特表 2022-523543 二機能性融合タンパク質及びその医薬的使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-04-25

(54)【発明の名称】二機能性融合タンパク質及びその医薬的使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/62 20060101AFI20220418BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20220418BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20220418BHJP

   C12N 15/11 20060101ALI20220418BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20220418BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20220418BHJP

   A61K 38/16 20060101ALI20220418BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20220418BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20220418BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20220418BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20220418BHJP

   A61K 47/55 20170101ALI20220418BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20220418BHJP

   A61P 31/12 20060101ALI20220418BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20220418BHJP

【ＦＩ】

C12N15/62 Z ZNA

C12N15/13

C12N15/12

C12N15/11 Z

C12N15/63 Z

C07K19/00

A61K38/16

A61K39/395 D

A61K31/7088

A61K48/00

A61P35/00

A61K47/55

A61P31/04

A61P31/12

A61P35/02

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021551978

(86)(22)【出願日】2020-03-05

(85)【翻訳文提出日】2021-10-28

(86)【国際出願番号】 CN2020077907

(87)【国際公開番号】W WO2020177733

(87)【国際公開日】2020-09-10

(31)【優先権主張番号】201910168433.0

(32)【優先日】2019-03-06

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(31)【優先権主張番号】201910437477.9

(32)【優先日】2019-05-24

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】510166892

【氏名又は名称】ジエンス ヘンルイ メデイシンカンパニー リミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＪＩＡＮＧＳＵ ＨＥＮＧＲＵＩ ＭＥＤＩＣＩＮＥ ＣＯ．，ＬＴＤ．

(71)【出願人】

【識別番号】508209602

【氏名又は名称】シャンハイ ヘンルイ ファーマスーティカル カンパニー リミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＳＨＡＮＧＨＡＩ ＨＥＮＧＲＵＩ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＣＯ．， ＬＴＤ．

(74)【代理人】

【識別番号】100147485

【弁理士】

【氏名又は名称】杉村 憲司

(74)【代理人】

【識別番号】230118913

【弁護士】

【氏名又は名称】杉村 光嗣

(74)【代理人】

【識別番号】100181272

【弁理士】

【氏名又は名称】神 紘一郎

(72)【発明者】

【氏名】グ シャオリン

(72)【発明者】

【氏名】イェ シン

(72)【発明者】

【氏名】フー ビン

(72)【発明者】

【氏名】グォ フー

(72)【発明者】

【氏名】タオ ウェイカン

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

4C085

4C086

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C076AA95

4C076CC07

4C076CC27

4C076CC41

4C076EE41

4C076EE59

4C076FF70

4C084AA02

4C084AA07

4C084AA13

4C084BA02

4C084BA41

4C084BA44

4C084CA17

4C084DA39

4C084DA41

4C084NA05

4C084NA13

4C084NA14

4C084ZB26

4C084ZB27

4C084ZB33

4C084ZB35

4C085AA13

4C085AA14

4C085AA16

4C085AA21

4C085BB11

4C085BB31

4C085CC22

4C085DD62

4C085EE01

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA04

4C086NA05

4C086NA13

4C086NA14

4C086ZB26

4C086ZB27

4C086ZB33

4C086ZB35

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA76

4H045EA28

4H045FA74

(57)【要約】

二機能性融合タンパク質及びその医薬的使用が提供される。具体的には、ＳＩＲＰγペプチドバリアントと抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体とを含む二機能性融合タンパク質、ＳＩＲＰγペプチドバリアント及びそれらの医薬的使用が提供される。二機能性融合タンパク質は、ＰＤ－Ｌ１及びＣＤ４７に特異的に結合し、ＰＤ－Ｌ１又はＣＤ４７のそれらの受容体又はリガンドへの結合を阻害することができる。さらに、二機能性融合タンパク質の調製及び応用、並びにがん及び免疫関連疾患の治療も提供される。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＳＩＲＰγペプチドバリアントと抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体とを含む二機能性融合タンパク質であって、前記ＳＩＲＰγペプチドバリアントがリンカーを介して直接又は間接的に前記抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体のポリペプチド鎖に連結しており、
前記ＳＩＲＰγペプチドバリアントが、配列番号２０に示される野生型ＳＩＲＰγペプチドに対してＮ５１位に置換変異を有するＳＩＲＰγペプチドバリアントであり、好ましくは、前記リンカーが、配列番号８９～９６、（ＧＧＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＥＳ）ｎ及び（ＧＫＰＧＳ）ｎ（ｎは２～７の整数）からなる群のいずれか１つから選択される、二機能性融合タンパク質。

【請求項2】

請求項１に記載の二機能性融合タンパク質であって、前記ＳＩＲＰγペプチドバリアントのカルボキシル末端が前記抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖可変領域のアミノ末端に連結しているか、
又は前記ＳＩＲＰγペプチドバリアントのカルボキシル末端が前記抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体の軽鎖可変領域のアミノ末端に連結しているか、
又は前記抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖のカルボキシル末端が前記ＳＩＲＰγペプチドバリアントのアミノ末端に連結しているか、
又は前記抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体の軽鎖のカルボキシル末端が前記ＳＩＲＰγペプチドバリアントのアミノ末端に連結している、二機能性融合タンパク質。

【請求項3】

請求項１又は２に記載の二機能性融合タンパク質であって、前記ＳＩＲＰγペプチドバリアントが、野生型ＳＩＲＰγペプチドに対してＫ１９、Ｋ５３、Ｎ１０１、Ｌ３１、Ｑ５２、Ｅ５４、Ｈ５６、Ｎ７０、Ｍ７２及びＭ１１２からなる群より選択される１つ又は複数の位置にアミノ酸置換（単数又は複数）をさらに含む、二機能性融合タンパク質。

【請求項4】

請求項１～３のいずれか一項に記載の二機能性融合タンパク質であって、Ｎ５１位に置換変異を有する前記ＳＩＲＰγペプチドバリアントが赤血球表面上のＣＤ４７と実質的に結合せず、好ましくは、Ｎ５１位に置換変異を有する前記ＳＩＲＰγペプチドバリアントがＮ５１Ｆ、Ｎ５１Ｉ、Ｎ５１Ｌ、Ｎ５１Ｍ又はＮ５１Ｖ置換変異を含む、二機能性融合タンパク質。

【請求項5】

請求項１～３のいずれか一項に記載の二機能性融合タンパク質であって、前記ＳＩＲＰγペプチドバリアントが、配列番号２０に示される野生型ＳＩＲＰγペプチドに対するＮ５１Ｒ置換変異を含む、二機能性融合タンパク質。

【請求項6】

請求項１～５のいずれか一項に記載の二機能性融合タンパク質であって、前記ＳＩＲＰγペプチドバリアントが、配列番号２０に示される野生型ＳＩＲＰγペプチドに対するＫ１９Ｅ、Ｋ５３Ｇ及びＮ１０１Ｄ置換変異を含み；
好ましくは、前記ＳＩＲＰγペプチドバリアントが、配列番号２０に示される野生型ＳＩＲＰγペプチドに対するＫ１９Ｅ、Ｎ５１Ｖ、Ｑ５２Ｓ、Ｋ５３Ｇ、Ｅ５４Ｒ、Ｍ７２Ｋ及びＮ１０１Ｄ変異を含むか；
前記ＳＩＲＰγペプチドバリアントが、配列番号２０に示される野生型ＳＩＲＰγペプチドに対するＫ１９Ｅ、Ｎ５１Ｍ、Ｑ５２Ｓ、Ｋ５３Ｇ、Ｅ５４Ｒ、Ｍ７２Ｋ及びＮ１０１Ｄ変異を含む、二機能性融合タンパク質。

【請求項7】

請求項６に記載の二機能性融合タンパク質であって、前記ＳＩＲＰγペプチドバリアントがＭ６、Ｖ２７、Ｌ３０、Ｖ３３、Ｖ３６、Ｌ３７、Ｖ４２、Ｅ４７、Ｌ６６、Ｔ６７、Ｖ９２及びＳ９８からなる群より選択される１つ又は複数の位置にアミノ酸置換（単数又は複数）をさらに含む、二機能性融合タンパク質。

【請求項8】

請求項６に記載の二機能性融合タンパク質であって、前記ＳＩＲＰγペプチドバリアントが配列番号１に示される通りである、二機能性融合タンパク質。

【請求項9】

請求項６に記載の二機能性融合タンパク質であって、前記ＳＩＲＰγペプチドバリアントが配列番号２に示される通りである、二機能性融合タンパク質。

【請求項10】

請求項６に記載の二機能性融合タンパク質であって、前記ＳＩＲＰγペプチドバリアントが配列番号２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９及び４０からなる群のいずれか１つに示される通りである、二機能性融合タンパク質。

【請求項11】

請求項１～１０のいずれか一項に記載の二機能性融合タンパク質であって、前記抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体が、アベルマブ、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、ＪＳ－００３、ＣＳ－１００１、ＬＹ－３３０００５４、ＫＤ－０３３、ＣＫ－３０１、ＣＣＸ－４５０３、ＣＸ－０７２、ＫＮ－０３５、ＨＲＰ０００５２、ＨＲＰ０００４９、ＦＡＺ－０５３、ＧＲ－１４０５、ＫＤ－００５、ＨＬＸ－２０、ＫＬ－Ａ１６７、ＣＢＴ－５０２、ＳＴＩ－Ａ１０１４、ＲＥＭＤ－２９０、ＢＧＢ－Ａ３３３、ＢＣＤ－１３５及びＭＣＬＡ－１４５からなる群より選択される、二機能性融合タンパク質。

【請求項12】

請求項１～１０のいずれか一項に記載の二機能性融合タンパク質であって、前記抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体が重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含み、
前記重鎖可変領域が、配列番号６に示される重鎖可変領域の配列と同じ配列（単数又は複数）のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３領域を含み、
前記軽鎖可変領域が、配列番号７に示される軽鎖可変領域の配列と同じ配列（単数又は複数）のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３領域を含むか；
前記重鎖可変領域が、配列番号８に示される重鎖可変領域の配列と同じ配列（単数又は複数）のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３領域を含み、
前記軽鎖可変領域が、配列番号９に示される軽鎖可変領域の配列と同じ配列（単数又は複数）のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３領域を含むか；
前記重鎖可変領域が、配列番号８に示される重鎖可変領域の配列と同じ配列（単数又は複数）のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３領域を含み、
前記軽鎖可変領域が、配列番号１１３に示される軽鎖可変領域の配列と同じ配列（単数又は複数）のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３領域を含むか；
好ましくは、
前記重鎖可変領域が、配列番号９７、９８及び９９にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３領域を含み、
前記軽鎖可変領域が、配列番号１００、１０１及び１０２にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３領域を含むか；
前記重鎖可変領域が、配列番号１０３、１０４及び１０５にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３領域を含み、
前記軽鎖可変領域が、配列番号１０６、１０７及び１０８にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３領域を含むか；
前記重鎖可変領域が、配列番号１０３、１０４及び１０５にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３領域を含み、
前記軽鎖可変領域が、配列番号１０６、１１２及び１０８にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３領域を含む、二機能性融合タンパク質。

【請求項13】

請求項１２に記載の二機能性融合タンパク質であって、前記抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体が重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含み、
前記重鎖可変領域が配列番号６に示される通りであり、
前記軽鎖可変領域が配列番号７に示される通りであるか；
前記重鎖可変領域が配列番号８に示される通りであり、
前記軽鎖可変領域が配列番号１１３に示される通りであるか；
前記重鎖可変領域が配列番号８に示される通りであり、
前記軽鎖可変領域が配列番号９に示される通りである、二機能性融合タンパク質。

【請求項14】

請求項１２又は１３に記載の二機能性融合タンパク質であって、前記抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体が重鎖定常領域と軽鎖定常領域とをさらに含み、好ましくは、前記重鎖定常領域が配列番号１０又は１１に示される通りであり、前記軽鎖定常領域が配列番号１２に示される通りである、二機能性融合タンパク質。

【請求項15】

請求項１４に記載の二機能性融合タンパク質であって、前記抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体が重鎖と軽鎖とを含み、前記重鎖が配列番号１３又は１５に示される通りであり、前記軽鎖が配列番号１４に示される通りであるか；
前記重鎖が配列番号１６又は１８に示される通りであり、前記軽鎖が配列番号１７又は１１１に示される通りである、二機能性融合タンパク質。

【請求項16】

請求項１５に記載の二機能性融合タンパク質であって、第１ポリペプチドと第２ポリペプチドとを含み、
前記第１ポリペプチドが配列番号４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１及び６２からなる群のいずれか１つに示されるポリペプチドより選択され、前記第２ポリペプチドが配列番号１４に示されるポリペプチドから選択されるか；
前記第１ポリペプチドが配列番号６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２及び１０９からなる群のいずれか１つに示されるポリペプチドより選択され、前記第２ポリペプチドが配列番号１７に示されるポリペプチドから選択されるか；
前記第１ポリペプチドが配列番号６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２及び１０９からなる群のいずれか１つに示されるポリペプチドより選択され、前記第２ポリペプチドが配列番号１１１に示されるポリペプチドから選択される、二機能性融合タンパク質。

【請求項17】

ＳＩＲＰγペプチドバリアントであって、配列番号２０に示される野生型ＳＩＲＰγペプチドに対してＮ５１位に置換変異を有するＳＩＲＰγペプチドバリアントである、ＳＩＲＰγペプチドバリアント。

【請求項18】

請求項１７に記載のＳＩＲＰγペプチドバリアントであって、野生型ＳＩＲＰγペプチドに対してＫ１９、Ｋ５３、Ｎ１０１、Ｌ３１、Ｑ５２、Ｅ５４、Ｈ５６、Ｎ７０、Ｍ７２及びＭ１１２からなる群より選択される１つ又は複数の位置にアミノ酸置換（単数又は複数）をさらに含む、ＳＩＲＰγペプチドバリアント。

【請求項19】

請求項１７又は１８に記載のＳＩＲＰγペプチドバリアントであって、Ｎ５１位に置換変異を有する前記ＳＩＲＰγペプチドバリアントが赤血球表面上のＣＤ４７と実質的に結合せず、好ましくは、Ｎ５１位に置換変異を有する前記ＳＩＲＰγペプチドバリアントがＮ５１Ｆ、Ｎ５１Ｉ、Ｎ５１Ｌ、Ｎ５１Ｍ又はＮ５１Ｖ置換変異を含む、ＳＩＲＰγペプチドバリアント。

【請求項20】

請求項１７又は１８に記載のＳＩＲＰγペプチドバリアントであって、配列番号２０に示される野生型ＳＩＲＰγペプチドに対するＮ５１Ｒ置換変異を含む、ＳＩＲＰγペプチドバリアント。

【請求項21】

請求項１７～２０のいずれか一項に記載のＳＩＲＰγペプチドバリアントであって、配列番号２０に示される野生型ＳＩＲＰγペプチドに対するＫ１９Ｅ、Ｋ５３Ｇ及びＮ１０１Ｄ置換変異を含む、ＳＩＲＰγペプチドバリアント。

【請求項22】

請求項１７～２１のいずれか一項に記載のＳＩＲＰγペプチドバリアントであって、Ｍ６、Ｖ２７、Ｌ３０、Ｖ３３、Ｖ３６、Ｌ３７、Ｖ４２、Ｅ４７、Ｌ６６、Ｔ６７、Ｖ９２及びＳ９８からなる群より選択される１つ又は複数の位置にアミノ酸置換（単数又は複数）をさらに含む、ＳＩＲＰγペプチドバリアント。

【請求項23】

請求項２１に記載のＳＩＲＰγペプチドバリアントであって、配列番号１に示される通りである、ＳＩＲＰγペプチドバリアント。

【請求項24】

請求項２１に記載のＳＩＲＰγペプチドバリアントであって、配列番号２に示される通りである、ＳＩＲＰγペプチドバリアント。

【請求項25】

請求項２１に記載のＳＩＲＰγペプチドバリアントであって、配列番号２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９及び４０からなる群に示される通りである、ＳＩＲＰγペプチドバリアント。

【請求項26】

ＳＩＲＰγペプチドバリアントと抗体Ｆｃフラグメントとを含む融合タンパク質であって、前記ＳＩＲＰγペプチドバリアントが請求項１７～２５のいずれか一項に記載のＳＩＲＰγペプチドバリアントであり、好ましくは、前記抗体Ｆｃフラグメントがヒト抗体Ｆｃフラグメントであり、より好ましくは、前記抗体Ｆｃフラグメントの配列が配列番号１０又は１１に示される重鎖定常領域のＦｃフラグメント配列と同じであり、最も好ましくは、前記融合タンパク質のアミノ酸配列が配列番号８６、１１０、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０及び１３１からなる群に示される通りである、融合タンパク質。

【請求項27】

軽鎖可変領域と重鎖可変領域とを含む抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体であって、前記重鎖可変領域が配列番号１０３、１０４及び１０５にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３領域を含み、前記軽鎖可変領域が配列番号１０６、１１２及び１０８にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３領域を含む、抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体。

【請求項28】

前記重鎖可変領域が配列番号８に示されており、前記軽鎖可変領域が配列番号１１３に示されている、請求項２７に記載の抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体。

【請求項29】

請求項２８に記載の抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体であって、前記抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体が抗体定常領域をさらに含む全長抗体であり、好ましくは、前記抗体定常領域の重鎖定常領域がヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４の定常領域から選択され、前記抗体定常領域の軽鎖定常領域がヒト抗体κ鎖及びλ鎖の定常領域から選択され、より好ましくは、前記全長抗体が、配列番号１０又は１１に示される重鎖定常領域と、配列番号１２に示される軽鎖定常領域とを含む、抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体。

【請求項30】

請求項２８に記載の抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体であって、配列番号１６又は１８に示される重鎖と、配列番号１１１に示される軽鎖とを含む、抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体。

【請求項31】

治療有効量の請求項１～１６のいずれか一項に記載の二機能性融合タンパク質又は請求項１７～２５のいずれか一項に記載のＳＩＲＰγペプチドバリアント又は請求項２６に記載の融合タンパク質又は請求項２７～３０のいずれか一項に記載の抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体と、１つ若しくは複数の薬学的に許容される担体、希釈剤、緩衝剤又は賦形剤とを含む医薬組成物。

【請求項32】

請求項１～１６のいずれか一項に記載の二機能性融合タンパク質又は請求項１７～２５のいずれか一項に記載のＳＩＲＰγペプチドバリアント又は請求項２６に記載の融合タンパク質又は請求項２７～３０のいずれか一項に記載の抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体をコードする単離された核酸分子。

【請求項33】

請求項３２に記載の単離された核酸分子を含む組換えベクター。

【請求項34】

被験体の免疫抑制関連疾患を除去する方法であって、被験体に治療有効量の請求項１～１６のいずれか一項に記載の二機能性融合タンパク質又は請求項１７～２５のいずれか一項に記載のＳＩＲＰγペプチドバリアント又は請求項２６に記載の融合タンパク質又は請求項２７～３０のいずれか一項に記載の抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体又は請求項３１に記載の医薬組成物又は請求項３２に記載の単離された核酸分子を投与することを含む方法であり、好ましくは、前記治療有効量が、０．１～３０００ｍｇの請求項１～１６のいずれか一項に記載の二機能性融合タンパク質又は請求項１７～２５のいずれか一項に記載のＳＩＲＰγペプチドバリアント又は請求項２６に記載の融合タンパク質又は請求項２７～３０のいずれか一項に記載の抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体を含む前記組成物の単位用量である、方法。

【請求項35】

請求項３４に記載の被験体の免疫抑制関連疾患を除去する方法であって、前記免疫抑制関連疾患には以下が含まれる、方法：がん、細菌感染又はウイルス感染であって、好ましくは、前記がんには癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫及び白血病又はリンパ系悪性腫瘍が含まれ、より好ましくは、以下が含まれる：扁平上皮細胞癌、骨髄腫、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、頭頸部扁平上皮細胞癌、神経膠腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄球性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、原発性縦隔大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、Ｔ細胞／組織球豊富型大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄細胞白血病－１タンパク質、骨髄異形成症候群、消化器がん、卵巣がん、肝臓がん、リンパ芽球性白血病、リンパ球性白血病、大腸がん、子宮内膜がん、前立腺がん、甲状腺がん、黒色腫、軟骨肉腫、神経芽細胞腫、膵臓がん、多形性膠芽腫、骨がん、ユーイング肉腫、子宮頸がん、脳腫瘍、膀胱がん、乳がん、結腸がん、肝細胞がん、明細胞腎細胞がん、頭頸部がん、咽頭喉頭がん、肝胆道がん、中枢神経系がん、食道がん、悪性胸膜中皮腫、全身性軽鎖アミロイドーシス、リンパ形質細胞性リンパ腫、骨髄異形成症候群、骨髄異形成腫瘍、神経内分泌腫瘍、メルケル細胞腫、精巣がん及び皮膚がん。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、ＰＤ－Ｌ１とＣＤ４７とに特異的に結合する二機能性融合タンパク質、該二機能性融合タンパク質を含む医薬組成物及び抗がん剤としてのその使用に関する。

【背景技術】

【0002】

本明細書の記述は、本開示に関連する背景情報を提供するに過ぎず、必ずしも先行技術を構成するものではない。

【0003】

プログラム細胞死－ｌ（ＰＤ－ｌ）は、１９９２年に発見されたＴ細胞の表面に発現するタンパク質受容体であり、細胞アポトーシスのプロセスに関与している。ＰＤ－ｌはＣＤ２８ファミリーに属し、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ－４）と２３％のアミノ酸相同性を持つ。しかし、ＰＤ－ｌの発現は、ＣＴＬＡ－４とは異なり、主に活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞及び骨髄性細胞上である。ＰＤ－１には、それぞれＰＤ－Ｌ１とＰＤ－Ｌ２という２つのリガンドがある。ＰＤ－Ｌ１は、主にＴ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ及び樹状細胞（ＤＣ）に発現しており、細胞上の発現は活性化に伴ってアップレギュレートされる。ＰＤ－Ｌ２の発現は、主に活性化マクロファージ及び樹状細胞などの抗原提示細胞上に比較的限られている。

【0004】

ＰＤ－Ｌ１タンパク質の高発現は、乳がん、肺がん、胃がん、腸がん、腎臓がん、黒色腫などのヒト腫瘍組織で検出され、ＰＤ－Ｌ１の発現レベルが患者の臨床及び予後と密接に関連していることが新たな研究で明らかになった。ＰＤ－Ｌ１は、Ｔ細胞の増殖を抑制する第２シグナル経路の役割を果たしているため、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１の結合を遮断することは、腫瘍免疫療法の分野において非常に有望な新しい標的となっている。

【0005】

細胞表面タンパク質であるＣＤ４７は、急性骨髄性白血病、Ｂ細胞性非ホジキンリンパ腫の様々なサブタイプ及び多くのヒト固形腫瘍細胞を含む多くの腫瘍タイプで発現又は過剰発現している。ＣＤ４７とマクロファージ上のシグナル調節タンパク質α（ＳＩＲＰα）との結合は、腫瘍細胞の表面における「私を食べないで（ｄｏ ｎｏｔ ｅａｔ ｍｅ）」シグナルである。最近のデータによると、抗ＣＤ４７抗体は、免疫寛容マウスにおける効果的な抗腫瘍Ｔ細胞応答を改善するのにも役立つという。したがって、抗ＣＤ４７抗体は、自然免疫系及び適応免疫系を調節する新しいクラスの免疫チェックポイント阻害剤である。

【0006】

現在、ＣＤ４７の関連特許として、ＷＯ２０１６０６５３２９、ＷＯ２０１６１０９４１５、ＷＯ２０１４０８７２４８、ＷＯ２０１４０９３６７８、ＣＮ１０７８４９１４３Ａ、ＣＮ１０８３５００４８、ＣＮ１０６５３５９１４、ＷＯ２０１６０２３００１Ａ、ＣＮ１０７４５９５７８Ａ、ＣＮ２０１７１１０１６７９８９などがある。例えば、ＷＯ２０１６０２３００１Ａには、高親和性ＰＤ－１模倣ペプチドとＣＤ４７に特異的に結合する高親和性ＳＩＲＰ－αとを含む多特異性ＰＤ－１模倣ペプチド及びその使用が記載されている；ＣＮ１０７４５９５７８Ａには、ＣＤ４７とＰＤ－Ｌ１分子とを標的とするＳＩＲＰα変異体と抗ＰＤ－Ｌ１抗体とを含む組換え融合タンパク質が記載されている；ＣＮ２０１７１１０１６７９８．９には、ＳＩＲＰαの細胞外部分とＰＤ－１の細胞外部分とを含む多機能性融合タンパク質が開示されている。

【0007】

しかし、現在の前臨床試験及び臨床試験では、抗ＣＤ４７抗体、ＳＩＲＰα受容体タンパク質及び人工ＳＩＲＰα受容体タンパク質、抗ＳＩＲＰα抗体及び二重特異性抗体など、ＣＤ４７／ＳＩＲＰα相互作用に着目した治療法が多く、ＳＩＲＰγペプチドを含む多特異性融合タンパク質に関する報告はない。

