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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-04-21
(54)【発明の名称】幹細胞の大規模調製のための三次元培養方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/00 20060101AFI20220414BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20220414BHJP
C12N 5/0735 20100101ALI20220414BHJP
C12N 5/074 20100101ALI20220414BHJP
C12N 5/0775 20100101ALI20220414BHJP
C12N 1/02 20060101ALI20220414BHJP
C12N 1/04 20060101ALI20220414BHJP
C12M 1/00 20060101ALI20220414BHJP
C12M 1/26 20060101ALI20220414BHJP
C12M 3/00 20060101ALI20220414BHJP
【ＦＩ】
C12N5/00
C12N5/10
C12N5/0735
C12N5/074
C12N5/0775
C12N1/02
C12N1/04
C12M1/00 A
C12M1/00 C
C12M1/26
C12M3/00 A
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021544774
(86)(22)【出願日】2019-10-14
(85)【翻訳文提出日】2021-10-04
(86)【国際出願番号】 CN2019110956
(87)【国際公開番号】W WO2020155668
(87)【国際公開日】2020-08-06
(31)【優先権主張番号】201910812773.2
(32)【優先日】2019-08-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(31)【優先権主張番号】201910476110.8
(32)【優先日】2019-06-03
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(31)【優先権主張番号】201910505614.8
(32)【優先日】2019-06-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(31)【優先権主張番号】201910097650.5
(32)【優先日】2019-01-31
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(31)【優先権主張番号】201910098003.6
(32)【優先日】2019-01-31
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(31)【優先権主張番号】201910101736.0
(32)【優先日】2019-01-31
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】520162031
【氏名又は名称】北京華龕生物科技有限公司
(74)【代理人】
【識別番号】100123788
【弁理士】
【氏名又は名称】宮崎 昭夫
(74)【代理人】
【識別番号】100127454
【弁理士】
【氏名又は名称】緒方 雅昭
(72)【発明者】
【氏名】ヤン、 シャオジュン
(72)【発明者】
【氏名】リウ、 ウエイ
(72)【発明者】
【氏名】ザン、 クン
【テーマコード（参考）】
4B029
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B029AA02
4B029AA08
4B029AA09
4B029AA21
4B029BB11
4B029CC01
4B029CC02
4B029CC13
4B029GA08
4B029GB10
4B029HA05
4B065AA93X
4B065AC20
4B065BA30
4B065BC01
4B065BC41
4B065BD09
4B065BD12
4B065BD15
4B065CA44
4B065CA60
(57)【要約】
三次元マイクロキャリアーに基づく細胞蘇生方法、三次元マイクロキャリアーに基づくｉｎ ｓｉｔｕ継代方法、細胞のｉｎ ｓｉｔｕ凍結保存方法における三次元マイクロキャリアー、三次元マイクロキャリアー細胞吸着培養法、三次元マイクロキャリアー上の細胞を採取する方法、マイクロキャリアー上で培養した細胞をサンプリングする方法、三次元マイクロキャリアーを用いた細胞大規模増殖方法を含む、幹細胞の大規模培養のための三次元培養法。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
三次元マイクロキャリアに基づく細胞蘇生方法、三次元マイクロキャリア細胞培養に基づくｉｎ ｓｉｔｕ継代方法、および三次元マイクロキャリアに基づくｉｎ ｓｉｔｕ細胞凍結保存方法を含む、三次元マイクロキャリアに基づく細胞培養方法のセットであって；三次元マイクロキャリアに基づく細胞蘇生方法は以下の工程：細胞蘇生および培養のために、三次元マイクロキャリア上に解凍後に、凍結保存された細胞または凍結保存された細胞微小組織の細胞懸濁液を接種する工程を含み；
三次元マイクロキャリア細胞培養に基づくｉｎ ｓｉｔｕ継代方法は、以下の工程：シードマイクロキャリアを新しいマイクロキャリアに挿入する工程を含み；ここでシードマイクロキャリアは継代される細胞と共に培養されるマイクロキャリアであり；
三次元マイクロキャリアに基づくｉｎ ｓｉｔｕ細胞凍結保存方法は、以下の工程：
（Ａ１）細胞の三次元マイクロキャリア懸濁液を遠心分離し、上清を廃棄して、細胞含有キャリアを得る工程と； （Ａ２）工程（Ａ１）で得られた細胞含有キャリアを凍結保存溶液と混合し、極低温貯蔵管に加える工程と；
（Ａ３）工程（Ａ２）で細胞含有キャリアを加えた極低温貯蔵管を冷却し、次いでそれを液体窒素に移し、三次元マイクロキャリア上の細胞のｉｎ ｓｉｔｕ凍結保存を可能にする工程と、を含む。
【請求項2】
前記方法が三次元マイクロキャリア上での細胞付着培養の方法、三次元マイクロキャリア上の細胞を採取する方法、およびマイクロキャリア上で培養された細胞をサンプリングする方法をさらに含み、三次元マイクロキャリア上の細胞付着培養の方法は、三次元マイクロキャリア上で細胞を接種するために使用され、三次元マイクロキャリア上の細胞を採取する方法は、三次元マイクロキャリアから細胞を分離するために使用され、マイクロキャリア上で培養された細胞をサンプリングする方法は、マイクロキャリア上で培養された細胞の総数および／または細胞密度の計算を実行するために使用される、請求項１に記載の方法であって；三次元マイクロキャリア上での細胞付着培養の方法は以下の工程：（Ｂ１）細胞接種：細胞懸濁液を乾燥三次元マイクロキャリアと混合して、細胞懸濁液と混合されたマイクロキャリアを得る工程と；（Ｂ２）細胞付着：工程（Ｂ１）で得られた細胞懸濁液と混合されたマイクロキャリアを、細胞が三次元マイクロキャリアに付着するようにインキュベートする工程と；（Ｂ３）細胞培養：工程（Ｂ２）での細胞付着後、完全培養培地を添加し、培養を実施する工程とを含み；
三次元マイクロキャリア上の細胞を採取する方法は以下の工程：（Ｃ１）培養細胞に付着した三次元マイクロキャリアを自然沈殿または遠心分離し、上清を除去して細胞を含む三次元マイクロキャリアを得る工程と；（Ｃ２）細胞を含む三次元マイクロキャリアに溶解液を添加し、その中の三次元マイクロキャリアをインキュベートおよび溶解する工程と；（Ｃ３）工程（Ｃ２）において三次元マイクロキャリアを完全に溶解した後、溶解を終了させるために停止液を添加する工程または直接工程（Ｃ４）に進んで溶解を終了させる工程と；（Ｃ４）工程（Ｃ３）において得られた系を遠心分離し、上清を廃棄し、三次元マイクロキャリア上の細胞を採取する工程と、を含み；
マイクロキャリア上で培養された細胞をサンプリングする方法は以下の工程：（Ｄ１）細胞培養のための所定重量のマイクロキャリアを秤量し、それらをサンプリングチューブに入れ、細胞培養プロセスをシミュレートするために液体を添加し、それらを４～６０℃で０～２４時間浸漬し、次いで、サンプリングチューブ上のマイクロキャリアによって占められる体積に対応するスケールを標準スケールとしてマーキングする工程と；（Ｄ２）マイクロキャリア上で培養された細胞を、次のように、マイクロキャリアの体積を標準スケールにするために、サンプリングチューブを用いて細胞培養系からマイクロキャリアをサンプリングする工程と、を含む。
【請求項3】
前記三次元マイクロキャリアに基づく細胞蘇生方法が、三次元マイクロキャリアに基づく動的細胞蘇生方法または三次元マイクロキャリアに基づく静的細胞蘇生方法である請求項１または２に記載の方法であって；三次元マイクロキャリアに基づく動的細胞蘇生方法は、以下の工程：（Ｅ１）三次元マイクロキャリアを採取し、細胞培養容器に入れ、細胞培養培地を添加し、直ちに次の工程または、放置または撹拌する処理方法で１分間以上処理する工程と；（Ｅ２）凍結保存された細胞又は凍結保存された細胞微小組織を解凍して得た細胞懸濁液を工程（Ｅ１）で調製したマイクロキャリアを含む細胞培養容器に３７℃で接種し、次いで細胞培養培地を添加し、培地に対するマイクロキャリアの比率を１ｍｇ：１～１０００μＬに調整し、次いで細胞培養容器を攪拌機上に置き、インキュベーター中で攪拌する工程と；（Ｅ３）工程（Ｅ２）の完了後、細胞蘇生が完了するまで細胞を攪拌し続ける工程と、を含み；
三次元マイクロキャリアに基づく静的細胞蘇生方法は、以下の工程：（Ｆ１）静的培養容器およびマイクロキャリアの調製：三次元マイクロキャリアを採取し、細胞培養容器に入れる工程と；（Ｆ２）凍結保存細胞の解凍、接種：凍結保存細胞または凍結保存細胞微小組織を採取し、３７℃で解凍し、次いで工程（Ｆ１）で調製したマイクロキャリアを含む静的培養容器に２０～２４０分間接種する工程と；（Ｆ３）工程（Ｆ２）の完了後、細胞蘇生が完了するまで細胞を培養し続ける工程と、を含む。
【請求項4】
撹拌が一定速度撹拌または可変速度交互撹拌または可変速度周期撹拌であり、撹拌が時計方向の撹拌、反時計方向の撹拌または交互方向での撹拌であり、撹拌時間が０．１～１００時間であり、撹拌速度が１～２００ｒｐｍである請求項３に記載の方法。
【請求項5】
撹拌が次の（ａ）又は（ｂ）又は（ｃ）のとおりである、請求項４に記載の方法：（ａ）１～４時間放置した後、時計方向に周期的な可変速度で１～２４時間撹拌し、その後、時計方向に９６時間まで一定速度で撹拌する；
（ｂ）周期的な可変速度で時計方向に１～２４時間撹拌した後、９６時間まで時計方向に一定速度で撹拌する；
（ｃ）１～９６時間、一定速度で時計方向に撹拌する。
【請求項6】
工程（Ｅ２）または（Ｆ２）において、マイクロキャリアに対する細胞数の比率が、５～１００×１０３細胞／ｍｇマイクロキャリアである、請求項３～５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項7】
前記三次元マイクロキャリア細胞培養に基づくｉｎ ｓｉｔｕ継代方法において、前記シードマイクロキャリアは１０，０００～１，０００，０００細胞／ｍｇマイクロキャリアの細胞密度を有し、前記シードマイクロキャリア対新しいマイクロキャリアの比は、０．０００２～２００ｍｇシードマイクロキャリア／ｍｇ新しいマイクロキャリアである、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項8】
三次元マイクロキャリア細胞培養に基づくｉｎ ｓｉｔｕ継代方法が、三次元マイクロキャリア細胞培養に基づく動的なｉｎ ｓｉｔｕ継代方法または三次元マイクロキャリア細胞培養に基づく静的なｉｎ ｓｉｔｕ継代方法である請求項１～６のいずれか１項に記載の方法であって；三次元マイクロキャリア細胞培養に基づく動的なｉｎ ｓｉｔｕ継代方法は以下の工程：（Ｇ１）新しいマイクロキャリア懸濁液の調製工程：インペラー内蔵細胞培養フラスコに新しいマイクロキャリアを入れ、細胞培養培地を１～２，０００μＬ：１ｍｇのマイクロキャリアの比で添加し、新しいマイクロキャリア懸濁液を得るために０時間を超えて静置または撹拌する；（Ｇ２）シードマイクロキャリア懸濁液の調製工程：シードマイクロキャリアは１０，０００～１００万細胞／ｍｇマイクロキャリアの細胞密度を有し、シードマイクロキャリアを０．１～５０ｍｇ／ｍＬに細胞培養培地で再懸濁してシードマイクロキャリア懸濁液を得る；（Ｇ３）接種工程：（Ｇ１）で調製した新しいマイクロキャリア懸濁液を含むインペラー内蔵細胞培養フラスコに、（Ｇ２）で調製されたシードマイクロキャリア懸濁液を混合する工程であって、（Ｇ１）で調製された新しいマイクロキャリアに対するシードマイクロキャリアの比は０．０００２～２００ｍｇのシードマイクロキャリア／ｍｇの新しいマイクロキャリアであり、培地に対するマイクロキャリアの比を１ｍｇ：１～１０００μＬに調整するために細胞培養培地を添加し工程、インペラー内蔵細胞培養フラスコを攪拌機上に置き、０～１００時間攪拌するためにインキュベーター中に置く；（Ｇ４）培養工程：攪拌を続け、動的なｉｎ ｓｉｔｕ継代を完了する、を含み；
三次元マイクロキャリア細胞培養に基づく静的なｉｎ ｓｉｔｕ継代方法は、以下の工程：（Ｈ１）シードマイクロキャリア懸濁液の調製工程：シードマイクロキャリアの細胞密度が１０，０００～１，０００，０００細胞／ｍｇマイクロキャリアであり、シードマイクロキャリアを細胞培養培地で０．１～５０ｍｇ／ｍＬに再懸濁してシードマイクロキャリア懸濁液を得る；（Ｈ２）接種工程：（Ｈ１）で調製されたシードマイクロキャリア懸濁液を新しいマイクロキャリアに滴下する、シードマイクロキャリアと新しいマイクロキャリアとの比は０．０００２～２００ｍｇシードマイクロキャリア／ｍｇ新しいマイクロキャリアであり、十分に混合し、インキュベーションするためにインキュベーター中に０．５～２４時間置く；（Ｈ３）培養工程：細胞培養培地を添加し、培養を継続する、すなわち静的なｉｎ ｓｉｔｕ継代を完了する、を含む。
【請求項9】
請求項８に記載の方法であって、工程（Ｇ１）において、インペラ内蔵細胞培養フラスコに入れた新しいマイクロキャリアと細胞培養培地の割合がマイクロキャリア１００ｍｇ／細胞培養培地１０ｍＬであり、インペラ内蔵細胞培養フラスコに入れた後、０．１～２４時間放置し方法；
工程（Ｇ２）において、シードマイクロキャリア中の細胞密度は、１５０，０００～５００，０００細胞／ｍｇマイクロキャリアであり；および／またはシードマイクロキャリア懸濁液中のシードマイクロキャリアの含有量が１～１０ｍｇ／ｍＬである；
工程（Ｇ３）、シードマイクロキャリアの新しいマイクロキャリアに対する比率は１～１０ｍｇのシードマイクロキャリア／１００ｍｇの新しいマイクロキャリアであり；および／またはマイクロキャリアの培地に対する比率が細胞培養培地を添加することによって１～１０ｍｇ：１ｍＬに調節され；および／または撹拌速度が１ｒｐｍ～２００ｒｐｍであり、撹拌は定速撹拌または可変速交互撹拌または可変速周期撹拌によるものであり、撹拌方向は、時計方向撹拌、反時計方向撹拌または交互方向撹拌である方法。
【請求項10】
請求項８または９に記載の方法であって、工程（Ｈ１）において、シードマイクロキャリア中の細胞密度が１２０，０００～５００，０００細胞／ｍｇマイクロキャリアであり、シードマイクロキャリア懸濁液中のシードマイクロキャリアの含有量が５～１５ｍｇ／ｍＬであり方法；
工程（Ｈ２）において、シードマイクロキャリア対新しいマイクロキャリアの比は、１～３ｍｇシードマイクロキャリア／２０ｍｇ新しいマイクロキャリアであり；および／またはインキュベーション時間が０～２４時間である方法。
【請求項11】
前記三次元マイクロキャリアに基づくｉｎ ｓｉｔｕ細胞凍結保存方法において、前記工程（Ａ１）において、前記遠心分離は５０～１６１０×ｇの速度で１～１０分の時間行われ、前記工程（Ａ２）において、前記細胞含有キャリアの質量に対する凍結保存溶液の体積の比は１ｍＬ：０．１～５０ｍｇである請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項12】
前記三次元マイクロキャリアに基づくｉｎ ｓｉｔｕ細胞凍結保存方法において、凍結保存溶液が１０％ＤＭＳＯ、１０～９０％ＦＢＳおよび０～８０％基礎媒地、１０％ＤＭＳＯおよび０～８０％基礎培地、１０～９０％ＦＢＳおよび０～８０％基礎培地、又は他の市販入手可能な凍結保存溶液から成るものであり、極低温貯蔵管を冷凍機に置き、－２０～－１９６℃に冷却し、該冷却がプログラムされているかまたはプログラムされておらず、プログラムされた冷却は－１～－１５℃／分の冷却速度を有し、冷凍時間は１～２４時間である、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項13】
請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法であって、前記三次元マイクロキャリアに基づくｉｎ ｓｉｔｕ細胞凍結保存方法において、前記冷却は前記工程（Ａ２）において、前記極低温貯蔵管を細胞冷却ボックスに入れ、冷却のために１～１０分以内に冷凍機に入れることによって行われ、前記極低温貯蔵管に添加された３７℃の予熱されたＰＢＳまたは基礎培地は１：５～３０の比率で希釈される、方法。
【請求項14】
前記三次元マイクロキャリアに基づくｉｎ ｓｉｔｕ細胞凍結保存方法において、前記工程（Ａ３）の後に、細胞蘇生工程：前記工程（Ａ３）の処理後の前記極低温保存管を水浴中に置き、前記極低温保存管中の氷が溶融したときに前記水浴を除去することによって、前記細胞を蘇生し；次いで、３７℃の予熱されたＰＢＳまたは基礎培地を添加して前記細胞を希釈し、次いで遠心分離する工程を有し；前記水浴は、３５～０℃の温度および１～５分の時間を有し；前記工程（Ａ３）の後の前記遠心分離が５０～１６１０×ｇの速度で１～１０分間行われる、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項15】
前記三次元マイクロキャリア上の細胞付着培養方法において、前記細胞懸濁液は１×１０４～１×１０８細胞／ｍＬの密度を有し、前記細胞懸濁液は前記細胞を培養液又は液体生体マトリックス原料に再懸濁したものであり、前記三次元マイクロキャリアの質量に対する前記細胞懸濁液の体積の比率は１～１０００μＬ ：１ｍｇであり、前記工程（Ｂ１）において、前記細胞懸濁液を前記三次元マイクロキャリアと混合し、前記細胞懸濁液を前記三次元マイクロキャリアに滴下することを特徴とする請求項２～１４のいずれか１項に記載の三次元マイクロキャリア上の細胞付着培養方法。
【請求項16】
三次元マイクロキャリア上での細胞付着培養の方法において、インキュベーション条件は温度３５～４０℃、時間０．５～２４時間、二酸化炭素の体積百分率濃度５～３０％であり、付着法は、重力付着法、膨潤付着法、撹拌回転式の付着法、遠心法、弾性表面波法または磁気付着法を含む、請求項２～１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項17】
三次元マイクロキャリア上での細胞付着培養の方法において、培養条件は３５～４０℃の温度、５～３０体積％の二酸化炭素のパーセンテージ濃度；三次元マイクロキャリアは多孔質マイクロキャリアであり；工程（Ｂ１）の前に、３次元マイクロキャリアをガス滅菌、放射線滅菌またはＵＶ滅菌する工程がある、請求項２～１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項18】
３次元マイクロキャリア上で細胞を採取するための方法において、溶解溶液が細胞付着を排除してマイクロキャリアを溶解するための活性成分を含み、活性成分が、コラゲナーゼ、ペプシン、ヒアルロニダーゼ、ディスパーゼ、中性プロテアーゼ、プロテイナーゼＫ、マトリックスメタロプロテイナーゼ、クエン酸ナトリウム、トリプシン、デオキシリボヌクレアーゼ、トリプシン置換物、タンパク質ヒドロラーゼ、エチレンジアミン四酢酸、リゾチームおよびグルタチオンのうちの少なくとも１つの水溶液から選択される、請求項２～１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項19】
前記三次元マイクロキャリア上で細胞を採取する方法において、前記工程（Ｃ１）において、前記遠心分離を５０～１６１０×ｇの速度で１～１０分間行い、前記上清を除去する工程は遠心分離を行い、前記上清をピペッティングした後、適量のＰＢＳを加え、手で２０～３０秒間穏やかに振り混ぜ、前記上清をピペッティングし、前記ＰＢＳ洗浄を１回繰り返すことを特徴とする請求項２～１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項20】
三次元マイクロキャリア上に細胞を採取する方法において、細胞を付着させ培養するための三次元マイクロキャリアの質量と溶解溶液の体積との比が１ｍｇ ： ０．０１～５ｍＬであり、インキュベーションが４℃～４０℃の温度で１０秒～２４時間であり、細胞を付着させ培養するための三次元マイクロキャリアの質量と溶解溶液の体積との比が１ｍｇ ： ０．０１～５ｍＬであり、工程（Ｃ４）において、遠心分離が、５０～１６１０×ｇの速度で１～１０分間行われる、請求項２～１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項21】
マイクロキャリア上で培養された細胞の総数および／または細胞密度の計算のためにマイクロキャリア上で培養された細胞をサンプリングするための方法が以下の工程：（Ｄ１）細胞培養のための所定の重量のマイクロキャリアを秤量する工程と、サンプリングチューブ内にそれらを配置する工程と、細胞培養プロセスをシミュレートするために液体を添加する工程と、それらを４～６０℃で０～２４時間浸漬する工程と、次いで、マイクロキャリアによって占有される体積に対応するスケールをサンプリングチューブ上に標準スケールとしてマーキングする工程と、（Ｄ２）マイクロキャリアの体積を標準スケールにするために、サンプリングチューブを用いて細胞培養システムからマイクロキャリアをサンプリングする工程と、（Ｄ３）（Ｄ２）で収集されたマイクロキャリア中の細胞を計数する工程と、（Ｄ４）（Ｄ１）で計量されたマイクロキャリアの重量に基づいて、細胞培養システム全体中の細胞の総数を計算する工程と、（Ｄ３）で計数された細胞の数および（Ｄ３）で計数されたマイクロキャリアの総重量細胞培養系全体を計算し、細胞密度を計算する、を含む、請求項２～２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項22】
工程（Ｄ１）において、添加される液体が、マイクロキャリア上での細胞培養に使用される培地と同一または類似の粘度、親水性、ｐＨ、イオン濃度であり；工程（Ｄ１）において、液体およびマイクロキャリアは１０～１０００μＬ：１ｍｇの比であり；さらに、液体中にマイクロキャリアを浸漬した後の自然沈殿または遠心沈殿を含む、請求項２～２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項23】
工程（Ｄ２）において、サンプリングチューブを使用する細胞培養系からのマイクロキャリアのサンプリングは以下の工程：細胞培養系から懸濁液をピペッティングする工程、それをサンプリングチューブに添加する工程、およびマイクロキャリアを自然に沈殿させる工程、または遠心分離により沈殿させる工程、および工程（Ｄ１）で較正された標準スケールにマイクロキャリアの体積が到達したかどうかを観察する工程；到達していない場合には標準スケールに到達するまで懸濁液をピペッティングし続け、超えた場合には過剰のマイクロキャリアをサンプリングチューブから除去する工程、を含む方法に従って実施される、請求項２～２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項24】
工程（Ｄ４）において、全細胞培養系中の細胞の総数が（Ｄ３）においてカウントされた細胞の数に、上記（Ｄ１）において秤量されたマイクロキャリアの重量に関連するマイクロキャリアの総質量を乗じたものに等しく；工程（Ａ４）において、総数がマイクロキャリアの総質量または総数、または培養系の総体積で割られて、細胞／ｍｇマイクロキャリア、細胞／マイクロキャリア、細胞／ｍＬ培養系における細胞密度の異なる単位を得る、請求項２～２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項25】
請求項１～２４のいずれか１項に記載の方法であって、前記方法は三次元マイクロキャリアに基づく細胞の大規模増殖方法をさらに含み、前記方法は、以下の工程：撹拌バイオリアクター中の三次元マイクロキャリア上で細胞の大規模増殖を達成する工程を含む、方法。
【請求項26】
細胞が接着細胞である請求項１～２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項27】
接着細胞が幹細胞である請求項２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は細胞培養の分野に関し、特に幹細胞の大規模調製のための三次元（３Ｄ）培養方法に関する。
【背景技術】
【0002】
幹細胞は自己複製能を有する多能性細胞の一種であり、適切な条件下で誘導した後、神経細胞、心筋細胞、血管内皮細胞、腎細胞、肝細胞など様々な機能細胞に分化することができる。幹細胞研究の発展に伴い、幹細胞の医学的価値は計り知れないものであり、臨床応用の可能性は医療の発展に大きな影響を与えている。幹細胞、ならびにその分泌物は、腫瘍、脊髄損傷、多発性硬化症、卒中、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、変形性関節症、大腿骨頭壊死、椎間板変性、心筋梗塞、肝硬変、クローン病、間質性肺疾患、全身性エリテマトーデス、勃起不全、および早発性卵巣不全などの様々な疾患の治療において役割を果たすことがいくつかの研究で証明されている。再生医療に用いることができる幹細胞には間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、脂肪細胞幹細胞（ＡＤＳＣ）、神経幹細胞（ＮＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）などが含まれるが、これらに限定されず、これらの中でＭＳＣが最も臨床的に使用されている。
【0003】
幹細胞は、世界中の多くの国において、管理および承認のための「薬剤」と考えられている。現在、国際的に利用可能な幹細胞治療製品は１４種類あるが、中国では未だに承認された製品はない。しかし、２０１８年以降、中国の幹細胞薬剤が医薬品の監督・管理により規制されるようになり、中華人民共和国国家医療製品管理局（ＮＭＰＡ）が幹細胞薬剤の一部を承認し、そのうち３つがＩＮＤ（臨床試験申請）により臨床試験に参加することが承認されている。同時に、５１件の幹細胞臨床研究が中華人民共和国国家衛生健康委員会に提出され、臨床研究の実施が許可されている。これらの数字は、中国が幹細胞薬剤の開発および変革の急速な発展段階に入ることを意味する。
【0004】
幹細胞とそれに由来する細胞産物は、不均一性や活性の変化などの特殊な性質から、長い間薬剤になりにくいと考えられてきた。伝統的な「化学薬剤」および「タンパク質、核酸」および他の生物学的薬剤と比較して、新たな細胞薬剤の製造および調製は、より複雑かつ困難である。しかしながら、現在、外国で市販されている幹細胞製品および国内臨床試験または研究用幹細胞製品の両方の製造プロセスは、依然として、人工培養の伝統的な二次元調製プロセスに依拠している。この調製方法は多数の手動操作、煩わしい工程、および過度に労働集約的なオープンエンドプロセスに依存し、これは、操作を標準化すること、および種々の細胞治療の必要性を満たすために必要とされる大量の細胞を産生することを困難にする。必要とされる高コストおよび大面積の生産スペースに加えて、生産される細胞産物のバッチの数が限られていること、および各プロセスにおける不確実性および制御不能な要因のためにバッチ毎の幹細胞の不安定な品質によって引き起こされる安全性の問題は、すべて、幹細胞が大規模適用のための薬剤になる可能性を疑問視している。したがって、今後、細胞を市場性のある市販製品に製剤化する場合、その規模は同じ製造バッチで１０１１以上の細胞数を必要とすることがある。とりわけ、細胞製品が治療作用を達成するために多数回の高用量を必要とする場合、そのような量は、現存する製造プロセスによって一貫してかつ適時に提供することができない。したがって、幹細胞治療産業を推進し、臨床グレードの幹細胞調製を可能にするための重要な因子として、操作を単純化し、手動操作を低減し、幹細胞の閉鎖的または半閉鎖的な大規模培養を可能にすることができる方法を確立することが緊急に必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明は、幹細胞の大規模調製のための三次元培養方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明は、三次元マイクロキャリアに基づく細胞蘇生方法、三次元マイクロキャリア細胞培養に基づくｉｎ ｓｉｔｕ継代方法、および三次元マイクロキャリアに基づくｉｎ ｓｉｔｕ細胞凍結保存方法を含む、三次元マイクロキャリアに基づく細胞培養方法のセットを提供する。
三次元マイクロキャリアに基づく細胞蘇生方法は以下の工程：細胞蘇生および培養のために、三次元マイクロキャリア上に解凍後に、凍結保存細胞または凍結保存細胞微小組織の細胞懸濁液を接種する工程を含み；
三次元マイクロキャリア細胞培養に基づくｉｎ ｓｉｔｕ継代方法は、以下の工程：シードマイクロキャリアを新しいマイクロキャリアに挿入する工程を含み；該シードマイクロキャリアが継代される細胞と共に培養されるマイクロキャリアであり；
