特表 2022-523200 活性化可能な免疫チェックポイント阻害剤とコンジュゲートされた活性化可能な抗体の組み合わせ療法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-04-21

(54)【発明の名称】活性化可能な免疫チェックポイント阻害剤とコンジュゲートされた活性化可能な抗体の組み合わせ療法

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/395 20060101AFI20220414BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20220414BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20220414BHJP

   A61K 38/05 20060101ALI20220414BHJP

   A61K 31/407 20060101ALI20220414BHJP

   A61K 31/5365 20060101ALI20220414BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20220414BHJP

【ＦＩ】

A61K39/395 U

A61P35/00

A61K39/395 T

A61P37/04

A61K39/395 L

A61K38/05

A61K31/407

A61K31/5365

A61K47/68 ZNA

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021549538

(86)(22)【出願日】2020-02-26

(85)【翻訳文提出日】2021-10-12

(86)【国際出願番号】 US2020019978

(87)【国際公開番号】W WO2020176672

(87)【国際公開日】2020-09-03

(31)【優先権主張番号】62/825,228

(32)【優先日】2019-03-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/810,698

(32)【優先日】2019-02-26

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】520011599

【氏名又は名称】シートムエックス セラピューティクス，インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100114775

【弁理士】

【氏名又は名称】高岡 亮一

(74)【代理人】

【識別番号】100121511

【弁理士】

【氏名又は名称】小田 直

(74)【代理人】

【識別番号】100202751

【弁理士】

【氏名又は名称】岩堀 明代

(74)【代理人】

【識別番号】100208580

【弁理士】

【氏名又は名称】三好 玲奈

(74)【代理人】

【識別番号】100191086

【弁理士】

【氏名又は名称】高橋 香元

(72)【発明者】

【氏名】ル スコラン，エルワン

(72)【発明者】

【氏名】チェ，ティファニー

(72)【発明者】

【氏名】クリム，マイケル，エー．

(72)【発明者】

【氏名】ガーナー，ウィル

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

4C085

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C076AA95

4C076BB11

4C076CC27

4C076EE41

4C076EE59

4C076FF67

4C076FF68

4C084AA02

4C084AA03

4C084BA01

4C084BA14

4C084DA27

4C084NA05

4C084NA13

4C084NA14

4C084ZB02

4C084ZB05

4C084ZB09

4C084ZB26

4C084ZC75

4C085AA14

4C085AA26

4C085AA27

4C085BB01

4C085BB11

4C085BB17

4C085BB18

4C085CC21

4C085DD62

4C085EE01

4C085GG01

4C086AA01

4C086AA02

4C086CB03

4C086CB22

4C086MA03

4C086MA05

4C086MA66

4C086NA05

4C086NA13

4C086NA14

4C086ZB02

4C086ZB05

4C086ZB09

4C086ZB26

4C086ZC75

(57)【要約】

活性化されたときにＣＤ１６６に特異的に結合するコンジュゲートされた活性化可能な抗ＣＤ１６６抗体と活性化可能な免疫チェックポイント阻害剤を組み合わせる治療法に関連する組成物及び方法が、本明細書で提供される。活性化されたときに、哺乳動物ＰＤ－１又は哺乳動物ＰＤ－Ｌ１である免疫チェックポイントに特異的に結合する、活性化可能な抗免疫チェックポイント抗体とコンジュゲートされた活性化可能な抗体を組み合わせる治療法に関連する組成物及び方法も、本明細書で提供される。
【選択図】図１Ａ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

対象において癌を治療する、癌の症状を緩和する、又は癌の進行を遅らせる方法であって、
（ａ）コンジュゲートされた活性化可能な抗ＣＤ１６６抗体を前記対象に投与すること；及び
（ｂ）活性化可能な免疫チェックポイント阻害剤を前記対象に投与すること、
を含み、
前記コンジュゲートされた活性化可能な抗ＣＤ１６６抗体が、
（ｉ）前記哺乳動物ＣＤ１６６に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片（ＡＢ１）と、前記活性化可能な抗ＣＤ１６６抗体が非切断状態にあるときに前記哺乳動物ＣＤ１６６への前記ＡＢ１の結合を阻害するマスキング部分（ＭＭ１）と、前記ＡＢ１に共役された切断可能な部分（ＣＭ１）であって、プロテアーゼの基質として機能するポリペプチドである、ＣＭ１を含む活性化可能な抗ＣＤ１６６抗体、かつ
（ｉｉ）前記活性化可能な抗ＣＤ１６６抗体にコンジュゲートされた毒素又はその毒素断片
を含む、方法。

【請求項2】

前記ＡＢ１が、ＶＨ ＣＤＲ１アミノ酸配列ＧＦＳＬＳＴＹＧＭＧＶＧ（配列番号１）；ＶＨ ＣＤＲ２アミノ酸配列ＮＩＷＷＳＥＤＫＨ（配列番号２）；ＶＨ ＣＤＲ３アミノ酸配列ＩＤＹＧＮＤＹＡＦＴＹ（配列番号３）；ＶＬ ＣＤＲ１アミノ酸配列ＲＳＳＫＳＬＬＨＳＮＧＩＴＹＬＹ（配列番号４）又はＲＳＳＱＳＬＬＨＳＮＧＩＴＹＬＹ（配列番号５）；ＶＬ ＣＤＲ２アミノ酸配列ＱＭＳＮＬＡＳ（配列番号６）又はＱＭＳＮＲＡＳ（配列番号７）；及びＶＬ ＣＤＲ３アミノ酸配列ＡＱＮＬＥＬＰＹＴ（配列番号８）を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記免疫チェックポイントが、Ａ２ＡＲ、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７－Ｈ４、ＢＴＬＡ（ＣＤ２７２）、ＣＳＦ－１Ｒ、ＣＴＬＡ－４、ＩＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＮＯＸ２、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＴＤＯ、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ－３、ＳＩＧＬＥＣ７（ＣＤ３２８）、及びＶＩＳＴＡからなる群から選択される、請求項１又は請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記免疫チェックポイントが、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、及びＰＤ－Ｌ１からなる群から選択される、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記免疫チェックポイント阻害剤が、前記免疫チェックポイントに特異的に結合する抗体である、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記活性化可能な免疫チェックポイント阻害剤が、
前記免疫チェックポイントに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片（ＡＢ２）と、前記活性化可能な抗免疫チェックポイント抗体が非切断状態にあるときに前記免疫チェックポイントへの前記ＡＢ２の結合を阻害するマスキング部分（ＭＭ２）と、ＡＢ２に共役された切断可能部分（ＣＭ２）であって、プロテアーゼの基質として機能するポリペプチドである、ＣＭ２
を含む活性化可能な抗免疫チェックポイント抗体である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記ＭＭ１が、４０個以下のアミノ酸長のポリペプチドである、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記ＡＢ１が、ヒト又はカニクイザルのＣＤ１６６に特異的に結合する、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記ＭＭ１ポリペプチド配列が、前記ＡＢ１の任意の天然結合パートナーと５０％以下同一である、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記ＭＭ１が、アミノ酸配列ＬＣＨＰＡＶＬＳＡＷＥＳＣＳＳ（配列番号１９）を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記ＣＭ１が、アミノ酸配列ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号２０）を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

前記ＡＢ１のその抗原結合断片が、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、ｓｃＦｖ、ｓｃＡｂ、ｄＡｂ、単一ドメイン重鎖抗体、及び単一ドメイン軽鎖抗体からなる群から選択される、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

前記ＡＢ１が、前記ＣＭ１に連結される、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

前記ＡＢ１が、前記ＣＭ１に直接連結される、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

前記ＡＢ１が、連結ペプチドを介して前記ＣＭ１に連結される、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

前記ＭＭ１が、非切断状態の前記活性化可能な抗体が以下のようにＮ末端からＣ末端への構造的配置：ＭＭ１－ＣＭ１－ＡＢ１又はＡＢ１－ＣＭ１－ＭＭ１を含むように前記ＣＭ１に連結される、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

前記活性化可能な抗体が、前記ＭＭ１と前記ＣＭ１の間に連結ペプチドを含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

前記活性化可能な抗体が、前記ＣＭ１と前記ＡＢ１の間に連結ペプチドを含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

前記活性化可能な抗体が、第１の連結ペプチド（ＬＰ１）及び第２の連結ペプチド（ＬＰ２）を含み、かつ非切断状態で前記活性化可能な抗体が、以下のようにＮ末端からＣ末端への構造的配置：ＭＭ１－ＬＰ１－ＣＭ１－ＬＰ２－ＡＢ１又はＡＢ１－ＬＰ２－ＣＭ１－ＬＰ１－ＭＭ１を有する、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

前記２つの連結ペプチドが、互いに同一ではない、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

ＬＰ１及びＬＰ２の各々が、約１～２０個のアミノ酸長のペプチドである、請求項１９又は請求項２０に記載の方法。

【請求項22】

前記活性化可能な抗ＣＤ１６６抗体が、アミノ酸配列の配列番号１２を含む重鎖可変領域とアミノ酸配列の配列番号１７又は配列番号１８を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項23】

前記活性化可能な抗ＣＤ１６６抗体が、配列番号９及び配列番号１０から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖と配列番号１５及び配列番号１６から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項24】

前記薬剤が、毒素又はその毒素断片である、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項25】

前記薬剤が、微小管阻害剤である、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項26】

前記薬剤が、核酸損傷剤である、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項27】

前記薬剤が、ドラスタチン又はその誘導体、オーリスタチン又はその誘導体、メイタンシノイド又はその誘導体、デュオカルマイシン又はその誘導体、カリケアマイシン又はその誘導体、ピロロベンゾジアゼピン又はその誘導体、及びビンカアルカロイド又はその誘導体からなる群から選択される、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項28】

前記薬剤が、オーリスタチンＥ又はその誘導体である、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項29】

前記薬剤が、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）である、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項30】

前記薬剤が、モノメチルオーリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）である、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項31】

前記薬剤が、ＤＭ１及びＤＭ４からなる群から選択されるメイタンシノイドである、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項32】

前記薬剤が、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、ビンカミノール、ビネリジン、ビンブルニン、ビンポセチン、ビンカミン、アポビンカミン、ミノビンシン、メトキシミノビンシン、ミノビンシニン、ビンカディフォルミン、デスオキシビンカミノール、及びビンカマジンからなる群から選択されるビンカアルカロイドである、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項33】

前記薬剤が、デュオカルマイシンである、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項34】

前記薬剤が、リンカーを介して前記ＡＢ１にコンジュゲートされる、請求項１～３３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項35】

それにより前記薬剤がＡＢ１にコンジュゲートされるリンカーが、ＳＰＤＢ部分、バリン－シトルリン部分、又はＰＥＧ２－ｖｃ部分を含む、請求項３４に記載の方法。

【請求項36】

前記ＡＢにコンジュゲートされるリンカー及び毒素が、ＳＰＤＢ－ＤＭ４部分、ｖｃ－ＭＭＡＤ部分、ｖｃ－ＭＭＡＥ部分、ｖｃ－デュオカルマイシン部分、又はＰＥＧ２－ｖｃ－ＭＭＡＤ部分を含む、請求項３４又は請求項３５に記載の方法。

【請求項37】

前記リンカーが、切断可能なリンカーである、請求項３４～３６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項38】

前記リンカーが、切断可能でないリンカーである、請求項３４～３６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項39】

前記コンジュゲートされた活性化可能な抗ＣＤ１６６抗体が、前記活性化可能な免疫チェックポイント阻害剤の投与前、投与後、又は投与と同時に投与される、請求項１～３８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項40】

前記コンジュゲートされた活性化可能な抗ＣＤ１６６抗体が、前記活性化可能な免疫チェックポイント阻害剤の投与と同時に投与され、前記同時投与が、単一の組成物中又は別々の組成物中である、請求項３９に記載の方法。

【請求項41】

前記コンジュゲートされた活性化可能な抗ＣＤ１６６抗体が、前記活性化可能な免疫チェックポイント阻害剤の投与の約１日前に投与される、請求項４０に記載の方法。

【請求項42】

前記コンジュゲートされた活性化可能な抗ＣＤ１６６抗体の投与及び前記活性化可能な免疫チェックポイント阻害剤の投与が、同じ投与スケジュールの一部として投与される、請求項１～４１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項43】

前記コンジュゲートされた活性化可能な抗ＣＤ１６６抗体が、前記対象に静脈内、腹腔内、又は口腔内投与される、請求項１～４２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項44】

前記活性化可能な免疫チェックポイント阻害剤が、前記対象に静脈内、腹腔内、又は口腔内投与される、請求項１～４３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項45】

前記コンジュゲートされた活性化可能なト抗ＣＤ１６６抗体が、注入療法によって前記対象に投与される、請求項１～４４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項46】

前記活性化可能な免疫チェックポイント阻害剤が、注入療法によって前記対象に投与される、請求項１～４５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項47】

前記対象への前記コンジュゲートされた活性化可能な抗ＣＤ１６６抗体の投与が、前記対象の標的組織における免疫原性細胞死を誘導することを含む、請求項１～４６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項48】

前記対象への前記コンジュゲートされた活性化可能な抗ＣＤ１６６抗体の投与が、前記対象における樹状細胞成熟及び／又は活性化を誘導することを含む、請求項１～４７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項49】

前記コンジュゲートされた活性化可能な抗ＣＤ１６６抗体が、治療量以下の用量で前記対象に投与される、請求項１～４８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項50】

前記活性化可能な免疫チェックポイント阻害剤が、治療量以下の用量で前記対象に投与される、請求項１～４８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項51】

前記コンジュゲートされた活性化可能な抗ＣＤ１６６抗体及び前記活性化可能な免疫チェックポイント阻害剤が、治療量以下の用量で前記対象に投与される、請求項１～４８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項52】

前記コンジュゲートされた活性化可能な抗ＣＤ１６６抗体が、治療有効量で前記対象に投与される、請求項１～４８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項53】

前記活性化可能な免疫チェックポイント阻害剤が、治療有効量で前記対象に投与される、請求項１～４８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項54】

前記活性化可能な免疫チェックポイント阻害剤及び前記活性化可能な免疫チェックポイント阻害剤が、治療有効量で投与される、請求項１～４８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項55】

前記活性化可能な免疫チェックポイント阻害剤が、前記活性化可能な免疫チェックポイント阻害剤が投与される用量よりも多い用量で投与される、請求項１～５４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項56】

前記活性化可能な免疫チェックポイント阻害剤が、前記活性化可能な免疫チェックポイント阻害剤が投与される用量よりも少ない用量で投与される、請求項１～５４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項57】

前記活性化可能な免疫チェックポイント阻害剤が、前記活性化可能な免疫チェックポイント阻害剤が投与される用量と同じ用量で投与される、請求項１～５４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項58】

前記治療される対象が、腫瘍再負荷アッセイにおいて記憶Ｔ細胞応答を示す、請求項１～５７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項59】

前記治療される対象からのＣＤ８＋Ｔ細胞が、腫瘍再負荷アッセイでＩＦＮ－ガンマ生成を示す、請求項１～５８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項60】

前記治療される対象からのＣＤ４＋Ｔ細胞が、ＩＦＮ－ガンマ、ＩＬ－２、及び／又はＴＮＦ－アルファの生成を示す、請求項１～５９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項61】

前記ＣＤ４＋Ｔ細胞が、前記対象の腫瘍に由来する、請求項６０に記載の方法

【請求項62】

前記治療される対象からのＣＤ８＋Ｔ細胞が、ＩＦＮ－γ及び／又はＴＮＦ－α生成を示す、請求項１～６１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項63】

前記ＣＤ８＋Ｔ細胞が、前記対象の腫瘍に由来する、請求項６２に記載の方法。

【請求項64】

前記免疫チェックポイントが、哺乳動物ＰＤ－１である、請求項１～６３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項65】

前記ＡＢ２が、ヒト又はカニクイザルのＰＤ－１に特異的に結合する、請求項６４に記載の方法。

【請求項66】

前記活性化可能な免疫チェックポイント阻害剤が、
哺乳動物ＰＤ－１に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片（ＡＢ２）と、活性化可能な抗哺乳動物ＰＤ－１抗体が非切断状態にあるときに前記哺乳動物ＰＤ－１へのＡＢ２の結合を阻害するマスキング部分（ＭＭ２）と、ＡＢ２に共役された切断可能部分（ＣＭ２）であって、プロテアーゼの基質として機能するポリペプチドである、ＣＭ２
を含む活性化可能な抗哺乳動物ＰＤ－１抗体である、請求項６４又は請求項６５に記載の方法。

【請求項67】

前記ＡＢ２が、ＶＨ ＣＤＲ１アミノ酸配列ＧＦＴＦＳＧＹＡＭＳ（配列番号５１）；ＹＩＳＮＳＧＧＮＡＨ（配列番号５２）を含むＶＨ ＣＤＲ２配列、ＥＤＹＧＴＳＰＦＶＹ（配列番号５３）を含むＶＨ ＣＤＲ３配列、ＲＡＳＥＳＶＤＡＹＧＩＳＦＭＮ（配列番号５４）を含むＶＬ ＣＤＲ１配列、ＡＡＳＮＱＧＳ（配列番号５５）を含むＶＬ ＣＤＲ２配列、及びＱＱＳＫＤＶＰＷＴ（配列番号５６）を含むＶＬ ＣＤＲ３配列を含む、請求項６４～６６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項68】

前記ＭＭ２が、アミノ酸配列ＴＳＹＣＳＩＥＨＹＰＣＮＴＨＨ（配列番号６６）を含む、請求項６４～６７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項69】

前記活性化可能な免疫チェックポイント阻害剤が、アミノ酸配列の配列番号６０を含む重鎖可変領域及びアミノ酸配列の配列番号６４又は配列番号６５を含む軽鎖可変領域を含む活性化可能な抗免疫チェックポイント抗体である、請求項６４～６８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項70】

前記活性化可能な免疫チェックポイント阻害剤が、アミノ酸配列の配列番号５７又は配列番号５８を含む重鎖及びアミノ酸配列の配列番号６２又は配列番号６３を含む軽鎖を含む活性化可能な抗免疫チェックポイント抗体である、請求項６４～６９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項71】

前記免疫チェックポイントが、哺乳動物ＰＤ－Ｌ１である、請求項１～６３のいずれか一項に記載の方法

【請求項72】

前記ＡＢ２が、ヒト又はカニクイザルのＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する、請求項７１に記載の方法。

【請求項73】

前記活性化可能な抗哺乳動物ＰＤ－Ｌ１抗体が、
哺乳動物ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片（ＡＢ２）と、前記活性化可能な哺乳動物ＰＤ－１抗体が非切断状態にあるときに前記哺乳動物ＰＤ－Ｌ１への前記ＡＢ２の結合を阻害するマスキング部分（ＭＭ２）と、ＡＢ２に共役された切断可能な部分（ＣＭ２）であって、プロテアーゼの基質として機能するポリペプチドである、ＣＭ２を含む、請求項７１又は請求項７２に記載の方法。

【請求項74】

前記ＡＢ２が、ＶＨ ＣＤＲ１アミノ酸配列ＳＹＡＭＳ（配列番号６８）；ＳＳＩＷＲＮＧＩＶＴＶＹＡＤＳ（配列番号６９）を含むＶＨ ＣＤＲ２配列；ＷＳＡＡＦＤＹ（配列番号７０）を含むＶＨ ＣＤＲ３配列；ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ（配列番号７１）を含むＶＬ ＣＤＲ１配列；ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号７２）又はＹＡＳＴＬＱＳ（配列番号８６）を含むＶＬ ＣＤＲ２配列；及びＤＮＧＹＰＳＴ（配列番号７３）を含むＶＬ ＣＤＲ３配列を含む、請求項７１～７３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項75】

前記ＭＭ２が、アミノ酸配列ＧＩＡＬＣＰＳＨＦＣＱＬＰＱＴ（配列番号８３）を含む、請求項７１～７４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項76】

前記活性化可能な抗免疫チェックポイント阻害剤抗体が、アミノ酸配列の配列番号７７を含む重鎖可変領域及びアミノ酸配列の配列番号８１又は配列番号８２を含む軽鎖可変領域を含む、請求項７１～７５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項77】

前記活性化可能な抗チェックポイント阻害剤抗体が、アミノ酸配列の配列番号７４又は配列番号７５を含む重鎖及びアミノ酸配列の配列番号７９又は配列番号８０を含む軽鎖を含む、請求項７１～７６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項78】

前記ＭＭ２が、４０個以下のアミノ酸長のポリペプチドである、請求項６４～７７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項79】

前記ＭＭ２ポリペプチド配列が、ＡＢ２の任意の天然結合パートナーと５０％以下同一である、請求項６４～７８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項80】

前記ＣＭ２が、アミノ酸配列ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＮＰ（配列番号６７）又はＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号８５）を含む、請求項６４～７９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項81】

ＡＢ２のその抗原結合断片が、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、ｓｃＦｖ、ｓｃＡｂ、ｄＡｂ、単一ドメイン重鎖抗体、及び単一ドメイン軽鎖抗体からなる群から選択される、請求項６４～８０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項82】

前記ＡＢ２が、前記ＣＭ２に連結される、請求項６４～８１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項83】

前記ＡＢ２が、前記ＣＭ２に直接連結される、請求項６４～８２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項84】

前記ＡＢ２が、連結ペプチドを介して前記ＣＭ２に連結される、請求項６４～８３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項85】

前記ＭＭ２が、非切断状態で前記活性化可能な抗体が以下のようにＮ末端からＣ末端への構造的配置：ＭＭ２－ＣＭ２－ＡＢ２又はＡＢ２－ＣＭ２－ＭＭ２を含むように前記ＣＭ２に連結される、請求項６４～８４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項86】

前記活性化可能な抗体が、前記ＭＭ２と前記ＣＭ２の間に連結ペプチドを含む、請求項６４～８５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項87】

前記活性化可能な抗体が、前記ＣＭ２と前記ＡＢ２の間に連結ペプチドを含む、請求項６４～８６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項88】

前記活性化可能な抗体が、第１の連結ペプチド（ＬＰ３）及び第２の連結ペプチド（ＬＰ４）を含み、かつ非切断状態で前記活性化可能な抗体が以下のようにＮ末端からＣ末端への構造的配置：ＭＭ２－ＬＰ３－ＣＭ２－ＬＰ４－ＡＢ２又はＡＢ２－ＬＰ３－ＣＭ２－ＬＰ４－ＭＭ２を有する、請求項６４～８７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項89】

前記２つの連結ペプチドが、互いに同一ではない、請求項８８に記載の方法。

【請求項90】

ＬＰ３及びＬＰ４の各々が、約１～２０個のアミノ酸長のペプチドである、請求項８８又は請求項８９に記載の方法。

【請求項91】

ＬＰ３及びＬＰ３が、配列番号２１～３８及びＧＧＳからなる群から選択される、請求項８８～９０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項92】

ＬＰ３が、ＧＧＧＳＳＧＧＳ（配列番号２１）でありかつＬＰ４が、ＧＧＧＳ（配列番号３６）である、請求項９１に記載の方法。

【請求項93】

ＬＰ３が、ＧＧＧＳＳＧＧＳ（配列番号２１）でありかつＬＰ４が、ＧＧＳである、請求項９１に記載の方法。

【請求項94】

対象において癌を治療する、癌の症状を緩和する、又は癌の進行を遅らせる方法であって、
（ａ）活性化可能な抗免疫チェックポイント抗体を前記対象に投与すること；及び
（ｂ）コンジュゲートされた活性化可能な抗体を前記対象に投与すること、を含み、
前記活性化可能な抗免疫チェックポイント抗体が、
哺乳動物免疫チェックポイントに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片（ＡＢ２）と、前記活性化可能な抗免疫チェックポイント抗体が非切断状態にあるときに前記哺乳動物免疫チェックポイント阻害剤への前記ＡＢ２の結合を阻害するマスキング部分（ＭＭ２）と、前記ＡＢ２と共役した切断可能な部分（ＣＭ２）であって、プロテアーゼの基質として機能するポリペプチドである、ＣＭ２を含む活性化可能な抗体
を含み、かつ
前記免疫チェックポイントが、哺乳動物ＰＤ－Ｌ１又は哺乳動物ＰＤ－１である、方法。

【請求項95】

前記ＡＢ２が、ヒト又はカニクイザルのＰＤ－１に特異的に結合する、請求項９４に記載の方法。

【請求項96】

前記ＡＢ２が、ＶＨ ＣＤＲ１アミノ酸配列ＧＦＴＦＳＧＹＡＭＳ（配列番号５１）；ＹＩＳＮＳＧＧＮＡＨ（配列番号５２）を含むＶＨ ＣＤＲ２配列；ＥＤＹＧＴＳＰＦＶＹ（配列番号５３）を含むＶＨ ＣＤＲ３配列；ＲＡＳＥＳＶＤＡＹＧＩＳＦＭＮ（配列番号：５４）を含むＶＬ ＣＤＲ１配列；ＡＡＳＮＱＧＳ（配列番号５５）を含むＶＬ ＣＤＲ２配列；かつＱＱＳＫＤＶＰＷＴ（配列番号５６）を含むＶＬ ＣＤＲ３配列を含む、請求項９４又は請求項９５に記載の方法。

【請求項97】

前記ＭＭ２が、アミノ酸配列ＴＳＹＣＳＩＥＨＹＰＣＮＴＨＨ（配列番号６６）を含む、請求項９４～９６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項98】

前記ＣＭ２が、アミノ酸配列ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＮＰ（配列番号６７）又はＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号８５）を含む、請求項９４～９７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項99】

前記活性化可能な抗チェックポイント抗体が、アミノ酸配列の配列番号６０を含む重鎖可変領域及びアミノ酸配列の配列番号６４又は配列番号６５を含む軽鎖可変領域を含む、請求項９４～９８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項100】

前記活性化可能な抗チェックポイント抗体が、アミノ酸配列の配列番号５７又は配列番号５８を含む重鎖、アミノ酸配列の配列番号６２又は配列番号６３を含む軽鎖を含む、請求項９４～９９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項101】

前記ＡＢ２が、ヒト又はカニクイザルのＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する、請求項９４に記載の方法。

【請求項102】

前記ＡＢ２が、ＶＨ ＣＤＲ１アミノ酸配列ＳＹＡＭＳ（配列番号６８）；ＳＳＩＷＲＮＧＩＶＴＶＹＡＤＳ（配列番号６９）を含むＶＨ ＣＤＲ２配列；ＷＳＡＡＦＤＹ（配列番号７０）を含むＶＨ ＣＤＲ３配列；ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ（配列番号７１）を含むＶＬ ＣＤＲ１配列；ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号７２）又はＹＡＳＴＬＱＳ（配列番号８６）を含むＶＬ ＣＤＲ２配列；かつＤＮＧＹＰＳＴ（配列番号７３）を含むＶＬ ＣＤＲ３配列を含む、請求項１０１に記載の方法。

【請求項103】

前記ＭＭ２が、アミノ酸配列ＧＩＡＬＣＰＳＨＦＣＱＬＰＱＴ（配列番号８３）を含む、請求項１００又は請求項１０１に記載の方法。

【請求項104】

前記活性化可能な抗チェックポイント抗体が、アミノ酸配列の配列番号７７を含む重鎖可変領域及びアミノ酸配列の配列番号８１又は配列番号８２を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１００～１０３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項105】

前記活性化可能な抗チェックポイント抗体が、アミノ酸配列の配列番号７４又は配列番号７５を含む重鎖及びアミノ酸配列の配列番号７９又は配列番号８０を含む軽鎖を含む、請求項１００～１０４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項106】

前記コンジュゲートされた活性化可能な抗体が
（ｉ）標的に特異的に結合する抗体若しくはその抗原結合断片（ＡＢ１）と、前記活性化可能な抗体が非切断状態にある場合に前記ＡＢ１の前記標的への結合を阻害するマスキング部分（ＭＭ１）と、前記ＡＢ１と共役した切断可能な部分（ＣＭ１）であって、プロテアーゼの基質として機能するポリペプチドである、ＣＭ１を含む活性化可能な抗体、かつ
（ｉｉ）前記活性化可能な抗体にコンジュゲートされた毒素又はその毒素断片
を含む、請求項９４～１０５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項107】

ＡＢ１が、腫瘍細胞上に見られる抗原に特異的に結合する、請求項１０６に記載の方法。

【請求項108】

ＡＢ１が、樹状細胞上に見られる抗原に特異的に結合する、請求項１０６又は請求項１０７に記載の方法。

【請求項109】

ＡＢ１が、哺乳動物ＣＤ１６６に特異的に結合する、請求項１０６～１０８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項110】

ＡＢ１が、ヒト又はカニクイザルのＣＤ１６６に特異的に結合する、請求項１０９に記載の方法。

【請求項111】

前記ＭＭ２が、４０個以下のアミノ酸長のポリペプチドである、請求項９４～１１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項112】

前記ＭＭ２ポリペプチド配列が、前記ＡＢ２の任意の天然結合パートナーと５０％以下同一である、請求項９４～１１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項113】

ＡＢ２のその抗原結合断片が、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、ｓｃＦｖ、ｓｃＡｂ、ｄＡｂ、単一ドメイン重鎖抗体、及び単一ドメイン軽鎖抗体からなる群から選択される、請求項９４～１１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項114】

前記ＡＢ２が、前記ＣＭ２に連結される、請求項９４～１１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項115】

前記ＡＢ２が、前記ＣＭ２に直接連結される、請求項９４～１１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項116】

前記ＡＢ２が、連結ペプチドを介して前記ＣＭ２に連結される、請求項９４～１１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項117】

前記ＭＭ２が、非切断状態で前記活性化可能な抗体が以下のようにＮ末端からＣ末端への構造的配置：ＭＭ２－ＣＭ２－ＡＢ２又はＡＢ２－ＣＭ２－ＭＭ２を含むように前記ＣＭ２に連結される、請求項９４～１１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項118】

前記活性化可能な抗体が、前記ＭＭ２と前記ＣＭ２の間に連結ペプチドを含む、請求項９４～１１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項119】

前記活性化可能な抗体が、前記ＣＭ２と前記ＡＢ２の間に連結ペプチドを含む、請求項９４～１１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項120】

前記活性化可能な抗体が、第１の連結ペプチド（ＬＰ３）及び第２の連結ペプチド（ＬＰ４）を含み、かつ非切断状態で前記活性化可能な抗体が、以下のようにＮ末端からＣ末端への構造的配置：ＭＭ２－ＬＰ３－ＣＭ２－ＬＰ４－ＡＢ２又はＡＢ２－ＬＰ４－ＣＭ２－ＬＰ３－ＭＭ２を有する、請求項９４～１１９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項121】

前記２つの連結ペプチドが、互いに同一ではない、請求項１２０に記載の方法。

【請求項122】

ＬＰ３及びＬＰ４の各々が、約１～２０個のアミノ酸長のペプチドである、請求項１２０又は請求項１２１に記載の方法。

【請求項123】

前記ＭＭ１が、４０個以下のアミノ酸長のポリペプチドである、請求項９４～１２２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項124】

前記ＡＢ１が、ヒト又はカニクイザルのＣＤ１６６に特異的に結合する、請求項９４～１２３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項125】

前記ＭＭ１ポリペプチド配列が、前記ＡＢ１の任意の天然結合パートナーと５０％以下同一である、請求項９４～１２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項126】

前記標的が、ヒト又はカニクイザルのＣＤ１６６であり、かつ前記ＭＭ１が、アミノ酸配列ＬＣＨＰＡＶＬＳＡＷＥＳＣＳＳ（配列番号１９）を含む、請求項９４～１２５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項127】

前記ＣＭ１が、アミノ酸配列ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号２０）を含む、請求項９４～１２６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項128】

ＡＢ１のその抗原結合断片が、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、ｓｃＦｖ、ｓｃＡｂ、ｄＡｂ、単一ドメイン重鎖抗体、及び単一ドメイン軽鎖抗体からなる群から選択される、請求項９４～１２７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項129】

前記ＡＢ１が、前記ＣＭ１に連結される、請求項９４～１２８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項130】

前記ＡＢ１が、前記ＣＭ１に直接連結される、請求項９４～１２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項131】

前記ＡＢ１が、連結ペプチドを介して前記ＣＭ１に連結される、請求項９４～１３０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項132】

前記ＭＭ１が、非切断状態の前記活性化可能な抗体が以下のようにＮ末端からＣ末端への構造的配置：ＭＭ１－ＣＭ１－ＡＢ１又はＡＢ１－ＣＭ１－ＭＭ１を含むように前記ＣＭ１に連結される、請求項９４～１３１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項133】

前記活性化可能な抗体が、前記ＭＭ１と前記ＣＭ１の間に連結ペプチドを含む、請求項９４～１３２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項134】

前記活性化可能な抗体が、前記ＣＭ１と前記ＡＢ１の間に連結ペプチドを含む、請求項９４～１３３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項135】

前記活性化可能な抗体が、第１の連結ペプチド（ＬＰ１）及び第２の連結ペプチド（ＬＰ２）を含み、かつ前記非切断状態の前記活性化可能な抗体が、以下のようにＮ末端からＣ末端への構造的配置：ＭＭ１－ＬＰ１－ＣＭ１－ＬＰ２－ＡＢ１又はＡＢ１－ＬＰ２－ＣＭ１－ＬＰ１－ＭＭ１を有する、請求項９４～１３４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項136】

前記２つの連結ペプチドが、互いに同一ではない、請求項１３５に記載の方法。

【請求項137】

ＬＰ１及びＬＰ２の各々が、約１～２０個のアミノ酸長のペプチドである、請求項１３５又は請求項１３６に記載の方法

【請求項138】

前記標的が、ヒト又はカニクイザルのＣＤ１６６であり、かつ前記活性化可能な抗ＣＤ１６６抗体が、ＶＨ ＣＤＲ１アミノ酸配列ＧＦＳＬＳＴＹＧＭＧＶＧ（配列番号１）；ＶＨ ＣＤＲ２アミノ酸配列ＮＩＷＷＳＥＤＫＨ（配列番号２）；ＶＨ ＣＤＲ３アミノ酸配列ＩＤＹＧＮＤＹＡＦＴＹ（配列番号３）；ＶＬ ＣＤＲ１アミノ酸配列ＲＳＳＫＳＬＬＨＳＮＧＩＴＹＬＹ（配列番号４）又はＲＳＳＱＳＬＬＨＳＮＧＩＴＹＬＹ（配列番号５）；ＶＬ ＣＤＲ２アミノ酸配列ＱＭＳＮＬＡＳ（配列番号６）又はＱＭＳＮＲＡＳ（配列番号７）；及びＶＬ ＣＤＲ３アミノ酸配列ＡＱＮＬＥＬＰＹＴ（配列番号８）を含む、請求項９４～１３７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項139】

前記標的が、ヒト又はカニクイザルのＣＤ１６６であり、
かつ前記活性化可能な抗ＣＤ１６６抗体が、アミノ酸配列の配列番号１２を含む重鎖可変領域及びアミノ酸配列の配列番号１７若しくは配列番号１８を含む軽鎖可変領域を含み；又は
前記活性化可能な抗ＣＤ１６６抗体が、アミノ酸配列の配列番号９若しくは配列番号１０を含む重鎖及びアミノ酸配列の配列番号１５若しくは配列番号１６を含む軽鎖を含む、請求項９４～１３８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項140】

前記薬剤が、毒素又はその毒素断片である、請求項９４～１３９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項141】

前記薬剤が、微小管阻害剤である、請求項９４～１４０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項142】

前記薬剤が、核酸損傷剤である、請求項９４～１４０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項143】

前記薬剤が、ドラスタチン又はその誘導体、オーリスタチン又はその誘導体、メイタンシノイド又はその誘導体、デュオカルマイシン又はその誘導体、カリケアマイシン又はその誘導体、ピロロベンゾジアゼピン又はその誘導体、及びビンカアルカロイド又はその誘導体からなる群から選択される、請求項９４～１４０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項144】

前記薬剤が、オーリスタチンＥ又はその誘導体である、請求項９４～１４０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項145】

前記薬剤が、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）である、請求項９４～１４０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項146】

前記薬剤が、モノメチルオーリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）である、請求項９４～１４０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項147】

前記薬剤が、ＤＭ１及びＤＭ４からなる群から選択されるメイタンシノイドである、請求項９４～１４０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項148】

前記薬剤が、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、ビンカミノール、ビネリジン、ビンブルニン、ビンポセチン、ビンカミン、アポビンカミン、ミノビンシン、メトキシミノビンシン、ミノビンシニン、ビンカディフォルミン、デスオキシビンカミノール、及びビンカマジンからなる群から選択されるビンカアルカロイドである、請求項９４～１４０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項149】

前記薬剤が、デュオカルマイシンである、請求項９４～１４０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項150】

前記薬剤が、リンカーを介して前記ＡＢ１にコンジュゲートされる、請求項９４～１４９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項151】

それにより前記薬剤が前記ＡＢ１にコンジュゲートされるリンカーが、ＳＰＤＢ部分、バリン－シトルリン部分、又はＰＥＧ２－ｖｃ部分を含む、請求項１４９に記載の方法。

【請求項152】

前記ＡＢにコンジュゲートされるリンカー及び毒素が、ＳＰＤＢ－ＤＭ４部分、ｖｃ－ＭＭＡＤ部分、ｖｃ－ＭＭＡＥ部分、ｖｃ－デュオカルマイシン部分、又はＰＥＧ２－ｖｃ－ＭＭＡＤ部分を含む、請求項１５０又は請求項１５１に記載の方法。

【請求項153】

前記リンカーが、切断可能なリンカーである、請求項１５０～１５２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項154】

前記リンカーが、切断可能でないリンカーである、請求項１５０～１５２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項155】

前記コンジュゲートされた活性化可能な抗体が、前記活性化可能な抗免疫チェックポイント阻害剤抗体の投与前、投与後、又は投与と同時に投与される、請求項９４～１５４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項156】

前記コンジュゲートされた活性化可能な抗体が、前記活性化可能な抗免疫チェックポイント阻害剤抗体の投与と同時に投与され、前記同時投与が、単一の組成物又は別々の組成物中である、請求項１５５に記載の方法。

【請求項157】

前記コンジュゲートされた活性化可能な抗体が、前記活性化可能な抗免疫チェックポイント阻害剤抗体の投与の約１日前に投与される、請求項１５６に記載の方法。

【請求項158】

前記コンジュゲートされた活性化可能な抗体の投与及び前記活性化可能な抗免疫チェックポイント阻害剤抗体の投与が、同じ投与スケジュールの一部として投与される、請求項９４～１５７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項159】

前記コンジュゲートされた活性化可能な抗体が、前記対象に静脈内、腹腔内、又は腫瘍内投与される、請求項９４～１５８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項160】

前記活性化可能な免疫チェックポイント阻害剤が、前記対象に静脈内、腹腔内、又は腫瘍内投与される、請求項９４～１５９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項161】

前記コンジュゲートされた活性化可能な抗体が、前記対象に静脈内、腹腔内、又は腫瘍内投与される、請求項９４～１６０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項162】

前記活性化可能な免疫チェックポイント阻害剤が、前記対象に静脈内、腹腔内、又は腫瘍内投与される、請求項９４～１６１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項163】

前記対象への前記コンジュゲートされた活性化可能な抗体の投与が、前記対象の標的組織において免疫原性細胞死を誘導することを含む、請求項９４～１６２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項164】

前記対象への前記コンジュゲートされた活性化可能な抗体の投与が、前記対象における樹状細胞成熟及び／又は活性化を誘導することを含む、請求項９４～１６３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項165】

前記コンジュゲートされた活性化可能な抗体が、治療量未満の用量で前記対象に投与される、請求項９４～１６３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項166】

前記活性化可能な免疫チェックポイント阻害剤が、治療量未満の用量で前記対象に投与される、請求項９４～１６３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項167】

前記コンジュゲートされた活性化可能な抗体及び前記活性化可能な免疫チェックポイント阻害剤が、治療量未満の用量で前記対象に投与される、請求項９４～１６３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項168】

前記コンジュゲートされた活性化可能な抗体が、治療有効量で前記対象に投与される、請求項９４～１６３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項169】

前記活性化可能な免疫チェックポイント阻害剤が、治療有効量で前記対象に投与される、請求項９４～１６３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項170】

前記活性化可能な免疫チェックポイント阻害剤及び前記活性化可能な免疫チェックポイント阻害剤が、治療有効量で投与される、請求項９４～１６３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項171】

前記活性化可能な免疫チェックポイント阻害剤が、前記活性化可能な免疫チェックポイント阻害剤が投与される用量よりも多い用量で投与される、請求項９４～１７０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項172】

前記活性化可能な免疫チェックポイント阻害剤が、前記活性化可能な免疫チェックポイント阻害剤が投与される用量より少ない用量で投与される、請求項９４～１７１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項173】

前記活性化可能な免疫チェックポイント阻害剤が、前記活性化可能な免疫チェックポイント阻害剤が投与される用量と同じ用量で投与される、請求項９４～１７２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項174】

前記治療される対象が、腫瘍再負荷アッセイにおいて記憶Ｔ細胞応答を示す、請求項９４～１７３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項175】

前記治療される対象からのＣＤ８＋Ｔ細胞が、腫瘍再負荷アッセイにおいてＩＦＮ－ガンマ生成を示す、請求項９４～１７４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項176】

前記治療される対象からのＣＤ４＋Ｔ細胞が、ＩＦＮ－ガンマ、ＩＬ－２、及び／又はＴＮＦ－アルファ生成を示す、請求項９４～１７５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項177】

前記ＣＤ４＋Ｔ細胞が、前記対象の腫瘍に由来する、請求項１７６に記載の方法。

【請求項178】

前記治療される対象からのＣＤ８＋Ｔ細胞が、ＩＦＮ－ガンマ及び／又はＴＮＦ－アルファ生成を示す、請求項９４～１７７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項179】

前記Ｄ８＋Ｔ細胞が、前記対象の腫瘍に由来する、請求項１７８に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願への相互参照
本願は、２０１９年２月２６日出願の米国仮出願第６２／８１０，６８号、及び２０１９年３月２８日出願の同第６２／８２５，２２８号の利益を主張するものであり、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0002】

発明の分野
本発明は一般に、癌の治療のためのコンジュゲートされた活性化可能な抗体と活性化可能な免疫チェックポイント阻害剤の組み合わせの投与方法及び組成物に関する。

