特表 2022-523464 脂肪性肝疾患を処置するためのモノアセチルジアシルグリセロール化合物を含む組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-04-25

(54)【発明の名称】脂肪性肝疾患を処置するためのモノアセチルジアシルグリセロール化合物を含む組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/231 20060101AFI20220418BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20220418BHJP

   A61P 3/06 20060101ALI20220418BHJP

   A23L 33/12 20160101ALI20220418BHJP

【ＦＩ】

A61K31/231 ZNA

A61P1/16

A61P3/06

A23L33/12

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021541223

(86)(22)【出願日】2020-03-06

(85)【翻訳文提出日】2021-09-10

(86)【国際出願番号】 IB2020051990

(87)【国際公開番号】W WO2020178803

(87)【国際公開日】2020-09-10

(31)【優先権主張番号】10-2019-0026326

(32)【優先日】2019-03-07

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(31)【優先権主張番号】10-2019-0086967

(32)【優先日】2019-07-18

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(31)【優先権主張番号】62/908,392

(32)【優先日】2019-09-30

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】516343099

【氏名又は名称】エンジーケム ライフサイエンシーズ コーポレーション

【氏名又は名称原語表記】ＥＮＺＹＣＨＥＭ ＬＩＦＥＳＣＩＥＮＣＥＳ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ

(74)【代理人】

【識別番号】100189131

【弁理士】

【氏名又は名称】佐伯 拓郎

(74)【代理人】

【識別番号】100182486

【弁理士】

【氏名又は名称】中村 正展

(74)【代理人】

【識別番号】100147289

【弁理士】

【氏名又は名称】佐伯 裕子

(72)【発明者】

【氏名】ソン，キ ヨン

(72)【発明者】

【氏名】キム，ジェ ファ

(72)【発明者】

【氏名】ユン，ソン ヨン

【テーマコード（参考）】

4B018

4C206

【Ｆターム（参考）】

4B018MD14

4B018ME07

4B018ME14

4C206AA01

4C206AA02

4C206DB07

4C206DB48

4C206MA01

4C206MA04

4C206MA72

4C206NA14

4C206ZA75

4C206ZC33

(57)【要約】

脂肪性肝疾患を処置するための組成物が開示される。該組成物は、脂肪性肝疾患を処置するための有効成分として式１のモノアセチルジアシルグリセロール化合物を含む。
【化１】

［式中、Ｒ１およびＲ２は、独立して、１４～２２個の炭素分子の脂肪酸残基である。］
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

脂肪性肝疾患を処置するための式１の化合物を含む組成物：

【化1】

［式中、Ｒ１およびＲ２は、独立して、１４～２２個の炭素原子の脂肪酸残基である］。

【請求項2】

Ｒ１およびＲ２が、パルミトイル、オレオイル、リノレオイル、リノレノイル、ステアロイル、ミリストイル、およびアラキドノイルからなる群から独立して選択される、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

式１の化合物が式２の化合物：

【化2】

である、請求項１に記載の組成物。

【請求項4】

脂肪性肝疾患が非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）である、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項5】

非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）が非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）である、請求項４に記載の組成物。

【請求項6】

非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）が肝線維症である、請求項４に記載の組成物。

【請求項7】

脂肪性肝疾患が１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）によって誘発される、請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項8】

式１の化合物が、肝細胞および血漿中のトリグリセリド（ＴＧ）の濃度を低減させる、請求項１～７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項9】

式１の化合物がリポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）の発現を改善する、請求項１～８のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項10】

式１の化合物が、門脈におけるＡｐｏＢ４８を含むアポリポタンパク質の発現を低減させる、請求項１～９のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項11】

前記組成物が、前記組成物の０．００１～１００重量％の量で式１の１つまたは複数の化合物を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項12】

対象に、請求項１～１１のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、脂肪性肝疾患を処置するための方法。

【請求項13】

脂肪性肝疾患を軽減または予防するための式１のモノアセチルジアシルグリセロール化合物を含む健康機能性食品組成物：

【化3】

［式中、Ｒ１およびＲ２は、独立して、１４～２２個の炭素原子の脂肪酸残基である］。

【請求項14】

Ｒ１およびＲ２が、パルミトイル、オレオイル、リノレオイル、リノレノイル、ステアロイル、ミリストイル、およびアラキドノイルからなる群から独立して選択される、請求項１３に記載の健康機能性食品組成物。

【請求項15】

対象に、有効量の式１の化合物：

【化4】

［式中、Ｒ１およびＲ２が、独立して、１４～２２個の炭素原子の脂肪酸残基である］を投与することを含む、脂肪性肝疾患に罹患しているかまたは易罹患性の対象を処置するための方法。

【請求項16】

Ｒ１およびＲ２が、パルミトイル、オレオイル、リノレオイル、リノレノイル、ステアロイル、ミリストイル、およびアラキドノイルからなる群から独立して選択される、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

式１の化合物が以下の式２の化合物：

【化5】

である、請求項１５に記載の方法。

【請求項18】

対象が非アルコール性脂肪酸肝疾患（ＮＡＦＬＤ）に罹患しているかまたは易罹患性である、請求項１５～１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

対象が非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）に罹患しているかまたは易罹患性である、請求項１５～１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

対象が肝線維症に罹患しているかまたは易罹患性である、請求項１５～１９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項21】

対象に、有効量の式１の化合物：

【化6】

［式中、Ｒ１およびＲ２が、独立して、１４～２２個の炭素原子の脂肪酸残基である］を投与することを含む、非アルコール性脂肪酸肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝線維症、肝炎に起因する脂肪性肝疾患、肥満に起因する脂肪性肝疾患、糖尿病に起因する脂肪性肝疾患、インスリン抵抗性に起因する脂肪性肝疾患、高トリグリセリド血症に起因する脂肪性肝疾患、無ベータリポタンパク血症、糖原病、ウェーバー・クリスチャン病、ウォルマンズ病、妊娠時急性脂肪肝、および／またはリポジストロフィーに罹患しているかまたは易罹患性である対象を処置する方法。

【請求項22】

Ｒ１およびＲ２が、パルミトイル、オレオイル、リノレオイル、リノレノイル、ステアロイル、ミリストイル、およびアラキドノイルからなる群から独立して選択される、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

式１の化合物が以下の式２の化合物：

【化7】

である、請求項２１に記載の方法。

【請求項24】

対象が、非アルコール性脂肪酸肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝線維症、肝炎に起因する脂肪性肝疾患、肥満に起因する脂肪性肝疾患、糖尿病に起因する脂肪性肝疾患、インスリン抵抗性に起因する脂肪性肝疾患、高トリグリセリド血症に起因する脂肪性肝疾患、無ベータリポタンパク血症、糖原病、ウェーバー・クリスチャン病、ウォルマンズ病、妊娠時急性脂肪肝、および／またはリポジストロフィーに罹患していることが特定され；および
式１の化合物が、前記特定された対象に投与される、請求項１７～２３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項25】

対象が非アルコール性脂肪酸肝疾患（ＮＡＦＬＤ）に罹患していることが特定され、式Ｉの化合物が前記特定された対象に投与される、請求項２４に記載の方法。

【請求項26】

対象が非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）に罹患していることが特定され、式Ｉの化合物が前記特定された対象に投与される、請求項２４に記載の方法。

【請求項27】

対象が肝線維症に罹患していることが特定され、式Ｉの化合物が前記特定された対象に投与される、請求項２４に記載の方法。

【請求項28】

対象がヒトである、請求項１２または１５～２７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項29】

（ａ）請求項１～１１のいずれか一項に記載の化合物または組成物；
（ｂ）対象における脂肪性肝疾患を処置または予防するために前記化合物を使用するための説明書、を含む、キット。

【請求項30】

（ａ）ｌ－パルミトイル－２－リノレオイル－３－アセチルグリセロール（ＰＬＡＧ）；
（ｂ）脂肪性肝疾患を処置または予防するために前記ＰＬＡＧを使用するための説明書、を含む、キット。

【請求項31】

治療有効量のＰＬＡＧを含む、請求項３１に記載のキット。

【請求項32】

前記化合物またはＰＬＡＧの使用のための書面による説明書を含む、請求項２９～３１のいずれか一項に記載のキット。

【請求項33】

非アルコール性脂肪酸肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝線維症、肝炎に起因する脂肪性肝疾患、肥満に起因する脂肪性肝疾患、糖尿病に起因する脂肪性肝疾患、インスリン抵抗性に起因する脂肪性肝疾患、高トリグリセリド血症に起因する脂肪性肝疾患、無ベータリポタンパク血症、糖原病、ウェーバー・クリスチャン病、ウォルマンズ病、妊娠時急性脂肪肝、および／またはリポジストロフィーを処置するための前記化合物または前記ＰＬＡＧの使用のための書面による説明書を含む、請求項２９～３２のいずれか一項に記載のキット。

【請求項29】

説明書が製品ラベルである、請求項２９～３３のいずれか一項に記載のキット。

【請求項34】

対象に、ｉ）有効量の式１の化合物およびｉｉ）式１の化合物とは異なる１つまたは複数の追加の肝線維症処置薬：

【化8】

［式中、Ｒ１およびＲ２が、独立して、１４～２２個の炭素原子の脂肪酸残基である］を投与することを含む、脂肪性肝疾患に罹患しているかまたは易罹患性の対象を処置する方法。

【請求項35】

Ｒ１およびＲ２が、パルミトイル、オレオイル、リノレオイル、リノレノイル、ステアロイル、ミリストイル、およびアラキドノイルからなる群から独立して選択される、請求項３４に記載の方法。

【請求項36】

式１の化合物が以下の式２の化合物：

【化9】

である、請求項３４に記載の方法。

【請求項37】

対象が非アルコール性脂肪酸肝疾患（ＮＡＦＬＤ）に罹患しているかまたは易罹患性である、請求項３４～３６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項38】

対象が非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）に罹患しているかまたは易罹患性である、請求項３４～３７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項39】

対象が肝線維症に罹患しているかまたは易罹患性である、請求項３４～３８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項40】

１つまたは複数の異なる肝線維症処置薬が、オベチコール酸（ＯＣＡ）、エラフィブラノル（ＧＦＴ５０５）、セロンセルチブ（ＧＳ－４９９７）、セニクリビロック（ＣＶＣ）、リラグルチド、メタドキシン、ヒドロキシチロソールおよびビタミンＥ、ＮＧＭ２８２（Ｍ７０）、ＢＭＳ－９８６０３６、エムリカサン（ＩＤＮ－６５５６）、アラムコール、アトルバスタチンおよび／またはＬカルニチン、ＭＧＬ－３１９６、ボリキシバット（ＳＨＰ６２６）、ＧＳ－９６７４、セマグルチド、サログリタザル、ＮＣＴ０２６０５６１６（Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃ，米国ミネソタ州ロチェスター市）の薬剤、ＬＭＢ７６３、ＩＶＡ３３７、ＬＪＮ４５２、ＣＦ１０２、ＭＴ－３９９５、ピオグリタゾン、ＭＮ－００１（チペルカスト）、ＭＳＤＣ－０６０２Ｋ、ＪＫＢ－１２１、ＩＭＭ－１２４Ｅおよび／またはＡＲＩ－３０３７ＭＯ、ならびにその医薬上許容される塩または酸からなる群から選択される１つまたは複数を含む、請求項３４～３９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項41】

対象に、ｉ）有効量の式１の化合物およびｉｉ）式１の１つまたは複数の前記化合物の化合物とは異なる有効量の１つまたは複数の肝線維症処置薬：

【化10】

［式中、Ｒ１およびＲ２が、独立して、１４～２２個の炭素原子の脂肪酸残基である］を投与することを含む、非アルコール性脂肪酸肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝線維症、肝炎に起因する脂肪性肝疾患、肥満に起因する脂肪性肝疾患、糖尿病に起因する脂肪性肝疾患、インスリン抵抗性に起因する脂肪性肝疾患、高トリグリセリド血症に起因する脂肪性肝疾患、無ベータリポタンパク血症、糖原病、ウェーバー・クリスチャン病、ウォルマンズ病、妊娠時急性脂肪肝、および／またはリポジストロフィーに罹患しているかまたは易罹患性である対象を処置するための方法。

【請求項42】

Ｒ１およびＲ２が、パルミトイル、オレオイル、リノレオイル、リノレノイル、ステアロイル、ミリストイル、およびアラキドノイルからなる群から独立して選択される、請求項４１に記載の方法。