三次元マイクロキャリアに基づくｉｎ ｓｉｔｕ細胞凍結保存方法は、以下の工程
（Ａ１）細胞の三次元マイクロキャリア懸濁液を遠心分離し、上清を廃棄して、細胞含有キャリアを得る工程と；（Ａ２）工程（Ａ１）で得られた細胞含有キャリアを凍結保存溶液と混合し、極低温貯蔵管に加える工程と；
（Ａ３）工程（Ａ２）で細胞含有キャリアを加えた極低温貯蔵管を冷却し、次いでそれを液体窒素に移し、三次元マイクロキャリア上の細胞のｉｎ ｓｉｔｕ凍結保存を可能にする工程と、を含む。
三次元マイクロキャリアに基づく細胞蘇生方法は以下の工程：細胞蘇生および培養のために、三次元マイクロキャリア上に解凍後に、凍結保存細胞または凍結保存細胞微小組織の細胞懸濁液を接種する工程を含み；
三次元マイクロキャリア細胞培養に基づくｉｎ ｓｉｔｕ継代方法は、以下の工程：シードマイクロキャリアを新しいマイクロキャリアに挿入する工程を含み；該シードマイクロキャリアが継代される細胞と共に培養されるマイクロキャリアであり；
三次元マイクロキャリアに基づくｉｎ ｓｉｔｕ細胞凍結保存方法は、以下の工程
（Ａ１）細胞の三次元マイクロキャリア懸濁液を遠心分離し、上清を廃棄して、細胞含有キャリアを得る工程と；（Ａ２）工程（Ａ１）で得られた細胞含有キャリアを凍結保存溶液と混合し、極低温貯蔵管に加える工程と；
（Ａ３）工程（Ａ２）で細胞含有キャリアを加えた極低温貯蔵管を冷却し、次いでそれを液体窒素に移し、三次元マイクロキャリア上の細胞のｉｎ ｓｉｔｕ凍結保存を可能にする工程と、を含む。
【0007】
本方法はさらに、三次元マイクロキャリア上での細胞付着培養の方法、三次元マイクロキャリア上の細胞を採取する方法、およびマイクロキャリア上で培養された細胞をサンプリングする方法を含む。三次元マイクロキャリア上での細胞付着培養の方法は、三次元マイクロキャリア上で細胞を接種するために使用され、三次元マイクロキャリア上の細胞を採取する方法は、三次元マイクロキャリアから細胞を分離するために使用され、マイクロキャリア上で培養された細胞をサンプリングする方法は、マイクロキャリア上で培養された細胞の総数および／または細胞密度の計算を実行するために使用される。
【0008】
三次元マイクロキャリア上での細胞付着培養の方法は、以下の工程：（Ｂ１）細胞接種：細胞懸濁液と乾燥三次元マイクロキャリアとを混合して、細胞懸濁液と混合されたマイクロキャリアを得る工程と；（Ｂ２）細胞付着：細胞が三次元マイクロキャリアに付着するように、工程（Ｂ１）で得られた細胞懸濁液と混合されたマイクロキャリアをインキュベートする工程と；（Ｂ３）細胞培養：工程（Ｂ２）での細胞付着後、完全培養培地を添加し、培養を実施する工程と、を含む。
【0009】
三次元マイクロキャリア上の細胞を採取する方法は、以下の工程：（Ｃ１）培養細胞が付着した三次元マイクロキャリアを自然沈殿または遠心分離し、上清を除去して細胞を含む三次元マイクロキャリアを得る工程と；（Ｃ２）細胞を含む三次元マイクロキャリアに溶解液を添加し、その中の三次元マイクロキャリアをインキュベートおよび溶解する工程と；（Ｃ３）工程（Ｃ２）において三次元マイクロキャリアを完全に溶解した後、溶解を終了させるために停止液を添加する工程、または直接工程（Ｃ４）に進んで溶解を終了させる工程と；（Ｃ４）工程（Ｃ３）において得られた系を遠心分離し、上清を廃棄し、三次元マイクロキャリア上の細胞を採取する工程と、を含む。
【0010】
マイクロキャリア上で培養された細胞をサンプリングする方法は、以下の工程：（Ｄ１）細胞培養のための所定重量のマイクロキャリアを秤量し、それらをサンプリングチューブに入れ、細胞培養プロセスをシミュレートするために液体を添加し、それらを４～６０℃で０～２４時間浸漬し、次いで、サンプリングチューブ上のマイクロキャリアによって占有される体積に対応するスケールを標準スケールとしてマーキングする工程と；（Ｄ２）マイクロキャリア上で培養された細胞を、次のように、マイクロキャリアの体積を標準スケールにするために、サンプリングチューブを用いて細胞培養系からマイクロキャリアをサンプリングする工程と、を含む。
【0011】
三次元マイクロキャリアに基づく細胞蘇生方法において、凍結保存された細胞微小組織は、三次元マイクロキャリア中に凍結保存された細胞である。凍結保存された微小組織１ｍｇ当たり０．１～２５×１０６の細胞が存在する。本発明の一実施形態において、微小組織１ｍｇ当たり０．２５×１０６個の細胞が存在する。
三次元マイクロキャリアに基づく細胞蘇生方法は、三次元マイクロキャリアに基づく動的細胞蘇生方法または三次元マイクロキャリアに基づく静的細胞蘇生方法である。
三次元マイクロキャリアに基づく細胞蘇生方法は、三次元マイクロキャリアに基づく動的細胞蘇生方法または三次元マイクロキャリアに基づく静的細胞蘇生方法である。
【0012】
三次元マイクロキャリアに基づく動的細胞蘇生方法は、以下の工程：（Ｅ１）三次元マイクロキャリアを採取し、細胞培養容器に入れ、細胞培養培地を添加し、直ちに次の工程または、放置または撹拌する処理方法で１分間以上処理する工程と；（Ｅ２）凍結保存された細胞または凍結保存された細胞微小組織を解凍して得た細胞懸濁液を、工程（Ｅ１）で調製したマイクロキャリアを含む細胞培養容器に３７℃で接種し、次いで、細胞培養培地を添加し、培地に対するマイクロキャリアの比率を１ｍｇ：１～１０００μＬに調整し、次いで細胞培養容器を攪拌機上に置き、インキュベーター中で攪拌する工程と；（Ｅ３）工程（Ｅ２）の完了後、細胞蘇生が完了するまで細胞を攪拌し続ける工程と、を含む。
【0013】
三次元マイクロキャリアに基づく静的細胞蘇生方法は、以下の工程：（Ｆ１）静的培養容器およびマイクロキャリアの調製：三次元マイクロキャリアを採取し、細胞培養容器に入れる工程と；（Ｆ２）凍結保存細胞の解凍、接種：凍結保存細胞または凍結保存細胞微小組織を採取し、３７℃で解凍し、次いで工程（Ｆ１）で調製したマイクロキャリアを含む静的培養容器に２０～２４０分間接種する工程と；（Ｆ３）工程（Ｆ２）の完了後、細胞蘇生が完了するまで細胞を培養し続ける工程と、を含む。
【0014】
工程（Ｅ１）では、細胞培養培地を添加した後、１～１０分間放置することができる。本発明の一実施形態では、放置時間は１０分である。
工程（Ｅ１）では、工程（Ｅ２）における撹拌蘇生中に、添加する細胞培養液の体積は培地の体積の０～５０％である。本発明の実施形態において、添加される細胞培養培地の体積は、工程（Ｅ２）における撹拌および蘇生の間、培地の体積の１／６である。
工程（Ｅ２）において、解凍後の細胞懸濁液の体積は、工程（Ｅ２）における撹拌および蘇生中の培地の体積の１～１００％である。本発明の実施形態において、細胞懸濁液の体積は、工程（Ｅ２）における撹拌および蘇生の間、培地の体積の１／３０である。細胞懸濁液中の細胞濃度は、５～５００×１０５細胞／ｍＬである。一実施形態では、細胞懸濁液中の細胞濃度が１×１０６細胞／ｍＬである。
工程（Ｅ２）において、細胞または細胞微小組織は、５～１００×１０３細胞／マイクロキャリアｍｇの細胞数対マイクロキャリアの比率で、マイクロキャリアを含む細胞培養容器に接種される。１つの実施形態において、新しいマイクロキャリアに対する細胞数の比は、１０４細胞／マイクロキャリアｍｇであり；培地に対するマイクロキャリアの比が細胞培養培地を添加することによって、１ｍｇ：３００μＬに調節される。
工程（Ｅ１）では、工程（Ｅ２）における撹拌蘇生中に、添加する細胞培養液の体積は培地の体積の０～５０％である。本発明の実施形態において、添加される細胞培養培地の体積は、工程（Ｅ２）における撹拌および蘇生の間、培地の体積の１／６である。
工程（Ｅ２）において、解凍後の細胞懸濁液の体積は、工程（Ｅ２）における撹拌および蘇生中の培地の体積の１～１００％である。本発明の実施形態において、細胞懸濁液の体積は、工程（Ｅ２）における撹拌および蘇生の間、培地の体積の１／３０である。細胞懸濁液中の細胞濃度は、５～５００×１０５細胞／ｍＬである。一実施形態では、細胞懸濁液中の細胞濃度が１×１０６細胞／ｍＬである。
工程（Ｅ２）において、細胞または細胞微小組織は、５～１００×１０３細胞／マイクロキャリアｍｇの細胞数対マイクロキャリアの比率で、マイクロキャリアを含む細胞培養容器に接種される。１つの実施形態において、新しいマイクロキャリアに対する細胞数の比は、１０４細胞／マイクロキャリアｍｇであり；培地に対するマイクロキャリアの比が細胞培養培地を添加することによって、１ｍｇ：３００μＬに調節される。
【0015】
工程（Ｅ２）において、撹拌は、定速撹拌または可変速交互撹拌または可変速サイクル撹拌である。
撹拌は、時計方向の撹拌、反時計方向の撹拌、または交互方向での撹拌である。
撹拌時間は０．１～１００時間（例えば９６時間）である。
撹拌速度は１～２００ｒｐｍである。撹拌速度は、好ましくは５～８０ｒｐｍ、より好ましくは１０～６０ｒｐｍである。
また、撹拌蘇生は、次の（ａ）または（ｂ）または（ｃ）のように行われる：
（ａ）１～４時間放置した後、時計方向に周期的な可変速度で１～２４時間攪拌し、その後、時計方向に９６時間まで一定速度で攪拌する；
（ｂ）周期的な可変速度で時計方向に１～２４時間攪拌した後、９６時間まで時計方向に一定速度で攪拌；
（ｃ）１～９６時間、一定速度で時計方向に撹拌する。
撹拌は、時計方向の撹拌、反時計方向の撹拌、または交互方向での撹拌である。
撹拌時間は０．１～１００時間（例えば９６時間）である。
撹拌速度は１～２００ｒｐｍである。撹拌速度は、好ましくは５～８０ｒｐｍ、より好ましくは１０～６０ｒｐｍである。
また、撹拌蘇生は、次の（ａ）または（ｂ）または（ｃ）のように行われる：
（ａ）１～４時間放置した後、時計方向に周期的な可変速度で１～２４時間攪拌し、その後、時計方向に９６時間まで一定速度で攪拌する；
（ｂ）周期的な可変速度で時計方向に１～２４時間攪拌した後、９６時間まで時計方向に一定速度で攪拌；
（ｃ）１～９６時間、一定速度で時計方向に撹拌する。
【0016】
本発明の一実施形態では、撹拌は、４時間放置し、次いで、２４時間までは４０ｒｐｍで５分間のサイクルと２０ｒｐｍで２０分間のサイクルの周期的な可変速度で時計方向に撹拌し、９６時間までは一定速度（６０ｒｐｍ）で時計方向に撹拌することによって行われる。
本発明の一実施形態では、撹拌は、２４時間までは４０ｒｐｍで５分間のサイクルと２０ｒｐｍで２０分間のサイクルの周期的な可変速度で時計方向に撹拌し、９６時間までは一定速度（６０ｒｐｍ）で時計方向に撹拌することによって行われる。
本発明の一実施形態では、攪拌は、９６時間までは一定速度（６０ｒｐｍ）で時計方向に撹拌することによって行われる。
本発明の一実施形態では、撹拌は、２４時間までは４０ｒｐｍで５分間のサイクルと２０ｒｐｍで２０分間のサイクルの周期的な可変速度で時計方向に撹拌し、９６時間までは一定速度（６０ｒｐｍ）で時計方向に撹拌することによって行われる。
本発明の一実施形態では、攪拌は、９６時間までは一定速度（６０ｒｐｍ）で時計方向に撹拌することによって行われる。
【0017】
工程（Ｅ３）において、攪拌方法は前節を参照することができる。本発明の一実施形態では、撹拌が時計方向に一定速度（６０ｒｐｍ）で行われる。
工程（Ｅ１）～（Ｅ３）において、細胞培養容器は、マイクロキャリアを撹拌して、懸濁させることができる容器である。本発明の一実施形態で使用される細胞培養容器は、インペラ内蔵細胞培養フラスコ（ベルコガラス社，米国；カタログ番号：１９６５－６１００１）である。
工程（Ｅ１）～（Ｅ３）において、細胞培養容器は、マイクロキャリアを撹拌して、懸濁させることができる容器である。本発明の一実施形態で使用される細胞培養容器は、インペラ内蔵細胞培養フラスコ（ベルコガラス社，米国；カタログ番号：１９６５－６１００１）である。
【0018】
工程（Ｆ２）において、細胞数に対するマイクロキャリアの比率は、５～１００×１０３細胞／ｍｇマイクロキャリアである。本発明の一実施形態では、新しいマイクロキャリアに対する細胞の数の比が１０，０００細胞／ｍｇマイクロキャリアである。
工程（Ｆ２）では、細胞を接種した後、細胞培養培地を添加し、マイクロキャリアに対する培地の割合を１００～４００μＬ：２０ｍｇに調整する。本発明の一実施形態では、細胞培養培地対マイクロキャリアの比が２００μＬ：２０ｍｇである。
本発明の一実施形態では、インキュベーション時間は２４０分である。
上記三次元マイクロキャリアに基づく細胞蘇生方法において、三次元マイクロキャリアは、三次元多孔質マイクロキャリアである。三次元多孔質マイクロキャリアは、具体的には３Ｄ ＴａｂｌｅＴｒｉｘマイクロキャリア（北京華館生物科技有限公司；カタログ番号：Ｆ０１－１００）であり得る。
工程（Ｆ２）では、細胞を接種した後、細胞培養培地を添加し、マイクロキャリアに対する培地の割合を１００～４００μＬ：２０ｍｇに調整する。本発明の一実施形態では、細胞培養培地対マイクロキャリアの比が２００μＬ：２０ｍｇである。
本発明の一実施形態では、インキュベーション時間は２４０分である。
上記三次元マイクロキャリアに基づく細胞蘇生方法において、三次元マイクロキャリアは、三次元多孔質マイクロキャリアである。三次元多孔質マイクロキャリアは、具体的には３Ｄ ＴａｂｌｅＴｒｉｘマイクロキャリア（北京華館生物科技有限公司；カタログ番号：Ｆ０１－１００）であり得る。
【0019】
三次元マイクロキャリア細胞培養に基づくｉｎ ｓｉｔｕ継代法では、新しいマイクロキャリアは細胞を含まないマイクロキャリアである。シードマイクロキャリアは１０，０００～１，０００，０００細胞／ｍｇマイクロキャリア（例えば、１００，０００～５００，０００細胞／ｍｇマイクロキャリア、または１２０，０００～５００，０００細胞／ｍｇマイクロキャリア）の細胞密度を有する。シードマイクロキャリア対新しいマイクロキャリアの比は０．０００２～２００ｍｇシードマイクロキャリア／ｍｇ新しいマイクロキャリア（例えば、２～１５ｍｇシードマイクロキャリア／１００ｍｇ新しいマイクロキャリア）である。
さらに、シードマイクロキャリアは１２０，０００～５００，０００細胞／ｍｇマイクロキャリア（特に、以下に記載されるような静的なｉｎ ｓｉｔｕ継代に適している）または１５０，０００～５００，０００細胞／ｍｇマイクロキャリア（特に、以下に記載されるような動的なｉｎ ｓｉｔｕ継代に適している）の細胞密度を有する。シードマイクロキャリア対新しいマイクロキャリアの比は１～３ｍｇシードマイクロキャリア／２０ｍｇ新しいマイクロキャリア（特に、以下に記載されるような静的なｉｎ ｓｉｔｕ継代に適している）、または２～６．７ｍｇシードマイクロキャリア／１００ｍｇ新しいマイクロキャリア（特に、以下に記載されるような動的なｉｎ ｓｉｔｕ継代に適している）である。
三次元マイクロキャリア細胞培養に基づくｉｎ ｓｉｔｕ継代法は、三次元マイクロキャリア細胞培養に基づく動的なｉｎ ｓｉｔｕ継代法または三次元マイクロキャリア細胞培養に基づく静的なｉｎ ｓｉｔｕ継代法である。
さらに、シードマイクロキャリアは１２０，０００～５００，０００細胞／ｍｇマイクロキャリア（特に、以下に記載されるような静的なｉｎ ｓｉｔｕ継代に適している）または１５０，０００～５００，０００細胞／ｍｇマイクロキャリア（特に、以下に記載されるような動的なｉｎ ｓｉｔｕ継代に適している）の細胞密度を有する。シードマイクロキャリア対新しいマイクロキャリアの比は１～３ｍｇシードマイクロキャリア／２０ｍｇ新しいマイクロキャリア（特に、以下に記載されるような静的なｉｎ ｓｉｔｕ継代に適している）、または２～６．７ｍｇシードマイクロキャリア／１００ｍｇ新しいマイクロキャリア（特に、以下に記載されるような動的なｉｎ ｓｉｔｕ継代に適している）である。
三次元マイクロキャリア細胞培養に基づくｉｎ ｓｉｔｕ継代法は、三次元マイクロキャリア細胞培養に基づく動的なｉｎ ｓｉｔｕ継代法または三次元マイクロキャリア細胞培養に基づく静的なｉｎ ｓｉｔｕ継代法である。
【0020】
三次元マイクロキャリア細胞培養に基づく動的なｉｎ ｓｉｔｕ継代方法は、以下の工程：（Ｇ１）新しいマイクロキャリア懸濁液の調製工程：インペラー内蔵細胞培養フラスコに新しいマイクロキャリアを入れ、細胞培養培地を１～２，０００μＬ：１ｍｇのマイクロキャリアの比で添加し、新しいマイクロキャリア懸濁液を得るために０時間を超えて静置または撹拌する；（Ｇ２）シードマイクロキャリア懸濁液の調製工程：シードマイクロキャリアは１０，０００～１００万細胞／ｍｇマイクロキャリアの細胞密度を有し、シードマイクロキャリアを０．１～５０ｍｇ／ｍＬに細胞培養培地で再懸濁してシードマイクロキャリア懸濁液を得る；（Ｇ３）接種工程：（Ｇ１）で調製した新しいマイクロキャリア懸濁液を含むインペラー内蔵細胞培養フラスコに（Ｇ２）で調製したシードマイクロキャリア懸濁液を混合する、（Ｇ１）で調製した新しいマイクロキャリアに対する種マイクロキャリアの比は０．０００２～２００ｍｇのシードマイクロキャリア／ｍｇの新しいマイクロキャリアであり、培地に対するマイクロキャリアの比を１ｍｇ：１～１０００μＬに調整するために細胞培養培地を添加する。インペラー内蔵細胞培養フラスコを攪拌機上に置き、インキュベーター中に０～１００時間攪拌しながら置く；（Ｇ４）培養工程：攪拌を続けて動的なｉｎ ｓｉｔｕ継代を完了させる；を含む。
【0021】
三次元マイクロキャリア細胞培養に基づく静的なｉｎ ｓｉｔｕ継代方法は以下の工程：（Ｈ１）シードマイクロキャリア懸濁液の調製：シードマイクロキャリアの細胞密度は１０，０００～１，０００，０００細胞／ｍｇマイクロキャリアであり、シードマイクロキャリアを細胞培養培地で０．１～５０ｍｇ／ｍＬに再懸濁し、シードマイクロキャリア懸濁液を得る；（Ｈ２）接種：（Ｈ１）で調製されたシードマイクロキャリア懸濁液を新しいマイクロキャリアに新しいマイクロキャリアに対するシードマイクロキャリアの比率が０．０００２～２００ｍｇシードマイクロキャリア／ｍｇ新しいマイクロキャリアで滴下し、よく混合し、インキュベートするためにインキュベーター中に０．５～２４時間置く；（Ｈ３）培養工程：細胞培養培地を添加し、培養を継続する、すなわち静的なｉｎ ｓｉｔｕ継代を完了する、を含む。
【0022】
工程（Ｇ１）ではインペラ内蔵細胞培養フラスコに入れた新たなマイクロキャリアと細胞培養培地との比率を、マイクロキャリア１００ｍｇ／細胞培養培地１０ｍＬとすることができ、インペラ内蔵細胞培養フラスコに入れた後、０．１～２４時間（本発明の特定の実施形態では特に１４時間）放置することができる。
工程（Ｇ２）において、シードマイクロキャリア中の細胞密度は１５０，０００～５００，０００細胞／ｍｇマイクロキャリアとすることができ、シードマイクロキャリア懸濁液中のシードマイクロキャリアの含有量は１～１０ｍｇ／ｍＬとすることができる（本発明の具体的な実施形態において、シードマイクロキャリア懸濁液中のシードマイクロキャリアの含有量は具体的には１ｍｇ／ｍＬである）。
本発明の一実施形態ではシードマイクロキャリア中の細胞密度が具体的には５００，０００細胞／ｍｇマイクロキャリアであり、シードマイクロキャリア懸濁液中のシードマイクロキャリアの含有量は具体的には１ｍｇ／ｍＬである。
本発明の一実施形態ではシードマイクロキャリア中の細胞密度が具体的には１５０，０００細胞／ｍｇマイクロキャリアであり、シードマイクロキャリア懸濁液中のシードマイクロキャリアの含有量は具体的には１ｍｇ／ｍＬである。
工程（Ｇ２）において、シードマイクロキャリア中の細胞密度は１５０，０００～５００，０００細胞／ｍｇマイクロキャリアとすることができ、シードマイクロキャリア懸濁液中のシードマイクロキャリアの含有量は１～１０ｍｇ／ｍＬとすることができる（本発明の具体的な実施形態において、シードマイクロキャリア懸濁液中のシードマイクロキャリアの含有量は具体的には１ｍｇ／ｍＬである）。
本発明の一実施形態ではシードマイクロキャリア中の細胞密度が具体的には５００，０００細胞／ｍｇマイクロキャリアであり、シードマイクロキャリア懸濁液中のシードマイクロキャリアの含有量は具体的には１ｍｇ／ｍＬである。
本発明の一実施形態ではシードマイクロキャリア中の細胞密度が具体的には１５０，０００細胞／ｍｇマイクロキャリアであり、シードマイクロキャリア懸濁液中のシードマイクロキャリアの含有量は具体的には１ｍｇ／ｍＬである。
【0023】
工程（Ｇ３）ではシードマイクロキャリア対新しいマイクロキャリアの比が１～１０ｍｇシードマイクロキャリア／１００ｍｇ新しいマイクロキャリア（例えば、２～６．７ｍｇシードマイクロキャリア／１００ｍｇ新しいマイクロキャリア）であり得；細胞培養培地を添加することによって、マイクロキャリア対培地の比は１～１０ｍｇ：１ｍＬ（例えば、１０６．７～２０４ｍｇ：６０ｍＬ）に調節され得；撹拌速度は１ｒｐｍ～２００ｒｐｍであり得、撹拌は定速撹拌または可変速交互撹拌または可変速サイクルの撹拌によるものであり得、撹拌方向は時計方向撹拌、反時計方向撹拌または交互方向撹拌であり得、これにより、シードマイクロキャリア上の細胞を新しいマイクロキャリアに移す。
本発明の一実施形態において、シードマイクロキャリア対新しいマイクロキャリアの比は具体的には２ｍｇシードマイクロキャリア／１００ｍｇ新しいマイクロキャリアであり；マイクロキャリア対培地の比が細胞培養培地を添加することによって、２０４ｍｇ：６０ｍＬに特異的に調整され；撹拌は、具体的には２４時間の全サイクル中、６０ｒｐｍで５分間、２０ｒｐｍで２０分間の特定のパラメータを用いた可変速サイクルの撹拌である。
本発明の一実施形態では、シードマイクロキャリア対新しいマイクロキャリアの比が具体的には６．７ｍｇシードマイクロキャリア／１００ｍｇ新しいマイクロキャリアであり、培地に対するマイクロキャリアの比は細胞培養培地を添加することによって１０６．７ｍｇ：６０ｍＬに具体的に調整され、撹拌は、具体的には２４時間の全サイクル中、６０ｒｐｍ５分間、２０ｒｐｍで２０分間の特定のパラメータを用いた、可変速サイクルの時計方向撹拌である。
本発明の一実施形態において、シードマイクロキャリア対新しいマイクロキャリアの比は具体的には２ｍｇシードマイクロキャリア／１００ｍｇ新しいマイクロキャリアであり；マイクロキャリア対培地の比が細胞培養培地を添加することによって、２０４ｍｇ：６０ｍＬに特異的に調整され；撹拌は、具体的には２４時間の全サイクル中、６０ｒｐｍで５分間、２０ｒｐｍで２０分間の特定のパラメータを用いた可変速サイクルの撹拌である。
本発明の一実施形態では、シードマイクロキャリア対新しいマイクロキャリアの比が具体的には６．７ｍｇシードマイクロキャリア／１００ｍｇ新しいマイクロキャリアであり、培地に対するマイクロキャリアの比は細胞培養培地を添加することによって１０６．７ｍｇ：６０ｍＬに具体的に調整され、撹拌は、具体的には２４時間の全サイクル中、６０ｒｐｍ５分間、２０ｒｐｍで２０分間の特定のパラメータを用いた、可変速サイクルの時計方向撹拌である。
【0024】
工程（Ｈ１）において、シードマイクロキャリア中の細胞密度は、１２０，０００～５００，０００細胞／ｍｇマイクロキャリアであり得；シードマイクロキャリア懸濁液中のシードマイクロキャリアの含有量が５～１５ｍｇ／ｍＬであり得る。
本発明の一実施形態ではシードマイクロキャリア中の細胞密度が具体的には５００，０００細胞／ｍｇマイクロキャリアであり、シードマイクロキャリア懸濁液中のシードマイクロキャリアの含有量は具体的には５ｍｇ／ｍＬである。
本発明の一実施形態ではシードマイクロキャリア中の細胞密度が具体的には１２０，０００細胞／ｍｇマイクロキャリアであり、シードマイクロキャリア懸濁液中のシードマイクロキャリアの含有量は具体的には１５ｍｇ／ｍＬである。
さらに、工程（Ｈ２）において、シードマイクロキャリア対新しいマイクロキャリアの比は、１～３ｍｇシードマイクロキャリア／２０ｍｇ新しいマイクロキャリアであり得；インキュベーション時間が０～２４時間であり得る。
本発明の実施形態において、シードマイクロキャリア対新しいマイクロキャリアの比は、具体的には１ｍｇシードマイクロキャリア／２０ｍｇ新しいマイクロキャリアであり；インキュベーション時間は具体的には２時間である。
本発明の実施形態において、シードマイクロキャリア対新しいマイクロキャリアの比は、具体的には３ｍｇシードマイクロキャリア／２０ｍｇ新しいマイクロキャリアであり；インキュベーション時間が具体的には２時間である。
ここで、本方法の全インキュベーション時間は、細胞、提供されるシードと新しいキャリアの比率、最終的に得られる細胞の所望の数などに依存し得る。
本発明の一実施形態ではシードマイクロキャリア中の細胞密度が具体的には５００，０００細胞／ｍｇマイクロキャリアであり、シードマイクロキャリア懸濁液中のシードマイクロキャリアの含有量は具体的には５ｍｇ／ｍＬである。
本発明の一実施形態ではシードマイクロキャリア中の細胞密度が具体的には１２０，０００細胞／ｍｇマイクロキャリアであり、シードマイクロキャリア懸濁液中のシードマイクロキャリアの含有量は具体的には１５ｍｇ／ｍＬである。
さらに、工程（Ｈ２）において、シードマイクロキャリア対新しいマイクロキャリアの比は、１～３ｍｇシードマイクロキャリア／２０ｍｇ新しいマイクロキャリアであり得；インキュベーション時間が０～２４時間であり得る。
本発明の実施形態において、シードマイクロキャリア対新しいマイクロキャリアの比は、具体的には１ｍｇシードマイクロキャリア／２０ｍｇ新しいマイクロキャリアであり；インキュベーション時間は具体的には２時間である。
本発明の実施形態において、シードマイクロキャリア対新しいマイクロキャリアの比は、具体的には３ｍｇシードマイクロキャリア／２０ｍｇ新しいマイクロキャリアであり；インキュベーション時間が具体的には２時間である。
ここで、本方法の全インキュベーション時間は、細胞、提供されるシードと新しいキャリアの比率、最終的に得られる細胞の所望の数などに依存し得る。
【0025】
三次元マイクロキャリア細胞培養に基づくｉｎ ｓｉｔｕ継代法において、マイクロキャリアは、３Ｄ ＦｌｏＴｒｉｘマイクロキャリア（北京華館生物科技有限公司；カタログ番号：ＣＮＦ－Ｆ０１Ｔ－５０）である。インペラー内臓細胞培養フラスコは、米国ベルコガラス社のカタログ番号：１９６５－６１００１の製品である。撹拌機は、低速撹拌機（３Ｄ ＦｌｏＴｒｉｘ ｍｉｎｉＳｐｉｎ低速攪拌機，北京華館生物科技有限公司；カタログ番号：３Ｄ ＦＴｍＳ－２－２）である。
【0026】
三次元マイクロキャリアに基づくｉｎ ｓｉｔｕ細胞凍結保存法では、工程（Ａ１）において、遠心分離は５０～１６１０×ｇ、具体的には４００×ｇの速度で、１～１０分間、具体的には２分間行われる。工程（Ａ２）において、細胞含有キャリアの質量に対する凍結保存溶液の体積の比は、１ｍＬ：０．１～５０ｍｇ、具体的には１ｍＬ：１０ｍｇまたは１ｍＬ：０．１～２０ｍｇである。
三次元マイクロキャリアに基づくｉｎ ｓｉｔｕ細胞凍結保存方法では、凍結保存溶液が１０％ ＤＭＳＯ、１０～９０％ ＦＢＳおよび０～８０％基礎培地、１０％ ＤＭＳＯおよび０～８０％基礎培地、１０～９０％ ＦＢＳおよび０～８０％基礎培地、またはＣＦ１０１セルレジェン無血清凍結保存溶液のような他の市販の細胞凍結保存溶液を含む。
三次元マイクロキャリアに基づくｉｎ ｓｉｔｕ細胞凍結保存法では、極低温貯蔵管を冷凍機に入れ、－２０～－１９６℃、具体的には－２０～－８０℃に冷却され；冷却はプログラムされているかまたはプログラムされておらず；プログラムされた冷却は－１～－１５℃／分の冷却速度を有し；冷却時間は１～２４時間、具体的には２４時間、１０～２４時間または１５～２４時間とすることができる。
三次元マイクロキャリアに基づくｉｎ ｓｉｔｕ細胞凍結保存法では、冷却は、工程（Ａ２）において極低温貯蔵管を細胞冷却ボックスに入れ、１～１０分以内に冷凍機に入れて方法実施される。
三次元マイクロキャリアに基づくｉｎ ｓｉｔｕ細胞凍結保存法では、極低温貯蔵管に添加された３７℃の予め温められたＰＢＳまたは基礎培地が１：５～３０であり得る比で希釈される。
三次元マイクロキャリアに基づくｉｎ ｓｉｔｕ細胞凍結保存法では、工程（Ａ３）に続いて、細胞蘇生工程：工程（Ａ３）の処理後の極低温保存管を水浴中に置き、極低温保存管中の氷が溶融したときに水浴を除去することによって細胞を蘇生し、次いで３７℃の予め温めたＰＢＳまたは基礎培地を添加することによって細胞を希釈し、次いで遠心分離する。
三次元マイクロキャリアに基づくｉｎ ｓｉｔｕ細胞凍結保存法では、水浴の温度は３５～４０℃とすることができ、水浴の時間は１～５分とすることができる。
三次元マイクロキャリアに基づくｉｎ ｓｉｔｕ細胞凍結保存法では、工程（Ａ３）後に細胞を蘇生する場合、遠心分離の速度は１～１０分間、具体的には２分間、５０～１６１０×ｇ、具体的には４００×ｇとすることができる。
三次元マイクロキャリアに基づくｉｎ ｓｉｔｕ細胞凍結保存方法では、凍結保存溶液が１０％ ＤＭＳＯ、１０～９０％ ＦＢＳおよび０～８０％基礎培地、１０％ ＤＭＳＯおよび０～８０％基礎培地、１０～９０％ ＦＢＳおよび０～８０％基礎培地、またはＣＦ１０１セルレジェン無血清凍結保存溶液のような他の市販の細胞凍結保存溶液を含む。
三次元マイクロキャリアに基づくｉｎ ｓｉｔｕ細胞凍結保存法では、極低温貯蔵管を冷凍機に入れ、－２０～－１９６℃、具体的には－２０～－８０℃に冷却され；冷却はプログラムされているかまたはプログラムされておらず；プログラムされた冷却は－１～－１５℃／分の冷却速度を有し；冷却時間は１～２４時間、具体的には２４時間、１０～２４時間または１５～２４時間とすることができる。
三次元マイクロキャリアに基づくｉｎ ｓｉｔｕ細胞凍結保存法では、冷却は、工程（Ａ２）において極低温貯蔵管を細胞冷却ボックスに入れ、１～１０分以内に冷凍機に入れて方法実施される。
三次元マイクロキャリアに基づくｉｎ ｓｉｔｕ細胞凍結保存法では、極低温貯蔵管に添加された３７℃の予め温められたＰＢＳまたは基礎培地が１：５～３０であり得る比で希釈される。