【0003】

配列表への言及
ファイル名「ＣＹＴＸ－０６０－ＰＣＴ＿ＳＴ２５」としてＥＦＳ－Ｗｅｂを介してコンピュータ可読形式（ＣＦＲ）で、米国特許規則（３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ．セクション１.８２１）に従い本明細書と同時に電子提出された「配列表」は、参照により本明細書に組み込まれる。配列表の電子コピーは、２０２０年２月１３日に作成され、ディスク・サイズは８５キロバイトである。

【背景技術】

【0004】

発明の背景
抗体ベースの治療法は、癌を含むいくつかの疾患に対して有効な治療法であることが証明されているが、場合によっては、広範な標的発現による毒性が、それらの治療有効性を制限している。加えて、抗体ベースの治療法は、投与後の循環からの迅速なクリアランスなどの他の制限を示してきた。
抗体薬コンジュゲートを含む、治療抗体プロドラッグを提供するための戦略が開発されている。このような抗体プロドラッグは、比較的不活性な（又は著しく低い活性の）形態で投与され、親抗体の治療指標を高めることができる。一旦投与されると、プロドラッグ抗体は、インビボで活性化合物に代謝される。このようなプロドラッグ戦略は、その意図された標的のための薬物の選択性の増加と副作用の低下を提供できる。いくつかの抗体プロドラッグは、免疫チェックポイントファミリーのメンバーに向けられる。いくつかの抗体プロドラッグは、癌細胞で高発現される分子を標的に向けられる。いくつかの抗体プロドラッグを細胞傷害性化合物にコンジュゲートし、抗体薬物コンジュゲートのプロドラッグバージョンを生じ得る。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

【課題を解決するための手段】

【0006】

したがって、抗体ベースの治療のプロドラッグ分野では、治療指数が増加した抗体及び抗体薬物コンジュゲートの継続的なニーズがある。

【発明の効果】

【0007】

本発明の一態様では、対象において癌を治療するか、癌の症状を緩和するか、又は癌の進行を遅らせる方法であって、（ａ）コンジュゲートされた活性化可能な抗ＣＤ１６６抗体を対象に投与すること、及び（ｂ）活性化可能な免疫チェックポイント阻害剤を対象に投与すること、を含み、コンジュゲートされた活性化可能な抗ＣＤ１６６抗体が、（ｉ）哺乳動物ＣＤ１６６に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片（ＡＢ１）と、活性化可能な抗ＣＤ１６６抗体が非切断状態にあるときに哺乳動物ＣＤ１６６へのＡＢ１の結合を阻害するマスキング部分（ＭＭ１）と、ＡＢ１と共役した切断可能な部分（ＣＭ１）であって、プロテアーゼの基質として機能するポリペプチドである、ＣＭ１を含む活性化可能な抗ＣＤ１６６抗体、かつ（ｉｉ）活性化可能な抗ＣＤ１６６抗体にコンジュゲートされた毒素又はその毒素断片、を含む、方法が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイントは、Ａ２ＡＲ、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７－Ｈ４、ＢＴＬＡ（ＣＤ２７２）、ＣＳＦ－１Ｒ、ＣＴＬＡ－４、ＩＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＮＯＸ２、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＴＤＯ、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ－３、ＳＩＧＬＥＣ７（ＣＤ３２８）、及びＶＩＳＴＡからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、免疫チェックポイントに特異的に結合する抗体である。いくつかの実施形態では、活性化可能な免疫チェックポイント阻害剤は、免疫チェックポイントに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片（ＡＢ２）と、活性化可能な抗免疫チェックポイント抗体が非切断状態にあるときに免疫チェックポイントへのＡＢ２の結合を阻害するマスキング部分（ＭＭ２）と、ＡＢ２と共役された切断可能部分（ＣＭ２）であって、プロテアーゼの基質として機能するポリペプチドである、ＣＭ２を含む、活性化可能な抗免疫チェックポイント抗体である。いくつかの実施形態では、ＡＢ１及び／又はＡＢ２のその抗原結合断片は、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、ｓｃＦｖ、ｓｃＡｂ、ｄＡｂ、単一ドメイン重鎖抗体、及び単一ドメイン軽鎖抗体からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＭＭ１は、非切断状態の活性化可能な抗体が、以下のようにＮ末端からＣ末端への構造的配置：ＭＭ１－ＣＭ１－ＡＢ１又はＡＢ１－ＣＭ１－ＭＭ１を含むように、ＣＭ１に連結される。いくつかの実施形態では、活性化可能な抗体は、第１の連結ペプチド（ＬＰ１）及び第２の連結ペプチド（ＬＰ２）を含み、非切断状態の上記活性化可能な抗体が、以下のようにＮ末端からＣ末端への構造的配置：ＭＭ１－ＬＰ１－ＣＭ１－ＬＰ２－ＡＢ１又はＡＢ１－ＬＰ２－ＣＭ１－ＬＰ１－ＭＭ１を有する。いくつかの実施形態では、薬剤は、毒素又はその毒素断片である。いくつかの実施形態では、薬剤は、微小管阻害剤又は核酸損傷剤である。いくつかの実施形態では、薬剤は、ドラスタチン又はその誘導体、オーリスタチン又はその誘導体、メイタンシノイド又はその誘導体、デュオカルマイシン又はその誘導体、カリケアマイシン又はその誘導体、ピロロベンゾジアゼピン又はその誘導体、及びビンカアルカロイド又はその誘導体からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、薬剤は、オーリスタチンＥ、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルオーリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）、デュオカルマイシン、ＤＭ１及びＤＭ４からなる群から選択されるメイタンシノイド、又はビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、ビンカミノール、ビネリジン、ビンブルニン、ビンポセチン、ビンカミン、アポビンカミン、ミノビンシン、メトキシミノビンシン、ミノビンシニン、ビンカディフォルミン、デスオキシビンカミノール、及びビンカマジンからなる群から選択されるビンカアルカロイドである。いくつかの実施形態では、薬剤は、切断可能であっても又は切断可能でなくてもよいリンカーを介してＡＢ１にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、薬剤をＡＢ１にコンジュゲートさせる際に用いるリンカーは、ＳＰＤＢ部分、バリン－シトルリン部分、又はＰＥＧ２－ｖｃ部分を含む。

【0008】

いくつかの実施形態では、コンジュゲートされた活性化可能な抗ＣＤ１６６抗体は、活性化可能な免疫チェックポイント阻害剤の投与の前に、投与の後に、又は投与と同時に投与される。いくつかの実施形態では、コンジュゲートされた活性化可能な抗ＣＤ１６６抗体は、活性化可能な免疫チェックポイント阻害剤の投与と同時に投与され、同時投与は、単一組成物中で又は別々の組成物中である。いくつかの実施形態では、コンジュゲートされた活性化可能な抗ＣＤ１６６抗体は、活性化可能な免疫チェックポイント阻害剤の投与の約１日前に投与される。いくつかの実施形態では、コンジュゲートされた活性化可能な抗ＣＤ１６６抗体の投与及び活性化可能な免疫チェックポイント阻害剤の投与は、同じ投与スケジュールの一部として投与される。いくつかの実施形態では、コンジュゲートされた活性化可能な抗ＣＤ１６６抗体及び／又は活性化可能な免疫チェックポイント阻害剤は、対象に静脈内、腹腔内、又は腫瘍内投与される。いくつかの実施形態では、コンジュゲートされた活性化可能な抗ＣＤ１６６抗体及び／又は活性化可能な免疫チェックポイント阻害剤は、注入療法によって対象に投与される。いくつかの実施形態では、対象へのコンジュゲートされた活性化可能な抗ＣＤ１６６抗体の投与は、対象の標的組織において免疫原性細胞死を誘導することを含む。いくつかの実施形態では、対象へのコンジュゲートされた活性化可能な抗ＣＤ１６６抗体の投与は、対象における樹状細胞成熟及び／又は活性化を誘導することを含む。いくつかの実施形態では、コンジュゲートされた活性化可能な抗ＣＤ１６６抗体及び／又は活性化可能な免疫チェックポイント阻害剤は、注入療法によって対象に投与される。いくつかの実施形態では、コンジュゲートされた活性化可能な抗ＣＤ１６６抗体及び／又は活性化可能な免疫チェックポイント阻害剤は、治療量未満の用量で投与される。いくつかの実施形態では、コンジュゲートされた活性化可能な抗ＣＤ１６６抗体及び／又は活性化可能な免疫チェックポイント阻害剤は、治療有効量で投与される。いくつかの実施形態では、治療対象は、腫瘍再負荷アッセイにおいて記憶Ｔ細胞応答を示す。いくつかの実施形態では、治療対象からのＣＤ８＋Ｔ細胞は、腫瘍再負荷アッセイにおいてＩＦＮ－ガンマ生成を示す。いくつかの実施形態では、治療対象からのＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＩＦＮ－ガンマ、ＩＬ－２、及び／又はＴＮＦ－アルファ生成を示す。いくつかの実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、対象の腫瘍に由来する。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイントは、哺乳動物、ヒト、及び／又はカニクイザルのＰＤ－１である。いくつかの実施形態では、活性化可能な免疫チェックポイント阻害剤は、哺乳動物ＰＤ－１に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片（ＡＢ２）と、活性化可能な抗哺乳動物ＰＤ－１抗体が非切断状態にあるときに哺乳動物ＰＤ－１へのＡＢ２の結合を阻害するマスキング部分（ＭＭ２）と、ＡＢ２と共役された切断可能部分（ＣＭ２）であって、プロテアーゼの基質として機能するポリペプチドである、ＣＭ２、を含む活性化可能な抗哺乳動物ＰＤ－１抗体である。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイントは、哺乳動物、ヒト、及び／又はカニクイザルのＰＤ－Ｌ１である。いくつかの実施形態では、活性化可能な免疫チェックポイント阻害剤は、哺乳動物ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片（ＡＢ２）と、活性化可能な抗哺乳動物ＰＤ－１抗体が非切断状態にあるときに哺乳動物ＰＤ－Ｌ１へのＡＢ２の結合を阻害するマスキング部分（ＭＭ２）と、ＡＢ２と共役された切断可能部分（ＣＭ２）であって、プロテアーゼの基質として機能するポリペプチドである、ＣＭ２、を含む活性化可能な抗哺乳動物ＰＤ－Ｌ１抗体である。いくつかの実施形態では、ＭＭ２は、非切断状態の活性化可能な抗体が以下のようにＮ末端からＣ末端へと構造的配置：ＭＭ２－ＣＭ２－ＡＢ２又はＡＢ２－ＣＭ２－ＭＭ２を含むように、ＣＭ２に連結される。いくつかの実施形態では、活性化可能な抗体は、第１の連結ペプチド（ＬＰ３）及び第２の連結ペプチド（ＬＰ４）を含み、非切断状態の活性化可能な抗体は、以下のようにＮ末端からＣ末端へと構造的配置：ＭＭ２－ＬＰ３－ＣＭ２－ＬＰ４－ＡＢ２又はＡＢ２－ＬＰ３－ＣＭ２－ＬＰ４－ＭＭ２を有する。

【図面の簡単な説明】

【0009】

【図1A-1C】図１Ａ、１Ｂ、及び１Ｃは、様々なヒト免疫細胞におけるＣＤ１６６発現のレベルの研究の例示的な結果を示す。これらの結果は、ＣＤ１６６が血中骨髄性樹状細胞（ｍＤＣ）及び形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）、並びに単球及びＢ細胞において高発現され、かつＣＤ４＋Ｔ細胞の刺激後に誘導され得ることを示す。

【図2A-2C】図２Ａ、２Ｂ、及び２Ｃは、ヒトＣＤ１６６を発現するトランスジェニックＣＴ２６マウス細胞株の研究の例示的な結果を示す。

【図3A-3D】図３Ａ～３Ｄは、同系マウスモデルにおける抗ＣＤ１６６活性化可能なコンジュゲート抗体と活性化可能な抗ＰＤ－１抗体の組み合わせのインビボ有効性の例示的な結果を示す。

【図4A-4C】図４Ａ、４Ｂ、及び４Ｃは、マウスの再負荷アッセイの例示的な結果を示し、再負荷アッセイ中に保護されたマウスが、併用治療に起因する免疫学的記憶応答を確立したことを示す。

【図5A-5G】図５Ａ～５Ｇは、ＣＤ８＋Ｔ細胞を腫瘍担持マウスから枯渇させることが、単独療法で、又は活性化可能な抗ＰＤ－１抗体との組み合わせで活性化可能な抗ＣＤ１６６抗体薬物コンジュゲートの抗腫瘍インビボ有効性の低下をもたらすことを示す例示的な結果を示す。

【図6】図６は、これらの例示的な研究でのマウスにおけるＣＤ８＋Ｔ細胞枯渇の程度を示す。

【図7A-7B】図７Ａ及び７Ｂは、成熟樹状細胞及び活性化Ｔ細胞に対する様々な検査品の細胞傷害性の例示的な結果を示す。

【図8A-8B】図８Ａ及び８Ｂは、樹状細胞成熟及びＴ細胞共刺激の促進に対する抗ＣＤ１６６抗体薬物コンジュゲートの効果の例示的な結果を示す。

【図9A-9C】図９Ａ、９Ｂ、及び９Ｃは、遊離ＤＭ４及び抗ＣＤ１６６ ＡＤＣが、癌細胞及びＣＤ１６６発現細胞における免疫原性細胞死と関連付けられるシグナルを増加させることができることを示す例示的な結果を示す。

【発明を実施するための形態】

【0010】

本発明は、活性化白血球細胞接着分子（ＡＬＣＡＭ）としても知られるＣＤ１６６を特異的に結合する活性化可能なモノクローナル抗体を提供する。いくつかの実施形態では、活性化可能なモノクローナル抗体は、ＣＤ１６６含有細胞によって内部移行する。ＣＤ１６６は、ＣＤ６を結合する細胞接着分子であり、スカベンジャー受容体システインリッチ（ＳＲＣＲ）タンパク質スーパーファミリー（ＳＲＣＲＳＦ）に属する細胞表面受容体である。ＣＤ１６６は、細胞間相互作用及び細胞マトリックス相互作用、細胞接着、細胞遊走、並びにＴ細胞活性化及び増殖と関連付けられることが知られている。ＣＤ１６６の異常な発現及び／又は活性とＣＤ１６６関連シグナル伝達は、癌、炎症、及び自己免疫などの多くの疾患並びに障害の病因に関与している。例えば、ＣＤ１６６は、例えば、前立腺癌、乳癌、ＮＳＣＬＣ及び／又はＳＣＬＣなどの肺癌、中咽頭癌、子宮頸癌、及びＨＮＳＣＣなどの頭頸部癌などの様々なタイプの癌において高発現される。

【0011】

本開示は、異常なＣＤ１６６発現及び／又は活性と関連付けられる疾患又は障害を治療する、予防する、進行を遅らせる、その症状を寛解及び／又は緩和させる方法において有用である活性化可能な抗ＣＤ１６６抗体を提供する。例えば、活性化可能な抗ＣＤ１６６抗体は、癌又は他の腫瘍状態を治療する、予防する、進行を遅らせる、その症状を寛解及び／又は緩和させる方法で使用される。

【0012】

本開示は、ＣＤ１６６を発現する細胞と関連付けられる疾患又は障害を治療する、予防する、進行を遅らせる、その症状を寛解及び／又は緩和させる方法で有用である活性化可能な抗ＣＤ１６６抗体を提供する。いくつかの実施形態では、細胞は、異常なＣＤ１６６発現及び／又は活性と関連付けられる。いくつかの実施形態では、細胞は、正常なＣＤ１６６発現及び／又は活性と関連付けられる。例えば、活性化可能な抗ＣＤ１６６抗体は、癌又は他の腫瘍状態を治療する、予防する、進行を遅らせる、その症状を寛解及び／又は緩和させる方法で使用される。

【0013】

本開示は、疾患細胞がＣＤ１６６を発現する疾患又は障害を治療する、予防する、進行を遅らせる、その症状を寛解及び／又は緩和させる方法で有用である活性化可能な抗ＣＤ１６６抗体を提供する。いくつかの実施形態では、疾患細胞は、異常なＣＤ１６６発現及び／又は活性と関連付けられる。いくつかの実施形態では、疾患細胞は、正常なＣＤ１６６発現及び／又は活性と関連付けられる。例えば、活性化可能な抗ＣＤ１６６抗体は、癌又は他の腫瘍状態を治療する、予防する、進行を遅らせる、その症状を寛解及び／又は緩和させる方法で使用される。

【0014】

活性化可能な抗ＣＤ１６６抗体は、マスキング部分（ＭＭ）と共役したＣＤ１６６を特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を含み、それによりＭＭの共役が、ＣＤ１６６に結合する抗体又はその抗原結合断片の能力を低下させる。ＭＭは、プロテアーゼ、例えば、対象における治療部位においてＣＤ１６６と共局在化するプロテアーゼの基質（切断可能な部分、ＣＭ）を含む配列を介して抗体／抗原結合断片と共役される。

【0015】

定義
特に定義されない限り、本開示に関連して使用される科学用語及び技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。用語「１つ（ａ）」の実体又は「１つ（ａｎ）」の実体は、その実体の１以上を指す。例えば、化合物は、１以上の化合物を指す。そのようなものとして、「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」、「１以上」及び「少なくとも１つ」という用語は、互換的に使用できる。さらに、文脈で特に必要とされない限り、単数の用語は複数を含み、複数の用語は単数形を含む。一般に、本明細書に記載の細胞及び組織培養、分子生物学、及びタンパク質とオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド化学及びハイブリダイゼーションと関連して利用される命名法、並びにそれらの技術は、当技術分野でよく知られ、一般的に使用されているものである。標準的な技術は、組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、並びに組織培養及び形質転換（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）に使用される。酵素反応及び精製技術は、製造業者の仕様に従って、又は当技術分野で一般的に達成されるか、又は本明細書に記載されているように行われる。前述の技術及び手順は一般に、当技術分野でよく知られている従来の方法に従って行われ、本明細書全体を通して引用され、議論される様々な一般的かつより具体的な参考文献に記載されているように行われる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））を参照。本明細書に記載の分析化学、合成有機化学、及び薬用医薬品化学に関連して利用される命名法、並びにそれらの実験手順及び技術は、当技術分野でよく知られており、一般的に使用されているものである。標準的な技術は、化学合成、化学分析、医薬品の調製、製剤化、及び送達、並びに対象の治療に使用される。

【0016】

本開示に従って利用される場合、以下の用語は、特に示されない限り、以下の意味を有すると理解されるものとする。

【0017】

本明細書で使用する場合、用語「抗体」は免疫グロブリン分子、免疫学的に活性のある、例えば、抗原結合、免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の一部、すなわち、抗原を特異的に結合する（免疫反応する）抗原結合部位を含む分子を指す。「特異的に結合する」又は「免疫反応する」又は「免疫特異的に結合する」は、抗体が所望の抗原の１以上の抗原決定基と反応し、他のポリペプチドと反応しないか、又ははるかに低い親和性（Ｋ_ｄ＞１０^－６）で結合することを意味する。抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ドメイン抗体、一本鎖、Ｆａｂ、及びＦ（ａｂ’）_２断片、ｓｃＦｖ、及びＦａｂ発現ライブラリーを含むが、これらに限定されない。

【0018】

基本的な抗体構造単位は、四量体を含むことが知られている。各四量体は、２つの同一のポリペプチド鎖の対で構成され、各対は１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）及び１つの「重」鎖（約５０～７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、主に抗原認識に関与する１００～１１０個の又はそれより多いアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、主にエフェクター機能に関与する定常領域を定義する。一般に、ヒトから得られた抗体分子は、分子中に存在する重鎖の性質によって互いに異なるＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ及びＩｇＤクラスのいずれかに関する。あるクラスは、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２などのサブクラスも有する。さらに、ヒトにおいて、軽鎖は、カッパ鎖又はラムダ鎖であり得る。

【0019】

用語「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）又は「モノクローナル抗体組成物」は、本明細書で使用する場合、特有の軽鎖遺伝子産物及び特有の重鎖遺伝子産物からなる抗体分子の分子種を１つだけ含む抗体分子の集団を指す。特に、モノクローナル抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、集団のすべての分子において同一である。ｍＡｂは、それに対する特有の結合親和性によって特徴付けられる抗原の特定のエピトープと免疫反応できる抗原結合部位を含む。

【0020】

用語「抗原結合部位」又は「結合部分」は、抗原結合に関与する免疫グロブリン分子の部分を指す。抗原結合部位は、重（「Ｈ」）鎖及び軽（「Ｌ」）鎖のＮ末端可変（「Ｖ」）領域のアミノ酸残基によって形成される。「超可変領域」と呼ばれる重鎖と軽鎖のＶ領域内の３つの非常に多岐のストレッチは、「フレームワーク領域」又は「ＦＲ」として知られているより保存された隣接ストレッチの間に介在する。そのため、用語「ＦＲ」は、免疫グロブリンにおける超可変領域間に、及びそれらに隣接して自然界に見られるアミノ酸配列を指す。抗体分子において、軽鎖の３つの超可変領域と重鎖の３つの超可変領域は、互いに対し３次元空間内に配置されて、抗原結合面を形成する。抗原結合面は、結合抗原の３次元表面と相補的であり、重鎖及び軽鎖の各々の３つの超可変領域は、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」と呼ばれる。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、免疫学的関心のあるタンパク質のカバット配列（米国立衛生研究所、Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９８７及び１９９１））、又はＣｈｏｔｈｉａ＆Ｌｅｓｋ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７），Ｃｈｏｔｈｉａら Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７８－８８３（１９８９）の定義に従う。

【0021】

本明細書で使用する場合、用語「エピトープ」は、免疫グロブリン、ｓｃＦｖ、又はＴ細胞受容体に特異的に結合できる任意のタンパク質決定基を含む。用語「エピトープ」は、免疫グロブリン又はＴ細胞受容体に特異的に結合できる任意のタンパク質決定基を含む。エピトープ決定基は通常、アミノ酸又は糖側鎖などの分子の化学的に活性のある表面グルーピングからなり、通常、特定の３次元構造特性、並びに特定の電荷特性を有する。例えば、抗体は、ポリペプチドのＮ末端又はＣ末端ペプチドに対して作製され得る。抗体は、解離定数が１μＭ以下、いくつかの実施形態では、１００ｎＭ以下、及びいくつかの実施形態では、１０ｎＭ以下である場合、抗原を特異的に結合すると言われる。

【0022】

本明細書で使用する場合、用語「特異的結合」、「免疫学的結合性」、及び「免疫学的結合特性」は、免疫グロブリン分子と、それに対し免疫グロブリンが特異的である抗原との間に生じる種類の非共有結合相互作用を指す。免疫学的結合相互作用の強さ又は親和性は、相互作用の解離定数（Ｋ_ｄ）の観点から表すことができ、より低いＫ_ｄは、より大きな親和性を表す。選択されたポリペプチドの免疫学的結合特性は、当技術分野で周知の方法を用いて定量化できる。そのような方法の１つは、抗原結合部位／抗原複合体の形成及び解離の速度を測定する必要があり、これらの速度は複合体パートナーの濃度、相互作用の親和性、及び両方向の速度に等しく影響を与える幾何学的パラメータに依存する。そのため、「オン速度定数」（Ｋ_ｏｎ）と「オフ速度定数」（Ｋ_ｏｆｆ）の両方は、濃度と実際の会合速度及び解離速度の計算によって決定できる（Ｎａｔｕｒｅ ３６１：１８６－８７（１９９３）参照）。Ｋ_ｏｆｆ／Ｋ_ｏｎの比率は、親和性と関連しない全てのパラメータの取り消しを可能にし、解離定数Ｋ_ｄに等しい（一般的に、Ｄａｖｉｅｓら（１９９０）Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ５９：４３９－４７３参照）。本開示の抗体は、放射性リガンド結合アッセイ又は当業者に知られている同様のアッセイなどのアッセイによって測定される、結合定数（Ｋ_ｄ）が１μＭ以下、いくつかの実施形態では、１００ｎＭ以下、及びいくつかの実施形態では、１０ｎＭ以下、いくつかの実施形態では、１００ｐＭ以下～１ｐＭである場合、標的に特異的に結合すると言われる。

【0023】

本明細書で使用する場合、用語「単離ポリヌクレオチド」は、ゲノム、ｃＤＮＡ、又は合成起源のポリヌクレオチド又はそれらのいくつかの組み合わせを意味し、その起源により、「単離ポリヌクレオチド」は、（１）自然界に見られるポリヌクレオチドの全部又は一部と関連付けられていない、（２）自然界では連結されないポリヌクレオチドに作動可能に連結される、又は（３）より大きな配列の一部として自然界に存在しない。本開示によるポリヌクレオチドは、本明細書に示す重鎖免疫グロブリン分子をコードする核酸分子、及び本明細書に示す軽鎖免疫グロブリン分子をコードする核酸分子を含む。

【0024】

本明細書で指す用語「単離タンパク質」は、ｃＤＮＡ、組換えＲＮＡ、又は合成起源の又はそれらのいくつかの組み合わせのタンパク質を意味し、その起源又は誘導源により、「単離タンパク質」は、（１）自然界に見られるタンパク質と関連付けられない、（２）同じ源からの他のタンパク質を含まない、例えば、マウスタンパク質を含まない、（３）異なる種由来の細胞により発現される、又は（４）自然界に存在しない。

【0025】

用語「ポリペプチド」は、天然のタンパク質、断片、又はポリペプチド配列の類似体を指すための一般的な用語として本明細書で使用する。それゆえ、天然タンパク質断片、及び類似体は、ポリペプチド属の種である。本開示によるポリペプチドは、本明細書に示す重鎖免疫グロブリン分子と、本明細書に示す軽鎖免疫グロブリン分子、並びにカッパ軽鎖免疫グロブリン分子などの軽鎖免疫グロブリン分子と重鎖免疫グロブリン分子を含む組み合わせ、及びその逆によって形成される抗体分子、並びにその断片及び類似体を含む。

【0026】

本明細書で使用する場合、物体に適用される用語「天然に存在する」は、物体が自然界で見出され得るという事実を指す。例えば、自然界の源から単離することができ、かつ実験室で人によって意図的に改変されていない、又はそうでなければ、天然に存在する生物（ウイルスを含む）に存在する、ポリペプチド又はポリヌクレオチド配列である。

【0027】

本明細書で使用する場合、用語「作動可能に連結された」は、そのように記載される成分の位置が、それらが意図される様式で機能することを可能にする関係にあることを指す。コード配列に「作動可能に連結された」制御配列は、制御配列と適合する条件下でコード配列の発現が達成されるような方法でライゲーションされる。

【0028】

本明細書で使用する場合、用語「制御配列」は、それらがライゲーションされるコード配列の発現及びプロセシングに影響を与えるのに必要な、ポリヌクレオチド配列を指す。このような制御配列の性質は、原核生物における宿主生物によって異なり、そのような制御配列は一般に、真核生物におけるプロモーター、リボソーム結合部位、及び転写終結配列を含み、一般に、そのような制御配列は、プロモーター及び転写終結配列を含む。用語「制御配列」は、少なくとも、その存在が発現及びプロセシングに必須である全ての成分を含むことが意図され、その存在が有利である追加の成分、例えば、リーダー配列及び融合パートナー配列を含んでもよい。本明細書で言及する用語「ポリヌクレオチド」は、少なくとも１０塩基長のヌクレオチド、リボヌクレオチド又はデオキシヌクレオチドのいずれか、又はいずれかの種類のヌクレオチドの修飾された形態を意味する。この用語は、一本鎖及び二本鎖ＤＮＡの形態を含む。

【0029】

本明細書で言及する用語オリゴヌクレオチドは、天然に存在するオリゴヌクレオチド結合及び天然に存在しないオリゴヌクレオチド結合によって共に連結される天然のヌクレオチド、及び改変されたヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは、２００塩基以下の長さを一般に含むポリヌクレオチドサブセットである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１０～６０塩基長、いくつかの実施形態では、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０～４０塩基長である。オリゴヌクレオチドは通常、例えば、プローブについては一本鎖であるが、オリゴヌクレオチドは、例えば、遺伝子変異体の構築に使用する場合には二本鎖であり得る。本開示のオリゴヌクレオチドは、センス又はアンチセンスのいずれかのオリゴヌクレオチドである。

【0030】

本明細書で言及する用語「天然に存在するヌクレオチド」は、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドを含む。本明細書で言及する用語「修飾ヌクレオチド」は、修飾されるか又は置換された糖基などを有するヌクレオチドを含む。本明細書で言及する用語「オリゴヌクレオチド結合」は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレロエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホラニラデート（ｐｈｏｓｈｏｒａｎｉｌａｄａｔｅ）、ホスホロンミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｎｍｉｄａｔｅ）などのオリゴヌクレオチド結合を含む。例えば、ＬａＰｌａｎｃｈｅら．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：９０８１（１９８６）；Ｓｔｅｃら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０６：６０７７（１９８４），Ｓｔｅｉｎら．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：３２０９（１９８８），Ｚｏｎら、抗癌薬の設計（Ａｎｔｉ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ）６：５３９（１９９１）；Ｚｏｎら、オリゴヌクレオチドと類似体：実践的なアプローチ（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ）：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｐｐ．８７－１０８（Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ（編），Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９１））；Ｓｔｅｃら、米国特許第５，１５１，５１０号；Ｕｈｌｍａｎｎ ａｎｄ Ｐｅｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ９０：５４３（１９９０）を参照されたい。オリゴヌクレオチドは、必要に応じて検出用の標識を含んでよい。

【0031】

本明細書で使用する場合、２０個の従来のアミノ酸及びそれらの略語は、従来の使用法に従う。免疫学－合成（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ－Ａ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）（第２版，Ｅ．Ｓ．Ｇｏｌｕｂ及びＤ．Ｒ．Ｇｒｅｅｎ（編），Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，Ｍａｓｓ．（１９９１））を参照されたい。２０個の従来のアミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄ－アミノ酸）、α－，α－二置換アミノ酸、Ｎ－アルキルアミノ酸、乳酸、及び他の特殊なアミノ酸などの非天然アミノ酸も、本開示のポリペプチドに適する成分であり得る。特殊なアミノ酸の例としては、４ヒドロキシプロリン、γカルボキシグルタミン酸、ε－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルリジン、ε－Ｎ－アセチルリジン、Ｏ－ホスホセリン、Ｎ－アセチルセリン、Ｎ－ホルミルメチオニン、３－メチルヒスチジン、５－ヒドロキシリジン、σ－Ｎ－メチルアルギニン、並びに他の類似のアミノ酸及びイミノ酸（例えば、４－ヒドロキシプロリン）が挙げられる。本明細書で用いられるポリペプチド表記法において、標準的な使用法及び規則に従い、左側方向はアミノ末端方向であり、右側方向はカルボキシ末端方向である。

【0032】

同様に、特に指定しない限り、一本鎖ポリヌクレオチド配列の左側端は、５'末端であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左側方向を、５'方向と称する。新生ＲＮＡ転写産物の５'から３'の付加の方向は、転写方向と呼ばれ、ＲＮＡと同じ配列を有するＤＮＡ鎖上にありＲＮＡ転写産物の５'末端に対して５'である配列領域は、「上流領域」と呼ばれ、ＲＮＡと同じ配列を有するＤＮＡ鎖上にありＲＮＡ転写産物の３'末端に対して３'である配列領域は、「下流領域」と呼ばれる。

【0033】

ポリペプチドに適用される用語「実質的同一性」は、２つのペプチド配列が、デフォルトのギャップウェイトを使用するプログラムＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴなどにより最適に整列された場合に、少なくとも８０％の配列同一性、いくつかの実施形態では、少なくとも９０％の配列同一性、いくつかの実施形態では、少なくとも９５％の配列同一性、及びいくつかの実施形態では、少なくとも９９％の配列同一性を共有することを意味する。

【0034】

いくつかの実施形態では、同一でない残基の位置は、保存的アミノ酸置換によって異なる。

【0035】

本明細書で議論したように、抗体又は免疫グロブリン分子のアミノ酸配列の少数の変異は本開示に包含されると企図され、ただし、アミノ酸配列の変異は、少なくとも７５％、いくつかの実施形態では、少なくとも８０％、９０％、９５％、かついくつかの実施形態では、９９％を維持する。特に、保存的アミノ酸置換が企図される。保存的置換は、それらの側鎖に関連しているアミノ酸のファミリー内で生じるものである。遺伝子コードアミノ酸は、一般的にファミリーに分けられる；（１）酸性アミノ酸は、アスパラギン酸、グルタミン酸であり；（２）塩基性アミノ酸は、リジン、アルギニン、ヒスチジンであり；（３）非極性アミノ酸は、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンであり、かつ（４）無電荷極性アミノ酸は、グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシンである。親水性アミノ酸は、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、セリン、及びスレオニンを含む。疎水性アミノ酸は、アラニン、システイン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシン及びバリンを含む。アミノ酸の他のファミリーは、（ｉ）脂肪族ヒドロキシファミリーであるセリン及びスレオニン；（ｉｉ）アミド含有ファミリーであるアスパラギン及びグルタミン；（ｉｉｉ）脂肪族のファミリーであるアラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシン；並びに（ｉｖ）芳香族ファミリーであるフェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシンを含む。例えば、ロイシンとイソロイシン若しくはバリンの分離置換、アスパラギン酸とグルタミン酸の分離置換、スレオニンとセリンの分離置換、又はアミノ酸と構造的に関連するアミノ酸との同様の置換は、特に置換がフレームワーク部位内のアミノ酸を伴わない場合に、生じる分子の結合又は特性に大きな影響を及ぼさないと予想するのが妥当である。アミノ酸の変化が機能的ペプチドをもたらすかどうかは、ポリペプチド誘導体の比活性をアッセイすることにより容易に決定できる。アッセイは、本明細書に詳述される。抗体若しくは免疫グロブリン分子の断片又は類似体は、当業者が容易に調製できる。断片又は類似体の適切なアミノ末端及びカルボキシ末端は、機能的ドメインの境界付近で生じる。構造ドメイン及び機能ドメインは、ヌクレオチド及び／又はアミノ酸配列データを公の又は独自の配列データベースと比較することによって同定できる。いくつかの実施形態では、コンピュータ化された比較方法が、公知の構造及び／又は機能の他のタンパク質で生じる配列モチーフ又は予測タンパク質の立体配座を同定するために使用される。公知の三次元構造に折り畳まれたタンパク質配列を同定する方法が、知られている。Ｂｏｗｉｅら Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３：１６４（１９９１）。そのため、上記の例は、当業者が、本開示に従って構造的及び機能的ドメインを定義するために使用され得る配列モチーフ及び構造立体配座を認識できることを実証する。

【0036】

適切なアミノ酸置換は、（１）タンパク質分解に対する感受性を低下させるもの、（２）酸化に対する感受性を低下させるもの、（３）タンパク質複合体を形成するために結合親和性を変えるもの、（４）結合親和性を変えるもの、及び（５）そのような類似体の他の物理化学的又は機能的特性を与えるか、又は変更するもの、である。類似体は、天然に存在するペプチド配列以外の配列の様々な変異タンパク質を含んでよい。例えば、単一又は複数のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）は、天然に存在する配列中（例えば、分子間接触を形成するドメイン（複数可）の外のポリペプチドの部分中）で行われ得る。保存的アミノ酸置換は、親配列の構造的特性を実質的に変化させてはならない（例えば、置換アミノ酸は、親配列に生じるらせんを壊す又は親配列を特徴づける他の種類の二次構造を破壊する傾向があってはならない）。当技術分野で認められたポリペプチドの二次及び三次構造の例は、タンパク質、構造及び分子原理（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ（編），Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８４））；タンパク質構造の概要（Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）（Ｃ．Ｂｒａｎｄｅｎ及びＪ．Ｔｏｏｚｅ（編），Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９１））；並びにＴｈｏｒｎｔｏｎら．Ｎａｔｕｒｅ ３５４：１０５（１９９１）に記載されている。

【0037】

本明細書で使用する用語「ポリペプチド断片」は、アミノ末端及び／若しくはカルボキシ末端の欠失並びに／又は１以上の内部欠失（複数可）を有するポリペプチドを指すが、残りのアミノ酸配列は、例えば、全長ｃＤＮＡ配列から推測される天然に存在する配列中の対応する位置と同一である。断片は典型的には、少なくとも５、６、８又は１０個のアミノ酸長、いくつかの実施形態では、少なくとも１４個のアミノ酸長、いくつかの実施形態では、少なくとも２０個のアミノ酸長、通常、少なくとも５０個のアミノ酸長、いくつかの実施形態では、少なくとも７０個のアミノ酸長である。本明細書で使用する場合、用語「類似体」は、推定アミノ酸配列の一部と実質的な同一性を有し、かつ適切な結合条件下で標的への特異的な結合を有する、少なくとも２５個のアミノ酸のセグメントで構成されるポリペプチドを指す。典型的には、ポリペプチド類似体は、天然に存在する配列に関する保存的アミノ酸置換（又は付加若しくは欠失）を含む。類似体は典型的には、少なくとも２０個のアミノ酸長、いくつかの実施形態では、少なくとも５０個又はそれ以上のアミノ酸長であり、多くの場合、完全長の天然ポリペプチドと同じくらいの長さであり得る。

【0038】

用語「薬剤」は、生体材料から作製される化合物、化合物の混合物、生体高分子、又は抽出物を示すために本明細書で使用される。

【0039】

本明細書で使用する場合、用語「標識」または「標識された」は、例えば、放射標識されたアミノ酸の取り込み、又は標識されたアビジン（例えば、蛍光マーカーを含むストレプトアビジン、又は光学的方法若しくは熱量測定法によって検出できる酵素活性）によって検出できるビオチン部分のポリペプチドへの付着による検出マーカーの取り込みを指す。ある状況では、標識又はマーカーはまた、治療用であり得る。ポリペプチド及び糖タンパク質の標識の様々な方法は、当技術分野で公知であり、使用され得る。ポリペプチドの標識の例としては、限定されないが、以下のもの：放射性同位元素又は放射性核種（例えば、^３Ｈ、^１４Ｃ、^１５Ｎ、^３５Ｓ、^９０Ｙ、^９９Ｔｃ、^１１１Ｉｎ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ）、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニドリン光体）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、p－ガラクトシダーゼ、ルシファーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光、ビオチニル基、二次レポーター（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）によって認識される所与のポリペプチドエピトープが挙げられる。いくつかの実施形態では、標識は、潜在的な立体障害を低減するために様々な長さのスペーサーアームによって取り付けられる。本明細書で使用する場合、用語「医薬剤又は薬物」は、対象に適切に投与された場合に、所望の治療効果を誘導できる化合物又は組成物を指す。

【0040】

本明細書では、他の化学用語は、マグロウヒル化学用語辞典（Ｔｈｅ ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｒｍｓ）（Ｐａｒｋｅｒ，Ｓ．（編），ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ（１９８５））によって例示されるように、当技術分野における従来の使用法に従って使用される。

【0041】

本明細書で使用する場合、「実質的に純粋な」は、目的の種が、存在する主要な種である（すなわち、モルベースで、それは組成物中の他のどの個々の種よりも豊富である）ことを意味し、いくつかの実施形態では、実質的に精製された画分は、目的の種が、存在する全ての高分子種の少なくとも約５０％（モルベースで）を構成する、組成物である。

【0042】

一般に、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在する全ての高分子種の約８０％超、いくつかの実施形態では、約８５％、９０％、９５％、及び９９％超を構成する。いくつかの実施形態では、目的の種が本質的に均質になるまで精製され（混入種が従来の検出法によって組成物中に検出できない）、組成物は本質的に単一の高分子種からなる。

【0043】

対象という用語は、ヒト及び獣医の対象を含む。

【0044】

活性化可能な抗体（ＡＡ）
本開示は、哺乳動物標的を特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を含むＡＡを提供する。いくつかの実施形態では、標的は、哺乳動物ＣＤ１６６（ＡＬＣＡＭ）である。いくつかの実施形態では、標的は哺乳動物ＰＤ－１である。いくつかの実施形態では、標的は哺乳動物ＰＤ－Ｌ１である。

【0045】

いくつかの実施形態では、哺乳動物標的は、ヒト標的及びカニクイザル標的からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＡＢは、１ｎＭ未満の解離定数で、ヒト標的又はカニクイザル標的に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、哺乳動物標的は、ヒト標的である。いくつかの実施形態では、哺乳動物標的は、カニクイザル標的である。いくつかの実施形態では、ＡＢは、以下の特徴：（ａ）ＡＢはヒト標的に特異的に結合する；（ｂ）ＡＢはヒト標的及びカニクイザル標的に特異的に結合する、の１以上を有する。

【0046】

いくつかの実施形態では、ＡＢは、以下の特徴：（ａ）ＡＢは、ヒトＣＤ１６６及びカニクイザルＣＤ１６６に特異的に結合する；（ｂ）ＡＢは、哺乳動物ＣＤ１６６への哺乳動物ＣＤ６の結合を阻害する；（ｃ）ＡＢは、ヒトＣＤ１６６へのヒトＣＤ６の結合を阻害する；かつ（ｄ）ＡＢは、カニクイザルＣＤ１６６へのカニクイザルＣＤ６の結合を阻害する、の１以上を有する。

【0047】

いくつかの実施形態では、ＡＢは、以下の特徴：（ａ）ＡＢは、ヒトＰＤ－１及び／又はカニクイザルＰＤ－１に特異的に結合する；（ｂ）ＡＢは、ヒトＰＤ－Ｌ１及び／又はカニクイザルＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する；（ｃ）ＡＢは、哺乳動物ＰＤ－１への哺乳動物ＰＤ－Ｌ１又はＰＤ－Ｌ２の結合を阻害する；（ｄ）ＡＢは、ヒトＰＤ－１へのヒトＰＤ－Ｌ１又はＰＤ－Ｌ２の結合を阻害する；かつ（ｅ）ＡＢは、カニクイザルＰＤ－１へのカニクイザルＰＤ－Ｌ１又はＰＤ－Ｌ２の結合を阻害する、の１以上を有する。

