特表 2022-522989 銅ナノクラスター、それを含む組成物、及び多発性硬化症の治療

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-04-21

(54)【発明の名称】銅ナノクラスター、それを含む組成物、及び多発性硬化症の治療

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/555 20060101AFI20220414BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20220414BHJP

   A61K 31/30 20060101ALI20220414BHJP

   A61K 9/14 20060101ALI20220414BHJP

   A61K 31/728 20060101ALI20220414BHJP

   A61K 38/05 20060101ALI20220414BHJP

   A61K 38/07 20060101ALI20220414BHJP

   A61K 38/06 20060101ALI20220414BHJP

【ＦＩ】

A61K31/555

A61P25/28

A61K31/30

A61K9/14

A61K31/728

A61K38/05

A61K38/07

A61K38/06

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021541304

(86)(22)【出願日】2019-06-28

(85)【翻訳文提出日】2021-09-15

(86)【国際出願番号】 CN2019093463

(87)【国際公開番号】W WO2020147268

(87)【国際公開日】2020-07-23

(31)【優先権主張番号】PCT/CN2019/071901

(32)【優先日】2019-01-16

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】521313935

【氏名又は名称】武漢広行科学研究有限公司

【氏名又は名称原語表記】ＷＵＨＡＮ ＶＡＳＴ ＣＯＮＤＵＣＴ ＳＣＩＥＮＣＥ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ ＣＯ．， ＬＴＤ．

【住所又は居所原語表記】Ｒｏｏｍ ５０６， Ｂｕｉｌｄｉｎｇ １， Ｏｐｔｉｃｓ Ｖａｌｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅ Ａｃｃｅｌｅｒａｔｏｒ， Ｎｏ． ３８８ Ｇａｏｘｉｎ ２ｎｄ Ｒｏａｄ， Ｄｏｎｇｈｕ Ｎｅｗ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｚｏｎｅ Ｗｕｈａｎ， Ｈｕｂｅｉ ４３００７０ （ＣＮ）

(74)【代理人】

【識別番号】110001139

【氏名又は名称】ＳＫ特許業務法人

(74)【代理人】

【識別番号】100130328

【弁理士】

【氏名又は名称】奥野 彰彦

(74)【代理人】

【識別番号】100130672

【弁理士】

【氏名又は名称】伊藤 寛之

(72)【発明者】

【氏名】スゥン、タオレイ

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

4C086

4C206

【Ｆターム（参考）】

4C076AA29

4C076CC01

4C084AA02

4C084AA03

4C084BA14

4C084BA15

4C084BA16

4C084DC50

4C084NA14

4C084ZA15

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA17

4C086EA25

4C086HA01

4C086HA28

4C086MA01

4C086MA04

4C086NA14

4C086ZA15

4C206AA01

4C206AA02

4C206JA58

4C206MA01

4C206MA02

4C206MA04

4C206MA05

4C206NA14

4C206ZA15

(57)【要約】

銅ナノクラスター（ＣｕＮＣｓ）の多発性硬化症の治療における使用。
【選択図】図２０

【特許請求の範囲】

【請求項1】

対象の多発性硬化症を治療するための医薬の製造における銅ナノクラスターの使用であって、前記銅ナノクラスターがリガンドを含む、使用。

【請求項2】

前記リガンドで修飾した銅ナノクラスターは、直径の範囲が０．５～３ｎｍである、請求項１に記載の使用。

【請求項3】

前記リガンドで修飾した銅ナノクラスターは、直径の範囲が０．５～２．５ｎｍである、請求項１に記載の使用。

【請求項4】

前記リガンドは、チミン、チミンで修飾したヒアルロン酸、Ｌ－システイン及びその誘導体、Ｄ－システイン及びその誘導体、システイン含有オリゴペプチド及びそれらの誘導体、及びその他のチオール含有化合物からなる群より選ばれる一つである、請求項１に記載の使用。

【請求項5】

前記Ｌ－システイン及びその誘導体が、Ｌ－システイン、Ｎ－イソブタノイル－Ｌ－システイン、及びＮ－アセチル－Ｌ－システインからなる群より選ばれ、かつ、前記Ｄ－システイン及びその誘導体が、Ｄ－システイン、Ｎ－イソブタノイル－Ｄ－システイン、及びＮ－アセチル－Ｄ－システインからなる群より選ばれる、請求項４に記載の使用。

【請求項6】

前記システイン含有オリゴペプチド及びそれらの誘導体が、システイン含有ジペプチド、システイン含有トリペプチド又はシステイン含有テトラペプチドである、請求項４に記載の使用。

【請求項7】

前記システイン含有ジペプチドが、Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニンジペプチド、Ｌ－アルギニン－Ｌ－システインジペプチド、Ｌ－ヒスチジン－Ｌ－システインジペプチド、及びＬ－システイン－Ｌ－ヒスチジンジペプチドからなる群より選ばれる、請求項６に記載の使用。

【請求項8】

前記システイン含有トリペプチドが、グリシン－Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニントリペプチド、Ｌ－プロリン－Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニントリペプチド、Ｌ－リジン－Ｌ－システイン－Ｌ－プロリントリペプチド、及びＬ－グルタチオンからなる群より選ばれる、請求項６に記載の使用。

【請求項9】

前記システイン含有テトラペプチドが、グリシン－Ｌ－セリン－Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニンテトラペプチド、及びグリシン－Ｌ－システイン－Ｌ－セリン－Ｌ－アルギニンテトラペプチドからなる群より選ばれる、請求項６に記載の使用。

【請求項10】

前記その他のチオール含有化合物が、１－［（２Ｓ）－２－メチル－３－チオール－１－オキソプロピル］－Ｌ－プロリン、チオグリコール酸、メルカプトエタノール、チオフェノール、Ｄ-ペニシラミン、Ｎ－（２－メルカプトプロピオニル）－グリシン、及びドデシルメルカプタンからなる群より選ばれる、請求項４に記載の使用。

【請求項11】

多発性硬化症を有する対象を治療するための銅ナノクラスターの使用であって、前記銅ナノクラスターがリガンドを含む、使用。

【請求項12】

前記リガンドで修飾した銅ナノクラスターは、直径の範囲が０．５～３ｎｍである、請求項１１に記載の使用。

【請求項13】

前記リガンドで修飾した銅ナノクラスターは、直径の範囲が０．５～２．５ｎｍである、請求項１１に記載の使用。

【請求項14】

前記リガンドは、チミン、チミンで修飾したヒアルロン酸、Ｌ－システイン及びその誘導体、Ｄ－システイン及びその誘導体、システイン含有オリゴペプチド及びそれらの誘導体、及びその他のチオール含有化合物からなる群より選ばれる一つである、請求項１１に記載の使用。

【請求項15】

前記Ｌ－システイン及びその誘導体が、Ｌ－システイン、Ｎ－イソブタノイル－Ｌ－システイン、及びＮ－アセチル－Ｌ－システインからなる群より選ばれ、及び前記Ｄ－システイン及びその誘導体が、Ｄ－システイン、Ｎ－イソブタノイル－Ｄ－システイン、及びＮ－アセチル－Ｄ－システインからなる群より選ばれる、請求項１４に記載の使用。

【請求項16】

前記システイン含有オリゴペプチド及びそれらの誘導体が、システイン含有ジペプチド、システイン含有トリペプチド又はシステイン含有テトラペプチドである、請求項１４に記載の使用。

【請求項17】

前記システイン含有ジペプチドが、Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニンジペプチド、Ｌ－アルギニン－Ｌ－システインジペプチド、Ｌ－ヒスチジン－Ｌ－システインジペプチド、及びＬ－システイン－Ｌ－ヒスチジンジペプチドからなる群より選ばれる、請求項１６に記載の使用。

【請求項18】

前記システイン含有トリペプチドが、グリシン－Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニントリペプチド、Ｌ－プロリン－Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニントリペプチド、Ｌ－リジン－Ｌ－システイン－Ｌ－プロリントリペプチド、及びＬ－グルタチオンからなる群より選ばれる、請求項１６に記載の使用。

【請求項19】

前記システイン含有テトラペプチドが、グリシン－Ｌ－セリン－Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニンテトラペプチド、及びグリシン－Ｌ－システイン－Ｌ－セリン－Ｌ－アルギニンテトラペプチドからなる群より選ばれる、請求項１６に記載の使用。

【請求項20】

前記その他のチオール含有化合物が、１－［（２Ｓ）－２－メチル－３－チオール－１－オキソプロピル］－Ｌ－プロリン、チオグリコール酸、メルカプトエタノール、チオフェノール、Ｄ-ペニシラミン、Ｎ－（２－メルカプトプロピオニル）－グリシン、及びドデシルメルカプタンからなる群より選ばれる、請求項１４に記載の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、銅ナノクラスター（ＣｕＮＣｓ）、ＣｕＮＣｓを含む組成物、及びそれらの多発性硬化症の治療における応用に関する。

【背景技術】

【0002】

多発性硬化症（ＭＳ）は、炎症過程及び脱髄を特徴とする中枢神経系（ＣＮＳ）の多因子疾患である。ＭＳは、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）、及び／又はミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）に対する自己免疫疾患である。疾患の病因はまだ十分に理解されていない。酸化ストレス（ＯＳ）が多発性硬化症（ＭＳ）の病因において主要な役割を果たすことを示唆する証拠が増えてきている。生成すると酸化ストレスに過剰に導く活性酸素種（ＲＯＳ）は、ＭＳ及びその動物モデルの両方における脱髄及び軸索損傷のメディエーターとして考えられる。急性期では、ＯＳが炎症過程を開始させ、慢性期ではＯＳが神経変性を維持する。ＭＳにおける酸化還元プロセスは、ミトコンドリア機能不全、軸索バイオエネルギーの調節不全、脳内の鉄蓄積、酸化剤／抗酸化剤バランスの損傷、及びＯＳメモリと関連する。ＭＳの各段階において、ＯＳは、疾患の病因における重要な要素である。再発の際に、これらの全てのプロセスが増強され、数年にわたるニューロンの損失につながる（Ａｄａｍｃｚｙｋ ２０１６；Ｏｈｌ ２０１６）。

【0003】

現在の治療は、炎症の減少に焦点を合わせるが、神経変性の予防に注目されるのは一部の研究しかない。疾患の経過は、抗酸化物質と抗酸化経路に影響を与える物質との使用により影響を受け、抗酸化経路は、重症度を軽減し、より速い寛解と神経炎症及び神経変性のより目立たない経過を引き起こす。抗酸化物質は、フリーラジカルから体を保護する物質である。抗酸化剤は、酵素的又は非酵素的であってもよい。酵素の中で最も重要なものには、カタラーゼ（ＣＡＴ）、グルタヒオンペルオキシダーゼ（ＧＰｘ）、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）が含まれます（Ａｄａｍｃｚｙｋ ０１６）。

【0004】

銅ナノクラスタ（ＣｕＮＣｓ）は、銅原子と銅ナノ結晶との間にある物質であり、表面上の安定化配位子を有する数～数十の銅原子から構成される（Ｙａｏ２０１８）。ＣｕＮＣｓは、それらの固有のサイズ依存的光学特性及び電子特性のためにかなりの注目を集めており、従って、ナノ粒子触媒、バイオセンサー、細胞標識、及び光電子ナノデバイスのような幅広い用途に大きな見込みを示す（Ｊｉｎ、２０１６；Ｌｉｕ、２０１８）。出願人が知っている限り、神経変性疾患の治療にＣｕＮＣｓを適用することに関する報告がない。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】Adamczyk B, Adamczyk-Sowa M. New Insights into the Role of Oxidative Stress Mechanisms in the Pathophysiology and Treatment of Multiple Sclerosis. Oxid Med Cell Longev. 2016:1973834. Epub 2016 Oct 18.

【非特許文献2】Jin R, et al. Atomically Precise Colloidal Metal Nanoclusters and Nanoparticles: Fundamentals and Opportunities, Chem. Rev., 2016, 116, 10346-10413

【非特許文献3】Kim GH, et al. The Role of Oxidative Stress in Neurodegenerative Diseases, Exp Neurobiol. 2015, 24(4): 325-340

【非特許文献4】Liu X, et al. Atomically Precise Copper Nanoclusters and Their Applications, Coord. Chem. Rev., 2018, 359, 112-126

【非特許文献5】Ohl K, Tenbrock K, Kipp M. Oxidative stress in multiple sclerosis: Central and peripheral mode of action. Exp Neurol. 2016; 277:58-67.

【非特許文献6】Yao Q, et al. Toward Total Synthesis of Thiolate-Protected Metal Nanoclusters, Acc. Chem. Res.; 2018; 51; 1338-1348

【発明の概要】

【0006】

本発明は、対象の多発性硬化症を治療するための医薬の製造における銅ナノクラスター（ＣｕＮＣｓ）の使用であって、前記ＣｕＮＣｓがリガンドを含む、製造使用を提供する。

【0007】

前記製造使用の特定の実施形態では、前記リガンドで修飾したＣｕＮＣｓは、直径の範囲が０．５～３ｎｍである。

【0008】

前記製造使用の特定の実施形態では、前記リガンドで修飾したＣｕＮＣｓは、直径の範囲が０．５～２．５ｎｍである。

【0009】

前記製造使用の特定の実施形態では、前記リガンドは、チミン、チミンで修飾したヒアルロン酸（ＴＭＨＡ）、Ｌ－システイン及びその誘導体、Ｄ－システイン及びその誘導体、システイン含有オリゴペプチド及びそれらの誘導体、及びその他のチオール含有化合物からなる群より選ばれる一つである。

【0010】

前記製造使用の特定の実施形態では、前記Ｌ－システイン及びその誘導体が、Ｌ－システイン、Ｎ－イソブタノイル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＩＢＣ）、及びＮ－アセチル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＡＣ）からなる群より選ばれ、前記Ｄ－システイン及びその誘導体が、Ｄ－システイン、Ｎ－イソブタノイル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＩＢＣ）、及びＮ－アセチル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＡＣ）からなる群より選ばれる。

【0011】

前記製造使用の特定の実施形態では、前記システイン含有オリゴペプチド及びそれらの誘導体は、システイン含有ジペプチド、システイン含有トリペプチド又はシステイン含有テトラペプチドである。

【0012】

前記製造使用の特定の実施形態では、前記システイン含有ジペプチドが、Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニンジペプチド（ＣＲ）、Ｌ－アルギニン－Ｌ－システインジペプチド（ＲＣ）、Ｌ－ヒスチジン－Ｌ－システインジペプチド（ＨＣ）、及びＬ－システイン－Ｌ－ヒスチジンジペプチド（ＣＨ）からなる群より選ばれる。

【0013】

前記製造使用の特定の実施形態では、前記システイン含有トリペプチドが、グリシン－Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニントリペプチド（ＧＣＲ）、Ｌ－プロリン－Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニントリペプチド（ＰＣＲ）、Ｌ－リジン－Ｌ－システイン－Ｌ－プロリントリペプチド（ＫＣＰ）、及びＬ－グルタチオン（ＧＳＨ）からなる群より選ばれる。

【0014】

前記製造使用の特定の実施形態では、前記システイン含有テトラペプチドが、グリシン－Ｌ－セリン－Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニンテトラペプチド（ＧＳＣＲ）、及びグリシン－Ｌ－システイン－Ｌ－セリン－Ｌ－アルギニンテトラペプチド（ＧＣＳＲ）からなる群より選ばれる。

【0015】

前記製造使用の特定の実施形態では、前記その他のチオール含有化合物が、１－［（２Ｓ）－２－メチル－３－チオール－１－オキソプロピル］－Ｌ－プロリン、チオグリコール酸、メルカプトエタノール、チオフェノール、Ｄ-ペニシラミン、Ｎ－（２－メルカプトプロピオニル）－グリシン、及びドデシルメルカプタンからなる群より選ばれる。

【0016】

本発明は、多発性硬化症を有する対象を治療するための銅ナノクラスター（ＣｕＮＣｓ）の使用であって、前記ＣｕＮＣｓがリガンドを含む治療使用を提供する。

【0017】

前記治療使用の特定の実施形態では、前記リガンドで修飾したＣｕＮＣｓは、直径の範囲が０．５～３ｎｍである。

【0018】

前記治療使用の特定の実施形態では、前記リガンドで修飾したＣｕＮＣｓは、直径の範囲が０．５～２．５ｎｍである。

【0019】

前記治療使用の特定の実施形態では、前記リガンドは、チミン、チミンで修飾したヒアルロン酸（ＴＭＨＡ）、Ｌ－システイン及びその誘導体、Ｄ－システイン及びその誘導体、システイン含有オリゴペプチド及びそれらの誘導体、及びその他のチオール含有化合物からなる群より選ばれる一つである。

【0020】

前記治療使用の特定の実施形態では、前記Ｌ－システイン及びその誘導体が、Ｌ－システイン、Ｎ－イソブタノイル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＩＢＣ）、及びＮ－アセチル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＡＣ）からなる群より選ばれ、前記Ｄ－システイン及びその誘導体が、Ｄ－システイン、Ｎ－イソブタノイル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＩＢＣ）、及びＮ－アセチル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＡＣ）からなる群より選ばれる。

【0021】

前記治療使用の特定の実施形態では、前記システイン含有オリゴペプチド及びそれらの誘導体は、システイン含有ジペプチド、システイン含有トリペプチド又はシステイン含有テトラペプチドである。

【0022】

前記治療使用の特定の実施形態では、前記システイン含有ジペプチドが、Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニンジペプチド（ＣＲ）、Ｌ－アルギニン－Ｌ－システインジペプチド（ＲＣ）、Ｌ－ヒスチジン－Ｌ－システインジペプチド（ＨＣ）、及びＬ－システイン－Ｌ－ヒスチジンジペプチド（ＣＨ）からなる群より選ばれる。

【0023】

前記治療使用の特定の実施形態では、前記システイン含有トリペプチドが、グリシン－Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニントリペプチド（ＧＣＲ）、Ｌ－プロリン－Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニントリペプチド（ＰＣＲ）、Ｌ－リジン－Ｌ－システイン－Ｌ－プロリントリペプチド（ＫＣＰ）、及びＬ－グルタチオン（ＧＳＨ）からなる群より選ばれる。

【0024】

前記治療使用の特定の実施形態では、前記システイン含有テトラペプチドが、グリシン－Ｌ－セリン－Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニンテトラペプチド（ＧＳＣＲ）、及びグリシン－Ｌ－システイン－Ｌ－セリン－Ｌ－アルギニンテトラペプチド（ＧＣＳＲ）からなる群より選ばれる。

【0025】

前記治療使用の特定の実施形態では、前記その他のチオール含有化合物が、１－［（２Ｓ）－２－メチル－３－チオール－１－オキソプロピル］－Ｌ－プロリン、チオグリコール酸、メルカプトエタノール、チオフェノール、Ｄ-ペニシラミン、Ｎ－（２－メルカプトプロピオニル）－グリシン、及びドデシルメルカプタンからなる群より選ばれる。

【0026】

本発明の目的及び利点は、添付の図面と関連して、以下の好ましい実施形態の詳細な説明から明らかになる。

【図面の簡単な説明】

【0027】

以下、図面を参照して本発明の好適な実施の形態を説明するが、同様の符号は同様の要素を示す。

【0028】

【図1】図１（ａ）（ｉ）は、式１で示されるＴＭＨＡの構造を示す。図１（ａ）（ｉｉ）は、ＴＭＨＡの合成を説明する。そして、図１（ａ）（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）は、それぞれ、ＨＡ及びＴＭＨＡの典型的な外見を示す。図１（ｂ）は、それぞれ、ＴＭＨＡ（赤線）及び純粋なＨＡ（青線）のＵＶ－ｖｉｓスペクトルを示す。図１（ｃ）は、ＨＡ及びＴＭＨＡのＦＴ－ＩＲを示す。そして、図１（ｄ）は、ＨＡ及びＴＭＨＡの^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。

【0029】

【図2】図２は、得られたＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓの蛍光強度に対する（ａ）Ｃｕ^２＋とＴＭＨＡとのモル比、（ｂ）反応ｐＨ値、（ｃ）反応温度、及び（ｄ）反応時間の影響を示すグラフを提供する。

【0030】

【図3】図３は、得られたＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓの蛍光強度に対する（ａ）ＮａＣｌ濃度（０～１Ｍ）、（ｂ）共有カチオン及びアニオン、（ｃ）ｐＨ値（４～１０）、及び（ｄ）重合時間（０～５週間）の影響を示すグラフを提供する。

【0031】

【図4】図４は、チミンの置換度（ＤＳ）が異なるＴＭＨＡにより製造されたＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓを示す写真及びグラフを提供する。図４（ａ）及び（ｄ）は、それぞれ、チミンのＤＳが３．２％であるＴＭＨＡで製造されたＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓのＴＥＭ又はＡＦＭ画像を示す。図４（ｂ）及び（ｅ）は、チミンのＤＳが１０．５％であるＴＭＨＡで製造されたＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓのＴＥＭ又はＡＦＭ画像を示す。図４（ｃ）及び（ｆ）は、チミンのＤＳが２０．１％であるＴＭＨＡで製造されたＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓのＴＥＭ又はＡＦＭ画像を示す。図４（ｇ）及び（ｈ）は、それぞれ、ＴＭＨＡ又はＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓのＭＳスペクトルを示す。そして、図４（ｉ）及び（ｊ）は、（ｉ）ＣｕＮＣｓの全領域及び（ｊ）Ｃｕ ２ｐ領域のＸＰＳスペクトルを示す。図４では、挿入図（ｂ、ｇ、ｈ）は、それぞれ、ＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓ ナノワイヤー、イオン化断片及びＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓの模式図であり、（ｅ、ｆ）は、単離されたナノワイヤーからなるＣｕＮＣｓである。

【0032】

【図5】図５は、ＧＳＨリガンドを有するＣｕＮＣｓの熱重量分析を示すグラフである。

【0033】

【図6】図６は、それぞれ、チミンのＤＳが３．２％、１０．５％、及び２０．１であるものを使用して得られたＣｕＮＣｓの励起（λ_ｅｍ＝６１３ｎｍで測定される。）スペクトルを示すグラフである。

【0034】

【図7】図７は、（ａ）異なるチミンのＤＳでのＰＬスペクトル（左）及び減衰プロファイル（右）、挿入図：３６５ｎｍ励起での画像；（ｂ）Ｃｕ^２＋含有量に対するＴＭＨＡプローブのＰＬ応答；（ｃ）様々な金属に対するＣｕ^２＋についてのＴＭＨＡプローブのＰＬ及び色改変（挿入図）、を示すグラフを提供する。

【0035】

【図8】図８は、（ａ）ＣｕＮＣｓと反応するＨ_２Ｏ_２のＵＶ吸収、（ｂ）ＣｕＮＣｓ及び様々な対照物のＧＰｘ様活性の初期速度、（ｃ）ＣｕＮＣｓ ＳＯＤ様活性、挿入図：Ｏ_２生成速度、（ｄ）ＣｕＮＣｓとその他の金属との触媒活性の比較、を示すグラフを提供する。

【0036】

【図9】図９は、ＰＤの早期診断のための尿液Ｃｕ^２＋の検出を示すグラフを提供する。

【0037】

【図10】図１０（ａ）は、細胞生存率のデータを示す直方図を提供する（＊＊＊ｐ＜０．００１）。図１０（ｂ）は、ＰＩ色素により染色された、４ｍＭ ＭＰＰ^＋、２μＭ Ｃｕ^２＋及び１０μｇ・ｍｌ^－１ ＴＭＨＡで処理された死亡（赤）細胞を示す。そして、図１０（ｃ）は、カルセイン－ＡＭにより染色された、４ｍＭ ＭＰＰ^＋、１０μＭ Ｃｕ^２＋及び１０μｇ・ｍｌ^－１ ＴＭＨＡで処理された生存（緑）細胞を示す。

【0038】

【図11】図１１（ａ）は、細胞内ＲＯＳレベルのデータを示す直方図を提供する、＊＊＊ｐ＜０．００１；図１１（ｂ）は、４ｍＭのＭＰＰ^＋、１０μｇ・ｍＬ^－１ ＴＭＨＡで処理され、及び特定の蛍光プローブＤＣＦＨ－ＤＡを使用して染色された細胞における細胞内ＲＯＳ ＣＬＳＭ画像を示す。そして、図１１（ｃ）は、４ｍＭのＭＰＰ^＋、１０μｇ・ｍＬ^－１ ＴＭＨＡ、１０μＭのＣｕ^２＋で処理され、及びＤＣＦＨ－ＤＡで染色された細胞における細胞内ＲＯＳのＣＬＳＭ画像を示す。

【0039】

【図12】図１２（ａ）は、記憶障害のマウスの移動距離及び落下待ち時間を示す、＊＊＊ｐ＜０．００１。図１２（ｂ）は、高用量のＭＰＴＰ（３０ｍｇ・ｋｇ^－１）で治療された動物からのミトコンドリアを示し、赤線により示すように、ミトコンドリアは、膨潤、液胞形状及び重度なクリステ破壊を示す。そして、図１２（ｃ）は、ＭＰＴＰ（３０ｍｇ・ｋｇ^－１）＋ＴＭＨＡ（３０ｍｇ・ｋｇ^－１）で治療された動物からのミトコンドリアを示し、赤線により示すように、ミトコンドリアは、正常な形態を示す。

【0040】

【図13】図１３は、α－ｓｙｎフィブリル化動態に対するＬ－グルタチオン（ＧＳＨ）で修飾したＣｕＮＣｓ（ＧＳＨ－ＣｕＮＣｓ）の影響を示すグラフを提供する。

【0041】

【図14】図１４は、ＭＰＰ^＋病変ＰＤ細胞（ＳＨ－ｓｙ５ｙ）モデルの細胞生存率に対するＣｕＮＣｓの影響を示す直方図を提供する。

【0042】

【図15】図１５は、ＣｕＮＣｓの同定データを示す。（Ａ）は、一般的なＣｕＮＣｓの透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像である。（Ｂ）ＴＥＭ画像から計算されたＣｕＮＣｓのサイズ分布である。（Ｃ）ＣｕＮＣｓ中のＣｕ（０）の２ｐ_３／２及び２ｐ_１／２電子のＸ線光電子分光法（ＸＰＳ）スペクトルである。（Ｄ）ＧＳＨ（上）とＧＳＨ（下）で修飾したＣｕＮＣｓのフーリエ変換赤外（ＦＴ－ＩＲ）分光法の比較である。（Ｅ）ＣｕＮＣｓの蛍光励起（左）及び発光スペクトル（右）である。

