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特表2022-523366癌の診断及び予後に関するバイオマーカーパネル
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-04-22
(54)【発明の名称】癌の診断及び予後に関するバイオマーカーパネル
(51)【国際特許分類】
   C12Q 1/6886 20180101AFI20220415BHJP
   G01N 33/50 20060101ALI20220415BHJP
   G01N 33/53 20060101ALI20220415BHJP
【FI】
C12Q1/6886 Z ZNA
G01N33/50 P
G01N33/53 M
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021549322
(86)(22)【出願日】2020-02-21
(85)【翻訳文提出日】2021-10-07
(86)【国際出願番号】 EP2020054667
(87)【国際公開番号】W WO2020169826
(87)【国際公開日】2020-08-27
(31)【優先権主張番号】19158682.5
(32)【優先日】2019-02-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(31)【優先権主張番号】19174483.8
(32)【優先日】2019-05-14
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】509223977
【氏名又は名称】ウニベルジテート ハイデルベルク
(74)【代理人】
【識別番号】100088904
【弁理士】
【氏名又は名称】庄司 隆
(74)【代理人】
【識別番号】100124453
【弁理士】
【氏名又は名称】資延 由利子
(74)【代理人】
【識別番号】100135208
【弁理士】
【氏名又は名称】大杉 卓也
(74)【代理人】
【識別番号】100163544
【弁理士】
【氏名又は名称】平田 緑
(74)【代理人】
【識別番号】100183656
【弁理士】
【氏名又は名称】庄司 晃
(72)【発明者】
【氏名】ショット,サラ
(72)【発明者】
【氏名】ゾーン,クリストフ
(72)【発明者】
【氏名】ガーラワット,イーファ
(72)【発明者】
【氏名】ウィッテ トバール,タニア
【テーマコード(参考)】
2G045
4B063
【Fターム(参考)】
2G045AA26
2G045AA35
2G045CA25
2G045CA26
2G045CB01
2G045CB03
2G045CB07
2G045CB11
2G045CB30
2G045DA12
2G045DA13
2G045DA14
2G045FA36
2G045FB01
2G045FB02
4B063QA01
4B063QA19
4B063QQ03
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QR55
4B063QR62
4B063QS34
4B063QX01
(57)【要約】
本発明は、マーカー遺伝子内のシトシンメチル化レベルをインビトロで決定すること、及び/又はmiRNAマーカーの発現レベルを決定することを含む、癌を診断又は予後診断する方法に関する。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
被験体における癌を診断又は予後診断する方法であって、前記被験体から得られた試料において
a)HYAL2、MGRN1、RPTOR、SLC22A18、FUT7、RAPSN及びS100Pからなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子内の少なくとも1つのCpGジヌクレオチドのシトシンメチル化をインビトロで決定する工程、及び/又は
b)miR-148b、miR-409、miR-652、miR-200c、miR-375及びmiR-320b及びmiR-141からなる群から選択される少なくとも1種のmiRNAの発現レベル(但し、該少なくとも1種のmiRNAは、miR-200c、miR-375及びmiR-320bからなる群から選択される少なくとも1種のmiRNAを含む)をインビトロで決定する工程、を含み、
ここで該方法は、任意選択でmiR-451aの発現レベルを決定することをさらに含み、
ここで該少なくとも1つの遺伝子内の少なくとも1つのCpGジヌクレオチドのシトシンメチル化のレベルの低下及び該少なくとも1種のmiRNAの発現レベルの変化は、前記被験体における現在及び/又は将来の癌疾患状態の指標である、方法。
【請求項2】
以下が癌の存在及び/又は癌を発症する可能性の増加の指標である、請求項1に記載の方法:
HYAL2、MGRN1、RPTOR、SLC22A18、FUT7、RAPSN及びS100Pからなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子内の少なくとも1つのCpGジヌクレオチドのシトシンメチル化のレベルの低下、及び/又は
miR-148b、miR-409-3p、miR-652-3p、miR-200c-3p、miR-320b及びmiR-141から選択されるmiRNAの発現レベルの増加、及び/又は
miR-375の発現レベルの低下。
【請求項3】
前記癌が乳癌及び/又は卵巣癌である、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項4】
請求項1~3のいずれか1項に記載の方法であって、ここで
i)少なくとも2個、3個、4個、5個、6個、又は7個の異なるCpGジヌクレオチドのメチル化状態が決定され、及び/又は
ii)少なくとも2種、3種、4種、5種、6種、又は7種の異なるmiRNAの発現レベルが決定される、方法。
【請求項5】
請求項1~4のいずれか1項に記載の方法であって、ここで
(i)HYAL2及びS100P内の少なくとも1つのCpGジヌクレオチドのメチル化状態が決定され、及び/又は
(ii)miRNA miR-200c及びmiR-375の少なくとも発現レベルが決定される、方法。
【請求項6】
前記被験体が、癌を有するリスクが増加しているか、又は癌を発症するリスクが増加している、請求項1~5のいずれか1項に記載の方法。
【請求項7】
前記試料が、体液試料又は組織試料であり、ここで該体液試料が、好ましくは、血液、血清、血漿、滑液、尿、唾液、リンパ液、涙液及び腺から得ることができる体液からなる群から選択され、より好ましくは末梢血である、請求項1~6のいずれか1項に記載の方法。
【請求項8】
(c)1つ以上の参照試料における前記少なくとも1つの遺伝子内の少なくとも1個のCpGジヌクレオチドの前記シトシンメチル化のレベル及び/又は前記少なくとも1つの遺伝子の発現レベル、及び前記少なくとも1種のmiRNAの前記発現レベル、をインビトロで決定する工程をさらに含む、請求項1~7のいずれか1項に記載の方法。
【請求項9】
請求項1~8のいずれか一項に記載の癌を予測又は検出することを含む、癌を診断する方法、又は癌をスクリーニングする方法。
【請求項10】
請求項1~8のいずれか1項に記載の癌を繰り返し予測又は検出することを含む、癌を発症するリスクが増加した被験体を監視する方法。
【請求項11】
治療期間にわたって繰り返し、請求項1~8のいずれか1項に記載の癌を予測又は検出することを含む、被験体の癌治療を監視する方法。
【請求項12】
治療中及び/又は治療後に、請求項1~8のいずれか1項に記載の癌を予測又は検出することを含む、癌治療に対する被験体の応答を評価する方法。
【請求項13】
請求項1~8のいずれか1項に記載の方法に従って検出された癌を有する被験体を治療する方法であって、癌療法を該被験体に実施することをさらに含む、方法。
【請求項14】
以下を特異的に検出するためのオリゴヌクレオチドを含むキット:
HYAL2、MGRN1、RPTOR、SLC22A18、FUT7、RAPSN及びS100Pからなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子内の少なくとも1個のCpGジヌクレオチドのシトシンメチル化のレベル、及び/又は
miR-148b、miR-409-3p、miR-652-3p、miR-200c-3p、miR-375、miR-320b、miR-451a及びmiR-141からなる群から選択される少なくとも1種のmiRNAの発現レベル(但し、該少なくとも1種のmiRNAは、miR-200c-3p、miR-375、miR-320b及びmiR-451aからなる群から選択される少なくとも1種のmiRNAを含む)。
【請求項15】
癌、好ましくは乳癌及び卵巣癌を予測、予後診断及び/又は診断するための請求項15に記載のキットの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、メチル化及びmiRNAマーカーのパネル、並びに癌の予後診断、診断及び/又は治療におけるそれらの使用、前記マーカーを検出するための手段、並びに前記手段を含むキットに関する。
【0002】
(発明の背景)
癌は、世界で最も重要な医学的及び健康上の問題のひとつである。世界の主要な死因として、2008年には新たに1240万人の癌症例があり、そして760万人の癌に関連した死亡例があった。世界中の癌による死亡者数は継続的に増加しており、そして2030年には1200万人が癌によって死亡すると予測されている。乳癌は女性に最も一般的な癌である。約9人に1人の女性が、その生涯の間に乳癌を発症することになる(非特許文献1)。世界中では、毎年約130万人の女性が乳癌を発症する。死亡率は、早期診断及び早期治療におけるあらゆる取り組み及び進歩により、年々低下し続けている(非特許文献2)。それにもかかわらず、毎年何千人もの女性がこの疾患により亡くなっている。米国女性において、5年全生存率は、早期ステージで診断された場合には98%であるのに対し、遠隔臓器にすでに拡がっている場合には23%である。このように、早期の乳癌検出は、この疾患との戦いにおける主要な課題の一つに当たるものである。マンモグラフィースクリーニングは、最近では診断基準として適用されている。しかし、マンモグラフィースクリーニングは、それが電離放射線を使用すること、そして偽陽性率が、スクリーニングされる個体の年齢にも応じて8~10%であることから、限界がある(非特許文献3)。
【0003】
乳癌の多くは散発的に生ずるが、家族性乳癌は全ての乳癌症例の約10%を占める(非特許文献4)。主要な乳癌関連遺伝子であるBRCA1及びBRCA2おける変異は、全ての家族性の症例の25%を占め、他の中浸透度及び低浸透度の遺伝子における変異は、約5%の割合を占めている(非特許文献5)。最近のゲノムワイド関連解析(GWAS)及び単一候補遺伝子アプローチは、乳癌に関する遺伝的低リスク多様体の検出において大きな成功を収めている(非特許文献6;非特許文献7;非特許文献8;非特許文献9;非特許文献10;非特許文献11)。しかし、多数の乳癌リスク因子が、依然として調査されている。
【0004】
BCと比較して、卵巣癌(OvCa)は、比較的まれにしか起こらないが、その高い悪性度のため婦人科学的な癌による主な死因である。2008年には、世界中で225,000人の女性が卵巣癌と診断され、そしてこれらの女性のうち140,000人が該疾患により亡くなっている。典型的には、OvCaを患う女性は、初期症状をほとんど示さないため、卵巣癌の症例のほぼ四分の三は進行期にあり、その際にその疾患は卵巣を越えて十分に拡がっている。膵臓癌(PaCa)は、全ての上皮性悪性腫瘍のうちで最も侵襲性が強い。世界中で新たに279,000人がPaCaと診断され、PaCa患者の5年全生存率は、5%未満である。最近のゲノムワイド関連解析(GWAS)は、BC、OvCa及びPaCaのリスクに関連するいくつかの遺伝的変異体の検出に成功しているが、BCの早期検出のための価値あるマーカーは同定されていない。
【0005】
転移性乳癌(MBC)は、世界的に主要な健康問題である。現在の治療戦略は、治癒する症例が極めて少ないプライマリ緩和ケア(primary palliative care)を対象としている。MBCに取り組む代替的なアプローチは、高リスク群及び治療応答を同定するためのスクリーニング方法の開発及びバイオマーカーの適用である。これは、臨床医の意思決定を容易にし、かつ患者のための適切な治療計画を採用する助けとなる可能性がある。
【0006】
循環腫瘍細胞(CTC)は、転移のための、具体的には無増悪生存期間及び全生存期間のための、FDA承認された独立した予後マーカーとして提案されている。血液7.5mlあたり5CTCを超える基本的なカットオフは、CTC陽性と定義されている(非特許文献12)。しかしながら、顕性遠隔転移を伴うかなりの割合の患者がCTCについて陰性であることを留意することが重要である。これは、CTCにおける上皮間葉転換の現象に部分的に寄与し得、その場合、それらはEpCAM又はサイトケラチン-8、サイトケラチン-18及びサイトケラチン-19などの上皮マーカーの発現を利用する計数技術によっては見落とされ得る。
【0007】
CTC以外に、癌胎児性抗原(CEA)及び炭水化物抗原15-3(CA15-3)などのタンパク質ベースの循環腫瘍マーカーは、予後診断マーカーのほか、乳癌治療の成功や経過観察のモニタリングに広く用いられている(非特許文献13;非特許文献14)。しかし、これらのマーカー感度は低い。したがって、新たな高感度かつ特異的であるだけでなく最低限の侵襲性のマーカーが必要とされている。
【0008】
エピジェネティックな変化とは、ゲノムDNA配列における何らかの変化によるものではない遺伝子発現の変化として定義される。異常なエピジェネティックシグネチャは、ヒト癌の特徴として考えられている(非特許文献15)。最も重要なエピジェネティックシグネチャの一つであるDNAメチル化は、遺伝子活性の制御及び細胞の核の構造において重要な役割を有する(非特許文献16)。さらに、遺伝子マーカー又は変異体とは異なり、DNAメチル化は原則的に可逆的である。したがって、特定の遺伝子のメチル化プロファイルは、治療ターゲットとして考えられている(非特許文献17)。一方、可変的特徴のために、DNAメチル化は、環境因子とゲノムとの間のリンクとして作用し得る。環境因子又は老化によって調節されるDNAメチル化は、細胞の重要な遺伝子の発現を変化させ、そしてその結果、細胞の悪性転換又は癌さえも誘導し得る(非特許文献18)。
【0009】
癌の発生における早期の事象として、DNAメチル化の変化は、癌の早期検出のためのマーカーとして特に有望である。最近の研究は、血液細胞DNAのメチル化分析が信頼できる、かつ強力なマーカーとなり得ることが示された。集中的な研究により、癌におけるDNAメチル化シグネチャの変化が体細胞レベルで開示されているが、ごく僅かな研究だけが、候補遺伝子アプローチにより癌における末梢血DNA中のメチル化シグネチャを解析しているにすぎなかった。
【0010】
以前の研究では、腫瘍抑制遺伝子のプロモーター領域における、それらの正常な隣接組織と比較した高メチル化及び乳癌における癌遺伝子のプロモーター領域における、それらの正常な隣接組織と比較した低メチル化が調査されている(非特許文献19;非特許文献20;非特許文献21;非特許文献22)。末梢血DNA及び乳がんリスクにおけるメチル化シグネチャに焦点を当てた研究は非常に少ない。これらの研究においては、特定の遺伝子、例えばBRCA1(非特許文献23)、ATM(非特許文献24)、及び特定の経路における遺伝子(非特許文献25)のみが調査されている。
【0011】
したがって、乳癌、卵巣癌、及び他の癌のさらなるマーカーの同定、好ましくは低侵襲性の手段によって試料を得ることによって、例えば血液試料を採取することによって、罹患した被験体の特定を可能にすることが、当技術分野において必要とされている。
【0012】
したがって、癌、特に乳癌、卵巣癌及び膵臓癌の診断及び予後診断のための改善された方法が、当技術分野において緊急に必要とされている。これらの方法は、好ましくは見かけ上健康な被験体の予防的スクリーニングにおいても使用されることとなり、侵襲性のグレードが低いことが好まれることとなる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0013】
【非特許文献1】Feuer, E.J., et al., The lifetime risk of developing breast cancer;J Natl Cancer lnst 85, 892-897 (1993)
【非特許文献2】Jemal A, Bray F, Center MM, Ferlay J, Ward E, Forman D. Globalcancer statistics. CA Cancer J Clin 2011;61:69-90
【非特許文献3】Taplin S et al.; J Natl Cancer Inst 2008; 100: 876-87
【非特許文献4】Fackenthal et al.; Nat Rev Cancer 7, 937-948 (2007)
【非特許文献5】Yang, R. & Burwinkel, B.(eds.);Familial risk in breast cancer, 251-256(Springer, 2010)
【非特許文献6】Thomas, G., et al., Nat Genet 41, 579-584 (2009);Cox, A., et al., Nat Genet 39, 352-358 (2007)
【非特許文献7】Stacey, S.N., et al., Nat Genet 40, 703-706 (2008)
【非特許文献8】Ahmed, S., et al., Nat Genet 41,585-590 (2009)
【非特許文献9】Easton, D.F., et al., Nature 447, 1087-1093 (2007)
【非特許文献10】Milne, R.L., et al., J Natl Cancer Inst 101, 1012-1018 (2009)
【非特許文献11】Frank, B., et al., J Natl Cancer Inst 100,437-442 (2008)
【非特許文献12】Cristofanilli et al., N Engl J Med. 2004 Aug 19;351(8):781-91
【非特許文献13】Uehara et al., Int J Clin Oncol 2008;13:447-51
【非特許文献14】Harris et al., J Clin Oncol 2007;25:5287-312
【非特許文献15】Esteller, M. Nat Rev Genet 8, 286-298 (2007)
【非特許文献16】Weber, M., et al., Nat Genet 37, 853-862 (2005)
【非特許文献17】Mack, G.S. J Natl Cancer Inst 98, 1443-1444 (2006)
【非特許文献18】Widschwendter, M., et al. Epigenotyping in peripheral blood cell DNA and breastcancer risk: a proof of principle study. P LoS One 3, e2656 (2008)
【非特許文献19】Ito, Y., et al. Hum Mol Genet 17, 2633-2643 (2008)
【非特許文献20】Potapovaet al., Cancer Res 68, 998-1002 (2008)
【非特許文献21】Radpour et al.,Oncogene 28, 2969-2978 (2009)
【非特許文献22】Widschwendter, M. & Jones, P.A.Oncogene 21, 5462-5482 (2002)
【非特許文献23】Iwamoto et al., Breast Cancer Res Treat 129, 69-77 (2011)
【非特許文献24】Flanagan, et al., Hum Mol Genet 18, 1332-1342 (2009)
【非特許文献25】Widschwendter et al. (2008), loc.cit.
【発明の概要】
【0014】
第1の態様では、本発明は、被験体における癌を診断又は予後診断する方法であって、前記被験体から得られた試料においてインビトロで以下を決定する工程を含む、方法を提供する:
a) HYAL2、MGRN1、RPTOR、SLC22A18、FUT7、RAPSN及びS100Pからなる群から選択された少なくとも1つの遺伝子内の少なくとも1つのCpGジヌクレオチドのシトシンメチル化及び/又は
b) miR-148b、miR-409、miR-652、miR-200c、miR-375、miR-320b及びmiR-141からなる群から選択される少なくとも1つのmiRNAの発現レベル(但し、該少なくとも1つのmiRNAは、miR-200c-3p、miR-375及びmiR-320bからなる群から選択される少なくとも1つのmiRNAを含む)、
ここで該方法は、miR-451aの発現レベルを決定することを任意選択でさらに含み、
ここで少なくとも1つの遺伝子内の少なくとも1つのCpGジヌクレオチドのシトシンメチル化の減少したレベル及び少なくとも1つのmiRNAの変化した発現レベルは、前記被験体における現在及び/又は将来の癌疾患状態の指標である。
【0015】
第2の態様では、本発明は、本発明の第1の態様に従って癌を予測又は検出することを含む、癌を診断するための方法又は癌をスクリーニングする方法を提供する。
【0016】
第3の態様では、本発明は、本発明の第1の態様に従って癌を繰り返し予測又は検出することを含む、癌を発症するリスクが増大した被験体を監視する方法を提供する。
【0017】
第4の態様では、本発明は、治療期間にわたって繰り返し本発明の第1の態様に従って癌を予測又は検出することを含む、被験体の癌治療を監視する方法を提供する。
【0018】
第5の態様では、本発明は、治療中及び/又は治療後に、本発明の第1の態様に従って癌を予測又は検出することを含む、癌治療に対する被験体の応答を評価する方法を提供する。
【0019】
第6の態様では、本発明は、本発明の第1の態様による方法に従って検出された癌を有する被験体を治療する方法であって、癌療法を該被験体に実施することをさらに含む、方法を提供する。
【0020】
第7の態様では、本発明は、以下を特異的に検出するためのオリゴヌクレオチドを含むキットを提供する:
HYAL2、MGRN1、RPTOR、SLC22A18、FUT7、RAPSN及びS100Pからなる群から選択された少なくとも1つの遺伝子内の少なくとも1つのCpGジヌクレオチドのシトシンメチル化のレベル及び/又は該少なくとも1つの遺伝子の発現レベル、及び/又は
miR-148b、miR-409-3p、miR-652-3p、miR-200c-3p、miR-375、miR-320b、miR-451a及びmiR-141からなる群から選択される少なくとも1つのmiRNAの発現レベル(但し、該少なくとも1つのmiRNAは、miR-200c-3p、miR-375、miR-320b及びmiR-451aからなる群から選択される少なくとも1つのmiRNAを含む)。
【0021】
第8の態様では、本発明は、癌、好ましくは乳癌、卵巣癌、及び/又は膵臓癌、好ましくは乳癌及び卵巣癌を予測、予後診断及び/又は診断するための、本発明の第7の態様のキットの使用を提供する。
【0022】
以下、本明細書に含まれる図面の内容が説明される。この文脈では、上記及び/又は下記の発明の詳細な説明も参照されたい。
【図面の簡単な説明】
【0023】
図1】使用された15個のマーカーのリストを参照するものである。提供された遺伝子のリストは、CpGジヌクレオチドにおけるシトシンメチル化が決定された遺伝子である。右欄は、好ましくは乳癌の早期診断のために測定された好ましいCpGを示す。さらに、その発現レベルが決定された、好ましいmiRNAがリストされる。さらに、好ましい臨床マーカー-年齢-及び循環miRNAの総量の尺度-Qubitisがリストされる。
図2】卵巣癌患者からなるHEIScreenコホートにおいて試験された6つの異なるモデルを参照するものである。モデル1において試験された49のマーカーは、患者の年齢、CA125、Qubit、miR-409、miR-652、miR-148b、miR-375、miR-200c、miR-320b、RPTOR_CpG1、RPTOR_CpG2、RPTOR_CpG5、RPTOR_CpG6、RPTOR_CpG8、FUT7_CpG1、FUT7_CpG2、FUT7_CpG3、FUT7_CpG4、FUT7_CpG6、FUT7_CpG7、S100P_CpG2.3、S100P_CpG4、S100P_CpG7、S100P_CpG8、S100P_CpG9、S100P_CpG10.11.12、SLC22A18_CpG1、SLC22A18_CpG3、SLC22A18_CpG4、SLC22A18_CpG6、SLC22A18_CpG8、HYAL2_CpG1、HYAL2_CpG2、HYAL2_CpG3、HYAL2_CpG4、MGRN1_CpG4、MGRN1_CpG5.6.7.8、MGRN1_CpG12、MGRN1_CpG15、MGRN1_CpG16.17.18、MGRN1_CpG19.20、MGRN1_CpG22.23、MGRN1_CpG26、RAPSN_CpG1、RAPSN_CpG2、RAPSN_CpG4、RAPSN_CpG6、RAPSN_CpG7、RAPSN_CpG8である。 モデル2では、卵巣癌の診断によく用いられる抗原CA125が省略された。モデル3では、モデル1の全てのメチル化部位と臨床マーカー年齢がモデルに含まれた。モデル4は、示された遺伝子内のメチル化マーカーのみを含んだ。モデル5は、モデル1に含まれる全てのmiRNA及び臨床マーカー年齢を用いたが、モデル6は、示されたmiRNAの発現レベルのみを用いた。示されたモデルの精度、感度、特異度及び曲線下面積(AUC)は下側の表に提供される。予測のために、ランダムフォレスト及び非常にブーストされたツリーが使用された。
図3】卵巣癌におけるmiRNAマーカーを参照するものである。卵巣癌患者のドレスデンのコホートで試験された2つの異なるモデル及び個々のmiRNAマーカー。モデル1は、上記のグラフに示される全てのmiRNAを使用したが、モデル2は示されたmiRNAのみを使用した。示されたモデルの精度、感度、特異度及び曲線下面積(AUC)が下側の表に提供される。
図4】卵巣癌におけるマーカーを参照するものである。図2及び図3の卵巣癌コホートHEIScreen及びドレスデンの組み合わせにおいて2つのモデルが試験された。モデル1は、図3のモデル1の全てのmiRNAを使用したが、モデル2は示されたmiRNAのみを使用した。試験された被験体251例を示す欄にはドレスデンのコホートのみを用いたが(症例176例、対照75例)、被験体401例を示す欄には追加のHEIScreenコホートを含む(症例91例、対照59例)。
図5】乳癌と卵巣癌におけるmiRNAマーカーを参照するものである。示されたmiRNAの発現レベルは、卵巣癌患者のHEIScreen及びドレスデンのコホート、並びに乳癌症例163例において測定された。アスタリスクは、以下のp値、*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001及び****p<0.0001を指す 。
図6】乳癌におけるmiRNAマーカーを参照するものである。miRNA-375は、乳癌患者のネオアジュバントコホートにおいて測定された。miR‐375の発現レベルは、癌治療に対する患者の応答と相関し、そして治療に対する応答を予測することができる。左のグラフは、ネオアジュバントコホートにおけるmiR-375発現を示している。該コホートメンバーは、手術時(OP)の病理学的応答に従って、応答者と非応答者に分類されている。左のグラフは、治療の異なる段階の間のmiR-375発現レベルを示す。発現は治療に応答しない被験体の方が高い。右のグラフは、代表的な患者(NB30)からのデータを提供している。この患者は、無細胞miRNA(Qubit)のレベルの50倍の増加も特徴とする、進行性疾患(転移)を有する非応答者であった。A:診断時、B及びC:ネオアジュバント化学療法中の間隔、D Pre-OP:術前、E Post OP:術後22日、FU:術後7ヵ月の追跡調査
図7】乳癌におけるメチル化マーカーを参照するものである。示された遺伝子内の個々のCpG部位のメチル化レベルが測定された。マーカーは、患者54例からなるネオアジュバントコホートにおいて決定され、そして5つの時点で測定された。グラフのy軸は、メチル化パーセンテージを参照する。HER2+、TNBC及びLumBは、異なるタイプのの乳癌を指す。A:診断時、B及びC:ネオアジュバント化学療法中の間隔、D Pre-OP:術前、E Post OP:術後 。
図8】HER2+乳癌におけるメチル化マーカーを参照するものである。ネオアジュバントコホートのメンバーにおける個々のメチル化レベルが測定された。メンバーは、手術時に決定された病理学的応答により、応答者と非応答者に分類される。
図9】乳癌における長期追跡調査を参照するものである。長期追跡調査のメンバーの特徴が提供される。初回診断時及び追跡調査時に測定された患者87例について、試料は患者52例から得られた一方、5例の試料は質が悪く、そして患者26例は調査中に死亡した。
図10】長期追跡調査における予後マーカーとしてのmiRNAを参照するものである。miRNA miR-625及びmiR-200cは、全生存(OS)、無病生存(DFS)及び無増悪生存(PFS)と相関して決定された。追加のマーカーとしてQubitが決定された。x軸上に示される時間は、年で示される。調査された患者は、miRNA発現レベルの中央値との差に基づき、低値群と高値群に割り当てられており、低値群は中央値を下回り、高値群は中央値を上回った。
図11】全生存における予後マーカーとしてのDNAメチル化を参照するものである。示された遺伝子内のCpGジヌクレオチドのメチル化が決定されている(図にリストされたのと同じCpGが使用されている)。次いで、患者は、各アンプリコンの平均メチル化からのマイナス2標準偏差に基づいて、2つの異なる群(低メチル化及び高メチル化)に割り当てられた。6個の試験された遺伝子のうち5個は、診断時にメチル化レベルが低い場合、OSの予後不良と有意に相関する。
図12】無増悪生存期間における予後マーカーとしてのDNAメチル化を参照するものである。示された遺伝子内のCpGジヌクレオチド(図11と同じ)のメチル化が決定されている。次いで、患者は、メチル化部位のそれぞれの平均からの偏差に基づいて、2つの異なる群(低メチル化及び高メチル化)に割り当てられた。検査された6個の遺伝子のうち3個は、診断時にメチル化値が低い場合、PFSと有意に相関する。
図13】無病生存における予後診断マーカーとしてのDNAメチル化を参照するものである。示された遺伝子内のCpGジヌクレオチド(図11と同じ)のメチル化が決定されている。次いで、患者は、メチル化部位のそれぞれの平均からの偏差に基づいて、2つの異なる群(低メチル化及び高メチル化)に割り当てられた。
図14】乳癌症例のコホート全体(対照312例及び乳癌症例238例)におけるマーカーの試験、及び弾性ネットモデルにより算出された最良の予測マーカーを参照するものである。 以下のマーカーが分析に使用された :Qubit、年齢、miR-148b、miR-652、miR-200c、miR-409、miR-375、miR-320b、miR-801、HYAL2_CpG1、HYAL2_CpG2、HYAL2_CpG3、HYAL2_CpG4、S100P_CpG2.3、S100P_CpG4、S100P_CpG7、S100P_CpG8、S100P_CpG9、S100P_CpG_10.11.12、SLC22A18_CpG1、SLC22A18_CpG3、SLC22A18_CpG4、SLC22A18_CpG6、SLC22A18_CpG8、RPTOR_CpG1、RPTOR_CpG2、RPTOR_CpG3、RPTOR_CpG5、RPTOR_CpG6、RPTOR_CpG8、 RAPSN_CpG1、RAPSN_CpG2、RAPSN_CpG4、RAPSN_CpG5、RAPSN_CpG6、RAPSN_CpG7、RAPSN_CpG8、FUT7_CpG1、FUT7_CpG2、FUT7_CpG3、FUT7_CpG4、 FUT7_CpG6、FUT7_CpG7、FUT7_CpG8、MGRN1_CpG2、MGRN1_CpG4、MGRN1_CpG_5.6.7.8、MGRN1_CpG12、MGRN1_CpG15、MGRN1_CpG16.17.18、MGRN1_CpG_19.20、MGRN1_CpG_22、23、MGRN1_CpG26、MGRN1_CpG27、MGRN1_CpG28、MGRN1_CpG29、MGRN1_CpG31、MGRN1_CpG32、国籍、身長[cm]、体重[kg]、初潮の年齢、高コレステロール、糖尿病、子宮内膜症、筋腫(Myom)、卵巣嚢胞、PCO、自己免疫疾患、薬物治療、妊娠、最初の妊娠の年齢、避妊薬又はホルモン、喫煙者、菜食主義者、スポーツ
図15図14と同じ乳癌症例のコホートにおいて選択された最良の予測マーカーを参照するが、年齢(50歳未満及び50歳より上)に応じて群がサブグループに分けられている。
図16】全生存率を参照したHEIScreen乳癌コホートの長期調査を参照するものである。以下のリストのマーカーが、長期調査に使用された(全生存、無増悪生存及び無病生存分析(n=63)):年齢、疾病負荷、乳癌タイプ、ステージ、cT、cN、cM、「pT(手術)」、「pN(手術)」、化学療法(はい又はいいえ)、HYAL2 CpG1、HYAL2_CpG2、HYAL2_CpG3、HYAL2_CpG4、S100P_CpG2.3、S100P_CpG4、S100P_CpG7、S100P_CpG8、S100P_CpG9、S100P_CpG10.11.12、RAPSN_CpG1、RAPSN_CpG2、RAPSN_CpG4、RAPSN_CpG5、RAPSN_CpG6、RAPSN_CpG7、RAPSN_CpG8、FUT7_CpG1、FUT7_CpG2、FUT7_CpG3、FUT7_CpG4、FUT7_CpG6、FUT7_CpG7、SLC22A18_CpG1、SLC22A18_CpG3、SLC22A18_CpG4、SLC22A18_CpG6、SLC22A18_CpG8、MGRN1 CpG.2、MGRN1_CpG4、MGRN1 CpG5.6.7.8、MGRN1 CpG12、MGRN1 CpG15、MGRN1 CpG16.17.18、MGRN1 CpG_19.20、MGRN1 CpG_22.23、MGRN1 CpG26、RPTOR_CpG1、RPTOR_CpG2、RPTOR_CpG3、RPTOR_CpG5、RPTOR_CpG6、RPTOR_CpG8、Qubit、miR-148b、miR-200c、miR-320b、miR-375、miR-409、miR-652、miR-205、miR141及びmiR-210。 本調査の目標は、全生存(OS)、無病生存(DFS)及び無増悪生存(PFS)を比較し、良好な比較が可能な各マーカーを選択することであった。最初の分析では、臨床マーカーである年齢診断、疾病負荷、乳癌型、cT、cN、cM、グレード、pT及びpNがマーカーと並んで用いられた。2回目の分析では、pT及びpNは除外された。さらに、2つの分析ではメチル化マーカー及びmiRNAのみがそれぞれ用いられた。 マーカーは、弾性ネット罰則付きCoxモデルをフィッティングすることによって選択された。次いで、2つの群は、2平均クラスタリングによる選択されたマーカーに基づいて構築され、そして対応する生存時間は、対応する信頼区間を有するカプランマイヤー曲線をプロットすることによって比較された。 OSの最良の予測因子として上記マーカーパネルから選択されたマーカーは、臨床マーカー疾病負荷(転移のタイプ:内臓、非内臓又はその両方)、乳癌タイプ、cT、cM及びpTであった。さらに、以下のメチル化マーカーがモデルによって選択された:HYAL2CpG3、HYAL2 CpG4、S100P CpG9、及びRPTOR CpG8、並びにmi-200cの発現レベル。ログランク検定の結果、群1と群2の間に有意な差異が認められた(p<0.0001)。
図17図16と同じ調査を参照するが、マーカーpT及びpN(腫瘍の病理学的病期分類)は除外された。ログランク検定の結果、群1と群2の間に有意な差異が認められた(p<0.0001)。
図18図16と同じ調査を参照するが、メチル化マーカーのみが使用された(n=43)。次いで、モデルは、HYAL2 CpG3、HYAL2 CpG4、S100P CpG9、RAPSNCpG4、RAPSN CpG5、FUT7 CpG3、SLC22A18 CpG8、MGRN1CpG2、MGRN1CpG4及びRPTOR CpG8である最良のマーカーを選択した。ログランク検定の結果、p=0.003であった。
図19図16と同じ調査を参照するが、全てのmiRNA(miR-148b、miR-200c、miR-320b、miR-375、miR-409、miR-652、miR-205、miR141及びmiR-210)が分析に含められた。変数の数が少ないため、miRNAを選択することができず、ログランク検定の結果、p=0.136であった。
図20図16に詳述したものと同じ調査を参照するが、この場合、無病生存率は図16に示されるマーカーと相関したという違いがある。この試験で最良の予測因子として選択されたマーカーは、臨床マーカーである「疾病負荷」、「乳癌のタイプ」、cT、cN、及びcMであった。さらに、以下のメチル化マーカーがモデルによって選択された:SLC22A18 CpG8及びMGRN1 CpG2、並びにQubit及びmiRNA200c、miRNA320b、及びmiRNA-141。ログランク検定の結果、群1と群2の間に有意な差異が認められた(p<0.001)。
図21】使用されたモデルによって予測されるパラメータとして無病生存を使用する、図20と同じ調査を参照するものである。pT及びpNを除いて、図20に示したものと同じマーカーが使用された。モデルは、以下のマーカーを最良の予測因子として選択した:疾病負荷、乳癌のタイプ、cT、cN、cM、SLC22A18.CpG8、MGRN1.1.CpG2、miR-200c、miR-320b、miR-141及びQubit。ログランク検定の結果、群1と群2の間に有意な差異が認められた(p<0.0001)。
図22図20と同じ調査を参照するものである。しかし、このモデルに使用されるマーカーはメチル化マーカーのみを含む。以下のメチル化マーカーが最良の予測因子として選択された:HYAL2(CpG2とCpG4)、S100P(CpG2.3とCpG 4)、RAPSN(CpG7とCpG8)、FUT7(CpG3)、SLC22A18(CpG4とCpG8)、MGRN1(CpG2とCpG26)及びRPTOR(CpG5とCpG8)。ログランク検定の結果、p=0.524であった。
図23図20と同じ調査を参照するが、miRNAマーカーのみが使用された。使用された弾性ネットモデルは、変数(miRNAマーカー)の数が少ないため、最良のマーカーを予測できなかった。ログランク検定の結果、p=0.108であった。
図24図16と同じ調査を参照するものであり、そこで示された全てのマーカーを使用したが、この場合、無増悪生存がマーカーと相関していたという差異があった。最良の予測因子として選択されたマーカーは、臨床マーカー「疾病負荷」、cN及びcMであった。さらに、以下のメチル化マーカーが、モデルによって選択された:HYAL2 CpG4、S100P CpG4、RAPSN CpG7、 FUT7 CpG3、SLC22A18 CpG8、及びMGRN1 CpG2、並びにQubit及びmiRNA-200c、miRNA-320b、及びmiRNA-375。ログランク検定の結果、群1と群2の間に有意な差異が認められた(p<0.001)。
図25】使用されるモデルによって予測されるパラメータとして無増悪生存を使用して、図24と同じ調査を参照するものである。pT及びpNを除いて、図24に示したものと同じマーカーが使用され、そしてモデルは図24と同じ最良のマーカーを選択した。ログランク検定の結果、p=0.174であった。
図26図24と同じ調査を参照するが、メチル化マーカーのみが試験された。以下のメチル化マーカーがモデルによって選択された:HYAL2 CpG3及びCpG4、RAPSN CpG2、CpG5及びCpG7、FUT7 CpG3、SLC22A18 CpG8、MGRN1 CpG2及びCpG26並びにRPTOR CpG5及びCpG8。ログランク検定の結果、p=0.108であった。
図27図24と同じ調査を参照するが、miRNAマーカーのみが試験された。miRNAマーカーmiR-148b、miR-200c、miR-320b、miR-375、miR-409、miR-652、miR-205、miR141及びmiR-210のみが分析に含まれた。変数の数が少ないため、miRNAを選択することができなかった。ログランク検定の結果、p=0.23であった。
図28】年齢又は高リスク群(BRCA+)に分類された、一般的(all)及び患者サブグループにおける乳癌(BC)の診断を参照するものである。以下のメチル化マーカーは、高リスク群に対して決定された:HYAL2_CpG1、HYAL2_CpG2、HYAL2_CpG3、HYAL2_CpG4、S100P_CpG2、3、S100P_CpG7、S100P_CpG8、S100P_CpG9、S100P_CpG10、11、12、SLC22A18_CpG1、SLC22A18_CpG3、SLC22A18_CpG4、SLC22A18_CpG6、RPTOR_CpG1、RPTOR_CpG2、RPTOR_CpG3、RPTOR_CpG5、RPTOR_CpG6、RPTOR_CpG8、RAPSN_CpG1、RAPSN_CpG4、RAPSN_CpG6、RAPSN_CpG7、RAPSN_CpG8、FUT7_CpG1、FUT7_CpG2、FUT7_CpG3、FUT7_CpG4、FUT7_CpG6、FUT7_CpG7、MGRN1_CpG4、MGRN1_CpG5、6、7、8、MGRN1_CpG12、MGRN1_CpG15、MGRN1_CpG16、17、18、MGRN1_CpG19、20、MGRN1_CpG22、23、MGRN1_CpG26。 以下のマーカーは、BCの全ての群と年齢サブグループに対して決定されている:年齢、身長[cm]、体重[kg]、糖尿病、筋腫(Myom)、自己免疫疾患、妊娠、最初の妊娠時の年齢、避妊薬、喫煙者、スポーツ、miR-148b、miR-652、miR-200c、miR-409、miR-375、miR-320b、Qubit、HYAL2_CpG_1、HYAL2_CpG_2、HYAL2_CpG_3、HYAL2_CpG_4、S100P_CpG_2、3、S100P_CpG_4、S100P_CpG_7、S100P_CpG_8、S100P_CpG_9、S100P_CpG_10、11、12、SLC22A18_CpG_1、SLC22A18_CpG_3、SLC22A18_CpG_4、SLC22A18_CpG_6、SLC22A18_CpG_8、RPTOR_CpG_1、RPTOR_CpG_2、RPTOR_CpG_3、RPTOR_CpG_5、RPTOR_CpG_6、RPTOR_CpG_8、RAPSN_CpG_1、RAPSN_CpG_2、RAPSN_CpG_4、RAPSN_CpG_5、RAPSN_CpG_6、RAPSN_CpG_7、RAPSN_CpG_8、FUT7_CpG_1、FUT7_CpG_2、FUT7_CpG_3、FUT7_CpG_4、FUT7_CpG_6、FUT7_CpG_7、MGRN1_CpG_2、MGRN1_CpG_4、MGRN1_CpG_5、6、7、8、MGRN1_CpG_12、MGRN1_CpG_15、MGRN1_CpG_16、17、18、MGRN1_CpG_19、20、MGRN1_CpG_22、23、MGRN1_CpG_26。
