特表 2022-523783 栄養障害型表皮水疱症の治療に使用されるオリゴヌクレオチド

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-04-26

(54)【発明の名称】栄養障害型表皮水疱症の治療に使用されるオリゴヌクレオチド

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/113 20100101AFI20220419BHJP

   C12N 15/86 20060101ALI20220419BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20220419BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20220419BHJP

   A61K 31/7125 20060101ALI20220419BHJP

   A61K 31/712 20060101ALI20220419BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20220419BHJP

   A61K 47/32 20060101ALI20220419BHJP

   A61K 9/06 20060101ALI20220419BHJP

   C07K 14/78 20060101ALN20220419BHJP

【ＦＩ】

C12N15/113 Z ZNA

C12N15/86 Z

A61K31/7105

A61P17/00

A61K31/7125

A61K31/712

A61K48/00

A61K47/32

A61K9/06

C07K14/78

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021550687

(86)(22)【出願日】2020-02-28

(85)【翻訳文提出日】2021-09-29

(86)【国際出願番号】 US2020020541

(87)【国際公開番号】W WO2020176904

(87)【国際公開日】2020-09-03

(31)【優先権主張番号】1902735.8

(32)【優先日】2019-02-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】521381901

【氏名又は名称】フェニシス セラピューティクス， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】スウィルデンズ， ジム

(72)【発明者】

【氏名】ハイスマ， エリザベス マリーン

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

4C086

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C076AA09

4C076CC18

4C076EE09A

4C076FF68

4C084AA13

4C084MA27

4C084MA55

4C084NA14

4C084ZA891

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA02

4C086MA04

4C086MA05

4C086MA27

4C086MA55

4C086NA14

4C086ZA89

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA40

(57)【要約】

本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）及びヒト疾患の治療におけるＡＯＮの使用に関する。特に、本発明は栄養障害型表皮水疱症（ＤＥＢ）の治療に適したＡＯＮに関する。より詳しくは、本発明はヒトＣＯＬ７Ａ１前駆体ｍＲＮＡからエクソン１０５スキッピングを誘導することができるＡＯＮ及びエクソン１０５スキッピング効率において、従来技術で既知のＡＯＮより優れているＡＯＮに関する。さらに、本発明はＣＯＬ７Ａ１遺伝子のエクソン１０５に突然変異を保有する患者のＤＥＢの治療におけるこれら新規のＡＯＮの使用に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ヒトコラーゲンＶＩＩ型α１鎖（ＣＯＬ７Ａ１）ｍＲＮＡが細胞内で前駆体ｍＲＮＡからスプライシングによって生産されるとき、前記ｍＲＮＡへのエクソン１０５の包含を阻止または低減することができるアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）であって、
前記ＡＯＮが配列番号４８、４２、６０、４４、４６、５１、５２、５８、５９、５～４１、４３、４５、４７、４９、５０及び５３～５７からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むかまたはからなる、前記ＡＯＮ。

【請求項2】

前記ＡＯＮが配列番号４８、４２、６０、４４、４６、５１、５２、５８及び５９からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むかまたはからなる、請求項１に記載のＡＯＮ。

【請求項3】

前記ＡＯＮが配列番号２４、２６、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２５、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、５、６、８、９、１０、１１、１２及び１３からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むかまたはからなる、請求項１に記載のＡＯＮ。

【請求項4】

ヒトＣＯＬ７Ａ１ｍＲＮＡが細胞内で前駆体ｍＲＮＡからスプライシングによって生産されるとき、前記ｍＲＮＡへのエクソン１０５の包含を阻止または低減することができるＡＯＮであって、
前記ＡＯＮが配列番号４８、４２、６０、４４、４６、５１、５２、５８、５９、５～４１、４３、４５、４７、４９、５０及び５３～５７のいずれか１つに対応するＣＯＬ７Ａ１前駆体ｍＲＮＡ中の標的ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含むかまたはからなる、前記ＡＯＮ。

【請求項5】

前記ＡＯＮが配列番号４８、４２、６０、４４、４６、５１、５２、５８及び５９のいずれか１つに対応するＣＯＬ７Ａ１前駆体ｍＲＮＡ中の標的ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含むかまたはからなる、請求項４に記載のＡＯＮ。

【請求項6】

前記ＡＯＮが配列番号２４、２６、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２５、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、５、６、８、９、１０、１１、１２及び１３に対応するＣＯＬ７Ａ１前駆体ｍＲＮＡ中の標的ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含むかまたはからなる、請求項４に記載のＡＯＮ。

【請求項7】

前記ＡＯＮがオリゴリボヌクレオチドである、請求項１～６のいずれか１項に記載のＡＯＮ。

【請求項8】

前記ＡＯＮが少なくとも１つの非天然型結合修飾を含む、請求項１～７のいずれか１項に記載のＡＯＮ。

【請求項9】

前記非天然型結合修飾がホスホロチオエート結合である、請求項８に記載のＡＯＮ。

【請求項10】

前記糖部位の２’位、３’位及び／または５’位で１つまたは２つ置換している少なくとも１つのヌクレオチドを含む、請求項１～９のいずれか１項に記載のＡＯＮ。

【請求項11】

前記置換が、－ＯＨ；－Ｆ；１つ以上のヘテロ原子により中断されてもよい置換または非置換の、直鎖または分枝鎖低級（Ｃ１－Ｃ１０）アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アリルまたはアラルキル；Ｏ－アルキル、Ｓ－アルキルまたはＮ－アルキル；Ｏ－アルケニル、Ｓ－アルケニルまたはＮ－アルケニル；Ｏ－アルキニル、Ｓ－アルキニルまたはＮ－アルキニル；Ｏ－アリル、Ｓ－アリルまたはＮ－アリル；Ｏ－アルキル－Ｏ－アルキル；－メトキシ；－アミノプロポキシ；－メトキシエトキシ；－ジメチルアミノオキシエトキシ；及び－ジメチルアミノエトキシエトキシからなる群から選択される、請求項１０に記載のＡＯＮ。

【請求項12】

（ａ）全ての糖部位が２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）置換で修飾されるかもしくは全ての糖部位が２’－メトキシエトキシ（２’－ＭＯＥ）置換で修飾されるか；
（ｂ）５’末端ヌクレオチド及び３’末端ヌクレオチドがＬＮＡ修飾され、全ての他の糖部位が２’－ＯＭｅ置換もしくは２’－ＭＯＥ置換で修飾されるか；または
（ｃ）２つの５’末端ヌクレオチド及び２つの３’末端ヌクレオチドがＬＮＡ修飾され、全ての他の糖部位が２’－ＯＭｅ置換もしくは２’－ＭＯＥ置換で修飾される、請求項１１に記載のＡＯＮ。

【請求項13】

請求項１～６のいずれか１項に記載のＡＯＮをコードするヌクレオチド配列を含むウイルスベクター。

【請求項14】

請求項１～１２のいずれか１項に記載のＡＯＮまたは請求項１３に記載のウイルスベクターを含み、キャリア、賦形剤、安定化剤、トランスフェクション試薬、希釈液、ゲル化剤またはバッファーの１つ以上を更に含む、医薬組成物。

【請求項15】

栄養障害型表皮水疱症（ＤＥＢ）に罹患するヒト被検体の治療に使用される請求項１～１２のいずれか１項に記載のＡＯＮ。

【請求項16】

前記治療が前記ＡＯＮの局所投与を含む、請求項１５に記載の使用されるＡＯＮ。

【請求項17】

前記ＡＯＮがカルボマーヒドロゲル製剤中にある、請求項１６に記載の使用されるＡＯＮ。

【請求項18】

ヒト被検体のＤＥＢの治療、予防、寛解または遅延のための薬剤の作製における請求項１～１２のいずれか１項に記載のＡＯＮまたは請求項１３に記載のウイルスベクターの使用。

【請求項19】

ヒトＣＯＬ７Ａ１ｍＲＮＡがヒト細胞内で前駆体ｍＲＮＡからスプライシングによって生産されるとき、前記ｍＲＮＡへのエクソン１０５の包含を阻止または低減する方法であって、
インビトロ、インビボまたはエクスビボの設定で前記細胞を準備することと、
前記細胞に請求項１～１２のいずれか１項に記載のＡＯＮ、請求項１３に記載のウイルスベクターまたは請求項１４に記載の医薬組成物を投与することとを含む、前記方法。

【請求項20】

ヒト被検体のＤＥＢの治療のための方法であって、
前記被検体に請求項１～１２のいずれか１項に記載のＡＯＮ、請求項１３に記載のウイルスベクターまたは請求項１４に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、前記方法。

【請求項21】

前記ＤＥＢが前記ヒト被検体のＣＯＬ７Ａ１遺伝子のエクソン１０５における突然変異が原因である、請求項１５～１７のいずれか１項に記載のＡＯＮ、請求項１８に記載の使用または請求項２０に記載の方法。

【請求項22】

前記ＤＥＢが前記ヒト被検体のＣＯＬ７Ａ１遺伝子のエクソン１０５におけるｃ．７８６４ｄｅｌＣ突然変異が原因である、請求項１５～１７のいずれか１項に記載のＡＯＮ、請求項１８に記載の使用または請求項２０に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は２０１９年２月２８日出願の英国特許出願第１９０２７３５．８号の利益を主張し、その開示の全内容を参照することにより本明細書に援用する。

【0002】

配列表の組み入れ
本明細書によって、添付の配列表中の物質は参照により本出願に援用する。０５６５２０－５０３００１ＷＯ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ＴＸＴと名付けられた添付の配列表テキストファイルは、２０２０年２月２８日に作成され、１４ＫＢのサイズである。

【0003】

本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）及びヒト疾患の治療におけるＡＯＮの使用に関する。特に、本発明は栄養障害型表皮水疱症（ＤＥＢ）の治療に適したＡＯＮに関する。より詳しくは、本発明はヒトＣＯＬ７Ａ１前駆体ｍＲＮＡからエクソン１０５スキッピングを誘導することができるＡＯＮ及びＣＯＬ７Ａ１遺伝子のエクソン１０５に突然変異を保有する患者のＤＥＢの治療におけるＡＯＮの使用に関する。

【背景技術】

【0004】

表皮水疱症（ＥＢ）は遺伝性皮膚疾患のグループであり、これらは表皮及び粘膜の慢性の脆弱性及び水疱形成を特徴とする。サブタイプに応じて、ＥＢの症状の範囲は、最小の表皮の脆弱性から全身の合併症を伴う非常に重篤な症状まで非常に広い。世界中で約３５０，０００人の患者が冒されている。ＥＢのいくつかの型では、爪、髪及び歯が関連する場合がある。ＥＢの主要な型としては、単純型ＥＢ（ＥＢＳ）、接合型ＥＢ（ＪＥＢ）、栄養障害型ＥＢ（ＤＥＢ）及びキンドラー症候群（ＫＳ）が挙げられる。

【0005】

世界中で約４４，０００人の患者がＤＥＢに冒されている。水疱形成及び表皮浸食は、少し触れるだけで発生するかまたは自発的にも発生する。症状としては、開放創、皮膚感染、ならびに指及び足指（疑似合指症）の融合が挙げられる。劣性ＤＥＢ（ＲＤＥＢ；ＤＥＢ患者の約５０％）を有する患者は、一生を通して全身性の水疱形成、慢性潰瘍、ならびに複数の臓器病変、主要な病的状態、生命を脅かす合併症及び扁平上皮癌（ＳＣＣ）をもたらす瘢痕後遺症に悩まされる。ＳＣＣを発症すると、ＲＤＥＢを有する患者の期待寿命が減るため、患者は３０年または４０年の寿命を超えて生存しにくくなる。優性ＤＥＢ（ＤＤＥＢ）の特徴としては、手、足、肘及び膝に局在し得るかまたは全身性になり得る水疱形成が挙げられる。一般的な所見としては、瘢痕、稗粒腫、粘膜病変及び異常な爪または爪がないことが挙げられる。通常、ＲＤＥＢはＤＤＥＢより全身性であり、より重篤である。ＲＤＥＢの一般的な症状発現としては、ＤＤＥＢの症状に加えて、栄養失調症、貧血、骨粗鬆症、食道狭窄、成長遅延、ミトン変形の原因となる指及び足指のみずかき形成または癒着、筋拘縮の発症、歯の奇形、小口症及び目の瘢痕が挙げられる。

【0006】

高いアンメットメディカルニーズにもかかわらず、現在、ＤＥＢ患者が利用できる疾患修飾治療は存在せず、緩和ケアだけが行われている。ＲＤＥＢの重篤な型は社会の医療予算に高いコストを課し、包帯材及び薬の平均コストが患者１人当たり１年に約２００，０００ユーロである。

【0007】

ＤＥＢは、ＶＩＩ型コラーゲンα１タンパク質（Ｃ７）をコードするＣＯＬ７Ａ１遺伝子中の１つ以上の突然変異が原因である。Ｃ７は真皮を表皮に繋ぐ係留線維（ＡＦ）の主成分である。ＡＦはＣ７α鎖の三量体形成によって形成する。続いて、これらの三量体が集合して逆平行フィラメントを構築し、Ｎ末端ドメインで基底膜の緻密層領域内のラミニン３３２及びＩＶ型コラーゲンと順に相互作用する。そのため、機能性Ｃ７のレベルが低下すると、係留線維がなくなるかまたは機能不全が生じ、これにより表皮脆弱性をもたらす。ＤＥＢ重症度は、基底膜領域でＶＩＩ型コラーゲン発現の量におおよそ相関する。
ＣＯＬ７Ａ１遺伝子内で、ミスセンス変異及び「未成熟終止コドン（ＰＴＣ）」を導く突然変異を含む４００を超える異なる突然変異が知られている。ヒトＣＯＬ７Ａ１遺伝子は１１８エクソンを含む。これらの大多数はインフレームであり、特定のエクソンが存在しない場合、隣接したエクソン（一緒になって連結される）がインフレームでまだ翻訳されることを意味する。エクソン１、２、３、４、６、７、２４、２５、２７、１１３及び１１８はインフレームでない。インフレームエクソンはＤＥＢの原因となる多くの突然変異を有しているため、タンパク質機能を保持しつつ突然変異を排除する潜在的に現実的な方法としてこのようなインフレームエクソンのエクソンスキッピングが確認され（Ｇｏｔｏ ｅｔ ａｌ．２００６．Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｓｋｉｐｐｉｎｇ ｏｆ ａ Ｓｉｎｇｌｅ Ｅｘｏｎ Ｈａｒｂｏｒｉｎｇ ａ Ｐｒｅｍａｔｕｒｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ Ｃｏｄｏｎ Ｍｕｔａｔｉｏｎ：Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ Ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃ Ｅｐｉｄｅｒｍｏｌｙｓｉｓ Ｂｕｌｌｏｓａ Ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ １２６（１２）：２６１４－２６２０）、この戦略はいくつかの研究グループによって更に調査されている。事実、ＡＯＮを適用することによってＣＯＬ７Ａ１前駆体ｍＲＮＡにおけるエクソンスキッピングがエクソン１３、７３、７４、８０及び１０５に対して示唆され、かつ／または示されている（Ｂｏｒｎｅｒｔ ｅｔ ａｌ．２０１６．Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｅｘｏｎ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｉｎ ＣＯＬ７Ａ１ ｒｅｖｅａｌｓ ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ ｆｏｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃ ｅｐｉｄｅｒｍｏｌｙｓｉｓ ｂｕｌｌｏｓａ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２４（７）：１３０２－１３１１；Ｂｒｅｍｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１６ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｅｘｏｎ Ｓｋｉｐｐｉｎｇ ａｓ ａ Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ Ｒｅｃｅｓｓｉｖｅ Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃ Ｅｐｉｄｅｒｍｏｌｙｓｉｓ Ｂｕｌｌｏｓａ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ５（１０）：ｅ３７９；Ｇｏｔｏ ｅｔ ａｌ．２００６；Ｔｕｒｃｚｙｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．２０１６．Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｅｘｏｎ Ｓｋｉｐｐｉｎｇ Ｒｅｓｔｏｒｅｓ Ｔｙｐｅ ＶＩＩ Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ａｎｃｈｏｒｉｎｇ Ｆｉｂｒｉｌ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ａｎ Ｉｎ Ｖｉｖｏ ＲＤＥＢ Ｍｏｄｅｌ．Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ １３６（１２）：２３８７－２３９５；ＷＯ２０１３／０５３８１９；ＷＯ２０１６／１４２５３８；Ｗ０２０１６／１８５０４１；ＷＯ２０１７／０７８５２６）。エクソン１３または１０５が欠損するＣ７について、タンパク質の折り畳みは影響を受けず、細胞接着及び移入プロセス（Ｃ７が役割を果たす）が正常であることが証明された（Ｂｏｒｎｅｒｔ ｅｔ ａｌ．２０１６）。さらに、エクソン７３及び８０について、各エクソンのスキッピング後、患者細胞によって生産される少し短いＣ７Δ７３及びＣ７Δ８０タンパク質が表皮真皮接合部で組み込まれ、係留線維を形成することができることが示された（Ｔｕｒｃｚｙｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．２０１６）。ＡＯＮ投与の意図されたルートは、ヒドロゲル媒体を用いる局所適用によるものである。
従来技術のエクソンスキッピングオリゴヌクレオチドは、この恐ろしい疾患に取り組む際に有望なステップを提供するが、エクソンスキッピングの効率を向上する他のオリゴヌクレオチドをまだ必要としている。注目すべきことに、２つのＡＯＮを併用すると、エクソン１０５のスキッピングが効率的になることが分かっているだけであった（Ｂｏｒｎｅｒｔ ｅｔ ａｌ．２０１６；Ｂｒｅｍｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１６；ＷＯ２０１７／０７８５２６）。本発明は、ＣＯＬ７Ａ１前駆体ｍＲＮＡからのエクソン１０５スキッピングのために改良されたＡＯＮを同定し、使用することを目的とし、そのＡＯＮは従来技術のＡＯＮより優れ、単一の活性成分として使用することが好ましい。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0008】

【特許文献1】国際公開第２０１３／０５３８１９号

【特許文献2】国際公開第２０１６／１４２５３８号

【特許文献3】国際公開第２０１６／１８５０４１号

【非特許文献】

【0009】

【非特許文献1】Ｇｏｔｏ ｅｔ ａｌ．２００６．Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｓｋｉｐｐｉｎｇ ｏｆ ａ Ｓｉｎｇｌｅ Ｅｘｏｎ Ｈａｒｂｏｒｉｎｇ ａ Ｐｒｅｍａｔｕｒｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ Ｃｏｄｏｎ Ｍｕｔａｔｉｏｎ：Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ Ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃ Ｅｐｉｄｅｒｍｏｌｙｓｉｓ Ｂｕｌｌｏｓａ Ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ １２６（１２）：２６１４－２６２０