【0008】

ＳＩＲＰγは、Ｔ細胞及び活性化ＮＫ細胞に発現しており、ＳＩＲＰαと比較して、ＳＩＲＰγは１０分の１の親和性でＣＤ４７と結合する。ＣＤ４７－ＳＩＲＰγ相互作用は、抗原提示細胞とＴ細胞の接触に関与するとともに、Ｔ細胞の活性化を共刺激し、Ｔ細胞の増殖を促進する（Ｐｉｃｃｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ２００５，１０５，２４２１－２４２７）。さらに、ＣＤ４７－ＳＩＲＰγ相互作用は、Ｔ細胞の経内皮移動にも関与している（Ｓｔｅｆａｎｉｓａｋｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ２００８，１１２，１２８０－１２８９）。

【発明の概要】

【0009】

本開示は、ＳＩＲＰγペプチドバリアントを含む二機能性融合タンパク質を提供するものである。野生型ＳＩＲＰγペプチドと比較して、ＳＩＲＰγペプチドバリアントは、ＣＤ４７に対する親和性が著しく向上している。

【0010】

いくつかの実施形態では、ＳＩＲＰγペプチドバリアントと抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体とを含む二機能性融合タンパク質であって、ＳＩＲＰγペプチドバリアントが抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体のポリペプチド鎖に連結しており、
当該ＳＩＲＰγペプチドバリアントが、配列番号２０に示される野生型ＳＩＲＰγペプチドに対してＮ５１位に置換変異を有するＳＩＲＰγペプチドバリアントである二機能性融合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、前述のＳＩＲＰγペプチドバリアントは、腫瘍細胞の表面上のＣＤ４７に結合する活性を有する。好ましくは、ＳＩＲＰγペプチドバリアントは、野生型ＳＩＲＰγペプチドよりも腫瘍細胞の表面上のＣＤ４７に結合する活性がより増強されている。

【0011】

いくつかの実施形態では、ヒトＳＩＲＰγペプチドバリアントと抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体とを含む二機能性融合タンパク質であって、ＳＩＲＰγペプチドバリアントが抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体のポリペプチド鎖に連結しており、
当該ＳＩＲＰγペプチドバリアントが、配列番号２０に示される野生型ＳＩＲＰγペプチドに対してＮ５１位に置換変異を有するＳＩＲＰγペプチドバリアントである二機能性融合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、前述のＳＩＲＰγペプチドバリアントは、腫瘍細胞の表面上のＣＤ４７に結合する活性を有する。好ましくは、ＳＩＲＰγペプチドバリアントは、野生型ＳＩＲＰγペプチドよりも腫瘍細胞の表面上のＣＤ４７に結合する活性がより増強されている。いくつかの実施形態では、前述の二機能性融合タンパク質であって、ＳＩＲＰγペプチドバリアントと抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体のポリペプチド鎖とが、ペプチド結合によって直接連結しているか、又はリンカーを介して共有結合されている、二機能性融合タンパク質。好ましくは、リンカーは、配列番号８９～９６、（ＧＧＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＥＳ）ｎ及び（ＧＫＰＧＳ）ｎ（ｎは２～７の整数）からなる群に示されるリンカーのいずれか１つから選択され得る。

【0012】

いくつかの実施形態では、前述の二機能性融合タンパク質であって、ＳＩＲＰγペプチドバリアントのカルボキシル末端が抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖可変領域のアミノ末端に連結しているか、
又はＳＩＲＰγペプチドバリアントのカルボキシル末端が抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体の軽鎖可変領域のアミノ末端に連結しているか、
又は抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖のカルボキシル末端がＳＩＲＰγペプチドバリアントのアミノ末端に連結しているか、
又は抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体の軽鎖のカルボキシル末端がＳＩＲＰγペプチドバリアントのアミノ末端に連結している、二機能性融合タンパク質。

【0013】

いくつかの好ましい実施形態では、前述の二機能性融合タンパク質であって、上記ＳＩＲＰγペプチドバリアントが、野生型ＳＩＲＰγペプチドに対してＫ１９、Ｋ５３、Ｎ１０１、Ｌ３１、Ｑ５２、Ｅ５４、Ｈ５６、Ｎ７０、Ｍ７２及びＭ１１２からなる群より選択される１つ又は複数の位置にアミノ酸置換（単数又は複数）をさらに含むＳＩＲＰγペプチドバリアントである、二機能性融合タンパク質。

【0014】

いくつかの好ましい実施形態では、前述の二機能性融合タンパク質であって、上記ＳＩＲＰγペプチドバリアントが、野生型ＳＩＲＰγペプチドに対してＫ１９、Ｋ５３及びＮ１０１から選択される１つ又は複数の位置にアミノ酸置換をさらに含むＳＩＲＰγペプチドバリアントである、二機能性融合タンパク質。

【0015】

いくつかの好ましい実施形態では、前述の二機能性融合タンパク質であって、上記ＳＩＲＰγペプチドバリアントが、配列番号２０に示される野生型ＳＩＲＰγペプチドに対するＮ５１Ｒ置換変異を有するＳＩＲＰγペプチドバリアントである、二機能性融合タンパク質。

【0016】

いくつかの好ましい実施形態では、前述の二機能性融合タンパク質であって、Ｎ５１位に置換変異を有する上記ＳＩＲＰγペプチドバリアントが赤血球表面上のＣＤ４７と実質的に結合せず、好ましくは、Ｎ５１位に置換変異を有する上記ＳＩＲＰγペプチドバリアントがＮ５１Ｆ、Ｎ５１Ｉ、Ｎ５１Ｌ、Ｎ５１Ｍ又はＮ５１Ｖ置換変異を含むＳＩＲＰγペプチドバリアントである、二機能性融合タンパク質。

【0017】

いくつかの好ましい実施形態では、前述の二機能性融合タンパク質であって、上記ＳＩＲＰγペプチドバリアントが、配列番号２０に示される野生型ＳＩＲＰγペプチドに対するＫ１９Ｅ、Ｋ５３Ｇ及びＮ１０１Ｄ置換変異をさらに含むＳＩＲＰγペプチドバリアントである、二機能性融合タンパク質。

【0018】

いくつかの好ましい実施形態では、前述の二機能性融合タンパク質であって、上記ＳＩＲＰγペプチドバリアントが、配列番号２０に示される野生型ＳＩＲＰγペプチドに対するＫ１９Ｅ、Ｎ５１Ｖ、Ｑ５２Ｓ、Ｋ５３Ｇ、Ｅ５４Ｒ、Ｍ７２Ｋ及びＮ１０１Ｄ変異をさらに含む、二機能性融合タンパク質。

【0019】

いくつかの好ましい実施形態では、前述の二機能性融合タンパク質であって、上記ＳＩＲＰγペプチドバリアントが、配列番号２０に示される野生型ＳＩＲＰγペプチドに対するＫ１９Ｅ、Ｎ５１Ｍ、Ｑ５２Ｓ、Ｋ５３Ｇ、Ｅ５４Ｒ、Ｍ７２Ｋ及びＮ１０１Ｄ変異をさらに含む、二機能性融合タンパク質。

【0020】

いくつかの好ましい実施形態では、前述の二機能性融合タンパク質であって、上記ＳＩＲＰγペプチドバリアントがＭ６、Ｖ２７、Ｌ３０、Ｖ３３、Ｖ３６、Ｌ３７、Ｖ４２、Ｅ４７、Ｌ６６、Ｔ６７、Ｖ９２及びＳ９８からなる群より選択される１つ又は複数の位置にアミノ酸置換をさらに含むＳＩＲＰγペプチドバリアントである、二機能性融合タンパク質。

【0021】

いくつかの好ましい実施形態では、前述の二機能性融合タンパク質であって、ＳＩＲＰγペプチドバリアント（一般式Ｉ）のアミノ酸配列が配列番号１：

【化1】

（Ｘ_１はＬ又はＷから選択され、Ｘ_２はＭ、Ｖ、Ｆ、Ｉ又はＬから選択され、Ｘ_３はＱ、Ｓ又はＴから選択され、Ｘ_４はＥ、Ｔ又はＲから選択され、Ｘ_５はＨ又はＲから選択され、Ｘ_６はＤ、Ｎ又はＥから選択され、Ｘ_７はＩ、Ｖ、Ｍ、Ｒ又はＫから選択され、Ｘ_８はＭ又はＶから選択される）に示される通りである、二機能性融合タンパク質。

【0022】

いくつかの実施形態では、前述の二機能性融合タンパク質であって、ＳＩＲＰγペプチドバリアント（一般式ＩＩ）のアミノ酸配列が配列番号２：

【化2】

（Ｘ_１はＬ又はＷから選択され、Ｘ_３はＱ、Ｓ又はＴから選択され、Ｘ_４はＥ、Ｔ又はＲから選択され、Ｘ_５はＨ又はＲから選択され、Ｘ_６はＤ、Ｎ又はＥから選択され、Ｘ_７はＩ、Ｖ、Ｍ、Ｒ又はＫから選択され、Ｘ_８はＭ又はＶから選択される）に示される通りである、二機能性融合タンパク質。

【0023】

さらに好ましい実施形態では、前述の二機能性融合タンパク質であって、ＳＩＲＰγペプチドバリアントが配列番号２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９及び４０からなる群に示される通りであり、好ましくは配列番号２６又は２７に示される通りである、二機能性融合タンパク質。

【0024】

いくつかの実施形態では、前述の二機能性融合タンパク質であって、抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体が、アベルマブ、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、ＪＳ－００３、ＣＳ－１００１、ＬＹ－３３０００５４、ＫＤ－０３３、ＣＫ－３０１、ＣＣＸ－４５０３、ＣＸ－０７２、ＫＮ－０３５、ＨＲＰ０００５２、ＨＲＰ０００４９、ＦＡＺ－０５３、ＧＲ－１４０５、ＫＤ－００５、ＨＬＸ－２０、ＫＬ－Ａ１６７、ＣＢＴ－５０２、ＳＴＩ－Ａ１０１４、ＲＥＭＤ－２９０、ＢＧＢ－Ａ３３３、ＢＣＤ－１３５及びＭＣＬＡ－１４５からなる群より選択される、二機能性融合タンパク質。

【0025】

いくつかの実施形態では、前述の二機能性融合タンパク質であって、抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体が重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含み、
重鎖可変領域が、配列番号６に示される重鎖可変領域の配列と同じ配列（単数又は複数）のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３領域を含み、
軽鎖可変領域が、配列番号７に示される軽鎖可変領域の配列と同じ配列（単数又は複数）のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３領域を含むか；
重鎖可変領域が、配列番号８に示される重鎖可変領域の配列と同じ配列（単数又は複数）のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３領域を含み、
軽鎖可変領域が、配列番号９に示される軽鎖可変領域の配列と同じ配列（単数又は複数）のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３領域を含むか；
重鎖可変領域が、配列番号８に示される重鎖可変領域の配列と同じ配列（単数又は複数）のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３領域を含み、
軽鎖可変領域が、配列番号１１３に示される軽鎖可変領域の配列と同じ配列（単数又は複数）のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３領域を含む、二機能性融合タンパク質。さらに、いくつかの実施形態では、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３領域並びにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３領域は、Ｋａｂａｔのナンバリング基準によって定義される。

【0026】

いくつかの実施形態では、前述の二機能性融合タンパク質であって、抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖可変領域が、配列番号９７、９８及び９９にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３領域を含み、抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体の軽鎖可変領域が、配列番号１００、１０１及び１０２にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３領域を含むか；
抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖可変領域が、配列番号１０３、１０４及び１０５にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３領域を含み、抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体の軽鎖可変領域が、配列番号１０６、１０７及び１０８にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３領域を含むか；
抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖可変領域が、配列番号１０３、１０４及び１０５にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３領域を含み、抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体の軽鎖可変領域が、配列番号１０６、１１２及び１０８にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３領域を含む、二機能性融合タンパク質。

【0027】

いくつかの実施形態では、前述の二機能性融合タンパク質であって、抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体が重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含み、
重鎖可変領域が配列番号６に示されており、軽鎖可変領域が配列番号７に示されているか；
重鎖可変領域が配列番号８に示されており、軽鎖可変領域が配列番号１１３に示されているか；
重鎖可変領域が配列番号８に示されており、軽鎖可変領域が配列番号９に示されている、二機能性融合タンパク質。

【0028】

いくつかの実施形態では、前述の二機能性融合タンパク質であって、抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体が重鎖定常領域と軽鎖定常領域とをさらに含み、好ましくは、重鎖定常領域が配列番号１０又は１１に示される通りであり、軽鎖定常領域が配列番号１２に示される通りである、二機能性融合タンパク質。

【0029】

いくつかの実施形態では、前述の二機能性融合タンパク質であって、抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体が重鎖と軽鎖とを含み、重鎖が配列番号１３又は１５に示される通りであり、軽鎖が配列番号１４に示される通りであるか；
重鎖が配列番号１６又は１８に示される通りであり、軽鎖が配列番号１７に示される通りであるか；
重鎖が配列番号１６又は１８に示される通りであり、軽鎖が配列番号１１１に示される通りである、二機能性融合タンパク質。

【0030】

いくつかの実施形態では、前述の二機能性融合タンパク質であって、第１ポリペプチドと第２ポリペプチドとを含み、
第１ポリペプチドが配列番号４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１及び６２からなる群のいずれか１つに示されるポリペプチドより選択され、第２ポリペプチドが配列番号１４に示されるポリペプチドから選択されるか；
第１ポリペプチドが配列番号６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２及び１０９からなる群のいずれか１つに示されるポリペプチドより選択され、第２ポリペプチドが配列番号１７に示されるポリペプチドから選択されるか；
第１ポリペプチドが配列番号６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２及び１０９からなる群のいずれか１つに示されるポリペプチドより選択され、第２ポリペプチドが配列番号１１１に示されるポリペプチドから選択される、二機能性融合タンパク質。

【0031】

本開示のいくつかの他の実施形態では、ＳＩＲＰγペプチドバリアントであって、配列番号２０に示される野生型ＳＩＲＰγペプチドに対してＮ５１位に置換変異を有するＳＩＲＰγペプチドバリアントであるＳＩＲＰγペプチドバリアントが提供される。いくつかの実施形態では、前述のＳＩＲＰγペプチドバリアントは、腫瘍細胞の表面上のＣＤ４７に結合する活性を有する。好ましくは、ＳＩＲＰγペプチドバリアントは、野生型ＳＩＲＰγペプチドよりも腫瘍細胞の表面上のＣＤ４７と結合する活性がより増強されている。

【0032】

いくつかの好ましい実施形態では、前述のＳＩＲＰγペプチドバリアントであって、野生型ＳＩＲＰγペプチドに対してＫ１９、Ｋ５３、Ｎ１０１、Ｌ３１、Ｑ５２、Ｅ５４、Ｈ５６、Ｎ７０、Ｍ７２及びＭ１１２からなる群より選択される１つ又は複数の位置にアミノ酸置換を有するＳＩＲＰγペプチドバリアントである、ＳＩＲＰγペプチドバリアント。

【0033】

いくつかの好ましい実施形態では、前述のＳＩＲＰγペプチドバリアントであって、当該ＳＩＲＰγペプチドバリアントが、野生型ＳＩＲＰγペプチドに対してＫ１９、Ｋ５３及びＮ１０１から選択される１つ又は複数の位置にアミノ酸置換をさらに含むＳＩＲＰγペプチドバリアントである、ＳＩＲＰγペプチドバリアント。

【0034】

いくつかの好ましい実施形態では、前述のＳＩＲＰγペプチドバリアントであって、当該ＳＩＲＰγペプチドバリアントが、配列番号２０に示される野生型ＳＩＲＰγペプチドに対するＮ５１Ｒ置換変異を有するＳＩＲＰγペプチドバリアントである、ＳＩＲＰγペプチドバリアント。

【0035】

いくつかの好ましい実施形態では、前述のＳＩＲＰγペプチドバリアントであって、Ｎ５１位に置換変異を有する当該ＳＩＲＰγペプチドバリアントが赤血球表面上のＣＤ４７と実質的に結合せず、好ましくは、Ｎ５１位に置換変異を有する当該ＳＩＲＰγペプチドバリアントがＮ５１Ｆ、Ｎ５１Ｉ、Ｎ５１Ｌ、Ｎ５１Ｍ又はＮ５１Ｖ置換変異を含むＳＩＲＰγペプチドバリアントである、ＳＩＲＰγペプチドバリアント。

【0036】

いくつかの好ましい実施形態では、前述のＳＩＲＰγペプチドバリアントであって、当該ＳＩＲＰγペプチドバリアントが、配列番号２０に示される野生型ＳＩＲＰγに対するＫ１９Ｅ、Ｋ５３Ｇ及びＮ１０１Ｄ置換変異を含むＳＩＲＰγペプチドバリアントである、ＳＩＲＰγペプチドバリアント。

【0037】

いくつかの好ましい実施形態では、前述のＳＩＲＰγペプチドバリアントであって、当該ＳＩＲＰγペプチドバリアントが、配列番号２０に示される野生型ＳＩＲＰγペプチドに対するＫ１９Ｅ、Ｎ５１Ｖ、Ｑ５２Ｓ、Ｋ５３Ｇ、Ｅ５４Ｒ、Ｍ７２Ｋ及びＮ１０１Ｄ変異を含む、ＳＩＲＰγペプチドバリアント。

【0038】

いくつかの好ましい実施形態では、前述のＳＩＲＰγペプチドバリアントであって、当該ＳＩＲＰγペプチドバリアントが、配列番号２０に示される野生型ＳＩＲＰγペプチドに対するＫ１９Ｅ、Ｎ５１Ｍ、Ｑ５２Ｓ、Ｋ５３Ｇ、Ｅ５４Ｒ、Ｍ７２Ｋ及びＮ１０１Ｄ変異を含む、ＳＩＲＰγペプチドバリアント。

【0039】

いくつかの好ましい実施形態では、前述のＳＩＲＰγペプチドバリアントであって、当該ＳＩＲＰγペプチドバリアントがＭ６、Ｖ２７、Ｌ３０、Ｖ３３、Ｖ３６、Ｌ３７、Ｖ４２、Ｅ４７、Ｌ６６、Ｔ６７、Ｖ９２及びＳ９８からなる群より選択される１つ又は複数の位置にアミノ酸置換をさらに含むＳＩＲＰγペプチドバリアントである、ＳＩＲＰγペプチドバリアント。

【0040】

いくつかの好ましい実施形態では、前述のＳＩＲＰγペプチドバリアントであって、当該ＳＩＲＰγペプチドバリアントが配列番号１：

【化3】

（Ｘ_１はＬ又はＷから選択され、Ｘ_２はＭ、Ｖ、Ｆ、Ｉ又はＬから選択され、Ｘ_３はＱ、Ｓ又はＴから選択され、Ｘ_４はＥ、Ｔ又はＲから選択され、Ｘ_５はＨ又はＲから選択され、Ｘ_６はＤ、Ｎ又はＥから選択され、Ｘ_７はＩ、Ｖ、Ｍ、Ｒ又はＫから選択され、Ｘ_８はＭ又はＶから選択される）に示される通りである、ＳＩＲＰγペプチドバリアント。

【0041】

いくつかの好ましい実施形態では、前述のＳＩＲＰγペプチドバリアントであって、当該ＳＩＲＰγペプチドバリアントが配列番号２：

【化4】

（Ｘ_１はＬ又はＷから選択され、Ｘ_３はＱ、Ｓ又はＴから選択され、Ｘ_４はＥ、Ｔ又はＲから選択され、Ｘ_５はＨ又はＲから選択され、Ｘ_６はＤ、Ｎ又はＥから選択され、Ｘ_７はＩ、Ｖ、Ｍ、Ｒ又はＫから選択され、Ｘ_８はＭ又はＶから選択される）に示される通りである、ＳＩＲＰγペプチドバリアント。

【0042】

いくつかの好ましい実施形態では、前述のＳＩＲＰγペプチドバリアントであって、当該ＳＩＲＰγペプチドバリアントが配列番号２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９及び４０からなる群に示される通りである、ＳＩＲＰγペプチドバリアント。

【0043】

本開示の他の態様では、ＳＩＲＰγペプチドバリアントと抗体Ｆｃフラグメントとを含む融合タンパク質であって、当該ＳＩＲＰγペプチドバリアントが前述のいずれか１つに記載のＳＩＲＰγペプチドバリアントである融合タンパク質も提供される；いくつかの実施形態では、当該抗体Ｆｃフラグメントはヒト抗体Ｆｃフラグメントである；いくつかの好ましい実施形態では、当該抗体Ｆｃフラグメントの配列は配列番号１０又は１１に示される重鎖定常領域のＦｃフラグメント配列と同じである；いくつかの好ましい実施形態では、当該融合タンパク質のアミノ酸配列は配列番号８６、１１０、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０及び１３１からなる群に示される通りである。

【0044】

本開示の他の態様では、抗体の軽鎖可変領域と重鎖可変領域とを含む抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体も提供され、当該重鎖可変領域は配列番号１０３、１０４及び１０５にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３領域を含み、当該軽鎖可変領域は配列番号１０６、１１２及び１０８にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３領域を含む。

【0045】

いくつかの実施形態では、前述の抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体であって、重鎖可変領域が配列番号８に示されており、軽鎖可変領域が配列番号１１３に示されている、抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体。

【0046】

いくつかの実施形態では、前述の抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体であって、当該抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体が抗体定常領域をさらに含む全長抗体であり、好ましくは、当該抗体の重鎖定常領域がヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４の定常領域から選択され、当該抗体の軽鎖定常領域がヒト抗体κ鎖及びλ鎖の定常領域から選択され、より好ましくは、当該全長抗体が、配列番号１０又は１１に示される重鎖定常領域と、配列番号１２に示される軽鎖定常領域とを含む、抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体。

【0047】

いくつかの好ましい実施形態では、前述の抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体であって、配列番号１６又は１８に示される重鎖と、配列番号１１１に示される軽鎖とを含む、抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体。

【0048】

他の態様では、本開示は、治療有効量の前述の二機能性融合タンパク質又は前述のＳＩＲＰγペプチドバリアント又は前述の融合タンパク質又は前述の抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体と、１つ若しくは複数の薬学的に許容される担体、希釈剤、緩衝剤又は賦形剤とを含む医薬組成物も提供する。いくつかの実施形態では、治療有効量は、０．１～３０００ｍｇの前述の二機能性融合タンパク質又は前述のＳＩＲＰγペプチドバリアント又は前述の融合タンパク質又は前述の抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体を含む組成物の単位用量である。

【0049】

他の態様では、本開示は、前述の二機能性融合タンパク質をコードするか、前述のＳＩＲＰγペプチドバリアントをコードする単離された核酸分子も提供する。

【0050】

他の態様では、本開示は、前述の抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体をコードする単離された核酸分子も提供する。

【0051】

他の態様では、本開示は、前述の単離された核酸分子を含む組換えベクターも提供する。

【0052】

他の態様では、本開示は、原核細胞及び真核細胞、好ましくは真核細胞、より好ましくは哺乳動物細胞又は昆虫細胞から選択される前述の組換えベクターで形質転換された宿主細胞も提供する。

【0053】

他の態様では、本開示は、前述の二機能性融合タンパク質を製造する方法又は前述のＳＩＲＰγペプチドバリアントを製造する方法又は前述の融合タンパク質を製造する方法又は前述の抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体を製造する方法も提供し、本方法は、前述の宿主細胞を培養培地中で培養して、前述の二機能性融合タンパク質又は前述のＳＩＲＰγペプチドバリアントを形成して蓄積することと、当該二機能性融合タンパク質又はＳＩＲＰγペプチドバリアント又は前述の融合タンパク質又は前述の抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体を培養物から回収することとを含む。

【0054】

他の態様では、本開示は、被験体の免疫抑制関連疾患を除去する方法であって、被験体に治療有効量の前述の二機能性融合タンパク質又は前述のＳＩＲＰγペプチドバリアント又は前述の融合タンパク質又は前述の抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体又は前述の医薬組成物又は前述の単離された核酸分子を投与することを含む方法も提供し、好ましくは、当該治療有効量は、０．１～３０００ｍｇの前述の二機能性融合タンパク質又は前述のＳＩＲＰγペプチドバリアント又は前述の抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体を含む前述の組成物の単位用量である。

【0055】

いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１－ＣＤ４７二機能性融合タンパク質、ＳＩＲＰγペプチドバリアント又は前述の融合タンパク質又は前述の抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体を、約１０μｇ／ｋｇ、約５０μｇ／ｋｇ、約１００μｇ／ｋｇ、約２００μｇ／ｋｇ、約３００μｇ／ｋｇ、約４００μｇ／ｋｇ、約５００μｇ／ｋｇ、約６００μｇ／ｋｇ、約７００μｇ／ｋｇ、約８００μｇ／ｋｇ、約９００μｇ／ｋｇ、約１０００ｇ／ｋｇ、約１１００ｇ／ｋｇ、１２００ｇ／ｋｇ、１３００ｇ／ｋｇ、１４００ｇ／ｋｇ、１５００ｇ／ｋｇ、１６００ｇ／ｋｇ、１７００ｇ／ｋｇ、１８００ｇ／ｋｇ、１９００ｇ／ｋｇ、約２０００ｇ／ｋｇ、約３０００ｇ／ｋｇ、約４０００ｇ／ｋｇ、約５０００ｇ／ｋｇ、約６０００ｇ／ｋｇ、約７０００ｇ／ｋｇ、約８０００ｇ／ｋｇ、約９０００ｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ、約４０ｍｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇ、約６０ｍｇ／ｋｇ、約７０ｍｇ／ｋｇ、約８０ｍｇ／ｋｇ、約９０ｍｇ／ｋｇ、約１００ｍｇ／ｋｇ、約２００ｍｇ／ｋｇ、約３００ｍｇ／ｋｇ、約４００ｍｇ／ｋｇ、約５００ｍｇ／ｋｇ、約６００ｍｇ／ｋｇ、約７００ｍｇ／ｋｇ、約８００ｍｇ／ｋｇ、約９００ｍｇ／ｋｇ又は約１０００ｍｇ／ｋｇの用量で、単回又は累積投与で個体に投与する。

