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特表2022-524140遺伝子置換による希少な眼疾患のための改善された治療方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-04-27
(54)【発明の名称】遺伝子置換による希少な眼疾患のための改善された治療方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/864 20060101AFI20220420BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20220420BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20220420BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20220420BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20220420BHJP
【ＦＩ】
C12N15/864 100Z
A61P27/02
A61K31/7088
A61K35/76
C12N15/12
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021553393
(86)(22)【出願日】2020-03-09
(85)【翻訳文提出日】2021-10-27
(86)【国際出願番号】 EP2020056199
(87)【国際公開番号】W WO2020182722
(87)【国際公開日】2020-09-17
(31)【優先権主張番号】19305276.8
(32)【優先日】2019-03-08
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(31)【優先権主張番号】19306381.5
(32)【優先日】2019-10-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
２．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】521404048
【氏名又は名称】ユニベルシテ パリ－サクレー
(71)【出願人】
【識別番号】516086358
【氏名又は名称】サントル ナショナル デ ラ ルシェルシュ シアンティフィック
(71)【出願人】
【識別番号】521402181
【氏名又は名称】レティナ フランス
(71)【出願人】
【識別番号】521402192
【氏名又は名称】ヴァリアント
(74)【代理人】
【識別番号】100114775
【弁理士】
【氏名又は名称】高岡 亮一
(74)【代理人】
【識別番号】100121511
【弁理士】
【氏名又は名称】小田 直
(74)【代理人】
【識別番号】100202751
【弁理士】
【氏名又は名称】岩堀 明代
(74)【代理人】
【識別番号】100208580
【弁理士】
【氏名又は名称】三好 玲奈
(74)【代理人】
【識別番号】100191086
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 香元
(72)【発明者】
【氏名】ロジャー，ジェローム
(72)【発明者】
【氏名】グラリエ，エロディー キム
【テーマコード（参考）】
4C086
4C087
【Ｆターム（参考）】
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZA33
4C087AA01
4C087AA02
4C087BC83
4C087CA12
4C087NA14
4C087ZA33
(57)【要約】
本発明は、それを必要とする対象でのＣＲＸ関連ＩＲＤの処置に使用するための、またはＣＲＸの標的遺伝子のｈｙｐｏｍｏｒｐｈｉｃ変異により引き起こされる遺伝性網膜ジストロフィーの処置に使用するための、網膜の転写因子である錐体－杆体ホメオボックス（ＣＲＸ）をコードする核酸配列を担持する組み換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターに関する。
【選択図】図２
【選択図】図２
【特許請求の範囲】
【請求項1】
それを必要とする対象においてＣＲＸ関連ＩＲＤの処置に使用するための、網膜の転写因子である錐体－杆体ホメオボックス（ＣＲＸ）をコードする核酸配列を含むベクター組み換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター。
【請求項2】
ＡＡＶ２血清型である、請求項１に記載のＡＡＶベクター。
【請求項3】
ＡＡＶ２／５またはＡＡＶ２／８の血清型である、請求項２に記載のＡＡＶベクター。
【請求項4】
前記ポリヌクレオチドが、ロドプシン（Ｒｈｏ）、β－ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）、網膜色素変性症１（ＲＰ１）、またはヒトロドプシンキナーゼ１（ＧＲＫ１）のプロモーターから選択される、杆体光受容器および錐体光受容器における発現を駆動するプロモーターの制御下にある、請求項１～３のいずれか１項に記載のＡＡＶベクター。
【請求項5】
前記ポリヌクレオチドが、ＧＲＫ１プロモーターの制御下にある、請求項４に記載のＡＡＶベクター。
【請求項6】
前記ＣＲＸ関連ＩＲＤが、ＣＲＸ遺伝子の優性変異からもたらされる網膜症から選択されるか、またはＣＲＸの発現により治癒されるｈｙｐｏｍｏｒｐｈｉｃ変異に起因する症状をもたらす、請求項１～５のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項7】
前記ＣＲＸ関連ＩＲＤが、網膜色素変性症、レーバー先天黒内障、もしくは錐体－杆体ジストロフィーから選択されるか、またはＰＤＥ６Ｂ、ＮＭＮＡＴ１、ＡＲＬ１３ｂ、ＡＩＰＬ１、もしくはＡＢＣＡ４遺伝子などのＣＲＸの標的遺伝子におけるｈｙｐｏｍｏｒｐｈｉｃ変異に関連する、請求項６に記載のベクター。
【請求項8】
治療有効量で前記対象に投与される、請求項１～７のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項9】
前記ベクターの量が、１０８～１０１２ｖｇ／眼、より好ましくは１×１０９～１×１０１２ｖｇ／眼である、請求項８に記載のベクター。
【請求項10】
前記ベクターが、疾患の発症前に投与される、先行する請求項のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項11】
前記ベクターが、光受容器の変性の開始後に投与される、先行する請求項のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項12】
機能的な錐体光受容器および／または杆体光受容器が存在する限り投与される、先行する請求項のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項13】
前記ベクターが、組成物、より具体的には医薬組成物に含まれている、先行する請求項のいずれか１項に記載のベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、網膜疾患を処置するための方法および活性物質としてＣＲＸを含む医薬組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
遺伝性網膜疾患（ＩＲＤ）における光受容器（ＰＲ）の進行性の消失は、視力障害の一般的な原因であり、これは１／４，０００の有病率であり、フランスにおいて約１７，０００名の患者を意味する。これらは、同定された６０超のヒト遺伝子を伴う遺伝的および臨床的に異種性の疾患のグループを形成する。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の眼内注射による遺伝子療法の効力および安全性は、臨床有効性と言い換えられる前臨床の成功で証明されている。このような手法は、ほとんどの場合、機能の変異の劣性の喪失を有する患者に使用される。この目的は、完全に機能的なコピーで疾患を引き起こす変異した遺伝子を補償することである。
【0003】
ＰＲ変性の優性型は、網膜色素変性症（ＲＰ）の症例の少なくとも２０％を表す。今日では、これら優性型で、非常に限定された数の治療上の手法が開始されている。実際に、優性変異は、遺伝子産物の活性を増大させ得るか、または遺伝子産物の新規活性を提供し得る。よって、劣性型とは対照的に、ＰＲ変性の優性型は、失う機能を修復することが十分ではない場合があるため、治癒することがより困難である。実際に、優性型は、同時に起こる変異した遺伝子産物のサイレンシングを伴い、健常なコピーを発現することを必要とし得る。
【0004】
ヒトＣＲＸ遺伝子の５０超の変異が、常染色体優性レーバー先天黒内障（ＬＣＡ）、錐体－杆体ジストロフィー（ＣＯＲＤ）、およびＲＰに関連する。
【0005】
転写因子である錐体－杆体ホメオボックス（Cone-Rod Homeobox）（ＣＲＸ）は、網膜の主要な光検知細胞である、杆体光受容器および錐体光受容器の遺伝子発現の制御において中心的な役割を果たしている。錐体－杆体ホメオボックス（ＣＲＸ）のタンパク質は、杆体光受容器および錐体光受容器の転写の調節に重要である「対形成されたような（ｐａｉｒｅｄ－ｌｉｋｅ）」ホメオドメイン転写因子である。ＣＲＸは、コアクチベーターと相互作用し、標的遺伝子プロモーターでヒストンアセチル化を促進し、標的の光受容器の遺伝子のエンハンサー／プロモーターの染色体内のループ形成の相互作用を媒介することにより、転写アクチベーターとして作用する。
【0006】
これに関連して、驚くべきことに、ＣＲＸ関連疾患、すなわちＣＲＸにおける優性網膜変異に関連する遺伝性ジストロフィー、を有する対象または少なくとも１つのＣＲＸの標的遺伝子に少なくとも１つのｈｙｐｏｍｏｒｐｈｉｃ変異を有する対象を、副作用を全く伴うことなく処置するために転写因子ＣＲＸの発現を利用できることが見出された。
【0007】
本発明は、全般的に、組み換えウイルスベクター、および網膜疾患を罹患する対象の網膜においてＣＲＸタンパク質を発現するために組み換えウイルスベクターを使用する方法に関する。
【発明の概要】
【0008】
よって、本発明は、それを必要とする対象におけるＣＲＸ関連ＩＲＤの処置に使用するための、網膜の転写因子である錐体－杆体ホメオボックス（ＣＲＸ）をコードする核酸配列を含むベクター組み換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターに関する。
【0009】
本発明の一実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２血清型である。
【0010】
本発明のより具体的な態様では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２／５またはＡＡＶ２／８の血清型である。
【0011】
さらなる態様では、本発明のＡＡＶベクターに含まれるポリヌクレオチドは、ロドプシン（Ｒｈｏ）、β－ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）、網膜色素変性症１（retinitis pigmentosa 1）（ＲＰ１）、またはヒトロドプシンキナーゼ１（ＧＲＫ１またはＲＫ１）のプロモーターから選択される、杆体光受容器および錐体光受容器における発現を駆動するプロモーターの制御下にある。
【0012】
より具体的な態様では、ポリヌクレオチドは、ＧＲＫ１プロモーターの制御下にある。
【0013】
一実施形態では、本発明のベクターは、ＣＲＸ関連ＩＲＤの処置に使用するためのものであり、ここで、ＣＲＸ関連ＩＲＤは、ＣＲＸ遺伝子における優性変異からもたらされる網膜症から選択されるか、またはＣＲＸの発現により治癒されるｈｙｐｏｍｏｒｐｈｉｃ変異に起因する症状をもたらす。
【0014】
さらなる実施形態では、本発明のベクターは、ＣＲＸ関連疾患の処置に使用するためのものであり、ここで、ＣＲＸ関連ＩＲＤは、網膜色素変性症、レーバー先天黒内障、もしくは錐体－杆体ジストロフィーから選択されるか、またはＰＤＥ６Ｂ、ＮＭＮＡＴ１、ＡＲＬ１３ｂ、ＡＩＰＬ１、もしくはＡＢＣＡ４遺伝子などのＣＲＸの標的遺伝子におけるｈｙｐｏｍｏｒｐｈｉｃ変異に関連する。
【0015】
さらなる態様では、本発明の使用のためのベクターは、治療有効量で対象に投与される。
【0016】
