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特表2022-522725アルブミンと結合したＳｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２を含む骨関連疾患の予防または治療用組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-04-20
(54)【発明の名称】アルブミンと結合したＳｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２を含む骨関連疾患の予防または治療用組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 38/17 20060101AFI20220413BHJP
A61K 47/64 20170101ALI20220413BHJP
A61P 19/08 20060101ALI20220413BHJP
A61P 19/10 20060101ALI20220413BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220413BHJP
A61K 9/08 20060101ALI20220413BHJP
C07K 14/47 20060101ALI20220413BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20220413BHJP
C07K 14/765 20060101ALI20220413BHJP
【ＦＩ】
A61K38/17 ZNA
A61K47/64
A61P19/08
A61P19/10
A61P35/00
A61K9/08
C07K14/47
C07K19/00
C07K14/765
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021550273
(86)(22)【出願日】2020-02-27
(85)【翻訳文提出日】2021-08-27
(86)【国際出願番号】 KR2020002825
(87)【国際公開番号】W WO2020175935
(87)【国際公開日】2020-09-03
(31)【優先権主張番号】10-2019-0023376
(32)【優先日】2019-02-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
２．ｗｉｔｅｐｓｏｌ
(71)【出願人】
【識別番号】508131716
【氏名又は名称】デウン ファーマシューティカル カンパニー リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＤＡＥＷＯＯＮＧ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＣＯ．， ＬＴＤ
【住所又は居所原語表記】３５－１４，Ｊｅｙａｋｇｏｎｇｄａｎ ４－ｇｉｌ，Ｈｙａｎｇｎａｍ－ｅｕｐ，Ｈｗａｓｅｏｎｇ－ｓｉ，Ｇｙｅｏｎｇｇｉ－ｄｏ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ
(74)【代理人】
【識別番号】100121728
【弁理士】
【氏名又は名称】井関 勝守
(74)【代理人】
【識別番号】100165803
【弁理士】
【氏名又は名称】金子 修平
(74)【代理人】
【識別番号】100170900
【弁理士】
【氏名又は名称】大西 渉
(72)【発明者】
【氏名】ゴ ジョンミン
(72)【発明者】
【氏名】ギム ソンソブ
(72)【発明者】
【氏名】アン ギョンフン
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C076AA11
4C076BB11
4C076CC09
4C076CC41
4C076EE59Q
4C076FF63
4C084AA01
4C084AA02
4C084BA01
4C084BA22
4C084BA23
4C084BA41
4C084CA18
4C084CA53
4C084DC50
4C084MA16
4C084MA66
4C084NA03
4C084NA12
4C084ZA961
4C084ZA971
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045CA40
4H045DA70
4H045EA01
4H045EA20
4H045FA74
4H045GA26
(57)【要約】
本発明は、アルブミンと結合したＳｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２を含む骨関連疾患の予防または治療用組成物に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
アルブミンと結合したＳｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２を含む、骨関連疾患の予防または治療用薬学組成物。
【請求項2】
前記アルブミンは、ヒト血清アルブミン（ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）である、請求項１に記載の骨関連疾患の予防または治療用薬学組成物。
【請求項3】
前記ヒト血清アルブミンは、前記Ｓｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２のＮ－末端に結合されている、請求項２に記載の骨関連疾患の予防または治療用薬学組成物。
【請求項4】
前記ヒト血清アルブミンは、配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の骨関連疾患の予防または治療用薬学組成物。
【請求項5】
前記Ｓｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２は、配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の骨関連疾患の予防または治療用薬学組成物。
【請求項6】
前記アルブミンと前記Ｓｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２の間にリンカーをさらに含む、請求項１に記載の骨関連疾患の予防または治療用薬学組成物。
【請求項7】
前記リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）ｎであり、ここで、ｎは１～１０の整数である、請求項６に記載の骨関連疾患の予防または治療用薬学組成物。
【請求項8】
注射剤として投与されている、請求項１に記載の骨関連疾患の予防または治療用薬学組成物。
【請求項9】
前記骨関連疾患は、骨粗しょう症（ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ）、骨折、骨損失、変形性関節症（ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、骨転移がん及びパジェット病（Ｐａｇｅｔ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）からなる群から選ばれるいずれか一つ以上である、請求項１に記載の骨関連疾患の予防または治療用薬学組成物。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、アルブミンと結合したＳｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２を含む骨関連疾患の予防または治療用組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
Ｓｌｉｔタンパク質は、神経系の発生過程の間にニューロンとエクソンの移動を調節するものとしてよく知られているタンパク質である。Ｓｌｉｔタンパク質はＲｏｂｏ受容体と作用して生理学的活性を調節し得、心臓、肺、腎臓、乳房組織など様々な組織において様々な細胞内過程を調節する因子として役割を果たすことが知られており、最近、細胞の成長、付着能及び移動能の調節に重要な役割を果たすことが報告され、細胞の分化過程における移動及びがんの発生と転移過程においてＳｌｉｔタンパク質が関与できることが報告されている。
【0003】
このような背景下で、本発明者らは、Ｓｌｉｔ３のＬＲＲＤ２が細胞及び動物モデルにおいて骨形成を増加させ、骨吸収を減少させ、骨粗しょう症の発病率と負の相関関係を有しており、骨折または骨粗しょう症の予防または治療用組成物及び骨折または骨粗しょう症の発生リスクを予測するためのバイオマーカーとして有用に使用できることを明らかにした（大韓民国登録特許第１０－１６１７４９７号）。ＬＲＲＤ２は、注射剤であって、患者が病院に来院して投与を受けなければならないが、生体内半減期が非常に短く、その薬効が発揮されるためには、投与周期が短くなるしかなく、これによる過度の薬剤の使用により効能が減少する問題が発生するものと予想される。
【0004】
そこで、本発明者らは、ＬＲＲＤ２の生体内半減期を増進することにより、その効能を改善させたＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質（ＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）を開発し、本発明を完成した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明の目的は、Ｓｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２の骨関連疾患の予防または治療効能を改善させた組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0006】
上述した課題を解決するため、本発明は、アルブミンと結合したＳｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２を含む骨関連疾患の予防または治療用薬学組成物を提供する。
【0007】
本発明の好適な一実施例によれば、前記アルブミンは、ヒト血清アルブミン（ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）であってもよい。
【0008】
本発明の好適なさらに他の一実施例によれば、前記ヒト血清アルブミンは、Ｓｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２のＮ－末端に結合されたものであってもよい。
【0009】
本発明の好適なさらに他の一実施例によれば、前記ヒト血清アルブミンは、配列番号２のアミノ酸配列を含んでもよい。
【0010】
本発明の好適な他の一実施例によれば、前記Ｓｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２は、配列番号３のアミノ酸配列を含んでもよい。
【0011】
本発明の好適なさらに他の一実施例によれば、前記アルブミンとＳｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２間にリンカーをさらに含んでもよい。
【0012】
本発明の好適な他の一実施例によれば、前記リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号５）であり、ここで、ｎは、１～１０の整数であってもよい。
【0013】
本発明の好適なさらに他の一実施例によれば、前記薬学組成物は、注射剤として投与されてもよい。
【0014】
本発明の好適な他の一実施例によれば、前記骨関連疾患は、骨粗しょう症（ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ）、骨折、骨損失、変形性関節症（ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、骨転移がん及びパジェット病（Ｐａｇｅｔ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）からなる群から選ばれるいずれか一つ以上であってもよい。
【発明の効果】
【0015】
本発明のアルブミンと結合したＳｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２は、アルブミンと結合しないＳｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２と同じ細胞学的効能を示し、アルブミンと結合しないＳｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２と比較し、生体内半減期が著しく増加し、骨関連疾患をより効果的に予防または治療しうる。
【図面の簡単な説明】
【0016】
【発明を実施するための形態】
【0017】
上述したように、Ｓｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２は、細胞及び動物モデルにおいて骨形成を増加させ、骨吸収を減少させることにより、骨折または骨粗しょう症の予防または治療に使用してもよいが、生体内半減期が非常に短く、その薬効が発揮されるためには、投与周期が短くなるしかなく、これによる過度の薬剤の使用により効能が減少する問題が発生するものと予想された。
【0018】
そこで、本発明者らは、ＬＲＲＤ２の生体内半減期を増進することにより、その効能を改善させたＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質（ＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）を開発することにより、上述した問題の解決方案を模索した。本発明のアルブミンと結合したＳｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２は、アルブミンと結合しないＳｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２と同じ細胞学的効能を示し、アルブミンと結合しないＳｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２と比較して、生体内半減期が著しく増加して骨関連疾患をより効果的に予防または治療しうる。
【0019】
以下、本発明をより詳細に説明する。
【0020】
本発明は、アルブミンと結合したＳｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２を含む骨関連疾患の予防または治療用薬学組成物を提供する。
【0021】
本発明の薬学組成物にあって、「Ｓｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２」は、Ｓｌｉｔ３タンパク質内の２番目のロイシンリッチリピートドメイン（ｌｅｕｃｉｎｅ ｒｉｃｈ ｒｅｐｅａｔ ｄｏｍａｉｎ、ＬＲＲＤ２）をいう。
【0022】
本発明において、用語の「Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２」とは、「Ｓｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２」を意味し、相互互換的に使用されてもよい。
【0023】
本発明の薬学組成物において、前記アルブミンは、ヒト血清アルブミン（ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）、リーサス（ｒｈｅｓｕｓ）血清アルブミン（ＲｈＳＡ）、カニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｏｕｓ ｍｏｎｋｅｙ）血清アルブミン（ＣｙＳＡ）、またはミューリン（ｍｕｒｉｎｅ）血清アルブミン（ＭｕＳＡ）であってもよく、好ましくは、ヒト血清アルブミンであってもよい。前記Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２は、ヒト血清アルブミンの存在下のＳｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２の生体内半減期は、ヒト血清アルブミンの不在下におけるＳｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２の生体内半減期よりも少なくとも１０倍以上さらに長い。
【0024】
本発明の具体的な一実施例において、ヒト血清アルブミンの存在下のＳｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２の血清半減期は、ヒト血清アルブミンの不在下におけるＳｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２より１４倍さらに長い。
【0025】
本発明の薬学組成物において、ヒト血清アルブミンとＳｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２は、ヒト血清アルブミン及びＳｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２の順序で結合されるか、またはその逆であってもよい。好ましくは、ヒト血清アルブミン及びＳｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２の順序で結合される。例えば、ヒト血清アルブミンがＳｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２のＮ末端に結合する場合、Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２の生体内半減期及びその骨関連疾患の治療効能が最も優れており、ヒト血清アルブミンがＣ末端に結合する場合、程度の差があり得るが、有効な効能を示すことができる。
【0026】
本発明の薬学組成物において、前記ヒト血清アルブミンは、６０９個のアミノ酸からなる全長またはその一部のアミノ酸配列を含む断片として使用されてもよい。ヒト血清アルブミンの全長アミノ酸配列は、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ９８７９７．１に開示されたもので、本発明の具体的な一実施例では、６０９個のアミノ酸からなる全長のヒト血清アルブミンにおいて２５番目～６０９番目のアミノ酸（５８５個のアミノ酸）からなる断片の形態を使用した。本発明の薬学組成物において、ヒト血清アルブミンは、下記配列番号２のアミノ酸配列からなる。
【0027】
ＤＡＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫＤＬＧＥＥＮＦＫＡＬＶＬＩＡＦＡＱＹＬＱＱＣＰＦＥＤＨＶＫＬＶＮＥＶＴＥＦＡＫＴＣＶＡＤＥＳＡＥＮＣＤＫＳＬＨＴＬＦＧＤＫＬＣＴＶＡＴＬＲＥＴＹＧＥＭＡＤＣＣＡＫＱＥＰＥＲＮＥＣＦＬＱＨＫＤＤＮＰＮＬＰＲＬＶＲＰＥＶＤＶＭＣＴＡＦＨＤＮＥＥＴＦＬＫＫＹＬＹＥＩＡＲＲＨＰＹＦＹＡＰＥＬＬＦＦＡＫＲＹＫＡＡＦＴＥＣＣＱＡＡＤＫＡＡＣＬＬＰＫＬＤＥＬＲＤＥＧＫＡＳＳＡＫＱＲＬＫＣＡＳＬＱＫＦＧＥＲＡＦＫＡＷＡＶＡＲＬＳＱＲＦＰＫＡＥＦＡＥＶＳＫＬＶＴＤＬＴＫＶＨＴＥＣＣＨＧＤＬＬＥＣＡＤＤＲＡＤＬＡＫＹＩＣＥＮＱＤＳＩＳＳＫＬＫＥＣＣＥＫＰＬＬＥＫＳＨＣＩＡＥＶＥＮＤＥＭＰＡＤＬＰＳＬＡＡＤＦＶＥＳＫＤＶＣＫＮＹＡＥＡＫＤＶＦＬＧＭＦＬＹＥＹＡＲＲＨＰＤＹＳＶＶＬＬＬＲＬＡＫＴＹＥＴＴＬＥＫＣＣＡＡＡＤＰＨＥＣＹＡＫＶＦＤＥＦＫＰＬＶＥＥＰＱＮＬＩＫＱＮＣＥＬＦＥＱＬＧＥＹＫＦＱＮＡＬＬＶＲＹＴＫＫＶＰＱＶＳＴＰＴＬＶＥＶＳＲＮＬＧＫＶＧＳＫＣＣＫＨＰＥＡＫＲＭＰＣＡＥＤＹＬＳＶＶＬＮＱＬＣＶＬＨＥＫＴＰＶＳＤＲＶＴＫＣＣＴＥＳＬＶＮＲＲＰＣＦＳＡＬＥＶＤＥＴＹＶＰＫＥＦＮＡＥＴＦＴＦＨＡＤＩＣＴＬＳＥＫＥＲＱＩＫＫＱＴＡＬＶＥＬＶＫＨＫＰＫＡＴＫＥＱＬＫＡＶＭＤＤＦＡＡＦＶＥＫＣＣＫＡＤＤＫＥＴＣＦＡＥＥＧＫＫＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧＬ（配列番号２）。
【0028】
本発明の薬学組成物において、前記Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２は、ヒト由来であり、１５２３個のアミノ酸からなるＳｌｉｔ３タンパク質内のＬＲＲＤ２の全長またはその一部のアミノ酸配列を含む断片として使用されてもよい。Ｓｌｉｔ３タンパク質の全長アミノ酸配列は、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＱ８９２４３．１に開示されたもので、本発明の具体的な一実施例において、Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２は、１５２３個のアミノ酸からなる全長のＳｌｉｔ３タンパク質において２７８番目～４８６番目のアミノ酸（２０９個のアミノ酸）からなる断片の形態を使用した。本発明の薬学組成物において、Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２は、下記配列番号３のアミノ酸配列からなる。
【0029】
ＩＳＣＰＳＰＣＴＣＳＮＮＩＶＤＣＲＧＫＧＬＭＥＩＰＡＮＬＰＥＧＩＶＥＩＲＬＥＱＮＳＩＫＡＩＰＡＧＡＦＴＱＹＫＫＬＫＲＩＤＩＳＫＮＱＩＳＤＩＡＰＤＡＦＱＧＬＫＳＬＴＳＬＶＬＹＧＮＫＩＴＥＩＡＫＧＬＦＤＧＬＶＳＬＱＬＬＬＬＮＡＮＫＩＮＣＬＲＶＮＴＦＱＤＬＱＮＬＮＬＬＳＬＹＤＮＫＬＱＴＩＳＫＧＬＦＡＰＬＱＳＩＱＴＬＨＬＡＱＮＰＦＶＣＤＣＨＬＫＷＬＡＤＹＬＱＤＮＰＩＥＴＳＧＡＲＣＳＳＰＲＲＬＡＮＫＲＩＳＱＩＫＳＫＫＦＲＣＳ（配列番号３）。