三次元マイクロキャリアに基づくｉｎ ｓｉｔｕ細胞凍結保存法では、工程（Ａ３）に続いて、細胞蘇生工程：工程（Ａ３）の処理後の極低温保存管を水浴中に置き、極低温保存管中の氷が溶融したときに水浴を除去することによって細胞を蘇生し、次いで３７℃の予め温めたＰＢＳまたは基礎培地を添加することによって細胞を希釈し、次いで遠心分離する。
三次元マイクロキャリアに基づくｉｎ ｓｉｔｕ細胞凍結保存法では、水浴の温度は３５～４０℃とすることができ、水浴の時間は１～５分とすることができる。
三次元マイクロキャリアに基づくｉｎ ｓｉｔｕ細胞凍結保存法では、工程（Ａ３）後に細胞を蘇生する場合、遠心分離の速度は１～１０分間、具体的には２分間、５０～１６１０×ｇ、具体的には４００×ｇとすることができる。
【0027】
三次元マイクロキャリア上での細胞付着培養法において、細胞懸濁液は１×１０４～１×１０８細胞／ｍＬの密度を有し、該細胞懸濁液は培養培地または液状生物学的マトリックス材料中に細胞を再懸濁することによって得られ、ここで、該材料はコラーゲン、ゼラチン、ゼラチン誘導体、プロテオグリカン、糖タンパク質、アルギン酸塩、アルギン酸塩誘導体、寒天、マトリックスゴム、ヒアルロン酸、フィブロネクチンまたはラミニンからなる群より具体的に選択され得る。三次元マイクロキャリアの質量に対する細胞懸濁液の体積比は１～１０００μＬ：１ｍｇ、具体的には１０μＬ：１ｍｇ、１～１０μＬ：１ｍｇ、１０～１５μＬ：１ｍｇ、５～１５μＬ：１ｍｇ、または２５０～３５０μＬ：１ｍｇである。
三次元マイクロキャリア上での細胞付着培養方法では、工程（Ｂ１）において、細胞懸濁液は、以下のように三次元マイクロキャリアと混合される：細胞懸濁液が三次元マイクロキャリアに滴下して添加される。工程（Ｂ１）では、乾燥した三次元マイクロキャリアを使用し、細胞懸濁液をそれと直接混合し、三次元マイクロキャリアを前もって膨潤させる必要性を排除し、したがって、マイクロキャリアへの細胞の接種を単純化する。
三次元マイクロキャリア上での細胞付着培養方法において、インキュベーション条件は、以下の通りであり得る：３５～４０℃、具体的には３７℃、３７～４０℃または３５～３７℃の温度；０．５～２４時間の期間、具体的には２時間または２４時間；５～３０％、具体的には５％～１０％または５～２０％の二酸化炭素の体積百分率濃度。付着方法は、重力付着法、膨潤付着法、攪拌回転式の付着法、遠心法、弾性表面波法または磁気付着法を含む。
三次元マイクロキャリア上での細胞付着培養方法において、培養の条件は３５～４０℃、具体的には３７℃、３７～４０℃または３５～３７℃であり得、二酸化炭素の体積百分率濃度は５～３０％、具体的には５％、５～１０％または５～２０％であり得る。
三次元マイクロキャリア上での細胞付着培養方法において、工程（Ｂ１）の前に、三次元マイクロキャリアをガス滅菌、放射線滅菌またはＵＶ滅菌する工程がある。
三次元マイクロキャリア上での細胞付着培養方法において、三次元マイクロキャリアは多孔性マイクロキャリアであり、具体的に、カタログ番号：ＣＮＦ－Ｆ０１Ｔ－５０；サイトポア１およびサイトポア２（ＧＥから市場で入手可能）、カタログ番号：１７－０９１１および１７－１２７１； ＣｕｌｔｉＳｐｈｅｒ（Ｍ９４１８）（Ｓｉｇｍａから市場で入手可能）と共に、北京華館生物科技有限公司から市場で入手可能）である３Ｄ ＦｌｏＴｒｉｘマイクロキャリアである。
三次元マイクロキャリア上での細胞付着培養方法では、工程（Ｂ１）において、細胞懸濁液は、以下のように三次元マイクロキャリアと混合される：細胞懸濁液が三次元マイクロキャリアに滴下して添加される。工程（Ｂ１）では、乾燥した三次元マイクロキャリアを使用し、細胞懸濁液をそれと直接混合し、三次元マイクロキャリアを前もって膨潤させる必要性を排除し、したがって、マイクロキャリアへの細胞の接種を単純化する。
三次元マイクロキャリア上での細胞付着培養方法において、インキュベーション条件は、以下の通りであり得る：３５～４０℃、具体的には３７℃、３７～４０℃または３５～３７℃の温度；０．５～２４時間の期間、具体的には２時間または２４時間；５～３０％、具体的には５％～１０％または５～２０％の二酸化炭素の体積百分率濃度。付着方法は、重力付着法、膨潤付着法、攪拌回転式の付着法、遠心法、弾性表面波法または磁気付着法を含む。
三次元マイクロキャリア上での細胞付着培養方法において、培養の条件は３５～４０℃、具体的には３７℃、３７～４０℃または３５～３７℃であり得、二酸化炭素の体積百分率濃度は５～３０％、具体的には５％、５～１０％または５～２０％であり得る。
三次元マイクロキャリア上での細胞付着培養方法において、工程（Ｂ１）の前に、三次元マイクロキャリアをガス滅菌、放射線滅菌またはＵＶ滅菌する工程がある。
三次元マイクロキャリア上での細胞付着培養方法において、三次元マイクロキャリアは多孔性マイクロキャリアであり、具体的に、カタログ番号：ＣＮＦ－Ｆ０１Ｔ－５０；サイトポア１およびサイトポア２（ＧＥから市場で入手可能）、カタログ番号：１７－０９１１および１７－１２７１； ＣｕｌｔｉＳｐｈｅｒ（Ｍ９４１８）（Ｓｉｇｍａから市場で入手可能）と共に、北京華館生物科技有限公司から市場で入手可能）である３Ｄ ＦｌｏＴｒｉｘマイクロキャリアである。
【0028】
三次元マイクロキャリア上に細胞を採取する方法において、溶解液は、細胞付着の排除と共にマイクロキャリアを溶解するための活性成分を含む。活性成分は、コラゲナーゼ、ペプシン、ヒアルロニダーゼ、ディスパーゼ、中性プロテアーゼ、プロテイナーゼＫ、マトリックスメタロプロテイナーゼ、クエン酸ナトリウム、トリプシン、デオキシリボヌクレアーゼ、トリプシン置換物、タンパク質ヒドロラーゼ、エチレンジアミン四酢酸、リゾチームおよびグルタチオンの少なくとも１つの水溶液から選択される。一実施形態では、溶解液の処方は、０．１％（質量パーセント）コラゲナーゼ、０．１％（質量パーセント）エチレンジアミン四酢酸、および０．０５％（質量パーセント）トリプシンを含む。
三次元マイクロキャリア上に細胞を採取する方法において、停止液は、溶解液の選択された組成に依存して、全培地、１０％血清アルブミンまたは血清を含有するＰＢＳ、トリプシンインヒビター、プロテアーゼインヒビター、ＰＢＳおよびイオン性キレート剤のうちの少なくとも１つから選択される。イオン性キレート剤は、特にエチレンジアミン四酢酸であり得る。
三次元マイクロキャリア上に細胞を採取する方法において、停止液は、溶解液の選択された組成に依存して、全培地、１０％血清アルブミンまたは血清を含有するＰＢＳ、トリプシンインヒビター、プロテアーゼインヒビター、ＰＢＳおよびイオン性キレート剤のうちの少なくとも１つから選択される。イオン性キレート剤は、特にエチレンジアミン四酢酸であり得る。
【0029】
三次元マイクロキャリア上に細胞を採取する方法では、工程（Ｃ１）において、遠心分離は、５０～１６１０×ｇ、具体的には２００×ｇの速度で、１～１０分間、具体的には２分間であり得る。上清を除去するための工程は次の通りである：遠心分離および上清のピペッティング；次いで、適切な量のＰＢＳを添加し、２０～３０秒間、手で穏やかに振盪し、上清をピペッティングし、そしてＰＢＳ洗浄を１回繰り返す。
三次元マイクロキャリア上に細胞を採取する方法において、細胞を付着させ、培養するための三次元マイクロキャリアの質量の溶解液の体積に対する比は１ｍｇ：０．０１～５ｍＬ、具体的には２０ｍｇ：３ｍＬ、１ｍｇ：０．１５～０．５ｍＬまたは１ｍｇ：０．１～２ｍＬであり得；インキュベーションは４℃～４０℃、具体的には３７℃の温度で、１０秒～２４時間、具体的には３０分間であり得る。特定の実施形態において、記載されるインキュベーション期間の間、ブローイングは、１０分間隔で１ｍＬピペットを使用して数回穏やかに行われる。
三次元マイクロキャリア上に細胞を採取する方法において、細胞を付着させ、培養するための三次元マイクロキャリアの質量の、停止液の体積に対する比は、１ｍｇ：０．０１～５０ｍＬ、具体的には２０ｍｇ：３ｍＬまたは１ｍｇ：０．１～２５ｍＬであり得る。
三次元マイクロキャリア上に細胞を採取する方法では、工程（Ｃ４）において、遠心分離は、５０～１６１０×ｇ、具体的には４００×ｇの速度で、１～１０分間、具体的には２分間または２～８分間行われる。
三次元マイクロキャリア上に細胞を採取する方法において、細胞を付着させ、培養するための三次元マイクロキャリアの質量の溶解液の体積に対する比は１ｍｇ：０．０１～５ｍＬ、具体的には２０ｍｇ：３ｍＬ、１ｍｇ：０．１５～０．５ｍＬまたは１ｍｇ：０．１～２ｍＬであり得；インキュベーションは４℃～４０℃、具体的には３７℃の温度で、１０秒～２４時間、具体的には３０分間であり得る。特定の実施形態において、記載されるインキュベーション期間の間、ブローイングは、１０分間隔で１ｍＬピペットを使用して数回穏やかに行われる。
三次元マイクロキャリア上に細胞を採取する方法において、細胞を付着させ、培養するための三次元マイクロキャリアの質量の、停止液の体積に対する比は、１ｍｇ：０．０１～５０ｍＬ、具体的には２０ｍｇ：３ｍＬまたは１ｍｇ：０．１～２５ｍＬであり得る。
三次元マイクロキャリア上に細胞を採取する方法では、工程（Ｃ４）において、遠心分離は、５０～１６１０×ｇ、具体的には４００×ｇの速度で、１～１０分間、具体的には２分間または２～８分間行われる。
【0030】
マイクロキャリア上で培養された細胞の総数および／または細胞密度の計算のためにマイクロキャリア上で培養された細胞をサンプリングする方法は以下の工程を含む：（Ｄ１）細胞培養のためにある重量のマイクロキャリアを秤量し、それらをサンプリングチューブ内に置き、細胞培養プロセスをシミュレートするために液体を添加し、それらを４～６０℃で０～２４時間浸漬し、次いで、標準スケールとして、サンプリングチューブ上のマイクロキャリアによって占有される体積に対応するスケールをマーキングすること；（Ｄ２）マイクロキャリアの体積を標準スケールにするために、サンプリングチューブを用いて細胞培養システムからマイクロキャリアをサンプリングすること；（Ｄ３）（Ｄ２）において収集されたマイクロキャリア中の細胞を計数すること；（Ｄ４）（Ｄ１）において秤量されたマイクロキャリアの重量、（Ｄ３）において計数された細胞の数、および細胞培養システム全体中のマイクロキャリアの総重量に基づいて、細胞培養システム全体中の細胞の総数を計算すること；したがって、細胞密度を計算すること。
工程（Ｄ１）において、マイクロキャリアを含むサンプリングチューブに液体を添加し、４～６０℃で０～２４時間浸漬する方法は、マイクロキャリアの完全な浸漬および膨潤の方法である。ここで、添加される液体はマイクロキャリア上での細胞培養に使用される本発明の培地（例えば、細胞培養またはＰＢＳに使用される本発明の培地）と同じまたは類似の粘度、親水性、ｐＨ、イオン濃度であり得る。マイクロキャリアを浸漬および膨潤させるのに必要な温度および時間は、マイクロキャリアに依存して変化する。これは、様々な製造業者からのマイクロキャリアの指示に従って行うことができる。例えば、ＧＥから入手可能なマイクロキャリアＣｙｔｏｄｅｘ １を使用して、乾燥されたマイクロキャリアを、３０～５０ｍＬ／ｇの比で少なくとも３時間、室温でＰＢＳに浸漬することによって膨潤させる。例えば、北京華館生物科技有限公司から入手可能な３Ｄ ＦｌｏＴｒｉｘマイクロキャリア（ＣＮＦ－Ｆ０１Ｔ－５０）を、ＰＢＳ中に０．５～２４時間、具体的には６時間、１０～１０００μＬ：１ｍｇ、具体的には１０μＬ：１ｍｇ、１０～１５μＬ：１ｍｇ、５～１５μＬ：１ｍｇまたは２５０～３５０μＬ：１ｍｇの比で浸漬し、膨潤させる。
工程（Ｄ１）では、マイクロキャリアを液体に浸漬した後、マイクロキャリアをできるだけ迅速に沈殿させる目的で、自然沈殿または遠心沈殿（例えば、１，５００ｒｐｍで２分間の遠心分離）のさらなる工程も含まれる。
工程（Ｄ２）において、サンプリングチューブを用いて細胞培養システムからマイクロキャリアをサンプリングすることは、以下の工程を含む方法に従って実施することができる：細胞培養系から懸濁液をピペッティングし、サンプリングチューブに添加し、マイクロキャリアを自然に又は遠心分離（沈殿速度を上げるために、遠心分離は５０～１６１０×ｇ、具体的には２００×ｇの速度で１～１０分間、具体的には２分間）のいずれかで沈殿させる工程と、工程（Ｄ１）で較正された標準スケールに達するかどうかを観察する工程と、達しない場合には標準スケールに達するまで懸濁液をピペッティングし続け、超過した場合にはサンプリングチューブから過剰のマイクロキャリアを除去する工程方法。
工程（Ｄ３）において、（Ｄ２）で収集されたマイクロキャリア中の細胞の計数は以下の工程：（Ｄ２）においてサンプリングチューブを遠心分離し（例えば、２００×ｇで２分間）、上清を廃棄し、沈殿物に細胞消化溶液を添加してマイクロキャリアから細胞を消化し、および次いで計数することを包含する方法に従って実施され得る。
工程（Ｄ４）では、全細胞培養系中の細胞の総数が（Ｄ３）で計数された細胞の数に、上記（Ｄ１）で計量されたマイクロキャリアの重量に関連するマイクロキャリアの総重量を乗じたものに等しい。
工程（Ｄ４）では、該総数をマイクロキャリアの総重量または総数、または培養系の総体積で割って、異なる単位、例えば、細胞／ｍｇマイクロキャリア、細胞／マイクロキャリア、細胞／ｍＬ培養系における細胞密度を得る。
工程（Ｄ１）において、マイクロキャリアを含むサンプリングチューブに液体を添加し、４～６０℃で０～２４時間浸漬する方法は、マイクロキャリアの完全な浸漬および膨潤の方法である。ここで、添加される液体はマイクロキャリア上での細胞培養に使用される本発明の培地（例えば、細胞培養またはＰＢＳに使用される本発明の培地）と同じまたは類似の粘度、親水性、ｐＨ、イオン濃度であり得る。マイクロキャリアを浸漬および膨潤させるのに必要な温度および時間は、マイクロキャリアに依存して変化する。これは、様々な製造業者からのマイクロキャリアの指示に従って行うことができる。例えば、ＧＥから入手可能なマイクロキャリアＣｙｔｏｄｅｘ １を使用して、乾燥されたマイクロキャリアを、３０～５０ｍＬ／ｇの比で少なくとも３時間、室温でＰＢＳに浸漬することによって膨潤させる。例えば、北京華館生物科技有限公司から入手可能な３Ｄ ＦｌｏＴｒｉｘマイクロキャリア（ＣＮＦ－Ｆ０１Ｔ－５０）を、ＰＢＳ中に０．５～２４時間、具体的には６時間、１０～１０００μＬ：１ｍｇ、具体的には１０μＬ：１ｍｇ、１０～１５μＬ：１ｍｇ、５～１５μＬ：１ｍｇまたは２５０～３５０μＬ：１ｍｇの比で浸漬し、膨潤させる。
工程（Ｄ１）では、マイクロキャリアを液体に浸漬した後、マイクロキャリアをできるだけ迅速に沈殿させる目的で、自然沈殿または遠心沈殿（例えば、１，５００ｒｐｍで２分間の遠心分離）のさらなる工程も含まれる。
工程（Ｄ２）において、サンプリングチューブを用いて細胞培養システムからマイクロキャリアをサンプリングすることは、以下の工程を含む方法に従って実施することができる：細胞培養系から懸濁液をピペッティングし、サンプリングチューブに添加し、マイクロキャリアを自然に又は遠心分離（沈殿速度を上げるために、遠心分離は５０～１６１０×ｇ、具体的には２００×ｇの速度で１～１０分間、具体的には２分間）のいずれかで沈殿させる工程と、工程（Ｄ１）で較正された標準スケールに達するかどうかを観察する工程と、達しない場合には標準スケールに達するまで懸濁液をピペッティングし続け、超過した場合にはサンプリングチューブから過剰のマイクロキャリアを除去する工程方法。
工程（Ｄ３）において、（Ｄ２）で収集されたマイクロキャリア中の細胞の計数は以下の工程：（Ｄ２）においてサンプリングチューブを遠心分離し（例えば、２００×ｇで２分間）、上清を廃棄し、沈殿物に細胞消化溶液を添加してマイクロキャリアから細胞を消化し、および次いで計数することを包含する方法に従って実施され得る。
工程（Ｄ４）では、全細胞培養系中の細胞の総数が（Ｄ３）で計数された細胞の数に、上記（Ｄ１）で計量されたマイクロキャリアの重量に関連するマイクロキャリアの総重量を乗じたものに等しい。
工程（Ｄ４）では、該総数をマイクロキャリアの総重量または総数、または培養系の総体積で割って、異なる単位、例えば、細胞／ｍｇマイクロキャリア、細胞／マイクロキャリア、細胞／ｍＬ培養系における細胞密度を得る。
【0031】
マイクロキャリア上で培養された細胞をサンプリングするための方法において、マイクロキャリアは、北京華館生物科技有限公司から入手可能な３Ｄ ＦｌｏＴｒｉｘマイクロキャリア（カタログ番号：ＣＮＦ－Ｆ０１Ｔ－５０）である。サンプリングチューブは、具体的には１．５ｍｌの微量遠心チューブである。
一実施形態では、工程（Ｄ１）で秤量されるマイクロキャリアの重量は５ｍｇであり、サンプリングチューブは１．５ｍｌのマイクロ遠心チューブであり、標準スケールは０．１ｍＬスケールであり、細胞培養システム中のマイクロキャリアの重量は２００ｍｇであり、培養中の細胞の初期数は２００万であり、培養系中の培地は６０ｍＬの体積を有し、サンプリングは細胞培養の７２時間後に行われる。
上記の方法のいずれも、以下の工程を含む、細胞の大規模増殖のための三次元マイクロキャリアに基づく方法をさらに含む：撹拌バイオリアクター中の三次元マイクロキャリア上での細胞の大規模増殖を達成する工程。
一実施形態では、工程（Ｄ１）で秤量されるマイクロキャリアの重量は５ｍｇであり、サンプリングチューブは１．５ｍｌのマイクロ遠心チューブであり、標準スケールは０．１ｍＬスケールであり、細胞培養システム中のマイクロキャリアの重量は２００ｍｇであり、培養中の細胞の初期数は２００万であり、培養系中の培地は６０ｍＬの体積を有し、サンプリングは細胞培養の７２時間後に行われる。
上記の方法のいずれも、以下の工程を含む、細胞の大規模増殖のための三次元マイクロキャリアに基づく方法をさらに含む：撹拌バイオリアクター中の三次元マイクロキャリア上での細胞の大規模増殖を達成する工程。
【0032】
撹拌バイオリアクターは半自動、完全自動、または一体型バイオリアクターを含み得るが、これらに限定されない。撹拌バイオリアクターは、具体的には３Ｄ ＦｌｏＴｒｉｘ（商標）ミニスピン小規模バイオリアクターまたは３Ｄ ＦｌｏＴｒｉｘ（商標）ｖｉｖａＳｐｉｎバイオリアクターのいずれかであり得る。１つのバイオリアクター単独または２つのバイオリアクターを組み合わせて使用することができる。
細胞がバイオリアクター中で培養される条件は、細胞の増殖に従って制御することができる。例えば、インキュベーションｐＨは６．５～７．５、好ましくは７．０～７．５、より好ましくは７．２とすることができ、ＣＯ２の能動ポンプ輸送は約３～１０％、好ましくは約５～８％、より好ましくは約５％とすることができ、温度は３０℃～４０℃、好ましくは３７℃とすることができ、攪拌スピードは１０～１５０ｒｐｍ、好ましくは４０～８０ｒｐｍとすることができ、気体送達の頻度は、１～４０ｃｃｍ、より好ましくは約５～２０ｃｃｍとすることができる。
本発明の一例では、細胞を三次元マイクロキャリアに接種し、次いで、３Ｄ ＦｌｏＴｒｉｘ（商標）ｖｉｖａＳｐｉｎバイオリアクターに移す前に、６０ｒｐｍの一定の時計方向速度で６日間培養するために３Ｄ ＦｌｏＴｒｉｘ（商標）ｍｉｎｉＳｐｉｎ小規模バイオリアクターに置いた。３Ｄ ＦｌｏＴｒｉｘ（商標）ｖｉｖａＳｐｉｎバイオリアクターについて設定したプロセスパラメーターは、以下のように制御した：プロセス全体を通して１２ｃｃｍの５％ＣＯ２の能動ポンプ輸送、および３７℃。Ｔ＝０時間において８００ｍＬの完全培地を１０ｍＬ／分の速度で能動的にポンプ注入し、Ｔ＝９６時間において５００ｍＬの液体を１０ｍＬ／分の速度で能動的にポンプ注入し、続いて１０ｍＬ／分の速度で５００ｍＬの新鮮培地をポンプ注入し、Ｔ＝１４４時間において５００ｍＬの液体を１０ｍＬ／分の速度で能動的にポンプ注入し、続いて１０ｍＬ／分で反応器に能動的にポンプ注入した５００ｍＬの新鮮培地に再懸濁した５０錠の３Ｄ ＴａｂｌｅＴｒｉｘ（商標）マイクロキャリアを能動的にポンプ注入した。Ｔ＝０～１２時間およびＴ＝１４４～１５６時間の撹拌速度は、５分間４０ｒｐｍ、２０分間２０ｒｐｍのサイクルで可変速度、残りの時間は６０ｒｐｍの一定速度であった。
細胞がバイオリアクター中で培養される条件は、細胞の増殖に従って制御することができる。例えば、インキュベーションｐＨは６．５～７．５、好ましくは７．０～７．５、より好ましくは７．２とすることができ、ＣＯ２の能動ポンプ輸送は約３～１０％、好ましくは約５～８％、より好ましくは約５％とすることができ、温度は３０℃～４０℃、好ましくは３７℃とすることができ、攪拌スピードは１０～１５０ｒｐｍ、好ましくは４０～８０ｒｐｍとすることができ、気体送達の頻度は、１～４０ｃｃｍ、より好ましくは約５～２０ｃｃｍとすることができる。
本発明の一例では、細胞を三次元マイクロキャリアに接種し、次いで、３Ｄ ＦｌｏＴｒｉｘ（商標）ｖｉｖａＳｐｉｎバイオリアクターに移す前に、６０ｒｐｍの一定の時計方向速度で６日間培養するために３Ｄ ＦｌｏＴｒｉｘ（商標）ｍｉｎｉＳｐｉｎ小規模バイオリアクターに置いた。３Ｄ ＦｌｏＴｒｉｘ（商標）ｖｉｖａＳｐｉｎバイオリアクターについて設定したプロセスパラメーターは、以下のように制御した：プロセス全体を通して１２ｃｃｍの５％ＣＯ２の能動ポンプ輸送、および３７℃。Ｔ＝０時間において８００ｍＬの完全培地を１０ｍＬ／分の速度で能動的にポンプ注入し、Ｔ＝９６時間において５００ｍＬの液体を１０ｍＬ／分の速度で能動的にポンプ注入し、続いて１０ｍＬ／分の速度で５００ｍＬの新鮮培地をポンプ注入し、Ｔ＝１４４時間において５００ｍＬの液体を１０ｍＬ／分の速度で能動的にポンプ注入し、続いて１０ｍＬ／分で反応器に能動的にポンプ注入した５００ｍＬの新鮮培地に再懸濁した５０錠の３Ｄ ＴａｂｌｅＴｒｉｘ（商標）マイクロキャリアを能動的にポンプ注入した。Ｔ＝０～１２時間およびＴ＝１４４～１５６時間の撹拌速度は、５分間４０ｒｐｍ、２０分間２０ｒｐｍのサイクルで可変速度、残りの時間は６０ｒｐｍの一定速度であった。
【0033】
本発明の別の実施例では、細胞を三次元マイクロキャリアに接種し、次いで３Ｄ ＦｌｏＴｒｉｘ（商標）ｖｉｖａＳｐｉｎバイオリアクターに直接接種した。３Ｄ ＦｌｏＴｒｉｘ（商標）ｖｉｖａＳｐｉｎバイオリアクターについて設定されたプロセスパラメーターは、以下のように制御された：プロセス全体を通して１０ｃｃｍの５％ＣＯ２の能動ポンプ輸送、および３７℃。Ｔ＝０時間において４６０ｍＬの完全培地を１０ｍＬ／分の速度で能動的にポンプ注入し、続いてＴ＝４８時間において５００ｍＬの液体を１０ｍＬ／分の速度で能動的にポンプ注入した。その後２４時間毎に、５００ｍＬの液体を１０ｍＬ／分の速度で能動的にポンピングし、続いて５００ｍＬの新鮮な培地を１２０時間まで１０ｍＬ／分の速度で反応器に能動的にポンピングした。Ｔ＝１２０時間において１０ｍＬ／分で５００ｍＬの液体ｎを能動的にポンピングした後、５００ｍＬの新鮮な培地に再懸濁した３Ｄ ＴａｂｌｅＴｒｉｘ（商標）マイクロキャリアの４０個の錠剤を、１０ｍＬ／分の速度で反応器に能動的にポンピングした。撹拌速度は、Ｔ＝０～１２０時間では６０ｒｐｍの一定速度であり、Ｔ＝１２０～１３６時間では６０ｒｐｍで５分間、２０ｒｐｍで２０分間のサイクルで可変速度であり、Ｔ＝１３６～２４０時間では６０ｒｐｍの一定速度であった（２４０時間後、撹拌モードは６０ｒｐｍの一定速度であった）。
【0034】
上記の三次元マイクロキャリアのいずれかは、特に、多孔質構造を有するマイクロキャリアビーズを指し得、ここで、培養されるべき細胞は細胞培養容器（例えば、細胞培養フラスコ、ウェルプレートまたはバイオリアクター）内の三次元マイクロキャリア上で培養される。マイクロキャリア培養において、細胞は三次元マイクロキャリアの表面および内部に連結された孔の内側に付着し得、一方、マイクロキャリアは穏やかに撹拌することによって培養容器中の培養培地中に懸濁され得る。例示的な三次元マイクロキャリアには３Ｄ ＴａｂｌｅＴｒｉｘ（商標）マイクロキャリア、３Ｄ ＦｌｏＴｒｉｘ（商標）マイクロキャリアなどが含まれるが、これらに限定されない。
【0035】
上記の細胞のいずれも、接着細胞であり、これは、特に幹細胞であり得る。幹細胞は限定されるわけではないが、様々な組織源の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、脂肪細胞幹細胞（ＡＤＳＣ）、神経幹細胞（ＮＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）および幹細胞に由来する細胞などを含む。幹細胞は、特に間葉系幹細胞であり得る。ＭＳＣは、具体的には脂肪由来ＭＳＣまたは臍帯ＭＳＣであり得る。
【図面の簡単な説明】
【0036】
【図1】本発明の実施例１で使用したインペラーを内蔵した細胞培養フラスコを示す。
【図2】本発明の実施例１における細胞およびマイクロキャリアの回転式の付着法によるマイクロキャリア上に徐々に付着した細胞数および付着効率を示す。
【図3】本発明の実施例２における方法による細胞付着後の蛍光染色の結果のグラフを示す。
【図4】本発明の実施例２において顕微鏡の明視野下で観察されたマイクロキャリア溶解および蛍光顕微鏡下で観察された生細胞の図を示す。
【図5】従来のトリプシン処理によって得られた培養フラスコ中の細胞の活性と比較した、本発明の実施例２における溶解液から採取した三次元マイクロキャリア（３Ｄ ＦｌｏＴｒｉｘマイクロキャリア）上の細胞の活性の比較結果を示す。
【図6】５ｍｇのマイクロキャリアが本発明の実施例３における１．５ｍｌのマイクロ遠心チューブ上の０．１ｍＬスケールに正確に一致するスケールに達することを示す。
【図7】本発明の実施例３において、自然沈殿後の懸濁液定量サンプリング法によりピペットで採取した懸濁液１ｍＬの状態を示す。Ａ１～Ａ３は、３回の反復を示す。
【図8】本発明の実施例３において、自然沈殿後にマイクロキャリア定量サンプリング法によりピペットで採取した懸濁液１ｍＬの状態を示す。Ｂ１～Ｂ３は、３回の反復を示す。
【図9】本発明の実施例３における懸濁液定量サンプリング法およびマイクロキャリア定量サンプリング法によって得られた細胞の総数を、実際の状況と比較した比較結果を示す。
【図10】本発明の実施例４における三次元静的蘇生細胞および対照細胞のモニタリング結果を示す。
【図11】本発明の実施例４における三次元静的蘇生細胞および対照細胞の増殖を示す。
【図12】本発明の実施例４における三次元静的蘇生細胞微細構造のモニタリング結果を示す。
【図13】本発明の実施例４における三次元動的蘇生細胞法の細胞モニタリング結果を示す。
【図14】本発明の実施例４における三次元動的蘇生細胞法の細胞増殖を示す。
【図15】本発明の実施例４における６つの細胞蘇生方法の比較を示す。
【図16】本発明の実施例４における三次元静的蘇生細胞微細構造のモニタリング結果を示す。
【図17】本発明の実施例４における三次元動的蘇生細胞微細構造の細胞増殖を示す。
【図18】本発明の実施例４において、静的ｉｎ ｓｉｔｕ継代方法によって脂肪由来ＭＳＣを接種した場合、細胞が存在しているマイクロキャリア（明るい点）は僅かであったが、ｉｎ ｓｉｔｕ継代培養後４日目にはすべてのマイクロキャリア上に細胞が存在したことを示す。
【図19】本発明の実施例５において、臍帯ＭＳＣが静的ｉｎ ｓｉｔｕ継代方法によって接種された２日後に、多くの細胞が存在しているマイクロキャリア（明るい点）は少数のみであるのに対し、ｉｎ ｓｉｔｕ継代培養後の４日目に、細胞が全てのマイクロキャリア上に存在したことを示す。
【図20】本発明の実施例５において、脂肪由来ＭＳＣを静的ｉｎ ｓｉｔｕ継代培養方法により培養した後、接種時の５００，０００から２１０万に増加した細胞数が、従来の消化後継代培養方法により得られた細胞数（２４０万）と有意差（ｐ＝０．３２）がなかったことを示す。
【図21】本発明の実施例５において、臍帯ＭＳＣを静的ｉｎ ｓｉｔｕ継代培養方法により培養した後、細胞数が接種時の３００，０００から１９０万に増加したことを示す。
【図22】本発明の実施例５において、脂肪由来ＭＳＣを動的ｉｎ ｓｉｔｕ継代方法によって接種した２日後に、多くの細胞が存在しているマイクロキャリア（明るい点）は少数のみであるのに対し、ｉｎ ｓｉｔｕ継代培養後５日目には、全てのマイクロキャリア上に細胞が存在したことを示す。
【図23】本発明の実施例５において、臍帯ＭＳＣが動的ｉｎ ｓｉｔｕ継代方法によって接種された場合、多くの細胞が存在しているマイクロキャリア（明るい点）は少数のみであるのに対し、ｉｎ ｓｉｔｕ継代培養後５日目にはすべてのマイクロキャリア上に細胞が存在したことを示す。
【図24】本発明の実施例５において、脂肪由来ＭＳＣが動的なｉｎ ｓｉｔｕ継代方法によって、最初のシードマイクロキャリア上のわずか２００万個の細胞から、５日間の培養後の５０００万個まで成長および増殖され得ることを示す。
【図25】本発明の実施例５において、臍帯ＭＳＣが動的ｉｎ ｓｉｔｕ継代方法によって、最初のシードマイクロキャリア上のわずか１００万個の細胞から、７日間の培養後に１５２０万個まで、成長及び増殖され得ることを示す。
【図26】本発明の実施例６における、異なる凍結保存時間後のマイクロキャリア上のｉｎ ｓｉｔｕ凍結保存ＨＥＫ２９３細胞の蘇生結果のグラフを示す。
【図27】本発明の実施例６における、マイクロキャリア上のＨＥＫ２９３細胞の凍結保存前と凍結保存後に蘇生された生細胞の割合の結果を示すグラフである。
【図28】本発明の実施例６における凍結保存および蘇生後の３Ｄ ＦｌｏＴｒｉｘマイクロキャリアおよび競合マイクロキャリア（ＧＥ Ｃｙｔｏｄｅｘ）上のＨＥＫ２９３細胞の数のヒストグラムを示す。
【図29】本発明の実施例６における異なる凍結保存時間後のマイクロキャリア上のｉｎ ｓｉｔｕ凍結保存ＡＤ－ＭＳＣの蘇生結果のグラフを示す。
【図30】本発明の実施例６における凍結保存の前後のＡＤ－ＭＳＣの活性の比較を示す。
【図31】本発明の実施例６における、凍結保存前後の細胞数およびＡＤ－ＭＳＣの凍結保存後の細胞蘇生率の統計を示す。
【図32】本発明の実施例７の第１部における細胞数の増殖の統計的結果を示す。
【図33】本発明の実施例７の第１部で使用した自動化バイオリアクター（３Ｄ ｖｉｖａＳＰＩＮ Ｖ１，北京華館生物科技有限公司）を示す。