【0056】

他の態様では、本開示は、被験体の免疫抑制関連疾患を除去するための医薬の調製における、前述の二機能性融合タンパク質又は前述のＳＩＲＰγペプチドバリアント又は前述の融合タンパク質又は前述の抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体又は前述の医薬組成物又は前述の単離された核酸分子の使用も提供し、好ましくは、医薬組成物の単位用量は、０．１～３０００ｍｇの前述の二機能性融合タンパク質又は前述のＳＩＲＰγペプチドバリアント又は前述の抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体を含む。

【0057】

他の態様では、本開示は、被験体の免疫抑制関連疾患を除去するための医薬として使用される前述の二機能性融合タンパク質又は前述のＳＩＲＰγペプチドバリアント又は前述の融合タンパク質又は前述の抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体又は前述の医薬組成物又は前述の単離された核酸分子も提供し、好ましくは、医薬組成物の単位用量は、０．１～３０００ｍｇの前述の二機能性融合タンパク質又は前述のＳＩＲＰγペプチドバリアント又は前述の抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体を含む。

【0058】

別の態様では、本開示は、医薬として使用される前述の二機能性融合タンパク質又は前述のＳＩＲＰγペプチドバリアント又は前述の融合タンパク質又は前述の抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体又は前述の医薬組成物又は前述の単離された核酸分子も提供し、好ましくは、医薬組成物の単位用量は、０．１～３０００ｍｇの前述の二機能性融合タンパク質又は前述のＳＩＲＰγペプチドバリアント又は前述の抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体を含む。

【0059】

いくつかの実施形態では、前述の被験体の免疫抑制関連疾患の除去には、がん、細菌感染又はウイルス感染が含まれる。当該がんには癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫及び白血病又はリンパ系悪性腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。当該がんのより具体的な例には、以下が含まれる：扁平上皮細胞癌、骨髄腫、小細胞肺がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、頭頸部扁平上皮細胞癌（ＨＮＳＣＣ）、神経膠腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄球性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、原発性縦隔大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、Ｔ細胞／組織球豊富型大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄細胞白血病－１タンパク質（Ｍｃｌ－１）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、消化器（管）がん、腎臓がん、卵巣がん、肝臓がん、リンパ芽球性白血病、リンパ球性白血病、大腸がん、子宮内膜がん、前立腺がん、甲状腺がん、黒色腫、軟骨肉腫、神経芽細胞腫、膵臓がん、多形性膠芽腫、胃がん、骨がん、ユーイング肉腫、子宮頸がん、脳腫瘍、膀胱がん、肝がん、乳がん、結腸がん、肝細胞がん（ＨＣＣ）、明細胞腎細胞がん（ＲＣＣ）、頭頸部がん、咽頭喉頭がん、肝胆道がん、中枢神経系がん、食道がん、悪性胸膜中皮腫、全身性軽鎖アミロイドーシス、リンパ形質細胞性リンパ腫、骨髄異形成症候群、骨髄異形成腫瘍、神経内分泌腫瘍、メルケル細胞腫、精巣がん及び皮膚がん。

【図面の簡単な説明】

【0060】

【図1】いくつかの実施形態におけるＰＤ－Ｌ１－ＣＤ４７二機能性融合タンパク質の模式図である。

【図2A】ＰＤ－Ｌ１－ＣＤ４７二機能性融合タンパク質のヒト赤血球表面上のＣＤ４７に対する結合能試験を表す図であり、右側の陰性対照は細胞＋二次抗体を表す。様々なＰＤ－Ｌ１－ＣＤ４７二機能性融合タンパク質（１０μｇ／ｍｌ）の赤血球表面上のＣＤ４７に対する結合能試験を表す；

【図2B】ＰＤ－Ｌ１－ＣＤ４７二機能性融合タンパク質のヒト赤血球表面上のＣＤ４７に対する結合能試験を表す図であり、右側の陰性対照は細胞＋二次抗体を表す。様々なＰＤ－Ｌ１－ＣＤ４７二機能性融合タンパク質（１０μｇ／ｍｌ）の赤血球表面上のＣＤ４７に対する結合能試験を表す；

【図2C】ＰＤ－Ｌ１－ＣＤ４７二機能性融合タンパク質のヒト赤血球表面上のＣＤ４７に対する結合能試験を表す図であり、右側の陰性対照は細胞＋二次抗体を表す。様々なＰＤ－Ｌ１－ＣＤ４７二機能性融合タンパク質（１０μｇ／ｍｌ及び１μｇ／ｍｌ）の赤血球表面上のＣＤ４７に対する結合能試験を表す。

【図3】ＰＤ－Ｌ１－ＣＤ４７二機能性融合タンパク質とＲａｊｉ細胞表面上のＣＤ４７との結合能試験を表す図であり、右側の陰性対照は細胞＋二次抗体を表す。

【図4】ＰＤ－Ｌ１－ＣＤ４７二機能性融合タンパク質が媒介する赤血球の食作用を示す図である。

【図5A】ＰＤ－Ｌ１－ＣＤ４７二機能性融合タンパク質が媒介する腫瘍細胞（Ｍｏｌｐ－８細胞）の食作用を示す図である。様々な実験バッチで検出された様々なＰＤ－Ｌ１－ＣＤ４７二機能性融合タンパク質によって媒介される腫瘍細胞の食作用を表す。

【図5B】ＰＤ－Ｌ１－ＣＤ４７二機能性融合タンパク質が媒介する腫瘍細胞（Ｍｏｌｐ－８細胞）の食作用を示す図である。様々な実験バッチで検出された様々なＰＤ－Ｌ１－ＣＤ４７二機能性融合タンパク質によって媒介される腫瘍細胞の食作用を表す。

【図6】ＰＤ－Ｌ１－ＣＤ４７二機能性融合タンパク質が媒介する赤血球凝固作用を示す図である。

【図7A】ＰＤ－Ｌ１－ＣＤ４７二機能性融合タンパク質によって媒介されるＩＦＮ－γ分泌を示す図である。様々なＰＤ－Ｌ１－ＣＤ４７二機能性融合タンパク質によって媒介されるＩＦＮ－γ分泌の結果を表す。

【図7B】ＰＤ－Ｌ１－ＣＤ４７二機能性融合タンパク質によって媒介されるＩＦＮ－γ分泌を示す図である。様々なＰＤ－Ｌ１－ＣＤ４７二機能性融合タンパク質によって媒介されるＩＦＮ－γ分泌の結果を表す。

【図7C】ＰＤ－Ｌ１－ＣＤ４７二機能性融合タンパク質によって媒介されるＩＦＮ－γ分泌を示す図である。様々なＰＤ－Ｌ１－ＣＤ４７二機能性融合タンパク質によって媒介されるＩＦＮ－γ分泌の結果を表す。

【図7D】ＰＤ－Ｌ１－ＣＤ４７二機能性融合タンパク質によって媒介されるＩＦＮ－γ分泌を示す図である。様々なＰＤ－Ｌ１－ＣＤ４７二機能性融合タンパク質によって媒介されるＩＦＮ－γ分泌の結果を表す。

【図7E】ＰＤ－Ｌ１－ＣＤ４７二機能性融合タンパク質によって媒介されるＩＦＮ－γ分泌を示す図である。様々なＰＤ－Ｌ１－ＣＤ４７二機能性融合タンパク質によって媒介されるＩＦＮ－γ分泌の結果を表す。

【図8】ＭＣ３８／Ｈ－１１－ｈＣＤ４７（＃５－４）担がんＢ－ｈＣＤ２７４／ｈＣＤ４７／ｈＳＩＲＰαマウスモデルの腫瘍体積に対する様々なＰＤ－Ｌ１－ＣＤ４７二機能性融合タンパク質の効果を示す図である。

【図9】ＭＣ３８－ｈＰＤ－Ｌ１－ｈＣＤ４７担がんＣ５７／ＢＬ－６マウスモデルの腫瘍体積に対する様々なＰＤ－Ｌ１－ＣＤ４７二機能性融合タンパク質の効果を示す図である。

【図10】ＭＣ３８－ｈＰＤ－Ｌ１担がんＣ５７／ＢＬ－６マウスモデルの腫瘍体積に対する様々なＰＤ－Ｌ１－ＣＤ４７二機能性融合タンパク質の効果を示す図である。

【図11】Ｍｏｌｐ－８担がんヌードマウスｉｎ ｖｉｖｏモデルの腫瘍体積に対する様々なＰＤ－Ｌ１－ＣＤ４７二機能性融合タンパク質の効果を示す図である。このモデルでは、ＣＤ４７標的経路における二機能性融合タンパク質の抗腫瘍効果を調べることに焦点を当てている。

【発明を実施するための形態】

【0061】

（用語）
本開示で使用されるアミノ酸の３文字コード及び１文字コードは、Ｊ．ｂｉｏｌ．ｃｈｅｍ，２４３，ｐ３５５８（１９６８）に記載されている通りである。

【0062】

「二機能性融合タンパク質」という用語は、２つの標的タンパク質又は標的抗原に結合することができるタンパク質分子を指す。本開示における二機能性融合タンパク質は、主に、細胞表面上のＰＤ－Ｌ１及びＣＤ４７に結合することができるタンパク質を含み、これは抗ＰＤ－Ｌ１抗体とＳＩＲＰγポリペプチドバリアントとを連結して形成される融合タンパク質である。

【0063】

「ＰＤ－Ｌ１」という用語は、ＣＤ２７４又はＢ７Ｈ１としても知られているプログラム細胞死リガンド１を指す。ヒト完全長ＰＤ－Ｌ１のアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ＮＰ＿０５４８６２．１で提供されている。ヒト以外の種に由来すると明記されていない限り、「ＰＤ－Ｌ１」という用語は、ヒトＰＤ－Ｌ１を意味する。

【0064】

抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体とは、ヒトＰＤ－Ｌ１に結合することができ、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１の結合を遮断することができる抗体を指す。抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体は、アベルマブ、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、ＪＳ－００３、ＣＳ－１００１、ＬＹ－３３０００５４、ＫＤ－０３３、ＣＫ－３０１、ＣＣＸ－４５０３、ＣＸ－０７２、ＫＮ－０３５、ＨＲＰ０００５２、ＨＲＰ０００４９、ＦＡＺ－０５３、ＧＲ－１４０５、ＫＤ－００５、ＨＬＸ－２０、ＫＬ－Ａ１６７、ＣＢＴ－５０２、ＳＴＩ－Ａ１０１４、ＲＥＭＤ－２９０、ＢＧＢ－Ａ３３３、ＢＣＤ－１３５、ＭＣＬＡ－１４５等から選択され得る。さらに、本開示における抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体は、全長抗体ｈ１８３０、ｈ１８３１又はｈ１８３０抗体及びｈ１８３１抗体のＣＤＲ組み合わせと同じＣＤＲ組み合わせを有する抗ＰＤ－Ｌ１抗体若しくはその抗原結合フラグメントから選択することもできる。

【0065】

「ＳＩＲＰγペプチド」とは、ヒトＣＤ４７に結合する活性を有するヒトＳＩＲＰγ－Ｄ１ドメインペプチド（野生型ＳＩＲＰγペプチドのアミノ酸配列を配列番号２０に示す）を指す。ＳＩＲＰγペプチドには、野生型ＳＩＲＰγペプチドに対して１つ又は複数の位置にアミノ酸置換を有するヒトＳＩＲＰγ－Ｄ１ドメインペプチド変異体、すなわち「ＳＩＲＰγペプチドバリアント」を含むことができ、そのアミノ酸置換変異の数は２０以下、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２であり、ＳＩＲＰγペプチドバリアントは、野生型ＳＩＲＰγペプチドよりも腫瘍細胞表面上のＣＤ４７に結合する活性が増強されている（野生型ＳＩＲＰγのＣＤ４７との結合親和性はマイクロモルレベルである）。さらに、いくつかの特定の実施形態では、ＳＩＲＰγペプチドバリアントは、ヒト赤血球表面上のＣＤ４７に結合しないという特性又は（腫瘍細胞表面上のＣＤ４７への結合活性に比べて）結合が減少するという特性を得る。以下の表１に示すように、例えば、Ｓ５８ペプチドは、配列番号２０に示される野生型ＳＩＲＰγペプチドに対してＫ１９位をＫ１９Ｅに、Ｎ５１位をＮ５１Ｍに、Ｑ５２位をＱ５２Ｓに、Ｋ５３位をＫ５３Ｇに、Ｅ５４位をＥ５４Ｒに、及びＮ１０１位をＮ１０１Ｄに置換した変異体である。

【0066】

いくつかの特定の実施形態では、アミノ酸置換変異の代替位置は、Ｋ１９、Ｋ５３、Ｎ１０１、Ｌ３１、Ｎ５１、Ｑ５２、Ｅ５４、Ｈ５６、Ｎ７０、Ｍ７２、Ｍ１１２、Ｍ６、Ｖ２７、Ｌ３０、Ｖ３３、Ｖ３６、Ｌ３７、Ｖ４２、Ｅ４７、Ｌ６６、Ｔ６７、Ｖ９２又はＳ９８から選択される１つ又は複数の位置（単数又は複数）でのアミノ酸置換変異を含み得る。

【0067】

いくつかの特定の実施形態では、ＳＩＲＰγペプチドバリアントは、配列番号１：

【化5】

（Ｘ_１はＬ又はＷから選択され、Ｘ_２はＭ、Ｖ、Ｆ、Ｉ又はＬから選択され、Ｘ_３はＱ、Ｓ又はＴから選択され、Ｘ_４はＥ、Ｔ又はＲから選択され、Ｘ_５はＨ又はＲから選択され、Ｘ_６はＤ、Ｎ又はＥから選択され、Ｘ_７はＩ、Ｖ、Ｍ、Ｒ又はＫから選択され、Ｘ_８はＭ又はＶから選択される）に示される通りである。

【0068】

いくつかの特定の実施形態では、ＳＩＲＰγペプチドバリアントは、配列番号２：

【化6】

（Ｘ_１はＬ又はＷから選択され、Ｘ_３はＱ、Ｓ又はＴから選択され、Ｘ_４はＥ、Ｔ又はＲから選択され、Ｘ_５はＨ又はＲから選択され、Ｘ_６はＤ、Ｎ又はＥから選択され、Ｘ_７はＩ、Ｖ、Ｍ、Ｒ又はＫから選択され、Ｘ_８はＭ又はＶから選択される）に示される通りである。

【0069】

以下の表は、野生型ＳＩＲＰγペプチドに対する様々なＳＩＲＰγペプチドバリアントのアミノ酸置換変異位置及び例示的な置換アミノ酸残基を示している。

【表1】

【0070】

「抗体（Ａｂ）」という用語は、特定の抗原（又はそのエピトープ、例えばＰＤ－Ｌ１抗原又はそのエピトープ）と特異的に結合又は相互作用する少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む抗原結合分子又は分子複合体を含む。「抗体」という用語は、ジスルフィド結合（単数又は複数）で相互に連結された２本の重（Ｈ）鎖と２本の軽（Ｌ）鎖との４本のポリペプチド鎖を含む免疫グロブリン分子及びそれらの多量体（例えば、ＩｇＭ）を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＨＣＶＲ又はＶＨと略す）と重鎖定常領域（ＣＨ）とを含む。この重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３の３つの領域（ドメイン）を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＬＣＶＲ又はＶＬと略す）と軽鎖定常領域（ＣＬ）とを含む。軽鎖定常領域は、１つの領域（ドメイン、ＣＬ）を含む。ＶＨ及びＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域にさらに細分化することができ、その間には、より保存的な領域（フレームワーク領域、ＦＲと呼ばれる）が介在している。各ＶＨ及びＶＬは、３つのＣＤＲと４つのＦＲからなり、アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、以下の順序で配置されている：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。本開示の異なる例では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体（又はその抗原結合フラグメント）のＦＲは、ヒト生殖細胞系列と同じであり得るか、天然又は人工的に改変され得る。抗体は、異なるサブクラスの抗体、例えば、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３若しくはＩｇＧ４サブクラス）、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＭ抗体であり得る。

【0071】

「全長抗体」、「インタクト抗体」、「完全抗体」及び「全抗体」という用語は、本明細書において交換可能に使用され、以下に定義される抗原結合フラグメントとは区別される、実質的に無傷の形態の抗体を指す。これらの用語は、具体的には、重鎖がＶＨ領域、ＣＨ１領域、ヒンジ領域及びＦｃ領域をアミノ末端からカルボキシル末端に含み、軽鎖がＶＬ領域及びＣＬ領域をアミノ末端からカルボキシル末端に含む抗体を指す。

【0072】

抗原結合フラグメントの非限定的な例としては、以下のものが挙げられる：（ｉ）Ｆａｂフラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント；（ｉｉｉ）Ｆｄフラグメント；（ｉｖ）Ｆｖフラグメント；（ｖ）一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子；（ｖｉ）ｄＡｂフラグメント；及び（ｖｉｉ）抗体の超可変領域を模倣したアミノ酸残基からなる最小認識単位（例えば単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、例えばＣＤＲ３ペプチド）又は制限的ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４ペプチド。他の人工分子、例えば領域特異的抗体、単一ドメイン抗体、領域欠失抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、ナノボディ（例えば、一価ナノボディ、二価ナノボディ等）、小モジュール免疫医薬品（ＳＭＩＰ）及びサメ可変ＩｇＮＡＲ領域も、本明細書で使用される「抗原結合フラグメント」という用語に包含される。

【0073】

抗体の抗原結合フラグメントは、通常、少なくとも１つの可変領域を含む。可変領域は、任意のサイズ又はアミノ酸組成の領域であり得、一般に、１つ若しくは複数のフレームワーク配列（単数若しくは複数）に隣接するか、又はフレームワーク内のＣＤＲを含む。ＶＨ領域及びＶＬ領域を有する抗原結合フラグメントでは、ＶＨ領域及びＶＬ領域は、任意の適切な配置で互いに向かい合って配置され得る。例えば、可変領域は二量化され、ＶＨ－ＶＬ又はＶＬ－ＶＨ二量体を含み得る。

【0074】

特定の例では、抗原結合フラグメントの可変領域及び定常領域の任意の構成において、可変領域と定常領域は互いに直接連結し得るか、又はインタクト若しくは部分的なヒンジ又はリンカー領域を介して連結し得る。ヒンジ領域は、少なくとも２個（例えば、５、１０、１５、２０、４０、６０個又はそれ以上）のアミノ酸からなり得るため、単一のポリペプチド分子内の隣接する可変領域及び／又は定常領域の間に柔軟性及び半柔軟性のある接続を作り出す。その上、本開示の抗原結合フラグメントは、互いに非共有結合している、及び／又は１つ若しくは複数の単量体ＶＨ又はＶＬ領域に（例えばジスルフィド結合によって）連結している可変領域と定常領域とを含むホモ二量体又はヘテロ二量体（又は他の多量体）を生じさせる。

【0075】

本開示における「マウス抗体」という用語は、当該技術分野の知識と技能に従って調製されたマウス又はラット由来のモノクローナル抗体である。調製の際には、被験体に抗原を注射した後、所望の配列又は機能特性を有する抗体を発現するハイブリドーマを単離する。注射を受けた被験体がマウスの場合、産生される抗体はマウス由来の抗体であり、注射を受けた被験体がラットの場合、産生される抗体はラット由来の抗体である。

【0076】

「キメラ抗体」とは、第１種（マウス等）の抗体の可変領域と第２種（ヒト等）の抗体の定常領域とを融合して形成される抗体のことである。キメラ抗体を樹立するには、まず第１種のモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを樹立し、次にハイブリドーマ細胞から可変領域遺伝子をクローニングし、必要に応じて第２種の抗体定常領域遺伝子をクローニングし、第１種の可変領域遺伝子と第２種の定常領域遺伝子とを連結してキメラ遺伝子を形成し、これを発現ベクターに挿入し、最終的に真核生物系又は原核生物系でキメラ抗体分子を発現させる必要がある。本開示の好ましい実施形態では、キメラ抗体の抗体軽鎖は、ヒトκ、λ鎖又はそのバリアントの軽鎖定常領域をさらに含む。キメラ抗体の抗体重鎖は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４又はそれらのバリアントの重鎖定常領域、好ましくは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２若しくはＩｇＧ４の重鎖定常領域、又はアミノ酸変異（ＹＴＥ変異、復帰突然変異、Ｌ２３４Ａ及び／若しくはＬ２３５Ａ変異又はＳ２２８Ｐ変異等）を含むＩｇＧ１、ＩｇＧ２若しくはＩｇＧ４の重鎖定常領域バリアントをさらに含む。

【0077】

ＣＤＲ移植抗体を含む「ヒト化抗体」という用語は、動物（例えばマウス）由来の抗体のＣＤＲ配列を、ヒト抗体の可変領域のフレームワーク領域に移植して産生された抗体を指す。ヒト化抗体は、多量の異種タンパク質成分を含むキメラ抗体によって引き起こされる不均一反応を克服することができる。そのようなフレームワーク配列は、生殖細胞系列の抗体遺伝子配列を含む公開ＤＮＡデータベース又は公開参考文献から得ることができる。例えば、ヒト重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子の生殖細胞系ＤＮＡ配列は、「ＶＢａｓｅ」ヒト生殖細胞系配列データベース（インターネットｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｖｂａｓｅ２．ｏｒｇ／で入手可能）、並びにＫａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎにおいて見つけることができる。免疫原性の低下による活性の低下を回避するために、ヒト抗体可変領域のＦＲ配列に少量の復帰突然変異を加えて活性を維持することができる。また、本開示のヒト化抗体は、ファージによってさらに提示され、ＣＤＲに対する親和性成熟を受けたヒト化抗体を含む。

【0078】

抗原の接触残基のために、ＣＤＲ移植化は、抗原と接触しているフレームワーク残基のために、生産された抗体又はその抗原結合フラグメントの抗原に対する親和性の低下をもたらす可能性がある。そのような相互作用は、体細胞の超変異の結果である可能性がある。したがって、そのようなドナーフレームワークアミノ酸をヒト化抗体のフレームワークに移植することが依然として必要である場合がある。抗原結合に関与する非ヒト抗体又はその抗原結合フラグメント由来のアミノ酸残基は、動物モノクローナル抗体の可変領域の配列及び構造を調べることによって同定することができる。生殖細胞系列と異なるＣＤＲドナーフレームワークの残基は、関連性があると見なすことができる。最も近い生殖細胞系列を特定できない場合、その配列をサブクラスのコンセンサス配列又は類似度の高い動物抗体配列と比較することができる。希少なフレームワーク残基は、体細胞の超変異の結果であると考えられており、したがって結合において重要な役割を果たしている。

【0079】

本開示の一実施形態では、抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒト若しくはマウスのκ鎖、λ鎖又はそのバリアントの軽鎖定常領域をさらに含み得るか、又はヒト若しくはマウスのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４又はそのバリアントの重鎖定常領域をさらに含み得る。

【0080】

ヒト抗体重鎖定常領域及びヒト抗体軽鎖定常領域の「従来のバリアント」とは、従来技術で開示されているヒト由来の重鎖定常領域又は軽鎖定常領域のバリアントであって、抗体可変領域の構造及び機能を変更していないものを指す。例示的なバリアントとしては、重鎖定常領域に部位特異的修飾及びアミノ酸置換を施したＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４重鎖定常領域バリアントが挙げられる。具体的な置換としては、ＹＴＥ変異、Ｌ２３４Ａ及び／若しくはＬ２３５Ａ変異、又はＳ２２８Ｐ変異、又は当該技術分野で知られているｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅ構造を得るための変異（抗体重鎖がｋｎｏｂ－Ｆｃとｈｏｌｅ－Ｆｃの組み合わせを持つようにする）などが挙げられる。これらの変異は、抗体に新たな特性を持たせることが確認されているが、抗体可変領域の機能を変えるものではない。

【0081】

「ヒト抗体」及び「ヒト由来抗体」は、交換可能に使用することができ、ヒト由来の抗体又は抗原刺激に応答して特異的ヒト抗体を産生するように「操作」されたトランスジェニック生物から得られた抗体であり得、当該技術分野で知られている任意の方法で産生することができる。いくつかの技術では、ヒト重鎖及び軽鎖遺伝子座のエレメントを、内因性重鎖及び軽鎖遺伝子座が標的破壊された細胞株に導入する。このトランスジェニック生物は、抗原に特異的なヒト抗体を合成することができ、この生物を用いてヒト抗体分泌ハイブリドーマを産生することができる。ヒト抗体は、重鎖及び軽鎖が１つ又は複数のヒトＤＮＡ起源に由来するヌクレオチド配列によってコードされている抗体でもあり得る。完全ヒト抗体は、遺伝子又は染色体トランスフェクション法及びファージディスプレイ技術によって構築することも、ｉｎ ｖｉｔｒｏで活性化されたＢ細胞によって構築することもでき、これらは全て当該技術分野で知られている。