【0030】
本発明の薬学組成物において、「Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２」は、配列番号３のアミノ酸配列との機能的同等物を含んでもよい。
【0031】
前記「機能的同等物」とは、タンパク質またはペプチドのアミノ酸付加、置換または欠失により、本発明の配列番号１～４のアミノ酸配列と少なくとも７０％以上、好ましくは、８０％以上、より好ましくは、９０％以上、さらに好ましくは、９５％以上の配列相同性を持つもので、配列番号１～４のアミノ酸配列から構成されたタンパク質またはペプチドと実質的に同質の生理活性を示すタンパク質またはペプチドをいう。
【0032】
具体的には、本発明の薬学組成物に含まれる融合タンパク質は、その野生型アミノ酸配列を有するタンパク質またはペプチドだけでなく、そのアミノ酸配列変異体も本発明の範囲に含まれてもよい。前記アミノ酸配列変異体とは、Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２の野生型アミノ酸配列と１つ以上のアミノ酸残基が欠失、挿入、非保全的または保全的置換またはこれらの組み合わせによって異なる配列を有するタンパク質またはペプチドを意味する。
【0033】
分子の活性を全体的に変更させないタンパク質及びペプチドにおいて、可能なアミノ酸の交換は、当該分野に公知されている（Ｈ．Ｎｅｕｒａｔｈ，Ｒ．Ｌ．Ｈｉｌｌ，Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７９）。最も一般的に起こる交換は、アミノ酸残基Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｈｙ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ間の交換である。場合によっては、リン酸化（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）、硫化（ｓｕｌｆａｔｉｏｎ）、アセチル化（ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ）、糖化（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）、メチル化（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）、ファルネシル化（ｆａｒｎｅｓｙｌａｔｉｏｎ）などで修飾（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）されてもよい。
【0034】
本発明のＳｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２、またはその変異体は、天然から抽出したり、合成（Ｍｅｒｒｉｆｌｅｌｄ，Ｊ．Ａｍｅｒ．ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９－２１５６，１９６３）またはＤＮＡ配列を基本とする遺伝子組換え方法により製造されてもよい（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ，２版，１９８９）。
【0035】
本発明の薬学組成物において、アルブミンとＳｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２の間には、リンカーがさらに含まれてもよい。好ましいリンカーの種類としては、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号５）であってもよく、ここで、ｎは、１～１０の整数であってもよく、好ましくは、ｎは、１～５の整数であってもよい。
【0036】
本発明のＳｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２は、その生体内半減期を増進させるため、アルブミン融合以外にもＩｇＧのＦｃタンパク質融合またはペギュレーション（ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）などが行われてもよい。
【0037】
本発明の薬学組成物は、経口または非経口の様々な剤形であってもよい。前記薬学組成物を剤形化する場合、１つ以上の緩衝剤（例えば、生理食塩水またはＰＢＳ）、抗酸化剤、静菌剤、キレート化剤（例えば、ＥＤＴＡまたはグルタチオン）、充填剤、増量剤、結合剤、アジュバント（例えば、アルミニウムハイドロオキサイド）、懸濁剤、濃厚剤、湿潤剤、崩解剤または界面活性剤、希釈剤または賦形剤を使用して調製されてもよい。
【0038】
経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれており、これらの固形剤は、一つ以上の化合物に少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、澱粉（トウモロコシ澱粉、小麦澱粉、米澱粉、ジャガイモ澱粉などを含む）、炭酸カルシウム（ｃａｌｃｉｕｍ ｃａｒｂｏｎａｔｅ）、スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）、ラクトース（ｌａｃｔｏｓｅ）、デキストロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、セルロース、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース及びヒドロキシプロピルメチル－セルロースまたはゼラチンなどを混合して調剤される。例えば、活性成分を固体賦形剤と配合した後、これを粉砕し、適切な補助剤を添加した後、顆粒混合物に加工することにより、錠剤または糖衣錠剤が得られる。
【0039】
また、単純な賦形剤の他にステアリン酸マグネシウム、タルクなどの潤滑剤も使用される。経口投与のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤またはシロップ剤などが該当するが、よく使用される単純希釈剤である水、リキッドパラフィンの他に様々な賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤または保存剤などが含まれてもよい。また、場合によっては、架橋結合ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸またはナトリウムアルギネートなどを崩解剤として添加してもよく、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤及び防腐剤などをさらに含んでもよい。
【0040】
非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁溶剤、乳剤、凍結乾燥製剤または坐剤などが含まれる。非水性溶剤及び懸濁溶剤としては、プロピレングリコール（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）、ポリエチレングリコール、オリーブオイルなどの植物油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルなどが使用されてもよい。坐剤の基剤としては、ウイテプゾール（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、ツイン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロール、ゼラチンなどが使用されてもよい。
【0041】
本発明の薬学組成物は、経口または非経口で投与されてもよく、非経口投与時に皮膚外用、腹腔内、直腸、静脈、筋肉、皮下、子宮内硬膜または脳血管内に注射する注射剤、経皮投与剤、または鼻腔吸入剤の形態で当業界で公知の方法により剤形化されてもよい。
【0042】
前記注射剤の場合には、必ず滅菌されなければならず、バクテリア及び真菌などの微生物の汚染から保護されるべきである。注射剤の場合、適切な担体の例としては、これに限定されるものではないが、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコールなど）、これらの混合物及び／又は植物油を含む溶媒または分散媒質であってもよい。より好ましくは、適切な担体としては、ハンクス液、リンゲル液、トリエタノールアミンが含有されたＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）または注射用滅菌水、１０％エタノール、４０％プロピレングリコール及び５％デキストロースなどの等張溶液などが使用されてもよい。前記注射剤を微生物汚染から保護するためには、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどの様々な抗菌剤及び抗真菌剤をさらに含んでもよい。また、前記注射剤は、ほとんどの場合、糖またはナトリウムクロライドなどの等張化剤をさらに含んでもよい。
【0043】
経皮投与剤の場合、軟膏剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、外用液剤、パスタ剤、リニメント剤、エアロール剤などの形態が含まれる。前記において経皮投与は、薬学組成物を局所的に皮膚に投与して薬学組成物に含有された有効な量の活性成分が皮膚内に伝達されることを意味する。
【0044】
吸入投与剤の場合、本発明によって使用される融合タンパク質は、適切な推進剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適切な気体を使用し、加圧パックまたは煙霧機からエアロゾルスプレーの形態で便利に伝達しうる。加圧エアロゾルの場合、投薬単位は、計量された量を伝達する弁を提供して決定してもよい。例えば、吸入器または吹込器に使用されるゼラチンカプセル及びカートリッジは、化合物及びラクトース又はデンプンなどの適切な粉末基剤の粉末混合物を含有するように剤形化してもよい。非経口投与用剤形は、すべての製薬化学で一般的に公知の処方書である文献（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９７５．Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ １８０４２，Ｃｈａｐｔｅｒ ８７：Ｂｌａｕｇ，Ｓｅｙｍｏｕｒ）に記載されている。
【0045】
本発明の薬学組成物は、薬剤学的に有効な量で投与する。本発明において、「薬剤学的に有効な量」とは、医学的治療に適用可能な合理的な恩恵／リスク比で疾患を治療するのに十分な量を意味し、有効用量の水準は、患者の疾患の種類、重症度、薬物の活性、薬物に対する感度、投与時間、投与経路及び排出比率、治療期間、同時に使用される薬物を含む要素及びその他の医学分野でよく知られている要素に応じて決定されてもよい。本発明の薬学組成物は、個別治療剤として投与するか、または他の治療剤と併用して投与されてもよく、従来の治療剤とは、順次的又は同時に投与されてもよく、単一または多重投与されてもよい。すなわち、本発明の組成物の総有効量は、単一投与量（ｓｉｎｇｌｅ ｄｏｓｅ）で患者に投与されてもよく、多重投与量（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｄｏｓｅ）で長期間投与される分割治療方法（ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌ）によって投与されてもよい。前記要素をすべて考慮し、副作用なしに最小限の量で最大の効果が得られる量を投与することが重要であり、これは当業者によって容易に決定されてもよい。
【0046】
本発明の薬学組成物の投与量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率及び疾患の重症度に応じて、その範囲が多様である。一日投与量としては、非経口投与時にＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２を基準に一日に体重１ｋｇ当たり好ましくは、０．０１～５０ｍｇ、より好ましくは、０．１～３０ｍｇの量で投与されるように、そして、経口投与時には、本発明のＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２を基準に一日に体重１ｋｇ当たり、好ましくは、０．０１～１００ｍｇ、より好ましくは、０．０１～１０ｍｇの量で投与されるように１～数回に分けて投与してもよい。しかし、投与経路、肥満の重症度、性別、体重、年齢などによって増減されてもよいので、前記投与量がいかなる方法によっても本発明の範囲を限定するものではない。
【0047】
本発明の薬学組成物は、単独で、または手術、放射線治療、ホルモン治療、化学治療及び生物学的反応調節剤を使用する方法と併用して使用してもよい。
【0048】
本発明の薬学組成物は、さらに外用剤の剤形として提供しうる。本発明の骨関連疾患の予防及び治療用薬学組成物を皮膚外用剤として使用する場合、さらに脂肪物質、有機溶媒、溶解剤、濃縮剤及びゲル化剤、軟化剤、抗酸化剤、懸濁化剤、安定化剤、発泡剤（ｆｏａｍｉｎｇ ａｇｅｎｔ）、芳香剤、界面活性剤、水、イオン型乳化剤、非イオン型乳化剤、充填剤、金属イオン封鎖剤、キレート化剤、保存剤、ビタミン、遮断剤、湿潤化剤、必須オイル、染料、顔料、親水性活性剤、親油性活性剤または脂質小胞などの皮膚外用剤に通常使用される任意の他の成分と同じ皮膚科学分野において通常使用される補助剤を含有してもよい。また、前記成分は、皮膚科学分野において一般的に使用される量で導入されてもよい。
【0049】
本発明の骨関連疾患の予防及び治療用薬学組成物が皮膚外用剤として提供される場合、これらに制限されるものではないが、軟膏、パッチ、ゲル、クリームまたは噴霧剤などの剤形であってもよい。
【0050】
本発明の骨関連疾患は、骨吸収の増加または骨形成の減少、例えば、骨形成が骨吸収より少なくなって骨量が減少して発生可能な疾患を意味し、骨粗しょう症（ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ）、骨折、骨損失、変形性関節症（ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、骨転移がん及びパジェット病（Ｐａｇｅｔ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）からなる群から選ばれるいずれか一つ以上であることがより好ましいが、これに限定されるものではない。
【0051】
本発明は、さらにアルブミンと結合したＳｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２を含む骨関連疾患の予防または改善用健康機能食品組成物を提供する。本発明の健康機能食品の組成物に含まれる有効成分の構成及びその効果は、前述の薬学組成物に対するものと同じなので、その記載を省略する。
【0052】
本発明による健康機能食品組成物は、当業界で公知の通常の方法によって様々な形態で製造されてもよい。一般食品としては、これに限定されるものではないが、飲料（アルコール性飲料を含む）、果実及びその加工食品（例えば、果物缶詰、瓶詰、ジャム、マーマレードなど）、魚類、肉類及びその加工食品（例えば、ハム、ソーセージ、コンビーフなど）、パン類及び麺類（例えば、うどん、そば、ラーメン、スパゲッティ、マカロニなど）、果汁、各種ドリンク、クッキー、飴、乳製品（例えば、バター、チーズなど）、食用植物油脂、マーガリン、植物性タンパク質、レトルト食品、冷凍食品、各種調味料（例えば、味噌、醤油、ソースなど）などに本発明のＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質を添加して製造してもよい。また、栄養補助剤としては、これに限定されるものではないが、カプセル、タブレット、丸薬などに本発明のＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質を添加して製造してもよい。また、健康機能食品としては、これに限定されるものではないが、例えば、本発明のＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質そのものをお茶、ジュース及びドリンクの形態で製造して飲用（健康飲料）できるように液状化、顆粒化、カプセル化及び粉末化して摂取してもよい。また、本発明のＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質を食品添加剤の形態で使用するためには、粉末または濃縮液の形態で製造して使用してもよい。また、本発明のＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質と骨関連疾患の予防及び筋機能の改善効果があると知られている公知の活性成分とともに混合して組成物の形態で製造してもよい。
【0053】
本発明のＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質を健康飲料として用いる場合、前記健康飲料組成物は、通常の飲料のように様々な香味剤または天然炭水化物などを追加成分として含有してもよい。前述の天然炭水化物は、ブドウ糖、果糖などのモノサッカライドと、マルトース、スクロースなどのジサッカライド、デキストリン、シクロデキストリンなどのポリサッカライド、キシリトール、ソルビトール、エリスリトールなどの糖アルコールであってもよい。甘味剤としては、タウマチン、ステビア抽出物などの天然甘味剤、サッカリン、アスパルテームなどの合成甘味剤などを使用してもよい。前記天然炭水化物の割合は、本発明の組成物１００ｍＬ当たり、一般的に約０．０１～０．０４ｇ、好ましくは、約０．０２～０．０３ｇである。
【0054】
また、本発明のＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質は、骨関連疾患の予防または改善用食品組成物の有効成分として含有されてもよいが、その量は、骨関連疾患の予防または改善効果を達成するのに有効な量で、特に限定されるものではないが、全組成物の総重量に対して、０．０１～１００重量％であることが好ましい。本発明の健康機能食品組成物は、ＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質とともに骨関連疾患に効果があることが知られている他の活性成分とともに混合して製造されてもよい。
【0055】
前記の他に本発明の健康機能食品組成物は、様々な栄養剤、ビタミン、電解質、風味剤、着色剤、ペクチン酸、ペクチン酸の塩、アルギン酸、アルギン酸の塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調整剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコールまたは炭酸化剤などを含有してもよい。その他に本発明の健康食品は、天然フルーツジュース、フルーツジュース飲料、または野菜飲料の製造のための果肉を含有してもよい。これらの成分は、独立してまたは混合して使用してもよい。これらの添加剤の割合は、それほど重要ではないが、本発明の組成物１００重量部当たり、０．０１～０．１重量部の範囲で選ばれるのが一般的である。
【0056】
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は、単に本発明を例示するためのもので、本発明の範囲がこれらの実施例により制限されるものと解釈されないことは、当業界において通常の知識を有する者にとって自明であろう。
【0057】
下記実施例に使用された略語及びその意味は、以下の表１の通りである。
【0058】
【表1】
【実施例】
【0059】
［実施例１］
ＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質（ＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）の製造
ＰＣ ＤＮＡ ３．１ベクターＳＰシスタチンＳ－ＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲ Ｄ２－ＦＬＡＧ ＤＮＡ １．６ｍｇ／ｍｌをＥｘｐｉ２９３Ｆ懸濁液細胞にトランスフェクションさせて発現を行った。１２５ｍｌの２９３Ｆ細胞懸濁液で細胞を４．５～５×１０６細胞／ｍｌまで培養し、培地のみを新しく交換した後、エクスピフェタミン（Ｅｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅ）４００μｌとＯｐｔｉ－ｍｅｍ７．５ｍｌ（Ａサンプル）を常温で５分間反応し、ＤＮＡ１５０μｇ、Ｏｐｔｉ－ｍｅｍ７．５ｍｌ（Ｂサンプル）を常温で５分間反応後、ＡとＢサンプルを互いに混合し、２０分間常温で反応してトランスフェクションを行った。２４時間後、エンハンサー１と２を混合して処理した後、７日間培養した。
ＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質（ＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）の製造
