特表 2022-524215 改変抗体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-04-28

(54)【発明の名称】改変抗体

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/13 20060101AFI20220421BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20220421BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20220421BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20220421BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20220421BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20220421BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20220421BHJP

   C12N 15/56 20060101ALI20220421BHJP

   C07K 16/00 20060101ALI20220421BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20220421BHJP

【ＦＩ】

C12N15/13

C12N15/62 Z

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12N15/56

C07K16/00

C12P21/08

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021557655

(86)(22)【出願日】2020-03-30

(85)【翻訳文提出日】2021-11-26

(86)【国際出願番号】 US2020025638

(87)【国際公開番号】W WO2020198731

(87)【国際公開日】2020-10-01

(31)【優先権主張番号】62/825,448

(32)【優先日】2019-03-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】509240479

【氏名又は名称】ダニスコ・ユーエス・インク

(74)【代理人】

【識別番号】100071010

【弁理士】

【氏名又は名称】山崎 行造

(74)【代理人】

【識別番号】100118647

【弁理士】

【氏名又は名称】赤松 利昭

(74)【代理人】

【識別番号】100123892

【弁理士】

【氏名又は名称】内藤 忠雄

(74)【代理人】

【識別番号】100169993

【弁理士】

【氏名又は名称】今井 千裕

(74)【代理人】

【識別番号】100173978

【弁理士】

【氏名又は名称】朴 志恩

(72)【発明者】

【氏名】チャン、ジミー

(72)【発明者】

【氏名】エステル、デイビッド エー

(72)【発明者】

【氏名】ムノス、ジェフリー ウェイン

(72)【発明者】

【氏名】ミラー、マイケル シー

(72)【発明者】

【氏名】ニコラエフ、イゴール

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG27

4B064CA02

4B064CA05

4B064CA06

4B064CA19

4B064CC24

4B064CE12

4B064DA01

4B065AA01X

4B065AA26X

4B065AA57X

4B065AA70X

4B065AA70Y

4B065AA72X

4B065AA79X

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065BA02

4B065CA25

4B065CA44

4H045AA11

4H045BA41

4H045CA15

4H045CA40

4H045DA76

4H045DA89

4H045EA20

4H045FA74

4H045GA26

(57)【要約】

本明細書には、とりわけ、切断抵抗性の抗体及び抗体産生宿主細胞、並びにそれらの作製、使用、及び分泌改良のための方法が開示される。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ポリペプチドのタンパク質分解を低減する１つ以上のアミノ酸修飾を含むヒンジ領域を含む、モノクローナルＩｇＧ１抗体重鎖ポリペプチド。

【請求項2】

ＩｇＧ１抗体軽鎖ポリペプチドをさらに含む、請求項１に記載のポリペプチド。

【請求項3】

前記修飾が、アミノ酸位置２１６、２１７、２２２、２２６、及び／又は２３４のうちの１つ以上における修飾を含み、前記アミノ酸位置が、配列番号１における番号付けに従って番号付けされる、請求項１又は２に記載のポリペプチド。

【請求項4】

前記修飾が、２１６Ｔ若しくはＶ；２１７Ｔ若しくはＳ；２２２Ｃ、Ｄ、若しくはＥ；２２６Ｎ若しくはＰ；及び／又は２３４Ｒのうちの１つ以上を含む、請求項３に記載のポリペプチド。

