特表 2022-522848 ゲノム編集された鳥

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-04-20

(54)【発明の名称】ゲノム編集された鳥

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20220413BHJP

   C12N 15/54 20060101ALI20220413BHJP

   C12N 15/55 20060101ALI20220413BHJP

   A01K 67/027 20060101ALI20220413BHJP

   C12N 5/073 20100101ALI20220413BHJP

   C12N 15/873 20100101ALI20220413BHJP

【ＦＩ】

C12N15/09 110

C12N15/54 ZNA

C12N15/55

A01K67/027

C12N5/073

C12N15/873 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021552184

(86)(22)【出願日】2020-03-03

(85)【翻訳文提出日】2021-10-01

(86)【国際出願番号】 IL2020050242

(87)【国際公開番号】W WO2020178822

(87)【国際公開日】2020-09-10

(31)【優先権主張番号】62/814,162

(32)【優先日】2019-03-05

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】509219903

【氏名又は名称】ザ ステイト オブ イスラエル ミニストリー オブ アグリカルチャー アンド ルーラル ディベロップメント アグリカルチュラル リサーチ オーガニゼイション （エー．アール．オー．） （ボルカニ センター）

【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＳＴＡＴＥ ＯＦ ＩＳＲＡＥＬ， ＭＩＮＩＳＴＲＹ ＯＦ ＡＧＲＩＣＵＬＴＵＲＥ ＆ ＲＵＲＡＬ ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴ， ＡＧＲＩＣＵＬＴＵＲＡＬ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＯＲＧＡＮＩＺＡＴＩＯＮ （ＡＲＯ）（ＶＯＬＣＡＮＩ ＣＥＮＴＥＲ）

【住所又は居所原語表記】Ｖｏｌｃａｎｉ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｐ．Ｏ． Ｂｏｘ １５１５９， Ｒｉｓｈｏｎ－ＬｅＺｉｏｎ， Ｉｓｒａｅｌ

(74)【代理人】

【識別番号】110001379

【氏名又は名称】特許業務法人 大島特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】シナモン、ユヴァル

(72)【発明者】

【氏名】ベン－タル コーエン、エンバル

【テーマコード（参考）】

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AB01

4B065BA02

4B065CA60

(57)【要約】

本開示は、キメラ鳥細胞およびキメラ鳥を生成するための外因性ポリヌクレオチドカセットを提供する。ポリヌクレオチドカセットは、雄鳥胚において条件付きで致死の表現型を生成するために使用され得る。一実施形態において、本開示は、雄のヒヨコ胚をｉｎ－ｏｖｏで破壊するための方法を提供する。
【選択図】図２６Ａ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

式５'－ＬＨＡ－ＯＩＥ－ＬＩＥ－ＲＨＡ－３'または式５'－ＬＨＡ－ＬＩＥ－ＯＩＥ－ＲＨＡ－３'を有するポリヌクレオチドカセットを含むＤＮＡ編集剤であって、
（ｉ）前記ＬＨＡが、鳥の染色体Ｚ上の第１の対応するヌクレオチド配列と実質的に相同である第１のヌクレオチド配列を含み、
（ｉｉ）前記ＯＩＥが、インデューサー活性化部位特異的リコンビナーゼ酵素をコードする第２のヌクレオチド配列に機能的に連結した第１のプロモーターを含み、
（ｉｉｉ）前記ＬＩＥが、前記インデューサー活性化部位特異的リコンビナーゼ酵素の活性に動作可能に連結された致死促進タンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列を含み、かつ
（ｉｖ）前記ＲＨＡが、鳥の染色体Ｚ上の第２の対応するヌクレオチド配列と実質的に相同である第４のヌクレオチド配列を含む、ＤＮＡ編集剤。

【請求項2】

前記第１の対応するヌクレオチド配列または前記第２の対応するヌクレオチド配列が、染色体Ｚ上のオープンに転写された領域に位置する、請求項１に記載のＤＮＡ編集剤。

【請求項3】

前記オープンに転写された領域が、鳥の染色体Ｚ上のヒスチジントライアドヌクレオチド結合タンパク質１－Ｚ遺伝子座に、またはその下流に位置する、請求項２に記載のＤＮＡ編集剤。

【請求項4】

（ｉ）前記ＬＨＡが、配列番号１０５に記載のヌクレオチド配列もしくはその断片を含むか、
（ｉｉ）前記ＲＨＡが、配列番号１０６に記載のヌクレオチド配列もしくはその断片を含むか、または
（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の両方である、請求項１に記載のＤＮＡ編集剤。

【請求項5】

前記第１のプロモーターが、ｐＣＡＧＧ（配列番号１００）、ｐＧＫ（配列番号１０９）、ｐＣＭＶ（配列番号１１０）、ｐｈＳｙｎ（配列番号１１１）、およびｐＥＦ１－ａ（配列番号１１２）からなる群から選択される、請求項１に記載のＤＮＡ編集剤。

【請求項6】

前記インデューサー活性化部位特異的リコンビナーゼ酵素が、ＣｒｅリコンビナーゼまたはＭａｇリコンビナーゼを含む、請求項１に記載のＤＮＡ編集剤。

【請求項7】

前記インデューサー活性化部位特異的リコンビナーゼ酵素が、配列番号１１３、配列番号１１４、または配列番号６５の配列を含むヌクレオチド配列によってコードされる、請求項６に記載のＤＮＡ編集剤。

【請求項8】

前記インデューサー活性化部位特異的リコンビナーゼ酵素の発現が、インデューサーによって誘導される、請求項１に記載のＤＮＡ編集剤。

【請求項9】

前記インデューサーが、電磁エネルギーである、請求項８に記載のＤＮＡ編集剤。

【請求項10】

前記電磁エネルギーが、３８０～７４０ｎｍの波長を有する可視光である、請求項９に記載のＤＮＡ編集剤。

【請求項11】

前記可視光が、４５０～４８５ｎｍの波長を有する青色光である、請求項１０に記載のＤＮＡ編集剤。

【請求項12】

前記インデューサー活性化部位特異的リコンビナーゼ酵素が、前記インデューサーの存在下で結合して活性インデューサー活性化部位特異的リコンビナーゼ酵素を形成する、前記インデューサー活性化部位特異的リコンビナーゼ酵素の非機能的ペプチド断片を含む、請求項８に記載のＤＮＡ編集剤。

【請求項13】

前記インデューサー活性化部位特異的リコンビナーゼ酵素が、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素である、請求項１に記載のＤＮＡ編集剤。

【請求項14】

前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素が、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質エンドヌクレアーゼである、請求項１３に記載のＤＮＡ編集剤。

【請求項15】

前記ポリヌクレオチドカセットが、前記鳥の必須遺伝子を標的とするガイドＲＮＡをコードする第５のヌクレオチド配列をさらに含み、前記第５のヌクレオチド配列が前記インデューサー活性化部位特異的リコンビナーゼ酵素の前記活性に作動可能に連結されている、請求項１３に記載のＤＮＡ編集剤。

【請求項16】

前記必須遺伝子が、骨形成タンパク質受容体ＩＡ型、骨形成タンパク質２、骨形成タンパク質４、および線維芽細胞成長因子受容体１（ＦＧＦＲ１）からなる群から選択される、請求項１５に記載のＤＮＡ編集剤。

【請求項17】

前記致死促進タンパク質が、毒素、アポトーシス促進タンパク質、Ｗｎｔシグナル伝達経路の阻害剤、ＢＭＰアンタゴニスト、ＦＧＦアンタゴニスト、野生型カスパーゼ３、構成的に活性なカスパーゼ３、Ｎｏｇｇｉｎ、およびそれらの致死誘導断片からなる群から選択される、請求項１に記載のＤＮＡ編集剤。

【請求項18】

致死誘導タンパク質が、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、または配列番号９９のアミノ酸配列を有する、請求項１７に記載のＤＮＡ編集剤。

【請求項19】

前記鳥が、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、キジ、およびダチョウからなる群から選択される、請求項１に記載のＤＮＡ編集剤。

【請求項20】

（ｉ）前記ＬＨＡが、配列番号１０５の配列を含み、
（ｉｉ）前記ＯＩＥが、配列番号１１６の配列に接続されている、配列番号１０４の配列に接続されている、配列番号１０２の配列に接続されている、配列番号１０３の配列に接続されている、配列番号１０１の配列に接続されている、配列番号１１６の配列に接続されている、配列番号１００の配列を含むか、または、前記ＯＩＥが、配列番号１１６の配列に接続されている、配列番号１０４の配列に接続されている、配列番号１０８の配列に接続されている、配列番号１０３の配列に接続されている、配列番号１０７の配列に接続されている、配列番号１１６の配列に接続されている、配列番号１００の配列を含み、
（ｉｉｉ）前記ＬＩＥが、配列番号９２、または配列番号９４、または配列番号９６、または配列番号９８の配列を含み、かつ
（ｉｖ）前記ＲＨＡが、配列番号１０６の配列を含む、請求項１に記載のＤＮＡ編集剤。

【請求項21】

鳥細胞の集団であって、前記鳥細胞が、請求項１に記載のＤＮＡ編集剤を含む、集団。

【請求項22】

前記鳥細胞が、始原生殖細胞または鳥の配偶子である、請求項２１に記載の集団。

【請求項23】

前記始原生殖細胞が、生殖腺始原生殖細胞、血液始原生殖細胞、および生殖三日月環始原生殖細胞からなる群から選択される、請求項２２に記載の集団。

【請求項24】

前記鳥が、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、キジ、およびダチョウからなる群から選択される、請求項２１に記載の集団。

【請求項25】

請求項２１に記載の鳥細胞の集団を含む、キメラ鳥。

【請求項26】

前記鳥が、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、キジ、およびダチョウからなる群から選択される、請求項２５に記載のキメラ鳥。

【請求項27】

請求項１に記載のＤＮＡ編集剤を鳥細胞の集団に投与し、それによりゲノム編集された鳥細胞を生成するステップと、
前記ゲノム編集された鳥細胞をレシピエント鳥胚に移し、それによりキメラ鳥を生成するステップと、を含む、キメラ鳥を生成する方法。

【請求項28】

前記鳥が、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、キジ、およびダチョウからなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

前記鳥細胞の集団が、始原生殖細胞を含む、請求項２７に記載の方法。

【請求項30】

前記ＰＧＣが、生殖腺ＰＧＣ、血液ＰＧＣ、および生殖三日月環ＰＧＣからなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。

【請求項31】

前記鳥細胞が、ｉｎ－ｏｖｏまたはｅｘ－ｏｖｏ注射によって前記レシピエント鳥胚に移される、請求項２７に記載の方法。

【請求項32】

鳥の雄胚において致死を誘導する方法であって、
請求項１に記載のＤＮＡ編集剤を鳥細胞の集団に投与し、それによりゲノム編集された鳥細胞を生成するステップと、
前記ゲノム編集された鳥細胞をレシピエント鳥胚に移すステップと、
前記胚を、前記ＤＮＡ編集剤によってコードされる前記致死促進タンパク質の発現を誘発するインデューサーにさらし、それにより前記鳥の雄胚において致死を誘導するステップと、を含む、方法。

【請求項33】

前記鳥が、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、キジ、およびダチョウからなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。

【請求項34】

前記インデューサーが、４５０～４８５ｎｍの波長を有する青色光である、請求項３２に記載の方法。

【請求項35】

前記ＤＮＡ編集剤が、
（ｉ）配列番号１０５の配列を有するＬＨＡ、
（ｉｉ）配列番号１１６の配列に接続されている、配列番号１０４の配列に接続されている、配列番号１０２の配列に接続されている、配列番号１０３の配列に接続されている、配列番号１０１の配列に接続されている、配列番号１１６の配列に接続されている、配列番号１００の配列を有するＯＩＥ、または、配列番号１１６の配列に接続されている、配列番号１０４の配列に接続されている、配列番号１０８の配列に接続されている、配列番号１０３の配列に接続されている、配列番号１０７の配列に接続されている、配列番号１１６の配列に接続されている、配列番号１００の配列を有するＯＩＥ、
（ｉｉｉ）配列番号９２、または配列番号９４、または配列番号９６、または配列番号９８の配列を有するＬＩＥ、および
（ｉｖ）配列番号１０６の配列を有するＲＨＡを含む、請求項３２に記載の方法。

【請求項36】

前記ＯＩＥにおける前記第１のプロモーターの下流だが、前記インデューサー活性化部位特異的リコンビナーゼ酵素をコードする前記第２のヌクレオチド配列の上流に挿入されるセーフロック要素をさらに含み、前記セーフロック要素が、前記ＯＩＥによってコードされる前記インデューサー活性化部位特異的リコンビナーゼ酵素の転写を防ぐＳＴＯＰ要素を含む、請求項１に記載のＤＮＡ編集剤。

【請求項37】

前記ＳＴＯＰ要素が、２つのＦＲＴ部位に隣接している、請求項３６に記載のＤＮＡ編集剤。

【請求項38】

前記ＤＮＡ編集剤が、配列番号１２０～１２７のうちの１つの配列を含む、請求項３６に記載のＤＮＡ編集剤。

【請求項39】

鳥細胞の集団であって、前記鳥細胞が、請求項３６に記載のＤＮＡ編集剤を含む、集団。

【請求項40】

前記鳥細胞が、始原生殖細胞または鳥の配偶子である、請求項３９に記載の集団。

【請求項41】

前記始原生殖細胞が、生殖腺始原生殖細胞、血液始原生殖細胞、および生殖三日月環始原生殖細胞からなる群から選択される、請求項４０に記載の集団。

【請求項42】

前記鳥が、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、キジ、およびダチョウからなる群から選択される、請求項３９に記載の集団。

【請求項43】

請求項３９に記載の鳥細胞の集団を含む、キメラ鳥。

【請求項44】

前記鳥が、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、キジ、およびダチョウからなる群から選択される、請求項４３に記載のキメラ鳥。

【請求項45】

請求項３６に記載のＤＮＡ編集剤を鳥細胞の集団に投与し、それによりゲノム編集された鳥細胞を生成するステップと、
前記ゲノム編集された鳥細胞をレシピエント鳥胚に移し、それによりキメラ鳥を生成するステップと、を含む、キメラ鳥を生成する方法。

【請求項46】

前記鳥が、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、キジ、およびダチョウからなる群から選択される、請求項４５に記載の方法。

【請求項47】

前記鳥細胞の集団が、始原生殖細胞を含む、請求項４５に記載の方法。

【請求項48】

前記始原生殖細胞が、生殖腺始原生殖細胞、血液始原生殖細胞、および生殖三日月環始原生殖細胞からなる群から選択される、請求項４７に記載の方法。

【請求項49】

前記鳥細胞が、ｉｎ－ｏｖｏ注射によって鳥胚に移される、請求項４５に記載の方法。

【請求項50】

鳥の雄胚において致死を誘導する方法であって、
請求項３６に記載のＤＮＡ編集剤を鳥細胞の集団に投与し、それによりゲノム編集された鳥細胞を生成するステップと、
前記ゲノム編集された鳥細胞をレシピエント鳥胚に移すステップと、
前記胚を、前記ＤＮＡ編集剤から前記ＳＴＯＰ要素を除去する薬剤にさらし、それにより前記ＤＮＡ編集剤によってコードされる前記致死促進タンパク質の発現を誘発し、前記鳥の雄胚において致死を誘導するステップと、を含む、方法。

【請求項51】

前記鳥が、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、キジ、およびダチョウからなる群から選択される、請求項５０に記載の方法。

【請求項52】

前記ＤＮＡ編集剤が、配列番号１２０～１２７のうちの１つの配列を含む、請求項５０に記載の方法。

【請求項53】

前記薬剤が、ＦｌｐＯタンパク質またはＣｒｅタンパク質をコードするヌクレオチド配列である、請求項５０に記載の方法。

【請求項54】

雄胚において致死を誘導することが、前記胚を４５０～４８５ｎｍの波長を有する青色光にさらすことをさらに含む、請求項５０に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（配列表の提示）
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０２０年２月２４日に作成されたＡＳＣＩＩコピーは、Ｐ－５８５１１０－ＰＣ＿ＳＴ２５．ｔｘｔという名称で、３５５．８ＫＢのサイズである。

【0002】

本開示は、ＤＮＡ編集剤、およびＤＮＡ編集された細胞および鳥の準備におけるその使用に関する。本開示はさらに、ＤＮＡ編集された鳥の卵における雄胚に条件付きで致死の表現型を与える方法に関する。

【背景技術】

【0003】

ＺＷ性決定システムは、鳥、一部の魚や甲殻類、一部の昆虫、一部の爬虫類において子孫の性別を決定する染色体システムである。文字ＺおよびＷは、このシステムをＸＹ性決定システムと区別するために使用される。ＺＷシステムにおいて、卵子が子孫の性別を決定する。雄は同型配偶子性（ＺＺ）であり、雌は異型配偶子性（ＺＷ）である。Ｚ染色体は、ＸＹシステムのＸ染色体のように、より大きく、より多くの遺伝子を持っている。

【0004】

早期の性別の識別および分離は、すべての鳥類の商業用途、特に食用卵産業の重要な態様である。ブロイラーおよびシチメンチョウの場合、性別の分離により、２つの性別の異なるニーズに応じたより適切な管理および給餌のスキームが可能になる。本質的にすべての商業用孵化場は、群れの性別分離を使用している。商業的価値の低い雄のニワトリは、孵化場で間引かれ、雌のニワトリは卵生産に使用される。

【0005】

現在、家禽の性別を決定するために利用可能な３つの方法がある。日齢のヒヨコの性別は、肛門／排泄腔識別、または羽毛分類法のいずれかによって決定できる。または、二次性徴が明らかになるまで雄および雌のヒヨコを一緒に飼育し、その後、ヒヨコを性別に基づいて分離することができる。肛門／排泄腔分類は、性別に関連する解剖学的構造の外観に依存している。羽毛分類は、雄および雌のヒヨコの間で異なる羽毛の特徴、例えば、綿毛の色模様、および翼の羽毛の速い／遅い成長速度に基づく。第３の方法は、例えば、雄においてとさかおよび肉垂が雌のものよりも大きくなる、自然な二次性徴の現れに依存する。

【0006】

日齢のヒヨコの肛門／排泄腔性別決定は、難しく、費用がかかる。鳥の性別を識別するには、高度に熟練した人員が必要である。実行するのはより容易であるが、羽毛分類は、鳥の特定の遺伝的交雑に限定されるという欠点がある。二次性徴による雌雄分類は実行するのに最も容易な方法であるが、孵化後の最初の数週間は両方の性別の鳥を一緒に飼育する必要があり、給餌コストおよび給餌切り替えのために、孵化場にとって肛門／排泄腔分類の費用に比べて対価がより高くなり得るという欠点を有する。

【0007】

最も重要なことは、米国とヨーロッパでのみ、毎年ほぼ１０億羽の雄のヒヨコが様々な方法で殺されていることである。これは経済的な問題だけでなく、益々倫理的な問題になる。

【0008】

商業孵化場の分野において、好ましくは卵の段階でさえ、雄のヒヨコの産生を防ぎ、したがって生存可能な雄のヒヨコに関連する問題を回避するためのハイスループットの方法が必要である。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0009】

本明細書で提供されるのは、雄胚のヒヨコのｉｎ－ｏｖｏ破壊のための組成物と方法を含む技術である。そのような組成物および方法は、農家などの鳥の繁殖の分野に熟練した人が、より商業的に有用な雌の子孫を選択して、雄および雌の子孫間の自然な１：１の比率を歪めることを可能にするので有益である。

【0010】

一実施形態において、本明細書で提供されるのは、式５'－ＬＨＡ（左相同性アーム）－ＯＩＥ（光遺伝学的誘導性要素）－ＬＩＥ（致死誘導要素）－ＲＨＡ（右相同性アーム）－３'または式５'－ＬＨＡ－ＬＩＥ－ＯＩＥ－ＲＨＡ－３'を有するポリヌクレオチドカセットを含むＤＮＡ編集剤であり、（ｉ）ＬＨＡが、鳥の染色体Ｚ上の第１の対応するヌクレオチド配列と実質的に相同である第１のヌクレオチド配列を含み、（ｉｉ）ＯＩＥが、インデューサー活性化部位特異的リコンビナーゼ酵素をコードする第２のヌクレオチド配列に機能的に連結した第１のプロモーターを含み、（ｉｉｉ）ＬＩＥが、インデューサー活性化部位特異的リコンビナーゼ酵素の活性に動作可能に連結されている致死促進タンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列を含み、かつ（ｉｖ）ＲＨＡが、鳥の染色体Ｚ上の第２の対応するヌクレオチド配列と実質的に相同である第４のヌクレオチド配列を含む。

【0011】

特定の実施形態において、ＬＨＡおよびＲＨＡの一方または両方は、鳥の染色体Ｚ上のオープンに転写された領域に位置する対応するヌクレオチド配列と実質的に相同である。例えば、オープンに転写された領域は、鳥の染色体Ｚ上のヒスチジントライアドヌクレオチド結合タンパク質１－Ｚ（ＨＩＮＴ１Ｚ）遺伝子座に、またはその下流に位置し得る。

【0012】

特定の実施形態において、インデューサー活性化部位特異的リコンビナーゼ酵素は、Ｃｒｅリコンビナーゼ（Ｃｒｅ）（配列番号１１３）、またはＭａｇ（配列番号１１４および配列番号６５）であり得る。特定の実施形態において、インデューサー活性化部位特異的リコンビナーゼ酵素の発現は、インデューサーによって誘導される。特定の実施形態において、インデューサーは、電磁エネルギーである。例えば、インデューサーは、４５０～４８５ｎｍの波長を有する青色光であり得る。

【0013】

特定の実施形態において、インデューサー活性化部位特異的リコンビナーゼ酵素は、インデューサーの存在下で結合して活性インデューサー活性化部位特異的リコンビナーゼ酵素を形成する、インデューサー活性化部位特異的リコンビナーゼの非機能的ペプチド断片を含む。

【0014】

特定の実施形態において、致死誘導タンパク質は、毒素、アポトーシス促進タンパク質、ウィングレス／統合（Ｗｎｔ）シグナル伝達経路の阻害剤、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）アンタゴニスト、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）アンタゴニスト、野生型カスパーゼ３、構成的に活性なカスパーゼ３、Ｎｏｇｇｉｎ、または上記タンパク質のうちのいずれかの致死誘導断片であり得る。

【0015】

一実施形態において、本明細書に開示のＤＮＡ編集剤は、（ｉ）配列番号１０５の配列を含むＬＨＡと、（ｉｉ）配列番号１１６の配列に接続されている、配列番号１０４の配列に接続されている、配列番号１０２の配列に接続されている、配列番号１０３の配列に接続されている、配列番号１０１の配列に接続されている、配列番号１１６の配列に接続されている、配列番号１００の配列を含むＯＩＥ、または配列番号１１６の配列に接続されている、配列番号１０４の配列に接続されている、配列番号１０１の配列に接続されている、配列番号１０３の配列に接続されている、配列番号１０２の配列に接続されている、配列番号１１６の配列に接続されている、配列番号１００の配列を含むＯＩＥ、または配列番号１１６の配列に接続されている、配列番号１０４の配列に接続されている、配列番号１０８の配列に接続されている、配列番号１０３の配列に接続されている、配列番号１０７の配列に接続されている、配列番号１１６の配列に接続されている、配列番号１００の配列を含むＯＩＥ、または配列番号１１６の配列に接続されている、配列番号１０４の配列に接続されている、配列番号１０７の配列に接続されている、配列番号１０３の配列に接続されている、配列番号１０８の配列に接続されている、配列番号１１６の配列に接続されている、配列番号１００の配列を含むＯＩＥと、（ｉｉｉ）配列番号９２、または配列番号９４、または配列番号９６、または配列番号９８の配列を含むＬＩＥと、（ｉｖ）配列番号１０６の配列を含むＲＨＡと、を含む。

【0016】

特定の実施形態において、本明細書に開示のポリヌクレオチドカセットは、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、キジ、またはダチョウなどの鳥に適用し得る。

【0017】

別の実施形態において、本開示は、本明細書に開示のポリヌクレオチドカセットを含む鳥細胞をさらに提供する。別の実施形態において、本明細書に開示のポリヌクレオチドカセットを含む鳥細胞を含むキメラ鳥が、提供される。

【0018】

別の態様において、キメラ鳥を生成するために本明細書に開示のＤＮＡ編集剤を使用する方法が、さらに提供される。特定の実施形態において、方法は、鳥の細胞を本明細書に開示の外因性ポリヌクレオチドカセットと接触させ、それによりゲノム編集された鳥細胞を生成し、次いでこれらのゲノム編集された鳥細胞をレシピエント鳥胚に移すステップを含む。別の態様において、上記の方法から生成されたキメラ鳥がさらに提供される。

【0019】

別の態様において、鳥の雄胚において致死を誘導する方法がさらに提供され、本明細書に開示のＤＮＡ編集剤を鳥細胞の集団に投与し、それによりゲノム編集された鳥細胞を生成するステップ；これらのゲノム編集された鳥細胞をレシピエント鳥胚に移すステップ；および胚を、ＤＮＡ編集剤によってコードされる致死促進タンパク質の発現を誘発するインデューサーにさらし、それにより鳥の雄胚において致死を誘導するステップを含む。

【0020】

別の実施形態において、本明細書に開示されるＤＮＡ編集剤は、ＯＩＥにおけるプロモーターの下流だが、インデューサー活性化部位特異的リコンビナーゼをコードする配列の上流に挿入されるセーフロック要素をさらに含む。セーフロック要素は、ＯＩＥによってコードされるインデューサー活性化部位特異的リコンビナーゼの転写を防ぐヌクレオチド配列（ＳＴＯＰ要素）を含む。一実施形態において、ＳＴＯＰ要素は、２つのＦＲＴ部位に隣接している。一実施形態において、配列番号１２０～１２７のうちの１つの配列を有するＤＮＡ編集剤のそれぞれは、セーフロック要素を含む。別の態様において、セーフロック要素を含むＤＮＡ編集剤を使用してキメラ鳥を生成する方法がさらに提供される。

【0021】

別の実施形態において、鳥の雄胚において致死を誘導するためのセーフロック要素を含むＤＮＡ編集剤を使用する方法が提供され、該方法は、そのようなＤＮＡ編集剤を鳥細胞の集団に投与し、それによりゲノム編集された鳥細胞を生成するステップ；これらのゲノム編集された鳥細胞をレシピエント鳥胚に移すステップ；および胚を、ＤＮＡ編集剤からＳＴＯＰ要素を除去する薬剤にさらし、それによりＤＮＡ編集剤によってコードされる致死促進タンパク質の発現を誘発し、鳥の雄胚における致死を誘導するステップを含む。

【0022】

別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および／または科学用語は、態様または実施形態が係る当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または同等の方法および材料を態様の実施形態の実施または試験に使用することができるが、例示的な方法および／または材料を以下に記載する。矛盾する場合には、定義を含む特許明細書が優先する。さらに、材料、方法、および例は単なる例示であり、必ずしも限定することを意図するものではない。

【図面の簡単な説明】

【0023】

本明細書では、いくつかの実施形態を、単なる例として、添付の図面を参照して説明する。ここで図面を特に詳細に参照すると、示されている詳細は、例としてのものであり、特定の実施形態の例示的な考察の目的のためであることが強調されている。これに関して、図面とともに行われる説明は、実施形態がどのように実施され得るかを当業者に明らかにする。

【0024】

本明細書で提供されるとみなされる主題は、本明細書の結論部分で特に指摘され、明確に主張されている。しかしながら、構成および作動方法の両方に関する実施形態は、その目的、特徴、および利点とともに、添付の図面とともに読まれる場合、以下の詳細な説明を参照することによって最良に理解され得る。

【0025】

【図1】雌産卵鶏ヒヨコのみが孵化する光遺伝学的誘導性ニワトリ系統の生成の実施形態を示す図である。野生型の雄鶏（ＺＺ）を遺伝子改変雌鶏（ＺＷ）と交配することにより、すべての雌の受精卵は野生型のＺＷ染色体を担持する。すべての雄の受精卵は、遺伝子改変Ｚが遺伝子改変雌鶏のゲノムに由来するＺＺ染色体を担持する。受精卵への青色光照明時に、この遺伝子改変染色体の光遺伝学的システムは、活性になって、産卵直後に初期の雄胚死亡を引き起こす死亡機構を活性化する。青色光照明の影響を受けない雌は、孵化し、成体に成長し、食用の無精卵を産む。

【図2】青色光照明によって遺伝子発現を制御する戦略の実施形態を示す。２つの融合タンパク質、すなわち、Ｃｒｅの非活性Ｎ末端を持つＣｒｙ２（Ｃｒｙ２－ＣｒｅＮ末端）およびＣｒｅの非活性Ｃ末端と融合するＣＩＢＮ（ＣＩＢＮ－Ｃｒｅ－Ｃ末端）が作成される。青色光照明がないと、Ｃｒｅは不活性である。青色光照明時に、Ｃｒｙ２およびＣＩＢＮは複合体を形成し、Ｃｒｅの２つの部分が一緒になって活性Ｃｒｅ酵素を形成する。

【図3】Ｚ染色体上の相同性アームの実施形態を示す。ＨＩＮＴ１Ｚ遺伝子座の下流のゲノム領域が描かれている。５'および３'アームは、それぞれＨＡ－１（左相同性アーム、ＬＨＡ）およびＨＡ－２（右相同性アーム、ＲＨＡ）である。アームを増幅するためのプライマーは、白抜きの矢印で示されている（ＦＷＤ ＨＡ５' Ｐ１およびＲＥＶ ＨＡ３' Ｐ２）。相同性アームの間の両方のＤＮＡ鎖には、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９の配列がある（白抜きのボックス、ＣＲＩＳＰＲガイド１および３）。図３の下部は、２つの相同性アーム間の領域を詳細に示す。ＬＨＡ－ＣＲＩＳＰＲ－ＲＨＡ断片を含む、配列番号１に記載の配列を示している。

【図4A】ターゲティングベクターまたはＤＮＡ編集剤の異なる実施形態を示し、３つの主要な要素を含むターゲティングベクターを示す。第１の要素は、外因性挿入カセット全体に隣接している、相同組換え（ＨＲ）のための５'および３'相同性アーム（ＨＡ）である。第２の要素は、光誘導システムであり、この場合はＣｒｙ２－ＣｒｅＮおよびＣＩＢＮ－Ｃｒｅ－Ｃである。第３の要素は、致死遺伝子カセットである。単一ターゲティングベクター戦略の一実施形態において、５'ＨＡの後に、自己切断ペプチドＰ２Ａによって分離されるＣＲＹ２－ＣｒｅＮおよびＣＩＢＮ－Ｃｒｅ－Ｃ遺伝子の発現を駆動するｐＧＫプロモーターが続く。この要素の後に、ｐＧＫプロモーターを含む外因性致死遺伝子カセットが続き、その後にＬｏｘＰ－ＳＴＯＰ－ＬｏｘＰ部位（ＬＳＬ）が続き、その後に致死誘導遺伝子が続く。この外因性カセットの後に３'ＨＡが続く。光誘導時に、ＣＲＹ２－ＣｒｅＮおよびＣＩＢＮ－Ｃｒｅ－Ｃが二量体化して、活性型のＣｒｅを形成する。その後、後者はＬＳＬ要素を切除し、したがって、致死誘導遺伝子の発現を可能にし、このベクターを担持するすべての胚の死亡に繋がる。

【図4B】ターゲティングベクターまたはＤＮＡ編集剤の異なる実施形態における代替のアプローチを示す。ＬＳＬ要素を使用することに代えて、Ｄｉｏ－ｌｏｘ反転戦略が使用される。Ｄｉｏ－ｌｏｘ部位間において、ＧＦＰの後にポリアデニル化部位＃１（ＰＡ１）が続き、致死遺伝子の後に逆方向の異なるポリアデニル化部位＃２（ＰＡ２）が続く。この場合、光活性化の前に、ｐＧＫプロモーターがＧＦＰの発現を駆動する。光活性化時に、Ｄｉｏ－ｌｏｘ部位間のカセットが反転し、致死遺伝子はここで発現する正方向にある一方、ＧＦＰはここで逆方向になり、もはや活性ではなくなる。

【図4C】ターゲティングベクターまたはＤＮＡ編集剤のさらに別の実施形態を示す。Ｃｒｅの活性化後に、ＬＳＬは除去され、Ｃａｓ９および単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を発現する。これは、必須遺伝子のコーディング領域（ｓｇＲＮＡによって標的化される）におけるミスセンス変異の導入に繋がり、ゆえに、胚の致死を誘導する。