【0048】

いくつかの実施形態では、ＡＢは、５ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、５００ｎＭ以下、及び／又は１０００ｎＭ以下のＥＣ５０で、哺乳動物標的に結合する天然のリガンド又は受容体の能力を阻止する。いくつかの実施形態では、ＡＢは、５ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、５００ｎＭ以下、及び／又は１０００ｎＭ以下のＥＣ５０で、哺乳動物ＣＤ１６６に結合する哺乳動物ＣＤ６の能力を阻止する。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６６の天然のリガンド又は受容体は、ＣＤ６である。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１の天然のリガンド又は受容体は、ＰＤ－Ｌ１又はＰＤ－Ｌ２である。

【0049】

いくつかの実施形態では、ＡＢは、５ｎＭ～１０００ｎＭ、５ｎＭ～５００ｎＭ、５ｎＭ～１００ｎＭ、５ｎＭ～５０ｎＭ、５ｎＭ～１０ｎＭ、１０ｎＭ～１０００ｎＭ、１０ｎＭ～５００ｎＭ、１０ｎＭ～１００ｎＭ、１０ｎＭ～５０ｎＭ、５０ｎＭ～１０００ｎＭ、５０ｎＭ～５００ｎＭ、５０ｎＭ～１００ｎＭ、１００ｎＭ～１０００ｎＭ、１００ｎＭ～５００ｎＭ、１５０ｎＭ～４００ｎＭ、２００ｎＭ～３００ｎＭ、５００ｎＭ～１０００ｎＭのＥＣ５０で、哺乳動物標的に結合する天然リガンドの能力を阻止する。いくつかの実施形態では、ＡＢは、５ｎＭ～１０００ｎＭ、５ｎＭ～５００ｎＭ、５ｎＭ～１００ｎＭ、５ｎＭ～５０ｎＭ、５ｎＭ～１０ｎＭ、１０ｎＭ～１０００ｎＭ、１０ｎＭ～５００ｎＭ、１０ｎＭ～１００ｎＭ、１０ｎＭ～５０ｎＭ、１５ｎＭ～７５ｎＭ、３０ｎＭ～８０ｎＭ、４０ｎＭ～１５０ｎＭ、５０ｎＭ～１０００ｎＭ、５０ｎＭ～５００ｎＭ、５０ｎＭ～１００ｎＭ、１００ｎＭ～１０００ｎＭ、１００ｎＭ～５００ｎＭ、１５０ｎＭ～４００ｎＭ、２００ｎＭ～３００ｎＭ、５００ｎＭ～１０００ｎＭのＥＣ５０で、哺乳動物ＣＤ１６６に結合する哺乳動物ＣＤ６の能力を阻止する。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６６の天然のリガンド又は受容体は、ＣＤ６である。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１の天然のリガンド又は受容体は、ＰＤ－Ｌ１又はＰＤ－Ｌ２である。

【0050】

いくつかの実施形態では、本開示のＡＢは、哺乳動物標的を発現する細胞の成長、増殖、及び／若しくは転移を抑制又は低下させる。いかなる理論にも拘束される意図はないが、本開示のＡＢは、標的に特異的に結合し、哺乳動物標的への天然のリガンド若しくは受容体の結合を阻害、阻止、及び／又は防止することによって、哺乳動物標的を発現する細胞の成長、増殖、及び／若しくは転移を阻害又は低下させ得る。

【0051】

ＡＡの抗体又はその抗原結合断片は、マスキング部分（ＭＭ）と共役され、それによりＭＭの共役がその標的に結合する抗体又はその抗原結合断片の能力を低下させる。いくつかの実施形態では、ＭＭは、プロテアーゼ、例えば、疾患組織において活性のあるプロテアーゼ及び／又は対象の治療部位において標的と共局在化するプロテアーゼの基質を含む配列を介して共役される。本明細書に提供される活性化可能な抗体は、本明細書では互換的にＡＡ又は活性化可能な抗体とも呼ばれ、循環中で安定であり、治療及び／又は診断の意図される部位で活性化されるが、正常な、例えば、治療及び／又は診断で標的とされない健康な組織又は他の組織では活性化されず、活性化されると、本明細書で親抗体とも呼ばれる対応する非修飾抗体に少なくとも匹敵する、標的への結合を示す。いくつかの実施形態では、標的は、ＣＤ１６６、ＰＤ－Ｌ１、又はＰＤ－１である。

【0052】

本開示は、ＡＡで使用するためのその哺乳動物標的を特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片（ＡＢ）を提供する。いくつかの実施形態では、抗体は、標的を特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６６を結合する抗体又はその抗原結合断片は、モノクローナル抗体、ドメイン抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ'）_２断片、ｓｃＦｖ、ｓｃＡｂ、ｄＡｂ、単一ドメイン重鎖抗体、又は単一ドメイン軽鎖抗体である。いくつかの実施形態では、標的を結合するそのような抗体又はその抗原結合断片は、マウス、他のげっ歯類、キメラ、ヒト化又は完全ヒトモノクローナル抗体である。

【0053】

したがって、（１）哺乳動物ＣＤ１６６に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片（ＡＢ）と、ＡＢと共役したマスキング部分（ＭＭ）であって、ＡＡが非切断状態にあるときに哺乳動物標的へのＡＢの結合を阻害する、ＭＭと、ＡＢと共役した切断可能な部分（ＣＭ）であって、プロテアーゼの基質として機能するポリペプチドである、ＣＭを含む活性化可能な抗体（ＡＡ）が、本明細書で提供される。

【0054】

いくつかの実施形態では、本開示のＡＡ中の抗体（ＡＢ）は、例えば、哺乳動物ＣＤ１６６、及び／又はヒトＣＤ１６６などのＣＤ１６６標的を特異的に結合する。いくつかの実施形態では、本開示のＡＡ中の抗体（ＡＢ）は、例えば、哺乳動物ＰＤ－１、及び／又はヒトＰＤ－１などのＰＤ－１標的を特異的に結合する。いくつかの実施形態では、本開示のＡＡ中の抗体（ＡＢ）は、例えば、哺乳動物ＰＤ－Ｌ１、及び／又はヒトＰＤ－Ｌ１などのＰＤ－Ｌ１標的を特異的に結合する。

【0055】

いくつかの実施形態では、ＡＢは、哺乳動物標的への結合について約１００ｎＭ以下の解離定数を有する。いくつかの実施形態では、ＡＢは、哺乳動物標的への結合について約１０ｎＭ以下の解離定数を有する。いくつかの実施形態では、ＡＢは、標的への結合について約５ｎＭ以下の解離定数を有する。いくつかの実施形態では、ＡＢは、標的への結合について約１ｎＭ以下の解離定数を有する。いくつかの実施形態では、ＡＢは、標的への結合について約０.５ｎＭ以下の解離定数を有する。いくつかの実施形態では、ＡＢは、標的への結合について約０.１ｎＭ以下の解離定数を有する。いくつかの実施形態では、ＡＢは、哺乳動物標的への結合について０.０１ｎＭ～１００ｎＭ、０.０１ｎＭ～１０ｎＭ、０.０１ｎＭ～５ｎＭ、０.０１ｎＭ～１ｎＭ、０.０１ｎＭ～０.５ｎＭ、０.０１ｎＭ～０.１ｎＭ、０.０１ｎＭ～０.０５ｎＭ、０.０５ｎＭ～１００ｎＭ、０.０５ｎＭ～１０ｎＭ、０.０５ｎＭ～５ｎＭ、０.０５ｎＭ～１ｎＭ、０.０５～０.５ｎＭ、０.０５ｎＭ～０.１ｎＭ、０.１ｎＭ～１００ｎＭ、０.１ｎＭ～１０ｎＭ、０.１ｎＭ～５ｎＭ、０.１ｎＭ～１ｎＭ、０.１～０.５ｎＭ、０.５ｎＭ～１００ｎＭ、０.５ｎＭ～１０ｎＭ、０.５ｎＭ～５ｎＭ、０.５ｎＭ～１ｎＭ、１ｎＭ～１００ｎＭ、１ｎＭ～１０ｎＭ、１ｎＭ～５ｎＭ、５ｎＭ～１００ｎＭ、５ｎＭ～１０ｎＭ、又は１０ｎＭ～１００ｎＭの解離定数を有する。いくつかの実施形態では、標的は、ＣＤ１６６、ＰＤ－Ｌ１、又はＰＤ－１である。

【0056】

いくつかの実施形態では、非切断状態のＡＡは、１ｎＭ以下、５ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１５ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、２５ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、１５０ｎＭ以下、２５０ｎＭ以下、５００ｎＭ以下、７５０ｎＭ以下、１０００ｎＭ以下、及び１２２．／又は２０００ｎＭ以下の解離定数で哺乳動物標的に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、標的は、標的、ＰＤ－Ｌ１、又はＰＤ－１である。

【0057】

いくつかの実施形態では、非切断状態のＡＡは、１ｎＭ以上、５ｎＭ以上、１０ｎＭ以上、１５ｎＭ以上、２０ｎＭ以上、２５ｎＭ以上、５０ｎＭ以上、１００ｎＭ以上、１５０ｎＭ以上、２５０ｎＭ以上、５００ｎＭ以上、７５０ｎＭ以上、１０００ｎＭ以上及び１２２．／又は２０００ｎＭ以上の解離定数で哺乳動物標的に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、標的は、標的、ＰＤ－Ｌ１、又はＰＤ－１である。

【0058】

いくつかの実施形態では、非切断状態のＡＡは、１ｎＭ～２０００ｎＭ、１ｎＭ～１０００ｎＭ、１ｎＭ～７５０ｎＭ、１ｎＭ～５００ｎＭ、１ｎＭ～２５０ｎＭ、１ｎＭ～１５０ｎＭ、１ｎＭ～１００ｎＭ、１ｎＭ～５０ｎＭ、１ｎＭ～２５ｎＭ、１ｎＭ～１５ｎＭ、１ｎＭ～１０ｎＭ、１ｎＭ～５ｎＭ、５ｎＭ～２０００ｎＭ、５ｎＭ～１０００ｎＭ、５ｎＭ～７５０ｎＭ、５ｎＭ～５００ｎＭ、５ｎＭ～２５０ｎＭ、５ｎＭ～１５０ｎＭ、５ｎＭ～１００ｎＭ、５ｎＭ～５０ｎＭ、５ｎＭ～２５ｎＭ、５ｎＭ～１５ｎＭ、５ｎＭ～１０ｎＭ、１０ｎＭ～２０００ｎＭ、１０ｎＭ～１０００ｎＭ、１０ｎＭ～７５０ｎＭ、１０ｎＭ～５００ｎＭ、１０ｎＭ～２５０ｎＭ、１０ｎＭ～１５０ｎＭ、１０ｎＭ～１００ｎＭ、１０ｎ～５０ｎＭ、１０ｎ～２５ｎＭ、１０ｎ～１５ｎＭ、１５ｎＭ～２０００ｎＭ、１５ｎＭ～１０００ｎＭ、１５ｎＭ～７５０ｎＭ、１５ｎＭ～５００ｎＭ、１５ｎＭ～２５０ｎＭ、１５ｎＭ～１５０ｎＭ、１５ｎＭ～１００ｎＭ、１５ｎＭ～５０ｎＭ、１５ｎＭ～２５ｎＭ、２５ｎＭ～２０００ｎＭ、２５ｎＭ～１０００ｎＭ、２５ｎＭ～７５０ｎＭ、２５ｎＭ～５００ｎＭ、２５ｎＭ～２５０ｎＭ、２５ｎＭ～１５０ｎＭ、２５ｎＭ～１００ｎＭ、２５ｎＭ～５０ｎＭ、５０ｎＭ～２０００ｎＭ、５０ｎＭ～１０００ｎＭ、５０ｎＭ～７５０ｎＭ、５０ｎＭ～５００ｎＭ、５０ｎＭ～２５０ｎＭ、５０ｎＭ～１５０ｎＭ、５０ｎＭ～１００ｎＭ、１００ｎＭ～２０００ｎＭ、１００ｎＭ～１０００ｎＭ、１００ｎＭ～７５０ｎＭ、１００ｎＭ～５００ｎＭ、１００ｎＭ～２５０ｎＭ、１００ｎＭ～１５０ｎＭ、１５０ｎＭ～２０００ｎＭ、１５０ｎＭ～１０００ｎＭ、１５０ｎＭ～７５０ｎＭ、１５０ｎＭ～５００ｎＭ、１５０ｎ～２５０ｎＭ、２５０ｎＭ～２０００ｎＭ、２５０ｎＭ～１０００ｎＭ、２５０ｎＭ～７５０ｎＭ、２５０ｎＭ～５００ｎＭ、５００ｎＭ～２０００ｎＭ、５００ｎＭ～１０００ｎＭ、５００ｎＭ～７５０ｎＭ、５００ｎＭ～５００ｎＭ、５００ｎＭ～２５０ｎＭ、５００ｎ～１５０ｎＭ、５００ｎＭ～１００ｎＭ、５００ｎＭ～５０ｎＭ、７５０ｎＭ～２０００ｎＭ、７５０ｎＭ～１０００ｎＭ、又は１０００ｎＭ～２０００ｎＭの範囲の解離定数で哺乳動物標的に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、標的は、標的、ＰＤ－Ｌ１、又はＰＤ－１である。

【0059】

いくつかの実施形態では、活性化状態のＡＡは、０.０１ｎＭ、０.０５ｎＭ、０.１ｎＭ、０.５ｎＭ、１ｎＭ、５ｎＭ、又は１０ｎＭ以下である解離定数で哺乳動物標的に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、活性化状態のＡＡは、０.０１ｎＭ、０.０５ｎＭ、０.１ｎＭ、０.５ｎＭ、１ｎＭ、５ｎＭ、又は１０ｎＭ以上である解離定数で哺乳動物標的に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、標的は、標的、ＰＤ－Ｌ１、又はＰＤ－１である。

【0060】

いくつかの実施形態では、活性化状態のＡＡは、０.０１ｎＭ～１００ｎＭ、０.０１ｎＭ～１０ｎＭ、０.０１ｎＭ～５ｎＭ、０.０１ｎＭ～１ｎＭ、０.０１ｎＭ～０．５ｎＭ、０.０１ｎＭ～０．１ｎＭ、０.０１ｎＭ～０．０５ｎＭ、０.０５ｎＭ～１００ｎＭ、０.０５ｎＭ～１０ｎＭ、０.０５ｎＭ～５ｎＭ、０.０５ｎＭ～１ｎＭ、０.０５～０．５ｎＭ、０.０５ｎＭ～０．１ｎＭ、０.１ｎＭ～１００ｎＭ、０.１ｎＭ～１０ｎＭ、０.１ｎＭ～５ｎＭ、０.１ｎＭ～１ｎＭ、０.１～０．５ｎＭ、０.５ｎＭ～１００ｎＭ、０.５ｎＭ～１０ｎＭ、０.５ｎＭ～５ｎＭ、０.５ｎＭ～１ｎＭ、１ｎＭ～１００ｎＭ、１ｎＭ～１０ｎＭ、１ｎＭ～５ｎＭ、５ｎＭ～１００ｎＭ、５ｎＭ～１０ｎＭ、又は１０ｎＭ～１００ｎＭの範囲の解離定数で哺乳動物標的に特異的に結合する。

【0061】

本発明の例示的な活性化可能な抗ＣＤ１６６抗体は、例えば、下に示す重鎖及び軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）、完全長アミノ酸配列、並びに可変領域アミノ酸配列を含むか、それらであるか、又はそれらに由来する重鎖及び軽鎖を含む活性化可能な抗体（ＡＡ）を含む。

【表1】

【0062】

いくつかの実施形態では、ＡＡの血清半減期は、対応する抗体のそれよりも長い。例えば、ＡＡのｐＫは、対応する抗体のそれよりも長い。いくつかの実施形態では、ＡＡの血清半減期は、対応する抗体のそれと類似している。いくつかの実施形態では、ＡＡの血清半減期は、生物に投与された場合、少なくとも１５日である。いくつかの実施形態では、ＡＡの血清半減期は、生物に投与された場合、少なくとも１２日である。いくつかの実施形態では、ＡＡの血清半減期は、生物に投与された場合、少なくとも１１日である。いくつかの実施形態では、ＡＡの血清半減期は、生物に投与された場合、少なくとも１０日である。いくつかの実施形態では、ＡＡの血清半減期は、生物に投与された場合、少なくとも９日である。いくつかの実施形態では、ＡＡの血清半減期は、生物に投与された場合、少なくとも８日である。いくつかの実施形態では、ＡＡの血清半減期は、生物に投与された場合、少なくとも７日である。いくつかの実施形態では、ＡＡの血清半減期は、生物に投与された場合、少なくとも６日である。いくつかの実施形態では、ＡＡの血清半減期は、生物に投与された場合、少なくとも５日である。いくつかの実施形態では、ＡＡの血清半減期は、生物に投与された場合、少なくとも４日である。いくつかの実施形態では、ＡＡの血清半減期は、生物に投与された場合、少なくとも３日である。いくつかの実施形態では、ＡＡの血清半減期は、生物に投与された場合、少なくとも２日である。いくつかの実施形態では、ＡＡの血清半減期は、生物に投与された場合、少なくとも２４時間である。いくつかの実施形態では、ＡＡの血清半減期は、生物に投与された場合、少なくとも２０時間である。いくつかの実施形態では、ＡＡの血清半減期は、生物に投与された場合、少なくとも１８時間である。いくつかの実施形態では、ＡＡの血清半減期は、生物に投与された場合、少なくとも１６時間である。いくつかの実施形態では、ＡＡの血清半減期は、生物に投与された場合、少なくとも１４時間である。いくつかの実施形態では、ＡＡの血清半減期は、生物に投与された場合、少なくとも１２時間である。いくつかの実施形態では、ＡＡの血清半減期は、生物に投与された場合、少なくとも１０時間である。いくつかの実施形態では、ＡＡの血清半減期は、生物に投与された場合、少なくとも８時間である。いくつかの実施形態では、ＡＡの血清半減期は、生物に投与された場合、少なくとも６時間である。いくつかの実施形態では、ＡＡの血清半減期は、生物に投与された場合、少なくとも４時間である。いくつかの実施形態では、ＡＡの血清半減期は、生物に投与された場合、少なくとも３時間である。

【0063】

例示的な活性化可能な抗体
例示的な実施形態では、本開示のＡＡは、以下の配列の任意の１以上を含む。

【表2】

【0064】

例示的な実施形態では、ＡＡは、（ａ）哺乳動物ＣＤ１６６に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片（ＡＢ）であって、配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、ＡＢと、（ｂ）ＡＢと共役したマスキング部分（ＭＭ）であって、ＡＡが非切断状態にあるときに哺乳動物ＣＤ１６６へのＡＢの結合を阻害し、配列番号１９のアミノ酸配列を含む、ＭＭと、（ｃ）ＡＢと共役した切断可能な部分（ＣＭ）であって、プロテアーゼの基質として機能するポリペプチドであり、配列番号２０のアミノ酸配列を含む、ＣＭを含む。

【0065】

例示的な実施形態では、ＡＡは、（ａ）哺乳動物ＣＤ１６６に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片（ＡＢ）を含み、ＡＢは、配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖を及び配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、ｓｐｄｂリンカーを介してＤＭ４にコンジュゲートされ（この例示的なコンジュゲートＡＡは、本明細書では「スペーサー－７６１４.６－３００１－ＨｃＣＤ１６６－ＳＰＤＢ－ＤＭ４」と呼ばれる）、「コンビネーション５５」とも呼ばれる。リンカー毒素ＳＰＤＢ－ＤＭ４はまた、Ｎ－スクシンイミジル４－（２－ピリジルジチオ）ブタノエート－Ｎ２’－デアセチル－Ｎ２’－（４－メルカプト－４－メチル－１－オキソペンチル）－メイタンシンとしても知られている。

【0066】

別の例示的な実施形態では、ＡＡは、（ａ）哺乳動物ＣＤ１６６に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片（ＡＢ）を含み、ＡＢは、配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号１５のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、さらにｓｐｄｂリンカーを介してＤＭ４にコンジュゲートされ、この例示的なコンジュゲートＡＡは、本明細書では「７６１４.６－３００１－ＨｃＣＤ１６６－ＳＰＤＢ－ＤＭ４」とも呼ばれる（「コンビネーション６０」とも呼ばれる）。

【0067】

例示的な実施形態では、ＡＡは、（ａ）哺乳動物ＰＤ－１に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片（ＡＢ）であって、配列番号５７又は配列番号５８のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号５９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、ＡＢと、（ｂ）ＡＢと共役したマスキング部分（ＭＭ）であって、ＡＡが非切断状態にあるときに哺乳動物ＰＤ－１へのＡＢの結合を阻害し、配列番号６６のアミノ酸配列を含む、ＭＭと、（ｃ）ＡＢと共役した切断可能な部分（ＣＭ）であって、プロテアーゼの基質として機能するポリペプチドであり、配列番号６７のアミノ酸配列を含む、ＣＭを含む。

【0068】

例示的な実施形態では、ＡＡは、（ａ）哺乳動物ＰＤ－１に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片（ＡＢ）を含み、ＡＢは、配列番号５７又は配列番号５８のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号６２又は配列番号６３のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。例示的な実施形態では、ＡＡは、（ａ）哺乳動物ＰＤ－１に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片（ＡＢ）を含み、ＡＢは、配列番号６０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号６４又は配列番号６５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。

【0069】

例示的な実施形態では、ＡＡは、（ａ）哺乳動物ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片（ＡＢ）であって、配列番号７４又は配列番号７５のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号７６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、ＡＢと、（ｂ）ＡＢと共役したマスキング部分（ＭＭ）であって、ＡＡが非切断状態にあるときに哺乳動物ＰＤ－Ｌ１へのＡＢの結合を阻害し、配列番号８３のアミノ酸配列を含む、ＭＭと、（ｃ）ＡＢと共役した切断可能な部分（ＣＭ）であって、プロテアーゼの基質として機能するポリペプチドであり、配列番号８４のアミノ酸配列を含む、ＣＭを含む。

【0070】

例示的な実施形態では、ＡＡは、（ａ）哺乳動物ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片（ＡＢ）を含み、ＡＢは、配列番号７４又は配列番号７５のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号７９又は配列番号８０のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。例示的な実施形態では、ＡＡは、（ａ）哺乳動物ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片（ＡＢ）を含み、ＡＢは、配列番号７７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号８１又は配列番号８２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。

【0071】

マスキング部分（ＭＭ）
本明細書に記載の活性化可能な抗体は、抗体治療薬、特にインビボで少なくともある程度まで毒性が知られている抗体治療薬の限界を克服する。標的媒介性毒性は、治療抗体の開発に大きな限界をもたらす。本明細書で提供される活性化可能な抗体は、従来の治療抗体による正常組織における標的の阻害と関連付けられ毒性を対処するように設計される。これらの活性化可能な抗体は、疾患部位でタンパク質分解により活性化されるまでマスクされたままである。親の治療抗体としての抗体で始め、本発明の活性化可能な抗ＣＤ１６６抗体を、プロテアーゼ基質を組み込むリンカー（ＣＭ）を介して抗体を阻害マスク（マスキング部分、ＭＭ）と共役させることによって操作した。

【0072】

したがって、本明細書で提供される活性化可能な抗体は、マスキング部分（ＭＭ）を含む。いくつかの実施形態では、ＭＭは、抗体と共役又は他の方法で付着したアミノ酸配列であり、ＭＭがその標的を特異的に結合する抗体の能力を低下させるように、活性化可能な抗体構築物内に配置される。適切なマスキング部分は、様々な公知の技術のいずれかを用いて同定される。例えば、ペプチドマスキング部分は、その内容が参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＤａｕｇｈｅｒｔｙらによるＰＣＴ公開ＷＯ ２００９／０２５８４６に記載された方法を用いて同定される。

【0073】

いくつかの実施形態では、標的の存在下で、ＭＭは、例えば、その内容が参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開ＷＯ ２０１０／０８１１７３に記載のアッセイなどの標的置換アッセイを用いてインビトロでアッセイした場合に、ＣＭが切断されたときと比較して、ＣＭが切断されていないときに、その標的に結合するＡＢの能力を少なくとも９０％低下させる。

【0074】

いくつかの実施形態では、ＭＭは、約２～４０個のアミノ酸長のポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ＭＭは、最大約４０個のアミノ酸長のポリペプチドである。

【0075】

いくつかの実施形態では、ＭＭポリペプチド配列は、ＡＢの標的のものとは異なる。いくつかの実施形態では、ＭＭポリペプチド配列は、ＡＢの任意の天然結合パートナーと５０％未満同一である。いくつかの実施形態では、ＭＭポリペプチド配列は、ＡＢの標的のそれとは異なり、ＡＢの任意の天然結合パートナーと４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、又は１０％以下同一である。

【0076】

１つの例示的な実施形態では、本明細書で提供されるＡＡは、そのアミノ酸配列が記載される、ＭＭを含む：

【表3】

【0077】

ＡＢが、ＭＭで修飾され、標的の存在下にある場合、その標的に対するＡＢの特異的結合は、ＭＭで修飾されていないＡＢの特異的結合又は標的に対する親ＡＢの特異的結合と比較して、低下されるか又は阻害される。

【0078】

ＭＭで修正されたＡＢの標的に対するＫ_ｄは、ＭＭで修飾されていないＡＢのＫ_ｄよりも又は標的に対する親ＡＢのＫ_ｄよりも少なくとも５、１０、２５、５０、１００、２５０、５００、１，０００、２，５００、５，０００、１０，０００、５０，０００、１００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００倍若しくはそれを超えて、又は５～１０、１０～１００、１０～１，０００、１０～１０，０００、１０～１００，０００、１０～１，０００，０００、１０～１０，０００，０００、２５～５０、５０～２５０、１００～１，０００、１００～１０，０００、１００～１００，０００、１００～１，０００，０００、１００～１０，０００，０００、５００～２，５００、１，０００～１０，０００、１，０００～１００，０００、１，０００～１，０００，０００、１０００～１０，０００，０００、２，５００～５，０００、５，０００～５０，０００、１０，０００～１００，０００、１０，０００～１，０００，０００、１０，０００～１０，０００，０００、５０，０００～５，０００，０００、１００，０００～１，０００，０００、又は１００，０００～１０，０００，０００倍高い。逆に、ＭＭで修飾されたＡＢの標的に対する結合親和性は、ＭＭで修飾されていないＡＢの結合親和性よりも又は標的に対する親ＡＢの結合親和性よりも少なくとも２、３、４、５、１０、２５、５０、１００、２５０、５００、１，０００、２，５００、５，０００、１０，０００、５０，０００、１００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００倍若しくはそれを超えて、又は５～１０、１０～１００、１０～１，０００、１０～１０，０００、１０～１００，０００、１０～１，０００，０００、１０～１０，０００，０００、２５～５０、５０～２５０、１００～１，０００、１００～１０，０００、１００～１００，０００、１００～１，０００，０００、１００～１０，０００，０００、５００～２，５００、１，０００～１０，０００、１，０００～１００，０００、１，０００～１，０００，０００、１０００～１０，０００，０００、２，５００～５，０００、５，０００～５０，０００、１０，０００～１００，０００、１０，０００～１，０００，０００、１０，０００～１０，０００，０００、５０，０００～５，０００，０００、１００，０００～１，０００，０００、又は１００，０００～１０，０００，０００倍低い。

【0079】

いくつかの実施形態では、ＡＢへのＭＭの共役は、ＭＭに共役されるときのその標的に対するＡＢの解離定数（Ｋ_ｄ）が、ＭＭに共役されないときのその標的に対するＡＢのＫ_ｄよりも少なくとも２倍高いように、その標的を結合するＡＢの能力を低下させる。

【0080】

いくつかの実施形態では、ＡＢへのＭＭの共役は、ＭＭに共役されるときのその標的に対するＡＢの解離定数（Ｋ_ｄ）が、ＭＭに共役されないときのその標的に対するＡＢのＫ_ｄよりも少なくとも５倍高いように、その標的を結合するＡＢの能力を低下させる。

【0081】

いくつかの実施形態では、ＡＢへのＭＭの共役は、ＭＭに共役されるときのその標的に対するＡＢの解離定数（Ｋ_ｄ）が、ＭＭに共役されないときのその標的に対するＡＢのＫ_ｄよりも少なくとも１０倍高いように、その標的を結合するＡＢの能力を低下させる。

【0082】

いくつかの実施形態では、ＡＢへのＭＭの共役は、ＭＭに共役されるときのその標的に対するＡＢの解離定数（Ｋ_ｄ）が、ＭＭに共役されないときのその標的に対するＡＢのＫ_ｄよりも少なくとも２０倍高いように、その標的を結合するＡＢの能力を低下させる。

【0083】

いくつかの実施形態では、ＡＢへのＭＭの共役は、ＭＭに共役されるときのその標的に対するＡＢの解離定数（Ｋ_ｄ）が、ＭＭに共役されないときのその標的に対するＡＢのＫ_ｄよりも少なくとも４０倍高いように、その標的を結合するＡＢの能力を低下させる。

【0084】

いくつかの実施形態では、ＡＢへのＭＭの共役は、ＭＭに共役されるときのその標的に対するＡＢの解離定数（Ｋ_ｄ）が、ＭＭに共役されないときのその標的に対するＡＢのＫ_ｄよりも少なくとも１００倍高いように、その標的を結合するＡＢの能力を低下させる。

【0085】

いくつかの実施形態では、ＡＢへのＭＭの共役は、ＭＭに共役されるときのその標的に対するＡＢの解離定数（Ｋ_ｄ）が、ＭＭに共役されないときのその標的に対するＡＢのＫ_ｄよりも少なくとも１０００倍高いように、その標的を結合するＡＢの能力を低下させる。

【0086】

いくつかの実施形態では、ＡＢへのＭＭの共役は、ＭＭに共役されるときのその標的に対するＡＢの解離定数（Ｋ_ｄ）が、ＭＭに共役されないときのその標的に対するＡＢのＫ_ｄよりも少なくとも１０，０００倍高いように、その標的を結合するＡＢの能力を低下させる。

【0087】

ＡＢに対するＭＭの解離定数（Ｋ_ｄ）は、標的に対するＡＢのＫ_ｄよりも一般に高い。ＡＢに対するＭＭのＫ_ｄは、標的に対するＡＢのＫ_ｄよりも少なくとも５、１０、２５、５０、１００、２５０、５００、１，０００、２，５００、５，０００、１０，０００、１００，０００、１，０００，０００又はさらに１０，０００，０００倍高い可能性がある。逆に、ＡＢに対するＭＭの結合親和性は一般に、標的に対するＡＢの結合親和性よりも低い。ＡＢに対するＭＭの結合親和性は、標的に対するＡＢの結合親和性よりも少なくとも５、１０、２５、５０、１００、２５０、５００、１，０００、２，５００、５，０００、１０，０００、１００，０００、１，０００，０００又はさらに１０，０００，０００倍低い可能性がある。

【0088】

いくつかの実施形態では、ＡＢに対するＭＭの解離定数（Ｋｄ）は、標的に対するＡＢのＫｄとほぼ等しい。いくつかの実施形態では、ＡＢに対するＭＭの解離定数（Ｋｄ）は、標的に対するＡＢの解離定数以下である。

【0089】

いくつかの実施形態では、ＡＢに対するＭＭの解離定数（Ｋｄ）は、標的に対するＡＢの解離定数よりも低い。

【0090】

いくつかの実施形態では、ＡＢに対するＭＭの解離定数（Ｋｄ）は、標的に対するＡＢの解離定数よりも高い。

【0091】

いくつかの実施形態では、ＭＭは、標的へのＡＢの結合についてのＫｄ以下である、ＡＢへの結合についてのＫｄを有する。

【0092】

いくつかの実施形態では、ＭＭは、標的へのＡＢの結合についてのＫｄより低い、ＡＢへの結合についてのＫｄを有する。

【0093】

いくつかの実施形態では、ＭＭは、標的へのＡＢの結合についてのＫｄとほぼ等しい、ＡＢへの結合についてのＫｄを有する。

【0094】

いくつかの実施形態では、ＭＭは、標的へのＡＢの結合についてのＫｄ以上である、ＡＢへの結合についてのＫｄを有する。

【0095】

いくつかの実施形態では、ＭＭは、標的へのＡＢの結合についてのＫｄより高い、ＡＢへの結合についてのＫｄを有する。

【0096】

いくつかの実施形態では、ＡＢに対するＭＭの解離定数（Ｋ_ｄ）は、ＡＢが標的に結合するＫｄよりも２、３、４、５、１０、２５、５０、１００、２５０、５００、１，０００、２，５００、５，０００、１０，０００、５０，０００、１００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００倍若しくはそれを超えて、又は１～５、５～１０、１０～１００、１０～１，０００、１０～１０，０００、１０～１００，０００、１０～１，０００，０００、１０～１０，０００，０００、２５～５０、５０～２５０、１００～１，０００、１００～１０，０００、１００～１００，０００、１００～１，０００，０００、１００～１０，０００，０００、２５～５００、５００～２，５００、１，０００～１０，０００、１，０００～１００，０００、１，０００～１，０００，０００、１，０００～１０，０００，０００、２，５００～５，０００、５，０００～５０，０００、１０，０００～１００，０００、１０，０００～１，０００，０００、１０，０００～１０，０００，０００、５０，０００～５，０００，０００、１００，０００～１，０００，０００、又は１００，０００～１０，０００，０００倍高い。いくつかの実施形態では、ＭＭは、ＡＢが標的に結合するＫｄよりも１～５、２～５、２～１０、５～１０、５～２０、５～５０、５～１００、１０～１００、１０～１，０００、２０～１００、２０～１０００、又は１００～１，０００倍高い、ＡＢへの結合についてのＫｄを有する。

【0097】

いくつかの実施形態では、ＭＭは、標的に対するＡＢの結合親和性よりも低いＡＢへの結合親和性を有する。

【0098】

いくつかの実施形態では、ＭＭは、標的に対するＡＢの結合親和性以下であるＡＢへの結合親和性を有する。

【0099】

いくつかの実施形態では、ＭＭは、標的に対するＡＢの結合親和性とほぼ等しいＡＢへの結合親和性を有する。

【0100】

いくつかの実施形態では、ＭＭは、標的に対するＡＢの結合親和性以上のＡＢへの結合親和性を有する。

【0101】

いくつかの実施形態では、ＭＭは、標的に対するＡＢの結合親和性よりも高いＡＢへの結合親和性を有する。

【0102】

いくつかの実施形態では、ＭＭは、標的に対するＡＢの結合親和性よりも２、３、４、５、１０、２５、５０、１００、２５０、５００、又は１，０００倍低いＡＢへの結合親和性を有する。いくつかの実施形態では、ＭＭは、標的に対するＡＢの結合親和性よりも１～５、２～５、２～１０、５～１０、５～２０、５～２５、５～５０、５～１００、１０～１００、１０～１，０００、２０～１００、２０～１０００、２５～２５０、５０～５００、又は１００～１，０００倍低いＡＢへの結合親和性を有する。いくつかの実施形態では、ＭＭは、標的に対するＡＢの結合親和性よりも２～２０倍低いＡＢへの結合親和性を有する。いくつかの実施形態では、ＡＢと等モル濃度で、ＡＢに共有結合されないＭＭは、ＡＢの標的への結合を阻害しない。

【0103】

ＡＢがＭＭで修飾されかつ標的の存在下にある時、標的に対するＡＢの特異的結合は、ＭＭで修飾されていないＡＢの特異的結合又は標的に対する親ＡＢの特異的結合と比較して、低下されるか又は阻害される。ＭＭで修飾されていないＡＢの結合又は標的に対する親ＡＢの結合と比較して、ＭＭで修飾された場合、標的に結合するＡＢの能力は、インビボアッセイ又はインビトロアッセイで測定すると、少なくとも、２、４、６、８、１２、２８、２４、３０、３６、４８、６０、７２、８４、若しくは９６時間、又は５、１０、１５、３０、４５、６０、９０、１２０、１５０、若しくは１８０日、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２ヶ月以上の間、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、さらには１００％低下され得る。

【0104】

ＭＭは、標的へのＡＢの結合を阻害する。ＭＭは、ＡＢの抗原結合ドメインを結合し、ＡＢの標的への結合を阻害する。ＭＭは、標的へのＡＢの結合を立体的に阻害できる。ＭＭは、ＡＢの標的への結合をアロステリックに阻害できる。これらの実施形態では、ＡＢが、標的の存在下で、ＭＭによって修飾されるか又はＭＭと共役した場合、インビボアッセイ又はインビトロアッセイで測定すると、少なくとも２、４、６、８、１２、２８、２４、３０、３６、４８、６０、７２、８４、若しくは９６時間、又は５、１０、１５、３０、４５、６０、９０、１２０、１５０、若しくは１８０日、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２ヶ月以上の間、標的へのＡＢの結合はないか又は実質的にないか、又はＭＭで修飾されていないＡＢの結合、親ＡＢの結合、若しくはＭＭと共役していないＡＢの標的への結合と比較して、標的へのＡＢの結合は０.００１％、０.０１％、０.１％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、、３０％、３５％、４０％、又は５０％以下である。

【0105】

ＡＢがＭＭに共役されるか又はＭＭによって修飾される場合、ＭＭ「マスク」は、標的へのＡＢの特異的結合を低下させるか又はそうでなければ阻害する。ＡＢがＭＭに共役されるか又はＭＭによって修飾される場合、そのような共役又は修飾は、ＡＢがその標的に特異的に結合する能力を低下させるか又は阻害する構造的変化に影響を及ぼし得る。

【0106】

ＭＭに共役された又はＭＭで修飾されたＡＢは、以下の式（アミノ（Ｎ）末端領域からカルボキシル（Ｃ）末端領域への順で）：
（ＭＭ）－（ＡＢ）
（ＡＢ）－（ＭＭ）
（ＭＭ）－Ｌ－（ＡＢ）
（ＡＢ）－Ｌ－（ＭＭ）
（式中、ＭＭはマスキング部分であり、ＡＢは抗体又はその抗体断片であり、Ｌはリンカーである）によって表すことができる。多くの実施形態では、柔軟性を提供するために、１以上のリンカー、例えば、柔軟なリンカーを組成物に挿入することが望ましい場合がある。

【0107】

ある実施形態では、ＭＭは、ＡＢの天然の結合パートナーではない。いくつかの実施形態では、ＭＭは、ＡＢの任意の天然の結合パートナーに対する相同性を全く含まないか、又は実質的に含まない。いくつかの実施形態では、ＭＭは、ＡＢの任意の天然の結合パートナーと５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、又は８０％以下類似している。いくつかの実施形態では、ＭＭは、ＡＢの任意の天然の結合パートナーと５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、又は８０％以下同一である。いくつかの実施形態では、ＭＭは、ＡＢの任意の天然の結合パートナーと２５％以下同一である。いくつかの実施形態では、ＭＭは、ＡＢの天然の結合パートナーと５０％以下同一である。いくつかの実施形態では、ＭＭは、ＡＢの任意の天然の結合パートナーと２０％以下同一である。いくつかの実施形態では、ＭＭは、ＡＢの任意の天然の結合パートナーと１０％以下同一である。

【0108】

切断可能な部分（ＣＭ）
本明細書に提供される活性化可能な抗体は、切断可能な部分（ＣＭ）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭは、プロテアーゼ、通常は、細胞外プロテアーゼの基質であるアミノ酸配列を含む。適切な基質は、様々な公知の技術のいずれかを用いて同定できる。例えば、ペプチド基質は、その各内容が参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＤａｕｇｈｅｒｔｙらによる米国特許第７，６６６，８１７号、Ｓｔａｇｌｉａｎｏらによる米国特許第８，５６３，２６９号、及びＬａ ＰｏｒｔｅらによるＰＣＴ公開ＷＯ ２０１４／０２６１３６に記載の方法を用いて同定される（Ｂｏｕｌｗａｒｅら 迅速な加水分解動態を示すプロテアーゼのペプチド基質の進化的最適化（Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅａｓｅｓ ｔｈａｔ ｅｘｈｉｂｉｔ ｒａｐｉｄ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｋｉｎｅｔｉｃｓ） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．１０６．３（２０１０）：３３９－４６）も参照されたい）。

【0109】

いくつかの実施形態では、ＣＭを切断するプロテアーゼは、疾患組織で活性があり、例えば、上方制御されるか又はそうでなければ制御されず、プロテアーゼは、ＡＡがプロテアーゼに曝されたときにＡＡ中のＣＭを切断する。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、組織において標的と共局在し、プロテアーゼは、ＡＡがプロテアーゼにさらされたときにＡＡ中のＣＭを切断する。図１は、腫瘍特異的プロテアーゼが存在する腫瘍微小環境中で優先的に活性化される、活性化可能な抗体薬物コンジュゲートを示す。

【0110】

いくつかの実施形態では、ＡＡは、ＭＭによって修飾され１以上の切断可能な部分（ＣＭ）も含む、ＡＢを含む。そのようなＡＡは、ＡＢの標的に対して活性化可能な／切り替え可能な結合を示す。ＡＡは一般に、マスキング部分（ＭＭ）及び修飾可能又は切断可能な部分（ＣＭ）によって修飾されるか又は共役した抗体又は抗体断片（ＡＢ）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭは、少なくとも１つのプロテアーゼの基質として機能するアミノ酸配列を含む。

【0111】

いくつかの実施形態では、ＣＭは、最大１５個のアミノ酸長のポリペプチドである。

【0112】

いくつかの実施形態では、ＣＭは、少なくとも１つのマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）の基質である第１の切断可能な部分（ＣＭ１）及び少なくとも１つのセリンプロテアーゼ（ＳＰ）の基質である第２の切断可能な部分（ＣＭ２）を含むポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ＣＭ１－ＣＭ２基質のＣＭ１基質配列及びＣＭ２基質配列の各々は、独立して最大１５個のアミノ酸長のポリペプチドである。

【0113】

いくつかの実施形態では、そのアミノ酸配列が記載される、ＣＭはＣＭ１－ＣＭ２基質である：

【表4】

【0114】

ＡＡの要素が配置され、それによりＭＭ及びＣＭは、切断（又は比較的活性である）状態でかつ標的の存在下で、ＡＢが標的を結合し、一方でＡＡが標的の存在下で切断されない（又は比較的不活性である）状態にあるときは、ＡＢのその標的への特異的結合が低下されるか又は阻害されるように位置付けられる。ＡＢのその標的への特異的結合は、ＭＭによってその標的に特異的に結合するＡＢの能力の阻害又はマスキングにより低下させることができる。