【0043】

【図16】図１６は、ＣｕＮＣｓのＣＡＴ活性を示す。

【0044】

【図17】図１７は、ＣｕＮＣｓのＧＰｘ活性を示す。

【0045】

【図18】図１８は、ＣｕＮＣｓのＳＯＤ活性を示す。

【0046】

【図19】図１９は、Ｈ_２Ｏ_２誘発緑内障細胞（ＲＧＣ－５）モデルにおける細胞生存率に対するＣｕＮＣｓの効果を示す直方図である。

【0047】

【図20】図２０は、ＥＡＥによってモデル化された多発性硬化症マウスモデルの運動挙動に対するＧＳＨ修飾銅クラスター（ＣｕＮＣｓ）の効果を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0048】

本発明は、本発明の特定の実施形態の以下の詳細な説明を参照することにより、より容易に理解することができる。

【0049】

この出願において、本発明が関連する技術の状態をより完全に説明するために、刊行物が参照される場合、これらの刊行物の開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0050】

スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）は、高反応性Ｏ_２ ^－から反応性がより少ないＨ_２Ｏ_２及び酸素への分解を触媒する際に重要な役割を果たす。サイトゾル銅／亜鉛－ＳＯＤ （ＳＯＤ１）、ミトコンドリアマンガンＳＯＤ（ＳＯＤ２）、及び細胞外ＳＯＤ（ＳＯＤ３）は、同定されたＳＯＤの３つの異なるアイソフォームである。ＳＯＤ１とＳＯＤ２は、それぞれ、主にサイトゾルとミトコンドリアにおけるＯ_２ ^－の除去に関与する（Ｋｉｍ ２０１５）。

【0051】

グルタチオン過酸化酵素（ＧＰＸ）は、電子供与体としてグルタチオン（ＧＳＨ）を利用してＨ_２Ｏ_２及び脂質過酸化物の還元を触媒する複数のイソ酵素のファミリーを含む。ＧＰＸは、サイトゾルとミトコンドリアの両方にある。哺乳動物では、セレン依存性グルタチオン過酸化酵素の５つの異なるアイソフォーム（ＧＰＸ１～４と６）、及びセレノシステインの代わりにシステインを有する３つの非セレン同族体（ＧＰＸ５、７と８）が存在する。ＧＰＸの抗酸化機能は、細胞内の各アイソフォーム及び位置に依存し、ＧＰＸ１は脳内の主要な抗酸化酵素の１つとみなされる。研究によると、ＧＰＸ１のアップレギュレーションがニューロン損傷に対する保護応答の１つであることを示唆している（Ｋｉｍ ２０１５）。

【0052】

カタラーゼは、補因子として鉄又はマンガンのいずれかを用いて、Ｈ_２Ｏ_２を水及び酸素へ変換させるものである。カタラーゼは、ペルオキシソームにありし、細胞質及びミトコンドリアにも見出される。カタラーゼの役割は、低レベルのＨ_２Ｏ_２の場合では重要でないが、より高いレベルのＨ_２Ｏ_２の場合ではより重要になる（Ｋｉｍ ２０１５）。

【0053】

正常な生物では、活性酸素種（ＲＯＳ）は、種々の酵素の調節を通してホメオスタシスを維持する。カタラーゼ（ＣＡＴ）は、ほとんど全ての生物中に存在する。ＣＡＴは酵素捕捉剤であり、鉄ポルフィリンに基づく接触酵素である。これは、Ｈ_２Ｏ_２から分子状酸素及び水への分解を促進し、生物学的防御システムにおける重要な酵素の１つである。グルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰｘ）は、体内に広く存在する重要な過酸化物分解酵素である。ＧＰｘの活性中心はセレノシステインである。セレンはＧＳＨからＧＳＳＧへの変換を触媒し、毒性の過酸化物を非毒性のヒドロキシ化合物に還元することにより過酸化物による干渉及び損傷から細胞膜の構造及び機能を保護するＧＳＨ酵素系の成分である。スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）は、有害なスーパーオキシドラジカルを過酸化水素に変換する体中の天然に存在するスーパーオキシドラジカル捕捉剤である。過酸化水素は体に有害な酸素であるが、体内のペルオキシダーゼは直ちに完全に無害な水に分解する。ＣＡＴは、酸化ストレス中の過剰なＨ_２Ｏ_２の除去を行うことが知られているが、ＧＰｘは、細胞信号におけるＨ_２Ｏ_２の濃度を微調整することができる。ＣＡＴ－ＧＰｘ相乗作用は、病態生理学的条件下でのＨ_２Ｏ_２レベルの正確な制御のために重要であることが報告されている。このようにして、３つの酵素は完全な抗酸化剤鎖を形成する。

【0054】

本発明は、活性酸素種（ＲＯＳ）による酸化ストレス（ＯＳ）により開始又は加速される多発性硬化症を治療するための組成物及び方法を提供する。前記多発性硬化症は、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脊髄小脳症（ＳＣＡ）、及び緑内障を含むが、これらに限定されない。

【0055】

本発明は、一つ又は複数のリガンドで修飾した銅ナノクラスター（ＣｕＮＣｓ）を提供する。特定の実施形態では、前記リガンドで修飾したＣｕＮＣｓは、直径が０．５～５ｎｍの範囲にあり、好ましくは０．５～３ｎｍの範囲にあり、より好ましくは０．５～２．５ｎｍの範囲にある。特定の実施形態では、前記リガンドは、チミン、チミンで修飾したヒアルロン酸（ＴＭＨＡ）、Ｌ（Ｄ）－システイン及びＮ－イソブタノイル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＩＢＣ）、Ｎ－イソブタノイル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＩＢＣ）、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン及びＮ－アセチル－Ｄ－システイン等のその他のシステイン誘導体、システイン含有オリゴペプチド及びそれらの誘導体（例えば、Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニンジペプチド（ＣＲ）、Ｌ－アルギニン－Ｌ－システインジペプチド（ＲＣ）、Ｌ－システイン Ｌ－ヒスチジン（ＣＨ）、グリシン－Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニントリペプチド（ＧＣＲ）、Ｌ－プロリン－Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニントリペプチド（ＰＣＲ）、Ｌ－グルタチオン（ＧＳＨ）、グリシン－Ｌ－セリン－Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニンテトラペプチド（ＧＳＣＲ）及びグリシン－Ｌ－システイン－Ｌ－セリン－Ｌ－アルギニンテトラペプチド（ＧＣＳＲ）等のジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、及びその他のシステイン含有ペプチドを含むが、これらに限定されない。）、及び１－［（２Ｓ）－２－メチル－３－チオール－１－オキソプロピル］－Ｌ－プロリン、チオグリコール酸、メルカプトエタノール、チオフェノール、Ｄ-ペニシラミン及びドデシルメルカプタンのうち一つ又は複数等のその他のチオール含有化合物を含むが、これらに限定されない。

【0056】

本発明は、多発性硬化症を有する対象を治療するための組成物を提供する。特定の実施形態では、前記組成物は、銅ナノクラスター（ＣｕＮＣｓ）と、薬理学的に許容される賦形剤とを含む。

【0057】

特定の実施形態では、前記組成物は、チミンで修飾したヒアルロン酸（ＴＭＨＡ）と、薬理学的に許容される賦形剤とを含む。

【0058】

特定の実施形態では、前記組成物は、ＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓと、薬理学的に許容される賦形剤とを含む。

【0059】

本発明は、ＭＳを治療するための医薬の製造における銅ナノクラスター（ＣｕＮＣｓ）の使用を提供する。

【0060】

本発明は、ＭＳを治療するための医薬の製造におけるチミンで修飾したヒアルロン酸（ＴＭＨＡ）の使用を提供する。

【0061】

本発明は、ＭＳを治療するための医薬の製造におけるＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓの使用を提供する。

【0062】

本発明は、ＭＳを有する対象を治療する方法を提供する。

【0063】

特定の実施形態では、前記方法は、前記対象に有効用量の銅ナノクラスター（ＣｕＮＣｓ）を含む組成物を投与することを含む。

【0064】

特定の実施形態では、前記方法は、前記対象に有効用量のチミンで修飾したヒアルロン酸（ＴＭＨＡ）を含む組成物を投与することを含む。

【0065】

特定の実施形態では、前記方法は、前記対象に有効用量のＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓを含む組成物を投与することを含む。

【0066】

特定の実施形態では、前記ＭＳを有する対象には、腹腔内注射により有効量のＣｕＮＣｓが投与される。特定の実施形態では、前記ＭＳを有する対象には、腹腔内注射により有効量のＴＭＨＡが投与される。特定の実施形態では、前記ＭＳを有する対象には、腹腔内注射により有効量のＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓが投与される。特定の実施形態では、前記有効量は、２～１００ ｍｇ ｋｇ^－１の範囲にある。

【0067】

本発明は、チミンで修飾したヒアルロン酸（ＴＭＨＡ）及びＴＭＨＡを合成する方法を提供する。

【0068】

ＴＭＨＡの構造は、図１（ａ）（ｉ）に示すように、式１で示され、ＨＡがグルクロン酸（ＧｌｃＡ）－Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）の繰り返し単位からなり、ＧｌｃＮＡｃがチミンで修飾され、及びｎが整数であり、１０～１０,０００であり、好ましくは１０～１,０００であり、より好ましくは１０～１００である。なお、ＨＡにおけるすべてのＧｌｃＮＡｃが必ずしもチミンで修飾したものではない。ＴＭＨＡにおけるチミンの置換度（ＤＳ）とは、ＴＭＨＡの１００つの糖残基当たりのチミン分子の数と定義される。ＴＭＨＡにおけるチミンの置換度（ＤＳ）は、１～５０％の範囲にあり、好ましくは４～３０％の範囲にあり、より好ましくは５～２０％の範囲にあり、さらに好ましくは７～１６％の範囲にあり、よりさらに好ましくは８～１５％の範囲にある。

【0069】

ＴＭＨＡを合成する方法は、

【0070】

０．０５～０．０２ｗ／ｖ％の濃度でチミンの酸性水溶液を提供することと、（特定の実施形態では、前記酸性水溶液が水とＨＣｌから構成される。）

【0071】

１～５ｗｔ％の濃度でＨＡ溶液を提供することと

【0072】

ＨＡ溶液に触媒を添加することと（特定の実施形態では、前記触媒がポリリン酸エステルである。）

【0073】

ＨＡ－チミン混合物を形成するようにチミンの酸性水溶液を触媒含有ＨＡ溶液に添加することと（特定の実施形態では、チミンの酸性水溶液を滴下注入により添加する。）

【0074】

ＨＡ－チミン混合物を所定の時間加熱することと（特定の実施形態では、前記加熱は、オイルバスにおいて４５～５０℃で１２～２０時間行う。）、

【0075】

加熱されたＨＡ－チミン混合物を所定の温度まで冷却することと（特定の実施形態では、未反応のチミンを沈殿させるために、前記所定の温度は、約０℃である。）、

【0076】

冷却されたＨＡ－チミン混合物から上清液を透析することと（特定の実施形態では、未反応の試薬及び不純物を除去するために、前記透析は、分子量カットオフ８０００で、４８～９６時間行う。）、

【0077】

透析された溶液を凍結乾燥して、ＴＭＨＡを得ることと、
を含む。

【0078】

本発明は、さらに、ＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓ及びＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓの合成方法を提供する。

【0079】

特定の実施形態では、ＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓの合成方法は、

【0080】

ＴＭＨＡ溶液を提供することと（特定の実施形態では、前記ＴＭＨＡ溶液が０．１ｍＭであり、ｐＨ７．０。）、

【0081】

ＴＭＨＡ溶液にＣｕＳＯ_４溶液を添加することと（特定の実施形態では、前記ＣｕＳＯ_４溶液が２０ｍＭであり、ｐＨ７．０、かつ、滴下により添加される。）、を含み、

【0082】

それにより、前記混合物を反応させる。特定の実施形態では、前記反応は、遮光で３７℃で２０分間行って、ＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓ溶液を得て、前記ＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓ溶液が、使用まで、遮光で４℃で保存される。

【0083】

ＵＶ光（３６５ｎｍ）照射で、明るいオレンジ色の発光が綺麗に見られ、発光ＣｕＮＣｓの形成が成功することがわかっている。

【0084】

特定の実施形態では、ＣｕとＴＭＨＡとのモル比が、１０：１～５００：１の範囲にあり、好ましくは１５：１～３００：１の範囲にあり、より好ましくは２０：１～２００：１の範囲にあり、さらに好ましくは２５：１～１００：１の範囲にあり、よりさらに好ましくは３０：１～８０：１の範囲にある。

【0085】

前記ＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓは、良好に分散された直径０．５～３ｎｍの球状ナノクラスターを含有する。

【0086】

以下の実施例は、本発明の原理を説明する目的のみで提供され、それらは本発明の範囲を限定することを意図するものではない。

【0087】

実施例

【0088】

（１）チミンで修飾したヒアルロン酸（ＴＭＨＡ）の合成

【0089】

まず、ポリリン酸エステルが触媒として製造された。ジエチルエーテル（１４．５ｍＬ）及びＣＨＣｌ_３（５．６ｍＬ）を撹拌しながら五酸化リン（１０ｇ）に添加し、混合物を還流で５０℃で１２時間加熱し、透明な溶液を得た。室温までに冷却した後、溶媒を真空下で留去した。得られた無色の粘性残留物は、ポリリン酸エステルであり、さらに精製することなく、触媒として使用された。

【0090】

次に、ＴＭＨＡを以下のように合成した。チミン（２３．６ｍｇ）の透明な溶液は、０．２５ｍＬの濃縮ＨＣｌ溶液（２５％）を添加した２５ｍＬのＨ_２Ｏに溶解することにより得られた。ポリリン酸エステル（１．５ｇ）を、ＨＡ溶液（５０ｍＬ、２．２ｗｔ％；ＭＷ１２０ＫＤ）に添加し、次にチミンを滴下注入し、混合物をオイルバスで５０℃まで１６時間加熱し、そして０℃まで冷却し、未反応のチミンを沈殿させた。続いて、上清液を透析バッグ（分子量カットオフ８０００）を介して７２時間透析して、いずれの未反応の試薬及び不純物を除去した。得られた溶液を凍結乾燥して、ＴＭＨＡを得た。その収率が８６％であり、置換度（ＤＳ）が１０．５％であった。最終生成物の品質は、^１Ｈ ＮＭＲ及びＦＴ－ＩＲにより同定された。

【0091】

図１を参照すると、図１（ａ）（ｉｉ）は、ＴＭＨＡの合成を示す。そして、図１（ａ）（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）は、それぞれ、ＨＡ及びＴＭＨＡの典型的な外見を示す。図１（ｂ）は、それぞれ、ＴＭＨＡ（赤線）及び純粋なＨＡ（青線）のＵＶ－ｖｉｓスペクトルを示す。図１（ｃ）は、ＨＡ及びＴＭＨＡのＦＴ－ＩＲを示す。そして、図１（ｄ）は、ＨＡ及びＴＭＨＡの^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。^１Ｈ ＮＭＲスペクトル分析は、８０℃、４００ＭＨｚでＤ_２Ｏにおいて、１０ｍｇ・ｍＬ^－１の試料濃度で行われた。ＦＴＩＲ解析に関して、試料準備においてＫＢｒ結晶がマトリックスとして使用された。

【0092】

ＴＭＨＡ複合体の化学的構造は、天然ＨＡとその誘導体のスペクトルとの比較を介して、ＦＴＩＲにより定性的に検討された。これらのスペクトルは、天然ＨＡと比較して、特にＤＳがより高いＴＭＨＡ誘導体と比較して、３０００～３２００ｃｍ^－１及び１３００～１８００ｃｍ^－１の範囲において顕著な相違を示した。前記天然ＨＡの特徴的ピークの割り当ては、３３６０ｃｍ^－１（二次Ｏ－Ｈストレッチ）、２８７３ｃｍ^－１（Ｃ－Ｈストレッチ）、１６２２ｃｍ^－１（アミドＩＩバンド、アセチル基のＣ－Ｏストレッチ）、１５５４ｃｍ^－１（アミドＩＩバンド、Ｎ－Ｈストレッチ）、１３８０ｃｍ^－１（ＣＨ_２基の非対称Ｃ－Ｈストレッチ曲げ）、１３１４ｃｍ^－１（第一級アルコール性基のＯ－Ｈストレッチ）、及び１０２６ｃｍ^－１（架橋Ｃ－Ｏストレッチに関する骨格振動）であった。ＴＭＨＡ誘導体のスペクトルは、３つの特徴的ピークを示し、即ち、３１９５と３０７９ｃｍ^－１（Ｎ－Ｈストレッチ）、１７３０ｃｍ^－１（Ｃ＝Ｏストレッチ）、及び１３４０ｃｍ^－１（Ｃ－Ｎストレッチ振動）であり、チミンによるＨＡの官能化を示唆している。より重要的には、ＨＡに属する第一級アルコール性基のＯ－Ｈストレッチに当たる１３１４ｃｍ^－１でのバンドの消失は、ＨＡのＧｌｃＮＡｃの第一級－ＯＨ基のみがチミンと反応する、反応メカニズムを示唆している。^１Ｈ ＮＭＲ解析により、修飾の成功がさらに確認された。

【0093】

（２）ＴＭＨＡを用いたＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓの合成

【0094】

１０ｍＬのＴＭＨＡ（ＤＳが１０．５％）溶液（０．１ｍＭ、ｐＨ７．０）を徐々に３７℃まで加熱し、ＴＭＨＡを溶解した。２ｍＬのＣｕＳＯ_４（２０ｍＭ、ｐＨ７．０）溶液を滴下し、遮光、３７℃でさらなる２０分間反応させた。ＵＶ光照射（３６５ｎｍ）で、明るいオレンジ色の発光が綺麗に見られ、発光ＣｕＮＣｓの形成が成功したことがわかった。最後に、使用まで、遮光で４℃で保存された。

【0095】

最適な合成条件、例えば、Ｃｕ^２＋／ＴＭＨＡのモル比、ｐＨ値、反応温度、及び時間のそれぞれについて詳細に検討した。反応系に対するＣｕ^２＋含有量の影響を研究するために、異なる濃度の２ｍＬのＣｕＳＯ_４を、１０ｍＬのＴＭＨＡ溶液に添加し、当該反応系におけるＣｕ^２＋とＴＭＨＡとのモル比が、５：１、１０：１、１５：１、２０：１、３０：１、４０：１、６０：１、８０：１、１００未満：１であった。軽く撹拌しながら遮光、３７℃で、ｐＨ７．０で２０分間反応した後、コロイド試料が得られ、発光分光計により検測された。ＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓの形成に対するｐＨ値の影響をよく理解するために、１．０Ｍ ＮａＯＨ又は１．０Ｍ ＨＣｌにより調整した異なるｐＨ値以外、同じ環境で一連の試験を実施した。また、反応温度（２０～７０℃）、及び反応時間（１～２５分間）の影響についても、それぞれ、検討した。発光分光計により、得られた試料を検測した。

【0096】

図２を参照すると、得られたＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓの蛍光強度に対する（ａ）Ｃｕ^２＋とＴＭＨＡとのモル比、（ｂ）反応ｐＨ値、（ｃ）反応温度、及び（ｄ）反応時間の影響を示すグラフを提供する。図２（ａ）に示すように、ＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓの蛍光強度は、Ｃｕ^２＋とＴＭＨＡとのモル比が５から４０まで増加するとともに向上し、Ｃｕ^２＋とＴＭＨＡとの比をさらに４０から１００まで増加すると、徐々に低下した。図２（ｂ）に示すように、反応ｐＨ値は、高品質のＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓの形成に重要な役割を果たした。ＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓの蛍光強度は、反応ｐＨ値が４から７まで増加するとともに大幅に増強し、そして速やかに低下し始めた。例えば、反応ｐＨ１０で、ＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓの発光は、蛍光分光法を介して観察することが困難となった。図２（ｃ）に示すように、２０～５０℃の反応温度は、高度な蛍光ＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓの形成に理想的なパラメータであった。図２（ｄ）に示すように、製造されたＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓの蛍光強度は、合成時間が１分間から８分間まで延長すると、大幅に増強した。時間がさらに２５分間まで増加すると、ＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓの蛍光強度が一定に維持された。全ての観測に基づいて、ＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓの最高の蛍光強度は、以下の最適化された合成条件で得られることを確認した：Ｃｕ^２＋とＴＭＨＡとのモル比が約４０、ｐＨ７．０溶液、そして３７℃で４時間反応した。

【0097】

（３）ＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓの安定性の研究

【0098】

ＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓの発光安定性の評価は、以下の手順に従って行われた。まず、様々な濃度のＮａＣｌ溶液（１００μＬ）をＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓ溶液（９００μＬ）と混合し、２５℃で３０分間インキュベートした。次に、５００μＬのＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓ溶液と様々な陽イオン又は陰イオン溶液（５００μＬ、２ｍＭ）とを十分に混合して、２５℃で３０分間インキュベートした。そして、ＮａＯＨ（１．０Ｍ）又はＨＣｌ（１．０Ｍ）を５ｍＬのＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓ溶液に入れて、体系ｐＨを調整し、２５℃で３０分間インキュベートした。最後に、ＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓの蛍光スペクトルを励起波長３８５ｎｍ及び発光波長６１０ｎｍで測定した。

【0099】

図３を参照すると、得られたＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓの蛍光強度に対する（ａ）ＮａＣｌ濃度（０～１Ｍ）、（ｂ）共有カチオン及びアニオン、（ｃ）ｐＨ値（４～１０）、及び（ｄ）重合時間（０～５週間）の影響を示すグラフを提供する。図３（ａ）に示すように、異なる濃度（０、０．２、０．４、０．６、０．８及び１．０Ｍ）のＮａＣｌ溶液において、ＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓの蛍光強度は変化せず、強イオン強度の環境でのＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓの高い安定性を示した。より重要的には、２ｍＭのＮａ^＋、Ｂａ^２＋、Ｆｅ^３＋、Ｇｄ^３＋、Ｓｎ^４＋のようなその他の遷移金属イオン、及びＣｌ^－、ＣＯ_３ ^２－、ＰＯ_４ ^３－、Ｃ_２Ｏ_４ ^２－、Ｃ_６Ｈ_５Ｏ_７ ^３－のようなアニオンをＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓの溶液に添加すると、これらの選ばれたイオンは、いずれも蛍光強度に無視できるぐらいの影響を与えた（図３（ｂ））。同じような安定的な蛍光性能も、図３（ｃ）に示されている。ｐＨ値を４．０から１０．０まで調整しても、対応するＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓの蛍光スペクトルに明らかな影響を与えることがない。これから明らかなように、当該緩衝系において、ＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓは、ｐＨ値に敏感ではないとわかった。また、空気中、室温（２５℃）で５週間重合した後、ＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓに沈殿、凝集や蛍光強度の低下が見られなかった（図３（ｄ））。これらの全ての結果から、ＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓが優れた安定性を有し、実際の応用が見込まれていることがわかった。

【0100】

（４）ＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓの合成に対するＴＭＨＡ中のチミンの置換度（ＤＳ）の影響

【0101】

ヒアルロン酸（ＨＡ）及びチミンは、天然生物的分子であり、チミンは、Ｃｕ^２＋を十分にキレート化させる役割を果たし、ＨＡのヒドロキシル基は、金属ナノクラスターの成核と成長のための還元剤として作用する。本発明の発明者らは、チミンの置換度（ＤＳ）がＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓの合成に重要な調整因子であると見出した。ｐＨ７．０溶液において、Ｃｕ^２＋とＴＭＨＡとのモル比が約５０であり、そして３７℃で４時間反応させた。

【0102】

図４を参照すると、チミンの置換度（ＤＳ）が異なるＴＭＨＡにより製造されたＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓを示す写真及びグラフを提供する。図４（ａ）及び（ｄ）は、それぞれ、チミンのＤＳが３．２％であるＴＭＨＡで製造されたＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓのＴＥＭ又はＡＦＭ画像を示す。図４（ｂ）及び（ｅ）は、チミンのＤＳが１０．５％であるＴＭＨＡで製造されたＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓのＴＥＭ又はＡＦＭ画像を示す。図４（ｃ）及び（ｆ）は、チミンのＤＳが２０．１％であるＴＭＨＡで製造されたＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓのＴＥＭ又はＡＦＭ画像を示す。図４（ｇ）及び（ｈ）は、それぞれ、ＴＭＨＡ又はＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓのＭＳスペクトルを示す。そして、図４（ｉ）及び（ｊ）は、（ｉ）ＣｕＮＣｓの全領域及び（ｊ）Ｃｕ_２ｐ領域のＸＰＳスペクトルを示す。図４では、挿入図（ｂ、ｇ、ｈ）は、それぞれ、ＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓナノワイヤー、イオン化断片及びＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓの模式図であり、（ｅ、ｆ）は、ナノワイヤーで構成される単離されたＣｕＮＣｓである。

【0103】

チミンのＤＳレベルが１０．５％である場合、よく分散された、直径が０．５～３ｎｍの範囲にある、平均直径が１．６４±０．４８ｎｍである球状ＣｕＮＣｓを生成した。それに対して、より低い（３．２％）又は高い（２０．１％）レベルでは、大量のワタ状のＣｕＮＣｓは、それぞれ、直径が１．０８±０．７２ｎｍ及び１．９６±０．８３ｎｍであるものとして現れた。次に、ＴＭＨＡを未処理ＨＡに変更した以外に、同じ試験要素で試験を行う場合、酷く縮合された大分子のネットワークしか確認されなかった（図４（ｉ）及び（ｊ））。さらに予想外のは、１０．５％のＤＳにより、直径８．０５±０．４３ｎｍであるＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓナノワイヤーの一次元組立体を生成した（図４（ｂ）及び（ｅ））。チミンのＤＳが２０．１％まで増加すると、ナノワイヤーは、長さ／直径比が大きく低下したため、一部が区別できなくなった（図４（ｃ）及び（ｆ））。微調整されたＣｕＮＣｓと線形ＴＭＨＡ鋳型との共有結合により、ＣｕＮＣｓが高次アレイ、即ちＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓに自己組織化することを保証した。なお、凝集誘起発光（ＡＩＥ）に基づいて、このようなナノワイヤーは、効果的にＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓの蛍光安定性及び強度を向上した（詳細は後述する）。