【請求項5】

前記修飾が２２７位における修飾をさらに含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項6】

前記修飾が２２７Ｐを含む、請求項５に記載のポリペプチド。

【請求項7】

前記修飾が、２１６位における修飾と、アミノ酸位置２２２、２２６、２２７、及び／又は２３４における１つ以上の修飾とを含む、請求項３又は４に記載のポリペプチド。

【請求項8】

前記修飾が、２１６Ｔと、２２２Ｃ、Ｄ、若しくはＥ；２２６Ｎ若しくはＰ；２２７Ｐ；及び／又は２３４Ｒのうちの１つ以上とを含む、請求項７に記載のポリペプチド。

【請求項9】

前記修飾が、２１７位における修飾と、アミノ酸位置２２２、２２６、２２７、及び／又は２３４における１つ以上の修飾とを含む、請求項３又は４に記載のポリペプチド。

【請求項10】

前記修飾が、２１７Ｔと、２２２Ｃ、Ｄ、若しくはＥ；２２６Ｎ若しくはＰ；２２７Ｐ；及び／又は２３４Ｒのうちの１つ以上とを含む、請求項７に記載のポリペプチド。

【請求項11】

前記修飾が、（ａ）Ｒ２１７Ｓ－Ｔ２２６Ｎ；（ｂ）Ｒ２１７Ｓ－Ｓ２２２Ｃ；（ｃ）Ｔ２１６Ｖ－Ｒ２１７Ｓ－Ｔ２２６Ｎ；（ｄ）Ｓ２２２Ｃ－Ｈ２２７Ｐ；（ｅ）Ｒ２１７Ｓ－Ｓ２２２Ｅ－Ｈ２２７Ｐ；（ｆ）Ｔ２１６Ｖ－Ｒ２１７Ｓ－Ｓ２２２Ｃ－Ｔ２２６Ｐ；（ｇ）Ｔ２２６Ｐ－Ｈ２２７Ｐ；（ｈ）Ｒ２１７Ｓ－Ｓ２２２Ｃ－Ｔ２２６Ｐ；（ｉ）Ｔ２１６Ｖ－Ｓ２２２Ｄ－Ｔ２２６Ｐ；（ｊ）Ｔ２１６Ｖ－Ｓ２２２Ｃ－Ｔ２２６Ｐ－Ｈ２２７Ｐ；（ｋ）Ｔ２１６Ｖ－Ｓ２２２Ｅ－Ｔ２２６Ｎ；（ｌ）Ｔ２１６Ｖ－Ｓ２２２Ｃ－Ｈ２２７Ｐ；（ｍ）Ｒ２１７Ｓ－Ｓ２２２Ｃ－Ｔ２２６Ｎ；（ｎ）Ｓ２２２Ｃ－Ｔ２２６Ｐ－Ｈ２２７Ｐ；（ｏ）Ｔ２１６Ｖ－Ｓ２２２Ｃ－Ｔ２２６Ｎ－Ｈ２２７Ｐ；（ｐ）Ｒ２１７Ｓ－Ｓ２２２Ｄ－Ｔ２２６Ｐ－Ｈ２２７Ｐ；（ｑ）Ｔ２１６Ｖ－Ｈ２２７Ｐ；（ｒ）Ｓ２２２Ｅ－Ｔ２２６Ｐ－Ｈ２２７Ｐ；（ｓ）Ｒ２１７Ｓ－Ｓ２２２Ｄ－Ｔ２２６Ｎ－Ｈ２２７Ｐ；（ｔ）Ｒ２１７Ｓ－Ｓ２２２Ｅ－Ｔ２２６Ｐ－Ｈ２２７Ｐ；（ｕ）Ｔ２１６Ｖ－Ｓ２２２Ｃ；（ｖ）Ｒ２１７Ｓ－Ｓ２２２Ｄ；（ｗ）Ｓ２２２Ｅ－Ｔ２２６Ｐ；（ｘ）Ｒ２１７Ｓ－Ｓ２２２Ｃ－Ｔ２２６Ｐ－Ｈ２２７Ｐ；（ｙ）Ｔ２１６Ｖ－Ｔ２２６Ｐ－Ｈ２２７Ｐ；（Ｚ）Ｔ２１６Ｖ－Ｓ２２２Ｄ－Ｈ２２７Ｐ；（ａａ）Ｔ２２６Ｎ－Ｈ２２７Ｐ；（ｂｂ）Ｓ２２２Ｄ－Ｔ２２６Ｎ－Ｈ２２７Ｐ；（ｃｃ）Ｒ２１７Ｓ－Ｓ２２２Ｅ－Ｔ２２６Ｎ；（ｄｄ）Ｒ２１７Ｓ－Ｔ２２６Ｎ－Ｈ２２７Ｐ；（ｅｅ）Ｒ２１７Ｓ－Ｓ２２２Ｅ－Ｔ２２６Ｎ－Ｈ２２７Ｐ；（ｆｆ）Ｔ２１６Ｖ－Ｒ２１７Ｓ－Ｈ２２７Ｐ；（ｇｇ）Ｔ２１６Ｖ－Ｓ２２２Ｅ－Ｔ２２６Ｐ－Ｈ２２７Ｐ；（ｈｈ）Ｔ２１６Ｖ－Ｓ２２２Ｃ－Ｔ２２６Ｎ；（ｉｉ）Ｒ２１７Ｓ－Ｔ２２６Ｐ－Ｈ２２７Ｐ；（ｊｊ）Ｔ２１６Ｖ－Ｔ２２６Ｐ；（ｋｋ）Ｓ２２２Ｅ－Ｔ２２６Ｎ－Ｈ２２７Ｐ；（ｌｌ）Ｓ２２２Ｅ－Ｈ２２７Ｐ；（ｍｍ）Ｒ２１７Ｓ－Ｓ２２２Ｅ－Ｔ２２６Ｐ；（ｎｎ）Ｒ２１７Ｓ－Ｔ２２６Ｐ；（ｏｏ）Ｔ２１６Ｖ－Ｓ２２２Ｄ；（ｐｐ）Ｒ２１７Ｓ－Ｓ２２２Ｃ－Ｈ２２７Ｐ；（ｑｑ）Ｔ２１６Ｖ－Ｓ２２２Ｅ－Ｔ２２６Ｎ－Ｈ２２７Ｐ；（ｒｒ）Ｓ２２２Ｃ－Ｔ２２６Ｎ－Ｈ２２７Ｐ；（ｓｓ）Ｔ２１６Ｖ－Ｒ２１７Ｓ－Ｓ２２２Ｃ－Ｔ２２６Ｎ－Ｈ２２７Ｐ；（ｔｔ）Ｒ２１７Ｓ－Ｓ２２２Ｄ－Ｔ２２６Ｐ；及び（ｕｕ）Ｓ２２２Ｄ－Ｔ２２６Ｎ（ｖｖ）からなる群から選択される組み合わせの修飾である、請求項１～６のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項12】