一実施形態では、本発明の使用のためのベクターは、１０８～１０１２ｖｇ／眼、より好ましくは１×１０９～１×１０１２ｖｇ／眼の量で投与される。
【0017】
一実施形態では、本発明のベクターは、疾患が発症する前に投与される。
【0018】
別の実施形態では、本発明のベクターは、光受容器の変性の開始後に投与される。
【0019】
さらなる実施形態では、本発明のベクターは、機能的な錐体光受容器および／または杆体光受容器が存在する限り投与される。
【0020】
一実施形態では、本発明の使用のためのベクターは、組成物、より具体的には医薬組成物に含まれている。
【発明を実施するための形態】
【0021】
定義
本発明では、以下の用語は以下の意味を有する。
本発明では、以下の用語は以下の意味を有する。
【0022】
「ＡＡＶ」は、アデノ随伴ウイルスの略語であり、このウイルス自体またはその派生体を表すように使用され得る。
【0023】
「ＡＡＶ－ＣＲＸまたはＡＡＶ－ｈＲＫ１－ＣＲＸ」は、ヒトＣＲＸの発現を駆動するヒトロドプシンキナーゼ１プロモーターを含むＡＡＶ２／５ベクターを表す。
【0024】
「ＡＡＶ－ＧＦＰまたはＡＡＶ－ｈＲＫ１－ＧＦＰ」は、ＧＦＰの発現を駆動するヒトロドプシンキナーゼ１プロモーターを含むＡＡＶ２／５ベクターを表す。
【0025】
「ＣＲＸ」は、錐体－杆体ホメオボックスＣＲＸ（ＮＣＢＩ：Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ＮＭ＿０００５５４．６；Ｐｒｏｔｅｉｎ ＮＰ＿０００５４５．１、またはＥｎｓｅｍｂｌ Ｎｏ． ＥＮＳＧ０００００１０５３９２）を表し、網膜および脳の松果体細胞において脊椎動物の杆体光受容器および錐体光受容器の細胞で優先的に発現するＯｔｄ／ＯＴＸ様の「対形成された」ホメオドメイン転写因子である。ＣＲＸは、機能的な哺乳類の杆体光受容器および錐体光受容器の発達および維持に重要な役割を果たす。ＣＲＸは、ＤＮＡの結合に寄与するそのＮ末端の近くのホメオドメイン（ＨＤ）を含む２９９のアミノ酸タンパク質をコードする。当業者は、ＣＲＸコード配列が、ＣＲＸ遺伝子産物をコードするいずれかの核酸配列を含み得ることを理解するであろう。ＣＲＸコード配列は、介入する調節エレメント（たとえばイントロン、エンハンサー、または他の非コード配列）を含んでもよくまたは含まなくてもよい。
【0026】
「優性遺伝性網膜疾患」は、家族を介した疾患の遺伝の形式を表す。優性は、変異した遺伝子を担持する１つのみのアレルが、ＲＰ、ＣＯＲＤ、およびＬＣＡの特定の形態である疾患例を誘発するために十分であることを意味する。
【0027】
「ｈＣＲＸ」は、ヒトＣＲＸ遺伝子を表す。
【0028】
「異種性遺伝子」または「異種性ヌクレオチド配列」は、通常、ウイルスに天然に存在しない遺伝子またはヌクレオチド配列を表す。あるいは、異種性遺伝子またはヌクレオチド配列は、（たとえばウイルスに天然において結合しないプロモーターに結合することにより）天然に存在しない環境に置かれるウイルス配列を表し得る。
【0029】
「Ｈｙｐｏｍｏｒｐｈｉｃ変異」は、変化した遺伝子産物に対する活性のレベルの低下を提供する変異または変化した遺伝子産物の発現のレベルの低下をもたらす変異を表す。このような変異の非限定的な例は、ホスホジエステラーゼ６Ｂ（ＰＤＥ６Ｂ）の変異の特定のサブタイプ、および、たとえばＮＭＮＡＴ１、ＡＲＬ１３ｂ、ＡＩＰＬ１、またはＡＢＣＡ４遺伝子で同定された他の変異である。
【0030】
「ＩＴＲ」または「末端逆位配列」は、ＡＡＶの溶解および潜伏のライフサイクルの完了に必要である、Ｔ字型のパリンドローム構造を形成し得るＡＡＶベクターおよび／または組み換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）に存在する核酸配列の区間を表す（Ｍｕｚｙｃｚｋａ Ｎ ａｎｄ Ｂｅｒｎｓ ＫＩ ２００１）。用語「非分解性ＩＴＲ」は、Ｒｅｐタンパク質による分解が低減されるように修飾されたＩＴＲを表す。非分解性ＩＴＲは、非分解性ＩＴＲの低い分解または非分解をもたらし、自己相補的なＡＡＶベクターの９０～９５％をもたらす、末端分解部位（ＴＲＳ）を伴わないＩＴＲ配列であり得る（ＭｃＣａｒｔｙ ｅｔ ａｌ ２００３）。
【0031】
「操作可能に結合した」は、２つ以上のポリヌクレオチド（たとえばＤＮＡ）セグメントの間の機能的な関係を表す。通常、この用語は、転写される配列に対する転写制御配列の機能的な関係を表す。たとえば、プロモーターまたはエンハンサー配列は、適切な宿主細胞または他の発現系においてコード配列の転写を刺激または調節する場合、コード配列に操作可能に結合している。一般的に、転写される配列に操作可能に結合しているプロモーター転写制御配列は、転写される配列に連続しており、すなわちこれらはシス作用性である。しかしながら一部の転写制御配列、たとえばエンハンサーは、物理的に連続的である必要はなく、またはそれらが転写を増強するコード配列に近接した位置する必要はない。
【0032】
「目的のポリヌクレオチド」は、ＣＲＸをコードするいずれかのヌクレオチド配列を表す。
【0033】
「プロモーター」は、操作可能に結合した遺伝子、またはタンパク質をコードするヌクレオチド配列などの転写を調節する配列を表す。プロモーターは、転写、ならびにＲＮＡポリメラーゼおよび効率的な転写に必要な他の転写因子の認識部位を方向付けるために十分な配列を提供し、細胞に特異的な発現を指示できる。転写を指示するために十分な配列に加えて、本発明のプロモーター配列はまた、転写の調節に関与する他の調節エレメント（たとえばエンハンサー、コザック配列、およびイントロン）の配列を含み得る。さらに、既知の調節エレメントを混合しマッチングすることにより機能的なプロモーターを作製するための標準的な技術が当該分野で知られている。「トランケートされたプロモーター」もまた、プロモーターフラグメントから、または既知の調節エレメントのフラグメントの混合およびマッチングにより、作製され得る。
【0034】
「対象」または「それを必要とする対象」は、哺乳類、好ましくはヒトを表す。一実施形態では、対象は、「患者」、すなわち、医療の受診を待機しているか、または医療を受診しているか、または過去／現在／将来医療の対象であった／ある／あり得るか、または疾患の発症に関してモニタリングされている温血動物、より好ましくはヒトであり得る。一実施形態では、対象は、成年（たとえば１８歳超の対象）である。別の実施形態では、対象は、小児（たとえば１８歳未満の対象）である。一実施形態では、対象は雄性である。別の実施形態では、対象は雌性である。
【0035】
遺伝性網膜ジストロフィー（ＩＲＤ）の「処置（ｔｒｅａｔｉｎｇまたはｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、たとえばその発症またはその臨床症状の少なくとも１つを遅延または停止または低減することにより、ＩＲＤを軽減することを表す。「処置（ｔｒｅａｔｉｎｇまたはｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」はまた、患者により識別可能でなくてもよいものを含む少なくとも１つの身体的パラメータを緩和または軽減することを表し得る。「処置（ｔｒｅａｔｉｎｇまたはｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」はまた、物理的に（たとえば識別可能な症状の安定化）、生理的に（たとえば身体的パラメータの安定化）、またはその両方のいずれかで、ＩＲＤを調節することを表し得る。より具体的には、ＩＲＤの「処置」は、ＩＲＤを有する対象の視覚機能および／または局所的な解剖学的形態の改善または保存をもたらすいずれかの作用を意味する。「処置」はまた、本明細書使用される場合、ＩＲＤの発症（ｏｎｓｅｔ）または発症（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）または進行を予防または遅延することを表す「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇまたはｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」を包有する。「予防」は、ＩＲＤに関連する場合、ＩＲＤを有する患者ならびに視覚機能、網膜の解剖学的状態、および／またはＩＲＤパラメータの悪化に関してリスクのある患者において、後述されるように上記悪化を予防または遅延させるいずれかの作用を意味する。疾患の処置および／または予防を評価するための方法は、当該分野で知られており、本明細書中以下で記載されている。
【0036】
「ウイルスベクター（Ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒまたはｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ）」は、遺伝子送達ビヒクルとして機能し、ウイルス（たとえばＡＡＶ）のカプシドの中にパッケージングされた組み換えウイルスゲノムを含む、野生型ではない組み換えウイルス粒子を表すように意図されている。特定のタイプのウイルスベクターは、「組み換えアデノ随伴ウイルスベクター」または「ＡＡＶベクター」であり得る。ウイルスベクターにパッケージングされた組み換えウイルスゲノムはまた、本明細書中「ベクターゲノム」と呼ばれる。
【0037】
本発明の詳細な説明
本発明は、錐体光受容器細胞および杆体光受容器細胞の両方において異種性ＣＲＸ遺伝子を発現するウイルスベクターの発見に基づく。
本発明は、錐体光受容器細胞および杆体光受容器細胞の両方において異種性ＣＲＸ遺伝子を発現するウイルスベクターの発見に基づく。
【0038】
よって、本発明は、錐体および杆体の細胞において網膜の転写因子である錐体－杆体ホメオボックス（ＣＲＸ）の発現を指示する組み換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、当該ベクターを含む組成物、ならびにこのベクターまたは組成物の使用方法に関する。
【0039】
本発明のウイルスベクターは、組み換えアデノ随伴（ｒＡＡＶまたはＡＡＶ）ベクターであり得る。ＡＡＶベクターは、効率的な複製を容易にするためのヘルパーウイルスを必要とする小分子の一本鎖ＤＮＡウイルスである。ウイルスベクターは、ベクターゲノムおよびタンパク質のカプシドを含む。ウイルスベクターのカプシドは、現在同定されているヒトおよび非ヒトのＡＡＶ血清型および未だ同定されていないＡＡＶ血清型を含む、当該分野で知られているＡＡＶ血清型のいずれかから供給され得る。ウイルスのカプシドは、ハイブリッドウイルスベクターを形成するために他のベクターの成分と混合およびマッチングされてよく、たとえばウイルスベクターのＩＴＲおよびカプシドは、異なるＡＡＶ血清型からもたらされてもよい。一態様では、ＩＴＲは、ＡＡＶ２血清型由来であってもよく、カプシドは、たとえばＡＡＶ２またはＡＡＶ５血清型由来である。さらに、当業者は、ベクターのカプシドがモザイクカプシド（たとえば異なる血清型由来のカプシドのタンパク質の混合物から構成されるカプシド）またはさらにはキメラカプシド（たとえばマーカーを作製するためおよび／または組織の指向性を変えるために外来性または関連しないタンパク質配列を含むカプシドタンパク質）でもあり得ることを認識している。本発明のウイルスベクターはＡＡＶ２カプシドを含み得ることが企図されている。さらに本発明はＡＡＶ５カプシドを含み得ることが企図されている。
【0040】
本発明では、用語「ＡＡＶ」は、ＡＡＶ１型（ＡＡＶ－１）、ＡＡＶ２型（ＡＡＶ－２）、ＡＡＶ３型（ＡＡＶ－３）、ＡＡＶ４型（ＡＡＶ－４）、ＡＡＶ５型（ＡＡＶ－５）、ＡＡＶ６型（ＡＡＶ－６）、ＡＡＶ７型（ＡＡＶ－７）、およびＡＡＶ８型（ＡＡＶ－８）およびＡＡＶ９型（ＡＡＶ９）を表す。様々なＡＡＶの血清型のゲノム配列およびネイティブな末端反復（ＴＲ）、Ｒｅｐタンパク質、およびカプシドのサブユニットの配列は、当該分野で知られている。このような配列は、文献または公的なデータベース、たとえばＧｅｎＢａｎｋで見出され得る。たとえばＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１４０１（ＡＡＶ－２）、ＡＦ０４３３０３（ＡＡＶ２）、およびＮＣ＿００６１５２（ＡＡＶ－５）を参照されたい。
【0041】
本明細書中使用される場合、「ＡＡＶベクター」は、杆体および／または錐体の細胞での遺伝子発現のための目的のポリヌクレオチド（すなわち異種性ポリヌクレオチド）を含むＡＡＶベクターを表す。ｒＡＡＶベクターは、５’および３’のアデノ随伴ウイルスの末端逆位配列（ＩＴＲ）、および配列に操作可能に結合した目的のポリヌクレオチド（ＣＲＸ）を含み、標的細胞においてその発現を制御する。