ＰＣ ＤＮＡ ３．１ベクターＳＰシスタチンＳ－ＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲ Ｄ２－ＦＬＡＧ ＤＮＡ １．６ｍｇ／ｍｌをＥｘｐｉ２９３Ｆ懸濁液細胞にトランスフェクションさせて発現を行った。１２５ｍｌの２９３Ｆ細胞懸濁液で細胞を４．５～５×１０６細胞／ｍｌまで培養し、培地のみを新しく交換した後、エクスピフェタミン（Ｅｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅ）４００μｌとＯｐｔｉ－ｍｅｍ７．５ｍｌ（Ａサンプル）を常温で５分間反応し、ＤＮＡ１５０μｇ、Ｏｐｔｉ－ｍｅｍ７．５ｍｌ（Ｂサンプル）を常温で５分間反応後、ＡとＢサンプルを互いに混合し、２０分間常温で反応してトランスフェクションを行った。２４時間後、エンハンサー１と２を混合して処理した後、７日間培養した。
【0060】
７日たった培養液を遠心分離器４℃８０００ｒｐｍで２０分間細胞を沈殿させた後、上澄み液をコーニング（ｃｏｒｎｉｎｇ）社の０．２２μｍフィルターでろ過して使用した。レジンは、シグマ（Ｓｉｇｍａ）社の抗－ＦＬＡＧレジンを使用して行った。レジンをそれぞれ１．２ｍｌずつ使用し、精製は、４℃１ｍｌ／分の速度で行った。ＴＢＳ（Ｔｒｉｓ Ｇｌｙｃｉｎｅ ｐＨ７．４）を用いたウォッシングバッファーをレジンの２０倍で流し込んだ。溶出は、シグマ社のＦＬＡＧペプチド２００μｌとＴＢＳ９．８ｍｌを混合して使用したが、分画（ｆｒａｃｔｉｏｎ）あたり５００μｌずつ８個を得て、タンパク質分画を集めてバッファーをＤＰＢＳに変えて濃縮した後、濃度を測定した。
【0061】
【0062】
［実施例２］
様々な形態のＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質（ＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ＬＲＲＤ２ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）の受容体結合能確認
２－１．様々な形態のＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質の製造
実施例１の製造方法に基づいて、下記表２に示すように１２種の様々なＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質を製造した。リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号６）を使用した。
様々な形態のＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質（ＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ＬＲＲＤ２ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）の受容体結合能確認
２－１．様々な形態のＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質の製造
実施例１の製造方法に基づいて、下記表２に示すように１２種の様々なＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質を製造した。リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号６）を使用した。
【0063】
【表2】
【0064】
前記１２種のＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質のアミノ酸配列は、表３に示した。
【0065】
【表3】
【0066】
前記表３において下線で表示された配列は、ＨＳＡとＬＲＲＤ２を連結するＧＳリンカーであり、太字で表示された配列は、融合タンパク質を最終形態で発現させるため、Ｃ－末端に付加される配列を連結するＧＳリンカーである。
【0067】
２－２．様々な形態のＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質（ＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）の受容体結合能確認
骨細胞に対するＳｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２の作用は、Ｒｏｂｏ１及びＲｏｂｏ２受容体を介して媒介される。したがって、本実施例では、実施例２－１で製造された１２種のＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質のＲｏｂｏ１受容体結合能を確認した。１２種のＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質と受容体の結合能は、ＥＬＩＳＡシステムを使用して定量した。詳細条件は、次の通りである。
骨細胞に対するＳｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２の作用は、Ｒｏｂｏ１及びＲｏｂｏ２受容体を介して媒介される。したがって、本実施例では、実施例２－１で製造された１２種のＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質のＲｏｂｏ１受容体結合能を確認した。１２種のＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質と受容体の結合能は、ＥＬＩＳＡシステムを使用して定量した。詳細条件は、次の通りである。
【0068】
１２種のＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質は、分子量を考慮してウェル当たり０、１、１０、１００、１０００ｎＭとなるように、４℃で１８時間９６－ウェルＭａｘｉｓｏｒｐ微量定量板（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ ｐｌａｔｅｓ）（ＮＵＮＣ社）にコーティングした。コーティングされた物質は、０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０が含まれたＰＢＳ（ＰＢＳＴ）を使用して３回洗浄した。非特異的なバインディングを遮断するため、１％ＢＳＡが添加されたＰＢＳＴで室温で２時間ブロッキングを行った。ブロッキングバッファーを除去するためにＰＢＳＴで３回洗浄した。洗浄後、骨芽細胞であるＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞株から得られたタンパク３０μｇを（溶解バッファー（ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）：０．５％ＮＰ４０、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２ｍＭ ＮａＦ、１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ））室温で２時間付着させた。ＰＢＳＴを使用して３回洗浄した後、０．１％ＢＳＡで１：１０００希釈させたＲｏｂｏ１抗体（ａｂｃａｍ：ａｂ７２７９）を室温で２時間付着させた。ＰＢＳＴを使用して３回洗浄した後、０．１％ＢＳＡで１：２０００希釈させたＨＲＰ結合抗体（ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ：７０７４）を室温で２時間付着させた。ＰＢＳＴを使用して５回洗浄した後、ＴＭＢ溶液で３７℃で３０分間反応させた。前記反応を停止させるために１００μｌの１Ｎ Ｈ２ＳＯ４を使用し、４５０ｎｍで吸光度を測定した。
【0069】
その結果、図３に示すように、ＬＲＲＤ２－３とＬＲＲＤ２－６の受容体結合能が最も優れていることを確認した。
【0070】
［実施例３］
様々な形態のＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質（ＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）の細胞学的効能確認
本実施例では、実施例２－１で製造された１２種のＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質の処理による骨芽細胞移動能、及び破骨細胞分化能を観察することにより、その細胞学的効能を確認した。
様々な形態のＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質（ＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）の細胞学的効能確認
本実施例では、実施例２－１で製造された１２種のＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質の処理による骨芽細胞移動能、及び破骨細胞分化能を観察することにより、その細胞学的効能を確認した。
【0071】
３－１．骨芽細胞移動能測定
細胞移動能測定のためにボイデンチャンバーシステム（ｔｒａｎｓｗｅｌｌ、８μｍ ｐｏｒｅｓ）を使用した。骨芽細胞株であるＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞株（１×１０５）を０.２％ＦＢＳが添加されたＭＥＭ－アルファ培地に希釈して内側チャンバー（ｉｎｎｅｒ ｃｈａｍｂｅｒ）に６時間付着させた後、外側チャンバー（ｏｕｔｅｒ ｃｈａｍｂｅｒ）に薬物を２４時間処理した。侵入した（ｉｎｖａｄｅｄ）細胞は、固定液（ｆｉｘｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）が含まれたクリスタルバイオレット溶液を１０分間処理した後、光学顕微鏡で細胞数を測定した。
細胞移動能測定のためにボイデンチャンバーシステム（ｔｒａｎｓｗｅｌｌ、８μｍ ｐｏｒｅｓ）を使用した。骨芽細胞株であるＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞株（１×１０５）を０.２％ＦＢＳが添加されたＭＥＭ－アルファ培地に希釈して内側チャンバー（ｉｎｎｅｒ ｃｈａｍｂｅｒ）に６時間付着させた後、外側チャンバー（ｏｕｔｅｒ ｃｈａｍｂｅｒ）に薬物を２４時間処理した。侵入した（ｉｎｖａｄｅｄ）細胞は、固定液（ｆｉｘｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）が含まれたクリスタルバイオレット溶液を１０分間処理した後、光学顕微鏡で細胞数を測定した。
【0072】
その結果、図４に示すように、ＬＲＲＤ２－３の骨芽細胞移動能が最も優れていることを確認した。
【0073】
３－２．破骨細胞分化能測定
６週齢のＩＣＲマウス大腿骨と脛骨から破骨前駆細胞を抽出した後、３７℃培養器で１８時間培養した。浮遊細胞だけを集めて３０ｎｇ／ｍｌ Ｍ－ＣＳＦと３０ｎｇ／ｍｌＲＡＮＫＬを処理して破骨細胞に分化させた。４日後、ＴＲＡＰ染色溶液（Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｃｉｄ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）で１０分間反応させた後、光学顕微鏡でＴＲＡＰ染色された核が３つ以上の多核細胞を破骨細胞とみなし、細胞数を測定した。
６週齢のＩＣＲマウス大腿骨と脛骨から破骨前駆細胞を抽出した後、３７℃培養器で１８時間培養した。浮遊細胞だけを集めて３０ｎｇ／ｍｌ Ｍ－ＣＳＦと３０ｎｇ／ｍｌＲＡＮＫＬを処理して破骨細胞に分化させた。４日後、ＴＲＡＰ染色溶液（Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｃｉｄ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）で１０分間反応させた後、光学顕微鏡でＴＲＡＰ染色された核が３つ以上の多核細胞を破骨細胞とみなし、細胞数を測定した。
【0074】
その結果、図５に示すように、ＬＲＲＤ２－３とＬＲＲＤ２－６の破骨細胞分化抑制能が残りの１０種のＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質に比べて優れていることを確認した。
【0075】
［実施例４］
ＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質（ＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）の細胞学的効能確認
本実施例では、実施例２と３の結果に基づいて、細胞における効能が最も優れたＬＲＲＤ２－３を選定し、アルブミンと結合しないＳｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２の骨芽細胞移動能、骨芽細胞のｂ－カテニン活性及び破骨細胞分化抑制能と比較観察した。
ＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質（ＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）の細胞学的効能確認
本実施例では、実施例２と３の結果に基づいて、細胞における効能が最も優れたＬＲＲＤ２－３を選定し、アルブミンと結合しないＳｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２の骨芽細胞移動能、骨芽細胞のｂ－カテニン活性及び破骨細胞分化抑制能と比較観察した。
【0076】
４－１．骨芽細胞移動能の測定
細胞移動能測定のためにボイデンチャンバーシステム（ｔｒａｎｓｗｅｌｌ、８μｍ ｐｏｒｅｓ）を使用した。骨芽細胞株であるＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞株（１×１０５）を０.２％ＦＢＳが添加されたＭＥＭ－アルファ培地に希釈して内側チャンバー（ｉｎｎｅｒ ｃｈａｍｂｅｒ）に６時間付着させた後、外側チャンバー（ｏｕｔｅｒ ｃｈａｍｂｅｒ）に薬物を２４時間処理した。侵入した（ｉｎｖａｄｅｄ）細胞は、固定液（ｆｉｘｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）が含まれたクリスタルバイオレット溶液を１０分間処理した後、光学顕微鏡で細胞数を測定した。
細胞移動能測定のためにボイデンチャンバーシステム（ｔｒａｎｓｗｅｌｌ、８μｍ ｐｏｒｅｓ）を使用した。骨芽細胞株であるＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞株（１×１０５）を０.２％ＦＢＳが添加されたＭＥＭ－アルファ培地に希釈して内側チャンバー（ｉｎｎｅｒ ｃｈａｍｂｅｒ）に６時間付着させた後、外側チャンバー（ｏｕｔｅｒ ｃｈａｍｂｅｒ）に薬物を２４時間処理した。侵入した（ｉｎｖａｄｅｄ）細胞は、固定液（ｆｉｘｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）が含まれたクリスタルバイオレット溶液を１０分間処理した後、光学顕微鏡で細胞数を測定した。
【0077】
その結果、図６の（Ａ）に示すように、ＬＲＲＤ２－３は、アルブミンと結合しないＳｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２と同じ程度に骨芽細胞移動能を促進した。
【0078】
４－２．骨芽細胞のｂ－カテニン活性の測定
ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞株（２Ｘ１０４／ウェル）を２４－ウェルプレートに１８時間培養した後、１００ｎｇの８ＸＳｕｐｅｒＴＯＰＦｌａｓｈと１０ｎｇのレニラレポータープラスミド（Ｒｅｎｉｌｌａ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｐｌａｓｍｉｄ）を細胞に形質注入した。４８時間後、デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイ（Ｄｕａｌ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ａｓｓａｙ）キットを使用し、ルシフェラーゼ活性を測定した。
ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞株（２Ｘ１０４／ウェル）を２４－ウェルプレートに１８時間培養した後、１００ｎｇの８ＸＳｕｐｅｒＴＯＰＦｌａｓｈと１０ｎｇのレニラレポータープラスミド（Ｒｅｎｉｌｌａ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｐｌａｓｍｉｄ）を細胞に形質注入した。４８時間後、デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイ（Ｄｕａｌ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ａｓｓａｙ）キットを使用し、ルシフェラーゼ活性を測定した。
【0079】
その結果、図６の（Ｂ）に示すように、ＬＲＲＤ２－３は、アルブミンと結合しないＳｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２と同じ程度に骨芽細胞のｂ－カテニンを活性化した。
【0080】
４－３．破骨細胞の分化能測定
６週齢のＩＣＲマウス大腿骨と脛骨から破骨前駆細胞を抽出した後、３７℃培養器で１８時間培養した。浮遊細胞だけを集めて３０ｎｇ／ｍｌ Ｍ－ＣＳＦと３０ｎｇ／ｍｌ ＲＡＮＫＬを処理して破骨細胞に分化させた。４日後、ＴＲＡＰ染色溶液（Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｃｉｄ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）で１０分間反応させた後、光学顕微鏡でＴＲＡＰ染色された核が３つ以上の多核細胞を破骨細胞とみなし、細胞数を測定した。
６週齢のＩＣＲマウス大腿骨と脛骨から破骨前駆細胞を抽出した後、３７℃培養器で１８時間培養した。浮遊細胞だけを集めて３０ｎｇ／ｍｌ Ｍ－ＣＳＦと３０ｎｇ／ｍｌ ＲＡＮＫＬを処理して破骨細胞に分化させた。４日後、ＴＲＡＰ染色溶液（Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｃｉｄ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）で１０分間反応させた後、光学顕微鏡でＴＲＡＰ染色された核が３つ以上の多核細胞を破骨細胞とみなし、細胞数を測定した。
【0081】
その結果、図６の（Ｃ）に示すように、ＬＲＲＤ２－３は、アルブミンと結合しないＳｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２と同じ程度に破骨細胞の分化を抑制した。
【0082】
［実施例５］
マウスにおいてＳｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２及びＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質の薬物動態研究
薬物動態学の研究は、新薬開発過程の一部分で、時間による体内の薬物濃度の変化評価を通じて試験薬物の吸収、分布、代謝及び排泄に対する情報を得ることを目的とする。本実施例では、Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２－３及びＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質（ＬＲＲＤ２－３）の１回静脈内投与後、マウスにおいて薬物動態特性を確認した。
マウスにおいてＳｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２及びＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質の薬物動態研究
薬物動態学の研究は、新薬開発過程の一部分で、時間による体内の薬物濃度の変化評価を通じて試験薬物の吸収、分布、代謝及び排泄に対する情報を得ることを目的とする。本実施例では、Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２－３及びＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質（ＬＲＲＤ２－３）の１回静脈内投与後、マウスにおいて薬物動態特性を確認した。
【0083】
５－１．化学物質及び溶媒
本実施例で使用されたカルバマゼピン（ｃａｒｂａｍａｚｅｐｉｎｅ）は、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから購入し、アセトニトリルとメタノールは、ＨＰＬＣグレードでＪ．Ｔ．Ｂａｋｅｒから購入した。
本実施例で使用されたカルバマゼピン（ｃａｒｂａｍａｚｅｐｉｎｅ）は、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから購入し、アセトニトリルとメタノールは、ＨＰＬＣグレードでＪ．Ｔ．Ｂａｋｅｒから購入した。
【0084】
５－２．動物及び投与条件
本実施例では、体重３０～３２．５ｇ範囲のＩＣＲ系雄性マウス（６週齢、(株）オリエントバイオ、城南、大韓民国）を使用した。マウスは、実験前に４時間絶食し、投与後４時間まで絶食を維持した。飼育場は、１２時間ずつ明暗を与えて適正温度（２０～２５℃）及び湿度（４０～６０％）を維持した。