【非特許文献2】Ｂｏｒｎｅｒｔ ｅｔ ａｌ．２０１６．Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｅｘｏｎ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｉｎ ＣＯＬ７Ａ１ ｒｅｖｅａｌｓ ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ ｆｏｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃ ｅｐｉｄｅｒｍｏｌｙｓｉｓ ｂｕｌｌｏｓａ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２４（７）：１３０２－１３１１

【非特許文献3】Ｂｒｅｍｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１６ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｅｘｏｎ Ｓｋｉｐｐｉｎｇ ａｓ ａ Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ Ｒｅｃｅｓｓｉｖｅ Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃ Ｅｐｉｄｅｒｍｏｌｙｓｉｓ Ｂｕｌｌｏｓａ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ５（１０）：ｅ３７９

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明は、ヒトコラーゲンＶＩＩ型α１鎖（ＣＯＬ７Ａ１）ｍＲＮＡが哺乳動物細胞（例えば、インビボでのヒト細胞）内で前駆体ｍＲＮＡからスプライシングによって生産されるとき、ヒトＣＯＬ７Ａ１ｍＲＮＡへのエクソン１０５の包含を阻止または低減することができる様々なアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）を提供する。一態様では、本発明は、ヒトＣＯＬ７Ａ１ｍＲＮＡが細胞内で前駆体ｍＲＮＡからスプライシングによって生産されるとき、ヒトＣＯＬ７Ａ１ｍＲＮＡへのエクソン１０５の包含を阻止または低減することができるＡＯＮであって、ＡＯＮが配列番号４８、４２、６０、４４、４６、５１、５２、５８、５９、５～４１、４３、４５、４７、４９、５０及び５３～５７からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むかまたはからなる、該ＡＯＮに関する。いくつかの実施形態では、ＡＯＮが配列番号４８、４２、６０、４４、４６、５１、５２、５８及び５９からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むかまたはからなる。いくつかの実施形態では、ＡＯＮが配列番号４８、４２及び６０からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むかまたはからなる。いくつかの実施形態では、ＡＯＮが配列番号２４、２６、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２５、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、５、６、８、９、１０、１１、１２及び１３からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むかまたはからなる。本発明の好ましいＡＯＮは、配列番号２４、配列番号２６または配列番号１４に従うヌクレオチド配列からなる。別の態様では、本発明は、ヒトＣＯＬ７Ａ１ｍＲＮＡが細胞内で前駆体ｍＲＮＡからスプライシングによって生産されるとき、ヒトＣＯＬ７Ａ１ｍＲＮＡへのエクソン１０５の包含を阻止または低減することができるＡＯＮであって、ＡＯＮが配列番号４８、４２、６０、４４、４６、５１、５２、５８、５９、５～４１、４３、４５、４７、４９、５０及び５３～５７のいずれか１つに対応するＣＯＬ７Ａ１前駆体ｍＲＮＡ中の標的ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含むかまたはからなる、該ＡＯＮに関する。いくつかの実施形態では、ＡＯＮが配列番号４８、４２、６０、４４、４６、５１、５２、５８及び５９のいずれか１つに対応するＣＯＬ７Ａ１前駆体ｍＲＮＡ中の標的ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含むかまたはからなる。いくつかの実施形態では、ＡＯＮが配列番号４８、４２または６０に対応するＣＯＬ７Ａ１前駆体ｍＲＮＡ中の標的ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含むかまたはからなる。いくつかの実施形態では、ＡＯＮが配列番号２４、２６、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２５、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、５、６、８、９、１０、１１、１２及び１３のいずれか１つに対応するＣＯＬ７Ａ１前駆体ｍＲＮＡ中の標的ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含むかまたはからなる。好ましい実施形態では、本発明のＡＯＮの長さは１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７または２８ヌクレオチドである。より好ましくは、本発明によるＡＯＮの長さは２４ヌクレオチドである。更に別の好ましい態様では、本発明によるＡＯＮが少なくとも１つの非天然型結合修飾、好ましくはホスホロチオエート結合を含む。特に好ましい一態様では、本発明によるＡＯＮの全ての糖部位が２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）置換または２’－メトキシエトキシ（２’－ＭＯＥ）置換で修飾される。別の態様では、５’末端ヌクレオチド及び３’末端ヌクレオチドがＬＮＡ修飾され、全ての他の糖部位が２’－ＯＭｅ置換または２’－ＭＯＥ置換で修飾される。更に別の態様では、２つの５’末端ヌクレオチド及び２つの３’末端ヌクレオチドがＬＮＡ修飾され、全ての他の糖部位が２’－ＯＭｅ置換または２’－ＭＯＥ置換で修飾される。

【0011】

別の実施形態では、本発明は、本発明によるＡＯＮをコードするヌクレオチド配列を含むウイルスベクターに関する。本発明はまた、本発明によるＡＯＮまたはウイルスベクターを含む医薬組成物であって、該組成物がキャリア、賦形剤、安定化剤、トランスフェクション試薬、希釈液、ゲル化剤またはバッファーの１つ以上を更に含む、該医薬組成物に関する。

【0012】

別の態様では、本発明は、ヒトＣＯＬ７Ａ１ｍＲＮＡがヒト細胞内で前駆体ｍＲＮＡからスプライシングによって生産されるとき、ｍＲＮＡへのエクソン１０５の包含を阻止または低減する方法であって、インビトロ、インビボまたはエクスビボの設定で細胞を準備することと、細胞に本発明によるＡＯＮ、本発明によるウイルスベクターまたは本発明による医薬組成物を投与することとを含む、該方法に関する。

【0013】

更に別の態様では、本発明は、栄養障害型表皮水疱症（ＤＥＢ）に罹患するヒト被検体の治療に使用される本発明によるＡＯＮであって、ＤＥＢが被検体のＣＯＬ７Ａ１遺伝子のエクソン１０５における突然変異が原因であることが好ましく、突然変異がｃ．７８６４ｄｅｌＣ突然変異であることがより好ましい、該ＡＯＮに関する。治療は、例えば、カルボマーヒドロゲル製剤などのヒドロゲル製剤中のＡＯＮの局所投与を含むことが好ましい。別の態様では、本発明は、ヒト被検体のＤＥＢの治療、予防、寛解または遅延のための薬剤の作製における本発明によるＡＯＮまたは本発明によるウイルスベクターの使用に関する。別の態様では、本発明は、ヒト被検体のＤＥＢの治療のための方法であって、被検体に本発明によるＡＯＮ、本発明によるウイルスベクターまたは本発明による医薬組成物を投与するステップを含む、該方法に関する。いくつかの実施形態では、ＤＥＢはヒト被検体のＣＯＬ７Ａ１遺伝子のエクソン１０５における突然変異が原因である。いくつかの実施形態では、突然変異はｃ．７８６４ｄｅｌＣ突然変異である。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1-1】上部に、ヒトＣＯＬ７Ａ１遺伝子のエクソン１０５（５’から３’；大文字、太字；配列番号１）の野生型（ここではＲＮＡ）配列を上流及び下流のイントロン配列（小文字）の部分と共に示す。ｃ．７８６４ｄｅｌＣ突然変異の位置に下線を引く。このイントロン－エクソン－イントロン配列（配列番号２）の下にアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）を３’から５’（左から右）でそれらの対応する識別子及び配列番号と共に示す。ｃ．７８６４ｄｅｌＣ突然変異の位置に関して、野生型配列との重なりをＡＯＮ１２、１５及び１６の下線が引かれたグアノシンと共に示す。ＡＯＮがその特定の位置に重なるが、グアノシンを欠損する場所はＡＯＮ８、９、１３、１４、１７、１９、２７及び２８のように「－」で示す。

【図1-2】同上。

【図2】２つの修飾変形における当該技術分野で知られる２つの異なるＡＯＮ（本明細書では「ＵＭＣＧ－ＡＯＮ１」または「ＵＭＣＧ－１」及び「ＵＭＣＧ－ＡＯＮ２」または「ＵＭＣＧ－２」という）をトランスフェクトした野生型線維芽細胞から得られたｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡに関するＰＣＲ結果を示す。１つの変形はＡＯＮが糖部位において２’－ＯＭｅ置換で完全に修飾されたものであり（本明細書では「２ ｏ－ＭＥ」と示す）、もう１つの変形はＡＯＮが糖部位において２’－ＭＯＥ修飾で完全に修飾されたものである（本明細書では「ＭＯＥ」と示す）。これらのＡＯＮを本明細書に詳述する１つの新規なＡＯＮ（ＡＯＮ８）と比較した。このＡＯＮ８は完全に２’－ＭＯＥ修飾されていた。右の矢印は使用されたプライマーを有するＰＣＲ産物の大きさを示し、ｗｔ産物（上の矢印）及びエクソン１０５がスキップされ、発生したｃＤＮＡに存在しない産物（下の矢印）の位置を示す。ＮＴはトランスフェクトしなかった陰性対照であり、ＰＥＩはトランスフェクション試薬のみを使用した陰性対照である。

【図3】２’－ＯＭｅ（本明細書では「ＯＭｅ」）及び２’－ＭＯＥ（本明細書では「ＭＯＥ」）変形の各々の５つの異なるＡＯＮ（ＡＯＮ７、８、９、１０及び１１）をトランスフェクトした野生型線維芽細胞から得られたｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡに関するＰＣＲ結果を示す。矢印は使用されたプライマーを有するＰＣＲ産物の大きさを示し、ｗｔ産物（上の矢印）及びエクソン１０５がスキップされ、発生したｃＤＮＡに存在しない産物（下の矢印）の位置を示す。Ｍはマーカーであり、ＮＴはトランスフェクトしなかった陰性対照であり、ＰＥＩはトランスフェクション試薬のみを使用した陰性対照である。

【図4】２’－ＭＯＥで完全に修飾されたＡＯＮ１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９及び２０をトランスフェクトした野生型線維芽細胞から得られたｍＲＮＡ及びｃＤＮＡからのＰＣＲ結果を示す。２’－ＭＯＥ変形（本明細書では「ＭＯＥ」）及び２’－ＯＭｅ変形（本明細書では「２Ｏ－Ｍｅ」；二重反復で実施した）のＡＯＮ８が含まれた。右の矢印は得られたｍＲＮＡにおけるエクソン１０５の存在（上の矢印）またはエクソン１０５の不在（下の矢印）を示す。

【図5】野生型ヒト線維芽細胞への２’－ＯＭｅ変形（本明細書では「２ｏＭｅ」）及び２’－ＭＯＥ変形（本明細書では「ＭＯＥ」）のＡＯＮ８、１２、１５、１６、１８及び２０全てのトランスフェクション後、ｄｄＰＣＲアッセイを用いてエクソン１０５スキッピングの割合を示す。ＮａＣｌのみ、トランスフェクション試薬（ＭａｘＰＥＩ）のみ、水のみ及び関連しない２’－ＭＯＥ修飾を組み合わせたオリゴヌクレオチドを用いたトランスフェクション（ＭＯＥ Ｓｃｒ）の４つの陰性対照が含まれた。

【図6】野生型ヒト線維芽細胞（ＦＤ０３０）、ｃ．７８６４ｄｅｌＣ突然変異を受けるＤＥＢ患者から得られた線維芽細胞（ＰＬＵ００２Ａ）及びＤＥＢを罹患していないが、１アレルにｃ．７８６４ｄｅｌＣ欠失を保有するヒト被検体から得られた線維芽細胞（ＰＬＵ００３Ａ）への２’－ＯＭｅ変形（本明細書では「２ＯＭｅ」）及び２’－ＭＯＥ変形（本明細書では「ＭＯＥ」）のＡＯＮ８、ＡＯＮ１８及びＡＯＮ２０全てのトランスフェクション後、ｄｄＰＣＲアッセイを用いてＣＯＬ７Ａ１（Ｃ７）エクソン１０５スキッピングの割合を示す。ＮａＣｌのみ、トランスフェクション試薬（ＭａｘＰＥＩ）のみ、逆転写対照（ＲＴ－ＣＴＲＬ）及び関連しない２’－ＭＯＥ修飾を組み合わせたオリゴヌクレオチドを用いたトランスフェクション（ＭＯＥ Ｓｃｒ）の４つの陰性対照が含まれた。

【図7】二重反復で（Ｐ６及びＰ７）ＰＬＵ００２Ａ線維芽細胞及びＰＬＵ００３Ａ線維芽細胞への２’－ＯＭｅ（本明細書では「２ＯＭｅ」）で完全に修飾されたＡＯＮ２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２及び３３全てのトランスフェクション後、ｄｄＰＣＲアッセイを用いてＣＯＬ７Ａ１（Ｃ７）エクソン１０５スキッピングの割合を示す。陽性対照は２つの濃度（１００及び２５０ｎＭ）の、２’－ＭＯＥで完全に修飾されたＡＯＮ８及び２’－ＭＯＥ及び２’－ＯＭｅの２つの変形のＡＯＮ１８であった。ＮａＣｌのみ、トランスフェクション試薬（ＭａｘＰＥＩ）のみ、逆転写対照（ＲＴ－ＣＴＲＬ）、関連しない２’－ＭＯＥ修飾を組み合わせたオリゴヌクレオチドを用いたトランスフェクション（ＭＯＥ Ｓｃｒ）及び水のみの対照の５つの陰性対照が含まれた。

【図8】ＰＬＵ００２Ａ及びＰＬＵ００３Ａ線維芽細胞へのＡＯＮ８、ＡＯＮ１８、ＡＯＮ２０、ＡＯＮ２３、ＡＯＮ２９及びＡＯＮ３２の２’－ＯＭｅ及び２’－ＭＯＥ変形のトランスフェクション後、ｄｄＰＣＲアッセイを用いてエクソン１０５スキッピングの割合を示す。ＮａＣｌのみ、ＭａｘＰＥＩ及び組み合わされた２’－ＭＯＥ修飾オリゴヌクレオチドの３つの陰性対照が含まれた。

【図9】ＰＬＵ００２Ａ線維芽細胞へのＡＯＮ８、ＡＯＮ１８及びＡＯＮ２０の２’－ＯＭｅ（本明細書では「２ＯＭｅ」）及び２’－ＭＯＥ変形（本明細書では「ＭＯＥ」）のトランスフェクション後、ｄｄＰＣＲアッセイを用いてエクソン１０５スキッピングの割合を示す。これらの３つの最良に機能するＡＯＮのスキッピング効率をＵＭＣＧ－ＡＯＮ１及びＵＭＣＧ－ＡＯＮ２（表１参照）の従来技術のＡＯＮのスキッピング効率と比較した。これらは単独または組み合わせてＰＬＵ００２Ａ細胞にトランスフェクトした。示されるように、完全な２’－ＯＭｅ変形及び完全な２’－ＭＯＥ変形でＵＭＣＧ ＡＯＮを両方とも試験した。陰性対照はＮａＣｌ及びトランスフェクション試薬（ＭａｘＰＥＩ）のみであった。

【図10-1】ｄｄＰＣＲで分析されるように、示されたＡＯＮの２’－ＯＭｅ変異体をトランスフェクトしたヒト線維芽細胞由来のヒトＣＯＬ７Ａ１前駆体ｍＲＮＡにおけるエクソン１０５スキッピングの頻度を示す。１ｘＬＮＡ：ＬＮＡ修飾された５’末端ヌクレオチド及び３’末端ヌクレオチド、２’－ＯＭｅ修飾された全ての他のヌクレオチド。２ｘＬＮＡ：ＬＮＡ修飾された２つの５’末端ヌクレオチド及び２つの３’末端ヌクレオチド、２’－ＯＭｅ修飾された全ての他のヌクレオチド。陰性対照：ＮａＣｌ及びトランスフェクション試薬（ＭａｘＰＥＩ）のみ。

【図10-2】同上。

【図11】ｄｄＰＣＲで分析されるように、示されたＡＯＮの２’－ＭＯＥ変異体をトランスフェクトしたヒト線維芽細胞由来のヒトＣＯＬ７Ａ１前駆体ｍＲＮＡにおけるエクソン１０５スキッピングの頻度を示す。１ｘＬＮＡ：ＬＮＡ修飾された５’末端ヌクレオチド及び３’末端ヌクレオチド、２’－ＭＯＥ修飾された全ての他のヌクレオチド。２ｘＬＮＡ：ＬＮＡ修飾された２つの５’末端ヌクレオチド及び２つの３’末端ヌクレオチド、２’－ＭＯＥ修飾された全ての他のヌクレオチド。陰性対照：ＮａＣｌ及びトランスフェクション試薬（ＭａｘＰＥＩ）のみ。

【図12】ｄｄＰＣＲで分析されるように、示されたＡＯＮの２’－ＯＭｅ変異体のジムノシスによる取り込みの後の、ＨｅＬａ細胞由来のヒトＣＯＬ７Ａ１前駆体ｍＲＮＡにおけるエクソン１０５スキッピングの頻度を示す。１ｘＬＮＡ：ＬＮＡ修飾された５’末端ヌクレオチド及び３’末端ヌクレオチド、２’－ＯＭｅ修飾された全ての他のヌクレオチド。２ｘＬＮＡ：ＬＮＡ修飾された２つの５’末端ヌクレオチド及び２つの３’末端ヌクレオチド、２’－ＯＭｅ修飾された全ての他のヌクレオチド。陰性対照：ＮａＣｌ。

【図13】ｄｄＰＣＲで分析されるように、示されたＡＯＮの２’－ＭＯＥ変異体のジムノシスによる取り込みの後の、ＨｅＬａ細胞由来のヒトＣＯＬ７Ａ１前駆体ｍＲＮＡにおけるエクソン１０５スキッピングの頻度を示す。１ｘＬＮＡ：ＬＮＡ修飾された５’末端ヌクレオチド及び３’末端ヌクレオチド、２’－ＭＯＥ修飾された全ての他のヌクレオチド。２ｘＬＮＡ：ＬＮＡ修飾された２つの５’末端ヌクレオチド及び２つの３’末端ヌクレオチド、２’－ＭＯＥ修飾された全ての他のヌクレオチド。陰性対照：ＮａＣｌ。

【図14】ｄｄＰＣＲで分析されるように、示されたＡＯＮのジムノシスによる取り込みの後の、ＨｅＬａ細胞由来のヒトＣＯＬ７Ａ１前駆体ｍＲＮＡにおけるエクソン１０５スキッピングの頻度に関する様々な濃度（３μＭ、１０μＭ、３０μＭ及び５０μＭ）の示されたＡＯＮに対する用量反応を示す。ＯＭｅ：２’－ＯＭｅ修飾された全てのヌクレオチド。ＯＭｅ／１ｘＬＮＡ：ＬＮＡ修飾された５’末端ヌクレオチド及び３’末端ヌクレオチド、２’－ＯＭｅ修飾された全ての他のヌクレオチド。ＭＯＥ／１ｘＬＮＡ：ＬＮＡ修飾された５’末端ヌクレオチド及び３’末端ヌクレオチド、２’－ＭＯＥ修飾された全ての他のヌクレオチド。陰性対照：未処理。