【図34】本発明の実施例７の第１部における細胞活性の結果を示す。
【図35】本発明の実施例７の第２部における細胞数の増殖の統計的結果を示す。
【図36】本発明の実施例７の第２部における細胞活性の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0037】
以下の実施形態／実施例は本発明のより良い理解を容易にするが、本発明を限定するものではない。以下の実施形態／実施例における実験方法は特に明記しない限り、全て日常的な方法であった。以下の実施形態において使用される試験材料は特に明記しない限り、全て、日常的な生化学試薬店から購入した。以下の実施形態／実施例における定量試験は、３回の反復実験で設定され、平均値が結果として得られた。
【実施例】
【0038】
実施例１：三次元マイクロキャリア細胞付着培養の方法
実施例で使用したマイクロキャリアは、ＣＮＦ－Ｆ０１Ｔ－５０のカタログ番号を有する、北京華館生物科技有限公司から購入した３Ｄ ＦｌｏＴｒｉｘマイクロキャリアであった。
Ｉ． 攪拌機回転付着を用いる三次元マイクロキャリア細胞付着の方法；
１．マイクロキャリア調製：２００ｍｇのマイクロキャリア粉末を、紫外線滅菌のために秤量し、次いで、（図１に示されるように）インペラー内蔵滅菌細胞培養フラスコに注ぎ、３つの群を準備した；
２．細胞調製：脂肪由来ＭＳＣ懸濁液を予め調製し、５×１０６細胞を、後の使用のために６０ｍｌの完全培地に再懸濁し、３つの群を準備した；
３．細胞接種：上記の細胞懸濁液を、内蔵インペラーを有する細胞培養フラスコ中に混合し、２００ｍｇのマイクロキャリアと十分に混合した；
４．細胞付着：インペラーを内蔵した細胞培養フラスコを低速攪拌機に置き、３７℃、５％ ＣＯ２インキュベーターに入れて８０ｒｐｍで攪拌し、細胞をマイクロキャリアに回転付着させた；
５．付着速度を得るためのＩｎ－ｓｉｔｕ計数：
ａ． マイクロキャリア収集：３つの群のマイクロキャリアを、それぞれ２、４および６時間撹拌した後、細胞懸濁液と混合し、次いで、７０μｍ細胞篩を通して収集し、ＰＢＳで１回洗浄して、マイクロキャリアに付着していない任意の細胞を洗い流した。次いで、細胞を含有するマイクロキャリア懸濁液を１５００ｒｐｍで２分間遠心分離し、上清を廃棄した。
ｂ． 細胞計数： ２００ｍｇのマイクロキャリアを５０ｍＬの０．１％クリスタルバイオレット溶液（０．１ｇのクリスタルバイオレット、２．１ｇのクエン酸、２０μＬのＴｗｅｅｎ－８０、１００ｍｌの脱イオン水）に３７℃で２～５時間添加し、細胞計数プレートで細胞を計数し、最初の接種数による換算後に付着速度を得た。
ｃ． 結果分析：図２は、撹拌時間が増加するにつれて、細胞は回転付着によってマイクロキャリアに徐々に付着し得、付着効率は撹拌の２時間で６７％に達し、４時間で８１％に達し、６時間で９２％に達したことを示す。
実施例で使用したマイクロキャリアは、ＣＮＦ－Ｆ０１Ｔ－５０のカタログ番号を有する、北京華館生物科技有限公司から購入した３Ｄ ＦｌｏＴｒｉｘマイクロキャリアであった。
Ｉ． 攪拌機回転付着を用いる三次元マイクロキャリア細胞付着の方法；
１．マイクロキャリア調製：２００ｍｇのマイクロキャリア粉末を、紫外線滅菌のために秤量し、次いで、（図１に示されるように）インペラー内蔵滅菌細胞培養フラスコに注ぎ、３つの群を準備した；
２．細胞調製：脂肪由来ＭＳＣ懸濁液を予め調製し、５×１０６細胞を、後の使用のために６０ｍｌの完全培地に再懸濁し、３つの群を準備した；
３．細胞接種：上記の細胞懸濁液を、内蔵インペラーを有する細胞培養フラスコ中に混合し、２００ｍｇのマイクロキャリアと十分に混合した；
４．細胞付着：インペラーを内蔵した細胞培養フラスコを低速攪拌機に置き、３７℃、５％ ＣＯ２インキュベーターに入れて８０ｒｐｍで攪拌し、細胞をマイクロキャリアに回転付着させた；
５．付着速度を得るためのＩｎ－ｓｉｔｕ計数：
ａ． マイクロキャリア収集：３つの群のマイクロキャリアを、それぞれ２、４および６時間撹拌した後、細胞懸濁液と混合し、次いで、７０μｍ細胞篩を通して収集し、ＰＢＳで１回洗浄して、マイクロキャリアに付着していない任意の細胞を洗い流した。次いで、細胞を含有するマイクロキャリア懸濁液を１５００ｒｐｍで２分間遠心分離し、上清を廃棄した。
ｂ． 細胞計数： ２００ｍｇのマイクロキャリアを５０ｍＬの０．１％クリスタルバイオレット溶液（０．１ｇのクリスタルバイオレット、２．１ｇのクエン酸、２０μＬのＴｗｅｅｎ－８０、１００ｍｌの脱イオン水）に３７℃で２～５時間添加し、細胞計数プレートで細胞を計数し、最初の接種数による換算後に付着速度を得た。
ｃ． 結果分析：図２は、撹拌時間が増加するにつれて、細胞は回転付着によってマイクロキャリアに徐々に付着し得、付着効率は撹拌の２時間で６７％に達し、４時間で８１％に達し、６時間で９２％に達したことを示す。
【0039】
ＩＩ． 小容量の高密度膨潤付着を用いた三次元マイクロキャリア細胞付着の方法
１． マイクロキャリア調製：マイクロキャリア粉末２０ｍｇを、後の使用のために紫外線滅菌のために秤量した；
２． 細胞調製：脂肪由来ＭＳＣ懸濁液を予め２．５×１０６細胞／ｍＬの密度で調製し、三次元マイクロキャリア２０ｍｇ毎に２００μＬを調製した；
３． 細胞接種：２００μＬの細胞懸濁液をピペットで移し、２０ｍｇのマイクロキャリアに滴下し、細胞懸濁液をマイクロキャリアと十分に混合した；
４． 細胞付着：細胞懸濁液とよく混合したマイクロキャリアを３７℃、５％ ＣＯ２インキュベーターに入れ、２時間インキュベートし、細胞をマイクロキャリアに付着させた；
５． 細胞培養：細胞が付着した後、３ｍｌの完全培地を添加し、細胞を３７℃で５％ ＣＯ２インキュベーター中で２４時間インキュベートし、次いで観察した；
６． 対照実験：工程３～５は本発明の方法である小容量高密度付着法を採用し；さらに、一般的な付着法（大容量低密度）の対照実験群を調製、すなわち、細胞懸濁液２００μＬを完全培地３ｍＬに混合し、２０ｍｇのマイクロキャリアを直接添加して、その後２４時間観察した；
７． 細胞観察：
１） キット：動物細胞の死滅生存率／細胞毒性アッセイキット、カタログ番号： ＫＧＡＦ００１；
２） 細胞を含有する三次元マイクロキャリア懸濁液５０～１００μＬを９６ウェルプレートに添加した。
３） 上清を可能な限り除去し、ＰＢＳを添加し、１回洗浄し、２分後に可能な限りＰＢＳを除去し、各ウェルを、キットの説明書に従って構成された１００μＬの染色溶液を添加することによって染色した。室温で２０～３０分間染色し、光から保護した後、蛍光顕微鏡下で観察した結果を図３に示す。
図３から分かるように、生細胞は染色溶液で染色され、蛍光によって発光することが観察され、発光する細胞は生細胞であった。この図は大容量低密度付着方法によって、少数の細胞がマイクロキャリア上、主にマイクロキャリアの表面上に付着したのに対して、小容量高密度付着方法によって、多数の細胞をマイクロキャリア上に付着させることができ、細胞がマイクロキャリアの表面上だけでなく多孔質マイクロキャリアの細孔内にも存在したことを示しており、したがって、本発明の小容量高密度付着方法は、マイクロキャリア上への細胞の付着においてより有効であり、多孔質マイクロキャリアの大面積をより良好に利用し得ることを示している。
１． マイクロキャリア調製：マイクロキャリア粉末２０ｍｇを、後の使用のために紫外線滅菌のために秤量した；
２． 細胞調製：脂肪由来ＭＳＣ懸濁液を予め２．５×１０６細胞／ｍＬの密度で調製し、三次元マイクロキャリア２０ｍｇ毎に２００μＬを調製した；
３． 細胞接種：２００μＬの細胞懸濁液をピペットで移し、２０ｍｇのマイクロキャリアに滴下し、細胞懸濁液をマイクロキャリアと十分に混合した；
４． 細胞付着：細胞懸濁液とよく混合したマイクロキャリアを３７℃、５％ ＣＯ２インキュベーターに入れ、２時間インキュベートし、細胞をマイクロキャリアに付着させた；
５． 細胞培養：細胞が付着した後、３ｍｌの完全培地を添加し、細胞を３７℃で５％ ＣＯ２インキュベーター中で２４時間インキュベートし、次いで観察した；
６． 対照実験：工程３～５は本発明の方法である小容量高密度付着法を採用し；さらに、一般的な付着法（大容量低密度）の対照実験群を調製、すなわち、細胞懸濁液２００μＬを完全培地３ｍＬに混合し、２０ｍｇのマイクロキャリアを直接添加して、その後２４時間観察した；
７． 細胞観察：
１） キット：動物細胞の死滅生存率／細胞毒性アッセイキット、カタログ番号： ＫＧＡＦ００１；
２） 細胞を含有する三次元マイクロキャリア懸濁液５０～１００μＬを９６ウェルプレートに添加した。
３） 上清を可能な限り除去し、ＰＢＳを添加し、１回洗浄し、２分後に可能な限りＰＢＳを除去し、各ウェルを、キットの説明書に従って構成された１００μＬの染色溶液を添加することによって染色した。室温で２０～３０分間染色し、光から保護した後、蛍光顕微鏡下で観察した結果を図３に示す。
図３から分かるように、生細胞は染色溶液で染色され、蛍光によって発光することが観察され、発光する細胞は生細胞であった。この図は大容量低密度付着方法によって、少数の細胞がマイクロキャリア上、主にマイクロキャリアの表面上に付着したのに対して、小容量高密度付着方法によって、多数の細胞をマイクロキャリア上に付着させることができ、細胞がマイクロキャリアの表面上だけでなく多孔質マイクロキャリアの細孔内にも存在したことを示しており、したがって、本発明の小容量高密度付着方法は、マイクロキャリア上への細胞の付着においてより有効であり、多孔質マイクロキャリアの大面積をより良好に利用し得ることを示している。
【0040】
実施例２ 三次元マイクロキャリア上の細胞を採取するための方法
本実施例で使用したマイクロキャリアは、ＣＮＦ－Ｆ０１Ｔ－５０のカタログ番号を有する、北京華館生物科技有限公司から購入した３Ｄ ＦｌｏＴｒｉｘマイクロキャリアであった。
１． 溶解液処方：０．１％（質量％）コラゲナーゼ（シグマ－アルドリッチ（上海）貿易社， Ｃ０１３０）、０．１％（質量％）ＥＤＴＡ（北京ソーラーバイオテクノロジー社， Ｅ１１７０）、０．０５％（質量％）トリプシン（Ｍ＆Ｃ 遺伝子技術社（北京）、ＣＣ０１７）；停止液：完全培地；
２． 培養皿からの脂肪由来ＭＳＣを有する三次元マイクロキャリア２０ｍｇを遠心分離チューブに移し、４００×ｇで２分間遠心分離し、上清をピペットで取り、適切な量のＰＢＳを添加し、２０～３０秒間手で穏やかに振盪し、上清を可能な限りピペットで取り、ＰＢＳ洗浄を１回繰り返した。
３． 溶解液３ｍＬを添加し、細胞をセルインキュベーター中で３７℃で３０分間インキュベートし、その間１０分毎に１ｍＬピペットで数回穏やかに吹き込んだ。
４．３０分後、マイクロキャリアを完全に溶解し、３ｍＬの完全培地を添加して溶解プロセスを停止させた。
５． ２００×ｇで５分間遠心分離を行い、上清を廃棄し、細胞をその後の適用に必要なように再懸濁した。
本実施例で使用したマイクロキャリアは、ＣＮＦ－Ｆ０１Ｔ－５０のカタログ番号を有する、北京華館生物科技有限公司から購入した３Ｄ ＦｌｏＴｒｉｘマイクロキャリアであった。
１． 溶解液処方：０．１％（質量％）コラゲナーゼ（シグマ－アルドリッチ（上海）貿易社， Ｃ０１３０）、０．１％（質量％）ＥＤＴＡ（北京ソーラーバイオテクノロジー社， Ｅ１１７０）、０．０５％（質量％）トリプシン（Ｍ＆Ｃ 遺伝子技術社（北京）、ＣＣ０１７）；停止液：完全培地；
２． 培養皿からの脂肪由来ＭＳＣを有する三次元マイクロキャリア２０ｍｇを遠心分離チューブに移し、４００×ｇで２分間遠心分離し、上清をピペットで取り、適切な量のＰＢＳを添加し、２０～３０秒間手で穏やかに振盪し、上清を可能な限りピペットで取り、ＰＢＳ洗浄を１回繰り返した。
３． 溶解液３ｍＬを添加し、細胞をセルインキュベーター中で３７℃で３０分間インキュベートし、その間１０分毎に１ｍＬピペットで数回穏やかに吹き込んだ。
４．３０分後、マイクロキャリアを完全に溶解し、３ｍＬの完全培地を添加して溶解プロセスを停止させた。
５． ２００×ｇで５分間遠心分離を行い、上清を廃棄し、細胞をその後の適用に必要なように再懸濁した。
【0041】
６． 細胞検出方法：
（１）生細胞のＩｎ ｓｉｔｕカルセイン－ＡＭ／ＰＩ染色法：
１） キット：動物細胞の死滅生存率／細胞毒性アッセイキット、カタログ番号： ＫＧＡＦ００１；
２） 細胞を含有する３Ｄマイクロキャリア懸濁液２０ｍｇを遠心分離チューブ分離チューブに添加し、４００×ｇで２分間遠心分離した；
３） 上清を可能な限り除去し、ＰＢＳを添加し、１回洗浄し、２分後に可能な限りＰＢＳを除去し、キットの指示に従って構成された染色溶液１００μＬを染色のために添加した。室温で２０～３０分間染色し、光から保護した後、チューブを４００×ｇで２分間遠心分離した；
４） 上清を廃棄し、３ｍＬの溶解液を添加し、マイクロキャリア溶解を光学顕微鏡下で観察し、生細胞を蛍光顕微鏡下で０分、１０分および３０分で観察した；結果を図４に示す。
図４に見られるように、マイクロキャリアは光学顕微鏡の明視野において観察され、徐々に溶解し、時間とともに消失し、細胞のみを残した。蛍光顕微鏡による染色された細胞の観察は溶解液がマイクロキャリアを溶解することにつれて、細胞がマイクロキャリアから単一細胞に分離されたが、死細胞の数は増加せず、細胞は活性のままであったことを示した。これは、マイクロキャリアに対する溶解がマイクロキャリアの活性に影響を及ぼすことなく、マイクロキャリアから細胞を蘇生することができたことを示した。
（１）生細胞のＩｎ ｓｉｔｕカルセイン－ＡＭ／ＰＩ染色法：
１） キット：動物細胞の死滅生存率／細胞毒性アッセイキット、カタログ番号： ＫＧＡＦ００１；
２） 細胞を含有する３Ｄマイクロキャリア懸濁液２０ｍｇを遠心分離チューブ分離チューブに添加し、４００×ｇで２分間遠心分離した；
３） 上清を可能な限り除去し、ＰＢＳを添加し、１回洗浄し、２分後に可能な限りＰＢＳを除去し、キットの指示に従って構成された染色溶液１００μＬを染色のために添加した。室温で２０～３０分間染色し、光から保護した後、チューブを４００×ｇで２分間遠心分離した；
４） 上清を廃棄し、３ｍＬの溶解液を添加し、マイクロキャリア溶解を光学顕微鏡下で観察し、生細胞を蛍光顕微鏡下で０分、１０分および３０分で観察した；結果を図４に示す。
図４に見られるように、マイクロキャリアは光学顕微鏡の明視野において観察され、徐々に溶解し、時間とともに消失し、細胞のみを残した。蛍光顕微鏡による染色された細胞の観察は溶解液がマイクロキャリアを溶解することにつれて、細胞がマイクロキャリアから単一細胞に分離されたが、死細胞の数は増加せず、細胞は活性のままであったことを示した。これは、マイクロキャリアに対する溶解がマイクロキャリアの活性に影響を及ぼすことなく、マイクロキャリアから細胞を蘇生することができたことを示した。
【0042】
（２）フローサイトメトリーによるアポトーシス率を決定するための分析方法：
１） 細胞収集：細胞を含有する三次元マイクロキャリア懸濁液２０ｍｇを４００×ｇで２分間遠心分離し、上清を廃棄した。０．１％コラゲナーゼＩＶ型溶液（１ＬのＰＢＳに溶解した１ｇのコラゲナーゼＩＶ型（Ｇｉｂｃｏ、１７１０４０１９））３ｍＬを添加し、溶液を細胞インキュベーター中で３７℃で３０分間インキュベートし、４００×ｇで５分間遠心分離し、上清を廃棄した。二次元（２Ｄ）細胞の採取には、従来のトリプシン消化法を用い、すなわち、細胞培養フラスコ中の培地を廃棄し、適切な量のＰＢＳを添加し、２回洗浄し、適切な量の０．２５％トリプシン溶液を添加し、細胞を３７℃で２分間、またはフラスコから分離するまでインキュベートした。等量の完全培地を加えて停止させた後、懸濁液を遠心分離チューブ中に取り出し、４００×ｇで５分間遠心分離し、上清を捨てた。
２） 細胞洗浄：細胞を、４℃で予冷したＰＢＳによって１回再懸濁し、４００×ｇで５分間遠心分離し、次いで、細胞を洗浄した。
３） 細胞染色：細胞を、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ－ＦＩＴＣ／ＰＩアポトーシス検出キット（新海遺伝子検査社（ＨａｉＧｅｎｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ．， Ｌｔｄ）， Ｓ０１８５）を使用して染色し、すなわち、３００μＬの結合緩衝液を添加し、続いて、５μＬのＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ－ＦＩＴＣを添加し、混合し、室温で１５分間インキュベートし、光から保護した；次いで、５μＬのＰＩを添加し、５分間染色した；２００μＬの結合緩衝液を補充した。
４） 細胞流量サイトメトリー：染色された細胞の流量サイトメトリーを、ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩ ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒを使用して実施し、細胞分類分析の報告を機器によって作成した。
１） 細胞収集：細胞を含有する三次元マイクロキャリア懸濁液２０ｍｇを４００×ｇで２分間遠心分離し、上清を廃棄した。０．１％コラゲナーゼＩＶ型溶液（１ＬのＰＢＳに溶解した１ｇのコラゲナーゼＩＶ型（Ｇｉｂｃｏ、１７１０４０１９））３ｍＬを添加し、溶液を細胞インキュベーター中で３７℃で３０分間インキュベートし、４００×ｇで５分間遠心分離し、上清を廃棄した。二次元（２Ｄ）細胞の採取には、従来のトリプシン消化法を用い、すなわち、細胞培養フラスコ中の培地を廃棄し、適切な量のＰＢＳを添加し、２回洗浄し、適切な量の０．２５％トリプシン溶液を添加し、細胞を３７℃で２分間、またはフラスコから分離するまでインキュベートした。等量の完全培地を加えて停止させた後、懸濁液を遠心分離チューブ中に取り出し、４００×ｇで５分間遠心分離し、上清を捨てた。
２） 細胞洗浄：細胞を、４℃で予冷したＰＢＳによって１回再懸濁し、４００×ｇで５分間遠心分離し、次いで、細胞を洗浄した。
３） 細胞染色：細胞を、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ－ＦＩＴＣ／ＰＩアポトーシス検出キット（新海遺伝子検査社（ＨａｉＧｅｎｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ．， Ｌｔｄ）， Ｓ０１８５）を使用して染色し、すなわち、３００μＬの結合緩衝液を添加し、続いて、５μＬのＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ－ＦＩＴＣを添加し、混合し、室温で１５分間インキュベートし、光から保護した；次いで、５μＬのＰＩを添加し、５分間染色した；２００μＬの結合緩衝液を補充した。
４） 細胞流量サイトメトリー：染色された細胞の流量サイトメトリーを、ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩ ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒを使用して実施し、細胞分類分析の報告を機器によって作成した。
【0043】
５） 細胞フローサイトメトリー報告書の解釈：
Ａ）アネキシン－Ｖ陰性－ＰＩ陰性は、正常細胞、すなわち４フレーム細胞分類図の左下のグループを表し、その細胞の割合は生細胞の割合である。
Ｂ）アネキシン－Ｖ陽性－ＰＩ陰性は、アポトーシスの初期段階の細胞、すなわち４フレーム細胞分類図の右下のグループを表し、その細胞の割合は、アポトーシスの初期段階の細胞の割合である。
Ｃ）アネキシン－Ｖ陽性－ＰＩ陽性は、アポトーシスまたは壊死細胞の後期段階の細胞、すなわち、４フレーム細胞分類図の右上のグループを表し、その細胞の割合は、アポトーシスの後期段階の細胞の割合である。
図５の結果から分かるように、溶解液によって三次元マイクロキャリア（３Ｄ ＦｌｏＴｒｉｘマイクロキャリア）上で収集された細胞の活性は、従来のトリプシン消化によって培養フラスコ内で得られた細胞の活性と同様であるか、またはそれよりもわずかに高く、本発明は溶解液でマイクロキャリアを標的化し、それによってマイクロキャリア上の細胞を収集することによって、高活性を有する細胞を収集する際に有効であることを示した。
Ａ）アネキシン－Ｖ陰性－ＰＩ陰性は、正常細胞、すなわち４フレーム細胞分類図の左下のグループを表し、その細胞の割合は生細胞の割合である。
Ｂ）アネキシン－Ｖ陽性－ＰＩ陰性は、アポトーシスの初期段階の細胞、すなわち４フレーム細胞分類図の右下のグループを表し、その細胞の割合は、アポトーシスの初期段階の細胞の割合である。
Ｃ）アネキシン－Ｖ陽性－ＰＩ陽性は、アポトーシスまたは壊死細胞の後期段階の細胞、すなわち、４フレーム細胞分類図の右上のグループを表し、その細胞の割合は、アポトーシスの後期段階の細胞の割合である。
図５の結果から分かるように、溶解液によって三次元マイクロキャリア（３Ｄ ＦｌｏＴｒｉｘマイクロキャリア）上で収集された細胞の活性は、従来のトリプシン消化によって培養フラスコ内で得られた細胞の活性と同様であるか、またはそれよりもわずかに高く、本発明は溶解液でマイクロキャリアを標的化し、それによってマイクロキャリア上の細胞を収集することによって、高活性を有する細胞を収集する際に有効であることを示した。
【0044】
実施例３ マイクロキャリア上で培養された細胞をサンプリングし、計数するための方法
該実施例で使用したマイクロキャリアは、ＣＮＦ－Ｆ０１Ｔ－５０のカタログ番号を有する、北京華館生物科技有限公司から購入した３Ｄ ＦｌｏＴｒｉｘマイクロキャリアであった。
該実施例に関与する細胞は間葉幹細胞であった。
設計概念：本発明では、マイクロキャリアの所定重量の体積を測定することによって、標準スケールを較正する。細胞培養にマイクロキャリアを用いる場合、標準的なスケールに達するためには、採取するマイクロキャリアの体積（培養液の体積とは無関係）が必要であり、その後、細胞を計数し、全培養系に変換して細胞の総数を求め、これをマイクロキャリア定量採取法と呼ぶ。
該実施例で使用したマイクロキャリアは、ＣＮＦ－Ｆ０１Ｔ－５０のカタログ番号を有する、北京華館生物科技有限公司から購入した３Ｄ ＦｌｏＴｒｉｘマイクロキャリアであった。
該実施例に関与する細胞は間葉幹細胞であった。
設計概念：本発明では、マイクロキャリアの所定重量の体積を測定することによって、標準スケールを較正する。細胞培養にマイクロキャリアを用いる場合、標準的なスケールに達するためには、採取するマイクロキャリアの体積（培養液の体積とは無関係）が必要であり、その後、細胞を計数し、全培養系に変換して細胞の総数を求め、これをマイクロキャリア定量採取法と呼ぶ。
【0045】
特定のプロトコルの実施例：
１． ５ｍｇのマイクロキャリアを、１．５ｍＬのサンプリングチューブ（マイクロ遠心分離チューブ）に添加し、１ｍＬのＰＢＳに溶解し、十分に浸漬し、そして膨潤させ、次いで、１５００ｒｐｍで２分間遠心分離して、サンプリングチューブ中のマイクロキャリアによって占有される体積を較正した。該実施例において、５ｍｇのマイクロキャリアが、１．５ｍＬサンプリングチューブ上の０．１ｍＬスケールに正確に一致するスケールまで沈殿したことが見出された（図６）。
２． ６０ｍｌの培地中に２００万個の細胞を再懸濁した後、２００ｍｇのマイクロキャリアを添加し、そして５％ ＣＯ２インキュベーター中で３７℃でインキュベートした。
３． ７２時間後、以下の２つのサンプリング方法を使用した。
（ａ）培養容器を振盪することによって、マイクロキャリアを６０ｍＬの培地中にできるだけ均一に懸濁させ、１ｍＬの懸濁液をできるだけ早くピペットで移し、１．５ｍＬのサンプリングチューブに添加した。計３本のチューブをピペットで採取した（図７参照）。これを懸濁液定量サンプリング法とした。
（ｂ）培養容器を振盪することによってマイクロキャリアを培地に懸濁させ、懸濁液を１．５ｍＬサンプリングチューブにピペットで入れた。マイクロキャリアが沈降するのを数分間待った後、マイクロキャリアの体積が工程１で較正された標準スケールに達したかどうかが観察され、該実施例では、０．１ｍＬの標準スケールが使用された（５ｍｇのマイクロキャリアに対応する、図６）。そわない場合にはスケールに達するまで懸濁液をピペットで移し続け、そして超える場合には過剰のマイクロキャリアをサンプリングチューブから除去した。計３本のチューブをピペットで採取した（図８参照）。これをマイクロキャリア定量サンプリング法とした。
４． 上記のサンプリングチューブを１５００ｒｐｍで２分間遠心分離し、上清を廃棄した。細胞消化溶液を添加することによって細胞をマイクロキャリアから消化し、次いでカウントし、そして培養系中の細胞の総数を、サンプリング方法に依存する対応する式に従って推測した。
（ａ）懸濁定量サンプリング法：懸濁試料１ｍＬの細胞数×培養系の全懸濁液量（６０ｍＬ）＝全細胞数。
結果を表１に示す。
１． ５ｍｇのマイクロキャリアを、１．５ｍＬのサンプリングチューブ（マイクロ遠心分離チューブ）に添加し、１ｍＬのＰＢＳに溶解し、十分に浸漬し、そして膨潤させ、次いで、１５００ｒｐｍで２分間遠心分離して、サンプリングチューブ中のマイクロキャリアによって占有される体積を較正した。該実施例において、５ｍｇのマイクロキャリアが、１．５ｍＬサンプリングチューブ上の０．１ｍＬスケールに正確に一致するスケールまで沈殿したことが見出された（図６）。
２． ６０ｍｌの培地中に２００万個の細胞を再懸濁した後、２００ｍｇのマイクロキャリアを添加し、そして５％ ＣＯ２インキュベーター中で３７℃でインキュベートした。
３． ７２時間後、以下の２つのサンプリング方法を使用した。
（ａ）培養容器を振盪することによって、マイクロキャリアを６０ｍＬの培地中にできるだけ均一に懸濁させ、１ｍＬの懸濁液をできるだけ早くピペットで移し、１．５ｍＬのサンプリングチューブに添加した。計３本のチューブをピペットで採取した（図７参照）。これを懸濁液定量サンプリング法とした。
（ｂ）培養容器を振盪することによってマイクロキャリアを培地に懸濁させ、懸濁液を１．５ｍＬサンプリングチューブにピペットで入れた。マイクロキャリアが沈降するのを数分間待った後、マイクロキャリアの体積が工程１で較正された標準スケールに達したかどうかが観察され、該実施例では、０．１ｍＬの標準スケールが使用された（５ｍｇのマイクロキャリアに対応する、図６）。そわない場合にはスケールに達するまで懸濁液をピペットで移し続け、そして超える場合には過剰のマイクロキャリアをサンプリングチューブから除去した。計３本のチューブをピペットで採取した（図８参照）。これをマイクロキャリア定量サンプリング法とした。
４． 上記のサンプリングチューブを１５００ｒｐｍで２分間遠心分離し、上清を廃棄した。細胞消化溶液を添加することによって細胞をマイクロキャリアから消化し、次いでカウントし、そして培養系中の細胞の総数を、サンプリング方法に依存する対応する式に従って推測した。
（ａ）懸濁定量サンプリング法：懸濁試料１ｍＬの細胞数×培養系の全懸濁液量（６０ｍＬ）＝全細胞数。
結果を表１に示す。
【0046】
【表1】
【0047】
（ｂ）マイクロキャリア定量サンプリング法：５ｍｇのマイクロキャリア（すなわち、０．１ｍＬマイクロキャリア体積）試料の細胞数×培養系の全マイクロキャリア重量（すなわち、２００ｍｇ）＝全細胞数。
結果を表２に示す。
結果を表２に示す。
【0048】
【表2】
【0049】
５． ２００ｍｇのマイクロキャリアからのすべてのマイクロキャリア懸濁液、６０ｍＬの培地培養系を除去し、１５００ｒｐｍで２分間遠心分離し、上清を捨て、細胞消化溶液を添加することによってマイクロキャリアから細胞を消化し、実際の総数を計数し、工程４のサンプリングカウントからのデータと比較した。
結果を図９に示す。この結果は、マイクロキャリア定量サンプリング法による３つのサンプルがより再現性があり（分散が少ない）、実際の合計に近いことを示している。
結果を図９に示す。この結果は、マイクロキャリア定量サンプリング法による３つのサンプルがより再現性があり（分散が少ない）、実際の合計に近いことを示している。
【0050】
実施例４ 三次元マイクロキャリアに基づく細胞蘇生方法
本実施例で使用したマイクロキャリアは、ＣＮＦ－Ｆ０１Ｔ－５０のカタログ番号を有する、北京華館生物科技有限公司から購入した３Ｄ ＦｌｏＴｒｉｘマイクロキャリアであった。
該実施例で用いた脂肪間葉系幹細胞培地は、ヒト間葉系幹細胞培地（武漢ヴィノサイバイオテクノロジー社、カタログ番号： Ｍ００１）であった。
本実施例で使用したマイクロキャリアは、ＣＮＦ－Ｆ０１Ｔ－５０のカタログ番号を有する、北京華館生物科技有限公司から購入した３Ｄ ＦｌｏＴｒｉｘマイクロキャリアであった。
該実施例で用いた脂肪間葉系幹細胞培地は、ヒト間葉系幹細胞培地（武漢ヴィノサイバイオテクノロジー社、カタログ番号： Ｍ００１）であった。
【0051】
（Ｉ）三次元マイクロキャリアに基づく細胞蘇生および静的培養
Ｉ． 脂肪由来間葉系幹細胞の蘇生・静的培養
１． 静的培養容器およびマイクロキャリアの調製
滅菌および乾燥したマイクロキャリアを培養容器に入れ；使用に利用可能な培養容器は、付着処理なしのウェルプレート、ペトリ皿などであった。蘇生される細胞の数に応じて適切なサイズを選択し、細胞が必要とする環境に応じて容器の気密性に注意を払うべきである。必要なマイクロキャリアを選択した培養容器に無菌的に取り込み、接種が完了するまでマイクロキャリアを室温に保ち、乾燥させることを確実にした。実験のために、１錠（２０ｍｇ）のマイクロキャリアを非接着性処理６ウェルプレートに使用した。
２． 凍結保存細胞の蘇生
凍結保存された脂肪由来ＭＳＣを採取し、３７℃の恒温水浴中で迅速に解凍した。氷がなくなった際に、それらは、その後の定期的な蘇生操作のために、ウルトラクリーンベンチに迅速に移された。
３． 解凍した凍結保存細胞の移植
工程２の終了後、解凍した細胞を洗浄し、遠心分離して上清を除去し、培養液を用いて細胞を再懸濁し、好ましくは５～５００×１０５細胞／ｍＬの細胞懸濁液を得た。懸濁液中の細胞濃度は１×１０６細胞／ｍＬであった。
４． 接種
