(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-04-26
(54)【発明の名称】抗－ＦＧＦ１９抗体
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20220419BHJP
C07K 16/22 20060101ALI20220419BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220419BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20220419BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20220419BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13 ZNA
C07K16/22
A61P35/00
A61P43/00 111
A61K39/395 D
A61K39/395 E
A61K39/395 N
A61K39/395 T
A61P43/00 105
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021544899
(86)(22)【出願日】2020-02-02
(85)【翻訳文提出日】2021-09-29
(86)【国際出願番号】 CN2020074154
(87)【国際公開番号】W WO2020156539
(87)【国際公開日】2020-08-06
(31)【優先権主張番号】PCT/CN2019/074530
(32)【優先日】2019-02-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】517106833
【氏名又は名称】フアフイ ヘルス リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＨＵＡＨＵＩ ＨＥＡＬＴＨ ＬＴＤ．
(74)【代理人】
【識別番号】110001896
【氏名又は名称】特許業務法人朝日奈特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】スイ、ジャンフア
(72)【発明者】
【氏名】リウ、フイシ
【テーマコード（参考）】
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C085AA13
4C085AA14
4C085BB11
4C085BB31
4C085BB41
4C085BB43
4C085CC03
4C085CC31
4C085DD62
4C085EE01
4C085GG02
4C085GG06
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA72
4H045FA74
4H045GA26
(57)【要約】
線維芽細胞増殖因子１９（ＦＧＦ１９）のＮ－末端を選択的に標的化する抗－ＦＧＦ１９抗体およびその抗原結合断片が提供される。また、上記抗体の組成物および使用、ならびに抗－ＦＧＦ１９抗体を投与することにより、異常なＦＧＦ１９－ＦＧＦＲ４シグナル伝達により引き起こされるかまたはそれに関連する疾患または障害、例えばがんを治療する方法が提供される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号３のアミノ酸配列または１個または２個のアミノ酸置換を含むその変異体を有するＨＣＤＲ１、配列番号４のアミノ酸配列または１個または２個のアミノ酸置換を含むその変異体を有するＨＣＤＲ２、
配列番号１９のアミノ酸配列または１個または２個のアミノ酸置換を含むその変異体を有するＨＣＤＲ３
を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；および
配列番号６のアミノ酸配列または１個または２個のアミノ酸置換を含むその変異体を有するＬＣＤＲ１、
配列番号７のアミノ酸配列または１個または２個のアミノ酸置換を含むその変異体を有するＬＣＤＲ２、
配列番号１４のアミノ酸配列または１個または２個のアミノ酸置換を含むその変異体を有するＬＣＤＲ３
を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）
を含むヒト線維芽細胞増殖因子１９（ＦＧＦ１９）に結合する抗体またはその抗原結合断片。
【請求項2】
（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、配列番号４のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２、
配列番号１９のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３
を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；および
配列番号６のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、
配列番号７のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２、
配列番号１４のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３
を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；
（ｂ）配列番号３のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、
配列番号４のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２、
配列番号１３のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３
を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；および
配列番号６のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、
配列番号７のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２、
配列番号１４のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３
を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；または
（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、
配列番号４のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２、
配列番号５のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３
を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；および
配列番号６のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、
配列番号７のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２、
配列番号８のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３
を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；
を含む請求項１記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項3】
配列番号９、１５または２０のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメインを含む請求項１または２記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項4】
配列番号１０、１６または２１のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインを含む請求項１または２記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項5】
（ａ）配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン、および配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン；（ｂ）配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン、および配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン；または
（ｃ）配列番号２０のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン、および配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン
を含む請求項１または２記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項6】
（ａ）配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、および配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；（ｂ）配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、および配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；または
（ｃ）配列番号２０のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、および配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン
を含む請求項１または２記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項7】
配列番号１１、１７または２２のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメインを含む請求項１または２記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項8】
配列番号１２、１８または２３のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインを含む請求項１または２記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項9】
（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン、および配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン；（ｂ）配列番号１７のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン、および配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン；または
（ｃ）配列番号２２のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン、および配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン
を含む請求項１または２記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項10】
（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、および配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；（ｂ）配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、および配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；または
（ｃ）配列番号２２のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、および配列番号２３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン
を含む請求項１または２記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項11】
抗原結合断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）またはジスルフィド安定化Ｆｖ（ｄｓＦｖ）である請求項１～１０のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項12】
抗体またはその抗原結合断片が、以下の特徴：（ｉ）ヒトＦＧＦ１９に表面プラズモン共鳴（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ）または同様の技術で測定された場合に約１×１０-9Ｍ～約１×１０-12ＭのＫD値で結合する；（ii）カニクイザルＦＧＦ１９と交差反応する；（iii）ヒトＦＧＦ１９のヒトＦＧＦＲ４および／またはヒトＦＧＦＲ４－ＫＬＢ複合体への結合を阻止する；（iv）ＦＧＦ１９誘導細胞増殖を抑制する；（ｖ）ＦＧＦ－抑制ＣＹＰ７Ａ１発現に影響を与えないかまたはごくわずかに影響する；および（vi）ＦＧＦ１９維持胆汁酸恒常性を損なわないまたはわずかに損なう、の少なくとも一つを有する請求項１～１１のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項13】
請求項１～１０のいずれか１項に記載の抗体の同じエピトープに結合する抗体またはその抗原結合断片であって、抗体またはその抗原結合断片が、以下の特徴：（ｉ）ヒトＦＧＦ１９に表面プラズモン共鳴（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ）または同様の技術で測定された場合に約１×１０-9Ｍ～約１×１０-12ＭのＫD値で結合する；（ii）カニクイザルＦＧＦ１９と交差反応する；（iii）ヒトＦＧＦ１９のヒトＦＧＦＲ４および／またはヒトＦＧＦＲ４－ＫＬＢ複合体への結合を阻止する；（iv）ＦＧＦ１９誘導細胞増殖を抑制する；（ｖ）ＦＧＦ－抑制ＣＹＰ７Ａ１発現に影響を与えないかまたはごくわずかに影響する；および（vi）ＦＧＦ１９維持胆汁酸恒常性を損なわないまたはわずかに損なう、の少なくとも一つを有する抗体またはその抗原結合断片。
【請求項14】
請求項１～１０のいずれか１項に記載の抗体とヒトＦＧＦ１９への結合について競争する抗体またはその抗原結合断片であって、抗体またはその抗原結合断片が、以下の特徴：（ｉ）ヒトＦＧＦ１９に表面プラズモン共鳴（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ）または同様の技術で測定された場合に約１×１０-9Ｍ～約１×１０-12ＭのＫD値で結合する；（ii）カニクイザルＦＧＦ１９と交差反応する；（iii）ヒトＦＧＦ１９のヒトＦＧＦＲ４および／またはヒトＦＧＦＲ４－ＫＬＢ複合体への結合を阻止する；（iv）ＦＧＦ１９誘導細胞増殖を抑制する；（ｖ）ＦＧＦ－抑制ＣＹＰ７Ａ１発現に影響を与えないかまたはごくわずかに影響する；および（vi）ＦＧＦ１９維持胆汁酸恒常性を損なわないまたはわずかに損なう、の少なくとも一つを有する抗体またはその抗原結合断片。
【請求項15】
エピトープがヒトＦＧＦ１９（配列番号１）の以下の残基：Ｗ３８、Ｄ４０、Ｐ４１、Ｉ４２、Ｒ４３、Ｌ４４、Ｒ４５の少なくとも１個を含む請求項１３記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項16】
エピトープがヒトＦＧＦ１９（配列番号１）の次の領域：アミノ酸３８～４５位を含む請求項１３記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項17】
請求項１～１６のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合断片をコードするヌクレオチドを含む単離された核酸分子。
【請求項18】
請求項１～１６のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合断片、および薬学的に許容され得る賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項19】
異常なＦＧＦ１９－ＦＧＦＲ４シグナル伝達により引き起こされるかまたはそれに関連する疾患または障害の予防または治療方法であって、それを必要とする対象に、治療に有効な量の請求項１～１６のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合断片または請求項１８記載の医薬組成物を投与することを含む方法。
【請求項20】
異常なＦＧＦ１９－ＦＧＦＲ４シグナル伝達により引き起こされるかまたはそれに関連する疾患または障害の再発を予防するための方法であって、それを必要とする対象に、治療に有効な量の請求項１～１６のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合断片または請求項１８記載の医薬組成物を投与することを含む方法。