【図15】ｄｄＰＣＲで分析されるように、カルボマーヒドロゲル製剤における示されたＡＯＮを用いた３週間の治療の後の創傷のヒト皮膚等価物（ＨＳＥ）モデルの真皮、表皮または真皮及び表皮両方由来のヒトＣＯＬ７Ａ１前駆体ｍＲＮＡにおけるエクソン１０５スキッピングの頻度を示す。ＯＭｅ：２’－ＯＭｅ修飾された全てのヌクレオチド。ＯＭｅ／１ｘＬＮＡ：ＬＮＡ修飾された５’末端ヌクレオチド及び３’末端ヌクレオチド、２’－ＯＭｅ修飾された全ての他のヌクレオチド。ＭＯＥ／１ｘＬＮＡ：ＬＮＡ修飾された５’末端ヌクレオチド及び３’末端ヌクレオチド、２’－ＭＯＥ修飾された全ての他のヌクレオチド。陰性対照：未処理。

【発明を実施するための形態】

【0015】

本発明は、従来技術に開示されるアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）に比べて、類似のまたは良好なエクソン１０５スキッピングの特徴を有しているように見えるＡＯＮを開示する。本発明のＡＯＮは活性薬剤物質としてヒト疾患、より特に表皮水疱症（ＥＢ）、更に特にヒトＣＯＬ７Ａ１遺伝子のエクソン１０５における突然変異と関連したＥＢを治療する療法に使用することができる。本発明のＡＯＮは唯一の活性薬剤物質として使用することが好ましいが、ＣＯＬ７Ａ１エクソン１０５を標的とする他のＡＯＮ（従来技術からのもの及び／または本明細書に開示されるものを含む）と組み合わせて、他のエクソンを標的とするＡＯＮ（二重変異体の場合、同じアレルまたは異なるアレルに存在し、エクソン１３、７３、７４または８０に突然変異を含む）と組み合わせて及び／またはＥＢ疾患を治療するための他の活性薬剤物質と組み合わせて使用してもよい。併用療法は単一組成または複数の組成の形で同時にまたは連続して投与されてもよい。

【0016】

いくつかのエクソン１０５突然変異は、当該技術分野において同定され、原理的にはその全ては明細書に初めて開示されるＡＯＮを用いるエクソン１０５スキッピングによって除去することができる。ヒトＣＯＬ７Ａ１のエクソン１０５に存在すると以前に同定された突然変異の例としては、ｃ．７７９５Ｇ＞Ｔ、ｃ．７８０４Ｇ＞Ａ、ｃ．７８０５Ｇ＞Ａ、ｃ．７８２８Ｃ＞Ｔ、ｃ．７８５６ｄｅｌｌ、ｃ．７８６１＿７８６５ｄｅｌ５、ｃ．７８６４Ｃ＞Ｔ、ｃ．７８６４ｄｅｌＣ、ｃ．７８６５Ｇ＞Ａ、ｃ．７８６８Ｇ＞Ａ、ｃ．７８６８Ｇ＞Ｔ及びｃ．７８７５＋ｌＧ＞Ｃが挙げられる（Ｅｓｃａｍｅｚ ｅｔ ａｌ．２０１０．Ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ＣＯＬ７Ａ１ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｓｕｒｖｅｙ ｉｎ ａ ｌａｒｇｅ Ｓｐａｎｉｓｈ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃ ｅｐｉｄｅｒｍｏｌｙｓｉｓ ｂｕｌｌｏｓａ ｃｏｈｏｒｔ：ｃ．６５２７ｉｎｓＣ ｄｉｓｃｌｏｓｅｄ ａｓ ａｎ ｕｎｕｓｕａｌｌｙ ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ．Ｂｒ Ｊ Ｄｅｒｍａｔｏｌ １６３（１）：１５５－１６１；Ｖａｒｋｉ ｅｔ ａｌ．２００７．Ｅｐｉｄｅｒｍｏｌｙｓｉｓ ｂｕｌｌｏｓａ．ＩＩ．Ｔｙｐｅ ＶＩＩ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ－ｇｅｎｏｔｙｐｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃ ｓｕｂｔｙｐｅｓ．Ｊ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ ４４：１８１－１９２；ｃｏｌ７ａｌ－ｄａｔａｂａｓｅ．ｉｎｆｏ）。非限定的な例として、ｃ．７８６４ｄｅｌＣ突然変異（タンパク質：ｐ．Ａｒｇ２６２２ＧｌｙｆｓＸ９）を本明細書において更に使用する。

【0017】

本明細書に開示されるように、ヒトＣＯＬ７Ａ１ｍＲＮＡが哺乳動物細胞内で前駆体ｍＲＮＡからスプライシングによって生産されるとき、ヒトＣＯＬ７Ａ１ｍＲＮＡへのエクソン１０５の包含を阻止または低減することができ、オリゴヌクレオチド配列がエクソン１０５の内部部分に好ましくは１００％相補的であることを特徴とするＡＯＮが同定されている。ヒトＣＯＬ７Ａ１ｍＲＮＡが哺乳動物細胞内で前駆体ｍＲＮＡからスプライシングによって生産されるとき、ヒトＣＯＬ７Ａ１ｍＲＮＡへのエクソン１０５の包含を阻止または低減することができるＡＯＮが記載されている。これらのＡＯＮは、ヒトＣＯＬ７Ａ１ｍＲＮＡへのエクソン１０５の包含を阻止または低減するのに使用される良好な候補と考えられる。本発明のＡＯＮは、互いに組み合わせてまたはエクソン１０５（もしくはヒトＣＯＬ７Ａ１ｍＲＮＡにおける他のインフレームのエクソン）のスキッピングに有効な他のＡＯＮと組み合わせて使用されてもよいが、エクソン１０５における突然変異が原因であるＤＥＢの治療のための薬剤に唯一の活性化合物として本発明のＡＯＮを使用することが好ましい。

【0018】

一態様では、本発明は、ヒトＣＯＬ７Ａ１ｍＲＮＡが細胞内で前駆体ｍＲＮＡからスプライシングによって生産されるとき、ヒトＣＯＬ７Ａ１ｍＲＮＡへのエクソン１０５の包含を阻止または低減することができるＡＯＮであって、ＡＯＮが配列番号５～６０からなる群から選択されるヌクレオチド配列及びその変異体であって、その変異体がエクソン１０５の包含を阻止または低減するために派生する親のヌクレオチド配列の活性の少なくともいくらか（例えば、全てまたは実質的に全て）を与えるその変異体を含むかまたはからなる、該ＡＯＮに関する。いくつかの実施形態では、ＡＯＮが配列番号４２、４４、４６、４８、５１、５２、５８、５９及び６０からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むかまたはからなる。いくつかの実施形態では、ＡＯＮが配列番号４２、４８及び６０からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むかまたはからなる。いくつかの実施形態では、ＡＯＮが配列番号２４、２６、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２５、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、５、６、８、９、１０、１１、１２及び１３からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むかまたはからなる。好ましい実施形態では、本発明のＡＯＮの長さは１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７または２８ヌクレオチドである。より好ましくは、本発明のＡＯＮの長さは２４ヌクレオチドである。本発明の非常に好ましいＡＯＮは、配列番号２４、配列番号２６または配列番号１４に従うヌクレオチド配列からなり、これらの長さは全て２４ヌクレオチドである。

【0019】

一実施形態では、本発明によるＡＯＮは、ヒトＣＯＬ７Ａ１のエクソン１０５と相補性がある領域を含み、相補性がある領域の長さは多くとも３０ヌクレオチドであり、好ましくは８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８または２９ヌクレオチドである。本発明のＡＯＮによって標的とされるヒトＣＯＬ７Ａ１遺伝子のエクソン１０５の（前駆体）ｍＲＮＡ中の好ましい領域は、５’－ＴＴＧＧＣＴＴＣＡＴＧＧＧ－３’（配列番号６１）の配列である。したがって、発明の好ましいＡＯＮは５’－ＣＣＣＡＵＧＡＡＧＣＣＡＡ－３’（配列番号６２）の配列を含む。

【0020】

別の態様では、本発明は、ヒトＣＯＬ７Ａ１ｍＲＮＡが細胞内で前駆体ｍＲＮＡからスプライシングによって生産されるとき、ヒトＣＯＬ７Ａ１ｍＲＮＡへのエクソン１０５の包含を阻止または低減することができるＡＯＮであって、ＡＯＮが配列番号４８、４２、６０、４４、４６、５１、５２、５８、５９、５～４１、４３、４５、４７、４９、５０及び５３～５７のいずれか１つに対応するＣＯＬ７Ａ１前駆体ｍＲＮＡ中の標的ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含むかまたはからなる、該ＡＯＮに関する。本文脈中、特定のヌクレオチド配列に対応する標的ヌクレオチド配列は、特定のヌクレオチド配列の逆相補である。例えば、配列番号６２のヌクレオチド配列に対応するＣＯＬ７Ａ１前駆体ｍＲＮＡ中の標的ヌクレオチド配列は、配列番号６１のヌクレオチド配列である。いくつかの実施形態では、ＡＯＮが配列番号４８、４２、６０、４４、４６、５１、５２、５８及び５９のいずれか１つに対応するＣＯＬ７Ａ１前駆体ｍＲＮＡ中の標的ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含むかまたはからなる。いくつかの実施形態では、ＡＯＮが配列番号４８、４２または６０に対応するＣＯＬ７Ａ１前駆体ｍＲＮＡ中の標的ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含むかまたはからなる。いくつかの実施形態では、ＡＯＮが配列番号２４、２６、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２５、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、５、６、８、９、１０、１１、１２及び１３のいずれか１つに対応するＣＯＬ７Ａ１前駆体ｍＲＮＡ中の標的ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含むかまたはからなる。いくつかの実施形態では、オリゴリボヌクレオチドは、生理学的条件下でＣＯＬ７Ａ１前駆体ＲＮＡ分子中の標的ヌクレオチド配列にアニール化され、それによりエクソン１０５のスキッピングを促進することができるように、標的ヌクレオチド配列に相補的なオリゴリボヌクレオチド中のヌクレオチド配列は、標的ヌクレオチド配列に対して十分な相補性の程度を有する。いくつかの実施形態では、標的ヌクレオチド配列に相補的なオリゴリボヌクレオチド中のヌクレオチド配列は、標的ヌクレオチド配列に対して約８０％以上（例えば、約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のいずれか）の相補性の程度を有する。

【0021】

本発明によるＡＯＮはオリゴリボヌクレオチドであることが好ましい。ＡＯＮは少なくとも非天然型結合修飾を含むことがより好ましく、その非天然型結合修飾がホスホロチオエート結合であることが更により好ましい。好ましい態様では、本発明によるＡＯＮは、糖部位の２’位、３’位及び／または５’位で１つまたは２つ置換している少なくとも１つのヌクレオチドを含む。置換が、－ＯＨ；－Ｆ；１つ以上のヘテロ原子により中断されてもよい置換または非置換の、直鎖または分枝鎖低級（Ｃ１－Ｃ１０）アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アリルまたはアラルキル；Ｏ－アルキル、Ｓ－アルキルまたはＮ－アルキル；Ｏ－アルケニル、Ｓ－アルケニルまたはＮ－アルケニル；Ｏ－アルキニル、Ｓ－アルキニルまたはＮ－アルキニル；Ｏ－アリル、Ｓ－アリルまたはＮ－アリル；Ｏ－アルキル－Ｏ－アルキル；－メトキシ；－アミノプロポキシ；－メトキシエトキシ；－ジメチルアミノオキシエトキシ；及び－ジメチルアミノエトキシエトキシからなる群から選択されることが好ましい。非常に好ましい態様では、本発明によるＡＯＮの全ての糖部位は２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）置換で修飾されるかまたは全ての糖部位は２’－メトキシエトキシ（２’－ＭＯＥ）置換で修飾される。いくつかの実施形態では、５’末端ヌクレオチド及び３’末端ヌクレオチドでの修飾を除く全ての糖部位は２’－ＯＭｅ置換または２’－ＭＯＥ置換で修飾され、この修飾はロック核酸（ＬＮＡ）修飾などの異なる修飾を含み得る。いくつかの実施形態では、２つの５’末端ヌクレオチド及び２つの３’末端ヌクレオチドでの修飾を除く全ての糖部位は２’－ＯＭｅ置換または２’－ＭＯＥ置換で修飾され、この修飾はＬＮＡ修飾などの異なる修飾を含み得る。

【0022】

別の実施形態では、本発明は、配列番号５～６０からなる群から選択される配列を有する、本発明によるＡＯＮをコードするヌクレオチド配列を表現形式で含むウイルスベクターに関する。いくつかの実施形態では、ＡＯＮが配列番号４２、４４、４６、４８、５１、５２、５８、５９及び６０からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むかまたはからなる。いくつかの実施形態では、ＡＯＮが配列番号４２、４８及び６０からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むかまたはからなる。いくつかの実施形態では、ＡＯＮが配列番号２４、２６、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２５、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、５、６、８、９、１０、１１、１２及び１３からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むかまたはからなる。本発明はまた、本発明によるＡＯＮまたは本発明によるウイルスベクターを含み、キャリア、賦形剤、安定化剤、トランスフェクション試薬、希釈液、ゲル化剤またはバッファーの１つ以上を更に含む医薬組成物に関する。

【0023】

更に別の態様では、本発明は、栄養障害型表皮水疱症（ＤＥＢ）に罹患するヒト被検体の治療に使用される本発明によるＡＯＮであって、ＤＥＢが被検体のＣＯＬ７Ａ１遺伝子のエクソン１０５における突然変異が原因であることが好ましい、突然変異がｃ．７８６４ｄｅｌＣ突然変異であることがより好ましい、該ＡＯＮに関する。治療は、ＡＯＮを含むヒドロゲル製剤（例えば、カルボマーヒドロゲル製剤）の使用などのＡＯＮの局所投与を含むことが好ましい。

【0024】

別の態様では、本発明は、ＤＥＢの治療、予防、寛解または遅延のための薬剤の作製における本発明によるＡＯＮまたは本発明によるウイルスベクターの使用であって、ＤＥＢがＣＯＬ７Ａ１遺伝子のエクソン１０５における突然変異が原因であることが好ましく、突然変異がｃ．７８６４ｄｅｌＣ突然変異であることがより好ましい、該使用に関する。

【0025】

更に別の態様では、本発明は、ヒトＣＯＬ７Ａ１ｍＲＮＡがヒト細胞内で前駆体ｍＲＮＡからスプライシングによって生産されるとき、ヒトＣＯＬ７Ａ１ｍＲＮＡへのエクソン１０５の包含を阻止または低減する方法であって、インビトロ、インビボまたはエクスビボの設定で細胞を準備することと、細胞に本発明によるＡＯＮ、本発明によるウイルスベクターまたは本発明による医薬組成物を投与することとを含む、該方法に関する。別の態様では、本発明は、ヒト被検体のＤＥＢの治療のための方法であって、被検体に本発明によるＡＯＮ、ウイルスベクターまたは医薬組成物を投与するステップを含む、該方法に関する。ＤＥＢがヒト被検体のＣＯＬ７Ａ１遺伝子のエクソン１０５における突然変異が原因であることが好ましい、突然変異がｃ．７８６４ｄｅｌＣ突然変異であることがより好ましい。

【0026】

本発明の全ての実施形態では、用語「エクソンの包含を阻止するかまたは少なくとも低減する」及び「エクソンスキッピング」は同義である。ＣＯＬ７Ａ１に関して「エクソンの包含を阻止するかまたは少なくとも低減する」及び「エクソンスキッピング」は、ヒトＣＯＬ７Ａ１前駆体ｍＲＮＡからのエクソン１０５の排除として解釈されるものである。本明細書において用語エクソンスキッピングは、エクソンスキッピングなしで成熟ｍＲＮＡに存在する特定のエクソンを含まない成熟ｍＲＮＡの細胞内の導入として定義される。エクソンスキッピングは、例えば、スプライシングの生化学的プロセスを許容するために必要なスプライスドナーまたはスプライスアクセプター配列などの配列を妨げることができる分子または成熟ｍＲＮＡに含まれるエクソンとしてヌクレオチドのストレッチの認識に必要なエクソン包含シグナルを妨げることができる分子を成熟ｍＲＮＡの前駆体ｍＲＮＡを発現する細胞に提供することによって達成される。このような分子はエクソンスキッピング分子を意味することもある。

【0027】

用語前駆体ｍＲＮＡは、転写によって細胞中でＤＮＡテンプレートから合成される、処理していないまたは部分的に処理された前駆体ｍＲＮＡを意味する。

【0028】

用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」（本明細書において、一般的にＡＯＮと略記され、他でＡＳＯと略記されることもある）は、前駆体ｍＲＮＡ分子ｈｎＲＮＡ（ヘテロ核ＲＮＡ）またはｍＲＮＡ分子における標的ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を意味することが理解され、それに対応する標的配列とアニール化されることが可能である。本発明のＡＯＮは一本鎖であることが好ましい。

【0029】

本明細書で用いられる用語「相補的」は「完全に相補的」及び「実質的に相補的」を含み、これらはオリゴヌクレオチドとそれに対応する標的配列の間の相補性の程度が通常８０％を超え、好ましくは８５％を超え、更により好ましくは９０％を超え、最も好ましくは９５％を超えることを意味する。例えば、長さが２０ヌクレオチドであるオリゴヌクレオチドの配列とその標的配列との間に１つのミスマッチを有する当該オリゴヌクレオチドに対する相補性の程度は９５％である。アンチセンス配列の相補性の程度は、生理学的条件下でアンチセンス配列を含む分子がＲＮＡ分子中の標的ヌクレオチド配列にアニール化され、それによりエクソンスキッピングを促進することができるようなものが好ましい。所定のミスマッチは、融解温度すなわちＴｍに関して発現されるＡＯＮと標的配列の間での結合の強度への影響が他のミスマッチよりも小さいため、所定のミスマッチが他のミスマッチより許容できることが当業者に周知されている。所定の非相補的な塩基対は、真のミスマッチより少ない程度まで全体の結合を破壊する、いわゆる「ゆらぎ」を形成する場合がある。ＡＯＮの長さも結合の強度においてある役割を果たし、一般にＡＯＮは長い方が短いものより高い融解温度を有する。オリゴヌクレオチドのＧ／Ｃ含有量も結合の強度を決定する因子であり、Ｇ／Ｃ含有量が高いほど、任意の所定の長さに対して融解温度が高くなる。単一の突然変異がＡＯＮに相補的である領域内にあるエクソン１０５に存在する場合、ＡＯＮは標的配列に完全に相補的であるとわけではない（例えば、ＡＯＮが野生型配列に相補的である場合）が、エクソンスキッピングを引き起こすにはまだ効率的である。本発明によって考えられるように、核酸塩基または糖－リン酸主鎖の所定の化学修飾も結合の強度に影響する場合があるため、本発明によるオリゴヌクレオチドを設計する際、相補性の程度は考慮に入れるべき唯一の因子である。

