可変領域のＣ末端をヒトＩｇＧ２定常領域のＮ末端に連結し、軽鎖可変領域のＣ末端をヒトカッパ定常領域のＮ末端に連結した。すべての発現コンストラクトをＤＮＡ配列によって確認した。ＨＥＫ２９３Ｆ発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）を重鎖および軽鎖発現ベクターでトランスフェクトし、例１０に説明されたプロトコルに従って、１０のヒト化抗ＣＤ４０抗体（１３Ａ２が５、７Ｂ４が５）を一時的に発現させた。ヒト化抗体を例３に説明されたように精製した。
【0216】
例１４ 例示的なキメラおよびヒト化抗ＣＤ４０抗体の特性評価
【0217】
例５に説明されたプロトコルに従って、ＨＥＫ２９３Ａ／ヒトＣＤ４０細胞およびＨＥＫ２９３ＡアカゲザルＣＤ４０細胞への結合の能力について、キメラおよびヒト化抗ＣＤ４０抗体の特性評価を更に行った。また、例７および例９におけるプロトコルに従って、ＨＥＫ－ＢｌｕｅアッセイにおいてＣＤ４０シグナル伝達を活性化する能力、および、樹状細胞成熟を促進する能力についてそれぞれ試験し、樹状細胞は３名の健康なヒトドナーから採取された。製造者の指示に従って、ヒトＩＬ１２（ｐ４０）ＥＬＩＳＡキット（ＢＤ、米国、Ｃａｔ＃：５５１１１６）を使用することによって、樹状細胞によるＩＬ‐１２（ｐ４０）分泌を測定した。
【0218】
図８、図９、図１０（ドナー１）、図１１（ドナー２）、および図１２（ドナー３）に示されるように、ヒト化抗ＣＤ４０抗体１３Ａ２－ＶＨ３ＶＬ２、１３Ａ２－ＶＨ３ＶＬ３および７Ｂ４ＶＨ２ＶＬ２は、最高の結合、アゴニスト、および機能活性を示した。
【0219】
例１５ ヒトＣＤ４０に対する例示的なキメラまたはヒト化抗ＣＤ４０抗体の結合親和性
【0220】
ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）８Ｋ計器（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に対するヒトＣＤ４０に対するキメラまたはヒト化抗ＣＤ４０抗体の結合親和性を決定するためにＳＰＲアッセイを実行した。簡潔に説明すると、ヒトＣＤ４０（ＥＣＤ）‐ｈｉｓタンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、中国、Ｃａｔ＃：１０７７４－Ｈ０８Ｈ）の１００～２００の応答単位（ＲＵ）がＣＭ５バイオセンサチップ（Ｃａｔ＃：ＢＲ－１００５－３０、ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に結合され、その後、１Ｍエタノールアミンを用いて、未反応の群のブロックを行った。０．３μＭ～１０μＭの濃度範囲の連続希釈された抗体をＳＰＲ泳動緩衝液（ＨＢＳ－ＥＰ緩衝液、ｐＨ７．４、ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；米国；Ｃａｔ＃：ＢＲ－１００６－６９）に３０μｌ／分で注入した。ブランク対照のＲＵを減算して結合能力を計算した。１対１のラングミュア結合モデル（ＢＩＡ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して会合速度（ｋａ）および解離速度（ｋｄ）を計算した。平衡解離定数ＫＤをｋｄ／ｋａ比として計算した。抗体のＳＰＲで決定された結合曲線を図１３に示した。キメラまたはヒト化抗体の結合親和性を表９に列挙した。
表９
ヒトＣＤ４０に対する抗ＣＤ４０抗体の結合親和性
表９
ヒトＣＤ４０に対する抗ＣＤ４０抗体の結合親和性
【表9】
【0221】
例１６ 例示的なキメラまたはヒト化抗ＣＤ４０抗体のエピトープマッピング
【0222】
ＥＬＩＳＡによって、結合エピトープについてキメラおよびヒト化抗ＣＤ４０抗体を試験した。
【0223】
ＣＤ４０細胞外ドメイン（ＥＣＤ）には４つの個別のシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）、すなわち、ＣＲＤ１、ＣＲＤ２、ＣＲＤ３およびＣＲＤ４がある。ＣＤ４０ ＥＣＤの構造に基づいて、１つの完全長ＣＤ４０ ＥＣＤ、５つのＣＤ４０ ＥＣＤ欠失体、および、４つのＣＤ４０ ＥＣＤ変異体を生成した。その情報は下の表１０において見ることができる。これらの組換えタンパク質は、タンパク質分泌のためにＮ末端においてシグナルペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８３）に連結され、ＥＬＩＳＡアッセイのためにＣ末端においてｍＦｃタグ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８４）に連結される。これらの組換えタンパク質をエンコードするＤＮＡ配列を合成し、ｐＣＤＮＡ３．１ベクターにサブクローニングした。例１０におけるプロトコルに従って、組換えタンパク質の発現および精製を実行した。例２におけるプロトコルに従って、組み換えＣＤ４０タンパク質に対するｍＡｂの結合能力を評価するためにＥＬＩＳＡアッセイを実行した。
【0224】
