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特表2022-523540４－ヒドロキシメチルフルフラールおよびその誘導体のインビボ合成のための方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-04-25
(54)【発明の名称】４－ヒドロキシメチルフルフラールおよびその誘導体のインビボ合成のための方法
(51)【国際特許分類】
C12P 17/04 20060101AFI20220418BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20220418BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20220418BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20220418BHJP
C07D 307/68 20060101ALI20220418BHJP
C08G 63/672 20060101ALI20220418BHJP
C12N 9/16 20060101ALN20220418BHJP
C12N 9/04 20060101ALN20220418BHJP
C12N 15/53 20060101ALN20220418BHJP
C12N 15/55 20060101ALN20220418BHJP
C07D 307/46 20060101ALN20220418BHJP
【ＦＩ】
C12P17/04 ZNA
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C07D307/68
C08G63/672
C12N9/16 B
C12N9/04
C12N15/53
C12N15/55
C07D307/46
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021551764
(86)(22)【出願日】2020-03-02
(85)【翻訳文提出日】2021-10-05
(86)【国際出願番号】 BR2020050064
(87)【国際公開番号】W WO2020176958
(87)【国際公開日】2020-09-10
(31)【優先権主張番号】62/812,904
(32)【優先日】2019-03-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】319007767
【氏名又は名称】ブラスケム エス．エー．
(74)【代理人】
【識別番号】100102978
【弁理士】
【氏名又は名称】清水 初志
(74)【代理人】
【識別番号】100102118
【弁理士】
【氏名又は名称】春名 雅夫
(74)【代理人】
【識別番号】100160923
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 裕孝
(74)【代理人】
【識別番号】100119507
【弁理士】
【氏名又は名称】刑部 俊
(74)【代理人】
【識別番号】100142929
【弁理士】
【氏名又は名称】井上 隆一
(74)【代理人】
【識別番号】100148699
【弁理士】
【氏名又は名称】佐藤 利光
(74)【代理人】
【識別番号】100128048
【弁理士】
【氏名又は名称】新見 浩一
(74)【代理人】
【識別番号】100129506
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 智彦
(74)【代理人】
【識別番号】100205707
【弁理士】
【氏名又は名称】小寺 秀紀
(74)【代理人】
【識別番号】100114340
【弁理士】
【氏名又は名称】大関 雅人
(74)【代理人】
【識別番号】100121072
【弁理士】
【氏名又は名称】川本 和弥
(72)【発明者】
【氏名】ラドワーン アレクサンドリノ パウロ モイゼス
(72)【発明者】
【氏名】エストラーダ ゴウヴェイア イウリ
(72)【発明者】
【氏名】レイテ ケイロス ヴェロニカ
【テーマコード（参考）】
4B050
4B064
4B065
4C037
4J029
【Ｆターム（参考）】
4B050CC07
4B050DD02
4B050DD04
4B050KK06
4B050LL05
4B064AD09
4B064CC24
4B064DA16
4B065AA01X
4B065AA01Y
4B065AA57X
4B065AA57Y
4B065AA72X
4B065AA72Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065BB16
4B065BB17
4B065BB18
4B065CA10
4C037HA20
4C037MA01
4J029AA03
4J029AB01
4J029AB07
4J029CF19
4J029HB01
4J029KE17
(57)【要約】
本開示は、炭素源からの４－ＨＭＦ、２，４－フランジメタノール、フラン－２，４－ジカルボアルデヒド、４－（ヒドロキシメチル）フロン酸、２－ホルミルフラン－４－カルボキシレート、４－ホルミルフラン－２－カルボキシレート、および／または２，４－ＦＤＣＡの産生のための組換え微生物および方法を提供する。本方法は、炭素源の、４－ＨＭＦ、２，４－フランジメタノール、フラン－２，４－ジカルボアルデヒド、４－（ヒドロキシメチル）フロン酸、２－ホルミルフラン－４－カルボキシレート、４－ホルミルフラン－２－カルボキシレート、および／もしくは２，４－ＦＤＣＡへの変換を触媒する内因性ならびに／または外因性核酸分子を発現する操作された微生物を提供する。本開示はさらに、４－ＨＭＦ、２，４－フランジメタノール、フラン－２，４－ジカルボアルデヒド、４－（ヒドロキシメチル）フロン酸、２－ホルミルフラン－４－カルボキシレート、４－ホルミルフラン－２－カルボキシレート、および／または２，４－ＦＤＣＡから誘導されるポリマーを産生する方法を提供する。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
グリセルアルデヒド３－リン酸（Ｇ３Ｐ）を２，４－フランジカルボン酸（２，４－ＦＤＣＡ）に酵素的に変換することによって２，４－フランジカルボン酸（２，４－ＦＤＣＡ）を産生する方法であって、前記方法が、（ａ）Ｇ３Ｐの（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートへの変換を触媒するメチルホスフェートシンターゼの存在下で、Ｇ３Ｐを提供することと、
（ｂ）（ａ）からの前記（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートに、前記（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートの４－ヒドロキシメチルフルフラール（４－ＨＭＦ）への変換を触媒するホスファターゼを提供することと、
（ｃ）（ｂ）からの４－ＨＭＦの２，４ ＦＤＣＡへの酸化を、直接的にもしくは中間体であるフラン－２，４－ジカルボアルデヒド、４－（ヒドロキシメチル）フロン酸、４－ホルミルフラン－２－カルボキシレート、４－ホルミルフラン－２－カルボキシレート、２－ホルミルフラン－４－カルボキシレートの産生を介して、独立してもしくは相乗的に触媒するデヒドロゲナーゼおよび／またはオキシダーゼに、（ｂ）からの前記４－ＨＭＦを提供することと
を含む、方法。
【請求項2】
前記２，４－ＦＤＣＡが、フラン－２，４－ジカルボアルデヒド、および／または－（ヒドロキシメチル）フロン酸中間体から産生され、（ａ）デヒドロゲナーゼ、オキシダーゼ、またはペルオキシゲナーゼが、前記４－ＨＭＦの、フラン－２，４－ジカルボアルデヒド、および／または４－（ヒドロキシメチル）フロン酸への前記変換を触媒する、ならびに／あるいは
（ｂ）デヒドロゲナーゼ、オキシダーゼ、またはペルオキシゲナーゼが、（ａ）からの前記フラン－２，４－ジカルボアルデヒドの４－ホルミルフラン－２－カルボキシレートへの前記変換を触媒する、ならびに／あるいは
（ｃ）デヒドロゲナーゼ、オキシダーゼ、またはペルオキシゲナーゼが、（ａ）からの前記４－（ヒドロキシメチル）フロン酸の４－ホルミルフラン－２－カルボキシレートへの前記変換を触媒する、ならびに／あるいは
（ｄ）デヒドロゲナーゼ、オキシダーゼ、またはペルオキシゲナーゼが、（ａ）からの前記フラン－２，４－ジカルボアルデヒドの２－ホルミルフラン－４－カルボキシレートへの前記変換を触媒する、ならびに／あるいは
（ｅ）デヒドロゲナーゼ、オキシダーゼ、またはペルオキシゲナーゼが、（ｂ）および／もしくは（ｃ）からの前記４－ホルミルフラン－２－カルボキシレートの、または（ｄ）からの前記２－ホルミルフラン－４－カルボキシレートの２，４－ＦＤＣＡへの前記変換を触媒する、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
（ａ）からの前記メチルホスフェートシンターゼが、ＥＣ番号４．２．３．１５３として分類される、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記メチルホスフェートシンターゼが、（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートシンターゼである、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートシンターゼが、ＭｆｎＢ１、ＭｆｎＢ７、およびＭｆｎＢ１４から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートシンターゼが、配列番号１、配列番号７、または配列番号１４を含むアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
（ｂ）からの前記ホスファターゼが、ＥＣ番号３．１．３として分類される、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
前記ホスファターゼが、ハロ酸デハロゲナーゼとして分類される、請求項５に記載の方法。
【請求項9】
前記ホスファターゼが、宿主内因性である、請求項１に記載の方法。
【請求項10】
前記宿主内因性の前記ホスファターゼ酵素が、過剰発現される、請求項１１に記載の方法。
【請求項11】
前記ホスファターゼが、４－ＨＭＦホスファターゼである、請求項５～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
前記４－ＨＭＦホスファターゼが、ストレプトミセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、またはエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に由来する、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記４－ＨＭＦホスファターゼが、配列番号２８、配列番号４０～５２のうちのいずれか１つ、または配列番号５３～６８のうちのいずれか１つ、を含むアミノ酸配列によってコードされている、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項14】
（ｃ）からの前記デヒドロゲナーゼが、ＥＣ番号１．１．１．またはＥＣ番号１．２．１として分類される、請求項１に記載の方法。
【請求項15】
前記デヒドロゲナーゼが、アルコールデヒドロゲナーゼまたはアルデヒドデヒドロゲナーゼである、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
（ｃ）からの前記オキシダーゼが、ＥＣ番号１．１．３として分類される、請求項１に記載の方法。
【請求項17】
前記オキシダーゼが、５－ヒドロキシメチルフルフラールオキシダーゼである、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
前記デヒドロゲナーゼが、ＥＣ番号１．２．１．またはＥＣ番号１．１．１として分類される、請求項２に記載の方法。
【請求項19】
前記デヒドロゲナーゼが、アルデヒドデヒドロゲナーゼまたはアルコールデヒドロゲナーゼである、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
前記オキシダーゼが、ＥＣ番号１．１．３として分類される、請求項２に記載の方法。
【請求項21】
前記オキシダーゼが、５－ヒドロキシメチルフルフラールオキシダーゼである、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
前記オキシダーゼが、４－ＨＭＦオキシダーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項23】
前記４－ＨＭＦオキシダーゼが、ＨｍｆＨ６およびＨｍｆＨ７から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
前記４－ＨＭＦオキシダーゼが、配列番号８５または配列番号８６を含むアミノ酸配列を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項25】
前記デヒドロゲナーゼが、ＥＣ番号１．２．１として分類される、請求項２に記載の方法。
【請求項26】
前記デヒドロゲナーゼが、アルデヒドデヒドロゲナーゼである、請求項２５に記載の方法。
【請求項27】
炭素源を含む原料から２，４－フランジカルボン酸（２，４－ＦＤＣＡ）を産生することができる組換え微生物であって、前記組換え微生物が、以下の：（ａ）炭素源をグリセルアルデヒド３－リン酸（Ｇ３Ｐ）に変換することができる内因性および／または外因性核酸分子、
（ｂ）（ａ）からのＧ３Ｐの（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートへの変換を触媒する（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートシンターゼをコードする少なくとも１つの内因性または外因性核酸分子、
（ｃ）（ｂ）からの（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートの４－ヒドロキシメチルフルフラール（４－ＨＭＦ）への変換を触媒するホスファターゼをコードする少なくとも１つの内因性または外因性核酸分子、
（ｄ）（ｃ）からの４－ＨＭＦの２，４ ＦＤＣＡへの酸化を、直接的にもしくは中間体であるフラン－２，４－ジカルボアルデヒド、４－（ヒドロキシメチル）フロン酸、４－ホルミルフラン－２－カルボキシレート、４－ホルミルフラン－２－カルボキシレート、２－ホルミルフラン－４－カルボキシレートの産生を介して、独立してもしくは相乗的に触媒するペルオキシゲナーゼ、デヒドロゲナーゼまたはオキシダーゼをコードする少なくとも１つの内因性または外因性核酸分子
を発現する、組換え微生物。
【請求項28】
前記炭素源が、ヘキソース、ペントース、グリセロール、Ｃ０２、スクロース、および／またはこれらの組み合わせを含む、請求項２７に記載の組換え微生物。
【請求項29】
（ａ）からの前記メチルホスフェートシンターゼが、ＥＣ番号４．２．３．１５３として分類される、請求項２７に記載の組換え微生物。
【請求項30】
前記シンターゼが、（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートシンターゼである、請求項２９に記載の組換え微生物。
【請求項31】
（ｃ）からの前記ホスファターゼが、ＥＣ番号３．１．３として分類される、請求項２７に記載の組換え微生物。
【請求項32】
前記ホスファターゼが、ハロ酸デハロゲナーゼとして分類される、請求項３１に記載の組換え微生物。
【請求項33】
前記ホスファターゼが、宿主内因性である、請求項３１に記載の組換え微生物。
【請求項34】
前記宿主内因性のホスファターゼ酵素が過剰発現される、請求項３３に記載の組換え微生物。
【請求項35】
（ｄ）からの前記オキシダーゼが、ＥＣ番号１．１．３として分類される、請求項２７に記載の組換え微生物。
【請求項36】
（ｄ）からの前記オキシダーゼが、５－ヒドロキシメチルフルフラールオキシダーゼである、請求項３５に記載の組換え微生物。
【請求項37】
（ｄ）からの前記デヒドロゲナーゼが、ＥＣ番号１．１．１またはＥＣ番号１．２．１として分類される、請求項３６に記載の組換え微生物。
【請求項38】
前記デヒドロゲナーゼが、アルコールデヒドロゲナーゼまたはアルデヒドデヒドロゲナーゼである、請求項３７に記載の組換え微生物。
【請求項39】
前記２，４－ＦＤＣＡが、フラン－２，４－ジカルボアルデヒド、および／または－（ヒドロキシメチル）フロン酸中間体から産生され、（ａ）デヒドロゲナーゼ、オキシダーゼ、またはペルオキシゲナーゼが、（ｃ）からの前記４－ＨＭＦのフラン－２，４－ジカルボアルデヒドへの、および／または４－（ヒドロキシメチル）フロン酸への前記変換を触媒する、ならびに／あるいは
（ｂ）デヒドロゲナーゼ、オキシダーゼ、またはペルオキシゲナーゼが、（ａ）からの前記フラン－２，４－ジカルボアルデヒドの４－ホルミルフラン－２－カルボキシレートへの前記変換を触媒する、ならびに／あるいは
（ｃ）デヒドロゲナーゼ、オキシダーゼ、またはペルオキシゲナーゼが、（ｂ）からの前記４－（ヒドロキシメチル）フロン酸の４－ホルミルフラン－２－カルボキシレートへの前記変換を触媒する、ならびに／あるいは
（ｄ）デヒドロゲナーゼ、オキシダーゼ、またはペルオキシゲナーゼが、（ｃ）からの前記フラン－２，４－ジカルボアルデヒドの２－ホルミルフラン－４－カルボキシレートへの前記変換を触媒する、ならびにあるいは
（ｅ）デヒドロゲナーゼ、オキシダーゼ、またはペルオキシゲナーゼが、（ｂ）および／もしくは（ｃ）からの前記４－ホルミルフラン－２－カルボキシレートの、または（ｄ）からの前記２－ホルミルフラン－４－カルボキシレートの２，４－ＦＤＣＡへの前記変換を触媒する、請求項２７に記載の組換え微生物。
【請求項40】
（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、および／または（ｅ）からの前記デヒドロゲナーゼが、ＥＣ番号１．２．１．またはＥＣ番号１．１．１として分類される、請求項３９に記載の組換え微生物。
【請求項41】
前記デヒドロゲナーゼが、アルデヒドデヒドロゲナーゼまたはアルコールデヒドロゲナーゼである、請求項４０に記載の組換え微生物。
【請求項42】
（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および／または（ｅ）からの前記オキシダーゼが、ＥＣ番号１．１．３として分類される、請求項３９に記載の組換え微生物。
【請求項43】
前記オキシダーゼが、５－（ヒドロキシメチル）フルフラールオキシダーゼである、請求項４２に記載の組換え微生物。
【請求項44】
前記１つ以上の組換え微生物が、クロストリジウム属の種（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．）、クロストリジウム・リュングダリイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ）、クロストリジウム・オートエタノゲナム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ）、クロストリジウム・ラグスダレイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｇｓｄａｌｅｉ）、ユーバクテリウム・リノサム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｍｏｓｕｍ）、ブチリバクテリウム・メチロトロフィカム（Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）、ムーレラ・サーモアセチカ（Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、クロストリジウム・アセチカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｉｃｕｍ）、アセトバクテリウム・ウッディイ（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｗｏｏｄｉｉ）、アルカリバクルム・バッキ（Ａｌｋａｌｉｂａｃｕｌｕｍ ｂａｃｃｈｉｉ）、クロストリジウム・ドラケイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｒａｋｅｉ）、クロストリジウム・カルボキシジボランス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ）、クロストリジウム・フォルミコアセティカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｆｏｒｍｉｃｏａｃｅｔｉｃｕｍ）、クロストリジウム・スカトロゲネス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｃａｔｏｌｏｇｅｎｅｓ）、モーレラ・サーモオートトロフィカ（Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ）、アセトネマ・ロンガム（Ａｃｅｔｏｎｅｍａ ｌｏｎｇｕｍ）、ブラウティア・プロダクタ（Ｂｌａｕｔｉａ ｐｒｏｄｕｃｔａ）、クロストリジウム・グリコリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｌｙｃｏｌｉｃｕｍ）、クロストリジウム・マグナム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｍａｇｎｕｍ）、カンジダ・クルゼイ（Ｃａｎｄｉｄａ ｋｒｕｓｅｉ）、クロストリジウム・マヨムベイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｍａｙｏｍｂｅｉ）、クロストリジウム・メソオキシベンゾボランス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｍｅｔｈｏｘｙｂｅｎｚｏｖｏｒａｎｓ）、クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、クロストリジウム・ベイジェリンキイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）、オキソバクター・フェニジイ（Ｏｘｏｂａｃｔｅｒ ｐｆｅｎｎｉｇｉｉ）、サーモアナエロバクター・キブイ（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｋｉｖｕｉ）、スポロミュサ・オバータ（Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｏｖａｔａ）、サーモアセトゲニウム・フェウム（Ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｏｇｅｎｉｕｍ ｐｈａｅｕｍ）、アセトバクテリウム・カービノリカム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｒｂｉｎｏｌｉｃｕｍ）、イサチェンキア・オリエンタリス（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）、スポロミュサ・ターミティダ（Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｔｅｒｍｉｔｉｄａ）、モーレラ・グリセリニ（Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｇｌｙｃｅｒｉｎｉ）、ユーバクテリウム・アグレガンス（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｇｇｒｅｇａｎｓ）、トレポネーマ・アゾトニュートリシウム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ａｚｏｔｏｎｕｔｒｉｃｉｕｍ）、ピキア・クドリアヴゼヴィイ（Ｐｉｃｈｉａ ｋｕｄｒｉａｖｚｅｖｉｉ）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）、バチルス属の種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）、コリネバクテリウム属の種（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、シェフェルソマイセス・スティピティス（Ｓｃｈｅｆｆｅｒｓｏｍｙｃｅｓ ｓｔｉｐｉｔｉｓ）、およびテリスポロバクター・グリコリカス（Ｔｅｒｒｉｓｐｏｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌｙｃｏｌｉｃｕｓ）からなる群から選択される親微生物に由来する、請求項２７に記載の組換え微生物。
【請求項45】
前記１つ以上の組換え微生物が、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｇｓｄａｌｅｉ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｍｏｓｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｉｃｕｍ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｗｏｏｄｉｉ、Ａｌｋａｌｉｂａｃｕｌｕｍ ｂａｃｃｈｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｒａｋｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｆｏｒｍｉｃｏａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｃａｔｏｌｏｇｅｎｅｓ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ、Ａｃｅｔｏｎｅｍａ ｌｏｎｇｕｍ、Ｂｌａｕｔｉａ ｐｒｏｄｕｃｔａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｌｙｃｏｌｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｍａｇｎｕｍ、Ｃａｎｄｉｄａ ｋｒｕｓｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｍａｙｏｍｂｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｍｅｔｈｏｘｙｂｅｎｚｏｖｏｒａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ、Ｏｘｏｂａｃｔｅｒ ｐｆｅｎｎｉｇｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｋｉｖｕｉ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｏｖａｔａ、Ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｏｇｅｎｉｕｍ ｐｈａｅｕｍ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｒｂｉｎｏｌｉｃｕｍ、Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｔｅｒｍｉｔｉｄａ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｇｌｙｃｅｒｉｎｉ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｇｇｒｅｇａｎｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ａｚｏｔｏｎｕｔｒｉｃｉｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ ｋｕｄｒｉａｖｚｅｖｉｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｓｃｈｅｆｆｅｒｓｏｍｙｃｅｓ ｓｔｉｐｉｔｉｓ、およびＴｅｒｒｉｓｐｏｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌｙｃｏｌｉｃｕｓからなる群から選択される親微生物に由来する、請求項４４に記載の組換え微生物。
【請求項46】
請求項２７に記載の組換え微生物を使用して２，４－ＦＤＣＡを産生する方法であって、前記方法が、前記２，４－ＦＤＣＡが産生されるまで、炭素源を提供する原料を含有する培養培地で前記組換え微生物を培養することを含む、方法。
【請求項47】
炭素源を含む原料から２，４－ＦＤＣＡを産生することができる組換え微生物を産生する方法であって、前記方法が、前記組換え微生物に、以下の：（ａ）グリセロールまたは単糖をグリセルアルデヒド３－リン酸（Ｇ３Ｐ）に変換することができる内因性および／または外因性核酸分子、
（ｂ）（ａ）からのＧ３Ｐの（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートへの前記変換を触媒する（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートシンターゼをコードする少なくとも１つの内因性または外因性核酸分子、
（ｃ）（ｂ）からの（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートの４－ヒドロキシメチルフルフラール（４－ＨＭＦ）への前記変換を触媒するホスファターゼをコードする少なくとも１つの内因性または外因性核酸分子、
（ｄ）（ｃ）からの４－ＨＭＦの２，４ ＦＤＣＡへの酸化を、直接的にもしくは中間体フラン－２，４－ジカルボアルデヒド、４－（ヒドロキシメチル）フロン酸、４－ホルミルフラン－２－カルボキシレート、４－ホルミルフラン－２－カルボキシレート、２－ホルミルフラン－４－カルボキシレートの産生を介して、独立してもしくは相乗的に触媒する、ペルオキシゲナーゼ、デヒドロゲナーゼ、またはオキシダーゼをコードする少なくとも１つの内因性または外因性核酸分子
を導入することおよび／あるいは過剰発現させることを含む、方法。
【請求項48】
前記炭素源が、ヘキソース、ペントース、グリセロール、Ｃ０２、スクロース、および／またはこれらの組み合わせを含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項49】
（ａ）からの前記メチルホスフェートシンターゼが、ＥＣ番号４．２．３．１５３として分類される、請求項４７に記載の方法。
【請求項50】
前記シンターゼが、（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートシンターゼである、請求項４９に記載の方法。
【請求項51】
（ｃ）からの前記ホスファターゼが、ＥＣ番号３．１．３として分類される、請求項４７に記載の方法。
【請求項52】
前記ホスファターゼが、ハロ酸デハロゲナーゼとして分類される、請求項５１に記載の方法。
【請求項53】
前記ホスファターゼが、宿主内因性である、請求項４７に記載の方法。
【請求項54】
前記宿主内因性のホスファターゼ酵素が、過剰発現される、請求項５３に記載の方法。
【請求項55】
（ｄ）からの前記デヒドロゲナーゼが、ＥＣ番号１．１．１．またはＥＣ番号１．２．１として分類される、請求項３９に記載の方法。
【請求項56】
前記デヒドロゲナーゼが、アルコールデヒドロゲナーゼまたはアルデヒドデヒドロゲナーゼである、請求項４７に記載の方法。
【請求項57】
（ｄ）からの前記オキシダーゼが、ＥＣ番号１．１．３として分類される、請求項３９に記載の方法。
【請求項58】
前記オキシダーゼが、（５－（ヒドロキシメチル）フルフラールオキシダーゼである、請求項４９に記載の方法。
【請求項59】
前記２，４－ＦＤＣＡが、フラン－２，４－ジカルボアルデヒド、および／または－（ヒドロキシメチル）フロン酸中間体から産生され、（ａ）デヒドロゲナーゼ、オキシダーゼ、またはペルオキシゲナーゼが、前記４－ＨＭＦのフラン－２，４－ジカルボアルデヒド、および／または４－（ヒドロキシメチル）フロン酸への前記変換を触媒する、および／あるいは
（ｂ）デヒドロゲナーゼ、オキシダーゼ、またはペルオキシゲナーゼが、（ａ）からの前記フラン－２，４－ジカルボアルデヒドの４－ホルミルフラン－２－カルボキシレートへの前記変換を触媒する、および／あるいは
（ｃ）デヒドロゲナーゼ、オキシダーゼ、またはペルオキシゲナーゼが、（ａ）からの前記４－（ヒドロキシメチル）フロン酸の４－ホルミルフラン－２－カルボキシレートへの前記変換を触媒する、および／あるいは
（ｄ）デヒドロゲナーゼ、オキシダーゼ、またはペルオキシゲナーゼが、（ａ）からの前記フラン－２，４－ジカルボアルデヒドの２－ホルミルフラン－４－カルボキシレートへの前記変換を触媒する、およびあるいは
（ｅ）デヒドロゲナーゼ、オキシダーゼ、またはペルオキシゲナーゼが、（ｂ）および／もしくは（ｃ）からの前記４－ホルミルフラン－２－カルボキシレートの、または（ｄ）からの前記２－ホルミルフラン－４－カルボキシレートの２，４－ＦＤＣＡへの前記変換を触媒する、請求項３９に記載の方法。
【請求項60】
（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および／または（ｅ）からの前記デヒドロゲナーゼが、ＥＣ番号１．２．１．またはＥＣ番号１．１．１として分類される、請求項５９に記載の方法。
【請求項61】
前記デヒドロゲナーゼが、アルデヒドデヒドロゲナーゼまたはアルコールデヒドロゲナーゼである、請求項６０に記載の方法。
【請求項62】
（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および／または【請求項63】
前記オキシダーゼが、５－（ヒドロキシメチル）フルフラールオキシダーゼである、請求項６２に記載の方法。
【請求項64】
請求項１～２６または４６～６３のいずれか一項に記載の方法に従って産生された、２，４－ＦＤＣＡ。
【請求項65】
請求項２７～４５または６６～７３のいずれか一項に記載の組換え微生物に従って産生された、２，４－ＦＤＣＡ。
【請求項66】
請求項６４または６５に記載の２，４－ＦＤＣＡから産生された、ポリマー。
【請求項67】
２，４－ＦＤＣＡからの前記ポリマーが、非生物学的プロセスで形成される、請求項６６に記載のポリマー。
【請求項68】
外因性炭素源を含む原料から４－ヒドロキシメチルフルフラール（４－ＨＭＦ）を産生することができる組換え微生物であって、前記組換え微生物が、以下の：（ａ）前記炭素源をグリセルアルデヒド３－リン酸（Ｇ３Ｐ）に変換することができる内因性および／または外因性核酸分子と、
（ｂ）（ａ）からのＧ３Ｐの（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートへの変換を触媒する（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートシンターゼをコードする少なくとも１つの内因性または外因性核酸分子と、
（ｃ）（ｂ）からの（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートの４－ヒドロキシメチルフルフラール（４－ＨＭＦ）への変換を触媒するホスファターゼをコードする少なくとも１つの内因性または外因性核酸分子と
を発現する、組換え微生物。
【請求項69】
（ａ）からの前記メチルホスフェートシンターゼが、ＥＣ番号４．２．３．１５３として分類される、請求項６８に記載の組換え微生物。
【請求項70】
前記シンターゼが、（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートシンターゼである、請求項６９に記載の組換え微生物。
【請求項71】
（ｃ）からの前記ホスファターゼが、ＥＣ番号３．１．３として分類される、請求項６８に記載の組換え微生物。
【請求項72】
前記ホスファターゼが、ハロ酸デハロゲナーゼとして分類される、請求項７１に記載の組換え微生物。
【請求項73】
前記ホスファターゼが、宿主内因性である、請求項６８に記載の組換え微生物。
【請求項74】
前記宿主内因性の前記ホスファターゼ酵素が、過剰発現される、請求項７３に記載の組換え微生物。
【請求項75】
炭素源を含む原料から２，４－フランジカルボン酸（２，４－ＦＤＣＡ）を産生することができる組換え微生物であって、前記組換え微生物が、以下の：（ａ）グリセロールまたは単糖をグリセルアルデヒド３－リン酸（Ｇ３Ｐ）に変換することができる内因性および／または外因性核酸分子、
（ｂ）（ａ）からのＧ３Ｐの（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートへの変換を触媒する（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートシンターゼをコードする少なくとも１つの内因性または外因性核酸分子、
（ｃ）（ｂ）からの（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートの４－ヒドロキシメチルフルフラール（４－ＨＭＦ）への変換を触媒するホスファターゼをコードする少なくとも１つの内因性または外因性核酸分子、
（ｄ）（ｂ）からの４－ＨＭＦの２，４ ＦＤＣＡへの酸化を、直接的にもしくは中間体フラン－２，４－ジカルボアルデヒド、４－（ヒドロキシメチル）フロン酸、４－ホルミルフラン－２－カルボキシレート、４－ホルミルフラン－２－カルボキシレート、２－ホルミルフラン－４－カルボキシレートの産生を介して、独立してもしくは相乗的に触媒する、デヒドロゲナーゼおよび／またはオキシダーゼをコードする、少なくとも１つの内因性または外因性核酸分子
のうちの１つ以上を発現させる、組換え微生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年３月１日に出願された「４－ヒドロキシメチルフルフラールおよびその誘導体のインビボ合成のための方法」と題する米国仮特許出願第６２／８１２，９０４号の優先権を主張し、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１９年３月１日に出願された「４－ヒドロキシメチルフルフラールおよびその誘導体のインビボ合成のための方法」と題する米国仮特許出願第６２／８１２，９０４号の優先権を主張し、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
発明の分野
本出願は、４－ＨＭＦ、２，４－フランジメタノール、フラン－２，４－ジカルボアルデヒド、４－（ヒドロキシメチル）フロン酸、２－ホルミルフラン－４－カルボキシレート、４－ホルミルフラン－２－カルボキシレート、および２，４－ＦＤＣＡのうちの１つ以上の生合成のための組換え微生物、ならびに組換え微生物を産生する方法に関する。本出願はまた、微生物の非存在下、または微生物が実質的に存在しない状態で、酵素触媒を用いて２，４－フランジメタノール、フラン－２，４－ジカルボアルデヒド、４－（ヒドロキシメチル）フロン酸、２－ホルミルフラン－４－カルボキシレート、４－ホルミルフラン－２－カルボキシレート、および２，４－ＦＤＣＡのうちの１つ以上を産生する方法に関する。本出願はさらに、２，４－フランジメタノール、フラン－２，４－ジカルボアルデヒド、４－（ヒドロキシメチル）フロン酸、２－ホルミルフラン－４－カルボキシレート、４－ホルミルフラン－２－カルボキシレート、および２，４－ＦＤＣＡのうちの１つ以上からポリマーおよび可塑剤を産生する方法に関する。本出願はさらに、これらの化合物および／または組換え微生物のうちの１つ以上を含む組成物に関する。
本出願は、４－ＨＭＦ、２，４－フランジメタノール、フラン－２，４－ジカルボアルデヒド、４－（ヒドロキシメチル）フロン酸、２－ホルミルフラン－４－カルボキシレート、４－ホルミルフラン－２－カルボキシレート、および２，４－ＦＤＣＡのうちの１つ以上の生合成のための組換え微生物、ならびに組換え微生物を産生する方法に関する。本出願はまた、微生物の非存在下、または微生物が実質的に存在しない状態で、酵素触媒を用いて２，４－フランジメタノール、フラン－２，４－ジカルボアルデヒド、４－（ヒドロキシメチル）フロン酸、２－ホルミルフラン－４－カルボキシレート、４－ホルミルフラン－２－カルボキシレート、および２，４－ＦＤＣＡのうちの１つ以上を産生する方法に関する。本出願はさらに、２，４－フランジメタノール、フラン－２，４－ジカルボアルデヒド、４－（ヒドロキシメチル）フロン酸、２－ホルミルフラン－４－カルボキシレート、４－ホルミルフラン－２－カルボキシレート、および２，４－ＦＤＣＡのうちの１つ以上からポリマーおよび可塑剤を産生する方法に関する。本出願はさらに、これらの化合物および／または組換え微生物のうちの１つ以上を含む組成物に関する。
【0003】
配列表に関する記述
本出願に関連する配列表は、紙のコピーの代わりにテキスト形式で提供され、参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名前は、ＢＲＳＫ－０１９＿０１ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。テキストファイルは約２４０ＫＢで、２０２０年２月２７日に作成され、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提出されている。
本出願に関連する配列表は、紙のコピーの代わりにテキスト形式で提供され、参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名前は、ＢＲＳＫ－０１９＿０１ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。テキストファイルは約２４０ＫＢで、２０２０年２月２７日に作成され、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提出されている。
【背景技術】
【0004】
背景
２，５－フランジカルボン酸（２，５－ＦＤＣＡ）は、ポリエステル、特にポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）の合成においてテレフタル酸を置換する能力のために、多くの注目を集めている（Ｓｏｕｓａ，Ａｎｄｒｅｉａ Ｆ．，ｅｔ ａｌ．“Ｂｉｏｂａｓｅｄ ｐｏｌｙｅｓｔｅｒｓ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｆｒｏｍ ２，５－ｆｕｒａｎｄｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ：ａ ｔｒｉｂｕｔｅ ｔｏ ｆｕｒａｎ ｅｘｃｅｌｌｅｎｃｙ．”Ｐｏｌｙｍｅｒ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ６．３３（２０１５）：５９６１－５９８３（非特許文献１））。ＰＥＴにおいて、テレフタル酸をそのフラン類似体である２，５－ＦＤＣＡに置換すると、２，５－フランジカルボキシレート（２，５－ＰＥＦ）につながり得、このポリマーは、ＰＥＴと比較していくつかの利点を有する。一態様では、２，５－ＰＥＦは、その対応するものと比較して、熱特性、バリア特性、および機械的特性が優れている（ＰＥＰ Ｒｅｐｏｒｔ ２９４）。さらに、エチレングリコールは再生可能資源から生産され得ることが知られているため、２．５－ＰＥＦは、半再生可能ＰＥＴとは対照的に１００％再生可能であり得る。
２，５－フランジカルボン酸（２，５－ＦＤＣＡ）は、ポリエステル、特にポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）の合成においてテレフタル酸を置換する能力のために、多くの注目を集めている（Ｓｏｕｓａ，Ａｎｄｒｅｉａ Ｆ．，ｅｔ ａｌ．“Ｂｉｏｂａｓｅｄ ｐｏｌｙｅｓｔｅｒｓ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｆｒｏｍ ２，５－ｆｕｒａｎｄｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ：ａ ｔｒｉｂｕｔｅ ｔｏ ｆｕｒａｎ ｅｘｃｅｌｌｅｎｃｙ．”Ｐｏｌｙｍｅｒ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ６．３３（２０１５）：５９６１－５９８３（非特許文献１））。ＰＥＴにおいて、テレフタル酸をそのフラン類似体である２，５－ＦＤＣＡに置換すると、２，５－フランジカルボキシレート（２，５－ＰＥＦ）につながり得、このポリマーは、ＰＥＴと比較していくつかの利点を有する。一態様では、２，５－ＰＥＦは、その対応するものと比較して、熱特性、バリア特性、および機械的特性が優れている（ＰＥＰ Ｒｅｐｏｒｔ ２９４）。さらに、エチレングリコールは再生可能資源から生産され得ることが知られているため、２．５－ＰＥＦは、半再生可能ＰＥＴとは対照的に１００％再生可能であり得る。
【0005】
テレフタル酸と比較した２，５－ＦＤＣＡのすべての前述の利点にもかかわらず、２，５－ＦＤＣＡ製造コストは、依然としてモノマー使用の拡大における現在の制限である。既存の技術は、テレフタル酸と比較してコスト競争力がない。この考えられる理由の１つは、いくつかの連続した工業的ステップが必要になることに関連している。２，５－ＦＤＣＡ生産コストの低減に役立つ可能性のある１つの問題は、糖から所望の分子への直接的な発酵経路を見つけることであるが、そのような経路は報告されていない。
【0006】
本開示は、２，５－ＦＤＣＡの異性体である、２，４－ＦＤＣＡに対する直接発酵経路である。我々の知る限りでは、本開示以外に、ＦＤＣＡ異性体のいずれについても、記載された直接的な発酵経路はない。
【0007】