【0042】
特定の態様では、本発明のＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２血清型である。
【0043】
別の態様では、本発明のＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２／５またはＡＡＶ２／８血清型である。
【0044】
本発明のＡＡＶ２／５またはＡＡＶ２／８ベクターは、当該分野で知られている方法を使用して産生される。要約すると、本方法は、全般的に、（ａ）宿主細胞へのＡＡＶベクターの導入、（ｂ）宿主細胞へのＡＡＶヘルパーコンストラクトの導入（ここでヘルパーコンストラクトは、ＡＡＶベクターから欠けているウイルスの機能を含む）、および（ｃ）ヘルパーウイルスを宿主細胞へ導入することを含む。ＡＡＶビリオンの複製およびパッケージングのための全ての機能は、ＡＡＶビリオン内へのＡＡＶベクターの複製およびパッケージングを達成するため、存在する必要がある。宿主細胞への導入は、同時にまたは経時的に標準的なウイルス学の技術を使用して行われ得る。最後に、宿主細胞は、ＡＡＶビリオンを産生するために培養され、塩化セシウム（ＣｓＣｌ）勾配などの標準的な技術を使用して精製される。残存するヘルパーウイルスの活性は、たとえば熱失活などの既知の方法を使用して失活され得る。その後、精製されたＡＡＶビリオンは、本発明の方法に使用するための準備が整った状態にある。
【0045】
また本ベクターは、コードされたタンパク質の発現および分泌を可能にする制御配列、たとえばプロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）をコードする配列などを含み得る。これに関して、本ベクターは、感染した細胞においてタンパク質の発現をもたらすまたは向上させるために、目的のポリヌクレオチドに操作可能に結合しているプロモーター領域を含む。このようなプロモーターは、感染した組織においてタンパク質の効率的かつ適切な産生を可能にするために、遍在性、組織特異性、強力、弱小、制御されたもの、キメラ性、誘導可能などであり得る。プロモーターは、コードされたタンパク質に対して同種性であり得るか、または細胞性プロモーター、ウイルスプロモーター、真菌プロモーター、植物プロモーター、または合成プロモーターを含む異種性であり得る。本発明の使用に好ましいプロモーターは、網膜色素変性症１（ＲＰ１）またはヒトロドプシンキナーゼ１（ＧＲＫ１）などの錐体および杆体の細胞で発現を駆動することができるプロモーターの中から選択される。
【0046】
好ましい態様では、本発明は、ＣＲＸをコードするポリヌクレオチドがヒトロドプシンキナーゼ１（ＧＲＫ１）プロモーターの制御下にあるＡＡＶベクターに言及する。
【0047】
ＣＲＸの例示的なアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＰ＿０００５４５．１であり、ＣＲＸの例示的な核酸配列は、ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＭ＿０００５５４．６である。
【0048】
また本発明は、本発明のウイルスベクターを含む組成物および医薬組成物に言及する。本医薬組成物は、薬学的に許容される担体と共に製剤化されている。本組成物は、たとえばＣＲＸ関連ＩＲＤの処置または予防に適切な１つ以上の他の治療用作用物質をさらに含み得る。薬学的に許容される担体は、本組成物を増強もしくは安定化し、または本組成物の調製を容易にするために使用され得る。薬学的に許容される賦形剤は、いずれかの種類の非毒性の固体、半固体、または液体のフィラー、希釈剤、カプセル化材料、または製剤化助剤を表す。本発明の組成物に使用され得る薬学的に許容される賦形剤として、限定するものではないが、生理的に適合可能である溶媒、界面活性剤、分散媒体、コーティング剤、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤など、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒト血清アルブミンなどの血清タンパク質、リン酸塩などの緩衝物質、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分的なグリセリド混合物、水、塩、または電解質、たとえば硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、シリカ、コロイドシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロースベースの物質（たとえばカルボキシメチルセルロースナトリウム）、ポリエチレングリコール、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン－ポリオキシプロピレンブロックポリマー、ポリエチレングリコール、および羊毛脂が挙げられる。
【0049】
本発明に係る医薬組成物は、限定するものではないが、アスコルビン酸、アスコルビルパルミタート、ブチルヒドロキシトルエン、ソルビン酸カリウム、またはローズマリー（Ｒｏｓｍａｒｉｎｕｓ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）抽出物を含む抗酸化剤をさらに含み得る。
【0050】
本発明に係る医薬組成物は、限定するものではないが、無機酸、たとえば塩酸もしくはリン酸、または有機酸、たとえば酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などで形成される酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基で形成）を含む薬学的に許容される塩をさらに含み得る。遊離カルボキシル基で形成された塩はまた、無機塩基、たとえばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または水酸化第二鉄など、および有機塩基、たとえばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどに由来し得る。
【0051】
また賦形剤は、たとえば水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、および液体のポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、ならびにオレイン酸などの植物油を含む、溶媒または分散媒体であり得る。たとえば、レシチン（すなわちダイズレシチンまたは脱脂したダイズレシチン）などのコーティング剤の使用、分散の場合では必要とされる粒径の維持、および界面活性剤の使用により、適切な流動性が維持され得る。
【0052】
本発明のベクターまたは医薬組成物は、当該分野で知られている様々な方法により投与され得る。投与の経路および／または形式は、望まれる結果に応じて変動する。投与は、網膜下であることが好ましい。薬学的に許容される担体は、網膜下、硝子体内、静脈内、皮下、または局所投与に適している。
【0053】
本組成物は、無菌性かつ流動的であるべきである。適切な流動性は、たとえば、レシチンなどのコーティング剤の使用、分散の場合では必要とされる粒径の維持、および界面活性剤の使用により、維持され得る。多くの場合、等張剤、たとえば糖、マンニトールまたはソルビトールなどのポリアルコール、および塩化ナトリウムを本組成物に含むことが好ましい。
【0054】
関連する当業者は、たとえば塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、乳酸加リンゲル注射液などの等張性ビヒクルを使用して適切な液剤を良好に調製することができる。保存剤、安定化剤、バッファー、抗酸化剤、および／または他の添加剤が、必要に応じて含まれ得る。遅延放出では、本ベクターは、たとえば生体適合性ポリマーから形成されるマイクロカプセルまたは当該分野で知られている方法によるリポソームの担体系などの、徐放のために製剤化されている医薬組成物に含まれ得る。
【0055】
本発明の医薬組成物は、当該分野でよく知られており規定通り行われる方法により調製され得る。
【0056】
医薬組成物は、好ましくはＧＭＰの条件下で製造される。通常、ウイルスベクターの治療上有効な用量または効果的な用量が、本発明の医薬組成物に使用される。ウイルスベクターは、当業者に知られている従来の方法により薬学的に許容される剤形へと製剤化され得る。投与レジメンは、最適な望ましい反応（たとえば治療反応）を提供するために調節される。たとえば、単回のボーラスが投与されてもよく、いくつかの分割した用量が経時的に投与されてもよく、または用量が治療状況の緊急時により示される場合などで比例的に低減もしくは増大されてもよい。投与の容易さおよび用量の均一性のための用量単位形態に非経口組成物を製剤化することが特に好適である。本明細書中使用される用量単位形態は、処置される対象に対して単位用量として適切な物理的に個別の単位を表し；各単位は、必要とされる薬学的な担体と共に望ましい治療効果をもたらすように計算された所定の量の有効な化合物を含む。
【0057】
本発明の医薬組成物中の有効成分の実際の用量のレベルは、患者に対する毒性を伴わない、特定の患者、組成物、および投与形式にとって望ましい治療上の反応を達成するために有効な有効成分の量を得るために変動し得る。選択された用量のレベルは、使用される本発明の特定の組成物の活性、投与経路、投与時間、使用される特定の化合物の排泄速度、処置の期間、使用される特定の組成物と併用して使用される他の薬物、化合物、および／または物質、処置される患者の年齢、性別、体重、状態、全般的な健康状態、以前の病歴などの要因を含む様々な薬物動態的な要因に応じて変化する。
【0058】
本発明は、錐体および杆体の細胞で発現する場合に網膜疾患に好適な作用を有するＣＲＸをコードするポリヌクレオチドを含むＡＡＶベクターを、それを必要とする対象の眼に送達することによる、前記対象のＣＲＸ関連ＩＲＤを処置するための方法を提供する。
【0059】
より具体的には、本発明は、それを必要とする対象のＣＲＸ関連ＩＲＤを処置するための方法であって、ＣＲＸ関連ＩＲＤは、ＣＲＸ遺伝子の優性変異からもたらされる網膜症に関するか、またはＣＲＸの発現により治癒されるｈｙｐｏｍｏｒｐｈｉｃ変異による症状をもたらす、方法を提供し、さらにより具体的には、ＲＰ、ＣＯＲＤ、もしくはＬＣＡなどの網膜変性疾患の優性型を処置するため、またはＰＤＥ６Ｂのｈｙｐｏｍｏｒｐｈｉｃ変異を処置するための方法を提供する。
【0060】
さらなる態様では、本発明は、それを必要とする対象でのＣＲＸ関連ＩＲＤの処置に使用するための、ＣＲＸを発現するＡＡＶベクターに言及する。
【0061】
本発明では、ＣＲＸ関連ＩＲＤは、ＣＲＸ遺伝子の優性変異からもたらされる網膜症に関連するか、またはＣＲＸの発現により治癒されるｈｙｐｏｍｏｒｐｈｉｃ変異による症状をもたらす。
【0062】
通常、対象は、ＣＲＸ遺伝子の優性変異からもたらされるＣＲＸ関連ＩＲＤに罹患しているかまたは罹患している可能性が高い。この遺伝子の優性変異は、ＲＰ、ＣＯＲＤ、またはＬＣＡなどの網膜変性疾患の優性型に関連している。
【0063】
別の態様では、本発明はまた、ＣＲＸ遺伝子の優性変異に由来するＣＲＸ関連ＩＲＤの処置に使用するためのベクターまたは組成物または医薬組成物に言及する。
【0064】
別の態様ではまた、本発明は、ＣＲＸの標的遺伝子のｈｙｐｏｍｏｒｐｈｉｃ変異により引き起こされるＣＲＸ関連ＩＲＤの処置に使用するためのベクターまたは組成物または医薬組成物に言及する。
【0065】
より具体的な態様では、本発明はまた、ＰＤＥ６Ｂのｈｙｐｏｍｏｒｐｈｉｃ変異の処置に使用するためのベクターまたは組成物または医薬組成物に言及する。
【0066】
本発明では、処置は、治療上の処置または防止的もしくは予防的な処置のいずれかである。
【0067】
よって、処置される対象は、ＩＲＤにすでに罹患しているものおよびこの疾患を有する傾向があるものまたはこの疾患を予防すべきもののいずれかである。
【0068】
一実施形態では、本発明に係る化合物の治療有効量を投与された後、対象が特定の疾患に関連する１つ以上の症状の観察可能かつ／もしくは測定可能な低減；および／またはクオリティオブライフの改善を示す場合、対象の「処置」は成功している。
【0069】
処置の成功および疾患の改善を評価するためのパラメータは、医師によく知られている規定の手段により容易に測定可能である。
【0070】