【0115】

ＭＭ及びＣＭで修飾されたＡＢの標的に対するＫ_ｄは、ＭＭ及びＣＭで修飾されていないＡＢの標的に対するＫ_ｄ、又は親のＡＢの標的に対するＫ_ｄよりも、少なくとも５、１０、２５、５０、１００、２５０、５００、１，０００、２，５００、５，０００、１０，０００、５０，０００、１００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００倍若しくはそれを超えて、又は５～１０、１０～１００、１０～１，０００、１０～１０，０００、１０～１００，０００、１０～１，０００，０００、１０～１０，０００，０００、２５～５０、５０～２５０、１００～１，０００、１００～１０，０００、１００～１００，０００、１００～１，０００，０００、１００～１０，０００，０００，２５～５００、５００～２，５００、１，０００～１０，０００，１，０００～１００，０００，１，０００～１，０００，０００、１０００～１０，０００，０００、２，５００～５，０００、５，０００～５０，０００，１０，０００～１００，０００、１０，０００～１，０００，０００、１０，０００～１０，０００，０００、５０，０００～５，０００，０００、１００，０００～１，０００，０００、又は１００，０００～１０，０００，０００倍高い。逆に、ＭＭ及びＣＭで修飾されたＡＢの標的に対する結合親和性は、ＭＭ及びＣＭで修飾されていないＡＢの標的に対する結合親和性、又は親のＡＢの標的に対する結合親和性よりも、少なくとも５、１０、２５、５０、１００、２５０、５００、１，０００、２，５００、５，０００、１０，０００、５０，０００、１００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００倍若しくはそれを超えて、又は５～１０、１０～１００、１０～１，０００、１０～１０，０００、１０～１００，０００、１０～１，０００，０００、１０～１０，０００，０００、２５～５０、５０～２５０、１００～１，０００、１００～１０，０００、１００～１００，０００、１００～１，０００，０００、１００～１０，０００，０００、２５～５００、５００～２，５００、１，０００～１０，０００、１，０００～１００，０００、１，０００～１，０００，０００、１０００～１０，０００，０００、２，５００～５，０００、５，０００～５０，０００、１０，０００～１００，０００、１０，０００～１，０００，０００、１０，０００～１０，０００，０００、５０，０００～５，０００，０００、１００，０００～１，０００，０００、又は１００，０００～１０，０００，０００倍低い。

【0116】

ＡＢがＭＭ及びＣＭで修飾され、かつ標的の存在下にあるが修飾剤（例えば、少なくとも１つのプロテアーゼ）の存在下にない場合、ＡＢのその標的への特異的結合は、ＭＭ及びＣＭで修飾されていないＡＢの標的への特異的結合又は親ＡＢの標的への特異的結合と比較して低下されるか又は阻害される。親のＡＢのその標的への結合又はＭＭ及びＣＭで修飾されていないＡＢのその標的への結合と比較すると、ＭＭ及びＣＭで修飾された場合に、標的に結合するＡＢの能力は、インビボアッセイ又はインビトロアッセイで測定すると、少なくとも、２、４、６、８、１２、２８、２４、３０、３６、４８、６０、７２、８４、若しくは９６時間、又は５、１０、１５、３０、４５、６０、９０、１２０、１５０、若しくは１８０日、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２ヶ月以上の間、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、さらには１００％低下させることができる。

【0117】

本明細書で使用する場合、用語「切断状態」は、少なくとも１つのプロテアーゼによるＣＭの修飾後のＡＡの状態を指す。用語「非切断状態」は、本明細書で使用する場合、プロテアーゼによるＣＭ切断のないＡＡの状態を指す。上で説明したように、用語「活性化可能な抗体」は、その非切断（天然）状態とその切断状態の両方のＡＡを指すために本明細書で使用される。いくつかの実施形態では、切断されたＡＡがプロテアーゼによるＣＭ切断のためにＭＭを欠き、その結果、少なくともＭＭの放出が生じ得る（例えば、ＭＭが共有結合（例えば、システイン残基間のジスルフィド結合）によってＡＡに連結されていない場合）ことは、当業者には明らかであろう。

【0118】

活性化可能又は切り替え可能とは、ＡＡは、ＡＡが阻害されるか、マスクされるか又は非切断状態にある（すなわち、第１の立体構造）場合に標的に結合する第１のレベルと、阻害されず、マスクされず、かつ／又は切断された状態（すなわち、第２の立体構造）での標的に結合する第２のレベルを示すことを意味し、標的結合の第２のレベルは、第１の結合レベルよりも高い。一般に、ＡＡのＡＢへの標的のアクセスは、ＣＭを切断できる切断剤、すなわちプロテアーゼの存在下で、そのような切断剤の不在下よりも大きい。そのため、ＡＡが非切断状態の場合、ＡＢは標的結合から阻害され、標的結合からマスクされ得（すなわち、第１の立体構造はＡＢが標的を結合できないようなものであり）、切断状態では、ＡＢは標的結合を阻害されないか、又はマスクされない。

【0119】

ＡＡのＣＭ及びＡＢは、ＡＢが所与の標的に対する結合部分を表し、かつＣＭがプロテアーゼの基質を表すように選択される。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、対象における治療部位又は診断部位で標的と共局在化される。本明細書で使用する場合、共局在化は、同じ部位又は比較的近傍にあることを指す。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、ＣＭを切断し、切断部位の近くに位置する標的に結合する活性化可能な抗体をもたらす。本明細書で開示されるＡＡは、例えば、ＣＭ中の部位を切断できるプロテアーゼ、すなわちプロテアーゼが、非治療部位の組織（例えば、健康な組織）よりも治療部位又は診断部位の標的含有組織において比較的より高いレベルで存在する場合に、特に用いられる。いくつかの実施形態では、本開示のＣＭはまた、１以上の他のプロテアーゼによって切断される。いくつかの実施形態では、それは、標的と共局在化され、かつインビボでＣＭの切断を担う、１以上の他のプロテアーゼである。

【0120】

いくつかの実施形態では、ＡＡは、ＡＢがマスクされていないか、又はそうでなければ標的への結合を阻害された場合に、非治療部位でＡＢの結合から生じる可能性のある毒性及び／又は副作用を低下させる。

【0121】

一般に、ＡＡは、目的のＡＢを選択すること、およびＡＡの残りの部分を構築することによって設計でき、その結果、立体構造的に制限された場合に、ＭＭは、ＡＢをマスキングするか、又はその標的に対するＡＢの結合を低下させる。構造設計基準を考慮して、この機能的特徴を提供できる。

【0122】

阻害された立体構造と阻害されていない立体構造における標的結合についての所望のダイナミックレンジの切り替え可能な表現型を呈するＡＡが、提供される。ダイナミックレンジは一般に、（ａ）第１の条件設定下でのパラメータの最大検出レベル対（ｂ）第２の条件設定下でのパラメータの最小検出レベルの比率を指す。例えば、活性化可能な抗体の文脈において、ダイナミックレンジは、（ａ）ＡＡのＣＭを切断できる少なくとも１つのプロテアーゼの存在下でＡＡに結合する標的タンパク質の最大検出レベル対（ｂ）プロテアーゼの不在時にＡＡに結合する標的タンパク質の最小検出レベルの比率を指す。ＡＡのダイナミックレンジは、ＡＡ切断剤（例えば、酵素）処理の解離定数とＡＡ切断剤処理の解離定数の比率として計算できる。活性化可能な抗体のダイナミックレンジが大きいほど、活性化可能な抗体の切り替え可能な表現型は優れている。比較的高い（例えば、１より大きい）ダイナミックレンジ値を有するＡＡは、ＡＡによる標的タンパク質結合が切断剤の不在時よりもＡＡのＣＭを切断できる切断剤（例えば、酵素）の存在下でより大きな程度に生じる（例えば、主に生じる）ような、より望ましいスイッチング表現型を示す。

【0123】

ＣＭは、約０．００１～１５００×１０^４Ｍ^－１Ｓ^－１又は少なくとも０．００１、０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、２．５、５、７．５、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、２００、２５０、５００、７５０、１０００、１２５０、又は１５００×１０^４Ｍ^－１Ｓ^－１の速度で少なくとも１つのプロテアーゼによって特異的に切断される。いくつかの実施形態では、ＣＭは、約１００，０００Ｍ^－１Ｓ^－１の速度で特異的に切断される。いくつかの実施形態では、ＣＭは、約１×１０Ｅ２～約１×１０Ｅ６Ｍ^－１Ｓ^－１（すなわち、約１×１０^２～約１×１０^６Ｍ^－１Ｓ^－１）の速度で特異的に切断される。

【0124】

酵素による特異的切断のために、酵素とＣＭの間で接触が起きる。ＭＭ及びＣＭと共役したＡＢを含むＡＡが標的及び十分な酵素活性の存在下にある場合、ＣＭを切断できる。十分な酵素活性は、ＣＭと接触し効果的な切断を行う酵素の能力を指してよい。酵素はＣＭの近くにあり得るが、他の細胞因子又は酵素のタンパク質修飾が原因で切断できないことは、容易に想像できる。

【0125】

活性化可能な抗体の構造配置
本開示のＡＡは、様々な構造配置で提供できる。ＡＡの例示的な式を以下に示す。ＡＢ、ＭＭ及びＣＭのＮ末端からＣ末端への順は、活性化可能な抗体内で逆転してもよいことが特に企図される。例えば、ＣＭがＭＭ内に含まれるように、ＣＭとＭＭがアミノ酸配列内で重複してよいことも、特に企図される。

【0126】

例えば、ＡＡは、以下の式によって（アミノ（Ｎ）末端領域からカルボキシル（Ｃ）末端領域のへ順で）表すことができる：
（ＭＭ）－（ＣＭ）－（ＡＢ）
（ＡＢ）－（ＣＭ）－（ＭＭ）
式中、ＭＭはマスキング部分であり、ＣＭは切断可能な部分であり、ＡＢは抗体又はその断片である。ＭＭ及びＣＭは、上記の式において明確な成分として示されているが、本明細書で開示される全ての例示的な実施形態（式を含む）において、例えば、ＣＭがＭＭ内に完全に又は部分的に含まれるように、ＭＭ及びＣＭのアミノ酸配列が重複してよいことが企図されることに留意されたい。加えて、上記の式は、ＡＡ要素に対しＮ末端又はＣ末端に位置付けられ得る追加のアミノ酸配列を提供する。

【0127】

多くの実施形態では、ＭＭ－ＣＭ接合部、ＣＭ－ＡＢ接合部、又はその両方の１以上で柔軟性を提供するために、１以上のリンカー、例えば、柔軟なリンカーをＡＡ構築物に挿入することが望ましい場合がある。例えば、ＡＢ、ＭＭ、及び／又はＣＭは、所望の柔軟性を提供するのに十分な数の残基（例えば、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、特にＧｌｙ及びＳｅｒ、特にＧｌｙ）を含有しなくてよい。そのようなものとして、そのようなＡＡ構築物の切り替え可能な表現型は、柔軟なリンカーを提供するために、１以上のアミノ酸の導入から利益を得ることができる。加えて、後述するように、ＡＡが立体構造的に制限された構築物として提供される場合、柔軟なリンカーを作動可能に挿入して、切断されない活性化可能な抗体における環状構造の形成及び維持を容易にできる。

【0128】

いくつかの実施形態では、ＡＡは、第１の連結ペプチド（ＬＰ１）及び第２の連結ペプチド（ＬＰ２）を含み、非切断状態のＡＡは、以下のようにＮ末端からＣ末端へと構造配置：ＭＭ－ＬＰ１－ＣＭ－ＬＰ２－ＡＢ又はＡＢ－ＬＰ２－ＣＭ－ＬＰ１－ＭＭを有する。いくつかの実施形態では、２つの連結ペプチドは、互いに同一である必要はない。

【0129】

いくつかの実施形態では、ＬＰ１又はＬＰ２の少なくとも１つは、（ＧＳ）_ｎ、（ＧＧＳ）_ｎ、（ＧＳＧＧＳ）_ｎ(配列番号２２)及び（ＧＧＧＳ)_ｎ(配列番号２３)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ｎは少なくとも１の整数である。

【0130】

いくつかの実施形態では、ＬＰ１又はＬＰ２の少なくとも１つは、ＧＧＳＧ（配列番号２４）、ＧＧＳＧＧ（配列番号２５）、ＧＳＧＳＧ（配列番号２６）、ＧＳＧＧＧ（配列番号２７）、ＧＧＧＳＧ（配列番号２８）、及びＧＳＳＳＧ（配列番号２９）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0131】

いくつかの実施形態では、ＬＰ１は、アミノ酸配列ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧ（配列番号３０）、ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＧ（配列番号３１）、ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号３２）、ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号３３）、ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧ（配列番号３４）、又はＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＳ（配列番号３５）を含む。

【0132】

いくつかの実施形態では、ＬＰ２は、アミノ酸配列ＧＳＳ、ＧＧＳ、ＧＧＧＳ（配列番号３６）、ＧＳＳＧＴ（配列番号３７）又はＧＳＳＧ（配列番号３８）を含む。

【0133】

いくつかの実施形態では、ＡＢは、その標的への結合について約１００ｎＭ以下の解離定数を有する。

【0134】

例えば、ある実施形態では、ＡＡは、以下の式（式は、Ｎ末端からＣ末端方向又はＣ末端からＮ末端方向のいずれかでのアミノ酸配列を表す）：
（ＭＭ）－ＬＰ１－（ＣＭ）－（ＡＢ）
（ＭＭ）－（ＣＭ）－ＬＰ２－（ＡＢ）
（ＭＭ）－ＬＰ１－（ＣＭ）－ＬＰ２－（ＡＢ）
の１つを含み、ＭＭ、ＣＭ、及びＡＢは上で定義したとおりであり、ＬＰ１及びＬＰ２は各々独立して、任意に存在するか、又は存在せず、かつ少なくとも１つの柔軟なアミノ酸（例えば、Ｇｌｙ）を含む同じ又は異なる柔軟なリンカーである。加えて、上の式は、ＡＡ要素に対してＮ末端又はＣ末端に位置付けられ得る追加のアミノ酸配列を提供する。例としては、標的部分（例えば、標的組織に存在する細胞の受容体に対するリガンド）及び血清半減期延長部分（例えば、免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ）又は血清アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＡＳ）などの血清タンパク質を結合するポリペプチド））が挙げられるが、これらに限定されない。

【0135】

いくつかの実施形態では、ＡＡは、活性化状態又は切断状態で活性化可能な抗体が、プロテアーゼがＣＭを切断した後にＬＰ２及び／又はＣＭ配列の少なくとも一部を含む軽鎖アミノ酸配列を含むように、プロテアーゼに曝露され、それにより切断される。

【0136】

本明細書に記載の組成物での使用に適するリンカーは一般に、標的へのＡＢの結合の阻害を促進するために、修飾されたＡＢ又はＡＡの柔軟性を提供するものである。そのようなリンカーは一般に、柔軟なリンカーと呼ばれる。適切なリンカーは、容易に選択でき、１個のアミノ酸（例えば、Ｇｌｙ）～２０個のアミノ酸、２個のアミノ酸～１５個のアミノ酸、３個のアミノ酸～１２個のアミノ酸、４個のアミノ酸～１０個のアミノ酸、５個のアミノ酸～９個のアミノ酸、６個のアミノ酸～８個のアミノ酸、又は７個のアミノ酸～８個のアミノ酸などの、適切で異なる長さのいずれかのものであり得、かつ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０個のアミノ酸長であり得る。

【0137】

例示的な柔軟なリンカーは、グリシンポリマー（Ｇ）n、グリシン－セリンポリマー（例えば、（ＧＳ）n、（ＧＳＧＧＳ）n（配列番号２２）及び（ＧＧＧＳ）n（配列番号２３）を含み、ｎは少なくとも１の整数である）、グリシン－アラニンポリマー、アラニン－セリンポリマー、及び当技術分野で公知の他の柔軟なリンカーを含む。グリシン及びグリシン－セリンポリマーは、比較的構造不定であり、したがって、成分間の中性テザーとして機能できる。グリシンは、アラニンよりもｐｈｉ－ｐｓｉ空間にかなり近づき、より長い側鎖を有する残基よりもはるかに制限されていない（Ｓｃｈｅｒａｇａ，Ｒｅｖ．Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｍ．１１１７３－１４２（１９９２）参照）。例示的な柔軟なリンカーは、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ（配列番号２４）、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（配列番号２５）、Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ（配列番号２６）、Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（配列番号２７）、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ（配列番号２８）、Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ（配列番号２９）などを含むが、これらに限定されない。当業者は、ＡＡの設計は、全て柔軟な又は部分的に柔軟なリンカーを含めることができ、それによりリンカーは、柔軟性なリンカーならびに所望のＡＡ構造を提供するために柔軟性の低い構造を与える１以上の部分を含み得ることを認識するであろう。

【0138】

いくつかの実施形態では、ＡＡはシグナルペプチドも含む。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、スペーサーを介してＡＡにコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、スペーサーはシグナルペプチドの不在下でＡＡにコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、スペーサーは、活性化可能な抗体のＭＭに直接結合される。いくつかの実施形態では、スペーサーは、スペーサー－ＭＭ－ＣＭ－ＡＢのＮ末端からＣ末端への構造配置においてＡＡのＭＭに直接結合される。ＡＡのＭＭのＮ末端に直接結合されるスペーサーの例は、ＱＧＱＳＧＱ（配列番号３９）である。ＡＡのＭＭのＮ末端に直接結合されるスペーサーの他の例は、ＱＧＱＳＧＱＧ（配列番号１４）、ＱＧＱＳＧ（配列番号４０）、ＱＧＱＳ（配列番号４１）、ＱＧＱ、ＱＧ、及びＱを含む。ＡＡのＭＭのＮ末端に直接結合されるスペーサーの他の例は、ＧＱＳＧＱＧ（配列番号８７）、ＱＳＧＱＧ（配列番号８８）、ＳＧＱＧ（配列番号１１７）、ＧＱＧ、及びＧを含む。いくつかの実施形態では、スペーサーは、ＭＭのＮ末端に結合されない。いくつかの実施形態では、スペーサーは、少なくともアミノ酸配列ＱＧＱＳＧＱ（配列番号３９）を含む。いくつかの実施形態は、スペーサーは、少なくともアミノ酸配列ＱＧＱＳＧＱＧ（配列番号１４）を含む。いくつかの実施形態では、スペーサーは、少なくともアミノ酸配列ＱＧＱＳＧ（配列番号４０）を含む。いくつかの実施形態では、スペーサーは、少なくともアミノ酸配列ＱＧＱＳ（配列番号４１）を含む。いくつかの実施形態では、スペーサーは、少なくともアミノ酸配列ＱＧＱを含む。いくつかの実施形態では、スペーサーは、少なくともアミノ酸配列ＱＧを含む。いくつかの実施形態では、スペーサーは、少なくともアミノ酸残基Ｑを含む。いくつかの実施形態では、スペーサーは、少なくともアミノ酸配列ＧＱＳＧＱＧ（配列番号４２）を含む。いくつかの実施形態では、スペーサーは、少なくともアミノ酸配列ＱＳＧＱＧ（配列番号４３）を含む。いくつかの実施形態では、スペーサーは、少なくともアミノ酸配列ＳＧＱＧ（配列番号４４）を含む。いくつかの実施形態では、スペーサーは、少なくともアミノ酸配列ＧＱＧを含む。いくつかの実施形態では、スペーサーは、少なくともアミノ酸配列Ｇを含む。いくつかの実施形態では、スペーサーは存在しない。

【0139】

コンジュゲートされた活性化可能な抗体
本明細書で提供されるＡＡ組成物及び方法は、活性化可能な抗標的抗体の活性（例えば、マスキング、活性化又は結合の活性）を損なうことなく、ＡＢ中の１以上のシステイン残基（例えば、システイン、リジン）への１以上の薬剤の付着を可能にする。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物及び方法は、ＭＭ内の１以上のジスルフィド結合を低下させるか又はそうでなければ妨害することなく、ＡＢ中の１以上のシステイン残基に１以上の薬剤を付着することを可能にする。本明細書で提供される組成物及び方法は、１以上の薬剤、例えば、様々な治療薬、診断薬及び／又は予防薬のいずれかにコンジュゲートされる活性化可能な抗標的抗体を生成し、例えば、いくつかの実施形態では、薬剤（複数可）のいずれも、活性可能な抗標的抗体のＭＭにコンジュゲートされない。本明細書で提供される組成物及び方法は、ＭＭが非切断状態でＡＡのＡＢを効果的かつ効率的にマスクする能力を保持する、コンジュゲートされた活性化可能な抗標的抗体を生成する。本明細書で提供される組成物及び方法は、ＡＡが、ＣＭを切断できるプロテアーゼの存在下でなお活性化されている、すなわち、切断された、コンジュゲートされた活性化可能な抗標的抗体を生成する。

【0140】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＡＡは、活性化可能な抗体にコンジュゲートされた薬剤も含む。いくつかの実施形態では、コンジュゲートされる剤は、抗炎症剤及び／又は抗腫瘍剤などの、治療薬である。このような実施形態では、薬剤は、活性化可能な抗体の炭水化物部分にコンジュゲートされ、例えば、いくつかの実施形態では、炭水化物部分は、抗体の抗原結合領域又は活性化可能な抗体内の抗原結合断片の外側に位置する。いくつかの実施形態では、薬剤は、抗体又は活性化可能な抗体中の抗原結合断片のスルフヒドリル基にコンジュゲートされる。

【0141】

いくつかの実施形態では、薬剤は、毒素（例えば、細菌、真菌、植物、若しくは動物由来の酵素的に活性のある毒素、若しくはそれらの断片）などの細胞傷害性薬剤、又は放射性同位体（すなわち、放射性コンジュゲート）である。

【0142】

いくつかの実施形態では、薬剤は、例えば、標識又は他のマーカーなどの、検出可能な部分である。例えば、薬剤は、放射性標識アミノ酸、標識されたアビジン（例えば、光学的又は熱量的方法によって検出できる蛍光マーカー又は酵素活性を含むストレプトアビジン）によって検出できる１以上のビオチン部分、１以上の放射性同位元素若しくは放射性核種、１以上の蛍光標識、１以上の酵素標識、及び／又は１以上の化学発光剤であるか、又はそれらを含む。いくつかの実施形態では、検出可能な部分にはスペーサー分子が付着する。

【0143】

本開示はまた、毒素（例えば、細菌、真菌、植物、又は動物由来又はそれらの断片の酵素的に活性のある毒素）などの細胞傷害性薬剤、又は放射性同位体（すなわち、放射性コンジュゲート）にコンジュゲートされる抗体を含む免疫コンジュゲートに関する。適切な細胞傷害性薬剤は、例えば、ドラスタチン及びその誘導体（例えば、アウリスタチンＥ、ＡＦＰ、ＭＭＡＦ、ＭＭＡＥ、ＭＭＡＤ、ＤＭＡＦ、ＤＭＡＥ）を含む。例えば、薬剤は、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）又はモノメチルアウリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）である。いくつかの実施形態では、薬剤は、表１に列挙されるグループから選択される薬剤である。いくつかの実施形態では、薬剤は、ドラスタチンである。いくつかの実施形態では、薬剤は、アウリスタチン又はその誘導体である。いくつかの実施形態では、薬剤は、アウリスタチンＥ又はその誘導体である。いくつかの実施形態では、薬剤は、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）である。いくつかの実施形態では、薬剤は、モノメチルアウリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）である。いくつかの実施形態では、薬剤は、メイタンシノイド又はメイタンシノイド誘導体である。いくつかの実施形態では、薬剤は、ＤＭ１又はＤＭ４である。いくつかの実施形態では、薬剤は、デュオカルマイシン又はその誘導体である。いくつかの実施形態では、薬剤は、カリケアマイシン又はその誘導体である。いくつかの実施形態では、薬剤は、ピロロベンゾジアゼピンである。例示的な実施形態では、薬剤はＤＭ４である。

【0144】

いくつかの実施形態では、薬剤は、マレイミドカプロイル－バリン－シトルリン－リンカー又はマレイミドＰＥＧ－バリン－シトルリン－リンカーを用いてＡＢに連結される。いくつかの実施形態では、薬剤は、マレイミドカプロイル－バリン－シトルリン－リンカーを用いてＡＢに連結される。いくつかの実施形態では、薬剤は、マレイミドＰＥＧ－バリン－シトルリン－リンカーを用いてＡＢに連結される。いくつかの実施形態では、薬剤は、マレイミドＰＥＧ－バリン－シトルリン－パラアミノベンジルオキシカルボニルリンカーを用いてＡＢに連結されるモノメチルアウリスタチンＤ（ＶＣ－ＭＭＡＤ）であり、このリンカーペイロード構築物は、本明細書で「ｖｃ－ＭＭＡＤ」と呼ばれる。いくつかの実施形態では、薬剤は、マレイミドＰＥＧ－バリン－シトルリン－パラアミノベンジルオキシカルボニルリンカーを用いてＡＢに連結されたモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）であり、このリンカーペイロード構築物は、本明細書で「ｖｃ－ＭＭＡＥ」と呼ばれる。いくつかの実施形態では、薬剤は、マレイミドＰＥＧ－バリン－シトルリン－リンカーを用いてＡＢに連結される。いくつかの実施形態では、薬剤は、マレイミドビス－ＰＥＧ－バリン－シトルリン－パラアミノベンジルオキシカルボニルリンカーを用いてＡＢに連結されるモノメチルアウリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）であり、このリンカーペイロード構築物は、本明細書で「ＰＥＧ２－ｖｃ－ＭＭＡＤ」と呼ばれる。ｖｃ－ＭＭＡＤ、ｖｃ－ＭＭＡＥ、及びＰＥＧ２－ｖｃ－ＭＭＡＤの構造を、以下に示す：
ｖｃ－ＭＭＡＤ

【化1】

ｖｃ－ＭＭＡＥ

【化2】

ＰＥＧ２－ｖｃ－ＭＭＡＤ

【化3】

【0145】

例示的な実施形態では、薬剤は、リジンを介してＡＡにコンジュゲートされる。例示的な実施形態では、ＳＰＤＢ－ＤＭ４は、ＡＡ上のリジンのイプシロンアミノ基、例えば、リジンのイプシロンアミノ基を介して活性化可能な抗体に付着される。

【0146】

例示的な実施形態では、薬剤はＤＭ４であり、リンカー－ＤＭは以下のとおりである：

【化4】

【0147】

本開示はまた、モノメチルアウリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）ペイロードに結合されたＡＡを含むコンジュゲートＡＡを提供し、ＡＡは、標的に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片（ＡＢ）と、非切断状態のＡＡのＡＢの標的への結合を阻害するマスキング部分（ＭＭ）と、ＡＢと共役した切断可能な部分（ＣＭ）であって、少なくとも１つのＭＭＰプロテアーゼの基質として機能するポリペプチドである、ＣＭを含む。

【0148】

いくつかの実施形態では、ＭＭＡＤコンジュゲートＡＡは、ＡＢに薬剤を付着させるいくつかの方法：（ａ）ＡＢの炭水化物部分への付着、又は（ｂ）ＡＢのスルフヒドリル基への付着、又は（ｃ）ＡＢのアミノ基への付着、又は（ｄ）ＡＢのカルボキシ基への付着のいずれかを用いてコンジュゲートできる。

【0149】

いくつかの実施形態では、ＭＭＡＤペイロードは、リンカーを介してＡＢにコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、ＭＭＡＤペイロードは、リンカーを介してＡＢ中のシステインにコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、ＭＭＡＤペイロードは、リンカーを介してＡＢ中のリジンにコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、ＭＭＡＤペイロードは、本明細書で開示される残基などの、ＡＢの別の残基にリンカーを介してコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、リンカーは、チオール含有リンカーである。いくつかの実施形態では、リンカーは、切断可能なリンカーである。いくつかの実施形態では、リンカーは、切断可能でないリンカーである。いくつかの実施形態では、リンカーは、表６及び７に示すリンカーからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＡＡ及びＭＭＡＤペイロードは、マレイミドカプロイル－バリン－シトルリンリンカーを介して連結される。いくつかの実施形態では、ＡＡ及びＭＭＡＤペイロードは、マレイミドＰＥＧ－バリン－シトルリンリンカーを介して連結される。いくつかの実施形態では、ＡＡ及びＭＭＡＤペイロードは、マレイミドカプロイル－バリン－シトルリン－パラアミノベンジルオキシカルボニルリンカーを介して連結される。いくつかの実施形態では、ＡＡ及びＭＭＡＤペイロードは、マレイミドＰＥＧ－バリン－シトルリン－パラアミノベンジルオキシカルボニルリンカーを介して連結される。いくつかの実施形態では、ＭＭＡＤペイロードは、本明細書に開示される部分的還元及びコンジュゲーション技術を用いてＡＢにコンジュゲートされる。

【0150】

いくつかの実施形態では、本開示のリンカーのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）成分は、２エチレングリコールモノマー、３エチレングリコールモノマー、４エチレングリコールモノマー、５エチレングリコールモノマー、６エチレングリコールモノマー、７エチレングリコールモノマー、８エチレングリコールモノマー、９エチレングリコールモノマー、又は少なくとも１０エチレングリコールモノマーから形成される。本開示のいくつかの実施形態では、ＰＥＧ成分は、分岐ポリマーである。本開示のいくつかの実施形態では、ＰＥＧ成分は、非分岐ポリマーである。いくつかの実施形態では、ＰＥＧポリマー成分は、アミノ基又はその誘導体、カルボキシル基又はその誘導体、又はアミノ基若しくはその誘導体とカルボキシル基若しくはその誘導体の両方で官能化される。

【0151】

いくつかの実施形態では、本開示のリンカーのＰＥＧ成分は、アミノテトラエチレングリコールカルボキシル基又はその誘導体である。いくつかの実施形態では、本開示のリンカーのＰＥＧ成分は、アミノトリエチレングリコールカルボキシル基又はその誘導体である。いくつかの実施形態では、本開示のリンカーのＰＥＧ成分は、アミノジエチレングリコールカルボキシル基又はその誘導体である。いくつかの実施形態では、アミノ誘導体は、それがコンジュゲートされるアミノ基とカルボキシル基の間のアミド結合の形成である。いくつかの実施形態では、カルボキシル誘導体は、それがコンジュゲートされるカルボキシル基とアミノ基の間のアミド結合の形成である。いくつかの実施形態では、カルボキシル誘導体は、それがコンジュゲートされるカルボキシル基とヒドロキシル基の間のエステル結合の形成である。

【0152】

使用できる酵素活性のある毒素及びその断片は、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素Ａ鎖（緑膿菌由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ－サルシン、シナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンチンタンパク質、フィトラッカ・アメリカーナタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ－Ｓ）、ツルレイシ（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、クルシン、クロチン、サポナリアオフィシナリス（ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ゲロニン、ミトジェリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、及びトリコテセンを含む。様々な放射性核種は、放射性コンジュゲート抗体の生成に利用可能である。例としては、^２１２Ｂｉ、^１３１Ｉ、^１３１Ｉｎ、^９０Ｙ、及び^１８６Ｒｅが挙げられる。

【0153】

抗体及び細胞傷害性薬剤のコンジュゲートは、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオール）プロピオン酸（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能誘導体（ジメチルアジピミデートＨＣＬなど）、活性エステル（スベリン酸ジスクシンイミジルなど）、アルデヒド類（グルタルアルデヒドなど）、ビス－アジド化合物（ビス（ｐ－アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス－ジアゾニウム誘導体（ビス－（ｐ－ジアゾニウムベンゾイル）エチレンジアミン、ジイソシアネート（トリレン－２，６－ジイソシアネートなど）、及びビス活性フッ素化合物（１，５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼン）などの様々な二官能性タンパク質共役剤を用いて作製される。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：１０９８（１９８７）に記載されているように調製できる。炭素１４標識１－イソチオシアネートベンジル－３－メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ－ＤＴＰＡ）は、抗体への放射性核種のコンジュゲーションのための例示的なキレート化剤である。（ＷＯ９４／１１０２６参照）。

【0154】

本明細書に記載の開示で採用され得る例示的な医薬品の一部を表１に列挙するが、決して網羅的な列挙を意味するものではない。

【0155】

表１：コンジュゲーションのための例示的な医薬品

【表5】

【0156】

当業者は、多種多様な可能性のある部分を、結果として得られる本開示の抗体に結合できることを認識するだろう（例えば、「コンジュゲートワクチン（Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｖａｃｃｉｎｅｓ）」、Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ ｔｏ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊ．Ｍ．Ｃｒｕｓｅ及びＲ．Ｅ．Ｌｅｗｉｓ，Ｊｒ（編），Ｃａｒｇｅｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９８９）を参照されたく、その内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0157】

いくつかの実施形態では、ＡＡは、薬剤の１以上の同等物にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、ＡＡは、薬剤の１つの同等物にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、ＡＡは、薬剤の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１０超の同等物にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、ＡＡは、コンジュゲート剤の均一な数の同等物を有するＡＡの混合物の一部である。いくつかの実施形態では、ＡＡは、コンジュゲート剤の不均一な数の同等物を有するＡＡの混合物の一部である。いくつかの実施形態では、ＡＡの混合物は、各ＡＡにコンジュゲートされる薬剤の平均数が、０～１、１～２、２～３、３～４、４～５、５～６、６～７、７～８、８～９、９～１０、及び１０を超えるようなものである。いくつかの実施形態では、ＡＡの混合物は、各ＡＡにコンジュゲートされる薬剤の平均数が１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれを超えるようなものである。いくつかの実施形態では、各ＡＡにコンジュゲートされる薬剤の平均数が３～４であるようなＡＡの混合物がある。いくつかの実施形態では、各ＡＡにコンジュゲートされる薬剤の平均数が３.４～３.８であるようなＡＡの混合物がある。いくつかの実施形態では、各ＡＡにコンジュゲートされる薬剤の平均数が３.４～３.６であるようなＡＡの混合物がある。いくつかの実施形態では、ＡＡは、活性化可能な抗体の元のアミノ酸配列に対してリジン及び／又はシステイン残基の数が増加又は減少し、そのため、いくつかの実施形態では、活性化可能な抗体にコンジュゲートできる薬剤の数を対応して増加又は減少させるか、又はいくつかの実施形態では、部位特異的にＡＡへの薬剤のコンジュゲーションを制限するような、１以上の部位特異的アミノ酸配列修飾を含む。いくつかの実施形態では、修飾されるＡＡは、部位特異的な方法で１以上の非天然アミノ酸で修飾され、そのためいくつかの実施形態では、非天然アミノ酸の部位にのみ薬剤のコンジュゲーションを制限する。

【0158】

コンジュゲートされた活性化可能な抗体を生成するための組成物と方法
活性化可能な抗標的抗体は、薬剤に対して少なくとも１つのコンジュゲーションの位置を有する（コンジュゲートＡＡを生成するために）。いくつかの実施形態では、コンジュゲーションの全ての可能な位置が使用されるわけではない。いくつかの実施形態では、天然の接触位置のいくつかは、変更又は除去されて、もはや薬剤へのコンジュゲーションに利用できない。いくつかの実施形態では、コンジュゲーションの１以上の位置は、リジンのイプシロンアミノ基などの、窒素原子である。

【0159】

いくつかの実施形態では、コンジュゲーションの１以上の位置は、ジスルフィド結合に関与する硫黄原子である。いくつかの実施形態では、コンジュゲーションの１以上の位置は、鎖間ジスルフィド結合に関与する硫黄原子である。いくつかの実施形態では、コンジュゲーションの１以上の位置は、鎖間スルフィド結合に関与する硫黄原子であるが、鎖内ジスルフィド結合に関与する硫黄原子ではない。いくつかの実施形態では、コンジュゲーションの１以上の位置は、システインの硫黄原子又は硫黄原子を含む他のアミノ酸残基の硫黄原子である。そのような残基は、抗体構造中に自然に存在し得るか、又は部位特異的突然変異誘発、化学的転換、又は非天然アミノ酸の誤った組み込みによって抗体に組み込まれ得る。

【0160】

ＡＢ中に１以上の鎖間ジスルフィド結合とＭＭ中に１以上の鎖内ジスルフィド結合を有する活性化可能な抗標的抗体のコンジュゲートを調製する方法も提供され、遊離チオールと反応する薬物が提供される。本方法は一般に、例えば、ＴＣＥＰなどの還元剤を用いてＡＡ中の鎖間ジスルフィド結合を部分的に還元すること、及び部分的に還元された活性化可能な抗体に遊離チオールと反応する薬物をコンジュゲートすることを含む。本明細書で使用する場合、部分還元という用語は、活性化可能な抗標的抗体が還元剤と接触され、全てのジスルフィド結合未満、例えば、コンジュゲーションの全ての可能な部位未満が還元される状態を指す。いくつかの実施形態では、コンジュゲーションの全ての可能な部位の９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％又は５％未満が、還元される。

【0161】

さらに他の実施形態では、薬剤、例えば、薬物を還元し、薬剤の配置に選択性をもたらす活性化可能な抗標的抗体にコンジュゲートする方法が提供される。本方法は一般に、ＡＡのマスキング部分又は他の非ＡＢ部分の任意のコンジュゲーション部位が還元されないように、活性化可能な抗標的抗体を還元剤で部分的に還元すること、およびＡＢ中の鎖間チオールに薬剤をコンジュゲートすることを含む。コンジュゲーション部位（複数可）は、所望の部位でコンジュゲーションを行えるように、薬剤の所望の配置を可能にするように選択される。還元剤は、例えば、ＴＣＥＰである。例えば、活性化可能な抗体に対する還元剤の比率、インキュベーションの長さ、インキュベーション中の温度、還元反応溶液のｐＨなどの還元反応条件は、ＭＭが非切断状態でＡＡのＡＢを効果的かつ効率的にマスクする能力を保持する、コンジュゲートＡＡを生成する条件を特定することによって決定される。活性化可能な抗標的抗体に対する還元剤の比率は、活性化可能な抗体によって異なる。いくつかの実施形態では、活性化可能な抗標的抗体に対する還元剤の比率は、約２０：１～１：１、約１０：１～１：１、約９：１～１：１、約８：１～１：１、約７：１～１：１、約６：１～１：１、約５：１～１：１、約４：１～１：１、約３：１～１：１、約２：１～１：１、約２０：１～１：１.５、約１０：１～１：１.５、約９：１～１：１.５、約８：１～１：１.５、約７：１～１：１.５、約６：１～１：１.５、約５：１～１：１.５、約４：１～１：１.５、約３：１～１：１.５、約２：１～１：１.５、約１.５：１～１：１.５、又は約１：１～１：１.５の範囲である。いくつかの実施形態では、比は約５：１～１：１の範囲である。いくつかの実施形態では、比は約５：１～１.５：１の範囲である。いくつかの実施形態では、比は約４：１～１：１の範囲である。いくつかの実施形態では、比は約４：１～１.５：１の範囲である。いくつかの実施形態では、比は約８：１～約１：１の範囲である。いくつかの実施形態では、比は約２．５：１～１：１の範囲である。

【0162】

いくつかの実施形態では、活性化可能な抗標的抗体のＡＢ中の鎖間ジスルフィド結合を還元し、かつＡＢ上に薬剤（複数可）を選択的に位置付けるために薬剤、例えば、薬物などのチオール含有剤を得られた鎖間チオールにコンジュゲートする方法が提供される。本方法は一般に、還元剤でＡＢを部分的に還元して、活性化可能な抗体中で全ての可能な鎖間チオールを形成することなく少なくとも２つの鎖間チオールを形成すること；及び部分的に還元したＡＢの鎖間チオールに薬剤をコンジュゲートさせることを含む。例えば、ＡＡのＡＢを、還元剤：活性化可能な抗体の所望の比で、約３７℃で約１時間、部分的に還元する。いくつかの実施形態では、ＡＡに対する還元剤の比率は、約２０：１～１：１、約１０：１～１：１、約９：１～１：１、約８：１～１：１、約７：１～１：１、約６：１～１：１、約５：１～１：１、約４：１～１：１、約３：１～１：１、約２：１～１：１、約２０：１～１：１.５、約１０：１～１：１.５、約９：１～１：１.５、約８：１～１：１.５、約７：１～１：１.５、約６：１～１：１.５、約５：１～１：１.５、約４：１～１：１.５、約３：１～１：１.５、約２：１～１：１.５、約１.５：１～１：１.５、又は約１：１～１：１.５の範囲である。いくつかの実施形態では、比は約５：１～１：１の範囲である。いくつかの実施形態では、比は約５：１～１.５：１の範囲である。いくつかの実施形態では、比は約４：１～１：１の範囲である。いくつかの実施形態では、比は約４：１～１.５：１の範囲である。いくつかの実施形態では、比は約８：１～１：１の範囲である。いくつかの実施形態では、比は約２．５：１～１：１の範囲である。

【0163】

チオール含有試薬は、例えば、システイン又はＮ－アセチルシステインであり得る。還元剤は、例えば、ＴＣＥＰであり得る。いくつかの実施形態では、還元されたＡＡは、例えば、カラムクロマトグラフィー、透析、又は透析濾過を用いて、コンジュゲーション前に精製できる。あるいは、還元された抗体は、部分的還元後及びコンジュゲーション前に精製されない。

【0164】

本発明はまた、ＡＡ中の少なくとも１つの鎖間ジスルフィド結合が、活性化可能な抗体内の任意の鎖内ジスルフィド結合を妨げることなく還元剤で還元された、部分的に還元された活性化可能な抗標的抗体を提供し、ＡＡは、標的に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片（ＡＢ）と、非切断状態でＡＡのＡＢの標的への結合を阻害するマスキング部分（ＭＭ）と、ＡＢと共役した切断可能な部分（ＣＭ）を含み、ＣＭは、プロテアーゼの基質として機能するポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ＭＭは、ＣＭを介してＡＢと共役される。いくつかの実施形態では、ＡＡの１以上の鎖内ジスルフィド結合（複数可）は、還元剤によって妨げられない。いくつかの実施形態では、ＡＡ中のＭＭの１以上の鎖内ジスルフィド結合（複数可）は、還元剤によって妨げられない。いくつかの実施形態では、非切断状態のＡＡは、以下のようにＮ末端からＣ末端への構造的配置：ＭＭ－ＣＭ－ＡＢ又はＡＢ－ＣＭ－ＭＭを有する。いくつかの実施形態では、還元剤は、ＴＣＥＰである。