【0104】

（５）チミンからその他のリガンドへの置き換え

【0105】

金属のコアサイズを変更せずにナノワイヤーを形成する単独のＣｕＮＣｓをより明確的に検出するため、チミンリガンドを、より強いＣｕ－Ｓ結合を生成することにより、チオレートに置き換えた。ＧＳＨをリガンドとして予想通りＣｕＮＣｓを形成したが、その使用により、母体ナノワイヤーが容易にその構築単位、即ちＣｕＮＣｓに分解される。図５に示すように、ＧＳＨリガンドを有するＣｕＮＣｓの熱重量解析を示すグラフを提供した。ここで、リガンド交換の策略を利用して、母体ナノワイヤーをその構築単位、例えばＣｕＮＣｓに分解する。製造直後のＴＭＨＡ鋳型のＣｕＮＣｓ（１ｍＬ）を、ＧＳＨ水溶液（０．０５Ｍ、５ｍＬ）に添加し、室温で８時間撹拌した。白色沈殿は、反応が進行するともに生成した。８０００ｒｐｍで約１０分間遠心することにより、生成した上清液が回収された。エタノールの添加により、上清液からＧＳＨ安定化ＣｕＮＣｓを沈殿させ、エタノールで３回洗浄を繰り返した。最後に、生成物は、凍結乾燥され、冷蔵庫で長期間保存のために保存された。

【0106】

（６）ＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓの同定

【0107】

なお、中間ＤＳが１０．５％である場合、断面プロフィール解析及び多分散指数により実証されるように、完全、球状、及び均一のＣｕＮＣｓが形成される。ＨＲ－ＴＥＭ画像から細かく計算すると、０．２０７ｎｍの模様間隔距離が示され、面心格子金属Ｃｕの（１１１）結晶面と一致した。図６は、チミンのＤＳが３．２％（青）、１０．５％（赤）、及び２０．１（緑）であるものをそれぞれ使用して得られたＣｕＮＣｓの励起（λ_ｅｍ＝６１３ｎｍで測定される。）スペクトルを示すグラフである。

【0108】

以下では、特に断らない限り、１０．５％のＤＳでＴＭＨＡにより製造されたＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓを使用した。

【0109】

電子顕微鏡の補足として、質量分析（ＭＳ）も、クラスターサイズ解析において信頼性のあるツールであることが証明された。ここで、高解像度エレクトロスプレーイオン化ＭＳ（ＥＳＩ－ＭＳ）を利用して、サブナノメートルサイズのＣｕＮＣｓの正確な分子式を同定することを試みた。注目すべきことに、純粋なＨＡは、主として、陽イオンモードにおいてそのイオン化効率が低いため、いかなる可視イオン信号も示されなかった。対照的にＴＭＨＡの陽イオン化は、ｍ／ｚ＝１０６．１９３６で単一のピークを生成した（図（４（ｇ））。チミンからのＨＮＣＯの損失のため、[Ｃ_４Ｈ_５ＮＯ＋Ｎａ]^＋の式に帰することができる。いくつかの測定パラメータをスクリーニングした後、ＴＨＭＡの代わりに、Ｃ_４Ｈ_５ＮＯがＣｕＮＣｓのイオン化においてリガンドとして作用する場合、豊富なイオン信号を放出することが容易になる。これらのパラメータは、チミンの分解を促進するために適切なエネルギーを供給するので、最適なものとして選択され、キャピラリー電圧ｃａ．４５００Ｖ、乾燥温度１５０℃であった。元素解析とｍ／ｚ＝１０４３．２５４５での最高のイオンピーク（図（４（ｈ））とを組み合わせることにより、ＣｕＮＣｓの定義式は、Ｃｕ_６Ｌ_５として決定された。低質量範囲の他のイオンピークも、Ｃｕ_６関連化学種のフラグメントと正確に対応した。その結果から、Ｃｕ_６クラスターは支配的な種であり、ＤＳが３．２％及び２０．１％である二つの対照群に対して、チミンのＤＳが１０．５％であるＴＭＨＡにより合成されたＣｕＮＣが優れた単分散性を有する。

【0110】

Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）解析により、ＣｕＮＣが、Ｃ、Ｏ、Ｎ、及びＣｕを含む全ての予想される元素から構成されたことが明らかになった。ＣｕＮＣ中の無機含有量を計算すると、２９．８重量％であった。さらに、９３２．３及び９５２．１ｅＶでの２つの強いシグナルが、Ｃｕ^０の２ｐ_３／_２及び２ｐ_１／_２電子の結合エネルギーによるものである、また、サテライトシグナルがないことから、Ｃｕ^２＋の欠如がわかった。なお、Ｃｕ^０の２ｐ_３／_２結合エネルギーは、Ｃｕ^＋の２ｐ_３／_２結合エネルギーに非常に近い。従って、製造されたＣｕＮＣｓの原子価状態は、０と＋１の間にある可能性が最も高いとなった。

【0111】

図７を参照すると、（ａ）チミンの異なるＤＳでのＰＬスペクトル（左）及び減衰プロファイル（右）、挿入図：３６５ｎｍ励起での画像；（ｂ）Ｃｕ^２＋含有量に対するＴＭＨＡプローブのＰＬ応答；（ｃ）様々な金属に対する、Ｃｕ^２＋のためのＴＭＨＡプローブのＰＬ及び色改変（挿入図）、を示すグラフを提供する。

【0112】

（７）Ｃｕ^２＋イオンの検出のためのプローブとしてのＴＭＨＡ

【0113】

３つを健康な成人ボランティアから採取し、残りをＰＤを有する成人ボランティアから採取した５つの尿試料を、それぞれ尿中のタンパク質及び他の生物種の干渉を除去するようにアセトニトリルで希釈した。１０℃で１２,０００ｒｐｍの速度で１０分間遠心分離した後、上清液を回収し次の実験に利用した。最初に、上清液を脱イオン水で希釈して、上清中に残存するＣｕ^２＋濃度を減少させた。次いで、１００μＬの尿試料を２００μＬのＴＭＨＡ（０～４０μｇ・ｍＬ^－１）と混合し、２５℃で１０分間インキュベートした後、蛍光分光法により検査された。

【0114】

なお、５６０ｎｍでの大きなＣｕナノ粒子の表面プラズモン共鳴とは光学的特徴が明らかに異なる。ＸＲＤピークのベースラインへの広がりは、ＣｕＮＣｓの小さなサイズと一致した。興味深いことに、サブナノ規模のＣｕＮＣｓは、ＤＳ依存性フォトルミネセンス（ＰＬ）特徴を有した。３８５ｎｍの励起下で、１０．５％のＤＳ誘導ナノワイヤーは、６１３ｎｍにピークを有し、５７μｓの長い寿命と、１４．８％の大きな量子収率を有する明らかな安定的な発光を示した（図（７（ａ））。より低次のＣｕＮＣｓ組立体では、これらの特性が急速に低下し、自己組織化駆動のＡＩＥを示唆している。より多くのＣｕＮＣｓが密にかつ規則的に充填されると、より安定で強いＰＬ応答が得られる。反応因子を調整することにより、本発明の清浄な合成経路は、ＴＭＨＡ（キレート化、Ｃｕ^２＋を還元し、かつ自己組立体をＣｕＮＣｓナノワイヤーへの鋳型とするする。）に依存し、従来の経路で導入された不純物を消去し、顕著なＰＬ特性を得ることができた。例えば、ＴＭＨＡセンサのＰＬ強度は、直線的で、Ｃｕ^２＋濃度に応じて明らかに改善されたものであり、２．２ｐｐｂの極めて低い検出限界に対応する（図（７（ｂ））。現在報告されている方法と比較して、その解析性能は、従来技術のプローブ及び米国ＥＰＡにより設定された飲料水の最大レベルに比べて、約１．５倍及び４８０倍小さいことを示した。また、図（７（ｃ）において、外来イオンに対して、光学特性はＣｕ^２＋に対して選択的であった。従って、ＴＭＨＡは、高感度及び選択性を有する比色及び蛍光Ｃｕ^２＋プローブとして使用することができる。

【0115】

（８）ＣｕＮＣｓの酸化防止機能

【0116】

細胞酸化防止酵素を機能的に模倣するＣｕＮＣｓの能力を研究した。予想外に、ＣｕＮＣｓは、１次反応速度論に基づいてＨ_２Ｏ_２を激しく分解することができた（図（８（ａ））。次に、本発明者らは、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）アッセイを介してＣｕＮＣｓのＧＰｘ様活性を研究した。種々のアッセイ条件で記録された初期速度は、図（８（ｂ）に示され、ＣｕＮＣｓのＧＰｘ様機能を直接支持した。さらに、ＣｕＮＣｓは、顕著なＳＯＤ様活性を有し、そして、スーパーオキシド源としてのＫＯ_２からの大量Ｏ_２が生成することから、スーパーオキシドのＨ_２Ｏ_２及びＯ_２（図（８（ｃ））への不均化の作用原理が推定された。さらに、ＣｕＮＣｓは、細胞酸化防止剤として使用される既存の金属よりも明らかな多酵素的利点を有した（図（８（ｄ））。

【0117】

図８を参照すると、（ａ）ＣｕＮＣｓと反応するＨ_２Ｏ_２のＵＶ吸収、（ｂ）ＣｕＮＣｓ及び様々な対照群のＧＰｘ様活性の初期速度、（ｃ）ＣｕＮＣｓ ＳＯＤ様活性、挿入図：Ｏ_２生成速度、（ｄ）ＣｕＮＣｓとその他の金属との触媒活性の比較、を示すグラフを提供する。

【0118】

（９）ＴＭＨＡによるＰＤの非侵襲的診断

【0119】

プローブとしてＴＭＨＡを用いてヒト尿液試料中のＣｕ^２＋含有量を測定した。注目すべきことに、赤色蛍光がＰＤ患者からの尿液試料中のみに現れた。その高い特異性及び簡単な操作を考慮すると、ＴＭＨＡは、ＰＤについての早期診断及びリスク評価において新しい機会を開くことができた。

【0120】

図９を参照すると、ＰＤの早期診断のための尿液Ｃｕ^２＋の検出を示すグラフを提供する。

【0121】

（１０）インビトロ細胞試験

【0122】

ＰＣ１２（ラット副腎髄質褐色細胞腫細胞株）、ＳＨＳＹ－５Ｙ（ヒト神経芽細胞腫細胞株）、及びＨＥＫ２９３（ヒト胎児腎臓細胞株）細胞は、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、２ｍＭ・Ｌ－グルタミン、１００ＵｍＬ^－１ペニシリン、１００μｇ・ｍＬ^－１ストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で３７℃、５％ＣＯ_２で培養した。

【0123】

メチルチアゾリルテトラゾリウム（ＭＴＴ）アッセイを実施して、細胞生存率を測定することによりＴＭＨＡのインビトロ細胞毒性を測定した。ＭＴＴアッセイでは、ＳＨＳＹ－５Ｙ細胞をウェル当たり５０００個の生存細胞の密度で９６ウェルプレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ_２で２４時間インキュベートして細胞付着を可能にした。次いで、この細胞を、特定の濃度で、ブランクＴＭＨＡ溶液（Ｃｕ^２＋添加なし）と共にインキュベートした。その後、細胞を３７℃、５％ＣＯ_２で２４時間インキュベートした。培地を５ｍｇ・ｍＬ^－１ＭＴＴを含有する新鮮なＤＭＥＭで置き換えた後、細胞をさらに４時間インキュベートした。ＭＴＴ溶液を除去した後、ＤＭＳＯで紫色のホルマザン結晶を溶解し、吸光度をマイクロプレートリーダー（ＦＬ ６００、Ｂｉｏ－Ｔｅｋ）上で５７０ｎｍでモニターした。結果を、３つの測定値の平均値として表した。同じ方法で、ＨＥＫ２９３細胞及びＰＣ１２細胞に対する純粋なＴＨＭＡのインビトロ細胞毒性を測定した。ＴＭＨＡは、５００μｇ・ｍＬ^－１ほど高い用量で非毒性であった。

【0124】

次に、本発明者らは、ＰＤ表現型の実験的細胞モデルにおけるＴＭＨＡの細胞保護特性を調べた。このモデルは、ＭＰＴＰ（１－メチル－４－フェニル－１，２，３，６－テトラヒドロピリジン）の活性代謝物であるＭＰＰ^＋（１－メチル－４－フェニルピリジニウム）を用いて、ラット副腎髄質褐色細胞腫細胞（ＰＣ１２）を処理することにより生成された。

【0125】

１－メチル－４－フェニル－１，２，３，６－テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）は神経毒である。それ自体は毒性ではないが、脳に入ると、この神経毒は化合物１－メチル－４－フェニルピリジン（ＭＰＰ^＋）に代謝される。ＭＰＰ^＋は、黒質中のＤＡ作動性ニューロンを破壊する可能性がある。同時に、ＭＰＰ^＋は、ミトコンドリア代謝の呼吸鎖中の重要な物質であるＮＡＤＨデヒドロゲナーゼと干渉することができ、細胞死及びフリーラジカルの蓄積を引き起こす。このプロセスにより引き起こされるＤＡ作動性ニューロンの大量死は、大脳皮質による運動制御に重大な影響を及ぼし、その結果、ＰＤの類似の症状をもたらす。そのため、ＭＰＴＰ及びＭＰＰ^＋は、ＰＤ関連動物及び細胞モデルの確立並びにＰＤ薬物の研究及び開発において広く使用されている。

【0126】

ＰＣ１２細胞を、Ｃｕ^２＋及びＴＨＭＡの非存在下又は存在下で６ウェルプレートで培養した。次いで、種々の濃度のＭＰＰ^＋（０．５～４ｍＭ）を添加した。細胞の相対的生存率もＭＴＴアッセイにより決定した。４ｍＭのＭＰＰ^＋は、ＰＣ１２細胞の重篤な細胞傷害性（即ち、２０％未満の細胞生存率未満）を誘発した。驚きなのは、４ｍＭ ＭＰＰ^＋誘発細胞毒性は、８μＭ Ｃｕ^２＋及び１０μｇ・ｍｌ^－１ ＴＭＨＡ（即ち、８０％以上の細胞生存率）により完全に逆転された。細胞生存率のデータは、図（１０（ａ）（＊＊＊ｐ＜０．００１）に示された。

【0127】

共焦点レーザ走査顕微鏡（ＣＬＳＭ）を用いて細胞形態変化を取得した。ＣＬＳＭ上の生存細胞及び死細胞の観察のために、３'，６'－ジ（Ｏ－アセチル）－４'，５'－ビス[Ｎ，Ｎ－ビス（カルボキシメチル）アミノメチル]フルオレセイン（即ち、テトラアセトキシメチルエステル（カルセイン－ＡＭ））を用いて、生細胞を緑色蛍光（λ_ｅｘ＝４９０ｎｍ、λ_ｅｍ＝５１５ｎｍ）として染色し、そしてヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を用いて死細胞を赤色蛍光（λ_ｅｘ＝５３５ｎｍ、λ_ｅｍ＝６１７ｎｍ）として染色した。具体的には、培地を除去した後、０．１ｍｌのカルセイン－ＡＭ溶液（２０ｍＭ）及び０．１ｍｌのＰＩ溶液（２０ｍＭ）を、両方とも、培地の除去の後に添加した。１０分間インキュベートした後、２つの染色溶液を迅速に除去し、細胞をＰＢＳで２回リンスした。次いで、得られた細胞をＣＬＳＭにより可視化することができた。図１０（ｂ）は、ＰＩ色素により染色され、４ｍＭ ＭＰＰ^＋、２μＭ Ｃｕ^２＋、１０μｇ・ｍｌ^－１ ＴＭＨＡという条件で処理された死亡（赤）細胞を示し、図１０（ｃ）は、カルセイン－ＡＭにより染色され、４ｍＭ ＭＰＰ^＋、１０μＭ Ｃｕ^２＋、１０μｇ・ｍｌ^－１ ＴＭＨＡという条件で処理された生存（緑）細胞を示す。

【0128】

ＣＬＳＭを用いて活性酸素種（ＲＯＳ）を直接観察するために、最初にＣＬＳＭ専用培養ディスクにＰＣ１２細胞を播種し、５％ＣＯ_２ガスで３７℃で一晩付着させた。１ｍＬの２'，７'－ジクロロフルオレセイン二酢酸塩（ＤＣＦＨ－ＤＡ）と約２０分間インキュベートした後、培養液を、それぞれ、以下の物質を含有する新鮮な培地（ｐＨ＝７．４）に置き換えた：（ａ）対照群としての４ｍＭのＭＰＰ^＋、（ｂ）４ｍＭのＭＰＰ^＋、１０ ｏｆ μｇ・ｍＬ^－１ ＴＭＨＡ、（ｃ）４ｍＭのＭＰＰ^＋、１０μＭのＣｕ^２＋、（ｄ）４ｍＭのＭＰＰ^＋、１０ μｇ・ｍＬ^－１のＴＭＨＡ、２μＭのＣｕ^２＋、（ｅ）４ｍＭのＭＰＰ^＋、１０ μｇ・ｍＬ^－１のＴＭＨＡ、４μＭのＣｕ^２＋；（ｆ）４ｍＭのＭＰＰ^＋、１０ μｇ・ｍＬ^－１のＴＭＨＡ、６μＭのＣｕ^２＋、（ｇ）４ｍＭのＭＰＰ^＋、１０ μｇ・ｍＬ^－１のＴＭＨＡ、８μＭのＣｕ^２＋、及び（ｈ）４ｍＭのＭＰＰ^＋、１０ μｇ・ｍＬ^－１のＴＭＨＡ、１０μＭのＣｕ^２＋。細胞は、さらに３７℃で５％ＣＯ_２で３０分間インキュベートした後、新鮮なＰＢＳで２回洗浄された。細胞内ＲＯＳレベルは、新たに形成されたＤＣＦ（λ_ｅｘ＝４８８ｎｍ、λ_ｅｍ＝５２５ｎｍ）の蛍光を検出することにより評価した。細胞内ＲＯＳレベルのデータは、図（１１（ａ）に示され、＊＊＊ｐ＜０．００１であった。

【0129】

図１１（ｂ）は、４ｍＭのＭＰＰ^＋、１０μｇ・ｍＬ^－１ ＴＭＨＡで処理され、かつ特定の蛍光プローブＤＣＦＨ－ＤＡで染色された細胞における細胞内ＲＯＳ ＣＬＳＭ画像を示す。そして、図１１（ｃ）は、４ｍＭのＭＰＰ^＋、１０μｇ・ｍＬ^－１ ＴＭＨＡ、１０μＭのＣｕ^２＋で処理され、かつＤＣＦＨ－ＤＡで染色された細胞における細胞内ＲＯＳのＣＬＳＭ画像を示す。ＲＯＳ特異的蛍光強度の明らかな低下からわかるように、ＴＭＨＡが細胞内上昇ＲＯＳを効率的に捕捉することができることを示した。特徴的１：２：２：１ヒドロキシルラジカルスピンにより、ＴＭＨＡ処理による細胞内ＲＯＳ誘導の減少が実証された。

【0130】

（１１）インビボ保護試験

【0131】

一般的に、１－メチル－４－フェニル－１，２，３，６－テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）の投与は、ヒトにおける散発性ＰＤと著しく類似した動物の臨床症状をもたらすことが広く受け入れられている。従って、当該の実験では、本発明者らは、ＭＰＴＰを利用して、ＰＤの動物モデルにおいてパーキンソン症状を生じさせた。簡単にまとめると、Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、７群（ｎ＝５マウス／群）にランダムに分けて、即ち、空白対照群（正常生理食塩水）、高用量のＴＭＨＡ（１００ｍｇ・ｋｇ^－１）、低用量のＴＭＨＡ（５０ｍｇ・ｋｇ^－１）、高用量のＭＰＴＰ（３０ｍｇ・ｋｇ^－１）、低用量のＭＰＴＰ（１０ｍｇ・ｋｇ^－１）、ＭＰＴＰ＋ＴＭＨＡ（３０ｍｇ・ｋｇ^－１＋１０ｍｇ・ｋｇ^－１）及びＭＰＴＰ＋ＴＭＨＡ（３０ｍｇ・ｋｇ^－１＋２０ｍｇ・ｋｇ^－１）。具体的には、モデル群は、ＭＰＴＰを、少なくとも４日間連続腹腔内注射により投与して、ＰＤのマウスモデルを生成した。空白対照群及びＴＨＭＡ群は、それぞれ腹腔内注射により生理食塩水及びＴＨＭＡで治療した。ＭＰＴＰ＋ＴＭＨＡ群は、ＴＭＨＡ（用量：１０又は２０ｍｇ・ｋｇ^－１）を予め腹腔内０．５時間（１日１回）注射し、次いで３０ｍｇ・ｋｇ^－１のＭＰＴＰを７日間腹腔内注射した。

【0132】

水泳試験により運動機能を評価した。各動物を直径１２０ｃｍ及び高さ８０ｃｍのサイズを有する円形プールに入れた。水（２５℃）の深さは６０ｃｍであった。追跡システム（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｊｉｌｉａｎｇ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ.,Ｌｔｄ．）を使用して１０分間隔で移動距離（ｃｍ・１０ｍｉｎ^－１）及び持続時間（秒間）を記録した。回転ロッド（Ｕｇｏ Ｂａｓｉｌｅ）を用いて運動の姿勢及びバランスを測定した。マウスに、１０ｒｐｍから始まり、そして３０秒間をかけて２２ｒｐｍまで加速した回転ロッド上で１５分間の３回の試験を行った。この試験間の間隔は３分間であった。各群について、ロッドからの落下時間を測定し、平均化した。図１２（ａ）は、記憶障害のマウスの移動距離及び落下待ち時間を示し、***ｐ＜０．００１であった。これらのデータは、ＴＭＨＡ治療がＭＰＴＰ処置動物の認知活動を回復することができることを示した。

【0133】

ミトコンドリアの形態の変化は、ＲＯＳにより誘発されるミトコンドリア機能不全の早期かつ重要な徴候である。ここで、本発明者らは、ミトコンドリアの形態変化を可視化するためにＴＥＭを使用した。一般に、Ｃ７５ＢＬ／６マウス由来の脳組織を、順次に冷２．５%グルタルアルデヒドを含有する０．１Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ７．２）と２％パラホルムアルデヒドを含有する０．１ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）との混合物中で一晩固定し、その後、エポキシ樹脂に入れた。埋め込まれた試料をカプセルに装填し、３８℃で９時間重合させ、次いで６０℃で４８時間重合させた。ウルトラミクロトーム（ＲＭＣ、ＵＳＡ）を用いて薄切片を作製し、銅グリッド上に収集した。切片の適当な領域を１００ｎｍの厚さで切断し、飽和４％ウラニル酢酸／４％クエン酸鉛で切片を染色した後、透過型電子顕微鏡（ＪＥＭ－２１００Ｆ）を用いて８０ｋＶで検査した。図１２（ｂ）は、高用量のＭＰＴＰ（３０ｍｇ・ｋｇ^－１）で治療された動物からのミトコンドリアを示し、赤線により示すように、ミトコンドリアは、膨潤、液胞形状及び重度なクリステ破壊を示す。それに対して、図１２（ｃ）は、ＭＰＴＰ（３０ｍｇ・ｋｇ^－１）＋ＴＭＨＡ（３０ｍｇ・ｋｇ^－１）で治療された動物からのミトコンドリアを示し、赤線により示すように、ミトコンドリアは、正常な形態を示す。

【0134】

（１２）異なるリガンドを有する単体ＣｕＮＣｓによるα－ｓｙｎ凝集動態試験

【0135】

異なるリガンドで修飾したＣｕＮＣｓを、文献に従って製造した。チオフラビンＴ（略語：ＴｈＴ）は、アミロイドの存在を同定するために使用される高感度の蛍光マーカーである。ＴｈＴをポリペプチド又はタンパク質のモノマーと共にインキュベートすると、その蛍光は実質的に変化しない。ＴｈＴが繊維構造を有するアミロイドポリペプチド又はタンパク質に遭遇すると、それは、アミロイドポリペプチド又はタンパク質に直ちに接着し、その蛍光強度は指数関数的に増加する。従って、ＴｈＴは、ペプチド又はタンパク質のアミロイドーシスをモニターするためのメーカーとして広く使用されている。本実施形態は、ＣｕＮＣｓの存在下でα－ｓｙｎの線維化凝集の動態過程をモニターするために、ＴｈＴ蛍光標識法を採用した。具体的な実験方法は以下の通りである。

【0136】

α－ｓｙｎモノマーの前処理：凍結乾燥したα－ｓｙｎ粉末（Ｂａｃｈｅｍ Ｃｏｒｐ．）をＨＦＩＰ中に溶解して、１ｇ／Ｌのα－ｓｙｎ溶液を得た。シーリングの後、室温で２～４時間インキュベートし、次いで、高純度窒素を使用して、ヒュームボードにおいてＨＦＩＰを除去するように、適切な流速でブローし、乾燥したα－ｓｙｎを２００μＬのＤＭＳＯ中に溶解させ、溶液をシールし、将来の使用のために、それを最大一週間まで－２０℃の冷蔵庫に保存した。使用前に、α－ｓｙｎ ＤＭＳＯ溶液を、リン酸緩衝液（ＰＢＳ、１０ｍＭ、ｐＨ＝７．４）を用いて２０μＭに希釈して、α－ｓｙｎ ＰＢＳ溶液を得た。実験における全てのα－ｓｙｎ ＰＢＳ溶液は、使用直前に製造された。

【0137】

試料の製造及び検出：リガンドで修飾したＣｕＮＣｓをα－ｓｙｎ ＰＢＳ溶液に添加して、ＣｕＮＣｓ及びα－ｓｙｎをそれぞれ５ｐｐｍ及び３５μｍの最終濃度に到達させた。溶液を９６ウェルプレート中で３７℃で連続的にインキュベートし、１０分毎にマイクロプレートリーダーにより蛍光強度をモニターし、ＴｈＴの蛍光強度の変化を通してα－ｓｙｎ凝集の動態的プロセスを同定した。実験群は、リガンドで修飾したＣｕＮＣｓをしようした。リガンド対象群は、ＣｕＮＣｓと結合しないリガンド分子を使用した。空白対照群は、α－ｓｙｎのみを使用した。

【0138】

図１３を参照すると、α－ｓｙｎフィブリル化動態に対するＬ－グルタチオン（ＧＳＨ）で修飾したＣｕＮＣｓ（ＧＳＨ－ＣｕＮＣｓ）の影響を示すグラフを提供する。結果によれば、３７℃で３５μＭのα－ｓｙｎのインキュベーション工程において、ＴｈＴ標識された蛍光強度が２５時間目から急速に増加し、α－ｓｙｎ凝集及びフィブリル化が起こったことを示した。リガンド対照群の結果は、リガンドＧＳＨを単独使用することがα－ｓｙｎの凝集動態に明らかな影響をあたえることがないことを示した。ＣｕＮＣｓを添加した実験群については、ＴｈＴ標識された蛍光強度は、７０時間の実験にわたって増加することなく、ベースラインの近くに保持され、ＧＳＨで修飾したＣｕＮＣｓがα－ｓｙｎ凝集及びフィブリル化を完全に阻害することができ、その効果はＧＳＨリガンドではなくＣｕＮＣｓによることを示唆している。