別の態様では、本発明のベクター、組成物、または医薬組成物は、治療有効量で投与される。
【0071】
医師は、本医薬組成物で使用される本発明のウイルスベクターの投与を、望ましい治療効果を達成するために必要とされる用量よりも低いレベルで開始し、望ましい効果が達成されるまで用量を徐々に増大させることができる。一般的に、本発明の組成物の有効な用量は、本明細書中記載されるＣＲＸ関連の網膜ジストロフィーの処置で、投与手段、標的部位、患者の生理的状態、患者がヒトまたは動物であるかどうか、行われる他の薬物療法、および処置が防止的または治療的であるかどうかを含む多くの異なる要因に応じて変動する。
【0072】
本明細書中使用される場合、「治療有効量」は、対象に治療上の利点を提供するＡＡＶベクターの量を意味する。一実施形態では、用語「有効量」は、標的に有意な負の作用または有害な副作用を引き起こすことなく、（１）ＣＲＸ関連ＩＲＤの発症を遅延もしくは予防するか、（２）ＣＲＸ関連ＩＲＤの１つ以上の症状の進行、憎悪、もしくは悪化を遅延もしくは停止するか、（３）ＣＲＸ関連ＩＲＤの症状の軽減をもたらすか、（４）ＣＲＸ関連ＩＲＤの重症度もしくは発症頻度を低減するか、または（５）ＣＲＸ関連ＩＲＤを治癒することを目的とするベクターのレベルまたは量を意味する。
【0073】
ベクターの用量は、疾患の状態、対象（たとえば患者の体重、代謝などによる）、処置スケジュールなどに応じて適応され得る。本発明の文脈の中での好ましい有効用量は、ＰＲ細胞で最適な発現を可能にする用量である。
【0074】
処置用量は、安全性および有効性を最適化するために用量設定される必要がある。ウイルスベクターを用いた網膜下投与では、用量は、１×１０８ベクターゲノム（ｖｇ）／眼～１×１０１２ｖｇ／眼の範囲であり得る。たとえば、用量は、１×１０８ｖｇ／眼、１．５×１０８ｖｇ／眼、２×１０８ｖｇ／眼、２．５×１０８ｖｇ／眼、３×１０８ｖｇ／眼、４×１０８ｖｇ／眼、５×１０８ｖｇ／眼、６×１０８ｖｇ／眼、７．５×１０８ｖｇ／眼、８×１０８ｖｇ／眼、９×１０８ｖｇ／眼、０．５×１０９ｖｇ／眼、１×１０９ｖｇ／眼、１．５×１０９ｖｇ／眼、２．５×１０９ｖｇ／眼、３×１０９ｖｇ／眼、４×１０９ｖｇ／眼、５×１０９ｖｇ／眼、６×１０９ｖｇ／眼、７×１０９ｖｇ／眼、７．５×１０９ｖｇ／眼、８×１０９ｖｇ／眼、９×１０９ｖｇ／眼、０．５×１０１０ｖｇ／眼、１×１０１０ｖｇ／眼、１．５×１０１０ｖｇ／眼、２．５×１０１０ｖｇ／眼、３×１０１０ｖｇ／眼、４×１０１０ｖｇ／眼、５×１０１０ｖｇ／眼、６×１０１０ｖｇ／眼、７×１０１０ｖｇ／眼、７．５×１０１０ｖｇ／眼、８×１０１０ｖｇ／眼、９×１０１０ｖｇ／眼、０．５×１０１１ｖｇ／眼、１×１０１１ｖｇ／眼、１．５×１０１１ｖｇ／眼、２．５×１０１１ｖｇ／眼、３×１０１１ｖｇ／眼、４×１０１１ｖｇ／眼、５×１０１１ｖｇ／眼、６×１０１１ｖｇ／眼、７×１０１１ｖｇ／眼、７．５×１０１１ｖｇ／眼、８×１０１１ｖｇ／眼、９×１０１１ｖｇ／眼、０．５×１０１２ｖｇ／眼、１×１０１２ｖｇ／眼であり得る。
【0075】
本発明の好ましい実施形態では、ベクターまたは上記ベクターを含む組成物は、１×１０９～１×１０１２ｖｇ／眼の量で投与される。
【0076】
対象に本発明のベクターを投与することは、錐体および杆体の細胞におけるＣＲＸの発現のため直接的な網膜下注射により行われ得る。
【0077】
別の態様では、本発明に係る使用のためのベクターまたは組成物は、疾患の発症の前かつこの発症を予防する必要がある場合に、投与される。
【0078】
別の態様では、本発明に係る使用のためのベクターまたは組成物は、光受容器の変性の開始後、より具体的には、機能的な錐体および／または光受容器が存在する限りかつ必要性がある限り、光受容器の変性の開始後に、投与される。
【0079】
本明細書中記載されるウイルスベクターは、主に、眼あたり１回の用量として使用され、ここで、以前の投与ではカバーされない網膜の領域を処置するための反復投与を行う可能性がある。投与の用量は、処置が防止的または治療的かどうかに応じて変動し得る。
【0080】
上記の個別のセクションおよび実施形態で言及される本発明の様々な特性および実施形態は、適宜、変更すべき点は変更して、他のセクションおよび実施形態に適用する。結果として、１つのセクションまたは実施形態で記述された特性は、他のセクションまたは実施形態で記述された特性と、適宜組み合わせられ得る。
【0081】
さらに本発明を、以下の図面および実施例により示す。しかしながらこれら実施例および図面は、本発明の範囲を限定するといかなる方法であっても解釈すべきではない。
【図面の簡単な説明】
【0082】
【図1】ヒトＣＲＸの発現を駆動するヒトロドプシンキナーゼ１プロモーターを含む８２２－ｐＫＬ．ＡＡＶ．ＧＲＫ１．ｈＣＲＸの最終的なベクターのプラスミドマップ。このプロモーターは、制限部位ＳｐｅＩおよびＥｃｏＲＩを使用してサブクローニングされた。ヒトＣＲＸをコードするｃＤＮＡは、粘着部位をもたらすＫｐｎ１消化を使用してサブクローニングされ、平滑末端化され、続いてＸｂａ１消化を行った。
【図2】選択されたプロモーターと組み合わされた選択されたＡＡＶベクターは、ＷＴ光受容器およびＣｒｘＲｉｐ／＋の未成熟な錐体様の光受容器の効率的な形質導入を可能にする。 ＷＴまたはＣｒｘＲｉｐ／＋マウスに、Ｐ３０で２．５×１０１０のＡＡＶ－ＧＦＰの単回網膜下注射を行った。切片作製および抗ＧＦＰ抗体での免疫標識のため、１４日後に眼を回収した。核は、ＤＡＰＩで染色した。 ＯＮＬ：外顆粒層；ＩＮＬ：内顆粒層；ＧＣＬ：神経節細胞層。スケールバー、２０μｍ。
【図3】ＣｒｘＲｉｐ／＋におけるＡＡＶ－ＣＲＸの網膜下注射の後のＣＲＸの過剰発現 ＣｒｘＲｉｐ／＋マウスに、Ｐ３０で３つの異なる用量のＡＡＶ－ＣＲＸ（０．５×１０１０、１×１０１０および２．５×１０１０ｖｇ／眼）の単回網膜下注射を行うかまたは行わなかった。１４日後に、ＣＲＸ発現をイムノブロッティングにより評価した。
【図4】ＡＡＶ－ＧＦＰまたはＡＡＶ－ＣＲＸの網膜下注射の後のＣＲＸ発現の定量化 ＣｒｘＲｉｐ／＋マウスに、Ｐ３０～Ｐ４０に、０．５×１０１０、１×１０１０、または２．５×１０１０ｖｇ／眼の３つの異なる用量のＡＡＶ－ＧＦＰまたはＡＡＶ－ＣＲＸの単回網膜下注射を行った。１４日後に、ＣＲＸ発現を、イムノブロッティングにより定量化した。発現は、チューブリンを使用して正規化した。全ての定量化は、０．５．１０１０ｖｇのＡＡＶ－ＧＦＰを注射した動物における内因性ＣＲＸ発現に対して報告した。 黒色のバー：ＡＡＶ－ＧＦＰを注射したＣｒｘＲｉｐ／＋における内因性ＣＲＸ発現；白色のバー：ＡＡＶ－ＣＲＸを注射したＣｒｘＲｉｐ／＋マウスにおけるＣＲＸ発現。
【図5】分化したＰＲが、ＡＡＶ－ＣＲＸベクターを使用したＣｒｘＲｉｐ／＋網膜で観察され得る。 ＣｒｘＲｉｐ／＋マウスに、Ｐ３０で２．５×１０１０のＡＡＶ－ＣＲＸの単回網膜下注射を行った。 他の眼には注射せず、対照として使用した。１カ月後に、切片を作製し、抗ロドプシン抗体および抗錐体アレスチン抗体で標識するために、眼を回収した。核は、ＤＡＰＩで染色した。 ＯＮＬ、外顆粒層；ＩＮＬ、内顆粒層；ＧＣＬ、神経節細胞層、スケールバー、２０μｍ。
【図6】外節で分化したＰＲが、低用量のＡＡＶ－ＣＲＸベクター（０．５．１０１０ｖｇ）を使用してＣｒｘＲｉｐ／＋網膜で観察できる。 （Ａ）ＣｒｘＲｉｐ／＋マウスの両眼に、Ｐ３０で０．５×１０１０ｖｇのＡＡＶ－ＣＲＸまたはＡＡＶ－ＧＦＰの網膜下注射を行った。２カ月後に眼を回収し、抗ロドプシン抗体および抗錐体アレスチン抗体で標識した後に、平面状に標本作製した。ＡＡＶ－ＧＦＰ網膜下注射の後にＧＦＰ発現が直接観察された。スケールバー、２０μｍ。 （Ｂ）ＣｒｘＲｉｐ／＋マウスにて、Ｐ３０で、０．５×１０１０のＡＡＶ－ＣＲＸおよび少ない用量（＜１．１０９ｖｇ）のＡＡＶ－ＧＦＰの単回網膜下注射を、ＧＦＰを用いた低密度標識の形質導入光受容器のために行い、これらの形態を可視化した。複数のｚセクションの共焦点の獲得は、３Ｄの再構築を可能にした。 １、外節；２：核；３、シナプス終末、スケールバー、５μｍ。
【図7】ＡＡＶ－ＣＲＸ網膜下注射は、光受容器の光感受性の回復を可能にした。 ＣｒｘＲｉｐ／＋マウスの両眼に、Ｐ３０で、０．５×１０１０のＡＡＶ－ＣＲＸまたはＡＡＶ－ＧＦＰの単回網膜下注射を行った。注射から４カ月後に、光応答を評価した。 （Ａ）暗順応ｂ波の応答の増大が、２．２ ｌｏｇ ｃｄ．ｓｅｃ／ｍ２の刺激強度で、ＡＡＶ－ＧＦＰ対照と比較してＡＡＶ－ＣＲＸで処置した動物において統計上有意であった。（Ｂ）明順応ｂ波の応答の増大が、１．６ ｌｏｇ ｃｄ．ｓｅｃ／ｍ２の刺激強度で、ＡＡＶ－ＧＦＰ対照と比較してＡＡＶ－ＣＲＸで処置した動物において統計上有意であった。（Ｃ）明／暗の選択試験は、ＡＡＶ－ＣＲＸを注射したＣｒｘＲｉｐ／＋マウスが明室の区画に向かう線を横切った回数は、注射を行わなかったＷＴマウスに匹敵することを示した。対照的に、ＡＡＶ－ＧＦＰを注射したＣｒｘＲｉｐ／＋マウスはより頻繁にこの線を超え、光を検出するそれらの特性の不履行を示している。 灰色のバー、注射を行っていないＷＴ；黒色のバー、ＡＡＶ－ＧＦＰを注射したＣｒｘＲｉｐ／＋マウス；白色のバー、ＡＡＶ－ＣＲＸを注射したＣｒｘＲｉｐ／＋マウス、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。
【図8】２．５．１０１０ｖｇの用量でのＡＡＶ－ＣＲＸベクター注射の後に、ｒｄ１０マウスにおいて光受容器の変性が低減した。 （Ａ）ＡＡＶ－ＣＲＸベクターを、Ｐ１４ Ｒｄ１０マウスに注射するかまたは注射を行わなかった。注射から２カ月後に網膜を回収した。網膜の切片を、抗ロドプシン抗体（Ｒｈｏ）および抗錐体アレスチン抗体（ＣＡ）で免疫標識した。核は、ＤＡＰＩで染色した。 （Ｂ）ヒストグラムは、ＡＡＶ－ＣＲＸを注射した（白色のバー）または注射しなかった（ＮＩ、黒色のバー）ｒｄ１０ ＯＮＬの厚さの測定を表す。ＯＮＬ、外顆粒層；ＩＮＬ、内顆粒層；ＧＣＬ、神経節細胞層。スケールバー、２０μｍ。
【図9】０．５．１０１０および１．１０１０ｖｇの用量でのＡＡＶ－ＣＲＸベクター注射の後に、ｒｄ１０マウスにおいて光受容器の変性が低減した。 ヒストグラムは、Ｐ１４でのＡＡＶ－ＣＲＸの注射から２カ月後のｒｄ１０ ＯＮＬの厚さの測定を表す。パラフィン切片上のヒトＣＲＸの特異的な検出は、形質導入した領域または形質導入しなかった領域の区別を可能にした。 黒色のバー、ＡＡＶ－ＣＲＸを形質導入しなかった領域；白色のバー、ＡＡＶ－ＣＲＸを形質導入した領域。
【図10】錐体のみの網膜におけるＣＲＸＲ４１Ｗの発現は、ＡＡＶ－ＣＲＸを使用して予防され得る錐体の変性をもたらす。 （Ａ）２．８ ｌｏｇ ｃｄ．ｓｅｃ／ｍ２の光刺激でＮｒｌ－／－と比較した２カ月齢のＮｒｌ－／－；Ｔｇ（ＣＲＸＲ４１Ｗ）における明順応ｂ波の振幅の減少を表すヒストグラム。 （Ｂ）ＡＡＶ－ＧＦＰと比較したＡＡＶ－ＣＲＸで２カ月目に処置したＮｒｌ－／－；Ｔｇ（ＣＲＸＲ４１Ｗ）における明順応ｂ波の振幅の注射から２カ月後の保存を表すヒストグラム。＊ｐ＜０．０５。
【実施例】
【0083】
本発明を、以下の実施例によりさらに示す。
【0084】
実施例１
材料および方法
動物
雄性および雌性の成年（３～８週齢）のＣ５７ＢＬ／６Ｊの、ＣｒｘＲｉｐ／＋およびＴｇ（ＣＲＸＲ４１Ｗ）のマウス、ならびに雄性および雌性の若年（２週齢）のｒｄ１０マウスは、研究動物施設（Ａｎｉｍａｌｅｒｉｅ ｃｅｎｔｒａｌ － ｃａｍｐｕｓ ＣＮＲＳ Ｇｉｆ ｓｕｒ Ｙｖｅｔｔｅ）で産生された。
材料および方法
動物
雄性および雌性の成年（３～８週齢）のＣ５７ＢＬ／６Ｊの、ＣｒｘＲｉｐ／＋およびＴｇ（ＣＲＸＲ４１Ｗ）のマウス、ならびに雄性および雌性の若年（２週齢）のｒｄ１０マウスは、研究動物施設（Ａｎｉｍａｌｅｒｉｅ ｃｅｎｔｒａｌ － ｃａｍｐｕｓ ＣＮＲＳ Ｇｉｆ ｓｕｒ Ｙｖｅｔｔｅ）で産生された。
【0085】
全ての動物実験は、実験動物のケアおよび使用の欧州のガイドラインにしたがい行われ、地域の倫理委員会（ＣＥＥＡ５９）により認可された。
【0086】
ベクター
ヒトロドプシンキナーゼ（ＧＲＫ１）プロモーターの制御の下の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）またはヒト錐体－杆体ホメオボックスタンパク質（ＣＲＸ）を発現するｒＡＡＶ２／５ベクターを産生した。
ヒトロドプシンキナーゼ（ＧＲＫ１）プロモーターの制御の下の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）またはヒト錐体－杆体ホメオボックスタンパク質（ＣＲＸ）を発現するｒＡＡＶ２／５ベクターを産生した。