【0082】

「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体を指し、すなわち、考え得るバリアント抗体（例えば、天然に存在する変異又はモノクローナル抗体調製物の製造中に生じた変異を含み、これらのバリアントは通常少量しか存在しない）を除いて、集団を構成する個々の抗体が同じものを認識し、及び／又は同じエピトープと結合する。モノクローナル抗体調製物（製剤）の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して指向される。したがって、「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均一な抗体集団から得られた抗体の特性を示すものであり、抗体の製造に特定の方法を必要とすると解釈すべきではない。例えば、本開示に従って使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、並びに完全又は部分的なヒト免疫グロブリン遺伝子座を含むトランスジェニック動物を利用する方法を含むが、これらに限定されない様々な技術によって調製することができる。モノクローナル抗体を調製するためのそのような方法及び他の例示的な方法は、本明細書に記載されている。

【0083】

さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメインＶＬ及びＶＨは別々の遺伝子にコードされているが、組換え法を用いてそれらを合成リンカーで連結することにより、それらをＶＬ領域とＶＨ領域とが対になって一価分子を形成する単一タンパク質鎖として製造することができる（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）と呼ばれる；例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６；及びＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８５： ５８７９－５８８３を参照）。そのような一本鎖抗体も、抗体の「抗原結合フラグメント」という用語に含まれることが意図されている。そのような抗体フラグメントは、当業者に知られている従来技術を用いて得られ、そのフラグメントは、インタクト抗体のスクリーニングに用いられるのと同様の方法で機能についてスクリーニングされる。抗原結合部位は、組換えＤＮＡ技術によって、又はインタクトな免疫グロブリンの酵素的若しくは化学的フラグメント化によって製造することができる。

【0084】

抗原結合フラグメントは、一対のタンデムＦｖフラグメント（ＶＨ－ＣＨ１－ＶＨ－ＣＨ１）を含む一本鎖分子に組み込むこともでき、これは、相補的な軽鎖ポリペプチドと一緒になって一対の抗原結合領域を形成する（Ｚａｐａｔａ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７－１０６２；ａｎｄ Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，６４１，８７０）。

【0085】

Ｆａｂは、ＩｇＧ抗体をプロテアーゼパパイン（Ｈ鎖の２２４位のアミノ酸残基を切断する）で処理することによって得られる、分子量約５０，０００Ｄａの抗原結合活性を有する抗体フラグメントであり、Ｎ末端側のＨ鎖の約半分とＬ鎖全体がジスルフィド結合（単数又は複数）で結合している。

【0086】

Ｆ（ａｂ’）２は、ＩｇＧのヒンジ領域にある２つのジスルフィド結合の下流部分をペプシンで消化することによって得られる、分子量約１００，０００Ｄａの抗原結合活性を有する抗体フラグメントであり、ヒンジ位置で連結した２つのＦａｂ領域を含む。

【0087】

Ｆａｂ’は、前述のＦ（ａｂ’）２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断することによって得られる、分子量約５０，０００Ｄａの抗原結合活性を有する抗体フラグメントである。Ｆａｂ’は、抗原を特異的に認識して結合するＦ（ａｂ’）２を、例えばジチオスレイトールなどの還元剤で処理することにより製造することができる。

【0088】

さらに、抗体のＦａｂ’フラグメントをコードするＤＮＡを原核生物発現ベクター又は真核生物発現ベクターに挿入し、そのベクターを原核生物又は真核生物に導入することで、Ｆａｂ’を発現させることができる。

【0089】

「一本鎖抗体」、「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」という用語は、リンカーで連結された抗体重鎖可変ドメイン（すなわち領域；ＶＨ）と抗体軽鎖可変ドメイン（すなわち領域；ＶＬ）とを含む分子を指す。そのようなｓｃＦｖ分子は、一般式：ＮＨ_２－ＶＬ－リンカー－ＶＨ－ＣＯＯＨ又はＮＨ_２－ＶＨ－リンカー－ＶＬ－ＣＯＯＨで表すことができる。先行技術の適切なリンカーは、反復ＧＧＧＧＳアミノ酸配列又はそれらのバリアント、例えば、１～４（１、２、３又は４を含む）の反復バリアントからなる（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９３），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４－６４４８）。本開示で使用することができる他のリンカーは、Ａｌｆｔｈａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５），Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８：７２５－７３１、Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：９４－１０６、Ｈｕ ｅｔ ａｌ．（１９９６），Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６：３０５５－３０６１、Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．（１９９９），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：４１－５６及びＲｏｏｖｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５０：５１－５９に記載されている。

【0090】

「抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体」には、ヒトＰＤ－Ｌ１に特異的に結合することができる全長抗体のほか、全長抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含む抗原結合フラグメントが挙げられ、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂフラグメント又は全長抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含むｓｃＦｖ若しくはＦａｂを含む他の抗原結合フラグメントが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【0091】

「ＳＩＲＰγペプチドが抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体のポリペプチド鎖に連結している」という表現で用いられる場合の「連結している」とは、ポリペプチド間の有効な接続を意味し、例えば、ペプチド結合を介した接続又はリンカーを介した接続などが挙げられる。この接続により、ＳＩＲＰγペプチド及び抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体のそれぞれの機能が失われることはない。

【0092】

「リンカー」は、通常、ある程度の柔軟性を持って、タンパク質ドメイン又は各種タンパク質又は各種ポリペプチドを接続するために使用される接続ポリペプチド配列を指す。リンカーを使用することで、タンパク質ドメインの本来の機能が失われることはない。例示的なリンカーを以下の表に示す。

【表2】

【0093】

いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体を、リンカー（単数又は複数）によってＳＩＲＰγペプチドバリアントに連結することができる。いくつかの例示的な二機能性融合タンパク質には、以下に示す融合タンパク質が挙げられる：

【表3】

【0094】

ダイアボディは、二量体化したｓｃＦｖの抗体フラグメントを指し、二価の抗原結合活性を持つ抗体フラグメントである。二価の抗原結合活性では、２つの抗原は同じであっても異なっていてもよい。

【0095】

ｄｓＦｖは、ポリペプチド（ＶＨ及びＶＬのそれぞれの１つのアミノ酸残基がシステイン残基で置換されている）を、システイン残基間のジスルフィド結合を介して接続することにより得られる。システイン残基で置換されるアミノ酸残基は、抗体の三次元構造予測に基づく既知の方法（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．７：６９７（１９９４））に従って選択することができる。

【0096】

本開示のいくつかの例における抗原結合フラグメントは、以下の工程によって製造することができる：抗原を特異的に認識して結合する本開示のモノクローナル抗体のＶＨ及び／又はＶＬ並びにその他の必要なドメインをコードするｃＤＮＡを取得し、抗原結合フラグメントをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物発現ベクター又は真核生物発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物又は真核生物に導入して抗原結合フラグメントを発現させる。

【0097】

「Ｆｃ領域」は、ネイティブ配列のＦｃ領域又はバリアントのＦｃ領域であり得る。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変化する可能性があるが、ヒトＩｇＧ重鎖のＦｃ領域は、通常Ｃｙｓ２２６位又はＰｒｏ２３０位のアミノ酸残基からそのカルボキシル末端まで延びていると定義される。Ｆｃ領域の残基のナンバリングは、ＫａｂａｔのＥＵインデックスのナンバリングと同じである。Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９９１。免疫グロブリンのＦｃ領域は、通常ＣＨ２とＣＨ３の２つの定常領域ドメインを持つ。

【0098】

「アミノ酸差」又は「アミノ酸変異」という用語は、元のタンパク質又はポリペプチドと比較して、バリアントのタンパク質又はポリペプチドにアミノ酸の変化若しくは変異があることを指し、元のタンパク質又はポリペプチドを基準として、１つ又は複数のアミノ酸の挿入、欠失若しくは置換が挙げられる。

【0099】

抗体の「可変領域」とは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）又は抗体重鎖可変領域（ＶＨ）単独若しくは組み合わせたものを指す。当該技術分野で知られているように、重鎖及び軽鎖の可変領域はそれぞれ、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）（超可変領域とも呼ばれる）によって連結された４つのフレームワーク領域（ＦＲ）で構成されている。各鎖のＣＤＲはＦＲによって強固に保持されており、他の鎖のＣＤＲとともに抗体の抗原結合部位の形成に寄与している。ＣＤＲを決定する手法としては、少なくとも２つの手法を挙げることができる：（１）異種間配列変動性に基づく方法（すなわち、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，（５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＭＤ））；及び（２）抗原－抗体複合体の結晶学的研究に基づく方法（Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７－９４８（１９９７））。本明細書で使用される場合、ＣＤＲは、いずれかの方法又は２つの方法の組み合わせによって決定されるＣＤＲを指すことができる。

【0100】

「抗体フレームワーク」又は「ＦＲ領域」という用語は、可変ドメインＶＬ又はＶＨの部位を指し、これは可変ドメインの抗原結合ループ（ＣＤＲ）の足場として機能する。基本的に、これはＣＤＲのない可変ドメインである。

【0101】

「相補性決定領域」及び「ＣＤＲ」という用語は、抗体の可変領域に存在する６つの超可変領域のうち、主に抗原結合に寄与する領域を指す。一般に、各重鎖可変領域には３つのＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）が存在し、各軽鎖可変領域には３つのＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）が存在する。様々な周知のスキームのいずれかを使用してＣＤＲのアミノ酸配列境界を決定することができ、これには、「Ｋａｂａｔ」のナンバリング基準（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１），“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”，５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤを参照）、「Ｃｈｏｔｈｉａ」のナンバリング基準（Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９７） ＪＭＢ ２７３：９２７－９４８）及びＩｍＭｕｎｏＧｅｎＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）のナンバリング基準（Ｌｅｆｒａｎｃ Ｍ．Ｐ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔ，７，１３２－１３６（１９９９）；Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２７，５５－７７（２００３））などがある。例えば、古典的な形式では、Ｋａｂａｔの基準に従うと、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）のＣＤＲアミノ酸残基番号は、３１－３５（ＨＣＤＲ１）、５０－６５（ＨＣＤＲ２）及び９５－１０２（ＨＣＤＲ３）であり；軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）のＣＤＲアミノ酸残基番号は、２４－３４（ＬＣＤＲ１）、５０－５６（ＬＣＤＲ２）及び８９－９７（ＬＣＤＲ３）である。Ｃｈｏｔｈｉａの基準に従うと、ＶＨのＣＤＲアミノ酸番号は、２６－３２（ＨＣＤＲ１）、５２－５６（ＨＣＤＲ２）及び９５－１０２（ＨＣＤＲ３）であり；ＶＬのアミノ酸残基番号は、２６－３２（ＬＣＤＲ１）、５０－５２（ＬＣＤＲ２）及び９１－９６（ＬＣＤＲ３）である。Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａの両方のＣＤＲ定義を組み合わせると、ＣＤＲは、ヒトＶＨのアミノ酸残基２６－３５（ＨＣＤＲ１）、５０－６５（ＨＣＤＲ２）及び９５－１０２（ＨＣＤＲ３）と、ヒトＶＬのアミノ酸残基２４－３４（ＬＣＤＲ１）、５０－５６（ＬＣＤＲ２）及び８９－９７（ＬＣＤＲ３）とからなる。ＩＭＧＴの基準では、ＶＨのＣＤＲアミノ酸残基番号は、おおよそ２６－３５（ＣＤＲ１）、５１－５７（ＣＤＲ２）及び９３－１０２（ＣＤＲ３）であり、ＶＬのＣＤＲアミノ酸残基番号は、おおよそ２７－３２（ＣＤＲ１）、５０－５２（ＣＤＲ２）及び８９－９７（ＣＤＲ３）である。ＩＭＧＴの基準に従うと、ＩＭＧＴ／ＤｏｍａｉｎＧａｐ Ａｌｉｇｎというプログラムを使って、抗体のＣＤＲ領域を決定することができる。

【0102】

「抗体定常領域ドメイン」は、抗体の軽鎖及び重鎖の定常領域に由来するドメインを指し、様々なタイプの抗体に由来するＣＬ及びＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４ドメインが含まれる。

【0103】

「エピトープ」又は「抗原決定基」は、免疫グロブリン又は抗体が特異的に結合する抗原上の部位を指す。エピトープは通常、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４若しくは１５個の連続又は非連続アミノ酸を含み、固有の空間的構造をしている。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６６，Ｇ．Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ，Ｅｄ．（１９９６）を参照。

【0104】

「特異的に結合する」、「選択的に結合する」、「選択的結合」及び「特異的結合」という用語は、抗体が所定の抗原上のエピトープに結合することを指す。

【0105】

「親和性」という用語は、単一エピトープにおける抗体と抗原間の相互作用の強さを意味する。各抗原部位内で、抗体「アーム」の可変領域は、弱い非共有結合力を介して複数のアミノ酸位置で抗原と相互作用する；その相互作用が大きいほど、親和性は強くなる。本明細書で使用される場合、抗体又はその抗原結合フラグメント（例えばＦａｂフラグメント）の「高親和性」という用語は、一般的にＫ_Ｄが１Ｅ^－９Ｍ以下（例えば、Ｋ_Ｄが１Ｅ^－１０Ｍ以下、Ｋ_Ｄが１Ｅ^－１１Ｍ以下、Ｋ_Ｄが１Ｅ^－１２Ｍ以下、Ｋ_Ｄが１Ｅ^－１３Ｍ以下、Ｋ_Ｄが１Ｅ^－１４Ｍ以下等）の抗体又は抗原結合フラグメントを指す。

【0106】

「ＫＤ」又は「Ｋ_Ｄ」という用語は、特定の抗体－抗原相互作用の解離平衡定数を指す。一般的に、抗体は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術を用いたＢＩＡＣＯＲＥ装置で測定した解離平衡定数（ＫＤ）が、例えば約１Ｅ^－８Ｍ以下、例えば約１Ｅ^－９Ｍ以下、約１Ｅ^－１０Ｍ以下又は約１Ｅ^－１１Ｍ以下の抗原に結合する。ＫＤ値が小さいほど、親和性が高いと言える。

【0107】

「核酸分子」という用語は、ＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子を指す。核酸分子は、一本鎖又は二本鎖のＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子であり得、例えば、二本鎖のＤＮＡ又はｍＲＮＡである。核酸が別の核酸配列と機能的関係に置かれると、その核酸は「作動可能に連結している」。例えば、プロモーター又はエンハンサーがコーディング配列の転写に影響を与える場合、プロモーター又はエンハンサーはコーディング配列に作動可能に連結している。

【0108】

「ベクター」という用語は、１つ又は複数の標的遺伝子又は配列を送達することができ、好ましくは宿主細胞内でそれを発現させることができる構築物を意味する。ベクターの例としては、ウイルスベクター、裸のＤＮＡ又はＲＮＡ発現ベクター、プラスミド、コスミド又はファージベクター、カチオン性凝集剤と会合したＤＮＡ又はＲＮＡ発現ベクター、リポソームにカプセル化されたＤＮＡ又はＲＮＡ発現ベクター及び産生細胞などの特定の真核細胞が挙げられるが、これらに限定されない。

【0109】

抗体及び抗原結合フラグメントの製造・精製方法は、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｃｈａｐｔｅｒｓ ５－８ ａｎｄ １５などの先行技術においてよく知られている。例えば、マウスを抗原又はそのフラグメントで免疫し、得られた抗体を復元して精製し、従来の方法を使用してアミノ酸配列決定を行うことができる。抗原結合フラグメントも、従来の方法を使用して調製することができる。本開示による抗体又は抗原結合フラグメントは、非ヒトＣＤＲ領域に１つ又は複数のヒトＦＲ領域を付加するように遺伝子操作されている。ヒトＦＲ生殖細胞系配列は、ウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／からＭＯＥソフトウェアを介してＩＭＧＴヒト抗体可変領域生殖細胞系列遺伝子データベースに対してアラインメントすることにより入手することができ、又はＴｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ＦａｃｔｓＢｏｏｋ，２００１ＩＳＢＮ０１２４４１３５１から入手することができる。

【0110】

「宿主細胞」という用語は、発現ベクターが導入された細胞を指す。宿主細胞には、細菌、微生物、植物又は動物の細胞が含まれ得る。容易に形質転換できる細菌としては、腸内細菌科のメンバー、例えば大腸菌又はサルモネラ菌株；バシラス科、例えば枯草菌；肺炎球菌；連鎖球菌及びインフルエンザ菌などが挙げられる。適切な微生物には、サッカロミセス・セレビシエ及びピキア・パストリスが挙げられる。適切な動物宿主細胞株には、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣細胞株）、ＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ２９３Ｅ細胞などの非限定的な例）及びＮＳ０細胞が挙げられる。

【0111】

改変抗体又は抗原結合フラグメントは、従来の方法で調製及び精製することができる。例えば、重鎖及び軽鎖をコードするｃＤＮＡ配列をクローニングし、ＧＳ発現ベクターに組み替えることができる。組換え免疫グロブリン発現ベクターは、ＣＨＯ細胞に安定してトランスフェクトすることができる。代替となる先行技術として、哺乳動物の発現系は、特にＦｃ領域の高度に保存されたＮ末端位置において、抗体のグリコシル化をもたらす可能性がある。抗原と特異的に結合する抗体を発現させることで、安定したクローンが得られる。陽性クローンは、バイオリアクターの無血清培地で増殖して抗体を産生する。抗体が分泌された培養液は、従来技法で精製することができる。例えば、精製には、調整された緩衝液を含むプロテインＡ又はプロテインＧセファロースＦＦカラムを用いることができる。非特異的に結合した成分は洗い流される。その後、結合した抗体をｐＨグラジエントで溶出し、抗体フラグメントをＳＤＳ－ＰＡＧＥで検出して回収する。この抗体を従来の方法で濾過し、濃縮することができる。可溶性混合物及び多量体も、例えばモレキュラーシーブ及びイオン交換などの従来の方法で除去することができる。得られた生成物は、－７０℃などで直ちに凍結するか、凍結乾燥する必要がある。

【0112】

「投与する」、「投与」、「与える」及び「処理する」は、動物、ヒト、実験被験体、細胞、組織、器官又は生体液に適用される場合、外因性医薬品、治療剤、診断薬、組成物又は手動操作（例えば、実施例では「安楽死」）を、動物、ヒト、被験体、細胞、組織、器官又は生体液と接触させることを意味する。「与える」及び「処理する」は、例えば、治療、薬物動態、診断、研究及び実験方法を意味し得る。細胞の処理には、試薬を細胞に接触させること、及び試薬を流体に接触させることが含まれ、その際、流体は細胞と接触する。「与える」及び「処理する」という用語は、例えば、試薬、診断薬、結合組成物によって、又は別の種類の細胞によってｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｅｘ ｖｉｖｏで細胞を処理することも意味する。「処理する」は、ヒト、獣医又は研究対象に適用される場合、治療的処理、予防又は予防措置、研究及び診断用途を意味する。

【0113】

「治療」は、内用又は外用治療剤、例えば本開示の化合物のいずれか１つを含む組成物を、治療剤が治療効果を有することが知られている１つ又は複数の疾患症状を有する（又は有することが疑われる、又は罹患しやすい）患者（又は被験体）に適用することを意味する。一般に、治療剤は、治療を受ける患者（若しくは被験体）又は集団の１つ又は複数の疾患症状を緩和するのに有効な量で投与され、そのような症状の退行を誘導するか、そのような症状の発現を臨床的に検出可能な程度まで抑制する。任意の特定の疾患症状を緩和するのに有効な治療剤の量（「治療有効量」とも呼ばれる）は、様々な要因、例えば患者（又は被験体）の病状、年齢及び体重並びに患者（又は被験体）において所望の治療効果をもたらす薬剤の能力などによって異なる場合がある。疾患の症状が緩和されたかどうかは、医師又は他の医療専門家によって一般的に使用されて、症状の重症度又は進行度を評価する任意の臨床試験方法によって評価することができる。本開示の実施形態（例えば、治療方法又は製品）は、各標的疾患症状を緩和する効果はないが、スチューデントのｔ検定、カイ二乗検定、マン・アンド・ホイットニーのＵ検定、クラスカル・ウォリス検定（Ｈ検定）、ヨンクヒール・タプストラ検定及びウィルコクソン検定などの当該技術分野で知られている任意の統計的検定方法に従って決定される、統計的に有意な数の患者（又は被験体）において標的疾患症状を軽減するものとする。

【0114】

「アミノ酸の保存的修飾」又は「アミノ酸の保存的置換」とは、タンパク質又はポリペプチド中のアミノ酸を、同様の特性（例えば、電荷、側鎖のサイズ、疎水性／親水性、主鎖の構造及び剛性等）を有する他のアミノ酸で置換することで、タンパク質又はポリペプチドの生物活性又は他の必要な特性（例えば、抗原親和性及び／若しくは特異性）を変えることなく頻繁な変更を可能にすることを指す。当業者は、一般に、ポリペプチドの非必須領域における単一のアミノ酸置換が生物活性を実質的に変化させないことを知っている（例えば、Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ，Ｔｈｅ Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｐａｇｅ ２２４，（４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ）を参照）。さらに、類似の構造又は機能を有するアミノ酸の置換は、生物活性を破壊する可能性が低い。例示的な保存的置換は、以下の表「アミノ酸の例示的な保存的置換」に記載されている。

【表4】

【0115】

「有効量」、「有効用量」は、１つ又は複数の有益な若しくは所望の治療結果を得るために必要な薬剤、化合物又は医薬組成物の量を指す。予防的用途の場合、有益な又は所望の結果には、リスクの排除若しくは低減、重症度の低減又は疾患の生化学的、組織学的及び／若しくは行動学的症状、それらの合併症並びに疾患の発生過程で現れる中間的な病理学的表現型を含む疾患の発症の遅延が挙げられる。治療用途の場合、有益な又は所望の結果には、例えば、本開示の様々な標的抗原関連障害の発生率を低減させる、又は障害の１つ若しくは複数の症状を改善する、障害の治療に必要な他の薬剤の用量を低減させる、別の薬剤の治療効果を増強させる、及び／又は患者（若しくは被験体）における本開示の標的抗原関連障害の進行を遅らせる臨床結果が含まれる。

【0116】

「外因性」とは、状況に応じて生物、細胞又は人体の外部で生成される物質を指す。

【0117】

「内因性」とは、状況に応じて細胞、生物又は人間の内部で生成される物質を指す。

【0118】

「単離された」とは、精製された状態を意味し、この場合、指定の分子が他の生体分子、例えば核酸、タンパク質、脂質、炭水化物又は他の物質、例えば細胞残屑及び増殖培地を実質的に含まないことを意味する。一般に、「単離された」という用語は、本明細書に記載されている化合物の実験的又は治療的使用を著しく妨げる量で存在しない限り、これらの物質が完全に存在しないこと、又は水、緩衝剤若しくは塩が存在しないことを意味するものではない。

【0119】

「任意選択の」又は「任意選択で」とは、用語の後に続く事象又は環境が発生する可能性はあるが、必ずしも発生する必要はないことを意味し、本記述には、事象又は環境が発生する場合又は発生しない場合が含まれる。

【0120】

「医薬組成物」は、本開示に記載されている１つ又は複数の化合物、又はその生理学的／薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグ、並びにその他の化学組成物、例えば生理学的／薬学的に許容される担体及び賦形剤を含む混合物を意味する。医薬組成物の目的は、生物への投与を促進することで、有効成分の吸収を容易にし、それによって生物活性を発揮することである。

【0121】

「薬学的に許容される担体」という用語は、抗体又は抗原結合フラグメントの送達用製剤に使用するのに適した任意の不活性物質を指す。担体は、付着防止剤、結合剤、コーティング剤、崩壊剤、充填剤又は希釈剤、防腐剤（酸化防止剤、抗菌剤若しくは抗真菌剤等）、甘味料、吸収遅延剤、湿潤剤、乳化剤、緩衝剤等であり得る。適切な薬学的に許容される担体の例としては、水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロパンジオール、ポリエチレングリコール等）、デキストロース、植物油（例えばオリーブオイル）、生理食塩水、緩衝剤、緩衝生理食塩水及び等張剤、例えばサッカライド、ポリオール、ソルビトール及び塩化ナトリウムが挙げられる。

【0122】

さらに、本開示の別の態様は、本開示のモノクローナル抗体若しくは抗体フラグメント、又は融合タンパク質、又は二機能性融合タンパク質（標的抗原を特異的に認識し結合する）を有効成分として用いる、標的抗原の免疫検出又は判定方法、標的抗原の免疫検出又は判定試薬、標的抗原を発現する細胞の免疫検出又は判定方法及び標的抗原陽性細胞に関連する疾患を診断するための診断薬に関するものである。

