▶ ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティーの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-04-26
(54)【発明の名称】人工網膜用のハニカム形状の電気神経インターフェース
(51)【国際特許分類】
A61F 9/007 20060101AFI20220419BHJP
A61N 1/05 20060101ALI20220419BHJP
A61N 1/36 20060101ALI20220419BHJP
【ＦＩ】
A61F9/007 190A
A61N1/05
A61N1/36
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021557341
(86)(22)【出願日】2020-03-25
(85)【翻訳文提出日】2021-11-17
(86)【国際出願番号】 US2020024619
(87)【国際公開番号】W WO2020198305
(87)【国際公開日】2020-10-01
(31)【優先権主張番号】62/823,395
(32)【優先日】2019-03-25
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】503115205
【氏名又は名称】ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー
(74)【代理人】
【識別番号】110001379
【氏名又は名称】特許業務法人 大島特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】パランカー、ダニエル・ブイ
(72)【発明者】
【氏名】フローレス、トーマス
【テーマコード（参考）】
4C053
【Ｆターム（参考）】
4C053BB12
4C053BB21
4C053JJ11
4C053JJ13
4C053JJ21
(57)【要約】
網膜細胞の網膜下空間の空隙への移動を向上させるように設計された神経細胞刺激用の電極アレイの３次元構成を提供する。各ピクセルを囲む壁が電界を垂直に整列させ、網膜の双極細胞の方向に一致させ、それによって刺激のしきい値を下げる。またこれらの壁により、電界侵入深さに対するピクセル幅の影響が切り離され、ピクセルサイズが細胞寸法まで縮小可能となる。内側の網膜細胞は電極のキャビティに移動し、これにより非常に効率的な刺激が可能となる。電界をキャビティに沿って１次元で整列させることにより、刺激しきい値電流密度が、ピクセルサイズの縮小に伴って大幅に増加することがなくなり、平面状アレイで見られる二次曲線的な増加は生じない。
【選択図】図２Ａ
【選択図】図２Ａ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
神経細胞の電気刺激のための装置であって、キャビティ内の神経細胞の移動を可能にするように構成されたキャビティのアレイを備え、
前記キャビティの各々は、床部と、導電性の壁とを有し、
前記キャビティの各々は、前記床部に配置された第１の電極を有し、
前記キャビティの各々は、前記壁の上側に配置され、前記床部の対応する前記第１の電極から垂直方向に離隔された第２の電極を有し、
前記装置の動作中、イオン電流が前記キャビティの内容物を通って流れ、
各キャビティ内における導電性の前記壁の静電容量より、前記第２の電極の静電容量の方が大きく、それにより、前記第２の電極は、導電性の前記壁の側面に対して優先的にイオン電流を収集することを特徴とする装置。
【請求項2】
請求項１に記載の装置であって、前記キャビティの深さが、１０μｍ～１００μｍの間であることを特徴とする装置。
【請求項3】
請求項１に記載の装置であって、前記キャビティの幅が、５μｍ～１００μｍの間であることを特徴とする装置。
【請求項4】
請求項１に記載の装置であって、前記キャビティの深さが、前記キャビティの幅より大きいことを特徴とする装置。
【請求項5】
請求項１に記載の装置であって、前記キャビティのアレイが、周期的であることを特徴とする装置。
【請求項6】
請求項５に記載の装置であって、前記キャビティが、六角形であることを特徴とする装置。
【請求項7】
請求項１に記載の装置であって、前記神経細胞が網膜細胞であることを特徴とする装置。
【請求項8】
請求項１に記載の装置であって、前記装置の動作時に、前記キャビティの前記第１の電極に注入される電荷密度は、０．１ｍＣ／ｃｍ２～１０ｍＣ／ｃｍ２であることを特徴とする装置。
【請求項9】
請求項１に記載の装置であって、前記第２の電極の単位面積あたりの静電容量は、前記導電性の壁の単位面積あたりの静電容量より少なくとも１００倍大きいことを特徴とする装置。
【請求項10】
神経細胞の電気刺激のための装置であって、キャビティ内の神経細胞の移動を可能にするように構成されたキャビティのアレイを備え、
前記キャビティの各々は、床部と、電気的に絶縁性の壁とを有し、
前記キャビティの各々は、前記床部に配置された第１の電極を有し、
前記キャビティの各々は、前記キャビティのアレイの外側に配置された、共通の戻り電極を有し、
前記装置の動作中、イオン電流が前記キャビティの内容物を通って流れ、
それにより、前記電気的に絶縁性の前記壁は、前記イオン電流を前記キャビティ内で垂直に流れるように強制することにより、刺激効率を向上させ、前記装置内での隣接するキャビティ同士の間のクロストークを低減することを特徴とする装置。
【請求項11】
請求項１０に記載の装置であって、前記キャビティの深さが、１０μｍ～１００μｍの間であることを特徴とする装置。
【請求項12】
請求項１０に記載の装置であって、前記キャビティの幅が、５μｍ～１００μｍの間であることを特徴とする装置。
【請求項13】
請求項１０に記載の装置であって、前記キャビティの深さが、前記キャビティの幅より大きいことを特徴とする装置。
【請求項14】
請求項１０に記載の装置であって、前記キャビティのアレイが、周期的であることを特徴とする装置。
【請求項15】
請求項１４に記載の装置であって、前記キャビティが、六角形であることを特徴とする装置。
【請求項16】
請求項１０に記載の装置であって、前記神経細胞が網膜細胞であることを特徴とする装置。
【請求項17】
請求項１０に記載の装置であって、前記装置の動作時に、前記キャビティの前記第１の電極に注入される電荷密度は、０．１ｍＣ／ｃｍ２～１０ｍＣ／ｃｍ２であることを特徴とする装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、本発明は、神経細胞の電気刺激に関する。
【背景技術】
【0002】
従来の人工視覚デバイス用の刺激アレイは、アクティブ電極と戻り電極の平面状の構造を有する。この平面状の構造は、人工視覚デバイスを、小さく、かつ有用な視力を提供するのに十分な程度に密に詰まったピクセルを有するようにスケーリングする際に深刻な困難を生ずる。ピクセルサイズが小さくなると、２つの主な問題が生ずる。すなわち隣接するピクセル間のクロストークの増加、及びピクセル刺激しきい値（つまり、細胞応答を取得するために必要な電流密度）が高くなることである。ピクセルサイズが小さくなると刺激しきい値を増加させること、網膜インプラントとして望ましいピクセルサイズにおいて必要な電流密度が生物学的に危険になることから、特に厄介な問題となる。従って、平面状刺激アレイのこれらの限界を緩和することが当技術分野における進歩となろう。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0003】
網膜細胞の網膜下空間の空隙への移動を向上させるように設計された神経細胞刺激用の電極アレイの３次元構成を提供する。各ピクセルを囲む壁が電界を垂直に整列させ、網膜の双極細胞の方向に一致させ、それによって刺激のしきい値を下げる。またこれらの壁により、電界侵入深さに対するピクセル幅の影響が切り離され、ピクセルサイズが細胞寸法まで縮小可能となる。内側の網膜細胞はハニカムウェルに移動するため、これらの神経細胞は電極のキャビティ内に存在し、非常に効率的な刺激が可能となる。電界をキャビティに沿って１次元で整列させることにより、刺激しきい値電流密度が、ピクセルサイズの縮小に伴って大幅に増加することがなくなり、平面状アレイで見られる二次曲線的な増加は生じない。この３次元電極構成により、平面状電極アレイよりもはるかに小さいピクセルで視力を回復できる可能性が得られる。同様の３次元アレイは、他の用途における脳との電気神経インターフェースに使用することもできる。
【0004】
好ましい実施形態では、ピクセルのキャビティは、１０μｍ～１００μｍの間の深さ、及び５μｍ～１００μｍの間の幅を有する。アクティブ中心電極での電流密度は、好ましくは、０．０１Ａ／ｃｍ２～１Ａ／ｃｍ２の間である。装置全体の幅は、好ましくは０．５ｍｍ～５ｍｍの間であり、網膜移植に適している。アクティブ電極へのパルスあたりの注入電荷密度は、好ましくは、０．１ｍＣ／ｃｍ２～１０ｍＣ／ｃｍ２の間である。
