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特表2022-522875関節リウマチを予防又は処置するための新規ワクチン戦略
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-04-20
(54)【発明の名称】関節リウマチを予防又は処置するための新規ワクチン戦略
(51)【国際特許分類】
C12N 15/55 20060101AFI20220413BHJP
C07K 14/47 20060101ALI20220413BHJP
C12N 5/0783 20100101ALI20220413BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20220413BHJP
A61P 19/02 20060101ALI20220413BHJP
A61P 17/06 20060101ALI20220413BHJP
A61K 38/16 20060101ALI20220413BHJP
A61K 38/04 20060101ALI20220413BHJP
A61K 39/00 20060101ALI20220413BHJP
【ＦＩ】
C12N15/55
C07K14/47 ZNA
C12N5/0783
A61P29/00 101
A61P19/02
A61P17/06
A61K38/16
A61K38/04
A61K39/00 H
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021552528
(86)(22)【出願日】2020-03-06
(85)【翻訳文提出日】2021-09-28
(86)【国際出願番号】 EP2020056015
(87)【国際公開番号】W WO2020178426
(87)【国際公開日】2020-09-10
(31)【優先権主張番号】19305265.1
(32)【優先日】2019-03-07
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】591100596
【氏名又は名称】アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル
(71)【出願人】
【識別番号】511025226
【氏名又は名称】ユニヴェルシテ デクス－マルセイユ
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ Ｄ’ＡＩＸ－ＭＡＲＳＥＩＬＬＥ
【住所又は居所原語表記】Ｊａｒｄｉｎ ｄｕ Ｐｈａｒｏ， ５８， Ｂｌｄ Ｃｈａｒｌｅｓ Ｌｉｖｏｎ， Ｆ－１３２８４ Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ ｃｅｄｅｘ ０７， Ｆｒａｎｃｅ
(71)【出願人】
【識別番号】509196062
【氏名又は名称】アシスタンス・ピュブリク・オピトー・ドゥ・マルセイユ
【氏名又は名称原語表記】ＡＳＳＩＳＴＡＮＣＥ ＰＵＢＬＩＱＵＥ ＨＯＰＩＴＡＵＸ ＤＥ ＭＡＲＳＥＩＬＬＥ
(74)【代理人】
【識別番号】110001508
【氏名又は名称】特許業務法人 津国
(72)【発明者】
【氏名】ルーディエ，ジャン
(72)【発明者】
【氏名】オージェ，イザベル
(72)【発明者】
【氏名】バランドロー，ナタリー
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA94X
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA44
4C084AA01
4C084AA02
4C084AA03
4C084AA07
4C084BA01
4C084BA08
4C084BA18
4C084BA23
4C084MA17
4C084MA52
4C084MA56
4C084MA66
4C084NA14
4C084ZA891
4C084ZA892
4C084ZA961
4C084ZA962
4C084ZB151
4C084ZB152
4C085AA03
4C085BA01
4C085BB11
4C085EE01
4C085EE06
4C085EE07
4C085GG01
4C085GG02
4C085GG03
4C085GG04
4C085GG05
4C085GG06
4C085GG08
4H045AA11
4H045BA17
4H045BA18
4H045BA19
4H045CA40
4H045DA86
4H045DA89
4H045EA20
4H045FA33
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、関節リウマチの処置の分野に関する。本発明者らは、アルギニンをシトルリンへと変換する酵素の１つであるＰＡＤ４が、ＡＣＰＡの産生を補助するＴ細胞の標的抗原であると提唱する。本発明者らは最近、ペプチジルアルギニルデイミナーゼによる免疫化が、通常のマウスにおいて抗シトルリン化フィブリノーゲン抗体産生をトリガーすることを実証した。ここで、本発明者らは、１２個のＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子型のそれぞれと関連した関節リウマチを発症するリスク（ＯＲ）は、各遺伝子型によってコードされる２つのＨＬＡ－ＤＲ分子が、ＰＡＤ４に由来する少なくとも１つのランダムなペプチドに結合する確率には相関するが、シトルリン化フィブリノーゲン又は天然フィブリノーゲンに由来するペプチドに結合する確率とは相関しないことを実証する。関節リウマチ患者、乾癬性関節炎患者、及び対照に由来する末梢血リンパ球はＰＡＤ４に対して増殖し、そしてそれらは、特に、関節リウマチ患者及び数人の乾癬性関節炎患者由来のＴ細胞を刺激する、ＰＡＤ４由来のペプチドであるｐ８（配列番号６）を同定する。ｐ８に対する増殖応答は、関節リウマチ、共有エピトープ陽性であるＨＬＡ－ＤＲ対立遺伝子、及びＰＡＤ４に対する抗体に関連している。したがって、本発明は、ＰＡＤ４タンパク質に由来するペプチド、並びに関節リウマチの処置及び予防におけるその使用に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号２のＰＡＤ４タンパク質に由来するペプチド。
【請求項2】
ペプチドが、表１に記載されている、請求項に記載のペプチド。
【請求項3】
ペプチドが、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０１０１、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４０１、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４０４、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４０２又はＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０７０１の分子に結合する、請求項１記載のペプチド。
【請求項4】
ペプチドが、配列番号２のアミノ酸６１～１００のアミノ酸配列を含むか又はからなる、請求項１記載のペプチド。
【請求項5】
ペプチドが、配列番号３又は配列番号４のアミノ酸配列を含むか又はからなる、請求項４記載のペプチド。
【請求項6】
ペプチドが、配列番号５：DPGVEVTLTMK-Xaa12-ASGSTGDQ（ここでのＸａａ１２は、アラニン（Ａｌａ又はＡ）又はバリン（Ｖａｌ又はＶ）である）のアミノ酸配列又はその機能の保存された変異体を含むか又はからなる、請求項１記載のペプチド。
【請求項7】
ペプチドが、配列番号６若しくは配列番号７のアミノ酸配列又はその機能の保存された変異体を有する、請求項６記載のペプチド。
【請求項8】
ペプチドが、配列番号８のアミノ酸配列又はその機能の保存された変異体を有する、請求項１記載のペプチド。
【請求項9】
請求項１～８に記載のＰＡＤ４タンパク質に由来するペプチドをコードしている核酸配列。
【請求項10】
医薬品として使用するための、請求項１～８記載のＰＡＤ４タンパク質に由来するペプチド、又は請求項９記載の核酸配列。
【請求項11】
関節リウマチ又は乾癬性関節炎の処置を必要とする対象において、関節リウマチ又は乾癬性関節炎の処置に使用するための、請求項１～８記載のＰＡＤ４タンパク質に由来するペプチド、又は請求項９記載の核酸配列。
【請求項12】
関節リウマチ又は乾癬性関節炎の処置又は予防を必要とする対象に請求項１～８記載のペプチド又は請求項９記載の核酸配列を投与することによる、関節リウマチ又は乾癬性関節炎を処置又は予防するための方法。
【請求項13】
請求項１～８記載のＰＡＤ４タンパク質に由来するペプチド又は請求項９記載の核酸配列を含むワクチン組成物。
【請求項14】
関節リウマチ又は乾癬性関節炎の予防又は処置を必要とする対象において、関節リウマチ又は乾癬性関節炎の予防又は治療に使用するための、請求項１～８記載のＰＡＤ４タンパク質に由来するペプチド又は請求項９記載の核酸配列を含むワクチン組成物。
【請求項15】
請求項１～８記載のペプチドを特異的に認識するＴリンパ球。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
発明の分野：
したがって、本発明は、ＰＡＤ４タンパク質に由来するペプチド、並びに関節リウマチの処置及び予防におけるその使用に関する。
したがって、本発明は、ＰＡＤ４タンパク質に由来するペプチド、並びに関節リウマチの処置及び予防におけるその使用に関する。
【0002】
発明の背景：
関節リウマチの発症に対するＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子の影響は、１９７６年以来知られ、関節リウマチ患者のリンパ球は、混合リンパ球培養液中で互いに刺激しないことが観察されている（１）。
関節リウマチの発症に対するＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子の影響は、１９７６年以来知られ、関節リウマチ患者のリンパ球は、混合リンパ球培養液中で互いに刺激しないことが観察されている（１）。
【0003】
その時以来、ＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子及びそれらの産物が特徴付けられ、それらの機能であるＣＤ４Ｔ細胞へのペプチドの提示が同定されている。ＨＬＡ－ＤＲＢ１の多形が記載され、そして、関節リウマチに関連するＨＬＡ－ＤＲＢ１対立遺伝子が、それらのβ１鎖の第３超可変領域において類似したモチーフを共有していることが示されている。「共有エピトープ」と呼ばれるこのモチーフは、関節リウマチに関連したあらゆるＨＬＡ－ＤＲＢ１対立遺伝子に存在している（２）。個体において発現されているどちらのＨＬＡ－ＤＲＢ１対立遺伝子も、関節リウマチ発症リスクに影響を及ぼす。２０１３年に南フランスにおいて、本発明者らは、３０００人の被験者に対してＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子型の関節リウマチとの関連研究を行ない、１３６個の最もありふれたＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子型の中の１０６個について関節リウマチを発症する、０．２から３０の範囲のオッズ比を示す二項目の表を公開した（３）。
【0004】
同様に、関節リウマチの定義は、定期的な診断基準の改訂と共に改善され続けた。２０１０年の米国リウマチ学会の基準は、関節リウマチに特徴的な抗シトルリン化ペプチド抗体（ＡＣＰＡ）の存在を含む（４）。ＡＣＰＡは、多くの異なるタンパク質上のシトルリン残基を認識する（５～８）。シトルリンは、脱イミン化と呼ばれ、ペプチジルアルギニルデイミナーゼ（ＰＡＤ）と呼ばれる酵素によって行なわれる、翻訳後修飾後に得られる修飾形のアルギニンである（９）。ＡＣＰＡは、関節リウマチ患者のおよそ３分の２に存在している。それらは関節リウマチに先行することが多い。しかしながら、共有エピトープ陽性のＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子が、どのようにして関節リウマチの発症に寄与するかは、依然として不明である。
【0005】