【請求項43】

式１の化合物が以下の式２の化合物：

【化11】

である、請求項４１に記載の方法。

【請求項44】

対象が非アルコール性脂肪酸肝疾患（ＮＡＦＬＤ）に罹患しているかまたは易罹患性である、請求項４１～４３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項45】

対象が非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）に罹患しているかまたは易罹患性である、請求項４１～４４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項46】

対象が肝線維症に罹患しているかまたは易罹患性である、請求項４１～４５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項47】

１つまたは複数の異なる肝線維症処置薬が、オベチコール酸（ＯＣＡ）、エラフィブラノル（ＧＦＴ５０５）、セロンセルチブ（ＧＳ－４９９７）、セニクリビロック（ＣＶＣ）、リラグルチド、メタドキシン、ヒドロキシチロソールおよびビタミンＥ、ＮＧＭ２８２（Ｍ７０）、ＢＭＳ－９８６０３６、エムリカサン（ＩＤＮ－６５５６）、アラムコール、アトルバスタチンおよび／またはＬカルニチン、ＭＧＬ－３１９６、ボリキシバット（ＳＨＰ６２６）、ＧＳ－９６７４、セマグルチド、サログリタザル、ＮＣＴ０２６０５６１６（Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃ，米国ミネソタ州ロチェスター市）の薬剤、ＬＭＢ７６３、ＩＶＡ３３７、ＬＪＮ４５２、ＣＦ１０２、ＭＴ－３９９５、ピオグリタゾン、ＭＮ－００１（チペルカスト）、ＭＳＤＣ－０６０２Ｋ、ＪＫＢ－１２１、ＩＭＭ－１２４Ｅおよび／またはＡＲＩ－３０３７ＭＯ、ならびにその医薬上許容される塩または酸からなる群から選択される１つまたは複数を含む、請求項４１～４６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項48】

（ａ）請求項１～１１のいずれか一項に記載の化合物または組成物；
（ｂ）請求項１～１１のいずれか一項に記載の化合物または組成物とは異なる１つまたは複数の肝線維症処置薬；および
（ｃ）対象における脂肪性肝疾患を処置または予防するために前記化合物および前記１つまたは複数の異なる肝線維症処置薬を使用するための説明書、
を含む、キット。

【請求項49】

（ａ）ｌ－パルミトイル－２－リノレオイル－３－アセチルグリセロール（ＰＬＡＧ）；
（ｂ）異なる形態のＰＬＡＧである１つまたは複数の肝線維症処置薬；および
（ｂ）脂肪性肝疾患を処置または予防するための前記ＰＬＡＧおよび前記１つまたは複数の異なる肝線維症処置薬のための説明書、
を含む、キット。

【請求項50】

治療有効量のＰＬＡＧを含む、請求項４９に記載のキット。

【請求項51】

前記化合物またはＰＬＡＧおよび前記１つまたは複数の異なる肝線維症処置薬を使用するための書面による説明書を含む、請求項４８～５０のいずれか一項に記載のキット。

【請求項52】

ｉ）前記化合物または前記ＰＬＡＧおよびｉｉ）前記１つまたは複数の追加の肝線維症処置薬を使用するための書面による説明書を含む、非アルコール性脂肪酸肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝線維症、肝炎に起因する脂肪性肝疾患、肥満に起因する脂肪性肝疾患、糖尿病に起因する脂肪性肝疾患、インスリン抵抗性に起因する脂肪性肝疾患、高トリグリセリド血症に起因する脂肪性肝疾患、無ベータリポタンパク血症、糖原病、ウェーバー・クリスチャン病、ウォルマンズ病、妊娠時急性脂肪肝、および／またはリポジストロフィーを処置するための、請求項４８～５１のいずれか一項に記載のキット。

【請求項53】

説明書が製品ラベルである、請求項４８～５２のいずれか一項に記載のキット。

【請求項54】

前記１つまたは複数の異なる肝線維症処置薬が、オベチコール酸（ＯＣＡ）、エラフィブラノル（ＧＦＴ５０５）、セロンセルチブ（ＧＳ－４９９７）、セニクリビロック（ＣＶＣ）、リラグルチド、メタドキシン、ヒドロキシチロソールおよびビタミンＥ、ＮＧＭ２８２（Ｍ７０）、ＢＭＳ－９８６０３６、エムリカサン（ＩＤＮ－６５５６）、アラムコール、アトルバスタチンおよび／またはＬカルニチン、ＭＧＬ－３１９６（レスメチロム）、ボリキシバット（ＳＨＰ６２６）、ＧＳ－９６７４、セマグルチド、サログリタザル、ＮＣＴ０２６０５６１６（Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃ，米国ミネソタ州ロチェスター市）の薬剤、ＬＭＢ７６３、ＩＶＡ３３７、ＬＪＮ４５２、ＣＦ１０２、ＭＴ－３９９５、ピオグリタゾン、ＭＮ－００１（チペルカスト）、ＭＳＤＣ－０６０２Ｋ、ＪＫＢ－１２１、ＩＭＭ－１２４Ｅおよび／またはＡＲＩ－３０３７ＭＯ、ならびにその医薬上許容される塩または酸からなる群から選択される１つまたは複数を含む、請求項４８～５３のいずれか一項に記載のキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年９月３０日出願の米国仮特許出願公開第６２／９０８，３９２号明細書、２０１９年３月７日出願の韓国特許出願第１０－２０１９－００２６３２６号公報、２０１９年７月１８日出願の韓国特許出願第１０－２０１９－００８６９６７号公報の利益を主張しており、これらの内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

本発明は、脂肪性肝疾患を処置するための有効成分としてモノアセチルジアシルグリセロール化合物を含む組成物、より詳細には、脂肪性肝疾患の症状を予防するおよび／または軽減する経口投与用のモノアセチルジアシルグリセロール化合物を含む組成物に関する。

【背景技術】

【0003】

肝臓は、身体の器官の中で最も重要な代謝器官のうちの１つであり、胆汁分泌、栄養素貯蔵、解毒などの重要な機能を担っている。肝臓が異常な状態である場合、グルコース代謝、脂質代謝、タンパク質および窒素代謝、アミノ酸代謝、タンパク質代謝および肝脳疾患、ビタミン代謝、吸収不良などの代謝障害が起こることがある。加えて、肝疾患は、感染症、脂肪肝、肝硬変などによって悪化することがある。現在までに公知の肝疾患は、薬物に起因する急性肝炎、アルコール性脂肪肝、肥満、糖尿病、高脂血症に起因する非アルコール性脂肪肝、ウイルス感染に起因する急性肝炎、慢性肝炎、肝硬変などと関係している。

【0004】

なかでも、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）は、アルコールの有無にかかわらず、肥満、糖尿病、および高脂血症を随伴する最も一般的な慢性肝疾患であり、肝臓内での過剰な脂質（主にトリグリセリド）の蓄積を特徴とする。一般に、ＮＡＦＬＤでは、総肝重量の５重量％超が脂質である。ＮＡＦＬＤは、脂肪性肝炎、線維化、肝硬変、さらには肝細胞癌にまで発展する可能性がある。

【0005】

ＮＡＦＬＤについては数多くの研究があるが、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）との関係については比較的知られていない。最近の報告では、Ｔ１Ｄが、慢性糖尿病合併症についての独立した危険因子であるＮＡＦＬＤを引き起こし得ることが指摘されている。

【0006】

１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）とは、患者自身の免疫系がベータ細胞を攻撃し破壊する自己免疫疾患である。１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）における脂肪肝の病理発生はまだ明らかではない。しかしながら、ＲｅｇｎｅｌｌｌおよびＬｅｍｍａｒｋは、主に血流およびリンパ球の活性化を経て脂質を輸送するよう機能するリポタンパク質の異常、ならびに／またはグルコース代謝および脂質合成をそれぞれ調節する転写因子である炭水化物応答要素結合タンパク質（ＣｈＲＥＢＰ）およびステロール調節要素結合タンパク質１ｃ（ＳＲＥＢＰ－１Ｃ）の活性化によって引き起こされる可能性があることを示唆した（非特許文献１）。

【0007】

非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）は、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の１つである。ＮＡＳＨの根本原因はわかっていない。しかしながら、ＮＡＳＨに罹患している患者を解析すると、ＮＡＳＨは、肥満、２型糖尿病、脂質異常症、またはメタボリックシンドローム（腹囲９０ｃｍ超、トリグリセリド１５０ｍｇ／ｄＬ以上、ＨＤＬ４０ｍｇ／ｄＬ以下、空腹時血糖１００ｍｇ／ｄＬ以上、収縮期血圧１３０ｍｍＨｇ以上）と関係している。それゆえ、これらは、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）を引き起こすための因子とみなされており、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）患者の増加の主要因と認識されている。

【0008】

また、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）は、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）に罹患していない対照群と比較して、２型糖尿病を発症するリスクを２～４倍上昇させることも公知である。言い換えれば、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）は、インスリン抵抗性と密接に関連している。

【0009】

リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）は、膵臓、肝臓、および内皮のリパーゼとして作用し、主に骨格筋、心臓および脂肪組織に分布する。リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）は、ＡｐｏＥ（ＡＰＯタンパク質）に結合してトリグリセリドを筋肉および脂肪組織に分配するカイロミクロン（ＣＭ）を含み、トリグリセリド（トリグリセリド、ＴＧ）を加水分解する超低密度リポタンパク質である。これらは、トリグリセリド（ＴＧ）を加水分解し、エネルギー源または貯蔵源のために筋肉および脂肪組織などの末梢組織からトリグリセリド（ＴＧ）を除去するのに重要な役割を担っている。それゆえ、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）が低減（喪失）すると、トリグリセリド（ＴＧ）が過剰に循環し、高トリグリセリド血症の原因となる。

【0010】

ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）は、細胞の迅速かつ不可逆的な壊死を誘導する選択的な膵β細胞毒素であり、糖尿病を誘発するために使用されることがよくある。ＳＴＺはまた、脂肪肝をモデル化するのに適した候補でもある。ＳＴＺ誘発性糖尿病は、高血糖症、脂質異常症、体重減少および脂肪肝を特徴とする。

【0011】

したがって、脂肪性肝疾患のための新たな療法を有することが望ましいであろう。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0012】

【非特許文献1】Ｓ．Ｅ．Ｒｅｇｎｅｌｌ，Ａ．Ｌｅｒｎｍａｒｋ，Ｈｅｐａｔｉｃ ｓｔｅａｔｏｓｉｓ ｉｎ ｔｙｐｅ １ ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｒｅｖ Ｄｉａｂｅｔ Ｓｔｕｄ ８（２０１１）４５４－４６７

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0013】

一態様では、モノアセチルジアシルグリセロール化合物を含む脂肪性肝疾患を処置するための組成物および方法が提供される。好ましい方法および組成物では、肝細胞および血漿中のトリグリセリド（ＴＧ）レベルを低減させることができ、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）の発現を改善することができる。

【0014】

別の態様では、非毒性でありかつその症状を含めて脂肪性肝疾患を軽減するモノアセチルジアシルグリセロール化合物を有効成分として含む、脂肪性肝疾患を処置するための組成物および方法が提供される。

【0015】

より詳細には、脂肪性肝疾患を処置するための式１のモノアセチルジアシルグリセロール化合物を含む組成物および方法が提供される。

【0016】

【化1】

【0017】

式中、Ｒ_１およびＲ_２は独立して、１４～２２個の炭素原子からなる脂肪酸残基、好ましくは１５～２０個の炭素原子からなる脂肪酸残基である。

【0018】

一実施形態では、モノアセチルジアシルグリセロールは、以下の式２の化合物である。

【0019】

【化2】

【0020】

式２の化合物は、１－パルミトイル－２－リノレオイル－３－アセチル－ｒａｃ－グリセロールであり、式１のＲ_１およびＲ_２がそれぞれパルミトイルおよびリノレオイルである式１の化合物に相当する。式２の化合物は、本開示では「ＰＬＡＧ」または「ＥＣ－１８」と称されることがある。