図１４のパネルＡに示されるように、すべての抗体は完全長ＣＤ４０ ＥＣＤに結合したが、欠失体には結合しなかった。これは、ＣＤ４０のＣＲＤ１ドメインが抗体の結合に関与し、重要であることを示す。図１４のパネルＢは、キメラ１３Ａ２抗体、３つのヒト化抗体、およびＡＤＣ１０１３が、ＣＤ４０変異体２－４に結合できないことを示した。このことは、５つの抗体が同一または同様の結合エピトープを共有することを示す。ＲＯ７００９７８９は変異体１、２および４に結合できず、ＡＰＸ００５は変異体２および４に結合できない。
表１０
ＣＤ４０ ＥＣＤ欠失体および変異体
注：ＣＲＤΔ１：欠失したＣＤＲ１ドメイン
表１０
ＣＤ４０ ＥＣＤ欠失体および変異体
【表10】
【0225】
例１７ ヒトＣＤ４０に特異的に結合する例示的なヒト化抗ＣＤ４０抗体
【0226】
相同性アミノ酸配列を有する他のヒトＴＮＦＲＳＦメンバーと比較してヒトＣＤ４０に対する抗ＣＤ４０抗体の結合特異性を決定するために、例２に説明されるプロトコルに従ってＥＬＩＳＡアッセイを実行した。
【0227】
ヒトＣＤ４０（ＥＣＤ）‐ｈｉｓ（ＴＮＦＲＳＦ５、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、中国、Ｃａｔ＃：１０７７４－Ｈ０８Ｈ）、ヒトＯＸ４０－ｈｉｓ（ＴＮＦＲＳＦ４、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、中国、Ｃａｔ＃：１０４８１－Ｈ０８Ｈ）、ヒトＨＶＥＭ－ｍＦｃ（ＴＮＦＲＳＦ１４、ＡＣＲＯ、中国、Ｃａｔ＃：ＨＶＭ－Ｈ５２５５）、ヒト４－１ＢＢ（ＴＮＦＲＳＦ９、ＡＣＲＯ、中国、Ｃａｔ＃：４１Ｂ－Ｈ５２２ａ）、ヒトＮＧＦＲ（ＴＮＦＲＳＦ１６、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、中国、Ｃａｔ＃：１３１８４－Ｈ０８Ｈ）、ヒトＤＲ６（ＴＮＦＲＳＦ２１、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、中国、Ｃａｔ＃：１０１７５－Ｈ０８Ｈ）、ヒトＲＡＮＫ（ＴＮＦＲＳＦ１１、ＡＣＲＯ、中国、Ｃａｔ＃：ＲＡＬ－Ｈ５２４０）に対する抗ＣＤ４０抗体の結合親和性を試験した。
【0228】
図１５に示すように、１３Ａ２ＶＨ３ＶＬ３および７Ｂ４ＶＨ２ＶＬ２のいずれも、組み換えヒトＯＸ４０（ＴＮＦＲＳＦ４）、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４）、４‐１ＢＢ（ＴＮＦＲＳＦ９）、ＮＧＦＲ（ＴＮＦＲＳＦ１６）、ＤＲ６（ＴＮＦＲＳＦ２１）、またはＲＡＮＫ（ＴＮＦＲＳＦ１１）に対する結合を示さなかった。このことは、１３Ａ２ＶＨ３ＶＬ３および７Ｂ４ＶＨ２ＶＬ２がヒトＣＤ４０に特異的に結合したことを示唆する。
【0229】
例１８ 操作された抗ＣＤ４０抗体はより良いアゴニスト活性を有した。
【0230】
アゴニスト抗ＣＤ４０抗体の最適な生物学的抗腫瘍作用は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）の共係合（ｃｏｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ）を必要とすることが示唆されている（Ｒｉｃｈｍａｎ ａｎｄ Ｖｏｎｄｅｒｈｅｉｄｅ， （２０１４） Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ ２（１）： １９－２６）。したがって、１３Ａ２ＶＨ３ＶＬ３または７Ｂ４ＶＨ２ＶＬ２の重鎖／軽鎖可変領域＋ヒトＩｇＧ１／カッパ定常領域を有する抗ＣＤ４０抗体を調製した。ヒトＩｇＧ１定常領域は、２６７ＥおよびＬ３２８Ｆ変異（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４において記載された、変異したＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列）を有するように操作した。取得された抗体をそれぞれ、１３Ａ２－ＶＨ３ＶＬ３－ＩｇＧ１（ＳＥ／ＬＦ）および７Ｂ４－ＶＨ２ＶＬ２－ＩｇＧ１（ＳＥ／ＬＦ）と名付け、例９におけるプロトコルに従って、樹状細胞成熟を促進する能力について更に特性評価を行った。ＲＯ７００９７８９、ＡＤＣ１０１３、およびＡＰＸ００５をポジティブコントロールとして使用し、Ｈｅｌをネガティブコントロールとして使用した。
【0231】
図１６に示すように、１３Ａ２－ＶＨ３ＶＬ３－ＩｇＧ１（ＳＥ／ＬＦ）および７Ｂ４－ＶＨ２ＶＬ２－ＩｇＧ１（ＳＥ／ＬＦ）は両方とも、親の抗体と比べて、樹状細胞成熟の促進において、著しく高いアゴニスト活性を示し、１３Ａ２－ＶＨ３ＶＬ３－ＩｇＧ１（ＳＥ／ＬＦ）は、すべての試験された抗体の中で最高の活性を有する。
【0232】
例１９ 例示的なヒト化抗ＣＤ４０抗体がｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍作用を有した。
【0233】