本実施例では、体重３０～３２．５ｇ範囲のＩＣＲ系雄性マウス（６週齢、(株）オリエントバイオ、城南、大韓民国）を使用した。マウスは、実験前に４時間絶食し、投与後４時間まで絶食を維持した。飼育場は、１２時間ずつ明暗を与えて適正温度（２０～２５℃）及び湿度（４０～６０％）を維持した。
【0085】
【表4】
【0086】
Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２を１ｍｇ／ｍＬの容量でＰＢＳに溶かして準備した。ＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２（ＬＲＲＤ２－３）の場合、分子量を考慮して３．５ｍｇ／ｍＬの容量（Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２として１ｍｇ／ｍＬ）でＰＢＳに溶かして準備した。投与容量は、両群とも１０ｍＬ／ｋｇで、左側の尾静脈を介して投与した。
【0087】
５－３．薬物動態試験
薬物動態試験の場合、絶食させたマウスにＳｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２とＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２（ＬＲＲＤ２－３）をそれぞれ１０ｍｇ／ｋｇ及び３５ｍｇ／ｋｇの容量で尾静脈を介してそれぞれ投与した。投与後、それぞれ０．０５、０．１２、０．３３、１、３、７、１０、２４、４８、及び７２時間にマウスを手で固定した後、ヘパリンコーティングされた毛細管で右側の眼窩静脈叢から血液７０μＬを採血した。取られた血液は、５分間遠心分離した後、血漿を分離して分析前まで－２０℃で冷凍保管した。
薬物動態試験の場合、絶食させたマウスにＳｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２とＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２（ＬＲＲＤ２－３）をそれぞれ１０ｍｇ／ｋｇ及び３５ｍｇ／ｋｇの容量で尾静脈を介してそれぞれ投与した。投与後、それぞれ０．０５、０．１２、０．３３、１、３、７、１０、２４、４８、及び７２時間にマウスを手で固定した後、ヘパリンコーティングされた毛細管で右側の眼窩静脈叢から血液７０μＬを採血した。取られた血液は、５分間遠心分離した後、血漿を分離して分析前まで－２０℃で冷凍保管した。
【0088】
５－４．分析方法
血漿試料のうち、Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２の濃度は、ＨＰＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステムを用いて定量した。試料前処理の前、血漿試料は、Ｎｉ－ＮＴＡマグネティックビードを用いて精製した。精製されたＳｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２及びＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２（ＬＲＲＤ２－３）に６Ｍの尿素と１８ｍＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ）を加えて変性させた後、２２５ｍＭのヨードアセトアミドを用いてアルキル化を誘導した。以後、シグネチャーペプチド（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｐｅｐｔｉｄｅ）を得るため、８５０ｎｇの組換えブタトリプシン（Ｖ５１１７、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）を加えて２４時間３７℃に設定されたウォーターバス（ｗａｔｅｒ ｂａｔｈ）で反応させた。反応後に生成されたトリプシン消化物７０μＬにＭｅＯＨに溶解した３％のギ酸５０μＬを加えた後、ボルテックスミキサー（ｖｏｒｔｅｘ ｍｉｘｅｒ）を用いて１０分間混合試料を懸濁し、１３,５００ｒｐｍで１０分間遠心分離して上澄み液１６０μＬを取って分析容器に移し、そのうち５μＬをＨＰＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステムに注入して分析を行った。
血漿試料のうち、Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２の濃度は、ＨＰＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステムを用いて定量した。試料前処理の前、血漿試料は、Ｎｉ－ＮＴＡマグネティックビードを用いて精製した。精製されたＳｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２及びＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２（ＬＲＲＤ２－３）に６Ｍの尿素と１８ｍＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ）を加えて変性させた後、２２５ｍＭのヨードアセトアミドを用いてアルキル化を誘導した。以後、シグネチャーペプチド（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｐｅｐｔｉｄｅ）を得るため、８５０ｎｇの組換えブタトリプシン（Ｖ５１１７、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）を加えて２４時間３７℃に設定されたウォーターバス（ｗａｔｅｒ ｂａｔｈ）で反応させた。反応後に生成されたトリプシン消化物７０μＬにＭｅＯＨに溶解した３％のギ酸５０μＬを加えた後、ボルテックスミキサー（ｖｏｒｔｅｘ ｍｉｘｅｒ）を用いて１０分間混合試料を懸濁し、１３,５００ｒｐｍで１０分間遠心分離して上澄み液１６０μＬを取って分析容器に移し、そのうち５μＬをＨＰＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステムに注入して分析を行った。
【0089】
詳細な分析条件は、次の通りである。
【0090】
－ＨＰＬＣシステム：Ａｇｉｌｅｎｔ １１００（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）
－カラム：ＺＯＲＢＡＸ（登録商標）Ｃ８ ３．５μｍ、２．１＊５０ｍｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ）
－移動相（Ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ）：
－流速：３００μＬ／ｍｉｎ
－温度：カラムで２０℃、及び自動サンプル機トレイ（ａｕｔｏｓａｍｐｌｅｒ ｔｒａｙ）で１０℃
－ランタイム：５分
－検出：タンデム四重極型質量分析計（ＡＰＩ ４０００，ＱＴＲＡＰ（登録商標），Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＭＤＳ ＳＣＩＥＸ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）
－カーテンガス（ｃｕｒｔａｉｎ ｇａｓ）：２０ｐｓｉ
－イオンソースガス １（ｉｏｎ ｓｏｕｒｃｅ ｇａｓ １）：５０ｐｓｉ
－イオンソースガス ２（ｉｏｎ ｓｏｕｒｃｅ ｇａｓ ２）：６０ｐｓｉ
－イオンスプレー電圧（ｉｏｎｓｐｒａｙ ｖｏｌｔａｇｅ）：５５００Ｖ
－温度：６００℃
－多重反応モニタリング（ｍｕｌｔｉｐｌｅ－ｒｅａｃｔｉｏｎ－ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ、ＭＲＭ）モード：陽性
－カラム：ＺＯＲＢＡＸ（登録商標）Ｃ８ ３．５μｍ、２．１＊５０ｍｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ）
－移動相（Ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ）：
－温度：カラムで２０℃、及び自動サンプル機トレイ（ａｕｔｏｓａｍｐｌｅｒ ｔｒａｙ）で１０℃
－ランタイム：５分
－検出：タンデム四重極型質量分析計（ＡＰＩ ４０００，ＱＴＲＡＰ（登録商標），Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＭＤＳ ＳＣＩＥＸ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）
－カーテンガス（ｃｕｒｔａｉｎ ｇａｓ）：２０ｐｓｉ
－イオンソースガス １（ｉｏｎ ｓｏｕｒｃｅ ｇａｓ １）：５０ｐｓｉ
－イオンソースガス ２（ｉｏｎ ｓｏｕｒｃｅ ｇａｓ ２）：６０ｐｓｉ
－イオンスプレー電圧（ｉｏｎｓｐｒａｙ ｖｏｌｔａｇｅ）：５５００Ｖ
－温度：６００℃
－多重反応モニタリング（ｍｕｌｔｉｐｌｅ－ｒｅａｃｔｉｏｎ－ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ、ＭＲＭ）モード：陽性
【0091】
Ｓｉｌｔ３ ＬＲＲＤ２のシグネチャペプチド（Ｐ６）の分子イオンは、２３Ｖの衝突エネルギー（ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ ｅｎｅｒｇｙ）によって断片化され、衝突ガス（ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ ｇａｓ）は、装備において「ｍｅｄｉｕｍ（８ｐｓｉ）」に設定した。イオンの検出は、ＥＳＩ陽性ＭＲＭモードで行い、Ｐ６は、ｍ／ｚ ５８７．９７→４９１．５０で定量した。検出ピークの積分は、Ａｎａｌｙｓｔ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖｅｒｓｉｏｎ １．４．２（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＭＤＳ ＳＣＩＥＸ）を用いて行った。血漿中においてＳｉｌｔ３ ＬＲＲＤ２の定量可能範囲は、１～１００μｇ／ｍＬであり、ＨＳＡ－Ｓｉｌｔ３ ＬＲＲＤ２（ＬＲＲＤ２－３）の場合、３～１００μｇ／ｍＬであった。該当分析においてＳｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２は、３．２９分のピーク保持時間を示した。
【0092】
５－５．データ分析
時間による血漿中のＣＮＣ０００００の濃度を前記実施例５－４に記載されたＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析法を用いて求め、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ４．２（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｙ，ＮＣ，ＵＳＡ）のソフトウェアのノンコンパートメント解析（ｎｏｎ－ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ）で薬物動態的パラメータ（ＰＫ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ）を計算した。最高濃度（Ｃｍａｘ）と最高濃度到達時間（Ｔｍａｘ）は、血中薬物濃度に対して時間による曲線から経時的に求め、消失速度定数（Ｋe）は、ログスケール（ｌｏｇ ｓｃａｌｅ）の最終段階（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｐｈａｓｅ）において線形回帰分析によって計算した。半減期（Ｔ１／２）は、ＬＮ２をＫｅで除して求め、血中薬物濃度に対して時間曲線下面積（ＡＵＣ０－∞）及び血中薬物モーメントに対して時間曲線下面積（ＡＵＭＣ０－∞）は、線形台形法（ｌｉｎｅａｒ ｔｒａｐｅｚｏｉｄａｌ ｒｕｌｅ）と標準面積外挿法（ｓｔａｎｄａｒｄ ａｒｅａ ｅｘｔｒａｐｏｌａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）により計算した。クリアランス（ｃｌｅａｒａｎｃｅ、ＣＬ）と分布容積（ｓｔｅａｄｙ ｓｔａｔｅ ｖｏｌｕｍｅ ｏｆ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ、Ｖｓｓ）は、次の［式１］～［式３］により計算した。
時間による血漿中のＣＮＣ０００００の濃度を前記実施例５－４に記載されたＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析法を用いて求め、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ４．２（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｙ，ＮＣ，ＵＳＡ）のソフトウェアのノンコンパートメント解析（ｎｏｎ－ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ）で薬物動態的パラメータ（ＰＫ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ）を計算した。最高濃度（Ｃｍａｘ）と最高濃度到達時間（Ｔｍａｘ）は、血中薬物濃度に対して時間による曲線から経時的に求め、消失速度定数（Ｋe）は、ログスケール（ｌｏｇ ｓｃａｌｅ）の最終段階（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｐｈａｓｅ）において線形回帰分析によって計算した。半減期（Ｔ１／２）は、ＬＮ２をＫｅで除して求め、血中薬物濃度に対して時間曲線下面積（ＡＵＣ０－∞）及び血中薬物モーメントに対して時間曲線下面積（ＡＵＭＣ０－∞）は、線形台形法（ｌｉｎｅａｒ ｔｒａｐｅｚｏｉｄａｌ ｒｕｌｅ）と標準面積外挿法（ｓｔａｎｄａｒｄ ａｒｅａ ｅｘｔｒａｐｏｌａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）により計算した。クリアランス（ｃｌｅａｒａｎｃｅ、ＣＬ）と分布容積（ｓｔｅａｄｙ ｓｔａｔｅ ｖｏｌｕｍｅ ｏｆ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ、Ｖｓｓ）は、次の［式１］～［式３］により計算した。
【0093】
【数1】
【0094】
【数2】
【0095】
【数3】
【0096】
５－６．結果
時間による血漿内のＳｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２及びＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２（ＬＲＲＤ２－３）の濃度は、図７及び表５と６に示し、薬物動態パラメータは、表６に示した。これに関連したパラメータとすべての値は、個体毎に算出した後、平均で示した。時間による血中濃度パターンと動物実験記録紙を参考して異常のある個体群は、データの分析から排除し、データの解釈に使用された実験群は、少なくともｎ＝３以上となるようにした。
時間による血漿内のＳｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２及びＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２（ＬＲＲＤ２－３）の濃度は、図７及び表５と６に示し、薬物動態パラメータは、表６に示した。これに関連したパラメータとすべての値は、個体毎に算出した後、平均で示した。時間による血中濃度パターンと動物実験記録紙を参考して異常のある個体群は、データの分析から排除し、データの解釈に使用された実験群は、少なくともｎ＝３以上となるようにした。
【0097】
【表5】
【0098】
【表6】
【0099】
下記表７から確認されるように、ＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質(ＬＲＲＤ２－３)は、Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２に対して約１４倍改善された半減期を示した。
【表7】
【0100】
［実施例６］
ＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質（ＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）の生体効能確認
１２週齢のＳＣＩＤマウスに４週間アルブミンと結合しないＳｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２またはＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質（ＬＲＲＤ２－３）を処理した。各薬物は、１日１回、毎週５回静脈注射により投与し、Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２は、毎日１０ｍｇ、ＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質（ＬＲＲＤ２－３）は、毎日３７．１３ｍｇ（Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２は、毎日１０ｍｇに該当）注射した。投与前後に小動物用骨密度を測定してその変化幅を確認し、その結果を下記表８に示す。
ＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質（ＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）の生体効能確認
１２週齢のＳＣＩＤマウスに４週間アルブミンと結合しないＳｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２またはＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質（ＬＲＲＤ２－３）を処理した。各薬物は、１日１回、毎週５回静脈注射により投与し、Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２は、毎日１０ｍｇ、ＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質（ＬＲＲＤ２－３）は、毎日３７．１３ｍｇ（Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２は、毎日１０ｍｇに該当）注射した。投与前後に小動物用骨密度を測定してその変化幅を確認し、その結果を下記表８に示す。
【0101】
【表8】
【0102】
表８に示すように、アルブミンと結合しないＳｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２は、ＢＭＤ及びＢＭＣが改善されたが、統計的に有意ではなく、ＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質（ＬＲＲＤ２－３）は、ＢＭＤ及びＢＭＣを全て有意に改善させる効果を示した。これにより、ＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質（ＬＲＲＤ２－３）は、アルブミンと結合しないＳｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２よりさらに強力に骨関連疾患に対する治療効果を示すことを確認した。
【産業上の利用可能性】
【0103】
本発明のアルブミンと結合したＳｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２は。アルブミンと結合しないＳｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２と同じ細胞学的効能を示し、アルブミンと結合しないＳｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２と比較して、生体内半減期が著しく増加して骨関連疾患をより効果的に予防または治療しうる。
【0104】
本発明をサポートした国家研究開発事業は、下記の通りである。
(１)［この発明をサポートした国家研究開発事業］
［課題固有番号］ ２０１７－１２２９（ＨＩ１５Ｃ０３７７０１００１７）
［省庁名］ 保健福祉部
［研究管理専門機関］ 韓国保健産業振興院
［研究事業名］ 疾病中心仲介重点研究
［研究課題名］ 骨形成促進作用を持つ巨核細胞分泌因子の発掘
［寄与率］ ７５／１００
［主管機関］ ソウル峨山病院
［研究期間］ ２０１７．０９．０７～２０１８．０９．０６
（２）［この発明をサポートした国家研究開発事業］
［課題固有番号］ ２０１３－２２３４（ＨＩ１３Ｃ１６３４０６００１８）
［省庁名］ 保健福祉部
［研究管理専門機関］ 韓国保健産業振興院
［研究事業名］ 疾病中心仲介重点研究
［研究課題名］ Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２の薬物動態研究及びＳｌｉｔ３ ＴＧマウスを用いたｉｎ ｖｉｖｏ毒性の検証
［寄与率］ ２５/１００
［主管機関］ 忠南大学校産学協力団
［研究期間］ ２０１３．１１．０１～２０１９．０６．３０
(１)［この発明をサポートした国家研究開発事業］
［課題固有番号］ ２０１７－１２２９（ＨＩ１５Ｃ０３７７０１００１７）
