特表 2022-523701 内臓痛の予防および／または処置のためのラクトコッカス・ラクティス株

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-04-26

(54)【発明の名称】内臓痛の予防および／または処置のためのラクトコッカス・ラクティス株

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/20 20060101AFI20220419BHJP

   A61K 35/744 20150101ALI20220419BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20220419BHJP

   A61P 1/00 20060101ALI20220419BHJP

   A23L 33/135 20160101ALI20220419BHJP

   A61K 31/197 20060101ALN20220419BHJP

   C12N 15/31 20060101ALN20220419BHJP

【ＦＩ】

C12N1/20 A

A61K35/744

A61P29/00

A61P1/00

A23L33/135 ZNA

A61K31/197

C12N15/31

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021543499

(86)(22)【出願日】2020-01-31

(85)【翻訳文提出日】2021-08-18

(86)【国際出願番号】 EP2020052466

(87)【国際公開番号】W WO2020157297

(87)【国際公開日】2020-08-06

(31)【優先権主張番号】19305125.7

(32)【優先日】2019-02-01

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】505129079

【氏名又は名称】アンスティテュ・ナシオナル・ドゥ・ルシェルシュ・プール・ラグリキュルテュール，ラリマンタシオン・エ・ランヴィロンヌマン

【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＴＩＴＵＴ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＰＯＵＲ Ｌ’ＡＧＲＩＣＵＬＴＵＲＥ，Ｌ’ＡＬＩＭＥＮＴＡＴＩＯＮ ＥＴ Ｌ’ＥＮＶＩＲＯＮＮＥＭＥＮＴ

(71)【出願人】

【識別番号】508242067

【氏名又は名称】アンスティテュ・ナショナル・デ・シヤンス・アプリケ・ドゥ・トゥールーズ

【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＴＩＴＵＴ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥＳ ＳＣＩＥＮＣＥＳ ＡＰＰＬＩＱＵＥＥＳ ＤＥ ＴＯＵＬＯＵＳＥ

(71)【出願人】

【識別番号】511134470

【氏名又は名称】セントレ ナショナル デ ラ ルシェルシェ サイエンティフィック

(71)【出願人】

【識別番号】521329338

【氏名又は名称】エコール ダンジェニウル ドゥ ピュルパン

【氏名又は名称原語表記】ＥＣＯＬＥ Ｄ’ＩＮＧＥＮＩＥＵＲＳ ＤＥ ＰＵＲＰＡＮ

【住所又は居所原語表記】７５ ｖｏｉｅ ｄｕ Ｔｏｅｃ ＢＰ ５７６１１，３１０７６ ＴＯＵＬＯＵＳＥ Ｃｅｄｅｘ ０３（ＦＲ）

(71)【出願人】

【識別番号】521329349

【氏名又は名称】エコール ナシオナル ヴェテリネール デュ トゥールーズ

【氏名又は名称原語表記】ＥＣＯＬＥ ＮＡＴＩＯＮＡＬＥ ＶＥＴＥＲＩＮＡＩＲＥ ＤＥ ＴＯＵＬＯＵＳＥ

【住所又は居所原語表記】２３，Ｃｈｅｍｉｎ ｄｅｓ Ｃａｐｅｌｌｅｓ，３１３００ ＴＯＵＬＯＵＳＥ（ＦＲ）

(71)【出願人】

【識別番号】517264018

【氏名又は名称】ユニヴェルシテ トゥールーズ トロワズィエム－ポール サバティエ

(74)【代理人】

【識別番号】110000659

【氏名又は名称】特許業務法人広江アソシエイツ特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】コケイン－ブスケ，ミュリエル

(72)【発明者】

【氏名】ウータムネ，エレーヌ

(72)【発明者】

【氏名】メルシエ ボナン，ミュリエル

(72)【発明者】

【氏名】テオドロウ，ヴァシリア

(72)【発明者】

【氏名】ラルート，ヴァレリー

(72)【発明者】

【氏名】ダベラン－ミニョ，マリエ－ライン

【テーマコード（参考）】

4B018

4B065

4C087

4C206

【Ｆターム（参考）】

4B018MD86

4B018ME02

4B018ME14

4B065AA01X

4B065AC14

4B065BC02

4B065CA42

4B065CA44

4C087BC55

4C087CA09

4C087CA41

4C087MA16

4C087MA27

4C087MA34

4C087MA52

4C087NA14

4C087ZA08

4C087ZA21

4C087ZA66

4C206AA01

4C206AA02

4C206FA45

4C206MA01

4C206MA04

4C206MA36

4C206MA47

4C206MA54

4C206MA72

4C206NA14

4C206ZA08

4C206ZA21

4C206ZA66

(57)【要約】

本発明は、内臓痛の予防および／または処置に用いるための、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）株またはその細胞画分に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

腹部痛または内臓痛の予防および／または処置に使用するための、２４時間以下の培養時間で少なくとも１０ｍＭのγ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）を産生することができるラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）株。

【請求項2】

腹部痛または内臓痛の予防および／または治療に使用するための、７時間～８時間に含まれる培養時間において、少なくとも２０μモル/分ピリドカル－５’－リン酸（ＰＬＰ）依存性酵素グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）ｍｇを産生するラクトコッカス・ラクティス株。

【請求項3】

ＣＮＣＭ Ｉ－５３８８、ＣＮＣＭ Ｉ－５３８６、およびＮＣＤＯ２１１８からなる群で選択されることを特徴とする、請求項１または請求項２に記載のラクトコッカス・ラクティス株。

【請求項4】

遊離グルタミン酸の存在下で投与されることを特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載のラクトコッカス・ラクティス株。

【請求項5】

内臓痛の予防および／または処置に使用するための、請求項１から３のいずれか一項に記載のラクトコッカス・ラクティス株から得られる細胞画分。

【請求項6】

内臓痛の予防および／または処置に使用するための、請求項１から３のいずれか一項に記載のラクトコッカス・ラクティス株または請求項４に記載の細胞画分を含む組成物。

【請求項7】

１日当たり少なくとも１０^６コロニー形成単位（ｃｆｕ）のラクトコッカス・ラクティス株の投与を可能にする、該Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）株の含有量を含むことを特徴とする、請求項６に記載のラクトコッカス・ラクティス株を含む組成物。

【請求項8】

遊離グルタミン酸も含むことを特徴とする、請求項６または請求項７に記載の組成物。

【請求項9】

食品であることを特徴とする、請求項６から８のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項10】

内臓痛が心理的ストレス事象および／または不安に関連することを特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載のラクトコッカス・ラクティス株または請求項５に記載の細胞画分または請求項６から９のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項11】

内臓痛が口腔灼熱症候群（ＢＭＳ）によるものであることを特徴とする、請求項１０に記載の使用のための、請求項１から３のいずれか一項に記載のラクトコッカス・ラクティス株または請求項５に記載の細胞画分または請求項６から９のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項12】

ＣＮＣＭ Ｉ－５３８８、ＣＮＣＭ Ｉ－５３８６からなる群で選択されることを特徴とする、ラクトコッカス・ラクティス株。

【請求項13】

請求項１２に記載のラクトコッカス・ラクティス株から得られる細胞画分。

【請求項14】

請求項１２に記載のラクトコッカス・ラクティス株または請求項１３に記載の細胞画分を含む組成物。

【請求項15】

乾燥重量グラム当たり少なくとも１０^６ｃｆｕを含むことを特徴とする、請求項１４に記載のラクトコッカス・ラクティス株を含む組成物。

【請求項16】

食品であることを特徴とする、請求項１４または１５に記載の組成物。

【請求項17】

医薬として使用するための、請求項１４または１５に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、痛み、特に、内臓痛を軽減する能力を有するラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）株に関し、これらの株は、個体における内臓痛の予防および/または処置に有用である。本発明はまた、これらのラクトコッカス・ラクティス株の中の新しい株およびそれらを含有する組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

内臓痛は、身体の内部臓器を包含する内臓に関連する痛みである。ここで、内臓という用語は、口腔から肛門までのすべての胃腸管を含む。これらの臓器にはまた、例えば、心臓、肺、生殖器、膀胱、尿管、消化管の臓器、好ましくは舌、腹部腸、肝臓、膵臓、脾臓、および腎臓も含まれる。内臓痛は、限局性であるが、腹部および/または背部に放散する傾向があり得る、漠然とした、拡散性の、鈍いうずく痛みによって特徴付けられる。倦怠感を伴うことがあり得、重度の場合、発汗、血管運動反応、徐脈、悪心、および嘔吐などの強い自律神経現象を誘発する。これは通常、正中線および体内の深部で感じられる。