【0087】
１．ベクタープラスミドクローニング（８２２－ｐＫＬ．ＡＡＶ．ＧＲＫ１．ｈＣＲＸベクター＃６５５６ ｂａｔｃｈ）
ベクタープラスミドを、以下に記載されるように２つの段階で構築した。
まず、７５４－ｐＡＡＶ．ＧＲＫ１．ｅＧＦＰ．ｗｐｒｅ．ｂＧＨからＳｐｅ１（１８５位）およびＥｃｏＲ１（４２７位）のダブルダイジェスションによりプロモーターＧＲＫ１を抽出し、７７８－ｐＫＬ．ＡＡＶ．ＣＡＧ．ｂＧＨベクタープラスミドをＳｐｅ１（１８８位）－ＥｃｏＲ１（１９４７位）により前もってダブルダイジェスションを行ってＣＡＧプロモーターを抽出し、中間体のプラスミドｐＫＬ．ＡＡＶ．ｂＧＨを得てから、プロモーターＧＲＫ１を挿入した。ＧＲＫ１プロモーターを、ｐＫＬ．ＡＡＶ．ｂＧＨに挿入して、８２１－ｐＫＬ．ＡＡＶ．ＧＲＫ１．ｂＧＨバックボーンプラスミドを作製した。
第２のステップ：８２１－ｐＫＬ．ＡＡＶ．ＧＲＫ１．ｂＧＨバックボーンプラスミドを、ＥｃｏＲ１（５３１位）／Ｘｂａ１（５６９位）のダブルダイジェスションにより直線状にした。ｈＣＲＸ遺伝子を、Ｋｐｎ１消化（１１７１位）によりｐｃＤＮＡ４ｃ．ｈＣＲＸプラスミドから抽出し、粘着部位を作製し、平滑末端化し、続いてＸｂａ１消化（２１２０位）を行った。抽出したｈＣＲＸ遺伝子を、直線状にしたｐＫＬ．ＡＡＶ．ｈＣＲＸ．ｂＧＨの５３１位に挿入し、８２２－ｐＫＬ．ＡＡＶ．ＧＲＫ１．ｈＣＲＸの最終的なベクタープラスミドを作製した（図１）。
ベクタープラスミドを、以下に記載されるように２つの段階で構築した。
まず、７５４－ｐＡＡＶ．ＧＲＫ１．ｅＧＦＰ．ｗｐｒｅ．ｂＧＨからＳｐｅ１（１８５位）およびＥｃｏＲ１（４２７位）のダブルダイジェスションによりプロモーターＧＲＫ１を抽出し、７７８－ｐＫＬ．ＡＡＶ．ＣＡＧ．ｂＧＨベクタープラスミドをＳｐｅ１（１８８位）－ＥｃｏＲ１（１９４７位）により前もってダブルダイジェスションを行ってＣＡＧプロモーターを抽出し、中間体のプラスミドｐＫＬ．ＡＡＶ．ｂＧＨを得てから、プロモーターＧＲＫ１を挿入した。ＧＲＫ１プロモーターを、ｐＫＬ．ＡＡＶ．ｂＧＨに挿入して、８２１－ｐＫＬ．ＡＡＶ．ＧＲＫ１．ｂＧＨバックボーンプラスミドを作製した。
第２のステップ：８２１－ｐＫＬ．ＡＡＶ．ＧＲＫ１．ｂＧＨバックボーンプラスミドを、ＥｃｏＲ１（５３１位）／Ｘｂａ１（５６９位）のダブルダイジェスションにより直線状にした。ｈＣＲＸ遺伝子を、Ｋｐｎ１消化（１１７１位）によりｐｃＤＮＡ４ｃ．ｈＣＲＸプラスミドから抽出し、粘着部位を作製し、平滑末端化し、続いてＸｂａ１消化（２１２０位）を行った。抽出したｈＣＲＸ遺伝子を、直線状にしたｐＫＬ．ＡＡＶ．ｈＣＲＸ．ｂＧＨの５３１位に挿入し、８２２－ｐＫＬ．ＡＡＶ．ＧＲＫ１．ｈＣＲＸの最終的なベクタープラスミドを作製した（図１）。
【0088】
８２２－ｐＫＬ．ＡＡＶ．ＧＲＫ１．ｈＣＲＸの最終的なベクタープラスミドは、発現カセットに対応する１０６位から２７４５ｂｐまでシーケンスされている。
【0089】
２．ＡＡＶ２／５の製造および精製の操作法
細胞の増幅、トランスフェクション、収集、および上清のＰＥＧ沈殿
ベントキャップを有するＣｅｌｌＳｔａｃｋ Ｃｅｌｌｓ ５チャンバー（ＣＳ５）に播種したＨＥＫ２９３細胞を、１０％のＦＢＳおよび１％のＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐを補充したＤＭＥＭで培養した。約８０％のコンフルエンスで、細胞に、ＣａＰＯ４沈殿技術を使用して、ベクタープラスミドおよびヘルパープラスミド（アデノウイルス（Ｅ２Ａ、Ｅ４、およびＶＡ ＲＮＡ）由来のヘルパー遺伝子ならびにｒｅｐの血清型－２およびカプシド血清型－５に対応するｒｅｐ ｃａｐ遺伝子を含む）を同時にトランスフェクトする。培養培地を、ＣＳ５から除去し、トランスフェクション培地と交換し、次に細胞を、３７±１℃および５±１％のＣＯ２で、６～１５時間インキュベートする。次に、トランスフェクション培地をＣＳ５から除去し、新鮮な交換培地（ＤＭＥＭ、１％のＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）に置き換えた後、３７±１℃および５±１％のＣＯ２で３日間インキュベーションを行う。次に、トランスフェクトしたＣＳ５の細胞を回収する。この上清のみを、ＰＥＧで一晩、５±３℃で沈殿させる。次に沈殿した上清を遠心分離する。この上清を廃棄し、ＰＥＧ－ペレットを、ＴＢＳに再懸濁した後、ベンゾナーゼ（ｂｅｎｚｏｎａｓｅ）による消化を行う。
細胞の増幅、トランスフェクション、収集、および上清のＰＥＧ沈殿
ベントキャップを有するＣｅｌｌＳｔａｃｋ Ｃｅｌｌｓ ５チャンバー（ＣＳ５）に播種したＨＥＫ２９３細胞を、１０％のＦＢＳおよび１％のＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐを補充したＤＭＥＭで培養した。約８０％のコンフルエンスで、細胞に、ＣａＰＯ４沈殿技術を使用して、ベクタープラスミドおよびヘルパープラスミド（アデノウイルス（Ｅ２Ａ、Ｅ４、およびＶＡ ＲＮＡ）由来のヘルパー遺伝子ならびにｒｅｐの血清型－２およびカプシド血清型－５に対応するｒｅｐ ｃａｐ遺伝子を含む）を同時にトランスフェクトする。培養培地を、ＣＳ５から除去し、トランスフェクション培地と交換し、次に細胞を、３７±１℃および５±１％のＣＯ２で、６～１５時間インキュベートする。次に、トランスフェクション培地をＣＳ５から除去し、新鮮な交換培地（ＤＭＥＭ、１％のＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）に置き換えた後、３７±１℃および５±１％のＣＯ２で３日間インキュベーションを行う。次に、トランスフェクトしたＣＳ５の細胞を回収する。この上清のみを、ＰＥＧで一晩、５±３℃で沈殿させる。次に沈殿した上清を遠心分離する。この上清を廃棄し、ＰＥＧ－ペレットを、ＴＢＳに再懸濁した後、ベンゾナーゼ（ｂｅｎｚｏｎａｓｅ）による消化を行う。
【0090】
二重のＣｓＣｌ勾配の超遠心分離によるベクター精製
ウイルスの懸濁液を遠心分離し、ベクターを含む上清を、ＳＷ２８ローター用のＵｌｔｒａ－Ｃｌｅａｒチューブに段階的な（ｓｔｅｐ）密度のＣｓＣｌ勾配で充填する。この勾配を、１５℃で２４時間、２８０００ｒｐｍで遠心分離する。完全な粒子のバンドを回収し、新規のＳＷ４１ローター用のＵｌｔｒａ－Ｃｌｅａｒチューブに移す。第２の勾配を、３８０００ｒｐｍで４８時間遠心分離する。次に、濃縮された完全な粒子のバンドを回収する。次に、ウイルスの懸濁液を、眼の製剤用のバッファー溶液に対してＳｌｉｄｅ－ａ Ｌｙｚｅｒカセットにおいて４回の連続した透析に供する。最終的に精製したベクターを回収し、ｖｇの力価および純度のアッセイのためにサンプリングし、ポリプロピレン低結合クライオバイアルに－７０℃未満で保存する。
ウイルスの懸濁液を遠心分離し、ベクターを含む上清を、ＳＷ２８ローター用のＵｌｔｒａ－Ｃｌｅａｒチューブに段階的な（ｓｔｅｐ）密度のＣｓＣｌ勾配で充填する。この勾配を、１５℃で２４時間、２８０００ｒｐｍで遠心分離する。完全な粒子のバンドを回収し、新規のＳＷ４１ローター用のＵｌｔｒａ－Ｃｌｅａｒチューブに移す。第２の勾配を、３８０００ｒｐｍで４８時間遠心分離する。次に、濃縮された完全な粒子のバンドを回収する。次に、ウイルスの懸濁液を、眼の製剤用のバッファー溶液に対してＳｌｉｄｅ－ａ Ｌｙｚｅｒカセットにおいて４回の連続した透析に供する。最終的に精製したベクターを回収し、ｖｇの力価および純度のアッセイのためにサンプリングし、ポリプロピレン低結合クライオバイアルに－７０℃未満で保存する。
【0091】
３．クオリティコントロール：ベクターゲノムの定量化
ベクターの用量を決定するための基本的な単位は、ベクターゲノム（ｖｇ）である。ベクターゲノムは、目的の遺伝子を含む粒子の濃度に対応しており、Ｄ’Ｃｏｓｔａらの２０１６年の論文に記載されるＩＴＲ－２に特異的なプライマーを使用した定量的なＰＣＲにより定量化される。
ベクターの用量を決定するための基本的な単位は、ベクターゲノム（ｖｇ）である。ベクターゲノムは、目的の遺伝子を含む粒子の濃度に対応しており、Ｄ’Ｃｏｓｔａらの２０１６年の論文に記載されるＩＴＲ－２に特異的なプライマーを使用した定量的なＰＣＲにより定量化される。
【0092】
ｉｎ ｖｉｖｏでの網膜下ＡＡＶ注射
成年／若年のマウスに、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）におけるキシラジン（１ｍｇ／ｍＬ）およびケタミン（１０ｍｇ／ｍＬ）から構成される溶液をマウスあたり５０μＬ／１０ｇ使用して、腹腔内注射で麻酔をかけた。特有の点眼剤（Ｍｙｄｒｉａｔｉｃｕｍ（トロピカミド５ｍｇ ０．５％）およびＮｅｏｓｙｎｅｐｈｒｉｎｅ（塩酸フェニレフリン２．５％））を使用して虹彩を散大させた。眼に、Ｃｅｂｅｓｉｎｅ ０．４％を使用して麻酔をかけた。
成年／若年のマウスに、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）におけるキシラジン（１ｍｇ／ｍＬ）およびケタミン（１０ｍｇ／ｍＬ）から構成される溶液をマウスあたり５０μＬ／１０ｇ使用して、腹腔内注射で麻酔をかけた。特有の点眼剤（Ｍｙｄｒｉａｔｉｃｕｍ（トロピカミド５ｍｇ ０．５％）およびＮｅｏｓｙｎｅｐｈｒｉｎｅ（塩酸フェニレフリン２．５％））を使用して虹彩を散大させた。眼に、Ｃｅｂｅｓｉｎｅ ０．４％を使用して麻酔をかけた。
【0093】
麻酔をかけた後、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、ｒｄ１０およびＣｒｘＲｉｐ／＋のマウスに、
５×１０９ｖｇ／眼（ｎ＝２０匹のＣｒｘＲｉｐ／＋マウス；ｎ＝３匹のｒｄ１０マウス；ｎ＝２匹のＮｒｌ－／－；Ｔｇ（ＣＲＸＲ４１Ｗ）
１×１０１０ｖｇ／眼（ｎ＝８匹のＣｒｘＲｉｐ／＋マウス、ｎ＝２匹のｒｄ１０マウス）
２．５×１０１０ｖｇ／眼（ｎ＝３匹のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス；ｎ＝１０匹のＣｒｘＲｉｐ／＋マウス；ｎ＝２匹のｒｄ１０マウス）
のＡＡＶ２／５．ｈＧＲＫ１．ＧＦＰ（ＡＡＶ－ＧＦＰ）、または
５×１０９ｖｇ／眼（ｎ＝３匹のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス；ｎ＝２１匹のＣｒｘＲｉｐ／＋マウス；ｎ＝３匹のｒｄ１０マウス；ｎ＝２匹のＮｒｌ－／－）
１×１０１０ｖｇ／眼（ｎ＝９匹のＣｒｘＲｉｐ／＋マウス；ｎ＝４匹のｒｄ１０マウス）
２．５×１０１０ｖｇ／眼（ｎ＝６匹のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス；ｎ＝１０匹のＣｒｘＲｉｐ／＋マウス；ｎ＝１４匹のｒｄ１０マウス）
のＡＡＶ２／５．ｈＧＲＫ１．ｈＣＲＸ（ＡＡＶ－ＣＲＸ）
を網膜下腔に注射した。
５×１０９ｖｇ／眼（ｎ＝２０匹のＣｒｘＲｉｐ／＋マウス；ｎ＝３匹のｒｄ１０マウス；ｎ＝２匹のＮｒｌ－／－；Ｔｇ（ＣＲＸＲ４１Ｗ）
１×１０１０ｖｇ／眼（ｎ＝８匹のＣｒｘＲｉｐ／＋マウス、ｎ＝２匹のｒｄ１０マウス）
２．５×１０１０ｖｇ／眼（ｎ＝３匹のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス；ｎ＝１０匹のＣｒｘＲｉｐ／＋マウス；ｎ＝２匹のｒｄ１０マウス）
のＡＡＶ２／５．ｈＧＲＫ１．ＧＦＰ（ＡＡＶ－ＧＦＰ）、または
５×１０９ｖｇ／眼（ｎ＝３匹のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス；ｎ＝２１匹のＣｒｘＲｉｐ／＋マウス；ｎ＝３匹のｒｄ１０マウス；ｎ＝２匹のＮｒｌ－／－）
１×１０１０ｖｇ／眼（ｎ＝９匹のＣｒｘＲｉｐ／＋マウス；ｎ＝４匹のｒｄ１０マウス）
２．５×１０１０ｖｇ／眼（ｎ＝６匹のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス；ｎ＝１０匹のＣｒｘＲｉｐ／＋マウス；ｎ＝１４匹のｒｄ１０マウス）
のＡＡＶ２／５．ｈＧＲＫ１．ｈＣＲＸ（ＡＡＶ－ＣＲＸ）
を網膜下腔に注射した。
【0094】
５μＬのハミルトンシリンジに取り付けられた３３Ｇの斜角のついた針を、視神経近くのＲＰＥ／脈絡膜を通り腹側の網膜下腔へと挿入した。２μＬをゆっくりと注射して、（約３０秒の間に）ＲＰＥ細胞から網膜を剥離した。
【0095】
タンパク質の抽出およびイムノブロット解析