【請求項21】
疾患または障害が、異常なＦＧＦ１９－ＦＧＦＲ４シグナル伝達により引き起こされるかまたはそれに関連するがんである請求項１９または２０記載の方法。
【請求項22】
がんが肝細胞癌腫（ＨＣＣ）である請求項２１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
線維芽細胞増殖因子１９（ＦＧＦ１９）、具体的にはＦＧＦ１９のＮ末端の抗体のエピトープを含む主要な残基、に結合する抗体およびその抗原結合断片が本明細書に開示される。また、本明細書において、上記抗体の組成物および使用、ならびに、抗－ＦＧＦ１９抗体を投与することにより異常なＦＧＦ１９－ＦＧＦＲ４シグナル伝達により引き起こされるかまたはそれに関連する疾患または障害、例えばがんを治療する方法が提供される。
【背景技術】
【0002】
線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）は、線虫からヒトまで生命体の発達において多様な機能を有するタンパク質のファミリーである。多くの正常な発達過程および生理学的過程において、ＦＧＦ－ＦＧＦＲ（ＦＧＦ受容体）シグナル伝達は非常に重要であり、その調節異常は腫瘍の発生および進行において重要な役割を有し得るということが見出された（非特許文献１）。
【0003】
ヒトにおいては、線維芽細胞増殖因子１９（ＦＧＦ１９）は、胆汁酸生合成のための必須酵素であるコレステロール－７－ａ－ヒドロキシラーゼ１（ＣＹＰ７Ａ１）をコードする遺伝子の肝臓での転写を抑制するために、肝細胞発現ＦＧＦ受容体４（ＦＧＦＲ４）およびβ－クロソ（klotho）（ＫＬＢ）を結合することにより胆汁酸の代謝を調節するために機能する胆汁酸誘導および回腸由来ペプチド増殖因子である（非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５）。その胆汁酸制御機能に加え、ＦＧＦ１９およびその同種受容体ＦＧＦ４Ｒは両方、隣接する非腫瘍組織と比較して腫瘍において高度に発現されているということが臨床観察により証明された（非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８、非特許文献９、非特許文献２、非特許文献１０、非特許文献１１）。
【0004】
ＦＧＦ１９は、すべての肝臓がん症例のおよそ９０％を占める肝臓がんの最も一般的な種類である、肝細胞癌腫（ＨＣＣ）の発症におけるドライバー遺伝子であると提唱されていた（非特許文献１２）。肝臓がんは、世界的に６番目に多く診断されるがんであるが、世界的にがん関連死が３番目に多い症例として位置づけられている（非特許文献１３）。いくつかの臨床研究は、ＨＣＣは、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）１９の高度に局限化された増幅を特徴付けるということを示している（非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８、非特許文献９）。ＦＧＦ１９および／またはＦＧＦＲ４の高い発現は、腫瘍の進行を促進することが見出され、ＨＣＣ患者の予後不良を予測することも可能であった（非特許文献１４、非特許文献１５）。トランスジェニックマウスにおいて、ＦＧＦ１９の過剰発現は肝細胞異形成、新生物および最終的にはＨＣＣを引き起こすが（非特許文献１６）、これはＦＧＦＲ４ノックアウトマウスにおいては見られず（was abolished）（非特許文献１７）、したがって、異常なＦＧＦ１９／ＦＧＦＲ４シグナル伝達の腫瘍発生活性を機序的に確認することは、潜在的ながん治療としてＦＧＦ１９／ＦＧＦＲ４経路を標的化する拮抗薬の開発の理論的基礎を提供する。しかしながら、ＨＣＣの治療のために開発中であるいくつかの選択的ＦＧＦＲ４阻害剤は、臨床前動物モデルまたは初期ヒト臨床試験のいずれかにおいて胆汁酸合成および肝毒性の増加をもたらした（非特許文献１８、非特許文献１９、非特許文献２０、非特許文献２１、非特許文献２２）。ＨＣＣを治療するための治療標的としてＦＧＦ１９を直接標的化する薬物の開発に努力がなされ、中和抗－ＦＧＦ１９抗体が得られた（特許文献１Genentech, Inc）。この抗－ＦＧＦ１９抗体（１Ａ６）の治療は、ＦＧＦ１９を過剰発現するマウスがＨＣＣを発症するのを防ぎ、またそのような治療は、マウスにおけるＨＣＣ異種移植片の増殖も抑制した（非特許文献６、非特許文献１０）。しかし残念なことに、毒性試験においてヒト化１Ａ６抗体のカニクイザルへの投与は、ＣＹＰ７Ａ１の肝臓での転写を増加し、胆汁酸合成を上昇させ、したがって、劇的に胆汁酸代謝が変化し、体重減少、ひどい下痢、および摂餌量の低下などの重篤な用量依存性の副作用を引き起こす（非特許文献２３）。胆汁酸代謝の制御におけるＦＧＦ１９の役割を考慮すれば、ＦＧＦを標的とする抗体は、この点でその正常な生理学的機能を損なう恐れがあり、受け入れがたい副作用をもたらす。これらの事実を考慮すると、抗体によるＦＧＦ１９を標的とする臨床的治療は、そのような副作用に対処する必要があるであろう。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】国際公開第２００７１３６８９３号
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】Turner N, Grose R. Nature Reviews Cancer, 2010, 10(2): 116, https://www.nature.com/articles/nrc2780
【非特許文献2】M. H. Xie et al., Cytokine 11, 729-735 (1999)
【非特許文献3】J. A. Holt et al., Genes & development 17, 1581-1591 (2003)
【非特許文献4】H. Kurosu et al., The Journal of biological chemistry 282, 26687-26695 (2007)
【非特許文献5】B. C. Lin et al., The Journal of biological chemistry 282, 27277-27284 (2007)
【非特許文献6】E. T. Sawey et al., Cancer Cell 19, 347-358 (2011)
【非特許文献7】K. Wang et al., Hepatology 58, 706-717 (2013)
【非特許文献8】S. M. Ahn et al., Hepatology 60, 1972-1982 (2014)
【非特許文献9】K. Schulze et al., Nat Genet 47, 505-511 (2015)
【非特許文献10】L. R. Desnoyers et al., Oncogene 27, 85-97 (2008)
【非特許文献11】Y. Li et al., Oncotarget, (2016)
【非特許文献12】J. M. Llovet et al., Nat Rev Dis Primers 2, 16018 (2016)
【非特許文献13】F. Bray et al., CA Cancer J Clin 68, 394-424 (2018)
【非特許文献14】S. Miura et al., BMC Cancer12, 56 (2012)
【非特許文献15】J. Hyeon, S. Ahn, J. J. Lee, D. H. Song, C. K. Park, Digestive diseases and sciences 58, 1916-1922 (2013)
【非特許文献16】K. Nicholes et al., Am J Pathol 160, 2295-2307 (2002)
【非特許文献17】D. M. French et al., PLoS One 7, e36713 (2012)
【非特許文献18】M. Hagel et al., Cancer Discov 5, 424-437 (2015)
【非特許文献19】R. Kim et al., European Journal of Cancer 69, S41 (2016)
【非特許文献20】S. L. Chan et al., Cancer research 77, CT106-CT106 (2017)
【非特許文献21】J. J. Joshi et al., Cancer research 77, 6999-7013 (2017)
【非特許文献22】B. Ruggeri et al., Cancer research 77, 1234-1234 (2017)
【非特許文献23】R. Pai et al., Toxicological sciences: an official journal of the Society of Toxicology 126, 446-456 (2012)
【発明の概要】
【0007】
本発明は、ＦＧＦ１９のＮ－末端を特異的に標的化する抗－ＦＧＦ１９抗体を提供することにより、その要求を満たすものである。これはＦＧＦ１９の正常な胆汁酸制御機能に悪影響は及ぼすことなく抗－ＨＣＣ治療として高い有効性を示す。
【0008】
科学出版物、特許出願公報および特許公報を含むすべての参考文献は、すべての目的のためにその存在が本明細書に組み込まれる。
【0009】
本発明は、一つにはＦＧＦ１９上、具体的にはＦＧＦ１９のＮ－末端の新しい結合領域の発見、およびＨＣＣに対して強い抗腫瘍活性を示し、かつＦＧＦ１９のＮ－末端の該結合領域に特異的に結合することにより胆汁酸の合成のＦＧＦ１９による調節に影響を与えない望ましい安全性を有する抗－ＦＧＦ１９抗体の同定に基づく。それにより、本発明はＦＧＦ１９のＮ－末端上の治療的可能性のある新しい標的と、また異常なＦＧＦ１９／ＦＧＦＲ４シグナル伝達に関連するかまたはそれにより引き起こされる病的状態、具体的にはＨＣＣを含むがこれに限定されるものではない異常なＦＧＦ１９／ＦＧＦＲ４シグナル伝達に関連するかまたはそれにより引き起こされるがんの診断、予防、治療および／または予後のための上記標的に特異的に結合する抗体も提供する。また、その抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸配列を含む核酸分子、発現ベクターおよび宿主細胞も提供される。本発明はまた、ＦＧＦ１９／ＦＧＦＲ４シグナル伝達経路のモジュレーションに関連した医薬組成物、方法、キット、製品および医薬用途も提供する。
【0010】
第一の態様において、本開示は、ヒト線維芽細胞増殖因子１９（ＦＧＦ１９）に結合し、その結合がＦＧＦ１９のＮ－末端に依存する単離された抗体またはその抗原結合断片を提供する。一実施態様において、本願の抗体または抗原結合断片は、配列番号１の３８～４５位のアミノ酸残基に位置するエピトープに結合する。より具体的には、そのエピトープは、ヒトＦＧＦ１９（配列番号１）の次の残基：Ｗ３８、Ｄ４０、Ｐ４１、Ｉ４２、Ｒ４３、Ｌ４４、Ｒ４５の少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個を含む。別の実施態様において、本願の抗体または抗原結合断片は、配列番号１の３８～４５位のアミノ酸残基およびヒトＦＧＦ１９（配列番号１）の次の残基：Ｅ８１、Ｐ１６１、Ｌ１６９の少なくとも１個からなるエピトープに結合する。さらなる実施態様において、抗体またはその抗原結合断片は、次の特徴：（ｉ）ヒトＦＧＦ１９に表面プラズモン共鳴（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ）または同様の技術で測定された場合に約１×１０-9Ｍ～約１×１０-12ＭのＫD値で結合する；（ii）カニクイザルＦＧＦ１９と交差反応する；（iii）ヒトＦＧＦ１９のヒトＦＧＦＲ４および／またはヒトＦＧＦＲ４－ＫＬＢ複合体への結合を阻止する；（iv）ＦＧＦ１９誘導細胞増殖を抑制する；（ｖ）ＦＧＦ－抑制ＣＹＰ７Ａ１発現に影響を与えないかまたはごくわずかに影響する；および（vi）ＦＧＦ１９維持胆汁酸恒常性を損なわないまたはわずかに損なう、の少なくとも一つを有する。
【0011】
第一の態様のもう一つの実施態様において、本願の抗－ＦＧＦ１９抗体または抗原結合断片は、配列番号３、４、５、１３または１９のアミノ酸配列または１個または複数の保存的置換を含むその変異体を含む少なくとも１、２、または３個の重鎖可変（ＶＨ）ドメイン相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。もう一つの実施態様において、本願の抗－ＦＧＦ１９抗体またはその抗原結合断片は、配列番号６、７、８または１４のアミノ酸配列または１個または複数の保存的置換を含むその変異体を含む少なくとも１、２、３個の軽鎖可変（ＶＬ）ドメインＣＤＲを含む。もう一つの実施態様において、本願の抗－ＦＧＦ１９抗体または抗原結合断片は、配列番号３、４、５、１３または１９のアミノ酸配列または１個または複数の保存的置換を含むその変異体を含む少なくとも１、２または３個の重鎖可変（ＶＨ）ドメインＣＤＲと、配列番号６、７、８または１４のアミノ酸配列または１個または複数の保存的置換を含むその変異体を含む少なくとも１、２、または３個の軽鎖可変（ＶＬ）ドメインＣＤＲとを含む。さらなる実施態様において、抗体またはその抗原結合断片は、次の特徴：（ｉ）ヒトＦＧＦ１９に表面プラズモン共鳴（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ）または同様の技術で測定された場合に約１×１０-9Ｍ～約１×１０-12ＭのＫD値で結合する；（ii）カニクイザルＦＧＦ１９と交差反応する；（iii）ヒトＦＧＦ１９のヒトＦＧＦＲ４および／またはヒトＦＧＦＲ４－ＫＬＢ複合体への結合を阻止する；（iv）ＦＧＦ１９誘導細胞増殖を抑制する；（ｖ）ＦＧＦ－抑制ＣＹＰ７Ａ１発現に影響を与えないかまたはごくわずかに影響する；および（vi）ＦＧＦ１９維持胆汁酸恒常性を損なわないまたはわずかに損なう、の少なくとも一つを有する。
【0012】
一実施態様において、本願の抗－ＦＧＦ１９抗体またはその抗原結合断片は、（ａ）配列番号３のアミノ酸配列または１個または複数の保存的置換を含むその変異体を有するＨＣＤＲ１（重鎖相補性決定領域１）、配列番号４のアミノ酸配列または１個または複数の保存的置換を含むその変異体を有するＨＣＤＲ２、および配列番号５、配列番号１３、配列番号１９のアミノ酸配列または１個または複数の保存的置換を含むその変異体を有するＨＣＤＲ３を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメイン；および／または（ｂ）配列番号６のアミノ酸配列または１個または複数の保存的置換を含むその変異体を有するＬＣＤＲ１（軽鎖相補性決定領域１）、配列番号７のアミノ酸配列または１個または複数の保存的置換を含むその変異体を有するＬＣＤＲ２、および配列番号８、配列番号１４のアミノ酸配列または１個または複数の保存的置換を含むその変異体を有するＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含む。
【0013】
一実施態様において、本願の抗－ＦＧＦ１９抗体またはその抗原結合断片は、（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、配列番号４のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２、および配列番号５、配列番号１３、または配列番号１９のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメイン；および／または（ｂ）配列番号６のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、配列番号７のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２、および配列番号８、または配列番号１４のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含む。
【0014】
一実施態様において、本願の抗－ＦＧＦ１９抗体またはその抗原結合断片は、（ａ）配列番号３のアミノ酸配列または１個または複数の保存的置換を含むその変異体を有するＨＣＤＲ１、配列番号４のアミノ酸配列または１個または複数の保存的置換を含むその変異体を有するＨＣＤＲ２、および配列番号５のアミノ酸配列または１個または複数の保存的置換を含むその変異体を有するＨＣＤＲ３を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメイン；および／または（ｂ）配列番号６のアミノ酸配列または１個または複数の保存的置換を含むその変異体を有するＬＣＤＲ１、配列番号７のアミノ酸配列または１個または複数の保存的置換を含むその変異体を有するＬＣＤＲ２、および配列番号８のアミノ酸配列または１個または複数の保存的置換を含むその変異体を有するＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含む。より具体的な実施態様において、本願の抗－ＦＧＦ１９抗体またはその抗原結合断片は、（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、配列番号４のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２、および配列番号５のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメイン；および／または（ｂ）配列番号６のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、配列番号７のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２、および配列番号８のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含む。