【0123】

「がん」、「がん性」又は「悪性腫瘍」という用語は、一般的に無秩序な細胞増殖を特徴とする哺乳動物における生理的状態を指す又は説明するものであり、本開示では交換可能に使用される。がん又は悪性腫瘍の例には、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫及び白血病又はリンパ系悪性腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。当該がんのより具体的な例には、以下が含まれる：扁平上皮細胞癌、骨髄腫、小細胞肺がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、頭頸部扁平上皮細胞癌（ＨＮＳＣＣ）、神経膠腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄球性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、原発性縦隔大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、Ｔ細胞／組織球豊富型大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄細胞白血病－１タンパク質（Ｍｃｌ－１）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、消化器（管）がん、腎臓がん、卵巣がん、肝臓がん、リンパ芽球性白血病、リンパ球性白血病、大腸がん、子宮内膜がん、腎臓がん、前立腺がん、甲状腺がん、黒色腫、軟骨肉腫、神経芽細胞腫、膵臓がん、多形性膠芽腫、胃がん、骨がん、ユーイング肉腫、子宮頸がん、脳腫瘍、胃がん、膀胱がん、肝がん、乳がん、結腸がん、肝細胞がん（ＨＣＣ）、明細胞腎細胞がん（ＲＣＣ）、頭頸部がん、咽頭喉頭がん、肝胆道がん、中枢神経系がん、食道がん、悪性胸膜中皮腫、全身性軽鎖アミロイドーシス、リンパ形質細胞性リンパ腫、骨髄異形成症候群、骨髄異形成腫瘍、神経内分泌腫瘍、メルケル細胞腫、精巣がん及び皮膚がん。

【0124】

「炎症性疾患」は、過剰な若しくは制御不能な炎症反応により、過剰な炎症症状、宿主組織の損傷又は組織機能の喪失が生じる疾患、障害又は症候群を指す。「炎症性疾患」は、白血球又は好中球の走化性プールによって媒介される病理学的状態も指す。

【0125】

「炎症」は、組織の損傷又は破壊によって引き起こされる局所的な防御反応を指し、有害物質及び損傷した組織を破壊、弱体化又は排除（分離）するために利用される。炎症は、白血球又は好中球の走化性プールと大きく関係している。炎症は、病原体及びウイルスのほか、外傷又は心筋梗塞後の再灌流若しくは脳梗塞などの非感染性の原因、外来性抗原に対する免疫反応及び自己免疫反応などによっても引き起こされる。

【0126】

本開示のモノクローナル抗体又は抗体フラグメントを用いて、標的抗原を発現している細胞を検出又は測定することにより、標的抗原陽性細胞に関連する前述の疾患を診断することができる。

【0127】

ポリペプチドを発現している細胞を検出するために、既知の免疫検出法を用いることができ、好ましくは、免疫沈降法、蛍光細胞染色法、免疫組織化学的染色法などを用いる。さらに、ＦＭＡＴ８１００ＨＴＳシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製）を利用した蛍光抗体染色法を用いることもできる。

【0128】

本開示において、標的抗原の検出又は測定に用いるｉｎ ｖｉｖｏサンプルは、標的抗原を発現する細胞を含む可能性のあるものであれば特に限定されず、例えば、組織球、血液、血漿、血清、膵液、尿、糞便、組織液又は培養液などが挙げられる。

【0129】

必要な診断方法によれば、本開示のモノクローナル抗体又はその抗体フラグメントを含む診断薬は、抗原抗体反応を行うための試薬又は反応を検出するための試薬をさらに含み得る。抗原抗体反応を行うための試薬としては、緩衝剤、塩等が挙げられる。検出に用いる試薬としては、免疫検出法又は測定法に一般的に用いられる試薬、例えば、モノクローナル抗体、その抗体フラグメント又はそのコンジュゲートを認識する標識された二次抗体及びその標識に対応する基質等が挙げられる。

【0130】

本発明の１つ又は複数の実施形態の詳細は、上記の明細書に示されている。本明細書に記載されたものと類似又は同一の任意の方法及び材料を本開示の実施又は試験に使用することができるが、好ましい方法及び材料を以下に記載する。本開示の他の特徴、目的及び利点は、本明細書及び特許請求の範囲を通じて明らかになるであろう。本明細書及び特許請求の範囲において、文脈上明確に示されていない限り、単数形は複数形の場合を含む。別段の定義がない限り、本明細書で使用されている全ての専門用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって理解される一般的な意味を有する。本明細書中で引用されている全ての特許及び刊行物は、参照により組み込まれる。以下の実施例は、本発明で開示される好ましい実施形態をより完全に説明するために提供される。これらの実施例は、本開示の範囲をいかなる方法でも限定するものと解釈されるべきではなく、本開示の範囲は、特許請求の範囲によって定義される。

【実施例】

【0131】

（実施例１．ＣＤ４７抗原及び検出用タンパク質の調製）
ＵｎｉＰｒｏｔ白血球表面抗原ＣＤ４７（ヒトＣＤ４７タンパク質、Ｕｎｉｐｒｏｔ番号：Ｑ０８７２２）をＣＤ４７のテンプレートとして使用した。本開示に関わる抗原と検出用タンパク質のアミノ酸配列を設計し、あるいはＣＤ４７タンパク質をベースに様々なタグ（ｈｉｓタグ又はＦｃ等）を融合させた。
１．Ｈｉｓタグ付きＣＤ４７タンパク質の細胞外ドメイン（ＣＤ４７－ＥＣＤ－Ｈｉｓ）：（配列番号３）
ＱＬＬＦＮＫＴＫＳＶＥＦＴＦＣＮＤＴＶＶＩＰＣＦＶＴＮＭＥＡＱＮＴＴＥＶＹＶＫＷＫＦＫＧＲＤＩＹＴＦＤＧＡＬＮＫＳＴＶＰＴＤＦＳＳＡＫＩＥＶＳＱＬＬＫＧＤＡＳＬＫＭＤＫＳＤＡＶＳＨＴＧＮＹＴＣＥＶＴＥＬＴＲＥＧＥＴＩＩＥＬＫＹＲＶＶＳＷＦＳＰＮＥＨＨＨＨＨＨ
注：下線部は６×ｈｉｓタグである。
２．検出試薬としてのＣＤ４７細胞外ドメインとヒトＩｇＧ１Ｆｃとの融合タンパク質（ＣＤ４７－ＥＣＤ－Ｆｃ）：（配列番号４）
ＱＬＬＦＮＫＴＫＳＶＥＦＴＦＣＮＤＴＶＶＩＰＣＦＶＴＮＭＥＡＱＮＴＴＥＶＹＶＫＷＫＦＫＧＲＤＩＹＴＦＤＧＡＬＮＫＳＴＶＰＴＤＦＳＳＡＫＩＥＶＳＱＬＬＫＧＤＡＳＬＫＭＤＫＳＤＡＶＳＨＴＧＮＹＴＣＥＶＴＥＬＴＲＥＧＥＴＩＩＥＬＫＹＲＶＶＳＷＦＳＰＮＥＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
注：下線部はヒトＩｇＧ１－Ｆｃ部位である。
３．結合及び遮断検出試薬としてのヒトＳＩＲＰαとヒトＩｇＧ１Ｆｃとの融合タンパク質（ＳＩＲＰα－Ｆｃ）：（配列番号５）
ＥＥＥＬＱＩＩＱＰＤＫＳＶＳＶＡＡＧＥＳＡＩＬＨＣＴＩＴＳＬＦＰＶＧＰＩＱＷＦＲＧＡＧＰＡＲＶＬＩＹＮＱＲＱＧＰＦＰＲＶＴＴＶＳＥＴＴＫＲＥＮＭＤＦＳＩＳＩＳＮＩＴＰＡＤＡＧＴＹＹＣＩＫＦＲＫＧＳＰＤＴＥＦＫＳＧＡＧＴＥＬＳＶＲＡＫＰＳＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
注：下線部はヒトＩｇＧ１－Ｆｃ部位である。
４．Ｈｉｓタグ付きＳＩＲＰαタンパク質の細胞外ドメイン（ＳＩＲＰα－Ｈｉｓ）
ＥＥＥＬＱＶＩＱＰＤＫＳＶＳＶＡＡＧＥＳＡＩＬＨＣＴＶＴＳＬＩＰＶＧＰＩＱＷＦＲＧＡＧＰＡＲＥＬＩＹＮＱＫＥＧＨＦＰＲＶＴＴＶＳＥＳＴＫＲＥＮＭＤＦＳＩＳＩＳＮＩＴＰＡＤＡＧＴＹＹＣＶＫＦＲＫＧＳＰＤＴＥＦＫＳＧＡＧＴＥＬＳＶＲＡＫＰＳＨＨＨＨＨＨ（配列番号１３２）。

【0132】

（実施例２．ＣＤ４７及びＳＩＲＰα関連組換えタンパク質の精製）
１．Ｈｉｓタグ付き組換えタンパク質の精製工程：
細胞発現上清を高速遠心して不純物を除去し、緩衝液をＰＢＳに置き換え、イミダゾールを最終濃度が５ｍＭになるように添加した。ニッケルカラムを５ｍＭイミダゾールを含むＰＢＳ溶液で平衡化し、カラム容量を２～５回洗浄した。置換後の上清サンプルをＩＭＡＣカラムに充填した。Ａ２８０の読み取り値がベースラインに下がるまで、５ｍＭイミダゾールを含むＰＢＳ溶液でカラムを洗浄した。その後、クロマトグラフィーカラムをＰＢＳ＋１０ｍＭイミダゾールで洗浄し、非特異的に結合したタンパク質不純物を除去して、流出液を回収した。続いて、３００ｍＭイミダゾールを含むＰＢＳ溶液で標的タンパク質を溶出し、溶出ピークを回収した。回収した溶出液を濃縮し、移動相をＰＢＳとしたゲルクロマトグラフィーＳｕｐｅｒｄｅｘ２００（ＧＥ社製、２８－９８９３－３５）でさらに精製した。多量体ピークを除去し、溶出ピークを回収した。得られたタンパク質を電気泳動、ペプチドマップ及びＬＣ－ＭＳで同定した後、分注して使用した。

【0133】

得られたＨｉｓタグ付きＣＤ４７－ＥＣＤ－Ｈｉｓ（配列番号３）を、本開示の抗体の免疫原又は検出試薬として使用した。ＣＤ４７－ＥＣＤ－Ｈｉｓは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの化学的手法によりＫＬＨタンパク質とカップリング反応させた後、マウスの免疫を刺激する免疫原として使用することもできる。

【0134】

２．ＣＤ４７－ＥＣＤ－Ｆｃ及びＳＩＲＰα－Ｆｃ融合タンパク質の精製工程：
細胞発現上清を高速遠心して不純物を除去した後、上清をＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ（ＧＥ、１７－５４３８－０１）アフィニティクロマトグラフィーにかけた。ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅカラムは、最初に０．１ＭのＮａＯＨで再生し、純水で洗浄した後、ＰＢＳで平衡化した。上清を結合させた後、Ａ２８０の読み取り値がベースラインに下がるまでＰＢＳでカラムを洗浄した。標的タンパク質を０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ３．５）で溶出し、１Ｍトリス－ＨＣｌで中和した。溶出したサンプルを適切に濃縮した後、ＰＢＳ平衡化ゲルクロマトグラフィーＳｕｐｅｒｄｅｘ２００（ＧＥ社製、２８－９８９３－３５）でさらに精製した。標的タンパク質を含む収集チューブをプールし、適切な濃度に濃縮した。

【0135】

この方法を使用して、ＣＤ４７－ＥＣＤ－Ｆｃ（配列番号４）及びＳＩＲＰα－Ｆｃ（配列番号５）融合タンパク質を精製した。この方法を使用して、本開示に関わるヒト化抗体タンパク質を精製することも可能である。

【0136】

（実施例３．抗ＰＤ－Ｌ１ヒト化抗体（ＩｇＧ４－Ｓ２２８Ｐ形態）の構築及び発現）
抗ＰＤ－Ｌ１抗体の軽鎖及び重鎖可変領域は、ＷＯ２０１７０８４４９５Ａ１の抗ＰＤ－Ｌ１抗体から改変されており、その配列及び関連する特性は、出願番号ＰＣＴ／ＣＮ２０１９／０７０９８２のＰＣＴ出願に記録されており、その内容全体が本出願に組み込まれている。
抗ＰＤ－Ｌ１抗体９－２ Ｈ５Ｌ１１：
９－２ Ｈ５重鎖可変領域（配列番号６）
ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＧＳＩＳＤＧＳＡＹＷＳＷＩＲＱＨＰＧＫＧＬＥＹＩＧＦＩＳＲＡＧＳＴＹＮＴＰＳＬＫＧＲＶＴＩＳＲＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＧＧＷＬＡＰＦＤＹＷＧＲＧＴＬＶＴＶＳＳ
９－２ Ｌ１１軽鎖可変領域（配列番号７）
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＬＦＹＨＳＮＱＫＨＳＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＧＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＹＹＧＹＰＹＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
抗ＰＤ－Ｌ１抗体 ２４Ｄ５ Ｈ１２Ｌ６１：
２４Ｄ５ Ｈ１２重鎖可変領域（配列番号８）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＷＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＲＩＴＰＳＳＧＦＡＭＹＮＥＫＦＫＮＲＶＴＭＴＲＤＴＳＴＳＴＶＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＧＳＳＹＤＹＦＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
２４Ｄ５ Ｌ６１軽鎖可変領域（配列番号９）
ＤＩＶＬＴＱＳＰＡＳＬＡＶＳＰＧＱＲＡＴＩＴＣＲＡＳＥＳＶＳＩＨＧＴＨＬＭＨＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＡＡＳＮＬＥＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＮＰＶＥＡＥＤＴＡＮＹＹＣＱＱＳＦＥＤＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
注：上記の抗体９－２及び２４Ｄ５に由来する軽鎖及び重鎖可変領域の下線が引かれたＣＤＲは、Ｋａｂａｔのナンバリング基準で定義されたＣＤＲである。

【表5】

【0137】

プライマーを設定した；各ヒト化抗体ＶＨ／ＶＫ遺伝子フラグメントをＰＣＲで構築した後、発現ベクターｐＨｒ（シグナルペプチド及び定常領域遺伝子（ＣＨ１－ＦＣ／ＣＬ）フラグメントを含む）との相同組換えを行い、全長抗体を発現するベクターＶＨ－ＣＨ１－ＦＣ－ｐＨｒ／ＶＫ－ＣＬ－ｐＨｒを構築した。

【0138】

ＩｇＧ４－Ｓ２２８Ｐ重鎖定常領域の配列は以下の通りであった：（配列番号１０）
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ

【0139】

ＩｇＧ１重鎖定常領域の配列は以下の通りであった：（配列番号１１）
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ

【0140】

抗体の軽鎖（カッパ鎖）定常領域の配列は以下の通りであった：（配列番号１２）
ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ

【0141】

構築された完全長抗体は以下の通りであった：
抗ＰＤ－Ｌ１ ＩｇＧ４抗体 ｈ１８３０
ｈ１８３０重鎖（配列番号１３）
ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＧＳＩＳＤＧＳＡＹＷＳＷＩＲＱＨＰＧＫＧＬＥＹＩＧＦＩＳＲＡＧＳＴＹＮＴＰＳＬＫＧＲＶＴＩＳＲＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＧＧＷＬＡＰＦＤＹＷＧＲＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ
ｈ１８３０軽鎖（配列番号１４）
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＬＦＹＨＳＮＱＫＨＳＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＧＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＹＹＧＹＰＹＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
抗ＰＤ－Ｌ１ ＩｇＧ４抗体 ｈ１８３０Ｇ１
ｈ１８３０Ｇ１重鎖：（配列番号１５）
ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＧＳＩＳＤＧＳＡＹＷＳＷＩＲＱＨＰＧＫＧＬＥＹＩＧＦＩＳＲＡＧＳＴＹＮＴＰＳＬＫＧＲＶＴＩＳＲＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＧＧＷＬＡＰＦＤＹＷＧＲＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
ｈ１８３０Ｇ１軽鎖（ｈ１８３０軽鎖のものと同じ、配列番号１４）：
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＬＦＹＨＳＮＱＫＨＳＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＧＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＹＹＧＹＰＹＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
ＰＤ－Ｌ１抗体ｈ１８３１：
ｈ１８３１重鎖（配列番号１６）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＷＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＲＩＴＰＳＳＧＦＡＭＹＮＥＫＦＫＮＲＶＴＭＴＲＤＴＳＴＳＴＶＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＧＳＳＹＤＹＦＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ
ｈ１８３１軽鎖（配列番号１７）
ＤＩＶＬＴＱＳＰＡＳＬＡＶＳＰＧＱＲＡＴＩＴＣＲＡＳＥＳＶＳＩＨＧＴＨＬＭＨＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＡＡＳＮＬＥＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＮＰＶＥＡＥＤＴＡＮＹＹＣＱＱＳＦＥＤＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
抗ＰＤ－Ｌ１ ＩｇＧ１抗体 ｈ１８３１Ｇ１
ｈ１８３０Ｇ１重鎖：（配列番号１８）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＷＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＲＩＴＰＳＳＧＦＡＭＹＮＥＫＦＫＮＲＶＴＭＴＲＤＴＳＴＳＴＶＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＧＳＳＹＤＹＦＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
ｈ１８３１Ｇ１軽鎖（ｈ１８３１軽鎖のものと同じ、配列番号１７）
ＤＩＶＬＴＱＳＰＡＳＬＡＶＳＰＧＱＲＡＴＩＴＣＲＡＳＥＳＶＳＩＨＧＴＨＬＭＨＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＡＡＳＮＬＥＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＮＰＶＥＡＥＤＴＡＮＹＹＣＱＱＳＦＥＤＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ。

【0142】

（実施例４．ＳＩＲＰγ変異体のスクリーニング及び調製）
（４．１ ＳＩＲＰγの親和性成熟ファージライブラリの構築及びライブラリのスクリーニング）
高親和性ＣＤ４７受容体を得るために、ＣＤ４７受容体ＳＩＲＰγのＤ１ドメインに対して、ファージディスプレイプラットフォーム技術により親和性成熟を行った。野生型ＳＩＲＰγをベースに、ＣＤ４７結合ドメインを指向する親和性成熟ファージライブラリを設計及び調製し、新たなＳＩＲＰγ変異体についてのスクリーニングを行った。野生型ＳＩＲＰγのＤ１ドメインの特定の配列は以下の通りであった。
野生型ＳＩＲＰγペプチドのＤＮＡコーディング配列：（配列番号１９）
ＧＡＧＧＡＧＧＡＧＣＴＡＣＡＧＡＴＧＡＴＴＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＡＧＣＴＣＣＴＧＴＴＧＧＴＣＡＣＡＧＴＴＧＧＡＡＡＧＡＣＡＧＣＣＡＣＴＣＴＧＣＡＣＴＧＣＡＣＴＧＴＧＡＣＣＴＣＣＣＴＧＣＴＴＣＣＣＧＴＧＧＧＡＣＣＣＧＴＣＣＴＧＴＧＧＴＴＣＡＧＡＧＧＡＧＴＴＧＧＡＣＣＡＧＧＣＣＧＧＧＡＡＴＴＡＡＴＣＴＡＣＡＡＴＣＡＡＡＡＡＧＡＡＧＧＣＣＡＣＴＴＣＣＣＣＡＧＧＧＴＡＡＣＡＡＣＡＧＴＴＴＣＡＧＡＣＣＴＣＡＣＡＡＡＧＡＧＡＡＡＣＡＡＣＡＴＧＧＡＣＴＴＴＴＣＣＡＴＣＣＧＣＡＴＣＡＧＴＡＧＣＡＴＣＡＣＣＣＣＡＧＣＡＧＡＴＧＴＣＧＧＣＡＣＡＴＡＣＴＡＣＴＧＴＧＴＧＡＡＧＴＴＴＣＧＡＡＡＡＧＧＧＡＧＣＣＣＴＧＡＧＡＡＣＧＴＧＧＡＧＴＴＴＡＡＧＴＣＴＧＧＡＣＣＡＧＧＣＡＣＴＧＡＧＡＴＧＧＣＴＴＴＧＧＧＴＧＣＣＡＡＡＣＣＣＴＣＴ
野生型ＳＩＲＰγペプチド：（配列番号２０）
ＥＥＥＬＱＭＩＱＰＥＫＬＬＬＶＴＶＧＫＴＡＴＬＨＣＴＶＴＳＬＬＰＶＧＰＶＬＷＦＲＧＶＧＰＧＲＥＬＩＹＮＱＫＥＧＨＦＰＲＶＴＴＶＳＤＬＴＫＲＮＮＭＤＦＳＩＲＩＳＳＩＴＰＡＤＶＧＴＹＹＣＶＫＦＲＫＧＳＰＥＮＶＥＦＫＳＧＰＧＴＥＭＡＬＧＡＫＰＳ。

【0143】

ファージライブラリの構築：縮重プライマーを設計し、設計した変異アミノ酸をＰＣＲによりＳＩＲＰγファージ変異体ライブラリに導入し、各ライブラリのサイズを約１０^９とした。

【0144】

ＳＩＲＰγファージ変異体ライブラリのスクリーニング：パッケージ化されたＳＩＲＰγファージ変異体ライブラリ（１×１０^１２ －１×１０^１３）と１００μｌのストレプトアビジン・マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、カリフォルニア州オーバーン）を、２％スキムミルクを含む１ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＭＰＢＳと略す）に加え、室温で１時間インキュベートした後、磁気スタンドに置き、上清を回収した。上清に１０μｇ／ｍｌのビオチン化ヒトＣＤ４７－ＥＣＤ－ｈｉｓタンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社から購入）を加え、室温で１時間インキュベートした。ストレプトアビジンでコーティングした磁気ビーズ１００μｌ（１ｍｌのＭＰＢＳでプレインキュベートしたもの）を加え、室温で１時間インキュベートした。サンプルを磁気スタンドシステムに載せて選別し、上清を除去した。１ｍｌのＰＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０を含むリン酸緩衝液）を加え、数回ひっくり返した。上清を完全に除去した後、新鮮な洗浄溶液を加え、この工程を１１回繰り返して未結合の変異体を除去し、０．５ｍｌの溶出溶液（４５０μｌのＰＢＳに５０μｌの１０ｍｇ／ｍｌトリプシンストック溶液を加えたもの）を加えた。サンプルを室温で１５分間振とうした後、磁気スタンドに置き、上清を新しいＥＰチューブに移した。ＴＧ１を２ＹＴ培地に播種し、細菌密度がＯＤ６００＝０．４になるまで増殖させた。１．７５ｍｌのＴＧ１（ＯＤ６００＝０．４）を各チューブに加え、２５０μｌの溶出ファージを加え、３７℃の水浴で３０分間インキュベートし、グラジエント希釈したプレートに広げて力価を測定した。残りのＴＧ１溶液を遠心分離してプレートに広げ、３７℃で一晩インキュベートした。

【0145】

ＳＩＲＰγファージ変異体ライブラリには、ビオチン化したヒトＣＤ４７－ＥＣＤ－ｈｉｓタンパク質抗原を使用し、ＭＡＣＳスクリーニング（ストレプトアビジン磁気ビーズ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）の第２～３ラウンドの後、野生型ＳＩＲＰγよりも高い親和性を持つファージ変異体モノクローンを最終的に得て、配列決定検証にかけた。配列決定したクローンを比較及び分析した。冗長配列を除去した後、哺乳動物細胞において発現させるために非冗長配列をＰＤＬ１－ＣＤ４７二機能性融合タンパク質に変換した。

【0146】

（４．２ ＳＩＲＰγの親和性成熟酵母ライブラリの構築及びライブラリのスクリーニング）
より親和性の高いＣＤ４７受容体を得るために、ＣＤ４７受容体ＳＩＲＰγ－Ｄ１ドメインの親和性成熟化を酵母ディスプレイプラットフォーム技術によって実施した。ＳＩＲＰγ－Ｄ１をベースに、ＣＤ４７結合ドメインを指向した親和性成熟酵母ライブラリを設計及び調製し、新たなＳＩＲＰγ変異体についてのスクリーニングを行った。

【0147】

酵母ライブラリの構築：縮重プライマーを設計し、設計した変異アミノ酸をＰＣＲによりＳＩＲＰγ変異体ライブラリに導入し、各ライブラリのサイズを約１０^９とした。構築した酵母ライブラリの多様性を、第二世代配列決定法により確認した。

【0148】

スクリーニングの第１ラウンドでは、ＳＩＲＰγ変異体ライブラリからの約５×１０^１０個の細胞と、１０μｇ／ｍｌのビオチン化ヒトＣＤ４７－Ｆｃタンパク質とを、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むリン酸緩衝液（ＰＢＳＡと表記）５０ｍｌ中で、室温で１時間インキュベートした。その後、混合液を０．１％ＰＢＳＡで３回洗浄し、未結合の抗体フラグメントを除去した。次に、ビオチン化ヒトＣＤ４７－Ｆｃタンパク質と結合したＳＩＲＰγ変異体ライブラリに、ストレプトアビジンビーズ（Ｍｉｌｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、カリフォルニア州オーバーン）を１００μｌ加え、ＡｕｔｏＭＡＣＳシステムに載せて選別を行った。ＣＤ４７－Ｆｃに対して高い親和性を持つライブラリ細胞を回収した後、ＳＤＣＡＡ培地（２０ｇのデキストロース、６．７ｇのアミノ酸不含Ｄｉｆｃｏ酵母窒素源、５ｇのバクトカゼインアミノ酸、５．４ｇのＮａ_２ＨＰＯ_４及び８．５６ｇのＮａＨ_２ＰＯ_４・Ｈ_２Ｏを１Ｌの蒸留水に溶解したもの）において、３０℃、２５０ｒｐｍで２４時間増殖させた。その後、培養を、ＳＧＣＡＡ培地（２０ｇのガラクトース、６．７ｇのアミノ酸不含Ｄｉｆｃｏ酵母窒素源、５ｇのバクトカゼインアミノ酸、５．４ｇのＮａ_２ＨＰＯ_４及び８．５６ｇのＮａＨ_２ＰＯ_４・Ｈ_２Ｏを１Ｌの蒸留水に溶解したもの）に、２０℃、２５０ｒｐｍで１８時間誘導した。得られた濃縮ライブラリを、ビオチン化組換えヒトＣＤ４７－Ｆｃとの結合についてスクリーニングの第２ラウンドにかけた。スクリーニングの第２及び／又は第３ラウンド用の抗体ライブラリの多様性を十分に確保するために、入力細胞数として前ラウンドの１００倍のライブラリサイズを用いた。