【0005】
本発明の用途としては、網膜変性における視力回復のための人工視覚デバイス、及び一般的な高解像度の電気神経インターフェースが含まれる。本発明の実施により、電気神経インターフェースのピクセルを細胞の寸法まで縮小することが可能となるという有利な効果が得られる。
【図面の簡単な説明】
【0006】
【発明を実施するための形態】
【0007】
以下、（Ａ）では本発明の実施形態に関連する一般的な原理を説明する。（Ｂ）では、実験例の詳細を説明する。
【0008】
（Ａ）一般的な原理
本発明の実施形態をよりよく理解するために、図１に示される、従来技術の平面状刺激アレイ１００の動作を最初に検討することが有用である。この図は、ピクセル１０２、１０４、１０６の行の断面図である。「オン」ピクセル（１０２及び１０６）は、電流を生成し、その電流を中央のアクティブ電極（例えば、ピクセル１０２の１０８）を通して電解質に注入し、次に、電流は、ピクセル外部の（またはピクセル間の）離隔戻り電極１１０によって収集される。電流の流れは黒い矢印で示されている。電解質を流れる電流は、電位の勾配（陰影で示す）を生成する。電流はアクティブ電極からすべての方向に広がり、隣接するピクセルの細胞にも影響を与える。例えば、Ｘの符号を付された「オフ」ピクセル１０４は、隣接するピクセルから寄生刺激を受け取り、望ましくない結果であるコントラストの低下をもたらす。
本発明の実施形態をよりよく理解するために、図１に示される、従来技術の平面状刺激アレイ１００の動作を最初に検討することが有用である。この図は、ピクセル１０２、１０４、１０６の行の断面図である。「オン」ピクセル（１０２及び１０６）は、電流を生成し、その電流を中央のアクティブ電極（例えば、ピクセル１０２の１０８）を通して電解質に注入し、次に、電流は、ピクセル外部の（またはピクセル間の）離隔戻り電極１１０によって収集される。電流の流れは黒い矢印で示されている。電解質を流れる電流は、電位の勾配（陰影で示す）を生成する。電流はアクティブ電極からすべての方向に広がり、隣接するピクセルの細胞にも影響を与える。例えば、Ｘの符号を付された「オフ」ピクセル１０４は、隣接するピクセルから寄生刺激を受け取り、望ましくない結果であるコントラストの低下をもたらす。
【0009】
図２Ａは、本発明の第１の実施形態の断面を示す。図２Ａの実施形態では、刺激アレイ２００は、ピクセル２０２、２０４、２０６を含む。「オン」ピクセル２０２及び２０６は、電流を生成し、その電流を中央のアクティブ電極（例えば、ピクセル２０２の２１４）を通して電解質に注入する。電流は電解質（組織）を通って上向きに流れ、壁２１８の上部にある戻り電極、すなわち戻り電極２１６によって収集されて、回路を完成させる。電解質を通る電流は、主に「オン」ピクセルの前に電位の勾配（陰影で示す）を生成し、これにより網膜の局所的な刺激が可能となる。図２Ａのピクセル２０４の上の図１のピクセル１０４と比較して薄くなった陰影に留意されたい。導電性ハニカム壁２１８の上部に堆積された大容量材料（戻り電極２１６）により、電解質を通る電流の大部分が壁の上部に集められ、電流が導電性壁の側面を通して収集される電流は金属と電解質の間の界面の静電容量が小さいため無視できるレベルになることが確実となる。このような構成により、側壁の不動態化または絶縁を必要とせずに、ハニカム構造を有する戻りの高い電極を作製することが可能となる。
【0010】
より正確には、本発明の第１の実施形態は、キャビティ内の神経細胞の移動を可能にするように構成されたキャビティのアレイを含む神経細胞の電気刺激のための装置である。各キャビティは、床（例えば、図２Ａの２１２）及び導電性の壁（例えば、図２Ａの２１８）を有する。各キャビティは、その床に配置された第１の電極（例えば、図２Ａの２１４）を有し、前記壁の上部に配置され、対応する床電極から垂直に離隔された第２の電極（例えば、図２Ａの２１６）を有する。装置の動作中、イオン電流がキャビティの内容物を通って流れる。第２の電極のキャビティ１つあたりの静電容量は、導電性の壁のキャビティ１つあたりの静電容量よりも大きく、それにより、第２の電極は、導電性の壁の側面より優先的にイオン電流を収集する。好ましくは、第２の電極の単位面積あたりの静電容量は、導電性壁の単位面積あたりの静電容量よりも少なくとも１００倍大きい。
【0011】
図２Ｂは、本発明の第２の実施形態の断面図を示す。ここで、刺激アレイ２５０は、ピクセル２５２、２５４、２５６を含む。「オン」ピクセル２５２及び２５６は、電流を生成し、中央のアクティブ電極（例えば、ピクセル２５２の２１４）を通して電解質に注入する。電流は、電気絶縁性の壁２６２に囲まれたハニカムウェルを通って上向きに流れ、次に、ピクセルの外側の離隔戻り電極２６４によって収集される。電解質を通る電流は、主に「オン」ピクセルの前に電位の勾配（陰影）を生成し、垂直壁がない場合よりもはるかに優れた網膜の局所刺激を可能にする。図１のピクセル１０４と比較して、図２Ｂのピクセル２５４の上の陰影が薄くなっていることに留意されたい。
【0012】
より正確には、本発明の第２の実施形態は、キャビティ内の神経細胞の移動を可能にするように構成されたキャビティのアレイを含む神経細胞の電気刺激のための装置である。各キャビティは、床（例えば、図２Ｂの２１２）及び電気絶縁性の壁（例えば、図２Ｂの２６２）を有する。各キャビティは、その床に配置された第１の電極（例えば、図２Ｂ上の２１４）を有する。この装置は、キャビティのアレイの外側に配置された共通の戻り電極（例えば、図２Ｂ上の２６４）を含む。装置の動作中、イオン電流がキャビティの内容物を通って流れる。電気絶縁性の壁は、イオン電流をキャビティ内を垂直に移動させることにより、刺激効率を改善し、装置の隣接するキャビティ間のクロストークを低減する。
【0013】
図２Ａ～図２Ｂの実施形態の好ましい構成は以下の通りである。キャビティの深さは、好ましくは１０μｍ～１００μｍの間である。キャビティの幅は、好ましくは５μｍ～１００μｍの間である。キャビティの深さは、好ましくは、キャビティの幅よりも大きい。キャビティのアレイは、好ましくは周期的であり、この場合、キャビティは六角形であることが好ましい。好ましい実施形態では、神経細胞は網膜細胞である。好ましくは、キャビティの第１の電極に注入された電荷密度は、動作中、０．１ｍＣ／ｃｍ２～１０ｍＣ／ｃｍ２の間である。
【0014】
前述の説明では、キャビティのそれぞれが壁を有するキャビティであると称することが便利であった。しかし、ほとんどの場合、アレイ構造（例えば、図４Ａのように）では、壁が隣接するキャビティ間で共有されていることは明らかである。共有壁の場合、壁の部分が２つの隣接するキャビティのそれぞれに任意に割り当てられる。本発明の実施に際しては、この理論上の分割がどのように行われると考えられるかには何ら影響を受けない。同様に、局所的な戻り電極（例えば、図２Ａの２１６）は、ほとんどの場合、隣接するキャビティ間で同様に共有される。共有戻り電極の場合、戻り電極の部分が２つの隣接するキャビティのそれぞれに任意に割り当てられる。本発明の実施に際しては、この理論上の分割がどのように行われると考えられるかには何ら影響を受けない。
【0015】
（Ｂ）実験例の詳細
（Ｂ１）序論
視力回復への電子的アプローチは急速に進歩しており、遺伝性網膜変性症（網膜色素変性症、ＲＰ）によって盲検化された患者での臨床使用が承認されたシステムも存在すれば、臨床試験中のシステムも存在する。ＲＰの影響を受け、網膜上プロテーゼＡｒｇｕｓ（商標）ＩＩ（Ｓｅｃｏｎｄ Ｓｉｇｈｔ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｉｎｃ．米国カリフォルニア州シルマー）または網膜下Ａｌｐｈａ ＩＭＳ／ＡＭＳ（商標）（Ｒｅｔｉｎａ Ｉｍｐｌａｎｔ ＡＧ 独国ロイトリンゲン）が移植された患者は、歩行と視覚探索のパフォーマンスの向上を示し、最もよく報告されている視力はそれぞれ２０／１２６０と２０／５４６であった。好ましい結果と言えるが、これらの有利な効果は、網膜変性の最も一般的な形態である加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）を補助するのに十分ではなく、この場合、患者は通常２０／４００以上の視力で周辺視野を保持するが、高解像度の中心視力を失うことになる。
（Ｂ１）序論
視力回復への電子的アプローチは急速に進歩しており、遺伝性網膜変性症（網膜色素変性症、ＲＰ）によって盲検化された患者での臨床使用が承認されたシステムも存在すれば、臨床試験中のシステムも存在する。ＲＰの影響を受け、網膜上プロテーゼＡｒｇｕｓ（商標）ＩＩ（Ｓｅｃｏｎｄ Ｓｉｇｈｔ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｉｎｃ．米国カリフォルニア州シルマー）または網膜下Ａｌｐｈａ ＩＭＳ／ＡＭＳ（商標）（Ｒｅｔｉｎａ Ｉｍｐｌａｎｔ ＡＧ 独国ロイトリンゲン）が移植された患者は、歩行と視覚探索のパフォーマンスの向上を示し、最もよく報告されている視力はそれぞれ２０／１２６０と２０／５４６であった。好ましい結果と言えるが、これらの有利な効果は、網膜変性の最も一般的な形態である加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）を補助するのに十分ではなく、この場合、患者は通常２０／４００以上の視力で周辺視野を保持するが、高解像度の中心視力を失うことになる。