【図5A】ＰＧＣ株誘導および特性評価。ＰＧＣの培養。

【図5B】ＰＧＣ株誘導および特性評価。左、異なる多能性マーカーおよび生殖細胞マーカーのｍＲＮＡ発現。右、雌ＰＧＣ（左、リボソームＳ１８およびＷ染色体の２つのＰＣＲ産物）および雄ＰＧＣ（右、リボソームＳ１８のみ）の性別識別の代表的な特性評価。

【図5C】ＰＧＣ株誘導および特性評価。抗ＳＳＥＡ１抗体で染色するＰＧＣ。

【図5D】ＰＧＣ株誘導および特性評価。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００試薬を使用したｐＣＡＧＧ－ＧＦＰプラスミドによるＰＧＣのトランスフェクション。

【図5E】ＰＧＣ株誘導および特性評価。エレクトロポレーションを使用したｐＣＡＧＧ－ＧＦＰプラスミドによるＰＧＣのトランスフェクション。

【図5F】ＰＧＣ株誘導および特性評価。胚の生殖腺（精巣）、ＧＦＰ発現培養ＰＧＣの移植から１０日後。

【図6A】ＣＲＩＳＰＲ媒介ターゲティングのためのｓｇＲＮＡ部位の設計。潜在的なＣＲＩＳＰＲターゲティング部位のＺ染色体上のゲノム領域の例を示す。

【図6B】ＣＲＩＳＰＲ媒介ターゲティングのためのｓｇＲＮＡ部位の設計。上位１２個のｓｇＲＮＡ配列を示す（ガイド＃１～＃１２）。反対方向に部分的に重複するガイド＃１および＃３を、さらなる実験のために選択した。３ヌクレオチドのＰＡＭ配列は、ガイド配列の一部ではなく、ＰＡＭ配列は、配列番号６６～７７に含まれていない。

【図6C】ＣＲＩＳＰＲ媒介ターゲティングのためのｓｇＲＮＡ部位の設計。ガイド＃１についての潜在的なオフターゲットの検索の上位１０個の結果を示す。配列番号７８～８７は、３ヌクレオチドのＰＡＭ配列を含んでいない。

【図7A】エンドヌクレアーゼアッセイを用いたＣＲＩＳＰＲ活性の検証。アニールされたＷＴ ３２０ｂｐ ＰＣＲ産物およびＣＲＩＳＰＲ１の予測切断部位での変異産物を示された比率で使用したエンドヌクレアーゼアッセイのポジティブコントロール。

【図7B】エンドヌクレアーゼアッセイを用いたＣＲＩＳＰＲ活性の検証。ＣＲＩＳＰＲ１プラスミドをトランスフェクションした１２個のコロニーに関するエンドヌクレアーゼアッセイ。

【図7C】エンドヌクレアーゼアッセイを用いたＣＲＩＳＰＲ活性の検証。ＣＲＩＳＰＲ３プラスミドをトランスフェクションした１２個のコロニーに関するエンドヌクレアーゼアッセイ。ＣＲＩＳＰＲ１およびＣＲＩＳＰＲ３の２つの予測される切断部位の間には１２ｂｐの距離がある。

【図8A】ＤＮＡ配列決定を使用したＣＲＩＳＰＲ活性の検証。ＣＲＩＳＰＲ１の予測される切断部位の野生型（ＷＴ）ゲノム領域のＤＮＡクロマトグラムは、ネガティブコントロールとしての正常な配列を示している。

【図8B】ＤＮＡ配列決定を使用したＣＲＩＳＰＲ活性の検証。ポジティブコントロールとして、予測される切断部位の後にダブルピークの出現（矢じり）を示すＷＴおよび人工変異ＰＣＲ産物の混合物の配列。

【図8C】ＤＮＡ配列決定を使用したＣＲＩＳＰＲ活性の検証。正常な配列を示す陰性コロニーの配列決定。

【図8D】ＤＮＡ配列決定を使用したＣＲＩＳＰＲ活性の検証。ＣＲＩＳＰＲ１切断部位に続くダブルピークの出現を示す陽性コロニーの配列（矢じり）。

【図9】（Ａ）～（Ｆ）よりなる、Ｚ染色体へのゲノム組み込みのためのターゲティングベクターの構築。（Ａ）ゲノムＤＮＡは、ＣＲＩＳＰＲサイトを含む領域に隣接する５'ＨＡおよび３'ＨＡ領域（破線で区切られている）にあるプライマーＰ１およびＰ２を使用したＰＣＲ反応のテンプレートとして使用された。（Ｂ）ＨＩＮＴ１Ｚ遺伝子座の下流に位置する約３ｋｂの産物をシャトルベクターｐＪｅｔ１．２に連結した。このプラスミドを、プライマーＰ３およびＰ４を用いたＰＣＲについてのテンプレートとして使用した。これらのプライマーは、ｐＣＡＧＧ－Ｎｅｏ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰ断片の同等の領域に対応する延出オーバーハング配列（波括弧で区画されている）を有する。（Ｃ）ギブソン反応時にｐＣＡＧＧ－Ｎｅｏ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰカセットの末端に結合する配列が隣接する、ＣＲＩＳＰＲ部位含有領域を除く２つの相同性アームを含む線状化された産物（ベクター）。（Ｄ）ｐＣＡＧＧ－Ｎｅｏ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰプラスミドを、プライマーＰ５およびＰ６を用いたＰＣＲ反応についてのテンプレートとして使用した。これらのプライマーは、相同性アームの端にある同等の領域に対応する延出オーバーハング配列（波括弧で区画されている）を含む。（Ｅ）相同性アームの末端に結合する配列に隣接する線状化された挿入カセット。ベクターおよびインサートをギブソンアセンブリ反応によってつなぎ合わせ、（Ｆ）に示す最終的なターゲティングベクタープラスミドを作成した。

【図10A】ターゲティングベクターおよびＣＲＩＳＰＲプラスミドのＰＧＣへのコトランスフェクション。ＣＲＩＳＰＲ１およびＨＲターゲティングベクタープラスミドを用いたＰＧＣへのリポフェクション媒介コトランスフェクション。

【図10B】ターゲティングベクターおよびＣＲＩＳＰＲプラスミドのＰＧＣへのコトランスフェクション。Ｇ－４１８選択の２週間後、耐性ＰＧＣの＞９９％がＧＦＰに対して陽性であった。

【図10C】ターゲティングベクターおよびＣＲＩＳＰＲプラスミドのＰＧＣへのコトランスフェクション。宿主胚への標的化ＰＧＣの注入の１０日後、多数の細胞が生殖腺（精巣）に局在していることがわかった。

【図10D】ターゲティングベクターおよびＣＲＩＳＰＲプラスミドのＰＧＣへのコトランスフェクション。生殖腺を解剖し、抗ＧＦＰ抗体で免疫染色し、共焦点顕微鏡（緑色のＧＦＰ抗体染色、青色の４'、６ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で対比染色した核）を使用してスキャンした。

【図11A】ＦＡＣＳ選別ＰＧＣにおけるＨＲ組み込みの検証。Ｇ－４１８耐性ＰＧＣのＦＡＣＳ選別。ＦＡＣＳゲーティングは、９６ウェルプレートでプールまたは個々の細胞として選別された特異（ｓｉｎ）ＧＦＰ陽性細胞を選別するように設計された。

【図11B】ＦＡＣＳ選別ＰＧＣにおけるＨＲ組み込みの検証。ＰＣＲ分析に対して、５'組み込み部位（Ｐ７およびＰ８）および３'組み込み部位（Ｐ９およびＰ１０）についての２セットのプライマーを設計した。

【図11C】ＦＡＣＳ選別ＰＧＣにおけるＨＲ組み込みの検証。プールした細胞から抽出したゲノムＤＮＡを、ＰＣＲおよびネガティブコントロールとして機能するＷＴ ＤＮＡのためのテンプレートとして使用した。予測された１．６ｋｂおよび１．８ｋｂのバンドは、それぞれ５'および３'領域での適切なＨＲ組み込みについて明らかであった。

【図11D】ＦＡＣＳ選別ＰＧＣにおけるＨＲ組み込みの検証。単一細胞ＦＡＣＳ選別ＰＧＣに由来する雄および雌細胞コロニーから抽出されたゲノムＤＮＡを、ＰＣＲおよびネガティブコントロールとして機能するＷＴ ＤＮＡのためのテンプレートとして使用した。予測された１．６ｋｂおよび１．８ｋｂのバンドは、それぞれ５'および３'領域での適切なＨＲ組み込みについて明らかであった。

【図12A】ＨＲ組み込みのサザンブロット解析。ＷＴ対立遺伝子、およびＨＲ組み込みを受けた対立遺伝子についてのサザンブロット解析において予想されるＢｇｌＩＩ切断産物の模式図。５'、３'組み込み部位およびｎｅｏに使用されるプローブは、短いバーとしてマークされている。各ＤＮＡプローブについてＢｇｌＩＩ消化後の予測される産物サイズを示す。

【図12B】ＨＲ組み込みのサザンブロット解析。ＰＣＲによるＤｉｇ標識されたプローブの調製。標識プローブ（＋）または未標識（－）をアガロースゲルで解析した。ｄｉｇ標識された産物は実際のサイズよりも高くシフトされて、ｄｉｇ標識されたヌクレオチドの組み込みが確認された。プローブを増幅するために使用されたプライマーのセットが示されている。

【図12C】ＨＲ組み込みのサザンブロット解析。雄由来ＰＧＣのプールされ純粋なコロニーから抽出されたＤＮＡの５'および３'プローブを用いたサザンブロット解析。ネガティブコントロールとして機能するＨＲの前の元の株から抽出されたＷＴ ＤＮＡ。

【図12D】ＨＲ組み込みのサザンブロット解析。雌由来ＰＧＣ上で５'およびＮｅｏプローブを用いたサザンブロット解析。両方の場合に単一の７．５ｋｂバンドが明らかであり、適切なＨＲが発生し、ターゲティングベクターの単一コピーのみが組み込まれたことが示された。

【図13】ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＨＥＫ２９３細胞の光遺伝学的システムの検証。ｐｍＣｈｅｒｒｙ－Ｃｒｙ２－ＣｒｅＮ、ｐｍＣｈｅｒｒｙ－ＣＩＢＮ－Ｃｒｅ－ＣおよびＰＢ－ＲＡＧＥ－ＧＦＰプラスミドを用いたトリプルトランスフェクション。トランスフェクションの２４時間後、コントロール細胞を暗所に保ちながら（上段）、実験群における細胞を１５秒間の青色光照明にさらした。照明後（下段）、細胞をさらに２４時間インキュベートした。これらの細胞では、ＧＦＰ発現が明らかであり、青色光照明時のＣｒｅ酵素の活性化が確認された。

【図14】エレクトロポレーション前に５４～６０時間インキュベートされた、ヒヨコ胚におけるｉｎ－ｏｖｏでの光遺伝学的システムの検証。ｐｍＣｈｅｒｒｙ－Ｃｒｙ２－ＣｒｅＮ、ｐｍＣｈｅｒｒｙ－ＣＩＢＮ－ＣｒｅＣおよびＰＢ－ＲＡＧＥ－ＧＦＰプラスミドを用いたニワトリ胚へのトリプルエレクトロポレーション。エレクトロポレーションの１２時間後、コントロール胚を暗所に保ちながら（上段）、実験群の胚を１５秒間ｉｎ－ｏｖｏで青色光照明にさらした。照明後（下段）、両方の群由来の胚をさらに１２時間インキュベートした。インキュベーション後、ＧＦＰ発現細胞は照明群で明確に現れ、したがって、ｉｎ－ｏｖｏでのニワトリ胚における青色光照明時に光遺伝学的システムおよびＣｒｅ酵素の活性化が確認された。

【図15A】ＣＡＧＧプロモーターの下での単一の光遺伝子発現ベクターの構築。光遺伝子プラスミドｐｍＣｈｅｒｒｙ－ＣＩＢＮ－ＣｒｅＣおよびｐｍＣｈｅｒｒｙ－Ｃｒｙ２－ＣｒｅＮをテンプレートとして使用して、それぞれＰ４０～Ｐ４１およびＰ４２～Ｐ４３プライマーを使用して光遺伝子融合タンパク質を増幅した。

【図15B】ＣＡＧＧプロモーターの下での単一の光遺伝子発現ベクターの構築。２つの産物は、プライマーＰ４１およびＰ４２において導入されたＰ２Ａ部位で重複配列を共有する。

【図15C】ＣＡＧＧプロモーターの下での単一の光遺伝子発現ベクターの構築。１サイクルのオーバーハング延出ＰＣＲが可能になり、２つの断片（図１５Ｂ参照）を一つのピースに結合させて、ｐＪｅｔ１．２シャトルベクターに連結することができた。

【図15D】ＣＡＧＧプロモーターの下での単一の光遺伝子発現ベクターの構築。それぞれＳｍａＩおよびＮｈｅＩ制限部位を有するテールを含むプライマーＰ４４およびＰ４５を使用して、産物が生成された。

【図15E】ＣＡＧＧプロモーターの下での単一の光遺伝子発現ベクターの構築。図１５Ｄに示す産物を、適切な制限酵素を使用して消化し、同じ酵素で消化したｐＣＡＧＧ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰに連結した。

【図15F】ＣＡＧＧプロモーターの下での単一の光遺伝子発現ベクターの構築。得られたベクターを示す。

【図16】ＨＥＫ２９３細胞におけるｐＣＡＧＧ－Ｏｐｔｏｇｅｎｅプラスミドの活性の検証。ｐＣＡＧＧ－ＯｐｔｏｇｅｎｅおよびｐＢ－ＲＡＧＥ－ｍＣｈｅｒｒｙプラスミドを用いたコトランスフェクション。トランスフェクションの２４時間後、ネガティブコントロール群を暗所に保ちながら（上段）、実験群の細胞を１５秒間青色光照明にさらした（下段）。照明後（下段）、細胞をさらに２４時間インキュベートした。これらの細胞では、ｍＣｈｅｒｒｙの発現が明白であり（白色の矢印）、青色光照明時にｐＣＡＧＧ－ＯｐｔｏｇｅｎｅプラスミドによるＣｒｅ酵素の活性化が確認された。

【図17】ｉｎ－ｏｖｏでのｐＣＡＧＧ－Ｏｐｔｏｇｅｎｅプラスミドを使用した単一ベクター戦略の検証。ステージ１４～１６Ｈ＆Ｈでのニワトリ胚を、ｐＣＡＧＧ－ＯｐｔｏｇｅｎｅおよびｐＢ－ＲＡＧＥ－ｍＣｈｅｒｒｙプラスミドを用いてコエレクトロポレーションした。後者のプラスミドは、光遺伝学的システムの活性のためのレポーター遺伝子として機能する。エレクトロポレーションの１２時間後、コントロール胚を暗所に保ったまま（上段）、実験群の胚（下段）をｉｎ－ｏｖｏで青色光照明に１５秒間さらした。胚をさらに１２時間インキュベートした。インキュベーション後、ＧＦＰ発現細胞は両方の群で明らかであり、成功裏のエレクトロポレーションが示されたが、照明群のみにおいてはｍＣｈｅｒｒｙ発現細胞が明らかであり、ｉｎ－ｏｖｏでのニワトリ胚における青色光照明時に光遺伝学的システムおよびＣｒｅ酵素の活性化が確認された。

【図18】ｐＧＫプロモーターの下でのＤＴＡの発現は、ｉｎ－ｏｖｏでのタンパク質合成を阻害する。ステージ１４～１６Ｈ＆Ｈ胚を、ｐＧＫ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰ（上段）またはｐＧＫ－ＤＴＡ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰ（下段）発現ベクターのどちらかを用いてエレクトロポレーションした。ネガティブコントロールの胚は、通常のタンパク質合成を示すＧＦＰ（上段、矢印）を広く発現する。ＤＴＡ発現細胞はＧＦＰ発現を示さず（下段）、これらの胚でのタンパク質合成が阻害されることを示している。ＧＦＰのみ、明視野のみ、および明視野に重ねられたＧＦＰの画像を表示している。

【図19A】ターゲティングベクターの実施形態。これらのベクターでは、活性化酵素（Ｃｒｅなど）は致死遺伝子カセットから分離されている。活性化酵素を母雌鶏のゲノムに挿入し、不活性致死カセットを雄鶏のＺ染色体に挿入し、ここで、Ｚ染色体はこの対立遺伝子のホモ接合体である。この場合、雄胚における致死性の活性化は、光誘導を必要とせずに２つのトランスジェニック親を交配することにより行われる。すべての雄におけるＣｒｅは、母体Ｚ染色体におけるＬＳＬを除去し、これにより致死遺伝子を発現させることを可能にするが、雌胚は不活性な致死カセットを保持し、したがって、影響を受けない。

【図19B】ターゲティングベクターの実施形態。これらのベクターでは、活性化酵素（Ｃｒｅなど）は致死遺伝子カセットから分離されている。母雌鶏のＺ染色体は、正しい方向のＦＬＰリコンビナーゼを、それに続いてＣＡＧＧプロモーターによって駆動される逆方向の致死遺伝子を含むＤｉｏ－Ｌｏｘフリッピングカセットにより標的化される。雄鶏、再度の、ＦＲＴ部位が隣接するＣＡＧＧ－Ｃｒｅカセットにより標的化されるＺ染色体のホモ接合体。２つの交配時に、雄胚は父のＺ染色体上に位置するＣｒｅを発現し、Ｄｉｏ－Ｌｏｘカセットは反転し、致死遺伝子は活性になり、これによって雄胚の胚致死に繋がる。この交配による雌胚の接合体には、卵形成中に産生されたＦＬＰリコンビナーゼ酵素の母体の寄与が含まれている。この母体タンパク質は、Ｚ染色体からＣＡＧＧ－Ｃｒｅカセットを除去し、Ｚ染色体上にＦＲＴの「瘢痕」のみにより雌胚を生きた状態にしておく。

【図20】ＨＩＮＴ１ＺおよびポジティブコントロールとしてＧＡＰＤＨのプライマー（ＧＡＰＤＨプライマー：順方向－（配列番号９０）、逆方向－（配列番号９１）、９３ｂｐ）を用いた、産卵されたばかりの全胚盤葉（Ｂｌ）およびＰＧＣからの全ＲＮＡ抽出物からのｃＤＮＡのＲＴ－ＰＣＲ。１５３ｂｐの予測サイズのバンドは、両方のサンプルで、Ｚ染色体上にあるＨＩＮＴ１Ｚが転写されていることを示している。

【図21】改変された光遺伝学的システムを含む２つのプラスミド（ｐＣＡＧＧ－ＣＩＢＮ－Ｃｒｅ－Ｃ－Ｐ２Ａ－Ｃｒｙ２－Ｃｒｅ－ＮおよびｐＣＡＧＧ－Ｃｒｙ２－Ｃｒｅ－Ｎ－Ｐ２Ａ－ＣＩＢＮ－Ｃｒｅ－Ｃ）の模式図。

【図22】培養ＨＥＫ２９３細胞における光遺伝学的システムの検証。光遺伝学的プラスミドｐＣＡＧＧ－ＣＩＢＮ－ＣｒｅＣ－ＩＲＥＳ－Ｃｒｙ２－ＣｒｅＮ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰをｐＢ－ＲＡＧＥ－ｍＣｈｅｒｒｙでコトランスフェクトした。上記のＰＢ－ＲＡＧＥ－ＧＦＰベクターと同様に、ｐＢ－ＲＡＧＥ－ｍＣｈｅｒｒｙは、ｍＣｈｅｒｒｙコーディング領域の上流のＬｏｘＰ部位に隣接する複数の停止コドン配列を含む。Ｃｒｅ活性化時に、停止コドンが除去され、したがって、ｍＣｈｅｒｒｙを発現させることが可能になる。コトランスフェクションを行い、暗所に保ったＨＥＫ２９３細胞においては、ｍＣｈｅｒｒｙ陽性細胞が存在しない一方、青色光照明にさらされたコトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞においては、多くの細胞が、ｍＣｈｅｒｒｙを発現し、ｐＣＡＧＧ－Ｏｐｔｏｇｅｎｅの単一ベクター戦略がシステムの光遺伝学的特性を保持していることが確認された。

【図23】ニワトリ胚におけるエレクトロポレーションによる光遺伝学的システムの検証。ＧＦＰもコードするｐＣＡＧＧ－ＣＩＢＮ－ＩＲＥＳ－Ｃｒｙ２は、活性Ｃｒｅリコンビナーゼの存在下で赤色蛍光を発するＰＢ－ＲＡＧＥ－ｍＣｈｅｒｒｙとともにエレクトロポレーションされた。青色光で誘導されると、Ｃｒｙ２－ＣｒｅＮおよびＣＩＢＮ－ＣｒｅＣは二量体化し、したがって、Ｃｒｅ活性を可能にする。白い円は、重複する蛍光の領域を示す。

【図24A】ＤＴＡを用いたＰＧＣにおける細胞死の誘導。ＰＧＣの細胞死に対するＤＴＡの効果を示す。ＰＧＣにコントロール１ ＰＧＫ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰ、コントロール２ ｐＣＡＧＧ－ＧＦＰ、またはＰＧＫ－ＤＴＡ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰおよびｐＣＡＧＧ－ＧＦＰのプラスミドをトランスフェクトし、２４、４８、７２時間インキュベートした。細胞死は、ＧＦＰおよびＰＩについてフローサイトメトリーを使用して評価した。結果は、ＧＦＰ＋ＰＩ細胞とＧＦＰのみの細胞との間の比率を示している。

【図24B】カスパーゼ３を用いたＰＧＣにおける細胞死の誘導。ＰＧＣの細胞死に対するＣａｓｐの効果を示す。ＰＧＣは、コントロールＰＧＫ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰ、ＰＧＫ－ＷＴカスパーゼ３－ＩＲＥＳ－ＧＦＰまたはＰＧＫ－ＣＡカスパーゼ３－ＩＲＥＳ－ＧＦＰのプラスミドをトランスフェクトし、図２４Ａに示されるように分析の前に２４、４８、および７２時間インキュベートした。

【図25】すべての要素および青色光照明による致死誘導カセットの活性化が含むターゲティングベクターの模式図。

【図26A】実施例３において説明される「セーフロック」機構を含むターゲティングベクターの模式図。

【図26B】実施例３において説明される「セーフロック」機構を含むターゲティングベクターの模式図。

【図27A】培養ＨＥＫ２９３細胞におけるターゲティングベクターの検証。ｉｎ－ｖｉｔｒｏ検証のために、ＨＥＫ２９３細胞をＴＶ４のみでトランスフェクトした。

【図27B】培養ＨＥＫ２９３細胞におけるターゲティングベクターの検証。ｉｎ－ｖｉｔｒｏ検証のために、ＨＥＫ２９３細胞をｐＣＡＧＧ－Ｃｒｅでトランスフェクトした。

【図27C】培養ＨＥＫ２９３細胞におけるターゲティングベクターの検証。ｉｎ－ｖｉｔｒｏ検証のために、ＨＥＫ２９３細胞をｐＣＡＧＧ－ＦｌｐＯプラスミドでトランスフェクトした。細胞を暗所に保った。

【図27D】培養ＨＥＫ２９３細胞におけるターゲティングベクターの検証。ｉｎ－ｖｉｔｒｏ検証のために、ＨＥＫ２９３細胞をｐＣＡＧＧ－ＦｌｐＯプラスミドでトランスフェクトした。細胞をトランスフェクションの２４時間後に青色光に１５秒間さらした。照明後、細胞をさらに２４時間インキュベートした。

【図28A】ニワトリ胚におけるエレクトロポレーションによるターゲティングベクターの検証。ニワトリ胚は、プラスミドを神経管に注入され、本明細書に記載されているようにエレクトロポレーションされた。白い線は、配向の目的で、神経管および肢芽の背側正中線を示している。４つの処理群がテストされ、図２８Ａは、ＴＶ４のみの発現を示す。

【図28B】ニワトリ胚におけるエレクトロポレーションによるターゲティングベクターの検証。ニワトリ胚は、プラスミドを神経管に注入され、本明細書に記載されているようにエレクトロポレーションされた。白い線は、配向の目的で、神経管および肢芽の背側正中線を示している。４つの処理群がテストされ、図２８Ｂは、ポジティブコントロールとしてＴＶ４およびｐＣＡＧＧ－Ｃｒｅのプラスミドのコエレクトロポレーションを示す。

【図28C】ニワトリ胚におけるエレクトロポレーションによるターゲティングベクターの検証。ニワトリ胚は、プラスミドを神経管に注入され、本明細書に記載されているようにエレクトロポレーションされた。白い線は、配向の目的で、神経管および肢芽の背側正中線を示している。４つの処理群がテストされ、図２８Ｃは、ＴＶ４およびｐＣＡＧＧ－ＦｌｐＯのプラスミドのコエレクトロポレーションを示す。細胞は暗所に保たれた。

【図28D】ニワトリ胚におけるエレクトロポレーションによるターゲティングベクターの検証。ニワトリ胚は、プラスミドを神経管に注入され、本明細書に記載されているようにエレクトロポレーションされた。白い線は、配向の目的で、神経管および肢芽の背側正中線を示している。４つの処理群がテストされ、図２８Ｄは、ＴＶ４およびｐＣＡＧＧ－ＦｌｐＯのプラスミドのコエレクトロポレーション後１５秒間青色光にさらし、さらに１２時間インキュベートした。

【図29A】致死誘導遺伝子Ｎｏｇｇｉｎの光依存活性。ヒヨコ胚は、ターゲティングベクターＴＶ１、ｐＣＡＧＧ－ＦｌｐＯおよびｐＣＡＧＧ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰのプラスミドを神経管にエレクトロポレーションされた。ターゲティングベクターＴＶ１は、致死誘導要素としてＮｏｇｇｉｎのコード配列を含む。光誘導なしの結果；上段、背面図；下段、右側面図を示す。

【図29B】致死誘導遺伝子Ｎｏｇｇｉｎの光依存活性。ヒヨコ胚は、ターゲティングベクターＴＶ１、ｐＣＡＧＧ－ＦｌｐＯおよびｐＣＡＧＧ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰのプラスミドを神経管にエレクトロポレーションされた。ターゲティングベクターＴＶ１は、致死誘導要素としてＮｏｇｇｉｎのコード配列を含む。青色光誘導での結果を示す。

【図30A】Ｎｏｇｇｉｎは胚盤葉胚の段階で胚発育を止めることができる。胚盤葉は、Ｎｏｇｇｉｎの外因性源で処理された。プラスミドｐＣＡＧＧ－Ｎｏｇｇｉｎ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰまたはｐＣＡＧＧ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰ（ネガティブコントロールとして）をＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞から抽出された総タンパク質を、抗Ｎｏｇｇｉｎ抗体および抗α－チューブリン－ＨＲＰ抗体を用いたウエスタンブロットによって分析したことを示している。

【図30B】Ｎｏｇｇｉｎは胚盤葉胚の段階で胚発育を止めることができる。胚盤葉は、Ｎｏｇｇｉｎの外因性源で処理された。プラスミドｐＣＡＧＧ－Ｎｏｇｇｉｎ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰまたはｐＣＡＧＧ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰ（ネガティブコントロールとして）をＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。コントロールおよびＮｏｇｇｉｎ発現細胞からの馴化培地を、産卵されたばかりの受精卵に注入し、その後、２４時間インキュベートした。

【図30C】Ｎｏｇｇｉｎは胚盤葉胚の段階で胚発育を止めることができる。胚盤葉は、Ｎｏｇｇｉｎの外因性源で処理された。プラスミドｐＣＡＧＧ－Ｎｏｇｇｉｎ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰまたはｐＣＡＧＧ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰ（ネガティブコントロールとして）をＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。コントロールおよびＮｏｇｇｉｎ発現細胞からの馴化培地を、産卵されたばかりの受精卵に注入し、その後、２４時間インキュベートした。

【図30D】Ｎｏｇｇｉｎは胚盤葉胚の段階で胚発育を止めることができる。胚盤葉は、Ｎｏｇｇｉｎの外因性源で処理された。プラスミドｐＣＡＧＧ－Ｎｏｇｇｉｎ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰまたはｐＣＡＧＧ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰ（ネガティブコントロールとして）をＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。コントロールおよびＮｏｇｇｉｎ発現細胞からの馴化培地を、産卵されたばかりの受精卵に注入し、その後、５４時間インキュベートした。

【図30E】Ｎｏｇｇｉｎは胚盤葉胚の段階で胚発育を止めることができる。胚盤葉は、Ｎｏｇｇｉｎの外因性源で処理された。プラスミドｐＣＡＧＧ－Ｎｏｇｇｉｎ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰまたはｐＣＡＧＧ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰ（ネガティブコントロールとして）をＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。コントロールおよびＮｏｇｇｉｎ発現細胞からの馴化培地を、産卵されたばかりの受精卵に注入し、その後、５４時間インキュベートした。

【図31A】ＴＶ１でＺ染色体上にＨＲを受けたＰＧＣは、ヒヨコ胚における生殖腺にコロニー形成することに成功した。図３１Ａは、ＴＶ１でＨＲを受け、ＧＦＰを発現した純粋な雌ＰＧＣ株を示す。

【図31B】ＴＶ１でＺ染色体上にＨＲを受けたＰＧＣは、ヒヨコ胚における生殖腺にコロニー形成することに成功した。図３１Ｂは、ＰＧＣ注入の５日後の胚の腹側の図を示す。ＰＧＣは、生殖腺の肛門である生殖隆起にコロニー形成した（図３１Ｂ、矢じり）。雌のヒヨコを、卵巣を分析するために孵化後１０日目に犠死させた。

【図31C】ＴＶ１でＺ染色体上にＨＲを受けたＰＧＣは、ヒヨコ胚における生殖腺にコロニー形成することに成功した。図３１Ｃは、多数のＧＦＰ陽性ＰＧＣを含む卵巣（線で示されている）を示す。

【0026】

実例を単純かつ明確にするために、図に示される要素は、必ずしも縮尺どおりに描かれていないことが理解されるであろう。例えば、いくつかの要素の寸法は、明確にするために他の要素に比較して誇張され得る。さらに、適切であると考えられる場合、対応する要素または類似の要素を示すために、参照番号が図の間で繰り返され得る。

【発明を実施するための形態】

【0027】

以下の詳細な説明において、本明細書で提供される組成物および方法の完全な理解を提供するために、多くの具体的な詳細が記載される。しかしながら、本開示がこれらの特定の詳細なしで実行され得ることが、当業者によって理解されるであろう。他の事例において、本明細書で提供される組成物および方法を不明瞭にしないように、周知の方法、手順、および構成要素は、詳細に説明されていない。

【0028】

本開示の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本開示は、その適用において、以下の説明に記載されるかまたは実施例によって例示されている詳細に必ずしも限定されるものではないことが理解されるべきである。本開示は、他の実施形態を包含するか、または様々な方法で実施または実行し得る。

【0029】

「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語およびそれらの同根語は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）が限定されない」ことを包含する。

【0030】

本明細書で使用される単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈からそうでないことが明確に示されない限り、複数の言及を含む。例えば、用語「化合物」または「少なくとも１つの化合物」は、その混合物を含む複数の化合物を含んでもよい。

【0031】

いくつかの実施形態では、「約」という用語は、示される数または数の範囲から、０．０００１～５％の偏差を指す。いくつかの実施形態では、「約」という用語は、示される数または数の範囲から、１～１０％の偏差を指す。いくつかの実施形態では、「約」という用語は、示される数または数の範囲から、最大２５％の偏差を指す。いくつかの実施形態において、「約」という用語は±１０％を指す。

【0032】

本出願にわたって、様々な実施形態は、範囲形式で提示され得る。範囲形式での記載は単に便宜上および簡潔にするためのものであり、ある実施形態の範囲に対する柔軟性のない制限として解釈されるべきではないことが理解される必要がある。したがって、範囲の記載は、すべての可能な部分範囲およびその範囲内の個々の数値を具体的に開示しているとみなされるべきである。例えば、１～６などの範囲の記載は、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６などの部分範囲、および、その範囲内の個々の数字、例えば、１、２、３、４、５および６を具体的に開示しているとみなされるべきである。これは、範囲の広さにかかわりなく適用される。

【0033】

本明細書で数値範囲が示される際は常に、示された範囲内に任意の引用された数字（分数または整数）を含むことが意味される。第１に示された数字と第２に示された数字との「間の範囲」は、および第１に示された数字「から」第２に示された数字「までの範囲」の表現は、本明細書では交換可能に使用され、第１の示された数字および第２に示された数字ならびにそれらの間の小数および整数のすべてを含むことを意味する。