重要なことには、開示された２，４－ＦＤＣＡ分子は、十分に研究された２，５－ＦＤＣＡと比較して、固有の特性を有する。ジオールで２，４－ＦＤＣＡを触媒的に重合すると、貴重な特性を有する２，４－ＦＤＣＡで構成されるポリマーが得られる。ある研究では、Ｔｈｉｙａｇａｒａｊａｎとその共同研究者（２０１４）は、２，４－ＦＤＣＡ、３，４－ＦＤＣＡ、２，５－ＦＤＣＡ、およびテレフタル酸から作られたポリエステルを比較し、２，４－ＦＤＣＡおよび３，４－ＦＤＣＡポリエステルは、産業的に適用可能な方法によって十分な分子量で作製できると結論付けた（Ｔｈｉｙａｇａｒａｊａｎ，Ｓｈａｎｍｕｇａｍ，ｅｔ ａｌ．“Ｂｉｏｂａｓｅｄ ｆｕｒａｎｄｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄｓ（ＦＤＣＡｓ）：ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｉｓｏｍｅｒｉｃ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｏｎ ｐｏｌｙｅｓｔｅｒ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．”Ｇｒｅｅｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １６．４（２０１４）：１９５７－１９６６（非特許文献２））。別の研究では、Ｔｈｉｙａｇａｒａｊａｎとその共同著者は、２，４－ＦＤＣＡと２，５－ＦＤＣＡの構造解析により、２，４－ＦＤＣＡが、２，５－ＦＤＣＡよりも、よりテレフタル酸に類似する線形特性を有することを明らかにした。これらの特徴により、２，４－ＦＤＣＡは合成ポリエステルの興味深いモノマーとなる（Ｔｈｉｙａｇａｒａｊａｎ ｅｔ ａｌ．“Ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｕｒａｎ－２，５－ ａｎｄ ｆｕｒａｎ－２，４－ｄｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ：ｕｎｅｘｐｅｃｔｅｄ ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｅｎｋｅｌ ｒｅａｃｔｉｏｎ”ＲＳＣ Ａｄｖａｎｃｅｓ ３（２０１３）：１５６７８－１５６８６（非特許文献３））。さらに、これらの材料は、２，５－ＦＤＣＡポリエステルとは異なる特性を有する（Ｂｏｕｒｄｅｔ ｅｔ ａｌ．“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｉｎ Ａｍｏｒｐｈｏｕｓ Ｂｉｏｂａｓｅｄ Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ２，５－ｆｕｒａｎｄｉｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）ａｎｄ Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ２，４－ｆｕｒａｎｄｉｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）．”Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ５１．５（２０１８）：１９３７－１９４５（非特許文献４））。
【0008】
場合によっては、２，４－ＦＤＣＡポリマーは、２，５－ＦＤＣＡポリマーが有する特性よりも優れた特性を有すると報告されている。Ｃｕｉおよびその共同研究者（２０１６）は、中央の環と連結する二重のカルボキシル基間の結合角が、ＬＣＤテレビ、ノートパソコン、および他の表示素子に使用されるような、ネマチック液晶分子の安定に影響を与える重要な要因であることを報告している（Ｃｕｉ，Ｍｉｎ－Ｓｈｕ，ｅｔ ａｌ．“Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ４－ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌｆｕｒｆｕｒａｌ ｆｒｏｍ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｏｆ ｂｉｏｍａｓｓ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｆｏｒ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｅｒｓ．”ＡＣＳ Ｓｕｓｔａｉｎａｂｌｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ４．３（２０１６）：１７０７－１７１４（非特許文献５））。初めて発見された液晶、テレフタル酸ジエステル分子は、２つのカルボキシル基間に１８０°の結合角を有する。比較すると、２，５－フランジカルボン酸は、２つのカルボキシル基の間に１３７°の結合角度を有する。重要なことに、２，４－フランジカルボン酸は、２つのカルボキシル基の間に１６０°の結合角を有し、ネマチック液晶分子の合成により適している。
【0009】
２，４－ＦＤＣＡポリマーのこれらの潜在的用途にもかかわらず、２，４－ＦＤＣＡの製造コストはまた、このモノマー用途を拡大する上での現在の障壁になっている（Ｃｕｉ ＭＳ，ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ４－Ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌｆｕｒｆｕｒａｌ ｆｒｏｍ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｍａｓｓ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｆｏｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ａｎｄ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ．ＡＣＳ Ｓｕｓｔａｉｎａｂｌｅ Ｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．４（３）：１７０７－１７１４（非特許文献５）およびＷＯ２０１１００３３００Ａ１（特許文献１））。２，４－ＦＤＣＡを含む２，４－置換フランの以前の合成には、複数の合成ステップが必要であり、したがって２，４－ＦＤＣＡ由来のポリマーは、現在利用可能な方法論および工業技術によって桁違いのコストがかかる。
【0010】
本開示は、初めて、組換え微生物における２，４－ＦＤＣＡへの直接発酵経路を提供する。グルコース、キシロース、グリセロールなどの炭素原料由来のグリセルアルデヒド－３－リン酸（Ｇ３Ｐ）からの、または任意のＣＯ２由来／回収技術からの、２，４－ＦＤＣＡの新規直接発酵により、工業規模での商業的に適用可能な新規ポリマーおよび材料の産生が可能となる。本開示はさらに、初めて、組換え微生物における４－ＨＭＦ、２，４－フランジメタノール、フラン－２，４－ジカルボアルデヒド、４－（ヒドロキシメチル）フロン酸、２－ホルミルフラン－４－カルボキシレート、および４－ホルミルフラン－２－カルボキシレートのうちの１つ以上を産生するための直接発酵経路を提供する。本開示はまた、初めて、酵母およびＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来の内因性ホスファターゼが、（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートを４－ＨＭＦに脱リン酸化することができ、酵素（オキシダーゼ、デヒドロゲナーゼおよび／またはペルオキシゲナーゼ）が４－ＨＭＦを２，４ ＦＤＣＡに酸化することができる（直接的にまたは中間体の産生を介して）ことを実証する。ここで展開される酵素候補のいくつかは、５－ＨＭＦ異性体基質、および中間体に対し活性を有すると特徴付けられてきたが、４－ＨＭＦ（およびその中間体）に対するそれらの活性は、特徴付けられていない。これらの新規の直接発酵経路は、商業的に適用可能な２，４－置換フランの産生を可能にする。バイオ燃料の前駆体としての４－ＨＭＦの例示的な用途については、Ｄｅｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３．Ｌｉｎｋｅｄ Ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｕｅｌｓ ｖｉａ Ｆｏｒｍｏｓｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ，３：１２４４（非特許文献６））を参照されたい。高度な特性を持つポリマーでの２，４－フランジメタノールの例示的な用途については、Ｚｅｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３．Ｂｉｏ－ｂａｓｅｄ Ｆｕｒａｎ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｗｉｔｈ Ｓｅｌｆ－Ｈｅａｌｉｎｇ Ａｂｉｌｉｔｙ．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，４６．５：１７９４－１８０２（非特許文献７））を参照されたい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0011】
【特許文献1】ＷＯ２０１１００３３００Ａ１
【非特許文献】
【0012】
【非特許文献1】Ｓｏｕｓａ，Ａｎｄｒｅｉａ Ｆ．，ｅｔ ａｌ．“Ｂｉｏｂａｓｅｄ ｐｏｌｙｅｓｔｅｒｓ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｆｒｏｍ ２，５－ｆｕｒａｎｄｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ：ａ ｔｒｉｂｕｔｅ ｔｏ ｆｕｒａｎ ｅｘｃｅｌｌｅｎｃｙ．”Ｐｏｌｙｍｅｒ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ６．３３（２０１５）：５９６１－５９８３
【非特許文献2】Ｔｈｉｙａｇａｒａｊａｎ，Ｓｈａｎｍｕｇａｍ，ｅｔ ａｌ．“Ｂｉｏｂａｓｅｄ ｆｕｒａｎｄｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄｓ（ＦＤＣＡｓ）：ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｉｓｏｍｅｒｉｃ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｏｎ ｐｏｌｙｅｓｔｅｒ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．”Ｇｒｅｅｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １６．４（２０１４）：１９５７－１９６６
【非特許文献3】Ｔｈｉｙａｇａｒａｊａｎ ｅｔ ａｌ．“Ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｕｒａｎ－２，５－ ａｎｄ ｆｕｒａｎ－２，４－ｄｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ：ｕｎｅｘｐｅｃｔｅｄ ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｅｎｋｅｌ ｒｅａｃｔｉｏｎ”ＲＳＣ Ａｄｖａｎｃｅｓ ３（２０１３）：１５６７８－１５６８６
【非特許文献4】Ｂｏｕｒｄｅｔ ｅｔ ａｌ．“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｉｎ Ａｍｏｒｐｈｏｕｓ Ｂｉｏｂａｓｅｄ Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ２，５－ｆｕｒａｎｄｉｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）ａｎｄ Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ２，４－ｆｕｒａｎｄｉｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）．”Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ５１．５（２０１８）：１９３７－１９４５
【非特許文献5】Ｃｕｉ ＭＳ，ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ４－Ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌｆｕｒｆｕｒａｌ ｆｒｏｍ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｍａｓｓ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｆｏｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ａｎｄ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ．ＡＣＳ Ｓｕｓｔａｉｎａｂｌｅ Ｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．４（３）：１７０７－１７１４
【非特許文献6】Ｄｅｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３．Ｌｉｎｋｅｄ Ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｕｅｌｓ ｖｉａ Ｆｏｒｍｏｓｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ，３：１２４４）
【非特許文献7】Ｚｅｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３．Ｂｉｏ－ｂａｓｅｄ Ｆｕｒａｎ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｗｉｔｈ Ｓｅｌｆ－Ｈｅａｌｉｎｇ Ａｂｉｌｉｔｙ．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，４６．５：１７９４－１８０２）
【発明の概要】
【0013】
開示の概要
場合によっては、２，４－ＦＤＣＡポリマーは、２，５－ＦＤＣＡポリマーが有する特性よりも優れた特性を有すると報告されている。Ｃｕｉおよびその共同研究者（２０１６）は、中央の環と連結する二重のカルボキシル基間の結合角が、ＬＣＤテレビ、ノートパソコン、および他の表示素子に使用されるような、ネマチック液晶分子の安定に影響を与える重要な要因であることを報告している（Ｃｕｉ，Ｍｉｎ－Ｓｈｕ，ｅｔ ａｌ．“Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ４－ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌｆｕｒｆｕｒａｌ ｆｒｏｍ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｏｆ ｂｉｏｍａｓｓ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｆｏｒ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｅｒｓ．”ＡＣＳ Ｓｕｓｔａｉｎａｂｌｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ４．３（２０１６）：１７０７－１７１４）。初めて発見された液晶、テレフタル酸ジエステル分子は、２つのカルボキシル基間に１８０°の結合角を有する。比較すると、２，５－フランジカルボン酸は、２つのカルボキシル基の間に１３７°の結合角度を有する。重要なことに、２，４－フランジカルボン酸は、２つのカルボキシル基の間に１６０°の結合角を有し、ネマチック液晶分子の合成により適している。
場合によっては、２，４－ＦＤＣＡポリマーは、２，５－ＦＤＣＡポリマーが有する特性よりも優れた特性を有すると報告されている。Ｃｕｉおよびその共同研究者（２０１６）は、中央の環と連結する二重のカルボキシル基間の結合角が、ＬＣＤテレビ、ノートパソコン、および他の表示素子に使用されるような、ネマチック液晶分子の安定に影響を与える重要な要因であることを報告している（Ｃｕｉ，Ｍｉｎ－Ｓｈｕ，ｅｔ ａｌ．“Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ４－ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌｆｕｒｆｕｒａｌ ｆｒｏｍ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｏｆ ｂｉｏｍａｓｓ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｆｏｒ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｅｒｓ．”ＡＣＳ Ｓｕｓｔａｉｎａｂｌｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ４．３（２０１６）：１７０７－１７１４）。初めて発見された液晶、テレフタル酸ジエステル分子は、２つのカルボキシル基間に１８０°の結合角を有する。比較すると、２，５－フランジカルボン酸は、２つのカルボキシル基の間に１３７°の結合角度を有する。重要なことに、２，４－フランジカルボン酸は、２つのカルボキシル基の間に１６０°の結合角を有し、ネマチック液晶分子の合成により適している。
【0014】
本開示は、グリセルアルデヒド３－リン酸（Ｇ３Ｐ）を２，４－フランジカルボン酸（２，４－ＦＤＣＡ）に酵素的に変換することによって、２，４－フランジカルボン酸（２，４－ＦＤＣＡ）を産生する方法を提供し、方法は、（ａ）Ｇ３Ｐの（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートへの変換を触媒するメチルホスフェートシンターゼの存在下で、Ｇ３Ｐを提供することと、（ｂ）（ａ）からの（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートに、（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートの４－ヒドロキシメチルフルフラール（４－ＨＭＦ）への変換を触媒するホスファターゼを提供することと、（ｃ）（ｂ）からの４－ＨＭＦの２，４ ＦＤＣＡへの酸化を、直接的にもしくは中間体であるフラン－２，４－ジカルボアルデヒド、４－（ヒドロキシメチル）フロン酸、４－ホルミルフラン－２－カルボキシレート、４－ホルミルフラン－２－カルボキシレート、２－ホルミルフラン－４－カルボキシレートの産生を介して、独立してもしくは相乗的に触媒する、デヒドロゲナーゼおよび／またはオキシダーゼに、（ｂ）からの４－ＨＭＦを提供することと、を含む。
【0015】
いくつかの実施形態では、２，４－ＦＤＣＡは、フラン－２，４－ジカルボアルデヒド、および／または－（ヒドロキシメチル）フロン酸中間体から産生され、（ａ）デヒドロゲナーゼ、オキシダーゼ、またはペルオキシゲナーゼが、４－ＨＭＦの、フラン－２，４－ジカルボアルデヒド、および／または４－（ヒドロキシメチル）フロン酸への変換を触媒する、ならびに／あるいは（ｂ）デヒドロゲナーゼ、オキシダーゼ、またはペルオキシゲナーゼが、（ａ）からのフラン－２，４－ジカルボアルデヒドの４－ホルミルフラン－２－カルボキシレートへの変換を触媒する、ならびに／あるいは（ｃ）デヒドロゲナーゼ、オキシダーゼ、またはペルオキシゲナーゼが、（ａ）からの４－（ヒドロキシメチル）フロン酸の４－ホルミルフラン－２－カルボキシレートへの変換を触媒する、ならびに／あるいは（ｄ）デヒドロゲナーゼ、オキシダーゼ、またはペルオキシゲナーゼが、（ａ）からのフラン－２，４－ジカルボアルデヒドの２－ホルミルフラン－４－カルボキシレートへの変換を触媒する、ならびにあるいは（ｅ）デヒドロゲナーゼ、オキシダーゼ、またはペルオキシゲナーゼが、（ｂ）および／もしくは（ｃ）からの４－ホルミルフラン－２－カルボキシレートの、または（ｄ）からの２－ホルミルフラン－４－カルボキシレートの、２，４－ＦＤＣＡへの変換を触媒する。
【0016】
いくつかの実施形態では、（ａ）からのメチルホスフェートシンターゼは、ＥＣ番号４．２．３．１５３として分類される。いくつかの実施形態では、メチルホスフェートシンターゼは、（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートシンターゼである。いくつかの実施形態では、（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートシンターゼは、ＭｆｎＢ１、ＭｆｎＢ７、およびＭｆｎＢ１４から選択される。
【0017】
いくつかの実施形態では、（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートシンターゼは、配列番号１、配列番号７、または配列番号１４を含むアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、（ｂ）からのホスファターゼは、ＥＣ番号３．１．３として分類される。いくつかの実施形態では、ホスファターゼは、ハロ酸デハロゲナーゼとして分類される。いくつかの実施形態では、ホスファターゼは、宿主内因性である。
【0018】
いくつかの実施形態では、宿主内因性のホスファターゼ酵素は、過剰発現される。いくつかの実施形態では、ホスファターゼは、４－ＨＭＦホスファターゼである。
【0019】
いくつかの実施形態では、４－ＨＭＦホスファターゼは、ストレプトミセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、サッカロミセス・セレビシア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、またはエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に由来する。
【0020】
いくつかの実施形態では、４－ＨＭＦホスファターゼは、配列番号２８、配列番号４０～５２のうちのいずれか１つ、または配列番号５３～６８のうちのいずれか１つ、を含むアミノ酸配列によってコードされる。
【0021】
いくつかの実施形態では、（ｃ）からのデヒドロゲナーゼは、ＥＣ番号１．１．１またはＥＣ番号１．２．１として分類される。いくつかの実施形態では、デヒドロゲナーゼは、アルコールデヒドロゲナーゼまたはアルデヒドデヒドロゲナーゼである。いくつかの実施形態では、（ｃ）からのオキシダーゼは、ＥＣ番号１．１．３として分類される。いくつかの実施形態では、オキシダーゼは、５－ヒドロキシメチルフルフラールオキシダーゼである。いくつかの実施形態では、デヒドロゲナーゼは、ＥＣ番号１．２．１．またはＥＣ番号１．１．１として分類される。いくつかの実施形態では、デヒドロゲナーゼは、アルデヒドデヒドロゲナーゼまたはアルコールデヒドロゲナーゼである。
【0022】
いくつかの実施形態では、オキシダーゼは、ＥＣ番号１．１．３として分類される。いくつかの実施形態では、オキシダーゼは、５－ヒドロキシメチルフルフラールオキシダーゼである。いくつかの実施形態では、オキシダーゼは、４－ＨＭＦオキシダーゼである。いくつかの実施形態では、４－ＨＭＦオキシダーゼは、ＨｍｆＨ６およびＨｍｆＨ７から選択される。いくつかの実施形態では、４－ＨＭＦオキシダーゼは、配列番号８５または配列番号８６を含むアミノ酸配列を含む。
【0023】
いくつかの実施形態では、デヒドロゲナーゼは、ＥＣ番号１．２．１として分類される。いくつかの実施形態では、デヒドロゲナーゼは、アルデヒドデヒドロゲナーゼである。
【0024】
本開示は、炭素源を含む原料から２，４－フランジカルボン酸（２，４－ＦＤＣＡ）を産生することができる組換え微生物を提供し、組換え微生物は、以下の、（ａ）炭素源をグリセルアルデヒド３－リン酸（Ｇ３Ｐ）に変換することができる内因性および／または外因性核酸分子、（ｂ）（ａ）からのＧ３Ｐの（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートへの変換を触媒する（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートシンターゼをコードする少なくとも１つの内因性または外因性核酸分子、（ｃ）（ｂ）からの（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートの４－ヒドロキシメチルフルフラール（４－ＨＭＦ）への変換を触媒するホスファターゼをコードする少なくとも１つの内因性または外因性核酸分子、（ｄ）（ｃ）からの４－ＨＭＦの２，４ ＦＤＣＡへの酸化を、直接的にもしくは中間体であるフラン－２，４－ジカルボアルデヒド、４－（ヒドロキシメチル）フロン酸、４－ホルミルフラン－２－カルボキシレート、４－ホルミルフラン－２－カルボキシレート、２－ホルミルフラン－４－カルボキシレートの産生を介して、独立してもしくは相乗的に触媒するペルオキシゲナーゼ、デヒドロゲナーゼまたはオキシダーゼをコードする少なくとも１つの内因性または外因性核酸分子、を発現させる。
【0025】
いくつかの実施形態では、炭素源は、ヘキソース、ペントース、グリセロール、Ｃ０２、スクロース、および／またはこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、（ａ）からのメチルホスフェートシンターゼは、ＥＣ番号４．２．３．１５３として分類される。いくつかの実施形態では、シンターゼは、（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートシンターゼである。
【0026】
いくつかの実施形態では、（ｃ）からのホスファターゼは、ＥＣ番号３．１．３として分類される。いくつかの実施形態では、ホスファターゼは、ハロ酸デハロゲナーゼとして分類される。いくつかの実施形態では、ホスファターゼは、宿主内因性である。いくつかの実施形態では、宿主内因性のホスファターゼ酵素は、過剰発現される。
【0027】
いくつかの実施形態では、（ｄ）からのオキシダーゼは、ＥＣ番号１．１．３として分類される。いくつかの実施形態では、（ｄ）からの酸化酵素は、５－ヒドロキシメチルフルフラールオキシダーゼである。
【0028】
いくつかの実施形態では、（ｄ）からのデヒドロゲナーゼは、ＥＣ番号１．１．１またはＥＣ番号１．２．１として分類される。いくつかの実施形態では、デヒドロゲナーゼは、アルコールデヒドロゲナーゼまたはアルデヒドデヒドロゲナーゼである。
【0029】
いくつかの実施形態では、２，４－ＦＤＣＡは、フラン－２，４－ジカルボアルデヒド、および／または－（ヒドロキシメチル）フロン酸中間体から産生され、（ａ）デヒドロゲナーゼ、オキシダーゼ、またはペルオキシゲナーゼが、（ｃ）からの４－ＨＭＦのフラン－２，４－ジカルボアルデヒド、および／または４－（ヒドロキシメチル）フロン酸への変換を触媒する、ならびに／あるいは（ｂ）デヒドロゲナーゼ、オキシダーゼ、またはペルオキシゲナーゼが、（ａ）からのフラン－２，４－ジカルボアルデヒドの４－ホルミルフラン－２－カルボキシレートへの変換を触媒する、ならびに／あるいは（ｃ）デヒドロゲナーゼ、オキシダーゼ、またはペルオキシゲナーゼが、（ｂ）からの４－（ヒドロキシメチル）フロン酸の４－ホルミルフラン－２－カルボキシレートへの変換を触媒する、ならびに／あるいは（ｄ）デヒドロゲナーゼ、オキシダーゼ、またはペルオキシゲナーゼが、（ｃ）からのフラン－２，４－ジカルボアルデヒドの２－ホルミルフラン－４－カルボキシレートへの変換を触媒する、ならびに／あるいは（ｅ）デヒドロゲナーゼ、オキシダーゼ、またはペルオキシゲナーゼが、（ｂ）および／もしくは（ｃ）からの４－ホルミルフラン－２－カルボキシレートの、または（ｄ）からの２－ホルミルフラン－４－カルボキシレートの２ ４－ＦＤＣＡへの変換を触媒する。
【0030】
いくつかの実施形態では、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、および／または（ｅ）からのデヒドロゲナーゼは、ＥＣ番号１．２．１またはＥＣ番号１．１．１として分類される。いくつかの実施形態では、デヒドロゲナーゼは、アルデヒドデヒドロゲナーゼまたはアルコールデヒドロゲナーゼである。いくつかの実施形態では、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および／または（ｅ）からのオキシダーゼは、ＥＣ番号１．１．３として分類される。いくつかの実施形態では、オキシダーゼは、５－（ヒドロキシメチル）フルフラールオキシダーゼである。
【0031】
いくつかの実施形態では、１つ以上の組換え微生物は、クロストリジウム属の種（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．）、クロストリジウム・リュングダリイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ）、クロストリジウム・オートエタノゲナム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ）、クロストリジウム・ラグスダレイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｇｓｄａｌｅｉ）、ユーバクテリウム・リノサム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｍｏｓｕｍ）、ブチリバクテリウム・メチロトロフィカム（Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）、ムーレラ・サーモアセチカ（Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、クロストリジウム・アセチカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｉｃｕｍ）、アセトバクテリウム・ウッディイ（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｗｏｏｄｉｉ）、アルカリバクルム・バッキ（Ａｌｋａｌｉｂａｃｕｌｕｍ ｂａｃｃｈｉｉ）、クロストリジウム・ドラケイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｒａｋｅｉ）、クロストリジウム・カルボキシジボランス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ）、クロストリジウム・フォルミコアセティカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｆｏｒｍｉｃｏａｃｅｔｉｃｕｍ）、クロストリジウム・スカトロゲネス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｃａｔｏｌｏｇｅｎｅｓ）、モーレラ・サーモオートトロフィカ（Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ）、アセトネマ・ロンガム（Ａｃｅｔｏｎｅｍａ ｌｏｎｇｕｍ）、ブラウティア・プロダクタ（Ｂｌａｕｔｉａ ｐｒｏｄｕｃｔａ）、クロストリジウム・グリコリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｌｙｃｏｌｉｃｕｍ）、クロストリジウム・マグナム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｍａｇｎｕｍ）、カンジダ・クルゼイ（Ｃａｎｄｉｄａ ｋｒｕｓｅｉ）、クロストリジウム・マヨムベイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｍａｙｏｍｂｅｉ）、クロストリジウム・メソオキシベンゾボランス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｍｅｔｈｏｘｙｂｅｎｚｏｖｏｒａｎｓ）、クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、クロストリジウム・ベイジェリンキイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）、オキソバクター・フェニジイ（Ｏｘｏｂａｃｔｅｒ ｐｆｅｎｎｉｇｉｉ）、サーモアナエロバクター・キブイ（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｋｉｖｕｉ）、スポロミュサ・オバータ（Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｏｖａｔａ）、サーモアセトゲニウム・フェウム（Ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｏｇｅｎｉｕｍ ｐｈａｅｕｍ）、アセトバクテリウム・カービノリカム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｒｂｉｎｏｌｉｃｕｍ）、イサチェンキア・オリエンタリス（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）、スポロミュサ・ターミティダ（Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｔｅｒｍｉｔｉｄａ）、モーレラ・グリセリニ（Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｇｌｙｃｅｒｉｎｉ）、ユーバクテリウム・アグレガンス（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｇｇｒｅｇａｎｓ）、トレポネーマ・アゾトニュートリシウム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ａｚｏｔｏｎｕｔｒｉｃｉｕｍ）、ピキア・クドリアヴゼヴィイ（Ｐｉｃｈｉａ ｋｕｄｒｉａｖｚｅｖｉｉ）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）、バチルス属の種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）、コリネバクテリウム属の種（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、シェフェルソマイセス・スティピティス（Ｓｃｈｅｆｆｅｒｓｏｍｙｃｅｓ ｓｔｉｐｉｔｉｓ）、およびテリスポロバクター・グリコリカス（Ｔｅｒｒｉｓｐｏｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌｙｃｏｌｉｃｕｓ）からなる群から選択される親微生物に由来する。
【0032】
いくつかの実施形態では、１つ以上の組換え微生物は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｇｓｄａｌｅｉ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｍｏｓｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｉｃｕｍ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｗｏｏｄｉｉ、Ａｌｋａｌｉｂａｃｕｌｕｍ ｂａｃｃｈｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｒａｋｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｆｏｒｍｉｃｏａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｃａｔｏｌｏｇｅｎｅｓ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ、Ａｃｅｔｏｎｅｍａ ｌｏｎｇｕｍ、Ｂｌａｕｔｉａ ｐｒｏｄｕｃｔａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｌｙｃｏｌｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｍａｇｎｕｍ、Ｃａｎｄｉｄａ ｋｒｕｓｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｍａｙｏｍｂｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｍｅｔｈｏｘｙｂｅｎｚｏｖｏｒａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ、Ｏｘｏｂａｃｔｅｒ ｐｆｅｎｎｉｇｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｋｉｖｕｉ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｏｖａｔａ、Ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｏｇｅｎｉｕｍ ｐｈａｅｕｍ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｒｂｉｎｏｌｉｃｕｍ、Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｔｅｒｍｉｔｉｄａ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｇｌｙｃｅｒｉｎｉ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｇｇｒｅｇａｎｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ａｚｏｔｏｎｕｔｒｉｃｉｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ ｋｕｄｒｉａｖｚｅｖｉｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｓｃｈｅｆｆｅｒｓｏｍｙｃｅｓ ｓｔｉｐｉｔｉｓ、およびＴｅｒｒｉｓｐｏｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌｙｃｏｌｉｃｕｓからなる群から選択される親微生物に由来する。
【0033】
本開示は、請求項２７に記載の組換え微生物を使用して２，４－ＦＤＣＡを産生する方法を提供し、方法は、２，４－ＦＤＣＡが産生されるまで、炭素源を提供する原料を含有する培養培地で組換え微生物を培養することを含む。
【0034】
本開示は、炭素源を含む原料から２，４－ＦＤＣＡを産生することができる組換え微生物を産生する方法を提供し、方法は、組換え微生物に、以下の、（ａ）グリセロールまたは単糖をグリセルアルデヒド３－リン酸（Ｇ３Ｐ）に変換することができる内因性および／または外因性核酸分子、（ｂ）（ａ）からのＧ３Ｐの（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートへの変換を触媒する（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートシンターゼをコードする少なくとも１つの内因性または外因性核酸分子、（ｃ）（ｂ）からの（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートの４－ヒドロキシメチルフルフラール（４－ＨＭＦ）への変換を触媒するホスファターゼをコードする少なくとも１つの内因性または外因性核酸分子、（ｄ）（ｃ）からの４－ＨＭＦの２，４ ＦＤＣＡへの酸化を、直接的にもしくは中間体フラン－２，４－ジカルボアルデヒド、４－（ヒドロキシメチル）フロン酸、４－ホルミルフラン－２－カルボキシレート、４－ホルミルフラン－２－カルボキシレート、２－ホルミルフラン－４－カルボキシレートの産生を介して、独立してもしくは相乗的に触媒する、ペルオキシゲナーゼ、デヒドロゲナーゼ、またはオキシダーゼをコードする少なくとも１つの内因性または外因性核酸分子、を導入すること、ならびに／あるいは過剰発現させることを含む。
【0035】
いくつかの実施形態では、炭素源は、ヘキソース、ペントース、グリセロール、Ｃ０２、スクロース、および／またはこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、（ａ）からのメチルホスフェートシンターゼは、ＥＣ番号４．２．３．１５３として分類される。いくつかの実施形態では、シンターゼは、（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートシンターゼである。いくつかの実施形態では、（ｃ）からのホスファターゼは、ＥＣ番号３．１．３として分類される。いくつかの実施形態では、ホスファターゼは、ハロ酸デハロゲナーゼとして分類される。いくつかの実施形態では、ホスファターゼは、宿主内因性である。いくつかの実施形態では、宿主内因性のホスファターゼ酵素は、過剰発現される。
【0036】
いくつかの実施形態では、（ｄ）からのデヒドロゲナーゼは、ＥＣ番号１．１．１またはＥＣ番号１．２．１として分類される。いくつかの実施形態では、デヒドロゲナーゼは、アルコールデヒドロゲナーゼまたはアルデヒドデヒドロゲナーゼである。いくつかの実施形態では、（ｄ）からのオキシダーゼは、ＥＣ番号１．１．３として分類される。いくつかの実施形態では、オキシダーゼは、（５－（ヒドロキシメチル）フルフラールオキシダーゼである。
【0037】
いくつかの実施形態では、２，４－ＦＤＣＡは、フラン－２，４－ジカルボアルデヒド、および／または－（ヒドロキシメチル）フロン酸中間体から産生され、（ａ）デヒドロゲナーゼ、オキシダーゼ、またはペルオキシゲナーゼが、４－ＨＭＦのフラン－２，４－ジカルボアルデヒド、および／または４－（ヒドロキシメチル）フロン酸への変換を触媒する、ならびに／あるいは（ｂ）デヒドロゲナーゼ、オキシダーゼ、またはペルオキシゲナーゼが、（ａ）からのフラン－２，４－ジカルボアルデヒドの４－ホルミルフラン－２－カルボキシレートへの変換を触媒する、ならびに／あるいは（ｃ）デヒドロゲナーゼ、オキシダーゼ、またはペルオキシゲナーゼが、（ａ）からの４－（ヒドロキシメチル）フロン酸の４－ホルミルフラン－２－カルボキシレートへの変換を触媒する、ならびに／あるいは（ｄ）デヒドロゲナーゼ、オキシダーゼ、またはペルオキシゲナーゼが、（ａ）からのフラン－２，４－ジカルボアルデヒドの２－ホルミルフラン－４－カルボキシレートへの変換を触媒する、ならびに／あるいは（ｅ）デヒドロゲナーゼ、オキシダーゼ、またはペルオキシゲナーゼが、（ｂ）および／もしくは（ｃ）からの４－ホルミルフラン－２－カルボキシレートの、または（ｄ）からの２－ホルミルフラン－４－カルボキシレートの２，４－ＦＤＣＡへの変換を触媒する。
【0038】
いくつかの実施形態では、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、および／または（ｅ）からのデヒドロゲナーゼは、ＥＣ番号１．２．１またはＥＣ番号１．１．１として分類される。いくつかの実施形態では、デヒドロゲナーゼが、アルデヒドデヒドロゲナーゼまたはアルコールデヒドロゲナーゼである。いくつかの実施形態では、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および／または（ｅ）からのオキシダーゼは、ＥＣ番号１．１．３として分類される。いくつかの実施形態では、オキシダーゼは、５－（ヒドロキシメチル）フルフラールオキシダーゼである。
【0039】
本開示は、本開示の方法に従って産生された２，４－ＦＤＣＡを提供する。
【0040】
本開示は、本開示の微生物に従って産生された２，４－ＦＤＣＡを提供する。
【0041】
本開示は、本開示の実施形態の２，４－ＦＤＣＡから産生されたポリマーを提供する。いくつかの実施形態では、２，４－ＦＤＣＡからのポリマーが、非生物学的プロセスで形成される。
【0042】
本開示は、外因性炭素源を含む原料から４－ヒドロキシメチルフルフラール（４－ＨＭＦ）を産生することができる組換え微生物を提供し、組換え微生物は、以下の、（ａ）炭素源をグリセルアルデヒド３－リン酸（Ｇ３Ｐ）に変換することができる内因性および／または外因性核酸分子と、（ｂ）（ａ）からのＧ３Ｐの（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートへの変換を触媒する（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートシンターゼをコードする少なくとも１つの内因性または外因性核酸分子と、（ｃ）（ｂ）からの（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートの４－ヒドロキシメチルフルフラール（４－ＨＭＦ）への変換を触媒するホスファターゼをコードする少なくとも１つの内因性または外因性核酸分子と、を発現させる。
【0043】
いくつかの実施形態では、（ａ）からのメチルホスフェートシンターゼは、ＥＣ番号４．２．３．１５３として分類される。いくつかの実施形態では、シンターゼは、（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートシンターゼである。いくつかの実施形態では、（ｃ）からのホスファターゼは、ＥＣ番号３．１．３として分類される。いくつかの実施形態では、ホスファターゼは、ハロ酸デハロゲナーゼとして分類される。いくつかの実施形態では、ホスファターゼは、宿主内因性である。いくつかの実施形態では、宿主内因性のホスファターゼ酵素は、過剰発現される。
【0044】