【0021】

考察したように、式１および式２の化合物は、非アルコール性脂肪酸肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝炎に起因する脂肪性肝疾患、肥満に起因する脂肪性肝疾患、糖尿病に起因する脂肪性肝疾患、インスリン抵抗性に起因する脂肪性肝疾患、高トリグリセリド血症に起因する脂肪性肝疾患、無ベータリポタンパク血症、糖原病、ウェーバー・クリスチャン病、ウォルマンズ病、妊娠時急性脂肪肝、および／またはリポジストロフィーをはじめとする脂肪性肝疾患に罹患しているかまたは易罹患性である対象を処置するために使用されてもよい。

【0022】

詳細な態様では、式１および２の化合物は、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）に罹患しているかまたは易罹患性である対象を処置するために使用される。

【0023】

さらなる詳細な態様では、式１および２の化合物は、非アルコール性脂肪酸肝疾患（ＮＡＦＬＤ）に罹患しているかまたは易罹患性である対象を処置するために使用される。

【0024】

詳細な態様では、本明細書に開示される疾患または障害の処置のために対象が特定および選定され、次いで、式１または２の化合物が該特定および選定された対象に投与される。

【0025】

例えば、患者を非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）に罹患していると特定および選定することができ、該非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）に罹患していると特定された患者に式１または２の化合物を投与して、それにより非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）を軽減または処置することができる。患者を非アルコール性脂肪酸肝疾患（ＮＡＦＬＤ）に罹患していると特定および選定することができ、該非アルコール性脂肪酸肝疾患（ＮＡＦＬＤ）に罹患していると同定された患者に式１または２の化合物を投与して、それにより非アルコール性脂肪酸肝疾患（ＮＡＦＬＤ）を軽減または処置することができる。患者を肝線維症に罹患していると特定および選定することができ、該肝線維症に罹患していると特定された患者に式１または２の化合物を投与して、それにより非アルコール性脂肪酸肝疾患（ＮＡＦＬＤ）を軽減または処置することができる。

【0026】

ある特定の態様では、式１もしくは２の１つまたは複数の化合物またはＰＬＡＧは、式１もしくは２の１つまたは複数の化合物またはＰＬＡＧとは異なる１つまたは複数の肝線維症処置薬と組み合わせてまたは協調して対象に投与することができる。ある特定の態様では、式１もしくは２の１つまたは複数の化合物、またはＰＬＡＧと同時投与されるかまたは組み合わせで投与される１つまたは複数の異なる肝線維症処置薬は、オベチコール酸（ＯＣＡ）、エラフィブラノル（ＧＦＴ５０５）、セロンセルチブ（ＧＳ－４９９７）、セニクリビロック（ＣＶＣ）、リラグルチド、メタドキシン、ヒドロキシチロソールおよびビタミンＥ、ＮＧＭ２８２（Ｍ７０）、ＢＭＳ－９８６０３６、エムリカサン（ＩＤＮ－６５５６）、アラムコール、アトルバスタチンおよび／またはＬ－カルニチン、ＭＧＬ－３１９６（レスメチロム）、ボリキシバット（ＳＨＰ６２６）、ＧＳ－９６７４、セマグルチド、サログリタザル、ＮＣＴ０２６０５６１６（Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃ，米国ミネソタ州ロチェスター市）の薬剤、ＬＭＢ７６３、ＩＶＡ３３７、ＬＪＮ４５２、ＣＦ１０２、ＭＴ－３９９５、ピオグリタゾン、ＭＮ－００１（チペルカスト）、ＭＳＤＣ－０６０２Ｋ、ＪＫＢ－１２１、ＩＭＭ－１２４Ｅおよび／またはＡＲＩ－３０３７ＭＯ、ならびにその医薬上許容される塩または酸であることができる。

【0027】

ある特定の好ましい態様では、ＰＬＡＧは、例えば、ＮＡＳＨまたはＮＡＦＬＤなどの脂肪性肝疾患または脂肪性肝障害に罹患している対象、例えばヒトを処置するなどのために、オベチコール酸（ＯＣＡ）と同時投与されることができる。追加のある特定の好ましい態様では、ＰＬＡＧは、例えば、ＮＡＳＨまたはＮＡＦＬＤなどの脂肪性肝疾患または脂肪性肝障害に罹患している対象、例えばヒトを処置するなどのために、ＭＧＬ－３１９６と同時投与されることができる。さらに追加のある特定の好ましい態様では、ＰＬＡＧは、ＮＡＳＨまたはＮＡＦＬＤなどの脂肪性肝疾患または脂肪性肝障害に罹患している対象、例えばヒトを処置するなどのために、ＭＧＬ－３１９６およびオベチコール酸（ＯＣＡ）の両方と同時投与されることができる。

【0028】

本明細書で言及されるように、肝線維症処置薬は、式１もしくは２の化合物、またはＰＬＡＧとは異なっており、肝線維症処置薬は、式１もしくは２の化合物、またはＰＬＡＧと化学構造が異なっている。例えば、異なる肝線維症処置は、モノアセチルジアシルグリセロール構造を含まなくてもよく、またはジアシルグリセロール構造化合物を含まなくてもよく、またはグリセロール構造を含まなくてもよい。投与された異なる肝線維症処置薬はまた、同時投与された式１もしくは２の化合物、またはＰＬＡＧと分子量が少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００％（高くまたは低く）異なっていてもよい。

【0029】

ある特定の態様では、本治療方法は、肝炎に罹患している対象の処置と関係していない。この態様では、肝炎に罹患している対象および／または肝炎のための処置を求めている対象は、本治療方法から除外されるであろう。関連する態様では、肝炎に罹患していると特定された、処置を求めている対象は、本治療方法から除外されるであろう。

【0030】

さらなる態様では、本治療方法は、糖尿病に罹患している対象の処置と関係していない。この態様では、糖尿病に罹患している対象および／または糖尿病のための処置を求めている対象は、本治療方法から除外されるであろう。

【0031】

なおも追加の態様では、本治療方法は、創傷または損傷組織に悩む対象と関係していない。この態様では、創傷もしくは損傷組織に悩む対象および／または創傷もしくは損傷組織のための処置を求めている対象は、本治療方法から除外される。関連する態様では、組織の修復または再生を包含する処置を求めている対象は、本治療方法から除外される。

【0032】

さらなる態様では、先に明らかにされた式１または２の化合物を含む医薬組成物が提供される。該組成物は、適切には、１つまたは複数の医薬として許容され得る担体を含むことができる。好ましい実施形態では、該組成物は、本明細書に開示される脂肪性肝疾患の処置のために製剤されることができるか、またはさもなくば該処置に適合していることができる。好ましい態様では、該組成物は、錠剤またはカプセル剤として経口投与に適合していることができる。

【0033】

なおもさらなる態様では、本明細書に開示される脂肪性肝疾患を処置または予防するために使用するためのキットが提供される。本発明のキットは、適切には、１）式１または式２の１つまたは複数の化合物と、２）本明細書に開示される脂肪性肝疾患を処置するかまたは予防するために１つまたは複数の化合物を使用するための説明書とを含むことができる。好ましくは、キットは、治療有効量の式１または式２の１つまたは複数の化合物を含む。説明書は、適切には、製品ラベルをはじめとする、記載された形式であることができる。

【0034】

本発明はまた、脂肪性肝疾患を軽減するかまたは予防するための式１のモノアセチルジアシルグリセロール化合物を含む健康機能性食品組成物も提供する。

【0035】

本発明の組成物は、門脈内でＡｐｏＢ４８を含むａｐｏＢタンパク質の発現を低減させることができ、非毒性であり、脂肪性肝疾患を処置および／または軽減する。

【0036】

本発明の他の態様を以下に開示する。
本特許または出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含有している。本特許または特許出願公開の、カラー図面付きの写しは、請求および必要な料金の支払いに応じて特許庁によって提供される。

【図面の簡単な説明】

【0037】

【図1】図１は、本発明の実験プロトコルを示す。

【0038】

【図2】図２（図２のＡおよび図２のＢを含む）は、本発明による組成物を投与したときの体重変化を示すグラフおよびチャート（図２のＡ）ならびに肝重量変化を示すチャート（図２のＢ）を示す。

【0039】

【図3】図３は、本発明による組成物を使用したときのヘマトキシリン・エオシンおよびオイルレッドＯで染色した肝臓切片の顕微鏡写真を示す。

【0040】

【図4】図４は、小腸において吸収された脂肪が肝臓に影響を及ぼす例示的な機序を示す。

【0041】

【図5】図５（図５のＡおよび図５のＢを含む）は、本発明による組成物を使用したときの、肝臓および血漿中のトリグリセリドのレベルおよび含量を示すチャート（図５のＡ）および門脈血漿中のａｐｏＢ４８タンパク質発現を示すチャート（図５のＢ）を示す。

【0042】

【図6】図６（図６のＡ～図６のＣを含む）は、本発明による組成物を使用したときの、筋肉組織中のトリグリセリドの含量を示すチャート（図６のＡ）、筋肉組織中のＬＰＬの相対的なｍＲＮＡ発現を示すチャート（図６のＢ）、および筋肉切片におけるＬＰＬ染色の代表的な免疫組織化学的画像を示す写真（図６のＣ）を示す。

【0043】

【図7】図７（図７のＡ～図７のＣを含む）は、マウス由来の筋肉標本および骨格筋の重量を示すチャート（図７のＡ）、ならびに腓腹筋および大腿四頭筋をはじめとする筋肉組織におけるカベオリン３の相対的なｍＲＮＡ発現の結果（図７のＢ）、ならびに筋芽細胞および筋管におけるカベオリン３およびミオゲニンの相対的なｍＲＮＡ発現の結果（図７のＣ）を示す。

【0044】

【図8】図８（図８のＡ～図８のＤを含む）は、ＰＬＡＧおよびＰＬＧの構造化学式（図８のＡ）、ならびに各群の体重変化を示すチャート（図８のＢ）および肉眼的肝臓標本の写真（図８のＣ）、ならびにヘマトキシリン・エオシン染色した肝臓切片の写真（図８のＤ）を示す。

【0045】

【図9】図９は、本発明の別の実験プロトコルを示す。

【0046】

【図10】図１０は、本発明による組成物を使用したときの体重変化を示すグラフである。

【0047】

【図11】図１１（図１１のＡ～図１１のＣを含む）は、本発明による組成物を使用したときの体重（図１１のＡ）、肝重量（図１１のＢ）および肝重量対体重比（図１１のＣ）を示すグラフである。

【0048】

【図12】図１２（図１２のＡ～図１２のＣを含む）は、本発明による組成物を使用したときの、血漿ＡＬＴ（図１２のＡ）および血漿ＡＳＴ（図１２のＢ）およびＡＬＴ／ＡＳＴ比（図１２のＣ）を示すグラフである。

【0049】

【図13】図１３は、本発明による組成物を使用したときの、ヘマトキシリン・エオシンおよびオイルレッドＯで染色した肝臓切片の顕微鏡写真を示す。

【0050】

【図14】図１４（図１４のＡ～図１４のＤを含む）は、本発明による組成物を使用したときの、ヘマトキシリン・エオシンおよびオイルレッドＯで染色した肝臓切片を示すグラフを示す。

【0051】

【図15】図１５は、本発明による組成物を使用したときのシリウスレッド染色した肝臓切片の顕微鏡写真を示す。

【0052】

【図16】図１６は、本発明による組成物を使用したときの肝臓組織の線維部分（シリウスレッド陽性面積）を示すグラフを示す。

【0053】

【図17】図１７は、実施例１２の第１～６の群の肝臓トリグリセリドのレベルのグラフを示す。

【0054】

【図18】図１８は、実施例１２の第１～６の群の血漿サイトケラチン１８のグラフを示す。

【0055】

【図19】図１９は、実施例１２の第１～６の群のＦ４／８０免疫染色された肝臓切片の代表的な顕微鏡写真を示す。

【0056】

【図20】図２０は、実施例１２の第１～６の群の炎症領域（Ｆ４／８０陽性面積％）のグラフを示す。

【0057】

【図21】図２１は、実施例１２の第１～６の群の定量的ＲＴ－ＰＣＲによって測定された相対的な遺伝子発現を示す。

【発明を実施するための形態】

【0058】

本発明による脂肪性肝疾患を処置するための組成物は、式１のモノアセチルジアシルグリセロール化合物を有効成分として含む。

【0059】

【化3】

【0060】

本発明では、「モノアセチルジアシルグリセロール化合物」という用語は、アセチル基と２個のアシル基とを含有するグリセロール誘導体を意味し、モノアセチルジアシルグリセロール（ＭＡＤＧ）とも称される。