図29】早期OCにおける診断能を参照するものである。10分割交差検証分析は、早期OCにおいてOCキットマーカー単独(A)、OCキットマーカーとCA-125との組み合わせ(B)又はCA-125単独(C)で得られた平均AUCを示す。
図30】乳癌における診断能を参照するものである。10分割交差検証分析は、BCにおいて15マーカーBCキット(A)又は変数として年齢のない14マーカーBCキット(B)について得られた平均AUCを示す。
【0024】
(配列の一覧)
配列番号1 hsa-miR-652-3p(MIMAT0003322):aauggcgccacuaggguugug
配列番号2 hsa-miR-652-5p(MIMAT0022709):caacccuaggagagggugccauuca
配列番号3 hsa-miR-409-3p(MIMAT0001639):gaauguugcucggugaaccccu
配列番号4 hsa-miR-409-5p(MIMAT0001638):agguuacccgagcaacuuugcau
配列番号5 hsa-miR-148b-3p(MIMAT0000759):ucagugcaucacagaacuuugu
配列番号6 hsa-miR-148b-5p(MIMAT0004699):aaguucuguuauacacucaggc
配列番号7 hsa-miR-200c-3p(MIMAT0000617):uaauacugccggguaaugaugga
配列番号8 hsa-miR-200c-5p(MIMAT0004657):cgucuuacccagcaguguuugg
配列番号9 hsa-miR-375-3p(MIMAT0000728):uuuguucguucggcucgcguga
配列番号10 hsa-miR-375-5p(MIMAT0037313):gcgacgagccccucgcacaaacc
配列番号11 hsa-miR-141-3p(MIMAT0000432):uaacacugucugguaaagaugg
配列番号12 hsa-miR-141-5p(MIMAT0004598):caucuuccaguacaguguugga
配列番号13 hsa-miR-451a(MIMAT0001631):aaaccguuaccauuacugaguu
配列番号14 hsa-mir-320b-1 (MI0003776):auaaauuaaucccucucuuucuaguucuuccuagagugaggaaaagcuggguugagagggcaaacaaauuaa
配列番号15 hsa-mir-320b-2 (MI0003839):gucucuuaggcuuucucuucccagauuucccaaaguugggaaaagcuggguugagagggcaaaaggaaaaa
【0025】
(発明の詳細な説明)
本発明を下記に詳細に説明する前に、本明細書に記載の特定の方法論、プロトコル及び試薬は変更することができるため、本発明がこれらに限定されないことを理解されたい。本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態を説明することを目的とするものに過ぎず、かつ添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図するものではないことも理解されるべきである。他に定義のない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。
【0026】
好ましくは、本明細書で使用される用語は、"A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPACRecommendations)", Leuenberger, H.G.W, Nagel, B. and Klbl, H. eds. (1995),Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland)において記載される通りに定義される。
【0027】
本明細書及び以下の特許請求の範囲を通じて、文脈上別段の定めがない限り、単語「comprise」、及び「comprises」及び「comprising」などの変形は、提示の整数若しくは工程又は整数若しくは工程の群を含むが、任意の他の整数若しくは工程又は整数若しくは工程の群を除外しないことを意味するものと理解される。以下の節において、本発明の異なる態様がより詳細に定義される。そのように定義された各態様は、明確に反対に示されない限り、任意の他の態様(複数の場合もある)と組み合わせられ得る。特に、任意選択で、好ましい、又は有利であると示される任意の特徴は、任意選択の、好ましい又は有利であると示される任意の他の特徴(複数の場合もある)と組み合わせられ得る。
【0028】
本明細書の本文全体でいくつかの文献が引用される。本明細書中で引用される各文献(全ての特許、特許出願、科学刊行物、製造業者の仕様書、指示書などを含む)は、上記又は下記のいずれも、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書中のいずれの記載も、本発明が先行発明のためにかかる開示に先行する権利がないことを認めるものと解釈されるものではない。本明細書に引用される幾つかの文献は、「引用することにより本明細書の一部をなす」ものとして特徴づけられる。そのような本明細書の一部をなす引用文献の規定又は教示と本明細書において詳述される規定又は教示との間に不一致が生じた場合には、本明細書の文章を優先する。
【0029】
以下において、本発明の要素について記載する。これらの要素は、特定の実施形態とともに挙げられているが、更なる実施形態を作成するのに、これらの要素をどのような方法及びどのような数でも組み合わせることができることを理解されたい。多様に記載された実施例及び好ましい実施形態は、本発明を明示的に記載された実施形態のみに限定するものとは解釈されるべきではない。本明細書は、明示的に記載された実施形態と、任意の数の開示された及び/又は好ましい要素とを組み合わせた実施形態を支持及び包含することが理解されるべきである。さらに、文脈上別段の指示のない限り、本出願において記載された全ての要素の任意の並び替え及び組み合わせが本出願の明細書により開示されているとみなされるべきである。
【0030】
(定義)
以下において、本明細書で頻繁に使用される用語のいくつかの定義が提供される。これらの用語は、その使用の各事例において、本明細書の残りの部分において、それぞれ定義された意味及び好ましい意味を有する。
【0031】
本明細書の本文全体でいくつかの文献が引用される。本明細書中で引用される各文献(全ての特許、特許出願、科学刊行物、製造業者の仕様書、指示書などを含む)は、上記又は下記のいずれも、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書中のいずれの記載も、本発明が先行発明のためにかかる開示に先行する権利がないことを認めるものと解釈されるものではない。
【0032】
miRNAは、mRNA分子の分解又は該mRNAの翻訳の阻害によって転写後レベルの遺伝子発現を調節する短いノンコーディングRNA(約18~25ヌクレオチド長)である(BartelDP. Cell 2004;116: 281-97)。したがって、これらは、癌を含む数多くの生物学的プロセスの調節において必須の役割を担っている(Calin et al., Proc Natl Acad Sci USA 2002;99:15524-9)。標準的な命名系のもとに、実験的に確認されたmiRNAに名前が割り当てられている。接頭辞「mir」に続いてダッシュ及び番号が付される。大文字で書かれていない「mir-」はpre-miRNAを指し、一方、大文字で書かれた「miR-」は、成熟形を指す。1ヌクレオチド又は2ヌクレオチドを除いてほぼ同一の配列を有するmiRNAには、追加の小文字で注釈が付される。起源となる種は、三文字頭字語、例えばホモ・サピエンス(ヒト)についてはhsaで示される。同じpre-miRNAの対向するアームに由来する2つの成熟miRNAは、-3p又は-5p接尾辞で示される。
【0033】
循環miRNAは、血漿、血清等のような体液の無細胞成分中に存在するmiRNAとして定義される。Lawrieら(Br J Haematol 2008;141:672-5)は、体液中のmiRNAの存在を初めて裏付けた。それ以来、循環miRNAは、種々のタイプの癌、例えば前立腺癌、結腸直腸癌又は食道癌における血漿又は血清において異常に発現されると報告されている(Brase et al., Int J Cancer 2011;128:608-16.;Huanget al., Int J Cancer 2010;127:118-26.;Zhang et al.,Clin Chem 2010;56:1871-9.)。循環miRNAの最も重要な利点には、最低限の侵襲性で繰り返し測定される見込み並びに血漿/血清におけるそれらの注目すべき安定性が含まれ、その際、循環miRNAは、大抵エキソソームの外側で循環し、かつアルゴノートタンパク質に結合しているため安定である(Mitchell et al., Proc Natl Acad Sci U S A 2008;105:10513-8;Turchinovich et al. Nucleic Acids Res 2011;39:7223-33;Arroyoet al., Proc Natl Acad Sci U S A 2011;108:5003-8)。
【0034】
本明細書で使用される場合に、用語「マイクロRNA」並びに「miRNA」及び「miR」のような別形は、当業者によれば真核細胞中及び後生動物の体液中に見出される短いリボ核酸(RNA)分子に関連すると理解される。miRNAには、ヒトmiRNA、成熟一本鎖miRNA、前駆miRNA(pre-miR)及びそれらの多様体が含まれ、これらは天然に存在し得る。幾つかの事例では、用語「miRNA」には、一次miRNA転写物(pri-miRNA)及び二本鎖miRNAも含まれる。特に記載がない限り、本明細書で使用される場合に、具体的なmiRNAの名称は、成熟miRNAを指す。miRNA前駆体は、25ヌクレオチド~数千ヌクレオチドからなってもよく、典型的に40ヌクレオチド~130ヌクレオチド、50ヌクレオチド~120ヌクレオチド、又は60ヌクレオチド~110ヌクレオチドからなってもよい。典型的に、成熟miRNAは、5ヌクレオチド~100ヌクレオチドからなり、しばしば10ヌクレオチド~50ヌクレオチド、12ヌクレオチド~40ヌクレオチド、又は18ヌクレオチド~26ヌクレオチドからなる。またmiRNAという用語には、最終的にRNA誘導サイレンシング複合体(RISC)に取り込まれる「ガイド」鎖が含まれるだけでなく、それに相補的な「パッセンジャー」鎖も含まれる。
【0035】
幾つかのmiRNAの配列は、当該技術分野において既知であり、良く知られた配列データベース、例えばmiRBase(http://www.mirbase.org/)、(Griffiths-Jones S., NAR 2004 32(DatabaseIssue):D109-D111;Kozomara A, Griffiths-Jones S., NAR2011 39(Database Issue):D152-D157)等を介して当業者に容易に評価され得る。以下に示される個々のmiRNAのデータベースのアクセッション番号は、ヒト起源のmiRNAのアクセッション番号であると理解される。しかしながら、これらのデータベースのエントリは、また異なる起源のそれぞれのmiRNA、例えば任意の哺乳類起源、爬虫類起源又は鳥類起源のmiRNA等、例えば実験動物(例えばマウス又はラット)、家畜(例えば、モルモット、ウサギ、ウマ、ロバ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ニワトリ、ラクダ、ネコ、イヌ、ウミガメ、リクガメ、ヘビ又はトカゲを含む)又はチンパンジー、ボノボ及びゴリラを含む霊長類のmiRNAからなる群から選択されるmiRNA等のデータベースのアクセッション番号を提供する。また特定のmiRNAに対するその番号による参照(例えばmiR-652)は、同様に-3p配列及び-5p配列(miR-652-3p及びmiR-652-5p)を指すことが理解される。
【0036】
miR-652の配列は、本発明の配列番号1及び2にそれぞれ対応するhsa-miR-652-3p(MIMAT0003322)及びhsa-miR-652-5p(MIMAT0022709)を含むmiRBase ID MI0003667に寄託される。
【0037】
miR-409の配列は、本発明の配列番号3及び4にそれぞれ対応するhsa-miR-409-3p(MIMAT0001639)及びhsa-miR-409-5p(MIMAT0001638)を含むmiRBase ID MI0001735に寄託される。
【0038】
miR-148bの配列は、本発明の配列番号5及び6にそれぞれ対応するhsa-miR-148b-3p(MIMAT0000759)及びhsa-miR-148b-5p(MIMAT0004699)を含むmiRBase ID MI0000811に寄託される。
【0039】
miR-200cの配列は、本発明の配列番号7及び8にそれぞれ対応するhsa-miR-200c-3p(MIMAT0000617)及びhsa-miR-200c-5p(MIMAT0004657)を含むmiRBase ID MI0000650に寄託される。
【0040】
miR-375の配列は、本発明の配列番号9及び10にそれぞれ対応するhsa-miR-375-3p(MIMAT0000728)及びhsa-miR-375-5p(MIMAT0037313)を含むmiRBase ID MI0000783に寄託される。
【0041】
miR-141の配列は、本発明の配列番号11及び12にそれぞれ対応するhsa-miR-141-3p(MIMAT0000432)及びhsa-miR-141-5p(MIMAT0004598)を含むmiRBase ID MI0000457に寄託される。
【0042】
miR-451aの配列は、本発明の配列番号13に対応するhsa-miR-451a(MIMAT0001631)を含むmiRBase ID MI0001729に寄託される。
【0043】
miR-320bの配列は、本発明の配列番号14及び15にそれぞれ対応するhsa-mir-320b-1(MI0003776)及びhsa-mir-320b-2(MI0003839)を含むmiRBase ID MIMAT0005792に寄託される。
【0044】
用語「miRNAの組み合わせ」は、本発明のmiRNAの組み合わせに関する。miRNAの量は、当該技術分野で周知の技術によって、被験体の試料中で決定され得る。試料の性質に応じて、当該量は、ポリヌクレオチドの量の定量化のためのPCRベースの技術によって、又は質量分析若しくは(次世代)シーケンシングのようなその他の方法によって、又は実施例に記載される方法(Cissell KA, Deo SK. Trends in microRNA detection. Anal Bioanal Chem. 2009;394(4):1109-1116 orde Planell-Saguer M, Rodicio MC. Analytical aspects of microRNA in diagnostics:a review. Anal Chim Acta 2011Aug 12;699(2):134-52)の1つによって決定され得る。本明細書で使用される用語「miRNAの組み合わせの少なくともmiRNAの量を決定する」とは、好ましくは、該組み合わせの各miRNAの量を前記miRNAに特異的な参照と比較することができるように、該組み合わせの各miRNAの量を別々に決定することに関する。
【0045】
本明細書で使用される用語「プライマー」とは、典型的にDNA複製酵素の出発点として働く一本鎖オリゴヌクレオチドを指す。プライマーは、DNA鋳型に結合又はハイブリダイズし、そして典型的に結合すると考えられるDNA配列に相補的である配列を含む。またプライマーは、追加の配列、例えばヌクレアーゼ開裂部位(例えば、Bam H1、Hind IIIなど)として働く配列を含んでもよい。プライマーの長さは、意図される用途に応じて選択される。例えば、ポリメラーゼ-連鎖反応(PCR)におけるDNAの増幅のために使用されるプライマーは、典型的には少なくとも10ヌクレオチド、好ましくは10~50(すなわち、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、50)ヌクレオチド、より好ましくは15~30ヌクレオチドの長さを有する。少なくとも5ヌクレオチドのより短いプライマーが、DNA鋳型のシーケンシングのために使用される。また、用語「プライマー」には、類似しているが同一ではないプライマーの混合物である「縮重プライマー」も包含される。プライマーは、分光的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、化学的手段又はその他の物理的手段によって検出可能なマーカー分子でタグ付け又は標識されてもよい。
【0046】
用語「発現レベル」とは、体内又は試料中の特定の時点で存在する遺伝子産物の量を指す。発現レベルは、例えば遺伝子から発現された蛋白質又はmRNAによって測定/定量化/検出することができる。発現レベルは、例えば試料中に存在する対象となる遺伝子産物の量を、同じ試料若しくは参照試料(例えば、同じ個体から同時に採取された試料又は同じ試料の同一の大きさ(重量、容量)の一部)中の同じ部類(全タンパク質又はmRNA)の遺伝子産物の全量で正規化することによって、又は規定の試料の大きさ(重量、容量等)あたりの対象となる遺伝子産物の量を特定することによって定量化され得る。発現レベルは、当該技術分野で知られている任意の方法、例えば対象となる遺伝子産物の直接的な検出及び定量化のための方法(例えば質量分析)又は対象となる遺伝子産物の間接的な検出及び測定のための方法であって、通常、対象となる遺伝子産物と、対象となる遺伝子産物に対して特異的な1つ以上の異なる分子若しくは検出手段(例えば、1つ以上のプライマー、プローブ、抗体、足場タンパク質)との結合によって行われる方法によって測定又は検出され得る。1つ以上のフラグメントの非存在又は存在の決定(例えば核酸プローブ又はプライマーを介して、例えば定量的PCR、多重ライゲーション依存性プローブ増幅(MLPA)PCR)も含む遺伝子コピーのレベルの決定も、当業者の知識の範囲内である。
【0047】
以下のアクセッション番号が参照するGeneBankリリースは、リリース228である。
【0048】
HYAL2:
転写多様体1についてのGeneBankアクセッション番号:NM_003773.5(GI:289802998)、
転写多様体2についてのGeneBankアクセッション番号:NM_033158.4(GI:289802999)、
転写多様体1によってコードされるHYAL2ポリペプチドについてのGeneBankアクセッション番号:NP_003764.3(GI:15022801)、
転写多様体2によってコードされるHYAL2ポリペプチドについてのGeneBankアクセッション番号:NP_149348.2(GI:34304377)。
【0049】
MGRN1:
転写変異体2についてのGeneBankアクセッション番号:NM_001142289.2、及び
転写変異体3についてのGeneBankアクセッション番号:NM_001142290.2、及び
転写変異体4についてのGeneBankアクセッション番号:NM_001142291.2、及び
転写物変異体1についてのGeneBankアクセッション番号:NM_015246.3、及び
転写変異体2によってコードされるMGRN1ポリペプチドについてのGeneBankアクセッション番号:NP_001135761.2;
転写変異体3によってコードされるMGRN1ポリペプチドについてのGeneBankアクセッション番号:NP_001135762.1;
GeneBankアクセッション番号:転写変異体4によりコードされるMGRN1ポリペプチドについてのNP_001135763.2;
転写変異体1によりコードされるMGRN1ポリペプチドについてのGeneBankアクセッション番号:NP_056061.1;
【0050】
RPTOR
転写変異体2についてのGeneBankアクセッション番号:NM_001163034.1、
転写変異体1についてのGeneBankアクセッション番号:NM_020761.3、
転写変異体2によりコードされるRPTORポリペチドについてのGeneBankアクセッション番号:NP_001156506.1;
転写変異体1によってコードされるRPTORポリペチドについてのGeneBankアクセッション番号:NP_065812.1;
【0051】
SLC22A18
転写変異体1についてのGeneBankアクセッション番号:NM_002555.5、
転写変異体2についてのGeneBankアクセッション番号:NM_183233.2、
転写変異体1によりコードされるSLC22A18ポリペチドについてのGeneBankアクセッション番号:NP_002546.3;
転写変異体2によりコードされるSLC22A18ポリペプチドについてのGeneBankアクセッション番号:NP_899056.2;
【0052】
FUT7
転写物についてのGeneBankアクセッション番号:NM_004479.3、
転写物によってコードされるFUT7ポリペチドについてのGeneBankアクセッション番号:NP_004470.1;
【0053】
RAPSN
転写変異体1についてのGeneBankアクセッション番号:NM_005055.5
転写変異体2についてのGeneBankアクセッション番号:NM_032645.4
転写変異体1によりコードされるRAPSNポリペチドについてのGeneBankアクセッション番号:NP_005046.2;
転写物変異体1によってコードされるRAPSNポリペチドについてのGeneBankアクセッション番号:NP_116034.2;
【0054】
S100P
転写物についてのGeneBankアクセッション番号:NM_005980.3
転写物によってコードされるS100PポリペチドについてのGeneBankアクセッション番号:NP_005971.1;
【0055】
本明細書で使用される用語「組織」は、特定の機能を協奏的に満たす同じ起源の細胞の集団を指す。組織の例には、限定されるものではないが、結合組織、筋肉組織、神経組織及び上皮組織が含まれる。多数の組織が一緒になって、特定の機能を果たす「器官」を形成する。器官の例には、限定されるものではないが、腺、筋肉、血液、脳、心臓、肝臓、腎臓、胃、骨格、関節及び皮膚が含まれる。
【0056】
用語「疾患」及び「障害」は、本明細書において互換的に使用され、異常な状態、特に異常な医学的状態、例えば組織、器官又は個体がその機能をもはや効果的に満たすこをができない病気又は損傷を指す。典型的には、必ずしもそうとは限らないが、疾患がそのような疾患の存在を示す特定の症状又は徴候と関連する。したがって、そのような症状又は徴候の存在は、疾患を患う組織、器官又は個体のための指標であってもよい。これらの症状又は徴候の変化は、そのような疾患の進行に関する指標となり得る。疾患の進行は、典型的には、該疾患の「悪化」又は「好転」を示し得るそのような症状又は徴候の増加又は減少によって特徴付けられる。疾患の「悪化」は、組織、器官又は生物がその機能を効果的に満たす能力の低下によって特徴付けられ、一方、疾患の「好転」は、典型的には、組織、器官又は個体がその機能を効果的に満たす能力の増加によって特徴付けられる。疾患を「発症するリスク」がある組織、器官又は個体は、健康な状態にあるが、疾患出現の可能性を示す。典型的には、疾患を発症するリスクは、そのような疾患の早期の又は弱い徴候又は症状と関連している。このような場合に、疾患の発症は、未だ治療によって予防される可能性がある。疾患の例としては、外傷性疾患、炎症性疾患、感染性疾患、皮膚状態、内分泌疾患、腸疾患、神経障害、関節疾患、遺伝性疾患、自己免疫疾患、及び様々なタイプの癌が挙げられるが、これらに限定されない。
【0057】
「癌」とは、被験体のその他の組織又は器官にまで侵入又は拡がることがある異常な細胞増殖を伴う増殖障害を指す。癌は、腫瘍細胞に似ており、したがって腫瘍の起源であると推定される細胞のタイプによって分類される。これらのタイプには、癌腫(上皮細胞に由来する癌)、肉腫(例えば骨、軟骨、脂肪、神経などの結合組織から生じる癌)、リンパ腫及び白血病(骨髄を離れてリンパ節及び血液中で成熟する傾向のある造血細胞から生じる癌)、胚細胞腫瘍(多能性細胞に由来する癌)、及び芽細胞腫(未成熟な「前駆」細胞又は胚組織に由来する癌)が含まれるが、これらに限定されない。特に、癌としては、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、急性骨髄白血病、副腎皮質癌、AIDS関連癌、AIDS関連リンパ腫、肛門癌、虫垂癌、星状細胞腫、小児の小脳又は大脳癌、基底細胞癌腫、胆管癌、肝外癌、膀胱癌、骨腫瘍、骨肉腫/悪性線維性組織球腫、脳幹神経膠腫、脳癌、脳腫瘍(小脳星状細胞腫、大脳星状細胞腫/悪性神経膠腫、上衣腫、髄芽腫、テント上原始神経外胚葉腫瘍(supratentorial primitive neuroectodermal tumors)、視経路及び視床下部の神経膠腫)、乳癌、気管支腺腫/カルチノイド、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍、中枢神経系リンパ腫、小脳星状細胞腫、子宮頸癌、慢性気管支炎、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性障害、結腸癌、皮膚性T細胞リンパ腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、子宮内膜癌、上衣腫、食道癌、ユーイングファミリーの腫瘍のユーイング肉腫、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管癌、眼癌(眼内黒色腫、網膜芽腫)、胆嚢癌、胃の(胃)癌、胃腸カルチノイド腫瘍、胃腸間質腫瘍(GIST)、胚細胞腫瘍(頭蓋外、性腺外、又は卵巣)、妊娠性絨毛腫瘍、脳幹神経膠腫、胃カルチノイド、有毛細胞白血病、頭頸部癌、心臓癌、肝細胞(肝臓)癌、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、視床下部及び視経路の神経膠腫、眼内黒色腫、膵島細胞癌腫(膵内分泌部)、カポジ肉腫、腎臓癌(腎細胞癌)、咽頭癌、白血病(急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病)、口唇及び口腔癌、脂肪肉腫、肝臓癌、肺癌(非小細胞、小細胞)、リンパ腫(AIDS関連リンパ腫、バーキットリンパ腫、皮膚T細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫)、マクログロブリン血症(ワルデンストレーム)、男性乳癌、骨の悪性線維性組織球腫/骨肉腫、髄芽腫、黒色腫、メルケル細胞癌、中皮腫、原発不明転移性扁平上皮性頸部癌(metastatic squamous neck cancer with occult primary)、口癌、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫/形質細胞腫瘍、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄異形成/骨髄増殖性疾患、骨髄性白血病、慢性、骨髄白血病、骨髄腫、骨髄増殖性障害、鼻腔及び副鼻腔の癌、上咽頭癌腫、神経芽腫、乏突起神経膠腫、口腔癌、中咽頭癌、骨肉腫/骨の悪性線維性組織球腫、卵巣癌、卵巣上皮癌、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍、膵臓癌、副鼻腔及び鼻腔の癌、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、褐色細胞腫、松果体星状細胞腫、松果体胚腫、松果体芽腫及びテント上原始神経外胚葉腫瘍、下垂体腺腫、形質細胞腫/多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫、原発性中枢神経系リンパ腫、前立腺癌、直腸癌、腎細胞癌腫、腎盂及び尿管の癌、網膜芽腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、肉腫(ユーイングファミリー腫瘍、カポジ肉腫、軟組織肉腫、子宮肉腫)、セザリー症候群、皮膚癌(癌腫、黒色腫、非黒色腫性癌、メルケル細胞癌)、小細胞肺癌、小腸癌、軟部肉腫、扁平上皮癌腫、テント上原始神経外胚葉腫瘍、精巣癌、咽喉癌、胸腺腫、胸腺腫及び胸腺の癌腫、甲状腺癌、腎盂及び尿管の移行細胞癌、絨毛性腫瘍、尿道癌、子宮癌(子宮内膜癌、肉腫)、膣癌、視経路及び視床下部の神経膠腫、外陰癌、ウィルムス腫瘍(腎臓癌)が挙げられるが、それらに限定されない。
【0058】
本明細書中で使用される場合、用語「乳房腫瘍」は、良性(非癌性)腫瘍又は悪性(癌性)腫瘍であり得る、対象における乳房組織細胞の異常な過剰増殖に関する。良性の乳房腫瘍には、好ましくは、線維腺腫、顆粒細胞腫、乳管内乳頭腫、及び葉状腫瘍が含まれる。悪性腫瘍は、本明細書で上記に特定されるような乳癌(BC)である。
【0059】
本明細書で使用される場合、用語「転移性乳癌」(MBC)は、癌細胞が少なくとも1つの続発性部位、すなわち、被験体の非隣接器官又は身体の一部で転移として増殖する乳癌に関する。
【0060】
本明細書で使用される場合、用語「卵巣腫瘍」は、被験体における卵巣組織細胞の異常な過剰増殖に関するものであり、良性(非癌性)腫瘍又は悪性(癌性)腫瘍であり得る。悪性腫瘍は、本明細書で上記に特定されるような卵巣癌(OvaCa)である。
【0061】
本明細書で使用される場合、用語「膵臓腫瘍」は、被験体における卵巣組織細胞の異常な過剰増殖に関するものであり、良性(非癌性)腫瘍又は悪性(癌性)腫瘍であり得る。悪性腫瘍は、本明細書中上記に特定されるような膵臓癌(PaCa)である。
【0062】
用語「循環腫瘍細胞」又は「CTC」は、当業者により理解され、原発腫瘍又は転移腫瘍から剥離して血流中を循環している腫瘍細胞に関する。CTCの数は、乳癌における疾患及び治療成果に関する予後マーカーであり、例えば全生存期間に関する予後マーカーであると理解されるべきである。用語「CTCステータス」は、試料中でのCTCの参照量を超える量の存在又は不存在に関する。好ましくは、CTCの参照量は、7.5mlの血液あたり2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、又は7.5のCTCであり、7.5mlの血液あたり5のCTCがより好ましい。血液試料が前記参照量より多いCTCを含む被験体では、CTCステータスは好ましくなく、好結果の治療の見込みが低く、無増悪生存期間及び全生存期間の見込みが低いことを示す。逆に、血液試料が前記参照量未満のCTCを含む被験体では、CTCステータスは好ましく、好結果の治療の見込みが高く、無増悪生存期間及び全生存期間の見込みが高いことを示す。有利には、本発明において、本明細書において以下に定義される被験体のCTCステータスを決定するために使用されるmiRNAの量が、被験体のCTCステータスの指標であることが見出された。したがって、本明細書で使用されるように、被験体におけるCTCステータスを決定することは、前記1種以上のmiRNAの量を決定すること、したがって、被験体のCTCステータスの指標を得ることに関する。好ましくは、該ステータスは、「好ましい」又は「好ましくない」と診断され得る。
【0063】
疾患の「症状」は、そのような疾患を有する組織、器官又は生体によって知ることができる疾患の影響であり、かつ組織、器官又は個体の疼痛、衰弱、圧痛、緊張、硬直、及び痙攣を含むが、これらに限定されない。疾患の「徴候」又は「シグナル」は、バイオマーカー又は分子マーカーなどの特定の指標の存在、不在、増加又は上昇、低下又は減少、又は症状の発症、存在、又は悪化のような変化又は変更を含むが、これらに限定されない。
【0064】
用語「指標」及び「マーカー」は、本明細書では互換的に使用され、状態についての徴候又はシグナルを指すか、又は状態を監視するために使用される。このような「状態」は、細胞、組織又は器官の生物学的状態、又は個体の健康及び/又は疾患状態を指す。指標は、ペプチド、タンパク質、及び核酸を含むがこれらに限定されない分子の存在又は不存在であってもよく、又は細胞、組織、器官若しくは個体におけるこのような分子の発現レベル又は発現パターンにおける変化であってもよい。指標は、個体における疾患の開始、発症若しくは存在についての、又はそのような疾患のさらなる進行についての徴候であってもよい。また指標は、個体における疾患の発症のリスクについての徴候であってもよい。
【0065】
本明細書で使用される場合、用語「遺伝子産物」は、好ましくは巨大分子の物理的実体に関し、細胞中のその存在は、前記細胞中の前記遺伝子の発現に依存する。遺伝子発現のメカニズムは、転写の基本的なメカニズム、すなわち前記遺伝子又はその一部に対応するRNAの形成、及び翻訳、すなわち遺伝子コードに従って前記RNAによってコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチド分子の産生を含むことが当業者によく知られており、他の細胞プロセスが、例えば、RNAプロセシング、RNA編集、タンパク質分解プロセシング、タンパク質編集などと同様に遺伝子発現に関与し得ることは、当業者によく知られている。したがって、遺伝子産物という用語は、RNA、好ましくはmRNA、並びに前記遺伝子から発現されるポリペプチドを含む。上記から、遺伝子産物という用語はまた、好ましくは少なくとも10、少なくとも12、少なくとも20、少なくとも50、又は少なくとも100ヌクレオチドの長さを有する1種以上の前記RNAの断片、及び好ましくは少なくとも8、少なくとも10、少なくとも12、少なくとも15、少なくとも20アミノ酸の長さを有する前記ポリペプチド由来の断片(ペプチド)を含むことが明らかである。
【0066】
遺伝子産物の量を「決定すること」は、前記遺伝子産物の量を、好ましくは半定量的又は定量的に測定することに関する。測定は、直接的又は間接的に行われ得る。好ましくは、測定は、処理された試料に対して行われ、前記処理は該試料からのポリヌクレオチド又はポリペプチドの抽出を含む。しかし、本発明によれば、遺伝子産物が、例えば免疫組織化学(IHC)によってin situで決定されることも考えられる。
【0067】
本発明のポリヌクレオチドの量は、当該技術分野でよく知られるいくつかの方法で決定することができる。定量化は、好ましくは絶対的であり、すなわち、ポリヌクレオチドの具体的な数に関連し、又はより好ましくは、相対的であり、すなわち、任意の正規化された単位で測定される。好ましくは、正規化は、特定のポリヌクレオチドの数と、ポリヌクレオチド又は参照増幅産物の全数との比率を計算することによって実施される。絶対的又は相対的な定量化を可能にする方法は、当該技術分野でよく知られている。例えば、定量的PCR法は、相対的な定量化のための方法であり、較正曲線がこのようなアッセイに組み込まれる場合、相対的な定量化は、絶対的な定量化を得るために使用され得る。他の公知の方法は、例えば増幅されたポリヌクレオチドのドットブロット又はルミネックス検出と組み合わせた核酸配列ベース増幅(NASBA)又は分岐DNAシグナル増幅アッセイ法である。好ましくは、ポリヌクレオチド量は、正規化されたポリヌクレオチド量であり、すなわち得られるポリヌクレオチド量は、少なくとも1種の参照増幅産物に対して設定され、それによって、好ましくは、ポリヌクレオチド量は、試料中の細胞の数及び/又はポリヌクレオチド増幅の効率に対して設定される。したがって、好ましくは、参照増幅産物は、それぞれの細胞中の一定の存在度を有することが知られるポリヌクレオチド、すなわち試料の殆どの、好ましくは全ての細胞中にほぼ同量で含まれるポリヌクレオチドから得られる産物である。より好ましくは、参照増幅産物は、染色体遺伝子若しくはミトコンドリア遺伝子から、又はハウスキーピング遺伝子のmRNAから増幅される。グ、ピロシーケンシング、次世代シーケンシング、一分子リアルタイムシーケンシング、Ion Torrentシーケンシング、合成によるシーケンシング、ライゲーションによるシーケンシング、超並列シグネチャシーケンシング、Polonyシーケンシング、DNAナノボールシーケンシング、Heliscope一分子シーケンシング、一分子リアルタイム(SMRT)シーケンシング、ナノポアDNAシーケンシング、トンネル電流DNAシーケンシング、ハイブリダイゼーションによるシーケンシング、質量分析を用いたシーケンシング、マイクロ流体サンガーシーケンシング、透過型電子顕微鏡検査DNAシーケンシング、RNAポリメラーゼシーケンシング、in vitroウイルスハイスループットシーケンシング、RNA精製によるクロマチン単離(ChIRP-Seq)、Global Run-onシーケンシング(GRO-Seq)、リボソームプロファイリングシーケンシング(Ribo-Seq)/ARTseq、RNA免疫沈降シーケンシング(RIP-Seq)、CLIP cDNAライブラリーのハイスループットシーケンシング(HITS-CLIP)、架橋及び免疫沈降シーケンシング、光励起性リボヌクレオシド増強架橋及び免疫沈降(PAR-CLIP)、個別ヌクレオチド分解CLIP(iCLIP)、自然伸長転写物シーケンシング(NET-Seq)、ポリソームmRNAの標的精製(TRAP-Seq)、ハイブリッドの架橋、ライゲーション及びシーケンシング(CLASH-Seq)、RNA末端シーケンシングの平行解析(PARE-Seq)、非キャップ転写物のゲノム規模でのマッピング(GMUCT)、転写物アイソフォームシーケンシング(TIF-Seq)、TSSのペアエンド解析(PEAT)、プライマー伸長シーケンシングにより解析される選択的2’-ヒドロキシルアシル化(SHAPE-Seq)、RNA構造の平行解析(PARS-Seq)、フラグメンテーションシーケンシング(FRAG-Seq)、CXXC親和性精製シーケンシング(CAP-Seq)、仔ウシ腸アルカリホスファターゼ-タバコ酸性ピロホスファターゼシーケンシング(CIP-TAP)、イノシンケミカルイレーシングシーケンシング(ICE)、m6A特異的メチル化RNA免疫沈降シーケンシング(MeRIP-Seq)、デジタルRNAシーケンシング、単一細胞についての全転写物増幅(Quartz-Seq)、設計されたプライマーベースのRNAシーケンシング(DP-Seq)、RNA鋳型の5’末端でのスイッチ機構(Smart-Seq)、RNA鋳型の5’末端でのスイッチ機構バージョン2(Smart-Seq2)、固有の分子識別子(UMI)、線形増幅シーケンシングによる細胞発現(CEL-Seq)、単一細胞タグ付き逆転写シーケンシング(STRT-Seq)、一分子の分子反転プローブ(smMIP)、多置換増幅(MDA)、多重アニーリング及びループ化をベースとする増幅サイクル(MALBAC)、オリゴヌクレオチド選択的シーケンシング(OS-Seq)、二重鎖シーケンシング(Duplex-Seq)、バイサルファイトシーケンシング(BS-Seq)、ポストバイサルファイトアダプタータギング(PBAT)、タグメンテーションベース全ゲノムバイサルファイトシーケンシング(T-WGBS)、酸化的バイサルファイトシーケンシング(oxBS-Seq)、Tet支援バイサルファイトシーケンシング(TAB-Seq)、メチル化DNA免疫沈降シーケンシング(MeDIP-Seq)、メチル化キャプチャー(MethylCap)シーケンシング、メチル結合ドメインキャプチャー(MBDCap)シーケンシング、限定表示バイサルファイトシーケンシング(Reduced-Representation Bisulfite Sequencing)(RRBS-Seq)、DNアーゼI高感受性部位シーケンシング(DNase-Seq)、ヌクレオソームシーケンシングのMNアーゼ補助単離(MAINE-Seq)、クロマチン免疫沈降シーケンシング(ChIP-Seq)、調節エレメントのホルムアルデヒド補助単離(FAIRE-Seq)、トランスポゼース接近可能クロマチンのシーケンシングアッセイ(ATAC-Seq)、ペアエンドタグシーケンシングによるクロマチン相互作用解析(ChIA-PET)、クロマチン立体配座捕捉(Hi-C/3C-Seq)、環状クロマチン立体配座捕捉(4-C又は4C-Seq)、クロマチン立体配座捕捉カーボンコピー(5-C)、レトロトランスポゾン捕捉シーケンシング(RC-Seq)、トランスポゾンシーケンシング(Tn-Seq)又は挿入シーケンシング(INSeq)、転位捕捉シーケンシング(TC-Seq)、蛍光ベースの方法(例えば、マイクロアレイ、リアルタイムPCR)、質量ベースの方法(質量分析)、制限酵素ベースの方法、抗体-免疫沈降ベースの方法、及びデジタルPCRにより決定され得る。
【0068】
本発明のペプチド又はポリペプチドの量は、様々な方法で決定され得る。直接的な測定は、ペプチド又はポリペプチド自体から得られるシグナル及び試料中に存在するペプチドの分子の数と直接的に相関する強度に基づいてペプチド又はポリペプチドの量を測定することに関する。このようなシグナル(強度シグナルと呼ばれることもある)は、例えばペプチド又はポリペプチドの特定の物理的又は化学的特性の強度値を測定することによって得ることができる。間接的な測定は、二次成分(すなわち、ペプチド又はポリペプチド自体ではない成分)又は生物学的読取り系、例えば測定可能な細胞応答、リガンド、標識若しくは酵素反応産物から得られるシグナルの測定を含む。
【0069】
ペプチド又はポリペプチドの量の決定は、試料中のペプチドの量を決定するためのあらゆる公知の手段によって達成され得る。前記手段は、イムノアッセイ及び/又は免疫組織化学装置及び種々のサンドウィッチ、競合、又は他のアッセイ形式で標識分子を利用し得る方法を含む。前記アッセイは、ペプチド又はポリペプチドの存在又は非存在を示すシグナルを発生することとなる。さらに、シグナル強度は、好ましくは、試料中に存在するポリペプチドの量に直接的又は間接的に相関(例えば、反比例)され得る。さらなる適切な方法は、ペプチド又はポリペプチドに特異的な物理的又は化学的特性、例えばその正確な分子量又はNMRスペクトルを測定することを包含する。前記方法は、好ましくはバイオセンサー、イムノアッセイに連結された光学デバイス、バイオチップ、分析装置、例えば質量分析計、NMR分析器、又はクロマトグラフィー装置を含む。さらに、方法は、マイクロプレートELISAベースの方法、完全自動化又はロボットによるイムノアッセイ、コバルト結合アッセイ、及びラテックス凝集アッセイを含む。