前記ポリペプチドが、前記１つ以上のアミノ酸修飾を含まないモノクローナルＩｇＧ１抗体重鎖ポリペプチドと比較して、少なくとも約５０％少ないタンパク質分解を示す、請求項１～１１のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項13】

前記ポリペプチドが、検出可能なタンパク質分解を示さない、請求項１～１２のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項14】

シグナル配列をコードするポリペプチドをさらに含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項15】

担体タンパク質をコードするポリペプチドをさらに含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項16】

前記担体タンパク質をコードするポリペプチドが、シグナル配列をコードするポリペプチドに隣接する、請求項１４又は１５に記載のポリペプチド。

【請求項17】

前記担体タンパク質が、ＣＢＨ１又はその断片を含む、請求項１４～１６のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項18】

前記抗体が、抗ＲＳウイルス（ＲＳＶ）抗体、抗エボラウイルス抗体、抗凝集βアミロイド（Ａβ）抗体、抗ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗体、抗単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）抗体、抗精子抗体（例えば、抗ヒト避妊抗原（ＨＣＡ）抗体）、又は抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体である、請求項１～１７のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項19】

前記ポリペプチドが、前記１つ以上のアミノ酸修飾を含まないモノクローナルＩｇＧ１抗体重鎖ポリペプチドと比較して、増大した安定性を示す、請求項１～１８のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項20】

請求項１～１９のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドをコードする核酸。

【請求項21】

請求項２０に記載の核酸をコードするベクター。

【請求項22】

プロモーターをコードする核酸配列をさらに含む、請求項２１に記載のベクター。

【請求項23】

請求項１～１９のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項２０に記載の核酸、又は請求項２１若しくは請求項２２に記載のベクターを含む宿主細胞。

【請求項24】

前記宿主細胞が、哺乳類宿主細胞、細菌宿主細胞、及び真菌宿主細胞からなる群から選択される、請求項２３に記載の宿主細胞。

【請求項25】

前記哺乳類細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項２４に記載の宿主細胞。

【請求項26】

前記細菌細胞が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞である、請求項２４に記載の宿主細胞。

【請求項27】

前記真菌細胞が、酵母細胞又は糸状菌細胞である、請求項２４に記載の宿主細胞。

【請求項28】

前記酵母細胞が、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）の種である、請求項２７に記載の宿主細胞。

【請求項29】

前記真菌細胞が、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の種、アオカビ属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）の種、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）の種、クリソスポリウム属（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）の種、グリオクラジウム属（Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ）の種、コウジカビ属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の種、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）の種、ケカビ属（Ｍｕｃｏｒ）の種、アカパンカビ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）の種、ボタンタケ属（Ｈｙｐｏｃｒｅａ）の種、マイセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）の種、及びエメリセラ属（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ）の種からなる群から選択される、請求項２４又は請求項２７に記載の宿主細胞。

