特表 2022-524018 ＩＬ－１０バリアント分子ならびに炎症性疾患および腫瘍を処置する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-04-27

(54)【発明の名称】ＩＬ－１０バリアント分子ならびに炎症性疾患および腫瘍を処置する方法

(51)【国際特許分類】

   C07K 19/00 20060101AFI20220420BHJP

   C07K 14/54 20060101ALI20220420BHJP

   C07K 16/24 20060101ALI20220420BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20220420BHJP

   A61K 38/20 20060101ALI20220420BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20220420BHJP

   C12N 15/62 20060101ALN20220420BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20220420BHJP

   C12N 15/24 20060101ALN20220420BHJP

【ＦＩ】

C07K19/00 ZNA

C07K14/54

C07K16/24

C07K16/28

A61K38/20

A61P29/00

C12N15/62

C12N15/13

C12N15/24

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021552750

(86)(22)【出願日】2020-03-06

(85)【翻訳文提出日】2021-11-02

(86)【国際出願番号】 US2020021498

(87)【国際公開番号】W WO2020181235

(87)【国際公開日】2020-09-10

(31)【優先権主張番号】62/814,669

(32)【優先日】2019-03-06

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/899,504

(32)【優先日】2019-09-12

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/962,332

(32)【優先日】2020-01-17

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】521395827

【氏名又は名称】デカ バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】マム， ジョン

【テーマコード（参考）】

4C084

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C084AA21

4C084BA22

4C084DA12

4C084NA14

4C084ZB11

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA02

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

本出願は、がん、炎症性疾患または障害、および自己免疫疾患または障害の処置に有用な、バリアントＩＬ－１０分子、その融合タンパク質、およびキメラタンパク質を含む組成物または製剤に関する。本出願は、ＩＬ－１０受容体結合領域および／またはＩＬ－１０分子に存在するドメイン間角度に関与するドメインに対する改変を含む、インターロイキン１０（ＩＬ－１０）のバリアント形態に関する。ＩＬ－１０におけるこれらのドメインの一方または両方を改変することによって、結果として生じるＩＬ－１０受容体の生物学的機能を、特定の生物学的応答を誘起するように調整またはモジュレートすることができることを発見した。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

式（Ｉ～ＶＩＩ）
ＩＬ１０－Ｌ^１－Ｘ^１－Ｌ^１－Ｘ^２－Ｌ^１－ＩＬ１０（式Ｉ）、
（Ｚ）_ｎ－Ｘ^１－Ｌ^２－Ｙ^２－Ｌ^１－ＩＬ１０（式ＩＩ）、
ＩＬ１０－Ｌ^１－Ｙ^１－Ｌ^２－Ｘ^２－（Ｚ）_ｎ（式ＩＩＩ）、
Ｘ^１－Ｌ^２－Ｘ^２－Ｌ^１－ＩＬ１０（式ＩＶ）、
ＩＬ１０－Ｌ^１－Ｘ^１－Ｌ^２－Ｘ^２（式Ｖ）、
Ｘ^１－Ｌ^１－ＩＬ１０（式ＶＩ）、
ＩＬ１０－Ｌ^１－Ｘ２（式ＶＩＩ）、またはこれらの任意の組合せ
の融合タンパク質であって、
式中、
「ＩＬ－１０」は、配列番号１、３、１４、１５、１６、１８、１９、５５、５７、または５９から選択される単量体配列であり、
「Ｌ^１」は、配列番号３１または５４のリンカーであり、
「Ｌ^２」は、配列番号３０のリンカーであり、
「Ｘ^１」は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）；ＣＤ５２；ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＢＴＬＡ、ＬＡＧ３、もしくはＣＴＬＡ４などであるがこれらに限定されない様々な免疫チェックポイント標的；ＣＤ２０；ＣＤ４７；ＧＤ－２；ＨＥＲ２；ＥｐＣＡＭ；ＩＣＡＭ（ＩＣＡＭ－１、－２、－３、－４、－５）、ＶＣＡＭ、ＦＡＰα；５Ｔ４；Ｔｒｏｐ２；ＥＤＢ－ＦＮ；ＴＧＦβ Ｔｒａｐ；ＭａｄＣａｍ、β７インテグリンサブユニット；α４β７インテグリン；α４インテグリンＳＲ－Ａ１；ＳＲ－Ａ３；ＳＲ－Ａ４；ＳＲ－Ａ５；ＳＲ－Ａ６；ＳＲ－Ｂ；ｄＳＲ－Ｃ１；ＳＲ－Ｄ１；ＳＲ－Ｅ１；ＳＲ－Ｆ１；ＳＲ－Ｆ２；ＳＲ－Ｇ；ＳＲ－Ｈ１；ＳＲ－Ｈ２；ＳＲ－Ｉ１；ＳＲ－Ｊ１；ＨＩＶ、またはエボラに特異的な第１の抗体から得られたＶＨ領域であり、
「Ｘ^２」は、Ｘ_１と同じ抗体から得られたＶＬ領域であり、
「Ｙ^１」は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）；ＣＤ５２；ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＢＴＬＡ、ＬＡＧ３、もしくはＣＴＬＡ４などであるがこれらに限定されない様々な免疫チェックポイント標的；ＣＤ２０；ＣＤ４７；、ＧＤ－２；ＨＥＲ２；ＥｐＣＡＭ；ＩＣＡＭ（ＩＣＡＭ－１、－２、－３、－４、－５）、ＶＣＡＭ、ＦＡＰα；５Ｔ４；Ｔｒｏｐ２；ＥＤＢ－ＦＮ；ＴＧＦβ Ｔｒａｐ；ＭａｄＣａｍ、β７インテグリンサブユニット；α４β７インテグリン、α４インテグリンＳＲ－Ａ１；ＳＲ－Ａ３；ＳＲ－Ａ４；ＳＲ－Ａ５；ＳＲ－Ａ６；ＳＲ－Ｂ；ｄＳＲ－Ｃ１；ＳＲ－Ｄ１；ＳＲ－Ｅ１；ＳＲ－Ｆ１；ＳＲ－Ｆ２；ＳＲ－Ｇ；ＳＲ－Ｈ１；ＳＲ－Ｈ２；ＳＲ－Ｉ１；ＳＲ－Ｊ１；ＨＩＶ、またはエボラに特異的な第２の抗体から得られたＶＨ領域であり、
「Ｙ^２」は、Ｙ_１と同じ抗体から得られたＶＬ領域であり、
ＸおよびＹは、同じかまたは異なる抗体から得られ、
「Ｚ」は、ＩＬ－６、ＩＬ－４、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－５、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１５、ＩＬ－２６、ＩＬ－２７、ＩＬ－２８、ＩＬ－２９、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、インターフェロン－α、－β、－γ、ＴＧＦ－β、または腫瘍壊死因子－α、－β、塩基性ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＬ－４、ＩＬ－１１、またはＩＬ－１３から選択されるサイトカインであり、
「ｎ」は、０～２から選択される整数である、
融合タンパク質。

【請求項2】

式ＩＩおよびＩＩＩが、融合タンパク質複合体を形成することができ、式ＩＩおよびＩＩＩのそれぞれに由来するＩＬ－１０単量体が、機能性ホモ二量体ＩＬ－１０またはそのバリアントを形成することができる、請求項１に記載の融合タンパク質。

【請求項3】

式ＩＩが、配列番号２４、２６、２８、４１、４８、または５０である、請求項２に記載の融合タンパク質。

【請求項4】

式ＩＩＩが、配列番号２５、２７、２９、４２、４９、または５１である、請求項２に記載の融合タンパク質。

【請求項5】

前記融合タンパク質複合体が、配列番号２４と２５との間、２６と２７との間、２８と２９との間、４１と４２との間、４８と４９との間、または５０と５１との間で形成される、請求項２に記載の融合タンパク質。

【請求項6】

式ＩＶおよびＶが、融合タンパク質複合体を形成することができ、式ＩＶおよびＶのそれぞれに由来するＩＬ－１０単量体が、機能性ホモ二量体ＩＬ－１０またはそのバリアントを形成することができる、請求項１に記載の融合タンパク質。

【請求項7】

式ＩＶが、配列番号３５、３８、４６、４８、または５０である、請求項６に記載の融合タンパク質。

【請求項8】

式Ｖが、配列番号３６、３９、４７、４９、または５１である、請求項６に記載の融合タンパク質。

【請求項9】

前記融合タンパク質複合体が、配列番号３５と３６との間、３８と３９との間、４６と４７との間、４８と４９との間、または５０と５１との間で形成される、請求項６に記載の融合タンパク質。

【請求項10】

式ＶＩおよびＶＩＩが、融合タンパク質複合体を形成することができ、式ＶＩおよびＶＩＩのそれぞれに由来するＩＬ－１０単量体が、機能性ホモ二量体ＩＬ－１０またはそのバリアントを形成することができる、請求項１に記載の融合タンパク質。

【請求項11】

式Ｉが、配列番号３３～３４、４０、４３～４４、４５、５２、または５３である、請求項１に記載の融合タンパク質。

【請求項12】

「ｎ」が１以上であり、Ｚが、ＩＬ－２、Ｉｌ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、またはこれらの任意の組合せである、請求項１に記載の融合タンパク質。

【請求項13】

Ｚが、Ｘ^１、Ｙ^１、または両方のＮ末端にコンジュゲートされている、請求項１２に記載の融合タンパク質。

【請求項14】

がんを処置する方法であって、それを必要とする患者に、請求項１に記載の融合タンパク質を含む組成物を投与するステップを含む、方法。

【請求項15】

前記融合タンパク質が、配列番号２８～２９、３５～３６、３８～３９、４６～４７、５２、５３、６１、６３、６５、または６７である、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

前記融合タンパク質が、タンパク質複合体を形成し、前記タンパク質複合体が、配列番号２８と２９との間、３５と３６との間、３８と３９との間、または４６と４７との間で形成される、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

前記融合タンパク質が、配列番号５９のＤＶ０７からなるＩＬ－１０を含む、請求項１４に記載の方法。

【請求項18】

炎症性疾患を処置する方法であって、それを必要とする患者に、請求項１に記載の融合タンパク質を含む組成物を投与するステップを含む、方法。

【請求項19】

前記融合タンパク質が、配列番号２６～２７、４１～４２、４８、または４９である、請求項１７に記載の方法。

【請求項20】

前記融合タンパク質が、タンパク質複合体を形成し、前記タンパク質複合体が、配列番号２６と２７との間、４１と４２との間、および４８と４９との間で形成される、請求項１８に記載の方法。

【請求項21】

前記組成物が、配列番号３７、４０、または４３の融合タンパク質を含む、請求項１８に記載の方法。

【請求項22】

前記融合タンパク質が、配列番号５７のＤＶ０６からなるＩＬ－１０を含む、請求項１８に記載の方法。

【請求項23】

脂質に基づく疾患を処置する方法であって、それを必要とする患者に、請求項１に記載の融合タンパク質を含む組成物を投与するステップを含む、方法。

【請求項24】

前記融合タンパク質が、配列番号２４～２５、５０、または５１である、請求項２３に記載の方法。

【請求項25】

前記融合タンパク質が、タンパク質複合体を形成し、前記タンパク質複合体が、配列番号２４と２５との間および５０と５１との間で形成される、請求項２４に記載の方法。

【請求項26】

前記組成物が、配列番号４５の融合タンパク質を含む、請求項２３に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願のへ相互参照
本出願は、２０１９年３月６日に出願された米国特許仮出願第６２／８１４，６６９号、２０１９年９月１２日に出願された米国特許仮出願第６２／８９９，５０４号、および２０２０年１月１７日に出願された米国特許仮出願第６２／９６２，３３２号に基づく優先権を主張し、それぞれの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0002】

序論
本出願は、ＩＬ－１０受容体結合領域および／またはＩＬ－１０分子に存在するドメイン間角度に関与するドメインに対する改変を含む、インターロイキン１０（ＩＬ－１０）のバリアント形態に関する。ＩＬ－１０におけるこれらのドメインの一方または両方を改変することによって、本発明者らは、驚くべきことに、結果として生じるＩＬ－１０受容体の生物学的機能を、特定の生物学的応答を誘起するように調整またはモジュレートすることができることを発見した。本出願はまた、非タンパク質ベースの血清延長部分ならびにタンパク質ベースの延長モダリティを含む、半減期が延長されたＩＬ－１０またはＩＬ－１０バリアント分子に関する。本出願はまた、ＩＬ－１０バリアント分子を含む融合タンパク質にも関する。

【背景技術】

【0003】

背景
ＩＬ－１０は、（ｉ）リポ多糖に応答した単球／マクロファージによる炎症促進性サイトカイン分泌、ならびに（ｉｉ）ＣＤ４^＋ Ｔ細胞のインターロイキン２（ＩＬ－２）分泌および増殖の両方を阻害するその能力に起因して、サイトカイン合成阻害性因子として説明されている。ＩＬ－１０のウイルスアナログが発見され、ヒトＩＬ－１０と類似または同一な機能を共有することが報告されたとき、これらのＩＬ－１０のウイルスアナログは、ヒトゲノムにおいて見出される抑制性サイトカインの機能を採用することによって、ウイルスの毒性を増強したと推定された。

【0004】

ＩＬ－１０の抑制作用のさらなる調査は、慢性全腸炎を発症するＩＬ－１０ノックアウトマウスの生成によって可能となった。これらのマウスにより得られたデータは、ＩＬ－１０ノックアウトマウスが、主として単球／マクロファージおよびＣＤ４^＋ Ｔ細胞による慢性炎症性サイトカイン分泌を通じて、消化管全体にわたって重度の炎症を発症することを明確に示し、これは、初期のｉｎ ｖｉｔｒｏでの観察と一貫性がある。

【0005】

まとめると、ＩＬ－１０が炎症の抑制において主要な役割を果たしたことが、データにより示された。特に、機能性ＩＬ－１０受容体またはＩＬ－１０を産生する能力が欠如した患者は、炎症関連の消化管疾患を発症する素因の増加を示した。

【0006】

複数の臨床試験を行って、乾癬、リウマチ性関節炎、およびクローン病の状況におけるＩＬ－１０の抗炎症機能を評価した。一般的に、組換えヒトＩＬ－１０（ｒＨｕＩＬ－１０）処置は、安全であるが有効性に欠けることが見出されている。特に、ｒＨｕＩＬ－１０でのクローン病患者の処置は、低用量が炎症を中等度に阻害し、高用量では抑制作用が失われる、逆用量応答をもたらす。最終的なクローン病研究の厳密な分析により、１０および２０μｇ／ｋｇのｒＨｕＩＬ－１０を投与した患者が、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）およびネオプテリンの血清濃度の増加を示したことが判明している。ＩＦＮγは、炎症性腸疾患およびクローン病の病因を悪化させることが知られている。データは、高用量では、ＩＬ－１０での処置によりＩＦＮγが誘導され、これが、炎症性疾患を悪化させることを示唆する。

【0007】

健常なヒトにおけるＩＬ－１０の作用のさらなる分析により、炎症促進性因子リポ多糖（ＬＰＳ）への曝露の前にＩＬ－１０を投与することで、炎症促進性サイトカインの産生が阻害されることが示唆される。しかしながら、ＬＰＳへの曝露の後にｒＨｕＩＬ－１０を投与すると、炎症促進性サイトカインの分泌が増強された。ＬＰＳは、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を有する患者の正常および外来の両方の腸内細菌の生成物であるため、これらの患者は、ＬＰＳが「なくなる」ことは決してなく、したがって、ＩＬ－１０処置をＬＰＳの前に適用することができる状態には決してならない。したがって、これらのデータは、クローン病および他の炎症性疾患を有する患者が、ＩＬ－１０処置の治療的利点を得ることが決してないことを示唆している。

【0008】

ＩＬ－１０が抗腫瘍応答を誘導するように免疫系を活性化することを示すデータの蓄積により、ＩＬ－１０の役割にさらなる混乱が付加されている。初期のデータは、ＩＬ－１０が、ＮＫ細胞を活性化したことを示唆していたが、さらなる調査により、ＩＬ－１０処置が、ＣＤ８^＋ Ｔ細胞およびＩＦＮγに依存する様式で、腫瘍成長を阻害することが判明した。継続的な調査により、ＩＬ－１０処置が、ＦｏｘＰ３^＋ＣＤ４^＋制御性Ｔ細胞の増殖を阻害し、クッパー細胞の除去を増強したことが判明しており、これらはすべて、ＩＬ－１０が抑制因子というよりはむしろ強力な免疫刺激因子であることを示唆する機能である。最後に、これらの刺激性活性は、確認されている場合、ＰＥＧ化ＩＬ－１０で処置した腫瘍患者の臨床研究におけるものである。

【0009】

まとめると、これらのデータは、自己免疫関連の炎症を患う患者のＩＬ－１０処置は、治療的利点を誘起することができないことを示し、ＩＬ－１０が、汎免疫抑制物質ではないことを示唆する。これと一致して、（ＰＥＧ）ＩＬ－１０でのがん患者の処置は、ＩＬ－１０で処置したクローン病患者と同様に、強力かつ治療的に有用な免疫活性化、特に、用量依存的な血清ＩＦＮγの誘導をもたらし、ＩＬ－１０が、強力な免疫刺激因子であることを示す。

【0010】

ではなぜウイルスがＩＬ－１０配列を獲得するのかについては、不明である。エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ－ＩＬ１０）およびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ－ＩＬ１０）の両方のホモログのさらなる分析により、これらのウイルスが、２つの主要な様式で、天然のＩＬ－１０配列を変化させていることが示唆される。ＥＢＶ－ＩＬ１０は、ホモ二量体相互作用の類似する三次元角度を維持してリガンド受容体相互作用の特定の角度をもたらすが、ＩＬ－１０受容体に対するその親和性が実質的に減少していると考えられる。ＣＭＶ－ＩＬ１０は、ＩＬ－１０受容体に対する親和性の増加を示すが、ＩＬ－１０受容体との相互作用の角度が実質的に変化している。ＥＢＶ－ＩＬ１０およびＣＭＶ－ＩＬ１０配列は、それぞれ、天然のＩＬ－１０に対しておよそ８０％および２７％の相同性を維持するが、ウイルスホモログのそれぞれは、完全に異なるＩＬ－１０受容体親和性、異なる受容体結合角度を有し、それぞれのウイルスホモログが、天然のＩＬ－１０に高度に類似する抗炎症性機能を発揮するように思われる。したがって、ＩＬ－１０受容体に対する親和性および／または受容体相互作用の角度が、どのようにしてその後のＩＬ－１０の下流シグナル伝達に影響を及ぼすかは不明である。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0011】

様々な好ましい実施形態の概要
本出願は、概して、ＩＬ－１０受容体シグナル伝達をモジュレートする新規なＩＬ－１０バリアント分子に関する。したがって、本出願は、ＩＬ－１０分子の構造に対する改変を組み込んだＩＬ－１０バリアント分子に関し、変更されたＩＬ－１０受容体結合親和性および／または変更されたＩＬ－１０ドメイン間角度を有する新規なＩＬ－１０バリアント分子をもたらす。本発明者は、驚くべきことに、ＩＬ－１０受容体親和性および／またはＩＬ－１０ドメイン間角度に影響を及ぼす鍵となるドメインにおいてＩＬ－１０を改変することにより、免疫疾患、炎症性疾患または状態の処置、ならびにがんの処置において使用することができるＩＬ－１０受容体アゴニストが作製されることを発見した。さらに、ＩＬ－１０バリアント分子は、ＩＬ－１０またはＩＬ－１０バリアントの単量体がＩＬ－１０ホモ二量体を形成するのを妨害することなく、バリアントＩＬ－１０分子を融合タンパク質、例えば、様々な抗体ドメイン（Ｆｃまたは可変ドメイン）の一部として組み込むことによって、増加した血清半減期も有することができる。

【0012】

ある特定の実施形態では、ＩＬ－１０バリアント分子は、改変されたヒトＩＬ－１０である。他の実施形態では、ＩＬ－１０バリアント分子は、改変されたマウスＩＬ－１０である。好ましい実施形態では、ＩＬ－１０バリアント分子は、ＩＬ－１０の改変されたウイルスホモログである。より好ましい実施形態では、ウイルスＩＬ－１０ホモログは、ＣＭＶ－ＩＬ１０である。もっとも好ましい実施形態では、ウイルスＩＬ－１０ホモログは、ＥＢＶ－ＩＬ１０である。

【0013】

さらなる実施形態では、ＩＬ－１０バリアント分子は、受容体結合領域内に少なくとも１つまたは複数のアミノ酸付加、欠失、または置換を組み込む。なおも他の実施形態では、ＩＬ－１０バリアント分子は、ＩＬ－１０のドメイン間角度を形成することに関与する領域において、少なくとも１つまたは複数のアミノ酸付加、欠失、または置換を組み込む。好ましい実施形態では、ＩＬ－１０バリアント分子は、受容体結合ドメインおよび／またはドメイン間角度に関与する領域に対する改変のうちの一方または両方を組み込む。もっとも好ましい実施形態では、ＩＬ－１０バリアント分子は、ＥＢＶ－ＩＬ１０タンパク質分子における一方または両方の改変を組み込む。

【0014】

様々な実施形態では、ＩＬ－１０バリアント分子は、野生型ＩＬ－１０と比較すると、ＩＬ－１０受容体または受容体複合体に対する親和性が増強されている。他の実施形態では、ＩＬ－１０バリアント分子は、野生型ＩＬ－１０と比較すると、ＩＬ－１０受容体または受容体複合体に対する親和性が減弱されている。他の実施形態では、ＩＬ－１０バリアント分子は、野生型ＩＬ－１０、より好ましくはＥＢＶ－ＩＬ１０と比較すると、狭いかまたは制限されたドメイン間角度を形成する。別の実施形態では、ＩＬ－１０バリアント分子は、野生型ＩＬ－１０、より好ましくはＥＢＶ ＩＬ－１０と比較すると、広いかまたは弛緩したドメイン間角度を形成する。

【0015】

なおもさらなる実施形態では、ＥＢＶ ＩＬ－１０バリアント分子は、ＥＢＶ ＩＬ－１０のヘリックスＡ、ＡＢループ、および／またはヘリックスＦ（「部位１」）に位置する受容体結合領域内に、少なくとも１つまたは複数のアミノ酸付加、欠失、または置換を組み込む。受容体結合ドメイン領域に対する改変は、ある特定の実施形態では、ＩＬ－１０受容体または受容体複合体に対する親和性を増加または増強させ得る。ある特定の他の実施形態では、受容体結合領域に対する改変は、ＩＬ－１０受容体または受容体複合体に対する親和性を減弱または減少させ得る。

【0016】

さらなる実施形態では、ＥＢＶ ＩＬ－１０バリアント分子は、ドメイン間角度形成に関与するＥＢＶ ＩＬ－１０領域内に、少なくとも１つまたは複数のアミノ酸付加、欠失、または置換を組み込む。好ましい実施形態では、改変は、ＥＢＶ ＩＬ－１０のＤＥループにおいて生じ得る。ＤＥループにおける改変は、制限されたドメイン間角度または弛緩したドメイン間角度を有するＥＢＶ ＩＬ－１０バリアント分子をもたらす。

【0017】

他の態様では、ＩＬ－１０バリアント分子は、キメラまたは融合分子である。一実施形態では、キメラまたは融合タンパク質は、単一のタンパク質内に、別のタンパク質の特徴を付与する異なるタンパク質または突然変異に由来する１つまたは複数のドメインを含むであろう。好ましい実施形態では、キメラまたは融合タンパク質は、アルブミン、酵素、グリコシルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、ＩｇＧヒンジ領域（例えば、Ｆｃ領域）、１つまたは複数の抗体の１つまたは複数の可変ドメイン（例えば、可変重鎖または可変軽鎖であるがこれらに限定されない）、サイトカイン（例えば、ＩＬ－６、ＩＬ－４、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－５、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、インターフェロン－α、－β、－γ、ＴＧＦ－β、および腫瘍壊死因子－α、－β）、標識、薬剤、化学療法剤、放射性同位体、ならびに半減期延長剤（例えば、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ化）、ポリシアル酸、ヘパロサン（ｈｅｐａｒｏｓａｎ）ポリマー、エラスチン様ポリペプチド、およびヒアルロン酸）を含むがこれらに限定されない別の分子に融合された、本明細書に記載されるＩＬ－１０バリアント分子を含む、第１の部分を含むであろう。さらに別の実施形態では、ＩＬ－１０バリアント分子は、１つまたは複数の抗体重鎖または軽鎖可変領域に融合されている。融合タンパク質は、融合タンパク質の異なる部分に共有結合的に連結された１つまたは複数のリンカーを含み得る。融合タンパク質は、同じ種類の別の融合タンパク質との非共有結合的に結合した複合体を形成してもよい。そのような融合タンパク質は、ＩＬ－１０の単量体、またはバリアントＩＬ－１０分子の単量体が、一緒に会合して、ＩＬ－１０またはバリアントＩＬ－１０の機能性ホモ二量体となることを可能にするであろう。

【0018】

他の実施形態では、バリアントＩＬ－１０分子は、操作された融合タンパク質の一部である。融合タンパク質は、融合タンパク質の第１の末端において、リンカーまたはスペーサーにコンジュゲートされたＩＬ－１０またはＩＬ－１０バリアント分子の少なくとも１つの単量体を含み、ここで、１つまたは複数のスペーサーは、融合タンパク質の様々な部分を連結させるために使用されており、これが、次いで、他方の末端にコンジュゲートされた少なくとも１つの他の分子にコンジュゲートされ、ここで、この分子は、少なくとも１つのサイトカインまたはその単量体、治療剤、標識、血清半減期延長分子、またはタンパク質（例えば、受容体、リガンド、もしくは抗体の様々な部分であるがこれらに限定されない）から選択される。好ましい実施形態では、融合タンパク質は、リンカーまたはスペーサーを介して、少なくとも１つの重鎖および／または軽鎖可変領域にコンジュゲートされた、ＩＬ－１０の単量体またはＩＬ－１０バリアント分子の単量体を含む。もっとも好ましい実施形態では、融合タンパク質は、リンカーまたはスペーサーを介して、少なくとも１つの重鎖および／または軽鎖領域にコンジュゲートされた、ＥＢＶ ＩＬ－１０の単量体またはＥＢＶ ＩＬ－１０バリアント分子の単量体を含む。もっとも好ましい実施形態では、ＥＢＶ ＩＬ－１０またはそのＥＢＶ ＩＬ－１０バリアント分子の単量体は、１つの重鎖可変領域および１つの軽鎖可変領域にコンジュゲートされており、単量体が一緒になって二量体複合体を形成している。ＥＢＶ ＩＬ－１０の単量体またはＥＢＶ ＩＬ－１０バリアント分子の単量体は、重鎖または軽鎖可変領域のアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかにコンジュゲートされ得る。

【0019】

ある特定の実施形態では、治療量の本出願のＩＬ－１０バリアント分子、その融合タンパク質、またはキメラタンパク質は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、潰瘍性大腸炎、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、および非アルコール性脂肪性肝臓疾患（ＮＡＦＬＤ）などであるがこれらに限定されない、炎症性疾患または状態を患う対象に投与される。別の実施形態では、治療量の本出願のＩＬ－１０バリアント分子、その融合タンパク質、またはキメラタンパク質は、がんを患う対象に投与される。１つを上回る病状を有する対象の処置もまた、想定される。より好ましい実施形態では、ＩＬ－１０バリアント分子は、ＥＢＶ－ＩＬ１０バリアント、その融合タンパク質、またはキメラタンパク質である。なおも別の実施形態では、ＩＬ－１０バリアント分子、その融合タンパク質、またはキメラタンパク質は、組合せ治療において使用される。例えば、ＩＬ－１０バリアント分子、その融合タンパク質、またはキメラタンパク質は、他の治療法または処置と併用して、対象に投与され得る。なおも他の実施形態では、治療量の本出願のＩＬ－１０バリアント分子、その融合タンパク質、またはキメラタンパク質は、コレステロールレベルの上昇などであるがこれに限定されない脂質に基づく疾患を患う対象に投与される。

【0020】

様々な実施形態では、本出願のＩＬ－１０バリアント分子またはその融合タンパク質は、単離され精製されたタンパク質として送達される。送達は、皮下ボーラス注射の形態であり得るか、または真皮および皮下組織への複数回の微量注射の形態であり得る。なおも別の実施形態では、ＩＬ－１０バリアント分子は、ＩＬ－１０バリアント、その融合タンパク質、またはキメラタンパク質をコードする配列を含む核酸ベクターとして、送達され得る。核酸ベクターは、プラスミドまたはウイルスベクターを保持するウイルス粒子であり得る。一実施形態では、ＩＬ－１０バリアント分子は、当業者に一般的に公知の遺伝子医薬技法によって、対象に送達され得る。

【0021】

他の実施形態では、ＩＬ－１０バリアント分子は、組合せ治療レジメンの一部として投与されてもよい。一実施形態では、ＩＬ－１０バリアント分子は、例えば、がん、ＩＢＤ、クローン病、ＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨ、および自己免疫疾患の処置に現在利用可能な免疫療法である、二重特異性Ｔ細胞結合因子（ＢＩＴＥＳ）と組み合わせて投与することができる。

【0022】

別の実施形態では、核酸ベクターは、１つまたは複数のＡＡＶ末端逆位反復（ＩＴＲ）配列エレメントおよび標的細胞においてＩＬ－１０バリアント分子をコードする配列の発現を誘導するための制御エレメントを有する、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであり、ＡＡＶベクターは、プラスミド（「ネイキッド」ＤＮＡ）としてまたはＡＡＶ粒子にパッケージングされたものとしてのいずれかで投与され得る。別の実施形態では、核酸ベクターは、ワクシニアウイルスベクターである。ＷＲ株（ＡＴＣＣ ＶＲ－１１９）、Ｗｙｅｔｈ株（ＡＴＣＣ ＶＲ－３２５）、Ｌｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株（ＡＴＣＣ ＶＲ－３２５）、ＣＬ株（ＡＴＣＣ ＶＲ－１１７）、およびその他など、異なる株に由来する様々なワクシニアウイルスベクターを使用して、本出願のバリアントＩＬ－１０分子を導入することができ、これらの株のすべては、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ．）から入手可能である。

【0023】

別の実施形態では、ＰＥＧ化ＩＬ－１０バリアント分子を含むがこれに限定されない本明細書に記載されるＩＬ－１０バリアント分子のいずれも、本明細書に記載されるかまたは当該技術分野において一般的に公知である任意の方法によって、対象に送達され得る。

【0024】

本出願のこれらおよび他の実施形態は、本明細書における開示を踏まえ、当業者には容易に想起されるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0025】

【図1】図１は、単量体ＩＬ－１０分子のリボンダイアグラム（Josephson et al, Immunity, 15, p. 35-46）を示す。赤色で強調されている部分は、部位Ｉの受容体接触境界部を示し、緑色は、部位ＩＩの受容体接触境界部を示す。

【0026】

【図2】図２Ａ～２Ｃは、ＩＬ－１β（図２Ａ）およびＴＮＦα（図２Ｂ）サイトカイン産生を試験することによってＩＬ－１０およびＥＢＶ ＩＬ－１０が単球／マクロファージ（Ｍθ）を活性化する能力、ならびにドナー１におけるＩＦＮγ（図２Ｃ）産生を試験することによってＴ細胞の刺激を比較する。

【0027】

【図3】図３Ａ～３Ｃは、ＩＬ－１β（図３Ａ）およびＴＮＦα（図３Ｂ）サイトカイン産生を試験することによってＩＬ－１０およびＥＢＶ ＩＬ－１０が単球／マクロファージ（Ｍθ）を活性化する能力、ならびにドナー１におけるＩＦＮγ（図３Ｃ）産生を試験することによってＴ細胞の刺激を比較する。

【0028】

【図4】図４Ａ～Ｂは、ＩＬ－１０またはＥＢＶ ＩＬ－１０による刺激後のＴ細胞からのＩＦＮγ誘導の量を示す。

【0029】

【図5】図５Ａ～５Ｃは、ＭＣ／９細胞増殖（図５Ａ）、ＬＰＳに応答した単球／マクロファージ（Ｍθ）によるＴＮＦα分泌（図５Ｂ）、およびＴ細胞受容体刺激に応答したＴ細胞によるＩＦＮγ分泌（図５Ｃ）に対する、Ｎ末端の５ｋＤａのモノおよびジ－ＰＥＧ化ＥＢＶ－ＩＬ－１０の作用を示す。

【0030】

【図6-1】図６Ａ～６Ｅは、ＥＢＶ－ＩＬ－１０を含む様々なＩＬ－１０バリアント分子および融合タンパク質の特定のアミノ酸配列を示す。

【図6-2】図６Ａ～６Ｅは、ＥＢＶ－ＩＬ－１０を含む様々なＩＬ－１０バリアント分子および融合タンパク質の特定のアミノ酸配列を示す。

【図6-3】図６Ａ～６Ｅは、ＥＢＶ－ＩＬ－１０を含む様々なＩＬ－１０バリアント分子および融合タンパク質の特定のアミノ酸配列を示す。

【図6-4】図６Ａ～６Ｅは、ＥＢＶ－ＩＬ－１０を含む様々なＩＬ－１０バリアント分子および融合タンパク質の特定のアミノ酸配列を示す。

【図6-5】図６Ａ～６Ｅは、ＥＢＶ－ＩＬ－１０を含む様々なＩＬ－１０バリアント分子および融合タンパク質の特定のアミノ酸配列を示す。

【0031】

【図7】図７は、リンカーまたはスペーサーにコンジュゲートされたＩＬ－１０またはＩＬ－１０バリアント分子を含む、融合タンパク質の概略図を示す（この事例では、ｓｃＦｖ）。この代表的な例は、Ｎ末端およびＣ末端の両方にコンジュゲートしたＩＬ－１０またはＩＬ－１０バリアント分子を示す。