【0016】
米国の法定失明の限度である２０／２００の視力は、幾何学的に約５０μｍのピクセルピッチに対応する。電極と電解質の界面を横断する電荷注入の安全を確保するために、電極の最小サイズに制限が加わる。さらに、隣接する電極間のクロストークは、ピクセルサイズが小さくなると増加する。後者の問題は、各ピクセルに円周方向の戻り電極を設けることで対処できるが、この手法により、組織への電界の侵入深さがさらに減少する。
【0017】
網膜下腔での電極と組織の分離は、ピラー電極を使用して低減することができる。内顆粒層（ＩＮＬ）の網膜細胞が移動して、このような３Ｄインプラントの空隙を埋めると、標的ニューロンが刺激電極に近づき、刺激しきい値が低下する。しかし、そのようなピラー電極は、刺激しきい値を２分の１だけしか減少させず、５５μｍ未満のピクセルサイズでは有意な減少を達成できなかった。電極のサイズを制限している根本的な問題は、小さな電極から広がって標的細胞の下の別の電極に戻る電界の形状にある。
【0018】
ここでは、これらの制限を克服し、ピクセルを細胞の寸法に縮小できるようにするために、網膜下プロテーゼの新しい３Ｄジオメトリを提示する。これをハニカム型構成と呼ぶ。このアプローチでは、戻り電極は、各ピクセルを囲む垂直の絶縁性壁で持ち上げられ、電界を垂直に整列させ、網膜の双極細胞の方向に一致させ、それによって刺激のしきい値を下げる。図３－１（Ｂ）の持ち上げ戻り電極３０６を、図３－１（Ａ）の平面状構成と比較する。ここで、３０２は刺激電極であり、３０４は刺激電極３０２が配置される基板である。
【0019】
図３－２（Ｃ）は、周方向の戻りを有する平面状ピクセルが、垂直方向への延びが短い局所的に閉じ込められた電界を生成することを示している。電界内の細胞は、それらの長さ全体にわたる電位差によって分極する。双極細胞体細胞と軸索終末は、それぞれＩＮＬ（内顆粒層）とＩＰＬ（内網状層）に存在する。従って、電位はＩＰＬの途中の電位に対する電位として表される。図３－２（Ｄ）は、絶縁壁の上部にある戻り電極が、局所的なピクセル体積に限定された垂直ダイポールを生成し、それによって、標的細胞層全体の垂直方向の電位降下を最大化することを示している。電流の大きさ（矢印の長さ）は対数目盛で表示されている。ＩＰＬの中央（５７μｍ）に関する電位差は、６８ｎＡの電流に対してグレースケールで示されている。
【0020】
これらの壁により、電界の延びの深さがピクセル幅から切り離され、ピクセルサイズを細胞のサイズまで縮小が可能となる。まず、２０、３０、４０μｍピクセルのインプラントを使用して、このような３Ｄ構造と網膜の解剖学的統合を調べ、次に、実験測定によって検証されたネットワーク媒介網膜刺激モデルを使用して電気刺激能力を定量化する。この実験の結果は、この技術が２０／１００よりも優れた視力で人工視力への扉を開くことを示しており、このことは、ＲＰによって完全に盲目になっている患者だけでなく、ＡＭＤのはるかに多くの患者の中心視力の回復にも非常に有益である。
【0021】
網膜下腔に埋め込まれた膜の開口部への網膜細胞の移動と、網膜下プロテーゼへの影響について以前に説明した。しかし、その膜の構成では、インプラントの底部には、電流がインプラントの下を伝播することを可能にする開口部があった。しかし実際には、人工網膜インプラントは通常、中実である。すなわち、電流はそれらを貫通せず、従って、ここで図３－２（Ｃ）及び図３－２（Ｄ）に示されるように、それは上向きにのみ流れることができる。従って、ここでは、このような刺激アレイを使用した電界の最適な成形に適した戻り電極のさまざまな形状と材料について説明する。
【0022】
（Ｂ２）結果
（Ｂ２ａ）解剖学的統合
図４Ａ～図４Ｃは、網膜下ハニカム型インプラントを示す。図４Ａは、４０μｍ（＊）、３０μｍ（＊＊）、及び２０μｍ（＊＊＊）ピクセルピッチの２５μｍの深さのハニカム構造を備えた１ｍｍ幅のデバイスの画像を示している。第４象限には１０μｍピッチの構造が含まれていたが、これは処理限界を超えていたため、作製しなかった。壁がないため、これを「平面状」領域と呼ぶ。図４Ｂは、３０μｍピッチのハニカムの高倍率の像である。図４Ｃは、術後６週間のＲＣＳラットにおける網膜下インプラントのＯＣＴ画像である。スケールバーは、図４Ａでは２００μｍ、図４Ｂでは５０μｍ、図４Ｃでは１００μｍである。
（Ｂ２ａ）解剖学的統合
図４Ａ～図４Ｃは、網膜下ハニカム型インプラントを示す。図４Ａは、４０μｍ（＊）、３０μｍ（＊＊）、及び２０μｍ（＊＊＊）ピクセルピッチの２５μｍの深さのハニカム構造を備えた１ｍｍ幅のデバイスの画像を示している。第４象限には１０μｍピッチの構造が含まれていたが、これは処理限界を超えていたため、作製しなかった。壁がないため、これを「平面状」領域と呼ぶ。図４Ｂは、３０μｍピッチのハニカムの高倍率の像である。図４Ｃは、術後６週間のＲＣＳラットにおける網膜下インプラントのＯＣＴ画像である。スケールバーは、図４Ａでは２００μｍ、図４Ｂでは５０μｍ、図４Ｃでは１００μｍである。
【0023】
ハニカムと変性網膜との統合を評価するために、直径１ｍｍのシリコンアレイをＲＣＳラット（Ｐ１８０－３００、ｎ＝６）の網膜下腔に６週間移植した。各アレイを、４０μｍ、３０μｍ、及び２０μｍピッチのハニカム領域と平面状領域を含む象限に分割した（図４Ａ）。アレイは、２５μｍの深さのハニカムチャンバを画定するためにボッシュエッチングプロセスを用いてシリコンで製造した（図４Ｂ）。網膜とのインプラントの統合は、光コヒーレンストモグラフィー（ＯＣＴ）によって生体内でモニタリングした（図４Ｃ）。移植の６週間後、ＩＮＬはハニカム領域の上のＯＣＴではほとんど検出できなかったが（図４Ｃ、右）、平面状の象限の上（図４Ｃ、左）とインプラントの外側にみられ、これはＩＮＬがキャビティに移動していることを示している。
【0024】
図５に示すように、組織学的検査によりＩＮＬ細胞の遊走が確認され、線維症や外傷の目に見える兆候は見られなかった。網膜構造は保存されたままであり、明確にＩＮＬ、内網状層（ＩＰＬ）、及び神経節細胞層（ＧＣＬ）が存在する。一部のＩＮＬ細胞はハニカム壁の上に残ったが、キャビティはアレイの基部まで密集した細胞で完全に満たされている。黒い矢印は、元の壁の位置を指している。壁は、サンプルの埋め込み後に除去され、セクショニングのためにエポキシが再充填された。図５のスケールバーは４０μｍである。
【0025】
網膜統合と免疫応答の包括的な評価は、インプラントを使用した網膜全体の３Ｄ共焦点イメージングを使用して行った。３Ｄ再構成により、観察されたハニカムキャビティのほとんどにＩＮＬ（ＤＡＰＩ）が密に詰まっていることがわかる。単一のハニカム列の側面図は、アレイの基部までの完全な移行を示している。
【0026】
縮退したＲＣＳ制御網膜内では、ＩＰＬ内の拡張ミクログリアプロセスはミクログリアの休止状態を示し、ＩＮＬの下のミクログリアは縮退した外網状層（ＯＰＬ）を介してプロセスを拡張する。網膜下インプラントでは、ＩＰＬのミクログリアは対照網膜のミクログリアと同様にみられ、拡張プロセスはミクログリアの休止状態を示す。平面状インプラントでは、ミクログリアはデバイス表面の近くに存在する。これらのアクティブなインプラントによる皮質反応の存在は、網膜下プロテーゼ上のミクログリアが電気刺激を妨げないことを示している。ハニカム型インプラントを使用すると、ミクログリアプロセスは主に壁の上部に沿って広がり、ウェルへの広がりは最小限に抑えられる。
【0027】
網膜統合の程度は、各サイズのキャビティの基部からの高さの関数として細胞密度を分析することによって評価した。ＩＮＬ細胞の平均５０％、４５％、５４％が、それぞれ４０、３０、２０μｍのハニカムピッチのキャビティ内で見つかった。電場は壁の上に広がることができるので（図６Ａ）、より多くの細胞を刺激することができる。
【0028】
（Ｂ２ｂ）生体内での網膜反応のモデル化
図６Ａは、０．５Ａ／ｃｍ２のアクティブ電極電流密度の場合について計算された、ＩＰＬの中央（ｚ＝５７μｍ）に対する平面状アレイ（上）及びハニカム型アレイ（下）の電位を示す。図６Ｂは、アクティブ電極上の電流密度に関して、平面状デバイス（破線）及びハニカム型デバイス（点線）デバイスの実験的しきい値（データポイント）及び計算されたしきい値を示す。平面モデル（以下で説明するように、バイナリと線形の両方）は、実験測定で観察された傾向を再現する。ハニカム型アレイは刺激しきい値（点線）を大幅に低減し、これにより４０μｍ未満のピクセルを有するデバイスの安全な操作が可能となる。ＳＩＲＯＦによる最大電荷注入（１０ｍｓパルスで３ｍＣ／ｃｍ２）は一点鎖線で示されている。ここで、ＳＩＲＯＦはスパッタイリジウム酸化物フィルムの略である。種々の手段（電気めっき、化学蒸着など）で蒸着されたＩｒＯｘ、多孔質Ｐｔ、ＰＥＤＯＴ、カーボンナノチューブなどの他の生体適合性のある大容量材料も高容量電極に使用できる。