１３Ａ２－ＶＨ３ＶＬ３または７Ｂ４－ＶＨ２ＶＬ２の重鎖／軽鎖可変領域およびマウスＩｇＧ１／カッパ定常領域（それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２、６６に記載されたマウスＩｇＧ１／カッパ定常領域のアミノ酸配列）を有する抗ＣＤ４０抗体のｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍活性を、ヒトＣＤ４０を有する遺伝子組み換えマウス（ＧｅｍＰｈａｒｍａｔｅｃｈ Ｃｏ． Ｌｔｄ、中国）にＭＣ３８ネズミ結腸腺癌を移植することによって確立された動物モデルにおいて試験した。マウスモデルにおけるＦｃ機能を強化するためにマウスＩｇＧ１／カッパ定常領域を使用した。０日目に各マウスの片方の脇腹に１×１０６のＭＣ３８細胞を皮下注射した。腫瘍が約８０ｍｍ３に増殖したとき、動物を５群に無作為に割り付けた（８マウス／群）。次に、１３Ａ２－ＶＨ３ＶＬ３、７Ｂ４－ＶＨ２ＶＬ２、ＲＯ７００９７８９、ＡＰＸ００５またはＰＢＳを１０ｍｇ／ｋｇ／日の用量で、４日目、７日目、１１日目、１４日目、１８日目、２１日目に動物に腹腔内投与した。ＲＯ７００９７８９およびＡＰＸ００５は両方とも、マウスＩｇＧ１／カッパ定常領域（それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２および６６に記載されたマウスＩｇＧ１／カッパ定常領域のアミノ酸配列）を有するように操作された。
【0234】
腫瘍サイズおよびマウス体重を経時的に追跡した。腫瘍の寸法（幅および長さ）をノギスで測定し、腫瘍体積を公式ＴＶ＝（長さ×幅２）／２で計算した。抗体投与群における腫瘍体積が３．５ｃｍ３に到達する前に実験を終了した。腫瘍体積の差を識別するために一元配置分散分析を使用した。
【0235】
２５日目に、各群からのより大きい腫瘍を有する４匹のマウスをＴ細胞分析のために選択した。マウスを犠牲にした直後に腫瘍を採取し、コラゲナーゼを有するＨａｎｋｓ緩衝液に配置した。次に、腫瘍を小片に切断し、コラゲナーゼを有するＨａｎｋｓ緩衝液において、穏やかに振とうしながら３７℃で３０分間インキュベートした。その後、コラゲナーゼを不活性化して免疫細胞の生存を維持するために１０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳを各試料に添加した。試料を７０μｍの細胞フィルタ膜（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃａｔ＃：３５２３５０）に通し、新しい管に配置した。試料をペレット化して、１×１０７細胞／ｍｌの密度でＰＢＳＦ緩衝液（ＰＢＳ＋２％ＦＢＳ）に再懸濁した。試料をＰＢＳＦ緩衝液で２回洗浄した。各試料を２つの部分に分割した。一方には、抗ＣＤ４５（Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ７８５（登録商標）抗マウスＣＤ４５抗体；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；米国；Ｃａｔ＃：１０３１４９）、抗ＣＤ８（ＡＰＣ抗マウスＣＤ８ａ抗体；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；米国；Ｃａｔ＃：１００７１２）、抗ＣＤ３（ＦＩＴＣ抗マウスＣＤ３抗体；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；米国；Ｃａｔ＃：１００２０３）および抗ＣＤ４（ＰｅｒＣＰ抗マウスＣＤ４抗体；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；米国；Ｃａｔ＃：１００４３２）蛍光抗体混合物を添加し、他方には、抗ＣＤ１１ｃ（ＡＰＣ抗マウスＣＤ８ａ抗体；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；米国；Ｃａｔ＃：１００７１２）、抗ＣＤ８０（ＡＰＣ抗マウスＣＤ１１ｃ抗体；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；米国；Ｃａｔ＃：１１７３１０）、抗ＣＤ８３（ＰＥ／Ｃｙ７抗マウスＣＤ８３抗体；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；米国；Ｃａｔ＃：１２１５１８）および抗ＣＤ８６（ＦＩＴＣ抗マウスＣＤ８６抗体；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；米国；Ｃａｔ＃：１０５００５）蛍光抗体混合物を添加した。結果として生じる混合物を４℃で３０分インキュベートした。細胞をＰＢＳＦ緩衝液によって２回洗浄し、ＦＡＣＳマシン（ＢＤ）上で解析した。
【0236】