本開示は、炭素源を含む原料から２，４－フランジカルボン酸（２，４－ＦＤＣＡ）を産生することができる組換え微生物を提供し、組換え微生物は、以下の、（ａ）グリセロールまたは単糖をグリセルアルデヒド３－リン酸（Ｇ３Ｐ）に変換することができる内因性および／または外因性核酸分子、（ｂ）（ａ）からのＧ３Ｐの（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートへの変換を触媒する（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートシンターゼをコードする少なくとも１つの内因性または外因性核酸分子、（ｃ）（ｂ）からの（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートの４－ヒドロキシメチルフルフラール（４－ＨＭＦ）への変換を触媒するホスファターゼをコードする少なくとも１つの内因性または外因性核酸分子、（ｄ）（ｂ）からの４－ＨＭＦの２，４ ＦＤＣＡへの酸化を、直接的にもしくは中間体フラン－２，４－ジカルボアルデヒド、４－（ヒドロキシメチル）フロン酸、４－ホルミルフラン－２－カルボキシレート、４－ホルミルフラン－２－カルボキシレート、２－ホルミルフラン－４－カルボキシレートの産生を介して、独立してもしくは相乗的に触媒する、デヒドロゲナーゼおよび／またはオキシダーゼをコードする、少なくとも１つの内因性または外因性核酸分子、のうちの１つ以上を発現させる。
【0045】
いくつかの態様では、本開示は、概して、組換え微生物において、グリセルアルデヒド３－リン酸（Ｇ３Ｐ）を２，４－フランジカルボン酸（２，４－ＦＤＣＡ）に酵素的に変換することによって、微生物不在下では酵素触媒によって、２，４－フランジカルボン酸（２，４－ＦＤＣＡ）を産生する方法に関心が寄せられ、方法は、（ａ）メチルホスフェートシンターゼまたはＧ３Ｐの（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートへの変換を触媒することができる任意の酵素の存在下で、Ｇ３Ｐを提供することと、（ｂ）ホスファターゼまたは（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートの４－ヒドロキシメチルフルフラール（４－ＨＭＦ）への変換を触媒することができる任意の酵素に、（ａ）からの（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートを提供することと、（ｃ）４－ＨＭＦの２，４ ＦＤＣＡへの酸化を、直接的にもしくは中間体フラン－２，４－ジカルボアルデヒド、４－（ヒドロキシメチル）フロン酸、４－ホルミルフラン－２－カルボキシレート、４－ホルミルフラン－２－カルボキシレート、２－ホルミルフラン－４－カルボキシレートの産生を介して、独立してもしくは相乗的に触媒することができる、オキシダーゼ、デヒドロゲナーゼまたはペルオキシゲナーゼに、（ｂ）からの４－ＨＭＦを提供することと、を含む。
【0046】
この意味では、ステップＣは、デヒドロゲナーゼもしくはオキシダーゼまたは４－ＨＭＦの、（ｉ）フラン－２，４－ジカルボアルデヒド、および／もしくは（ｉｉ）４－（ヒドロキシメチル）フロン酸への変換を触媒するものに、（ｂ）からの４－ＨＭＦを提供することによって、（ｄ）（ｉ）フラン－２，４－ジカルボアルデヒドの４－ホルミルフラン－２－カルボキシレートへの変換を触媒するデヒドロゲナーゼ、オキシダーゼ、もしくはペルオキシゲナーゼに（ｃ）（ｉ）からのフラン－２，４－ジカルボアルデヒドを提供する、（ｉｉ）４－（ヒドロキシメチル）フロン酸の４－ホルミルフラン－２－カルボキシレートへの変換を触媒するデヒドロゲナーゼ、オキシダーゼ、もしくはペルオキシゲナーゼに（ｃ）（ｉｉ）からの４－（ヒドロキシメチル）フロン酸を提供する、および／または（ｉｉｉ）フラン－２，４－ジカルボアルデヒドの２－ホルミルフラン－４－カルボキシレートへの変換を触媒するデヒドロゲナーゼ、オキシダーゼ、もしくはペルオキシゲナーゼにＩ（ｉ）からのフラン－２，４－ジカルボアルデヒドを提供することによって、（ｅ）（ｄ）（ｉ）および／もしくは（ｄ）（ｉｉ）からの４－ホルミルフラン－２－カルボキシレートの、または（ｄ）（ｉｉｉ）からの２－ホルミルフラン－４－カルボキシレートの２，４－ＦＤＣＡへの変換を触媒するデヒドロゲナーゼまたはオキシダーゼに、（ｄ）（ｉ）および／もしくは（ｄ）（ｉｉ）からの４－ホルミルフラン－２－カルボキシレートまたは（ｄ）（ｉｉｉ）からの２－ホルミルフラン－４－カルボキシレートを提供することによって、実行することができる。
【0047】
いくつかの態様では、（ａ）からのメチルホスフェートシンターゼは、ＥＣ番号４．２．３．１５３として分類される。いくつかの態様では、シンターゼは、（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートシンターゼである。
【0048】
いくつかの態様では、（ｂ）からのホスファターゼは、ＥＣ番号３．１．３として分類されるリン酸モノエステルヒドロラーゼである。いくつかの態様では、ホスファターゼは、ハロ酸デハロゲナーゼとして分類される（Ｋｏｏｎｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４４（１）．１９９４）。いくつかの態様では、反応ｂのホスファターゼは、宿主内因性である（Ｏｆｆｌｅｙ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎ．６５．２０１９）。いくつかの態様では、宿主内因性のホスファターゼ酵素は、過剰発現される。一部の事例では、所望の反応を実施することができる異種ホスファターゼが使用され、アルカリホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、フルクトース－ビスホスファターゼ、糖－ホスファターゼ、または糖－末端－ホスファターゼから選択される。
【0049】
いくつかの態様では、（ｃ）からのデヒドロゲナーゼは、アルコールをカルボニルに酸化する場合、ＥＣ番号１．１．１として分類され、またはカルボニルを酸に酸化する場合、ＥＣ番号１．２．１として分類される。いくつかの態様では、デヒドロゲナーゼは、アルコールデヒドロゲナーゼまたはアルデヒドデヒドロゲナーゼである。
【0050】
いくつかの態様では、（ｃ）からのオキシダーゼは、ＥＣ番号１．１．３として分類される。いくつかの態様では、オキシダーゼは、５－（ヒドロキシメチルフルフラールオキシダーゼである。いくつかの態様では、５－ヒドロキシメチルフルフラールオキシダーゼは、４－ヒドロキシメチルフルフラール（４－ＨＭＦ）を、３ステップ反応で２，４ ＦＤＣＡに変換する。
【0051】
いくつかの態様では、本開示は一般に、炭素源を含む原料から２，４－フランジカルボン酸（２，４－ＦＤＣＡ）を産生することができる組換え微生物に関心が寄せられ、組換え微生物は、以下の、（ａ）炭素源をグリセルアルデヒド３－リン酸（Ｇ３Ｐ）に変換することができる内因性および／または外因性核酸分子、（ｂ）（ａ）からのＧ３Ｐの（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートへの変換を触媒する（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートシンターゼをコードする少なくとも１つの内因性または外因性核酸分子、（ｃ）（ｂ）からの（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートの４－ヒドロキシメチルフルフラール（４－ＨＭＦ）への変換を触媒するホスファターゼをコードする少なくとも１つの内因性または外因性核酸分子、（ｄ）（ｃ）からの４－ＨＭＦの２，４ ＦＤＣＡへの変換を、直接的にもしくは中間体フラン－２，４－ジカルボアルデヒド、４－（ヒドロキシメチル）フロン酸、４－ホルミルフラン－２－カルボキシレート、４－ホルミルフラン－２－カルボキシレート、２－ホルミルフラン－４－カルボキシレートの産生を介して触媒する、ペルオキシゲナーゼ、デヒドロゲナーゼおよび／またはオキシダーゼをコードする、少なくとも１つの内因性または外因性核酸分子、を発現させる。
【0052】
いくつかの態様では、２，４－フランジカルボン酸（２，４－ＦＤＣＡ）は、４－ＨＭＦの（ｉ）フラン－２，４－ジカルボアルデヒド、および／または（ｉｉ）４－（ヒドロキシメチル）フロン酸への変換を触媒するデヒドロゲナーゼまたはオキシダーゼまたはペルオキシダーゼに、（ｃ）からの４－ＨＭＦを提供することによって、（ｄ）（ｉ）フラン－２，４－ジカルボアルデヒドの４－ホルミルフラン－２－カルボキシレートへの変換を触媒するデヒドロゲナーゼ、オキシダーゼ、またはペルオキシゲナーゼに、（ｃ）（ｉ）からのフラン－２，４－ジカルボアルデヒドを提供する、（ｉｉ）４－（ヒドロキシメチル）フロン酸の４－ホルミルフラン－２－カルボキシレートへの変換を触媒するデヒドロゲナーゼ、オキシダーゼ、ペルオキシゲナーゼに、（ｃ）（ｉｉ）からの４－（ヒドロキシメチル）フロン酸を提供する、および／または（ｉｉｉ）フラン－２，４－ジカルボアルデヒドの２－ホルミルフラン－４－カルボキシレートへの変換を触媒するオキシダーゼ、またはペルオキシゲナーゼに、Ｉ（ｉ）からのフラン－２，４－ジカルボアルデヒドを提供することによって、（ｅ）（ｄ）（ｉ）および／もしくは（ｄ）（ｉｉ）からの４－ホルミルフラン－２－カルボキシレート、または（ｄ）（ｉｉｉ）からの２－ホルミルフラン－４－カルボキシレートの２，４－ＦＤＣＡへの変換を触媒するデヒドロゲナーゼまたはオキシダーゼに、（ｄ）（ｉ）および／もしくは（ｄ）（ｉｉ）からの４－ホルミルフラン－２－カルボキシレートまたは（ｄ）（ｉｉｉ）からの２－ホルミルフラン－４－カルボキシレートを提供することによって、産生され得る。
【0053】
いくつかの態様では、宿主微生物は、Ｇ３Ｐの（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートへの変換を触媒する（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートシンターゼに対するＧ３Ｐの利用能を改善するために遺伝子改変される。転写の調節（Ａｌｐｅｒ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ １０２（３６）．２００５）、ｍＲＮＡ安定性および翻訳（Ｆｅｒｒｅｉｒａ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ １１０（２８）．２０１３）（Ｓａｌｉｓ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２７．２００９）、タンパク質安定性（Ｃａｍｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．３２．２０１４）、またはより効率の低いもしくはより効率的な相同分子種の遺伝子置換を介して、様々なレベルの遺伝子発現を達成するために、異なる代謝工学戦略を実施することができる。
【0054】
いくつかの態様では、炭素源は、ヘキソース、ペントース、グリセロール、Ｃ０２、スクロース、および／またはこれらの組み合わせを含む。
【0055】
いくつかの態様では、（ｂ）からのメチルホスフェートシンターゼは、ＥＣ番号４．２．３．１５３として分類される。いくつかの態様では、シンターゼは、（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートシンターゼである（表１）。
【0056】
いくつかの態様では、（ｃ）からのホスファターゼは、ＥＣ番号３．１．３として分類されるリン酸モノエステルヒドロラーゼである。いくつかの態様では、ホスファターゼは、ハロ酸デハロゲナーゼとして分類される（Ｋｏｏｎｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４４（１）．１９９４）。いくつかの態様では、反応ｃのホスファターゼは、宿主内因性である（Ｏｆｆｌｅｙ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎ．６５．２０１９）。いくつかの態様では、宿主内因性のホスファターゼ酵素は、過剰発現される。一部の事例では、所望の反応を実施することができる異種ホスファターゼが使用され、アルカリホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、フルクトース－ビスホスファターゼ、糖－ホスファターゼ、または糖末端ホスファターゼから選択される。
【0057】
いくつかの態様では、（ｄ）からのオキシダーゼは、ＥＣ番号１．１．３として分類される。いくつかの態様では、オキシダーゼは、５－ヒドロキシメチルフルフラールオキシダーゼである。いくつかの態様では、５－ヒドロキシメチルフルフラールオキシダーゼは、４－ヒドロキシメチルフルフラール（４－ＨＭＦ）を、３ステップ反応で２，４ ＦＤＣＡに変換する。
【0058】
いくつかの態様では、（ｄ）からのデヒドロゲナーゼは、アルコールをカルボニルに酸化する場合、ＥＣ番号１．１．１として分類され、またはカルボニルを酸に酸化する場合、ＥＣ番号１．２．１として分類される。いくつかの態様では、デヒドロゲナーゼは、アルコールデヒドロゲナーゼまたはアルデヒドデヒドロゲナーゼである。
【0059】
いくつかの態様では、（ｅ）からのデヒドロゲナーゼは、ＥＣ番号１．２．１．またはＥＣ番号１．１．１として分類される。いくつかの態様では、デヒドロゲナーゼは、アルデヒドデヒドロゲナーゼまたはアルコールデヒドロゲナーゼである。いくつかの態様では、（ｅ）からのオキシダーゼは、ＥＣ番号１．１．３として分類される。いくつかの態様では、オキシダーゼは、（５－（ヒドロキシメチル）フルフラールオキシダーゼである。いくつかの態様では、（ｆ）からのデヒドロゲナーゼは、ＥＣ番号１．２．１として分類される。いくつかの態様では、デヒドロゲナーゼは、アルデヒドデヒドロゲナーゼである。いくつかの態様では、（ｆ）からのオキシダーゼは、ＥＣ番号１．１．３として分類される。いくつかの態様では、オキシダーゼは、（５－（ヒドロキシメチル）フルフラールオキシダーゼである。
【0060】
いくつかの態様では、１つ以上の組換え微生物は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｇｓｄａｌｅｉ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｍｏｓｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｉｃｕｍ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｗｏｏｄｉｉ、Ａｌｋａｌｉｂａｃｕｌｕｍ ｂａｃｃｈｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｒａｋｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｆｏｒｍｉｃｏａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｃａｔｏｌｏｇｅｎｅｓ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ、Ａｃｅｔｏｎｅｍａ ｌｏｎｇｕｍ、Ｂｌａｕｔｉａ ｐｒｏｄｕｃｔａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｌｙｃｏｌｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｍａｇｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｍａｙｏｍｂｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｍｅｔｈｏｘｙｂｅｎｚｏｖｏｒａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ、Ｏｘｏｂａｃｔｅｒ ｐｆｅｎｎｉｇｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｋｉｖｕｉ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｏｖａｔａ、Ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｏｇｅｎｉｕｍ ｐｈａｅｕｍ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｒｂｉｎｏｌｉｃｕｍ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｔｅｒｍｉｔｉｄａ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｇｌｙｃｅｒｉｎｉ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｇｇｒｅｇａｎｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ａｚｏｔｏｎｕｔｒｉｃｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｓｃｈｅｆｆｅｒｓｏｍｙｃｅｓ ｓｔｉｐｉｔｉｓ、およびＴｅｒｒｉｓｐｏｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌｙｃｏｌｉｃｕｓからなる群から選択される親微生物に由来する。
【0061】
いくつかの態様では、本開示は一般に、本開示の組換え微生物を使用して２，４－ＦＤＣＡを産生する方法に関心が寄せられ、方法は、２，４－ＦＤＣＡが産生されるまで、炭素源を提供する原料を含有する培養培地において組換え微生物を培養することを含む。
【0062】
いくつかの態様では、本開示は一般に、炭素源を含む原料からの２，４－ＦＤＣＡを産生することができる組換え微生物を産生する方法に関心が寄せられ、方法は、組換え微生物に、以下の、（ａ）グリセロールまたは単糖をグリセルアルデヒド３－リン酸（Ｇ３Ｐ）に変換することができる内因性および／または外因性核酸分子、（ｂ）（ａ）からのＧ３Ｐの（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートへの変換を触媒する（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートシンターゼをコードする少なくとも１つの内因性または外因性核酸分子、（ｃ）（ｂ）からの（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートの４－ヒドロキシメチルフルフラール（４－ＨＭＦ）への変換を触媒するホスファターゼをコードする少なくとも１つの内因性または外因性核酸分子、（ｄ）（ｃ）からの４－ＨＭＦの、（ｉ）フラン－２，４－ジカルボアルデヒドおよび／または（ｉｉ）４－（ヒドロキシメチル）フロン酸への変換を触媒するペルオキシゲナーゼ、デヒドロゲナーゼ、またはオキシダーゼをコードする少なくとも１つの内因性または外因性核酸分子、（ｅ）（ｉ）（ｄ）（ｉ）からのフラン－２，４－ジカルボアルデヒドの４－ホルミルフラン－２－カルボキシレートへの変換、および／または（ｉｉ）（ｄ）（ｉｉ）からの４－（ヒドロキシメチル）フロン酸の４－ホルミルフラン－２－カルボキシレートへの変換、および／または（ｉｉｉ）（ｃ）（ｉ）からのフラン－２，４－ジカルボアルデヒドの２－ホルミルフラン－４－カルボキシレートへの変換を触媒するペルオキシゲナーゼ、デヒドロゲナーゼ、またはオキシダーゼをコードする少なくとも１つの内因性または外因性核酸分子、（ｆ）（ｅ）（ｉ）および（ｅ）（ｉｉ）からの４－ホルミルフラン－２－カルボキシレートの、または（ｅ）（ｉｉｉ）からの２－ホルミルフラン－２－カルボキシレートの２，４－ＦＤＣＡへの変換を触媒するペルオキシゲナーゼ、デヒドロゲナーゼ、またはオキシダーゼをコードする少なくとも１つの内因性または外因性核酸分子を導入することおよび／または過剰発現させることを含む。
【0063】
いくつかの態様では、炭素源は、ヘキソース、ペントース、グリセロール、および／またはこれらの組み合わせを含む。いくつかの態様では、（ｂ）からのメチルホスフェートシンターゼは、ＥＣ番号４．２．３．１５３として分類される。いくつかの態様では、シンターゼは、（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートシンターゼである。いくつかの態様では、（ｃ）からのホスファターゼは、ＥＣ番号３．１．３として分類されるリン酸モノエステルヒドロラーゼである。いくつかの態様では、ホスファターゼは、ハロ酸デハロゲナーゼとして分類される（Ｋｏｏｎｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４４（１）．１９９４）。いくつかの態様では、反応ｃのホスファターゼは、宿主内因性である（Ｏｆｆｌｅｙ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎ．６５．２０１９）。いくつかの実施形態では、宿主内因性のホスファターゼ酵素は、過剰発現される。一部の事例では、所望の反応を実施することができる異種ホスファターゼが使用され、アルカリホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、フルクトース－ビスホスファターゼ、糖－ホスファターゼ、または糖末端ホスファターゼから選択される。
【0064】
いくつかの態様では、（ｄ）からのデヒドロゲナーゼは、アルコールをカルボニルに酸化する場合、ＥＣ番号１．１．１として分類され、またはカルボニルを酸に酸化する場合、ＥＣ番号１．２．１として分類される。いくつかの態様では、デヒドロゲナーゼは、アルコールデヒドロゲナーゼまたはアルデヒドデヒドロゲナーゼである。
【0065】
いくつかの態様では、（ｄ）からのオキシダーゼは、ＥＣ番号１．１．３として分類される。いくつかの態様では、オキシダーゼは、５－（ヒドロキシメチルフルフラールオキシダーゼである。いくつかの態様では、５－ヒドロキシメチルフルフラールオキシダーゼは、４－ヒドロキシメチルフルフラール（４－ＨＭＦ）を、３ステップ反応で２，４ ＦＤＣＡに変換する。
【0066】
いくつかの態様では、（ｅ）からのオキシダーゼは、ＥＣ番号１．１．３として分類される。いくつかの態様では、オキシダーゼは、（５－（ヒドロキシメチル）フルフラールオキシダーゼである。いくつかの態様では、（ｆ）からのデヒドロゲナーゼは、ＥＣ番号１．２．１として分類される。いくつかの態様では、デヒドロゲナーゼは、アルデヒドデヒドロゲナーゼである。いくつかの態様では、（ｆ）からのオキシダーゼは、ＥＣ番号１．１．３として分類される。いくつかの態様では、オキシダーゼは、（５－（ヒドロキシメチル）フルフラールオキシダーゼである。
【0067】
いくつかの態様では、本開示は、微生物によって産生される２，４－ＦＤＣＡからポリマーを産生する方法に関心が寄せられ、２，４－ＦＤＣＡおよびジオールは非生物学的プロセスで触媒的に重合される。いくつかの態様では、２，４－ＦＤＣＡは、可塑剤組成物の一部であり、可塑剤は、可塑化ポリマー組成物の一部である。
【0068】
いくつかの態様では、本開示は、概して、外因性炭素源を含む原料から４－ヒドロキシメチルフルフラール（４－ＨＭＦ）を産生することができる組換え微生物に関心が寄せられ、組換え微生物は、以下の、（ａ）炭素源をグリセルアルデヒド３－リン酸（Ｇ３Ｐ）に変換することができる内因性および／または外因性核酸分子と、（ｂ）（ａ）からのＧ３Ｐの（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートへの変換を触媒する（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートシンターゼをコードする少なくとも１つの内因性または外因性核酸分子と、（ｃ）（ｂ）からの（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートの４－ヒドロキシメチルフルフラール（４－ＨＭＦ）への変換を触媒するホスファターゼをコードする少なくとも１つの内因性または外因性核酸分子と、を発現させる。
【0069】
いくつかの態様では、ホスファターゼは、ハロ酸デハロゲナーゼとして分類される（Ｋｏｏｎｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４４（１）．１９９４）。いくつかの態様では、反応ｂのホスファターゼは、宿主内因性である（Ｏｆｆｌｅｙ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎ．６５．２０１９）。いくつかの態様では、宿主内因性のホスファターゼ酵素は、過剰発現される。一部の事例では、所望の反応を実施することができる異種ホスファターゼが使用され、アルカリホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、フルクトース－ビスホスファターゼ、糖－ホスファターゼ、または糖末端ホスファターゼから選択される。
【0070】
いくつかの態様では、本開示は一般に、炭素源を含む原料から２，４－フランジカルボン酸（２，４－ＦＤＣＡ）を産生することができる組換え微生物に関心が寄せられ、組換え微生物は、以下の、（ａ）グリセロールまたは単糖をグリセルアルデヒド３－リン酸（Ｇ３Ｐ）に変換することができる内因性および／または外因性核酸分子、（ｂ）（ａ）からのＧ３Ｐの（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートへの変換を触媒する（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートシンターゼをコードする少なくとも１つの内因性または外因性核酸分子；（ｃ）（ｂ）からの（５－ホルミルフラン－３－イル）チルホスフェートの４－ヒドロキシメチルフルフラール（４－ＨＭＦ）への変換を触媒するホスファターゼをコードする少なくとも１つの内因性または外因性核酸分子、（ｄ）（ｃ）からの４－ＨＭＦの２，４ ＦＤＣＡへの変換を直接的にもしくは中間体フラン－２，４－ジカルボアルデヒド、４－（ヒドロキシメチル）フロン酸、４－ホルミルフラン－２－カルボキシレート、４－ホルミルフラン－２－カルボキシレート、２－ホルミルフラン－４－カルボキシレートの産生を介して触媒するもの、のうちの１つ以上を発現させる。
【0071】
いくつかの態様では、２，４－フランジカルボン酸（２，４－ＦＤＣＡ）は、（ｃ）からの４－ＨＭＦを、（ｃ）からの４－ＨＭＦの（ｉ）フラン－２，４－ジカルボアルデヒドおよび／または（ｉｉ）４－（ヒドロキシメチル）フロン酸への変換を触媒するペルオキシゲナーゼ、デヒドロゲナーゼ、またはオキシダーゼをコードする少なくとも１つの内因性または外因性核酸分子に、（ｅ）（ｉ）（ｄ）（ｉ）からのフラン－２，４－ジカルバルアルデヒドの４－ホルミルフラン－２－カルボキシレートへの変換、および／または（ｉｉ）（ｄ）（ｉｉ）からの４－（ヒドロキシメチル）フロン酸の４－ホルミルフラン－２－カルボキシレートへの変換を触媒するペルオキシゲナーゼ、デヒドロゲナーゼ、またはオキシダーゼをコードする少なくとも１つの内因性または外因性核酸分子に、（ｆ）（ｅ）からの４－ホルミルフラン－２－カルボキシレートの２，４－ＦＤＣＡへの変換を触媒するペルオキシゲナーゼ、デヒドロゲナーゼ、またはオキシダーゼをコードする少なくとも１つの内因性または外因性核酸分子に、提供することによって産生することができる。
【図面の簡単な説明】
【0072】
【図1】Ｇ３Ｐの４－ＨＭＦへの新規な変換のための本開示の組換え微生物によって利用される生合成経路の図式概要である。酵素反応の列の下の数字は、対応する酵素の３桁のＥＣ番号を示す。
【図2】４－ＨＭＦを基質として使用する、意図される産生物の生合成産生の図式概要である。産生物としては、以下に限定されないが、２，４－フランジメタノール、フラン－２，４－ジカルボアルデヒド、４－（ヒドロキシメチル）フロン酸、２－ホルミルフラン－４－カルボキシレート、４－ホルミルフラン－２－カルボキシレート、および２，４－ＦＤＣＡが挙げられる。酵素反応の列の近くの数字は、対応する酵素の３桁のＥＣ番号を示す。
【図3】炭素源（この場合はグルコースまたはグリセロール）のＧ３Ｐへの変換のための、可能性のある生合成経路の図式概要である。
【図4】発現および精製された５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートシンターゼ候補、ＭｆｎＢ１の、例示的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ画像である。
【図5】陰性対照試料（灰色）、およびＧ３Ｐから産生された（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートを示すメチルホスフェートシンターゼ反応（黒色）を示す、代表的なＵＶスペクトルである。
【図6】ｔ０（上パネル）およびｔ２ｈ（下パネル）での、メチルホスフェートシンターゼによるＧ３Ｐからの（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェート産生を示す代表的なＵＶスペクトルである。
【図7】ホスファターゼ（上パネル）、Ｅ．ｃｏｌｉ溶解物（中パネル）、および酵母溶解物（下パネル）による、（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートからの４－ＨＭＦ産生を示す代表的なＵＶスペクトルである。
【図8】発現させた４－ＨＭＦオキシダーゼ候補であるＨｍｆＨ１の、精製形態（ＰＥ）、精製前の可溶性相（ＳＰ）、不溶性相（ＩＰ）、および精製後のフロースルー（ＦＴ）での、例示的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ画像である。
【図9】１６時間のインキュベーション後の、４－ＨＭＦオキシダーゼ候補であるＨｍｆＨ１（上パネル）、ＨｍｆＨ６（中パネル）、およびＨｍｆＨ７（下パネル）による、４－ＨＭＦからの２，４ ＦＤＣＡ産生を示す代表的なＵＶスペクトルである。反応中間体４－ホルミルフラン－２－カルボキシレート（２，４－ＦＦＣＡ）およびフラン－２，４－ジカルボアルデヒド（２，４－ＤＦＦ）も同定し、定量した。クロマトグラフィー分離を、ＨＰＬＣ－ＤＡＤにより行った。
【図10】ｈＭＦｈ７により４－ＨＭＦから産生された２，４－ＦＤＣＡの同定を示す、代表的なＧＣ－ＭＳクロマトグラム（上パネル）および質量スペクトル（下パネル）である。
【図11】シリル化２，４－ＦＤＣＡの表示である。
【図12】４－ＨＭＦデヒドロゲナーゼ候補ＤＨ１、ＤＨ２、またはＤＨ６による２，４－ＨＭＦの２，４－フランジメタノールへの還元中の、酸化によるＮＡＤ（Ｐ）Ｈの枯渇を示す代表的なプロットである。
【図13】補助因子の還元および２，４－ＨＭＦ基質のフラン－２，４－ジカルアルデヒドへの酸化によるＮＡＤ（Ｐ）Ｈ形成を示す代表的なプロットである。
【図14】アルデヒドデヒドロゲナーゼ候補、ＤＨ８、ＤＨ９、ＤＨ１０、およびＤＨ１１による、補助因子の還元および２，４－ＨＭＦ基質の４－（ヒドロキシメチル）フロン酸への酸化によるＮＡＤ（Ｐ）Ｈ形成を示す代表的なプロットである。
【図15】アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＤＨ８）とアルコールデヒドロゲナーゼ（ＤＨ６）との組合せによる、４－ＨＭＦからの２，４－ＦＤＣＡ産生を示す代表的なクロマトグラムである。４－ＨＭＦ基質なしで行った陰性対照反応物（上パネル）。ＤＨ８、ＤＨ６、および４－ＨＭＦ基質を有する反応物（中パネル）。ＤＨ６およびＤＨ８酵素なしで行われた陰性対照反応物（下パネル）。
【図16】ｔ０（上パネル）およびｔ４８ｈ（下パネル）での、グルコース発酵からのインビボでの２，４－ＦＤＣＡ産生を示す代表的なクロマトグラムである。
【発明を実施するための形態】
【0073】
詳細な説明
定義
以下の定義および略語は、本開示の解釈に使用されるべきである。
定義
以下の定義および略語は、本開示の解釈に使用されるべきである。
【0074】
本明細書中および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が別途明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「酵素」への言及は、複数のそのような酵素を含み、また「微生物」への言及は、１つ以上の微生物への言及などを含む。
【0075】
本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含める（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含めている（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｅ）」、「有している（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「含有している（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」という用語、またはそれらの任意の他の変形は、非排他的包含を網羅することが意図される。要素のリストを含む組成物、混合物、プロセス、方法、物品、または装置は、必ずしもそれらの要素のみに限定されるものではなく、そのような組成物、混合物、プロセス、方法、物品、または装置に明示的に列挙されていない、または固有ではない他の要素を含み得る。さらに、反対に明示的に述べられていない限り、「または」は、包括的な「または」を指し、排他的な「または」を指すものではない。
【0076】
本明細書において数値を変更するために使用される場合、「約」および「おおよそ」という用語は、その明示的な値をとり囲む近い範囲を示す。「Ｘ」が値である場合、「約Ｘ」または「おおよそＸ」は、０．９Ｘ～１．１Ｘの値、またはいくつかの実施形態では、０．９５Ｘ～１．０５Ｘの値を示す。「約Ｘ」または「おおよそＸ」への任意の言及は、少なくともＸ、０．９５Ｘ、０．９６Ｘ、０．９７Ｘ、０．９８Ｘ、０．９９Ｘ、１．０１Ｘ、１．０２Ｘ、１．０３Ｘ、１．０４Ｘ、および１．０５Ｘの値を具体的に示す。したがって、「約Ｘ」および「おおよそＸ」は、例えば、「０．９８Ｘ」の請求の範囲での限定に対し、明細書による裏付けを教示し、提供することを意図している。
【0077】
本明細書で使用される場合、「微生物の」、「微生物生物」、および「微生物」というは、古細菌、細菌、または真核生物のドメイン内に含まれる顕微鏡サイズの細胞として存在する任意の生物を含み、後者は、酵母および糸状菌、原虫、藻類、または高等原生生物を含む。したがって、この用語は、顕微鏡サイズを有する原核細胞もしくは真核細胞または生物を包含することを意図しており、すべての種の細菌、古細菌、および真正細菌、ならびに酵母および真菌などの真核微生物を含む。また、化学物質の産生のために培養され得る任意の種の細胞培養も含まれる。
【0078】
本明細書に記載されるように、いくつかの実施形態では、組換え微生物は原核微生物である。いくつかの実施形態では、原核微生物は細菌である。「細菌」、または「真正細菌」は、原核生物のドメインを指す。細菌は、以下のように少なくとも１１の別個の群を含む：（１）グラム陽性（グラム＋）細菌、このうち、２つの主要な下位区分があり、（１）高Ｇ＋Ｃ群（アクチノミセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）、マイコバクテリア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、その他）（２）低Ｇ＋Ｃ群（Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｓ））、（２）プロテオバクテリア（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、例えば、紅色光合成＋非光合成グラム陰性細菌（最も「一般的な」グラム陰性細菌を含む）、（３）シアノバクテリア（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、例えば、酸素発生型光合成生物、（４）スピロヘータおよび関連種、（５）プランクトマイセス（Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｓ）、（６）バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、フラボバクテリア（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａ）、（７）Ｃｈｌａｍｙｄｉａ、（８）緑色硫黄細菌（９）緑色非硫黄細菌（嫌気性光栄養生物も）（１０）放射線耐性ミクロコッカス（ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｉ）および近縁種（１１）サーモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）およびサーモシフォ・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ）。
【0079】
「グラム陰性細菌」には、球菌、非腸内桿菌（ｎｏｎｅｎｔｅｒｉｃ ｒｏｄ）、および腸内桿菌（ｅｎｔｅｒｉｃ ｒｏｄ）が含まれる。グラム陰性細菌の属には、例えば、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、スピリラム（Ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、アエロバクター（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）、スピリラ（Ｓｐｉｒｉｌｌａ）、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、およびフゾバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）が含まれる。
【0080】
「グラム陽性細菌」には、球菌、非胞子形成桿菌、および胞子形成桿菌が含まれる。グラム陽性細菌の属には、例えば、アクチノマイセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エリシペロスリクス（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ミクソコッカス（Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ）、ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、およびストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）が含まれる。
【0081】
「組換え微生物」および「組換え宿主細胞」という用語は、本明細書において互換的に使用され、組み込み構築物において、内因性酵素を発現もしくは過剰発現させるために、ベクターに含まれる異種酵素などの異種酵素を発現するために遺伝子改変された微生物、または内因性遺伝子の発現に変化を有する微生物を指す。「変化（ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ）」とは、遺伝子の発現、１つ以上のポリペプチドもしくはポリペプチドサブユニットをコードするＲＮＡ分子もしくは同等のＲＮＡ分子のレベル、または１つ以上のポリペプチドもしくはポリペプチドサブユニットの活性が、上方制御または下方制御され、それにより発現、レベル、または活性が、変化の非存在下で観察されたものよりも多いか、またはそれ以下であることを意味する。「組換え微生物」および「組換え宿主細胞」という用語は、特定の組換え微生物だけでなく、そのような微生物の子孫または潜在的な子孫を指すことが理解される。
【0082】
遺伝子配列に関する「発現」という用語は、遺伝子の転写、および適宜、結果として生じるｍＲＮＡ転写物のタンパク質への翻訳を指す。したがって、文脈から明らかになるように、タンパク質の発現は、オープンリーディングフレーム配列の転写および翻訳から生じる。宿主細胞中の所望の産物の発現レベルは、細胞中に存在する対応するｍＲＮＡの量、または選択された配列によってコードされる所望の産物の量のいずれかに基づいて決定され得る。例えば、選択された配列から転写されたｍＲＮＡは、ｑＲＴ－ＰＣＲによって、またはノーザンハイブリダイゼーションによって定量化され得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）を参照されたい）。選択配列によってコードされるタンパク質は、様々な方法によって、例えば、ＥＬＩＳＡによって、タンパク質の生物学的活性をアッセイすることによって、またはそのような活性に依存しないアッセイ、例えばウェスタンブロッティングまたは放射性イムノアッセイなどを用いて、タンパク質を認識し結合する抗体を用いて、定量化することができる。上記Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９を参照されたい。
【0083】
遺伝子または酵素活性の発現レベルを「減少する」または「低減する」という用語は、遺伝子または酵素活性の発現を部分的または完全に抑制することを指す。発現または活性のこの抑制は、遺伝子の発現の阻害、遺伝子発現に必要なプロモーター領域のすべてもしくは一部の欠失、遺伝子のコード領域の欠失、または弱い天然プロモーターもしくは合成プロモーターによる野生型プロモーターの置換のいずれかであり得る。例えば、遺伝子は完全に欠失されてもよく、本開示による株の同定、単離および精製を促進する選択マーカー遺伝子によって置換されてもよい。あるいは、内因性遺伝子をノックアウトまたは欠失させて、新しい代謝経路を優先してもよい。さらに別の実施形態では、遺伝子の発現は、弱いプロモーターを使用することによって、または特定の変異を導入することによって減少または低減され得る。
【0084】
本明細書で使用される場合、本開示の微生物または酵素活性に関連して使用される場合、「非天然の」という用語は、微生物または酵素が、参照される種の野生型系統を含む、参照される種の天然に存在する系統において通常見出されない少なくとも１つの遺伝的変化を有することを意味することが意図される。遺伝子変化としては、例えば、代謝ポリペプチドをコードする発現可能な核酸を導入する改変、他の核酸付加、核酸欠失、および／または微生物の遺伝物質の他の機能的破壊が挙げられる。かかる改変には、例えば、参照種に対する異種ポリペプチド、相同ポリペプチド、または異種ポリペプチドと相同ポリペプチドの両方に対するコード領域およびその機能的断片が含まれる。追加の改変としては、例えば、改変が遺伝子またはオペロンの発現を変化させる非コード調節領域が含まれる。例示的な非天然の微生物または酵素活性は、上述のヒドロキシル化活性を含む。
【0085】
様々な分子、例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、酵素などに関して本明細書で使用される場合、「外因性」という用語は、自然界の所与の酵母、細菌、生物、微生物、または細胞に通常または自然に見つからない、かつ／または産生されない分子を指す。
【0086】
一方で、様々な分子、例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、酵素などに関して本明細書で使用される場合、「内因性」または「生来性」という用語は、自然界の所与の酵母、細菌、生物、微生物、または細胞に通常、または自然に見出され、かつ／またはそれらによって産生される分子を指す。
【0087】
改変宿主細胞に関連して本明細書で使用される場合、「異種」という用語は、様々な分子を指し、例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、酵素、など、以下のうちの少なくとも１つがあてはまる：（ａ）分子が、宿主細胞に対し、外来性（「外因性」）（すなわち、そこに自然には見られない）、（ｂ）分子が、所与の宿主微生物または宿主細胞に自然に見出される（例えば、それに「内因性」である）が、細胞の不自然な位置で、または不自然な量で産生される、および／または（ｃ）分子が、内因性ヌクレオチドまたはアミノ酸配列とはヌクレオチドまたはアミノ酸配列が異なり、その結果、内因的に見出されるような内因性ヌクレオチドまたはアミノ酸とヌクレオチドまたはアミノ酸配列が異なる分子は、細胞内で不自然な量で（例えば、自然に見出されるよりも多い）産生される。
【0088】
第１のファミリーまたは種の原酵素または遺伝子に関して本明細書で使用される場合、「相同体」という用語は、第２のファミリーまたは種の別個の酵素または遺伝子を指し、これらは機能解析、構造解析、またはゲノム解析によって、第１のファミリーまたは種の原酵素または遺伝子に対応する第２のファミリーまたは種の酵素または遺伝子であると決定される。相同体は、機能的、構造的、またはゲノム的な類似性を有することが多い。酵素または遺伝子の相同体を、遺伝的プローブおよびＰＣＲを使用して容易にクローン化し得る技術が公知である。相同体としてのクローン配列の同一性は、機能的アッセイおよび／または遺伝子のゲノムマッピングによって確認することができる。
【0089】