【0165】

本開示はまた、ＡＡ中の少なくとも１つの鎖間ジスルフィド結合が、活性化可能な抗体中の任意の鎖内ジスルフィド結合を妨げることなく還元剤で還元された、部分的に還元されたＡＡを提供し、ＡＡは、標的、例えば、ＣＤ１６６に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片（ＡＢ）と、非切断状態でＡＡのＡＢの標的への結合を阻害するマスキング部分（ＭＭ）と、ＡＢと共役した切断可能な部分（ＣＭ）を含み、ＣＭは、少なくとも１種のプロテアーゼの基質として機能するポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ＭＭは、ＣＭを介してＡＢと共役される。いくつかの実施形態では、ＡＡの１以上の鎖内ジスルフィド結合（複数可）は、還元剤によって妨げられない。いくつかの実施形態では、ＡＡ内のＭＭの１以上の鎖内ジスルフィド結合（複数可）は、還元剤によって妨げられない。いくつかの実施形態では、非切断状態のＡＡは、以下のようにＮ末端からＣ末端への構造的配置：ＭＭ－ＣＭ－ＡＢ又はＡＢ－ＣＭ－ＭＭを有する。いくつかの実施形態では、還元剤は、ＴＣＥＰである。

【0166】

さらに他の実施形態では、薬剤、例えば、薬物を還元し、活性化可能な抗標的抗体にコンジュゲートする方法であって、リジン及び／又はシステイン残基の定義された数及び位置を有する活性化可能な抗標的抗体を提供することにより、薬剤の配置に選択性をもたらす方法。いくつかの実施形態では、リジン及び／又はシステイン残基の定義された数は、親抗体又は活性化可能な抗体のアミノ酸配列中の対応する残基の数よりも多いか、又は少ない。いくつかの実施形態では、定義された数のリジン及び／又はシステイン残基は、抗標的抗体又は活性化可能な抗標的抗体にコンジュゲートできる、定義された数の薬剤同等物をもたらし得る。いくつかの実施形態では、定義された数のリジン及び／又はシステイン残基は、部位特異的に抗標的抗体又は活性化可能な抗標的抗体にコンジュゲートできる、定義された数の薬剤同等物をもたらし得る。いくつかの実施形態では、修飾Ａは、部位特異的に１以上の非天然アミノ酸で修飾され、そのため、いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸の部位にのみ薬剤のコンジュゲーションを制限する。いくつかの実施形態では、リジン及び／又はシステイン残基の定義された数及び位置を有する抗標的抗体又は活性化可能な抗標的抗体は、ＡＡのマスキング部分又は他の非ＡＢ部分の任意のコンジュゲーション部位が還元されないように、本明細書で論じる還元剤で部分的に還元され、ＡＢ中の鎖間チオールに薬剤をコンジュゲートし得る。

【0167】

共役は、抗体と他の部分がそれぞれの活性を保持する限り、２つの分子を結合する任意の化学反応によって達成され得る。この連結は、多くの化学機構、例えば、共有結合、親和性結合、インターカレーション、配位結合及び錯体化を含む。しかし、いくつかの実施形態では、結合は、共有結合である。共有結合は、既存の側鎖の直接凝縮又は外の架橋分子の組み込みのいずれかによって達成できる。多くの二価又は多価の連結剤は、本開示の抗体などのタンパク質分子を他の分子と共役するのに有用である。例えば、代表的な共役剤は、チオエステル、カルボジイミド、スクシンイミドエステル、ジイソシアネート、グルタルアルデヒド、ジアゾベンゼン及びヘキサメチレンジアミンなどの有機化合物を含んでよい。この列挙は、当技術分野で公知の様々なクラスの共役剤を網羅することを意図したものではなく、むしろ、より一般的な共役剤の例示である（Ｋｉｌｌｅｎ及びＬｉｎｄｓｔｒｏｍ，Ｊｏｕｒ．Ｉｍｍｕｎ．１３３：１３３５－２５４９（１９８４）；Ｊａｎｓｅｎら，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ６２：１８５－２１６（１９８２）；及びＶｉｔｅｔｔａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：１０９８（１９８７）参照）。

【0168】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物及び方法に加えて、コンジュゲートＡＡは、ＡＡ配列に挿入又は他の方法で含まれる改変アミノ酸配列を介した部位特異的コンジュゲーションのために改変されてもよい。これらの改変アミノ酸配列は、活性化可能なコンジュゲート抗体内のコンジュゲート剤の配置及び／又は投与量を制御できるように設計される。例えば、ＡＡは、反応性チオール基を提供し、かつタンパク質のフォールディング及びアセンブリに悪影響を及ぼさず、抗原結合も変えない軽鎖及び重鎖上の位置でシステイン置換を含むように操作できる。いくつかの実施形態では、ＡＡは、コンジュゲーションに適する部位を提供するために、ＡＡ内の１以上の非天然アミノ酸残基を含むか、又はそうでなければ導入するために操作できる。いくつかの実施形態では、ＡＡは、ＡＡ配列内に酵素的に活性化可能なペプチド配列を含むか、又はそうでなければ導入するために操作できる。

【0169】

適切なリンカーが、文献に記載されている（例えば、ＭＢＳ（Ｍ－マレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルの使用を説明するＲａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ，Ｓ．ら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４４：２０１－２０８（１９８４）を参照されたい。オリゴペプチドリンカーによって抗体と共役させたハロゲン化アセチルヒドラジド誘導体の使用を説明する、米国特許第５，０３０，７１９号も参照されたい。いくつかの実施形態では、適切なリンカーは、（ｉ）ＥＤＣ（１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩；（ｉｉ）ＳＭＰＴ（４－スクシンイミジルオキシカルボニル－アルファ－メチル－アルファ－（２－ピリジルジチオ）－トルエン（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，カタログ番号（２１５５８Ｇ）；（ｉｉｉ）ＳＰＤＰ（スクシンイミジル－６［３－（２－ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエート（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ.Ｃｏ.，カタログ番号２１６５１Ｇ）；（ｉｖ）スルホ－ＬＣ－ＳＰＤＰ（スルホスクシンイミジル６［３－（２－ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエート（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ.Ｃｏ.カタログ番号２１６５－Ｇ）；及び（ｖ）ＥＤＣにコンジュゲートされたスルホ－ＮＨＳ（Ｎ－ヒドロキシスルホ－スクシンイミド：Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ.Ｃｏ.カタログ番号２４５１０）が含まれる。追加のリンカーには、ＳＭＣＣ（（スクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート）、スルホ－ＳＭＣＣ（スルホスクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート、ＳＰＤＢ（Ｎ－スクシンイミジル－４－（２－ピリジルジチオ）ブタノエート）、又はスルホ－ＳＰＤＢ（Ｎ－スクシンイミジル－４－（２－ピリジルジチオ）－２－スルホブタノエート）を含むが、これらに限定されない。

【0170】

上記のリンカーは、異なる属性を有する成分を含み、そのため、異なる物理化学的性質を有するコンジュゲートをもたらす。例えば、アルキルカルボキシレートのスルホ－ＮＨＳエステルは、芳香族カルボキシレートのスルホ－ＮＨＳエステルよりも安定である。リンカーを含むＮＨＳエステルは、スルホ－ＮＨＳエステルよりも可溶性が低い。さらに、リンカーＳＭＰＴは、立体的に妨げられたジスルフィド結合を含有し、安定性が増加したコンジュゲートを形成できる。ジスルフィド結合は、一般的に、ジスルフィド結合がインビトロで切断されるため他の結合よりも安定性が低く、その結果、利用可能なコンジュゲートをそれほどもたらさない。スルホ－ＮＨＳは、特に、カルボジイミド共役の安定性を高めることができる。カルボジイミド共役（ＥＤＣなど）は、スルホ－ＮＨＳと併用すると、カルボジイミド共役反応単独よりも加水分解に対して耐性のあるエステルを形成する。例示的な実施形態では、リンカーは、ＳＰＤＢである。別の例示的な実施形態では、リンカーはＳＰＤＢであり、薬剤はＤＭ４である。

【0171】

いくつかの実施形態では、リンカーは、切断可能である。いくつかの実施形態では、リンカーは、切断可能でない。いくつかの実施形態では、２以上のリンカーが存在する。２以上のリンカーは、全て同じである、すなわち、切断可能である又は切断できず、又は２以上のリンカーは異なる、すなわち、少なくとも１つは切断可能であり、少なくとも１つは切断可能でない。

【0172】

本開示は、ＡＢに薬剤を付着させるいくつかの方法：（ａ）ＡＢの炭水化物部分への付着、又は（ｂ）ＡＢのスルフヒドリル基への付着、又は（ｃ）ＡＢのアミノ基への付着、又は（ｄ）ＡＢのカルボキシレート基への付着、を利用する。本開示によれば、ＡＢは、１つはＡＢと反応し、もう１つは薬剤と反応する少なくとも２つの反応基を有する中間リンカーを介して薬剤に共有結合され得る。リンカーは、任意の適合性のある有機化合物を含んでよく、ＡＢ（又は薬剤）との反応がＡＢ反応性及び選択性に悪影響を及ぼさないように選択できる。さらに、リンカーの薬剤への付着は、薬剤の活性を破壊しない可能性がある。酸化抗体又は酸化抗体断片との反応に適するリンカーは、１級アミン、２級アミン、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシルアミン、フェニルヒドラジン、セミカルバジド及びチオセミカルバジド基からなる群から選択されるアミンを含むものを含む。そのような反応性官能基は、リンカーの構造の一部として存在してもよく、又はそのような基を含まないリンカーの適切な化学修飾によって導入されてもよい。

【0173】

本開示によれば、還元されたＡＢへの付着に適するリンカーは、還元抗体又は断片のスルフヒドリル基と反応できる特定の反応基を有するものを含む。そのような反応性基は、反応性ハロアルキル基（例えば、ハロアセチル基を含む）、p－水銀安息香酸基及びマイケル型付加反応が可能な基（例えば、マレイミド、並びにＭｉｔｒａ及びＬａｗｔｏｎ，１９７９，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０１：３０９７－３１１０に記載の種類の基を含む）を含むが、これらに限定されない。

【0174】

本開示によれば、酸化も還元もされないＡｂへの付着に適するリンカーは、Ａｂ中の非修飾リジン残基に存在する１級アミノ基と反応できる特定の官能基を有するものを含む。そのような反応性基は、ＮＨＳカルボキシルエステル又は炭酸エステル、スルホ－ＮＨＳカルボキシルエステル又は炭酸エステル、４－ニトロフェニルカルボキシルエステル又は炭酸エステル、ペンタフルオロフェニルカルボキシルエステル又は炭酸エステル、アシルイミダゾール、イソシアネート、及びイソチオシアネートを含むが、これらに限定されない。

【0175】

本開示によれば、酸化も還元もされないＡｂへの付着に適するリンカーは、適切な試薬で活性化されている、Ａｂ中のアスパラギン酸又はグルタミン酸残基に存在するカルボン酸基と反応できる特定の官能基を有するものを含む。適切な活性化試薬は、ＮＨＳ又はスルホ－ＮＨＳの付加の有無にかかわらないＥＤＣ、及びカルボキサミド形成に利用される他の脱水剤を含む。これらの例では、適切なリンカーに存在する官能基は、１級及び２級アミン、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、及びヒドラジドを含む。

【0176】

薬剤は、リンカーがＡＢに付着する前又は後に、リンカーに付着されてよい。ある適用では、リンカーが関連薬剤を含まない、ＡＢ－リンカー中間体を最初に生成することが望ましい場合がある。特定の用途に応じて、特異的薬剤が次いで、リンカーに共有結合され得る。いくつかの実施形態では、ＡＢを、ＭＭ、ＣＭ及び関連リンカーに最初に付着させ、次いで、コンジュゲーション目的のためにリンカーに付着させる。

【0177】

分岐リンカー：具体的な実施形態では、薬剤の付着のための複数の部位を有する分岐リンカーが利用される。複数部位のリンカーの場合、ＡＢへの単一共有結合は、いくつかの部位で薬剤を結合できるＡＢ－リンカー中間体をもたらし得る。部位は、アルデヒド基又はスルフヒドリル基、又は薬剤が付着できる任意の化学部位であり得る。

【0178】

いくつかの実施形態では、より高い比活性（又はＡＢに対する薬剤のより高い比率）は、ＡＢ上の複数の部位での単一部位リンカーの付着によって達成できる。この複数の部位は、２つの方法のいずれかによってＡＢに導入され得る。最初に、同じＡＢ中に複数のアルデヒド基及び／又はスルフヒドリル基を生成してよい。第２に、リンカーへのその後の付着のための複数の官能基部位を有する「分岐リンカー」を、ＡＢのアルデヒド又はスルフヒドリルに付着してよい。分岐リンカー又は複数部位リンカーの官能基部位は、アルデヒド基又はスルフヒドリル基であるか、又はリンカーが付着し得る任意の化学部位であり得る。なお高い比活性は、これらの２つのアプローチを組み合わせることによって、すなわち、ＡＢ上のいくつかの部位で複数部位リンカーを付着することによって取得され得る。

【0179】

切断可能なリンカー：限定されないが、ｕ－プラスミノーゲン活性化剤、組織プラスミノーゲン活性化剤、トリプシン、プラスミン、又はタンパク質分解活性を有する別の酵素などの、補体系の酵素による切断を受けやすいペプチドリンカーが、本開示の一実施形態で使用され得る。本開示の１つの方法によれば、薬剤は、補体による切断を受けやすいリンカーを介して取り付けられる。抗体は、補体を活性化できるクラスから選択される。抗体－薬剤コンジュゲートは、そのため、補体カスケードを活性化し、標的部位で薬剤を放出する。本開示の別の方法によれば、薬剤は、ｕ－プラスミノーゲン活性化剤、組織プラスミノーゲン活性化剤、プラスミン、又はトリプシンなどのタンパク質分解活性を有する酵素によって切断されやすいリンカーを介して取り付けられる。これらの切断可能なリンカーは、細胞外毒素、例えば、非限定的な例として、表１に示す細胞外毒素のいずれか、を含むコンジュゲートＡＡにおいて有用である。

【0180】

切断可能なリンカー配列の非限定的な例を表２に提供する。
表２：コンジュゲーションのための例示的リンカー配列

【表6】

【0181】

加えて、薬剤は、ジスルフィド結合（例えば、システイン分子上のジスルフィド結合）を介してＡＢに付着されてよい。多くの腫瘍は高レベルのグルタチオン（還元剤）を自然に放出するので、これは、ジスルフィド結合を還元でき、その後、送達部位で薬剤を放出する。いくつかの実施形態では、ＣＭを改変する還元剤は、コンジュゲートされた活性化可能な抗体のリンカーも改変する。

【0182】

スペーサー及び切断可能な要素：いくつかの実施形態では、薬剤と活性化可能な抗体のＡＢの間の間隔を最適化するような方法で、リンカーを構築する必要があり得る。これは、一般的な構造のリンカー：Ｗ－（ＣＨ_２）ｎ－Ｑ
（式中、
Ｗは－－ＮＨ－－ＣＨ_２－－又は－－ＣＨ_２－－のいずれかであり；
Ｑはアミノ酸、ペプチドであり；かつ
ｎは、０～２０の整数である）
を用いて達成され得る。

【0183】

いくつかの実施形態では、リンカーは、スペーサー要素及び切断可能な要素を含んでよい。スペーサー要素は、切断可能な要素が切断を担当する酵素へよりアクセスしやすくなるように、切断可能な要素をＡＢのコアから離して配置するのに役立つ。上記のいくつかの分岐リンカーは、スペーサー要素として機能し得る。

【0184】

この議論を通して、リンカーの薬剤への（又は、スペーサー要素への切断可能な要素の、又は薬剤への切断可能な要素の）付着は、付着又は反応の特定のモードである必要はないことを理解すべきである。適切な安定性と生物学的適合性の生成物を提供する任意の反応が、許容される。

【0185】

血清補体及びリンカーの選択：本開示の１つの方法に従って、薬剤の放出が望まれる場合、補体を活性化できるクラスの抗体であるＡＢが、使用される。生じるコンジュゲートは、抗原に結合する能力と補体カスケードを活性化する能力の両方を保持する。そのため、本開示のこの実施形態によれば、薬剤は、切断可能なリンカー又は切断可能な要素の一端に結合され、リンカー基の他端は、ＡＢ上の特異的部位に付着される。例えば、薬剤がヒドロキシ基又はアミノ基を有する場合、それは、それぞれエステル又はアミド結合を介してペプチド、アミノ酸又は他の適切に選択されたリンカーのカルボキシ末端に付着されてよい。例えば、そのような薬剤は、カルボジイミド反応を介してリンカーペプチドに付着されてよい。薬剤が、リンカーへの付着を妨げる官能基を含む場合、これらの干渉官能基は、付着の前にブロックされかつ生成物のコンジュゲート又は中間体が作成されると、及びブロック解除できる。リンカーの反対又はアミノ末端は次いで、直接使用されるか、又は補体を活性化できるＡＢへの結合のためのさらなる修飾の後に使用される。

【0186】

リンカー（又はリンカーのスペーサー要素）は、任意の所望の長さであり得、その一端は、活性化可能な抗体のＡＢ上の特異的部位に共有結合され得る。リンカー又はスペーサー要素の他端は、アミノ酸又はペプチドリンカーに付着されてよい。

【0187】

そのため、これらのコンジュゲートが補体の存在下で抗原に結合したときに、リンカーに薬剤を付着させるアミド結合又はエステル結合は、切断され、活性形態での薬剤の放出をもたらす。これらのコンジュゲートは、対象に投与されると、標的部位で薬剤の送達及び放出を達成し、表１に提示されるがそれらに限定されない医薬剤、抗生物質、代謝拮抗薬、抗増殖剤などのインビボの送達に特に有効である。

【0188】

補体活性化のない放出用リンカー：標的送達のさらに別の適用では、補体カスケードの活性化が最終的に標的細胞を溶解するので、補体活性化のない薬剤の放出が望まれる。したがって、この手法は、標的細胞を殺すことなく薬剤の送達及び放出を達成すべきときに有用である。そのようなものは、標的細胞へのホルモン、酵素、コルチコステロイド、神経伝達物質、遺伝子又は酵素などの細胞媒介物の送達が望まれる場合に、目標である。これらのコンジュゲートは、血清プロテアーゼによる切断に軽度に影響を受けやすいリンカーを介して補体を活性化できないＡＢに薬剤を付着させることによって調製され得る。このコンジュゲートが個体に投与されると、抗原抗体複合体が迅速に形成し、一方で薬剤の切断はゆっくりと起こり、そのため、標的部位で化合物の放出をもたらす。

【0189】

生化学的クロスリンカー：いくつかの実施形態では、ＡＡは、ある生化学的架橋剤を用いて１以上の治療薬にコンジュゲートされ得る。架橋試薬は、２つの異なる分子の官能基を結ぶ分子架橋を形成する。２つの異なるタンパク質を段階的に連結するために、望ましくないホモポリマー形成を排除するヘテロ二官能性架橋剤を使用できる。

【0190】

リソソームプロテアーゼによって切断可能なペプチジルリンカー、例えば、Ｖａｌ－Ｃｉｔ、Ｖａｌ－Ａｌａ又は他のジペプチドも、有用である。加えて、リソソームの低ｐＨ環境で切断可能な酸に不安定なリンカー、例えば、ビスシアリルエーテルを用いてよい。他の適切なリンカーは、カテプシンに不安定な基質、特に酸性ｐＨで最適な機能を示すものを含む。

【0191】

例示的なヘテロ二官能性架橋剤を表３で参照する。
表３：例示的なヘテロ二官能性架橋剤

【表7】

【0192】

切断可能でないリンカー又は直接付着：本開示のいくつかの実施形態では、コンジュゲートは、薬剤が標的に送達されるが放出されないように設計され得る。これは、直接又は切断可能でないリンカーを介して、薬剤をＡＢに取り付けることによって達成され得る。

【0193】

これらの切断可能でないリンカーは、アミノ酸、ペプチド、Ｄ－アミノ酸、又は本明細書に記載の方法によるＡＢへの付着にその後利用できる官能基を含むように修飾され得る、他の有機化合物を含み得る。そのような有機リンカーの一般式は、
Ｗ－（ＣＨ_２）ｎ－Ｑ
（式中、
Ｗは、－－ＮＨ－－ＣＨ_２－－又は－－ＣＨ_２－－のいずれかであり；
Ｑは、アミノ酸、ペプチドであり；かつ
ｎは、０～２０の整数である）
であり得る。

【0194】

切断可能でないコンジュゲート：いくつかの実施形態では、化合物は、補体を活性化しないＡＢに付着されてもよい。補体活性化ができないＡＢを使用する場合、この付着は、活性化された補体によって切断されやすいリンカーを用いるか、又は活性化された補体による切断を受けにくいリンカーを用いて達成され得る。

【0195】

本明細書で開示される抗体は、免疫リポソームとして製剤化することもできる。抗体を含むリポソームは、Ｅｐｓｔｅｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：３６８８（１９８５）；Ｈｗａｎｇら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４０３０（１９８０）；及び米国特許第４，４８５，０４５号及び同第４，５４４，５４５号に記載されている方法などの、当技術分野で公知の方法によって調製される。循環時間が延長されたリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。

【0196】

特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、及びＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ－ＰＥ）を含む脂質組成物を用いた逆相蒸発法により作製できる。リポソームは、所望の直径を有するリポソームを得るために、定義された細孔サイズのフィルターを通して押し出される。本開示の抗体のＦａｂ’断片は、ジスルフィド交換反応を介してＭａｒｔｉｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ.,２５７：２８６－２８８（１９８２）に記載されているようにリポソームにコンジュゲートできる。

【0197】

非結合性立体部分又は非結合性立体部分に対する結合パートナーを有する活性化可能な抗体
本開示はまた、非結合性立体部分（ＮＢ）又は非結合性立体部分に対する結合パートナー（ＢＰ）を含むＡＡも提供し、ＢＰは、活性化可能な抗体にＮＢを補充するか、又はそうでなければ誘引する。本明細書に提供されるＡＡは、例えば、非結合性立体部分（ＮＢ）、切断可能なリンカー（ＣＬ）及び標的に結合する抗体又は抗体断片（ＡＢ）を含むＡＡ；非結合性立体部分（ＢＰ）、ＣＬ及びＡＢの結合パートナーを含むＡＡ；並びにＮＢが補充されたＢＰ、標的と結合するＣＬ及びＡＢを含むＡＡを含む。ＮＢがＡＡのＣＬ及びＡＢに共有結合されるか、ＡＡのＣＬ及びＡＢに共有結合されるＢＰとの相互作用によって関連付けられるＡＡは、本明細書において「ＮＢを含有する活性化可能な抗体」と呼ばれる。活性化可能な又は切り替え可能なとは、ＡＡは、ＡＡが阻害されるか、マスクされるか、又は切断されない状態（すなわち、第１の立体構造）にある場合に標的に結合する第１のレベル、並びにＡＡが阻害されないか、マスクされないか及び／又は切断状態（すなわち、第２の立体構造、すなわち活性化可能な抗体）にある場合に標的に結合する第２のレベルを示すことを意味し、標的結合の第２のレベルは、標的結合の第１のレベルより大きい。ＡＡ組成物は、従来の抗体治療薬に比べて増加されたバイオアベイラビリティ及びより良好な体内分布を示し得る。

【0198】

いくつかの実施形態では、ＡＡは、ＡＢがマスクされていないか、又はそうでなければそのような部位への結合を阻害された場合に、別の方法で非治療部位及び／又は非診断部位での結合から生じる可能性のある毒性及び／又は有害な副作用を低減することを提供する。

【0199】

非結合性立体部分（ＮＢ）を含むＡＡは、その内容が参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開２０１３／１９２５４６に記載の方法を用いて作製できる。

【0200】

活性化可能な抗体の生成
本開示はまた、ポリペプチドの発現をもたらす条件下で細胞を培養することにより活性化可能な抗標的抗体ポリペプチドを生成する方法を提供し、細胞は、本明細書に記載の抗体及び／若しくはＡＡをコードする単離核酸分子、並びに／又はこれらの単離核酸配列を含むベクターを含む。本開示は、抗体及び／又は活性化可能な抗体の発現をもたらす条件下で細胞を培養することによって抗体及び／又はＡＡを生成する方法を提供し、細胞は、本明細書に記載の抗体及び／又はＡＡをコードする単離核酸分子、及び／又はこれらの単離核酸配列を含むベクターを含む。

【0201】

本発明はまた、（ａ）活性化可能な抗体の発現をもたらす条件下でＡＡをコードする核酸構築物を含む細胞を培養することであって、ＡＡが、マスキング部分（ＭＭ）、切断可能な部分（ＣＭ）、及び標的を特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片（ＡＢ）を含み、（ｉ）ＣＭが、プロテアーゼの基質として機能するポリペプチドであり；（ｉｉ）ＣＭが、ＡＡが非切断状態にあるときに、ＭＭが標的へのＡＢの特異的結合に干渉し、切断状態の時に、ＭＭが標的へのＡＢの特異的結合に干渉又は競合しないようにＡＡ中に配置される、培養すること；かつ（ｂ）活性化可能な抗体を回収すること、により活性化状態で標的を結合するＡＡを製造する方法を提供する。適切なＡＢ、ＭＭ、及び／又はＣＭは、本明細書に開示されるＡＢ、ＭＭ及び／又はＣＭのいずれかを含む。

【0202】

以下の例示的なヌクレオチド配列は、本明細書に提供されるＡＡ及びコンジュゲートＡＡを作製し、使用するために提供される。以下に提供されるヌクレオチド配列に少なくとも９０％、９５％、又はさらに９９％相同であるヌクレオチド配列も提供される。

【表8】

【0203】

活性化可能な抗体及びコンジュゲートされた活性化可能な抗体の治療的使用
本開示は、標的を結合するＡＡ、特に、結合し、標的及び／又は標的媒介シグナル伝達の少なくとも１つの生物活性を中和するか、又はそうでなければ阻害するＡＡを用いて、対象における標的の異常な発現及び／又は活性と関連付けられる症状の治療、発症若しくは進行の防止及び／又は遅延、又は緩和の方法を提供する。

【0204】

本開示はまた、標的を結合するＡＡ、特に、標的を発現する若しくは異常に発現している細胞を結合するか、標的化するか、中和するか、死滅させるか、又はそうでなければ細胞の少なくとも１つの生物活性を阻害するＡＡを用いて、対象において標的を発現若しくは異常に発現している細胞の存在、成長、増殖、転移、及び／若しくは活性と関連付けられる症状の治療、発症若しくは進行の防止及び／又は遅延、又は緩和の方法を提供する。

【0205】

本開示はまた、標的を結合するＡＡ、特に、標的を発現している細胞を結合するか、標的化するか、中和するか、死滅させるか、又はそうでなければ細胞の少なくとも１つの生物活性を阻害するＡＡを用いて、対象において標的を発現している細胞の存在、成長、増殖、転移、及び／若しくは活性と関連付けられる症状の治療、発症若しくは進行の防止及び／又は遅延、又は緩和の方法を提供する。

【0206】

本開示はまた、標的を結合するＡＡ、特に、標的を発現している細胞を結合するか、標的化するか、中和するか、死滅させるか、又はそうでなければ細胞の少なくとも１つの生物活性を阻害するＡＡを用いて、対象において標的を異常に発現している細胞の存在、成長、増殖、転移、及び／若しくは活性と関連付けられる症状の治療、発症若しくは進行の防止及び／又は遅延、又は緩和の方法を提供する。

【0207】

本開示はまた、それを必要としている対象に、本明細書に記載の治療有効量の抗標的抗体、コンジュゲート抗標的抗体、活性化可能な抗標的抗体、及び／又はコンジュゲートされた活性化可能な抗標的抗体を投与することによって、対象における癌を防止する、進行を遅延させる、治療する、症状を緩和する、又はそうでなければ改善する方法を提供する。

【0208】

本開示はまた、対象における標的の異常な発現及び／若しくは活性と関連付けられる症状の治療、発症若しくは進行の予防及び／又は遅延、又は緩和に使用するための、標的を結合するＡＡ、特に、結合し、標的及び／又は標的媒介シグナル伝達の少なくとも１つの生物活性を中和するか、又はそうでなければ阻害するＡＡを提供する。

【0209】

本開示はまた、対象において標的を発現若しくは異常に発現している細胞の存在、成長、増殖、転移、及び／若しくは活性と関連付けられる症状の治療、発症若しくは進行の防止及び／又は遅延、又は緩和に使用するための、標的を結合するＡＡ、特に、標的を発現若しくは異常に発現している細胞を結合するか、標的化するか、中和するか、死滅させるか、又はそうでなければ細胞の少なくとも１つの生物活性を阻害するＡＡを提供する。

【0210】

本開示はまた、対象における癌の防止、進行の遅延、治療、症状の緩和、又はそうでなければ改善に使用するための、抗標的抗体、コンジュゲート抗標的抗体、活性化可能な抗標的抗体及び／又はコンジュゲートされた活性化可能な抗標的抗体を提供し、抗体は、治療的有効量での投与のためである。

【0211】

非限定的な例として、本開示のＡＡは、上皮癌又は扁平上皮癌、カルチノイド、及び／若しくは神経内分泌癌の治療、発症若しくは進行の予防及び／又は遅延に使用できる。癌の例としては、腺癌、胆管（ｂｉｌｅ ｄｕｃｔ）（胆管（ｂｉｌｉａｒｙ））癌、膀胱癌、乳癌、例えば、トリプルネガティブ乳癌、Ｈｅｒ２陰性乳癌、エストロゲン受容体陽性乳癌；カルチノイド癌；子宮頸癌；胆管細胞癌；結腸直腸癌；子宮内膜癌；神経膠腫；頭頸部癌、例えば、頭頸部扁平上皮癌；白血病；肝臓癌；肺癌、例えば、ＮＳＣＬＣ、ＳＣＬＣ；リンパ腫；黒色腫；中咽頭（ｏｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ）癌；卵巣癌；膵臓癌；前立腺癌，例えば、転移性去勢抵抗性前立腺癌；腎癌；皮膚癌；扁平上皮癌；胃癌；精巣癌；甲状腺癌；及び尿路上皮癌が挙げられるが、これらに限定されない。

【0212】

いくつかの実施形態では、癌は、任意の上皮癌又は扁平上癌である。いくつかの実施形態では、癌は、前立腺癌、乳癌、肺癌、子宮頸癌、中咽頭癌、及び／又は頭頸部癌である。

【0213】

いくつかの実施形態では、癌は、膀胱癌、骨癌、乳癌、カルチノイド、子宮頸癌、結腸直腸癌、結腸癌、子宮内膜癌、上皮癌、神経膠腫、頭頸部癌、肝臓癌、肺癌、黒色腫、中咽頭癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、腎癌、肉腫、皮膚癌、胃癌、精巣癌、甲状腺癌、泌尿生殖器癌、及び／又は尿路上皮癌である。

【0214】

いくつかの実施形態では、癌は、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、Ｒａｓ変異型大腸癌、稀な上皮癌、中咽頭癌、子宮頸癌、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、及び／又は前立腺癌からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、癌は、標的発現腫瘍と関連付けられる。いくつかの実施形態では、癌は、標的発現腫瘍によるものである。

【0215】

これらの方法及び使用の実施形態のいずれかで使用される抗標的抗体、コンジュゲート抗標的抗体、活性化可能な抗標的抗体及び／又はコンジュゲートされた活性化可能な抗標的抗体は、疾患のいずれのステージでも投与できる。例えば、そのような抗標的抗体、コンジュゲート抗標的抗体、活性化可能な抗標的抗体及び／又はコンジュゲートされた活性化可能な抗標的抗体は、早期～転移のいずれかのステージの癌を患う対象に投与できる。

【0216】

例示的な実施形態では、対象は、乳癌、去勢抵抗性前立腺癌（ＣＰＲＣ）、胆管細胞癌、子宮内膜癌、上皮性卵巣癌、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、及び非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）に罹患しているか、又は罹患していると疑われる。

【0217】

例示的な実施形態では、対象は、皮膚病変に罹患しているか、又は罹患していると疑われる。いくつかの実施形態では、皮膚病変は、皮膚転移である。

【0218】

本明細書に提供されるとおり、治療される対象は、ヒト、非ヒト霊長類、コンパニオン動物（例えば、猫、犬、馬）、家畜、作業用動物、又は動物園の動物などの哺乳動物である。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトである。いくつかの実施形態では、対象は、コンパニオン動物である。いくつかの実施形態では、対象は、獣医師にかかっている動物である。

【0219】

いくつかの実施形態では、乳癌に罹患しているか、又は罹患していると疑われており、本開示のＡＡ、例えば、組み合わせ５５又は組み合わせ６０を投与される対象は、エストロゲン受容体発現（ＥＲ＋）腫瘍を有し、抗ホルモン療法を投与されるべきであり、本開示のＡＡで治療される前に疾患進行を経験している。いくつかの実施形態では、乳癌に罹患しているか、又は罹患していると疑われており、本開示のＡＡ、例えば、組み合わせ５５又は組み合わせ６０を投与される対象は、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）を有し、本開示のＡＡで治療される前に、２つ以上の事前の一連の治療を受けている。

【0220】

いくつかの実施形態では、去勢抵抗性前立腺癌に罹患しているか、又は罹患していると疑われており、本開示のＡＡ、例えば、組み合わせ５５又は組み合わせ６０を投与される対象は、本開示のＡＡで治療される前に、１つ以上の事前の治療を受けている。

【0221】

いくつかの実施形態では、胆管細胞癌に罹患しているか、又は罹患していると疑われており、本開示のＡＡ、例えば、組み合わせ５５又は組み合わせ６０を投与される対象は、本開示のＡＡで治療される前に、ゲムシタビンを含む投与計画の１つ以上の事前の治療に失敗している。

【0222】

いくつかの実施形態では、子宮内膜癌に罹患しているか、又は罹患していると疑われており、本開示のＡＡ、例えば、組み合わせ５５又は組み合わせ６０を投与される対象は、本開示のＡＡで治療される前に、子宮外の又は進行した疾患のための１つ以上の白金を含む投与計画を受けている。

【0223】

いくつかの実施形態では、上皮性卵巣癌に罹患しているか、又は罹患していると疑われており、本開示のＡＡ、例えば、組み合わせ５５又は組み合わせ６０を投与される対象は、非乳癌（ＢＲＣＡ）変異（生殖細胞性又は体細胞性）を有するか、又は未知のＢＲＣＡ変異状態を有し、白金耐性又は白金抵抗性の卵巣癌を有する。いくつかの実施形態では、上皮性卵巣癌に罹患しているか、又は罹患していると疑われており、本開示のＡＡ、例えば、組み合わせ５５又は組み合わせ６０を投与される対象は、ＢＲＣＡ変異を有し、ＰＡＲＰ阻害剤に抵抗性であるか、又はそうでなければ不適格である。

【0224】

いくつかの実施形態では、ＨＮＳＣＣに罹患しているか、又は罹患していると疑われており、本開示のＡＡ、例えば、組み合わせ５５又は組み合わせ６０を投与される対象は、本開示のＡＡで治療される前に、１つ以上の白金を含む投与計画及びＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１阻害剤（対象の兆候及び局所性に対して許可された場合）を受けている。

【0225】

いくつかの実施形態では、ＮＳＣＬＣに罹患しているか、又は罹患していると疑われており、本開示のＡＡ、例えば、組み合わせ５５又は組み合わせ６０を投与される対象は、本開示のＡＡで治療される前に、１つ以上の白金を含む投与計画を受けている。いくつかの実施形態では、ＮＳＣＬＣに罹患しているか、又は罹患していると疑われており、本開示のＡＡ、例えば、組み合わせ５５又は組み合わせ６０を投与される対象は、本開示のＡＡで治療される前に、チェックポイント阻害剤（その局所性における対象の兆候に対して許可された場合）を事前に投与されている。

【0226】

いくつかの実施形態では、以下のいずれかを有する対象者は、乳癌、去勢抵抗性前立腺癌（ＣＰＲＣ）、胆管細胞癌、子宮内膜癌、上皮性卵巣癌、ＨＮＳＣＣ、及びＮＳＣＬＣの治療のための、本開示のＡＡを受ける資格がない場合がある：活動性又は慢性角膜障害、角膜移植歴、活動性ヘルペス性角膜炎、及び継続的な治療／モニタリングを必要とする活動性の眼の状態；臨床的に関連する活動性感染を含む重篤な併発疾患；現在の活動性自己免疫疾患の病歴；最近の心筋梗塞などの顕著な心疾患；多発性硬化症又は他の脱髄性疾患の病歴、イートン・ランバート症候群（傍腫瘍性症候群）、過去６ヶ月以内の出血性若しくは虚血性脳卒中の病歴、又はアルコール性肝疾患；元の新生物によって引き起こされる潰瘍性病変を除く非治癒創傷（複数可）又は潰瘍（複数可）；以前のモノクローナル抗体療法に対する重度のアレルギー反応又はアナフィラキシー反応の病歴；ワルファリンでの抗凝固療法を現在受けていること；又は投与に先立つ３ヶ月以内の大手術（全身麻酔を必要とする）。

【0227】

活性化可能な抗標的抗体及び／又はコンジュゲートされた活性化可能な抗標的抗体及びそれらの治療製剤は、異常な標的発現及び／若しくは活性と関連付けられる疾患又は障害に罹患しているか、又は罹患しやすい対象に投与される。異常な標的発現及び／若しくは活性と関連付けられる疾患又は障害に罹患しているか、又は罹患しやすい対象は、当技術分野で公知の様々な方法のいずれかを用いて特定される。例えば、癌又は他の腫瘍性病態に罹患している対象は、健康状態を評価するために、身体検査並びに血液、尿及び／若しくは便の分析などの様々な臨床検査並びに／又は実験室検査のいずれかを用いて特定される。例えば、炎症及び／又は炎症性障害に罹患している対象は、健康状態を評価するために、身体検査及び／若しくは体液分析、例えば、血液、尿及び／又は便の分析などの様々な臨床検査並びに／実験室検査のいずれかを用いて特定される。

【0228】

異常な標的発現及び／若しくは活性と関連付けられる疾患又は障害に罹患している対象への抗標的抗体、コンジュゲート抗標的抗体、活性化可能な抗標的抗体及び／又はコンジュゲートされた活性化可能な抗標的抗体の投与は、様々な実験室又は臨床の目的のいずれかが達成された場合に、成功したと考えられる。例えば、異常な標的発現及び／若しくは活性と関連付けられる疾患又は障害に罹患している対象への抗標的抗体、コンジュゲート抗標的抗体、活性化可能な抗標的抗体及び／又はコンジュゲートされた活性化可能な抗標的抗体の投与は、疾患又は障害と関連付けられる症状の１以上が緩和、低減、抑制されるか、又はさらなる、すなわち、より悪化した状態へ進行しない場合に、成功したと考えられる。異常な標的発現及び／若しくは活性と関連付けられる疾患又は障害に罹患している対象への抗標的抗体、コンジュゲート抗標的抗体、活性化可能な抗標的抗体及び／又はコンジュゲートされた活性化可能な抗標的抗体の投与は、疾患又は障害が寛解に入るか、又はさらなる、すなわち、より悪化した状態へ進行しない場合に、成功したと考えられる。

【0229】

いくつかの実施形態では、活性化可能な抗標的抗体及び／又はコンジュゲートされた活性化可能な抗標的抗体及びそれらの治療製剤は、対象の疾患細胞が標的を発現している、癌又は他の新生物病態に罹患している対象などの、疾患又は障害に罹患しているか、又は罹患しやすい対象に投与される。いくつかの実施形態では、疾患細胞は、異常な標的発現及び／又は活性と関連付けられる。いくつかの実施形態では、疾患細胞は、正常な標的発現及び／又は活性と関連付けられる。対象の疾患細胞が標的を発現する、疾患若しくは障害に罹患しているか、又は罹患しやすい対象は、当技術分野で公知の様々な方法のいずれかを用いて特定される。例えば、癌又は他の腫瘍性病態に罹患している対象は、健康状態を評価するための身体検査並びに血液、尿及び／又は便の分析などの様々な臨床検査及び／実験室検査のいずれかを用いて特定される。例えば、炎症及び／又は炎症性障害に罹患している対象は、健康状態を評価するための、身体検査及び／又は体液分析、例えば、血液、尿及び／又は便の分析などの様々な臨床検査及び／又は実験室検査のいずれかを用いて特定される。

【0230】

いくつかの実施形態では、活性化可能な抗標的抗体及び／又はコンジュゲートされた活性化可能な抗標的抗体及びそれらの治療製剤は、癌又は他の腫瘍状態に罹患している対象などの、標的を発現する細胞又はそのような細胞の存在、成長、増殖、転移、及び／若しくは活性と関連付けられる疾患又は障害に罹患しているか、又は罹患しやすい対象に投与される。いくつかの実施形態では、細胞は、異常な標的発現及び／又は活性と関連付けられる。いくつかの実施形態では、細胞は、正常な標的の発現及び／又は活性と関連付けられる。標的を発現する細胞と関連付けられる疾患又は障害に罹患しているか、又は罹患しやすい対象は、当技術分野で公知の様々な方法のいずれかを用いて特定される。例えば、癌又は他の腫瘍性病態に罹患している対象は、健康状態を評価するための身体検査並びに／又は血液、尿及び／若しくは便の分析などの様々な臨床検査及び／又は実験室検査のいずれかを用いて特定される。例えば、炎症及び／又は炎症性障害に罹患している対象は、健康状態を評価するための、身体検査及び／又は体液分析、例えば、血液、尿及び／又は便の分析などの様々な臨床検査及び／又は実験室検査のいずれかを用いて特定される。