【0015】
一実施態様において、本願の抗－ＦＧＦ１９抗体またはその抗原結合断片は、（ａ）配列番号３のアミノ酸配列または１個または複数の保存的置換を含むその変異体を有するＨＣＤＲ１、配列番号４のアミノ酸配列または１個または複数の保存的置換を含むその変異体を有するＨＣＤＲ２、および配列番号１３のアミノ酸配列または１個または複数の保存的置換を含むその変異体を有するＨＣＤＲ３を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメイン；および／または（ｂ）配列番号６のアミノ酸配列または１個または複数の保存的置換を含むその変異体を有するＬＣＤＲ１、配列番号７のアミノ酸配列または１個または複数の保存的置換を含むその変異体を有するＬＣＤＲ２、および配列番号１４のアミノ酸配列または１個または複数の保存的置換を含むその変異体を有するＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含む。より具体的な実施態様において、本願の抗－ＦＧＦ１９抗体またはその抗原結合断片は、（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、配列番号４のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２、および配列番号１３のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメイン；および／または（ｂ）配列番号６のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、配列番号７のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２、および配列番号１４のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含む。
【0016】
一実施態様において、本願の抗－ＦＧＦ１９抗体またはその抗原結合断片は、（ａ）配列番号３のアミノ酸配列または１個または複数の保存的置換を含むその変異体を有するＨＣＤＲ１、配列番号４のアミノ酸配列または１個または複数の保存的置換を含むその変異体を有するＨＣＤＲ２、および配列番号１９のアミノ酸配列または１個または複数の保存的置換を含むその変異体を有するＨＣＤＲ３を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメイン；および／または（ｂ）配列番号６のアミノ酸配列または１個または複数の保存的置換を含むその変異体を有するＬＣＤＲ１、配列番号７のアミノ酸配列または１個または複数の保存的置換を含むその変異体を有するＬＣＤＲ２、および配列番号１４のアミノ酸配列または１個または複数の保存的置換を含むその変異体を有するＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含む。より具体的な実施態様において、本願の抗－ＦＧＦ１９抗体またはその抗原結合断片は、（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、配列番号４のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２、および配列番号１９のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメイン；および／または（ｂ）配列番号６のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、配列番号７のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２、および配列番号１４のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含む。
【0017】
一つの好ましい実施態様において、本願の抗－ＦＧＦ１９抗体またはその抗原結合断片は、配列番号９、１５または２０のアミノ酸配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一性を有する重鎖可変ドメイン；および／または配列番号１０、１６または２１のアミノ酸配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一性を有する軽鎖可変ドメインを含む。一つの好ましい実施態様において、本願の抗－ＦＧＦ１９抗体またはその抗原結合断片は、配列番号９、１５または２０のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン；および／または配列番号１０、１６または２１のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを含む。
【0018】
一つの好ましい実施態様において、本願の抗－ＦＧＦ１９抗体またはその抗原結合断片は、（ａ）配列番号９のアミノ酸配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一性を有する重鎖可変ドメイン、および／または配列番号１０のアミノ酸配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一性を有する軽鎖可変ドメイン；（ｂ）配列番号１５のアミノ酸配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一性を有する重鎖可変ドメイン、および／または配列番号１６のアミノ酸配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一性を有する軽鎖可変ドメイン；または（ｃ）配列番号２０のアミノ酸配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一性を有する重鎖可変ドメイン、および／または配列番号２１のアミノ酸配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一性を有する軽鎖可変ドメインを含む。一つの好ましい実施態様において、本願の抗－ＦＧＦ１９抗体またはその抗原結合断片は、（ａ）配列番号９のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン、および／または配列番号１０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン；（ｂ）配列番号１５のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン、および／または配列番号１６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン；または（ｃ）配列番号２０のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン、および／または配列番号２１のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを含む。
【0019】
一つの好ましい実施態様において、本願の抗－ＦＧＦ１９抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１１、１７または２２のアミノ酸配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一性を有する重鎖可変ドメイン；および／または配列番号１２、１８または２３のアミノ酸配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一性を有する軽鎖可変ドメインを含む。一つの好ましい実施態様において、本願の抗－ＦＧＦ１９抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１１、１７または２２のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン；および／または配列番号１２、１８または２３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを含む。
【0020】
一つの好ましい実施態様において、本願の抗－ＦＧＦ１９抗体またはその抗原結合断片は、（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一性を有する重鎖可変ドメイン、および／または配列番号１２のアミノ酸配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一性を有する軽鎖可変ドメイン；（ｂ）配列番号１７のアミノ酸配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一性を有する重鎖可変ドメイン、および／または配列番号１８のアミノ酸配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一性を有する軽鎖可変ドメイン；または（ｃ）配列番号２２のアミノ酸配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一性を有する重鎖可変ドメイン、および／または配列番号２３のアミノ酸配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一性を有する軽鎖可変ドメインを含む。一つの好ましい実施態様において、本願の抗－ＦＧＦ１９抗体またはその抗原結合断片は、（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン、および／または配列番号１２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン；（ｂ）配列番号１７のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン、および／または配列番号１８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン；または（ｃ）配列番号２２のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン、および／または配列番号２３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを含む。
【0021】
一実施態様において、本願は、ヒトＦＧＦ１９への結合について、配列番号３のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、配列番号４のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２、および配列番号５のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメイン；および配列番号６のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、配列番号７のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２、および配列番号８のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含む抗体と競争する抗－ＦＧＦ１９抗体またはその抗原結合断片を提供する。より具体的な実施態様において、本願は、ヒトＦＧＦ１９への結合について、配列番号９のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインおよび配列番号１０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを含む抗体と競争する抗－ＦＧＦ１９抗体またはその抗原結合断片を提供する。より好ましくは、該抗体またはその抗原結合断片は、次の特徴：（ｉ）ヒトＦＧＦ１９に表面プラズモン共鳴（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ）または同様の技術で測定された場合に約１×１０-9Ｍ～約１×１０-12ＭのＫD値で結合する；（ii）カニクイザルＦＧＦ１９と交差反応する；（iii）ヒトＦＧＦ１９のヒトＦＧＦＲ４および／またはヒトＦＧＦＲ４－ＫＬＢ複合体への結合を阻止する；（iv）ＦＧＦ１９誘導細胞増殖を抑制する；（ｖ）ＦＧＦ－抑制ＣＹＰ７Ａ１発現に影響を与えないかまたはごくわずかに影響する；および（vi）ＦＧＦ１９維持胆汁酸恒常性を損なわないまたはわずかに損なう、の少なくとも一つを有する。
【0022】
一実施態様において、本願は、ヒトＦＧＦ１９への結合について、配列番号３のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、配列番号４のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２、および配列番号１３のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメイン；および配列番号６のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、配列番号７のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２、および配列番号１４のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含む抗体と競争する抗－ＦＧＦ１９抗体または抗原結合断片を提供する。より具体的な実施態様において、本願は、ヒトＦＧＦ１９への結合について、配列番号１５のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインおよび配列番号１６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを含む抗体と競争する抗－ＦＧＦ１９抗体または抗原結合断片を提供する。より好ましくは、該抗体またはその抗原結合断片は、次の特徴：（ｉ）ヒトＦＧＦ１９に表面プラズモン共鳴（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ）または同様の技術で測定された場合に約１×１０-9Ｍ～約１×１０-12ＭのＫD値で結合する；（ii）カニクイザルＦＧＦ１９と交差反応する；（iii）ヒトＦＧＦ１９のヒトＦＧＦＲ４および／またはヒトＦＧＦＲ４－ＫＬＢ複合体への結合を阻止する；（iv）ＦＧＦ１９誘導細胞増殖を抑制する；（ｖ）ＦＧＦ－抑制ＣＹＰ７Ａ１発現に影響を与えないかまたはごくわずかに影響する；および（vi）ＦＧＦ１９維持胆汁酸恒常性を損なわないまたはわずかに損なう、の少なくとも一つを有する。
【0023】
一実施態様において、本願は、ヒトＦＧＦ１９への結合について、配列番号３のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、配列番号４のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２、および配列番号１９のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメイン；および配列番号６のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、配列番号７のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２、および配列番号１４のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含む抗体と競争する抗－ＦＧＦ１９抗体または抗原結合断片を提供する。より具体的な実施態様において、本願は、ヒトＦＧＦ１９への結合について、配列番号２０のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインおよび配列番号２１のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを含む抗体と競争する抗－ＦＧＦ１９抗体または抗原結合断片を提供する。より好ましくは、該抗体またはその抗原結合断片は、次の特徴：（ｉ）ヒトＦＧＦ１９に表面プラズモン共鳴（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ）または同様の技術で測定された場合に約１×１０-9Ｍ～約１×１０-12ＭのＫD値で結合する；（ii）カニクイザルＦＧＦ１９と交差反応する；（iii）ヒトＦＧＦ１９のヒトＦＧＦＲ４および／またはヒトＦＧＦＲ４－ＫＬＢ複合体への結合を阻止する；（iv）ＦＧＦ１９誘導細胞増殖を抑制する；（ｖ）ＦＧＦ－抑制ＣＹＰ７Ａ１発現に影響を与えないかまたはごくわずかに影響する；および（vi）ＦＧＦ１９維持胆汁酸恒常性を損なわないまたはわずかに損なう、の少なくとも一つを有する。
【0024】