【0030】

オリゴヌクレオチドにおける１つのＣｐＧまたは複数（２以上）のＣｐＧの存在は、通常オリゴヌクレオチドの免疫原性の上昇に関連する。治療されるべき組織、すなわち皮膚（真皮及び／または表皮）の創傷を誘発し得るため、免疫原性の上昇は望ましくない。したがって、本発明のＡＯＮは１つまたは２つ以下のＣｐＧジヌクレオチド配列を含むことが好ましい。本発明のＡＯＮは多くても１つのＣｐＧジヌクレオチド配列を含むことがより好ましい。本発明のＡＯＮはＣｐＧジヌクレオチド配列を含まないことが更により好ましい。

【0031】

本発明は、許容できるＲＮＡ結合動力学及び／または熱力学的性質を有するオリゴヌクレオチドを設計することを可能にする。ＲＮＡ結合動力学及び／または熱力学的性質は、ＡＯＮ標的エクソン複合体の基準Ｔｍ及び最も近い隣接モデル、ならびに／または自由エネルギーを使用して一本鎖ＲＮＡのためにオリゴヌクレオチドのＴｍ（当業者に知られているオリゴヌクレオチド特性計算機で算出される）によって少なくとも部分的に決定される。Ｔｍが高すぎる場合、オリゴヌクレオチドはより特異的ではないと考えられる。許容できるＴｍ及び自由エネルギーは、オリゴヌクレオチドの配列、主鎖（ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホラミデート、ペプチド－核酸など）の化学的性質、糖部位（リボース、デオキシリボース、置換リボース及び分子内架橋）の性質及び核酸塩基の化学修飾に依存する。したがって、Ｔｍの範囲はかなり広くなり得る。

【0032】

任意の所定のプライマーセットに対して、所定数のＰＣＲサイクル後、増幅した野生型バンドの濃度を決定子、増幅した短縮（エクソン１０５なし）バンドの濃度で割り、１００％をかけることによってエクソンスキッピングの割合または効率を計算してもよい。ただしサイクル数は増幅がまだ対数期にあるものとする。定量化は、ＤＮＡ１０００キットと組み合わせてＡｇｉｌｅｎｔ ２１００ バイオアナライザーを用いて行うことができる。

【0033】

本発明によるＡＯＮは、配列番号１に示すようにヌクレオチド配列と相補的な配列を含むことが好ましく、相補部分が標的配列に少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、最も好ましくは約１００％相補的になるものである。したがって、相補性がある領域における全ての塩基が反対の鎖の塩基と対になることができることが絶対に必要という訳ではない。例えば、オリゴヌクレオチドを設計する際、相補鎖上の塩基と塩基対にならない残基を組み込みたいと考えてもよい。細胞内の状況下でヌクレオチドのストレッチが相補部分に十分にハイブリダイズする場合、ミスマッチがある程度許容されてもよい。本文脈中、「十分に」は本発明によるＡＯＮがエクソン１０５のエクソンスキッピングを誘導することができることを意味する。好都合なことに、標的エクソンのスキッピングはＰＣＲ／バイオアナライザーまたはデジタルドロップレットＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）で評価してもよい。相補領域を組み合わせる際、前駆体ｍＲＮＡ中のエクソンに特異的となるように相補領域を設計することが好ましい。このような特異性は系内の他の（前駆体）ｍＲＮＡ分子中の実際の配列に依存するため、相補領域の様々な長さを使用して作成してもよい。製造性、精製及び／または分析論に対する問題になるほどオリゴヌクレオチドの長さは長くないが、オリゴヌクレオチドが１つ以上の他の前駆体ｍＲＮＡ分子にもハイブリダイズすることを可能にするリスクは、オリゴヌクレオチドのサイズが増加するとともに減少する。

【0034】

本発明において、相補性領域にミスマッチを含むが、前駆体ｍＲＮＡ中の標的領域（複数可）にハイブリダイズ及び／又は結合する能力を保持するＡＯＮを使用可能なことは明らかである。しかし、少なくとも相補部分は、通常１以上の相補領域にこのようなミスマッチを有するＡＯＮよりも効率性が高くかつ特異性が高いため、この相補部分はこのようなミスマッチを含まないことが好ましい。ハイブリダイゼーション強度がより高いと（すなわち、反対の鎖と相互作用する数が増加すると）、系のスプライシング機構を妨げるプロセスの効率を上げる際に有利であると考えられる。相補性は９０％から１００％であることが好ましい。一般に、これは２０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドに１つまたは２つのミスマッチを許容している。

【0035】

本発明のエクソンスキッピング分子は単離された一本鎖（アンチセンス）オリゴヌクレオチドであることが好ましく、このオリゴヌクレオチドはエクソン１０５配列（配列番号１）に相補的であり、ヒトＣＯＬ７Ａ１エクソン１０５ＤＮＡから転写されるＲＮＡ標的配列に向け相補性が求められる。

【0036】

オリゴヌクレオチドの相補部分の長さはオリゴヌクレオチドと同じ長さであり、標的ＲＮＡと塩基対を形成しないＡＯＮの５’末端または３’末端が存在しないことを意味することが好ましい。したがって、本発明のＡＯＮの好ましい長さは２４ヌクレオチド以下であり、例えば、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４ヌクレオチドである。特に良好な結果は、２０、２１、２２、２３または２４ヌクレオチドの長さを有するＡＯＮを用いて得られている。

【0037】

本明細書に詳述されるように、本発明によるＡＯＮは、多くのＤＮＡ残基（結果的に、ＲＮＡ「ｕ」残基はＤＮＡ対応物として「ｔ」残基となる）のうちの１つまたは１つ以上のＲＮＡ残基及び／または１つ以上のヌクレオチド類似体もしくは等価物を含んでもよい。

【0038】

本発明のＡＯＮがヌクレアーゼ耐性を上昇させ、かつ／または標的配列に対するＡＯＮの親和性を上昇させるために修飾される１以上の残基を含むことが好ましい。したがって、好ましい実施形態では、アンチセンスヌクレオチド配列は少なくとも１つのヌクレオチド類似体または等価物を含み、ここでヌクレオチド類似体または等価物は（非天然型）修飾塩基及び／または（非天然型）修飾主鎖及び／または（非天然型）ヌクレオシド間の結合またはこれらの修飾の組み合わせを有する残基として定義される。「非天然型」は修飾が天然で出現しないことを意味し、非天然型修飾を本発明のＡＯＮに導入する場合、このようなＡＯＮが天然で出現するかまたは天然現象を示す産物であることを意味する（ことが好ましい）。

【0039】

好ましい実施形態では、ヌクレオチド類似体または等価物は修飾主鎖を含む。このような主鎖としては、モルフォリノ主鎖、カルバメート主鎖、シロキサン主鎖、スルフィド、スルホキシド及びスルホン主鎖、ホルムアセチル及びチオホルムアセチル主鎖、メチレンホルムアセチル主鎖、リボアセチル主鎖、アルケン含有主鎖、スルファマート、スルホナート及びスルホンアミド主鎖、メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ主鎖、ならびにアミド主鎖が挙げられる。ホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマーはアンチセンス薬としてこれまで検討されている修飾主鎖オリゴヌクレオチドである。モルフォリノオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡのデオキシリボース糖が六員環で置換され、ホスホジエステル結合がホスホロジアミデート結合で置換される非電荷の主鎖を有する。モルフォリノオリゴヌクレオチドは酵素分解に耐性を有し、ＲＮａｓｅ Ｈを活性化するよりもむしろ翻訳を停止するかまたは前駆体ｍＲＮＡスプライシングを妨げることによりアンチセンス薬として機能するように見える。モルフォリノオリゴヌクレオチドは物理的に細胞膜を破壊する方法で組織培養細胞へ適切に送達され、これらの方法のいくつかを比較する研究からスクレープ負荷が最も効率的な送達方法であることが分かった。しかし、モルフォリノ主鎖は非電荷のため、カチオン性脂質が細胞に取り込まれたモルフォリノオリゴヌクレオチドの有効なメディエーターではない。

【0040】

一実施形態では、好ましいヌクレオチド類似体または等価物は修飾ポリアミド主鎖を有するペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む。ＰＮＡ系分子は塩基対の認識に関するＤＮＡ分子の典型的な擬態である。ＰＮＡの主鎖はペプチド結合で連結されるＮ－（２－アミノエチル）－グリシンユニットからなり、これは核酸塩基がメチレンカルボニル結合で主鎖に連結される。代替主鎖は１炭素延長ピロリジンＰＮＡモノマーを含む。ＰＮＡ分子の主鎖は荷電リン酸基を含まないため、ＰＮＡ－ＲＮＡハイブリッドはそれぞれ通常ＲＮＡ－ＲＮＡまたはＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッドより安定している。

【0041】

本発明の一実施形態によると、主鎖中の残基間の結合はリン酸原子を含まず、例えば、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間の結合で形成される結合、混合ヘテロ原子とアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間の結合または１つ以上の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環式ヌクレオシド間の結合である。

【0042】

更に別の実施形態では、本発明のヌクレオチド類似体または等価物はホスホジエステル結合中に非架橋酸素の１つの置換を含む。この修飾は塩基対形成をわずかに不安定にするが、ヌクレアーゼ分解に対する有意な耐性を追加する。好ましいヌクレオチド類似体または等価物は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホストリエステル、Ｈ－ホスホネート、メチルホスホネート及び３’－ルキレンホスホネート、５’－ルキレンホスホネート及びキラルホスホネートを含むアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’－アミノホスホルアミデート及びアミノアルキルホスホルアミデートを含むホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスフェートまたはボラノホスフェートを含む。本発明は標的核酸に結合することができるＡＯＮを包含し、少なくとも１つのヌクレオシド間の結合がキラル中心（Ｘ－ホスホネート部位を含み、式中、Ｘがアルキル、アルコキシ、アリール、アルキルチオ、アシル、－ＮＲ^１Ｒ^１、アルケニルオキシ、アルキニルオキシ、アルケニルチオ、アルキニルチオ、－Ｓ－Ｚ^＋、－Ｓｅ－Ｚ^＋もしくは－ＢＨ_３－Ｚ^＋であり、Ｒ^１は独立して水素、アルキル、アルケニル、アルキニルもしくはアリール、Ｚ^＋はアンモニウムイオン、アルキルアンモニウムイオン、ヘテロ芳香族イミニウムイオンもしくはヘテロ環状イミニウムイオン、これらのうちいくつかは１次、２次、３次もしくは４次であり、Ｚは１価の金属イオンである）を含むことが好ましいことが理解されるべきである。計算モデリングを使用するこのような結合自体の忍容性の決定及びキラル中心を含む結合の好ましいＳｐまたはＲｐ立体異性体の決定の両方により、本発明の部分が形成される。

【0043】

好ましい一実施形態では、本発明はＡＯＮに関し、ここでキラリティーを示すヌクレオシド間の結合がホスホロチオエート結合である。更に好ましい実施形態では、本発明のＡＯＮは所定のＲｐまたはＳｐホスホロチオエート構成を有する少なくとも１つのヌクレオシド間の結合を含み、これはＡＯＮの製造時、ホスホロチオエート結合のＲｐまたはＳｐ構成が標的配列の方へのＡＯＮの安定性及び／または効率を向上するように選択されることを意味する。それに加え、ＡＯＮ中の全てのホスホロチオエート結合が予め選択されたＲｐまたはＳｐ構成（またはＡＯＮ全体にわたるそれらの組合せ）を有する点でＡＯＮは完全に立体化学的に純粋であってもよい。

【0044】

本発明の更に好ましいヌクレオチド類似体または等価物は、－ＯＨ；－Ｆ；１つ以上のヘテロ原子により中断されてもよい置換または非置換の、直鎖または分枝鎖低級（Ｃ１－Ｃ１０）アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アリルまたはアラルキル；Ｏ－、Ｓ－またはＮ－アルキル；Ｏ－、Ｓ－またはＮ－アルケニル；Ｏ－、Ｓ－またはＮ－アルキニル；Ｏ－、Ｓ－またはＮ－アリル；Ｏ－アルキル－Ｏ－アルキル；－メトキシ；－アミノプロポキシ；－メトキシエトキシ；－ジメチルアミノオキシエトキシ；または－ジメチルアミノエトキシエトキシなどの２’位、３’位及び／または５’位で１つまたは２つ置換している１以上の糖部位を含む。

【0045】

本明細書に開示される非限定的な例に更に概説されるように、糖部位の特に好ましい修飾は２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）及び２’－メトキシエトキシ（２’－Ｏ－メトキシエチル、すなわち２’－ＭＯＥ）修飾である。糖部位はまた、フラノースもしくはその誘導体、またはデオキシフラノースもしくはその誘導体、好ましくはリボースもしくはその誘導体、またはデオキシリボースもしくはその誘導体であってもよい。好ましい誘導体化した糖部位はロック核酸（ＬＮＡ）を含み、これは２’炭素原子が糖環の３’または４’炭素原子に結合し、２環式糖部位を形成する。好ましいＬＮＡは２’－Ｏ，４’－Ｃ－エチレン架橋核酸を含む。これらの置換はヌクレオチド類似体または等価物ＲＮａｓｅ Ｈ及びヌクレアーゼ耐性を付与し、標的ＲＮＡに対する親和性を増大させる。いくつかの実施形態では、本発明のＡＯＮは１種類より多い糖部位修飾を含む。例えば、本発明のＡＯＮのいくつかの実施形態では、５’末端ヌクレオチド及び３’末端ヌクレオチドがＬＮＡ修飾され、全ての他の糖部位が２’－ＯＭｅ置換または２’－ＭＯＥ置換で修飾され、他の実施形態では、２つの５’末端ヌクレオチド及び２つの３’末端ヌクレオチドがＬＮＡ修飾され、全ての他の糖部位が２’－ＯＭｅ置換または２’－ＭＯＥ置換で修飾される。

【0046】

アンチセンスオリゴヌクレオチド中のヌクレオシド間の全ての結合が修飾される必要がないことは当業者に理解される。例えば、いくつかのヌクレオシド間の結合は修飾されなくてもよいが、他のヌクレオシド間の結合は修飾される。ＡＯＮの長さに沿って均一または不均一に分布する、（修飾）ヌクレオシド間結合の１つの型、（修飾）ヌクレオシド間結合の複数の型からなる主鎖を含むＡＯＮは全て本発明によって包含される。さらに、主鎖修飾（均一、不均一、１つの型または複数の型及びその全ての入れ替え）の任意の様式は、以下に記載の糖もしくはヌクレオチド修飾または類似体の任意の型と組み合わせてもよい。

【0047】

本発明によるＡＯＮのための特に好ましい主鎖は均一な（全て）ホスホロチオエート（ＰＳ）主鎖であり、それはキラリティー（予め選択されたＲｐ及び／またはＳｐ構成で）において立体化学的に純粋にしてもよい（上で概説されるように）。

【0048】

別の実施形態では、本発明のヌクレオチド類似体または等価物は１以上の塩基修飾または置換を含む。修飾塩基はイノシン、キサンチン、ヒポキサンチン及び当該技術分野において知られているまたは知られるであろうピリミジン及びプリン塩基の他の－アザ、－デアザ、－ヒドロキシ、－ハロ、－チオ、チオール、－アルキル、－アルケニル、－アルキニル、チオアルキル誘導体などの合成及び天然塩基を含む。

【0049】

ＡＯＮ中の全ての位置が均一に修飾される必要がないことは当業者に理解される。さらに、上記類似体または等価物の１つを超えるものが単独ＡＯＮにまたはＡＯＮ内の単独の位置で組み込まれてもよい。ある実施形態では、本発明のＡＯＮは少なくとも２種類の異なる類似体または等価物を有する。

【0050】

好ましい実施形態によると、本発明によるＡＯＮは２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）修飾リボース（ＲＮＡ）、２’－Ｏ－メトキシエチル（＝２’－メトキシエトキシ；２’－ＭＯＥ）修飾リボース、２’－Ｏ－エチル修飾リボース、２’－Ｏ－プロピル修飾リボース及び／またはハロゲン化誘導体などのこれらの修飾の置換誘導体などの２’－Ｏ（好ましくは低級）アルキルホスホロチオエートＡＯＮを含む。

【0051】

本発明による有効かつ好ましいＡＯＮ型式はホスホロチオエート主鎖を有する２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）修飾リボース部位を含み、ここで実質的に全てのリボース部位が２’－ＯＭｅであり、実質的に全てのヌクレオシド間の結合がホスホロチオエート結合であることが好ましい。本発明による更に別の有効かつ好ましいＡＯＮ型式はホスホロチオエート主鎖を有する２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）修飾リボース部位を含み、ここで実質的に全てのリボース部位が２’－ＭＯＥであり、実質的に全てのヌクレオシド間の結合がホスホロチオエート結合であること好ましい。

【0052】

いくつかの実施形態では、配列番号５～６０からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むかまたはからなり、全ての糖部位が２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）置換で修飾される、本発明によるＡＯＮが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、ＡＯＮが配列番号４８、４２、６０、４４、４６、５１、５２、５８及び５９からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むかまたはからなる。いくつかの実施形態では、ＡＯＮが配列番号４８、４２及び６０からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むかまたはからなる。いくつかの実施形態では、ＡＯＮが配列番号４８のヌクレオチド配列を含むかまたはからなる。いくつかの実施形態では、ＡＯＮが配列番号４２のヌクレオチド配列を含むかまたはからなる。いくつかの実施形態では、ＡＯＮが配列番号６０のヌクレオチド配列を含むかまたはからなる。いくつかの実施形態では、ＡＯＮが配列番号２４、２６、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２５、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、５、６、８、９、１０、１１、１２及び１３からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むかまたはからなる。いくつかの実施形態では、ＡＯＮが完全なホスホロチオエート主鎖を有する。