【請求項30】

前記真菌細胞が、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、トリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ）、トリコデルマ・コニンギ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ハルチアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、フミコラ・グリセア（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｇｒｉｓｅａ）、クリソスポリウム・ルクノウェンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、コウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、クロカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・カワチ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｋａｗａｃｈｉ）、アスペルギルス・アクレアタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、アスペルギルス・ジャポニクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、ショウユコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ）、マイセリオフトラ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、及びアワモリコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）からなる群から選択される、請求項２９に記載の宿主細胞。

【請求項31】

請求項１～１９のいずれか一項に記載のポリペプチドを産生するための方法であって、請求項２３～３０のいずれか一項に記載の宿主細胞を、前記ポリペプチドの産生に適した条件下で培養することを含む方法。

【請求項32】

前記ポリペプチドを単離することをさらに含む、請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

前記ポリペプチドが、前記１つ以上のアミノ酸修飾を含まないモノクローナルＩｇＧ１抗体重鎖ポリペプチドと比較して、少なくとも約５０％少ないタンパク質分解を示す、請求項３１又は３２に記載の方法。

【請求項34】

前記ポリペプチドが、検出可能なタンパク質分解を示さない、請求項３１～３３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項35】

タンパク質分解に対するその抵抗性を増大させるためにモノクローナルＩｇＧ１抗体重鎖ポリペプチドを修飾する方法であって、前記ポリペプチドのヒンジ領域内の１つ以上のアミノ酸残基を修飾することを含む方法。

【請求項36】

前記修飾が、アミノ酸位置２１６、２１７、２２２、２２６、及び／又は２３３のうちの１つ以上における修飾を含み、前記アミノ酸位置が、配列番号１における番号付けに従って番号付けされる、請求項３１に記載の方法。

