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特表2022-523691生体電気回路、それを製造および使用するためのシステムおよび方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-04-26
(54)【発明の名称】生体電気回路、それを製造および使用するためのシステムおよび方法
(51)【国際特許分類】
C12M 1/34 20060101AFI20220419BHJP
C12Q 1/37 20060101ALI20220419BHJP
C12Q 1/48 20060101ALI20220419BHJP
C12Q 1/44 20060101ALI20220419BHJP
C07K 7/08 20060101ALN20220419BHJP
C07K 7/52 20060101ALN20220419BHJP
C07K 16/10 20060101ALN20220419BHJP
C07K 16/44 20060101ALN20220419BHJP
C07K 14/705 20060101ALN20220419BHJP
C07K 14/36 20060101ALN20220419BHJP
C12N 15/11 20060101ALN20220419BHJP
【ＦＩ】
C12M1/34 E
C12Q1/37 ZNA
C12Q1/48 Z
C12Q1/44
C07K7/08
C07K7/52
C07K16/10
C07K16/44
C07K14/705
C07K14/36
C12N15/11 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021543394
(86)(22)【出願日】2020-01-30
(85)【翻訳文提出日】2021-09-22
(86)【国際出願番号】 US2020015931
(87)【国際公開番号】W WO2020160300
(87)【国際公開日】2020-08-06
(31)【優先権主張番号】62/799,006
(32)【優先日】2019-01-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．テフロン
(71)【出願人】
【識別番号】507243142
【氏名又は名称】アリゾナ・ボード・オブ・リージェンツ・オン・ビハーフ・オブ・アリゾナ・ステイト・ユニバーシティー
【氏名又は名称原語表記】Ａｒｉｚｏｎａ Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｒｅｇｅｎｔｓ ｏｎ ｂｅｈａｌｆ ｏｆ Ａｒｉｚｏｎａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
(74)【代理人】
【識別番号】110000338
【氏名又は名称】特許業務法人ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ
(72)【発明者】
【氏名】リンジィ，スチュアート
(72)【発明者】
【氏名】チャン，ビンテン
(72)【発明者】
【氏名】デン，ハンチン
【テーマコード（参考）】
4B029
4B063
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B029AA07
4B029BB15
4B029BB16
4B029BB17
4B029CC02
4B029FA13
4B063QA20
4B063QQ26
4B063QQ34
4B063QQ36
4B063QR32
4B063QR42
4B063QR48
4B063QS36
4B063QX04
4H045AA20
4H045AA30
4H045AA40
4H045BA13
4H045BA16
4H045BA17
4H045CA11
4H045CA40
4H045DA75
4H045DA89
4H045EA50
4H045EA55
(57)【要約】
リガンド－レセプター相互作用の電気的特性およびタンパク質内部の準金属的特性を利用して、タンパク質を集合させ、電気的に接続して、生体電気検出器および論理回路を作製するための汎用接続装置。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ａ）第１の電極および第２の電極と、（ｂ）タンパク質特異的な第１のリガンドおよび第２のリガンドであって、前記第１のリガンドは前記第１の電極に付着し、前記第２のリガンドは前記第２の電極に付着するように、前記リガンドは改変されている、前記第１のリガンドおよび前記第２のリガンドと、
（ｃ）前記第１のリガンドおよび前記第２のリガンドに結合するように改変されているタンパク質であって、第１のリガンドおよび第２のリガンドへの前記タンパク質の結合は、前記電極と前記タンパク質との間に電気的接続を形成する、前記タンパク質と、
を含む、生体電気回路。
【請求項2】
前記電極は、パラジウム、白金または金からなる群より選択される金属を含む、請求項１に記載の生体電気回路。
【請求項3】
前記リガンドは、ＨＳＣＨ２ＣＨ２－ジニトロフェノール、ＣＡＬＤＲＷＥＫＩＲＬＲ（配列番号１）、ＣＨＮＴＰＶＹＫＬＤＩＳＥＡＴＱＶ（配列番号２）、環状ＲＧＤｆＣ、チオール化ストレプトアビジン、およびＨＳＣＨ２ＣＨ２－ビオチンからなる群より選択される、請求項１または２に記載の生体電気回路。
【請求項4】
前記タンパク質は、ＩｇＥ抗ＤＮＰ、ＩｇＧ抗ＨＩＶ、ＩｇＧ抗エボラ、Ｆａｂ抗エボラ、αＶβ３インテグリン、およびストレプトアビジンからなる群より選択される、請求項１または２に記載の生体電気回路。
【請求項5】
前記タンパク質がポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼまたはプロテオソームであることをさらに含む、請求項１または２に記載の生体電気回路。
【請求項6】
少なくとも１つの前記リガンドは、チオール、アミン、ジスルフィドまたはシアニド部分を含むように改変されている、請求項１に記載の生体電気回路。
【請求項7】
前記リガンドは、チオール化ストレプトアビジンである、請求項１に記載の生体電気回路。
【請求項8】
前記タンパク質は、ビオチンを含有するように改変されている、請求項１または７に記載の生体電気回路。
【請求項9】
前記タンパク質は、ビスビオチン化ポリメラーゼである、請求項１または２に記載の生体電気回路。
【請求項10】
（ａ）第１の電極および第２の電極と、（ｂ）タンパク質特異的な第１のリガンドであって、前記第１のリガンドは前記第１の電極に付着するように改変されている、前記第１のリガンドと、
（ｃ）前記第１のリガンドに結合するタンパク質であって、第２のリガンドに結合するように改変されている、前記タンパク質と、
（ｄ）前記タンパク質に結合する第２のリガンドであって、前記第２の電極に付着することによって、前記第１の電極と前記第２の電極と前記タンパク質との間に電気的接続を形成するように改変されている、前記第２のリガンドと、
を含む、生体電気回路。
【請求項11】
前記第１のリガンドへの前記タンパク質の結合部位は、フレキシブルリンカー配列に近接している、請求項１０に記載の生体電気回路。
【請求項12】
前記第２のリガンドへの前記タンパク質の第２の結合部位は、フレキシブルリンカー配列に近接している、請求項１０に記載の生体電気回路。
【請求項13】
前記フレキシブルリンカー配列は、ＧＮＳＴＮＧＴＳＮＧＳＳ（配列番号３）を含む、請求項１１または１２に記載の生体電気回路。
【請求項14】
（ａ）第１の電極および第２の電極と、（ｂ）第１のタンパク質であって、前記第１のタンパク質は、ビオチン－ストレプトアビジン相互作用を介して、前記第１の電極に付着している、前記第１のタンパク質と、
（ｃ）第２のタンパク質であって、前記第２のタンパク質は、ビオチン－ストレプトアビジン相互作用を介して、前記第１のタンパク質に付着しており、前記第２のタンパク質はリガンドに結合するように改変されている、前記第２のタンパク質と、
（ｄ）前記第２のタンパク質に結合するリガンドであって、前記第２の電極に付着することによって、前記第１の電極と前記第２の電極と前記第１のタンパク質と前記第２のタンパク質との間に電気的接続を形成するように改変されている、前記リガンドと、
を含む、生体電気回路。
【請求項15】
前記第１のタンパク質は、２つのビオチンを含む、請求項１４に記載の生体電気回路。
【請求項16】
前記第２のタンパク質は、２つのビオチン化Ａｖｉタグ配列を含む、請求項１５に記載の生体電気回路。
【請求項17】
（ａ）第１の電極および第２の電極と、（ｂ）第１のタンパク質および第２のタンパク質であって、前記第１のタンパク質および前記第２のタンパク質のうち１つまたは両方は、ビオチン－ストレプトアビジン相互作用を通して、前記第１の電極および前記第２の電極に付着していることによって、前記第１の電極と前記第２の電極と、前記第１のタンパク質および前記第２のタンパク質のうち１つまたは両方との間に電気的接続を形成する、前記第１のタンパク質および前記第２のタンパク質と、
を含む、生体電気回路。
【請求項18】
第１の結合部位は、ビオチン化することができる１つ以上の残基を含む、請求項１７に記載の生体電気回路。
【請求項19】
（ａ）第１の電極および第２の電極と、（ｂ）第１のタンパク質であって、前記第１のタンパク質は、ビオチン－ストレプトアビジン相互作用を介して、前記第１の電極に付着している、前記第１のタンパク質と、
（ｃ）第２のタンパク質であって、前記第２のタンパク質は、ビオチン－ストレプトアビジン相互作用を介して、前記第１のタンパク質に付着しており、前記第２のタンパク質は、ビオチン－ストレプトアビジン相互作用を介して、前記第２の電極に付着している、前記第２のタンパク質と、
（ｄ）第３のタンパク質であって、前記第３のタンパク質は、ビオチン－ストレプトアビジン相互作用を介して、前記第１のタンパク質および前記第２のタンパク質に付着していることにより、前記第１の電極と前記第２の電極と前記第１のタンパク質と前記第２のタンパク質と前記第３のタンパク質との間に電気的接続を形成する、前記第３のタンパク質と、
を含む、生体電気回路。
【請求項20】
（ａ）第１の電極と、（ｂ）第１のタンパク質であって、前記第１のタンパク質は、ビオチン－ストレプトアビジン相互作用を介して、前記第１の電極に付着している、前記第１のタンパク質と、
（ｃ）第２のタンパク質であって、前記第２のタンパク質は、ビオチン－ストレプトアビジン相互作用を介して、前記第１のタンパク質に付着しており、前記第２のタンパク質は、ビオチン－ストレプトアビジン相互作用を介して、第２の電極に付着している、前記第２のタンパク質と、
（ｄ）電解質と接続しており、前記第１の電極に接続された、第２の電極と、
（ｅ）電圧バイアスを印加するための手段と、
（ｆ）電流を感知することにより、前記第１の電極と前記第２の電極と前記第１のタンパク質と前記第２のタンパク質との間に電気的接続を形成するための手段と、
を含む、生体電気回路。
【請求項21】
生体電気回路の製造方法であって、前記方法は、（ａ）少なくとも１つのストレプトアビジン分子を少なくとも１つの電極に付着させる工程と、
（ｂ）ビオチン化タンパク質を、工程（ａ）由来のストレプトアビジン－電極に対して導入し、前記少なくとも１つの電極、前記少なくとも１つのストレプトアビジン分子、および前記ビオチン化タンパク質を含む複合体を形成する工程と、
を含む、方法。
【請求項22】
ポリメラーゼの活性の検出方法であって、前記方法は、ＤＮＡ鋳型およびヌクレオ三リン酸の溶液を、請求項１に記載の生体電気回路に対して導入する工程を含み、
重合産物が、前記ポリメラーゼが活性であることを示す、方法。
【請求項23】
タンパク質の活性の検出方法であって、前記方法は、前記タンパク質の基質を、請求項１に記載の生体電気回路に対して導入する工程と、
電位変化を検出する工程と、
を含む、方法。
【請求項24】
タンパク質活性の電気的測定のためのシステムであって、前記システムは、（ａ）請求項１に記載の生体電気回路と、
（ｂ）第１の電極と第２の電極との間にバイアスを印加するための手段と、
（ｃ）前記生体電気回路を通る電流を検出するための手段と、
を含む、システム。
【請求項25】
（ａ）第１の電極および第２の電極と、（ｂ）タンパク質特異的な第１のリガンドおよび第２のリガンドであって、前記第１のリガンドは前記第１の電極に付着し、前記第２のリガンドは前記第２の電極に付着するように、前記リガンドは改変されている、前記第１のリガンドおよび前記第２のリガンドと、
（ｃ）前記第１のリガンドおよび前記第２のリガンドに結合する、第１のタンパク質および第２のタンパク質と、
（ｄ）前記第１のタンパク質および前記第２のタンパク質に結合するように改変されている第３のタンパク質であって、第１のタンパク質および第２のタンパク質への前記第３のタンパク質の結合は、前記電極と前記タンパク質との間に電気的接続を形成する、前記第３のタンパク質と、
を含む、生体電気回路。
【請求項26】
前記第１のタンパク質および前記第２のタンパク質は、ストレプトアビジンである、請求項２５に記載の生体電気回路。
【請求項27】
前記第１のリガンドおよび前記第２のリガンドは、ビオチンである、請求項２５に記載の生体電気回路。
【請求項28】
前記第３のタンパク質は、ビオチン化されている、請求項２５に記載の生体電気回路。
【請求項29】
（ａ）第１の電極および第２の電極と、（ｂ）タンパク質特異的な第１のリガンドおよび第２のリガンドであって、前記第１のリガンドは前記第１の電極に付着し、前記第２のリガンドは前記第２の電極に付着するように、前記リガンドは改変されている、前記第１のリガンドおよび前記第２のリガンドと、
（ｃ）少なくとも第１のタンパク質と、第２のタンパク質とであって、前記第１のタンパク質および前記第２のタンパク質は、前記第１のリガンドおよび前記第２のリガンドに結合し、リガンドを介してさらなるタンパク質に結合していてもよく、コンダクションが得られる範囲で延在している、前記第１のタンパク質および前記第２のタンパク質と、
を含む、生体電気回路。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【0001】
〔連邦政府による資金提供を受けた研究または開発〕
本発明は、国立衛生研究所より授与されたＲ０１ ＨＧ００９１８０の下での政府の支援によりなされたものである。政府は、本発明における一定の権利を有する。
本発明は、国立衛生研究所より授与されたＲ０１ ＨＧ００９１８０の下での政府の支援によりなされたものである。政府は、本発明における一定の権利を有する。
【0002】
〔背景〕
市販されている多くの試薬を用いて、分子集合体を構築するためにストレプトアビジン－ビオチン結合を使用することは、当技術分野で公知である。電極へのタンパク質の化学的カップリングが、金属電極とタンパク質との間の電子伝達を増強することもまた、公知である。これにより、特異的共有結合が形成され得１、あるいは、電極に親水性を付与し、したがってタンパク質と水素結合を形成する能力を付与する小分子（アミノ酸など）による電極の官能化がなされ得る２。
市販されている多くの試薬を用いて、分子集合体を構築するためにストレプトアビジン－ビオチン結合を使用することは、当技術分野で公知である。電極へのタンパク質の化学的カップリングが、金属電極とタンパク質との間の電子伝達を増強することもまた、公知である。これにより、特異的共有結合が形成され得１、あるいは、電極に親水性を付与し、したがってタンパク質と水素結合を形成する能力を付与する小分子（アミノ酸など）による電極の官能化がなされ得る２。