【0053】

いくつかの実施形態では、配列番号５～６０からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むかまたはからなり、全ての糖部位が２’－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）置換で修飾される、本発明によるＡＯＮが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、ＡＯＮが配列番号４８、４２、６０、４４、４６、５１、５２、５８及び５９からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むかまたはからなる。いくつかの実施形態では、ＡＯＮが配列番号４８、４２及び６０からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むかまたはからなる。いくつかの実施形態では、ＡＯＮが配列番号４８のヌクレオチド配列を含むかまたはからなる。いくつかの実施形態では、ＡＯＮが配列番号４２のヌクレオチド配列を含むかまたはからなる。いくつかの実施形態では、ＡＯＮが配列番号６０のヌクレオチド配列を含むかまたはからなる。いくつかの実施形態では、ＡＯＮが配列番号２４、２６、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２５、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、５、６、８、９、１０、１１、１２及び１３からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むかまたはからなる。いくつかの実施形態では、ＡＯＮが完全なホスホロチオエート主鎖を有する。

【0054】

いくつかの実施形態では、配列番号５～６０からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むかまたはからなり、５’末端ヌクレオチド及び３’末端ヌクレオチドがＬＮＡ修飾され、全ての他の糖部位が２’－ＯＭｅ置換もしくは２’－ＭＯＥ置換で修飾される、本発明によるＡＯＮが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、全ての他の糖部位が２’－ＯＭｅ置換で修飾される。いくつかの実施形態では、全ての他の糖部位が２’－ＭＯＥ置換で修飾される。いくつかの実施形態では、ＡＯＮが配列番号４８、４２、６０、４４、４６、５１、５２、５８及び５９からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むかまたはからなる。いくつかの実施形態では、ＡＯＮが配列番号４８、４２及び６０からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むかまたはからなる。いくつかの実施形態では、ＡＯＮが配列番号４８のヌクレオチド配列を含むかまたはからなる。いくつかの実施形態では、ＡＯＮが配列番号４２のヌクレオチド配列を含むかまたはからなる。いくつかの実施形態では、ＡＯＮが配列番号６０のヌクレオチド配列を含むかまたはからなる。いくつかの実施形態では、ＡＯＮが配列番号２４、２６、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２５、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、５、６、８、９、１０、１１、１２及び１３からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むかまたはからなる。いくつかの実施形態では、ＡＯＮが完全なホスホロチオエート主鎖を有する。

【0055】

いくつかの実施形態では、配列番号５～６０からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むかまたはからなり、２つの５’末端ヌクレオチド及び２つの３’末端ヌクレオチドがＬＮＡ修飾され、全ての他の糖部位が２’－ＯＭｅ置換もしくは２’－ＭＯＥ置換で修飾される、本発明によるＡＯＮが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、全ての他の糖部位が２’－ＯＭｅ置換で修飾される。いくつかの実施形態では、全ての他の糖部位が２’－ＭＯＥ置換で修飾される。いくつかの実施形態では、ＡＯＮが配列番号４８、４２、６０、４４、４６、５１、５２、５８及び５９からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むかまたはからなる。いくつかの実施形態では、ＡＯＮが配列番号４８、４２及び６０からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むかまたはからなる。いくつかの実施形態では、ＡＯＮが配列番号４８のヌクレオチド配列を含むかまたはからなる。いくつかの実施形態では、ＡＯＮが配列番号４２のヌクレオチド配列を含むかまたはからなる。いくつかの実施形態では、ＡＯＮが配列番号６０のヌクレオチド配列を含むかまたはからなる。いくつかの実施形態では、ＡＯＮが配列番号２４、２６、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２５、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、５、６、８、９、１０、１１、１２及び１３からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むかまたはからなる。いくつかの実施形態では、ＡＯＮが完全なホスホロチオエート主鎖を有する。

【0056】

ＣＯＬ７Ａ１遺伝子のエクソン１０５の効率的なスキッピングのために、異なるＡＯＮを組み合わせることができることは当業者にも理解されるだろう。少なくとも１つのＡＯＮが本発明によるものである限り、本発明の方法にエクソン１０５の同じまたは異なる領域を標的とする２つの異なるＡＯＮ、３つの異なるＡＯＮ、４つの異なるＡＯＮまたは５つの異なるＡＯＮなどの２つ以上の異なるＡＯＮの組合せを使用してもよい。いくつかの実施形態では、２つ以上の異なるＡＯＮの組合せは、配列番号４２のヌクレオチド配列を含むかまたはからなる本発明の第１ＡＯＮ及び配列番号４４のヌクレオチド配列を含むかまたはからなる本発明の第２ＡＯＮを含む。いくつかの実施形態では、２つ以上の異なるＡＯＮの組合せは、配列番号４５のヌクレオチド配列を含むかまたはからなる本発明の第１ＡＯＮ及び配列番号５２のヌクレオチド配列を含むかまたはからなる本発明の第２ＡＯＮを含む。いくつかの実施形態では、２つ以上の異なるＡＯＮの組合せは配列番号４８のヌクレオチド配列を含むかまたはからなる本発明の第１ＡＯＮ及び配列番号５１のヌクレオチド配列を含むかまたはからなる本発明の第２ＡＯＮを含む。

【0057】

ＡＯＮは細胞、好ましくは皮膚細胞中ＡＯＮの取り込みを増強する部位に連結することができる。このような部位としては、コレステロール、炭水化物、ビタミン、ビオチン、脂質、リン脂質、アンテナペディア、ＴＡＴ、トランスポータンを含むが、これらに限定されない細胞透過性ペプチド、オリゴアルギニンン、ポリアルギニン、オリゴリシンまたはポリリシンなどの正に荷電したアミノ酸、抗原によって提供されるような抗原結合ドメイン、抗原のＦａｂフラグメントまたはラクダ単一ドメイン抗原結合ドメインなどの単鎖抗原結合ドメインが挙げられる。好ましい投与方法はカルボマーヒドロゲルなどの本発明のＡＯＮを配合したヒドロゲルを利用する。

【0058】

本発明によるＡＯＮは、裸の（ジムノシスによる）ＡＯＮまたは複合体の形態またはベクターから発現され（ベクトル化したＡＯＮ）てもよい。ＡＯＮは、当該技術分野において知られている適切な手段を使用して投与されてもよい。エクソンスキッピング分子がベクター化したＡＯＮであるとき、このＡＯＮは、例えば、発現ベクターがオリゴヌクレオチドを含む転写物をコードする発現ベクターの形態でエクソンスキッピング分子が個体または個体の細胞、組織もしくは器官に提供されてもよい。発現ベクターはウイルスベクターなどの遺伝子送達媒体を介して細胞、組織、器官または個体に導入されることが好ましい。好ましい実施形態では、本明細書において同定されるように、エクソンスキッピング分子の発現または転写を駆動する発現カセットまたは転写カセットを含むウイルス系発現ベクターが提供される。したがって、本発明は、エクソンスキッピング分子の発現につながる条件下に配置されるとき、本発明によるＡＯＮを発現するウイルスベクターを提供する。細胞はエクソン１０５の包含に必須または少なくともつながる配列を妨げることができるエクソンスキッピング分子を備え得るため、このような妨害では、例えば、アデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルス系ベクターによって提供されるプラスミド由来ＡＯＮ発現またはウイルス発現によってＣＯＬ７Ａ１ｍＲＮＡへのエクソン１０５の包含を阻止または少なくとも低減する。発現はＵ１、Ｕ６またはＵ７ＲＮＡプロモーターなどのポリメラーゼＩＩＩプロモーターによって駆動されてもよい。好ましい送達媒体はアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）などのウイルスベクターまたはレンチウイルスなどのレトロウイルスベクターなどである。また、本明細書に定義されるように、プラスミド、人工染色体、標的相同組換えに使用可能なプラスミド及び細胞の哺乳動物（好ましくはヒト）ゲノムの組込みをオリゴヌクレオチドの送達に好適に適用してもよい。転写がＰｏｌ－ＩＩＩプロモーターから駆動され、かつ／または転写物がＵ１またはＵ７転写物との融合物の形態であるベクターが本発明にとって好ましく、これが小さい転写物の送達に関する良好な結果をもたらす。適した転写物を設計することは当業者の技術の範囲内である。Ｐｏｌ－ＩＩＩ駆動転写物が好ましい。Ｕ１またはＵ７転写物との融合転写物の形態が好ましい。

【0059】

本発明はまた、ＣＯＬ７Ａ１エクソン１０５のスキッピングを誘発するための本発明のＡＯＮの発現のため、ＰｏｌＩＩＩ－プロモーター駆動発現カセットを含むウイルス性ベクターを提供する。本明細書に他で示されるように、本発明によるＡＡＶベクターは組換えＡＡＶベクターであり、ＡＡＶ血清型由来のキャプシドタンパク質のタンパク質シェルにキャプシド形成される本発明によるコードしたＡＯＮを含むＡＡＶゲノムの一部を含むＡＡＶベクターを意味する。ＡＡＶゲノムの一部はＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９などのアデノ随伴ウイルス血清型由来の逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含有してもよい。キャプシドタンパク質からなるタンパク質シェルはＡＡＶ１、２、３、４、５、６、７、８、９などのＡＡＶ血清型に由来してもよい。タンパク質シェルはキャプシドタンパク質シェルと呼ばれる場合もある。ＡＡＶベクターは１つまたは好ましくは全ての欠失した野生型ＡＡＶ遺伝子を有していてもよいが、機能的なＩＴＲ核酸配列をまだ含んでもよい。機能的なＩＴＲ配列はＡＡＶビリオンの複製、レスキュー及びパッケージングに必要である。ＩＴＲ配列は野生型配列であってもよく、または野生型配列との少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％もしくは１００％の配列同一性を有してもよく、またはＩＴＲ配列が機能的なままである限り、例えば、ヌクレオチドの挿入、突然変異、欠失もしくは置換で変更されてもよい。本文脈中、機能性はキャプシドシェルにゲノムを直接パッケージングし、感染する宿主細胞または標的細胞中の発現を可能にする能力を示す。本発明に関連して、キャプシドタンパク質シェルはＡＡＶベクターゲノムＩＴＲと異なる血清型であってもよい。したがって、本発明によるＡＡＶベクターはキャプシドタンパク質シェル、すなわち正二十面体キャプシドからなってもよく、このキャプシドはＡＡＶ血清型、例えば、ＡＡＶ血清型２のキャプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２及び／またはＶＰ３）である。一方、そのＡＡＶ５ベクターに含有されるＩＴＲ配列はＡＡＶ２ベクターを含む上記ＡＡＶ血清型のいずれかであってもよい。したがって、「ＡＡＶ２ベクター」はＡＡＶ血清型２のキャプシドタンパク質シェルを含み、例えば、「ＡＡＶ５ベクター」はＡＡＶ血清型５のキャプシドタンパク質シェルを含み、それによりＡＡＶ２ベクターまたはＡＡＶ５ベクターのいずれかは本発明による任意のＡＡＶベクターゲノムＩＴＲをキャプシド形成してもよい。本発明による組換えＡＡＶベクターがＡＡＶ血清型２、５、６、７、８または９のキャプシドタンパク質シェルを含み、このＡＡＶベクターに存在するＡＡＶゲノムまたはＩＴＲはＡＡＶ血清型２、５、８または９に由来することが好ましい。このようなＡＡＶベクターはそれぞれＡＡＶ２／２、ＡＡＶ２／５、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／９、ＡＡＶ５／２、ＡＡＶ５／５、ＡＡＶ５／８、ＡＡＶ５／９、ＡＡＶ８／２、ＡＡＶ８／５、ＡＡＶ８／８、ＡＡＶ８／９、ＡＡＶ９／２、ＡＡＶ９／５、ＡＡＶ９／８またはＡＡＶ９／９ベクターを示す。本発明による組換えＡＡＶベクターは真皮及び表皮細胞の指向性を有し、ＡＡＶ血清型５または８のキャプシドタンパク質シェルを含むことがより好ましい。ベクターに存在するＡＡＶゲノムまたはＩＴＲは、ＡＡＶ血清型２などの同じまたは異なる血清型に由来し得る。このようなベクターはＡＡＶ２／５またはＡＡＶ２／８ベクターという。血清型５キャプシドを有するＡＡＶは基底及び基底上のケラチノサイト及び皮膚線維芽細胞の指向性を有する。５型キャプシドを有するＡＡＶベクターは、２型キャプシドを有するＡＡＶに比べて、非常により高い形質導入効率を示す。同様に、血清型８のキャプシドを有するＡＡＶは皮膚線維芽細胞及び（主に）基底上のケラチノサイトへの指向性を示す。さらに、哺乳動物、好ましくはヒト真皮及び表皮細胞を形質導入する際、ＡＡＶ２／８はＡＡＶ２／５より効率的になる傾向がある。しかし、形質導入効率は創傷治癒中、投与のタイミングに依存するように見え、ＡＡＶ２／２は後の時点のＡＡＶ２／５及びＡＡＶ２／８より高い形質導入効率を示す。したがって、ＡＡＶ２／２、ＡＡＶｘ／５及びＡＡＶｘ／８は本発明によるＡＯＮを送達するために好ましいＡＡＶであり、投与時期及び標的とされる細胞型を考慮してその選択を決定し得る。前臨床または臨床試験において、当業者はこれらの詳細を容易に理解することができる。上記で同定されるように、選択した核酸配列によって表された本発明によるＡＯＮをコードする核酸分子はＡＡＶゲノムまたはＩＴＲ配列の間に、例えば、コード配列に動作可能に連結された発現調節エレメントを含む発現構築物と３’末端配列の間に挿入することが好ましい。

【0060】

「ＡＡＶヘルパー機能」は一般にトランスにＡＡＶベクターに付与されるＡＡＶ複製及びパッケージングに必要な対応するＡＡＶ機能を意味する。ＡＡＶヘルパー機能はＡＡＶベクター中欠けているＡＡＶ機能を補足するが、これらはＡＡＶＩＴＲ（ＡＡＶベクターゲノムによって提供される）を欠いている。ＡＡＶヘルパー機能はＡＡＶの２つの主要なＯＲＦ、すなわちｒｅｐコード領域及びｃａｐコード領域またはその機能性がある実質的に同一の配列を含む。ｒｅｐ及びｃａｐ領域は当該技術分野において周知である。ＡＡＶヘルパー機能はＡＡＶヘルパー構築物に付与されることができ、それはプラスミドであってもよい。本明細書において同定されるように、ＡＡＶベクターに存在するＡＡＶゲノムの導入の前にまたは同時に、例えば、形質転換、トランスフェクションまたは形質導入によって宿主細胞へヘルパー構築物を導入することができる。したがって、本発明のＡＡＶヘルパー構築物は、一方ではＡＡＶベクターのキャプシドタンパク質シェルの血清型と他方ではＡＡＶベクター複製及びパッケージングに存在するＡＡＶゲノムの血清型の望ましい組合せを作成するように選択され得る。

【0061】

「ＡＡＶヘルパーウイルス」はＡＡＶ複製及びパッケージングに必要とされる付加機能を与える。適切なＡＡＶヘルパーウイルスはアデノウイルス、単純ヘルペスウイルス（例えば、１型及び２型ＨＳＶ）及びワクシニアウイルスを含む。ＵＳ６，５３１，４５６に記載されるように、ヘルパーウイルスにより与えられる付加機能をベクターを介して宿主細胞に導入することができる。本発明による組換えＡＡＶベクターに存在するＡＡＶゲノムはＡＡＶのｒｅｐ（複製）またはｃａｐ（キャプシド）遺伝子などのウイルスタンパク質をコードする任意のヌクレオチド配列を含まないことが好ましい。ＡＡＶゲノムは、例えば、当該技術分野において知られている抗生剤耐性遺伝子をコードする遺伝子、蛍光タンパク質（例えば、ｇｆｐ）または化学的に、酵素的にもしくは別の方法で検出可能な及び／もしくは選択可能な産物（例えば、ｌａｃＺ、ａｐｈなど）をコードする遺伝子などのマーカーまたはレポーター遺伝子を更に含んでもよい。

【0062】

これまでのところ既に達成されている進歩を考慮すると、本発明によるエクソンスキッピング分子を個体または個体の細胞、組織、器官に提供する手段の改良が予測される。本発明の方法を用いるｍＲＮＡの再構築への言及された影響を達成するために、もちろん、このような将来の改良を組み込んでもよい。本発明によるＡＯＮをそのまま個体、個体の細胞、組織または器官に送達することができる。本発明によるＡＯＮを投与するとき、送達方法と相性が良い溶液に分子を溶解することが好ましい。

【0063】

ジムノシスによるＡＯＮはインビボで多数の細胞によって容易に取り込まれる。通常、等張（生理食塩）水への本発明によるＡＯＮの溶解は、皮膚（真皮及び表皮）細胞などの標的細胞に到達するのには十分である。あるいは、本発明のジムノシスによるＡＯＮは薬理学的に許容される賦形剤、添加剤、安定化剤、溶媒、着色剤などを使用して配合されてもよい。加えてまたはあるいは、ジムノシスによるＡＯＮは下記トランスフェクション助剤のいずれかと共に配合されてもよい。

【0064】

等張（生理食塩）水などの水溶液中にプラスミドを提供することによって、皮膚（真皮及び表皮）細胞はＡＯＮ発現用プラスミドを備え得る。あるいは、プラスミドは既知のトランスフェクション試薬を使用するトランスフェクションによって提供され得る。

【0065】

静脈内、皮下、筋肉内、クモ膜下腔内及び／または心室内投与のために、溶液が等張（生理食塩）水であることが好ましい。本発明においては、細胞に及び／又は細胞内に、好ましくは皮膚（真皮及び表皮）細胞内に本明細書に定義される構成成分のそれぞれの送達に役立つであろう賦形剤またはトランスフェクション試薬の使用が特に好ましい。細胞膜を介して小胞もしくはリポソームにおいて組み合わせられるかまたは捕捉される、本明細書に定義される各構成成分を送達する複合体、ナノ粒子、ミセル、小胞及び／またはリポソームを形成することができる賦形剤またはトランスフェクション試薬が好ましい。これらの賦形剤の多くが当該技術分野において知られている。適切な賦形剤またはトランスフェクション試薬は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ；ＥｘＧｅｎ５００（ＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ））、リポフェクトＡＭＩＮＥ（商標）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）もしくはその誘導体、ポリエチレンイミンまたはポリエチレンイミンコポリマー（ＰＥＣ）及び誘導体を含む類似のカチオン性ポリマー、合成両親媒性試薬（ＳＡＩＮＴ－１８）、リポフェクチン（商標）、ＤＯＴＡＰ及び／または細胞、好ましくは皮膚（真皮または表皮）細胞に本明細書に定義される各構成成分を送達することができる粒子に自己集合化できるウイルス性キャプシドタンパク質を含む。このような賦形剤は、皮膚（真皮及び表皮）細胞を含む多種多様な培養細胞にＡＯＮなどのオリゴヌクレオチドを効率的に送達することが示されている。全細胞生存に関して許容できる低い毒性から中程度までの毒性とこれらの高いトランスフェクション力が組み合わされる。構造修飾の容易さを利用して、更なる修飾、ならびにそれらの（インビボでの）核酸導入特性及び毒性の分析を可能にすることができる。リポフェクチンはリポソーム型トランスフェクション試薬の一例を表す。リポフェクチンは、カチオン性脂質Ｎ－［１－（２，３ジオレオイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）（メチル硫酸塩であるｃｐ．ＤＯＴＡＰ）及び中性脂質ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）の２つの脂質成分からなる。中性成分は細胞内放出を媒介する。送達システムの別のグループはポリマーナノ粒子である。ジエチルアミノエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）－デキストランのようなポリカチオンはＤＮＡトランスフェクション試薬として周知であり、これはブチルシアノアクリレート（ＰＢＣＡ）及びヘキシルシアノアクリレート（ＰＨＣＡ）と組み合わせ、細胞内で細胞膜を横切って本明細書に定義される各成分、好ましくはオリゴヌクレオチドを送達することができるカチオン性ナノ粒子を配合することができる。