【0139】

特定の実施形態では、ＣｕＮＣｓは、例えば、Ｌ（Ｄ）－システイン、Ｎ－イソブタノイル－Ｌ（Ｄ）－システイン（Ｌ（Ｄ）－ＮＩＢＣ）及びＮ－アセチル－Ｌ（Ｄ）－システイン（Ｌ（Ｄ）－ＮＡＣ）を含むその他のリガンドで修飾され、そして修飾されたＣｕＮＣｓも、同じプロトコルで研究された。異なるリガンドで修飾したＣｕＮＣｓについても同様の現象が観察され、これらのリガンド自体は、α－ｓｙｎ凝集及びフィブリル化に影響を与えず、一方、リガンドで修飾したＣｕＮＣｓは、α－ｓｙｎ凝集及びフィブリル化を完全に阻害することができるという同じ結論に至った。

【0140】

（１３）ＭＰＰ^＋誘導のＰＤ細胞（ＳＨ－ｓｙ５ｙ）モデル試験

【0141】

実験は、ＣＣＫ－８法の試験結果から得られた細胞生存率を指標として使用して、ＰＤのＳＨ－ｓｙ５ｙ細胞モデルにおけるＭＰＰ^＋（一般的に使用された神経毒）の毒性効果に対するリガンドで修飾したＣｕＮＣｓの耐性効果を反映して、ＰＤ特異的方法に対するそれらの神経保護効果を実証した。具体的な方法は以下のとおりである。

【0142】

１）対数増殖期においてＳＨ－ｓｙ５ｙ細胞を摂取した。完全培地で希釈して、５×１０^４／ｍＬの細胞密度を有する細胞懸濁液を形成した。プレート２００μＬの細胞懸濁液を９６ウェルプレートの各ウェルに入れ、インキュベータ中で３７℃、５％ＣＯ_２の環境で培養した。細胞を付着させた後に試料を添加した。

【0143】

２）最終濃度を０．１ｐｐｍ、１ｐｐｍ、５ｐｐｍ、１０ｐｐｍ及び２０ｐｐｍとするように、維持培地で製造された、異なる粒径を有するリガンドで修飾したＣｕＮＣｓ試料又はリガンドで修飾した銅ナノ粒子試料１００μＬを添加した。リガンドで修飾したＣｕＮＣｓで２時間前処理した後、異なる細胞群にＭＰＰ^＋（最終濃度１ｍＭ）を添加した。これにより、ＳＨ－ｓｙ５ｙ細胞を含有しない空白対照群、ＳＨ－ｓｙ５ｙ細胞を含有するがＣｕＮＣｓ及びＭＰＰ^＋を含まない陰性対照群、ＳＨ－ｓｙ５ｙ細胞及び１ｍＭ ＭＰＰ^＋のみを含有する細胞対照群、ＳＨ－ｓｙ５ｙ細胞及び１００ｐｐｍのＣｕＮＣｓを含有するがＭＰＰ^＋を含まない試料対照群、及びＳＨ－ｓｙ５ｙ細胞と１ｍＭ ＭＰＰ^＋と対応するリガンド分子（最終濃度２０ｐｐｍ）とを含有するリガンド対照群を設置した。次いで、細胞を３７℃で２４時間培養した。培養培地を除去するために遠心分離した後、１０％ＣＣＫ－８を含む１００μＬの維持培地を各ウェルに添加し、次いで４時間インキュベートした後、各ウェルの吸光度を４５０ｎｍで測定した。吸光度は、ＭＰＰ^＋病変に対するリガンドで修飾したＣｕＮＣｓの事前保護及び治療効果を反映することができる。

【0144】

図１４を参照すると、ＭＰＰ^＋病変ＰＤ細胞（ＳＨ－ｓｙ５ｙ）モデルの細胞生存率に対するＣｕＮＣｓの影響を示す直方図を提供した。結果によれば、２４時間の培養後、１００ｐｐｍのＣｕＮＣｓを添加したが、ＭＰＰ^＋で処理されなかった試料対照群の細胞生存率は、空白対照群（１００％として設定）に対して１１０．０±６．２％に増加し（Ｐ＜０．０１）、ＣｕＮＣｓが非毒性であることを示唆している。１ｍＭ ＭＰＰ^＋を添加したが、ＣｕＮＣｓがないモデル対照群の細胞生存率は、５８．９±５．４％まで低下し（Ｐ＜０．０１、空白対照群に対して）、リガンド対照群の細胞生存率は５６．９±３．４％であり（Ｐ＜０．０１、空白対照群に対して）、リガンド自体がＭＰＰ^＋病変細胞の生存率を上昇させないことを示唆している。０．１ｐｐｍ、１ｐｐｍ、５ｐｐｍ、１０ｐｐｍ及び２０ｐｐｍのＣｕＮＣｓを添加した投与群の細胞生存率は７０．９±７．１％（Ｐ＜０．００１、モデル対照群に対して）、８９．３±４．１％（Ｐ＜０．００１、モデル対照群に対して）、９０．５±６．１％（Ｐ＜０．００１、モデル対照群に対して）、９２．８±４．８％（Ｐ＜０．００１、モデル対照群に対して）、８８．５±１．４％（Ｐ＜０．００１、モデル対照群に対して）に上昇した。この結果は、本発明により提供されるリガンドで修飾したＣｕＮＣｓが、ＰＤの神経細胞に対して著しい保護効果を有し、この効果は、リガンドでなくＣｕＮＣｓによるものであることを示唆している。

【0145】

Ｌ（Ｄ）－システイン、Ｎ－イソブタノイル－Ｌ（Ｄ）－システイン（Ｌ（Ｄ）－ＮＩＢＣ）及びＮ－アセチル－Ｌ（Ｄ）－システイン（Ｌ（Ｄ）－ＮＡＣ）等のその他のリガンドで修飾したＣｕＮＣｓについても、同じ工程を採用して実験を実施した。これらの効果は同様であり、詳細な説明を省略する。

【0146】

（１４）ＣｕＮＣｓの同定

【0147】

一つ又は複数のリガンドで修飾したＣｕＮＣｓを合成した。前記リガンドは、チミン、Ｌ（Ｄ）－システイン、及びＮ－イソブタノイル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＩＢＣ）、Ｎ－イソブタノイル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＩＢＣ）、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン及びＮ－アセチル－Ｄ－システイン等のその他のシステイン誘導体、システイン含有オリゴペプチド及びそれらの誘導体（Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニンジペプチド（ＣＲ）、Ｌ－アルギニン－Ｌ－システインジペプチド（ＲＣ）、Ｌ－システインＬ－ヒスチジン（ＣＨ）、グリシン－Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニントリペプチド（ＧＣＲ）、Ｌ－プロリン－Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニントリペプチド（ＰＣＲ）、Ｌ－グルタチオン（ＧＳＨ）、グリシン－Ｌ－セリン－Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニンテトラペプチド（ＧＳＣＲ）及びグリシン－Ｌ－システイン－Ｌ－セリン－Ｌ－アルギニンテトラペプチド（ＧＣＳＲ）等のジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、及びその他のシステイン含有ペプチドを含むが、これらに限定されない。）、及び１－[（２Ｓ）－２－メチル－３－チオール－１－オキソプロピル]－Ｌ－プロリン、チオグリコール酸、メルカプトエタノール、チオフェノール、Ｄ－３－Ｔｒｏｌｏｖｏｌ及びドデシルメルカプタンのうち一つ又は複数等のその他のチオール含有化合物を含む。

【0148】

以下に、ＧＳＨで修飾したＣｕＮＣｓの特徴データを例として示す。

【0149】

１）透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）による形態の観察

【0150】

試験粉末（ＧＳＨで修飾したＣｕＮＣｓ試料）を試料として、超純水に２ｍｇ／Ｌになるように溶解し、次いで、懸濁液滴法により試験試料を製造した。具体的な方法は、以下のとおりである。即ち、５μＬの試料を銅メッシュ上に滴下し、水が消失するまで自然に揮発させ、次いでＪＥＭ－２１００Ｆ ＳＴＥＭ／ＥＤＳ電界放出高分解能ＴＥＭにより試料の形態を観察した。

【0151】

図（１５）のパネルＡ及びパネルＢは、ＧＳＨで修飾したＣｕＮＣｓの典型的なＳＥＭ画像を示し、異なるＴＥＭ画像からそれらのサイズ分布を計算した。その結果、ＣｕＮＣｓが十分に分散され、それらのサイズが０．５－５．０ｎｍの範囲にあることを示した。

【0152】

２）Ｘ線光電子分光法

【0153】

Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）スペクトルを、ＥＳＣＡＬＡＢ ２５０Ｘｉ Ｘ線光電子分光計で測定した。両面導電性接着剤（３ｍｍ×３ｍｍ）をアルミニウム箔に付着させ、試験粉末を両面テープ上に均一に広げ、アルミニウム箔の層で被覆した。試料を８ＭＰａの圧力下で１分間保持した。表面上の残留粉末を除去し、次いで中心試料（１ｍｍ×１ｍｍ）をＸＰＳ試験のために切り出した。

【0154】

図１５のパネルＣは、ＣｕＮＣｓ中のＣｕ元素のＸＰＳスペクトルである。２つのピークは、それぞれ、９３１．９８及び９５１．８８ｅＶに現れ、Ｃｕの２ｐ_３／２及び２ｐ_１／２電子の結合エネルギーによるものである。９４２．０ｅＶ付近のＣｕ２ｐ_３／２サテライトピークの不在により、Ｃｕ（ＩＩ）電子が存在しないことが確認された。Ｃｕ（０）の結合エネルギーはＣｕ（Ｉ）のそれから０．１ｅＶだけ離れたため、Ｃｕ（Ｉ）の形成を排除することは不可能であり、得られたＧＳＨで修飾したＣｕＮＣｓ中のＣｕの原子価状態は、０から＋１の間にある可能性が最も高かった。

【0155】

３）フーリエ変換赤外（ＦＴ－ＩＲ）分光法

【0156】

ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ＬＳ ５５蛍光分光計でＦＴ－ＩＲスペクトルを試験した。試験粉末を超純水に溶解し、室温で測定した。走査範囲は２００～８００ｎｍであり、試料セルは１ｃｍの光路を有する標準石英キュベットであった。

【0157】

図１５のパネルＤは、ＧＳＨで修飾したＣｕＮＣｓ（上）とＧＳＨ（下）とのＦＴ－ＩＲ分光法の比較を示す。ＧＳＨは、数多くの特徴的ＩＲバンド、即ち、ＣＯＯＨ^－（１３９０及び１５００ｃｍ^－１）、Ｎ－Ｈストレッチ（３４１０ｃｍ^－１）、及びＮＨ_２基のＮ－Ｈ曲げ（１６１０ｃｍ^－１）を示した。２５０３ｃｍ^－１で観察されたピークは、Ｓ－Ｈストレッチ振動モードによるものである。Ｓ－Ｈストレッチ振動帯（２５０３ｃｍ^－１）以外のすべての対応する特徴的ＩＲバンドは、ＧＳＨで修飾したＣｕＮＣｓに見られる。これは、Ｓ－Ｈ結合が切断されること、及び、Ｃｕ－Ｓ結合を形成することにより、ＧＳＨ分子がＣｕＮＣｓの表面に結合されることを示唆している。

【0158】

４）蛍光分光法

【0159】

試験粉末を超純水に溶解し、室温で蛍光分光法により測定した。

【0160】

図１５のパネルＥに示されるように、ＣｕＮＣｓは、３６５ｎｍでの励起ピーク下で、５９５ｎｍでピークを有する赤色発光と、約８０ｎｍの対応する半値全幅（ＦＷＨＭ）とを示す。なお、凝集誘起発光特性のため、エタノールが溶液に添加されたとき、ＣｕＮＣｓのＦＬ強度が著しく改善された。さらに、大きなストークスシフト（２３０ｎｍ）は、蛍光プローブ及びバイオイメージングのための良好な見込みを示した。

【0161】

（１５）ＣｕＮＣｓのＣＡＴ活性

【0162】

現在、ＣＡＴ活性の検出は、紫外線吸収のみにより２４０ｎｍでの過酸化水素の紫外線吸収強度が特徴づけられる。しかしながら、合成された銅クラスターは、Ｈ_２Ｏ_２プロセスを触媒した後に変化する可能性があるので、紫外線吸収は、３００ｎｍ未満で大きく増加する。従って、本実験は、ＣｕＮＣｓにより触媒されるＨ_２Ｏ_２から生成された酸素を観察することによりＣｕＮＣｓの触媒効果を確認した。本実験は、Ｈ_２Ｏ_２の分解により生成された気泡を観察し、従って、実験的現象は、Ｈ_２Ｏ_２の濃度が高いほど明らかである。実験手順は以下の通りであった。

【0163】

室温で、１０％Ｈ_２Ｏ_２溶液（４ｍｌ）を試験管に添加し、次いで２０００ｐｐｍのＣｕＮＣｓ溶液（２ｍｌ）を添加し、３分間触媒した。図１６に示すように、左側の試験管は、ＣｕＮＣｓが添加された試験管であり、管壁にＨ_２Ｏ_２の触媒分解により生成された大量のＯ_２気泡を有し、右側の試験管は、等量の超純水が添加された対照群であり、明らかな気泡を有しなかった。本実験から、ＣｕＮＣｓが優れたカタラーゼ活性を有することがわかった。

【0164】

（１６）ＣｕＮＣｓのＧＰｘ活性

【0165】

銅クラスターのＧＰｘ活性を５，５'－ジチオビス－（２－ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）発色アッセイにより研究した。ＧＰｘは、過酸化水素と還元型グルタチオン（ＧＳＨ）との反応を促進して、水及び酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）を形成する。チオール含有化合物はＤＴＮＢと反応してＤＴＮＢのジスルフィド結合を切断して、２－ニトロ－５－チオ安息香酸（ＮＴＢ^－）を生成することができ、これは中性又はアルカリ性のｐＨ条件下で水中で、イオン化して、ＮＴＢ^２－二価アニオンを形成することができる。ＮＴＢ^２－は、４１２ｎｍでの吸光度を測定することにより定量することができ、それにより、反応におけるＧＳＨの量を定量することができる。

【0166】

実験手順は以下の通りであった。

【0167】

以下の試薬を試験管に室温で順次添加した。

【0168】

（１）０．２ｍｌの一定濃度のＣｕＮＣｓ溶液（適切な量のＣｕＮＣｓをＰＢＳ緩衝液に溶解したもの）。

【0169】

（２）０．５ｍｌのＧＳＨ（１ｍＭ）（適切な量のＧＳＨ粉末をＰＢＳ緩衝液に溶解したもの）。

【0170】

（３）０．５ｍｌのＨ_２Ｏ_２溶液（１．５ｍＭ）

【0171】

（４）０．２ｍｌの１％クエン酸ナトリウムを含むＤＴＮＢ（１ｍＭ）（０．３ｇのクエン酸三ナトリウム二水和物をＰＢＳ緩衝液（３０ｍｌ）に溶解し、それにＤＴＮＢを溶解し、超音波処理を行ったもの）。

【0172】

試験管を穏やかに振盪することにより溶液を混合し、ＵＶスペクトルを検出した。

【0173】

ブランク群では、ＣｕＮＣｓ溶液を０．２ｍｌ ＰＢＳ緩衝液で置き換えた；実験群は、銅クラスターの濃度及び触媒時間を変化させることにより触媒効果を研究した。

【0174】

図１７ａは、異なる濃度の銅クラスター（３０ｐｐｍ、６０ｐｐｍ、９０ｐｐｍ、１２０ｐｐｍ、１５０ｐｐｍ）について室温で５分間触媒することにより得られた実験結果を示す。４１２ｎｍでのＵＶ吸収が触媒濃度の増加に従って著しく減少することが見出され、システム中のＧＳＨが触媒濃度の増加と共に減少したことがわかった。これからも、触媒の増加と伴い、より多くのＨ_２Ｏ_２がＧＳＨを酸化させたことを意味する。

【0175】

その後の実験の結果を観察するために、反応時間を延長した。図１７ｂは、１３分間の触媒作用後の結果を示す。銅クラスター濃度が３０ｐｐｍ及び６０ｐｐｍであると、紫外線吸収が減少し続け、触媒反応が継続していることを示し、一方、銅ナノクラスター濃度が９０ｐｐｍ以上である場合には、反応はほとんど停止し、ＧＳＨがほとんど完全に触媒されたことを示した。従って、９０ｐｐｍを選択して連続モニタリングを行った。

【0176】

図１７ｃに示すように、触媒反応が開始時に遅く、触媒速度は反応が進行するにつれて徐々に増加し、触媒反応は１１～１３分間でほとんど完了した。

【0177】

（１７）ＣｕＮＣｓのＳＯＤ活性

【0178】

ＳＯＤ活性アッセイは、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）アッセイキット（Ｎａｎｊｉｎｇ Ｊｉａｎｃｈｅｎｇ Ｂｉｏ）を用いて測定した。要するに、レンゲオキシダーゼ及びキサンチンオキシダーゼを反応させてスーパーオキシドを生成し、さらにＷＳＴ－１（２－（４－ヨードフェニル）－３－（４－ニトロフェニル）－５－（２，４－ジフェニル）－２Ｈ－テトラゾリウム）を還元し、生成したホルマザンを４４０ｎｍの紫外スペクトルにおいて検出する。４４０ｎｍでの紫外線吸収の減少を観察するために、銅クラスターを添加することによりＳＯＤ活性を判定した。

【0179】

基質作用溶液の調製：基質原液：緩衝溶液を１：２００の比率で混合して、現在使用される基質作用溶液を調製した。

【0180】

酵素作用溶液の調製：酵素原液：酵素希釈溶液を１：１０の比率で混合して、現在使用される酵素作用溶液を調製した。

【0181】

実験群は以下のように設定した。

【0182】

上記の設定によれば、９６ウェルプレート中のウェルに、（１）基質作用溶液、（２）酵素希釈溶液、（３）被験試料又は蒸留水、及び（（４）酵素作用溶液を順次に添加した。混合されたウェルをマイクロプレートリーダーで３７℃でインキュベートし、４５０ｎｍでＵＶ吸光度を読み取った。

【0183】

図１８ａは、異なる濃度のＣｕＮＣｓを用いて６０分間のインキュベーションの間、４５ｎｍでのＵＶ吸光度を示す。図１８ａに示すように、ＣｕＮＣｓの濃度が増加したと伴い、インキュベーションの間にＵＶ吸収値が徐々に減少し、ＣｕＮＣｓの各用量に対するＵＶ吸収値は３０分後に平坦化された。これから、ＣｕＮＣｓが優れたＳＯＤ活性を有し、そのＳＯＤ活性がＣｕＮＣｓの濃度の増加と伴い増加したことがわかった。上記の結果から、２０分間のインキュベーション時間でのＵＶ吸収値を選択してＳＯＤ阻害率を計算した。図１８ｂに示すように、６０ｐｐｍ、９０ｐｐｍ、１２０ｐｐｍ、１５０ｐｐｍ、及び１８０ｐｐｍでＣｕＮＣｓのＳＯＤ阻害率は、それぞれ、１６．９％、２３．２％、３３．７％、４４．８％、及び５５．２％であった。ＳＯＤ活性は、ＳＯＤ阻害率が反応系において５０％に達する際にＳＯＤ活性単位に対応する酵素の量を意味する。従って、例えば、１５０ｐｐｍのＣｕＮＣｓは、１０．２４Ｕ／ｍｇのＳＯＤ活性を有する。

【0184】

実験結果から、合成されたＧＳＨ－ＣｕＮＣｓが、カタラーゼ（ＣＡＴ）、グルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰｘ）及びスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）という異なる構造及び機能を有する３つの主要抗酸化酵素の酵素活性を有することがわかった。

【0185】

（１８）Ｈ_２Ｏ_２誘発緑内障細胞（ＲＧＣ－５）モデル

【0186】

この実施形態では、細胞生存率を指標として用いて、Ｈ_２Ｏ_２により誘導される細胞毒性についてリガンドで修飾した銅ナノクラスター（ＣｕＮＣｓ）の効果を試験した。ｃｃｋ－８アッセイの結果は、ＣｕＮＣｓが網膜神経節細胞（ＲＧＣ）における酸化ストレス誘導損傷に対する神経保護効果を有することを示した。

【0187】

対数増殖期のＲＧＣ－５細胞を完全培地（ＤＭＥＭ培地＋１０％ＦＢＳ＋１％ペニシリン－ストレプトマイシン）で５×１０^４／ｍｌの密度の細胞懸濁液に希釈し、９６ウェルプレート中１００μＬ／ウェルで接種した。細胞を５％ＣＯ_２インキュベーター中で３７℃で培養した。細胞を付着させた後、元の培養液を廃棄し、維持培地（ＤＭＥＭ培地＋２％ＦＢＳ＋１％ペニシリン－ストレプトマイシン）から調製した５０μｌの異なる濃度のＣｕＮＣｓをそれぞれのウェルに加えた。最終濃度は、それぞれ、０．５、５及び２０ｐｐｍであった（即ち、それぞれ、図１９中の５、６、７）。２時間前処理後、約５０μｌのＨ_２Ｏ_２（最終濃度１０５μＭ）を加えた。細胞を２４時間インキュベートし、１０％ＣＣＫ－８を各ウェルに加え、各ウェルの吸光度値を４５０ｎｍの波長で測定し、Ｈ_２Ｏ_２誘発損傷に対するＣｕＮＣｓの保護効果を評価した。上記実験では、細胞を処理しなかったブランク対照群、１０５μＭのＨ_２Ｏ_２で細胞を処理したモデル対照群、１００ｐｐｍのＣｕＮＣｓを添加したがＨ_２Ｏ_２を添加しなかったＣｕＮＣｓ対照群、及び２０ｐｐｍのリガンドと１０５μＭのＨ_２Ｏ_２を添加した配位子対照群（即ち、それぞれ、図１９中の１、２、３、４）を提供した。

【0188】

図１９に示すように、ＧＳＨで修飾したＣｕＮＣｓの実験結果を例として挙げる。その結果は、２４時間の培養後に、１００ｐｐｍのＣｕＮＣを補充したが、Ｈ_２Ｏ_２で処理されなかった銅クラスター対照群（即ち、群２）の細胞生存率は、ブランク対照群（即ち、群１）（１００％）に対して１０３．２±７．０％であり（Ｐ＞０．０５）、ＣｕＮＣが非毒性であったことがわかった。１００μＭ Ｈ_２Ｏ_２を添加したが、ＣｕＮＣを添加しなかったモデル対照群（即ち、群３）の細胞生存率は、ブランク対照群の５８．０±６．２％まで低下した（Ｐ＜０．００５）。２０ｐｐｍのＧＳＨ及び１００μｍのＨ_２Ｏ_２を添加したリガンド対照群（即ち、群４）の細胞生存率は、ブランク対照群の５６．５±５．９％であり（ブランク対照群との比較する場合Ｐ＜０．０１、モデル対照群と比較する場合Ｐ＞０．０５）、単独で使用したときに、リガンドが、Ｈ_２Ｏ_２誘発損傷細胞モデルにおける細胞生存率を増加させないことがわかった。０．５ｐｐｍ （即ち、群５）、５ｐｐｍ （即ち、群６）及び２０ｐｐｍ （即ち、群７）ＣｕＮＣｓでの投与群の細胞生存率は、６５．９±４．５％（モデル対照群と比較する場合ｐ＜０．０５）、８７．１±７．４％（モデル対照群と比較する場合ｐ＜０．０１）、及び９１．２±５．７％（モデル対照群と比較する場合ｐ＜０．０１）に増加した。

【0189】

上記の結果によれば、本発明のＣｕＮＣｓが、Ｈ_２Ｏ_２誘発損傷ＲＧＣ細胞モデルにおける細胞生存率を有意に改善することができ、酸化ストレスにより誘導されるＲＧＣ細胞のアポトーシスに抵抗することができる一方、ＧＳＨが、酸化ストレスにより誘導されるＲＧＣ細胞のアポトーシスに明らかな影響を及ばないことがわかった。

【0190】

他のリガンドで修飾したＣｕＮＣｓも同様の工程の後に試験されており、同様の効果を有するため、ここで説明を省略する。

【0191】

（１９）多発性硬化症（ＭＳ）マウスモデル

【0192】

実験的自己免疫性脳炎（ＥＡＥ）は、主としてＣＤ４^＋ Ｔ細胞によって媒介されるＭＳに対応する古典的な動物モデルである。抗原増感されたＣＤ４^＋ Ｔ細胞が血液脳関門を横切って中枢神経系に入ると、それらは自己のミエリン抗原に対する免疫応答を誘発し、脳及び脊髄に免疫損傷をもたらす。ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）は、ミエリン膜及びオリゴデンドロサイトの最外層に存在するため、高免疫原性であり、抗ＭＯＧ抗体がＭＳの病因において重要な役割を果たしているという証拠がある。そのため、ＭＯＧ ３５－５５を持つＣ５７ＢＬ／６マウスを免疫することによってＥＡＥモデルを誘導した。

【0193】

（１）材料

【0194】

１０週齢の１８匹の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｗｕｈａｎ Ｗａｎｑｉａｎ Ｊｉａｘｉｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入した）、Ｈｏｏｋｅ ｋｉｔ^ＴＭ ＭＯＧ３５－５５／ＣＦＡ Ｅｍｕｌｓｉｏｎ ＰＴＸ Ｋｉｔ （Ｃａｔ．Ｎｏ．ＥＫ－２１１０）（Ｈｏｏｋｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ （ＵＳＡ）から購入した）。

【0195】

（２）ＥＡＥモデル確立

【0196】

ａ．マウスを、異なる身体部位（Ｈｏｏｋｅ ｋｉｔ^ＴＭ ＭＯＧ３５－５５／ＣＦＡ Ｅｍｕｌｓｉｏｎ ＰＴＸ ｋｉｔ）で、１部位あたり０．１ｍｌ、各マウスについて０．２ｍｌ、２回抗原乳化剤を皮下注射した。