【0003】
いくつかのタンパク質は非常に長い距離にわたって導電性であることが知られている２～４一方、電極とタンパク質との間に特異的な化学的接続が形成された場合にのみ、特に、リガンドと相互作用するように進化したタンパク質の疎水性内部と相互作用する同系のリガンドの相互作用に基づく接続がなされた場合にのみ、このコンダクティビティがはっきりとすることが、近年明らかになった５。さらに、高い電子コンダクティビティ（長距離、２～２０ｎｍ、でｎＳ）は、電子伝達機能を実行するように進化したタンパク質だけでなく、タンパク質共通の特性であるらしいことを、この最近の研究は示した。このような挙動は、本明細書では準金属的コンダクションと呼ばれる。最後に、タンパク質の表面チオール改変を介した電極へのタンパク質自体の直接的な付着よりも、タンパク質への特異的なリガンド分子（それ自体がチオール結合によって電極に結合している）の結合が、タンパク質への良好な接続を生じたこともまた、この研究は示した。したがって、弱い可逆的結合を介して結合することができるが、そうすることでタンパク質の疎水性内部と接続するリガンドは、タンパク質の親水性外部上の残基への強い不可逆的共有結合よりも、より良好な電気的コネクタである。タンパク質と電極との間、または１つのタンパク質と別のタンパク質との間の電気的接続を形成するための最も堅牢な方法は、進化したタンパク質が形成する特異的な化学的接続、すなわちリガンド－レセプター相互作用を使用することである。さらに、タンパク質の内部は電子輸送材料として準金属的特性を示す、と確信する理論的な根拠がある６。これは、電子伝達タンパク質ではない一連のタンパク質において測定するには高すぎるコンダクタンス（すなわち、接続が制限される）のＺｈａｎｇらによる研究結果と一致する５。同じ性質が電子伝達タンパク質に存在する（それらは、生物学的必要性に基づいて予想され得る）。興味深いことに、試験された機能性タンパク質はすべて、電子輸送機能を実行しないタンパク質において、現在、それについての既知の進化的役割が存在しないにもかかわらず、この準金属的特性を有する。
【0004】
〔発明の概要〕
本開示は、生体電気回路、それを製造および使用するためのシステムおよび方法を提供する。
本開示は、生体電気回路、それを製造および使用するためのシステムおよび方法を提供する。
【0005】
一実施形態において、生体電気回路が提供される。この実施形態の一態様において、生体電気回路は、（ａ）少なくとも１つの電極と、（ｂ）タンパク質特異的な少なくとも１つのリガンドであって、当該リガンドは少なくとも１つの電極に付着するように改変されている、少なくとも１つのリガンドと、（ｃ）少なくとも１つのタンパク質であって、リガンドに結合することによって、電極と当該タンパク質との間に電気的接続を形成する、少なくとも１つのタンパク質と、を含む。
【0006】
第２の態様において、生体電気回路は、（ａ）第１の電極および第２の電極と、（ｂ）タンパク質特異的な第１のリガンドおよび第２のリガンドであって、第１のリガンドは第１の電極に付着し、第２のリガンドは第２の電極に付着するように、リガンドは改変されている、第１のリガンドおよび第２のリガンドと、（ｃ）第１のリガンドおよび第２のリガンドに結合するように改変されているタンパク質であって、第１のリガンドおよび第２のリガンドへのタンパク質の結合は、電極と当該タンパク質との間に電気的接続を形成する、タンパク質と、を含む。
【0007】
第３の態様において、生体電気回路は、（ａ）第１の電極および第２の電極と、（ｂ）タンパク質特異的な第１のリガンドであって、第１のリガンドは第１の電極に付着するように改変されている、第１のリガンドと、（ｃ）第１のリガンドに結合するタンパク質であって、第２のリガンドに結合するように改変されている、タンパク質と、（ｄ）タンパク質に結合する第２のリガンドであって、第２の電極に付着することによって、第１の電極と第２の電極とタンパク質との間に電気的接続を形成するように改変されている、第２のリガンドと、を含む。
【0008】
第４の態様において、生体電気回路は、（ａ）第１の電極および第２の電極と、（ｂ）第１のタンパク質であって、第１のタンパク質は、ビオチン－ストレプトアビジン相互作用を介して、第１の電極に付着している、第１のタンパク質と、（ｃ）第２のタンパク質であって、第２のタンパク質は、ビオチン－ストレプトアビジン相互作用を介して、第１のタンパク質に付着しており、第２のタンパク質はリガンドに結合するように改変されている、第２のタンパク質と、（ｄ）第２のタンパク質に結合するリガンドであって、第２の電極に付着することによって、第１の電極と第２の電極と第１のタンパク質と第２のタンパク質との間に電気的接続を形成するように改変されている、リガンドと、を含む。
【0009】
第５の態様において、生体電気回路は、（ａ）第１の電極および第２の電極と、（ｂ）第１のタンパク質および第２のタンパク質であって、第１のタンパク質および第２のタンパク質のうち１つまたは両方は、ビオチン－ストレプトアビジン相互作用を通して、第１の電極および第２の電極に付着していることによって、第１の電極と第２の電極と、第１のタンパク質および第２のタンパク質のうち１つまたは両方との間に電気的接続を形成する、第１のタンパク質および第２のタンパク質と、を含む。
【0010】
第６の態様において、生体電気回路は、（ａ）第１の電極および第２の電極と、（ｂ）第１のタンパク質であって、第１のタンパク質は、ビオチン－ストレプトアビジン相互作用を介して、第１の電極に付着している、第１のタンパク質と、（ｃ）第２のタンパク質であって、第２のタンパク質は、ビオチン－ストレプトアビジン相互作用を介して、第１のタンパク質に付着しており、第２のタンパク質は、ビオチン－ストレプトアビジン相互作用を介して、第２の電極に付着している、第２のタンパク質と、（ｄ）第３のタンパク質であって、第３のタンパク質は、ビオチン－ストレプトアビジン相互作用を介して、第１のタンパク質および第２のタンパク質に付着していることにより、第１の電極と第２の電極と第１のタンパク質と第２のタンパク質と第３のタンパク質との間に電気的接続を形成する、第３のタンパク質と、を含む。
【0011】
第７の態様において、生体電気回路は、（ａ）第１の電極と、（ｂ）第１のタンパク質であって、第１のタンパク質は、ビオチン－ストレプトアビジン相互作用を介して、第１の電極に付着している、第１のタンパク質と、（ｃ）第２のタンパク質であって、第２のタンパク質は、ビオチン－ストレプトアビジン相互作用を介して、第１のタンパク質に付着しており、第２のタンパク質は、ビオチン－ストレプトアビジン相互作用を介して、第２の電極に付着している、第２のタンパク質と、（ｄ）電解質と接続しており、第１の電極に接続された、第２の電極と、（ｅ）電圧バイアスを印加するための手段と、（ｆ）電流を感知することにより、第１の電極と第２の電極と第１のタンパク質と第２のタンパク質との間に電気的接続を形成するための手段と、を含む。
【0012】
第８の態様において、生体電子回路は、本明細書に記載のものであり、タンパク質は、タンパク質の表面に配置された２つ以上のＡｖｉタグ配列と、タンパク質内にチロシン、トリプトファンまたはヒスチジンからの１０以下のアミノ酸残基と、を含む。
【0013】
第９の態様において、生体電気回路は、（ａ）第１の電極および第２の電極と、（ｂ）タンパク質特異的な第１のリガンドおよび第２のリガンドであって、第１のリガンドは第１の電極に付着し、第２のリガンドは第２の電極に付着するように、リガンドは改変されている、第１のリガンドおよび第２のリガンドと、（ｃ）第１のリガンドおよび第２のリガンドに結合する、第１のタンパク質および第２のタンパク質と、（ｄ）第１のタンパク質および第２のタンパク質に結合するように改変されている第３のタンパク質であって、第１のタンパク質および第２のタンパク質への第３のタンパク質の結合は、電極とタンパク質との間に電気的接続を形成する、第３のタンパク質と、を含む。
【0014】
第１０の態様において、生体電子回路は、（ａ）第１の電極および第２の電極と、（ｂ）タンパク質特異的な第１のリガンドおよび第２のリガンドであって、第１のリガンドは第１の電極に付着し、第２のリガンドは第２の電極に付着するように、リガンドは改変されている、第１のリガンドおよび第２のリガンドと、（ｃ）少なくとも第１のタンパク質と、第２のタンパク質とであって、第１のタンパク質および第２のタンパク質は、第１のリガンドおよび第２のリガンドに結合し、リガンドを介してさらなるタンパク質に結合していてもよく、コンダクションが得られる範囲で延在している、第１のタンパク質および第２のタンパク質と、を含む。
【0015】
別の実施形態において、タンパク質活性の電気的測定のためのシステムが提供される。当該システムは、（ａ）本明細書に記載の生体電気回路と、（ｂ）第１の電極と第２の電極との間にバイアスを印加するための手段と、（ｃ）生体電気回路を通る電流を検出するための手段と、を含む。
【0016】
別の実施形態において、生体電気回路の製造方法が提供される。一態様において、当該方法は、（ａ）少なくとも１つのストレプトアビジン分子を少なくとも１つの電極に付着させる工程と、（ｂ）ビオチン化タンパク質を、工程（ａ）由来のストレプトアビジン－電極に対して導入し、少なくとも１つの電極、少なくとも１つのストレプトアビジン分子、およびビオチン化タンパク質を含む複合体を形成する工程と、を含む。
【0017】
別の実施形態において、ポリメラーゼの活性の検出方法であって、当該方法は、ＤＮＡ鋳型およびヌクレオ三リン酸の溶液を、本明細書中に記載の生体電気回路のいずれかに対して導入する工程を含み、重合産物が、ポリメラーゼが活性であることを示す。
【0018】
別の実施形態において、タンパク質の活性の検出方法。当該方法は、タンパク質の基質を、本明細書に記載の生体電気回路のいずれかに対して導入する工程と、電位変化を検出する工程と、を含む。
【0019】
〔図面の簡単な説明〕
図１は、ビスビオチンシスタミン分子の化学構造を示す。
図１は、ビスビオチンシスタミン分子の化学構造を示す。
【0020】
【0021】
図３は、ビオチン改変ポリメラーゼを回路に配線するためにストレプトアビジンワイヤを使用する生体電気回路の概略図を示す。
【0022】
図４は、２つのストレプトアビジン分子に結合したビオチン化ポリメラーゼが活性であり、効率的な酵素作用が可能であることを実証するゲルアッセイを示す。
【0023】
【0024】
【0025】
図７Ａおよび図７Ｂは、ビオチンと結合し、電極に直接的に結合したチオール化ストレプトアビジンについて測定されたコンダクタンス分布と、図２に示すチオール化ビオチンと電極に結合した野生型ストレプトアビジンについてのコンダクタンス分布と、の比較を示す。ここで、ビオチンは、明確にするために大きさが誇張されて示されている。
【0026】
図８は、２つ以上の選択的リガンドを用いて生体分子ＡＮＤゲートを形成する配向回路素子の概略図を示す。
【0027】
【0028】
図１０Ａおよび図１０Ｂは、２つのＡｖｉタグリンカーを含むように改変されたｐｈｉ２９ポリメラーゼについてのタンパク質配列の例を示し、荷電残基の組み込みがどのようにミスフォールディングを引き起こし得るかを示す。
【0029】
【0030】
図１２は、生体分子ＯＲゲートの概略図を示す。
【0031】
図１３は、生体分子スリーステートゲートの概略図を示す。
【0032】
図１４は、電解質溶液に浸漬された酸化還元活性タンパク質によって第２の接続が形成される、単一電極回路の概略図を示す。
【0033】
【0034】
【0035】
〔発明の詳細な説明〕
本発明は、以下を含む。
本発明は、以下を含む。
【0036】
１．図示および記載の生体電気回路。
【0037】
２．図示および記載のタンパク質活性の電気的測定のためのシステム。
【0038】
３．図示および記載のタンパク質活性の検出方法。
【0039】
４．（ａ）少なくとも１つの電極と、
（ｂ）タンパク質特異的な少なくとも１つのリガンドであって、当該リガンドは少なくとも１つの電極に付着するように改変されている、少なくとも１つのリガンドと、
（ｃ）少なくとも１つのタンパク質であって、リガンドに結合することによって、電極と当該タンパク質との間に電気的接続を形成する、少なくとも１つのタンパク質と、
を含む、生体電気回路。
（ｂ）タンパク質特異的な少なくとも１つのリガンドであって、当該リガンドは少なくとも１つの電極に付着するように改変されている、少なくとも１つのリガンドと、
（ｃ）少なくとも１つのタンパク質であって、リガンドに結合することによって、電極と当該タンパク質との間に電気的接続を形成する、少なくとも１つのタンパク質と、
を含む、生体電気回路。
【0040】
５．電極は、パラジウム、白金または金からなる群より選択される金属を含む、上記４に記載の生体電気回路。
【0041】
６．リガンドは、ＨＳＣＨ２ＣＨ２－ジニトロフェノール、ＣＡＬＤＲＷＥＫＩＲＬＲ（配列番号１）、ＣＨＮＴＰＶＹＫＬＤＩＳＥＡＴＱＶ（配列番号２）、環状ＲＧＤｆＣ、チオール化ストレプトアビジン、およびＨＳＣＨ２ＣＨ２－ビオチンからなる群より選択される、上記４または５に記載の生体電気回路。
【0042】
７．タンパク質は、ＩｇＥ抗ＤＮＰ、ＩｇＧ抗ＨＩＶ、ＩｇＧ抗エボラ、Ｆａｂ抗エボラ、αＶβ３インテグリン、およびストレプトアビジンからなる群より選択される、上記４～６のいずれかに記載の生体電気回路。
【0043】
８．タンパク質がポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼまたはプロテオソームであることをさらに含む、上記４～６のいずれかに記載の生体電気回路。
【0044】
９．少なくとも１つのリガンドは、チオール、アミン、ジスルフィドまたはシアニド部分を含むように改変されている、上記４に記載の生体電気回路。
【0045】
１０．（ａ）第１の電極および第２の電極と、
（ｂ）タンパク質特異的な第１のリガンドおよび第２のリガンドであって、第１のリガンドは第１の電極に付着し、第２のリガンドは第２の電極に付着するように、リガンドは改変されている、第１のリガンドおよび第２のリガンドと、
（ｃ）第１のリガンドおよび第２のリガンドに結合するように改変されているタンパク質であって、第１のリガンドおよび第２のリガンドへのタンパク質の結合は、電極とタンパク質との間に電気的接続を形成する、タンパク質と、
を含む、生体電気回路。
（ｂ）タンパク質特異的な第１のリガンドおよび第２のリガンドであって、第１のリガンドは第１の電極に付着し、第２のリガンドは第２の電極に付着するように、リガンドは改変されている、第１のリガンドおよび第２のリガンドと、
（ｃ）第１のリガンドおよび第２のリガンドに結合するように改変されているタンパク質であって、第１のリガンドおよび第２のリガンドへのタンパク質の結合は、電極とタンパク質との間に電気的接続を形成する、タンパク質と、
を含む、生体電気回路。
【0046】
１１．リガンドは、チオール化ストレプトアビジンである、上記１０に記載の生体電気回路。
【0047】
１２．タンパク質は、ビオチンを含有するように改変されている、上記１０または１１に記載の生体電気回路。
【0048】
１３．タンパク質は、ビスビオチン化ポリメラーゼである、上記１０～１２のいずれかに記載の生体電気回路。
【0049】
１４．（ａ）第１の電極および第２の電極と、
（ｂ）タンパク質特異的な第１のリガンドであって、第１のリガンドは第１の電極に付着するように改変されている、第１のリガンドと、