遺伝子によってコードされるアミノ酸配列が第２の遺伝子のアミノ酸配列と類似のアミノ酸配列を有する場合に、あるタンパク質は、第２のタンパク質に対して「相同性」を有しているか、または「相同」である。あるいは、２つのタンパク質が「類似の」アミノ酸配列を有する場合、タンパク質は、第２のタンパク質と相同性を有する。したがって、「相同タンパク質」という用語は、２つのタンパク質が類似のアミノ酸配列を有することを意味することが意図される。ある特定の例では、２つのタンパク質間の相同性は、進化に関連付けられた、その共有された祖先を示す。「相同配列」または「相同体」という用語は、機能的に関連すると考えられ、信じられ、または知られている。機能的関係は、（ａ）配列同一性の程度、および／または（ｂ）同一もしくは類似の生物学的機能を含むがこれに限定されない、いくつかの方法のうちのいずれか１つで示され得る。好ましくは、（ａ）および（ｂ）の両方が示されている。配列同一性の程度は変化してもよく、しかし一実施形態では、少なくとも５０％（当該技術分野で公知の標準的な配列アライメントプログラムを使用する場合）、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも９８．５％、または少なくとも約９９％、または少なくとも９９．５％、または少なくとも９９．８％、または少なくとも９９．９％である。相同性は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９８７）Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ３０，ｓｅｃｔｉｏｎ ７．７１８，Ｔａｂｌｅ ７．７１で論じたような、当技術分野で容易に入手可能なソフトウェアプログラムを使用して決定することができる。一部のアラインメント・プログラムは、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｌｔｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｕ．Ｋ．）およびＡＬＩＧＮ Ｐｌｕｓ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ａｎｄ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）である。他の非限定的なアライメントプログラムには、Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，Ｍｉｃｈｉｇａｎ）、ＡｌｉｇｎＸ、およびＶｅｃｔｏｒ ＮＴＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）が含まれる。類似の生物学的機能には、限定されるものではないが、以下が含まれ得る：同じまたは類似の酵素反応を触媒すること、基質または補助因子に対して同じまたは類似の選択性を有すること、同じまたは類似の安定性を有すること、様々な発酵条件（温度、ｐＨなど）に対して同じまたは類似の耐性を有すること、および／または様々な代謝基質、産生物、副産物、中間体などに対する同じまたは類似の耐性を有すること。生物学的機能の類似性の程度は変動し得るが、一実施形態では、所与の生物学的機能を決定するための、当業者に公知の１つ以上のアッセイによれば、少なくとも１％、少なくとも２％であり、少なくとも３％であり、少なくとも４％であり、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％であり、少なくとも８％、少なくとも９％であり、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％であり、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％であり、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも約９１％であり、少なくとも約９２％であり、少なくとも約９３％であり、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％であり、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも９８．５％、または少なくとも約９９％であり、または少なくとも９９．５％、または少なくとも９９．８％、または少なくとも９９．９％である。
【0090】
「バリアント」という用語は、本明細書に記載される任意のポリペプチドまたは酵素を指す。バリアントはまた、多量体、個々の成分を含む多量体、個々の成分の倍数を含む多量体（例えば、参照分子の多量体）、化学分解産物、および生物学的分解産物の１つ以上の成分を包含する。特に、非限定的な実施形態では、酵素は、参照酵素をコードするポリペプチド配列の任意の部分における変化により、参照酵素に対する「バリアント」であり得る。参照酵素のバリアントは、参照酵素の調製物の酵素活性を測定するために使用される標準アッセイにおいて、少なくとも１０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１０５％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１３０％またはそれ以上の酵素活性を有し得る。いくつかの実施形態では、バリアントはまた、本開示の全長酵素または未処理酵素に対して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するポリペプチドを指し得る。いくつかの実施形態では、バリアントはまた、本開示の成熟酵素、または処理された酵素に対し、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するポリペプチドを指し得る。
【0091】
本明細書において使用される場合、「生産力」という用語は、生合成経路からの産生物の収率を指す。一実施形態では、生産力は、出発化合物の重量当たりの最終産生物の重量パーセントとして表すことができる。
【0092】
本明細書で使用される場合、「熱力学的最大収率」という用語は、原料と比較した産生物のエネルギー値に基づく、グルコースなどの所与の原料の発酵から得られた産生物の最大収率を指す。通常の発酵では、例えば、光、水素ガス、またはメタンまたは電気などの追加のエネルギー源を使用しない場合、産生物は、原料よりも多くのエネルギーを含有しない。熱力学的最大収率は、原料からのすべてのエネルギーおよび質量が産生物に変換される産生物の収率を意味する。この収率は計算することができ、特定の経路に依存しない。産生物への特定の経路が、熱力学的最大収率よりも低い収率を有する場合、産生物は質量を失い、産生物へのより効率的な経路に改善されるか、または置き換られ得る可能性が最も高い。
【0093】
「酸化還元バランス」という用語は、所与の一連の反応における酸化還元補助因子の総量を指す。酸化還元補助因子が不足している場合、酸化還元バランスは負であり、補助因子の需要を満たすために原料を燃焼させる必要があるため、このような経路の収率は現実的ではない。酸化還元補助因子が余剰である場合、酸化還元バランスは正であると言われ、そのような経路の収率は最大収率よりも低くなる（Ｄｕｇａｒ ｅｔ ａｌ．“Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐａｔｈｗａｙｓ ｆｏｒ ｂｉｏｆｕｅｌｓ ａｎｄ ｂｉｏ－ｂａｓｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ”Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２９．１２（２０１１）：１０７４）。さらに、経路が消費するのと同じ量の酸化還元補助因子を産生する場合、酸化還元バランスはゼロであり、この経路を「酸化還元バランス」と呼んでもよい。代謝経路を設計し、酸化還元補助因子がバランスが取れているか、またはバランスがとれている状態に近いように生物を操作することにより、通常、バランスの取れていない経路と比較して、所望の化合物のより効率的で高収率の産生が得られる。酸化還元反応は、２つの半反応が同時に起こるので常に一緒に起こり、１つは酸化反応であり、もう一つは還元反応である。酸化還元プロセスでは、還元剤は電子を酸化剤に伝達する。したがって、反応において、還元体または還元剤が電子を失って酸化され、酸化体または酸化剤が電子を得て還元される。一実施形態では、酸化還元反応は、生物学的システムで起こる。酸化還元状態という用語は、微生物細胞などの生物学的システムにおける天然または非天然の代謝経路のＮＡＤ＋／ＮＡＤＨとＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨのバランスを記述するためにしばしば使用される。酸化還元状態は、いくつかの代謝物のセット（例えば、乳酸およびピルビン酸、ベータ－ヒドロキシ酪酸、およびアセト酢酸）のバランスに反映され、その相互変換はこれらの比に依存する。一実施形態では、水素をＮＡＤ（Ｐ）Ｈに変換することができるヒドロゲナーゼ酵素の使用と組み合わせた、または使用しない水素または電子の外部供給源は、負の酸化還元バランスを有する代謝経路における産生物の収率を増加させるために、すなわち、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈなどの酸化還元補助因子に不足がある場合に有益であり得る。
【0094】
「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」、および「オリゴヌクレオチド」という用語は、互換的に使用される。これらは、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、またはその類似体のいずれかの長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有してもよく、既知または未知の任意の機能を実施することができる。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例である。遺伝子または遺伝子断片のコード領域または非コード領域、連鎖解析から定義される遺伝子座、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマー。ポリヌクレオチドは、１つ以上の改変ヌクレオチド、例えば、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体を含んでもよい。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する改変は、ポリマーのアセンブリの前または後に付与され得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断されてもよい。ポリヌクレオチドは、例えば標識成分とのコンジュゲーションなどにより、重合後にさらに改変されてもよい。
【0095】
「相補性」は、従来のワトソンクリックまたは他の非従来型のいずれかによる、別の核酸配列との水素結合を形成する核酸の能力を指す。相補性のパーセントは、第２の核酸配列との水素結合（例えば、ワトソン－クリック塩基対合）を形成することができる核酸分子中の残基のパーセンテージを示す（例えば、１０個のうちの５、６、７、８、９、１０は、それぞれ５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、および１００％の相補性である）。「完全相補的」とは、核酸配列の全ての連続残基が、第二の核酸配列中の同じ数の連続残基と水素結合することを意味する。本明細書で使用される場合、「実質的に相補的」とは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、またはそれ以上のヌクレオチドの領域にわたって少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％である相補性の程度を指し、またはストリンジェントな条件下でハイブリダイズする２つの核酸を指す。例えば、相補性パーセントを評価する目的などでの配列同一性は、任意の適切なアライメントアルゴリズムによって測定されてもよく、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（例えば、ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／ｅｍｂｏｓｓ＿ｎｅｅｄｌｅ／ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ．ｈｔｍｌで入手可能なＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅ ａｌｉｇｎｅｒを参照されたい、任意選択でデフォルト設定あり）、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（例えば、ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉで入手可能なＢＬＡＳＴ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｔｏｏｌを参照されたい、任意選択でデフォルト設定あり）、またはＳｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（例えば、ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／ｅｍｂｏｓｓ＿ｗａｔｅｒ／ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ．ｈｔｍｌで入手可能なＥＭＢＯＳＳ Ｗａｔｅｒ ａｌｉｇｎｅｒを参照されたい、任意でデフォルト設定あり）を含むが、これらに限定されない。最適なアライメントは、デフォルトパラメータを含む、選択されたアルゴリズムの任意の適切なパラメータを使用して評価され得る。
【0096】
「生物学的に純粋な培養物」または「実質的に純粋な培養物」という用語は、培養物の複製を妨げるか、または通常の細菌学的技術によって検出されるのに十分な量で他の細菌種を含まない、本明細書に記載の細菌種の培養物を指す。
【0097】
本明細書で使用される場合、「制御配列」は、オペレーター、プロモーター、サイレンサー、またはターミネーターを指す。
【0098】
本明細書で使用される場合、「導入される」とは、自然に発生する導入ではなく、現代のバイオテクノロジーによる導入を指す。
【0099】
本明細書で使用される場合、「構成的プロモーター」は、ほとんどの条件下でおよび／またはほとんどの開発段階の間に活性であるプロモーターである。バイオテクノロジーで使用される発現ベクターに構成的プロモーターを使用することにはいくつかの利点があり、例えば、トランスジェニック細胞または生物を選択するために使用されるタンパク質の高レベルの産生、容易な検出および定量を可能にするレポータータンパク質またはスコア化可能な（ｓｃｏｒａｂｌｅ）マーカーの高レベルの発現、調節転写システムの一部である転写因子の高レベルの産生、生物体において偏在する活性を必要とする化合物の産生、および開発のすべての段階に必要な化合物の製造である。
【0100】
本明細書で使用される場合、「非構成的プロモーター」は、特定の条件下で、特定のタイプの細胞で、および／または特定の発達段階の間に活性であるプロモーターである。例えば、誘導性プロモーター、および開発制御下にあるプロモーターは、非構成的プロモーターである。
【0101】
本明細書で使用される場合、「誘導性」プロモーターまたは「抑制性」プロモーターは、化学的または環境的要因の制御下にあるプロモーターである。誘導性プロモーターによる転写に影響を与え得る環境条件の例としては、嫌気性条件、特定の化学物質、光の存在、酸性または塩基性条件などが挙げられる。
【0102】
本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」という用語は、一方の機能が他方によって制御されるように、単一の核酸断片上の核酸配列の会合を指す。例えば、プロモーターは、そのコード配列の発現を制御できる（すなわち、コード配列がプロモーターの転写制御下にある）場合、コード配列と作動可能に連結される。コード配列は、センスまたはアンチセンス方向で調節配列に作動可能に連結され得る。別の実施例では、本開示の相補的ＲＮＡ領域は、直接的または間接的に、標的ｍＲＮＡに５’で、または標的ｍＲＮＡに３’で、または標的ｍＲＮＡ内に連結されてもよく、または標的ｍＲＮＡに対して第１の相補的領域は５’であり、その補体は３’である。
【0103】
本明細書で使用される場合、「触媒的に重合された」という用語は、本開示のモノマーが非生物学的または非インビボの状況で重合される重合プロセスを指す。
【0104】
本明細書で使用される場合、「シグナル配列」という用語は、ペプチドおよびポリペプチドを細胞の位置または細胞外環境に向けて標的指向させるアミノ酸配列を指す。シグナル配列は、典型的にはポリペプチドのＮ末端部分にあり、典型的には酵素的に除去される。それらのシグナル配列を有するポリペプチドは、全長および／または未処理と呼称される。それらのシグナル配列が除去されたポリペプチドは、成熟および／または処理されていると称される。
【0105】
本明細書で使用される場合、「微生物組成物」は、本開示の１つ以上の微生物を含む組成物を指す。
【0106】
本明細書で使用される場合、「担体」、「許容可能な担体」、「商業的に許容可能な担体」、または「工業的に許容可能な担体」は、微生物が投与、保存、または移動され得る希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指し、微生物に有害な影響を与えない。
【0107】
本明細書で使用される場合、「生産性」という用語は、１時間当たりの、産生される（２，４－ＦＤＣＡ）などの生物学的産物の総量を指す。
【0108】
本明細書で使用される場合、「生合成産物」という用語は、本明細書で企図される以下の産物の任意の一つ以上を指す：４－ＨＭＦ、２，４－フランジメタノール、フラン－２，４－ジカルボアルデヒド、４－（ヒドロキシメチル）フロン酸、２－ホルミルフラン－４－カルボキシレート、４－ホルミルフラン－２－カルボキシレート、および２，４－ＦＤＣＡ。
【0109】
組換え微生物
一実施形態では、本開示は、本明細書で企図される生合成産物の任意の一つ以上を産生することができる組換え微生物を提供する。一実施形態では、組換え微生物は４－ＨＭＦを産生する。一実施形態では、組換え微生物は、２，４，フランジメタノールを産生する。一実施形態では、組換え微生物は、フラン－２，４－ジカルボアルデヒドを産生する。一実施形態では、組換え微生物は、４－（ヒドロキシメチル）フロン酸を産生する。一実施形態では、組換え微生物は、２－ホルミルフラン－４－カルボキシレートを産生する。一実施形態では、組換え微生物は、４－ホルミルフラン－２－カルボキシレートを産生する。一実施形態では、組換え微生物は、２，４－ＦＤＣＡを産生する。
一実施形態では、本開示は、本明細書で企図される生合成産物の任意の一つ以上を産生することができる組換え微生物を提供する。一実施形態では、組換え微生物は４－ＨＭＦを産生する。一実施形態では、組換え微生物は、２，４，フランジメタノールを産生する。一実施形態では、組換え微生物は、フラン－２，４－ジカルボアルデヒドを産生する。一実施形態では、組換え微生物は、４－（ヒドロキシメチル）フロン酸を産生する。一実施形態では、組換え微生物は、２－ホルミルフラン－４－カルボキシレートを産生する。一実施形態では、組換え微生物は、４－ホルミルフラン－２－カルボキシレートを産生する。一実施形態では、組換え微生物は、２，４－ＦＤＣＡを産生する。
【0110】
一実施形態では、組換え微生物は、生合成産物のうちのいずれか６つを産生する。一実施形態では、組換え微生物は、生合成産物のうちのいずれか５つを産生する。一実施形態では、組換え微生物は、生合成産物のうちのいずれか４つを産生する。一実施形態では、組換え微生物は、生合成産物のうちのいずれか３つを産生する。
【0111】
一実施形態では、炭素源は、グリセルアルデヒド３－リン酸（Ｇ３Ｐ）に変換される。Ｇ３Ｐは、共通の天然中間代謝物である。いくつかの実施形態では、それは、グルコースから解糖経路を介して、またはキシロース（ペントースリン酸経路からであるが限定されない）から、またはグリセロールから産生することができる。いくつかの実施形態では、Ｇ３Ｐは、ＣＯ２捕捉技術から誘導され得る。一実施形態では、組換え微生物は、ヘキソース、ペントース、グリセロール、またはＣＯ２捕捉技術を含む炭素源を利用して、生合成産物の任意の１つ以上を産生することができる。特定の実施形態では、炭素源はグリセロールである。
【0112】
一実施形態では、組換え微生物は、いくつかの酵素的に触媒された連続するステップを介して、Ｇ３Ｐを任意の１つ以上の生合成産物に変換する新規の能力を含む。
【0113】
一実施形態では、宿主微生物は、Ｇ３Ｐの（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートへの変換を触媒する（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートシンターゼに対するＧ３Ｐの利用可能性を改善するために遺伝子改変される。
【0114】
一実施形態では、前記組換え微生物は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｇｓｄａｌｅｉ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｍｏｓｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｉｃｕｍ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｗｏｏｄｉｉ、Ａｌｋａｌｉｂａｃｕｌｕｍ ｂａｃｃｈｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｒａｋｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｆｏｒｍｉｃｏａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｃａｔｏｌｏｇｅｎｅｓ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ、Ａｃｅｔｏｎｅｍａ ｌｏｎｇｕｍ、Ｂｌａｕｔｉａ ｐｒｏｄｕｃｔａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｌｙｃｏｌｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｍａｇｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｍａｙｏｍｂｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｍｅｔｈｏｘｙｂｅｎｚｏｖｏｒａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ、Ｏｘｏｂａｃｔｅｒ ｐｆｅｎｎｉｇｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｋｉｖｕｉ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｏｖａｔａ、Ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｏｇｅｎｉｕｍ ｐｈａｅｕｍ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｒｂｉｎｏｌｉｃｕｍ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｔｅｒｍｉｔｉｄａ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｇｌｙｃｅｒｉｎｉ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｇｇｒｅｇａｎｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ａｚｏｔｏｎｕｔｒｉｃｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｓｃｈｅｆｆｅｒｓｏｍｙｃｅｓ ｓｔｉｐｉｔｉｓ、メチロボラス属の種（Ｍｅｔｈｙｌｏｖｏｒｕｓ ｓｐ．）、キュープリアビダス属の種（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｓｐ．）、メタノカルドコックス属の種（Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）およびＴｅｒｒｉｓｐｏｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌｙｃｏｌｉｃｕｓからなる群から選択される親微生物に由来する。
【0115】
４－ＨＭＦ
一実施形態では、本開示は、１つ以上の炭素源をグリセルアルデヒド３－リン酸（Ｇ３Ｐ）に変換すること、Ｇ３Ｐを（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェート（ステップＡ）に変換すること、（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートを４－ヒドロキシメチルフルフラール（４－ＨＭＦ）に変換すること（ステップＢ）を含む。
一実施形態では、本開示は、１つ以上の炭素源をグリセルアルデヒド３－リン酸（Ｇ３Ｐ）に変換すること、Ｇ３Ｐを（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェート（ステップＡ）に変換すること、（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートを４－ヒドロキシメチルフルフラール（４－ＨＭＦ）に変換すること（ステップＢ）を含む。
【0116】
一実施形態では、本明細書に開示される実施形態のいずれか１つの組換え微生物は、炭素源をグリセルアルデヒド３－リン酸（Ｇ３Ｐ）に変換することができる内因性および／または外因性核酸分子を含む。一実施形態では、グリセロールは、グリセロールキナーゼをコードする少なくとも１つの内因性または外因性核酸分子によってグリセロール－３－リン酸に変換される。一実施形態では、グリセロール－３－リン酸は、グリセロール－３－リン酸デヒドロゲナーゼをコードする少なくとも１つの内因性または外因性核酸分子によってジヒドロキシアセトンリン酸（ＤＨＡＰ）に変換される。一実施形態では、グリセロールは、グリセロールデヒドロゲナーゼをコードする少なくとも１つの内因性または外因性核酸分子によってジヒドロキシアセトンに変換される。一実施形態では、ジヒドロキシアセトンは、ジヒドロキシアセトンキナーゼをコードする少なくとも１つの内因性または外因性核酸分子によって、ジヒドロキシアセトンリン酸（ＤＨＡＰ）に変換される。一実施形態では、ＤＨＡＰは、トリオースリン酸イソメラーゼをコードする少なくとも１つの内因性または外因性核酸分子によってＧ３Ｐに変換される。本明細書で企図される例示的であるが非限定的なグリセロール同化経路については、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１０．Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，７６．８：２３９７－２４０１）を参照されたい。
【0117】
一実施形態では、本明細書に開示される実施形態のいずれか１つの組換え微生物は、Ｇ３Ｐの（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートへの変換を触媒する（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートシンターゼをコードする少なくとも１つの内因性または外因性核酸分子を含む。一実施形態では、（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートシンターゼは、ＥＣ番号４．２．３．１５３として分類される。いくつかの実施形態では、ＥＣ ４．２．３．１５３（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートシンターゼは、遺伝子ｍｆｎＢから誘導することができる。いくつかの実施形態では、ｍｆｎＢは、メタノカルドコックス・ヤンナスキイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）に由来し得る。いくつかの実施形態では、（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートシンターゼは、表１に列挙された酵素候補から誘導され得る。いくつかの実施形態では、（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートシンターゼは、表１に列挙されたアミノ酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートシンターゼは、表１に列挙された酵素と相同であるか、または類似している。いくつかの実施形態では、（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートシンターゼ酵素は、その触媒効率、著しいｋｃａｔを改善するために進化（ｅｖｏｌｖｅ）または操作される。
【0118】
（表１）（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートシンターゼ酵素
【0119】
一実施形態では、本明細書に開示される実施形態のいずれか１つの組換え微生物は、（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートの（４－ＨＭＦ）への変換を触媒するホスファターゼまたはキナーゼをコードする少なくとも１つの内因性または外因性核酸分子を含む。一実施形態では、ホスファターゼは、ハロ酸デハロゲナーゼ（Ｋｏｏｎｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４４（１）．１９９４）として分類される。いくつかの態様では、反応ｂのホスファターゼは、宿主内因性である（Ｏｆｆｌｅｙ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎ．６５．２０１９）。いくつかの態様では、宿主内因性のホスファターゼ酵素は過剰発現される。一部の事例では、所望の反応を実施することができる異種ホスファターゼが使用され、アルカリホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、フルクトース－ビスホスファターゼ、糖－ホスファターゼ、または糖末端ホスファターゼから選択される。いくつかの実施形態では、ホスファターゼは、表２に列挙された酵素候補から誘導され得る。いくつかの実施形態では、ホスファターゼは、表２に列挙された酵素と相同であるか、または類似している。いくつかの実施形態では、４－ＨＭＦホスファターゼ酵素は、表２に列挙されたアミノ酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、ホスファターゼ酵素は、（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートの（４－ＨＭＦ）への変換のための触媒効率および／または特異性を改善するために進化または操作される。
【0120】
（表２）４－ＨＭＦホスファターゼ酵素
【0121】
したがって、一実施形態では、本明細書では、炭素源をグリセルアルデヒド３－リン酸（Ｇ３Ｐ）に変換することができる内因性および／または外因性核酸分子、Ｇ３Ｐの（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートへの変換を触媒する（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートシンターゼをコードする少なくとも１つの内因性または外因性核酸分子、（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートの４－ＨＭＦへの変換を触媒するホスファターゼをコードする少なくとも１つの内因性または外因性核酸分子、を含む、組換え微生物が提供される。
【0122】
２，４－ＦＤＣＡ
一実施形態では、本開示は、炭素源から２，４－フランジカルボン酸（２，４－ＦＤＣＡ）を産生することができる組換え微生物を提供する。本開示のいくつかの実施形態を図１、図２、および図３に提示し、これらは炭素原料の２，４－ＦＤＣＡへの生合成変換を集合的に詳述する。
一実施形態では、本開示は、炭素源から２，４－フランジカルボン酸（２，４－ＦＤＣＡ）を産生することができる組換え微生物を提供する。本開示のいくつかの実施形態を図１、図２、および図３に提示し、これらは炭素原料の２，４－ＦＤＣＡへの生合成変換を集合的に詳述する。
【0123】
一実施形態では、組換え微生物は、本明細書に記載されるいくつかの酵素的に触媒された連続的なステップを介して、Ｇ３Ｐを２，４－ＦＤＣＡに変換する新規の能力を含む。一実施形態では、本開示は、４－ＨＭＦを２，４ ＦＤＣＡに、直接的にまたは中間体フラン－２，４－ジカルボアルデヒド、４－（ヒドロキシメチル）フロン酸、４－ホルミルフラン－２－カルボキシレート、４－ホルミルフラン－２－カルボキシレート、２－ホルミルフラン－４－カルボキシレートの産生を介して、変換することを含む。
【0124】
一実施形態では、本開示は、４－ＨＭＦをフラン－２，４－ジカルボアルデヒド（ステップＤ）および／または４－（ヒドロキシメチル）フロン酸（ステップＥ）に変換すること、フラン－２，４－ジカルボアルデヒドを４－ホルミルフラン－２－カルボキシレート（ステップＧ）および／または２－ホルミルフラン－４－カルボキシレート（ステップＦ）に変換することおよび／または４－（ヒドロキシメチル）フロン酸を４－ホルミルフラン－２－カルボキシレートに変換すること（ステップＨ）、４－ホルミルフラン－２－カルボキシレートを２，４－ＦＤＣＡに変換すること（ステップＪ）および／または２－ホルミルフラン－４－カルボキシレートを２，４－ＦＤＣＡに変換すること（ステップＩ）、を含む。
【0125】
一実施形態では、デヒドロゲナーゼは、アルコールをカルボニル基に酸化する場合、ＥＣ番号１．１．１として分類され、またはカルボニルを酸に酸化する場合、ＥＣ番号１．２．１として分類される。いくつかの態様では、デヒドロゲナーゼは、アルコールデヒドロゲナーゼまたはアルデヒドデヒドロゲナーゼである。
【0126】
いくつかの態様では、（ｃ）からのオキシダーゼは、ＥＣ番号１．１．３として分類される。いくつかの態様では、オキシダーゼは５－ヒドロキシメチルフルフラールオキシダーゼである。いくつかの態様では、５－ヒドロキシメチルフルフラールオキシダーゼは、４－ヒドロキシメチルフルフラール（４－ＨＭＦ）を、３ステップ反応で２，４ ＦＤＣＡに変換する。
【0127】
さらなる実施形態では、１つ以上の炭素源は、グリセロールまたは単糖を含んでもよい。
【0128】
一実施形態では、微生物は、４－ＨＭＦの、フラン－２，４－ジカルボアルデヒドおよび／または４－（ヒドロキシメチル）フロン酸への変換を触媒するデヒドロゲナーゼ、オキシダーゼ、またはペルオキシゲナーゼ（ｐｅｒｏｘｙｇｅｎａｓｅ）をコードする少なくとも１つの内因性または外因性核酸分子、フラン－２，４－ジカルボアルデヒドの４－ホルミルフラン－２－カルボキシレートおよび／または２－ホルミルフラン－４－カルボキシレートへの変換および／または４－（ヒドロキシメチル）フロン酸の４－ホルミルフラン－２－カルボキシレートへの変換を触媒するデヒドロゲナーゼ、オキシダーゼ、ペルオキシゲナーゼをコードする少なくとも１つの内因性または外因性核酸分子、２－ホルミルフラン－４－カルボキシレートの２，４－ＦＤＣＡへの変換および／または４－ホルミルフラン－２－カルボキシレートの２，４－ＦＤＣＡへの変換を触媒するデヒドロゲナーゼ、オキシダーゼ、ペルオキシゲナーゼをコードする少なくとも１つの内因性または外因性核酸分子を含む。
【0129】
一実施形態では、本明細書に開示される実施形態のいずれか１つの組換え微生物は、４－ＨＭＦのフラン－２，４－ジカルボアルデヒドへの変換を触媒するデヒドロゲナーゼ、オキシダーゼ、またはペルオキシゲナーゼをコードする少なくとも１つの内因性または外因性核酸分子を含む。一実施形態では、デヒドロゲナーゼは、ＥＣ番号１．１．１として分類される。一実施形態では、デヒドロゲナーゼＥＣ番号１．１．１は、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ番号１．１．１．１）、またはアルコールデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ＋）（ＥＣ番号１．１．１．２）、またはＤ－キシロースレダクターゼ（ＥＣ番号１．１．１．３０７）、またはアリール－アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ番号１．１．１．９０）、またはアリール－アルコールデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ＋）（ＥＣ番号１．１．１．９１）から選択される。一実施形態では、デヒドロゲナーゼは、表３に列挙された酵素候補から誘導され得る。いくつかの実施形態では、デヒドロゲナーゼは、表３に列挙された酵素と相同であるか、または類似している。いくつかの実施形態では、４－ＨＭＦデヒドロゲナーゼ酵素は、表３に列挙されたアミノ酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、デヒドロゲナーゼは、その所望の基質に対する触媒効率を改善するために進化または操作される。
【0130】
（表３）４ ＨＭＦデヒドロゲナーゼ酵素
【0131】
一実施形態では、オキシダーゼは、ＥＣ番号１．１．３として分類される。一実施形態では、オキシダーゼＥＣ番号１．１．３は、５－（ヒドロキシメチルフルフラールオキシダーゼ（ＥＣ番号１．１．３．４７）である。いくつかの実施形態では、ＨＭＦオキシダーゼは、ｈｍｆＨ遺伝子から誘導され得る。いくつかの実施形態では、ＨＭＦオキシダーゼは、Ｍｅｔｈｙｌｏｖｏｒｕｓ ｓｐ．ＭＰ６８８またはキュープリアビダス・バシレンシス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｂａｓｉｌｅｎｓｉｓ）由来であり得る。Ｄｉｊｋｍａｎ ａｎｄ Ｆｒａａｉｊｅ（２０１４．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，８０．３：１０８２－１０９０）およびＫｏｏｐｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１０．ＰＮＡＳ，１０７（１１）：４９１９－４９２４）を参照されたい。一実施形態では、ＨＭＦオキシダーゼＥＣ番号１．１．３は、アリール－アルコールオキシダーゼ（ＥＣ番号１．１．３．７）である。Ｃａｒｒｏ ｅｔ ａｌ．（２０１５）を参照されたい。一実施形態では、ペルオキシゲナーゼは、ＥＣ番号１．１１．２として分類される。一実施形態では、ペルオキシゲナーゼＥＣ番号１．１１．２は、非特異的ペルオキシゲナーゼ（ＥＣ番号１．１１．２．１）である。Ｃａｒｒｏ ｅｔ ａｌ．（２０１５）を参照されたい。いくつかの実施形態では、ＨＭＦオキシダーゼは、表４に列挙された酵素候補から誘導され得る。いくつかの実施形態では、ＨＭＦオキシダーゼは、表４に列挙された酵素と相同であるか、または類似している。いくつかの実施形態では、４－ＨＭＦオキシダーゼは、表４に列挙されたアミノ酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、ＨＭＦオキシダーゼ酵素は、その触媒効率を改善するために進化または操作される（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ Ｂｉｏｆｕｅｌｓ．（２０１８）１１，Ａｒｔｉｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒ：５６を参照されたい）。
【0132】
（表４）４－ＨＭＦオキシダーゼ酵素
【0133】
一実施形態では、本明細書に開示される実施形態のいずれか１つの組換え微生物は、４－ＨＭＦの４－（ヒドロキシメチル）フロン酸への変換を触媒するデヒドロゲナーゼ、またはオキシダーゼ、またはペルオキシゲナーゼをコードする少なくとも１つの内因性もしくは外因性核酸分子を含む。一実施形態では、デヒドロゲナーゼは、ＥＣ番号１．２．１として分類される。一実施形態では、デヒドロゲナーゼＥＣ番号１．２．１は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤ＋）（ＥＣ番号１．２．１．３）またはアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ＋）（ＥＣ番号１．２．１．４）またはアルデヒドデヒドロゲナーゼ［ＮＡＤ（Ｐ）＋］（ＥＣ番号１．２．１．５）または４－（γ－グルタミルアミノ）ブタナルデヒドロゲナーゼ（ＥＣ番号１．２．１．９９）から選択される。一実施形態では、オキシダーゼは、ＥＣ番号１．１．３として分類される。一実施形態では、オキシダーゼＥＣ番号１．１．３は、５－（ヒドロキシメチルフルフラールオキシダーゼ（ＥＣ番号１．１．３．４７）である。いくつかの実施形態では、ＥＣ １．１．３．４７オキシダーゼは、遺伝子ｈｍｆＨから誘導され得る。いくつかの実施形態では、ｈｍｆＨは、Ｍｅｔｈｙｌｏｖｏｒｕｓ ｓｐ．ＭＰ６８８またはＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｂａｓｉｌｅｎｓｉｓ由来であり得る。一実施形態では、オキシダーゼＥＣ番号１．１．３は、アリール－アルコールオキシダーゼ（ＥＣ番号１．１．３．７）である。一実施形態では、ペルオキシゲナーゼは、ＥＣ番号１．１１．２として分類される。一実施形態では、ペルオキシゲナーゼＥＣ番号１．１１．２は、非特異的ペルオキシゲナーゼ（ＥＣ番号１．１１．２．１）である。
【0134】
一実施形態では、本明細書に開示される実施形態のいずれか１つの組換え微生物は、フラン－２，４－ジカルボアルデヒドの４－ホルミルフラン－２－カルボキシレートおよび／または２－ホルミルフラン－４－カルボキシレートへの変換を触媒する、デヒドロゲナーゼ、またはオキシダーゼ、またはペルオキシゲナーゼをコードする少なくとも１つの内因性もしくは外因性核酸分子を含む。一実施形態では、デヒドロゲナーゼは、ＥＣ番号１．２．１として分類される。一実施形態では、デヒドロゲナーゼＥＣ番号１．２．１は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤ＋）（ＥＣ番号１．２．１．３）またはアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ＋）（ＥＣ番号１．２．１．４）またはアルデヒドデヒドロゲナーゼ［ＮＡＤ（Ｐ）＋］（ＥＣ番号１．２．１．５）または４－（γ－グルタミルアミノ）ブタナルデヒドロゲナーゼ（ＥＣ番号１．２．１．９９）から選択される。一実施形態では、オキシダーゼは、ＥＣ番号１．１．３として分類される。一実施形態では、オキシダーゼＥＣ番号１．１．３は、５－（ヒドロキシメチルフルフラールオキシダーゼ（ＥＣ番号１．１．３．４７）である。いくつかの実施形態では、ＥＣ １．１．３．４７オキシダーゼは、遺伝子ｈｍｆＨから誘導され得る。いくつかの実施形態では、ｈｍｆＨは、Ｍｅｔｈｙｌｏｖｏｒｕｓ ｓｐ．ＭＰ６８８またはＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｂａｓｉｌｅｎｓｉｓ由来であり得る。一実施形態では、オキシダーゼＥＣ番号１．１．３は、アリール－アルコールオキシダーゼ（ＥＣ番号１．１．３．７）である。一実施形態では、ペルオキシゲナーゼは、ＥＣ番号１．１１．２として分類される。一実施形態では、ペルオキシゲナーゼＥＣ番号１．１１．２は、非特異的ペルオキシゲナーゼ（ＥＣ番号１．１１．２．１）である。
【0135】
一実施形態では、本明細書に開示される実施形態のいずれか１つの組換え微生物は、４－（ヒドロキシメチル）フロン酸の４－ホルミルフラン－２－カルボキシレートへの変換を触媒するデヒドロゲナーゼ、またはオキシダーゼ、またはペルオキシゲナーゼをコードする少なくとも１つの内因性もしくは外因性核酸分子を含む。一実施形態では、デヒドロゲナーゼは、ＥＣ番号１．１．１として分類される。一実施形態では、デヒドロゲナーゼＥＣ番号１．１．１は、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ番号１．１．１．１）、またはアルコールデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ＋）（ＥＣ番号１．１．１．２）、またはＤ－キシロースレダクターゼ（ＥＣ番号１．１．１．３０７）、またはアリール－アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ番号１．１．１．９０）、またはアリール－アルコールデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ＋）（ＥＣ番号１．１．１．９１）から選択される。一実施形態では、デヒドロゲナーゼＥＣ番号１．１．１は、である。一実施形態では、オキシダーゼは、ＥＣ番号１．１．３として分類される。一実施形態では、オキシダーゼＥＣ番号１．１．３は、５－（ヒドロキシメチルフルフラールオキシダーゼ（ＥＣ番号１．１．３．４７）である。いくつかの実施形態では、ＥＣ １．１．３．４７オキシダーゼは、遺伝子ｈｍｆＨから誘導され得る。いくつかの実施形態では、ｈｍｆＨは、Ｍｅｔｈｙｌｏｖｏｒｕｓ ｓｐ．ＭＰ６８８またはＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｂａｓｉｌｅｎｓｉｓ由来であり得る。一実施形態では、オキシダーゼＥＣ番号１．１．３は、アリール－アルコールオキシダーゼ（ＥＣ番号１．１．３．７）である。一実施形態では、ペルオキシゲナーゼは、ＥＣ番号１．１１．２として分類される。一実施形態では、ペルオキシゲナーゼＥＣ番号１．１１．２は、非特異的ペルオキシゲナーゼ（ＥＣ番号１．１１．２．１）である。
【0136】