【0032】

【図8】図８Ａ～８Ｃは、ＥＢＶ ＩＬ－１０において作製されるバリアントなど、様々なＩＬ－１０バリアントの概略図である。図８Ａ（ＤＶ０５）は、配列番号３のアミノ酸３１位における単一の点突然変異（Ｖ３１Ｌ Ｖ３１Ｌ）を含むＩＬ－１０バリアントである。図８Ｂ（ＤＶ０６）は、配列番号３のアミノ酸７５位における単一の点突然変異（Ａ７５Ｉ Ａ７５Ｉ）を含むＩＬ－１０バリアントである。図８Ｃ（ＤＶ０７）は、配列番号３のアミノ酸３１位および７５位における２つの点突然変異（Ｖ３１ＬおよびＡ７５Ｉ）を含むＩＬ－１０バリアントである。

【0033】

図８Ｄは、野生型ヒトＩＬ－１０、ＥＢＶ－ＩＬ－１０、ＤＶ０５、ＤＶ０６、およびＤＶ０７を含む、ＩＬ－１０の様々な形態に対する単球／マクロファージの応答をアッセイする。ＩＬ－１０バリアント－ＤＶ０５、ＤＶ０６、ＤＶ０７を含め、すべての形態が、ＬＰＳに応答したＴＮＦαの分泌を抑制する。
図８Ｅは、ＩＬ－１０の様々な形態、野生型ヒトＩＬ－１０、ＥＢＶ ＩＬ－１０、ＤＶ０５、ＤＶ０６、およびＤＶ０７に対するＴ細胞応答をアッセイし、すべての形態がＩＦＮ－ガンマを誘導するわけではない。

【0034】

【図9】図９Ａ～９Ｆは、ＩＬ－１０融合タンパク質／イムノコンジュゲート／ダイアボディ構築物の様々な構成の概略図である。図９（ａ）～（ｃ）は、融合タンパク質複合体（すなわち、ダイアボディ）を表し、ここで、それぞれの融合タンパク質は、（ａ）例えば、アミノ酸３１位における、ＩＬ－１０受容体結合に影響を及ぼす単一の突然変異、（ｂ）例えば、アミノ酸７５位における、ＩＬ－１０受容体結合に影響を及ぼす単一の突然変異、ならびに（ｃ）例えば、アミノ酸３１位および７５位における、ＩＬ－１０受容体結合に影響を及ぼす２つの突然変異を有する、カルボキシ末端リンカーまたはアミノ末端リンカーを介してＩＬ－１０（ＩＬ－１０バリアント分子と置換されてもよい）の単量体に連結された２つの異なる抗体から得られたＶＨおよびＶＬ領域を含む。図９（ｄ）～（ｆ）は、融合タンパク質複合体（すなわち、ミニボディ）を表し、ここで、それぞれの融合タンパク質は、（ｄ）例えば、アミノ酸３１位における、ＩＬ－１０受容体結合に影響を及ぼす単一の突然変異、（ｅ）例えば、アミノ酸７５位における、ＩＬ－１０受容体結合に影響を及ぼす単一の突然変異、ならびに（ｆ）例えば、アミノ酸３１位および７５位における、ＩＬ－１０受容体結合に影響を及ぼす２つの突然変異を有する、カルボキシ末端リンカーまたはアミノ末端リンカーを介してＩＬ－１０（ＩＬ－１０バリアント分子と置換されてもよい）の単量体に連結された１つの抗体から得られた単一のＶＨまたはＶＬ領域を含む。

【0035】

【図10】図１０（Ａ）～１０（Ｆ）は、ＩＬ－１０融合タンパク質／イムノコンジュゲート／ダイアボディ構築物の様々な構成の概略図である。図１０（ａ）～（ｃ）は、単一の融合タンパク質（すなわち、ミニボディ）を表し、ここで、ＩＬ－１０（ＩＬ－１０バリアント分子と置換されてもよい）の単量体は、それぞれ、カルボキシ末端リンカーまたはアミノ末端リンカーを介して、同じ抗体に由来するＶＨまたはＶＬのいずれかに連結されており、ＶＨおよびＶＬは、一緒に連結されている。ＩＬ－１０の単量体は、（ａ）ＩＬ－１０受容体結合に影響を及ぼす、例えば、アミノ酸３１位における単一の突然変異、（ｂ）ＩＬ－１０受容体結合に影響を及ぼす、例えば、アミノ酸７５位における単一の突然変異、ならびに（ｃ）ＩＬ－１０受容体結合に影響を及ぼす、例えば、アミノ酸３１位および７５位における２つの突然変異を含む。図１０（ｄ）～（ｆ）は、単一の融合タンパク質を表し、ここで、ＩＬ－１０（ＩＬ－１０バリアント分子と置換され得る）の単量体は、一緒に連結されており、ＩＬ－１０のそれぞれの単量体は、カルボキシ末端リンカーまたはアミノ末端リンカーを介して、１つの抗体から得られた単一のＶＨまたはＶＬ領域にさらに連結されている。ＩＬ－１０単量体は、（ｄ）ＩＬ－１０受容体結合に影響を及ぼす、例えば、アミノ酸３１位における単一の突然変異、（ｅ）ＩＬ－１０受容体結合に影響を及ぼす、例えば、アミノ酸７５位における単一の突然変異、ならびに（ｆ）ＩＬ－１０受容体結合に影響を及ぼす、例えば、アミノ酸３１位および７５位における２つの突然変異を含む。

【0036】

【図11】図１１は、ＤＶ０７突然変異を含むダイアボディを使用した、ｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍体積の低減を示す。製剤緩衝液（１倍リン酸緩衝食塩水、「対照」）およびＤＶ０７ダイアボディ（成熟タンパク質のＶ３１Ｌ Ｖ３１ＬおよびＡ７５Ｉ Ａ７５Ｉを有するＥＢＶ ＩＬ－１０バリアント、ならびにＶＨ／ＶＬ対のいずれもマウス標的に結合しない抗ＣＤ３αおよび抗ＥＧＦＲに由来する可変ドメインを含む、融合タンパク質複合体）を、３日目に単回用量で投与した。１ｍｇ／ｋｇおよび０．４ｍｇ／ｋｇの用量濃度を、ＤＶ０７ダイアボディに関して試験した。

【0037】

【図12】図１２は、ＩＬ－１０の公開されているバリアント（菱形）、野生型ＩＬ－１０（円形）、およびＤＨｉｖＤＥｂｏ：ＤＶ０７と称されるＤＶ０７ダイアボディの代替形態（菱形、Ｖ３１ＬおよびＡ７５Ｉ突然変異を有するＥＢＶ ＩＬ－１０バリアント、ならびに抗ＨＩＶおよび抗エボラに由来する可変ドメイン（これらのＶＨ／ＶＬ対のいずれも、マウスタンパク質に結合しない）を含む、融合タンパク質複合体、ここで、ダイアボディは、図９（ｃ）に概略的に示される構造を有する）に対するｉｎ ｖｉｔｒｏでのＴ細胞応答を示す。

【0038】

【図13】図１３Ａは、ダイアボディの形態で、Ｖ３１ＬおよびＡ７５Ｉ突然変異を有するＥＢＶ ＩＬ－１０バリアント分子の様々な形態を使用した、単球／マクロファージに対するＬＰＳ曝露によって誘導されるＴＮＦαの抑制を比較する。「ｗｔ」は、ヒトＩＬ－１０を表し、「ＥＢＶ」は、ＥＢＶ ＩＬ－１０であり、「ＤＣｄ３ＤＥｇｆｒ：ＤＶ０５」は、Ｖ３１Ｌ突然変異を含むＥＢＶ ＩＬ－１０バリアントに連結された抗ＣＤ３抗体および抗ＥＧＦＲ抗体に由来するＶＨおよびＶＬ領域を含むダイアボディであり、「ＤＣｄ３ＤＥｇｆｒ：ＤＶ０７」は、Ｖ３１ＬおよびＡ７５Ｉの両方の突然変異を含むＥＢＶ ＩＬ－１０バリアントに連結された抗ＣＤ３抗体および抗ＥＧＦＲ抗体に由来するＶＨおよびＶＬ領域を含むダイアボディであり、「ＤＨｉｖＤＥｂｏ：ＤＶ０７」は、Ｖ３１ＬおよびＡ７５Ｉの両方の突然変異を含むＥＢＶ ＩＬ－１０バリアントに連結された抗ＨＩＶ抗体および抗エボラ抗体に由来するＶＨおよびＶＬ領域を含むダイアボディである。

【0039】

図１３Ｂは、ヒトＩＬ－１０（「ｗｔ」）、ＥＢＶ ＩＬ－１０（「ＥＢＶ」）を使用した、Ｖ３１ＬおよびＡ７５Ｉ突然変異を有するＥＢＶ ＩＬ－１０バリアント分子ならびに異なる抗体に由来するＶＨおよびＶＬ領域を含む様々なダイアボディ形態に対する応答アッセイにおいて、Ｔ細胞におけるＩＦＮγの分泌を比較する。形態ＤＨｉｖＤＥｇｆｒ：ＤＶ０７は、抗ＨＩＶおよび抗ＥＧＦＲに由来する可変領域を含む、Ｖ３１ＬおよびＡ７５Ｉ置換を有するＥＢＶ ＩＬ－１０バリアントダイアボディである。形態ＤＨｉｖＤＥｂｏ：ＤＶ０７は、抗ＨＩＶおよび抗エボラに由来する可変領域を含む、Ｖ３１ＬおよびＡ７５Ｉの両方の突然変異を有するＥＢＶ ＩＬ－１０バリアントダイアボディである。

【0040】

【図14】図１４Ａ～１４Ｂは、２人のドナーから単離された単球／マクロファージ（図１４Ａ）およびＴ細胞（図１４Ｂ）において、ＥＢＶ ＩＬ－１０バリアントダイアボディの２つの形態、ＤＨ：ＤＶ０７およびＤＨＤＥ：ＤＶ０７を比較する。形態ＤＨＤＶ０７は、抗ＨＩＶおよび抗ＥＧＦＲに由来する可変領域を含む、Ｖ３１ＬおよびＡ７５Ｉ置換を有するＥＢＶ ＩＬ－１０バリアントダイアボディである。形態ＤＨＤＥ：ＤＶ０７は、抗ＨＩＶおよび抗エボラに由来する可変領域を含む、Ｖ３１ＬおよびＡ７５Ｉ置換を有するＥＢＶ ＩＬ－１０バリアントダイアボディである。図１４Ａは、ヒトＩＬ－１０（「ｗｔ」）、ＤＨ：ＤＶ０７、およびＤＨＤＥ：ＤＶ０７を使用した、単離された単球／マクロファージにおけるＬＰＳによって誘導されるＴＮＦαの抑制を比較する。図１４Ｂは、ヒトＩＬ－１０（「ｗｔ」）、ＥＢＶ ＩＬ－１０、ＤＨ：ＤＶ０７、およびＤＨＤＥ：ＤＶ０７に応答した、単離されたＴ細胞におけるＩＦＮγの分泌を比較する。

【0041】

【図15】図１５は、ＭＣ／９マスト細胞におけるＥＢＶ－１０バリアントダイアボディ形態の様々な形態の直接的な比較である。このアッセイは、ヒトＩＬ－１０、ＥＢＶ ＩＬ－１０、Ｄ：ＤＶ０５（抗ＣＤ３αおよび抗ＥＧＦＲに由来する可変領域を含む、Ｖ３１Ｌ突然変異を有するＥＢＶ ＩＬ－１０）、Ｄ：ＤＶ０６（抗ＣＤ３αおよび抗ＥＧＦＲに由来する可変領域を含む、Ａ７５Ｉ突然変異を有するＥＢＶ ＩＬ－１０）、抗ＣＤ３αおよび抗ＥＧＦＲに由来する可変領域を含む、Ｖ３１ＬおよびＡ７５Ｉ突然変異を有するＤ：ＤＶ０７）、ならびにＤｈｉｖＤＥｂｏ：ＤＶ０７（抗ＨＩＶおよび抗エボラに由来する可変領域を含む、Ｖ３１ＬおよびＡ７５Ｉ置換を有するＥＢＶ ＩＬ－１０バリアントダイアボディ）を比較する。

【0042】

【図16】図１６Ａ～１６Ｃは、Ｄ：ＤＶ０７（抗ＣＤ３αおよび抗ＥＧＦＲに由来する可変領域を含み、Ｖ３１ＬおよびＡ７５Ｉ突然変異を有する）を使用した、ｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍研究により得られた結果である。Ｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍体積は、投薬製剤緩衝液（「対照」）、０．４ｍｇ／ｋｇで１週間に３回（ｑ３ｗ）、０．２ｍｇ／ｋｇで１週間に３回（ｑ３ｗ）、０．２ｍｇ／ｋｇで２日間休薬（ｑｄ）、０．１ｍｇ／ｋｇで２日間休薬（ｑｄ）の投与の後に評価した。

【0043】

【図17】図１７Ａ～１７Ｂは、それぞれ、図９Ｃおよび９Ｆの概略図に対応する、大きな分子量（大型）および小さな分子量（小型）の２つのＩＬ－１０バリアント融合タンパク質形式のｉｎ ｖｉｖｏ研究により得られた結果である。ＩＬ－１０バリアントは、Ｖ３１ＬおよびＡ７５Ｉ突然変異を含む。これらの結果は、標的化能力のないＩＬ－１０融合タンパク質の腫瘍サイズの低減に対する影響を試験した。融合タンパク質に由来するＶＨおよびＶＬ領域は、抗ＨＩＶおよび抗エボラ（大型）または抗エボラ（小型）のいずれかに由来する非標的化配列である。図１７Ａは、ｐｅｇ化ＩＬ－１０（０．７５ｍｇ／ｋｇ、１日ごと）と比較した、５日間の投薬、２日間の休薬で投薬した非標的化小型形式の投薬研究である。図１７Ｂは、ｐｅｇ化組換えヒトＩＬ－１０（０．７５ｍｇ／ｋｇ、１日ごと）と比較した、１週間に３回の投薬を用いた非標的化小型（１ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ）および大型（０．２ｍｇ／ｋｇ）形式の投薬研究である。

【0044】

【図18】図１８Ａ～１８Ｃは、それぞれ、図９Ｃおよび９Ｆの概略図に対応する、大型および小型の２つのＩＬ－１０バリアント融合タンパク質形式のｉｎ ｖｉｖｏ研究により得られた結果である。これらの結果は、標的化能力を有するＩＬ－１０融合タンパク質の腫瘍サイズの低減に対する影響を試験した。ＩＬ－１０バリアントは、Ｖ３１ＬおよびＡ７５Ｉ突然変異を含む。大型形式では、融合タンパク質に由来する一方のセットのＶＨおよびＶＬ領域は、抗ＥＧＦＲ抗体に由来し、他方のセットのＶＨおよびＶＬは、抗エボラ抗体に由来する。小型形式には、抗ＥＧＦＲ抗体だけに由来するＶＨおよびＶＬが含まれる。図１８Ａは、ｐｅｇ化組換えヒトＩＬ－１０（０．７５ｍｇ／ｋｇ）と比較した、標的化ＩＬ－１０融合タンパク質の大型形式（０．２５ｍｇ／ｋｇ）、小型形式（０．２５ｍｇ／ｋｇ）、および非標的化ＩＬ－１０融合タンパク質の小型形式（０．２５ｍｇ／ｋｇ）の１日ごとの投薬研究により得られた結果である。図１８Ｂは、大型形式の非標的化ＩＬ－１０融合タンパク質（ＤｈＤｅ：ＤＶ０７、０．２ｍｇ／ｋｇ）およびｐｅｇ化ＩＬ－１０（０．７５ｍｇ／ｋｇ、１日ごと）と比較した、大型形式の標的化ＩＬ－１０融合タンパク質（１ｍｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、および０．２５ｍｇ／ｋｇ、１日ごと）の１週間に３回の投薬研究により得られた結果である。図１８Ｃは、小型形式の非標的化ＩＬ－１０融合タンパク質（Ｄｅｂｏ：ＤＶ０７、１ｍｇ／ｋｇ）およびｐｅｇ化ＩＬ－１０（０．７５ｍｇ／ｋｇ、１日ごと）と比較した、小型形式の標的化ＩＬ－１０融合タンパク質（１ｍｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ）の１週間に３回の投薬研究により得られた結果である。

【0045】

【図19】図１９Ａ～１９Ｂは、抗ＣＤ３αおよび抗ＥＧＦＲに由来する可変領域を含む、Ｖ３１Ｌ突然変異を有するＥＢＶ ＩＬ－１０バリアントを有するダイアボディを使用した、ｉｎ ｖｉｖｏコレステロール研究により得られた結果である。

【0046】

【図20】図２０Ａ～２０Ｂは、マクロファージおよびＴ細胞に対する２つのＩＬ－１０バリアント融合タンパク質におけるｉｎ ｖｉｔｒｏ比較研究により得られた結果である。このアッセイは、ヒトＩＬ－１０と比較して、ＤＶ０６融合タンパク質の２つの形態のｉｎ ｖｉｔｒｏでの有効性を試験する。図２０Ａは、ＤｈｉｖＤｅｂｏ：ＤＶ０６（配列番号２６および２７）ならびにＤｍａｄｃａｍＤＥｂｏ：ＤＶ０６（配列番号４１および４２）を使用した単球／マクロファージアッセイである。図２０Ｂは、ＤｈｉｖＤｅｂｏ：ＤＶ０６（配列番号２６および２７）ならびにＤｍａｄｃａｍＤＥｂｏ：ＤＶ０６（配列番号４１および４２）を使用して、ＩＦＮ－ガンマによって測定される、Ｔ細胞応答アッセイである。

【0047】

【図21-1】図２１Ａ～２１Ｄは、ＥＢＶ ＩＬ－１０アミノ酸配列である。図２１Ａは、ＥＢＶ ＩＬ－１０である。図２１Ｂは、Ｖ３１Ｌ置換を含むＤＶ０５である。図２１Ｃは、Ａ７５Ｉ置換を含むＤＶ０６である。図２１Ｄは、Ｖ３１ＬおよびＡ７５Ｉの両方の置換を含むＤＶ０７である。

【図21-2】図２１Ａ～２１Ｄは、ＥＢＶ ＩＬ－１０アミノ酸配列である。図２１Ａは、ＥＢＶ ＩＬ－１０である。図２１Ｂは、Ｖ３１Ｌ置換を含むＤＶ０５である。図２１Ｃは、Ａ７５Ｉ置換を含むＤＶ０６である。図２１Ｄは、Ｖ３１ＬおよびＡ７５Ｉの両方の置換を含むＤＶ０７である。

【図21-3】図２１Ａ～２１Ｄは、ＥＢＶ ＩＬ－１０アミノ酸配列である。図２１Ａは、ＥＢＶ ＩＬ－１０である。図２１Ｂは、Ｖ３１Ｌ置換を含むＤＶ０５である。図２１Ｃは、Ａ７５Ｉ置換を含むＤＶ０６である。図２１Ｄは、Ｖ３１ＬおよびＡ７５Ｉの両方の置換を含むＤＶ０７である。

【図21-4】図２１Ａ～２１Ｄは、ＥＢＶ ＩＬ－１０アミノ酸配列である。図２１Ａは、ＥＢＶ ＩＬ－１０である。図２１Ｂは、Ｖ３１Ｌ置換を含むＤＶ０５である。図２１Ｃは、Ａ７５Ｉ置換を含むＤＶ０６である。図２１Ｄは、Ｖ３１ＬおよびＡ７５Ｉの両方の置換を含むＤＶ０７である。

【発明を実施するための形態】

【0048】

様々な好ましい実施形態の詳細な説明
様々な実施形態の適用を詳細に説明する前に、本出願が、特定の製剤またはプロセスパラメーターに制限されるものではなく、当然ながら、変動し得ることを理解されたい。本明細書において使用される用語は、様々な実施形態を説明する目的のものにすぎず、制限することを意図するものではないこともまた、理解されたい。

【0049】

本明細書に記載されるものに類似またはそれと同等のいくつかの方法および材料を、様々な記載される実施形態の実施において使用することができるが、好ましい材料および方法が、本明細書に記載されている。

【0050】

別途示されない限り、本明細書に記載される実施形態は、当業者には周知である分子生物学、生物化学、薬理学、化学、および免疫学の従来的な方法および技法を用いる。ＩＬ－１０のヒト、ＣＭＶ、および／またはＥＢＶ形態を含むがこれらに限定されない、ＩＬ－１０バリアントを設計および製造するための一般的な技法、ならびにＩＬ－１０バリアントを試験するためのアッセイの多くは、当該技術分野において容易に入手可能であり、詳述されている、周知の方法である。例えば、Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989)、Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.)、Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell eds., Blackwell Scientific Publications)、A. L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., current addition)を参照されたい。Ｎ末端アルデヒドに基づくＰＥＧ化化学反応もまた、当該技術分野において周知である。

【0051】

以下の用語は、本明細書において考察される様々な実施形態を説明するために使用され、以下に示されるように定義されることが意図される。

【0052】

様々な実施形態を説明する際に本明細書で使用される場合、単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈により別途明確に示されない限り、複数形の参照物を含む。

【0053】

「約」という用語は、示される数または数の範囲から０．０００１～５％の偏差を指す。一実施形態では、「約」という用語は、示される数または数の範囲から１～１０％の偏差を指す。一実施形態では、「約」という用語は、示される数または数の範囲から最大２５％の偏差を指す。より具体的な実施形態では、「約」という用語は、野生型配列と比較した場合に、ヌクレオチド配列相同性またはアミノ酸配列相同性に関して、１～２５％の差を指す。

【0054】

「インターロイキン－１０」または「ＩＬ－１０」という用語は、共有結合によらずに接合されてホモ二量体を形成する２つのサブユニットを含む、タンパク質を指し、ここで、ＩＬ－１０は、２つの６ヘリックスバンドル（ヘリックスＡ～Ｆ）から構成される介在二量体である。本明細書で使用される場合、別途示されない限り、「インターロイキン－１０」および「ＩＬ－１０」は、ヒトＩＬ－１０（「ｈＩＬ－１０」、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿０００５６３、もしくは米国特許第６，２１７，８５７号）タンパク質（配列番号１）または核酸（配列番号２）、マウスＩＬ－１０（「ｍＩＬ－１０」、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ３７８９７、もしくは米国特許第６，２１７，８５７号）タンパク質（配列番号７）または核酸（配列番号８）、またはウイルスＩＬ－１０（「ｖＩＬ－１０」）を指し得る。ウイルスＩＬ－１０ホモログは、ＥＢＶまたはＣＭＶ（それぞれ、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＣ＿００７６０５およびＤＱ３６７９６２）に由来し得る。ＥＢＶ－ＩＬ１０という用語は、ＩＬ－１０タンパク質（配列番号３）または核酸（配列番号４）のＥＢＶホモログを指す。ＣＭＶ－ＩＬ１０という用語は、ＩＬ－１０タンパク質（配列番号５）または核酸（配列番号６）のＣＭＶホモログを指す。単量体ＩＬ－１０という用語は、本明細書で使用される場合、共有結合によらずに接合されるとＩＬ－１０またはバリアントＩＬ－１０のホモ二量体を形成する、ＩＬ－１０またはバリアントＩＬ－１０の個々のサブユニットを指す。「野生型」、「ｗｔ」、および「天然の」という用語は、問題となる特定のＩＬ－１０の起源である種において天然に一般的に見出されるタンパク質（例えば、ＩＬ－１０、ＣＭＶ－ＩＬ１０、またはＥＢＶ－ＩＬ１０）の配列を指して、本明細書において互換可能に使用される。例えば、「野生型」または「天然の」ＥＢＶ－ＩＬ１０という用語は、したがって、天然にもっとも一般的に見出されるアミノ酸配列に対応するであろう。

【0055】

「由来する（ｄｅｒｉｖｅ）」、「由来する（ｄｅｒｉｖｅｄ）」、「に由来する（ｄｅｒｉｖｅ ｆｒｏｍ）」、または「に由来する（ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ）」という用語は、分子、例えば、ＩＬ－１０分子のウイルス形態の起源を特定するために本明細書に使用されるものであり、分子が調製、製造、製作、または作製される方法を制限することを意味するものではない。これには、化学的手段または組換え手段などであるがこれらに限定されない方法が含まれるであろう。

【0056】

「誘導体」という用語は、参照分子またはバリアントの所望される生物学的活性（例えば、抗炎症、および／またはＴ細胞刺激がないこと）が保持される限り、目的の参照分子またはそのアナログの任意の好適な改変形態、例えば、硫酸化、アセチル化、グリコシル化、リン酸化、ポリマーコンジュゲーション（例えば、ポリエチレングリコールを用いた）、ヘシル化（ｈｅｓｙｌａｔｉｏｎ）、またはその他の外来部分の付加を含むことが意図される。

【0057】

「バリアント」、「アナログ」、および「突然変異タンパク質」という用語は、所望される活性、例えば、例として、抗炎症活性を保持する、参照分子の生物学的に活性な誘導体を指す。一般的に、「バリアント（ｖａｒｉａｎｔ）」、「バリアント（ｖａｒｉａｎｔｓ）」、「アナログ」、および「突然変異タンパク質」という用語は、ポリペプチドに関連する場合、天然の分子と比べて、１つまたは複数のアミノ酸付加、置換（保存的な性質の）、および／または欠失を有する、天然のポリペプチド配列および構造を有する１つまたは複数の化合物を指す。そのため、「ＩＬ－１０バリアント」、「バリアントＩＬ－１０」、「ＩＬ－１０バリアント分子」という用語、ならびにこれらの文法上の変動形および複数形は、すべて、野生型ＩＬ－１０とは、配列同一性または相同性が１～２５％のいずれかで異なる、ＩＬ－１０アミノ酸（または核酸）配列を指す同等の用語であることが意図される。したがって、例えば、ＥＢＶ ＩＬ－１０バリアント分子は、１つまたは複数のアミノ酸（またはアミノ酸をコードするヌクレオチド配列）の付加、置換、および／または欠失を有することが、野生型ＥＢＶ ＩＬ－１０とは異なるものである。したがって、一形態では、ＥＢＶ ＩＬ－１０バリアントは、配列相同性に約１％～２５％の差を有することが、配列番号３の野生型配列とは異なるものであり、これは、約１～４２個のアミノ酸の相違に相当する。

【0058】

「融合タンパク質」という用語は、通常は天然に存在しない新規なタンパク質配置をもたらす、２つまたはそれよりも多くのタンパク質またはポリペプチドの組合せまたはコンジュゲーションを指す。融合タンパク質は、２つまたはそれよりも多くのタンパク質またはポリペプチドの共有結合的連結の結果である。融合タンパク質を構成する２つまたはそれよりも多くのタンパク質は、アミノ末端からカルボキシ末端に任意の構成で配置され得る。したがって、例えば、１つのタンパク質のカルボキシ末端は、別のタンパク質のカルボキシ末端またはアミノ末端のいずれかに共有結合的に連結され得る。例示的な融合タンパク質は、単量体ＩＬ－１０または単量体バリアントＩＬ－１０分子を、１つまたは複数の抗体可変ドメインと組み合わせることを含み得る。融合タンパク質はまた、二量体を形成し得るか、または同じ種類の他の融合タンパク質と会合してもよく、これにより、融合タンパク質複合体が生じる。融合タンパク質の複合体形成は、一部の事例では、複合体を形成していない融合タンパク質と比較した場合に、融合タンパク質の機能性を活性化または増加させ得る。例えば、１つまたは複数の抗体可変ドメインを有する単量体ＩＬ－１０または単量体バリアントＩＬ－１０分子は、ＩＬ－１０受容体に結合する能力が限定または減少されている場合があるが、しかしながら、融合タンパク質を複合体にすると、単量体形態のＩＬ－１０またはバリアントＩＬ－１０分子は、ホモ二量体となり、可変ドメインが会合して機能性抗体となる。

【0059】

「機能性バリアント」は、参照分子の生物学的活性を破壊しない改変（例えば、付加、置換、および／または欠失）を含む、ＩＬ－１０バリアント分子である。これらのバリアントは、以下に定義される参照分子に「相同」であり得る。一般的に、そのようなアナログのアミノ酸配列は、２つの配列をアライメントしたときに、参照配列に対して高い度合いの配列相同性、例えば、５０％を上回る、一般的には６０％～７０％を上回る、さらにより具体的には８０％～８５％またはそれを上回る、例えば、少なくとも９０％～９５％またはそれを上回るアミノ酸配列相同性を有するであろう。多くの場合、アナログは、同じ数のアミノ酸を含むが、置換を含むであろう。機能性バリアントは、天然の分子と比べて増強された、減弱された、または実質的に同じ、生物学的活性を保持するであろう。具体的には、「バリアント」ＩＬ－１０分子という用語は、「操作された」ＩＬ－１０分子またはＩＬ－１０バリアント分子またはＩＬ－１０バリアントという用語と互換可能であり、ＩＬ－１０分子またはタンパク質におけるＩＬ－１０受容体結合ドメインおよび／またはドメイン間角度もしくはホモ二量体間角度の形成に関与する領域に対する一方または両方の改変を含む、ＩＬ－１０分子またはタンパク質を指す。バリアントＩＬ－１０「融合タンパク質」または「ダイアボディ」または「融合体」は、概して、バリアントＩＬ－１０（単量体形態またはホモ二量体形態のいずれかで）および少なくとも１つの他のタンパク質を含む、融合タンパク質（または融合タンパク質複合体）の形成を指す。本明細書で使用される場合、バリアントＩＬ－１０「またはその融合タンパク質」は、そのようなバリアントＩＬ－１０融合タンパク質を説明するために、本明細書全体を通じて使用され得る。

【0060】

「アナログ（ａｎａｌｏｇ）」または「アナログ（ａｎａｌｏｇｓ）」は、保存的な性質である置換を含み得る。例えば、保存的置換には、（１）アスパラギン酸とグルタミン酸との間の酸性置換、（２）リシン、アルギニン、またはヒスチジンのうちのいずれか１つの間の塩基性置換、（３）アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、またはトリプトファンのうちのいずれか１つの間の非極性置換、ならびに（４）グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、またはチロシンのうちのいずれか１つの間の非荷電極性置換などであるがこれらに限定されない種類の置換が含まれ得る。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、芳香族アミノ酸として分類されることもある。所望される特定の生物学的活性がインタクトである限り、ロイシンとイソロイシンまたはバリン、アスパラギン酸とグルタミン酸、スレオニンとセリンとの単独置換、または１つのアミノ酸と構造的に関連性のあるアミノ酸との同様の保存的置換が行われ得ることも可能である。例えば、目的のポリペプチドは、分子の所望される機能がインタクトなままである限り、最大で約１～１０個の保存的もしくは非保存的アミノ酸置換、またはさらには最大で約１５～２５個もしくは１～５０個のうちの任意の整数個の保存的もしくは非保存的アミノ酸置換を含み得る。当業者であれば、当該技術分野において周知の変更を寛容し得る目的の分子の領域を容易に判定することができる。

【0061】

「突然変異タンパク質」は、アミノおよび／またはイミノ分子のみを含む化合物、１つまたは複数のアミノ酸アナログ（例えば、非天然のアミノ酸などを含む）を含むポリペプチド、置換された連結を有するポリペプチド、ならびに当該技術分野において公知の他の改変、天然に存在するおよび天然に存在しない（例えば、合成）の両方の環状化分岐分子などを含むがこれらに限定されない、１つまたは複数のアミノ酸様分子を有するポリペプチドをさらに含む。好ましくは、アナログまたは突然変異タンパク質は、天然の分子と比べて増強された、減弱された、または実質的に同じ、なんらかの生物学的活性を保持するであろう。ポリペプチドアナログおよび突然変異タンパク質を作製するための方法は、当該技術分野において周知である。

【0062】

「ホモログ」、「相同性」、「相同」、または「実質的に相同」という用語は、少なくとも２つのポリヌクレオチド配列間または少なくとも２つのポリペプチド配列間の同一性パーセントを指す。配列が、分子の所定の長さにわたって、少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約８０％～８５％、好ましくは少なくとも約９０％、もっとも好ましくは少なくとも約９５％～９８％の配列同一性を示す場合、これらの配列は、互いに相同である。

【0063】

「配列同一性」という用語は、ヌクレオチド間またはアミノ酸間での厳密な対応を指す。配列同一性は、１００％の配列同一性から５０％の配列同一性の範囲に及び得る。配列同一性パーセントは、配列をアライメントし、２つのアライメントした配列間での厳密な一致の数を計数し、参照配列の長さで除し、結果に１００を乗じることによる、２つの分子（参照配列と、参照配列に対して未知の同一性％を有する配列と）の間の配列情報の直接的な比較を含むがこれに限定されない、様々な方法を使用して判定することができる。容易に入手可能なコンピュータプログラムを使用して、同一性パーセントの特定を補助することができる。