（ｃ）第１のリガンドに結合するタンパク質であって、第２のリガンドに結合するように改変されている、タンパク質と、
（ｄ）タンパク質に結合する第２のリガンドであって、第２の電極に付着することによって、第１の電極と第２の電極とタンパク質との間に電気的接続を形成するように改変されている、第２のリガンドと、
を含む、生体電気回路。
（ｂ）タンパク質特異的な第１のリガンドであって、第１のリガンドは第１の電極に付着するように改変されている、第１のリガンドと、
（ｃ）第１のリガンドに結合するタンパク質であって、第２のリガンドに結合するように改変されている、タンパク質と、
（ｄ）タンパク質に結合する第２のリガンドであって、第２の電極に付着することによって、第１の電極と第２の電極とタンパク質との間に電気的接続を形成するように改変されている、第２のリガンドと、
を含む、生体電気回路。
【0050】
１５．第１のリガンドへのタンパク質の結合部位は、フレキシブルリンカー配列に近接している、上記１４に記載の生体電気回路。
【0051】
１６．第２のリガンドへのタンパク質の第２の結合部位は、フレキシブルリンカー配列に近接している、上記１４に記載の生体電気回路。
【0052】
１７．フレキシブルリンカー配列は、ＧＮＳＴＮＧＴＳＮＧＳＳ（配列番号３）を含む、上記１５または１６に記載の生体電気回路。
【0053】
１８．（ａ）第１の電極および第２の電極と、
（ｂ）第１のタンパク質であって、第１のタンパク質は、ビオチン－ストレプトアビジン相互作用を介して、第１の電極に付着している、第１のタンパク質と、
（ｃ）第２のタンパク質であって、第２のタンパク質は、ビオチン－ストレプトアビジン相互作用を介して、第１のタンパク質に付着しており、第２のタンパク質はリガンドに結合するように改変されている、第２のタンパク質と、
（ｄ）第２のタンパク質に結合するリガンドであって、第２の電極に付着することによって、第１の電極と第２の電極と第１のタンパク質と第２のタンパク質との間に電気的接続を形成するように改変されている、リガンドと、
を含む、生体電気回路。
（ｂ）第１のタンパク質であって、第１のタンパク質は、ビオチン－ストレプトアビジン相互作用を介して、第１の電極に付着している、第１のタンパク質と、
（ｃ）第２のタンパク質であって、第２のタンパク質は、ビオチン－ストレプトアビジン相互作用を介して、第１のタンパク質に付着しており、第２のタンパク質はリガンドに結合するように改変されている、第２のタンパク質と、
（ｄ）第２のタンパク質に結合するリガンドであって、第２の電極に付着することによって、第１の電極と第２の電極と第１のタンパク質と第２のタンパク質との間に電気的接続を形成するように改変されている、リガンドと、
を含む、生体電気回路。
【0054】
１９．第１のタンパク質は、２つのビオチンを含む、上記１８に記載の生体電気回路。
【0055】
２０．第２のタンパク質は、２つのビオチン化Ａｖｉタグ配列を含む、上記１９に記載の生体電気回路。
【0056】
２１．（ａ）第１の電極および第２の電極と、
（ｂ）第１のタンパク質および第２のタンパク質であって、第１のタンパク質および第２のタンパク質のうち１つまたは両方は、ビオチン－ストレプトアビジン相互作用を通して、第１の電極および第２の電極に付着していることによって、第１の電極と第２の電極と、第１のタンパク質および第２のタンパク質のうち１つまたは両方との間に電気的接続を形成する、第１のタンパク質および第２のタンパク質と、
を含む、生体電気回路。
（ｂ）第１のタンパク質および第２のタンパク質であって、第１のタンパク質および第２のタンパク質のうち１つまたは両方は、ビオチン－ストレプトアビジン相互作用を通して、第１の電極および第２の電極に付着していることによって、第１の電極と第２の電極と、第１のタンパク質および第２のタンパク質のうち１つまたは両方との間に電気的接続を形成する、第１のタンパク質および第２のタンパク質と、
を含む、生体電気回路。
【0057】
２２．第１の結合部位は、ビオチン化することができる１つ以上の残基を含む、上記２１に記載の生体電気回路。
【0058】
２３．（ａ）第１の電極および第２の電極と、
（ｂ）第１のタンパク質であって、第１のタンパク質は、ビオチン－ストレプトアビジン相互作用を介して、第１の電極に付着している、第１のタンパク質と、
（ｃ）第２のタンパク質であって、第２のタンパク質は、ビオチン－ストレプトアビジン相互作用を介して、第１のタンパク質に付着しており、第２のタンパク質は、ビオチン－ストレプトアビジン相互作用を介して、第２の電極に付着している、第２のタンパク質と、
（ｄ）第３のタンパク質であって、第３のタンパク質は、ビオチン－ストレプトアビジン相互作用を介して、第１のタンパク質および第２のタンパク質に付着していることにより、第１の電極と第２の電極と第１のタンパク質と第２のタンパク質と第３のタンパク質との間に電気的接続を形成する、第３のタンパク質と、
を含む、生体電気回路。
（ｂ）第１のタンパク質であって、第１のタンパク質は、ビオチン－ストレプトアビジン相互作用を介して、第１の電極に付着している、第１のタンパク質と、
（ｃ）第２のタンパク質であって、第２のタンパク質は、ビオチン－ストレプトアビジン相互作用を介して、第１のタンパク質に付着しており、第２のタンパク質は、ビオチン－ストレプトアビジン相互作用を介して、第２の電極に付着している、第２のタンパク質と、
（ｄ）第３のタンパク質であって、第３のタンパク質は、ビオチン－ストレプトアビジン相互作用を介して、第１のタンパク質および第２のタンパク質に付着していることにより、第１の電極と第２の電極と第１のタンパク質と第２のタンパク質と第３のタンパク質との間に電気的接続を形成する、第３のタンパク質と、
を含む、生体電気回路。
【0059】
２４．（ａ）第１の電極と、
（ｂ）第１のタンパク質であって、第１のタンパク質は、ビオチン－ストレプトアビジン相互作用を介して、第１の電極に付着している、第１のタンパク質と、
（ｃ）第２のタンパク質であって、第２のタンパク質は、ビオチン－ストレプトアビジン相互作用を介して、第１のタンパク質に付着しており、第２のタンパク質は、ビオチン－ストレプトアビジン相互作用を介して、第２の電極に付着している、第２のタンパク質と、
（ｄ）電解質と接続しており、第１の電極に接続された、第２の電極と、
（ｅ）電圧バイアスを印加するための手段と、
（ｆ）電流を感知することにより、第１の電極と第２の電極と第１のタンパク質と第２のタンパク質との間に電気的接続を形成するための手段と、
を含む、生体電気回路。
（ｂ）第１のタンパク質であって、第１のタンパク質は、ビオチン－ストレプトアビジン相互作用を介して、第１の電極に付着している、第１のタンパク質と、
（ｃ）第２のタンパク質であって、第２のタンパク質は、ビオチン－ストレプトアビジン相互作用を介して、第１のタンパク質に付着しており、第２のタンパク質は、ビオチン－ストレプトアビジン相互作用を介して、第２の電極に付着している、第２のタンパク質と、
（ｄ）電解質と接続しており、第１の電極に接続された、第２の電極と、
（ｅ）電圧バイアスを印加するための手段と、
（ｆ）電流を感知することにより、第１の電極と第２の電極と第１のタンパク質と第２のタンパク質との間に電気的接続を形成するための手段と、
を含む、生体電気回路。
【0060】
２５．生体電気回路の製造方法であって、当該方法は、
（ａ）少なくとも１つのストレプトアビジン分子を少なくとも１つの電極に付着させる工程と、
（ｂ）ビオチン化タンパク質を、工程（ａ）由来のストレプトアビジン－電極に対して導入し、少なくとも１つの電極、少なくとも１つのストレプトアビジン分子、およびビオチン化タンパク質を含む複合体を形成する工程と、
を含む。
（ａ）少なくとも１つのストレプトアビジン分子を少なくとも１つの電極に付着させる工程と、
（ｂ）ビオチン化タンパク質を、工程（ａ）由来のストレプトアビジン－電極に対して導入し、少なくとも１つの電極、少なくとも１つのストレプトアビジン分子、およびビオチン化タンパク質を含む複合体を形成する工程と、
を含む。
【0061】
２６．ポリメラーゼの活性の検出方法であって、当該方法は、
ＤＮＡ鋳型およびヌクレオ三リン酸の溶液を、上記４に記載の生体電気回路に対して導入する工程を含み、
重合産物が、ポリメラーゼが活性であることを示す。
ＤＮＡ鋳型およびヌクレオ三リン酸の溶液を、上記４に記載の生体電気回路に対して導入する工程を含み、
重合産物が、ポリメラーゼが活性であることを示す。
【0062】
２７．タンパク質の活性の検出方法であって、当該方法は、
タンパク質の基質を、上記４に記載の生体電気回路に対して導入する工程と、
電位変化を検出する工程と、
を含む。
タンパク質の基質を、上記４に記載の生体電気回路に対して導入する工程と、
電位変化を検出する工程と、
を含む。
【0063】
２８．タンパク質活性の電気的測定のためのシステムであって、当該システムは、
（ａ）本明細書に記載の生体電気回路と、
（ｂ）第１の電極と第２の電極との間にバイアスを印加するための手段と、
（ｃ）生体電気回路を通る電流を検出するための手段と、
を含む。
（ａ）本明細書に記載の生体電気回路と、
（ｂ）第１の電極と第２の電極との間にバイアスを印加するための手段と、
（ｃ）生体電気回路を通る電流を検出するための手段と、
を含む。
【0064】
２９．本明細書に記載の生体電子回路であって、タンパク質は、タンパク質の表面に配置された２つ以上のＡｖｉタグ配列と、タンパク質内にチロシン、トリプトファンまたはヒスチジンからの１０以下のアミノ酸残基と、を含む。
【0065】
３０．（ａ）第１の電極および第２の電極と、
（ｂ）タンパク質特異的な第１のリガンドおよび第２のリガンドであって、第１のリガンドは第１の電極に付着し、第２のリガンドは第２の電極に付着するように、リガンドは改変されている、第１のリガンドおよび第２のリガンドと、
（ｃ）第１のリガンドおよび第２のリガンドに結合する、第１のタンパク質および第２のタンパク質と、
（ｄ）第１のタンパク質および第２のタンパク質に結合するように改変されている第３のタンパク質であって、第１のタンパク質および第２のタンパク質への第３のタンパク質の結合は、電極とタンパク質との間に電気的接続を形成する、第３のタンパク質と、
を含む、生体電気回路。
（ｂ）タンパク質特異的な第１のリガンドおよび第２のリガンドであって、第１のリガンドは第１の電極に付着し、第２のリガンドは第２の電極に付着するように、リガンドは改変されている、第１のリガンドおよび第２のリガンドと、
（ｃ）第１のリガンドおよび第２のリガンドに結合する、第１のタンパク質および第２のタンパク質と、
（ｄ）第１のタンパク質および第２のタンパク質に結合するように改変されている第３のタンパク質であって、第１のタンパク質および第２のタンパク質への第３のタンパク質の結合は、電極とタンパク質との間に電気的接続を形成する、第３のタンパク質と、
を含む、生体電気回路。
【0066】
３１．第１のタンパク質および第２のタンパク質は、ストレプトアビジンである、上記３０に記載の生体電気回路。
【0067】
３２．第１のリガンドおよび第２のリガンドは、ビオチンである、上記３０に記載の生体電気回路。
【0068】
３３．第３のタンパク質は、ビオチン化されている、上記３０に記載の生体電気回路。
【0069】
３４．（ａ）第１の電極および第２の電極と、
（ｂ）タンパク質特異的な第１のリガンドおよび第２のリガンドであって、第１のリガンドは第１の電極に付着し、第２のリガンドは第２の電極に付着するように、リガンドは改変されている、第１のリガンドおよび第２のリガンドと、
（ｃ）少なくとも第１のタンパク質と、第２のタンパク質とであって、第１のタンパク質および第２のタンパク質は、第１のリガンドおよび第２のリガンドに結合し、リガンドを介してさらなるタンパク質に結合していてもよく、コンダクションが得られる範囲で延在している、第１のタンパク質および第２のタンパク質と、
を含む、生体電気回路。
（ｂ）タンパク質特異的な第１のリガンドおよび第２のリガンドであって、第１のリガンドは第１の電極に付着し、第２のリガンドは第２の電極に付着するように、リガンドは改変されている、第１のリガンドおよび第２のリガンドと、
（ｃ）少なくとも第１のタンパク質と、第２のタンパク質とであって、第１のタンパク質および第２のタンパク質は、第１のリガンドおよび第２のリガンドに結合し、リガンドを介してさらなるタンパク質に結合していてもよく、コンダクションが得られる範囲で延在している、第１のタンパク質および第２のタンパク質と、
を含む、生体電気回路。
【0070】
〔定義〕
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または等価の方法および材料を本開示の実施または試験に使用することができるが、以下では好適な方法および材料が記載される。材料、方法および実施例は、例示にすぎず、限定することを意図するものではない。本明細書で言及されるすべての刊行物、特許および他の文献は、その全体が参照により組み込まれる。
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または等価の方法および材料を本開示の実施または試験に使用することができるが、以下では好適な方法および材料が記載される。材料、方法および実施例は、例示にすぎず、限定することを意図するものではない。本明細書で言及されるすべての刊行物、特許および他の文献は、その全体が参照により組み込まれる。
【0071】
本明細書を通して、単語「含む（comprise）」、または「含む（comprises）」もしくは「含む（comprising）」のような変形は、記載された整数または整数のグループを包含ことを意味するが、他の整数または整数のグループを排除するものではないことが理解されるのであろう。
【0072】
用語「a」または「an」は、１つより多い項目を意味することがある。
【0073】
用語「および」および「または」は、連結または分離のいずれかを指し、「および／または」を意味することがある。
【0074】
用語「約」は、記載された数値の±１０％以内を意味する。例えば「約１００」とは、９０～１１０の任意の数値を指す。
【0075】
〔生体電気回路〕
本開示は、生体電気回路を提供する。生体電気回路は、（ａ）少なくとも１つの電極と、（ｂ）タンパク質特異的な少なくとも１つのリガンドであって、前記リガンドは少なくとも１つの電極に付着するように改変されている、少なくとも１つのリガンドと、（ｃ）少なくとも１つのタンパク質であって、少なくとも１つのリガンドに結合することによって、電極と当該タンパク質との間に電気的接続を形成する、少なくとも１つのタンパク質と、を含む。
本開示は、生体電気回路を提供する。生体電気回路は、（ａ）少なくとも１つの電極と、（ｂ）タンパク質特異的な少なくとも１つのリガンドであって、前記リガンドは少なくとも１つの電極に付着するように改変されている、少なくとも１つのリガンドと、（ｃ）少なくとも１つのタンパク質であって、少なくとも１つのリガンドに結合することによって、電極と当該タンパク質との間に電気的接続を形成する、少なくとも１つのタンパク質と、を含む。
【0076】
用途に応じて、生体電気回路は、タンパク質と直接接続する１つまたは２つの電極を含む。１つの電極のみがタンパク質と接続している場合には、酸化還元活性タンパク質と遠隔電極との間を流れるイオン電流によって、回路が完成する。一実施形態において、生体電気回路は、１つの電極を含む。別の実施形態において、生体電気回路は、２つの電極を含む。この実施形態のいくつかの態様において、第２の電極は、電解質によって第１の電極から分離されてはいない。