一実施形態では、本明細書に開示される実施形態のいずれか１つの組換え微生物は、４－ホルミルフラン－２－カルボキシレートおよび／または２－ホルミルフラン－４－カルボキシレートの２，４－ＦＤＣＡへの変換を触媒するデヒドロゲナーゼ、またはオキシダーゼ、またはペルオキシゲナーゼをコードする少なくとも１つの内因性または外因性核酸分子を含む。一実施形態では、デヒドロゲナーゼは、ＥＣ番号１．２．１として分類される。一実施形態では、デヒドロゲナーゼＥＣ番号１．２．１は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤ＋）（ＥＣ番号１．２．１．３）またはアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ＋）（ＥＣ番号１．２．１．４）またはアルデヒドデヒドロゲナーゼ［ＮＡＤ（Ｐ）＋］（ＥＣ番号１．２．１．５）または４－（γ－グルタミルアミノ）ブタナルデヒドロゲナーゼ（ＥＣ番号１．２．１．９９）から選択される。一実施形態では、オキシダーゼは、ＥＣ番号１．１．３として分類される。一実施形態では、オキシダーゼＥＣ番号１．１．３は、５－（ヒドロキシメチルフルフラールオキシダーゼ（ＥＣ番号１．１．３．４７）である。いくつかの実施形態では、ＥＣ １．１．３．４７オキシダーゼは、遺伝子ｈｍｆＨから誘導され得る。いくつかの実施形態では、ｈｍｆＨは、Ｍｅｔｈｙｌｏｖｏｒｕｓ ｓｐ．ＭＰ６８８またはＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｂａｓｉｌｅｎｓｉｓ由来であり得る。一実施形態では、オキシダーゼＥＣ番号１．１．３は、アリール－アルコールオキシダーゼ（ＥＣ番号１．１．３．７）である。一実施形態では、ペルオキシゲナーゼは、ＥＣ番号１．１１．２として分類される。一実施形態では、ペルオキシゲナーゼＥＣ番号１．１１．２は、非特異的ペルオキシゲナーゼ（ＥＣ番号１．１１．２．１）である。
【0137】
いくつかの態様では、２，４－ＦＤＣＡは、微生物の非存在下で酵素的に産生される。いくつかの態様では、２，４－ＦＤＣＡは、１つ以上の容器内で酵素的に産生される。いくつかの態様では、１つ以上の容器は微生物を実質的に含まない。いくつかの態様では、２，４－ＦＤＣＡの酵素的産生は、組換え微生物を利用する方法に記載されるのと同じ段階的様式で実行されるが、微生物は実質的に含まないか、または微生物の非存在下で実行される。いくつかの態様では、２，４－ＦＤＣＡの酵素的産生に利用される酵素は、微生物、組換え体、またはその他から単離され、２，４－ＦＤＣＡを産生するために利用される中間体を段階的に産生するために、対応する基質に提供される。いくつかの態様では、方法のステップのうちの１つ以上は、同じ容器で実行される。いくつかの態様では、本明細書に記載の個々の方法ステップの結果として所望の産生物が産生されると、産生物は単離および精製され、次いで２，４－ＦＤＣＡを産生する方法の次のステップで基質として利用される。
【0138】
２，４－フランジメタノール
一実施形態では、本開示は、炭素源から２，４－フランジメタノールを産生することができる組換え微生物を提供する。本開示のいくつかの実施形態を図１、図２、および図３に提示し、これらは炭素原料の２，４－フランジメタノールへの生合成変換を集合的に詳述する。
一実施形態では、本開示は、炭素源から２，４－フランジメタノールを産生することができる組換え微生物を提供する。本開示のいくつかの実施形態を図１、図２、および図３に提示し、これらは炭素原料の２，４－フランジメタノールへの生合成変換を集合的に詳述する。
【0139】
一実施形態では、４－ＨＭＦからの２，４－フランジメタノールの生物学的生産は、微生物によってコードされるデヒドロゲナーゼにより触媒される。一実施形態では、デヒドロゲナーゼは、ＥＣ番号１．１．１として分類される。一実施形態では、デヒドロゲナーゼＥＣ番号１．１．１は、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ番号１．１．１．１）から選択される。一実施形態では、デヒドロゲナーゼＥＣ番号１．１．１は、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ＋）（ＥＣ番号１．１．１．２）から選択される。一実施形態では、デヒドロゲナーゼＥＣ番号１．１．１は、Ｄ－キシロースレダクターゼ（ＥＣ番号１．１．１．９０）から選択される。一実施形態では、デヒドロゲナーゼＥＣ番号１．１．１は、アリール－アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ番号１．１．１．９１）から選択される。一実施形態では、デヒドロゲナーゼは、表５に列挙された酵素候補から誘導され得る。いくつかの実施形態では、デヒドロゲナーゼは、表５に列挙された酵素と相同であるか、または類似している。いくつかの実施形態では、４－ＨＭＦレダクターゼ酵素は、表５に列挙されたアミノ酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、デヒドロゲナーゼは、２，４－フランジメタノールへの４－ＨＭＦの還元の触媒効率を改善するために進化または操作される。
【0140】
（表５）４－ＨＭＦレダクターゼ酵素（４－ＨＭＦの２，４－フランジメタノールへの還元）
【0141】
いくつかの態様では、２，４－フランジメタノールは、微生物の非存在下で酵素的に産生される。いくつかの態様では、２，４－フランジメタノールは、１つ以上の容器内で酵素的に産生される。いくつかの態様では、１つ以上の容器は微生物を実質的に含まない。いくつかの態様では、２，４－フランジメタノールの酵素的産生は、組換え微生物を利用する方法に記載されるのと同じ段階的様式で実行されるが、微生物は実質的に含まないか、または微生物の非存在下で実行される。いくつかの態様では、２，４－フランジメタノールの酵素的産生に利用される酵素は、微生物、組換え体、またはその他から単離され、２，４－フランジメタノールを産生するために利用される中間体を段階的産生するために、対応する基質に提供される。いくつかの態様では、方法のステップのうちの１つ以上は、同じ容器で実行される。いくつかの態様では、本明細書に記載の個々の方法ステップの結果として所望の産生物が産生されると、産生物は単離および精製され、次いで２，４－フランジメタノールを産生する方法の次のステップで基質として利用される。
【0142】
フラン－２，４－ジカルボアルデヒド
一実施形態では、本開示は、炭素源からフラン－２，４－ジカルボアルデヒドを産生することができる組換え微生物を提供する。本開示のいくつかの実施形態を図１、図２、および図３に提示し、これらは炭素原料のフラン－２，４－ジカルボアルデヒドへの生合成変換を集合的に詳述する。
一実施形態では、本開示は、炭素源からフラン－２，４－ジカルボアルデヒドを産生することができる組換え微生物を提供する。本開示のいくつかの実施形態を図１、図２、および図３に提示し、これらは炭素原料のフラン－２，４－ジカルボアルデヒドへの生合成変換を集合的に詳述する。
【0143】
一実施形態では、図２のステップＤは、４－ＨＭＦを基質として利用する単一ステップの反応である。一実施形態では、４－ＨＭＦからのフラン－２，４－ジカルボアルデヒドの生物学的生産は、ＥＣ番号１．１．１．－、１．１．３．－、および１．１１．２．－によって表される１つ以上の酵素によって触媒される。
【0144】
一実施形態では、本明細書に開示される実施形態のいずれか１つの組換え微生物は、４－ＨＭＦのフラン－２，４－ジカルボアルデヒドへの変換を触媒するデヒドロゲナーゼ、オキシダーゼ、またはペルオキシゲナーゼをコードする少なくとも１つの内因性または外因性核酸分子を含む。一実施形態では、デヒドロゲナーゼは、ＥＣ番号１．１．１として分類される。一実施形態では、デヒドロゲナーゼＥＣ番号１．１．１は、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ番号１．１．１．１）、またはアルコールデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ＋）（ＥＣ番号１．１．１．２）、またはＤ－キシロースレダクターゼ（ＥＣ番号１．１．１．３０７）、またはアリール－アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ番号１．１．１．９０）、またはアリール－アルコールデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ＋）（ＥＣ番号１．１．１．９１）から選択される。一実施形態では、オキシダーゼは、ＥＣ番号１．１．３として分類される。一実施形態では、オキシダーゼＥＣ番号１．１．３は、５－（ヒドロキシメチルフルフラールオキシダーゼ（ＥＣ番号１．１．３．４７）である。いくつかの実施形態では、ＥＣ １．１．３．４７オキシダーゼは、遺伝子ｈｍｆＨから誘導され得る。いくつかの実施形態では、ｈｍｆＨは、Ｍｅｔｈｙｌｏｖｏｒｕｓ ｓｐ．ＭＰ６８８またはＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｂａｓｉｌｅｎｓｉｓ由来であり得る。Ｄｉｊｋｍａｎ ａｎｄ Ｆｒａａｉｊｅ（２０１４）およびＫｏｏｐｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１０）を参照されたい。一実施形態では、オキシダーゼＥＣ番号１．１．３は、アリール－アルコールオキシダーゼ（ＥＣ番号１．１．３．７）である。Ｃａｒｒｏ ｅｔ ａｌ．（２０１５）を参照されたい。一実施形態では、ペルオキシゲナーゼは、ＥＣ番号１．１１．２として分類される。一実施形態では、ペルオキシゲナーゼＥＣ番号１．１１．２は、非特異的ペルオキシゲナーゼ（ＥＣ番号１．１１．２．１）である。Ｃａｒｒｏ ｅｔ ａｌ．（２０１５）を参照されたい。
【0145】
いくつかの態様では、フラン－２，４－ジカルボアルデヒドは、微生物の非存在下で酵素的に産生される。いくつかの態様では、フラン－２，４－ジカルボアルデヒドは、１つ以上の容器内で酵素的に産生される。いくつかの態様では、１つ以上の容器は微生物を実質的に含まない。いくつかの態様では、フラン－２，４－ジカルボアルデヒドの酵素的産生は、組換え微生物を利用する方法において記載されるのと同じ段階的様式で実行されるが、微生物は実質的に含まないか、または微生物の非存在下で実行される。いくつかの態様では、フラン－２，４－ジカルボアルデヒドの酵素的産生に利用される酵素は、微生物、組換え体、またはその他から単離され、フラン－２，４－ジカルボアルデヒドを産生するために利用される中間体を段階的に産生するために、対応する基質に提供される。いくつかの態様では、方法のステップのうちの１つ以上は、同じ容器で実行される。いくつかの態様では、本明細書に記載の個々の方法ステップの結果として所望の産生物が産生されると、産生物は単離および精製され、次いで、フラン－２，４－ジカルボアルデヒドを産生する方法の次のステップで基質として利用される。
【0146】
４－（ヒドロキシメチル）フロン酸
一実施形態では、本開示は、炭素源から４－（ヒドロキシメチル）フロン酸を産生することができる組換え微生物を提供する。本開示のいくつかの実施形態を図１、図２、および図３に提示し、これらは炭素原料の４－（ヒドロキシメチル）フロン酸への生合成変換を集合的に詳述する。
一実施形態では、本開示は、炭素源から４－（ヒドロキシメチル）フロン酸を産生することができる組換え微生物を提供する。本開示のいくつかの実施形態を図１、図２、および図３に提示し、これらは炭素原料の４－（ヒドロキシメチル）フロン酸への生合成変換を集合的に詳述する。
【0147】
一実施形態では、図２のステップＥは、４－ＨＭＦを基質として利用する単一ステップ反応である。一実施形態では、４－ＨＭＦからの４－（ヒドロキシメチル）フロン酸の生物学的生産は、ＥＣ番号１．１．１．－、１．１．３．－、および１．１１．２．－によって表される１つ以上の酵素によって触媒される。
【0148】
一実施形態では、本明細書に開示される実施形態のいずれか１つの組換え微生物は、４－ＨＭＦから４－（ヒドロキシメチル）フロン酸への変換を触媒するデヒドロゲナーゼ、またはオキシダーゼ、またはペルオキシゲナーゼをコードする少なくとも１つの内因性もしくは外因性核酸分子を含む。一実施形態では、デヒドロゲナーゼは、ＥＣ番号１．２．１として分類される。一実施形態では、デヒドロゲナーゼＥＣ番号１．２．１は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤ＋）（ＥＣ番号１．２．１．３）またはアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ＋）（ＥＣ番号１．２．１．４）またはアルデヒドデヒドロゲナーゼ［ＮＡＤ（Ｐ）＋］（ＥＣ番号１．２．１．５）または４－（γ－グルタミルアミノ）ブタナルデヒドロゲナーゼ（ＥＣ番号１．２．１．９９）から選択される。一実施形態では、オキシダーゼは、ＥＣ番号１．１．３として分類される。一実施形態では、オキシダーゼＥＣ番号１．１．３は、５－（ヒドロキシメチルフルフラールオキシダーゼ（ＥＣ番号１．１．３．４７）である。いくつかの実施形態では、ＥＣ １．１．３．４７オキシダーゼは、遺伝子ｈｍｆＨから誘導され得る。いくつかの実施形態では、ｈｍｆＨは、Ｍｅｔｈｙｌｏｖｏｒｕｓ ｓｐ．ＭＰ６８８またはＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｂａｓｉｌｅｎｓｉｓ由来であり得る。一実施形態では、オキシダーゼＥＣ番号１．１．３は、アリール－アルコールオキシダーゼ（ＥＣ番号１．１．３．７）である。一実施形態では、ペルオキシゲナーゼは、ＥＣ番号１．１１．２として分類される。一実施形態では、ペルオキシゲナーゼＥＣ番号１．１１．２は、非特異的ペルオキシゲナーゼ（ＥＣ番号１．１１．２．１）である。
【0149】
いくつかの態様では、４－（ヒドロキシメチル）フロン酸は、微生物の非存在下で酵素的に産生される。いくつかの態様では、４－（ヒドロキシメチル）フロン酸は、１つ以上の容器内で酵素的に産生される。いくつかの態様では、１つ以上の容器は微生物を実質的に含まない。いくつかの態様では、４－（ヒドロキシメチル）フロン酸の酵素的産生は、組換え微生物を利用する方法において記載されるのと同じ段階的様式で実行されるが、微生物は実質的に含まないか、または微生物の非存在下で実行される。いくつかの態様では、４－（ヒドロキシメチル）フロン酸の酵素的産生に利用される酵素は、微生物、組換え体、またはその他から単離され、４－（ヒドロキシメチル）フロン酸を産生するために利用される中間体を段階的に産生するために、対応する基質に提供される。いくつかの態様では、方法のステップのうちの１つ以上は、同じ容器で実行される。いくつかの態様では、本明細書に記載の個々の方法ステップの結果として所望の産生物が産生されると、産生物は単離および精製され、次いで４－（ヒドロキシメチル）フロン酸を産生する方法の次のステップにおいて基質として利用される。
【0150】
２－ホルミルフラン－４－カルボキシレート
一実施形態では、本開示は、炭素源から２－ホルミルフラン－４－カルボキシレートを産生することができる組換え微生物を提供する。本開示のいくつかの実施形態を図１、図２、および図３に提示し、これらは炭素原料の２－ホルミルフラン－４－カルボキシレートへの生合成変換を集合的に詳述する。
一実施形態では、本開示は、炭素源から２－ホルミルフラン－４－カルボキシレートを産生することができる組換え微生物を提供する。本開示のいくつかの実施形態を図１、図２、および図３に提示し、これらは炭素原料の２－ホルミルフラン－４－カルボキシレートへの生合成変換を集合的に詳述する。
【0151】
一実施形態では、図２のステップＦは、フラン－２，４－ジカルボアルデヒドを基質として利用する単一ステップの反応である。一実施形態では、フラン－２，４－ジカルボアルデヒドからの２－ホルミルフラン－４－カルボキシレートの生物学的生産は、ＥＣ番号１．２．１．－、１．１．３．－、および１．１１．２．－によって表される１つ以上の酵素により触媒される。
【0152】
一実施形態では、本明細書に開示される実施形態のいずれか１つの組換え微生物は、フラン－２，４－ジカルボアルデヒドの２－ホルミルフラン－４－カルボキシレートへの変換を触媒するデヒドロゲナーゼ、またはオキシダーゼ、またはペルオキシゲナーゼをコードする少なくとも１つの内因性もしくは外因性核酸分子を含む。一実施形態では、デヒドロゲナーゼは、ＥＣ番号１．２．１として分類される。一実施形態では、デヒドロゲナーゼＥＣ番号１．２．１は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤ＋）（ＥＣ番号１．２．１．３）またはアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ＋）（ＥＣ番号１．２．１．４）またはアルデヒドデヒドロゲナーゼ［ＮＡＤ（Ｐ）＋］（ＥＣ番号１．２．１．５）または４－（γ－グルタミルアミノ）ブタナルデヒドロゲナーゼ（ＥＣ番号１．２．１．９９）から選択される。一実施形態では、オキシダーゼは、ＥＣ番号１．１．３として分類される。一実施形態では、オキシダーゼＥＣ番号１．１．３は、５－（ヒドロキシメチルフルフラールオキシダーゼ（ＥＣ番号１．１．３．４７）である。いくつかの実施形態では、ＥＣ １．１．３．４７オキシダーゼは、遺伝子ｈｍｆＨから誘導され得る。いくつかの実施形態では、ｈｍｆＨは、Ｍｅｔｈｙｌｏｖｏｒｕｓ ｓｐ．ＭＰ６８８またはＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｂａｓｉｌｅｎｓｉｓ由来であり得る。一実施形態では、オキシダーゼＥＣ番号１．１．３は、アリール－アルコールオキシダーゼ（ＥＣ番号１．１．３．７）である。一実施形態では、ペルオキシゲナーゼは、ＥＣ番号１．１１．２として分類される。一実施形態では、ペルオキシゲナーゼＥＣ番号１．１１．２は、非特異的ペルオキシゲナーゼ（ＥＣ番号１．１１．２．１）である。
【0153】
いくつかの態様では、２－ホルミルフラン－４－カルボキシレートは、微生物の非存在下で酵素的に産生される。いくつかの態様では、２－ホルミルフラン－４－カルボキシレートは、１つ以上の容器内で酵素的に産生される。いくつかの態様では、１つ以上の容器は微生物を実質的に含まない。いくつかの態様では、２－ホルミルフラン－４－カルボキシレートの酵素的産生は、組換え微生物を利用する方法において記載されるのと同じ段階的様式で実行されるが、微生物は実質的に含まないか、または微生物の非存在下で実行される。いくつかの態様では、２－ホルミルフラン－４－カルボン酸の酵素的産生に利用される酵素は、微生物、組換え体、またはその他から単離され、２－ホルミルフラン－４－カルボン酸を産生するために利用される中間体を段階的産生するために、対応する基質に提供される。いくつかの態様では、方法のステップのうちの１つ以上は、同じ容器で実行される。いくつかの態様では、本明細書に記載の個々の方法ステップの結果として所望の産生物が産生されると、産生物は単離および精製され、次いで、２－ホルミルフラン－４－カルボキシレートを産生する方法の次のステップで基質として利用される。
【0154】
４－ホルミルフラン－２－カルボキシレート
一実施形態では、本開示は、炭素源から４－ホルミルフラン－２－カルボキシレートを産生することができる組換え微生物を提供する。本開示のいくつかの実施形態を図１、図２、および図３に提示し、これらは炭素原料の４－ホルミルフラン－２－カルボキシレートへの生合成変換を集合的に詳細に示す。
一実施形態では、本開示は、炭素源から４－ホルミルフラン－２－カルボキシレートを産生することができる組換え微生物を提供する。本開示のいくつかの実施形態を図１、図２、および図３に提示し、これらは炭素原料の４－ホルミルフラン－２－カルボキシレートへの生合成変換を集合的に詳細に示す。
【0155】
一実施形態では、図２のステップＧは、フラン－２，４－ジカルボアルデヒドを基質として利用する単一ステップ反応である。一実施形態では、フラン－２，４－ジカルボアルデヒドからの４－ホルミルフラン－２－カルボキシレートの生物学的生産は、ＥＣ番号１．２．１．－、１．１．３．－、および１．１１．２．－によって表される一つ以上の酵素により触媒される。
【0156】
一実施形態では、本明細書に開示される実施形態のいずれか１つの組換え微生物は、フラン－２，４－ジカルバルアルデヒドの４－ホルミルフラン－２－カルボキシレートへの変換を触媒するデヒドロゲナーゼ、またはオキシダーゼ、またはペルオキシゲナーゼをコードする少なくとも１つの内因性または外因性核酸分子を含む。一実施形態では、デヒドロゲナーゼは、ＥＣ番号１．２．１として分類される。一実施形態では、デヒドロゲナーゼＥＣ番号１．２．１は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤ＋）（ＥＣ番号１．２．１．３）またはアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ＋）（ＥＣ番号１．２．１．４）またはアルデヒドデヒドロゲナーゼ［ＮＡＤ（Ｐ）＋］（ＥＣ番号１．２．１．５）または４－（γ－グルタミルアミノ）ブタナルデヒドロゲナーゼ（ＥＣ番号１．２．１．９９）から選択される。一実施形態では、オキシダーゼは、ＥＣ番号１．１．３として分類される。一実施形態では、オキシダーゼＥＣ番号１．１．３は、５－（ヒドロキシメチルフルフラールオキシダーゼ（ＥＣ番号１．１．３．４７）である。いくつかの実施形態では、ＥＣ １．１．３．４７オキシダーゼは、遺伝子ｈｍｆＨから誘導され得る。いくつかの実施形態では、ｈｍｆＨは、Ｍｅｔｈｙｌｏｖｏｒｕｓ ｓｐ．ＭＰ６８８またはＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｂａｓｉｌｅｎｓｉｓ由来であり得る。一実施形態では、オキシダーゼＥＣ番号１．１．３は、アリール－アルコールオキシダーゼ（ＥＣ番号１．１．３．７）である。一実施形態では、ペルオキシゲナーゼは、ＥＣ番号１．１１．２として分類される。一実施形態では、ペルオキシゲナーゼＥＣ番号１．１１．２は、非特異的ペルオキシゲナーゼ（ＥＣ番号１．１１．２．１）である。
【0157】
一実施形態では、図２のステップＨは、４－（ヒドロキシメチル）フロン酸を基質として利用する単一ステップ反応である。一実施形態では、４－（ヒドロキシメチル）フロン酸からの４－ホルミルフラン－２－カルボキシレートの生物学的生産は、ＥＣ番号１．１．１．－、１．１．３．－、および１．１１．２．－によって表される１つ以上の酵素により触媒される。
【0158】
一実施形態では、本明細書に開示される実施形態のいずれか１つの組換え微生物は、４－（ヒドロキシメチル）フロン酸の４－ホルミルフラン－２－カルボキシレートへの変換を触媒するデヒドロゲナーゼ、またはオキシダーゼ、またはペルオキシゲナーゼをコードする少なくとも１つの内因性もしくは外因性核酸分子を含む。一実施形態では、デヒドロゲナーゼは、ＥＣ番号１．１．１として分類される。一実施形態では、デヒドロゲナーゼＥＣ番号１．１．１は、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ番号１．１．１．１）、またはアルコールデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ＋）（ＥＣ番号１．１．１．２）、またはＤ－キシロースレダクターゼ（ＥＣ番号１．１．１．３０７）、またはアリール－アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ番号１．１．１．９０）、またはアリール－アルコールデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ＋）（ＥＣ番号１．１．１．９１）から選択される。一実施形態では、オキシダーゼは、ＥＣ番号１．１．３として分類される。一実施形態では、オキシダーゼＥＣ番号１．１．３は、５－（ヒドロキシメチルフルフラールオキシダーゼ（ＥＣ番号１．１．３．４７）である。いくつかの実施形態では、ＥＣ １．１．３．４７オキシダーゼは、遺伝子ｈｍｆＨから誘導され得る。いくつかの実施形態では、ｈｍｆＨは、Ｍｅｔｈｙｌｏｖｏｒｕｓ ｓｐ．ＭＰ６８８またはＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｂａｓｉｌｅｎｓｉｓ由来であり得る。Ｄｉｊｋｍａｎ ａｎｄ Ｆｒａａｉｊｅ（２０１４）およびＫｏｏｐｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１０）を参照されたい。一実施形態では、オキシダーゼＥＣ番号１．１．３は、アリール－アルコールオキシダーゼ（ＥＣ番号１．１．３．７）である。Ｃａｒｒｏ ｅｔ ａｌ．（２０１５）を参照されたい。一実施形態では、ペルオキシゲナーゼは、ＥＣ番号１．１１．２として分類される。一実施形態では、ペルオキシゲナーゼＥＣ番号１．１１．２は、非特異的ペルオキシゲナーゼ（ＥＣ番号１．１１．２．１）である。Ｃａｒｒｏ ｅｔ ａｌ．（２０１５）を参照されたい。
【0159】
いくつかの態様では、４－ホルミルフラン－２－カルボキシレートは、微生物の非存在下で酵素的に産生される。いくつかの態様では、４－ホルミルフラン－２－カルボキシレートは、１つ以上の容器内で酵素的に産生される。いくつかの態様では、１つ以上の容器は微生物を実質的に含まない。いくつかの態様では、４－ホルミルフラン－２－カルボキシレートの酵素的産生は、組換え微生物を利用する方法において記載されるのと同じ段階的様式で実行されるが、微生物は実質的に含まないか、または微生物の非存在下で実行される。いくつかの態様では、４－ホルミルフラン－２－カルボキシレートの酵素的産生に利用される酵素は、微生物、組換え体、またはその他から単離され、４－ホルミルフラン－２－カルボキシレートを産生するために利用される中間体を段階的に産生するために、対応する基質に提供される。いくつかの態様では、方法のステップのうちの１つ以上は、同じ容器で実行される。いくつかの態様では、本明細書に記載の個々の方法ステップの結果として所望の産生物が産生されると、産生物は単離および精製され、次いで４－ホルミルフラン－２－カルボキシレートを産生する方法の次のステップで基質として利用される。
【0160】
微生物集団の産生
遺伝子改変
本開示の１つ以上の微生物に導入される遺伝子改変は、標的遺伝子の調節配列を変化または無効化しうる。いくつかの態様では、本開示の１つ以上の微生物に導入される遺伝子改変は、１つ以上の微生物に新たな形質または表現型を導入し得る。遺伝的変異が導入される微生物に対応する動物、植物、真菌、酵母、細菌、またはウイルスのゲノム内に存在する異種調節配列および調節配列を含む、１つ以上の調節配列も挿入されてもよい。さらに、調節配列は、微生物培養中の遺伝子の発現レベルに基づいて選択されてもよい。遺伝的変異（ｇｅｎｅｔｉｃ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）は、標的部位に特異的に導入される、予め決定された遺伝的変異であってもよい。いくつかの態様では、遺伝的変異は、１つ以上の微生物染色体に導入される核酸配列である。いくつかの態様では、遺伝的変異は、１つ以上の染色体外核酸配列に導入される核酸配列である。遺伝的変異は、標的部位内のランダムな変異（ｍｕｔａｔｉｏｎ）であってもよい。遺伝的変異は、１つ以上のヌクレオチドの挿入または欠失であってもよい。一部の事例では、複数の異なる遺伝的変異（例えば、２、３、４、５、１０、またはそれ以上）が、単離された細菌のうちの１つ以上に導入される。複数の遺伝的変異は、上記タイプのいずれか、同じタイプまたは異なるタイプ、および任意の組み合わせであってもよい。一部の事例では、複数の異なる遺伝的変異が連続的に導入され、第一の単離ステップの後に第一の遺伝的変異、第二の単離ステップの後に第二の遺伝的変異が導入されるなど、微生物内に複数の所望の改変を蓄積するように、それらが繰り返される。
遺伝子改変
本開示の１つ以上の微生物に導入される遺伝子改変は、標的遺伝子の調節配列を変化または無効化しうる。いくつかの態様では、本開示の１つ以上の微生物に導入される遺伝子改変は、１つ以上の微生物に新たな形質または表現型を導入し得る。遺伝的変異が導入される微生物に対応する動物、植物、真菌、酵母、細菌、またはウイルスのゲノム内に存在する異種調節配列および調節配列を含む、１つ以上の調節配列も挿入されてもよい。さらに、調節配列は、微生物培養中の遺伝子の発現レベルに基づいて選択されてもよい。遺伝的変異（ｇｅｎｅｔｉｃ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）は、標的部位に特異的に導入される、予め決定された遺伝的変異であってもよい。いくつかの態様では、遺伝的変異は、１つ以上の微生物染色体に導入される核酸配列である。いくつかの態様では、遺伝的変異は、１つ以上の染色体外核酸配列に導入される核酸配列である。遺伝的変異は、標的部位内のランダムな変異（ｍｕｔａｔｉｏｎ）であってもよい。遺伝的変異は、１つ以上のヌクレオチドの挿入または欠失であってもよい。一部の事例では、複数の異なる遺伝的変異（例えば、２、３、４、５、１０、またはそれ以上）が、単離された細菌のうちの１つ以上に導入される。複数の遺伝的変異は、上記タイプのいずれか、同じタイプまたは異なるタイプ、および任意の組み合わせであってもよい。一部の事例では、複数の異なる遺伝的変異が連続的に導入され、第一の単離ステップの後に第一の遺伝的変異、第二の単離ステップの後に第二の遺伝的変異が導入されるなど、微生物内に複数の所望の改変を蓄積するように、それらが繰り返される。
【0161】
いくつかの態様では、２，４－ＦＤＣＡモノマーおよびポリマーの産生に記載される１つ以上の基質は、炭素原料（例えば、グルコースまたはグリセロール）から生合成される。
【0162】
概して、「遺伝的変異」という用語は、参照ゲノムもしくはその部分、または参照遺伝子もしくはその部分など、参照ポリヌクレオチドと比較してポリヌクレオチド配列に導入された任意の変更を指す。遺伝的変異は、「変異」と呼称されてもよく、遺伝的変異を含む配列または生物体は、「遺伝的バリアント」または「変異体」と呼称されてもよい。遺伝的変異は、遺伝子発現、代謝、および細胞シグナル伝達を含む、いくつかの生物学的活性の増加または減少など、いくつもの数の影響を与える可能性がある。
【0163】
遺伝的変異は、標的部位に特異的に導入され得るか、または無作為に導入され得る。遺伝的変異を導入するための様々な分子ツールおよび方法が利用可能である。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応変異誘発、オリゴヌクレオチド指定変異誘発、飽和変異誘発、断片シャフリング変異誘発、相同組換え、リコンビニアリング（ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇ）、ラムダレッド媒介組換え、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム、化学変異誘発、およびこれらの組み合わせを介して、遺伝的変異が導入され得る。遺伝的変異を導入する化学的方法には、化学変異原、例えば、メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）、メタンスルホン酸メチル（ＭＭＳ）、Ｎ－ニトロソウレア（ＥＮ Ｕ）、Ｎ－メチル－Ｎ－ニトロ－Ｎ’－ニトロソグアニジン、４－ニトロキノリンＮ－オキシド、硫酸ジエチル、ベンゾピレン、シクロホスファミド、ブレオマイシン、トリエチルメラミン、アクリルアミドモノマー、ナイトロジェンマスタード、ビンクリスチン、ジエポキシアルカン（例えば、ジエポキシブタン）、ＩＣＲ－１７０、ホルムアルデヒド、プロカルバジン塩酸塩、エチレンオキシド、ジメチルニトロサミン、７，１２ジメチルベンズ（ａ）アントラセン、クロラムブシル、ヘキサメチルホスホルアミド、ビスルファン（ｂｉｓｕｌｆａｎ）などへのＤＮＡの曝露が含まれる。放射線変異誘発剤は、紫外線、γ線照射、Ｘ線、および高速中性子衝撃を含む。遺伝的変異はまた、例えば、トリメチルプソラレンを紫外線と使用して核酸に導入することも可能である。移動性ＤＮＡ要素、例えば、転移因子のランダム挿入または標的挿入は、遺伝的変異を生成するための別の適切な方法である。
【0164】
遺伝的変異は、例えば、エラーが発生しやすいＰＣＲなどのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を使用して、細胞を含まないインビトロシステムでの増幅中に核酸に導入することができる。遺伝的変異は、ＤＮＡシャッフリング技術（例えば、エクソンシャッフリング、ドメインスワッピングなど）を使用してインビトロで核酸に導入することができる。遺伝的変異はまた、細胞中のＤＮＡ修復酵素の欠損の結果として核酸に導入され得る。例えば、変異型ＤＮＡ修復酵素をコードする変異型遺伝子の細胞中の存在は、細胞のゲノム中に高頻度の変異（すなわち、約１個の変異／１００個の遺伝子～１個の変異／１０，０００個の遺伝子）を産生することが予想される。ＤＮＡ修復酵素をコードする遺伝子の例としては、限定されるものではないが、Ｍｕｔ Ｈ、Ｍｕｔ Ｓ、Ｍｕｔ Ｌ、およびＭｕｔ Ｕ、ならびに他の種におけるそれらの相同体（例えば、ＭＳＨ １ ６、ＰＭＳ １ ２、ＭＬＨ １、ＧＴＢＰ、ＥＲＣＣ－１など）が挙げられる。遺伝的変異を導入するための様々な方法の実施例の記述は、例えば、Ｓｔｅｍｐｌｅ（２００４）Ｎａｔｕｒｅ ５：１－７；Ｃｈｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９３）ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ ２（３）：２１０－２１７、Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：１０７４７－１０７５１、および米国特許第６，０３３，８６１号、および第６，７７３，９００号を参照されたい。
【0165】
微生物に導入される遺伝的変異は、トランスジェニック、シスジェニック、ゲノム内、属内、属間、合成、進化、再配列、またはＳＮＰに分類され得る。
【0166】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ、クラスター化された規則的な間隔の短いパリンドロームの反復）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）システムを使用して、所望の変異を導入することができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を使用して侵入核酸のサイレンシングを導くことによって、ウイルスおよびプラスミドに対する適応免疫を細菌および古細菌に提供する。Ｃａｓ９タンパク質（またはその機能的に等価なタンパク質および／またはバリアント、すなわちＣａｓ９様タンパク質）は、タンパク質と、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ（ガイドＲＮＡとも呼ばれる）と呼ばれる２つの天然ＲＮＡ分子または合成ＲＮＡ分子との会合に依存するＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を自然に有している。一部の事例では、２つの分子は共有結合して単一の分子（単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）とも呼ばれる）を形成する。したがって、Ｃａｓ９またはＣａｓ９様タンパク質は、Ｃａｓ９またはＣａｓ９様タンパク質を活性化し、タンパク質を標的核酸配列に誘導する、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ（この用語は、２分子ガイドＲＮＡ構成および単一分子ガイドＲＮＡ構成の両方を包含する）と会合する。Ｃａｓ９またはＣａｓ９様タンパク質がその天然の酵素機能を保持する場合、標的ＤＮＡを切断して二本鎖切断を作製し、ゲノム変化（すなわち、編集：欠失、挿入（ドナーポリヌクレオチドが存在する場合）、置換など）をもたらし、それによって遺伝子発現を変化させることができる。Ｃａｓ９のいくつかのバリアント（そのバリアントはＣａｓ９様という用語によって包含される）は、それらがＤＮＡ切断活性の減少を有するように改変されている（場合によっては、それらは標的ＤＮＡの両方の鎖ではなく単一の鎖を切断し、他の場合には、それらはＤＮＡ切断活性がない場合まで著しく低下させる）。遺伝的変異を導入するためのＣＲＩＳＰＲシステムのさらなる例示的な説明は、例えば、ＵＳ８７９５９６５に見出すことができる。
【0167】
部位特異的変異誘導とも呼ばれるオリゴヌクレオチド指定変異誘発は、典型的には合成ＤＮＡプライマーを利用する。この合成プライマーは、所望の変異を含有し、目的の遺伝子中のＤＮＡとハイブリダイズできるように、変異部位周辺の鋳型ＤＮＡに対して相補的である。変異は、単一塩基変化（点変異）、複数の塩基変化、欠失、または挿入、またはこれらの組み合わせであってもよい。次いで、遺伝子の残りをコピーするＤＮＡポリメラーゼを使用して一本鎖プライマーを伸長させる。このようにコピーされた遺伝子は、変異部位を含有し、その後、ベクターとして宿主細胞に導入され、クローン化されてもよい。最後に、変異体は、ＤＮＡ配列決定によって選択され、所望の変異を含有することを確認することができる。
【0168】
遺伝的変異は、エラーが発生しやすいＰＣＲを使用して導入することができる。この技術では、目的の遺伝子は、配列の複製の忠実性が不十分な条件下で、ＤＮＡポリメラーゼを使用して増幅される。結果として、増幅産物は、配列に少なくとも１つのエラーを含む。遺伝子が増幅され、結果として生じる反応産物が、鋳型分子と比較した場合に配列の１つ以上の変化を含有する場合、結果として生じる産物は、鋳型と比較して変異誘発される。ランダム変異を導入する別の手段は、ニトロソグアニジンまたはメタンスルホン酸エチルなどの化学変異原に細胞を曝露させることであり（Ｎｅｓｔｍａｎｎ，Ｍｕｔａｔ Ｒｅｓ １９７５ Ｊｕｎｅ；２８（３）：３２３－３０）、次いで遺伝子を含有するベクターを宿主から単離する。
【0169】
相同組換え変異誘発は、外因性ＤＮＡ断片と標的ポリヌクレオチド配列との間の組換えを伴う。二本鎖の切断が生じた後、切断の５’末端周辺のＤＮＡ切片を切除（ｒｅｓｅｃｔｉｏｎ）と呼ばれるプロセスで切り取る。続く鎖の侵入ステップでは、破損したＤＮＡ分子の突出した３’末端が、その後、破損していない類似のまたは同一のＤＮＡ分子に「侵入」する。この方法は、遺伝子の削除、エクソンの除去、遺伝子の追加、および点変異の導入に使用することができる。相同組換え変異誘発は、永久的または条件付きであり得る。典型的には、組換え鋳型も提供される。組換え鋳型は、別のベクターの成分であってもよく、別個のベクターに含まれてもよく、または別個のポリヌクレオチドとして提供されてもよい。いくつかの態様では、組換え鋳型は、部位特異的ヌクレアーゼによってニック状または切断された標的配列内またはその近傍など、相同組換えの鋳型として機能するように設計される。鋳型ポリヌクレオチドは、約１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、５００、１０００、またはそれ以上のヌクレオチドの長さなど、任意の適切な長さであってもよい。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、標的配列を含むポリヌクレオチドの一部分に対して相補的である。最適に整列されている場合、鋳型ポリヌクレオチドは、標的配列の１つ以上のヌクレオチド（例えば、約１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、またはそれ以上のヌクレオチド）と重複し得る。いくつかの態様では、鋳型配列と標的配列を含むポリヌクレオチドとが最適に整列する場合、鋳型ポリヌクレオチドの最も近いヌクレオチドは、標的配列から約１、５、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、２００、３００、４００、５００、１０００、５０００、１００００、またはそれ以上のヌクレオチド内にある。相同組換えの方法に有用な部位特異的ヌクレアーゼの非限定的な例としては、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、およびメガヌクレアーゼが挙げられる。このようなヌクレアーゼの使用のさらなる説明については、例えば、ＵＳ８７９５９６５およびＵＳ２０１４０３０１９９０を参照されたい。
【0170】
遺伝的変異の導入は、不完全なプロセスであってもよく、その結果、処理された細菌集団の一部の細菌は所望の変異を担持し、他の細菌は担持しない。一部の事例では、所望の遺伝的変異を担持する細菌を富化するために、選択圧を適用することが望ましい。従来、成功した遺伝的バリアントに対する選択は、例えば、抗生物質耐性遺伝子を挿入する場合、または非致死性化合物を致死性代謝物へと変換することができる代謝活性を止める場合など、遺伝的変異によって付与または止められるいくつかの機能の、付与するかしないかに対する選択が含まれていた。ポリヌクレオチド配列自体に基づいて選択圧を適用することも可能であり、それにより、所望の遺伝的変異のみを導入する必要がある（例えば、選択可能なマーカーも必要としない）。この場合、選択圧は、標的部位に導入される遺伝的変異を欠く切断ゲノムを含んでもよく、その結果、選択は、遺伝的変異が導入されることが求められている参照配列に対して効果的に向けられる。典型的には、切断は、標的部位の１００ヌクレオチド以内（例えば、標的部位からの７５、５０、２５、１０、またはより少ないヌクレオチド以内での、標的部位でのまたは標的部位内の切断を含む）で発生する。切断は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、ＴＡＬＥヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはメガヌクレアーゼからなる群から選択される部位特異的ヌクレアーゼによって指示されうる。このようなプロセスは、相同組換えの鋳型が提供されないことを除いて、標的部位で相同組換えを強化するためのプロセスに類似する。結果として、所望の遺伝的変異を欠く細菌は、修復せずに放置すると細胞死をもたらす切断を受ける可能性がより高い。次いで、選択に耐えた細菌を単離して、改善された形質付与の評価をしてもよい。
【0171】
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを部位特異的ヌクレアーゼとして使用して、切断を標的部位に方向付けることができる。Ｃａｓ９を使用して非変異細胞を殺すことによって、変異した微生物の改善された選択を取得することができる。その後、微生物を組織から再単離することができる。非バリアントに対する選択のために用いられるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼシステムは、相同組換えの鋳型が提供されていないことを除いて、遺伝的変異の導入に関して上述したものと類似した要素を用いることができる。標的部位に向けられた切断により、影響を受けた細胞の死を促進する。
【0172】
ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）システム、およびメガヌクレアーゼなどの標的部位での切断を特異的に誘導するための他の選択肢が利用可能である。ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメインに融合することによって生成される人工ＤＮＡエンドヌクレアーゼである。ＺＦＮは、所望のＤＮＡ配列を標的にするように操作することができ、これにより、ジンクフィンガーヌクレアーゼは、固有の標的配列を切断することができる。細胞内に導入された場合、ＺＦＮは、二本鎖切断を誘導することによって、細胞内の標的ＤＮＡ（例えば、細胞のゲノム）を編集するために使用され得る。転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）は、ＴＡＬ（転写活性化因子様）エフェクターＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメインに融合することによって生成される人工ＤＮＡエンドヌクレアーゼである。ＴＡＬＥＮは、実質的に任意の所望のＤＮＡ配列を結合するように迅速に操作することができ、ＴＡＬＥＮを細胞内に導入すると、二本鎖切断を誘導することによって細胞中の標的ＤＮＡ（例えば、細胞のゲノム）を編集するために使用することができる。メガヌクレアーゼ（ホーミングエンドヌクレアーゼ）は、大きな認識部位（１２～４０塩基対の二本鎖ＤＮＡ配列）によって特徴付けられるエンドデオキシリボヌクレアーゼである。メガヌクレアーゼは、高度に標的化された方法で配列を置換、除去、または改変するために使用することができる。タンパク質工学を介してそれらの認識配列を改変することによって、標的配列を変更することができる。メガヌクレアーゼは、細菌、植物、または動物にかかわらず、すべてのゲノムタイプを改変するために使用でき、一般的に、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリー、ＧＩＹ－ＹＩＧファミリー、Ｈｉｓ－Ｃｙｓｔボックスファミリー、およびＨＮＨファミリーの４つのファミリーにグループ化される。例示的なホーミングエンドヌクレアーゼとしては、Ｉ－ＳｃｅＩ、Ｉ－ＣｅｕＩ、ＰＩ－ＰｓｐＩ、ＰＩ－Ｓｃｅ、Ｉ－ＳｃｅＩＶ、Ｉ－ＣｓｍＩ、Ｉ－ＰａｎＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩ、Ｉ－ＰｐｏＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ－ＣｒｅＩ、Ｉ－ＴｅｖＩ、Ｉ－ＴｅｖＩＩおよびＩ－ＴｅｖＩＩＩが挙げられる。
【0173】
微生物
本明細書に記載されるように、いくつかの態様では、組換え微生物は、４－ＨＭＦ、２，４－フランジメタノール、フラン－２，４－ジカルボアルデヒド、４－（ヒドロキシメチル）フロン酸、２－ホルミルフラン－４－カルボキシレート、４－ホルミルフラン－２－カルボキシレート、または２，４－ＦＤＣＡ、およびそれらの任意の組み合わせを産生することができる。
本明細書に記載されるように、いくつかの態様では、組換え微生物は、４－ＨＭＦ、２，４－フランジメタノール、フラン－２，４－ジカルボアルデヒド、４－（ヒドロキシメチル）フロン酸、２－ホルミルフラン－４－カルボキシレート、４－ホルミルフラン－２－カルボキシレート、または２，４－ＦＤＣＡ、およびそれらの任意の組み合わせを産生することができる。
【0174】