マウスを、頸椎脱臼を用いて安楽死させた。網膜を解剖しドライアイスで凍結し、次に－８０℃で保存した。タンパク質を、プロテアーゼ阻害剤（ｃＯｍｐｌｅｔｅ（商標））を含む溶解バッファー（２０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、２５０ｍＭのＮａＣｌ、５％のＤＴＴ、３０ｍＭのＮａＰＰｉ、０．１％のＮＰ－４０、５ｍＭのＥＤＴＡ）を使用して抽出した。機械的な破壊を、超音波処理により達成し、遠心分離（１０分間、１３２００ｒｐｍ、４°Ｃ）の後にタンパク質を単離した。
マウスを、頸椎脱臼を用いて安楽死させた。網膜を解剖しドライアイスで凍結し、次に－８０℃で保存した。タンパク質を、プロテアーゼ阻害剤（ｃＯｍｐｌｅｔｅ（商標））を含む溶解バッファー（２０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、２５０ｍＭのＮａＣｌ、５％のＤＴＴ、３０ｍＭのＮａＰＰｉ、０．１％のＮＰ－４０、５ｍＭのＥＤＴＡ）を使用して抽出した。機械的な破壊を、超音波処理により達成し、遠心分離（１０分間、１３２００ｒｐｍ、４°Ｃ）の後にタンパク質を単離した。
【0096】
試験される各眼由来のタンパク質２０μｇを、７．５％～１２％の勾配のアクリルアミドゲル（Ｂｉｏｒａｄ）上に充填した。このランを、一定の電圧（１００Ｖ）で行った。完了後に、ウェスタンブロットの転写（ｔｒａｎｓｆｅｒ）を、ニトロセルロース膜（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上でｉＢｌｏｔ ２ Ｄｒｙ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍを使用して行った。
【0097】
転写の後、ニトロセルロース膜を、ブロッキングバッファー（ＰＢＳＴ［ＰＢＳ、０．０５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００］、５％のミルク）と共に室温で１時間インキュベートした。次に、一次抗体を、４℃で一晩（マウス抗Ｃｒｘ（Ａ－９）、ｒｅｆ．：ｓｃ－３７７１３８［Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｉｎｃ．］、ｂａｔｃｈｅｓ Ｊ１１１６およびＨ２９１８、希釈１／５０００）、または室温で一時間（マウス抗チューブリンクローンＤＭ１Ａ、ｒｅｆ．：Ｔ９０２６［Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ］、ｂａｔｃｈ ０５２Ｍ４８３７、希釈１／１００００）、新鮮なブロッキングバッファーに添加した。過剰量の一次抗体をＰＢＳＴで１０分間、３回すすいだ。
【0098】
二次抗体を、室温で２時間（ヤギ抗マウスＩｇＧ－ペルオキシダーゼ、ｒｅｆ．：Ａ４４１６［Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ］、ｂａｔｃｈ ＳＬＢＨ３６９２、希釈１／５０００）、新鮮なブロッキングバッファーに添加し、その後、ＰＢＳＴで１０分間、３回すすいだ。
【0099】
ＥＣＬ顕色キット（Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ（商標）Ｗｅｓｔ Ｄｕｒａ Ｅｘｔｅｎｄｅｄ Ｄｕｒａｔｉｏｎ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ：３４０７６［ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ］；ｂａｔｃｈ ＳＫ２５６９８６）を、暗室で顕色を行う５分前に、ニトロセルロース膜に添加した（Ｃａｒｅｓｔｒｅａｍ（登録商標）Ｋｏｄａｋ（登録商標）ＢｉｏＭａｘ（登録商標）ｌｉｇｈｔ ｆｉｌｍ、ｒｅｆ．：Ｚ３７３５０８［Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ］）。
【0100】
膜は、ストリッピングバッファー（１．５ｇのグリシン、１ｍＬのＳＤＳ １０％、１ｍＬのＴｗｅｅｎ－２０、ｍｉｌｌｉＱ水 ｑｓ． １００ｍＬ、ｐＨ２．２）を用いてストリッピングすることができる。よって、この膜を、室温で１０分間、２回インキュベートした後、２回のＰＢＳ洗浄を１０分間行い、最後に、ＰＢＳＴで５分間、２回洗浄した。膜を、上述のように一次抗体および２次抗体とインキュベートした。顕色の後、フィルムをスキャンし、Ｉｍａｇｅ Ｊで解析した。
【0101】
組織学解析
マウスを、頸椎脱臼を用いて安楽死させた。眼を回収し、４％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で１時間固定し、ＰＢＳですすいだ後、脱水（ｄｅｈｙｄｒａｔａｔｉｏｎ）およびパラフィン包埋（ｐａｒａｆｆｉｎ ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ）を行った。７μｍ厚の切片を、ミクロトーム（ロータリーミクロトーム、ｒｅｆ．：ＨＭ ３４０Ｅ［ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ］）で切断し、３７℃で一晩載置し、その後、室温で保存した。免疫組織化学的検査（ＩＨＣ）の前に、スライドを、脱パラフィンし、次に、熱したクエン酸塩バッファー（ｐＨ６、０．１Ｍ）において５００Ｗで２０分間インキュベートした。冷却した後、スライドを、ＰＢＳの中に載置した。平坦な標本の網膜上での免疫染色（ＩＨＣ）のため、網膜を解剖し、４％のＰＦＡで１時間固定し、ＰＢＳですすぎ、一次抗体と共に直接インキュベートした。
マウスを、頸椎脱臼を用いて安楽死させた。眼を回収し、４％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で１時間固定し、ＰＢＳですすいだ後、脱水（ｄｅｈｙｄｒａｔａｔｉｏｎ）およびパラフィン包埋（ｐａｒａｆｆｉｎ ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ）を行った。７μｍ厚の切片を、ミクロトーム（ロータリーミクロトーム、ｒｅｆ．：ＨＭ ３４０Ｅ［ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ］）で切断し、３７℃で一晩載置し、その後、室温で保存した。免疫組織化学的検査（ＩＨＣ）の前に、スライドを、脱パラフィンし、次に、熱したクエン酸塩バッファー（ｐＨ６、０．１Ｍ）において５００Ｗで２０分間インキュベートした。冷却した後、スライドを、ＰＢＳの中に載置した。平坦な標本の網膜上での免疫染色（ＩＨＣ）のため、網膜を解剖し、４％のＰＦＡで１時間固定し、ＰＢＳですすぎ、一次抗体と共に直接インキュベートした。
【0102】
０．３％のトリトンＸ－１００を補充したＤａｋｏ ＲＥＡＬ（ｔｍ）抗体希釈液（ｒｅｆ Ｓ２０２２ ｌｏｔ ２００６００９１）における一次抗体を、乾燥チャンバー（マウス抗ロドプシンｃｌｏｎｅ ４Ｄ２、ｒｅｆ．：ＭＡＢＮ１５［Ｍｅｒｃｋ］、ｂａｔｃｈ ２９３５４９５、希釈１／１０００；ウサギ抗錐体アレスチン、ｒｅｆ．：ＡＢ１５２８２［Ｍｅｒｃｋ］、ｂａｔｃｈ ２８０２５９０、希釈１／１０００；ヤギ抗ＧＦＰ、ｒｅｆ．：ａｂ６６７３［Ａｂｃａｍ］、希釈１／１０００）において４℃で一晩、スライドに添加した。平坦な標本の網膜を、一次抗体と共に２日間インキュベートした。
【0103】
これらを、０．３％のトリトンＸ－１００を補充したＤａｋｏ ＲＥＡＬ（ｔｍ）抗体希釈液（ｒｅｆ Ｓ２０２２ ｌｏｔ ２００６００９１）における二次抗体（ロバ抗マウスＩｇＧ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５、ｒｅｆ．：Ａ３１５７０［ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ］、希釈１／１０００；ロバ抗ウサギＩｇＧ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、ｒｅｆ．：Ａ２１２０６［ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ］、希釈１／１０００；ロバ抗ヤギＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、ｒｅｆ．：Ａ１１０５５［ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ］、希釈１／１０００）を添加する５分前に、ＰＢＳＴで３回すすいだ。暗室において室温で２時間インキュベートした後、スライドをＰＢＳＴで５分間、３回すすぎ、ＤＡＰＩ（ｒｅｆ．：６２２４８［ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ］、ｂａｔｃｈ ＲＪ２２７９３６２、希釈１／１０００）をＰＢＳＴにおいて２０分間添加した。最後に、スライドを、ＰＢＳＴで３回すすいだ。平坦な標本の網膜を、二次抗体と共に一晩インキュベートした。
【0104】
平坦な標本の網膜で、網膜を、光受容器の側を上にしてスライド上に置いた。ＦｌｕｏｒＳａｖｅ（商標）Ｒｅａｇｅｎｔ（ｒｅｆ．：３４５７８９、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ｂａｔｃｈ ３０３４６３２）を、カバースリップを追加するために使用した。スライドは、４℃で保存した。写真は、Ｉｍａｇｅｒ Ｍ２顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）またはＬＳＭ７１０共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）を使用して入手し、ＺｅｎソフトウェアおよびＩｍａｇｅ Ｊを使用して解析した。
【0105】
網膜電図
網膜電図（ＥＲＧ）の記録を、Ｍｉｃｒｏｎ ＩＶ（Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に取り付けた局所ＥＲＧモジュールを使用して行った。簡潔に述べると、マウスを一晩暗順応させ、暗赤色灯の下実験のために調製した。マウスに、ケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）を使用して麻酔をかけ、点眼剤を介して塩酸プロパラカイン（０．５％、Ａｌｃｏｎ）を局所的に投与した。瞳孔を、トロピカミド（１％、Ａｌｃｏｎ）およびフェニレフリン（２．５％、Ａｌｃｏｎ）を使用して散大させ、ＧＯＮＡＫヒプロメロース点眼用粘滑溶液（ｈｙｐｒｏｍｅｌｌｏｓｅ ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ ｄｅｍｕｌｃｅｎｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（２．５％、Ａｋｏｒｎ）で軽くコーティングした。Ｍｉｃｒｏｎ ＩＶのレンズを角膜上に直接載置し、参照電極をマウスの頭に載置した。暗順応応答を、－１．７から２．２ｃｄ．ｓ／ｍ２まで光強度を増大させる一連のフラッシュを用いて引き起こした。明順応応答を、－０．５から２．８ｃｄ．ｓ／ｍ２まで光強度を増大させる一連のフラッシュを用いて杆体を脱感作させるバックグラウンド光の下で引き起こした。ａ波およびｂ波の値を引き出し、目的のグループ間の比較のためプロットした。
網膜電図（ＥＲＧ）の記録を、Ｍｉｃｒｏｎ ＩＶ（Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に取り付けた局所ＥＲＧモジュールを使用して行った。簡潔に述べると、マウスを一晩暗順応させ、暗赤色灯の下実験のために調製した。マウスに、ケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）を使用して麻酔をかけ、点眼剤を介して塩酸プロパラカイン（０．５％、Ａｌｃｏｎ）を局所的に投与した。瞳孔を、トロピカミド（１％、Ａｌｃｏｎ）およびフェニレフリン（２．５％、Ａｌｃｏｎ）を使用して散大させ、ＧＯＮＡＫヒプロメロース点眼用粘滑溶液（ｈｙｐｒｏｍｅｌｌｏｓｅ ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ ｄｅｍｕｌｃｅｎｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（２．５％、Ａｋｏｒｎ）で軽くコーティングした。Ｍｉｃｒｏｎ ＩＶのレンズを角膜上に直接載置し、参照電極をマウスの頭に載置した。暗順応応答を、－１．７から２．２ｃｄ．ｓ／ｍ２まで光強度を増大させる一連のフラッシュを用いて引き起こした。明順応応答を、－０．５から２．８ｃｄ．ｓ／ｍ２まで光強度を増大させる一連のフラッシュを用いて杆体を脱感作させるバックグラウンド光の下で引き起こした。ａ波およびｂ波の値を引き出し、目的のグループ間の比較のためプロットした。