一実施態様において、本願は、ヒトＦＧＦ１９への結合について、配列番号３のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、配列番号４のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２、および配列番号５のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメイン；および配列番号６のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、配列番号７のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２、および配列番号８のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含む抗体と同じヒトＦＧＦ１９のエピトープに結合する抗－ＦＧＦ１９抗体または抗原結合断片を提供する。より具体的な実施態様において、本願は、ヒトＦＧＦ１９への結合について、配列番号９のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインおよび配列番号１０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを含む抗体と同じヒトＦＧＦ１９のエピトープに結合する抗－ＦＧＦ１９抗体または抗原結合断片を提供する。より好ましくは、該抗体またはその抗原結合断片は、次の特徴：（ｉ）ヒトＦＧＦ１９に表面プラズモン共鳴（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ）または同様の技術で測定された場合に約１×１０-9Ｍ～約１×１０-12ＭのＫD値で結合する；（ii）カニクイザルＦＧＦ１９と交差反応する；（iii）ヒトＦＧＦ１９のヒトＦＧＦＲ４および／またはヒトＦＧＦＲ４－ＫＬＢ複合体への結合を阻止する；（iv）ＦＧＦ１９誘導細胞増殖を抑制する；（ｖ）ＦＧＦ－抑制ＣＹＰ７Ａ１発現に影響を与えないかまたはごくわずかに影響する；および（vi）ＦＧＦ１９維持胆汁酸恒常性を損なわないまたはわずかに損なう、の少なくとも一つを有する。
【0025】
一実施態様において、本願は、ヒトＦＧＦ１９への結合について、配列番号３のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、配列番号４のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２、および配列番号１３のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメイン；および配列番号６のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、配列番号７のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２、および配列番号１４のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含む抗体と同じヒトＦＧＦ１９のエピトープに結合する抗－ＦＧＦ１９抗体または抗原結合断片を提供する。より具体的な実施態様において、本願は、ヒトＦＧＦ１９への結合について、配列番号１５のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインおよび配列番号１６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを含む抗体と同じヒトＦＧＦ１９のエピトープに結合する抗－ＦＧＦ１９抗体または抗原結合断片を提供する。より好ましくは、該抗体またはその抗原結合断片は、次の特徴：（ｉ）ヒトＦＧＦ１９に表面プラズモン共鳴（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ）または同様の技術で測定された場合に約１×１０-9Ｍ～約１×１０-12ＭのＫD値で結合する；（ii）カニクイザルＦＧＦ１９と交差反応する；（iii）ヒトＦＧＦ１９のヒトＦＧＦＲ４および／またはヒトＦＧＦＲ４－ＫＬＢ複合体への結合を阻止する；（iv）ＦＧＦ１９誘導細胞増殖を抑制する；（ｖ）ＦＧＦ－抑制ＣＹＰ７Ａ１発現に影響を与えないかまたはごくわずかに影響する；および（vi）ＦＧＦ１９維持胆汁酸恒常性を損なわないまたはわずかに損なう、の少なくとも一つを有する。
【0026】
一実施態様において、本願は、ヒトＦＧＦ１９への結合について、配列番号３のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、配列番号４のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２、および配列番号１９のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメイン；および配列番号６のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、配列番号７のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２、および配列番号１４のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含む抗体と同じヒトＦＧＦ１９のエピトープに結合する抗－ＦＧＦ１９抗体または抗原結合断片を提供する。より具体的な実施態様において、本願は、ヒトＦＧＦ１９への結合について、配列番号２０のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインおよび配列番号２１のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを含む抗体と同じヒトＦＧＦ１９のエピトープに結合する抗－ＦＧＦ１９抗体またはその抗原結合断片を提供する。より好ましくは、該抗体またはその抗原結合断片は、次の特徴：（ｉ）ヒトＦＧＦ１９に表面プラズモン共鳴（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ）または同様の技術で測定された場合に約１×１０-9Ｍ～約１×１０-12ＭのＫD値で結合する；（ii）カニクイザルＦＧＦ１９と交差反応する；（iii）ヒトＦＧＦ１９のヒトＦＧＦＲ４および／またはヒトＦＧＦＲ４－ＫＬＢ複合体への結合を阻止する；（iv）ＦＧＦ１９誘導細胞増殖を抑制する；（ｖ）ＦＧＦ－抑制ＣＹＰ７Ａ１発現に影響を与えないかまたはごくわずかに影響する；および（vi）ＦＧＦ１９維持胆汁酸恒常性を損なわないまたはわずかに損なう、の少なくとも一つを有する。
【0027】
一実施態様において、抗－ＦＧＦ１９抗体はヒト抗体である。一実施態様において、抗－ＦＧＦ１９抗体は、ヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）である。
【0028】
一実施態様において、抗－ＦＧＦ１９抗体は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、または一本鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）である。
【0029】
一実施態様において、抗－ＦＧＦ１９抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはその変異体のサブクラスの重鎖定常領域、およびカッパまたはラムダまたはその変異体の種類の軽鎖定常領域を含む。
【0030】
一実施態様において、抗－ＦＧＦ１９抗体は、単離された抗体である。一実施態様において、抗－ＦＧＦ１９抗体は、組み換え抗体である。
【0031】
好ましい実施態様において、本願の第一の態様の本抗体または抗原結合断片は、異常なＦＧＦ１９－ＦＧＦＲ４シグナル伝達によって引き起こされるかまたはそれに関連する疾患または障害を治療するためのものであり、それを必要とする対象に投与することを含む。具体的な実施態様において、疾患または障害は、異常なＦＧＦ１９－ＦＧＦＲ４シグナル伝達により引き起こされるかまたはそれに関連するがんである。より具体的な実施態様において、がんは肝細胞癌腫（ＨＣＣ）である。
【0032】
第二の態様において、本開示は、本発明の第一の態様の抗－ＦＧＦ１９抗体または抗原結合断片、および薬学的に許容され得る賦形剤を含む組成物、例えば医薬組成物を提供する。好ましい実施態様において、医薬組成物は、治療に有効な量の抗－ＦＧＦ１９抗体または抗原結合断片を含む。
【0033】
第三の態様において、本開示は、本願の第一の態様の抗－ＦＧＦ１９抗体または抗原結合断片、または本願の第二の態様の組成物を含むキットを提供する。好ましい実施態様において、キットは、治療に有効な量の抗－ＦＧＦ１９抗体または抗原結合断片を含む。
【0034】
第四の態様において、本開示は、異常なＦＧＦ１９－ＦＧＦＲ４シグナル伝達により引き起こされるかまたはそれに関連する疾患または障害を予防または治療するための方法であって、それを必要とする対象に、治療に有効な量の本願の第一の態様の抗体または抗原結合断片、または本願の第二の態様の医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。具体的な実施態様において、疾患または障害は、異常なＦＧＦ１９－ＦＧＦＲ４シグナル伝達により引き起こされるかまたはそれに関連するがんである。より具体的な実施態様において、がんは肝細胞癌腫（ＨＣＣ）である。
【0035】
第五の態様において、本開示は、異常なＦＧＦ１９－ＦＧＦＲ４シグナル伝達により引き起こされるかまたはそれに関連する疾患または障害の再発を予防するための方法であって、それを必要とする対象に、治療に有効な量の本願の第一の態様の抗体または抗原結合断片、または本願の第二の態様の医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。具体的な実施態様において、疾患または障害は、異常なＦＧＦ１９－ＦＧＦＲ４シグナル伝達により引き起こされるかまたはそれに関連するがんである。より具体的な実施態様において、がんは肝細胞癌腫（ＨＣＣ）である。一実施態様において、疾患または障害の再発は手術後に起こる。
【0036】
第六の態様において、本開示は、本願の第一の態様の抗体または抗原結合断片、または本願の第二の態様の医薬組成物の、本明細書において説明される様々な障害または疾患を治療するための、または本明細書において説明される様々な障害または疾患の再発を予防するための使用を提供する。具体的な実施態様において、疾患または障害は、異常なＦＧＦ１９－ＦＧＦＲ４シグナル伝達により引き起こされるかまたはそれに関連する疾患または障害であり、好ましくは異常なＦＧＦ１９－ＦＧＦＲ４シグナル伝達により引き起こされるかまたはそれに関連するがんである。より具体的な実施態様において、がんは肝細胞癌腫（ＨＣＣ）である。一実施態様において、疾患または障害の再発は手術後に起こる。
【0037】
第七の態様において、本開示は、本願の第一の態様の抗体または抗原結合断片、または本願の第二の態様の医薬組成物の、本明細書において説明される様々な障害または疾患を治療するための、または本明細書において説明される様々な障害または疾患の再発を予防するための医薬の製造における使用を提供する。具体的な実施態様において、疾患または障害は、異常なＦＧＦ１９－ＦＧＦＲ４シグナル伝達により引き起こされるかまたはそれに関連する疾患または障害であり、好ましくは異常なＦＧＦ１９－ＦＧＦＲ４シグナル伝達により引き起こされるかまたはそれに関連するがんである。より具体的な実施態様において、がんは肝細胞癌腫（ＨＣＣ）である。一実施態様において、疾患または障害の再発は手術後に起こる。一実施態様において、疾患または障害の再発は手術後に起こる。
【図面の簡単な説明】
【0038】
【図1A】ＦＧＦ１９活性の仲介におけるＦＧＦ１９のＮ－末端の欠失可能な役割を示す図である。ＦＧＦ１９またはＦＧＦ１９ΔNT（ＦＧＦ１９のＮ－末端欠失変異体）のＦＧＦＲ４またはＦＧＦＲ４－ＫＬＢ複合体への結合アフィニティーが示される。Ｎ－末端欠失変異体ＦＧＦ１９ΔNTは、ＦＧＦＲ４に対して結合アフィニティーの低下を示した。ＦＧＦＲ４－ｈＦｃは、Ｂｉａｃｏｒｅにおけるセンサーチップ上にリガンドとして捕捉された。リガンドＦＧＦＲ４と検体ＦＧＦ１９またはＦＧＦ１９ΔNTとの間の相互作用は、２０μｇ／ｍｌヘパリンの存在下で測定された。検体ＦＧＦ１９およびＦＧＦ１９ΔNTは、１０００ｎＭから２倍連続希釈とした。
【図1B】ＦＧＦ１９活性の仲介におけるＦＧＦ１９のＮ－末端の欠失可能な役割を示す図である。Ｎ－末端欠失変異体ＦＧＦ１９ΔNTは、細胞増殖の誘導において活性の低下を示した。Ｈｅｐ３Ｂを、１％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭにおいて異なる濃度のＦＧＦ１９またはＦＧＦ１９ΔNTと培養した。
【図1C】ＦＧＦ１９活性の仲介におけるＦＧＦ１９のＮ－末端の欠失可能な役割を示す図である。Ｎ－末端欠失変異体ＦＧＦ１９ΔNTは、インビボでＣＰＹ７Ａ１遺伝子発現を抑制する能力を保持した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、示した治療で腹腔内注射をする前絶食とした。ＣＰＹ７Ａ１の肝臓の遺伝子発現は、ｑＰＣＲにより分析した。各治療群は３匹の雄マウスと３匹の雌マウスにより構成された。
【図2】抗体ファージディスプレイ技術を用いた抗体Ｇ１Ａ８の産生を説明する模式図である。ＦＧＦ１９のＮ－末端ペプチドまたは全長ＦＧＦ１９タンパク質は、本発明者らの大規模な非－免疫抗体ファージディスプレイ・ライブラリー（D. Li et al., A potent human neutralizing antibody Fc-dependently reduces established HBV infections. Elife 6, 2017)）に対して選択するための抗原として使用された。全長ＦＧＦ１９およびＮ－末端欠失変異体ＦＧＦ１９ΔNT両方との後のＥＬＩＳＡスクリーニングを通して、ＦＧＦ１９ΔNTよりも高いアフィニティーでＦＧＦ１９に結合する抗体が同定された。濃い灰色で陰影を付けたウェルは、明るい灰色で陰影をつけたウェルまたは白色のウェルと比較して高いアフィニティーを示す。一つの同定された抗体３１Ａ３およびそのアフィニティー向上抗体Ｇ１Ａ８の重鎖および軽鎖両方のＣＤＲ３領域のタンパク質配列が平行に示され、異なるアミノ酸に下線が付されている。
【図3A】Ｇ１Ａ８の向上された結合アフィニティーおよびより高いＮ－末端依存性を示す図である。ＳＰＲを用いた抗－ＦＧＧ１９抗体３１Ａ３またはＧ１Ａ８のＦＧＦ１９への結合の速度論分析を示す。ＦＧＦ１９は１００ｎＭから２倍連続希釈とした。
【図3B】Ｇ１Ａ８の向上された結合アフィニティーおよびより高いＮ－末端依存性を示す図である。３１Ａ３およびＧ１Ａ８両方のＦＧＦ１９への結合は、ＦＧＦ１９のＮ－末端に依存し、標的としてＦＧＦ１９またはＦＧＦ１９ΔNTを用いた場合異なる結合プロファイルによって示される。ＦＧＦ１９およびＦＧＦ１９ΔNTへの抗体の結合活性をＥＬＩＳＡにより分析した。
【図4A】Ｇ１Ａ８の特徴付けを示す図である。Ｇ１Ａ８および３１Ａ３は、ＦＧＦ１９誘導細胞増殖の阻害を示した。Ｈｅｐ３Ｂは、２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ１９と１００ｎＭの抗－ＦＧＦ１９抗体またはアイソタイプ対照抗体と共に培養した。
【図4B】Ｇ１Ａ８の特徴付けを示す図である。Ｇ１Ａ８は、ＦＧＦ１９とＦＧＦＲ５との相互作用を阻害した。抗体Ｇ１Ａ８およびアイソタイプ対照抗体は、１００ｎＭのＦＧＦＲ４－Ｆｃおよび２０μｇ／ｍｌのヘパリンと混合した。ＦＧＦＲ４のＦＧＦ１９への結合阻害は、ＥＬＩＳＡにより分析した。
【図4C】Ｇ１Ａ８の特徴付けを示す図である。Ｇ１Ａ８は、ＦＧＦ１９によりダウンレギュレーションされたマウスの肝臓ＣＹＰ７Ａ１遺伝子発現を損なわなかった。Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、示した治療で腹腔内注射をする前絶食とした。肝臓ＣＹＰ７Ａ１遺伝子発現レベルは、ｑＰＣＲにより分析した。各群は、３匹の雄マウスと３匹の雌マウスにより構成された。ＦＧＦ１９、０．１ｍｇ／ｋｇ；Ｇ１Ａ８、ＦＧＦ１９の５倍モル過剰。
【図5A】ヒト肝細胞癌腫異種移植片マウスモデルにおけるＧ１Ａ８の抗－腫瘍活性を示す図である。Ｇ１Ａ８は、腫瘍発達の初期の段階において腫瘍増殖を阻害した。ルシフェラーゼを安定的に発現するＨｅｐ３Ｂ－ルシフェラーゼは、ＮＯＤ ＳＣＩＤマウスに皮下的に（ｓ．ｃ．）注射された。マウスを、等価平均腫瘍生物発光強度に基づき群（ｎ＝６／群）に分け、２００μｇのＧ１Ａ８またはアイソタイプ対照抗体の治療を投与した。腫瘍増殖はカリパスにより測定した。
【図5B】ヒト肝細胞癌腫異種移植片マウスモデルにおけるＧ１Ａ８の抗－腫瘍活性を示す図である。Ｇ１Ａ８は、腫瘍発達の初期の段階において腫瘍増殖を阻害した。ルシフェラーゼを安定的に発現するＨｅｐ３Ｂ－ルシフェラーゼは、ＮＯＤ ＳＣＩＤマウスに皮下的に（ｓ．ｃ．）注射された。マウスを、等価平均腫瘍生物発光強度に基づき群（ｎ＝６／群）に分け、２００μｇのＧ１Ａ８またはアイソタイプ対照抗体の治療を投与した。腫瘍増殖は生物発光により測定した。
【図5C】ヒト肝細胞癌腫異種移植片マウスモデルにおけるＧ１Ａ８の抗－腫瘍活性を示す図である。Ｇ１Ａ８は、腫瘍発達の初期の段階において腫瘍増殖を阻害した。ルシフェラーゼを安定的に発現するＨｅｐ３Ｂ－ルシフェラーゼは、ＮＯＤ ＳＣＩＤマウスに皮下的に（ｓ．ｃ．）注射された。マウスを、等価平均腫瘍生物発光強度に基づき群（ｎ＝６／群）に分け、２００μｇのＧ１Ａ８またはアイソタイプ対照抗体の治療を投与した。腫瘍増殖は生物発光により測定した。
【図5D】ヒト肝細胞癌腫異種移植片マウスモデルにおけるＧ１Ａ８の抗－腫瘍活性を示す図である。Ｇ１Ａ８は、腫瘍発達の末期において腫瘍増殖を阻害した。Ｈｅｐ３Ｂ（ｓ．ｃ．）腫瘍を抱えるＮＳＧマウスを、等価平均腫瘍体積に基づき群（ｎ＝６／群）に分け、２００μｇのＧ１Ａ８またはアイソタイプ対照抗体の治療を投与した。腫瘍増殖はカリパスにより測定した。抗体治療が投与された日を矢印で記す。