【0066】

これらの一般のナノ粒子材料に加えて、カチオン性ペプチドプロタミンはコロイドとオリゴヌクレオチドを配合する代わりの手法を提供する。このコロイド状ナノ粒子系は、いわゆるプロティクルを形成することができ、これはパッケージングする簡便な自己集合プロセスによって調製され、オリゴヌクレオチドの細胞内放出を媒介することができる。当業者は、上記または他の市販の代替賦形剤、及びＣＯＬ７Ａ１遺伝子における変異エクソン１０５に関連した疾患または症状の予防、治療または遅延のためエクソンスキッピング分子を送達するために、本発明に使用されるエクソンスキッピング分子をパッケージングし、送達する送達システムのいずれかを選択し、利用してもよい。

【0067】

本発明によるＡＯＮは、細胞（特に、皮膚（真皮）細胞）、細胞質及び／またはその核への取り込みを促進するように具体的に設計された標的リガンドに共有結合または非共有結合で連結することできた。このようなリガンドは、（ｉ）細胞の取り込みを促進する細胞、組織または器官に特異的な要素を認識する化合物（ペプチド（様）構造を含むが、限定されない）、ならびに／または（ｉｉ）細胞への取り込み及び／もしくは小胞、例えば、エンドソームもしくはリソソームからのオリゴヌクレオチドの細胞内放出を促進することができる化学化合物を含むことができた。

【0068】

したがって、好ましい実施形態では、本発明によるＡＯＮは、組成または薬剤または組成物に配合され、それらは少なくとも賦形剤及び／または送達用標的リガンド及び／またはＡＯＮの細胞への送達デバイス及び／またはＡＯＮの細胞内送達の強化を備える。

【0069】

組成物が本明細書に後で定義される補助化合物などの追加成分を含む場合、組成物の各成分を単一の組合せまたは組成または製剤で配合してもよいことが理解される。それらの同一性に応じて、当業者はどのタイプの製剤が本明細書に定義される各成分に最も適切であるかが分かるだろう。一実施形態によれば、本発明は本発明によるＡＯＮ及び本明細書に後で定義される更なる補助化合物を含む部品のキットの形態で組成または製剤を提供する。

【0070】

必要であれば、本発明によるＡＯＮまたは本発明によるＡＯＮを発現するベクター、好ましくはウイルスベクターを、薬学的に許容されるキャリアを添加することによって薬学的に有効な混合物に組み込むことができる。

【0071】

本発明はまた、ジムノシスによるＡＯＮなどの本発明によるＡＯＮまたは本発明によるウイルスベクター及び薬学的に許容される賦形剤を含む、組成物、好ましくは医薬組成物を提供する。このような組成物は本発明による単一のＡＯＮを含んでもよいが、本発明による複数の異なったＡＯＮも含んでもよい。このような医薬組成物は、キャリア、賦形剤、安定化剤、トランスフェクション試薬、ゲル化剤、バッファー、充填剤、防腐剤、アジュバント、可溶化剤及び／または希釈液を含む任意の薬学的に許容される賦形剤を含んでもよい。例えば、このような薬学的に許容される成分はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ，２０００に見つけることができる。この組成物の各特徴は本明細書で先に定義されている。

【0072】

本発明による複数の異なったＡＯＮが使用される場合、本明細書に定義される濃度または用量は使用される全てのオリゴヌクレオチドの総濃度もしくは総用量または使用もしくは添加される各ＡＯＮの濃度もしくは用量を意味していてもよい。したがって、一実施形態では、各量または全量の使用される本発明によるＡＯＮを０．０００１～１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．００１～５０ｍｇ／ｋｇ、更により好ましくは０．０１～２０ｍｇ／ｋｇの範囲の量で投与する組成物が提供される。

【0073】

本発明による好ましいＡＯＮは、ＤＥＢ、更に一般的には個体の変異ＣＯＬ７Ａ１エクソン１０５関連疾患または症状の治療のためである。本発明の全ての実施形態では、用語「治療」は疾患または症状の予防及び／または遅延を含むと理解される。個体はＤＥＢまたはＣＯＬ７Ａ１エクソン１０５関連疾患または症状を有すると既に診断されていてもよく、この個体は本発明によるＡＯＮを使用して治療され得る。あるいは、本発明によるＡＯＮを使用して治療され得る個体はまだ診断されていない場合もあるが、未来の所定の個体の遺伝的背景においてＤＥＢ、ＣＯＬ７Ａ１エクソン１０５関連疾患もしくは症状を発症するリスクの増加を有する個体である場合もある。

【0074】

本発明によるＡＯＮの好ましい投与方法は、ＡＯＮを放出することができるＡＯＮ被覆包帯の適用による。Ｗ０２０１４／１５００７４に開示されるような多層（レイヤーバイレイヤー、ＬｂＬ）被覆包帯が特に有益である。ｓｉＲＮＡを含有する多層フィルムで被覆された絆創膏からの創傷治癒促進ｓｉＲＮＡの持続的で効果的な放出が開示されている。本発明によるＡＯＮと好適に併用してもよい包帯はＴｅｇａｄｅｒｍ（登録商標）である。本発明によるＡＯＮと併用してもよいｓｉＲＮＡの送達に適した多層コーティングは層状構造を含有するＬａｐｏｎｉｔｅ（登録商標）である。核酸治療薬を放出することができるＴｅｇａｄｅｒｍ（登録商標）以外の包帯を使用してもよい。包帯が皮膚または創傷部位に密着する限り、絆創膏でないものが患者にとって苦痛がより少ないような場合、その絆創膏でないものを使用してもよい。包帯と組み合わせた本発明によるＡＯＮの送達のためのＡＯＮ含有ＬＢＬフィルムはＷ０２０１４／１５００７４に記載されている。投与は、投与経路及び患者の必要に応じて毎日、毎週、毎月、年４回、１年１回であってもよい。

【0075】

疾患の早期発生のため、ＤＥＢを含むＣＯＬ７Ａ１遺伝子の変異エクソン１０５が原因であるかもしくは関連する疾患、障害もしくは症状を有するかまたは発症させるリスクのある患者は、子宮内、生後すぐ、月齢１、２、３、６ヵ月から、１歳から、３歳から、５歳から、病徴の発症前または後に治療され、緩和し、発症を遅らせ、疾患の病徴などが停止もしくは逆転し得る。

【0076】

本発明による使用または方法の治療は、患者の一生涯の間も少なくとも１週、少なくとも１ヶ月、少なくとも数ヵ月、少なくとも１年、少なくとも２、３、４、５、６年または慢性的である。本発明による使用のための、本明細書で定義される各エクソンスキッピング分子またはＡＯＮまたはその等価物は、既に影響を受けているかまたは変異ＣＯＬ７Ａ１エクソン１０５関連障害、疾患もしくは症状を発症するリスクのある個体のインビボでの細胞、組織及び／または器官への直接投与に好適であり、インビボ、エクスビボまたはインビトロで直接に投与されてもよい。本発明のＡＯＮ、組成物、化合物または補助化合物の投与頻度は、患者の年齢、エクソンスキッピング分子（例えば、ＡＡＶまたはレンチウイルスベクター発現したＡＯＮなどのジムノシスによるＡＯＮまたはベクトル化したＡＯＮ）の性質、用量、分子の処方などいくつかのパラメータに依存し得る。

【0077】

エクソンスキッピング分子、好ましくは本発明によるＡＯＮの用量範囲は、厳密なプロトコル必要条件が存在する臨床試験（インビボでの使用）における成長中の用量研究に基づいて設計することが好ましい。本明細書で定義されるＡＯＮは、０．０００１～１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．０１～２０ｍｇ／ｋｇの用量範囲で使用してもよい。用量及び治療レジメは、投与経路（例えば、全身対局所に）、ＡＯＮがジムノシスによるＡＯＮまたはベクトル化したＡＯＮとして投与されるか否か、投与レジメ、患者の年齢及び体重等を含むが、これらに限定されない多くの要因に応じて広く変化してもよい。

【0078】

好ましい実施形態では、本発明によるＡＯＮ用送達媒体としてウイルスベクター、好ましくは本明細書に先に記載されるＡＡＶベクターが注射当たり１×１０^９～１×１０^１７のウイルス粒子、より好ましくは注射当たり１×１０^１０～１×１０^１４のウイルス粒子、最も好ましくは注射当たり１×１０^１０～１×１０^１２のウイルス粒子の用量範囲で投与される。

【0079】

本発明が関係する当業者にとって、オリゴヌクレオチド（複数可）の配列及び化学的性質、投与経路、処方、用量、投与レジメ、型式（ウイルスベクターまたはジムノシスによるオリゴヌクレオチド）、患者の年齢及び体重、疾患のステージなどの要因に従ってかつ応じて治療の詳細が確立されなければならないことは明らかであり、これらは更なる非臨床の調査及び臨床の調査を必要とし得る。

【0080】

特に明記しない限り、本明細書に記載される各実施形態は、本明細書に記載される他の実施形態と組み合わせてもよい。

【0081】

本明細書における実験部分及び例で観察することができるように、ＲＮＡレベルでＣＯＬ７Ａ１遺伝子のエクソン１０５を標的にする本発明による種々のＡＯＮの添加は実際にエクソン１０５を欠くｍＲＮＡになり、より短いが機能的なコラーゲンＶＩＩタンパク質を生産する。

【0082】

（皮膚細胞に由来し得る）線維芽細胞においてコラーゲンＶＩＩが大量に発現される。したがって、ＤＥＢ患者からの培養線維芽細胞にＡＯＮを添加すると、ウエスタンブロットに検出可能である、短いが機能的なコラーゲンＶＩＩタンパク質の量が増加し、ＡＯＮに基づく療法がＣＯＬ７Ａ１ｍＲＮＡのスプライシングを再指示するだけでなく、コラーゲンＶＩＩ機能性の回復にもなることが期待されるだろう。

【0083】

用語「アデニン」、「グアニン」、「シトシン」、「チミン」、「ウラシル」及びヒポキサンチン（イノシン内の核酸塩基）はこのように核酸塩基を意味する。用語アデノシン、グアノシン、シチジン、チミジン、ウリジン及びイノシンは（デオキシ）リボシル糖に結合される核酸塩基を意味する。用語「ヌクレオシド」は（デオキシ）リボシル糖に結合される核酸塩基を意味する。

【0084】

本明細書及び特許請求の範囲において、動詞「ｔｏ ｃｏｍｐｒｉｓｅ」及びその活用形は非限定的な意味で使用され、その単語を伴うことが含まれるが、具体的に記述されないことが除かれないことを意味する。さらに、文脈が要素の１つ及び１つのみが存在することが明らかに必要ではない限り、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」による要素の参照は１つより多くの要素が存在する可能性を排除しない。したがって、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」は、通常「少なくとも１つ」を意味する。

【0085】

単語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、ならびにその時制及び活用形の全ては「含むが、それらに限定されない」と読むべきである。

【0086】

単語「エクソンスキッピング分子」はウイルスベクターを含み、相溶性細胞中にＡＯＮを発現することができるジムノシスによるＡＯＮ及びベクター化したＡＯＮを含むことを意味する。

【0087】

数値（例えば、約１０）に関連して使用されるとき、単語「約」または「およそ」はその数値が所定値（１０）±その値の５％であってもよいことを意味することが好ましい。

【実施例】

【0088】

実施例１：ヒトＣＯＬ７Ａ１前駆体ｍＲＮＡからのエクソン１０５の排除のためのＡＯＮの設計及び使用
ヒトＣＯＬ７Ａ１前駆体ｍＲＮＡからのエクソン１０５スキッピングを証明するために、本発明の発明者らはＢｒｅｍｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１６）及びＷＯ２０１７／０７８５２６に先に開示された２つのＡＯＮと比較して、活性について評価された３１の新規なＡＯＮを設計した。具体的に、糖部位において２’－ＯＭｅで完全に修飾されたＡＯＮまたは糖部位において２’－ＭＯＥで完全に修飾されたＡＯＮの２つの化学修飾に十分に取り組んだ。全てのＡＯＮはホスホロチオエート結合がヌクレオシドに接続される状態で修飾された。表１は、評価したＡＯＮをこれらの配列番号及びどのような２’置換変形でこれらが試験されたかを共に示す。図１はエクソン１０５（上部）における相補配列に対して全てのこれらのＡＯＮの各位置を示す。図１における下線は、当該技術分野で知られるｃ．７８６４ｄｅｌ突然変異において欠失するＣ位置である（Ｅｓｃａｍｅｚ ｅｔ ａｌ．２０１０）。ＡＯＮ１２、１５及び１６は、エクソン１０５配列と１００％相補的であり、野生型配列と重なる。ＡＯＮ８、９、１３、１４、１７、１９、２７及び２８はｃ．７８６４ｄｅｌＣ変異体配列と１００％相補的であり、ｃ．７８６４ｄｅｌＣ突然変異と重なる（これにより、対向するＧを欠損させる）。他のＡＯＮはこの突然変異の外側にあり、野生型配列と１００％相補的である。
表１：エクソン１０５のスキッピングについて試験したＡＯＮ。各カラムに「Ｘ」で示されるように異なる化学修飾を使用して、ＡＯＮを試験した。

【表1-1】

【表1-2】

^１ＭＯＥ＋ＰＳ：ＰＳ主鎖を有し、完全に２’－ＭＯＥ修飾された
^２ＯＭｅ＋ＰＳ：ＰＳ主鎖を有し、完全に２’－ＯＭｅ修飾された

【0089】

第１実験では、Ｂｒｅｍｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１６）及びＷＯ２０１７／０７８５２６で知られる２つのＵＭＣＧＡＯＮ（ＵＭＣＧ－ＡＯＮ１、配列番号３及びＵＭＣＧ－ＡＯＮ２、配列番号４）を本発明の発明者らにより作成された２’－ＭＯＥ変形のＡＯＮ８と比較した。

【0090】

このため、次のように野生型線維芽細胞を培養し、設計したＡＯＮをトランスフェクトした。第１線維芽細胞を集密度８０～９０％に成長させ、ＰＢＳで洗浄し、トリプシン処理した。細胞を、ＥＶＥ細胞カウンター（ＮａｎｏＥｎｔｅｋ）を使用して計数し、生存度（生存度必要条件＞８０％）について確認した。細胞を６ウェルプレートに１．５×１０^５個／ウェルで播種した。プレートを終夜インキュベートし、翌日、トランスフェクション試薬としてＭａｘＰＥＩ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してＵＭＣＧ－ＡＯＮ１及びＵＭＣＧ－ＡＯＮ２及びこれら２つの組合せ（総最終濃度２５０ｎＭ）を含む、２５０ｎＭの異なるＡＯＮを細胞にトランスフェクトした。充填比ＰＥＩ：ＡＯＮは１００ｎＭを用いるトランスフェクションに対して１．８μＬ：４００ｎｇであり、２５０ｎＭを用いるトランスフェクションに対して１：２の重量比（ＡＯＮ：Ｐｅｉ）であった。２４時間後、ＲＮＡ単離のためにサンプルを回収した。これに対し、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＲｅｌｉａＰｒｅｐ（商標）ＲＮＡ細胞ミニプレップシステムの２５０μＬＢＬ＋ＴＧ溶解バッファーで溶解した。製造者プロトコルに従ってｍＲＮＡを単離した。ＲＮＡを２５μＬＲＮアーゼ遊離水に溶出し、Ｎａｎｏｄｒｏｐ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）でＯＤ比２６０／２８０及び２６０／２３０を使用して濃度及び純度を測定した。３００ｎｇＲＮＡを使用してｃＤＮＡ合成を行った。製造者のプロトコル（Ｖｅｒｓｏ ｋｉｔ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）に従って反応混合物を添加した。４２℃で３０分間、ｃＤＮＡ合成を行った。ランダムヘキサマープライマー（ｔｈｅ Ｖｅｒｓｏ ｋｉｔより提供）を使用し、第１鎖ｃＤＮＡを合成した。続いて、ＦＷプライマー（５’－ＧＴ ＧＡＣ ＡＡＡＧＧＡＣ ＣＴＣ ＧＧＧＧ－３’配列番号６３）及びリバースプライマー（５’－ＣＴＣ ＣＡＴ Ｃ ＡＡＧＧＣ Ｃ ＡＣ ＡＧＧＣ－３’配列番号６４）を使用したｃＤＮＡテンプレート１μＬを使用してマスターミックス（キット及びｄＮＴＰ、両方ともＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃよりＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから提供）でＰＣＲを行った。６２℃３５サイクルでＰＣＲを実行した。異なるフラグメントサイズを検出し、収率に基づいて定量分析を実行するチップ技術（ＤＮＡ１０００キット、バイオアナライザー、Ａｇｉｌｅｎｔ）に関する研究室を使用してＰＣＲ産物を分析した。ＤＮＡ１０００チップを使用した。Ａｇｉｌｅｎｔバイオアナライザー２１００を使用して可視化を行った。