【0064】

「断片」という用語は、全長アミノ酸またはポリヌクレオチド配列および／または構造の一部分の分子を含むことが意図される。ポリペプチドの断片は、例えば、天然のポリペプチドのＣ末端欠失、Ｎ末端欠失、および／または内部欠失を含み得る。特定のタンパク質の活性なまたは機能性断片は、一般的に、全長分子の少なくとも約５～１０個の連続的なアミノ酸残基、好ましくは全長分子の少なくとも約１５～２５個の連続的なアミノ酸残基、もっとも好ましくは全長分子の少なくとも約２０～５０個またはそれを上回る連続的なアミノ酸残基、または５個のアミノ酸から全長配列までの間の任意の整数個を含むが、ただし、問題の断片が、生物学的活性、例えば、抗炎症活性を保持することを条件とする。抗体に関連する場合、抗体断片は、インタクトな抗体の抗原結合性部位または可変領域（重鎖および／または軽鎖領域）を含むインタクトな抗体の一部分を指す。これらとしては、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、（Ｆａｂ’）_２、Ｆｖ断片、ダイアボディ、一本鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）、１つの軽鎖可変ドメインを有する一本鎖ポリペプチド、軽鎖可変ドメインまたは重鎖可変ドメインの３つのＣＤＲを有する断片を挙げることができる。

【0065】

「実質的に精製された」という用語は、一般的に、物質が、それが存在する試料に対して大部分のパーセントを構成するような、物質の単離を指す。実質的に精製された成分は、試料のうちの５０％、好ましくは８０％～８５％、より好ましくは９０～９５％を構成する。同様に、「単離された」という用語は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに言及している場合、示される分子が、その分子が天然に見出される生物全体から分離され別個であるか、または同じ種類の他の生物学的巨大分子が実質的に不在の状態で存在することを意味する。

【0066】

「対象」、「個体」、および「患者」という用語は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物を指して、本明細書において互換可能に使用される。哺乳動物には、マウス、げっ歯類、サル、ヒト、家畜、競技動物、およびある特定の愛玩動物が含まれるが、これらに限定されない。

【0067】

「投与すること」という用語は、本出願の活性成分がその意図される機能を発揮することを可能にする、投与経路を含む。

【0068】

「治療有効量」は、例えば、本明細書に記載されるＥＢＶ－ＩＬ－１０バリアントまたはその融合タンパク質の投与に関連する場合、ある特定の生物学的活性を促進するのに十分であるＥＢＶ－ＩＬ－１０バリアントまたはその融合タンパク質の量を指す。これらには、例えば、骨髄系細胞機能の抑制、クッパー細胞活性の増強、および／またはＣＤ８^＋ Ｔ細胞に対する任意の作用の欠如もしくはＣＤ８^＋ Ｔ細胞活性の増強、ならびにＦｃ受容体のマスト細胞上方制御の遮断もしくは脱顆粒の防止を挙げることができる。したがって、「有効量」は、医学的状態の症状または兆候を軽減または予防する。有効量はまた、診断を可能にするかまたは容易にするのに十分な量も意味する。

【0069】

「処置する」または「処置」という用語は、疾患または状態の作用を低減させる方法を指す。処置はまた、症状だけではなく疾患または状態自体の根底にある原因を低減させる方法も指し得る。処置は、本来のレベルからの任意の低減であり得、疾患、状態、または疾患もしくは状態の症状の完全な排除であり得るが、これらに限定されない。

【0070】

「化学療法」剤は、がんの処置において有用な化学的化合物である。化学療法剤の例としては、アルキル化剤、例えば、チオテパ、シクロホスファミド（cyclosphosphamide）（ＣＹＴＯＸＡＮ（商標））、スルホン酸アルキル、例えば、ブスルファン、インプロスルファン、およびピポスルファン、アジリジン、例えば、ベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパ、およびウレドーパ、アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド（trietylenephosphoramide）、トリエチレンチオホスファオラミド（ｔｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈａｏｒａｍｉｄｅ）、およびトリメチロロメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｍｅ）を含むエチレンイミンおよびメチラメラミン、ナイトロジェンマスタード、例えば、クロラムブシル（chiorambucil）、クロルナファジン、コロホスファミド（ｃｈｏｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩（ｍｅｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｅ ｏｘｉｄｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、メルファラン、ノベムビシン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード、ニトロソ尿素、例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン、抗生物質、例えば、アクラノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリケアマイシン、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン（ｄｅｔｏｒｕｂｉｃｉｎ）、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン（ｅｓｏｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン（ｏｌｉｖｏｍｙｃｉｎ）、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、ケラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン、抗代謝剤、例えば、メトトレキセートおよび５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）、葉酸アナログ、例えば、デノプテリン、メトトレキセート、プテロプテリン、トリメトレキセート、プリンアナログ、例えば、フルダラビン、６－メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン、ピリミジンアナログ、例えば、アンシタビン、アザシチジン、６－アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、５－ＦＵ、アンドロゲン、例えば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン、抗副腎薬（ａｎｔｉ－ａｄｒｅｎａｌ）、例えば、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン、葉酸補液（ｆｏｌｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｐｌｅｎｉｓｈｅｒ）、例えば、フロリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）、アセグラトン、アルドホスファミドグリコシド（ａｌｄｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ）、アミノレブリン酸、アムサクリン、ベストラブシル（ｂｅｓｔｒａｂｕｃｉｌ）、ビスアントレン、エダトレキセート（edatraxate）、デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）、デメコルチン、ジアジクオン、エルフォルニチン（ｅｌｆｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）、酢酸エリプチニウム、エトグルシド、硝酸ガリウム、ヒドロキシ尿素、レンチナン、ロニダミン、ミトグアゾン、ミトキサントロン、モピダモール、ニトラクリン、ペントスタチン、フェナメット、ピラルビシン、ポドフィリン酸（ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）、２－エチルヒドラジド、プロカルバジン、ＰＳＫ（登録商標）、ラゾキサン、シゾフィラン、スピロゲルマニウム、テヌアゾン酸、トリアジクオン、２，２’，２’’－トリクロロトリエチルアミン、ウレタン、ビンデシン、ダカルバジン、マンノムスチン、ミトブロニトール、ミトラクトール、ピポブロマン、ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）、アラビノシド（Ａｒａ－Ｃ）、シクロホスファミド、チオテパ、タキソイド、例えば、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．）およびドセタキセル（doxetaxel）（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（商標）、Ｒｈｏｎｅ－Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ、Ａｎｔｏｎｙ、Ｆｒａｎｃｅ）、クロラムブシル、ゲムシタビン、６－チオグアニン、メルカプトプリン、メトトレキセート、白金アナログ、例えば、シスプラチンおよびカルボプラチン、ビンブラスチン、白金、エトポシド（ＶＰ－１６）、イホスファミド、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、ビンクリスチン、ビノレルビン、ナベルビン、ノバントロン、テニポシド、ダウノマイシン、アミノプテリン、Ｘｅｌｏｄａ（登録商標）Ｒｏｃｈｅ Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ、イバンドロネート、ＣＰＴ１１、トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ ２０００、ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）、レチノイン酸、エスペラミシン、カペシタビン、ならびに上述のもののいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体が挙げられる。腫瘍に対するホルモンの作用を調節または阻害するように作用する抗ホルモン剤、例えば、例として、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害性４（５）－イミダゾール、４－ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、およびトレミフェン（Ｆａｒｅｓｔｏｎ）を含む、抗エストロゲン剤、ならびにフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、およびゴセレリンなどの抗アンドロゲン剤、ならびに上述のもののいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体もまた、この定義に含まれる。

【0071】

「コンジュゲート」、「コンジュゲートされた」、「コンジュゲーション」、または「コンジュゲートする」という用語は、本出願において使用される場合、分子の２つまたはそれを上回る部分を一緒に連結させることを指す。連結は、共有結合（例えば、ペプチド結合）によって生じる。
ＩＬ－１０バリアントタンパク質

【0072】

本出願のＩＬ－１０バリアント分子は、ＩＬ－１０の任意の形態に対する改変を含む。ＩＬ－１０分子に対するこれらの改変としては、ＩＬ－１０受容体結合に関係する領域および／もしくはドメイン、ならびに／またはＩＬ－１０分子においてドメイン間もしくはホモ二量体間角度を付与することに関与するものにおける１つまたは複数のアミノ酸の付加、欠失、および／または置換が挙げられる。本出願のバリアントＩＬ－１０分子を構築する際に有用であり得る例示的なＩＬ－１０配列としては、エプスタインバーウイルス（「ＥＢＶ」、例えば、Moore et al., Science (1990) 248:1230-1234、Hsu et al., Science (1990) 250:830-832、Suzuki et al., J. Exp. Med. (1995) 182:477-486を参照されたい）、サイトメガロウイルス（「ＣＭＶ」、例えば、Lockridge et al., Virol. (2000) 268:272-280、Kotenko et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97:1695-1700を参照されたい）、およびウマヘルペスウイルス（例えば、Rode et al., Virus Genes (1993) 7:111-116を参照されたい）、ＯｒＦウイルス（例えば、Imlach et al., J. Gen. Virol. (2002) 83:1049-1058およびFleming et al., Virus Genes (2000) 21:85-95を参照されたい）に由来するホモログが挙げられるが、これらに限定されない。他の代表的なＩＬ－１０配列としては、ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ０１０５４８、ＡＦ３０７０１２、Ｍ３７８９７、Ｍ８４３４０（マウス配列）、Ｕ３８２００（ウマ）、Ｕ３９５６９、ＡＦ０６０５２０（ネコ配列）、Ｕ００７９９（ウシ）、Ｕ１１４２１、Ｚ２９３６２（ヒツジ配列）、Ｌ２６０３１、Ｌ２６０２９（マカク配列）、ＡＦ２９４７５８（サル）、Ｕ３３８４３（イヌ）、ＡＦ０８８８８７、ＡＦ０６８０５８（ウサギ配列）、ＡＦ０１２９０９、ＡＦ１２００３０（ウッドチャック配列）、ＡＦ０２６２７７（オポッサム）、ＡＦ０９７５１０（モルモット）、Ｕ１１７６７（シカ）、Ｌ３７７８１（アレチネズミ）、ＡＢ１０７６４９（ラマおよびラクダ）に記載される配列が挙げられる。

【0073】

一実施形態では、本明細書に記載されるＩＬ－１０バリアント分子は、ヒト（配列番号１）、ＣＭＶ（配列番号５）、ＥＢＶ（配列番号３）ＩＬ－１０配列、またはマウス（配列番号７）の野生型タンパク質を改変することによって得られる。様々なＩＬ－１０バリアント分子の代表的な例は、配列番号９～２３に提供されている。

【0074】

野生型ＩＬ－１０に対する改変は、（ｉ）ＩＬ－１０受容体結合および／または（ｉｉ）ＩＬ－１０分子のドメイン間もしくはホモ二量体間角度の形成に関与する領域における１つまたは複数のアミノ酸の付加、欠失、および／または置換を含む。
バリアントＩＬ－１０分子：ＩＬ－１０受容体結合領域

【0075】

受容体結合に関与する領域には、ＩＬ－１０のＩＬ－１０受容体１（ＩＬ１０Ｒ１）および／またはＩＬ－１０受容体２（ＩＬ１０Ｒ２）への結合に直接的に関与するかまたはそれを担う領域内に位置する任意のアミノ酸部分が含まれる。これらの領域には、例えば、当該技術分野においてこれまでに考察されマッピングされている、ＩＬ－１０分子の不連続部分が含まれ得る（例えば、Yoon 2005; Josephson 2001を参照されたい）。ＩＬ－１０のＩＬ－１０受容体への結合と関連する接触点または切断点を形成することに関与する、例えば、ヘリックスＡ、ヘリックスＦ、およびＡＢループなどであるがこれらに限定されない任意の領域に対する改変が、本出願において想定される。好ましい実施形態では、受容体結合ドメインに対する改変（例えば、付加、欠失、および／または置換）は、配列番号３のアミノ酸３１および／または７５を含む。特に好ましい実施形態では、改変は、配列番号３の３１位におけるバリンのロイシンへの置換（Ｖ３１Ｌ、本明細書において「ＤＶ０５」と称される）、配列番号３の７５位におけるアラニンのイソロイシンへの置換（Ａ７５Ｉ、本明細書において「ＤＶ０６」と称される）、または配列番号３におけるＶ３１ＬおよびＡ７５Ｉの両方の置換（本明細書において「ＤＶ０７」と称される）を含む。一態様では、ＤＶ０５は、配列番号５５であり、ＤＶ０６は、配列番号５７であり、ＤＶ０７は、配列番号５９である。

【0076】

一実施形態では、受容体結合ドメインに対する改変は、Josephson et al (Immunity, 2001, 15, p. 35-46, Figure 1）によって考察されている部位Ｉａおよび／または部位Ｉｂの境界部接触点のうちのいずれか１つまたは複数を含む。本出願の一実施形態では、部位Ｉａ境界部接触点は、ヘリックスＦの曲がり部分およびＡＢループに位置する１つまたは複数のアミノ酸を含む。別の実施形態では、部位Ｉｂ境界部接触点は、ヘリックスＡのＮ末端およびヘリックスＦのＣ末端に位置する１つまたは複数のアミノ酸を含む。別の実施形態では、受容体結合に関与するＩＬ－１０に位置するいずれか１つまたは複数のアミノ酸は、ヘリックスＡ内の１～１０個のアミノ酸およびＡＢループ内の１～７個のアミノ酸のうちのいずれか１つまたは複数を含む。別の実施形態では、受容体結合領域は、以下のアミノ酸またはそれを中心とした１～１０個のアミノ酸の１つまたは複数の改変を含み得、ここで、アミノ酸は、Ｇｌｕ－１４２、Ｌｙｓ－１３８、Ａｓｐ－１４４、Ｇｌｎ－３８、Ｓｅｒ－１４１、Ａｓｐ－４４、Ｇｌｎ－４２、Ｇｌｎ－３８、Ａｒｇ－２７、Ｇｌｕ－１５１、Ａｒｇ－２４、Ｐｒｏ－２０、Ｉｌｅ－１５８、またはこれらの任意の組合せである。

【0077】

一態様では、受容体結合ドメインに対する改変は、Josephson et al (Immunity, 2001, 15, p. 35-46, Figure 1）によって考察されている部位ＩＩａおよび／または部位ＩＩｂの境界部接触点のうちのいずれか１つまたは複数を含む。本出願の一実施形態では、部位ＩＩａ境界部接触点は、ＤＥループに位置する１つまたは複数のアミノ酸を含む。別の実施形態では、受容体結合領域は、以下のアミノ酸またはそれを中心とした１～１０個のアミノ酸の１つまたは複数の改変を含み得、ここで、アミノ酸は、Ｓｅｒ－１１、Ｔｈｒ－１３、Ａｓｎ－１８、Ａｒｇ－１０４、Ａｒｇ－１０７、またはこれらの任意の組合せである。一実施形態では、バリアントＩＬ－１０分子は、受容体結合ドメインに影響を及ぼす１～１００個（またはその中の任意の整数個）のアミノ酸付加、欠失、および／または置換を含み、そのような付加、欠失、および／または置換は、バリアントＩＬ－１０分子のＩＬ－１０受容体に対する結合親和性を増加させるか減少させるかのいずれかである。
バリアントＩＬ－１０分子：ドメイン間角度の改変

【0078】

ＩＬ－１０分子のドメイン間（ホモ二量体間、これは互換可能に使用される）角度の形成に関与する領域は、ＩＬ－１０ホモ二量体の特定のドメイン間角度の形成に直接的に関与するかまたはそれを担う領域内に位置する任意のアミノ酸部分を含む。野生型ＩＬ－１０は、ＩＬ－１０の２つの単量体単位が逆平行様式で相互接続すると、「Ｌ字型」二量体を形成する。結果として生じるヒトＩＬ－１０およびＥＢＶ－ＩＬ１０のドメイン間角度は、それぞれ、およそ８９度および９７度であることが報告されている。ＩＬ－１０受容体のシグナル伝達を調整するために、一実施形態では、本出願は、ドメイン間角度の形成に関与するそれぞれの単量体においてＬ字型二量体の形成に関与するヘリックスＤまたはヘリックスＥの部分であるＤＥループ内のアミノ酸を改変させることを探究する。別の実施形態では、ドメイン間角度に関与する領域は、ＩＬ－１０タンパク質のヘリックスＤとヘリックスＥとの間に位置する約１２個のアミノ酸のリンカー領域を含む。付加、欠失、または置換による改変は、ヒトＩＬ－１０またはＥＢＶ－ＩＬ１０のいずれかと比較した場合に、制限されたまたは弛緩したＩＬ－１０ドメイン間角度をもたらす。単量体ＩＬ－１０分子が改変されると、ホモ二量体化したときに制限された／緊密な／閉鎖された、または弛緩した／緩い／開放されたＩＬ－１０ドメイン間角度をもたらし、改変されたＩＬ－１０分子は、その同種受容体（ＩＬ－１０受容体）に結合しそれをモジュレートする変更されたドメイン間角度を有するバリアントＩＬ－１０分子を産生する。別の実施形態では、置換は、ＥＢＶ－ＩＬ１０のＤヘリックスとＥヘリックスとの間および／またはＣヘリックスとＤヘリックスとの間に位置するアミノ酸セグメント内にプロリンを導入することを含む。

【0079】

したがって、ある実施形態では、バリアントＩＬ－１０分子は、野生型ＩＬ－１０と比較した場合に、変更された分子間角度または変更されたドメイン間角度を呈する１つまたは複数の付加、欠失、および／または置換を含むであろう。変更された分子間角度または変更されたドメイン間角度は、同一または異なるバリアントＩＬ－１０分子と二量体化して、野生型ＩＬ－１０分子と比較した場合に、異なる結合角度でＩＬ－１０受容体に結合するバリアントＩＬ－１０分子をもたらし得る。バリアントＩＬ－１０分子の異なる結合角度は、ＩＬ－１０受容体のシグナル伝達を、炎症および／または免疫応答を活性化または抑制のいずれかを行うようにモジュレートまたは「調整」する能力をもたらす。好ましい実施形態では、バリアントＩＬ－１０分子は、ＥＢＶ－ＩＬ１０である。別の好ましい実施形態では、バリアントＩＬ－１０分子は、改変の基準として、ＥＢＶ－ＩＬ１０分子を使用する。なおも別の実施形態では、バリアントＩＬ－１０分子は、他のＩＬ－１０分子（ヒトＩＬ－１０、マウスＩＬ－１０、および／またはＣＭＶ－ＩＬ１０などであるがこれらに限定されない）に由来する部分およびドメインを得たハイブリッド分子である。

【0080】

別の好ましい実施形態では、バリアントＩＬ－１０分子は、炎症性細胞（骨髄系統細胞）応答を抑制し、リンパ系細胞、例えば、Ｔ細胞の活性化を誘導しない、弛緩したドメイン間角度をもたらす。受容体結合ドメインに対する改変、好ましくは、低下したかまたは変化しない受容体親和性をもたらす改変と組み合わせた場合、弛緩したドメイン間角度を有するバリアントＩＬ－１０分子は、炎症促進性刺激に応答した骨髄系細胞（単球、マクロファージ、好中球、顆粒球、マスト細胞、クッパー細胞）サイトカイン分泌を抑制するのに有効であろう。バリアントＩＬ－１０分子のこの構成は、例えば、ＩＢＤ、クローン病、乾癬、リウマチ性関節炎、ＮＡＦＬＤ、およびＮＡＳＨなどであるがこれらに限定されない炎症性疾患を処置するのに有用である。

【0081】

別の好ましい実施形態では、バリアントＩＬ－１０分子は、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞の活性化を増強させる、制限されたドメイン間角度をもたらす。受容体結合ドメインに対する改変、好ましくは、高い受容体親和性をもたらす改変と組み合わせた場合、制限されたドメイン間角度を有するバリアントＩＬ－１０分子は、例えば、ＣＤ８^＋ Ｔ細胞、ＮＫ細胞、およびクッパー細胞の排除を増強するのに有効であろう。バリアントＩＬ－１０分子のこの構成は、例えば、転移性がんを含む、様々な固形および造血系のがんを処置するのに有用である。

【0082】

ドメイン間角度の形成に関与する領域は、ＩＬ－１０分子内に位置する連続的または不連続的部分であり得る。一実施形態では、ＩＬ－１０バリアント分子のドメイン間角度は、１～２５度の角度変化を有し、別の好ましい実施形態では、角度変化は、１～１０度であり、より好ましい実施形態では、角度変化は、１～５度であり、もっとも好ましい実施形態では、角度変化は、５度を下回る。一実施形態では、バリアントＩＬ－１０分子は、ドメイン間角度に影響を及ぼす１～１００個（またはその中の任意の整数個）のアミノ酸付加、欠失、および／または置換を含むであろう。

【0083】

本出願の一実施形態では、バリアントＩＬ－１０分子は、コンピュータに基づくモデリングの補助により、ＩＬ－１０受容体結合および／またはドメイン間角度にもっとも関与する１つまたは複数の領域を予測して、設計および作製されるであろう。コンピュータに基づくモデリングは、受容体結合ドメインおよび／またはドメイン間角度に対する改変によりもっとも利益が得られるであろう領域を予測する高速かつ効率性の高い手段を提供するのを補助するであろう。

【0084】

別の実施形態では、本出願の分子は、バリアントＩＬ－１０分子の誘導体を含む。これらは、バリアント分子のサイズ、半減期、およびバイオアベイラビリティを増加させる実体を含めるためのバリアント分子に対する改変を含み得る。
バリアントＩＬ－１０分子：ＰＥＧ改変

【0085】

一実施形態では、バリアントＩＬ－１０分子は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の付加を含み得る。ＰＥＧ化ＩＬ－１０バリアントは、少なくとも１つのＰＥＧ分子の付加を含み得る。いずれの特定の理論にも束縛されるものではないが、ＩＬ－１０バリアントへのＰＥＧの付加は、タンパク質分解から保護し、免疫原性を減少させ、骨髄系細胞に対するその抑制作用を維持するために、受容体上でのＩＬ－１０バリアントの不安定化を促進し、Ｔ細胞の活性化を防止することができる。

【0086】

そのもっとも一般的な形態において、ＰＥＧは、ヒドロキシル基が末端にある直鎖状または分岐状ポリエーテルであり、以下の一般構造を有する。
ＨＯ－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ－ＣＨ_２ＣＨ_２－ＯＨ

【0087】

ＰＥＧを本出願のバリアントＩＬ－１０分子に連結させる方法は、当該技術分野においてすでに確立されている技法／プロトコールに従う。例えば、ＰＥＧのコンジュゲーションまたは連結は、一方または両方の末端に官能基を有するＰＥＧの誘導体を調製することによって、ＰＥＧを活性化することを必要とする。タンパク質のＰＥＧコンジュゲーションのもっとも一般的な経路は、リシンとの反応に好適な官能基およびＮ末端アミノ酸基でＰＥＧを活性化することである。特に、ＰＥＧをポリペプチドに連結させることに関与するもっとも一般的な反応基は、リシンのアルファまたはイプシロンアミノ基である。

【0088】

ＰＥＧ化リンカーのバリアントＩＬ－１０分子との反応は、主として以下の部位へのＰＥＧ部分の結合をもたらす：タンパク質のＮ末端におけるアルファアミノ基、リシン残基の側鎖上のイプシロンアミノ基、およびヒスチジン残基の側鎖上のイミダゾール基。一部の実施形態では、バリアントＩＬ－１０分子は、単一のアルファアミノ基ならびにいくつかのイプシロンアミノ基およびイミダゾール基を有する組換えタンパク質であり、リンカーの化学的性質に応じて多数の位置異性体が生成され得る。

【0089】

２つの広く使用されている第１世代の活性化モノメトキシＰＥＧ（ｍＰＥＧ）は、スクシンイミジルカーボネートＰＥＧ（ＳＣ－ＰＥＧ、例えば、Zalipsky, et al. (1992) Biotechnol. Appl. Biochem 15:100-114およびMiron and Wilcheck (1993) Bioconjug. Chem. 4:568-569を参照されたい）ならびにベンゾトリアゾールカーボネートＰＥＧ（ＢＴＣ－ＰＥＧ、例えば、Ｄｏｌｅｎｃｅらの米国特許第５，６５０，２３４号を参照されたい）であり、これは、リシン残基と優先的に反応して、カルバメート連結を形成するが、ヒスチジンおよびチロシン残基と反応することも知られている。ＩＦＮα上のヒスチジン残基への連結は、加水分解的に不安定なイミダゾールカルバメート連結であることが知られている（例えば、Lee and McNemar、米国特許第５，９８５，２６３号を参照されたく、これらは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。

【0090】

第２世代のＰＥＧ化技術は、これらの不安定な連結、ならびに残基反応性における選択性の欠如を回避するように設計されている。ＰＥＧ－アルデヒドリンカーの使用は、還元アミノ化を通じて、ポリペプチドおよび／またはタンパク質サブユニットのＮ末端上の単一の部位を標的とする。ＩＬ－１０は、異なる種類のリンカーおよびｐＨを使用してＰＥＧ化して、様々な形態のＰＥＧ化分子を得てもよい（例えば、米国特許第５，２５２，７１４号、米国特許第５，６４３，５７５号、米国特許第５，９１９，４５５号、米国特許第５，９３２，４６２号、米国特許第５，９８５，２６３号、米国特許第７，０５２，６８６号を参照されたく、これらはすべて、参照によりその全体が組み込まれる）。
ＩＬ－１０模倣体分子

【0091】

別の実施形態では、本出願は、ＩＬ－１０バリアント分子の生物学的機能を反映する模倣体分子を含む。これらの模倣体としては、バリアントＩＬ－１０分子により産生されるものと同じかまたは実質的に同じである構造および／または機能を有するペプチド、小分子、改変されたホルモン、および抗体が挙げられるが、これらに限定されない。ＩＬ－１０バリアント分子を複製または反映するための改変の基礎を形成し得るＩＬ－１０模倣体分子としては、米国公開第ＵＳ２００８０１３９４７８号、同第ＵＳ２０１２０２３８５０５号、および／または同第ＵＳ２０１５０２１８２２２号に記載されているものが挙げられ、これらはすべて、参照によりその全体が組み込まれる。
ＩＬ－１０ハイブリッド分子およびＩＬ－１０融合タンパク質

【0092】

別の実施形態では、本出願は、ヒトＩＬ－１０、ＥＢＶ－ＩＬ１０、および／またはＣＭＶ－ＩＬ１０から得られた部分から構成されるハイブリッド分子である、ＩＬ－１０バリアント分子を含む。例えば、ヒトＩＬ－１０、ＥＢＶ－ＩＬ１０、および／またはＣＭＶ－ＩＬ１０のそれぞれ内の異なるドメインを、一緒に組み合わせて、ハイブリッド分子を作製することができ、その結果、この組合せは、受容体結合ドメインおよび／またはＩＬ－１０におけるドメイン間角度に関与するドメインのすべてまたは部分を利用する。

【0093】

１つの他の実施形態では、バリアントＩＬ－１０分子は、操作された融合タンパク質の一部である。リンカーまたはスペーサーは、ランダムなアミノ酸配列（例えば、ＳＳＧＧＧＧＳ（配列番号３０、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３１）、またはＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５４））、抗体、ｓｃＦｖ、もしくはダイアボディの定常領域であり得る。定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、またはＩｇＥに由来し得るが、これらに限定されない。リンカーまたはスペーサーは、好ましくは、重鎖定常（ＣＨ）領域１、ＣＨ２、またはＣＨ３であり得る。より好ましい実施形態では、スペーサーのリンカーは、配列番号３０および／または３１のランダムなアミノ酸配列である。別の態様では、リンカーまたはスペーサーは、少なくとも２つの鎖間ジスルフィド結合をさらに含み得る。

【0094】

融合タンパク質はまた、融合タンパク質のＮ末端、Ｃ末端、または両方にコンジュゲートされたＩＬ－１０またはＩＬ－１０バリアント分子の少なくとも１つの単量体も含み得る。別の実施形態では、ＩＬ－１０またはＩＬ－１０バリアントを含む融合タンパク質はまた、ＩＬ－１０またはバリアントＩＬ－１０とは反対側の末端にコンジュゲートされた少なくとも１つのサイトカインも含み得、これには、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－２６、ＩＬ－２７、ＩＬ－２８、ＩＬ－２９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１０バリアント分子、ＩＦＮ－アルファ、ＴＧＦ－ベータ、塩基性ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＬ－４、ＩＬ－１１、もしくはＩＬ－１３、またはこれらの任意の組合せが含まれる。一部の好ましい実施形態では、融合タンパク質は、融合タンパク質のＮ末端にコンジュゲートされたＩＬ－１０またはＩＬ－１０バリアント分子の２つの単量体形態、および融合タンパク質のＣ末端にコンジュゲートされた２つのＩＬ－１０またはＩＬ－１０バリアント分子を含み、融合タンパク質は、融合タンパク質のＮ末端にコンジュゲートされたＩＬ－１０またはＩＬ－１０バリアント分子の２つの単量体形態、および融合タンパク質のＣ末端にコンジュゲートされた少なくとも１つのＩＬ－２分子を含み、融合タンパク質は、融合タンパク質のＮ末端にコンジュゲートされた２つのＩＬ－１０またはＩＬ－１０バリアント分子、および融合タンパク質のＣ末端にコンジュゲートされた少なくとも１つのＩＬ－１５分子を含む。別の実施形態では、融合タンパク質のＣ末端は、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－２６、ＩＬ－２７、ＩＬ－２８、ＩＬ－２９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１０バリアント分子、ＩＦＮ－アルファ、ＴＧＦ－ベータ、塩基性ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＬ－４、ＩＬ－１１、またはＩＬ－１３から選択される少なくとも２つの異なるサイトカインを有し得る。

【0095】

別の実施形態では、融合タンパク質は、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ、Ｆａｂ、または任意の抗体断片を、ＩＬ－１０の１つの単量体もしくは２つの単量体、ＩＬ－１０バリアント分子の１つの単量体もしくは２つの単量体、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－２６、ＩＬ－２７、ＩＬ－２８、ＩＬ－２９、ＩＦＮ－アルファ、ＴＧＦ－ベータ、塩基性ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＬ－４、ＩＬ－１１、もしくはＩＬ－１３、またはこれらの組合せがコンジュゲートされる基礎スキャフォールドとして使用して、作製される。

【0096】

１つの特に好ましい実施形態では、融合タンパク質は、ＩＬ－１０またはＩＬ－１０バリアント分子に連結された可変重鎖（ＶＨ）および／または可変軽鎖（ＶＬ）を有する少なくとも１つの可変領域を含む。この構成において、融合タンパク質は、抗体の少なくとも１つの可変領域に連結されたＩＬ－１０単量体またはバリアントＩＬ－１０単量体を含む。一態様では、この融合タンパク質は、ＩＬ－１０単量体またはＩＬ－１０単量体バリアント分子がＶＨに連結され、これがＶＬに連結され、これがＩＬ－１０単量体に連結されたもの含む、直鎖状の連続配列である。抗体の可変領域は、重鎖可変（ＶＨ）領域、軽鎖可変（ＶＬ）領域、または両方であり得る。第１の融合タンパク質は、ＩＬ－１０単量体またはバリアントＩＬ－１０単量体が、可変領域（ＶＨまたはＶＬまたは両方）のカルボキシ末端にコンジュゲートされるような、直鎖状の連続的な構成を有するタンパク質配列を含む。第２の融合タンパク質は、ＩＬ－１０単量体またはバリアントＩＬ－１０単量体が、可変領域（ＶＨまたはＶＬまたは両方）のアミノ末端に連結されるような、直鎖状の連続的な構成を有するタンパク質配列を含み得る。上述の第１の融合タンパク質の代表的な例としては、以下の構成を挙げることができる。
ａ）_ＮＨ２（Ａｂ１ＶＬ）_ＣＯＯＨ－（リンカー）－_ＮＨ２（ｍｏｎｏＩＬ１０）_ＣＯＯＨ

【0097】

上述の第２の融合タンパク質の代表的な例としては、以下の構成を挙げることができる。
ｂ）_ＮＨ２（ｍｏｎｏＩＬ１０）_ＣＯＯＨ－（リンカー）－_ＮＨ２（Ａｂ_１ＶＨ）_ＣＯＯＨ

【0098】

合わせると、第１（ａ）および第２（ｂ）の融合タンパク質は、逆平行様式で機能的なタンパク質複合体を形成し、それによって、末端に連結されるＩＬ－１０またはバリアントＩＬ－１０の単量体が機能性ホモ二量体を形成し、可変領域は、一緒に、機能的な抗原結合性部位（「ＡＢＳ」）を形成することができる（例えば、図９（ａ）～（ｆ）を参照されたい）。

【0099】

代替的な実施形態では、ＩＬ－１０単量体またはバリアントＩＬ－１０単量体は、同じ抗体または２つの異なる抗体に由来する、少なくとも２つの可変領域にコンジュゲートされ得る。この構成において、少なくとも２つの可変領域は、ＶＨおよびＶＬである。そのような構成の例としては、第１の抗体のＶＨ領域がそのカルボキシ末端において第２の抗体のＶＬ領域のアミノ末端に連結され、これが、続いて、ＩＬ－１０の単量体またはＩＬ－１０バリアント分子の単量体のアミノ末端に連結されたものから構成される直鎖状の連続的なタンパク質配列を有する第１の融合タンパク質が挙げられるであろう。代替的な構成としては、単量体ＩＬ－１０またはＩＬ－１０バリアント分子の単量体がそのカルボキシ末端において第２の抗体のＶＨ領域のアミノ末端に連結され、これが、続いて、第１の抗体のＶＬ領域のアミノ末端に連結されたものから構成される直鎖状の連続的なタンパク質配列を有する第２の融合タンパク質が挙げられるであろう。上述の第１の融合タンパク質の代表的な例としては、以下の構成を挙げることができる。
ａ）_ＮＨ２（Ａｂ_１－ＶＨ）_{ＣＯＯＨ－}－（リンカー）－_ＮＨ２（Ａｂ_２ＶＬ）_ＣＯＯＨ－（リンカー）－_ＮＨ２（ｍｏｎｏＩＬ１０）_ＣＯＯＨ