簡単な説明である「共有エピトープは、シトルリン化ペプチドに結合する」という仮説（ＳＥＣＩＴ）は、ＨＬＡ－ＤＲ拘束性Ｔ細胞が、ＡＣＰＡによって認識される多くの異なるシトルリン化タンパク質に対する抗体応答を補助し得ることを示唆する。このモデルでは、関節リウマチに関連したＨＬＡ－ＤＲＢ１対立遺伝子が、シトルリン化ペプチドに結合し、それらをヘルパーＴ細胞に提示すると考えられている。この仮説は、あるビメンチンペプチドに関する非常に少ない結合データによって支持され（１０）、天然形及びシトルリン化形の、数百個のフィブリノーゲン、ビメンチン、ＩＩ型コラーゲン、及びエプシュタインバーウイルスのペプチドに関する広範囲におよぶ結合データによって否定される（１１～１３）。それに加えて、ＡＣＰＡの数多くのシトルリン化標的タンパク質に特異的なヘルパーＴ細胞はつかみどころがない。端的に言えば、ＡＣＰＡの産生を補助するＴ細胞及びそれらの標的抗原（群）は依然として同定されていない。
【0006】
発明の要約：
ここで、本発明者らは、アルギニンをシトルリンへと変換する酵素の１つであるＰＡＤ４が、ＡＣＰＡの産生を補助するＴ細胞の標的抗原であると提唱する。本発明者らは近年、ＰＡＤに対する免疫化が、正常なマウスにおいて抗シトルリン化フィブリノーゲン抗体の産生をトリガーすることを実証した。ここで、本発明者らは、１２個の各々のＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子型と関連した関節リウマチを発症するリスク（オッズ比）は、各遺伝子型によってコードされる２つのＨＬＡ－ＤＲ分子がＰＡＤ４に由来する少なくとも１つのランダムなペプチドに結合する確率には相関するが、シトルリン化フィブリノーゲン又は天然フィブリノーゲンに由来するペプチドに結合する確率とは相関しないことを実証する。関節リウマチ患者、乾癬性関節炎患者、及び対照に由来する末梢血リンパ球がＰＡＤ４に対して増殖し、そして本発明者らは、特に、関節リウマチ患者及び数人の乾癬性関節炎患者由来のＴ細胞を刺激する、ＰＡＤ４由来のペプチドであるｐ８（配列番号６）を同定する。ｐ８に対する増殖応答は、関節リウマチ、共有エピトープ陽性のＨＬＡ－ＤＲ対立遺伝子、及びＰＡＤ４に対する抗体に関連している。
ここで、本発明者らは、アルギニンをシトルリンへと変換する酵素の１つであるＰＡＤ４が、ＡＣＰＡの産生を補助するＴ細胞の標的抗原であると提唱する。本発明者らは近年、ＰＡＤに対する免疫化が、正常なマウスにおいて抗シトルリン化フィブリノーゲン抗体の産生をトリガーすることを実証した。ここで、本発明者らは、１２個の各々のＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子型と関連した関節リウマチを発症するリスク（オッズ比）は、各遺伝子型によってコードされる２つのＨＬＡ－ＤＲ分子がＰＡＤ４に由来する少なくとも１つのランダムなペプチドに結合する確率には相関するが、シトルリン化フィブリノーゲン又は天然フィブリノーゲンに由来するペプチドに結合する確率とは相関しないことを実証する。関節リウマチ患者、乾癬性関節炎患者、及び対照に由来する末梢血リンパ球がＰＡＤ４に対して増殖し、そして本発明者らは、特に、関節リウマチ患者及び数人の乾癬性関節炎患者由来のＴ細胞を刺激する、ＰＡＤ４由来のペプチドであるｐ８（配列番号６）を同定する。ｐ８に対する増殖応答は、関節リウマチ、共有エピトープ陽性のＨＬＡ－ＤＲ対立遺伝子、及びＰＡＤ４に対する抗体に関連している。
【0007】
したがって、本発明は、関節リウマチの処置及び予防に使用するための、ＰＡＤ４タンパク質由来のペプチド及びその使用に関する。特に、本発明はその特許請求の範囲によって定義される。
【0008】
発明の詳細な説明：
本発明のペプチド
本発明の第一の態様は、配列番号２のＰＡＤ４タンパク質に由来するペプチドに関する。
本発明のペプチド
本発明の第一の態様は、配列番号２のＰＡＤ４タンパク質に由来するペプチドに関する。
【0009】
本明細書において使用する「ペプチジルアルギニンデイミナーゼ４」に対する「ＰＡＤ４」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、アルギニン残基をシトルリンへと変換するＣａ２＋依存性酵素を示す。ＰＡＤ４は、関節リウマチ疾患の発症及び進行において原因となる役割を果たすと広く信じられている。なぜなら、ＰＡＤ４遺伝子内の関節リウマチに関連した突然変異が多種多様な集団において同定され（A. Suzuki et al., Nat. Genet., 2003, 34: 395-402; T. Iwamoto et al., Rheumatology, 2006, 45: 804-807；及びY.H. Lee et al., Rheumatol. Int., 2007, 27: 827-233）、関節リウマチ患者は、シトルリン含有タンパク質を認識する自己抗体を産生するからである。ＰＡＤ４は、幾人かの関節リウマチ患者においてコンフォメーション依存的な自己抗原であることがすでに示されている（Y. Takizawa et al., Scand. J. Rheumatol., 2005, 3: 212-215）。ヒトでは、ＰＡＤ４タンパク質は、６６３アミノ酸残基（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿０３６５１９．１）を含有し、配列番号１に定義された核酸配列及び配列番号２に定義されたアミノ酸配列を有する。
【0010】
ＰＡＤ４の核酸配列（配列番号１）：
【化1】
【0011】
ＰＡＤ４のアミノ酸配列（配列番号２）：
【化2】
【0012】
特定の実施態様では、ＰＡＤ４タンパク質に由来するペプチドは、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０１０１、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４０１、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４０４、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４０２又はＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０７０１の分子に結合するペプチドである。特に、ＰＡＤ４タンパク質に由来するペプチドは、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４０１又はＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４０４の分子に結合する。
【0013】
別の特定の実施態様では、ＰＡＤ４タンパク質に由来するペプチドは、表１に記載のペプチドである。
【0014】
したがって、特定の実施態様では、ＰＡＤ４タンパク質に由来するペプチドは、配列番号６、配列番号８、又は配列番号１０～７２からなる群より選択されたアミノ酸配列からなる。
【0015】
特定の実施態様では、ＰＡＤ４タンパク質に由来するペプチドは、１５～２５アミノ酸のペプチドである。特定の実施態様では、ＰＡＤ４タンパク質に由来するペプチドは、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５アミノ酸のペプチドである。
【0016】
別の特定の実施態様では、ＰＡＤ４タンパク質に由来するペプチドは、配列番号２のアミノ酸６１～１００のアミノ酸配列を含むか又はからなるペプチドである。
【0017】
別の特定の実施態様では、ＰＡＤ４タンパク質に由来するペプチドは、配列番号２のアミノ酸６１～１００のアミノ酸配列を含むか又はからなるアミノ酸配列を有するペプチドである。特に、本発明のペプチドは、配列番号２のアミノ酸６１～１００に位置するＰＡＤ４タンパク質に由来するペプチドに対して６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一率を有し、かつ依然として抗原提示細胞によって効率的に提示されることができる。
【0018】
特定の実施態様では、本発明は、配列番号３又は４のアミノ酸配列に対して６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一率を有するＰＡＤ４タンパク質に由来するペプチドに関する。
【0019】
特定の実施態様では、ＰＡＤ４由来のペプチドは、配列番号３又は配列番号４のアミノ酸配列を含むか又はからなる。
【0020】
【化3】
【0021】
別の特定の実施態様では、ＰＡＤ４タンパク質由来のペプチドは、配列番号５：DPGVEVTLTMK-Xaa12-ASGSTGDQ（ここでのＸａａ１２は、アラニン（Ａｌａ又はＡ）又はバリン（Ｖａｌ又はＶ）である）のアミノ酸配列又はその機能の保存された変異体を含むか又はからなる。
【0022】
特定の実施態様では、ＰＡＤ４タンパク質由来のペプチドは、アミノ酸配列DPGVEVTLTMKAASGSTGDQ（配列番号６、ペプチドｐ８）又はDPGVEVTLTMKVASGSTGDQ（配列番号７、ペプチドｐ８に由来）又はその機能の保存された変異体を含むか又はからなる。
【0023】
特定の実施態様では、ＰＡＤ４タンパク質由来のペプチドは、アミノ酸配列VRVFQATRGKLSSKCSVVLG（配列番号８、ペプチドｐ２２）又はその機能の保存された変異体を含むか又はからなる。
【0024】
１つの実施態様では、本発明のペプチドは、本発明に記載の配列番号６（ｐ８）、配列番号７（ｐ８に由来）又は８（ｐ２２）のペプチドに対して少なくとも６０％、さらにより特定すると少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一率を含み、依然として抗原提示細胞によって効率的に提示されることができる。
【0025】
本明細書において使用する「機能の保存された変異体」という用語は、タンパク質又は酵素内の所与のアミノ酸残基が、該ポリペプチドの全体的なコンフォメーション及び機能を変化させることなく、変更（挿入、欠失、又は置換）されているものを指す。このような変異体は、欠失、挿入、及び／又は置換などの、アミノ酸の改変を有するタンパク質を含む。「欠失」は、タンパク質内に１つ以上のアミノ酸が存在しないことを指す。「挿入」は、タンパク質内における１つ以上のアミノ酸の付加を指す。「置換」は、タンパク質内の１つ以上のアミノ酸を、別のアミノ酸残基によって置換することを指す。典型的には、所与のアミノ酸は、類似した特性（例えば、極性度、水素結合能、酸性、塩基性、疎水性、芳香族性など）を有するアミノ酸によって置換されている。保存されていると示されているもの以外のアミノ酸は、タンパク質内で異なっていてもよく、よって類似の機能を有する任意の２つのタンパク質間のタンパク質配列又はアミノ酸配列の類似率は変動し得、例えば、Ｃｌｕｓｔｅｒ法などによるアラインメントスキームに従って決定したところ、７０％から９９％であり得、ここでの類似率は、ＭＥＧＡＬＩＧＮアルゴリズムに基づく。「機能の保存された変異体」はまた、ＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡアルゴリズムによって決定したところ少なくとも６０％、特に少なくとも７５％、より特定すると少なくとも８５％、さらに特定すると少なくとも９０％、さらにより特定すると少なくとも９５％のアミノ酸同一率を有し、かつ、それが比較される天然タンパク質又は親タンパク質と同じ又は実質的に類似した特性又は機能を有する、ポリペプチドも含む。２つのアミノ酸配列は、８０％超、特に８５％超、特に９０％超のアミノ酸が同一であるか、又は約９０％超、特に９５％超が、短い方の配列の全長に対して類似している（機能的に同一である）場合に、「実質的に相同」又は「実質的に類似」している。特に、類似した又は相同な配列は、例えばＧＣＧ（遺伝子コンピューターグループ、ＧＣＧパッケージ用のプログラムマニュアル、バージョン７、マジソン、ウィスコンシン州）パイルアッププログラム、又はＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなどの配列比較アルゴリズムのいずれかを使用したアラインメントによって同定される。
【0026】
特定の実施態様では、本発明のペプチドは、それらのＣ末端部分及びＮ末端部分に１つ又は２つ余分のアミノ酸を含有していてもよい。