【0091】

図２はバイオアナライザーに関するＰＣＲの結果を示す。特に当該技術分野で知られるオリゴヌクレオチドＵＭＣＧ－１ ＡＯＮ及びＵＭＣＧ－２ ＡＯＮの２’－ＭＯＥ変形と比較して、ＡＯＮ８（２’－ＭＯＥ変形）はエクソン１０５の有意なスキッピングを示した。Ｂｒｅｍｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１６）に示されたものを使用した列においては、ＡＯＮ１（２’－ＭＯＥ）及びＡＯＮ２（２’－ＭＯＥ）は任意の検出可能なスキップを示さず、一方、ＡＯＮを併用したとき、エクソン１０５スキッピングが観察された。２’－ＯＭｅ変形を使用した効果が２’－ＭＯＥ変形を使用した効果より顕著に見えたけれども、ＵＭＣＧ ＡＯＮの２’－ＯＭｅ変形を単独でまたは併用したとき、同じ効果が見られた。ＡＯＮ８（２’－ＭＯＥ）を単独で使用したとき、ＡＯＮ８はＵＭＣＧ－１（２’－ＭＯＥ）化合物及びＵＭＣＧ－２（２’－ＭＯＥ）化合物より優れていた。本明細書に先に概説されるように、発症及び治療目的（製造、毒性、組織の侵入など）のため、エクソン１０５スキッピングを達成する単一の活性化合物を有することが好ましい。この最初の実験から、エクソン１０５スキッピングを得るために先に示された当該技術の２つのＡＯＮを組み合わせたとき、比較すると、ＡＯＮ８はより優れたスキッピング効率を有すると結論づけた。ＡＯＮ８はｃ．７８６４ｄｅｌＣ変異体ｍＲＮＡと１００％相補的である（欠損した「Ｃ」の反対の位置で「Ｇ」を欠失することにより）が、ＡＯＮ８がエクソン１０５ｍＲＮＡと１００％相補的でない野生型線維芽細胞における適当なエクソン１０５スキッピングをまだ示すことに留意されたい。

【0092】

追跡実験では、類似のＰＣＲ実験において（上記と同じ手順を使用する）ＡＯＮ７、８、９、１０及び１１（表１参照）のぞれぞれについて２’－ＯＭｅ修飾を２’－ＭＯＥと比較した。ＡＯＮは、各位置で２’－ＯＭｅで完全に修飾されるかまたは各位置で２’－ＭＯＥで完全に修飾された。図３に結果を示す。ここで、いくつかのスキッピングはＡＯＮ７（２’－ＭＯＥ）で検出することできた。結果も、２’－ＯＭｅを用いるＡＯＮ７はその２’－ＭＯＥの等価物よりも優れ、ＡＯＮ８についてはこれが反対であることを示す。

【0093】

次の実験において、全てＡＯＮ８に基づきかつｃ．７８６４ｄｅｌＣ位置に野生型エクソン１０５ｍＲＮＡと１００％相補的であるＡＯＮを使用して新規な１セットのＡＯＮを作成した（ＡＯＮ１２、１５、１６、図１及び表１参考）。このために、野生型線維芽細胞にＡＯＮ１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９及び２０（全て完全に２’－ＭＯＥ修飾を保持する）をトランスフェクトし、ＡＯＮ８の２’－ＭＯＥ及び２’－ＯＭｅ修飾した変形を比較した。図４に結果を示す。最良に機能するＡＯＮはＡＯＮ１２、ＡＯＮ１５、ＡＯＮ１６、ＡＯＮ１８及びＡＯＮ２０であった。図１に見ることができるように、ＡＯＮ１２、１５及び１６は野生型エクソン１０５ｍＲＮＡと１００％相補的である。他の実験において、ｃ．７８６４ｄｅｌＣ突然変異したｍＲＮＡへのＡＯＮ８、９、１３、１４、１７及び１９の効果を決定する。ＡＯＮ１８はｃ．７８６４ｄｅｌＣ突然変異から離れた領域と相補的である。ＡＯＮ８、１２、１５、１６、１８及び２０（２’－ＭＯＥ修飾を有する）全てが従来技術からＡＯＮより優れていると結論づけた。

【0094】

実施例２：ｄｄＰＣＲを使用するヒトＣＯＬ７Ａ１前駆体ｍＲＮＡからのエクソン１０５の排除の定量化
本明細書に開示される異なるＡＯＮのトランスフェクション後、Ｃ７Δ１０５ｍＲＮＡの量をより良く定量化するために、本発明の発明者らはドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）分析法を開発した。

【0095】

２種類の二重検定を使用して、エクソン１０５スキッピングを測定した。分析１において、サンプル中のＣＯＬ７Ａ１の総量を測定し（ＦＡＭラベルを使用するＣＯＬ７Ａ１参照アッセイ）、分析２において、スキップしたエクソン１０５に特異的なプライマー及びプローブセット（ＦＡＭラベルを使用するＣＯＬ７Ａ１エクソン１０５スキッピングアッセイ）を使用した。サンプルを標準化するために、ＨＥＸラベルを使用する参照遺伝子としてＧｕｓＢを使用して、両方のアッセイを二重に行った。以下のプライマー及びプローブ配列を使用した。
ＧｕｓＢ
フォワードプライマー：５’－ＧＴＴＴＴＴ ＧＡＴ Ｃ Ｃ ＡＧＡＣ Ｃ Ｃ ＡＧＡＴ Ｇ－３’（配列番号６５）
リバースプライマー：５’－ＧＣＣＣＡＴＴＡＴＴＣＡＧＡＧＣＧＡＧＴＡ－３’（配列番号６６）
プローブ（ＨＥＸ）：５’－ＴＧＣＡＧＧＧＴＴＴＣＡＣＣＡＧＧＡＴＣＣＡＣ－３’（配列番号６７）
Ｃ７
フォワードプライマー：５’－ＴＣＧＧＴＴＧＣＴＧＧＡＡＡＣＴＧＣ－３’（配列番号６８）
リバースプライマー：５’－ＣＡＣＡＧＧＣＡＧＧＡＡＧＣＴＡＣＣ－３’（配列番号６９）
プローブ（ＦＡＭ）：５’－ＡＴＣＡＡＧＧＣＡＴＣＴＧＣＣＣＴＧＣＧＧＧＡＧ－３’（配列番号７０）
Ｃ７－Δ１０５
フォワードプライマー：５’－ＧＴＧＡＣＡＡＡＧＧＡＣＣＴＣＧＧＧＧ－３’（配列番号６３）
リバースプライマー：５’－ＣＴＣＣＡＴＣＡＡＧＧＣＣＡＣＡＧＧＣ－３’（配列番号６４）
プローブ（ＦＡＭ）：５’－ＡＣＴＣＣＣＣＧＴＴＣＡＣＣＣＧＧＧＴＣＡＣ－３’（配列番号７１）

【0096】

ｃＤＮＡテンプレート４μＬ、ならびに総容積２０μＬのプライマー及びプローブ（最終濃度０．２μＭ）を使用し、プローブ用ｄｄＰＣＲ ｓｕｐｅｒ ｍｉｘ（ｄＵＴＰ無し）（Ｂｉｏｒａｄ）を使用して二重式ｄｄＰＣＲを行った。ＱＸ２００ドロップレットジェネレーター（Ｂｉｏｒａｄ）を使用して液滴を作成し、Ｔ１００サーマルサイクラー（Ｂｉｏｒａｄ）を使用してアニーリング温度６２℃でＰＣＲを４０サイクル行った。ＰＣＲ後、ＱＸ２００ドロップレットリーダー（Ｂｉｏｒａｄ）で液滴を分析し、単一ラベルの液滴、二重ラベルの液滴及び陰性の液滴から蛍光シグナルを計測した。以下の式を用いてエクソン１０５スキッピング％を計算した。

【数1】

【0097】

野生型線維芽細胞を使用して実験を最初に行った。最初に、ＡＯＮ８、１２、１５、１６、１８及び２０をその２’－ＯＭｅ及び２’－ＭＯＥ変形で試験した。図５はこの最初のｄｄＰＣＲスクリーンの結果を示し、２’－ＭＯＥ変形をその２’－ＯＭｅの対応物との比較に使用するとき、各場合におけるより高いスキッピングの割合についてこの構成における２’－ＯＭｅ修飾よりも２’－ＭＯＥ修飾が優位であることを明らかに示す。ＡＯＮ８は依然として良好なものであったが、ＡＯＮ１８及びＡＯＮ２０は更により高いスキップ割合、最大８０％を与えた。２’－ＭＯＥによるＡＯＮ８と２’－ＯＭｅによるＡＯＮ８の明確な差は図３及び４に示される結果を反映し、これらにおいて、２’－ＭＯＥ変形も良好な結果を与えるように見えた。

【0098】

実施例３：患者由来の線維芽細胞を使用するエクソン１０５スキッピングの定量化
野生型線維芽細胞（ＦＤ０３０）、ｃ．７８６４ｄｅｌＣ突然変異を保有するＤＥＢ患者から得られた線維芽細胞（ＰＬＵ００２Ａ）及びＤＥＢに罹患していないが、ｃ．７８６４ｄｅｌＣ突然変異の保因者として特定されたヒト被検体から得られた線維芽細胞（ＰＬＵ００３Ａ）におけるエクソン１０５スキッピングの割合を決定するために、ｄｄＰＣＲアッセイも使用した。この実験では、２’－ＯＭｅ及び２’－ＭＯＥ変形両方のＡＯＮ８、ＡＯＮ１８及びＡＯＮ２０を試験し、そして非トランスフェクション及び組み換えた２’－ＭＯＥＡＯＮを陰性対照として含んでいた。実験の構成は実施例２に説明した通りであった。図６に結果を示す。これらの結果は、３つの細胞型全てにおいて２’－ＭＯＥで完全に修飾されたＡＯＮ１８及びＡＯＮ２０がそれらの２’－ＯＭｅの対応物及びＡＯＮ８より優れていることを示した。患者材料対保因者材料において得られた結果において劇的な相違は観察されなかったが、ＡＯＮのそれぞれに対して患者及び保因者の線維芽細胞におけるスキッピングの割合は野生型線維芽細胞におけるものより高かった。

【0099】

次に、更に他のセットのＡＯＮ（ＡＯＮ２１～３３；表１及び図１を参照）を作成した。これらは全てＡＯＮ８～２０の相補的領域を標的化することを判定した。ＡＯＮ２１の配列はＷＯ２０１７／０７８５２６に既に開示されているが、その配列中のエクソンスキッピング効率について特定のオリゴヌクレオチドが試験されていることは示されていなかった。ＰＬＵ００２Ａ及びＰＬＵ００３Ａ線維芽細胞においてもＡＯＮ２１～３３（全て、完全な２’－ＯＭｅ修飾による）を試験した。２つの異なる濃度の２’－ＭＯＥ及び２’－ＯＭｅ修飾によるＡＯＮ１８を試験し、新規に作成されたＡＯＮ及びＡＯＮ８と比較した。図７に結果を示す。ＡＯＮ３２はＡＯＮ８に相当するレベルに到達したが、新規に作成されたＡＯＮ（全て、２’－ＯＭｅ修飾を保有する）はいずれも、ＡＯＮ１８が２’－ＭＯＥ修飾を保有しながら得られたスキッピングの割合に届かなかったことを表している。

【0100】

…ＣＡＵＣＵＣＣ－３’を有する３’末端で終わり、ヒトＣＯＬ７Ａ１エクソン１０５スキッピングオリゴヌクレオチドにおける特定の末端を有することが優れた効率を提供することを示すＡＯＮ２３、ＡＯＮ２９及びＡＯＮ３２に対して、ＰＬＵ００２Ａ及びＰＬＵ００３Ａ線維芽細胞を使用する類似のｄｄＰＣＲ実験において、２’－ＭＯＥ変形を作成し、ＡＯＮ８、ＡＯＮ１８及びＡＯＮ２０の２’－ＭＯＥ変形と比較した。ＡＯＮ２０も…ＣＡＵＣＵＣＣ－３’末端を含む。図８は実験の結果を示し、ＡＯＮ８、ＡＯＮ３２、ＡＯＮ２０及びＡＯＮ１８が最良に機能しながら、特にＡＯＮ８、ＡＯＮ１８、ＡＯＮ２０、ＡＯＮ２９及びＡＯＮ３２が良好なエクソン１０５スキッピング結果を与えることを示す。

【0101】

実施例４：ＤＥＢ線維芽細胞における新規の及び既知のＡＯＮのトランスフェクション下でのエクソン１０５スキッピングの定量化
従来技術の２つの既知のＡＯＮと比較して、本発明のＡＯＮによるエクソン１０５スキッピングの効率を評価するために、２’－ＯＭｅまたは２’－ＭＯＥで完全に修飾されたＡＯＮ８、ＡＯＮ１８及びＡＯＮ２０を使用して、ＰＬＵ００２Ａ線維芽細胞への類似のトランスフェクションを行い、共に２’－ＯＭｅまたは２’－ＭＯＥで完全に修飾されたＵＭＣＧ－ＡＯＮ１及びＵＭＣＧ－ＡＯＮ２を使用する別のトランスフェクション、ならびにＵＭＣＧ－ＡＯＮ２（２’ＯＭｅ）を使用してＵＭＣＧ－ＡＯＮ１（２’－ＯＭｅ）を同時トランスフェクトしたかまたはＵＭＣＧ－ＡＯＮ２（２’－ＭＯＥ）を使用してＵＭＣＧ－ＡＯＮ１（２’－ＭＯＥ）を同時トランスフェクトした組み合わせたトランスフェクションと比較した。全ての場合において、トランスフェクトした全ＡＯＮの最終濃度が組み合わせた同時トランスフェクションでも２５０ｎＭであった。細胞培養、トランスフェクション、ｍＲＮＡ単離及びｄｄＰＣＲ手順は上記で記載された通りであった。図９に結果を示す。明らかに、ＡＯＮ８、ＡＯＮ１８及びＡＯＮ２０の２’－ＭＯＥ変形はそれらの２’－ＯＭｅの対応物より優れていた。全てのこれらの３つのＡＯＮについて、それらの２’－ＭＯＥ変形はまた、単独化合物としてトランスフェクトされるとき、２’－ＭＯＥ変形、ならびにＵＭＣＧ－ＡＯＮ１及びＵＭＣＧ－ＡＯＮ２の２’－ＯＭｅ変形より優れていた。ＡＯＮ１８（２’－ＭＯＥ）及びＡＯＮ２０（２’－ＭＯＥ）の単独のトランスフェクションは２’－ＯＭｅ及び２’－ＭＯＥ変形でのＵＭＣＧ－ＡＯＮ１／ＵＭＣＧ－ＡＯＮ２の組み合わせた同時トランスフェクション（各々、棒の下に示されるように二重で行われた）よりもより効率的なエクソン１０５スキッピングを与えることが重要であった。したがって、ＤＥＢに罹患するヒト患者から得られた細胞におけるヒトＣＯＬ７Ａ１前駆体ｍＲＮＡからの適切なエクソン１０５スキッピングに到達するために単一の活性化合物として使うことができる、本明細書に開示される新規なＡＯＮの有益性が明らかに示される。

【0102】

実施例５：ヒトＣＯＬ７Ａ１前駆体ｍＲＮＡからのエクソン１０５の排除のためのＡＯＮの設計及び特徴
ヒトＣＯＬ７Ａ１前駆体ｍＲＮＡにおけるエクソン１０５スキッピングの媒介に有用なＡＯＮを更に同定するために、２１の更なるＡＯＮをそれらの活性のために設計し、評価した。全てのＡＯＮはホスホロチオエート結合がヌクレオシドに接続される状態で修飾され、ＭＯＥ（糖部位で完全に２’－ＭＯＥ修飾された）、ＯＭｅ（糖部位で完全に２’－ＯＭｅ修飾された）、ＭＯＥ／１ｘＬＮＡ（糖部位で５’末端ヌクレオチド及び３’末端ヌクレオチドがＬＮＡ修飾され、全ての他のヌクレオチドが２’－ＭＯＥ修飾された）、ＯＭｅ／１ｘＬＮＡ（糖部位で５’末端ヌクレオチド及び３’末端ヌクレオチドがＬＮＡ修飾され、全ての他のヌクレオチドが２’－ＯＭｅで修飾された）、ＭＯＥ／２ｘＬＮＡ（糖部位で２つの５’末端ヌクレオチド及び２つの３’末端ヌクレオチドがＬＮＡ修飾され、全ての他のヌクレオチドが２’－ＭＯＥ修飾された）、ＯＭｅ／２ｘＬＮＡ（糖部位で２つの５’末端ヌクレオチド及び２つの３’末端ヌクレオチドがＬＮＡ修飾され、全ての他のヌクレオチドが２’－ＯＭｅ修飾された）の１つ以上においてのように修飾された。表２は、評価した更なるＡＯＮをこれらの配列番号及びどのような修飾変形で試験されたかを共に示す。図１はエクソン１０５（上部）における相補配列に対する全てのこれらのＡＯＮの各位置を示す。
表２：エクソン１０５のスキッピングについて試験された更なるＡＯＮ。各カラムに「ｘ」で示される異なる化学修飾を使用して、ＡＯＮを試験した。

【表2-1】

【表2-2】

^１ＭＯＥ＋ＰＳ：ＰＳ主鎖を有し、完全に２’－ＭＯＥ修飾された
^２ＯＭｅ＋ＰＳ：ＰＳ主鎖を有し、完全に２’－ＯＭｅ修飾された
^３ＭＯＥ／１ｘＬＮＡ＋ＰＳ：完全なＰＳ主鎖を有し、５’末端ヌクレオチド及び３’末端ヌクレオチドがＬＮＡ修飾され、全ての他のヌクレオチドが２’－ＭＯＥ修飾された
^４ＯＭｅ／１ｘＬＮＡ＋ＰＳ：完全なＰＳ主鎖を有し、５’末端ヌクレオチド及び３’末端ヌクレオチドがＬＮＡ修飾され、全ての他のヌクレオチドが２’－ＯＭｅで修飾された
^５ＭＯＥ／２ｘＬＮＡ＋ＰＳ：完全なＰＳ主鎖を有し、２つの５’末端ヌクレオチド及び２つの３’末端ヌクレオチドがＬＮＡ修飾され、全ての他のヌクレオチドが２’－ＭＯＥ修飾された
^６ＯＭｅ／２ｘＬＮＡ＋ＰＳ：完全なＰＳ主鎖を有し、２つの５’末端ヌクレオチド及び２つの３’末端ヌクレオチドがＬＮＡ修飾され、全ての他のヌクレオチドが２’－ＯＭｅ修飾された