【図5E】ヒト肝細胞癌腫異種移植片マウスモデルにおけるＧ１Ａ８の抗－腫瘍活性を示す図である。Ｇ１Ａ８は、腫瘍発達の末期において腫瘍増殖を阻害した。Ｈｅｐ３Ｂ（ｓ．ｃ．）腫瘍を抱えるＮＳＧマウスを、等価平均腫瘍体積に基づき群（ｎ＝６／群）に分け、２００μｇのＧ１Ａ８またはアイソタイプ対照抗体の治療を投与した。生存をカプラン・マイヤー生存分析により分析した。抗体治療が投与された日を矢印で記す。
【図6A】カニクイザルにおけるＧ１Ａ８の安全性評価を示す図である。Ｇ１Ａ８投与および動物からの試料採取のスケジュールを説明する模式図である。４匹のカニクイザルを、対照生理食塩水（灰色）またはＧ１Ａ８－ｈＩｇＧ１（黒）の静脈内（ｉ．ｖ．）投与を受ける二つの群に分けた。各群は、１匹の雄（三角）および１匹の雌（円）のサルから構成された。
【図6B】カニクイザルにおけるＧ１Ａ８の安全性評価を示す図である。カニクイザルの体重を示す。
【図6C】カニクイザルにおけるＧ１Ａ８の安全性評価を示す図である。カニクイザルの血液生化学を示す。カニクイザルの血清ＴＢＡを種々の時点で測定した。Ｇ１Ａ８または対照生理食塩水の静脈内投与の日が矢印で記された。破線および点線は、それぞれ雄および雌のカニクイザルにおける生化学パラメータの正常な参照区間を示す。
【図6D】カニクイザルにおけるＧ１Ａ８の安全性評価を示す図である。カニクイザルの血液生化学を示す。カニクイザルの血清ＴＢＩＬを種々の時点で測定した。Ｇ１Ａ８または対照生理食塩水の静脈内投与の日が矢印で記された。破線および点線は、それぞれ雄および雌のカニクイザルにおける生化学パラメータの正常な参照区間を示す。
【図6E】カニクイザルにおけるＧ１Ａ８の安全性評価を示す図である。カニクイザルの血液生化学を示す。カニクイザルの血清ＡＬＴを種々の時点で測定した。Ｇ１Ａ８または対照生理食塩水の静脈内投与の日が矢印で記された。破線および点線は、それぞれ雄および雌のカニクイザルにおける生化学パラメータの正常な参照区間を示す。
【図6F】カニクイザルにおけるＧ１Ａ８の安全性評価を示す図である。カニクイザルの血液生化学を示す。カニクイザルの血清ＡＳＴを種々の時点で測定した。Ｇ１Ａ８または対照生理食塩水の静脈内投与の日が矢印で記された。破線および点線は、それぞれ雄および雌のカニクイザルにおける生化学パラメータの正常な参照区間を示す。
【図6G】カニクイザルにおけるＧ１Ａ８の安全性評価を示す図である。胆汁酸代謝に関係する遺伝子発現を示す。カニクイザルの組織試料を、研究の終わりに採取した。肝臓において選択した遺伝子の発現をｑＰＣＲにより分析した。
【図6H】カニクイザルにおけるＧ１Ａ８の安全性評価を示す図である。胆汁酸代謝に関係する遺伝子発現を示す。カニクイザルの組織試料を、試験の終わりに採取した。い回腸において選択した遺伝子の発現をｑＰＣＲにより分析した。
【図6I】カニクイザルにおけるＧ１Ａ８の安全性評価を示す図である。胆汁酸代謝に関係する遺伝子発現を示す。カニクイザルの組織試料を、研究の終わりに採取した。い腎臓において選択した遺伝子の発現をｑＰＣＲにより分析した。
【図6J】カニクイザルにおけるＧ１Ａ８の安全性評価を示す図である。Ｇ１Ａ８の薬物動態プロファイルを示す。１日目に１０ｍｇ／ｋｇのＧ１Ａ８を投与した後のＧ１Ａ８を測定した。
【図6K】カニクイザルにおけるＧ１Ａ８の安全性評価を示す図である。Ｇ１Ａ８の薬物動態プロファイルを示す。１６日目に３０ｍｇ／ｋｇのＧ１Ａ８を投与した後のＧ１Ａ８を測定した。
【図6L】カニクイザルにおけるＧ１Ａ８の安全性評価を示す図である。Ｇ１Ａ８のカニクイザルＦＧＦ１９への結合の速度論分析を示す。カニクイザルＦＧＦ１９は、１００ｎＭから２倍連続希釈とした。
【図7A】ＦＧＦ１９－Ｇ１Ａ８複合体の構造分析を示す図である。直交視でのＦＧＦ－Ｇ１Ａ８のリボン表示を示す。ＦＧＦ１９を、灰色のＧ１Ａ８の可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）と共に、黒色で示す。ＦＧＦ１９のＮ－末端およびＣ－末端にラベルを付す。Ｇ１Ａ８Ｆａｂの定常領域をわかりやすくするために除いた。
【図7B】ＦＧＦ１９－Ｇ１Ａ８複合体の構造分析を示す図である。ＦＧＦ１９－Ｇ１Ａ８複合体の表面図を示す。構造により、一見すると完全な形状相補性がわかる。
【図7C】ＦＧＦ１９－Ｇ１Ａ８複合体の構造分析を示す図である。Ｇ１Ａ８－ＦＧＦ１９界面の詳細な図を示す。破線は水素結合を表す。
【図7D】ＦＧＦ１９－Ｇ１Ａ８複合体の構造分析を示す図である。野生型ＦＧＦ１９およびＦＧＦ１９アラニン突然変異体への５０ｎＭにおけるＧ１Ａ８の結合活性をＳＰＲを用いて分析した。
【図8A】ＨＳ２９の活性を示す図である。抗－ＦＧＦ１９抗体Ｇ１Ａ８とＨＳ２９との間のＦＧＦ１９アラニン突然変異体への結合分析はＳＰＲを用いて行った。ＦＧＦ１９アラニン突然変異体は５０ｎＭで試験した。
【図8B】ＨＳ２９の活性を示す図である。ＦＧＦ１９へのＨＳ２９の結合の速度論分析を示す。ＦＧＦ１９は、１００ｎＭから２倍連続希釈とした。
【図8C】ＨＳ２９の活性を示す図である。ＨＳ２９によるＦＧＦ１９誘導細胞増殖の阻害を示す。Ｈｅｐ３Ｂは２０ｍｇ／ｍｌのＦＧＦ１９および１００ｎＭの抗－ＦＧＦ１９抗体またはアイソタイプ対照抗体と培養した。
【図9A】患者由来異種移植片（ＰＤＸ）モデルにおけるＨＳ２９の抗－腫瘍活性の評価を示す図である。ＦＧＦ１９発現ＰＤＸ ＬＩ６６７７を有するＢＡＬＢ／ｃヌードマウスを、等価平均腫瘍体積で群（ｎ＝５／群）に分け、１０ｍｇ／ｋｇのＨＳ２９を腹腔内投与するか、または対照として治療なしとした。
【図9B】患者由来異種移植片（ＰＤＸ）モデルにおけるＨＳ２９の抗－腫瘍活性の評価を示す図である。非ＦＧＦ１９発現ＰＤＸ ＬＩ６６４６を有するＢＡＬＢ／ｃヌードマウスを、等価平均腫瘍体積で群（ｎ＝５／群）に分け、１０ｍｇ／ｋｇのＨＳ２９を腹腔内投与するか、または対照として治療なしとした。
【図9C】患者由来異種移植片（ＰＤＸ）モデルにおけるＨＳ２９の抗－腫瘍活性の評価を示す図である。ＰＤＸモデルにおけるＦＧＦ１９ｍＲＮＡ発現を示す。腫瘍試料を試験の終わりに採取し、ＦＧＦ１９の発現をｑＰＣＲで分析した。各データ点は一つのマウス腫瘍試料を表し、Ｈｅｐ３Ｂ培養細胞株のＦＧＦ１９ｍＲＮＡ発現のレベルを参照として使用した。破線はアッセイの信頼性のある検出限界を示す。
【図9D】患者由来異種移植片（ＰＤＸ）モデルにおけるＨＳ２９の抗－腫瘍活性の評価を示す図である。ＰＤＸを抱えるマウスの体重は試験のときに測定した。
【発明を実施するための形態】
【0039】
定義
本明細書の他の箇所で特に定義されていない限り、本明細書において使用されるすべての他の技術および科学用語は、この発明の属する技術における通常の知識を有する者により共通に理解される意味を有する。
本明細書の他の箇所で特に定義されていない限り、本明細書において使用されるすべての他の技術および科学用語は、この発明の属する技術における通常の知識を有する者により共通に理解される意味を有する。
【0040】
添付の特許請求の範囲を含め本明細書において使用される場合、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」などの単語の単数形は、文脈で明確に指示されていない限り、対応する複数の参照を含む。
【0041】
用語「または」は、文脈で明確に指示されていない限り、用語「および／または」を意味するために使用されるか、用語「および／または」と交換可能に使用される。
【0042】
本開示の文脈において、特段の指摘がない限り、表現「含む（comprise）」、および「含む（comprises）」および「含むこと（comprising）」などのその変形は、規定された要素、例えばアミノ酸配列、ヌクレオチド配列、性質、工程またはそれらの群の包含を暗に意味するものであり、任意の他の要素、例えばアミノ酸配列、ヌクレオチド配列、性質および工程の排除を意味するものではない。本明細書において使用される場合、用語「含む（comprise）」またはその任意の変形は、用語「含有する（contain）」、「含む（include）」または時には「有する（have）」またはその等価な変形と置き換えることができる。ある実施態様において、表現「含む（comprise）」は、「からなる（consisting of）」のシナリオをも含む。
【0043】
本明細書において使用される場合、用語「ＦＧＦ１９」は、回腸誘導ホルモン線維芽細胞増殖因子１９を意味し、それは、ＦＧＦＲ４（線維芽細胞増殖因子受容体４）に高いアフィニティーを有するリガンドである。上述したように、ＦＧＦ１９は、ＦＧＦＲ４／Ｋｌｏｔｈｏ－β受容体複合体を通して肝臓におけるＣＹＰ７Ａ１の転写を阻害することにより、とりわけ胆汁酸合成の制御において重要な役割を果たす。本願の文脈において、特段の明示がない限り、ＦＧＦ１９は、ヒトＦＧＦ１９を意味する。マウスにおけるヒトＦＧＦ１９のオルソログは、ＦＧＦ１５である。ＦＧＦ１９、例えばヒトＦＧＦ１９、のアミノ酸配列およびそれをコードするヌクレオチド配列は、本技術分野において知られている。ＦＧＦは、異なるＮ－末端およびＣ－末端に挟まれた１２個の逆平行β鎖により形成される相同コア領域を有する（A. Beenken and M. Mohammadi, Nature reviews. Drug discovery 8, 235-253 (2009)）。種々のＦＧＦのＮ－末端およびＣ－末端のうちの一次配列の変化は、それらの異なる生物活性の主な原因となる（N. Itoh and D. M. Ornitz, J Biochem 149, 121-130 (2011); R. Goetz and M. Mohammadi, Nat Rev Mol Cell Biol 14, 166-180 (2013)）。
【0044】
抗体およびその抗原結合断片
特段の明示がない限り、本明細書において使用される場合、用語「抗体」は、それがヒトＦＧＦ１９を認識しかつヒトＦＧＦ１９に結合する限り、最も広い意味で、抗体ならびに抗体断片を包含する。特に、本願の抗体は、ヒトＦＧＦ１９のＮ－末端、具体的には配列番号１のアミノ酸配列を有するＦＧＦ１９のアミノ酸残基３８～４５に結合する。本願の抗体は、一般に、単一特異性抗体を指す。しかし、本願はまた、異種特異的（異種特異性）抗体または多重特異性抗体も検討する。抗体は、特異的結合部位により特異的な抗原決定基またはエピトープに結合する。「抗体断片」は、全長抗体の一部を意味し、通常、抗原に対する結合または可変領域を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ断片；ダイアボディ（diabodies）；線状抗体（linear antibodies）；一本鎖抗体分子；および抗体断片から形成される多重特異性抗体などを挙げることができる。
特段の明示がない限り、本明細書において使用される場合、用語「抗体」は、それがヒトＦＧＦ１９を認識しかつヒトＦＧＦ１９に結合する限り、最も広い意味で、抗体ならびに抗体断片を包含する。特に、本願の抗体は、ヒトＦＧＦ１９のＮ－末端、具体的には配列番号１のアミノ酸配列を有するＦＧＦ１９のアミノ酸残基３８～４５に結合する。本願の抗体は、一般に、単一特異性抗体を指す。しかし、本願はまた、異種特異的（異種特異性）抗体または多重特異性抗体も検討する。抗体は、特異的結合部位により特異的な抗原決定基またはエピトープに結合する。「抗体断片」は、全長抗体の一部を意味し、通常、抗原に対する結合または可変領域を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ断片；ダイアボディ（diabodies）；線状抗体（linear antibodies）；一本鎖抗体分子；および抗体断片から形成される多重特異性抗体などを挙げることができる。
【0045】
最も一般的に見られる抗体の基本構造は、四量体である。各四量体は、ポリペプチド鎖の二つの同一の対を含み、各対は１個の「軽鎖」と表される小さな鎖（約２５ｋＤａ）と１個の「重鎖」と表される大きな鎖（約５０～７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端には、主に抗原認識に関与する約１００～１１０またはそれより多くのアミノ酸からなる可変ドメインを含む。重鎖の狩る母岸末端部分は、エフェクター機能に関与する定常領域と定義され得る。典型的には、ヒト抗体の軽鎖はカッパおよびラムダ軽鎖に分類される。さらに、ヒト抗体の重鎖は、典型的にはα、δ、ε、γ、またはμに分類され、抗体のアイソタイプをそれぞれＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭと、ならびにそのサブクラス、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４と定義する。各軽／重鎖の可変領域／ドメイン（ＶＬ／ＶＨ）対は抗体結合部位を形成する。それにより、完全な抗体は通常二つの結合部位を有する。
【0046】
用語「超可変ドメイン」は、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を意味する。超可変ドメインは「相補鎖決定領域（ＣＤＲ）」（すなわち、軽鎖可変ドメインにおけるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３ならびに重鎖可変ドメインにおけるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）由来のアミノ酸残基を含む。典型的には、重鎖および軽鎖両方の可変ドメインは、３つの超可変ドメイン、すなわちＣＤＲを含み、相対的に保存された「フレームワーク領域」または「ＦＲ」の間に位置する。ＣＤＲは、通常、フレームワーク領域によりアラインされ、特異的エピトープへの結合を可能にする。通常、Ｎ－末端からＣ－末端へ、軽鎖および重鎖両可変ドメインはＦＲ－１（またはＦＲ１）、ＣＤＲ－１（またはＣＤＲ１）、ＦＲ－２（ＦＲ２）、ＣＤＲ－２（ＣＤＲ２）、ＦＲ－３（ＦＲ３）、ＣＤＲ－３（ＣＤＲ３）、およびＦＲ－４（ＦＲ４）を含む。Ｋａｂａｔナンバリングシステムは、特に明記しない限り抗体のアミノ酸残基について使用される（Kabat et al., Sequence of proteins of immunological interest, 5th ed., Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, MD (1991)）。
【0047】
特に明記しない限り、「抗体断片」、「標的結合断片」および「抗原結合断片」は、本願の文脈において言い換え可能であり、全長抗体により結合される抗原（ＦＧＦ１９、または特にＦＧＦ１９のＮ－末端）に特異的に結合する能力を保持する抗体断片、例えば１個以上のＣＤＲ領域を保持する抗体断片を意味する。抗原結合断片の例としては、特に限定されるものではないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ断片；ダイアボディ（diabodies）；線状抗体（linear antibodies）；一本鎖抗体分子、例えば一本鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）；ナノボディ；および抗体断片から形成される多重特異性抗体などが挙げられる。
【0048】
「特異的結合」または「特異的に結合する」とは、抗体は、他のタンパク質と比較して特定の標的への優先的結合を示すことを意味するが、この特異性は、絶対的な結合特異性を必要としない。抗体は、その結合が、例えば、擬陽性などの望まない結果を生み出すことなく、試料中の標的タンパク質の存在を決定するものである場合、その意図する標的に対して「特異的」とみなされる。本発明の抗体またはその抗原結合断片は、標的タンパク質に、非標的タンパク質とのアフィニティーよりも、少なくとも２倍、好ましくは少なくとも１０倍、より好ましくは少なくとも２０倍、そして最も好ましくは少なくとも１００倍強いアフィニティーで結合するであろう。代替的に、または追加的に、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、その標的タンパク質に対して、１×１０-8Ｍより低い、１×１０-9Ｍ（１ｎＭ）より低い、１×１０-10Ｍより低い、１×１０-11Ｍより低い、または１×１０-12Ｍ（１ｐＭ）よりさらに低いＫＤ値により表される結合アフィニティーを有するであろう。本願の抗体は、所定のアミノ酸配列、例えば成熟したヒトＦＧＦ１９のアミノ酸配列、またはヒトＦＧＦ１９のＮ－末端残基３８～４５を含むポリペプチドに結合するが、その配列を欠いたタンパク質には結合しない場合、所定のアミノ酸配列、例えば成熟したヒトＦＧＦ１９のアミノ酸配列、またはヒトＦＧＦ１９のＮ－末端残基３８～４５を含むポリペプチドに特異的に結合すると言われる。
【0049】
本明細書において使用される場合、用語「ヒト抗体」は、ヒト免疫グロブリンタンパク質配列のみを含む抗体を意味する。ヒト抗体は、マウス、マウス細胞、またはマウス細胞由来のハイブリドーマにおいて生産される場合、マウスの炭水化物鎖を含んでもよい。同様に、「マウス抗体」または「ラット抗体」は、それぞれマウスまたはラットのみの免疫グロブリンタンパク質配列を含む抗体を意味する。
【0050】