【0149】

スクリーニングの第３及び第４ラウンドでは、前ラウンドのライブラリ細胞を、０．１％ＰＢＳＡ中の１μｇ／ｍｌのビオチン化ヒトＣＤ４７－Ｆｃタンパク質及び１０μｇ／ｍｌのマウス抗ｃＭｙｃ抗体（９Ｅ１０、ｓｉｇｍａ）とともに、室温で１時間インキュベートした。この混合液を０．１％ＰＢＳＡで３回洗浄し、未結合の抗体フラグメントを除去した。ヤギ抗マウスＡｌｅｘａ４８８（Ａ－１１００１、ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及びＳｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ－ＰＥ （Ｓ－８６６、Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を加え、４℃で１時間インキュベートした。この混合液を０．１％ＰＢＳＡで３回洗浄し、未結合の抗体フラグメントを除去した。最後に、親和性の高いＳＩＲＰγ変異体をＦＡＣＳスクリーニング（ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａＴＭ ＦＵＳＩＯＮ）でスクリーニングした。

【0150】

ビオチン化ヒトＣＤ４７－Ｆｃ抗原をＳＩＲＰγ変異体ライブラリに使用した：ＭＡＣＳスクリーニング（ストレプトアビジン磁気ビーズ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の第２～３ラウンド及びＦＡＣＳスクリーニング（ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａＴＭ ＦＵＳＩＯＮ）の第２～３ラウンドを実施した。その後、約４００個の酵母モノクローンを培養及び発現誘導用に選択した。酵母モノクローンのヒトＣＤ４７－Ｆｃ抗原への結合はＦＡＣＳ（ＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩ）を用いて検出し、野生型ＳＩＲＰγよりも高い親和性を持つ酵母モノクローンを選択し、配列決定検証にかけた。配列決定したクローンを比較及び分析した。冗長配列を除去した後、哺乳動物細胞において発現させるために非冗長配列をＰＤＬ１－ＣＤ４７二機能性融合タンパク質に変換した。

【0151】

スクリーニング後、最終的に得られたＳＩＲＰγペプチドバリアントは以下の通りであった：
Ｓ５８（配列番号２１）
ＥＥＥＬＱＭＩＱＰＥＫＬＬＬＶＴＶＧＥＴＡＴＬＨＣＴＶＴＳＬＬＰＶＧＰＶＬＷＦＲＧＶＧＰＧＲＥＬＩＹＭＳＧＲＧＨＦＰＲＶＴＴＶＳＤＬＴＫＲＮＮＭＤＦＳＩＲＩＳＳＩＴＰＡＤＶＧＴＹＹＣＶＫＦＲＫＧＳＰＥＤＶＥＦＫＳＧＰＧＴＥＭＡＬＧＡＫＰＳ
Ｓ７９（配列番号２２）
ＥＥＥＬＱＭＩＱＰＥＫＬＬＬＶＴＶＧＥＴＡＴＬＨＣＴＶＴＳＬＷＰＶＧＰＶＬＷＦＲＧＶＧＰＧＲＥＬＩＹＲＴＧＴＧＲＦＰＲＶＴＴＶＳＤＬＴＫＲＮＮＭＤＦＳＩＲＩＳＳＩＴＰＡＤＶＧＴＹＹＣＶＫＦＲＫＧＳＰＥＤＶＥＦＫＳＧＰＧＴＥＶＡＬＧＡＫＰＳ
Ｓ１５（配列番号２３）
ＥＥＥＬＱＭＩＱＰＥＫＬＬＬＶＴＶＧＥＴＡＴＬＨＣＴＶＴＳＬＬＰＶＧＰＶＬＷＦＲＧＶＧＰＧＲＥＬＩＹＶＳＧＲＧＨＦＰＲＶＴＴＶＳＤＬＴＫＲＥＮＲＤＦＳＩＲＩＳＳＩＴＰＡＤＶＧＴＹＹＣＶＫＦＲＫＧＳＰＥＤＶＥＦＫＳＧＰＧＴＥＭＡＬＧＡＫＰＳ
Ｓ１２（配列番号２４）
ＥＥＥＬＱＭＩＱＰＥＫＬＬＬＶＴＶＧＥＴＡＴＬＨＣＴＶＴＳＬＬＰＶＧＰＶＬＷＦＲＧＶＧＰＧＲＥＬＩＹＶＳＧＲＧＨＦＰＲＶＴＴＶＳＤＬＴＫＲＥＮＫＤＦＳＩＲＩＳＳＩＴＰＡＤＶＧＴＹＹＣＶＫＦＲＫＧＳＰＥＤＶＥＦＫＳＧＰＧＴＥＭＡＬＧＡＫＰＳ
Ｓ１９（配列番号２５）
ＥＥＥＬＱＭＩＱＰＥＫＬＬＬＶＴＶＧＥＴＡＴＬＨＣＴＶＴＳＬＬＰＶＧＰＶＬＷＦＲＧＶＧＰＧＲＥＬＩＹＶＳＧＲＧＨＦＰＲＶＴＴＶＳＤＬＴＫＲＮＮＲＤＦＳＩＲＩＳＳＩＴＰＡＤＶＧＴＹＹＣＶＫＦＲＫＧＳＰＥＤＶＥＦＫＳＧＰＧＴＥＭＡＬＧＡＫＰＳ
Ｓ８５（配列番号２６）
ＥＥＥＬＱＭＩＱＰＥＫＬＬＬＶＴＶＧＥＴＡＴＬＨＣＴＶＴＳＬＬＰＶＧＰＶＬＷＦＲＧＶＧＰＧＲＥＬＩＹＶＳＧＲＧＨＦＰＲＶＴＴＶＳＤＬＴＫＲＮＮＫＤＦＳＩＲＩＳＳＩＴＰＡＤＶＧＴＹＹＣＶＫＦＲＫＧＳＰＥＤＶＥＦＫＳＧＰＧＴＥＭＡＬＧＡＫＰＳ
Ｓ３７（配列番号２７）
ＥＥＥＬＱＭＩＱＰＥＫＬＬＬＶＴＶＧＥＴＡＴＬＨＣＴＶＴＳＬＬＰＶＧＰＶＬＷＦＲＧＶＧＰＧＲＥＬＩＹＭＳＧＲＧＨＦＰＲＶＴＴＶＳＤＬＴＫＲＮＮＫＤＦＳＩＲＩＳＳＩＴＰＡＤＶＧＴＹＹＣＶＫＦＲＫＧＳＰＥＤＶＥＦＫＳＧＰＧＴＥＭＡＬＧＡＫＰＳ
Ｓ３８（配列番号２８）
ＥＥＥＬＱＭＩＱＰＥＫＬＬＬＶＴＶＧＥＴＡＴＬＨＣＴＶＴＳＬＬＰＶＧＰＶＬＷＦＲＧＶＧＰＧＲＥＬＩＹＦＳＧＲＧＨＦＰＲＶＴＴＶＳＤＬＴＫＲＮＮＭＤＦＳＩＲＩＳＳＩＴＰＡＤＶＧＴＹＹＣＶＫＦＲＫＧＳＰＥＤＶＥＦＫＳＧＰＧＴＥＭＡＬＧＡＫＰＳ
Ｓ２２（配列番号２９）
ＥＥＥＬＱＭＩＱＰＥＫＬＬＬＶＴＶＧＥＴＡＴＬＨＣＴＶＴＳＬＬＰＶＧＰＶＬＷＦＲＧＶＧＰＧＲＥＬＩＹＩＳＧＲＧＨＦＰＲＶＴＴＶＳＤＬＴＫＲＮＮＭＤＦＳＩＲＩＳＳＩＴＰＡＤＶＧＴＹＹＣＶＫＦＲＫＧＳＰＥＤＶＥＦＫＳＧＰＧＴＥＭＡＬＧＡＫＰＳ
Ｓ２９（配列番号３０）
ＥＥＥＬＱＭＩＱＰＥＫＬＬＬＶＴＶＧＥＴＡＴＬＨＣＴＶＴＳＬＬＰＶＧＰＶＬＷＦＲＧＶＧＰＧＲＥＬＩＹＬＳＧＲＧＨＦＰＲＶＴＴＶＳＤＬＴＫＲＮＮＭＤＦＳＩＲＩＳＳＩＴＰＡＤＶＧＴＹＹＣＶＫＦＲＫＧＳＰＥＤＶＥＦＫＳＧＰＧＴＥＭＡＬＧＡＫＰＳ
Ｓ３４（配列番号３１）
ＥＥＥＬＱＭＩＱＰＥＫＬＬＬＶＴＶＧＥＴＡＴＬＨＣＴＶＴＳＬＬＰＶＧＰＶＬＷＦＲＧＶＧＰＧＲＥＬＩＹＲＳＧＲＧＨＦＰＲＶＴＴＶＳＤＬＴＫＲＮＮＭＤＦＳＩＲＩＳＳＩＴＰＡＤＶＧＴＹＹＣＶＫＦＲＫＧＳＰＥＤＶＥＦＫＳＧＰＧＴＥＭＡＬＧＡＫＰＳ
Ｓ４１（配列番号３２）
ＥＥＥＬＱＭＩＱＰＥＫＬＬＬＶＴＶＧＥＴＡＴＬＨＣＴＶＴＳＬＬＰＶＧＰＶＬＷＦＲＧＶＧＰＧＲＥＬＩＹＶＳＧＲＧＨＦＰＲＶＴＴＶＳＤＬＴＫＲＮＮＭＤＦＳＩＲＩＳＳＩＴＰＡＤＶＧＴＹＹＣＶＫＦＲＫＧＳＰＥＤＶＥＦＫＳＧＰＧＴＥＭＡＬＧＡＫＰＳ
Ｓ４２（配列番号３３）
ＥＥＥＬＱＭＩＱＰＥＫＬＬＬＶＴＶＧＥＴＡＴＬＨＣＴＶＴＳＬＬＰＶＧＰＶＬＷＦＲＧＶＧＰＧＲＥＬＩＹＭＳＧＲＧＨＦＰＲＶＴＴＶＳＤＬＴＫＲＮＮＩＤＦＳＩＲＩＳＳＩＴＰＡＤＶＧＴＹＹＣＶＫＦＲＫＧＳＰＥＤＶＥＦＫＳＧＰＧＴＥＭＡＬＧＡＫＰＳ
Ｓ４３（配列番号３４）
ＥＥＥＬＱＭＩＱＰＥＫＬＬＬＶＴＶＧＥＴＡＴＬＨＣＴＶＴＳＬＬＰＶＧＰＶＬＷＦＲＧＶＧＰＧＲＥＬＩＹＭＳＧＲＧＨＦＰＲＶＴＴＶＳＤＬＴＫＲＮＮＲＤＦＳＩＲＩＳＳＩＴＰＡＤＶＧＴＹＹＣＶＫＦＲＫＧＳＰＥＤＶＥＦＫＳＧＰＧＴＥＭＡＬＧＡＫＰＳ
Ｓ４４（配列番号３５）
ＥＥＥＬＱＭＩＱＰＥＫＬＬＬＶＴＶＧＥＴＡＴＬＨＣＴＶＴＳＬＬＰＶＧＰＶＬＷＦＲＧＶＧＰＧＲＥＬＩＹＭＳＧＲＧＨＦＰＲＶＴＴＶＳＤＬＴＫＲＮＮＶＤＦＳＩＲＩＳＳＩＴＰＡＤＶＧＴＹＹＣＶＫＦＲＫＧＳＰＥＤＶＥＦＫＳＧＰＧＴＥＭＡＬＧＡＫＰＳ
Ｓ４５（配列番号３６）
ＥＥＥＬＱＭＩＱＰＥＫＬＬＬＶＴＶＧＥＴＡＴＬＨＣＴＶＴＳＬＬＰＶＧＰＶＬＷＦＲＧＶＧＰＧＲＥＬＩＹＭＳＧＲＧＨＦＰＲＶＴＴＶＳＤＬＴＫＲＤＮＭＤＦＳＩＲＩＳＳＩＴＰＡＤＶＧＴＹＹＣＶＫＦＲＫＧＳＰＥＤＶＥＦＫＳＧＰＧＴＥＭＡＬＧＡＫＰＳ
Ｓ４６（配列番号３７）
ＥＥＥＬＱＭＩＱＰＥＫＬＬＬＶＴＶＧＥＴＡＴＬＨＣＴＶＴＳＬＬＰＶＧＰＶＬＷＦＲＧＶＧＰＧＲＥＬＩＹＭＳＧＲＧＨＦＰＲＶＴＴＶＳＤＬＴＫＲＥＮＫＤＦＳＩＲＩＳＳＩＴＰＡＤＶＧＴＹＹＣＶＫＦＲＫＧＳＰＥＤＶＥＦＫＳＧＰＧＴＥＭＡＬＧＡＫＰＳ
Ｓ４７（配列番号３８）
ＥＥＥＬＱＭＩＱＰＥＫＬＬＬＶＴＶＧＥＴＡＴＬＨＣＴＶＴＳＬＬＰＶＧＰＶＬＷＦＲＧＶＧＰＧＲＥＬＩＹＭＳＧＲＧＨＦＰＲＶＴＴＶＳＤＬＴＫＲＥＮＫＤＦＳＩＲＩＳＳＩＴＰＡＤＶＧＴＹＹＣＶＫＦＲＫＧＳＰＥＤＶＥＦＫＳＧＰＧＴＥＶＡＬＧＡＫＰＳ
Ｓ４８（配列番号３９）
ＥＥＥＬＱＭＩＱＰＥＫＬＬＬＶＴＶＧＥＴＡＴＬＨＣＴＶＴＳＬＬＰＶＧＰＶＬＷＦＲＧＶＧＰＧＲＥＬＩＹＲＳＧＲＧＨＦＰＲＶＴＴＶＳＤＬＴＫＲＮＮＫＤＦＳＩＲＩＳＳＩＴＰＡＤＶＧＴＹＹＣＶＫＦＲＫＧＳＰＥＤＶＥＦＫＳＧＰＧＴＥＭＡＬＧＡＫＰＳ
Ｓ４９（配列番号４０）
ＥＥＥＬＱＭＩＱＰＥＫＬＬＬＶＴＶＧＥＴＡＴＬＨＣＴＶＴＳＬＬＰＶＧＰＶＬＷＦＲＧＶＧＰＧＲＥＬＩＹＲＳＧＲＧＨＦＰＲＶＴＴＶＳＤＬＴＫＲＥＮＫＤＦＳＩＲＩＳＳＩＴＰＡＤＶＧＴＹＹＣＶＫＦＲＫＧＳＰＥＤＶＥＦＫＳＧＰＧＴＥＭＡＬＧＡＫＰＳ。

【0152】

（実施例５．ＰＤ－Ｌ１－ＣＤ４７二機能性融合タンパク質の構築及び発現）
得られた抗ＰＤ－Ｌ１抗体をＳＩＲＰγに連結して融合タンパク質を形成し、ＰＤ－Ｌ１－ＣＤ４７二機能性融合タンパク質を従来の方法による発現及び精製によって得た。

【表6-1】

【表6-2】

【表6-3】

【表6-4】

【表6-5】

【表6-6】

【表6-7】

【表6-8】

【表6-9】

【表6-10】

【表6-11】

【表6-12】

【表6-13】

【表6-14】

【表6-15】

【表6-16】

【表6-17】

【表6-18】

【表6-19】

【表6-20】

【0153】

陽性又は陰性対照として以下のタンパク質も従来の方法により調製し、精製した。
抗ＣＤ４７抗体ｈｕ５Ｆ９（配列はＵＳ０９０１７６７５Ｂより）
Ｈｕ５Ｆ９重鎖（配列番号８３）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＮＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＲＬＥＷＭＧＴＩＹＰＧＮＤＤＴＳＹＮＱＫＦＫＤＲＶＴＩＴＡＤＴＳＡＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＧＹＲＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ；
Ｈｕ５Ｆ９軽鎖（配列番号８４）
ＤＩＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＩＶＹＳＮＧＮＴＹＬＧＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＦＱＧＳＨＶＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ；
ＳＩＲＰα－ＣＶ（Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ＳＩＲＰα Ｖａｒｉａｎｔｓ ａｓ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｄｊｕｖａｎｔｓ ｔｏ Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１３ Ｊｕｌ ５；３４１（６１４１）：８８－９１を参照して合成、配列番号８５）
ＥＥＥＬＱＩＩＱＰＤＫＳＶＬＶＡＡＧＥＴＡＴＬＲＣＴＩＴＳＬＦＰＶＧＰＩＱＷＦＲＧＡＧＰＧＲＶＬＩＹＮＱＲＱＧＰＦＰＲＶＴＴＶＳＤＴＴＫＲＮＮＭＤＦＳＩＲＩＧＮＩＴＰＡＤＡＧＴＹＹＣＩＫＦＲＫＧＳＰＤＤＶＥＦＫＳＧＡＧＴＥＬＳＶＲＡＫＰＳＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ；
ＴＴＩ－６２１：（ＷＯ２０１４０９４１２２Ａ１からの配列、配列番号１３３）
ＥＥＥＬＱＶＩＱＰＤＫＳＶＳＶＡＡＧＥＳＡＩＬＨＣＴＶＴＳＬＩＰＶＧＰＩＱＷＦＲＧＡＧＰＡＲＥＬＩＹＮＱＫＥＧＨＦＰＲＶＴＴＶＳＥＳＴＫＲＥＮＭＤＦＳＩＳＩＳＮＩＴＰＡＤＡＧＴＹＹＣＶＫＦＲＫＧＳＰＤＴＥＦＫＳＧＡＧＴＥＬＳＶＲＡＫＰＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ；
Ｓ５８－Ｆｃ（配列番号８６）
ＥＥＥＬＱＭＩＱＰＥＫＬＬＬＶＴＶＧＥＴＡＴＬＨＣＴＶＴＳＬＬＰＶＧＰＶＬＷＦＲＧＶＧＰＧＲＥＬＩＹＭＳＧＲＧＨＦＰＲＶＴＴＶＳＤＬＴＫＲＮＮＭＤＦＳＩＲＩＳＳＩＴＰＡＤＶＧＴＹＹＣＶＫＦＲＫＧＳＰＥＤＶＥＦＫＳＧＰＧＴＥＭＡＬＧＡＫＰＳＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ；
抗ＣＤ４７抗体Ｈｕ１６７－ＩｇＧ４ ＡＡ（特許出願ＷＯ２０１８０９５４２８Ａ１に開示されている方法に従って調製）
Ｈｕ１６７－ＩｇＧ４ ＡＡ重鎖（配列番号８７）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＷＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＮＩＤＰＳＤＳＥＴＨＹＮＱＫＦＫＤＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＷＧＹＬＧＲＳＡＭＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ；
Ｈｕ１６７－ＩｇＧ４ ＡＡ軽鎖（配列番号８８）
ＤＶＱＩＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＴＳＫＳＩＳＫＦＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＧＳＴＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＮＥＹＰＷＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ；
Ｓ３７－Ｆｃ（配列番号１１０）
ＥＥＥＬＱＭＩＱＰＥＫＬＬＬＶＴＶＧＥＴＡＴＬＨＣＴＶＴＳＬＬＰＶＧＰＶＬＷＦＲＧＶＧＰＧＲＥＬＩＹＭＳＧＲＧＨＦＰＲＶＴＴＶＳＤＬＴＫＲＮＮＫＤＦＳＩＲＩＳＳＩＴＰＡＤＶＧＴＹＹＣＶＫＦＲＫＧＳＰＥＤＶＥＦＫＳＧＰＧＴＥＭＡＬＧＡＫＰＳＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ。