【0077】
少なくとも１つの電極は、貴金属を含む。一実施形態において、少なくとも１つの電極は、パラジウム、金、および白金からなる群から選択される貴金属を含む。別の実施形態において、少なくとも１つの電極は、パラジウムである。別の実施形態において、少なくとも１つの電極は、金である。別の実施形態において、少なくとも１つの電極は、白金である。少なくとも１つの電極に加えて、生体電気回路は、タンパク質特異的な、少なくとも１つの電極に付着するように改変されたリガンドを含む。
【0078】
リガンドは、Ｚｈａｎｇら５によって記載されているように、金属にカップリングするためのチオール末端を一方の末端に含有するように改変されていてもよい。リガンドの例は、システイン残基を一方の末端に含む抗体のためのペプチドエピトープ、認識ペプチド（システインを含むインテグリンに結合するためのＲＧＤペプチドなど）、および、タンパク質が結合するように選択された小分子（ジニトロフェニルに結合し、チオールを含むＩｇＥ分子など）である。
【0079】
タンパク質特異的であり、電極に付着するように改変された例示的なリガンドとしては、ＨＳＣＨ２ＣＨ２－ジニトロフェノール（標的タンパク質：ＩｇＥ抗ＤＮＰ）、ＣＡＬＤＲＷＥＫＩＲＬＲ（標的タンパク質：ＩｇＧ抗ＨＩＶ）（配列番号１）、ＣＨＮＴＰＶＹＫＬＤＩＳＥＡＴＱＶ（標的タンパク質：ＩｇＧ抗エボラ）（配列番号２）、ＣＨＮＴＰＶＹＫＬＤＩＳＥＡＴＱＶ（標的タンパク質：Ｆａｂ抗エボラ）（配列番号２）、環状ＲＧＤｆＣ（標的タンパク質：αＶβ３インテグリン）、チオール化ストレプトアビジン（標的：ビオチン）、およびＨＳＣＨ２ＣＨ２－ビオチン（標的：ストレプトアビジン）が挙げられるが、これらに限定されない。これらの種々の結合配置の概要を、Ｚｈａｎｇら５から適合させて、以下の表１に示す。
【0080】
【表1】
【0081】
本研究で使用したタンパク質およびリガンド。電極付着のために使用されるシステインまたはチオールは太字である。長さ寸法は、ＲＳＣＢ ＰＤＢからのものであり、短径を横切るか、または抗体については、結合頭部から結合頭部までのいずれかである：１ＩｇＥ構造４ＧＲＧ、２ＩｇＧ、構造４ＮＨＨ、Ｆａｂフラグメント構造１ＹＵＨ、４インテグリン構造１Ｌ５Ｇ、５ストレプトアビジン構造１ＶＷＡ。
【0082】
生体電気回路はまた、少なくとも１つのリガンドに結合する少なくとも１つのタンパク質を含む。当該タンパク質は、天然のタンパク質配列の改変を可能にする培地中で発現され得る任意のタンパク質であり得る。したがって、任意のタンパク質機能が電気回路に組み込まれ得、その結果、リガンドもしくは基質結合、または酵素活性によって誘導される変化は次いで、電気的に測定され得る。
【0083】
一実施形態において、生体電気回路は、（ａ）２つのパラジウム電極と、（ｂ）パラジウム電極に付着したチオール化ストレプトアビジンと、（ｃ）ビオチン化ポリメラーゼと、を含み、それによって電極とポリメラーゼとの間に電気的接続を形成する。以下に記載の生体電気回路はパラジウム電極とチオール化ストレプトアビジンとビオチン化ポリメラーゼを含むが、この実施形態は本開示の例示であり、本開示の範囲はこの１つの実施形態に限定されないことを理解されたい。
【0084】
この実施形態の一態様において、テトラマー当たり平均２．５チオールを有するチオール化ストレプトアビジンは、ProteinMods（Madison, Wisconsin）から入手した。一対の貴金属（パラジウム）電極（この一対は、約５ナノメートルギャップのナノスケール接合を形成する。図３における３２、３３）と共に、ストレプトアビジン（図３における３１）を１μＭ水溶液中でインキュベートした。一晩インキュベートすると、表面チオール（３４）によって金属電極に付着したストレプトアビジンの緻密な被覆が生じた。
【0085】
生体電気回路を完成させるために、ビスビオチン化φ２９ポリメラーゼを構築した（図３における３５）。Ａｖｉタグペプチド配列、ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ（配列番号４）を残基Ｇ１１１とＫ１１２との間に挿入し、第２のＡｖｉタグペプチド配列をφ２９ポリメラーゼ配列中のＥ２７９とＤ２８０との間に挿入した（そのエキソヌクレアーゼ活性は、Ｄ１２およびＥ１４をアラニンに変異させることによって欠失された）。これにより、約５ｎｍ離れた２つのＡｖｉタグを有するポリメラーゼを生成した。Ａｖｉタグは、当技術分野で公知のように、ＢｉｒＡ酵素を用いてビオチン化した。このようにして得られた分子（３５）は、２つのビオチン分子（図３における３６）を含有していた。ビオチン化ポリメラーゼをストレプトアビジン官能化接合部と共に２時間インキュベートした（φ２９ポリメラーゼの１μＭ水溶液中）。生体電気回路の電気特性は、それを横切るように電圧バイアスＶ（３７）を印加し、回路を通る電流（３８）を記録することによって、測定した。Ｚｈａｎｇら５によって指摘されるように、このバイアスは、接続発生ノイズを回避するために１００ｍＶ未満でなければならず、５０ｍＶのバイアスを使用して、ここに示されるデータを収集した。
【0086】
改変ポリメラーゼが依然として活性であることを確認するために、２つのストレプトアビジン分子によって結合された分子３５を用いて、ＤＮＡ鋳型のローリングサークル増幅を行った。ポリメラーゼ産物（図４における４２）のＤＮＡゲルによってモニターすると、ポリメラーゼ活性は、エキソヌクレアーゼ活性が欠失した天然酵素のそれ（図４における４１）に匹敵する。
【0087】
ビスビオチン化分子３５が接合部を架橋したことを確認するために、モノビオチン化φ２９ポリメラーゼを調製した。これを行うために、以下の配列をＷＴ（ただしエキソヌクレアーゼ不活性化）酵素のＮ末端に付加した：ＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＳＳＧＬＶＰＲＧＳＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥＧＡＳＳ（配列番号５）、ここで、５つのヒスチジンはタンパク質精製のためのｈｉｓタグであり、ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ（配列番号４）はＡｖｉタグである。
【0088】
あり得るすべての結合ジオメトリーにおける分子回路のコンダクタンスを特性付けるために、種々の分子接合部について繰り返し測定を行い、コンダクタンスの特定の値が記録される周波数を対数コンダクタンススケールでプロットした（Ｚｈａｎｇら５に記載されている通り）。図５は、モノビオチン化ポリメラーゼ（５１）およびビスビオチン化ポリメラーゼ（５２）について、当該分布を示す。ビスビオチン化分子は、モノ－ビオチン化分子について測定された分布には存在しない、新規で高いコンダクタンス特性（５３）を示す。この特性は、約４ｎＳのコンダクタンスに相当し、モノビオチン化分子について観察された最高のコンダクタンス特性（約０．７ｎＳ）を超える大幅な増加である。これは、Ｚｈａｎｇら５に記載されているような、１つまたは２つの特異的接続によって接続された、抗体などの分子について観察されたものと同様の増加である。これらの非常に高いコンダクティビティは、回路の一部を形成するストレプトアビジン分子を用いて得られ、いくつかのタンパク質の集合体が適切に接続されていれば、いくつかのタンパク質の順序通りの集合体がそれらの準金属的特性を維持することを示していることに留意されたい。
【0089】
図６は、静止状態６１、およびｄＮＴＰおよびＭｇの存在下でＤＮＡ鋳型を活発に重合しているその活性状態６２において、ビスビオチン化ポリメラーゼ分子から得られた電気的シグナルを示す。それぞれの場合において、電極を複合体と接続するように移動させた後、約９０秒間、電流データを記録した。ストレプトアビジン－φ２９ポリメラーゼ接続の形成には約２０秒かかり、その後、電流（５０ｍＶバイアスにて）は０から約６０ｐＡまでジャンプする。コントロール分子６１の場合、電流は、実験の残りの間、かなり静かで一定のままである。活性な分子６２については、ノイズのバースト６３が観察され、それぞれは数秒間持続する。これらのバーストのうちの１つの５０ミリ秒部分（６４）も示されている。バースト自体はサブバースト（６５）からなり、その持続時間および間隔は、（φ２９ポリメラーゼの既知の動態を考慮すれば）それぞれのサブバースト（６５）が単一のヌクレオチドの取り込みを示唆する、という解釈と一致する。これは、酵素活性を電気的にモニターすることができる回路を構築することにおける本発明の用途を示す。
【0090】
タンパク質の疎水性内部にできるだけ近接するように接続させることの重要性を認識しながら、それでもなお接続点自身はタンパク質表面上に現れるように、Ａｖｉタグの挿入部位はできるだけ近い芳香族残基に配置されるべきであるが、それでもなおタンパク質の外側にビオチン化部位を露出させるべきである。したがって、Ａｖｉタグは、タンパク質表面近くにあるチロシン、トリプトファンまたはヒスチジンにできるだけ近接して配置されるべきである。
【0091】
第２の実施形態において、生体電気回路は、（ａ）２つのパラジウム電極と、（ｂ）パラジウム電極に付着したチオール化ビオチンと、（ｃ）ストレプトアビジンと、を含む。この実施形態は、電極上での小分子の均一なコーティングを可能にする。
【0092】
この実施形態の一態様において、チオール化ビオチンとして、ビオチン化シスタミンを使用した。実施例に記載したようにして、Ｎ，Ｎ’－ビスビオチニル－シスタミン１１（図１に示す化学構造）を合成した。Ｓ－Ｓ結合（図１における１２）のために、１１は（大気のような）酸化的環境中で安定である。１１は、強力な還元剤の存在下でモノチオール２０（図２に示す化学物質）に還元することができる。還元剤は、当技術分野で公知であり、任意のものを使用することができる。いくつかの実施形態において、還元剤は、Thermo Scientificが提供している、固定化ＴＣＥＰ（Ｔｒｉｓ［２－カルボキシエチル］ホスフィンヒドロクロリド）ジスルフィド還元ゲル（カタログ番号７７７１２）である。
【0093】
この第２の実施形態において、電極をチオビオチンで官能化し、次いで接合部を野生型（すなわち、表面チオールを欠く）ストレプトアビジンに曝露する。その結果、強い導電性架橋が得られる。これは、図７に図示されている。コントロール実験（７１）では、ビオチンとインキュベートしたチオール化ストレプトアビジン分子によってギャップを架橋する（これは、Ｚｈａｎｇら５に記載されているように、ビオチン結合がストレプトアビジンのコンダクタンスを変化させるためであり、したがって、ビオチン結合ストレプトアビジン分子を比較して、これらの実験における固有の接続の差を見なければならないためである）。第２の測定（７２）において、電極は、最初にモノチオール化ビオチン（２０）で官能化し、次いで野生型ストレプトアビジンを導入して、回路を結合させ完成させる。電極に直接付着したチオール化ストレプトアビジン（ビオチン結合として）についての電流分布を７３に示す。ビオチン化電極の間に捕捉された野生型ストレプトアビジンについての分布を７４に示す。チオビオチン分子（２０）を用いてストレプトアビジンを電極に付着させる場合、約７ｎＳに新規で高いコンダクタンス特性（７５）が観察される。注目すべきことに、特異的に結合するリガンド（ビオチン）、すなわち、それ自体がチオールを介して電極に付着する、を介した結合は、タンパク質上の表面チオールを介したタンパク質自体の直接的な付着よりも良好な接続を形成することができる。
【0094】
上記の実施形態において、タンパク質は、リガンドに対して１つの接続を含む。以下の段落に記載される実施形態において、タンパク質は、リガンドに対して第２の接続を含む。
【0095】
例えば、表１に列挙したインテグリン分子は、優れた電気的接続を形成する小リガンド（表１に列挙したシステインを組み込んだ環状ＲＧＤペプチド）に対する１つの結合部位を有する。しかしながら、このインテグリンは１つのＲＧＤ結合部位しか有していないので、別のリガンドを介した第２の点への接続は形成することはできない。しかし、インテグリンのＮ末端付近の領域にＡｖｉタグ配列を組み込むことによって、明確な回路を完成させることができ、ゆえに、ここでは、当該回路は２つの特異的結合部位：（１）ＲＧＤペプチド結合部位、および（２）ビオチン結合部位；を有する。このような不均一な接続（１つの部位ではペプチド結合、別の部位ではビオチン化）には、ここでタンパク質に組み込まれた選択的付着を利用することによって、タンパク質を集合体に配向させることができる、という利点がある。例えば、一方の電極はストレプトアビジンで官能化され、もう一方はペプチド（すなわち、環状ＲＧＤ）で官能化されていてもよく、その結果、改変タンパク質は、両方の電極に対して明確な配向性をもって常に結合され得る。同じ技術は、タンパク質回路の連続的な集合体を可能にする。これは、図８に示されるタンパク質「ＡＮＤ」ゲートで説明される。
【0096】
より具体的には、リガンドＡの結合がコンダクティビティの増加を引き起こすように設計または選択されたタンパク質Ａ（８１）と、リガンドＢの結合がコンダクティビティの増加を引き起こすように設計または選択されたタンパク質Ｂ（８２）とが、直列に配線され、電極間に接続され、このペアは、リガンドＡおよびリガンドＢの両方が存在する場合にのみ高コンダクタンス状態が得られるため、化学的ＡＮＤゲートを含む。明らかに、タンパク質が所望の順序で配線されることを保証する方法の１つは、選択的接続を使用することである。したがって、第１の電極８４は、ストレプトアビジン分子８７に結合するチオビオチン分子８６で改変される。これは、次に、２つのビオチン化Ａｖｉタグ配列８３を組み込むように改変されているタンパク質Ａ８１に結合する。ストレプトアビジンとのさらなるインキュベーションは、タンパク質Ａ上に第２のストレプトアビジン８４を配置する。この位置で、タンパク質Ｂ８２は、ビオチン化Ａｖｉタグ配列８３を使用して、結合され得る。同じビオチンストレプトアビジン結合を用いて第２の電極８５への回路接続を完成させる場合、タンパク質Ｂが所望される第２の位置にタンパク質Ａが組み込まれ得る、という望ましくない可能性が生じる。この可能性を克服するために、異種の結合が用いられ、この場合、タンパク質Ｂ上のペプチド結合部位８８を利用する。第２の電極８５に結合した対応するペプチドリガンド８９は、タンパク質Ｂ上のその同系部位に結合することによって、回路を完成させる。１つのリガンドを別のリガンドに結合させることによって、追加の有用な構築単位を作り出すことができることが認識されるのであろう。例えば、ペプチドリガンド（表１に示されるもののうちの１つなど）をビオチン分子に連結することによって、ペプチドに対する特異的結合部位を有する第１のタンパク質がストレプトアビジンに連結することができ、例えば、続いて、ストレプトアビジン上の残りの占有されていないビオチン結合部位を介して回路に組み込むことができる。
【0097】
機能性タンパク質を２つの接続点で回路に接続する際に生じる別の考慮事項は、機能の破壊があり得ることである。これは、タンパク質を２つの点で束縛することによって課される機械的制約によって、引き起こされる。１つの点での接続は、タンパク質が溶液中にあるかのように動く余地をタンパク質に残すが、第２の付着点、特に（タンパク質の動きを感知するために）第１の付着点から離れて選択された１つの付着点は、明らかにタンパク質機能を破壊し得る。したがって、第２の接続部位が組み込まれる領域にフレキシブルリンカーが組み込まれることが非常に望ましい。これは、もちろん、２つの接続部位のいずれか１つであってもよい。