図１７に示されるように、抗ＣＤ４０抗体を用いた処置により、ネガティブコントロール群と比較して、腫瘍増殖が著しく低減または阻害された。ただし、反応は個体により異なる。腫瘍増殖の阻害はすべてのマウス（７Ｂ４ＶＨ２ＶＬ２またはＡＰＸ００５投与群）または大部分のマウス（１３Ａ２ＶＨ３ＶＬ３投与群では８のうち６、ＲＯ７００９７８９投与群では８のうち７）で観察された。２８日目に、７Ｂ４ＶＨ２ＶＬ２投与群における残り４匹のマウスすべてにおいて腫瘍が消失し、ＡＰＸ００５投与群における残り４匹のマウスのうち２匹においては腫瘍がまったく無かった。
【0237】
抗ＣＤ４０抗体を用いた治療により、抗体の毒性に起因して、マウス体重の低減が生じ得る。図１８および下の表１１に示されるように、２５日目の１３Ａ２ＶＨ３ＶＬ３群におけるマウスの体重が、腫瘍重量を考慮しても（２５日目の腫瘍は、サイズが約１０００ｍｍ３、重量が１．２ｇ）初期の重量と比較してやや増加した。このことは、抗体１３Ａ２ＶＨ３ＶＬ３の毒性が低いことを示している。換言すると、１３Ａ２ＶＨ３ＶＬ３を用いた治療は、ＲＯ７００９７８９群において観察されたような著しい体重の低減を生じさせず、７Ｂ４ＶＨ２ＶＬ２またはＡＰＸ００５群と比較して、マウス体重に対する影響が小さかった。
表１１
５群における経時的なマウス体重（平均±標準誤差（ｇ）、群あたり８マウス）
表１１
５群における経時的なマウス体重（平均±標準誤差（ｇ）、群あたり８マウス）
【表11】
【0238】
図１９は、抗体７Ｂ４ＶＨ２ＶＬ２によって、ＣＤ４５＋細胞におけるＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞およびＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞の両方の割合が明らかに増加したことを示す。１３Ａ２ＶＨ３ＶＬ３で治療したマウスにおいてもＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞の割合が増加した。加えて、図２０は、７Ｂ４ＶＨ２ＶＬ２処置によって、腫瘍浸潤樹状細胞（ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｃ＋細胞）におけるＣＤ８０およびＣＤ８３発現が著しく増加したことを示す。このことは、樹状細胞成熟の促進における強いアゴニスト活性を示す。
【0239】
いくつかの例示的な抗体重鎖／軽鎖可変領域のアミノ酸配列を下にまとめた。
【表12】
【表13】
【表14】
【0240】
開示は１または複数の実施形態に関連して上で説明されたが、開示はこれらの実施形態に限定されず、説明は添付の請求項の思想および範囲内に含まれ得るすべての代替形態、修正形態、および同等物を包含することが意図されていることが理解されるべきである。本明細書において参照される引用はすべて、参照によって全体的に更に組み込まれる。
［考えられる他の項目］
（項目１）
ＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含む重鎖可変領域、ならびに、ＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変領域を備え、
上記重鎖ＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域、ならびに、上記軽鎖ＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域は、（１）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、８、１５、２１、２７および３１；（２）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、９、１５、２１、２７および３１；（３）それぞれ２、９、１５、２１、２７および３１；（４）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１０、１６、２２、２８および３２；（５）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、１１、１７、２３、２９および３３；（６）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、１２、１８、２４、２７および３４；（７）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、１３、１９、２５、２７および３５；または（８）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、１４、２０、２６、３０および３６のアミノ酸配列を含む、
腫瘍壊死因子受容体ＣＤ４０に結合する単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
（項目２）
上記重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目１に記載の抗体またはその抗原結合部分。
（項目３）
上記軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０または６１に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目１に記載の抗体またはその抗原結合部分。