【0003】

腹部痛または内臓痛が存在し得る様々な状態が存在する。例えば、膵炎の痛み、陣痛、腸閉塞に関連する腹部手術の痛み、過敏性腸症候群の痛み、非潰瘍性消化不良、または月経困難症の腹部痛である。同様に、肝臓痛、腎臓痛、上腹部痛、胸膜痛、および有痛性胆道痛、虫垂炎痛は、すべて内臓痛であると考えられ得る。早期心筋梗塞による胸骨下の痛みまたは圧迫も内臓性である。さらに、口腔灼熱症候群（ＢＭＳ）は、胃起源が疑われる場合であっても、明確な病因のない舌および他の口腔部位における灼熱感または異常感覚を特徴とする慢性特発性障害である。このＢＭＳは、ドライマウス、刺痛、または味覚異常を伴う。ＢＭＳ患者において同定された末梢神経の病変を考慮して、いくつかの臨床試験は、ＢＭＳ症状に対する局所ＧＡＢＡ－Ａ結合受容体リガンドの有効性を実証した（非特許文献１）。胃、十二指腸、または結腸の疾患は、内臓痛を引き起こし得る。内臓痛を引き起こす一般的に遭遇する胃腸（ＧＩ）障害には、機能性腸障害（ＦＢＤ）および炎症性腸疾患（ＩＢＤ）が含まれる。これらのＧＩ障害には、ＦＢＤに関しては胃食道逆流、消化不良、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、および機能性腹痛症候群（ＦＡＰＳ）、ならびにＩＢＤに関してはクローン病、回腸炎、および潰瘍性大腸炎を含む、現在は中程度にしか制御されていない広範囲の疾患状態が含まれ、これらはすべて内臓痛を定期的に引き起こす。

【0004】

Ｒｏｍｅ ＩＶ基準によれば、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）は、原因不明の機能性胃腸障害であり、ほとんどの国で成人の１０～２０％が罹患している。ＩＢＳは、患者の生活の質に強く影響する様々な症状をもたらす（非特許文献２）。ストレスは、ＩＢＳの発症、維持、および悪化における重要な因子であり（非特許文献３）、重大な罹患率および医療費につながることが示されている。ＩＢＳは脳腸軸の障害であり、臨床症状には、構造的異常を伴わない腹部痛および便通の変化（すなわち、便秘、下痢）が含まれる（非特許文献４）。ＩＢＳ患者のサブセットは、３０％～４０％とさまざまであるが、結腸拡張に対する増強された感受性を示すことが報告されており、これは、結腸拡張に応答した痛みに対する閾値の低下、知覚の強度の増加、および／または過剰な内臓体照会を通して顕著である（非特許文献５～８）。したがって、内臓過敏は、ＩＢＳ患者が経験する便通、膨満、および腹部痛症状の重症度を説明する重要な臨床マーカとして提案されている（非特許文献９～１１）。ＩＢＳの病態生理学をよりよく理解するために、内臓感受性および腸通過時間の変化などのＩＢＳの特徴を模倣した、急性および慢性ストレス動物モデルを開発した（非特許文献１２）。ラットでは、直腸膨張に対する内臓過敏に関連する急性拘束ストレスは、コルチコトロピン放出因子（ＣＲＦ）の中枢放出に関連する（非特許文献１２）。これらの障害（ＩＢＳおよびＢＭＳ）の現在の薬理学的処置は、現在までのところ主に症状主導であり、それらの有効性は一般的に低い（非特許文献１３）。

【0005】

上記から、内臓痛の予防および／または処置のための薬理学的薬剤の代替物が必要であることが分かる。

【0006】

いくつかの実験的証拠は、プロバイオティクスが特にＩＢＳ患者において腹部痛を調節するための有効な処置の選択肢であることを示唆している（非特許文献１４～１７）。しかしながら、臨床結果は、使用されるプロバイオティクスの株、これらの株の混合物および投与量、ならびにＩＢＳ患者の処置期間およびサブタイプのために、研究間でかなり異なる（非特許文献１８）。

【0007】

近年、γ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）を産生するヒト腸内共生ビフィドバクテリウム・デンティウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｅｎｔｉｕｍ）は、内臓過敏のラット糞便保持モデルにおいて感覚ニューロン活性を調節することが示された（非特許文献１９）。さらに、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｎｉｓｓｌｅ１９１７株は、Ｃ１２ＡｓｎＧＡＢＡＯＨリポペプチドを産生し、マウスの内臓感受性を抑止できることが実証された（非特許文献２０）。しかしながら、プロバイオティクス自体の有効性の証拠は示されず、Ｃ１２ＡｓｎＧＡＢＡＯＨリポペプチドの鎮痛特性のみが示されている。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0008】

【非特許文献1】Pain Med. 2014; 15: 2164-5.

【非特許文献2】Am J Manag Care. 2005; 11: S17-26.

【非特許文献3】Gastroenterology. 2011; 140:761-765.

【非特許文献4】Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2012; 303: G775-85.

【非特許文献5】Gastroenterology. 1994; 107:271-293.

【非特許文献6】Gut. 2008; 57:384-404.

【非特許文献7】Dig. Dis. Sci. 2001; 46:2542-2548.

【非特許文献8】Pain. 2010; 148:454-461.

【非特許文献9】Aliment. Pharmacol. Ther. 2005; 22:157-164.

【非特許文献10】Gastroenterology. 2007; 133:1113-1123.

【非特許文献11】Clin. Gastroenterol. Hepatol. 2008; 6:772-781.

【非特許文献12】Neurogastroenterol Motil. 1997;9(4):271-9.

【非特許文献13】Curr Opin Gastroenterol. 2018; 34:50-56.

【非特許文献14】Gut. 2010; 59:325-332.

【非特許文献15】Aliment. Pharmacol. Ther. 2013; 38:864-886.

【非特許文献16】Am. J. Gastroenterol. 2014; 109:1547-1561.

【非特許文献17】World. J. Gastroenterol. 2015; 21:3072-3084.

【非特許文献18】J. Neurogastroenterol. Motil. 2015; 21:471-485.

【非特許文献19】Neurogastroenterol. Motil. 2017; 29, e12904.

【非特許文献20】Nat. Commun. 2017; 8, 1314.

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

したがって、内臓痛を軽減し、低い製造コストで製造することが容易な新しい治療アプローチを特定することは依然として有用である。

【課題を解決するための手段】

【0010】

これに関連して、本発明者らは、乳酸菌、ラクトコッカス・ラクティスの研究に集中した。ラクトコッカス・ラクティスの亜種、ラクティス株は、インビトロでＧＡＢＡを産生することが知られており（Ｎｏｍｕｒａら、１９９９）、理論的には、ＧＡＢＡのグルタミン酸を変換する酵素であるピリドカル－５’－リン酸（ＰＬＰ）依存性酵素グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）を発現することが遺伝的に可能であるが、ＧＡＤを発現してＧＡＢＡを産生するそれらの有効な能力は、未知の理由により非常に偶発的である。実際、本発明者らは、ＧＡＢＡ生合成に関与するｇａｄオペロンがＬ．ラクティスＮＣＤＯ２７２７株とＮＣＤＯ２１１８株との間で高い類似性を有するにもかかわらず、同様の培養条件下でのＧＡＢＡ産生は、ＮＣＤＯ２７２７株によって産生される非常に少ない量のＧＡＢＡで非常に異なっていたことを示した（図２Ａでは、ＧＡＢＡ濃度が、常に０．２ｍＭ未満）。同様に、ＮＣＤＯ２１１８株では高いＧＡＤ活性が得られたが、ＮＣＤＯ２７２７株では極めて低い値であった（表３）。

【発明を実施するための態様】

【0011】

乳製品で頻繁に見かけるＬ．ラクティスは、最も摂取される細菌の１つである（Ｍｉｌｌｓら、２０１０、Ｌａｒｏｕｔｅら、２０１７）。この細菌は、チーズ、または発酵乳を含む発酵乳製品などの乳製品に一般的に見られる。

【0012】

共生細菌としては考えられていないが、Ｌ．ラクティスは、研究中の株によっては、腸内で一時的に存続することが見出された（Ｗａｎｇら、２０１１、Ｒａｄｚｉｗｉｌｌ－Ｂｉｅｎｋｏｗｓｋａら、２０１６、Ｚｈａｎｇら、２０１６）。

【0013】

本発明者らは、２４時間以下の培養時間で多量のＧＡＢＡ、すなわち少なくとも１０ｍＭのγ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）を産生することができる新しいＬ．ラクティス株を同定し、これらの株が内臓痛を軽減する驚くべき予想外の能力を有することを示した。したがって、これらのＬ．ラクティス株は、内臓痛を予防および/または処置するための新しい手段であることを示している。

【0014】

さらに、本発明者らは、少量のＧＡＢＡを産生するＬ．ラクティス株ＮＣＤＯ２７２７が、そのような有利な特性を有さないことを実証した。

【0015】

したがって、本発明の対象は、個体における内臓痛の予防および/または処置に使用するための、２４時間以下の培養時間で少なくとも１０ｍＭのγ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）を産生することができるラクトコッカス・ラクティス株である。