【0027】
本発明によると、本発明のペプチドは、当技術分野において公知であるペプチド合成法に従って、ペプチドを合成することによって得ることができる。
【0028】
典型的には、本発明は、表１のペプチド又は配列番号３、配列番号４、配列番号６（ｐ８）、配列番号７（ｐ８に由来）、若しくは配列番号８（ｐ２２）のペプチドに対して実質的に同一であるペプチドを包含し、ここでの１つ以上の残基は、機能的に類似した残基で保存的に置換され、これらは上記のペプチドの機能的態様を示し、すなわち、依然として、所与のアミノ酸配列からなるペプチドと実質的に同じように、抗原提示細胞によって効率的に提示されることができる。
【0029】
保存的置換の例としては、１つの非極性（疎水性）残基、例えばイソロイシン、バリン、ロイシン、若しくはメチオニンを別の残基で置換、１つの極性（親水性）残基を、別の残基で置換、例えばアルギニンとリジンとの間、グルタミンとアスパラギンとの間、グリシンとセリンとの間で置換、１つの塩基性残基、例えばリジン、アルギニン、若しくはヒスチジンを別の残基で置換、又は、１つの酸性残基、例えばアスパラギン酸若しくはグルタミン酸を別の残基で置換などが挙げられる。
【0030】
「保存的置換」という用語はまた、誘導体化されていない残基の代わりに、化学的に誘導体化された残基の使用を含む。「化学的誘導体」は、側鎖官能基の反応によって化学的に誘導体化された１つ以上の残基を有する患者のペプチドを指す。このような誘導体化された分子の例としては、例えば、遊離アミノ基が誘導体化されて、アミン塩酸塩、ｐ－トルエンスルホニル基、カルボベンズオキシ基、ｔ－ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基、又はホルミル基を形成した分子が挙げられる。遊離カルボキシル基は、誘導体化されることにより、塩、メチルエステル及びエチルエステル、又は他の種類のエステル若しくはヒドラジドを形成し得る。遊離ヒドロキシル基は、誘導体化されることにより、Ｏ－アシル又はＯ－アルキル誘導体を形成し得る。ヒスチジンのイミダゾール窒素は、誘導体化されることにより、Ｎ－イム－ベンジルヒスチジン（N-im-benzylhistidine）を形成し得る。化学的誘導体としては、２０個の標準的なアミノ酸の１つ以上の天然に存在するアミノ酸の誘導体を含有しているペプチドが挙げられる。例えば：４－ヒドロキシプロリンを、プロリンに代えて置換してもよく；５－ヒドロキシリジンを、リジンに代えて置換してもよく；３－メチルヒスチジンをヒスチジンに代えて置換してもよく；ホモセリンを、セリンに代えて置換してもよく；オルニチンを、リジンに代えて置換してもよい。
【0031】
いくつかの実施態様では、本発明のペプチドは、異種ポリペプチドと融合している。いくつかの実施態様では、異種ポリペプチドは、細胞透過性ペプチド、転写トランス活性化因子（ＴＡＴ）細胞透過性配列、細胞透過性ペプチド又は膜透過性配列である。
【0032】
「細胞透過性ペプチド」という用語は当技術分野において周知であり、細胞透過性配列又は膜透過性配列、例えば、ペネトラチン、ＴＡＴミトコンドリア透過性配列、並びにBechara and Sagan, 2013; Jones and Sayers, 2012; Khafagy el and Morishita, 2012；及びMalhi and Murthy, 2012に記載の化合物を指す。
【0033】
特定の実施態様では、異種ポリペプチドは、細胞透過性ＨＩＶｔａｔペプチドに元来由来する、転写トランス活性化因子（ＴＡＴ）細胞透過性配列（GRKKRRQRRRPQ；配列番号９）である。
【0034】
核酸、ベクター、組換え宿主細胞、及びその使用
本発明の別の目的は、本発明に記載のＰＡＤ４タンパク質に由来するペプチドをコードしている核酸配列に関する。
本発明の別の目的は、本発明に記載のＰＡＤ４タンパク質に由来するペプチドをコードしている核酸配列に関する。
【0035】
特定の発明では、本発明は、配列番号６（ｐ８）、配列番号７（ｐ８に由来）又は配列番号８（ｐ２２）のペプチドをコードしている核酸配列又は本発明に記載のその機能の保存された変異体に関する。
【0036】
本発明の別の目的は、本発明に記載のＰＡＤ４タンパク質に由来するペプチドをコードしている核酸配列を含んでいる発現ベクターに関する。
【0037】
さらに別の目的では、本発明は、配列番号６（ｐ８）、配列番号７（ｐ８に由来）若しくは配列番号８（ｐ２２）のペプチドをコードしている核酸配列、又は本発明に記載のその機能の保存された変異体を含んでいる発現ベクターに関する。
【0038】
本発明によると、本発明に使用するのに適した発現ベクターは、核酸配列に作動可能に連結された少なくとも１つの発現制御配列を含み得る。発現制御配列は、ベクター内に、核酸配列の発現を制御及び調節するために挿入される。発現制御配列の例としては、λファージのｌａｃシステム、オペレーター領域及びプロモーター領域、酵母プロモーター、及びポリオーマ、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス若しくはシミアンウイルス４０由来のプロモーターが挙げられるがこれらに限定されない。さらなる好ましい又は必要とされる作動配列としては、リーダー配列、終結コドン、ポリアデニル化シグナル、並びに宿主系における核酸配列の適切な転写及び続く翻訳に必要とされるか又は好ましい任意の他の配列が挙げられるがこれらに限定されない。必要とされるか又は好ましい発現制御配列の正しい組合せは、選択された宿主系に依存するであろうことが当業者によって理解されるだろう。発現ベクターは、宿主系において核酸配列を含有している発現ベクターの導入及びその後の複製に必要な追加の配列を含有しているはずであることがさらに理解されるだろう。このような配列の例としては、複製起点及び選択マーカーが挙げられるがこれらに限定されない。このようなベクターは、従来の方法を使用して容易に作製されるか又は市販されていることが当業者によってさらに理解されるだろう。
【0039】
本発明の別の目的は、ここで上記されているような発現ベクターを含んでいる宿主細胞である。
【0040】
本発明によると、使用され得る宿主細胞の例は、真核細胞、例えば動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、及び酵母細胞、並びに原核細胞、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。遺伝子を保有しているベクターを細胞内に導入し得る手段としては、マイクロインジェクション法、電気穿孔法、形質導入法、又はＤＥＡＥ－デキストランを使用したトランスフェクション、リポフェクション、リン酸カルシウム法、又は当業者には公知である他の手順が挙げられるがこれらに限定されない。
【0041】
好ましい実施態様では、真核細胞において機能する真核細胞発現ベクターが使用される。このようなベクターの例としては、ウイルスベクター、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、レンチウイルス、細菌発現ベクター、プラスミド、例えばｐｃＤＮＡ３、又はバキュロウイルス導入ベクターが挙げられるがこれらに限定されない。好ましい真核細胞株としては、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞、２９３細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１５７３）、Ｔ２細胞、樹状細胞、又は単球が挙げられるがこれらに限定されない。
【0042】
治療的使用
本発明の第二の目的は、医薬品として使用するためのここで上記されているような、ＰＡＤ４タンパク質に由来するペプチド、核酸配列、ベクター、又は宿主細胞に関する。
本発明の第二の目的は、医薬品として使用するためのここで上記されているような、ＰＡＤ４タンパク質に由来するペプチド、核酸配列、ベクター、又は宿主細胞に関する。
【0043】
特定の実施態様では、本発明は、医薬品として使用するための、本発明に記載の、配列番号６（ｐ８）、配列番号７（ｐ８に由来）若しくは配列番号８（ｐ２２）のペプチド、又はその機能の保存された変異体に関する。
【0044】
別の特定の実施態様では、本発明は、医薬品として使用するための、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０１０１、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４０１、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４０４、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４０２又はＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０７０１の分子に結合する、ＰＡＤ４タンパク質由来のペプチドに関する。
【0045】
特定の実施態様では、本発明は、ワクチンとして使用するための、ここで上記されているようなペプチド、核酸配列、ベクター、又は宿主細胞に関する。
【0046】
１つの実施態様では、ここで上記されているようなＰＡＤ４タンパク質由来のペプチド、核酸配列、ベクター、又は宿主細胞は、それを必要とする対象における、関節リウマチ又は乾癬性関節炎の処置に使用され得る。
【0047】
したがって、別の実施態様では、本発明は、それを必要とする対象における、関節リウマチ又は乾癬性関節炎の処置に使用するための、ここで上記されているようなＰＡＤ４タンパク質由来のペプチド、核酸配列、ベクター、又は宿主細胞に関する。
【0048】
特定の実施態様では、本発明は、それを必要とする対象における、関節リウマチ又は乾癬性関節炎の処置に使用するための、本発明に記載の、配列番号６（ｐ８）、配列番号７（ｐ８に由来）若しくは配列番号８（ｐ２２）のペプチド、又はその機能の保存された変異体に関する。
【0049】
本明細書において使用する「対象」という用語は、哺乳動物、例えばげっ歯類、ネコ、イヌ、及び霊長類を示す。特に、本発明に記載の対象はヒトである。
【0050】
特に、それを必要とする対象は、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０１０１、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４０１、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４０４、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４０２、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０７０１を有する対象である。特に、該対象は、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４０１、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４０４を有する。
【0051】
本明細書において使用する「処置」又は「処置する」という用語は、疾患に罹患するリスクがあるか又は疾患に罹患していることが疑われる対象、並びに病気であるか又は疾患若しくは医学的状態を患っていると診断された対象の処置を含む、予防的処置又は防止的処置並びに治癒的処置又は疾患修飾処置の両方を指し、これは臨床的再発の抑制も含む。処置は、医学的障害を有するか又は最終的に障害を獲得する可能性がある対象に、障害又は再発している障害の１つ以上の症状を予防、治癒、その発症を遅延、その重症度を低減、又は寛解するために、あるいはこのような処置を行なわなかった場合に予想される生存期間を超えて対象の生存期間を延長するために投与され得る。「治療処方計画」は病気の処置のパターン、例えば療法中に使用される投薬パターンを意味する。治療処方計画は、導入処方計画及び維持処方計画を含み得る。「導入処方計画」又は「導入期間」という語句は、疾患の初期処置のために使用される治療処方計画（又は治療処方計画の一部）を指す。導入処方計画の一般的な目標は、処置処方計画の初期期間中に高いレベルの薬物を対象に提供することである。導入処方計画は、医師が維持処方計画中に使用するであろう用量よりも高い用量の薬物を投与すること、医師が維持処方計画中に薬物を投与するであろう頻度よりも高い頻度で薬物を投与すること、又はその両方を含み得る、「負荷処方計画」を（部分的に又は全体的に）使用し得る。「維持処方計画」又は「維持期間」という語句は、病気の処置中の対象の維持のために、例えば対象を長い期間にわたり（数か月間又は数年間）寛解状態に保つために使用される治療処方計画（又は治療処方計画の一部）を指す。維持処方計画は、連続療法（例えば、薬物を規則的な間隔で、例えば週１回、月１回、年１回などで投与）又は間欠的な療法（例えば断続的な処置、間欠的な処置、再発時の処置、又は特定の予め決定された基準［例えば、疾患の徴候など］の達成時における処置）を使用し得る。