本明細書に記載されるように、いくつかの態様では、組換え微生物は原核微生物である。いくつかの態様では、原核微生物は細菌である。「細菌」、または「真正細菌」は、原核生物のドメインを指す。細菌は、以下のように少なくとも１１の別個の群を含む：（１）グラム陽性（グラム＋）細菌、このうち、２つの主要な下位区分があり、（１）高Ｇ＋Ｃ群（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ、その他）（２）低Ｇ＋Ｃ群（Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｓ）、（２）Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、例えば、紅色光合成＋非光合成グラム陰性細菌（最も「一般的な」グラム陰性細菌を含む）、（３）Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、例えば、酸素発生型光合成生物、（４）スピロヘータおよび関連種、（５）Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｓ、（６）Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａ、（７）Ｃｈｌａｍｙｄｉａ、（８）緑色硫黄細菌（９）緑色非硫黄細菌（嫌気性光栄養生物も）（１０）放射線耐性ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｉおよび近縁種（１１）ＴｈｅｒｍｏｔｏｇａおよびＴｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ。
【0175】
「グラム陰性細菌」には、球菌、非腸内桿菌、および腸内桿菌が含まれる。グラム陰性細菌の属には、例えば、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｖｉｂｒｉｏ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｓｐｉｒｉｌｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｖｉｂｒｉｏ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ、およびＦｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍが含まれる。
【0176】
「グラム陽性細菌」には、球菌、非胞子形成桿菌、および胞子形成桿菌が含まれる。グラム陽性細菌の属には、例えば、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ、Ｎｏｃａｒｄｉａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓが含まれる。
【0177】
いくつかの態様では、本開示の微生物は真菌である。
【0178】
いくつかの態様では、組換え微生物は真核微生物である。いくつかの態様では、真核微生物は酵母である。例示的な態様では、酵母は、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、ハンゼニュラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、イサチェンキア（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）、ジゴサッカロミセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、デバリオミセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、パチソレン（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、およびミクソジマ（Ｍｙｘｏｚｙｍａ）からなる群から選択される属のメンバーである。
【0179】
いくつかの態様では、組換え微生物は原核微生物である。例示的な態様では、原核微生物は、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、およびブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）からなる群から選択される属のメンバーである。
【0180】
いくつかの態様では、本開示の方法における使用のための微生物は、Ｙａｒｒｏｗｉａ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ、Ｍｙｘｏｚｙｍａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、およびＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍからなる群から選択され得る。
【0181】
いくつかの態様では、本明細書に記載される方法から生じる微生物は、以下の属のいずれかから選択される種であってもよい。Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｖｉｂｒｉｏ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｓｐｉｒｉｌｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｖｉｂｒｉｏ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ、Ｎｏｃａｒｄｉａ、Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、およびアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）。
【0182】
いくつかの態様では、本開示の方法で使用するための微生物としては、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｇｓｄａｌｅｉ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｍｏｓｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｉｃｕｍ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｗｏｏｄｉｉ、Ａｌｋａｌｉｂａｃｕｌｕｍ ｂａｃｃｈｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｒａｋｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｆｏｒｍｉｃｏａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｃａｔｏｌｏｇｅｎｅｓ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ、Ａｃｅｔｏｎｅｍａ ｌｏｎｇｕｍ、Ｂｌａｕｔｉａ ｐｒｏｄｕｃｔａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｌｙｃｏｌｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｍａｇｎｕｍ、Ｃａｎｄｉｄａ ｋｒｕｓｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｍａｙｏｍｂｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｍｅｔｈｏｘｙｂｅｎｚｏｖｏｒａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ、Ｏｘｏｂａｃｔｅｒ ｐｆｅｎｎｉｇｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｋｉｖｕｉ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｏｖａｔａ、Ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｏｇｅｎｉｕｍ ｐｈａｅｕｍ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｒｂｉｎｏｌｉｃｕｍ、Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｔｅｒｍｉｔｉｄａ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｇｌｙｃｅｒｉｎｉ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｇｇｒｅｇａｎｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ａｚｏｔｏｎｕｔｒｉｃｉｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ ｋｕｄｒｉａｖｚｅｖｉｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｓｃｈｅｆｆｅｒｓｏｍｙｃｅｓ ｓｔｉｐｉｔｉｓ、およびＴｅｒｒｉｓｐｏｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌｙｃｏｌｉｃｕｓを含む。
【0183】
「組換え微生物」および「組換え宿主細胞」という用語は、本明細書において互換的に使用され、組み込み構築物において、内因性酵素を発現もしくは過剰発現させるために、ベクターに含まれる異種酵素などの異種酵素を発現するために遺伝子改変された微生物、または内因性遺伝子の発現に変化を有する微生物を指す。「変化」とは、遺伝子の発現、１つ以上のポリペプチドもしくはポリペプチドサブユニットをコードするＲＮＡ分子もしくは同等のＲＮＡ分子のレベル、または１つ以上のポリペプチドもしくはポリペプチドサブユニットの活性が、上方制御または下方制御され、それにより発現、レベル、または活性が、変化の非存在下で観察されたものよりも多いか、またはそれ以下であることを意味する。例えば、「変化する（ａｌｔｅｒ）」という用語は、「阻害する（ｉｎｈｉｂｉｔ）」を意味することができるが、「変化」という用語の使用は、この定義に限定されるものではない。「組換え微生物」および「組換え宿主細胞」という用語は、特定の組換え微生物だけでなく、そのような微生物の子孫または潜在的な子孫を指すことが理解される。変異または環境の影響のいずれかのために、特定の改変が後続する世代において起こり得るため、このような子孫は、実際には親細胞と同一ではないが、本明細書で使用される用語の範囲内に含まれる場合がある。
【0184】
本開示の方法で使用される微生物の培養は、本開示の微生物を使用して基質を培養および発酵させるために、当技術分野で公知の任意の数のプロセスを使用して実施することができる。
【0185】
発酵は、連続撹拌タンクバイオリアクター、バブルカラムバイオリアクター、エアリフトバイオリアクター、流動化床バイオリアクター、充填床バイオリアクター、光バイオリアクター、固定化細胞反応器、トリクルベッド反応器、移動床バイオフィルムリアクター、気泡塔、ガスリフト発酵槽、中空糸膜型バイオリアクターなどの膜リアクタなどの、任意の適切なバイオリアクターで行われてもよい。いくつかの態様では、バイオリアクターは、微生物が培養される第１の成長反応器と、成長反応器からの発酵ブロスが供給され、発酵産生物の大部分が産生される第２の発酵反応器とを含む。いくつかの態様では、バイオリアクターは、微生物の培養、および提供される基質および／または原料などの炭素源からの発酵産生物の産生を同時に達成する。
【0186】
いくつかの態様では、本開示は、２，４－ＦＤＣＡモノマーを回収／単離する方法に関心が寄せられる。いくつかの態様では、本開示は、４－ＨＭＦ、２，４－フランジメタノール、フラン－２，４－ジカルボアルデヒド、４－（ヒドロキシメチル）フロン酸、２－ホルミルフラン－４－カルボキシレート、４－ホルミルフラン－２－カルボキシレート、または２，４－ＦＤＣＡ、およびそれらの任意の組み合わせを回収／単離する方法に関心が寄せられる。いくつかの態様では、本開示は、２，４－フランジメタノール、フラン－２，４－ジカルボアルデヒド、４－（ヒドロキシメチル）フロン酸、２－ホルミルフラン－４－カルボキシレート、および／または４－ホルミルフラン－２－カルボキシレートモノマーまたはポリマーを回収／単離する方法に関心が寄せられる。いくつかの態様では、本開示は、４－ＨＭＦ、２，４－フランジメタノール、フラン－２，４－ジカルボアルデヒド、４－（ヒドロキシメチル）フロン酸、２－ホルミルフラン－４－カルボキシレート、４－ホルミルフラン－２－カルボキシレート、または２，４－ＦＤＣＡ、およびそれらの任意の組み合わせを回収／単離する方法に関心が寄せられる。回収／収集／単離は、蒸留、膜ベースの分離ガスストリッピング（ｍｅｍｂｒａｎｅ－ｂａｓｅｄ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｇａｓ ｓｔｒｉｐｐｉｎｇ）、沈殿、溶媒抽出、および拡張床吸着などの当技術分野で公知の方法によって行うことができる。
【0187】
原料
いくつかの態様では、原料は炭素源を含む。いくつかの態様では、炭素源は、糖、グリセロール、アルコール、有機酸、アルカン、脂肪酸、リグノセルロース、タンパク質、二酸化炭素、および一酸化炭素から選択されてもよい。一態様では、炭素源は糖である。一態様では、糖は単糖である。一態様では、糖は多糖類である。一態様では、糖はグルコースまたはそのグルコースのオリゴマーである。一態様では、グルコースのオリゴマーは、フルクトース、スクロース、デンプン、セロビオース、マルトース、ラクトース、およびセルロースから選択される。一態様では、糖は五炭糖である。一態様では、糖は六炭糖である。いくつかの態様では、原料は、１つ以上の五炭糖および／または１つ以上の六炭糖を含む。いくつかの態様では、原料は、キシロース、グルコース、アラビノース、ガラクトース、マルトース、フルクトース、マンノース、スクロース、および／またはこれらの組み合わせのうちの１つ以上を含む。いくつかの態様では、原料は、キシロースおよび／またはグルコースのうちの１つ以上を含む。いくつかの態様では、原料は、アラビノース、ガラクトース、マルトース、フルクトース、マンノース、スクロース、および／またはこれらの組み合わせのうちの１つ以上を含む。
いくつかの態様では、原料は炭素源を含む。いくつかの態様では、炭素源は、糖、グリセロール、アルコール、有機酸、アルカン、脂肪酸、リグノセルロース、タンパク質、二酸化炭素、および一酸化炭素から選択されてもよい。一態様では、炭素源は糖である。一態様では、糖は単糖である。一態様では、糖は多糖類である。一態様では、糖はグルコースまたはそのグルコースのオリゴマーである。一態様では、グルコースのオリゴマーは、フルクトース、スクロース、デンプン、セロビオース、マルトース、ラクトース、およびセルロースから選択される。一態様では、糖は五炭糖である。一態様では、糖は六炭糖である。いくつかの態様では、原料は、１つ以上の五炭糖および／または１つ以上の六炭糖を含む。いくつかの態様では、原料は、キシロース、グルコース、アラビノース、ガラクトース、マルトース、フルクトース、マンノース、スクロース、および／またはこれらの組み合わせのうちの１つ以上を含む。いくつかの態様では、原料は、キシロースおよび／またはグルコースのうちの１つ以上を含む。いくつかの態様では、原料は、アラビノース、ガラクトース、マルトース、フルクトース、マンノース、スクロース、および／またはこれらの組み合わせのうちの１つ以上を含む。
【0188】
いくつかの態様では、微生物は、１つ以上の五炭糖（ペントース）および／または１つ以上の六炭糖（ヘキソース）を利用する。いくつかの態様では、微生物は、キシロースおよび／またはグルコースのうちの１つ以上を利用する。いくつかの態様では、微生物は、アラビノース、ガラクトース、マルトース、フルクトース、マンノース、スクロース、および／またはこれらの組み合わせのうちの１つ以上を利用する。いくつかの態様では、微生物は、キシロース、グルコース、アラビノース、ガラクトース、マルトース、フルクトース、マンノース、スクロース、および／またはこれらの組み合わせのうちの１つ以上を利用する
【0189】
いくつかの態様では、ヘキソースは、Ｄ－アロース、Ｄ－アルトロース、Ｄ－グルコース、Ｄ－マンノース、Ｄ－グロース、Ｄ－イドース、Ｄ－ガラクトース、Ｄ－タロース、Ｄ－タグトース（ｔａｇｔｏｓｅ）、Ｄ－ソルボース、Ｄ－フルクトース、Ｄ－プシコース、および当技術分野で公知の他のヘキソースから選択され得る。いくつかの態様では、ペントースは、Ｄ－キシロース、Ｄ－リボース、Ｄ－アラビノース、Ｄ－リキソース、Ｄ－キシルロース、Ｄ－リブロース、および当技術分野で公知の他のペントースから選択されてもよい。いくつかの態様では、ヘキソースおよびペントースは、本明細書に開示されるヘキソースおよびペントースのいずれかの左旋性または右旋性エナンチオマーから選択され得る。
【0190】
微生物組成物
いくつかの態様では、本開示の微生物は微生物組成物に組み合わされる。
いくつかの態様では、本開示の微生物は微生物組成物に組み合わされる。
【0191】
いくつかの態様では、本開示の微生物組成物は固体である。固体組成物が使用される場合、以下を含むがこれらに限定されない１つ以上の担体材料を含むことが望まれ得る：シリカ、タルク、カオリン、石灰岩、チョーク、粘土、ドロマイト、珪藻土などの鉱物土類（ｍｉｎｅｒａｌ ｅａｒｔｈ）、硫酸カルシウム、硫酸マグネシウム、酸化マグネシウム、ゼオライト、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、トレハロース、キトサン、シェラック、アルブミン、デンプン、脱脂粉乳、スイートホエー粉末、マルトデキストリン、ラクトース、イヌリン、デキストロース、ならびにシリアルミール、樹皮ミール、木粉、およびナッツシェルミールなどの野菜由来の製品である。
【0192】
いくつかの態様では、本開示の微生物組成物は液体である。さらなる態様では、液体は、水またはアルコールまたは生理食塩水または炭水化物溶液を含み得る溶媒を含む。いくつかの態様では、本開示の微生物組成物は、ポリマー、カルボキシメチルセルロース、デンプン、ポリビニルアルコールなどの結合剤を含む。
【0193】
いくつかの態様では、本開示の微生物組成物は、糖類（例えば、単糖類、二糖類、三糖類、多糖類、オリゴ糖類など）、高分子糖類、脂質、高分子脂質、リポ多糖類、タンパク質、高分子タンパク質、リポタンパク質、核酸、核酸ポリマー、シリカ、無機塩、およびこれらの組み合わせを含む。さらなる態様では、微生物組成物は、寒天、アガロース、ゲルライト（ｇｅｌｒｉｔｅ）、ゲランガムなどのポリマーを含む。いくつかの態様では、微生物組成物は、プラスチックカプセル、エマルション（例えば、水および油）、膜、および人工膜を含む。いくつかの態様では、エマルションまたは連結ポリマー（ｌｉｎｋｅｄ ｐｏｌｙｍｅｒ）溶液は、本開示の微生物組成物を含む。Ｈａｒｅｌ ａｎｄ Ｂｅｎｎｅｔｔ（米国特許第８，４６０，７２６ Ｂ２号）を参照されたい。
【0194】
いくつかの態様では、本開示の微生物組成物は、固体形態（例えば、分散凍結乾燥胞子）または液体形態（保存媒体中に散在する微生物）で生じる。いくつかの態様では、本開示の微生物組成物は、使用直前に乾燥形態で液体に添加されて懸濁液を形成する。
【0195】
生合成産物を産生する方法
本開示は、組換え微生物を使用して１つ以上の生合成産物を産生する方法を提供する。生合成産物には、４－ＨＭＦ、２，４－フランジメタノール、フラン－２，４－ジカルボアルデヒド、４－（ヒドロキシメチル）フロン酸、２－ホルミルフラン－４－カルボキシレート、４－ホルミルフラン－２－カルボキシレート、および２，４－ＦＤＣＡが含まれる。一実施形態では、方法は、培養培地中で組換え微生物を培養することを含む。一実施形態では、培養培地は、組換え微生物が１つ以上の生合成産物を産生するために利用することができる炭素源を含む原料を含有する。一実施形態では、培養培地中の炭素源は、ヘキソース、ペントース、またはグリセロールを含む群から選択される。特定の実施形態では、炭素源はグリセロールである。本開示のいくつかの実施形態を図１、図２、および図３に提示し、炭素原料の１つ以上の生合成産物への生合成変換を集合的に詳細に示す。
本開示は、組換え微生物を使用して１つ以上の生合成産物を産生する方法を提供する。生合成産物には、４－ＨＭＦ、２，４－フランジメタノール、フラン－２，４－ジカルボアルデヒド、４－（ヒドロキシメチル）フロン酸、２－ホルミルフラン－４－カルボキシレート、４－ホルミルフラン－２－カルボキシレート、および２，４－ＦＤＣＡが含まれる。一実施形態では、方法は、培養培地中で組換え微生物を培養することを含む。一実施形態では、培養培地は、組換え微生物が１つ以上の生合成産物を産生するために利用することができる炭素源を含む原料を含有する。一実施形態では、培養培地中の炭素源は、ヘキソース、ペントース、またはグリセロールを含む群から選択される。特定の実施形態では、炭素源はグリセロールである。本開示のいくつかの実施形態を図１、図２、および図３に提示し、炭素原料の１つ以上の生合成産物への生合成変換を集合的に詳細に示す。
【0196】
本開示は、外因性炭素源を含む原料から、４－ＨＭＦ、２，４－フランジメタノール、フラン－２，４－ジカルボアルデヒド、４－（ヒドロキシメチル）フロン酸、２－ホルミルフラン－４－カルボキシレート、４－ホルミルフラン－２－カルボキシレート、および２，４－ＦＤＣＡを産生する組換え微生物を産生する方法を提供する。一実施形態では、本方法は、炭素源を４－ＨＭＦ、２，４－フランジメタノール、フラン－２，４－ジカルボアルデヒド、４－（ヒドロキシメチル）フロン酸、２－ホルミルフラン－４－カルボキシレート、４－ホルミルフラン－２－カルボキシレート、および２，４－ＦＤＣＡに変換することができる、内因性および／または外因性核酸分子を組換え微生物に導入および／または過剰発現させることを含む。一実施形態では、炭素源は、グリセロールおよび／または単糖を含んでもよい。
【0197】
一実施形態では、内因性および／または外因性核酸分子は、グリセロールまたは単糖をグリセルアルデヒド３－リン酸（Ｇ３Ｐ）に変換する。Ｇ３Ｐは、共通の天然中間代謝物である。いくつかの実施形態では、それはグルコースから解糖経路を介して、またはキシロースからペントースリン酸経路を介して、またはグリセロールから産生することができる。一実施形態では、４－ＨＭＦ、２，４－フランジメタノール、フラン－２，４－ジカルボアルデヒド、４－（ヒドロキシメチル）フロン酸、２－ホルミルフラン－４－カルボキシレート、４－ホルミルフラン－２－カルボキシレート、および２，４－ＦＤＣＡを産生することができる組換え微生物は、ヘキソース、ペントース、またはグリセロールを含む炭素源を利用する。特定の実施形態では、炭素源はグリセロールである。
【0198】
一実施形態では、本開示は、２，４－ＦＤＣＡを産生する方法、および２，４－ＦＤＣＡを産生するための複数のステップおよびプロセスを企図する。いくつかの実施形態では、本開示は、４－ＨＭＦ、２，４－フランジメタノール、フラン－２，４－ジカルボアルデヒド、４－（ヒドロキシメチル）フロン酸、２－ホルミルフラン－４－カルボキシレート、および４－ホルミルフラン－２－カルボキシレートのうちの１つ以上を産生するための個々の方法を企図しており、これらは２，４－ＦＤＣＡの作製プロセスに記載されている。
【0199】
一実施形態では、方法の組換え微生物は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｇｓｄａｌｅｉ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｍｏｓｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｉｃｕｍ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｗｏｏｄｉｉ、Ａｌｋａｌｉｂａｃｕｌｕｍ ｂａｃｃｈｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｒａｋｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｆｏｒｍｉｃｏａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｃａｔｏｌｏｇｅｎｅｓ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ、Ａｃｅｔｏｎｅｍａ ｌｏｎｇｕｍ、Ｂｌａｕｔｉａ ｐｒｏｄｕｃｔａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｌｙｃｏｌｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｍａｇｎｕｍ、Ｃａｎｄｉｄａ ｋｒｕｓｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｍａｙｏｍｂｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｍｅｔｈｏｘｙｂｅｎｚｏｖｏｒａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ、Ｏｘｏｂａｃｔｅｒ ｐｆｅｎｎｉｇｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｋｉｖｕｉ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｏｖａｔａ、Ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｏｇｅｎｉｕｍ ｐｈａｅｕｍ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｒｂｉｎｏｌｉｃｕｍ、Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｔｅｒｍｉｔｉｄａ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｇｌｙｃｅｒｉｎｉ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｇｇｒｅｇａｎｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ａｚｏｔｏｎｕｔｒｉｃｉｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ ｋｕｄｒｉａｖｚｅｖｉｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｓｃｈｅｆｆｅｒｓｏｍｙｃｅｓ ｓｔｉｐｉｔｉｓ、およびＴｅｒｒｉｓｐｏｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌｙｃｏｌｉｃｕｓからなる群から選択される親微生物由来である。
【0200】
４－ＨＭＦ
一実施形態では、本開示は、１つ以上の炭素源をグリセルアルデヒド３－リン酸（Ｇ３Ｐ）に変換すること、Ｇ３Ｐを（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェート（ステップＡ）に変換すること、（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートを４－ヒドロキシメチルフルフラール（４－ＨＭＦ）に変換すること（ステップＢ）を含む。
一実施形態では、本開示は、１つ以上の炭素源をグリセルアルデヒド３－リン酸（Ｇ３Ｐ）に変換すること、Ｇ３Ｐを（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェート（ステップＡ）に変換すること、（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートを４－ヒドロキシメチルフルフラール（４－ＨＭＦ）に変換すること（ステップＢ）を含む。
【0201】
一実施形態では、本開示は、炭素源をグリセルアルデヒド３－リン酸（Ｇ３Ｐ）に変換することができる内因性および／または外因性核酸分子を含む、本明細書に開示される実施形態のいずれか１つの組換え微生物を産生する方法に関心が寄せられる。一実施形態では、グリセロールは、グリセロールキナーゼをコードする少なくとも１つの内因性または外因性核酸分子によってグリセロール－３－リン酸に変換される。一実施形態では、グリセロール－３－リン酸は、グリセロール－３－リン酸デヒドロゲナーゼをコードする少なくとも１つの内因性または外因性核酸分子によってジヒドロキシアセトンリン酸（ＤＨＡＰ）に変換される。一実施形態では、グリセロールは、グリセロールデヒドロゲナーゼをコードする少なくとも１つの内因性または外因性核酸分子によってジヒドロキシアセトンに変換される。一実施形態では、ジヒドロキシアセトンは、ジヒドロキシアセトンキナーゼをコードする少なくとも１つの内因性または外因性核酸分子によって、ジヒドロキシアセトンリン酸（ＤＨＡＰ）に変換される。一実施形態では、ＤＨＡＰは、トリオースリン酸イソメラーゼをコードする少なくとも１つの内因性または外因性核酸分子によってＧ３Ｐに変換される。Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１０）を参照されたい。
【0202】
一実施形態では、本開示は、Ｇ３Ｐの（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートへの変換を触媒する（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートシンターゼをコードする少なくとも１つの内因性または外因性核酸分子を含む、本明細書に開示される実施形態のいずれか１つに記載の組換え微生物を産生する方法に関心が寄せられる。一実施形態では、（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートシンターゼは、ＥＣ番号４．２．３．１５３として分類される。いくつかの実施形態では、ＥＣ ４．２．３．１５３（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートシンターゼは、遺伝子ｍｆｎＢから誘導することができる。いくつかの実施形態では、ｍｆｎＢは、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉに由来し得る。いくつかの実施形態では、（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートシンターゼは、表１に列挙された酵素候補から誘導され得る。いくつかの実施形態では、（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートシンターゼは、表１に列挙された酵素と相同であるか、または類似している。いくつかの実施形態では、（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートシンターゼ酵素は、その触媒効率、著しくｋｃａｔを改善するために進化または操作される。
【0203】
一実施形態では、本開示は、（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートの（４－ＨＭＦ）への変換を触媒するホスファターゼをコードする少なくとも１つの内因性または外因性核酸分子を含む、本明細書に開示される実施形態のいずれか１つの組換え微生物を産生する方法に関心が寄せられる。一実施形態では、ホスファターゼは、ハロ酸デハロゲナーゼ（Ｋｏｏｎｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４４（１）．１９９４）として分類される。いくつかの態様では、反応ｂのホスファターゼは、宿主内因性である（Ｏｆｆｌｅｙ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎ．６５．２０１９）。いくつかの態様では、宿主内因性のホスファターゼ酵素は過剰発現される。一部の事例では、所望の反応を実施することができる異種ホスファターゼが使用され、アルカリホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、フルクトース－ビスホスファターゼ、糖－ホスファターゼ、または糖末端ホスファターゼから選択される。いくつかの実施形態では、ホスファターゼは、表２に列挙された酵素候補から誘導され得る。いくつかの実施形態では、ホスファターゼは、表２に列挙された酵素と相同であるか、または類似している。いくつかの実施形態では、ホスファターゼ酵素は、（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートの（４－ＨＭＦ）への変換のための触媒効率および／または特異性を改善するために進化または操作される。
【0204】
したがって、一実施形態において、本開示は、炭素源をグリセルアルデヒド３－リン酸（Ｇ３Ｐ）に変換することができる内因性および／または外因性核酸分子、Ｇ３Ｐの（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートへの変換を触媒する（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートシンターゼをコードする少なくとも１つの内因性または外因性核酸分子、（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートの４－ＨＭＦへの変換を触媒するホスファターゼをコードする少なくとも１つの内因性または外因性核酸分子、を含む組換え微生物を産生する方法に関心が寄せられる。
【0205】
２，４－ＦＤＣＡ
一実施形態では、本開示の方法は、いくつかの酵素的に触媒された連続的なステップを介して、Ｇ３Ｐを２，４－ＦＤＣＡに変換する。一実施形態では、本開示は、１つ以上の炭素源をグリセルアルデヒド３－リン酸（Ｇ３Ｐ）に変換することと、Ｇ３Ｐを（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートに変換することと（ステップＡ）、（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートを４－ヒドロキシメチルフルフラール（４－ＨＭＦ）に変換することと（ステップＢ）、４－ＨＭＦを２，４ ＦＤＣＡに、直接的に（ステップＣ）変換するか、または以下の中間体の産生であって、４－ＨＭＦをフラン－２，４－ジカルボアルデヒド（ステップＤ）および／もしくは４－（ヒドロキシメチル）フロン酸（ステップＥ）に変換し、フラン－２，４－ジカルボアルデヒドを４－ホルミルフラン－２－カルボキシレート（ステップＧ）および／もしくは２－ホルミルフラン－４－カルボキシレート（ステップＦ）に変換し、および／もしくは４－（ヒドロキシメチル）フロン酸を４－ホルミルフラン－２－カルボキシレート（ステップＨ）に変換し、４－ホルミルフラン－２－カルボキシレートを２ ４－ＦＤＣＡ（ステップＪ）に変換する、および／もしくは２－ホルミルフラン－４－カルボキシレートを２ ４－ＦＤＣＡ（ステップＩ）に変換する、中間体の産生を介して変換することと、を含む。さらなる実施形態では、１つ以上の炭素源は、グリセロールまたは単糖を含んでもよい。
一実施形態では、本開示の方法は、いくつかの酵素的に触媒された連続的なステップを介して、Ｇ３Ｐを２，４－ＦＤＣＡに変換する。一実施形態では、本開示は、１つ以上の炭素源をグリセルアルデヒド３－リン酸（Ｇ３Ｐ）に変換することと、Ｇ３Ｐを（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートに変換することと（ステップＡ）、（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートを４－ヒドロキシメチルフルフラール（４－ＨＭＦ）に変換することと（ステップＢ）、４－ＨＭＦを２，４ ＦＤＣＡに、直接的に（ステップＣ）変換するか、または以下の中間体の産生であって、４－ＨＭＦをフラン－２，４－ジカルボアルデヒド（ステップＤ）および／もしくは４－（ヒドロキシメチル）フロン酸（ステップＥ）に変換し、フラン－２，４－ジカルボアルデヒドを４－ホルミルフラン－２－カルボキシレート（ステップＧ）および／もしくは２－ホルミルフラン－４－カルボキシレート（ステップＦ）に変換し、および／もしくは４－（ヒドロキシメチル）フロン酸を４－ホルミルフラン－２－カルボキシレート（ステップＨ）に変換し、４－ホルミルフラン－２－カルボキシレートを２ ４－ＦＤＣＡ（ステップＪ）に変換する、および／もしくは２－ホルミルフラン－４－カルボキシレートを２ ４－ＦＤＣＡ（ステップＩ）に変換する、中間体の産生を介して変換することと、を含む。さらなる実施形態では、１つ以上の炭素源は、グリセロールまたは単糖を含んでもよい。
【0206】
したがって、一実施形態において、本明細書では、炭素源をグリセルアルデヒド３－リン酸（Ｇ３Ｐ）に変換することができる内因性および／または外因性核酸分子、Ｇ３Ｐの（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートへの変換を触媒する（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートシンターゼをコードする少なくとも１つの内因性または外因性核酸分子、（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートの（４－ＨＭＦ）への変換を触媒するホスファターゼをコードする少なくとも１つの内因性または外因性核酸分子、４－ＨＭＦの２，４ ＦＤＣＡへの変換であって、直接的にまたはフラン－２，４－ジカルボアルデヒド、および／もしくは４－（ヒドロキシメチル）フロン酸などの中間体の生産を介して、触媒するデヒドロゲナーゼ、オキシダーゼ、またはペルオキシゲナーゼをコードする少なくとも１つの内因性または外因性核酸分子、フラン－２，４－ジカルボアルデヒドの４－ホルミルフラン－２－カルボキシレートおよび／もしくは２－ホルミルフラン－４－カルボキシレートへの変換、および／もしくは４－（ヒドロキシメチル）フロン酸の４－ホルミルフラン－２－カルボキシレートへの変換を触媒するデヒドロゲナーゼ、オキシダーゼ、またはペルオキシゲナーゼをコードする少なくとも１つの内因性または外因性核酸分子、２－ホルミルフラン－４－カルボキシレートの２，４－ＦＤＣＡへの変換および／もしくは、４－ホルミルフラン－２－カルボキシレートから２，４－ＦＤＣＡへの変換を触媒するデヒドロゲナーゼ、オキシダーゼ、またはペルオキシゲナーゼをコードする少なくとも１つの内因性または外因性核酸分子、を含む組換え微生物を産生する方法が提供される。
【0207】
一実施形態では、本明細書に開示される方法の実施形態のいずれか１つの組換え微生物は、炭素源をグリセルアルデヒド３－リン酸（Ｇ３Ｐ）に変換することができる内因性および／または外因性核酸分子を含む。一実施形態では、グリセロールは、グリセロールキナーゼをコードする少なくとも１つの内因性または外因性核酸分子によってグリセロール－３－リン酸に変換される。一実施形態では、グリセロール－３－リン酸は、グリセロール－３－リン酸デヒドロゲナーゼをコードする少なくとも１つの内因性または外因性核酸分子によってジヒドロキシアセトンリン酸（ＤＨＡＰ）に変換される。一実施形態では、グリセロールは、グリセロールデヒドロゲナーゼをコードする少なくとも１つの内因性または外因性核酸分子によってジヒドロキシアセトンに変換される。一実施形態では、ジヒドロキシアセトンは、ジヒドロキシアセトンキナーゼをコードする少なくとも１つの内因性または外因性核酸分子によって、ジヒドロキシアセトンリン酸（ＤＨＡＰ）に変換される。一実施形態では、ＤＨＡＰは、トリオースリン酸イソメラーゼをコードする少なくとも１つの内因性または外因性核酸分子によってＧ３Ｐに変換される。
【0208】
一実施形態では、本明細書に開示される方法の実施形態のいずれか１つの組換え微生物は、Ｇ３Ｐから（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートへの変換を触媒する（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートシンターゼをコードする少なくとも１つの内因性または外因性核酸分子を含む。一実施形態では、（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートシンターゼは、ＥＣ番号４．２．３．１５３として分類される。いくつかの実施形態では、ＥＣ ４．２．３．１５３（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートシンターゼは、遺伝子ｍｆｎＢから誘導することができる。いくつかの実施形態では、ｍｆｎＢは、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉに由来し得る。いくつかの実施形態では、ＥＣ ４．２．３．１５３は、ｍｆｎＢの相同体から誘導され得る
【0209】
一実施形態では、本明細書に開示される方法の実施形態のいずれか１つの組換え微生物は、（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートの（４－ＨＭＦ）への変換を触媒するホスファターゼをコードする少なくとも１つの内因性または外因性核酸分子を含む。一実施形態では、ホスファターゼは、ＥＣ番号３．１．３として分類される。一実施形態では、ホスファターゼＥＣ番号３．１．３ホスファターゼは、アルカリホスファターゼ（ＥＣ番号３．１．３．１）、酸性ホスファターゼ（ＥＣ番号３．１．３．２）、フルクトース－ビスホスファターゼ（ＥＣ番号３．１．３．１１）、糖－ホスファターゼ（ＥＣ番号３．１．３．２３）、または糖末端ホスファターゼ（ＥＣ番号３．１．３．５８）から選択される。一実施形態では、キナーゼはＥＣ番号２．７．１として分類される。一実施形態では、キナーゼＥＣ番号２．７．１は、フルクトキナーゼ（ＥＣ番号２．７．１．４）、リボキナーゼ（ＥＣ番号２．７．１．１５）、リブロキナーゼ（ＥＣ番号２．７．１．１６）、キシルロキナーゼ（ＥＣ番号２．７．１．１７）、またはＤ－リブロキナーゼ（ＥＣ番号２．７．１．４７）から選択される。
【0210】
一実施形態では、本明細書に開示される方法の実施形態のいずれか１つの組換え微生物は、４－ＨＭＦのフラン－２，４－ジカルバルアルデヒドへの変換を触媒するデヒドロゲナーゼ、またはオキシダーゼ、またはペルオキシゲナーゼをコードする少なくとも１つの内因性または外因性核酸分子を含む。一実施形態では、デヒドロゲナーゼは、ＥＣ番号１．１．１として分類される。一実施形態では、デヒドロゲナーゼＥＣ番号１．１．１は、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ番号１．１．１．１）、またはアルコールデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ＋）（ＥＣ番号１．１．１．２）、またはＤ－キシロースレダクターゼ（ＥＣ番号１．１．１．３０７）、またはアリール－アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ番号１．１．１．９０）、またはアリール－アルコールデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ＋）（ＥＣ番号１．１．１．９１）から選択される。一実施形態では、オキシダーゼは、ＥＣ番号１．１．３として分類される。一実施形態では、オキシダーゼＥＣ番号１．１．３は、５－（ヒドロキシメチルフルフラールオキシダーゼ（ＥＣ番号１．１．３．４７）である。いくつかの実施形態では、ＥＣ １．１．３．４７オキシダーゼは、遺伝子ｈｍｆＨから誘導され得る。いくつかの実施形態では、ｈｍｆＨは、Ｍｅｔｈｙｌｏｖｏｒｕｓ ｓｐ．ＭＰ６８８またはＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｂａｓｉｌｅｎｓｉｓ由来であり得る。一実施形態では、オキシダーゼＥＣ番号１．１．３は、アリール－アルコールオキシダーゼ（ＥＣ番号１．１．３．７）である。一実施形態では、ペルオキシゲナーゼは、ＥＣ番号１．１１．２として分類される。一実施形態では、ペルオキシゲナーゼＥＣ番号１．１１．２は、非特異的ペルオキシゲナーゼ（ＥＣ番号１．１１．２．１）である。
【0211】
一実施形態では、本明細書に開示される方法の実施形態のいずれか１つの組換え微生物は、４－ＨＭＦから４－（ヒドロキシメチル）フロン酸への変換を触媒するデヒドロゲナーゼ、またはオキシダーゼ、またはペルオキシゲナーゼをコードする少なくとも１つの内因性または外因性核酸分子を含む。一実施形態では、デヒドロゲナーゼは、ＥＣ番号１．２．１として分類される。一実施形態では、デヒドロゲナーゼＥＣ番号１．２．１は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤ＋）（ＥＣ番号１．２．１．３）またはアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ＋）（ＥＣ番号１．２．１．４）またはアルデヒドデヒドロゲナーゼ［ＮＡＤ（Ｐ）＋］（ＥＣ番号１．２．１．５）または４－（γ－グルタミルアミノ）ブタナルデヒドロゲナーゼ（ＥＣ番号１．２．１．９９）から選択される。一実施形態では、オキシダーゼは、ＥＣ番号１．１．３として分類される。一実施形態では、オキシダーゼＥＣ番号１．１．３は、５－（ヒドロキシメチルフルフラールオキシダーゼ（ＥＣ番号１．１．３．４７）である。いくつかの実施形態では、ＥＣ １．１．３．４７オキシダーゼは、遺伝子ｈｍｆＨから誘導され得る。いくつかの実施形態では、ｈｍｆＨは、Ｍｅｔｈｙｌｏｖｏｒｕｓ ｓｐ．ＭＰ６８８またはＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｂａｓｉｌｅｎｓｉｓ由来であり得る。一実施形態では、オキシダーゼＥＣ番号１．１．３は、アリール－アルコールオキシダーゼ（ＥＣ番号１．１．３．７）である。一実施形態では、ペルオキシゲナーゼは、ＥＣ番号１．１１．２として分類される。一実施形態では、ペルオキシゲナーゼＥＣ番号１．１１．２は、非特異的ペルオキシゲナーゼ（ＥＣ番号１．１１．２．１）である。
【0212】