【0034】

一実施形態において、本明細書で提供される技術、製品および方法は、雌産卵鶏のみが孵化し、雄胚は受精後すぐに発育を停止するニワトリの品種を生成する。したがって、雄のヒヨコを処分する必要性がなくなり、また、孵化場において貴重なインキュベーションスペースの５０％が節約される。重要なことに、本明細書に開示する方法から得られた雌および卵の両方は、あらゆる面で、現在一般に消費されている産卵鶏雌鶏および食用卵と同一である。

【0035】

本明細書で使用される場合、「鳥」または「鳥類種」という用語は、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、キジ、およびダチョウを含むが、これらに限定されない、あらゆる鳥類を指す。特定の実施形態において、鳥は、家禽である。特定の実施形態において、鳥は、Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓである。特定の実施形態において、鳥は、家畜化Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓである。特定の実施形態において、鳥は、Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓである。

【0036】

特定の実施形態において、鳥は、雌である。特定の実施形態において、鳥は、雄である。特定の実施形態において、鳥は、ブロイラーである。特定の実施形態において、鳥は、雌鶏である。特定の実施形態において、鳥は、産卵鶏雌鶏である。特定の実施形態において、鳥は、家禽である。特定の実施形態において、鳥は、Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓの家畜化産卵鶏雌鶏である。

【0037】

本明細書で使用される場合、「卵」という用語は、生存可能なまたは生きている胚性鳥を含む鳥類の卵を指す。一実施形態において、「卵」という用語は、受精した鳥類の卵を指すことを意図している。一実施形態において、卵は、受精した鳥類の卵を、正常な胚形成を受けることができる鳥類の胚を含む卵である。

【0038】

ゲノム編集

【0039】

操作されたエンドヌクレアーゼを使用するゲノム編集は、ヌクレアーゼを使用して、ゲノムにおける望ましい場所（例えば、鳥のＺ染色体上）で特異的二本鎖切断を切断および生成し、それらは、次いで、相同組換え修復（ＨＤＲ）および非相同末端結合（ＮＨＥＪ）などの細胞内因性プロセスによって修復される遺伝的手法を指す。ＮＨＥＪは、二本鎖切断でＤＮＡ端を直接連結する一方、ＨＤＲは、切断点で欠損ＤＮＡ配列を再生するためのテンプレートとして相同配列を利用する。特異的ヌクレオチド修飾をゲノムＤＮＡに導入するために、望ましい配列を含むＤＮＡ修復テンプレートは、ＨＤＲ時に存在する必要がある。ほとんどの制限酵素はＤＮＡ上の少ない塩基対のみをそれらの標的として認識し、認識された塩基対の組み合わせがゲノム全体の多くの場所で見られ、望ましい場所に限定されない複数の切断をもたらすであろう可能性が非常に高いため、従来の制限エンドヌクレアーゼを使用してゲノム編集を実行することはできない。この課題を克服し、部位特異的な一本鎖または二本鎖切断を生成するために、現在までいくつかの別個のクラスのヌクレアーゼが発見され、バイオエンジニアリングされてきた。これらは、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを含む。

【0040】

メガヌクレアーゼ－それらは一般に、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリー、ＧＩＹ－ＹＩＧファミリー、Ｈｉｓ－ＣｙｓボックスファミリーおよびＨＮＨファミリーの４つのファミリーに分類される。これらのファミリーは、触媒活性および認識配列に影響を与える構造モチーフによって特徴付けられる。例えば、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリーのメンバーは、保存されたＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフのコピーを１つまたは２つを有することによって特徴付けられる。メガヌクレアーゼの４つのファミリーは、保存されている構造要素、ひいてはＤＮＡ認識配列の特異性および触媒活性に関して互いに大きく分離されている。メガヌクレアーゼは一般に微生物種に見られ、かなり長い認識配列（＞１４ｂｐ）を有するというユニークな特性を有し、したがって、望ましい場所での切断のためにそれらを自然にかなり特異的にする。これを利用して、ゲノム編集で部位特異的二本鎖切断を行うことができる。当業者はこれらの天然に存在するメガヌクレアーゼを使用することができるが、そのような天然に存在するメガヌクレアーゼの数は限られている。この課題を克服するために、変異誘発法およびハイスループットスクリーニング法を使用して、ユニークな配列を認識するメガヌクレアーゼ変異体を生成した。例えば、様々なメガヌクレアーゼが融合されて、新しい配列を認識するハイブリッド酵素が作成される。また、メガヌクレアーゼのアミノ酸と相互作用するＤＮＡは、配列特異的メガヌクレアーゼを設計するために変更され得る（例えば、米国特許第８，０２１，８６７号）。メガヌクレアーゼは、例えば、Ｃｅｒｔｏ，ＭＴ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ（２０１２）９：０７３－９７５、米国特許第８，３０４，２２２号、同第８，０２１，８６７号、同第８，１１９，３８１号、同第８，１２４，３６９号、同第８，１２９，１３４号、同第８，１３３，６９７号、同第８，１４３，０１５号、同第８，１４３，０１６号、同第８，１４８，０９８号、または同第８，１６３，５１４号に記載されている方法を使用して設計し得る。

【0041】

ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮ－２つの別個の操作されたヌクレアーゼのクラス、すなわち、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）は両方とも、標的化二本鎖切断の生成に効果的であることが証明されている。基本的に、ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮ制限エンドヌクレアーゼ技術は、特異的ＤＮＡ結合ドメイン（それぞれ一連のジンクフィンガードメインまたはＴＡＬＥ反復配列）に連結された非特異的ＤＮＡ切断酵素を利用する。典型的には、ＤＮＡ認識部位および切断部位が互いに分離されている制限酵素が選択される。切断部分は分離され、次にＤＮＡ結合ドメインに連結され、それにより、望ましい配列に対してかなり高い特異性を有するエンドヌクレアーゼを得る。そのような特性を有する例示的な制限酵素はＦｏｋｌである。さらに、Ｆｏｋｌは、ヌクレアーゼ活性を持たせるために二量体化が必要であるという利点があり、これは、各ヌクレアーゼパートナーがユニークなＤＮＡ配列を認識するために特異性が飛躍的に増加することを意味する。この効果を高めるために、ヘテロ二量体としてのみ機能し、かつ触媒活性が高くなったＦｏｋｌヌクレアーゼが操作された。ヘテロダイマー機能性ヌクレアーゼは、望ましくないホモダイマー活性の可能性を回避し、したがって、二本鎖切断の特異性を高める。

【0042】

したがって、例えば、ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮは、対の各メンバーは標的化部位で隣接配列を結合するように設計されているヌクレアーゼ対として構築され得る。細胞における一過性発現時に、ヌクレアーゼはそれらの標的部位に結合し、ＦｏｋＩドメインヘテロ二量体化して二本鎖切断を生成する。非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路を介したこれらの二本鎖切断の修復は、ほとんどの場合、小さい欠失または小さい配列挿入であるインデルをもたらす。ＮＨＥＪによって行われる各修復は一意であるため、単一のヌクレアーゼの対を使用すると、標的部位において異なる欠失の範囲を有する対立遺伝子のシリーズが生成される。欠失は、典型的には、長さが数塩基対～数百塩基対の範囲であるが、２対のヌクレアーゼを同時に使用することによって細胞培養においてより大きい欠失を成功裏に生成した（例えばＣａｒｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．；１０９（４３）：１７３８２－７、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．；２８（９）：４４５－６参照）。さらに、標的化領域に対する相同性を有するＤＮＡの断片がヌクレアーゼ対と組み合わせて導入されるとき、二本鎖切断が相同組換え修復を介して修復されて、特定の修飾が生成され得る（例えば、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３９（１）：３５９－７２、Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１７（９）：１１４４－５１、Ｕｒｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｎａｔｕｒｅ ４３５（７０４２）：６４６－５１参照）。

【0043】

ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮの両方のヌクレアーゼ部分は類似した特性を有するが、これらの操作されたヌクレアーゼの違いは、それらのＤＮＡ認識ペプチドにある。ＺＦＮは、Ｃｙｓ２－Ｈｉｓ２ジンクフィンガーおよびＴＡＬＥ上のＴＡＬＥＮに依存する。ペプチドドメインを認識するこれらのＤＮＡの両方は、それらがタンパク質の組み合わせにおいて自然に見られるという特徴を有する。Ｃｙｓ２－Ｈｉｓ２ジンクフィンガーは、通常、３ｂｐ離れた反復配列において見られ、タンパク質と相互作用する様々な核酸の種々の組み合わせにおいて見られる。一方、ＴＡＬＥは、アミノ酸と認識されたヌクレオチド対との間に１対１の認識率を有する反復配列において見られる。ジンクフィンガーおよびＴＡＬＥの両方は反復パターンで発生するため、様々な組み合わせを試して、様々な配列特異性を生成することができる。部位特異的ジンクフィンガーエンドヌクレアーゼを作成するためのアプローチとして、例えば、特に、モジュラーアセンブリ（トリプレット配列と相関するジンクフィンガーが必要な配列をカバーするために一列に取り付けられる）、ＯＰＥＮ（ペプチドドメイン対トリプレットヌクレオチドの低ストリンジェンシー選択、続いてペプチドの組み合わせ対細菌システムの最終標的の高ストリンジェンシー選択）、およびジンクフィンガーライブラリーの細菌ワンハイブリッドスクリーニングが挙げられる。

【0044】

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム－多くの細菌および古細菌は、侵入するファージおよびプラスミドの核酸を分解することができる内因性ＲＮＡベースの適応免疫システムを含んでいる。これらのシステムは、ＲＮＡ成分を産生するクラスター化されて規則的に間隔を空けて配置された短い回文配列の反復（ＣＲＩＳＰＲ）遺伝子、およびタンパク質成分をコードするＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子からなる。ＣＲＩＳＰＲ（ｃｒＲＮＡ）は、特定のウイルスおよびプラスミドに対する相同性の短区間を含み、Ｃａｓヌクレアーゼに対応する病原体の相補的核酸を分解させるためのガイドとして機能する。化膿レンサ球菌のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの研究は、３つの成分がＲＮＡ／タンパク質複合体を形成し、ともに、配列特異的ヌクレアーゼ活性、すなわち、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、標的配列に対する相同性の２０塩基対を含むｃｒＲＮＡ、およびトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）（Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１２）３３７：８１６－８２１）のために十分であることを示した。ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡの融合からなる合成キメラガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）が、ｉｎ ｖｉｔｒｏでｃｒＲＮＡに対して相補的であるＤＮＡ標的を切断するようにＣａｓ９に指示できることが、さらに示された。また、合成ｇＲＮＡと組み合わせたＣａｓ９の一過性発現を使用して、様々な異なる種において標的化二本鎖ブレーキを生成できることも示された（例えば、Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１（３）：２３０－２、Ｃｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９（６１２１）：８１９－２３、ＤｉＣａｒｌｏ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４１（７）：４３３６－４３、Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１（３）：２２７－９、Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｅｌｉｆｅ．２０１３ Ｊａｎ ２９；２：ｅ００４７１、Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．１０（１０）：９５７－６３）。

【0045】

ゲノム編集用のＣＲＩＰＳＲ／Ｃａｓシステムは、２つの異なる成分、すなわち、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）およびエンドヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９を含むことが既知である。ｇＲＮＡは、典型的には、単一キメラ転写物においてＣａｓ９ヌクレアーゼ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）にｃｒＲＮＡを連結する標的相同配列（ｃｒＲＮＡ）および内因性細菌ＲＮＡの組み合わせをコードする２０ヌクレオチド配列である。ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体は、ｇＲＮＡ配列と相補的ゲノムＤＮＡとの間の塩基対によって標的配列に対して補充される。Ｃａｓ９の結合を成功させるためには、ゲノム標的配列はまた、標的配列の直後に適切なプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列も含まれる必要がある。ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体の結合は、Ｃａｓ９が二本鎖切断を引き起こすＤＮＡの両方の鎖を切断することができるように、ゲノム標的配列に対してＣａｓ９を局在化する。ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮと同様に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓによって生成される二本鎖切断は、相同組換えまたはＮＨＥＪを受けることができる。特定の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）およびＣａｓタンパク質を含む。特定の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）およびＣａｓタンパク質の複合体を含む。特定の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのＣａｓは、単一ポリペプチドを含む。特定の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのＣａｓは、エンドヌクレアーゼである。特定の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９である。

【0046】

Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、各々が異なるＤＮＡ鎖を切断する２つの機能的ドメイン、すなわち、ＲｕｖＣおよびＨＮＨを有する。両ドメインが活性な場合、Ｃａｓ９はゲノムＤＮＡにおける二本鎖切断を引き起こす。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓの大きな利点は、合成ｇＲＮＡを簡単に作成する能力と結合されたこのシステムの高効率が、複数の遺伝子を同時に標的化できることである。ｇＲＮＡ配列およびゲノムＤＮＡ標的配列間の塩基対相互作用の明らかな柔軟性が、標的配列に対する不完全な一致がＣａｓ９によって切断されることを可能にする。

【0047】

単一不活性触媒ドメイン、すなわち、ＲｕｖＣ－またはＨＮＨ－のいずれかを含むＣａｓ９酵素の改変バージョンは、「ニッカーゼ」と呼ばれる。活性なヌクレアーゼドメインが１つしかないため、Ｃａｓ９ニッカーゼは標的ＤＮＡの１つの鎖のみを切断し、一本鎖切断または「ニック」を作成する。一本鎖切断またはニックは、通常、完全な相補ＤＮＡ鎖をテンプレートとして使用して、ＨＤＲ経路を介して迅速に修復される。ただし、Ｃａｓ９ニッカーゼによって導入された２つの近位の反対側のストランドニックは、「ダブルニック」ＣＲＩＳＰＲシステムとしばしば呼ばれる二重鎖切断として扱われる。ダブルニックは、遺伝子標的に対する望ましい効果に応じて、ＮＨＥＪまたはＨＤＲのいずれかによって修復され得る。したがって、特異性と低減されたオフターゲット効果が重要な場合、Ｃａｓ９ニッカーゼを使用して、近接してかつゲノムＤＮＡの反対側のストランド上に標的配列を有する２つのｇＲＮＡを設計することによってダブルニックを作成することにより、いずれかのｇＲＮＡを単独としてオフターゲット効果が低減し、ゲノムＤＮＡを変更しないニックをもたらす。

【0048】

２つの不活性な触媒ドメイン（死亡Ｃａｓ９またはｄＣａｓ９）を含むＣａｓ９酵素の改変バージョンは、ヌクレアーゼ活性はないが、ｇＲＮＡの特異性に基づいてＤＮＡに結合することは依然として可能である。ｄＣａｓ９は、既知の調節ドメインに不活性な酵素を融合することにより、ＤＮＡ転写調節因子のプラットフォームとして利用されて、遺伝子発現を活性化または抑制することができる。例えば、ゲノムＤＮＡのターゲット配列へのｄＣａｓ９単独の結合は、遺伝子転写を妨げ得る。特定の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓは、ＣＲＩＳＰＲ／ｄＣａｓ９である。

【0049】

ＣＲＩＳＰＲシステムを使用するには、ｇＲＮＡおよびＣａｓ９の両方を標的細胞において発現させる必要がある。挿入ベクターは、単一プラスミド上に両方のカセットを含み得るか、または、カセットは２つの別々のプラスミドから発現される。Ａｄｄｇｅｎｅのｐｘ３３０プラスミドなどのＣＲＩＳＰＲプラスミドは一般に入手可能である。さらに、Ｃａｓ９およびｇＲＮＡをコードするｍＲＮＡは、標的細胞、およびｇＲＮＡと複合体をなす組換えＣａｓ９タンパク質に対して導入され得る（すなわち、ＲＮＰ複合体を細胞に挿入し得る）。

【0050】

特定の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、クラス１ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムである。特定の実施形態において、クラス１ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、マルチサブユニットｃｒＲＮＡ－エフェクター複合体を含む。特定の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムである。特定の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムである。特定の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、ＩＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムである。

【0051】

特定の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、クラス２ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムである。特定の実施形態において、クラス２ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、単一サブユニットｃｒＲＮＡエフェクターモジュールを含む。特定の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムである。特定の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムである。

【0052】

特定の実施形態において、クラス２ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムにおけるＣａｓは、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２またはＣ２ｃ３であり得る。当業者は、それが当該技術分野でよく知られているように、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの分類を理解するであろう（例えば、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１７ Ｍａｒｃｈ，１５（３）：１６９－１８２、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１５ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ，１３（１１）：７２２－７３６）、そしてこの分類は時間とともに進化している（Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．２０１５ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ５，６０（３）：３８５－３９７）。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓは、当該技術分野で知られている任意のＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（ＣＡＳ）エンドヌクレアーゼである。

【0053】

組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を使用するゲノム編集は、生哺乳類細胞のゲノムにおけるＤＮＡ配列の挿入、欠失または置換を可能にするｒＡＡＶベクターに基づく。ｒＡＡＶゲノムは、一本鎖デオキシリボ核酸（ｓｓＤＮＡ）分子であり、陽性または陰性のいずれかであり、約４．７ｋｂの長さである。これらの一本鎖ＤＮＡウイルスベクターは、高い導入率を有し、ゲノムにおいて二本鎖ＤＮＡ切断がない場合に内因性相同組換えを促進する特異な特性を有する。当業者は、所望のゲノム遺伝子座を標的とし、細胞内の粗大および／または微細内因性遺伝子変化の両方を行うためのｒＡＡＶベクターを設計することができる。ｒＡＡＶゲノム編集は、一対立遺伝子を標的とし、オフターゲットゲノム変化をもたらさないという利点を有する。

【0054】

ＤＮＡ編集剤

【0055】

本明細書に記載の技術は、特定の態様および実施形態において、ＤＮＡ編集剤を提供する。ＤＮＡ編集剤は、当業者に周知の組換えＤＮＡ技術を使用して構築されてもよい。

【0056】

一実施形態において、本明細書に開示されるＤＮＡ編集剤は、単一の核酸構築物に含まれ得るか、または核酸構築物の組み合わせに含まれ得る。一実施形態において、ＤＮＡ編集剤は、以下に記載されるように、少なくとも２つの重要な要素を含む。

【0057】

第１の要素は、鳥のゲノムの特定の場所に安定して組み込まれるように定められているヌクレオチド配列カセットである。第１の要素は、鳥のゲノムに組み込まれると、鳥の遺伝子型を変更するが、特定の実施形態においておよび特定の条件下では、鳥の表現型も変更する。他の鳥の表現型と比較して、変化した鳥の表現型は、本明細書で提供される技術の目的である。本明細書で提供される実施形態によって簡潔に、そして詳細に説明されるように、変化した表現型は、雄胚からの生存可能な雄のヒヨコの発育の防止に有用である。この防止は、農家および孵化場に重大な経済的負担を軽減するだけでなく、生存可能な雄のヒヨコを犠死させる必要性を防ぐことができる。

【0058】

第２の要素は、第１の要素に隣接する第１および第２のヌクレオチド標的配列である。第２の要素は、第１の要素が安定して組み込まれる鳥のゲノム内の位置を決定する役割を果たす。外来ＤＮＡを任意の生物のゲノムにランダムに組み込むことは、それが基本的な細胞機能を担当する遺伝子に干渉する場合、有害だろう。あるいは、外来ＤＮＡがＤＮＡの非活性セグメントに組み込まれる場合、ランダムな組み込みは重要ではない可能性がある。第２の要素は、鳥のＤＮＡの定義された所定の領域への第１の要素の組み込みを指示する重要な機能を実行する。本開示の一実施形態において、第２の要素は、基本的な細胞機能に悪影響を与えることなく、鳥の染色体Ｚのオープンに転写された領域への第１の要素の組み込みを指示する。

【0059】

当業者は、「ＤＮＡ編集剤」という用語が、一般に、鳥などの生物のゲノムの変化を促進するヌクレオチド配列または酵素などの任意の分子を指すことを理解するであろう。変化は、例えば、ＤＮＡに組み込まれている薬剤によるＤＮＡへの付加、例えば、相同組換えによるＤＮＡの配列の置換、またはＤＮＡの欠失であり得る。

【0060】

一実施形態において、ＤＮＡ編集剤は、ウイルスベクターにおいて（例えば、単一のベクターまたは複数のベクターを使用して）構築され得る。そのようなベクターは、一般に、遺伝子導入および遺伝子治療用途で使用される。異なるウイルスベクターシステムには、独自の長所と短所がある。特定の実施形態の第１のヌクレオチド配列を鳥のＺ染色体に組み込むために使用され得るウイルスベクターには、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、アルファウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターを含むが、これらに限定されない。

【0061】

レトロウイルス構築物などのウイルス構築物には、少なくとも１つの転写プロモーター／エンハンサーもしくは遺伝子座定義要素、またはオルタナティブスプライシング、核ＲＮＡ輸出、もしくはメッセンジャーの翻訳後修飾などの手段によって遺伝子発現を制御する他の要素を含む。そのようなベクター構築物には、パッケージングシグナル、長い末端反復配列（ＬＴＲ）またはその一部、および、ウイルス構築物に既に存在しない限り、使用されるウイルスに適したプラスおよびマイナス鎖プライマー結合部位も含まれる。さらに、そのような構築物は、典型的には、それが配置されている宿主細胞からペプチドを分泌するためのシグナル配列を含む。特定の実施形態において、シグナル配列は、哺乳動物のシグナル配列であり得る。任意に、構築物は、ポリアデニル化を指示するシグナル、ならびに１つ以上の制限部位および翻訳終結配列も含んでもよい。例として、そのような構築物は、典型的には、５'ＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合部位、パッケージングシグナル、第二鎖ＤＮＡ合成の起源、および３'ＬＴＲまたはその一部を含む。カチオン性脂質、ポリリジン、またはデンドリマーなどの非ウイルス性である他のベクターを使用できる。

【0062】

一実施形態において、本明細書で提供されるのは、式５'－ＬＨＡ（左相同性アーム）－ＯＩＥ（光遺伝学的誘導性要素）－ＬＩＥ（致死誘導要素）－ＲＨＡ（右相同性アーム）－３ 'または式５'－ＬＨＡ－ＬＩＥ－ＯＩＥ－ＲＨＡ－３'を有するポリヌクレオチドカセットを含むＤＮＡ編集剤であり、（ｉ）ＬＨＡが、鳥の染色体Ｚ上の第１の対応するヌクレオチド配列と実質的に相同である第１のヌクレオチド配列を含み、（ｉｉ）ＯＩＥが、インデューサー活性化部位特異的リコンビナーゼ酵素をコードする第２のヌクレオチド配列に機能的に連結した第１のプロモーターを含み、（ｉｉｉ）ＬＩＥが、インデューサー活性化部位特異的リコンビナーゼ酵素の活性に動作可能に連結されている致死促進タンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列を含み、かつ（ｉｖ）ＲＨＡが、鳥の染色体Ｚ上の第２の対応するヌクレオチド配列と実質的に相同である第４のヌクレオチド配列を含む。

【0063】

当業者には明らかであるように、式５'－ＬＨＡ－ＯＩＥ－ＬＩＥ－ＲＨＡ－３'または式５'－ＬＨＡ－ＬＩＥ－ＯＩＥ－ＲＨＡ－３'は、同じＤＮＡ編集剤分子内の他のすべての要素に関連する任意の要素（例えば、ＬＨＡまたはＯＩＥまたはＬＩＥまたはＲＨＡ）のそれぞれの位置に関する。５'および３'の専門用語は広く受け入れられており、当業者に周知である。

【0064】

特定の実施形態において、ポリヌクレオチドカセットは、式５'－ＬＨＡ－ＯＩＥ－ＬＩＥ－ＲＨＡ－３'を含む。特定の実施形態において、ＯＩＥは、ＬＩＥの上流である。特定の実施形態において、ＯＩＥにおける第１のプロモーターは、インデューサー活性化部位特異的リコンビナーゼ酵素をコードする第２のヌクレオチド配列に機能的に連結され、致死促進タンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列にさらに機能的に連結されない。

【0065】

特定の実施形態において、ポリヌクレオチドカセットは、式５'－ＬＨＡ－ＬＩＥ－ＯＩＥ－ＲＨＡ－３'を含む。特定の実施形態において、ＬＩＥは、ＯＩＥの上流である。特定の実施形態において、ＯＩＥにおける第１のプロモーターは、インデューサー活性化部位特異的リコンビナーゼ酵素をコードする第２のヌクレオチド配列に機能的に連結され、致死促進タンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列にさらに機能的に連結されない。

【0066】

特定の実施形態において、ＤＮＡ編集剤は、式５'－ＬＨＡ－ＯＩＥ－ＬＩＥ－ＲＨＡ－３'を含み、（ｉ）ＬＨＡが、配列番号１０５に記載の配列を含むか、（ｉｉ）ＯＩＥが、配列番号１０１～１０３に記載の配列、もしくは配列番号１０７、配列番号１０３、および配列番号１０８に記載の配列を含むか、（ｉｉｉ）ＬＩＥが、配列番号９２に記載の配列、もしくは、配列番号９４に記載の配列、もしくは配列番号９６に記載の配列、もしくは配列番号９８に記載の配列を含むか、（ｉｖ）ＲＨＡが、配列番号１０６に記載の配列を含むか、または（ｖ）（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、および（ｉｖ）の任意の組み合わせである。

【0067】

特定の実施形態において、ＯＩＥは、配列番号１０２に記載の配列に接続されている、配列番号１０３に記載の配列に接続されている、配列番号１０１に記載の配列を含む。特定の実施形態において、ＯＩＥは、配列番号１０１に記載の配列に接続されている、配列番号１０３に記載の配列に接続されている、配列番号１０２に記載の配列を含む。

【0068】

特定の実施形態において、ＯＩＥは、配列番号１０８に記載の配列に接続されている、配列番号１０３に記載の配列に接続されている、配列番号１０７に記載の配列を含む。特定の実施形態において、ＯＩＥは、配列番号１０７に記載の配列に接続されている、配列番号１０３に記載の配列に接続されている、配列番号１０８に記載の配列を含む。

【0069】

特定の実施形態において、（ｉ）ＬＨＡは、配列番号１０５に記載の配列を含み、（ｉｉ）ＯＩＥは、配列番号１１６に記載の配列に接続されている、配列番号１０４に記載の配列に接続されている、配列番号１０２に記載の配列に接続されている、配列番号１０３に記載の配列に接続されている、配列番号１０１に記載の配列に接続されている、配列番号１１６に記載の配列に接続されている、配列番号１００に記載の配列を含むか、またはＯＩＥは、列番号１１６に記載の配列に接続されている、配列番号１０４に記載の配列に接続されている、配列番号１０１に記載の配列に接続されている、配列番号１０３に記載の配列に接続されている、配列番号１０２に記載の配列に接続されている、配列番号１１６に記載の配列に接続されている、配列番号１００に記載の配列を含むか、またはＯＩＥは、列番号１１６に記載の配列に接続されている、配列番号１０４に記載の配列に接続されている、配列番号１０８に記載の配列に接続されている、配列番号１０３に記載の配列に接続されている、配列番号１０７に記載の配列に接続されている、配列番号１１６に記載の配列に接続されている、配列番号１００に記載の配列を含むか、ＯＩＥは、番号１１６に記載の配列に接続されている、配列番号１０４に記載の配列に接続されている、配列番号１０７に記載の配列に接続されている、配列番号１０３に記載の配列に接続されている、配列番号１０８に記載の配列に接続されている、配列番号１１６に記載の配列に接続されている、配列番号１００に記載の配列を含み、（ｉｉｉ）ＬＩＥは、配列番号９２に記載の配列を含むか、または配列番号１０４に記載の配列に接続されている、配列番号９４に記載の配列もしくは配列番号９６に記載の配列もしくは配列番号９８に記載の配列を含み、かつ（ｉｖ）ＲＨＡは、配列番号１０６に記載の配列を含む。

【0070】

特定の実施形態において、ＤＮＡ編集剤は、配列番号１２０～１２７のうちの１つの配列を含む。

【0071】

ＤＮＡ編集剤は、ルシフェラーゼ、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β－ガラクトシダーゼ、分泌型胎盤アルカリホスファターゼ、ベータラクタマーゼ、ヒト成長ホルモン、およびその他の分泌型酵素レポーターを含むが、これらに限定されない、その存在または活性のいずれかによって容易に検出可能であるレポータータンパク質をコードする場合もある。一般に、レポーター遺伝子は、宿主細胞によって産生されないポリペプチドをコードし、細胞の分析、例えば、細胞の直接蛍光分析、放射性同位体分析または分光測光分析によって、通常はシグナル分析のために細胞を殺すことを必要とせずに、検出可能である。特定の実施形態において、レポーター遺伝子は、酵素をコードし、定性的、定量的、または半定量的機能または転写活性化によって検出可能である宿主細胞の蛍光特性における変化を生成する。例示的な酵素には、エステラーゼ、β－ラクタマーゼ、ホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、プロテアーゼ（組織プラスミノーゲンアクチベーターまたはウロキナーゼ）、および当業者に周知のまたは将来開発される適切な発色性または蛍光性基質によって機能が検出できる他の酵素が含まれる。レポーター遺伝子は、構築物のＺ染色体への成功裏の組み込みについてレポートしてもよい。

【0072】

特定の実施形態において、ＤＮＡ編集剤は、レポーターポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み得る。特定の実施形態において、レポーターポリペプチドは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（配列番号１１５）、またはｍＣｈｅｒｒｙ／ＲＦＰ（配列番号１１９）であり得る。

【0073】

特定の実施形態において、ＤＮＡ編集剤は、構築物との相同組換え事象を受けた形質転換細胞を効率的に選択するための陽性および／または陰性選択マーカーをさらに含む。陽性選択は、外来ＤＮＡを取り込んだクローンの集団を濃縮する手段を提供する。そのような陽性マーカーの非限定的な例には、グルタミンシンテターゼ、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、ならびにネオマイシン、ハイグロマイシン、ピューロマイシン、およびブラストサイジンＳ耐性カセットなどの抗生物質耐性を付与するマーカーが含まれる。マーカー配列（例えば、陽性マーカー）のランダムな組み込みおよび／または脱離に対して陰性選択マーカーを選択する必要がある。このような陰性マーカーの非限定的な例には、ガンシクロビル（ＧＣＶ）を細胞毒性ヌクレオシドアナログに変換する単純ヘルペスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫ）、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、ジフテリア毒素（ＤＴ）およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＡＲＰＴ）が含まれる。

【0074】

特定の実施形態において、ＤＮＡ編集剤のタンパク質をコードするコドンは、「最適化された」コドンであり、すなわち、コドンは、例えば、インフルエンザウイルスにおいて頻繁に使用されるコドンの代わりに、例えば、鳥類における高発現遺伝子において頻繁に現れるものである。そのようなコドン使用は、鳥類細胞におけるタンパク質の効率的な発現を提供する。コドンの使用パターンは、多くの種の高発現遺伝子についての文献で知られている（例えば、Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４（１）：２１４－５、ＭｃＥｗａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．２４（１）：１３１－６，１３８）。

【0075】

特定の実施形態において、ＤＮＡ編集剤は、これらに限定されないがＰ２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｅ２Ａを含む２Ａ（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔ ５，Ａｒｔｉｃｌｅ １６２７３（２０１５））、または内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列などの自己切断ペプチドをさらに含み得る。

【0076】

左および右の相同性アーム

【0077】

ＨＲについての相同性アームのサイズは、アーム間のインサートのサイズに比例する必要があることが概して認められている。当業者は、適切な長さの相同性アームを容易に決定し、構築するであろう。一実施形態において、相同性アームは、５０塩基のような短さであり得る。特定の実施形態において、（ｉ）ＬＨＡの長さは、約０．５～約５キロベース（ｋｂ）であるか、（ｉｉ）ＲＨＡの長さは、約０．５～約５ｋｂであるか、または（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の任意の組み合わせである。特定の実施形態において、（ｉ）ＬＨＡの長さは、約１．５ｋｂであるか、（ｉｉ）ＲＨＡの長さは、約１．５ｋｂであるか、または（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の任意の組み合わせである。特定の実施形態において、ＬＨＲおよび／またはＲＨＡは、５０塩基のような短さであり得る。

【0078】

特定の実施形態において、ＬＨＡの長さは、約０．５～約５キロベース（ｋｂ）である。特定の実施形態において、ＬＨＡの長さは、約０．５ｋｂである。特定の実施形態において、ＬＨＡの長さは、約１ｋｂである。特定の実施形態において、ＬＨＡの長さは、約１．５ｋｂである。特定の実施形態において、ＬＨＡの長さは、約２ｋｂである。特定の実施形態において、ＬＨＡの長さは、約２．５ｋｂである。特定の実施形態において、ＬＨＡの長さは、約３ｋｂである。特定の実施形態において、ＬＨＡの長さは、約３．５ｋｂである。特定の実施形態において、ＬＨＡの長さは、約４ｋｂである。特定の実施形態において、ＬＨＡの長さは、約４．５ｋｂである。特定の実施形態において、ＬＨＡの長さは、約５ｋｂである。特定の実施形態において、ＬＨＲは、５０塩基まで短くし得る。