【0052】
本明細書において使用する「治療有効量」は、患者に治療利点を与えるに必要な活性物質の最小量を意味する。例えば、患者への「活性物質の治療有効量」は、病理症状、疾患の進行、又は患者の罹患している疾患に関連した身体的状態の改善を誘発する、寛解する、又は引き起こす、活性物質の量である。
【0053】
特定の実施態様では、本発明は、ここで上記されているようなペプチド、核酸配列、ベクター、又は宿主細胞をそれを必要とする対象に投与することによって、関節リウマチ又は乾癬性関節炎を処置又は予防するための方法に関する。
【0054】
ワクチン組成物及びその使用
ＰＡＤ４は、ペプチドのシトルリン化に関与し、これによりプロセスの終了時にＢリンパ球によるシトルリン化ペプチドに対する自己抗体の産生が起こり、よって疾患に至る。
ＰＡＤ４は、ペプチドのシトルリン化に関与し、これによりプロセスの終了時にＢリンパ球によるシトルリン化ペプチドに対する自己抗体の産生が起こり、よって疾患に至る。
【0055】
本発明者らによって得られた結果のお蔭で（結果の部を参照）、本発明者らはここで、Ｂリンパ球が自己抗体を産生するのを補助するＴリンパ球の活性を不活化又は低減させ、よって、これらの自己抗体の産生を減少又は消失させることによって該疾患を予防及び／又は処置するために、本発明のペプチドを使用することを提案した。本発明者らは、これらのペプチド（特にｐ８及びｐ２２）が、特定のＨＬＡ－ＤＲによって提示され、この中のいくつかは、該疾患の出現及び／又は進行において重要な役割を果たしていることを示す。よって、本発明のペプチドを、それを必要とする対象を寛容化するためのワクチン組成物に使用することができる。
【0056】
したがって、本発明の第三の態様は、ここで上記されているようなＰＡＤ４タンパク質由来のペプチド、核酸配列、ベクター、又は宿主細胞を含んでいる、ワクチン組成物に関する。
【0057】
特定の実施態様では、前記ワクチン組成物は、配列番号６（ｐ８）、配列番号７（ｐ８に由来）若しくは配列番号８（ｐ２２）のペプチド、又は本発明に記載のその機能の保存された変異体を含む。
【0058】
１つの実施態様では、前記ワクチン組成物は、それを必要とする対象における関節リウマチ又は乾癬性関節炎を予防又は処置するのに有用である。
【0059】
特定の実施態様では、前記ワクチン組成物は、それを必要とする対象を寛容化するのに有用であり得る。
【0060】
１つの実施態様では、前記ワクチン組成物は、シトルリン化ペプチドに対する自己抗体の産生を減少又は消失させるのに有用である。
【0061】
本明細書において使用する「寛容化する」又は「寛容化」という用語は、特定のサプレッサーＴリンパ球の形成の刺激によって、寛容を誘導する事実を示す。このプロセスのお蔭で、本発明のペプチドを使用すると、これらのペプチドに対する寛容が誘導され、抗シトルリン化ペプチドに対する抗体は全く発生しないか又はより少ない抗体が発生するだろう。実際に、ＰＡＤ特異的な寛容化は、ＰＡＤワクチン接種とは反対の立場にあり、ＰＡＤに対する免疫応答を増強しようとするものではなく、それらを減少させるか又は完全に消失させようとするものである。これは、ＰＡＤ自己反応性Ｔ細胞の枯渇、不活化、若しくは死滅を通して、又は制御性Ｔ細胞の増殖を通して起こり得る。
【0062】
本発明のワクチン組成物の予防投与は、哺乳動物における関節リウマチ又は乾癬性関節炎のような疾患を予防又は減弱化するように作用するはずである。特定の実施態様では、関節リウマチ又は乾癬性関節炎のリスクの高い、哺乳動物、特にヒトは、本発明のワクチン組成物を用いて予防的に処置される。このような動物の例としては、関節リウマチ又は乾癬性関節炎の家族歴を有するヒトが挙げられるがこれらに限定されない。
【0063】
したがって、１つの実施態様では、前記ワクチン組成物は、治療用ワクチンとして使用されても、又は予防用ワクチンとして使用されてもよい。
【0064】
本発明の１つの実施態様では、本発明のペプチドは、リポタンパク質とコンジュゲートさせても、又はリポソーム形で若しくはアジュバントと共に投与されてもよい。
【0065】
本明細書において使用するような、本明細書において使用する「アジュバント」という用語は、宿主に単独で投与された場合には非免疫原性であり得るが、抗原と一緒に投与された場合にはその抗原に対する宿主の免疫応答を増大させる、化合物又は混合物を指す。
【0066】
１つの実施態様では、前記ワクチン組成物は医薬組成物である。
【0067】
このような実施態様では、ヒトに使用するための、前記ワクチン組成物は、ここで上記されているような少なくとも１つの抗原ペプチド、又はここで上記されているような少なくとも１つの抗体を、１つ以上の薬学的に許容される担体及び場合により他の治療成分と一緒に含む。担体（群）は、組成物の他の成分と適合性であり、そのレシピエントに対して有害ではないという意味において「許容可能」でなければならない。該ワクチン組成物は、簡便には単位投与剤形で提示され得、製薬分野において周知の任意の方法によって調製され得る。
【0068】
静脈内、皮内、筋肉内、皮下、又は腹腔内投与用に適したワクチン組成物は簡便には、活性物質の無菌水溶液を、レシピエントの血液と特に等張である溶液と共に含む。このような組成物は簡便には、固形の活性成分を、生理学的に適合性の物質、例えば塩化ナトリウム（例えば０．１～２．０Ｍ）、グリシンなどを含有し、かつ水溶液を生成するために生理的条件と適合した緩衝化されたｐＨを有し、かつ該溶液を無菌とした、水中に溶かすことによって調製され得る。これらは、単位投与量の容器又は複数回投与量の容器に、例えば密封されたアンプル中又はバイアル中に存在し得る。
【0069】
本発明のワクチン組成物は、安定化剤を取り込んでいてもよい。例示的な安定化剤は、ポリエチレングリコール、タンパク質、多糖、アミノ酸、無機酸、及び有機酸であり、これらは単独で使用されても、又は混和剤として使用されてもよい。これらの安定化剤は特に、活性物質の１重量部あたり、０．１１～１０，０００重量部の量で取り込まれる。２つ以上の安定化剤を使用しようとする場合、それらの総量は特に、上記に明記された範囲内である。これらの安定化剤は、水溶液中で適切な濃度及びｐＨで使用される。このような水溶液の具体的な浸透圧は一般的に、０．１～３．０オスモルの範囲内、特に０．８～１．２の範囲内である。水溶液のｐＨは、５．０～９．０の範囲内、特に６～８の範囲内になるように調整される。
【0070】
追加の薬学的方法を使用して、作用の持続時間を制御してもよい。放出制御製剤は、ポリマーを使用して、本発明のペプチドと複合体を形成するか又は吸着することを通して、成し遂げられ得る。制御された送達は、放出を制御するために、適切な巨大分子（例えばポリエステル、ポリアミノ酸、ポリビニルピロリドン、酢酸エチレンビニル、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、又は硫酸プロタミン）、及び巨大分子の濃度、並びに、取り込み法を選択することによって行なわれ得る。放出制御製剤による作用持続時間を制御する別の可能な方法は、本発明の抗原ペプチドを、ポリマー材料、例えばポリエステル、ポリアミノ酸、ヒドロゲル、ポリ（乳酸）、又はエチレン酢酸ビニルコポリマーの粒子に取り込むことである。あるいは、これらの物質をポリマー粒子に取り込む代わりに、これらの材料を、例えば、コアセルベーション技術によって若しくは界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンのマイクロカプセル及びポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセルに、又はコロイド状薬物送達システム、例えばリポソーム、アルブミンマイクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ粒子、及びナノカプセルに、又はマクロエマルションに捕捉することが可能である。
【0071】
経口製剤が望ましい場合、前記組成物を、典型的な担体、例えばラクトース、ショ糖、デンプン、タルク、ステアリン酸マグネシウム、結晶セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、グリセリン、アルギン酸ナトリウム、又はとりわけアラビアゴムと配合してもよい。
【0072】
本発明のワクチン組成物を用いた患者のワクチン接種は、慣用的な方法によって、例えば、慣用的なアジュバントの存在下において行なわれ得る。慣用的なアジュバントの例としては、金属塩、水中油滴型エマルション、Ｔｏｌｌ様受容体アゴニスト、サポニン、リピドＡ、アルキルグルコサミニドホスフェート、フロイントアジュバント、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、マンナン、ＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）、ミョウバン、サイトカイン、例えばＩＬ－１、ＩＬ－２、マクロファージコロニー刺激因子、及び腫瘍壊死因子、並びに免疫刺激剤として作用する他の物質、例えばムラミルペプチド又は細菌細胞壁成分、毒素、トキソイド、及びＴＬＲリガンドが挙げられるがこれらに限定されない。
【0073】
前記ワクチン組成物は、任意の適切な経路、例えば静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、皮内などによって投与され得る。免疫化組成物は、有意な免疫応答（例えば、ワクチン接種後に、使用されるワクチンペプチドに特異的なＣＤ４及びＣＤ８Ｔリンパ球の出現）が得られるまで、一回又は定期的な間隔で投与され得る。
【0074】
免疫化しようとする患者がすでに、関節リウマチ又は乾癬性関節炎に罹患している場合、本発明のワクチン組成物は、他の治療処置と組み合わせて投与されてもよい。他の治療処置の例としては、養子Ｔ細胞免疫療法、サイトカイン又は関節リウマチ若しくは乾癬性関節炎用の他の治療薬、例えばメトトレキサート、抗ＴＮＦα抗体、ＣＴＬＡ４ＩｇＧ（アバタセプト）、抗ＣＤ２０抗体、抗ＩＬ６抗体、又は抗ＩＬ－６受容体抗体との共投与が挙げられるがこれらに限定されない。
【0075】
患者に投与される予定の本発明のペプチドの用量は、例えば、処置される予定の疾患、該患者の年齢及び体重に応じて適宜調整され得る。投与され得る本発明の抗原ペプチドの範囲は、患者１人あたり約０．００１～約１００mgであり、好ましい用量は、患者１人あたり約０．０１～約１０mgである。
【0076】
本発明のワクチン組成物はまず、動物モデルにおいて、最初にげっ歯類において、及びヒト以外の霊長類において、最後にヒトにおいて評価され得る。免疫化手順の安全性は、免疫化された動物の全般的な健康状態（体重の変化、発熱、食欲、行動など）に対する免疫化の効果を調べることによって、及び解剖時の病的変化を調べることによって決定される。最初に動物で試験した後、がん患者を試験することができる。慣用的な方法を使用して、患者の免疫応答を評価することにより、免疫化組成物の有効性が決定されるだろう。
【0077】
Ｔリンパ球及びその使用
本発明の別の目的は、本発明のペプチドを特異的に認識するＴリンパ球に関する。
本発明の別の目的は、本発明のペプチドを特異的に認識するＴリンパ球に関する。
【0078】
本発明の１つの実施態様では、前記Ｔリンパ球は、ＣＤ４Ｔリンパ球、ＣＤ８Ｔリンパ球、又はヘルパーＴリンパ球である。
【0079】
本発明の別の実施態様では、前記Ｔリンパ球はＴ細胞クローンである。
【0080】