【0098】
フレキシブルリンカーを形成するアミノ酸配列は当技術分野で公知であり、例は、ワールドワイドウェブ上の、bmrb.wisc.edu/referenc/choufas.shtmlに列挙されている。特定のフレキシブルリンカーを選択する場合、３つの重要な設計考慮事項がある。
【0099】
第１の考慮事項は、取り込まれた配列が短い反復配列からなるべきではない、ということである。これは、クローニングを複雑にするためである。これを説明するために、公知のフレキシブルリンカーアミノ酸配列：ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号６）を考える。対応するＤＮＡ鋳型を図９Ａに示す。図９Ａはまた、プライマー配列間に形成され得るダイマーも示す。発現ベクターにクローニングした場合の結果を図９Ｂに示す。図９Ｂは、標識された望ましくないプライマーダイマーの産物を含む、得られたプラスミド配列を示す。
【0100】
第２の考慮事項は、新しいタンパク質の等電点を大きくは変化させてはならず、そのため、挿入されたリンカー中の残基は中性またはほぼ中性であるように選択されなければならない、ということである。これは、回路への配線のための２つのＡｖｉタグを含有するｐｈｉ２９ポリメラーゼの合成によって、説明される。この場合、フレキシブルリンカーを、Ｎ末端付近に位置するＡｖｉタグ配列の隣に配置した。第１の場合（図１０の配列１０１）において、フレキシブルリンカー（丸、１０３）は配列ＧＤＳＴＤＧＴＳＤＧＳＳ（配列番号７）を有し、その結果、タンパク質産物は７．２５の予測されたｐＩを有する。天然タンパク質（約８のｐＩである）のｐＩからのこの小さなシフトはミスフォールディングを引き起こすのに十分であるため、タンパク質は、ゲル１０６中でより短い産物１０５として現れる。リンカー配列中のアスパラギン酸（Ｄ）がアスパラギン（Ｎ）に交換されると（現在、ＧＮＳＴＮＧＴＳＮＧＳＳ（配列番号３）、配列１０２中の１０４）、天然のｐＩが復元され（ｐＩ＝８．１３）、産物は、今度は正しくフォールディングされた天然タンパク質の位置に移動する（ゲル１０８中の１０７）。
【0101】
第３の考慮事項は、２つの同一の配列（すなわち、２つのＡｖｉタグ配列）が、対応する反復ＤＮＡ配列がプライマー－ダイマーを生じるので、同一のクローニング発現系に挿入される場合に生じる。これを克服するために、クローニングは２段階で進行する。１つのＡｖｉタグ配列を有するクローンを最初に作製し、次いで、第２のＡｖｉタグ配列を挿入したこの第１のクローニングから第２のクローンを作製する。
【0102】
ＧＮＳＴＮＧＴＳＮＧＳＳ（配列番号３）リンカーの柔軟性、およびタンパク質内部のこの準金属的状態を支持するために特定のタンパク質フォールディングが必要とされ得るという懸念を考慮すると、重要な問題は、リンカーが挿入される場合にタンパク質のコンダクタンス特性が維持されるかどうか、ということである。図１１は、図５における５２として既に示した２つのＡｖｉタグポリメラーゼ（フレキシブルリンカー配列を欠く）についての、参照となるコンダクタンス分布１１０１を示す。ここで、２つのビオチン化部位に結合したことによる高いコンダクタンス特性が１１０３とラベルされている。１１０２は、フレキシブルリンカーを組み込んだｐｈｉ２９（図１０のタンパク質配列１０２）のコンダクタンス分布を示す。高いコンダクタンス特性は保存されており（１１０４）、タンパク質の準金属的状態が維持されながら、フレキシブルペプチドリンカーが組み込まれ得ることを示す。
【0103】
ストレプトアビジンは４価であり（４つまでのビオチンに結合する）、したがって、カップリングスキームおよびタンパク質自体の両方の、これらの顕著かつ予想外の電気的特性を総合すれば、生体電気回路を構築するための全く新規な手段が利用可能になる。
【0104】
図１２は、同じ集合体原理に基づく「ＯＲ」ゲートを示す（符号付けされた構成要素は図８について説明されたものと同様である）。これは、リガンドＡまたはリガンドＢのいずれかが存在する場合、高コンダクタンス状態に入る。
【0105】
ストレプトアビジンの４価の性質は、はるかにより複雑な回路を組み立てることを可能にする。この可能性の１つのバージョンが図１３に示されている。ここでも、符号付けは図８と同様である。ここで、第３のタンパク質「Ｃ」（１３００）は、結合するストレプトアビジン８７の占有されていない部位でタンパク質Ａおよびタンパク質Ｂの結合部に付着している。例えば、タンパク質Ｃが酸化分子の存在下で酸化状態を変化させる電気化学的に活性なタンパク質である場合、例えば、タンパク質Ｃの電荷の変化がＡ－Ｂ鎖を介した電子伝達を調節する。そのため、「Ａ」および「Ｂ」の機能は、「Ｃ」の電子状態に依存する第３の状態を生じることができる。
【0106】
これまでに説明した実施形態はすべて、第１の電極および第２の電極の両方を利用した。しかしながら、本明細書に記載されたリガンドベースの結合と組み合わされたタンパク質内部の準金属的コンダクタンスは、センサータンパク質（例えば、グルコースセンサー１）中に酸化還元活性を生成する分子を含む溶液中に浸漬されたセンサー電極の表面での非常に効率的な電子伝達を可能にする。したがって、関係するタンパク質は、図１４に図示されるように、１つの電極に直接連結されるのみでもよい。ここで、タンパク質Ｄ１４００は、酸化還元対１４０２、１４０３（例えば、酸化グルコースおよび還元グルコース）を含む電解質１４０１に浸漬された酸化還元活性タンパク質（例えば、グルコースオキシダーゼ）である。電解質１４０１は、第２（遠隔の）電極１４０４とも電解質１４０１と接している。タンパク質Ｄ１４００は、電圧バイアスを印加するための手段１４０５と、第１の電極８４と第２の電極１４０４との間を流れる電流を感知するための手段１４０６を用いて、第１の電極８４に接続されている。これは、現在存在する電気化学センサー技術を改善するために適用される、本発明の結合の用途の一例である。
【0107】
図３の生体電気回路は、改変された結合タンパク質が電極へ直接的に付着することを必要とする。しかしながら、Ｚｈａｎｇらに示されるように、改変されていない結合タンパク質を用いて電極に付着した小リガンドを介して結合が行われる場合、結合はより効率的である。これは、均一な被覆を得ることがより容易である小リガンドを用いて電極を官能化することができる、という利点を有する。したがって、図１５は、図２のチオビオチン１５３４、および結合性の改変されていないストレプトアビジン１５３１で改変された第１の電極１５３２を示す。ストレプトアビジン１５３１は、次に、牽引（tow）部位１５３６でビオチン化されているタンパク質１５３５に結合する。同様の官能化により、第２の電極１５３３への結合が完成する。
【0108】
タンパク質コンダクションがモニターされるギャップのサイズは、図１６に示されるように、各電極と結合したタンパク質の連結鎖を形成することによって、コンダクティビティにおける非常にわずかなコストで、実質的に増加され得る。ここで、第２の結合タンパク質１６０２が回路に添加され、図１に示されるビスビオチンのような２価リンカー１６０１よって、第１の結合タンパク質１５３１に結合される。
【0109】
〔実施例〕
以下の実施例は、例示の目的で提示されており、開示された主題の範囲を限定することに役立つべきではない。
以下の実施例は、例示の目的で提示されており、開示された主題の範囲を限定することに役立つべきではない。
【0110】
〔材料の供給源〕
ＲＧＤペプチド（環状（Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ｄ－Ｐｈｅ－Ｃｙｓ））は、Peptides International（Louisville, Kentucky）から購入した。抗ＨＩＶ抗体および抗エボラ抗体のためのペプチドリガンドは、純度＞９５％で、CPC Scientific（Sunnyvale, California）によって、合成された。ＤＮＰおよびビオチンジスルフィドは、我々の研究室で合成され（補足情報付録図Ｓ１０およびＳ１３）、Thermo Scientific（カタログ番号７７７１２）が提供している、固定化ＴＣＥＰ（Ｔｒｉｓ［２－カルボキシエチル］ホスフィンヒドロクロリド）ジスルフィド還元ゲルによって、製造者の指示に従って、使用前に２時間還元された。本明細書で使用される溶液の調製は、補足情報付録に記載されている。抗ＤＮＰ抗体（マウスモノクローナルＩｇＥ抗体）、野生型ストレプトアビジン、およびすべての他の化学物質は、Sigma Aldrich（Saint Louis, Missouri）から購入した。抗ＨＩＶ抗体（抗ＨＩＶ１ｐ１７抗体［３２／１．２４．８９］）およびすべてのアイソタイプコントロールは、Abcam（Cambridge, MA）から入手した。抗エボラ抗体は、以下に記載されるようにして、植物から培養した。３つの抗体すべての結合親和性は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって、測定した。テトラマー当たり平均２．５チオールを有するチオール化ストレプトアビジンは、ProteinMods（Madison, Wisconsin）からのものであった。３ＭのＫＣｌまたは１０ｍＭのＫＣｌによって塩架橋されたＡｇ／ＡｇＣｌ参照電極は、既に記載したようにして調製した（B. Zhang et al., Nano Futures 1 （2017））。サイクリックボルタンメトリーの詳細は、補足情報付録に記載されている。抗エボラ抗体および対応するモノマーのＦａｂフラグメントは、実施例７に記載されているようにして、調製および精製した。
ＲＧＤペプチド（環状（Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ｄ－Ｐｈｅ－Ｃｙｓ））は、Peptides International（Louisville, Kentucky）から購入した。抗ＨＩＶ抗体および抗エボラ抗体のためのペプチドリガンドは、純度＞９５％で、CPC Scientific（Sunnyvale, California）によって、合成された。ＤＮＰおよびビオチンジスルフィドは、我々の研究室で合成され（補足情報付録図Ｓ１０およびＳ１３）、Thermo Scientific（カタログ番号７７７１２）が提供している、固定化ＴＣＥＰ（Ｔｒｉｓ［２－カルボキシエチル］ホスフィンヒドロクロリド）ジスルフィド還元ゲルによって、製造者の指示に従って、使用前に２時間還元された。本明細書で使用される溶液の調製は、補足情報付録に記載されている。抗ＤＮＰ抗体（マウスモノクローナルＩｇＥ抗体）、野生型ストレプトアビジン、およびすべての他の化学物質は、Sigma Aldrich（Saint Louis, Missouri）から購入した。抗ＨＩＶ抗体（抗ＨＩＶ１ｐ１７抗体［３２／１．２４．８９］）およびすべてのアイソタイプコントロールは、Abcam（Cambridge, MA）から入手した。抗エボラ抗体は、以下に記載されるようにして、植物から培養した。３つの抗体すべての結合親和性は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって、測定した。テトラマー当たり平均２．５チオールを有するチオール化ストレプトアビジンは、ProteinMods（Madison, Wisconsin）からのものであった。３ＭのＫＣｌまたは１０ｍＭのＫＣｌによって塩架橋されたＡｇ／ＡｇＣｌ参照電極は、既に記載したようにして調製した（B. Zhang et al., Nano Futures 1 （2017））。サイクリックボルタンメトリーの詳細は、補足情報付録に記載されている。抗エボラ抗体および対応するモノマーのＦａｂフラグメントは、実施例７に記載されているようにして、調製および精製した。
【0111】
〔実施例１．Ｎ，Ｎ’－ビス－ビオチニル－シスタミン１１の合成（図１に示す化学構造）〕
シスタミンジヒドロクロリド（６０ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍＬ）に添加し、続いてトリエチルアミン（０．４４ｍＬ、３．１９ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を３０分間撹拌し、ビオチンＮＨＳエステル（０．２７ｇ、０．８０ｍｍｏｌ）を添加し、室温で１６時間撹拌した。シスタミンが消費され、生成された生成物がＤＣＭ中の２０％メタノールで０．６３のＲｆ値を有することを、ＴＬＣは示した。ＤＭＦおよびＴＥＡの大部分が除去されるまで、混合物をジクロロメタンと共蒸発させた。残渣を、カラム上で分離した。勾配は１２０分間でＤＣＭ中の０～２０％メタノールであり、流速は３ｍＬ／分であり、自動フラッシュクロマトグラフィー装置は、Teledyne Iscoであった。生成物を白色固体として得た（０．１１ｇおよび６７．１％）。１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）：δ１．２０－１．６０（ｍ，１２Ｈ），２．０７（ｔ，７．６Ｈｚ，４Ｈ），２．５７（ｄ，１２．４Ｈｚ，２Ｈ），２．７７（ｔ，６．６Ｈｚ，４Ｈ），２．８３（ｄｄ，５．１および１２．６，２Ｈ），３．０７－３．１２（ｍ，２Ｈ），３．３１（ｔ，６．４Ｈｚ，４Ｈ），４．１１－４．１５（ｍ，２Ｈ），４．３１（ｔ，５．２Ｈｚ，２Ｈ）；１３ＣＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）：δ２５．７０，２８．５０，２８．６５，３５．６２，３７．８３，３８．３７，４０．３２，５５．９２，５９．６８，６１．５２，１６３．１８，１７２．６９。
シスタミンジヒドロクロリド（６０ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍＬ）に添加し、続いてトリエチルアミン（０．４４ｍＬ、３．１９ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を３０分間撹拌し、ビオチンＮＨＳエステル（０．２７ｇ、０．８０ｍｍｏｌ）を添加し、室温で１６時間撹拌した。シスタミンが消費され、生成された生成物がＤＣＭ中の２０％メタノールで０．６３のＲｆ値を有することを、ＴＬＣは示した。ＤＭＦおよびＴＥＡの大部分が除去されるまで、混合物をジクロロメタンと共蒸発させた。残渣を、カラム上で分離した。勾配は１２０分間でＤＣＭ中の０～２０％メタノールであり、流速は３ｍＬ／分であり、自動フラッシュクロマトグラフィー装置は、Teledyne Iscoであった。生成物を白色固体として得た（０．１１ｇおよび６７．１％）。１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）：δ１．２０－１．６０（ｍ，１２Ｈ），２．０７（ｔ，７．６Ｈｚ，４Ｈ），２．５７（ｄ，１２．４Ｈｚ，２Ｈ），２．７７（ｔ，６．６Ｈｚ，４Ｈ），２．８３（ｄｄ，５．１および１２．６，２Ｈ），３．０７－３．１２（ｍ，２Ｈ），３．３１（ｔ，６．４Ｈｚ，４Ｈ），４．１１－４．１５（ｍ，２Ｈ），４．３１（ｔ，５．２Ｈｚ，２Ｈ）；１３ＣＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）：δ２５．７０，２８．５０，２８．６５，３５．６２，３７．８３，３８．３７，４０．３２，５５．９２，５９．６８，６１．５２，１６３．１８，１７２．６９。