【請求項37】

前記修飾が、２１６Ｔ若しくはＶ；２１７Ｓ；２２２Ｃ、Ｄ、若しくはＥ；２２６Ｎ若しくはＰ；及び／又は２３４Ｒのうちの１つ以上を含む、請求項３２に記載の方法。

【請求項38】

前記修飾が２２７Ｐをさらに含む、請求項３３に記載の方法。

【請求項39】

前記修飾が、（ａ）Ｒ２１７Ｓ－Ｔ２２６Ｎ；（ｂ）Ｒ２１７Ｓ－Ｓ２２２Ｃ；（ｃ）Ｔ２１６Ｖ－Ｒ２１７Ｓ－Ｔ２２６Ｎ；（ｄ）Ｓ２２２Ｃ－Ｈ２２７Ｐ；（ｅ）Ｒ２１７Ｓ－Ｓ２２２Ｅ－Ｈ２２７Ｐ；（ｆ）Ｔ２１６Ｖ－Ｒ２１７Ｓ－Ｓ２２２Ｃ－Ｔ２２６Ｐ；（ｇ）Ｔ２２６Ｐ－Ｈ２２７Ｐ；（ｈ）Ｒ２１７Ｓ－Ｓ２２２Ｃ－Ｔ２２６Ｐ；（ｉ）Ｔ２１６Ｖ－Ｓ２２２Ｄ－Ｔ２２６Ｐ；（ｊ）Ｔ２１６Ｖ－Ｓ２２２Ｃ－Ｔ２２６Ｐ－Ｈ２２７Ｐ；（ｋ）Ｔ２１６Ｖ－Ｓ２２２Ｅ－Ｔ２２６Ｎ；（ｌ）Ｔ２１６Ｖ－Ｓ２２２Ｃ－Ｈ２２７Ｐ；（ｍ）Ｒ２１７Ｓ－Ｓ２２２Ｃ－Ｔ２２６Ｎ；（ｎ）Ｓ２２２Ｃ－Ｔ２２６Ｐ－Ｈ２２７Ｐ；（ｏ）Ｔ２１６Ｖ－Ｓ２２２Ｃ－Ｔ２２６Ｎ－Ｈ２２７Ｐ；（ｐ）Ｒ２１７Ｓ－Ｓ２２２Ｄ－Ｔ２２６Ｐ－Ｈ２２７Ｐ；（ｑ）Ｔ２１６Ｖ－Ｈ２２７Ｐ；（ｒ）Ｓ２２２Ｅ－Ｔ２２６Ｐ－Ｈ２２７Ｐ；（ｓ）Ｒ２１７Ｓ－Ｓ２２２Ｄ－Ｔ２２６Ｎ－Ｈ２２７Ｐ；（ｔ）Ｒ２１７Ｓ－Ｓ２２２Ｅ－Ｔ２２６Ｐ－Ｈ２２７Ｐ；（ｕ）Ｔ２１６Ｖ－Ｓ２２２Ｃ；（ｖ）Ｒ２１７Ｓ－Ｓ２２２Ｄ；（ｗ）Ｓ２２２Ｅ－Ｔ２２６Ｐ；（ｘ）Ｒ２１７Ｓ－Ｓ２２２Ｃ－Ｔ２２６Ｐ－Ｈ２２７Ｐ；（ｙ）Ｔ２１６Ｖ－Ｔ２２６Ｐ－Ｈ２２７Ｐ；（Ｚ）Ｔ２１６Ｖ－Ｓ２２２Ｄ－Ｈ２２７Ｐ；（ａａ）Ｔ２２６Ｎ－Ｈ２２７Ｐ；（ｂｂ）Ｓ２２２Ｄ－Ｔ２２６Ｎ－Ｈ２２７Ｐ；（ｃｃ）Ｒ２１７Ｓ－Ｓ２２２Ｅ－Ｔ２２６Ｎ；（ｄｄ）Ｒ２１７Ｓ－Ｔ２２６Ｎ－Ｈ２２７Ｐ；（ｅｅ）Ｒ２１７Ｓ－Ｓ２２２Ｅ－Ｔ２２６Ｎ－Ｈ２２７Ｐ；（ｆｆ）Ｔ２１６Ｖ－Ｒ２１７Ｓ－Ｈ２２７Ｐ；（ｇｇ）Ｔ２１６Ｖ－Ｓ２２２Ｅ－Ｔ２２６Ｐ－Ｈ２２７Ｐ；（ｈｈ）Ｔ２１６Ｖ－Ｓ２２２Ｃ－Ｔ２２６Ｎ；（ｉｉ）Ｒ２１７Ｓ－Ｔ２２６Ｐ－Ｈ２２７Ｐ；（ｊｊ）Ｔ２１６Ｖ－Ｔ２２６Ｐ；（ｋｋ）Ｓ２２２Ｅ－Ｔ２２６Ｎ－Ｈ２２７Ｐ；（ｌｌ）Ｓ２２２Ｅ－Ｈ２２７Ｐ；（ｍｍ）Ｒ２１７Ｓ－Ｓ２２２Ｅ－Ｔ２２６Ｐ；（ｎｎ）Ｒ２１７Ｓ－Ｔ２２６Ｐ；（ｏｏ）Ｔ２１６Ｖ－Ｓ２２２Ｄ；（ｐｐ）Ｒ２１７Ｓ－Ｓ２２２Ｃ－Ｈ２２７Ｐ；（ｑｑ）Ｔ２１６Ｖ－Ｓ２２２Ｅ－Ｔ２２６Ｎ－Ｈ２２７Ｐ；（ｒｒ）Ｓ２２２Ｃ－Ｔ２２６Ｎ－Ｈ２２７Ｐ；（ｓｓ）Ｔ２１６Ｖ－Ｒ２１７Ｓ－Ｓ２２２Ｃ－Ｔ２２６Ｎ－Ｈ２２７Ｐ；（ｔｔ）Ｒ２１７Ｓ－Ｓ２２２Ｄ－Ｔ２２６Ｐ；及び（ｕｕ）Ｓ２２２Ｄ－Ｔ２２６Ｎ（ｖｖ）からなる群から選択される組み合わせの修飾である、請求項３１又は３２に記載の方法。

【請求項40】

前記ポリペプチドが、前記１つ以上のアミノ酸修飾を含まないモノクローナルＩｇＧ１抗体重鎖ポリペプチドと比較して、少なくとも約５０％少ないタンパク質分解を示す、請求項３５～３９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項41】

前記ポリペプチドが、検出可能なタンパク質分解を示さない、請求項３５～４０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項42】

前記ポリペプチドが、前記１つ以上のアミノ酸修飾を含まないモノクローナルＩｇＧ１抗体重鎖ポリペプチドと比較して、増大した安定性を示す、請求項３５～４１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項43】

請求項３５～４２のいずれか一項に記載の方法によって産生された、モノクローナルＩｇＧ１抗体重鎖ポリペプチド。

【請求項44】

ａ）請求項１～１９のいずれか一項に記載のポリペプチドを産生するための書面の説明書と、ｂ）１）請求項２０に記載の核酸；２）請求項２１又は２２に記載のベクター；及び／又は３）請求項２３～３０のいずれか一項に記載の宿主細胞のうちの１つ以上とを含むキット。