【0016】

好ましくは、本発明のラクトコッカス・ラクティス株は、２４時間以下の培養時間で少なくとも１０ｍＭのＧＡＢＡ、より好ましくは２０ｍＭのＧＡＢＡ、さらにより好ましくは４０ｍＭのＧＡＢＡ、最も好ましくは少なくとも６０ｍＭのＧＡＢＡを産生することができる（図２Ａ）。

【0017】

ＧＡＢＡを産生する能力は、発酵槽内のグルタミン酸、アルギニン、グルコース、およびＮａＣｌを補充したＭ１７培地中でラクトコッカス・ラクティス株を培養することによって評価することができる。培養の最初の数時間では、ｐＨを６．６に維持し、ＧＡＤが誘導され、蓄積する。培養の７～８時間で、株を個々の処置のために収集し、次いで、ｐＨを４．６で低下させ、ＧＡＢＡ産生速度を定量する。ＧＡＢＡの濃度を、２４時間まで経時的に測定する。

【0018】

本発明のラクトコッカス・ラクティス株における増殖およびＧＡＤ発現の誘導を可能にする、培養培地の調製および培養条件の定義付けは、当業者に周知であり、そのような培養培地は、各特定のＬ．ラクティス株に適合させることができる。例えば、ＣＮＣＭ Ｉ－５３８８株の場合、基本のＭ１７培養培地へのアルギニンおよびＮａＣｌの添加が、ＧＡＤの発現を誘導することが証明されており、ＣＮＣＭ Ｉ－５３８６などの他の株は、いかなる特定の化合物も添加せずに、このＭ１７培養培地で培養した場合、ＮＣＤＯ２１１８と同様のレベルでＧＡＤ発現を増強することができる。

【0019】

本発明による個体は、哺乳動物または鳥である。例えば、個体は、家禽またはペットなどの家畜飼育からの動物であり得る。特定の実施形態によれば、個体はヒトである。

【0020】

好ましくは、本発明のＬ．ラクティス株は、この株によって産生されるピリドカル－５’－リン酸（ＰＬＰ）依存性酵素グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）の活性が、７時間～８時間に含まれる培養時間において、少なくとも２０μモル/分タンパク質ｍｇであることを特徴とする。

【0021】

好ましくは、本発明におけるラクトコッカス・ラクティス株によって産生されるＧＡＤの活性は、７時間～８時間に含まれる培養時間において、少なくとも２０μモル／分タンパク質ｍｇ、より好ましくは４０μモル／分ｍｇ、さらにより好ましくは６０μモル／分ｍｇであり、増加する順に、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００μモル／分ｍｇ、最も好ましくは少なくとも８２０μモル／分ｍｇである。

【0022】

好ましくは、本発明のＬ．ラクティス株は、この株によるｐＨ４．６でのＧＡＢＡ産生速度が、８．５時間～１１．５時間に含まれる培養時間において、少なくとも１ミリモル／ｈ／細胞乾燥重量ｇであることを特徴とする。

【0023】

好ましくは、本発明におけるＧＡＢＡの比産生速度は、８．５時間～１１．５時間に含まれる培養時間において、少なくとも１ミリモル／ｈ／細胞乾燥重量ｇ、より好ましくは３ミリモル／ｈ／細胞乾燥重量ｇ、最も好ましくは少なくとも７ミリモル／ｈ／細胞乾燥重量ｇである。

【0024】

ＧＡＤ活性を評価するための方法は、実施例１に示すように、当技術分野で公知である。ＧＡＢＡ産生速度は、８．５時間と１１．５時間との間で算出された比速度（平均値）である。

【0025】

本発明におけるＬ．ラクティス株は、ＣＮＣＭ Ｉ－５３８８、ＣＮＣＭ Ｉ－５３８６、およびＮＣＤＯ２１１８からなる群において、好ましくはＣＮＣＭ Ｉ－５３８８とＣＮＣＭ Ｉ－５３８６との間で選択することができ、より好ましくはＬ．ラクティス株は、ＣＮＣＭ Ｉ－５３８８株である。

【0026】

ＣＮＣＭ Ｉ－５３８８株およびＣＮＣＭ Ｉ－５３８６株は、ブダペスト条約に従って、ＣＮＣＭ Ｉ－５３８６については２０１８年１１月２９日に、ＣＮＣＭ Ｉ－５３８８については２０１８年１２月１３日に、ＣＮＣＭ（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ、２５ ｒｕｅ ｄｕ Ｄｏｃｔｅｕｒ Ｒｏｕｘ、Ｐａｒｉｓ）に寄託した。

【0027】

本発明のＬ．ラクティス株は、内臓痛の予防または処置において、特に興味深い。

【0028】

本発明のＬ．ラクティス株の予防効果および治療効果は、遊離グルタミン酸の存在下で得られる。例えば、遊離グルタミン酸の量は、１０^９ｃｆｕのＬラクティス当たり約４ｍｇ／日、または約１７ｍｇ／ｋｇ ｂｗ／日である。

【0029】

実施例２で実証されているように、遊離グルタミン酸それ自体は、基礎およびストレス誘発性結腸直腸活性に対して、いかなる有益なまたは望ましくない効果ももたらさない。

【0030】

大陸および食文化に応じて、古典的な食事は、異なるレベルの遊離グルタミン酸を提供する（遊離グルタミン酸の平均集団摂取量は、５．５ｍｇ／ｋｇ ｂｗ／日（高齢オーストリア人）から３７ｍｇ／ｋｇ ｂｗ／日（ベルギーの幼児）までの範囲であり、高レベルの摂取量は、ベルギーの他の小児については最大８２ｍｇ／ｋｇ ｂｗ／日、デンマークの乳児については７７ｍｇ／ｋｇ ｂｗ／日、およびブルガリアの他の小児については５６ｍｇ／ｋｇ ｂｗ／日までの範囲であり、さらに、天然の遊離グルタミン酸および食事性タンパク質から、８１から１５５ｍｇ／ｋｇ ｂｗ／日の範囲が成人では摂取され得る。Ｄａｖｉｄ Ｒ．Ｔｅｎｎａｎｔ、Ａｎｎ．Ｎｕｔｒ．Ｍｅｔａｂ．２０１８、７３：２１～２８）．したがって、これらのデータに従い、本発明者らは、本発明のＬ．ラクティス株を単独で、すなわち遊離グルタミン酸を添加せずに投与して、腹部痛または内臓痛を効率的に予防または軽減することができると考えた。

【0031】

あるいは、遊離グルタミン酸を含まない食事または遊離グルタミン酸が特に少ない食事の場合、本発明のＬ．ラクティス株を、遊離グルタミン酸と一緒に投与してもよい。したがって、特定の実施形態では、本発明の別の対象は、個体における内臓痛の予防および／または処置に使用するための、本発明のＬ．ラクティス株と、１０～２０ｍｇ／ｋｇ ｂｗ／日、特に１７ｍｇ／ｋｇ ｂｗ／日の遊離グルタミン酸との組合せである。

【0032】

本発明の異なる態様では、内臓痛は、損傷、感染、炎症、疾患によって、または熱刺激、機械刺激、電気刺激、化学刺激、もしくは放射性刺激によって引き起こされ得る。

【0033】

本発明における内臓痛は、特に、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）だけでなく口腔灼熱症候群（ＢＭＳ）も含む、慢性腹部および骨盤痛障害で観察されるものである。ＩＢＳ患者は、誘発刺激（すなわち、直腸膨張）に対して著しく低い反応閾値を示し、正常な臓器機能の間に感受性の増加を訴え、体性（腹部）照会の拡大領域における圧痛の増加（すなわち、内臓過敏性と体性過敏性の両方）を呈する。機能的内臓（胃腸）障害は、変化した中枢神経系処理および/または調節不全の中枢性調節から生じた。この一連の事象において、後根神経節（ＤＲＧ）に位置する一次求心性侵害受容器の内臓入力が疼痛知覚の変化の原因である。しかしながら、すべての慢性疾患、例えば、肝炎、消化性潰瘍、ＩＢＤ（クローン病および潰瘍性大腸炎）、腹部痛および/または背痛が主訴であるＩＢＳ、ならびに知覚されるすべての感覚は、末梢感覚（求心性）ニューロンの活性によって開始される（Ｋｅｓｚｔｈｅｌｙｉ Ｄ．ら、２０１２）。米国で１００万人を超える人々が罹患している重要な慢性疼痛障害である口腔灼熱症候群（ＢＭＳ）について（Ｍｉｚｉａｒａら、２００９）。ＢＭＳは、唇および舌、主に先端および前方２／３に関与する陽性（灼熱痛、味覚異常、および異常感覚）および陰性（味覚の喪失および異常知覚）の両方の感覚症状を特徴とする。ＢＭＳは、３つのタイプに分類され得る（Ｓｕｎら、２０１３）。タイプ１では、患者は、覚醒時に痛みを伴わないが、日が経つにつれて症状が増加する。タイプ２では、患者は、１日を通して継続的な痛みを有し、このタイプは、患者の５５％を占め、心理学的障害との最も強い関連を有する（Ｃｏｃｕｌｅｓｃｕら、２０１４）。タイプ３では、患者は、日中に無痛期間を伴う間欠的な症状を有する。さらに、これらのＢＭＳ患者は、鬱病、不安症、時には糖尿病、さらには栄養／ミネラル欠乏症を有することが多い。