【0100】

上述の第２の融合タンパク質の代表的な例としては、以下の構成を挙げることができる。
ｂ）_ＮＨ２（ｍｏｎｏＩＬ１０）_ＣＯＯＨ－（リンカー）－_ＮＨ２（Ａｂ_２ＶＨ）_ＣＯＯＨ－（リンカー）－_ＮＨ２（Ａｂ_１－ＶＬ）_ＣＯＯＨ

【0101】

合わせると、第１（ａ）および第２（ｂ）の融合タンパク質は、逆平行様式で機能的なタンパク質複合体を形成し、それによって、末端に連結されるＩＬ－１０またはバリアントＩＬ－１０の単量体が機能性ホモ二量体を形成し、可変領域は、一緒に、ＡＢＳを形成することができる（例えば、図９（ａ）～（ｃ）を参照されたい）。

【0102】

なおも別の実施形態では、融合タンパク質は、一緒に融合されたＩＬ－１０の２つの単量体またはバリアントＩＬ－１０の２つの単量体、ならびに１つまたは複数のＶＨおよびＶＬ領域を含む。それぞれの単量体は、抗体の１つまたは複数のＶＨ領域および／またはＶＬ領域に個別に連結される。１つを上回るＶＨおよび／またはＶＬ領域が、この融合タンパク質構成において使用される場合、ＶＨおよびＶＬ領域は、同じ抗体に由来してもよく、または少なくとも２つの異なる抗体に由来してもよい。この融合タンパク質の１つの特定の構成において、ＶＨまたはＶＬ領域は、第１の単量体のアミノ末端に連結され、これが、次いで、そのカルボキシ末端によって、第２の単量体のアミノ末端に連結され、これが、次いで、ＶＬまたはＶＨのアミノ末端に連結される。必要に応じて、追加のＶＨまたはＶＬ領域が、アミノ末端またはカルボキシ末端に連結されてもよく、ここで、ＶＨまたはＶＬ領域は、同じ抗体に由来してもよく、または異なる抗体に由来してもよい。上述の融合タンパク質の代表的な例としては、以下の構成を挙げることができる（例えば、図１０（ｄ）～（ｆ）を参照されたい）。
_ＮＨ２（Ａｂ_１－ＶＨ）_{ＣＯＯＨ－}－（リンカー）－_ＮＨ２（ｍｏｎｏＩＬ１０）_ＣＯＯＨ－（リンカー）－_ＮＨ２（ｍｏｎｏＩＬ１０）_{ＣＯＯＨ－}（リンカー）_－ＮＨ２（Ａｂ_１－ＶＬ）_ＣＯＯＨ

【0103】

上述の融合タンパク質は、ＩＬ－１０の単量体がホモ二量体を形成し、抗体の可変ドメイン（ＶＨおよびＶＬ）が機能性ＡＢＳを形成するのを可能にする様式で、フォールディングすることができるであろう。

【0104】

別の実施形態では、融合タンパク質は、融合タンパク質の反対側の末端に位置するＩＬ－１０の２つの単量体またはバリアントＩＬ－１０の２つの単量体、ならびに少なくとも１つのＶＨおよびＶＬ領域を含み、ここで、ＶＨ領域およびＶＬ領域は、一緒に連結されている。この構成では、ＶＨ領域およびＶＬ領域は、一緒に融合され、それぞれの単量体は、第１の抗体のＶＬ領域またはＶＨ領域のいずれかに個別に連結される。この構成では、ＩＬ－１０単量体またはバリアントＩＬ－１０の単量体は、それぞれ、第１の抗体のＶＨまたはＶＬのいずれかに個別に連結される。上述の融合タンパク質の代表的な例としては、以下の構成を挙げることができる（例えば、図１０（ａ）～（ｃ）を参照されたい）。
ａ）_ＮＨ２（ｍｏｎｏＩＬ１０）_ＣＯＯＨ－（リンカー）_－ＮＨ２（Ａｂ_１－ＶＨ）_{ＣＯＯＨ－}（リンカー）－_ＮＨ２（Ａｂ_１－ＶＬ）_{ＣＯＯＨ－}（リンカー）_－ＮＨ２（ｍｏｎｏＩＬ１０）_ＣＯＯＨ
ｂ）_ＮＨ２（ｍｏｎｏＩＬ１０）_ＣＯＯＨ－（リンカー）_－ＮＨ２（Ａｂ_１－ＶＬ）_{ＣＯＯＨ－}（リンカー）－_ＮＨ２（Ａｂ_１－ＶＨ）_{ＣＯＯＨ－}（リンカー）_－ＮＨ２（ｍｏｎｏＩＬ１０）_ＣＯＯＨ

【0105】

ＩＬ－１０の単量体またはバリアントＩＬ－１０の単量体は、リンカー配列を通じてＶＨまたはＶＬ配列に連結され得る。リンカーは、可変鎖領域（ＶＨまたはＶＬ）のカルボキシ末端を、ＩＬ－１０の単量体または単量体ＩＬ－１０バリアント分子のアミノ末端に連結させる、カルボキシ末端リンカーであってもよい。あるいは、リンカーは、単量体ＩＬ－１０または単量体ＩＬ－１０バリアント分子のカルボキシ末端を、可変鎖領域（ＶＨまたはＶＬ）のアミノ末端に連結させる、アミノ末端リンカーであってもよい。

【0106】

したがって、一形態では、融合タンパク質は、少なくとも２つの異なる抗体に由来する２つの可変領域に連結された単量体ＩＬ－１０分子またはバリアントＩＬ－１０分子を含み、ここで、２つの可変領域は、第１の抗体に由来するＶＨ領域が第２の抗体に由来するＶＬ領域に連結されたもの、または第１の抗体に由来するＶＬが第２の抗体に由来するＶＨに連結されたものとして、構成される。この形態による融合タンパク質は、単量体ＩＬ－１０分子またはＩＬ－１０受容体に対する親和性を増加もしくは減少させる少なくとも１つのアミノ酸置換を含むそのバリアントを含み得る。ＩＬ－１０受容体結合に影響を及ぼすアミノ酸置換は、ヒト、ＣＭＶ、またはＥＢＶ ＩＬ－１０において生じ得る。アミノ酸置換は、好ましくは、ＥＢＶ ＩＬ－１０におけるものであり得、３１位、７５位、または両方におけるアミノ酸置換が含まれ得る。アミノ酸置換は、Ｖ３１ＬもしくはＡ７５Ｉ置換、または両方のうちのいずれか１つまたは複数を含み得る。ＩＬ－１０受容体親和性に影響を及ぼすアミノ酸置換に加えて、ＩＬ－１０バリアントは、ドメイン間角度に影響を及ぼす改変も含み得る。別の実施形態では、融合タンパク質は、（ａ）第１の抗体のＶＨ領域がそのカルボキシ末端において第２の抗体のＶＬ領域のアミノ末端に連結され、続いて、ＩＬ－１０もしくはそのバリアントの単量体のカルボキシ末端に連結されたもの、または（ｂ）ＩＬ－１０分子もしくはそのバリアントがそのカルボキシ末端において第２の抗体のＶＨ領域のアミノ末端に連結され、続いて、第１の抗体のＶＬ領域のアミノ末端に連結されたものから選択される構成を含む。これらの融合タンパク質の構成は、１つの好ましい実施形態では、配列番号２４～２８、２９、および３３～５３の配列を含む。これらの融合タンパク質配列は、複合体を形成することができ、ここで、ＩＬ－１０の単量体またはバリアントＩＬ－１０の単量体は、ホモ二量体を形成することができる。そのような複合体は、ダイアボディ複合体を含み得る、および／またはダイアボディ複合体として構成され得る。

【0107】

別の形態では、融合タンパク質は、第１の融合タンパク質であって、そのアミノ末端に、第１の抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）が第２の抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）に連結され、それがさらにＩＬ－１０の単量体に連結されたものを含む、第１の融合タンパク質と、第２の融合タンパク質であって、そのアミノ末端に、ＩＬ－１０の単量体が第２の抗体のＶＨに連結され、それがさらに第１の抗体のＶＬに連結されたものを含む、第２の融合タンパク質とを含む、イムノコンジュゲートとして形成され得、ここで、第１および第２の抗体のＶＨおよびＶＬは、会合してダイアボディとなり、ＩＬ－１０の単量体は、機能性二量体ＩＬ－１０分子を形成する。別の好ましい実施形態では、イムノコンジュゲート複合体は、第１の融合タンパク質であって、そのアミノ末端に、第１の抗体のＶＨ領域およびそのアミノ末端によって連結された単量体ＩＬ－１０分子を含む、第１の融合タンパク質と、第２の融合タンパク質であって、そのアミノ末端に、ＩＬ－１０の単量体が第１の抗体のＶＬに連結したものを含む、第２の融合タンパク質とを含み、ここで、第１の抗体のＶＨ領域は、第１の抗体のＶＬ領域と会合し、それによって、それぞれのペプチド鎖上の単量体ＩＬ－１０分子が、機能性ＩＬ－１０二量体を形成することが可能となっている。ＩＬ－１０の単量体またはバリアントＩＬ－１０の単量体は、上述のように、ＩＬ－１０受容体結合および／またはドメイン間角度に影響を及ぼすアミノ酸改変を含み得る。別の好ましい実施形態では、イムノコンジュゲート複合体は、第１の融合タンパク質であって、そのアミノ末端に、第１の抗体のＶＨ領域が単量体ＩＬ－１０分子に連結したものを含む、第１の融合タンパク質と、第２の融合タンパク質であって、そのアミノ末端に、ＩＬ－１０の単量体が第１の抗体のＶＬに連結したものを含む、第２の融合タンパク質とを含み、ここで、第１の抗体のＶＨ領域は、第１の抗体のＶＬ領域と会合し、それによって、それぞれのペプチド鎖上の単量体ＩＬ－１０分子が機能性ＩＬ－１０二量体を形成することが可能となっている。なおも別の実施形態では、イムノコンジュゲートは、そのアミノ末端に、第１のＩＬ－１０（またはＩＬ－１０バリアント分子）単量体の単量体が第１の抗体のＶＨ領域に連結され、それが第１の抗体のＶＬ領域に連結され、それが第２のＩＬ－１０（またはＩＬ－１０バリアント分子）の単量体に連結されたものを含み、ここで、２つのＩＬ－１０単量体は、一緒に会合して、ＩＬ－１０の機能性二量体を形成することができる。記載されるＶＨおよびＶＬ領域は、抗原（例えば、受容体、タンパク質、核酸など）を特異的に標的とする抗原結合性部位を形成することができる。したがって、一緒になって、機能性ＩＬ－１０（またはＩＬ－１０バリアント分子）ホモ二量体を形成する融合タンパク質複合体となる、鎖１および鎖２の２つの鎖が存在する。代表的な融合タンパク質鎖（すなわち、鎖１および鎖２）としては、以下のものが挙げられる。

【表1】

【0108】

融合タンパク質は、少なくとも１つの抗体に由来するＶＨおよびＶＬ対を含む。ＶＨおよびＶＬ対は、ＩＬ－１０またはそのバリアントの単量体が、ホモ二量体化して機能性ＩＬ－１０分子になることができるように結合し得る、スキャフォールディングとして機能する。したがって、当業者であれば、融合タンパク質において使用されるＶＨおよびＶＬのスキャフォールディングが、適切なＩＬ－１０またはＩＬ－１０バリアントタンパク質の二量体化に必要とされる所望される物理的属性ならびに／またはＶＨおよびＶＬの標的化能力の維持の要求に基づいて選択され得ることを理解するであろう。同様に、当業者であれば、ＶＨおよびＶＬ対内のＣＤＲ領域もまた、特異的に標的化される融合タンパク質を得るために、他のＣＤＲ領域と置換され得ることも理解するであろう。融合タンパク質が、いずれの特定の抗原も標的とするよう意図されない場合、ＶＨおよびＶＬ対は、抗ＨＩＶおよび／または抗エボラ抗体に由来するＶＨおよびＶＬ対など、いずれの特定の抗原も標的としない（またはｉｎ ｖｉｖｏにおいて存在度の低い抗原である）スキャフォールディングとして選択することができることも、想定される。融合タンパク質は、１～４個の範囲の可変領域を含み得る。可変領域は、同じ抗体に由来してもよく、または少なくとも２つの異なる抗体に由来してもよい。抗体可変鎖は、複数の抗体（例えば、タンパク質、細胞受容体、および／または腫瘍関連抗原などを標的とするもの）から得ることができるか、またはそれに由来し得る。別の実施形態では、可変領域は、様々な疾患（例えば、がん）と関連する抗原または健常な対象の血清においては典型的に見出されないかもしくは見出されることがまれであるものを標的とする抗体から得られ、例えば、ＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２Ｎｅｕ、ＦＧＦＲ、ＧＰＣ３、または他の腫瘍関連抗原、ＭａｄＣａｍ、ＩＣＡＭ、ＶＣＡＭ、または他の炎症関連細胞表面タンパク質、ＨＩＶおよび／またはエボラを対象とする抗体に由来する可変領域である。したがって、一実施形態では、可変領域は、例えば、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＭａｄＣａｍ抗体、抗ＨＩＶ抗体（Chan et al, J. Virol, 2018, 92(18):e006411-19）、抗ＩＣＡＭ抗体、抗ＶＣＡＭ抗体、または抗エボラ抗体（米国出願公開第２０１８／０１８０６１４号、参照によりその全体が組み込まれる、特に、表２、３、および４に記載されるｍＡｂ）から得られるか、またはそれに由来する。別の実施形態では、可変領域は、ＩＬ－１０がその生物学的作用を誘起することを可能にすることができるように、特定の標的領域に対して、サイトカイン、例えば、ＩＬ－１０の濃度を濃縮することができる抗体から得られるか、またはそれに由来する。そのような抗体としては、ある特定の罹患領域において過剰発現されるかもしくは上方制御されている受容体または抗原を標的とするもの、またはある特定の影響を受ける領域において特異的に発現されるものを挙げることができる。例えば、可変領域は、いくつか列挙すると、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＣＤ５２、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＢＴＬＡ、ＬＡＧ３、もしくはＣＴＬＡ４などであるがこれらに限定されない様々な免疫チェックポイント標的、ＣＤ２０、ＣＤ４７、ＧＤ－２、ＨＥＲ２、ＥｐＣＡＭ、ＩＣＡＭ（ＩＣＡＭ－１、－２、－３、－４、－５）、ＶＣＡＭ、ＦＡＰα、５Ｔ４、Ｔｒｏｐ２、ＥＤＢ－ＦＮ、ＴＧＦβ Ｔｒａｐ、ＭａｄＣａｍ、β７インテグリンサブユニット、α４β７インテグリン、α４インテグリン、ＳＲ－Ａ１、ＳＲ－Ａ３、ＳＲ－Ａ４、ＳＲ－Ａ５、ＳＲ－Ａ６、ＳＲ－Ｂ、ｄＳＲ－Ｃ１、ＳＲ－Ｄ１、ＳＲ－Ｅ１、ＳＲ－Ｆ１、ＳＲ－Ｆ２、ＳＲ－Ｇ、ＳＲ－Ｈ１、ＳＲ－Ｈ２、ＳＲ－Ｉ１、およびＳＲ－Ｊ１に特異的な抗体から得ることができる。ＩＬ－１０（例えば、ヒト、ＣＭＶ、もしくはＥＢＶ）またはバリアントＩＬ－１０分子（本明細書に記載される）の単量体は、ＩＬ－１０またはバリアントＩＬ－１０分子が、互いに二量体化することができるように、可変領域（ＶＨまたはＶＬ）のアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかにコンジュゲートされる。

【0109】

融合タンパク質または融合タンパク質複合体はまた、抗原標的化機能も有し得る。融合タンパク質または融合タンパク質複合体は、一緒に会合して抗原結合性部位またはＡＢＳを形成することができる、ＶＨおよびＶＬ領域を含むであろう。一部の構成において、ＩＬ－１０またはＩＬ－１０バリアント分子またはその単量体は、抗原結合性部位を含む末端に共有結合的に連結されるであろう。これらの標的化融合タンパク質は、融合タンパク質が、抗原を標的とする能力を保持する、ならびにＩＬ－１０またはＩＬ－１０バリアント分子の機能性ホモ二量体を有するように、少なくとも１つの機能性可変領域または対合したＶＨおよびＶＬを、融合タンパク質の一方の末端に含み得る（図９（ａ）～（ｆ）および１０（ａ）～（ｆ）を参照されたい）。可変領域は、対象における抗原性を低減する１つまたは複数のアミノ酸を変更することによって（例えば、付加、欠失（ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ）、または置換によって）さらに改変され得る。ＶＨおよびＶＬ対は、複数の抗体について得られたＣＤＲ領域をグラフトすることができるスキャフォールディングを形成する。そのような抗体ＣＤＲ領域としては、公知および上述の抗体が挙げられる。例えば、任意の抗体に由来するＣＤＲ領域は、配列番号３７、４４、もしくは４５に記載されるものなどのＶＨおよびＶＬ対、または配列番号４６および４７、４８および４９、もしくは５０および５１に記載されるものなどの融合タンパク質複合体を形成することができる融合タンパク質に、グラフトされ得る。上述のＶＨおよびＶＬスキャフォールディングにおけるＣＤＲ領域としては、ＣＤＲグラフト／挿入に利用可能な以下のアミノ酸位置番号が挙げられる。

【表2】

【0110】

別の態様では、上述の融合タンパク質は、以下の一般式のうちの１つによって表すことができ、
１）ＩＬ１０－Ｌ^１－Ｘ^１－Ｌ^１－Ｘ^２－Ｌ^１－ＩＬ１０（式Ｉ）、
２）（Ｚ）_ｎ－Ｘ^１－Ｌ^２－Ｙ^２－Ｌ^１－ＩＬ１０（式ＩＩ）、
３）ＩＬ１０－Ｌ^１－Ｙ^１－Ｌ^２－Ｘ^２－（Ｚ）_ｎ（式ＩＩＩ）、
４）Ｘ^１－Ｌ^２－Ｘ^２－Ｌ^１－ＩＬ１０（式ＩＶ）、
５）ＩＬ１０－Ｌ^１－Ｘ^１－Ｌ^２－Ｘ^２（式Ｖ）、
６）Ｘ^１－Ｌ^１－ＩＬ１０（式ＶＩ）、および
７）ＩＬ１０－Ｌ^１－Ｘ^２（式ＶＩＩ）
式中、
「ＩＬ－１０」は、ヒトＩｌ－１０（配列番号１）、ＥＢＶ ＩＬ－１０（配列番号３）、ＤＶ０５（配列番号１４、１８、もしくは５５）、ＤＶ０６（配列番号１５、１９、もしくは５７）、またはＤＶ０７（配列番号１６、２０、もしくは５９）であり、好ましい実施形態では、「ＩＬ－１０」は、ＤＶ０５、ＤＶ０６、またはＤＶ０７からなり、より好ましくは、「ＩＬ－１０」は、配列番号５５、５７、または５９からなり、
「Ｌ^１」は、配列番号３１または５４のリンカーであり、
「Ｌ^２」は、配列番号３０のリンカーであり、
「Ｘ^１」は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）；ＣＤ５２；ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＢＴＬＡ、ＬＡＧ３、もしくはＣＴＬＡ４などであるがこれらに限定されない様々な免疫チェックポイント標的；ＣＤ２０；ＣＤ４７；ＧＤ－２；ＨＥＲ２；ＥｐＣＡＭ；ＩＣＡＭ（ＩＣＡＭ－１、－２、－３、－４、－５）、ＶＣＡＭ、ＦＡＰα；５Ｔ４；Ｔｒｏｐ２；ＥＤＢ－ＦＮ；ＴＧＦβ Ｔｒａｐ；ＭａｄＣａｍ、β７インテグリンサブユニット；α４β７インテグリン；α４インテグリンＳＲ－Ａ１；ＳＲ－Ａ３；ＳＲ－Ａ４；ＳＲ－Ａ５；ＳＲ－Ａ６；ＳＲ－Ｂ；ｄＳＲ－Ｃ１；ＳＲ－Ｄ１；ＳＲ－Ｅ１；ＳＲ－Ｆ１；ＳＲ－Ｆ２；ＳＲ－Ｇ；ＳＲ－Ｈ１；ＳＲ－Ｈ２；ＳＲ－Ｉ１；ＳＲ－Ｊ１；ＨＩＶ、またはエボラに特異的な第１の抗体から得られたＶＨ領域であり、
「Ｘ^２」は、Ｘ_１と同じ抗体から得られたＶＬ領域であり、
「Ｙ^１」は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）；ＣＤ５２；ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＢＴＬＡ、ＬＡＧ３、もしくはＣＴＬＡ４などであるがこれらに限定されない様々な免疫チェックポイント標的；ＣＤ２０；ＣＤ４７；ＧＤ－２；ＨＥＲ２；ＥｐＣＡＭ；ＩＣＡＭ（ＩＣＡＭ－１、－２、－３、－４、－５）、ＶＣＡＭ、ＦＡＰα；５Ｔ４；Ｔｒｏｐ２；ＥＤＢ－ＦＮ；ＴＧＦβ Ｔｒａｐ；ＭａｄＣａｍ、β７インテグリンサブユニット；α４β７インテグリン；α４インテグリンＳＲ－Ａ１；ＳＲ－Ａ３；ＳＲ－Ａ４；ＳＲ－Ａ５；ＳＲ－Ａ６；ＳＲ－Ｂ；ｄＳＲ－Ｃ１；ＳＲ－Ｄ１；ＳＲ－Ｅ１；ＳＲ－Ｆ１；ＳＲ－Ｆ２；ＳＲ－Ｇ；ＳＲ－Ｈ１；ＳＲ－Ｈ２；ＳＲ－Ｉ１；ＳＲ－Ｊ１；ＨＩＶ、またはエボラに特異的な第２の抗体から得られたＶＨ領域であり、
「Ｙ^２」は、Ｙ_１と同じ抗体から得られたＶＬ領域であり、
ＸおよびＹは、同じかまたは異なる抗体から得られ、
「Ｚ」は、ＩＬ－６、ＩＬ－４、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－５、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ＿１５、ＩＬ－２６、ＩＬ－２７、ＩＬ－２８、ＩＬ－２９、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、インターフェロン－α、－β、－γ、ＴＧＦ－β、または腫瘍壊死因子－α、－β、塩基性ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＬ－４、ＩＬ－１１、またはＩＬ－１３から選択されるサイトカインであり、
「ｎ」は、０～２から選択される整数である。

【0111】

ある実施形態では、上記の式Ｉ～ＶＩＩの置換基は、好ましくは、以下から選択される：ＩＬ－１０は、好ましくは、ＤＶ０５、ＤＶ０６、もしくはＤＶ０７からなるか、より好ましくは、ＩＬ－１０は、ＤＶ０５、ＤＶ０６、もしくはＤＶ０７からなるか、またはもっとも好ましくは、ＩＬ－１０は、配列番号５５、５７、もしくは５９からなり、Ｘ_１およびＸ２は、好ましくは、抗ＥＧＦＲ、抗ＰＤＧＦＲ、抗ＦＧＦＲ、抗ＶＥＧＦ、抗Ｈｅｒ２Ｎｅｕ、抗ＧＰＣ３、抗ＭＡｄＣＡＭ、抗ＩＣＡＭ－１、－２、－３、－４、抗ＶＣＡＭ、抗ＨＩＶ、または抗エボラであり、Ｙ１およびＹ２は、好ましくは、抗ＥＧＦＲ、抗ＭＡｄＣＡＭ、抗ＩＣＡＭ－１、－２、－３、－４、抗ＶＣＡＭ、抗ＨＩＶ、または抗エボラであり、Ｚは、ＩＬ－２、ＩＬ－７、またはＩＬ－１５から選択され、ｎは、１である。もっとも好ましい実施形態では、融合タンパク質は、配列番号３３～５３、６１、６３、６５、または６７のうちのいずれかである。当業者であれば、ヒスチジンタグの存在が、融合タンパク質の精製プロセスにおいて使用され、インタクトなまま残され得るかまたは最終産物から除去され得ることを理解するであろう。当業者であれば、上述の抗体のうちのいずれかのＶＨおよびＶＬフレームワーク領域が、他の相補性決定領域（ＣＤＲ）領域と置換され得ることも理解するであろう。例えば、ＶＨおよびＶＬ領域が、抗エボラ抗体に由来する場合、６つのＣＤＲ領域（すなわち、ＶＨおよびＶＬの両方のＣＤＲ１～３）は、抗ＥＧＦＲ抗体（例えば、セツキシマブ）の６つのＣＤＲ領域で置換されてもよい。したがって、１つの好ましい実施形態では、融合タンパク質は、配列番号３３～３４、５２、または５３である。別の好ましい実施形態では、融合タンパク質は、配列番号３７、４４、４５、４６～４７、４８～４９、または５０～５１によって表されるスキャフォールディングを有するものであり、そこに、任意の抗体に由来する任意の６つのＣＤＲ領域が、グラフトされ得る。他の好ましい実施形態では、抗エボラ抗体のＶＨおよびＶＬ領域に由来するＣＤＲ領域は、抗ＭＡｄＣＡＭ、抗ＶＣＡＭ、または抗ＩＣＡＭ－１、－２、－３、－４抗体に由来するＣＤＲ領域とともにグラフトされ得、ここで、好ましい実施形態では、ＣＤＲ領域は、配列番号３７の融合タンパク質にグラフトされ得る。上述の式ＩＩおよびＩＩＩ、式ＩＶおよびＶ、ならびに式ＶＩおよびＶＩＩに記載される融合タンパク質は、一緒に会合してＩＬ－１０（またはそのバリアント）の生物学的に活性なホモ二量体を形成するように設計される。上述の融合タンパク質は、選択されるＶＨおよびＶＬ領域の対、ならびに／またはＶＨおよびＶＬにグラフトされるＣＤＲ領域に応じて、非標的化または標的化のいずれかとなるように設計される。「非標的化」という用語は、抗原が存在しないか、または抗原結合性部位（ＡＢＳ）が無効もしくは改変されてＡＢＳ機能性が排除されているため、ｉｎ ｖｉｖｏに位置する特定の抗原を標的とすることができないＶＨおよびＶＬ領域を説明することを意味する。

【0112】

上述の融合タンパク質は、さらに、補助タンパク質／分子にコンジュゲートされていてもよい。本明細書で使用される補助タンパク質は、ＩＬ－１０単量体またはバリアントＩＬ－１０単量体分子のものとは反対側に連結されるように、融合タンパク質または融合タンパク質複合体にコンジュゲートされる、タンパク質を指す。補助タンパク質の付加により、ＩＬ－１０またはＩＬ－１０バリアント分子の機能性および補助タンパク質の機能性の両方を組み込む多機能性分子が効果的に作製される。補助タンパク質（例えば、サイトカインＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５など）の結合は、例えば、ＶＨ領域のＮ末端において、ＶＨおよびＶＬスキャフォールディングを含む融合タンパク質に結合され得る。例えば、腫瘍を処置するための融合タンパク質または融合タンパク質複合体に適用される場合、補助タンパク質としては、ＩＬ－１０、ＩＬ－１０バリアント分子、ＩＬ－６、ＩＬ－４、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－５、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１５、ＩＬ－２６、ＩＬ－２７、ＩＬ－２８、ＩＬ－２９、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、インターフェロン－α、－β、－γ、ＴＧＦ－β、もしくは腫瘍壊死因子－α、－β、塩基性ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＬ－４、ＩＬ－１１、もしくはＩＬ－１３、またはこれらの任意の組合せが挙げられるが、これらに限定されない。炎症性疾患を処置するための融合タンパク質または融合タンパク質複合体に適用される場合、補助タンパク質としては、ＴＧＦβが挙げられるが、これに限定されない。自己免疫疾患（脂肪性肝臓疾患などであるがこれに限定されない）を処置するための融合タンパク質または融合タンパク質複合体に適用される場合、補助分子としては、オベチコール酸（obticholic acid）、アラムコール、エラフィブラノール、リラグルチド、セロンセルチブ、またはシムツズマブ（ｓｉｍｔｕｚｕｍａｂ）が挙げられるが、これらに限定されない。上記に定義される補助タンパク質は、上述の式Ｉ～Ｖを使用して記述される場合、スキャフォールディングのＶＨ部分のＮ末端側において、置換基Ｘ１またはＹ１に結合され得る。

【0113】

上述の融合タンパク質はまた、製造プロセス中の融合タンパク質の回収または精製を補助する追加のアミノ酸配列も含み得る。これらには、プロテインＡ、アルブミン結合性タンパク質、アルカリホスファターゼ、ＦＬＡＧエピトープ、ガラクトース結合性タンパク質、ヒスチジンタグ、および当該技術分野において周知である任意の他のタグなどであるがこれらに限定されない、様々な配列改変または親和性タグが含まれてもよい。例えば、Kimple et al (Curr. Protoc. Protein Sci., 2013, 73:Unit 9.9, Table 9.91、参照によりその全体が組み込まれる）を参照されたい。一態様では、親和性タグは、ＨＨＨＨＨＨ（配列番号３２）のアミノ酸配列を有するヒスチジンタグである。ヒスチジンタグは、最終産物から除去されてもよく、またはインタクトなまま残されてもよい。別の実施形態では、親和性タグは、配列番号３４または４４～５３に記載されるものなど、融合タンパク質（例えば、本明細書に記載される融合タンパク質のＶＨ領域）に組み込まれるプロテインＡ改変である。当業者であれば、本明細書に記載される任意の融合タンパク質配列が、当該技術分野において説明されている抗体フレームワーク領域内にアミノ酸点置換を挿入することによって、プロテインＡ改変を組み込むように改変することができることを理解するであろう。

【0114】

なおも別の実施形態では、上述の様々な融合タンパク質は、がんを処置する方法、ＩＢＤまたはクローン病、自己免疫疾患、ＮＡＦＬＤ、またはＮＡＳＨを処置または予防する方法において、使用することができる。
ＩＬ－１０バリアントポリヌクレオチド

【0115】

上述のバリアントＩＬ－１０分子ならびに様々な融合タンパク質および／または免疫サイトカインをコードするポリヌクレオチド配列もまた、本出願の範囲内に含まれる。本出願のバリアントＩＬ－１０分子における鍵となるＩＬ－１０受容体結合領域および／またはドメイン間角度のための領域の局在化の際、アミノ酸配列への所望される改変を実行するために必要なＤＮＡ改変は、当業者の技能の範囲内である。そのような改変は、従来的な組換えＤＮＡ技法および方法を用いるであろう。例えば、特定のアミノ酸配列の付加または置換を、合成オリゴヌクレオチドを用いる部位指向性突然変異生成方法を使用して、核酸（ＤＮＡ）レベルで、ＩＬ－１０配列に導入することができ、その方法もまた、当該技術分野において周知である。

【0116】

別の実施形態では、バリアントＩＬ－１０配列をコードするポリヌクレオチドは、分子生物学の標準的な技法を使用して作製することができる。例えば、上述のバリアント分子をコードするポリヌクレオチド配列は、組換え方法を使用して、例えば、その遺伝子を発現する細胞から得られたｃＤＮＡおよびゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって、またはその遺伝子を、それを含むことが判明しているベクターから誘導することによって、得ることができる。目的の遺伝子はまた、公知の配列に基づいて、クローニングではなく合成により産生させることもできる。分子は、特定の配列に適したコドンを用いて設計され得る。次いで、完全な配列は、標準的な方法によって調製されるオーバーラップするオリゴヌクレオチドからアセンブルされ、完全なコーディング配列にアセンブルされる。例えば、Edge, Nature (1981) 292:756、Nambair et al., Science (1984) 223:1299、およびJay et al., J. Biol. Chem. (1984) 259:6311を参照されたい。

【0117】

一実施形態では、ＩＬ－１０バリアント分子またはその融合タンパク質は、配列番号９～２９、３３～５３、５５、５７、または５９のうちのいずれかをコードする核酸分子である。別の実施形態では、ＩＬ－１０バリアント分子は、それぞれ、配列番号５６、５８、または６０のＤＶ０５、ＤＶ０６、またはＤＶ０７である。ＤＶ０５、ＤＶ０６、またはＤＶ０７をコードする核酸分子は、ＩＬ－１０バリアント分子の機能性を変化させない挿入、欠失、または置換（例えば、縮重コドン）を含み得る。本明細書に記載されるＩＬ－１０バリアントおよび融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、遺伝子コードの縮重に起因して、配列番号１、３、５、７、９～２９、３３～５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、または６７の配列とは異なり得、前述の配列に対して７０～９９％、好ましくは７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相同であり得る。配列番号１、３、５、７、９～２９、３３～５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、または６７のＩＬ－１０バリアントおよび融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列はまた、少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、欠失、または置換に起因して、７０％～９９％、好ましくは７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相同であり得る。少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、付加、欠失、または置換に起因して、配列番号２、４、６、８、５６、５８、６０、６２、６４、６６、および６８に対して７０～９９％、好ましくは７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列相同性を有するヌクレオチド配列もまた、本出願において想定される。さらに、本明細書に記載されるＩＬ－１０バリアントおよび融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、例えば、タンパク質の発現、産生、または分泌を補助する周知の配列をさらに含み得る。そのような配列としては、例えば、リーダー配列、シグナルペプチド、および／または翻訳開始部位／配列（例えば、コザックコンセンサス配列）を挙げることができる。本明細書に記載されるヌクレオチド配列はまた、様々な発現系／ベクターへの挿入を可能にする多くの制限酵素部位のうちの１つも含み得る。