【請求項45】

請求項１～１９又は４３のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む、シリンジ、カニューレ、又はカテーテル。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、その開示の全体が参照によって本明細書に組み込まれる２０１９年３月２８日に出願された米国仮特許出願第６２／８２５，４４８号の優先権を主張する。

【0002】

本明細書で提供されるのは、とりわけ、修飾されたヒンジ領域を有する抗体であり、本抗体は、修飾されていないヒンジ領域を有する同一の抗体と比べて、切断に対してより抵抗性であり、及び／又は増大した安定性を有する。

【背景技術】

【0003】

抗体は、特定の抗原に結合する免疫学的タンパク質である。ヒト及びマウスを含むほとんどの哺乳類において、抗体は、対を成す重及び軽ポリペプチド鎖から構成される。各鎖は、可変（Ｆｖ）及び定常（Ｆｃ）領域と称される２つの別個の領域からなる。軽鎖及び重鎖Ｆｖ領域は分子の抗原結合決定因子を含有し、標的抗原の結合に関与する。Ｆｃ領域は抗体のクラス（又はアイソタイプ）（例えば、ＩｇＧ）を定義し、重要な生化学的事象を誘発するためにいくつかの天然タンパク質の結合に関与する。重鎖の定常領域はさらに、ＣＨ１、ヒンジ領域、ＣＨ２及びＣＨ３と呼ばれる４つのより小さいドメインに分けることができる。定常領域の一部であるＦｃ領域は、いくつかの重要な細胞機能に関わる。一般に、Ｆｃ領域はＣＨ２及びＣＨ３のみを含むと定義され、ヒンジ領域の一部も包含し得る。

【0004】

ＩｇＧアイソタイプの抗体は、極めて柔軟な分子である。実際、ＩｇＧの生物学的機能は、非常に特異的且つ制御された変形方法を必要とする。ＩｇＧ分子の内部柔軟性に主として関与する構造は、定常領域の第１ドメイン（ＣＨ１）と第２ドメイン（ＣＨ２）との間に位置し、ヒンジ領域と呼ばれる。ヒンジは、それぞれ上部、中部及び下部ヒンジである３つのペプチド領域に分けることができる（Ｂｒｅｋｋｅ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ １６：８５－９０）。生化学的及び構造的研究によって、柔軟性を制御し、エフェクター機能を調節する重要な構造要素として、抗体のヒンジ領域が指摘されている。ＩｇＧ１ｂ１２の結晶構造（Ｓａｐｈｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９３：１１５５－１１５９及びＳａｐｈｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３１９（１）：９－１８）は、抗体内の極端なドメイン間柔軟性を示す極度の非対称を明らかにした。ｂ１２の構造はヒンジの別の特徴であるその脆弱さを明らかにした；ｂ１２の構造は、抗体ヒンジ特性についての予備的知識と一致して、ヒンジ領域における広範な損傷を示す。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

したがって、組換え抗体が宿主細胞において発現される際、多くの場合、抗体ヒンジ領域において著しいタンパク質分解的切断（すなわち、クリッピング）事象が観察されることは、意外なことではない。このような切断は抗体産生プロセスの効率を低下させ、機能性免疫グロブリンの力価の低下をもたらす。したがって、必要とされるのは、産生及び精製プロセス中に宿主細胞発現抗体のヒンジ領域におけるタンパク質分解的クリッピングの量を低減するための改良された組成物及び方法である。本明細書に開示される主題はこれらの必要性に対処し、付加的な利益も提供する。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本明細書で提供されるのは、とりわけ、産生及び精製中にプロテアーゼ媒介性の切断（すなわち、クリッピング）が低減されるか又は存在しない、抗体ヒンジ領域内のアミノ酸配列が変更された天然に存在しない改変モノクローナル抗体と、その産生方法とである。開示される方法、改変抗体、及び組換え宿主細胞は、開示される変更されたヒンジ領域アミノ酸配列を含有しない、及び／又は本明細書に開示される方法に従って使用されない抗体と比較して、増大された抗体の産生及び／又は精製をもたらす。