【0079】

特定の実施形態において、ＲＨＡの長さは、約０．５～約５キロベース（ｋｂ）である。特定の実施形態において、ＲＨＡの長さは約０．５ｋｂである。特定の実施形態において、ＲＨＡの長さは、約１ｋｂである。特定の実施形態において、ＲＨＡの長さは、約１．５ｋｂである。特定の実施形態において、ＲＨＡの長さは、約２ｋｂである。特定の実施形態において、ＲＨＡの長さは、約２．５ｋｂである。特定の実施形態において、ＲＨＡの長さは、約３ｋｂである。特定の実施形態において、ＲＨＡの長さは、約３．５ｋｂである。特定の実施形態において、ＲＨＡの長さは、約４ｋｂである。特定の実施形態において、ＲＨＡの長さは、約４．５ｋｂである。特定の実施形態において、ＲＨＡの長さは、約５ｋｂである。特定の実施形態において、ＲＨＡは、５０塩基まで短くし得る。

【0080】

特定の実施形態において、ＬＨＡおよびＲＨＡのそれぞれの長さは、約０．５ｋｂである。特定の実施形態において、ＬＨＡおよびＲＨＡのそれぞれの長さは、約１ｋｂである。特定の実施形態において、ＬＨＡおよびＲＨＡのそれぞれの長さは、約１．５ｋｂである。特定の実施形態において、ＬＨＡおよびＲＨＡのそれぞれの長さは、約２ｋｂである。特定の実施形態において、ＬＨＡおよびＲＨＡのそれぞれの長さは、約２．５ｋｂである。特定の実施形態において、ＬＨＡおよびＲＨＡのそれぞれの長さは、約３ｋｂである。特定の実施形態において、ＬＨＡおよびＲＨＡのそれぞれの長さは、約３．５ｋｂである。特定の実施形態において、ＬＨＡおよびＲＨＡのそれぞれの長さは、約４ｋｂである。特定の実施形態において、ＬＨＡおよびＲＨＡのそれぞれの長さは、約４．５ｋｂである。特定の実施形態において、ＬＨＡおよびＲＨＡのそれぞれの長さは、約５ｋｂである。特定の実施形態において、ＬＨＲおよびＲＨＡは、５０塩基まで短くし得る。

【0081】

特定の実施形態において、左および右の相同性アームのそれぞれの長さは、鳥の染色体ＤＮＡへの特異的組換えを可能にするのに十分である。一実施形態において、ＬＨＡおよび／またはＲＨＡは、少なくとも５００ヌクレオチド長であり、例えば、５００～３０００ヌクレオチド長である。典型的には、ＬＨＡおよび／またはＲＨＡ相同性アームの必要なサイズは、これらのアームに隣接するカセットの長さに依存する。カセットが小さければ小さいほど、短いアームを必要とし、逆もまた同様である。一実施形態において、相同性アームは、５０塩基のような短さであり得る。

【0082】

特定の実施形態において、（ｉ）ＬＨＡは、鳥の染色体Ｚ上のオープンに転写された領域に位置する対応する第１のヌクレオチド配列と実質的に相同であるか、（ｉｉ）ＲＨＡは、鳥の染色体Ｚ上のオープンに転写された領域に位置する対応する第２ヌクレオチド配列と実質的に相同であるか、または（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の両方である。

【0083】

当業者には明らかであるように、第１の配列および第２の配列が相同組換えによって互いに置き換え得る限り、第１の配列および第２の配列が、配列が類似または同一である場合、第１の配列は、第２の配列と「実質的に相同」である。相同組換えを試験および特定する方法は、当該技術分野でよく知られている。

【0084】

特定の実施形態において、実質的に相同であるのは、少なくとも５０％同一である。特定の実施形態において、実質的に相同であるのは、少なくとも６０％同一である。特定の実施形態において、実質的に相同であるのは、少なくとも７０％同一である。特定の実施形態において、実質的に相同であるのは、少なくとも８０％同一である。特定の実施形態において、実質的に相同であるのは、少なくとも９０％同一である。特定の実施形態において、実質的に相同であるのは、少なくとも９５％同一である。特定の実施形態において、実質的に相同であるのは、少なくとも９９％同一である。

【0085】

特定の実施形態において、ＬＨＡにおける第１のヌクレオチド配列は、染色体Ｚ上の第１の対応するヌクレオチド配列と配列が５０％～１００％同一である。特定の実施形態において、ＬＨＡにおける第１のヌクレオチド配列は、染色体Ｚ上の第１の対応するヌクレオチド配列と配列が８０％～１００％同一である。特定の実施形態において、ＬＨＡにおける第１のヌクレオチド配列は、染色体Ｚ上の第１の対応するヌクレオチド配列と配列が８５％～１００％同一である。特定の実施形態において、ＬＨＡにおける第１のヌクレオチド配列は、染色体Ｚ上の第１の対応するヌクレオチド配列と配列が９０％～１００％同一である。特定の実施形態において、ＬＨＡにおける第１のヌクレオチド配列は、染色体Ｚ上の第１の対応するヌクレオチド配列と配列が９５％～１００％同一である。特定の実施形態において、ＬＨＡにおける第１のヌクレオチド配列は、染色体Ｚ上の第１の対応するヌクレオチド配列と配列が９９％～１００％同一である。特定の実施形態において、ＬＨＡにおける第１のヌクレオチド配列は、染色体Ｚ上の第１の対応するヌクレオチド配列と配列が１００％同一である。

【0086】

特定の実施形態において、ＲＨＡにおける第４のヌクレオチド配列は、染色体Ｚ上の第２の対応するヌクレオチド配列と配列が５０％～１００％同一である。特定の実施形態において、ＲＨＡにおける第４のヌクレオチド配列は、染色体Ｚ上の第２の対応するヌクレオチド配列と配列が８０％～１００％同一である。特定の実施形態において、ＲＨＡにおける第４のヌクレオチド配列は、染色体Ｚ上の第２の対応するヌクレオチド配列と配列が８５％～１００％同一である。特定の実施形態において、ＲＨＡにおける第４のヌクレオチド配列は、染色体Ｚ上の第２の対応するヌクレオチド配列と配列が９０％～１００％同一である。特定の実施形態において、ＲＨＡにおける第４のヌクレオチド配列は、染色体Ｚ上の第２の対応するヌクレオチド配列と配列が９５％～１００％同一である。特定の実施形態において、ＲＨＡにおける第４のヌクレオチド配列は、染色体Ｚ上の第２の対応するヌクレオチド配列と配列が９９％～１００％同一である。特定の実施形態において、ＲＨＡにおける第４のヌクレオチド配列は、染色体Ｚ上の第２の対応するヌクレオチド配列と配列が１００％同一である。

【0087】

特定の実施形態において、ＬＨＡおよび／またはＲＨＡは、組み込み部位として機能する鳥の染色体Ｚ内の標的遺伝子座内の少なくとも１つのヌクレオチド配列と、相同であるか、または約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の相同性または同一性を示す。

【0088】

当業者は、「染色体におけるオープンに転写された領域」という用語は、概して、他の遺伝子も十分容易に転写されることを可能にするのに十分なレベルで転写される遺伝子を含む染色体の領域を指すことを理解するであろう。オープンに転写された領域の非限定的な例は、細胞または生物の一生の間で高度に転写されるハウスキーピング遺伝子に近接する領域である。オープンに転写された領域の他の非限定的な例は、遺伝子座の間の領域（例えば、クロマチン調節要素、非コードＤＮＡ、「ジャンクＤＮＡ」など）である。不十分に転写された領域の非限定的な例は、テロメアと呼ばれる各染色体の末端の領域であり、細胞または生物の一生の間で転写されない。特定の実施形態において、オープンに転写された領域は、鳥の染色体Ｚ上のＨｉｎｔ１Ｚ遺伝子に、またはその下流に位置する。

【0089】

一実施形態において、ＬＨＡおよび／またはＲＨＡは、鳥のＺ染色体上に存在するゲノム配列に対応する。好ましくは、ゲノム配列は、転写活性のある遺伝子に、またはその下流（例えば、Ｈｉｎｔ１Ｚ遺伝子（遺伝子ＩＤ：３９５４２４）に、またはその下流）に位置する。別の考えられる標的はＩｓｌ１（遺伝子ＩＤ３６９３８３）であり、これは、胚発生の初期段階から開始して発現する染色体Ｚ上にもある。図３は、Ｈｉｎｔ１Ｚ遺伝子の下流にある染色体Ｚ上の相同性アームの実施形態を示す。

【0090】

ＬＨＡおよび／またはＲＨＡ標的配列は、ＬＨＡおよび／またはＲＨＡ標的配列が、例えば自発的相同組換えまたは相同組換え修復（ＨＤＲ）によって、細胞の任意の他の染色体ではなくＺ染色体に特異的に組み込まれるように選択され得る。相同組換えは自然に発生し得る。さらに、ＬＨＡおよび／またはＲＨＡ標的配列は、第１の標的配列を染色体に組み込むためにどの方法に依存しているかによって選択され得る。ヌクレオチド配列を染色体に組み込む方法は、標的相同組換え、部位特異的リコンビナーゼ、および操作されたヌクレアーゼによるゲノム編集を含み、当該技術分野において周知である（例えば、Ｍｅｎｋｅ Ｄ．Ｇｅｎｅｓｉｓ（２０１３）５１：－６１８、Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）２４４：１２８８－１２９２、Ｓａｎｔｉａｇｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（２００８）１０５：５８０９－５８１４、国際特許出願第ＷＯ２０１４／０８５５９３号、同第ＷＯ２００９／０７１３３４号および同第ＷＯ２０１１／１４６１２１号、米国特許第８７７１９４５号、同第８５８６５２６号、同第６７７４２７９号および米国特許出願公開第２００３／０２３２４１０号、同第２００５／００２６１５７号、同第２００６／００１４２６４号参照）。ＰＢトランスポザーゼも考えられる。目的の遺伝子に核酸の変化を導入するための薬剤は、公的に利用可能なリソースによって設計され得る。

【0091】

特定の実施形態において、ＬＨＡの最初の５'ヌクレオチドは、染色体Ｚ、位置４４，９１４，９６１に対応する。特定の実施形態において、ＬＨＡの第１の対応するヌクレオチド配列は、染色体Ｚ、位置４４，９１４，９６１～位置４４，９１６，４５６に位置する。

【0092】

特定の実施形態において、ＬＨＡの最初の５'ヌクレオチドは、Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ染色体Ｚ、アセンブリＧＲＣｇ６ａ、ＮＣ＿００６１２７．５、位置４４，９１４，９６１に対応する。特定の実施形態において、ＬＨＡの第１の対応するヌクレオチド配列は、Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ染色体Ｚ、アセンブリＧＲＣｇ６ａ、ＮＣ＿００６１２７．５、位置４４，９１４，９６１～位置４４，９１６，４５６に位置する。

【0093】

特定の実施形態において、ＲＨＡの最初の５'ヌクレオチドは、染色体Ｚ、位置４４，９１６，４８０に対応する。特定の実施形態において、ＲＨＡの第２の対応するヌクレオチド配列は、染色体Ｚ、位置４４，９１６，４８０～位置４４，９１８，０４３に位置する。

【0094】

特定の実施形態において、ＲＨＡの最初の５'ヌクレオチドは、Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ染色体Ｚ、アセンブリＧＲＣｇ６ａ、ＮＣ＿００６１２７．５、位置４４，９１６，４８０に対応する。特定の実施形態において、ＲＨＡの第２の対応するヌクレオチド配列は、Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ染色体Ｚ、アセンブリＧＲＣｇ６ａ、ＮＣ＿００６１２７．５、位置４４，９１６，４８０～位置４４，９１８，０４３に位置する。

【0095】

特定の実施形態において、（ｉ）ＬＨＡは、配列番号１０５に記載のヌクレオチド配列、もしくはその断片、例えば、配列番号１０５に記載のヌクレオチド配列の少なくとも５０個、または少なくとも５００個の連続するヌクレオチドを含むか、（ｉｉ）ＲＨＡは、配列番号１０６に記載のヌクレオチド配列、もしくはその断片、例えば、配列番号１０６に記載のヌクレオチド配列の少なくとも５０個、または少なくとも５００個の連続するヌクレオチドを含むか、または（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の両方である。特定の実施形態において、（ｉ）ＬＨＡは、配列番号１０５に記載のヌクレオチド配列、もしくは配列番号１０５に記載のヌクレオチド配列の少なくとも１０００個の連続するヌクレオチドの断片を含むか、（ｉｉ）ＲＨＡは、配列番号１０６に記載のヌクレオチド配列、もしくは配列番号１０６に記載のヌクレオチド配列の少なくとも１０００個の連続するヌクレオチドの断片を含むか、または（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の両方である。

【0096】

特定の実施形態において、ＬＨＡは、配列番号１０５に記載のヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態において、ＬＨＡは、配列番号１０５に記載のヌクレオチド配列からの少なくとも５０個、または少なくとも５００個の連続するヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、ＬＨＡは、配列番号１０５に記載のヌクレオチド配列からの少なくとも１０００個の連続するヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、ＬＨＡは、配列番号１０５に記載のヌクレオチド配列からの５００個の連続するヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、ＬＨＡは、配列番号１０５に記載のヌクレオチド配列からの１０００個の連続するヌクレオチドを含む。

【0097】

特定の実施形態において、ＲＨＡは、配列番号１０６に記載のヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態において、ＲＨＡは、配列番号１０６に記載のヌクレオチド配列からの少なくとも５０個、または少なくとも５００個の連続したヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、ＲＨＡは、配列番号１０６に記載のヌクレオチド配列からの少なくとも１０００個の連続するヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、ＲＨＡは、配列番号１０６に記載のヌクレオチド配列からの５００個の連続するヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、ＲＨＡは、配列番号１０６に記載のヌクレオチド配列からの１０００個の連続するヌクレオチドを含む。

【0098】

特定の実施形態において、ＬＨＡは、配列番号１０５に記載のヌクレオチド配列、または配列番号１０５に記載のヌクレオチド配列の少なくとも５０個、または少なくとも５００個の連続するヌクレオチドの断片を含み、ＲＨＡは、配列番号１０６に記載のヌクレオチド配列、または配列番号１０６に記載のヌクレオチド配列の少なくとも５０個、または少なくとも５００個の連続するヌクレオチドの断片を含む。特定の実施形態において、ＬＨＡは、配列番号１０５に記載のヌクレオチド配列、または配列番号１０５に記載のヌクレオチド配列の少なくとも１０００個の連続するヌクレオチドの断片を含み、ＲＨＡは、配列番号１０６に記載のヌクレオチド配列、または配列番号１０６に記載のヌクレオチド配列の少なくとも１０００個の連続するヌクレオチドの断片を含む。特定の実施形態において、ＬＨＡは、配列番号１０５に記載のヌクレオチド配列を含み、ＲＨＡは、配列番号１０６に記載のヌクレオチド配列を含む。

【0099】

光遺伝学的誘導性要素

【0100】

プロモーター

【0101】

当業者には明らかであるように、「ヌクレオチド配列に機能的に連結したプロモーター」は、プロモーターがヌクレオチド配列の転写において上流に位置し、それにシスで関与することを包含する。ヌクレオチド配列に機能的に連結したプロモーターの非限定的な例は、インデューサー活性化部位特異的リコンビナーゼ酵素をコードするＯＩＥにおけるヌクレオチド配列の転写を駆動するＯＩＥにおける第１のプロモーターである。

【0102】

特定の実施形態において、第１のプロモーターは、鳥における構成的プロモーターである。当業者には明らかであるように、「構成的プロモーター」は、その関連するヌクレオチド配列または遺伝子の継続的な転写を可能にするプロモーターを包含する。

【0103】

特定の実施形態において、第１のプロモーターは、鳥における誘導性プロモーターである。当業者には明らかであるように、「誘導性プロモーター」は、その関連するヌクレオチド配列または遺伝子の非継続的な転写を可能にするプロモーターを包含する。特定の実施形態において、非継続的な転写は、インデューサーによって調節される。特定の実施形態において、インデューサーは、鳥の細胞に対して外因性である。

【0104】

特定の実施形態において、第１のプロモーターは、ｐＣＡＧＧ（配列番号１００）、ｐＧＫ（配列番号１０９）、ｐＣＭＶ（配列番号１１０）、ｐｈＳｙｎ（配列番号１１１）、またはｐＥＦ１－ａ（配列番号１１２）であり得る。

【0105】

インデューサー活性化部位特異的リコンビナーゼ

【0106】

特定の実施形態において、インデューサー活性化部位特異的リコンビナーゼ酵素は、Ｃｒｅリコンビナーゼ（Ｃｒｅ）（配列番号１１３）、またはＭａｇ（配列番号１１４および配列番号６５）であり得る。

【0107】

特定の実施形態によれば、インデューサーは、インデューサー活性化部位特異的リコンビナーゼ酵素をコードするヌクレオチド配列の転写を開始または増加させる。他の実施形態において、インデューサーは、インデューサー活性化部位特異的リコンビナーゼをコードするｍＲＮＡの翻訳を開始または増加させる。さらに他の実施形態において、インデューサーは、インデューサー活性化部位特異的リコンビナーゼ酵素の活性を開始または増加させる。特定の実施形態によれば、インデューサーは、部位特異的リコンビナーゼの非機能的断片を互いに複合体化することにより、機能的インデューサー活性化部位特異的リコンビナーゼ酵素の形成を開始または増加させる。当業者には明らかであるように、酵素が自然においてポリペプチドとして見出される酵素の複数の非機能的断片（ペプチド）は、図２に示されるように、各断片（ペプチド）が他の断片（ペプチド）に共有結合されていないにもかかわらず、相互作用して機能的酵素を形成し得る。特定の実施形態において、インデューサー活性化部位特異的リコンビナーゼ、インデューサーの存在下で結合して活性インデューサー活性化部位特異的リコンビナーゼ酵素を形成する、インデューサー活性化部位特異的リコンビナーゼの非機能的ペプチド断片を含む。

【0108】

本明細書で使用される「誘導性」という用語は、関与する分子機構に拘わらず、スイッチのすべての側面を包含してもよい。したがって、スイッチは、抗生物質ベースの誘導システム、電磁エネルギーベースの誘導システム、小分子ベースの誘導システム、核受容体ベースの誘導システムおよびホルモンベースの誘導システムを含み得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、スイッチは、光誘導システム、テトラサイクリン（Ｔｅｔ）／ＤＯＸ誘導システム、アブシジン酸（ＡＢＡ）誘導システム、クメートリプレッサー／オペレーターシステム、４０ＨＴ／エストロゲン誘導システム、エクジソンベースの誘導システムまたはＦＫＢＰ１２／ＦＲＡＰ（ＦＫＢＰ１２－ラパマイシン複合体）誘導システムである。インデューサーが孵化していない卵に投与される特定の例において、インデューサーは卵の殻に浸透することができる。特定の例において、インデューサーは、卵内の雌胚に対して毒性がなく、卵内の雌胚の発育を変化させない。

【0109】

本明細書で使用する場合、「スイッチ」という用語は、協調して作用して変化に影響を与える単一の成分または成分のセットを指し、その機能の活性化、抑制、促進または終了などの生物学的機能のすべての側面を包含する。一実施形態では、スイッチは、遺伝子調節に使用される誘導システムおよび／または抑制システムに関連する。一般に、遺伝子発現を可能にする何らかの分子またはエネルギー形態（インデューサーと呼ばれる）が存在しない限り、誘導システムはオフになる場合がある。この分子は「発現を誘導する」と言われている。これが起こる方法は、制御機構および細胞の種類の違いに依存する。抑制システムは、遺伝子発現を抑制する何らかの分子またはエネルギー形態（サプレッサーと呼ばれる）の存在下以外は「オフ」である。これが起こる方法は、制御機構および細胞の種類の違いに依存する。

【0110】

例示的な光遺伝学的スイッチを図４Ａ－４Ｃに示し、これらの各々は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ由来の感光性二量体化タンパク質ドメインであるクリプトクロム２（ＣＲＹ２）およびＣＩＢ１、ならびにエフェクター分子としての部位特異的リコンビナーゼを利用する。ＣＲＹ２はＣｒｅリコンビナーゼの一方の半分に対してインフレームで融合されるが、ＣＩＢ１はＣｒｅリコンビナーゼの他方の半分、すなわちスプリットリコンビナーゼ酵素に対してインフレームで融合される。したがって、インデューサー（青色光）が提供されるとき、ＣＲＹ２およびＣＩＢ１は、ヘテロ二量体化して、部位特異的組換えを実行できる機能的Ｃｒｅリコンビナーゼを産生する。

【0111】

特定の実施形態において、インデューサー活性化部位特異的リコンビナーゼ酵素の発現は、インデューサーによって誘導される。特定の実施形態において、インデューサーは、電磁エネルギーである。特定の実施形態において、電磁エネルギーは、３８０～７４０ｎｍの波長の可視光、または可視光の成分である。特定の実施形態において、可視光の成分は、波長４５０～４８５ｎｍの青色光である。

【0112】

一実施形態において、インデューサー活性化部位特異的リコンビナーゼは、電磁エネルギーを使用して誘導される。可視光の成分は、４５０ｎｍ～７００ｎｍまたは４５０ｎｍ～５００ｎｍの範囲の波長、すなわち青色光を有してもよい。青色光は、少なくとも０．２ｍＷ／ｃｍ２または少なくとも４ｍＷ／ｃｍ２の強度を有してもよい。可視光の成分は、６２０ｎｍ～７００ｎｍの範囲の波長、すなわち赤色光を有してもよい。任意の順序および任意の組み合わせでの可視光の単一または複数の適用が考えられる。可視光は、単一もしくは複数の連続的な適用として、またはパルス（パルス送達）として送達されてもよい。

【0113】

そのような光遺伝学的スイッチの例は、Ｍｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２０１５ Ｆｅｂ，３９６（２）：１４５－５２．ｄｏｉ：１０．１５１５／ｈｓｚ－２０１４－０１９９、Ｍｏｔｔａ Ｍｅｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．２０１４ Ｍａｒ，１０（３）：１９６－２０２、およびＷＯ２０１４／０１８４２３に記載されている。

【0114】

Ｐ１バクテリオファージ由来のＣｒｅリコンビナーゼおよび酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＦｌｐリコンビナーゼは、それぞれが特有の３４塩基対ＤＮＡ配列（それぞれ「Ｌｏｘ」および「ＦＲＴ」と呼ばれる）を認識する部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼである。Ｌｏｘ部位またはＦＲＴ部位のいずれかに隣接する配列は、それぞれＣｒｅまたはＦｌｐリコンビナーゼの発現時に部位特異的組換えを介して容易に除去され得る。

【0115】

特定の実施形態において、リコンビナーゼ認識部位は、Ｌｏｘ５１１、Ｌｏｘ５１７１、Ｌｏｘ２２７２、ｍ２、Ｌｏｘ７１、Ｌｏｘ６６、ＦＲＴ、Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４、Ｆ５、ＦＲＴ（ＬＥ）、ＦＲＴ（ＲＥ）、ａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＬ、またはａｔｔＲであり得る。

【0116】

例えば、Ｌｏｘ配列は、１３塩基対逆方向反復配列が隣接する非対称の８塩基対スペーサー領域で構成されている。Ｃｒｅは、１３塩基対の逆方向反復に結合し、スペーサー領域内で鎖の切断および再連結を触媒することにより、３４塩基対のＬｏｘ ＤＮＡ配列を再結合する。スペーサー領域においてＣｒｅによって作られた千鳥状ＤＮＡ切断は、６塩基対によって分離されて、同じ重複領域を有する組換え部位のみが再結合することを保証する相同性センサとして機能する重複領域を与える。

【0117】

特定の実施形態において、部位特異的リコンビナーゼシステムは、相同組換えの後、鳥の染色体から、ＤＮＡ、例えば、選択カセットを除去するために使用される。注目すべきことに、ＣｒｅおよびＦｌｐリコンビナーゼは、３４塩基対のＬｏｘまたはＦＲＴの「瘢痕」を残す。残っているＬｏｘまたはＦＲＴ部位は通常、改変された遺伝子座のイントロンまたは３'ＵＴＲに取り残されていて、これらの部位は典型的には遺伝子機能を著しく妨害しない。このシステムはまた、一時的にまたは組織特異的に不活性化または活性化できる条件変更された対立遺伝子の生成を可能にする。

【0118】

したがって、Ｃｒｅ／ＬｏｘおよびＦｌｐ／ＦＲＴ組換えは、対象の変異を含む３'および５'相同性アームを有するターゲティングベクター、２つのＬｏｘまたはＦＲＴ配列、および典型的には２つのＬｏｘまたはＦＲＴ配列間に配置される選択可能なカセットの導入を含み得る。陽性選択が適用され、標的化変異を含む相同組換えが特定される。陰性選択と組み合わせたＣｒｅまたはＦｌｐの一時的な発現は、選択カセットの切除をもたらし、カセットが欠損した細胞を選択する。最終的な標的化対立遺伝子には、外因性配列のＬｏｘまたはＦＲＴ瘢痕が含まれる。

【0119】

特定の実施形態において、インデューサーは、熱、超音波、電磁エネルギー、または化学物質である。特定の実施形態において、インデューサーは、産卵前の鳥の内部での卵生産の過程の間に卵に送達される。

【0120】

不要な雄胚は日光（または例として青色光）に自由にさらされ得るが、トランスジェニック細胞および生物は、本明細書で提供される光遺伝学的システムの望ましくない活性化を防ぐために特別な条件下に保たれる必要がある。また、雌鳥は緑色／赤色光の条件下で飼育すると生産性が高くなることが知られている。

【0121】

特定の実施形態において、本明細書で提供される方法は、緑色光の下で実行される。特定の実施形態において、本明細書で提供される細胞および生物は、緑色光の下に保たれる。特定の実施形態において、緑色光は、５００～５６５ｎｍの波長のものである。

【0122】

特定の実施形態において、本明細書で提供される方法は、赤色光の下で実行される。特定の実施形態において、本明細書で提供される細胞および生物は、赤色光の下に保たれる。特定の実施形態において、赤色光は、６２５～７４０ｎｍの波長のものである。

【0123】

エネルギー活性化のいくつかの方法、例えば、同様の効果を有する電界エネルギーおよび／または超音波が企図される。必要に応じて、スイッチのタンパク質対形成は、別のエネルギー源による最大の効果のために変更および／または修正される。

【0124】

電界エネルギーは、ｉｎ ｖｉｖｏ条件下で約１ボルト／ｃｍ～約１０キロボルト／ｃｍの１つ以上の電気パルスを使用して、実質的に当技術分野で説明されているように投与され得る。パルスに代えて、またはパルスに加えて、電界が連続的に送達されてもよい。電気パルスは、１～５００ミリ秒間、好ましくは１～１００ミリ秒間印加し得る。電界は、約５分間連続的にまたはパルス状に印加されてもよい。本明細書で使用される場合、「電界エネルギー」は、細胞がさらされる電気エネルギーである。特定の実施形態において、電界は、ｉｎ ｖｉｖｏ条件下で約１ボルト／ｃｍ～約１０キロボルト／ｃｍまたはそれ以上の強度を有する（例えばＷＯ９７／４９４５０参照）。

【0125】

本明細書で使用される場合、「電界」という用語は、可変容量および電圧で１つ以上のパルスを含み、指数関数的および／または方形波、および／または、変調波および／または変調方形波形態を含む。電界および電気への言及は、細胞の環境における電位差の存在への言及を含むようにとられるべきである。そのような環境は、当該技術分野で知られているように、静電気、交流（ＡＣ）、直流（ＤＣ）などによって設定されてもよい。電界は、均一、不均一、またはそうでなくてもよく、時間依存的に強度および／または方向が変化してもよい。

【0126】

電界の単一または複数の印加、および超音波の単一または複数の印加も、任意の順序および任意の組み合わせで可能である。超音波および／または電場は、単一または複数の連続的な印加として、またはパルス（パルス送達）として送達されてもよい。

【0127】

致死誘導要素

【0128】

当業者には明らかであるように、「第２のタンパク質の活性に作動可能に連結する第１のタンパク質」は、第２のタンパク質がトランスで第１のタンパク質の作動を制御することを包含する。第２のタンパク質の活性に作動可能に連結する第１のタンパク質の非限定的な例は、ＯＩＥにおいてコードされるインデューサー活性化部位特異的リコンビナーゼ酵素の活性によって活性になる、ＬＩＥにおいてコードされる致死促進タンパク質である。「シスで」および「トランスで」という用語は、当業者に広く受け入れられ、理解されている。

【0129】

インデューサー活性化部位特異的リコンビナーゼ酵素が、トランスで致死促進タンパク質を活性化するので、同じ分子または異なる分子におけるＯＩＥおよびＬＩＥのそれぞれの位置は、異なる実施形態において異なり得る。特定の実施形態において、ＯＩＥおよびＬＩＥは、同じ分子内にある。特定の実施形態において、ＯＩＥおよびＬＩＥは、異なる分子内にある。

【0130】

特定の実施形態において、活性化酵素（例えば、Ｃｒｅなどのリコンビナーゼ酵素）は、致死遺伝子カセットから分離されている。この場合、活性化酵素は雄もしくは雌の鳥のどちらかのゲノムに挿入され、不活性な致死カセットは鳥の対応する性別のＺ染色体に挿入される。この場合、雄の胚の致死性の活性化は、２つのトランスジェニック親を交配するだけで実行される。図１９Ａ～１９Ｂは、活性化酵素（例えば、Ｃｒｅ）が致死遺伝子カセットから分離されているターゲティングベクターの実施形態である。

【0131】

特定の実施形態において、ＬＩＥは、致死促進タンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列に機能的に連結した第２のプロモーターをさらに含む。特定の実施形態において、第２のプロモーターは、鳥における構成的プロモーターである。特定の実施形態において、第２のプロモーターは、鳥における誘導性プロモーターである。特定の実施形態において、第２のプロモーターは、ｐＣＡＧＧ（配列番号１００）、ｐＧＫ（配列番号１０９）、ｐＣＭＶ（配列番号１１０）、ｐｈＳｙｎ（配列番号１１１）、またはｐＥＦ１－ａ（配列番号１１２）であり得る。

【0132】

致死促進タンパク質

【0133】

本明細書で使用される場合、「致死タンパク質」という用語は、鳥類の胚（例えば、雄胚）に対して致死性であり、したがって、卵からの生きた雄の鳥の孵化を防止するタンパク質を指す。

【0134】

特定の実施形態において、Ｎ－カドヘリンなどの初期胚発生の基本段階を妨害し得る致死誘導タンパク質、および骨形成タンパク質（ＢＭＰ）または線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）によって媒介されるものなどの必須のシグナル伝達経路を妨害するタンパク質。

【0135】

特定の実施形態において、致死誘導タンパク質は、毒素、アポトーシス促進タンパク質、ウィングレス／統合（Ｗｎｔ）シグナル伝達経路の阻害剤、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）アンタゴニスト、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）アンタゴニストまたはそれらの致死誘導断片であり得る。特定の実施形態において、致死誘導タンパク質は、毒素またはその致死誘導断片である。特定の実施形態において、致死誘導タンパク質は、アポトーシス促進性タンパク質またはその致死誘導断片である。特定の実施形態において、致死誘導タンパク質は、Ｗｎｔシグナル伝達経路の阻害剤またはその致死誘導断片である。特定の実施形態において、致死誘導タンパク質は、ＢＭＰアンタゴニストまたはその致死誘導断片である。特定の実施形態において、致死誘導タンパク質は、ＦＧＦアンタゴニストまたはその致死誘導断片である。当業者には明らかであるように、分子の「致死誘導断片」は、致死を誘導するのに十分な分子の任意の断片である。

【0136】

特定の実施形態において、致死誘導タンパク質は、ジフテリア毒素Ａ（ＤＴＡ）（配列番号９３）、野生型カスパーゼ３（配列番号９５）、構成的に活性なカスパーゼ３（配列番号９７）、またはＮｏｇｇｉｎ（配列番号９９）であり得る。特定の実施形態において、致死誘導タンパク質は、シュードモナス外毒素（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢＵ６３１２４）、ジフテリア毒素（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＶ７０４８６）、またはリシン毒素（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＥＥＦ２７７３４）であり得る。特定の実施形態において、致死誘導タンパク質は、インターロイキン２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＡ００２２７）、ＣＤ３（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｐ０７７６６）、ＣＤ１６（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０００５６０．５）、インターロイキン４（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０００５８０．１）またはインターロイキン１０（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｐ２２３０１）であり得る。