【0118】

別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、所望されるＩＬ－１０配列を含むベクターに保持されるか、または当該技術分野において公知のオリゴヌクレオチド合成技法、例えば、部位指向性突然変異生成およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技法を使用して、人工的に合成される。例えば、Sambrook（上記）を参照されたい。別の実施形態では、バリアントＩＬ－１０分子をコードするヌクレオチド配列は、自動化されたポリヌクレオチド合成装置において産生される相補的なオーバーラップする合成オリゴヌクレオチドをアニーリングし、続いてＰＣＲによりライゲーションおよびライゲーションされたヌクレオチド配列の増幅を行うプロセスを通じて、得られる。例えば、Jayaraman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991) 88:4084-4088を参照されたい。加えて、オリゴヌクレオチド指向性合成（Jones et al., Nature (1986) 54:75-82）、既存のヌクレオチド領域のオリゴヌクレオチド指向性突然変異生成（Riechmann et al., Nature (1988) 332:323-327およびVerhoeyen et al., Science (1988) 239:1534-1536）、ならびにＴ４ ＤＮＡポリメラーゼを使用したギャップ付きオリゴヌクレオチドの酵素的充填（Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1989) 86:10029-10033）を使用して、主題の方法において使用するための分子を得ることができる。

【0119】

様々な好適な発現ベクターを使用することができ、これらは、当業者に周知であり、バリアントＩＬ－１０分子および融合タンパク質の発現および導入に使用することができる。これらのベクターとしては、例えば、ｐＵＣ型ベクター、ｐＢＲ型ベクター、ｐＢＩ型ベクター、ｐＧＡ型、ｐＢｉｎｌ９、ｐＢＩ１２１、ｐＧｒｅｅｎシリーズ、ｐＣＡＭＢＲＩＡシリーズ、ｐＰＺＰシリーズ、ｐＰＣＶ００１、ｐＧＡ４８２、ｐＣＬＤ０４５４１、ｐＢＩＢＡＣシリーズ、ｐＹＬＴＡＣシリーズ、ｐＳＢ１１、ｐＳＢ１、ｐＧＰＴＶシリーズ、およびウイルスベクターなどが挙げられこれらを使用することができる。

【0120】

ＩＬ－１０バリアント分子を保持するベクターはまた、ベクター機能性に必要とされる他のベクター構成要素も含み得る。例えば、ベクターは、シグナル配列、タグ配列、プロテアーゼ特定配列、選択マーカー、ならびにバリアントＩＬ－１０分子の適正な複製および発現に必要とされる他の配列制御配列、例えば、プロモーターを含み得る。ベクターにおいて用いられる特定のプロモーターは、それらが、様々な宿主細胞型においてバリアントＩＬ－１０分子の発現を誘導することができる限り、特に制限されない。同様に、タグプロモーターの種類は、タグ配列が、発現されるバリアントＩＬ－１０分子のより単純または容易な精製を容易にするのに役立つ限り、制限されない。これらとしては、例えば、６－ヒスチジン、ＧＳＴ、ＭＢＰ、ＨＡＴ、ＨＮ、Ｓ、ＴＦ、Ｔｒｘ、Ｎｕｓ、ビオチン、ＦＬＡＧ、ｍｙｃ、ＲＣＦＰ、ＧＦＰなどを挙げることができ、これらを使用することができる。プロテアーゼ認識配列は、特に制限されず、例えば、第Ｘａ因子、トロンビン、ＨＲＶ、３Ｃプロテアーゼなどの認識配列を使用することができる。選択されるマーカーは、これらが、形質転換されたイネ細胞を検出することができる限り、特に制限されず、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子などを使用することができる。

【0121】

結果として得られる所望されるＩＬ－１０バリアントまたは融合タンパク質を有するＤＮＡ構築物は、次いで、遺伝子療法において直接的に使用することができるか、または組換えＩＬ－１０バリアントもしくは融合タンパク質を産生させるために使用することができる。一実施形態では、本出願のバリアントＩＬ－１０分子または融合タンパク質は、突然変異体ＩＬ－１０タンパク質の直接的な投与、および突然変異体ＩＬ－１０タンパク質をコードするベクターを用いた遺伝子療法を含む、当該技術分野において公知の任意の方法によって送達することができる。遺伝子療法は、プラスミドＤＮＡまたはウイルスベクター、例えば、アデノ随伴ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどを使用して達成することができる。一部の実施形態では、本出願のウイルスベクターは、ウイルス粒子として投与され、他の実施形態では、それらは、プラスミドとして（例えば、「ネイキッド」ＤＮＡとして）投与される。

【0122】

ヌクレオチド配列の送達のための他の方法としては、当該技術分野において既知であるものが挙げられる。これらは、細胞透過性ペプチド、疎水性部分、静電複合体、リポソーム、リガンド、リポソームナノ粒子、リポタンパク質（好ましくは、ＨＤＬもしくはＬＤＬ）、葉酸標的化リポソーム、抗体（例えば、葉酸受容体、トランスフェリン受容体）、標的化ペプチドによる、またはアプタマーによる、ＩＬ－１０またはＩＬ－１０バリアント分子をコードする、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、またはそれらのバリアントなどであるがこれらに限定されないヌクレオチド配列の送達を含むであろう。ＩＬ－１０バリアント分子をコードするヌクレオチド配列は、直接的な注射、注入、パッチ、包帯、ミストもしくはエアロゾルによって、または薄膜送達によって、対象に送達され得る。ヌクレオチド（またはタンパク質）は、サイトカイン刺激の標的化送達に所望される任意の領域に指向され得る。これらとしては、例えば、肺、消化管、皮膚、肝臓、頭蓋内注射を介した脳、超音波よりガイドされる注射を介した深層に位置する転移腫瘍部位が挙げられるであろう。
ＩＬ－１０バリアントの試験

【0123】

一実施形態では、バリアントＩＬ－１０分子またはその融合タンパク質は、マクロファージによる炎症性サイトカインの分泌を抑制するが、Ｔ細胞を活性化しない、ＩＬ－１０ホモ二量体配列を使用してこれまでに生成されていなかった新規な機能に関して、スクリーニングされるであろう。好ましい実施形態のうちの１つにおいて、バリアントＩＬ－１０分子またはその融合タンパク質は、抗炎症応答を有するが、Ｔ細胞を刺激する能力が欠如した、ＥＢＶ－ＩＬ１０骨格に基づくであろう。これらのバリアントＥＢＶ－ＩＬ１０分子またはその融合タンパク質は、受容体結合ドメイン、ならびにこれまでに探究されていなかった、ＩＬ－１０ホモ二量体間の角度を制限するかまたは拡げる一次、二次、および三次構造を変更する連結領域に対する改変を含むであろう。別の実施形態では、連結領域またはドメイン間角度の形成に関与する領域に対する改変を含むＩＬ－１０バリアント分子は、増強されたＣＤ８＋ Ｔ細胞機能を有するであろう。別の実施形態では、連結領域またはドメイン間角度の形成に関与する領域に対する改変を含むＩＬ－１０バリアント分子またはその融合タンパク質は、抑制された骨髄系機能を有するが、増強されたクッパー細胞機能を有するであろう。

【0124】

バリアントＩＬ－１０分子またはその融合タンパク質が構築され発現された後、当業者であれば、ＩＬ－１０バリアント分子またはその融合タンパク質に対してスクリーニングアッセイを行って、分子が、ＩＬ－１０受容体結合領域および／またはドメイン間角度に対する改変によって付与される所望される生物学的機能を有するかどうかを判定することができるであろう。所望される生物学的機能に関して試験するための複数のスクリーニングアッセイが、当業者に公知であり、入手可能である。一実施形態では、所望される生物学的機能としては、抗炎症性応答の低減、Ｔ細胞刺激の低減、Ｔ細胞機能の増強、クッパー細胞機能性の増強、およびマスト細胞脱顆粒化の低減が挙げられるが、これらに限定されない。

【0125】

例えば、ＩＬ－１０への曝露は、Ｔ細胞受容体刺激の際により多くのＩＦＮγを生成し分泌するように、Ｔ細胞を刺激することが知られている。同時に、ＩＬ－１０曝露は、ＬＰＳに応答して単球／マクロファージから分泌されるＴＮＦα、ＩＬ－６、および他の炎症促進性サイトカインの分泌を予防する。ＩＬ－１０はまた、ＦｏｘＰ３^＋ＣＤ４^＋ Ｔ_ｒｅｇの増殖を抑制する。一実施形態では、単球／マクロファージの抑制を最大化するが、刺激性および抑制性の両方の応答を含むＴ細胞作用が欠如しているＩＬ－１０バリアント分子またはその融合タンパク質が、陽性選択されるであろう。一実施形態では、増加した抗炎症性作用を有するＩＬ－１０バリアント分子またはその融合タンパク質に関するスクリーニングは、自己免疫疾患、抗炎症性疾患、または両方の処置のために陽性選択されるであろう。別の実施形態では、クッパー細胞の排除を増強し、Ｔ_ｒｅｇ抑制が欠如した、ＩＬ－１０バリアント分子またはその融合タンパク質もまた、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）および／または非アルコール性脂肪性肝臓疾患（ＮＡＦＬＤ）の処置のための開発に選択されるであろう。なおも別の実施形態では、刺激性および抑制性の両方の応答を含む、Ｔ細胞生物学を最大化させ、増強されたクッパー細胞排除も有する、ＩＬ－１０バリアントが、がんの処置のための開発に選択されるであろう。

【0126】

文献は、免疫系の細胞、例えば、Ｔ細胞、単球／マクロファージ、クッパー細胞、Ｔ_ｒｅｇ細胞、およびマスト細胞などに対するサイトカインの作用をアッセイすることに関する記述で溢れている。本出願は、これらのアッセイ系を、本出願のバリアントＩＬ－１０分子またはその融合タンパク質を接触させることにより類似のアッセイを用いて生物学的応答を試験するために適用する。

【0127】

Ｔ細胞応答を誘起することの有効性をアッセイするための様々な方法が、先行技術分野において説明されている。これらの方法のうちのいずれか１つを、本明細書に記載されるバリアントＩＬ－１０分子を試験するのに適用することができる。例えば、Chan et al. (2015)は、バリアントＩＬ－１０分子に適用することができる１つのそのような方法について記載している。ＣＤ８^＋ Ｔ細胞を、抗ＣＤ８マイクロビーズを使用して末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離する。単離されたＣＤ８^＋ Ｔ細胞を、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体を使用して活性化する。例えば、活性化は、約３日間の期間にわたって、少なくとも約５～２０マイクログラム／ｍＬの抗ＣＤ３抗体および少なくとも約１～５マイクログラム／ｍＬの抗ＣＤ２８抗体でコーティングしたプレートを使用して生じ得る。活性化の後に、Ｔ細胞を回収し、播種し、約３～５日間の期間、ＥＢＶ－ＩＬ１０バリアントまたはその融合タンパク質で処置する。市販入手可能なＰＥＧ化組換えヒトＩＬ－１０またはＥＢＶ－ＩＬ１０を、対照として使用することができる。ＥＢＶ－ＩＬ１０バリアントでの処置の後に、Ｔ細胞を、可溶性抗ＣＤ３で処置した。抗ＣＤ３での処置の後に、細胞培養培地を回収し、ＥＬＩＳＡによって、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）の分泌に関してアッセイする。

【0128】

サイトカインによる単球／マクロファージ刺激をアッセイするための様々な方法が、先行技術分野において説明されている。これらの方法のうちのいずれか１つを、本明細書に記載されるバリアントＩＬ－１０分子を試験するのに適用することができる。例えば、Conway et al. (2017)は、バリアントＩＬ－１０分子に適用することができる１つのそのような方法について記載している。ヒト単球を、Ｆｉｃｏｌｌ勾配を使用して、新しいドナーの血液のバフィーコートから単離した後、Ｐｅｒｃｏｌｌにおける高浸透圧密度遠心分離を行う。５％ヒト血清および１％ Ｌ－グルタミンを補充したＲＰＭＩにおける３０分間の培養の後、単球は、接着性となり、これをＳＭＥＭ Ｓｐｉｎｎｅｒ培地で洗浄して、混入しているリンパ球を除去する。溶液および材料を試験して、ＬＰＳの不在を確認した。４日間の培養の後、単球／マクロファージを、１０ｎｇ／ｍｌ ＬＰＳおよび異なる濃度のバリアントＩＬ－１０分子と接触させ、それとともに少なくとも２４時間インキュベートする。培養上清を採取し、ＴＮＦ－αおよびＩＬ－１β濃度を、ＥＬＩＳＡによって判定する。

【0129】

サイトカインに対するクッパー細胞応答をアッセイするための様々な方法が、先行技術分野において説明されている。これらの方法のうちのいずれか１つを、本明細書に記載されるバリアントＩＬ－１０分子を試験するのに適用することができる。例えば、Chan et al (2016)は、バリアントＩＬ－１０分子に適用することができる１つのそのような方法について記載している。クッパー細胞を、２４ウェルまたは９６ウェルのプレートに播種し、肝細胞インキュベーション培地（フェノールレッド不含ＲＰＭＩ、ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ、Ｃｅｌｌ Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ Ｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））において一晩インキュベートする。細胞を洗浄し、バリアントＩＬ－１０分子に２４時間曝露した。細胞を１回洗浄し、１５～２０μｌのＤｉＩ－ＬＤＬ、ＤｉＩ－ＶＬＤＬ、ＤｉＩ－ＯｘＬＤＬ、またはＤｉＩ－ＡｃＬＤＬ、２μｌ ＤＭＳＯ、１５μｌサイトカラシンＤに曝露し、取り込みを４時間後に測定する。すべての細胞を、１倍ＰＢＳで１回洗浄し、１１０μｌの細胞溶解緩衝液で溶解させる。４５μｌの細胞ライセートを、透明底で黒色壁のプレートに移し、蛍光を５７５ｎｍで読み取る。

【0130】

サイトカインを使用して制御性Ｔ細胞応答を刺激することの有効性をアッセイするための様々な方法が、先行技術分野において説明されている。これらの方法のうちのいずれか１つを、本明細書に記載されるバリアントＩＬ－１０分子を試験するのに適用することができる。例えば、Chan et al (2016)は、バリアントＩＬ－１０分子に適用することができる１つのそのような方法について記載している。ＣＤ４^＋ Ｔ細胞を、ＣＤ４^＋マイクロビーズで単離し、様々な濃度のバリアントＩＬ－１０分子、ならびに２マイクログラム／ｍＬの固定化抗ＣＤ３および１ｍｇ／ｍＬの抗ＣＤ２８を含有するＡＩＭＶ培地において、５～６日間培養する。細胞を、フローサイトメトリー分析によってＦｏｘＰ３発現に関して分析して、ＴＧＦ－βまたはＩＬ－２が、ＦＯＸ Ｐ３^＋ ＣＤ４^＋制御性Ｔ細胞において誘導されるかどうかを判定する。

【0131】

サイトカイン刺激に応答してマスト細胞を増殖させることの有効性をアッセイするための様々な方法が、先行技術分野において説明されている。マウスマスト細胞系ＭＣ／９は、ＩＬ－１０分子の放出試験を作製するために使用される一般的な細胞系である。具体的には、ＩＬ－１０およびＩＬ－１０バリアント分子は、マスト細胞の用量滴定可能な増殖を誘導する。対照的に、ＩＬ－１０は、マスト細胞によるＦｃ発現を阻害し、ＩＬ－１０が、これらの細胞に対して刺激性および抑制性の両方の作用を発揮することを示唆する。これらの方法のうちのいずれか１つを、本明細書に記載されるバリアントＩＬ－１０分子を試験するのに適用することができる。例えば、Thompson-Snipes et al (1991)は、バリアントＩＬ－１０分子に適用することができる１つのそのような方法について記載している。ＭＣ／９マスト細胞を、１ｍｌのＲＰＭＩ １６４０、１０％ ＦＣＳ、５０ｍＭ ２－ＭＥ、および様々な濃度のバリアントサイトカインを含有する平底２４ウェルプレートに播種する。３日間培養した後、細胞計数器を使用して細胞を計数して、マスト細胞増殖に対するバリアントＩＬ－１０分子の影響を判定する。

【0132】

ＩＬ－１０は、マスト細胞によるＩｇＥ受容体、ＦｃεＲＩの発現、およびＩｇＥに媒介されるサイトカイン産生の阻害において役割を果たすことが知られている。したがって、マスト細胞に対するＩＬ－１０の影響を試験するための方法は、先行技術分野において説明されている。これらの方法は、本明細書に記載されるＩＬ－１０バリアント分子を試験するのに適用することができる。例えば、Kennedy Norton et al (2008)は、１つのそのような方法について記載している。ヒトマスト細胞を、ドナーの皮膚試料から単離し、ＩＬ－１０の存在下または不在下において、幹細胞因子（ＳＣＦ）を含有する培地において培養した。ＦｃεＲＩ発現は、抗ＦｃεＲＩ特異的抗体、続いてＦＩＴＣ標識した抗マウスＦ（ａｂ’）_２を使用して、フローサイトメトリーによって判定した。
ＩＬ－１０バリアント分子を含む組成物および製剤

【0133】

本出願のＩＬ－１０バリアント分子または融合タンパク質はまた、治療有効量のバリアントＩＬ－１０分子と、薬学的担体および／または薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物において製剤化することができる。医薬組成物は、広く使用されている緩衝剤、賦形剤、保存剤、安定化剤を用いて製剤化することができる。医薬組成物は、所望される治療結果を提供するのに十分な治療有効量で、患者に投与するために製剤化される。好ましくは、そのような量は、最小限の負の副作用を有する。一実施形態では、投与されるバリアントＩＬ－１０分子またはその融合タンパク質の量は、炎症性疾患または状態を処置するのに十分である。別の実施形態では、投与されるバリアントＩＬ－１０分子またはその融合タンパク質の量は、がんを処置するのに十分である。投与される量は、患者ごとに変動し得、対象または患者の疾患または状態、患者の全般的な健康状態、投与の方法、副作用の重症度などを考慮することによって判定することが必要であろう。好ましい実施形態では、医薬組成物は、受容体結合ドメインおよび／またはＩＬ－１０のドメイン間角度に対する一方または両方の改変を含む、バリアントＩＬ－１０分子またはその融合タンパク質を含むであろう。別の実施形態では、バリアントＩＬ－１０分子は、バリアントＩＬ－１０分子のＰＥＧ化形態である。なおもさらに好ましい実施形態では、医薬組成物は、融合タンパク質または免疫サイトカインとして組み込まれるバリアントＩＬ－１０分子と、薬学的賦形剤とを含む。

【0134】

特定の患者に対する有効量は、処置されている状態、患者の全般的な健康状態、投与の方法経路および用量、ならびに副作用の重症度などの因子に応じて変動し得る。患者に投与される適切な用量は、典型的には、処置に影響を及ぼすことが当該技術分野において公知であるかもしくは疑われるか、または処置に影響を及ぼすと予測される、パラメーターまたは因子を使用して、臨床医によって判定される。一般的に、用量は、最適な用量をいくらか下回る量で開始され、その後に、これを、任意の負の副作用に対して所望されるかまたは最適な作用が達成されるまで、少しの増分ずつ増加させる。重要な診断の尺度としては、例えば、炎症の症状、または産生される炎症性サイトカインのレベルが挙げられる。

【0135】

患者に投与される用量はまた、ＩＬ－１０またはバリアントＩＬ－１０分子に対するある特定の血清半減期延長改変の付加に基づいて最適化することができる（以下を参照：例えば、米国特許第９，９４３，５６８号、同第１０，０１０，５８８号、および同第１０，１４３，７２６号に詳細に考察されているｐｅｇ化ＩＬ－１０は、ＩＬ－１０の循環半減期を改善することが知られている）。本明細書に開示されるＩＬ－１０またはバリアントＩＬ－１０を含む融合タンパク質、イムノコンジュゲート、融合タンパク質、ミニボディ、およびダイアボディもまた循環半減期を延長することができ、同時に、ＩＬ－１０受容体への高い親和性の結合を保持する。したがって、一実施形態では、ＩＬ－１０と関連する様々な疾患、障害、もしくは状態、またはＩＬ－１０もしくはバリアントＩＬ－１０を含む融合タンパク質、融合タンパク質の複合体、イムノコンジュゲート、もしくはダイアボディを投与することによって改善することができるものを、それを必要とする患者に投与することができる。１つの好ましい実施形態では、ＩＬ－１０と関連する疾患、障害、または状態は、それを必要とする患者に、ＥＢＶ ＩＬ－１０またはそのバリアント（ＩＬ－１０受容体結合親和性に影響を及ぼすバリアントを含む）を有する治療有効量のイムノコンジュゲート複合体、融合タンパク質、またはダイアボディを投与することによって、処置または予防することができ、ここで、イムノコンジュゲート複合体、融合タンパク質、またはダイアボディは、約６０～１５５ｋＤａの分子量を有し、治療有効量は、約０．５マイクログラム／キログラム～１００マイクログラム／キログラムの範囲内である。本明細書に記載されるイムノコンジュゲート、融合タンパク質、またはダイアボディは、１日ごと、１週間に３回、１週間に２回、１週間ごと、１ヶ月に２回、または１ヶ月ごとに投与され得る。イムノコンジュゲート、融合タンパク質、またはダイアボディのＥＢＶ ＩＬ－１０部分および可変領域は、本明細書に考察される構造の任意の構成または組合せであり得る。本明細書に記載される半減期が延長された分子は、がん、炎症性疾患、自己免疫疾患（例えば、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）または非アルコール性脂肪性肝臓疾患（ＮＡＦＬＤ））、およびコレステロール上昇を含むがこれらに限定されない、様々な疾患を処置するのに有効であろう。

【0136】

第２の治療剤、例えば、サイトカイン、ステロイド、化学療法剤、抗生物質、抗炎症剤、または放射線照射を用いた共投与または処置のための方法は、当該技術分野において周知である。これらは、１つまたは複数の以下の：インターフェロン－β、例えば、ＩＦＮβ－１αおよびＩＦＮ－β－１ β、ミエリン塩基性タンパク質を刺激するタンパク質、コルチコステロイド、ＩＬ－１阻害剤、ＴＮＦ阻害剤、抗ＴＮＦα抗体、抗ＩＬ－６抗体、ＩＬ－１ｂｒ－Ｉｇ融合体、抗ＩＬ－２３抗体、ＣＤ４０リガンドおよびＣＤ８０に対する抗体、ＩＬ－１２およびＩＬ－２３のアンタゴニスト、例えば、ＩＬ－１２およびＩＬ－２３のｐ４０サブユニットのアンタゴニスト（例えば、ｐ４０サブユニットに対する阻害性抗体）、ＩＬ－２２アンタゴニスト、小分子阻害剤、例えば、メトトレキセート、レフルノミド、シロリムス（ラパマイシン）およびそのアナログ、例えば、ＣＣＩ－７７９、Ｃｏｘ－２およびｃＰＬＡ２阻害剤、ＮＳＡＩＤ、ｐ３８阻害剤、ＴＰＬ－２、Ｍｋ－２、ＮＦｋβ阻害剤、ＲＡＧＥもしくは可溶性ＲＡＧＥ、Ｐ－セレクチンもしくはＰＳＧＬ－１阻害剤（例えば、小分子阻害剤、それに対する抗体、例えば、Ｐ－セレクチンに対する抗体）、エストロゲン受容体ベータ（ＥＲＢ）アゴニスト、またはＥＲＢ－ＮＦｋβアンタゴニストなどであるがこれらに限定されない、他の治療剤との組合せ処置を含み得る。

【0137】

さらに、ＩＬ－１０バリアント分子またはその融合タンパク質の投与に有用な組合せ処置は、ＴＮＦ阻害剤を含み得、例えば、ＴＮＦに結合するキメラ、ヒト化、効果的にヒト、ヒト、またはｉｎ ｖｉｔｒｏ生成された抗体、またはその抗原結合性断片、ＴＮＦ受容体、例えば、ｐ５５またはｐ７５ヒトＴＮＦ受容体またはその誘導体の可溶性断片、例えば、７５ ｋｄＴＮＦＲ－ＩｇＧ（７５ｋＤ ＴＮＦ受容体－ＩｇＧ融合タンパク質、ＥＮＢＲＥＬ（商標））、ｐ５５ ｋＤ ＴＮＦ受容体－ＩｇＧ融合タンパク質、ならびにＴＮＦ酵素アンタゴニスト、例えば、ＴＮＦα変換酵素（ＴＡＣＥ）阻害剤を含み得る。標準的な非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）およびシクロ－オキシゲナーゼ－２阻害剤を含むがこれらに限定されない、抗炎症剤／薬を用いた他の組合せ処置。ＮＳＡＩＤとしては、アスピリン、セレコキシブ、ジクロフェナク、ジフルニサル、エトドラク、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、ケトロラック、ナブメトン、ナプロキセン、オキサプロジン、ピロキシカム、サルサレート、スリンダク、および／またはトルメチンを挙げることができる。本出願による組成物において用いられるシクロ－オキシゲナーゼ－２阻害剤は、例えば、セレコキシブまたはロフェコキシブであり得る。

【0138】

ＩＬ－１０バリアント分子またはその融合タンパク質と共投与および／または共製剤化され得る追加の治療剤としては、インターフェロン－β、例えば、ＩＦＮ β－１αおよびＩＦＮ β－１β、ＣＯＰＡＸＯＮＥ（登録商標）、コルチコステロイド、ＩＬ－１阻害剤、ＴＮＦアンタゴニスト（例えば、ＴＮＦ受容体、例えば、ｐ５５もしくはｐ７５ヒトＴＮＦ受容体またはその誘導体の可溶性断片、例えば、７５ｋｄＴＮＦＲ－ＩｇＧ、ＣＤ４０リガンドおよびＣＤ８０に対する抗体、ならびにＩＬ－１２および／またはＩＬ－２３のアンタゴニスト、例えば、ＩＬ－１２およびＩＬ－２３のｐ４０サブユニットのアンタゴニスト（例えば、ＩＬ－１２およびＩＬ－２３のｐ４０サブユニットに結合する阻害性抗体）、メトトレキセート、レフルノミド、およびシロリムス（ラパマイシン）、またはこれらのアナログ、例えば、ＣＣＩ－７７９のうちの１つまたは複数が挙げられる。他の治療剤としては、イミフィンジまたはアテゾリズマブを挙げることができる。

【0139】

ＮＡＳＨを処置する目的で、例えば、ＩＬ－１０バリアント分子またはその融合タンパク質は、コレステロール低下剤、例えば、スタチンおよび非スタチン薬と組み合わせることができる。これらの薬剤としては、シンバスタチン、アトルバスタチン、ロスバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、ゲムフィブロジル、フルバスタチン、コレスチラミン、フェノフィブラート、コレステロール吸収阻害剤、胆汁酸結合樹脂もしくは捕捉剤、ならびに／またはマイクロソームトリグリセリド輸送タンパク質（ＭＴＰ）阻害剤が挙げられるが、これらに限定されない。

【0140】

有効量の治療薬は、症状を緩和することによって炎症または疾患または状態のレベルに影響を及ぼすであろう。例えば、影響は、疾患または状態が、軽減または完全に処置されるように、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも約３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、またはそれを上回るレベルの影響を含み得る。

【0141】

バリアントＩＬ－１０分子またはその融合タンパク質を含む医薬組成物は、薬学的に許容される担体または賦形剤と混合される。様々な薬学的担体が、当該技術分野において公知であり、医薬組成物において使用され得る。例えば、担体は、本出願のバリアントＩＬ－１０分子組成物を患者に送達するのに好適な任意の適合性のある非毒性物質であり得る。好適な担体の例としては、生理食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液、およびハンクス溶液が挙げられる。担体としては、２９００（Ｌ６４）、３４００（Ｐ６５）、４２００（Ｐ８４）、４６００（Ｐ８５）、１１，４００（Ｆ８８）、４９５０（Ｐ１０３）、５９００（Ｐ１０４）、６５００（Ｐ１０５）、１４，６００（Ｆ１０８）、５７５０（Ｐ１２３）、および１２，６００（Ｆ１２７）の分子量を有するものを含むがこれらに限定されない、当業者に一般的に知られている任意のポロキサマーも挙げることができる。担体としては、いくつか列挙すると、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、およびポリソルベート８０を含むがこれらに限定されない乳化剤も挙げることができる。固定油およびオレイン酸エチルなどの非水性担体もまた、使用することができる。担体としては、等張性および化学的安定性を増強させる物質、例えば、緩衝剤および保存剤などの添加剤も挙げることができ、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences and U.S. Pharmacopeia: National Formulary, Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1984)を参照されたい。治療剤および診断剤の製剤は、例えば、凍結乾燥粉末、スラリー、水溶液、または懸濁液の形態で、生理学的に許容される担体、賦形剤、または安定化剤と混合することによって、調製することができる。

【0142】

本出願の組成物は、経口で投与することができるか、または身体に注射することができる。経口使用のための製剤は、消化管におけるプロテアーゼからバリアントＩＬ－１０分子をさらに保護するための化合物も含み得る。注射は、通常、筋肉内、皮下、皮内、または静脈内である。あるいは、関節内注射または他の経路を、適切な状況では使用することができる。非経口で投与されるバリアントＩＬ－１０分子は、好ましくは、薬学的担体および／または薬学的に許容される賦形剤と関連して、単位剤形の注射可能形態（溶液、懸濁液、エマルジョン）で製剤化される。他の実施形態では、本出願の組成物は、埋込み可能または注射可能な薬物送達系によって、患者の身体に導入され得る。
ＩＬ－１０バリアントの治療的使用

【0143】

一実施形態では、本出願は、炎症、炎症性疾患、または自己免疫疾患と関連する症状を処置、緩和、または低減する方法を提供する。本出願はまた、炎症、炎症性疾患、または自己免疫疾患、がん、または腫瘍のための医薬品として使用するためのＩＬ－１０、ＩＬ－１０バリアント分子、その融合タンパク質、またはそのキメラ分子も提供する。本出願はまた、炎症、または炎症性疾患、または自己免疫疾患、がん、または腫瘍の処置において使用するためのＩＬ－１０、ＩＬ－１０バリアント分子、その融合タンパク質、またはそのキメラ分子の使用も企図する。これらとしては、いくつか列挙すると、例えば、ＩＢＤ、クローン病、潰瘍性大腸炎、ＮＡＳＨ、ＮＡＦＬＤ、高コレステロール血症、またはがんが挙げられる。本方法は、治療有効量の、本明細書に記載されるバリアントＩＬ－１０分子またはその融合タンパク質のうちの１つまたは複数を投与することを企図する。一実施形態では、本出願は、炎症性疾患または自己免疫疾患を処置する方法であって、治療有効量の、受容体結合ドメインおよび／またはドメイン間角度の形成に関与する領域と関連する１つまたは複数の改変を含むバリアントＩＬ－１０分子を投与するステップを含む、方法を含む。１つの好ましい実施形態では、本方法は、バリアントＥＢＶ－ＩＬ１０分子またはその融合タンパク質を投与するステップを含む。１つの好ましい実施形態では、炎症性疾患を処置するのに有用なバリアントＩＬ－１０分子またはその融合タンパク質は、野生型ＩＬ－１０分子と比較して、制限されたドメイン間角度を有し、かつ／または低い受容体親和性も呈する、バリアント分子を含む。他の実施形態では、炎症性疾患を処置するのに有用なバリアントＩＬ－１０分子またはその融合タンパク質は、野生型ＩＬ－１０分子と比較して、弛緩したドメイン間角度を有し、かつ／または低い受容体親和性も呈する、バリアント分子を含む。バリアントＩＬ－１０分子のＰＥＧ化形態もまた、炎症性疾患または炎症に関して本出願の一部として想定される。