【0231】

標的を発現する細胞と関連付けられる疾患又は障害に罹患している対象への抗標的抗体、コンジュゲート抗標的抗体、活性化可能な抗標的抗体及び／又はコンジュゲートされた活性化可能な抗標的抗体の投与は、様々な実験室又は臨床の目的のいずれかが達成された場合に、成功したと考えられる。例えば、標的を発現する細胞と関連付けられる疾患又は障害に罹患している対象への抗標的抗体、コンジュゲート抗標的抗体、活性化可能な抗標的抗体及び／又はコンジュゲートされた活性化可能な抗標的抗体の投与は、疾患又は障害と関連付けられる症状の１以上が緩和、低減、抑制されるか、又はさらなる、すなわち、より悪化した状態へ進行しない場合に、成功したと考えられる。標的を発現する細胞と関連付けられる疾患又は障害に罹患している対象への抗標的抗体、コンジュゲート抗標的抗体、活性化可能な抗標的抗体及び／又はコンジュゲートされた活性化可能な抗標的抗体の投与は、疾患又は障害が寛解に入るか、又はさらなる、すなわち、より悪化した状態へ進行しない場合に、成功したと考えられる。

【0232】

いくつかの実施形態では、活性化可能な抗標的抗体及び／又はコンジュゲートされた活性化可能な抗標的抗体は、例えば、化学療法薬、抗炎症剤、及び／又は免疫抑制剤などの１以上の追加の薬剤と組み合わせて治療中及び／又は治療後に投与される。いくつかの実施形態では、活性化可能な抗標的抗体及び／又はコンジュゲートされた活性化可能な抗標的抗体及び追加の薬剤（複数可）は、同時に投与される。例えば、活性化可能な抗標的抗体及び／又はコンジュゲートされた活性化可能な抗標的抗体及び追加の薬剤（複数可）は、単一組成物で製剤化されるか、又は２以上の別々の組成物として投与できる。いくつかの実施形態では、活性化可能な抗標的抗体及び／又はコンジュゲートされた活性化可能な抗標的抗体及び追加の薬剤（複数可）は、順次投与される。

【0233】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の活性化可能な抗標的抗体及び／又はコンジュゲートされた活性化可能な抗標的抗体は、１以上の追加の薬剤又は追加の薬剤の組み合わせと併用される。適切な追加の薬剤は、例えば、癌などの意図された適用のための現在の医薬品及び／又は外科療法を含む。例えば、抗標的抗体、コンジュゲート抗標的抗体、活性化可能な抗標的抗体及び／又はコンジュゲートされた活性化可能な抗標的抗体は、追加の化学療法剤又は抗腫瘍剤と併用できる。

【0234】

いくつかの実施形態では、追加の薬剤（複数可）は、ドセタキセル、パクリタキセル、アブラキサン（すなわち、アルブミンコンジュゲートパクリタキセル）、ドキソルビシン、オキサリプラチン、カルボプラチン、シスプラチン、イリノチン、及びゲムシタビンからなる群から選択される化学療法剤などの、化学療法剤である。

【0235】

いくつかの実施形態では、追加の薬剤（複数可）は、チェックポイント阻害剤、キナーゼ阻害剤、腫瘍微小環境における阻害剤を標的にする薬剤、及び／又はＴ細胞又はＮＫアゴニストである。いくつかの実施形態では、追加の薬剤（複数可）は、単独の、又は化学療法剤若しくは抗腫瘍剤などの別の追加の薬剤（複数可）と組み合わせた放射線療法である。いくつかの実施形態では、追加の薬剤（複数可）は、ワクチン、オンコウイルス、及び／又は非限定的な例として、トール様受容体（ＴＬＲ）アゴニスト及び／若しくはα－ＣＤ４０などのＤＣ活性化剤である。いくつかの実施形態では、追加の薬剤（複数可）は、ＡＤＣＣを介して、又は毒素（例えば、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ））への直接コンジュゲーションを介して腫瘍を死滅させるように設計された腫瘍標的化抗体である。

【0236】

いくつかの実施形態では、チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、ＰＤ－１、標的、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ－３、Ｂ７Ｈ４、及びＶｉｓｔａからなる群から選択される標的の阻害剤である。いくつかの実施形態では、キナーゼ阻害剤は、イブルチニブなどの、Ｂ－ＲＡＦｉ、ＭＥＫｉ、及びＢｔｋ阻害剤からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、キナーゼ阻害剤はクリゾチニブである。いくつかの実施形態では、腫瘍微小環境阻害剤は、ＩＤＯ阻害剤、α－ＣＳＦ１Ｒ阻害剤、α－ＣＣＲ４阻害剤、ＴＧＦ－ベータ、骨髄由来の抑制細胞、又は調節性Ｔ細胞からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、アゴニストは、Ｏｘ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ１３７、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、及びＨＶＥＭからなる群から選択される。

【0237】

いくつかの実施形態では、阻害剤は、ＣＴＬＡ－４阻害剤である。いくつかの実施形態では、阻害剤は、ＬＡＧ－３阻害剤である。いくつかの実施形態では、阻害剤は、ＰＤ－１阻害剤である。いくつかの実施形態では、阻害剤は標的阻害剤である。いくつかの実施形態では、阻害剤は、ＴＩＧＩＴ阻害剤である。いくつかの実施形態では、阻害剤は、ＴＩＭ－３阻害剤である。いくつかの実施形態では、阻害剤はＢ７Ｈ４阻害剤である。いくつかの実施形態では、阻害剤はビスタ阻害剤である。いくつかの実施形態では、阻害剤はＢ－ＲＡＦｉ阻害剤である。いくつかの実施形態では、阻害剤はＭＥＫｉ阻害剤である。いくつかの実施形態では、阻害剤はＢｔｋ阻害剤である。いくつかの実施形態では、阻害剤はイブルチニブである。いくつかの実施形態では、阻害剤はクリゾチニブである。いくつかの実施形態では、阻害剤はＩＤＯ阻害剤である。いくつかの実施形態では、阻害剤はα－ＣＳＦ１Ｒ阻害剤である。いくつかの実施形態では、阻害剤がα－ＣＣＲ４阻害剤である。いくつかの実施形態では、阻害剤は、ＴＧＦ－ベータである。いくつかの実施形態では、阻害剤は、骨髄由来のサプレッサー細胞である。いくつかの実施形態では、阻害剤は調節性Ｔ細胞である。

【0238】

いくつかの実施形態では、アゴニストはＯｘ４０である。いくつかの実施形態では、アゴニストはＧＩＴＲである。いくつかの実施形態では、アゴニストはＣＤ１３７である。いくつかの実施形態では、アゴニストはＩＣＯＳである。いくつかの実施形態では、アゴニストはＣＤ２７である。いくつかの実施形態では、アゴニストはＨＶＥＭである。

【0239】

いくつかの実施形態では、ＡＡ及び／又はコンジュゲートＡＡは、例えば、化学療法剤、抗炎症剤、及び／又は免疫抑制剤などの１以上の追加の薬剤と組み合わせて治療中及び／又は治療後に投与される。いくつかの実施形態では、活性化可能な抗標的抗体及び／又はコンジュゲートされた活性化可能な抗標的抗体及び追加の薬剤は、単一の治療組成物に配合され、活性化可能な抗標的抗体及び／又はコンジュゲートされた活性化可能な抗標的抗体及び追加の薬剤が、同時に投与される。あるいは、活性化可能な抗標的抗体及び／又はコンジュゲートされた活性化可能な抗標的抗体及び追加の薬剤は、互いに分離され、例えば、それぞれは、別々の治療組成物に配合され、活性化可能な抗標的抗体及び／又はコンジュゲートされた活性化可能な抗標的抗体及び追加の薬剤は、同時に投与され、又は活性化可能な抗体及び／又はコンジュゲートされた活性化可能な抗標的抗体及び追加の薬剤が、治療投与計画中の異なる時間に投与される。例えば、活性化可能な抗標的抗体及び／又はコンジュゲートされた活性化可能な抗標的抗体は、追加の薬剤の投与の前に投与されるか、活性化可能な抗標的抗体及び／又はコンジュゲートされた活性化可能な抗標的抗体は、追加の薬剤の投与に続いて投与されるか、又は活性化可能な抗標的抗体及び／又はコンジュゲートされた活性化可能な抗標的抗体及び追加の薬剤が、交互に投与される。本明細書に記載のように、活性化可能な抗標的抗体及び／又はコンジュゲートされた活性化可能な抗標的抗体及び追加の薬剤は、単回用量で又は複数用量で投与される。

【0240】

いくつかの実施形態では、活性化可能な抗標的抗体及び／又はコンジュゲートされた活性化可能な抗標的抗体及び追加の薬剤（複数可）は、同時に投与される。例えば、活性化可能な抗標的抗体及び／又はコンジュゲートされた活性化可能な抗標的抗体及び追加の薬剤（複数可）は、単一の組成物で製剤化されるか、又は２以上の別々の組成物として投与できる。いくつかの実施形態では、活性化可能な抗標的抗体及び／又はコンジュゲートされた活性化可能な抗標的抗体及び追加の薬剤（複数可）は、順次投与されるか、又は活性化可能な抗標的抗体及び／又はコンジュゲートされた活性化可能な抗標的抗体及び追加の薬剤は、治療投与計画中の異なる時間に投与される。

【0241】

いくつかの実施形態では、活性化可能な抗標的抗体及び／又はコンジュゲートされた活性化可能な抗標的抗体は、非限定的な例として、化学療法剤、抗炎症剤、及び／又は免疫抑制剤、例えば、アルキル化剤、抗代謝産物、抗微小管剤、トポイソメラーゼ阻害剤、細胞傷害性抗生物質、及び／又は任意の他の核酸有害性物質などの１以上の追加の薬剤と組み合わせて治療中及び／又は治療後に投与される。いくつかの実施形態では、追加の薬剤は、パクリタキセル（例えば、アブラキサン（登録商標））などのタキサンである。いくつかの実施形態では、追加の薬剤は、ゲムシタビンなどの抗代謝産物である。いくつかの実施形態では、追加の薬剤は、カルボプラチン又はシスプラチンなどの白金系化学療法剤などのアルキル化剤である。いくつかの実施形態では、追加の薬剤は、キナーゼ阻害剤、例えば、ソラフェニブ又はエルロチニブなどの標的化剤である。いくつかの実施形態では、追加の薬剤は、別の抗体、例えば、モノクローナル抗体（例えば、ベバシズマブ）、二重特異性抗体、又は多重特異性抗体などの標的化剤である。いくつかの実施形態では、追加の薬剤は、ボルテゾミブ又はカルフィルゾミブなどのプロテオソーム阻害剤である。いくつかの実施形態では、追加の薬剤は、レノリドミンデ又はＩＬ－２などの免疫調節剤である。いくつかの実施形態では、追加の薬剤は、放射線である。いくつかの実施形態では、追加の薬剤は、当業者による治療の標準と考えられる薬剤である。いくつかの実施形態では、追加の薬剤は、当業者に周知の化学療法剤である。

【0242】

いくつかの実施形態では、追加の薬剤は、別の抗体若しくはその抗原結合断片、別のコンジュゲート抗体若しくはその抗原結合断片、別のＡＡ若しくはその抗原結合断片及び／又は別のコンジュゲートＡＡ若しくはその抗原結合断片である。いくつかの実施形態では、追加の薬剤は、別の抗体若しくはその抗原結合断片、別のコンジュゲート抗体若しくはその抗原結合断片、第１の抗体若しくはその抗原結合断片と同じ標的に対する別のＡＡ若しくはその抗原結合断片及び／又は別のコンジュゲートＡＡ若しくはその結合断片、第１のコンジュゲート抗体若しくはその抗原結合断片、例えば、標的に対するＡＡ若しくはその抗原結合断片及び／又はコンジュゲートＡＡ若しくはその結合断片である。いくつかの実施形態では、追加の薬剤は、別の抗体若しくはその抗原結合断片、別のコンジュゲート抗体若しくはその抗原結合断片、第１の抗体若しくはその抗原結合断片の標的とは異なる標的に対する別のＡＡ若しくはその抗原結合断片及び／又は別のコンジュゲートＡＡ若しくはその抗原結合断片、第１のコンジュゲート抗体若しくはその抗原結合断片、ＡＡ若しくはその抗原結合断片及び／又はコンジュゲートＡＡ若しくはその抗原結合断片である。

【0243】

いくつかの実施形態では、追加の抗体若しくはその抗原結合断片、コンジュゲート抗体若しくはその抗原結合断片、ＡＡ若しくはその抗原結合断片、及び／又はコンジュゲートＡＡ若しくはその抗原結合断片は、モノクローナル抗体、ドメイン抗体、一本鎖、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、ｓｃＦｖ、ｓｃＡｂ、ｄＡｂ、単一ドメイン重鎖抗体、又は単一ドメイン軽鎖抗体である。いくつかの実施形態では、追加の抗体若しくはその抗原結合断片、コンジュゲート抗体若しくはその抗原結合断片、ＡＡ若しくはその抗原結合断片、及び／又はコンジュゲートＡＡ若しくはその抗原結合断片は、マウス、他のげっ歯類、キメラ、ヒト化又は完全ヒトモノクローナル抗体である。

【0244】

本開示に従った治療実体の投与は、適切な担体、賦形剤、及び製剤に組み込まれる他の薬剤と共に投与され、改善された移動、送達、寛容などを提供することが理解されるであろう。多数の適切な製剤は、全ての製薬化学者に知られている処方集：レミントンの薬学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）（第１５版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９７５））、特に、その中のＢｌａｕｇ，Ｓｅｙｍｏｕｒによる第８７章で見出すことができる。これらの製剤は、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、油、脂質、小胞（リポフェクチン（商標）など）を含む脂質（カチオン性又はアニオン性）、ＤＮＡコンジュゲート、無水吸収ペースト、水中油型及び油中水型エマルジョン、エマルジョンカーボワックス（様々な分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル、及びカーボワックスを含む半固体混合物を含む。以前の混合物のいずれも、本開示に従って治療及び治療法において適切であり得るが、ただし、製剤中の活性成分は製剤によって不活性化されず、かつ製剤は生理学的に投与経路と適合し、許容可能である。製薬化学者に周知の製剤、賦形剤及び担体に関連する追加情報については、Ｂａｌｄｒｉｃｋ Ｐ．「医薬品賦形剤の開発：前臨床指導の必要性（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ： ｔｈｅ ｎｅｅｄ ｆｏｒ ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ｇｕｉｄａｎｃｅ）」 Ｒｅｇｕｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３２（２）：２１０－８（２０００），Ｗａｎｇ Ｗ．「固体タンパク質医薬品の凍結乾燥と開発（Ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｓｏｌｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）」 Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．２０３（１－２）：１－６０（２０００），Ｃｈａｒｍａｎ ＷＮ 「脂質、親油性薬物、及び経口薬物送達－いくつかの新しい概念（Ｌｉｐｉｄｓ，ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ ｄｒｕｇｓ，ａｎｄ ｏｒａｌ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ－ｓｏｍｅ ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｃｏｎｃｅｐｔｓ）」 Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．８９（８）：９６７－７８（２０００），Ｐｏｗｅｌｌら 「非経口製剤のための賦形剤の一覧（Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ ｆｏｒ ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ）」 ＰＤＡ Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ．５２：２３８－３１１（１９９８）及びそれらの中の引用文献も参照されたい。

【0245】

非限定的な例として、ＡＡ及び／又はコンジュゲートＡＡなどの活性化可能な抗標的抗体を含む、本開示の治療製剤は、異常な標的発現及び／若しくは活性と関連付けられる疾患又は障害を予防する、治療する又はそうでなければ改善するために使用される。例えば、ＡＡ及び／又はコンジュゲートされた活性化可能な抗体を含む本開示の治療製剤は、癌又は他の腫瘍状態、炎症、炎症性障害、及び／若しくは自己免疫疾患を治療する又はそうでなければ改善するために使用される。いくつかの実施形態では、癌は、標的が発現される固形腫瘍又は血液性悪性腫瘍である。いくつかの実施形態では、癌は標的が発現される固形腫瘍である。いくつかの実施形態では、癌は、標的が発現される血液悪性腫瘍である。いくつかの実施形態では、標的は、（例えば、癌、器官若しくは組織の機能（複数可）をしばしば行う器官又は組織の部分の中の）実質上で発現される。いくつかの実施形態では、標的は、細胞、組織、又は器官上で発現される。いくつかの実施形態では、標的は、間質（すなわち、細胞、組織、又は器官の結合支持フレームワーク）上で発現される。いくつかの実施形態では、標的は骨芽細胞上で発現している。いくつかの実施形態では、標的は、内皮（脈管構造）上で発現される。いくつかの実施形態では、標的は癌幹細胞上で発現される。いくつかの実施形態では、ＡＡがコンジュゲートされる薬剤は、微小管阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＡＡがコンジュゲートされる薬剤は、核酸損傷剤である。

【0246】

予防、改善又は治療の有効性は、例えば、異常な標的発現及び／若しくは活性などの標的発現及び／若しくは活性と関連付けられる疾患又は障害を診断又は治療するための任意の既知の方法との関連で決定される。対象の生存を延長すること、又はそうでなければ、対象における標的発現及び／若しくは活性、例えば、異常な標的発現及び／若しくは活性と関連付けられる疾患又は障害の進行を遅らせることは、ＡＡ及び／又はコンジュゲートＡＡが臨床的恩恵を与えることを示す。

【0247】

ＡＡ及び／又はコンジュゲートＡＡは、医薬組成物の形態で投与できる。そのような組成物の調製に関わる原則と考慮事項、及び成分の選択におけるガイダンスは、例えば、レミントン：薬学の科学と実践（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ Ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ） 第１９版（Ａｌｆｏｎｓｏ Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏら，編集） Ｍａｃｋ Ｐｕｂ． Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．：１９９５；薬物吸収強化：概念、可能性、制限、及び流行（Ｄｒｕｇ Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ：Ｃｏｎｃｅｐｔｓ，Ｐｏｓｓｉｂｉｌｉｔｉｅｓ，Ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ，Ａｎｄ Ｔｒｅｎｄｓ），Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｌａｎｇｈｏｒｎｅ，Ｐａ．，１９９４；及び「ペプチドとタンパク質の薬物送達（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ （Ａｄｖａｎｃｅｓ Ｉｎ Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ,４巻），１９９１，Ｍ．Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）で提供される。

【0248】

抗体断片が用いられるいくつかの実施形態では、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最小の断片が選択される。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、標的タンパク質配列を結合する能力を保持するペプチド分子を設計できる。そのようなペプチドは、化学合成及び／又は組換えＤＮＡ技術によって生成できる。（例えば、Ｍａｒａｓｃｏら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：７８８９－７８９３（１９９３）参照）。製剤はまた、治療される特定の徴候に対して必要に応じて２種以上の活性化合物、例えば、いくつかの実施形態では、互いに悪影響を及ぼさない相補的な活性を有するもの、を含んでよい。いくつかの実施形態では、又は加えて、組成物は、例えば、細胞傷害性薬剤、サイトカイン、化学療法剤、又は成長抑制剤などの、その機能を増強する薬剤を含んでよい。そのような分子は、意図する目的に有効な量で、組み合わされて適切に存在する。

【0249】

有効成分はまた、例えば、コアセルベーション技術によって又は界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンのマイクロカプセル及びポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセル中に、コロイド薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミン微小球、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル）中に又はマクロエマルジョン中に、包込されてもよい。

【0250】

生体内投与に使用される製剤は、無菌でなければならない。これは、滅菌濾過膜を通す濾過によって容易に達成される。

【0251】

持続放出製剤を、調製できる。持続放出製剤の適切な例としては、マトリックスが形のある製品、例えば、フィルム、又はマイクロカプセルの形態にある抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが挙げられる。徐放性マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２－ヒドロキシエチルメタクリレート）、又はポリ（ビニルアルコール）、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ－グルタミン酸とγエチル－Ｌ－グルタミン酸塩の共重合体、非分解性エチレンビニル酢酸、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ（商標）などの分解性乳酸－グリコール酸共重合体（乳酸グリコール酸共重合体及び酢酸ロイプロリドで構成される注入用ミクロスフェア）、及びポリ－Ｄ－（－）－３－ヒドロキシ酪酸）が挙げられる。エチレンビニル酢酸及び乳酸－グリコール酸などのポリマーは、１００日以上、分子の放出を可能にするが、ある種のヒドロゲルは、より短い期間タンパク質を放出する。

【0252】

診断用途
本発明はまた、様々な診断及び／又は予防的適応で活性化可能な抗標的抗体及び／又はコンジュゲートされた活性化可能な抗ＣＤ１６６抗体を用いるための方法及びキットを提供する。例えば、本発明は、（ｉ）活性化可能な抗標的抗体と対象若しくは試料を接触させることであって、抗標的ＡＡが、マスキング部分（ＭＭ）と、切断剤によって切断される切断可能な部分（ＣＭ）と、興味の標的に特異的に結合する抗原結合ドメイン又はその断片（ＡＢ）とを含み、切断されず、活性化されていない状態で抗標的ＡＡが、以下のようにＮ末端からＣ末端への構造的配置：ＭＭ－ＣＭ－ＡＢ又はＡＢ－ＣＭ－ＭＭを含み；（ａ）ＭＭは、ＡＢの標的への結合を阻害するペプチドであり、ＭＭは、ＡＢの天然の結合パートナーのアミノ酸配列を有しておらず、ＡＢの天然結合パートナーの修飾形態でもなく；かつ（ｂ）ＡＢが切断されず、活性化されていない状態にある場合、ＭＭは、ＡＢの標的への特異的結合に干渉し、ＡＢが切断され、活性化された状態にある場合には、ＭＭは、標的へのＡＢの特異的結合に干渉しないか、又はそれと競合しない、接触させること；かつ（ｉｉ）対象又は試料中の活性化された抗標的ＡＡのレベルを測定することであって、対象又は試料中の活性化された抗標的ＡＡの検出可能なレベルが、切断剤及び標的が対象又は試料中に存在することを示し、対象又は試料中の活性化された抗標的ＡＡの検出できないレベルが、切断剤、標的又は切断剤と標的の両方が対象又は試料に存在しないことを示す、測定すること、によって、対象又は試料中の切断剤及び興味の標的の有無を検出するための方法並びにキットを提供する。

【0253】

いくつかの実施形態では、活性化可能な抗標的抗体は、治療剤がコンジュゲートされる活性化可能な抗標的抗体である。いくつかの実施形態では、活性化可能な抗標的抗体は、薬剤にコンジュゲートされない。いくつかの実施形態では、活性化可能な抗標的抗体は、検出可能な標識を含む。いくつかの実施形態では、検出可能な標識は、ＡＢ上に配置される。いくつかの実施形態では、対象又は試料中の活性化可能な抗標的抗体のレベルを測定することは、活性化された抗体に特異的に結合する第２の試薬を用いて達成され、試薬は検出可能な標識を含む。いくつかの実施形態では、第２の試薬は、検出可能な標識を含む抗体である。

【0254】

これらの方法及びキットのいくつかの実施形態では、活性化可能な抗標的抗体は、検出可能な標識を含む。これらの方法及びキットのいくつかの実施形態では、検出可能な標識は、イメージング剤、造影剤、酵素、蛍光標識、発色団、色素、１以上の金属イオン、又はリガンドベースの標識を含む。これらの方法及びキットのいくつかの実施形態では、撮像剤は、放射性同位元素を含む。これらの方法及びキットのいくつかの実施形態では、放射性同位元素は、インジウム又はテクネチウムである。これらの方法及びキットのいくつかの実施形態では、造影剤は、ヨウ素、ガドリニウム又は酸化鉄を含む。これらの方法及びキットのいくつかの実施形態では、酵素は、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、又はβ－ガラクトシダーゼを含む。これらの方法及びキットのいくつかの実施形態では、蛍光標識は、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、修飾された赤色蛍光タンパク質（ｍＲＦＰ）、赤色蛍光タンパク質ｔｄｉｍｅｒ２（ＲＦＰ ｔｄｉｍｅｒ２）、ＨＣＲＥＤ、又はユーロピウム誘導体を含む。これらの方法及びキットのいくつかの実施形態では、発光標識は、Ｎ－メチルアクリジウム誘導体を含む。これらの方法のいくつかの実施形態では、標識は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６８０又はＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）７５０などのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）標識を含む。これらの方法及びキットのいくつか実施形態は、リガンドベースの標識は、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン又は１以上のハプテンを含む。

【0255】

これらの方法及びキットのいくつかの実施形態では、対象は哺乳動物である。これらの方法のいくつかの実施形態では、対象はヒトである。いくつかの実施形態では、対象は、非ヒト霊長類などの非ヒト哺乳動物、コンパニオン動物（例えば、猫、犬、馬）、家畜、作業用動物、又は動物園の動物である。いくつかの実施形態では、対象は、げっ歯類である。

【0256】

これらの方法及びキットのいくつかの実施形態では、本方法は、インビボ法である。これらの方法のいくつかの実施形態では、本方法は、インサイツ法である。これらの方法のいくつかの実施形態では、本方法は、エキソビボ法である。これらの方法のいくつかの実施形態では、本方法は、インビトロ法である。

【0257】

方法及びキットのいくつかの実施形態では、本方法は、本開示の抗標的ＡＡによる治療、その後、それを必要とする対象に、その活性化可能な抗標的抗体及び／又はコンジュゲートされた活性化可能な抗標的抗体を投与することによる治療に適する患者集団を特定又はそうでなければ精製するために使用される。例えば、標的（例えば、ＣＤ１６６）とこれらの方法で検査される抗標的ＡＡのＣＭ（ＣＭ）中の基質を切断するプロテアーゼの両方について検査で陽性を示す患者は、そのようなＣＭを含むそのような抗標的ＡＡによる治療に適する候補として特定され、その後、患者は、検査された治療有効量の活性化可能な抗標的抗体及び／又はコンジュゲートされた活性化可能な抗標的抗体を投与される。同様に、標的（例えばＣＤ１６６）と、これらの方法を用いて検査されるＡＡのＣＭ中の基質を切断するプロテアーゼの一方又は両方について検査で陰性を示す患者は、別の形態の治療法に適する候補として特定され得る。いくつかの実施形態では、そのような患者は、治療に適切な抗標的ＡＡが特定されるまで、他の抗標的ＡＡを用いて検査できる（例えば、疾患部位で患者によって切断されるＣＭを含む抗標的ＡＡ）。いくつかの実施形態では、患者は次いで、検査で陽性を示した患者のための治療有効量の活性化可能な抗標的抗体及び／又はコンジュゲートを投与される。適切なＡＢ、ＭＭ、及び／又はＣＭは、本明細書に開示されるＡＢ、ＭＭ及び／又はＣＭのいずれかを含む。

【0258】

いくつかの実施形態では、ＡＡ及び／又はコンジュゲートＡＡは、検出可能な標識を含む。インタクト抗体、又はその断片（例えば、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、又はＦ（ａｂ）_２）が用いられる。プローブ又は抗体に関して、用語「標識された」は、プローブ又は抗体に検出可能な物質を共役（すなわち、物理的に結合）させることによるプローブ又は抗体の直接標識、及び直接標識された別の試薬との反応性によるプローブ又は抗体の間接標識を包含することを意図している。間接標識の例としては、蛍光標識二次抗体及び蛍光標識ストレプトアビジンで検出できるようにビオチンによるＤＮＡプローブの末端標識を用いる一次抗体の検出が挙げられる。用語「生体試料」は、対象から分離された組織、細胞及び生体液、並びに対象内に存在する組織、細胞及び液体を含むことを意図する。したがって、血液と、血清、血漿、又はリンパを含む血液の一部又は成分は、用語「生体試料」の使用に含まれる。すなわち、本開示の検出方法は、インビトロ及びインビボで、生体試料中の分析物のｍＲＮＡ、タンパク質、又はゲノムＤＮＡを検出するために使用できる。例えば、分析物のｍＲＮＡの検出のためのインビトロ技術は、ノーザンハイブリダイゼーション及びインサイツハイブリダイゼーションを含む。分析物のタンパク質の検出のためのインビトロ技術は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット、免疫沈降、免疫化学的染色、及び免疫蛍光を含む。検体のゲノムＤＮＡの検出のためのインビトロ技術は、サザンハイブリダイゼーションを含む。イムノアッセイを行う手順は、例えば、「ＥＬＩＳＡ：理論と実践：分子生物学における方法（ＥＬＩＳＡ： Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、４２巻，Ｊ．Ｒ．Ｃｒｏｗｔｈｅｒ（編） Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，１９９５；「イムノアッセイ（Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）」，Ｅ．Ｄｉａｍａｎｄｉｓ及びＴ．Ｃｈｒｉｓｔｏｐｏｕｌｕｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ.，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１９９６；並びに「酵素イムノアッセイの実践と理論（Ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｎｄ Ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ）」，Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９８５に記載されている。さらに、検体タンパク質の検出のためのインビボ技術は、標識された抗検体タンパク質抗体を対象に導入することを含む。例えば、抗体は、対象中でのその存在及び位置を標準的なイメージング技術によって検出できる、放射性マーカーで標識できる。

【0259】

したがって、本開示のＡＡ及びコンジュゲートＡＡは、様々な診断及び予防の製剤にも有用である。一実施形態では、ＡＡ及び／又はコンジュゲートＡＡは、前述の障害の１以上を発症するおそれがある対象に投与される。前述の障害の１以上に対する対象又は器官の素因は、遺伝子、血清学的又は生化学的マーカーを用いて決定できる。

【0260】

本開示のいくつかの実施形態では、ＡＡ及び／又はコンジュゲートＡＡは、前述の障害の１以上と関連付けられる臨床徴候と診断されたヒト個体に投与される。診断時に、臨床徴候の影響を軽減又は逆転させるために、ＡＡ及び／又はコンジュゲートＡＡが投与される。

【0261】

本開示の活性化可能な抗体、及び／又はコンジュゲートＡＡは、対象試料中の標的の検出にも有用であり、したがって、診断として有用である。例えば、本開示の抗体及び／又は活性化可能な抗体、及びそのコンジュゲートバージョンは、対象試料中の標的レベルを検出するためにインビトロアッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡで使用される。

【0262】

一実施形態では、本開示のＡＡ及び／又はコンジュゲートＡＡは、固体支持体（例えば、マイクロタイタープレートのウェル（複数可））上に固定化される。固定化されたＡＡ及び／又はコンジュゲートＡＡは、検査試料中に存在し得る任意の標的の捕捉抗体として機能する。固定化された活性化可能な抗体、及び／又はそのコンジュゲートバージョンと対象試料を接触させる前に、固体支持体を洗い流し、ミルクタンパク質又はアルブミンなどのブロッキング剤で処理して、検体の非特異的吸着を防ぐ。

【0263】

その後、ウェルを、抗原を含む疑いのある検査試料、又は標準量の抗原を含む溶液で処理する。そのような試料は、例えば、病理の診断であると考えられる循環抗原のレベルを有すると疑われる対象からの血清試料である。検査試料又は標準物質を洗い流した後、固体支持体を、検出可能に標識された第２の抗体で処理する。標識された第２抗体は、検出抗体として機能する。検出可能な標識のレベルを測定し、検査試料中の標的抗原の濃度を、標準試料から作成された標準曲線との比較によって決定する。

【0264】

インビトロ診断アッセイで本開示のＡＡ及びそのコンジュゲートバージョンを用いて得られた結果に基づいて、標的抗原の発現レベルに基づき対象の疾患をステージ分類できることが理解される。所与の疾患について、血液試料を、疾患の進行の様々なステージ、かつ／又は疾患の治療処置の様々な時点にあると診断された対象から採取する。進行又は治療の各ステージの統計的に有意な結果を提供する試料集団を用いて、各ステージの特徴と考えられ得る抗原の濃度の範囲が指定される。

【0265】

ＡＡ及び／又はコンジュゲートＡＡは、診断及び／又はイメージング方法でも使用できる。いくつかの実施形態では、そのような方法はインビトロ法である。いくつかの実施形態では、そのような方法はインビボ法である。いくつかの実施形態では、そのような方法はインサイツ法である。いくつかの実施形態では、そのような方法はエキソビボ方法である。例えば、酵素的に切断可能なＣＭを有するＡＡは、ＣＭを切断できる酵素の有無を検出するために使用できる。そのようなＡＡは、所与の宿主生物の所与の細胞又は組織中の活性化された抗体（すなわち、活性化可能な抗体の切断から生じる抗体）の蓄積の測定による酵素活性（又は、いくつかの実施形態では、ジスルフィド結合の減少を提供できるような還元電位が増加した環境）のインビボ検出（例えば、定性的又は定量的）を含み得る診断に使用できる。そのような活性化された抗体の蓄積は、組織が酵素活性（又はＣＭの性質に応じた還元電位の増加）を表すだけでなく、組織が、活性化された抗体が結合する標的を発現することも示す。

【0266】

例えば、ＣＭを、腫瘍の部位、生物学的に閉じ込められた部位（例えば、膿瘍、器官など）でのウイルス又は細菌感染部位などで見出される少なくとも１つのプロテアーゼの基質であると選択できる。ＡＢは、標的抗原を結合するものであり得る。本明細書に開示される方法、又は適切な場合には、当業者に馴染みのある方法を用いて、検出可能な標識（例えば、蛍光標識又は放射性標識又は放射性トレーサー）を、ＡＢ又は抗体及び／若しくは活性化可能な抗体の他の領域にコンジュゲートできる。適切な検出標識は、上記のスクリーニング方法の文脈で議論され、追加の具体的な例を、以下に提供する。疾患状態のタンパク質又はペプチドに特異的なＡＢを用いて、興味の疾患組織においてその活性が上昇した少なくとも１つのプロテアーゼと共に、ＡＡは、ＣＭ特異的酵素が検出可能なレベルで存在しないか、又は疾患組織に比べて低いレベルで存在するか、又は不活性である（例えば、酵素原形態又は阻害剤との複合体にある）組織と比較して、疾患組織への結合率の増加を示す。小タンパク質及びペプチドは腎臓濾過システムによって血液から急速に除去されるので、かつＣＭに特異的な酵素は検出可能なレベルで存在しない（又は非疾患組織中で低いレベルで存在するか、又は不活性立体構造で存在する）ため、疾患組織における活性化された抗体の蓄積は、非疾患組織と比較して増強される。

【0267】

別の例では、ＡＡを用いて、試料中の切断剤の有無を検出できる。例えば、ＡＡが酵素による切断を受けやすいＣＭを含む場合、ＡＡを用いて、試料中の酵素の存在を（定性的又は定量的のいずれかで）検出できる。別の例では、ＡＡが還元剤による切断の影響を受けやすいＣＭを含む場合、ＡＡを用いて、試料中の還元条件の存在を（定性的又は定量的のいずれかで）検出できる。これらの方法での分析を容易にするために、ＡＡを、検出可能に標識でき、支持体（例えば、スライド又はビーズなどの固体支持体）に結合させることができる。検出可能な標識は、切断後に放出されないＡＡの部分の上に位置付けることができ、例えば、検出可能な標識は、切断が生じるまで検出できない、クエンチ蛍光標識又は他の標識であり得る。このアッセイは、例えば、固定化され、検出可能に標識されたＡＡを酵素及び／又は還元剤を含む疑いのある試料と、切断が起こるのに十分な時間接触させること、次いで、洗浄して過剰な試料及び混入物を除去することによって行うことができる。試料中の切断剤（例えば、酵素又は還元剤）の有無は次いで、試料と接触させる前のＡＡの検出可能なシグナルの変化、例えば、試料中の切断剤によるＡＡの切断による検出可能なシグナルの存在及び／又は増加によって評価される。

【0268】

そのような検出方法は、切断時にＡＡのＡＢを結合できる標的の有無の検出も提供するように適合させることができる。そのため、アッセイは、切断剤の有無と興味の標的の有無を評価するように適合させることができる。切断剤の有無は、上記のＡＡの検出可能な標識の存在及び／又は増加によって検出でき、標的の有無は、標的－ＡＢ複合体、例えば、検出可能に標識された抗標的抗体の使用によって検出できる。

【0269】

ＡＡは、例えば、プロテアーゼ切断、及び特定の標的への結合によるＡＡ活性化の検証のためのインサイツイメージングにも有用である。インサイツイメージングは、細胞培養又は組織切片などの生体試料中のタンパク質分解活性及び標的の局在化を可能にする技術である。この技術を用いて、検出可能な標識（例えば、蛍光標識）の存在に基づき所与の標的への結合とタンパク質分解活性の両方を確認できる。

【0270】

これらの技術は、疾患部位（例えば、腫瘍組織）若しくは健常な組織に由来する任意の凍結された細胞又は組織に有用である。これらの技術は、新鮮な細胞又は組織試料でも有用である。

【0271】

これらの技術において、ＡＡは、検出可能な標識で標識される。検出可能な標識は、蛍光色素（例えば、フルオロフォア、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）標識）、近赤外（ＮＩＲ）色素（例えば、Ｑｄｏｔ（登録商標）ナノ結晶）、コロイド金属、ハプテン、放射性マーカー、ビオチン及びストレプトアビジンなどの増幅試薬、又は酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ）であり得る。

【0272】

標識されたＡＡとインキュベートされた試料中の標識の検出で、ＡＡは、試料が標的を含み、活性化可能な抗体のＣＭに特異的なプロテアーゼを含むことを示す。いくつかの実施形態では、プロテアーゼの存在は、本明細書に記載のものなどの広域スペクトルのプロテアーゼ阻害剤を使用して、かつ／又はプロテアーゼに特異的である薬剤、例えば、プロテアーゼマトリプターゼに特異的であり、マトリプターゼのタンパク質分解活性を阻害するＡ１１などの抗体を使用することによって確認できる；例えば、２０１０年１１月１１日に公開された国際公開ＷＯ２０１０／１２９６０９を参照されたい。本明細書に記載のものなどの広域スペクトルプロテアーゼ阻害剤を用いる、及び／又はより選択的な阻害剤を用いることによる同様の手法は、活性化可能な抗体のＣＭに特異的であるプロテアーゼを特定するために使用できる。いくつかの実施形態では、標的の存在は、標的に特異的である薬剤、例えば、別の抗体を用いて確認でき、又は検出可能な標識は、標識されていない標的と競合できる。いくつかの実施形態では、標識されていないＡＡは、標識された二次抗体又はより複雑な検出システムによる検出で使用できる。

【0273】

同様の技術は、対象、例えば、ヒトを含む哺乳動物における蛍光シグナルの検出によって、疾患部位が標的を含み、活性化可能な抗体のＣＭに特異的なプロテアーゼを含むことが示されるインビボイメージングにも有用である。

【0274】

これらの技術は、活性化可能な抗体内のプロテアーゼ特異的ＣＭに基づく様々な細胞、組織、及び生物におけるプロテアーゼ活性の検出、特定又は特性評価のためのキット中で及び／又はそれらのための試薬としても有用である。

【0275】

本開示は、様々な診断及び／又は予防的適応においてＡＡを使用する方法を提供する。例えば、本開示は、（ｉ）活性化可能な抗体と対象若しくは試料を接触させることであって、ＡＡが、マスキング部分（ＭＭ）と、切断剤、例えば、プロテアーゼによって切断される切断可能な部分（ＣＭ）と、興味の標的に特異的に結合する抗原結合ドメイン又はその断片（ＡＢ）とを含み、切断されず、活性化されていない状態のＡＡが、以下のようにＮ末端からＣ末端への構造的配置：ＭＭ－ＣＭ－ＡＢ又はＡＢ－ＣＭ－ＭＭを含み；（ａ）ＭＭは、ＡＢの標的への結合を阻害するペプチドであり、ＭＭは、ＡＢの天然の結合パートナーのアミノ酸配列を有しておらず、ＡＢの天然結合パートナーの修飾形態でもなく；かつ（ｂ）切断されず、活性化されていない状態で、ＭＭは、ＡＢの標的への特異的結合に干渉し、切断され、活性化された状態で、ＭＭは、標的へのＡＢの特異的結合に干渉しないか、又はそれと競合しない、接触させること；かつ（ｉｉ）対象又は試料中の活性化されたＡＡのレベルを測定することであって、対象又は試料中の活性化されたＡＡの検出可能なレベルは、切断剤及び標的が対象又は試料中に存在することを示し、対象又は試料中の活性化されたＡＡの検出できないレベルは、切断剤、標的又は切断剤と標的の両方が対象又は試料に存在せず、かつ／又は十分に存在しないことを示す、測定すること、によって対象又は試料中の切断剤及び興味の標的の有無を検出する方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＡＡは、治療剤がコンジュゲートされるＡＡである。いくつかの実施形態では、ＡＡは、薬剤にコンジュゲートされない。いくつかの実施形態では、ＡＡは、検出可能な標識を含む。いくつかの実施形態では、検出可能な標識は、ＡＢ上に配置される。いくつかの実施形態では、対象又は試料中のＡＡのレベルを測定することは、活性化された抗体に特異的に結合する第２の試薬を用いて達成され、試薬は、検出可能な標識を含む。いくつかの実施形態では、第２の試薬は、検出可能な標識を含む抗体である。

【0276】

本開示はまた、（ｉ）興味の標的、例えば、標的の存在下でＡＡと対象若しくは試料を接触させることであって、ＡＡが、マスキング部分（ＭＭ）と、切断剤、例えば、プロテアーゼによって切断される切断可能な部分（ＣＭ）と、興味の標的に特異的に結合する抗原結合ドメイン又はその断片（ＡＢ）とを含み、切断されず、活性化されていない状態のＡＡが、以下のようにＮ末端からＣ末端への構造的配置：ＭＭ－ＣＭ－ＡＢ又はＡＢ－ＣＭ－ＭＭを含み；（ａ）ＭＭは、ＡＢの標的への結合を阻害するペプチドであり、ＭＭは、ＡＢの天然の結合パートナーのアミノ酸配列を有しておらず、ＡＢの天然結合パートナーの修飾形態でもなく；かつ（ｂ）切断されず、活性化されていない状態で、ＭＭは、ＡＢの標的への特異的結合に干渉し、切断され、活性化された状態で、ＭＭは、標的へのＡＢの特異的結合に干渉しないか、又はそれと競合しない、接触させること；かつ（ｉｉ）対象又は試料中の活性化されたＡＡのレベルを測定することであって、対象又は試料中の活性化されたＡＡの検出可能なレベルは、切断剤が対象又は試料中に存在することを示し、対象又は試料中の活性化されたＡＡの検出できないレベルは、切断剤が対象又は試料に存在せず、かつ／又は十分に存在しないことを示す、測定すること、によって対象又は試料中の切断剤の有無を検出する方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＡＡは、治療剤がコンジュゲートされるＡＡである。いくつかの実施形態では、ＡＡは、薬剤にコンジュゲートされない。いくつかの実施形態では、ＡＡは、検出可能な標識を含む。いくつかの実施形態では、検出可能な標識は、ＡＢ上に配置される。いくつかの実施形態では、対象又は試料中のＡＡのレベルを測定することは、活性化された抗体に特異的に結合する第２の試薬を用いて達成され、試薬は、検出可能な標識を含む。いくつかの実施形態では、第２の試薬は、検出可能な標識を含む抗体である。