本明細書において使用される場合、用語「モノクローナル抗体」または「ｍＡｂ」または「Ｍａｂ」は、実質的に均一な抗体の集団を指し、これは、その集団に含まれる抗体分子が、若干存在し得る起こり得る自然発生突然変異を除いてアミノ酸配列が同一であるということを意味する。「モノクローナル」とは、抗体の実質的に均一な集団から得られる物である抗体の特徴を示し、その抗体がある特定の方法により産生されることを必要とするものと解釈されるものではない。モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、本技術分野において既知の従来の方法により得ることができる。例えば、Kohler G et al., Nature 1975 256:495-497；米国特許第４，３７６，１１０号明細書；Ausubel FM et al., CURRENT PROTPCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY 1992; Harlow E et al., ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold spring Harbor Laboratory 1988；およびColligan JE et al., CURRENT PROTPCOLS IN IMMUNOLOGY 1993を参照。
【0051】
一実施態様において、ヒトＦＧＦ１９に特異的に結合する本発明の抗体は、ヒトＦＧＦ１９のカニクイザルオルソログと交差反応性も示す。本明細書において使用される場合、用語「交差反応性」は、他の種由来のホモログまたはオルソログと反応する抗体の能力を指す。抗体の交差反応性は、当技術分野において既知の任意の方法を用いて決定することができる。例えば、表面プラズモン共鳴（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ）または同様の技術（例えば、ＫｉｎＥｘａまたはＯＣＴＥＴ）による結合アフィニティーの測定により決定することができる。
【0052】
いくつかの実施態様において、本願の抗体または抗原結合断片は、ＦＧＦ１９抑制ＣＹＰ７Ａ１発現に影響しないかまたはわずかに影響する。言い換えれば、ＣＹＰ７Ａ１発現は、抗体または抗原結合断片を投与するとＦＧＦ１９によりかなり阻害される。より具体的には、ＣＹＰ７Ａ１発現レベルの変化、または具体的には増加は、ＦＧＦ１９の存在下、抗体または抗原結合断片を投与した後、５％、１０％、１５％または２０％以下である。
【0053】
いくつかの実施態様において、本願の抗体または抗原結合断片は、ＦＧＦ１９維持胆汁酸生合成を損なわないまたはわずかに損なう。安定な胆汁酸恒常性は、関連組織における胆汁酸代謝に関与する１個以上の遺伝子の転写または発現レベルをモニターすることにより決定することができる。例えば、該遺伝子は、胆汁酸トランスポータータンパク質をコードする遺伝子であり得る。測定される具体的な遺伝子は、肝臓、腎臓および／または回腸におけるＡＳＢＴ、ＩＢＡＢＰ、ＣＹＰ７Ａ１、ＮＴＣＰ、ＯＡＴＰ２、ＢＳＥＰ、ＯＳＴα、ＯＳＴβ、ＭＲＰ２、ＭＲＰ３および／またはＭＲＰ４であり得る。肝臓、腎臓および／または回腸におけるＡＳＢＴ、ＩＢＡＢＰ、ＣＹＰ７Ａ１、ＮＴＣＰ、ＯＡＴＰ２、ＢＳＥＰ、ＯＳＴα、ＯＳＴβ、ＭＲＰ２、ＭＲＰ３および／またはＭＲＰ４の１個以上の発現レベルの変化は、ＦＧＦ１９存在下、抗体または抗原結合断片を投与した後、例えば５％、１０％、１５％、または２０％以下に制限される。
【0054】
本願の抗体は、精製プロセスにかけ、望ましくない材料を除去し、精製された抗体を得ることができる。抗体を精製するための従来の方法は、本技術分野において周知のカラムクロマトグラフィー法を含むが、これに限定されるものではない。
【0055】
本発明の抗体または抗原結合断片は、単離された抗体であり得る。用語「単離された」とは、抗体または抗原結合断片は、少なくとも部分的にそれらを生産する細胞、細胞培養物、成長培地、発現系由来の他の生物学的材料または非生物学的材料を含まないということを意味する。該材料は、核酸、タンパク質、脂質、炭水化物、緩衝剤、塩、または細胞デブリおよび成長培地などの他の材料を含む。
【0056】
本願はまた、抗体または抗原結合断片がＦＧＦ１９に結合し、本明細書において説明する抗体の少なくとも一つの性質を有する限り、１個以上の保存的置換を含む抗体またはその抗原結合断片も検討する。アミノ酸の「保存的置換」は、本技術分野においてよく知られており、あるアミノ酸残基の、構造または機能において同様の側鎖を有する別のアミノ酸残基への変更を指す。例えば、保存的置換の例示的なリストを以下の表に提供する。
【0057】
本願はまた、本願の抗体またはその断片をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸配列も提供する。「単離された核酸」または「単離されたポリヌクレオチド」とは、単離されたポリヌクレオチドが天然に見出されるポリヌクレオチドの全てまたは一部から除去されるか、または単離されたポリヌクレオチドが天然には結合されていないポリヌクレオチドに結合されているＤＮＡまたはＲＮＡを意味する。特定のヌクレオチド配列を「含む（comprising）」単離された核酸分子は、その指定された配列に加え、列挙された核酸配列のコード領域を制御する動作可能に結合された調節配列を含んでもよい。コドン縮退のため、当業者は、特定のアミノ酸配列が異なるヌクレオチド配列によりコードされ得ることを理解することができる。
【0058】
治療使用
本開示は、異常なＦＧＦ１９－ＦＧＦＲ４シグナル伝達により引き起こされるかまたはそれに関連する疾患または障害の予防、治療または再発予防のための方法であって、それを必要とする対象に治療的に有効な量の本願の第一の態様の抗体または抗原結合断片、または本願の第二の態様の医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。具体的な実施態様において、疾患または障害は、異常なＦＧＦ１９－ＦＧＦＲ４シグナル伝達により引き起こされるかまたはそれに関連するがんである。より具体的な実施態様において、がんは、肝細胞癌種（ＨＣＣ）である。
本開示は、異常なＦＧＦ１９－ＦＧＦＲ４シグナル伝達により引き起こされるかまたはそれに関連する疾患または障害の予防、治療または再発予防のための方法であって、それを必要とする対象に治療的に有効な量の本願の第一の態様の抗体または抗原結合断片、または本願の第二の態様の医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。具体的な実施態様において、疾患または障害は、異常なＦＧＦ１９－ＦＧＦＲ４シグナル伝達により引き起こされるかまたはそれに関連するがんである。より具体的な実施態様において、がんは、肝細胞癌種（ＨＣＣ）である。
【0059】
本明細書において使用される場合、用語「投与（administration）」、「投与する（administering）」、「治療する（treating）」および「治療(treatment)」は、対象、例えばヒトを含む動物に、または細胞、組織、器官、または生体液に適用する場合、外因性の医薬品、治療薬、診断薬または組成物の、対象、細胞、組織、器官、または生体液への接触を意味する。細胞の治療は、試薬の細胞への接触、ならびに試薬の液体への接触（ここでその液体は細胞と接触している）を包含する。用語「投与」および「治療」はまた、インビトロおよびエクソビボ治療、例えば細胞の、試薬、診断、結合化合物または別の細胞による治療を含む。
【0060】
本明細書において使用される場合、用語「治療的に有効な量」は、疾患、または疾患または障害の少なくとも一つの臨床的症状を治療するために対象に投与する場合、疾患、障害または症状のためのそのような治療をもたらすのに十分である抗体の量を指す。「治療的に有効な量」は、抗体、疾患、障害、および／または疾患または障害の症状、疾患、障害、および／または疾患または障害の症状の重症度、治療される対象の年齢、および／または治療される対象の体重によって変化し得る。任意の事例での適切な量は、陶業差ｈに明らかであり得るか、または常法の実験により決定され得る。併用療法の場合、「治療的に有効な量」は、疾患、障害または状態の効果的な治療のための組合せ対象の総量を示す。
【0061】
本願の文脈において、「対象（subject）」とは、動物、好ましくは哺乳類、例えば霊長類、好ましくは高等霊長類、例えばヒトを指す。
【0062】
本明細書において用語「がん」または「腫瘍」は、上方調節された細胞増殖により典型的に特徴づけられる哺乳類における生理学的状態を意味するかまたは説明する。好ましい実施態様において、がんは異常なＦＧＦ１９－ＦＧＦＲ４シグナル伝達に関連付けられる。本願の抗体または抗原結合断片は、本願の抗－ＦＧＦ１９抗体が、例えば、乳がん、前立腺がん、結腸がん、肺がん、および胃がんを治療するために使用することができると考えることができる。
【実施例】
【0063】
材料および方法
以下の材料および方法が実施例において使用される。
以下の材料および方法が実施例において使用される。
【0064】
細胞株
ヒト肝細胞癌種細胞株Ｈｅｐ３Ｂは、北京大学健康科学センターのＦｅｎｇｍｉｎｇ Ｌｕ博士の研究室から贈られた。Ｈｅｐ３細胞は、１０％ウシ胎仔血清を追加したＤＭＥＭ培地（ギブコ、ＤＭＥＭ、Ｃ１１９６５５００ＢＴ）で培養された。細胞は、５％ＣＯ2雰囲気、３７℃で加湿インキュベータ内で培養された。
ヒト肝細胞癌種細胞株Ｈｅｐ３Ｂは、北京大学健康科学センターのＦｅｎｇｍｉｎｇ Ｌｕ博士の研究室から贈られた。Ｈｅｐ３細胞は、１０％ウシ胎仔血清を追加したＤＭＥＭ培地（ギブコ、ＤＭＥＭ、Ｃ１１９６５５００ＢＴ）で培養された。細胞は、５％ＣＯ2雰囲気、３７℃で加湿インキュベータ内で培養された。
【0065】
蛍ルシフェラーゼリポーター遺伝子を発現するＨｅｐ３－Ｌｕｃ２３安定細胞株は、レンチウイルス形質導入により生成され、ピューロマイシンで選択された。
【0066】
ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３－Ｆ細胞株は、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３発現培地（細胞株および培地の双方はサーモフィッシャーサイエンティフィックから）中で、３７℃、８％ＣＯ2雰囲気下、加湿されたオービタル振とう台（orbital shaker platform）において培養された。
【0067】
タンパク質の発現および精製
ヒトＦＧＦ１９（配列番号１）、およびＮ－末端欠失変異体ＦＧＦ１９ΔNT（配列番号１のＡｒｇ４３～Ｌｙｓ２１６に対応するアミノ酸配列を有する）およびＦＧＦ１９アラニン置換突然変異体を含むその変異体について、タンパク質のコード配列を、Ｃ－末端Ｈｉｓ－Ａｖｉタグを有する哺乳類細胞発現ベクターにクローニングし、これらを一時的にＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３－Ｆ細胞（フィッシャーサイエンティフィック）に、単独で、またはＥ．Ｃｏｌｉ ＢｉｒＡ ビオチン－タンパク質リガーゼのタンパク質配列をコードする発現ベクターと１：１の比率で同時トランスフェクトした。トランスフェクション後３～５日で、細胞上清を回収し、タンパク質またはビオチン化タンパク質をＮｉ－ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィー（キアゲン）を用いて精製した。
ヒトＦＧＦ１９（配列番号１）、およびＮ－末端欠失変異体ＦＧＦ１９ΔNT（配列番号１のＡｒｇ４３～Ｌｙｓ２１６に対応するアミノ酸配列を有する）およびＦＧＦ１９アラニン置換突然変異体を含むその変異体について、タンパク質のコード配列を、Ｃ－末端Ｈｉｓ－Ａｖｉタグを有する哺乳類細胞発現ベクターにクローニングし、これらを一時的にＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３－Ｆ細胞（フィッシャーサイエンティフィック）に、単独で、またはＥ．Ｃｏｌｉ ＢｉｒＡ ビオチン－タンパク質リガーゼのタンパク質配列をコードする発現ベクターと１：１の比率で同時トランスフェクトした。トランスフェクション後３～５日で、細胞上清を回収し、タンパク質またはビオチン化タンパク質をＮｉ－ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィー（キアゲン）を用いて精製した。
【0068】
全長ヒトＩｇＧ１抗体生成については、ＶＨおよびＶＬのコード配列を、ヒトＩｇＧ１重鎖（ＨＣ）哺乳細胞発現ベクターおよび軽鎖（ＬＣ）哺乳細胞発現ベクターにそれぞれクローニングした。ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３－Ｆ細胞を二つの発現ベクタープラスミド（ＨＣおよびＬＣ）により１：１の比率で一時的に同時トランスフェクトした。トランスフェクション後３～５日で、細胞培養上清を、タンパク質Ａビーズを備えたアフィニティークロマトグラフィー（ＧＥヘルスケアライフサイエンス）を用いるヒトＩｇＧ抗体の精製のために回収した。
【0069】
ＦＧＦ１９についての抗体ライブラリーのスクリーニング
ＦＧＦ１９Ｎ－末端の残基Ａｒｇ２３～Ｉｌｅ４２とそれに続くＣ末端にビオチン修飾を有する５つのアミノ酸（ＳＧＳＧＫ）を含むＦＧＦ１９Ｎ－末端ペプチド（配列番号２４）を、Ｓｃｉｌｉｇｈｔ－ｐｅｐｔｉｄｅ（北京、中国）により純度９５％超で合成した。Ｎ－末端ＦＧＦ１９ペプチドまたはビオチン化全長ＦＧＦ１９タンパク質を、標的タンパク質としてストレプトアビジン－結合磁気Ｍ－２８０ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）（サーモフィッシャーサイエンティフィック）上に捕捉し、その後、９３人の健常者ドナーの末梢血単核細胞から構築されたヒト非免疫抗体ファージディスプレイ・ライブラリー（サイズ：１．０×１０10）から調製された５×１０12ファージ－ｓｃＦｖ（可変ドメインの一本鎖断片）粒子でインキュベートした。セレクションを２ラウンド行った。第２ラウンドのセレクションについては、使用する標的タンパク質を減らし、広範な洗浄工程を適用した。従来の塩基性トリエタノールアミン溶液を用い、標的タンパク質への特異的結合を示すファージを溶離した。
ＦＧＦ１９Ｎ－末端の残基Ａｒｇ２３～Ｉｌｅ４２とそれに続くＣ末端にビオチン修飾を有する５つのアミノ酸（ＳＧＳＧＫ）を含むＦＧＦ１９Ｎ－末端ペプチド（配列番号２４）を、Ｓｃｉｌｉｇｈｔ－ｐｅｐｔｉｄｅ（北京、中国）により純度９５％超で合成した。Ｎ－末端ＦＧＦ１９ペプチドまたはビオチン化全長ＦＧＦ１９タンパク質を、標的タンパク質としてストレプトアビジン－結合磁気Ｍ－２８０ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）（サーモフィッシャーサイエンティフィック）上に捕捉し、その後、９３人の健常者ドナーの末梢血単核細胞から構築されたヒト非免疫抗体ファージディスプレイ・ライブラリー（サイズ：１．０×１０10）から調製された５×１０12ファージ－ｓｃＦｖ（可変ドメインの一本鎖断片）粒子でインキュベートした。セレクションを２ラウンド行った。第２ラウンドのセレクションについては、使用する標的タンパク質を減らし、広範な洗浄工程を適用した。従来の塩基性トリエタノールアミン溶液を用い、標的タンパク質への特異的結合を示すファージを溶離した。
【0070】
その後、単一クローンを採取し、回収して（rescue）細菌培養上清においてファージ－ｓｃＦｖｓを生成し；これらは、酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）において全長ＦＧＦ１９への結合をＦＧＦ１９のＮ－末端欠失バージョン（ＦＧＦ１９ΔNT）と比較することにより、ＦＧＦ１９のＮ－末端への特異的結合についてスクリーニングした。ＦＧＦ１９ΔNTよりも高いアフィニティーでＦＧＦ１９に結合するクローンを、ＦＧＦ１９のＮ－末端への特異的結合を有する候補として選抜し、これらのクローンの重鎖の可変領域（ＶＨ）および軽鎖の可変領域（ＶＬ）の遺伝子を配列決定した。選抜されたクローンの対応するアミノ酸配列をアラインさせて重複するクローンを排除し、それにより、さらなる特徴付けについて独自の抗体を同定した。
【0071】
アフィニティー向上のための３１Ａ３抗体サブ－ライブラリー構築およびセレクション
ＣＤＲ３－標的ランダム化を用いて抗体３１Ａ３のアフィニティーを向上させるために、３１Ａ３のＨＣＤＲ３およびＬＣＤＲ３についてのランダム変異導入法を伴うサブ－ライブラリーをＮＮＫ縮退コドンにより構築した。構築した抗体サブ－ライブラリーのサイズは１．２３×１０8であった。抗体サブ－ライブラリーセレクションおよびスクリーニングは、ＦＧＦ１９についての抗体ライブラリーのスクリーニングに関して上述したものと同様になされた。磁気ビーズから高アフィニティーヒットを得るために、３１Ａ３との競争溶出を用いた。その後、単一クローンを採取し、回収して細菌培養上清においてファージ－ｓｃＦｖｓを生成し、ＦＧＦ１９への結合についてスクリーニングした。３１Ａ３よりも高い結合アフィニティーを有するヒットのみを確保した。
ＣＤＲ３－標的ランダム化を用いて抗体３１Ａ３のアフィニティーを向上させるために、３１Ａ３のＨＣＤＲ３およびＬＣＤＲ３についてのランダム変異導入法を伴うサブ－ライブラリーをＮＮＫ縮退コドンにより構築した。構築した抗体サブ－ライブラリーのサイズは１．２３×１０8であった。抗体サブ－ライブラリーセレクションおよびスクリーニングは、ＦＧＦ１９についての抗体ライブラリーのスクリーニングに関して上述したものと同様になされた。磁気ビーズから高アフィニティーヒットを得るために、３１Ａ３との競争溶出を用いた。その後、単一クローンを採取し、回収して細菌培養上清においてファージ－ｓｃＦｖｓを生成し、ＦＧＦ１９への結合についてスクリーニングした。３１Ａ３よりも高い結合アフィニティーを有するヒットのみを確保した。
【0072】
ＥＬＩＳＡアッセイ