【0154】

（抗体ｈ１８３１Ｋ）
ｈ１８３１抗体にＣＤＲ変異修飾を施し、３６個の変異体を得て、最終的にＮ５３Ｋ（Ｋａｂａｔのナンバリング基準に従って決定した位置）の変異体ｈ１８３１Ｋを選択した。ｈ１８３１の軽鎖ＬＣＤＲ２をＡＡＳＮＬＥＳからＡＡＳＫＬＥＳに変異させて、新規抗体ｈ１８３１Ｋを得た。
ｈ１８３１軽鎖：（配列番号１１１）
ＤＩＶＬＴＱＳＰＡＳＬＡＶＳＰＧＱＲＡＴＩＴＣＲＡＳＥＳＶＳＩＨＧＴＨＬＭＨＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＡＡＳＫＬＥＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＮＰＶＥＡＥＤＴＡＮＹＹＣＱＱＳＦＥＤＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ；
（ＬＣＤＲ１はＲＡＳＥＳＶＳＩＨＧＴＨＬＭＨ（配列番号１０６）、ＬＣＤＲ２はＡＡＳＫＬＥＳ（配列番号１１２）、ＬＣＤＲ３はＱＱＳＦＥＤＰＬＴ（配列番号１０８）であった。）
ｈ１８３１Ｋ軽鎖可変領域（配列番号１１３）
ＤＩＶＬＴＱＳＰＡＳＬＡＶＳＰＧＱＲＡＴＩＴＣＲＡＳＥＳＶＳＩＨＧＴＨＬＭＨＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＡＡＳＫＬＥＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＮＰＶＥＡＥＤＴＡＮＹＹＣＱＱＳＦＥＤＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ；
ｈ１８３１Ｋ重鎖（ｈ１８３１重鎖配列のものと同じ、配列番号１６）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＷＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＲＩＴＰＳＳＧＦＡＭＹＮＥＫＦＫＮＲＶＴＭＴＲＤＴＳＴＳＴＶＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＧＳＳＹＤＹＦＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ；
＞ｈ１８３１Ｋ－１９－Ｓ３７重鎖（ｈ１８３１－１９－Ｓ３７重鎖配列のものと同じ、配列番号１０９）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＷＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＲＩＴＰＳＳＧＦＡＭＹＮＥＫＦＫＮＲＶＴＭＴＲＤＴＳＴＳＴＶＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＧＳＳＹＤＹＦＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＥＥＥＬＱＭＩＱＰＥＫＬＬＬＶＴＶＧＥＴＡＴＬＨＣＴＶＴＳＬＬＰＶＧＰＶＬＷＦＲＧＶＧＰＧＲＥＬＩＹＭＳＧＲＧＨＦＰＲＶＴＴＶＳＤＬＴＫＲＮＮＫＤＦＳＩＲＩＳＳＩＴＰＡＤＶＧＴＹＹＣＶＫＦＲＫＧＳＰＥＤＶＥＦＫＳＧＰＧＴＥＭＡＬＧＡＫＰＳ；
＞ｈ１８３１Ｋ－１９－Ｓ３７軽鎖（ｈ１８３１Ｋ軽鎖配列のものと同じ、配列番号１１１）
ＤＩＶＬＴＱＳＰＡＳＬＡＶＳＰＧＱＲＡＴＩＴＣＲＡＳＥＳＶＳＩＨＧＴＨＬＭＨＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＡＡＳＫＬＥＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＮＰＶＥＡＥＤＴＡＮＹＹＣＱＱＳＦＥＤＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ；
Ｓ７９－Ｆｃ（配列番号１１４）
ＥＥＥＬＱＭＩＱＰＥＫＬＬＬＶＴＶＧＥＴＡＴＬＨＣＴＶＴＳＬＷＰＶＧＰＶＬＷＦＲＧＶＧＰＧＲＥＬＩＹＲＴＧＴＧＲＦＰＲＶＴＴＶＳＤＬＴＫＲＮＮＭＤＦＳＩＲＩＳＳＩＴＰＡＤＶＧＴＹＹＣＶＫＦＲＫＧＳＰＥＤＶＥＦＫＳＧＰＧＴＥＶＡＬＧＡＫＰＳＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ；
Ｓ１５－Ｆｃ（配列番号１１５）
ＥＥＥＬＱＭＩＱＰＥＫＬＬＬＶＴＶＧＥＴＡＴＬＨＣＴＶＴＳＬＬＰＶＧＰＶＬＷＦＲＧＶＧＰＧＲＥＬＩＹＶＳＧＲＧＨＦＰＲＶＴＴＶＳＤＬＴＫＲＥＮＲＤＦＳＩＲＩＳＳＩＴＰＡＤＶＧＴＹＹＣＶＫＦＲＫＧＳＰＥＤＶＥＦＫＳＧＰＧＴＥＭＡＬＧＡＫＰＳＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ；
Ｓ１２－Ｆｃ（配列番号１１６）
ＥＥＥＬＱＭＩＱＰＥＫＬＬＬＶＴＶＧＥＴＡＴＬＨＣＴＶＴＳＬＬＰＶＧＰＶＬＷＦＲＧＶＧＰＧＲＥＬＩＹＶＳＧＲＧＨＦＰＲＶＴＴＶＳＤＬＴＫＲＥＮＫＤＦＳＩＲＩＳＳＩＴＰＡＤＶＧＴＹＹＣＶＫＦＲＫＧＳＰＥＤＶＥＦＫＳＧＰＧＴＥＭＡＬＧＡＫＰＳＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ；
Ｓ１９－Ｆｃ（配列番号１１７）
ＥＥＥＬＱＭＩＱＰＥＫＬＬＬＶＴＶＧＥＴＡＴＬＨＣＴＶＴＳＬＬＰＶＧＰＶＬＷＦＲＧＶＧＰＧＲＥＬＩＹＶＳＧＲＧＨＦＰＲＶＴＴＶＳＤＬＴＫＲＮＮＲＤＦＳＩＲＩＳＳＩＴＰＡＤＶＧＴＹＹＣＶＫＦＲＫＧＳＰＥＤＶＥＦＫＳＧＰＧＴＥＭＡＬＧＡＫＰＳＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ；
Ｓ８５－Ｆｃ（配列番号１１８）
ＥＥＥＬＱＭＩＱＰＥＫＬＬＬＶＴＶＧＥＴＡＴＬＨＣＴＶＴＳＬＬＰＶＧＰＶＬＷＦＲＧＶＧＰＧＲＥＬＩＹＶＳＧＲＧＨＦＰＲＶＴＴＶＳＤＬＴＫＲＮＮＫＤＦＳＩＲＩＳＳＩＴＰＡＤＶＧＴＹＹＣＶＫＦＲＫＧＳＰＥＤＶＥＦＫＳＧＰＧＴＥＭＡＬＧＡＫＰＳＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ；
Ｓ３８－Ｆｃ（配列番号１１９）
ＥＥＥＬＱＭＩＱＰＥＫＬＬＬＶＴＶＧＥＴＡＴＬＨＣＴＶＴＳＬＬＰＶＧＰＶＬＷＦＲＧＶＧＰＧＲＥＬＩＹＦＳＧＲＧＨＦＰＲＶＴＴＶＳＤＬＴＫＲＮＮＭＤＦＳＩＲＩＳＳＩＴＰＡＤＶＧＴＹＹＣＶＫＦＲＫＧＳＰＥＤＶＥＦＫＳＧＰＧＴＥＭＡＬＧＡＫＰＳＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ；
Ｓ２２－Ｆｃ（配列番号１２０）
ＥＥＥＬＱＭＩＱＰＥＫＬＬＬＶＴＶＧＥＴＡＴＬＨＣＴＶＴＳＬＬＰＶＧＰＶＬＷＦＲＧＶＧＰＧＲＥＬＩＹＩＳＧＲＧＨＦＰＲＶＴＴＶＳＤＬＴＫＲＮＮＭＤＦＳＩＲＩＳＳＩＴＰＡＤＶＧＴＹＹＣＶＫＦＲＫＧＳＰＥＤＶＥＦＫＳＧＰＧＴＥＭＡＬＧＡＫＰＳＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ；
Ｓ２９－Ｆｃ（配列番号１２１）
ＥＥＥＬＱＭＩＱＰＥＫＬＬＬＶＴＶＧＥＴＡＴＬＨＣＴＶＴＳＬＬＰＶＧＰＶＬＷＦＲＧＶＧＰＧＲＥＬＩＹＬＳＧＲＧＨＦＰＲＶＴＴＶＳＤＬＴＫＲＮＮＭＤＦＳＩＲＩＳＳＩＴＰＡＤＶＧＴＹＹＣＶＫＦＲＫＧＳＰＥＤＶＥＦＫＳＧＰＧＴＥＭＡＬＧＡＫＰＳＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ；
Ｓ３４－Ｆｃ（配列番号１２２）
ＥＥＥＬＱＭＩＱＰＥＫＬＬＬＶＴＶＧＥＴＡＴＬＨＣＴＶＴＳＬＬＰＶＧＰＶＬＷＦＲＧＶＧＰＧＲＥＬＩＹＲＳＧＲＧＨＦＰＲＶＴＴＶＳＤＬＴＫＲＮＮＭＤＦＳＩＲＩＳＳＩＴＰＡＤＶＧＴＹＹＣＶＫＦＲＫＧＳＰＥＤＶＥＦＫＳＧＰＧＴＥＭＡＬＧＡＫＰＳＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ；
Ｓ４１－Ｆｃ（配列番号１２３）
ＥＥＥＬＱＭＩＱＰＥＫＬＬＬＶＴＶＧＥＴＡＴＬＨＣＴＶＴＳＬＬＰＶＧＰＶＬＷＦＲＧＶＧＰＧＲＥＬＩＹＶＳＧＲＧＨＦＰＲＶＴＴＶＳＤＬＴＫＲＮＮＭＤＦＳＩＲＩＳＳＩＴＰＡＤＶＧＴＹＹＣＶＫＦＲＫＧＳＰＥＤＶＥＦＫＳＧＰＧＴＥＭＡＬＧＡＫＰＳＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ；
Ｓ４２－Ｆｃ（配列番号１２４）
ＥＥＥＬＱＭＩＱＰＥＫＬＬＬＶＴＶＧＥＴＡＴＬＨＣＴＶＴＳＬＬＰＶＧＰＶＬＷＦＲＧＶＧＰＧＲＥＬＩＹＭＳＧＲＧＨＦＰＲＶＴＴＶＳＤＬＴＫＲＮＮＩＤＦＳＩＲＩＳＳＩＴＰＡＤＶＧＴＹＹＣＶＫＦＲＫＧＳＰＥＤＶＥＦＫＳＧＰＧＴＥＭＡＬＧＡＫＰＳＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ；
Ｓ４３－Ｆｃ（配列番号１２５）
ＥＥＥＬＱＭＩＱＰＥＫＬＬＬＶＴＶＧＥＴＡＴＬＨＣＴＶＴＳＬＬＰＶＧＰＶＬＷＦＲＧＶＧＰＧＲＥＬＩＹＭＳＧＲＧＨＦＰＲＶＴＴＶＳＤＬＴＫＲＮＮＲＤＦＳＩＲＩＳＳＩＴＰＡＤＶＧＴＹＹＣＶＫＦＲＫＧＳＰＥＤＶＥＦＫＳＧＰＧＴＥＭＡＬＧＡＫＰＳＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ；
Ｓ４４－Ｆｃ（配列番号１２６）
ＥＥＥＬＱＭＩＱＰＥＫＬＬＬＶＴＶＧＥＴＡＴＬＨＣＴＶＴＳＬＬＰＶＧＰＶＬＷＦＲＧＶＧＰＧＲＥＬＩＹＭＳＧＲＧＨＦＰＲＶＴＴＶＳＤＬＴＫＲＮＮＶＤＦＳＩＲＩＳＳＩＴＰＡＤＶＧＴＹＹＣＶＫＦＲＫＧＳＰＥＤＶＥＦＫＳＧＰＧＴＥＭＡＬＧＡＫＰＳＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ；
Ｓ４５－Ｆｃ（配列番号１２７）
ＥＥＥＬＱＭＩＱＰＥＫＬＬＬＶＴＶＧＥＴＡＴＬＨＣＴＶＴＳＬＬＰＶＧＰＶＬＷＦＲＧＶＧＰＧＲＥＬＩＹＭＳＧＲＧＨＦＰＲＶＴＴＶＳＤＬＴＫＲＤＮＭＤＦＳＩＲＩＳＳＩＴＰＡＤＶＧＴＹＹＣＶＫＦＲＫＧＳＰＥＤＶＥＦＫＳＧＰＧＴＥＭＡＬＧＡＫＰＳＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ；
Ｓ４６－Ｆｃ（配列番号１２８）
ＥＥＥＬＱＭＩＱＰＥＫＬＬＬＶＴＶＧＥＴＡＴＬＨＣＴＶＴＳＬＬＰＶＧＰＶＬＷＦＲＧＶＧＰＧＲＥＬＩＹＭＳＧＲＧＨＦＰＲＶＴＴＶＳＤＬＴＫＲＥＮＫＤＦＳＩＲＩＳＳＩＴＰＡＤＶＧＴＹＹＣＶＫＦＲＫＧＳＰＥＤＶＥＦＫＳＧＰＧＴＥＭＡＬＧＡＫＰＳＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ；
Ｓ４７－Ｆｃ（配列番号１２９）
ＥＥＥＬＱＭＩＱＰＥＫＬＬＬＶＴＶＧＥＴＡＴＬＨＣＴＶＴＳＬＬＰＶＧＰＶＬＷＦＲＧＶＧＰＧＲＥＬＩＹＭＳＧＲＧＨＦＰＲＶＴＴＶＳＤＬＴＫＲＥＮＫＤＦＳＩＲＩＳＳＩＴＰＡＤＶＧＴＹＹＣＶＫＦＲＫＧＳＰＥＤＶＥＦＫＳＧＰＧＴＥＶＡＬＧＡＫＰＳＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ；
Ｓ４８－Ｆｃ（配列番号１３０）
ＥＥＥＬＱＭＩＱＰＥＫＬＬＬＶＴＶＧＥＴＡＴＬＨＣＴＶＴＳＬＬＰＶＧＰＶＬＷＦＲＧＶＧＰＧＲＥＬＩＹＲＳＧＲＧＨＦＰＲＶＴＴＶＳＤＬＴＫＲＮＮＫＤＦＳＩＲＩＳＳＩＴＰＡＤＶＧＴＹＹＣＶＫＦＲＫＧＳＰＥＤＶＥＦＫＳＧＰＧＴＥＭＡＬＧＡＫＰＳＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ；
Ｓ４９－Ｆｃ（配列番号１３１）
ＥＥＥＬＱＭＩＱＰＥＫＬＬＬＶＴＶＧＥＴＡＴＬＨＣＴＶＴＳＬＬＰＶＧＰＶＬＷＦＲＧＶＧＰＧＲＥＬＩＹＲＳＧＲＧＨＦＰＲＶＴＴＶＳＤＬＴＫＲＥＮＫＤＦＳＩＲＩＳＳＩＴＰＡＤＶＧＴＹＹＣＶＫＦＲＫＧＳＰＥＤＶＥＦＫＳＧＰＧＴＥＭＡＬＧＡＫＰＳＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ。

【0155】

陰性対照としてのＩｇＧ４対照は、ＰＤ－Ｌ１にもＣＤ４７にも関連しない標的に対する抗体であった。ＩｇＧ４－Ｆｃ及びＩｇＧ１－Ｆｃは、それぞれＦｃセグメントのみを含み、抗原特異的な可変領域セグメントを含まない。

【0156】

（試験例）
（試験例１．ＣＤ４７－ｈｉｓタンパク質に結合するＰＤ－Ｌ１－ＣＤ４７二機能性融合タンパク質のＥＬＩＳＡ実験）
ＰＤ－Ｌ１－ＣＤ４７二機能性融合タンパク質の結合は、ＥＬＩＳＡプレートに固定化されたヒトＣＤ４７又はｃｙｎｏ ＣＤ４７に結合した二機能性融合タンパク質の量を測定することにより検出した。ＣＤ４７－ＥＣＤ－Ｈｉｓ（表７を参照）をＰＢＳで１μｇ／ｍｌに希釈し、９６ウェルのＥＬＩＳＡプレートにコーティングした。プレートの洗浄及びブロッキングの後、様々な濃度の二機能性融合タンパク質サンプルを加え、プレートを再度洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ－ヤギ抗ヒト（Ｈ＋Ｌ）抗体（ Ｊａｃｋｓｏｎ、カタログ番号１０９－０３５－０８８）を加えた。再度プレートを洗浄し、発色用のテトラメチルベンジジン溶液を加えた。最後に停止液を加え、マイクロプレートリーダーでＯＤ４５０を測定し、ＥＣ５０値を算出した。その結果を表８－１及び表８－２に示す。

【0157】

【表7】

【0158】

【表8-1】

【表8-2】

【0159】

その結果、各ＰＤ－Ｌ１－ＣＤ４７二機能性融合タンパク質が遊離ヒトＣＤ４７タンパク質と非常に強い親和性を持ち、ｃｙｎｏ ＣＤ４７とも非常に強い交差親和性を持つことが示された。

【0160】

（試験例２．ＰＤ－Ｌ１－ｈｉｓタンパク質に結合するＰＤ－Ｌ１－ＣＤ４７二機能性融合タンパク質のＥＬＩＳＡ実験）
ＰＤ－Ｌ１－ＣＤ４７二機能性融合タンパク質の結合は、ＥＬＩＳＡプレートに固定化された異なる種のＰＤ－Ｌ１と結合した抗体の量を測定することにより検出した。異なる生殖細胞系列のＰＤ－Ｌ１－ｈｉｓ抗原（表９を参照）をＰＢＳで１μｇ／ｍｌに希釈し、９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｓｔａｒ社、カタログ番号３５９０）にコーティングした。プレートの洗浄及びブロッキングの後、様々な濃度のＰＤ－Ｌ１－ＣＤ４７二機能性融合タンパク質サンプルを加え、プレートを再度洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ－ヤギ抗ヒト（Ｈ＋Ｌ）抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ、カタログ番号１０９－０３５－０８８）を加えた。再度プレートを洗浄し、発色用のテトラメチルベンジジン溶液を加えた。最後に停止液を加え、マイクロプレートリーダーでＯＤ４５０を測定し、ＥＣ５０値を算出した。その結果を表１０に示す。

【表9】

【表10】

【0161】

その結果、各ＰＤ－Ｌ１－ＣＤ４７二機能性融合タンパク質が遊離ヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質と非常に強い親和性を持ち、ｃｙｎｏ ＰＤ－Ｌ１とも非常に強い交差親和性を持つことが示された。ｈ１８３０抗体を含むＰＤ－Ｌ１－ＣＤ４７二機能性融合タンパク質はマウスＰＤ－Ｌ１とも非常に強い交差親和性を持つ。

【0162】

（試験例３．ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ１の結合及びＰＤ－Ｌ１／Ｂ７．１の結合に対するＰＤ－Ｌ１－ＣＤ４７二機能性融合タンパク質の遮断効果）
ＰＤ－Ｌ１－Ｆｃ（自社調製）をＰＢＳで１μｇ／ｍｌに希釈し、９６ウェルプレートに１００μｌ／ウェルで加え、４℃で１６時間～２０時間置いた。ＰＢＳ緩衝液を９６ウェルプレートから除去し、ＰＢＳＴ（０．０５％ｔｗｅｅｎ２０を含むｐＨ７．４のＰＢＳ）緩衝液で１回洗浄した。ＰＢＳＴ／１％ミルクを１２０μｌ／ウェルで加え、室温で１時間インキュベートしてブロッキングした。ブロッキング液を除去し、プレートをＰＢＳＴ緩衝液で１回洗浄した。サンプル希釈液（５％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むｐＨ７．４のＰＢＳ）で適切な濃度に希釈した試験対象のＰＤ－Ｌ１－ＣＤ４７二機能性融合タンパク質９０μｌを加え、４℃で１時間プレインキュベートした。１０倍濃度のビオチン標識ＰＤ－１（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社、１０μｇ／ｍｌ）又はＢ７－１（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社、１０μｇ／ｍｌ）を１０μｌ／ウェルの容量で加えた。シェーカーで振とうして混合した後、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。反応系を取り出し、プレートをＰＢＳＴで６回洗浄した。ＰＢＳＴ緩衝液で希釈したストレプトアビジン－ペルオキシダーゼポリマー１：４００を１００μｌ／ウェル加え、室温で５０分間振とうしながらインキュベートした。プレートをＰＢＳＴで６回洗浄した。ＴＭＢを１００μｌ／ウェル加え、室温で５～１０分間インキュベートした。１Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４を１００μｌ／ウェル加えて反応を停止させた。ＮＯＶＯＳｔａｒを用いてマイクロプレートリーダーでＯＤ４５０を測定し、ＩＣ５０値を算出した。その結果を表１１に示す。

【表11】

【0163】

試験の結果、全ての二機能性融合タンパク質がＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１／Ｂ７．１経路も効果的に遮断し得ることが示された。

【0164】

（試験例４．ヒト赤血球に結合するＰＤ－Ｌ１－ＣＤ４７二機能性融合タンパク質の実験）
健康なヒトの新鮮血を等量のＰＢＳと混合し、３００ｇで５分間遠心分離して細胞クラスターを得た。ＰＢＳで３～５回洗浄した後、赤血球を得た。細胞をＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋５％ＢＳＡ）に再懸濁して細胞密度を２×１０^６個／ｍｌに調整し、９６ウェル丸底プレート（３７９５＃、ｃｏｒｎｉｎｇ）に１００μｌ／ウェルで播種した。その後、様々な濃度の抗体と二機能性融合タンパク質を加え、４℃で１時間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋２％ＦＢＳ）で２回洗浄した後、二次抗体（Ａｌｅｘａ ４８８ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ａ１１０１３））を加え、氷上で暗所にて３０分間インキュベートした。最後に、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した後、細胞を再懸濁した。プレートをＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩで読み取った。

【0165】

ＦＡＣＳ試験の結果、対照抗体ｈｕ５Ｆ９及びＨｕ１６７ ＩｇＧ４ＡＡがヒト赤血球表面の天然ＣＤ４７と強い結合能力を持つことが示された。関与する二機能性融合タンパク質のうち、ヒト赤血球表面のＣＤ４７と結合するＳ７９、Ｓ３４及びＳ４９を含む二機能性融合タンパク質を除いて、他の二機能性融合タンパク質はヒト赤血球表面の天然ＣＤ４７との結合能力を持たないことから、上記二機能性融合タンパク質の安全面での利点が示唆された。その結果を図２Ａ、図２Ｂ及び図２Ｃに示した（図２Ａ、図２Ｂ及び図２Ｃで行った実験には、異なるドナー細胞を用いた３バッチの実験が含まれる）。

【0166】

（試験例５．腫瘍細胞に結合するＰＤ－Ｌ１－ＣＤ４７二機能性融合タンパク質の実験）
Ｒａｊｉ細胞をＲＰＭＩ培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ、カタログ番号ＳＨ３０８０９．０１Ｂ）（１０％ウシ胎児血清を含む）で培養した。１×１０^６細胞／ｍｌのＲａｊｉ細胞を５％ＢＳＡでブロッキングし、二機能性融合タンパク質サンプルを１０μｇ／ｍｌの濃度になるように添加した。２回洗浄した後、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８－ヤギ抗ヒト（Ｈ＋Ｌ）抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ａ１１０１３）を加えた。２回洗浄した後、フローサイトメーターで蛍光シグナル値を読み取った。

【0167】

ＦＡＣＳ試験の結果、関与するＰＤ－Ｌ１－ＣＤ４７二機能性融合タンパク質がＲａｊｉ細胞の表面にある天然ＣＤ４７と非常に強い結合能力を持ち、これは対照抗体Ｈｕ５Ｆ９の結合能力と同等であることが示された。その結果を図３に示した。

【0168】

（試験例６．ＰＤ－Ｌ１－ＣＤ４７二機能性融合タンパク質のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞媒介性細胞食作用（ＡＤＣＰ）実験）
ヒトの新鮮血からＰＢＭＣを単離した後、ヒトＣＤ１４マイクロビーズ（１３０－０５０－２０１＃、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いてＣＤ１４＋単球を選別した。これらのＣＤ１４＋単球を、マクロファージ分化培地（１６４０＋１０％ＦＢＳ＋５０ｎｇ／ｍｌのＭ－ＣＳＦ）で９日間培養することにより、マクロファージに分化させた。これらの単球由来のマクロファージ（ＭＤＭ）は接着性を持ち、触手を持つようになった。実験当日、このマクロファージをトリプシンで５分間消化し、スクレーパーで軽く削り取り、９６ウェル丸底プレート（３７９５＃）に広げた。ヒトＲＢＣ細胞（赤血球）を０．５μＭのＣＦＳＥ（ＢＤ、カタログ番号５６５０８２＃）で、３７℃の水浴中で１３分間標識した。ＰＢＳで２回洗浄した後、マクロファージ１個につき５個のＲＢＣ細胞の割合でサンプルをマクロファージに添加し、ＰＤ－Ｌ１－ＣＤ４７二機能性融合タンパク質を様々な濃度で添加した。標的細胞を２．５時間かけて食作用に供した。食作用後、細胞をＰＢＳで２回洗浄した。その後、ヒトＦｃブロッカー（５６４２１９＃、ＢＤ）を一定の割合で添加し、室温で１０分間置いて非特異的結合を除いた。その後、ＡＰＣ標識ＣＤ１４抗体（１７－０１４９－４２＃、Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を加えた。細胞を氷上で３０分間インキュベートした。最後に２回の洗浄を行った後、フローサイトメトリーによる分析を行った。食作用は、ＡＰＣ＋陽性生細胞ゲートでＣＦＳＥ＋陽性細胞を選択し、ＣＳＦＥ＋陽性細胞の割合を評価することで測定した（図４を参照）。

【0169】

（試験例７．ＰＤ－Ｌ１－ＣＤ４７二機能性融合タンパク質のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞媒介性細胞食作用（ＡＤＣＰ）実験）
ヒトの新鮮血からＰＢＭＣを単離した後、ヒトＣＤ１４マイクロビーズ（１３０－０５０－２０１＃、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いてＣＤ１４＋単球を選別した。これらのＣＤ１４＋単球を、マクロファージ分化培地（１６４０＋１０％ＦＢＳ＋５０ｎｇ／ｍｌのＭ－ＣＳＦ）で９日間培養することにより、マクロファージに分化させた。これらの単球由来のマクロファージ（ＭＤＭ）は接着性を持ち、触手を持つようになった。実験当日、このマクロファージをトリプシンで５分間消化し、スクレーパーで軽く削り取り、９６ウェル丸底プレート（３７９５＃）に広げた。Ｍｏｌｐ－８細胞（Ｎａｎｊｉｎｇ ＣｏＢｉｏｅｒ）を０．１μＭのＣＦＳＥで、３７℃の水浴中で１３分間標識した。ＰＢＳで２回洗浄した後、マクロファージ１個につき５個のＭｏｌｐ－８腫瘍細胞の割合でサンプルをマクロファージに添加し、ＰＤ－Ｌ１－ＣＤ４７抗体を様々な濃度で添加した。標的細胞を２．５時間かけて食作用に供した。食作用後、細胞をＰＢＳで２回洗浄した。その後、ヒトＦｃブロッカーを一定の割合で添加し、室温で１０分間置いて非特異的結合を除いた。その後、ＡＰＣ標識ＣＤ１４抗体を加えた。細胞を氷上で３０分間インキュベートした。最後に２回の洗浄を行った後、フローサイトメトリーによる分析を行った。食作用は、ＡＰＣ＋陽性生細胞ゲートで選択し、ＣＳＦＥ＋陽性細胞の割合を評価することで測定した（図５Ａ及び図５Ｂを参照）。

【0170】

試験例６及び７の結果は、図４及び図５Ａ～図５Ｂに示されており、添加された二機能性融合タンパク質が腫瘍細胞に対する食作用を効果的に促進し得ることが示された。しかしながら、二機能性融合タンパク質は、赤血球に対する食作用を持たず、本開示の二機能性融合タンパク質抗体の安全面での潜在的な利点を示唆している。一方、対照抗体ｈｕ５Ｆ９は、赤血球を効果的に食作用し得る。

【0171】

（試験例８．ＰＤ－Ｌ１－ＣＤ４７二機能性融合タンパク質の赤血球凝集実験）
健康なヒトの新鮮血をＰＢＳ（Ｂ３２０＃、Ｓｈａｎｇｈａｉ ＢａｓａｌＭｅｄｉａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で１００倍希釈した。希釈した全血を９６ウェル丸底プレート（３７９５＃、ｃｏｒｎｉｎｇ）に３０μｌ／ウェルでプレーティングした。その後、様々な濃度勾配の抗体又は二機能性融合タンパク質を等量ずつ加えた。混合後、プレートを３７℃で４～６時間置いた。赤血球の沈降は、ハイコンテント顕微鏡を用いて観察した。血液が凝固していない細胞は明瞭な赤い斑点となり、血液が凝固した細胞は拡散して見えた。

【0172】

各サンプルは第１カラム（０．５ｍｇ／ｍｌ）～第１１カラム（１：３希釈）に希釈した。第１２カラムは抗体を含まないＰＢＳブランクウェルであった。

【0173】

その結果（図６を参照）、同じ条件下で、二機能性融合タンパク質ｈ１８３０－Ｓ３７、ｈ１８３０－Ｓ１９、ｈ１８３０－Ｓ１２、ｈ１８３０－Ｓ１５、ｈ１８３１－１９－Ｓ５８及びｈ１８３１－１９－Ｓ７９が試験した様々な濃度下で赤血球凝集を引き起こさないことが示され、本開示の二機能性融合タンパク質の安全面での利点が示唆された。