【0197】

ｂ．２時間後、ＰＴＸ毒素（Ｈｏｏｋｅ ｋｉｔ^ＴＭ ＭＯＧ３５－５５／ＣＦＡ Ｅｍｕｌｓｉｏｎ ＰＴＸ ｋｉｔ）を最初に注射した。各マウスに０．１ｍｌのＰＴＸ毒素を腹腔内注射した。

【0198】

ｃ．２４時間後、各マウスにＰＴＸ毒素を１回繰り返し注入した。

【0199】

ＰＴＸ毒素（キット中のＰＴＸを２００ｎｇ／μｌの濃度でグリセロールに溶解し、使用したときにＰＢＳ溶液に溶解し、各時間で新たに調製し、分注後２時間以内に使用した）は、以下の通り調製された。

【0200】

１）まず、実験で使用したマウスの数に基づいて注射に必要なＰＢＳ溶液の体積を計算した。一般に、０．１２ｍｌのＰＢＳ溶液を必要とすると仮定した。次いで、必要なＰＢＳ溶液を５０ｍｌの試験管に加えた

【0201】

２）次いで、必要な用量のＰＴＸ毒素を計算した。典型的には、各マウスの注射ごとに８０ｎｇのＰＴＸが必要である。必要なＰＴＸの総量は、実験で使用されたマウスの数に基づいて計算された。

【0202】

ＰＴＸ（ｕｌ）=マウス＊ＰＴＸ用量＊１．２／２００ｎｇ／ｕｌ （キット中のＰＴＸ濃度）

【0203】

３）次いで、ＰＴＸを、溶解のためにＰＢＳを含有する５０ｍｌの管に入れた。

【0204】

（３）実験

【0205】

１８匹のＣ５７ＢＬ／６マウスをランダムに３つの群（ｎ＝６）：ＰＴＸのみを投与するモデル対照群、ＰＴＸ及びＣｕＮＣｓを同時に投与する治療群、及び正常対照群、各群６匹のラットに無作為に分けた。治療群については、銅クラスター薬物を、モデリングの開始日に尾静脈を注射することにより１日に３０ｐｐｍの用量で投与した。正常対照群について、正常のマウスに、１日当たりの銅クラスター溶液と同じ体積の生理食塩水を注射した。

【0206】

マウスを毎日観察し、神経学的機能を評価した。スコアリング基準は、０点、後肢の延長、尾の延長、正常の歩容；１点、後肢の延長、尾部の張力消失、正常の歩容；１．５点、尾の垂下、後肢の動きが異常であり；２点、両後足の動きが弱く、マウスの歩容は調整されず、尾部は垂下している；２．５点、尾部は垂下し、後肢はドラッグされる；３点、二重後肢麻痺、尾垂下；４点、二重後肢麻痺、前肢麻痺、または筋肉の弱さ、尾の垂下；５点、動きなし、接触に応答しない、呼吸の変化、突然死又は死。

【0207】

（４）結果

【0208】

図２０は、ＥＡＥによってモデル化された多発性硬化症マウスモデルの運動挙動に対するＧＳＨ修飾銅クラスター（ＣｕＮＣｓ）の効果を示すグラフである。図２０に示すように、モデル対照群は、１０日目に明らかな運動障害を示し始め、１３日目から１４日目の下肢に痰が現れ始めたことに対して、正常対照群は、実験終了時の運動能力の有意な変化を示さなかったが。これは、モデルが成功したことを示した。治療群は、１４日目の尾のわずかなたるみの症状を示したが、実験の終わりまで及び正常マウスに対して有意な差を示さなかった。ＣｕＮＣｓ薬剤は、ＥＡＥマウスモデルの運動挙動に有意な保護効果を有し、多発性硬化症の予防及び治療に使用することができることを示した。

【0209】

Ｌ（Ｄ）－システイン、Ｎ－イソブタノイル－Ｌ（Ｄ）－システイン（Ｌ （Ｄ）－ＮＩＢＣ）及びＮ－アセチル－Ｌ（Ｄ）－システイン（Ｌ（Ｄ）－ＮＡＣ）等の他のリガンドで修飾したＣｕＮＣｓも、同じ手順で試験した。これらの効果は同様であるので、ここでは詳細には説明しない。

【0210】

本発明を特定の実施形態を参照して説明してきたが、実施形態は例示的なものであり、本発明の範囲はそれに限定されないことが理解されるべきである。本発明に係る分野の当業者にとって、本発明の他の実施形態は自明である。このような代替実施形態は、いずれも本発明の範囲内に包含されると考えられる。したがって、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲により定義され、前記の説明によりサポートされる。

【図1-1】

【図1-2】

【図1-3】

【図2】

【図3】

【図4-1】

【図4-2】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15-1】

【図15-2】

【図16】

【図17-1】

【図17-2】

【図18】

【図19】

【図20】

【手続補正書】

【提出日】2021-09-15

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

多発性硬化症を治療するための組成物であって、前記組成物は、銅ナノクラスターを含み、前記銅ナノクラスターがリガンドを含む、組成物。

【請求項2】

前記リガンドで修飾した銅ナノクラスターは、直径の範囲が０．５～３ｎｍである、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

前記リガンドで修飾した銅ナノクラスターは、直径の範囲が０．５～２．５ｎｍである、請求項１に記載の組成物。

【請求項4】

前記リガンドは、チミン、チミンで修飾したヒアルロン酸、Ｌ－システイン及びその誘導体、Ｄ－システイン及びその誘導体、システイン含有オリゴペプチド及びそれらの誘導体、及びその他のチオール含有化合物からなる群より選ばれる一つである、請求項１に記載の組成物。

【請求項5】

前記Ｌ－システイン及びその誘導体が、Ｌ－システイン、Ｎ－イソブタノイル－Ｌ－システイン、及びＮ－アセチル－Ｌ－システインからなる群より選ばれ、かつ、前記Ｄ－システイン及びその誘導体が、Ｄ－システイン、Ｎ－イソブタノイル－Ｄ－システイン、及びＮ－アセチル－Ｄ－システインからなる群より選ばれる、請求項４に記載の組成物。

【請求項6】

前記システイン含有オリゴペプチド及びそれらの誘導体が、システイン含有ジペプチド、システイン含有トリペプチド又はシステイン含有テトラペプチドである、請求項４に記載の組成物。

【請求項7】

前記システイン含有ジペプチドが、Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニンジペプチド、Ｌ－アルギニン－Ｌ－システインジペプチド、Ｌ－ヒスチジン－Ｌ－システインジペプチド、及びＬ－システイン－Ｌ－ヒスチジンジペプチドからなる群より選ばれる、請求項６に記載の組成物。

【請求項8】

前記システイン含有トリペプチドが、グリシン－Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニントリペプチド、Ｌ－プロリン－Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニントリペプチド、Ｌ－リジン－Ｌ－システイン－Ｌ－プロリントリペプチド、及びＬ－グルタチオンからなる群より選ばれる、請求項６に記載の組成物。

【請求項9】

前記システイン含有テトラペプチドが、グリシン－Ｌ－セリン－Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニンテトラペプチド、及びグリシン－Ｌ－システイン－Ｌ－セリン－Ｌ－アルギニンテトラペプチドからなる群より選ばれる、請求項６に記載の組成物。

【請求項10】

前記その他のチオール含有化合物が、１－［（２Ｓ）－２－メチル－３－チオール－１－オキソプロピル］－Ｌ－プロリン、チオグリコール酸、メルカプトエタノール、チオフェノール、Ｄ-ペニシラミン、Ｎ－（２－メルカプトプロピオニル）－グリシン、及びドデシルメルカプタンからなる群より選ばれる、請求項４に記載の組成物。

【手続補正2】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、銅ナノクラスター（ＣｕＮＣｓ）、ＣｕＮＣｓを含む組成物、及びそれらの多発性硬化症の治療における応用に関する。

【背景技術】

【0002】

多発性硬化症（ＭＳ）は、炎症過程及び脱髄を特徴とする中枢神経系（ＣＮＳ）の多因子疾患である。ＭＳは、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）、及び／又はミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）に対する自己免疫疾患である。疾患の病因はまだ十分に理解されていない。酸化ストレス（ＯＳ）が多発性硬化症（ＭＳ）の病因において主要な役割を果たすことを示唆する証拠が増えてきている。生成すると酸化ストレスに過剰に導く活性酸素種（ＲＯＳ）は、ＭＳ及びその動物モデルの両方における脱髄及び軸索損傷のメディエーターとして考えられる。急性期では、ＯＳが炎症過程を開始させ、慢性期ではＯＳが神経変性を維持する。ＭＳにおける酸化還元プロセスは、ミトコンドリア機能不全、軸索バイオエネルギーの調節不全、脳内の鉄蓄積、酸化剤／抗酸化剤バランスの損傷、及びＯＳメモリと関連する。ＭＳの各段階において、ＯＳは、疾患の病因における重要な要素である。再発の際に、これらの全てのプロセスが増強され、数年にわたるニューロンの損失につながる（Ａｄａｍｃｚｙｋ ２０１６；Ｏｈｌ ２０１６）。

【0003】

現在の治療は、炎症の減少に焦点を合わせるが、神経変性の予防に注目されるのは一部の研究しかない。疾患の経過は、抗酸化物質と抗酸化経路に影響を与える物質との使用により影響を受け、抗酸化経路は、重症度を軽減し、より速い寛解と神経炎症及び神経変性のより目立たない経過を引き起こす。抗酸化物質は、フリーラジカルから体を保護する物質である。抗酸化剤は、酵素的又は非酵素的であってもよい。酵素の中で最も重要なものには、カタラーゼ（ＣＡＴ）、グルタヒオンペルオキシダーゼ（ＧＰｘ）、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）が含まれます（Ａｄａｍｃｚｙｋ ０１６）。

【0004】

銅ナノクラスタ（ＣｕＮＣｓ）は、銅原子と銅ナノ結晶との間にある物質であり、表面上の安定化配位子を有する数～数十の銅原子から構成される（Ｙａｏ２０１８）。ＣｕＮＣｓは、それらの固有のサイズ依存的光学特性及び電子特性のためにかなりの注目を集めており、従って、ナノ粒子触媒、バイオセンサー、細胞標識、及び光電子ナノデバイスのような幅広い用途に大きな見込みを示す（Ｊｉｎ、２０１６；Ｌｉｕ、２０１８）。出願人が知っている限り、神経変性疾患の治療にＣｕＮＣｓを適用することに関する報告がない。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】Adamczyk B, Adamczyk-Sowa M. New Insights into the Role of Oxidative Stress Mechanisms in the Pathophysiology and Treatment of Multiple Sclerosis. Oxid Med Cell Longev. 2016:1973834. Epub 2016 Oct 18.

【非特許文献2】Jin R, et al. Atomically Precise Colloidal Metal Nanoclusters and Nanoparticles: Fundamentals and Opportunities, Chem. Rev., 2016, 116, 10346-10413

【非特許文献3】Kim GH, et al. The Role of Oxidative Stress in Neurodegenerative Diseases, Exp Neurobiol. 2015, 24(4): 325-340

【非特許文献4】Liu X, et al. Atomically Precise Copper Nanoclusters and Their Applications, Coord. Chem. Rev., 2018, 359, 112-126

【非特許文献5】Ohl K, Tenbrock K, Kipp M. Oxidative stress in multiple sclerosis: Central and peripheral mode of action. Exp Neurol. 2016; 277:58-67.

【非特許文献6】Yao Q, et al. Toward Total Synthesis of Thiolate-Protected Metal Nanoclusters, Acc. Chem. Res.; 2018; 51; 1338-1348

【発明の概要】

【0006】

本発明は、多発性硬化症を治療するための医薬組成物であって、前記医薬組成物は、銅ナノクラスター（ＣｕＮＣｓ）を含み、前記ＣｕＮＣｓがリガンドを含む、医薬組成物を提供する。

【0007】

前記医薬組成物の特定の実施形態では、前記リガンドで修飾したＣｕＮＣｓは、直径の範囲が０．５～３ｎｍである。

【0008】

前記医薬組成物の特定の実施形態では、前記リガンドで修飾したＣｕＮＣｓは、直径の範囲が０．５～２．５ｎｍである。

【0009】

前記医薬組成物の特定の実施形態では、前記リガンドは、チミン、チミンで修飾したヒアルロン酸（ＴＭＨＡ）、Ｌ－システイン及びその誘導体、Ｄ－システイン及びその誘導体、システイン含有オリゴペプチド及びそれらの誘導体、及びその他のチオール含有化合物からなる群より選ばれる一つである。

【0010】

前記医薬組成物の特定の実施形態では、前記Ｌ－システイン及びその誘導体が、Ｌ－システイン、Ｎ－イソブタノイル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＩＢＣ）、及びＮ－アセチル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＡＣ）からなる群より選ばれ、前記Ｄ－システイン及びその誘導体が、Ｄ－システイン、Ｎ－イソブタノイル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＩＢＣ）、及びＮ－アセチル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＡＣ）からなる群より選ばれる。

【0011】

前記医薬組成物の特定の実施形態では、前記システイン含有オリゴペプチド及びそれらの誘導体は、システイン含有ジペプチド、システイン含有トリペプチド又はシステイン含有テトラペプチドである。

【0012】

前記医薬組成物の特定の実施形態では、前記システイン含有ジペプチドが、Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニンジペプチド（ＣＲ）、Ｌ－アルギニン－Ｌ－システインジペプチド（ＲＣ）、Ｌ－ヒスチジン－Ｌ－システインジペプチド（ＨＣ）、及びＬ－システイン－Ｌ－ヒスチジンジペプチド（ＣＨ）からなる群より選ばれる。

【0013】

前記医薬組成物の特定の実施形態では、前記システイン含有トリペプチドが、グリシン－Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニントリペプチド（ＧＣＲ）、Ｌ－プロリン－Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニントリペプチド（ＰＣＲ）、Ｌ－リジン－Ｌ－システイン－Ｌ－プロリントリペプチド（ＫＣＰ）、及びＬ－グルタチオン（ＧＳＨ）からなる群より選ばれる。

【0014】

前記医薬組成物の特定の実施形態では、前記システイン含有テトラペプチドが、グリシン－Ｌ－セリン－Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニンテトラペプチド（ＧＳＣＲ）、及びグリシン－Ｌ－システイン－Ｌ－セリン－Ｌ－アルギニンテトラペプチド（ＧＣＳＲ）からなる群より選ばれる。

【0015】

前記医薬組成物の特定の実施形態では、前記その他のチオール含有化合物が、１－［（２Ｓ）－２－メチル－３－チオール－１－オキソプロピル］－Ｌ－プロリン、チオグリコール酸、メルカプトエタノール、チオフェノール、Ｄ-ペニシラミン、Ｎ－（２－メルカプトプロピオニル）－グリシン、及びドデシルメルカプタンからなる群より選ばれる。

【0016】

本発明の目的及び利点は、添付の図面と関連して、以下の好ましい実施形態の詳細な説明から明らかになる。

【図面の簡単な説明】

【0017】

以下、図面を参照して本発明の好適な実施の形態を説明するが、同様の符号は同様の要素を示す。

【0018】

【図1】図１（ａ）（ｉ）は、式１で示されるＴＭＨＡの構造を示す。図１（ａ）（ｉｉ）は、ＴＭＨＡの合成を説明する。そして、図１（ａ）（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）は、それぞれ、ＨＡ及びＴＭＨＡの典型的な外見を示す。図１（ｂ）は、それぞれ、ＴＭＨＡ（赤線）及び純粋なＨＡ（青線）のＵＶ－ｖｉｓスペクトルを示す。図１（ｃ）は、ＨＡ及びＴＭＨＡのＦＴ－ＩＲを示す。そして、図１（ｄ）は、ＨＡ及びＴＭＨＡの^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。

【0019】

【図2】図２は、得られたＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓの蛍光強度に対する（ａ）Ｃｕ^２＋とＴＭＨＡとのモル比、（ｂ）反応ｐＨ値、（ｃ）反応温度、及び（ｄ）反応時間の影響を示すグラフを提供する。

【0020】

【図3】図３は、得られたＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓの蛍光強度に対する（ａ）ＮａＣｌ濃度（０～１Ｍ）、（ｂ）共有カチオン及びアニオン、（ｃ）ｐＨ値（４～１０）、及び（ｄ）重合時間（０～５週間）の影響を示すグラフを提供する。

【0021】

【図4】図４は、チミンの置換度（ＤＳ）が異なるＴＭＨＡにより製造されたＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓを示す写真及びグラフを提供する。図４（ａ）及び（ｄ）は、それぞれ、チミンのＤＳが３．２％であるＴＭＨＡで製造されたＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓのＴＥＭ又はＡＦＭ画像を示す。図４（ｂ）及び（ｅ）は、チミンのＤＳが１０．５％であるＴＭＨＡで製造されたＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓのＴＥＭ又はＡＦＭ画像を示す。図４（ｃ）及び（ｆ）は、チミンのＤＳが２０．１％であるＴＭＨＡで製造されたＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓのＴＥＭ又はＡＦＭ画像を示す。図４（ｇ）及び（ｈ）は、それぞれ、ＴＭＨＡ又はＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓのＭＳスペクトルを示す。そして、図４（ｉ）及び（ｊ）は、（ｉ）ＣｕＮＣｓの全領域及び（ｊ）Ｃｕ ２ｐ領域のＸＰＳスペクトルを示す。図４では、挿入図（ｂ、ｇ、ｈ）は、それぞれ、ＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓ ナノワイヤー、イオン化断片及びＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓの模式図であり、（ｅ、ｆ）は、単離されたナノワイヤーからなるＣｕＮＣｓである。

【0022】

【図5】図５は、ＧＳＨリガンドを有するＣｕＮＣｓの熱重量分析を示すグラフである。

【0023】

【図6】図６は、それぞれ、チミンのＤＳが３．２％、１０．５％、及び２０．１％であるものを使用して得られたＣｕＮＣｓの励起（λ_ｅｍ＝６１３ｎｍで測定される。）スペクトルを示すグラフである。

【0024】

【図7】図７は、（ａ）異なるチミンのＤＳでのＰＬスペクトル（左）及び減衰プロファイル（右）、挿入図：３６５ｎｍ励起での画像；（ｂ）Ｃｕ^２＋含有量に対するＴＭＨＡプローブのＰＬ応答；（ｃ）様々な金属に対するＣｕ^２＋についてのＴＭＨＡプローブのＰＬ及び色改変（挿入図）、を示すグラフを提供する。

【0025】

【図8】図８は、（ａ）ＣｕＮＣｓと反応するＨ_２Ｏ_２のＵＶ吸収、（ｂ）ＣｕＮＣｓ及び様々な対照物のＧＰｘ様活性の初期速度、（ｃ）ＣｕＮＣｓ ＳＯＤ様活性、挿入図：Ｏ_２生成速度、（ｄ）ＣｕＮＣｓとその他の金属との触媒活性の比較、を示すグラフを提供する。

【0026】

【図9】図９は、ＰＤの早期診断のための尿液Ｃｕ^２＋の検出を示すグラフを提供する。

【0027】

【図10】図１０（ａ）は、細胞生存率のデータを示す直方図を提供する（＊＊＊ｐ＜０．００１）。図１０（ｂ）は、ＰＩ色素により染色された、４ｍＭ ＭＰＰ^＋、２μＭ Ｃｕ^２＋及び１０μｇ・ｍｌ^－１ ＴＭＨＡで処理された死亡（赤）細胞を示す。そして、図１０（ｃ）は、カルセイン－ＡＭにより染色された、４ｍＭ ＭＰＰ^＋、１０μＭ Ｃｕ^２＋及び１０μｇ・ｍｌ^－１ ＴＭＨＡで処理された生存（緑）細胞を示す。

【0028】

【図11】図１１（ａ）は、細胞内ＲＯＳレベルのデータを示す直方図を提供する、＊＊＊ｐ＜０．００１；図１１（ｂ）は、４ｍＭのＭＰＰ^＋、１０μｇ・ｍＬ^－１ ＴＭＨＡで処理され、及び特定の蛍光プローブＤＣＦＨ－ＤＡを使用して染色された細胞における細胞内ＲＯＳ ＣＬＳＭ画像を示す。そして、図１１（ｃ）は、４ｍＭのＭＰＰ^＋、１０μｇ・ｍＬ^－１ ＴＭＨＡ、１０μＭのＣｕ^２＋で処理され、及びＤＣＦＨ－ＤＡで染色された細胞における細胞内ＲＯＳのＣＬＳＭ画像を示す。

【0029】

【図12】図１２（ａ）は、記憶障害のマウスの移動距離及び落下待ち時間を示す、＊＊＊ｐ＜０．００１。図１２（ｂ）は、高用量のＭＰＴＰ（３０ｍｇ・ｋｇ^－１）で治療された動物からのミトコンドリアを示し、赤線により示すように、ミトコンドリアは、膨潤、液胞形状及び重度なクリステ破壊を示す。そして、図１２（ｃ）は、ＭＰＴＰ（３０ｍｇ・ｋｇ^－１）＋ＴＭＨＡ（３０ｍｇ・ｋｇ^－１）で治療された動物からのミトコンドリアを示し、赤線により示すように、ミトコンドリアは、正常な形態を示す。

【0030】

【図13】図１３は、α－ｓｙｎフィブリル化動態に対するＬ－グルタチオン（ＧＳＨ）で修飾したＣｕＮＣｓ（ＧＳＨ－ＣｕＮＣｓ）の影響を示すグラフを提供する。

【0031】

【図14】図１４は、ＭＰＰ^＋病変ＰＤ細胞（ＳＨ－ｓｙ５ｙ）モデルの細胞生存率に対するＣｕＮＣｓの影響を示す直方図を提供する。

【0032】

【図15】図１５は、ＣｕＮＣｓの同定データを示す。（Ａ）は、一般的なＣｕＮＣｓの透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像である。（Ｂ）ＴＥＭ画像から計算されたＣｕＮＣｓのサイズ分布である。（Ｃ）ＣｕＮＣｓ中のＣｕ（０）の２ｐ_３／２及び２ｐ_１／２電子のＸ線光電子分光法（ＸＰＳ）スペクトルである。（Ｄ）ＧＳＨ（上）とＧＳＨ（下）で修飾したＣｕＮＣｓのフーリエ変換赤外（ＦＴ－ＩＲ）分光法の比較である。（Ｅ）ＣｕＮＣｓの蛍光励起（左）及び発光スペクトル（右）である。

【0033】

【図16】図１６は、ＣｕＮＣｓのＣＡＴ活性を示す。

【0034】

【図17】図１７は、ＣｕＮＣｓのＧＰｘ活性を示す。

【0035】

【図18】図１８は、ＣｕＮＣｓのＳＯＤ活性を示す。

【0036】

【図19】図１９は、Ｈ_２Ｏ_２誘発緑内障細胞（ＲＧＣ－５）モデルにおける細胞生存率に対するＣｕＮＣｓの効果を示す直方図である。

【0037】

【図20】図２０は、ＥＡＥによってモデル化された多発性硬化症マウスモデルの運動挙動に対するＧＳＨ修飾銅クラスター（ＣｕＮＣｓ）の効果を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0038】

本発明は、本発明の特定の実施形態の以下の詳細な説明を参照することにより、より容易に理解することができる。

【0039】

この出願において、本発明が関連する技術の状態をより完全に説明するために、刊行物が参照される場合、これらの刊行物の開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0040】

スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）は、高反応性Ｏ_２ ^－から反応性がより少ないＨ_２Ｏ_２及び酸素への分解を触媒する際に重要な役割を果たす。サイトゾル銅／亜鉛－ＳＯＤ （ＳＯＤ１）、ミトコンドリアマンガンＳＯＤ（ＳＯＤ２）、及び細胞外ＳＯＤ（ＳＯＤ３）は、同定されたＳＯＤの３つの異なるアイソフォームである。ＳＯＤ１とＳＯＤ２は、それぞれ、主にサイトゾルとミトコンドリアにおけるＯ_２ ^－の除去に関与する（Ｋｉｍ ２０１５）。

【0041】

グルタチオン過酸化酵素（ＧＰＸ）は、電子供与体としてグルタチオン（ＧＳＨ）を利用してＨ_２Ｏ_２及び脂質過酸化物の還元を触媒する複数のイソ酵素のファミリーを含む。ＧＰＸは、サイトゾルとミトコンドリアの両方にある。哺乳動物では、セレン依存性グルタチオン過酸化酵素の５つの異なるアイソフォーム（ＧＰＸ１～４と６）、及びセレノシステインの代わりにシステインを有する３つの非セレン同族体（ＧＰＸ５、７と８）が存在する。ＧＰＸの抗酸化機能は、細胞内の各アイソフォーム及び位置に依存し、ＧＰＸ１は脳内の主要な抗酸化酵素の１つとみなされる。研究によると、ＧＰＸ１のアップレギュレーションがニューロン損傷に対する保護応答の１つであることを示唆している（Ｋｉｍ ２０１５）。

【0042】

カタラーゼは、補因子として鉄又はマンガンのいずれかを用いて、Ｈ_２Ｏ_２を水及び酸素へ変換させるものである。カタラーゼは、ペルオキシソームにありし、細胞質及びミトコンドリアにも見出される。カタラーゼの役割は、低レベルのＨ_２Ｏ_２の場合では重要でないが、より高いレベルのＨ_２Ｏ_２の場合ではより重要になる（Ｋｉｍ ２０１５）。

【0043】

正常な生物では、活性酸素種（ＲＯＳ）は、種々の酵素の調節を通してホメオスタシスを維持する。カタラーゼ（ＣＡＴ）は、ほとんど全ての生物中に存在する。ＣＡＴは酵素捕捉剤であり、鉄ポルフィリンに基づく接触酵素である。これは、Ｈ_２Ｏ_２から分子状酸素及び水への分解を促進し、生物学的防御システムにおける重要な酵素の１つである。グルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰｘ）は、体内に広く存在する重要な過酸化物分解酵素である。ＧＰｘの活性中心はセレノシステインである。セレンはＧＳＨからＧＳＳＧへの変換を触媒し、毒性の過酸化物を非毒性のヒドロキシ化合物に還元することにより過酸化物による干渉及び損傷から細胞膜の構造及び機能を保護するＧＳＨ酵素系の成分である。スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）は、有害なスーパーオキシドラジカルを過酸化水素に変換する体中の天然に存在するスーパーオキシドラジカル捕捉剤である。過酸化水素は体に有害な酸素であるが、体内のペルオキシダーゼは直ちに完全に無害な水に分解する。ＣＡＴは、酸化ストレス中の過剰なＨ_２Ｏ_２の除去を行うことが知られているが、ＧＰｘは、細胞信号におけるＨ_２Ｏ_２の濃度を微調整することができる。ＣＡＴ－ＧＰｘ相乗作用は、病態生理学的条件下でのＨ_２Ｏ_２レベルの正確な制御のために重要であることが報告されている。このようにして、３つの酵素は完全な抗酸化剤鎖を形成する。