【0103】

ヒト線維芽細胞におけるＡＯＮのトランスフェクションを媒介した送達
第１実験では、上述されるように、ＡＯＮの２’－ＯＭｅ変異体でトランスフェクトされたヒト線維芽細胞からヒトＣＯＬ７Ａ１前駆体ｍＲＮＡにおけるエクソン１０５スキッピングの頻度をｄｄＰＣＲで分析した（図１０）。試験したＡＯＮ３７、ＡＯＮ３９、ＡＯＮ４３、ＡＯＮ５３、ＡＯＮ５４及びＡＯＮ５５の変異体は、ＬＮＡ修飾された５’末端ヌクレオチド及び３’末端ヌクレオチド（１ｘＬＮＡ）を２’－ＯＭｅ修飾された全ての他のヌクレオチドと共に有するものを含んでいた。試験したＡＯＮ３７及びＡＯＮ３９の変異体は、ＬＮＡ修飾された２つの５’末端ヌクレオチド及び２つの３’末端ヌクレオチド（２ｘＬＮＡ）を２’－ＯＭｅ修飾された全ての他のヌクレオチドと共に有するものを含んでいた。ＮａＣｌ及びトランスフェクション試薬（ＭａｘＰＥＩ）のみの条件を陰性対照として含み、２’－ＯＭｅ修飾されたＵＭＣＧ－ＡＯＮ１（ＵＭＣＧ１）及びＵＭＣＧ－ＡＯＮ２（ＵＭＣＧ２）を参考に含んでいた。以下の対のＡＯＮ：ＡＯＮ３７＋ＡＯＮ３９；ＡＯＮ４０＋ＡＯＮ４７；ＡＯＮ４３＋ＡＯＮ４６；及びＵＭＣＧ１＋ＵＭＣＧ２はまた、組み合わせて試験した。図１０に示すように、実験の２’－ＯＭｅ修飾ＡＯＮの多くは、ＵＭＣＧ１またはＵＭＣＧ２と比較して、エクソン１０５スキッピングの頻度が向上した。１ｘＬＮＡ修飾を導入すると、試験した全てのＡＯＮについてエクソン１０５スキッピング頻度が向上し、少なくとも１つのＡＯＮについてエクソン１０５スキッピング頻度が２ｘＬＮＡ修飾で更に増加した（図１中ＡＯＮ３７、ＡＯＮ３７１ｘＬＮＡ及びＡＯＮ３７２ｘＬＮＡを参照）。特に、ＡＯＮ５５（２－ＯＭｅ修飾のみを有する）はエクソン１０５スキッピングに対する活性を示さなかったが、１ｘＬＮＡ修飾を更に導入すると、エクソン１０５の約２０％のスキッピングを媒介することができるＡＯＮになり、これは本実験におけるＵＭＣＧ１またはＵＭＣＧ２について観察されるものより高い。最も高い活性を有する２つの単一のＡＯＮはＡＯＮ４３ １ｘＬＮＡ及びＡＯＮ３７ ２ｘＬＮＡであり、両方ともエクソン１０５の約３５％のスキッピングを示した。エクソン１０５の約４０％のスキッピングでＡＯＮ４３＋ＡＯＮ４６の組合せについて最も高い活性が観察された。

【0104】

他の実験において、上述するように、示されたＡＯＮの２’－ＭＯＥ変異体をトランスフェクトするヒト線維芽細胞からヒトＣＯＬ７Ａ１前駆体ｍＲＮＡにおけるエクソン１０５スキッピングの頻度をｄｄＰＣＲで分析した（図１１）。試験したＡＯＮ３７、ＡＯＮ３９、ＡＯＮ４３、ＡＯＮ５３、ＡＯＮ５４及びＡＯＮ５５の変異体は、ＬＮＡ修飾された５’末端ヌクレオチド及び３’末端ヌクレオチド（１ｘＬＮＡ）を２’－ＭＯＥ修飾された全ての他のヌクレオチドと共に有するものを含んでいた。試験したＡＯＮ３７及びＡＯＮ３９の変異体は、ＬＮＡ修飾された２つの５’末端ヌクレオチド及び２つの３’末端ヌクレオチド（２ｘＬＮＡ）を２’－ＭＯＥ修飾された全ての他のヌクレオチドと共に有するものを含んでいた。ＮａＣｌ及びトランスフェクション試薬（ＭａｘＰＥＩ）のみの条件を陰性対照として含み、２’－ＭＯＥ修飾されたＵＭＣＧ－ＡＯＮ１（ＵＭＣＧ１）及びＵＭＣＧ－ＡＯＮ２（ＵＭＣＧ２）を参考に含んでいた。以下の対のＡＯＮ：ＡＯＮ３７＋ＡＯＮ３９；及びＵＭＣＧ１＋ＵＭＣＧ２はまた、組み合わせて試験した。図１１に示すように、実験の２’－ＭＯＥ修飾ＡＯＮの多数は、ＵＭＣＧ１またはＵＭＣＧ２と比較して、エクソン１０５スキッピングの頻度が向上した。１ｘＬＮＡ修飾を導入すると、試験した全てのＡＯＮのいくつかについてエクソン１０５スキッピング頻度が向上した（図１１中ＡＯＮ５４ １ｘＬＮＡ及びＡＯＮ５３ １ｘＬＮＡを参照）が、他のものは活性の減少（図１１中ＡＯＮ５５ １ｘＬＮＡ及びＡＯＮ３９ １ｘＬＮＡを参照）またはほとんど乃至まったく変化しないこと（図１１中ＡＯＮ３７ １ｘＬＮＡ及びＡＯＮ４３ １ｘＬＮＡを参照）が示された。２’－ＭＯＥ修飾単独でまたは１ｘＬＮＡ修飾を組み合わせてほとんど乃至まったく活性がなかった場合、エクソン１０５スキッピング頻度は２ｘＬＮＡ修飾で４０％を超えるまで増加し（図１１中ＡＯＮ３７、ＡＯＮ３７ １ｘＬＮＡ及びＡＯＮ３７ ２ｘＬＮＡを参照）、これは本実験におけるＵＭＣＧ１またはＵＭＣＧ２について観察されるものより高い。１ｘＬＮＡ修飾の導入で活性が減少した場合、エクソン１０５スキッピング頻度は２ｘＬＮＡ修飾で更に減少した（図１１中ＡＯＮ３９ ２ｘＬＮＡを参照）。ＡＯＮ４１単独について最も高い活性が観察され、これはエクソン１０５の約７０％のスキッピングを示した。ＡＯＮ３７＋ＡＯＮ３９の組み合せはエクソン１０５のわずか約７０％未満のスキッピングで類似の活性を示した。

【0105】

ＨｅＬａ細胞におけるＡＯＮのジムノシスによる送達
ＡＯＮを更に特徴づけるために、ジムノシスによる送達の後の細胞におけるエクソン１０５のスキッピングを媒介するＡＯＮの能力を評価した。上述されるように、示されたＡＯＮの２’－ＯＭｅ変異体のジムノシスによる取り込みの後の、ＨｅＬａ細胞由来のヒトＣＯＬ７Ａ１前駆体ｍＲＮＡにおけるエクソン１０５スキッピングの頻度をｄｄＰＣＲで分析した（図１２）。簡潔には、１２ウェルプレートに１ウェル当たり５．０×１０^４のＨｅＬａ細胞を播種し、その後、３７℃及び５．０％ＣＯ_２で１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン及び０．１ｍｇ／ｍＬストレプトマイシンで補充したＤＭＥＭに培養した。翌日、ウェルに直接ＡＯＮを終濃度３～５０μＭまで添加することによって細胞を処理した。７２時間、処理した後、細胞を回収し、上述するＲＮＡ分析前に－８０℃で保存した。試験したＡＯＮ３７、ＡＯＮ３９、ＡＯＮ４３、ＡＯＮ５３、ＡＯＮ５４及びＡＯＮ５５の変異体は、ＬＮＡ修飾された５’末端ヌクレオチド及び３’末端ヌクレオチド（１ｘＬＮＡ）を２’－ＯＭｅ修飾された全ての他のヌクレオチドと共に有するものを含んでいた。試験したＡＯＮ３７及びＡＯＮ３９の変異体は、ＬＮＡ修飾された２つの５’末端ヌクレオチド及び２つの３’末端ヌクレオチド（２ｘＬＮＡ）を２’－ＯＭｅ修飾された全ての他のヌクレオチドと共に有するものを含んでいた。ＮａＣｌのみの状態を陰性対照として含んでいた。以下の対のＡＯＮ：ＡＯＮ３７＋ＡＯＮ３９；ＡＯＮ４０＋ＡＯＮ４７；及びＡＯＮ４３＋ＡＯＮ４６はまた、組み合わせて試験した。図１２に示すように、２－ＯＭｅ修飾だけを有する実験のＡＯＮの多数は、１ｘＬＮＡまたは２ｘＬＮＡ修飾を更に含む各ＡＯＮと比較して、エクソン１０５スキッピングの頻度がかなり低い。１ｘＬＮＡ修飾を導入すると、ＡＯＮ５５、ＡＯＮ５３、ＡＯＮ３９、ＡＯＮ４３及びＡＯＮ３７についてエクソン１０５スキッピング頻度が向上した。２ｘＬＮＡ修飾を導入すると、ＡＯＮ３７についてエクソン１０５スキッピング頻度が更に向上した。２’－ＯＭｅのみが修飾したＡＯＮはエクソン１０５の約０．５％を超えるスキッピングを媒介することができたが、場合によっては１ｘＬＮＡまたは２ｘＬＮＡでの更なる修飾はエクソン１０５の最大約３％のスキッピングを可能にした（図１２中ＡＯＮ４３ １ｘＬＮＡ及びＡＯＮ３７ ２ｘＬＮＡを参照）。

【0106】

他の実験において、上述されるように、示されたＡＯＮの２’－ＭＯＥ変異体のジムノシスによる取り込みの後の、ＨｅＬａ細胞由来のヒトＣＯＬ７Ａ１前駆体ｍＲＮＡにおけるエクソン１０５スキッピングの頻度をｄｄＰＣＲで分析した（図１３）。試験したＡＯＮ３７、ＡＯＮ３９、ＡＯＮ４３、ＡＯＮ５３、ＡＯＮ５４及びＡＯＮ５５の変異体は、ＬＮＡ修飾された５’末端ヌクレオチド及び３’末端ヌクレオチド（１ｘＬＮＡ）を２’－ＭＯＥ修飾された全ての他のヌクレオチドと共に有するものを含んでいた。試験したＡＯＮ３７及びＡＯＮ３９の変異体は、ＬＮＡ修飾された２つの５’末端ヌクレオチド及び２つの３’末端ヌクレオチド（２ｘＬＮＡ）を２’－ＭＯＥ修飾された全ての他のヌクレオチドと共に有するものを含んでいた。ＮａＣｌのみの状態を陰性対照として含んでいた。以下の対のＡＯＮ：ＡＯＮ３７＋ＡＯＮ３９はまた、組み合わせて試験した。図１３に示すように、エクソン１０５スキッピングの頻度が１ｘＬＮＡ修飾の導入により約０．５％未満から約２％まで増加したＡＯＮ４３を除いて、２’－ＭＯＥ ＡＯＮ変異体のＬＮＡ修飾についてエクソン１０５スキッピング活性に関して効果があまり見られなかった。２’－ＭＯＥ修飾のみを有する実験のＡＯＮはいずれも少なくとも約１％のエクソン１０５スキッピングを促進することが可能でなかった。１つのＡＯＮのみ、すなわちＡＯＮ４３ １ｘＬＮＡがこのような活性を示し、エクソン１０５の約２％のスキッピングを示した。

【0107】

ｄｄＰＣＲで評価されるように、前述の研究（ＡＯＮ３７ ＯＭｅ／１ｘＬＮＡ、ＡＯＮ４３ ＯＭｅ／１ｘＬＮＡ及びＡＯＮ４３ ＭＯＥ／１ｘＬＮＡ）に示される最も活性化した変異体のいくつかを含む、サブセットのＡＯＮは、ＡＯＮのジムノシスによる取り込みの後のＨｅＬａ細胞からヒトＣＯＬ７Ａ１前駆体ｍＲＮＡにおけるエクソン１０５スキッピングの頻度について様々な濃度（３μＭ、１０μＭ及び５０μＭ）でこれらの用量反応を評価することを更に特徴とした（図１４）。図１４に示すように、試験したＡＯＮの全ては陽性の用量反応曲線を示し、ＡＯＮを用いた治療とエクソン１０５のスキッピングの因果関係に強い証拠が提供された。

【0108】

創傷のヒト皮膚等価（ＨＳＥ）モデル
皮膚創傷の三次元モデルにおけるＡＯＮの活性を評価するために、ヒト皮膚等価（ＨＳＥ）モデルを作成し、表在性創傷の後にＡＯＮを用いて治療した。

【0109】

ＨＳＥを作成するために、６ウェルフィルターインサートに８．０×１０^４の主要な線維芽細胞（継代数４～６）を使用して２０ｍＭ酢酸に約４ｍｇ／ｍＬでラット尾コラーゲンを播種することによって第１皮膚等価物を生成し、浸水条件下、１週間、５％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン及びＯ．１ｍｇ／ｍＬストレプトマイシンで補充された標準線維芽細胞媒体ＤＭＥＭにインキュベートした。その後、皮膚等価物上に１００μＬ播種媒体（ＤＭＥＭ：５％ＦＢＳ、１μＭヒドロコルチゾン、１μＭイソプロテレノール、０．１μＭインシュリン、１００Ｕ／ｍＬペニシリン及び０．１ｍｇ／ｍＬストレプトマイシンで補充されるハムＦ１２媒体（３：１））に１．５×１０^５または３．０×１０^５（継代数１）のケラチノサイトを滴下して播種した。播種して２時間後、追加の播種媒体１．５ｍＬを各モデルの上部に添加した。播種媒体中、３７℃及び７．３％ＣＯ_２で浸水条件下、ＨＳＥをインキュベートした。２日後、ＦＢＳは１％まで減少した。それから２日後、ＦＢＳを取り除き、創傷及び治療の前に１２日間気液界面でＨＳＥを培養した。この期間中、分化培地（ＤＭＥＭ：１００Ｕ／ｍＬペニシリン、０．１ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン、１μＭヒドロコルチゾン、１μＭイソプロテレノール、０．１μＭインシュリン、１０ｍＭ１－セリン、１０μＭ１－カルニチン及び５３ｎＭ亜セレン酸で補充されるハムＦ１２媒体（３：１））でＨＳＥを培養した。週２回、媒体をリフレッシュし、この時、次の補助剤：１００μｇ／ｍＬアスコルビン酸、β－デキストリン（終濃度）中の１μＭＤＬ－α－トコフェロール酢酸エステル、２４μＭウシ血清アルブミン及び２５μＭパルミチン酸、３０μＭリノール酸及び７μＭアラキドン酸を含有する遊離脂肪酸補助剤を新たに添加した。

【0110】

表皮を除去することにより、ＨＳＥに表在性創傷を形成した。簡潔には、濾紙の幅５～６ｍｍの無菌テンプレートの細片を各ＨＳＥの中心面に配置した。テンプレートの細片の両面に線状に切り込みを入れ、各テンプレートの細片の真下の表皮を無菌鉗子を用いて除去した。これにより、線維芽細胞を有する無処置の皮膚等価物上に表在性創傷が得られた。

【0111】

次に、１０ｍｇＡＯＮ／ｇゲルの濃度で０．７５％カルボマーヒドロゲルに配合されたＡＯＮを用いてＨＳＥを治療した。合計９の治療に対して週に３回（月曜日、水曜日及び金曜日）３週間、ＨＳＥを治療した。その量の、ＡＯＮを有するまたは有さないヒドロゲルの適用はできるだけ標準化されるように行われた。このために、各ＨＳＥに対してヒドロゲル５０ｍｇ／ｃｍ^２（創傷サイズに応じる；５ｍｍの創傷に対して５０μＬ（＝５０ｍｇ）及び６ｍｍの創傷に対して７５μＬ（＝７５ｍｇ）、Ｄ０３５及びＤ０９０）をパラフィルム１枚の上に秤量し、スパチュラで創傷したＨＳＥに塗布するかまたは測定し、ジティブディスプレイスメント式ピペットを用いて創傷したＨＳＥに塗布した。創面の全面上にスパチュラでヒドロゲルを広げ、創縁はヒドロゲルがないままにした。治療後、回収するまで全てのＨＳＥを培養（３７℃、７．３％ＣＯ^２）に戻した。

【0112】

創傷及び治療開始後３週間でＨＳＥモデルを回収した。ＲＮＡ単離のため、ＲＮＡｌａｔｅｒに４つの異なるサンプルを収集した。表皮及び真皮を含有するサンプル（ＲＮＡ Ｄ＋Ｅ）、表皮のみを含有するサンプル（ＲＮＡ Ｅ）、創床由来の皮膚サンプル（ＲＮＡ ＤＷ）、ならびに無処置の表皮の真下の皮膚サンプル（ＲＮＡ Ｄ）。サンプルを４℃で終夜保存し、その後－８０℃に移した。Ｒｎｅａｓｙプラス汎用ミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＲＮＡを単離し、－８０℃でＲＮＡを保存した。３００ｎｇのＲＮＡを使用してｃＤＮＡ合成を行った。ランダムヘキサマー（Ｖｅｒｓｏ ｋｉｔによって提供，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して４２℃で３０分間ｃＤＮＡ合成を行って、第１鎖ｃＤＮＡを合成した。－２０℃でｃＤＮＡを保存した。上記と同様の方法でエクソン１０５スキッピングを測定した。

【0113】

上述されるように、カルボマーヒドロゲル製剤中、以前の研究（ＡＯＮ３７ ＯＭｅ／１ｘＬＮＡ、ＡＯＮ４３ ＯＭｅ／１ｘＬＮＡ及びＡＯＮ４３ ＭＯＥ／１ｘＬＮＡ）で決定された最も活性化した変異体のいくつかを含む、示されたサブセットのＡＯＮを用いて３週間、治療を行った後の、創傷のＨＳＥモデルの真皮、表皮または真皮＋表皮由来のヒトＣＯＬ７Ａ１前駆体ｍＲＮＡにおけるエクソン１０５スキッピングの頻度をｄｄＰＣＲで分析した（図１５）。図１５に示すように、ＡＯＮで治療した創傷のＨＳＥモデルの真皮及び表皮の両方において、エクソン１０５のスキッピングを観察し、試験したＡＯＮの多くに対する真皮において頻度が約２０％以上であった。これらの結果は、栄養障害型表皮水疱症（ＤＥＢ）を罹患するヒトの皮膚創部への局所投与が皮膚の標的細胞に本明細書に記載のＡＯＮを送達する実行可能なアプローチであることを支持する。さらに、これらの所見は、ＥＢ標準治療に似ている処方がＡＯＮの送達に適しているように見えることを支持する。
配列表

【表3-1】

【表3-2】

【表3-3】

【表3-4】

【図1-1】

【図1-2】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10-1】

【図10-2】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【手続補正書】

【提出日】2021-10-28

【手続補正1】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】配列表

【補正方法】追加

【補正の内容】

【配列表】

2022523783000001.app

【国際調査報告】