［省庁名］ 保健福祉部
［研究管理専門機関］ 韓国保健産業振興院
［研究事業名］ 疾病中心仲介重点研究
［研究課題名］ 骨形成促進作用を持つ巨核細胞分泌因子の発掘
［寄与率］ ７５／１００
［主管機関］ ソウル峨山病院
［研究期間］ ２０１７．０９．０７～２０１８．０９．０６
（２）［この発明をサポートした国家研究開発事業］
［課題固有番号］ ２０１３－２２３４（ＨＩ１３Ｃ１６３４０６００１８）
［省庁名］ 保健福祉部
［研究管理専門機関］ 韓国保健産業振興院
［研究事業名］ 疾病中心仲介重点研究
［研究課題名］ Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２の薬物動態研究及びＳｌｉｔ３ ＴＧマウスを用いたｉｎ ｖｉｖｏ毒性の検証
［寄与率］ ２５/１００
［主管機関］ 忠南大学校産学協力団
［研究期間］ ２０１３．１１．０１～２０１９．０６．３０
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2021-08-27
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、アルブミンと結合したＳｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２を含む骨関連疾患の予防または治療用組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
Ｓｌｉｔタンパク質は、神経系の発生過程の間にニューロンとエクソンの移動を調節するものとしてよく知られているタンパク質である。Ｓｌｉｔタンパク質はＲｏｂｏ受容体と作用して生理学的活性を調節し得、心臓、肺、腎臓、乳房組織など様々な組織において様々な細胞内過程を調節する因子として役割を果たすことが知られており、最近、細胞の成長、付着能及び移動能の調節に重要な役割を果たすことが報告され、細胞の分化過程における移動及びがんの発生と転移過程においてＳｌｉｔタンパク質が関与できることが報告されている。
【0003】
このような背景下で、本発明者らは、Ｓｌｉｔ３のＬＲＲＤ２が細胞及び動物モデルにおいて骨形成を増加させ、骨吸収を減少させ、骨粗しょう症の発病率と負の相関関係を有しており、骨折または骨粗しょう症の予防または治療用組成物及び骨折または骨粗しょう症の発生リスクを予測するためのバイオマーカーとして有用に使用できることを明らかにした（大韓民国登録特許第１０－１６１７４９７号）。ＬＲＲＤ２は、注射剤であって、患者が病院に来院して投与を受けなければならないが、生体内半減期が非常に短く、その薬効が発揮されるためには、投与周期が短くなるしかなく、これによる過度の薬剤の使用により効能が減少する問題が発生するものと予想される。
【0004】
そこで、本発明者らは、ＬＲＲＤ２の生体内半減期を増進することにより、その効能を改善させたＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質（ＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）を開発し、本発明を完成した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明の目的は、Ｓｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２の骨関連疾患の予防または治療効能を改善させた組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0006】
上述した課題を解決するため、本発明は、アルブミンと結合したＳｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２を含む骨関連疾患の予防または治療用薬学組成物を提供する。
【0007】
本発明の好適な一実施例によれば、前記アルブミンは、ヒト血清アルブミン（ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）であってもよい。
【0008】
本発明の好適なさらに他の一実施例によれば、前記ヒト血清アルブミンは、Ｓｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２のＮ－末端に結合されたものであってもよい。
【0009】
本発明の好適なさらに他の一実施例によれば、前記ヒト血清アルブミンは、配列番号２のアミノ酸配列を含んでもよい。
【0010】
本発明の好適な他の一実施例によれば、前記Ｓｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２は、配列番号３のアミノ酸配列を含んでもよい。
【0011】
本発明の好適なさらに他の一実施例によれば、前記アルブミンとＳｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２間にリンカーをさらに含んでもよい。
【0012】
本発明の好適な他の一実施例によれば、前記リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号５）であり、ここで、ｎは、１～１０の整数であってもよい。
【0013】
本発明の好適なさらに他の一実施例によれば、前記薬学組成物は、注射剤として投与されてもよい。
【0014】
本発明の好適な他の一実施例によれば、前記骨関連疾患は、骨粗しょう症（ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ）、骨折、骨損失、変形性関節症（ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、骨転移がん及びパジェット病（Ｐａｇｅｔ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）からなる群から選ばれるいずれか一つ以上であってもよい。
【発明の効果】
【0015】
本発明のアルブミンと結合したＳｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２は、アルブミンと結合しないＳｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２と同じ細胞学的効能を示し、アルブミンと結合しないＳｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２と比較し、生体内半減期が著しく増加し、骨関連疾患をより効果的に予防または治療しうる。
【図面の簡単な説明】
【0016】
【発明を実施するための形態】
【0017】
上述したように、Ｓｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２は、細胞及び動物モデルにおいて骨形成を増加させ、骨吸収を減少させることにより、骨折または骨粗しょう症の予防または治療に使用してもよいが、生体内半減期が非常に短く、その薬効が発揮されるためには、投与周期が短くなるしかなく、これによる過度の薬剤の使用により効能が減少する問題が発生するものと予想された。
【0018】
そこで、本発明者らは、ＬＲＲＤ２の生体内半減期を増進することにより、その効能を改善させたＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質（ＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）を開発することにより、上述した問題の解決方案を模索した。本発明のアルブミンと結合したＳｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２は、アルブミンと結合しないＳｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２と同じ細胞学的効能を示し、アルブミンと結合しないＳｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２と比較して、生体内半減期が著しく増加して骨関連疾患をより効果的に予防または治療しうる。
【0019】
以下、本発明をより詳細に説明する。
【0020】
本発明は、アルブミンと結合したＳｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２を含む骨関連疾患の予防または治療用薬学組成物を提供する。
【0021】
本発明の薬学組成物にあって、「Ｓｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２」は、Ｓｌｉｔ３タンパク質内の２番目のロイシンリッチリピートドメイン（ｌｅｕｃｉｎｅ ｒｉｃｈ ｒｅｐｅａｔ ｄｏｍａｉｎ、ＬＲＲＤ２）をいう。
【0022】
本発明において、用語の「Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２」とは、「Ｓｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２」を意味し、相互互換的に使用されてもよい。
【0023】
本発明の薬学組成物において、前記アルブミンは、ヒト血清アルブミン（ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）、リーサス（ｒｈｅｓｕｓ）血清アルブミン（ＲｈＳＡ）、カニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｏｕｓ ｍｏｎｋｅｙ）血清アルブミン（ＣｙＳＡ）、またはミューリン（ｍｕｒｉｎｅ）血清アルブミン（ＭｕＳＡ）であってもよく、好ましくは、ヒト血清アルブミンであってもよい。前記Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２は、ヒト血清アルブミンの存在下のＳｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２の生体内半減期は、ヒト血清アルブミンの不在下におけるＳｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２の生体内半減期よりも少なくとも１０倍以上さらに長い。
【0024】
本発明の具体的な一実施例において、ヒト血清アルブミンの存在下のＳｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２の血清半減期は、ヒト血清アルブミンの不在下におけるＳｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２より１４倍さらに長い。
【0025】
本発明の薬学組成物において、ヒト血清アルブミンとＳｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２は、ヒト血清アルブミン及びＳｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２の順序で結合されるか、またはその逆であってもよい。好ましくは、ヒト血清アルブミン及びＳｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２の順序で結合される。例えば、ヒト血清アルブミンがＳｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２のＮ末端に結合する場合、Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２の生体内半減期及びその骨関連疾患の治療効能が最も優れており、ヒト血清アルブミンがＣ末端に結合する場合、程度の差があり得るが、有効な効能を示すことができる。
【0026】
本発明の薬学組成物において、前記ヒト血清アルブミンは、６０９個のアミノ酸からなる全長またはその一部のアミノ酸配列を含む断片として使用されてもよい。ヒト血清アルブミンの全長アミノ酸配列は、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ９８７９７．１に開示されたもので、本発明の具体的な一実施例では、６０９個のアミノ酸からなる全長のヒト血清アルブミンにおいて２５番目～６０９番目のアミノ酸（５８５個のアミノ酸）からなる断片の形態を使用した。本発明の薬学組成物において、ヒト血清アルブミンは、下記配列番号２のアミノ酸配列からなる。
【0027】
ＤＡＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫＤＬＧＥＥＮＦＫＡＬＶＬＩＡＦＡＱＹＬＱＱＣＰＦＥＤＨＶＫＬＶＮＥＶＴＥＦＡＫＴＣＶＡＤＥＳＡＥＮＣＤＫＳＬＨＴＬＦＧＤＫＬＣＴＶＡＴＬＲＥＴＹＧＥＭＡＤＣＣＡＫＱＥＰＥＲＮＥＣＦＬＱＨＫＤＤＮＰＮＬＰＲＬＶＲＰＥＶＤＶＭＣＴＡＦＨＤＮＥＥＴＦＬＫＫＹＬＹＥＩＡＲＲＨＰＹＦＹＡＰＥＬＬＦＦＡＫＲＹＫＡＡＦＴＥＣＣＱＡＡＤＫＡＡＣＬＬＰＫＬＤＥＬＲＤＥＧＫＡＳＳＡＫＱＲＬＫＣＡＳＬＱＫＦＧＥＲＡＦＫＡＷＡＶＡＲＬＳＱＲＦＰＫＡＥＦＡＥＶＳＫＬＶＴＤＬＴＫＶＨＴＥＣＣＨＧＤＬＬＥＣＡＤＤＲＡＤＬＡＫＹＩＣＥＮＱＤＳＩＳＳＫＬＫＥＣＣＥＫＰＬＬＥＫＳＨＣＩＡＥＶＥＮＤＥＭＰＡＤＬＰＳＬＡＡＤＦＶＥＳＫＤＶＣＫＮＹＡＥＡＫＤＶＦＬＧＭＦＬＹＥＹＡＲＲＨＰＤＹＳＶＶＬＬＬＲＬＡＫＴＹＥＴＴＬＥＫＣＣＡＡＡＤＰＨＥＣＹＡＫＶＦＤＥＦＫＰＬＶＥＥＰＱＮＬＩＫＱＮＣＥＬＦＥＱＬＧＥＹＫＦＱＮＡＬＬＶＲＹＴＫＫＶＰＱＶＳＴＰＴＬＶＥＶＳＲＮＬＧＫＶＧＳＫＣＣＫＨＰＥＡＫＲＭＰＣＡＥＤＹＬＳＶＶＬＮＱＬＣＶＬＨＥＫＴＰＶＳＤＲＶＴＫＣＣＴＥＳＬＶＮＲＲＰＣＦＳＡＬＥＶＤＥＴＹＶＰＫＥＦＮＡＥＴＦＴＦＨＡＤＩＣＴＬＳＥＫＥＲＱＩＫＫＱＴＡＬＶＥＬＶＫＨＫＰＫＡＴＫＥＱＬＫＡＶＭＤＤＦＡＡＦＶＥＫＣＣＫＡＤＤＫＥＴＣＦＡＥＥＧＫＫＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧＬ（配列番号２）。
【0028】
本発明の薬学組成物において、前記Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２は、ヒト由来であり、１５２３個のアミノ酸からなるＳｌｉｔ３タンパク質内のＬＲＲＤ２の全長またはその一部のアミノ酸配列を含む断片として使用されてもよい。Ｓｌｉｔ３タンパク質の全長アミノ酸配列は、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＱ８９２４３．１に開示されたもので、本発明の具体的な一実施例において、Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２は、１５２３個のアミノ酸からなる全長のＳｌｉｔ３タンパク質において２７８番目～４８６番目のアミノ酸（２０９個のアミノ酸）からなる断片の形態を使用した。本発明の薬学組成物において、Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２は、下記配列番号３のアミノ酸配列からなる。
【0029】
ＩＳＣＰＳＰＣＴＣＳＮＮＩＶＤＣＲＧＫＧＬＭＥＩＰＡＮＬＰＥＧＩＶＥＩＲＬＥＱＮＳＩＫＡＩＰＡＧＡＦＴＱＹＫＫＬＫＲＩＤＩＳＫＮＱＩＳＤＩＡＰＤＡＦＱＧＬＫＳＬＴＳＬＶＬＹＧＮＫＩＴＥＩＡＫＧＬＦＤＧＬＶＳＬＱＬＬＬＬＮＡＮＫＩＮＣＬＲＶＮＴＦＱＤＬＱＮＬＮＬＬＳＬＹＤＮＫＬＱＴＩＳＫＧＬＦＡＰＬＱＳＩＱＴＬＨＬＡＱＮＰＦＶＣＤＣＨＬＫＷＬＡＤＹＬＱＤＮＰＩＥＴＳＧＡＲＣＳＳＰＲＲＬＡＮＫＲＩＳＱＩＫＳＫＫＦＲＣＳ（配列番号３）。
【0030】
本発明の薬学組成物において、「Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２」は、配列番号３のアミノ酸配列との機能的同等物を含んでもよい。
【0031】
前記「機能的同等物」とは、タンパク質またはペプチドのアミノ酸付加、置換または欠失により、本発明の配列番号１～４のアミノ酸配列と少なくとも７０％以上、好ましくは、８０％以上、より好ましくは、９０％以上、さらに好ましくは、９５％以上の配列相同性を持つもので、配列番号１～４のアミノ酸配列から構成されたタンパク質またはペプチドと実質的に同質の生理活性を示すタンパク質またはペプチドをいう。
【0032】
具体的には、本発明の薬学組成物に含まれる融合タンパク質は、その野生型アミノ酸配列を有するタンパク質またはペプチドだけでなく、そのアミノ酸配列変異体も本発明の範囲に含まれてもよい。前記アミノ酸配列変異体とは、Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２の野生型アミノ酸配列と１つ以上のアミノ酸残基が欠失、挿入、非保全的または保全的置換またはこれらの組み合わせによって異なる配列を有するタンパク質またはペプチドを意味する。
【0033】
分子の活性を全体的に変更させないタンパク質及びペプチドにおいて、可能なアミノ酸の交換は、当該分野に公知されている（Ｈ．Ｎｅｕｒａｔｈ，Ｒ．Ｌ．Ｈｉｌｌ，Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７９）。最も一般的に起こる交換は、アミノ酸残基Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｈｙ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ間の交換である。場合によっては、リン酸化（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）、硫化（ｓｕｌｆａｔｉｏｎ）、アセチル化（ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ）、糖化（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）、メチル化（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）、ファルネシル化（ｆａｒｎｅｓｙｌａｔｉｏｎ）などで修飾（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）されてもよい。
【0034】
本発明のＳｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２、またはその変異体は、天然から抽出したり、合成（Ｍｅｒｒｉｆｌｅｌｄ，Ｊ．Ａｍｅｒ．ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９－２１５６，１９６３）またはＤＮＡ配列を基本とする遺伝子組換え方法により製造されてもよい（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ，２版，１９８９）。
【0035】
本発明の薬学組成物において、アルブミンとＳｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２の間には、リンカーがさらに含まれてもよい。好ましいリンカーの種類としては、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号５）であってもよく、ここで、ｎは、１～１０の整数であってもよく、好ましくは、ｎは、１～５の整数であってもよい。
【0036】
本発明のＳｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２は、その生体内半減期を増進させるため、アルブミン融合以外にもＩｇＧのＦｃタンパク質融合またはペギュレーション（ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）などが行われてもよい。
【0037】
本発明の薬学組成物は、経口または非経口の様々な剤形であってもよい。前記薬学組成物を剤形化する場合、１つ以上の緩衝剤（例えば、生理食塩水またはＰＢＳ）、抗酸化剤、静菌剤、キレート化剤（例えば、ＥＤＴＡまたはグルタチオン）、充填剤、増量剤、結合剤、アジュバント（例えば、アルミニウムハイドロオキサイド）、懸濁剤、濃厚剤、湿潤剤、崩解剤または界面活性剤、希釈剤または賦形剤を使用して調製されてもよい。
【0038】
経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれており、これらの固形剤は、一つ以上の化合物に少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、澱粉（トウモロコシ澱粉、小麦澱粉、米澱粉、ジャガイモ澱粉などを含む）、炭酸カルシウム（ｃａｌｃｉｕｍ ｃａｒｂｏｎａｔｅ）、スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）、ラクトース（ｌａｃｔｏｓｅ）、デキストロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、セルロース、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース及びヒドロキシプロピルメチル－セルロースまたはゼラチンなどを混合して調剤される。例えば、活性成分を固体賦形剤と配合した後、これを粉砕し、適切な補助剤を添加した後、顆粒混合物に加工することにより、錠剤または糖衣錠剤が得られる。
【0039】