一実施形態では、本明細書に開示される方法の実施形態のいずれか１つの組換え微生物は、フラン－２，４－ジカルボアルデヒドの４－ホルミルフラン－２－カルボキシレートおよび／または２－ホルミルフラン－４－カルボキシレートへの変換を触媒するデヒドロゲナーゼ、またはオキシダーゼ、またはペルオキシゲナーゼをコードする少なくとも１つの内因性もしくは外因性核酸分子を含む。一実施形態では、デヒドロゲナーゼは、ＥＣ番号１．２．１として分類される。一実施形態では、デヒドロゲナーゼＥＣ番号１．２．１は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤ＋）（ＥＣ番号１．２．１．３）またはアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ＋）（ＥＣ番号１．２．１．４）またはアルデヒドデヒドロゲナーゼ［ＮＡＤ（Ｐ）＋］（ＥＣ番号１．２．１．５）または４－（γ－グルタミルアミノ）ブタナルデヒドロゲナーゼ（ＥＣ番号１．２．１．９９）から選択される。一実施形態では、オキシダーゼは、ＥＣ番号１．１．３として分類される。一実施形態では、オキシダーゼＥＣ番号１．１．３は、５－（ヒドロキシメチルフルフラールオキシダーゼ（ＥＣ番号１．１．３．４７）である。いくつかの実施形態では、ＥＣ １．１．３．４７オキシダーゼは、遺伝子ｈｍｆＨから誘導され得る。いくつかの実施形態では、ｈｍｆＨは、Ｍｅｔｈｙｌｏｖｏｒｕｓ ｓｐ．ＭＰ６８８またはＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｂａｓｉｌｅｎｓｉｓ由来であり得る。一実施形態では、オキシダーゼＥＣ番号１．１．３は、アリール－アルコールオキシダーゼ（ＥＣ番号１．１．３．７）である。一実施形態では、ペルオキシゲナーゼは、ＥＣ番号１．１１．２として分類される。一実施形態では、ペルオキシゲナーゼＥＣ番号１．１１．２は、非特異的ペルオキシゲナーゼ（ＥＣ番号１．１１．２．１）である。
【0213】
一実施形態では、本明細書に開示される方法の実施形態のいずれか１つの組換え微生物は、４－（ヒドロキシメチル）フロン酸の４－ホルミルフラン－２－カルボキシレートへの変換を触媒するデヒドロゲナーゼ、またはオキシダーゼ、またはペルオキシゲナーゼをコードする少なくとも１つの内因性または外因性核酸分子を含む。一実施形態では、デヒドロゲナーゼは、ＥＣ番号１．１．１として分類される。一実施形態では、デヒドロゲナーゼＥＣ番号１．１．１は、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ番号１．１．１．１）、またはアルコールデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ＋）（ＥＣ番号１．１．１．２）、またはＤ－キシロースレダクターゼ（ＥＣ番号１．１．１．３０７）、またはアリール－アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ番号１．１．１．９０）、またはアリール－アルコールデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ＋）（ＥＣ番号１．１．１．９１）から選択される。一実施形態では、デヒドロゲナーゼＥＣ番号１．１．１は、である。一実施形態では、オキシダーゼは、ＥＣ番号１．１．３として分類される。一実施形態では、オキシダーゼＥＣ番号１．１．３は、５－（ヒドロキシメチルフルフラールオキシダーゼ（ＥＣ番号１．１．３．４７）である。いくつかの実施形態では、ＥＣ １．１．３．４７オキシダーゼは、遺伝子ｈｍｆＨから誘導され得る。いくつかの実施形態では、ｈｍｆＨは、Ｍｅｔｈｙｌｏｖｏｒｕｓ ｓｐ．ＭＰ６８８またはＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｂａｓｉｌｅｎｓｉｓ由来であり得る。一実施形態では、オキシダーゼＥＣ番号１．１．３は、アリール－アルコールオキシダーゼ（ＥＣ番号１．１．３．７）である。一実施形態では、ペルオキシゲナーゼは、ＥＣ番号１．１１．２として分類される。一実施形態では、ペルオキシゲナーゼＥＣ番号１．１１．２は、非特異的ペルオキシゲナーゼ（ＥＣ番号１．１１．２．１）である。
【0214】
一実施形態では、本明細書に開示される方法の実施形態のいずれか１つの組換え微生物は、４－ホルミルフラン－２－カルボキシレートおよび／または２－ホルミルフラン－４－カルボキシレートの２，４－ＦＤＣＡへの変換を触媒するデヒドロゲナーゼ、またはオキシダーゼ、またはペルオキシゲナーゼをコードする少なくとも１つの内因性または外因性核酸分子を含む。一実施形態では、デヒドロゲナーゼは、ＥＣ番号１．１．１として分類される。一実施形態では、デヒドロゲナーゼＥＣ番号１．１．１は、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ番号１．１．１．１）、またはアルコールデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ＋）（ＥＣ番号１．１．１．２）、またはＤ－キシロースレダクターゼ（ＥＣ番号１．１．１．３０７）、またはアリール－アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ番号１．１．１．９０）、またはアリール－アルコールデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ＋）（ＥＣ番号１．１．１．９１）から選択される。一実施形態では、デヒドロゲナーゼは、表３に列挙された酵素候補から誘導され得る。いくつかの実施形態では、デヒドロゲナーゼは、表３に列挙された酵素と相同であるか、または類似している。いくつかの実施形態では、デヒドロゲナーゼは、その所望の基質に対する触媒効率を改善するために進化または操作される。
【0215】
一実施形態では、オキシダーゼは、ＥＣ番号１．１．３として分類される。一実施形態では、オキシダーゼＥＣ番号１．１．３は、５－（ヒドロキシメチルフルフラールオキシダーゼ（ＥＣ番号１．１．３．４７）である。いくつかの実施形態では、ＨＭＦオキシダーゼは、遺伝子ｈｍｆＨから誘導され得る。いくつかの実施形態では、ＨＭＦオキシダーゼは、Ｍｅｔｈｙｌｏｖｏｒｕｓ ｓｐ．ＭＰ６８８またはＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｂａｓｉｌｅｎｓｉｓ由来であり得る。Ｄｉｊｋｍａｎ ａｎｄ Ｆｒａａｉｊｅ（２０１４．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，８０．３：１０８２－１０９０）およびＫｏｏｐｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１０．ＰＮＡＳ，１０７（１１）：４９１９－４９２４）を参照されたい。一実施形態では、ＨＭＦオキシダーゼＥＣ番号１．１．３は、アリール－アルコールオキシダーゼ（ＥＣ番号１．１．３．７）である。Ｃａｒｒｏ ｅｔ ａｌ．（２０１５）を参照されたい。一実施形態では、ペルオキシゲナーゼは、ＥＣ番号１．１１．２として分類される。一実施形態では、ペルオキシゲナーゼＥＣ番号１．１１．２は、非特異的ペルオキシゲナーゼ（ＥＣ番号１．１１．２．１）である。Ｃａｒｒｏ ｅｔ ａｌ．（２０１５）を参照されたい。いくつかの実施形態では、ＨＭＦオキシダーゼは、表４に列挙された酵素候補から誘導され得る。いくつかの実施形態では、ＨＭＦオキシダーゼは、表４に列挙された酵素と相同であるか、または類似している。いくつかの実施形態では、ＨＭＦオキシダーゼ酵素は、その触媒効率を改善するために進化または操作される。
【0216】
２，４－フランジメタノール
一実施形態では、本開示は、炭素源から２，４－フランジメタノールを産生することができる組換え微生物を産生する方法に関心が寄せられる。本開示のいくつかの実施形態を図１、図２、および図３に提示し、これらは炭素原料の２，４－フランジメタノールへの生合成変換を集合的に詳述する。
一実施形態では、本開示は、炭素源から２，４－フランジメタノールを産生することができる組換え微生物を産生する方法に関心が寄せられる。本開示のいくつかの実施形態を図１、図２、および図３に提示し、これらは炭素原料の２，４－フランジメタノールへの生合成変換を集合的に詳述する。
【0217】
一実施形態では、４－ＨＭＦからの２，４－フランジメタノールの生物学的生産は、微生物によってコードされるデヒドロゲナーゼにより触媒される。一実施形態では、デヒドロゲナーゼは、ＥＣ番号１．１．１として分類される。一実施形態では、デヒドロゲナーゼＥＣ番号１．１．１は、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ番号１．１．１．１）から選択される。一実施形態では、デヒドロゲナーゼＥＣ番号１．１．１は、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ＋）（ＥＣ番号１．１．１．２）から選択される。一実施形態では、デヒドロゲナーゼＥＣ番号１．１．１は、Ｄ－キシロースレダクターゼ（ＥＣ番号１．１．１．９０）から選択される。一実施形態では、デヒドロゲナーゼＥＣ番号１．１．１は、アリール－アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ番号１．１．１．９１）から選択される。一実施形態では、デヒドロゲナーゼは、表５に列挙された酵素候補から誘導され得る。いくつかの実施形態では、デヒドロゲナーゼは、表５に列挙された酵素と相同であるか、または類似している。いくつかの実施形態では、デヒドロゲナーゼは、２，４－フランジメタノールへの４－ＨＭＦの還元の触媒効率を改善するために進化または操作される。
【0218】
いくつかの態様では、２，４－フランジメタノールは、微生物の非存在下で酵素的に産生される。いくつかの態様では、２，４－フランジメタノールは、１つ以上の容器内で酵素的に産生される。いくつかの態様では、１つ以上の容器は微生物を実質的に含まない。いくつかの態様では、２，４－フランジメタノールの酵素的産生は、組換え微生物を利用する方法に記載されるのと同じ段階的様式で実行されるが、微生物は実質的に含まないか、または微生物の非存在下で実行される。いくつかの態様では、２，４－フランジメタノールの酵素的産生に利用される酵素は、微生物、組換え体、またはその他から単離され、２，４－フランジメタノールを産生するために利用される中間体を段階的産生するために、対応する基質に提供される。いくつかの態様では、方法のステップのうちの１つ以上は、同じ容器で実行される。いくつかの態様では、本明細書に記載の個々の方法ステップの結果として所望の産生物が産生されると、産生物は単離および精製され、次いで２，４－フランジメタノールを産生する方法の次のステップで基質として利用される。
【0219】
フラン－２，４－ジカルボアルデヒド
一実施形態では、本開示は、炭素源からフラン－２，４－ジカルボアルデヒドを産生することができる組換え微生物を産生する方法に関心が寄せられる。本開示のいくつかの実施形態を図１、図２、および図３に提示し、これらは炭素原料のフラン－２，４－ジカルボアルデヒドへの生合成変換を集合的に詳述する。
一実施形態では、本開示は、炭素源からフラン－２，４－ジカルボアルデヒドを産生することができる組換え微生物を産生する方法に関心が寄せられる。本開示のいくつかの実施形態を図１、図２、および図３に提示し、これらは炭素原料のフラン－２，４－ジカルボアルデヒドへの生合成変換を集合的に詳述する。
【0220】
一実施形態では、図２のステップＤは、４－ＨＭＦを基質として利用する単一ステップの反応である。一実施形態では、４－ＨＭＦからのフラン－２，４－ジカルボアルデヒドの生物学的生産は、ＥＣ番号１．１．１．－、１．１．３．－、および１．１１．２．－によって表される１つ以上の酵素によって触媒される。
【0221】
一実施形態では、本明細書に開示される実施形態のいずれか１つの組換え微生物は、４－ＨＭＦのフラン－２，４－ジカルボアルデヒドへの変換を触媒するデヒドロゲナーゼ、オキシダーゼ、またはペルオキシゲナーゼをコードする少なくとも１つの内因性または外因性核酸分子を含む。一実施形態では、デヒドロゲナーゼは、ＥＣ番号１．１．１として分類される。一実施形態では、デヒドロゲナーゼＥＣ番号１．１．１は、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ番号１．１．１．１）、またはアルコールデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ＋）（ＥＣ番号１．１．１．２）、またはＤ－キシロースレダクターゼ（ＥＣ番号１．１．１．３０７）、またはアリール－アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ番号１．１．１．９０）、またはアリール－アルコールデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ＋）（ＥＣ番号１．１．１．９１）から選択される。一実施形態では、オキシダーゼは、ＥＣ番号１．１．３として分類される。一実施形態では、オキシダーゼＥＣ番号１．１．３は、５－（ヒドロキシメチルフルフラールオキシダーゼ（ＥＣ番号１．１．３．４７）である。いくつかの実施形態では、ＥＣ １．１．３．４７オキシダーゼは、遺伝子ｈｍｆＨから誘導され得る。いくつかの実施形態では、ｈｍｆＨは、Ｍｅｔｈｙｌｏｖｏｒｕｓ ｓｐ．ＭＰ６８８またはＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｂａｓｉｌｅｎｓｉｓ由来であり得る。Ｄｉｊｋｍａｎ ａｎｄ Ｆｒａａｉｊｅ（２０１４）およびＫｏｏｐｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１０）を参照されたい。一実施形態では、オキシダーゼＥＣ番号１．１．３は、アリール－アルコールオキシダーゼ（ＥＣ番号１．１．３．７）である。Ｃａｒｒｏ ｅｔ ａｌ．（２０１５）を参照されたい。一実施形態では、ペルオキシゲナーゼは、ＥＣ番号１．１１．２として分類される。一実施形態では、ペルオキシゲナーゼＥＣ番号１．１１．２は、非特異的ペルオキシゲナーゼ（ＥＣ番号１．１１．２．１）である。Ｃａｒｒｏ ｅｔ ａｌ．（２０１５）を参照されたい。
【0222】
いくつかの態様では、フラン－２，４－ジカルボアルデヒドは、微生物の非存在下で酵素的に産生される。いくつかの態様では、フラン－２，４－ジカルボアルデヒドは、１つ以上の容器内で酵素的に産生される。いくつかの態様では、１つ以上の容器は微生物を実質的に含まない。いくつかの態様では、フラン－２，４－ジカルボアルデヒドの酵素的産生は、組換え微生物を利用する方法において記載されるのと同じ段階的様式で実行されるが、微生物は実質的に含まないか、または微生物の非存在下で実行される。いくつかの態様では、フラン－２，４－ジカルボアルデヒドの酵素的産生に利用される酵素は、微生物、組換え体、またはその他から単離され、フラン－２，４－ジカルボアルデヒドを産生するために利用される中間体を段階的に産生するために、対応する基質に提供される。いくつかの態様では、方法のステップのうちの１つ以上は、同じ容器で実行される。いくつかの態様では、本明細書に記載の個々の方法ステップの結果として所望の産生物が産生されると、産生物は単離および精製され、次いで、フラン－２，４－ジカルボアルデヒドを産生する方法の次のステップで基質として利用される。
【0223】
４－（ヒドロキシメチル）フロン酸
一実施形態では、本開示は、炭素源から４－（ヒドロキシメチル）フロン酸を産生することができる組換え微生物を産生する方法に関心が寄せられる。本開示のいくつかの実施形態を図１、図２、および図３に提示し、これらは炭素原料の４－（ヒドロキシメチル）フロン酸への生合成変換を集合的に詳述する。
一実施形態では、本開示は、炭素源から４－（ヒドロキシメチル）フロン酸を産生することができる組換え微生物を産生する方法に関心が寄せられる。本開示のいくつかの実施形態を図１、図２、および図３に提示し、これらは炭素原料の４－（ヒドロキシメチル）フロン酸への生合成変換を集合的に詳述する。
【0224】
一実施形態では、図２のステップＥは、４－ＨＭＦを基質として利用する単一ステップ反応である。一実施形態では、４－ＨＭＦからの４－（ヒドロキシメチル）フロン酸の生物学的生産は、ＥＣ番号１．１．１．－、１．１．３．－、および１．１１．２．－によって表される１つ以上の酵素によって触媒される。
【0225】
一実施形態では、本明細書に開示される実施形態のいずれか１つの組換え微生物は、４－ＨＭＦから４－（ヒドロキシメチル）フロン酸への変換を触媒するデヒドロゲナーゼ、またはオキシダーゼ、またはペルオキシゲナーゼをコードする少なくとも１つの内因性もしくは外因性核酸分子を含む。一実施形態では、デヒドロゲナーゼは、ＥＣ番号１．２．１として分類される。一実施形態では、デヒドロゲナーゼＥＣ番号１．２．１は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤ＋）（ＥＣ番号１．２．１．３）またはアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ＋）（ＥＣ番号１．２．１．４）またはアルデヒドデヒドロゲナーゼ［ＮＡＤ（Ｐ）＋］（ＥＣ番号１．２．１．５）または４－（γ－グルタミルアミノ）ブタナルデヒドロゲナーゼ（ＥＣ番号１．２．１．９９）から選択される。一実施形態では、オキシダーゼは、ＥＣ番号１．１．３として分類される。一実施形態では、オキシダーゼＥＣ番号１．１．３は、５－（ヒドロキシメチルフルフラールオキシダーゼ（ＥＣ番号１．１．３．４７）である。いくつかの実施形態では、ＥＣ １．１．３．４７オキシダーゼは、遺伝子ｈｍｆＨから誘導され得る。いくつかの実施形態では、ｈｍｆＨは、Ｍｅｔｈｙｌｏｖｏｒｕｓ ｓｐ．ＭＰ６８８またはＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｂａｓｉｌｅｎｓｉｓ由来であり得る。一実施形態では、オキシダーゼＥＣ番号１．１．３は、アリール－アルコールオキシダーゼ（ＥＣ番号１．１．３．７）である。一実施形態では、ペルオキシゲナーゼは、ＥＣ番号１．１１．２として分類される。一実施形態では、ペルオキシゲナーゼＥＣ番号１．１１．２は、非特異的ペルオキシゲナーゼ（ＥＣ番号１．１１．２．１）である。
【0226】
いくつかの態様では、４－（ヒドロキシメチル）フロン酸は、微生物の非存在下で酵素的に産生される。いくつかの態様では、４－（ヒドロキシメチル）フロン酸は、１つ以上の容器内で酵素的に産生される。いくつかの態様では、１つ以上の容器は微生物を実質的に含まない。いくつかの態様では、４－（ヒドロキシメチル）フロン酸の酵素的産生は、組換え微生物を利用する方法において記載されるのと同じ段階的様式で実行されるが、微生物は実質的に含まないか、または微生物の非存在下で実行される。いくつかの態様では、４－（ヒドロキシメチル）フロン酸の酵素的産生に利用される酵素は、微生物、組換え体、またはその他から単離され、４－（ヒドロキシメチル）フロン酸を産生するために利用される中間体を段階的に産生するために、対応する基質に提供される。いくつかの態様では、方法のステップのうちの１つ以上は、同じ容器で実行される。いくつかの態様では、本明細書に記載の個々の方法ステップの結果として所望の産生物が産生されると、産生物は単離および精製され、次いで４－（ヒドロキシメチル）フロン酸を産生する方法の次のステップにおいて基質として利用される。
【0227】
２－ホルミルフラン－４－カルボキシレート
一実施形態では、本開示は、炭素源から２－ホルミルフラン－４－カルボキシレートを産生することができる組換え微生物を産生する方法に関心が寄せられる。本開示のいくつかの実施形態を図１、図２、および図３に提示し、これらは炭素原料の２－ホルミルフラン－４－カルボキシレートへの生合成変換を集合的に詳述する。
一実施形態では、本開示は、炭素源から２－ホルミルフラン－４－カルボキシレートを産生することができる組換え微生物を産生する方法に関心が寄せられる。本開示のいくつかの実施形態を図１、図２、および図３に提示し、これらは炭素原料の２－ホルミルフラン－４－カルボキシレートへの生合成変換を集合的に詳述する。
【0228】
一実施形態では、図２のステップＦは、フラン－２，４－ジカルボアルデヒドを基質として利用する単一ステップの反応である。一実施形態では、フラン－２，４－ジカルボアルデヒドからの２－ホルミルフラン－４－カルボキシレートの生物学的生産は、ＥＣ番号１．２．１．－、１．１．３．－、および１．１１．２．－によって表される１つ以上の酵素により触媒される。
【0229】
一実施形態では、本明細書に開示される実施形態のいずれか１つの組換え微生物は、フラン－２，４－ジカルボアルデヒドの２－ホルミルフラン－４－カルボキシレートへの変換を触媒するデヒドロゲナーゼ、またはオキシダーゼ、またはペルオキシゲナーゼをコードする少なくとも１つの内因性もしくは外因性核酸分子を含む。一実施形態では、デヒドロゲナーゼは、ＥＣ番号１．２．１として分類される。一実施形態では、デヒドロゲナーゼＥＣ番号１．２．１は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤ＋）（ＥＣ番号１．２．１．３）またはアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ＋）（ＥＣ番号１．２．１．４）またはアルデヒドデヒドロゲナーゼ［ＮＡＤ（Ｐ）＋］（ＥＣ番号１．２．１．５）または４－（γ－グルタミルアミノ）ブタナルデヒドロゲナーゼ（ＥＣ番号１．２．１．９９）から選択される。一実施形態では、オキシダーゼは、ＥＣ番号１．１．３として分類される。一実施形態では、オキシダーゼＥＣ番号１．１．３は、５－（ヒドロキシメチルフルフラールオキシダーゼ（ＥＣ番号１．１．３．４７）である。いくつかの実施形態では、ＥＣ １．１．３．４７オキシダーゼは、遺伝子ｈｍｆＨから誘導され得る。いくつかの実施形態では、ｈｍｆＨは、Ｍｅｔｈｙｌｏｖｏｒｕｓ ｓｐ．ＭＰ６８８またはＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｂａｓｉｌｅｎｓｉｓ由来であり得る。一実施形態では、オキシダーゼＥＣ番号１．１．３は、アリール－アルコールオキシダーゼ（ＥＣ番号１．１．３．７）である。一実施形態では、ペルオキシゲナーゼは、ＥＣ番号１．１１．２として分類される。一実施形態では、ペルオキシゲナーゼＥＣ番号１．１１．２は、非特異的ペルオキシゲナーゼ（ＥＣ番号１．１１．２．１）である。
【0230】
いくつかの態様では、２－ホルミルフラン－４－カルボキシレートは、微生物の非存在下で酵素的に産生される。いくつかの態様では、２－ホルミルフラン－４－カルボキシレートは、１つ以上の容器内で酵素的に産生される。いくつかの態様では、１つ以上の容器は微生物を実質的に含まない。いくつかの態様では、２－ホルミルフラン－４－カルボキシレートの酵素的産生は、組換え微生物を利用する方法において記載されるのと同じ段階的様式で実行されるが、微生物は実質的に含まないか、または微生物の非存在下で実行される。いくつかの態様では、２－ホルミルフラン－４－カルボン酸の酵素的産生に利用される酵素は、微生物、組換え体、またはその他から単離され、２－ホルミルフラン－４－カルボン酸を産生するために利用される中間体を段階的産生するために、対応する基質に提供される。いくつかの態様では、方法のステップのうちの１つ以上は、同じ容器で実行される。いくつかの態様では、本明細書に記載の個々の方法ステップの結果として、所望の産生物が産生されると、産生物は単離および精製され、次いで、２－ホルミルフラン－４－カルボキシレートを産生する方法の次のステップで基質として利用される。
【0231】
４－ホルミルフラン－２－カルボキシレート
一実施形態では、本開示は、炭素源から４－ホルミルフラン－２－カルボキシレートを産生することができる組換え微生物を産生する方法に関心が寄せられる。本開示のいくつかの実施形態を図１、図２、および図３に提示し、これらは炭素原料の４－ホルミルフラン－２－カルボキシレートへの生合成変換を集合的に詳細に示す。
一実施形態では、本開示は、炭素源から４－ホルミルフラン－２－カルボキシレートを産生することができる組換え微生物を産生する方法に関心が寄せられる。本開示のいくつかの実施形態を図１、図２、および図３に提示し、これらは炭素原料の４－ホルミルフラン－２－カルボキシレートへの生合成変換を集合的に詳細に示す。
【0232】
一実施形態では、図２のステップＧは、フラン－２，４－ジカルボアルデヒドを基質として利用する単一ステップ反応である。一実施形態では、フラン－２，４－ジカルボアルデヒドからの４－ホルミルフラン－２－カルボキシレートの生物学的生産は、ＥＣ番号１．２．１．－、１．１．３．－、および１．１１．２．－によって表される一つ以上の酵素により触媒される。
【0233】
一実施形態では、本明細書に開示される実施形態のいずれか１つの組換え微生物は、フラン－２，４－ジカルボアルデヒドの４－ホルミルフラン－２－カルボキシレートへの変換を触媒するデヒドロゲナーゼ、またはオキシダーゼ、またはペルオキシゲナーゼをコードする少なくとも１つの内因性または外因性核酸分子を含む。一実施形態では、デヒドロゲナーゼは、ＥＣ番号１．２．１として分類される。一実施形態では、デヒドロゲナーゼＥＣ番号１．２．１は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤ＋）（ＥＣ番号１．２．１．３）またはアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ＋）（ＥＣ番号１．２．１．４）またはアルデヒドデヒドロゲナーゼ［ＮＡＤ（Ｐ）＋］（ＥＣ番号１．２．１．５）または４－（γ－グルタミルアミノ）ブタナルデヒドロゲナーゼ（ＥＣ番号１．２．１．９９）から選択される。一実施形態では、オキシダーゼは、ＥＣ番号１．１．３として分類される。一実施形態では、オキシダーゼＥＣ番号１．１．３は、５－（ヒドロキシメチルフルフラールオキシダーゼ（ＥＣ番号１．１．３．４７）である。いくつかの実施形態では、ＥＣ １．１．３．４７オキシダーゼは、遺伝子ｈｍｆＨから誘導され得る。いくつかの実施形態では、ｈｍｆＨは、Ｍｅｔｈｙｌｏｖｏｒｕｓ ｓｐ．ＭＰ６８８またはＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｂａｓｉｌｅｎｓｉｓ由来であり得る。一実施形態では、オキシダーゼＥＣ番号１．１．３は、アリール－アルコールオキシダーゼ（ＥＣ番号１．１．３．７）である。一実施形態では、ペルオキシゲナーゼは、ＥＣ番号１．１１．２として分類される。一実施形態では、ペルオキシゲナーゼＥＣ番号１．１１．２は、非特異的ペルオキシゲナーゼ（ＥＣ番号１．１１．２．１）である。
【0234】
一実施形態では、図２のステップＨは、４－（ヒドロキシメチル）フロン酸を基質として利用する単一ステップ反応である。一実施形態では、４－（ヒドロキシメチル）フロン酸からの４－ホルミルフラン－２－カルボキシレートの生物学的生産は、ＥＣ番号１．１．１．－、１．１．３．－、および１．１１．２．－によって表される１つ以上の酵素により触媒される。
【0235】
一実施形態では、本明細書に開示される実施形態のいずれか１つの組換え微生物は、４－（ヒドロキシメチル）フロン酸の４－ホルミルフラン－２－カルボキシレートへの変換を触媒するデヒドロゲナーゼ、またはオキシダーゼ、またはペルオキシゲナーゼをコードする少なくとも１つの内因性もしくは外因性核酸分子を含む。一実施形態では、デヒドロゲナーゼは、ＥＣ番号１．１．１として分類される。一実施形態では、デヒドロゲナーゼＥＣ番号１．１．１は、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ番号１．１．１．１）、またはアルコールデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ＋）（ＥＣ番号１．１．１．２）、またはＤ－キシロースレダクターゼ（ＥＣ番号１．１．１．３０７）、またはアリール－アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ番号１．１．１．９０）、またはアリール－アルコールデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ＋）（ＥＣ番号１．１．１．９１）から選択される。一実施形態では、オキシダーゼは、ＥＣ番号１．１．３として分類される。一実施形態では、オキシダーゼＥＣ番号１．１．３は、５－（ヒドロキシメチルフルフラールオキシダーゼ（ＥＣ番号１．１．３．４７）である。いくつかの実施形態では、ＥＣ １．１．３．４７オキシダーゼは、遺伝子ｈｍｆＨから誘導され得る。いくつかの実施形態では、ｈｍｆＨは、Ｍｅｔｈｙｌｏｖｏｒｕｓ ｓｐ．ＭＰ６８８またはＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｂａｓｉｌｅｎｓｉｓ由来であり得る。Ｄｉｊｋｍａｎ ａｎｄ Ｆｒａａｉｊｅ（２０１４）およびＫｏｏｐｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１０）を参照されたい。一実施形態では、オキシダーゼＥＣ番号１．１．３は、アリール－アルコールオキシダーゼ（ＥＣ番号１．１．３．７）である。Ｃａｒｒｏ ｅｔ ａｌ．（２０１５）を参照されたい。一実施形態では、ペルオキシゲナーゼは、ＥＣ番号１．１１．２として分類される。一実施形態では、ペルオキシゲナーゼＥＣ番号１．１１．２は、非特異的ペルオキシゲナーゼ（ＥＣ番号１．１１．２．１）である。Ｃａｒｒｏ ｅｔ ａｌ．（２０１５）を参照されたい。
【0236】
いくつかの態様では、４－ホルミルフラン－２－カルボキシレートは、微生物の非存在下で酵素的に産生される。いくつかの態様では、４－ホルミルフラン－２－カルボキシレートは、１つ以上の容器内において酵素的に産生される。いくつかの態様では、１つ以上の容器は微生物を実質的に含まない。いくつかの態様では、４－ホルミルフラン－２－カルボキシレートの酵素的産生は、組換え微生物を利用する方法において記載されるのと同じ段階的様式で実行されるが、微生物は実質的に含まないか、または微生物の非存在下で実行される。いくつかの態様では、４－ホルミルフラン－２－カルボキシレートの酵素的産生に利用される酵素は、微生物、組換え体、またはその他から単離され、４－ホルミルフラン－２－カルボキシレートを産生するために利用される中間体を段階的に産生するために、対応する基質に提供される。いくつかの態様では、方法のステップのうちの１つ以上は、同じ容器で実行される。いくつかの態様では、本明細書に記載の個々の方法ステップの結果として、所望の産生物が産生されると、産生物は単離および精製され、次いで４－ホルミルフラン－２－カルボキシレートを産生する方法の次のステップで基質として利用される。
【0237】
本開示は、４－ＨＭＦ、２，４－フランジメタノール、フラン－２，４－ジカルボアルデヒド、４－（ヒドロキシメチル）フロン酸、２－ホルミルフラン－４－カルボキシレート、４－ホルミルフラン－２－カルボキシレート、および２，４－ＦＤＣＡのうちの１つ以上を高収率で産生することができる方法および組換え微生物を提供する。一実施形態では、１分子のグルコースと２分子のＡＴＰは、正味の式１に従って、１分子の２，４－ＦＤＣＡと３分子のＮＡＤ（Ｐ）Ｈに変換される。
式１：１グルコース＋２ＡＴＰ→１ ２，４－ＦＤＣＡ＋３ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ
式１：１グルコース＋２ＡＴＰ→１ ２，４－ＦＤＣＡ＋３ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ
【0238】
正味の反応により、グルコース１グラム当たり約０．８７グラムの２，４－ＦＤＣＡの質量収率が得られる。この収率は、グルコース１グラム当たり１．１６グラムの２，４－ＦＤＣＡの最大熱力学的収率の７５％に相当する。いくつかの実施形態では、２，４－ＦＤＣＡの収率は、グルコース１グラム当たり約０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．１６グラムであり得る。
【0239】
一実施形態では、１分子のグルコース、２分子のＡＴＰおよび３分子の酸素は、正味の式２に従って、１分子の２，４－ＦＤＣＡと３分子の過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）とに変換される。
式２：１グルコース＋２ＡＴＰ＋３Ｏ２→１ ２，４－ＦＤＣＡ＋３Ｈ２Ｏ２
式２：１グルコース＋２ＡＴＰ＋３Ｏ２→１ ２，４－ＦＤＣＡ＋３Ｈ２Ｏ２
【0240】
一実施形態では、２分子のグリセロールと２分子のＡＴＰは、正味の式３に従って、１分子の２，４－ＦＤＣＡと５分子のＮＡＤ（Ｐ）Ｈとに変換される。
式３：２グリセロール＋２ＡＴＰ→１ ２，４－ＦＤＣＡ＋５ ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ
式３：２グリセロール＋２ＡＴＰ→１ ２，４－ＦＤＣＡ＋５ ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ
【0241】
正味の反応は、グリセロール１グラム当たり約０．８５グラムの２，４－ＦＤＣＡの質量収率をもたらす。この収率は、グリセロール１グラム当たり１．３２グラムの２，４－ＦＤＣＡの最大熱力学的収率の６４％に相当する。いくつかの実施形態では、２，４－ＦＤＣＡの収率は、グリセロール１グラム当たり約０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．３、１．３２グラムであり得る。
【0242】
一実施形態では、２分子のグリセロール、２分子のＡＴＰの、および３分子の酸素は、正味方程式４に従って、１分子の２，４－ＦＤＣＡ、および３分子の過酸化水素に変換される。
式４：２グリセロール＋２ＡＴＰ＋３Ｏ２→１ ２，４－ＦＤＣＡ＋３Ｈ２Ｏ２
式４：２グリセロール＋２ＡＴＰ＋３Ｏ２→１ ２，４－ＦＤＣＡ＋３Ｈ２Ｏ２
【0243】
生合成産物モノマーおよび／またはポリマーを産生および単離する方法
いくつかの態様では、本開示の改変微生物は、微生物が４－ＨＭＦ、２，４－フランジメタノール、フラン－２，４－ジカルボアルデヒド、４－（ヒドロキシメチル）フロン酸、２－ホルミルフラン－４－カルボキシレート、４－ホルミルフラン－２－カルボキシレート、および２，４－ＦＤＣＡモノマーを産生するように改変される。いくつかの態様では、本開示の改変微生物は、微生物が、４－ＨＭＦ、２，４－フランジメタノール、フラン－２，４－ジカルボアルデヒド、４－（ヒドロキシメチル）フロン酸、２－ホルミルフラン－４－カルボキシレート、４－ホルミルフラン－２－カルボキシレート、および２，４－ＦＤＣＡに由来するポリマーを産生するように改変される。いくつかの態様では、生合成産物モノマーおよび／またはポリマーを産生する方法は、生合成産物モノマーおよび／またはポリマーを産生するのに十分な条件下で、本開示の１つ以上の微生物を増殖／発酵させることと、得られた４－ＨＭＦ、２，４－フランジメタノール、フラン－２，４－ジカルバルアルデヒド、４－（ヒドロキシメチル）フロン酸、２－ホルミルフラン－４－カルボキシレート、４－ホルミル－２－フラン－４－カルボキシレート、および２，４－ＦＤＣＡおよび／またはそれらのポリマーを単離／収集することと、を含む。いくつかの態様では、生合成モノマーは、インビボでポリマーに重合する。いくつかの態様では、生合成モノマーおよびポリマーの産生は、微生物発酵プロセスにおいて利用される細菌の数に比例する。いくつかの態様では、細菌は、反応チャンバ内で増殖する。所望の数の細菌が達成されると、使用済みの培地は、生合成産物のモノマーおよび／またはポリマーを単離するためのプロセスに供される。いくつかの態様では、微生物は溶解され、細胞破片は、遠心分離器で溶液からペレット化される。いくつかの態様では、生合成産物モノマーおよび／またはポリマーは、溶媒抽出プロセスまたは勾配超遠心分離プロセスの助けを借りて、細胞ペレット画分または液体画分から収集される。いくつかの態様では、生合成産物ポリマーは、濾過によって単離することができる。
いくつかの態様では、本開示の改変微生物は、微生物が４－ＨＭＦ、２，４－フランジメタノール、フラン－２，４－ジカルボアルデヒド、４－（ヒドロキシメチル）フロン酸、２－ホルミルフラン－４－カルボキシレート、４－ホルミルフラン－２－カルボキシレート、および２，４－ＦＤＣＡモノマーを産生するように改変される。いくつかの態様では、本開示の改変微生物は、微生物が、４－ＨＭＦ、２，４－フランジメタノール、フラン－２，４－ジカルボアルデヒド、４－（ヒドロキシメチル）フロン酸、２－ホルミルフラン－４－カルボキシレート、４－ホルミルフラン－２－カルボキシレート、および２，４－ＦＤＣＡに由来するポリマーを産生するように改変される。いくつかの態様では、生合成産物モノマーおよび／またはポリマーを産生する方法は、生合成産物モノマーおよび／またはポリマーを産生するのに十分な条件下で、本開示の１つ以上の微生物を増殖／発酵させることと、得られた４－ＨＭＦ、２，４－フランジメタノール、フラン－２，４－ジカルバルアルデヒド、４－（ヒドロキシメチル）フロン酸、２－ホルミルフラン－４－カルボキシレート、４－ホルミル－２－フラン－４－カルボキシレート、および２，４－ＦＤＣＡおよび／またはそれらのポリマーを単離／収集することと、を含む。いくつかの態様では、生合成モノマーは、インビボでポリマーに重合する。いくつかの態様では、生合成モノマーおよびポリマーの産生は、微生物発酵プロセスにおいて利用される細菌の数に比例する。いくつかの態様では、細菌は、反応チャンバ内で増殖する。所望の数の細菌が達成されると、使用済みの培地は、生合成産物のモノマーおよび／またはポリマーを単離するためのプロセスに供される。いくつかの態様では、微生物は溶解され、細胞破片は、遠心分離器で溶液からペレット化される。いくつかの態様では、生合成産物モノマーおよび／またはポリマーは、溶媒抽出プロセスまたは勾配超遠心分離プロセスの助けを借りて、細胞ペレット画分または液体画分から収集される。いくつかの態様では、生合成産物ポリマーは、濾過によって単離することができる。
【0244】
いくつかの態様では、生合成産物モノマーは、モノマーが産生されるまで、炭素源を提供する原料を含有する培養培地中で組換え微生物を培養することによって産生される。いくつかの態様では、原料は、１つ以上のヘキソース、１つ以上のペントース、またはこれらの組み合わせを含む。いくつかの態様では、モノマーは、培養培地から抽出され、触媒の存在下で重合される。本開示は、本組換え型微生物によって産生される生合成産物からポリマーを産生する方法、および本開示の方法を提供する。一実施形態では、１つ以上の生合成産物は、ジオールと触媒的に重合されてポリマーを形成する。
【0245】
いくつかの態様では、生合成産物モノマーは、チタン系触媒、ゲルマニウム系触媒、マグネシウム系触媒、ケイ素系触媒、アルミニウム系触媒、またはアンチモン系触媒から選択される触媒の存在下で触媒される。いくつかの態様では、触媒は、酢酸アンチモン、三酸化アンチモン、二酸化ゲルマニウム、チタン酸テトラ－イソプロピル、およびチタン酸テトラ－ｎ－ブチルから選択される。
【0246】
いくつかの態様では、生合成産物由来ポリマーは、ｐｈａシンターゼによってインビボで重合される。いくつかの態様では、生合成産物由来モノマーは、ｐｈａシンターゼによってエクスビボで重合される。
【0247】
いくつかの態様では、生合成産物４－ＨＭＦは、培養培地から抽出され、触媒の存在下で、当技術分野で報告されているように他の生合成産物のうちの１つ以上に転換される。Ｖａｎ Ｐｕｔｔｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３．Ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌｆｕｒｆｕｒａｌ，ａ Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ Ｐｌａｔｆｏｒｍ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍａｄｅ ｆｒｏｍ Ｒｅｎｅｗａｂｌｅ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ．Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ，１１３．３：１４９９－１５９７）を参照されたい。
【0248】
いくつかの態様では、生合成産物４－ＨＭＦは、培養培地から抽出され、触媒の存在下で２，４－ジメチルフランに転換される。Ｄｅｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３．Ｌｉｎｋｅｄ Ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｕｅｌｓ ｖｉａ Ｆｏｒｍｏｓｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ，３：１２４４）を参照されたい。
【0249】
いくつかの態様では、本明細書に記載の方法および組成物によって産生される生合成産物の任意の１つ以上は、生合成される培養培地から抽出され、化学触媒または生物触媒の存在下で転換される。
【0250】
いくつかの態様では、化学触媒または生物学的触媒の存在下での生合成産物の転換は、微生物の非存在下で実行される。いくつかの態様では、生物学的触媒の存在下での生合成産物の転換は、微生物の非存在下で、１つ以上の微生物から単離され精製された１つ以上の酵素の存在下で実行される。
【0251】
いくつかの態様では、１つまたは複数の化学触媒は、２，４－フランジメタノール、フラン－２，４－ジカルボアルデヒド、４－（ヒドロキシメチル）フロン酸、２－ホルミルフラン－４－カルボキシレート、４－ホルミルフラン－２－カルボキシレート、および／または２，４－ＦＤＣＡの非生物合成に利用されることが知られている化学物質のうちのいずれか１つ以上である。
【0252】
いくつかの態様では、１つまたは複数の生物学的触媒は、図２の反応ステップＣ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、またはＪについて本明細書に記載される酵素のうちのいずれか１つ以上である。
【0253】
いくつかの態様では、生合成４－ＨＭＦの２，４－フランジメタノールへの転換は、微生物を実質的に含まない組成物中で、ＥＣ １．１．１．－の生物学的触媒などの、本明細書に記載の化学触媒または生物学的触媒の存在下で起こる。
【0254】
いくつかの態様では、生合成４－ＨＭＦのフラン－２，４－ジカルボアルデヒドへの転換は、微生物を実質的に含まない組成物中で、ＥＣ １．１．１．－、ＥＣ １．１．３．－、および／またはＥＣ １．１１．２．－の生物学的触媒などの、本明細書に記載の化学触媒または生物学的触媒の存在下で起こる。
【0255】
いくつかの態様では、生合成４－ＨＭＦの４－（ヒドロキシメチル）フロン酸への転換は、微生物を実質的に含まない組成物中で、ＥＣ １．１．１．－、ＥＣ １．１．３．－、および／またはＥＣ １．１１．２．－の生物学的触媒などの、本明細書に記載の化学触媒または生物学的触媒の存在下で起こる。
【0256】
いくつかの態様では、生合成２，４－フランジメタノールの２－ホルミルフラン－４－カルボキシレートへの転換は、微生物を実質的に含まない組成物中で、ＥＣ １．２．１．－、ＥＣ １．１．３．－、および／またはＥＣ １．１１．２．－の生物学的触媒などの、本明細書に記載の化学触媒または生物学的触媒の存在下で起こる。
【0257】
いくつかの態様では、生合成フラン－２，４－ジカルボアルデヒドの２－ホルミルフラン－４－カルボキシレートへの転換は、微生物を実質的に含まない組成物中で、ＥＣ １．２．１．－、ＥＣ １．１．３．－、および／またはＥＣ １．１１．２．－の生物学的触媒などの、本明細書に記載の化学触媒または生物学的触媒の存在下で起こる。
【0258】
いくつかの態様では、生合成フラン－２，４－ジカルボアルデヒドの４－ホルミルフラン－２－カルボキシレートへの転換は、微生物を実質的に含まない組成物中で、ＥＣ １．２．１．－、ＥＣ １．１．３．－、および／またはＥＣ １．１１．２．－の生物学的触媒などの、本明細書に記載の化学触媒または生物学的触媒の存在下で起こる。
【0259】
いくつかの態様では、生合成４－（ヒドロキシメチル）フロン酸の４－ホルミルフラン－３－カルボキシレートへの転換は、微生物を実質的に含まない組成物中で、ＥＣ １．２．１．－、ＥＣ １．１．３．－、および／またはＥＣ １．１１．２．－の生物学的触媒などの、本明細書に記載の化学的または生物学的触媒の存在下で起こる。
【0260】
いくつかの態様では、生合成２－ホルミルフラン－４－カルボキシレートの２，４－ＦＤＣＡへの転換は、微生物を実質的に含まない組成物中で、ＥＣ １．２．１．－、ＥＣ １．１．３．－、および／またはＥＣ １．１１．２．－の生物学的触媒などの、本明細書に記載の化学触媒または生物学的触媒の存在下で起こる。
【0261】
いくつかの態様では、生合成４－ホルミルフラン－２－カルボキシレートの２，４－ＦＤＣＡへの転換は、微生物を実質的に含まない組成物中で、ＥＣ １．２．１．－、ＥＣ １．１．３．－、および／またはＥＣ １．１１．２．－の生物学的触媒などの、本明細書に記載の化学触媒または生物学的触媒の存在下で起こる。
【0262】
いくつかの態様では、上述の任意の１つ以上の転換は、第１の転換の産生物が第２の転換の産生物の基質となるように、別の転換と組み合わせることができる。
【0263】
いくつかの態様では、上述の任意の１つ以上の転換は、第１の転換の産生物が第２の転換の産生物の基質となり、その産生物が第３の転換の産生物の基質となるように、別の変換と組み合わせることができる。
【0264】
生合成産物を産生するための生物学的プロセス