【0044】

本発明は、一つ又は複数のリガンドで修飾した銅ナノクラスター（ＣｕＮＣｓ）を提供する。特定の実施形態では、前記リガンドで修飾したＣｕＮＣｓは、直径が０．５～５ｎｍの範囲にあり、好ましくは０．５～３ｎｍの範囲にあり、より好ましくは０．５～２．５ｎｍの範囲にある。特定の実施形態では、前記リガンドは、チミン、チミンで修飾したヒアルロン酸（ＴＭＨＡ）、Ｌ（Ｄ）－システイン及びＮ－イソブタノイル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＩＢＣ）、Ｎ－イソブタノイル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＩＢＣ）、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン及びＮ－アセチル－Ｄ－システイン等のその他のシステイン誘導体、システイン含有オリゴペプチド及びそれらの誘導体（例えば、Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニンジペプチド（ＣＲ）、Ｌ－アルギニン－Ｌ－システインジペプチド（ＲＣ）、Ｌ－システイン Ｌ－ヒスチジン（ＣＨ）、グリシン－Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニントリペプチド（ＧＣＲ）、Ｌ－プロリン－Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニントリペプチド（ＰＣＲ）、Ｌ－グルタチオン（ＧＳＨ）、グリシン－Ｌ－セリン－Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニンテトラペプチド（ＧＳＣＲ）及びグリシン－Ｌ－システイン－Ｌ－セリン－Ｌ－アルギニンテトラペプチド（ＧＣＳＲ）等のジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、及びその他のシステイン含有ペプチドを含むが、これらに限定されない。）、及び１－［（２Ｓ）－２－メチル－３－チオール－１－オキソプロピル］－Ｌ－プロリン、チオグリコール酸、メルカプトエタノール、チオフェノール、Ｄ-ペニシラミン及びドデシルメルカプタンのうち一つ又は複数等のその他のチオール含有化合物を含むが、これらに限定されない。

【0045】

本発明は、多発性硬化症を有する対象を治療するための組成物を提供する。特定の実施形態では、前記組成物は、銅ナノクラスター（ＣｕＮＣｓ）と、薬理学的に許容される賦形剤とを含む。

【0046】

特定の実施形態では、前記組成物は、チミンで修飾したヒアルロン酸（ＴＭＨＡ）と、薬理学的に許容される賦形剤とを含む。

【0047】

特定の実施形態では、前記組成物は、ＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓと、薬理学的に許容される賦形剤とを含む。

【0048】

本発明は、ＭＳを治療するための医薬の製造における銅ナノクラスター（ＣｕＮＣｓ）の使用を提供する。

【0049】

本発明は、ＭＳを治療するための医薬の製造におけるチミンで修飾したヒアルロン酸（ＴＭＨＡ）の使用を提供する。

【0050】

本発明は、ＭＳを治療するための医薬の製造におけるＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓの使用を提供する。

【0051】

本発明は、ＭＳを有する対象を治療する方法を提供する。

【0052】

特定の実施形態では、前記方法は、前記対象に有効用量の銅ナノクラスター（ＣｕＮＣｓ）を含む組成物を投与することを含む。

【0053】

特定の実施形態では、前記方法は、前記対象に有効用量のチミンで修飾したヒアルロン酸（ＴＭＨＡ）を含む組成物を投与することを含む。

【0054】

特定の実施形態では、前記方法は、前記対象に有効用量のＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓを含む組成物を投与することを含む。

【0055】

特定の実施形態では、前記ＭＳを有する対象には、腹腔内注射により有効量のＣｕＮＣｓが投与される。特定の実施形態では、前記ＭＳを有する対象には、腹腔内注射により有効量のＴＭＨＡが投与される。特定の実施形態では、前記ＭＳを有する対象には、腹腔内注射により有効量のＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓが投与される。特定の実施形態では、前記有効量は、２～１００ ｍｇ ｋｇ^－１の範囲にある。

【0056】

本発明は、チミンで修飾したヒアルロン酸（ＴＭＨＡ）及びＴＭＨＡを合成する方法を提供する。

【0057】

ＴＭＨＡの構造は、図１（ａ）（ｉ）に示すように、式１で示され、ＨＡがグルクロン酸（ＧｌｃＡ）－Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）の繰り返し単位からなり、ＧｌｃＮＡｃがチミンで修飾され、及びｎが整数であり、１０～１０,０００であり、好ましくは１０～１,０００であり、より好ましくは１０～１００である。なお、ＨＡにおけるすべてのＧｌｃＮＡｃが必ずしもチミンで修飾したものではない。ＴＭＨＡにおけるチミンの置換度（ＤＳ）とは、ＴＭＨＡの１００つの糖残基当たりのチミン分子の数と定義される。ＴＭＨＡにおけるチミンの置換度（ＤＳ）は、１～５０％の範囲にあり、好ましくは４～３０％の範囲にあり、より好ましくは５～２０％の範囲にあり、さらに好ましくは７～１６％の範囲にあり、よりさらに好ましくは８～１５％の範囲にある。

【0058】

ＴＭＨＡを合成する方法は、

【0059】

０．０５～０．０２ｗ／ｖ％の濃度でチミンの酸性水溶液を提供することと、（特定の実施形態では、前記酸性水溶液が水とＨＣｌから構成される。）

【0060】

１～５ｗｔ％の濃度でＨＡ溶液を提供することと

【0061】

ＨＡ溶液に触媒を添加することと（特定の実施形態では、前記触媒がポリリン酸エステルである。）

【0062】

ＨＡ－チミン混合物を形成するようにチミンの酸性水溶液を触媒含有ＨＡ溶液に添加することと（特定の実施形態では、チミンの酸性水溶液を滴下注入により添加する。）

【0063】

ＨＡ－チミン混合物を所定の時間加熱することと（特定の実施形態では、前記加熱は、オイルバスにおいて４５～５０℃で１２～２０時間行う。）、

【0064】

加熱されたＨＡ－チミン混合物を所定の温度まで冷却することと（特定の実施形態では、未反応のチミンを沈殿させるために、前記所定の温度は、約０℃である。）、

【0065】

冷却されたＨＡ－チミン混合物から上清液を透析することと（特定の実施形態では、未反応の試薬及び不純物を除去するために、前記透析は、分子量カットオフ８０００で、４８～９６時間行う。）、

【0066】

透析された溶液を凍結乾燥して、ＴＭＨＡを得ることと、
を含む。

【0067】

本発明は、さらに、ＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓ及びＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓの合成方法を提供する。

【0068】

特定の実施形態では、ＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓの合成方法は、

【0069】

ＴＭＨＡ溶液を提供することと（特定の実施形態では、前記ＴＭＨＡ溶液が０．１ｍＭであり、ｐＨ７．０。）、

【0070】

ＴＭＨＡ溶液にＣｕＳＯ_４溶液を添加することと（特定の実施形態では、前記ＣｕＳＯ_４溶液が２０ｍＭであり、ｐＨ７．０、かつ、滴下により添加される。）、を含み、

【0071】

それにより、前記混合物を反応させる。特定の実施形態では、前記反応は、遮光で３７℃で２０分間行って、ＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓ溶液を得て、前記ＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓ溶液が、使用まで、遮光で４℃で保存される。

【0072】

ＵＶ光（３６５ｎｍ）照射で、明るいオレンジ色の発光が綺麗に見られ、発光ＣｕＮＣｓの形成が成功することがわかっている。

【0073】

特定の実施形態では、ＣｕとＴＭＨＡとのモル比が、１０：１～５００：１の範囲にあり、好ましくは１５：１～３００：１の範囲にあり、より好ましくは２０：１～２００：１の範囲にあり、さらに好ましくは２５：１～１００：１の範囲にあり、よりさらに好ましくは３０：１～８０：１の範囲にある。

【0074】

前記ＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓは、良好に分散された直径０．５～３ｎｍの球状ナノクラスターを含有する。

【0075】

以下の実施例は、本発明の原理を説明する目的のみで提供され、それらは本発明の範囲を限定することを意図するものではない。

【0076】

実施例

【0077】

（１）チミンで修飾したヒアルロン酸（ＴＭＨＡ）の合成

【0078】

まず、ポリリン酸エステルが触媒として製造された。ジエチルエーテル（１４．５ｍＬ）及びＣＨＣｌ_３（５．６ｍＬ）を撹拌しながら五酸化リン（１０ｇ）に添加し、混合物を還流で５０℃で１２時間加熱し、透明な溶液を得た。室温までに冷却した後、溶媒を真空下で留去した。得られた無色の粘性残留物は、ポリリン酸エステルであり、さらに精製することなく、触媒として使用された。

【0079】

次に、ＴＭＨＡを以下のように合成した。チミン（２３．６ｍｇ）の透明な溶液は、０．２５ｍＬの濃縮ＨＣｌ溶液（２５％）を添加した２５ｍＬのＨ_２Ｏに溶解することにより得られた。ポリリン酸エステル（１．５ｇ）を、ＨＡ溶液（５０ｍＬ、２．２ｗｔ％；ＭＷ１２０ＫＤ）に添加し、次にチミンを滴下注入し、混合物をオイルバスで５０℃まで１６時間加熱し、そして０℃まで冷却し、未反応のチミンを沈殿させた。続いて、上清液を透析バッグ（分子量カットオフ８０００）を介して７２時間透析して、いずれの未反応の試薬及び不純物を除去した。得られた溶液を凍結乾燥して、ＴＭＨＡを得た。その収率が８６％であり、置換度（ＤＳ）が１０．５％であった。最終生成物の品質は、^１Ｈ ＮＭＲ及びＦＴ－ＩＲにより同定された。

【0080】

図１を参照すると、図１（ａ）（ｉｉ）は、ＴＭＨＡの合成を示す。そして、図１（ａ）（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）は、それぞれ、ＨＡ及びＴＭＨＡの典型的な外見を示す。図１（ｂ）は、それぞれ、ＴＭＨＡ（赤線）及び純粋なＨＡ（青線）のＵＶ－ｖｉｓスペクトルを示す。図１（ｃ）は、ＨＡ及びＴＭＨＡのＦＴ－ＩＲを示す。そして、図１（ｄ）は、ＨＡ及びＴＭＨＡの^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。^１Ｈ ＮＭＲスペクトル分析は、８０℃、４００ＭＨｚでＤ_２Ｏにおいて、１０ｍｇ・ｍＬ^－１の試料濃度で行われた。ＦＴＩＲ解析に関して、試料準備においてＫＢｒ結晶がマトリックスとして使用された。

【0081】

ＴＭＨＡ複合体の化学的構造は、天然ＨＡとその誘導体のスペクトルとの比較を介して、ＦＴＩＲにより定性的に検討された。これらのスペクトルは、天然ＨＡと比較して、特にＤＳがより高いＴＭＨＡ誘導体と比較して、３０００～３２００ｃｍ^－１及び１３００～１８００ｃｍ^－１の範囲において顕著な相違を示した。前記天然ＨＡの特徴的ピークの割り当ては、３３６０ｃｍ^－１（二次Ｏ－Ｈストレッチ）、２８７３ｃｍ^－１（Ｃ－Ｈストレッチ）、１６２２ｃｍ^－１（アミドＩＩバンド、アセチル基のＣ－Ｏストレッチ）、１５５４ｃｍ^－１（アミドＩＩバンド、Ｎ－Ｈストレッチ）、１３８０ｃｍ^－１（ＣＨ_２基の非対称Ｃ－Ｈストレッチ曲げ）、１３１４ｃｍ^－１（第一級アルコール性基のＯ－Ｈストレッチ）、及び１０２６ｃｍ^－１（架橋Ｃ－Ｏストレッチに関する骨格振動）であった。ＴＭＨＡ誘導体のスペクトルは、３つの特徴的ピークを示し、即ち、３１９５と３０７９ｃｍ^－１（Ｎ－Ｈストレッチ）、１７３０ｃｍ^－１（Ｃ＝Ｏストレッチ）、及び１３４０ｃｍ^－１（Ｃ－Ｎストレッチ振動）であり、チミンによるＨＡの官能化を示唆している。より重要的には、ＨＡに属する第一級アルコール性基のＯ－Ｈストレッチに当たる１３１４ｃｍ^－１でのバンドの消失は、ＨＡのＧｌｃＮＡｃの第一級－ＯＨ基のみがチミンと反応する、反応メカニズムを示唆している。^１Ｈ ＮＭＲ解析により、修飾の成功がさらに確認された。

【0082】

（２）ＴＭＨＡを用いたＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓの合成

【0083】

１０ｍＬのＴＭＨＡ（ＤＳが１０．５％）溶液（０．１ｍＭ、ｐＨ７．０）を徐々に３７℃まで加熱し、ＴＭＨＡを溶解した。２ｍＬのＣｕＳＯ_４（２０ｍＭ、ｐＨ７．０）溶液を滴下し、遮光、３７℃でさらなる２０分間反応させた。ＵＶ光照射（３６５ｎｍ）で、明るいオレンジ色の発光が綺麗に見られ、発光ＣｕＮＣｓの形成が成功したことがわかった。最後に、使用まで、遮光で４℃で保存された。

【0084】

最適な合成条件、例えば、Ｃｕ^２＋／ＴＭＨＡのモル比、ｐＨ値、反応温度、及び時間のそれぞれについて詳細に検討した。反応系に対するＣｕ^２＋含有量の影響を研究するために、異なる濃度の２ｍＬのＣｕＳＯ_４を、１０ｍＬのＴＭＨＡ溶液に添加し、当該反応系におけるＣｕ^２＋とＴＭＨＡとのモル比が、５：１、１０：１、１５：１、２０：１、３０：１、４０：１、６０：１、８０：１、１００未満：１であった。軽く撹拌しながら遮光、３７℃で、ｐＨ７．０で２０分間反応した後、コロイド試料が得られ、発光分光計により検測された。ＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓの形成に対するｐＨ値の影響をよく理解するために、１．０Ｍ ＮａＯＨ又は１．０Ｍ ＨＣｌにより調整した異なるｐＨ値以外、同じ環境で一連の試験を実施した。また、反応温度（２０～７０℃）、及び反応時間（１～２５分間）の影響についても、それぞれ、検討した。発光分光計により、得られた試料を検測した。

【0085】

図２を参照すると、得られたＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓの蛍光強度に対する（ａ）Ｃｕ^２＋とＴＭＨＡとのモル比、（ｂ）反応ｐＨ値、（ｃ）反応温度、及び（ｄ）反応時間の影響を示すグラフを提供する。図２（ａ）に示すように、ＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓの蛍光強度は、Ｃｕ^２＋とＴＭＨＡとのモル比が５から４０まで増加するとともに向上し、Ｃｕ^２＋とＴＭＨＡとの比をさらに４０から１００まで増加すると、徐々に低下した。図２（ｂ）に示すように、反応ｐＨ値は、高品質のＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓの形成に重要な役割を果たした。ＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓの蛍光強度は、反応ｐＨ値が４から７まで増加するとともに大幅に増強し、そして速やかに低下し始めた。例えば、反応ｐＨ１０で、ＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓの発光は、蛍光分光法を介して観察することが困難となった。図２（ｃ）に示すように、２０～５０℃の反応温度は、高度な蛍光ＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓの形成に理想的なパラメータであった。図２（ｄ）に示すように、製造されたＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓの蛍光強度は、合成時間が１分間から８分間まで延長すると、大幅に増強した。時間がさらに２５分間まで増加すると、ＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓの蛍光強度が一定に維持された。全ての観測に基づいて、ＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓの最高の蛍光強度は、以下の最適化された合成条件で得られることを確認した：Ｃｕ^２＋とＴＭＨＡとのモル比が約４０、ｐＨ７．０溶液、そして３７℃で４時間反応した。

【0086】

（３）ＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓの安定性の研究

【0087】

ＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓの発光安定性の評価は、以下の手順に従って行われた。まず、様々な濃度のＮａＣｌ溶液（１００μＬ）をＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓ溶液（９００μＬ）と混合し、２５℃で３０分間インキュベートした。次に、５００μＬのＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓ溶液と様々な陽イオン又は陰イオン溶液（５００μＬ、２ｍＭ）とを十分に混合して、２５℃で３０分間インキュベートした。そして、ＮａＯＨ（１．０Ｍ）又はＨＣｌ（１．０Ｍ）を５ｍＬのＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓ溶液に入れて、体系ｐＨを調整し、２５℃で３０分間インキュベートした。最後に、ＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓの蛍光スペクトルを励起波長３８５ｎｍ及び発光波長６１０ｎｍで測定した。

【0088】

図３を参照すると、得られたＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓの蛍光強度に対する（ａ）ＮａＣｌ濃度（０～１Ｍ）、（ｂ）共有カチオン及びアニオン、（ｃ）ｐＨ値（４～１０）、及び（ｄ）重合時間（０～５週間）の影響を示すグラフを提供する。図３（ａ）に示すように、異なる濃度（０、０．２、０．４、０．６、０．８及び１．０Ｍ）のＮａＣｌ溶液において、ＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓの蛍光強度は変化せず、強イオン強度の環境でのＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓの高い安定性を示した。より重要的には、２ｍＭのＮａ^＋、Ｂａ^２＋、Ｆｅ^３＋、Ｇｄ^３＋、Ｓｎ^４＋のようなその他の遷移金属イオン、及びＣｌ^－、ＣＯ_３ ^２－、ＰＯ_４ ^３－、Ｃ_２Ｏ_４ ^２－、Ｃ_６Ｈ_５Ｏ_７ ^３－のようなアニオンをＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓの溶液に添加すると、これらの選ばれたイオンは、いずれも蛍光強度に無視できるぐらいの影響を与えた（図３（ｂ））。同じような安定的な蛍光性能も、図３（ｃ）に示されている。ｐＨ値を４．０から１０．０まで調整しても、対応するＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓの蛍光スペクトルに明らかな影響を与えることがない。これから明らかなように、当該緩衝系において、ＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓは、ｐＨ値に敏感ではないとわかった。また、空気中、室温（２５℃）で５週間重合した後、ＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓに沈殿、凝集や蛍光強度の低下が見られなかった（図３（ｄ））。これらの全ての結果から、ＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓが優れた安定性を有し、実際の応用が見込まれていることがわかった。

【0089】

（４）ＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓの合成に対するＴＭＨＡ中のチミンの置換度（ＤＳ）の影響

【0090】

ヒアルロン酸（ＨＡ）及びチミンは、天然生物的分子であり、チミンは、Ｃｕ^２＋を十分にキレート化させる役割を果たし、ＨＡのヒドロキシル基は、金属ナノクラスターの成核と成長のための還元剤として作用する。本発明の発明者らは、チミンの置換度（ＤＳ）がＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓの合成に重要な調整因子であると見出した。ｐＨ７．０溶液において、Ｃｕ^２＋とＴＭＨＡとのモル比が約５０であり、そして３７℃で４時間反応させた。

【0091】

図４を参照すると、チミンの置換度（ＤＳ）が異なるＴＭＨＡにより製造されたＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓを示す写真及びグラフを提供する。図４（ａ）及び（ｄ）は、それぞれ、チミンのＤＳが３．２％であるＴＭＨＡで製造されたＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓのＴＥＭ又はＡＦＭ画像を示す。図４（ｂ）及び（ｅ）は、チミンのＤＳが１０．５％であるＴＭＨＡで製造されたＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓのＴＥＭ又はＡＦＭ画像を示す。図４（ｃ）及び（ｆ）は、チミンのＤＳが２０．１％であるＴＭＨＡで製造されたＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓのＴＥＭ又はＡＦＭ画像を示す。図４（ｇ）及び（ｈ）は、それぞれ、ＴＭＨＡ又はＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓのＭＳスペクトルを示す。そして、図４（ｉ）及び（ｊ）は、（ｉ）ＣｕＮＣｓの全領域及び（ｊ）Ｃｕ_２ｐ領域のＸＰＳスペクトルを示す。図４では、挿入図（ｂ、ｇ、ｈ）は、それぞれ、ＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓナノワイヤー、イオン化断片及びＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓの模式図であり、（ｅ、ｆ）は、ナノワイヤーで構成される単離されたＣｕＮＣｓである。

【0092】

チミンのＤＳレベルが１０．５％である場合、よく分散された、直径が０．５～３ｎｍの範囲にある、平均直径が１．６４±０．４８ｎｍである球状ＣｕＮＣｓを生成した。それに対して、より低い（３．２％）又は高い（２０．１％）レベルでは、大量のワタ状のＣｕＮＣｓは、それぞれ、直径が１．０８±０．７２ｎｍ及び１．９６±０．８３ｎｍであるものとして現れた。次に、ＴＭＨＡを未処理ＨＡに変更した以外に、同じ試験要素で試験を行う場合、酷く縮合された大分子のネットワークしか確認されなかった（図４（ｉ）及び（ｊ））。さらに予想外のは、１０．５％のＤＳにより、直径８．０５±０．４３ｎｍであるＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓナノワイヤーの一次元組立体を生成した（図４（ｂ）及び（ｅ））。チミンのＤＳが２０．１％まで増加すると、ナノワイヤーは、長さ／直径比が大きく低下したため、一部が区別できなくなった（図４（ｃ）及び（ｆ））。微調整されたＣｕＮＣｓと線形ＴＭＨＡ鋳型との共有結合により、ＣｕＮＣｓが高次アレイ、即ちＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓに自己組織化することを保証した。なお、凝集誘起発光（ＡＩＥ）に基づいて、このようなナノワイヤーは、効果的にＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓの蛍光安定性及び強度を向上した（詳細は後述する）。

【0093】

（５）チミンからその他のリガンドへの置き換え

【0094】

金属のコアサイズを変更せずにナノワイヤーを形成する単独のＣｕＮＣｓをより明確的に検出するため、チミンリガンドを、より強いＣｕ－Ｓ結合を生成することにより、チオレートに置き換えた。ＧＳＨをリガンドとして予想通りＣｕＮＣｓを形成したが、その使用により、母体ナノワイヤーが容易にその構築単位、即ちＣｕＮＣｓに分解される。図５に示すように、ＧＳＨリガンドを有するＣｕＮＣｓの熱重量解析を示すグラフを提供した。ここで、リガンド交換の策略を利用して、母体ナノワイヤーをその構築単位、例えばＣｕＮＣｓに分解する。製造直後のＴＭＨＡ鋳型のＣｕＮＣｓ（１ｍＬ）を、ＧＳＨ水溶液（０．０５Ｍ、５ｍＬ）に添加し、室温で８時間撹拌した。白色沈殿は、反応が進行するともに生成した。８０００ｒｐｍで約１０分間遠心することにより、生成した上清液が回収された。エタノールの添加により、上清液からＧＳＨ安定化ＣｕＮＣｓを沈殿させ、エタノールで３回洗浄を繰り返した。最後に、生成物は、凍結乾燥され、冷蔵庫で長期間保存のために保存された。

【0095】

（６）ＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓの同定

【0096】

なお、中間ＤＳが１０．５％である場合、断面プロフィール解析及び多分散指数により実証されるように、完全、球状、及び均一のＣｕＮＣｓが形成される。ＨＲ－ＴＥＭ画像から細かく計算すると、０．２０７ｎｍの模様間隔距離が示され、面心格子金属Ｃｕの（１１１）結晶面と一致した。図６は、チミンのＤＳが３．２％（青）、１０．５％（赤）、及び２０．１％（緑）であるものをそれぞれ使用して得られたＣｕＮＣｓの励起（λ_ｅｍ＝６１３ｎｍで測定される。）スペクトルを示すグラフである。

【0097】

以下では、特に断らない限り、１０．５％のＤＳでＴＭＨＡにより製造されたＴＭＨＡ配位ＣｕＮＣｓを使用した。

【0098】

電子顕微鏡の補足として、質量分析（ＭＳ）も、クラスターサイズ解析において信頼性のあるツールであることが証明された。ここで、高解像度エレクトロスプレーイオン化ＭＳ（ＥＳＩ－ＭＳ）を利用して、サブナノメートルサイズのＣｕＮＣｓの正確な分子式を同定することを試みた。注目すべきことに、純粋なＨＡは、主として、陽イオンモードにおいてそのイオン化効率が低いため、いかなる可視イオン信号も示されなかった。対照的にＴＭＨＡの陽イオン化は、ｍ／ｚ＝１０６．１９３６で単一のピークを生成した（図（４（ｇ））。チミンからのＨＮＣＯの損失のため、[Ｃ_４Ｈ_５ＮＯ＋Ｎａ]^＋の式に帰することができる。いくつかの測定パラメータをスクリーニングした後、ＴＨＭＡの代わりに、Ｃ_４Ｈ_５ＮＯがＣｕＮＣｓのイオン化においてリガンドとして作用する場合、豊富なイオン信号を放出することが容易になる。これらのパラメータは、チミンの分解を促進するために適切なエネルギーを供給するので、最適なものとして選択され、キャピラリー電圧ｃａ．４５００Ｖ、乾燥温度１５０℃であった。元素解析とｍ／ｚ＝１０４３．２５４５での最高のイオンピーク（図（４（ｈ））とを組み合わせることにより、ＣｕＮＣｓの定義式は、Ｃｕ_６Ｌ_５として決定された。低質量範囲の他のイオンピークも、Ｃｕ_６関連化学種のフラグメントと正確に対応した。その結果から、Ｃｕ_６クラスターは支配的な種であり、ＤＳが３．２％及び２０．１％である二つの対照群に対して、チミンのＤＳが１０．５％であるＴＭＨＡにより合成されたＣｕＮＣが優れた単分散性を有する。

【0099】

Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）解析により、ＣｕＮＣが、Ｃ、Ｏ、Ｎ、及びＣｕを含む全ての予想される元素から構成されたことが明らかになった。ＣｕＮＣ中の無機含有量を計算すると、２９．８重量％であった。さらに、９３２．３及び９５２．１ｅＶでの２つの強いシグナルが、Ｃｕ^０の２ｐ_３／_２及び２ｐ_１／_２電子の結合エネルギーによるものである、また、サテライトシグナルがないことから、Ｃｕ^２＋の欠如がわかった。なお、Ｃｕ^０の２ｐ_３／_２結合エネルギーは、Ｃｕ^＋の２ｐ_３／_２結合エネルギーに非常に近い。従って、製造されたＣｕＮＣｓの原子価状態は、０と＋１の間にある可能性が最も高いとなった。