図６Ａは、０．５Ａ／ｃｍ２のアクティブ電極電流密度の場合について計算された、ＩＰＬの中央（ｚ＝５７μｍ）に対する平面状アレイ（上）及びハニカム型アレイ（下）の電位を示す。図６Ｂは、アクティブ電極上の電流密度に関して、平面状デバイス（破線）及びハニカム型デバイス（点線）デバイスの実験的しきい値（データポイント）及び計算されたしきい値を示す。平面モデル（以下で説明するように、バイナリと線形の両方）は、実験測定で観察された傾向を再現する。ハニカム型アレイは刺激しきい値（点線）を大幅に低減し、これにより４０μｍ未満のピクセルを有するデバイスの安全な操作が可能となる。ＳＩＲＯＦによる最大電荷注入（１０ｍｓパルスで３ｍＣ／ｃｍ２）は一点鎖線で示されている。ここで、ＳＩＲＯＦはスパッタイリジウム酸化物フィルムの略である。種々の手段（電気めっき、化学蒸着など）で蒸着されたＩｒＯｘ、多孔質Ｐｔ、ＰＥＤＯＴ、カーボンナノチューブなどの他の生体適合性のある大容量材料も高容量電極に使用できる。
【0029】
ハニカム形状のアレイの利点を評価するために、ネットワークを介した網膜刺激のモデルを使用した。このモデルを検証するために、まずモデリング結果を、さまざまなピクセルサイズの平面状網膜下光起電インプラントを使用したラットで測定された生体内刺激しきい値と比較し、次にさまざまなサイズのハニカム型アレイの刺激しきい値を計算した。
【0030】
このシステムの完全なモデル化には、デバイスによって生成されたシミュレートされた電界（図６Ａ）を網膜内ニューロンの応答に変換し、その後のネットワークを介した処理を網膜神経節細胞（ＲＧＣ）活性に適用し、最後に網膜出力を視覚誘発皮質電位（ＶＥＰ）に変換する必要があり、これは複数の未知数を伴う非常に複雑なモデリングタスクである。このタスクは、次の２つの仮定、（１）ネットワークを介した刺激は、シグモイド曲線に従うＲＧＣ活性を誘発し、（２）皮質反応は、網膜信号の合計によって駆動され、シグモイド曲線に従う、という仮定で簡略化できる。本発明者は、ネットワークを介した網膜応答の電界へのシグモイド依存性を、従前に行われた実験から、（１）刺激しきい値を横断するバイナリ遷移をモデル化するステップ関数と、（２）刺激の増加に応じた神経出力の漸次的増加をモデル化する線形関数、という２つの極端な方式のモデル化で近似した。その結果、総網膜応答は、ＩＮＬのボリューム全体の細胞応答を、（１）バイナリ係数（つまり刺激しきい値を超えるＩＮＬボリュームの一部のみを計算する）、または（２）その分極に比例する細胞応答のいずれかと統合することによって計算される。従って、２つのモデルをそれぞれ「バイナリ」及び「線形」と呼ぶ。
【0031】
網膜の電界は、定常状態の電流を想定し、ＣＯＭＳＯＬ Ｍｕｌｔｉｐｈｙｓｉｃｓ（商標）５．０のアレイ全体の有限要素モデルを使用して計算し、静電モジュールを使用してマクスウェルの電位方程式を解いた。次に、計算した電界を、バイナリモデルと線形モデルの両方を使用して網膜応答に変換した。各モデルには、網膜出力を皮質反応の振幅に関連付けるためのフィッティングパラメータは１つしかない。バイナリモデルの場合、皮質応答を引き出すためにアクティブ化する必要があるのはＩＮＬ細胞の割合であったが、線形モデルの場合、線形フィッティングの傾きであった。放射照度は、ピクセルの形状と２ダイオードピクセルの光から電流への変換効率に基づいて電流密度に変換される。従って、バイナリモデルをフィッティングさせるために、電場と放射照度を計算し、全てのピクセルサイズで刺激しきい値（１０ミリ秒の陽極パルスで４．８ｍＶ、「方法」の項を参照）を超えるＩＮＬの割合を計算する。以前に記録された１４０μｍ、７０μｍ、５５μｍ、及び４０μｍピクセルの実験しきい値を使用すると、ＶＥＰ応答を引き出すには、ＩＮＬボリュームの８．２７±１．４２％が刺激しきい値を超えている必要があることがわかる。バイナリモデルと線形モデルはいずれも、刺激しきい値とピクセルサイズの非常に類似したスケーリングを生成し、このことは、非常に重要な要素が、シグモイド応答曲線の細部ではなく電界の形状であることを示している。
【0032】
（Ｂ２ｃ）ハニカム型アレイによる刺激しきい値
平面状インプラントで得られた生体内刺激しきい値との比較によって検証されたバイナリモデルパラメータを使用して、ハニカム型アレイの刺激しきい値を計算した（「方法」の項の詳細を参照）。これらのしきい値は、１０ｍｓパルスのアクティブ電極上の電流密度に関して同じサイズの平面状ピクセルの場合よりも大幅に低く、ピクセルサイズの減少に伴ってあまり増加していない（図６Ｂ）。円周方向の戻りを伴う平面状アレイは、（ａ）アクティブ電極からの電界の半径方向の広がり、及び（ｂ）同一平面上の戻り電極（図３－２（Ｃ））のために、垂直軸に沿った電位の急激な低下の問題が生ずる。その結果、４０μｍ未満の平面状ピクセルには、１０ｍｓパルス（＞３０ｍＡ／ｃｍ２、または電荷密度が＞３ｍＣ／ｃｍ２）に対してＳＩＲＯＦの安全な電荷注入限界よりも大きい電流密度が必要となる。ピクセルを取り囲む絶縁ハニカム壁の上に戻り電極を配置すると、電流が主にアクティブ電極から上向きに流れるようになり（図３－２（Ｄ））、それによって電位が刺激しきい値を超える深さが大幅に増加する。さらに、ハニカム型アレイでは、組織への電界の侵入深さは、壁の高さによって設定されるため、ピクセル幅から切り離される。従って、電流密度に関する刺激しきい値は、ピクセル幅に依存せず（図６Ｂ）、ピクセルサイズを、網膜の移動によってのみ、すなわち細胞の寸法によってのみ制限されるサイズまで縮小できる。刺激しきい値の向上は表１に要約して示されている。
平面状インプラントで得られた生体内刺激しきい値との比較によって検証されたバイナリモデルパラメータを使用して、ハニカム型アレイの刺激しきい値を計算した（「方法」の項の詳細を参照）。これらのしきい値は、１０ｍｓパルスのアクティブ電極上の電流密度に関して同じサイズの平面状ピクセルの場合よりも大幅に低く、ピクセルサイズの減少に伴ってあまり増加していない（図６Ｂ）。円周方向の戻りを伴う平面状アレイは、（ａ）アクティブ電極からの電界の半径方向の広がり、及び（ｂ）同一平面上の戻り電極（図３－２（Ｃ））のために、垂直軸に沿った電位の急激な低下の問題が生ずる。その結果、４０μｍ未満の平面状ピクセルには、１０ｍｓパルス（＞３０ｍＡ／ｃｍ２、または電荷密度が＞３ｍＣ／ｃｍ２）に対してＳＩＲＯＦの安全な電荷注入限界よりも大きい電流密度が必要となる。ピクセルを取り囲む絶縁ハニカム壁の上に戻り電極を配置すると、電流が主にアクティブ電極から上向きに流れるようになり（図３－２（Ｄ））、それによって電位が刺激しきい値を超える深さが大幅に増加する。さらに、ハニカム型アレイでは、組織への電界の侵入深さは、壁の高さによって設定されるため、ピクセル幅から切り離される。従って、電流密度に関する刺激しきい値は、ピクセル幅に依存せず（図６Ｂ）、ピクセルサイズを、網膜の移動によってのみ、すなわち細胞の寸法によってのみ制限されるサイズまで縮小できる。刺激しきい値の向上は表１に要約して示されている。
【0033】
［表１］種々のピクセルサイズで計算された刺激しきい値電流密度
アスタリスク（＊）は、ＳＩＲＯＦ電荷注入制限を超える１０ｍｓパルスの電流密度を示す。
【0034】
刺激のしきい値に加えて、ハニカム電極は、高い視力に不可欠な電気刺激の空間選択性（つまり、隣接するピクセル間のコントラスト）を大幅に改善する。視力の生体内評価に使用される格子パターンを複製するために、ＯＮピクセルとＯＦＦピクセルの交互の行を使用してアレイからの電界分布をシミュレートする。両方の構成の電極のいずれの場合も、電流密度を上げると、ＯＮピクセルより上の正の電位と、ＯＦＦピクセルより上の負の電位が増加する。ハニカム形状の絶縁性壁は、電界の横方向の広がりを防止し、それによって、ＯＮピクセルの選択的アクティブ化のダイナミックレンジを広げる。さらに、電界はハニカム形状の壁の上に広がり、安全な電荷注入限界内でキャビティの基部から最大４０μｍの細胞を刺激し、クロストークなしで網膜全体の最大９９％のアクティブ化が可能となる。
【0035】
（Ｂ３）検討