【0070】
ペプチド又はポリペプチドの量の決定は、試料中のペプチド又はポリペプチドから得られる特異的強度シグナルを測定する工程を含む。上記のように、このようなシグナルは、ペプチド又はポリペプチドに特異的な質量スペクトル又はNMRスペクトルにおいて観察されるペプチド又はポリペプチドに特異的なm/z変数で観察されるシグナル強度であってもよい。
【0071】
本明細書で使用される場合、用語「CpG部位」は、ポリヌクレオチドに含まれる、好ましくはDNAに含まれる、より好ましくは被験体のゲノムDNAに含まれる、ジヌクレオチド配列5’-CG-3’に関する。本発明に従って分析されるCpG部位は、目的の遺伝子のイントロン、エキソン又はプロモーター領域に位置するCpG部位である。CpG部位がプロモーター領域に位置する場合、前記領域は、好ましくは目的のそれぞれの遺伝子の翻訳開始部位の3000ヌクレオチド、2500ヌクレオチド、2100ヌクレオチド、又は1750ヌクレオチド上流である。より好ましくは、本発明に従って分析されるべきCpG部位が、目的の遺伝子の翻訳開始部位の1750~3000ヌクレオチド、2100~3000ヌクレオチド、又は2500~3000ヌクレオチド上流の領域に位置するCpG部位である。
【0072】
したがって、本発明のCpG部位に対応するCpG部位の分析も本発明に包含される。当業者は、例えば、目的の遺伝子の翻訳開始部位を決定することによって、及び/又は試料からの前記配列を目的の遺伝子の配列に整列させることによって、本明細書中の上記に詳述されるCpG部位に対応する試料中のCpG部位を決定する方法を知っている。さらに、本発明のCpG部位のメチル化状態を決定することに加えて、他のCpG部位のメチル化状態が決定されることも本発明によって想定される。
【0073】
用語「メチル化状態を決定する」は、ポリヌクレオチド中のシトシンのピリミジン環の5位にメチル基が存在するかどうかを決定することに関する。好ましくは、シトシン残基の3’方向にグアノシン残基が続き、2つの残基がCpG部位を形成する。前記メチル基の存在は、当業者によく知られる様々な方法、例えばメチル化特異的PCR(MSP)、全ゲノムバイサルファイトシーケンシング若しくはその他のシーケンシングベースの方法(バイサルファイトシーケンシング(BS-Seq)、ポストバイサルファイトアダプタータギング(PBAT)、タグメンテーションベース全ゲノムバイサルファイトシーケンシング(T-WGBS)、酸化的バイサルファイトシーケンシング(oxBS-Seq)、Tet支援バイサルファイトシーケンシング(TAB-Seq)、メチル化DNA免疫沈降シーケンシング(MeDIP-Seq)、メチル化キャプチャー(MethylCap)シーケンシング、メチル結合ドメインキャプチャー(MBDCap)シーケンシング、限定表示バイサルファイトシーケンシング(RRBS-Seq))、バイサルファイト処理されたDNAのリアルタイムPCRベースの方法、例えばメチライト、すなわちメチル化感受性制限酵素での、例えばライゲーション媒介PCRによるHpaII小断片濃縮(HELP)アッセイにおける制限、バイサルファイト処理されたDNAのピロシーケンシング又はAIMS、つまりメチル化部位間の増幅、BC-seq、つまりバイサルファイト変換に続いてのキャプチャー及びシーケンシング、BiMP、つまりバイサルファイトメチル化プロファイリング、BS、つまりバイサルファイトシーケンシング、BSPP、つまりバイサルファイトパッドロックプローブ、CHARM、つまり相対メチル化のための包括的ハイスループットアレイ、COBRA、つまり混合型バイサルファイト制限分析、DMH、つまりディファレンシャルメチル化ハイブリダイゼーション、HELP、つまりライゲーション媒介PCRによるHpaII小断片濃縮、MCA、つまりメチル化CpGアイランド増幅、MCAM、マイクロアレイハイブリダイゼーションによるMCA、MeDIP、mDIP及びmCIP、つまりメチル化DNA免疫沈降、MIRA、つまりメチル化CpGアイランドリカバリーアッセイ、MMASS、単独試料のマイクロアレイベースメチル化評価、MS-AP-PCR、つまりメチル化感受性任意プライムPCR、MSCC、つまりメチル化感受性切断計数、MSP、つまりメチル化特異的PCR、MS-SNuPE、つまりメチル化感受性単独ヌクレオチドプライマー伸長、NGS、つまり次世代シーケンシング、RLGS、つまり制限ランドマークゲノムスキャニング、RRBS、つまり限定表示バイサルファイトシーケンシング、-seq、つまり引き続いてのシーケンシング、WGSBS、つまり全ゲノムショットガンバイサルファイトシーケンシングを含む方法によって決定され得る。(Manel Esteller, Cancer epigenomics: DNA methylomes andhistone-modification maps, Nature, 2007, 8:286-298;PeterW. Laird, Principles and challenges of genome-wide DNA methylation analysis. Nature Review Genetics, 2010, 11: 191-203)。好ましくは、メチル化状態は、本明細書の以下の実施例に記載される方法、例えば、Infinium 27Kメチル化アッセイ又はMALDI-TOF質量分析の質量分析ベースの方法によって決定される。したがって、特定のポリヌクレオチド分子中の特定のシトシン残基のメチル化状態は、「非メチル化」(0%メチル化を意味する)又は「メチル化」(100%メチル化を意味する)のみであってよい。2つのシトシン残基を含む二本鎖DNA分子中のCpG部位の場合、メチル化状態は、「非メチル化」(0%メチル化を意味する、すなわち2つのシトシン残基のいずれもメチル化されていない)、「半メチル化」(50%メチル化を意味する、すなわち2つのシトシン残基のうち1つがメチル化されている)、又は「メチル化」若しくは「完全にメチル化」(100%メチル化を意味する、すなわち両方のシトシン残基がメチル化されている)であり得る。しかしながら、多数の細胞由来のポリヌクレオチドが得られ、そして前記多数のポリヌクレオチド内の特定のシトシン残基のメチル化状態が決定される場合、例えば、好ましくはパーセンテージ(%メチル化)として表され得、かつ0%~100%の間の任意の値をとり得る平均メチル化状態が決定されることが、当業者によって理解される。メチル化状態は、異なる細胞集団の平均メチル化が決定される場合のパーセンテージとして表すことができることも、当業者によって理解される。例えば、本発明による血液細胞は、様々な細胞型の混合物である。ある特定の細胞型は、高いメチル化レベルを有するが、その他の細胞型は、より低いメチル化レベルを有し、かつ最終的に、例えば50%の平均メチル化に至ることが可能である。
【0074】
いくつかの場合において、いくつかのCpG部位のメチル化状態は、単一のメチル化レベルに組み合わされ得る。例えば、GeneX_CpG.1.2.3という用語は、GeneX内のCpG1、2及び3の平均メチル化レベルを指す。
【0075】
本明細書中で使用される場合、用語「検出剤」は、対象となる遺伝子の発現レベル、対象となる遺伝子のメチル化状態、又は本発明のmiRNAの存在若しくは量と特異的に相互作用し、このようにそれらを認識する作用剤に関する。好ましくは、前記検出剤は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドである。好ましくは、検出剤は、適切な手段による前記検出剤の検出を可能にする方法で標識される。標識は、当該技術分野でよく知られる様々な技術によって、使用されるべき標識に依存して行うことができる。使用されるべき好ましい標識は、とりわけ、フルオレセイン、ローダミン、又はテキサスレッドなどの蛍光色素を含む蛍光標識である。しかし、標識は、酵素又は抗体であってもよい。標識として使用されるべき酵素は、基質と反応することによって検出可能なシグナルを生成することとなると想定される。好適な酵素、基質及び技術は、当該技術分野でよく知られている。標識として使用されるべき検出剤は、直接的に(例えば、それ自体蛍光性である標的分子)又は間接的に(例えば、酵素のような検出可能なシグナルを生成する標的分子)検出され得る標的分子を特異的に認識し得る。標識された試料の検出剤は、特異的相互作用をさせるために試料と接触されることとなる。洗浄は、非特異的に結合した検出剤を除去するために必要なことがあり、さもなければ偽値が得られることとなる。この相互作用工程が完了した後に、調査員は、読み取り装置又はスキャナー中に検出装置を配置することとなる。蛍光標識を検出するための装置は、好ましくはいくつかのレーザー、好ましくは特殊な顕微鏡及びカメラからなる。蛍光標識は、レーザーによって励起され、かつ顕微鏡及びカメラが連携して、試料のデジタル画像を生成する。これらのデータは、次いで、コンピュータに記憶されてもよく、そして特別なプログラムが、例えばバックグラウンドデータを差し引くために使用されることとなる。結果として得られるデータは、好ましくは正規化され、そして数値及び共通の単位形式に変換されてもよい。該データは、試料と参照とを比較して、有意な変化を特定するために分析されることとなる。
【0076】
本明細書で使用される「比較」は、分析される試料に含まれる本明細書で述べられる指標の存在、不存在又は量と、適切な参照試料中の前記指標の存在、不存在又は量とを比較することを包含する。本明細書で使用される比較とは、対応するパラメータ又は値の比較を指し、例えば本明細書で述べられる指標の絶対量が、前記指標の絶対参照量と比較され、該指標の濃度が、前記指標の参照濃度と比較され、本明細書で述べられる試料中の指標から得られる強度シグナルが、参照試料中の前記指標の同じ種類の強度シグナルと比較されることと理解されるべきである。言及される比較は、手動で、又はコンピュータの支援により実行されてもよい。コンピュータの支援による比較に関しては、決定された量の値は、コンピュータプログラムによってデータベース中に記憶される適切な参照に相当する値と比較されてもよい。コンピュータプログラムは、エキスパートシステムによって比較の結果をさらに評価してもよい。したがって、本明細書で言及される同定の結果は、適切な出力形式で自動的に提供されてもよい。
【0077】
用語「試料」又は「対象の試料」は、本明細書で互換的に使用され、該用語は、組織、器官又は個体の全体を表すことが意図されるそのような組織、器官又は個体よりも典型的に小さい組織、器官又は個体の部分又は小片を指す。分析に際して、試料は、器官又は個体の組織状態又は健康状態又は疾患状態に関する情報を提供する。試料の例には、流体試料、例えば血液、血清、血漿、滑液、尿、唾液、リンパ液、涙液、及び腺から得ることができる流体、例えば乳腺若しくは前立腺、又は組織試料、例えば腫瘍組織又は腫瘍と隣接した組織から取得した組織抽出物が含まれるが、これらに限定されない。試料のさらなる例は、細胞培養物又は組織培養物、例えば、様々な癌細胞の培養物であるが、これらに限定されない。
【0078】
試料は、周知の技術によって得ることができ、好ましくは、消化管、肝臓、膵臓、肛門管、口腔、上部気道消化管及び表皮からの掻き取り物、スワブ又は生検材料を含む。このような試料は、ブラシ、(綿)スワブ((cotton) swabs)、スパチュラ、リンス/洗浄液、パンチ生検装置、針による空洞の穿刺、又は外科用器具の使用によって得ることができる。組織試料又は器官試料は、例えば生検又は他の外科的手順によって、任意の組織又は器官から得ることができる。より好ましくは試料が、体液、例えば、好ましくは血液、血漿、血清、尿、唾液、涙液、及び乳腺から入手可能な流体、例えば、乳汁の試料である。最も好ましくは、体液の試料は、被験体の細胞を含む。分離された細胞は、体液又は組織若しくは器官から、分離技術、例えば濾過、遠心分離又はセルソーティングによって得ることができる。好ましくは、試料は、本明細書の以下に記載されるこれらの体液から得られる。より好ましくは、細胞は、本明細書の以下に記載されるように前記体液から単離される。
【0079】
試料の分析は、視覚的又は化学的ベースで達成され得る。視覚分析は、試料の形態学的評価を可能にする組織、器官又は個体の顕微鏡イメージング又は放射線撮影スキャンを含むが、これらに限定されない。化学分析には、特定の指標又は変化の、その量又はレベルにおける存在又は不存在の検出が含まれるが、これらに限定されない。
【0080】
本明細書で使用される用語「参照試料」は、対象の試料と実質的に同一の様式で分析され、そしてその情報が対象の試料の情報と比較される試料を指す。それにより、参照試料は、対象となる試料から得られる情報の評価を可能にする標準を提供する。参照試料は、健康な又は正常な組織、器官又は個体に由来してもよく、それによって、組織、器官、又は個体の健康な状態の標準を提供する。正常な参照試料の状態と対象となる試料の状態との間の差異は、疾患の発症のリスク、又はそのような疾患若しくは障害の存在若しくはさらなる進行の指標となり得る。参照試料は、異常な又は罹患した組織、器官、又は個体に由来してもよく、それによって、組織、器官、又は個体の罹患状態の標準を提供する。異常な参照試料の状態と対象となる試料の状態との間の差異は、疾患の発症のリスクの低下、又はこのような疾患若しくは障害の不存在若しくは好転の指標となり得る。また、参照試料は、対象となる試料と同じ組織、器官、又は個体に由来してもよいが、より早い時点で採取されたものである。より早い時点で採取された参照試料の状態と対象となる試料の状態との間の差異は、疾患の進行、すなわち、疾患の経時的な好転又は悪化の指標となり得る。参照試料の採取と関心のある対象となる試料の採取との間で期間が経過する場合、参照試料は、より早い時点又はより遅い時点で採取された。このような期間は、年単位(例えば、1年、2年、3年、4年、5年、10年、15年、20年、25年、30年、35年、40年、45年、50年、60年、70年、80年、90年、100年)、月単位(1ヶ月、2ヶ月、3ヶ月、4ヶ月、5ヶ月、6ヶ月、7ヶ月、8ヶ月、9ヶ月、10ヶ月、11ヶ月、12ヶ月)、週単位(例えば、1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、7週間、8週間)、日単位(例えば、1日、2日、3日、4日、5日、10日、15日、20日、25日、30日、35日、40日、45日、50日、60日、70日、80日、90日、100日、200日、300日、400日、500日)、時間単位(1時間、2時間、3時間、4時間、5時間、6時間、7時間、8時間、9時間、10時間、11時間、12時間)、分単位(例えば、1分間、2分間、3分間、4分間、5分間、10分間、15分間、20分間、25分間、30分間、35分間、40分間、45分間、50分間、60分間)又は秒単位(例えば、1秒間、2秒間、3秒間、4秒間、5秒間、10秒間、15秒間、20秒間、25秒間、30秒間、35秒間、40秒間、45秒間、50秒間、60秒間)であってもよい。
【0081】
参照試料は、両方の試料が単独の要因以外は実質的に同一の方法で処置される場合、対象となる試料とは「異なるように処置」又は「異なるように曝露」され得る。このような単独の要因には、曝露の時間、曝露の濃度、又は特定の物質への曝露の温度が含まれるが、これらに限定されない。したがって、対象となる試料は、参照試料とは異なる適用量の特定の物質に曝露され得、又は参照試料とは異なる時間間隔にわたって曝露され得、又は参照試料とは異なる温度で曝露され得る。対象となる試料が曝露され得る種々の適用量には、参照試料が曝露される適用量の2倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、100倍及び/又は1000倍の増加又は減少された用量が挙げられるが、これらに限定されない。対象となる試料が曝露され得る種々の曝露時間には、参照試料の曝露よりも2倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、100倍及び/又は1000倍長い又は短い時間が含まれるが、これらに限定されない。関心のある試料が曝露され得る曝露の異なる温度には参照の曝露よりも2倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、100倍及び/又は1000倍増加又は減少した温度が含まれるが、これらに限定されない。非限定的な例では、対象となる試料は、参照試料よりも10倍増加した濃度の物質に曝露され得る。次いで、両方の試料の分析が、実質的に同一の様式で行われ、対象となる試料に対するこのような物質の増加した濃度の効果、すなわち有益な効果又は有害な効果を決定することが可能となる。当業者は、この例が必要な変更を加えて、異なる濃度範囲、異なる曝露時間、及び/又は曝露時の異なる温度に適用されることを推察するであろう。
【0082】
指標のレベルの「低下」又は「減少」という用語は、試料中のそのような指標のレベルが、参照又は参照試料と比較して低減されていることを指す。指標のレベルの「上昇」又は「増加」という用語は、試料中のそのような指標のレベルが、参照又は参照試料と比較してより高いことを指す。
【0083】
参照量は、原則的に、本明細書で特定される被験体の群又はコホートについて、所定のmiRNAについての平均値又は中央値に基づいて、標準的な統計学的手法を適用することによって計算され得る。特に、事象を診断することを目的とする方法のような試験の精度は、その受信機動作特性(ROC)によって最もよく説明される(特にZweig 1993, Clin. Chem. 39:561-577を参照されたい)。ROCグラフは、観察されたデータの全範囲にわたって決定閾値を連続的に変動させて得られる全ての感度対特異度の組のプロットである。診断法の臨床的性能は、その精度、すなわち被験体を特定の予後診断又は診断に正しく割り当てる能力に依存する。ROCプロットは、区別に適した閾値の全範囲にわたって感度対1-特異度をプロットすることによって2つの分布の間で重複を示す。y軸は、感度又は真陽性の割合であり、それは、真陽性の試験結果の数及び偽陰性の試験結果の数の合計に対する真陽性の試験結果の数の比率として定義される。これはまた、疾患又は状態の存在における陽性度とも呼ばれている。それは、罹患したサブグループのみから計算される。x軸は、偽陽性の割合、又は1-特異度であり、それは、真陰性の結果の数及び偽陽性の結果の数の合計に対する偽陽性の結果の数の比率として定義される。それは、特異度の指標であり、かつ罹患していないサブグループ全体から計算される。真陽性及び偽陽性の割合は、全体的に別々に、2つの異なるサブグループからの試験結果を使用して計算されるので、ROCプロットは、そのコホートにおける事象の有病率とは無関係である。ROCプロットにおけるそれぞれの点は、特定の決定閾値に相当する感度/-特異度の組を表す。完全な判別を伴う試験(2つの結果の分布において重複無し)は、左上隅を通るROCプロットを有し、その際、真陽性の割合は、1.0又は100%(完全な感度)であり、かつ偽陽性の割合は、0(完全な特異度)である。判別を伴わない試験(2つの群の結果の分布が同じ)の場合の理論上のプロットは、左下隅から右上隅までの45度の対角線である。ほとんどのプロットは、これら2つの両極の間にある。ROCプロットが45度の対角線より完全に下に含まれる場合に、これは、「陽性」の基準を「~より大きい」から「~未満」へと逆転させるか又はその逆にすることによって容易に改善される。定性的には、プロットが左上隅に近くなるほど、試験の全体的な精度は高くなる。所望の信頼区間に依存して、閾値は、ROC曲線から得ることができ、こうして所定の事象の診断又は予測は、感度及び特異度のそれぞれの適切なバランスを伴って可能となる。したがって、本発明の方法のために使用されるべき参照は、好ましくは、前記コホートについてのROCを確立し、そこから閾値量を得ることによって生成され得る。診断法について望ましい感度及び特異度に依存して、ROCプロットは、適切な閾値を得ることを可能にする。好ましくは、参照量は、少なくとも75%の感度及び少なくとも45%の特異度、又は少なくとも80%の感度並びに少なくとも40%の特異度、又は少なくとも85%の感度及び少なくとも33%の特異度、又は少なくとも90%の感度及び少なくとも25%の特異度を表す値の範囲内にある。
【0084】
好ましくは、本明細書で使用される参照量は、処置前に得られる被験体の試料から取得されるが、そのためには、そのドナーがBC又はMBCに罹患していたか否かは既知である。この参照量レベルは、離散的な数値であっても、又は数値範囲であってもよい。明らかに、参照レベル又は参照量は、個々のmiRNA種の間で変動し得る。したがって、測定系は、それぞれの特定のmiRNAの既知の量を含む1つの試料又は一連の試料で較正される。当業者によれば、そのような場合には、miRNAの量は、好ましくは任意単位(AU)として表すことができることが理解される。このように、好ましくは、miRNAの量は、試料から得られるシグナルと較正曲線に含まれるシグナルとを比較することによって決定される。個々の被験体に適用可能な参照量は、年齢又は亜集団などの様々な生理学的パラメータに依存して変動し得る。このように、適切な参照量は、本発明の方法によって、一緒に分析されるべき参照試料から、すなわち試験試料と同時に又は引き続いて、決定され得る。さらに、閾値量は、好ましくは参照量として使用され得る。参照量は、好ましくは、BC又はMBCに罹患しており、BC又はMBCに罹患していることが既知の被験体又は被験体の群の試料から取得できる。また参照量は、好ましくは、BC又はMBCに罹患していないことが既知の被験体又は被験体の群の試料から取得することもできる。前述の量は、測定の統計及び誤差のために変動し得るものと理解されるべきである。偏差、すなわち、本明細書で言及されるmiRNA量の減少又は増加は、好ましくは、統計学的に有意な偏差であり、すなわち統計学的に有意な減少又は統計学的に有意な増加である。
【0085】
本明細書で使用される場合に、疾患又は障害を「治療する」、「治療すること」、又は「治療」は、(a)障害の重症度を軽減すること、(b)治療される障害(複数の場合もある)の症状特性の発生を制限又は防止すること、(c)治療される障害(複数の場合もある)の症状特性の悪化を抑えること、(d)障害(複数の場合もある)を以前に有していた個体における障害(複数の場合もある)の再発を制限又は防止すること、及び(e)障害(複数の場合もある)に以前に徴候を有していた個体における症状の再発を制限又は防止することのうちの1つ以上を達成することを意味する。
【0086】
本明細書で使用される場合に、疾患又は障害を「予防する」、「予防すること」、「予防(prevention)」又は「予防(prophylaxis)」とは、そのような疾患又は障害が患者において起こることを予防することを意味する。
【0087】
本明細書で使用される場合、用語「療法」は、被験体に適用することで、本明細書で言及される疾患若しくは障害、又はそれに付随する症状を有意な程度まで改善するために、被験体に適用されるあらゆる措置を指す。本明細書で使用される前記療法には、本明細書で言及される疾患又は障害に関する健康の完全な回復を導く措置も含まれる。本発明により使用される療法は、治療される全ての被験体において有効でないこともあると理解されるべきである。しかし、この用語は、本明細書で言及される疾患又は障害に罹患している被験体の統計学的に有意な部分が効果的に治療され得ることを必要とするものとする。ある集団が統計学的に有意であるかどうかは、本明細書で先に論じられた様々なよく知られた統計学的評価ツールを使用して、当業者によって難なく決定され得る。
【0088】
本明細書で使用される用語「乳癌療法」は、転移性乳癌を含む乳癌に罹患した被験体に対して、該被験体から癌細胞を除去するための措置、癌細胞の増殖を阻害する措置、癌細胞を死滅させる措置、又は患者の身体に癌細胞の増殖を阻害させ若しくは癌細胞を死滅させる措置を適用することに関する。好ましくは、乳癌療法は、化学療法、抗ホルモン療法、標的療法、免疫療法、又はそれらの任意の組み合わせである。しかしながら、癌療法は、放射線療法若しくは手術単独か、又はそれとその他の治療レジメンとを組み合わせることが想定される。乳癌療法の選択は、被験体の年齢、腫瘍の病期分類、及び腫瘍細胞の受容体の状態のようないくつかの要因に依存することが当業者により理解される。しかし、乳癌療法の選択は、本発明による方法によって補助され得ることもまた、当業者によって理解される:例えば、BCの診断方法によってBCが診断されるが、MBCの診断方法によってMBCが診断されない場合、腫瘍の外科的除去で十分であり得る。例えば、BCの診断方法によってBCが診断され、かつMBCの診断方法によってMBCが診断される場合には、手術に加えて療法措置、例えば化学療法及び/又は標的療法が適切であり得る。同様に、例えばBCの診断方法によってBCが診断され、かつCTCステータスの決定方法によって好ましくないCTCステータスが決定される場合、例えば該治療レジメンに免疫療法を更に加えることが必要とされ得る。
【0089】
本明細書で使用される場合に、用語「化学療法」は、抗腫瘍薬による被験体の治療に関連する。好ましくは、化学療法は、アルキル化剤(例えば、シクロホスファミド)、白金(例えば、カルボプラチン)、アントラサイクリン(例えば、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン又はダウノルビシン)及びトポイソメラーゼII阻害剤(例えば、エトポシド、イリノテカン、トポテカン、カンプトテシン、又はVP16)、未分化リンパ腫キナーゼ(ALK)阻害剤(例えば、クリゾチニブ又はAP26130)、オーロラキナーゼ阻害剤(例えば、N-[4-[4-(4-メチルピペラジン-1-イル)-6-[(5-メチル-1H-ピラゾール-3-イル)アミノ]ピリミジン-2-イル]スルファニルフェニル]シクロプロパンカルボキサミド(VX-680))、抗血管新生薬(例えば、ベバシズマブ)、又はヨウ素131-1-(3-ヨードベンジル)グアニジン(治療用メタヨードベンジルグアニジン)、ヒストンデアセチラーゼ(HDAC)阻害剤を、単独又はそれらの任意の適切な組み合わせで含む治療である。化学療法は、好ましくは、治療の完全なサイクル、すなわち、そのような適用を行わない数日又は数週間によって隔てられた被験体に適用される一連の数回(例えば、4回、6回、又は8回)の用量の1種以上の抗腫瘍薬に関することが理解されるべきである。
【0090】
用語「抗ホルモン療法」は、腫瘍細胞上に発現されるホルモン受容体、例えばエストロゲン受容体又はプロゲステロン受容体を遮断することによる、又はエストロゲンの生合成を遮断することによる乳癌療法に関する。ホルモン受容体の遮断は、好ましくは、化合物、例えばタモキシフェンを投与し、特異的に結合させ、そして前記ホルモン受容体の活性を遮断することによって達成され得る。エストロゲン生合成の遮断は、好ましくは例えばアナストロゾール又はレトロゾールのようなアロマターゼ阻害剤の投与によって達成される。抗ホルモン療法は、腫瘍細胞がホルモン受容体を発現している場合にのみ勧められることが当業者に知られている。
【0091】
本明細書で使用される用語「標的療法」は、腫瘍形成又は癌又は癌細胞の増殖に必要であることが知られる特定の分子と干渉することによって癌細胞の増殖を遮断することが知られる化学物質を患者に適用することに関する。当業者に既知の例は、例えばPARP阻害剤(例えばイニパリブ)のような小分子、又は、例えばトラスツズマブのようなモノクローナル抗体である。
【0092】
本明細書で使用される用語「免疫療法」は、被験体の免疫応答の調節による癌の治療に関する。前記調節は、前記免疫応答の誘導、増強又は抑制であってもよい。用語「細胞ベースの免疫療法」は、免疫細胞、例えばT細胞、好ましくは腫瘍特異的NK細胞を被験体に適用することを含む乳癌療法に関する。
【0093】
用語「放射線療法」又は「放射線療法」は、当業者に知られている。当該用語は、癌を治療又は抑制するための電離放射線の使用に関する。当業者は、乳癌を治療するための手術的手段、例えば腫瘍組織の切除に関連する用語「手術」も知っている。
【0094】
本明細書中で使用される場合、用語「療法の監視(モニタリング)」は、前記癌に罹患した被験体の癌の状態に対する、癌に対する処置の効果に対する指標を得ることに関する。好ましくは、療法の監視は、同じ被験体からの2つの試料に対する本発明の方法の適用を含み、ここで第1の試料は第2の試料の前の時点で得られる。好ましくは、第1の試料を得る時点は、第2の試料を得る時点から、約1週間、約2週間、約3週間、約4(正:four)週間、約5週間、約6週間、約7週間、約2ヶ月、約3ヶ月、約5ヶ月、約6ヶ月、又は約6ヶ月隔てられる。しかしながら、本発明によれば、療法の監視の方法は、被験体の長期監視、例えば無再発生存期間などの時間を監視するために使用されることも想定される。そのような場合、第1の試料を得る時点は、第2の試料を得る時点から、好ましくは、少なくとも6ヶ月、少なくとも1年、少なくとも2年、少なくとも3年、少なくとも4年、少なくとも5年、又は少なくとも6年隔てられる。第1の試料は、好ましくは癌療法が開始される前に得られるが、第2の試料は、好ましくは療法が開始された後に得られることが当業者に知られている。しかしながら、本発明によれば、療法が開始された後に、両方の試料が得られることも想定される。当業者は、本発明の療法の監視のための方法によって、2つ以上の連続した試料を得ることができ、そのような場合に、第1の時点で得られた試料が、第2の試料に対して、並びに第3の試料に対して、第1の試料として使用され得ることも理解する。必要な変更を加えて、第2の時点で得られた試料は、それにもかかわらず、第3の試料に対する第1の試料などとして使用され得る。
【0095】
用語「治療の成功」は、本明細書で使用される場合、好ましくは本明細書で言及される疾患若しくは障害又はそれに伴う症状の有意な程度までの改善に関する。より好ましくは、該用語は、前記被験体の完全な治癒、すなわち転移性乳癌の少なくとも5年にわたる進行及び/又は再発の防止に関する。したがって、「治療の成功の決定」は、被験体が好結果に治療された可能性を評価することに関する。好ましくは、該用語は、より好ましくは特定の時間にわたる、被験体の無増悪生存期間及び/又は全生存期間の予測に関する。用語「無増悪生存期間の予測」は、特定の時間にわたって、転移性乳癌が再発及び/又は進行せずに被験体が生存する可能性を決定することに関する。したがって、用語「全生存期間の予測」は、被験体が特定の期間にわたって生存するであろう可能性を決定することに関する。好ましくは、前記期間は、少なくとも12ヶ月、より好ましくは少なくとも24ヶ月である。
【0096】
用語「医薬品」、「医薬」及び「薬剤」は、本明細書では互換的に使用され、組織状態又は疾患の特定、予防又は治療のために使用される物質及び/又は物質の組み合わせを指す。
【0097】
本明細書で使用される用語「キット」は、好ましくは別々に又は単独の容器内で提供される、前述の要素の集合体を指す。容器は、好ましくは、本発明の方法の実施のための説明書も含む。キットのそのような要素及びそれらの使用方法の例は、本明細書中に示されている。キットは、好ましくは、使用準備済の製剤において前述の要素を含有する。好ましくは、キットは、説明書、例えば要素、例えば検出剤の濃度の調整のため、及び本発明の方法によって提供される診断に関する任意の決定(複数の場合もある)の結果を解釈するための利用者マニュアルを更に含んでもよい。特に、そのようなマニュアルは、決定された遺伝子産物の量を診断の種類に割り当てるための情報を含んでもよい。詳細は、本明細書中の他の箇所に見出されるべきである。さらに、そのような利用者マニュアルは、それぞれのバイオマーカーの量(複数の場合もある)を決定するためにキットの要素を正しく使用することについての説明書を提供し得る。利用者マニュアルは、紙又は電子形式で、例えばCD又はCD ROMに記憶された電子形式で提供されてもよい。本発明は、本発明による方法のいずれかにおける前記キットの使用にも関する。
【0098】
用語「cT」、「cN」、「cM」、「pT」、「pN」及び「pM」は、悪性腫瘍(TNM)の国際対がん連合(UICC)分類を意味する。T、N及びMの3つの主要なパラメータは、原発腫瘍部位(T)、所属リンパ節転移(N)及び遠隔転移の拡がり(M)を記述する。これらのパラメータは、病期が治療前に臨床的に獲得された証拠(例えば、検査、臨床検査、画像検査又は生検)から決定されることを示す「c」などの接頭辞と組み合わせられ得る。接頭辞「p」は、詳細な術後病理学的TNM分類の結果を示す。
【0099】
「Qubit」という用語は、所与の試料中の核酸の濃度を正確に定量することができる蛍光ベースの方法のタイプを指す。Qubitは、DNA、RNA、miRNA又はタンパク質を定量するための特異的蛍光色素を提供する。これらの色素は、それらの標的分子に結合するまで、極めて低い蛍光を有し、したがって、核酸の定量に特異度及び精度を与える。Qubitは、好ましくは無細胞miRNAのレベルを参照する。
【0100】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用されるように、単数形「a」、「an」、及び「the」は、内容が他に明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。
【0101】
用語「約」は、数値に関連して使用される場合、示された数値より5%小さい下限を有し、かつ示された数値より5%大きい上限を有する範囲内の数値を包含することを意味する。
【0102】
(実施形態)
以下では、本発明の異なる態様がより詳細に定義される。そのように定義された各態様は、明確に反対に示されない限り、任意の他の1つ以上の態様と組み合わせられ得る。特に、好ましい、又は有利であると示される任意の特徴は、好ましい、又は有利であると示される任意の他の1つ以上の特徴と組み合わせられ得る。
【0103】
第1の態様では、本発明は、被験体における癌を診断又は予後診断する方法であって、前記被験体から得られた試料において、
a) HYAL2、MGRN1、RPTOR、SLC22A18、FUT7、RAPSN及びS100Pからなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子内の少なくとも1つのCpGジヌクレオチドのシトシンメチル化をインビトロで測定する工程及び/又は
b) miR-148b、miR-409、miR-652、miR-200c、miR-375、miR-320b及びmiR-141からなる群から選択される少なくとも1つのmiRNAの発現レベル(但し、該少なくとも1つのmiRNAがmiR-200c-3p、miR-375及びmiR-320bからなる群から選択される少なくとも1つのmiRNAを含む)をインビトロで測定する工程を含み、
ここで該方法は、miR-451aの発現レベルを測定することを任意選択でさらに含み、
ここで少なくとも1つの遺伝子内の少なくとも1つのCpGジヌクレオチドのシトシンメチル化の減少したレベル及び少なくとも1つのmiRNAの変化した発現レベルは、前記被験体における現在及び/又は将来の癌疾患状態を示す、方法を提供する。
【0104】
言い換えると、特許請求の範囲に記載の方法は、選択されたバイオマーカーのDNAメチル化のレベル及び/又は被験体に由来する試料中の選択されたmiRNAの発現レベルを用いて、前記被験体中の癌を検出又は予測する。上記の全てのCpGジヌクレオチド及びmiRNAは、単変量マーカーとして、又は多変量マーカーとして使用され得る。
【0105】
本発明の第1の態様の好ましい実施形態では、用語miR-148bは、-3p鎖又は5-p鎖(好ましくは-3p鎖)の配列を指し、用語miR-409は、-3p鎖又は-5p鎖(好ましくは-3p鎖)の配列を指し、用語miR-652は、-3p鎖又は-5p鎖(好ましくは-3p鎖)の配列を指し、用語miR-200cは、-3p鎖又は-5p鎖(好ましくは-3p鎖)の配列を指し、用語miR-375は、-3p鎖又は-5p鎖(好ましくは-3p鎖)の配列を指し、及び用語miR-320bは、-3p鎖又は-5p鎖(好ましくは-3p鎖)の配列を指す。
【0106】
本発明の第1の態様の好ましい実施形態では、HYAL2、MGRN1、RPTOR、SLC22A18、FUT7、RAPSN及び/又はS100Pのメチル化状態の変化は、組織状態又は癌疾患状態の悪化又は好転などの組織状態又は癌疾患状態における変化を示す。特に、HYAL2、MGRN1、RPTOR、SLC22A18、FUT7、RAPSN及びS100Pからなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子の中で、少なくとも1つのCpGジヌクレオチドのシトシンメチル化レベルの低下は、癌の存在を示す。特に、HYAL2、MGRN1、RPTOR、SLC22A18、FUT7、RAPSN及びS100Pからなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子の中で、少なくとも1つのCpGジヌクレオチドのシトシンメチル化レベルの低下は、癌が発症する可能性の増加を示す。特に、HYAL2、MGRN1、RPTOR、SLC22A18、FUT7、RAPSN及びS100Pからなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子の中で、少なくとも1つのCpGジヌクレオチドのシトシンメチル化レベルの低下は、癌の存在を示し、かつ癌が発症する可能性の増加を示す。癌が発症する可能性の増加とは、新たな癌の発症又は新たな腫瘍の発症の意味において使用される。
【0107】
本発明の第1の態様の好ましい実施形態において、miR-148b、miR-409、miR-652、miR-200c、miR-375、miR-320b及び/又はmiR-141のmiR発現レベルの変化は、組織状態又は疾患、特に癌の悪化又は好転などの組織状態又は疾患における変化を示す。
【0108】
本発明の第1の態様の好ましい実施形態において、工程b)のmiRNAは、好ましくは癌の診断のために、miR-200c、miR-375、miR-148b、miR-409及びmiR-652から選択される。より好ましくは、miRNAは、好ましくは癌、好ましくは卵巣癌の診断のために、miR-200c及びmiR-375から選択されるか、又はmiR-200c及びmiR-375である。より好ましくは、miRNAは、好ましくは癌、好ましくは乳癌の診断のために、miR-148b、miR-375、miR-409及びmiR-652から選択されるか、又はmiR-148b、miR-375、miR-409及びmiR-652である。
【0109】
本発明の第1の態様の好ましい実施形態において、工程a)の遺伝子は、好ましくは癌の診断のために、HYAL2、SLC22A18、RAPSN及びFUT7から選択される。より好ましくは、遺伝子は、好ましくは癌の診断、好ましくは卵巣癌の診断のために、HYAL2及びSLC22A18から選択されるか、又はHYAL2及びSLC22A18である。より好ましくは、遺伝子は、好ましくは癌の診断、好ましくは乳癌の診断のために、RAPSN及びFUT7から選択されるか、又はRAPSN及びFUT7である。好ましい遺伝子として示される遺伝子は、同じ目的のために好ましいmiRNAとして示されるmiRNAと組み合わされ得る。これらの組合せの例としては、好ましくは癌の診断、好ましくは卵巣癌の診断のために、HYAL2及びSLC22A18から選択されるか、又はHYAL2及びSLC22A18である遺伝子と共に、miR-200c及びmiR-375から選択されるか、又は(正:or)miR-200c及びmiR-375であるmiRNAである。別の例は、好ましくは癌の診断、好ましくは乳癌の診断のために、RAPSN及びFUT7から選択されるか、又はRAPSN及びFUT7である遺伝子と組み合わせて、miR-148b、miR-375、miR-409及びmiR-652から選択されるか、又はmiR-148b、miR-375、miR-409及びmiR-652であるmiRNAである。
【0110】
本発明の第1の態様の好ましい実施形態において、工程b)のmiRNAは、好ましくは癌の予後のために、miR-375、miR-652、miR-200c、miR-320b、miR-141から選択される。より好ましくは、miRNAは、好ましくは癌の予後、好ましくは卵巣癌の予後のために、miR-375、miR-652及びmiR-200cから選択されるか、又はmiR-375、miR-652及びmiR-200cであり、さらにより好ましくはmiR-375である。
【0111】
より好ましくは、miRNAは、好ましくは癌の予後、好ましくは乳癌の予後のために、miR-200c、miR-320b、miR-141から選択されるか、又はmiR-200c、miR-320b、miR-141であり、さらにより好ましくはmiR-200cである。
【0112】
本発明の第1の態様の好ましい実施形態において、工程a)の遺伝子は、好ましくは癌の予後のために、HYAL2、S100P、FUT7、SLC22A18、MGRN1及びRPTORから選択される。より好ましくは、遺伝子は、好ましくは癌の予後、好ましくは卵巣癌の予後のために、HYAL2、S100P、FUT7、SLC22A18及びMGRN1から選択されるか、又はHYAL2、S100P、FUT7、SLC22A18及びMGRN1であり、さらにより好ましくはHYAL2及びS100Pから選択されるか、又はHYAL2及びS100Pである。より好ましくは、遺伝子は、好ましくは癌の予後、好ましくは乳癌の予後のために、HYAL2、S100P及びRPTORから選択されるか、又はHYAL2、S100P及びRPTORである。好ましい遺伝子として示される遺伝子は、同じ目的のために好ましいmiRNAとして示されるmiRNAと組み合わされ得る。これらの組み合わせの例は、好ましくは癌の予後、好ましくは卵巣癌の予後のために、HYAL2、S100P、FUT7、SLC122A18及びMGRN1から選択されるか、又はHYAL2、S100P、FUT7、SLC122A18及びMGRN1である遺伝子と組み合わせて、miR-652及びmiR-200cから選択されるか、又はmiR-652及びmiR-200cであるmiRNAである。別の例は、好ましくは癌の予後、好ましくは卵巣癌の予後のために、HYAL2及びS100Pから選択されるか、又はHYAL2及びS100Pである遺伝子と組み合わせて、miRNA miR-375である。さらなる別の例は、HYAL2、S100P及びRPTORから選択されるか、又はHYAL2、S100P及びRPTORである遺伝子と組み合わせて、miR-200c、miR-320b及びmiR-141から選択されるか、又はmiR-200c、miR-320b及びmiR-141であるmiRNAである。さらなる別の例は、HYAL2、S100P及びRPTORから選択されるか、又はHYAL2、S100P及びRPTORである遺伝子と組み合わせて、miR-200c、miR-320b及びmiR-375から選択されるか、又はmiR-200c、miR-320b及びmiR-375であるmiRNAである。
【0113】