（項目４）
上記重鎖可変領域および上記軽鎖可変領域は、（１）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７および５１：（２）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８および５２：（３）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９および５３：（４）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０および５４：（５）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１および５５：（６）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４および５８：（７）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５および５９：（８）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６および６０：（９）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６および６１：（１０）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７および６０：（１１）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７および６１：（１２）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８および５９：（１３）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９および６０：（１４）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９および６１：（１５）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０および６０：または（１６）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０および６１に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目１に記載の抗体またはその抗原結合部分。
（項目５）
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２、６３、または６４に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖可変領域に連結された重鎖定常領域、および／または、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５または６６に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％ ９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域に連結された軽鎖定常領域を備える、項目１に記載の抗体またはその抗原結合部分。
（項目６）
（ａ）ヒトまたはサルＣＤ４０に結合し、（ｂ）マウスＣＤ４０に結合せず、（ｃ）ヒトＣＤ４０‐ヒトＣＤ４０Ｌ相互作用をブロックまたは促進し、（ｄ）ＣＤ４０シグナル伝達を活性化し、（ｅ）ＤＣ細胞成熟を促進し、（ｆ）ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞増殖を促進する、項目１に記載の抗体またはその抗原結合部分。
（項目７）
マウス、ヒト、キメラ、またはヒト化抗体である、項目１に記載の抗体またはその抗原結合部分。
（項目８）
ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４アイソタイプである項目１に記載の抗体またはその抗原結合部分。
（項目９）
項目１に記載の抗体またはその抗原結合部分と、薬学的に許容される担体とを備える医薬組成物。
（項目１０）
抗腫瘍剤および／またはサイトカインを更に含える、項目１０に記載の医薬組成物。
（項目１１）
癌疾患の治療に使用するための、項目１に記載の抗体またはその抗原結合部分。
（項目１２）
上記癌疾患は固形または非固形腫瘍である、項目１１に記載の使用するための抗体またはその抗原結合部分。
（項目１３）
上記癌疾患は、Ｂ細胞リンパ腫、慢性リンパ球性白血病、多発性骨髄腫、黒色腫、結腸腺癌、膵臓癌、大腸癌、胃腸癌、前立腺癌、膀胱癌、腎臓癌、卵巣癌、子宮頸癌、乳癌、肺癌、鼻咽頭癌から成る群から選択される、項目１２に記載の使用するための抗体またはその抗原結合部分。
（項目１４）