本発明者らによる研究は、現在のシステムの限界をはるかに超えた人工網膜の空間分解能の改善への道を提供する。最近まで、臨床試験で達成された人工視力の最高の視力は２０／５４６であり、Ａｌｐｈａ ＩＭＳ／ＡＭＳ網膜下インプラントを使用した２人の患者で観察された［２，２０］。７０μｍピクセルの場合、この人工視覚デバイスはサンプリング限界に対して２倍性能が低下しており、ピクセルサイズを継続的に縮小しても視力は改善されないと結論付ける人もいる。しかし、これらのデバイスのボトルネックは、生物学的ではなく電気的である可能性がある。すなわち各ピクセルのアクティブ電極が共通の離隔戻り電極を共有するこのインプラントの単極構成では、隣接する電極間で強いクロストークが発生し、空間コントラストが大幅に低下する。各ピクセルにアクティブ電極と戻り電極を設ける代替的な設計により、電界の局在化と関連する空間分解能が向上する。実際、局所的戻り電極を備えた１００μｍピクセルの光起電性網膜下インプラントを使用した最近の臨床試験では、最大２０／４６０の視力が示された。これは、このピクセルサイズ（２０／４００）のサンプリング限界をわずか１５％しか下回っていない。さらに、ラットでは、７０μｍ及び５５μｍピクセルの同様のインプラントが、サンプリング限界に一致する格子視力を提供した。これは、視力が各ピクセルの電界を適切に制限すると、刺激アレイのサンプリング密度の限界に達する可能性があることを示している。しかし、ピクセルサイズのさらなる減少は、刺激しきい値の急速な増大によって制限され、これは、４０μｍ幅の平面状ピクセルで安全限界近くまで上昇する（図６Ｂ）。
本発明者らによる研究は、現在のシステムの限界をはるかに超えた人工網膜の空間分解能の改善への道を提供する。最近まで、臨床試験で達成された人工視力の最高の視力は２０／５４６であり、Ａｌｐｈａ ＩＭＳ／ＡＭＳ網膜下インプラントを使用した２人の患者で観察された［２，２０］。７０μｍピクセルの場合、この人工視覚デバイスはサンプリング限界に対して２倍性能が低下しており、ピクセルサイズを継続的に縮小しても視力は改善されないと結論付ける人もいる。しかし、これらのデバイスのボトルネックは、生物学的ではなく電気的である可能性がある。すなわち各ピクセルのアクティブ電極が共通の離隔戻り電極を共有するこのインプラントの単極構成では、隣接する電極間で強いクロストークが発生し、空間コントラストが大幅に低下する。各ピクセルにアクティブ電極と戻り電極を設ける代替的な設計により、電界の局在化と関連する空間分解能が向上する。実際、局所的戻り電極を備えた１００μｍピクセルの光起電性網膜下インプラントを使用した最近の臨床試験では、最大２０／４６０の視力が示された。これは、このピクセルサイズ（２０／４００）のサンプリング限界をわずか１５％しか下回っていない。さらに、ラットでは、７０μｍ及び５５μｍピクセルの同様のインプラントが、サンプリング限界に一致する格子視力を提供した。これは、視力が各ピクセルの電界を適切に制限すると、刺激アレイのサンプリング密度の限界に達する可能性があることを示している。しかし、ピクセルサイズのさらなる減少は、刺激しきい値の急速な増大によって制限され、これは、４０μｍ幅の平面状ピクセルで安全限界近くまで上昇する（図６Ｂ）。
【0036】
本発明の実施で説明されている刺激アレイの根本的に異なる形状（ハニカム構成）は、この基本的な制限の問題に対処している。キャビティの底にあるアクティブ電極からの電流は、絶縁性壁によるピクセルの閉じ込めのために上向きに流れる（図３－１（Ｂ）及び図３－２（Ｄ））。電界の形状のこの変化は、刺激のしきい値を劇的に低下させる。さらに、電流の一方向の流れは、ピクセルサイズに応じて刺激しきい値のスケーリングを根本的に変える。この場合、必要な電流は電極のサイズによって変化しないため、電流密度は電極の面積に反比例して増加、つまり、半径の二乗に比例する。電極サイズとピクセル幅の比率が一定に維持されている場合、ピクセルが小さいほど高い電流密度が必要になるが、これは材料特性によって制限される。ただし、一次元の電流の流れでは状況が異なる。すなわち特定の電位降下に必要な電流密度はピクセル幅によって変わらないため、電極上で同じ電流密度を維持しながら、ピクセルをはるかに小さくすることができる。このことは、光起電性ピクセルの場合、ピクセル幅に対する電極の相対的な寸法が変化しない限り、しきい値放射照度はすべてのピクセルサイズでほぼ同じままである必要があることを意味する。
【0037】
ハニカム設計は、網膜下空間の空隙に移動する網膜内神経細胞の能力により、網膜下配置に独自に適している。本発明者らの研究から、内側の網膜ニューロンが幅１８μｍ（ピクセルピッチ２０μｍ）の小さなウェルに容易に移動することが分かった。６週間後の組織の生存率は、インプラントの上にある網膜血管系からの酸素と栄養素の拡散が、２５μｍの高さの壁内での細胞の生存に十分であることを示している。本発明者らの研究では統合の下限が観察されなかったため、ピクセル幅は縮小し続ける可能性があるが、約１０μｍの細胞サイズを下回ってはいないのは確実である。この範囲内の正確な最小値を決定するには、さらに実験が必要である。ピクセルサイズをさらに小さくしなくても、２０μｍピクセルのアレイは、ラットの自然な視力に一致する空間分解能の達成を可能にするが、これはヒトの視力の２０／１００よりも優れているはずである。
【0038】
ＩＮＬの大部分がキャビティに移動しても、網膜構造の残部には影響を与えないとみられ、ＩＮＬ、ＩＰＬ、及びＧＣＬが明確に表示されている。ＩＮＬ細胞のＲＧＣへの接続の全ては、ＩＰＬのハニカム壁の上にあるため、網膜信号処理はこの移行の影響を受けないと予想される。外網状層（ＯＰＬ）の光受容体の末端に接続された水平細胞を介した双極細胞間の横方向の接続性は、光受容体がないために変性網膜で失われている可能性がある。ハニカム壁のミクログリアの数は平面状デバイスの場合と同様であることがわかり、後者は動物の生涯を通じてＶＥＰを誘発するため、両方のインプラントによる免疫応答は許容範囲だとみられる。興味深いことに、ハニカム形状を使用すると、ミクログリアは壁の上部に局在し、神経細胞が刺激電極の近くに移動できるようになる。
【0039】
離隔した戻り電極を備えた既存の網膜下人工視覚デバイスに、ピクセルの周りに垂直壁を組み込むこともできる。そのような単極構成では、ウェルに移動する双極細胞の分極は、電場の垂直方向の整列のためにより効率的になるはずであり、従って、刺激しきい値ならびに隣接するピクセル間のクロストークは、図２Ｂに示されるように減少するはずである。ただし、局所的な戻り電極がない場合、暗いピクセル内の電位は、光が入った隣接ピクセルの影響を受ける。そのため、このようなアレイに表示されるパターンのダイナミックレンジは、図２Ａに示す双極電極構成の場合よりも低くなる。
【0040】
定常状態では、電極表面の電流密度は、単位面積あたりの静電容量に比例する。従って、電極が静電容量の非常に異なる２つの材料で構成されている場合、電流は主に静電容量の大きい方に流れる。この現象のため、静電容量が戻り電極のために壁の上に堆積された材料の静電容量よりもはるかに低い場合に限り、導電性材料からの３Ｄ電極の垂直壁の作製が可能となる。壁は導電性材料で作製されているが、電解質に流れる電流が非常に少なく、単位面積あたりの静電容量が非常に小さいため、液体中では壁が絶縁体からなるかのように作動する。例えば、壁は生理食塩水中で０．０１ｍＦ／ｃｍ２のオーダーの静電容量を有する金で電気めっきできるが、壁の上部の戻り電極は１～１０ｍＦ／ｃｍ２の静電容量を持つ酸化イリジウムから作製される。金属製の壁は導電性であるため、このような壁の上部にあるＩｒＯｘを電気めっきすることができる。あるいは、ＩｒＯｘはスパッタリングによって堆積することができるが、この場合には導電性の壁がこのコーティングをデバイスの表面の電気回路に接続する。壁は、プラチナ、アルミニウム、モリブデンなどの他の金属で作製することもできる。
【0041】
電解質と側壁の間で電流が流れるのを防止するために、側壁を非導電性材料でコーティングすることもできる。例えば、アルミニウムやモリブデンの酸化により、その表面は非導電性になる。壁はまた、限定しないが、原子層堆積または非導電性材料のフォトリソグラフィーを含む付加的なプロセスによって絶縁処理され得る。あるいは、壁は絶縁体で作製することができる。この場合、そのような壁の上に堆積された戻り電極は、この目的のために壁の上に堆積された導電性トラックを介して電気回路に接続されることになる。
【0042】
インプラント内のピクセルは光起電性、つまり、アクティブ電極と戻り電極の間に接続されたフォトダイオードを使用して、ピクセルに当たる光を電流に変換する構成であり得る。あるいは、電流を有線接続を介して電極に供給することができる。
【0043】
ハニカム型キャビティへの細胞の移動を可能にするために、それらの幅は細胞サイズを超えている、すなわち５μｍより大きい幅である必要がある。キャビティの幅が深さを大幅に超えると、キャビティの有利な効果は無視できる程度になってしまう。図６Ｂに示されるように、網膜刺激については、１００μｍより大きいピクセルでは無視できる程度になる。網膜下移植に使用するために、すなわち、剛性を有するアレイの便利なタイリングがヒトの目の曲面に追従できるようにするために、アレイのサイズは、０．５～５ｍｍの範囲、より一般的には１～３ｍｍでなければならない。これらの寸法では、アレイは前述のように柔軟な材料を使用する必要はないが、より大きなアレイの場合、目に適合させるために柔軟な基板を組み込むことができる。キャビティの深さは、内顆粒層からの細胞の移動を可能にするものでなければならない。つまり、内顆粒層と網膜下破片層の厚さ、つまり２０～７０μｍの範囲である。生体内での６週間の移植後の組織生存率から、ウェルの底部の穿孔は、追加の栄養素の流れ及び組織の生存のために必要でないことが分かる。