【0137】

特定の実施形態において、致死は、ＲＮＡ誘導ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素によって媒介される。特定の実施形態において、ＤＮＡ編集剤は、鳥の必須遺伝子を標的とするガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列をさらに含み、該ヌクレオチド配列はインデューサー活性化部位特異的リコンビナーゼ酵素の活性に作動可能に連結されている。特定の実施形態において、必須遺伝子は、骨形成タンパク質受容体ＩＡ型（ＢＭＰＲ１Ａ、遺伝子ＩＤ：３９６３０８）、骨形成タンパク質２（ＢＭＰ２、遺伝子ＩＤ：３７８７７９）、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４、遺伝子ＩＤ：３９６１６５）、または線維芽細胞成長因子受容体１（ＦＧＦＲ１、遺伝子ＩＤ：３９６５１６）であり得る。

【0138】

当業者には明らかであるように、「ＲＮＡ誘導ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素」は、ＤＮＡをほどき、ガイドＲＮＡ分子に相補的な部位を探すＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素を包含する。特定の実施形態において、ガイドＲＮＡ分子は、配列番号６６～７７のうちの１つに示されるヌクレオチド配列を含む。

【0139】

セーフロック要素

【0140】

一実施形態において、本明細書に開示のＤＮＡ編集剤は、セーフロック要素が除去されるまで光遺伝子致死機構が不活性であることを保証する「セーフロック」要素をさらに含み得る。この要素は基本的に、既定では光遺伝子致死システムを不活性の状態にする。光遺伝子致死システムは、ゲノム編集された細胞が、ＤＮＡ編集剤に由来するセーフロック要素を削除できる薬剤にさらされた場合にのみ活性になる。この「セーフロック」機構は、光遺伝子システムは本質的に不活性であるため、製造プロセス全体を通じて、ＨＲを受けた細胞を光から保護する必要がなくなることを保証する。

【0141】

一実施形態において、セーフロック要素は、ＯＩＥにおけるプロモーターの下流だが、インデューサー活性化部位特異的リコンビナーゼをコードする配列の上流に挿入される。セーフロック要素は、ＯＩＥによってコードされるインデューサー活性化部位特異的リコンビナーゼの転写を防ぐヌクレオチド配列（ＳＴＯＰ要素）を含む（図２６Ａ、不活性な「ロック」状態を参照）。一実施形態において、セーフロック要素は、タンパク質のコード配列とそれに続くポリアデニル化部位を含む。他の実施形態において、下流のコード配列の転写を妨げる任意の他の配列もまた、安全なロック要素として使用され得る。一実施形態において、セーフロック要素は、２つのＦＲＴ部位に隣接する。したがって、該セーフロック要素は、Ｆｌｐリコンビナーゼの発現時に除去され得る。セーフロック要素が除去されると、ＯＩＥにおいてコードされた光遺伝子が転写され、光依存的方法で活性になり得る（図２６Ａ、活性な「ロック解除」状態）。

【0142】

別の実施形態において、セーフロック要素およびインデューサー活性化部位特異的リコンビナーゼをコードする配列は、Ｌｏｘ配列に隣接している（図２６Ｂ、不活性な「ロック」状態）。Ｃｒｅリコンビナーゼを発現すると、セーフロック要素およびインデューサー活性化部位特異的リコンビナーゼをコードする配列を除去することができ、したがって、ＬＩＥにおいてコードされる致死促進タンパク質の発現が可能になる（図２６Ｂ、致死活性化状態）。

【0143】

キメラヒヨコ

【0144】

本明細書で使用される場合、「キメラの」、「キメラ」または「キメラヒヨコ」という用語は、本明細書に開示のＤＮＡ編集剤を含む鳥細胞、または本明細書に開示のＤＮＡ編集剤を含む細胞を有する鳥を指す。キメラ胚またはキメラ成鳥は「代理」と呼ばれ得、したがって、これらの用語は同じ意味で使用できることにも注意する必要がある。キメラ鳥細胞の代表的な例には、本明細書に開示のＤＮＡ編集剤を含む生殖腺ＰＧＣ、血液ＰＧＣ、生殖三日月環ＰＧＣ、または配偶子などの鳥の原始生殖細胞（ＰＧＣ）が挙げられるが、これらに限定されない。キメラ鳥の代表的な例には、本明細書に開示されるＤＮＡ編集剤を含む細胞を有するニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、キジ、またはダチョウが挙げられるが、これらに限定されない。

【0145】

本明細書で使用する「方法」という用語は、化学、薬理学、生物学、生化学、医学の実務家により既知の、または、化学、薬理学、生物学、生化学、医学の実務家による既知の方法、手段、技術、および手順から容易に開発される方法、手段、技術、および手順を含むが、これらに限定されない、所定のタスクを達成するための方法、手段、技術、および手順を指す。

【0146】

一実施形態において、式５'－ＯＩＥ－ＬＩＥ－３'または式５'－ＬＩＥ－ＯＩＥ－３'を含む、本明細書に開示の外因性ポリヌクレオチドカセットを含む鳥細胞が提供され、（ｉ）ＯＩＥが、インデューサー活性化部位特異的リコンビナーゼ酵素をコードする第２のヌクレオチド配列に機能的に連結した第１のプロモーターを含む、光遺伝学的誘導性要素であり、（ｉｉ）ＬＩＥが、インデューサー活性化部位特異的リコンビナーゼ酵素の活性に機能的に連結した致死促進タンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列を含む、致死誘導要素である。外因性ポリヌクレオチドカセットは、細胞のＺ染色体に安定して組み込まれる。

【0147】

別の態様では、本明細書に開示されるような外因性ポリヌクレオチドカセットを含む鳥細胞を含む、鳥細胞集団がさらに提供される。ポリヌクレオチドカセットは、式５'－ＯＩＥ－ＬＩＥ－３'または式５'－ＬＩＥ－ＯＩＥ－３'を含み、（ｉ）ＯＩＥが、インデューサー活性化部位特異的リコンビナーゼ酵素をコードする第２のヌクレオチド配列に機能的に連結した第１のプロモーターを含む、光遺伝学的誘導性要素であり、（ｉｉ）ＬＩＥが、インデューサー活性化部位特異的リコンビナーゼ酵素の活性に機能的に連結した致死促進タンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列を含む、致死誘導要素である。外因性ポリヌクレオチドカセットは、細胞のＺ染色体に安定して組み込まれる。

【0148】

特定の実施形態において、鳥の細胞は、式５'－ＬＨＡ－ＯＩＥ－ＬＩＥ－ＲＨＡ－３'または式５'－ＬＨＡ－ＬＩＥ－ＯＩＥ－ＲＨＡ－３'を含む外因性ポリヌクレオチドカセットを含み、（ｉ）ＬＨＡが、鳥の染色体Ｚ上の第１の対応するヌクレオチド配列と実質的に相同である第１のヌクレオチド配列を含む、左相同性アームであり、（ｉｉ）ＯＩＥが、インデューサー活性化部位特異的リコンビナーゼ酵素をコードする第２のヌクレオチド配列に機能的に連結した第１のプロモーターを含む、光遺伝学的誘導性要素であり、（ｉｉｉ）ＬＩＥが、インデューサー活性化部位特異的リコンビナーゼ酵素の活性に機能的に連結した致死促進タンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列を含む、致死誘導要素であり、（ｉｖ）ＲＨＡが、鳥の染色体Ｚ上の第２の対応するヌクレオチド配列と実質的に相同である第４のヌクレオチド配列を含む、右相同性アームである。

【0149】

特定の実施形態において、外因性ポリヌクレオチドカセットを含む鳥の細胞は、鳥の始原生殖細胞（ＰＧＣ）を含む。特定の実施形態において、鳥のＰＧＣは、生殖腺ＰＧＣ、血液ＰＧＣ、または生殖三日月環ＰＧＣであり得る。

【0150】

本明細書で使用される場合、「始原生殖細胞」および「ＰＧＣ」という用語は、初期胚に存在し、成鳥において半数体配偶子（すなわち、精子および卵子）に分化／発達させることができる二倍体細胞を指す。ＰＧＣは、胚盤葉からも発育の初期段階で入手し得る。

【0151】

当業者に知られているように、始原生殖細胞は、これらに限定されないが、生殖隆起、発育中の生殖腺、血液、および生殖三日月環などの発育中の鳥類胚における種々の発育段階および様々な部位から分離し得る（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ Ｉｎｔ ２１：４９５－９，１９９７、Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ Ｉｎｔ １９：１４３－９，１９９５、Ａｌｌｉｏｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ １６５：３０－７，１９９４、Ｓｗｉｆｔ，Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ １５：４８３－５１６、ＰＣＴ国際公報第ＷＯ９９／０６５３３号）。生殖隆起は、当業者に周知の発育中の胚の部分である（Ｓｔｒｅｌｃｈｅｎｋｏ，Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ ４５：１３０－１４１，１９９６、Ｌａｖｏｉｒ，Ｊ Ｒｅｐｒｏｄ Ｄｅｖ ３７：４１３－４２４，１９９４）。典型的には、ＰＧＣは過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）技術によって陽性に染色され得る。いくつかの種では、抗ＳＳＥＡ抗体を使用して、ＰＧＣを特定できる（ＳＳＥＡ抗原を表示しないＰＧＣの１つの顕著な例外はシチメンチョウである）。フィコール密度勾配遠心分離を使用した血液からのＰＧＣの濃縮を含むＰＧＣの単離および精製のための様々な技術が当該技術分野で知られている（Ｙａｓｕｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｒｅｐｒｏｄ Ｆｅｒｔｉｌ ９６：５２１－５２８，１９９２）。

【0152】

ＰＧＣのｉｎ ｖｉｔｒｏ培養は、ニワトリおよびウシ血清、馴化培地、フィーダー細胞、ＦＧＦ２などの成長因子を含む培地を使用して可能である（ｖａｎ ｄｅ Ｌａｖｏｉｒ ｅｔ ａｌ．２００６，Ｎａｔｕｒｅ ４４１：７６６－７６９．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０４８３１、Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．２０１０，ＰＬｏＳ ＯＮＥ ５：ｅ１２９６８．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００１２９６８、ＭａｃＤｏｎａｌｄ ｅｔ ａｌ．，２０１０．ＰＬｏＳ ＯＮＥ ５：ｅ１５５１８．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００１５５１８）。ＦＧＦ、インスリンおよびＴＧＦ－βシグナル伝達経路を活性化する成長因子を含むフィーダー代替培地を使用してＰＧＣを増殖できることが示された（Ｗｈｙｔｅ ｅｔ ａｌ．２０１５，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ ５：１１７１－１１８２．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｓｔｅｍｃｒ．２０１５．１０．００８）。

【0153】

原始生殖細胞（ＰＧＣ）は、任意の適切な技術によって本開示の主題を実施するために提供および処方され、所望に応じて使用前に保存、凍結、培養などされ得る。例えば、原始生殖細胞は、適切な胚形成期にドナー胚から収集され得る。鳥類の発育の段階は、２つの技術的に認知されたステージ分類システム、すなわち、発育の前原始線条段階に言及するのにローマ数字を使用するＥｙａｌ－Ｇｉｌａｄｉ ＆ Ｋｏｃｈａｖシステム（ＥＧ＆Ｋ：Ｅｙａｌ－Ｇｉｌａｄｉ ＆ Ｋｏｃｈａｖ，Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ ４９：３２１－３２７，１９７６）、および産卵後段階に言及するのにアラビア数字を使用するＨａｍｂｕｒｇｅｒ ＆ Ｈａｍｉｌｔｏｎステージ分類システム（Ｈ＆Ｈ：Ｈａｍｂｕｒｇｅｒ ＆ Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｊ Ｍｏｒｐｈｏｌ ８８：４９－９２，１９５１）のうちの１つによって本明細書では記載している。特に明記しない限り、本明細書で記載している段階は、Ｈ＆Ｈステージ分類システムによる段階である。特定の実施形態において、ＰＧＣは、ステージ１４（Ｈ＆Ｈ）胚から分離された血液に由来する。特定の実施形態において、ＰＧＣは、ステージ１５（Ｈ＆Ｈ）胚から分離された血液に由来する。特定の実施形態において、ＰＧＣは、ステージ１６（Ｈ＆Ｈ）胚から分離された血液に由来する。

【0154】

一実施形態において、ＰＧＣは、ステージ４で、または後期ステージにおいて血液、生殖隆起、もしくは生殖腺から収集される細胞を有するステージ３０を介して、生殖三日月環ステージで分離され得る。始原生殖細胞は、概して、体細胞の二倍のサイズであり、サイズに基づいて体細胞から容易に区別および分離され得る。雄（または同型配偶子）の始原生殖細胞（ＺＺ）は、特定のドナーから生殖細胞を収集し、そのドナーから他の細胞をタイピングするなど、任意の適切な技術によって異型配偶子始原生殖細胞（Ｚｗ）と区別され得、収集された細胞はタイピングされた細胞と同じ染色体型である。

【0155】

ＰＧＣの使用に対する代替は、本明細書に開示されているＤＮＡ編集剤を使用した精子の直接トランスフェクションである（Ｃｏｏｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１６ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ ２６：３３１－３４７，ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ１１２４８－０１６－０００３－０）。

【0156】

一実施形態において、ｉｎ ｖｉｔｒｏで編集されたＰＧＣからキメラ鳥を生成するために、外因性編集細胞は、その内因性ＰＧＣが生殖隆起に移動する段階で、代理宿主胚に静脈注射される。「ドナー」ＰＧＣは、代理宿主胚と同じ種または異なる種を有してもよい。編集された「ドナー」ＰＧＣは、生存可能なままである必要があり、一実施形態において、それらが形成する生殖腺にコロニー形成し、編集された染色体を、生殖細胞系列を通じて伝達する場合、内因性ＰＧＣを打ち負かす。ドナーＰＧＣに利点を提供するために、内因性ＰＧＣの数を化学的または遺伝的アブレーションによって減らすことができる（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ａｎｄｒｏｌｏｇｙ ３：１０３５－１０４９．ｄｏｉ：１０．１１１１／ａｎｄｒ．１２１０７）。代理胚の胚盤葉を乳化ブスルファンにさらすと、ドナーＰＧＣの生殖細胞系列伝達が９０％超に増加することが示されているが、ＰＧＣを培養または凍結保存した場合、この率は大幅に低下する（Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｒｅｐｒｏｄ Ｆｅｒｔｉｌ Ｄｅｖ ２０：９００－９０７．ｄｏｉ：１０．１０７１／ＲＤ０８１３８、Ｎａｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ａｎｉｍ Ｒｅｐｒｏｄ Ｓｃｉ．１５３：５０－６１．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ａｎｉｒｅｐｒｏｓｃｉ．２０１４．１２．００３）。天然ＰＧＣに対する編集されたＰＧＣの比率を歪める他の方法は、米国特許出願第２００６／００９５９８０号に記載されている。

【0157】

特定の実施形態において、概して遺伝子的に改変されたＰＧＣは、当該技術分野で知られている成体生殖腺に移植され得る（Ｔｒｅｆｉｌ ｅｔ ａｌ．，２０１７ Ｓｃｉ Ｒｅｐ，Ｏｃｔ ２７；７（１）／：１４２４６ ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５９８－０１７－１４４７５－ｗ）。

【0158】

遺伝的に改変された細胞（例えば、ＰＧＣ）は、細胞を解離（例えば、機械的解離により）し、細胞を薬学的に許容可能な担体（リン酸緩衝食塩水など）と密接に混和することにより、他の鳥に投与するために処方され得る。一実施形態において、始原生殖細胞は、生殖腺始原生殖細胞、または血液始原生殖細胞である（「生殖腺」または「血液」は元の胚ドナーの起源の組織を指す）。投与される始原生殖細胞は、異型配偶子（Ｚｗ）または同型配偶子（ＺＺ）であり得る。一実施形態において、ＰＧＣは、生理学的に許容される担体で、約６～約８または８．５のｐＨで、所望の効果を達成するのに適した量で投与され得る（例えば、胚あたり１００から３０，０００ＰＧＣ）。ＰＧＣは、他の成分または細胞を含まずに投与され得、または他の細胞および成分は、ＰＧＣとともに投与され得る。

【0159】

始原生殖細胞のｉｎ－ｏｖｏでのレシピエント動物への投与は、ＰＧＣが発生中の生殖腺になおも移動し得ることができる任意の適切な時点で実施することができる。一実施形態において、投与は、Ｅｙａｌ－Ｇｉｌａｄｉ ＆ Ｋｏｃｈａｖ（ＥＧ＆Ｋ）ステージ分類システムによる約ステージＩＸから胚発生のＨａｍｂｕｒｇｅｒ ＆ Ｈａｍｉｌｔｏｎステージ分類システムによる約ステージ３０まで行われるか、別の実施形態においては、ステージ１５で行われる。したがって、ニワトリの場合、投与の時期は、胚発生の１、２、３、または４日目であり、例えば、２日目～２．５日目である。投与は、典型的には、羊膜（胚を含む）、卵黄嚢などによって規定される領域など、任意の適切な標的部位への注入によって行われる。一実施形態において、細胞は、胚自体（胚体壁を含む）に注入される。代替の実施形態において、胚への血管内または体腔内注射を使用し得る。他の実施形態では、注入は心臓に行われる。本明細書で開示の主題の方法は、ｉｎ－ｏｖｏでレシピエント鳥の事前に滅菌して（例えば、ガンマ線またはＸ線照射によるブスルファンを使用する化学処理によって）実行され得る。本明細書で使用される場合、「滅菌」という用語は、内因性ＰＧＣに由来する配偶子を部分的にまたは完全に産生し得ないことを指す。ドナー配偶子がそのようなレシピエントから収集されるとき、それらはドナーおよびレシピエントの配偶子との混合物として収集され得る。この混合物を直接使用し得るか、この混合物をさらに処理して、その中のドナー配偶子の割合を高め得る。

【0160】

始原生殖細胞のｉｎ－ｏｖｏ投与は、任意の適切な技術により、手動でまたは自動化された方法で実行され得る。一実施形態では、ｉｎ－ｏｖｏ投与は注入により行われる。ｉｎ－ｏｖｏ投与の機構は重要ではないが、処理が孵化率を過度に低下させないように、機構が胚の組織および器官またはそれを取り囲む胚体外膜を過度に損傷させてはならない。約１８～２６ゲージの針を取り付けた皮下注射器が目的に適している。直径約２０～５０ミクロンの開口部を備えたガラス製の先鋭的引き抜きピペットを使用してもよい。発生の正確なステージと胚の位置に応じて、１インチ針は、ヒヨコの上にある流体またはヒヨコ自体の中のいずれかで終端する。針の損傷または鈍化を防止するために、針を挿入する前に、シェルにパンチでまたはドリルで下穴を開けることができる。必要に応じて、卵をワックスなどの実質的に細菌不浸透性シーリング材料でシールして、その後の望ましくない細菌の侵入を防ぐことができる。鳥類の胚に対する高速注入システムは、本明細書で開示の主題を実施するのに適していると想定される。本明細書に開示の方法を実施するように適合されるそのような装置すべてが、本明細書に記載されている始原生殖細胞の製剤を含む注射器を含み、注射器は、装置によって担持された卵を注入するように位置決めされる。さらに、注射後に卵における穴をシールするために、注入装置に動作可能に接続されたシーリング装置が提供され得る。別の実施形態において、引かれたガラスマイクロピペットを使用して、ＰＧＣを卵内の適切な場所、例えば、直接血流内に、静脈もしくは動脈のいずれかに、または直接心臓内に、導入し得る。

【0161】

卵に改変されたＰＧＣが注入されると、キメラ胚はインキュベートされて孵化する。一実施形態において、ヒヨコは、性的成熟まで飼育され、キメラ鳥はドナーＰＧＣに由来する配偶子を産生する。

【0162】

特定の実施形態において、鳥の細胞は、鳥の配偶子を含む。次に、キメラ由来（または、本明細書での上記の記載のように直接遺伝子操作された材料由来）の配偶子（卵または精子）を使用して、ファウンダーニワトリ（Ｆ１）を飼育する。当該技術分野で既知の分子生物学の技術（例えば、ＰＣＲおよび／またはサザンブロット）を使用して、生殖細胞系列伝達を確認してもよい。Ｆ１ニワトリを戻し交配して、ホモ接合ＺＺキャリア雄とキャリア雌を生成し得る（Ｆ２）。次いで、ファウンダーニワトリ由来配偶子Ｆ２を使用して、繁殖コロニーを拡大し得る。コロニーは、通常、性的成熟まで成長される。これらの群れから得られる受精卵は、致死表現型を誘発するインデューサー（例えば、青色光）へさらすことによって、雄の初期胚死亡について試験され得る。誘導（例えば、青色光照明による）後、卵をインキュベートし（例えば、８日間）、スクリーニングして（例えば、ライトキャンドリングによって）、初期胚死亡を検出する。

【0163】

一実施形態において、鳥細胞集団に式５'－ＯＩＥ－ＬＩＥ－３'または式５'－ＬＩＥ－ＯＩＥ－３'を有する外因性ポリヌクレオチドカセットを投与することを含む、キメラ鳥を生成する方法が提供され、（ｉ）ＯＩＥが、インデューサー活性化部位特異的リコンビナーゼ酵素をコードする第２のヌクレオチド配列に機能的に連結した第１のプロモーターを含む、光遺伝学的誘導性要素であり、（ｉｉ）ＬＩＥが、インデューサー活性化部位特異的リコンビナーゼ酵素の活性に機能的に連結した致死促進タンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列を含む、致死誘導要素である。外因性ポリヌクレオチドカセットは、細胞のＺ染色体に安定して組み込まれる。次に、これらのゲノム編集された細胞は、レシピエント鳥胚に注入される。

【0164】

別の実施形態において、鳥細胞集団に式５'－ＬＨＡ－ＯＩＥ－ＬＩＥ－ＲＨＡ－３'または式５'－ＬＨＡ－ＬＩＥ－ＯＩＥ－ＲＨＡ－３'を有する外因性ポリヌクレオチドカセットを投与することを含む、キメラ鳥を生成する方法が提供され、（ｉ）ＬＨＡが、鳥の染色体Ｚ上の第１の対応するヌクレオチド配列と実質的に相同である第１のヌクレオチド配列を含む、左相同性アームであり、（ｉｉ）ＯＩＥが、インデューサー活性化部位特異的リコンビナーゼ酵素をコードする第２のヌクレオチド配列に機能的に連結した第１のプロモーターを含む、光遺伝学的誘導性要素であり、（ｉｉｉ）ＬＩＥが、インデューサー活性化部位特異的リコンビナーゼ酵素の活性に機能的に連結した致死促進タンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列を含む、致死誘導要素であり、（ｉｖ）ＲＨＡが、鳥の染色体Ｚ上の第２の対応するヌクレオチド配列と実質的に相同である第４のヌクレオチド配列を含む、右相同性アームである。外因性ポリヌクレオチドカセットは、細胞のＺ染色体に安定して組み込まれる。次に、これらのゲノム編集された細胞は、レシピエント鳥の胚に注入される。

【0165】

特定の実施形態において、方法は、孵化するまで、ｉｎ－ｏｖｏでキメラ鳥胚をインキュベートすることをさらに含む。特定の実施形態において、方法は、キメラ鳥を性的成熟まで飼育することをさらに含み、キメラ鳥は投与された細胞に由来する配偶子を産生する。

【0166】

特定の実施形態において、ゲノム編集された細胞は、ｉｎ－ｏｖｏ注射によって投与される。別の実施形態において、胚を卵殻から取り出し、「ｅｘ－ｏｖｏ」で注入し、次に代理卵殻内に戻すことができる。特定の実施形態において、投与された細胞集団は、レシピエント鳥胚と同じ鳥類の種に由来する。特定の実施形態において、投与された細胞集団は、レシピエント鳥胚と異なる鳥類の種に由来する。

【0167】

別の実施形態において、キメラ鳥は、ゲノム編集されたＰＧＣを胚盤葉に注入することによって生成し得る。概して、ゲノム編集されたＰＧＣは、内因性ＰＧＣが配置されている場所に戻すか注入して戻し得る。一実施形態において、ゲノム編集されたＰＧＣは、胚盤葉に戻し得る。あるいは、ゲノム編集されたＰＧＣは、生殖三日月環、血液、胚生殖腺、さらには成体生殖腺に戻し得る。

【0168】

特定の実施形態において、ゲノム編集された鳥細胞集団は、レシピエント胚がＥｙａｌ－Ｇｉｌａｄｉ ＆ Ｋｏｃｈａｖステージ分類システムによる約ステージＩＸであるときに投与される。特定の実施形態において、鳥細胞集団は、レシピエント胚がＨａｍｂｕｒｇｅｒ ＆ Ｈａｍｉｌｔｏｎステージ分類システムによる約ステージ３０であるときに投与される。特定の実施形態において、細胞集団は、レシピエント胚がＥｙａｌ－Ｇｉｌａｄｉ ＆ Ｋｏｃｈａｖステージ分類システムによる約ステージＩＸ、およびＨａｍｂｕｒｇｅｒ ＆ Ｈａｍｉｌｔｏｎステージ分類システムによる約ステージ３０であるときに投与される。特定の実施形態において、細胞集団は、レシピエント胚がＨａｍｂｕｒｇｅｒ ＆ Ｈａｍｉｌｔｏｎステージ分類システムによるステージ１４の後にあるときに投与される。

【0169】

特定の実施形態において、ゲノム編集された鳥細胞集団は、胚の照射後に投与される。特定の実施形態において、照射は、γ線照射またはＸ線照射を含む。特定の実施形態において、照射は、６００～８００ラジアンのγ線照射を含む。特定の実施形態において、照射は、６００～８００ラジアンの照射を含む。特定の実施形態において、照射は、４００～１０００ラジアンの照射を含む。特定の実施形態において、照射は、２００～１２００ラジアンの照射を含む。

【0170】

別の態様において、上記の方法から得られるキメラ鳥がさらに提供される。

【0171】

使用方法

【0172】

一実施形態において、鳥の細胞を、本明細書に記載の式５'－ＯＩＥ－ＬＩＥ－３'または式５'－ＬＩＥ－ＯＩＥ－３'を有する外因性ポリヌクレオチドカセットと接触させるステップを含む、鳥の細胞を生成する方法が提供される。外因性ポリヌクレオチドカセットは、細胞のＺ染色体に安定して組み込まれる。別の実施形態において、方法は、鳥の細胞を、式５'－ＬＨＡ－ＯＩＥ－ＬＩＥ－ＲＨＡ－３'または式５'－ＬＨＡ－ＬＩＥ－ＯＩＥ－ＲＨＡ－３'を有する外因性ポリヌクレオチドカセットと接触させるステップを含む。外因性ポリヌクレオチドカセットは、細胞のＺ染色体に安定して組み込まれる。

【0173】

別の実施形態において、鳥の受精卵における雄胚における致死を誘導する方法が提供され、本明細書に開示のＤＮＡ編集剤を鳥細胞の集団に投与して、ゲノム編集された鳥細胞を生成するステップ；これらのゲノム編集された鳥細胞をレシピエントの鳥胚に移すステップ；および胚を、ＤＮＡ編集剤によってコードされる致死促進タンパク質の発現を誘発するインデューサーにさらし、それにより鳥の雄胚において致死を誘導するステップを含む。光遺伝学的誘導性要素、インデューサー活性化部位特異的リコンビナーゼ、インデューサー、致死促進タンパク質などの、ＤＮＡ編集剤の様々な要素が上で考察されてきた。

【0174】

一実施形態において、雄胚において致死を誘導する上記の方法において使用されるＤＮＡ編集剤は、（ｉ）配列番号１０５の配列を含むＬＨＡ、（ｉｉ）配列番号１１６の配列に接続されている、配列番号１０４の配列に接続されている、配列番号１０２の配列に接続されている、配列番号１０３の配列に接続されている、配列番号１０１の配列に接続されている、配列番号１１６の配列に接続されている、配列番号１００の配列を含むＯＩＥ、または配列番号１１６の配列に接続されている、配列番号１０４の配列に接続されている、配列番号１０８の配列に接続されている、配列番号１０３の配列に接続されている、配列番号１０７の配列に接続されている、配列番号１１６の配列に接続されている、配列番号１００の配列を含むＯＩＥ、（ｉｉｉ）配列番号９２、または配列番号９４、または配列番号９６、または配列番号９８の配列を含むＬＩＥ、および（ｉｖ）配列番号１０６の配列を含むＲＨＡ、を含む。

【0175】

別の実施形態において、鳥の受精卵において雄胚に致死を誘導する方法が提供され、鳥細胞の集団に、本明細書に開示されるようなセーフロック要素を含むＤＮＡ編集剤を投与し、それにより、ゲノム編集された鳥細胞を生成するステップ；これらのゲノム編集された鳥細胞をレシピエント鳥胚に移すステップ；および胚を、ＳＴＯＰ要素からＳＴＯＰ要素を除去する薬剤にさらし、それにより、ＤＮＡ編集剤によってコードされる致死促進タンパク質の発現を誘発し、鳥の受精卵において雄胚の致死を誘導するステップを含む。光遺伝学的誘導性要素、インデューサー活性化部位特異的リコンビナーゼ、インデューサー、セーフロック要素、致死促進タンパク質などの、ＤＮＡ編集剤の様々な要素が上で考察されてきた。一実施形態において、雄胚に致死を誘導する上記の方法で使用されるＤＮＡ編集剤は、配列番号１２０～１２７のうちの１つの配列を含む。

【0176】

一実施形態において、ＤＮＡ編集剤からのＳＴＯＰ要素の除去は、ＳＴＯＰ要素が２つのＦＲＴ部位に隣接している場合にＦｌｐの発現を必要とする（図２６Ａ、不活性な「ロック」状態を参照）。一実施形態において、Ｆｌｐの発現は、ゲノム編集された鳥類細胞を、Ｆｌｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列（例えば、配列番号１２９または配列番号１３１）と接触させることによって達成され得る。Ｆｌｐリコンビナーゼを発現すると、プロモーターと、ＯＬＥにおけるインデューサー活性化部位特異的リコンビナーゼをコードする配列との間に挿入されたＳＴＯＰ要素が除去され、したがって、インデューサー活性化部位特異的リコンビナーゼの発現が可能になる（図２６Ａ、活性「ロック解除」状態）。インデューサー（例えば、青色光）にさらに曝露すると、インデューサー活性化部位特異的リコンビナーゼが活性化され、その結果、ＯＬＥの除去、およびＬＩＥにおいてコードされる致死促進タンパク質の発現がもたらされる（図２６Ａ、致死活性化状態）。

【0177】

別の実施形態において、ＳＴＯＰ要素の除去は、ゲノム編集された鳥細胞を、Ｃｒｅタンパク質をコードするヌクレオチド配列（例えば、配列番号１２８または配列番号１３２）と接触させることによって達成され得る。一実施形態において、セーフロック要素およびインデューサー活性化部位特異的リコンビナーゼをコードする配列は、Ｌｏｘ配列に隣接している（図２６Ｂ、不活性な「ロック」状態）。Ｃｒｅリコンビナーゼを発現すると、セーフロック要素およびインデューサー活性化部位特異的リコンビナーゼをコードする配列が除去され、したがって、ＬＩＥにおいてコードされる致死促進タンパク質の発現が可能になる（図２６Ｂ、致死活性化状態）。

【0178】

本明細書で提供される技術の原理によれば、致死誘導のステップは、任意の発育段階、例えば産卵直後で行われ得る。死が誘導されるのが早ければ早いほど、胚は早く死ぬだろう。したがって、胚の死亡率は、その後達成される。毒素またはアポトーシス促進剤を使用して胚の死を誘導する場合、胚は、誘導後すぐに死ぬ。ＬＩＥがＢＭＰなどの必須のシグナル伝達経路を破壊する遺伝子に基づいている場合、例えばＢＭＰ４アンタゴニストＮｏｇｇｉｎを発現させることによって、経路が活性化して必要とされる発生時点で細胞死が誘導される。例えば、ＢＭＰは、胞胚形成、原腸形成、神経胚形成、器官形成を含む段階中、活性である。特定の実施形態において、致死は、産卵中に誘導され、胚はＮｏｇｇｉｎへの曝露後約３６時間以内に死ぬ。一例として、産卵直後に光遺伝学的システムが活性化されると（ステージＸ－ＸＩＩＩ ＥＧ＆Ｋ）、胚はそのステージで死ぬ。ＢＭＰ４ノックアウトマウス胚は、ニワトリ胚発生における最初の３０～３６時間のインキュベーションに相当する、交尾後６．５日（ｄｐｃ）～約８．５～９ｄｐｃに子宮内で死ぬ。特定の実施形態において、致死は、受精から孵化までの２１日間の間に誘導される。特定の実施形態において、致死は、受精から孵化までの２１日間に１回より多く誘導される。特定の実施形態において、致死は、ステージＸ－ＸＩＩＩ ＥＧ＆Ｋとして知られる初期の胞胚形成ステージ前の卵において誘導される（Ｅｙａｌ－Ｇｉｌａｄｉ ａｎｄ Ｋｏｃｈａｖ，１９７６）。