【0174】

（試験例９．ＢＩＡｃｏｒｅによって検出したＰＤ－Ｌ１－ＣＤ４７二機能性融合タンパク質の親和性実験）
様々な抗原に対する二機能性融合タンパク質の応答シグナルは、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００装置により、プロテインＡバイオセンサーチップ（カタログ番号２９１２７５５６、ＧＥ）を用いてＩｇＧをアフィニティキャプチャし、様々な抗原（ｈＣＤ４７、ｃｙｎｏ ＣＤ４７、ｈＰＤ－Ｌ１、ｃｙｎｏ ＰＤ－Ｌ１及びｍＰＤ－Ｌ１、ソースは試験例３及び４を参照）をチップの表面に流し、結合・解離曲線を得ることにより、リアルタイムで検出した。各実験サイクルの解離が完了したら、バイオセンサーチップを洗浄し、１０ｍＭグリシン－ＨＣｌ（ｐＨ１．５）緩衝液で再生した。実験用緩衝液系は、１×ＨＢＳ－ＥＰ緩衝液（カタログ番号ＢＲ－１００１－８８、ＧＥ）であった。実験終了後、ＧＥ Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎバージョン３．０ソフトウェアを用いてデータを（１：１）Ｌａｎｇｍｕｉｒモデルに当てはめ、親和性値を求めた。その結果を表１２－１及び表１２－２に示した。その結果、ヒトＣＤ４７に対する全ての修飾ＳＩＲＰγペプチドバリアントの親和性が、野生型ＳＩＲＰγペプチドの親和性と比較して劇的に改善されたことが示された。

【表12-1】

【表12-2】

【0175】

（試験例１０．ＰＢＭＣ－Ｔリンパ球活性化実験におけるＩＦＮγの細胞分泌に対するＰＤ－Ｌ１－ＣＤ４７二機能性融合タンパク質の効果）
ＰＤ－Ｌ１－ＣＤ４７二機能性融合タンパク質がヒト初代Ｔリンパ球の機能に及ぼす影響を調べるために、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を採取及び精製し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで５日間ツベルクリン（ＴＢ）刺激し、サイトカインＩＦＮγの分泌レベルを検出した。実験プロセスを以下に簡単に説明する：

【0176】

ＰＢＭＣは、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅ（１７－５４４２－０２、ＧＥ）を用いて新鮮血から密度勾配遠心分離（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により得られ、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ（１００９９－１４１、Ｇｉｂｃｏ）を添加したＲＰＭＩ１６４０（ＳＨ３０８０９．０１、ＧＥ）培地で３７℃、５％ＣＯ_２で培養した。

【0177】

分離及び精製した新鮮なＰＢＭＣをＲＰＭＩ１６４０培地で２×１０^６細胞／ｍｌの密度に調整した。２０ｍＬの細胞懸濁液に４０μｌのツベルクリン（９７－８８００、Ｓｙｎｂｉｏｔｉｃｓ社）を加え、３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベーターで５日間培養した。５日目に、前述の培養細胞を遠心分離により回収し、新鮮なＲＰＭＩ１６４０培地に再懸濁し、１．１×１０^６細胞／ｍｌの密度に調整し、９６ウェル細胞培養プレートに１ウェルあたり９０μｌ播種した。同時に、ＰＢＳで希釈したグラジエント希釈抗体サンプル（Ｂ３２０、Ｓｈａｎｇｈａｉ ＢａｓａｌＭｅｄｉａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を１ウェルあたり１０μｌ添加した。この細胞培養プレートを３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベーターに入れ、３日間培養した。細胞培養プレートを取り出し、遠心分離（４０００ｒｐｍ、１０分）して細胞培養上清を回収した。ＩＦＮ－γレベルは、ＥＬＩＳＡ法（ヒトＩＦＮ－γ 検出キット：ＥＨＣ１０２ｇ．９６、Ｎｅｏｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて検出した。具体的な操作は、試薬の説明書を参照した。

【0178】

その結果（図７Ａ～図７Ｅを参照）、試験した分子のうち、全ての二機能性融合タンパク質がＩＦＮ－γ分泌を活性化することができ、これは対照抗体ＨＲＰ０００５２に匹敵することが示された。

【0179】

（試験例１１．マウス結腸がんモデルＭＣ３８／Ｈ－１１－ｈＣＤ４７におけるＰＤ－Ｌ１－ＣＤ４７二機能性融合タンパク質の効果）
この実験では、Ｂ－ｈＣＤ２７４／ｈＣＤ４７／ｈＳＩＲＰαマウスを用い、人工的に改変したマウス結腸がんＭＣ３８細胞：ＭＣ３８／Ｈ－１１－ｈＣＤ４７（ヒトＰＤ－Ｌ１及びヒトＣＤ４７をトランスフェクトし、マウスＣＤ４７及びＰＤＬ１をノックアウトしたもの）を接種して担がんマウスモデルを構築し、異なる用量のＰＤ－Ｌ１－ＣＤ４７二機能性融合タンパク質ｈ１８３０－Ｓ８５、ＳＩＲＰγタンパク質Ｓ５８－Ｆｃ及びＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体ｈ１８３０のマウス結腸がん移植腫瘍の成長に対するｉｎ ｖｉｖｏ阻害効果を評価した。Ｂ－ｈＣＤ２７４／ｈＣＤ４７／ｈＳＩＲＰαマウスは、Ｂｉｏｃｙｔｏｇｅｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ａｎｉｍａｌｓ社から購入したＳＰＦグレード；体重：２２．０±３．０ｇ；性別：雌であった。

【0180】

ＭＣ３８／Ｈ－１１－ｈＣＤ４７（＃５－４）細胞を、１×１０^６細胞／１００μｌ／マウスの接種量でＢ－ｈＣＤ２７４／ｈＣＤ４７／ｈＳＩＲＰαマウスに皮下接種した。担がんモデルを確立した後、腫瘍体積を測定し、体重及び腫瘍サイズが大きすぎる動物と小さすぎる動物を除外した。担がんマウスは、腫瘍体積に応じて５つのグループ（ｎ＝７）に無作為に分けた：ＰＢＳ対照グループ、ｈ１８３０－Ｓ８５高用量実験グループ、ｈ１８３０－Ｓ８５低用量実験グループ、ｈ１８３０実験グループ及びＳ５８－Ｆｃ実験グループ。グルーピングの日付はＤ０とした。
１）腫瘍の直径を測定する方法を使用して、腫瘍の成長を観察し、記録した。同時に、動物の体重を観察し、記録した。
２）週に２回、腫瘍の直径及び動物の体重を測定した。
３）投与後１７日目に、ＰＢＳ対照グループの動物の腫瘍が比較的大きくなったため、動物福祉の原則に従ってＰＢＳ実験グループの動物を屠殺した；投与後２５日目に残りの実験グループの動物を屠殺した。
４）腫瘍体積（ＴＶ）の計算式：ＴＶ＝１／２×ａ×ｂ^２（式中、ａ及びｂはそれぞれ測定された腫瘍の長径と短径を表す）。
５）相対腫瘍増殖率Ｔ／Ｃ％＝（Ｔ－Ｔ０）／（Ｃ－Ｃ０）×１００％
６）腫瘍増殖抑制率ＴＧＩ％＝１－Ｔ／Ｃ％

【0181】

実験データの統計解析は、ＥｘｃｅｌとＧｒａｐｈＰａｄを用いて行った。各グループの動物の体重、腫瘍体積及び腫瘍重量は全て平均±標準誤差（平均±ＳＥＭ）で示し、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ６ソフトウェアを使用してプロットした。

【0182】

この実験では、Ｂ－ｈＣＤ２７４／ｈＣＤ４７／ｈＳＩＲＰαマウス結腸がん移植腫瘍モデルにおいて、異なる用量のＰＤ－Ｌ１－ＣＤ４７二機能性融合タンパク質の腫瘍増殖に対する抑制効果を評価することを目的とした。この実験では、グルーピングをする際に、様々な抗体又は二機能性融合タンパク質を同時に投与した。

【0183】

図８及び表１３の結果に示すように、異なる用量の二機能性融合タンパク質（ｈ１８３０－Ｓ８５）実験グループ、ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体（ｈ１８３０）実験グループ及びＳＩＲＰγタンパク質Ｓ５８－Ｆｃ実験グループでは、いずれもＰＢＳ対照グループよりも腫瘍体積が小さい；ＰＤ－Ｌ１－ＣＤ４７二機能性融合タンパク質の高用量実験グループの腫瘍抑制効果は、同用量のＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体実験グループ及びＳＩＲＰγタンパク質実験グループよりも良好である；異なるｈ１８３０－Ｓ８５用量の実験グループ間には用量依存関係がある。

【0184】

実験中、投与グループと対照グループの間で体重に有意差はなく、マウスは投与された各抗体に対して耐性を持っていた。

【表13】

【0185】

（試験例１２．マウスＭＣ３８－ｈＰＤ－Ｌ１－ｈＣＤ４７結腸がんモデルにおけるＰＤ－Ｌ１－ＣＤ４７二機能性融合タンパク質の効果）
ＭＣ３８－ｈＰＤ－Ｌ１－ｈＣＤ４７細胞（ヒトＰＤ－Ｌ１及びヒトＣＤ４７を導入し、マウスＣＤ４７をノックアウトしたＭＣ３８細胞）をＣ５７／ＢＬ－６マウスに５．８×１０^５細胞／１００μｌ／マウスで皮下接種した。担がんモデルを確立した後、腫瘍体積を測定し、体重及び腫瘍サイズが大きすぎる動物と小さすぎる動物を除外した。担がんマウスは、腫瘍体積に応じて５つのグループ（ｎ＝７）に無作為に分けた：ＩｇＧ４対照グループ、ｈ１８３０－Ｓ５８実験グループ、ＨＲＰ０００５２実験グループ、ｈ１８３０実験グループ及びＴＴＩ－６２１実験グループ。グルーピングの日付はＤ０とした。グルーピング後、各薬剤を週３回、計１０回、１８日間の投与サイクルで腹腔内投与した。投与を中止してから２日後に、担がんマウスの観察を終了した。週に２回、腫瘍体積を測定し、重量を測定し、データを記録した。グルーピング及び投与については下表を参照。この実験では、グルーピングの際に、異なる抗体を同時に投与した。投与後１４日目からは全ての実験グループで用量を半分に減らした；投与後２５日目からは全ての実験グループで投与を中止した。

【表14】

【0186】

各グループの動物の体重、腫瘍体積及び腫瘍重量は全て平均±標準誤差（平均±ＳＥＭ）で示し、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ６及びＥｘｃｅｌソフトウェアを使用してプロットし、統計解析にはスチューデントのｔ検定を使用した。
腫瘍体積（ＴＶ）＝１／２×Ｌ_長×Ｌ_短 ^２
腫瘍増殖率Ｔ／Ｃ％＝（Ｔ－Ｔ０）／（Ｃ－Ｃ０）×１００％
腫瘍増殖抑制率％ＴＧＩ＝１－Ｔ／Ｃ％

【0187】

図９の結果に示すように、ＰＤ－Ｌ１－ＣＤ４７二機能性融合タンパク質ｈ１８３０－Ｓ５８実験グループ及びＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体（ｈ１８３０）実験グループ（マウスＰＤ－Ｌ１と交差反応する）の腫瘍体積は、対照グループ及びＴＴＩ－６２１実験グループの腫瘍体積よりも小さく、対照グループとの統計的差異は投与後約１週間で認められた；ＴＴＩ－６２１実験グループは、この実験では腫瘍抑制効果を示さなかった。ｈ１８３０－Ｓ５８実験グループでは、投与後７日目に腫瘍抑制率が１２８．５１％に達した。実験終了時には、腫瘍抑制率は比較的高いレベルで維持されていた。

【0188】

実験後、担がんマウスを安楽死させ、腫瘍を採取して重量を測定した。腫瘍重量の結果は、腫瘍体積の結果と同様であった。実験中、投与グループと対照グループの間で体重に有意差はなく、マウスは投与された各抗体に対して耐性を持っていた。

【0189】

（試験例１３．マウスＭＣ３８－ｈＰＤ－Ｌ１結腸がんモデルにおけるＰＤ－Ｌ１－ＣＤ４７二機能性融合タンパク質の効果）
ＭＣ３８－ｈＰＤ－Ｌ１細胞（ヒトＰＤ－Ｌ１を導入したＭＣ３８細胞）をＣ５７／ＢＬ－６マウスに３．５×１０^５細胞／１００μｌ／マウスで皮下接種した。担がんモデルを確立した後、腫瘍体積を測定し、体重及び腫瘍サイズが大きすぎる動物と小さすぎる動物を除外した。担がんマウスは、腫瘍体積に応じて５つのグループ（ｎ＝７）に無作為に分けた：ＩｇＧ４対照グループ、ｈ１８３０－１９－Ｓ７９実験グループ、ｈ１８３０Ｇ１－１９－Ｓ７９実験グループ、ＳＩＲＰα－ＣＶ実験グループ及びｈ１８３０実験グループ。グルーピングの日付はＤ０とした。グルーピング後、各薬剤を週３回、計１２回、２８日間の投与サイクルで腹腔内投与した。投与を中止してから２日後に、担がんマウスの観察を終了した。週に２回、腫瘍体積を測定し、重量を測定し、データを記録した。グルーピング及び投与については下表を参照。

【表15】

【0190】

各グループの動物の体重、腫瘍体積及び腫瘍重量は全て平均±標準誤差（平均±ＳＥＭ）で示し、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ５及びＥｘｃｅｌソフトウェアを使用してプロットし、統計解析にはスチューデントのｔ検定を使用した。
腫瘍体積（ＴＶ）＝１／２×Ｌ_長×Ｌ_短 ^２
腫瘍増殖率Ｔ／Ｃ％＝（Ｔ－Ｔ０）／（Ｃ－Ｃ０）×１００％
腫瘍増殖抑制率％ＴＧＩ＝１－Ｔ／Ｃ％

【0191】

この実験は、Ｃ５７／ＢＬ－６マウス結腸がん移植腫瘍モデルにおいて、ＰＤ－Ｌ１－ＣＤ４７二機能性融合タンパク質の異なるＩｇＧ形態の腫瘍増殖に対する阻害効果を評価することを目的とした。この実験では、グルーピングの際に異なる抗体を同時に投与した。投与後１４日目からは、全ての実験グループで用量を半分に減らした；投与後２５日目からは全ての実験グループで投与を中止した。

【0192】

図１０の結果に示すように、投与後２５日目まで、全ての二機能性融合タンパク質投与グループ及びＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体ｈ１８３０投与グループの腫瘍体積は、ＩｇＧ４対照グループ及びＳＩＲＰα－ＣＶ（ＴＴＩ－６２１）実験グループの腫瘍体積よりも小さく、対照グループと比較して統計的差異が見られた。

【0193】

投与後２５日目に、腫瘍サイズが比較的大きかったため対照グループとＳＩＲＰα－ＣＶ（ＴＴＩ－６２１）実験グループを安楽死させたが、残りの実験グループでは投与を中止して観察を続けた。その結果、ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体ｈ１８３０実験グループの腫瘍体積は時間とともに急速に増加する傾向を示し、二機能性融合タンパク質ｈ１８３０－１９－Ｓ７９及びｈ１８３０Ｇ１－１９－Ｓ７９実験グループの腫瘍体積は大きく変化せず、二重特異性抗体のこれら２つの異なるＩｇＧ形態間にも有意差は認められなかった。

【0194】

実験後、担がんマウスを安楽死させ、腫瘍を採取して重量を測定した。腫瘍重量の結果は、腫瘍体積の結果と同様であった。実験中、投与グループと対照グループの間で体重に有意差はなく、マウスは投与された各抗体に対して耐性を持っていた。

【0195】

（試験例１４．ＭＯＬＰ－８移植腫瘍ヌードマウスに対するＰＤ－Ｌ１－ＣＤ４７二機能性融合タンパク質の有効性）
合計１２０匹のＢａｌｂ／ｃヌードマウスの右肋骨部にＭＯＬＰ－８細胞（５×１０^６＋５０％マトリゲル／マウス）を皮下接種した。１０日後、平均腫瘍体積は約２１４．８９±６．７５ｍｍ^３に達した。担がんマウスを無作為に７つのグループ（ｎ＝８）に分けた：ＰＢＳ対照グループ、ｈ１８３０－Ｓ３７実験グループ、ｈ１８３０－Ｓ５８実験グループ、ｈ１８３１Ｋ－１９－Ｓ３７、ｈ１８３０実験グループ、Ｓ３７－Ｆｃ及びＨｕ１６７ ＩｇＧ４ＡＡ実験グループ。グルーピングの日付はＤ０とした。グルーピング後、各薬剤を週に２回、３週間連続して腹腔内投与した。週に２回、腫瘍体積を測定し、重量を測定し、データを記録した。各グループの動物の体重、腫瘍体積及び腫瘍重量は全て平均±標準誤差（平均±ＳＥＭ）で示し、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ６及びＥｘｃｅｌソフトウェアを使用してプロットし、統計解析にはスチューデントのｔ検定を使用した。
腫瘍体積（Ｖ）の計算式：Ｖ＝１／２×Ｌ_長×Ｌ_短 ^２
相対腫瘍体積（ＲＴＶ）＝Ｖ_Ｔ／Ｖ_０
腫瘍増殖抑制率（％）＝（Ｃ_ＲＴＶ－Ｔ_ＲＴＶ）／Ｃ_ＲＴＶ（％）
（式中、Ｖ_０及び_ＶＴは、それぞれ実験開始時及び実験終了時の腫瘍体積である。Ｃ_ＲＴＶ及びＴ_ＲＴＶは、それぞれブランク対照グループ（ブランク）及び実験グループの実験終了時の相対腫瘍体積である。）

【0196】

この実験の結果は、マウスを１日おきに１回、１０回連続して腹腔内注射したことを示した（図１１を参照）。統計には、実験の２１日目までのデータを用いた。ＰＤ－Ｌ１－ＣＤ４７二機能性融合タンパク質ｈ１８３０－Ｓ３７（３０ｍｐｋ）の腫瘍抑制率は３４．９８％（Ｐ＜０．０５）である；二機能性融合タンパク質ｈ１８３１Ｋ－１９－Ｓ３７（３０ｍｐｋ）の腫瘍抑制率は５４．１８％（Ｐ＜０．０１）である；ｈ１８３０（２５ｍｐｋ）には腫瘍増殖抑制効果がなかった。

【0197】

投与中、各グループの動物の体重は正常であったことから、二機能性融合タンパク質には明らかな毒性及び副作用がないことが示された。

【0198】

（試験例１５．ＣＤ４７／ＳＩＲＰαの結合に対するＰＤ－Ｌ１－ＣＤ４７二機能性融合タンパク質の遮断効果）
ＣＤ４７－ＦｃをＰＢＳで１μｇ／ｍｌに希釈し、９６ウェルプレートに１００μｌ／ウェルで加え、４℃で１６時間～２０時間置いた。９６ウェルプレートからＰＢＳ緩衝液を除去し、ＰＢＳＴ（０．０５％ｔｗｅｅｎ２０を含むｐＨ７．４のＰＢＳ）緩衝液で１回洗浄した。ＰＢＳＴ／１％ミルクを１２０μｌ／ウェルで加え、室温で１時間インキュベートしてブロッキングした。ブロッキング溶液を除去し、プレートをＰＢＳＴ緩衝液で１回洗浄した。サンプル希釈液（５％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むｐＨ７．４のＰＢＳ）で適切な濃度に希釈した試験対象のＰＤ－Ｌ１－ＣＤ４７二機能性融合タンパク質を９０μｌ添加し、４℃で１時間プレインキュベートした。１０倍濃度のビオチン標識ＳＩＲＰα－ｈｉｓ（１０μｇ／ｍｌ）を１０μｌ／ウェルの容量で加え、シェーカーでよく振って混合した後、３７℃で１時間インキュベートした。反応系を取り出し、ＰＢＳＴでプレートを６回洗浄した。ＰＢＳＴ緩衝液で希釈したストレプトアビジン－ペルオキシダーゼポリマー１：４００を１００μｌ／ウェル加え、室温で５０分間振とうしながらインキュベートした。プレートをＰＢＳＴで６回洗浄した。ＴＭＢを１００μｌ／ウェル加え、室温で５～１０分間インキュベートした。１Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４を１００μｌ／ウェル加えて反応を停止させた。マイクロプレートリーダーでＮＯＶＯＳｔａｒを用いてＯＤ４５０を測定し、ＩＣ５０値を算出した。その結果を表１６に示す。

【表16】

【0199】

結果は、二機能性融合タンパク質がＣＤ４７及びＳＩＲＰαの経路を効果的に遮断できることを示した。

【0200】

（試験例１６．ヒト乳がん細胞ＭＤＡ－ＭＢ－２３１移植腫瘍に対するＰＤ－Ｌ１－ＣＤ４７二機能性融合タンパク質の有効性）
ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの右肋骨部にＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞（ＡＴＣＣ）を３×１０^６細胞／２００μｌ／マウス（５０％マトリゲルを含む）で皮下接種した。担がんマウスの平均腫瘍体積が約１４５ｍｍ^３に達した時点で、マウスを無作為に４つのグループに分けた：ＰＢＳ、ｈ１８３１Ｋ－１９－Ｓ３７－３０ｍｐｋ、ｈ１８３１Ｋ－１９－Ｓ３７－１０ｍｐｋ、ｈ１８３１Ｋ－２５ｍｐｋ（ｈ１８３１Ｋ－１９－Ｓ３７高用量の濃度と等モルの濃度に維持）、各グループ８匹のマウスを使用。グルーピングの日を実験の０日目とした。０日目に、ＣＤ３抗体で３日間刺激した２人のボランティアのＰＢＭＣを１：１の比率で混合し、マウス腫瘍組織に５×１０^５細胞／１００μｌ／マウスで注入した。残りのＰＢＭＣの刺激を止め、これらのＰＢＭＣを１週間培養し続け、５×１０^６細胞／１００μｌ／マウスで担がんマウスに腹腔内注射し、これを１回目の注射とした。実験終了時までに、合計２回のＰＢＭＣを注入した。０日目から週に３回、試験する各抗体を腹腔内注射した。週に２回、腫瘍体積及び動物の体重をモニターし、データを記録した。腫瘍体積が１０００ｍｍ^３を超えたとき、又はほとんどの腫瘍に潰瘍が観察されたとき、又は体重が２０％減少したとき、実験エンドポイントとして、担がん動物を安楽死させた。

【0201】

Ｅｘｃｅｌ及びＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５ソフトウェアを用いて全てのデータをグラフ化し、統計的に分析した。
腫瘍体積（Ｖ）の計算式：Ｖ＝１／２×ａ×ｂ^２（式中、ａ及びｂはそれぞれ長さ及び幅を表す。）
相対腫瘍増殖率Ｔ／Ｃ（％）＝（Ｔ－Ｔ_０）／（Ｃ－Ｃ_０）×１００（式中、Ｔ及びＣは実験終了時の治療グループ及び対照グループの腫瘍体積である；Ｔ_０及びＣ_０は実験開始時の腫瘍体積である）。
腫瘍増殖抑制率（ＴＧＩ）（％）＝１－Ｔ／Ｃ（％）。

【0202】

実験の結果は、ヒト乳がんＭＤＡ－ＭＢ－２３１マウス皮下移植腫瘍モデルにおいて、ＰＤＬ１－ＣＤ４７二重特異性抗体ｈ１８３１Ｋ－１９－Ｓ３７及びＰＤＬ１モノクローナル抗体ｈ１８３１Ｋがともに良好な腫瘍抑制効果を示すことを示した（ＰＢＳに対してｐ＜０．００１）。

【0203】

ＰＤ－Ｌ１－ＣＤ４７二重特異性抗体ｈ１８３１Ｋ－１９－Ｓ３７（３０、１０ｍｇ／ｋｇ）は、ヒト乳がんＭＤＡ－ＭＢ－２３１マウス皮下移植腫瘍の増殖を有意に抑制することができ、高用量と低用量の間に用量依存性が見られた。投与３日後から実験終了時（２３日目）まで、高用量グループ、低用量グループにかかわらず、ｈ１８３１Ｋ－１９－Ｓ３７の腫瘍抑制効果は、高用量のＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体対照ｈ１８３１Ｋ（２５ｍｇ／ｋｇ）の腫瘍抑制効果よりも常に良好であり（ｐ＜０．００１）、高用量と低用量の間にも統計的差異が見られた（ｐ＜０．０１）（表１７）。

【0204】

実験終了時に、担がんマウスを安楽死させ、腫瘍を採取し、腫瘍重量を測定した。その結果、ｅｘ ｖｉｖｏの腫瘍重量は、腫瘍体積の傾向と一致していることが示された。全ての治療グループが対照グループよりも有意に良好であった（ｐ＜０．００１）。二重特異性抗体ｈ１８３１Ｋ－１９－Ｓ３７の高用量及び低用量グループの両方が高用量ＰＤＬ１モノクローナル抗体対照ｈ１８３１Ｋ（２５ｍｇ／ｋｇ、ｐ＜０．００１）よりも良好であり、ｈ１８３１Ｋ－１９－Ｓ３７の高用量と低用量の間には用量依存的効果が見られた。

【0205】

担がんマウスは、ＰＤＬ１－ＣＤ４７二重特異性抗体及びそのモノクローナル抗体に対して耐性があった。投与プロセス全体で体重の変動はわずかであり、本薬剤による明らかな体重減少又はその他の症状は認められなかった。

【表17】

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図3】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図6】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図7D】

【図7E】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【配列表】

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【国際調査報告】