本開示は、本明細書に記載の生合成産物、４－ＨＭＦ、２，４－フランジメタノール、フラン－２，４－ジカルボアルデヒド、４－（ヒドロキシメチル）フロン酸、２－ホルミルフラン－４－カルボキシレート、４－ホルミルフラン－２－カルボキシレート、および２，４－ＦＤＣＡのうちの１つ以上を産生するための生物学的プロセスを提供する。いくつかの実施形態では、このプロセスは、少なくとも１つのバイオリアクターに、１つ以上の生合成経路からのグリセルアルデヒド３－リン酸（Ｇ３Ｐ）の生合成およびＧ３Ｐからの１つ以上の生合成産物に関与する１つ以上の酵素を発現するように操作された１つ以上の組換え微生物、外因性炭素源を含む原料を提供することと、原料を含む培養培地中で１つ以上の段階で１つ以上の組換え微生物を培養することと、得られた培養物を、好気性、微好気性および／または嫌気性条件下で１つ以上の段階で発酵させることと、発酵ステップ後、バイオリアクターから１つ以上の生合成産物を回収することと、を含む。
本開示は、本明細書に記載の生合成産物、４－ＨＭＦ、２，４－フランジメタノール、フラン－２，４－ジカルボアルデヒド、４－（ヒドロキシメチル）フロン酸、２－ホルミルフラン－４－カルボキシレート、４－ホルミルフラン－２－カルボキシレート、および２，４－ＦＤＣＡのうちの１つ以上を産生するための生物学的プロセスを提供する。いくつかの実施形態では、このプロセスは、少なくとも１つのバイオリアクターに、１つ以上の生合成経路からのグリセルアルデヒド３－リン酸（Ｇ３Ｐ）の生合成およびＧ３Ｐからの１つ以上の生合成産物に関与する１つ以上の酵素を発現するように操作された１つ以上の組換え微生物、外因性炭素源を含む原料を提供することと、原料を含む培養培地中で１つ以上の段階で１つ以上の組換え微生物を培養することと、得られた培養物を、好気性、微好気性および／または嫌気性条件下で１つ以上の段階で発酵させることと、発酵ステップ後、バイオリアクターから１つ以上の生合成産物を回収することと、を含む。
【0265】
生物学的プロセスのいくつかの実施形態では、１つ以上の生合成産物は、培養培地または原料が枯渇する前に連続的に回収される。いくつかの実施形態では、生合成産物は、培養培地または原料が枯渇する前にバッチで回収される。いくつかの実施形態では、前記１つ以上の組換え微生物は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｇｓｄａｌｅｉ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｍｏｓｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｉｃｕｍ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｗｏｏｄｉｉ、Ａｌｋａｌｉｂａｃｕｌｕｍ ｂａｃｃｈｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｒａｋｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｆｏｒｍｉｃｏａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｃａｔｏｌｏｇｅｎｅｓ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ、Ａｃｅｔｏｎｅｍａ ｌｏｎｇｕｍ、Ｂｌａｕｔｉａ ｐｒｏｄｕｃｔａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｌｙｃｏｌｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｍａｇｎｕｍ、Ｃａｎｄｉｄａ ｋｒｕｓｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｍａｙｏｍｂｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｍｅｔｈｏｘｙｂｅｎｚｏｖｏｒａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ、Ｏｘｏｂａｃｔｅｒ ｐｆｅｎｎｉｇｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｋｉｖｕｉ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｏｖａｔａ、Ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｏｇｅｎｉｕｍ ｐｈａｅｕｍ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｒｂｉｎｏｌｉｃｕｍ、Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｔｅｒｍｉｔｉｄａ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｇｌｙｃｅｒｉｎｉ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｇｇｒｅｇａｎｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ａｚｏｔｏｎｕｔｒｉｃｉｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ ｋｕｄｒｉａｖｚｅｖｉｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｓｃｈｅｆｆｅｒｓｏｍｙｃｅｓ ｓｔｉｐｉｔｉｓ、およびＴｅｒｒｉｓｐｏｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌｙｃｏｌｉｃｕｓからなる群から選択される親微生物由来である。
【0266】
生物学的プロセスのいくつかの実施形態では、原料は、Ｃ６炭水化物および／またはＣ５炭水化物を含む。いくつかの実施形態では、原料は、単糖類、二糖類、オリゴ糖、多糖類、またはこれらの組み合わせを含む。
【0267】
生物学的プロセスのいくつかの実施形態では、培養および発酵ステップは、同じ段階で起こる。いくつかの実施形態では、培養および発酵ステップは、別個の段階で起こる。いくつかの実施形態では、培養および発酵ステップは、別個のバイオリアクターで起こる。いくつかの実施形態では、培養および発酵ステップは、同じバイオリアクターで起こる。いくつかの実施形態では、バイオリアクターは、好気性、微好気性、または嫌気性条件下で、またはこれらの組み合わせ下で作動する。
【0268】
いくつかの実施形態では、１つ以上の段階は、培養物および／または培養培地をバッチ、流加バッチ、または連続モードフィードとして受け取る。いくつかの実施形態では、培養段階は、培養物および／または培養培地をバッチ、流加バッチ、または連続モードフィードとして受け取り、任意の後続の段階では、バッチ、流加バッチ、または連続モードフィードとして作動する。
【0269】
いくつかの実施形態では、培養培地は、Ｃ５炭水化物、Ｃ６炭水化物、および／または二糖から提供される炭素（Ｃ）を含む。いくつかの実施形態では、培養培地は、窒素（Ｎ）、リン（Ｐ）、マグネシウム（Ｍｇ）、および鉄（Ｆｅ）を含む必須栄養素を含む。
【0270】
いくつかの実施形態では、培養ステップにおけるＣ：Ｎの比は、少なくとも１０：１である。いくつかの実施形態では、培養ステップにおけるＣ：Ｐの比は、少なくとも５：１である。いくつかの実施形態では、培養ステップにおけるＣ：Ｍｇの比は、少なくとも５０：１である。いくつかの実施形態では、培養ステップにおけるＣ：Ｆｅの比は、少なくとも３００：１である。
【0271】
いくつかの実施形態では、培養ステップは、１つ以上の組換え微生物の細胞の培養のために５時間から１００時間まで作動する。いくつかの実施形態では、発酵ステップにおける培養は、細胞質量の約１％～約３０％を含み、これは、１つ以上の基質を有する培養培地中の培養ステップにから移される。いくつかの実施形態では、発酵ステップに提供される供給原料の総量は、約１００ｋｇ／ｍ３～約８００ｋｇ／ｍ３の範囲である。
【0272】
いくつかの実施形態では、発酵ステップにおけるＣ：Ｎの比は、少なくとも５０：１である。いくつかの実施形態では、発酵ステップにおけるＣ：Ｐの比は、少なくとも２０：１である。いくつかの実施形態では、発酵ステップにおけるＣ：Ｍｇの比は、少なくとも２００：１である。いくつかの実施形態では、発酵ステップにおけるＣ：Ｆｅの比は、少なくとも８００：１である。いくつかの実施形態では、発酵ステップは、流加操作の場合は１０時間から３００時間まで、連続操作の場合は３００時間まで作動する。
【実施例】
【0273】
実施例１：メチルホスフェートシンターゼの発現および精製
酵素アッセイで使用される酵素の発現および精製を、以下の条件下で行った：２７個の（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートシンターゼ候補をコードする遺伝子（表１）を、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔにより合成し、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ制限部位で発現ベクターｐＥＴ２８ａ中にクローニングした。発現ベクターでＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、酵素発現に使用するまで形質転換体を１５％グリセロール中に保存した。
酵素アッセイで使用される酵素の発現および精製を、以下の条件下で行った：２７個の（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートシンターゼ候補をコードする遺伝子（表１）を、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔにより合成し、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ制限部位で発現ベクターｐＥＴ２８ａ中にクローニングした。発現ベクターでＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、酵素発現に使用するまで形質転換体を１５％グリセロール中に保存した。
【0274】
保存された形質転換体を、カナマイシンを含有する５０ｍＬのＴＢブロスに接種し３７℃で１６時間撹拌して種培養物を調製した。種培養物を、カナマイシンを含有するＴＢブロス３００ｍＬに加えて初期ＯＤ（６００ｎｍ）０．２とし、次いで培養物を、ＯＤ（６００ｎｍ）が０．６～０．８に達するまで撹拌しながら３７℃でインキュベートし、この時点で１ｍＭのＩＰＴＧを添加して、撹拌しながら１８℃で一晩発現を誘導した。
【0275】
一晩発現させた後、細胞を６０００×ｒｐｍで３０分間遠心分離し、ペレット細胞を冷溶解緩衝液（２０ｍＭのリン酸緩衝液および５００ｍＭのＮａＣｌ ｐＨ７．４）中に懸濁してから超音波破壊した。細胞溶解物を再び、８０００ｒｐｍで４℃で３０分間遠心分離し、濾過して、アフィニティクロマトグラフィーで精製した。利用したカラムは、ｈｉｓタグ付きタンパク質精製用のＨｉｓＴｒａｐ ＦＦ Ｃｒｕｄｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）であった。精製タンパク質を、結合緩衝液Ａ（２０ｍＭのリン酸緩衝液、２０ｍＭのイミダゾール、５００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＰＭＳＦおよびベータ－メルカプトエタノール、ｐＨ７．４）でカラムに結合させ、洗浄し、溶出緩衝液Ｂ（２０ｍＭのリン酸緩衝液、５００ｍＭのイミダゾール、５００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＰＭＳＦおよびベータ－メルカプトエタノール、ｐＨ７．４）の勾配で溶出させた。次にＰＤ－１０カラムを使用して、緩衝液を５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．４に変更した。図４に示すように、候補の発現および精製を電気泳動により１２％ポリアクリルアミドゲル上で分析した。
【0276】
実施例２：Ｇ３Ｐからの（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェート産生
表１に記載される酵素候補によるグリセルアルデヒド－３－リン酸（Ｇ３Ｐ）からの（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェート産生を、約４５０μｇの精製候補を、２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、２００ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．４）緩衝液中に５ｍＭのグリセルアルデヒド－３－リン酸（Ｓｉｇｍａ）を含有する１ｍＬの溶液とインキュベートすることによってインビトロで実証した。反応物を、３７℃で２時間インキュベートした。シンターゼまたは基質（Ｇ３Ｐ）を含まない反応容器を、陰性対照として使用した。反応を、５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートの２８０ｎｍモル吸光係数（ε）に基づいて、分光光度計（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用するＵＶ－Ｖｉｓにより監視した。産生物の形成も、ＨＰＬＣ分析によって確認した。
表１に記載される酵素候補によるグリセルアルデヒド－３－リン酸（Ｇ３Ｐ）からの（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェート産生を、約４５０μｇの精製候補を、２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、２００ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．４）緩衝液中に５ｍＭのグリセルアルデヒド－３－リン酸（Ｓｉｇｍａ）を含有する１ｍＬの溶液とインキュベートすることによってインビトロで実証した。反応物を、３７℃で２時間インキュベートした。シンターゼまたは基質（Ｇ３Ｐ）を含まない反応容器を、陰性対照として使用した。反応を、５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートの２８０ｎｍモル吸光係数（ε）に基づいて、分光光度計（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用するＵＶ－Ｖｉｓにより監視した。産生物の形成も、ＨＰＬＣ分析によって確認した。
【0277】
（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートの産生のクロマトグラフィー定量的分析を、Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ－８７Ｈ Ｂｉｏｒａｄカラム（３００×７．８ｍｍ）を備えたＨＰＬＣ－ＤＡＤ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００）で実行した。カラムを５０℃で維持し、使用した移動相は、流量０．７５ｍＬ／分の５ｍＭのＨ２ＳＯ４溶液であった（アイソクラティック勾配モード）。
【0278】
表６、図５、および図６に示すように、Ｇ３Ｐは、メチルホスフェートシンターゼによってメチルホスフェート（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルへと首尾よく変換された。図５では、陰性対照試料（灰色の線）が２８０での低い吸光度を示し、メチルホスフェートシンターゼ（黒色の線）を含有する反応と比較して、（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートがほとんどまたは全く存在しないことを示し、シンターゼがＧ３Ｐからの（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートの形成を触媒したことを示しており、これらの結果を表６に要約する。図６は、シンターゼを含有する反応物における検出可能な（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートを示す（下パネル）が、陰性対照反応物では示さない（上パネル）。表７は、Ｇ３Ｐからの（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートの産生について陽性として試験されたメチルホスフェートシンターゼ候補のリストを含む。
【0279】
（表６）Ｇ３Ｐからの（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートの、メチルホスフェートシンターゼによる産生について２８０ｎｍで得られた吸光度
【0280】
（表７）Ｇ３Ｐからの（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートの産生の触媒反応について陽性として試験された（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートシンターゼ候補
【0281】
実施例３：（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートからの４－ヒドロキシメチルフルフラール（４－ＨＭＦ）の産生
ホスファターゼを使用した（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートからの４－ＨＭＦの産生を、市販のホスファターゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ溶解物、および酵母溶解物を使用して実証し、（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートから２，４－ＨＭＦを産生する能力を実証した。基質（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートを、実施例２に記載されるように、（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートシンターゼによって産生した。
ホスファターゼを使用した（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートからの４－ＨＭＦの産生を、市販のホスファターゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ溶解物、および酵母溶解物を使用して実証し、（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートから２，４－ＨＭＦを産生する能力を実証した。基質（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートを、実施例２に記載されるように、（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートシンターゼによって産生した。
【0282】
（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートおよび４－ＨＭＦ産生のクロマトグラフィー定量的分析を、Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ－８７Ｈ Ｂｉｏｒａｄカラム（３００×７．８ｍｍ）を備えたＨＰＬＣ－ＤＡＤ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００）で実行した。カラムを５０℃で維持し、使用した移動相は、流量０．７５ｍＬ／分の５ｍＭのＨ２ＳＯ４溶液であった（アイソクラティック勾配モード）。両方の化合物を２８０ｎｍで検出した。
【0283】
市販のホスファターゼを使用した（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートからの４－ＨＭＦの産生を示す反応を実施するために、２μＬのウシ腸粘膜（Ｓｉｇｍａ）由来のアルカリホスファターゼを、およそ１～２ｍＭの（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートを含有する実施例２からの１ｍＬの反応容器に加えた。反応物を３７℃で１時間インキュベートし、最初と最終の試料をＨＰＬＣ－ＤＡＤにより分析した。図７（上パネル）および表８に示すように、市販のホスファターゼは、（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートの４－ＨＭＦへの完全変換を行うことができた。
【0284】
（表８）メチルホスフェートシンターゼを使用して産生された（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートのピーク面積
【0285】
Ｅ．ｃｏｌｉ溶解物中のホスファターゼを使用した（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートからの４－ＨＭＦの産生を示す反応を実施するために、Ｅ．ｃｏｌｉＭＧ１６５５株を２００ｍＬのＬＢブロスに接種し、３７℃で一晩撹拌した。培養物を４０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、ペレットを２０ｍＬの２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．４に懸濁し、ＯＤを７０にした。溶解を超音波破壊によって行った。１ｍＬのＥ．ｃｏｌｉ溶解物を、実施例２からの１ｍＬの反応物と混合し、撹拌しながら３７℃で一晩インキュベートした。試料を、４－ＨＭＦの産生について、２８０ｎｍでＨＰＬＣ－ＤＡＤにより分析した。
【0286】
酵母溶解物中のホスファターゼを使用した（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートからの４－ＨＭＦの産生を示す反応を実施するために、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの株を２００ｍＬのＹＰＤブロスに接種し、３０℃で一晩撹拌した。培養物を４０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、ペレットを２０ｍＬの２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．４に懸濁し、ＯＤを１２０にした。細胞溶解を超音波破壊によって行った。１ｍＬの酵母溶解物を、実施例２からの１ｍＬの反応物と混合し、撹拌しながら３０℃で一晩インキュベートした。試料を、４－ＨＭＦの産生について、２８０ｎｍでＨＰＬＣ－ＤＡＤにより分析した。
【0287】
図７（中パネル）および図７（下パネル）ならびに表９に示すように、Ｅ．ｃｏｌｉおよび酵母溶解物の両方は、（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートの４－ＨＭＦへの変換を実行できる内因性ホスファターゼ活性を示した。
【0288】
（表９）１時間のインキュベーション後の市販のホスファターゼと、それぞれ３７℃および３０℃での一晩インキュベーション後のＥ．ｃｏｌｉ ｌおよび酵母溶解物による、（５－ホルミルフラン－３－イル）メチルホスフェートからの４－ＨＭＦ産生
【0289】
実施例４：４－ＨＭＦオキシダーゼ酵素の発現
７個の４－ＨＭＦオキシダーゼ酵素候補をコードする遺伝子（表４）を、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔにより合成し、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ制限部位で発現ベクターｐＥＴ２８ａ中にクローニングした。発現ベクターでＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、酵素発現に使用するまで形質転換体を１５％グリセロール中に保存した。
７個の４－ＨＭＦオキシダーゼ酵素候補をコードする遺伝子（表４）を、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔにより合成し、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ制限部位で発現ベクターｐＥＴ２８ａ中にクローニングした。発現ベクターでＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、酵素発現に使用するまで形質転換体を１５％グリセロール中に保存した。
【0290】
保存された形質転換体を、カナマイシンを含有する５０ｍＬのＴＢブロスに接種し３７℃で１６時間撹拌して種培養物を調製した。種培養物を、カナマイシンを含有するＴＢブロス３００ｍＬに加えて初期ＯＤ（６００ｎｍ）０．２とし、次いで培養物を、ＯＤ（６００ｎｍ）が０．６～０．８に達するまで撹拌しながら３７℃でインキュベートし、この時点で１ｍＭのＩＰＴＧを添加して、撹拌しながら１８℃で一晩発現を誘導した。
【0291】
一晩発現させた後、細胞を６０００ｘｒｐｍで３０分間遠心分離し、細胞ペレットを、冷溶解緩衝液（２０ｍＭのリン酸緩衝液および５００ｍＭのＮａＣｌ ｐＨ７．４）中に懸濁してから超音波破壊した。細胞溶解物を再び、８０００ｘｒｐｍで４℃で３０分間遠心分離し、濾過して、アフィニティクロマトグラフィーで精製した。利用したカラムは、ｈｉｓタグ付きタンパク質精製用のＨｉｓＴｒａｐ ＦＦ Ｃｒｕｄｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）であった。精製タンパク質を、結合緩衝液Ａ（２０ｍＭのリン酸緩衝液、２０ｍＭのイミダゾール、５００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＰＭＳＦおよびベータ－メルカプトエタノール、ｐＨ７．４）でカラムに結合させ、洗浄し、溶出緩衝液Ｂ（２０ｍＭのリン酸緩衝液、５００ｍＭのイミダゾール、５００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＰＭＳＦおよびベータ－メルカプトエタノール、ｐＨ７．４）の勾配で溶出させた。その後、ＰＤ－１０カラムを使用して、緩衝液を５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．４に変更した。図８に示すように、候補の発現および精製を電気泳動により１２％ポリアクリルアミドゲル上で分析した。
【0292】
実施例５：ＨｍｆＨオキシダーゼによる２，４－ＨＭＦからの２，４－ＦＤＣＡの産生
表４に記載される酵素候補物による２，４－ＨＭＦからの２，４－ＦＤＣＡ産生は、約１００μｇの精製されたＨｍｆＨオキシダーゼ候補物を、およそ１ｍＭの４－ＨＭＦを含有する実施例３からの１ｍＬの反応容器（市販のホスファターゼを使用）とインキュベートすることによってインビトロで実証した。反応物を、３０℃で１６時間インキュベートし、最初と最終試料との両方をＨＰＬＣ－ＤＡＤにより分析した。試料をＨＰＬＣ－ＤＡＤに注入し、２，４－ＦＤＣＡおよびその中間体の産生をＧＣ－ＭＳによって確認した。
表４に記載される酵素候補物による２，４－ＨＭＦからの２，４－ＦＤＣＡ産生は、約１００μｇの精製されたＨｍｆＨオキシダーゼ候補物を、およそ１ｍＭの４－ＨＭＦを含有する実施例３からの１ｍＬの反応容器（市販のホスファターゼを使用）とインキュベートすることによってインビトロで実証した。反応物を、３０℃で１６時間インキュベートし、最初と最終試料との両方をＨＰＬＣ－ＤＡＤにより分析した。試料をＨＰＬＣ－ＤＡＤに注入し、２，４－ＦＤＣＡおよびその中間体の産生をＧＣ－ＭＳによって確認した。
【0293】
２，４－ＦＤＣＡの定量的分析を、Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ－８７Ｈ Ｂｉｏｒａｄカラム（３００×７．８ｍｍ）を備えたＨＰＬＣ－ＤＡＤ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００）を使用して実行した。カラムを５０℃に維持した。使用した移動相は、アイソクラティック勾配モードを有する流量０．６ｍＬ／分の５ｍＭのＨ２ＳＯ４溶液であった。分子を２４５ｎｍで検出した。
【0294】
ＧＣ－ＭＳ同定については、ｐＨを２～３に減少させるために６ＭのＨＣｌを加えることにより、最初と最終の試料を停止した。産生物を、酢酸エチルを使用して液液抽出し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させて、微量の水を除去した。次に、抽出された物質を、スピードバック（ｓｐｅｅｄｖａｃ）で蒸発させ、ビス－（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミドを用いて６０℃で２時間誘導体化した。試料を、四重極質量検出器（ＩＳＱ、Ｔｈｅｒｍｏ社）と連結されたＨＰ－５ＭＳカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ社、３０ｍ×０．２５ｍｍ ＩＤ、０．２５ｕｍ膜厚）を備えるガスクロマトグラフに注入した。オーブンプログラムは、１１０℃で２分間開始され、２０℃／分のランプを３００℃まで増加させて、そこで３分間保持した。ヘリウムを１．２ｍＬ／分の流量でキャリアガスとして使用した。２，４－ＦＤＣＡは、それらの質量スペクトルを文献のものと比較することによって、同定した。（参考文献：Ｃａｒｒｏ，Ｊｕａｎ，ｅｔ ａｌ．“５－ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌｆｕｒｆｕｒａｌ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｂｙ ｆｕｎｇａｌ ａｒｙｌ－ａｌｃｏｈｏｌ ｏｘｉｄａｓｅ ａｎｄ ｕｎｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｅｒｏｘｙｇｅｎａｓｅ．”Ｔｈｅ ＦＥＢＳ ｊｏｕｒｎａｌ ２８２．１６（２０１５）：３２１８－３２２９．）４－ホルミルフラン－２－カルボキシレート（２，４－ＦＦＣＡ）およびフラン－２，４－ジカルボアルデヒド（２，４－ＤＦＦ）もまた、それらの質量スペクトルによって同定された。
【0295】
表１０および図９、図１０、および図１１に示すように、４－ＨＭＦの２，４－ＦＤＣＡへの変換は、４－ＨＭＦオキシダーゼ、特に２，４－ＨＭＦから２，４－ＦＤＣＡへの完全変換が可能な酵素ＨｍｆＨ７を用いて首尾よく実証された。
【0296】
図９（上パネル）は、ＨｍｆＨ１のクロマトグラムを示し、図９（中パネル）は、ＨｍｆＨ６のクロマトグラムを示し、図９（下パネル）は、ＨｍｆＨ７のクロマトグラムを示す。図１０（上パネル）は、ＧＣ－ＭＳで取得された産生物の相対存在量、およびシリル化２，４－ＦＤＣＡの質量スペクトル（下パネル）を示す（図１１）。
【0297】
（表１０）１６時間のインキュベーション後の４－ＨＭＦオキシダーゼ候補による４－ＨＭＦからの２，４ ＦＤＣＡ産生。反応中間体４－ホルミルフラン－２－カルボキシレート（２，４－ＦＦＣＡ）およびフラン－２，４－ジカルボアルデヒド（２，４－ＤＦＦ）も特定され、定量されたａ。
ａ陰性対照反応物は、同様のアッセイ条件下で実行されたが、ＨＭＦ－オキシダーゼ酵素は存在しなかった。
【0298】
実施例６：４－ＨＭＦからの２，４－フランジメタノールの産生－反応Ｃ
精製酵素を、実施例１に記載されるように産生した。
精製酵素を、実施例１に記載されるように産生した。
【0299】
表５に記載される酵素候補による、４－ＨＭＦからの２，４－フランジメタノールの産生は、およそ２０μｇの精製酵素候補を、１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）中で０．５ｍＭのＮＡＤ（Ｐ）ＨまたはＮＡＤＨとともにインキュベートすることによってインビトロで実証した。実施例３に示されるように得られた０．５ｍＭの４－ＨＭＦの添加によって反応を開始した。ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの減少を、ＵＶ－Ｖｉｓ分光光度計（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて、３７℃、４０分間、３４０ｎｍで監視した。産生物の形成はまた、ＨＰＬＣおよびＧＣ－ＭＳ分析によって確認された（データは示さず）。酵素または基質（４－ＨＭＦ）を含まない反応容器を、陰性対照として使用した。
【0300】
図１２に示されるように、酵素候補ＤＨ１、ＤＨ２、およびＤＨ６は、ＮＡＤ（Ｐ）ＨのＮＡＤ（Ｐ）＋への酸化によって測定される２，４－ＨＭＦの２，４－フランジメタノールへの還元を促進した。
【0301】
実施例７：４－ＨＭＦからのフラン－２，４－ジカルボアルデヒドの産生－反応Ｄ
精製酵素を、実施例１に記載されるように産生した。表３に記載される酵素候補による４－ＨＭＦからのフラン－２，４－ジカルボアルデヒド産生は、およそ２０μｇの精製酵素候補を１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）中で０．５ｍＭのＮＡＤ（Ｐ）＋またはＮＡＤ＋とともにインキュベートすることによってインビトロで実証した。実施例３に示されるように得られた０．５ｍＭの４－ＨＭＦの添加によって反応を開始した。ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの増加を、ＵＶ－Ｖｉｓ分光光度計（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて、３７℃、４０分間、３４０ｎｍで監視した。産生物の形成はまた、ＨＰＬＣおよびＧＣ－ＭＳ分析によって確認された（データは示さず）。酵素または基質（４－ＨＭＦ）を含まない反応容器を、陰性対照として使用した。
精製酵素を、実施例１に記載されるように産生した。表３に記載される酵素候補による４－ＨＭＦからのフラン－２，４－ジカルボアルデヒド産生は、およそ２０μｇの精製酵素候補を１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）中で０．５ｍＭのＮＡＤ（Ｐ）＋またはＮＡＤ＋とともにインキュベートすることによってインビトロで実証した。実施例３に示されるように得られた０．５ｍＭの４－ＨＭＦの添加によって反応を開始した。ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの増加を、ＵＶ－Ｖｉｓ分光光度計（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて、３７℃、４０分間、３４０ｎｍで監視した。産生物の形成はまた、ＨＰＬＣおよびＧＣ－ＭＳ分析によって確認された（データは示さず）。酵素または基質（４－ＨＭＦ）を含まない反応容器を、陰性対照として使用した。
【0302】
酵素ＤＨ２ついて示されるように、選択されたデヒドロゲナーゼは、４－ＨＭＦをインビトロでフラン－２，４－ジカルボアルデヒドに酸化することができる。図１３に示すデータは、ベースラインシグナルの減算後にプロットされており、酵素ＤＨ２を使用した場合の吸光度の増加ならびにその結果としての、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの還元および２，４－ＨＭＦのフラン－２，４－ジカルボアルデヒドへの酸化を強調している。
【0303】
実施例８：２，４－ＨＭＦからの４－（ヒドロキシメチル）フロン酸の産生－反応Ｅ
精製アルデヒドデヒドロゲナーゼ酵素を、実施例１に記載されるように産生した。表３に記載されるアルデヒドデヒドロゲナーゼ候補による４－ＨＭＦからの４－（ヒドロキシメチル）フロン酸産生は、およそ２０μｇの精製酵素候補を１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）中で０．５ｍＭのＮＡＤ（Ｐ）＋またはＮＡＤ＋とともにインキュベートすることによってインビトロで実証した。実施例３に示されるように得られた０．５ｍＭの４－ＨＭＦの添加によって反応を開始した。ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの増加を、ＵＶ－Ｖｉｓ分光光度計（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて、３７℃、４０分間、３４０ｎｍで監視した。産生物の形成はまた、ＨＰＬＣおよびＧＣ－ＭＳ分析によって確認された（データは示さず）。酵素または基質（４－ＨＭＦ）を含まない反応容器を、陰性対照として使用した。
精製アルデヒドデヒドロゲナーゼ酵素を、実施例１に記載されるように産生した。表３に記載されるアルデヒドデヒドロゲナーゼ候補による４－ＨＭＦからの４－（ヒドロキシメチル）フロン酸産生は、およそ２０μｇの精製酵素候補を１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）中で０．５ｍＭのＮＡＤ（Ｐ）＋またはＮＡＤ＋とともにインキュベートすることによってインビトロで実証した。実施例３に示されるように得られた０．５ｍＭの４－ＨＭＦの添加によって反応を開始した。ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの増加を、ＵＶ－Ｖｉｓ分光光度計（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて、３７℃、４０分間、３４０ｎｍで監視した。産生物の形成はまた、ＨＰＬＣおよびＧＣ－ＭＳ分析によって確認された（データは示さず）。酵素または基質（４－ＨＭＦ）を含まない反応容器を、陰性対照として使用した。
【0304】
酵素ＤＨ８、ＤＨ９、ＤＨ１０、およびＤＨ１１について代表的に示されるように、選択されたアルデヒドデヒドロゲナーゼは、インビトロで４－ＨＭＦを４－（ヒドロキシメチル）フロン酸に酸化することができる（図１４）。図１４に示すデータは、ベースラインシグナルの減算後にプロットされおり、評価の高いアルデヒドデヒドロゲナーゼを使用した場合の吸光度の増加ならびにその結果としてのＮＡＤ（Ｐ）Ｈの還元および２，４－ＨＭＦの４－（ヒドロキシメチル）フロン酸への酸化を強調している。
【0305】
実施例９：４－ＨＭＦからの２，４－ＦＤＣＡの産生のためのワンポット反応
精製アルデヒドデヒドロゲナーゼ酵素およびアルコールデヒドロゲナーゼ酵素を、実施例１に記載されるように産生した。代表的なアルデヒドデヒドロゲナーゼとしてＤＨ８、および代表的なアルコールデヒドロゲナーゼとしてＤＨ６を使用して、４－ＨＭＦからの２，４－ＦＤＣＡ産生についてワンポット酸化反応を実行した。
精製アルデヒドデヒドロゲナーゼ酵素およびアルコールデヒドロゲナーゼ酵素を、実施例１に記載されるように産生した。代表的なアルデヒドデヒドロゲナーゼとしてＤＨ８、および代表的なアルコールデヒドロゲナーゼとしてＤＨ６を使用して、４－ＨＭＦからの２，４－ＦＤＣＡ産生についてワンポット酸化反応を実行した。
【0306】
反応を実施するために、０．５ｍＭの２，４－ＨＭＦおよび１ｍＭのＮＡＤ（Ｐ）Ｈを含有する実施例３からの反応混合物２ｍＬに、２０ｕＭの精製酵素候補ＤＨ８およびＤＨ６を添加した。陽性対照反応物を、表１１に示すように調製した。２つの陰性対照を１つは酵素なしで、もう１つは基質なしで調製した。反応物を、３０℃で１６時間インキュベートし、最初と最終試料の両方をＨＰＬＣ－ＤＡＤにより分析した。試料をＨＰＬＣ－ＤＡＤに注入し、以下の方法を使用してＧＣ－ＭＳで２，４－ＦＤＣＡの産生を確認した。
【0307】
２，４－ＦＤＣＡの定量的分析を、Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ－８７Ｈ Ｂｉｏｒａｄカラム（３００×７．８ｍｍ）を備えたＨＰＬＣ－ＤＡＤ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００）を使用して実行した。カラムを５０℃に維持した。使用した移動相は、アイソクラティック勾配モードを有する流量０．６ｍＬ／分の５ｍＭのＨ２ＳＯ４溶液であった。分子を２４５ｎｍで検出した。
【0308】
ＧＣ－ＭＳ同定については、ｐＨを２～３に減少させるために６ＭのＨＣｌを加えることにより、最初と最終の試料を停止した。産生物を、酢酸エチルを使用して液液抽出し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させて、微量の水を除去した。次いで、抽出された物質を、スピードバックで蒸発させ、ビス－（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミドを用いて６０℃で２時間誘導体化した。試料を、四重極質量検出器（ＩＳＱ、Ｔｈｅｒｍｏ社）と連結されたＨＰ－５ＭＳカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ社、３０ｍ×０．２５ｍｍ ＩＤ、０．２５ｕｍ膜厚）を備えるガスクロマトグラフに注入した。オーブンプログラムは、１１０℃で２分間開始され、２０℃／分のランプを３００℃まで増加させて、そこで３分間保持した。ヘリウムを１．２ｍＬ／分の流量でキャリアガスとして使用した。２，４－ＦＤＣＡは、それらの質量スペクトルを文献のものと比較することによって、同定した。（参考文献：Ｃａｒｒｏ，Ｊｕａｎ，ｅｔ ａｌ．“５－ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌｆｕｒｆｕｒａｌ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｂｙ ｆｕｎｇａｌ ａｒｙｌ－ａｌｃｏｈｏｌ ｏｘｉｄａｓｅ ａｎｄ ｕｎｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｅｒｏｘｙｇｅｎａｓｅ．”Ｔｈｅ ＦＥＢＳ ｊｏｕｒｎａｌ ２８２．１６（２０１５）：３２１８－３２２９．）４－ホルミルフラン－２－カルボキシレート（２，４－ＦＦＣＡ）およびフラン－２，４－ジカルボアルデヒド（２，４－ＤＦＦ）もまた、それらの質量スペクトルによって同定された。
【0309】
表１１および図１５（中パネル）に示すように、４－ＨＭＦの２，４－ＦＤＣＡへの変換は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＤＨ８）およびアルコールデヒドロゲナーゼ（ＤＨ６）の相乗作用／組み合わせを用いて首尾よく実証された。
【0310】
（表１１）１６時間のインキュベーション後のアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＤＨ８）およびアルコールデヒドロゲナーゼ（ＤＨ６）の相乗作用／組み合わせによる、４－ＨＭＦからの２，４ ＦＤＣＡ産生（２，４ ＦＤＣＡピーク面積）
【0311】
実施例１０．グルコースからの２，４－ＦＤＣＡのインビボ産生
ＯＸＢ２０プロモーターの制御下にあるＭｆｎＢ１遺伝子（表１）を含有するプラスミドを、ｐＥＴ２８ａ骨格内に構築した。ＯＸＢ２０プロモーターの制御下にある２つの４－ＨＭＦオキシダーゼ遺伝子（ＨｍｆＨ６およびＨｍｆＨ７（表４））を含有する第２のプラスミドを、ｐＺＳ＊１３骨格中に構築した。プラスミドは、インフュージョン市販キットを使用して構築され、配列決定によって確認された。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２株ＭＧ１６５５（Ｆ－、λ－、ｒｐｈ－１、ｉｌｖＧ－、ｒｆｂ－５０、ΔｇａｐＡ：：ｇａｐＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ５９９３１）、ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ、ΔａｒａＦＧＨ、ΔｘｙｌＦＧＨ、ΔｆｕｃＯ）を産生宿主として使用した。
ＯＸＢ２０プロモーターの制御下にあるＭｆｎＢ１遺伝子（表１）を含有するプラスミドを、ｐＥＴ２８ａ骨格内に構築した。ＯＸＢ２０プロモーターの制御下にある２つの４－ＨＭＦオキシダーゼ遺伝子（ＨｍｆＨ６およびＨｍｆＨ７（表４））を含有する第２のプラスミドを、ｐＺＳ＊１３骨格中に構築した。プラスミドは、インフュージョン市販キットを使用して構築され、配列決定によって確認された。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２株ＭＧ１６５５（Ｆ－、λ－、ｒｐｈ－１、ｉｌｖＧ－、ｒｆｂ－５０、ΔｇａｐＡ：：ｇａｐＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ５９９３１）、ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ、ΔａｒａＦＧＨ、ΔｘｙｌＦＧＨ、ΔｆｕｃＯ）を産生宿主として使用した。
【0312】
グルコースからの２，４－ＦＤＣＡのインビボ産生は、以下によって構成される定義された培地を使用して、３回の振とうフラスコ発光で評価した。２．２ｇ．Ｌ－１ ＫＨ２ＰＯ４、９．４ｇ．Ｌ－１ Ｋ２ＨＰＯ４、１．３ｇ．Ｌ－１（ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｍｇ．Ｌ－１ チアミン、３２０ｍｇ．Ｌ－１ ＥＤＴＡ－ＮａＯＨ、２ｍｇ．Ｌ－１ ＣｏＣｌ２．６Ｈ２Ｏ、１０ｍｇ．Ｌ－１ ＭｎＳＯ４．Ｈ２Ｏ、５ｍｇ．Ｌ－１ ＣｕＳＯ４．５Ｈ２Ｏ、２ｍｇ．Ｌ－１ Ｈ３ＢＯ３、２ｍｇ．Ｌ－１ Ｎａ２ＭｏＯ４．２Ｈ２Ｏ、５４ｍｇ．Ｌ－１ ＺｎＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、１ｍｇ．Ｌ－１ ＮｉＳＯ４．６Ｈ２Ｏ、１００ｍｇ．Ｌ－１ クエン酸Ｆｅ（ＩＩＩ）、１００ｍｇ．Ｌ－１ ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ、０．３ｇ．Ｌ－１ ＭｇＳＯ４．Ｈ２Ｏ。炭素源は１０ｇ／Ｌのグルコースによって提供され、窒素源として硫酸窒素を使用した。三角フラスコに組換え株を０．１の初期ＯＤまで接種し、３７℃、２２５ｒｐｍで４８時間インキュベートした。ＨＰＬＣによる４８時間の上清の分析は、１４±２ｍｇ／Ｌの２，４－ＦＤＣＡの産生を示した（図１６）。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【配列表】
【国際調査報告】