【0100】

図７を参照すると、（ａ）チミンの異なるＤＳでのＰＬスペクトル（左）及び減衰プロファイル（右）、挿入図：３６５ｎｍ励起での画像；（ｂ）Ｃｕ^２＋含有量に対するＴＭＨＡプローブのＰＬ応答；（ｃ）様々な金属に対する、Ｃｕ^２＋のためのＴＭＨＡプローブのＰＬ及び色改変（挿入図）、を示すグラフを提供する。

【0101】

（７）Ｃｕ^２＋イオンの検出のためのプローブとしてのＴＭＨＡ

【0102】

３つを健康な成人ボランティアから採取し、残りをＰＤを有する成人ボランティアから採取した５つの尿試料を、それぞれ尿中のタンパク質及び他の生物種の干渉を除去するようにアセトニトリルで希釈した。１０℃で１２,０００ｒｐｍの速度で１０分間遠心分離した後、上清液を回収し次の実験に利用した。最初に、上清液を脱イオン水で希釈して、上清中に残存するＣｕ^２＋濃度を減少させた。次いで、１００μＬの尿試料を２００μＬのＴＭＨＡ（０～４０μｇ・ｍＬ^－１）と混合し、２５℃で１０分間インキュベートした後、蛍光分光法により検査された。

【0103】

なお、５６０ｎｍでの大きなＣｕナノ粒子の表面プラズモン共鳴とは光学的特徴が明らかに異なる。ＸＲＤピークのベースラインへの広がりは、ＣｕＮＣｓの小さなサイズと一致した。興味深いことに、サブナノ規模のＣｕＮＣｓは、ＤＳ依存性フォトルミネセンス（ＰＬ）特徴を有した。３８５ｎｍの励起下で、１０．５％のＤＳ誘導ナノワイヤーは、６１３ｎｍにピークを有し、５７μｓの長い寿命と、１４．８％の大きな量子収率を有する明らかな安定的な発光を示した（図（７（ａ））。より低次のＣｕＮＣｓ組立体では、これらの特性が急速に低下し、自己組織化駆動のＡＩＥを示唆している。より多くのＣｕＮＣｓが密にかつ規則的に充填されると、より安定で強いＰＬ応答が得られる。反応因子を調整することにより、本発明の清浄な合成経路は、ＴＭＨＡ（キレート化、Ｃｕ^２＋を還元し、かつ自己組立体をＣｕＮＣｓナノワイヤーへの鋳型とするする。）に依存し、従来の経路で導入された不純物を消去し、顕著なＰＬ特性を得ることができた。例えば、ＴＭＨＡセンサのＰＬ強度は、直線的で、Ｃｕ^２＋濃度に応じて明らかに改善されたものであり、２．２ｐｐｂの極めて低い検出限界に対応する（図（７（ｂ））。現在報告されている方法と比較して、その解析性能は、従来技術のプローブ及び米国ＥＰＡにより設定された飲料水の最大レベルに比べて、約１．５倍及び４８０倍小さいことを示した。また、図（７（ｃ）において、外来イオンに対して、光学特性はＣｕ^２＋に対して選択的であった。従って、ＴＭＨＡは、高感度及び選択性を有する比色及び蛍光Ｃｕ^２＋プローブとして使用することができる。

【0104】

（８）ＣｕＮＣｓの酸化防止機能

【0105】

細胞酸化防止酵素を機能的に模倣するＣｕＮＣｓの能力を研究した。予想外に、ＣｕＮＣｓは、１次反応速度論に基づいてＨ_２Ｏ_２を激しく分解することができた（図（８（ａ））。次に、本発明者らは、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）アッセイを介してＣｕＮＣｓのＧＰｘ様活性を研究した。種々のアッセイ条件で記録された初期速度は、図（８（ｂ）に示され、ＣｕＮＣｓのＧＰｘ様機能を直接支持した。さらに、ＣｕＮＣｓは、顕著なＳＯＤ様活性を有し、そして、スーパーオキシド源としてのＫＯ_２からの大量Ｏ_２が生成することから、スーパーオキシドのＨ_２Ｏ_２及びＯ_２（図（８（ｃ））への不均化の作用原理が推定された。さらに、ＣｕＮＣｓは、細胞酸化防止剤として使用される既存の金属よりも明らかな多酵素的利点を有した（図（８（ｄ））。

【0106】

図８を参照すると、（ａ）ＣｕＮＣｓと反応するＨ_２Ｏ_２のＵＶ吸収、（ｂ）ＣｕＮＣｓ及び様々な対照群のＧＰｘ様活性の初期速度、（ｃ）ＣｕＮＣｓ ＳＯＤ様活性、挿入図：Ｏ_２生成速度、（ｄ）ＣｕＮＣｓとその他の金属との触媒活性の比較、を示すグラフを提供する。

【0107】

（９）ＴＭＨＡによるＰＤの非侵襲的診断

【0108】

プローブとしてＴＭＨＡを用いてヒト尿液試料中のＣｕ^２＋含有量を測定した。注目すべきことに、赤色蛍光がＰＤ患者からの尿液試料中のみに現れた。その高い特異性及び簡単な操作を考慮すると、ＴＭＨＡは、ＰＤについての早期診断及びリスク評価において新しい機会を開くことができた。

【0109】

図９を参照すると、ＰＤの早期診断のための尿液Ｃｕ^２＋の検出を示すグラフを提供する。

【0110】

（１０）インビトロ細胞試験

【0111】

ＰＣ１２（ラット副腎髄質褐色細胞腫細胞株）、ＳＨＳＹ－５Ｙ（ヒト神経芽細胞腫細胞株）、及びＨＥＫ２９３（ヒト胎児腎臓細胞株）細胞は、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、２ｍＭ・Ｌ－グルタミン、１００ＵｍＬ^－１ペニシリン、１００μｇ・ｍＬ^－１ストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で３７℃、５％ＣＯ_２で培養した。

【0112】

メチルチアゾリルテトラゾリウム（ＭＴＴ）アッセイを実施して、細胞生存率を測定することによりＴＭＨＡのインビトロ細胞毒性を測定した。ＭＴＴアッセイでは、ＳＨＳＹ－５Ｙ細胞をウェル当たり５０００個の生存細胞の密度で９６ウェルプレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ_２で２４時間インキュベートして細胞付着を可能にした。次いで、この細胞を、特定の濃度で、ブランクＴＭＨＡ溶液（Ｃｕ^２＋添加なし）と共にインキュベートした。その後、細胞を３７℃、５％ＣＯ_２で２４時間インキュベートした。培地を５ｍｇ・ｍＬ^－１ＭＴＴを含有する新鮮なＤＭＥＭで置き換えた後、細胞をさらに４時間インキュベートした。ＭＴＴ溶液を除去した後、ＤＭＳＯで紫色のホルマザン結晶を溶解し、吸光度をマイクロプレートリーダー（ＦＬ ６００、Ｂｉｏ－Ｔｅｋ）上で５７０ｎｍでモニターした。結果を、３つの測定値の平均値として表した。同じ方法で、ＨＥＫ２９３細胞及びＰＣ１２細胞に対する純粋なＴＨＭＡのインビトロ細胞毒性を測定した。ＴＭＨＡは、５００μｇ・ｍＬ^－１ほど高い用量で非毒性であった。

【0113】

次に、本発明者らは、ＰＤ表現型の実験的細胞モデルにおけるＴＭＨＡの細胞保護特性を調べた。このモデルは、ＭＰＴＰ（１－メチル－４－フェニル－１，２，３，６－テトラヒドロピリジン）の活性代謝物であるＭＰＰ^＋（１－メチル－４－フェニルピリジニウム）を用いて、ラット副腎髄質褐色細胞腫細胞（ＰＣ１２）を処理することにより生成された。

【0114】

１－メチル－４－フェニル－１，２，３，６－テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）は神経毒である。それ自体は毒性ではないが、脳に入ると、この神経毒は化合物１－メチル－４－フェニルピリジン（ＭＰＰ^＋）に代謝される。ＭＰＰ^＋は、黒質中のＤＡ作動性ニューロンを破壊する可能性がある。同時に、ＭＰＰ^＋は、ミトコンドリア代謝の呼吸鎖中の重要な物質であるＮＡＤＨデヒドロゲナーゼと干渉することができ、細胞死及びフリーラジカルの蓄積を引き起こす。このプロセスにより引き起こされるＤＡ作動性ニューロンの大量死は、大脳皮質による運動制御に重大な影響を及ぼし、その結果、ＰＤの類似の症状をもたらす。そのため、ＭＰＴＰ及びＭＰＰ^＋は、ＰＤ関連動物及び細胞モデルの確立並びにＰＤ薬物の研究及び開発において広く使用されている。

【0115】

ＰＣ１２細胞を、Ｃｕ^２＋及びＴＨＭＡの非存在下又は存在下で６ウェルプレートで培養した。次いで、種々の濃度のＭＰＰ^＋（０．５～４ｍＭ）を添加した。細胞の相対的生存率もＭＴＴアッセイにより決定した。４ｍＭのＭＰＰ^＋は、ＰＣ１２細胞の重篤な細胞傷害性（即ち、２０％未満の細胞生存率未満）を誘発した。驚きなのは、４ｍＭ ＭＰＰ^＋誘発細胞毒性は、８μＭ Ｃｕ^２＋及び１０μｇ・ｍｌ^－１ ＴＭＨＡ（即ち、８０％以上の細胞生存率）により完全に逆転された。細胞生存率のデータは、図（１０（ａ）（＊＊＊ｐ＜０．００１）に示された。

【0116】

共焦点レーザ走査顕微鏡（ＣＬＳＭ）を用いて細胞形態変化を取得した。ＣＬＳＭ上の生存細胞及び死細胞の観察のために、３'，６'－ジ（Ｏ－アセチル）－４'，５'－ビス[Ｎ，Ｎ－ビス（カルボキシメチル）アミノメチル]フルオレセイン（即ち、テトラアセトキシメチルエステル（カルセイン－ＡＭ））を用いて、生細胞を緑色蛍光（λ_ｅｘ＝４９０ｎｍ、λ_ｅｍ＝５１５ｎｍ）として染色し、そしてヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を用いて死細胞を赤色蛍光（λ_ｅｘ＝５３５ｎｍ、λ_ｅｍ＝６１７ｎｍ）として染色した。具体的には、培地を除去した後、０．１ｍｌのカルセイン－ＡＭ溶液（２０ｍＭ）及び０．１ｍｌのＰＩ溶液（２０ｍＭ）を、両方とも、培地の除去の後に添加した。１０分間インキュベートした後、２つの染色溶液を迅速に除去し、細胞をＰＢＳで２回リンスした。次いで、得られた細胞をＣＬＳＭにより可視化することができた。図１０（ｂ）は、ＰＩ色素により染色され、４ｍＭ ＭＰＰ^＋、２μＭ Ｃｕ^２＋、１０μｇ・ｍｌ^－１ ＴＭＨＡという条件で処理された死亡（赤）細胞を示し、図１０（ｃ）は、カルセイン－ＡＭにより染色され、４ｍＭ ＭＰＰ^＋、１０μＭ Ｃｕ^２＋、１０μｇ・ｍｌ^－１ ＴＭＨＡという条件で処理された生存（緑）細胞を示す。

【0117】

ＣＬＳＭを用いて活性酸素種（ＲＯＳ）を直接観察するために、最初にＣＬＳＭ専用培養ディスクにＰＣ１２細胞を播種し、５％ＣＯ_２ガスで３７℃で一晩付着させた。１ｍＬの２'，７'－ジクロロフルオレセイン二酢酸塩（ＤＣＦＨ－ＤＡ）と約２０分間インキュベートした後、培養液を、それぞれ、以下の物質を含有する新鮮な培地（ｐＨ＝７．４）に置き換えた：（ａ）対照群としての４ｍＭのＭＰＰ^＋、（ｂ）４ｍＭのＭＰＰ^＋、１０ ｏｆ μｇ・ｍＬ^－１ ＴＭＨＡ、（ｃ）４ｍＭのＭＰＰ^＋、１０μＭのＣｕ^２＋、（ｄ）４ｍＭのＭＰＰ^＋、１０ μｇ・ｍＬ^－１のＴＭＨＡ、２μＭのＣｕ^２＋、（ｅ）４ｍＭのＭＰＰ^＋、１０ μｇ・ｍＬ^－１のＴＭＨＡ、４μＭのＣｕ^２＋；（ｆ）４ｍＭのＭＰＰ^＋、１０ μｇ・ｍＬ^－１のＴＭＨＡ、６μＭのＣｕ^２＋、（ｇ）４ｍＭのＭＰＰ^＋、１０ μｇ・ｍＬ^－１のＴＭＨＡ、８μＭのＣｕ^２＋、及び（ｈ）４ｍＭのＭＰＰ^＋、１０ μｇ・ｍＬ^－１のＴＭＨＡ、１０μＭのＣｕ^２＋。細胞は、さらに３７℃で５％ＣＯ_２で３０分間インキュベートした後、新鮮なＰＢＳで２回洗浄された。細胞内ＲＯＳレベルは、新たに形成されたＤＣＦ（λ_ｅｘ＝４８８ｎｍ、λ_ｅｍ＝５２５ｎｍ）の蛍光を検出することにより評価した。細胞内ＲＯＳレベルのデータは、図（１１（ａ）に示され、＊＊＊ｐ＜０．００１であった。

【0118】

図１１（ｂ）は、４ｍＭのＭＰＰ^＋、１０μｇ・ｍＬ^－１ ＴＭＨＡで処理され、かつ特定の蛍光プローブＤＣＦＨ－ＤＡで染色された細胞における細胞内ＲＯＳ ＣＬＳＭ画像を示す。そして、図１１（ｃ）は、４ｍＭのＭＰＰ^＋、１０μｇ・ｍＬ^－１ ＴＭＨＡ、１０μＭのＣｕ^２＋で処理され、かつＤＣＦＨ－ＤＡで染色された細胞における細胞内ＲＯＳのＣＬＳＭ画像を示す。ＲＯＳ特異的蛍光強度の明らかな低下からわかるように、ＴＭＨＡが細胞内上昇ＲＯＳを効率的に捕捉することができることを示した。特徴的１：２：２：１ヒドロキシルラジカルスピンにより、ＴＭＨＡ処理による細胞内ＲＯＳ誘導の減少が実証された。

【0119】

（１１）インビボ保護試験

【0120】

一般的に、１－メチル－４－フェニル－１，２，３，６－テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）の投与は、ヒトにおける散発性ＰＤと著しく類似した動物の臨床症状をもたらすことが広く受け入れられている。従って、当該の実験では、本発明者らは、ＭＰＴＰを利用して、ＰＤの動物モデルにおいてパーキンソン症状を生じさせた。簡単にまとめると、Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、７群（ｎ＝５マウス／群）にランダムに分けて、即ち、空白対照群（正常生理食塩水）、高用量のＴＭＨＡ（１００ｍｇ・ｋｇ^－１）、低用量のＴＭＨＡ（５０ｍｇ・ｋｇ^－１）、高用量のＭＰＴＰ（３０ｍｇ・ｋｇ^－１）、低用量のＭＰＴＰ（１０ｍｇ・ｋｇ^－１）、ＭＰＴＰ＋ＴＭＨＡ（３０ｍｇ・ｋｇ^－１＋１０ｍｇ・ｋｇ^－１）及びＭＰＴＰ＋ＴＭＨＡ（３０ｍｇ・ｋｇ^－１＋２０ｍｇ・ｋｇ^－１）。具体的には、モデル群は、ＭＰＴＰを、少なくとも４日間連続腹腔内注射により投与して、ＰＤのマウスモデルを生成した。空白対照群及びＴＨＭＡ群は、それぞれ腹腔内注射により生理食塩水及びＴＨＭＡで治療した。ＭＰＴＰ＋ＴＭＨＡ群は、ＴＭＨＡ（用量：１０又は２０ｍｇ・ｋｇ^－１）を予め腹腔内０．５時間（１日１回）注射し、次いで３０ｍｇ・ｋｇ^－１のＭＰＴＰを７日間腹腔内注射した。

【0121】

水泳試験により運動機能を評価した。各動物を直径１２０ｃｍ及び高さ８０ｃｍのサイズを有する円形プールに入れた。水（２５℃）の深さは６０ｃｍであった。追跡システム（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｊｉｌｉａｎｇ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ.,Ｌｔｄ．）を使用して１０分間隔で移動距離（ｃｍ・１０ｍｉｎ^－１）及び持続時間（秒間）を記録した。回転ロッド（Ｕｇｏ Ｂａｓｉｌｅ）を用いて運動の姿勢及びバランスを測定した。マウスに、１０ｒｐｍから始まり、そして３０秒間をかけて２２ｒｐｍまで加速した回転ロッド上で１５分間の３回の試験を行った。この試験間の間隔は３分間であった。各群について、ロッドからの落下時間を測定し、平均化した。図１２（ａ）は、記憶障害のマウスの移動距離及び落下待ち時間を示し、***ｐ＜０．００１であった。これらのデータは、ＴＭＨＡ治療がＭＰＴＰ処置動物の認知活動を回復することができることを示した。

【0122】

ミトコンドリアの形態の変化は、ＲＯＳにより誘発されるミトコンドリア機能不全の早期かつ重要な徴候である。ここで、本発明者らは、ミトコンドリアの形態変化を可視化するためにＴＥＭを使用した。一般に、Ｃ７５ＢＬ／６マウス由来の脳組織を、順次に冷２．５%グルタルアルデヒドを含有する０．１Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ７．２）と２％パラホルムアルデヒドを含有する０．１ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）との混合物中で一晩固定し、その後、エポキシ樹脂に入れた。埋め込まれた試料をカプセルに装填し、３８℃で９時間重合させ、次いで６０℃で４８時間重合させた。ウルトラミクロトーム（ＲＭＣ、ＵＳＡ）を用いて薄切片を作製し、銅グリッド上に収集した。切片の適当な領域を１００ｎｍの厚さで切断し、飽和４％ウラニル酢酸／４％クエン酸鉛で切片を染色した後、透過型電子顕微鏡（ＪＥＭ－２１００Ｆ）を用いて８０ｋＶで検査した。図１２（ｂ）は、高用量のＭＰＴＰ（３０ｍｇ・ｋｇ^－１）で治療された動物からのミトコンドリアを示し、赤線により示すように、ミトコンドリアは、膨潤、液胞形状及び重度なクリステ破壊を示す。それに対して、図１２（ｃ）は、ＭＰＴＰ（３０ｍｇ・ｋｇ^－１）＋ＴＭＨＡ（３０ｍｇ・ｋｇ^－１）で治療された動物からのミトコンドリアを示し、赤線により示すように、ミトコンドリアは、正常な形態を示す。

【0123】

（１２）異なるリガンドを有する単体ＣｕＮＣｓによるα－ｓｙｎ凝集動態試験

【0124】

異なるリガンドで修飾したＣｕＮＣｓを、文献に従って製造した。チオフラビンＴ（略語：ＴｈＴ）は、アミロイドの存在を同定するために使用される高感度の蛍光マーカーである。ＴｈＴをポリペプチド又はタンパク質のモノマーと共にインキュベートすると、その蛍光は実質的に変化しない。ＴｈＴが繊維構造を有するアミロイドポリペプチド又はタンパク質に遭遇すると、それは、アミロイドポリペプチド又はタンパク質に直ちに接着し、その蛍光強度は指数関数的に増加する。従って、ＴｈＴは、ペプチド又はタンパク質のアミロイドーシスをモニターするためのメーカーとして広く使用されている。本実施形態は、ＣｕＮＣｓの存在下でα－ｓｙｎの線維化凝集の動態過程をモニターするために、ＴｈＴ蛍光標識法を採用した。具体的な実験方法は以下の通りである。

【0125】

α－ｓｙｎモノマーの前処理：凍結乾燥したα－ｓｙｎ粉末（Ｂａｃｈｅｍ Ｃｏｒｐ．）をＨＦＩＰ中に溶解して、１ｇ／Ｌのα－ｓｙｎ溶液を得た。シーリングの後、室温で２～４時間インキュベートし、次いで、高純度窒素を使用して、ヒュームボードにおいてＨＦＩＰを除去するように、適切な流速でブローし、乾燥したα－ｓｙｎを２００μＬのＤＭＳＯ中に溶解させ、溶液をシールし、将来の使用のために、それを最大一週間まで－２０℃の冷蔵庫に保存した。使用前に、α－ｓｙｎ ＤＭＳＯ溶液を、リン酸緩衝液（ＰＢＳ、１０ｍＭ、ｐＨ＝７．４）を用いて２０μＭに希釈して、α－ｓｙｎ ＰＢＳ溶液を得た。実験における全てのα－ｓｙｎ ＰＢＳ溶液は、使用直前に製造された。

【0126】

試料の製造及び検出：リガンドで修飾したＣｕＮＣｓをα－ｓｙｎ ＰＢＳ溶液に添加して、ＣｕＮＣｓ及びα－ｓｙｎをそれぞれ５ｐｐｍ及び３５μｍの最終濃度に到達させた。溶液を９６ウェルプレート中で３７℃で連続的にインキュベートし、１０分毎にマイクロプレートリーダーにより蛍光強度をモニターし、ＴｈＴの蛍光強度の変化を通してα－ｓｙｎ凝集の動態的プロセスを同定した。実験群は、リガンドで修飾したＣｕＮＣｓをしようした。リガンド対象群は、ＣｕＮＣｓと結合しないリガンド分子を使用した。空白対照群は、α－ｓｙｎのみを使用した。

【0127】

図１３を参照すると、α－ｓｙｎフィブリル化動態に対するＬ－グルタチオン（ＧＳＨ）で修飾したＣｕＮＣｓ（ＧＳＨ－ＣｕＮＣｓ）の影響を示すグラフを提供する。結果によれば、３７℃で３５μＭのα－ｓｙｎのインキュベーション工程において、ＴｈＴ標識された蛍光強度が２５時間目から急速に増加し、α－ｓｙｎ凝集及びフィブリル化が起こったことを示した。リガンド対照群の結果は、リガンドＧＳＨを単独使用することがα－ｓｙｎの凝集動態に明らかな影響をあたえることがないことを示した。ＣｕＮＣｓを添加した実験群については、ＴｈＴ標識された蛍光強度は、７０時間の実験にわたって増加することなく、ベースラインの近くに保持され、ＧＳＨで修飾したＣｕＮＣｓがα－ｓｙｎ凝集及びフィブリル化を完全に阻害することができ、その効果はＧＳＨリガンドではなくＣｕＮＣｓによることを示唆している。

【0128】

特定の実施形態では、ＣｕＮＣｓは、例えば、Ｌ（Ｄ）－システイン、Ｎ－イソブタノイル－Ｌ（Ｄ）－システイン（Ｌ（Ｄ）－ＮＩＢＣ）及びＮ－アセチル－Ｌ（Ｄ）－システイン（Ｌ（Ｄ）－ＮＡＣ）を含むその他のリガンドで修飾され、そして修飾されたＣｕＮＣｓも、同じプロトコルで研究された。異なるリガンドで修飾したＣｕＮＣｓについても同様の現象が観察され、これらのリガンド自体は、α－ｓｙｎ凝集及びフィブリル化に影響を与えず、一方、リガンドで修飾したＣｕＮＣｓは、α－ｓｙｎ凝集及びフィブリル化を完全に阻害することができるという同じ結論に至った。

【0129】

（１３）ＭＰＰ^＋誘導のＰＤ細胞（ＳＨ－ｓｙ５ｙ）モデル試験

【0130】

実験は、ＣＣＫ－８法の試験結果から得られた細胞生存率を指標として使用して、ＰＤのＳＨ－ｓｙ５ｙ細胞モデルにおけるＭＰＰ^＋（一般的に使用された神経毒）の毒性効果に対するリガンドで修飾したＣｕＮＣｓの耐性効果を反映して、ＰＤ特異的方法に対するそれらの神経保護効果を実証した。具体的な方法は以下のとおりである。

【0131】

１）対数増殖期においてＳＨ－ｓｙ５ｙ細胞を摂取した。完全培地で希釈して、５×１０^４／ｍＬの細胞密度を有する細胞懸濁液を形成した。プレート２００μＬの細胞懸濁液を９６ウェルプレートの各ウェルに入れ、インキュベーター中で３７℃、５％ＣＯ_２の環境で培養した。細胞を付着させた後に試料を添加した。

【0132】

２）最終濃度を０．１ｐｐｍ、１ｐｐｍ、５ｐｐｍ、１０ｐｐｍ及び２０ｐｐｍとするように、維持培地で製造された、異なる粒径を有するリガンドで修飾したＣｕＮＣｓ試料又はリガンドで修飾した銅ナノ粒子試料１００μＬを添加した。リガンドで修飾したＣｕＮＣｓで２時間前処理した後、異なる細胞群にＭＰＰ^＋（最終濃度１ｍＭ）を添加した。これにより、ＳＨ－ｓｙ５ｙ細胞を含有しない空白対照群、ＳＨ－ｓｙ５ｙ細胞を含有するがＣｕＮＣｓ及びＭＰＰ^＋を含まない陰性対照群、ＳＨ－ｓｙ５ｙ細胞及び１ｍＭ ＭＰＰ^＋のみを含有する細胞対照群、ＳＨ－ｓｙ５ｙ細胞及び１００ｐｐｍのＣｕＮＣｓを含有するがＭＰＰ^＋を含まない試料対照群、及びＳＨ－ｓｙ５ｙ細胞と１ｍＭ ＭＰＰ^＋と対応するリガンド分子（最終濃度２０ｐｐｍ）とを含有するリガンド対照群を設置した。次いで、細胞を３７℃で２４時間培養した。培養培地を除去するために遠心分離した後、１０％ＣＣＫ－８を含む１００μＬの維持培地を各ウェルに添加し、次いで４時間インキュベートした後、各ウェルの吸光度を４５０ｎｍで測定した。吸光度は、ＭＰＰ^＋病変に対するリガンドで修飾したＣｕＮＣｓの事前保護及び治療効果を反映することができる。