【0179】

特定の実施形態において、方法は、ｉｎ－ｖｉｖｏで実行される。特定の実施形態において、方法は、ｅｘ－ｖｉｖｏで実行される。特定の実施形態において、方法は、ｉｎ－ｏｖｏで実行される。特定の実施形態において、方法は、ｉｎ－ｖｉｔｒｏで実行される。

【0180】

明確にするために、別個の実施形態の文脈において説明されている特定の実施形態の特定の特徴もまた、単一の実施形態で組み合わせて提供され得ることが理解される。逆に、簡潔にするために単一の実施形態の文脈で説明されている特定の実施形態の様々な特徴はまた、別個に、または任意の適切な部分的組み合わせで、または任意の他の記載の実施形態において適切として提供され得る。様々な実施形態についてのコンテキストで説明されている特定の特徴は、実施形態がそれらの要素を備えずに動作不能でない限り、それらの実施形態の本質的な特徴とみなされるべきではない。

【0181】

上記に記載され、以下の特許請求の範囲で請求される様々な実施形態および態様は、以下の実施例において実験的支持が見出される。

【実施例】

【0182】

ここで、上記の記載とともにいくつかの実施形態を非限定的な方法で示す以下の実施例を参照する。

【0183】

概して、本明細書で使用される命名法および利用される実験手順は、分子、生化学、微生物学および組換えＤＮＡ技術を含む。そのような技術は文献で十分に説明されている。例えば、"Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ"Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）、"Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ"Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ－ＩＩＩ Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．ｅｄ．（１９９４）、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，"Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ"，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８９）、Ｐｅｒｂａｌ，"Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ"，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）、Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，"Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ"，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｂｉｒｒｅｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ）"Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ"，Ｖｏｌｓ．１－４，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９８）、米国特許第４，６６６，８２８号、同第４，６８３，２０２号、同第４，８０１，５３１号、同第５，１９２，６５９号、および同第５，２７２，０５７号に記載されている方法、"Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ"，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ－ＩＩＩ Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．，ｅｄ．（１９９４）、"Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ－Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ"ｂｙ Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９４），Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、"Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ"Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ－ＩＩＩ Ｃｏｌｉｇａｎ Ｊ．Ｅ．，ｅｄ．（１９９４）、Ｓｔｉｔｅｓ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ），"Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ"（８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ（１９９４）、Ｍｉｓｈｅｌｌ ａｎｄ Ｓｈｉｉｇｉ（ｅｄｓ），"Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ"，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８０）を参照されたく、利用可能な免疫測定法については特許および科学文献に広範にわたって記載されており、例えば、米国特許第３，７９１，９３２号、同第３，８３９，１５３号、同第３，８５０，７５２号、同第３，８５０，５７８号、同第３，８５３，９８７号、同第３，８６７，５１７号、同第３，８７９，２６２号、同第３，９０１，６５４号、同第３，９３５，０７４号、同第３，９８４，５３３号、同第３，９９６，３４５号、同第４，０３４，０７４号、同第４，０９８，８７６号、同第４，８７９，２１９号、同第５，０１１，７７１号、および同第５，２８１，５２１号、"Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ"Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．，ｅｄ．（１９８４）、"Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ"Ｈａｍｅｓ， Ｂ． Ｄ．，ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．，ｅｄｓ．（１９８５）、"Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ"Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．，ｅｄｓ．（１９８４）、"Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ"Ｆｒｅｓｈｎｅｙ， Ｒ．Ｉ．，ｅｄ．（１９８６）、"Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ"ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）、"Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ"Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．，（１９８４）、および"Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ"Ｖｏｌ．１－３１７，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、"ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ"，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）、Ｍａｒｓｈａｋ ｅｔ ａｌ．，"Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ－Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ"ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）を参照されたく、これらのすべてが、本明細書に完全に記載されているかのように参照により本明細書に組み込まれる。他の一般的な参考文献は本明細書全体を通して提供されている。それらにおける手順は、当該技術分野で周知であると考えられ、読者の便宜のために提供されている。それらに含まれるすべての情報は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0184】

実施例１

【0185】

ゲノム改変ニワトリ系統の生成は多段階のプロセスである。最終製品は、産業界で今日使用されている産卵鶏と、ゲノムの内容に関して完全に同一の雌産卵鶏雌鶏系統である（図１参照）。

【0186】

一実施形態において、ワークフローは、５つの主要なステップ：（１）ニワトリ始原生殖細胞（ＰＧＣ）系統を生成し、培養すること；（２）培養ＰＧＣにおけるゲノム改変；（３）改変ＰＧＣの胚への移植、および生殖細胞系列伝達についてスクリーニングされたキメラニワトリを生産し、潜在的なファウンダー保因者を特定すること；（４）キメラから得られた遺伝物質からファウンダーニワトリを繁殖させること；（５）ファウンダーニワトリのコロニーをファウンダーの群れに拡大し、生殖細胞系列の伝達を再検証すること、を含む。

【0187】

材料および方法

【0188】

ＰＧＣ培地：鳥類ＰＧＣ培地は、水で２５０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌに希釈したＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）カルシウムフリー培地で構成され、鳥類ＤＭＥＭ中、１２．０ｍＭグルコース、２．０ｍＭ ＧｌｕｔａＭａｘ（Ｇｉｂｃｏ）、１．２ｍＭピルベート（Ｇｉｂｃｏ）、１倍ＭＥＭビタミン（Ｇｉｂｃｏ）、１倍Ｂ－２７サプリメント（Ｇｉｂｃｏ）、１倍ＮＥＡＡ（Ｇｉｂｃｏ）、０．１ｍＭβ－メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）、１倍ヌクレオシド（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）、０．２％オボアルブミン（Ｓｉｇｍａ）、０．１ｍｇ／ｍｌヘパリンナトリウム（Ｓｉｇｍａ）、ＣａＣｌ_２ ０．１５ｍＭ（Ｓｉｇｍａ）、１倍ＭＥＭビタミン（Ｇｉｂｃｏ）、１倍Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）、０．２％ニワトリ血清（Ｓｉｇｍａ）を含む。次の成長因子、ヒトアクチビンＡを２５ｎｇ／ｍＬ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、ヒトＦＧＦ２を４ｎｇ／ｍＬ（Ｒ＆Ｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、オボトランスフェリン（５μｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ）を使用前に追加した。ＡｋｏＤＭＥＭは、グルコース、ピルベートおよびビタミンを含む希釈培地を指す。

【0189】

ＰＧＣ株の誘導：ＰＧＣ株は、ステージ１４～１６（Ｈ＆Ｈ）胚から分離された約１．０～３．０μＬの血液を４８ウェルプレート内の３００μＬの培地に入れることによって誘導された。培地は２日ごとに交換された。総細胞数が１×１０^５に達したとき、培地の総量を２日ごとに交換し、細胞を２～４×１０^５細胞／ｍｌ培地で増殖させた。細胞を１０％ＤＭＳＯを含むＰＧＣ培地で凍結し、温度を徐々に－８０℃まで下げて、１～３日間保存し、液体窒素に移した。

【0190】

性別判定およびＰＧＣ株の特徴付け：各ＰＧＣ株は、性別、ＰＧＣマーカーのｍＲＮＡ発現、および既知のＰＧＣマーカーＳＳＥＡ１４のタンパク質発現について特徴付けられた。ドナー胚由来のＤＮＡを分離し、将来の参照のために保管した。性別については、２～４×１０^５ＰＧＣ細胞由来のＤＮＡを収集し、１００μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ（Ｓｉｇｍａ）を含むテールバッファー（１０２－Ｔ、Ｖｉａｇｅｎ）に再懸濁し、５５℃で３時間インキュベートした。プロテイナーゼＫは８５℃で４５分間不活性化された。コントロールとして雌染色体（Ｐ１７、Ｐ１８）およびリボソームＳ１８（Ｐ１９、Ｐ２０）を標的とするＷ染色体に由来のプライマーを用いて、性別判定のためのＰＣＲを実行した。遺伝子発現解析のために、ＴＲＩＺＯＬ試薬を使用してＲＮＡを精製し、逆転写ＰＣＲ反応（ＧｏＳｃｒｉｐｔ Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、Ｐｒｏｍｅｇａ）によるｃＤＮＡライブラリー生成のために、１μｇのＲＮＡを使用した。ｃＤＮＡは、それぞれＤａｚｌ、Ｓｏｘ２、ｃＰｏｕＶ、Ｎａｎｏｇ、Ｋｌｆ４、ｃＶＨプライマー、Ｐ２１－Ｐ２２、Ｐ２３－Ｐ２４、Ｐ２５－Ｐ２６、Ｐ２７－Ｐ２８、Ｐ２９－Ｐ３０、Ｐ３１－Ｐ３２をそれぞれ使用することにより、ＰＣＲのためのテンプレートとして機能した。

【0191】

抗ＳＳＥＡ１抗体を用いた免疫組織染色：細胞を収集し、４％ＰＦＡで固定し、ＰＢＳ０．１％トリトン中の５％正常ヤギ血清でブロックし、ブロッキングバッファー中抗ＳＳＥＡ１抗体（ＤＳＨＢ、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ｂａｎｋ）の１：１００希釈で一晩染色した。二次抗体が１時間加えられた（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、分子プローブ）ＰＢＳ０．１％トリトンで３０分間細胞を洗浄した後、細胞をＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ）で対比染色し、封入剤（Ｈｉｓｔｏｍｏｕｎｔ、ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で封入し、カバーした。

【0192】

ＰＧＣのトランスフェクション、選択およびＦＡＣＳ選別において、ＰＧＣのプラスミドトランスフェクションは、リポフェクションまたはエレクトロポレーションを使用して行われた。リポフェクションについては、製造業者のプロトコルに従ってリポフェクタミン２０００を使用した。３～５×１０^５個の細胞を９６ウェルプレートに、ＮＥＡＡ、ピルベート、ビタミン、ＣａＣｌ_２および成長因子（アクチビンＡ、ｈＦＧＦ、およびオボトランスフェリン）を含むＡｋｏＤＭＥＭで播種した。１００ｎｇのプラスミドおよび０．２５μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を別々に２０μｌのＯＰＴＩ－ＭＥＭ ｍｉｘで希釈し、２０分間インキュベートし、細胞にピペッティングした。エレクトロポレーションについては、３×１０^５個～１．５×１０^６個の細胞をＡｋｏＤＭＥＭで洗浄し、ネオンエレクトロポレーター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において１０００Ｖ、１２ｍｓ、３パルスでエレクトロポレーションを行い、抗生物質を含まないＰＧＣ培地でそれぞれ９６ウェルプレートまたは４８ウェルプレートに即時に播種した。培地を１～３時間後に交換した。２５～１００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８を用いた選択を、７２時間後に２～４週間開始した。選択に続いて、細胞を個別に手動で、またはＦＡＣＳ選別により分離した。ＦＡＣＳ選別については、穏やかな細胞のピペッティングを行い、細胞をＰＧＣ培地で選別した。陽性ＧＦＰ細胞が、ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩを用いて新しい９６ウェルプレートにウェルごとに１つの細胞として選別され、またはプールされた。（ＢＤ ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ、ＵＳＡ）を使用して、ＦＡＣＳ分析を行った。）

【0193】

プラスミド調製：

【0194】

ＣＲＩＳＰＲプラスミドのクローニング：ＣＲＩＳＰＲ配列は、ＣＲＩＳＰＲ設計ツール、Ｚｈａｎｇ ｌａｂ，ＭＩＴを使用して設計された。ｐｘ３３０－ＧＦＰプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃４２２３０から改変された）は、ＢｂｓＩ制限酵素を使用して切断され、ＣＲＩＳＰＲ部位挿入のための骨格として機能し、ｓｇＲＮＡを形成した。記載されているように、ｓｇＲＮＡ ＣＲＩＳＰＲ部位のオリゴ－ＣＲＩＳＰＲ１、ＣＲＩＳＰＲ３（それぞれオリゴＰ３４－Ｐ３５およびＰ３６－Ｐ３７）を９５℃で３０秒間変性させ、ゆっくりアニールし、ＢｂｓＩ切断プラスミドに結合し、Ｅ．ｃｏｌｉに形質転換し、精製し、配列検証した（Ｃｏｎｇ Ｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１３ Ｊａｎ ３．１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２３１１４３ ＰｕｂＭｅｄ ２３２８７７１８）。

【0195】

ｐＪｅｔ－ＨＡｓプラスミドのクローニング：５'ＨＡおよび３'ＨＡの両方を含むＺ染色体上のＨＩＮＴ１Ｚ遺伝子座に対して下流のゲノム領域を、ＰＣＲ（Ｋａｐａ、Ｒｏｃｈｅ）を使用して、Ｐ１およびＰ２プライマーでＰＧＣ ＤＮＡから増幅した。ＰＣＲ産物を精製し、製造業者のプロトコルに従ってｐＪｅｔ１．２プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に結合させた。

【0196】

ターゲティングベクターの構築：ｐＣＡＧＧ－ＩＲＥＳ－Ｎｅｏ－ＧＦＰプラスミドをＰＣＲのためのテンプレートとして使用し、Ｐ５－Ｐ６プライマーを使用して、インサートｐＣＡＧＧ－ＩＲＥＳ－Ｎｅｏ－ＧＦＰを増幅した。ｐＪｅｔ－ＨＡｓプラスミドをＰＣＲのためのテンプレートとして使用し、Ｐ３－Ｐ４プライマーを使用して、５'ＨＡおよび３'ＨＡを含むベクターを増幅した。ギブソン集合反応は、それぞれ０．０３ｐｍ、０．０６ｐｍの線状化された産物を取る精製されたベクターおよびインサートＰＣＲ産物に対して行われた。ギブソンアセンブリ反応産物をプラスミド調製のためにＥ．ｃｏｌｉに形質転換して、配列検証した。

【0197】

ｐＣＡＧＧ－Ｏｐｔｏｇｅｎｅベクターの構築：ｐＣＡＧＧ－Ｏｐｔｏｇｅｎｅベクターを生成するために、光遺伝子プラスミドｐｍＣｈｅｒｒｙ－ＣＩＢＮ－ＣｒｅＣおよびｐｍＣｈｅｒｒｙ－Ｃｒｙ２－ＣｒｅＮ１１をテンプレートとして使用し、Ｐ４０－Ｐ４１およびＰ４２－Ｐ４３プライマーを使用して光遺伝子を増幅し、それぞれ１．３ｋｂおよび２．１ｋｂ産物を得た。２つの産物は、プライマーＰ４１およびＰ４２において導入されたＰ２Ａ部位で重複配列を共有する。シングルサイクルオーバーハング延出ＰＣＲを使用して、２つの断片を結合させて、アガロースゲルから洗浄された単一の３．５ｋｂ産物にした。この産物を、それぞれＳｍａＩおよびＮｈｅＩ制限部位を有する尾部を含むプライマーＰ４４およびＰ４５を使用して、ＰＣＲについてのテンプルとして使用されたｐＪｅｔ１．２シャトルベクターに連結させた。この産物を、適切な制限酵素を使用して消化し、ベクターとして機能するＳｍａＩおよびＮｈｅＩ消化ｐＣＡＧＧ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰプラスミドに連結させる連結のためのインサートとして使用した。連結産物を大腸菌に形質転換し、増殖したプラスミドを配列検証した。

【0198】

ｐＧＫ－ＤＴＡ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰベクターの構築：ｐＧＫ－ＤＴＡ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰを生成するために、発現ベクターｐＳＫ ＢＳ－ＰＧＫ－ＤＴＡを、それぞれＸｍａＩおよびＮｈｅＩ制限部位についての拡張配列を含むプライマーＰ４６およびＰ４７を用いたＰＣＲのためのテンプレートとして使用した。０．６５ｋｂ産物をそれぞれの酵素で消化し、連結のためのベクターとして機能するｐＧＫ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰプラスミドにおいてＸｍａＩ－ＮｈｅＩ相補部位への連結のためのインサートとして使用された。連結産物を大腸菌に形質転換し、増殖したプラスミドを配列検証した。

【0199】

Ｉｎ－ｏｖｏエレクトロポレーション：Ｉｎ－ｏｖｏエレクトロポレーションは基本的に、前述のとおりに行われた。受精卵を３７．８℃で５６～６０時間インキュベートし、卵殻に窓を開け、約２μｇ／μｌの濃度のプラスミドＤＮＡを、直径１０～１５μｍの開口を有する鋭利なマイクロピペットを使用して神経管に注入した。ＥＣＭ８３０方形波エレクトロポレーションシステム（ＢＴＸ）を使用して、２５Ｖ、３０ｍｓの３つのパルスが送出された。エレクトロポレーション後、卵殻をパラフィルムでシールし、胚を分析までさらにインキュベートした。

【0200】

エンドヌクレアーゼアッセイ：Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００試薬を使用して、ＰＧＣにＣＲＩＳＰＲ１またはＣＲＩＳＰＲ３プラスミドをトランスフェクトした。４８時間後、個々のＧＦＰ陽性細胞を９６ウェルプレートに分離し、培養して純粋なコロニーを形成した。ＤＮＡを回収し、ＣＲＩＳＰＲ部位に隣接する３５０ｂｐ領域をＰ３８－Ｐ３９プライマーでＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物は９５℃で変性し、ゆっくりアニールし、Ｔ７エンドヌクレアーゼを用いて３７℃で１時間インキュベートした。較正目的で、かつポジティブコントロールとして、３５０ｂｐ ＰＣＲ産物をｐＪｅｔ１．２にサブクローニングし、部位特異的変異誘発を使用してＣＲＩＳＰＲ部位を変異させた。導入された変異は、ＷＴ配列ＡＴＡＣＣＡＧＡＴＡＡＣＧＴｇＣＣＴＴＡＴＴＴＧＧＣＣＧＴＴ（配列番号２）をＡＴＡＣＣＡＧＡＴＡＡＣＧＴａａｔＣＣＴＴＡＴＴＴＧＧＣＣＧＴＴ（配列番号３）に置き換えた。この人為的変異は、エンドヌクレアーゼアッセイ（図７Ａ）およびコントロール配列決定（図８Ｂ）の両方に対するポジティブコントロールとして機能した。

【0201】

サザンブロットアッセイ：５'ＨＡ、３'ＨＡおよびＮｅｏ遺伝子プローブのＤｉｇラベリングを、ＤＩＧ ＤＮＡラベリングミックス（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、それぞれプライマーＰ１３－Ｐ１４、Ｐ１５－Ｐ１６およびＰ１１－Ｐ１２用いたＰＣＲ増幅（Ｌｏｎｇａｍｐ、ＮＥＢ）により調製した。１５μｇのゲノムＤＮＡをＢｇｌＩＩ制限酵素を用いて３７℃で一晩消化した。ＤＮＡ断片を、０．８％（ｗ／ｖ）アガロースゲル（２０Ｖ、１２時間）での電気泳動により分離し、正に帯電したナイロン膜（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に転写した。転写後、各側で２５４ｎｍに設定されたＵＶ光を３分間使用して湿潤膜を架橋し、次いで２ＸＳＳＣでリンスした。ＤＩＧ Ｅａｓｙ－Ｈｙｂハイブリダイゼーション溶液（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、膜を４２℃で２時間プレハイブリダイズさせた。プローブ（５０ｎｇ／ｍｌ）を５分間で９５℃まで加熱することによって変性させ、即座に氷に浸漬させた。変性されたプローブを、１０ｍｌの温かいＤＩＧ Ｅａｓｙ－Ｈｙｂ溶液に加えて、４２℃で１２時間ハイブリダイズさせた。膜を室温で０．１％ＳＤＳの２ＸＳＳＣ中で撹拌させながら１０分間２回洗浄し、次いで０．１％ＳＤＳの０．２ＸＳＳＣ中で撹拌させながら６５℃で３０分間３回洗浄した。さらなる洗浄およびブロッキングが、ＤＩＧ洗浄およびブロックバッファーセット（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、かつそれらのプロトコルに従って行われた。ＤＩＧラベリングが、ＣＤＰ－Ｓｔａｒ試薬（Ｒｏｃｈｅ）を使用する化学ルミネッセンス反応が後続する抗ジゴキシゲニン－ＡＰ抗体１：１００００（Ｒｏｃｈｅ）を使用して検出された。Ｇ：ＢＯＸ ｇｅｌ ｉｍａｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｙｎｇｅｎｅ）を使用して画像を撮影した。

【0202】

胚へのＰＧＣ注入およびホールマウント染色：産卵されたばかりの卵を、３７．８℃、湿度５５％で５８～６２時間、先端を上に向けた状態でインキュベートした。インキュベーション後、卵殻に４～８ｍｍの窓を開け、約３０～４０μｍの開口を有する鋭利なマイクロピペットを使用して、３０００～８０００のＰＧＣを血流に注入した。窓を白い卵膜で覆い、さらにパラフィルム（Ｐａｒａｆｉｌｍ）またはＬｅｕｋｏｐｌａｓｔ（ＢＳＮ ｍｅｄｉｃａｌ ＧｍｂＨ）テープでシールした。胚を、孵化するまでインキュベートした。注入された胚のいくつかの生殖腺が分離され、ホールマウントＧＦＰ染色のために取られた。生殖腺を、４％ＰＦＡ中に固定し、ＰＢＳ１％Ｔｒｉｔｏｎ中５％正常ロバ血清でブロックしたＰＢＳで２時間洗浄し、ブロッキングバッファー中マウス抗ＳＳＥＡ１抗体またはウサギ抗ＧＦＰ抗体１：５００（Ａｂｃａｍ）の１：２０希釈で一晩染色した。ＰＢＳ１％ｔｒｉｔｏｎで２時間洗浄した後、二次ロバ抗マウスｃｙ３抗体１：５００（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）または二次ａｌｅｘａ４８８抗ウサギ抗体１：５００（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）をブロッキングバッファー中に３時間添加した。組織をＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ）で対比染色し、グリセロール中に取り付け、共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ、ＴＣＳ ＳＰＥ、ヴェッツラー、ドイツ）で撮像した。

【0203】

プライマーＰ１～Ｐ３２の配列は、配列番号４～３５に記載されており、プライマーＰ３４～Ｐ４７の配列は配列番号３６～４９に記載されている。

【0204】

プラスミドの配列は以下に記載する。

【0205】

１．ｐＸ３３０－ＧＦＰ（配列番号５０）、２．ＣＲＩＳＰＲ１（配列番号５１）、３．ＣＲＩＳＰＲ３（配列番号５２）、４．ｐＪｅｔ－Ｈａｓ（配列番号５３）、５．ｐＣＡＧＧ－Ｎｅｏ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰ（配列番号５４）、６．ターゲティングベクター（配列番号５５）、７．ｐｍＣｈｅｒｒｙ－Ｃｒｙ２－ＣｒｅＮ（配列番号５６）、８．ｐｍＣｈｅｒｒｙ－ＣＩＢＮ－ＣｒｅＣ（配列番号５７）、９．ｐＢ－ＲＡＧＥ－ＧＦＰ（配列番号５８）、１０．ｐＣＡＧＧ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰ（配列番号５９）、１１．ｐＣＡＧＧ－Ｏｐｔｏｇｅｎｅｓ（配列番号６０）、１２．ｐＢ－ＲＡＧＥ－ｍＣｈｅｒｒｙ（配列番号６１）、１３．ｐＳＫ ＢＳ－ＰＧＫ－ＤＴＡ（配列番号６２）、１４．ｐＧＫ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰ（配列番号６３）、１５．ｐＧＫ－ＤＴＡ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰ（配列番号６４）。

【0206】

結果

【0207】

ＰＧＣ株の誘導および特性評価

【0208】

胚発生の初期段階時、産卵直後および原腸形成の開始前に、ＰＧＣは胚外中胚葉層の前部の胚の生殖三日月環領域に対して吻側に移動する。この移動は、体細胞がそうであるように、ＰＧＣを分化プロセスを経ることから「保護」すると考えられている。約２．５日間のインキュベーション（ステージ１４～１７Ｈ＆Ｈ）の後、血管暗域（Ａｒｅａ Ｏｐａｃａ Ｖａｓｃｕｌｏｓａ）、血液および心拍の形成まで、細胞が血流を介して胚に戻り、生殖腺を誘発する生殖隆起にコロニー形成することはない。これらの段階で、直径約４０～６０μｍの開口を有するマイクロピペットを使用して、胚の血管系から１～３μｌの血液を採取し、４８ウェルプレート内のＰＧＣ培地に移した。ＰＧＣ培地は、ＰＧＣの速い分裂（２０～２４時間の細胞周期）を可能にする一方、フィーダーのない条件下で未分化状態を維持する。２～３週間の培養後、血液細胞は分解して消失した。別のさらに１～２週間以内に、培養されたＰＧＣはコンフルエントになった（図５Ａ）。これらの細胞は、遺伝子改変のためにさらに培養され得、または後者の改変のためにうまく凍結および解凍され得る。培養中のニワトリＰＧＣは、形態学的特徴、タンパク質およびｍＲＮＡ発現パターンを使用し、最終的にはステージが一致するレシピエント胚の血管系に注入されたときのそれらの生殖腺遊走の能力によって、文献で広く特徴付けられた。これらの特性は、生成されたＰＧＣ細胞培養物において調べられて、それらが良好に確立されたＰＧＣ機能を保持していることを示した。形態的には、ＰＧＣは、大きい核を含む直径約１５～２０μｍの大きくて、わずかに粒状化した細胞である。ＰＧＣは全能性細胞であり、したがって、ｃＰｏｕＶ、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４およびＮａｎｏｇ、ならび２つのユニークな生殖細胞マーカー、すなわち、ｃＶＨおよびＤＡＺＬなどの多能性マーカーを発現する。各ＰＧＣ株について、ポジティブコントロールとしてのリボソームＳ１８についてのプライマー（Ｐ１９～Ｐ２０、２５６ｂｐの産物サイズ）、および雌を特定するＷ染色体のプライマー（Ｐ１７～Ｐ１８、４１５ｂｐの産物サイズ）を使用して、性別判定のためにＤＮＡを抽出した（図５Ｂ）。さらに、ＰＧＣは膜ＳＳＥＡ－１抗原４を発現する（図５Ｃ）。

【0209】

ＰＧＣの１０個の株が、産卵鶏およびブロイラー、雄および雌の株の両方から確立された。プラスミドのトランスフェクションは、負に帯電したＤＮＡと相互作用するカチオン性脂質トランスフェクション試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を使用して実行され、細胞への浸透を可能にする。ＧＦＰをコードするプラスミド（ｐＣＡＧＧ－ＧＦＰ）のトランスフェクションは、約１５～２０％のトランスフェクション効率をもたらした（図５Ｄ）。さらに、エレクトロポレーションを使用したＰＧＣのトランスフェクションは、最大９０％のより高い効率をもたらした（図５Ｅ）。培養されたＰＧＣが生殖腺にうまく定着することを実証するために、ＧＦＰ発現ＰＧＣをステージ１４～１６Ｈ＆Ｈの血流に注入し、胚を１０日間インキュベートした。胚を解剖し、ＧＦＰ陽性細胞を生殖腺において特定した（図５Ｆ）。

【0210】

Ｚ染色体上のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９標的の設計

【0211】

一実施形態において、Ｚ染色体へのＤＮＡ編集は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９および相同組換えプロセスを使用して行われた。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムはＺ染色体の特定の部位でＤＮＡを直接切断するが、相同組換えプロセスを使用した内因性修復システムにより、正確な場所への所望のＤＮＡの標的化挿入が可能になる。この目的のために、Ｚ染色体上の挿入部位に対応する相同性アームを含むターゲティングベクタープラスミドの構築が必要である。コード遺伝子ＨＩＮＴ１Ｚの下流のＺ染色体におけるＤＮＡ挿入のための部位を選択した。ＣＲＩＳＰＲシステムの使用により、多くの研究で直接ＤＮＡ挿入イベントを改善することが示された。その目的のために広く使用されているｐｘ３３０プラスミドは、ｓｇＲＮＡ部位およびＣａｓ９酵素を含む。ｓｇＲＮＡ部位は、Ｃａｓ９酵素を標的部位に向け、特定のゲノム標的化ＤＳＤＢに繋がるユニークな配列が含まれている。ＣＲＩＳＰＲ設計エンジンツールを使用して、図６Ａに示すようにｓｇＲＮＡについて特有の配列を特定した。スコアに応じた上位１２個のガイドを図６Ｂに示す。ガイド１～１２の配列は、配列番号６６～７７に記載されている。

【0212】

ガイド＃１および＃３は、従来の二次構造の類似性によって選択され、不一致の程度によりスコア化されたニワトリゲノム内の可能なオフターゲット部位をチェックするために使用された。ガイド＃１についての潜在的なオフターゲットの検索の上位１０個の結果を図６Ｃおよび配列番号７８～８７に示す。特に、上位６個のオフターゲットには４つの不一致があり、このガイドの特異性が強調されている。

【0213】

Ｃａｓ－９のｃ末端に融合したインフレームＧＦＰを含む改変ｐｘ３３０プラスミドを切断することにより、ＤＮＡ配列挿入を行った。ｓｇＲＮＡ配列を含むアニールされたプライマーは、上述のようにＢｂｓＩ制限酵素に連結された（図６Ｂ）。連結産物を大腸菌に形質転換し、プラスミドを精製し、ｓｇＲＮＡの挿入を配列決定によって検証した。

【0214】

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムの活性検証

【0215】

フィーダーのない培地でＰＧＣを増殖させることにより、単一細胞に由来する純粋なコロニーが得られ、それによりＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムの効率の特性化が可能になる。このため、ＰＧＣはｐＸ３３０－ＧＦＰ－ＣＲＩＳＰＲ１およびｐＸ３３０－ＧＦＰ－ＣＲＩＳＰＲ３プラスミドのいずれかがトランスフェクトされ、クローンコロニーが成長された。ＧＦＰを発現する単一細胞に由来するコロニーから全ゲノムＤＮＡを抽出した。ＤＮＡをエンドヌクレアーゼアッセイにより分析し、配列決定した。エンドヌクレアーゼアッセイのために、ポジティブコントロールが設計された。このコントロールは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９活性の予測部位に変異が挿入された３２０ｂｐ ＰＣＲ産物であった。この産物を、それぞれ変異：ＷＴの異なる比率１：１５、１：７、１：１で類似の長さのＷＴ産物と混合し、アニールした混合物をエンドヌクレアーゼ活性に供した（図７Ａ）。１３６ｂｐおよび１８４ｂｐの予測されたサイズでの２つの短いバンドは、１：７および１：１の比率で明確に見え、アッセイが適切に機能していることを示した。同様に、ＣＲＩＳＰＲ１およびＣＲＩＳＰＲ３プラスミドのいずれかでトランスフェクトされた１２個のコロニーから得られたゲノムＤＮＡに対して同じアッセイを実行した（図７Ｂ、７Ｃ）。１２個のコロニーのうちの９個で、予測されたサイズの明確なダブレットが観察された。これは、ＣＲＩＳＰＲ１およびＣＲＩＳＰＲ３プラスミドの両方が、予測された部位でＤＳＤＢを効率的に生成することを示している。

【0216】

配列解析については、エンドヌクレアーゼアッセイのために使用されたＰＣＲ産物（図７Ａ～７Ｃ）も配列決定された（図８Ａ～８Ｄ）。ＷＴネガティブコントロールの配列決定により、ＣＲＩＳＰＲ１の予測される切断部位が明らかになった（図８Ａ）。ポジティブコントロールとして、ＷＴおよび人工的に変異された産物の混合物を配列決定することにより、予測される切断部位の直後のＤＮＡクロマトグラムにおける二重ピークの出現が明らかになった（矢印、図８Ｂ）。トランスフェクトされたコロニーの同じゲノム領域の同様の配列決定により、陰性コロニー（図８Ｃ）および陽性コロニー（図８Ｄの矢印）の両方が明らかになり、後者は事例の＞７０％であった。