【0007】

したがって、いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、ポリペプチドのタンパク質分解を低減する１つ以上のアミノ酸修飾を含むヒンジ領域を含むモノクローナルＩｇＧ１抗体重鎖ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ＩｇＧ１抗体軽鎖ポリペプチドをさらに含む。本明細書に開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、修飾は、アミノ酸位置２１６、２１７、２２２、２２６、及び／又は２３４のうちの１つ以上における修飾を含み、アミノ酸位置は、配列番号１における番号付けに従って番号付けされる。いくつかの実施形態では、修飾は、２１６Ｔ若しくはＶ；２１７Ｔ若しくはＳ；２２２Ｃ、Ｄ、若しくはＥ；２２６Ｎ若しくはＰ；及び／又は２３４Ｒのうちの１つ以上を含む。本明細書に開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、修飾は、２２７位における修飾をさらに含む。いくつかの実施形態では、修飾は２２７Ｐを含む。本明細書に開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、修飾は、２１６位における修飾と、アミノ酸位置２２２、２２６、２２７、及び／又は２３４における１つ以上の修飾とを含む。いくつかの実施形態では、修飾は、２１６Ｔと、２２２Ｃ、Ｄ、若しくはＥ；２２６Ｎ若しくはＰ；２２７Ｐ；及び／又は２３４Ｒのうちの１つ以上とを含む。本明細書に開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、修飾は、２１７位における修飾と、アミノ酸位置２２２、２２６、２２７、及び／又は２３４における１つ以上の修飾とを含む。いくつかの実施形態では、修飾は、２１７Ｔと、２２２Ｃ、Ｄ、若しくはＥ；２２６Ｎ若しくはＰ；２２７Ｐ；及び／又は２３４Ｒのうちの１つ以上とを含む。本明細書に開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、修飾は、（ａ）Ｒ２１７Ｓ－Ｔ２２６Ｎ；（ｂ）Ｒ２１７Ｓ－Ｓ２２２Ｃ；（ｃ）Ｔ２１６Ｖ－Ｒ２１７Ｓ－Ｔ２２６Ｎ；（ｄ）Ｓ２２２Ｃ－Ｈ２２７Ｐ；（ｅ）Ｒ２１７Ｓ－Ｓ２２２Ｅ－Ｈ２２７Ｐ；（ｆ）Ｔ２１６Ｖ－Ｒ２１７Ｓ－Ｓ２２２Ｃ－Ｔ２２６Ｐ；（ｇ）Ｔ２２６Ｐ－Ｈ２２７Ｐ；（ｈ）Ｒ２１７Ｓ－Ｓ２２２Ｃ－Ｔ２２６Ｐ；（ｉ）Ｔ２１６Ｖ－Ｓ２２２Ｄ－Ｔ２２６Ｐ；（ｊ）Ｔ２１６Ｖ－Ｓ２２２Ｃ－Ｔ２２６Ｐ－Ｈ２２７Ｐ；（ｋ）Ｔ２１６Ｖ－Ｓ２２２Ｅ－Ｔ２２６Ｎ；（ｌ）Ｔ２１６Ｖ－Ｓ２２２Ｃ－Ｈ２２７Ｐ；（ｍ）Ｒ２１７Ｓ－Ｓ２２２Ｃ－Ｔ２２６Ｎ；（ｎ）Ｓ２２２Ｃ－Ｔ２２６Ｐ－Ｈ２２７Ｐ；（ｏ）Ｔ２１６Ｖ－Ｓ２２２Ｃ－Ｔ２２６Ｎ－Ｈ２２７Ｐ；（ｐ）Ｒ２１７Ｓ－Ｓ２２２Ｄ－Ｔ２２６Ｐ－Ｈ２２７Ｐ；（ｑ）Ｔ２１６Ｖ－Ｈ２２７Ｐ；（ｒ）Ｓ２２２Ｅ－Ｔ２２６Ｐ－Ｈ２２７Ｐ；（ｓ）Ｒ２１７Ｓ－Ｓ２２２Ｄ－Ｔ２２６Ｎ－Ｈ２２７Ｐ；（ｔ）Ｒ２１７Ｓ－Ｓ２２２Ｅ－Ｔ２２６Ｐ－Ｈ２２７Ｐ；（ｕ）Ｔ２１６Ｖ－Ｓ２２２Ｃ；（ｖ）Ｒ２１７Ｓ－Ｓ２２２Ｄ；（ｗ）Ｓ２２２Ｅ－Ｔ２２６Ｐ；（ｘ）Ｒ２１７Ｓ－Ｓ２２２Ｃ－Ｔ２２６Ｐ－Ｈ２２７Ｐ；（ｙ）Ｔ２１６Ｖ－Ｔ２２６Ｐ－Ｈ２２７Ｐ；（Ｚ）Ｔ２１６Ｖ－Ｓ２２２Ｄ－Ｈ２２７Ｐ；（ａａ）Ｔ２２６Ｎ－Ｈ２２７Ｐ；（ｂｂ）Ｓ２２２Ｄ－Ｔ２２６Ｎ－Ｈ２２７Ｐ；（ｃｃ）