別の実施態様では、前記Ｔリンパ球は、本発明のペプチドを特異的に認識するＴ細胞受容体を発現している、遺伝子的に改変されたＴリンパ球である。
【0081】
本発明の別の目的は、本発明のペプチドを特異的に認識する、ここで上記されているような前記Ｔリンパ球を含んでいる、養子療法用の組成物である。
【0082】
特に、Ｔリンパ球を使用して、それを必要とする対象における関節リウマチ又は乾癬性関節炎を予防及び処置することができる。
【0083】
特定の実施態様では、Ｔ細胞は、それらを安定に維持するために、生理食塩水、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、培養培地などに含有される。投与は、例えば静脈内において成し遂げられ得る。
【0084】
どこでＴリンパ球を単離することができるかの例としては、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）、リンパ節、又は腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）が挙げられるがこれらに限定されない。
【0085】
このようなリンパ球は、当技術分野において公知である方法によって処置される予定の個体の末梢血から単離され、インビトロで培養され得る。リンパ球を、ＲＰＭＩ又はＲＰＭＩ １６４０などの培地中で２～５週間、特に２～３週間培養する。生存率は、トリパンブルー色素排除アッセイによって評価される。リンパ球は、全ての培養期間中、本発明の抗原ペプチドに曝される。
【0086】
好ましい実施態様では、前記リンパ球は、リンパ球全培養期間中、約１から約１０マイクログラム（μg）/mlの濃度の本発明のペプチドに曝される。ＩＬ－２などのサイトカインを、リンパ球培養液に加えてもよい。
【0087】
本発明のペプチドは、抗原提示細胞、例えば樹状細胞又は同種異系の放射線照射されたがん細胞株の細胞の存在下において培養液に添加されてもよい。
【0088】
特に、本発明のペプチドを、免疫抑制分子の存在下で培養液に加えて、制御性Ｔ細胞を得てもよい。
【0089】
前記ペプチドに感作させた後、Ｔリンパ球を、このような処置を必要とする患者に投与する。
【0090】
どのようにしてこれらの感作させたＴ細胞を哺乳動物に投与することができるかの例としては、静脈内、腹腔内、又は病巣内が挙げられるがこれらに限定されない。これらの感作したＴリンパ球の有効性を決定するために評価され得るパラメーターとしては、処置される患者における免疫細胞の産生、又は腫瘍退縮が挙げられるがこれらに限定されない。慣用的な方法を使用して、これらのパラメーターを評価する。このような処置は、サイトカイン又は遺伝子改変細胞と組み合わせて投与されてもよい（Rosenberg, S.A. et al. (1992) Human Gene Therapy, 3: 75-90; Rosenberg, S.A. et al. (1992) Human Gene Therapy, 3: 57-73）。
【0091】
本発明の別の目的は、本発明のペプチドを特異的に認識するＴリンパ球を産生する方法であり、該方法は、
（ａ）患者から得られた末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）又は腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を、本発明の少なくとも１つのペプチドを用いて刺激する工程、
（ｂ）（ａ）で使用されるペプチドに特異的なＴリンパ球集団を濃縮する工程、
（ｃ）場合により、（ａ）で使用されたペプチドに特異的な該Ｔリンパ球集団をクローニングする工程
を含んでいる。
（ａ）患者から得られた末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）又は腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を、本発明の少なくとも１つのペプチドを用いて刺激する工程、
（ｂ）（ａ）で使用されるペプチドに特異的なＴリンパ球集団を濃縮する工程、
（ｃ）場合により、（ａ）で使用されたペプチドに特異的な該Ｔリンパ球集団をクローニングする工程
を含んでいる。
【0092】
濃縮及び／又はクローニングは、ここで上記されているようなＭＨＣ／ペプチド多量体を使用することによって行なわれ得る。クローニングも、慣用的な方法によって行なわれてもよい。
【0093】
ＰＢＭＣの刺激は、本発明の少なくとも１つのペプチドのみを用いて行なわれても、又は樹状細胞若しくは同種異系の放射線照射されたがん細胞株の細胞などの抗原提示細胞によって提示された本発明の少なくとも１つのペプチドを用いて行なわれてもよい。典型的には、ＩＬ－２などのサイトカインも培養液に添加してもよい。
【0094】
本発明の別の目的は、関節リウマチ又は乾癬性関節炎のような疾患の予防又は処置のための、それを必要とする患者における、本発明のペプチドを特異的に認識するリンパ球を含む養子療法用の組成物であり、該Ｔリンパ球は、患者に再投与されるものである。
【0095】
本発明はさらに、以下の図面及び実施例によって説明されるだろう。しかしながら、これらの実施例及び図面は、いずれにしても本発明の範囲を制限するものと解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【0096】
【図1】４１人の関節リウマチ患者、２５人の乾癬性関節炎患者、及び１１人の健常な対照における、ヒトＰＡＤ４に対する増殖応答。４１人の関節リウマチ患者、２５人の乾癬性関節炎患者、及び１１人の正常な対照を、ＰＡＤ４、天然フィブリノーゲン及びシトルリン化フィブリノーゲンに対する増殖応答について試験した。各タンパク質について、ブロモデオキシウリジンの取り込みが４回繰り返して試験された。陽性率は、細胞とタンパク質とを含むウェルの吸光度と、細胞は含むがタンパク質は含まないウェルの吸光度との比が２より高い（吸光度比が２より高い）ことによって定義された。吸光度比の平均値は赤色で示されている。
【図2】２２人の関節リウマチ患者、１６人の乾癬性関節炎患者、及び１１人の正常な対照における、ＰＡＤ４由来ペプチドに対する増殖応答。２２人の関節リウマチ患者、１６人の乾癬性関節炎患者、及び１１人の健常な対照を、ＰＡＤ４ペプチドに対する増殖応答について試験した。各ペプチドについて、ブロモデオキシウリジンの取り込みが４回繰り返して試験された。陽性率は、細胞とペプチドとを含むウェルの吸光度と、細胞は含むがペプチドは含まないウェルの吸光度との比が２より高い（吸光度の比が２より高い）ことによって定義された。吸光度比の平均値は赤色で示されている。
【図3】４１人の関節リウマチ患者、２５人の乾癬性関節炎患者、及び１１人の健常な対照における、ヒトＰＡＤ４に対する抗体応答。４１人のＡＣＰＡ陽性関節リウマチ患者、２５人の乾癬性関節炎患者、及び１１人の健常な対照を、ＰＡＤ４に対するＩｇＭ及びＩｇＧについてＥＬＩＳＡによって試験した。各抗体アッセイは二度繰り返して行なわれた。陽性率は、血清とＰＡＤ４タンパク質とを含むウェルの吸光度と、血清は含むがＰＡＤ４タンパク質は含まないウェルの吸光度との比が、ＩｇＧについては２より高く（吸光度比が２より高い）、ＩｇＭについては３より高いことによって定義された。吸光度比の平均値は赤色で示されている。
【図4】４１人の関節リウマチ患者、２５人の乾癬性関節炎患者、及び１１人の健常な対照における、ＰＡＤ４に対する抗体応答及び増殖応答。４１人のＡＣＰＡ陽性関節リウマチ患者、２５人の乾癬性関節炎患者、及び１１人の健常な対照を、ＰＡＤ４に対するＴ細胞増殖応答及び抗体応答について試験し、結果に従って４つの群に分類した。ＳＥ：共有エピトープ。
【0097】
【表1】
【0098】
【表2】
【0099】
【表3】
【0100】
【表4】
【0101】
実施例：
材料及び方法
ヒトＰＡＤ４及びヒトフィブリノーゲンに由来する合成ペプチド
ペプチドを、固相システムを使用して合成し、精製した（７０％超）（ネオシステム社、ストラスブール、フランス）。本発明者らは、野生型ＰＡＤ４の残基１～６６３（遺伝子座ＮＭ＿０１２３８７上の残基Ｓ５５、Ａ８２、及びＡ１１２）を包含し、かつ１０アミノ酸重複している、６５個の２０アミノ酸長を合成した。それぞれペプチド５～６、８～９、及び１１～１２上の残基Ｓ５５、Ａ８２、及びＡ１１２（これらは多形である可能性もある）は、それらの天然の突然変異していない形で検出された。本発明者らは、ヒトフィブリノーゲンのＡ鎖及びＢ鎖（遺伝子座ＮＰ＿０００４９９、遺伝子座ＮＰ＿００５１３２）から１６７個の１５アミノ酸長（７１個の天然ペプチド、７１個のシトルリン化ペプチド、及びアルギニンもシトルリンも含有していない２５個のペプチド）を合成した。本発明者らが、ペプチド上のＲ残基の位置が、Ｐ４ポケットとの相互作用に影響を及ぼす可能性があると考えた場合にはいつでも、本発明者らは、余分な重複しているペプチドを合成した（１１）。
材料及び方法
ヒトＰＡＤ４及びヒトフィブリノーゲンに由来する合成ペプチド
ペプチドを、固相システムを使用して合成し、精製した（７０％超）（ネオシステム社、ストラスブール、フランス）。本発明者らは、野生型ＰＡＤ４の残基１～６６３（遺伝子座ＮＭ＿０１２３８７上の残基Ｓ５５、Ａ８２、及びＡ１１２）を包含し、かつ１０アミノ酸重複している、６５個の２０アミノ酸長を合成した。それぞれペプチド５～６、８～９、及び１１～１２上の残基Ｓ５５、Ａ８２、及びＡ１１２（これらは多形である可能性もある）は、それらの天然の突然変異していない形で検出された。本発明者らは、ヒトフィブリノーゲンのＡ鎖及びＢ鎖（遺伝子座ＮＰ＿０００４９９、遺伝子座ＮＰ＿００５１３２）から１６７個の１５アミノ酸長（７１個の天然ペプチド、７１個のシトルリン化ペプチド、及びアルギニンもシトルリンも含有していない２５個のペプチド）を合成した。本発明者らが、ペプチド上のＲ残基の位置が、Ｐ４ポケットとの相互作用に影響を及ぼす可能性があると考えた場合にはいつでも、本発明者らは、余分な重複しているペプチドを合成した（１１）。
【0102】
リンパ芽球細胞株からのＨＬＡ－ＤＲＢ１分子の精製
ＨＬＡホモ接合型リンパ芽球細胞株であるＪＥＳＴＨＯＭ（ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０１：０１）、ＳＡＶＣ（ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４：０１）、ＹＡＲ（ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４：０２）、ＰＥＹＳＳＯＮ（ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４：０４）、ＭＯＵ（ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０７：０１）を、１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０中で培養した。２×１０９個の細胞を、１０mMトリスｐＨ８、１０mM ＮａＣｌ、１０mM ＭｇＣｌ２、１％トリトンＸ１００、０．０５mg/mlのデオキシリボヌクレアーゼ、及びプロテアーゼ阻害剤に溶解した。これらのホモ接合型細胞株を選択したのは、それらが、３つの共有エピトープ陽性対立遺伝子であるＨＡＬ－ＤＲＢ１＊０１：０１、＊０４：０１、＊０４：０４、並びに、関節リウマチに関連していない２つの共有エピトープ陰性対立遺伝子であるＤＲＢ１＊０４：０２及びＤＲＢ１＊０７：０１を発現しているからである。全タンパク質抽出物を、臭化シアン活性化セファロース４Ｂ（シグマアルドリッチ社、サン・カンタン・ファラヴィエ、フランス）上に共有結合させた抗ＨＬＡ－ＤＲ ＬＢ３．１抗体によって免疫沈降させた。洗浄後、ＨＬＡ－ＤＲ分子を、０．５％のｎ－オクチルグルコシドを含むｐＨ２のＰＢＳ中で溶出し、１Ｍトリスで中和し、そして定量した（１１）。