工程３の完了後、細胞懸濁液を、５～１００×１０３細胞／ｍｇの細胞対マイクロキャリア比、および１００～４００μＬ：２０ｍｇの培地体積対マイクロキャリア比で、工程１で調製したマイクロキャリアを有する６ウェルプレートに接種した。試験では、工程１で調製した６ウェルプレートに２００μＬの細胞懸濁液（全細胞数２×１０５）を接種した。
Ｉ． 脂肪由来間葉系幹細胞の蘇生・静的培養
１． 静的培養容器およびマイクロキャリアの調製
滅菌および乾燥したマイクロキャリアを培養容器に入れ；使用に利用可能な培養容器は、付着処理なしのウェルプレート、ペトリ皿などであった。蘇生される細胞の数に応じて適切なサイズを選択し、細胞が必要とする環境に応じて容器の気密性に注意を払うべきである。必要なマイクロキャリアを選択した培養容器に無菌的に取り込み、接種が完了するまでマイクロキャリアを室温に保ち、乾燥させることを確実にした。実験のために、１錠（２０ｍｇ）のマイクロキャリアを非接着性処理６ウェルプレートに使用した。
２． 凍結保存細胞の蘇生
凍結保存された脂肪由来ＭＳＣを採取し、３７℃の恒温水浴中で迅速に解凍した。氷がなくなった際に、それらは、その後の定期的な蘇生操作のために、ウルトラクリーンベンチに迅速に移された。
３． 解凍した凍結保存細胞の移植
工程２の終了後、解凍した細胞を洗浄し、遠心分離して上清を除去し、培養液を用いて細胞を再懸濁し、好ましくは５～５００×１０５細胞／ｍＬの細胞懸濁液を得た。懸濁液中の細胞濃度は１×１０６細胞／ｍＬであった。
４． 接種
工程３の完了後、細胞懸濁液を、５～１００×１０３細胞／ｍｇの細胞対マイクロキャリア比、および１００～４００μＬ：２０ｍｇの培地体積対マイクロキャリア比で、工程１で調製したマイクロキャリアを有する６ウェルプレートに接種した。試験では、工程１で調製した６ウェルプレートに２００μＬの細胞懸濁液（全細胞数２×１０５）を接種した。
【0052】
５． インキュベーション
工程４の完了後、２０～２４０分間のインキュベーションが必要であったが、温度、湿度、無菌性、ガスなどの条件に注意して、インキュベーションプロセス全体を通して適切な環境を維持することが必要であった。正常な細胞培養のための正常なインキュベーターで十分であった。インキュベーターが湿度設定を有さない場合、いくつかの滅菌湿潤剤（ＰＢＳ、培養培地、蒸留水、および湿潤環境を提供するが、細胞に影響を及ぼさず、または細胞に利益を与えないいくつかの他の液体）を、接種されたマイクロキャリアの周りに手動で添加し得る。小さな皿中でインキュベートする場合、小さな皿はより大きな容器中に置かれ得、そしてウェルプレートについて同様に、小さな皿の周りに作製された湿った箱が、より大きな容器中に置かれ得る。試験では、６ウェルプレートを選択し、３７℃のＣＯ２インキュベーター中で２時間インキュベートし、２ｍＬのＰＢＳを６ウェルプレート間に添加した。
６． 培地補充
工程５の終了後、接種細胞数、培地交換サイクル、培地の種類に応じて補充量を選択した。血清培地１ｍｌは、通常１日６２０，０００細胞に十分であった。実験では、８ｍｌの培地を補充した。
７． 培養・蘇生
工程６の終了後、蘇生された細胞を、その後の細胞蘇生および培養のために適切な培養環境に置いた。この試験では、６ウェルプレートを３７℃のＣＯ２インキュベーターに入れて培養した。
８． モニタリング
実験の必要性に応じて、細胞培養時間、培地補充の期間および細胞状態検出の期間を設定することができる。細胞状態インジケータは、培地色、マイクロキャリア状態、細胞染色分析、細胞溶解カウントなどを含んでいた。細胞を実験において合計５日間培養し、４日目に培地を補充した。キットを用いた細胞検出を接種後１日目および４日目に行い（工程１０）、細胞計数を５日目に行った（工程１１）。
工程４の完了後、２０～２４０分間のインキュベーションが必要であったが、温度、湿度、無菌性、ガスなどの条件に注意して、インキュベーションプロセス全体を通して適切な環境を維持することが必要であった。正常な細胞培養のための正常なインキュベーターで十分であった。インキュベーターが湿度設定を有さない場合、いくつかの滅菌湿潤剤（ＰＢＳ、培養培地、蒸留水、および湿潤環境を提供するが、細胞に影響を及ぼさず、または細胞に利益を与えないいくつかの他の液体）を、接種されたマイクロキャリアの周りに手動で添加し得る。小さな皿中でインキュベートする場合、小さな皿はより大きな容器中に置かれ得、そしてウェルプレートについて同様に、小さな皿の周りに作製された湿った箱が、より大きな容器中に置かれ得る。試験では、６ウェルプレートを選択し、３７℃のＣＯ２インキュベーター中で２時間インキュベートし、２ｍＬのＰＢＳを６ウェルプレート間に添加した。
６． 培地補充
工程５の終了後、接種細胞数、培地交換サイクル、培地の種類に応じて補充量を選択した。血清培地１ｍｌは、通常１日６２０，０００細胞に十分であった。実験では、８ｍｌの培地を補充した。
７． 培養・蘇生
工程６の終了後、蘇生された細胞を、その後の細胞蘇生および培養のために適切な培養環境に置いた。この試験では、６ウェルプレートを３７℃のＣＯ２インキュベーターに入れて培養した。
８． モニタリング
実験の必要性に応じて、細胞培養時間、培地補充の期間および細胞状態検出の期間を設定することができる。細胞状態インジケータは、培地色、マイクロキャリア状態、細胞染色分析、細胞溶解カウントなどを含んでいた。細胞を実験において合計５日間培養し、４日目に培地を補充した。キットを用いた細胞検出を接種後１日目および４日目に行い（工程１０）、細胞計数を５日目に行った（工程１１）。
【0053】
９． 新鮮細胞対照群
（１）凍結保存された脂肪由来ＭＳＣを採取し、３７℃の恒温水浴中で迅速に解凍した。氷がなくなった際に、それらは、その後の定期的な蘇生操作のために、ウルトラクリーンベンチに迅速に移された。解凍した細胞を洗浄し、遠心分離して上清を除去し、培養液を用いて細胞を再懸濁し、細胞懸濁液を得、１５ｍｌの培地を添加したＴ７５細胞培養フラスコに１５，０００細胞／ｃｍ２の濃度で接種し、３日間培養して完全に増殖させた。
（２）工程（１）が完了した後、完全に増殖した細胞を通常の細胞消化に供し、遠心分離して上清を除去し、次いで好ましくは５～５００×１０５細胞／ｍＬの細胞濃縮物を有する培地中で使用した。細胞懸濁液中の細胞濃度は１×１０６細胞／ｍＬであった。
（３）工程（２）の完了後、操作は工程４～８に従い、マイクロキャリアを含む６ウェルプレートに細胞を接種し、その後の操作を続けた。キットを用いた細胞検出を接種後１日目および４日目に行い（工程１０）、細胞計数を５日目に行った（工程１１）。
（１）凍結保存された脂肪由来ＭＳＣを採取し、３７℃の恒温水浴中で迅速に解凍した。氷がなくなった際に、それらは、その後の定期的な蘇生操作のために、ウルトラクリーンベンチに迅速に移された。解凍した細胞を洗浄し、遠心分離して上清を除去し、培養液を用いて細胞を再懸濁し、細胞懸濁液を得、１５ｍｌの培地を添加したＴ７５細胞培養フラスコに１５，０００細胞／ｃｍ２の濃度で接種し、３日間培養して完全に増殖させた。
（２）工程（１）が完了した後、完全に増殖した細胞を通常の細胞消化に供し、遠心分離して上清を除去し、次いで好ましくは５～５００×１０５細胞／ｍＬの細胞濃縮物を有する培地中で使用した。細胞懸濁液中の細胞濃度は１×１０６細胞／ｍＬであった。
（３）工程（２）の完了後、操作は工程４～８に従い、マイクロキャリアを含む６ウェルプレートに細胞を接種し、その後の操作を続けた。キットを用いた細胞検出を接種後１日目および４日目に行い（工程１０）、細胞計数を５日目に行った（工程１１）。
【0054】
１０． 細胞モニタリング
（１）キット：動物細胞の死滅生存率／細胞毒性アッセイキット、カタログ番号： ＫＧＡＦ００１；
（２）細胞を含有する５０～１００μＬのマイクロキャリア懸濁液を９６ウェルプレートに添加した；
（３）上清を可能な限り除去し、ＰＢＳを添加し、１回洗浄し、２分後に可能な限りＰＢＳを除去し、各ウェルを、キットの説明書に従って構成された１００μＬの染色溶液を添加することによって染色した。室温で２０～３０分間染色し、光から保護した後、蛍光顕微鏡下で観察した。
（１）キット：動物細胞の死滅生存率／細胞毒性アッセイキット、カタログ番号： ＫＧＡＦ００１；
（２）細胞を含有する５０～１００μＬのマイクロキャリア懸濁液を９６ウェルプレートに添加した；
（３）上清を可能な限り除去し、ＰＢＳを添加し、１回洗浄し、２分後に可能な限りＰＢＳを除去し、各ウェルを、キットの説明書に従って構成された１００μＬの染色溶液を添加することによって染色した。室温で２０～３０分間染色し、光から保護した後、蛍光顕微鏡下で観察した。
【0055】
結果は図１０に示されている。結果は静的培養のためにマイクロキャリア上に蘇生された凍結保存脂肪由来ＭＳＣが各マイクロキャリア球上の最初の１～２個の細胞から４日後のすべてのマイクロキャリア上のより多くの細胞までの範囲であり、凍結保存脂肪由来ＭＳＣは静的培養のためにマイクロキャリア上に直接蘇生され得ることを示し、一方、蘇生細胞を接種されたマイクロスフェア上の細胞の数と、新鮮な細胞を接種されたマイクロスフェア上の細胞の数とを比較すると、ほとんど差がなく、このことは、細胞をマイクロキャリア上に直接蘇生することによって、細胞増殖が培養フラスコから伝統的に得られ、マイクロキャリア上に接種される場合と同じであり、したがって、培養フラスコ内に細胞を蘇生し、次いで、マイクロキャリア上に接種するためにそれらを消化して新鮮な細胞を得るための退屈な操作の必要性を排除することを示している。
【0056】
１１． 細胞増殖を測定するための細胞計数
細胞培養５日目に、特許出願「三次元マイクロキャリア上で細胞を回収する方法」（中国特許出願第２０１９１０１０１７３６．０号）に記載の方法に従って細胞を回収し、細胞計数板の手段によって計数した。
その結果を図１１に示す。その結果、脂肪由来ＭＳＣをマイクロキャリア上の静的培養（蘇生群）に蘇生した場合、接種時の２０万から５０２７万に増加し、従来の消化後静的培養方法（新鮮群）で得られた細胞数（５１８．７万）と有意差はなかった（ｐ＝０．４２）。
細胞培養５日目に、特許出願「三次元マイクロキャリア上で細胞を回収する方法」（中国特許出願第２０１９１０１０１７３６．０号）に記載の方法に従って細胞を回収し、細胞計数板の手段によって計数した。
その結果を図１１に示す。その結果、脂肪由来ＭＳＣをマイクロキャリア上の静的培養（蘇生群）に蘇生した場合、接種時の２０万から５０２７万に増加し、従来の消化後静的培養方法（新鮮群）で得られた細胞数（５１８．７万）と有意差はなかった（ｐ＝０．４２）。
【0057】
ＩＩ． 脂肪由来間葉系幹細胞マイクロキャリアの蘇生および静的培養
凍結保存された脂肪由来ＭＳＣマイクロキャリアは、特許出願「三次元マイクロキャリア上でのＩｎ ｓｉｔｕ細胞凍結保存方法」（中国出願第２０１９１００９７６５０．５号）に記載されている方法に従って調製した。
凍結保存された脂肪由来ＭＳＣマイクロキャリアは、特許出願「三次元マイクロキャリア上でのＩｎ ｓｉｔｕ細胞凍結保存方法」（中国出願第２０１９１００９７６５０．５号）に記載されている方法に従って調製した。
【0058】
１． 静的培養容器およびマイクロキャリアの調製
パートＩの工程１と同じ。
２． 凍結保存細胞の蘇生
凍結保存された脂肪由来ＭＳＣマイクロキャリア（以降の説明では脂肪由来ＭＳＣ微小組織と呼ぶ）を採取し、３７℃の恒温水浴中で急速に解凍した。微小組織は溶解結果の観察に影響を及ぼす可能性があるので、低温貯蔵管は観察中に傾けられ、穏やかに振盪される必要があり、氷がなくなった際に、それらは、その後の日常的蘇生操作のためにウルトラクリーンベンチに迅速に移された。
３． 解凍した凍結保存細胞の移植
工程２の終了後、解凍した細胞を洗浄、遠心分離して上清を除去し、培養液を用いて細胞を再懸濁して細胞懸濁液を得た。細胞懸濁液中の微小組織中の細胞数は、５～５００×１０５細胞／ｍｌであることが好ましい。しかしながら、実際のマイクロキャリア自体は大きな体積を占めることができ、または不十分な上清除去は予測されるよりもいくらか大きな再懸濁体積をもたらし得、これは、正確なカウントが必要とされる場合に、必要とされる細胞を採取するようにスケーリングされ得る。上清を除去するために、遠心力を増加させ、上清を可能な限りピペットで移すことができ、一方、マイクロキャリア自体については、占有された体積を排除することができ、後の実験にほとんど影響を及ぼさなかった。
４． 接種
工程３の完了後、２００μｌの細胞懸濁液を、工程１で調製したマイクロキャリアを有する６ウェルプレートに接種した。
５． インキュベーション
パートＩの工程５と同じ。
６． 培地補充
パートＩの工程６と同じ。
７． 培養・蘇生
パートＩの工程７と同じ。
８． モニタリング
パートＩの工程８と同じ。
９． 細胞モニタリング
パートＩの工程１０と同じ。
結果を図１２に示す。結果は、凍結保存された脂肪由来ＭＳＣ微小組織が静的培養で新しいマイクロキャリア上に蘇生されたことを示している。蘇生後１日目に、少数のマイクロキャリアのみがその上に多くの細胞を有し（明るい点）、これは蘇生された微小組織であり、より少ない細胞を有する他のマイクロキャリアは新しいマイクロキャリアであり、一方、培養後４日目には全てのマイクロキャリアはそれらの上に細胞を有し、凍結保存された微小組織は静的培養のために新しいマイクロキャリア錠剤上に蘇生され得ることを示した。
パートＩの工程１と同じ。
２． 凍結保存細胞の蘇生
凍結保存された脂肪由来ＭＳＣマイクロキャリア（以降の説明では脂肪由来ＭＳＣ微小組織と呼ぶ）を採取し、３７℃の恒温水浴中で急速に解凍した。微小組織は溶解結果の観察に影響を及ぼす可能性があるので、低温貯蔵管は観察中に傾けられ、穏やかに振盪される必要があり、氷がなくなった際に、それらは、その後の日常的蘇生操作のためにウルトラクリーンベンチに迅速に移された。
３． 解凍した凍結保存細胞の移植
工程２の終了後、解凍した細胞を洗浄、遠心分離して上清を除去し、培養液を用いて細胞を再懸濁して細胞懸濁液を得た。細胞懸濁液中の微小組織中の細胞数は、５～５００×１０５細胞／ｍｌであることが好ましい。しかしながら、実際のマイクロキャリア自体は大きな体積を占めることができ、または不十分な上清除去は予測されるよりもいくらか大きな再懸濁体積をもたらし得、これは、正確なカウントが必要とされる場合に、必要とされる細胞を採取するようにスケーリングされ得る。上清を除去するために、遠心力を増加させ、上清を可能な限りピペットで移すことができ、一方、マイクロキャリア自体については、占有された体積を排除することができ、後の実験にほとんど影響を及ぼさなかった。
４． 接種
工程３の完了後、２００μｌの細胞懸濁液を、工程１で調製したマイクロキャリアを有する６ウェルプレートに接種した。
５． インキュベーション
パートＩの工程５と同じ。
６． 培地補充
パートＩの工程６と同じ。
７． 培養・蘇生
パートＩの工程７と同じ。
８． モニタリング
パートＩの工程８と同じ。
９． 細胞モニタリング
パートＩの工程１０と同じ。
結果を図１２に示す。結果は、凍結保存された脂肪由来ＭＳＣ微小組織が静的培養で新しいマイクロキャリア上に蘇生されたことを示している。蘇生後１日目に、少数のマイクロキャリアのみがその上に多くの細胞を有し（明るい点）、これは蘇生された微小組織であり、より少ない細胞を有する他のマイクロキャリアは新しいマイクロキャリアであり、一方、培養後４日目には全てのマイクロキャリアはそれらの上に細胞を有し、凍結保存された微小組織は静的培養のために新しいマイクロキャリア錠剤上に蘇生され得ることを示した。
【0059】
（ＩＩ）三次元マイクロキャリアに基づく細胞蘇生および動的培養
Ｉ． 脂肪由来間葉系幹細胞の蘇生と動的培養
１． 動的培養容器およびマイクロキャリアの調製
適切な量のマイクロキャリアを、インペラーを内蔵した細胞培養フラスコまたは別の清潔で無菌のエンドトキシンを含まない容器に入れ、そこでマイクロキャリアを撹拌し、懸濁させた；０～５０％（ｖ／ｖ）の最終培養培地を添加することによってマイクロキャリアを再懸濁させ、０時間を超えて静置または撹拌した（時間制限なし）。実験では、２００ｍｇのマイクロキャリアの１０個の錠剤を、１０ｍｌの培地を含有する１２５ｍｌのインペラー内蔵細胞培養フラスコに添加し、１０分間放置した。
２． 凍結保存細胞の蘇生
凍結保存された脂肪由来ＭＳＣを採取し、３７℃の恒温水浴中で迅速に解凍した。氷がなくなった際に、それらは、その後の定期的な蘇生操作のために、ウルトラクリーンベンチに迅速に移された。
３． 解凍した凍結保存細胞の移植
工程２の終了後、解凍した細胞を洗浄し、遠心分離して上清を除去し、培養液を用いて細胞を再懸濁して細胞懸濁液を得、最終培養系の培地の１～１００％（体積百分率）を５～５００×１０５細胞／ｍＬとした。懸濁液中の細胞濃度は合計２ｍＬ中、１×１０６細胞／ｍＬであった。
４． 接種
工程３の完了後、上記の細胞懸濁液を、工程１で調製したインペラーを内蔵した細胞培養フラスコに混合し、新しいマイクロキャリアと混合した。新しいマイクロキャリアに対する細胞の比率は５～１００×１０３細胞／接種するマイクロキャリアのｍｇであり、混合後、細胞培養培地を添加し、マイクロキャリアの培地に対する比率を１ｍｇ：１～１０００μＬに調整した。実験では、２００万個の蘇生細胞を２００ｍｇの新しいマイクロキャリアに接種し、培地を６０ｍＬに補充した。
Ｉ． 脂肪由来間葉系幹細胞の蘇生と動的培養
１． 動的培養容器およびマイクロキャリアの調製
適切な量のマイクロキャリアを、インペラーを内蔵した細胞培養フラスコまたは別の清潔で無菌のエンドトキシンを含まない容器に入れ、そこでマイクロキャリアを撹拌し、懸濁させた；０～５０％（ｖ／ｖ）の最終培養培地を添加することによってマイクロキャリアを再懸濁させ、０時間を超えて静置または撹拌した（時間制限なし）。実験では、２００ｍｇのマイクロキャリアの１０個の錠剤を、１０ｍｌの培地を含有する１２５ｍｌのインペラー内蔵細胞培養フラスコに添加し、１０分間放置した。
２． 凍結保存細胞の蘇生
凍結保存された脂肪由来ＭＳＣを採取し、３７℃の恒温水浴中で迅速に解凍した。氷がなくなった際に、それらは、その後の定期的な蘇生操作のために、ウルトラクリーンベンチに迅速に移された。
３． 解凍した凍結保存細胞の移植
工程２の終了後、解凍した細胞を洗浄し、遠心分離して上清を除去し、培養液を用いて細胞を再懸濁して細胞懸濁液を得、最終培養系の培地の１～１００％（体積百分率）を５～５００×１０５細胞／ｍＬとした。懸濁液中の細胞濃度は合計２ｍＬ中、１×１０６細胞／ｍＬであった。
４． 接種
工程３の完了後、上記の細胞懸濁液を、工程１で調製したインペラーを内蔵した細胞培養フラスコに混合し、新しいマイクロキャリアと混合した。新しいマイクロキャリアに対する細胞の比率は５～１００×１０３細胞／接種するマイクロキャリアのｍｇであり、混合後、細胞培養培地を添加し、マイクロキャリアの培地に対する比率を１ｍｇ：１～１０００μＬに調整した。実験では、２００万個の蘇生細胞を２００ｍｇの新しいマイクロキャリアに接種し、培地を６０ｍＬに補充した。
【0060】
インペラー内蔵細胞培養フラスコを低速撹拌機上に置き、撹拌のためにインキュベーター中に置いた。攪拌は一定速度の攪拌または可変速度の交互または可変速度の周期的攪拌によって行うことができ、攪拌方向は時計方向、反時計方向、または交互方向の攪拌であって、細胞をシードマイクロキャリアから新しいマイクロキャリアに移動させることができ、攪拌時間は０．１～１００時間であり、攪拌速度は１～２００ｒｐｍであった。実験では、可変速繰返し時計方向撹拌法と定速時計方向撹拌法を比較し、次のように３組の実験を設定した：
第１群（静置接種）：内蔵インペラ内蔵細胞培養フラスコを低速撹拌機上に置き、インキュベーター中に４時間置き、次いで、時計方向に４０ｒｐｍで５分間、２０ｒｐｍで２０分間の可変速度の周期で２４時間まで撹拌し、次いで、時計方向に一定速度（６０ｒｐｍ）で９６時間まで撹拌した。
第２群（間欠接種）：インペラー内蔵細胞培養フラスコを低速攪拌機上に置き、インキュベーターに入れ、４０ｒｐｍで５分間、２０ｒｐｍで２０分間、周期的に時計方向に２４時間攪拌し、続いて９６時間まで一定速度（６０ｒｐｍ）で時計方向に攪拌した。
群３（定速接種）：インペラー内蔵細胞培養フラスコを低速撹拌機上に置き、９６時間まで時計方向に一定速度（６０回転／分）でインキュベーター中に置いた。
それぞれの群を、４時間毎に細胞検知のためにサンプリングした（工程６）。
培養を続けた。
工程４の完了後、６日目まで時計方向に撹拌しながら一定速度（６０ｒｐｍ）で培養を続けた。細胞計数のために、試料を１日目、２日目、３日目、４日目、５日目および６日目に採取した（工程７）。
第１群（静置接種）：内蔵インペラ内蔵細胞培養フラスコを低速撹拌機上に置き、インキュベーター中に４時間置き、次いで、時計方向に４０ｒｐｍで５分間、２０ｒｐｍで２０分間の可変速度の周期で２４時間まで撹拌し、次いで、時計方向に一定速度（６０ｒｐｍ）で９６時間まで撹拌した。
第２群（間欠接種）：インペラー内蔵細胞培養フラスコを低速攪拌機上に置き、インキュベーターに入れ、４０ｒｐｍで５分間、２０ｒｐｍで２０分間、周期的に時計方向に２４時間攪拌し、続いて９６時間まで一定速度（６０ｒｐｍ）で時計方向に攪拌した。
群３（定速接種）：インペラー内蔵細胞培養フラスコを低速撹拌機上に置き、９６時間まで時計方向に一定速度（６０回転／分）でインキュベーター中に置いた。
それぞれの群を、４時間毎に細胞検知のためにサンプリングした（工程６）。
培養を続けた。
工程４の完了後、６日目まで時計方向に撹拌しながら一定速度（６０ｒｐｍ）で培養を続けた。細胞計数のために、試料を１日目、２日目、３日目、４日目、５日目および６日目に採取した（工程７）。
【0061】
６． 細胞モニタリング
（１）キット：動物細胞の死滅生存率／細胞毒性アッセイキット、カタログ番号： ＫＧＡＦ００１；
（２）細胞を含有する５０～１００μＬのマイクロキャリア懸濁液を９６ウェルプレートに添加した；
（３）上清を可能な限り除去し、ＰＢＳを添加し、１回洗浄し、２分後に可能な限りＰＢＳを除去し、各ウェルを、キットの説明書に従って構成された１００μＬの染色溶液を添加することによって染色した。室温で２０～３０分間染色し、光から保護した後、蛍光顕微鏡下で観察した。
その結果を図１３に示した。動的培養における凍結保存脂肪由来ＭＳＣの蘇生時の撹拌方法や速度設定の違いが、マイクロキャリア中の細胞分布に影響を及ぼし、蘇生後の定速培養では細胞の均一な分布が促進されることを比較した。
７． 細胞増殖を測定するための細胞計数
細胞接種の種々の日数の後、特許出願「三次元マイクロキャリア上で細胞を採取する方法」（中国特許出願第２０１９１０１０１７３６．０号）に記載される方法に従って細胞を採取し、細胞計数プレートを用いて計数した。
結果を図１４に示す。この結果はマイクロキャリア上に蘇生された凍結保存細胞が培養３日後に最初の２００万個から約１７１３万個まで増殖し、これら３つの速度調整（工程４の群１～３）の間で細胞数に有意差がなかったことを示しており、動的培養のためのマイクロキャリア上への凍結保存された脂肪由来ＭＳＣの蘇生は、接種のための撹拌速度（細胞に適当な適度な速度）にかかわらず、細胞の蘇生および増殖プロセスに影響を及ぼさなかったことを示している。
（１）キット：動物細胞の死滅生存率／細胞毒性アッセイキット、カタログ番号： ＫＧＡＦ００１；
（２）細胞を含有する５０～１００μＬのマイクロキャリア懸濁液を９６ウェルプレートに添加した；
（３）上清を可能な限り除去し、ＰＢＳを添加し、１回洗浄し、２分後に可能な限りＰＢＳを除去し、各ウェルを、キットの説明書に従って構成された１００μＬの染色溶液を添加することによって染色した。室温で２０～３０分間染色し、光から保護した後、蛍光顕微鏡下で観察した。
その結果を図１３に示した。動的培養における凍結保存脂肪由来ＭＳＣの蘇生時の撹拌方法や速度設定の違いが、マイクロキャリア中の細胞分布に影響を及ぼし、蘇生後の定速培養では細胞の均一な分布が促進されることを比較した。
７． 細胞増殖を測定するための細胞計数
細胞接種の種々の日数の後、特許出願「三次元マイクロキャリア上で細胞を採取する方法」（中国特許出願第２０１９１０１０１７３６．０号）に記載される方法に従って細胞を採取し、細胞計数プレートを用いて計数した。
結果を図１４に示す。この結果はマイクロキャリア上に蘇生された凍結保存細胞が培養３日後に最初の２００万個から約１７１３万個まで増殖し、これら３つの速度調整（工程４の群１～３）の間で細胞数に有意差がなかったことを示しており、動的培養のためのマイクロキャリア上への凍結保存された脂肪由来ＭＳＣの蘇生は、接種のための撹拌速度（細胞に適当な適度な速度）にかかわらず、細胞の蘇生および増殖プロセスに影響を及ぼさなかったことを示している。
【0062】
方法の比較
三次元動的蘇生細胞群：工程４の群３。
三次元動的新鮮細胞群：（１）凍結保存脂肪由来ＭＳＣを採取し、３７℃の恒温水浴中で迅速に解凍した。氷がなくなった際に、それらは、その後の定期的な蘇生操作のために、ウルトラクリーンベンチに迅速に移された。解凍した細胞を洗浄し、遠心分離して上清を除去し、培養液を用いて細胞を再懸濁し、細胞懸濁液を得、１５ｍｌの培地を添加したＴ７５細胞培養フラスコに１５，０００細胞／ｃｍ２の濃度で接種し、３日間培養して完全に増殖させた。（２）工程（１）が完了した後、完全に増殖した細胞を通常の細胞消化に供し、遠心分離して上清を除去し、次いで好ましくは５～５００×１０５細胞／ｍＬの細胞濃縮物を有する培地中で使用した。細胞懸濁液中の細胞濃度は１×１０６細胞／ｍＬであった。（３）工程（２）の完了後、細胞懸濁液を、調製したインペラー内蔵細胞培養フラスコに入れ、パート（ＩＩ）の工程１に従って容器およびマイクロキャリアを調製した後、マイクロキャリアと混合した。混合後、細胞培養培地を添加し、培地に対するマイクロキャリアの比率を１ｍｇ：１～１，０００μＬに調整した。実験では、２００万個の新鮮な細胞を２００ｍｇの新しいマイクロキャリアに接種し、培地を６０ｍＬに補充した。インペラー内蔵細胞培養フラスコを低速撹拌機上に置き、６日目まで６０ｒｐｍで時計方向に一定に撹拌しながらインキュベーター中に置き、細胞計数のために１日目、２日目、３日目、４日目、５日目および６日目に試料を採取した。
三次元動的蘇生細胞群：工程４の群３。
三次元動的新鮮細胞群：（１）凍結保存脂肪由来ＭＳＣを採取し、３７℃の恒温水浴中で迅速に解凍した。氷がなくなった際に、それらは、その後の定期的な蘇生操作のために、ウルトラクリーンベンチに迅速に移された。解凍した細胞を洗浄し、遠心分離して上清を除去し、培養液を用いて細胞を再懸濁し、細胞懸濁液を得、１５ｍｌの培地を添加したＴ７５細胞培養フラスコに１５，０００細胞／ｃｍ２の濃度で接種し、３日間培養して完全に増殖させた。（２）工程（１）が完了した後、完全に増殖した細胞を通常の細胞消化に供し、遠心分離して上清を除去し、次いで好ましくは５～５００×１０５細胞／ｍＬの細胞濃縮物を有する培地中で使用した。細胞懸濁液中の細胞濃度は１×１０６細胞／ｍＬであった。（３）工程（２）の完了後、細胞懸濁液を、調製したインペラー内蔵細胞培養フラスコに入れ、パート（ＩＩ）の工程１に従って容器およびマイクロキャリアを調製した後、マイクロキャリアと混合した。混合後、細胞培養培地を添加し、培地に対するマイクロキャリアの比率を１ｍｇ：１～１，０００μＬに調整した。実験では、２００万個の新鮮な細胞を２００ｍｇの新しいマイクロキャリアに接種し、培地を６０ｍＬに補充した。インペラー内蔵細胞培養フラスコを低速撹拌機上に置き、６日目まで６０ｒｐｍで時計方向に一定に撹拌しながらインキュベーター中に置き、細胞計数のために１日目、２日目、３日目、４日目、５日目および６日目に試料を採取した。
【0063】
三次元静的蘇生細胞群：パート（Ｉ）の工程１における三次元静的蘇生細胞群。
三次元静的新鮮細胞群：パート（Ｉ）の工程１における三次元静的新鮮細胞群。
二次元蘇生群：凍結保存脂肪由来ＭＳＣを採取し、３７℃の恒温水浴中で迅速に解凍した。氷がなくなった際に、それらは、その後の定期的な蘇生操作のために、ウルトラクリーンベンチに迅速に移された。解凍した細胞を洗浄し、遠心分離して上清を除去し、培養培地を用いて細胞を再懸濁して細胞懸濁液を得、これを１００，０００細胞／ウェルの密度で６ウェルプレートに接種し、４ｍＬの培地を添加し、１日目、２日目、３日目および４日目の細胞計数のために１ウェルを採取した。
二次元継代群：ＭＳＣで満たされたＴ７５を採取し、従来の細胞消化法に従ってＴ７５から新鮮な細胞を消化し、遠心分離によって上清を除去し、細胞を培養培地を用いて再懸濁し、細胞懸濁液を得、これを１００，０００細胞／ウェルの密度で６ウェルプレートに接種し、培地４ｍＬを添加し、１日目、２日目、３日目および４日目にそれぞれ細胞計数のために１ウェルを採取した。
三次元静的新鮮細胞群：パート（Ｉ）の工程１における三次元静的新鮮細胞群。
二次元蘇生群：凍結保存脂肪由来ＭＳＣを採取し、３７℃の恒温水浴中で迅速に解凍した。氷がなくなった際に、それらは、その後の定期的な蘇生操作のために、ウルトラクリーンベンチに迅速に移された。解凍した細胞を洗浄し、遠心分離して上清を除去し、培養培地を用いて細胞を再懸濁して細胞懸濁液を得、これを１００，０００細胞／ウェルの密度で６ウェルプレートに接種し、４ｍＬの培地を添加し、１日目、２日目、３日目および４日目の細胞計数のために１ウェルを採取した。
二次元継代群：ＭＳＣで満たされたＴ７５を採取し、従来の細胞消化法に従ってＴ７５から新鮮な細胞を消化し、遠心分離によって上清を除去し、細胞を培養培地を用いて再懸濁し、細胞懸濁液を得、これを１００，０００細胞／ウェルの密度で６ウェルプレートに接種し、培地４ｍＬを添加し、１日目、２日目、３日目および４日目にそれぞれ細胞計数のために１ウェルを採取した。
【0064】
結果を図１５に示す。