また、単純な賦形剤の他にステアリン酸マグネシウム、タルクなどの潤滑剤も使用される。経口投与のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤またはシロップ剤などが該当するが、よく使用される単純希釈剤である水、リキッドパラフィンの他に様々な賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤または保存剤などが含まれてもよい。また、場合によっては、架橋結合ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸またはナトリウムアルギネートなどを崩解剤として添加してもよく、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤及び防腐剤などをさらに含んでもよい。
【0040】
非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁溶剤、乳剤、凍結乾燥製剤または坐剤などが含まれる。非水性溶剤及び懸濁溶剤としては、プロピレングリコール（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）、ポリエチレングリコール、オリーブオイルなどの植物油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルなどが使用されてもよい。坐剤の基剤としては、ウイテプゾール（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、ツイン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロール、ゼラチンなどが使用されてもよい。
【0041】
本発明の薬学組成物は、経口または非経口で投与されてもよく、非経口投与時に皮膚外用、腹腔内、直腸、静脈、筋肉、皮下、子宮内硬膜または脳血管内に注射する注射剤、経皮投与剤、または鼻腔吸入剤の形態で当業界で公知の方法により剤形化されてもよい。
【0042】
前記注射剤の場合には、必ず滅菌されなければならず、バクテリア及び真菌などの微生物の汚染から保護されるべきである。注射剤の場合、適切な担体の例としては、これに限定されるものではないが、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコールなど）、これらの混合物及び／又は植物油を含む溶媒または分散媒質であってもよい。より好ましくは、適切な担体としては、ハンクス液、リンゲル液、トリエタノールアミンが含有されたＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）または注射用滅菌水、１０％エタノール、４０％プロピレングリコール及び５％デキストロースなどの等張溶液などが使用されてもよい。前記注射剤を微生物汚染から保護するためには、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどの様々な抗菌剤及び抗真菌剤をさらに含んでもよい。また、前記注射剤は、ほとんどの場合、糖またはナトリウムクロライドなどの等張化剤をさらに含んでもよい。
【0043】
経皮投与剤の場合、軟膏剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、外用液剤、パスタ剤、リニメント剤、エアロール剤などの形態が含まれる。前記において経皮投与は、薬学組成物を局所的に皮膚に投与して薬学組成物に含有された有効な量の活性成分が皮膚内に伝達されることを意味する。
【0044】
吸入投与剤の場合、本発明によって使用される融合タンパク質は、適切な推進剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適切な気体を使用し、加圧パックまたは煙霧機からエアロゾルスプレーの形態で便利に伝達しうる。加圧エアロゾルの場合、投薬単位は、計量された量を伝達する弁を提供して決定してもよい。例えば、吸入器または吹込器に使用されるゼラチンカプセル及びカートリッジは、化合物及びラクトース又はデンプンなどの適切な粉末基剤の粉末混合物を含有するように剤形化してもよい。非経口投与用剤形は、すべての製薬化学で一般的に公知の処方書である文献（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９７５．Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ １８０４２，Ｃｈａｐｔｅｒ ８７：Ｂｌａｕｇ，Ｓｅｙｍｏｕｒ）に記載されている。
【0045】
本発明の薬学組成物は、薬剤学的に有効な量で投与する。本発明において、「薬剤学的に有効な量」とは、医学的治療に適用可能な合理的な恩恵／リスク比で疾患を治療するのに十分な量を意味し、有効用量の水準は、患者の疾患の種類、重症度、薬物の活性、薬物に対する感度、投与時間、投与経路及び排出比率、治療期間、同時に使用される薬物を含む要素及びその他の医学分野でよく知られている要素に応じて決定されてもよい。本発明の薬学組成物は、個別治療剤として投与するか、または他の治療剤と併用して投与されてもよく、従来の治療剤とは、順次的又は同時に投与されてもよく、単一または多重投与されてもよい。すなわち、本発明の組成物の総有効量は、単一投与量（ｓｉｎｇｌｅ ｄｏｓｅ）で患者に投与されてもよく、多重投与量（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｄｏｓｅ）で長期間投与される分割治療方法（ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌ）によって投与されてもよい。前記要素をすべて考慮し、副作用なしに最小限の量で最大の効果が得られる量を投与することが重要であり、これは当業者によって容易に決定されてもよい。
【0046】
本発明の薬学組成物の投与量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率及び疾患の重症度に応じて、その範囲が多様である。一日投与量としては、非経口投与時にＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２を基準に一日に体重１ｋｇ当たり好ましくは、０．０１～５０ｍｇ、より好ましくは、０．１～３０ｍｇの量で投与されるように、そして、経口投与時には、本発明のＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２を基準に一日に体重１ｋｇ当たり、好ましくは、０．０１～１００ｍｇ、より好ましくは、０．０１～１０ｍｇの量で投与されるように１～数回に分けて投与してもよい。しかし、投与経路、肥満の重症度、性別、体重、年齢などによって増減されてもよいので、前記投与量がいかなる方法によっても本発明の範囲を限定するものではない。
【0047】
本発明の薬学組成物は、単独で、または手術、放射線治療、ホルモン治療、化学治療及び生物学的反応調節剤を使用する方法と併用して使用してもよい。
【0048】
本発明の薬学組成物は、さらに外用剤の剤形として提供しうる。本発明の骨関連疾患の予防及び治療用薬学組成物を皮膚外用剤として使用する場合、さらに脂肪物質、有機溶媒、溶解剤、濃縮剤及びゲル化剤、軟化剤、抗酸化剤、懸濁化剤、安定化剤、発泡剤（ｆｏａｍｉｎｇ ａｇｅｎｔ）、芳香剤、界面活性剤、水、イオン型乳化剤、非イオン型乳化剤、充填剤、金属イオン封鎖剤、キレート化剤、保存剤、ビタミン、遮断剤、湿潤化剤、必須オイル、染料、顔料、親水性活性剤、親油性活性剤または脂質小胞などの皮膚外用剤に通常使用される任意の他の成分と同じ皮膚科学分野において通常使用される補助剤を含有してもよい。また、前記成分は、皮膚科学分野において一般的に使用される量で導入されてもよい。
【0049】
本発明の骨関連疾患の予防及び治療用薬学組成物が皮膚外用剤として提供される場合、これらに制限されるものではないが、軟膏、パッチ、ゲル、クリームまたは噴霧剤などの剤形であってもよい。
【0050】
本発明の骨関連疾患は、骨吸収の増加または骨形成の減少、例えば、骨形成が骨吸収より少なくなって骨量が減少して発生可能な疾患を意味し、骨粗しょう症（ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ）、骨折、骨損失、変形性関節症（ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、骨転移がん及びパジェット病（Ｐａｇｅｔ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）からなる群から選ばれるいずれか一つ以上であることがより好ましいが、これに限定されるものではない。
【0051】
本発明は、さらにアルブミンと結合したＳｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２を含む骨関連疾患の予防または改善用健康機能食品組成物を提供する。本発明の健康機能食品の組成物に含まれる有効成分の構成及びその効果は、前述の薬学組成物に対するものと同じなので、その記載を省略する。
【0052】
本発明による健康機能食品組成物は、当業界で公知の通常の方法によって様々な形態で製造されてもよい。一般食品としては、これに限定されるものではないが、飲料（アルコール性飲料を含む）、果実及びその加工食品（例えば、果物缶詰、瓶詰、ジャム、マーマレードなど）、魚類、肉類及びその加工食品（例えば、ハム、ソーセージ、コンビーフなど）、パン類及び麺類（例えば、うどん、そば、ラーメン、スパゲッティ、マカロニなど）、果汁、各種ドリンク、クッキー、飴、乳製品（例えば、バター、チーズなど）、食用植物油脂、マーガリン、植物性タンパク質、レトルト食品、冷凍食品、各種調味料（例えば、味噌、醤油、ソースなど）などに本発明のＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質を添加して製造してもよい。また、栄養補助剤としては、これに限定されるものではないが、カプセル、タブレット、丸薬などに本発明のＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質を添加して製造してもよい。また、健康機能食品としては、これに限定されるものではないが、例えば、本発明のＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質そのものをお茶、ジュース及びドリンクの形態で製造して飲用（健康飲料）できるように液状化、顆粒化、カプセル化及び粉末化して摂取してもよい。また、本発明のＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質を食品添加剤の形態で使用するためには、粉末または濃縮液の形態で製造して使用してもよい。また、本発明のＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質と骨関連疾患の予防及び筋機能の改善効果があると知られている公知の活性成分とともに混合して組成物の形態で製造してもよい。
【0053】
本発明のＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質を健康飲料として用いる場合、前記健康飲料組成物は、通常の飲料のように様々な香味剤または天然炭水化物などを追加成分として含有してもよい。前述の天然炭水化物は、ブドウ糖、果糖などのモノサッカライドと、マルトース、スクロースなどのジサッカライド、デキストリン、シクロデキストリンなどのポリサッカライド、キシリトール、ソルビトール、エリスリトールなどの糖アルコールであってもよい。甘味剤としては、タウマチン、ステビア抽出物などの天然甘味剤、サッカリン、アスパルテームなどの合成甘味剤などを使用してもよい。前記天然炭水化物の割合は、本発明の組成物１００ｍＬ当たり、一般的に約０．０１～０．０４ｇ、好ましくは、約０．０２～０．０３ｇである。
【0054】
また、本発明のＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質は、骨関連疾患の予防または改善用食品組成物の有効成分として含有されてもよいが、その量は、骨関連疾患の予防または改善効果を達成するのに有効な量で、特に限定されるものではないが、全組成物の総重量に対して、０．０１～１００重量％であることが好ましい。本発明の健康機能食品組成物は、ＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質とともに骨関連疾患に効果があることが知られている他の活性成分とともに混合して製造されてもよい。
【0055】
前記の他に本発明の健康機能食品組成物は、様々な栄養剤、ビタミン、電解質、風味剤、着色剤、ペクチン酸、ペクチン酸の塩、アルギン酸、アルギン酸の塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調整剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコールまたは炭酸化剤などを含有してもよい。その他に本発明の健康食品は、天然フルーツジュース、フルーツジュース飲料、または野菜飲料の製造のための果肉を含有してもよい。これらの成分は、独立してまたは混合して使用してもよい。これらの添加剤の割合は、それほど重要ではないが、本発明の組成物１００重量部当たり、０．０１～０．１重量部の範囲で選ばれるのが一般的である。
【0056】
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は、単に本発明を例示するためのもので、本発明の範囲がこれらの実施例により制限されるものと解釈されないことは、当業界において通常の知識を有する者にとって自明であろう。
【0057】
下記実施例に使用された略語及びその意味は、以下の表１の通りである。
【0058】
【表1】
【実施例】
【0059】
［実施例１］
ＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質（ＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）の製造
ＰＣ ＤＮＡ ３．１ベクターＳＰシスタチンＳ－ＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲ Ｄ２－ＦＬＡＧ ＤＮＡ １．６ｍｇ／ｍｌをＥｘｐｉ２９３Ｆ懸濁液細胞にトランスフェクションさせて発現を行った。１２５ｍｌの２９３Ｆ細胞懸濁液で細胞を４．５～５×１０６細胞／ｍｌまで培養し、培地のみを新しく交換した後、エクスピフェタミン（Ｅｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅ）４００μｌとＯｐｔｉ－ｍｅｍ７．５ｍｌ（Ａサンプル）を常温で５分間反応し、ＤＮＡ１５０μｇ、Ｏｐｔｉ－ｍｅｍ７．５ｍｌ（Ｂサンプル）を常温で５分間反応後、ＡとＢサンプルを互いに混合し、２０分間常温で反応してトランスフェクションを行った。２４時間後、エンハンサー１と２を混合して処理した後、７日間培養した。
ＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質（ＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）の製造
ＰＣ ＤＮＡ ３．１ベクターＳＰシスタチンＳ－ＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲ Ｄ２－ＦＬＡＧ ＤＮＡ １．６ｍｇ／ｍｌをＥｘｐｉ２９３Ｆ懸濁液細胞にトランスフェクションさせて発現を行った。１２５ｍｌの２９３Ｆ細胞懸濁液で細胞を４．５～５×１０６細胞／ｍｌまで培養し、培地のみを新しく交換した後、エクスピフェタミン（Ｅｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅ）４００μｌとＯｐｔｉ－ｍｅｍ７．５ｍｌ（Ａサンプル）を常温で５分間反応し、ＤＮＡ１５０μｇ、Ｏｐｔｉ－ｍｅｍ７．５ｍｌ（Ｂサンプル）を常温で５分間反応後、ＡとＢサンプルを互いに混合し、２０分間常温で反応してトランスフェクションを行った。２４時間後、エンハンサー１と２を混合して処理した後、７日間培養した。
【0060】
７日たった培養液を遠心分離器４℃８０００ｒｐｍで２０分間細胞を沈殿させた後、上澄み液をコーニング（ｃｏｒｎｉｎｇ）社の０．２２μｍフィルターでろ過して使用した。レジンは、シグマ（Ｓｉｇｍａ）社の抗－ＦＬＡＧレジンを使用して行った。レジンをそれぞれ１．２ｍｌずつ使用し、精製は、４℃１ｍｌ／分の速度で行った。ＴＢＳ（Ｔｒｉｓ Ｇｌｙｃｉｎｅ ｐＨ７．４）を用いたウォッシングバッファーをレジンの２０倍で流し込んだ。溶出は、シグマ社のＦＬＡＧペプチド２００μｌとＴＢＳ９．８ｍｌを混合して使用したが、分画（ｆｒａｃｔｉｏｎ）あたり５００μｌずつ８個を得て、タンパク質分画を集めてバッファーをＤＰＢＳに変えて濃縮した後、濃度を測定した。
【0061】
【0062】
［実施例２］
様々な形態のＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質（ＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ＬＲＲＤ２ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）の受容体結合能確認
２－１．様々な形態のＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質の製造
実施例１の製造方法に基づいて、下記表２に示すように１２種の様々なＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質を製造した。リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号６）を使用した。
様々な形態のＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質（ＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ＬＲＲＤ２ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）の受容体結合能確認
２－１．様々な形態のＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質の製造
実施例１の製造方法に基づいて、下記表２に示すように１２種の様々なＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質を製造した。リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号６）を使用した。
【0063】
【表2】
【0064】
前記１２種のＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質のアミノ酸配列は、表３に示した。
【0065】
【表3】
【0066】
前記表３において下線で表示された配列は、ＨＳＡとＬＲＲＤ２を連結するＧＳリンカーであり、太字で表示された配列は、融合タンパク質を最終形態で発現させるため、Ｃ－末端に付加される配列を連結するＧＳリンカーである。
【0067】
２－２．様々な形態のＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質（ＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）の受容体結合能確認
骨細胞に対するＳｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２の作用は、Ｒｏｂｏ１及びＲｏｂｏ２受容体を介して媒介される。したがって、本実施例では、実施例２－１で製造された１２種のＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質のＲｏｂｏ１受容体結合能を確認した。１２種のＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質と受容体の結合能は、ＥＬＩＳＡシステムを使用して定量した。詳細条件は、次の通りである。
骨細胞に対するＳｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２の作用は、Ｒｏｂｏ１及びＲｏｂｏ２受容体を介して媒介される。したがって、本実施例では、実施例２－１で製造された１２種のＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質のＲｏｂｏ１受容体結合能を確認した。１２種のＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質と受容体の結合能は、ＥＬＩＳＡシステムを使用して定量した。詳細条件は、次の通りである。
【0068】