【0112】
〔実施例２．化合物２０の合成〕
化合物２０は、製造者の指示に従って、Thermo Scientificからの固定化ＴＣＥＰ（Ｔｒｉｓ［２－カルボキシエチル］ホスフィンヒドロクロリド）ジスルフィド還元ゲル（カタログ番号７７７１２）に、Ｎ，Ｎ’－ビス－ビオチニル－シスタミン１１を（装置で使用する直前に）２時間曝露することによって、製造した。生成物（図２に示す化学構造）をＤＣＭ中の２０％メタノールに溶解し、この溶液を続いて電極を改変するために使用した。
化合物２０は、製造者の指示に従って、Thermo Scientificからの固定化ＴＣＥＰ（Ｔｒｉｓ［２－カルボキシエチル］ホスフィンヒドロクロリド）ジスルフィド還元ゲル（カタログ番号７７７１２）に、Ｎ，Ｎ’－ビス－ビオチニル－シスタミン１１を（装置で使用する直前に）２時間曝露することによって、製造した。生成物（図２に示す化学構造）をＤＣＭ中の２０％メタノールに溶解し、この溶液を続いて電極を改変するために使用した。
【0113】
〔実施例３．基板およびＳＴＭプローブの官能化〕
ＳＴＭ測定のためのパラジウム基板は、電子ビーム蒸着器（Lesker PVD 75）を使用して、１０ｎｍのチタン接着層を有するシリコンウェハ上に２００ｎｍのパラジウム膜を蒸着させることによって、調製した。官能化の直前に、基板を水素炎で処理し、次いでチオール化ＤＮＰ、ビオチン、ストレプトアビジンまたはシステイン残基含有ペプチドの溶液に一晩浸漬した。小リガンドによる基板官能化は、フーリエ変換赤外（ＦＴＩＲ）分光法（図Ｓ９）および偏光解析法によって、特性付けた。基板の被覆率は、ＳＴＭおよびＡＦＭ画像化によって、モニターした。
ＳＴＭ測定のためのパラジウム基板は、電子ビーム蒸着器（Lesker PVD 75）を使用して、１０ｎｍのチタン接着層を有するシリコンウェハ上に２００ｎｍのパラジウム膜を蒸着させることによって、調製した。官能化の直前に、基板を水素炎で処理し、次いでチオール化ＤＮＰ、ビオチン、ストレプトアビジンまたはシステイン残基含有ペプチドの溶液に一晩浸漬した。小リガンドによる基板官能化は、フーリエ変換赤外（ＦＴＩＲ）分光法（図Ｓ９）および偏光解析法によって、特性付けた。基板の被覆率は、ＳＴＭおよびＡＦＭ画像化によって、モニターした。
【0114】
交流電気化学法によって、０．２５ｍｍのＰｄワイヤ（California Fine Wires）からＳＴＭプローブをエッチングした。漏電電流を避けるために、金プローブについて以前に記載されている方法に従って、高密度ポリエチレンでプローブを絶縁した。M. Tuchband et al., Rev Sci Instrum 83, 015102 （2012）。＋０．５Ｖバイアスで１ｍＭのＰＢ緩衝液中のＳＴＭによって各プローブを試験し、漏電電流が＜１ｐＡであることを確認した。官能化のために、プローブをリガンド溶液中に、４時間または一晩、浸漬した。その後、プローブを取り出し、水洗し、窒素ガスを穏やかに吹き付けて乾燥し、直ちに使用した。ＳＴＭ測定のさらなる詳細は、実施例４に示す。
【0115】
〔実施例４．ＳＴＭ測定〕
ＳＴＭ測定は、データ取得用のＤＡＱカード（ＰＣＩ－６８２１またはＰＣＩＥ－７８４２Ｒ、National Instruments）と結合したＰｉｃｏＳＰＭ走査プローブ顕微鏡（Agilent Technologies）を用いて行った。緩衝溶液および検体を添加したテフロンセルをピラニア溶液で洗浄し、次いでＭｉｌｌｉ－Ｑ水中で３回、超音波処理し、残留物を除去した（ピラニア溶液は腐食性が高く、極めて慎重に扱わなければならないことに留意されたい）。表面電位をより良好に制御するために、１０ｍＭのＫＣｌ塩架橋を有するＡｇ／ＡｇＣｌ参照電極を基板上に接続した。プローブはまず、－０．２Ｖのバイアスで４ｐＡの設定点電流に係合し、その後、測定前に２時間、静置して安定させた。ＳＴＭ ＩＶ掃引測定では、最初にサーボシステムをオフにし、プローブを１ｎｍ／ｓの速度でΔＺｎｍだけ後退させた。その後、プローブをその高さで１分間吊り下げ、その間、カスタムLabviewプログラムを使用して、電流変化を監視した。電流が５０ｐＡの閾値を超えると、それを結合イベントとしてみなし、１Ｖ／ｓの掃引速度で－０．２Ｖから＋０．２ＶまでのＩＶ掃引を開始し、次いで逆走し、続いて０．２ｓ休止した。その後、電流を再度チェックした。電流が依然としてノイズレベルの２倍（６ｐＡ）を超える場合、結合したタンパク質分子が抜けるまで、ＩＶ曲線を連続的に記録した。１分間の測定後、サーボシステムをオンにして、プローブを再び係合し、その後、プロセス全体を反復した。各測定において、少なくとも１０００個のＩＶ曲線を収集し、そこから上り掃引と下り掃引とが重なった曲線（全体の８０％）を選択し、コンダクタンス分布ヒストグラムを構築した。プローブ保持プロセスの間、バイアスを一定に保持したことを除いて、同様の手順を用いる別のLabviewプログラムによって、電流対時間のトレースを記録した。アナログ／デジタルのサンプリングレートは５０ＫＨｚである。すべての検体について、コンダクタンス測定手順は同一であったが、結合親和性および官能化効率の差のために、異なる効率であった（表Ｓ１）。
ＳＴＭ測定は、データ取得用のＤＡＱカード（ＰＣＩ－６８２１またはＰＣＩＥ－７８４２Ｒ、National Instruments）と結合したＰｉｃｏＳＰＭ走査プローブ顕微鏡（Agilent Technologies）を用いて行った。緩衝溶液および検体を添加したテフロンセルをピラニア溶液で洗浄し、次いでＭｉｌｌｉ－Ｑ水中で３回、超音波処理し、残留物を除去した（ピラニア溶液は腐食性が高く、極めて慎重に扱わなければならないことに留意されたい）。表面電位をより良好に制御するために、１０ｍＭのＫＣｌ塩架橋を有するＡｇ／ＡｇＣｌ参照電極を基板上に接続した。プローブはまず、－０．２Ｖのバイアスで４ｐＡの設定点電流に係合し、その後、測定前に２時間、静置して安定させた。ＳＴＭ ＩＶ掃引測定では、最初にサーボシステムをオフにし、プローブを１ｎｍ／ｓの速度でΔＺｎｍだけ後退させた。その後、プローブをその高さで１分間吊り下げ、その間、カスタムLabviewプログラムを使用して、電流変化を監視した。電流が５０ｐＡの閾値を超えると、それを結合イベントとしてみなし、１Ｖ／ｓの掃引速度で－０．２Ｖから＋０．２ＶまでのＩＶ掃引を開始し、次いで逆走し、続いて０．２ｓ休止した。その後、電流を再度チェックした。電流が依然としてノイズレベルの２倍（６ｐＡ）を超える場合、結合したタンパク質分子が抜けるまで、ＩＶ曲線を連続的に記録した。１分間の測定後、サーボシステムをオンにして、プローブを再び係合し、その後、プロセス全体を反復した。各測定において、少なくとも１０００個のＩＶ曲線を収集し、そこから上り掃引と下り掃引とが重なった曲線（全体の８０％）を選択し、コンダクタンス分布ヒストグラムを構築した。プローブ保持プロセスの間、バイアスを一定に保持したことを除いて、同様の手順を用いる別のLabviewプログラムによって、電流対時間のトレースを記録した。アナログ／デジタルのサンプリングレートは５０ＫＨｚである。すべての検体について、コンダクタンス測定手順は同一であったが、結合親和性および官能化効率の差のために、異なる効率であった（表Ｓ１）。
【0116】
【表2】
【0117】
新たに官能化された基板およびプローブを用いて、各検体について反復測定を行った（表Ｓ４）。参照電極に対する電位は、基板と参照電極との間に接続されたバッテリ駆動電圧源を用いて設定した。
【0118】
【表3】
【0119】
〔実施例５．溶液の作製〕
チオール化ＤＮＰおよびビオチンは、新たに脱気した純粋なエタノール中で、最終濃度０．１ｍＭで調製した。ペプチドは、受け取ったら、脱気水中に最初に溶解し、次いで、アリコートし、－８０℃で凍結した。使用前毎に、１つのアリコートを取り出し、所望の濃度に、通常は基板およびプローブ官能化のために０．１ｍＭに、脱気水を用いて希釈した。基板上のＤＮＰおよびペプチドの官能化密度を低下させるために、２－メルカプトエタノール（ＭＣＥ）を２ｍＭの濃度で添加した。抗体およびアイソタイプコントロールをアリコートし、－８０℃で保存し、次いで使用前に１ｍＭのＰＢ緩衝液（ｐＨ＝７．４）で希釈した。ＳＴＭおよびソリッドステートチップ測定のために、１ｍＭのリン酸緩衝液（ＰＢ）中の１００ｎＭの抗体またはアイソタイプコントロールを使用した。１ｍＭのＰＢ緩衝液中の１μＭのチオール化ストレプトアビジンを、基板官能化のために調製した。１ｍＭのＰＢ緩衝液中の１ｍＭの遊離ビオチンおよび１００ｎＭの野生型ストレプトアビジンを、ＳＴＭによるコンダクタンス測定のために使用した。すべての緩衝液および溶液は、１８．２ＭΩのコンダクティビティを有するＭｉｌｌｉ－Ｑ水中で調製した。すべての測定について、１ｍＭのＰＢ緩衝液（ｐＨ７．４）は、アルゴンで脱気して、酸素からの干渉を回避した。
チオール化ＤＮＰおよびビオチンは、新たに脱気した純粋なエタノール中で、最終濃度０．１ｍＭで調製した。ペプチドは、受け取ったら、脱気水中に最初に溶解し、次いで、アリコートし、－８０℃で凍結した。使用前毎に、１つのアリコートを取り出し、所望の濃度に、通常は基板およびプローブ官能化のために０．１ｍＭに、脱気水を用いて希釈した。基板上のＤＮＰおよびペプチドの官能化密度を低下させるために、２－メルカプトエタノール（ＭＣＥ）を２ｍＭの濃度で添加した。抗体およびアイソタイプコントロールをアリコートし、－８０℃で保存し、次いで使用前に１ｍＭのＰＢ緩衝液（ｐＨ＝７．４）で希釈した。ＳＴＭおよびソリッドステートチップ測定のために、１ｍＭのリン酸緩衝液（ＰＢ）中の１００ｎＭの抗体またはアイソタイプコントロールを使用した。１ｍＭのＰＢ緩衝液中の１μＭのチオール化ストレプトアビジンを、基板官能化のために調製した。１ｍＭのＰＢ緩衝液中の１ｍＭの遊離ビオチンおよび１００ｎＭの野生型ストレプトアビジンを、ＳＴＭによるコンダクタンス測定のために使用した。すべての緩衝液および溶液は、１８．２ＭΩのコンダクティビティを有するＭｉｌｌｉ－Ｑ水中で調製した。すべての測定について、１ｍＭのＰＢ緩衝液（ｐＨ７．４）は、アルゴンで脱気して、酸素からの干渉を回避した。
【0120】
〔実施例６．サイクリックボルタンメトリー〕
Ｐｄ基板は、０．５ｃｍ×４．０ｃｍのサイズに切断し、約０．５ｃｍ×１．０ｃｍの活性セル面積を有する作用電極として使用された。基板は、官能化の前に水素炎で処理された。ポテンシオスタット（モデルＡＦＣＢＰ１、Pine Instruments）上で、対電極としてＰｔワイヤ、参照電極としてＡｇ／ＡｇＣｌ（３ＭのＫＣｌ）を用いて、サイクリックボルタンメトリーを実施した。掃引範囲は－０．５Ｖ～＋０．５Ｖであり、特に指定がない限り、掃引速度は１０ｍＶ／ｓである。
Ｐｄ基板は、０．５ｃｍ×４．０ｃｍのサイズに切断し、約０．５ｃｍ×１．０ｃｍの活性セル面積を有する作用電極として使用された。基板は、官能化の前に水素炎で処理された。ポテンシオスタット（モデルＡＦＣＢＰ１、Pine Instruments）上で、対電極としてＰｔワイヤ、参照電極としてＡｇ／ＡｇＣｌ（３ＭのＫＣｌ）を用いて、サイクリックボルタンメトリーを実施した。掃引範囲は－０．５Ｖ～＋０．５Ｖであり、特に指定がない限り、掃引速度は１０ｍＶ／ｓである。
【0121】
〔実施例７．ニコチアナ・ベンサミアナ（Nicotiana benthamiana）植物からの抗エボラ（ＥＢＯＶ）ｍＡｂ ６Ｄ８の発現および精製〕
６Ｄ８の重鎖および軽鎖のコード配列（Lai, H., et al., Plant Biotechnol J 10, 95-104, doi:10.1111/j.1467-7652.2011.00649.x （2012））を、MagnICONベースの発現ベクターにクローニングした。Lai, H. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 107, 2419-2424, doi:10.1073/pnas.0914503107 （2010）。次いで、Ｎ．ベンサミアナ（N. benthamiana）植物において、既に記載されたように、６Ｄ８を一時的に発現させた。Yang, M., et al., Plant Biotechnol J 16, 572-580, doi:10.1111/pbi.12796 （2018）。Ｎ．ベンサミアナの葉から、タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーにより、９５％を超える均一性にまで６Ｄ８ ｍＡｂを単離および精製した。Fulton, A. et al., J Chromatogr A 1389, 128-132, doi:10.1016/j.chroma.2015.02.013 （2015）。
６Ｄ８の重鎖および軽鎖のコード配列（Lai, H., et al., Plant Biotechnol J 10, 95-104, doi:10.1111/j.1467-7652.2011.00649.x （2012））を、MagnICONベースの発現ベクターにクローニングした。Lai, H. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 107, 2419-2424, doi:10.1073/pnas.0914503107 （2010）。次いで、Ｎ．ベンサミアナ（N. benthamiana）植物において、既に記載されたように、６Ｄ８を一時的に発現させた。Yang, M., et al., Plant Biotechnol J 16, 572-580, doi:10.1111/pbi.12796 （2018）。Ｎ．ベンサミアナの葉から、タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーにより、９５％を超える均一性にまで６Ｄ８ ｍＡｂを単離および精製した。Fulton, A. et al., J Chromatogr A 1389, 128-132, doi:10.1016/j.chroma.2015.02.013 （2015）。
【0122】
〔実施例８．６Ｄ８のモノマーのＦａｂの生成〕
モノマーのＦａｂフラグメントは、Pierce Fab Preparation Kit（Thermo Scientific）を用いて、製造者の指示（Thermos Scientific Pub. No. MAN0011651）に従って、６Ｄ８から調製した。簡単に述べると、精製した６Ｄ８を、最初に、アガロースビーズに固定化したパパインと共に、３７℃で６～１２時間、インキュベートした。次いで、消化されたｍＡｂ混合物を、１分間で５０００ｘｇの遠心分離によって回収し、タンパク質Ａクロマトグラフィーカラムで分離した。Ｆａｂフラグメントはフロースルー画分中に回収した一方、Ｆｃフラグメントおよび未消化ｍＡｂはタンパク質Ａカラム中に捕捉した。モノマーのＦａｂの製造が成功したことは、還元条件および非還元条件下でのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析によって、確認された。