図１５Ａは、脂肪由来ＭＳＣがマイクロキャリアへの蘇生後に動的に培養され、６日間の培養後に最初の２００万個の蘇生細胞から７６３３万個まで拡大されたことを示す。脂肪由来ＭＳＣを、培養フラスコ中で完全に増殖するまで蘇生し、次いで、動的培養のためにマイクロキャリアに継代し、６日間の培養後、最初の２００万個の細胞から５８９３万個の細胞に拡大した。最初の３日間では２種類の細胞間に有意差はなく、４日目と５日目では継代細胞は蘇生細胞より速く成長したが、６日目では蘇生細胞の方が継代細胞よりも数が多かった。図１５Ｂは対応する細胞の２次元対照を示し、そこから、継代細胞は最初の３日間で蘇生細胞よりも遅く増殖し、４日目までに、両方の細胞群が空間によって制限され、数が減少し、蘇生細胞が遅く増殖したことを示すことが分かる。図１５Ｃは、マイクロキャリアの静的および動的培養物に接種された蘇生細胞の増殖時間の比較を示す。２つの間に有意差はなかったが、微妙な差は静的蘇生が動的蘇生よりもわずかに遅いことを示し、蘇生細胞が中程度の撹拌速度により適していることを示唆した。図１５Ｄは継代された細胞が剪断力に対してより耐性があり、２つの間に有意差がなく、全体的に、凍結保存が細胞に非常に損傷を与え、蘇生するためにいくらかの時間を必要とすることを示した；図１５Ｅおよび図１５Ｆは動的培養および２次元培養の両方の細胞を比較し、最初の３日間に有意差はなく、４日目の２次元は、空間制限のために有意差を示した。
図１５Ａは、脂肪由来ＭＳＣがマイクロキャリアへの蘇生後に動的に培養され、６日間の培養後に最初の２００万個の蘇生細胞から７６３３万個まで拡大されたことを示す。脂肪由来ＭＳＣを、培養フラスコ中で完全に増殖するまで蘇生し、次いで、動的培養のためにマイクロキャリアに継代し、６日間の培養後、最初の２００万個の細胞から５８９３万個の細胞に拡大した。最初の３日間では２種類の細胞間に有意差はなく、４日目と５日目では継代細胞は蘇生細胞より速く成長したが、６日目では蘇生細胞の方が継代細胞よりも数が多かった。図１５Ｂは対応する細胞の２次元対照を示し、そこから、継代細胞は最初の３日間で蘇生細胞よりも遅く増殖し、４日目までに、両方の細胞群が空間によって制限され、数が減少し、蘇生細胞が遅く増殖したことを示すことが分かる。図１５Ｃは、マイクロキャリアの静的および動的培養物に接種された蘇生細胞の増殖時間の比較を示す。２つの間に有意差はなかったが、微妙な差は静的蘇生が動的蘇生よりもわずかに遅いことを示し、蘇生細胞が中程度の撹拌速度により適していることを示唆した。図１５Ｄは継代された細胞が剪断力に対してより耐性があり、２つの間に有意差がなく、全体的に、凍結保存が細胞に非常に損傷を与え、蘇生するためにいくらかの時間を必要とすることを示した；図１５Ｅおよび図１５Ｆは動的培養および２次元培養の両方の細胞を比較し、最初の３日間に有意差はなく、４日目の２次元は、空間制限のために有意差を示した。
【0065】
ＩＩ． 脂肪由来間葉系幹細胞マイクロキャリアの蘇生と動的培養
凍結保存された脂肪由来ＭＳＣマイクロキャリアは、特許出願「三次元マイクロキャリア上でのＩｎ ｓｉｔｕ細胞凍結保存方法」（中国出願第２０１９１００９７６５０．５号）に記載されている方法に従って調製した。
凍結保存された脂肪由来ＭＳＣマイクロキャリアは、特許出願「三次元マイクロキャリア上でのＩｎ ｓｉｔｕ細胞凍結保存方法」（中国出願第２０１９１００９７６５０．５号）に記載されている方法に従って調製した。
【0066】
１． 動的培養容器およびマイクロキャリアの調製
適切な量のマイクロキャリアを、インペラーを内蔵した細胞培養フラスコまたは別の清潔で無菌のエンドトキシンを含まない容器に入れ、そこでマイクロキャリアを撹拌し、懸濁させた；０～５０％（ｖ／ｖ）の最終培養培地を添加することによってマイクロキャリアを再懸濁させ、０時間を超えて静置または撹拌した（時間制限なし）。実験では、１０錠の２００ｍｇのマイクロキャリアを、１０ｍｌの培地を含有し、内蔵インペラーを有する１２５ｍｌの細胞培養フラスコに添加し、１０分間放置した。
適切な量のマイクロキャリアを、インペラーを内蔵した細胞培養フラスコまたは別の清潔で無菌のエンドトキシンを含まない容器に入れ、そこでマイクロキャリアを撹拌し、懸濁させた；０～５０％（ｖ／ｖ）の最終培養培地を添加することによってマイクロキャリアを再懸濁させ、０時間を超えて静置または撹拌した（時間制限なし）。実験では、１０錠の２００ｍｇのマイクロキャリアを、１０ｍｌの培地を含有し、内蔵インペラーを有する１２５ｍｌの細胞培養フラスコに添加し、１０分間放置した。
【0067】
２． 凍結保存された微小組織の蘇生
凍結保存された脂肪由来ＭＳＣマイクロキャリア（以降の説明では脂肪由来ＭＳＣ微小組織と呼ぶ）を採取し、３７℃の恒温水浴中で急速に解凍した。微小組織は溶解結果の観察に影響を及ぼす可能性があるので、低温貯蔵管は観察中に傾けられ、穏やかに振盪される必要があり、氷がなくなった際に、それらは、その後の定期的な蘇生操作のために、ウルトラクリーンベンチに迅速に移された。凍結組織１ｍｇ当たり０．１～２５×１０６個の細胞が存在し、総細胞数は５～１００×１０３の個細胞／ｍｇのマイクロキャリアが接種を意図していた。微小組織１ｍｇ当たり０．２５×１０６の細胞が存在し、総細胞数は２×１０６の細胞であった。
凍結保存された脂肪由来ＭＳＣマイクロキャリア（以降の説明では脂肪由来ＭＳＣ微小組織と呼ぶ）を採取し、３７℃の恒温水浴中で急速に解凍した。微小組織は溶解結果の観察に影響を及ぼす可能性があるので、低温貯蔵管は観察中に傾けられ、穏やかに振盪される必要があり、氷がなくなった際に、それらは、その後の定期的な蘇生操作のために、ウルトラクリーンベンチに迅速に移された。凍結組織１ｍｇ当たり０．１～２５×１０６個の細胞が存在し、総細胞数は５～１００×１０３の個細胞／ｍｇのマイクロキャリアが接種を意図していた。微小組織１ｍｇ当たり０．２５×１０６の細胞が存在し、総細胞数は２×１０６の細胞であった。
【0068】
３． 解凍した凍結保存細胞の移植
工程２の終了後、解凍した細胞を洗浄し、遠心分離して上清を除去し、培養液を用いて細胞を再懸濁して細胞懸濁液を得、最終培養系の培地の１～１００％（体積百分率）を５～５００×１０５細胞／ｍＬとした。懸濁液中の細胞濃度は、合計２ｍＬ中、１×１０６細胞／ｍＬであった。
工程２の終了後、解凍した細胞を洗浄し、遠心分離して上清を除去し、培養液を用いて細胞を再懸濁して細胞懸濁液を得、最終培養系の培地の１～１００％（体積百分率）を５～５００×１０５細胞／ｍＬとした。懸濁液中の細胞濃度は、合計２ｍＬ中、１×１０６細胞／ｍＬであった。
【0069】
４． 接種
工程３の完了後、上記の微小組織懸濁液を、工程１で調製したインペラー内蔵細胞培養フラスコに混合し、新しいマイクロキャリアと混合した。蘇生された微小組織上の細胞数は５～１００×１０３細胞／ｍｇの新しいマイクロキャリアであり、培地に対するマイクロキャリアの比率は、混合後に培地を添加することによって１ｍｇ：１～１０００μＬに調節した。実験では、２００万個の蘇生細胞を２００ｍｇの新しいマイクロキャリアに接種し、培地を６０ｍＬに補充した。
インペラー内蔵細胞培養フラスコを低速撹拌機上に置き、撹拌のためにインキュベーター中に置いた。撹拌は一定速度撹拌または可変速度交互または可変速度周期撹拌によって行うことができ、撹拌方向は培養を行うために時計方向、反時計方向、または交互方向撹拌とすることができる。実験は６０ｒｐｍの時計方向の一定速度を用いて９６時間行い、次いで６０ｒｐｍの時計方向の一定速度で４日間続けた。細胞検出（工程５）および細胞計数（工程６）のために、４日目に試料を採取した。
工程３の完了後、上記の微小組織懸濁液を、工程１で調製したインペラー内蔵細胞培養フラスコに混合し、新しいマイクロキャリアと混合した。蘇生された微小組織上の細胞数は５～１００×１０３細胞／ｍｇの新しいマイクロキャリアであり、培地に対するマイクロキャリアの比率は、混合後に培地を添加することによって１ｍｇ：１～１０００μＬに調節した。実験では、２００万個の蘇生細胞を２００ｍｇの新しいマイクロキャリアに接種し、培地を６０ｍＬに補充した。
インペラー内蔵細胞培養フラスコを低速撹拌機上に置き、撹拌のためにインキュベーター中に置いた。撹拌は一定速度撹拌または可変速度交互または可変速度周期撹拌によって行うことができ、撹拌方向は培養を行うために時計方向、反時計方向、または交互方向撹拌とすることができる。実験は６０ｒｐｍの時計方向の一定速度を用いて９６時間行い、次いで６０ｒｐｍの時計方向の一定速度で４日間続けた。細胞検出（工程５）および細胞計数（工程６）のために、４日目に試料を採取した。
【0070】
５． 細胞モニタリング
（１）キット：動物細胞の死滅生存率／細胞毒性アッセイキット、カタログ番号： ＫＧＡＦ００１；
（２）細胞を含有する５０～１００μＬのマイクロキャリア懸濁液を９６ウェルプレートに添加した；
（３）上清を可能な限り除去し、ＰＢＳを添加し、１回洗浄し、２分後に可能な限りＰＢＳを除去し、各ウェルを、キットの説明書に従って構成された１００μＬの染色溶液を添加することによって染色した。室温で２０～３０分間染色し、光から保護した後、蛍光顕微鏡下で観察した。
結果を図１６に示す。結果は凍結保存された脂肪由来ＭＳＣマイクロキャリアが新しいキャリア上に蘇生された場合、最初のより少ない細胞から各マイクロキャリア球上のより多くの細胞へ徐々に拡大を再開し、凍結保存された微小組織が新しいキャリア上に直接蘇生され得ることを示している。
（１）キット：動物細胞の死滅生存率／細胞毒性アッセイキット、カタログ番号： ＫＧＡＦ００１；
（２）細胞を含有する５０～１００μＬのマイクロキャリア懸濁液を９６ウェルプレートに添加した；
（３）上清を可能な限り除去し、ＰＢＳを添加し、１回洗浄し、２分後に可能な限りＰＢＳを除去し、各ウェルを、キットの説明書に従って構成された１００μＬの染色溶液を添加することによって染色した。室温で２０～３０分間染色し、光から保護した後、蛍光顕微鏡下で観察した。
結果を図１６に示す。結果は凍結保存された脂肪由来ＭＳＣマイクロキャリアが新しいキャリア上に蘇生された場合、最初のより少ない細胞から各マイクロキャリア球上のより多くの細胞へ徐々に拡大を再開し、凍結保存された微小組織が新しいキャリア上に直接蘇生され得ることを示している。
【0071】
６． 細胞増殖を測定するための細胞計数
細胞接種の種々の日数の後、特許出願「三次元マイクロキャリア上で細胞を収集するための方法」（中国特許出願第２０１９１０１０１７３６．０号）に記載される方法に従って細胞を収集し、細胞計数プレートを用いて計数した。
結果を図１７に示す。結果は、培養用マイクロキャリアへの蘇生後の凍結保存臍帯ＭＳＣ微小組織と培養用マイクロキャリアへの蘇生接種後の凍結保存細胞との間に有意差はなく、Ｐ値は０．７３であった。微小組織群は培養４日後に２００万細胞のみの初期シードマイクロキャリアから４２８２万まで拡大し、微小組織が凍結保存後にマイクロキャリアで蘇生できることを示した。
細胞接種の種々の日数の後、特許出願「三次元マイクロキャリア上で細胞を収集するための方法」（中国特許出願第２０１９１０１０１７３６．０号）に記載される方法に従って細胞を収集し、細胞計数プレートを用いて計数した。
結果を図１７に示す。結果は、培養用マイクロキャリアへの蘇生後の凍結保存臍帯ＭＳＣ微小組織と培養用マイクロキャリアへの蘇生接種後の凍結保存細胞との間に有意差はなく、Ｐ値は０．７３であった。微小組織群は培養４日後に２００万細胞のみの初期シードマイクロキャリアから４２８２万まで拡大し、微小組織が凍結保存後にマイクロキャリアで蘇生できることを示した。
【0072】
実施例５：三次元マイクロキャリア細胞培養に基づくｉｎ ｓｉｔｕ継代方法
該実施例で使用したマイクロキャリアは、ＣＮＦ－Ｆ０１Ｔ－５０のカタログ番号を有する、北京華館生物科技有限公司から購入した３Ｄ ＦｌｏＴｒｉｘマイクロキャリアであった。
（Ｉ）三次元マイクロキャリア細胞培養に基づく静的ｉｎ ｓｉｔｕ継代
試験細胞：脂肪由来ＭＳＣおよび臍帯ＭＳＣ。
Ｉ． 静的ｉｎ ｓｉｔｕ継代方法
１． 新規マイクロキャリアの調製
滅菌および乾燥したマイクロキャリアを培養容器に入れた；この実施形態では、２０ｍｇのマイクロキャリアを６ウェルプレートで使用した。
２． シードマイクロキャリア懸濁液の調製
シードマイクロキャリアは、試験細胞と共に培養されたマイクロキャリアであった。シードマイクロキャリアを、特許出願第２０１９１００９８００３．６号（三次元マイクロキャリア上での細胞付着培養の方法）に従って培養した。１０，０００～１，０００，０００細胞／ｍｇマイクロキャリアの細胞密度を有するマイクロキャリアを、シードマイクロキャリアとして使用し、そしてシードマイクロキャリアを、細胞培養培地を使用して、０．１～５０ｍｇ／ｍＬ（すなわち、０．５～２５００万細胞／ｍＬ体積）に再懸濁した。
ここで、脂肪由来ＭＳＣについては：５００，０００細胞／ｍｇマイクロキャリアの細胞密度、および５ｍｇ／ｍＬの再懸濁密度；臍帯ＭＳＣについては：１２０，０００細胞／ｍｇマイクロキャリアの細胞密度、および１５ｍｇ／ｍＬの再懸濁密度である。
３． 接種
上記工程２で調製したシードマイクロキャリア懸濁液をよく混合した後、適量のシードマイクロキャリア懸濁液をピペットで滴下し、２０ｍｇの新しいマイクロキャリアを含む工程１で調製した６ウェルプレートに滴下し、シードマイクロキャリア懸濁液を新しいマイクロキャリアとよく混合した；新しいマイクロキャリアに対するシードマイクロキャリアの比率は、０．０００２～２００ｍｇシードマイクロキャリア／ｍｇ新しいマイクロキャリアであった。混合したマイクロキャリアをインキュベーター中で適切な時間（０．５～２４時間、特に２時間または２４時間）インキュベートした；シードマイクロキャリア上の細胞を新しいマイクロキャリア上に通過させた。
脂肪由来ＭＳＣについて：２０ｍｇの新しいマイクロキャリアに接種された１ｍｇのシードマイクロキャリア；臍帯ＭＳＣについて：２０ｍｇのマイクロキャリアに接種された３ｍｇのシードマイクロキャリア懸濁液；細胞の両方の群をインキュベーター中で２時間インキュベートした。
４． 培養：インキュベーション後、従来の細胞培養方法に従って細胞培養培地を添加することによって細胞培養を継続し、次いで静的なｉｎ ｓｉｔｕ継代を完了した。
該実施例で使用したマイクロキャリアは、ＣＮＦ－Ｆ０１Ｔ－５０のカタログ番号を有する、北京華館生物科技有限公司から購入した３Ｄ ＦｌｏＴｒｉｘマイクロキャリアであった。
（Ｉ）三次元マイクロキャリア細胞培養に基づく静的ｉｎ ｓｉｔｕ継代
試験細胞：脂肪由来ＭＳＣおよび臍帯ＭＳＣ。
Ｉ． 静的ｉｎ ｓｉｔｕ継代方法
１． 新規マイクロキャリアの調製
滅菌および乾燥したマイクロキャリアを培養容器に入れた；この実施形態では、２０ｍｇのマイクロキャリアを６ウェルプレートで使用した。
２． シードマイクロキャリア懸濁液の調製
シードマイクロキャリアは、試験細胞と共に培養されたマイクロキャリアであった。シードマイクロキャリアを、特許出願第２０１９１００９８００３．６号（三次元マイクロキャリア上での細胞付着培養の方法）に従って培養した。１０，０００～１，０００，０００細胞／ｍｇマイクロキャリアの細胞密度を有するマイクロキャリアを、シードマイクロキャリアとして使用し、そしてシードマイクロキャリアを、細胞培養培地を使用して、０．１～５０ｍｇ／ｍＬ（すなわち、０．５～２５００万細胞／ｍＬ体積）に再懸濁した。
ここで、脂肪由来ＭＳＣについては：５００，０００細胞／ｍｇマイクロキャリアの細胞密度、および５ｍｇ／ｍＬの再懸濁密度；臍帯ＭＳＣについては：１２０，０００細胞／ｍｇマイクロキャリアの細胞密度、および１５ｍｇ／ｍＬの再懸濁密度である。
３． 接種
上記工程２で調製したシードマイクロキャリア懸濁液をよく混合した後、適量のシードマイクロキャリア懸濁液をピペットで滴下し、２０ｍｇの新しいマイクロキャリアを含む工程１で調製した６ウェルプレートに滴下し、シードマイクロキャリア懸濁液を新しいマイクロキャリアとよく混合した；新しいマイクロキャリアに対するシードマイクロキャリアの比率は、０．０００２～２００ｍｇシードマイクロキャリア／ｍｇ新しいマイクロキャリアであった。混合したマイクロキャリアをインキュベーター中で適切な時間（０．５～２４時間、特に２時間または２４時間）インキュベートした；シードマイクロキャリア上の細胞を新しいマイクロキャリア上に通過させた。
脂肪由来ＭＳＣについて：２０ｍｇの新しいマイクロキャリアに接種された１ｍｇのシードマイクロキャリア；臍帯ＭＳＣについて：２０ｍｇのマイクロキャリアに接種された３ｍｇのシードマイクロキャリア懸濁液；細胞の両方の群をインキュベーター中で２時間インキュベートした。
４． 培養：インキュベーション後、従来の細胞培養方法に従って細胞培養培地を添加することによって細胞培養を継続し、次いで静的なｉｎ ｓｉｔｕ継代を完了した。
【0073】
ＩＩ． 対照実験
対照実験のために、細胞を消化し、次いで継代用マイクロキャリア上に接種し、すなわち、シードマイクロキャリア上の細胞を消化し、回収し（特許出願第２０１９１０１０１７３６．０号「三次元マイクロキャリア上で細胞を採取する方法」）、次いで、細胞のみの懸濁液に再懸濁し、これを、工程３と同じ細胞濃度および接種体積で２０ｍｇのマイクロキャリアと混合し、２時間等しくインキュベートし、次いで、さらなるインキュベーションのために細胞培養培地に添加した。
対照実験のために、細胞を消化し、次いで継代用マイクロキャリア上に接種し、すなわち、シードマイクロキャリア上の細胞を消化し、回収し（特許出願第２０１９１０１０１７３６．０号「三次元マイクロキャリア上で細胞を採取する方法」）、次いで、細胞のみの懸濁液に再懸濁し、これを、工程３と同じ細胞濃度および接種体積で２０ｍｇのマイクロキャリアと混合し、２時間等しくインキュベートし、次いで、さらなるインキュベーションのために細胞培養培地に添加した。
【0074】
ＩＩＩ． 結果
１． 細胞観察
（１）キット：動物細胞の死滅生存率／細胞毒性アッセイキット、カタログ番号： ＫＧＡＦ００１；
（２）細胞を含有する５０～１００μＬのマイクロキャリア懸濁液を９６ウェルプレートに添加した；
（３）上清を可能な限り除去し、ＰＢＳを添加し、１回洗浄し、２分後に可能な限りＰＢＳを除去し、各ウェルを、キットの説明書に従って構成された１００μＬの染色溶液を添加することによって染色した。室温で２０～３０分間染色し、光から保護した後、蛍光顕微鏡下で観察した。
１． 細胞観察
（１）キット：動物細胞の死滅生存率／細胞毒性アッセイキット、カタログ番号： ＫＧＡＦ００１；
（２）細胞を含有する５０～１００μＬのマイクロキャリア懸濁液を９６ウェルプレートに添加した；
（３）上清を可能な限り除去し、ＰＢＳを添加し、１回洗浄し、２分後に可能な限りＰＢＳを除去し、各ウェルを、キットの説明書に従って構成された１００μＬの染色溶液を添加することによって染色した。室温で２０～３０分間染色し、光から保護した後、蛍光顕微鏡下で観察した。
【0075】
結果分析：
図１８は静的ｉｎ ｓｉｔｕ継代方法によって脂肪由来ＭＳＣを接種した場合、少数のマイクロキャリアのみがその上に細胞を有し（強調表示）、これはシードマイクロキャリアであり、細胞を含まない他は新しいマイクロキャリアであったが、一方、ｉｎ ｓｉｔｕ継代培養後４日目にはすべてのマイクロキャリアがその上に細胞を有し、シードマイクロキャリア上の細胞が新しいマイクロキャリアに移され、増殖し得ることを示す。
図１９は静的なｉｎ ｓｉｔｕ継代による接シード後２日目に、少数のマイクロキャリアのみがその上に多くの細胞（明るい点）を有し、これはシードマイクロキャリアであり、少数の細胞を有する他は新しいマイクロキャリアであったが、一方、ｉｎ ｓｉｔｕ継代培養後４日目にはすべてのマイクロキャリアがその上に細胞を有し、シードマイクロキャリア上の細胞が新しいマイクロキャリアに移され、増殖し得ることを示す。
図１８は静的ｉｎ ｓｉｔｕ継代方法によって脂肪由来ＭＳＣを接種した場合、少数のマイクロキャリアのみがその上に細胞を有し（強調表示）、これはシードマイクロキャリアであり、細胞を含まない他は新しいマイクロキャリアであったが、一方、ｉｎ ｓｉｔｕ継代培養後４日目にはすべてのマイクロキャリアがその上に細胞を有し、シードマイクロキャリア上の細胞が新しいマイクロキャリアに移され、増殖し得ることを示す。
図１９は静的なｉｎ ｓｉｔｕ継代による接シード後２日目に、少数のマイクロキャリアのみがその上に多くの細胞（明るい点）を有し、これはシードマイクロキャリアであり、少数の細胞を有する他は新しいマイクロキャリアであったが、一方、ｉｎ ｓｉｔｕ継代培養後４日目にはすべてのマイクロキャリアがその上に細胞を有し、シードマイクロキャリア上の細胞が新しいマイクロキャリアに移され、増殖し得ることを示す。
【0076】
２． 細胞が継代増殖を完了したかどうかを決定するための細胞計数
特許出願「三次元マイクロキャリア上で細胞を採取する方法」（出願番号２０１９１０１０１７３６．０）に従って実施される。
４日間のインキュベーションの後、２０ｍｇの細胞増殖マイクロキャリアを培養ウェルプレートから遠心分離チューブに移し、４００×ｇで２分間遠心分離し、上清をピペットで移し、適切な量のＰＢＳを加え、２０～３０秒間手で穏やかに振盪し、上清をできるだけ多くピペットで移し、ＰＢＳ洗浄を１回繰り返し、溶解液（溶解液処方：０．１％コラゲナーゼ、０．１％エチレンジアミン四酢酸、０．０５％トリプシン；％表示／１００ｍＬ）３ｍＬを加え、インキュベーター中で３０分間インキュベートし、その間、細胞を１０分毎に１ｍＬピペットで数回穏やかに抽出し；３０分後、マイクロキャリアを完全に溶解し、３ｍＬの全培地を加えて溶解プロセスを終了させ；チューブを２００×ｇで５分間遠心分離し、上清を廃棄し、細胞計数プレートを通して細胞を再懸濁し、カウントした。
結果分析：
図２０は脂肪由来ＭＳＣの数が接種時の５０万から静的ｉｎ ｓｉｔｕ継代方法により２１０万細胞に増加し、従来の消化後継代方法（２４０万）により得られた細胞数と有意差がなかったことを示している（ｐ＝０．３２）。図２１は、静的ｉｎ ｓｉｔｕ継代方法によって培養された臍帯ＭＳＣの数が接種時の３０万から１９０万細胞に増加したことを示し、細胞が増殖・拡増を受けたことを示している。
特許出願「三次元マイクロキャリア上で細胞を採取する方法」（出願番号２０１９１０１０１７３６．０）に従って実施される。
４日間のインキュベーションの後、２０ｍｇの細胞増殖マイクロキャリアを培養ウェルプレートから遠心分離チューブに移し、４００×ｇで２分間遠心分離し、上清をピペットで移し、適切な量のＰＢＳを加え、２０～３０秒間手で穏やかに振盪し、上清をできるだけ多くピペットで移し、ＰＢＳ洗浄を１回繰り返し、溶解液（溶解液処方：０．１％コラゲナーゼ、０．１％エチレンジアミン四酢酸、０．０５％トリプシン；％表示／１００ｍＬ）３ｍＬを加え、インキュベーター中で３０分間インキュベートし、その間、細胞を１０分毎に１ｍＬピペットで数回穏やかに抽出し；３０分後、マイクロキャリアを完全に溶解し、３ｍＬの全培地を加えて溶解プロセスを終了させ；チューブを２００×ｇで５分間遠心分離し、上清を廃棄し、細胞計数プレートを通して細胞を再懸濁し、カウントした。
結果分析：
図２０は脂肪由来ＭＳＣの数が接種時の５０万から静的ｉｎ ｓｉｔｕ継代方法により２１０万細胞に増加し、従来の消化後継代方法（２４０万）により得られた細胞数と有意差がなかったことを示している（ｐ＝０．３２）。図２１は、静的ｉｎ ｓｉｔｕ継代方法によって培養された臍帯ＭＳＣの数が接種時の３０万から１９０万細胞に増加したことを示し、細胞が増殖・拡増を受けたことを示している。
【0077】
（ＩＩ）三次元マイクロキャリア細胞培養に基づく動的ｉｎ ｓｉｔｕ継代
試験細胞：脂肪由来ＭＳＣおよび臍帯ＭＳＣ。
Ｉ． 動的ｉｎ ｓｉｔｕ継代
１． 新しいマイクロキャリア懸濁液の調製： ２００ｍｇの新しいマイクロキャリア粉末を秤量し、インペラー内蔵細胞培養フラスコ（Ｂｅｌｌｃｏ Ｇｌａｓｓ， ＵＳＡ；カタログ番号：１９６５－６１００１；図１に示す概略図）に注ぎ；細胞培養培地を１～２０００μＬ ：１ｍｇのマイクロキャリアの比率で添加し、０時間を越えて（０時間を含まず、時間制限なし）放置または撹拌した。
ここで、脂肪由来ＭＳＣに対して：２０ｍｌの細胞培養培地を２００ｍｇの新しいマイクロキャリアのために添加し、１４時間放置した。臍帯ＭＳＣに対して：１０ｍｌの細胞培養培地を１００ｍｇの新しいマイクロキャリアのために添加し、１４時間放置した。
２． シードマイクロキャリア懸濁液の調製
シードマイクロキャリアは、試験細胞と共に培養されたマイクロキャリアであった。シードマイクロキャリアを、特許出願第２０１９１００９８００３．６号（三次元マイクロキャリア上での細胞付着培養の方法）に従って培養した。１０，０００～１，０００，０００細胞／ｍｇマイクロキャリア（例えば、１００，０００～５００，０００細胞／ｍｇマイクロキャリア）の細胞密度を有するマイクロキャリアをシードマイクロキャリアとして使用し、シードマイクロキャリアを０．１～５０ｍｇ／ｍＬ（すなわち、０．５～２５００万細胞／ｍＬ体積）に再懸濁した。
ここで、脂肪由来ＭＳＣについて：５００，０００／ｍｇの細胞密度および１ｍｇ／ｍＬの再懸濁密度を有するシードマイクロキャリア。臍帯ＭＳＣについて：１５０，０００／ｍｇの細胞密度および１ｍｇ／ｍＬの再懸濁密度を有するシードマイクロキャリア。
３． 接種
上記の工程２で調製したシードマイクロキャリア懸濁液を、工程１でインペラー内蔵細胞培養フラスコに混合し、新しいマイクロキャリア懸濁液とよく混合した；シードマイクロキャリア対新しいマイクロキャリアの比は、０．０００２～２００ｍｇシードマイクロキャリア／ｍｇ新しいマイクロキャリアであり；細胞培地を添加して、マイクロキャリア対培養培地の比を１ｍｇ：１～１０００μＬに調整した。
ここで、脂肪由来ＭＳＣに対して：４ｍｇのシードマイクロキャリア（合計２００万細胞）を使用して、２００ｍｇの新しいマイクロキャリアに接種し、細胞培養培地を６０ｍＬに補充した。臍帯ＭＳＣに対して：６．７ｍｇのシードマイクロキャリア（合計１００万個の細胞）を使用して、１００ｍｇの新しいマイクロキャリアに接種し、細胞培養培地を６０ｍＬに補充した。
インペラー内蔵細胞培養フラスコを低速撹拌機（３Ｄ ＦｌｏＴｒｉｘ ｍｉｎｉＳｐｉｎ 低速攪拌機，北京華館バイオテクノロジー社，カタログ番号：３Ｄ ＦＴｍＳ－２－２）上に置き、撹拌のためにインキュベーター中に置いた。攪拌は一定速度の攪拌または可変速度の交互または可変速度の周期的攪拌によって行うことができ、攪拌方向は時計方向、反時計方向、または交互方向の攪拌であって、細胞をシードマイクロキャリアから新しいマイクロキャリアに移動させることができ、攪拌時間は０．１～１００時間であった。
ここで、両方のＭＳＣについて、可変速周期的時計方向撹拌法、具体的には、６０ｒｍｐで５分間、２０ｒｐｍで２０分間のサイクルを、合計２４時間使用した。
４． 培地
接種後、増殖効果が達成されるまで撹拌しながら培養を続けることができた。
ＩＩ． 対照実験
対照実験は脂肪由来ＭＳＣを用いて実施し、これを消化し、次いで継代用マイクロキャリアに接種した。すなわち、シードマイクロキャリア上の細胞を消化し、回収した（特許出願第２０１９１０１０１７３６．０号「三次元マイクロキャリア上で細胞を回収する方法」による）次いで、細胞のみの懸濁液に再懸濁した。２００万細胞を４ｍＬ中に再懸濁し、インペラー内蔵細胞培養フラスコ中の２００ｍｇの新しいマイクロキャリア中に接種し、細胞培養培地を６０ｍＬに補充した。インペラー内蔵細胞培養フラスコを低速攪拌機（３Ｄ ＦｌｏＴｒｉｘ Ｓｐｍｉｎｉｘ低速攪拌機、北京華館バイオテクノロジー社、カタログ番号：３Ｄ ＦＴｍＳ－２－２）上に置き、６０ｒｍｐで５分間、２０ｒｐｍで２０分間のサイクルで２４時間インキュベーターに入れ、具体的には攪拌培養は、増殖効果が得られるまで継続した。
ＩＩＩ． 結果
１． 細胞観察：
（１）キット：動物細胞の死滅生存率／細胞毒性アッセイキット、カタログ番号： ＫＧＡＦ００１；
（２）細胞を含有する５０～１００μＬのマイクロキャリア懸濁液を９６ウェルプレートに添加した；
（３）上清を可能な限り除去し、ＰＢＳを添加し、１回洗浄し、２分後に可能な限りＰＢＳを除去し、各ウェルを、キットの説明書に従って構成された１００μＬの染色溶液を添加することによって染色した。室温で２０～３０分間染色し、光から保護した後、蛍光顕微鏡下で観察した。
結果分析：
図２２は動的ｉｎ ｓｉｔｕ継代による脂肪由来ＭＳＣの接種後２日目に、少数のマイクロキャリアのみが、種マイクロキャリアである蛍光画像（明るい点）に見られるように、それらの上に多数の細胞を有していたことを示すが、明視野から、他のマイクロキャリアが存在し、少数の細胞を有する他のものは新しいマイクロキャリアであったことが明らかであり、いくつかの細胞がｉｎ ｓｉｔｕ継代によって新しいマイクロキャリアに移されたことを証明し、ｉｎ ｓｉｔｕ継代後５日目に、細胞はすべてのマイクロキャリア上に存在し、新しいマイクロキャリア上に継代された細胞が増殖し、拡大したことを示した。図２３は動的ｉｎ ｓｉｔｕ継代方法によって臍帯ＭＳＣを接種した場合、蛍光画像で見られるように、少数のマイクロキャリアのみがそれらの上に多くの細胞（明るい点）を有していたが、明視野から、他のマイクロキャリアが存在し、細胞を含まない他のマイクロキャリアが新しいマイクロキャリアであることが明らかであり、ｉｎ ｓｉｔｕ継代培養後５日目に、細胞がすべてのマイクロキャリア上に存在し、シードマイクロキャリア上の細胞が新しいマイクロキャリアに移され、増殖および拡増し得ることを示した。
２． 細胞が継代増殖を完了したかどうかを決定するための細胞計数
特許出願「三次元マイクロキャリア上で細胞を回収する方法」（出願番号２０１９１０１０１７３６．０）に従って実施される。
接種後の異なる日に、３ｍＬのマイクロキャリア懸濁液をフラスコから遠心分離チューブに移し、４００×ｇで２分間遠心分離し、上清をピペットで移し、適量のＰＢＳを加え、２０～３０秒間手で穏やかに振盪し、上清をできるだけ多くピペットで移し、ＰＢＳ洗浄を１回繰り返し、溶解液（溶解液処方：０．１％コラゲナーゼ、０．１％エチレンジアミン四酢酸、０．０５％トリプシン；％表示／１００ｍＬ）３ｍＬを加え、３７℃のインキュベーター中で３０分間インキュベートし、その間、細胞を１ｍＬのピペットで１０分毎に数回穏やかにブローし；３０分後、マイクロキャリアを完全に溶解させ、３ｍＬの全培地を加えて溶解プロセスを終了させ；チューブを２００×ｇで５分間遠心分離し、上清を廃棄し、その後の適用の要件に従って、細胞を再懸濁し、細胞を計数プレートを通してカウントした。