【0044】
側壁は、インプラントの外植を可能にすると同時に、網膜下腔内の機械的安定性を向上させるように設計できる。この研究で示されているように、完全に滑らかな垂直壁は、デバイスが組織から取り外されたときに組織に大きな機械的力を及ぼさない。しかし、キャビティに移動する組織が、デバイスを網膜に対して横方向に固定する手段となる。壁の上部に追加の張り出し部は、電気めっき手順をガイドするトレンチの上に電気めっきすることによって導入できる。この場合、キャビティ開口部ｄｏ＜ｄｃはその幅よりも小さくなるため、ｚ軸に沿ったインプラントの安定性をさらに向上させることができる。ただし、これによりデバイスの外植がより外傷を与えやすくなる可能性があるため、正しい構成は患者の年齢と外植の可能性に基づいて決定され得る。
【0045】
表１に示すように、刺激しきい値は０．０１～１Ａ／ｃｍ２の範囲で、パルス幅は１０ｍｓである。従って、電極材料は、０．１～１０ｍＣ／ｃｍ２の範囲の電荷密度を注入できるように選択する必要がある。
【0046】
インプラントが入射光に対して傾斜している場合、ハニカム形状の反射側壁は、ウェルの底にあるインプラントの感光領域に放射を向けるのに役立つ。この目的のために、電気めっきを使用して金属で壁を作ると、可視光及び赤外光に対する金属の高い反射性のために有利になる。反射率の高い他の材料やコーティングもこの目的、特に概ねかすめ角で壁に入射する光のために使用できる。
【0047】
（Ｂ４）方法
（Ｂ４ａ）パッシブハニカム型インプラント
パッシブハニカム型インプラントは、深いシリコンエッチング用のパターンを生成するための２つのマスク層を使用して結晶シリコンウェーハから作製した。ヘキサメチルジシラザン（ＨＭＤＳ）でプライミングされたウェーハを、２μｍのネガティブフォトレジスト（ＡＺ５２１４－ＩＲ）でスピンコーティングし、ハニカム壁を画定するべくプロセシングした。このレジストをさらに１５分間ＵＶで処理して、後続のエッチング中の選択性を高めた。ボッシュのエッチングプロセスを使用して、露出したシリコン領域に２５μｍの深さのキャビティを形成した。ハニカム画定用のレジストを除去した後、フォトレジスト（７．５％ＳＰＲ２２０－７、６８％ＭＥＫ、及び２４．５％ＰＧＭＥＡ）をウェーハ上に１４μｍの厚さにスプレーコーティングし、プロセシングして幅約１ｍｍのアレイの周囲にリリーストレンチを画定した。第２のボッシュプロセスが適用してこれらのリリーストレンチを作成し、その後フォトレジストを除去した。ウェーハに厚さ６０μｍの保護フォトレジストをスプレーコーティングし、続いてハニカムの基部から厚さ５００～５０μｍの裏面研削（Ｇｒｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ Ｄｉｃｉｎｇ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ｉｎｃ．米国カリフォルニア州サンノゼ）を実施した。その後、ＸｅＦ２ガスに残っている余分なシリコンをエッチングして、インプラントのリリースを完了した。得られた構造を図４Ａ及び図４Ｂに示す。キャビティは、４０μｍ、３０μｍ、及び２０μｍピッチの六角形のハニカムパターンに配置され、１０μｍの厚さの基部上に、それぞれ厚さ４μｍ、３μｍ、及び２μｍ、高さ２５μｍの高さの壁が存在している。第４象限は１０μｍピッチのハニカム用に設計されたが、これらは本出願人が利用できるリソグラフィシステムの処理限界を超えており、作製しなかった。本明細書では、この領域を「平面状」象限と称する。生体内での溶解を防止するために、シリコンインプラントの表面に５０ｎｍの厚さの酸化物を成長させた。
（Ｂ４ａ）パッシブハニカム型インプラント
パッシブハニカム型インプラントは、深いシリコンエッチング用のパターンを生成するための２つのマスク層を使用して結晶シリコンウェーハから作製した。ヘキサメチルジシラザン（ＨＭＤＳ）でプライミングされたウェーハを、２μｍのネガティブフォトレジスト（ＡＺ５２１４－ＩＲ）でスピンコーティングし、ハニカム壁を画定するべくプロセシングした。このレジストをさらに１５分間ＵＶで処理して、後続のエッチング中の選択性を高めた。ボッシュのエッチングプロセスを使用して、露出したシリコン領域に２５μｍの深さのキャビティを形成した。ハニカム画定用のレジストを除去した後、フォトレジスト（７．５％ＳＰＲ２２０－７、６８％ＭＥＫ、及び２４．５％ＰＧＭＥＡ）をウェーハ上に１４μｍの厚さにスプレーコーティングし、プロセシングして幅約１ｍｍのアレイの周囲にリリーストレンチを画定した。第２のボッシュプロセスが適用してこれらのリリーストレンチを作成し、その後フォトレジストを除去した。ウェーハに厚さ６０μｍの保護フォトレジストをスプレーコーティングし、続いてハニカムの基部から厚さ５００～５０μｍの裏面研削（Ｇｒｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ Ｄｉｃｉｎｇ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ｉｎｃ．米国カリフォルニア州サンノゼ）を実施した。その後、ＸｅＦ２ガスに残っている余分なシリコンをエッチングして、インプラントのリリースを完了した。得られた構造を図４Ａ及び図４Ｂに示す。キャビティは、４０μｍ、３０μｍ、及び２０μｍピッチの六角形のハニカムパターンに配置され、１０μｍの厚さの基部上に、それぞれ厚さ４μｍ、３μｍ、及び２μｍ、高さ２５μｍの高さの壁が存在している。第４象限は１０μｍピッチのハニカム用に設計されたが、これらは本出願人が利用できるリソグラフィシステムの処理限界を超えており、作製しなかった。本明細書では、この領域を「平面状」象限と称する。生体内での溶解を防止するために、シリコンインプラントの表面に５０ｎｍの厚さの酸化物を成長させた。
【0048】
（Ｂ４ｂ）動物及び外科的処置
すべての実験手順は、施設のガイドライン及び眼科及び視覚研究における動物の使用に関するＡＲＶＯ声明に従って実施した。動物の世話とその後の移植は、スタンフォード動物施設で維持されている王立外科医師会（ＲＣＳ）コロニーから得られた網膜変性を有するラットを使用して実施した。Ｎ＝６の動物にハニカム型アレイを移植し、光受容体の完全な変性を確実にするためにＰ１８０とＰ３００の間に移植を行った。ケタミン（７５ｍｇ／ｋｇ）とキシラジン（５ｍｇ／ｋｇ）の混合物を筋肉内注射して動物を麻酔した。角膜輪部の１．５ｍｍ後方の強膜と脈絡膜を通して１．５ｍｍの切開を行った。生理食塩水を注射して網膜を持ち上げ、インプラントを網膜下腔に挿入した。結膜をナイロン１０－０で縫合し、術後に局所抗生物質（バシトラシン／ポリミキシンＢ）を眼に塗布した。手術の成功と網膜の再付着は、光コヒーレンストモグラフィー（ＯＣＴ）（ＨＲＡ２－Ｓｐｅｃｔｒａｌｉｓ；Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、独国ハイデルベルク）を使用して検証した。移植後６週間で動物を安楽死させた。対照群の追加の動物は、平面状のアクティブインプラントを有しており、約６ヶ月の長い生体内実験の後に犠牲にした。
すべての実験手順は、施設のガイドライン及び眼科及び視覚研究における動物の使用に関するＡＲＶＯ声明に従って実施した。動物の世話とその後の移植は、スタンフォード動物施設で維持されている王立外科医師会（ＲＣＳ）コロニーから得られた網膜変性を有するラットを使用して実施した。Ｎ＝６の動物にハニカム型アレイを移植し、光受容体の完全な変性を確実にするためにＰ１８０とＰ３００の間に移植を行った。ケタミン（７５ｍｇ／ｋｇ）とキシラジン（５ｍｇ／ｋｇ）の混合物を筋肉内注射して動物を麻酔した。角膜輪部の１．５ｍｍ後方の強膜と脈絡膜を通して１．５ｍｍの切開を行った。生理食塩水を注射して網膜を持ち上げ、インプラントを網膜下腔に挿入した。結膜をナイロン１０－０で縫合し、術後に局所抗生物質（バシトラシン／ポリミキシンＢ）を眼に塗布した。手術の成功と網膜の再付着は、光コヒーレンストモグラフィー（ＯＣＴ）（ＨＲＡ２－Ｓｐｅｃｔｒａｌｉｓ；Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、独国ハイデルベルク）を使用して検証した。移植後６週間で動物を安楽死させた。対照群の追加の動物は、平面状のアクティブインプラントを有しており、約６ヶ月の長い生体内実験の後に犠牲にした。
【0049】
（Ｂ４ｃ）ホールマウント網膜イメージング