【0061】

式１中、Ｒ_１およびＲ_２は、独立して、１４～２２個の炭素原子の脂肪酸残基であり、好ましくは１５～２０個の炭素原子の脂肪酸残基である。該脂肪酸残基は、－ＯＨ基がそのカルボキシル基から除外された脂肪酸における残存部分を意味する。したがって、式１中、Ｒ１およびＲ２の非限定的な例としては、パルミトイル、オレオイル、リノレオイル、リノレノイル、ステアロイル、ミリストイル、アラキドノイルなどがある。Ｒ１およびＲ２の好ましい組み合わせとしては、オレオイル／パルミトイル、パルミトイル／オレオイル、パルミトイル／リノレオイル、パルミトイル／リノレノイル、パルミトイル／アラキドノイル、パルミトイル／ステアロイル、パルミトイル／パルミトイル、オレオイル／ステアロイル、リノレオイル／パルミトイル、リノレオイル／ステアロイル、ステアロイル／リノレオイル、ステアロイル／オレオイル、ミリストイル／リノレオイル、ミリストイル／オレオイルなどがある。Ｒ１およびＲ２のより好ましい組み合わせは、パルミトイル／リノレオイルである。光学活性において、式１のモノアセチルジアシルグリセロール誘導体は、（Ｒ）－形態、（Ｓ）－形態またはラセミ混合物であることができ、好ましくはラセミ混合物であることができ、これらの立体異性体を含んでよい。

【0062】

一実施形態では、モノアセチルジアシルグリセロールは、以下の式２の化合物である。

【0063】

【化4】

【0064】

式２の化合物は、１－パルミトイル－２－リノレオイル－３－アセチル－ｒａｃ－グリセロールであり、式１のＲ_１およびＲ_２がそれぞれパルミトイルおよびリノレオイルである式１の化合物に相当する。式２の化合物は、本開示では「ＰＬＡＧ」または「ＥＣ－１８」と称されることがある。

【0065】

モノアセチルジアシルグリセロール化合物は、天然のシカの枝角から分離および抽出することができるか、または公知の有機合成法（韓国特許第１０－０７８９３２３号公報）によって製造することができる。より具体的には、シカの枝角をヘキサンで抽出した後、残渣をクロロホルムで抽出し、クロロホルムを除去してクロロホルム抽出物を得る。この抽出のための溶媒の量は、シカの枝角を浸漬するのにちょうど十分である。一般に、シカの枝角１ｋｇに対して約４～５リットルのヘキサンおよび／またはクロロホルムが使用されるが、これに限定されない。この方法によって取得された抽出物を、さらに、一連のシリカゲルカラムクロマトグラフおよびＴＬＣ法を用いて分画および精製して、本発明のモノアセチルジアシルグリセロール化合物を取得する。抽出のための溶媒は、クロロホルム／メタノール、ヘキサン／酢酸エチル／酢酸から選択されるが、これらに限定されない。

【0066】

モノアセチルジアシルグリセロール化合物の調製のための化学合成方法は、韓国特許第１０－０７８９３２３号公報に示されている。具体的には、該方法は、（ａ）１－Ｒ１－グリセロールの３位に保護基を導入することによって、１－Ｒ１－３－保護基－グリセロールを調製する工程、（ｂ）１－Ｒ１－３－保護基－グリセロールの２位にＲ２を導入することによって、１－Ｒ１－２－Ｒ２－３－保護基－グリセロールを調製する工程、（ｃ）１－Ｒ１－３－保護基－グリセロールの脱保護反応とアセチル化反応とを同時に行うことによって、所望のモノアセチルジアシルグリセロール化合物を調製する工程を含む。モノアセチルジアシルグリセロール化合物は、必要な場合、さらに精製してよい。あるいは、モノアセチルジアシルグリセロール化合物は、ホスファチジルコリンの酸分解（アセトリシス）によって調製することができるが、これに限定されない。式１の化合物の立体異性体も本発明の範囲内である。

【0067】

本発明のモノアセチルジアシルグリセロール化合物は、脂肪性肝疾患の処置および／または軽減に有効に用いることができる。「脂肪性肝疾患」という用語は、肝臓に蓄積した過剰な脂肪（主としてトリグリセリド）を特徴とする疾患である。一般に、「脂肪性肝疾患」という用語は、肝臓の脂肪量が全肝重量の５重量％を超える状態を意味する。

【0068】

脂肪性肝疾患としては、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）がある。非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）は、アルコールの使用以外の原因による肝臓における過剰な脂肪の蓄積である。

【0069】

具体的には、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）は、過体重、肥満、インスリン抵抗性、糖尿病（１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）、２型糖尿病など）、脂質異常症（高脂血症）、メタボリックシンドローム（例えば、高血圧、高血糖、腹部肥満、低ＨＤＬコレステロールおよび高トリグリセリドによって引き起こされるメタボリックシンドローム）などと関係している慢性肝疾患である。ＮＡＦＬＤは、アルコール使用以外の原因による肝臓での過剰な脂肪（主としてトリグリセリド）の蓄積によって引き起こされ、通常、総肝重量に関して５重量％を超える脂肪の蓄積を指す。本開示では、ＮＡＦＬＤとしては、ＮＡＦＬＤに起因する疾患が含まれる。

【0070】

非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）としては、肝細胞に損傷を与えることなく単に脂肪が肝臓に蓄積する非アルコール性脂肪肝だけでなく、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝線維症、肝硬変、さらには肝細胞癌も含まれる。具体的には、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）は、１型～４型に分類することができる。具体的には、１型は、脂肪変性のみを随伴し、肝細胞損傷を随伴しない単純な脂肪肝を意味する。２型は、重度および持続性の脂肪変性および肝細胞損傷による、小葉における炎症反応を随伴する脂肪性肝炎を意味する。３型は、肝細胞の風船状変化ならびに脂肪変性および脂肪壊死が現れている状態を意味する。４型は、３型の症状を随伴するマロリー体または線維化が現れている状態を意味する。３型および４型では、肝硬変が起こることがある。

【0071】

全脂肪性肝疾患患者の約１０％が、脂肪性肝炎として公知である。非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）は、高インスリン血症によるトリグリセリドの上昇および脂肪代謝の低下によって引き起こされる。非アルコール性脂肪肝および非アルコール性脂肪性肝炎が処置されていない場合、肝機能が悪化することがあり、肝線維症を経て肝硬変が生じることがある。

【0072】

線維化とは、肝臓組織における創傷治癒過程の１種である。肝組織が肝炎ウイルス、非アルコール性脂肪肝、薬物などによって損傷されると、肝細胞が継続的に損傷され、再生されるにつれて、肝小葉において脈管構造が崩壊する。結果として、再生結節により喪失された機能が生じ、肝臓で線維化反応が起こり、肝硬変につながることがある。

【0073】

損傷した肝細胞は、フリーラジカルおよび炎症性物質を分泌して、クーパー細胞および炎症性細胞を活性化し、肝星細胞の活性化につながる。肝星細胞は、正常な状態ではビタミンＡの貯蔵体であるが、肝損傷が起こると活性化され、コラーゲンなどのさまざまな細胞外基質を合成し、分泌して肝線維症を引き起こすことができる。肝損傷が慢性的に繰り返されると、損傷した肝細胞はもはや再生されることができず、コラーゲンなどの細胞外マトリックスと徐々に置き換えられ、肝線維症および肝硬変につながる可能性がある。

【0074】

すなわち、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）は、単純な非アルコール性脂肪肝から脂肪性肝疾患および肝線維症を経て肝硬変へと進行する連続的な疾患である。

【0075】

本発明のモノアセチルジアシルグリセロール化合物は、非アルコール性脂肪肝、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝線維症をはじめとする非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の処置に有効に使用することができる。「処置」という用語には、本発明の組成物を投与することによる、非アルコール性脂肪肝、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）および肝線維症の症状の遅延または低減、ならびに症状の部分的なもしくは完全な除去または予防が含まれる。

【0076】

併用療法

【0077】

考察したように、式１もしくは２のうちの１つまたは複数の化合物、またはＰＬＡＧおよび１つまたは複数の肝線維症処置薬は、ＮＡＳＨをはじめとする脂肪性肝疾患に罹患しているヒトをはじめとする対象を処置するなどのために組み合わせて投与することができる。

【0078】

本明細書で使用する場合、対象への療法の投与の文脈における「組み合わせて」という用語は、治療上の利益のための１つを超える療法の使用を指す。投与の文脈における「組み合わせて」という用語はまた、少なくとも１つの追加の療法と共に使用されるときの対象への療法の予防上の使用を指すこともできる。「組み合わせて」という用語の使用は、療法（例えば、第１および第２の療法）が対象に投与される順序を制限しない。該療法は、本明細書に開示される処置を必要とする対象への第２の療法の投与の前（例えば、１分前、５分前、１５分前、３０分前、４５分前、１時間前、２時間前、４時間前、６時間前、１２時間前、２４時間前、４８時間前、７２時間前、９６時間前、１週間前、２週間前、３週間前、４週間前、５週間前、６週間前、８週間前、または１２週間前）に、該投与と同時に、または該投与に続いて（例えば、１分後、５分後、１５分後、３０分後、４５分後、１時間後、２時間後、４時間後、６時間後、１２時間後、２４時間後、４８時間後、７２時間後、９６時間後、１週間後、２週間後、３週間後、４週間後、５週間後、６週間後、８週間後、または１２週間後に）投与することができる。該療法は、該療法が一緒に作用することができるように、連続してかつある時間間隔内で対象に投与される。詳細な実施形態では、療法は、他の方法で投与された場合よりも高い恩恵をもたらすように、連続してかつある時間間隔内で対象に投与される。いずれの追加の療法も、その他の追加の療法と共に何らかの順序で投与することができる。

【0079】

化合物（例えば、式１もしくは２の化合物、またはＰＬＡＧ）および１つまたは複数の肝線維症処置薬の投与は、他の成分と組み合わせて、脂肪肝疾患、例えば、非アルコール性脂肪酸肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝線維症、肝炎に起因する脂肪性肝疾患、肥満に起因する脂肪性肝疾患、糖尿病に起因する脂肪性肝疾患、インスリン抵抗性に起因する脂肪性肝疾患、高トリグリセリド血症に起因する脂肪性肝疾患、無ベータリポタンパク血症、糖原病、ウェーバー・クリスチャン病、ウォルマンズ病、妊娠時急性脂肪肝、および／またはリポジストロフィーを軽減し、低減させ、または安定化するのに有効な治療薬濃度を結果としてもたらす適切な手段によるものであってよい。

【0080】

化合物（例えば、式１もしくは２の化合物、またはＰＬＡＧ）および１つまたは複数の異なる肝線維症処置薬は、同時にまたは逐次投与されてもよい。いくつかの実施形態では、肝線維症の処置は、疾患適応症のための確立された療法であり、化合物（例えば、式１もしくは２の化合物、またはＰＬＡＧ）の添加によるものであり、このような処置により患者に対する治療上の恩恵が向上する。このような向上は、患者ごとの応答の上昇または患者集団における応答の上昇として測定することができる。併用療法はまた、より少量の用量またはより頻度の少ない治療薬の投与での応答性の向上をもたらし、結果としてより良好な許容される処置投与計画が得られる。示されるように、化合物（例えば、式１もしくは２の化合物、またはＰＬＡＧ）と１つまたは複数の異なる肝線維症処置薬との併用療法は、さまざまな機序、例えば、小腸で吸収された脂肪が肝臓に影響を及ぼす機序（例えば、摂取量の増加または腸生理学的作用および微生物叢の調節不全のいずれかによる、小腸（腸）から肝臓への食事性脂肪送達の上昇）、２）非エステル化プールから（例えば、白色脂肪組織から）の遊離脂肪酸の流入の増加、３）過剰な炭水化物からのデノボ肝臓脂肪生成（およびまたは脂肪組織インスリン抵抗性からの高インスリン血症）の上昇などのさまざまな機序を経て臨床上の活性を提供する増強することができる。

【0081】

いくつかの態様では、該方法（例えば、脂肪肝疾患のための併用療法）は、第２の治療薬（式１もしくは式２の化合物またはＰＬＡＧとは異なる１つまたは複数の肝線維症処置薬）の投与、または肝線維症のための第２の療法（例えば、当技術分野において標準的である治療薬または療法）を用いた処置を含むことができる。