結果分析：
図２４は脂肪由来ＭＳＣが動的ｉｎ ｓｉｔｕ継代方法により、最初はわずか２００万個の細胞を有するシードマイクロキャリアから、培養５日後に５９７７万まで増殖および拡大され得ることを示しており、これは、従来の消化後継代方法（５１４０万）により得られた細胞数と有意差がなかった（ｐ＝０．１４）。図２５は臍帯ＭＳＣが動的ｉｎ ｓｉｔｕ継代方法により、最初はわずか１００万個の細胞を有するシードマイクロキャリアから、培養７日後に１５２０万個まで、増殖、拡大され得ることを示す。
試験細胞：脂肪由来ＭＳＣおよび臍帯ＭＳＣ。
Ｉ． 動的ｉｎ ｓｉｔｕ継代
１． 新しいマイクロキャリア懸濁液の調製： ２００ｍｇの新しいマイクロキャリア粉末を秤量し、インペラー内蔵細胞培養フラスコ（Ｂｅｌｌｃｏ Ｇｌａｓｓ， ＵＳＡ；カタログ番号：１９６５－６１００１；図１に示す概略図）に注ぎ；細胞培養培地を１～２０００μＬ ：１ｍｇのマイクロキャリアの比率で添加し、０時間を越えて（０時間を含まず、時間制限なし）放置または撹拌した。
ここで、脂肪由来ＭＳＣに対して：２０ｍｌの細胞培養培地を２００ｍｇの新しいマイクロキャリアのために添加し、１４時間放置した。臍帯ＭＳＣに対して：１０ｍｌの細胞培養培地を１００ｍｇの新しいマイクロキャリアのために添加し、１４時間放置した。
２． シードマイクロキャリア懸濁液の調製
シードマイクロキャリアは、試験細胞と共に培養されたマイクロキャリアであった。シードマイクロキャリアを、特許出願第２０１９１００９８００３．６号（三次元マイクロキャリア上での細胞付着培養の方法）に従って培養した。１０，０００～１，０００，０００細胞／ｍｇマイクロキャリア（例えば、１００，０００～５００，０００細胞／ｍｇマイクロキャリア）の細胞密度を有するマイクロキャリアをシードマイクロキャリアとして使用し、シードマイクロキャリアを０．１～５０ｍｇ／ｍＬ（すなわち、０．５～２５００万細胞／ｍＬ体積）に再懸濁した。
ここで、脂肪由来ＭＳＣについて：５００，０００／ｍｇの細胞密度および１ｍｇ／ｍＬの再懸濁密度を有するシードマイクロキャリア。臍帯ＭＳＣについて：１５０，０００／ｍｇの細胞密度および１ｍｇ／ｍＬの再懸濁密度を有するシードマイクロキャリア。
３． 接種
上記の工程２で調製したシードマイクロキャリア懸濁液を、工程１でインペラー内蔵細胞培養フラスコに混合し、新しいマイクロキャリア懸濁液とよく混合した；シードマイクロキャリア対新しいマイクロキャリアの比は、０．０００２～２００ｍｇシードマイクロキャリア／ｍｇ新しいマイクロキャリアであり；細胞培地を添加して、マイクロキャリア対培養培地の比を１ｍｇ：１～１０００μＬに調整した。
ここで、脂肪由来ＭＳＣに対して：４ｍｇのシードマイクロキャリア（合計２００万細胞）を使用して、２００ｍｇの新しいマイクロキャリアに接種し、細胞培養培地を６０ｍＬに補充した。臍帯ＭＳＣに対して：６．７ｍｇのシードマイクロキャリア（合計１００万個の細胞）を使用して、１００ｍｇの新しいマイクロキャリアに接種し、細胞培養培地を６０ｍＬに補充した。
インペラー内蔵細胞培養フラスコを低速撹拌機（３Ｄ ＦｌｏＴｒｉｘ ｍｉｎｉＳｐｉｎ 低速攪拌機，北京華館バイオテクノロジー社，カタログ番号：３Ｄ ＦＴｍＳ－２－２）上に置き、撹拌のためにインキュベーター中に置いた。攪拌は一定速度の攪拌または可変速度の交互または可変速度の周期的攪拌によって行うことができ、攪拌方向は時計方向、反時計方向、または交互方向の攪拌であって、細胞をシードマイクロキャリアから新しいマイクロキャリアに移動させることができ、攪拌時間は０．１～１００時間であった。
ここで、両方のＭＳＣについて、可変速周期的時計方向撹拌法、具体的には、６０ｒｍｐで５分間、２０ｒｐｍで２０分間のサイクルを、合計２４時間使用した。
４． 培地
接種後、増殖効果が達成されるまで撹拌しながら培養を続けることができた。
ＩＩ． 対照実験
対照実験は脂肪由来ＭＳＣを用いて実施し、これを消化し、次いで継代用マイクロキャリアに接種した。すなわち、シードマイクロキャリア上の細胞を消化し、回収した（特許出願第２０１９１０１０１７３６．０号「三次元マイクロキャリア上で細胞を回収する方法」による）次いで、細胞のみの懸濁液に再懸濁した。２００万細胞を４ｍＬ中に再懸濁し、インペラー内蔵細胞培養フラスコ中の２００ｍｇの新しいマイクロキャリア中に接種し、細胞培養培地を６０ｍＬに補充した。インペラー内蔵細胞培養フラスコを低速攪拌機（３Ｄ ＦｌｏＴｒｉｘ Ｓｐｍｉｎｉｘ低速攪拌機、北京華館バイオテクノロジー社、カタログ番号：３Ｄ ＦＴｍＳ－２－２）上に置き、６０ｒｍｐで５分間、２０ｒｐｍで２０分間のサイクルで２４時間インキュベーターに入れ、具体的には攪拌培養は、増殖効果が得られるまで継続した。
ＩＩＩ． 結果
１． 細胞観察：
（１）キット：動物細胞の死滅生存率／細胞毒性アッセイキット、カタログ番号： ＫＧＡＦ００１；
（２）細胞を含有する５０～１００μＬのマイクロキャリア懸濁液を９６ウェルプレートに添加した；
（３）上清を可能な限り除去し、ＰＢＳを添加し、１回洗浄し、２分後に可能な限りＰＢＳを除去し、各ウェルを、キットの説明書に従って構成された１００μＬの染色溶液を添加することによって染色した。室温で２０～３０分間染色し、光から保護した後、蛍光顕微鏡下で観察した。
結果分析：
図２２は動的ｉｎ ｓｉｔｕ継代による脂肪由来ＭＳＣの接種後２日目に、少数のマイクロキャリアのみが、種マイクロキャリアである蛍光画像（明るい点）に見られるように、それらの上に多数の細胞を有していたことを示すが、明視野から、他のマイクロキャリアが存在し、少数の細胞を有する他のものは新しいマイクロキャリアであったことが明らかであり、いくつかの細胞がｉｎ ｓｉｔｕ継代によって新しいマイクロキャリアに移されたことを証明し、ｉｎ ｓｉｔｕ継代後５日目に、細胞はすべてのマイクロキャリア上に存在し、新しいマイクロキャリア上に継代された細胞が増殖し、拡大したことを示した。図２３は動的ｉｎ ｓｉｔｕ継代方法によって臍帯ＭＳＣを接種した場合、蛍光画像で見られるように、少数のマイクロキャリアのみがそれらの上に多くの細胞（明るい点）を有していたが、明視野から、他のマイクロキャリアが存在し、細胞を含まない他のマイクロキャリアが新しいマイクロキャリアであることが明らかであり、ｉｎ ｓｉｔｕ継代培養後５日目に、細胞がすべてのマイクロキャリア上に存在し、シードマイクロキャリア上の細胞が新しいマイクロキャリアに移され、増殖および拡増し得ることを示した。
２． 細胞が継代増殖を完了したかどうかを決定するための細胞計数
特許出願「三次元マイクロキャリア上で細胞を回収する方法」（出願番号２０１９１０１０１７３６．０）に従って実施される。
接種後の異なる日に、３ｍＬのマイクロキャリア懸濁液をフラスコから遠心分離チューブに移し、４００×ｇで２分間遠心分離し、上清をピペットで移し、適量のＰＢＳを加え、２０～３０秒間手で穏やかに振盪し、上清をできるだけ多くピペットで移し、ＰＢＳ洗浄を１回繰り返し、溶解液（溶解液処方：０．１％コラゲナーゼ、０．１％エチレンジアミン四酢酸、０．０５％トリプシン；％表示／１００ｍＬ）３ｍＬを加え、３７℃のインキュベーター中で３０分間インキュベートし、その間、細胞を１ｍＬのピペットで１０分毎に数回穏やかにブローし；３０分後、マイクロキャリアを完全に溶解させ、３ｍＬの全培地を加えて溶解プロセスを終了させ；チューブを２００×ｇで５分間遠心分離し、上清を廃棄し、その後の適用の要件に従って、細胞を再懸濁し、細胞を計数プレートを通してカウントした。
結果分析：
図２４は脂肪由来ＭＳＣが動的ｉｎ ｓｉｔｕ継代方法により、最初はわずか２００万個の細胞を有するシードマイクロキャリアから、培養５日後に５９７７万まで増殖および拡大され得ることを示しており、これは、従来の消化後継代方法（５１４０万）により得られた細胞数と有意差がなかった（ｐ＝０．１４）。図２５は臍帯ＭＳＣが動的ｉｎ ｓｉｔｕ継代方法により、最初はわずか１００万個の細胞を有するシードマイクロキャリアから、培養７日後に１５２０万個まで、増殖、拡大され得ることを示す。
【0078】
実施例６：三次元マイクロキャリアベースのｉｎ ｓｉｔｕ細胞凍結保存方法
Ｉ．
切片中の細胞は、ＣＢＰ６０４３９のカタログ番号を有する北京協和医学院の細胞基礎医学の細胞リソースセンターから購入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞であり；三次元マイクロキャリアがＣＮＦ－Ｆ０１Ｔ－５０のカタログ番号を有する北京華館バイオテクノロジー社から購入した３Ｄ ＦｌｏＴｒｉｘマイクロキャリアであった。
実施例では、細胞の三次元マイクロキャリア懸濁液を、以下の工程に従って調製した。
１． マイクロキャリア調製： ２００ｍｇのマイクロキャリア粉末を、紫外線滅菌のために秤量し、次いで、（図１に示されるような）インペラー内蔵滅菌細胞培養フラスコに注ぎ、３つの群を調製した；
２． 細胞調製：脂肪由来ＭＳＣ懸濁液を予め調製し、５×１０６細胞を、後の使用のために６０ｍｌの完全培地に再懸濁した；３群を調製した；
３． 細胞接種：上記の細胞懸濁液を、インペラー内蔵細胞培養フラスコ中に混合し、２００ｍｇのマイクロキャリアと十分に混合した；
４． 細胞付着：インペラー内蔵細胞培養フラスコを低速撹拌機上に置き、３７℃、５％ ＣＯ２インキュベータ中にいれ、８０ｒｐｍで撹拌し、細胞を回転によってマイクロキャリアに付着させた；
１． ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を含有する三次元マイクロキャリア懸濁液を４００×ｇで２分間遠心分離し、上清を廃棄した。
２． 凍結保存溶液（９０％ ＦＢＳ ＋ １０％ ＤＭＳＯ）を添加し、極低温貯蔵管に分配した（１ｍｌの凍結保存溶液は１０ｍｇの細胞含有マイクロキャリアを含み、管当たり０．５～１ｍｌであった）。
３． 極低温貯蔵管をセルプログラムされた冷却ボックスに装填し、５分以内に－８０℃の冷凍機に入れ、２４時間後に液体窒素に移すべきである。
４． マイクロキャリアに付着した細胞の蘇生：蘇生のために、３７℃の予め温めた基礎培地を調製し、次いで、極低温貯蔵管を、３７℃の水浴中に迅速に置き、この時間の間、絶えず穏やかに振盪し、１粒の米のようなサイズの氷が残ったところで（水浴中で約１～２分間）、管を水浴から迅速に取り出した。次いで、細胞を含む融解した三次元マイクロキャリア懸濁液を、１：５の希釈比で基礎培地で直ちに希釈し、続いて４００×ｇで２分間遠心分離し、次いで後の使用のために再懸濁した。
Ｉ．
切片中の細胞は、ＣＢＰ６０４３９のカタログ番号を有する北京協和医学院の細胞基礎医学の細胞リソースセンターから購入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞であり；三次元マイクロキャリアがＣＮＦ－Ｆ０１Ｔ－５０のカタログ番号を有する北京華館バイオテクノロジー社から購入した３Ｄ ＦｌｏＴｒｉｘマイクロキャリアであった。
実施例では、細胞の三次元マイクロキャリア懸濁液を、以下の工程に従って調製した。
１． マイクロキャリア調製： ２００ｍｇのマイクロキャリア粉末を、紫外線滅菌のために秤量し、次いで、（図１に示されるような）インペラー内蔵滅菌細胞培養フラスコに注ぎ、３つの群を調製した；
２． 細胞調製：脂肪由来ＭＳＣ懸濁液を予め調製し、５×１０６細胞を、後の使用のために６０ｍｌの完全培地に再懸濁した；３群を調製した；
３． 細胞接種：上記の細胞懸濁液を、インペラー内蔵細胞培養フラスコ中に混合し、２００ｍｇのマイクロキャリアと十分に混合した；
４． 細胞付着：インペラー内蔵細胞培養フラスコを低速撹拌機上に置き、３７℃、５％ ＣＯ２インキュベータ中にいれ、８０ｒｐｍで撹拌し、細胞を回転によってマイクロキャリアに付着させた；
１． ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を含有する三次元マイクロキャリア懸濁液を４００×ｇで２分間遠心分離し、上清を廃棄した。
２． 凍結保存溶液（９０％ ＦＢＳ ＋ １０％ ＤＭＳＯ）を添加し、極低温貯蔵管に分配した（１ｍｌの凍結保存溶液は１０ｍｇの細胞含有マイクロキャリアを含み、管当たり０．５～１ｍｌであった）。
３． 極低温貯蔵管をセルプログラムされた冷却ボックスに装填し、５分以内に－８０℃の冷凍機に入れ、２４時間後に液体窒素に移すべきである。
４． マイクロキャリアに付着した細胞の蘇生：蘇生のために、３７℃の予め温めた基礎培地を調製し、次いで、極低温貯蔵管を、３７℃の水浴中に迅速に置き、この時間の間、絶えず穏やかに振盪し、１粒の米のようなサイズの氷が残ったところで（水浴中で約１～２分間）、管を水浴から迅速に取り出した。次いで、細胞を含む融解した三次元マイクロキャリア懸濁液を、１：５の希釈比で基礎培地で直ちに希釈し、続いて４００×ｇで２分間遠心分離し、次いで後の使用のために再懸濁した。
【0079】
５． 細胞検出方法：
（１）生細胞のＩｎ ｓｉｔｕカルセイン－ＡＭ／ＰＩ染色法：
１） キット：動物細胞の死滅生存率／細胞毒性アッセイキット、カタログ番号： ＫＧＡＦ００１；
２） 凍結保存前または凍結保存後に蘇生した細胞を含む三次元マイクロキャリア懸濁液５０～１００μｌをそれぞれ９６ウェルプレートに添加した；
３） 上清を可能な限り除去し、ＰＢＳを添加し、１回洗浄し、２分後に可能な限りＰＢＳを除去し、各ウェルを、キットの説明書に従って構成された１００μＬの染色液を添加することによって染色した。室温で２０～３０分間染色し、光から保護した後、蛍光顕微鏡下で観察した結果を図２６に示す。
（１）生細胞のＩｎ ｓｉｔｕカルセイン－ＡＭ／ＰＩ染色法：
１） キット：動物細胞の死滅生存率／細胞毒性アッセイキット、カタログ番号： ＫＧＡＦ００１；
２） 凍結保存前または凍結保存後に蘇生した細胞を含む三次元マイクロキャリア懸濁液５０～１００μｌをそれぞれ９６ウェルプレートに添加した；
３） 上清を可能な限り除去し、ＰＢＳを添加し、１回洗浄し、２分後に可能な限りＰＢＳを除去し、各ウェルを、キットの説明書に従って構成された１００μＬの染色液を添加することによって染色した。室温で２０～３０分間染色し、光から保護した後、蛍光顕微鏡下で観察した結果を図２６に示す。
【0080】
図２６から分かるように、生細胞は染色液で染色され、蛍光によって発光することが観察され、発光する細胞は生細胞であった。照射された球形マイクロキャリアは、生細胞がマイクロキャリアに依然として付着していることを証明した。図２６Ａは生細胞をｉｎ ｓｉｔｕで凍結保存し、３Ｄ ＦｌｏＴｒｉｘマイクロキャリア上で蘇生することができ、凍結保存の２週間後でも成功したことを実証する。しかし、図２６Ｂでは、競合マイクロキャリア（ＧＥ Ｃｙｔｏｄｅｘ， Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．： １７－１２７１－０１，北京シンクファーテクノロジー社から購入）を凍結保存し、蘇生した後、細胞がマイクロキャリアから剥離していることがわかり、蛍光観察により、細胞はマイクロキャリアに付着せず、液中に点在し、散乱していることがわかった。
【0081】
（２）フローサイトメトリーによるアポトーシス速度の検出のための分析方法：
１） 細胞収集：細胞を含有する三次元マイクロキャリア懸濁液２０ｍｇを４００×ｇで２分間遠心分離し、上清を廃棄した。０．１％コラゲナーゼＩＶ型溶液（１ＬのＰＢＳに溶解した１ｇのコラゲナーゼＩＶ型（Ｇｉｂｃｏ、１７１０４０１９））３ｍＬを添加し、溶液を細胞インキュベータ中で３７℃で３０分間インキュベートし、４００×ｇで５分間遠心分離し、上清を廃棄した。
２） 細胞洗浄：細胞を、４℃で予冷したＰＢＳによって１回再懸濁し、４００×ｇで５分間遠心分離し、次いで、細胞を洗浄した。
３） 細胞染色：細胞を、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ－ＦＩＴＣ／ＰＩアポトーシス検出キット（新海遺伝子検査社（ＨａｉＧｅｎｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ．， Ｌｔｄ），Ｓ０１８５）を使用して染色し、すなわち、３００μＬの結合緩衝液を添加し、続いて、５μＬのＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ－ＦＩＴＣを添加し、混合し、室温で１５分間インキュベートし、光から保護した；次いで、５μＬのＰＩを添加し、５分間染色した；２００μＬの結合緩衝液を補充した。
４） 細胞フローサイトメトリー：ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩ ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒを用いて染色細胞のフローサイトメトリーを実施し、細胞分類分析の報告を装置によって作成した。
５） 細胞フローサイトメトリー報告書の解釈：
Ａ）アネキシン－Ｖ陰性－ＰＩ陰性は正常細胞、すなわち４フレーム細胞分類図の左下の群を表し、その細胞の割合は生細胞の割合である。
Ｂ）アネキシン－Ｖ陽性－ＰＩ陰性はアポトーシスの初期段階の細胞、すなわち４フレーム細胞分類図の右下のグループを表し、その細胞の割合は、アポトーシスの初期段階の細胞の割合である。
Ｃ）アネキシン－Ｖ陽性－ＰＩ陽性はアポトーシスまたは壊死細胞の後期段階の細胞、すなわち、４フレーム細胞分類図の右上のグループを表し、その細胞の割合は、アポトーシスの後期段階の細胞の割合である。
図２７は凍結保存前の３Ｄ ＦｌｏＴｒｉｘマイクロキャリア上の生存細胞のパーセンテージが９０．４％であったのに対し、凍結保存後、次いで蘇生後の生存細胞のパーセンテージは８９．６％であり、１％弱の減少であったことを示し、したがって、本発明で使用される３Ｄ ＦｌｏＴｒｉｘマイクロキャリア上の細胞はマイクロキャリアと共にｉｎ ｓｉｔｕで保存することができ、蘇生後にそれらの活性を維持することができる。
１） 細胞収集：細胞を含有する三次元マイクロキャリア懸濁液２０ｍｇを４００×ｇで２分間遠心分離し、上清を廃棄した。０．１％コラゲナーゼＩＶ型溶液（１ＬのＰＢＳに溶解した１ｇのコラゲナーゼＩＶ型（Ｇｉｂｃｏ、１７１０４０１９））３ｍＬを添加し、溶液を細胞インキュベータ中で３７℃で３０分間インキュベートし、４００×ｇで５分間遠心分離し、上清を廃棄した。
２） 細胞洗浄：細胞を、４℃で予冷したＰＢＳによって１回再懸濁し、４００×ｇで５分間遠心分離し、次いで、細胞を洗浄した。
３） 細胞染色：細胞を、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ－ＦＩＴＣ／ＰＩアポトーシス検出キット（新海遺伝子検査社（ＨａｉＧｅｎｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ．， Ｌｔｄ），Ｓ０１８５）を使用して染色し、すなわち、３００μＬの結合緩衝液を添加し、続いて、５μＬのＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ－ＦＩＴＣを添加し、混合し、室温で１５分間インキュベートし、光から保護した；次いで、５μＬのＰＩを添加し、５分間染色した；２００μＬの結合緩衝液を補充した。
４） 細胞フローサイトメトリー：ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩ ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒを用いて染色細胞のフローサイトメトリーを実施し、細胞分類分析の報告を装置によって作成した。
５） 細胞フローサイトメトリー報告書の解釈：
Ａ）アネキシン－Ｖ陰性－ＰＩ陰性は正常細胞、すなわち４フレーム細胞分類図の左下の群を表し、その細胞の割合は生細胞の割合である。
Ｂ）アネキシン－Ｖ陽性－ＰＩ陰性はアポトーシスの初期段階の細胞、すなわち４フレーム細胞分類図の右下のグループを表し、その細胞の割合は、アポトーシスの初期段階の細胞の割合である。
Ｃ）アネキシン－Ｖ陽性－ＰＩ陽性はアポトーシスまたは壊死細胞の後期段階の細胞、すなわち、４フレーム細胞分類図の右上のグループを表し、その細胞の割合は、アポトーシスの後期段階の細胞の割合である。
図２７は凍結保存前の３Ｄ ＦｌｏＴｒｉｘマイクロキャリア上の生存細胞のパーセンテージが９０．４％であったのに対し、凍結保存後、次いで蘇生後の生存細胞のパーセンテージは８９．６％であり、１％弱の減少であったことを示し、したがって、本発明で使用される３Ｄ ＦｌｏＴｒｉｘマイクロキャリア上の細胞はマイクロキャリアと共にｉｎ ｓｉｔｕで保存することができ、蘇生後にそれらの活性を維持することができる。
【0082】
（３）Ｉｎ ｓｉｔｕ細胞計数法：
１） マイクロキャリア収集：細胞を含む三次元マイクロキャリア懸濁液２０ｍｇを、７０μｍ細胞篩を通して収集し、ＰＢＳで１回洗浄して、マイクロキャリアに付着していない任意の細胞を洗浄除去した。次いで、細胞を含有するマイクロキャリア懸濁液を１５００ｒｐｍで２分間遠心分離し、上清を廃棄した。
２）細胞計数：３７℃で２～５時間、３ｍＬの０．１％クリスタルバイオレット溶液（０．１ｇのクリスタルバイオレット、２．１ｇのクエン酸、２０μＬのＴｗｅｅｎ－８０、１００ｍｌの脱イオン水）、細胞計数プレートで細胞を計数した。
３） 結果分析：図２８の結果は凍結保存および蘇生後、３Ｄ ＦｌｏＴｒｉｘマイクロキャリア上の細胞の数は凍結保存前のものと一致したままであったが、競合マイクロキャリア（ＧＥ Ｃｙｔｏｄｅｘ、カタログ番号：１７－１２７１－０１、北京シンクファーテクノロジー社から購入）上の細胞の数はマイクロキャリアの破裂および細胞の散乱のために大幅に減少したことを示し、したがって、本発明において、細胞培養のための３Ｄ ＦｌｏＴｒｉｘマイクロキャリアの使用、続いての凍結保存およびその後の蘇生はｉｎ ｓｉｔｕ三次元細胞凍結を可能にし、細胞培養および保存方法の連鎖全体を三次元環境で維持する。
１） マイクロキャリア収集：細胞を含む三次元マイクロキャリア懸濁液２０ｍｇを、７０μｍ細胞篩を通して収集し、ＰＢＳで１回洗浄して、マイクロキャリアに付着していない任意の細胞を洗浄除去した。次いで、細胞を含有するマイクロキャリア懸濁液を１５００ｒｐｍで２分間遠心分離し、上清を廃棄した。
２）細胞計数：３７℃で２～５時間、３ｍＬの０．１％クリスタルバイオレット溶液（０．１ｇのクリスタルバイオレット、２．１ｇのクエン酸、２０μＬのＴｗｅｅｎ－８０、１００ｍｌの脱イオン水）、細胞計数プレートで細胞を計数した。
３） 結果分析：図２８の結果は凍結保存および蘇生後、３Ｄ ＦｌｏＴｒｉｘマイクロキャリア上の細胞の数は凍結保存前のものと一致したままであったが、競合マイクロキャリア（ＧＥ Ｃｙｔｏｄｅｘ、カタログ番号：１７－１２７１－０１、北京シンクファーテクノロジー社から購入）上の細胞の数はマイクロキャリアの破裂および細胞の散乱のために大幅に減少したことを示し、したがって、本発明において、細胞培養のための３Ｄ ＦｌｏＴｒｉｘマイクロキャリアの使用、続いての凍結保存およびその後の蘇生はｉｎ ｓｉｔｕ三次元細胞凍結を可能にし、細胞培養および保存方法の連鎖全体を三次元環境で維持する。
【0083】
ＩＩ．
切片中の細胞は、ＡＤ－ＭＳＣ細胞（精華大学医学院から）であり；三次元マイクロキャリアがＣＮＦ－Ｆ０１Ｔ－５０のカタログ番号を有する、北京華館生物科技有限公司から購入した３Ｄ ＦｌｏＴｒｉｘマイクロキャリアであった。
１． ＡＤ－ＭＳＣ細胞を含有する三次元マイクロキャリア懸濁液を４００×ｇで２分間遠心分離し、上清を廃棄した。
２． 凍結保存溶液（９０％ ＦＢＳ ＋ １０％ ＤＭＳＯ）を添加し、極低温貯蔵管に分配した（１ｍｌの凍結保存溶液は１０ｍｇの細胞含有マイクロキャリアを含み、管当たり０．５～１ｍｌであった）。
３． 極低温貯蔵管をセルプログラムされた冷却ボックスに装填し、５分以内に－８０℃の冷凍機に入れ、２４時間後に液体窒素に移した。
４． マイクロキャリアに付着した細胞の蘇生：蘇生のために、３７℃の予め温めた基礎培地を調製し、次いで、極低温貯蔵管を、３７℃の水浴中に迅速に置き、この時間の間、絶えず穏やかに振盪し、１粒の米のようなサイズの氷が残ったところで（水浴中で約１～２分間）、管を水浴から迅速に取り出した。次いで、細胞を含む融解した三次元マイクロキャリア懸濁液を、１：５の希釈比で基礎培地で直ちに希釈し、続いて４００×ｇで２分間遠心分離し、次いで後の使用のために再懸濁した。
切片中の細胞は、ＡＤ－ＭＳＣ細胞（精華大学医学院から）であり；三次元マイクロキャリアがＣＮＦ－Ｆ０１Ｔ－５０のカタログ番号を有する、北京華館生物科技有限公司から購入した３Ｄ ＦｌｏＴｒｉｘマイクロキャリアであった。
１． ＡＤ－ＭＳＣ細胞を含有する三次元マイクロキャリア懸濁液を４００×ｇで２分間遠心分離し、上清を廃棄した。
２． 凍結保存溶液（９０％ ＦＢＳ ＋ １０％ ＤＭＳＯ）を添加し、極低温貯蔵管に分配した（１ｍｌの凍結保存溶液は１０ｍｇの細胞含有マイクロキャリアを含み、管当たり０．５～１ｍｌであった）。
３． 極低温貯蔵管をセルプログラムされた冷却ボックスに装填し、５分以内に－８０℃の冷凍機に入れ、２４時間後に液体窒素に移した。
４． マイクロキャリアに付着した細胞の蘇生：蘇生のために、３７℃の予め温めた基礎培地を調製し、次いで、極低温貯蔵管を、３７℃の水浴中に迅速に置き、この時間の間、絶えず穏やかに振盪し、１粒の米のようなサイズの氷が残ったところで（水浴中で約１～２分間）、管を水浴から迅速に取り出した。次いで、細胞を含む融解した三次元マイクロキャリア懸濁液を、１：５の希釈比で基礎培地で直ちに希釈し、続いて４００×ｇで２分間遠心分離し、次いで後の使用のために再懸濁した。
【0084】
５． 細胞検出方法：
（１）生細胞のＩｎ ｓｉｔｕカルセイン－ＡＭ／ＰＩ染色法：
１） キット：動物細胞の死滅生存率／細胞毒性アッセイキット、カタログ番号： ＫＧＡＦ００１；
２） 凍結保存前または凍結保存後に蘇生した細胞を含む三次元マイクロキャリア懸濁液５０～１００μｌをそれぞれ９６ウェルプレートに添加した；
３） 上清を可能な限り除去し、ＰＢＳを添加し、１回洗浄し、２分後に可能な限りＰＢＳを除去し、各ウェルを、キットの説明書に従って構成された１００μＬの染色溶液を添加することによって染色した。室温で２０～３０分間染色し、光から保護した後、蛍光顕微鏡下で観察した結果を図２９に示す。
図２９から分かるように、生細胞は染色液で染色され、蛍光によって発光することが観察され、発光する細胞は生細胞であった。照射された球形マイクロキャリアは、生細胞がマイクロキャリアに依然として付着していることを証明した。図２９は３Ｄ ＦｌｏＴｒｉｘマイクロキャリア上での凍結保存の１～２日後のＡＤ－ＭＳＣの蘇生結果を示し、発光生細胞は依然としてマイクロキャリアに付着しており、３Ｄ ＦｌｏＴｒｉｘがＭＳＣの凍結保存を補助することを示す。
図３０は、３Ｄ ＦｌｏＴｒｉｘマイクロキャリア上のＭＳＣが凍結保存の前後で９０％を超える生細胞比を有し、凍結保存の前後での細胞活性の差は有意ではなかったことを示す。したがって、本発明で使用される３Ｄ ＦｌｏＴｒｉｘマイクロキャリア上のＭＳＣはマイクロキャリアと共にｉｎ ｓｉｔｕで保存することができ、回復後にそれらの活性を維持することができる。
（１）生細胞のＩｎ ｓｉｔｕカルセイン－ＡＭ／ＰＩ染色法：
１） キット：動物細胞の死滅生存率／細胞毒性アッセイキット、カタログ番号： ＫＧＡＦ００１；
２） 凍結保存前または凍結保存後に蘇生した細胞を含む三次元マイクロキャリア懸濁液５０～１００μｌをそれぞれ９６ウェルプレートに添加した；
３） 上清を可能な限り除去し、ＰＢＳを添加し、１回洗浄し、２分後に可能な限りＰＢＳを除去し、各ウェルを、キットの説明書に従って構成された１００μＬの染色溶液を添加することによって染色した。室温で２０～３０分間染色し、光から保護した後、蛍光顕微鏡下で観察した結果を図２９に示す。
図２９から分かるように、生細胞は染色液で染色され、蛍光によって発光することが観察され、発光する細胞は生細胞であった。照射された球形マイクロキャリアは、生細胞がマイクロキャリアに依然として付着していることを証明した。図２９は３Ｄ ＦｌｏＴｒｉｘマイクロキャリア上での凍結保存の１～２日後のＡＤ－ＭＳＣの蘇生結果を示し、発光生細胞は依然としてマイクロキャリアに付着しており、３Ｄ ＦｌｏＴｒｉｘがＭＳＣの凍結保存を補助することを示す。
図３０は、３Ｄ ＦｌｏＴｒｉｘマイクロキャリア上のＭＳＣが凍結保存の前後で９０％を超える生細胞比を有し、凍結保存の前後での細胞活性の差は有意ではなかったことを示す。したがって、本発明で使用される３Ｄ ＦｌｏＴｒｉｘマイクロキャリア上のＭＳＣはマイクロキャリアと共にｉｎ ｓｉｔｕで保存することができ、回復後にそれらの活性を維持することができる。
【0085】
（３）溶解細胞計数方法：
１） マイクロキャリア収集：細胞を含む三次元マイクロキャリア懸濁液２０ｍｇを、７０μｍ細胞篩を通して収集し、ＰＢＳで１回洗浄して、マイクロキャリアに付着していない任意の細胞を洗浄除去した。次いで、細胞を含有するマイクロキャリア懸濁液を１５００ｒｐｍで２分間遠心分離し、上清を廃棄した。
２） 細胞計数： ３ｍＬの溶解溶液（溶解液処方：０．１％コラゲナーゼ、０．１％エチレンジアミン四酢酸、０．０５％トリプシン；％表示ｇ／１００ｍＬ）を添加し、インキュベーター中で３０分間インキュベートし、その間、細胞を１０分毎に１ｍｌピペットで数回穏やかにブローし；３０分後、マイクロキャリアを完全に溶解し、３ｍＬの全培地を添加して溶解プロセスを終了させ；チューブを２００×ｇで５分間遠心分離し、上清を廃棄し、細胞を再懸濁し、細胞計数プレートを通して計数した。
３） 結果分析：図３１の結果は、凍結保存および蘇生後、３Ｄ ＦｌｏＴｒｉｘマイクロキャリア上の細胞の数が凍結保存前の数と一致したままであったことを示す。従って、本発明において、ＭＳＣ培養のための３Ｄ ＦｌｏＴｒｉｘマイクロキャリアの使用は長期間の凍結保存を可能にし、細胞培養の全連鎖を維持し、そして三次元環境において保存する。