２μｇ／ｍＬのＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ（シグマアルドリッチ）リン酸鑑賞生理食塩水（ＰＢＳ）を、９６ウェルのＵ底プレート（ヌンク（Nunc）、ＭａｘｉＳｏｒｐ（商標））上にウェル当たり１００μＬでコートし、４℃で一晩インキュベートした。その後、ウェル当たり１００μＬで、２μｇ／ｍＬのビオチン化ＦＧＦ１９またはＦＧＦ変異体を、３０℃、０．５～１時間のインキュベーションによりプレート上に捕捉した。ＦＧＦ１９またはＦＧＦ１９変異体も９６ウェルのＵ底プレート上に直接ウェル当たり１００μＬでコートし、４℃で一晩インキュベートした。ｈＩｇＧ１抗体に基づくＥＬＩＳＡのために、２％の無脂肪乳を含むＰＢＳに３倍連続希釈された抗体をウェル当たり１００μＬ加えた。競争ＥＬＩＳＡについて、試験抗体を３倍連続希釈とし、競争相手のＦＧＦＲ４－ｈＦｃと混合した。その後、結合した抗体をＨＲＰ－共役ヤギ抗－ｈＦｃ抗体（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を用いて検出した。
２μｇ／ｍＬのＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ（シグマアルドリッチ）リン酸鑑賞生理食塩水（ＰＢＳ）を、９６ウェルのＵ底プレート（ヌンク（Nunc）、ＭａｘｉＳｏｒｐ（商標））上にウェル当たり１００μＬでコートし、４℃で一晩インキュベートした。その後、ウェル当たり１００μＬで、２μｇ／ｍＬのビオチン化ＦＧＦ１９またはＦＧＦ変異体を、３０℃、０．５～１時間のインキュベーションによりプレート上に捕捉した。ＦＧＦ１９またはＦＧＦ１９変異体も９６ウェルのＵ底プレート上に直接ウェル当たり１００μＬでコートし、４℃で一晩インキュベートした。ｈＩｇＧ１抗体に基づくＥＬＩＳＡのために、２％の無脂肪乳を含むＰＢＳに３倍連続希釈された抗体をウェル当たり１００μＬ加えた。競争ＥＬＩＳＡについて、試験抗体を３倍連続希釈とし、競争相手のＦＧＦＲ４－ｈＦｃと混合した。その後、結合した抗体をＨＲＰ－共役ヤギ抗－ｈＦｃ抗体（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を用いて検出した。
【0073】
表面プラズモン共鳴分析（ＳＰＲ）アッセイによる結合速度論分析
本願の抗－ＦＧＦ１９ヒトＩｇＧ１抗体の速度論分析は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（ＧＥヘルスケアライフサイエンス）を用いて２５℃で行われた。抗－ｈＦｃ抗体（ＧＥヘルスケアライフサイエンス）をＣＭ５センサーチップ上にアミン－結合キット（ＧＥヘルスケアライフサイエンス）を用いて固定した。本願の抗－ＦＧＦ１９ヒトＩｇＧ１抗体を、リガンドとしてセンサーチップ上に捕捉し、続いて分析物ＦＧＦ１９（１００ｎＭから２倍連続希釈で）またはＦＧＦ１９アラニン突然変異体（５０ｎＭ）を各フローセルに注入した。陰性対照としてバッファー（０．５％Ｔｗｅｅｎ２０および０．３ｍＭ ＥＤＴＡを有するＨＢＳ）の注入が供された。各結合および解離サイクル間の再生バッファーとして３Ｍ ＭｇＣｌ2を用いた。結合速度（ｋａ）、解離速度（ｋｄ）、およびアフィニティー定数（ＫＤ）を、ＢｉａｃｏｒｅＴ２００評価ソフトウェアを用いて計算した。
本願の抗－ＦＧＦ１９ヒトＩｇＧ１抗体の速度論分析は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（ＧＥヘルスケアライフサイエンス）を用いて２５℃で行われた。抗－ｈＦｃ抗体（ＧＥヘルスケアライフサイエンス）をＣＭ５センサーチップ上にアミン－結合キット（ＧＥヘルスケアライフサイエンス）を用いて固定した。本願の抗－ＦＧＦ１９ヒトＩｇＧ１抗体を、リガンドとしてセンサーチップ上に捕捉し、続いて分析物ＦＧＦ１９（１００ｎＭから２倍連続希釈で）またはＦＧＦ１９アラニン突然変異体（５０ｎＭ）を各フローセルに注入した。陰性対照としてバッファー（０．５％Ｔｗｅｅｎ２０および０．３ｍＭ ＥＤＴＡを有するＨＢＳ）の注入が供された。各結合および解離サイクル間の再生バッファーとして３Ｍ ＭｇＣｌ2を用いた。結合速度（ｋａ）、解離速度（ｋｄ）、およびアフィニティー定数（ＫＤ）を、ＢｉａｃｏｒｅＴ２００評価ソフトウェアを用いて計算した。
【0074】
細胞増殖アッセイ
ヒトＨＣＣ細胞株Ｈｅｐ３を、１％ウシ胎仔血清を補足したＤＭＥＭ中の種々の濃度のＦＧＦ１９またはＦＧＦ１９変異体で処理し、過剰な細胞増殖を誘導した。抗－ＦＧＦ１９抗体によるＦＧＦ１９－誘導細胞増殖に対する阻害活性の評価のため、１５μｇ／ｍｌ（１００ｎＭ）ｈＩｇＧ１抗体を細胞培養培地に加えた。７２時間後、細胞増殖をＣｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ－８（ドージンドーモレキュラーテクノロジーズ）を用いて製造業者の製品取扱説明書に従って測定した。
ヒトＨＣＣ細胞株Ｈｅｐ３を、１％ウシ胎仔血清を補足したＤＭＥＭ中の種々の濃度のＦＧＦ１９またはＦＧＦ１９変異体で処理し、過剰な細胞増殖を誘導した。抗－ＦＧＦ１９抗体によるＦＧＦ１９－誘導細胞増殖に対する阻害活性の評価のため、１５μｇ／ｍｌ（１００ｎＭ）ｈＩｇＧ１抗体を細胞培養培地に加えた。７２時間後、細胞増殖をＣｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ－８（ドージンドーモレキュラーテクノロジーズ）を用いて製造業者の製品取扱説明書に従って測定した。
【0075】
肝臓におけるＣＹＰ７Ａ１の発現
５～６週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスを、２μｇの（１）ＦＧＦ１９、（２）ＦＧＦ１９変異体、または（３）ＦＧＦ１９と６０μｇ抗ＦＧＦ１９抗体の腹腔内（ｉ．ｐ．）注射の前、一晩断食させた。マウスをｉ．ｐ．注射の３時間後に安楽死させ、肝臓を採取した。続くＣＹＰ７Ａ１ ｍＲＮＡ発現レベルの分析のため、肝臓の総ＲＮＡをＴＲＩｚｏｌ試薬（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を用いて抽出し、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を、Ｐｒｉｍｅ Ｓｃｒｉｐｔ ＲＴ－ＰＣＲ Ｋｉｔ（タカラ）を用いて逆転写により作成した。ＡＢＩ Ｆａｓｔ ７５００リアルタイム装置（アプライドバイオシステムズ）を用いるｑＰＣＲにより、ＣＹＰ７Ａ１ ｍＲＮＡ発現レベル（ＧＡＰＤＨと比較して）を評価した。
５～６週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスを、２μｇの（１）ＦＧＦ１９、（２）ＦＧＦ１９変異体、または（３）ＦＧＦ１９と６０μｇ抗ＦＧＦ１９抗体の腹腔内（ｉ．ｐ．）注射の前、一晩断食させた。マウスをｉ．ｐ．注射の３時間後に安楽死させ、肝臓を採取した。続くＣＹＰ７Ａ１ ｍＲＮＡ発現レベルの分析のため、肝臓の総ＲＮＡをＴＲＩｚｏｌ試薬（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を用いて抽出し、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を、Ｐｒｉｍｅ Ｓｃｒｉｐｔ ＲＴ－ＰＣＲ Ｋｉｔ（タカラ）を用いて逆転写により作成した。ＡＢＩ Ｆａｓｔ ７５００リアルタイム装置（アプライドバイオシステムズ）を用いるｑＰＣＲにより、ＣＹＰ７Ａ１ ｍＲＮＡ発現レベル（ＧＡＰＤＨと比較して）を評価した。
【0076】
動物実験
ＮＯＤ ＳＣＩＤおよびＮＳＧマウスを、抗－ＦＧＦ１９抗体の抗－腫瘍活性を評価するために用いた。６～８週齢のマウスの右側腹部に、５×１０6Ｈｅｐ３細胞（マウス当たり１００μｌ）を皮下注射した。マウスを、等価平均腫瘍生物発光強度または腫瘍体積に基づき３つの群（群当たりｎ＝６）に分け、２００μｇのＧ１Ａ８または対照ＩｇＧを週２回腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。インビボで、腫瘍を抱えるマウスの腫瘍生物発光強度を、１５ｍｇ／ｋｇのＤ－ルシフェリン（パーキンエルマー）のｉ．ｐ．注射の後、ＩＶＩＳ Ｌｕｍｉｎａ ＩＩＩ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（パーキンエルマー）を用いて測定した。腫瘍体積は電子カリパスを用いて測定し、式３．１４×Ｌ×Ｗ２／６を用いて計算した（式中、ＬおよびＷはそれぞれ最大および最小の測定された直径である）。全ての動物プロトコルは、中国の実験動物の収容および飼養のための国内ガイドラインにより実施され、ＮＩＢＳでＩＡＣＵＣよりの承認のうえ、組織の規制に従い行われた。ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスでの患者由来の異種移植片における抗体の抗－腫瘍効果を評価するための研究は、クラウンバイオサイエンス社（Crown Bioscience Inc.）で承認されたＩＡＣＵＣプロトコルのもとで実施された。
ＮＯＤ ＳＣＩＤおよびＮＳＧマウスを、抗－ＦＧＦ１９抗体の抗－腫瘍活性を評価するために用いた。６～８週齢のマウスの右側腹部に、５×１０6Ｈｅｐ３細胞（マウス当たり１００μｌ）を皮下注射した。マウスを、等価平均腫瘍生物発光強度または腫瘍体積に基づき３つの群（群当たりｎ＝６）に分け、２００μｇのＧ１Ａ８または対照ＩｇＧを週２回腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。インビボで、腫瘍を抱えるマウスの腫瘍生物発光強度を、１５ｍｇ／ｋｇのＤ－ルシフェリン（パーキンエルマー）のｉ．ｐ．注射の後、ＩＶＩＳ Ｌｕｍｉｎａ ＩＩＩ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（パーキンエルマー）を用いて測定した。腫瘍体積は電子カリパスを用いて測定し、式３．１４×Ｌ×Ｗ２／６を用いて計算した（式中、ＬおよびＷはそれぞれ最大および最小の測定された直径である）。全ての動物プロトコルは、中国の実験動物の収容および飼養のための国内ガイドラインにより実施され、ＮＩＢＳでＩＡＣＵＣよりの承認のうえ、組織の規制に従い行われた。ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスでの患者由来の異種移植片における抗体の抗－腫瘍効果を評価するための研究は、クラウンバイオサイエンス社（Crown Bioscience Inc.）で承認されたＩＡＣＵＣプロトコルのもとで実施された。
【0077】
本願の抗体、具体的には、Ｇ１Ａ８の安全性評価は、ＪＯＩＮＮ研究所（北京）において実施された。体重～３ｋｇの３～４歳の健常な実験に使われたことのないカニクイザルに、３０ｍｇ／ｋｇ体重の量でＧ１Ａ８抗体を、対照として３０ｍｇ／ｋｇ体重の量で１６日目に生理食塩水を、静脈内注射した。臨床観察、体重、体温、血液化学、および解剖病理を評価した。Ｇ１Ａ８の薬物動態分析のため、血液試料を種々の時点（１日目、８日目、１５日目、２３日目、および３０日目）で採取した。肝臓、回腸、および腎臓試料を、胆汁酸代謝に関連する遺伝子のＲＮＡ分析のための研究の終わりに採取した。
【0078】
ＦＧＦ１９－Ｇ１Ａ８複合体の結晶化および構造決定
ＦＧＦ１９およびＧ１Ａ８－Ｆａｂは、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３－Ｆ細胞において別々に発現され、Ｎｉ－ＮＴＡフローサイトメトリー（キアゲン）により独立して精製した。ＦＧＦ１９－Ｇ１Ａ８複合体を得るため、ＦＧＦ１９およびＧ１Ａ８－Ｆａｂは、１：１モル比で混合し、４℃で一晩インキュベートし、さらに、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ Ｓ２００ １０／３００カラム（ＧＥ ヘルスケア）により１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、および５００ｍＭのＮａＣｌを含むバッファーで精製した。生成したＦＧＦ１９－Ｇ１Ａ８複合体は、その後、１８ｍｇ／ｍＬに濃縮し、２０℃で、１μＬのタンパク質と、０．２Ｍの硫酸リチウム一水和物、０．１ＭのＢｉｓ－Ｔｒｉｓ ｐＨ６．９、２６％ｗ／ｖのポリエチレングリコール３３５０を含む１μＬの貯留溶液とを混合することによってハンギングドロップ上記拡散法を用いて結晶化した。四辺形形状の結晶が７日で現れた。結晶を液体窒素中で急速冷凍した。
ＦＧＦ１９およびＧ１Ａ８－Ｆａｂは、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３－Ｆ細胞において別々に発現され、Ｎｉ－ＮＴＡフローサイトメトリー（キアゲン）により独立して精製した。ＦＧＦ１９－Ｇ１Ａ８複合体を得るため、ＦＧＦ１９およびＧ１Ａ８－Ｆａｂは、１：１モル比で混合し、４℃で一晩インキュベートし、さらに、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ Ｓ２００ １０／３００カラム（ＧＥ ヘルスケア）により１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、および５００ｍＭのＮａＣｌを含むバッファーで精製した。生成したＦＧＦ１９－Ｇ１Ａ８複合体は、その後、１８ｍｇ／ｍＬに濃縮し、２０℃で、１μＬのタンパク質と、０．２Ｍの硫酸リチウム一水和物、０．１ＭのＢｉｓ－Ｔｒｉｓ ｐＨ６．９、２６％ｗ／ｖのポリエチレングリコール３３５０を含む１μＬの貯留溶液とを混合することによってハンギングドロップ上記拡散法を用いて結晶化した。四辺形形状の結晶が７日で現れた。結晶を液体窒素中で急速冷凍した。
【0079】
Ｘ線回折データを、上海シンクロトロン放射光施設（Shanghai Synchrotron Radiatin Facility）（ＳＳＲＦ）ビームラインＢＬ１７Ｕで収集した。データをＨＫＬ２０００およびＸＤＳで加工した。結晶はＰ２1２1２1空間群に属し、非対称ユニット当たりＦＧＦ１９－Ｇ１Ａ８複合体の二つのコピーを含む。構造は、サーチモデルとして次の構造：ＦＧＦ１９（ＰＤＢ ＩＤ：２Ｐ２３）および抗－ステロイドＦａｂ５Ｆ２構造（ＰＤＢ ＩＤ：３ＫＤＭ）を用いてＰｈｅｎｉｘのＰｈａｓｅｒを用いて分子置換により決定した。モデルをＣｏｏｔに反復的に構築し、ＰＨＥＮＩＸにおいて精緻化した。
【0080】
統計学的分析
すべての分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ バージョン６．００を用いて行った。通常の一元配置分散分析（one-way ANOVA）または対応のないスチューデントｔ検定を群間の比較のために使用した。二元配置分散分析（two-way ANOVA）およびチューキーの多重比較検定を連続型変数の評価のために使用した。カプラン・マイヤー生存分析およびログ・ランク検定を生存分析のために使用した。
すべての分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ バージョン６．００を用いて行った。通常の一元配置分散分析（one-way ANOVA）または対応のないスチューデントｔ検定を群間の比較のために使用した。二元配置分散分析（two-way ANOVA）およびチューキーの多重比較検定を連続型変数の評価のために使用した。カプラン・マイヤー生存分析およびログ・ランク検定を生存分析のために使用した。
【0081】
実施例１．ＦＧＦ１９のＮ－末端での結合標的の同定
本発明者らは、機能的な違いが全ＦＧＦ１９とそのＮ－末端欠失バージョンとの間に存在するかどうかを調査するために多様なアッセイを行った。
本発明者らは、機能的な違いが全ＦＧＦ１９とそのＮ－末端欠失バージョンとの間に存在するかどうかを調査するために多様なアッセイを行った。
【0082】
全長ＦＧＦ１９と比較して、ＦＧＦ１９ΔNT変異体（ＦＧＦ１９ΔNTは、配列番号１の残基Ａｒｇ４３～Ｌｙｓ２１６に相当するアミノ酸配列を有する）は、ＦＧＦＲ４に対して有意に弱い結合アフィニティーを有し、インビトロアッセイにおいて腫瘍細胞増殖を誘導するための活性に有意な低下を発揮した（図１Ａおよび図１Ｂ）。
【0083】
さらに、全長ＦＧＦ１９と上記Ｎ－末端欠失変異体ＦＧＦ１９ΔNTの胆汁酸制御機能を検査した。外因性ＦＧＦ１９が、ヒトＦＧＦＲ４と９０％のアミノ酸同一性を共有するマウス受容体ＦＧＦＲ４に結合によりその胆汁酸制御機能を発揮し、ＣＹＰ７Ａ１のマウス肝臓転写を抑制するため、この検査においてマウスモデルを使用した（M. Zhou et al., 2014, 上記; R. Goetz et al., Molecular and cellular biology 27, 3417-3428 (2007)）。ＦＧＦ１９またはＦＧＦ１９ΔNTの腹腔内注射の後、これらのマウスにおいて肝臓のＣＹＰ７Ａ１遺伝子発現レベルを評価した。統計学的な有意差は、肝臓のＣＹＰ７Ａ１遺伝子発現レベルの抑制による胆汁酸制御機能において、全長およびＮ－末端欠失変異体ＦＧＦ１９ΔNTとの間に観察されなかった（図１Ｃ）。この結果を踏まえれば、ＦＧＦ１９のＮ－末端を標的とする治療剤が潜在的にその腫瘍原生活性をその胆汁酸制御生理学的機能に悪影響を及ぼすことなく阻害できるということが合理的に期待できる。
【0084】
実施例２．ヒトＦＧＦ１９のＮ－末端を特異的に標的化する抗体の産生
配列番号１または配列番号２４を結合標的として用いる次の二つの異なるセレクション戦略が、ＦＧＦ１９のＮ－末端を特異的に標的化する抗体を同定するために設計された（図２）。抗体セレクションは、ＦＧＦ１９Ｎ－末端ペプチド（配列番号２４）または全長ＦＧＦ１９（配列番号１）のいずれかを結合標的として用いることにより実施され、大きな非免疫ヒト抗体ファージディスプレイ・ライブラリー（D. Li et al., Elife 6, 2017, 上記）が選択された。ＦＧＦ１９のＮ－末端断片と全長ＦＧＦ１９の両方に結合アフィニティーを示す抗体を次のスクリーニング工程のために選択した。