モノマーのＦａｂフラグメントは、Pierce Fab Preparation Kit（Thermo Scientific）を用いて、製造者の指示（Thermos Scientific Pub. No. MAN0011651）に従って、６Ｄ８から調製した。簡単に述べると、精製した６Ｄ８を、最初に、アガロースビーズに固定化したパパインと共に、３７℃で６～１２時間、インキュベートした。次いで、消化されたｍＡｂ混合物を、１分間で５０００ｘｇの遠心分離によって回収し、タンパク質Ａクロマトグラフィーカラムで分離した。Ｆａｂフラグメントはフロースルー画分中に回収した一方、Ｆｃフラグメントおよび未消化ｍＡｂはタンパク質Ａカラム中に捕捉した。モノマーのＦａｂの製造が成功したことは、還元条件および非還元条件下でのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析によって、確認された。
【0123】
〔１分子コンダクタンス測定〕
分子のコンダクタンスの再現可能な２点測定は、再現可能な接続を必要とし、（７）したがって、単一インテグリン分子（それらの同系リガンドによって２つの電極のうち１つだけに結合している）における、大きな（ｎＳスケール）コンダクタンス変動の再現可能な観察は、驚くべき発見であった。（８）この先行研究は、タンパク質を通る任意の直流電流を不明瞭にする漏電電流が原因で、低バイアス領域（変動が存在しない）を精査しなかった。ここでは、走査型トンネル顕微鏡（ＳＴＭ）を使用して、溶液中で１分子測定を行い、特異的接続および非特異的接続の両方の役割を系統的に探索した。適切に絶縁されたＳＴＭプローブ、（９）および電極の電位制御により、バックグラウンドの漏電電流は、全バイアス範囲にわたって１ｐＡ以下にまで減少した。十分な安定化により、ＳＴＭギャップは１分間にわたって一定に保たれるので、ギャップ制御サーボを無効にし、チップを後退させ、電流－電圧（ＩＶ）曲線を記録することができた。このような曲線（上りおよび下りの両方を掃引する）を６０個まで記録してから、サーボを再係合し、基板の別の領域で工程を繰り返した。２つの特異的な接続を作るために、２価抗体（１つのＩｇＥと２つのＩｇＧ）を用いた。最大４つのビオチン分子を結合するストレプトアビジンと同様に、それぞれが２つの結合部位を示すため、エピトープまたはビオチン官能化電極を特異的な結合で架橋することができた。むき出しの金属電極を使用した場合、１分子あたり平均２．５個の表面チオールで改変されたストレプトアビジン上の表面チオールに接続させた。さらに、２つのペプチド官能化電極のうち１つのみと特異的な結合を形成することができるインテグリンを用いて、測定を繰り返した。タンパク質およびリガンドを表１に列挙する。
分子のコンダクタンスの再現可能な２点測定は、再現可能な接続を必要とし、（７）したがって、単一インテグリン分子（それらの同系リガンドによって２つの電極のうち１つだけに結合している）における、大きな（ｎＳスケール）コンダクタンス変動の再現可能な観察は、驚くべき発見であった。（８）この先行研究は、タンパク質を通る任意の直流電流を不明瞭にする漏電電流が原因で、低バイアス領域（変動が存在しない）を精査しなかった。ここでは、走査型トンネル顕微鏡（ＳＴＭ）を使用して、溶液中で１分子測定を行い、特異的接続および非特異的接続の両方の役割を系統的に探索した。適切に絶縁されたＳＴＭプローブ、（９）および電極の電位制御により、バックグラウンドの漏電電流は、全バイアス範囲にわたって１ｐＡ以下にまで減少した。十分な安定化により、ＳＴＭギャップは１分間にわたって一定に保たれるので、ギャップ制御サーボを無効にし、チップを後退させ、電流－電圧（ＩＶ）曲線を記録することができた。このような曲線（上りおよび下りの両方を掃引する）を６０個まで記録してから、サーボを再係合し、基板の別の領域で工程を繰り返した。２つの特異的な接続を作るために、２価抗体（１つのＩｇＥと２つのＩｇＧ）を用いた。最大４つのビオチン分子を結合するストレプトアビジンと同様に、それぞれが２つの結合部位を示すため、エピトープまたはビオチン官能化電極を特異的な結合で架橋することができた。むき出しの金属電極を使用した場合、１分子あたり平均２．５個の表面チオールで改変されたストレプトアビジン上の表面チオールに接続させた。さらに、２つのペプチド官能化電極のうち１つのみと特異的な結合を形成することができるインテグリンを用いて、測定を繰り返した。タンパク質およびリガンドを表１に列挙する。
【0124】
〔測定されるコンダクタンスは接続に依存する〕
２つの電極のうちの少なくとも１つにタンパク質が特異的に結合した場合にのみ電流が観察された。典型的には、交代後の数秒間は、電流は記録されず、その後、結合タンパク質の存在下で電流は大きな（かつ可変の）値にジャンプした。電流は分の時間スケールでは変動するが、通常は、数秒間は安定しているため、上り掃引で記録された曲線の８０％が下り掃引で再現される（データ不図示）。コントロール（緩衝液単独、または溶液中に非同系タンパク質）は、シグナルを出さなかった。インテグリンについて報告された（８）急速に変動する（ｍｓ時間スケール）テレグラフノイズ（ＴＮ）もまた、抗ＤＮＰについて観察され（データ不図示）、すべての他のタンパク質は、０．１Ｖを超えて研究された。これは、タンパク質捕捉の遍在的なシグナルであり、すべての場合において同じ２レベルのスイッチを示す。これらの変動は元々、固定接合チップに捕捉されたタンパク質について観察されたものであり（８）、本研究ではＳＴＭを使用しているが、ＴＮの測定は、ここで研究されたタンパク質の１つ（抗ＤＮＰ）について、ＳＴＭと同様にチップにおいても反復されており、これらが測定法の何らかのアーチファクトではないことを示した（データ不図示）。ＴＮに対する電圧閾値は、接続がほぼ破断するまでギャップに依存しておらず（データ不図示）、これは、既に提案され（８）、以下により詳細に議論されるように、大部分が接続で生じる電位降下によって駆動される接続の変動に関連することを意味する。
２つの電極のうちの少なくとも１つにタンパク質が特異的に結合した場合にのみ電流が観察された。典型的には、交代後の数秒間は、電流は記録されず、その後、結合タンパク質の存在下で電流は大きな（かつ可変の）値にジャンプした。電流は分の時間スケールでは変動するが、通常は、数秒間は安定しているため、上り掃引で記録された曲線の８０％が下り掃引で再現される（データ不図示）。コントロール（緩衝液単独、または溶液中に非同系タンパク質）は、シグナルを出さなかった。インテグリンについて報告された（８）急速に変動する（ｍｓ時間スケール）テレグラフノイズ（ＴＮ）もまた、抗ＤＮＰについて観察され（データ不図示）、すべての他のタンパク質は、０．１Ｖを超えて研究された。これは、タンパク質捕捉の遍在的なシグナルであり、すべての場合において同じ２レベルのスイッチを示す。これらの変動は元々、固定接合チップに捕捉されたタンパク質について観察されたものであり（８）、本研究ではＳＴＭを使用しているが、ＴＮの測定は、ここで研究されたタンパク質の１つ（抗ＤＮＰ）について、ＳＴＭと同様にチップにおいても反復されており、これらが測定法の何らかのアーチファクトではないことを示した（データ不図示）。ＴＮに対する電圧閾値は、接続がほぼ破断するまでギャップに依存しておらず（データ不図示）、これは、既に提案され（８）、以下により詳細に議論されるように、大部分が接続で生じる電位降下によって駆動される接続の変動に関連することを意味する。
【0125】
ＴＮを除いて、応答は線形であるため、各ＩＶトレースは単一のコンダクタンス値Ｇによって特性付けることができる。測定されたＧの分布は、１分子測定において通常観察される対数正規分布に従う（データ不図示）（１０）。その分布は、固定されたギャップおよびバイアスで電流対時間を記録して得られた電流値の分布に類似しているので（データ不図示）、その分布は、電極と分子との間の異種接続だとされた。インテグリン（ギャップ＝４．５ｎｍ）およびチオストレプトアビジン（ギャップ＝２．５ｎｍ）についての分布は、約０．３ｎＳに単一のピークを有する（データ不図示）。むき出しの金属電極を使用して、チオール化ストレプトアビジンを捕捉し、ここで、チオール媒介接続は電極表面上の汚染物質に取って代わり（１１）、直接的な金属－分子接続を形成する。インテグリンは、２つの電極のうち１つのみで環状ＲＧＤペプチドによって捕捉され、両方の電極が官能化されていない限り、シグナルは観察されなかった。ペプチドによる官能化は、特異的に結合されていない電極におけるタンパク質上の親水性部位との非特異的接続を可能にする。３つの抗体は、２つのコンダクタンスピーク（約０．３ｎＳおよび約２ｎＳ）を生じ、２つの結合様式を示唆した：インテグリンについてはＮＳ－Ｓ、および；両方の抗原結合部位が特異的に結合する場合には所望のＳ－Ｓ（データ不図示）。この解釈は、１つの電極上のペプチドをメルカプトエタノールで置換し、それを親水性にし、ＮＳ－Ｓ架橋を形成可能にすることによって、試験された。単一のピークのみが観察された（データ不図示）。さらなる試験として、抗エボラＩｇＧ由来のＦａｂフラグメントを、１価の結合ヘッドのみを用いて調製した。このフラグメントは、４．５ｎｍのギャップを架橋するためには小さすぎたため、データは２．５ｎｍのギャップにて記録された。コンダクタンス分布には単一のピークのみが存在し、単一のＮＳ－Ｓ接続を反映している（データ不図示）。したがって、より高いコンダクタンスピークは、２つの抗原結合部位を介するコンダクションに対応しなければならない。この効果を見るために、データセットは、１分子接続が支配的でなければならない。２．５ｎｍのギャップを横切る単一のＦａｂフラグメントのコンダクタンスが、４．５ｎｍのギャップを横切る抗体のコンダクタンスよりもはるかに小さいこと（データ不図示）は、注目に値する。これは、タンパク質の固有内部コンダクタンスが、測定された（接続制限された）値よりもはるかに高いことを示唆する。この発見は、非常に異なるサイズのタンパク質について測定された類似のコンダクタンスに関する先の報告（１２、１３）の原因を説明するものである。
【0126】
〔ギャップサイズに依存しないコンダクタンス〕
高いコンダクタンスの内部（分子を貫通する（１４））経路の存在は、上述の技術を使用するが、初期チップ後退量を増加させた、異なるギャップサイズにて行われた一連の測定によって説明される（データ不図示）。驚くべきことに、データが蓄積される頻度は低下するにもかかわらず、ピークコンダクタンス値はギャップサイズと共には変化しない（データ不図示）。この効果は、所定の高さにおける接続のために利用可能なプローブの面積を反映する。ギャップがタンパク質の高さに匹敵する場合（タンパク質データベースに見出される類似の構造について表１に列挙される）、利用可能な部位は非常に少ない。アズリン（Ｒｕｉｚら（１５）の補足情報参照）およびプローブと基板との間に捕捉される棒状分子について、ギャップに依存しないコンダクタンスが以前に報告されている（１４）。上記で指摘したように、接続点は、測定の間（およそ分）変化し、ＳＴＭプローブの位置におけるオングストロームスケールの変化の反映である。コンダクタンス分布の全体的な形状を生成するのは、これらの様々な接続形状である（データ不図示）。分布は、異なるギャップサイズで同じピーク位置および形状を保持するので、データは、より小さいギャップサイズでタンパク質が「圧迫」されていることを示すものではない。
高いコンダクタンスの内部（分子を貫通する（１４））経路の存在は、上述の技術を使用するが、初期チップ後退量を増加させた、異なるギャップサイズにて行われた一連の測定によって説明される（データ不図示）。驚くべきことに、データが蓄積される頻度は低下するにもかかわらず、ピークコンダクタンス値はギャップサイズと共には変化しない（データ不図示）。この効果は、所定の高さにおける接続のために利用可能なプローブの面積を反映する。ギャップがタンパク質の高さに匹敵する場合（タンパク質データベースに見出される類似の構造について表１に列挙される）、利用可能な部位は非常に少ない。アズリン（Ｒｕｉｚら（１５）の補足情報参照）およびプローブと基板との間に捕捉される棒状分子について、ギャップに依存しないコンダクタンスが以前に報告されている（１４）。上記で指摘したように、接続点は、測定の間（およそ分）変化し、ＳＴＭプローブの位置におけるオングストロームスケールの変化の反映である。コンダクタンス分布の全体的な形状を生成するのは、これらの様々な接続形状である（データ不図示）。分布は、異なるギャップサイズで同じピーク位置および形状を保持するので、データは、より小さいギャップサイズでタンパク質が「圧迫」されていることを示すものではない。
【0127】
ギャップサイズの関数としてのＴＮが起こるための電圧閾値のプロットは、電圧閾値がギャップサイズによって大きく変化しないことを示す。したがって、ＴＮ変動は、金属－分子界面における局所場によって駆動されなければならず、タンパク質の内部を横切って低下する電位は相対的に少ない。これはまた、ＴＮの寿命がピーク電流値に指数関数的に関係しているという我々の知見とも一致し、観測結果は、コンダクタンスを支配する回路内の単一の「弱リンク」トンネル接合によって、説明することができる（８）。
【0128】
〔コンダクタンスはタンパク質構造の変化に感応性である〕
コンダクタンス経路は、内部か、または表面輪郭に沿うかのいずれかで、タンパク質の幾何学的形状をたどるので、タンパク質の幾何学的形状の変更、および、それによるコンダクタンス経路の変更は、どの接続点がコンダクタンスを制御するかに影響を及ぼす可能性がある。これにより、タンパク質の構造変化の直接的な電気的感知が可能になる。この効果は、図７Ａに図示される。チオール化ストレプトアビジン試料中のビオチン錯化は、コンダクタンス分布を有意に変化させる（図７Ａ）。ストレプトアビジン分子は４つのビオチン結合部位を有するため（１６）、非チオール化アポタンパク質は２つのビオチンによって架橋され得る。チオール化ビオチンを合成し、それを用いてプローブおよび基板の両方を官能化し（図７Ｂ）、続いてアポストレプトアビジンを試料セルに流した。その結果、Ｇ分布は３つのピークを有し、最高値はほぼ７ｎＳであった。したがって、測定されたコンダクタンスは、タンパク質構造の局所的変化および接続の化学的性質の両方に感応性であり、接続がタンパク質の構造的変化によってどのように影響されるかを示す。チオール化ストレプトアビジンを基質に付着させ、ビオチン化プローブを用いて精査すると、同様の結果（データ不図示）であり、単一のビオチン媒介接続が約７ｎＳの高いコンダクタンス状態を生成するために十分であることを実証した。
コンダクタンス経路は、内部か、または表面輪郭に沿うかのいずれかで、タンパク質の幾何学的形状をたどるので、タンパク質の幾何学的形状の変更、および、それによるコンダクタンス経路の変更は、どの接続点がコンダクタンスを制御するかに影響を及ぼす可能性がある。これにより、タンパク質の構造変化の直接的な電気的感知が可能になる。この効果は、図７Ａに図示される。チオール化ストレプトアビジン試料中のビオチン錯化は、コンダクタンス分布を有意に変化させる（図７Ａ）。ストレプトアビジン分子は４つのビオチン結合部位を有するため（１６）、非チオール化アポタンパク質は２つのビオチンによって架橋され得る。チオール化ビオチンを合成し、それを用いてプローブおよび基板の両方を官能化し（図７Ｂ）、続いてアポストレプトアビジンを試料セルに流した。その結果、Ｇ分布は３つのピークを有し、最高値はほぼ７ｎＳであった。したがって、測定されたコンダクタンスは、タンパク質構造の局所的変化および接続の化学的性質の両方に感応性であり、接続がタンパク質の構造的変化によってどのように影響されるかを示す。チオール化ストレプトアビジンを基質に付着させ、ビオチン化プローブを用いて精査すると、同様の結果（データ不図示）であり、単一のビオチン媒介接続が約７ｎＳの高いコンダクタンス状態を生成するために十分であることを実証した。