１） マイクロキャリア収集：細胞を含む三次元マイクロキャリア懸濁液２０ｍｇを、７０μｍ細胞篩を通して収集し、ＰＢＳで１回洗浄して、マイクロキャリアに付着していない任意の細胞を洗浄除去した。次いで、細胞を含有するマイクロキャリア懸濁液を１５００ｒｐｍで２分間遠心分離し、上清を廃棄した。
２） 細胞計数： ３ｍＬの溶解溶液（溶解液処方：０．１％コラゲナーゼ、０．１％エチレンジアミン四酢酸、０．０５％トリプシン；％表示ｇ／１００ｍＬ）を添加し、インキュベーター中で３０分間インキュベートし、その間、細胞を１０分毎に１ｍｌピペットで数回穏やかにブローし；３０分後、マイクロキャリアを完全に溶解し、３ｍＬの全培地を添加して溶解プロセスを終了させ；チューブを２００×ｇで５分間遠心分離し、上清を廃棄し、細胞を再懸濁し、細胞計数プレートを通して計数した。
３） 結果分析：図３１の結果は、凍結保存および蘇生後、３Ｄ ＦｌｏＴｒｉｘマイクロキャリア上の細胞の数が凍結保存前の数と一致したままであったことを示す。従って、本発明において、ＭＳＣ培養のための３Ｄ ＦｌｏＴｒｉｘマイクロキャリアの使用は長期間の凍結保存を可能にし、細胞培養の全連鎖を維持し、そして三次元環境において保存する。
【0086】
実施例７：三次元培養方法を用いた幹細胞の大規模増殖
Ｉ． 撹拌バイオリアクター中での連続細胞増殖培養
１． １０錠（合計２００ｍｇ）の３Ｄ ＴａｂｌｅＴｒｉｘマイクロキャリア（北京華館生物科技有限公司；カタログ番号：Ｆ０１－１００）を、インペラー内蔵細胞培養フラスコ（ベルコガラス社，米国；カタログ番号：１９６５－６１００１）に入れ、１０ｍｌの細胞培養培地を添加した。
２． ５０ｍＬの脂肪由来ＭＳＣ細胞懸濁液（２００万個の細胞を含有する）を、工程１で調製したマイクロキャリアを含有するインペラー内蔵細胞培養フラスコに接種した。
３． 工程２からのインペラー内蔵細胞培養フラスコを、細胞培養インキュベーター中の３Ｄ ＦｌｏＴｒｉｘ（商標）ミニスピン小規模バイオリアクター（北京華館生物科技有限公司；３Ｄ ｍｉｎｉＳＰＩＮ Ｍ１）上に置き、６０ｒｐｍの一定速度で時計方向に６日間インキュベートした（３日目に６０ｍＬの新鮮な培地を補充）。細胞サンプリングおよび計数を毎日行って、細胞拡大曲線に関するデータを得た。６日目に、細胞培養フラスコから採取した２００万個の細胞を含有する微小組織（すなわち、細胞を含有するマイクロキャリア）を、電気ピペットを用いて５０ｍＬの新鮮な培地に再懸濁し、３Ｄ ＦｌｏＴｒｉｘ（商標） ｖｉｖａＳｐｉｎバイオリアクター（北京華館生物科技有限公司； ３Ｄ ｖｉｖａＳＰＩＮ Ｖ１、図３３）に移し、５０ｍＬの培地に予め再懸濁（０～３０分間放置）した３Ｄ ＴａｂｌｅＴｒｉｘマイクロキャリア（北京華館生物科技有限公司；カタログ番号： Ｆ０１－１００）５０錠（計１ｇ）を加えた。細胞をサンプリングし、毎日カウントして、細胞増殖曲線に関するデータを得、細胞活性も測定した。
３Ｄ ＦｌｏＴｒｉｘ（商標）ｖｉｖａＳｐｉｎバイオリアクターについて設定したプロセスパラメーターは、以下のように制御した：プロセス全体を通して１２ ｃｃｍの５％ ＣＯ２の能動ポンプ輸送、および３７℃。Ｔ＝０時間において８００ｍＬの完全培地を１０ｍＬ／分の速度で能動的にポンプ注入し、５００ｍＬの液体を１０ｍＬ／分の速度で能動的にポンプ注入し、続いてＴ＝９６時間において５００ｍＬの新鮮培地を１０ｍＬ／分の速度でポンプ注入し、５００ｍＬの液体を１０ｍＬ／分の速度で能動的にポンプ注入し、続いてＴ＝１４４時間において１０ｍＬ／分で反応器に能動的にポンプ注入した５００ｍＬの新鮮培地に再懸濁した５０錠の３Ｄ ＴａｂｌｅＴｒｉｘ（商標）マイクロキャリアを能動的にポンプ注入した。Ｔ＝０～１２時間およびＴ＝１４４～１５６時間の撹拌速度は、５分間４０ｒｐｍ、２０分間２０ｒｐｍのサイクルで可変速度、残りの時間は６０ｒｐｍの一定速度であった。
細胞サンプリングおよび計数方法：すべての試料を、３Ｄ ＦｌｏＴｒｉｘ（商標）ｖｉｖａＳｐｉｎバイオリアクターのサンプラーを通してピペットで１ｍＬの試料×３反復で採取し、遠心分離チューブに移し、４００×ｇで２分間遠心分離し、上清をピペットで移した。１ｍＬの溶解液（溶解液処方：０．１％コラゲナーゼ、０．１％エチレンジアミン四酢酸、０．０５％トリプシン；％表示ｇ／１００ｍＬ）を添加し、マイクロキャリアが完全に溶解するまで（その間、細胞を１０分毎に１ｍＬピペットで穏やかに数回吹き付けた）、インキュベーター中で３０分間インキュベートし、１ｍＬの全培地を添加して溶解プロセスを終了させ；２００×ｇで５分間遠心分離し、上清を廃棄し、細胞を懸濁し、細胞計数プレートを通して計数した。
細胞活性アッセイ： ５０μＬの細胞懸濁液を５０μＬの０．２％トリパンブルー染色溶液と混合し、適切な量の細胞を計数のために採取した。自動細胞計数器（例えば、Ｃｏｕｎｔｓｔａｒ（登録商標）上海瑞楚生物科技有限公司）または細胞計数プレートのいずれかを使用することができる。透明な細胞の数および青色に染色された細胞の数を別々に記録し、細胞懸濁液中の細胞の数を、対応する希釈比から外挿した。
細胞活性比（％）＝未染色細胞数／（未染色細胞数＋青染色細胞数）×１００％。
細胞数アッセイの結果を図３２に示す。培養プロセス全体を、３Ｄ ＦｌｏＴｒｉｘ（商標）ミニスピンの細胞培養フラスコ中のＭｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒｓ（商標）１０錠に６日間直接接種した２００万個の細胞から、新たなＭｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒｓ（商標）を添加し、８日間のさらなる培養のために３Ｄ ＦｌｏＴｒｉｘ（商標）ｖｉＳｐｖｉｉｎ自動バイオリアクター中で増殖させて、１億個の細胞の最終収穫に到達させ、そのうちの０日目から６日目までの小規模バイオリアクター中で、６日間の培養の後、最初の２００万個から４９２０万個の細胞が蘇生され、増殖が約２４．６倍に増加した。それらをシードとして使用し、自動バイオリアクターで８日間の培養の後、合計約２５億９千万個の細胞が蘇生され約５２．７倍の増殖、すなわち、１４日間の培養で合計約１，２９５倍の増殖を表した。
細胞活性アッセイの結果を図３４に示す。この結果は細胞活性が培養プロセス全体を通して９０％を超えて維持されたことを示した。全培養方法は１人のみ、０．２５ｍ２未満の空間、１４日間の培養期間、２リットルの培養培地および１１０錠のマイクロキャリアを必要とし、その結果、ヒト、物質および財源の有意な節約をもたらした。
Ｉ． 撹拌バイオリアクター中での連続細胞増殖培養
１． １０錠（合計２００ｍｇ）の３Ｄ ＴａｂｌｅＴｒｉｘマイクロキャリア（北京華館生物科技有限公司；カタログ番号：Ｆ０１－１００）を、インペラー内蔵細胞培養フラスコ（ベルコガラス社，米国；カタログ番号：１９６５－６１００１）に入れ、１０ｍｌの細胞培養培地を添加した。
２． ５０ｍＬの脂肪由来ＭＳＣ細胞懸濁液（２００万個の細胞を含有する）を、工程１で調製したマイクロキャリアを含有するインペラー内蔵細胞培養フラスコに接種した。
３． 工程２からのインペラー内蔵細胞培養フラスコを、細胞培養インキュベーター中の３Ｄ ＦｌｏＴｒｉｘ（商標）ミニスピン小規模バイオリアクター（北京華館生物科技有限公司；３Ｄ ｍｉｎｉＳＰＩＮ Ｍ１）上に置き、６０ｒｐｍの一定速度で時計方向に６日間インキュベートした（３日目に６０ｍＬの新鮮な培地を補充）。細胞サンプリングおよび計数を毎日行って、細胞拡大曲線に関するデータを得た。６日目に、細胞培養フラスコから採取した２００万個の細胞を含有する微小組織（すなわち、細胞を含有するマイクロキャリア）を、電気ピペットを用いて５０ｍＬの新鮮な培地に再懸濁し、３Ｄ ＦｌｏＴｒｉｘ（商標） ｖｉｖａＳｐｉｎバイオリアクター（北京華館生物科技有限公司； ３Ｄ ｖｉｖａＳＰＩＮ Ｖ１、図３３）に移し、５０ｍＬの培地に予め再懸濁（０～３０分間放置）した３Ｄ ＴａｂｌｅＴｒｉｘマイクロキャリア（北京華館生物科技有限公司；カタログ番号： Ｆ０１－１００）５０錠（計１ｇ）を加えた。細胞をサンプリングし、毎日カウントして、細胞増殖曲線に関するデータを得、細胞活性も測定した。
３Ｄ ＦｌｏＴｒｉｘ（商標）ｖｉｖａＳｐｉｎバイオリアクターについて設定したプロセスパラメーターは、以下のように制御した：プロセス全体を通して１２ ｃｃｍの５％ ＣＯ２の能動ポンプ輸送、および３７℃。Ｔ＝０時間において８００ｍＬの完全培地を１０ｍＬ／分の速度で能動的にポンプ注入し、５００ｍＬの液体を１０ｍＬ／分の速度で能動的にポンプ注入し、続いてＴ＝９６時間において５００ｍＬの新鮮培地を１０ｍＬ／分の速度でポンプ注入し、５００ｍＬの液体を１０ｍＬ／分の速度で能動的にポンプ注入し、続いてＴ＝１４４時間において１０ｍＬ／分で反応器に能動的にポンプ注入した５００ｍＬの新鮮培地に再懸濁した５０錠の３Ｄ ＴａｂｌｅＴｒｉｘ（商標）マイクロキャリアを能動的にポンプ注入した。Ｔ＝０～１２時間およびＴ＝１４４～１５６時間の撹拌速度は、５分間４０ｒｐｍ、２０分間２０ｒｐｍのサイクルで可変速度、残りの時間は６０ｒｐｍの一定速度であった。
細胞サンプリングおよび計数方法：すべての試料を、３Ｄ ＦｌｏＴｒｉｘ（商標）ｖｉｖａＳｐｉｎバイオリアクターのサンプラーを通してピペットで１ｍＬの試料×３反復で採取し、遠心分離チューブに移し、４００×ｇで２分間遠心分離し、上清をピペットで移した。１ｍＬの溶解液（溶解液処方：０．１％コラゲナーゼ、０．１％エチレンジアミン四酢酸、０．０５％トリプシン；％表示ｇ／１００ｍＬ）を添加し、マイクロキャリアが完全に溶解するまで（その間、細胞を１０分毎に１ｍＬピペットで穏やかに数回吹き付けた）、インキュベーター中で３０分間インキュベートし、１ｍＬの全培地を添加して溶解プロセスを終了させ；２００×ｇで５分間遠心分離し、上清を廃棄し、細胞を懸濁し、細胞計数プレートを通して計数した。
細胞活性アッセイ： ５０μＬの細胞懸濁液を５０μＬの０．２％トリパンブルー染色溶液と混合し、適切な量の細胞を計数のために採取した。自動細胞計数器（例えば、Ｃｏｕｎｔｓｔａｒ（登録商標）上海瑞楚生物科技有限公司）または細胞計数プレートのいずれかを使用することができる。透明な細胞の数および青色に染色された細胞の数を別々に記録し、細胞懸濁液中の細胞の数を、対応する希釈比から外挿した。
細胞活性比（％）＝未染色細胞数／（未染色細胞数＋青染色細胞数）×１００％。
細胞数アッセイの結果を図３２に示す。培養プロセス全体を、３Ｄ ＦｌｏＴｒｉｘ（商標）ミニスピンの細胞培養フラスコ中のＭｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒｓ（商標）１０錠に６日間直接接種した２００万個の細胞から、新たなＭｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒｓ（商標）を添加し、８日間のさらなる培養のために３Ｄ ＦｌｏＴｒｉｘ（商標）ｖｉＳｐｖｉｉｎ自動バイオリアクター中で増殖させて、１億個の細胞の最終収穫に到達させ、そのうちの０日目から６日目までの小規模バイオリアクター中で、６日間の培養の後、最初の２００万個から４９２０万個の細胞が蘇生され、増殖が約２４．６倍に増加した。それらをシードとして使用し、自動バイオリアクターで８日間の培養の後、合計約２５億９千万個の細胞が蘇生され約５２．７倍の増殖、すなわち、１４日間の培養で合計約１，２９５倍の増殖を表した。
細胞活性アッセイの結果を図３４に示す。この結果は細胞活性が培養プロセス全体を通して９０％を超えて維持されたことを示した。全培養方法は１人のみ、０．２５ｍ２未満の空間、１４日間の培養期間、２リットルの培養培地および１１０錠のマイクロキャリアを必要とし、その結果、ヒト、物質および財源の有意な節約をもたらした。
【0087】
ＩＩ． ３Ｄ ＦｌｏＴｒｉｘ（商標）ｖｉｖａＳｐｉｎバイオリアクター（１０００ｍＬ）における連続細胞増殖
１． ３Ｄ ＴａｂｌｅＴｒｉｘ（商標）マイクロキャリア４０錠を、無菌の３Ｄ ＦｌｏＴｒｉｘ（商標）ｖｉｖａＳｐｉｎバイオリアクターに加え、６６０万の脂肪由来ＭＳＣの懸濁液４０ｍＬを無菌作業台で再懸濁した。
２． バイオリアクターを組み立て、プロセスパラメーターを、以下のように制御するように設定した：プロセス全体を通して１０ ｃｃｍの５％ ＣＯ２の能動ポンプ輸送、および３７℃。Ｔ＝０時間において、４６０ｍＬの完全培地を１０ｍＬ／分の速度で能動的にポンプ注入し、続いてＴ＝４８時間において、５００ｍＬの液体を１０ｍＬ／分の速度で能動的にポンプ注入した。その後２４時間毎に、５００ｍＬの液体を１０ｍＬ／分の速度で能動的にポンプ注入し、続いて５００ｍＬの新鮮な培地を１２０時間まで１０ｍＬ／分の速度で反応器に能動的にポンピングした。Ｔ＝１２０時間において５００ｍＬの液体ｎを１０ｍＬ／分で能動的にポンプ注入した後、５００ｍＬの新鮮な培地に再懸濁した３Ｄ ＴａｂｌｅＴｒｉｘ（商標）マイクロキャリアの４０錠を、１０ｍＬ／分の速度で反応器に能動的にポンプ注入した。Ｔ＝０～１２０時間の撹拌速度は６０ｒｐｍの一定速度であり、Ｔ＝１２０～１３６時間の場合、撹拌速度は６０ｒｐｍで５分間、２０ｒｐｍで２０分間のサイクルで可変速度であり、Ｔ＝１３６～２４０時間の場合、撹拌速度は６０ｒｐｍの一定速度であった（２４０時間後、撹拌モードは６０ｒｐｍの一定速度であった）。細胞をサンプリングし、毎日カウントして、細胞増殖曲線に関するデータを得、細胞活性を測定した。
結果を図３５および図３６に示す。結果は脂肪由来ＭＳＣが４０錠のマイクロキャリアに接種した６６０万細胞から３Ｄ ＦｌｏＴｒｉｘ（商標）ｖｉｖａＳｐｉｎバイオリアクター中で２．２４×１０９細胞に拡大し、さらに４０錠のマイクロキャリア（培地に再懸濁）を６日目にポンプで送り、１０日間完全封じ込め培養したところ、約３４０倍の増殖が得られたことを示している。３Ｄ ＦｌｏＴｒｉｘ（商標）ｖｉｖａＳｐｉｎバイオリアクターにおける脂肪由来ＭＳＣの活性は、一貫して９０％を超えて維持された。
１． ３Ｄ ＴａｂｌｅＴｒｉｘ（商標）マイクロキャリア４０錠を、無菌の３Ｄ ＦｌｏＴｒｉｘ（商標）ｖｉｖａＳｐｉｎバイオリアクターに加え、６６０万の脂肪由来ＭＳＣの懸濁液４０ｍＬを無菌作業台で再懸濁した。
２． バイオリアクターを組み立て、プロセスパラメーターを、以下のように制御するように設定した：プロセス全体を通して１０ ｃｃｍの５％ ＣＯ２の能動ポンプ輸送、および３７℃。Ｔ＝０時間において、４６０ｍＬの完全培地を１０ｍＬ／分の速度で能動的にポンプ注入し、続いてＴ＝４８時間において、５００ｍＬの液体を１０ｍＬ／分の速度で能動的にポンプ注入した。その後２４時間毎に、５００ｍＬの液体を１０ｍＬ／分の速度で能動的にポンプ注入し、続いて５００ｍＬの新鮮な培地を１２０時間まで１０ｍＬ／分の速度で反応器に能動的にポンピングした。Ｔ＝１２０時間において５００ｍＬの液体ｎを１０ｍＬ／分で能動的にポンプ注入した後、５００ｍＬの新鮮な培地に再懸濁した３Ｄ ＴａｂｌｅＴｒｉｘ（商標）マイクロキャリアの４０錠を、１０ｍＬ／分の速度で反応器に能動的にポンプ注入した。Ｔ＝０～１２０時間の撹拌速度は６０ｒｐｍの一定速度であり、Ｔ＝１２０～１３６時間の場合、撹拌速度は６０ｒｐｍで５分間、２０ｒｐｍで２０分間のサイクルで可変速度であり、Ｔ＝１３６～２４０時間の場合、撹拌速度は６０ｒｐｍの一定速度であった（２４０時間後、撹拌モードは６０ｒｐｍの一定速度であった）。細胞をサンプリングし、毎日カウントして、細胞増殖曲線に関するデータを得、細胞活性を測定した。
結果を図３５および図３６に示す。結果は脂肪由来ＭＳＣが４０錠のマイクロキャリアに接種した６６０万細胞から３Ｄ ＦｌｏＴｒｉｘ（商標）ｖｉｖａＳｐｉｎバイオリアクター中で２．２４×１０９細胞に拡大し、さらに４０錠のマイクロキャリア（培地に再懸濁）を６日目にポンプで送り、１０日間完全封じ込め培養したところ、約３４０倍の増殖が得られたことを示している。３Ｄ ＦｌｏＴｒｉｘ（商標）ｖｉｖａＳｐｉｎバイオリアクターにおける脂肪由来ＭＳＣの活性は、一貫して９０％を超えて維持された。
【0088】
ＩＩＩ． フローサイトメトリー分析を用いた二次元フラスコおよび三次元マイクロキャリア中で培養されたＭＳＣの部分的特性化
工程１および２で培養した微小組織を、特許出願「三次元マイクロキャリア上の細胞を採取する方法」（中国特許出願番号２０１９１０１０１７３６．０）に従って細胞懸濁液から採取し、２００×ｇで５分間遠心分離し、上清を廃棄し、そして９つの遠心分離チューブに均等に分け、それらをＰＥ－ＣＤ１９（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社、米国、カタログ番号：３０２２０７）、ＡＰＣ－ＣＤ１４（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社、米国、カタログ番号：３０１８０３）、ＦＩＴＣ－ＣＤ３４（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社、米国、カタログ番号：３４３５０３）、ＡＰＣ－ＣＤ４５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社、米国、カタログ番号：３６８５１１）、ＦＩＴＣ－ＨＬＡＤＲ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社、米国、カタログ番号：３０７６０３）、ＦＩＴＣ－ＣＤ９０（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社、米国、カタログ番号：３２８１０７）、ＦＩＴＣ－ＣＤ１０５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社、米国、カタログ番号：８００５０５）、およびＦＩＴＣ－ＣＤ７３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社、米国、カタログ番号：３４４０１５）の蛍光標識抗体で染色し、陰性対照としてブランク緩衝液を用いた。４℃の冷凍機で０．５時間インキュベートした後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳに再懸濁し、フローチューブに移した。染色した細胞を、ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩフローサイトメトリーソーターを用いてフローサイトメトリーにかけ、ＭＳＣ特徴的表面マーカーの発現比を、細胞分類分析のための機器によって報告した。
工程１および２で培養した微小組織を、特許出願「三次元マイクロキャリア上の細胞を採取する方法」（中国特許出願番号２０１９１０１０１７３６．０）に従って細胞懸濁液から採取し、２００×ｇで５分間遠心分離し、上清を廃棄し、そして９つの遠心分離チューブに均等に分け、それらをＰＥ－ＣＤ１９（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社、米国、カタログ番号：３０２２０７）、ＡＰＣ－ＣＤ１４（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社、米国、カタログ番号：３０１８０３）、ＦＩＴＣ－ＣＤ３４（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社、米国、カタログ番号：３４３５０３）、ＡＰＣ－ＣＤ４５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社、米国、カタログ番号：３６８５１１）、ＦＩＴＣ－ＨＬＡＤＲ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社、米国、カタログ番号：３０７６０３）、ＦＩＴＣ－ＣＤ９０（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社、米国、カタログ番号：３２８１０７）、ＦＩＴＣ－ＣＤ１０５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社、米国、カタログ番号：８００５０５）、およびＦＩＴＣ－ＣＤ７３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社、米国、カタログ番号：３４４０１５）の蛍光標識抗体で染色し、陰性対照としてブランク緩衝液を用いた。４℃の冷凍機で０．５時間インキュベートした後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳに再懸濁し、フローチューブに移した。染色した細胞を、ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩフローサイトメトリーソーターを用いてフローサイトメトリーにかけ、ＭＳＣ特徴的表面マーカーの発現比を、細胞分類分析のための機器によって報告した。
【0089】
【表3】
【0090】
データは、三次元マイクロキャリア上で大規模に培養されたＭＳＣが、従来の二次元で培養されたものと同様の発現プロファイルを有し、両者とも認定基準を満たすことを示した。
上記のデータはＭＳＣの大規模培養のための三次元マイクロキャリアの使用が実現可能であり、費用効果があり、高度のプロセス制御および最小限の空間占有で閉鎖系において実施され得ることを示唆した。
上記のデータはＭＳＣの大規模培養のための三次元マイクロキャリアの使用が実現可能であり、費用効果があり、高度のプロセス制御および最小限の空間占有で閉鎖系において実施され得ることを示唆した。
【産業上の利用可能性】
【0091】
本発明は、三次元マイクロキャリアに基づく細胞蘇生方法、三次元マイクロキャリア細胞培養に基づくｉｎ ｓｉｔｕ継代方法、細胞の大規模増殖のための三次元マイクロキャリアに基づく方法、三次元マイクロキャリアに基づくｉｎ ｓｉｔｕ細胞凍結保存方法、三次元マイクロキャリア上での細胞付着培養方法、三次元マイクロキャリア上で細胞を採取する方法、およびマイクロキャリア上で培養された細胞をサンプリングする方法を含む、三次元マイクロキャリアに基づく細胞培養方法のセットを提供する。
【0092】
本発明によって提供される三次元マイクロキャリアに基づく細胞蘇生方法は、基材として三次元マイクロキャリアを使用し、これは、新たなキャリア上への直接的に蘇生された細胞または微小組織の接種を可能にし（マイクロキャリア蘇生方法）、次いで、マイクロキャリア上での細胞付着、接着および成長のプロセスを完了することができ、細胞を新たな培養基材上に接種する前に、まず完全に成長させ、収穫するために二次元基材に細胞を回収する必要があるという複雑な操作を回避する。マイクロキャリアは高い弾性を有し、それらは動的インキュベーションの間に、壊れやすく、新たに蘇生された細胞とマイクロキャリアとの衝突によって引き起こされる刺激を緩衝し、より穏やかであり、そして多孔質マイクロキャリアは壁付着のためのより多くの空間を提供するより大きな比表面積を有する。多孔質構造はまた、脆い細胞が、流動媒体の剪断力の影響を受けにくい細孔に埋め込まれることを可能にする。この方法は三次元培養プロセスを中断することなく細胞継代を行うことを可能にし、それにより、三次元培養細胞産物または組織工学産物の調製の間中、細胞を三次元状態に維持し、細胞蘇生の分野におけるいくらかの革新または補完または経験を提供する目的で、完全に封入された細胞培養および連続的な増殖を可能にする。三次元マイクロキャリアに基づく細胞蘇生方法の利点：（１）蘇生された細胞が三次元で再培養される場合に、プロセスを合理化すること、この方法は三次元培養のためにマイクロキャリアに接種する前に継代および消化された二次元培養基質に細胞がフルサイズに成長した後の単一細胞蘇生および凍結保存からのプロセスに必要とされる煩わしいプロセスおよび試薬消耗品を排除し、これは時間およびコストを大幅に節約することができる；（２）得られた細胞がインビボ細胞に近く、細胞の培養およびその後の再培養のための凍結保存および蘇生はインビボ三次元環境と同様に維持され、したがって、得られた細胞は生理学および機能の点でインビボ細胞に近い。
【0093】
本発明により提供される三次元マイクロキャリア細胞培養に基づくｉｎ ｓｉｔｕ継代方法は培養されたマイクロキャリア（すなわち、シードマイクロキャリア）を新しいマイクロキャリアに接種して「ｉｎ ｓｉｔｕ継代」を達成する。細胞は三次元マイクロキャリア上に付着、広がり、増殖、および移動することができ、次いで、シードマイクロキャリア上の細胞を脱落させることにより新しいマイクロキャリアに付着し、次いで、増殖し、新しいマイクロキャリア上で成長するか、または新しいマイクロキャリアとシードマイクロキャリアとが接触し、シードマイクロキャリア上の細胞が移動し、その結果、シードマイクロキャリア上の細胞は増殖し、成長し続けるために新しいマイクロキャリアに移され、これを賢明に利用して、三次元マイクロキャリア上の細胞の「ｉｎ ｓｉｔｕ継代」を達成する。三次元マイクロキャリア細胞培養に基づくｉｎ ｓｉｔｕ継代方法の利点：（１）それは従来の二次元細胞消化および継代を回避し、これは消化溶液による細胞への損傷を減少させるだけでなく、消化および継代の退屈な操作方法も排除し、したがって、大規模な培養拡大におけるかなりの労力および資源を節約し、高品質の細胞を得る；（２）それは時間節約であり、細胞を消化し、それらに接種するのに時間がかかるが、継代方法は時間を節約する；（３）ｉｎ ｓｉｔｕ継代の選択が消化溶液などの試薬および消耗品の必要性を排除し、方法を合理化し、コストを低減する。
【0094】
本発明によって提供される三次元マイクロキャリアに基づくｉｎ ｓｉｔｕ細胞凍結保存方法は、細胞をマイクロキャリアから分離し、次いでそれらを凍結保存する必要なしに、しかし細胞を三次元マイクロキャリア上でｉｎ ｓｉｔｕで直接保存することを可能にする三次元マイクロキャリア上での細胞培養物のｉｎ ｓｉｔｕ凍結保存を可能にし、する。この方法はマイクロキャリアが凍結保存（－２０～－１９６℃液体窒素保存まで）および蘇生（すなわち、液体窒素または－８０℃からの加温および解凍）の間に破壊または変形されず、一方、細胞は三次元マイクロキャリアに付着したままであり、したがって、三次元培養細胞産物または組織工学産物の調製の全体にわたって細胞を三次元状態に維持し、使用者による拡張三次元細胞産物の貯蔵、輸送および蘇生を容易にするので、三次元培養プロセスを中断することなく、細胞の凍結保存を可能にする。この方法は、蘇生後に生存率が高く、細胞特性が変化していない三次元マイクロキャリア上で培養された細胞の長期保存に適している。
【0095】
本発明によって提供される三次元マイクロキャリア上での細胞付着培養の方法は、三次元マイクロキャリアが細胞懸濁液を使用して直接膨潤される高密度で、低容量の方法を使用する。細胞懸濁液は乾燥した三次元マイクロキャリアに添加した直後にマイクロキャリアに吸収され、接種時にマイクロキャリアの細孔内に細胞を直接引き込むことを容易にし、マイクロキャリアの細孔内に細胞を分散させ、その後、再成長のために付着させ、細胞により多くの成長領域を提供し、他方で、マイクロキャリアを前もって膨潤させる必要がある工程を節約し、したがって、マイクロキャリア内に細胞を接種する操作を単純化する。培養物の無菌操作はより容易であり、汚染の危険性は回避される。この方法は大規模なバイオリアクター培養に適しており、三次元マイクロキャリアの独特の膨潤－吸収特性は多数の細胞が担体の接続された開口部の内側に入ることを可能にし、バイオニック三次元成長パターンをより良好に形成し、そしてインビトロ細胞培養の間の機能を促進する。
【0096】
本発明によって提供される、三次元マイクロキャリア上の細胞を採取する方法は、三次元マイクロキャリア上の細胞を採取することを対象とする。細胞が三次元マイクロキャリア上で培養されるにつれて、本発明はその後の適用のためのキャリア上での細胞の穏やかな採取を可能にし；本発明が溶解のためのマイクロキャリアを標的にし、これは固体から液体状態にマイクロキャリアを溶解し、それによって、キャリア上の細胞を溶液に放出し、これは遠心分離の手段によって細胞から分離され、したがって、細胞を得る。本発明の溶解液はマイクロキャリアのために設計され、マイクロキャリアの組成に合わせることができ；溶解液はマイクロキャリアを溶解し、したがって、細胞上で穏やかであり、細胞活性を維持し、細胞自身によって分泌されたタンパク質を保持する。
【0097】
本発明によって提供されるマイクロキャリア上で培養された細胞をサンプリングするための方法を、従来の懸濁液定量サンプリング方法と比較すると、本発明によって提供される定量マイクロキャリアサンプリング方法を使用してマイクロキャリア培養システムにおいて計数される細胞の３つのサンプルは、再現性があり（小さな変動）、実際の合計に非常に近い。
本発明によって提供される細胞の大規模増殖のための三次元マイクロキャリアに基づく方法は三次元マイクロキャリアを使用するＭＳＣの大規模培養を実現でき、費用効果があり、より高度のプロセス制御および最小の空間占有で閉鎖系において実施され得ることを実証する。これは、細胞を産生するコストおよび時間を減少させ、細胞治療生成物が臨床使用のために大規模に調製されることを可能にする。
本発明は、細胞、特に幹細胞の三次元培養に非常に重要である。
本発明によって提供される細胞の大規模増殖のための三次元マイクロキャリアに基づく方法は三次元マイクロキャリアを使用するＭＳＣの大規模培養を実現でき、費用効果があり、より高度のプロセス制御および最小の空間占有で閉鎖系において実施され得ることを実証する。これは、細胞を産生するコストおよび時間を減少させ、細胞治療生成物が臨床使用のために大規模に調製されることを可能にする。
本発明は、細胞、特に幹細胞の三次元培養に非常に重要である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34】
【図35】
【図36】
【国際調査報告】