【0082】

いくつかの態様では、該方法（例えば、脂肪肝疾患のための併用療法）は、第２の治療薬（式１もしくは式２の化合物またはＰＬＡＧとは異なる１つまたは複数の肝線維症処置薬）の投与、またはＮＡＦＬＤおよび／もしくはＮＡＳＨの処置のための第２の療法（例えば、当技術分野において標準的である治療薬または療法）を用いた処置を含むことができる。

【0083】

例示的な治療薬としては、１つまたは複数の肝線維症処置薬がある。「肝線維症処置薬」とは、脂肪性肝疾患、例えば、非アルコール性脂肪酸肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝線維症、肝炎に起因する脂肪性肝疾患、肥満に起因する脂肪性肝疾患、糖尿病に起因する脂肪性肝疾患、インスリン抵抗性に起因する脂肪性肝疾患、高トリグリセリド血症に起因する脂肪性肝疾患、無ベータリポタンパク血症、糖原病、ウェーバー・クリスチャン病、ウォルマンズ病、妊娠時急性脂肪肝、および／またはリポジストロフィーの処置において有用な化合物である。

【0084】

本発明の方法、組成物およびキットにおける使用のための肝線維症処置薬の例としては、オベチコール酸（ＯＣＡ）、エラフィブラノル（ＧＦＴ５０５）、セロンセルチブ（ＧＳ－４９９７）、セニクリビロック（ＣＶＣ）、リラグルチド、メタドキシン、ヒドロキシチロソールおよびビタミンＥ、ＮＧＭ２８２（Ｍ７０）、ＢＭＳ－９８６０３６、エムリカサン（ＩＤＮ－６５５６）、アラムコール、アトルバスタチンおよび／またはＬカルニチン、ＭＧＬ－３１９６（レスメチロム）、ボリキシバット（ＳＨＰ６２６）、ＧＳ－９６７４、セマグルチド、サログリタザル、ＮＣＴ０２６０５６１６（Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃ，米国ミネソタ州ロチェスター市）の薬剤、ＬＭＢ７６３、ＩＶＡ３３７、ＬＪＮ４５２、ＣＦ１０２、ＭＴ－３９９５、ピオグリタゾン、ＭＮ－００１（チペルカスト）、ＭＳＤＣ－０６０２Ｋ、ＪＫＢ－１２１、ＩＭＭ－１２４Ｅおよび／またはＡＲＩ－３０３７ＭＯ、ならびにその医薬上許容される塩または酸がある。考察されるように、ある特定の好ましい方法、キットおよび組成物は、対象、例えばＮＡＳＨまたはＮＡＦＬＤなどの脂肪性肝疾患または脂肪肝障害に罹患しているヒトを処置することをはじめとする、ＭＧＬ－３１９６（レスメチロム）および／またはオベチコール酸（ＯＣＡ）を含む１つまたは複数の肝線維症処置薬を含むことができる。

【0085】

加えて、肝線維症処置薬の例としては、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲβ／δ、および／またはＰＰＡＲγ）アゴニスト（例えば、ＧＷ５０１５１６、エラフィブラノル、チアゾリジンジオン、ピオグリタゾン、またはサログリタザル）、ＦＸＲ－胆汁酸軸（例えば、オベチコール酸、ＦＧＦ－１９、ＮＧＭ－２８２、ＮＣＴ０２５４８３５１における作用薬、ＮＣＴ０２４４３１１６における作用薬など）、脂質変化薬（例えば、ステアロイル－ＣｏＡデサチュラーゼ（ＳＯＤ）阻害薬、アラムコール、）、インクレチン系療法（例えば、エキセナチド、リラグルチド、シタグリプチンなど）、炎症、細胞損傷もしくは細胞死（アポトーシス）および酸化ストレスを標的とする作用薬（例えば、ビタミンＥ、ＥＮＣＯＲＥ－ＮＦにおける作用薬、ＮＣＴ０２６８６７６２、ペントキシフィリンなど）、腸および微生物叢関連療法に使用する作用薬（例えば、ＩＭＭ－１２４ｅ、オルリスタット、ＮＣＴ０２５１０５９９における作用薬など）ならびに／または抗線維症療法のための作用薬（例えば、シンツズマブ、ＧＲ－ＭＤ－０２など）がある。

【0086】

例えば、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）には、肝臓、脂肪組織、心臓、骨格筋および腎臓において発現し、Ｂ酸化、脂質輸送および糖新生をはじめとする複数の代謝過程を転写調節する核内受容体の群がある。

【0087】

本発明の方法、組成物およびキットにおいて使用することができる追加の肝線維症薬としては、国際公開第２０１７／１３６３０９号において開示されているような可溶性グアニル酸シクラーゼ（ｓＧＣ）刺激薬、および米国特許出願公開第２０１８／０３６０８４６号明細書に開示されているようなセニクリビロックがある。

【0088】

考察されるように、１）式１もしくは２の化合物、またはＰＬＡＧおよび２）１つまたは複数の異なる肝線維症処置薬は、別個の医薬組成物として、または単一の医薬組成物中に混合してのいずれかで、対象に「同時投与され」、すなわち協調した様式で一緒に投与することができる。「同時投与される」によって、１つまたは複数の追加の別個の肝線維症処置薬はまた、式１もしくは２の化合物と同時に投与されてもよく、または異なるタイミングおよび異なる頻度をはじめとして、式１または２の化合物と別々に投与されてもよい。１つまたは複数の異なる肝線維症処置薬は、経口で、静脈内に、皮下に、筋肉内に、鼻になど、作用薬のための何らかの適切な経路によって投与することができ、該治療薬はまた、何らかの従来の経路によって投与することもできる。少なくともある特定の実施形態では、１つまたは複数の別個の肝線維症薬を経口投与することができる。

【0089】

いくつかの実施形態では、該化合物（例えば、式１もしくは２の化合物、またはＰＬＡＧ）および／または１つまたは複数の別個の肝線維症処置薬は、毎日、例えば、２４時間ごとに、または連続してもしくは１日あたり数回、例えば１時間ごと、２時間ごと、３時間ごと、４時間ごと、５時間ごと、６時間ごと、７時間ごと、８時間ごと、９時間ごと、１０時間ごと、１１時間ごと、または１２時間ごとに投与することができる。

【0090】

別個の肝線維症処置薬の例示的な有効な１日用量には、０．１μｇ／ｋｇ～１００μｇ／ｋｇ体重、例えば、０．１、０．３、０．５、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または９９μｇ／ｋｇ体重がある。

【0091】

あるいは、別個の肝線維症処置薬は、１週間に約１回、例えば７日ごとに約１回投与される。または、別個の肝線維症処置薬は、１週間に２回、１週間に３回、１週間に４回、１週間に５回、１週間に６回、または１週間に７回投与される。肝線維症処置薬の例示的な有効な１週間用量には、０．０００１ｍｇ／ｋｇ～４ｍｇ／ｋｇ体重、例えば、０．００１、０．００３、０．００５、０．０１．０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、または４ｍｇ／ｋｇ体重がある。例えば、別個の肝線維症処置薬の有効な１週間用量は、０．１μｇ／ｋｇ体重～４００μｇ／ｋｇ体重である。

【0092】

本開示の実施例では、モノアセチルジアシルグリセロール化合物を用いると、（１）ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）によって低減した体重が回復したこと、（２）トリグリセリド（ＴＧ）が肝臓内に過剰に蓄積することにより増加した肝重量が低減したことが示されている（実施例１）。したがって、モノアセチルジアシルグリセロール化合物の投与により脂肪肝が改善されることがわかる。

【0093】

トリグリセリド（ＴＧ、中性脂肪）は、外生脂肪として小腸で吸収され、ＡｐｏＢ４８のアポリポタンパク質を含む。トリグリセリド（ＴＧ）をＡｐｏＢ４８と共にカイロミクロン（ＣＭ）と再度組み合わせる。高トリグリセリドＣＭは、全身を循環しながらリンパ系を経て血液中へと輸送され、トリグリセリド（ＴＧ）は、エネルギーまたは貯蔵のために、筋肉、脂肪組織および単球をはじめとする末梢組織内へと吸収される。次いで、ＣＭ中に含有されているトリグリセリド（ＴＧ）は、門脈を経て肝臓に輸送されることができるようにリポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）によって加水分解され、結果としてより小さなＣＭ残存粒子となる。したがって、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）が低減すると、筋肉、脂肪組織および免疫細胞をはじめとする末梢組織内の未使用のＣＭは肝臓に輸送され、結果として肝臓へのトリグリセリド（ＴＧ）の過剰な循環をもたらす。このことは高トリグリセリド血症を引き起こし、脂肪性肝疾患につながる可能性がある。

【0094】

ＡｐｏＢ４８とは、血中コレステロールおよびトリグリセリドを輸送するリポタンパク質である。ＡｐｏＢ４８が過剰であるとき、トリグリセリド（ＴＧ）が高く、そのことが脂質異常症に寄与することを意味する。このため、肝臓におけるトリグリセリド（ＴＧ）の取り込みは、脂肪肝を引き起こす肝細胞の脂肪蓄積を促進し得る（図４を参照されたい）。

【0095】

本開示の他の例では、実験群の肝臓を観察し、ヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）を使用して小胞の脂肪を撮像し、オイルレッドＯ（ＯＲＯ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、米国ミズーリ州セントルイス市）を使用して肝臓脂肪の蓄積の程度を測定した。（１）肝細胞および血漿中のトリグリセリド（ＴＧ）濃度が低減し（実施例２、３）、（２）リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）の発現が改善され（実施例４）、ならびに（３）門脈におけるＡｐｏＢ４８を含むアポリポタンパク質の発現が低減した（実施例３）ことが示されている。モノアセチルジアシルグリセロール化合物により、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）を産生および分泌する末梢組織の機能改善が達成されることが確認された。これらの結果はまた、モノアセチルジアシルグリセロール化合物が脂肪肝を処置するのに有効であることも示している。

【0096】

本開示の他の例では、モノアセチルジアシルグリセロール化合物を使用すると、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）に対するＮＡＦＬＤ活性スコア（ＮＡＳ）、脂肪変性、小葉炎症および肝細胞風船様拡大が低減し（実施例１０）、（２）肝組織の線維化部分が低減した（実施例１１）ことが示されている。

【0097】

本発明のモノアセチルジアシルグリセロール化合物を含む医薬組成物は、従来の医薬として許容され得る担体、賦形剤、または希釈剤を含むことができる。該医薬組成物中のモノアセチルジアシルグリセロールの量は、特に制限されず、幅広く変えることができ、具体的には、組成物の総量に関して、０．０００１～１００重量％、好ましくは０．００１～９０重量％であり、例えば、該モノアセチルジアシルグリセロールは、７０～８０重量％含有されてよい。

【0098】

本発明の医薬組成物はさらに、脂肪性肝疾患の治療効果を有する他の有効成分を含んでよい。該医薬組成物は、経口投与または非経口投与のための固形状、液状、ゲル状または懸濁状形態、例えば錠剤、ボーラス剤、散剤、顆粒剤、硬質または軟質のゼラチンカプセル剤などのカプセル剤、エマルション剤、懸濁剤、シロップ剤、乳化可能な濃縮物、滅菌水溶液剤、非水溶液剤、凍結乾燥製剤などに製剤されてよい。該組成物の製剤化では、充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、および界面活性剤などの従来の賦形剤または希釈剤を使用することができる。経口投与用の固形製剤としては、錠剤、ボーラス剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などがあり、該固形製剤は、１つまたは複数の有効成分と、デンプン、炭酸カルシウム、スクロース、ラクトース、ゼラチンなどの少なくとも１つの賦形剤とを混合することによって調製することができる。賦形剤の他に、ステアリン酸マグネシウムおよびタルクなどの潤滑剤もまた使用することができる。経口投与のための液体製剤としては、エマルション剤、懸濁剤、シロップ剤などがあり、水および流動パラフィンなどの従来の希釈剤を含んでよく、または湿潤剤、甘味料、香味料、および防腐剤などのさまざまな賦形剤を含んでよい。非経口投与用製剤としては、滅菌水溶液剤、非水溶液剤、凍結乾燥製剤、坐剤などがあり、このような液剤のための溶媒としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、オレイン酸エチルなどの注射器による注射のためのエステルがあってよい。坐剤の基剤材料としては、ウィテップゾール、マクロゴール、トゥイーン６１、カカオバター、ラウリンおよびグリセロゼラチンがあってよい。