本発明の第1の態様の好ましい実施形態において、HYAL2_CpG4、S100P_CpG4;SLC22A18CpG3、RPTOR_CpG2、RPASN_CpG5;MGRN1_CpG12及びFUT7_CpG7から選択される少なくとも1つのCpGのメチル化レベルは、工程a)において決定され、かつ以下のmiRNAの少なくとも1つの発現レベルは、工程b)miR-148b、miR-409、好ましくはmiR-409-3p、miR-652、好ましくはmiR-652-3p、miR-200c、好ましくはmiR-200c-3p、miR-375、miR-320b及び任意選択でmiR-451aにおいて決定される。代替の実施形態において、S100P_CpG7は、S100P_CpG4の代わりに、又はS100P_CpG4に加えて決定される。
【0114】
本発明の第1の態様の好ましい実施形態において、HYAL2_CpG4、S100P_CpG4;SLC22A18CpG3、RPTOR_CpG2、RPASN_CpG5;MGRN1_CpG12及びFUT7_CpG7から選択される少なくとも2つのCpGのメチル化レベルは、工程a)において決定され、かつ以下のmiRNAの少なくとも2つの発現レベルは、工程b)miR-148b、miR-409、好ましくはmiR-409-3p、miR-652、好ましくはmiR-652-3p、miR-200c、好ましくはmiR-200c-3p、miR-375、miR-320b及び任意選択でmiR-451aにおいて決定される。代替の実施形態において、S100P_CpG7は、S100P_CpG4の代わりに、又はS100P_CpG4に加えて決定される。
【0115】
本発明の第1の態様の好ましい実施形態において、HYAL2_CpG4、S100P_CpG4;SLC22A18CpG3、RPTOR_CpG2、RPASN_CpG5;MGRN1_CpG12及びFUT7_CpG7のメチル化レベルは、工程a)において決定され、かつ以下のmiRNAの発現レベルは、工程b)miR-148b、miR-409、好ましくはmiR-409-3p、miR-652、好ましくはmiR-652-3p、miR-200c、好ましくはmiR-200c-3p、miR-375、miR-320b及び任意選択でmiR-451aにおいて決定される。代替の実施形態において、S100P_CpG7は、S100P_CpG4の代わりに、又はS100P_CpG4に加えて決定される。
【0116】
本発明の第1の態様の好ましい実施形態において、工程a)のシトシンメチル化及び/又は工程b)のmiRNA発現レベルに加えて、好ましくは患者の年齢、CA125、Qubit、疾病負荷、乳癌のタイプ、ステージ、cT、cN、cM、「pT(手術)」、「pN(手術)」、pM、化学療法(はい又はいいえ)、国籍、身長[cm]、体重[kg]、初潮の年齢、高コレステロール、糖尿病、子宮内膜症、筋腫(Myom)、卵巣嚢胞、PCO、自己免疫疾患、薬物治療、妊娠、最初の妊娠の年齢、避妊薬又はホルモン、喫煙者、菜食主義者及びスポーツから選択される、少なくとも1つの臨床マーカーが決定される。最も好ましい臨床マーカーは、年齢、CA125、cT、cN、cM、「pT(手術)」、「pN(手術)」、pM及びQubitである。
【0117】
本発明の第1の態様の好ましい実施形態において、工程a)のシトシンメチル化及び/又は工程b)のmiRNA発現レベルに加えて、臨床マーカー患者の年齢が決定される。
【0118】
本発明の第1の態様の好ましい実施形態において、工程a)のシトシンメチル化及び/又は工程b)のmiRNA発現レベルに加えて、臨床マーカーCA125が決定される。
【0119】
第1の態様の好ましい実施形態において、miR-148b、miR-409、miR-652、miR-200c、miR-375及び/又はmiR-320bの発現レベルの変化は、組織状態又は癌疾患状態の悪化又は好転などの組織状態又は癌疾患状態の変化を示す。特に、miR-148b、miR-409-3p、miR-652-3p、miR-200c-3p、miR-320bから選択されるmiRNAの発現レベルの増加は、癌の存在及び/又は癌が発症する可能性の増加を示す。miR-375の発現レベルの減少は、癌の存在及び/又は癌が発症する可能性の増加を示す。
【0120】
本発明の第1の態様の好ましい実施形態において、HYAL2、MGRN1、RPTOR、SLC22A18、FUT7、RAPSN及びS100Pからなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子の発現レベルは、工程a)において決定されるシトシンメチル化に加えて決定され、ここで発現レベルの増加は、現在及び/又は将来の癌疾患状態を示す。発現レベルの増加は、癌の存在及び/又は癌が発症する可能性の増加を示す。
【0121】
本発明の第1の態様の好ましい実施形態において、HYAL2、MGRN1、RPTOR、SLC22A18、FUT7、RAPSN及びS100Pからなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子の発現レベルは、工程a)において決定されるシトシンメチル化の代わりに決定され、ここで発現レベルの増加は、現在及び/又は将来の癌疾患状態を示す。発現レベルの増加は、癌の存在及び/又は癌が発症する可能性の増加を示す。
【0122】
好ましい実施形態において、メチル化状態の決定は、HYAL2、MGRN1、RPTOR、SLC22A18、FUT7、RAPSN及び/又はS100P遺伝子内の少なくとも1つのCpG部位のメチル化を決定することを含む。特に、前記遺伝子のプロモーター、イントロン及び/又はエキソン領域のメチル化状態が決定される。
【0123】
特に、HYAL2遺伝子は、ヒト3番染色体に位置するヒトHYAL2遺伝子である(GeneBankアクセッション番号:NC_000003.11 GI: 224589815)。特に、ヒト3番染色体上の位置50334760と位置50335700との間に位置する少なくとも1つのCpG部位のメチル化状態が決定される。より具体的には、特にヒトゲノムのbuild36.1/hg18を参照して、位置50335694(cg27091787)、位置50335584(HYAL_CpG_1)、位置50335646(HYAL_CpG_2)、若しくは位置50335671(HYAL_CpG_3)、位置50335166(HYAL_is_CpG_1)、位置50335180(HYAL_is_CpG_2)、位置50335192(HYAL_is_310_CpG_3)、位置50335195(HYAL-is-310 CpG_4)、位置50335227(HYAL_is_310_CpG_5)、位置50335233(HYAL_is_310_CpG_6)、位置50335300(HYAL_is_310_CpG_7)、位置50335315(HYAL_is_310_CpG_8)、位置50335375(HYAL-is-310 CpG_9)、位置50335392(HYAL-is-310 CpG_10)、位置50335401(HYAL-is-310 CpG_11)、位置50334744(HYAL2-is-325_CpG_1)、位置50334761(HYAL2-is-325_CpG_2)、位置50334804(HYAL2-is-325_CpG_3)、位置50334844(HYAL2-is-325_CpG_4)、位置50334853(HYAL2-is-325_CpG_5)、位置50334862(HYAL2-is-325_CpG_6)、位置50334880(HYAL2-is-325_CpG_7)、位置50334906(HYAL2-is-325_CpG_8)、位置50334913(HYAL2-is-325_CpG_9)、位置50334917(HYAL2-is-325_CpG_10)、位置0334928(HYAL2-is-325_CpG_11)、位置50334944(HYAL2-is-325_CpG_12)、位置50334956(HYAL2-is-325_CpG_13)、位置50334980(HYAL2-is-325_CpG_14)、位置50334982(HYAL2-is-325_CpG_15)、位置50335010(HYAL2-is-325_CpG_16)位置50335014(HYAL2-is-325_CpG_17)、位置50331237(cg08776109)及び位置50330420(cg06721473)に位置する少なくとも1つのCpG部位でのメチル化状態が決定される。
【0124】
最も具体的には、少なくとも1つのCpG部位は、位置50335646のHYAL2_CpG_2、及び位置50335671のHYAL2_CpG_3及び位置50335195のHYAL2_CpG_4からなるリストから選択される。特に、本発明の少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、又は少なくとも15個のCpG部位のメチル化状態が決定される。当業者によれば、前記CpG部位の正確な番号付けは、特定のゲノム配列及び分析されるべき試料中に含まれるHYAL2プロモーター領域の特定の配列に依存し得ることが理解され、例えば、HYAL2遺伝子は、build37/hg19においては3番染色体:位置50,355,221-50,360,337に位置するが、build36/hg18においては3番染色体:位置50,330,244-50,335,146に位置する。
【0125】
好ましい実施形態において、本明細書中で定義されるCpGの100bp、80bp、70bp、60bp、50bp、40bp、30bp、20bp、10bp、5bpの距離内の全てのCpGが、示される領域の平均メチル化値を得るように測定される。この実施形態は、特に癌患者において知られている、隣接するCpGの共メチル化の現象に基づく。最も一般的なのは、CpGアイランド及び/又はCpGショアの領域における共メチル化である。
【0126】
特に、MGRN1遺伝子は、ヒト16番染色体に位置するヒトMGRN1遺伝子(GeneBankアクセッション番号:NC_000016.10、範囲: 4624824-4690974、参照GRCh38プライマリアセンブリ;GeneBankアクセッション番号:NC_018927.2、範囲:4674882-4741756、オルタネイトアセンブリCHM1_1.1;GeneBankアクセッション番号:AC_000148.1、範囲: 4641815-4707494、オルタネイトアセンブリHuRef)である。特に、ヒト16番染色体上の位置4654000と位置4681000との間に位置するCpG部位の少なくとも1つのメチル化状態が決定される。特に、CpG部位(複数の場合もある)は、16番染色体の以下の領域の1つ以上に位置する:4670069-4670542、4654000-4655000、4669000-4674000、及び4678000-4681000。より具体的には、ヒトゲノムのbuild36.1/hg18を特に参照して、少なくとも1つのCpG部位のメチル化状態は以下の位置に位置する:4670487(MGRN1_CpG_1)、4670481(MGRN1_CpG_2)、4670466(MGRN1_CpG_3)、4670459(MGRN1_CpG_4)、4670442(MGRN1_CpG_5)、4670440(MGRN1_CpG_6)、4670435(MGRN1_CpG_7)、4670433(MGRN1_CpG_8)、4670422(MGRN1_CpG_9)、4670414(MGRN1_CpG_10)、4670411(MGRN1_CpG_11)、4670402(MGRN1_CpG_12)、4670393(MGRN1_CpG_13)、4670357(MGRN1_CpG_14)、4670352(MGRN1_CpG_15)、4670343(MGRN1_CpG_16)、4670341(MGRN1_CpG_17)、4670336(MGRN1_CpG_18)、4670313(MGRN1_CpG_19)、4670310(MGRN1_CpG_20)、4670301(MGRN1_CpG_21)、4670292(MGRN1_CpG_22)、4670287(MGRN1_CpG_23)、4670281(MGRN1_CpG_24)、4670276(MGRN1_CpG_25)、4670264(MGRN1_CpG_26)、4670234(MGRN1_CpG_27)、4670211(MGRN1_CpG_28)、4670180(MGRN1_CpG_29)、4670174(MGRN1_CpG_30)、4670157(MGRN1_CpG_31)、4670137(MGRN1_CpG_32)、4670123(MGRN1_CpG_33)、4670117(MGRN1_CpG_34)。最も具体的には、少なくとも1つのCpG 部位は、位置4670481 のMGRN1_CpG_2、位置4670459 のMGRN1_CpG_4、位置4670402 のMGRN1_CpG_12及び位置4670264のMGRN1_CpG_26 からなる一覧から選択される。特に、本発明の少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、又は少なくとも15個のCpG部位のメチル化状態が決定される。当業者によれば、前記CpG部位の正確な番号付けは、特定のゲノム配列及び分析されるべき試料中に含まれるMGRN1プロモーター領域の特定の配列に依存し得ることが理解される。
【0127】
特に、RPTOR遺伝子は、ヒト17番染色体に位置するヒトRPTOR遺伝子(GeneBankアクセッション番号:NC_000017.11、範囲: 80544825-80966373、GRCh38プライマリアセンブリ;GeneBankアクセッション番号:NG_013034.1、範囲: 5001-426549、RefSeq遺伝子;GeneBankアクセッション番号:NC_018928.2、範囲: 78604958-79026514、オルタネイトアセンブリCHM1_1.1;GeneBankアクセッション番号:NG_013034.1;GeneBankアクセッション番号:AC_000149.1、範囲: 73954508-74378467、オルタネイトアセンブリHuRef)である。特に、ヒト17番染色体上の位置76.297.000と位置76.416.000との間に位置する少なくとも1つのCpG部位のメチル化状態が決定される。特に、CpG部位(複数の場合もある)は、17番染色体の以下の領域の1つ以上に位置する:76.369.937-76.370.536、76.297.000-76.310.000、76.333.000-76.341.000、76.360.000-76.380.000、及び76.411.000-76.416.000。より具体的には、ヒトゲノムのbuild36.1/hg18を特に参照して、少なくとも1つのCpG部位のメチル化状態は以下の位置に位置する:76370001(RPTOR_CpG_1)、76370037(RPTOR_CpG_2)、76370073(RPTOR_CpG_3)、76370092(RPTOR_CpG_4)、76370172(RPTOR_CpG_5)、76370199(RPTOR_CpG_6)、76370220(RPTOR_CpG_7)、76370253(RPTOR_CpG_8)。最も具体的には、少なくとも1つのCpG部位が、位置76370037のRPTOR_CpG_2、位置76370172のRPTOR_CpG_5及び位置76370253のRPTOR_CpG_8からなる一覧から選択される。特に、本発明の少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、又は少なくとも15個のCpG部位のメチル化状態が決定される。当業者によれば、前記CpG部位の正確な番号付けは、特定のゲノム配列及び分析されるべき試料中に含まれるRPTORプロモーター領域の特定の配列に依存し得ることが理解される。
【0128】
特に、SLC22A18遺伝子は、ヒト11番染色体に位置するヒトSLC22A18遺伝子(GeneBankアクセッション番号:NC_000011.10、範囲: 2899721-2925246、参照GRCh38プライマリアセンブリ;GeneBankアクセッション番号:NG_011512.1、範囲:5001-30526、RefSeq遺伝子;GeneBankアクセッション番号:NT_187585.1、範囲: 131932-157362、参照GRCh38 ALT_REF_LOCI_1;GeneBankアクセッション番号:AC_000143.1、範囲:2709509-2734907、オルタネイトアセンブリHuRef;GeneBankアクセッション番号:NC_018922.2、範囲: 2919878-2945340、オルタネイトアセンブリCHM1_1.1)である。特に、ヒト11番染色体上の位置2876000と位置2883000との間に位置する少なくとも1つのCpG部位のメチル化状態が決定される。特に、CpG部位は、2.877.113-2.877.442に位置する。より具体的には、11番染色体:2.876.000-11番染色体:2.883.000、7000bpの癌関連、特にBC、OvaCa及び/又はPaCA関連の、差次的メチル化領域は、SLC22A18(転写変異体)のプロモーター領域、CpGアイランド及び遺伝子体領域の一部をカバーする。より具体的には、ヒトゲノムのbuild36.1/hg18を特に参照して、少なくとも1つのCpG部位のメチル化状態は以下の位置に位置する:2877395(SLC22A18_CpG_1)、2877375(SLC22A18_CpG_2)、2877365(SLC22A18_CpG_3)、2877341(SLC22A18_CpG_4)、2877323(SLC22A18_CpG_5)、2877311(SLC22A18_CpG_6)、2877193(SLC22A18_CpG_7)、2877140(SLC22A18_CpG_8)。最も具体的には、少なくとも1つのCpG部位が、位置2877365のSLC22A18_CpG_3、位置2877341のSLC22A18_CpG_4、及び位置2877140のSLC22A18_CpG_8からなる一覧から選択される。特に、本発明の少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、又は少なくとも15個のCpG部位のメチル化状態が決定される。当業者によれば、前記CpG部位の正確な番号付けは、特定のゲノム配列及び分析されるべき試料中に含まれるSLC22A18プロモーター領域の特定の配列に依存し得ることが理解される。
【0129】
特にFUT7 遺伝子は、ヒトの9番染色体に位置するヒトのFUT7 遺伝子(GeneBankアクセッション番号:NC_000009.12、範囲:137030174-137032840、参照GRCh38プライマリアセンブリ;GeneBankアクセッション番号:NG_007527.1、範囲: 5001-7667、RefSeq遺伝子;GeneBankアクセッション番号:AC_000141.1、範囲:109383478-109386144、オルタネイトアセンブリHuRef;GeneBankアクセッション番号:NC_018920.2、範囲: 140073389-140076055、オルタネイトアセンブリCHM1_1.1)である。特に、ヒト9番染色体上の位置139046000と位置139048000との間に位置する少なくとも1つのCpG部位のメチル化状態が決定される。より具体的には、2000bpのBC、OvaCa、及び/又はPaCA関連の差次的メチル化領域は、FUT7のプロモーター領域に位置する。特に、CpG部位は、139.047.218-139.047.610、139.046.000-139.048.000、及び139.045.065-139.045.817に位置する。より具体的には、ヒトゲノムのbuild36.1/hg18を特に参照して、少なくとも1つのCpG部位のメチル化状態は以下の位置に位置する:139047253(FUT_CpG_1)、139047314(FUT_CpG_2)、139047346(FUT_CpG_3)、139047427(FUT_CpG_4)、139047445(FUT_CpG_5)、139047467(FUT_CpG_6)、139047483(FUT_CpG_7)、139047566(FUT_CpG_8)。最も具体的には、少なくとも1つのCpG部位が、位置139047346のFUT7_CpG_3及び位置139047483のFUT7_CpG_7から選択される。特に、本発明の少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、又は少なくとも15個のCpG部位のメチル化状態が決定される。当業者によれば、前記CpG部位の正確な番号付けは、特定のゲノム配列及び分析されるべき試料中に含まれるFUT7プロモーター領域の特定の配列に依存し得ることが理解される。
【0130】
特に、RAPSN遺伝子は、ヒト11番染色体に位置するヒトRAPSN遺伝子(GeneBankアクセッション番号:NC_000011.10、範囲:47437757~47449178、参照GRCh38プライマリアセンブリ;GeneBankアクセッション番号:NG_008312.1、範囲:5001~16423、RefSeq遺伝子;GeneBankアクセッション番号:NC_018922.2、範囲:47458570-47469991、オルタネイトアセンブリCHM1_1.1;GeneBankアクセッション番号:AC_000143.1、範囲:47159075-47170494、オルタネイトアセンブリHuRef)である。特に、ヒト11番染色体上の位置47427500と位置47428500との間に位置するCpG部位の少なくとも1つのメチル化状態が決定される。好ましくは、CpG部位は47427500-47428300に位置する。より具体的には、1000bpの癌関連、好ましくはBC、OvaCa、及び/又はPaCA関連の、差次的メチル化領域は、RAPSNのプロモーター領域に位置する。より具体的には、ヒトゲノムのbuild36.1/hg18を特に参照して、少なくとも1つのCpG部位のメチル化状態は以下の位置に位置する:47427787(RAPSN_CpG_1)、47427825(RAPSN_CpG_2)、47427883(RAPSN_CpG_3)、47427915(RAPSN_CpG_4)、47427930(RAPSN_CpG_5)、47427976(RAPSN_CpG_6)、47428029(RAPSN_CpG_7)、47428110(RAPSN_CpG_8)。最も具体的には、少なくとも1つのCpG部位が、位置47427825のRAPSN_CpG_2、位置47427915のRAPSN_CpG_4、位置47427930のRAPSN_CpG_5、位置47428029のRAPSN_CpG_7、及び位置47428110のRAPSN_CpG_8から選択される。特に、本発明の少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、又は少なくとも15個のCpG部位のメチル化状態が決定される。当業者によれば、前記CpG部位の正確な番号付けは、特定のゲノム配列及び分析されるべき試料中に含まれるRAPSNプロモーター領域の特定の配列に依存し得ることが理解される。
【0131】
特に、S100P遺伝子は、ヒト4番染色体に位置するヒトS100P遺伝子(GeneBankアクセッション番号:NC_000004.12、範囲:6693839-6697170、参照GRCh38プライマリアセンブリ;GeneBankアクセッション番号:AC_000136.1、範囲: 6627254-6630595、オルタネイトアセンブリHuRef;GeneBankアクセッション番号:NC_018915.2、範囲:6693944-6697285、オルタネイトアセンブリCHM1_1.1)である。特に、ヒト4番染色体上の位置6746000と位置6747000との間に位置する少なくとも1つのCpG部位のメチル化状態が決定される。より具体的には、1000bpの癌関連の(好ましくはBC、OvaCa、及び/又はPaCA関連の)差示的メチル化領域は、S100Pのプロモーター領域からS100Pの第1エキソンまでに位置している。特に、CpG部位は、6.746.537-6.746.823に位置する。より具体的には、ヒトゲノムのbuild36.1/hg18を特に参照して、少なくとも1つのCpG部位のメチル化状態は以下の位置に位置する:6746565(S100P_CpG_1)、6746599(S100P_CpG_2)、6746609(S100P_CpG_3)、6746616(S100P_CpG_4)、6746623(S100P_CpG_5)、6746634(S100P_CpG_6)、6746710(S100P_CpG_7)、6746728(S100P_CpG_8)、6746753(S100P_CpG_9)、6746779(S100P_CpG_10)、6746788(S100P_CpG_11)、6746791(S100P_CpG_12)。最も具体的には、少なくとも1つのCpG部位が、位置6746599のS100P_CpG_2、位置6746609のS100P_CpG_3、位置6746616のS100P_CpG_4、及び位置6746710のS100P_CpG_7から選択される。特に、本発明の少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、又は少なくとも15個のCpG部位のメチル化状態が決定される。当業者によれば、前記CpG部位の正確な番号付けは、特定のゲノム配列及び分析されるべき試料中に含まれるS100Pプロモーター領域の特定の配列に依存し得ることが理解される。
【0132】
さらなる実施形態において、癌を予後診断及び/又は診断する方法は、前記被験体において、少なくとも1種のCpGジヌクレオチドのメチル化状態及び少なくとも1種のmiRNAマーカーの存在、特に発現レベルと、少なくとも1つのCpGジヌクレオチドのメチル化状態及び1つ以上の参照における少なくとも1種のmiRNAマーカーの存在、特に発現レベルとを比較する工程をさらに含む。特に、参照は、閾値、参照値又は参照試料である。
【0133】
参照が閾値である実施形態においては、HYAL2、MGRN1、RPTOR、SLC22A18、FUT7、RAPSN、及びS100Pからなる群から選択される少なくとも1種の(正:at least one)メチル化マーカーのメチル化状態であって、閾値を下回るメチル化状態は、癌に罹患している被験体、癌を発症するリスクの増加、又は疾患の悪化の指標であるが、一方、その閾値と等しい又はそれを上回るメチル化状態は、癌に罹患していない被験体、癌を発症するリスクの低下、又は疾患の好転の指標である。前述のレベルは、測定の統計及び誤差のために変化し得ることが理解されるべきである。
【0134】
参照が閾値である実施形態においては、HYAL2、MGRN1、RPTOR、SLC22A18、FUT7、RAPSN、及びS100Pからなる群から選択される少なくとも1種のメチル化マーカーの発現レベルであって、その閾値と等しい又はそれを上回る発現レベルは、癌に罹患している被験体、癌を発症するリスクの増加、又は疾患の悪化の指標であるが、一方、その閾値を下回る発現レベルは、癌に罹患していない被験体、癌を発症するリスクの低下、又は疾患の好転の指標である。前述のレベルは、測定の統計及び誤差のために変化し得ることが理解されるべきである。
【0135】
参照が閾値である実施形態においては、miR-148b、miR-409、miR-652、miR-200c、miR-375、miR-320b及びmiR-141からなる群から選択される少なくとも1種のmiRNAマーカーの量であって、その閾値と等しい又はそれを上回る量は、癌に罹患している被験体、癌を発症するリスクの増加、又は疾患の悪化の指標であるが、一方、その閾値を下回る量は、癌に罹患していない被験体、癌を発症するリスクの低下、又は疾患の好転の指標である。前述の量は、測定の統計及び誤差のために変化し得ることが理解されるべきである。
【0136】
参照が参照値である実施形態においては、前記参照値が癌の不存在、癌の存在、又は癌を発症するリスクの増加若しくは低下の代表的な値である。
【0137】
さらなる実施形態においては、参照試料は、健康な個体に由来する参照試料、罹患した個体に由来する参照試料、対象となる試料と同じ個体に由来するより早い時点又はより後の時点に採取される参照試料、及び健康な個体について代表的な参照試料、又は癌の存在若しくは不存在について代表的な参照試料、又は癌を発症するリスクの増加若しくは低下について代表的な参照試料からなる群から選択される。
【0138】
本発明の第1の態様の好ましい実施形態において、癌は、乳癌及び/又は卵巣癌である。別の好ましい実施形態において、方法は、乳癌の予後診断のための方法である。別の好ましい実施形態において、方法は、卵巣癌の予後診断のための方法である。別の好ましい実施形態において、方法は、乳癌を診断するための方法である。別の好ましい実施形態において、方法は、卵巣癌を診断するための方法である。
【0139】
本発明の第1の態様の好ましい実施形態において、少なくとも2個、3個、4個、5個、6個、又は7個の異なるCpGジヌクレオチドのメチル化状態が決定される。CpGは、同一遺伝子内又は異なる遺伝子内に位置し得る。
【0140】
本発明の第1の態様の好ましい実施形態において、少なくとも2種、3種、4種、5種、6種、又は7種の異なるmiRNAの発現レベルが決定される。
【0141】
本発明の第1の態様の好ましい実施形態において、少なくとも2種、3種、4種、5種、6種、又は7種の異なるCpGジヌクレオチドのメチル化状態が決定され、かつ少なくとも2種、3種、4種、5種、6種、又は7種の異なるmiRNAの発現レベルが決定される。
【0142】
本発明の第1の態様の好ましい実施形態において、HYAL2及びS100P内での少なくとも1つのCpGジヌクレオチドのメチル化状態が決定される。
【0143】
本発明の第1の態様の好ましい実施形態において、少なくともmiRNA miR-200c及びmiR-375の発現レベルが決定される。
【0144】
本発明の第1の態様の好ましい実施形態において、HYAL2及びS100P内の少なくとも1つのCpGジヌクレオチドのメチル化状態が決定され、そして少なくともmiRNA miR-200c及びmiR-375の発現レベルが決定される。
【0145】
本発明の第1の態様の好ましい実施形態において、被験体は、癌、好ましくは乳癌及び/若しくは卵巣癌を有するか、又は発症するリスクが増加している。
【0146】
本発明の第1の態様の好ましい実施形態において、試料は、体液試料又は組織試料であり、ここで該体液試料は、好ましくは血液、血清、血漿、滑液、尿、唾液、リンパ液、涙液、及び腺から得ることができる流体からなる群から選択され、より好ましくは末梢血である。
【0147】
本発明の第1の態様の好ましい実施形態において、方法は、
(c) 前記少なくとも1つの遺伝子内の少なくとも1つのCpGジヌクレオチドのシトシン化レベル及び/又は前記少なくとも1つの遺伝子の発現レベル及び1つ以上の参照試料における前記少なくとも1つのmiRNAの発現レベルをインビトロにおいて決定する工程、をさらに含む。
【0148】
本発明の第1の態様の好ましい態様において、工程a)のCpGは、HYAL2_CpG1、HYAL2_CpG2、HYAL2_CpG3、HYAL2_CpG4、S100P_CpG_2.3、S100P_CpG4、S100P_CpG7、S100P_CpG8、S100P_CpG9、S100P_CpG10.11.12、SLC22A18_CpG1、SLC22A18_CpG3、SLC22A18_CpG4、SLC22A18_CpG6、SLC22A18_CpG8、RPTOR_CpG1、RPTOR_CpG2、RPTOR_CpG3、RPTOR_CpG5、RPTOR_CpG6、RPTOR_CpG8、RAPSN_CpG1、RAPSN_CpG2、RAPSN_CpG4、RAPSN_CpG5、RAPSN_CpG6、RAPSN_CpG7、RAPSN_CpG8、FUT7_CpG1、FUT7_CpG2、FUT7_CpG3、FUT7_CpG4、FUT7_CpG6、FUT7_CpG7、MGRN1_CpG2、MGRN1_CpG4、MGRN1_CpG5.6.7.8、MGRN1_CpG12、MGRN1_CpG15、MGRN1_CpG_16.17.18、MGRN1_CpG19.20、MGRN1_CpG22.23、MGRN1_CpG26から選択される。
【0149】
本発明の第1の態様の好ましい実施形態において、工程a)において以下のCpGが決定される:HYAL2_CpG1、HYAL2_CpG2、HYAL2_CpG3、HYAL2_CpG4、S100P_CpG_2.3、S100P_CpG4、S100P_CpG7、S100P_CpG8、S100P_CpG9、S100P_CpG10.11.12、SLC22A18_CpG1、SLC22A18_CpG3、SLC22A18_CpG4、SLC22A18_CpG6、SLC22A18_CpG8、RPTOR_CpG1、RPTOR_CpG2、RPTOR_CpG3、RPTOR_CpG5、RPTOR_CpG6、RPTOR_CpG8、RAPSN_CpG1、RAPSN_CpG2、RAPSN_CpG4、RAPSN_CpG5、RAPSN_CpG6、RAPSN_CpG7、RAPSN_CpG8、FUT7_CpG1、FUT7_CpG2、FUT7_CpG3、FUT7_CpG4、FUT7_CpG6、FUT7_CpG7、MGRN1_CpG2、MGRN1_CpG4、MGRN1_CpG5.6.7.8、MGRN1_CpG12、MGRN1_CpG15、MGRN1_CpG_16.17.18、MGRN1_CpG19.20、MGRN1_CpG22.23、MGRN1_CpG26。
【0150】
本発明の第1の態様の好ましい実施形態において、工程a)において以下のCpGが決定される:HYAL2_CpG1、HYAL2_CpG2、HYAL2_CpG3、HYAL2_CpG4、S100P_CpG2、3、S100P_CpG7、S100P_CpG8、S100P_CpG9、S100P_CpG10、11、12、SLC22A18_CpG1、SLC22A18_CpG3、SLC22A18_CpG4、SLC22A18_CpG6、RPTOR_CpG1、RPTOR_CpG2、RPTOR_CpG3、RPTOR_CpG5、RPTOR_CpG6、RPTOR_CpG8、RAPSN_CpG1、RAPSN_CpG4、RAPSN_CpG6、RAPSN_CpG7、RAPSN_CpG8、FUT7_CpG1、FUT7_CpG2、FUT7_CpG3、FUT7_CpG4、FUT7_CpG6、FUT7_CpG7、MGRN1_CpG4、MGRN1_CpG5、6、7、8、MGRN1_CpG12、MGRN1_CpG15、MGRN1_CpG16、17、18、MGRN1_CpG19、20、MGRN1_CpG22、23、MGRN1_CpG26。このマーカー選択は、好ましくは乳癌の診断又は予後診断、特にBRCA+乳癌の診断及び予後診断に使用される。
【0151】
本発明の第1の態様の好ましい実施形態において、少なくともmiR-200cの発現レベルが工程b)において決定され、かつ工程a)における遺伝子の選択はHYAL2を含む。
【0152】
本発明の第1の態様の好ましい実施形態において、少なくともmiR-200cの発現レベルが工程b)において決定され、かつ工程a)における遺伝子の選択はHYAL2及びS100Pを含む。
【0153】
本発明の第1の態様の好ましい実施形態において、少なくともmiR-200cの発現レベルが工程b)において決定され、かつ工程a)における遺伝子の選択はHYAL2、S100P及びMGRN1を含む。
【0154】
本発明の第1の態様の好ましい実施形態において、少なくともmiR-375の発現レベルが工程b)において決定され、かつ工程a)における遺伝子の選択はHYAL2を含む。
【0155】
本発明の第1の態様の好ましい実施形態において、少なくともmiR-375の発現レベルが工程b)において決定され、かつ工程a)における遺伝子の選択はHYAL2及びS100Pを含む。
【0156】
本発明の第1の態様の好ましい実施形態において、少なくともmiR-375の発現レベルが工程b)において決定され、かつ工程a)における遺伝子の選択はHYAL2、S100P及びMGRN1を含む。
【0157】
本発明の第1の態様の好ましい実施形態において、少なくともmiR-320bの発現レベルが工程b)において決定され、かつ工程a)における遺伝子の選択はHYAL2を含む。
【0158】
本発明の第1の態様の好ましい実施形態において、少なくともmiR-320bの発現レベルが工程b)において決定され、かつ工程a)における遺伝子の選択はHYAL2及びS100Pを含む。
【0159】
本発明の第1の態様の好ましい実施形態において、少なくともmiR-320bの発現レベルが工程b)において決定され、かつ工程a)における遺伝子の選択はHYAL2、S100P及びMGRN1を含む。
【0160】
本発明の第1の態様の好ましい実施形態において、少なくともmiR-200c及びmiR-320bの発現レベルが工程b)において決定され、かつ工程a)における遺伝子の選択はHYAL2を含む。
【0161】
本発明の第1の態様の好ましい実施形態において、少なくともmiR-200c及びmiR-320bの発現レベルが工程b)において決定され、かつ工程a)における遺伝子の選択はHYAL2及びS100Pを含む。
【0162】
本発明の第1の態様の好ましい実施形態において、少なくともmiR-200c及びmiR-320bの発現レベルが工程b)において決定され、かつ工程a)における遺伝子の選択はHYAL2、S100P及びMGRN1を含む。
【0163】
本発明の第1の態様の好ましい実施形態において、少なくともmiR-200c、miR-320b及びmiR-375の発現レベルが工程b)において決定され、かつ工程a)における遺伝子の選択はHYAL2を含む。
【0164】
本発明の第1の態様の好ましい実施形態において、少なくともmiR-200c、miR-320b及びmiR-375の発現レベルが工程b)において決定され、かつ工程a)における遺伝子の選択はHYAL2及びS100Pを含む。
【0165】
本発明の第1の態様の好ましい実施形態において、少なくともmiR-200c、miR-320b及びmiR-375の発現レベルが工程b)において決定され、かつ工程a)における遺伝子の選択はHYAL2、S100P及びMGRN1を含む。
【0166】
本発明の第1の態様の好ましい実施形態において、方法は、早期癌、好ましくは早期卵巣癌を診断又は予後診断するための方法である。
【0167】
本明細書において使用される用語「早期癌」は、その初期段階の癌を指す。当技術分野では、いくつかの病期分類システムが知られており、早期又は早期段階の癌を定義するために本発明において使用することができる。例えば、卵巣癌のために一般的に使用されている病期分類システムは、FIGO(International Federation of Gynecology and Obstetrics)システムである(www.figo.orgを参照されたい)。このシステムは、この癌の病期分類(分類)に3つの因子を用いる:腫瘍の範囲(サイズ)(T)、近くのリンパ節への拡がり(N)及び遠隔部位への拡がり(転移)(M)。T、N、及びMの後の数字又は文字は、これらの因子のそれぞれについてのさらなる詳細を提供する。数字が大きいほど、癌がより進行していることを意味する。一旦、ヒトのT、N、及びMカテゴリが決定されると、この情報は全体的なステージを割り当てるために、ステージグルーピングと呼ばれるプロセスにおいて組み合わされる。
【0168】
下記の表の病期分類システムでは、病理学的病期(外科的病期とも呼ばれる)が用いられる。これは手術中に除去された組織を検査することによって決定される。これは外科的病期分類としても知られている。時として、直ちに手術ができない場合は、その代わりに癌は臨床病期が付与されることとなる。これは、手術前に行われた身体診察、生検、及び画像検査の結果に基づいている。
【0169】
【表1-1】
【表1-2】
【表1-3】
表中英語
Stage grouping:ステージグルーピング
FIGO Stage:FIGO病期
Stage description* :病期説明*
The cancer is onlyin the ovary (or ovaries) or fallopian tube(s) (T1). :癌が1つ若しくは複数の卵巣又は卵管(複数の場合もある)のみに認められる(T1)。
It has not spreadto nearby lymph nodes (N0) or to distant sites (M0). :近くのリンパ節(N0)又は遠隔部位(M0)には拡がっていない。
The cancer is inone ovary, and the tumor is confined to the inside of the ovary; or the canceris in one fallopian tube, and is only inside the fallopian tube. :癌が片側の卵巣内にあり、かつ腫瘍が卵巣の内部に限局している;又は癌が片側の卵管内にあり、かつ卵管の内部のみに認められる。
There is no canceron the outer surfaces of the ovary or fallopian tube. :卵巣又は卵管の外表面に癌は認められない。
No cancer cells arefound in the fluid (ascites) or washings from the abdomen and pelvis (T1a). :体液(腹水)又は腹部及び骨盤の洗浄液に癌細胞は認められない(T1a)。
It has not spreadto nearby lymph nodes (N0) or to distant sites (M0). :近くのリンパ節(N0)や遠隔部位(M0)には拡がっていない。
The cancer is inboth ovaries or fallopian tubes but not on their outer surfaces. :癌が両側の卵巣又は卵管に存在しているが、それらの外表面には存在していない。
No cancer cells arefound in the fluid (ascites) or washings from the abdomen and pelvis (T1b). :体液(腹水)又は腹部及び骨盤の洗浄液に癌細胞は認められない(T1b)。
It has not spreadto nearby lymph nodes (N0) or to distant sites (M0). :近くのリンパ節(N0)又は遠隔部位(M0)には拡がっていない。
The cancer is inone or both ovaries or fallopian tubes and any of the following are present: :癌が片側若しくは両側の卵巣又は卵管に認められ、かつ以下の条件のいずれかが満たされる:
The tissue(capsule) surrounding the tumor broke during surgery, which could allow cancercells to leak into the abdomen and pelvis (called surgical spill). :手術中に腫瘍の周囲の組織(被膜)が破れて、癌細胞が腹部又は骨盤内に漏れ出てしまうことがある(外科的漏出と呼ばれる)。
This is stage IC1. :これはステージIC1である。