動物をＢｅｕｔｈａｎｅｓｉａの心臓内注射で安楽死させ、眼を除核し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、Ｇｉｂｃｏ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国カリフォルニア州サニーベール）でリンスした。前眼部と水晶体を取り除き、実体顕微鏡下でインプラントの位置を確認し、アイカップをインプラントの中心で３ｍｍ×３ｍｍの正方形にカットし、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ；ＥＭＳ、米国ペンシルベニア州）で４oＣで１２時間固定した。インプラントは、除去による組織の損傷や再編成を防ぐために所定の位置に保持した。サンプルを、ＰＢＳ中の１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、米国カリフォルニア州）で、室温で３時間透過処理した。サンプルを１０％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）ブロッキングバッファーに入れ、続いて２つの一次抗体とともに室温で１２時間インキュベートした。具体的には、この処置は、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、５％ＢＳＡを含むＰＢＳ中のウサギ抗ＩＢＡ１抗体（１：２００；Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、米国バージニア州）及びマウス抗グルタミンシンテターゼ（ＧＳ、１：１００；Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、米国コロラド州）とともに行った。サンプルをＰＢＳ中の０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（ＰＢＳ－Ｔ）で室温で６時間洗浄し、２つの二次抗体とともに室温で１２時間インキュベートした。具体的には、この処置は、ロバ抗ウサギＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ４８８（１：２００；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国カリフォルニア州サニーベール）及びロバ抗マウスＣＹ３（１：２００；Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．、米国ペンシルベニア州）とともに行い、ＰＢＳ中の４'，６－ジアミジン－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で対比染色した。ＰＢＳＴで６時間洗浄した後、サンプルを封入剤Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Ｈ－１０００；Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国カリフォルニア州バーリンガム）を用いてマウントした。
動物をＢｅｕｔｈａｎｅｓｉａの心臓内注射で安楽死させ、眼を除核し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、Ｇｉｂｃｏ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国カリフォルニア州サニーベール）でリンスした。前眼部と水晶体を取り除き、実体顕微鏡下でインプラントの位置を確認し、アイカップをインプラントの中心で３ｍｍ×３ｍｍの正方形にカットし、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ；ＥＭＳ、米国ペンシルベニア州）で４oＣで１２時間固定した。インプラントは、除去による組織の損傷や再編成を防ぐために所定の位置に保持した。サンプルを、ＰＢＳ中の１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、米国カリフォルニア州）で、室温で３時間透過処理した。サンプルを１０％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）ブロッキングバッファーに入れ、続いて２つの一次抗体とともに室温で１２時間インキュベートした。具体的には、この処置は、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、５％ＢＳＡを含むＰＢＳ中のウサギ抗ＩＢＡ１抗体（１：２００；Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、米国バージニア州）及びマウス抗グルタミンシンテターゼ（ＧＳ、１：１００；Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、米国コロラド州）とともに行った。サンプルをＰＢＳ中の０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（ＰＢＳ－Ｔ）で室温で６時間洗浄し、２つの二次抗体とともに室温で１２時間インキュベートした。具体的には、この処置は、ロバ抗ウサギＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ４８８（１：２００；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国カリフォルニア州サニーベール）及びロバ抗マウスＣＹ３（１：２００；Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．、米国ペンシルベニア州）とともに行い、ＰＢＳ中の４'，６－ジアミジン－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で対比染色した。ＰＢＳＴで６時間洗浄した後、サンプルを封入剤Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Ｈ－１０００；Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国カリフォルニア州バーリンガム）を用いてマウントした。
【0050】
Ｚｅｉｓｓ ＺＥＮＢｌａｃｋソフトウェアを備えたＺｅｉｓｓＬＳＭ８８０共焦点倒立顕微鏡を使用して３Ｄイメージングを実施した。画像面は、Ｚスタックを使用して網膜の全厚を通して取得し、上限及び下限はそれぞれ内境界膜（ＩＬＭ）とハニカムキャビティの基部の下１０μｍで定義されている。スタックは、取得領域が２２５μｍ×２２５μｍ、３６０ｎｍのＺ方向ステップ、及び０．５５μｍピンホールの４０倍の油浸対物レンズを使用して、各ハニカム象限の中央で取得した。
【0051】
（Ｂ４ｄ）画像分析
共焦点データセットは、ＩｍａｇｅＪのＦｉＪｉ分布を使用して分析した。ウェル内及びインプラント上部の細胞密度を分析するために、最初に個々のＸＹ平面のコントラストを最大化して、スタック内のさまざまなＺ方向位置での輝度変動を補正するために０．３％のチャネル飽和を確保した。次に、ＸＹ平面の斑点を取り除き、バックグラウンドを差し引いた。ガウスぼかしフィルタ（σ＝３ピクセル、０．４２μｍ）を適用して、個々の細胞内の明るさの変化を滑らかにした。次に、ＸＹ平面をエッジ検出フィルタに通し、処理された画像とエッジ検出された画像の背景を差し引いたＯＲの組み合わせから最終画像を作成した。細胞密度分析では、チャネルしきい値を調整して（デフォルトの方法）、細胞のバイナリ表現を得た。次に、ハニカム壁が占める面積を考慮して、細胞が占める面積のパーセントとして定義されるＸＹ平面内の細胞密度を計算した。網膜組織学の局所的変動を説明するために、各ハニカムユニットを独立して分析し、細胞密度をユニットスタック内の最大値に正規化した。キャビティ内に含まれるＩＮＬの割合は、次のように計算される。
式中、Ｄ（ｚ）は、基部（ｚ＝０）からの高さ（ｚ）の関数としてのＸＹ平面当たりのセルの相対密度であり、ｚ'は壁の高さ（２５μｍ）であり、ｚ"はＩＮＬの末端であり、Ｄ（ｚ）＜０．０２の点として定義される。
共焦点データセットは、ＩｍａｇｅＪのＦｉＪｉ分布を使用して分析した。ウェル内及びインプラント上部の細胞密度を分析するために、最初に個々のＸＹ平面のコントラストを最大化して、スタック内のさまざまなＺ方向位置での輝度変動を補正するために０．３％のチャネル飽和を確保した。次に、ＸＹ平面の斑点を取り除き、バックグラウンドを差し引いた。ガウスぼかしフィルタ（σ＝３ピクセル、０．４２μｍ）を適用して、個々の細胞内の明るさの変化を滑らかにした。次に、ＸＹ平面をエッジ検出フィルタに通し、処理された画像とエッジ検出された画像の背景を差し引いたＯＲの組み合わせから最終画像を作成した。細胞密度分析では、チャネルしきい値を調整して（デフォルトの方法）、細胞のバイナリ表現を得た。次に、ハニカム壁が占める面積を考慮して、細胞が占める面積のパーセントとして定義されるＸＹ平面内の細胞密度を計算した。網膜組織学の局所的変動を説明するために、各ハニカムユニットを独立して分析し、細胞密度をユニットスタック内の最大値に正規化した。キャビティ内に含まれるＩＮＬの割合は、次のように計算される。