【0099】

モノアセチルジアシルグリセロール化合物は、医薬有効量で投与することができる。「医薬有効量」という用語は、医学的処置において所望の結果を達成するのに十分である量を指すために使用される。「医薬有効量」は、対象の区分、年齢、性別、疾患の重症度および種類、薬物の活性、薬物に対する感受性、投与時間、投与経路、排泄率などによって決定することができる。本発明の組成物は、単独で、または他の治療薬と共に逐次もしくは同時に投与することができる。本発明の組成物は、単回投与または複数回投与することができる。本発明の組成物の好ましい量は、患者の容態および体重、疾患の重症度、薬物の製剤の種類、投与経路ならびに処置期間によって変えることができる。１日あたりの適切な総投与量は、医師によって決定することができ、一般に約０．００１～約５，０００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．０５～１，０００ｍｇ／ｋｇで１日１回であるか、または分割用量で１日に複数回投与することができる。本発明の組成物は、脂肪性肝疾患の予防または処置を必要とする何らかの対象に投与することができる。例えば、本発明の組成物は、ヒトだけでなく、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、ラット、マウス、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギなどの非ヒト動物（具体的には哺乳動物）にも投与することができる。

【0100】

いくつかの実施形態では、本発明は、式１のモノアセチルジアシルグリセロールを有効成分として含む、脂肪性肝疾患を予防、軽減または改善するための健康機能性食品組成物を提供する。

【0101】

本発明のモノアセチルジアシルグリセロール化合物は、対象における脂肪性肝疾患を改善するための健康機能性食品組成物へと含まれていてよい。モノアセチルジアシルグリセロール化合物および脂肪性肝疾患は、先に説明した通りである。本発明の化合物が健康機能性食品組成物へと含まれているとき、該健康食品組成物中のモノアセチルジアシルグリセロールの量は、意図した使用に応じて適切に決定することができる。一般に、モノアセチルジアシルグリセロールの量は、食品または飲料に含まれるとき、該健康機能性食品組成物の総量に関して、好ましくは０．０１重量％以上１５重量％未満である。しかしながら、モノアセチルジアシルグリセロールの量は増減してよい。健康管理および衛生の目的のための長期使用の場合、モノアセチルジアシルグリセロールの量は、先の範囲未満とすることができる。安全性の点で問題がないので、モノアセチルジアシルグリセロールは、先の範囲を超える量で使用してよい。本発明の化合物を添加することができる食品は、制限されておらず、さまざまな食品、例えば、食肉、ソーセージ、パン、チョコレート、飴、スナック菓子、ピザ、麺類、ガム類、アイスクリームなどの日用品、スープ、飲料、茶、嚥下可能な飲料、アルコール飲料、複合ビタミン類およびいずれの健康機能食品も含まれる。

【0102】

モノアセチルジアシルグリセロールが飲料製品において使用されるとき、該飲料製品は、甘味料、香味料または炭水化物を含んでよい。炭水化物の例としては、グルコースおよびフルクトースなどの単糖類、マルトースおよびスクロースなどの二糖類、デキストリンおよびシクロデキストリンなどの多糖類、ならびにキシリトール、ソルビトールおよびエリスリトールなどの糖アルコールがある。飲料組成物中の炭水化物の量は、具体的な制限がなく幅広く変えることができ、該飲料１００ｍｌあたり、好ましくは０．０１～０．０４ｇ、より好ましくは０．０２～０．０３ｇである。甘味料の例としては、タウマチンおよびステビア抽出物などの天然甘味料、ならびにサッカリンおよびアスパルテームなどの人工甘味料がある。上記に加えて、本発明の健康機能性食品組成物には、さまざまな栄養素、ビタミン類、電解質、香味料、着色料、ペクチン酸およびその塩、アルギン酸およびその塩、有機酸、保護コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に用いられる炭酸化剤などが含まれてよい。さらに、本発明の健康機能性食品組成物は、天然果汁および果汁飲料、ならびに野菜飲料を調製する上で使用されるような果実類を含んでよい。

【0103】

本発明は、脂肪性肝疾患の疑いのある個体に該医薬組成物を投与するステップを含む、脂肪性肝疾患を処置する方法を提供する。脂肪性肝疾患の疑いのある対象に該組成物を投与することによって、該脂肪性肝疾患が効率的に処置される。「脂肪性肝疾患の疑いのある対象」という用語は、脂肪性肝疾患に罹患している対象、または発症する可能性のある対象を指す。脂肪性肝疾患は、該脂肪性肝疾患を処置するかまたは予防する必要のある患者に、有効量の該化合物を投与することによって、処置または予防することができる。モノアセチルジアシルグリセロール化合物の種類、およびモノアセチルジアシルグリセロール化合物の用量、ならびに脂肪性肝疾患については、先に説明した通りである。「投与」という用語は、本発明の医薬組成物を何らかの適切な方法によって、必要とする患者に導入することを意味する。投与経路は、標的組織に到達することができる限り、経口または非経口と、何らかのまたはさまざまな経路であってよく、例えば、経口投与、腹腔内投与、経皮投与（局所適用など）、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、鼻腔内投与、直腸投与、鼻腔内投与、腹腔内投与などが使用されてよいが、これらに限定されない。

【実施例】

【0104】

以下の実施例は、本発明をよりよく理解するために提供される。しかしながら、本発明は実施例によって限定されるものではない。

【0105】

脂肪性肝疾患の処置における１－パルミトイル－２－リノレオイル－３－アセチルグリセロール（ＥＣ－１８またはＰＬＡＧ）の有効性を確認するために、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）誘発性脂肪性肝疾患モデルを本実験に使用した。

【0106】

実験例１：非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の処置の有効性を確認するための対照群および実験群の準備

【0107】

図１は、本発明の実験プロトコルを示す。図１に示すように、マウスを無作為に対照群とストレプトゾトシン（ＳＴＺ）処置群とに分けた。すべてのＳＴＺ処置群に、２００ｍｇ／ｋｇ体重（ＢＷ）の用量（１日）でＳＴＺの腹腔内注射を行い、該用量は、クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）中に溶解した。

【0108】

ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）投与翌日、グルコメーター（ＡＣＣＵ－ＣＨＥＫ，Ｒｏｃｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｉｎｃ．）により糖尿病誘発を確認し、急性糖尿病を誘発した。空腹時血糖レベルが２００ｍｇ／ｄＬを超えるマウスはすべて、急性糖尿病に罹患しているとみなした。誘発を確認した後、実験群のマウスをさらに３つの群、すなわちＳＴＺ単独処置群、ならびに低用量および高用量のＰＬＡＧ＋ＳＴＺ処置群へと無作為化した。式２によって表される１－パルミトイル－２－リノレオイル－３－アセチル－ｒａｃ－グリセロール（ＰＬＡＧ）を有効成分として使用した。

【0109】

マウスにＰＬＡＧを経口強制飼養によって３日間投与した。意図する経口薬用量は、マウスにおいてそれぞれ２５０および５０ｍｇ／ｋｇＢＷとした。対照群およびＳＴＺ単独処置群には同じＰＢＳを３日間経口投与し、マウスを４日目に屠殺した。

【0110】

実施例１：体重および相対肝重量の解析

【0111】

先の実験において準備した対照群、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）単独、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）＋低用量ＰＬＡＧ処置群、およびストレプトゾトシン（ＳＴＺ）＋高用量ＰＬＡＧ処置群の全マウスの体重を毎日同じ時刻に測定および記録し、結果を図２のＡに示す。また、対照群および実験群の相対肝重量を以下の方程式を用いて計算したので、結果を図２のＢに示す。

【0112】

（数式１）
（絶対肝重量）／（屠殺当日のＢＷ）×１００

【0113】

図２のＡに示すように、ＳＴＺ処置マウスはすべて、対照群と比較してＢＷの統計学的に有意な低下を示した。しかしながら、高用量ＰＬＡＧ群は、ＳＴＺのみを投与したマウスと比較してＢＷの減少が少ないことを示した。ＳＴＺ群と低用量ＰＬＡＧ群との間でＢＷに差はなかった。このことは、経口ＰＬＡＧ投与が糖尿病による体重減少を減弱させたことを示唆している。

【0114】

図２のＢに示すように、ＳＴＺ単独群の相対肝重量（ｇＢＷあたり）は、対照群よりも有意に大きかった。しかしながら、ＰＬＡＧ処置群は、ＳＴＺ群よりも平均肝重量が小さく、ＰＬＡＧ補充が脂肪肝を改善したことを示した。

【0115】

実施例２：組織病理学的解析

【0116】

４日間の実験期間の終了時に、マウスを６時間絶食させた後、屠殺した。図３は、Ｈ＆ＥおよびＯＲＯで染色した肝臓切片の写真である。具体的には、肝臓脂肪の蓄積の程度を測定するために、対照群および実験群の肝臓を観察し、ヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）ならびにオイルレッドＯを使用して撮像した。肝臓試料を直ちに室温で１０％緩衝ホルマリン中で固定した後、組織をパラフィン内に包埋し、切片作製し、ヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。凍結肝臓切片を４％パラホルムアルデヒドで２０分間固定した後、室温で１５分間ＯＲＯ染色した。次に、試料をマイヤーのヘマトキシリンで１０秒間対比染色し、載せた。画像は光学顕微鏡（オリンパス、日本国東京都）下で取得した。

【0117】

図３に示すように、予想通り、Ｈ＆Ｅ染色によって、脂肪空胞数の増加（大滴性脂肪変性および小滴性脂肪変性）によって証明されるように、ＳＴＺ単独群で肝脂肪変性の劇的な証拠が示された。しかしながら、２５０ｍｇ／ｋｇ／日の薬用量のＰＬＡＧは、微小胞脂肪変性を目に見えて低減させた。同じ程度ではないが、低用量ＰＬＡＧ処理マウス群も低下を呈した。

【0118】

ＯＲＯ染色により、ＳＴＺ単独群で肝臓ＴＧがより高含量であることを明らかにし、これはＰＬＡＧによって低減した。これらの結果は、ＰＬＡＧが用量依存的様式で肝脂肪変性を緩和することを示唆している。

【0119】

実施例３：肝臓および血漿のＴＧレベルの分析

【0120】

対照群および実験群の血漿に含まれるトリグリセリド（ＴＧ）の濃度を測定するために、眼出血（ｅｙｅ ｂｌｅｅｄｉｎｇ）により血液を採取し、３，０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によって血漿を分離した。血漿試料をアッセイまで凍結したままにした。

【0121】

図４は、小腸で吸収された脂肪が肝臓に影響を及ぼす機序の一例であり、図５は、本発明による組成物を使用したときの、肝臓および血漿中のＴＧのレベルおよび含量を示すチャート（図５のＡ）、ならびに門脈血漿中のａｐｏＢ４８タンパク質発現を示すチャート（図５のＢ）である。具体的には、肝細胞のトリグリセリド（ＴＧ）含量を測定するために、肝組織（２０ｍｇ）を、組織粉砕機を用いてイソプロパノール中で均質化した。ホモジネートを５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を回収した。上清のＴＧ含量は、トリグリセリドＨキット（Ｗａｋｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、米国バージニア州リッチモンド市）を用いて測定した。肝臓ＴＧの取り込みを確認するために、本発明者らは、体内での高ＴＧＣＭの輸送および取り込みのマーカーとして、門脈血におけるＡｐｏＢ４８発現を測定した。

【0122】

図５に示されるように、ＳＴＺ処理マウスのＡｐｏＢ４８レベルは、対照群と比較して高かった。しかしながら、ＰＬＡＧ処理は、ＡｐｏＢ４８レベルを用量依存的に低減させ、このことは、ＰＬＡＧが、末梢組織または全身へのＴＧの取り込みを増強することによって脂質代謝を改善したことを示した。

【0123】

実施例４：免疫組織化学的解析

【0124】

図６は、本発明による組成物を使用したときの、筋肉組織中のＴＧ含量を示すチャート（図６のＡ）、筋肉組織中のＬＰＬの相対的なｍＲＮＡ発現を示すチャート（図６のＢ）、および筋切片のＬＰＬ染色の代表的な免疫組織化学的画像を示す写真（図６のＣ）である。具体的には、ＴＧクリアランスの律速酵素であるリポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）は、ＣＭをはじめとする高ＴＧリポタンパク質の異化を制御する。ＰＬＡＧ処理後の末梢組織によるＴＧクリアランスを調べるために、筋肉組織内のＬＰＬタンパク質およびｍＲＮＡのレベルを調べた。