【0217】

ゲノム組み込みのためのターゲティングベクターの構築

【0218】

ＨＲを使用して、Ｚ染色体への標的化ゲノム組み込みを実証するために、ターゲティングベクターを設計した（図９）。ベクターには、ｐＣＡＧＧプロモーターに続いて、ネオマイシン選択遺伝子、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、ＧＦＰおよびウサギベータグロビンポリアデニル化部位が含まれる。このカセットには、それぞれ５'末端および３'末端に約１．５ｋｂの相同性アームが隣接していた。このベクターを生成するために、両方の相同性アームを含む約３ｋｂのＤＮＡ断片を、プライマーＰ１およびＰ２を使用して増幅し、シャトルベクターｐｊｅｔ１．２に連結した。この断片の完全な配列決定は、ニワトリのゲノム配列と同一であることがわかった。このプラスミドｐＪｅｔ－ＨＡｓをテンプレートとして使用して、ＣＲＩＳＰＲ ｓｇＲＮＡ部位を間に含む２３ｂｐ配列を除く２つの分離した相同性アームを含む線状化ＰＣＲ産物を生成した。増幅は、ｐＣＡＧＧ－Ｎｅｏ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰカセットの端に対応する５'末端に配列を含むＰ３およびＰ４プライマーを使用して行なわれた。この線状化ＰＣＲ産物は「ベクター」と呼ばれる。ｐＣＡＧＧ－Ｎｅｏ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰプラスミドを、テンプレートとして使用して線状化ＰＣＲ産物を生成した。この断片は、それぞれ５'ＨＡおよび３'ＨＡ末端の３'および５'末端に対応する配列を含むプライマーＰ５およびＰ６を使用して増幅された。この産物は「インサート」と呼ばれる。ベクターおよびインサートをギブソンアセンブリ反応を使用してつなぎ合わせ、最終的なターゲティングベクターを作成した。

【0219】

ターゲティングベクターおよびＣＲＩＳＰＲプラスミドを使用したＺ染色体への相同組換え

【0220】

単一の細胞から純粋なＰＧＣコロニーを得る能力は、ＰＣＲおよびサザンブロットなどの方法を使用して、適切に挿入されたＨＲを受けた陽性コロニーの特定を可能にする。ＰＧＣトランスフェクションについては、５～１０％（図１０Ａ）のトランスフェクション効率を有するリポフェクションまたは＞４０％の効率を有するエレクトロポレーションを使用した。トランスフェクションを、２つのプラスミド、ターゲティングベクターおよび上記の２つのＣＲＩＳＰＲの１つ（ＣＲＩＳＰＲ１またはＣＲＩＳＰＲ３）を用いて実行した。トランスフェクション後、細胞を回収するために２４時間放置し、選択のためにＧ－４１８含有培地に移した。選択した２週間後、Ｇ－４１８耐性細胞のみが生存し、そのうちの＞９９％がＧＦＰ陽性であった（図１０Ｂ）。細胞が生殖腺にコロニー形成する能力を保持していることを確認するために、図１Ｆ（図１０Ｃ）で前述したように、その細胞を宿主胚に注入した。生殖腺を、抗ＧＦＰ抗体で免疫染色し、生殖腺におけるＧＦＰ陽性ＰＧＣ細胞のコロニー形成を共焦点顕微鏡を使用して検証した（図１０Ｄ）。

【0221】

Ｇ－４１８耐性のＧＦＰ陽性細胞は、潜在的に不均一な集団からなる。したがって、ＨＲ組み込みを検証し、純粋な均質集団を得るために、ＦＡＣＳ選別を使用して、単一のＧＦＰ陽性細胞を９６ウェルプレートへ分離した（図１１Ａ）。純粋なコロニーを飼育し、ＰＣＲおよびサザンブロット解析のためにゲノムＤＮＡを抽出した。並行して、プールされたＧＦＰ陽性細胞をＦＡＣＳ選別した。ＰＣＲ解析のために、２セットのプライマーを設計した。第１には、５'ＨＡに対して上流の順方向Ｐ７およびＣＡＧＧプロモーターからの逆方向Ｐ８（１．６ｋｂの産物サイズ）、第２には、ウサギベータグロビンポリアデニル化部位からの順方向Ｐ９および３'ＨＡに対して下流の逆方向Ｐ１０（１．８ｋｂの産物長、図１１Ｂ）である。プールされた細胞（図１１Ｃ）および純粋なコロニー（図１１Ｄ）における両方で、５'および３'について予想される産物が検出され、これらの細胞で適切なＨＲ組み込みが生じたことを示した。

【0222】

適切なＨＲ組み込みをさらに検証し、ターゲティングベクターの単一のコピーのみがゲノムに組み込まれていることを確認するために、サザンブロット解析を行った。雄および雌のドナーからの２つのＰＧＣ細胞株を解析した。注目すべきことに、雌の株はＺ染色体の単一のコピーのみを有する。３つのジゴキシゲニン標識（ｄｉｇ標識）ＤＮＡプローブを設計した（図１２Ａおよび図１２Ｂを参照）。それぞれ５００ｂｐの長さのプライマーＰ１１－Ｐ１２およびＰ１３－Ｐ１４を使用して増幅された最初の２つのプローブは、それぞれ５'および３'ＨＡの上流および下流に位置する。７０４ｂｐの長さのプライマーＰ１５～Ｐ１６を使用して増幅された３番目のプローブは、ターゲティングベクター内部のＮｅｏ遺伝子を検出するように設計されているため、ベクターの単一のコピーのみが組み込まれたことを確認できる。ＢｇｌＩＩ制限酵素を使用して、解析のためにゲノムＤＮＡを切断した。互いに約６．５ｋｂ離れた２つの制限部位は、それぞれ５'および３'プローブの上流および下流のＷＴ染色体上に位置する。追加のＢｇｌＩＩ部位はターゲティングベクター内に位置し、予測される７．５ｋｂおよび３．３ｋｂの断片を得て、適切なＨＲ組み込みを特定する。雄のＰＧＣ株から抽出されたゲノムＤＮＡのサザンブロット解析の結果は、それぞれ５'および３'部位について、予測された大きさ、すなわち、ＷＴ対立遺伝子に対して６．５ｋｂおよび正しいＨＲ組み込みを受けた対立遺伝子に対して７．５ｋｂおよび３．３ｋｂの２つのバンドを明らかにした。これは、プールされた細胞からのＤＮＡおよび純粋なコロニーの両方について確認された（図１２Ｃ）。雌のＰＧＣ細胞株についても同様の解析を行った。この場合、５'組み込み部位の予測されるサイズの７．５ｋｂで単一のバンドが見つかった。雌ゲノムはＺ染色体の単一のコピーのみを含むため、ＷＴ対立遺伝子（６．５ｋｂ）は検出されなかった。Ｎｅｏ遺伝子を厳密に調査すると、７．５ｋｂの予測されるサイズの単一のバンドが明らかになり、ターゲティングベクターの単一コピーのみがゲノムに組み込まれていることが確認された（図１２Ｄ）。

【0223】

ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＨＥＫ２９３細胞、およびｉｎ－ｏｖｏでのニワトリ胚における光遺伝学的システムの検証。

【0224】

ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ－ｏｖｏでのニワトリ胚における誘導システムの活性を検証するために、３つのプラスミド、ｐｍＣｈｅｒｒｙ－Ｃｒｙ２－ＣｒｅＮ、ｐｍＣｈｅｒｒｙ－ＣＩＢＮ－ＣｒｅＣおよびレポーターＰＢ－ＲＡＧＥ－ＧＦＰをＨＥＫ２９３細胞（図１３）およびヒヨコ胚（図１４）にトランスフェクトした。最初の２つの光遺伝学的プラスミドは、成功裏のトランスフェクションを確認するレポーター遺伝子ｍＣｈｅｒｒｙをコードする。ＰＢ－ＲＡＧＥ－ＧＦＰ抑制ベクターには、ＧＦＰコーディング領域の上流のＬｏｘＰ部位に隣接する複数の停止コドン配列が含まれている。Ｃｒｅ活性化時に、ＳＴＯＰコドンが除去され、したがって、ＧＦＰを発現させることが可能になる。一方、トリプルトランスフェクションされ、暗所で保たれたネガティブコントロールＨＥＫ２９３細胞において、ＧＦＰ陽性細胞は存在しなかった（図１３、上段）。トランスフェクションの２４時間後に青色光照明にさらされた細胞において、多くの細胞がＧＦＰを発現し（図１３、下段）、これらの細胞における光遺伝学的システムの活性化を確認した。

【0225】

ｉｎ－ｏｖｏでの光遺伝学的システムの活性を検証するために、ステージ１６Ｈ＆Ｈでのニワトリ胚神経管へのエレクトロポレーションによりｐｍＣｈｅｒｒｙ－Ｃｒｙ２－ＣｒｅＮ、ｐｍＣｈｅｒｒｙ－ＣＩＢＮ－ＣｒｅＣおよびＰＢ－ＲＡＧＥ－ＧＦＰプラスミドを用いたトリプルトランスフェクションを行った。エレクトロポレーションの１２時間後、ネガティブコントロール胚を暗所に保ちながら、実験群の胚に１５秒間の青色光照射を行った。胚をさらに１２時間インキュベートし、蛍光ステレオスコープでＧＦＰ発現を確認した（図１４）。暗所に保たれた胚においては（図１４、上段）、ｍＣｈｅｒｒｙのみが発現され、成功裏のエレクトロポレーションを確認したが、実験群の胚においては、ＧＦＰ陽性細胞が明確に現れ（図９、下段）、光誘導性Ｃｒｅが活性化されたことが確認された。

【0226】

光遺伝子プラスミドｐｍＣｈｅｒｒｙ－Ｃｒｙ２－ＣｒｅＮおよびｐｍＣｈｅｒｒｙ－ＣＩＢＮ－ＣｒｅＣは、ニワトリ細胞においては好ましくないＣＭＶプロモーターを使用して遺伝子の発現を駆動する。これを克服し、２つを単一のベクターに結合するために、ニワトリ細胞において活性が高いＣＡＧＧプロモーターの下で、Ｐ２Ａ自己切断ペプチドによって連結されたＣＩＢＮ－ＣｒｅＣおよびＣｒｙ２－ＣｒｅＮ、続くＩＲＥＧ－ＧＦＰの発現を駆動するプラスミドベクターを設計した。ｐＣＡＧＧ－ＣＩＢＮ－ＣｒｅＣ－Ｐ２Ａ－Ｃｒｙ２－ＣｒｅＮ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰの合成は、Ｋｅｎｎｅｄｙ ｅｔ ａｌ．，２０１０（Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１０ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ；７（１２）：９７３－９７５）に記載されている元の光遺伝子プラスミドの修飾に基づいた。これらのプラスミドの各々は、ｍＣｈｅｒｒｙに続いて、ＣＩＢＮ－ＣｒｅＣ（Ｃｒｅ酵素のＣ末端に融合したＣＩＢ１の切り取り形）またはＣＲＹ２－ＣｒｅＮ（Ｃｒｅ酵素のＮ末端に融合したクリプトクロム２、図１５Ａ）のいずれかを有するＩＲＥＳ配列をコードする。次のクローニングの目標は、ＣＡＧＧプロモーターの下で、２つの融合光遺伝子を自己切断ペプチドＰ２Ａを、続いてＩＲＥＳ－ＧＦＰを結合することであった。この目的ため、ＣＩＢＮ－ＣｒｅＣプラスミドをＰ４０およびＰ４１プライマーを用いたＰＣＲについてのテンプレートとして使用し、ＣＲＹ２－ＣｒｅＮプラスミドをＰ４２およびＰ４３プライマーを用いたＰＣＲについてのテンプレートとして使用した（図１５Ａ）。特に、Ｐ２Ａ切断部位を含むプライマーＰ４１およびＰ４２は、１サイクルのオーバーハング延出ＰＣＲによって２つの産物をマージできるオーバーラップ配列を共有する（図１５Ｂ）。ＣＩＢＮ－ＣｒｅＣ－Ｐ２Ａ－ＣＲＹ２－ＣｒｅＮを含むこの産物を、シャトルベクターｐＪｅｔ１．２に連結し、配列検証した（図１５Ｃ）。このプラスミドは、５'および３'末端にそれぞれＳｍａＩおよびＮｈｅＩ制限部位を産物に付加したプライマーＰ４４およびＰ４５を用いたＰＣＲについてのテンプレートとして機能した（図１５Ｄ）。この産物を制限酵素で消化し、同じ酵素を使用して切断もしたｐＣＡＧＧ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰプラスミドに連結した（図１５Ｅ）。この連結産物は、ＣＡＧＧプロモーター、続いてＣＩＢＮ－ＣｒｅＣ、Ｐ２Ａ自己切断ペプチド、ＣＲＹ２－ＣｒｅＮ、ＩＲＥＳ、ＧＦＰおよびウサギベータグロビンポリアデニル化サイト（本明細書ではｐＣＡＧＧ－Ｏｐｔｏｇｅｎｅと呼ばれる）を含み、配列検証された（図１５Ｆ）。

【0227】

ｉｎ－ｖｉｔｒｏでｐＣＡＧＧ－Ｏｐｔｏｇｅｎｅベクターの活性を検証するために、成功裏のトランスフェクションのためのレポーターとしてＧＦＰを発現するプラスミドを、ｐＢ－ＲＡＧＥ－ｍＣｈｅｒｒｙを用いてＨＥＫ２９３にコトランスフェクションを行った。上記のＰＢ－ＲＡＧＥ－ＧＦＰベクター（図１３）と同様に、ｐＢ－ＲＡＧＥ－ｍＣｈｅｒｒｙは、ｍＣｈｅｒｒｙコーディング領域の上流のＬｏｘＰ部位に隣接する複数の停止コドン配列を含む。Ｃｒｅ活性化時に、停止コドンが除去され、したがって、ｍＣｈｅｒｒｙを発現させることが可能になる（図１６）。一方、コトランスフェクションされ、暗所で保たれた維持されたＨＥＫ２９３細胞においては、ｍＣｈｅｒｒｙ陽性細胞は存在しなかった（図１６、上段）。対照的に、青色光照明にさらされた細胞においては、多くの細胞がｍＣｈｅｒｒｙを発現しており（図１６、下段）、ｐＣＡＧＧ－Ｏｐｔｏｇｅｎｅｓの単一ベクター戦略がシステムの光遺伝的特性を維持していることを確認した。

【0228】

ｉｎ－ｏｖｏの生きているヒヨコ胚におけるｐＣＡＧＧ－Ｏｐｔｏｇｅｎｅベクターの活性を検証するために、ｐＢ－ＲＡＧＥ－ｍＣｈｅｒｒｙと一緒にステージ１４～１６Ｈ＆Ｈヒヨコ胚にエレクトロポレーションによってプラスミドにコトランスフェクションを行った。エレクトロポレーションの１２時間後、ネガティブコントロール群の卵は暗所に保ち、一方、実験群の胚は１５秒間青色光にさらした（図１７）。両方の群をさらに１２時間インキュベートし、蛍光ステレオスコープで検査した。インキュベーション後、両群において高レベルのＧＦＰ発現が明らかになり、成功裏のエレクトロポレーションが示された。ただし、光にさらされた群においてのみ（図１７、下段）、ｍＣｈｅｒｒｙ陽性発現細胞が特定され、ｐＣＡＧＧ－Ｏｐｔｏｇｅｎｅの単一ベクター戦略を使用した光遺伝学的システムが光誘導可能な方法で活性化されたことが示された。

【0229】

ヒヨコ胚の致死性の誘導

【0230】

毒素を使用して死亡を引き起こす実現可能性を示すために、ネガティブ選択マーカーとして一般に使用されるＤＴＡ１２のコーディング領域を、ｐＧＫプロモーターおよびそれに続くＩＲＥＳ－ＧＦＰを含む発現ベクター（ｐＧＫ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰ）にクローニングした。このプラスミドはネガティブコントロールとしても機能した。ＤＴＡコーディング領域は、細胞における発現時に細胞死に繋がるタンパク質合成を阻害するｐＧＫ－ＤＴＡ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰを誘発するＩＲＥＳ配列の上流にクローニングされた。

【0231】

ニワトリ胚におけるＤＴＡ発現の影響を試験するために、ステージ１４～１６Ｈ＆Ｈ胚を、ネガティブコントロールとしてのｐＧＫ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰまたはｐＧＫ－ＤＴＡ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰを用いてエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションの１２時間後、胚を蛍光顕微鏡下でＧＦＰの発現について解析した（図１８）。コントロール胚においてはＧＦＰが神経管内で広範に発現しが（図１８）、ＤＴＡを発現する胚においてはＧＦＰ発現は検出されず、これらの細胞においてはタンパク質合成がブロックされたことが示された。

【0232】

実施例２

【0233】

本明細書に記載の実験の目的は、致死誘導カセットを、雄または雌由来のＰＧＣのいずれかのＺ染色体に導入することであった。最終的な目標は、Ｚ染色体でのゲノム挿入を含む雌鶏を取得することであった。この染色体は次世代の雄胚にのみ分離し、青色光の誘導により致死誘導カセットを活性化し、したがって、雄胚は胚発生の初期段階で死ぬ。

【0234】

カセット別名ターゲティングベクター（ＴＶ）は、本明細書に記載されるように３つの要素を有する。第１の要素は、「相同性アーム」である。第２の要素は、「光遺伝学的誘導性要素」である。第３の要素は、「致死誘導カセット」である。一実施形態において、２つの約１．５ｋｂの相同性アームが、ＴＶの５'および３'末端の両方に配置されている。これは、相同組換え（ＨＲ）をＺ染色体上にあるＨＩＮＴ１Ｚ遺伝子座の下流に向けるように設計されている。ＨＩＮＴ１Ｚ遺伝子は、ＰＧＣおよび胚盤葉全体（これらは産卵されたばかりのヒヨコ胚）において転写されるため、ＨＲについてこの部位が選択された。Ｚ染色体上の他のすべてのオープンに転写された領域も、この目的のための潜在的に良い候補である。

【0235】

図２０は、ＰＧＣおよび全胚盤葉由来のｃＤＮＡに対するＦＷＤプライマー（配列番号８８）およびＲＥＶプライマー（配列番号８９）を使用するＲＴ－ＰＣＲを示す。産物予測サイズ１５３ｂｐ。

【0236】

第２の要素は、「光遺伝学的誘導性要素」である。一実施形態において、光遺伝学的システムは、特定の光波長の下で励起され、それらが二量体化することを可能にするコンフォメーションに変化するタンパク質に基づく。２つの光遺伝学的タンパク質が二量体化した場合にのみ標的遺伝子の転写が行われるように、これらのタンパク質を追加のタンパク質と融合させることが可能である。例えば、第１のタンパク質がＧａｌ４－ＢＤ（Ｇａｌ４結合ドメイン）などのＤＮＡ標的ドメインと融合し、第２のタンパク質がＧａｌ４－ＡＤ（Ｇａｌ４活性化ドメイン）などの転写活性化因子と融合している場合、下流の遺伝子を活性化することが可能である。同様に、抑制ドメインを使用して遺伝子発現を抑制し得る。しかし、光遺伝子の問題は、それらがある程度の基本的な二量体化を有し、したがって、光の誘導に関係なく起こる遺伝子の活性化であるということである。誘導に対する感受性および基本的な二量体化の間の適切なバランスを見つけることは、それらの使用の鍵である。Ｋｅｎｎｅｄｙ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（Ｒａｐｉｄ ｂｌｕｅ－ｌｉｇｈｔ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｌｉｖｉｎｇ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ７，９７３－９７５，２０１０）において開発されたシステムの修正版が使用された。元の光遺伝子プラスミドは、ニワトリ細胞においては好ましくないＣＭＶプロモーターを使用して遺伝子の発現を駆動するｐｍＣｈｅｒｒｙ－Ｃｒｙ２－ＣｒｅＮおよびｐｍＣｈｅｒｒｙ－ＣＩＢＮ－ＣｒｅＣである。これを克服し、２つを単一のベクターに結合するために、ニワトリ細胞において活性が高いＣＡＧＧプロモーターを使用して、ＩＲＥＳ配列によって連結されたＣＩＢＮ－ＣｒｅＣおよびＣｒｙ２－ＣｒｅＮ、それに続くＩＲＥＧ－ＧＦＰの発現を駆動するプラスミドベクターを設計した。ｐＣＡＧＧ－ＣＩＢＮ－ＣｒｅＣ－ＩＲＥＳ－Ｃｒｙ２－ＣｒｅＮ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰの合成は、Ｋｅｎｎｅｄｙ ｅｔ ａｌ．，２０１０（Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１０，７（１２）：９７３－９７５）に記載されている元の光遺伝子プラスミドの修飾に基づいた。クローニングの目標は、ＣＡＧＧプロモーターの下で、２つの融合光遺伝子をＩＲＥＳで結合し、続いてＩＲＥＳ－ＧＦＰを結合することであった。光遺伝子の順序、すなわちＣｒｙ２－ＣｒｅＮにＣＩＢＮ－ＣｒｅＣが続く同様のプラスミドの構築も成功裏に実行され、同様の結果が得られた。図２１は、上記のプラスミドの模式図を示す。

【0237】

ｉｎ－ｖｉｔｒｏでｐＣＡＧＧ－Ｏｐｔｏｇｅｎｅベクターの活性を検証するために、成功裏のトランスフェクションのためのレポーターとしてＧＦＰを発現するプラスミドを、ＨＥＫ２９３にｐＢ－ＲＡＧＥ－ｍＣｈｅｒｒｙとコトランスフェクションした。このプラスミドは、ｐＣＡＧＧプロモーターおよびｍＣｈｅｒｒｙレポーター遺伝子の間にＬｏｘ－ＳＴＯＰ－Ｌｏｘ（ＬＳＬ、ＲＡＧＥ）要素を含む。したがって、光遺伝子プラスミドでコトランスフェクトされた場合、青色光照射およびＣｒｅの活性化により、ＬＳＬが除去され、ｍＣｈｅｒｒｙが発現する。システムが不活性である暗所においては、図２２に示すように、光遺伝子プラスミドからのレポーターＧＦＰのみが発現される。

【0238】

ｉｎ－ｏｖｏで生きているヒヨコ胚における光遺伝学的システムの活性を検証するために、光遺伝学的プラスミドとレポーターｐＢ－ＲＡＧＥ－ｍＣｈｅｒｒｙプラスミドを５６～６０時間インキュベートしたヒヨコ胚の神経管にコエレクトロポレーションした。鋭利なマイクロピペットを使用してプラスミドＤＮＡ混合物を神経管の内腔に注入し、３～５ｍｍ離れた２つのタングステン電極（エレクトロポレーターＢＴＸ８３０）を使用してエレクトロポレーションを適用した。３０Ｖ、４５ｍｓの４つのパルスそれぞれが、各パルス間７４５ｍｓの間隔で送達された。エレクトロポレーション後、卵をシールし、１２～１８時間インキュベートした。次に、コントロール群の卵を暗所に保ち、実験群の卵を卵殻を通して１分間の青色光照明にさらした。両方の群は、分析前にさらに１２～１８時間インキュベーター内に戻された。

【0239】

図２３に示されるように、すべての実験群において、レポーターＧＦＰは、すべての胚において高くかつ広く発現され、プラスミドのエレクトロポレーションおよび発現の成功を示した。暗所に保たれた卵においてはｍＣｈｅｒｒｙの発現はなかった。対照的に、青色光で照らされた卵においては神経管でｍＣｈｅｒｒｙが発現していた。

【0240】

ＣＩＢＮ－Ｃｒｙ２の改良されたシステムは、Ｃｒｙ２を改変することによって作成し得る。この改変は、Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌｕｍｅ１２，ｐａｇｅｓ４２５－４３０（２０１６）に公開されているように、最初の５３５アミノ酸のみを含む切り捨てられたＣｒｙ２遺伝子－Ｃｒｙ２－Δ５３５－Ｌ３４８ＦにおけるＬ３４８Ｆ変異の挿入を含む。

【0241】

ＣＩＢＮ－Ｃｒｙ２光遺伝学的システムの代替アプローチとして、別の概念的に類似したシステムを使用して、同じ目標を達成することができる。このシステムはＭＡＧＮＥＴシステムに基づいており、２つの光遺伝学的タンパク質－正に帯電したＰ－Ｍａｇと負に帯電したＮ－Ｍａｇが青色光照射により二量体化する。これらのタンパク質はそれぞれ、Ｃｒｅリコンビナーゼ酵素の不活性部分に融合し、２つの光遺伝子が二量体化すると、Ｃｒｅの活性型が生成される（Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌｕｍｅ１２，１０５９－１０６４ ２０１６）。

【0242】

第３の要素は、「致死誘導カセット」である。一実施形態において、致死誘導カセットは、細胞死または胚発生の初期段階に必要な分子シグナル伝達経路（例えば、ＢＭＰ４）への重度の介入によって初期胚死を駆動する遺伝子（例えば、毒素）を含む。例えば、これは、ジフテリア毒素Ａ（ＤＴＡ）などの毒素でプログラム細胞死（アポトーシス）を誘導すること、カスパーゼ３またはカスパーゼ３の変異した構成的に活性な変異した形態などのカスパーゼ遺伝子を発現させること、またはＢＭＰ４－Ｎｏｇｇｉｎの阻害剤タンパク質を発現させることによって達成され得る。ＤＴＡについてのヌクレオチド配列は、配列番号９２に記載されている。ＤＴＡのアミノ酸配列は、配列番号９３に示されている。

【0243】

一実施形態において、ニワトリＣａｓｐ３ ＣＤＳ（ＷＴ）についてのヌクレオチド配列は、配列番号９４に記載されている。ニワトリＣａｓｐ３ ＣＤＳ（ＷＴ）についてのアミノ酸配列は、配列番号９５に記載されている。

【0244】

一実施形態において、構成的に活性な（変異した）形態のニワトリＣａｓｐ３についてのヌクレオチド配列は、配列番号９６に記載されている。構成的に活性な（変異した）形態のニワトリＣａｓｐ３タンパク質についてのアミノ酸配列は、配列番号９７に記載されている。

【0245】

一実施形態において、Ｎｏｇｇｉｎについてのヌクレオチド配列は、配列番号９８に記載されている。Ｎｏｇｇｉｎについてのアミノ酸配列は配列番号９９に記載されている。

【0246】

特定の実施形態において、「致死誘導カセット」は、必須のシグナル伝達経路を破壊する遺伝子に基づく。死が誘導されるのが早ければ早いほど、胚は早く死ぬだろう。特定の実施形態において、必須のシグナル伝達経路は、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）を含む。特定の実施形態において、ＢＭＰは、ＢＭＰ４である。特定の実施形態において、致死促進タンパク質は、ＢＭＰ４のアンタゴニストである。特定の実施形態において、ＢＭＰ４アンタゴニストは、Ｎｏｇｇｉｎである。特定の実施形態において、致死促進タンパク質Ｎｏｇｇｉｎの発現は、ＢＭＰ経路が活性であり、必要とされる発育段階で誘導される。特定の実施形態において、ＢＭＰ経路は、胞胚形成、原腸形成、神経胚形成、または器官形成の間に活性であるか、または誘導される。特定の実施形態において、光遺伝学的システムは産卵直後（ステージＸ～ＸＩＩＩ ＥＧ＆Ｋ）に活性化される。特定の実施形態において、光遺伝学的システムは、ステージＸで活性化され、致死促進タンパク質を誘導する。特定の実施形態において、光遺伝学的システムは、ステージＸＩで活性化される。特定の実施形態において、光遺伝学的システムは、ステージＸＩＩで活性化される。特定の実施形態において、光遺伝学的システムは、ステージＸＩＩＩで活性化される。特定の実施形態において、光遺伝学的システムは、受精から孵化するまでの胚発生始動中の任意の時点で活性化される。特定の実施形態において、致死は、受精から孵化までの２１日間の間に誘導される。特定の実施形態において、致死は、受精の１日後に誘導される。特定の実施形態において、致死は、受精の２日後に誘導される。特定の実施形態において、致死は、受精の３日後に誘導される。特定の実施形態において、致死は、受精の４日後に誘導される。特定の実施形態において、致死は、受精の５日後に誘導される。特定の実施形態において、致死は、受精の６日後に誘導される。特定の実施形態において、致死は、受精の７日後に誘導される。特定の実施形態において、致死は、受精の８日後に誘導される。特定の実施形態において、致死は、受精の９日後に誘導される。特定の実施形態において、致死は、受精の１０日後に誘導される。特定の実施形態において、致死は、受精の１１日後に誘導される。特定の実施形態において、致死は、受精の１２日後に誘導される。特定の実施形態において、致死は、受精の１３日後に誘導される。特定の実施形態において、致死は、受精の１４日後に誘導される。特定の実施形態において、致死は、受精の１５日後に誘導される。特定の実施形態において、致死は、受精の１６日後に誘導される。特定の実施形態において、致死は、受精の１７日後に誘導される。特定の実施形態において、致死は、受精の１８日後に誘導される。特定の実施形態において、致死は、受精の１９日後に誘導される。特定の実施形態において、致死は、受精の２０日後に誘導される。特定の実施形態において、致死は、受精の２１日後に誘導される。特定の実施形態において、光遺伝学的システムは、最大３０時間のインキュベーション後のニワトリ胚発生中に活性化される。特定の実施形態において、光遺伝学的システムは、最大３１時間のインキュベーション後のニワトリ胚発生中に活性化される。特定の実施形態において、光遺伝学的システムは、最大３２時間のインキュベーション後のニワトリ胚発生中に活性化される。特定の実施形態において、光遺伝学的システムは、最大３３時間のインキュベーション後のニワトリ胚発生中に活性化される。特定の実施形態において、光遺伝学的システムは、最大３４時間のインキュベーション後のニワトリ胚発生中に活性化される。特定の実施形態において、光遺伝学的システムは、最大３５時間のインキュベーション後のニワトリ胚発生中に活性化される。特定の実施形態において、光遺伝学的システムは、最大３６時間のインキュベーション後のニワトリ胚発生中に活性化される。特定の実施形態において、光遺伝学的システムは、鳥の中で活性化される。特定の実施形態において、光遺伝学的システムは、胚を取り囲む卵殻の形成の前に活性化される。特定の実施形態において、光遺伝学的システムは、胚を取り囲む卵殻の形成の前に、鳥の中で活性化される。特定の実施形態において、光遺伝学的システムは、胚をインデューサーと直接接触させることによって活性化される。特定の実施形態において、インデューサーは、卵に挿入される。特定の実施形態において、最初に、卵殻が少なくとも部分的に開かれ、次にインデューサーが胚に直接投与される。

【0247】

ニワトリ細胞における細胞死の誘導を検証するために、ＤＴＡおよび２つの形態のカスパーゼ３を、ＰＧＫ（ホスホグリセリン酸キナーゼ）またはＣＡＧＧプロモーター、それに続く、トランスフェクション効率を確認するために機能するＩＲＥＳ ＧＦＰを有する発現ベクターにクローニングした。ＰＧＫプロモーターは、ニワトリ胚性細胞におけるｐＣＡＧＧよりも弱くて遅い。

【0248】

一実施形態において、作成されたベクターは、ＰＧＫ－ＤＴＡ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰ、ｐＣＡＧＧ－ＤＴＡ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰ、ＰＧＫ－ＣＡＳＰ３－ＩＲＥＳ－ＧＦＰ、ｐＣＡＧＧ－ＣＡＳＰ３－ＩＲＥＳ－ＧＦＰ、ＰＧＫ－ｍＣＡＳＰ３－ＩＲＥＳ－ＧＦＰ、ｐＣＡＧＧ－ｍＣＡＳＰ３－ＩＲＥＳ－ＧＦＰであった。コントロールとして致死誘導遺伝子を含まない発現ベクターを使用した（ＰＧＫ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰおよびｐＣＡＧＧ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰ）。

【0249】

発現ベクターをエレクトロポレーションによってＰＧＣにトランスフェクトし、細胞を２４時間、４８時間、および７２時間インキュベートした後、フローサイトメトリーを使用して分析し、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）によって陽性発現細胞を検出し、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色を使用して死細胞を特定した。ＧＦＰをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１１５に記載されている。