Cancer is on theouter surface of at least one of the ovaries or fallopian tubes or the capsule(tissue surrounding the tumor) has ruptured (burst) before surgery (which couldallow cancer cells to spill into the abdomen and pelvis). :癌が少なくとも1つの卵巣又は卵管の外表面に存在しているか、又は被膜(腫瘍の周囲の組織)が手術前に破裂(破裂)している(癌細胞が腹部及び骨盤内に漏れる可能性がある)。
This is stage IC2. :これはステージIC2である。
Cancer cells arefound in the fluid (ascites) or washings from the abdomen and pelvis. :体液(腹水)又は腹部及び骨盤の洗浄液中に癌細胞が認められる。
This is stage IC3. :これはステージIC3である。
It has not spreadto nearby lymph nodes (N0) or to distant sites (M0). :近くのリンパ節(N0)又は遠隔部位(M0)には拡がっていない。
The cancer is inone or both ovaries or fallopian tubes and has spread to other organs (such asthe uterus, bladder, the sigmoid colon, or the rectum) within the pelvis orthere is primary peritoneal cancer (T2). :癌が片側若しくは両側の卵巣又は卵管に認められ、かつ骨盤内の他の器官(子宮、膀胱、S状結腸、直腸など)に拡がっているか、又は原発性腹膜癌がある(T2)。
It has not spreadto nearby lymph nodes (N0) or to distant sites (M0). :近くのリンパ節(N0)又は遠隔部位(M0)には拡がっていない。
The cancer hasspread to or has invaded (grown into) the uterus or the fallopian tubes, or theovaries. :癌が子宮又は卵管、又は卵巣に拡がっているか、浸潤している(増殖している)。
It has not spreadto nearby lymph nodes (N0) or to distant sites (M0). :近くのリンパ節(N0)又は遠隔部位(M0)には拡がっていない。
The cancer is onthe outer surface of or has grown into other nearby pelvic organs such as thebladder, the sigmoid colon, or the rectum (T2b). :癌が膀胱、S状結腸、又は直腸などの他の近くの骨盤臓器の外表面に存在しているか、又はその中に増殖している(T2b)。
It has not spreadto nearby lymph nodes (N0) or to distant sites (M0). :近くのリンパ節(N0)又は遠隔部位(M0)には拡がっていない。
T1 or T2 :T1又はT2
The cancer is inone or both ovaries or fallopian tubes, or there is primary peritoneal cancer(T1) and it may have spread or grown into nearby organs in the pelvis (T2). :癌が片側又は両側の卵巣又は卵管に存在しているか、又は原発性腹膜癌が認められ(T1)、かつ骨盤内の近くの臓器に拡がっているか、又は近くの臓器中に増殖している場合がある(T2)。
It has spread tothe retroperitoneal (pelvic and/or para-aortic) lymph nodes only. :後腹膜リンパ節(骨盤リンパ節及び/又は傍大動脈リンパ節)のみに拡がっている。
It has not spreadto distant sites (M0). :それは遠隔部位には拡がっていない(M0)。
N0 or N1 :N0又はN1
The cancer is inone or both ovaries or fallopian tubes, or there is primary peritoneal cancerand it has spread or grown into organs outside the pelvis. :癌が片側又は両側の卵巣又は卵管に存在しているか、又は原発性腹膜癌が存在し、かつ骨盤外の臓器に拡がっているか、又は骨盤外の臓器中に増殖している。
During surgery, nocancer is visible in the abdomen (outside of the pelvis) to the naked eye, buttiny deposits of cancer are found in the lining of the abdomen when it isexamined in the lab (T3a). :手術中、腹部(骨盤の外側)から肉眼では癌は認められないが、実験室で検査すると腹部の内壁において癌の小さな沈着物が認められる(T3a)。
The cancer might ormight not have spread to retroperitoneal lymph nodes (N0 or N1), but it has notspread to distant sites (M0). :癌は後腹膜リンパ節に拡がっている場合もあれば、拡がっていない場合もあるが(N0又はN1)、遠隔部位(M0)には拡がっていない。
There is cancer inone or both ovaries or fallopian tubes, or there is primary peritoneal cancerand it has spread or grown into organs outside the pelvis. :片側又は両側の卵巣又は卵管に癌が認められるか、又は原発性腹膜癌があり、かつ骨盤外の臓器に拡がっているか、又は骨盤外の臓器中に増殖している。
The deposits ofcancer are large enough for the surgeon to see, but are no bigger than 2 cm(about 3/4 inch) across. :癌の沈着は、外科医が診るのに十分な大きさであるが、2cm(約3/4インチ)を超えない大きさである。
It may or may nothave spread to the retroperitoneal lymph nodes (N0 or N1), but it has notspread to the inside of the liver or spleen or to distant sites (M0). :後腹膜リンパ節に拡がっている場合と拡がっていない場合があるが(N0又はN1)、肝臓又は脾臓の内部、あるいは遠隔部位には拡がっていない(M0)。
The cancer is inone or both ovaries or fallopian tubes, or there is primary peritoneal cancerand it has spread or grown into organs outside the pelvis. :癌が片側若しくは両側の卵巣又は卵管に存在しているか、又は原発性腹膜癌が存在し、かつ骨盤外の臓器に拡がっているか、又は骨盤外の臓器中に増殖している。
The deposits ofcancer are larger than 2 cm (about 3/4 inch) across and may be on the outside(the capsule) of the liver or spleen (T3c). :癌の沈着は直径2cm(約3/4インチ)を超える大きさであり、かつ肝臓又は脾臓の外側(被膜)にできる場合がある(T3c)。
It may or may nothave spread to the retroperitoneal lymph nodes (N0 or N1), but it has notspread to the inside of the liver or spleen or to distant sites (M0). :後腹膜リンパ節に拡がっている場合と拡がっていない場合があるが(N0又はN1)、肝臓又は脾臓の内部、あるいは遠隔部位には拡がっていない(M0)。
Any T :任意のT
Any N :任意のN
Cancer cells arefound in the fluid around the lungs (called a malignant pleural effusion) withno other areas of cancer spread such as the liver, spleen, intestine, or lymphnodes outside the abdomen (M1a). :肺の周囲の体液中に癌細胞が認められ(悪性胸水と呼ばれる)、肝臓、脾臓、腸、又は腹部の外側のリンパ節など、癌の他の領域の拡がりは認められない(M1a)。
The cancer hasspread to the inside of the spleen or liver, to lymph nodes other than theretroperitoneal lymph nodes, and/or to other organs or tissues outside theperitoneal cavity such as the lungs and bones (M1b). :脾臓又は肝臓の内部、後腹膜リンパ節以外のリンパ節、及び/又は肺及び骨などの腹膜腔の外側の他の臓器若しくは組織に、癌が拡がっている(M1b)。
【0170】
上記の表は、卵巣癌に使用され得る癌病期分類システムの一例である。本発明の文脈における早期卵巣癌は、FIGOステージI及びII(すなわち、I、IA、IB、IC、II、IIA及びIIB)である。
【0171】
異なる癌タイプのための他の病期分類システムは、当技術分野でよく知られている。
【0172】
本発明の第1の態様の好ましい実施形態において、早期癌、好ましくは早期卵巣癌を診断又は予後診断するために、miRNA miR-148b、miR-652、miR-409、miR200c、miR-375及びmiR-320bの発現レベルが決定され、任意選択で臨床マーカーCA125が決定される。
【0173】
本発明の第1の態様の好ましい実施形態において、癌、好ましくは乳癌の診断又は予後診断のために、miRNA miR-148b、miR-652、miR-409、miR200c、miR-375及びmiR-320bの発現レベルが決定され、そしてHYAL2、MGRN1、RPTOR、SLC22A18、FUT7、RAPSN及びS100Pのそれぞれの中の少なくとも1つのCpGジヌクレオチドのシトシンメチル化が決定され、任意に、本方法は臨床マーカー年齢及び/又はQubitをさらに含む。
【0174】
本発明の代替的な第1の態様において、被験体における癌を診断又は予後診断する方法であって、前記被験体から得られた試料中で
a) miR-148b、miR-409、miR-652、miR-200c、miR-375及びmiR-320b及びmiR-141からなる群から選択される少なくとも3種のmiRNAの発現レベル(但し、該少なくとも3種のmiRNAは、少なくともmiRNA miR-200c、miR-375及びmiR-320bを含む)、
b) 任意選択で、HYAL2、MGRN1、RPTOR、SLC22A18、FUT7、RAPSN及びS100Pからなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子内の少なくとも1つのCpGジヌクレオチドのシトシンメチル化をインビトロで測定する工程を含み、及び/又は
ここで該方法は、任意選択で、miR-451aの発現レベルを決定することをさらに含み、
ここで該方法は、任意選択で、好ましくは患者の年齢、CA125、cT、cN、cM、pT(手術)、pN(手術)、pM及びQubitから選択される少なくとも1つの臨床マーカーを決定することをさらに含み、
ここで該少なくとも3種のmiRNAの発現レベルの変化、及び決定された場合、少なくとも1つの遺伝子内の少なくとも1つのCpGジヌクレオチドのシトシンメチル化のレベルの低下が、前記被験体における現在及び/又は将来の癌疾患状態を示す、方法。
【0175】
前述の第1の態様の実施形態は、本発明の代替的な第1の態様にも適用される。
【0176】
第2の態様において、本発明は、本発明の第1の態様により癌を予測又は検出することを含む、癌を診断する方法又は癌をスクリーニングする方法を提供する。癌を検出することは、すでに存在する癌の状態を決定することと理解されるべきである。これは、例えば、診断すること及び予後診断することを包含する。癌を予測することは、癌がすでに存在していることを必要とせず、かつ例えば、癌に対する感受性又は癌を発症する可能性の尺度を提供することを含む。第1の態様の方法は、癌を予測するためにも使用され得る。
【0177】
第3の態様において、本発明は、本発明の第1の態様による癌を繰り返し予測又は検出することを含む、癌を発症するリスクが増加した被験体を監視する方法を提供する。
【0178】
第4の態様において、本発明は、治療期間にわたって繰り返し本発明の第1の態様により癌を予測又は検出することを含む、被験体の癌治療を監視する方法を提供する。
【0179】
第5の態様において、本発明は、治療中及び/又は治療後に、本発明の第1の態様により癌を予測又は検出することを含む、癌治療に対する被験体の応答を評価する方法を提供する。
【0180】
第6の態様において、本発明は、本発明の第1の態様による方法に従って検出された癌を有する被験体を治療する方法であって、該被験体に癌療法を実施することをさらに含む、方法を提供する。
【0181】
第7の態様において、本発明は、以下を特異的に検出するためのオリゴヌクレオチドを含むキットを提供する:
HYAL2、MGRN1、RPTOR、SLC22A18、FUT7、RAPSN及びS100Pからなる群内の少なくとも1つのCpGジヌクレオチドのシトシンメチル化のレベル、及び/又は
miR-148b、miR-409-3p、miR-652-3p、miR-200c-3p、miR-375、miR-320b、miR-451a及びmiR-141からなる群から選択される少なくとも1つのmiRNAの発現レベル(但し、少なくとも1つのmiRNAがmiR-200c-3p、miR-375、miR-320b及びmiR-451aからなる群から選択される少なくとも1つのmiRNAを含む)。
【0182】
好ましい実施形態において、キットは、以下を特異的に検出するためのオリゴヌクレオチドを含んでいる:
HYAL2、MGRN1、RPTOR、SLC22A18、FUT7、RAPSN及びS100Pからなる群の遺伝子内の少なくとも1つのCpGジヌクレオチドのシトシンメチル化のレベル、及び/又は
miR-148b、miR-409-3p、miR-652-3p、miR-200c-3p、miR-375、miR-320b、miR-451a及びmiR-141からなる群からのmiRNAの発現レベル。
好ましい実施形態において、キットは以下をさらに含む
(a) コンテナ、及び/又は
(b) 次のような情報を含むデータキャリア:
(i) 癌の発症リスクの同定及び/又は存在の同定及び/又は進行を監視する方法に関する説明書、
(ii) 少なくとも1つのメチル化マーカーのメチル化状態及び/又は発現レベル、並びに、特に試料中の、より具体的には個体及び/又はキットからの試料中の少なくとも1つのmiRNAの量を検出するための手段の使用説明書、
(iii) 少なくとも1つのメチル化マーカーのメチル化状態及び/又は発現レベル、並びに少なくとも1つのmiRNAマーカー及び/又はキットの量を検出するための手段のロット/バッチ番号、製造若しくは組み立て現場、又は有効期限若しくは販売期限に関する情報、キットの正しい保管又は取り扱いに関する情報などの質の情報、
(iv) 少なくとも1つのメチル化マーカーのメチル化状態及び/又は発現レベル並びに少なくとも1つのmiRNAマーカーの量を検出するための緩衝液(複数の場合もある)、希釈剤(複数の場合もある)、試薬(複数の場合もある)、及び/又は少なくとも1つのメチル化マーカーのメチル化状態及び/又は発現レベル及び少なくとも1つのmiRNAマーカーの量を検出するための手段の組成物に関する情報、
(v) 癌の進行を同定及び/又は監視する上記の方法を実施する際に得られる情報の解釈に関する情報、
(vi) 不適切な方法及び/又は不適切な手段を適用する場合、起こりうる誤解又は誤った結果に関する警告、及び/又は
(vii) 不適切な試薬(複数の場合もある)及び/又は緩衝液(複数の場合もある)を使用する場合、起こりうる誤解又は誤った結果に関する警告。
【0183】
好ましい実施形態において、キットは、上記で詳細に特定された方法において使用するためのものである。特に、キット(正:kit)は、以下からなる群から選択される方法において使用するためのものである:
(i)被験体において、(a)HYAL2、MGRN1、RPTOR、SLC22A18、FUT7、RAPSN、S100Pからなる群から選択される少なくとも1つのメチル化マーカーのメチル化状態及び/又は発現レベルを決定すること、及び(b)miR-148b、miR-409、miR-652、miR-200c、miR-375、miR-320b及びmiR-141からなる群から選択される少なくとも1つのmiRNAマーカーの発現レベルを決定することを含む、被験体において、癌、特に乳癌及び/又は卵巣癌を診断及び/又は予後診断する方法であって、ここで少なくとも1つのメチル化マーカーのメチル化状態及び/又は発現レベル並びに少なくとも1つのmiRNAの存在が、前記被験体の予後診断及び/又は診断の指標である、方法、
(ii)被験体における癌の変化又は癌の予防若しくは治療のための医薬品の投与量を決定する方法であって、(a)被験体の試料における、先に詳細に指定された、HYAL2、MGRN1、RPTOR、SLC22A18、FUT7、RAPSN、S100Pからなる群から選択される少なくとも1つのメチル化マーカーのメチル化状態及び/又は発現レベル、並びに先に詳細に指定された、miR-148b、miR-409、miR-652、miR-200c、miR-375、miR-320b及びmiR-141からなる群から選択される少なくとも1つのmiRNAマーカーの量を決定し、かつ任意選択で、対象となる試料中の少なくとも1つのメチル化マーカーのメチル化状態及び/又は発現レベル及び少なくとも1つのmiRNAマーカーの量との比較のための参照における少なくとも1つのメチル化マーカーのメチル化状態及び/又は発現レベル及び少なくとも1つのmiRNAマーカーの量を決定する工程、並びに(b)対象となる試料中の少なくとも1つのメチル化マーカーのメチル化状態及び/又は発現レベル及び少なくとも1つのmiRNAマーカーの量に応じて、任意選択で対象となる試料及び参照又は参照試料中の少なくとも1つのメチル化マーカーのメチル化状態及び/又は発現レベル及び少なくとも1つのmiRNAマーカーの量の比較に応じて、医薬品の投与量を決定する工程を含む、方法、
(iii)癌の変化又は癌の予防若しくは癌の治療のための医薬品の投与量を適応させる方法であって、(a)試料における、先に詳細に指定された、HYAL2、MGRN1、RPTOR、SLC22A18、FUT7、RAPSN、S100Pからなる群から選択される少なくとも1つのメチル化マーカーのメチル化状態及び/又は発現レベル、並びに先に詳細に指定された、miR-148b、miR-409、miR-652、miR-200c、miR-375、miR-320b及びmiR-141からなる群から選択される少なくとも1つのmiRNAマーカーの量を決定する工程、(b)1つ以上の参照又は参照試料中の少なくとも1つのメチル化マーカーのメチル化状態及び/又は発現レベル及び少なくとも1つのmiRNAマーカーの量を決定する工程、(c)前記対象となる試料中に存在する少なくとも1つのメチル化マーカーのメチル化状態及び/又は発現レベル及び少なくとも1つのmiRNAマーカーの量が、1つ以上の参照又は参照試料中のレベルと異なるかどうかについて試験される試料を検査する工程、及び(d)対象となる試料中の少なくとも1つのメチル化マーカーのメチル化状態及び/又は発現レベル及び少なくとも1つのmiRNAマーカーの量が、1つ以上の参照又は参照試料中のレベルと異なるかどうかに応じて、医薬品の投与量を適応させる工程を含む、方法、
(iv)癌又は癌の発生に対する物質の有益及び/又は有害な作用を決定する方法であって、(a)対象となる試料における、先に詳細に指定された、HYAL2、MGRN1、RPTOR、SLC22A18、FUT7、RAPSN、S100Pからなる群から選択される少なくとも1つのメチル化マーカーのメチル化状態及び/又は発現レベル、並びに先に詳細に指定された、miR-148b、miR-409、miR-652、miR-200c、miR-375、miR-320b及びmiR-141からなる群から選択される少なくとも1つのmiRNAマーカーの量を決定する工程、(b)1つ以上の参照又は参照試料中の少なくとも1つのメチル化マーカーのメチル化状態及び/又は発現レベル及び少なくとも1つのmiRNAマーカーの量を決定する工程、及び(c)前記対象となる試料中に存在する少なくとも1つのメチル化マーカーのメチル化状態及び/又は発現レベル及び少なくとも1つのmiRNAマーカーの量が、1つ以上の参照又は参照試料中のレベルと異なるかどうかについて対象となる試料を検査する工程であって、ここで該対象となる試料が、該1つ以上の参照又は参照試料とは異なる方法で前記物質に曝露された、工程を含む、方法、
(v)癌治療に対する応答者としての患者を特定する方法であって、第1の試料及び該第1の試料に引き続いて採取された1つ以上の更なる試料における、先に詳細に指定された、HYAL2、MGRN1、RPTOR、SLC22A18、FUT7、RAPSN、S100Pからなる群から選択される少なくとも1つのメチル化マーカーのメチル化状態及び/又は発現レベル、並びに先に詳細に指定された、miR-148b、miR-409、miR-652、miR-200c、miR-375、miR-320b及びmiR-141からなる群から選択される少なくとも1つのmiRNAマーカーの量を決定することを含み、ここで少なくとも1つのメチル化マーカーのメチル化状態の増加及び/又は少なくとも1つのメチル化マーカーのより低い発現レベル、並びに少なくとも1つのmiRNAマーカーの不存在又は量の減少が、治療に対する応答を示す、方法、
(vi)癌治療に対する非応答者としての患者を特定する方法であって、第1の試料及び該第1の試料に引き続いて採取された1つ以上の更なる試料における、先に詳細に指定された、HYAL2、MGRN1、RPTOR、SLC22A18、FUT7、RAPSN、S100Pからなる群から選択される少なくとも1つのメチル化マーカーのメチル化状態及び/又は発現レベル、並びに先に詳細に指定された、miR-148b、miR-409、miR-652、miR-200c、miR-375、miR-320b及びmiR-141からなる群から選択される少なくとも1つのmiRNAマーカーの量を決定することを含み、ここで少なくとも1つのメチル化マーカーのメチル化状態の減少及び/又は少なくとも1つのメチル化マーカーの発現レベルの増加、並びに少なくとも1つのmiRNAマーカーの存在又は量の増加が、治療に対する応答の欠如を示す、方法、並びに
(vii)癌を治療する方法であって、(i)被験体の第1の試料における、先に詳細に指定された、HYAL2、MGRN1、RPTOR、SLC22A18、FUT7、RAPSN、S100Pからなる群から選択される少なくとも1つのメチル化マーカーのメチル化状態及び/又は発現レベル、並びに先に詳細に指定された、miR-148b、miR-409、miR-652、miR-200c、miR-375、miR-320b及びmiR-141からなる群から選択される少なくとも1つのmiRNAマーカーの量を決定する工程、(ii)1つ以上の抗癌剤又は療法を含む第1の治療レジメンで前記患者の治療を開始する工程、(iii)前記被験体の1つ以上の引き続き採取された更なる試料における、少なくとも1つのメチル化マーカーのメチル化状態及び/又は少なくとも1つのメチル化マーカーの発現レベル、並びに少なくとも1つのmiRNAの量を決定する工程、(iv)任意選択で工程(ii)及び(iii)を1回以上繰り返す工程、(v)少なくとも1つのメチル化マーカーのメチル化状態の本質的な増加及び/又は少なくとも1つのメチル化マーカーのより低い発現レベル、並びに少なくとも1つのmiRNAマーカーの量の減少若しくは不存在が見られる場合に、該第1の治療レジメンによる該患者の治療を継続する工程、又は(vi)少なくとも1つのメチル化マーカーのメチル化状態の減少及び/又は少なくとも1つのメチル化マーカーの発現レベルの増加、並びに少なくとも1つのmiRNAマーカーの量の増加若しくは存在が見られる場合に、該治療を修正するか、又は該第1の治療レジメンによる該患者の治療を終了し、そして該第1の治療レジメンに含まれない1つ以上の抗癌剤若しくは療法を含む第2の治療レジメンでその代わりに該患者を治療する工程を含む、方法。
【0184】
第8の態様において、本発明は、癌、好ましくは乳癌及び卵巣癌を予測、予後診断及び/又は診断するための、本発明の第7の態様のキットの使用を提供する。
【0185】
以下の実施例は、単に本発明を説明するものとする。実施例は、決して本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【0186】
実施例1:マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析(MALDI-TOF MS)を使用したメチル化分析。
DNAメチル化のハイスループット定量分析は、塩基特異的切断及びMALDIーTOF MSを利用するMassARRAYアッセイ(Agena BioScience、Inc.、ドイツ)によって実施され、そしてEhrichら(Ehrich M. et al., Nucleic Acid Res, 2005. 33(4):pe38)によって記載されている。200μlの全血から単離された500ngのゲノムDNAは、EZ DNAメチル化-Gold商標キット(Zymo Research、フライブルグ、ドイツ)を用いた重亜硫酸塩転換に使用される。1μlの重亜硫酸塩処理されたDNAは、重亜硫酸塩特異的プライマーを用いたタッチダウンPCRによる増幅のための鋳型として使用される(表1)。タッチダウンPCRに使用したプログラムは、表2に示される。ゲル電気泳動によるPCR産物の品質管理の後、それらは、MassARRAY EpiTYPERアッセイ(Agena BioScienceInc.、ハンブルグ、ドイツ)の標準プロトコルに従って処理される。簡単に述べると、PCR産物は、Shrimpアルカリホスファターゼ(SAP)で脱リン酸化され、インビトロ転写され、そしてRNase Aにより切断される。切断産物は、ddHOで最終容量27μlまで希釈される。その後、6mgのCLEAN樹脂(Agena BioScienceInc.、ハンブルグ、ドイツ)は、質量分析のための核酸フラグメントのリン酸骨格を調製するために試料に添加される。次に、384ウェルプレートが2000rpmで2分間遠心分離され、そして30分間回転される。
【0187】
MALDI-TOF MSを実施するために、22ナノリットルの各切断は、Spectropointナノディスペンサーを使用して、3-ヒドロキシピコリン酸のマトリックスでプレスポットされた384ウェルフォーマットのSpectroCHIP(Agena BioScienceInc.、ハンブルグ、ドイツ)上にロボットで分配される。チップは、質量分析計(Agena BioScience Inc.、ハンブルグ、ドイツ)によって読み取られる。データは、SpectroACQUIRE v3.3.1.3ソフトウェアによって収集され、そしてMassARRAY EpiTYPER v1.0 ソフトウェアで視覚化される。このソフトウェアは、異なる標的配列にわたる複数又は単一のCpG部位についての定量的結果を自動的に提供する。
【0188】
【表2-1】
【表2-2】
表1.重亜硫酸塩特異的プライマー
表中英語
Amplicons:アンプリコン
Primers :プライマー
PrimerID :プライマーID
Sequences :配列
sense:センス
SEQ ID NO: 16:配列番号16
antisense:アンチセンス
SEQ ID NO: 17:配列番号 17
SEQ ID NO: 18:配列番号18
SEQ ID NO: 19:配列番号19
SEQ ID NO: 20:配列番号20
SEQ ID NO: 21:配列番号21
SEQ ID NO: 22:配列番号22
SEQ ID NO: 23:配列番号23
SEQ ID NO: 24:配列番号24
SEQ ID NO: 25:配列番号25
SEQ ID NO: 26:配列番号26
SEQ ID NO: 27:配列番号27
SEQ ID NO: 28:配列番号28
SEQ ID NO: 29:配列番号29
【0189】
【表3】
表2.Program forTouch down PCR:タッチダウンPCRのプログラム
表中英語
Table 2. :表2
Program for Touchdown PCR:タッチダウンPCRのプログラム
min:分
sec:秒
go to 2, 4x:2へ進む、4サイクル
go to 2, 35 x:2へ進む、35サイクル
for ever:永遠
【0190】
実施例2:定量的PCR(qPCR)を用いたmiRNA分析
血液処理及び血漿からのmiRNA単離
EDTA血液試料は、症例の個体及び対照の個体から採取され、そして同日に血漿のために処理された。EDTAチューブは、最初に1300gで20分間室温(RT)で遠心分離された。上清(血漿)は、2mlの微量遠心分離チューブに移され、続いて12,000gで10分間(RT)の第2の高速遠心分離工程を行い、細胞デブリ及び断片を除去された。血漿は、クライオバイアルに分注され、そして-80℃で保存された。循環miRNAは、NucleoSpin miRNA plasmaキット(Machery Nagel、ドイツ)を製造者のプロトコールに従って使用して300μlの血漿から抽出された。miRNAは、30μlのRNaseフリー水に溶出された。miRNA濃度は、Qubit Fluorometer(ThermoFischerScientific、ドイツ)によって測定された。
【0191】
選択されたマーカー候補の検証
MIRCURY LNAキット(Qiagen、ドイツ)を用いて、最終容量10μlにおいて逆転写が行われた。各反応は、2μlのRT緩衝液、1μlのRT酵素混合物、2μlのmiRNA鋳型及び5μlのRNaseフリー水で構成された。RTは、製造業者によって推奨される通り、42℃で1時間行われ、続いて95℃で5分間行われた。得られたcDNAは、-20℃で保存され、そして使用直前に1:30に希釈された。
リアルタイムqPCR反応は、デュープリケートで行われ、2.5μlのPrimaQuant CYBR Mastermix(Steinbrenner、ドイツ)、0.5μlの特異的miRCURY LNA PCRアッセイ(Qiagen、ドイツ)、0.4μlのヌクレアーゼフリー水及び1.6μlの希釈されたcDNAを含む反応で行われた。リアルタイムPCRは、qTOWER機器(Analytik Jena、ドイツ)において、以下の条件下で実施された:
【0192】
【表4】
表3:リアルタイムqPCRプログラム
表中英語
initialdenaturation:最初の変性
continuous:連続的
Meltcurve:融解曲線
【0193】
実施例3:統計解析
第1の工程において、関連する変数(すなわち、miRNA及びメチル化CpG部位)が選択された。したがって、弾性ネット法(H. Zou and T. Hastie. Journal of the Royal Statistical Society, SeriesB, 67:301-3)が、変数選択のために使用された(C. De Molet al.; Journal of Complexity, 25(2):201-230, Apr. 2009)。弾性ネット法は、5回のクロスバリデーションによって選択された2つの超変数に依存する。
【0194】
弾性ネット法によって選択された変数(すなわち、miRNA及びメチル化CpG部位)が確実に決定され得ない場合、それらは、より低いランクの変数によって置き換えられている。
【0195】
第2の工程において、「症例」と「対照」との間の分類が確立された。好ましい方法は、「ランダムフォレスト」(L. Breiman, Random forests. In Machine Learning, pages 5-32, 2001)のようなツリー系の方法であった。基礎となる超変数は、5回の交差検証により選択された。
【0196】
第3の工程において、モデルが評価された。「オーバーフィッティング」を避けるために、全てのパラメータ(すなわち、感度、特異度、AUC及び精度)が、5回の交差検証により決定された。
【0197】
全ての統計解析は、「R」ソフトウェアパッケージを用いて行われた(R Core Team (2018). R: A language and environment for statisticalcomputing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. URLhttps://www.R-project.org/)。いくつかの分析には、Python 3の使用が追加で含まれた。
【0198】
実施例4:卵巣癌(OC)マーカーパネル
OCマーカーパネル(「OCキット」)は、循環miR-148b、miR-652、miR-409、miR-200c、miR-375及びmiR-320bの発現レベルに基づき、そして0.89のAUCを有する卵巣癌の検出のために使用され得る(表4:対照対症例)。
【0199】
早期卵巣癌について、CA-125(現行のゴールドスタンダード)は単独で0.916のAUCを得た。OCキットマーカーとの組み合わせにおいて、0.94のAUCに達した。OCが早期に診断される場合、生存率は有意に上昇する(表4:対照対早期)。
【0200】
結果は2つの異なるアルゴリズム(Lasso回帰及びブーストされたツリー(Lasso regression and boosted trees)(「Xgboost」))を使用したストリンジェントな機械学習方法を使用して計算され、そして定義されたコホートについてのそれらの最高成績を比較する。データは、試験セット及び訓練セットに無作為に分割され、そして信頼できる結果に到達するために10回繰り返される5分割交差手順を実行することによってさらに検証される。得られた全体のROC曲線は、全10回の交差検証のマージに対応する(図29)。この分析において、Lasso回帰はXgboostアルゴリズムを上回ったため、表4に提供される最終結果はこのアルゴリズムに基づく。さらに、該モデルにおいて使用される変数の特定の組み合わせは、最終的な出力に影響を及ぼす可能性がある。全ての統計解析は、Python(バージョン3.6.8)を用いて実施された。
【0201】
【表5】
表4:6種のマイクロRNA OCキットマーカー、CA-125と組み合わせたキットマーカー及びCA-125単独について、AUC、感度、特異度、陽性予測値及び陰性予測値が示される。AUC values were calculated based on a 90% specificity. :AUC値は、90%の特異度に基づいて算出された。
表中英語
GROUP:群
Model:モデル
Sens:感度
Spec :特異度
PPV:陽性予測値
NPV:陰性予測値
Control vs case:対称対症例
n=57 vs 100:n=57対100
Kit:キット
Control vs. early:対照対早期
n=57 vs 31:n=57対31
Control vs. late:対照対後期
n=57 vs 68:n=57対68
【0202】
実施例5: 統計的手法(lasso回帰及びXgboost)
1.データ取扱い
全ての分析は、Python、バージョン3.6.8を用いて実行された。主なパッケージは、numpy-1.17.2、pandas-0.25.1、matplotlib-3.1.2、scikit-learn-0.22、xgboost-0.90である。miRNA発現、メチル化レベル及び/又は疫学的特徴(すなわち、妊娠の数、診断時の年齢、BMIなど)のような定義された特徴は、各分析のために以前に定義されている。特徴の欠損値(NA)は、それらを完全に情報価値のないものに保つために、無作為な補完で(探索的分析の後及び予測モデリングの前に)補完された。乱数シードは、全ての結果を再現可能にするために、分析を通して一貫して使用される。
卵巣コホートについて、LASSOアルゴリズムによって必要に応じてデータが追加で標準化された(「Zスコア」)(以下のセクション3を参照されたい)。
【0203】
2.モデル選択
最高予測成績に関して2つのアルゴリズムが比較された:ラッソ回帰及びブーストされたツリー(「Xgboost」)。比較は、10回繰り返され、層別化された5分割交差検証様式(5分割の予測を一緒にマージしている)を用いて行われた。乳癌コホートについては、1つのサブグループを除いて(このサブグループの患者数が少ないため)、Xgboostは一貫してLasso回帰を上回った。したがって、乳癌コホートについては、予測成績及び特徴の重要性に関する全ての最終的な解析は、Xgboostに基づく。
一方、卵巣コホートについては、Lasso回帰が一貫してXgboostを上回るか、又は少なくともXgboostと同程度に良好であったが、予測成績の分散は通常小さかった。これは、ほとんどのコホートの記録数が少ないためであろう。したがって、卵巣コホートの予測成績及び特徴の重要性に関する全ての最終的な分析は、ペナルティチューニングパラメータの固定値を使用したLASSOに基づく。
【0204】
3.予測成績
予測性能は、実行ごとに全ての分割の予測が一緒にマージされた、10回繰り返された5分割交差検証手順によって評価される。したがって、10のAUC値が導出され、そして標準偏差(sd;図29及び図30を参照されたい)を推定するために使用される。全体のROC曲線を得るために、全10回の実行の予測もマージされる。
感度、特異度、PPV(陽性予測値)及びNPV(陰性予測値)は、カットオフ値(これを超えると患者の疾患が予測される)及び有病率に依存するため、これらのメトリック値は全て、異なるカットオフ値に対する乳癌の再スケーリングされた疾患有病率0.011(ベイズの論理を適用)に基づいて算出される。さらに、これらのメトリックは、0.9の固定された特異度に基づいて計算される。
【0205】
実施例6:乳癌(BC)マーカーパネル
乳癌の診断のために2つのマーカーパネルが試験された。「15マーカーBCキット」は、年齢、Qubitにより測定された循環miRNAの総量、miR-148b、miR-652、miR-409、miR-200c、miR-375及びmiR-320bからなる6種の循環マイクロRNAマーカーの発現レベル、並びに以下の遺伝子HYAL2、MGRN1、RPTOR、SLC22A18、FUT7、RAPSN及びS100P(すなわち、HYAL2CpG4、S100P CpG7、SLC22A18 CpG3、RPTOR CpG2、RAPSN CpG4、FUT7 CpG7、MGRN1 CpG12;図1を参照されたい)内の7つのCpGジヌクレオチドの血液中でのシトシンメチル化の組み合わせからなる。「14マーカーBCキット」は、マーカーとして年齢を除外するが、それ以外は「15マーカーBCキット」と同一である。
【0206】
健常対照242例と比較して最初に乳癌と診断された症例216例からなる乳癌コホートにおいて、15マーカーBCキットは、BC検出のためのAUCが0.8であった(表5)。
【0207】
表2に示されるように、3つの追加のサブグループが試験された(50歳未満又は50歳より上の女性としての年齢、妊娠している女性又は妊娠していない女性、及び肥満度指数(BMI)が24より上又は24未満)。1回より少ない妊娠のサブグループのみがより良好な転帰を示した。AUCは、上記の卵巣癌と同様に、試験コホート及びトレーニングコホートを使用した機械学習アルゴリズム並びに10回繰り返された5分割交差手順で算出された。XGboostアルゴリズムは、この分析においてLassoモデルを上回ったため、全ての結果はこのアルゴリズムに基づく。
【0208】
【表6】
表5:6種のマイクロRNAマーカーの組み合わせ、Qubitにより測定された循環miRNAの量、及び変数として年齢を含む(15マーカーBCキット)若しくは年齢を除外した(14マーカーBCキット)7つのメチル化部位について、AUC、感度、特異度、陽性予測値及び陰性予測値が提示され、90%の特異度に基づいてAUC値が算出された。
表中英語
Model:モデル
Subgroup:サブグループ
Sens:感度
Spec :特異度
PPV:陽性予測値
NPV:陰性予測値
15 marker BC kit:15マーカーBCキット
all:全て
Age <50:50歳未満の年齢
Age >50:50歳より上の年齢
Pregnancies <1:1回未満の妊娠
Pregnancies >1:1回より多い妊娠
BMI_<24:24 未満のBMI
BMI_>24:24より多いBMI
14 marker BC kit:14マーカーBCキット
15 marker BC kit(Lasso logistic regression):15 マーカーBC キット(Lasso ロジスティック回帰)
【0209】
コアマーカーパネルを同定するために、マーカーの異なるパネルの成績が、AUC、感度及び特異度に関して15マーカーパネルと比較された(表6を参照されたい)。Xgboostモデルは、前述のように、この目的に最も適する分析の方法として使用された。
【0210】
【表7-1】
【表7-2】
表6:異なるマーカーセットの性能の比較
表中英語
Marker set:マーカーセット
Sens:感度
Spec:特異度
PPV:陽性予測値
NPV:陰性予測値
15 marker BC kit:15マーカーBCキット
Age:年齢
【0211】
最良のAUCが15マーカーパネルで得られたが、miR-200c、miR-375及びmiR-320bからなるコアマーカーパネルが同定された。このパネルは、完全な15マーカーパネルと比較して、ごくわずかに低いAUCを有した。したがって、上記の3種のmiRNAを有するコアマーカーパネルは、他のマーカーの添加によってさらに改善され得る良好な予測品質を有するコアパネルを提供するようである。
【0212】