【0125】

図６に示すように、筋ＴＧ含量は群間で有意差がなかった（図６のＡ）。ＲＴ－ＰＣＲの結果は、ＬＰＬのｍＲＮＡ発現が対照群と比較してＳＴＺ群で低減したのに対し、高用量ＰＬＡＧ群では上昇したことを示した（図６のＢ）。

【0126】

免疫組織化学的性質は、対照群では豊富な発現を示し、ＳＴＺ処理動物では低下した。しかしながら、ＰＬＡＧ処置群におけるＬＰＬタンパク質発現は対照と同様であった。全体として、ｍＲＮＡおよびタンパク質の所見は、ＰＬＡＧが末梢組織におけるこの機能を回復させることによってＴＧクリアランスを誘導することを示唆している（図６のＣ）。

【0127】

実施例５：ウエスタンブロット法

【0128】

図７は、マウス由来の筋肉標本および骨格筋の重量を示すチャート（図７のＡ）、ならびに腓腹筋および大腿四頭筋をはじめとする含む筋肉組織におけるカベオリン３の相対的なｍＲＮＡ発現の結果（図７のＢ）、ならびに筋芽細胞および筋管におけるカベオリン３およびミオゲニンの相対的なｍＲＮＡ発現の結果（図７のＣ）である。具体的には、門脈血漿中のアポリポタンパク質Ｂ４８（ＡｐｏＢ４８）の相対量をウエスタンブロットにより評価した。一定量の血漿を５％ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で分離した。タンパク質抽出物をＡｐｏＢ４８抗体（１：５００，Ａｂｃａｍ，英国ケンブリッジ）により免疫ブロット法を施した。検出は、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ＨＲＰ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，米国マサチューセッツ州ビレリカ町）を用いて行った。

【0129】

図７に示すように、筋萎縮は、筋肉量の減少として定義され、ＳＴＺ誘発性糖尿病の状況で起こる。ＢＷと同様に、筋重量もまたＳＴＺ処理によって有意に低下した。ＰＬＡＧ処理は、筋肉量をわずかに改善したが、ＳＴＺ単独群とＰＬＡＧ群との間に有意差はなかった（図７のＡ）。

【0130】

それは、筋芽細胞から筋管への分化を測定することによって、筋機能に対するＰＬＡＧの効果を調べた。この形質転換は、形態および筋肉特異的遺伝子発現の変化を誘導する。本発明者らは、ＣＡＶ３およびミオゲニンのｍＲＮＡレベルがＳＴＺ処理Ｃ２Ｃ１２細胞で低下したが、ＰＬＡＧ処理はレベルを正常まで回復させたことを発見した（図５のＣ）。このことは、大腿四頭筋および腓腹筋をはじめとする筋肉組織からのインビボでの結果と一致する（図５のＢ）。これらの結果は、ＳＴＺが正常な筋芽細胞分化を損ない、ＰＬＡＧが筋機能の正常化を助ける可能性があることを示す。

【0131】

実施例６：ＰＬＡＧの特異性

【0132】

図８は、ＰＬＡＧおよびＰＬＧの構造化学式（図８のＡ）、ならびに各群の体重変化を示すチャート（図８のＢ）および肉眼的肝臓標本の写真（図８のＣ）、ならびにＨ＆Ｅ染色した肝臓切片の写真である。具体的には、ＳＴＺ誘発性マウスモデルにおけるＰＬＡＧおよびＰＬＧの効果を比較することによって、ＰＬＡＧの選択性を調べた。ＰＬＧはジアシルグリセロールの原型であり、ＰＬＡＧはアセチル化ジアシルグリセロールの一種である。後述の図８に示すように、ＰＬＡＧ処理マウスは、ＳＴＺのみを投与されたマウスと比較してＢＷの減少が少ないことを示した。ＳＴＺ群とＰＬＧ処理マウスとの間でＢＷに差はなかった（図８のＢ）。加えて、結果は、ＰＬＡＧが脂肪肝を減弱させることを示した。対照的に、肝損傷はＰＬＧによって低下しなかった（Ｃ＆Ｄ）。これらの結果は、ＰＬＡＧがＳＴＺ誘発性脂肪肝から肝臓を保護する上で具体的な役割を担っていることを示唆している。

【0133】

実施例７：ＲＮＡ単離およびＲＴ－ＰＣＲ分析

【0134】

ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｆａｖｏｒｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ，台湾）を使用して、個々のマウスの筋肉から全ＲＮＡを単離した。Ｍ－ＭＬＶ逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成した。各試料からの遺伝子発現を二連で分析し、内部対照遺伝子グリセルアルデヒド３－リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）に対して正規化した。ＧＡＰＤＨ、ＬＰＬ、カベオリン３およびミオゲニンのプライマー配列を以下の表１に示す。

【0135】

［表１］

【表1】

【0136】

実験例２：非アルコール性脂肪性肝炎のＳＴＡＭモデルにおけるＥＣ－１８の効果を検討するための実験群の準備

【0137】

非アルコール性脂肪性肝炎および肝線維症の処置のための１－パルミトイル－２－リノレオイル－３－アセチルグリセロール（ＥＣ－１８またはＰＬＡＧ）の有効性を決定するために、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）かつ高脂肪食（ＨＦＤ）由来モデルを用いて実験を行った。

【0138】

図９は、本発明の別の実験プロトコルであり、図９に示されるように、すべてのマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）は、出生時に２００μｇのストレプトゾトシン（ＳＴＺ）溶液を皮下注射され、４週齢後に高脂肪食（ＨＦＤ）を与えられた。マウス群をさらに６群、すなわち対照群（ＰＢＳ）、ＭＧＬ－３１９６処置群、オベチコール酸（ＯＣＡ）処置群、低ＥＣ－１８群、中ＥＣ－１８群および高ＥＣ－１８群へと無作為化した。ＥＣ－１８は、式２によって表される１－パルミトイル－２－リノレオイル－３－アセチル－ｒａｃ－グリセロールを使用し、ＭＧＬ－３１９６は、２－（３，５－ジクロロ－４－（（５－イソプロピル－６－オキソ－１，６－ジヒドロピリダジン－３－イル）オキシ）フェニル）－３，５－ジオキソ－２，３，４，５－テトラヒドロ－１，２，４－トリアジン－６－カルボニトリル（レスメチロム）を使用し、オベチコール酸（ＯＣＡ）は、６α－エチル－ケノデオキシコール酸（６－ＥＣＤＣＡ）を使用した。

【0139】

実施例８：体重および相対肝重量の解析

【0140】

図１０は、本発明による組成物を使用したときの体重の変化を示すグラフであり、図１１は、本発明による組成物を使用したときの体重（図１１のＡ）、肝重量（図１１のＢ）および肝重量対体重（図１１のＣ）を示すグラフである。具体的には、実験例２のマウスは、処理前の体重を記録し、毎日同じ時刻に体重を測定し、体重変化を記録した。各投与のおおよそ６０分後に、毒性、瀕死および死亡の有意な臨床徴候についてマウスを観察した。処理期間中、ＯＣＡ群および中ＥＣ－１８群の各々において１匹のマウスが死亡した。該マウスを９週目に屠殺した。マウスの相対肝重量および平均体重を以下の表２に示す。

【0141】

［表２］

【表2】

【0142】

図１０および１１ならびに表２に示されているように、屠殺日の平均体重において、対照群と処置群との間に有意差はなかった。ＭＧＬ－３１９６および低ＥＣ１８群は、対照群と比較して平均肝重量の有意な低下を示した。中ＥＣ－１８群の平均肝重量は、対照群と比較して低下する傾向にあった。ＯＣＡ群の肝臓対体重比は、ビヒクル群と比較して上昇する傾向にあり、ＭＧＬ－３１９６群の肝臓対体重比は対照群と比較して低下する傾向にあった。

【0143】

実施例９：血漿の生化学的性質の測定

【0144】

図１２は、本発明による組成物を使用したときの、血漿ＡＬＴ（Ａ）および血漿ＡＳＴ（Ｂ）およびＡＬＴ／ＡＳＴ比（Ｃ）を示すグラフである。具体的には、抗凝固薬（Ｎｏｖｏ－ヘパリン）含有ポリプロピレンチューブに非絶食血液を採取し、１，０００×ｇで１５分間、４℃で遠心分離した。血漿アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）および血漿アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）をＦＵＪＩ ＤＲＩ－ＣＨＥＭ７０００によって測定した。ＡＬＴ／ＡＳＴ比を計算し、以下の表３に示した。

【0145】

血漿ＡＬＴは、肝細胞内に多量に含有される酵素である。肝臓が損傷を受けると、血漿ＡＬＴ活性が上昇する。血漿ＡＬＴは、肝疾患の指標である。血漿ＡＬＴはまた、肝細胞の他に赤血球、骨格筋にも分布し、細胞が死滅／破壊されると血液中に放出される。

【0146】

［表３］

【表3】

【0147】

図１２および表３に示すように、対照群と処置群との間で血漿ＡＬＴレベルに有意差はなかった。対照群とその他の処置群との間で血漿ＡＳＴレベルに有意差はなかった（図１２のＡ）。ＯＣＡ群の血漿ＡＳＴレベルは、対照群と比較して低下する傾向にあった（図１２のＢ）。対照群とその他の処置群との間でＡＬＴ／ＡＳＴ比に有意差はなかった。ＯＣＡ群のＡＬＴ／ＡＳＴ比は、対照群と比較して上昇する傾向にあった（図１２のＣ）。

【0148】

実施例１０：組織学的解析

【0149】

図１３は、本発明による組成物を使用したときの、ヘマトキシリン・エオシンおよびオイルレッドＯで染色した肝臓切片の写真を示す。図１４は、本発明による組成物を使用したときの、ヘマトキシリン・エオシンおよびオイルレッドＯで染色した肝臓切片を示すグラフである。具体的には、ＮＡＦＬＤ活性スコア（ＮＡＳ）について、Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定を用いて統計解析を実行し、以下の表４に示す。加えて、各処置群のＮＡＳを統計解析した結果を表５に示す。

【0150】

ＮＡＳの数値では、０．０５未満のＰ値を統計学的に有意とみなした。他のデータについては、ボンフェローニ多重比較検定を用いて統計解析を実行した。０．０５未満のＰ値を統計学的に有意とみなした。片側ｔ検定が０．１未満のＰ値を返したとき、傾向変動または傾向を仮定した。すべての結果を平均±標準偏差として表した。ＮＡＳ値のスコアについての範囲を以下の表６に示す。

【0151】

［表４］

【表4】

【0152】

［表５］

【表5】

【0153】

［表６］

【表6】

【0154】

図１３および図１４ならびに先の表４に示すように、対照群の肝臓切片は、小滴性および大滴性の脂肪沈着、肝細胞の風船様拡大ならびに炎症性細胞浸潤を呈した。ＯＣＡ群および高ＥＣ－１８群は、対照群と比較してＮＡＳの有意な低下を示した。ＭＧＬ－３１９６群、低ＥＣ－１８群および中ＥＣ－１８群のＮＡＳは、対照群と比較して低下する傾向にあった。

【0155】

実施例１１：肝線維化に対する有効性を判定するための組織学的解析

【0156】

実験例１で使用したマウスの肝細胞を同じ様式で使用した。図１５は、ＨＥ染色した肝臓切片の顕微鏡写真である。具体的には、コラーゲン沈着を可視化するために、Ｂｏｕｉｎ固定された肝臓切片を、ピクロシリウスレッド溶液を用いて染色した。線維化領域の定量解析のために、シリウスレッド染色切片の明視野画像を、デジタルカメラを２００倍の倍率で使用して、中心静脈の周りで無作為にとらえた。

【0157】

図１６は、本発明による組成物を使用したときの肝臓組織の線維部分（シリウスレッド陽性面積）を示すグラフである。具体的には、ピクロシリウスレッド液を用いて染色した肝臓切片において、線維化部位を観察し、その部分の数値を以下の表７に示した。