【0034】

本発明のある実施形態によれば、内臓痛は、根底にある歯科的または医学的原因の非存在下での口腔粘膜の灼熱感を特徴とする、過敏性腸症候群または口腔灼熱症候群などの胃腸障害によって引き起こされる。これはまた、機能性および器質性消化不良、麻薬性腸症候群、ＩＢＤ、結腸癌、慢性膵炎、憩室炎、虫垂炎、卵巣嚢胞にも当てはまる。

【0035】

内臓痛は、様々な心理的ストレス状態（急性および慢性）において増加することが知られている。

【0036】

急性部分拘束ストレスは、内臓感受性を増加（過敏症）させ、また感受性の閾値を減少（異痛症）させる。

【0037】

本発明のある実施形態によれば、本発明におけるＬ．ラクティス株は、内臓痛が心理的ストレス事象および/または不安に関連する場合に有用である。心理的ストレス事象および／または不安のモデルは、急性部分拘束ストレス（ＰＲＳ）である。

【0038】

ＰＲＳは、軽度の非潰瘍性モデル（Ｗｉｌｌｉａｍｓら、１９８７）と考えられ、エチルエーテルによる浅麻酔下で動物の体の動きを制限することからなる。このために、動物の前肢上部は、２時間の間、動物の体の動きを制限するために胸幹までテープで留められる。次いで、ラットをホームケージに戻す。ラットでは、ＰＲＳは、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）および血漿コルチコステロン濃度の増加の両方によって反映され（Ｓｕｎら、２００６）、コルチコトロピン放出因子（ＣＲＦ）の中枢放出に関連する直腸膨張に対する内臓過敏症（Ｇｕｅら、１９９７）、および腸透過性の増加（Ａｉｔ－Ｂｅｌｇｎａｏｕｉら、２００５）に関連する。

【0039】

実際、本発明者らは、高レベルのＧＡＢＡを産生するＬ．ラクティスＮＣＤＯ２１１８が急性ストレスラットモデルにおいて内臓過敏を予防するのに対して、低レベルのＧＡＢＡを産生するＬラクティスＮＣＤＯ２７２７はそのような効果を誘導することができないことを示した。

【0040】

さらに、ＧＡＢＡを産生することができないＮＣＤＯ２１１８ΔｇａｄＢ変異株は、同じモデルにおいて内臓過敏を予防することができなかった。

【0041】

本発明の一態様では、本発明のＬ．ラクティス株は、これらの株によってもたらされる効果が、心理的ストレス事象および/または不安に関連する内臓痛の処置の１０日間、より好ましくは７日間、さらにより好ましくは５日間、最も好ましくは４日間から得られることを特徴とする。

【0042】

実際、本発明者らは、ＣＮＣＭ Ｉ－５３８８によってもたらされる有益な効果が急性ストレスに関連する内臓痛の処置の５日間から得られ、ＮＣＤＯ２１１８によってもたらされる効果がそのような処置の１０日間から得られることを示した。

【0043】

本発明の別の態様は、口腔灼熱症候群（ＢＭＳ）による内臓痛の予防および／または処置に使用するための、上で定義されるラクトコッカス・ラクティス株である。

【0044】

本発明の対象はまた、内臓痛の予防および／または処置に使用するための、特に心理的ストレス事象および/または不安に関連する内臓痛の予防および/または処置に使用するための、上で定義されるラクトコッカス・ラクティス株から得られる細胞画分である。

【0045】

この細胞画分は、特に、本発明のＬ．ラクティスの培養物から得られる細菌酵素、特にＧＡＤを含有する調製物である。培養上清またはこれらの株の画分であってもよい。細胞画分を、当業者に公知の方法に従って、調製することができる。限定されないが、これらの方法は、一般に、培養後に得られた細菌を溶解する工程と、溶解工程後に得られた全溶解物から、特に遠心分離または濾過によって、この細菌の膜を含有する画分を分離する工程とを含む。

【0046】

本発明の別の態様は、口腔灼熱症候群（ＢＭＳ）による内臓痛の予防および／または処置に使用するための、上で定義されるラクトコッカス・ラクティス株から得られる細胞画分である。

【0047】

本発明の対象はまた、内臓痛の予防および/または処置に使用するための、本発明によるラクトコッカス・ラクティス株または本発明による細胞画分と、場合により、好ましくは１０～２０ｍｇ／ｋｇ ｂｗ／日、特に１７ｍｇ／ｋｇ ｂｗ／日の量の遊離グルタミン酸とを、含む組成物である。

【0048】

本発明の組成物において、株を、生きているまたは死んでいる可能性がある、細菌全体の形態で使用することができる。あるいは、株を、細菌溶解物の形態で使用することができる。好ましくは、細菌細胞は、生きた、成長可能な細胞として存在する。

【0049】

本発明の組成物は、投与、特に、経口投与に適した任意の形態であり得る。これには、例えば、固体、半固体、液体、および粉末が含まれる。

【0050】

細菌が生細菌の形態である場合、１日当たりに与えられる組成物は、少なくとも１０^６コロニー形成単位（ｃｆｕ）のＬ．ラクティス株、好ましくは少なくとも１０^７ｃｆｕ、さらにより好ましくは少なくとも１０^８ｃｆｕ、最も好ましくは少なくとも１０^９ｃｆｕの投与を可能にする、本発明によるＬ．ラクティス株の含有量を含み得る。

【0051】

本発明の別の態様は、口腔灼熱症候群（ＢＭＳ）による内臓痛の予防および／または処置に使用するための、本発明のラクトコッカス・ラクティス株または本発明の細胞画分を含む組成物である。

【0052】

本発明の対象はまた、内臓痛を予防および／または処置する方法であって、それを必要とする哺乳動物に、治療量の、上で定義される本発明のラクトコッカス・ラクティス株または本発明の細胞画分を投与することを含む、方法である。治療量の決定は、特に本明細書で提供される詳細な開示を考慮すれば、当業者に周知である。

【0053】

本発明の対象はまた、内臓痛を予防および／または処置するための医薬を製造するための、上で定義される本発明のラクトコッカス・ラクティス株または本発明の細胞画分の使用である。

【0054】

本明細書で使用される場合、処置または予防は、とりわけ、内臓痛を予防および／または減少させることを包含する。

【0055】

本発明の組成物は、食品、例えば、食品サプリメントおよび機能性食品を含む、医薬組成物または栄養組成物であり得る。食品は、乳製品および発酵乳製品を含む。

【0056】

医薬組成物は、錠剤、カプセル剤、散剤、シロップ発泡性組成物、およびスプレー剤などの経口形態であり得る。医薬組成物はまた、舌の下に投与される舌下錠および溶液組成物、ならびに頬と歯茎との間に配置されるバッカル錠などの舌下およびバッカルの形態であってもよい。

【0057】

食品サプリメントは、食材に通常使用される化合物から製造される製品を指すが、錠剤、粉末、カプセル、ポーション、または通常は栄養物に関連しない任意の他の形態であり、健康に有益な効果を有する。

【0058】

機能性食品は、健康にも有益な効果を有する栄養物である。特に、食品サプリメントおよび機能性食品は、疾患または痛みに対して保護的または治癒的な生理学的効果を有し得る。

【0059】

組成物は、液体の形態であってもよく、または液体を乾燥させることによって得られる乾燥粉末の形態で存在してもよい。

【0060】

好ましい実施形態では、製品は新鮮な製品である。厳しい熱処理工程を経ていない新鮮な製品は、存在する細菌株が生きた形態であるという利点を有する。

【0061】

本発明者らはまた、前述の特異的能力を有する２つの新しいラクトコッカス・ラクティス株を同定した。

【0062】

したがって、本発明はまた、ラクトコッカス・ラクティス株において、株がＣＮＣＭ Ｉ－５３８８、ＣＮＣＭ Ｉ－５３８６からなる群において選択されることを特徴とする、株を提供する。