１２種のＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質は、分子量を考慮してウェル当たり０、１、１０、１００、１０００ｎＭとなるように、４℃で１８時間９６－ウェルＭａｘｉｓｏｒｐ微量定量板（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ ｐｌａｔｅｓ）（ＮＵＮＣ社）にコーティングした。コーティングされた物質は、０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０が含まれたＰＢＳ（ＰＢＳＴ）を使用して３回洗浄した。非特異的なバインディングを遮断するため、１％ＢＳＡが添加されたＰＢＳＴで室温で２時間ブロッキングを行った。ブロッキングバッファーを除去するためにＰＢＳＴで３回洗浄した。洗浄後、骨芽細胞であるＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞株から得られたタンパク３０μｇを（溶解バッファー（ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）：０．５％ＮＰ４０、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２ｍＭ ＮａＦ、１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ））室温で２時間付着させた。ＰＢＳＴを使用して３回洗浄した後、０．１％ＢＳＡで１：１０００希釈させたＲｏｂｏ１抗体（ａｂｃａｍ：ａｂ７２７９）を室温で２時間付着させた。ＰＢＳＴを使用して３回洗浄した後、０．１％ＢＳＡで１：２０００希釈させたＨＲＰ結合抗体（ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ：７０７４）を室温で２時間付着させた。ＰＢＳＴを使用して５回洗浄した後、ＴＭＢ溶液で３７℃で３０分間反応させた。前記反応を停止させるために１００μｌの１Ｎ Ｈ２ＳＯ４を使用し、４５０ｎｍで吸光度を測定した。
【0069】
その結果、図３に示すように、ＬＲＲＤ２－３とＬＲＲＤ２－６の受容体結合能が最も優れていることを確認した。
【0070】
［実施例３］
様々な形態のＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質（ＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）の細胞学的効能確認
本実施例では、実施例２－１で製造された１２種のＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質の処理による骨芽細胞移動能、及び破骨細胞分化能を観察することにより、その細胞学的効能を確認した。
様々な形態のＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質（ＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）の細胞学的効能確認
本実施例では、実施例２－１で製造された１２種のＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質の処理による骨芽細胞移動能、及び破骨細胞分化能を観察することにより、その細胞学的効能を確認した。
【0071】
３－１．骨芽細胞移動能測定
細胞移動能測定のためにボイデンチャンバーシステム（ｔｒａｎｓｗｅｌｌ、８μｍ ｐｏｒｅｓ）を使用した。骨芽細胞株であるＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞株（１×１０５）を０.２％ＦＢＳが添加されたＭＥＭ－アルファ培地に希釈して内側チャンバー（ｉｎｎｅｒ ｃｈａｍｂｅｒ）に６時間付着させた後、外側チャンバー（ｏｕｔｅｒ ｃｈａｍｂｅｒ）に薬物を２４時間処理した。侵入した（ｉｎｖａｄｅｄ）細胞は、固定液（ｆｉｘｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）が含まれたクリスタルバイオレット溶液を１０分間処理した後、光学顕微鏡で細胞数を測定した。
細胞移動能測定のためにボイデンチャンバーシステム（ｔｒａｎｓｗｅｌｌ、８μｍ ｐｏｒｅｓ）を使用した。骨芽細胞株であるＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞株（１×１０５）を０.２％ＦＢＳが添加されたＭＥＭ－アルファ培地に希釈して内側チャンバー（ｉｎｎｅｒ ｃｈａｍｂｅｒ）に６時間付着させた後、外側チャンバー（ｏｕｔｅｒ ｃｈａｍｂｅｒ）に薬物を２４時間処理した。侵入した（ｉｎｖａｄｅｄ）細胞は、固定液（ｆｉｘｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）が含まれたクリスタルバイオレット溶液を１０分間処理した後、光学顕微鏡で細胞数を測定した。
【0072】
その結果、図４に示すように、ＬＲＲＤ２－３の骨芽細胞移動能が最も優れていることを確認した。
【0073】
３－２．破骨細胞分化能測定
６週齢のＩＣＲマウス大腿骨と脛骨から破骨前駆細胞を抽出した後、３７℃培養器で１８時間培養した。浮遊細胞だけを集めて３０ｎｇ／ｍｌ Ｍ－ＣＳＦと３０ｎｇ／ｍｌＲＡＮＫＬを処理して破骨細胞に分化させた。４日後、ＴＲＡＰ染色溶液（Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｃｉｄ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）で１０分間反応させた後、光学顕微鏡でＴＲＡＰ染色された核が３つ以上の多核細胞を破骨細胞とみなし、細胞数を測定した。
６週齢のＩＣＲマウス大腿骨と脛骨から破骨前駆細胞を抽出した後、３７℃培養器で１８時間培養した。浮遊細胞だけを集めて３０ｎｇ／ｍｌ Ｍ－ＣＳＦと３０ｎｇ／ｍｌＲＡＮＫＬを処理して破骨細胞に分化させた。４日後、ＴＲＡＰ染色溶液（Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｃｉｄ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）で１０分間反応させた後、光学顕微鏡でＴＲＡＰ染色された核が３つ以上の多核細胞を破骨細胞とみなし、細胞数を測定した。
【0074】
その結果、図５に示すように、ＬＲＲＤ２－３とＬＲＲＤ２－６の破骨細胞分化抑制能が残りの１０種のＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質に比べて優れていることを確認した。
【0075】
［実施例４］
ＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質（ＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）の細胞学的効能確認
本実施例では、実施例２と３の結果に基づいて、細胞における効能が最も優れたＬＲＲＤ２－３を選定し、アルブミンと結合しないＳｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２の骨芽細胞移動能、骨芽細胞のｂ－カテニン活性及び破骨細胞分化抑制能と比較観察した。
ＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質（ＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）の細胞学的効能確認
本実施例では、実施例２と３の結果に基づいて、細胞における効能が最も優れたＬＲＲＤ２－３を選定し、アルブミンと結合しないＳｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２の骨芽細胞移動能、骨芽細胞のｂ－カテニン活性及び破骨細胞分化抑制能と比較観察した。
【0076】
４－１．骨芽細胞移動能の測定
細胞移動能測定のためにボイデンチャンバーシステム（ｔｒａｎｓｗｅｌｌ、８μｍ ｐｏｒｅｓ）を使用した。骨芽細胞株であるＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞株（１×１０５）を０.２％ＦＢＳが添加されたＭＥＭ－アルファ培地に希釈して内側チャンバー（ｉｎｎｅｒ ｃｈａｍｂｅｒ）に６時間付着させた後、外側チャンバー（ｏｕｔｅｒ ｃｈａｍｂｅｒ）に薬物を２４時間処理した。侵入した（ｉｎｖａｄｅｄ）細胞は、固定液（ｆｉｘｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）が含まれたクリスタルバイオレット溶液を１０分間処理した後、光学顕微鏡で細胞数を測定した。
細胞移動能測定のためにボイデンチャンバーシステム（ｔｒａｎｓｗｅｌｌ、８μｍ ｐｏｒｅｓ）を使用した。骨芽細胞株であるＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞株（１×１０５）を０.２％ＦＢＳが添加されたＭＥＭ－アルファ培地に希釈して内側チャンバー（ｉｎｎｅｒ ｃｈａｍｂｅｒ）に６時間付着させた後、外側チャンバー（ｏｕｔｅｒ ｃｈａｍｂｅｒ）に薬物を２４時間処理した。侵入した（ｉｎｖａｄｅｄ）細胞は、固定液（ｆｉｘｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）が含まれたクリスタルバイオレット溶液を１０分間処理した後、光学顕微鏡で細胞数を測定した。
【0077】
その結果、図６の（Ａ）に示すように、ＬＲＲＤ２－３は、アルブミンと結合しないＳｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２と同じ程度に骨芽細胞移動能を促進した。
【0078】
４－２．骨芽細胞のｂ－カテニン活性の測定
ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞株（２Ｘ１０４／ウェル）を２４－ウェルプレートに１８時間培養した後、１００ｎｇの８ＸＳｕｐｅｒＴＯＰＦｌａｓｈと１０ｎｇのレニラレポータープラスミド（Ｒｅｎｉｌｌａ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｐｌａｓｍｉｄ）を細胞に形質注入した。４８時間後、デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイ（Ｄｕａｌ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ａｓｓａｙ）キットを使用し、ルシフェラーゼ活性を測定した。
ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞株（２Ｘ１０４／ウェル）を２４－ウェルプレートに１８時間培養した後、１００ｎｇの８ＸＳｕｐｅｒＴＯＰＦｌａｓｈと１０ｎｇのレニラレポータープラスミド（Ｒｅｎｉｌｌａ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｐｌａｓｍｉｄ）を細胞に形質注入した。４８時間後、デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイ（Ｄｕａｌ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ａｓｓａｙ）キットを使用し、ルシフェラーゼ活性を測定した。
【0079】
その結果、図６の（Ｂ）に示すように、ＬＲＲＤ２－３は、アルブミンと結合しないＳｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２と同じ程度に骨芽細胞のｂ－カテニンを活性化した。
【0080】
４－３．破骨細胞の分化能測定
６週齢のＩＣＲマウス大腿骨と脛骨から破骨前駆細胞を抽出した後、３７℃培養器で１８時間培養した。浮遊細胞だけを集めて３０ｎｇ／ｍｌ Ｍ－ＣＳＦと３０ｎｇ／ｍｌ ＲＡＮＫＬを処理して破骨細胞に分化させた。４日後、ＴＲＡＰ染色溶液（Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｃｉｄ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）で１０分間反応させた後、光学顕微鏡でＴＲＡＰ染色された核が３つ以上の多核細胞を破骨細胞とみなし、細胞数を測定した。
６週齢のＩＣＲマウス大腿骨と脛骨から破骨前駆細胞を抽出した後、３７℃培養器で１８時間培養した。浮遊細胞だけを集めて３０ｎｇ／ｍｌ Ｍ－ＣＳＦと３０ｎｇ／ｍｌ ＲＡＮＫＬを処理して破骨細胞に分化させた。４日後、ＴＲＡＰ染色溶液（Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｃｉｄ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）で１０分間反応させた後、光学顕微鏡でＴＲＡＰ染色された核が３つ以上の多核細胞を破骨細胞とみなし、細胞数を測定した。
【0081】
その結果、図６の（Ｃ）に示すように、ＬＲＲＤ２－３は、アルブミンと結合しないＳｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２と同じ程度に破骨細胞の分化を抑制した。
【0082】
［実施例５］
マウスにおいてＳｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２及びＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質の薬物動態研究
薬物動態学の研究は、新薬開発過程の一部分で、時間による体内の薬物濃度の変化評価を通じて試験薬物の吸収、分布、代謝及び排泄に対する情報を得ることを目的とする。本実施例では、Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２－３及びＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質（ＬＲＲＤ２－３）の１回静脈内投与後、マウスにおいて薬物動態特性を確認した。
マウスにおいてＳｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２及びＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質の薬物動態研究
薬物動態学の研究は、新薬開発過程の一部分で、時間による体内の薬物濃度の変化評価を通じて試験薬物の吸収、分布、代謝及び排泄に対する情報を得ることを目的とする。本実施例では、Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２－３及びＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質（ＬＲＲＤ２－３）の１回静脈内投与後、マウスにおいて薬物動態特性を確認した。
【0083】
５－１．化学物質及び溶媒
本実施例で使用されたカルバマゼピン（ｃａｒｂａｍａｚｅｐｉｎｅ）は、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから購入し、アセトニトリルとメタノールは、ＨＰＬＣグレードでＪ．Ｔ．Ｂａｋｅｒから購入した。
本実施例で使用されたカルバマゼピン（ｃａｒｂａｍａｚｅｐｉｎｅ）は、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから購入し、アセトニトリルとメタノールは、ＨＰＬＣグレードでＪ．Ｔ．Ｂａｋｅｒから購入した。
【0084】
５－２．動物及び投与条件
本実施例では、体重３０～３２．５ｇ範囲のＩＣＲ系雄性マウス（６週齢、(株）オリエントバイオ、城南、大韓民国）を使用した。マウスは、実験前に４時間絶食し、投与後４時間まで絶食を維持した。飼育場は、１２時間ずつ明暗を与えて適正温度（２０～２５℃）及び湿度（４０～６０％）を維持した。
本実施例では、体重３０～３２．５ｇ範囲のＩＣＲ系雄性マウス（６週齢、(株）オリエントバイオ、城南、大韓民国）を使用した。マウスは、実験前に４時間絶食し、投与後４時間まで絶食を維持した。飼育場は、１２時間ずつ明暗を与えて適正温度（２０～２５℃）及び湿度（４０～６０％）を維持した。
【0085】
【表4】
【0086】
Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２を１ｍｇ／ｍＬの容量でＰＢＳに溶かして準備した。ＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２（ＬＲＲＤ２－３）の場合、分子量を考慮して３．５ｍｇ／ｍＬの容量（Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２として１ｍｇ／ｍＬ）でＰＢＳに溶かして準備した。投与容量は、両群とも１０ｍＬ／ｋｇで、左側の尾静脈を介して投与した。
【0087】
５－３．薬物動態試験
薬物動態試験の場合、絶食させたマウスにＳｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２とＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２（ＬＲＲＤ２－３）をそれぞれ１０ｍｇ／ｋｇ及び３５ｍｇ／ｋｇの容量で尾静脈を介してそれぞれ投与した。投与後、それぞれ０．０５、０．１２、０．３３、１、３、７、１０、２４、４８、及び７２時間にマウスを手で固定した後、ヘパリンコーティングされた毛細管で右側の眼窩静脈叢から血液７０μＬを採血した。取られた血液は、５分間遠心分離した後、血漿を分離して分析前まで－２０℃で冷凍保管した。
薬物動態試験の場合、絶食させたマウスにＳｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２とＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２（ＬＲＲＤ２－３）をそれぞれ１０ｍｇ／ｋｇ及び３５ｍｇ／ｋｇの容量で尾静脈を介してそれぞれ投与した。投与後、それぞれ０．０５、０．１２、０．３３、１、３、７、１０、２４、４８、及び７２時間にマウスを手で固定した後、ヘパリンコーティングされた毛細管で右側の眼窩静脈叢から血液７０μＬを採血した。取られた血液は、５分間遠心分離した後、血漿を分離して分析前まで－２０℃で冷凍保管した。
【0088】
５－４．分析方法
血漿試料のうち、Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２の濃度は、ＨＰＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステムを用いて定量した。試料前処理の前、血漿試料は、Ｎｉ－ＮＴＡマグネティックビードを用いて精製した。精製されたＳｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２及びＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２（ＬＲＲＤ２－３）に６Ｍの尿素と１８ｍＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ）を加えて変性させた後、２２５ｍＭのヨードアセトアミドを用いてアルキル化を誘導した。以後、シグネチャーペプチド（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｐｅｐｔｉｄｅ）を得るため、８５０ｎｇの組換えブタトリプシン（Ｖ５１１７、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）を加えて２４時間３７℃に設定されたウォーターバス（ｗａｔｅｒ ｂａｔｈ）で反応させた。反応後に生成されたトリプシン消化物７０μＬにＭｅＯＨに溶解した３％のギ酸５０μＬを加えた後、ボルテックスミキサー（ｖｏｒｔｅｘ ｍｉｘｅｒ）を用いて１０分間混合試料を懸濁し、１３,５００ｒｐｍで１０分間遠心分離して上澄み液１６０μＬを取って分析容器に移し、そのうち５μＬをＨＰＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステムに注入して分析を行った。
血漿試料のうち、Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２の濃度は、ＨＰＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステムを用いて定量した。試料前処理の前、血漿試料は、Ｎｉ－ＮＴＡマグネティックビードを用いて精製した。精製されたＳｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２及びＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２（ＬＲＲＤ２－３）に６Ｍの尿素と１８ｍＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ）を加えて変性させた後、２２５ｍＭのヨードアセトアミドを用いてアルキル化を誘導した。以後、シグネチャーペプチド（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｐｅｐｔｉｄｅ）を得るため、８５０ｎｇの組換えブタトリプシン（Ｖ５１１７、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）を加えて２４時間３７℃に設定されたウォーターバス（ｗａｔｅｒ ｂａｔｈ）で反応させた。反応後に生成されたトリプシン消化物７０μＬにＭｅＯＨに溶解した３％のギ酸５０μＬを加えた後、ボルテックスミキサー（ｖｏｒｔｅｘ ｍｉｘｅｒ）を用いて１０分間混合試料を懸濁し、１３,５００ｒｐｍで１０分間遠心分離して上澄み液１６０μＬを取って分析容器に移し、そのうち５μＬをＨＰＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステムに注入して分析を行った。
【0089】