ＨＬＡホモ接合型リンパ芽球細胞株であるＪＥＳＴＨＯＭ（ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０１：０１）、ＳＡＶＣ（ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４：０１）、ＹＡＲ（ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４：０２）、ＰＥＹＳＳＯＮ（ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４：０４）、ＭＯＵ（ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０７：０１）を、１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０中で培養した。２×１０９個の細胞を、１０mMトリスｐＨ８、１０mM ＮａＣｌ、１０mM ＭｇＣｌ２、１％トリトンＸ１００、０．０５mg/mlのデオキシリボヌクレアーゼ、及びプロテアーゼ阻害剤に溶解した。これらのホモ接合型細胞株を選択したのは、それらが、３つの共有エピトープ陽性対立遺伝子であるＨＡＬ－ＤＲＢ１＊０１：０１、＊０４：０１、＊０４：０４、並びに、関節リウマチに関連していない２つの共有エピトープ陰性対立遺伝子であるＤＲＢ１＊０４：０２及びＤＲＢ１＊０７：０１を発現しているからである。全タンパク質抽出物を、臭化シアン活性化セファロース４Ｂ（シグマアルドリッチ社、サン・カンタン・ファラヴィエ、フランス）上に共有結合させた抗ＨＬＡ－ＤＲ ＬＢ３．１抗体によって免疫沈降させた。洗浄後、ＨＬＡ－ＤＲ分子を、０．５％のｎ－オクチルグルコシドを含むｐＨ２のＰＢＳ中で溶出し、１Ｍトリスで中和し、そして定量した（１１）。
【0103】
ＨＬＡ－ＤＲペプチド結合アッセイ
ＥＬＩＳＡプレートを、１ウェルあたり１０μgのＰＡＤ４又はフィブリノーゲンペプチドでコーティングし、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロッキングした。１μgの精製ＨＬＡ－ＤＲ分子を、プレートに加えた。洗浄後、結合したＨＬＡ－ＤＲを、ビオチニル化抗ＨＬＡ－ＤＲ抗体Ｂ８１２２（イムノテック社、マルセイユ、フランス）によって検出し、続いて、ペルオキシダーゼに結合させたアビジンで検出した。ペルオキシダーゼにコンジュゲートさせた抗マウスＩｇＧ及びペルオキシダーゼにコンジュゲートさせたアビジンは、シグマアルドリッチ社（サン・カンタン・ファラヴィエ、フランス）によって供給された。４０５nmにおける吸光度を解読した。各々の精製されたＨＬＡ－ＤＲ対立遺伝子の結合を、ＰＡＤ４又はフィブリノーゲンに由来するペプチドでコーティングされたＥＬＩＳＡプレート上でアッセイし（各々、２つ複製したウェルで）、対照として、２つのウェルを、古典的な陽性結合物質であるインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）ペプチド（PKYVKQNTLKLAT）でコーティングした。陽性結合は、ＨＡペプチドの吸光度と等しい吸光度の数値として定義された。
ＥＬＩＳＡプレートを、１ウェルあたり１０μgのＰＡＤ４又はフィブリノーゲンペプチドでコーティングし、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロッキングした。１μgの精製ＨＬＡ－ＤＲ分子を、プレートに加えた。洗浄後、結合したＨＬＡ－ＤＲを、ビオチニル化抗ＨＬＡ－ＤＲ抗体Ｂ８１２２（イムノテック社、マルセイユ、フランス）によって検出し、続いて、ペルオキシダーゼに結合させたアビジンで検出した。ペルオキシダーゼにコンジュゲートさせた抗マウスＩｇＧ及びペルオキシダーゼにコンジュゲートさせたアビジンは、シグマアルドリッチ社（サン・カンタン・ファラヴィエ、フランス）によって供給された。４０５nmにおける吸光度を解読した。各々の精製されたＨＬＡ－ＤＲ対立遺伝子の結合を、ＰＡＤ４又はフィブリノーゲンに由来するペプチドでコーティングされたＥＬＩＳＡプレート上でアッセイし（各々、２つ複製したウェルで）、対照として、２つのウェルを、古典的な陽性結合物質であるインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）ペプチド（PKYVKQNTLKLAT）でコーティングした。陽性結合は、ＨＡペプチドの吸光度と等しい吸光度の数値として定義された。
【0104】
特定のＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子型について、所与のタンパク質に由来する少なくとも１つのペプチドに結合する確率の計算
簡潔に言えば、本発明者らは、特定のＨＬＡ－ＤＲＢ１対立遺伝子が、所与のタンパク質に由来する所与の（未知な）ペプチドに結合する確率は、結合したペプチドの数と、このタンパク質に由来するペプチドの総数との間の比であると考えた。この比は、該タンパク質を網羅する１セットのペプチドの結合を研究することによって評価され得る。その後、所与の対立遺伝子が、同タンパク質に由来するペプチドに結合しない確率は、１－（マイナス）ペプチドに結合する確率である。遺伝子型によってコードされている２つのＨＬＡ－ＤＲＢ１対立遺伝子が、同タンパク質に由来するどのペプチドにも結合しない確率は、２つの確立の積である：（対立遺伝子１に結合しない確率）×（対立遺伝子２に結合しない確率）。最後に、所与のＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子型の産物が、タンパク質に由来する少なくとも１つのペプチドに結合する確率は、１－（マイナス）（（対立遺伝子１に結合しない確率）×（対立遺伝子２に結合しない確率））である（表２）。
簡潔に言えば、本発明者らは、特定のＨＬＡ－ＤＲＢ１対立遺伝子が、所与のタンパク質に由来する所与の（未知な）ペプチドに結合する確率は、結合したペプチドの数と、このタンパク質に由来するペプチドの総数との間の比であると考えた。この比は、該タンパク質を網羅する１セットのペプチドの結合を研究することによって評価され得る。その後、所与の対立遺伝子が、同タンパク質に由来するペプチドに結合しない確率は、１－（マイナス）ペプチドに結合する確率である。遺伝子型によってコードされている２つのＨＬＡ－ＤＲＢ１対立遺伝子が、同タンパク質に由来するどのペプチドにも結合しない確率は、２つの確立の積である：（対立遺伝子１に結合しない確率）×（対立遺伝子２に結合しない確率）。最後に、所与のＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子型の産物が、タンパク質に由来する少なくとも１つのペプチドに結合する確率は、１－（マイナス）（（対立遺伝子１に結合しない確率）×（対立遺伝子２に結合しない確率））である（表２）。
【0105】
患者
本発明者らは、フランス、マルセイユのサントマルグリット病院のリウマチ科の４１人の関節リウマチ（ＲＡ）患者、２５人の乾癬性関節炎（ＰｓＡ）患者、並びに研究室及びリウマチ病棟のスタッフからの１１人の健常な対照を試験した。関節リウマチ患者は、２０１０年の米国リウマチ学会／欧州リウマチ学会の基準を満たし、正常値上限の３倍を超えるＡＣＰＡ抗体力価を示した（４）。乾癬性関節炎患者は、乾癬性関節炎の分類基準（ＣＡＳＰＡＲ）という基準を満たした（２６）。ＨＬＡ－ＤＲＢ１型判定は、あらゆる患者及び対照におけるＰＣＲ／配列特異的オリゴヌクレオチド分析によって行なわれた（３）。抗環状シトルリン化ペプチドＩｇＧ抗体は、第二世代ＥＬＩＳＡ（Immunoscan RA Mark 2、Eurodiagnostica社、マルメ、スウェーデン）によって検出された。リウマチ因子は、Orgentec社のキット（マインツ、ドイツ）を使用してＥＬＩＳＡによって検出された。患者のベースラインの特徴が表３及び表４に提示されている。
本発明者らは、フランス、マルセイユのサントマルグリット病院のリウマチ科の４１人の関節リウマチ（ＲＡ）患者、２５人の乾癬性関節炎（ＰｓＡ）患者、並びに研究室及びリウマチ病棟のスタッフからの１１人の健常な対照を試験した。関節リウマチ患者は、２０１０年の米国リウマチ学会／欧州リウマチ学会の基準を満たし、正常値上限の３倍を超えるＡＣＰＡ抗体力価を示した（４）。乾癬性関節炎患者は、乾癬性関節炎の分類基準（ＣＡＳＰＡＲ）という基準を満たした（２６）。ＨＬＡ－ＤＲＢ１型判定は、あらゆる患者及び対照におけるＰＣＲ／配列特異的オリゴヌクレオチド分析によって行なわれた（３）。抗環状シトルリン化ペプチドＩｇＧ抗体は、第二世代ＥＬＩＳＡ（Immunoscan RA Mark 2、Eurodiagnostica社、マルメ、スウェーデン）によって検出された。リウマチ因子は、Orgentec社のキット（マインツ、ドイツ）を使用してＥＬＩＳＡによって検出された。患者のベースラインの特徴が表３及び表４に提示されている。
【0106】
タンパク質
ヒトＰＡＤ４タンパク質は、バキュロウイルス発現系において産生され、精製された（プロテオジェニックス社、シルティカイム、フランス）。活性及び自己シトルリン化状態を、Ｔ細胞増殖アッセイ前に試験した。ヒトフィブリノーゲン（メルクミリポア社、ダルムシュタット、ドイツ）を、１Ｍトリス塩酸塩（ｐＨ７．４）、１００mM ＣａＣｌ２、５０mMジチオトレイトール緩衝液中、ウサギＰＡＤ２タンパク質（シグマアルドリッチ社、サン・タンカン・ファラヴィエ、フランス）１mg/mlの濃度でインキュベートした。シトルリン化は、３７℃で２時間行なわれた。シトルリン化されていなフィブリノーゲンは、ＰＡＤの代わりに水を加えた以外は、同様に処理された。
ヒトＰＡＤ４タンパク質は、バキュロウイルス発現系において産生され、精製された（プロテオジェニックス社、シルティカイム、フランス）。活性及び自己シトルリン化状態を、Ｔ細胞増殖アッセイ前に試験した。ヒトフィブリノーゲン（メルクミリポア社、ダルムシュタット、ドイツ）を、１Ｍトリス塩酸塩（ｐＨ７．４）、１００mM ＣａＣｌ２、５０mMジチオトレイトール緩衝液中、ウサギＰＡＤ２タンパク質（シグマアルドリッチ社、サン・タンカン・ファラヴィエ、フランス）１mg/mlの濃度でインキュベートした。シトルリン化は、３７℃で２時間行なわれた。シトルリン化されていなフィブリノーゲンは、ＰＡＤの代わりに水を加えた以外は、同様に処理された。
【0107】
Ｔ細胞増殖アッセイ
患者の単核細胞を、２０mlのヘパリン処理された血液から、フィコール－ヒストパック（シグマアルドリッチ社、サン・タンカン・ファラヴィエ、フランス）を通した遠心分離によって単離した。細胞を、１μg/mlのヒトＰＡＤ４若しくはヒトフィブリノーゲン若しくはＰＨＡ（フィトヘマグルチニン）又は５μg/mlのＰＡＤ４ペプチドの存在下で、１０％自己血清を含むＲＰＭＩ１６４０中、１０６個の細胞/mlの密度で培養した。３７℃で６日間培養した後、タンパク質に対する増殖応答を、比色定量ブロモデオキシウリジンキット（ロシュダイアグノスティックス社、メラン、フランス）を使用して評価した。陽性Ｔ細胞応答は、タンパク質又はペプチドを伴わずに培養された細胞についての吸光度の２倍を超える吸光度（ＯＤ）によって定義された。
患者の単核細胞を、２０mlのヘパリン処理された血液から、フィコール－ヒストパック（シグマアルドリッチ社、サン・タンカン・ファラヴィエ、フランス）を通した遠心分離によって単離した。細胞を、１μg/mlのヒトＰＡＤ４若しくはヒトフィブリノーゲン若しくはＰＨＡ（フィトヘマグルチニン）又は５μg/mlのＰＡＤ４ペプチドの存在下で、１０％自己血清を含むＲＰＭＩ１６４０中、１０６個の細胞/mlの密度で培養した。３７℃で６日間培養した後、タンパク質に対する増殖応答を、比色定量ブロモデオキシウリジンキット（ロシュダイアグノスティックス社、メラン、フランス）を使用して評価した。陽性Ｔ細胞応答は、タンパク質又はペプチドを伴わずに培養された細胞についての吸光度の２倍を超える吸光度（ＯＤ）によって定義された。
【0108】
抗ＰＡＤ４抗体の検出
プレートを、０．５μgのヒトＰＡＤ４でコーティングし、２％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を用いてブロッキングした。１：１００に希釈された血清を、プレート上でインキュベートした。洗浄後、ペルオキシダーゼにコンジュゲートさせた抗ヒトＩｇＧ又はＩｇＭを加えた。４０５nmにおける吸光度（ＯＤ）を解読した。バックグラウンドの吸光度は、各血清を、タンパク質を含まないウェルに加えることによって得られた。陽性の血清は、ＩｇＧではバックグラウンド吸光度の２倍を超える吸光度の数値、ＩｇＭではバックグラウンド吸光度の３倍を超える吸光度の数値によって定義された。