【0129】
〔考えられるメカニズム〕
電子トンネル効果は、長距離輸送を説明するにはあまりにも速く減衰する。トンネルコンダクタンスは、Ｇ≒Ｇ０ｅｘｐ（－βｘ）から推定できる。ここで、Ｇ０は７７μＳであり、βは約１Å－１である（２４）。ｘが約４ｎｍである小さいタンパク質については、Ｇ＜１０－２１Ｓが得られ、観察されたものより１２桁小さい。距離１０ｎｍにわたるｎＳコンダクタンスの観測を説明するためには、β＜０．１Å－１が必要であろう。よく研究されたＤＮＡの場合、熱活性化ホッピング（１７）は、容易にイオン化されるグアニン間の距離が３ヌクレオチドを超える場合、ほぼ距離に依存しない輸送をもたらす（１８）。同様の輸送（容易に酸化されるアミノ酸を介する）が、ペプチドにおいて観察されている（１９）。これらの場合、輸送は電荷注入によって制限され、電荷注入に対する約１．５ｅＶの障壁は６３０ｎｍ（約２ｅＶ）光で励起される発色団を用いて克服された。電極からの電荷注入において同様の輸送メカニズムが作用する場合、Ｐｄのフェルミエネルギー（仕事関数５．２ｅＶ）と、容易に酸化される残基であるチロシンおよびトリプトファンの絶対酸化還元電位と、の間のエネルギーギャップによって障壁が決定される。これらのポテンシャルは約＋１～約＋１．２Ｖ対ＮＨＥであるから（２０）（２１）、ＮＨＥ（２２）の仕事関数について４．４ｅＶを用いると、真空下で５．４～５．６ｅＶ付近の絶対電位を与えるか、またはＰｄのフェルミエネルギーに対して＋０．２～０．４ｅＶの障壁を与える。したがって、この大きさの障壁は、電極へのタンパク質の結合に関連する結合性分極によって、克服されなければならない。これは、チオール結合によって貴金属表面に付着した小分子について観察される仕事関数の変化の十分に範囲内である（２３）。有意な電流は、３つの状況において得られた：（ａ）両方の電極への接続が直接的なチオール媒介結合を介する場合；（ｂ）１つの結合が、エピトープまたはリガンドへの特異的結合によって形成され、もう１つの結合が、電極に付着した親水性分子とタンパク質の親水性外部との間の非特異的相互作用によって形成される場合、および；（ｃ）最大の電流が観察されるのは、タンパク質が両方の電極において認識リガンドによって結合される場合（すべての場合において、リガンドはチオールを介して電極に連結される）。弱い非特異的結合は、有意な電流の流れをもたらさない：少なくとも１つの付着が共有結合またはリガンド媒介結合を介するものでなければならない。したがって、電極に直接結合するようにタンパク質自体が共有結合的に改変されていない場合には、少なくとも１つの特異的リガンドの結合によって、電荷注入に対する障壁が克服される。
電子トンネル効果は、長距離輸送を説明するにはあまりにも速く減衰する。トンネルコンダクタンスは、Ｇ≒Ｇ０ｅｘｐ（－βｘ）から推定できる。ここで、Ｇ０は７７μＳであり、βは約１Å－１である（２４）。ｘが約４ｎｍである小さいタンパク質については、Ｇ＜１０－２１Ｓが得られ、観察されたものより１２桁小さい。距離１０ｎｍにわたるｎＳコンダクタンスの観測を説明するためには、β＜０．１Å－１が必要であろう。よく研究されたＤＮＡの場合、熱活性化ホッピング（１７）は、容易にイオン化されるグアニン間の距離が３ヌクレオチドを超える場合、ほぼ距離に依存しない輸送をもたらす（１８）。同様の輸送（容易に酸化されるアミノ酸を介する）が、ペプチドにおいて観察されている（１９）。これらの場合、輸送は電荷注入によって制限され、電荷注入に対する約１．５ｅＶの障壁は６３０ｎｍ（約２ｅＶ）光で励起される発色団を用いて克服された。電極からの電荷注入において同様の輸送メカニズムが作用する場合、Ｐｄのフェルミエネルギー（仕事関数５．２ｅＶ）と、容易に酸化される残基であるチロシンおよびトリプトファンの絶対酸化還元電位と、の間のエネルギーギャップによって障壁が決定される。これらのポテンシャルは約＋１～約＋１．２Ｖ対ＮＨＥであるから（２０）（２１）、ＮＨＥ（２２）の仕事関数について４．４ｅＶを用いると、真空下で５．４～５．６ｅＶ付近の絶対電位を与えるか、またはＰｄのフェルミエネルギーに対して＋０．２～０．４ｅＶの障壁を与える。したがって、この大きさの障壁は、電極へのタンパク質の結合に関連する結合性分極によって、克服されなければならない。これは、チオール結合によって貴金属表面に付着した小分子について観察される仕事関数の変化の十分に範囲内である（２３）。有意な電流は、３つの状況において得られた：（ａ）両方の電極への接続が直接的なチオール媒介結合を介する場合；（ｂ）１つの結合が、エピトープまたはリガンドへの特異的結合によって形成され、もう１つの結合が、電極に付着した親水性分子とタンパク質の親水性外部との間の非特異的相互作用によって形成される場合、および；（ｃ）最大の電流が観察されるのは、タンパク質が両方の電極において認識リガンドによって結合される場合（すべての場合において、リガンドはチオールを介して電極に連結される）。弱い非特異的結合は、有意な電流の流れをもたらさない：少なくとも１つの付着が共有結合またはリガンド媒介結合を介するものでなければならない。したがって、電極に直接結合するようにタンパク質自体が共有結合的に改変されていない場合には、少なくとも１つの特異的リガンドの結合によって、電荷注入に対する障壁が克服される。
【0130】
接続における界面電荷の小さな変化は、輸送に強く影響することが示されており（２４）、これは、ファラデー電流を避けるためには、小さな範囲にわたってのみではあるが、電位制御を用いて変化させることができる変数である。おそらく、小さな変化は、界面における結合性分極のために、はるかに大きな場によって支配される。アミノ酸残基の酸化還元電位に加えて、タンパク質の三次元フォールディングが重要な役割を果たさなければならない。これは、ブレークジャンクションで伸長した小ペプチドは伝導しないが（２５）、電極表面上でフォールディングした類似の小ペプチドは伝導するからである（２６）。これは、いくつかの特別な幾何学的形状の結果（２７）、または水素結合の配置の結果であり得る（２８）。
【0131】
我々は、最終的に、±１００ｍＶを超えた印加バイアスに設定した変動を調べる。ギャップサイズへのこの閾値電圧の小さな依存性（データ不図示）は、タンパク質の内部コンダクタンスが接点におけるコンダクタンスよりもはるかに高い、という仮説と一致しており、これらのシグナルが接点自体の電圧駆動変動から生じることを意味している。インテグリンに関する我々の先の研究（８）でこのようなメカニズムを我々は提案したが、ここでは、「オン」状態の寿命τはピーク電流ｉｐに関係することを示した。ここで、ピーク電流ｉｐは、テレグラフノイズピークのものであり、τ∝ｌｎ（ｉｐ）という電流および結合強度の両方を決定する単一の障壁によって説明できる関係を介する。オンになると電流は電圧とともに線形に増大し、新しいオームコンダクタンスチャネルが開くことを示している（データ不図示）。オンになるプロセスは、
【0132】
【数1】
【0133】
の形式の指数関数によって記述される。ここで、Ｖｃは活性化電位である。フィッティングすると、Ｖｃが約０．２５Ｖという水中の水素結合強度に特徴的な値となり（２９）、水素結合が回路中の「弱結合」であり得ることを示唆している。
【0134】
この０．２５Ｖの障壁は、上述のように、アミノ酸の酸化還元電位から推定される電荷注入の障壁に類似していることに注目することは、興味深い。もし電荷注入比率が０．２２～０．４７Ｖの障壁にわたる熱活性化ホッピングによって制限され、コンダクタンスを決定するのがこの比率であるならば、
【0135】
【数2】
【0136】
のコンダクタンスを観測することが期待されるのであろう。ここで、０．２２＜Ｖ＜０．４７ボルトであり、これは、報告される値を包含する範囲である１２ｎＳ～０．５ｐＳからのものである。
【0137】
〔電子コンダクタンスにおける特異的結合の役割〕
特異的なリガンド－レセプター相互作用がタンパク質への良好な電気的接続を形成する、と我々は結論付けた。これは、図７Ａおよび図７Ｂに図示されるデータによって、示される。金属電極に直接結合した表面リシンの共有結合的（チオール）改変を介してなされた接続は、チオール末端エタン結合を介して電極に結合した非共有結合的ストレプトアビジン－ビオチン結合（６．８ｎＳ）よりも低い最大コンダクタンス（０．５６ｎＳ）を生じる。このコンダクタンスは、１つのビオチン化リンカーのみが使用される場合、ほとんど変化しない（データ不図示）。したがって、タンパク質の疎水性内部へのより弱い結合は、たとえそのような結合がなされたのが１つのみだとしても、親水性外部へのより強い結合よりも、より効果的である。一旦注入され、タンパク質内部を電子が容易に移動する場合、第２の（非特異的である）接続は、タンパク質の親水性表面において障壁としてのみ作用する。このようなメカニズムは、１つの部位のみでリガンドによって結合された場合のインテグリンの高いコンダクタンス、および、両方の接続が非共有結合的および非特異的である場合のコンダクタンスの完全な欠如を説明する。
特異的なリガンド－レセプター相互作用がタンパク質への良好な電気的接続を形成する、と我々は結論付けた。これは、図７Ａおよび図７Ｂに図示されるデータによって、示される。金属電極に直接結合した表面リシンの共有結合的（チオール）改変を介してなされた接続は、チオール末端エタン結合を介して電極に結合した非共有結合的ストレプトアビジン－ビオチン結合（６．８ｎＳ）よりも低い最大コンダクタンス（０．５６ｎＳ）を生じる。このコンダクタンスは、１つのビオチン化リンカーのみが使用される場合、ほとんど変化しない（データ不図示）。したがって、タンパク質の疎水性内部へのより弱い結合は、たとえそのような結合がなされたのが１つのみだとしても、親水性外部へのより強い結合よりも、より効果的である。一旦注入され、タンパク質内部を電子が容易に移動する場合、第２の（非特異的である）接続は、タンパク質の親水性表面において障壁としてのみ作用する。このようなメカニズムは、１つの部位のみでリガンドによって結合された場合のインテグリンの高いコンダクタンス、および、両方の接続が非共有結合的および非特異的である場合のコンダクタンスの完全な欠如を説明する。
【0138】
〔参照〕
以下の参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
以下の参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0139】
米国特許出願６２／６７３，０８０（２０１８年５月１７日出願）。
【0140】
米国特許出願６２／６８２，９９１（２０１８年６月１０日出願）。
【0141】
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【0142】
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【0143】
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【0144】
４．Malvankar, N.S., M. Vargas, K.P. Nevin, A.E. Franks, C. Leang, B.C. Kim, K. Inoue, T. Mester, S.F. Covalla, J.P. Johnson, V.M. Rotello, M.T. Tuominen, and D.R. Lovley, Tunable metallic-like conductivity in microbial nanowire networks. Nat Nanotechnol, 2011. 6(9): p. 573-9。
【0145】
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【0146】
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【0147】
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【0148】
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【0149】
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【0159】
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【0168】
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【0169】
２９．Jeffrey GA (1997) An Introduction to Hydrogen Bonding (Oxford University Press New York)。
【0170】
本開示の特定の実施形態が、任意の組み合わせで、上記および下記に示される実施形態のうちの１つ以上を対象とし得ることは、当業者には明らかであろう。
【0171】
特定の材料、製剤、操作順序、プロセスパラメータ、および最終生成物が、本発明を説明および例示するために記載されているが、それらは限定することを意図するものではない。むしろ、記載の開示は例示的なものにすぎず、様々な他の代替、適応および改変が本開示の範囲内で行われ得ることが、当業者によって留意されるべきである。したがって、本開示は、本明細書に示される特定の実施形態に限定されず、以下の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【図面の簡単な説明】
【0172】
【図7A】図７Ａおよび図７Ｂは、ビオチンと結合し、電極に直接的に結合したチオール化ストレプトアビジンについて測定されたコンダクタンス分布と、図２に示すチオール化ビオチンと電極に結合した野生型ストレプトアビジンについてのコンダクタンス分布と、の比較を示す。ここで、ビオチンは、明確にするために大きさが誇張されて示されている。
【図7B】図７Ａおよび図７Ｂは、ビオチンと結合し、電極に直接的に結合したチオール化ストレプトアビジンについて測定されたコンダクタンス分布と、図２に示すチオール化ビオチンと電極に結合した野生型ストレプトアビジンについてのコンダクタンス分布と、の比較を示す。ここで、ビオチンは、明確にするために大きさが誇張されて示されている。
【図10A】図１０Ａおよび図１０Ｂは、２つのＡｖｉタグリンカーを含むように改変されたｐｈｉ２９ポリメラーゼについてのタンパク質配列の例を示し、荷電残基の組み込みがどのようにミスフォールディングを引き起こし得るかを示す。
【図10B】図１０Ａおよび図１０Ｂは、２つのＡｖｉタグリンカーを含むように改変されたｐｈｉ２９ポリメラーゼについてのタンパク質配列の例を示し、荷電残基の組み込みがどのようにミスフォールディングを引き起こし得るかを示す。
【図11A】図１１Ａおよび図１１Ｂは、ビオチンストレプトアビジンリンカーを有する回路に配線された、フレキシブルリンカー配列を有する、および有しない２つのポリメラーゼについて測定されたコンダクタンス分布を示す。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図6A】
【図6B】
【図7A】
【図7B】
【図8】
【図9A】
【図9B】
【図10A】
【図10B】
【図11A】
【図11B】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【配列表】
【国際調査報告】