1.被験体における癌を診断又は予後診断する方法であって、前記被験体から得られた試料において
a)miR-148b、miR-409、miR-652、miR-200c、miR-375及びmiR-320b及びmiR-141からなる群から選択される少なくとも3種のmiRNAの発現レベル(但し、該少なくとも3種のmiRNAは、少なくともmiRNA miR-200c、miR-375及びmiR-320bを含む)をインビトロで決定する工程、
b)任意選択で、HYAL2、MGRN1、RPTOR、SLC22A18、FUT7、RAPSN及びS100Pからなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子の各々のうちの少なくとも1つのCpGジヌクレオチドのシトシンメチル化をインビトロで決定する工程、を含み、及び/又は、
ここで該方法は、任意選択でmiR-451aの発現レベルを決定することをさらに含み、
ここで該方法は、任意選択で好ましくは患者の年齢、CA125、cT、cN、cM、pT(手術)、pN(手術)、pM及びQubitから選択される少なくとも1つの臨床マーカーを決定することをさらに含み、
ここで少なくとも3種のmiRNAの発現レベルの変化、及び決定された場合、少なくとも1つの遺伝子内の少なくとも1つのCpGジヌクレオチドのシトシンメチル化のレベルの低下が、前記被験体における現在及び/又は将来の癌疾患状態の指標である、方法。
2.以下が、癌の存在及び/又は癌を発症する可能性の増加の指標である、前項1に記載の方法:
HYAL2、MGRN1、RPTOR、SLC22A18、FUT7、RAPSN及びS100Pからなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子内で少なくとも1つのCpGジヌクレオチドのシトシンメチル化のレベルの低下、及び/又は
miR-148b、miR-409-3p、miR-652-3p、miR-200c-3p、miR-320b及びmiR-141から選択されるmiRNAの発現レベルの増加、及び/又は
miR-375の発現レベルの低下。
3.前記癌が乳癌及び/又は卵巣癌、好ましくは早期卵巣癌である、前項1又は2に記載の方法。
4.前項1~3のいずれか1項に記載の方法であって、ここで
i)少なくとも2個、3個、4個、5個、6個、又は7個の異なるCpGジヌクレオチドのメチル化状態が決定され、及び/又は
ii)少なくとも3種、4種、5種、6種、又は7種の異なるmiRNAの発現レベルが決定される、方法。
5.HYAL2及びS100P内の少なくとも1つのCpGジヌクレオチドのメチル化状態が決定される、前項(正:items)1~4のいずれか1項に記載の方法。
6.前記被験体が、癌を有するリスクが増加しているか、又は癌を発症するリスクが増加している、前項1~5のいずれか一項に記載の方法。
7.前記試料が、体液試料又は組織試料であり、ここで該体液試料が、好ましくは血液、血清、血漿、滑液、尿、唾液、リンパ液、涙液及び腺から得ることができる体液からなる群から選択され、より好ましくは末梢血である、前項1~6のいずれか一項に記載の方法。
8.(c)1つ以上の参照試料における前記少なくとも1つの遺伝子内の少なくとも1つのCpGジヌクレオチドのシトシンメチル化のレベル及び/又は前記少なくとも1つの遺伝子の発現レベル、及び前記少なくとも3種のmiRNAの発現レベル、をインビトロで決定する工程をさらに含む、前項1~7のいずれか一項に記載の方法。
9.前項1~8のいずれか1項に記載の癌を予測又は検出することを含む、癌を診断する方法、又は癌をスクリーニングする方法。
10.前項1~8のいずれか1項に記載の癌を繰り返し予測又は検出することを含む、癌を発症するリスクが増加した被験体を監視する方法。
11.前項1~8のいずれか1項に記載の癌を治療期間にわたって繰り返し予測又は検出することを含む、被験体の癌治療を監視する方法。
12.治療中及び/又は治療後に前項1~8のいずれか1項に記載の癌を予測又は検出することを含む、癌治療に対する被験体の応答を評価する方法。
13.前項1~8のいずれか一項に記載の方法により検出された癌を有する被験体を治療する方法であって、該被験体に癌療法を実施することをさらに含む、方法。
14.以下を特異的に検出するためのオリゴヌクレオチドを含むキット:
HYAL2、MGRN1、RPTOR、SLC22A18、FUT7、RAPSN及びS100Pからなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子内の少なくとも1つのCpGジヌクレオチドのシトシンメチル化のレベル、及び/又は
miR-148b、miR-409-3p、miR-652-3p、miR-200c-3p、miR-375、miR-320b、miR-451a及びmiR-141からなる群から選択される少なくとも3種のmiRNAの発現レベル(但し、該少なくとも3種のmiRNAは、miRNA miR-200c-3p、miR-375、miR-320bを含む)。
15.癌、好ましくは乳癌及び卵巣癌を予測、予後診断及び/又は診断するための前項15に記載のキットの使用。
【符号の説明】
【0213】
図1
Clinical:臨床
Age:年齢
alternative:代替
hemolysis control:溶血対照
Total quantity ofcirculating miRNAs:循環miRNAの総量
Measured by Qubit:Qubitにより測定された