【0063】

本発明はまた、ＣＮＣＭ Ｉ－５３８８、ＣＮＣＭ Ｉ－５３８６からなる群において選択される、ラクトコッカス・ラクティス株から得られる細胞画分を包含する。

【0064】

本発明はまた、上で定義されるラクトコッカス・ラクティス株または上で定義される細胞画分を含む、組成物を提供する。

【0065】

組成物は、組成物の乾燥重量グラム当たり、少なくとも１０^６コロニー形成単位（ｃｆｕ）、好ましくは少なくとも１０^７ｃｆｕ、より好ましくは少なくとも１０^８ｃｆｕ、最も好ましくは少なくとも１０^９ｃｆｕを含み得る。

【0066】

上で定義される組成物は、上で定義される食品を含む、医薬組成物または栄養組成物であり得る。

【0067】

組成物は、液体の形態であってもよく、または液体を乾燥させることによって得られる乾燥粉末の形態で存在してもよい。

【0068】

好ましい実施形態では、製品は新鮮な製品である。

【0069】

本発明の対象は、上で定義されるラクトコッカス・ラクティス株または細胞画分と、薬学的に許容されるビヒクルとを含む医薬組成物に関し、場合により、組成物は遊離グルタミン酸も含む。

【0070】

本発明のある実施形態では、上で定義される組成物は、医薬として使用するためのものである。医薬の製剤は、スプレー剤または錠剤の形態で、局所処置が舌の下で融解することを可能にするように適合される。

【0071】

組成物は、内臓痛の予防および／または処置に特に有用である。

【0072】

本発明はさらに、上で定義される内臓痛を予防および／または処置するための処置方法であって、ラクトコッカス・ラクティス株もしくは細胞画分または上で定義される組成物を個体に投与することを含む、方法に関する。

【0073】

本発明はまた、上で定義される内臓痛の予防および／または処置のための医薬品を調製するための、場合により遊離グルタミン酸と会合した、本発明のラクトコッカス・ラクティス株または細胞画分に関する。

【0074】

本発明は、内臓痛を軽減するための本発明におけるＬ．ラクティス株の能力を示す実施例、および添付の図面を参照する以下のさらなる説明から、より明確に理解されるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0075】

【図1】異なる株におけるｇａｄクラスターの構成を示す。

【図2】遊離グルタミン酸（８ｇ／Ｌ）、アルギニン（５ｇ／Ｌ）、グルコース（４５ｇ／Ｌ）、およびＮａＣｌ（３００ｍＭ）を補充したＭ１７中での、Ｌ．ラクティスＮＣＤＯ２１１８（四角）、ＣＮＣＭ Ｉ－５３８８（ダイヤモンド）、ＣＮＣＭ Ｉ－５３８６（三角）、またはＮＣＤＯ２７２７（丸）の増殖中のＧＡＢＡ産生（ｍＭ）（Ａ）およびバイオマス（ｇ／Ｌ）の発生（Ｂ）を示す。独立した二連（黒塗り記号：第１の実験、白抜き記号：第２の実験）。

【図3】ＣＲＤのすべての膨張圧（１５～６０ｍｍＨｇ）でのビヒクル処置ラットのＰＲＳ誘発性結腸直腸感受性に対する遊離グルタミン酸（食餌中２ｍｇ、およびＬラクティスと同時投与された２ｍｇ）の１０日間経口投与の効果を示す。データを平均±ＳＥＭ（「ビヒクル」群（白抜き四角、破線）についてｎ＝１０；「ＰＲＳ＋ビヒクル」群（黒四角、実線）についてｎ＝１０；「ビヒクル＋遊離グルタミン酸」群（黒丸、破線）についてｎ＝１１；「ＰＲＳ＋ビヒクル＋遊離グルタミン酸」群（黒丸、実線）についてｎ＝１１）として表す。ビヒクルで処置した動物の基礎値に対して^＊Ｐ＜０．０５；^＊＊Ｐ＜０．０１；^＊＊＊Ｐ＜０．００１。

【図4】ＣＲＤのすべての膨張圧（１５～６０ｍｍＨｇ）でのＰＲＳ誘発性内臓過敏に対するＬ．ラクティスＮＣＤＯ２１１８およびＬ．ラクティスＮＣＤＯ２７２７の１０日間経口投与の効果を示す。データを平均±ＳＥＭ（「ビヒクル」群（白四角、破線）および「ＰＲＳ＋ビヒクル」群（黒四角、実線）についてｎ＝９；「ＰＲＳ＋ＮＣＤＯ２１１８＋遊離グルタミン酸」群（黒三角、実線）についてｎ＝１２；「ＰＲＳ＋ＮＣＤＯ２７２７＋遊離グルタミン酸」群（黒星、実線）についてｎ＝８）として表す。ビヒクルで処置した動物の基礎値に対して^＊＊＊Ｐ＜０．００１。ビヒクルで処置したストレス負荷動物の値に対して＋Ｐ＜０．０５；＋＋Ｐ＜０．０１。

【図5】ＣＲＤのすべての膨張圧（１５～６０ｍｍＨｇ）でのＰＲＳ誘発性内臓過敏に対するＬ．ラクティスＮＣＤＯ２１１８およびＬ．ラクティスＣＮＣＭ Ｉ－５３８８の５日間または１０日間経口投与の効果を示す。Ａ．Ｌ．ラクティスＮＣＤＯ２１１８を用いて５日目に得られた結果．データを平均±ＳＥＭ（「ビヒクル」群（白四角、破線）についてｎ＝１１、「ＰＲＳ＋ビヒクル」群（黒四角、実線）についてｎ＝１１、および「ＰＲＳ＋ＮＣＤＯ２１１８＋遊離グルタミン酸」群（黒三角、実線）についてｎ＝１１）として表す。^＊＊Ｐ＜０．０１は、ビヒクルで処置した動物の基礎値に対して有意に異なる。Ｂ．Ｌ．ラクティスＣＮＣＭ Ｉ－５３８８を用いて５日目に得られた結果。データを平均±ＳＥＭ（「ビヒクル」群（白四角、破線）についてｎ＝７；「ＰＲＳ＋ビヒクル」群（黒四角、実線）についてｎ＝７；「ＰＲＳ＋ＣＮＣＭ Ｉ－５３８８」群（黒/白ダイヤモンド、一点鎖線）、および「ＰＲＳ＋ＣＮＣＭ Ｉ－５３８８＋遊離グルタミン酸」（黒ダイヤモンド、実線）についてｎ＝７）として表す。ビヒクルで処置した動物の基礎値に対して^＊Ｐ＜０．０５；^＊＊Ｐ＜０．０１、Ｃ．Ｌ．ラクティスＮＣＤＯ２１１８を用いて１０日目に得られた結果。データを平均±ＳＥＭ（「ビヒクル」群（白四角、実線）についてｎ＝９；「ＰＲＳ＋ビヒクル」群（黒四角、実線）についてｎ＝９；「ＰＲＳ＋ＮＣＤＯ２１１８＋遊離グルタミン酸」群（黒三角、実線）についてｎ＝１２；「ＰＲＳ＋ＮＣＤＯ２１１８」群（黒／白三角形、一点鎖線）についてｎ＝８）として表すビヒクルで処置した動物の基礎値に対して^＊＊＊Ｐ＜０．００１。ビヒクルで処置したストレス負荷動物の値に対して^＋Ｐ＜０．０５；^＋＋Ｐ＜０．０１。Ｄ．Ｌ．ラクティスＣＮＣＭ Ｉ－５３８８を用いて１０日目に得られた結果。データを平均±ＳＥＭ（「ビヒクル」群（白四角、破線）についてｎ＝７；「ＰＲＳ＋ビヒクル」群（黒四角、実線）についてｎ＝７；「ＰＲＳ＋ＣＮＣＭ Ｉ－５３８８」群（黒/白ダイヤモンド、一点鎖線）についてｎ＝８、および「ＰＲＳ＋ＣＮＣＭ Ｉ－５３８８＋遊離グルタミン酸」（黒ダイヤモンド、実線）についてｎ＝７として表す。ビヒクルで処置した動物の基礎値に対して^＊＊Ｐ＜０．０１。ビヒクルで処置したストレス負荷動物の値に対して^＋Ｐ＜０．０５。

【図6】ＣＲＤのすべての膨張圧（１５～６０ｍｍＨｇ）でのＰＲＳ誘発性内臓過敏に対するＧＡＢＡ産生Ｌ．ラクティスＮＣＤＯ２１１８および非ＧＡＢＡ産生ＮＣＤＯ２１１８ΔｇａｄＢ変異体（１０^９ｃｆｕ／日）の効果を示す。データを平均±ＳＥＭ（「ビヒクル」群（白四角、破線）および「ＰＲＳ＋ビヒクル」群（黒四角、実線）についてｎ＝１３；「ＰＲＳ＋ＮＣＤＯ２１１８＋遊離グルタミン酸」群（黒三角、実線）についてｎ＝１４；「ＰＲＳ＋ＮＣＤＯ２１１８ΔｇａｄＢ＋遊離グルタミン酸」（逆三角、一点鎖線）群についてｎ＝１３）として表す。ビヒクルで処置した動物の基礎値に対して^＊＊Ｐ＜０．０１；^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。ビヒクルで処置したストレス負荷動物の値に対して^＋＋Ｐ＜０．０１；^＋＋＋Ｐ＜０．００１ＮＣＤＯ２１１８で処置したストレス負荷動物の値に対して＄Ｐ＜０．０５。