【0250】

図２４Ａ～２４Ｂに示される結果は、全ＧＦＰ陽性細胞のうちの死細胞の割合を示している。

【0251】

一実施形態において、上記の３つの要素を、Ｚ染色体に組み込むことができる単一の活性ユニットに統合するターゲティングベクターを構築した。図２５に示されるように、ユニットは、５'および３'相同性アームに隣接している。プロモーター（ｐＣＡＧＧ）は、ＩＲＥＳ配列によって分離された光遺伝学的システムの２つのユニットの発現を駆動する。光遺伝学的システムに、ポリアデニル化配列（ＰＡ）が続く。光遺伝子カセットは、２つのＬｏｘＰ部位に隣接している。光遺伝学的システムは、ＣＩＢＮ－Ｃｒｙ２、ＭＡＧＮＥＴ、または上記のその他のシステムに基づくことができる。第２のＬｏｘＰ部位に続くのは、致死誘導コード配列であり、第２のポリアデニル化配列が続く。この致死誘導コード配列はプロモーターを有しないため、光遺伝子の二量体化、およびＬｏｘＰ部位間に隣接する光遺伝子カセットを除去するＣｒｅ酵素の活性化をもたらす青色光照射が適用されるまでその配列は不活性である。この切除により、致死コード配列が、その発現を駆動するｐＣＡＧＧプロモーターのすぐ下流に配置される。この戦略は、単一のプロモーターを含み、「ＳＴＯＰ」配列を必要としないため、より短い設計の恩恵を受ける。

【0252】

一実施形態において、ｐＣＡＧＧプロモーターについてのヌクレオチド配列は、配列番号１００に記載されている。ｐＧＫプロモーターについてのヌクレオチド配列は、配列番号１０９に記載されている。ｐＣＭＶプロモーターについてのヌクレオチド配列は、配列番号１１０に記載されている。ｐｈＳｙｎプロモーターについてのヌクレオチド配列は、配列番号１１１に記載されている。ｐＥＦ１－ａプロモーターについてのヌクレオチド配列は、配列番号１１２に記載されている。

【0253】

一実施形態において、Ｏｐｔｏｇｅｎ１－ＮＬＳ－Ｃｒｙ２－Δ５３５－Ｌ３４８Ｆ－ＣｒｅＮ（ＡＡ１９－１０４）についてのヌクレオチド配列は、配列番号１０１に記載されている。Ｏｐｔｏｇｅｎ２－ＣＩＢＮ（ａａ１－１７０）－ＮＬＳ－Ｃｒｅ－Ｃ（ａａ１０６－３４３）についてのヌクレオチド配列は、配列番号１０２に記載されている。Ｃｒｅリコンビナーゼについてのヌクレオチド配列は、配列番号１１３に記載されている。ＣｒｅＮ（ＡＡ１９－１０４）についてのヌクレオチド配列は、配列番号１１７に記載されている。ＣｒｅＣ（ＡＡ１０６～３４３）についてのヌクレオチド配列は、配列番号１１８に記載されている。

【0254】

一実施形態において、ＩＲＥＳ配列についてのヌクレオチド配列は、配列番号１０３に記載されている。ポリアデニル化部位配列（ウサギベータグロビン）についてのヌクレオチド配列は、配列番号１０４に記載されている。５'相同性アーム（ＬＨＡ）についてのヌクレオチド配列は、配列番号１０５に記載されている。３'相同性アーム（ＲＨＡ）についてのヌクレオチド配列は、配列番号１０６に記載されている。

【0255】

一実施形態において、ＭＡＧＮＥＴシステムに関して、以下の配列は、Ｃｒｙ２－ＣＩＢＮシステムの代わりに使用し得る代替のオプトゲン（ｏｐｔｏｇｅｎｓ）である。例えば、ＣｒｅＮ（ａａ１８－５９）＿Ｎ－Ｍａｇ＿ＮＬＳについてのヌクレオチド配列は、配列番号１０７に記載されている。ＮＬＳ＿Ｐ－Ｍａｇ＿Ｃｒｅ－Ｃ（ａａ６０－２３７）についてのヌクレオチド配列は、配列番号１０８に記載されている。

【0256】

一実施形態において、改変されたＰＧＣの胚への移植、および生殖系列伝達および潜在的なファウンダー保因者についてスクリーニングされるキメラニワトリの作製は、以下のように実施された。ターゲティングベクターの生成に続いて、雌および雄の両方の胚に由来するＰＧＣ株は、ｐｘ３３０－ａｌｌ－ｉｎ－ｏｎｅ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９－ＧＦＰをコードするプラスミドおよびターゲティングベクターのコエレクトロポレーションを受けた。ＣＲＩＳＰＲプラスミドは、染色体Ｚにおける設計された部位にＤＮＡ二本鎖切断を作成し、したがって、ターゲティングベクターの相同組換えを促進する。ＣＲＩＳＰＲプラスミドは、ＧＦＰとインフレームで融合したＣａｓ９をコードしており、したがってトランスフェクションの成功を確認できる。トランスフェクションの２４～７２時間後、陽性の単一細胞を９６ウェルプレートに単一細胞でＦＡＣＳ選別し、増殖させて純粋なＰＧＣコロニーを形成し、ＰＣＲおよびサザンブロットでスクリーニングして、適切な相同組換えを受けたコロニーを特定した。

【0257】

キメラニワトリは、次のように生成された。キメラニワトリは、遺伝子組換えされたＰＧＣを機能的な配偶子に変換する手段である。キメラを生成するために、ステージ１４～１６Ｈ＆Ｈ胚は、＞３０００個のＰＧＣ（通常は８０００個～１００００個まで）で血流（例えば、心臓）に注入された。これらの細胞は、内因性ＰＧＣと並んで胚生殖腺にコロニーを形成し、したがって、それらはキメラと呼ばれる。生殖細胞系伝達の効率、すなわち遺伝子組換えされたＰＧＣを機能的ＰＧＣに変換する能力は、生殖腺内の内因性ＰＧＣおよび注入されたＰＧＣの比率を含むいくつかの要因に依存する。内因性ＰＧＣの量を減らすために、産卵されたばかりの受精卵を６００～８００ラジアンのγ線照射をする。特定の実施形態において、照射は、６００～８００ラジアンの照射を含む。特定の実施形態において、照射は、４００～１０００ラジアンの照射を含む。特定の実施形態において、照射は、２００～１２００ラジアンの照射を含む。

【0258】

ＰＧＣは体細胞よりもγ線照射を受けやすいか、または照射後ＰＧＣは体細胞のように再生する能力が低いと考えられている。したがって、照射後、内因性ＰＧＣの総量は減少する。照射後、卵は、通常、ＰＧＣ注射に適したステージ１４－１６Ｈ＆Ｈに胚が達するまで培養された。照射効率の指標として、胚がステージ１４～１６Ｈ＆Ｈに到達するのに必要なインキュベーション時間は、約１０時間で増加し、照射された胚の７０％が正常に発育せず、したがってＰＧＣの注入は使用されない。種々のニワトリ株、卵殻の種類、厚さ、色で、異なる照射条件が必要になる場合があり、したがってエネルギー量はキャリブレーションを必要とする。注射後、卵をシールし、キメラヒヨコが孵化するまでインキュベーションする。その後、ヒヨコは性的に成熟するまで飼育され、雄においては、半定量的ＰＣＲまたはリアルタイムＰＣＲを使用して生殖細胞系列の伝達を分析するために精子が収集される。

【0259】

実施例３

【0260】

本実施例は、付加要素、本明細書で「セーフロック」要素と呼ばれる要素を含むターゲティングベクターを提示する。この要素は、基本的に光遺伝子致死システムをロックし、既定ではシステムは不活性である。「セーフロック解除」株と交配することによってのみ、光遺伝子致死システムは活性になる。この要素は、活性化するために追加の「ロック解除」株を使用する必要があるため、品種をよりよく保護することによってシステム全体に利益をもたらす。これはまた、光遺伝子システムが本質的に不活性であるため、製造プロセス全体を通して、ＨＲを受けた細胞を光から保護する必要がないことを保証する。

【0261】

本実施例は、８つの「オールインワン」ターゲティングベクターを開示し、それらが設計どおりに機能することをｉｎ－ｖｉｔｒｏおよびｉｎ－ｖｉｖｏの両方で示している。データはまた、ＭＡＧＮＥＴ光遺伝子システムがニワトリ胚で機能しており、致死誘導メカニズムを活性化できることを示している。ＭＡＧＮＥＴシステムは、上述されている。さらに、データは、胚の致死誘導遺伝子としてのＮｏｇｇｉｎが、産卵からの胚の発育を停止させること（産卵されたばかりの卵から）を示している。

【0262】

本明細書に開示される８つのターゲティングベクターは、２つの光遺伝子システム（ＭＡＧＮＥＴおよびＣＩＢＮ－Ｃｒｙ２）および４つの致死誘導遺伝子（ＤＴＡ、Ｎｏｇｇｉｎ、ｃａＣＡＳＰ３、および制御および検証プロセスに使用されるｍＣｈｅｒｒｙ）の８つの組み合わせ選択肢をカバーする。明確にするために、ｍＣｈｅｒｒｙ自体は致死を誘導せず、他の要素の作用を確認するために使用された。

【0263】

上で考察されたように、本明細書に記載の実験の目的は、致死誘導カセットを、雄または雌由来のＰＧＣのいずれかのＺ染色体に導入することである。最終的な目標は、Ｚ染色体でゲノム挿入を含む雌鶏を得ることである。この染色体は次世代の雄胚にのみ分離し、青色光の誘導により致死誘導カセットを活性化し、したがって、雄胚は胚発生の初期段階で死ぬ。したがって、性染色体分離により、雌の産卵鶏雌鶏は、雄鶏側からＷＴ Ｚ染色体を、母雌鶏側からＷＴ Ｗ染色体を取得するため、改変された遺伝物質を獲得しない（図１を参照）。この実施例では、ターゲティングベクターは、以下に説明するように４つの要素を含む（図２６の例を参照）。

【0264】

図２６に示すように、第１の要素は「相同性アーム」である。一実施形態において、２つの約１．５ｋｂの相同性アームが、ベクターの５'および３'末端の両方に位置している。これは、相同組換え（ＨＲ）をＺ染色体上にあるＨＩＮＴ１Ｚ遺伝子座の下流に向けるように設計されている。ＨＩＮＴ１Ｚ遺伝子は、ＰＧＣおよび胚盤葉全体（これらは産卵されたばかりのヒヨコ胚）において転写されるため、ＨＲについてこの部位が選択された。Ｚ染色体上の他のすべてのオープンに転写された領域も、この目的のための潜在的に良い候補である。

【0265】

第２の要素は、ＳＴＯＰカセットが取り外されるまで、光遺伝子致死メカニズムが不活性であることを保証する「セーフロック」メカニズムである。ＳＴＯＰカセットは２つのＦＲＴ部位に隣接し、ｐＣＡＧＧプロモーターおよび光遺伝子の間に位置しているため、光遺伝子の発現が妨げられる。以下に記載されるようにＦｌｐ発現株と交配すると、ＳＴＯＰ要素が除去され、光遺伝子が転写され、光依存的方法で活性になることを可能にする（図２６Ａ、活性「ロック解除」状態）。本実施例において、「セーフロック」要素は、ＧＦＰについてのコード配列、それに続くポリアデニル化部位を含む。下流の要素の転写を妨げる他の配列も「セーフロック」要素として使用し得る。

【0266】

第３の要素は「光遺伝学的誘導性要素」である。上で考察されたように、光遺伝学的システムは、特定の光波長の下で励起され、コンフォメーションを変化させて第２の特定のタンパク質と二量体化するタンパク質に基づいている。光遺伝学的システムの例は、上で考察されている。

【0267】

本実施例において、２つの代替光遺伝子システムがテストされ、使用された。第１は、ＭＡＧＮＥＴシステムで、２つの光遺伝学的タンパク質－正に帯電したＰ－Ｍａｇおよび負に帯電したＮ－Ｍａｇが青色光照射により二量体化する。部位特異的リコンビナーゼ酵素Ｍａｇをコードする配列は、配列番号１１４および配列番号６５に記載されている。これらのタンパク質はそれぞれ、Ｃｒｅリコンビナーゼ酵素の不活性部分に融合し、２つの光遺伝子が二量体化すると、Ｃｒｅの活性型が生成される（例えば、Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌｕｍｅ１２，１０５９－１０６４ ２０１６を参照）。この場合、自己切断ペプチドＰ２Ａ（図２６の「Ｌｉｎｋ」）の配列は、２つの光遺伝子の間に位置する。

【0268】

使用された第２の光遺伝子システムは、ＣＩＢＮ（ＣｒｅＣ）－Ｃｒｙ２（ＣｒｅＮ）の改良されたシステムである。この場合、改変は、最初の５３５アミノ酸のみを含む切り捨てられたＣｒｙ２遺伝子へのＬ３４８Ｆ変異の挿入－Ｃｒｙ２－Δ５３５－Ｌ３４８Ｆを含む（Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２５ ｖｏｌｕｍｅ１２，ｐａｇｅｓ４２５－４３０（２０１６）を参照）。一実施形態において、２つの光遺伝子間のリンカーは、ＩＲＥＳ配列（図２６の「Ｌｉｎｋ」）である。

【0269】

第４の要素は「致死誘導カセット」である。一実施形態において、致死誘導カセットは、細胞死またはＢＭＰ４などの胚発生の初期段階に必要な分子シグナル伝達経路への重度の介入によって初期胚死を促進する遺伝子を含む。上で考察されたように、致死誘導遺伝子の例には、ジフテリア毒素Ａ（ＤＴＡ）などの毒素、カスパーゼ３またはカスパーゼ３の変異した構成的に活性な変異した形態などのカスパーゼ遺伝子、またはＢＭＰ４－Ｎｏｇｇｉｎの阻害剤タンパク質を含むが、これらに限定されない。

【0270】

次の表に、これら８つのターゲティングベクターの機能を示す。一実施形態において、これらのベクターは、ｐＪｅｔ１．２シャトルベクタープラスミドにクローン化された。

【0271】

【表1】

【0272】

ターゲティングベクター（ＴＶ）における要素の活性は、ＨＥＫ２９３細胞ではｉｎ－ｖｉｔｒｏで評価され（図２７）、ニワトリ胚においてはｉｎ－ｏｖｏで評価された（図２８－２９）。ｉｎ－ｖｉｔｒｏ検証のために、ＨＥＫ２９３細胞をＴＶ４のみ（図２７Ａ）、ｐＣＡＧＧ－Ｃｒｅ（配列番号１２８）（図２７Ｂ）、またはｐＣＡＧＧ－ＦｌｐＯ（配列番号１２９）プラスミドでトランスフェクトした。後者は２つの処理下で行われ、１つは暗所に保たれ（図２７Ｃ）、他方は、トランスフェクションの２４時間後に青色光に１５秒間さらされた。照明後、細胞をさらに２４時間インキュベートした（図２７Ｄ）。

【0273】

単独で発現させた場合、ＴＶ４は他のすべてのＴＶと同様にＧＦＰを発現し、したがって「セーフロック」状態の活動を示している（図２７Ａ）。ｐＣＡＧＧ－Ｃｒｅプラスミドと共発現させた場合、「セーフロック」カセットと光遺伝子カセットは完全に除去され（図２６Ｂ、図２７Ｂ）、これはＧＦＰの発現の喪失およびｍＣｈｅｒｒｙ発現（致死誘導遺伝子の代理として）の開始によって示された。この結果から、「セーフロック」要素と光遺伝子要素を切除すると、致死誘導要素がアクティブになることを確認する。ＴＶ４が、ｐＣＡＧＧ－ＦｌｐＯプラスミドと共発現された場合、ＧＦＰの発現の喪失によって示されるように「セーフロック」要素のみが除去され（図２６Ａ、図２７Ｃ～Ｄ）、光遺伝子システムが光依存的方法で活性化された。細胞を暗所に保った場合、光遺伝子システムの活性化およびｍＣｈｅｒｒｙの発現はなく、致死カセットが発現されなかったことを示している（図２７Ｃ）。しかしながら、同じ条件下で、細胞が照されると、光遺伝子システムは、活性になり、致死要素を発現させるために切除された（図２６Ａを参照）。これは、図２７Ｄに示されるようにｍＣｈｅｒｒｙの発現によって示される。

【0274】

ｉｎ－ｖｉｖｏでのＴＶ要素の活性を実証するために、ニワトリ胚はプラスミドを神経管に注入され、上記のようにエレクトロポレーションされた。図２８において、白い線は、配向の目的で、神経管および肢芽の背側正中線を示している。４つの処理群がテストされた：１．ＴＶ４のみの発現（図２８Ａ）、２．ポジティブコントロールとしてのＴＶ４およびｐＣＡＧＧ－Ｃｒｅプラスミドのコエレクトロポレーション（図２８Ｂ）、３．暗所に保たれた、ＴＶ４およびｐＣＡＧＧ－ＦｌｐＯプラスミドのコエレクトロポレーションン（図２８Ｃ）、ならびに、４．ＴＶ４およびｐＣＡＧＧ－ＦｌｐＯプラスミドのコエレクトロポレーション後１５秒間、青色光への曝露、およびさらなる１２時間のインキュベーション（図２８Ｄ）。

【0275】

単独でエレクトロポレーションした場合、ＴＶ４はＧＦＰを発現し、既定の不活性な「セーフロック」状態を示し、ｍＣｈｅｒｒｙは発現しなかった（図２８Ａ）。ｐＣＡＧＧ－Ｃｒｅプラスミドと共発現させた場合、「セーフロック」および光遺伝子カセットが除去され（図２６Ｂ、図２８Ｂ）、したがって、ＧＦＰ発現はないが、ｍＣｈｅｒｒｙは発現した。これは、致死誘導要素の活性化のためのポジティブコントロールとして機能する。ＴＶ４をｐＣＡＧＧ－ＦｌｐＯプラスミドと共発現させることにより、ＦＲＴに隣接する「セーフロック」要素のみが除去され、したがって、ＧＦＰ発現はなかったが（図２８Ｃ－２８Ｄ）、光遺伝子システムは光依存的方法で活性化された。細胞を暗所に保った場合、ＧＦＰ発現はなく、光遺伝子システムがその活性状態にあったが、ｍＣｈｅｒｒｙは発現されなかった、すなわち致死カセットは不活性であったことを示した（図２８Ｃ）。しかし、エレクトロポレーションの１２時間後に胚を照らすと、光遺伝子システムは、活性になり、致死要素を発現させるために切除された。これは、図２８Ｄに示されるようなｍＣｈｅｒｒｙの発現によって示される。

【0276】

光依存的方法における致死誘導遺伝子Ｎｏｇｇｉｎの活性を実証するために、致死誘導要素としてＮｏｇｇｉｎのコード配列を含むＴＶ１を、ｐＣＡＧＧ－ＦｌｐＯプラスミドと、３６時間インキュベートされたヒヨコ胚の吻側神経管（中脳および後脳の軸レベル）にコエレクトロポレーションした。この段階で、神経堤細胞は、ＢＭＰ４依存的方法で背側神経管から層間剥離する。したがって、背側神経管におけるＮｏｇｇｉｎの異所性発現によってＢＭＰ４シグナル伝達経路を阻害すると、神経堤細胞の層間剥離が阻害されると予測される。神経堤細胞を可視化するために、神経堤マーカーＨＮＫ－１を染色するための抗ＨＮＫ－１抗体を使用した。

【0277】

図２９は、ＴＶ１（配列番号１２０）、ｐＣＡＧＧ－ＦｌｐＯ（配列番号１２９）およびｐＣＡＧＧ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰ（配列番号５９）プラスミドを神経管にエレクトロポレーションした胚を示している。後者は、トランスフェクトされた細胞のモニタリングを可能にするためにポジティブコントロールとして追加された。トランスフェクションの２４時間後、実験を通して暗所に保たれた胚において（図２９Ａ、上段、背面図、下段、右側面図）、神経堤細胞が層間剥離し、背側神経管から正常に遊走した。ＨＮＫ－１染色は、左右両方の神経褶（神経堤細胞の遊走を引き起こす神経管の最も背側の側面）、および神経堤細胞の遊走において、背側管における左右相称の発現パターンを明らかにした（図２９Ａ、矢じり）。しかし、エレクトロポレーションの１２時間後に光にさらされた胚においては、神経堤細胞が剥離してチューブから遊走することができず、ＨＮＫ－１染色により、右神経褶、エレクトロポレーション側での発現の著しい低下が明らかになった（図２９Ｂ、矢印）。したがって、これらの結果は、ＴＶ１から「セーフロック」要素を削除すると、Ｎｏｇｇｉｎの発現および活性が、ＭＡＧＮＥＴ光遺伝子システムによって光依存的方法で調節されることを示している。

【0278】

卵が産卵されるとすぐにＮｏｇｇｉｎが胚発生を停止できることを実証するために、胚盤葉胚の段階において、胚盤葉をｉｎ－ｏｖｏで外因性のＮｏｇｇｉｎ源で処理した（図３０）。この目的のために、ｐＣＡＧＧ－Ｎｏｇｇｉｎ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰ（配列番号１３０）、またはネガティブコントロールとして、ｐＣＡＧＧ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰ（配列番号５９）プラスミドをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞におけるＮｏｇｇｉｎの発現を検証するために、トランスフェクトされた細胞から抽出された総タンパク質を、抗Ｎｏｇｇｉｎ抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ１６０５４、予測サイズ約２４ｋＤａ）およびローディングコントロールとして抗α－チューブリン－ＨＲＰ抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ４０７４２、予測サイズ約５５ｋＤａ）を用いたウエスタンブロットによって分析した。図３０Ａは、ネガティブコントロールでトランスフェクトされた細胞（ＣＯＮ）においてはＮｏｇｇｉｎの発現がなかったが、ｐＣＡＧＧ－Ｎｏｇｇｉｎ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰでトランスフェクトされた細胞（ＮＯＧ）はＮｏｇｇｉｎを産生したことを示す。染色済みのタンパク質ラダーが左側のレーンに表示された（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＰａｇｅＲｕｌｅｒ＃２６６１７）。図３０Ｂ～Ｃおよび図３０Ｄ～Ｅにそれぞれ示されるように、コントロールおよびＮｏｇｇｉｎ発現細胞からの馴化培地を、産卵されたばかりの受精卵に注入し、その後、２４時間または５４時間インキュベートした。図３０Ｂ～Ｃは、処理された胚の高解像度エピスコピック顕微鏡（ＨＲＥＭ）３Ｄ再構成モデルを示す。原始線条（矢印で区切る）の形成によって示されるように、コントロール処理胚（図３０Ｂ）は正常に発育し続け、正常な原腸形成を受けたが、Ｎｏｇｇｉｎ処理胚は原腸形成できず、明らかな原始線条がなく、胚発生のプロセスは本質的に停止したことを示している（図３０Ｃ）。５４時間のインキュベーションで胚をさらに発育させた場合（図３０Ｄ～Ｅ）、コントロール処理した胚は正常に発育し、正常な神経胚形成プロセスを経て鼓動する心臓を形成した（図３０Ｄ）が、Ｎｏｇｇｉｎ処理した胚は明白な特徴を持たない細胞の塊を形成した（図３０Ｅ、矢印）。

【0279】

まとめると、上記の結果は、図２６に示した、「セーフロック」要素および光依存的方法で致死誘導要素を活性化するＭＡＧＮＥＴ光遺伝子システムを含む、分子作用様式戦略が予測どおりに機能することを示している。さらに、産卵されたばかりの卵において胚盤葉をＮｏｇｇｉｎで処理することによるＢＭＰシグナル伝達経路の阻害は、胚発生の進行を停止させた。

【0280】

Ｚ染色体上に組み込まれたターゲティングベクターを含むＰＧＣの純粋な株の作成

【0281】

一実施形態において、Ｚ染色体への標的化された組み込みを有するＰＧＣを生成するために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を送達するためのリボヌクレオプロテイン（ＲＮＰ）システムが使用された。ＲＮＰシステムの使用は、とりわけ、高効率、迅速なＤＮＡ切断、およびトランスフェクトされた細胞からのＲＮＰ複合体の迅速な除去の恩恵を受ける。ＲＮＰ複合体は、組換えＣａｓ９またはハイフィデリティーＣａｓ９ヌクレアーゼ、およびｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体の混合物で構成されている。ｔｒａｃｒＲＮＡは市販されており（ＩＤＴ）、ｃｒＲＮＡは、標的ゲノムＤＮＡ上の所望の切断部位に対応する特定の２０ヌクレオチド配列でカスタムメイドできる。一実施形態において、本明細書に開示される配列番号６６および配列番号６８を使用して、２つのｃｒＲＮＡオリゴを合成した（図８を参照）。

【0282】

ＰＧＣ培地および株誘導は、上述されている。ＰＧＣをエレクトロポレーションするために、５×１０^５個の細胞を、ＡｋｏＤＭＥＭで洗浄し、０．７μｇのターゲティングベクタープラスミド（本実施例において、ＴＶ１）、１μＭ Ａｌｔ－Ｒ（登録商標）ｃａｓ９エレクトロポレーションエンハンサー（ＩＤＴ）、ならびに、終濃度が１．５μＭの組換えＣａｓ９またはハイフィデリティーＣａｓ９ヌクレアーゼ（それぞれＡｌｔ－Ｒ（登録商標）Ｓ．ｐ．Ｃａｓ９ヌクレアーゼまたはＳ．ｐ．ＨｉＦｉ Ｃａｓ９ヌクレアーゼＶ３、ＩＤＴ）、および１．８μＭのｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ複合体、カスタムＡｌｔ－Ｒ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｃｒＲＮＡおよびＡｌｔ－Ｒ（登録商標）ｔｒａｃｒＲＮＡ、ＩＤＴ）を有するＲＮＰ複合体を含むバッファー「Ｒ」（Ｎｅｏｎバッファー、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に移した。

【0283】

ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体は、ＲＮＡオリゴを９５℃で１分間加熱し、室温まで冷却することによって調製した。ＲＮＰ複合体（Ｃａｓ９タンパク質＋ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ）混合物は、組換えＣａｓ９またはハイフィデリティーＣａｓ９ヌクレアーゼタンパク質をｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体に添加し、室温で１０～２０分間インキュベートすることによって調製した。ハイフィデリティーＣａｓ９は、オフターゲットを引き起こすことが少ないはずであると一般に考えられている。

【0284】

エレクトロポレーションについては、ＲＮＰ複合体、エレクトロポレーションエンハンサー試薬、およびターゲティングベクタープラスミドを含む１０μｌのバッファー「Ｒ」をＰＧＣペレットに添加し、混合物を、ネオンエレクトロポレーター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、１０００Ｖの３つのパルスでそれぞれ１３ｍｓの持続時間で直ちにエレクトロポレーションした。続いて、細胞を、１μＭ ＳＣＲ７－ピラジン（ＳＭＬ１５４６ ｓｉｇｍａ）を含むＰＧＣ培地で４８ウェルプレートに直ちに播種した。１～４時間後に培地を交換し、トランスフェクトした細胞を７～１０日間回復させた。ＳＣＲ７－ピラジンは、エレクトロポレーション後４８時間添加された。トランスフェクトされた細胞は、ＦＡＣＳ選別によって個別に分離された。ＦＡＣＳ選別については、穏やかな細胞のピペッティングを行い、細胞をＰＧＣ培地で選別した。単一のＧＦＰ陽性細胞をＦＡＣＳソニーソーター（ソニー）でＵ字型９６ウェルプレートに選別した。選別された細胞を２～３週間増殖させて純粋なコロニーを形成した。これらのコロニーから、分析のために全ゲノムＤＮＡを抽出し、凍結保存し、陽性コロニーを代理宿主胚に注入した。ターゲティングベクターの正しい組み込みを検証するために使用されるＰＣＲおよびサザンブロット分析は、上述されている（例えば図１５～１６を参照）。代理キメラヒヨコを作成する方法も、上述されている。

【0285】

図３１Ａは、ＴＶ１でＨＲを受け、ＧＦＰを発現した純粋な雌ＰＧＣ株を示す。このコロニー由来の細胞は、移植後５日間インキュベートされた代理宿主胚に注入された。図３１Ｂは、ＰＧＣ注入の５日後の胚の腹側の図を示す。この段階で、ＰＧＣは、生殖腺の肛門である生殖隆起にコロニー形成した（図３１Ｂ、矢じり）。他の注入された胚を孵化するまで培養し、雌のヒヨコを孵化後１０日目に卵巣を分析するために犠死させた。図３１Ｃは、多数のＧＦＰ陽性ＰＧＣを含む卵巣（線で示されている）を示す。これらの結果は、ＴＶ１でＺ染色体上でＨＲを受けたＰＧＣが生殖腺に成功裏にコロニーを形成することを示している。

【0286】

ＣｒｅまたはＦｌｐＯを発現する「ロック解除」株の作成。

【0287】

ターゲティングベクターＴＶ１～８を発現するトランスジェニックニワトリ株は、ゲノムに「セーフロック」要素を有し、したがって、光遺伝子－致死システムは不活性である。ＦＲＴ部位に隣接する「セーフロック」要素を除去するために（図２６Ａを参照）、これらの株をＦｌｐＯを発現するニワトリ株と交配する必要がある。この株を生成するために、ＦｌｐＯ酵素、それに続くＩＲＥＳ－ＧＦＰを含むターゲティングベクターを作成した（ＴＶ－ＦｌｐＯ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰ、配列番号１３１）。ポジティブコントロールとして、および光に依存しない方法で致死誘導カセットを活性化する手段として、Ｃｒｅ発現品種を使用し得る。この場合、ＬｏｘＰ部位に隣接する「セーフロック」および光遺伝子要素が除去されて、致死誘導要素が活性化される（図２６Ｂを参照）。この株を生成するために、Ｃｒｅ酵素、それに続くＰ２Ａ－ＧＦＰを含むターゲティングベクターを作成した（ＴＶ－Ｃｒｅ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ、配列番号１３２）。これらの２つのターゲティングベクターは、同じ５'および３'相同性アームおよびレポーター遺伝子ＧＦＰを共有し、ＴＶ１～８について前述したようにＺ染色体に組み込まれるように設計されている。

【0288】

上記のターゲティングベクター（ＴＶ－ＦｌｐＯ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰおよびＴＶ－Ｃｒｅ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ）を使用して、代理キメラ胚に注入されたＰＧＣを生成した。ＰＧＣのトランスフェクション、ＦＡＣＳ分析、ＨＲ組み込みの検証、胚注入などの方法は、上述されている。

【0289】

別の実施形態において、「セーフロック」要素を除去するために組換えＣＲＥまたはＦｌｐＯタンパク質を使用する選択肢が存在する。一実施形態において、組換えタンパク質をコードする配列は、細胞浸透ペプチドであるＴＡＴペプチドの配列、それに続く核局在化配列（ＮＬＳ）、次に、ＣｒｅまたはＦｌｐＯ酵素のいずれかをコードする配列を含み、細胞または胚に適用し得る。これらの組換えタンパク質は、培養細胞に有効であり、市販されている。これらの組換えタンパク質は、胚または成体に注入することができ、Ｃｒｅ／Ｆｌｐトランスジェニックニワトリを生成して交配する必要なしにシステムを活性化する可能性があると考えられている。卵殻の開口部を通じてヒヨコ胚へアクセスできるため、血流または胚の近くに直接注入できる。したがって、一実施形態において、上記の組換えタンパク質を胚に直接注入して、「セーフロック」要素を除去することができる。

【0290】

特定の実施形態をその具体的な実施形態と合わせて説明したが、多くの代替、修正、および変形が当業者に明らかであることは明白である。したがって、添付の特許請求の範囲の趣旨および広い範囲内にあるそのような代替、修正、および変形のすべてを包含することが意図される。

【0291】

本明細書で言及されているすべての出版物、特許、および特許出願は、個々の出版物、特許、または特許出願が参照により本明細書に組み込まれることが具体的かつ個別に示されるのと同程度に、参照により全体が本明細書に組み込まれる。さらに、本出願における任意の参考文献の引用または識別は、そのような参考文献が本開示の先行技術として利用可能であることの承認として解釈されるべきではない。セクション見出しが使用されている限り、それらは必ず限定するものとして解釈されるべきではない。

【0292】

態様または実施形態の特定の特徴が本明細書に図示され、説明されてきたが、多くの修正、置換、変更、および同等物を直ちに、当業者は想起するであろう。したがって、添付の特許請求の範囲は、本明細書で提供される態様または実施形態の真の趣旨内に収まるように、すべてのそのような修正および変更を網羅することを意図することを理解されたい。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【図5E】

【図5F】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図8D】

【図9】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図10D】

【図11A】

【図11B】

【図11C】

【図11D】

【図12A】

【図12B】

【図12C】

【図12D】

【図13】

【図14】

【図15A】

【図15B】

【図15C】

【図15D】

【図15E】

【図15F】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19A】

【図19B】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24A】

【図24B】

【図25】

【図26A】

【図26B】

【図27A】

【図27B】

【図27C】

【図27D】

【図28A】

【図28B】

【図28C】

【図28D】

【図29A】

【図29B】

【図30A】

【図30B】

【図30C】

【図30D】

【図30E】

【図31A】

【図31B】

【図31C】

【配列表】

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【国際調査報告】