【0277】

本開示はまた、対象又は試料中の切断剤及び標的の有無を検出する方法で使用するキットも提供し、キットは、マスキング部分（ＭＭ）と、切断剤、例えば、プロテアーゼによって切断される切断可能な部分（ＣＭ）と、興味の標的に特異的に結合する抗原結合ドメイン又はその断片（ＡＢ）を含む少なくとも１つのＡＡとを含み、切断されず、活性化されていない状態のＡＡは、以下のようにＮ末端からＣ末端への構造的配置：ＭＭ－ＣＭ－ＡＢ又はＡＢ－ＣＭ－ＭＭを含み；（ａ）ＭＭは、ＡＢの標的への結合を阻害するペプチドであり、ＭＭは、ＡＢの天然の結合パートナーのアミノ酸配列を有しておらず、ＡＢの天然結合パートナーの修飾形態でもなく；かつ（ｂ）切断されず、活性化されていない状態で、ＭＭは、ＡＢの標的への特異的結合に干渉し、切断され、活性化された状態で、ＭＭは、標的へのＡＢの特異的結合に干渉しないか、又はそれと競合せず；かつ（ｉｉ）対象又は試料中の活性化されたＡＡのレベルを測定することであって、対象又は試料中の活性化されたＡＡの検出可能なレベルは、切断剤が対象又は試料中に存在することを示し、対象又は試料中の活性化されたＡＡの検出できないレベルは、切断剤が対象又は試料に存在せず、かつ／又は十分に存在しないことを示す、測定することを含む。いくつかの実施形態では、ＡＡは、治療剤がコンジュゲートされるＡＡである。いくつかの実施形態では、ＡＡは、薬剤にコンジュゲートされない。いくつかの実施形態では、ＡＡは、検出可能な標識を含む。いくつかの実施形態では、検出可能な標識は、ＡＢ上に配置される。いくつかの実施形態では、対象又は試料中のＡＡのレベルを測定することは、活性化可能な抗体に特異的に結合する第２の試薬を用いて達成され、試薬は、検出可能な標識を含む。いくつかの実施形態では、第２の試薬は、検出可能な標識を含む抗体である。

【0278】

本開示はまた、（ｉ）切断可能な抗体と対象又は試料とを接触させることであって、ＡＡが、マスキング部分（ＭＭ）と、切断剤、例えば、プロテアーゼによって切断される切断可能な部分（ＣＭ）と、標的に特異的に結合する抗原結合ドメイン（ＡＢ）と、検出可能な標識とを含み、切断されず、活性化されていない状態のＡＡは、以下のようにＮ末端からＣ末端への構造的配置：ＭＭ－ＣＭ－ＡＢ又はＡＢ－ＣＭ－ＭＭを含み；ＭＭは、ＡＢの標的への結合を阻害するペプチドであり、ＭＭは、ＡＢの天然の結合パートナーのアミノ酸配列を有しておらず、ＡＢの天然結合パートナーの修飾形態でもなく；切断されず、活性化されていない状態で、ＭＭは、ＡＢの標的への特異的結合に干渉し、切断され、活性化された状態で、ＭＭは、標的へのＡＢの特異的結合に干渉しないか、又はそれと競合せず；検出可能な標識は、ＣＭの切断後に放出されるＡＡの一部上に配置される、接触させること；かつ（ｉｉ）対象又は試料中の検出可能な標識のレベルを測定することであって、対象又は試料中の検出可能な標識の検出可能なレベルは、切断剤が対象又は試料に存在せず、かつ／又は十分に存在しないことを示し、対象又は試料中の検出可能な標識の検出できないレベルは、切断剤が対象又は試料中に存在することを示す、測定すること、によって対象又は試料中の切断剤の有無を検出する方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＡＡは、治療剤がコンジュゲートされるＡＡである。いくつかの実施形態では、ＡＡは、薬剤にコンジュゲートされない。いくつかの実施形態では、ＡＡは、検出可能な標識を含む。いくつかの実施形態では、検出可能な標識は、ＡＢ上に配置される。いくつかの実施形態では、対象又は試料中のＡＡのレベルを測定することは、活性化された抗体に特異的に結合する第２の試薬を用いて達成され、試薬は、検出可能な標識を含む。いくつかの実施形態では、第２の試薬は、検出可能な標識を含む抗体である。

【0279】

本開示はまた、対象又は試料中の切断剤及び標的の有無を検出する方法で使用するためのキットであって、対象又は生体試料に接触する際に使用するための、本明細書に記載の少なくとも１つのＡＡ及び／又はコンジュゲートＡＡ（例えば、治療剤がコンジュゲートされるＡＡ）、並びに対象又は生体試料中の活性化されたＡＡ及び／又はコンジュゲートＡＡのレベルを検出する手段を含む、キットを提供し、対象又は生体試料中の活性化されたＡＡの検出可能なレベルは、切断剤及び標的が対象又は生体試料中に存在することを示し、対象又は生体試料中の活性されたＡＡの検出できないレベルは、切断剤、標的又は切断剤と標的の両方が、対象又は生体試料中に存在せず、かつ／又は十分に存在しないことを示し、それによりＡＡの標的結合及び／又はプロテアーゼ切断は、対象又は生体試料において検出できない。

【0280】

本開示はまた、（ｉ）標的の存在下で対象又は生体試料をＡＡと接触させること；かつ（ｉｉ）対象又は生体試料中の活性化されたＡＡのレベルを測定すること、によって対象又は試料の切断剤の有無を検出する方法であって、対象又は生体試料中の活性されたＡＡの検出可能なレベルは、切断剤が対象又は生体試料中に存在することを示し、対象又は生体試料中の活性されたＡＡの検出できないレベルは、切断剤が、対象又は生体試料中に存在せず、かつ／又は十分に存在しないことを示し、それによりＡＡのプロテアーゼ切断は、対象又は生体試料において検出できない、方法を提供する。そのようなＡＡは、マスキング部分（ＭＭ）と、切断剤、例えば、プロテアーゼによって切断される切断可能な部分（ＣＭ）と、標的に特異的に結合する抗原結合ドメイン又はその断片（ＡＢ）とを含み、切断されない（すなわち、活性化されていない）状態のＡＡは、以下のようにＮ末端からＣ末端への構造的配置：ＭＭ－ＣＭ－ＡＢ又はＡＢ－ＣＭ－ＭＭを含み；（ａ）ＭＭは、ＡＢの標的への結合を阻害するペプチドであり、ＭＭは、ＡＢの天然の結合パートナーのアミノ酸配列を有しておらず；かつ（ｂ）切断されていない状態のＡＡのＭＭは、ＡＢの標的への特異的結合に干渉し、切断された（すなわち、活性化された）状態のＡＡのＭＭは、標的へのＡＢの特異的結合に干渉しないか、又はそれと競合しない。いくつかの実施形態では、ＡＡは、治療剤がコンジュゲートされるＡＡである。いくつかの実施形態では、ＡＡは、薬剤にコンジュゲートされない。いくつかの実施形態では、検出可能な標識は、マスキング部分に付着される。いくつかの実施形態では、検出可能な標識は、ＣＭのプロテアーゼ切断部位のＮ末端に付着される。いくつかの実施形態では、ＡＢの単一の抗原結合部位は、マスクされる。本開示の抗体が少なくとも２つの抗原結合部位を有するいくつかの実施形態では、少なくとも１つの抗原結合部位がマスクされ、少なくとも１つの抗原結合部位はマスクされない。いくつかの実施形態では、全ての抗原結合部位がマスクされる。いくつかの実施形態では、測定工程は、検出可能な標識を含む第２の試薬の使用を含む。

【0281】

本開示はまた、対象又は試料中の切断剤及び標的の有無を検出する方法で使用するためのキットであって、標的の存在下で対象又は生体試料とＡＡを接触させること、及び対象又は生体試料中の活性化されたＡＡのレベルを測定することにおいて使用するための、本明細書に記載の少なくとも１つのＡＡ及び／又はコンジュゲートＡＡを含む、キットを提供し、対象又は生体試料中の活性されたＡＡの検出可能なレベルは、切断剤が対象又は生体試料中に存在することを示し、対象又は生体試料中の活性されたＡＡの検出できないレベルは、切断剤が、対象又は生体試料中に存在せず、かつ／又は十分に存在しないことを示し、それによりＡＡのプロテアーゼ切断は、対象又は生体試料において検出できない。そのようなＡＡは、マスキング部分（ＭＭ）と、切断剤、例えば、プロテアーゼによって切断される切断可能な部分（ＣＭ）と、標的に特異的に結合する抗原結合ドメイン又はその断片（ＡＢ）とを含み、切断されない（すなわち、活性化されていない）状態のＡＡは、以下のようにＮ末端からＣ末端への構造的配置：ＭＭ－ＣＭ－ＡＢ又はＡＢ－ＣＭ－ＭＭを含み；（ａ）ＭＭは、ＡＢの標的への結合を阻害するペプチドであり、ＭＭは、ＡＢの天然の結合パートナーのアミノ酸配列を有しておらず；かつ（ｂ）切断されない状態のＡＡのＭＭは、ＡＢの標的への特異的結合に干渉し、切断された（すなわち、活性化された）状態のＡＡのＭＭは、標的へのＡＢの特異的結合に干渉しないか、又はそれと競合しない。いくつかの実施形態では、ＡＡは、治療剤がコンジュゲートされるＡＡである。いくつかの実施形態では、ＡＡは、薬剤にコンジュゲートされない。いくつかの実施形態では、検出可能な標識は、マスキング部分に付着される。いくつかの実施形態では、検出可能な標識は、ＣＭのプロテアーゼ切断部位のＮ末端に付着される。いくつかの実施形態では、ＡＢの単一の抗原結合部位はマスクされる。本開示の抗体が少なくとも２つの抗原結合部位を有するいくつかの実施形態では、少なくとも１つの抗原結合部位がマスクされて、少なくとも１つの抗原結合部位はマスクされない。いくつかの実施形態では、全ての抗原結合部位がマスクされる。いくつかの実施形態では、測定工程は、検出可能な標識を含む第２の試薬の使用を含む。

【0282】

本開示はまた、対象又は試料における切断剤の有無を検出する方法で使用するためのキットであって、対象又は生体試料に接触する際に使用するための、本明細書に記載の少なくとも１つのＡＡ及び／又はコンジュゲートＡＡ、並びに対象又は生体試料中の活性化されたＡＡ及び／又はコンジュゲートＡＡのレベルを検出する手段を含む、キットを提供し、ＡＡは、ＣＭの切断後に放出されるＡＡの一部上に配置される検出可能な標識を含み、対象又は生体試料中の活性されたＡＡの検出可能なレベルは、切断剤が、対象又は生体試料中に存在せず、かつ／又は十分に存在しないことを示し、それによりＡＡの標的結合及び／又はプロテアーゼ切断は、対象又は生体試料において検出できず、対象又は生体試料中の活性されたＡＡの検出できないレベルは、切断剤が対象又は生体試料中に検出可能なレベルで存在することを示す。

【0283】

本開示は、（ｉ）ＡＡがＣＭの切断後に放出されるＡＡの一部上に配置される検出可能な標識を含む、活性化可能な抗体と対象又は生体試料を接触させること、かつ（ｉｉ）対象又は試料中の活性化されたＡＡのレベルを測定することであって、対象又は試料中の活性化されたＡＡの検出可能なレベルは、切断剤、標的又は切断剤と標的の両方が対象又は生体試料中に存在せず、かつ／又は十分に存在しないことを示し、それによりＡＡの標的結合及び／又はプロテアーゼ切断は、対象又は生体試料において検出できず、対象又は生体試料中の活性化されたＡＡの検出可能なレベルの低下は、切断剤及び標的が対象又は生体試料に存在することを示す、測定すること、によって対象又は試料中の切断剤及び標的の有無を検出する方法を提供する。検出可能な標識のレベルの低下は、例えば、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、及び／又は約１００％の低下である。そのようなＡＡは、マスキング部分（ＭＭ）と、切断剤によって切断される切断可能な部分（ＣＭ）と、標的に特異的に結合する抗原結合ドメイン又はその断片（ＡＢ）とを含み、切断されない（すなわち、活性化されていない）状態のＡＡは、以下のようにＮ末端からＣ末端への構造的配置：ＭＭ－ＣＭ－ＡＢ又はＡＢ－ＣＭ－ＭＭを含み；（ａ）ＭＭは、ＡＢの標的への結合を阻害するペプチドであり、ＭＭは、ＡＢの天然の結合パートナーのアミノ酸配列を有しておらず；かつ（ｂ）切断されない状態のＡＡのＭＭは、ＡＢの標的への特異的結合に干渉し、切断された（すなわち、活性化された）状態のＡＡのＭＭは、標的へのＡＢの特異的結合に干渉しないか、又はそれと競合しない。いくつかの実施形態では、ＡＡは、治療剤がコンジュゲートされるＡＡである。いくつかの実施形態では、ＡＡは、薬剤にコンジュゲートされない。いくつかの実施形態では、ＡＡは、検出可能な標識を含む。いくつかの実施形態では、検出可能な標識はＡＢ上に配置される。いくつかの実施形態では、対象又は試料中のＡＡのレベルを測定することは、活性化可能な抗体に特異的に結合する第２の試薬を用いて達成され、試薬は、検出可能な標識を含む。いくつかの実施形態では、第２の試薬は、検出可能な標識を含む抗体である。

【0284】

本開示はまた、対象又は試料中の切断剤及び標的の有無を検出する方法で使用するためのキットであって、対象又は生体試料に接触する際に使用するための、本明細書に記載の少なくとも１つのＡＡ及び／又はコンジュゲートＡＡ、並びに対象又は生体試料における活性化されたＡＡ及び／又はコンジュゲートＡＡのレベルを検出する手段を含む、キットを提供し、対象又は生体試料中の活性化されたＡＡの検出可能レベルは、切断剤、標的又は切断剤と標的の両方が対象又は生体試料中に存在せず、かつ／又は十分に存在しないことを示し、それによりＡＡの標的結合及び／又はプロテアーゼ切断は、対象又は生体試料において検出できず、対象又は生体試料中の活性化されたＡＡの検出可能なレベルの低下は、切断剤及び標的が対象又は生体試料に存在しないことを示す。検出可能な標識のレベルの低下は、例えば、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、及び／又は約１００％の低下である。

【0285】

本開示はまた、（ｉ）ＡＡがＣＭの切断後に放出されるＡＡの一部上に配置される検出可能な標識を含む、活性化可能な抗体と対象又は生体試料を接触させること、かつ（ｉｉ）対象又は試料中の検出可能な標識のレベルを測定することであって、対象又は生体試料中の検出可能な標識の検出可能なレベルは、切断剤が検出可能なレベルで対象又は生体試料中に存在せず、かつ／又は十分に存在しないことを示し、それによりＡＡのプロテアーゼ切断は、対象又は生体試料において検出できず、対象又は生体試料中の検出可能な標識の検出可能なレベルの低下は、切断剤が対象又は生体試料に存在しないことを示す、測定すること、によって対象又は試料中の切断剤の有無を検出する方法を提供する。検出可能な標識のレベルの低下は、例えば、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％及び／又は約１００％の低下である。そのようなＡＡは、マスキング部分（ＭＭ）と、切断剤によって切断される切断可能な部分（ＣＭ）と、標的に特異的に結合する抗原結合ドメイン又はその断片（ＡＢ）とを含み、切断されない（すなわち、活性化されていない）状態のＡＡは、以下のようにＮ末端からＣ末端への構造的配置：ＭＭ－ＣＭ－ＡＢ又はＡＢ－ＣＭ－ＭＭを含み；（ａ）ＭＭは、ＡＢの標的への結合を阻害するペプチドであり、ＭＭは、ＡＢの天然の結合パートナーのアミノ酸配列を有しておらず；かつ（ｂ）切断されない状態のＡＡのＭＭは、ＡＢの標的への特異的結合に干渉し、切断された（すなわち、活性化された）状態のＡＡのＭＭは、標的へのＡＢの特異的結合に干渉しないか、又はそれと競合しない。いくつかの実施形態では、ＡＡは、治療剤がコンジュゲートされるＡＡである。いくつかの実施形態では、ＡＡは、薬剤にコンジュゲートされない。いくつかの実施形態では、ＡＡは、検出可能な標識を含む。いくつかの実施形態では、検出可能な標識は、ＡＢ上に配置される。いくつかの実施形態では、対象又は試料中のＡＡのレベルを測定することは、活性化された抗体に特異的に結合する第２の試薬を用いて達成され、試薬は、検出可能な標識を含む。いくつかの実施形態では、第２の試薬は、検出可能な標識を含む抗体である。

【0286】

本開示はまた、対象又は試料において興味の切断剤の有無を検出する方法で使用するためのキットであって、対象又は生体試料に接触する際に使用するための、本明細書に記載の少なくとも１つのＡＡ及び／又はコンジュゲートＡＡ、並びに対象又は生体試料における活性化されたＡＡ及び／又はコンジュゲートＡＡのレベルを検出する手段を含む、キットを提供し、ＡＡは、ＣＭの切断後に放出されるＡＡの一部上に配置される検出可能な標識を含み、対象又は生体試料中の検出可能な標識の検出可能なレベルは、切断剤、標的又は切断剤と標的の両方が対象又は生体試料中に存在せず、かつ／又は十分に存在しないことを示し、それによりＡＡの標的結合及び／又はプロテアーゼ切断は、対象又は生体試料において検出できず、対象又は生体試料中の検出可能な標識の検出可能なレベルの低下は、切断剤及び標的が対象又は生体試料に存在することを示す。検出可能な標識のレベルの低下は、例えば、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、及び／又は約１００％の低下である。

【0287】

これらの方法及びキットのいくつかの実施形態では、ＡＡは、検出可能な標識を含む。これらの方法及びキットのいくつかの実施形態では、検出可能な標識は、イメージング剤、造影剤、酵素、蛍光標識、発色団、色素、１以上の金属イオン、又はリガンドベースの標識を含む。これらの方法及びキットのいくつかの実施形態では、イメージング剤は、放射性同位元素を含む。これらの方法及びキットのいくつかの実施形態では、放射性同位元素は、インジウム又はテクネチウムである。これらの方法及びキットのいくつかの実施形態では、造影剤は、ヨウ素、ガドリニウム又は酸化鉄を含む。これらの方法及びキットのいくつかの実施形態では、酵素は、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、又はβ－ガラクトシダーゼを含む。これらの方法及びキットのいくつかの実施形態では、蛍光標識は、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、修飾赤色蛍光タンパク質（ｍＲＦＰ）、赤色蛍光タンパク質ｔｄｉｍｅｒ２（ＲＦＰ ｔｄｉｍｅｒ２）、ＨＣＲＥＤ、又はユーロピウム誘導体を含む。これらの方法及びキットのいくつかの実施形態では、発光標識は、Ｎ－メチルアクリジウム誘導体を含む。これらの方法のいくつかの実施形態では、標識は、Ａｌｅｘ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６８０又はＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）７５０などのＡｌｅｘ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）標識を含む。これらの方法及びキットのいくつかの実施形態では、リガンドベースの標識は、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン又は１以上のハプテンを含む。

【0288】

これらの方法及びキットのいくつかの実施形態では、対象は哺乳動物である。これらの方法及びキットのいくつかの実施形態では、対象はヒトである。いくつかの実施形態では、対象は、非ヒト霊長類などの非ヒト哺乳動物、コンパニオン動物（例えば、猫、犬、馬）、家畜、作業用動物、又は動物園の動物である。いくつかの実施形態では、対象は、げっ歯類である。

【0289】

これらの方法のいくつかの実施形態では、本方法は、インビボ法である。これらの方法のいくつかの実施形態では、本方法は、インサイツ法である。これらのいくつかの実施形態では、本方法は、エキソビボ法である。これらの方法のいくつかの実施形態では、本方法は、インビトロ法である。

【0290】

いくつかの実施形態では、インサイツイメージング及び／又はインビボイメージングは、治療する対象を特定する方法において有用である。例えば、インサイツイメージングでは、ＡＡを用いて、対象試料をスクリーニングし、適切な場所、例えば、腫瘍部位で適切なプロテアーゼ（複数可）及び標的（複数可）を有するそれらの対象を特定する。

【0291】

いくつかの実施形態では、インサイツイメージングは、本開示のＡＡによる治療に適する対象集団を特定するか、又はそうでなければ精緻化するために使用される。例えば、標的（例えば、標的）と、検査されるＡＡのＣＭ（ＣＭ）中の基質を切断するプロテアーゼの両方について検査で陽性を示す対象は、そのようなＣＭを含むそのようなＡＡによる治療に適する候補として特定される。同様に、標的（例えば、標的）と、これらの方法を用いて検査されるＡＡのＣＭ中の基質を切断するプロテアーゼの一方又は両方について検査で陰性を示す対象は、別の形態の治療法に適する候補として特定され得る。いくつかの実施形態では、第１のＡＡに対して検査で陰性を示すそのような対象は、治療に適するＡＡが特定されるまで、異なるＣＭを含む他のＡＡ（例えば、疾患部位で対象によって切断されるＣＭを含むＡＡ）で検査できる。いくつかの実施形態では、検査で陽性を示す対象は次いで、治療有効量のＡＡを投与される。

【0292】

いくつかの実施形態では、インビボイメージングは、本開示のＡＡによる治療に適する対象集団を特定するか、又はそうでなければ精緻化するために使用される。例えば、標的（例えば、標的）と、検査されるＡＡのＣＭ（ＣＭ）中の基質を切断するプロテアーゼの両方について検査で陽性を示す（例えば、疾患部位で活性化された抗体を蓄積する）対象は、そのようなＣＭを含むそのようなＡＡによる治療に適する候補として特定される。同様に、検査で陰性を示す対象は、別の形態の治療法に適する候補として特定され得る。いくつかの実施形態では、第１のＡＡに対して検査で陰性を示すそのような対象は、治療に適するＡＡが特定されるまで異なるＣＭを含む他のＡＡ（例えば、疾患部位で対象によって切断されるＣＭを含むＡＡ）で検査できる。いくつかの実施形態では、検査で陽性を示す対象は次いで、治療有効量のＡＡを投与される。

【0293】

方法及びキットのいくつかの実施形態では、本方法又はキットは、本開示のＡＡによる治療に適する対象集団を特定するか、又はそうでなければ精緻化するために使用される。例えば、標的（例えば、標的）と、これらの方法で検査されるＡＡのＣＭ（ＣＭ）中の基質を切断するプロテアーゼの両方について検査で陽性を示す対象は、そのようなＣＭを含むそのようなＡＡによる治療に適する候補として特定される。同様に、標的（例えば、標的）と、これらの方法を用いて検査されているＡＡのＣＭ中の基質を切断するプロテアーゼの両方について検査で陰性を示すそのような対象は、別の形態の治療法に適する候補として特定され得る。いくつかの実施形態では、そのような対象は、治療に適切なＡＡが特定されるまで、他のＡＡ（例えば、疾患部位で対象によって切断されるＣＭを含むＡＡ）で検査できる。いくつかの実施形態では、標的（例えば、標的）のいずれかについて検査で陰性を示す対象は、そのようなＣＭを含むそのようなＡＡによる治療に適する候補として特定される。いくつかの実施形態では、標的（例えば、標的）のいずれかについて検査で陰性を示す対象は、そのようなＣＭを含むそのようなＡＡによる治療に適する候補ではないと特定される。いくつかの実施形態では、そのような対象は、治療に適切なＡＡが特定されるまで、他のＡＡ（例えば、疾患部位で対象によって切断されるＣＭを含むＡＡ）で検査できる。いくつかの実施形態では、ＡＡは、治療剤がコンジュゲートされるＡＡである。いくつかの実施形態では、ＡＡは、薬剤にコンジュゲートされない。いくつかの実施形態では、ＡＡは、検出可能な標識を含む。いくつかの実施形態では、検出可能な標識は、ＡＢ上に配置される。いくつかの実施形態では、対象又は試料中のＡＡのレベルを測定することは、活性化可能な抗体に特異的に結合する第２の試薬を用いて達成され、試薬は、検出可能な標識を含む。いくつかの実施形態では、第２の試薬は、検出可能な標識を含む抗体である。

【0294】

いくつかの実施形態では、方法又はキットは、本開示の抗標的ＡＡ及び／又はコンジュゲートＡＡ（例えば、治療剤がコンジュゲートするＡＡ）による治療、その後、それを必要とする対象にＡＡ及び／又はコンジュゲートＡＡを投与することによる治療に適する対象集団を特定するか、又はそうでなければ精緻化するために使用される。例えば、標的（例えば、標的）と、これらの方法で検査されているＡＡ及び／又はコンジュゲートＡＡのＣＭ（ＣＭ）中の基質を切断するプロテアーゼの両方の検査で陽性を示す対象は、そのようなＣＭを含むそのような抗体及び／又はそのようなコンジュゲートＡＡによる治療に適する候補として特定され、対象は次いで、検査された治療有効量のＡＡ及び／又はコンジュゲートＡＡを投与される。同様に、標的（例えば、標的）と、これらの方法を用いて検査されるＡＡのＣＭ中の基質を切断するプロテアーゼの一方又は両方について検査で陰性を示す対象は、別の形態の治療法に適する候補として特定され得る。いくつかの実施形態では、そのような対象は、治療に適する抗体及び／又はコンジュゲートＡＡが特定されるまで、他の抗体及び／又はコンジュゲートＡＡ（例えば、疾患の部位で対象によって切断されるＣＭを含むＡＡ及び／又はコンジュゲートＡＡ）で検査できる。いくつかの実施形態では、検査で陽性を示す対象は次いで、治療有効量のＡＡ及び／又はコンジュゲートＡＡを投与される。

【0295】

これらの方法及びキットのいくつかの実施形態では、ＭＭは、約４～４０個のアミノ酸長を有するペプチドである。これらの方法及びキットのいくつかの実施形態では、ＡＡは、リンカーペプチドを含み、リンカーペプチドはＭＭ及びＣＭの間に位置付けられる。これらの方法及びキットのいくつかの実施形態では、ＡＡはリンカーペプチドを含み、リンカーペプチドはＡＢとＣＭの間に位置付けられる。これらの方法及びキットのいくつかの実施形態では、ＡＡは、第１のリンカーペプチド（ＬＰ１）及び第２のリンカーペプチド（ＬＰ２）を含み、第１のリンカーペプチドはＭＭとＣＭの間に位置付けられ、第２のリンカーペプチドはＡＢとＣＭの間に位置付けられる。これらの方法及びキットのいくつかの実施形態では、ＬＰ１及びＬＰ２の各々は、約１～２０個のアミノ酸長のペプチドであり、ＬＰ１及びＬＰ２の各々は同じリンカーである必要はない。これらの方法及びキットのいくつかの実施形態では、ＬＰ１及びＬＰ２の一方又は両方は、グリシン－セリンポリマーを含む。これらの方法及びキットのいくつかの実施形態では、ＬＰ１及びＬＰ２の少なくとも一方は、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号２２）及び（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号２３）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ｎは少なくとも１の整数である。これらの方法及びキットのいくつかの実施形態では、ＬＰ１及びＬＰ２の少なくとも一方は、式（ＧＧＳ）ｎを有するアミノ酸配列を含み、ｎは少なくとも１の整数である。これらの方法及びキットのいくつかの実施形態では、ＬＰ１及びＬＰ２の少なくとも一方は、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ（配列番号２４）、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（配列番号２５）、Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ（配列番号２６）、Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ-Ｇｌｙ（配列番号２７）、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ（配列番号２８）、及びＧｌｙ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ（配列番号２９）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0296】

これらの方法及びキットのいくつかの実施形態では、ＡＢは、本明細書に提示される交差反応性抗体配列から選択される抗体又は抗体断片配列を含む。これらの方法及びキットのいくつかの実施形態では、ＡＢは、Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ又は一本鎖抗体（ｓｃＡｂ）を含む。

【0297】

これらの方法及びキットのいくつかの実施形態では、切断剤は、対象又は試料中に標的と共局在するプロテアーゼであり、ＣＭは、プロテアーゼの基質として機能するポリペプチドであり、プロテアーゼは、ＡＡがプロテアーゼに曝露されたときにＡＡのＣＭを切断する。これらの方法及びキットのいくつかの実施形態では、ＣＭは、最大１５個のアミノ酸長のポリペプチドである。これらの方法及びキットのいくつかの実施形態では、ＣＭは、ＡＢのＮ末端と共役される。これらの方法及びキットのいくつかの実施形態では、ＣＭは、ＡＢのＣ末端と共役される。これらの方法及びキットのいくつかの実施形態では、ＣＭは、ＡＢのＶＬ鎖のＮ末端と共役される。

【0298】

本開示の抗体、コンジュゲート抗体、ＡＡ及びコンジュゲートＡＡは、診断用及び予防用の製剤に使用される。一実施形態では、ＡＡは、前述の炎症、炎症性障害、癌又は他の障害の１以上を発症するおそれがある対象に投与される。

【0299】

前述の障害の１以上に対する対象又は器官の素因は、遺伝子マーカー、血清マーカー又は生化学的マーカーを用いて決定できる。

【0300】

本開示のいくつかの実施形態では、ＡＡ及び／又はコンジュゲートＡＡは、前述の障害の１以上と関連付けられる臨床徴候を有すると診断されたヒト個体に投与される。診断時に、ＡＡ及び／又はコンジュゲートＡＡは、臨床徴候の影響を軽減する又は逆転させるために投与される。

【0301】

本開示の抗体、コンジュゲート抗体、ＡＡ及びコンジュゲートＡＡはまた、対象試料中の標的の検出に有用であり、それに応じて診断法として有用である。例えば、本開示の抗体、コンジュゲート抗体、ＡＡ及びコンジュゲートＡＡは、対象試料中の標的レベルを検出するためにインビトロアッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡで使用される。

【0302】

一実施形態では、本開示の抗体及び／又はＡＡは、固体支持体（例えば、マイクロタイタープレートのウェル（複数可））上に固定化される。固定化抗体及び／又はＡＡは、検査試料中に存在し得る任意の標的の捕捉抗体として機能する。固定化抗体及び／又はＡＡと対象試料を接触させる前に、固体支持体を、軽くすすぎ、検体の非特異的吸着を防ぐために、牛乳タンパク質又はアルブミンなどのブロッキング剤で処理する。

【0303】

その後、ウェルを、抗原を含む疑いのある検査試料、又は標準量の抗原を含む溶液で処理する。そのような試料は、例えば、病理に特徴的であると考えられる循環抗原のレベルを有すると疑われる対象からの血清試料である。検査試料又は標準物質を洗い流した後に、固体支持体を、検出可能に標識された第２の抗体で処理する。標識された第２抗体は、検出抗体として機能する。検出可能な標識のレベルを測定し、検査試料中の標的抗原の濃度を、標準試料から作成された標準曲線との比較によって決定する。

【0304】

インビトロ診断アッセイで本開示の抗体及び／又はＡＡを用いて得られた結果に基づいて、標的抗原の発現レベルに基づき対象の疾患をステージ分類できることが理解される。所与の疾患について、血液試料を、疾患の進行の様々なステージ、かつ／又は疾患の治療処置の様々な時点にあると診断された対象から採取する。進行又は治療の各ステージの統計的に有意な結果を提供する試料集団を用いて、各ステージの特徴と考えられ得る抗原の濃度の範囲が指定される。

【0305】

抗体、コンジュゲーション抗体、ＡＡ及びコンジュゲートＡＡは、診断及び／又はイメージング方法でも使用できる。いくつかの実施形態では、そのような方法は、インビトロ法である。いくつかの実施形態では、そのような方法は、インビボ法である。いくつかの実施形態では、そのような方法は、インサイツ法である。いくつかの実施形態では、そのような方法は、エキソビボ方法である。例えば、酵素的に切断可能なＣＭを有するＡＡを、ＣＭを切断できる酵素の有無を検出するために使用できる。そのようなＡＡは、所与の宿主生物の所与の細胞又は組織における活性化された抗体（すなわち、活性化可能な抗体の切断から生じる抗体）の蓄積の測定による酵素活性（又は、いくつかの実施形態では、ジスルフィド結合の減少を提供できるような還元電位が増加した環境）のインビボ検出（例えば、定性的又は定量的）を含み得る、診断に使用できる。そのような活性化された抗体の蓄積は、組織が酵素活性（又はＣＭの性質に応じた還元電位の増加）を表すだけでなく、組織が、それに対し活性化された抗体が結合する標的を発現することも示す。

【0306】

例えば、ＣＭを、腫瘍の部位、生物学的に閉じ込められた部位（例えば、膿瘍、器官など）でのウイルス又は細菌感染部位などで見出されるプロテアーゼのプロテアーゼ基質であると選択できる。ＡＢは、標的抗原を結合するものであり得る。当業者に馴染みのある方法を用いて、検出可能な標識（例えば、蛍光標識又は放射性標識又は放射性トレーサー）を、ＡＢ又は活性化可能な抗体の他の領域にコンジュゲートできる。適切な検出可能な標識は、上記のスクリーニング方法の文脈で議論され、追加の具体的な例を、以下に提供する。興味の疾患組織において活性が上昇したプロテアーゼと共に、疾患状態のタンパク質又はペプチドに特異的なＡＢを用いて、ＡＡは、ＣＭ特異的酵素が検出可能なレベルで存在しないか、又は疾患組織に比べて低いレベルで存在するか、又は不活性である（例えば、酵素原形態又は阻害剤との複合体にある）組織と比較して、疾患組織への結合率の増加を示す。小タンパク質及びペプチドは腎臓濾過システムによって血液から急速に除去されるので、かつＣＭに特異的な酵素は検出可能なレベルで存在しない（又は非疾患組織に低いレベルで存在するか、又は不活性立体構造に存在する）ため、疾患組織における活性化された抗体の蓄積は、非疾患組織と比較して増強される。

【0307】

別の例では、ＡＡを用いて、試料中の切断剤の有無を検出できる。例えば、ＡＡが酵素による切断を受けやすいＣＭを含む場合、ＡＡを用いて、試料中の酵素の存在を（定性的又は定量的のいずれかで）検出できる。別の例では、ＡＡが還元剤による切断の影響を受けやすいＣＭを含む場合、ＡＡを用いて、試料中の還元条件の存在を（定性的又は定量的のいずれかで）検出できる。これらの方法での分析を容易にするために、ＡＡを、検出可能に標識でき、支持体（例えば、スライド又はビーズなどの固体支持体）に結合させることができる。検出可能な標識は、切断後に放出されないＡＡの部分上に位置付けることができ、例えば、検出可能な標識は、切断が生じるまで検出できないクエンチ蛍光標識又は他の標識であり得る。このアッセイは、例えば、固定化され、検出可能に標識されたＡＡを酵素及び／又は還元剤を含む疑いのある試料と、切断が起こるのに十分な時間接触させ、次いで、洗浄して、過剰な試料及び混入物を除去することによって行うことができる。試料中の切断剤（例えば、酵素又は還元剤）の有無が次いで、試料と接触する前のＡＡの検出可能なシグナルの変化、例えば、試料中の切断剤によるＡＡの切断による検出可能なシグナルの存在及び／又は増加によって評価される。

【0308】

そのような検出方法は、切断時にＡＡのＡＢと結合できる標的の有無の検出も提供するように適合させることができる。そのため、アッセイは、切断剤の有無と興味の標的の有無を評価するように適合させることができる。切断剤の有無は、上記のＡＡの検出可能な標識の存在及び／又は増加によって検出でき、標的の有無は、標的－ＡＢ複合体、例えば、検出可能に標識された抗標的抗体の使用によって検出できる。

【0309】

ＡＡは、例えば、プロテアーゼ切断、及び特定の標的への結合によるＡＡ活性化の検証のためのインサイツイメージングにも有用である。インサイツイメージングは、細胞培養又は組織切片などの生体試料中のタンパク質分解活性及び標的の局在化を可能にする技術である。この技術を用いて、検出可能な標識（例えば、蛍光標識）の存在に基づき所与の標的への結合とタンパク質分解活性の両方を確認できる。

【0310】

これらの技術は、疾患部位（例えば、腫瘍組織）若しくは健常な組織に由来する任意の凍結された細胞又は組織で有用である。これらの技術は、新鮮な細胞又は組織試料でも有用である。

【0311】

これらの技術において、ＡＡは、検出可能な標識で標識される。検出可能な標識は、蛍光色素（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、近赤外（ＮＩＲ）色素（例えば、Ｑｄｏｔ（登録商標）ナノ結晶）、コロイド金属、ハプテン、放射性マーカー、ビオチン及びストレプトアビジンなどの増幅試薬、又は酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ）であり得る。

【0312】

標識されたＡＡとインキュベートされた試料中の標識の検出で、ＡＡは、試料が標的を含み、活性化可能な抗体のＣＭに特異的なプロテアーゼを含むことを示す。いくつかの実施形態では、プロテアーゼの存在は、本明細書に記載のものなどの広域スペクトルのプロテアーゼ阻害剤を使用して、及び／又はプロテアーゼに特異的である薬剤、例えば、プロテアーゼマトリプターゼに特異的であり、マトリプターゼのタンパク質分解活性を阻害するＡ１１などの抗体を使用することによって確認できる；例えば、２０１０年１１月１１日に公開された国際公開ＷＯ２０１０／１２９６０９を参照されたい。本明細書に記載のものなどの広域スペクトルプロテアーゼ阻害剤を用いる、及び／又はより選択的な阻害剤を用いることによる同様の手法は、活性化可能な抗体のＣＭに特異的であるプロテアーゼ又はプロテアーゼのクラスを特定するために使用できる。いくつかの実施形態では、標的の存在は、標的に特異的である薬剤、例えば、別の抗体を用いて確認でき、又は検出可能な標識は、標識されていない標的と競合できる。いくつかの実施形態では、標識されていないＡＡは、標識された二次抗体又はより複雑な検出システムによる検出で使用できる。

【0313】

同様の技術は、対象、例えば、ヒトを含む哺乳動物における蛍光シグナルの検出が、疾患部位が標的を含み、かつ活性化可能な抗体のＣＭに特異的なプロテアーゼを含むことを示す、インビボイメージングにも有用である。

【0314】

これらの技術は、活性化可能な抗体内のプロテアーゼ特異的ＣＭに基づく様々な細胞、組織、及び生物におけるプロテアーゼ活性の検出、特定又は特性評価のためのキットにおいて及び／又はそれらのための試薬としても有用である。

【0315】

いくつかの実施形態では、インサイツイメージング及び／又はインビボイメージングは、治療する対象を特定する方法において有用である。例えば、インサイツイメージングでは、ＡＡは、対象試料をスクリーニングして、適切な場所、例えば、腫瘍部位で適切なプロテアーゼ（複数可）及び標的（複数可）を有する対象を特定するために使用される。

【0316】

いくつかの実施形態では、インサイツイメージングは、本開示のＡＡによる治療に適する対象集団を特定するか、又はそうでなければ精緻化するために使用される。例えば、標的と、検査されるＡＡのＣＭ（ＣＭ）中の基質を切断するプロテアーゼの両方について検査で陽性を示す（例えば、疾患部位で活性化された抗体を蓄積する）対象は、そのようなＣＭを含むそのようなＡＡによる治療に適する候補として特定される。同様に、標的と、これらの方法を用いて検査されるＡＡのＣＭ中の基質を切断するプロテアーゼの一方又は両方について検査で陰性を示す対象は、別の形態の治療法に適する（すなわち、検査されているＡＡによる治療に適さない）候補として特定される。いくつかの実施形態では、第１のＡＡに対して検査で陰性を示すそのような対象は、治療に適するＡＡが特定されるまで、異なるＣＭを含む他のＡＡ（例えば、疾患部位で対象によって切断されるＣＭを含むＡＡ）で検査できる。

【0317】

いくつかの実施形態では、インビボイメージングは、本開示のＡＡによる治療に適する対象集団を特定するか、又はそうでなければ精緻化するために使用される。例えば、標的と、検査されるＡＡのＣＭ（ＣＭ）中の基質を切断するプロテアーゼの両方について検査で陽性を示す（例えば、疾患部位で活性化された抗体を蓄積する）対象は、そのようなＣＭを含むそのようなＡＡによる治療に適する候補として特定される。同様に、検査で陰性を示す対象は、別の形態の治療法に適する（すなわち、検査されているＡＡによる治療に適さない）候補として特定される。いくつかの実施形態では、第１のＡＡに対して検査で陰性を示すそのような対象は、治療に適するＡＡが特定されるまで、異なるＣＭを含む他のＡＡ（例えば、疾患部位で対象によって切断されるＣＭを含むＡＡ）で検査できる。

【0318】

医薬組成物
本開示のＡＡ及びコンジュゲートＡＡ（本明細書では「活性化合物」とも呼ばれる）、及びその誘導体、断片、類似体及び相同体は、投与に適する医薬組成物に組み込むことができる。そのような組成物は典型的には、ＡＡ及び／又はコンジュゲートＡＡ及び医薬として許容される担体を含む。本明細書で使用される用語「医薬として許容される担体」は、医薬投与と適合する全ての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などを含むことを意図する。適切な担体は、参照により本明細書に組み込まれる、当技術分野の標準的な参照テキストであるレミントンの薬学の最新版に記載されている。そのような担体又は希釈剤の適切な例としては、水、生理食塩水、リンゲル溶液、デキストロース溶液、及び５％ヒト血清アルブミンが挙げられるが、これらに限定されない。リポソーム及び固定油などの非水性ビヒクルも使用され得る。医薬として活性のある物質に対するそのような培地及び薬剤の使用は、当技術分野において周知である。いずれかの従来の培地又は薬剤が活性化合物と不適合である場合を除き、組成物中でのその使用が企図される。補足活性化合物も組成物に組み込むことができる。