【0144】

本出願の炎症性疾患または自己免疫疾患には、望ましくないまたは所望されない炎症および免疫反応と関連する任意の疾患または状態が含まれる。これらの疾患としては、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、乾癬、リウマチ性関節炎、非アルコール性脂肪性肝臓疾患（ＮＡＦＬＤ）、または非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）が挙げられるが、これらに限定されない。他の実施形態では、疾患または状態としては、神経変性障害、例えば、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ａｍｙｅｌｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、ＡＬＳ）、致死性家族性不眠症、ラスムッセン脳炎、ダウン症、ハンチントン病、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー病、結節性硬化症、神経セロイドリポフスチン沈着症、亜急性硬化性全脳炎、ライム病、ツェツェ病（アフリカ睡眠病）、ＨＩＶ認知症、牛海綿状脳症（「狂牛」病）、クロイツフェルトヤコブ病、単純ヘルペス脳炎、帯状疱疹小脳炎、進行性麻痺（梅毒）、結核性髄膜炎、結核性脳炎、視神経炎、肉芽腫性血管炎、側頭関節炎（temporal arthritis）、脳血管炎、スパッツリンドバーグ病（Ｓｐａｔｚ－Ｌｉｎｄｅｎｂｅｒｇ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、メタンフェタミン関連血管炎、コカイン関連血管炎、外傷性脳損傷、卒中、ランスアダムス症候群、無酸素後脳障害、放射線壊死、辺縁系脳炎、アルツハイマー病、進行性核上性麻痺、線条体黒質変性症、大脳皮質基底核神経節変性症、原発性進行性失語症、第１７染色体と関連する前頭側頭型認知症、脊髄性筋萎縮症、ＨＩＶ関連ミエロパチー、ＨＴＬＶ－１関連ミエロパチー（熱帯性痙性不全対麻痺症）、脊髄癆（梅毒）、横断性脊髄炎、ポリオ後症候群、脊髄損傷、放射線ミエロパチー、シャルコーマリートゥース病、ＨＩＶ関連多発ニューロパチー、カンピロバクター関連運動軸索障害、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー、糖尿病性筋萎縮症 剥離、幻肢、複合性局所性疼痛症候群、糖尿病性ニューロパチー、傍腫瘍性ニューロパチー、筋強直性ジストロフィー、ＨＴＬＶ－１関連ミオパチー、旋毛虫症、炎症性ミオパチー（多発性筋炎、封入体筋炎、皮膚筋炎）、鎌状赤血球症、アルファ－１－抗トリプシン欠乏症、結核、亜急性細菌性心内膜炎、慢性ウイルス性肝炎、ウイルス性心筋症、シャーガス病、マラリア、コクサッキーＢ感染症、黄斑変性症、網膜色素変性症、血管炎、炎症性腸疾患、リウマチ性関節炎、水疱性天疱瘡、チャーグストラウス症候群、心筋梗塞、中毒性表皮壊死、ショック（例えば、急性アナフィラキシーショック）、１型糖尿病、自己免疫性甲状腺炎、リンパ腫、卵巣がん、ループス（全身性エリテマトーデス）、喘息、早老症、サルコイドーシス、２型糖尿病、およびメタボリック症候群が挙げられるが、これらに限定されない。本出願の実施形態である、炎症と関連する他の疾患または状態としては、炎症性肺障害、例えば、気管支炎、酸化体に誘導される肺損傷および慢性閉塞性気道疾患、角膜ジストロフィー、高眼圧症、トラコーマ、オンコセルカ症、網膜炎、ブドウ膜炎、交感性眼炎、および眼内炎を含む眼の炎症性障害、歯周炎を含む歯肉の慢性炎症性障害、関節炎、敗血症性関節炎および骨関節炎、結核性関節炎、癩病性関節炎、サルコイド関節炎を含む関節の慢性炎症性障害、硬化性皮膚炎、日焼け、乾癬、および湿疹を含む皮膚の障害、脳脊髄炎およびウイルス性もしくは自己免疫性脳炎、免疫複合体型血管炎を含む自己免疫疾患、ならびに虚血性心疾患、心不全、および心筋症を含む心臓の疾患が挙げられる。バリアントＩＬ－１０分子またはその融合タンパク質から利益を得ることができる疾患の他の非限定的な例としては、副腎機能不全、高コレステロール血症、アテローム性動脈硬化、骨吸収の増加と関連する骨疾患、例えば、骨粗鬆症、子癇前症、子癇、尿毒性併発症、慢性肝不全、および炎症と関連する他の障害、例えば、嚢胞性線維症、結核、カヘキシー、虚血（ｉｓｃｈｅｉｍｉａ）／再灌流、血液透析関連の状態、糸球体腎炎、再狭窄、ウイルス感染症の炎症性続発症、低酸素症、高比重酸素性痙攣および毒性、認知症、シデナム舞踏病、ハンチントン病、癲癇、コルサコフ病、脳血管障害に関連する知的障害、ＮＯに媒介される脳損傷および関連する続発症、虚血性脳浮腫（卒中）、偏頭痛、嘔吐、免疫複合体疾患、同種移植片拒絶、侵襲性微生物によって引き起こされる感染症、ならびに加齢が挙げられる。

【0145】

抗炎症性疾患または状態を処置するのにもっとも有効なＩＬ－１０バリアントまたはその融合タンパク質としては、Ｔ細胞を刺激する能力が低下しているものが挙げられる。したがって、７５位におけるアミノ酸置換を通じた受容体結合ドメインの改変は、もっとも少ない量のＴ細胞刺激を誘導することが、本出願の発明者によって示されている。具体的には、配列番号３（または配列番号５７）におけるＡ７５Ｉ置換を有するＥＢＶ ＩＬ－１０は、Ｔ細胞刺激を減少させることが示されている（例えば、図８Ｅ、ＤＶ０６と表記されているものを参照されたい）。したがって、１つの特に好ましい実施形態は、ＤＶ０６に基づく突然変異（配列番号３または配列番号５７のアミノ酸７５位における置換）を有するＩＬ－１０バリアント分子を有するダイアボディおよびモノボディの使用を企図する。より好ましい実施形態では、炎症性疾患の方法は、配列番号２６～２７、３７、４０、４１～４２、４３、４８～４９、またはこれらの組合せを含む融合タンパク質または融合タンパク質複合体を利用するであろう。

【0146】

本出願の別の実施形態では、処置の方法は、がんと関連する症状を処置または低減させるために、ＩＬ－１０またはバリアントＩＬ－１０分子またはその融合タンパク質を投与するステップを含む。本方法は、治療有効量の、本明細書に記載されるＩＬ－１０分子またはバリアントＩＬ－１０分子またはその融合タンパク質のうちの１つまたは複数を投与することを企図する。一実施形態では、本出願は、がんと関連する症状を処置または低減させる方法であって、治療有効量の、受容体結合ドメインおよび／またはドメイン間角度の形成に関与する領域と関連する１つまたは複数の改変を含むバリアントＩＬ－１０分子を投与するステップを含む、方法を含む。１つの好ましい実施形態では、本方法は、バリアントＥＢＶ－ＩＬ１０分子またはその融合タンパク質を投与するステップを含む。がんを処置するのに有用なバリアントＩＬ－１０分子またはその融合タンパク質は、野生型ＩＬ－１０分子と比較して、制限されたドメイン間角度を有し、かつ／または高い受容体親和性も呈する、バリアント分子を含む。がんと関連する症状を処置または低減させるのに有用なバリアントＩＬ－１０分子またはその融合タンパク質は、野生型ＩＬ－１０分子と比較して、弛緩したドメイン間角度を有し、かつ／または高い受容体親和性も呈する、バリアント分子を含む。バリアントＩＬ－１０分子のＰＥＧ化形態もまた、がんの処置に関して本出願の一部として想定される。ｉｎ ｖｉｖｏにおいて腫瘍体積を低減させることができる融合タンパク質の１つの特定の例としては、配列番号３のアミノ酸３１位および７５位における２つの置換を有するＩＬ－１０バリアントが挙げられ、これは、ＤＶ０７と称されるＶ３１ＬおよびＡ７５Ｉの特定の置換を含む（例えば、配列番号５９）。図１６Ａ～Ｃは、様々な用量において、Ｄ：ＤＶ０７と称される、ダイアボディ構造体にコンジュゲートしたＤＶ０７ ＥＢＶ ＩＬ－１０分子を含む融合タンパク質が、７および１０日間の時間過程にわたって、腫瘍体積を低減させたことを示す。したがって、１つの特に好ましい実施形態は、ＤＶ０７に基づく突然変異（配列番号３または配列番号５９のアミノ酸３１位および７５位における置換）を有するＩＬ－１０バリアント分子を有するダイアボディおよびモノボディの使用を企図する。より好ましい実施形態では、がんまたは腫瘍または腫瘍を処置する方法は、配列番号２８～２９、３３、３４、３５～３６、３８～３９、４６～４７、６１、６３、６５、もしくは６７、またはこれらの組合せを含む融合タンパク質または融合タンパク質複合体を利用する。

【0147】

本明細書に記載されるバリアントＩＬ－１０分子またはその融合タンパク質によって処置することができるがんまたは増殖性障害としては、子宮、子宮頸、乳房、前立腺、精巣、陰茎、消化管、例えば、食道、中咽頭、胃、小腸もしくは大腸、結腸、または直腸、腎臓、腎細胞、膀胱、骨、骨髄、皮膚、頭頸部、皮膚、肝臓、胆嚢、心臓、肺、膵臓、唾液腺、副腎、甲状腺、脳、例えば、神経膠腫、神経節、中枢神経系（ＣＮＳ）および末梢神経系（ＰＮＳ）、ならびに免疫系、例えば、脾臓または胸腺のがんが挙げられるがこれらに限定されない、様々な形態のがんが挙げられる。本出願は、例えば、免疫原性腫瘍、非免疫原性腫瘍、潜伏腫瘍、ウイルスに誘導されるがん、例えば、上皮細胞がん、内皮細胞がん、扁平上皮細胞癌、パピローマウイルス、腺癌、リンパ腫、癌腫、黒色腫、白血病、骨髄腫、肉腫、奇形癌、化学的に誘導されるがん、転移、および血管新生を処置する方法を提供する。本出願はまた、例えば、制御性Ｔ細胞（Ｔ_ｒｅｇ）および／またはＣＤ８^＋ Ｔ細胞の活性をモジュレートすることによって、腫瘍細胞またはがん細胞抗原に対する寛容性を低減させることを企図する。好ましい実施形態では、ＩＬ－１０バリアント分子は、肝臓転移疾患を有する患者または対象を処置するのに特に有用である。

【0148】

なおも他の実施形態では、炎症性疾患またはがんと関連する症状を処置または低減させる方法は、他の治療剤と組み合わせて、バリアントＩＬ－１０分子またはその融合タンパク質またはその誘導体化形態（例えば、ＰＥＧ化）を投与するステップを含む。これらの治療剤としては、限定することなく、サイトカインまたはサイトカインアンタゴニスト、例えば、ＩＬ－１２、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、インターフェロン－アルファ、または抗上皮成長因子受容体、ドキソルビシン、エピルビシン、抗葉酸剤、例えば、メトトレキセートもしくはフルオロウラシル、イリノテカン、シクロホスファミド、放射線療法、ホルモンもしくは抗ホルモン療法、例えば、アンドロゲン、エストロゲン、抗エストロゲン、フルタミド、もしくはジエチルスチルベストロール、外科手術、タモキシフェン、イホスファミド、ミトラクトール、アルキル化剤、例えば、メルファランもしくはシス－プラチン、エトポシド、ビノレルビン、ビンブラスチン、ビンデシン、グルココルチコイド、ヒスタミン受容体アンタゴニスト、血管新生阻害剤、放射線照射、放射線感作剤、アントラサイクリン、ビンカアルカロイド、タキサン、例えば、パクリタキセルおよびドセタキセル、細胞周期阻害剤、例えば、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤、別の腫瘍抗原に対するモノクローナル抗体、モノクローナル抗体および毒素の複合体、Ｔ細胞アジュバント、骨髄移植、または抗原提示細胞、例えば、樹状細胞療法が挙げられる。

【0149】

他の実施形態では、本出願はまた、脂質関連障害、例えば、高コレステロール血症および高トリグリセリド血症を処置する、ならびに／または脂質パラメーター、例えば、総コレステロール、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）コレステロール、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロール、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）コレステロール、トリグリセリド、および非ＨＤＬコレステロールを改善させる、方法であって、バリアントＩＬ－１０分子またはその誘導体化形態（例えば、ＰＥＧ化）を投与するステップを含む、方法を具現化する。

【0150】

脂質関連疾患または障害を処置するのにもっとも有効なＩＬ－１０バリアントまたはその融合タンパク質としては、マクロファージに対してもっとも低い抑制能力を有するものが挙げられる。したがって、３１位におけるアミノ酸置換（ホモ二量体のドメイン間角度の増加と関連する）を通じた受容体結合ドメインの改変は、もっとも少ない量のマクロファージ応答を誘導することが、本出願の発明者によって示されている。具体的には、配列番号３におけるＶ３１Ｌ置換を有するＥＢＶ ＩＬ－１０は、マクロファージ応答を減少させることが示されている（例えば、図８Ａ、ＤＶ０５と表記されるもの、または配列番号５５を参照されたい）。したがって、１つの特に好ましい実施形態は、ＤＶ０５に基づく突然変異（配列番号３または配列番号５５のアミノ酸３１位における置換）を有するＩＬ－１０バリアント分子を有するダイアボディおよびモノボディの使用を企図する。より好ましい実施形態では、脂質に基づく疾患または障害を処置する方法は、配列番号２４～２５、５０～５１、または４５を含む融合タンパク質または融合タンパク質複合体を利用する。

【0151】

本出願のなおも別の実施形態では、いずれも必要に応じてＰＥＧ化またはＨＥＳ化を含み得る、ＩＬ－１０バリアント分子またはその融合タンパク質、ウイルスＩＬ－１０（ＥＢＶまたはＣＭＶ ＩＬ－１０を含む）、または野生型ＩＬ－１０は、マスト細胞脱顆粒化を低減させることによって、マスト細胞を標的化する方法において使用される。好ましい実施形態では、マスト細胞を標的化する方法は、季節性アレルギーまたは急性アナフィラキシー応答を処置するために、ウイルスＩＬ－１０またはＩＬ－１０バリアント分子と接触させるステップを含む。別の態様では、ＩＬ－１０バリアント分子、ウイルスＩＬ－１０（ＥＢＶもしくはＣＭＶ ＩＬ－１０を含む）、または野生型ＩＬ－１０は、ＩｇＥ応答性を低減させるための方法において使用される。

【0152】

なおも別の実施形態では、本出願のＩＬ－１０バリアント分子またはその融合タンパク質は、好ましくは、患者集団をスクリーニングするときに、記載される方法（例えば、抗炎症および／またはがん）において有用である。一実施形態では、上昇したまたは高いＩＦＮγ応答が存在するプロファイルを呈する患者は、ＩＬ－１０バリアント分子を使用してがんを処置するのにもっとも感受性であるかまたは理想的である。別の実施形態では、減少したまたは低いＩＦＮγ応答が存在するプロファイルを呈する患者は、ＩＬ－１０バリアント分子を使用して抗炎症を処置するのにもっとも感受性であるかまたは理想的である。

【0153】

本出願の広い範囲は、以下の実施例を参照するともっとも良好に理解され、それらの実施例は、本出願をいずれの特定の実施形態にも制限することを意図しない。本明細書におけるすべての引用物は、それぞれ個別の刊行物または特許出願が、具体的かつ個別に参照により組み込まれると示されるのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。

【0154】

当業者には理解されるように、本出願の多数の改変形および変化形が、その趣旨および範囲から逸脱することなく作製され得る。本明細書に記載される特定の実施形態は、例として提供されており、本出願は、添付の特許請求の範囲の条件、同様にそのような特許請求の範囲が権利を有する均等物の完全な範囲によって制限されるものではなく、本出願は、例として本明細書に提示されている特定の実施形態によって制限されるものではない。さらに、前述の明細書において引用されているすべての参考文献、特許、および特許出願は、参照により本明細書に組み込まれる。

【実施例】

【0155】

以下の実施例は、単に本出願の様々な実施形態を例示するものであり、決して本出願の範囲を制限するものと解釈されるべきではない。
（実施例１）

【0156】

ＥＢＶ－ＩＬ－１０バリアントまたはその融合タンパク質を、標準的な分子生物学クローニング技法によって、一次配列の変更によって構築する。一次配列における変更は、受容体結合ドメインの親和性を変更するように、ならびにドメイン間角度を開放または閉鎖するように、設計する。受容体親和性は、成熟分泌配列における３１位および／または７５位およびその周囲のアミノ酸を変化させることによって、変更することができる。ドメイン間角度は、例えば、ヘリックスＣおよびＤの間、ならびにＤおよびＥの間の非アルファヘリックス配列にプロリンを導入して変更することができるが、これに限定されない。プロリンは、一次アミノ酸配列の直鎖方向にねじれを誘導し、続いて生じるＤおよびＥヘリックスの二次構造および三次構造によって誘導されるドメイン間角度を潜在的に変更する。同様に、嵩高い側鎖を有するアミノ酸、例えば、トリプトファンの導入は、一次アミノ酸骨格の線状構造にあまり重大でない変更を導入し、二次および三次構造にあまり顕著でない変化をもたらすことができる。
（実施例２）

【0157】

以下の実施例は、バリアントＩＬ－１０分子またはその融合タンパク質が、マクロファージにおいてどのように評価されるかについての説明を提供する。

【0158】

健常な患者集団または炎症性疾患（例えば、クローン病）を患う患者からヒト血液を採取し、新しく採取したバフィーコートを、標準的なＦｉｃｏｌｌ密度勾配遠心分離手順を使用して処理し、ＰＢＭＣを得る。ＰＢＭＣを、次いで、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）ヒト単球濃縮キット（カタログ番号１９０５９、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用し、製造業者の説明書に従って、ＣＤ１４^＋単球細胞の濃縮に供する。濃縮効率を、標準的なフローサイトメトリーによって評価する。

【0159】

濃縮した単球を、５％ヒト血清およびＰＳＧを補充したＲＰＭＩ培地中、２×１０^６個の細胞／ｍＬ／ウェルで、２４ウェルプレートに播種する。細胞を、バリアントＩＬ－１０分子の連続希釈物（０、０．１、１、１０、１００、１０００ｎｇ／ｍＬ）で処置し、３７℃／５％ＣＯ２加湿インキュベーターにおいて１時間処置し、次いで、１０ｎｇ／ｍＬ ＬＰＳ（カタログ番号Ｌ４３９１、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）に１２～１６時間曝露する。一晩インキュベートした後、上清を採取し、炎症性サイトカイン（ＩＬ－６、ＴＮＦα、ＩＬ－１β）を、標準的なＥＬＩＳＡによってかまたはｉＱｕｅ Ｓｃｒｅｅｎｅｒ（Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ）を使用してのいずれかで測定する。

【0160】

この研究において、上述の手順を使用して、マクロファージに対する免疫抑制能力に対する非ＰＥＧ化ＥＢＶ－ＩＬ１０および非ＰＥＧ化ヒトＩＬ－１０の影響を比較する。図２Ａ、２Ｂ、および３Ａ、３Ｂは、ＥＢＶ－ＩＬ１０が、炎症性サイトカインＩＬ－１βおよびＴＮＦαを抑制する能力を保持したことを示し、これにより、ドメイン間角度の違いを有するとしても、ＥＢＶ－ＩＬ１０が、ヒトＩＬ－１０と同様の様式で、その炎症抑制能力を維持することができることが示される。
（実施例３）

【0161】

以下の実施例は、バリアントＩＬ－１０分子またはその融合タンパク質が、ヒトＣＤ８^＋Ｔ細胞においてどのように評価されるかについての説明を提供する。

【0162】

健常な患者集団または炎症性疾患（例えば、クローン病）を患う患者からヒト血液を採取し、新しく採取したバフィーを、標準的なＦｉｃｏｌｌ密度勾配遠心分離手順を使用して処理し、ＰＢＭＣを得る。ＰＢＭＣを、次いで、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）ヒトＣＤ８^＋ Ｔ細胞濃縮キット（カタログ番号１９０５３、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を製造業者の説明書に従って使用して、ＣＤ８^＋ Ｔ細胞の濃縮に供する。濃縮効率を、標準的なフローサイトメトリー法によって評価する。濃縮した細胞を、ＡＩＭＶ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１２０５５０８３）培養培地に懸濁する。２４ウェルプレートを、３７℃／５％００２加湿細胞培養インキュベーターにおいてインキュベートし、続いて、１倍ＰＢＳで１～２回洗浄することによって、１０マイクログラム／ｍＬの抗ＣＤ３（カタログ番号１６－００３９－８５、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および２マイクログラム／ｍＬの抗ＣＤ２８（カタログ番号１６－０２８９－８５、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で２時間コーティングする。

【0163】

濃縮したＣＤ８^＋ Ｔ細胞（３×１０^６個／ｍＬ／ウェル）を、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８をコーティングしたプレートに添加し、３７℃／５％ＣＯ２加湿細胞培養インキュベーターにおいて７２時間インキュベートする。

【0164】

７２時間後に、細胞を採取し、計数して、バリアントＩＬ－１０分子の連続希釈物（０、０．１、１、１０、１００、１０００ｎｇ／ｍＬ、１００μＬ／ウェルで添加）または対照試料の存在下／不在下において、１００μｌを丸底９６ウェルプレート（２×１０５個の細胞／ウェル）に再播種する。試験を、三連に行う。細胞を、バリアントＩＬ－１０分子またはその融合タンパク質とともに、３７℃／５％ＣＯ_２加湿インキュベーターにおいて７２時間インキュベートする。７２時間後に、細胞を回収し、洗浄し、３７℃／５％ＣＯ２加湿インキュベーターにおいて４時間、可溶性抗ＣＤ３（カタログ番号１６－００３９－８５、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の存在下で、新しい丸底９６ウェルプレートに再播種する。

【0165】

この研究において、上述の手順を使用して、ＣＤ８^＋Ｔ細胞の刺激に対する非ＰＥＧ化ＥＢＶ－ＩＬ１０および非ＰＥＧ化ヒトＩＬ－１０の影響を比較する。図２Ｃおよび３Ｃは、ＥＢＶ－ＩＬ１０が、ヒトＩＬ－１０と比較して、ＩＦＮγ（Ｔ細胞刺激の尺度）のレベルの減弱を呈したことを示す。これは、ドメイン間角度を変更することによって、Ｔ細胞の刺激をモジュレートする能力が存在することを示す。図４Ａおよび４Ｂは、処置したドナーの半数が、所望される完全な抗炎症作用を呈し、半数は呈さなかったことを示す。開発に選択したバリアントは、ドナー１の応答、マクロファージ細胞によるＬＰＳに応答した炎症性サイトカインの分泌の完全な抑制、および活性化ＣＤ８^＋ Ｔ細胞からのＩＦＮγ誘導の欠如を模倣するであろう。ドナー２は、ドナー１と同様に単球／マクロファージによる炎症性サイトカインの分泌の抑制を呈したが、曲線およびＴ細胞ＩＦＮγ分泌の最大活性化を右方向にシフトしただけであった。受容体親和性およびドメイン間角度を変更するＩＬ－１０バリアント分子は、さらに、ドナー２と同様に、患者におけるＴ細胞活性化を低減させるはずである。
（実施例４）

【0166】

ＡＴＣＣから購入したヒト単球／マクロファージ、Ｔ細胞、およびマウスＭＣ／９細胞を、前述のように培養し、モノまたはジ－Ｎ末端５ｋＤａ ＰＥＧ化ＥＢＶ－ＩＬ１０に対する応答を評価した。ＥＢＶ－ＩＬ１０のＰＥＧ化は、ＬＰＳに対するマクロファージ応答の低減はわずかしかもたらさないが（図５Ｂ）、刺激されたＴ細胞からのＩＦＮγ誘導のほぼ完全な抑制をもたらす（図５Ｃ）。同様に、ＥＢＶ－ＩＬ１０のＰＥＧ化は、ＭＣ／９細胞に対するその刺激性作用をほぼ消失させる（図５Ａ）。

【0167】

抗ＣＤ３αおよび抗ＥＧＦＲのＶＨおよびＶＬ領域を用いたＥＢＶ－ＩＬ－１０バリアントダイアボディの様々な形態を、ＭＣ／９細胞増殖アッセイを使用して試験した。ＥＢＶ－１０バリアント部分には、Ｄ：ＤＶ０５（Ｖ３１Ｌ突然変異を有するＥＢＶ ＩＬ－１０）、Ｄ：ＤＶ０６（Ａ７５Ｉ突然変異を有するＥＢＶ ＩＬ－１０）、およびＶ３１ＬおよびＡ７５Ｉ突然変異を有するＤ：ＤＶ０７）が含まれた。加えて、抗ＨＩＶおよび抗エボラＶＨおよびＶＬ領域を含むＤＶ０７ダイアボディもまた、試験した。様々なバリアントダイアボディ形態を、ヒトＩＬ－１０およびＥＢＶ ＩＬ－１０と比較した。結果を、図１５に提供する。

【0168】

ＥＢＶ－ＩＬ－１０融合タンパク質の他の形態もまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏで試験した。特に、ＤｈｉｖＤｅｂｏ：ＤＶ０６（配列番号２６および２７）ならびにＤｍａｄｃａｍＤｅｂｏ：ＤＶ０６（配列番号４１および４２）を、本明細書に記載されるマクロファージおよびＴ細胞応答アッセイにおいて、ヒトＩＬ－１０と比較した。結果を、図２０Ａおよび２０Ｂに提供する。
（実施例５）

【0169】

以下の実施例は、ＩＬ－１０およびＩＬ－１０バリアント分子ならびにその融合タンパク質をｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍モデルにおいて試験するための代表的なプロトコールを提供する。すべてのｉｎ ｖｉｖｏ研究は、標準的な操作手順およびＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（「ＩＡＣＵＣ」）によって承認されている確立されたガイドラインに従って行う。

【0170】

８週齢の雌性Ｂａｌｂ／Ｃマウスを購入し、１週間隔離し、標準的な２４時間の明／暗サイクルにおいて、１週間に１回の床敷き交換で通常の食餌および水で維持する。

【0171】

ＣＴ２６腫瘍細胞（２×１０^５個）を、ハンクス緩衝食塩水に懸濁させ、８週齢のマウスの皮下に埋め込み、成長させる。ＣＴ２６腫瘍（平均５０～１５０ｍｍ^３）を保持する野生型Ｂａｌｂ／Ｃ Ｅｎｖｉｇｏ）、またはＢ細胞ノックアウト（Ｊａｃｋｓｏｎ）マウスを、０．４および０．２ｍｇ／ｋｇで１週間に３回（ｑ３ｗ）、０．２および０．１ｍｇ／ｋｇで毎日（ｑｄ）を２日間の休薬で５日間、ＩＬ－１０またはＩＬ－１０バリアント分子またはその融合タンパク質（例えば、２つの異なる抗体またはダイアボディに由来するＶＨおよびＶＬに共有結合的に連結された２つの受容体結合置換、ＤＶ０７を有するＥＢＶ ＩＬ－１０バリアント分子（図８Ｃ））で、皮下（首筋）に１０日間処置する。腫瘍の長さおよび幅を、電子キャリパーで３日間に１回測定し、腫瘍体積を計算する（（Ｌ×Ｗ^２）／２））。野生型マウスにおいてＢ細胞を、２００μｇ／マウスの抗マウスＣＤ２０の静脈内（ｉ．ｖ．）投与により、枯渇させる。１つのそのような研究の結果は、図１６に提供されており、これは、抗ＣＤ３αおよび抗ＥＧＦＲに由来する可変領域を含む、Ｖ３１ＬおよびＡ７５Ｉ突然変異を有するＩＬ－１０バリアントである、Ｄ：ＤＶ０７と称されるＩＬ－１０バリアント分子を使用していた。

【0172】

図１７Ａおよび１７Ｂでは、図９Ｃ（大型形式）および９ｆ（小型形式）によって表される、ＩＬ－１０バリアント融合タンパク質（すなわち、Ｖ３１ＬおよびＡ７５Ｉの両方の突然変異を含むＩＬ－１０バリアント、ＤＶ０７）の２つの形式を、ｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍モデルにおいて比較する。融合タンパク質は、非標的化融合タンパク質であり、抗ＨＩＶ抗体および抗エボラ抗体（大型形式）に由来するＶＨおよびＶＬ領域、ならびに抗エボラ抗体に由来するＶＨおよびＶＬ領域を含む。投薬研究により、５日間の投薬、２日間の休薬（図１７Ａ）で投与した小型形式の非標的化ＩＬ－１０融合タンパク質の作用を、ｐｅｇ化組換えヒトＩＬ－１０（０．７５ｍｇ／ｋｇ、毎日）と比較して、試験した。さらに、投薬研究により、１週間に３回投与した大型および小型形式の非標的化ＩＬ－１０融合タンパク質（図１７Ｂ）の作用を、ｐｅｇ化ＩＬ－１０（０．７５ｍｇ／ｋｇ、毎日）と比較して試験した。

【0173】

腫瘍標的化能力を有する小型および大型形式のＩＬ－１０融合タンパク質（すなわち、Ｖ３１ＬおよびＡ７５Ｉの両方の突然変異を含むＩＬ－１０バリアント、ＤＶ０７）を使用した研究もまた、ｉｎ ｖｉｖｏで試験した。図１８Ａは、様々な標的化ＩＬ－１０バリアント融合タンパク質の毎日の投与により得られた結果であり、大型形式（ＤｅｇｆＤｅｂｏ：ＤＶ０７）および小型形式（Ｄｅｇｆ：ＤＶ０７）を、小型形式の非標的化（Ｄｅｂｏ：ＤＶ０７）ＩＬ－１０融合タンパク質およびｐｅｇ化ＩＬ－１０と比較した。図１８Ｂは、様々な大型形式の標的化ＩＬ－１０バリアント融合タンパク質の１週間に３回の投与により得られた結果であり、様々な用量（１ｍｇ／ｋｇおよび０．２５ｍｇ／ｋｇ）の大型形式（ＤｅｇｆＤｅｂｏ：ＤＶ０７）を、小型形式の非標的化（ＤｈＤｅ：ＤＶ０７）ＩＬ－１０融合タンパク質およびｐｅｇ化ＩＬ－１０と比較した。図１８Ｃは、様々な小型形式の標的化ＩＬ－１０バリアント融合タンパク質の１週間に３回の投与により得られた結果であり、様々な用量（１ｍｇ／ｋｇおよび０．２５ｍｇ／ｋｇ）の小型形式（Ｄｅｇｆ：ＤＶ０７）を、小型形式の非標的化（Ｄｅｂｏ：ＤＶ０７）ＩＬ－１０融合タンパク質およびｐｅｇ化ＩＬ－１０と比較した。
（実施例６）

【0174】

以下の実施例は、ＩＬ－１０およびＩＬ－１０バリアント分子ならびにその融合タンパク質をｉｎ ｖｉｖｏコレステロールモデルにおいて試験するための代表的なプロトコールを提供する。すべてのｉｎ ｖｉｖｏ研究は、標準的な操作手順およびＩＡＣＵＣによって承認されている確立されたガイドラインに従って行った。

【0175】

８週齢の雌性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを適切な供給業者から購入し、１週間隔離し、標準的な２４時間の明／暗サイクルにおいて、１回／１週間の床敷き交換で通常の食餌および水で維持する。

【0176】

Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓの８週齢の雌性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、高脂肪食（Ｅｎｖｉｇｏ）を３週間与える。ＩＬ－１０またはＩＬ－１０バリアントまたはその融合タンパク質（例えば、ダイアボディに連結された、配列番号３のアミノ酸３１位における単一の置換（Ｖ３１Ｌ）を含むＥＢＶ ＩＬ－１０バリアント（Ｄ：ＤＶ０５ ＥＢＶ ＩＬ－１０バリアント））での処置の前に、血漿試料を、それぞれのマウスの後眼窩採血によって得る。マウスを、０．４および０．２ｍｇ／ｋｇで１週間に３回（ｑ３ｗ）、ならびに０．２および０．１ｍｇ／ｋｇで１週間（ｑｄ）に５日間の処置２日間の休薬で、２週間、皮下処置する。動物を２週間処置し、最後の採血を行い、その後に、投薬前および投薬後の血漿コレステロール濃度を定量する。処置開始前の日に、２００μｇ／マウスの抗マウスＣＤ２０の静脈内（ｉ．ｖ．）投与により、Ｂ細胞を枯渇させる。１つのそのような研究の結果は、図１９Ａおよび１９Ｂに提供されている。
（実施例７）

【0177】

以下の実施例は、ＩＬ－１０およびＩＬ－１０バリアント分子ならびにその融合タンパク質をｉｎ ｖｉｖｏ硫酸デキストランナトリウム（「ＤＳＳ」）炎症モデルにおいて試験するための代表的なプロトコールを提供する。すべてのｉｎ ｖｉｖｏ研究は、標準的な操作手順およびＩＡＣＵＣによって承認されている確立されたガイドラインに従って行う。

【0178】

８週齢の雌性Ｂａｌｂ／Ｃマウスを適切な供給業者から購入し、１週間隔離し、標準的な２４時間の明／暗サイクルにおいて、１回／１週間の床敷き交換で通常の食餌および水で維持する。Ｂ細胞ノックアウト（Ｊａｃｋｓｏｎ）マウスに、水中４％ ＤＳＳを、６日間自由に摂取させ、その後、それらに、通常の水を与える。５日目に、マウスを、０．４および０．２ｍｇ／ｋｇで１週間に３回（ｑ３ｗ）、０．２および０．１ｍｇ／ｋｇで毎日（ｑｄ）、５日間の投薬２日間の休薬で、ＩＬ－１０またはＩＬ－１０バリアントまたはその融合タンパク質（例えば、ダイアボディに連結された、配列番号３のアミノ酸７５位における単一の置換（Ａ７５Ｉ）を含むＥＢＶ ＩＬ－１０バリアント（Ｄ：ＤＶ０６ ＥＢＶ ＩＬ－１０バリアント））で、１０日間、皮下（首筋）処置する。マウスを、以下について毎日評価する：
１．）体重
２．）便潜血
３．）肉眼で見える出血
４．）便の硬さ

【0179】

疾患活動性インデックスを、以下のスコアを合わせることによって判定する。
１．体重減少
２．便の硬さ
３．出血（３で除す）

【0180】

それぞれのスコアは、以下のように判定する：体重の変化（０：１％を下回る、１：１～５％、２：５～１０％、３：１０～１５％、４：１５％を上回る、血便（０：陰性、２：陽性）、肉眼で見える出血（４）、および便の硬さ（０：正常、２：緩い便、４：下痢）。
好ましい実施形態の一覧

【0181】

１．野生型エプスタインバーウイルスＩＬ－１０（ＥＢＶ－ＩＬ１０）と比較したときに、変更されたドメイン間角度および／または変更された同種受容体に対する親和性を呈する１つまたは複数のアミノ酸付加、欠失、および／または置換を含む、ＥＢＶ－ＩＬ１０バリアントタンパク質であって、変更されたドメイン間角度により、二量体化したときに、同種受容体との結合の角度がモジュレートされる、ＥＢＶ－ＩＬ１０バリアントタンパク質。