【0106】
明－暗の選択
装置は、２０ｃｍ高のプレキシグラスの壁を有し、トラップドア（６×６ｃｍ）により暗室ボックス（１５×１５ｃｍ）に接続した明るく照らされた白色のボックス（４０×１５ｃｍ）からなるものであった。暗室ボックスの照明は、１０ルクス未満であった。明室ボックスでは、光は、４０ｃｍの区画の端に配置されており、よって、入口の６００ルクスから区画の端の１５００ルクスまで増大する照明の勾配を提供した。
装置は、２０ｃｍ高のプレキシグラスの壁を有し、トラップドア（６×６ｃｍ）により暗室ボックス（１５×１５ｃｍ）に接続した明るく照らされた白色のボックス（４０×１５ｃｍ）からなるものであった。暗室ボックスの照明は、１０ルクス未満であった。明室ボックスでは、光は、４０ｃｍの区画の端に配置されており、よって、入口の６００ルクスから区画の端の１５００ルクスまで増大する照明の勾配を提供した。
【0107】
試験を、午前９時～１２時に行った。各マウスを、暗室の区画に１０秒間置き、次にトラップドアを開口し、５分間マウスに装置全体を自由に利用させた。ステップスルー潜時、進入の数、および明室の区画で過ごした時間の合計をスコア付けした。
【0108】
実施例２
ＣＲＸ関連網膜症マウスモデルにおいて効率的に形質導入された光受容器に対して使用されるプロモーターおよびＡＡＶベクターの血清型の選択
いくつかのＡＡＶ血清型およびプロモーターが試験されており、成年において成熟した光受容器の形質導入を示した。ＣｒｘＲｉｐ／＋網膜の場合、外顆粒層は、未成熟な錐体様の光受容器のみを含み、よって、分化した光受容器を処置するために一般に使用されるＡＡＶベクターは効率的ではない場合がある。よって、本発明者らは、杆体光受容器および錐体光受容器での遺伝子発現を方向付ける、光受容器に特異的なプロモーターにより駆動されるＧＦＰを発現するいくつかの血清型を試験した。ｉ）すでに杆体光受容器および錐体光受容器において遺伝子を発現することが良好に特徴づけられている、ｉｉ）臨床試験ですでに使用されている（ＰＤＥ６Ｂ）、ｉｉｉ）本発明者らの公開済みのトランスクリプトームのデータに基づき本発明者らのマウスモデルにおいて活性であるため、ヒトロドプシンキナーゼ１（ＧＲＫ１）プロモーターを選択した。血清型では、本発明者らは、マウス光受容器を特異的に形質導入することが記載されたＡＡＶ２／５ベクターを選択した。
ＣＲＸ関連網膜症マウスモデルにおいて効率的に形質導入された光受容器に対して使用されるプロモーターおよびＡＡＶベクターの血清型の選択
いくつかのＡＡＶ血清型およびプロモーターが試験されており、成年において成熟した光受容器の形質導入を示した。ＣｒｘＲｉｐ／＋網膜の場合、外顆粒層は、未成熟な錐体様の光受容器のみを含み、よって、分化した光受容器を処置するために一般に使用されるＡＡＶベクターは効率的ではない場合がある。よって、本発明者らは、杆体光受容器および錐体光受容器での遺伝子発現を方向付ける、光受容器に特異的なプロモーターにより駆動されるＧＦＰを発現するいくつかの血清型を試験した。ｉ）すでに杆体光受容器および錐体光受容器において遺伝子を発現することが良好に特徴づけられている、ｉｉ）臨床試験ですでに使用されている（ＰＤＥ６Ｂ）、ｉｉｉ）本発明者らの公開済みのトランスクリプトームのデータに基づき本発明者らのマウスモデルにおいて活性であるため、ヒトロドプシンキナーゼ１（ＧＲＫ１）プロモーターを選択した。血清型では、本発明者らは、マウス光受容器を特異的に形質導入することが記載されたＡＡＶ２／５ベクターを選択した。
【0109】
異なる用量のＧＦＰを発現するＡＡＶベクターを、１×１０９～５×１０１０ｖｇ／ＣｒｘＲｉｐ／＋の眼の範囲で、出生後３０日目（Ｐ３０）に網膜下腔に注射した。直後に、網膜下注射の質を、ＯＣＴ（光干渉断層撮影：Ｏｐｔｉｃａｌ Ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）により観察される網膜剥離の存在により確認した。２週間後に、網膜剥離が消失し、光受容器の形質導入の効率を、蛍光眼底イメージング（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｆｕｎｄｕｓ ｉｍａｇｉｎｇ）、次いで組織学解析を行うことにより評価した。注射した網膜由来の切片で行ったＧＦＰ免疫蛍光解析により、光受容器が局在する外顆粒層に限定される注射領域での強力なＧＦＰ発現が、明らかとなった（図２）。
【0110】
結論として、さらなる治療のために選択されたＡＡＶベクター血清型は、ＧＲＫ１プロモーターを含むＡＡＶ２／５ベクターである。
【0111】
実施例３
ＡＡＶ２／５ベクターを使用したＧＲＫ１プロモーターにより駆動されるＣＲＸ発現の定量化
産物（ＣＲＸを発現するＡＡＶベクターまたはＡＡＶ－ＣＲＸ）がＣＲＸタンパク質を産生できることを検証するために、一連の網膜下注射を、ＣｒｘＲｉｐ／＋網膜にて３回の異なる用量（０．５．１０１０、１．１０１０、および２．５．１０１０ｖｇ）で行い、１４日後にＣＲＸ発現を評価した。試験した３つの全ての用量で、ＣＲＸの発現の増大が観察された。産生される量は、使用される用量よりも注射に依存していた（図３）。この実験は、網膜下注射の技術が完全に習得されたときに反復したが、このときは、対照としてＧＦＰを発現するベクター（ＡＡＶ－ＧＦＰ）を３つの異なる用量（０．５．１０１０、１．１０１０および２．５．１０１０ｖｇ）で注射した（図４）。ＣＲＸの相対発現を、チューブリンの正規化の後に定量化し、０．５．１０１０ｖｇでのＡＡＶ－ＧＦＰ注射の後に内因性ＣＲＸ発現に対して記録した。ＣＲＸ発現は、使用される用量に比例してＡＡＶ－ＣＲＸ注射後に明らかに有意に増大した。
ＡＡＶ２／５ベクターを使用したＧＲＫ１プロモーターにより駆動されるＣＲＸ発現の定量化
産物（ＣＲＸを発現するＡＡＶベクターまたはＡＡＶ－ＣＲＸ）がＣＲＸタンパク質を産生できることを検証するために、一連の網膜下注射を、ＣｒｘＲｉｐ／＋網膜にて３回の異なる用量（０．５．１０１０、１．１０１０、および２．５．１０１０ｖｇ）で行い、１４日後にＣＲＸ発現を評価した。試験した３つの全ての用量で、ＣＲＸの発現の増大が観察された。産生される量は、使用される用量よりも注射に依存していた（図３）。この実験は、網膜下注射の技術が完全に習得されたときに反復したが、このときは、対照としてＧＦＰを発現するベクター（ＡＡＶ－ＧＦＰ）を３つの異なる用量（０．５．１０１０、１．１０１０および２．５．１０１０ｖｇ）で注射した（図４）。ＣＲＸの相対発現を、チューブリンの正規化の後に定量化し、０．５．１０１０ｖｇでのＡＡＶ－ＧＦＰ注射の後に内因性ＣＲＸ発現に対して記録した。ＣＲＸ発現は、使用される用量に比例してＡＡＶ－ＣＲＸ注射後に明らかに有意に増大した。
【0112】
実施例４
ＡＡＶ－ＣＲＸ注射によるＣｒｘＲｉｐ／＋網膜における光受容器分化の回復
光受容器の分化を回復させるための産物（ＣＲＸを発現するＡＡＶベクターまたはＡＡＶ－ＣＲＸ）の特性を評価するために、Ｐ３０にＡＡＶ－ＣＲＸを２．５×１０１０ｖｇ／眼で注射した。組織学解析のため、２カ月後に網膜を回収した。免疫組織化学的検査の解析を、抗ロドプシンおよび抗錐体アレスチンを使用して行い、それぞれ杆体光受容器および錐体光受容器を標識した。その結果は、注射した領域周辺に、大きなロドプシンおよび錐体アレスチンに陽性の細胞の領域があることを明確に明らかにした（図５）。ＣｒｘＲｉｐ／＋におけるＡＡＶ－ＣＲＸ網膜下注射から４カ月後の平坦な標本の網膜上のロドプシンおよび錐体アレスチンに陽性の細胞のイメージングは、０．５．１０．１０ｖｇの用量で完全に分化した杆体光受容器および錐体光受容器を示した（図６Ａ）。対照的に、ＡＡＶ－ＧＦＰを注射した眼は、これらのマーカーに対し陽性の細胞を示さなかった。ＡＡＶ－ＣＲＸ処置から４カ月後に分化した光受容器の形態を良好に可視化するために、低量のＡＡＶ－ＧＦＰ（＜１．１０９）を同時に注射して、イメージングしやすい低密度のＧＦＰ陽性細胞の存在を得た。高い拡大率のＡＡＶ－ＣＲＸで形質導入された平坦な標本の網膜上のＧＦＰ陽性光受容器は、良好に形成された外節、およびシナプス終末の存在を示した（図６Ｂ）。
ＡＡＶ－ＣＲＸ注射によるＣｒｘＲｉｐ／＋網膜における光受容器分化の回復
光受容器の分化を回復させるための産物（ＣＲＸを発現するＡＡＶベクターまたはＡＡＶ－ＣＲＸ）の特性を評価するために、Ｐ３０にＡＡＶ－ＣＲＸを２．５×１０１０ｖｇ／眼で注射した。組織学解析のため、２カ月後に網膜を回収した。免疫組織化学的検査の解析を、抗ロドプシンおよび抗錐体アレスチンを使用して行い、それぞれ杆体光受容器および錐体光受容器を標識した。その結果は、注射した領域周辺に、大きなロドプシンおよび錐体アレスチンに陽性の細胞の領域があることを明確に明らかにした（図５）。ＣｒｘＲｉｐ／＋におけるＡＡＶ－ＣＲＸ網膜下注射から４カ月後の平坦な標本の網膜上のロドプシンおよび錐体アレスチンに陽性の細胞のイメージングは、０．５．１０．１０ｖｇの用量で完全に分化した杆体光受容器および錐体光受容器を示した（図６Ａ）。対照的に、ＡＡＶ－ＧＦＰを注射した眼は、これらのマーカーに対し陽性の細胞を示さなかった。ＡＡＶ－ＣＲＸ処置から４カ月後に分化した光受容器の形態を良好に可視化するために、低量のＡＡＶ－ＧＦＰ（＜１．１０９）を同時に注射して、イメージングしやすい低密度のＧＦＰ陽性細胞の存在を得た。高い拡大率のＡＡＶ－ＣＲＸで形質導入された平坦な標本の網膜上のＧＦＰ陽性光受容器は、良好に形成された外節、およびシナプス終末の存在を示した（図６Ｂ）。
【0113】
実施例５
ＡＡＶ－ＣＲＸ注射によるＣｒｘＲｉｐ／＋網膜における部分的な機能の回復
ＣｒｘＲｉｐ／＋におけるＡＡＶ－ＣＲＸ処置により新規に分化した杆体光受容器および錐体光受容器の機能性を評価するために、暗順応および明順応のＥＲＧの記録を行った。２．２ Ｌｏｇ ｃｄ ｓｅｃ／ｍ２の最大刺激での暗順応Ｂ波の振幅の統計上有意な増加（図７Ａ）が記録された。明順応応答では、全体的にわずかに改善したが、ＡＡＶ－ＧＦＰで処置した動物と比較して１．６ Ｌｏｇ ｃｄ ｓｅｃ／ｍ２の刺激でのみ統計上有意であった（図７Ｂ）。視覚に特化した脳領域に視覚シグナルを形質導入するためのＣｒｘＲｉｐ／＋の新規に分化した光受容器の特性を推定するために、「明／暗の選択」と命名された挙動を使用した。ＷＴマウスは、ボックスの暗部側で時間の大部分をすごし、未処置のＣｒｘＲｉｐ／＋マウスは、完全な盲目のため無関係に両側に移動する。対照的に、ＡＡＶ－ＣＲＸで処置したＣｒｘＲｉｐ／＋マウスは、ボックスの明部側に通じる線を有意に少なく横切ることにより、暗部側でより多くの時間を過ごした（図７Ｃ）。まとめると、これら結果は、ＣｒｘＲｉｐ／＋光受容器の分化と、ＡＡＶ－ＣＲＸで処置されたマウスの特に光を検出する特性による部分的な機能の回復とをもたらすＡＡＶ－ＣＲＸ処置の特性を示した。
ＡＡＶ－ＣＲＸ注射によるＣｒｘＲｉｐ／＋網膜における部分的な機能の回復
ＣｒｘＲｉｐ／＋におけるＡＡＶ－ＣＲＸ処置により新規に分化した杆体光受容器および錐体光受容器の機能性を評価するために、暗順応および明順応のＥＲＧの記録を行った。２．２ Ｌｏｇ ｃｄ ｓｅｃ／ｍ２の最大刺激での暗順応Ｂ波の振幅の統計上有意な増加（図７Ａ）が記録された。明順応応答では、全体的にわずかに改善したが、ＡＡＶ－ＧＦＰで処置した動物と比較して１．６ Ｌｏｇ ｃｄ ｓｅｃ／ｍ２の刺激でのみ統計上有意であった（図７Ｂ）。視覚に特化した脳領域に視覚シグナルを形質導入するためのＣｒｘＲｉｐ／＋の新規に分化した光受容器の特性を推定するために、「明／暗の選択」と命名された挙動を使用した。ＷＴマウスは、ボックスの暗部側で時間の大部分をすごし、未処置のＣｒｘＲｉｐ／＋マウスは、完全な盲目のため無関係に両側に移動する。対照的に、ＡＡＶ－ＣＲＸで処置したＣｒｘＲｉｐ／＋マウスは、ボックスの明部側に通じる線を有意に少なく横切ることにより、暗部側でより多くの時間を過ごした（図７Ｃ）。まとめると、これら結果は、ＣｒｘＲｉｐ／＋光受容器の分化と、ＡＡＶ－ＣＲＸで処置されたマウスの特に光を検出する特性による部分的な機能の回復とをもたらすＡＡＶ－ＣＲＸ処置の特性を示した。
【0114】
実施例６
ＡＡＶ－ＣＲＸは、細胞死からｒｄ１０光受容器を保護する。