【0158】

［表７］

【表7】

【0159】

図１５および表７に示すように、対照群の肝臓切片は、肝小葉の中心周囲領域におけるコラーゲン沈着の上昇を示した。ＯＣＡ群および高ＥＣ－１８群は、対照群と比較して線維化領域（シリウスレッド陽性面積）の有意な低下を示した。ＭＧＬ－３１９６および低ＥＣ－１８群における線維化面積は、ビヒクル群と比較して低下する傾向にあった。ビヒクル群と中ＥＣ－１８群との間で線維化面積に有意差はなかった。

【0160】

実施例に示すように、低ＥＣ－１８および高ＥＣ－１８は、ＮＡＳおよび線維化面積における統計的な低減を示し、中ＥＣ－１８は対照群と比較してＮＡＳにおける統計的な低減を示した。結論として、ＥＣ－１８は、抗ＮＡＳＨ効果および抗線維化効果の特色を示した。

【0161】

実施例１２：非アルコール性脂肪性肝炎のＳＴＡＭ（商標）マウスモデルにおけるＥＣ－１８のインビボでの有効性の試験

【0162】

非アルコール性脂肪性肝炎のＳＴＡＭモデルにおけるＥＣ－１８のインビボでの有効性の試験を追加で行った。

【0163】

用語
ＣＫ－１８：サイトケラチン１８
ＭＣＰ ：単球走化性タンパク質
ＮＡＳＨ ：非アルコール性脂肪性肝炎
ＯＣＡ ：オベチコール酸
ＰＢＳ ：リン酸緩衝生理塩類溶液
ＳＤ ：標準偏差
ＳＭＡ ：平滑筋アクチン
ＳＴＡＭ ：Ｓｔｅｌｉｃ動物モデル
ＴＧＦ ：形質転換成長因子
ＴＩＭＰ ：メタロプロテイナーゼ組織阻害剤
ＴＮＦ ：腫瘍壊死因子

【0164】

材料および方法
試料
以下の群の肝臓および血漿の試料を使用した。
第１の群：ビヒクル
８匹のＮＡＳＨマウスに、ビヒクル（ＰＢＳ）を５ｍＬ／ｋｇの量で１日１回、６週齢から９週齢まで経口投与した。
第２の群：ＭＧＬ－３１９６
８匹のＮＡＳＨマウスに、３ｍｇ／ｋｇの用量で（５ｍＬ／ｋｇの量で）ＭＧＬ－３１９６を補充した［水中２％Ｋｌｕｃｅｌ ＬＦ、０．１％Ｔｗｅｅｎ８０］を、６週齢から９週齢まで１日１回経口投与した。
第３の群：ＯＣＡ
７匹のＮＡＳＨマウスに、３０ｍｇ／ｋｇの高用量の（５ｍＬ／ｋｇの量の）ＯＣＡを補充した［１％メチルセルロース］を６週齢から９週齢まで１日１回経口投与した。
第４の群：ＥＣ－１８ ３０ｍｇ／ｋｇ
８匹のＮＡＳＨマウスに、３０ｍｇ／ｋｇの用量の（５ｍＬ／ｋｇの量の）ＥＣ－１８を補充したビヒクルを６週齢から９週齢まで１日１回経口投与した。
第５の群：ＥＣ－１８ １００ｍｇ／ｋｇ
７匹のＮＡＳＨマウスに、１００ｍｇ／ｋｇの用量の（５ｍＬ／ｋｇの量の）ＥＣ－１８を補充したビヒクルを６週齢から９週齢まで１日１回経口投与した。
第６の群：ＥＣ－１８ ２５０ｍｇ／ｋｇ
８匹のＮＡＳＨマウスに、２５０ｍｇ／ｋｇの用量の（５ｍＬ／ｋｇの量の）ＥＣ－１８を補充したビヒクルを６週齢から９週齢まで１日１回経口投与した。

【0165】

肝トリグリセリド含量の測定
肝臓全脂質抽出物をＦｏｌｃｈの方法（Ｆｏｌｃｈ Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９５７：２２６：４９７）によって得た。肝臓試料をクロロホルム－メタノール（２：１（ｖ／ｖ））中で均質化し、室温で一晩インキュベートした。クロロホルム－メタノール－水（８：４：３（ｖ／ｖ／ｖ））で洗浄した後、抽出物を蒸発乾固させ、イソプロパノール中に溶解した。肝トリグリセリド含量をトリグリセリドＥ－検査キット（富士フィルム和光純薬工業株式会社、日本国）によって測定した。

【0166】

血漿ＣＫ－１８レベルの測定
血漿ＣＫ－１８レベルをマウスサイトケラチン１８－Ｍ３０ ＥＬＩＳＡキット（Ｃｕｓａｂｉｏ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ．，Ｌｔｄ，中国）によって定量した。

【0167】

組織学的解析
免疫組織化学用に、Ｔｉｓｓｕｅ－Ｔｅｋ Ｏ．Ｃ．Ｔ．コンパウンド中に包埋した凍結肝臓組織の切片を切り出し、アセトン中で固定した。内在性ペルオキシダーゼ活性を、０．０３％Ｈ２Ｏ２を用いて５分間遮断し、続いてＢｌｏｃｋ Ａｃｅ（ＤＳ Ｐｈａｒｍａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｌｔｄ、日本国）と共に１０分間インキュベートした。切片を抗Ｆ４／８０抗体と共に室温で１時間インキュベートした。次に、切片をビオチン結合二次抗体（ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ Ｅｌｉｔｅ ＡＢＣキット、Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓｍＩｎｃ．米国）、続いてＡＢＣ試薬と各々室温で３０分間インキュベートした。３，３’－ジアミノベンジジン／Ｈ２Ｏ２溶液（ニチレイバイオサイエンス株式会社、日本国）を用いて酵素基質反応を行った。炎症領域の定量解析のために、デジタルカメラ（ＤＦＣ２９５、Ｌｅｉｃａ）を用いて２００倍の倍率でＦ４／８０免疫染色切片の明視野画像を中心静脈周辺で捕捉し、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（米国国立衛生研究所）を用いて５視野／切片の陽性面積を測定した。一次抗体および二次抗体のプロファイルを表８に示す。

【0168】

［表８］

【表8】

【0169】

定量的ＲＴ－ＰＣＲ
全ＲＮＡを、ＲＮＡｉｓｏ（タカラバイオ、日本国）を製造元の説明書によって使用して肝臓試料から抽出した。４．４ｍＭのＭｇＣｌ２（Ｆ．Ｈｏｆｆｍａｎｎ－Ｌａ Ｒｏｃｈｅ、スイス国）、４０ＵのＲＮアーゼ阻害剤（東洋紡、日本国）、０．５ｍＭのｄＮＴＰ（プロメガ、米国）、６．２８μＭのランダムヘキサマー（Ｐｒｏｍｅｇａ）、５×第一の鎖の緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）、１０ｍＭのジチオトレイトール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）および２００ＵのＭＭＬＶ－ＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を２０μＬの最終量で含有する反応混合物を使用して、１μｇのＲＮＡを逆転写した。反応は、３７℃で１時間、続いて９９℃で５分間行った。リアルタイムＰＣＲ ＤＩＣＥおよびＴＢ Ｇｒｅｅｎ（商標）Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（商標）ＩＩ（タカラバイオ）を使用してリアルタイムＰＣＲを行った。相対的なｍＲＮＡ発現レベルを計算するために、各遺伝子の発現を参照遺伝子３６Ｂ４（遺伝子記号：Ｒｐｌｐ０）の発現に対して正規化した。ＰＣＲ－プライマーセットおよびプレートレイアウトの情報を表９～表１０において説明した。

【0170】

［表９］ＰＣＲプライマー

【表9】

【0171】

［表１０］ＰＣＲプレート

【表10】

【0172】

統計的検定
統計解析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．，米国）に対するボンフェローニ多重比較検定を用いて行った。０．０５未満のＰ値を統計学的に有意とみなした。片側ｔ検定が０．１未満のＰ値を返したとき、傾向変動または傾向を仮定した。結果を平均±標準偏差として表した。

【0173】

結果
生化学的性質
肝トリグリセリド（図１７および表１１）
ＭＧＬ－３１９６群は、ビヒクル群と比較して肝トリグリセリド含量の有意な低下を示した。ＥＣ－１８ １００ｍｇ／ｋｇ群およびＥＣ－１８ ２５０ｍｇ／ｋｇ群における肝トリグリセリド含量は、ビヒクル群と比較して低下する傾向にあった。ビヒクル群とその他の処置群との間で肝トリグリセリド含量に有意差はなかった。

【0174】

血漿ＣＫ－１８（図１８および表１１）
ＥＣ－１８ ３０ｍｇ／ｋｇ、ＥＣ－１８ １００ｍｇ／ｋｇおよびＥＣ－１８ ２５０ｍｇ／ｋｇ群は、ビヒクル群と比較して血漿ＣＫ－１８レベルの有意な低下を示した。ＯＣＡ群の血漿ＣＫ－１８レベルは、ビヒクル群と比較して低下する傾向にあった。ビヒクル群とＭＧＬ－３１９６群との間で血漿ＣＫ－１８レベルに有意差はなかった。

【0175】

［表１１］

【表11】

【0176】

Ｆ４／８０免疫染色および炎症領域（図１９～図２０および表１２）
Ｆ４／８０免疫染色切片の代表的な顕微鏡写真を図２．１に示す。ビヒクル群の肝臓切片のＦ４／８０免疫染色は、肝小葉におけるＦ４／８０＋細胞の蓄積を実証した。ＯＣＡ群およびＥＣ－１８ ２５０ｍｇ／ｋｇ群は、ビヒクル群と比較して炎症領域（Ｆ４／８０陽性面積）の有意な低下を示した。ＥＣ－１８ ３０ｍｇ／ｋｇ群およびＥＣ－１８ １００ｍｇ／ｋｇ群における炎症領域は、ビヒクル群と比較して低下する傾向にあった。

【0177】

［表１２］組織学的解析

【表12】

【0178】

遺伝子発現解析（図２１および表１３）
ＭＣＰ－１
ＭＧＬ－３１９６群におけるＭＣＰ－１ｍＲＮＡ発現レベルは、ビヒクル群と比較して下方調節する傾向にあった。ビヒクル群とその他の処置群との間でＭＣＰ－１ｍＲＮＡ発現レベルに有意差はなかった。

【0179】

ＴＮＦ－α
ビヒクル群といずれの処置群との間でもＴＮＦ－α ｍＲＮＡ発現レベルに有意差はなかった。

【0180】

ＴＧＦ－β
ＭＧＬ－３１９６群におけるＴＧＦ－βｍＲＮＡ発現レベルは、ビヒクル群と比較して下方調節する傾向にあった。ビヒクル群とその他の処置群との間でＴＧＦ－βｍＲＮＡ発現レベルに有意差はなかった。

【0181】

ＴＩＭＰ－１
ビヒクル群といずれの処置群との間でＴＩＭＰ－１ｍＲＮＡ発現レベルに有意差はなかった。

【0182】

α－ＳＭＡ
ビヒクル群といずれの処置群との間でα－ＳＭＡｍＲＮＡ発現レベルに有意差はなかった。

【0183】

［表１３］遺伝子発現解析

【表13】

【0184】

概要
ＭＧＬ－３１９６
ＭＧＬ－３１９６による処理は、ビヒクル群と比較して、肝トリグリセリド含量の有意な低下、ならびにＭＣＰ－１およびＴＧＦ－β ｍＲＮＡ発現レベルの低下傾向を示した。

【0185】

ＯＣＡ
ＯＣＡによる処理は、ビヒクル群と比較して、炎症領域の有意な低下、および血漿ＣＫ－１８レベルの低下傾向を示した。

【0186】

ＥＣ－１８
３０ｍｇ／ｋｇの用量でのＥＣ－１８による処置は、ビヒクル群と比較して血漿ＣＫ－１８レベルの有意な低下、および炎症領域の低下傾向を示した。１００ｍｇ／ｋｇの用量でのＥＣ－１８による処置は、ビヒクル群と比較して血漿ＣＫ－１８レベルの有意な低下、ならびに肝トリグリセリド含量および炎症領域の低下傾向を示した。２５０ｍｇ／ｋｇの用量でのＥＣ－１８による処置は、ビヒクル群と比較して血漿ＣＫ－１８レベルおよび炎症領域の有意な低下、ならびに肝トリグリセリド含量の低下傾向を示した。

【0187】

本明細書で言及されるすべての文書は、参照により本明細書に完全に組み込まれる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21-1】

【図21-2】

【国際調査報告】