プレートを、０．５μgのヒトＰＡＤ４でコーティングし、２％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を用いてブロッキングした。１：１００に希釈された血清を、プレート上でインキュベートした。洗浄後、ペルオキシダーゼにコンジュゲートさせた抗ヒトＩｇＧ又はＩｇＭを加えた。４０５nmにおける吸光度（ＯＤ）を解読した。バックグラウンドの吸光度は、各血清を、タンパク質を含まないウェルに加えることによって得られた。陽性の血清は、ＩｇＧではバックグラウンド吸光度の２倍を超える吸光度の数値、ＩｇＭではバックグラウンド吸光度の３倍を超える吸光度の数値によって定義された。
【0109】
統計
関節リウマチを発症するＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子型のオッズ比と、所与の遺伝子型について少なくとも１つのＰＡＤ４又はフィブリノーゲンペプチドに結合する確率との間の相関は、ピアソンの相関検定によって評価された。Ｔ細胞及び抗体アッセイについての群間の比較は、フィッシャー検定を使用して行なわれた。グラフパッドプリズム５．０２（グラフパッドソフトウェア）を、全ての統計分析のために使用した。
関節リウマチを発症するＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子型のオッズ比と、所与の遺伝子型について少なくとも１つのＰＡＤ４又はフィブリノーゲンペプチドに結合する確率との間の相関は、ピアソンの相関検定によって評価された。Ｔ細胞及び抗体アッセイについての群間の比較は、フィッシャー検定を使用して行なわれた。グラフパッドプリズム５．０２（グラフパッドソフトウェア）を、全ての統計分析のために使用した。
【0110】
結果
５つの異なるＨＬＡ－ＤＲ分子に対するＰＡＤ４及びフィブリノーゲンペプチドへの結合
５つの精製されたＨＬＡ－ＤＲ分子に対する、ＰＡＤ４由来の６５個のペプチド、フィブリノーゲンに由来する９６個のシトルリン化ペプチド又はアルギニン非含有ペプチド、及びそれらの９６個のシトルリン化されていない対応物の結合を試験した（表１、及びデータは示されていない）。各々の精製されたＨＬＡ－ＤＲＢ１分子は、６５個のＰＡＤ４ペプチドの中の２～９個に結合し、９６個のフィブリノーゲンペプチドの中の１２～２３個に結合し、９６個のシトルリン化フィブリノーゲンペプチドの中の１１～２３個に結合した。
５つの異なるＨＬＡ－ＤＲ分子に対するＰＡＤ４及びフィブリノーゲンペプチドへの結合
５つの精製されたＨＬＡ－ＤＲ分子に対する、ＰＡＤ４由来の６５個のペプチド、フィブリノーゲンに由来する９６個のシトルリン化ペプチド又はアルギニン非含有ペプチド、及びそれらの９６個のシトルリン化されていない対応物の結合を試験した（表１、及びデータは示されていない）。各々の精製されたＨＬＡ－ＤＲＢ１分子は、６５個のＰＡＤ４ペプチドの中の２～９個に結合し、９６個のフィブリノーゲンペプチドの中の１２～２３個に結合し、９６個のシトルリン化フィブリノーゲンペプチドの中の１１～２３個に結合した。
【0111】
１２個の異なるＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子型の各々について、ＰＡＤ４ペプチドに結合する確率
本発明者らが関節リウマチを発症するリスクを計算しておいた１２個の遺伝子型が、少なくとも１つのＰＡＤ４ペプチド、１つの天然フィブリノーゲンペプチド、及び１つのシトルリン化フィブリノーゲンペプチドに結合する確率を計算した（表２）。
本発明者らが関節リウマチを発症するリスクを計算しておいた１２個の遺伝子型が、少なくとも１つのＰＡＤ４ペプチド、１つの天然フィブリノーゲンペプチド、及び１つのシトルリン化フィブリノーゲンペプチドに結合する確率を計算した（表２）。
【0112】
関節リウマチを発症するオッズ比と、１２個のＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子型について少なくとも１つのＰＡＤ４ペプチド又はフィブリノーゲンペプチドに結合する確率との間の相関
各々のＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子型によって保有される関節リウマチを発症するリスクと、その２つのコードされているＨＬＡ－ＤＲＢ１分子が少なくとも１つのＰＡＤ４ペプチドに結合する確率との間には強力な相関がある（ｐ＝０．０４２ピアソンの検定）（データは示されていない）。逆に、各々のＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子型の有する関節リウマチを発症するリスクと、その２つのコードされているＨＬＡ－ＤＲＢ１分子が、天然又はシトルリン化されたフィブリノーゲンに由来する少なくとも１つのペプチドに結合する確率との間には相関は全くない（データは示されていない）。
各々のＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子型によって保有される関節リウマチを発症するリスクと、その２つのコードされているＨＬＡ－ＤＲＢ１分子が少なくとも１つのＰＡＤ４ペプチドに結合する確率との間には強力な相関がある（ｐ＝０．０４２ピアソンの検定）（データは示されていない）。逆に、各々のＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子型の有する関節リウマチを発症するリスクと、その２つのコードされているＨＬＡ－ＤＲＢ１分子が、天然又はシトルリン化されたフィブリノーゲンに由来する少なくとも１つのペプチドに結合する確率との間には相関は全くない（データは示されていない）。
【0113】
ヒトＰＡＤ４に対するＴ細胞増殖応答は、関節リウマチ患者、乾癬性関節炎患者、及び正常な対照において共通している
４１人のＡＣＰＡ陽性関節リウマチ患者、２５人の乾癬性関節炎患者、及び１１人の健常な対照に由来する末梢血リンパ球を、ヒトＰＡＤ４、ヒト天然フィブリノーゲン及びシトルリン化フィブリノーゲンに対するＴ細胞増殖応答について、ブロモデオキシウリジンの取り込みによって試験した（表３、図１）。
４１人のＡＣＰＡ陽性関節リウマチ患者、２５人の乾癬性関節炎患者、及び１１人の健常な対照に由来する末梢血リンパ球を、ヒトＰＡＤ４、ヒト天然フィブリノーゲン及びシトルリン化フィブリノーゲンに対するＴ細胞増殖応答について、ブロモデオキシウリジンの取り込みによって試験した（表３、図１）。
【0114】
４１人中１９人（４６％）の関節リウマチ患者、２５人中８人（３２％）の乾癬性関節炎患者、１１人中４人（３６％）の対照において、ＰＡＤ４に対してＴ細胞は増殖した（関節リウマチ対その他、ｐ＝０．０３５ フィッシャー検定、有意差なし）。
【0115】
１人（２．４％）の関節リウマチ患者が、シトルリン化フィブリノーゲンに対する増殖応答を示し、乾癬性関節炎患者又は健常な対照は誰も示さなかった。ＰＡＤ４と共に培養された末梢血リンパ球において観察された増殖応答が、Ｔ細胞に起因することを確認するために、本発明者らは、さらに１０人の関節リウマチ患者及び７人の対照においてフローサイトメトリー分析を行なった。この分析において、ＣＤ４Ｔ細胞は、ＰＡＤ４を用いて刺激された全血試料中において、Ｔ細胞の初期活性化マーカーであるＣＤ１５４の増加した発現、及びＴＮＦαの増加した産生を示した（データは示されていない）。
【0116】
２２人の関節リウマチ患者、１６人の乾癬性関節炎患者、及び１１人の健常な対照における、ＰＡＤ４由来のペプチドに対するＴ細胞増殖応答
ＰＡＤ４上のどのエピトープ（群）がＴ細胞によって認識されたかを同定するために、本発明者らは、２２人の関節リウマチ患者、１６人の乾癬性関節炎患者、及び１１人の健常な対照において、本発明者らがＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４:０１、＊０４:０４、＊０１:０１、＊０４:０２又は＊０７:０１の良好な結合物質であることを発見していた、ＰＡＤ４由来の１１個の２０アミノ酸長に対する増殖応答を研究した（表４、図２）。
ＰＡＤ４上のどのエピトープ（群）がＴ細胞によって認識されたかを同定するために、本発明者らは、２２人の関節リウマチ患者、１６人の乾癬性関節炎患者、及び１１人の健常な対照において、本発明者らがＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４:０１、＊０４:０４、＊０１:０１、＊０４:０２又は＊０７:０１の良好な結合物質であることを発見していた、ＰＡＤ４由来の１１個の２０アミノ酸長に対する増殖応答を研究した（表４、図２）。
【0117】
ペプチド２２（ｐ２２、配列：VRVFQATRGKLSSKCSVVLG；配列番号８、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４:０１のみに結合することが判明したペプチド）に対する増殖応答が、２２人中２人（９％）の関節リウマチ患者、１６人中２人（１２．５％）の乾癬性関節炎患者に観察されたが、１１人の対照には誰にも観察されなかった（関節リウマチ対その他、フィッシャー検定、有意差なし）。
【0118】
ペプチド８（ｐ８、配列：DPGVEVTLTMKAASGSTGDQ、配列番号６、５つ全ての試験されたＨＬＡ－ＤＲＢ１対立遺伝子に結合したペプチド）に対する増殖応答は、関節リウマチに関連し；実際に、２２人中９人（４１％）の関節リウマチ患者、１６人中３人（１９％）の乾癬性関節炎患者、及び１１人中０人の対照が、ｐ８に対して増殖した（関節リウマチ対その他、ｐ＝０．０２、フィッシャー検定）。
【0119】
ペプチド８に対する増殖応答は、共有エピトープに関連していた：応答者において７５％（１２人中９人）、これに対して非応答者においては４０％（３７人中１５人）（応答者対非応答者、ｐ＝０．０５、フィッシャー検定）。
【0120】
ペプチド８に対する増殖応答は、抗ＰＡＤ４抗体に関連していた（全ての被験者がペプチド８に対して増殖し、これに対し、全ての被験者が抗ＰＡＤ４抗体を有していた、ｐ＝００５、フィッシャー検定）。
【0121】
４１人の関節リウマチ患者、２５人の乾癬性関節炎患者、及び１１人の正常な対照における、ヒトＰＡＤ４に対する抗体応答
ＰＡＤ４に対するＩｇＧ抗体が、４１人中１１人（２７％）の関節リウマチ患者、２５人中１人（４％）の乾癬性関節炎患者、及び１１人中０人の健常な対照において検出された（関節リウマチ対その他、フィッシャー検定、ｐ＝０．００４）（図３）。
ＰＡＤ４に対するＩｇＧ抗体が、４１人中１１人（２７％）の関節リウマチ患者、２５人中１人（４％）の乾癬性関節炎患者、及び１１人中０人の健常な対照において検出された（関節リウマチ対その他、フィッシャー検定、ｐ＝０．００４）（図３）。
【0122】
ヒトＰＡＤ４に対するＩｇＭ抗体は、４１人中１４人（３４％）の関節リウマチ患者に検出され、これに対して、２５人中３人（１２％）の乾癬性関節炎患者に検出され、１１人の健常な対照には誰にも検出されなかった（関節リウマチ対その他、フィッシャー検定、ｐ＝０．０１）（図３）。
【0123】
関節リウマチ患者におけるＰＡＤ４に対するＩｇＭ陽性応答は、ＥＬＩＳＡに使用されたペルオキシダーゼで標識された抗ＩｇＭ抗体による、ＰＡＤ４に対するＩｇＧ抗体に結合したＩｇＭリウマチ因子の認識によって引き起こされた確率が最も高い。実際に、ＰＡＤ４に対するＩｇＭが陽性と判定された、１４人中１１人の関節リウマチ患者は、ＩｇＭリウマチ因子についても陽性と判定された。それ故、本発明者らが関節リウマチ患者において検出したＰＡＤ４に対するＩｇＭ抗体は、これらの患者におけるＰＡＤ４に対するＩｇＧ抗体の存在を高い確率で示す。したがって、本発明者らは、ＰＡＤ４に対するＩｇＭ及びＩｇＧ抗体をプールし、それらを「抗ＰＡＤ４抗体」と呼んだ。
【0124】
ＰＡＤ４に対する抗体は、４１人中２１人（５１％）の関節リウマチ患者、２５人中４人（１６％）の乾癬性関節炎患者、及び１１人中０人の健常な対照において存在する（関節リウマチ対その他、ｐ＝０．０００２、フィッシャー検定）。
【0125】
ＰＡＤ４に対する抗体を有し、ＰＡＤ４に対するＴ細胞増殖を示す、１４人中１３人の患者が関節リウマチを有する
試験された７７人の被験者の中で、ＰＡＤ４に対するＴ細胞増殖及び抗体応答により、本発明者らは、４つの亜群を定義することができた（図４）：