項目１に記載の抗体またはその抗原結合部分が、免疫刺激抗体、共刺激抗体、化学療法剤、および／またはサイトカインと共に投与される、項目１２に記載の使用するための抗体またはその抗原結合部分。
（項目１５）
上記免疫刺激抗体は、抗ＶＩＳＴＡ抗体、抗ＰＤ‐１抗体、抗ＰＤ‐Ｌ１抗体、抗ＬＡＧ‐３抗体、抗ＴＩＭ‐３抗体、抗ＳＴＡＴ３抗体、および抗ＲＯＲ１抗体から成る群から選択される、項目１４に記載の使用するための抗体またはその抗原結合部分。
（項目１６）
上記共刺激抗体は、抗ＣＤ１３７抗体または抗ＧＩＴＲ抗体である、項目１４に記載の使用するための抗体またはその抗原結合部分。
（項目１７）
上記化学療法剤はエピルビシン、オキサリプラチン、および／または、５‐フルオロウラシルである、項目１４に記載の使用するための抗体またはその抗原結合部分。
（項目１８）
上記サイトカインはＧＭ‐ＣＳＦおよび／またはＩＬ‐４である、項目１４に記載の使用するための抗体またはその抗原結合部分。
（項目１９）
項目１に記載の抗体またはその抗原結合断片を備える二重特異性分子。
（項目２０）
項目１に記載の抗体またはその抗原結合部分をエンコードするポリヌクレオチドを備える宿主細胞。
［考えられる他の項目］
（項目１）
ＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含む重鎖可変領域、ならびに、ＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変領域を備え、
上記重鎖ＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域、ならびに、上記軽鎖ＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域は、（１）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、８、１５、２１、２７および３１；（２）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、９、１５、２１、２７および３１；（３）それぞれ２、９、１５、２１、２７および３１；（４）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１０、１６、２２、２８および３２；（５）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、１１、１７、２３、２９および３３；（６）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、１２、１８、２４、２７および３４；（７）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、１３、１９、２５、２７および３５；または（８）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、１４、２０、２６、３０および３６のアミノ酸配列を含む、
腫瘍壊死因子受容体ＣＤ４０に結合する単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
（項目２）
上記重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目１に記載の抗体またはその抗原結合部分。
（項目３）
上記軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０または６１に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目１に記載の抗体またはその抗原結合部分。
（項目４）
上記重鎖可変領域および上記軽鎖可変領域は、（１）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７および５１：（２）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８および５２：（３）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９および５３：（４）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０および５４：（５）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１および５５：（６）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４および５８：（７）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５および５９：（８）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６および６０：（９）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６および６１：（１０）