【0319】

本開示の医薬組成物は、その意図された投与経路と適合するように製剤化される。投与経路の例としては、非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、経口（例えば、吸入）、経皮（すなわち、局所）、経粘膜、及び直腸投与が挙げられる。例示的な実施形態では、投与経路は、静脈内投与である。

【0320】

非経口、皮内、若しくは皮下適用に使用される溶液又は懸濁液は、以下の成分：注入用水、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール又は他の合成溶媒などの無菌希釈剤；ベンジルアルコール又はメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）などのキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩又はリン酸塩などの緩衝剤、及び塩化ナトリウム又はデキストロースなどの浸透圧の調整のための薬剤を含んでよい。ｐＨは、塩酸若しくは水酸化ナトリウムなどの酸又は塩基で調整できる。非経口製剤は、アンプル、使い捨て注射器又はガラス若しくはプラスチック製の複数回用量バイアルに封入できる。

【0321】

注入使用に適する医薬組成物は、滅菌の水溶液（水溶性の場合）又は分散液及び無菌注入液若しくは分散液の即時調製のための無菌粉末を含む。静脈内投与の場合、適切な担体は、生理食塩水、静菌水、クレモファーＥＬ^（商標）（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．）又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含む。全ての場合において、組成物は、無菌でなければならず、容易に注射器が使用できる程度に流体でなければならない。それは、製造及び保管の条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用に対して保護される必要がある。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、及びそれらの適切な混合物を含有する溶媒又は分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用によって、分散液の場合に必要な粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持できる。微生物の作用の予防は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成できる。いくつかの実施形態では、等張性薬剤、例えば、糖、マンニトールなどのポリアルコール、ソルビトール、塩化ナトリウムを組成物に含めるのが望ましい。注入用組成物の長期吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物に含めることによってもたらされ得る。

【0322】

滅菌注入液は、上記に列挙した成分の１つ又は組み合わせを用いて適切な溶媒に必要量で活性化合物を組み込むこと、必要に応じて、その後、濾過滅菌を行うことによって調製できる。一般に、分散液は、上記に列挙されたものから塩基性分散媒及び必要な他の成分を含む滅菌ビヒクルに活性化合物を組み込むことによって調製される。滅菌注入液の調製のための無菌粉末の場合、調製方法は、その事前に滅菌濾過した溶液から活性成分及び任意の追加の所望の成分の粉末をもたらす、真空乾燥及び凍結乾燥である。

【0323】

経口組成物は一般に、不活性希釈剤又は食用担体を含む。それらは、ゼラチンカプセルに封じ込めるか、又は錠剤に圧縮できる。経口治療投与の目的のために、活性化合物は、賦形剤と共に組み込まれ、錠剤、トローチ、又はカプセルの形態で使用できる。経口組成物を、口内洗浄剤として使用する流体担体を用いて調製することもでき、流体担体内の化合物は経口で塗布され、局所使用され、喀痰されるか又は飲み込まれる。医薬適合性のある結合剤、及び／又はアジュバント材料を、組成物の一部として含めることができる。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチなどは、以下の成分：微結晶セルロース、ガムトラガカント若しくはゼラチンなどの結合剤；デンプン若しくはラクトースなどの賦形剤、アルギン酸、プリモゲル、若しくはコーンスターチなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム若しくはステローテなどの滑剤；コロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤；スクロース若しくはサッカリンなどの甘味剤；又はペパーミント、サリチル酸メチル、若しくはオレンジ香料などの香料剤、又は類似の性質の化合物のいずれかを含んでよい。

【0324】

吸入による投与のために、化合物は、適切な推進剤、例えば、二酸化炭素などのガスを含む圧力容器又はディスペンサーからエアロゾルスプレーの形態で、又はネブライザーで送達される。

【0325】

全身投与はまた、経粘膜又は経皮的手段によっても可能である。経粘膜又は経皮投与については、浸透する障壁に適する浸透剤が、製剤中で使用される。そのような浸透剤は、一般に当技術分野で公知であり、例えば、経粘膜投与、洗剤、胆汁酸塩、及びフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は、鼻スプレー又は坐剤の使用を介して達成できる。経皮投与については、活性化合物は、当技術分野で一般に知られているような軟膏、膏薬、ゲル、又はクリームに配合される。

【0326】

化合物はまた、坐剤（例えば、ココアバター及び他のグリセリドなどの従来の坐薬基剤を用いて）又は直腸送達のための保持浣腸の形態で調製することもできる。

【0327】

一実施形態では、活性化合物は、インプラント及びマイクロカプセル化送達システムを含む制御放出製剤などの身体からの迅速な排除から化合物を保護する担体と共に調製される。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸などの、生分解性、生体適合性ポリマーを使用できる。そのような製剤の調製方法は、当業者には明らかであろう。材料はまた、Ａｌｚａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ及びＮｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃから商業的に入手できる。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を用いて感染細胞に標的化されるリポソームを含む）も、医薬として許容される担体として使用できる。これらは、当業者に公知の方法、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載されている方法に従って調製できる。

【0328】

投与の容易さと投与量の均一性のために、経口又は非経口組成物を投与単位形態で配合することが特に有利である。本明細書で使用する投与単位形態は、治療対象の単位投与量として適する物理的に別個の単位を指す。所与量の活性化合物を含む各単位は、必要な医薬担体と関連付けられる所望の治療効果を生じるように計算される。本開示の投与単位形態の仕様は、活性化合物の固有の特性及び達成される特定の治療効果、及び個体の治療のためのそのような活性化合物の配合における、当技術分野で固有の制限によって指示され、それらに直接依存する。

【0329】

医薬組成物を、投与のための説明書と共に容器、パック、又はディスペンサーに含めることができる。

【0330】

投薬
本明細書に提供されるように、対象は、約１ｎｇ／ｋｇ～１００ｇ／ｋｇの任意の用量でＡＡ又はコンジュゲートＡＡを投与される。例示的な実施形態では、対象は、約６ｍｇ／ｋｇ超～約１０ｍｇ／ｋｇの用量でＡＡ又はコンジュゲートＡＡを投与される。一実施形態では、対象は、６ｍｇ／ｋｇ超の用量でＡＡ又はコンジュゲートＡＡを投与される。別の実施形態では、対象は、約７ｍｇ／ｋｇの用量でＡＡ又はコンジュゲートＡＡを投与される。別の実施形態では、対象は、約８ｍｇ／ｋｇの用量でＡＡ又はコンジュゲートＡＡを投与される。別の実施形態では、対象は、約９ｍｇ／ｋｇの用量でＡＡ又はコンジュゲートＡＡを投与される。別の実施形態では、対象は、約１０ｍｇ／ｋｇの用量でＡＡ又はコンジュゲートＡＡを投与される。別の実施形態では、対象は、６ｍｇ／ｋｇ超～約７ｍｇ／ｋｇの用量でＡＡ又はコンジュゲートＡＡを投与される。別の実施形態では、対象は、約７ｍｇ／ｋｇ～約８ｍｇ／ｋｇの用量でＡＡ又はコンジュゲートＡＡを投与される。別の実施形態では、対象は、約８ｍｇ／ｋｇ～約９ｍｇ／ｋｇの用量でＡＡ又はコンジュゲートＡＡを投与される。別の実施形態では、対象は、約９ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇの用量でＡＡ又はコンジュゲートＡＡを投与される。別の実施形態では、対象は、６ｍｇ／ｋｇ超～約８ｍｇ／ｋｇの用量でＡＡ又はコンジュゲートＡＡを投与される。別の実施形態では、対象は、約７ｍｇ／ｋｇ～約９ｍｇ／ｋｇの用量でＡＡ又はコンジュゲートＡＡを投与される。別の実施形態では、対象は、約８ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇの用量でＡＡ又はコンジュゲートＡＡを投与される。別の実施形態では、対象は、２４０ｍｇ超～約１０００ｍｇの固定用量でＡＡ又はコンジュゲートＡＡを投与される。別の実施形態では、対象は、２４０ｍｇ超～約４００ｍｇの固定用量でＡＡ又はコンジュゲートＡＡを投与される。別の実施形態では、対象は、６００ｍｇ超～約１０００ｍｇの固定用量でＡＡ又はコンジュゲートＡＡを投与される。別の実施形態では、対象は、２４０ｍｇ超～６００ｍｇ超の固定用量でＡＡ又はコンジュゲートＡＡを投与される。別の実施形態では、対象は、２４０ｍｇ超～約２８０ｍｇの固定用量でＡＡ又はコンジュゲートＡＡを投与される。別の実施形態では、対象は、約２８０ｍｇ～約３２０ｍｇの固定用量でＡＡ又はコンジュゲートＡＡを投与される。別の実施形態では、対象は、約３２０ｍｇ～約３６０ｍｇの固定用量でＡＡ又はコンジュゲートＡＡを投与される。別の実施形態では、対象は、約３６０ｍｇ～約４００ｍｇの固定用量でＡＡ又はコンジュゲートＡＡを投与される。別の実施形態では、対象は、２４０ｍｇ超～約３２０ｍｇの固定用量でＡＡ又はコンジュゲートＡＡを投与される。別の実施形態では、対象は、約２８０ｍｇ～約３６０ｍｇの固定用量でＡＡ又はコンジュゲートＡＡを投与される。別の実施形態では、対象は、約３２０ｍｇ～約４００ｍｇの固定用量でＡＡ又はコンジュゲートＡＡを投与される。別の実施形態では、対象は、６００ｍｇ超～約７００ｍｇの固定用量でＡＡ又はコンジュゲートＡＡを投与される。別の実施形態では、対象は、約７００ｍｇ～約８００ｍｇの固定用量でＡＡ又はコンジュゲートＡＡを投与される。別の実施形態では、対象は、約８００ｍｇ～約９００ｍｇの固定用量でＡＡ又はコンジュゲートＡＡを投与される。別の実施形態では、対象は、約９００ｍｇ～約１０００ｍｇの固定用量でＡＡ又はコンジュゲートＡＡを投与される。別の実施形態では、対象は、６００ｍｇ超～約８００ｍｇの固定用量でＡＡ又はコンジュゲートＡＡを投与される。別の実施形態では、対象は、約７００ｍｇ～約９００ｍｇの固定用量でＡＡ又はコンジュゲートＡＡを投与される。別の実施形態では、対象は、約８００ｍｇ～約１０００ｍｇの固定用量でＡＡ又はコンジュゲートＡＡを投与される。

【0331】

いくつかの実施形態では、対象は、対象の重量に基づいてコンジュゲートＡＡを投与される。

【0332】

いくつかの実施形態では、対象は、ｍｇ／ｋｇで測定される場合の投与量が対象の実際の体重に基づく、コンジュゲートＡＡを投与される。

【0333】

いくつかの実施形態では、対象は、ｍｇ／ｋｇで測定される場合の投与量が対象の調節された理想体重（ＡＩＢＷ）に基づく、コンジュゲートＡＡを投与される。いくつかの実施形態では、調節された理想体重は、所与の対象の実際の体重と、対象に応じて事前に決定された男性及び女性の対象の理想体重（ＩＢＷ）との差に基づいて計算される。いくつかの実施形態では、所与の対象の理想的な体重は、対象の身長に基づく。いくつかの実施形態では、キログラムでの所与の男性対象の理想体重（ＩＢＷ）は、ＩＢＷ＝０.９×（ｃｍの高さ）－８８と決定され、キログラムでの所与の女性対象のＩＢＷは、ＩＢＷ＝０.９×（ｃｍの高さ）－９２として決定される。いくつかの実施形態では、キログラムでの所与の対象に対して調整された理想体重（ＡＩＢＷ）は、ＡＩＢＷ＝ＩＢＷ＋０.４×（実際の体重－ＩＢＷ）によって決定され、ＩＢＷは、それらの所与の身長と性別に基づく。いくつかの実施形態では、男性及び女性の対象はヒトの対象である。いくつかの実施形態では、ヒト対象のＡＩＢＷは、約４０ｋｇ～約１００ｋｇである。

【0334】

いくつかの実施形態では、対象は、毎日、２日ごと、３日ごと、４日ごと、５日ごと、６日ごと、７日ごと、８日ごと、９日ごと、１０日ごと、１１日ごと、１２日ごと、１３日ごと、１４日ごと、１５日ごと、１６日ごと、１７日ごと、１８日ごと、１９日ごと、２０日ごと、２１日ごと、又は３０日ごとにＡＡ又はコンジュゲートＡＡを静脈内投与される。いくつかの実施形態では、対象は、ＡＡ及び／又は薬剤が有効である限り、ＡＡ又はコンジュゲートＡＡを静脈内投与される。

【0335】

いくつかの実施形態では、対象は、ＡＡ又はコンジュゲートＡＡを１日１回投与される。いくつかの実施形態では、対象は、ＡＡ又はコンジュゲートＡＡを１日に複数回、例えば、４時間ごと、６時間ごと、４～６時間ごと、８時間ごと、又は１２時間ごとに投与される。

【0336】

本開示のいくつかの実施形態では、本開示のＡＡの投与と併せて、対象は、眼毒性を軽減又は予防することを意図した１以上の治療投与計画及び／又は予防措置で予防的に治療され得る。理論に縛られずに、これらの予防的措置は、本開示のコンジュゲートＡＡと関連付けられるＤＭ４などの、メイタンシノイドと関連付けられる眼毒性を緩和及び／又は予防することを意図している。眼毒性を緩和及び／又は予防するための例示的な予防的措置は、ＵＶ Ａ／Ｂの眼保護（例えば、サングラス）の使用、人工涙点眼薬の使用、局所血管収縮剤の点眼薬（例えば、ブリモニジン酒石酸塩の点眼溶液、テトラヒドロゾリン点眼薬）、及び／又は局所ステロイド点眼薬（例えば、酢酸プレドニゾロン点眼薬）の使用を含む。いくつかの実施形態では、治療対象への眼の予防措置の投与は、任意である。いくつかの実施形態では、治療対象への眼の予防措置の投与は、必須である。

【0337】

本発明は、以下の実施例でさらに説明されるが、これは特許請求の範囲に記載する発明の範囲を制限しない。

【0338】

実施例
実施例１：免疫細胞及び活性化されたＴ細胞上でのＣＤ１６６発現
この例示的研究では、ヒトドナー（末梢血単核細胞；ＰＢＭＣ）からの免疫細胞はＣＤ１６６を発現することが示された。これらの例示的結果は、免疫細胞が、ＣＤ１６６を特異的に結合する抗体、及び活性化されたときにＣＤ１６６に特異的に結合する活性化可能な抗体によって選択的に標的化され得ることを実証する。

【0339】

免疫細胞の表面上でのＣＤ１６６発現を調べるために、ヒトＰＢＭＣを、４人の健常ドナーの血液（Ｌｅｕｋｏ Ｐａｋ，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）から単離した。ＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ密度勾配媒体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃａｔａｌｏｇ♯ １７ １４４０ ０２）を用いて単離した。単離したＰＢＭＣを、免疫細胞のＣＤ１６６発現を検出するための膜マーカーについてフローサイトメトリーによって分析した。本明細書に記載のこの及び他の研究におけるフローサイトメトリー分析のために、細胞を、氷上でＦｃブロッキング試薬と１０分間事前にインキュベートし、次に、氷上で３０分間（又は細胞内染色の場合は、室温で１時間）、染色緩衝液（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ♯４２０２０１、又はＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ♯５６３７９４）中のコンジュゲート抗体溶液（抗ヒトＣＤ１６６抗体３Ａ６、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色した。細胞を、染色緩衝液で３回洗浄した（４００ｇ、５分、４Ｃ）。ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ ｆｉｘａｂｌｅ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｄｙｅ ｅＦｌｕｏｒ^（商標）７８０（ｅＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ ♯ ６５－０８６５－１４）を用いて、死細胞を除外した。

【0340】

図１Ａを参照して、蛍光マイナス１（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｍｉｎｕｓ Ｏｎｅ（ＦＭＯ））対照と比較して、単球、Ｂ細胞、及び血中骨髄樹状細胞（ｍＤＣ）上でのＣＤ１６６発現を測定した。これらの例示的結果は、ｍＤＣにおいて最高レベルのＣＤ１６６発現を示す。

【0341】

図１Ｂを参照して、フローサイトメトリー分析を用いて、ＣＤ１６６を発現する異なる免疫細胞サブタイプの集団の割合を測定した。これらの例示的結果は、血液骨髄樹状細胞（ｍＤＣ）及び形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）がＣＤ１６６を発現した細胞の中で最も高い割合を示し、その後に単球及びＢ細胞が続くことを示す。ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、未処理ＣＤ４＋Ｔ細胞、未処理ＣＤ８＋細胞、及びＴｒｅｇ細胞は、実質的にＣＤ１６６発現を示さなかった。

【0342】

図１Ｃを参照して、ＣＤ１６６発現は、ＣＤ３／ＣＤ２８刺激時に、未処理ＣＤ４＋Ｔ細胞上で誘導され得る。この例示的研究では、健康なヒトドナーのＰＢＭＣから単離されるＣＤ４＋Ｔ細胞を、フィコール及び磁気ビーズ（＃１７９５２、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）によって単離した。ＣＤ４＋Ｔ細胞を、ａＣＤ３／ａＣＤ２８ビーズで４日間刺激し、細胞を、毎日フローサイトメトリーで分析して、ＣＤ１６６発現を検出した。図１Ｃの結果は、２つの独立したドナーからのものであり、両方とも刺激後３日目及び４日目のＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＣＤ１６６発現を示す。他の例示的研究は、ＣＤ１６６が、植物性凝集素（ＰＨＡ）又はブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）処理後にＴ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞においても誘導できることを示した。

【0343】

これらの結果は、樹状細胞（ｍＤＣ及びｐＤＣ）、並びに活性化Ｔ細胞が、活性化されたときにＣＤ１６６を結合する活性化可能な抗体によって標的化され得ることを示す。

【0344】

実施例２：ヒトＣＤ１６６同系腫瘍マウスモデル
この例示的研究では、これらの研究で使用される抗ＣＤ１６６抗体及び活性化可能な抗体がマウスＣＤ１６６を結合しないので、同種マウスモデルを作製した。これらの結果は、ヒトＣＤ１６６を発現するマウス細胞株が、プロテアーゼで活性化された活性化可能な抗ＣＤ１６６抗体薬物コンジュゲートに対してインビトロで感受性であり、免疫適格性マウスでｈｕＣＤ１６６発現腫瘍モデルを確立するために使用できることを示した。

【0345】

ＣＴ２６細胞を、ＡＴＣＣから入手した。細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ,Ｉｎｃ、カタログ番号１６１４０－０７１）を補充したＲＰＭＩ－１６４０（商標）培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ,Ｉｎｃ、カタログ番号７２４００１２０）中で培養した。細胞を、３７℃で５％ＣＯ２の加湿雰囲気中で維持した。ＣＴ２６マウス結腸癌の親細胞に、ヒトＣＤ１６６レンチウイルスベクターを形質導入した。ヒトＣＤ１６６を過剰発現したＣＴ２６細胞を、ピューロマイシンで選択した。図２Ａを参照して、これらのトランスジェニックＣＴ２６を、フローサイトメトリーによって分析して、ヒトＣＤ１６６の発現を確認した。

【0346】

ＣＴ２６ ｈｕＣＤ１６６細胞が、ＤＭ４にコンジュゲートした活性化可能な抗ＣＤ１６６抗体（組み合わせ５５）に感受性であることを実証するために、例示的研究を行った。図２Ｂを参照して、親ＣＴ２６細胞及びトランスジェニックＣＴ２６ ｈｕＣＤ１６６細胞を、ＤＭ４にコンジュゲートしたアイソタイプ（Ｓｙｎａｇｉｓ）又はマトリプターゼによって活性化されるコンビネーション５５の活性化可能な抗体薬物コンジュゲート（ＡＡＤＣ）の存在下で４日間培養した。組換えヒトマトリプターゼ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓカタログ＃３９４６－ＳＥ）は、ＭＵＧＢ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈカタログ＃５１０１０）で用量設定し５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０、ｐＨ７．４で希釈した活性部位であった。細胞生存率を、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏを用いて測定した。これらの例示的データは、トランスジェニックＣＴ２６ ｈｕＣＤ１６６細胞がプロテアーゼで活性化された抗ＣＤ１６６ ＡＡＤＣに感受性であることを実証する。

【0347】

ＣＴ２６ ｈｕＣＤ１６６細胞がマウスに移植され腫瘍を形成できることを示すために、例示的研究を行った。図２Ｃを参照して、７週齢のＢＡＬＢ／Ｃマウスに、示される数のＣＴ２６ ｈｕＣＤ１６６細胞を移植し、腫瘍体積を、経時的に測定した。

【0348】

実施例３：コンジュゲートされた活性化可能な抗ＣＤ１６６抗体と活性化可能な抗ＰＤ－１抗体の組み合わせの同系マウスモデルにおけるインビボ有効性
この例示的研究では、抗ＣＤ１６６ＤＭ４がコンジュゲートされた活性化可能な抗体（組み合わせ５５ ＡＡＤＣ）及び活性化可能な抗ＰＤ－１抗体（ｍｕＰＤ－１ ＡＡ）のインビボ有効性を、同系マウスモデルを用いて決定した。これらの結果は、これらの薬物の両方がマウスモデルにおけるｈｕＣＤ１６６発現腫瘍に対するインビボ有効性を示したこと、及び両剤の組み合わせ投与がより高いレベルのインビボ有効性を示したことを示す。

【0349】

インビボ有効性研究のために、免疫適格性雌（ＢＡＬＢ／Ｃ）マウス（７週齢；Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ）の各々に、０.１ｍＬの血清を含まないＲＰＭＩ１６４０細胞培養培地中の１０^６個のＣＴ２６ ｈｕＣＤ１６６細胞を右後方側腹部に皮下接種した。腫瘍体積及び体重を、接種後週２回記録した。腫瘍の寸法を、キャリパー測定により決定し、腫瘍体積を、式（ａ×ｂ^２）／２（式中、ａは最長の直径であり、ｂは最短の直径である）を用いて計算した。腫瘍サイズが１００～１７５ｍｍ^３に達したとき、マウスを、無作為化し（０日目）、以下の投薬計画に従って投与した。抗ＣＤ１６６ ＡＡＤＣ（組み合わせ５５）を、週１回×２週（０日目及び７日目）に５ｍｇ／ｋｇを静脈内投与した。活性化可能な抗マウスＰＤ－１抗体（ｍｕＰＤ－１ ＡＡ）を、１０ｍｇ／ｋｇ ｂ．ｉ．ｗ．×２.５週（１日目、５日目、８日目、１２日目、及び１５日目）の腹腔内注入によって投与した。いくつかの実験では、完全な腫瘍退行を示したマウスに、薬物の最後の投与の２週間後にＣＴ－２６ ｈｕＣＤ１６６腫瘍細胞を再負荷した。対照群にはビヒクル対照（ＰＢＳ）を投与した。

【0350】

組み合わせ５５の活性化可能な抗ＣＤ１６６抗体は、配列番号８又は配列番号９の重鎖と、配列番号１４又は配列番号１５の軽鎖を含む。活性化可能なコンジュゲート抗ＣＤ１６６抗体を、ＳＰＤＢリンカーを介してＤＭ４にコンジュゲートできる。

【0351】

ヒトＣＤ１６６の例示的アミノ酸配列は以下である：
MESKGASSCRLLFCLLISATVFRPGLGWYTVNSAYGDTIIIPCRLDVPQNLMFGKWKYEKPDGSPVFIAFRSSTKKSVQYDDVPEYKDRLNLSENYTLSISNARISDEKRFVCMLVTEDNVFEAPTIVKVFKQPSKPEIVSKALFLETEQLKKLGDCISEDSYPDGNITWYRNGKVLHPLEGAVVIIFKKEMDPVTQLYTMTSTLEYKTTKADIQMPFTCSVTYYGPSGQKTIHSEQAVFDIYYPTEQVTIQVLPPKNAIKEGDNITLKCLGNGNPPPEEFLFYLPGQPEGIRSSNTYTLMDVRRNATGDYKCSLIDKKSMIASTAITVHYLDLSLNPSGEVTRQIGDALPVSCTISASRNATVVWMKDNIRLRSSPSFSSLHYQDAGNYVCETALQEVEGLKKRESLTLIVEGKPQIKMTKKTDPSGLSKTIICHVEGFPKPAIQWTITGSGSVINQTEESPYINGRYYSKIIISPEENVTLTCTAENQLERTVNSLNVSAISIPEHDEADEISDENREKVNDQAKLIVGIVVGLLLAALVAGVVYWLYMKKSKTASKHVNKDLGNMEENKKLEENNHKTEA（配列番号５０)。

【0352】

図３Ａ～３Ｄを参照して、３つの独立した研究の腫瘍成長曲線が示される。単剤として、ｈｕＣＤ１６６ＡＡＤＣ（図３Ｃ）とｍｕＰＤ－１ＡＡ（図３Ｂ）のみの両方は、ビヒクル対照と比較して腫瘍成長を遅らせる（図３Ａ）が、それらは完全な腫瘍退縮を誘発しない。対照的に、両方の薬物が組み合わされた場合（図３Ｄ）、単剤のいずれかと比較して抗腫瘍活性の有意な増加があり（ｈｕＣＤ１６６ＡＡＤＣ単独対組み合わせ：Ｌｏｇ１０差：－０.７６９９、ｐ＜０.０００１）、複数の完全な応答（最初の投与後２０日目の腫瘍体積は０日目の測定値よりも低い）が２種類の薬物の組み合わせでのみ観察された。３つの独立した研究の分析は、ｈｕＣＤ１６６ ＡＡＤＣとｍｕＰＤ－１ ＡＡの組み合わせが５１％の全体的な応答率（ＯＲＲ）をもたらしたことを示した。

【0353】

これらの結果は、活性化可能な抗ＰＤ－１抗体と活性化可能な抗ＣＤ１６６抗体薬物コンジュゲートの組み合わせのインビボ有効性が、いずれの薬物単独よりも有意に高い有効性を示したことを示す。

【0354】

実施例４：抗ＣＤ１６６がコンジュゲートされた活性化可能な抗体と活性化可能な抗ＰＤ－１抗体の組み合わせは記憶Ｔ細胞応答を誘導する
この例示的研究で、結果は、治療後に腫瘍のないままであった、実施例３で研究したマウスが、腫瘍再負荷から保護されたことを実証し、免疫学的記憶応答がマウスにおいて確立されたことを示した。

【0355】

組み合わせ治療の最終投与後１５日目に腫瘍のないままであった実施例３の治療マウスに、ＣＴ－２６ ｈｕＣＤ１６６腫瘍細胞を再負荷した。図４Ｂに示すように、腫瘍のないマウスの５０％（６匹中３匹）は、腫瘍再負荷から保護されるが、全ての未処置マウス（１０匹中０匹）は、急速に腫瘍を発症した（図４Ａ）。

【0356】

腫瘍再負荷の２週間後に、これらの保護マウスに由来する脾細胞を、ブレフェルディンの存在下でＣＴ２６特異的ペプチドであるＡＨ１（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ ＃ＡＳ－６４７９８）で刺激し、フローサイトメトリーにより評価して、末梢ＣＤ８＋Ｔ細胞によるＩＦＮ－γの生成を決定した。図４Ｃを参照して、腫瘍再負荷アッセイで保護されたマウスから単離したＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＩＦＮ－γを生成する（図４Ｃ、底部パネル）が、保護されていないマウスから単離したＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＡＨ１ペプチドに応答してＩＦＮ－γを生成しない（図４Ｃ、上部パネル）。これらの結果は、ｈｕＣＤ１６６ ＡＡＤＣとマウスＰＤ－１ ＡＡの組み合わせが、この組み合わせで治療したマウスにおいてＴ細胞中心の免疫学的記憶応答を誘導することを示す。

【0357】

これらの結果におけるＣＤ８＋細胞の役割のさらなる証拠を提供するために、免疫適格性マウス腫瘍モデルにおけるｈｕＣＤ１６６ ＡＡＤＣ、ｈｕＣＤ１６６ ＡＡＤＣとｍｕＰＤ－１ ＡＡの組み合わせ治療、又はビヒクル対照（ＰＢＳ）のインビボ有効性に対するＣＤ８＋Ｔ細胞枯渇の効果を決定した。この例示的研究では、腫瘍を、実施例３に記載のように免疫適格性ＢＡＬＢ／ＣマウスにＣＴ２６ ｈｕＣＤ１６６を移植することにより形成させた。ＣＤ８＋Ｔ細胞を枯渇させたマウスについては、抗ＣＤ８枯渇抗体（５３－６.７２；ラットＩｇＧ２ａ、Ｂｉｏ Ｘ細胞）を、２日前、０日目、７日目、及び８日目に１０ｍｇ／ｋｇでマウスに投与した。図６を参照して、ＣＤ８＋Ｔ細胞枯渇を、１０日目に採取した血液試料のフローサイトメトリー分析により確認した。ＣＤ８＋Ｔ細胞を枯渇した及び枯渇していない腫瘍担持マウスを、ｈｕＣＤ１６６ ＡＡＤＣ、ｈｕＣＤ１６６ ＡＡＤＣとｍｕＰＤ－１ ＡＡの両方、又はビヒクル対照（ＰＢＳ）で治療した。抗ｈｕＣＤ１６６ ＡＡＤＣ（組み合わせ５５）を、週１回×２週（０日目及び７日目）、５ｍｇ／ｋｇで静脈内投与した。活性化可能な抗マウスＰＤ－１抗体（ｍｕＰＤ－１ ＡＡ）を、ｂ．ｉ．ｗ.×２.５週（１日目、５日目、８日目、１２日目、及び１５日目）に１０ｍｇ／ｋｇで腹腔内注入により投与した。

【0358】

図５Ａ～５Ｃを参照して、ＣＤ８＋Ｔ細胞を枯渇していない腫瘍担持マウスにおいて、ｈｕＣＤ１６６ ＡＡＤＣとｍｕＰＤ－１ ＡＡの組み合わせ治療は、ｈｕＣＤ１６６ ＡＡＤＣ単剤療法（図５Ｂ）又はビヒクル対照（図５Ａ）のいずれかよりも高い有効性を示した。図５Ｄ～５Ｆを参照して、ｈｕＣＤ１６６ ＡＡＤＣ単剤療法（図５Ｅ）又はｈｕＣＤ１６６ ＡＡＤＣとｍｕＰＤ－１ ＡＡ（図５Ｆ）の組み合わせの有効性は、ＣＤ８＋Ｔ細胞枯渇マウスにおける抗腫瘍有効性の有意な低下を示した。

【0359】

これらの結果は、ｈｕＣＤ１６６ ＡＡＤＣの抗腫瘍有効性とｈｕＣＤ１６６ ＡＡＤＣとｍｕＰＤ－１ ＡＡの組み合わせの抗腫瘍有効性が、治療対象におけるＣＤ８＋Ｔ細胞に部分的に依存していることを示す。

【0360】

実施例５：成熟樹状細胞及び活性化Ｔ細胞に対するｈｕＣＤ１６６ ＡＡＤＣの細胞傷害活性
この例示的研究で、結果は、抗ＣＤ１６６抗体薬物コンジュゲート（ｈｕＣＤ１６６ ＡＤＣ、配列番号１２のＶＨ及び配列番号１３のＶＬ）が、共にＣＤ１６６を発現するヒト樹状細胞及び活性化ヒトＴ細胞に対して適度な細胞傷害性活性を示したが、この細胞障害性は、腫瘍細胞、例えば、ｈｕＣＤ１６６を発現するトランスジェニックＣＴ２６に対するその有効性よりも低いことを実証した。

【0361】

免疫細胞に対するＤＭ４コンジュゲート抗ＣＤ１６６抗体（ｈｕＣＤ１６６ ＡＤＣ）の細胞傷害性を、この例示的研究で検査した。ＣＤ４＋Ｔ細胞と単球を、製造業者の説明書に従って、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社の磁気ビーズ（ＣＤ４＋Ｔ細胞については＃１７９５２、及び単球については＃１１９３５９）を用いてＰＢＭＣから単離した。単離した単球を、製造業者の説明書に従ってＳｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ樹状細胞分化キット（＃１０９８８）を用いて樹状細胞（ＭｏＤＣ）に分化させた。いくつかのアッセイでは、樹状細胞を、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＤＣ成熟キット（＃１０９８９）を用いて、完全に活性化されたＭｏＤＣに成熟させた。ＭｏＤＣを、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ樹状細胞培地（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ＃１０９８７）を用いて培養した。いくつかのアッセイでは、精製したＣＤ４＋Ｔ細胞を、１つのビーズに対して１つのＴ細胞の比率で、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体（Ｇｉｂｃｏ カタログ番号１１１３２Ｄ）に共有結合させたダイナビーズで活性化した。

【0362】

Ｔ細胞を、検査品で処理する前にＣＤ１６６の発現を可能にするために、２４時間事前活性化した。図７Ａを参照して、活性化Ｔ細胞を、示した濃度の示した検査品（ＤＭ４にコンジュゲートしたＳｙｎａｇｉｓアイソタイプ抗体（Ｉｓｏ－ＤＭ４ ＡＤＣ）、ＤＭ４にコンジュゲートした抗ヒトＣＤ１６６抗体（ＣＤ１６６－ＤＭ４ ＡＤＣ）、又は抗ヒトＣＤ１６６抗体（ＣＤ１６６ ｍＡｂ）で７２時間処理した。細胞生存率を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏルミネセンス生存率アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ＃Ｇ７５７０）を用いて、各処理について測定した。図７Ｂを参照して、完全に活性化したＭｏＤＣを、示した濃度での示した処理で４８時間インキュベートした。細胞生存率を、ＣｙｔｏＴｏｘ－Ｇｌｏ細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ ＃Ｇ９２９０１）を用いて測定した。これらの例示的な結果は、抗ＣＤ１６６ ＡＤＣがＭｏＤＣと活性化Ｔ細胞の両方に対して最小限の細胞傷害活性を有することを実証する。細胞傷害性は、ＤＭ４にコンジュゲートさせたアイソタイプ対照の活性と同様に、１０ｎＭを超える用量でのみ観察された。

【0363】

これらの例示的結果は、抗ＣＤ１６６ ＡＤＣが、これらの細胞でのＣＤ１６６発現のレベルにもかかわらず、標的媒介毒性よりむしろこれらの免疫細胞に対して中程度でオフターゲットの細胞傷害活性を有することを示唆する。

【0364】

実施例６：樹状細胞成熟とＴ細胞刺激に対するｈｕＣＤ１６６ ＡＤＣの影響
この例示的研究において、結果は、抗ＣＤ１６６抗体薬物コンジュゲート（ｈｕＣＤ１６６ ＡＤＣ、配列番号１２のＶＨ及び配列番号１３のＶＬ）が、インビトロで樹状細胞の成熟を促進したことを実証した。

【0365】

この研究では、樹状細胞を、ＤＭ４（ＣＤ１６６－ＤＭ４ ＡＤＣ）又は樹状細胞成熟カクテル（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＤＣ成熟キット（＃１０９８９））にコンジュゲートした１０ｍＭの抗ＣＤ１６６抗体と共に４８時間培養した。樹状細胞をまた、１０ｍＭの遊離ＤＭ４、ＳｙｎａｇｉｓアイソタイプＤＭ４ ＡＤＣのいずれかで処理するか、又は対照として処理しなかった。ＭｏＤＣを次に、樹状細胞成熟マーカーＣＤ８０（２Ｄ１０抗体、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＣＤ８３（ＨＢ１５ｅ抗体、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＨＬＡ－ＤＲ（Ｌ２４３抗体、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、及びＣＤ８６（ＩＴ２．２抗体、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）のフローサイトメトリー測定によって成熟について評価した。

【0366】

図８Ａを参照して、ＣＤ８３及びＣＤ８６の発現は、未処理細胞と比較して抗ＣＤ１６６－ＤＭ４ ＡＤＣ又は遊離ＤＭ４処理細胞においてわずかに増加した。これらの例示的な結果は、ＤＭ４が樹状細胞活性化を促進し得るが、樹状細胞成熟を完全に誘導することが知られているサイトカインの成熟カクテルよりも少ない程度までであることを示している。

【0367】

Ｔ細胞を活性化する能力に対するこれらの処理した樹状細胞の影響を、決定した。この例示的研究では、上記に示すように検査品で処理したＭｏＤＣを次に、１：２５の樹状細胞対Ｔ細胞の比率で、同種ＣＤ４＋Ｔ細胞と２日間共培養した。Ｔ細胞活性化を、ＥＬＩＳＡで決定されるＩＬ－２生成を測定することにより、４８時間後に評価した。図８Ｂを参照して、ＣＤ１６６－ＤＭ４ ＡＤＣ、ＤＭ４にコンジュゲートしたアイソタイプ、又は遊離ＤＭ４で前処理したＭｏＤＣは、同種Ｔ細胞によるＩＬ－２の生成をほんのわずか増加させる。しかし、ＭｏＤＣが樹状細胞成熟カクテルと組み合わせて以前の薬物で前処理された場合には、ＩＬ－２生成は、成熟カクテルで処理した樹状細胞と共培養したＴ細胞と比較して有意により高く、成熟カクテルのみで観察される。

【0368】

全体として、これらの例示的データは、ＣＤ１６６＋腫瘍細胞に対するその細胞傷害活性とは対照的に、ＣＤ１６６ ＡＤＣがＴ細胞及び樹状細胞を温存し、かつＴ細胞プライミングを増強し得ることを示唆する。同様に、これらの結果は、活性化された活性化可能な抗ＣＤ１６６薬物コンジュゲート（抗ＣＤ１６６ ＡＡＤＣ）が樹状細胞の成熟を通じてインビボでＴ細胞プライミングを増強し、理論に縛られずに、抗ＣＤ１６６ ＡＡＤＣ及び抗ＰＤ－１ ＡＡの組み合わせ療法の観察される相乗効果の根拠を提供することを示唆する。

【0369】

実施例７：ｈｕＣＤ１６６ ＡＡＤＣは細胞株において免疫原性細胞死を誘導する
この例示的研究で、結果は、抗ＣＤ１６６抗体薬物コンジュゲート（ＤＭ４にコンジュゲートされたｈｕＣＤ１６６ ＡＤＣ、配列番号１２のＶＨ及び配列番号１３のＶＬ）がインビトロで免疫原性細胞死（ＩＣＤ）を誘導することを実証した。これらの例示的結果は、抗ｈｕＣＤ１６６ ＡＤＣが癌細胞及びＣＤ１６６発現細胞においてＩＣＤに関するシグナルを増加させることができることを示す。

【0370】

免疫原性細胞死（ＩＣＤ）は、それによりある種の細胞傷害性薬物が免疫系を刺激する様式で腫瘍細胞のアポトーシスを誘導できる、過程である。腫瘍細胞などの細胞は、薬物コンジュゲートで処理すると、損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ）などの細胞危険シグナルの放出を通じて免疫原性の可能性を高めることができる。ＤＡＭＰは、次に、樹状細胞などの抗原提示細胞を活性化でき、腫瘍標的免疫応答及び免疫学的記憶を引き出すことができる。

【0371】

ＩＣＤは、癌細胞の表面上のカルレティキュリンの発現及びＨＭＧＢ１の分泌などのマーカーにより測定できる。この例示的研究では、ヒト悪性黒色腫に由来するＡ３７５細胞（ＡＴＣＣ）を、示した量の薬物の存在下で、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を有するＲＰＭＩ－１６４０（商標）培地中で４８時間培養した。ヒト乳癌に由来するＨＣＣ１８０６細胞（ＡＴＣＣ）を、示した量の薬物の存在下で、ＤＭＥ培地中で４８時間培養した。ＣＴ－２６細胞及びＣＴ２６ ｈｕＣＤ１６６細胞（本明細書で説明したヒトＣＤ１６６ポリペプチドを発現するＣＴ２６細胞）を、示した量の薬物の存在下で、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を有するＲＰＭＩ－１６４０（商標）培地中で７２時間培養した。インキュベーション後、カルレティキュリン発現を、ＦＩＴＣコンジュゲートカルレティキュリン抗体を（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏ，クローン１Ｇ６Ａ７；＃ＮＢＰ１－４７５１８Ｆ）用いたフローサイトメトリーにより検出した。ＨＭＧＢ１タンパク質をＥＬＩＳＡ（Ｔｅｃａｎ ＨＭＧＢ１ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ，♯ＮＣ９９５９９４７）により検出した。

【0372】

図９Ａ及び９Ｂを参照して、この例示的研究で、示した量の遊離ＤＭ４（図９Ａ）又は抗ＣＤ１６６ ＡＤＣ（図９Ｂ）は、黒色腫細胞Ａ３７５及び乳癌細胞ＨＣＣ１８０６がカルレティキュリン（ＣＲＴ）の発現増加及びＨＭＧＢ１の分泌量の増加を示したことを示した。図９Ｃを参照して、この例示的研究で、示した量の遊離ＤＭ４又はＣＤ１６６ ＡＤＣはまた、ＣＴ２６又はＣＴ２６ ｈｕＣＤ１６６細胞上のカルレティキュリン（ＣＲＴ）の表面発現の増加も誘導した。

【0373】

これらの例示的データは、抗ＣＤ１６６ ＡＤＣが、癌細胞及びＣＤ１６６を発現する細胞においてＩＣＤ関連シグナルを誘導することを示唆する。これらの例示的結果は、抗腫瘍有効性がＩＣＤによって生じ得ることを示す。

【0374】

他の実施形態
本発明はその詳細な説明と併せて説明されているが、上記の説明は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明を説明することを意図し、範囲を限定するものではない。他の態様、利点、及び変更は、以下の範囲内にある。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図2A】

【図2B-C】

【図3A-D】

【図4A-C】

【図5A-D】

【図5E-F】

【図6】

【図7A-B】

【図8A】

【図8B】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【手続補正書】

【提出日】2021-11-16

【手続補正1】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】配列表

【補正方法】追加

【補正の内容】

【配列表】

2022523200000001.app

【国際調査報告】