【図7】ＣＲＤのすべての膨張圧（１５～６０ｍｍＨｇ）でのＰＲＳ誘発性内臓過敏に対するＬ．ラクティスＣＮＣＭ Ｉ－５３８８の５日間または１０日間経口投与の効果を示す。Ａ．Ｌ．ラクティスＣＮＣＭ Ｉ－５３８８を用いて５日目に得られた結果．データを平均±ＳＥＭ（「ビヒクル」群（白四角、破線）についてｎ＝１０、「ＰＲＳ＋ビヒクル」群（黒四角、実線）についてｎ＝１０、「ＰＲＳ＋ＣＮＣＭ Ｉ－５３８８」群（白輪、実線）についてｎ＝１０、「ＰＲＳ＋ＣＮＣＭ Ｉ－５３８８＋遊離グルタミン酸」群（黒輪、実線）についてｎ＝９、「ＰＲＳ＋ＣＮＣＭ Ｉ－５３８８＋遊離グルタミン酸＋阻害剤」群（白菱形、実線）についてｎ＝９、「ＰＲＳ＋ＣＮＣＭ Ｉ－５３８８Δｇａｄ変異体＋遊離グルタミン酸」群（黒菱形、実線）についてｎ＝９として表す。ビヒクルで処置した動物の基礎値に対して^＊Ｐ＜０．０５；^＊＊Ｐ＜０．０１；^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。ビヒクルで処置したストレス負荷動物の値に対して^＋＋＋Ｐ＜０．００１。Ｂ．Ｌ．ラクティスＣＮＣＭ Ｉ－５３８８を用いて１０日目に得られた結果。データを平均±ＳＥＭ（「ビヒクル」群（（白四角、破線）についてｎ＝１０、「ＰＲＳ＋ビヒクル」群（黒四角、実線）についてｎ＝１０、「ＰＲＳ＋ＣＮＣＭ Ｉ－５３８８」群（白輪、実線）についてｎ＝９、「ＰＲＳ＋ＣＮＣＭ Ｉ－５３８８＋遊離グルタミン酸」群（黒輪、実線）についてｎ＝９、「ＰＲＳ＋ＣＮＣＭ Ｉ－５３８８＋遊離グルタミン酸＋阻害剤」群（白菱形、実線）についてｎ＝９、「ＰＲＳ＋ＣＮＣＭ Ｉ－５３８８Δｇａｄ変異体＋遊離グルタミン酸」群（黒菱形、実線）についてｎ＝９）として表す。ビヒクルで処置した動物の基礎値に対して^＊Ｐ＜０．０５；^＊＊Ｐ＜０．０１；^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。ビヒクルで処置したストレス負荷動物の値に対して^＋Ｐ＜０．０５；^＋＋Ｐ＜０．０１。

【実施例】

【0076】

実施例１：目的の細菌懸濁液の生理学的特徴付け

【0077】

１．材料および方法：
１．１．細菌株、培地および培養条件：
データセットは、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティスに属する４つの株から構成される。２つの株、ＮＣＤＯ２１１８およびＮＣＤＯ２７２７は野菜から単離されたが、ＣＮＣＭ Ｉ－５３８８およびＣＮＣＭ Ｉ－５３８６は、乳製品由来である（それぞれ生乳および乳清）。

【0078】

これらの株では、ＧＡＢＡ生合成に関与するｇａｄクラスターは、染色体上のｋｅｆＡ遺伝子とｒｎｈＢ遺伝子との間に位置する（図１）。ｇａｄクラスターは、オペロン制御因子、グルタミン酸／ＧＡＢＡアンチポータ、およびグルタミン酸デカルボキシラーゼをそれぞれコードする、ｇａｄＲ、ｇａｄＣ、およびｇａｄＢから構成される。ＣＮＣＭ Ｉ－５３８６を除いて、これらの株では同じクラスター構成が保持されている。実際、挿入配列ＩＳ９８１のコピーが、ｇａｄＣＢオペロンのプロモータにおいて見出されている。この挿入配列は、外向き－３５プロモータ成分を含み、天然の－１０ボックスから正しい距離でのその挿入は、プロモータの強度およびその制御を改変することができる。ｇａｄＲ、ｇａｄＣ、およびｇａｄＢ遺伝子のヌクレオチド配列は、９８％を超える同一性を有する４つの株において非常に類似している（図１）。

【0079】

細菌培養を、２ＬのＢｉｏｓｔａｔ Ｂ－プラスバイオリアクター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、Ｍｅｌｓｕｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中、５５ｍＭ（８ｇ／Ｌ）の遊離グルタミン酸、２９ｍＭ（５ｇ／Ｌ）のアルギニン、２５０ｍＭ（４５ｇ／Ｌ）のグルコース、および３００ｍＭのＮａＣｌを補充したＭ１７培地（表１）において、二連で行った。培養物を、３０℃でインキュベートした。

【0080】

【表1】

【0081】

発酵は、気相中に空気を含むが空気バブリングなしの酸素制限条件下で行った。ＫＯＨ添加によってｐＨを６．６に８時間維持し、次いでｐＨを改変し、４．６に制御した。

【0082】

培養物に、同様の培地で、三角フラスコ内で増殖させた前培養物からの細胞を接種し、指数期の間に回収し、発酵槽において５８０ｎｍで０．２５の初期光学密度（ＯＤ）を得るために濃縮した。

【0083】

細菌増殖は、５８０ｎｍでの分光光度測定によって推定した（Ｌｉｂｒａ Ｓ１１、Ｂｉｏｃｈｏｍ、１吸光度の単位は、０．３ｇ／Ｌに相当する）。

【0084】

増殖培地中のＧＡＢＡ濃度のＨＰＬＣ測定のために、試料を３０分毎に収集した。

【0085】

経口投与用の細胞試料を以下のように調製した。ｐＨ改変前に細胞を回収した（すなわち、ＮＣＤＯ２１１８およびＮＣＤＯ２７２７については７時間）。

【0086】

およそ３×１０^１１個の細胞に必要な培養体積を、５０００ｇおよび４℃で１０分間遠心分離して、細菌細胞をペレット化した。

【0087】

細胞を０．９％のＮａＣｌで２回洗浄し、１５％のグリセロールを含有する０．９％のＮａＣｌに、１０×１０^９ｃｆｕ／ｍＬの最終濃度で懸濁し、使用するまで－２０℃で保存した。

【0088】

１．２．ＧＡＢＡの抽出および定量：
培養上清または酵素アッセイの反応混合物中のＧＡＢＡ濃度を、ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ１２００ Ｓｅｒｉｅｓ、Ｗａｌｄｂｒｏｎｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって測定した。

【0089】

ＨＰＬＣの前に、４体積のメタノールを１体積の試料に添加することによって、タンパク質を沈殿させた。混合物を遠心分離し、ＨＰＬＣ分析のために上清を保持した。オルトフタルアルデヒド（ＯＰＡ）および９－フルオレニルメチル－クロロホルミエート（ＦＭＯＣ－Ｃ１）を用いて、アミノ酸を自動的に得た。誘導体を、トリエチルアミン（０．０１８％）、テトラヒドロフラン（０．３％）、およびアセトニトリルを含む酢酸緩衝液（ｐＨ７．２）の直線勾配によって、４０℃でＨｙｐｅｒｓｉｌ ＡＡ－ＯＤＳカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で分離した。ＯＰＡ誘導体については３３８ｎｍ、ＦＭＯＣ誘導体については２６２ｎｍのダイオードアレイ検出器を使用した。

【0090】

１．３．グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）の活性：
５０ｍｇの細菌細胞を、７時間の培養で回収した。細胞を、０．２％のＫＣｌで２回洗浄し、４．５ｍＭのＭｇＣｌ２、２２％のグリセロール、および１．５ｍＭのＤＴＴを含有する酢酸ナトリウム緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ４．６）に懸濁した。細胞を、超音波処理（離間した３０秒および６０秒の４サイクル、６．５ｍ／秒）によって破壊し、処理中は氷上に保持した。細胞残屑を、１０，０００ｇおよび４℃で１５分間の遠心分離によって除去した。

【0091】

上清を酵素アッセイに使用し、抽出物のタンパク質濃度を、標準としてウシ血清アルブミンを用いて、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法によって決定した。