配列番号１または配列番号２４を結合標的として用いる次の二つの異なるセレクション戦略が、ＦＧＦ１９のＮ－末端を特異的に標的化する抗体を同定するために設計された（図２）。抗体セレクションは、ＦＧＦ１９Ｎ－末端ペプチド（配列番号２４）または全長ＦＧＦ１９（配列番号１）のいずれかを結合標的として用いることにより実施され、大きな非免疫ヒト抗体ファージディスプレイ・ライブラリー（D. Li et al., Elife 6, 2017, 上記）が選択された。ＦＧＦ１９のＮ－末端断片と全長ＦＧＦ１９の両方に結合アフィニティーを示す抗体を次のスクリーニング工程のために選択した。
【0085】
ＥＬＩＳＡアッセイを使用する次のスクリーニング工程において、全長ＦＧＦ１９およびＮ－末端欠失変異体ＦＧＦ１９ΔNTの両方を結合標的として使用し、全長ＦＧＦ１９に結合することができるがＦＧＦ１９ΔNTには結合できないかあるいは弱く結合する抗体を同定した。多くの同定した抗体のなかでも、相対的に高い結合アフィニティーを示し、ＦＧＦ１９のＮ－末端を特異的に認識する３１Ａ３と指定した抗体をさらなる分析のために選択した（図２および３）。
【0086】
実施例３．ＦＧＦ１９の腫瘍原生活性に対する３１Ａ３の阻害効果のインビトロ評価
インビトロでＦＧＦ１９の腫瘍原生活性を阻害する３１Ａ３の能力を評価するために抗－増殖アッセイを実施した。３１Ａ３が、ＦＧＦ１９により特異的に誘導されるＨＣＣ細胞増殖を阻害することができるかどうかを評価するために、ＨＣＣ細胞株Ｈｅｐ３を外因性ＦＧＦ１９の存在下、３１Ａ３で処理した。図４Ａに示すように、３１Ａ３は、Ｈｅｐ３細胞のＦＧＦ１９誘導性増殖を阻害した。
インビトロでＦＧＦ１９の腫瘍原生活性を阻害する３１Ａ３の能力を評価するために抗－増殖アッセイを実施した。３１Ａ３が、ＦＧＦ１９により特異的に誘導されるＨＣＣ細胞増殖を阻害することができるかどうかを評価するために、ＨＣＣ細胞株Ｈｅｐ３を外因性ＦＧＦ１９の存在下、３１Ａ３で処理した。図４Ａに示すように、３１Ａ３は、Ｈｅｐ３細胞のＦＧＦ１９誘導性増殖を阻害した。
【0087】
実施例４．向上された結合アフィニティーを有する３１Ａ３誘導突然変異体の作出
ＦＧＦ１９のＮ－末端に対する３１Ａ３のアフィニティーを向上させるために、部位特異的アラニンスキャニング突然変異誘発法を、３１Ａ３のＨＣＤＲ３およびＬＣＤＲ３領域内で行った。これは、４つのアミノ酸残基、すなわちＨＣＤＲ３のＶ９６およびＷ９７ならびにＬＣＤＲ３のＹ９１およびＴ９５が、他のアミノ酸との置換により結合アフィニティーを向上するための潜在的な候補となることを示している。本発明者らは、ついで、ＨＣＤＲ３およびＬＣＤＲ３領域の上記４つの位置で無作為突然変異を有する３１Ａ３誘導抗体を含む抗体ファージディスプレイ・ライブラリーを構築した。この３１Ａ３誘導サブライブラリーセレクションのあいだ、３１Ａ３－ｈＩｇＧ１タンパク質を、ＦＧＦ１９に対するより高い結合アフィニティーを有する結合剤を排除するための競争相手として使用した。ストリンジェントなバイオパニング選択工程の後、アフィニティーの向上した抗体の小さなパネルが得られた。結果得られた抗体の一つであるＧ１Ａ８は、３つのアミノ酸が３１Ａ３とは異なっており、親の抗体３１Ａ３よりも２７倍のアフィニティーの増加と、６０倍遅い解離速度と、より強い抗－増殖活性を示した（図２、図３Ａ、図３Ｂ、および図４Ａ）。
ＦＧＦ１９のＮ－末端に対する３１Ａ３のアフィニティーを向上させるために、部位特異的アラニンスキャニング突然変異誘発法を、３１Ａ３のＨＣＤＲ３およびＬＣＤＲ３領域内で行った。これは、４つのアミノ酸残基、すなわちＨＣＤＲ３のＶ９６およびＷ９７ならびにＬＣＤＲ３のＹ９１およびＴ９５が、他のアミノ酸との置換により結合アフィニティーを向上するための潜在的な候補となることを示している。本発明者らは、ついで、ＨＣＤＲ３およびＬＣＤＲ３領域の上記４つの位置で無作為突然変異を有する３１Ａ３誘導抗体を含む抗体ファージディスプレイ・ライブラリーを構築した。この３１Ａ３誘導サブライブラリーセレクションのあいだ、３１Ａ３－ｈＩｇＧ１タンパク質を、ＦＧＦ１９に対するより高い結合アフィニティーを有する結合剤を排除するための競争相手として使用した。ストリンジェントなバイオパニング選択工程の後、アフィニティーの向上した抗体の小さなパネルが得られた。結果得られた抗体の一つであるＧ１Ａ８は、３つのアミノ酸が３１Ａ３とは異なっており、親の抗体３１Ａ３よりも２７倍のアフィニティーの増加と、６０倍遅い解離速度と、より強い抗－増殖活性を示した（図２、図３Ａ、図３Ｂ、および図４Ａ）。
【0088】
もう一つの変異体抗体ＨＳ２９は、上記パニングから得られた抗体の小さなパネルの配列分析に基づいて作出された。ＨＳ２９は、Ｇ１Ａ８と同様の結合エピトープ、抗－増殖活性、および結合アフィニティーを有する（図８）。
【0089】
実施例５．インビトロおよびインビボでの有効性
活性のインビトロ試験において、Ｇ１Ａ８は、１．３９ｎＭのＩＣ50値でＦＧＦ１９－ＦＧＦＲ４相互作用を遮断した（図４Ｂ）。さらに、Ｇ１Ａ８はまた、外因性ＦＧＦ１９処置Ｈｅｐ３細胞で強い抗－増殖効果を発揮した（図４Ａ）。
活性のインビトロ試験において、Ｇ１Ａ８は、１．３９ｎＭのＩＣ50値でＦＧＦ１９－ＦＧＦＲ４相互作用を遮断した（図４Ｂ）。さらに、Ｇ１Ａ８はまた、外因性ＦＧＦ１９処置Ｈｅｐ３細胞で強い抗－増殖効果を発揮した（図４Ａ）。
【0090】
その後、インビボでのその抗－腫瘍活性を、異種移植片マウスモデルを用いて評価した（図５）。本発明者らは、まず、ルシフェラーゼを安定に発現するＨｅｐ３Ｂ－Ｌｕｃ２３細胞株を確立し、それによりインビボで生物発光イメージングを用いて腫瘍増殖の定量を可能とした。マウスにこれらＨｅｐ３Ｂ－Ｌｕｃ２３細胞を右側腹部に皮下注射し、その後、等価平均腫瘍生物発光強度を有する３群に分け、その後、４週間、週に２回の抗体治療（Ｇ１Ａ８またはアイソタイプ対照２００μｇ）の腹腔内注射を投与した。腫瘍体積および相対的腫瘍細胞生物発光強度を測定することによる経時的な腫瘍増殖のモニタリングにより、Ｇ１Ａ８はアイソタイプ対照抗体と比較して有意に腫瘍増殖を抑制したということが示された（図５Ａ～図５Ｃ）。
【0091】
移植された野生型Ｈｅｐ３Ｂ細胞から形成された異種移植片腫瘍に対する抗－腫瘍有効性も評価した。抗体治療は、腫瘍体積が約１００ｍｍ3のサイズに達したところで開始した。Ｈｅｐ３Ｂを有するマウスを等価平均主要堆積で３群に分け、週に２回の抗体（２００μｇのＧ１Ａ８またはアイソタイプ対照抗体）の腹腔内注射を３週間受けた。Ｈｅｐ３Ｂ－Ｌｕｃ２３異種移植片に関する上記結果と同様に、Ｇ１Ａ８は、Ｈｅｐ３Ｂ腫瘍進行を有意に阻害した（図５Ｄ）。さらに、Ｇ１Ａ８での治療は、アイソタイプ対照群と比較してマウスの生存を有意に延長した（図５Ｅ）。
【0092】
ＨＳ２９は、Ｇ１Ａ８と同様に強い抗－増殖活性を示した（図８Ｃ）。ＨＳ２９の抗－腫瘍活性は、患者由来異種移植片（ＰＤＸ）腫瘍モデルにおいて試験した（図９Ａ）。ＨＳ２９の治療は、平均腫瘍堆積が約１５０ｍｍ3に達したところで開始した。１０ｍｇ／ｋｇのＨＳ２９を腹腔内注射で投与されたマウスは、対照マウスと比較して停止した腫瘍増殖を示した。特に、対照マウスは、腫瘍が増殖し続けるあいだ有意な体重減少を示し、それらのうちの２匹は腫瘍の進行による生理学的条件の不良のために死亡したが；一方、ＨＳ２９治療マウスは、一定の体重を維持し、健康を保持した（図９Ｄ）。これらのデータから、インビトロおよびインビボ両方でのＨＳ２９の抗－腫瘍活性を確認した。
【0093】
実施例６．マウスおよびカニクイザルにおける安全性評価
本願の抗体、特にＧ１Ａ８は、ＦＧＦ１９とたった４９％のアミノ酸配列同一性を共有するマウスＦＧＦ１５（ヒトＦＧＦ１９のオルソログ）と交差反応性を示さないということを見出した（T. J. Wright et al., Dev Biol 269, 264-275 (2004)）。この見解を考慮すれば、上述のマウス腫瘍異種移植片モデルは、Ｇ１Ａ８治療の安全性プロファイルを評価するためには適切でないおそれがある。それにもかかわらず、ヒトＦＧＦ１９が、肝臓ＣＹＰ７Ａ１転写を抑制するためのマウスＦＧＦＲ４を介してマウスにおいてその胆汁酸制御機能を発揮することを思い出し（M. Zhou et al., 2014, 上記; R. Goetz et al., 2007, 上記）（図１Ｃ）、このマウスモデルは、Ｇ１Ａ８が肝臓のＣＹＰ７Ａ１転写に影響を与えるかどうかを評価するために使用された。驚くべきことに、Ｇ１Ａ８は、肝臓のＣＹＰ７Ａ１転写のＦＧＦ１９誘導抑制に影響を与えず（図４Ｃ）、これはＧ１Ａ８がＦＧＦ１９の胆汁酸制御機能をおそらく妨げないことを示した。
本願の抗体、特にＧ１Ａ８は、ＦＧＦ１９とたった４９％のアミノ酸配列同一性を共有するマウスＦＧＦ１５（ヒトＦＧＦ１９のオルソログ）と交差反応性を示さないということを見出した（T. J. Wright et al., Dev Biol 269, 264-275 (2004)）。この見解を考慮すれば、上述のマウス腫瘍異種移植片モデルは、Ｇ１Ａ８治療の安全性プロファイルを評価するためには適切でないおそれがある。それにもかかわらず、ヒトＦＧＦ１９が、肝臓ＣＹＰ７Ａ１転写を抑制するためのマウスＦＧＦＲ４を介してマウスにおいてその胆汁酸制御機能を発揮することを思い出し（M. Zhou et al., 2014, 上記; R. Goetz et al., 2007, 上記）（図１Ｃ）、このマウスモデルは、Ｇ１Ａ８が肝臓のＣＹＰ７Ａ１転写に影響を与えるかどうかを評価するために使用された。驚くべきことに、Ｇ１Ａ８は、肝臓のＣＹＰ７Ａ１転写のＦＧＦ１９誘導抑制に影響を与えず（図４Ｃ）、これはＧ１Ａ８がＦＧＦ１９の胆汁酸制御機能をおそらく妨げないことを示した。
【0094】
先の研究（非特許文献２３）は、カニクイザルにおけるヒト化抗－ＦＧＦ１９抗体（１Ａ６）の投与が、体重減少、摂餌量の低下、ひどい下痢およびなどの臨床的兆候と共にＦＧＦ１９機能の妨害およびＣＹＰ７Ａ１遺伝子発現の増加による胆汁酸代謝の崩壊を引き起こし、最終的には１０および３０ｍｇ／ｋｇ治療群におけるすべての動物の予定外の安楽死という結果となったことを示した。カニクイザルのＦＧＦ１９のアミノ酸配列とヒトＦＧＦ１９のアミノ酸配列とはほぼ同一であった（９８％のアミノ酸同一性を共有）。本発明者らはまた、本願の抗体の交差反応性を試験し、Ｇ１Ａ８がカニクイザルＦＧＦ１９およびヒトＦＧＦ１９の両方に同様の結合アフィニティーで結合することを立証した（図３Ａおよび図６Ｌ）。したがって、カニクイザルは、Ｇ１Ａ８の安全性プロファイル、特にそれがＦＧＦ１９の胆汁酸制御機能を損なうかどうかを評価するための良好なモデルであることが決定された。
【0095】
４匹の治療を受けていないカニクイザルを無作為に２群に分け、対照生理食塩水、または１０ｍｇ／ｋｇのＧ１Ａ８を１日目に、そして３０ｍｇ／ｋｇのＧ１Ａ８を１６日目に静脈内投与した。各群は１匹の雄と１匹の雌を含んでいた。血液試料を試験期間の初めから終わりまで採取した（図６Ａ）。
【0096】
すべてのサルは２回のＧ１Ａ８投与で治療を完了し、それらはいずれも、体重減少、摂餌量の低下、液状の糞便または下痢などの１Ａ６（ＦＧＦ１９のＣ－末端に結合する）について報告されているいかなる臨床的な副作用も示さなかった（図６Ｂ）。サルにおける１Ａ６治療（１回投与）の先の研究は、血清総胆汁酸（ＴＢＡ）レベル、アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）、およびアスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）の顕著な増加を報告した（非特許文献２３）。Ｇ１Ａ８治療群のサルは当初、Ｇ１Ａ８（１０ｍｇ／ｋｇ）治療後１５日目（第１回目の検査時点）で血清ＴＢＡ濃度のわずかな増加を示したが、次のより高用量の３０ｍｇ／ｋｇの第２回目の投与の１６日目ではさらなる増加は観察されず、むしろ減少が観察された（図６Ｃ）。この知見は、１５日目に観察された血清ＴＢＡレベルのわずかな増加は、動物における正常な生理学的変化によって説明できそうであるということを示唆する。総ビリルビン（ＴＢＩＬ）、アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）、およびアスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）の血清レベルは、対照生理食塩水またはＧ１Ａ８のいずれかで処理されたマウスにおいて有意差は示されず、Ｇ１Ａ８の投与によって肝臓障害が生じないことを示唆した（図６Ｇ～図６Ｉ）。
【0097】
本発明者らはまた、胆汁酸代謝に影響を与えることが知られている複数の遺伝子の発現レベルを評価するために、胆汁酸リサイクルに関与する器官（肝臓、回腸、および腎臓）からサルの組織試料を採取した（図６Ｄ～図６Ｆ）。Ｇ１Ａ８で治療した動物の肝臓において、ＣＹＰ７Ａ１遺伝子発現に増加は見られず、胆汁酸輸送タンパク質をコードする他の遺伝子の発現は対照群の動物に比べて有意な増加は示さなかった（図６Ｄ）。腎臓および回腸において、胆汁酸輸送体の遺伝子の発現は、Ｇ１Ａ８治療群と対照群との間で違いはなく（図６Ｅ、図６Ｆ）、胆汁酸のリサイクルおよび代謝は、正常な生理学的レベルで維持されたことを示した。二つの異なるＧ１Ａ８投与量に関する血清濃度－時間プロファイルにより、１０ｍｇ／ｋｇおよび３０ｍｇ／ｋｇで投与されたカニクイザルにおいてそれぞれ１７４．２９時間および１８８．３８時間のＧ１Ａ８についての同様の終末相半減期が明らかとなった（図６Ｊおよび図６Ｋ）。
【0098】
総合すると、カニクイザルにおけるこれらの安全性評価実験は、Ｇ１Ａ８の投与により胆汁酸関連毒性を伴わないことを証明し、したがって、治療的設定におけるＧ１Ａ８の治療は、胆汁酸の有意な吸収不良または他の胆汁酸関連副作用を引き起こす可能性は低いことが示唆された。
【0099】
実施例７．ＦＧＦ１９－Ｇ１Ａ８複合体の構造的分析
ＦＧＦ１９との複合体におけるＧ１Ａ８のＦａｂバージョンの構造は、本願の抗体とＦＧＦ１９との間の相互作用の分子基盤を理解するためにＸ－線結晶学により２．６Å分解能で決定した。抗体Ｇ１Ａ８がこの分析のために選択された。
ＦＧＦ１９との複合体におけるＧ１Ａ８のＦａｂバージョンの構造は、本願の抗体とＦＧＦ１９との間の相互作用の分子基盤を理解するためにＸ－線結晶学により２．６Å分解能で決定した。抗体Ｇ１Ａ８がこの分析のために選択された。
【0100】
構造は、分子置換法により解かれ、良好な配置を有する０．２１６／０．２７８のＲwork／Ｒfreeに精緻化された（表１、以下参照）。ＦＧＦ１９およびＧ１Ａ８の構造において、明確に定義された電子密度を示すＦＧＦ１９の残基３７～１７２をモデルとした。ＦＧＦ１９およびＧ１Ａ８の構造は、一見したところ完全な形状相補性を示し、合計９８３Å2の表面を覆っている。Ｇ１Ａ８の可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）に関する覆われた表面領域ほぼ同一である（４９５Å2対４８８Å2）。Ｇ１Ａ８のエピトープを含む主要な残基は、ＦＧＦ１９のＮ－末端および配列番号１のアミノ酸残基３８～４５からなる断片（配列番号２）内にあり、ＶＨおよびＶＬの間の割れ目の上に位置している（図７Ａおよび図７Ｂ）。この知見は、上述したようにＦＧＦ１９のＮ－末端を特異的に標的化するＧ１Ａ８の指定された特徴と一致している。
【0101】
【表1】
【0102】
具体的には、ＦＧＦ１９の３８～４５位までの８個の残基は、図７Ｃおよび表２により示されるように、疎水性および極性接触の混合によりＧ１Ａ８のＶＨおよびＶＬ両方由来の６個すべての相補性決定領域（ＣＤＲ）ループとの広範な相互作用を保証する（engage）。ＦＧＦ１９のＮ－末端の残基Ｔｒｐ３８の側鎖は、ＨＣＤＲ１～３のＡｌａ３３、Ｓｅｒ５２、Ｓｅｒ５７、Ｔｙｒ５９、Ｇｌｎ１０２およびＬｅｕ１０４により形成される疎水性ポケットに固定され、一方でＦＧＦ１９のＡｒｇ４５は、それぞれＨＣＤＲ３およびＬＣＤＲ２のＧｌｕ１０３およびＡｓｐ５２と塩架橋相互作用を保証する（図７Ｃ）。ＦＧＦ１９／Ｔｒｐ３８Ａｌａ突然変異体は、Ｇ１Ａ８に対して結合アフィニティーの低下を示し、Ａｒｇ４５のＡｌａへの突然変異が結果として完全な結合の喪失となり（図７Ｄ）、これらの相互作用が必要不可欠であることを確認した。ＦＧＦ１９のＡｒｇ４５はまた、ＨＣＤＲ３のＡｓｎ１００と付加的な水素結合相互作用をなす（図７Ｃ）。Ｇ１Ａ８の親の抗体３１Ａ３は、この同じ位置にＶａｌを有するが、この違いはＧ１Ａ８よりも３１Ａ３のアフィニティーが低い原因であるようである（図２および図３Ａ）。Ｇ１Ａ８－ＦＧＦ１９複合体構造はまた、ＦＧＦ１９のＣ－末端の残基１６８～１７２がＦＧＦ１９およびＧ１Ａ８の相互作用界面でＮ－末端とごく接近しているということを明らかにした。ＦＧＦ１９のＮ－末端に沿ってＣ－末端で残基Ｌｅｕ１６９は、ＬＣＤＲ２のＴｙｒ５１およびＰｒｏ５７と疎水性相互作用を形成する。Ｔｒｙ５１とＦＧＦ１９／Ｐｒｏ１６７の骨格カルボニル基との間の水素結合は、ＦＧＦ１９のＣ－末端相互作用をさらに安定化する。Ｌｅｕ１６９のＡｌａへの突然変異は、結果として解離速度が速くなることにより抗体に対する結合アフィニティーを減少させる結果となる（図７Ｄ）。
【0103】
【表2】
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図5E】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図6E】
【図6F】
【図6G】
【図6H】
【図6I】
【図6J】
【図6K】
【図6L】
【図7A-7B】
【図7C】
【図7D】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図9D】
【配列表】
【国際調査報告】