【0182】

２．１つまたは複数のアミノ酸付加、欠失、および／または置換が、ＩＬ－１０受容体結合ドメインに位置する、先行する実施形態に記載のＥＢＶ－ＩＬ１０タンパク質。

【0183】

３．１つまたは複数のアミノ酸付加、欠失、および／または置換が、アルファヘリックスＡおよび／またはヘリックスＤ内に位置する、先行する実施形態のいずれかに記載のＥＢＶ－ＩＬ１０タンパク質。

【0184】

４．１つまたは複数のアミノ酸付加、欠失、および／または置換が、ＥＢＶ－ＩＬ１０の連結ドメインに存在する、先行する実施形態のいずれかに記載のＥＢＶ－ＩＬ１０タンパク質。

【0185】

５．１つまたは複数のアミノ酸付加、欠失、および／または置換が、ＥＢＶ－ＩＬ１０のＤＥループ内に位置する、先行する実施形態のいずれかに記載のＥＢＶ－ＩＬ１０タンパク質。

【0186】

６．１つまたは複数のアミノ酸付加、欠失、および／または置換が、アルファヘリックスＤとアルファヘリックスＥとの間、またはアルファヘリックスＣとアルファヘリックスＤとの間に見出される１２個のアミノ酸のリンカー領域内に位置し、好ましくは、１２個のアミノ酸のリンカー領域内のプロリンの付加または置換である、先行する実施形態のいずれかに記載のＥＢＶ－ＩＬ１０タンパク質。

【0187】

７．同種受容体に対する変更された親和性が、ＩＬ－１０受容体結合ドメインにおける１つまたは複数のアミノ酸付加、欠失、および／または置換を含む、先行する実施形態のいずれかに記載のＥＢＶ－ＩＬ１０タンパク質。

【0188】

８．アルファヘリックスＡおよび／またはアルファヘリックスＤ内に位置する１つまたは複数のアミノ酸付加、欠失、および／または置換をさらに含む、先行する実施形態のいずれかに記載のＥＢＶ－ＩＬ１０タンパク質。

【0189】

９．ＩＬ－１０受容体結合ドメインにおける１つまたは複数のアミノ酸付加、欠失、および／または置換をさらに含む、先行する実施形態のいずれかに記載のＥＢＶ－ＩＬ１０タンパク質。

【0190】

１０．アルファヘリックスＡおよび／またはアルファヘリックスＤ内に位置する１つまたは複数のアミノ酸付加、欠失、および／または置換をさらに含む、先行する実施形態のいずれかに記載のＥＢＶ－ＩＬ１０タンパク質。

【0191】

１１．１つまたは複数のアミノ酸付加、欠失、および／または置換が、配列番号３のアミノ酸３１位および／または７５位にある、先行する実施形態のいずれかに記載のＥＢＶ－ＩＬ１０タンパク質。

【0192】

１２．同一の単量体タンパク質とホモ二量体を形成することができる、Ａ～Ｆと番号付けされた６つのアルファヘリックスを含む単量体組換えタンパク質であって、アルファヘリックスＤおよびＥが、鎖間アミノ酸リンカーによって連結され、このリンカーが、ホモ二量体化されたときのタンパク質の分子間角度を変更する少なくとも１つのアミノ酸の付加、欠失、または置換により改変されている、単量体組換えタンパク質。

【0193】

１３．タンパク質が、ウイルス由来のタンパク質である、先行する実施形態に記載の組換えタンパク質。

【0194】

１４．ウイルスが、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）である、先行する実施形態のいずれかに記載の組換えタンパク質。

【0195】

１５．２つの同一な単量体タンパク質間で形成されるホモ二量体が、その同種受容体との相互作用の特定の角度を形成する、先行する実施形態のいずれかに記載の組換えタンパク質。

【0196】

１６．相互作用の角度が、天然の野生型タンパク質を上回る、先行する実施形態のいずれかに記載の組換えタンパク質。

【0197】

１７．ホモ二量体化したときに形成される相互作用の角度が、同種受容体に対する高い親和性を有するタンパク質をもたらす、先行する実施形態のいずれかに記載の組換えタンパク質。

【0198】

１８．ホモ二量体化したときに形成される相互作用の角度が、同種受容体に対する低い親和性を有するタンパク質をもたらす、先行する実施形態のいずれかに記載の組換えタンパク質。

【0199】

１９．相互作用の角度が、天然の野生型タンパク質を下回る、先行する実施形態のいずれかに記載の組換えタンパク質。

【0200】

２０．相互作用の角度が、同種受容体に対する高い親和性を有するタンパク質をもたらす、先行する実施形態のいずれかに記載の組換えタンパク質。

【0201】

２１．相互作用の角度が、同種受容体に対する低い親和性を有するタンパク質をもたらす、先行する実施形態のいずれかに記載の組換えタンパク質。

【0202】

２２．単量体タンパク質が、インターロイキン１０である、先行する実施形態のいずれかに記載の組換えタンパク質。

【0203】

２３．単量体タンパク質が、ＥＢＶ－ＩＬ１０である、先行する実施形態のいずれかに記載の組換えタンパク質。

【0204】

２４．タンパク質の角度が、同種受容体との相互作用の角度をもたらすリンカーに対する改変によって付与される、先行する実施形態のいずれかに記載の組換えタンパク質。

【0205】

２５．エプスタインバーウイルスＩＬ－１０（ＥＢＶ－ＩＬ１０）タンパク質であって、ＥＢＶ－ＩＬ１０のアルファヘリックスＤとＥとの間のリンカー領域および／またはＥＢＶ－ＩＬ１０の受容体結合領域に対する少なくとも１つのアミノ酸付加、欠失、または置換を含む、組換えバリアントＥＢＶ－ＩＬ１０タンパク質。

【0206】

２６．バリアントＥＢＶ－ＩＬ１０タンパク質が、同一のタンパク質と相互作用して、変更されたその同種受容体との相互作用の角度および／または変更されたホモ二量体間角度を有するホモ二量体をもたらす、先行する実施形態に記載の組換えタンパク質。

【0207】

２７．バリアントＥＢＶ－ＩＬ１０タンパク質が、野生型ＥＢＶ－ＩＬ１０タンパク質を上回る、相互作用の角度および／または変更されたホモ二量体間角度を形成する、先行する実施形態のいずれかに記載の組換えタンパク質。

【0208】

２８．バリアントＥＢＶ－ＩＬ１０タンパク質が、野生型ＥＢＶ－ＩＬ１０タンパク質を下回る、相互作用の角度および／または変更されたホモ二量体間角度を形成する、先行する実施形態のいずれかに記載の組換えタンパク質。

【0209】

２９．ホモ二量体の形成時に形成される相互作用の角度が、その同種受容体に対する増加した親和性を有するバリアントＥＢＶ－ＩＬ１０タンパク質をもたらす、先行する実施形態のいずれかに記載の組換えタンパク質。

【0210】

３０．ホモ二量体の形成時に形成される相互作用の角度が、その同種受容体に対する減弱した親和性を有するバリアントＥＢＶ－ＩＬ１０タンパク質をもたらす、先行する実施形態のいずれかに記載の組換えタンパク質。

【0211】

３１．相互作用の角度が、その同種受容体に対する親和性の増加をもたらす、先行する実施形態のいずれかに記載の組換えタンパク質。

【0212】

３２．相互作用の角度が、その同種受容体に対する親和性の減少をもたらす、先行する実施形態のいずれかに記載の組換えタンパク質。

【0213】

３３．先行する実施形態のいずれかに記載のタンパク質をコードする、単離された組換えポリヌクレオチド。

【0214】

３４．先行する実施形態のいずれかに記載のタンパク質をコードする、単離された組換えポリヌクレオチド。

【0215】

３５．先行する実施形態のいずれかに記載のタンパク質をコードする核酸を含む、ベクター。

【0216】

３６．先行する実施形態のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む、宿主細胞。

【0217】

３７．対象において炎症を処置または予防する方法であって、対象に、治療有効量の先行する実施形態のいずれかに記載のバリアントタンパク質を投与するステップを含む、方法。

【0218】

３８．変更されたバリアントタンパク質の角度が、野生型ＥＢＶ－ＩＬ１０を下回る、先行する実施形態に記載の方法。

【0219】

３９．バリアントタンパク質が、野生型ＥＢＶ－ＩＬ１０と比較したときに、中等度の親和性でＩＬ１０受容体に結合する、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。

【0220】

４０．炎症が、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪性肝臓疾患（ＮＡＦＬＤ）、乾癬、リウマチ性関節炎、急性アナフィラキシーショック、および／または季節性アレルギーである、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。

【0221】

４１．対象において自己免疫疾患を処置または予防する方法であって、対象に、治療有効量の先行する実施形態のいずれかに記載のバリアントタンパク質を投与するステップを含む、方法。

【0222】

４２．変更されたバリアントタンパク質の角度が、野生型ＥＢＶ－ＩＬ１０を下回る、先行する実施形態に記載の方法。

【0223】

４３．バリアントタンパク質が、野生型ＥＢＶ－ＩＬ１０と比較したときに、中等度の親和性でＩＬ１０受容体に結合する、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。

【0224】

４４．対象においてＩＢＤまたはクローン病を処置または予防する方法であって、対象に、治療有効量の先行する実施形態のいずれかに記載のバリアントタンパク質を投与するステップを含む、方法。

【0225】

４５．変更されたバリアントタンパク質の角度が、野生型ＥＢＶ－ＩＬ１０を下回る、先行する実施形態に記載の方法。

【0226】

４６．バリアントタンパク質が、野生型ＥＢＶ－ＩＬ１０と比較したときに、中等度の親和性でＩＬ１０受容体に結合する、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。

【0227】

４７．対象において非アルコール性脂肪性肝臓疾患（ＮＡＦＬＤ）または非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）を処置または予防する方法であって、対象に、治療有効量の請求項１に記載のバリアントタンパク質を投与するステップを含む、方法。

【0228】

４８．変更されたバリアントタンパク質の角度が、野生型ＥＢＶ－ＩＬ１０を下回る、先行する実施形態に記載の方法。

【0229】

４９．バリアントタンパク質が、野生型ＥＢＶ－ＩＬ１０と比較したときに、中等度の親和性でＩＬ１０受容体に結合する、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。

【0230】

５０．対象においてがんを処置または予防する方法であって、対象に、治療有効量の先行する実施形態のいずれかに記載のバリアントタンパク質を投与するステップを含む、方法。

【0231】

５１．変更されたバリアントタンパク質の角度が、野生型ＥＢＶ－ＩＬ１０を上回る、先行する実施形態に記載の方法。

【0232】

５２．バリアントタンパク質が、野生型ＥＢＶ－ＩＬ１０と比較したときに、増加した親和性でＩＬ１０受容体に結合する、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。

【0233】

５３．操作された融合タンパク質であって、融合タンパク質の第１の末端にコンジュゲートされた少なくとも１つのＩＬ－１０またはＩＬ－１０バリアント分子の単量体と、融合タンパク質の第２の末端にコンジュゲートされた少なくとも１つのサイトカインまたはその単量体と、リンカーまたはスペーサーとを含み、
リンカーまたはスペーサーが、第１および第２の末端を接続する、
操作された融合タンパク質。

【0234】

５４．リンカーまたはスペーサーが、抗体の定常領域である、先行する実施形態に記載の融合タンパク質。

【0235】

５５．定常領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、またはＩｇＥに由来する、先行する実施形態のいずれかに記載の融合タンパク質。

【0236】

５６．リンカーまたはスペーサーが、少なくとも２つの鎖間ジスルフィド結合をさらに含む、先行する実施形態のいずれかに記載の融合タンパク質。

【0237】

５７．リンカーまたはスペーサーが、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、またはその断片である、先行する実施形態のいずれかに記載の融合タンパク質。

【0238】

５８．定常領域が、重鎖定常（ＣＨ）領域１、ＣＨ２、ＣＨ３、またはこれらの任意の組合せである、先行する実施形態のいずれかに記載の融合タンパク質。

【0239】

５９．少なくとも１つのＩＬ－１０またはＩＬ－１０バリアント分子が、融合タンパク質のＮ末端、Ｃ末端、または両方にコンジュゲートされている、先行する実施形態のいずれかに記載の融合タンパク質。

【0240】

６０．もう一方の末端にコンジュゲートされる少なくとも１つのサイトカインが、ＩＬ－１０、ＩＬ－１０バリアント分子、ＩＬ－６、ＩＬ－４、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－５、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１５、ＩＬ－２６、ＩＬ－２７、ＩＬ－２８、ＩＬ－２９、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、インターフェロン－α、－β、－γ、ＴＧＦ－β、もしくは腫瘍壊死因子－α、－β、塩基性ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＬ－４、ＩＬ－１１、もしくはＩＬ－１３、またはこれらの任意の組合せを含む、先行する実施形態のいずれかに記載の融合タンパク質。

【0241】

６１．融合タンパク質が、融合タンパク質のＮ末端にコンジュゲートされた２つのＩＬ－１０またはＩＬ－１０バリアント分子、ならびに融合タンパク質のＣ末端にコンジュゲートされた２つのＩＬ－１０またはＩＬ－１０バリアント分子を含む、先行する実施形態のいずれかに記載の融合タンパク質。

【0242】

６２．融合タンパク質が、融合タンパク質のＮ末端にコンジュゲートされた２つのＩＬ－１０またはＩＬ－１０バリアント分子、ならびに融合タンパク質のＣ末端にコンジュゲートされた少なくとも１つのＩＬ－２分子を含む、先行する実施形態のいずれかに記載の融合タンパク質。

【0243】

６３．Ｃ末端が、ＩＬ－６、ＩＬ－４、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－５、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１５、ＩＬ－２６、ＩＬ－２７、ＩＬ－２８、ＩＬ－２９、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、インターフェロン－α、－β、－γ、ＴＧＦ－β、または腫瘍壊死因子－α、－β、塩基性ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＬ－４、ＩＬ－１１、またはＩＬ－１３をさらに含む、先行する実施形態のいずれかに記載の融合タンパク質。

【0244】

６４．融合タンパク質が、融合タンパク質のＮ末端にコンジュゲートされた２つのＩＬ－１０またはＩＬ－１０バリアント分子、ならびに融合タンパク質のＣ末端にコンジュゲートされた少なくとも１つのＩＬ－１５分子を含む、先行する実施形態のいずれかに記載の融合タンパク質。

【0245】

６５．Ｃ末端が、ＩＬ－６、ＩＬ－４、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－５、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１５、ＩＬ－２６、ＩＬ－２７、ＩＬ－２８、ＩＬ－２９、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、インターフェロン－α、－β、－γ、ＴＧＦ－β、または腫瘍壊死因子－α、－β、塩基性ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＬ－４、ＩＬ－１１、またはＩＬ－１３をさらに含む、融合タンパク質ｖ。

【0246】

６６．融合タンパク質が、融合タンパク質のＮ末端にコンジュゲートされた２つのＩＬ－１０またはＩＬ－１０バリアント分子、ならびに融合タンパク質のＣ末端にコンジュゲートされた少なくとも１つのＩＬ－２分子を含む、先行する実施形態のいずれかに記載の融合タンパク質。

【0247】

６７．Ｃ末端が、ＩＬ－１０、ＩＬ－１０バリアント分子、ＩＬ－６、ＩＬ－４、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－５、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１５、ＩＬ－２６、ＩＬ－２７、ＩＬ－２８、ＩＬ－２９、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、インターフェロン－α、－β、－γ、ＴＧＦ－β、または腫瘍壊死因子－α、－β、塩基性ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＬ－４、ＩＬ－１１、またはＩＬ－１３をさらに含む、先行する実施形態のいずれかに記載の融合タンパク質。

【0248】

６８．融合タンパク質が、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）スキャフォールド上に作製される、先行する実施形態のいずれかに記載の融合タンパク質。

【0249】

６９．融合タンパク質が、ダイアボディスキャフォールド上に作製される、先行する実施形態のいずれかに記載の融合タンパク質。

【0250】

７０．融合タンパク質が、Ｆａｂスキャフォールド上に作製される、先行する実施形態のいずれかに記載の融合タンパク質。

【0251】

７１．融合タンパク質が、融合タンパク質の第１の末端にコンジュゲートされた少なくとも１つのＩＬ－１０またはＩＬ－１０バリアント分子の単量体と、融合タンパク質の第２の末端にコンジュゲートされた少なくとも１つのサイトカインまたはその単量体と、リンカーまたはスペーサーとを有する別の融合タンパク質と複合体を形成し、
リンカーまたはスペーサーが、第１および第２の末端を接続する、
先行する実施形態のいずれかに記載の融合タンパク質。

【0252】

７２．がんの処置を、それを必要とする対象において行う方法であって、対象に、先行する実施形態のいずれかに記載の操作された融合タンパク質を投与するステップを含む、方法。

【0253】

７３．ＩＢＤまたはクローン病を処置または予防する方法であって、対象に、先行する実施形態のいずれかに記載の操作された融合タンパク質を投与するステップを含む、方法。

【0254】

７４．対象において非アルコール性脂肪性肝臓疾患（ＮＡＦＬＤ）または非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）を処置または予防する方法であって、対象に、先行する実施形態のいずれかに記載の操作された融合タンパク質を投与するステップを含む、方法。

【0255】

７５．ＣＤ８陽性Ｔ細胞を活性化する方法であって、先行する実施形態のいずれかに記載の操作された融合タンパク質を投与するステップを含む、方法。

【0256】

７６．投与が、ｉｎ ｖｉｔｒｏ投与である、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。

【0257】

７７．投与が、それを必要とする対象へのｉｎ ｖｉｖｏ投与であり、対象が、がん、ＩＢＤ、もしくはクローン病、またはＮＡＦＬＤもしくはＮＡＳＨと診断されている、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。

【0258】

７８．融合タンパク質が、融合タンパク質の第１の末端におけるＩＬ－１０またはＩＬ－１０バリアント分子、ならびに融合タンパク質の第２の末端におけるＩＬ－２および／またはＩＬ－１５を含む、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。

【0259】

７９．がんの処置を、それを必要とする対象において行う方法であって、対象に、二重特異性Ｔ細胞結合因子（ＢＩＴＥ）、ならびにＩＬ－１０、ＩＬ－１０バリアント分子、またはＩＬ－１０もしくはＩＬ－１０バリアント分子を含む操作された融合タンパク質を投与するステップを含む、方法。

【0260】

８０．操作された融合タンパク質が、融合タンパク質の第１の末端にコンジュゲートされた少なくとも１つのＩＬ－１０またはＩＬ－１０バリアント分子と、融合タンパク質の第２の末端にコンジュゲートされた少なくとも１つのサイトカインと、リンカーまたはスペーサーとを含み、リンカーまたはスペーサーが、第１および第２の末端を接続する、先行する実施形態に記載の方法。

【0261】

８１．ＩＬ－１０、ＩＬ－１０バリアント分子、またはＩＬ－１０もしくはＩＬ－１０バリアント分子を含む操作された融合タンパク質が、Ｔ細胞受容体複合体（ＣＤ３）シグナル伝達を増加および持続させる、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。

【0262】

８２．対象において炎症を処置または予防する方法であって、対象に、治療有効量のバリアントＩＬ－１０分子をコードするヌクレオチド配列を投与するステップを含む、方法。

【0263】

８３．ヌクレオチド配列が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその改変されたバリアントである、先行する実施形態に記載の方法。

【0264】

８４．ヌクレオチド配列が、ヌクレオシドに連結されたｍＲＮＡまたは改変されたｍＲＮＡである、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。

【0265】

８５．ヌクレオチド配列が、細胞、組織、または生物内においてバリアントＩＬ－１０分子をｉｎ ｖｉｖｏ発現させることができる、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。

【0266】

８６．ヌクレオチド配列が、細胞透過性ペプチド、疎水性部分、静電複合体、リポソーム、リガンド、リポソームナノ粒子、リポタンパク質（好ましくは、ＨＤＬもしくはＬＤＬ）、葉酸標的化リポソーム、抗体（例えば、葉酸受容体、トランスフェリン受容体）、標的化ペプチドによって、またはアプタマーによって、細胞、組織、または生物に送達される、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。

【0267】

８７．対象において自己免疫疾患を処置または予防する方法であって、対象に、治療有効量のバリアントＩＬ－１０分子をコードするヌクレオチド配列を投与するステップを含む、方法。

【0268】

８８．ヌクレオチド配列が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその改変されたバリアントである、先行する実施形態に記載の方法。

【0269】

８９．ヌクレオチド配列が、ヌクレオシドに連結されたｍＲＮＡまたは改変されたｍＲＮＡである、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。

【0270】

９０．ヌクレオチド配列が、細胞、組織、または生物内においてバリアントＩＬ－１０分子をｉｎ ｖｉｖｏ発現させることができる、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。

【0271】

９１．ヌクレオチド配列が、細胞透過性ペプチド、疎水性部分、静電複合体、リポソーム、リガンド、リポソームナノ粒子、リポタンパク質（好ましくは、ＨＤＬもしくはＬＤＬ）、葉酸標的化リポソーム、抗体（例えば、葉酸受容体、トランスフェリン受容体）、標的化ペプチドによって、またはアプタマーによって、細胞、組織、または生物に送達される、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。

【0272】

９２．対象においてＩＢＤまたはクローン病を処置または予防する方法であって、対象に、治療有効量のバリアントＩＬ－１０分子をコードするヌクレオチド配列を投与するステップを含む、方法。

【0273】

９３．ヌクレオチド配列が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその改変されたバリアントである、先行する実施形態に記載の方法。

【0274】

９４．ヌクレオチド配列が、ヌクレオシドに連結されたｍＲＮＡまたは改変されたｍＲＮＡである、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。

【0275】

９５．ヌクレオチド配列が、細胞、組織、または生物内においてバリアントＩＬ－１０分子をｉｎ ｖｉｖｏ発現させることができる、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。

【0276】

９６．ヌクレオチド配列が、細胞透過性ペプチド、疎水性部分、静電複合体、リポソーム、リガンド、リポソームナノ粒子、リポタンパク質（好ましくは、ＨＤＬもしくはＬＤＬ）、葉酸標的化リポソーム、抗体（例えば、葉酸受容体、トランスフェリン受容体）、標的化ペプチドによって、またはアプタマーによって、細胞、組織、または生物に送達される、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。

【0277】

９７．対象において非アルコール性脂肪性肝臓疾患（ＮＡＦＬＤ）または非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）を処置または予防する方法であって、対象に、治療有効量のバリアントＩＬ－１０分子をコードするヌクレオチド配列を投与するステップを含む、方法。

【0278】

９８．ヌクレオチド配列が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその改変されたバリアントである、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。

【0279】

９９．ヌクレオチド配列が、ヌクレオシドに連結されたｍＲＮＡまたは改変されたｍＲＮＡである、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。

【0280】

１００．ヌクレオチド配列が、細胞、組織、または生物内においてバリアントＩＬ－１０分子をｉｎ ｖｉｖｏ発現させることができる、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。

【0281】

１０１．ヌクレオチド配列が、細胞透過性ペプチド、疎水性部分、静電複合体、リポソーム、リガンド、リポソームナノ粒子、リポタンパク質（好ましくは、ＨＤＬもしくはＬＤＬ）、葉酸標的化リポソーム、抗体（例えば、葉酸受容体、トランスフェリン受容体）、標的化ペプチドによって、またはアプタマーによって、細胞、組織、または生物に送達される、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。

【0282】

１０２．少なくとも２つの異なる抗体に由来する２つの可変領域に連結された単量体ＩＬ－１０分子またはそのバリアントを含む、融合タンパク質であって、２つの可変領域が、第１の抗体に由来する重鎖可変（ＶＨ）領域が第２の抗体に由来する軽鎖可変（ＶＬ）領域に連結されたもの、または第１の抗体に由来するＶＬが第２の抗体に由来するＶＨに連結されたものとして構成される、融合タンパク質。

【0283】

１０３．単量体ＩＬ－１０分子またはそのバリアントが、ＩＬ－１０受容体に対する親和性を増加または減少させる少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、先行する実施形態のいずれかに記載の融合タンパク質。

【0284】

１０４．単量体ＩＬ－１０分子またはそのバリアントが、ＩＬ－１０受容体に対する親和性を増加させる少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、先行する実施形態のいずれかに記載の融合タンパク質。

【0285】

１０５．単量体ＩＬ－１０分子またはそのバリアントが、配列番号３のエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）ＩＬ－１０ホモログである、先行する実施形態のいずれかに記載の融合タンパク質。

【0286】

１０６．ＥＢＶ ＩＬ－１０ホモログが、３１位、７５位、または両方におけるアミノ酸置換を含む、先行する実施形態のいずれかに記載の融合タンパク質。

【0287】

１０７．ＥＢＶ－ＩＬ－１０ホモログが、３１位におけるアミノ酸置換を含む、先行する実施形態のいずれかに記載の融合タンパク質。

【0288】

１０８．ＥＢＶ－ＩＬ－１０ホモログが、７５位におけるアミノ酸置換を含む、先行する実施形態のいずれかに記載の融合タンパク質。

【0289】

１０９．ＥＢＶ－ＩＬ－１０ホモログが、３１位および７５位におけるアミノ酸置換を含む、先行する実施形態のいずれかに記載の融合タンパク質。

【0290】

１１０．ＥＢＶ－ＩＬ－１０ホモログが、Ｖ３１Ｌアミノ酸置換を含む、先行する実施形態のいずれかに記載の融合タンパク質。

【0291】

１１１．ＥＢＶ－ＩＬ－１０ホモログが、Ａ７５Ｉアミノ酸置換を含む、先行する実施形態のいずれかに記載の融合タンパク質。

【0292】

１１２．ＥＢＶ－ＩＬ－１０ホモログが、Ｖ３１ＬおよびＡ７５Ｉアミノ酸置換を含む、先行する実施形態のいずれかに記載の融合タンパク質。

【0293】

１１３．第１の抗体のＶＨ領域が、抗ＨＩＶモノクローナル抗体に由来し、第２の抗体のＶＬ領域が、抗エボラモノクローナル抗体に由来する、先行する実施形態のいずれかに記載の融合タンパク質。

【0294】

１１４．第１の抗体のＶＨ領域が、抗エボラモノクローナル抗体に由来し、第２の抗体のＶＬ領域が、抗ＨＩＶモノクローナル抗体に由来する、先行する実施形態のいずれかに記載の融合タンパク質。

【0295】

１１５．融合タンパク質が、配列番号２４～２８、２９、３３～５１、６１、６３、６５、または６７から選択されるアミノ酸配列である、先行する実施形態のいずれかに記載の融合タンパク質。

【0296】

１１６．融合タンパク質が、ダイアボディである、先行する実施形態のいずれかに記載の融合タンパク質。

【0297】

１１７．融合タンパク質が、（ａ）第１の抗体のＶＨ領域がそのカルボキシ末端において第２の抗体のＶＬ領域のアミノ末端に連結され、これが、続いてＩＬ－１０もしくはそのバリアントの単量体のアミノ末端に連結されたもの、または
（ｂ）ＩＬ－１０分子もしくはそのバリアントがそのカルボキシ末端において第２の抗体のＶＨ領域のアミノ末端に連結され、これが、続いて第１の抗体のＶＬ領域のアミノ末端に連結されたもの
から選択される構成を含む、先行する実施形態のいずれかに記載の融合タンパク質。

【0298】

１１８．構成（ａ）および（ｂ）が、一緒に、ダイアボディ複合体を形成する、先行する実施形態のいずれかに記載の融合タンパク質。

【0299】

１１９．ＶＨ領域とＶＬ領域との間にリンカーをさらに含む、先行する実施形態のいずれかに記載の融合タンパク質。

【0300】

１２０．アミノ酸配列が、配列番号２４～２８、２９、３３～５３、６１、６３、６５、６７から選択される、先行する実施形態のいずれかに記載の融合タンパク質。

【0301】

１２１．第１および第２の抗体が、対象における抗原性を低減させる１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、先行する実施形態のいずれかに記載の融合タンパク質。

【0302】

１２２．イムノコンジュゲート複合体であって、ｉ）第１の融合タンパク質であって、そのアミノ末端に第１の抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）が第２の抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）に連結され、それがさらにＩＬ－１０またはそのバリアントの単量体に連結されたものを含む、第１の融合タンパク質と、ｉｉ）第２の融合タンパク質であって、そのアミノ末端にＩＬ－１０またはそのバリアントの単量体が第２の抗体のＶＨに連結され、それがさらに第１の抗体のＶＬに連結されたものを含む、第２の融合タンパク質とを含み、第１および第２の抗体のＶＨおよびＶＬが、会合して、ダイアボディとなり、ＩＬ－１０の単量体が、機能性二量体ＩＬ－１０分子を形成する、イムノコンジュゲート複合体。

【0303】

１２３．ＩＬ－１０の単量体が、ＩＬ－１０受容体に対する親和性を増加または減少させる少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、先行する実施形態のいずれかに記載のイムノコンジュゲート複合体。

【0304】

１２４．ＩＬ－１０分子が、ＩＬ－１０受容体に対する親和性を増加させる少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、先行する実施形態のいずれかに記載のイムノコンジュゲート複合体。

【0305】

１２５．ＩＬ－１０の単量体が、配列番号３のエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）ＩＬ－１０ホモログである、先行する実施形態のいずれかに記載のイムノコンジュゲート複合体。

【0306】

１２６．ＥＢＶ ＩＬ－１０ホモログが、３１位、７５位、または両方におけるアミノ酸置換を含む、先行する実施形態のいずれかに記載のイムノコンジュゲート複合体。

【0307】

１２７．ＥＢＶ－ＩＬ－１０ホモログが、３１位におけるアミノ酸置換を含む、先行する実施形態のいずれかに記載のイムノコンジュゲート複合体。

【0308】

１２８．ＥＢＶ－ＩＬ－１０ホモログが、７５位におけるアミノ酸置換を含む、先行する実施形態のいずれかに記載のイムノコンジュゲート複合体。

【0309】

１２９．ＥＢＶ－ＩＬ－１０ホモログが、３１位および７５位におけるアミノ酸置換を含む、先行する実施形態のいずれかに記載のイムノコンジュゲート複合体。

【0310】

１３０．ＥＢＶ－ＩＬ－１０ホモログが、Ｖ３１Ｌアミノ酸置換を含む、先行する実施形態のいずれかに記載のイムノコンジュゲート複合体。

【0311】

１３１．ＥＢＶ－ＩＬ－１０ホモログが、Ａ７５Ｉアミノ酸置換を含む、先行する実施形態のいずれかに記載のイムノコンジュゲート複合体。

【0312】

１３２．ＥＢＶ－ＩＬ－１０ホモログが、Ｖ３１ＬおよびＡ７５Ｉアミノ酸置換を含む、先行する実施形態のいずれかに記載のイムノコンジュゲート複合体。

【0313】

１３３．第１の抗体が、抗ＨＩＶモノクローナル抗体に由来し、第２の抗体が、抗エボラモノクローナル抗体に由来する、先行する実施形態のいずれかに記載のイムノコンジュゲート複合体。

【0314】

１３４．第１の融合タンパク質が、配列番号２４、２６、２８、３５、３８、４１、４６、４８、または５０から選択されるアミノ酸配列である、先行する実施形態のいずれかに記載のイムノコンジュゲート複合体。

【0315】

１３５．第２の融合タンパク質が、配列番号２５、２７、２９、３６、３９、４２、４７、４９、または５１から選択されるアミノ酸配列である、先行する実施形態のいずれかに記載のイムノコンジュゲート複合体。

【0316】

１３６．ＶＨ領域とＶＬ領域との間にリンカーをさらに含む、先行する実施形態のいずれかに記載のイムノコンジュゲート複合体。

【0317】

１３７．第１の融合タンパク質におけるＩＬ－１０の単量体が、そのアミノ末端によって、ＶＬ領域に連結されている、先行する実施形態のいずれかに記載のイムノコンジュゲート複合体。

【0318】

１３８．第２の融合タンパク質におけるＩＬ－１０の単量体が、そのカルボキシ末端によって、ＶＨ領域に連結されている、先行する実施形態のいずれかに記載のイムノコンジュゲート複合体。

【0319】

１３９．第１および第２の抗体が、対象における抗原性を低減させる１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、先行する実施形態のいずれかに記載のイムノコンジュゲート複合体。

【0320】

１４０．第１の抗体に由来する重鎖可変領域（ＶＨ）、第２の抗体に由来する軽鎖可変領域（ＶＬ）、および単量体ＩＬ－１０を含む第１のペプチド鎖と、第２の抗体に由来するＶＨおよびＶＬならびに単量体ＩＬ－１０分子を含む第２のペプチド鎖とを含む、ダイアボディであって、第１の抗体のＶＨ領域が、第１の抗体のＶＬ領域と会合し、第２の抗体のＶＨ領域が、第２の抗体のＶＬ領域と会合し、それによって、それぞれのペプチド鎖の単量体ＩＬ－１０分子が、機能性ＩＬ－１０二量体を形成することが可能となる、ダイアボディ。

【0321】

１４１．単量体ＩＬ－１０が、ＩＬ－１０受容体に対する親和性を増加または減少させる少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、先行する実施形態のいずれかに記載のダイアボディ。

【0322】

１４２．単量体ＩＬ－１０分子が、ＩＬ－１０受容体に対する親和性を増加させる少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、先行する実施形態のいずれかに記載のダイアボディ。

【0323】

１４３．単量体ＩＬ－１０分子が、配列番号３のエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）ＩＬ－１０ホモログである、先行する実施形態のいずれかに記載のダイアボディ。