【0092】

３０℃でインキュベートし、次いで０．５ｍＬの上清と混合した２０ｍＭのグルタミン酸ナトリウム、２ｍＭのピリドキサールリン酸（ＰＬＰ）からなる０．５ｍＬの基質溶液を用いて酵素アッセイを実現した。４時間まで３０分ごとに、１００μＬをサンプリングし、５分間煮沸させることによって不活性化して、脱カルボキシル化反応を停止させた。その後、反応混合物を、ＨＰＬＣを使用して、ＧＡＢＡの存在について分析した。

【0093】

ＧＡＤ活性を、７時間および中性ｐＨ条件で測定した。

【0094】

酵素活性の１ユニットを、本明細書では、１分および１ｍｇのタンパク質当たり、１μモルのグルタミン酸を変換した酵素の量として定義した。

【0095】

２．結果：
２．１．インビトロＧＡＢＡ産生：
ＮＣＤＯ２１１８株、ＣＮＣＭ Ｉ－５３８８株、ＣＮＣＭ Ｉ－５３８６株、およびＮＣＤＯ２７２７株について、培養全体にわたってバイオマスおよびＧＡＢＡ濃度を測定した（図２）。

【0096】

最初の８時間では、細菌ＮＣＤＯ２１１８およびＣＮＣＭ Ｉ－５３８８、ＣＮＣＭ Ｉ－５３８６は、ＮＣＤＯ２７２７と比較して、ｐＨ６．６で急速に増殖した（約０．７～０．８ｈ－１の増殖速度）。ＧＡＢＡは、すべての株について低レベルで蓄積した。次いで、８時間でｐＨを低下させ、４．６に制御し、その後増殖を停止させ、バイオマスを減少させた。この細胞生存率の低下を、プレーティングによって確認した。

【0097】

増殖停止にもかかわらず、ＮＣＤＯ２１１８株またはＣＮＣＭ Ｉ－５３８８およびＣＮＣＭ Ｉ－５３８６によるＧＡＢＡの産生は、ＧＡＢＡ産生速度の増加と共に続いた（表２）。ＣＮＣＭＩ－５３８８の最大ＧＡＢＡ濃度は、２４時間で６０ｍＭに達した。同様の結果が、バイオリアクターにおける第２の培養（独立した二連）で得られた。４０～６０ｍＭのＧＡＢＡ産生は、初期濃度の遊離グルタミン酸のバイオリアクターへの完全な生物変換に対応する。

【0098】

４つの株すべてにおけるｇａｄオペロン配列および構成の強い類似性にもかかわらず、類似の培養条件下で特徴付けられたＮＣＤＯ２７２７株のＧＡＢＡ産生パターンは非常に異なり、ＧＡＢＡ濃度は常に０．２ｍＭ未満であり（図２Ａ）、ＧＡＢＡ産生速度は低い（表２）ので、非常に少ない量のＧＡＢＡが産生された。

【0099】

【表2】

【0100】

２．２．インビトロＧＡＤ活性：
ＮＣＤＯ２１１８株では、高いＧＡＢＡ産生能と一致して高いＧＡＤ活性が得られたが、ＮＣＤＯ２７２７株では、その量が極めて低かった（表３）。ＧＡＤ活性の中間レベルをＣＮＣＭ Ｉ－５３８６株で得た一方で、非常に高い活性をＣＮＣＭＩ－５３８８株で測定した。しかしながら、７時間の中性ｐＨ条件下では、ＮＣＤＯ２１１８株、ＣＮＣＭ Ｉ－５３８８、またはＣＮＣＭ Ｉ－５３８６のＧＡＤ活性は、バイオリアクターに蓄積したＧＡＢＡ産生が低かったにもかかわらず、高かったことに注目することができ、ＧＡＢＡ産生のための酵素装置は細胞内で既に発現されているが、まだ活性ではなかったことを示唆している。

【0101】

【表3】

【0102】

実施例２：ラットのストレスモデル（モデルＩＢＳ）における目的のＬ．ラクティス株の効果

【0103】

１．材料および方法：
１．１．動物および外科的手順：
成体雌Ｗｉｓｔａｒラット（２００～２２５ｇ）をＪａｎｖｉｅｒ Ｌａｂｓ（Ｌｅ Ｇｅｎｅｓｔ Ｓｔ Ｉｓｌｅ、Ｆｒａｎｃｅ）から購入し、標準条件下（温度２２±２℃および１２時間の明/暗サイクル）でポリプロピレンケージに個別に収容した。動物には、水および食物（標準ペレット２０１６、Ｅｎｖｉｇｏ ＲＭＳ ＳＡＲＬ、Ｇａｎｎａｔ、Ｆｒａｎｃｅ）を自由に摂取させた。すべての実験は、欧州指令２０１０／６３／ＵＥに従い、Ｌｏｃａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された。

【0104】

０．６ｍｇ／ｋｇのアセプロマジン（ｃａｌｍｉｖｅｔ、Ｖｅｔｏｑｕｉｎｏｌ、Ｌｕｒｅ、Ｆｒａｎｃｅ）および１２０ｍｇ／ｋｇのケタミン（Ｉｍａｌｇｅｎｅ １０００、Ｍｅｒｉａｌ、Ｌｙｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ）の腹腔内投与による全身麻酔下で、以前に記載された技法（Ｍｏｒｔｅａｕら、１９９４）に従って、腹部横紋筋電図検査（ＥＭＧ）のために動物を調製した。

【0105】

３対のＮｉＣｒワイヤ電極（長さ６０ｃｍおよび直径８０μｍ）を正中線から横方向に２ｃｍで横紋筋に両側移植した。電極の自由端を頸部後方に露出させ、皮膚に取り付けられたガラス管によって保護した。

【0106】

１．２．結腸直腸膨張手順およびＥＭＧ記録：
雌ラットは、その環境への慣れを達成するために、結腸直腸膨張（ＣＲＤ）の前の数日間、移動、逃避、または方向転換ができないポリプロピレントンネル（長さ２０ｃｍおよび直径７ｃｍ）内にいることに慣れさせた。

【0107】

塞栓除去プローブ（Ｆｏｇａｒｔｙ）から採取した硬質カテーテルに固定した長さ４ｃｍのラテックスバルーンを使用した。

【0108】

機械刺激であるＣＲＤは、肛門から１ｃｍの直腸にバルーンを挿入した後に行った。チューブを尾部の根元に固定した。結腸の等圧膨張を、バルーンをＤｉｓｔｅｎｄｅｒ Ｓｅｒｉｅｓ ＩＩＲ バロスタット（Ｇ＆Ｊ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ Ｉｎｃ、Ｔｏｒｏｎｔｏ、Ｃａｎａｄａ）に接続することによって、０ｍｍＨｇ～６０ｍｍＨｇで行った。

【0109】

最初の膨張を１５ｍｍＨｇの圧力で実施し、１５ｍｍＨｇの増分を、６０ｍｍＨｇの最大圧力に達するまで、その後の各工程で加え、各膨張工程を５分間続けた。

【0110】

腹部痙攣に関連する横紋筋スパイクバーストを、低周波信号（３Ｈｚ未満）を除去するために短い時定数（０．０３秒）を使用して、移植した電極から脳波計（Ｍｉｎｉ ＶＩＩＩ、Ａｌｖａｒ、Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）で記録した。ＥＭＧ記録は、手術の７日後に開始した。

【0111】

５分間の収縮回数は内臓痛の強さを表す。

【0112】

１．３．ストレス手順：
概日リズムの影響を最小限に抑えるために、すべてのストレスセッションを同じ時間帯（午前１０時～正午１２時）に行った。

【0113】

急性ストレスの比較的軽度の非潰瘍性モデルである部分拘束ストレス（ＰＲＳ）を、以前に記載されたように行った（Ｗｉｌｌｉａｍｓら、１９８８）。

【0114】

雌ラットをジエチルエーテルで鎮静させ、前肩、前肢上部、および胸幹を紙テープの閉じ込めハーネスで包み、体の動きを制限したが妨げなかった。

【0115】

次いで、動物をホームケージに２時間入れた。

【0116】

１．４．実験プロトコル：
強制経口投与による１０日間の処置に基づいて、４つの一連の実験を、各シリーズについて、ＥＭＧを備えた７～１２匹の雌ラットからなる３つの群を使用して行った。

【0117】

ラットに、１０日間にわたって１日１回、強制投与によってＬ．ラクティスＮＣＤＯ２１１８またはＮＣＤＯ２７２７を与えた。ラットに最初に投与したＧＡＢＡの量を最小限に抑えるために、洗浄した細菌細胞（１０^９ｃｆｕ／日）を使用した。特に明記しない限り、インビボでのＧＡＢＡ産生を促進するために、遊離グルタミン酸（０．２％（ｗ／ｖ））を強制投与の混合物に添加した。