【0133】

図１４を参照すると、ＭＰＰ^＋病変ＰＤ細胞（ＳＨ－ｓｙ５ｙ）モデルの細胞生存率に対するＣｕＮＣｓの影響を示す直方図を提供した。結果によれば、２４時間の培養後、１００ｐｐｍのＣｕＮＣｓを添加したが、ＭＰＰ^＋で処理されなかった試料対照群の細胞生存率は、空白対照群（１００％として設定）に対して１１０．０±６．２％に増加し（Ｐ＜０．０１）、ＣｕＮＣｓが非毒性であることを示唆している。１ｍＭ ＭＰＰ^＋を添加したが、ＣｕＮＣｓがないモデル対照群の細胞生存率は、５８．９±５．４％まで低下し（Ｐ＜０．０１、空白対照群に対して）、リガンド対照群の細胞生存率は５６．９±３．４％であり（Ｐ＜０．０１、空白対照群に対して）、リガンド自体がＭＰＰ^＋病変細胞の生存率を上昇させないことを示唆している。０．１ｐｐｍ、１ｐｐｍ、５ｐｐｍ、１０ｐｐｍ及び２０ｐｐｍのＣｕＮＣｓを添加した投与群の細胞生存率は７０．９±７．１％（Ｐ＜０．００１、モデル対照群に対して）、８９．３±４．１％（Ｐ＜０．００１、モデル対照群に対して）、９０．５±６．１％（Ｐ＜０．００１、モデル対照群に対して）、９２．８±４．８％（Ｐ＜０．００１、モデル対照群に対して）、８８．５±１．４％（Ｐ＜０．００１、モデル対照群に対して）に上昇した。この結果は、本発明により提供されるリガンドで修飾したＣｕＮＣｓが、ＰＤの神経細胞に対して著しい保護効果を有し、この効果は、リガンドでなくＣｕＮＣｓによるものであることを示唆している。

【0134】

Ｌ（Ｄ）－システイン、Ｎ－イソブタノイル－Ｌ（Ｄ）－システイン（Ｌ（Ｄ）－ＮＩＢＣ）及びＮ－アセチル－Ｌ（Ｄ）－システイン（Ｌ（Ｄ）－ＮＡＣ）等のその他のリガンドで修飾したＣｕＮＣｓについても、同じ工程を採用して実験を実施した。これらの効果は同様であり、詳細な説明を省略する。

【0135】

（１４）ＣｕＮＣｓの同定

【0136】

一つ又は複数のリガンドで修飾したＣｕＮＣｓを合成した。前記リガンドは、チミン、Ｌ（Ｄ）－システイン、及びＮ－イソブタノイル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＩＢＣ）、Ｎ－イソブタノイル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＩＢＣ）、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン及びＮ－アセチル－Ｄ－システイン等のその他のシステイン誘導体、システイン含有オリゴペプチド及びそれらの誘導体（Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニンジペプチド（ＣＲ）、Ｌ－アルギニン－Ｌ－システインジペプチド（ＲＣ）、Ｌ－システインＬ－ヒスチジン（ＣＨ）、グリシン－Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニントリペプチド（ＧＣＲ）、Ｌ－プロリン－Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニントリペプチド（ＰＣＲ）、Ｌ－グルタチオン（ＧＳＨ）、グリシン－Ｌ－セリン－Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニンテトラペプチド（ＧＳＣＲ）及びグリシン－Ｌ－システイン－Ｌ－セリン－Ｌ－アルギニンテトラペプチド（ＧＣＳＲ）等のジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、及びその他のシステイン含有ペプチドを含むが、これらに限定されない。）、及び１－[（２Ｓ）－２－メチル－３－チオール－１－オキソプロピル]－Ｌ－プロリン、チオグリコール酸、メルカプトエタノール、チオフェノール、Ｄ－３－Ｔｒｏｌｏｖｏｌ及びドデシルメルカプタンのうち一つ又は複数等のその他のチオール含有化合物を含む。

【0137】

以下に、ＧＳＨで修飾したＣｕＮＣｓの特徴データを例として示す。

【0138】

１）透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）による形態の観察

【0139】

試験粉末（ＧＳＨで修飾したＣｕＮＣｓ試料）を試料として、超純水に２ｍｇ／Ｌになるように溶解し、次いで、懸濁液滴法により試験試料を製造した。具体的な方法は、以下のとおりである。即ち、５μＬの試料を銅メッシュ上に滴下し、水が消失するまで自然に揮発させ、次いでＪＥＭ－２１００Ｆ ＳＴＥＭ／ＥＤＳ電界放出高分解能ＴＥＭにより試料の形態を観察した。

【0140】

図（１５）のパネルＡ及びパネルＢは、ＧＳＨで修飾したＣｕＮＣｓの典型的なＳＥＭ画像を示し、異なるＴＥＭ画像からそれらのサイズ分布を計算した。その結果、ＣｕＮＣｓが十分に分散され、それらのサイズが０．５－５．０ｎｍの範囲にあることを示した。

【0141】

２）Ｘ線光電子分光法

【0142】

Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）スペクトルを、ＥＳＣＡＬＡＢ ２５０Ｘｉ Ｘ線光電子分光計で測定した。両面導電性接着剤（３ｍｍ×３ｍｍ）をアルミニウム箔に付着させ、試験粉末を両面テープ上に均一に広げ、アルミニウム箔の層で被覆した。試料を８ＭＰａの圧力下で１分間保持した。表面上の残留粉末を除去し、次いで中心試料（１ｍｍ×１ｍｍ）をＸＰＳ試験のために切り出した。

【0143】

図１５のパネルＣは、ＣｕＮＣｓ中のＣｕ元素のＸＰＳスペクトルである。２つのピークは、それぞれ、９３１．９８及び９５１．８８ｅＶに現れ、Ｃｕの２ｐ_３／２及び２ｐ_１／２電子の結合エネルギーによるものである。９４２．０ｅＶ付近のＣｕ２ｐ_３／２サテライトピークの不在により、Ｃｕ（ＩＩ）電子が存在しないことが確認された。Ｃｕ（０）の結合エネルギーはＣｕ（Ｉ）のそれから０．１ｅＶだけ離れたため、Ｃｕ（Ｉ）の形成を排除することは不可能であり、得られたＧＳＨで修飾したＣｕＮＣｓ中のＣｕの原子価状態は、０から＋１の間にある可能性が最も高かった。

【0144】

３）フーリエ変換赤外（ＦＴ－ＩＲ）分光法

【0145】

ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ＬＳ ５５蛍光分光計でＦＴ－ＩＲスペクトルを試験した。試験粉末を超純水に溶解し、室温で測定した。走査範囲は２００～８００ｎｍであり、試料セルは１ｃｍの光路を有する標準石英キュベットであった。

【0146】

図１５のパネルＤは、ＧＳＨで修飾したＣｕＮＣｓ（上）とＧＳＨ（下）とのＦＴ－ＩＲ分光法の比較を示す。ＧＳＨは、数多くの特徴的ＩＲバンド、即ち、ＣＯＯＨ^－（１３９０及び１５００ｃｍ^－１）、Ｎ－Ｈストレッチ（３４１０ｃｍ^－１）、及びＮＨ_２基のＮ－Ｈ曲げ（１６１０ｃｍ^－１）を示した。２５０３ｃｍ^－１で観察されたピークは、Ｓ－Ｈストレッチ振動モードによるものである。Ｓ－Ｈストレッチ振動帯（２５０３ｃｍ^－１）以外のすべての対応する特徴的ＩＲバンドは、ＧＳＨで修飾したＣｕＮＣｓに見られる。これは、Ｓ－Ｈ結合が切断されること、及び、Ｃｕ－Ｓ結合を形成することにより、ＧＳＨ分子がＣｕＮＣｓの表面に結合されることを示唆している。

【0147】

４）蛍光分光法

【0148】

試験粉末を超純水に溶解し、室温で蛍光分光法により測定した。

【0149】

図１５のパネルＥに示されるように、ＣｕＮＣｓは、３６５ｎｍでの励起ピーク下で、５９５ｎｍでピークを有する赤色発光と、約８０ｎｍの対応する半値全幅（ＦＷＨＭ）とを示す。なお、凝集誘起発光特性のため、エタノールが溶液に添加されたとき、ＣｕＮＣｓのＦＬ強度が著しく改善された。さらに、大きなストークスシフト（２３０ｎｍ）は、蛍光プローブ及びバイオイメージングのための良好な見込みを示した。

【0150】

（１５）ＣｕＮＣｓのＣＡＴ活性

【0151】

現在、ＣＡＴ活性の検出は、紫外線吸収のみにより２４０ｎｍでの過酸化水素の紫外線吸収強度が特徴づけられる。しかしながら、合成された銅クラスターは、Ｈ_２Ｏ_２プロセスを触媒した後に変化する可能性があるので、紫外線吸収は、３００ｎｍ未満で大きく増加する。従って、本実験は、ＣｕＮＣｓにより触媒されるＨ_２Ｏ_２から生成された酸素を観察することによりＣｕＮＣｓの触媒効果を確認した。本実験は、Ｈ_２Ｏ_２の分解により生成された気泡を観察し、従って、実験的現象は、Ｈ_２Ｏ_２の濃度が高いほど明らかである。実験手順は以下の通りであった。

【0152】

室温で、１０％Ｈ_２Ｏ_２溶液（４ｍｌ）を試験管に添加し、次いで２０００ｐｐｍのＣｕＮＣｓ溶液（２ｍｌ）を添加し、３分間触媒した。図１６に示すように、左側の試験管は、ＣｕＮＣｓが添加された試験管であり、管壁にＨ_２Ｏ_２の触媒分解により生成された大量のＯ_２気泡を有し、右側の試験管は、等量の超純水が添加された対照群であり、明らかな気泡を有しなかった。本実験から、ＣｕＮＣｓが優れたカタラーゼ活性を有することがわかった。

【0153】

（１６）ＣｕＮＣｓのＧＰｘ活性

【0154】

銅クラスターのＧＰｘ活性を５，５'－ジチオビス－（２－ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）発色アッセイにより研究した。ＧＰｘは、過酸化水素と還元型グルタチオン（ＧＳＨ）との反応を促進して、水及び酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）を形成する。チオール含有化合物はＤＴＮＢと反応してＤＴＮＢのジスルフィド結合を切断して、２－ニトロ－５－チオ安息香酸（ＮＴＢ^－）を生成することができ、これは中性又はアルカリ性のｐＨ条件下で水中で、イオン化して、ＮＴＢ^２－二価アニオンを形成することができる。ＮＴＢ^２－は、４１２ｎｍでの吸光度を測定することにより定量することができ、それにより、反応におけるＧＳＨの量を定量することができる。

【0155】

実験手順は以下の通りであった。

【0156】

以下の試薬を試験管に室温で順次添加した。

【0157】

（１）０．２ｍｌの一定濃度のＣｕＮＣｓ溶液（適切な量のＣｕＮＣｓをＰＢＳ緩衝液に溶解したもの）。

【0158】

（２）０．５ｍｌのＧＳＨ（１ｍＭ）（適切な量のＧＳＨ粉末をＰＢＳ緩衝液に溶解したもの）。

【0159】

（３）０．５ｍｌのＨ_２Ｏ_２溶液（１．５ｍＭ）

【0160】

（４）０．２ｍｌの１％クエン酸ナトリウムを含むＤＴＮＢ（１ｍＭ）（０．３ｇのクエン酸三ナトリウム二水和物をＰＢＳ緩衝液（３０ｍｌ）に溶解し、それにＤＴＮＢを溶解し、超音波処理を行ったもの）。

【0161】

試験管を穏やかに振盪することにより溶液を混合し、ＵＶスペクトルを検出した。

【0162】

ブランク群では、ＣｕＮＣｓ溶液を０．２ｍｌ ＰＢＳ緩衝液で置き換えた；実験群は、銅クラスターの濃度及び触媒時間を変化させることにより触媒効果を研究した。

【0163】

図１７ａは、異なる濃度の銅クラスター（３０ｐｐｍ、６０ｐｐｍ、９０ｐｐｍ、１２０ｐｐｍ、１５０ｐｐｍ）について室温で５分間触媒することにより得られた実験結果を示す。４１２ｎｍでのＵＶ吸収が触媒濃度の増加に従って著しく減少することが見出され、システム中のＧＳＨが触媒濃度の増加と共に減少したことがわかった。これからも、触媒の増加と伴い、より多くのＨ_２Ｏ_２がＧＳＨを酸化させたことを意味する。

【0164】

その後の実験の結果を観察するために、反応時間を延長した。図１７ｂは、１３分間の触媒作用後の結果を示す。銅クラスター濃度が３０ｐｐｍ及び６０ｐｐｍであると、紫外線吸収が減少し続け、触媒反応が継続していることを示し、一方、銅ナノクラスター濃度が９０ｐｐｍ以上である場合には、反応はほとんど停止し、ＧＳＨがほとんど完全に触媒されたことを示した。従って、９０ｐｐｍを選択して連続モニタリングを行った。

【0165】

図１７ｃに示すように、触媒反応が開始時に遅く、触媒速度は反応が進行するにつれて徐々に増加し、触媒反応は１１～１３分間でほとんど完了した。

【0166】

（１７）ＣｕＮＣｓのＳＯＤ活性

【0167】

ＳＯＤ活性アッセイは、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）アッセイキット（Ｎａｎｊｉｎｇ Ｊｉａｎｃｈｅｎｇ Ｂｉｏ）を用いて測定した。要するに、レンゲオキシダーゼ及びキサンチンオキシダーゼを反応させてスーパーオキシドを生成し、さらにＷＳＴ－１（２－（４－ヨードフェニル）－３－（４－ニトロフェニル）－５－（２，４－ジフェニル）－２Ｈ－テトラゾリウム）を還元し、生成したホルマザンを４４０ｎｍの紫外スペクトルにおいて検出する。４４０ｎｍでの紫外線吸収の減少を観察するために、銅クラスターを添加することによりＳＯＤ活性を判定した。

【0168】

基質作用溶液の調製：基質原液：緩衝溶液を１：２００の比率で混合して、現在使用される基質作用溶液を調製した。

【0169】

酵素作用溶液の調製：酵素原液：酵素希釈溶液を１：１０の比率で混合して、現在使用される酵素作用溶液を調製した。

【0170】

実験群は以下のように設定した。

【0171】

上記の設定によれば、９６ウェルプレート中のウェルに、（１）基質作用溶液、（２）酵素希釈溶液、（３）被験試料又は蒸留水、及び（（４）酵素作用溶液を順次に添加した。混合されたウェルをマイクロプレートリーダーで３７℃でインキュベートし、４５０ｎｍでＵＶ吸光度を読み取った。

【0172】

図１８ａは、異なる濃度のＣｕＮＣｓを用いて６０分間のインキュベーションの間、４５０ｎｍでのＵＶ吸光度を示す。図１８ａに示すように、ＣｕＮＣｓの濃度が増加したと伴い、インキュベーションの間にＵＶ吸収値が徐々に減少し、ＣｕＮＣｓの各用量に対するＵＶ吸収値は３０分後に平坦化された。これから、ＣｕＮＣｓが優れたＳＯＤ活性を有し、そのＳＯＤ活性がＣｕＮＣｓの濃度の増加と伴い増加したことがわかった。上記の結果から、２０分間のインキュベーション時間でのＵＶ吸収値を選択してＳＯＤ阻害率を計算した。図１８ｂに示すように、６０ｐｐｍ、９０ｐｐｍ、１２０ｐｐｍ、１５０ｐｐｍ、及び１８０ｐｐｍでＣｕＮＣｓのＳＯＤ阻害率は、それぞれ、１６．９％、２３．２％、３３．７％、４４．８％、及び５５．２％であった。ＳＯＤ活性は、ＳＯＤ阻害率が反応系において５０％に達する際にＳＯＤ活性単位に対応する酵素の量を意味する。従って、例えば、１５０ｐｐｍのＣｕＮＣｓは、１０．２４Ｕ／ｍｇのＳＯＤ活性を有する。

【0173】

実験結果から、合成されたＧＳＨ－ＣｕＮＣｓが、カタラーゼ（ＣＡＴ）、グルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰｘ）及びスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）という異なる構造及び機能を有する３つの主要抗酸化酵素の酵素活性を有することがわかった。

【0174】

（１８）Ｈ_２Ｏ_２誘発緑内障細胞（ＲＧＣ－５）モデル

【0175】

この実施形態では、細胞生存率を指標として用いて、Ｈ_２Ｏ_２により誘導される細胞毒性についてリガンドで修飾した銅ナノクラスター（ＣｕＮＣｓ）の効果を試験した。ｃｃｋ－８アッセイの結果は、ＣｕＮＣｓが網膜神経節細胞（ＲＧＣ）における酸化ストレス誘導損傷に対する神経保護効果を有することを示した。

【0176】

対数増殖期のＲＧＣ－５細胞を完全培地（ＤＭＥＭ培地＋１０％ＦＢＳ＋１％ペニシリン－ストレプトマイシン）で５×１０^４／ｍｌの密度の細胞懸濁液に希釈し、９６ウェルプレート中１００μＬ／ウェルで接種した。細胞を５％ＣＯ_２インキュベーター中で３７℃で培養した。細胞を付着させた後、元の培養液を廃棄し、維持培地（ＤＭＥＭ培地＋２％ＦＢＳ＋１％ペニシリン－ストレプトマイシン）から調製した５０μｌの異なる濃度のＣｕＮＣｓをそれぞれのウェルに加えた。最終濃度は、それぞれ、０．５、５及び２０ｐｐｍであった（即ち、それぞれ、図１９中の５、６、７）。２時間前処理後、約５０μｌのＨ_２Ｏ_２（最終濃度１０５μＭ）を加えた。細胞を２４時間インキュベートし、１０％ＣＣＫ－８を各ウェルに加え、各ウェルの吸光度値を４５０ｎｍの波長で測定し、Ｈ_２Ｏ_２誘発損傷に対するＣｕＮＣｓの保護効果を評価した。上記実験では、細胞を処理しなかったブランク対照群、１０５μＭのＨ_２Ｏ_２で細胞を処理したモデル対照群、１００ｐｐｍのＣｕＮＣｓを添加したがＨ_２Ｏ_２を添加しなかったＣｕＮＣｓ対照群、及び２０ｐｐｍのリガンドと１０５μＭのＨ_２Ｏ_２を添加した配位子対照群（即ち、それぞれ、図１９中の１、２、３、４）を提供した。

【0177】

図１９に示すように、ＧＳＨで修飾したＣｕＮＣｓの実験結果を例として挙げる。その結果は、２４時間の培養後に、１００ｐｐｍのＣｕＮＣを補充したが、Ｈ_２Ｏ_２で処理されなかった銅クラスター対照群（即ち、群２）の細胞生存率は、ブランク対照群（即ち、群１）（１００％）に対して１０３．２±７．０％であり（Ｐ＞０．０５）、ＣｕＮＣが非毒性であったことがわかった。１００μＭ Ｈ_２Ｏ_２を添加したが、ＣｕＮＣを添加しなかったモデル対照群（即ち、群３）の細胞生存率は、ブランク対照群の５８．０±６．２％まで低下した（Ｐ＜０．００５）。２０ｐｐｍのＧＳＨ及び１００μｍのＨ_２Ｏ_２を添加したリガンド対照群（即ち、群４）の細胞生存率は、ブランク対照群の５６．５±５．９％であり（ブランク対照群との比較する場合Ｐ＜０．０１、モデル対照群と比較する場合Ｐ＞０．０５）、単独で使用したときに、リガンドが、Ｈ_２Ｏ_２誘発損傷細胞モデルにおける細胞生存率を増加させないことがわかった。０．５ｐｐｍ （即ち、群５）、５ｐｐｍ （即ち、群６）及び２０ｐｐｍ （即ち、群７）ＣｕＮＣｓでの投与群の細胞生存率は、６５．９±４．５％（モデル対照群と比較する場合ｐ＜０．０５）、８７．１±７．４％（モデル対照群と比較する場合ｐ＜０．０１）、及び９１．２±５．７％（モデル対照群と比較する場合ｐ＜０．０１）に増加した。

【0178】

上記の結果によれば、本発明のＣｕＮＣｓが、Ｈ_２Ｏ_２誘発損傷ＲＧＣ細胞モデルにおける細胞生存率を有意に改善することができ、酸化ストレスにより誘導されるＲＧＣ細胞のアポトーシスに抵抗することができる一方、ＧＳＨが、酸化ストレスにより誘導されるＲＧＣ細胞のアポトーシスに明らかな影響を及ばないことがわかった。

【0179】

他のリガンドで修飾したＣｕＮＣｓも同様の工程の後に試験されており、同様の効果を有するため、ここで説明を省略する。

【0180】

（１９）多発性硬化症（ＭＳ）マウスモデル

【0181】

実験的自己免疫性脳炎（ＥＡＥ）は、主としてＣＤ４^＋ Ｔ細胞によって媒介されるＭＳに対応する古典的な動物モデルである。抗原増感されたＣＤ４^＋ Ｔ細胞が血液脳関門を横切って中枢神経系に入ると、それらは自己のミエリン抗原に対する免疫応答を誘発し、脳及び脊髄に免疫損傷をもたらす。ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）は、ミエリン膜及びオリゴデンドロサイトの最外層に存在するため、高免疫原性であり、抗ＭＯＧ抗体がＭＳの病因において重要な役割を果たしているという証拠がある。そのため、ＭＯＧ ３５－５５を持つＣ５７ＢＬ／６マウスを免疫することによってＥＡＥモデルを誘導した。

【0182】

（１）材料

【0183】

１０週齢の１８匹の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｗｕｈａｎ Ｗａｎｑｉａｎ Ｊｉａｘｉｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入した）、Ｈｏｏｋｅ ｋｉｔ^ＴＭ ＭＯＧ３５－５５／ＣＦＡ Ｅｍｕｌｓｉｏｎ ＰＴＸ Ｋｉｔ （Ｃａｔ．Ｎｏ．ＥＫ－２１１０）（Ｈｏｏｋｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ （ＵＳＡ）から購入した）。

【0184】

（２）ＥＡＥモデル確立

【0185】

ａ．マウスを、異なる身体部位（Ｈｏｏｋｅ ｋｉｔ^ＴＭ ＭＯＧ３５－５５／ＣＦＡ Ｅｍｕｌｓｉｏｎ ＰＴＸ ｋｉｔ）で、１部位あたり０．１ｍｌ、各マウスについて０．２ｍｌ、２回抗原乳化剤を皮下注射した。

【0186】

ｂ．２時間後、ＰＴＸ毒素（Ｈｏｏｋｅ ｋｉｔ^ＴＭ ＭＯＧ３５－５５／ＣＦＡ Ｅｍｕｌｓｉｏｎ ＰＴＸ ｋｉｔ）を最初に注射した。各マウスに０．１ｍｌのＰＴＸ毒素を腹腔内注射した。

【0187】

ｃ．２４時間後、各マウスにＰＴＸ毒素を１回繰り返し注入した。

【0188】

ＰＴＸ毒素（キット中のＰＴＸを２００ｎｇ／μｌの濃度でグリセロールに溶解し、使用したときにＰＢＳ溶液に溶解し、各時間で新たに調製し、分注後２時間以内に使用した）は、以下の通り調製された。

【0189】

１）まず、実験で使用したマウスの数に基づいて注射に必要なＰＢＳ溶液の体積を計算した。一般に、０．１２ｍｌのＰＢＳ溶液を必要とすると仮定した。次いで、必要なＰＢＳ溶液を５０ｍｌの試験管に加えた

【0190】

２）次いで、必要な用量のＰＴＸ毒素を計算した。典型的には、各マウスの注射ごとに８０ｎｇのＰＴＸが必要である。必要なＰＴＸの総量は、実験で使用されたマウスの数に基づいて計算された。

【0191】

ＰＴＸ（ｕｌ）=マウス＊ＰＴＸ用量＊１．２／２００ｎｇ／ｕｌ （キット中のＰＴＸ濃度）

【0192】

３）次いで、ＰＴＸを、溶解のためにＰＢＳを含有する５０ｍｌの管に入れた。

【0193】

（３）実験

【0194】

１８匹のＣ５７ＢＬ／６マウスをランダムに３つの群（ｎ＝６）：ＰＴＸのみを投与するモデル対照群、ＰＴＸ及びＣｕＮＣｓを同時に投与する治療群、及び正常対照群、各群６匹のラットに無作為に分けた。治療群については、銅クラスター薬物を、モデリングの開始日に尾静脈を注射することにより１日に３０ｐｐｍの用量で投与した。正常対照群について、正常のマウスに、１日当たりの銅クラスター溶液と同じ体積の生理食塩水を注射した。

【0195】

マウスを毎日観察し、神経学的機能を評価した。スコアリング基準は、０点、後肢の延長、尾の延長、正常の歩容；１点、後肢の延長、尾部の張力消失、正常の歩容；１．５点、尾の垂下、後肢の動きが異常であり；２点、両後足の動きが弱く、マウスの歩容は調整されず、尾部は垂下している；２．５点、尾部は垂下し、後肢はドラッグされる；３点、二重後肢麻痺、尾垂下；４点、二重後肢麻痺、前肢麻痺、または筋肉の弱さ、尾の垂下；５点、動きなし、接触に応答しない、呼吸の変化、突然死又は死。

【0196】

（４）結果

【0197】

図２０は、ＥＡＥによってモデル化された多発性硬化症マウスモデルの運動挙動に対するＧＳＨ修飾銅クラスター（ＣｕＮＣｓ）の効果を示すグラフである。図２０に示すように、モデル対照群は、１０日目に明らかな運動障害を示し始め、１３日目から１４日目の下肢に痰が現れ始めたことに対して、正常対照群は、実験終了時の運動能力の有意な変化を示さなかったが。これは、モデルが成功したことを示した。治療群は、１４日目の尾のわずかなたるみの症状を示したが、実験の終わりまで及び正常マウスに対して有意な差を示さなかった。ＣｕＮＣｓ薬剤は、ＥＡＥマウスモデルの運動挙動に有意な保護効果を有し、多発性硬化症の予防及び治療に使用することができることを示した。

【0198】

Ｌ（Ｄ）－システイン、Ｎ－イソブタノイル－Ｌ（Ｄ）－システイン（Ｌ （Ｄ）－ＮＩＢＣ）及びＮ－アセチル－Ｌ（Ｄ）－システイン（Ｌ（Ｄ）－ＮＡＣ）等の他のリガンドで修飾したＣｕＮＣｓも、同じ手順で試験した。これらの効果は同様であるので、ここでは詳細には説明しない。

【0199】

本発明を特定の実施形態を参照して説明してきたが、実施形態は例示的なものであり、本発明の範囲はそれに限定されないことが理解されるべきである。本発明に係る分野の当業者にとって、本発明の他の実施形態は自明である。このような代替実施形態は、いずれも本発明の範囲内に包含されると考えられる。したがって、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲により定義され、前記の説明によりサポートされる。

【国際調査報告】