過剰発現したＣＲＸＷＴの潜在的な関心は、その標的遺伝子の発現を刺激することである。これらのうち、多くは、ｈｙｐｏｍｏｒｐｈｉｃ変異によるＩＲＤに関連する酵素をコードし、特定のサブタイプのＰＤＥ６Ｂ変異などの低い発現または低い活性をもたらす。過剰発現したＣＲＸＷＴによりＣＲＸの標的遺伝子の発現を増強することは、発現および／または活性の特定の閾値に達することを可能にし、適切な光伝達および長期間のＰＲの維持を可能にする。これは、Ｐｄｅ６ｂのｈｙｐｏｍｏｒｐｈｉｃ劣性の変異を担持するｒｄ１０マウスを使用して行った。注目すべきことに、網膜の変性は、このマウスにおいておよそＰ１５で開始し、Ｐ３０までに、杆体の大部分が消失する。十分な発現レベルの増大は、ｃＧＭＰレベルを低減するために十分な酵素の活性の特定の閾値に達することを可能にし、よって、シグナル伝達カスケードを回復させる。よって、本発明の治療産物は、より多くの患者を潜在的に処置可能にする適用の幅広いスペクトラムを有する。
ＡＡＶ－ＣＲＸは、細胞死からｒｄ１０光受容器を保護する。
過剰発現したＣＲＸＷＴの潜在的な関心は、その標的遺伝子の発現を刺激することである。これらのうち、多くは、ｈｙｐｏｍｏｒｐｈｉｃ変異によるＩＲＤに関連する酵素をコードし、特定のサブタイプのＰＤＥ６Ｂ変異などの低い発現または低い活性をもたらす。過剰発現したＣＲＸＷＴによりＣＲＸの標的遺伝子の発現を増強することは、発現および／または活性の特定の閾値に達することを可能にし、適切な光伝達および長期間のＰＲの維持を可能にする。これは、Ｐｄｅ６ｂのｈｙｐｏｍｏｒｐｈｉｃ劣性の変異を担持するｒｄ１０マウスを使用して行った。注目すべきことに、網膜の変性は、このマウスにおいておよそＰ１５で開始し、Ｐ３０までに、杆体の大部分が消失する。十分な発現レベルの増大は、ｃＧＭＰレベルを低減するために十分な酵素の活性の特定の閾値に達することを可能にし、よって、シグナル伝達カスケードを回復させる。よって、本発明の治療産物は、より多くの患者を潜在的に処置可能にする適用の幅広いスペクトラムを有する。
【0115】
ｈｙｐｏｍｏｒｐｈｉｃ変異に関するＡＡＶ－ＣＲＸベクターの潜在的な治療効果を評価するために、Ｐ１４でｒｄ１０マウスに網膜下注射（２．５×１０１０ｖｇ）を行い、１カ月後に網膜を回収した。ＩＨＣ解析は、対照と比較して処置した眼において良好なＯＮＬの保存を明らかにした。外節が顕著に減少した注射を行わなかった眼とは対照的に、杆体および錐体のＰＲは、良好に保存された外節を呈し、ここでロドプシンおよび錐体アレスチンは、健常な網膜などで局在化している（図８（Ａ））。ＯＮＬの厚さの測定から、保存が確認された（図８（Ｂ））。さらに、Ｐ１４での注射から１カ月後の効力を、２つのさらなる用量のＡＡＶ－ＣＲＸ：０．５．１０１０ｖｇおよび１．１０１０ｖｇを用いて試験した。パラフィン切片を使用して、形質導入した領域を、ＡＡＶにより産生されるヒトＣＲＸを特異的に認識し、内因性マウスＣｒｘを特異的に認識しない抗ＣＲＸを使用して決定した。ＯＮＬの厚さの測定から、１．１０１０ｖｇの用量が形質導入しなかった領域と比較して良好なＯＮＬの保存をもたらしたことが示された（図９）。これら結果は、ＩＲＤの特定のサブタイプに関する本発明の産物の使用の治療上の価値を明らかに示すものであった。
【0116】
しかしながら、Ｐ１４で開始する変性の動態および注射時間により、ＡＡＶ－ＣＲＸ注射は、変性の発症の前にＡＡＶによるＣＲＸ産生のためより多くの時間を提供することにより治療の効果の評価を改善するためにｒｄ１０の生涯において早期に行われなければならない。
【0117】
光受容器に特異的なヒト野生型ＣＲＸ ｃＤＮＡの正しい発現を実証した。月齢１カ月のＣｒｘＲｉｐ／＋マウスにおけるＡＡＶ－ＣＲＸの予備的な網膜下注射は、ｉ）０．５．１０１０ｖｇの用量での毒性の不存在、ｉｉ）ＣＲＸ発現レベルの増大、およびｉｉｉ）処置を行わなかったマウスと比較して大きなロドプシンおよび錐体アレスチンに陽性の細胞の領域を伴う、注射から４カ月後のＰＲ分化の再開を示した。特に、本発明の遺伝子療法産物は、杆体光受容器と比較して多い錐体の分化をもたらす。最後に、網膜下注射から４カ月後の暗順応および明順応の網膜電図（ＥＲＧ）の応答のわずかな回復が観察された。まとめると、これらの非常に有望な結果は、成年のＣｒｘＲｉｐ／＋網膜におけるＰＲの分化を回復させる本発明の産物の有効性を明らかに示している。
【0118】
実施例７
第２のマウスモデルは、ＣＲＸＲ４１Ｗ変異を担持するＣＯＲＤの発端者をそれぞれ伴うフランスの２家族の同定に基づき確立された。この優性変異は、ＣＲＸの核の局在化を変えないが、そのＤＮＡ結合の特性を低減し、その標的遺伝子の転写活性の減少をもたらす。この変異は、ドミナントネガティブ作用またはＣＲＸＲ４１Ｗを標的プロモーターに結合させない機能喪失をもたらし得る。よって、遺伝子導入系のＴｇ（ＣＲＸＲ４１Ｗ）が、レンチウイルスの手法（ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｏｎ Ｐ． Ｃｈａｒｎｅａｕ ａｎｄ Ｌ． Ｖｉｖｅｓ， Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ， Ｐａｒｉｓ）を使用して作製されている。この系は、Ｃｒｘプロモーターの制御の下ｍｙｃタグと融合した反復性ヒトＣＲＸＲ４１Ｗ変異を担持する。導入遺伝子の複数のコピーを有するＴｇ（ＣＲＸＲ４１Ｗ）創始者の第１のグループは、光受容器の変性による暗順応および明順応のＥＲＧ応答の喪失を示した。コピー数を減らすために野生型（ＷＴ）のマウスと連続して交配させることにより、ＥＲＧ応答の部分的な回復がもたらされ、疾患の発症におけるＣＲＸＷＴおよびＣＲＸＲ４１Ｗの量の間の比率の重要性を示している。これらの知見は、変異したＣＲＸの負の作用を補償するためにＣＲＸＷＴの量を増大させる治療上の関心を明らかに示している。導入遺伝子ＣＲＸＲ４１Ｗの１つのコピーを有する３つの系（ＥＲＧ応答のわずかな減少を伴う光受容器の正常な分化が見出されている）が確立されている。光受容器における導入遺伝子の発現は、ＩＨＣにより検証された。
第２のマウスモデルは、ＣＲＸＲ４１Ｗ変異を担持するＣＯＲＤの発端者をそれぞれ伴うフランスの２家族の同定に基づき確立された。この優性変異は、ＣＲＸの核の局在化を変えないが、そのＤＮＡ結合の特性を低減し、その標的遺伝子の転写活性の減少をもたらす。この変異は、ドミナントネガティブ作用またはＣＲＸＲ４１Ｗを標的プロモーターに結合させない機能喪失をもたらし得る。よって、遺伝子導入系のＴｇ（ＣＲＸＲ４１Ｗ）が、レンチウイルスの手法（ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｏｎ Ｐ． Ｃｈａｒｎｅａｕ ａｎｄ Ｌ． Ｖｉｖｅｓ， Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ， Ｐａｒｉｓ）を使用して作製されている。この系は、Ｃｒｘプロモーターの制御の下ｍｙｃタグと融合した反復性ヒトＣＲＸＲ４１Ｗ変異を担持する。導入遺伝子の複数のコピーを有するＴｇ（ＣＲＸＲ４１Ｗ）創始者の第１のグループは、光受容器の変性による暗順応および明順応のＥＲＧ応答の喪失を示した。コピー数を減らすために野生型（ＷＴ）のマウスと連続して交配させることにより、ＥＲＧ応答の部分的な回復がもたらされ、疾患の発症におけるＣＲＸＷＴおよびＣＲＸＲ４１Ｗの量の間の比率の重要性を示している。これらの知見は、変異したＣＲＸの負の作用を補償するためにＣＲＸＷＴの量を増大させる治療上の関心を明らかに示している。導入遺伝子ＣＲＸＲ４１Ｗの１つのコピーを有する３つの系（ＥＲＧ応答のわずかな減少を伴う光受容器の正常な分化が見出されている）が確立されている。光受容器における導入遺伝子の発現は、ＩＨＣにより検証された。
【0119】
Ｔｇ（ＣＲＸＲ４１Ｗ）の２つのコピーを有するマウスが（１つのコピーを有する系から）得られている。Ｔｇ（ＣＲＸＲ４１Ｗ）の１つのコピーを有する系がＥＲＧ応答に欠陥を有さない場合、２つのコピーを有するマウスは、６カ月齢で明順応応答の低減を示した。よって、この系は、本発明の治療効果を試験するための良好な錐体－杆体ジストロフィーのモデルであるが、変性は、強力ではなくゆっくりとしたものである。この問題を回避するために、全ての光受容器が錐体であるＮｒｌ－／－バックグラウンド上でこの変異を発現する系を確立した。この系で、高い光刺激での明順応応答の減少が、２カ月で観察できた（図１０（Ａ））。２カ月齢の動物におけるＡＡＶ－ＣＲＸまたはＡＡＶ－ＧＦＰの予備注射は、注射から２カ月後に、ＡＡＶ－ＣＲＸで処置したＮｒｌ－／－；Ｔｇ（ＣＲＸＲ４１Ｗ）の明順応応答が、ＡＡＶ－ＧＦＰで処置した動物と比較して保存されていることを示した（図１０（Ｂ））。
【0120】
患者のＣＲＸ変異型ｉＰＳＣ株から分化した光受容器細胞の表現型の特徴および遺伝子置換の効力の評価
ｉＰＳＣは、ＩＲＤを有する患者の線維芽細胞から初期化され得るため、概念実証遺伝子療法試験のための優れたモデルを提示する疾患に特異的な網膜細胞モデルを作製することが可能である。ｉＰＳＣ由来の光受容器モデルを、ＣＯＲＤ（ｐ．Ａｒｇ４１Ｔｒｐ）；ＬＣＡ（ｐ．Ｐｒｏ２３２Ａｒｇｆｓ＊１３９）およびＲＰ（ｐ．Ａｓｐ６５Ｈｉｓ）をもたらすＣＲＸ変異を担持する３名の患者から作製した。ＣＯＲＤおよびＬＣＡの患者のｉＰＳＣを作製し、それらの多能性および遺伝子の安定性を確認した。さらに、対照およびＣＯＲＤの個体由来のｉＰＳＣを、光受容器を含む網膜オルガノイドに分化させた。分化の異なる時間でのｑＰＣＲ解析を使用して、２つの株の間の最大１６０日間の早期の光受容器マーカー（ＳＩＸ３、ＶＸＶＸ２、ＲＡＸ、ＯＴＸ２、ＮＥＵＲＯＤ１、ＮＲＬ）の類似の発現パターンを観察した。ＣＯＲＤ株のＣＲＸ発現は、対照と比較して１６０日目以前は類似しているように見えたが、それ以降は減少したことが検出された。対照的に、ＮＲ２Ｅ３発現の減少が、ＣＯＲＤ株で試験された全ての時点で検出された。これは、ＮＲ２Ｅ３が杆体の発達に関してＣＲＸと相互作用するため特に興味深い。さらに、ＣＯＲＤ株は、対照と比較して、より成熟した錐体（ＯＰＮ１ＳＷ、ＣＡＲ、ＯＰＳＮ１ＭＷ）および杆体（ＲＫ、ＲＣＶＲＮ）のマーカーの発現が減少していることが、検出された。さらに、ロドプシンの発現は、ＣＯＲＤ株のｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルで検出することができなかった。これら結果は、ｐ．Ａｒｇ４１Ｔｒｐ／Ｒ４１Ｗ変異の場合の光受容器の分化の遅延または変更を示すものである。
ｉＰＳＣは、ＩＲＤを有する患者の線維芽細胞から初期化され得るため、概念実証遺伝子療法試験のための優れたモデルを提示する疾患に特異的な網膜細胞モデルを作製することが可能である。ｉＰＳＣ由来の光受容器モデルを、ＣＯＲＤ（ｐ．Ａｒｇ４１Ｔｒｐ）；ＬＣＡ（ｐ．Ｐｒｏ２３２Ａｒｇｆｓ＊１３９）およびＲＰ（ｐ．Ａｓｐ６５Ｈｉｓ）をもたらすＣＲＸ変異を担持する３名の患者から作製した。ＣＯＲＤおよびＬＣＡの患者のｉＰＳＣを作製し、それらの多能性および遺伝子の安定性を確認した。さらに、対照およびＣＯＲＤの個体由来のｉＰＳＣを、光受容器を含む網膜オルガノイドに分化させた。分化の異なる時間でのｑＰＣＲ解析を使用して、２つの株の間の最大１６０日間の早期の光受容器マーカー（ＳＩＸ３、ＶＸＶＸ２、ＲＡＸ、ＯＴＸ２、ＮＥＵＲＯＤ１、ＮＲＬ）の類似の発現パターンを観察した。ＣＯＲＤ株のＣＲＸ発現は、対照と比較して１６０日目以前は類似しているように見えたが、それ以降は減少したことが検出された。対照的に、ＮＲ２Ｅ３発現の減少が、ＣＯＲＤ株で試験された全ての時点で検出された。これは、ＮＲ２Ｅ３が杆体の発達に関してＣＲＸと相互作用するため特に興味深い。さらに、ＣＯＲＤ株は、対照と比較して、より成熟した錐体（ＯＰＮ１ＳＷ、ＣＡＲ、ＯＰＳＮ１ＭＷ）および杆体（ＲＫ、ＲＣＶＲＮ）のマーカーの発現が減少していることが、検出された。さらに、ロドプシンの発現は、ＣＯＲＤ株のｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルで検出することができなかった。これら結果は、ｐ．Ａｒｇ４１Ｔｒｐ／Ｒ４１Ｗ変異の場合の光受容器の分化の遅延または変更を示すものである。
【0121】
網膜オルガノイドにおける患者に特異的なｉＰＳＣ由来の光受容器を、ＡＡＶ－ＣＲＸで形質導入して野生型のＣＲＸ発現を増大させ、この分化のプロファイルを経時的にモニタリングし、未処置および対照の細胞と比較した。
【0122】
結果、ｉ）遺伝子型－表現型の相関を入手し、よって、各変異に関連する差次的な臨床プロファイルの基盤を解明し、ｉｉ）全ての形態が遺伝子置換戦略から利益を受けることができるかどうかどうか、およびＣＲＸ過剰発現に関連した毒性作用が存在するかどうかが決定された。これら試験は、ｉｎ ｖｉｖｏでの投与のチャレンジの不存在下で、外因性のＣＲＸ発現の真の効果を評価することを可能にする。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【国際調査報告】