【0324】

１４４．ＥＢＶ ＩＬ－１０ホモログが、３１位、７５位、または両方におけるアミノ酸置換を含む、先行する実施形態のいずれかに記載のダイアボディ。

【0325】

１４５．ＥＢＶ－ＩＬ－１０ホモログが、３１位におけるアミノ酸置換を含む、先行する実施形態のいずれかに記載のダイアボディ。

【0326】

１４６．ＥＢＶ－ＩＬ－１０ホモログが、７５位におけるアミノ酸置換を含む、先行する実施形態のいずれかに記載のダイアボディ。

【0327】

１４７．ＥＢＶ－ＩＬ－１０ホモログが、３１位および７５位におけるアミノ酸置換を含む、先行する実施形態のいずれかに記載のダイアボディ。

【0328】

１４８．ＥＢＶ－ＩＬ－１０ホモログが、Ｖ３１Ｌアミノ酸置換を含む、先行する実施形態のいずれかに記載のダイアボディ。

【0329】

１４９．ＥＢＶ－ＩＬ－１０ホモログが、Ａ７５Ｉアミノ酸置換を含む、先行する実施形態のいずれかに記載のダイアボディ。

【0330】

１５０．ＥＢＶ－ＩＬ－１０ホモログが、Ｖ３１ＬおよびＡ７５Ｉアミノ酸置換を含む、先行する実施形態のいずれかに記載のダイアボディ。

【0331】

１５１．第１の抗体が、抗ＨＩＶモノクローナル抗体に由来し、第２の抗体が、抗エボラモノクローナル抗体に由来する、先行する実施形態のいずれかに記載のダイアボディ。

【0332】

１５２．第１のペプチド鎖が、配列番号２４、２６、２８、３５、３８、４１、４６、４８、または５０から選択されるアミノ酸配列である、先行する実施形態のいずれかに記載のダイアボディ。

【0333】

１５３．第２のペプチド鎖が、配列番号２５、２７、２９、３６、３９、４２、４７、４９、または５１から選択されるアミノ酸配列である、先行する実施形態のいずれかに記載のダイアボディ。

【0334】

１５４．ＶＨ領域とＶＬ領域との間にリンカーをさらに含む、先行する実施形態のいずれかに記載のダイアボディ。

【0335】

１５５．第１および第２の抗体が、対象における抗原性を低減させる１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、先行する実施形態のいずれかに記載のダイアボディ。

【0336】

１５６．ＩＬ－１０の単量体が、そのカルボキシ末端によって、第１および第２のペプチド鎖に連結されている、先行する実施形態のいずれかに記載のダイアボディ。

【0337】

１５７．第１および第２の抗体が、対象における抗原性を低減させる１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、先行する実施形態のいずれかに記載のダイアボディ。

【0338】

１５８．ｉ）第１の融合タンパク質であって、そのアミノ末端に、第１の抗体の重鎖可変（ＶＨ）領域およびそのアミノ末端によって連結された単量体ＩＬ－１０分子を含む、第１の融合タンパク質と、ｉｉ）第２の融合タンパク質であって、そのアミノ末端に、第１の抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）に連結されたＩＬ－１０の単量体を含む、第２の融合タンパク質とを含む、イムノコンジュゲート複合体であって、第１の抗体のＶＨ領域が、第１の抗体のＶＬ領域と会合し、それによって、それぞれのペプチド鎖の単量体ＩＬ－１０分子が、機能性ＩＬ－１０二量体を形成することが可能となる、イムノコンジュゲート複合体。

【0339】

１５９．ＩＬ－１０の単量体が、ＩＬ－１０受容体に対する親和性を増加または減少させる少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、先行する実施形態のいずれかに記載のイムノコンジュゲート複合体。

【0340】

１６０．ＩＬ－１０分子が、ＩＬ－１０受容体に対する親和性を増加させる少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、先行する実施形態のいずれかに記載のイムノコンジュゲート複合体。

【0341】

１６１．ＩＬ－１０の単量体が、配列番号３のエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）ＩＬ－１０ホモログである、先行する実施形態のいずれかに記載のイムノコンジュゲート複合体。

【0342】

１６２．ＥＢＶ ＩＬ－１０ホモログが、３１位、７５位、または両方におけるアミノ酸置換を含む、先行する実施形態のいずれかに記載のイムノコンジュゲート複合体。

【0343】

１６３．ＥＢＶ－ＩＬ－１０ホモログが、３１位におけるアミノ酸置換を含む、先行する実施形態のいずれかに記載のイムノコンジュゲート複合体。

【0344】

１６４．ＥＢＶ－ＩＬ－１０ホモログが、７５位におけるアミノ酸置換を含む、先行する実施形態のいずれかに記載のイムノコンジュゲート複合体。

【0345】

１６５．ＥＢＶ－ＩＬ－１０ホモログが、３１位および７５位におけるアミノ酸置換を含む、先行する実施形態のいずれかに記載のイムノコンジュゲート複合体。

【0346】

１６６．ＥＢＶ－ＩＬ－１０ホモログが、Ｖ３１Ｌアミノ酸置換を含む、先行する実施形態のいずれかに記載のイムノコンジュゲート複合体。

【0347】

１６７．ＥＢＶ－ＩＬ－１０ホモログが、Ａ７５Ｉアミノ酸置換を含む、先行する実施形態のいずれかに記載のイムノコンジュゲート複合体。

【0348】

１６８．ＥＢＶ－ＩＬ－１０ホモログが、Ｖ３１ＬおよびＡ７５Ｉアミノ酸置換を含む、先行する実施形態のいずれかに記載のイムノコンジュゲート複合体。

【0349】

１６９．第１の抗体のＶＨおよびＶＬ領域が、抗上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）モノクローナル抗体に由来する、先行する実施形態のいずれかに記載のイムノコンジュゲート複合体。

【0350】

１７０．第１の融合タンパク質が、第１の抗体のＶＨ領域を単量体ＩＬ－１０に連結させる第２の抗体に由来するＶＬ領域をさらに含み、第２の融合タンパク質が、単量体ＩＬ－１０をＶＬ領域に連結させる第２の抗体に由来するＶＨ領域をさらに含む、先行する実施形態のいずれかに記載のイムノコンジュゲート複合体。

【0351】

１７１．第２の抗体のＶＨおよびＶＬ領域が、抗エボラモノクローナル抗体に由来する、先行する実施形態のいずれかに記載のイムノコンジュゲート複合体。

【0352】

１７２．可変領域が、リンカーを通じてＩＬ－１０の単量体に連結されている、先行する実施形態のいずれかに記載のイムノコンジュゲート複合体。

【0353】

１７３．第１および第２の抗体が、対象における抗原性を低減させる１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、先行する実施形態のいずれかに記載のイムノコンジュゲート複合体。

【0354】

１７４．第１および第２の抗体が、対象における抗原性を低減させる１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、先行する実施形態のいずれかに記載のイムノコンジュゲート複合体。

【0355】

１７５．ＩＬ－１０の単量体に融合された第１の抗体の軽鎖可変（ＶＬ）および重鎖可変（ＶＨ）領域を含む、融合タンパク質であって、ＩＬ－１０単量体が、互いに直接的に連結されている、融合タンパク質。

【0356】

１７６．ＩＬ－１０単量体が、第１のＩＬ－１０単量体のカルボキシ末端から、第２のＩＬ－１０単量体のアミノ末端まで連結されている、先行する実施形態のいずれかに記載の融合タンパク質。

【0357】

１７７．融合タンパク質が、アミノ末端からカルボキシ末端への様式で以下の：第１の抗体のＶＬ領域が第１のＩＬ－１０単量体に連結され、これが第２のＩＬ－１０単量体に連結され、これが第１の抗体のＶＨ領域に連結された構成を含む、先行する実施形態のいずれかに記載の融合タンパク質。

【0358】

１７８．第２の抗体のＶＨ領域が第１の抗体のＶＬ領域のアミノ末端に連結され、第２の抗体のＶＬ領域が第１の抗体のＶＨ領域のカルボキシ末端に連結されたものをさらに含む、先行する実施形態のいずれかに記載の融合タンパク質。

【0359】

１７９．ＩＬ－１０単量体が、それぞれ、ＩＬ－１０受容体に対する親和性を増加または減少させる少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、先行する実施形態のいずれかに記載の融合タンパク質。

【0360】

１８０．ＩＬ－１０単量体が、それぞれ、ＩＬ－１０受容体に対する親和性を増加させる少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、先行する実施形態のいずれかに記載の融合タンパク質。

【0361】

１８１．ＩＬ－１０単量体が、配列番号３のエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）ＩＬ－１０ホモログである、先行する実施形態のいずれかに記載の融合タンパク質。

【0362】

１８２．ＥＢＶ ＩＬ－１０ホモログが、３１位、７５位、または両方におけるアミノ酸置換を含む、請求項１８１に記載の融合タンパク質。

【0363】

１８３．ＥＢＶ－ＩＬ－１０ホモログが、３１位におけるアミノ酸置換を含む、先行する実施形態のいずれかに記載の融合タンパク質。

【0364】

１８４．ＥＢＶ－ＩＬ－１０ホモログが、７５位におけるアミノ酸置換を含む、先行する実施形態のいずれかに記載の融合タンパク質。

【0365】

１８５．ＥＢＶ－ＩＬ－１０ホモログが、Ｖ３１Ｌアミノ酸置換を含む、先行する実施形態のいずれかに記載の融合タンパク質。

【0366】

１８６．ＥＢＶ－ＩＬ－１０ホモログが、Ａ７５Ｉアミノ酸置換を含む、先行する実施形態のいずれかに記載の融合タンパク質。

【0367】

１８７．第１の抗体が、抗エボラモノクローナル抗体である、先行する実施形態のいずれかに記載の融合タンパク質。

【0368】

１８８．第１の抗体が、抗上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）モノクローナル抗体である、先行する実施形態のいずれかに記載の融合タンパク質。

【0369】

１８９．第１の抗体が、抗エボラモノクローナル抗体であり、第２の抗体が、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体である、先行する実施形態のいずれかに記載の融合タンパク質。

【0370】

１９０．疾患、障害、または状態の処置を、それを必要とする患者において行う方法であって、患者に、治療有効量のエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）ＩＬ－１０イムノコンジュゲート複合体を投与するステップを含み、イムノコンジュゲート複合体が、約６０～１５５ｋＤａの分子量を有し、治療有効量が、約０．５マイクログラム／キログラム～１００マイクログラム／キログラムの範囲内であり、イムノコンジュゲートのＥＢＶ ＩＬ－１０部分が、配列番号３に由来する、方法。

【0371】

１９１．イムノコンジュゲート複合体が、１ヶ月に１回、１ヶ月に２回、１週間に１回、１週間に２回、１週間に３回、または１日１回投与される、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。

【0372】

１９２．バリアントＥＢＶ ＩＬ－１０が、ＩＬ－１０受容体への結合を増加または減少させる少なくとも１つのアミノ酸置換を含むバリアントである、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。

【0373】

１９３．バリアントＥＢＶ ＩＬ－１０が、配列番号３の３１位、７５位、または両方におけるアミノ酸置換を含む、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。

【0374】

１９４．バリアントＥＢＶ ＩＬ－１０が、Ｖ３１Ｌアミノ酸置換を含む、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。

【0375】

１９５．ＥＢＶ ＩＬ－１０が、Ａ７５Ｉアミノ酸置換を含む、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。

【0376】

１９６．ＥＢＶ ＩＬ－１０が、Ｖ３１ＬおよびＡ７５Ｉアミノ酸置換を含む、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。

【0377】

１９７．イムノコンジュゲート複合体が、２つの融合タンパク質の複合体である、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。

【0378】

１９８．イムノコンジュゲート複合体が、ｉ．第１の融合タンパク質であって、そのアミノ末端に、第１の抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）が第２の抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）に連結され、それがさらにＥＢＶ ＩＬ－１０の単量体のカルボキシ末端に連結されたものを含む、第１の融合タンパク質と、ｉｉ．第２の融合タンパク質であって、そのアミノ末端に、ＥＢＶ ＩＬ－１０の単量体が第２の抗体のＶＨに連結され、それがさらに第１の抗体のＶＬに連結されたものを含む、第２の融合タンパク質とを含み、第１および第２の抗体のＶＨおよびＶＬが、会合してダイアボディとなり、ＥＢＶ ＩＬ－１０の単量体が、機能性二量体ＥＢＶ ＩＬ－１０分子を形成する、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。

【0379】

１９９．第１の抗体および第２の抗体が、異なる抗体である、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。

【0380】

２００．第１の抗体が、抗ＨＩＶモノクローナル抗体であり、第２の抗体が、抗エボラモノクローナル抗体である、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。

【0381】

２０１．融合タンパク質が、配列番号２４～５１から選択されるアミノ酸配列である、請求項２０２に記載の方法。

【0382】

２０２．第１の融合タンパク質が、配列番号２４、２６、２８、３５、３８、４１、４６、４８、または５０から選択されるアミノ酸配列である、請求項２０２に記載の方法。

【0383】

２０３．第２の融合タンパク質が、配列番号２５、２７、２９、３６、３９、４２、４７、４９、または５１から選択されるアミノ酸配列である、請求項２０２に記載の方法。

【0384】

２０４．イムノコンジュゲート複合体が、いずれかの末端に融合されたＥＢＶ ＩＬ－１０単量体を含むダイアボディであり、ＥＢＶ ＩＬ－１０単量体が、会合して機能性ＥＢＶ ＩＬ－１０二量体となることができる、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。

【0385】

２０５．疾患、障害、または状態が、がん、炎症性疾患、自己免疫疾患、またはコレステロールから選択される、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。

【0386】

２０６．ＥＢＶ ＩＬ－１０イムノコンジュゲート複合体が、少なくとも２～３日ごとの投与に基づいて、安定なＩＬ－１０血清濃度を維持するのに十分な量で投与される、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。

【0387】

２０７．イムノコンジュゲートが、ＴＮＦα分泌を抑制し、野生型ＩＬ－１０と類似の濃度でＩＦＮγ産生を誘導することができる、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。

【0388】

２０８．ＥＢＶ ＩＬ－１０イムノコンジュゲート複合体が、野生型ＩＬ－１０と類似の活性を有する、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。

【0389】

２０９．イムノコンジュゲート複合体が、
（ａ）第１の抗体のＶＨ領域がＮ末端において第２の抗体のＶＬ領域に連結され、それがＩＬ－１０分子のカルボキシ末端に連結されたものと、
（ｂ）ＩＬ－１０分子が第２の抗体のＶＨ領域に連結され、それが第１の抗体のＶＬ領域に連結されたもの
を含む、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。

【0390】

２１０．がんの処置を、それを必要とする患者において行う方法であって、患者に、第１の抗体に由来する重鎖可変領域（ＶＨ）、第２の抗体に由来する軽鎖可変領域（ＶＬ）、および単量体ＩＬ－１０分子を有する第１のペプチド鎖と、第２の抗体に由来するＶＨおよびＶＬならびに単量体ＩＬ－１０分子を有する第２のペプチド鎖とを含む、ダイアボディを投与するステップを含み、第１の抗体のＶＨ領域が、第１の抗体のＶＬ領域と会合し、第２の抗体のＶＨ領域が、第２の抗体のＶＬ領域と会合し、それによって、それぞれのペプチド鎖の単量体ＩＬ－１０分子が、機能性ＩＬ－１０二量体を形成することが可能となる、方法。

【0391】

２１１．単量体ＩＬ－１０が、配列番号３のエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）ＩＬ－１０ホモログである、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。

【0392】

２１２．ＥＢＶ ＩＬ－１０が、配列番号３の３１位におけるアミノ酸置換を含む、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。

【0393】

２１３．ＥＢＶ ＩＬ－１０が、Ｖ３１Ｌアミノ酸置換を含む、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。

【0394】

２１４．第１の抗体のＶＨ領域が、抗ＨＩＶモノクローナル抗体に由来し、第２の抗体のＶＬ領域が、抗エボラモノクローナル抗体に由来する、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。

【0395】

２１５．第１のペプチド鎖が、配列番号２８、３５、３８、４６から選択されるアミノ酸配列である、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。

【0396】

２１６．第２のペプチド鎖が、配列番号２９、３６、３９、４７から選択されるアミノ酸配列である、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。

【0397】

２１７．ＶＨ領域とＶＬ領域との間にリンカーをさらに含む、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。

【0398】

２１８．ＶＨおよびＶＬが、それぞれ、患者における抗原性を低減させる１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。

【0399】

２１９．第１の抗体が、抗ＨＩＶモノクローナル抗体に由来し、第２の抗体が、抗エボラモノクローナル抗体に由来する、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。

【0400】

２２０．ダイアボディが、アミノ末端からカルボキシ末端に以下の：（ａ）第１のペプチドが、第１の抗体のＶＨ領域が第２の抗体のＶＬ領域に連結され、それがＩＬ－１０単量体またはそのバリアントのアミノ末端に連結されたものを含み、
（ｂ）第２のペプチドが、ＩＬ－１０単量体が第２の抗体のＶＨ領域に連結され、それが第１の抗体のＶＬ領域に連結されたものを含む、
構成を有する、２つのペプチド鎖により形成される、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。

【0401】

２２１．コレステロールの処置を、それを必要とする患者において行う方法であって、患者に、第１の抗体に由来する重鎖可変領域（ＶＨ）、第２の抗体に由来する軽鎖可変領域（ＶＬ）、および単量体ＩＬ－１０を有する第１のペプチド鎖と、第２の抗体に由来するＶＨおよびＶＬならびに単量体ＩＬ－１０分子を有する第２のペプチド鎖とを含む、コレステロールを低減させる量のダイアボディを投与するステップを含み、第１の抗体のＶＨ領域が、第１の抗体のＶＬ領域と会合し、第２の抗体のＶＨ領域が、第２の抗体のＶＬ領域と会合し、それによって、それぞれのペプチド鎖の単量体ＩＬ－１０分子が、機能性ＩＬ－１０二量体を形成することが可能となる、方法。

【0402】

２２２．単量体ＩＬ－１０が、配列番号３のエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）ＩＬ－１０ホモログである、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。

【0403】

２２３．ＥＢＶ ＩＬ－１０が、配列番号３の３１位におけるアミノ酸置換を含む、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。

【0404】

２２４．ＥＢＶ ＩＬ－１０が、Ｖ３１Ｌアミノ酸置換を含む、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。

【0405】

２２５．第１の抗体のＶＨ領域が、抗ＨＩＶモノクローナル抗体に由来し、第２の抗体のＶＬ領域が、抗エボラモノクローナル抗体に由来する、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。

【0406】

２２６．第１のペプチド鎖が、配列番号２４または５０から選択されるアミノ酸配列である、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。

【0407】

２２７．第２のペプチド鎖が、配列番号２５または５１から選択されるアミノ酸配列である、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。

【0408】

２２８．ＶＨ領域とＶＬ領域との間にリンカーをさらに含む、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。

【0409】

２２９．ＶＨおよびＶＬが、それぞれ、患者における抗原性を低減させる１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。

【0410】

２３０．第１の抗体が、抗ＨＩＶモノクローナル抗体に由来し、第２の抗体が、抗エボラモノクローナル抗体に由来する、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。

【0411】

２３１．ダイアボディが、アミノ末端からカルボキシ末端に以下の：
（ａ）第１のペプチド鎖が、第１の抗体のＶＨ領域が第２の抗体のＶＬ領域に連結され、これが、ＩＬ－１０単量体またはそのバリアントのアミノ末端に連結されたものを含み、
（ｂ）第２のペプチドが、ＩＬ－１０単量体またはそのバリアントが第２の抗体のＶＨ領域に連結され、それが第１の抗体のＶＬ領域に連結されたものを含む、
構成を有する、２つのペプチド鎖によって形成される、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。

【0412】

２３２．非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）または非アルコール性脂肪性肝臓疾患（ＮＡＦＬＤ）の処置を、それを必要とする患者において行う方法であって、患者に、第１の抗体に由来する重鎖可変領域（ＶＨ）、第２の抗体に由来する軽鎖可変領域（ＶＬ）、および単量体ＩＬ－１０を有する第１のペプチド鎖と、第２の抗体に由来するＶＨおよびＶＬならびに単量体ＩＬ－１０分子を有する第２のペプチド鎖とを含む、ＮＡＳＨまたはＮＡＦＬＤ量のダイアボディを投与するステップを含み、第１の抗体のＶＨ領域が、第１の抗体のＶＬ領域と会合し、第２の抗体のＶＨ領域が、第２の抗体のＶＬ領域と会合し、それによって、それぞれのペプチド鎖の単量体ＩＬ－１０分子が機能性ＩＬ－１０二量体を形成することが可能となる、方法。

【0413】

２３３．単量体ＩＬ－１０が、配列番号３のエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）ＩＬ－１０ホモログである、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。

【0414】

２３４．ＥＢＶ ＩＬ－１０が、配列番号３の３１位におけるアミノ酸置換を含む、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。

【0415】

２３５．ＥＢＶ ＩＬ－１０が、Ｖ３１Ｌアミノ酸置換を含む、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。

【0416】

２３６．第１の抗体のＶＨ領域が、抗ＨＩＶモノクローナル抗体に由来し、第２の抗体のＶＬ領域が、抗エボラモノクローナル抗体に由来する、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。

【0417】

２３７．第１のペプチド鎖が、配列番号２４または５０から選択されるアミノ酸配列である、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。

【0418】

２３８．第２のペプチド鎖が、配列番号２５または５１から選択されるアミノ酸配列である、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。

【0419】

２３９．ＶＨ領域とＶＬ領域との間にリンカーをさらに含む、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。

【0420】

２４０．ＶＨおよびＶＬが、それぞれ、患者における抗原性を低減させる１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。

【0421】

２４１．第１の抗体が、抗ＨＩＶモノクローナル抗体に由来し、第２の抗体が、抗エボラモノクローナル抗体に由来する、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。

【0422】

２４２．炎症の処置を、それを必要とする患者において行う方法であって、患者に、第１の抗体に由来する重鎖可変領域（ＶＨ）、第２の抗体に由来する軽鎖可変領域（ＶＬ）、および単量体ＩＬ－１０を有する第１のペプチド鎖と、第２の抗体に由来するＶＨおよびＶＬならびに単量体ＩＬ－１０分子を有する第２のペプチド鎖とを含む、抗炎症量のダイアボディを投与するステップを含み、第１の抗体のＶＨ領域が、第１の抗体のＶＬ領域と会合し、第２の抗体のＶＨ領域が、第２の抗体のＶＬ領域と会合し、それによって、それぞれのペプチド鎖の単量体ＩＬ－１０分子が、機能性ＩＬ－１０二量体を形成することが可能となる、方法。

【0423】

２４３．単量体ＩＬ－１０が、配列番号３のエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）ＩＬ－１０ホモログである、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。

【0424】

２４４．ＥＢＶ ＩＬ－１０が、配列番号３の７５位におけるアミノ酸置換を含む、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。

【0425】

２４５．ＥＢＶ ＩＬ－１０が、Ｖ３１Ｌアミノ酸置換を含む、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。

【0426】

２４６．第１の抗体のＶＨ領域が、抗ＨＩＶモノクローナル抗体に由来し、第２の抗体のＶＬ領域が、抗エボラモノクローナル抗体に由来する、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。

【0427】

２４７．第１のペプチド鎖が、配列番号２６、４１、または４８から選択されるアミノ酸配列である、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。

【0428】

２４８．第２のペプチド鎖が、配列番号２７、４２、４９から選択されるアミノ酸配列である、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。

【0429】

２４９．ＶＨ領域とＶＬ領域との間にリンカーをさらに含む、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。

【0430】

２５０．ＶＨおよびＶＬが、それぞれ、患者における抗原性を低減させる１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。

【0431】

２５１．第１の抗体が、抗ＨＩＶモノクローナル抗体に由来し、第２の抗体が、抗エボラモノクローナル抗体に由来する、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。

【0432】

２５２．式（Ｉ～ＶＩＩ）
ＩＬ１０－Ｌ^１－Ｘ^１－Ｌ^１－Ｘ^２－Ｌ^１－ＩＬ１０（式Ｉ）、（Ｚ）_ｎ－Ｘ^１－Ｌ^２－Ｙ^２－Ｌ^１－ＩＬ１０（式ＩＩ）、ＩＬ１０－Ｌ^１－Ｙ^１－Ｌ^２－Ｘ^２－（Ｚ）_ｎ（式ＩＩＩ）、Ｘ^１－Ｌ^２－Ｘ^２－Ｌ^１－ＩＬ１０（式ＩＶ）、ＩＬ１０－Ｌ^１－Ｘ^１－Ｌ^２－Ｘ^２（式Ｖ）、Ｘ^１－Ｌ^１－ＩＬ１０（式ＶＩ）、ＩＬ１０－Ｌ^１－Ｘ２（式ＶＩＩ）、またはこれらの任意の組合せ
の融合タンパク質であって、
式中、
「ＩＬ－１０」は、配列番号１、３、１４、１８、１５、１９、１６、２０、５５、５７、または５９から選択される単量体配列であり、より好ましくは、「ＩＬ－１０」は、配列番号５５、５７、または５９からなり、
「Ｌ^１」は、配列番号３１または５４のリンカーであり、
「Ｌ^２」は、配列番号３０のリンカーであり、
「Ｘ^１」は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）；ＣＤ５２；ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＢＴＬＡ、ＬＡＧ３、もしくはＣＴＬＡ４などであるがこれらに限定されない様々な免疫チェックポイント標的；ＣＤ２０；ＣＤ４７；ＧＤ－２；ＨＥＲ２；ＥｐＣＡＭ；ＩＣＡＭ（ＩＣＡＭ－１、－２、－３、－４、－５）、ＶＣＡＭ、ＦＡＰα；５Ｔ４；Ｔｒｏｐ２；ＥＤＢ－ＦＮ；ＴＧＦβ Ｔｒａｐ；ＭａｄＣａｍ、β７インテグリンサブユニット；α４β７インテグリン；α４インテグリンＳＲ－Ａ１；ＳＲ－Ａ３；ＳＲ－Ａ４；ＳＲ－Ａ５；ＳＲ－Ａ６；ＳＲ－Ｂ；ｄＳＲ－Ｃ１；ＳＲ－Ｄ１；ＳＲ－Ｅ１；ＳＲ－Ｆ１；ＳＲ－Ｆ２；ＳＲ－Ｇ；ＳＲ－Ｈ１；ＳＲ－Ｈ２；ＳＲ－Ｉ１；ＳＲ－Ｊ１；ＨＩＶ、またはエボラに特異的な第１の抗体から得られたＶＨ領域であり、
「Ｘ_２」は、Ｘ_１と同じ抗体から得られたＶＬ領域であり、
「Ｙ_１」は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）；ＣＤ５２；ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＢＴＬＡ、ＬＡＧ３、もしくはＣＴＬＡ４などであるがこれらに限定されない様々な免疫チェックポイント標的；ＣＤ２０；ＣＤ４７；ＧＤ－２；ＨＥＲ２；ＥｐＣＡＭ；ＩＣＡＭ（ＩＣＡＭ－１、－２、－３、－４、－５）、ＶＣＡＭ、ＦＡＰα；５Ｔ４；Ｔｒｏｐ２；ＥＤＢ－ＦＮ；ＴＧＦβ Ｔｒａｐ；ＭａｄＣａｍ、β７インテグリンサブユニット；α４β７インテグリン；α４インテグリンＳＲ－Ａ１；ＳＲ－Ａ３；ＳＲ－Ａ４；ＳＲ－Ａ５；ＳＲ－Ａ６；ＳＲ－Ｂ；ｄＳＲ－Ｃ１；ＳＲ－Ｄ１；ＳＲ－Ｅ１；ＳＲ－Ｆ１；ＳＲ－Ｆ２；ＳＲ－Ｇ；ＳＲ－Ｈ１；ＳＲ－Ｈ２；ＳＲ－Ｉ１；ＳＲ－Ｊ１；ＨＩＶ、またはエボラに特異的な第２の抗体から得られたＶＨ領域であり、
「Ｙ_２」は、Ｙ_１と同じ抗体から得られたＶＬ領域であり、
ＸおよびＹは、同じかまたは異なる抗体から得られ、
「Ｚ」は、ＩＬ－１０、ＩＬ－１０バリアント分子、ＩＬ－６、ＩＬ－４、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－５、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１５、ＩＬ－２６、ＩＬ－２７、ＩＬ－２８、ＩＬ－２９、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、インターフェロン－α、－β、－γ、ＴＧＦ－β、または腫瘍壊死因子－α、－β、塩基性ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＬ－４、ＩＬ－１１、またはＩＬ－１３から選択されるサイトカインであり、
「ｎ」は、０～２から選択される整数である、
融合タンパク質。

【0433】

２５３．式ＩＩおよびＩＩＩが、融合タンパク質複合体を形成することができ、式ＩＩおよびＩＩＩのそれぞれに由来するＩＬ－１０単量体が、機能性ホモ二量体ＩＬ－１０またはそのバリアントを形成することができる、先行する実施形態に記載の融合タンパク質。

【0434】

２５４．式ＩＩが、配列番号２４、２６、２８、４１、４８、または５０である、先行する実施形態のいずれかに記載の融合タンパク質。

【0435】

２５５．式ＩＩＩが、配列番号２５、２７、２９、４２、４９、または５１である、先行する実施形態のいずれかに記載の融合タンパク質。

【0436】

２５６．融合タンパク質複合体が、配列番号２４と２５との間、２６と２７との間、２８と２９との間、４１と４２との間、４８と４９との間、または５０と５１との間で形成される、先行する実施形態のいずれかに記載の融合タンパク質。

【0437】

２５７．式ＩＶおよびＶが、融合タンパク質複合体を形成することができ、式ＩＶおよびＶのそれぞれに由来するＩＬ－１０単量体が、機能性ホモ二量体ＩＬ－１０またはそのバリアントを形成することができる、先行する実施形態のいずれかに記載の融合タンパク質。

【0438】

２５８．式ＩＶが、配列番号３５、３８、４６、４８、または５０である、先行する実施形態のいずれかに記載の融合タンパク質。

【0439】

２５９．式Ｖが、配列番号３６、３９、４７、４９、または５１である、先行する実施形態のいずれかに記載の融合タンパク質。

【0440】

２６０．融合タンパク質複合体が、配列番号３５と３６との間、３８と３９との間、４６と４７との間、４８と４９との間、または５０と５１との間で形成される、先行する実施形態のいずれかに記載の融合タンパク質。

【0441】

２６１．式ＶＩおよびＶＩＩが、融合タンパク質複合体を形成することができ、式ＶＩおよびＶＩＩのそれぞれに由来するＩＬ－１０単量体が、機能性ホモ二量体ＩＬ－１０またはそのバリアントを形成することができる、先行する実施形態のいずれかに記載の融合タンパク質。

【0442】

２６２．式Ｉが、配列番号３３～３４、４０、４３～４４、４５、５２、５３、６１、６３、６５、または６７である、先行する実施形態のいずれかに記載の融合タンパク質。

【0443】

２６３．「ｎ」が１以上であり、Ｚが、ＩＬ－２、Ｉｌ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、またはこれらの任意の組合せである、先行する実施形態のいずれかに記載の融合タンパク質。

【0444】

２６４．Ｚが、Ｘ^１、Ｙ^１、または両方のＮ末端にコンジュゲートされている、先行する実施形態のいずれかに記載の融合タンパク質。

【0445】

２６５．がんを処置する方法であって、それを必要とする患者に、先行する実施形態のいずれかに記載の融合タンパク質を含む組成物を投与するステップを含む、方法。

【0446】

２６６．融合タンパク質が、配列番号２８～２９、３５～３６、３８～３９、４６～４７、５２、５３、６１、６３、６５、または６７である、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。

【0447】

２６７．融合タンパク質が、タンパク質複合体を形成し、タンパク質複合体が、配列番号２８と２９との間、３５と３６との間、３８と３９との間、または４６と４７との間で形成される、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。

【0448】

２６８．組成物が、配列番号３３、３４、４４、５２、または５３、６１、６３、６５、または６７の融合タンパク質を含む、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。

【0449】

２６９．融合タンパク質が、配列番号５９のＤＶ０７からなるＩＬ－１０を含む、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。

【0450】

２７０．炎症性疾患を処置する方法であって、それを必要とする患者に、先行する実施形態のいずれかに記載の融合タンパク質を含む組成物を投与するステップを含む、方法。

【0451】

２７１．融合タンパク質が、配列番号２６～２７、４１～４２、４８、または４９である、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。

【0452】

２７２．融合タンパク質が、タンパク質複合体を形成し、タンパク質複合体が、配列番号２６と２７との間、４１と４２との間、４８と４９との間で形成される、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。

【0453】

２７３．組成物が、配列番号３７、４０、または４３の融合タンパク質を含む、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。

【0454】

２７４．融合タンパク質が、配列番号５７のＤＶ０６からなるＩＬ－１０を含む、請求項１８に記載の方法。

【0455】

２７５．脂質に基づく疾患を処置する方法であって、それを必要とする患者に、先行する実施形態のいずれかに記載の融合タンパク質を含む組成物を投与するステップを含む、方法。

【0456】

２７６．融合タンパク質が、配列番号２４～２５、５０、または５１である、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。

【0457】

２７７．融合タンパク質が、タンパク質複合体を形成し、タンパク質複合体が、配列番号２４と２５との間、５０と５１との間で形成される、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。

【0458】

２７８．組成物が、配列番号４５の融合タンパク質を含む、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。

【0459】

参考文献

【化1】

【化2】

【化3】

【化4】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6-1】

【図6-2】

【図6-3】

【図6-4】

【図6-5】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21-1】

【図21-2】

【図21-3】

【図21-4】

【配列表】

2022524018000001.app

【国際調査報告】