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７および６０：（１１）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７および６１：（１２）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８および５９：（１３）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９および６０：（１４）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９および６１：（１５）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０および６０：または（１６）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０および６１に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目１に記載の抗体またはその抗原結合部分。
（項目５）
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２、６３、または６４に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖可変領域に連結された重鎖定常領域、および／または、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５または６６に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％ ９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域に連結された軽鎖定常領域を備える、項目１に記載の抗体またはその抗原結合部分。
（項目６）
（ａ）ヒトまたはサルＣＤ４０に結合し、（ｂ）マウスＣＤ４０に結合せず、（ｃ）ヒトＣＤ４０‐ヒトＣＤ４０Ｌ相互作用をブロックまたは促進し、（ｄ）ＣＤ４０シグナル伝達を活性化し、（ｅ）ＤＣ細胞成熟を促進し、（ｆ）ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞増殖を促進する、項目１に記載の抗体またはその抗原結合部分。
（項目７）
マウス、ヒト、キメラ、またはヒト化抗体である、項目１に記載の抗体またはその抗原結合部分。
（項目８）
ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４アイソタイプである項目１に記載の抗体またはその抗原結合部分。
（項目９）
項目１に記載の抗体またはその抗原結合部分と、薬学的に許容される担体とを備える医薬組成物。
（項目１０）
抗腫瘍剤および／またはサイトカインを更に含える、項目１０に記載の医薬組成物。
（項目１１）
癌疾患の治療に使用するための、項目１に記載の抗体またはその抗原結合部分。
（項目１２）
上記癌疾患は固形または非固形腫瘍である、項目１１に記載の使用するための抗体またはその抗原結合部分。
（項目１３）
上記癌疾患は、Ｂ細胞リンパ腫、慢性リンパ球性白血病、多発性骨髄腫、黒色腫、結腸腺癌、膵臓癌、大腸癌、胃腸癌、前立腺癌、膀胱癌、腎臓癌、卵巣癌、子宮頸癌、乳癌、肺癌、鼻咽頭癌から成る群から選択される、項目１２に記載の使用するための抗体またはその抗原結合部分。
（項目１４）
項目１に記載の抗体またはその抗原結合部分が、免疫刺激抗体、共刺激抗体、化学療法剤、および／またはサイトカインと共に投与される、項目１２に記載の使用するための抗体またはその抗原結合部分。
（項目１５）
上記免疫刺激抗体は、抗ＶＩＳＴＡ抗体、抗ＰＤ‐１抗体、抗ＰＤ‐Ｌ１抗体、抗ＬＡＧ‐３抗体、抗ＴＩＭ‐３抗体、抗ＳＴＡＴ３抗体、および抗ＲＯＲ１抗体から成る群から選択される、項目１４に記載の使用するための抗体またはその抗原結合部分。
（項目１６）
上記共刺激抗体は、抗ＣＤ１３７抗体または抗ＧＩＴＲ抗体である、項目１４に記載の使用するための抗体またはその抗原結合部分。
（項目１７）
上記化学療法剤はエピルビシン、オキサリプラチン、および／または、５‐フルオロウラシルである、項目１４に記載の使用するための抗体またはその抗原結合部分。
（項目１８）
上記サイトカインはＧＭ‐ＣＳＦおよび／またはＩＬ‐４である、項目１４に記載の使用するための抗体またはその抗原結合部分。
（項目１９）
項目１に記載の抗体またはその抗原結合断片を備える二重特異性分子。
（項目２０）
項目１に記載の抗体またはその抗原結合部分をエンコードするポリヌクレオチドを備える宿主細胞。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【図11A】
【図11B】
【図12A】
【図12B】
【図12C】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【配列表】
【国際調査報告】