詳細な分析条件は、次の通りである。
【0090】
－ＨＰＬＣシステム：Ａｇｉｌｅｎｔ １１００（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）
－カラム：ＺＯＲＢＡＸ（登録商標）Ｃ８ ３．５μｍ、２．１＊５０ｍｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ）
－移動相（Ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ）：
－流速：３００μＬ／ｍｉｎ
－温度：カラムで２０℃、及び自動サンプル機トレイ（ａｕｔｏｓａｍｐｌｅｒ ｔｒａｙ）で１０℃
－ランタイム：５分
－検出：タンデム四重極型質量分析計（ＡＰＩ ４０００，ＱＴＲＡＰ（登録商標），Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＭＤＳ ＳＣＩＥＸ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）
－カーテンガス（ｃｕｒｔａｉｎ ｇａｓ）：２０ｐｓｉ
－イオンソースガス １（ｉｏｎ ｓｏｕｒｃｅ ｇａｓ １）：５０ｐｓｉ
－イオンソースガス ２（ｉｏｎ ｓｏｕｒｃｅ ｇａｓ ２）：６０ｐｓｉ
－イオンスプレー電圧（ｉｏｎｓｐｒａｙ ｖｏｌｔａｇｅ）：５５００Ｖ
－温度：６００℃
－多重反応モニタリング（ｍｕｌｔｉｐｌｅ－ｒｅａｃｔｉｏｎ－ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ、ＭＲＭ）モード：陽性
－カラム：ＺＯＲＢＡＸ（登録商標）Ｃ８ ３．５μｍ、２．１＊５０ｍｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ）
－移動相（Ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ）：
－温度：カラムで２０℃、及び自動サンプル機トレイ（ａｕｔｏｓａｍｐｌｅｒ ｔｒａｙ）で１０℃
－ランタイム：５分
－検出：タンデム四重極型質量分析計（ＡＰＩ ４０００，ＱＴＲＡＰ（登録商標），Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＭＤＳ ＳＣＩＥＸ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）
－カーテンガス（ｃｕｒｔａｉｎ ｇａｓ）：２０ｐｓｉ
－イオンソースガス １（ｉｏｎ ｓｏｕｒｃｅ ｇａｓ １）：５０ｐｓｉ
－イオンソースガス ２（ｉｏｎ ｓｏｕｒｃｅ ｇａｓ ２）：６０ｐｓｉ
－イオンスプレー電圧（ｉｏｎｓｐｒａｙ ｖｏｌｔａｇｅ）：５５００Ｖ
－温度：６００℃
－多重反応モニタリング（ｍｕｌｔｉｐｌｅ－ｒｅａｃｔｉｏｎ－ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ、ＭＲＭ）モード：陽性
【0091】
Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２のシグネチャペプチド（Ｐ６）の分子イオンは、２３Ｖの衝突エネルギー（ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ ｅｎｅｒｇｙ）によって断片化され、衝突ガス（ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ ｇａｓ）は、装備において「ｍｅｄｉｕｍ（８ｐｓｉ）」に設定した。イオンの検出は、ＥＳＩ陽性ＭＲＭモードで行い、Ｐ６は、ｍ／ｚ ５８７．９７→４９１．５０で定量した。検出ピークの積分は、Ａｎａｌｙｓｔ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖｅｒｓｉｏｎ １．４．２（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＭＤＳ ＳＣＩＥＸ）を用いて行った。血漿中においてＳｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２の定量可能範囲は、１～１００μｇ／ｍＬであり、ＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２（ＬＲＲＤ２－３）の場合、３～１００μｇ／ｍＬであった。該当分析においてＳｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２は、３．２９分のピーク保持時間を示した。
【0092】
５－５．データ分析
時間による血漿中のＣＮＣ０００００の濃度を前記実施例５－４に記載されたＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析法を用いて求め、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ４．２（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｙ，ＮＣ，ＵＳＡ）のソフトウェアのノンコンパートメント解析（ｎｏｎ－ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ）で薬物動態的パラメータ（ＰＫ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ）を計算した。最高濃度（Ｃｍａｘ）と最高濃度到達時間（Ｔｍａｘ）は、血中薬物濃度に対して時間による曲線から経時的に求め、消失速度定数（Ｋe）は、ログスケール（ｌｏｇ ｓｃａｌｅ）の最終段階（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｐｈａｓｅ）において線形回帰分析によって計算した。半減期（Ｔ１／２）は、ＬＮ２をＫｅで除して求め、血中薬物濃度に対して時間曲線下面積（ＡＵＣ０－∞）及び血中薬物モーメントに対して時間曲線下面積（ＡＵＭＣ０－∞）は、線形台形法（ｌｉｎｅａｒ ｔｒａｐｅｚｏｉｄａｌ ｒｕｌｅ）と標準面積外挿法（ｓｔａｎｄａｒｄ ａｒｅａ ｅｘｔｒａｐｏｌａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）により計算した。クリアランス（ｃｌｅａｒａｎｃｅ、ＣＬ）と分布容積（ｓｔｅａｄｙ ｓｔａｔｅ ｖｏｌｕｍｅ ｏｆ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ、Ｖｓｓ）は、次の［式１］～［式３］により計算した。
時間による血漿中のＣＮＣ０００００の濃度を前記実施例５－４に記載されたＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析法を用いて求め、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ４．２（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｙ，ＮＣ，ＵＳＡ）のソフトウェアのノンコンパートメント解析（ｎｏｎ－ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ）で薬物動態的パラメータ（ＰＫ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ）を計算した。最高濃度（Ｃｍａｘ）と最高濃度到達時間（Ｔｍａｘ）は、血中薬物濃度に対して時間による曲線から経時的に求め、消失速度定数（Ｋe）は、ログスケール（ｌｏｇ ｓｃａｌｅ）の最終段階（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｐｈａｓｅ）において線形回帰分析によって計算した。半減期（Ｔ１／２）は、ＬＮ２をＫｅで除して求め、血中薬物濃度に対して時間曲線下面積（ＡＵＣ０－∞）及び血中薬物モーメントに対して時間曲線下面積（ＡＵＭＣ０－∞）は、線形台形法（ｌｉｎｅａｒ ｔｒａｐｅｚｏｉｄａｌ ｒｕｌｅ）と標準面積外挿法（ｓｔａｎｄａｒｄ ａｒｅａ ｅｘｔｒａｐｏｌａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）により計算した。クリアランス（ｃｌｅａｒａｎｃｅ、ＣＬ）と分布容積（ｓｔｅａｄｙ ｓｔａｔｅ ｖｏｌｕｍｅ ｏｆ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ、Ｖｓｓ）は、次の［式１］～［式３］により計算した。
【0093】
【数1】
【0094】
【数2】
【0095】
【数3】
【0096】
５－６．結果
時間による血漿内のＳｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２及びＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２（ＬＲＲＤ２－３）の濃度は、図７及び表５と６に示し、薬物動態パラメータは、表７に示した。これに関連したパラメータとすべての値は、個体毎に算出した後、平均で示した。時間による血中濃度パターンと動物実験記録紙を参考して異常のある個体群は、データの分析から排除し、データの解釈に使用された実験群は、少なくともｎ＝３以上となるようにした。
時間による血漿内のＳｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２及びＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２（ＬＲＲＤ２－３）の濃度は、図７及び表５と６に示し、薬物動態パラメータは、表７に示した。これに関連したパラメータとすべての値は、個体毎に算出した後、平均で示した。時間による血中濃度パターンと動物実験記録紙を参考して異常のある個体群は、データの分析から排除し、データの解釈に使用された実験群は、少なくともｎ＝３以上となるようにした。
【0097】
【表5】
【0098】
【表6】
【0099】
下記表７から確認されるように、ＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質(ＬＲＲＤ２－３)は、Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２に対して約１４倍改善された半減期を示した。
【表7】
【0100】
［実施例６］
ＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質（ＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）の生体効能確認
１２週齢のＳＣＩＤマウスに４週間アルブミンと結合しないＳｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２またはＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質（ＬＲＲＤ２－３）を処理した。各薬物は、１日１回、毎週５回静脈注射により投与し、Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２は、毎日１０ｍｇ、ＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質（ＬＲＲＤ２－３）は、毎日３７．１３ｍｇ（Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２は、毎日１０ｍｇに該当）注射した。投与前後に小動物用骨密度を測定してその変化幅を確認し、その結果を下記表８に示す。
ＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質（ＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）の生体効能確認
１２週齢のＳＣＩＤマウスに４週間アルブミンと結合しないＳｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２またはＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質（ＬＲＲＤ２－３）を処理した。各薬物は、１日１回、毎週５回静脈注射により投与し、Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２は、毎日１０ｍｇ、ＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質（ＬＲＲＤ２－３）は、毎日３７．１３ｍｇ（Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２は、毎日１０ｍｇに該当）注射した。投与前後に小動物用骨密度を測定してその変化幅を確認し、その結果を下記表８に示す。
【0101】
【表8】
【0102】
表８に示すように、アルブミンと結合しないＳｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２は、ＢＭＤ及びＢＭＣが改善されたが、統計的に有意ではなく、ＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質（ＬＲＲＤ２－３）は、ＢＭＤ及びＢＭＣを全て有意に改善させる効果を示した。これにより、ＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質（ＬＲＲＤ２－３）は、アルブミンと結合しないＳｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２よりさらに強力に骨関連疾患に対する治療効果を示すことを確認した。
【産業上の利用可能性】
【0103】
本発明のアルブミンと結合したＳｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２は。アルブミンと結合しないＳｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２と同じ細胞学的効能を示し、アルブミンと結合しないＳｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２と比較して、生体内半減期が著しく増加して骨関連疾患をより効果的に予防または治療しうる。
【0104】
本発明をサポートした国家研究開発事業は、下記の通りである。
(１)［この発明をサポートした国家研究開発事業］
［課題固有番号］ ２０１７－１２２９（ＨＩ１５Ｃ０３７７０１００１７）
［省庁名］ 保健福祉部
［研究管理専門機関］ 韓国保健産業振興院
［研究事業名］ 疾病中心仲介重点研究
［研究課題名］ 骨形成促進作用を持つ巨核細胞分泌因子の発掘
［寄与率］ ７５／１００
［主管機関］ ソウル峨山病院
［研究期間］ ２０１７．０９．０７～２０１８．０９．０６
（２）［この発明をサポートした国家研究開発事業］
［課題固有番号］ ２０１３－２２３４（ＨＩ１３Ｃ１６３４０６００１８）
［省庁名］ 保健福祉部
［研究管理専門機関］ 韓国保健産業振興院
［研究事業名］ 疾病中心仲介重点研究
［研究課題名］ Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２の薬物動態研究及びＳｌｉｔ３ ＴＧマウスを用いたｉｎ ｖｉｖｏ毒性の検証
［寄与率］ ２５/１００
［主管機関］ 忠南大学校産学協力団
［研究期間］ ２０１３．１１．０１～２０１９．０６．３０
(１)［この発明をサポートした国家研究開発事業］
［課題固有番号］ ２０１７－１２２９（ＨＩ１５Ｃ０３７７０１００１７）
［省庁名］ 保健福祉部
［研究管理専門機関］ 韓国保健産業振興院
［研究事業名］ 疾病中心仲介重点研究
［研究課題名］ 骨形成促進作用を持つ巨核細胞分泌因子の発掘
［寄与率］ ７５／１００
［主管機関］ ソウル峨山病院
［研究期間］ ２０１７．０９．０７～２０１８．０９．０６
（２）［この発明をサポートした国家研究開発事業］
［課題固有番号］ ２０１３－２２３４（ＨＩ１３Ｃ１６３４０６００１８）
［省庁名］ 保健福祉部
［研究管理専門機関］ 韓国保健産業振興院
［研究事業名］ 疾病中心仲介重点研究
［研究課題名］ Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２の薬物動態研究及びＳｌｉｔ３ ＴＧマウスを用いたｉｎ ｖｉｖｏ毒性の検証
［寄与率］ ２５/１００
［主管機関］ 忠南大学校産学協力団
［研究期間］ ２０１３．１１．０１～２０１９．０６．３０
【手続補正2】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
アルブミンと結合したＳｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２を含む、骨関連疾患の予防または治療用薬学組成物。
【請求項2】
前記アルブミンは、ヒト血清アルブミン（ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）である、請求項１に記載の骨関連疾患の予防または治療用薬学組成物。
【請求項3】
前記ヒト血清アルブミンは、前記Ｓｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２のＮ－末端に結合されている、請求項２に記載の骨関連疾患の予防または治療用薬学組成物。
【請求項4】
前記ヒト血清アルブミンは、配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の骨関連疾患の予防または治療用薬学組成物。
【請求項5】
前記Ｓｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２は、配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の骨関連疾患の予防または治療用薬学組成物。
【請求項6】
前記アルブミンと前記Ｓｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２の間にリンカーをさらに含む、請求項１に記載の骨関連疾患の予防または治療用薬学組成物。
【請求項7】
前記リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）ｎであり、ここで、ｎは１～１０の整数である、請求項６に記載の骨関連疾患の予防または治療用薬学組成物。
【請求項8】
注射剤として投与されている、請求項１に記載の骨関連疾患の予防または治療用薬学組成物。
【請求項9】
前記骨関連疾患は、骨粗しょう症（ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ）、骨折、骨損失、変形性関節症（ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、骨転移がん及びパジェット病（Ｐａｇｅｔ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）からなる群から選ばれるいずれか一つ以上である、請求項１に記載の骨関連疾患の予防または治療用薬学組成物。
【請求項10】
骨関連疾患の予防または治療用薬剤を製造するための、アルブミンと結合したＳｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２の使用。
【請求項11】
前記アルブミンは、ヒト血清アルブミン（ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）である、請求項１０に記載の使用。
【請求項12】
前記ヒト血清アルブミンは、前記Ｓｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２のＮ－末端に結合されている、請求項１１に記載の使用。
【請求項13】
前記ヒト血清アルブミンは、配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載の使用。
【請求項14】
前記Ｓｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２は、配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載の使用。
【請求項15】
前記アルブミンと前記Ｓｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２の間にリンカーをさらに含む、請求項１０に記載の使用。
【請求項16】
前記リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）ｎであり、ここで、ｎは１～１０の整数である、請求項１５に記載の使用。
【請求項17】
前記Ｓｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２は、注射剤として投与されている、請求項１０に記載の使用。
【請求項18】
骨粗しょう症（ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ）、骨折、骨損失、変形性関節症（ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、骨転移がん及びパジェット病（Ｐａｇｅｔ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）からなる群から選ばれるいずれか一つ以上である、請求項１０に記載の使用。
【国際調査報告】