【0052】
それぞれ４０μｍ、３０μｍ、及び２０μｍサイズのハニカムを含む６つの埋め込まれたデバイスを画像化し、分析した。３つのデバイスでは、２０μｍサイズのハニカムが損傷したため、これらは分析から除外した。
【0053】
（Ｂ４ｅ）組織学的調製物
共焦点イメージング後、サンプルをバッファーですすぎ、１．２５％グルタルアルデヒド溶液で２４時間室温で固定した。次に、それらを四酸化オスミウムで室温で２時間後固定し、段階的アルコールと酸化プロピレンで脱水した。室温でエポキシ（ＤＭＰ－３０なし）に一晩浸透した後、（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ－Ａｒａｌｄｉｔｅ－ＥＭｂｅｄ、ＲＴ１３９４０、Ｍｏｌｌｅｎｈａｕｅｒ'ｓ ｋｉｔを使用）、サンプルを７０℃のオーブンに３６時間放置した。次に、シリコンインプラントが露出するまでエポキシブロックをトリミングした。切断用ナイフの損傷とハニカム構造からのシリコン破片の形成を防ぐために、ＸｅＦ２エッチング（Ｘａｃｔｉｘ ｅ－１、２３℃、３トル）を使用してシリコンインプラントを除去した。次に、ブロックにエポキシを再充填し、真空デシケーターに２時間入れた後、７０℃で一晩ベーキング処理した。このインプラントのエッチング後に残ったボイドの補充処理が、切断中に構造的サポートを提供した。７００ｎｍの厚さの切片（Ｒｅｉｃｈａｒｔ ＵｌｔｒａｃｕｔＥで切断）を光学顕微鏡用にトルイジンブルーで染色した。
共焦点イメージング後、サンプルをバッファーですすぎ、１．２５％グルタルアルデヒド溶液で２４時間室温で固定した。次に、それらを四酸化オスミウムで室温で２時間後固定し、段階的アルコールと酸化プロピレンで脱水した。室温でエポキシ（ＤＭＰ－３０なし）に一晩浸透した後、（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ－Ａｒａｌｄｉｔｅ－ＥＭｂｅｄ、ＲＴ１３９４０、Ｍｏｌｌｅｎｈａｕｅｒ'ｓ ｋｉｔを使用）、サンプルを７０℃のオーブンに３６時間放置した。次に、シリコンインプラントが露出するまでエポキシブロックをトリミングした。切断用ナイフの損傷とハニカム構造からのシリコン破片の形成を防ぐために、ＸｅＦ２エッチング（Ｘａｃｔｉｘ ｅ－１、２３℃、３トル）を使用してシリコンインプラントを除去した。次に、ブロックにエポキシを再充填し、真空デシケーターに２時間入れた後、７０℃で一晩ベーキング処理した。このインプラントのエッチング後に残ったボイドの補充処理が、切断中に構造的サポートを提供した。７００ｎｍの厚さの切片（Ｒｅｉｃｈａｒｔ ＵｌｔｒａｃｕｔＥで切断）を光学顕微鏡用にトルイジンブルーで染色した。
【0054】
（Ｂ４ｆ）電界と網膜刺激のモデル化
網膜の電界を、ＣＯＭＳＯＬ Ｍｕｌｔｉｐｈｙｓｉｃｓ ５．０の完全なアレイの３Ｄ有限要素モデルを使用して計算し、静電気モジュールを使用して、定常状態の電流を想定して、マクスウェルの電位方程式を解いた。モデル化されたアレイは、直径１ｍｍ、厚さ３０μｍで、表２に示すさまざまなサイズの六角形のピクセルで構成され、戻り電極が１つのメッシュに接続されている。
網膜の電界を、ＣＯＭＳＯＬ Ｍｕｌｔｉｐｈｙｓｉｃｓ ５．０の完全なアレイの３Ｄ有限要素モデルを使用して計算し、静電気モジュールを使用して、定常状態の電流を想定して、マクスウェルの電位方程式を解いた。モデル化されたアレイは、直径１ｍｍ、厚さ３０μｍで、表２に示すさまざまなサイズの六角形のピクセルで構成され、戻り電極が１つのメッシュに接続されている。
【0055】
［表２］モデル化された光起電アレイのピクセル数とその形状
【0056】
電界は、周囲に接地（０電位）が定義されているボリューム（体積部）（立方体、一辺＝１０ｍｍ）において計算される。モデル化された人工視覚デバイスは、アクティブ電極から注入されたすべての電流が戻り電極に収集されるクローズドシステムとして機能する。電極表面の境界条件は、定常状態に対応する均一な電流密度を有するものとして定義した。
【0057】
定常状態の電極－電解質界面の電流密度は、単位面積あたりの電極容量に比例する。従って、側壁が絶縁されていなくても、電流は主にＳＩＲＯＦでコーティングされた上部を流れる。例えば、ＳＩＲＯＦコーティングを戻り電極材料として使用した場合、その静電容量は金の静電容量の約１０００倍になる（１０ｍＦ／ｃｍ２対０．０１ｍＦ／ｃｍ２）。ピクセルあたりの側壁の面積に対する壁の上部に配置された戻り電極の面積の比率は、壁の半分の幅とその高さの比率に等しい。アスペクト比（高さ対幅）が５：１の壁の場合、壁の上部と側面の面積の比率は約１０：１である。従って、側壁の静電容量は、ピクセルあたり、ハニカムの上部に堆積されたＳＩＲＯＦ戻り電極の静電容量の１００分の１になる。従って、壁が金属でできている場合でも、電解液には非常に低い電流しか受け入れられないため、壁が絶縁性であるかのように機能する。これにより、側壁を絶縁する必要なしに単純な電気めっきが可能になるため、ハニカムの製造が大幅に簡素化される。
【0058】
２つの電極構成、（１）局所的戻り電極を有する平面状構成（図３－１（Ａ））、及び（２）局所的戻り電極を有するハニカム型構成（図３－１（Ｂ））について調べた。いずれの構成においても、共通の戻り電極は、収集された電流の合計が個々のアクティブ電極に注入された電流の合計になるように、すべてのアクティブピクセルによって生成された電流を収集する。ハニカム型の側壁は非導電性である。アクティブデバイスを使用した以前の検査では、さまざまな空間周波数の格子パターンを１００％のコントラストで投影することにより、生体内の空間分解能を評価した。最大解像度は、ピクセルの交互の行をアクティブにすること（ＯＮ行、ＯＦＦ行を設ける）に対応する。シミュレーションでこの構成を複製するために、同一のアクティブ化スキームを使用して電界分布を計算し、隣接するピクセル間のクロストークが最も高いアレイの中心で電界を分析する。電気的シミュレーションを当社の光起電力プロテーゼで光強度に関連付けるべく、ピクセルあたりの総電流を、２ダイオード構成のダイオード面積と測定された光から電流への変換効率（１４０μｍ、７０μｍ、５５μｍ、及び４０μｍピクセルでそれぞれ０．４０、０．３１、０．２６、及び０．２４Ａ／Ｗ）に基づいて計算した。
【0059】
網膜刺激しきい値は、ネットワークを介したアクティブ化のモデルを使用して評価した。このアプローチでは、双極細胞間の電圧降下によって定義されるネットワークを介した刺激しきい値を想定した。外部電界中では、細胞内媒体はマイクロ秒以内に等電位になり、アノードの近位と遠位の細胞膜において過分極と脱分極がそれぞれもたらされる。文献から得た１０ｍｓパルスの大きな電極の網膜ネットワークを介した刺激しきい値電流密度、網膜の平均抵抗率（１０００Ω・ｃｍ）、及びＩＮＬの中央からＩＰＬの中央までの距離（３７μｍ）として推定される双極細胞の平均長さを用いて、アノード刺激のための体細胞から軸索終末までの４．８ｍＶの電位差しきい値を計算した。－２１ｍＶのカソードしきい値は、アノード及びカソード刺激でラット網膜で測定されたネットワーク媒介アクティブ化曲線（計算されたアノードしきい値に一致するようにスケーリングされたもの）に基づいて計算した。
【0060】
重要な点として、本発明者らのモデルは文献から得た刺激電流密度に基づいているが、計算された経細胞電圧は網膜抵抗率に線形に比例していることに注意されたい。これについては従来の文献にコンセンサスがない。刺激しきい値に対して、組織内のアクティブ化ゾーンの境界を評価するための手段としてのみ経細胞電圧を使用している。想定される網膜抵抗率のばらつきは、しきい値電位を含め、同じ電流の電位に直線的に影響する。従って、これらのばらつきは、刺激しきい値に関連して計算されるため、アクティブ化ゾーンの境界に影響を与えない。
【0061】
本発明者らは増加する電界に対するネットワークを介した網膜応答のシグモイド依存性を、従前に行われた実験から（１）刺激しきい値を横断するバイナリ遷移をモデル化するステップ関数と、（２）刺激の増加に応じた神経出力の漸次的増加をモデル化する線形関数、という２つの極端な方式のモデル化で近似した。その結果、総網膜応答は、ＩＮＬのボリューム全体の細胞応答を、（１）バイナリ係数（つまり刺激しきい値を超えるＩＮＬボリュームの一部のみを計算する）、または（２）その分極に比例する細胞応答のいずれかと統合することによって計算される。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図3-1】
【図3-2】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【国際調査報告】