図2
The dataset consistsof n = 189 subjects, separated in 91 cases, 59 controls and 39 benigns.:データセットは、n=189人の被験体からなり、症例91人、対照59人、及び良性39人に分けられた。
6 models were tested:6つのモデルが試験された
1. All markers (p =49):1.全てのマーカー(p=49)
2. All markersexcept CA124 (p = 48):2. CA124以外の全てのマーカー(p=48)
3. All methylationsites and age (p = 41):3. 全てのメチル化部位及び年齢 (p=41)
4. Only HYAL2 andSLC22A18 (p = 9):4. HYAL2及びSLC22A18のみ(p=9)
5. All miRNAs andage (p = 7):5. 全てのmiRNA及び年齢(p=7)
6. Only miR-200cand miR-375 (p =2):6. miR-200c 及びmiR-375 のみ(p=2)
Results Case vs.Control:結果 症例対対照
Model:モデル
Accuracy:精度
Sensitivity:感度
Specificity:特異度

図3
Ct value:Ct値
Control:対照
Case:症例
2 models weretested:2つのモデルが試験された
1. All miRNAs (p =6):1. 全てのmiRNA(p=6)
2. Only miR-200c andmiR-375 (p = 2):2. miR-200c 及びmiR-375 のみ(p=2)
Results:結果
Model:モデル
Accuracy:精度
Sensitivity:感度
Specificity:特異度