【0118】

すべての条件について、ＣＲＤに対する基礎腹部反応を処置の９日目に記録し、ＣＲＤに対するＰＲＳ誘発性内臓過敏を処置の１０日目に記録した。

【0119】

２時間のＰＲＳセッションの２０分後に、ＣＲＤ測定を行った。

【0120】

ビヒクル処置動物では、遊離グルタミン酸（０．２％（ｍ／ｖ））は、基礎およびストレス誘発性結腸直腸感受性にそれ自体影響を及ぼさないことが確認されている。

【0121】

１．５．統計的方法：
動物実験については、データを平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として報告する。統計分析については、ソフトウェアＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６．０（ＧｒａｐｈＰａｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用した。一元配置ＡＮＯＶＡ、続いてＴｕｋｅｙの多重比較検定を行って、異なる動物群間でデータを比較した。統計学的有意性は、Ｐ＜０．０５で認めた。

【0122】

２．結果：
２．１．基礎およびストレス誘発性結腸直腸感受性に対する遊離グルタミン酸の効果
基礎条件下（すなわち、ＰＲＳの前）で、ビヒクルで処置したラットでは、漸進的な結腸直腸膨張（ＣＲＤ）は、圧力依存的に腹部収縮の頻度を増加させた（図３）。

【0123】

ビヒクルと比較して、遊離グルタミン酸の投与は、ＣＲＤに対する腹部応答に影響を及ぼさなかった（図３）。

【0124】

ビヒクル処置ラットでは、２時間のＰＲＳは、基礎条件と比較して腹部収縮の数を有意に増加させた。遊離グルタミン酸の投与は、ＰＲＳセッション後に測定されたＣＲＤに対する内臓過敏応答を変化させなかった（図３）。

【0125】

したがって、遊離グルタミン酸は、基礎およびストレス誘発性結腸直腸感受性にそれ自体影響を及ぼさなかった。

【0126】

２．２．内臓過敏に対するＬ．ラクティスＮＣＤＯ２１１８の効果
ＣＲＤに対するストレス誘発性内臓過敏に対するＬ．ラクティスＮＣＤＯ２１１８およびＮＣＤＯ２７２７の影響を図４に示す。

【0127】

ビヒクル処置ラットでは、２時間のＰＲＳは、３０ｍｍＨｇから適用されたすべての膨張圧について、基礎条件と比較して腹部収縮の数を有意に増加させた（Ｐ＜０．００１、図４）。

【0128】

重要なことに、Ｌ．ラクティスＮＣＤＯ２１１８の１０日間の経口投与は、腹部収縮のＰＲＳ誘発性増強を抑制し（６０ｍｍＨｇの膨張圧についてはＰ＜０．０１、図４）、ＣＲＤに対する準基礎感受性を回復させた。

【0129】

対照的に、Ｌ．ラクティスＮＣＤＯ２７２７の経口投与は、ストレス誘発性内臓過敏に影響を及ぼさなかった（図４）。

【0130】

結論として、急性拘束ストレスは、ラットにおいて膨張に対する結腸過敏を誘発し、この過敏表現型は、１０日間の毎日の経口投与（１０^９ｃｆｕ／日）後に、Ｌ．ラクティスＮＣＤＯ２１１８によっては反転したが、Ｌ．ラクティスＮＣＤＯ２７２７によっては反転しなかった。

【0131】

実施例３：Ｌ．ラクティスＮＣＤＯ２１１８によるストレス誘発性内臓過敏の予防は、インビボでＧＡＢＡを送達する能力によるものである

【0132】

１．材料および方法：
１．１．細菌株
ＮＣＤＯ２１１８およびＮＣＤＯ２７２７株を使用した。

【0133】

Ｌ．ラクティスＮＣＤＯ２１１８ΔｇａｄＢを、染色体における二重交差によって構築した。

【0134】

ＧＡＢＡ経路を遮断するために、ＧＡＤをコードする遺伝子ｇａｄＢを欠失させた。

【0135】

ＮＣＤＯ２１１８染色体をマトリックスとして、それぞれｇａｄＢコード配列のすぐ上流および下流で、８２９および９８１ｂｐの２つの断片をＰＣＲ増幅した。プライマーを表４に列挙する。２つの断片を、オーバーラップＰＣＲによって融合した。ｐＧｈｏｓｔ９ベクターをＰＣＲ増幅し、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリ法（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｇ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して、融合断片に連結した。得られたプラスミドを配列決定によって確認し、Ｌ．ラクティスＮＣＤＯ２１１８に導入した。次いで、ｇａｄＢの染色体欠失を、以前に記載されたように二重交差によって得た（Ｍａｇｕｉｎら、１９９６）。染色体へのｇａｄＢ配列の欠失を、ＰＣＲによって確認した。

【0136】

株の培養条件は、実施例１に記載したものと同じである。

【0137】

【表4】

【0138】

１．２．ｇａｄオペロンの配列解析：
ＮＣＤＯ２１１８株において、ＮＣＢＩ－ＧｅｎＢａｎｋデータベースに受託番号ＣＰ００９０５４で寄託されている染色体配列から、ｇａｄオペロン配列を抽出した。

【0139】

ＮＣＤＯ２７２７株のｇａｄオペロンを増幅するために、２つのプライマー、ＧａｄＳｅｑ＿Ｆ（５’－ＴＣＣＡＧＡＡＡＴＡＡＣＡＧＣＴＡＣＡＴＴＧＡＣＡＴＡＡＴＧ－３’）およびＧａｄＳｅｑ＿Ｒ（５’－ＴＡＡＣＡＧＣＣＣＣＡＴＴＡＴＣＴＡＡＧＡＴＴＡＣＴＣＣ－３’）を使用した。Ｑ５ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）を使用し、製造業者の推奨に従って、２５μＬの反応混合物中に、２０ｎｇのゲノムＤＮＡを用いて増幅を行った。ＰＣＲ条件は、９８℃で３分間の初期変性工程、続いて９８℃で１０秒間、６４℃で３０秒間、および７２℃で３分間の３０サイクル、ならびに７２℃で２分間の最終伸長工程からなった。

【0140】

次いで、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（ＱＩＡｇｅｎ）を使用して、アンプリコンを精製した。

【0141】

配列は、表５に列挙したプライマーのセットを用いてＥｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓによって実施した。オペロンの配列は、ＮＣＢＩ－ＧｅｎＢａｎｋデータベースに受託番号ＭＫ２２５５７７で寄託されている。

【0142】

ｇａｄオペロンの配列を、Ｂｌａｓｔアラインメントアルゴリズムによって比較した。

【0143】

【表5】

【0144】

２．結果：
この欠失により、同じ培養条件下で、変異体は野生型と同様に増殖することができた（増殖速度０．６５ｈ^－１）。しかしながら、これらの条件下では、ＧＡＢＡは産生されず（２４時間で０．２９ｍＭ未満）、７時間でＧＡＤ活性は検出されなかった。

【0145】

ストレス誘発性内臓過敏に対するＬ．ラクティスＮＣＤＯ２１１８処置の有益な効果（Ｐ＜０．００１）は、動物がＮＣＤＯ２１１８ΔｇａｄＢ同質遺伝子株（図６、ＮＣＤＯ２１１８ΔｇａｄＢ－対ＮＣＤＯ２１１８処置動物でＰ＜０．０５）を受けた場合に反転した。

【0146】

実施例４：ラットのストレスモデル（モデルＩＢＳ）において、目的のＬ．ラクティス株を用いて内臓過敏に対して得られた効果の比較

【0147】

１．材料および方法：
動物の調製は、実施例２に記載したものと同じである。

【0148】

ラットに、４日間または９日間にわたって１日１回、強制投与によってＬ．ラクティスＮＣＤＯ２１１８またはＣＮＣＭ Ｉ－ｕ５３８８を与えた。ラットに最初に投与したＧＡＢＡの量を最小限に抑えるために、洗浄した細菌細胞（１０^９ｆｆｕ／日）を使用した。特に明記しない限り、インビボでのＧＡＢＡ産生を促進するために、遊離グルタミン酸（０．２％（ｗ／ｖ））を強制投与の混合物に添加した。

【0149】

２．結果：
ＣＲＤに対するストレス誘発性内臓過敏に対するＬ．ラクティスＮＣＤＯ２１１８、ＣＮＣＭ Ｉ－５３８８、およびＣＮＣＭ Ｉ－５３８８Δｇａｄの経時的な影響を図５および図７に示す。

【0150】

グルタミン酸の存在下で、ＣＮＣＭＩ－５３８８およびＮＣＤＯ２１１８は、ストレスに対する内臓過敏を軽減する。

【0151】

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【0152】

【数1】

【0153】

【数2】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図5C】

【図5D】

【図6】

【図7】

【配列表】

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【国際調査報告】