試験された７７人の被験者の中で、ＰＡＤ４に対するＴ細胞増殖及び抗体応答により、本発明者らは、４つの亜群を定義することができた（図４）：
【0126】
７７人中３５人の被験者が、ＰＡＤ４に対する抗体及び増殖の両方について陰性であった。それらは、４１人中１４人（３４％）の関節リウマチ患者、２５人中１４人（５６％）の乾癬性関節炎患者、及び１１人中７人（６４％）の健常な対照を含んでいた。関節リウマチ患者は、この群において少数しか存在しなかった（関節リウマチ対その他、ｐ＝０．０４、フィッシャー検定）。
【0127】
７７人中１７人の被験者が、ＰＡＤ４に対する抗体については陰性、ＰＡＤ４に対するＴ細胞増殖については陽性であった。それらは、４１人中６人（１５％）の関節リウマチ患者、２５人中７人（２８％）の乾癬性関節炎患者、及び１１人中４人（３６％）の健常な対照を含んでいた（関節リウマチ対その他、ｐ＝０．１、有意差なし）。
【0128】
７７人中１１人の被験者が、ＰＡＤ４に対する抗体については陽性、ＰＡＤ４に対するＴ細胞増殖については陰性であった。それらは、４１人中８人（１９．５％）の関節リウマチ患者、２５人中３人（１２％）の乾癬性関節炎患者、及び１１人中０人の健常な対照を含んでいた（関節リウマチ対その他、ｐ＝０．２、有意差なし）。
【0129】
７７人中１４人の被験者が、ＰＡＤ４に対する抗体及びＴ細胞増殖の両方について陽性であった。それらは、４１人中１３人（３２％）の関節リウマチ患者、２５人中１人（４％）の乾癬性関節炎患者、及び１１人中０人の健常な対照を含んでいた（関節リウマチ対その他、ｐ＝０．０００９、フィッシャー検定）（図４）。
【0130】
この「二重陽性」群では、７１％（１４人中１０人）の患者が、共有エピトープを発現し、これに対してその他の群では４１％であった（フィッシャー検定、ｐ＝０．０７）。
【0131】
さらに、２５人が、ＰＡＤ４に対する抗体を有し、その中の１６人が共有エピトープ陽性のＨＬＡ－ＤＲ対立遺伝子を発現し、５２人が、抗ＰＡＤ４抗体に対して陰性であり、その中の２０人が、共有エピトープ陽性のＨＬＡ－ＤＲ対立遺伝子を発現していた（フィッシャー検定、ｐ＝０．０５１）（図４）。
【0132】
３１人の被験者は、ＰＡＤ４に対する増殖応答を示し、その中の１５人が、共有エピトープ陽性のＨＬＡＤＲ対立遺伝子を発現し、４６人が、ＰＡＤ４に対する増殖応答を全く示さず、その中の２１人が共有エピトープ陽性のＨＬＡ－ＤＲ対立遺伝子を発現した（ｐ＝０．８、フィッシャー検定）（図４）。
【0133】
したがって、ＨＬＡ－ＤＲの共有エピトープは、抗ＰＡＤ４抗体と関連しているが、抗ＰＡＤ４増殖応答とは関連していない。
【0134】
結論：
本発明者らは、「共有エピトープはシトルリン化ペプチドに結合する」という仮説の代案を開発した。実際に、関節リウマチの発症には、ＰＡＤ４（ペプチジルアルギニルデイミナーゼ、シトルリン化酵素）に対するＩｇＧの抗体の出現が先行する（１７～２１）。このことは、関節リウマチ患者におけるＰＡＤ４に特異的なヘルパーＴ細胞の存在を示唆する。ＰＡＤ４は、複数のタンパク質に結合しシトルリン化するので、ＰＡＤ４に結合しシトルリン化されるどのタンパク質も、古典的なハプテン担体機序による補助から利点が得られる可能性がある。実際に、ＰＡＤ４に結合したタンパク質上のシトルリン化残基に特異的なＢ細胞は、内部移行して、ＰＡＤ４/シトルリン化タンパク質複合体を処理し、ＰＡＤ４ペプチドをヘルパーＴ細胞に提示することができた。これにより、複数のシトルリン化タンパク質に対するＩｇＧ抗体が産生されるだろう。この点を証明するために、本発明者らは近年、ヒト及び／又はマウスのＰＡＤを用いて正常な自己免疫のないマウスを免疫化し、マウスの２０％が、シトルリン化フィブリノーゲンに対するＴ細胞応答が全く存在しない下で、抗シトルリン化フィブリノーゲン抗体を発生したことを発見した（２２）。
本発明者らは、「共有エピトープはシトルリン化ペプチドに結合する」という仮説の代案を開発した。実際に、関節リウマチの発症には、ＰＡＤ４（ペプチジルアルギニルデイミナーゼ、シトルリン化酵素）に対するＩｇＧの抗体の出現が先行する（１７～２１）。このことは、関節リウマチ患者におけるＰＡＤ４に特異的なヘルパーＴ細胞の存在を示唆する。ＰＡＤ４は、複数のタンパク質に結合しシトルリン化するので、ＰＡＤ４に結合しシトルリン化されるどのタンパク質も、古典的なハプテン担体機序による補助から利点が得られる可能性がある。実際に、ＰＡＤ４に結合したタンパク質上のシトルリン化残基に特異的なＢ細胞は、内部移行して、ＰＡＤ４/シトルリン化タンパク質複合体を処理し、ＰＡＤ４ペプチドをヘルパーＴ細胞に提示することができた。これにより、複数のシトルリン化タンパク質に対するＩｇＧ抗体が産生されるだろう。この点を証明するために、本発明者らは近年、ヒト及び／又はマウスのＰＡＤを用いて正常な自己免疫のないマウスを免疫化し、マウスの２０％が、シトルリン化フィブリノーゲンに対するＴ細胞応答が全く存在しない下で、抗シトルリン化フィブリノーゲン抗体を発生したことを発見した（２２）。
【0135】
ここで、ＰＡＤ４又はフィブリノーゲンに由来するどのペプチド（群）が、Ｔ細胞応答を刺激するのに重要であるかが分からないので、本発明者らは、１２個のＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子型のそれぞれによってコードされる２つのＨＬＡ－ＤＲ分子が、ＰＡＤ４タンパク質に由来する６５個のペプチドの中の少なくとも１つ、及びヒトフィブリノーゲンに由来する９６個の天然ペプチド若しくは９６個のシトルリン化ペプチドの中の１つに結合する確率を評価した。そうするために、本発明者らは、５つの異なるＨＬＡ－ＤＲ対立遺伝子に対する、ＰＡＤ４及び天然又はシトルリン化フィブリノーゲンに由来する重複しているペプチドの結合を研究した。この分析の目標は、ヘルパーＴ細胞によって見られる、ＰＡＤ４又はフィブリノーゲンに由来する実際のペプチド（群）を同定することではなく、所与の遺伝子型によってコードされる２つのＨＬＡ－ＤＲ分子が、ＰＡＤ４又はフィブリノーゲンに由来する未知の関連性のあるペプチドに結合する確率を定量することであった。６６３アミノ酸タンパク質であるＰＡＤ４に関して、それは、約６５００個の関連したペプチド（６５３個の１０アミノ酸長、６５２個の１１アミノ酸長・・・６４２個の２０アミノ酸長）を生じることができ、本発明者らは、その中の６５個のみの試料を使用して結合する確率を評価した。したがって、この分析は、本発明者らに、一対のＨＬＡ－ＤＲ分子が、所与のタンパク質に由来するペプチドに結合できることを示唆することができるが、関連するＴ細胞エピトープを同定したという確信をもたらすことはできない。
【0136】
本発明者らは、各々のＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子型によってコードされる２つのＨＬＡ－ＤＲＢ１分子の中の少なくとも１つが、ＰＡＤ４に由来する少なくとも１つのペプチドに結合することのできる確率と、この遺伝子型に関連した関節リウマチを発症するオッズ比との間の相関を発見した。このことは、フィブリノーゲンに由来する天然又はシトルリン化ペプチドには観察されなかった。
【0137】
本発明者らは、その後、関節リウマチ患者、乾癬性関節炎患者、及び健常な対照の末梢血リンパ球におけるＰＡＤ４に対するＴ細胞応答を調べた。本発明者らは、４１人中１９人の関節リウマチ患者、２５人中８人の乾癬性関節炎患者、及び１１人中４人の健常な対照が、ＰＡＤ４に対する増殖応答を示したことを発見した。４１人中１３人の関節リウマチ患者は、ＰＡＤ４に対する増殖応答及び該患者の血清中の抗ＰＡＤ４抗体の両方を有し、これは、その他の全てと異なっていた（ｐ＝０．０００９、フィッシャー検定）。このことは、これらの１３人の患者では、ＰＡＤ４特異的Ｔ細胞が、ＰＡＤ４特異的Ｂ細胞を補助し得ることを示唆した。したがって、ＰＡＤ４に対する増殖応答は、健常な被験者においてさえも共通している。しかしながら、それが抗ＰＡＤ４抗体に関する場合には、それはＡＣＰＡ陽性関節リウマチに特徴的である。ＰＡＤ４に対して増殖応答を示す３１人の被験者（１９人の関節リウマチ、８人の乾癬性関節炎、及び４人の対照）の中で、共有エピトープＨＬＡ－ＤＲＢ１対立遺伝子は、抗ＰＡＤ４抗体と関連していた（フィッシャー検定、ｐ＝０．０３）。このことは、共有エピトープ陽性ＨＬＡ－ＤＲＢ１対立遺伝子が、ＰＡＤ４特異的Ｔ細胞に、おそらく特異的ペプチド（群）の結合を通して、抗ＰＡＤ４抗体の産生を補助することを可能とさせ得ることを示唆した。
【0138】
ＰＡＤ４に対して増殖するＴ細胞によって認識されるＰＡＤ４由来のペプチドを同定するために、本発明者らは、２２人の関節リウマチ患者、１６人の乾癬性関節炎患者、及び１１人の健常な対照において、共有エピトープ陽性ＨＬＡ－ＤＲＢ１対立遺伝子に結合すると予測された、ＰＡＤ４に由来する１１個のペプチドを用いた増殖試験を行なった。本発明者らは、２２人中９人の関節リウマチ患者、１６人中３人の乾癬性関節炎患者によって認識され、健常な対照によって全く認識されなかった、ＰＡＤ４由来の１つの特定のペプチド、すなわちペプチド８（ｐ８）を同定した。ｐ８に対する増殖応答は、関節リウマチ（ｐ＝０．０２、フィッシャー検定）、ＨＬＡ－ＤＲＢ１共有エピトープ（ｐ＝０．０５、フィッシャー検定）、及びＰＡＤ４に対する抗体（ｐ＝０．０５、フィッシャー検定）に関連していた。これらの関連についての最も簡単な説明は、ｐ８がヘルパーＴ細胞を活性化させている可能性があるというものである。しかしながら、ｐ８は、共有エピトープに特異的な結合物質ではなく、それはＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４:０１、０４:０４、０１:０１、０７:０１、０４:０２に結合する。ｐ８についての本発明者らの結合データと一致して、ｐ８に対する増殖応答を示す１３人中１２人の患者は、これらの５つの対立遺伝子の中の少なくとも１つを発現している。共有エピトープ陽性ＨＬＡ－ＤＲＢ１対立遺伝子によるｐ８の提示は、共有エピトープ陰性対立遺伝子よりもより効率的であり得、それにより、ヘルパーＴ細胞の活性化を可能とし得ると考えられる。同様に、ｐ８は、ＨＡＬ－ＤＲＢ１＊０４:０１についてすでに公知であるように、共有エピトープ陰性のＨＬＡ－ＤＲＢ１対立遺伝子よりも、共有エピトープ陽性のＨＬＡ－ＤＲＢ１対立遺伝子を発現している被験者において、ＰＡＤ４からより良好にプロセシングされることが可能である（２３）。
【0139】
したがって、本発明者らのデータは、ＡＣＰＡの発生モデルを示唆し、ここでは、ＰＡＤ４に特異的なＴ細胞が、予想通り、ＰＡＤ４に特異的なＢ細胞を補助し、これにより、ＰＡＤ４に対するＩｇＧ抗体が産生され、同時に、シトルリン化された抗原に特異的であるＢ細胞が産生され、これは、内部移行し、ＰＡＤ４/シトルリン化抗原複合体をプロセシングし、ＰＡＤ４ペプチドを提示する。これらの結果は、関節リウマチに至る免疫学的対立の中心にＰＡＤ４を置く。それらは本発明者らに、ＰＡＤ４をコードしている遺伝子が、アジア及びいくつかの欧州の集団において関節リウマチに関連していることを思い起こさせる（２４）。最後に、抗シトルリン化タンパク質に対する免疫が、複数のタンパク質に由来するシトルリン化ペプチド（群）ではなく、１つのタンパク質であるＰＡＤ４に由来するペプチド（群）に特異的なヘルパーＴ細胞の影響下で発達する場合、個体のＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子型によって同定されるリスクの高い個体における、ＰＡＤ４ワクチン接種による、関節リウマチの予防の見通しを改善させる。
【0140】
これに関して、ＰＡＤ４に由来するペプチド８（及び本発明の他のペプチド）の同定は、ペプチドによる寛容化にとって有用であろう。
【0141】
参考文献：
本出願全体を通して、様々な参考文献が、本発明が属する技術分野の最先端技術を記載している。これらの参考文献の開示は、本開示への参照によりここに組み入れられる。
本出願全体を通して、様々な参考文献が、本発明が属する技術分野の最先端技術を記載している。これらの参考文献の開示は、本開示への参照によりここに組み入れられる。
【0142】
【表5】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【配列表】
【国際調査報告】