図4
2 models weretested:2つのモデルが試験された
1. All miRNAs (p =6):1. 全てのmiRNA(p=6)
2. Only miR-200cand miR-375 (p = 2):2. miR-200c 及びmiR-375 のみ(p=2)
Results:結果
Model:モデル
Accuracy:精度
Sensitivity:感度
Specificity:特異度

図5
Ct value:Ct値
Control:対照
BC Case:BC症例

図6
Diagnosis:診断
Responder:応答者
Non responder :非応答者

図7
HYAL2 methylationby Subtypes:サブタイプによるHYAL2メチル化
Not subgrouped byresponse:応答によりサブグループ化されていない
Fraction PreOP:術前画分
Fraction PostOP:術後画分
S100P methylationby Subtypes:サブタイプによるS100Pメチル化

図8
HYAL2 HER2+Responders :HYAL2 HER2+応答者
Baseline:ベースライン
PostOP:術後
HYAL2 HER2+Non Responders:HYAL2 HER2+非応答者
S100P HER2+Responders:S100P HER2+応答者
S100P HER2+Non Responders:S100P HER2+非応答者

図9
BC Type:BC型
mean age:平均年齢
metastasis:転移
relapse:再発

図10
Overall Survival:全生存率
Percent survival:生存率
Time:時間
Survival of Qubit:Qubitの生存率
Low:低
High:高
Disease Free Survival:無病生存率
Progression Free Survival:無増悪生存率

図11
Percent survival:生存率
Years fromdiagnosis:診断からの年数
Low Meth:低メチル化
High Meth:高メチル化

図12
Percent survival:生存率
Years:年
Low Meth:低メチル化
High Meth:高メチル化

図13
Percent survival:生存率
Years:年
Low Meth:低メチル化
High Meth:高メチル化

図14
New calculationsfor all measurements so far (n =550):ここまでの全ての測定値に対する新しい計算(n=550)
312 x controls: Avage 45,7:対照312人:平均年齢 45.7歳
238x BC cases: Avage 55,3:BC症例238人:平均年齢55.3歳
Control:対照
BC Case:BC症例
Selected markersout markers of March and epidemiological features:Marchのマーカーと疫学的特徴から選択されたマーカー
Markers:マーカー
Age:年齢
Age. at. first.pregnancy:最初の妊娠の年齢
Myom:筋腫
Diabetes:糖尿病
Results:結果
Accuracy:精度
Sensitivity:感度
Specificity:特異度
Positive PredictiveValue:陽性予測値
Negative PredictiveValue:陰性予測値

図15
Selected markersout of March and the epidemiological features:March及び疫学的特徴から選択されたマーカー
Markers:マーカー
Age:年齢
Smoker:喫煙者
Diabetes:糖尿病
Results:結果
Accuracy:精度
Sensitivity:感度
Specificity :特異度
Positive PredictiveValue:陽性予測値
Negative PredictiveValue:陰性予測値
Pregnancies:妊娠

図16
Strata:階層
group:群
Survivalprobability:生存確率
Time [years]:時間[年]

図17
Strata:階層
group:群
Survivalprobability:生存確率
Time [years]:時間[年]

図18
Strata:階層
group:群
Survivalprobability:生存確率
Time [years]:時間[年]

図19
Strata:階層
group:群
Survivalprobability:生存確率
Time [years]:時間[年]

図20
Strata:階層
group:群
Survivalprobability:生存確率
Time [years]:時間[年]

図21
Strata:階層
group:群
Survivalprobability:生存確率
Time [years]:時間[年]

図22
Strata:階層
group:群
Survivalprobability:生存確率
Time [years]:時間[年]

図23
Strata:階層
group:群
Survivalprobability:生存確率
Time [years]:時間[年]

図24
Strata:階層
group:群
Survivalprobability:生存確率
Time [years]:時間[年]

図25
Strata:階層
group:群
Survivalprobability:生存確率
Time[years]:時間[年]

図26
Strata:階層
group:群
Survivalprobability:生存確率
Time[years]:時間[年]

図27
Strata:階層
group:群
Survivalprobability:生存確率
Time[years]:時間[年]

図28
accuracy:精度
sensitivity:感度
specificity:特異度
age:年齢
highrisk:高リスク

図29
Kit:キット
sensitivity:感度
mean:平均
repetitionsmerged:マージされた繰り返し
1-specificity:1-特異度

図30
15MarkerBCKit:15マーカーBCキット
sensitivity:感度
mean:平均
repetitionsmerged:マージされた繰り返し
1-specificity:1-特異度
14 Marker BC Kit:14マーカーBCキット
図1
図2
図3
図4
図5
図6
図7
図8
図9
図10
図11
図12
図13
図14
図15
図16
図17
図18
図19
図20
図21
図22
図23
図24
図25
図26
図27
図28
図29
図30
【配列表】
2022523366000001.app
【国際調査報告】