Ｒ２１７Ｓ－Ｓ２２２Ｅ－Ｔ２２６Ｎ；（ｄｄ）Ｒ２１７Ｓ－Ｔ２２６Ｎ－Ｈ２２７Ｐ；（ｅｅ）Ｒ２１７Ｓ－Ｓ２２２Ｅ－Ｔ２２６Ｎ－Ｈ２２７Ｐ；（ｆｆ）Ｔ２１６Ｖ－Ｒ２１７Ｓ－Ｈ２２７Ｐ；（ｇｇ）Ｔ２１６Ｖ－Ｓ２２２Ｅ－Ｔ２２６Ｐ－Ｈ２２７Ｐ；（ｈｈ）Ｔ２１６Ｖ－Ｓ２２２Ｃ－Ｔ２２６Ｎ；（ｉｉ）Ｒ２１７Ｓ－Ｔ２２６Ｐ－Ｈ２２７Ｐ；（ｊｊ）Ｔ２１６Ｖ－Ｔ２２６Ｐ；（ｋｋ）Ｓ２２２Ｅ－Ｔ２２６Ｎ－Ｈ２２７Ｐ；（ｌｌ）Ｓ２２２Ｅ－Ｈ２２７Ｐ；（ｍｍ）Ｒ２１７Ｓ－Ｓ２２２Ｅ－Ｔ２２６Ｐ；（ｎｎ）Ｒ２１７Ｓ－Ｔ２２６Ｐ；（ｏｏ）Ｔ２１６Ｖ－Ｓ２２２Ｄ；（ｐｐ）Ｒ２１７Ｓ－Ｓ２２２Ｃ－Ｈ２２７Ｐ；（ｑｑ）Ｔ２１６Ｖ－Ｓ２２２Ｅ－Ｔ２２６Ｎ－Ｈ２２７Ｐ；（ｒｒ）Ｓ２２２Ｃ－Ｔ２２６Ｎ－Ｈ２２７Ｐ；（ｓｓ）Ｔ２１６Ｖ－Ｒ２１７Ｓ－Ｓ２２２Ｃ－Ｔ２２６Ｎ－Ｈ２２７Ｐ；（ｔｔ）Ｒ２１７Ｓ－Ｓ２２２Ｄ－Ｔ２２６Ｐ；及び（ｕｕ）Ｓ２２２Ｄ－Ｔ２２６Ｎ（ｖｖ）からなる群から選択される組み合わせの修飾である。本明細書に開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、前記ポリペプチドは、前記１つ以上のアミノ酸修飾を含まないモノクローナルＩｇＧ１抗体重鎖ポリペプチドと比較して、少なくとも約５０％少ないタンパク質分解を示す。本明細書に開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、前記ポリペプチドは、検出可能なタンパク質分解を示さない。本明細書に開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、ポリペプチドは、シグナル配列をコードするポリペプチドをさらに含む。本明細書に開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、ポリペプチドは、担体タンパク質をコードするポリペプチドをさらに含んだ。本明細書に開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、担体タンパク質をコードするポリペプチドは、シグナル配列をコードするポリペプチドに隣接する。本明細書に開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、担体タンパク質は、ＣＢＨ１又はその断片を含む。本明細書に開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、抗体は、抗ＲＳウイルス（ＲＳＶ）抗体、抗エボラウイルス抗体、抗凝集βアミロイド（Ａβ）抗体、抗ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗体、抗単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）抗体、抗精子抗体（例えば、抗ヒト避妊抗原（ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ｃｏｎｔｒａｃｅｐｔｉｖｅ ａｎｔｉｇｅｎ）（ＨＣＡ）抗体）、又は抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体である。本明細書に開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、ポリペプチドは、前記１つ以上のアミノ酸修飾を含まないモノクローナルＩｇＧ１抗体重鎖ポリペプチドと比較して、増大した安定性を示す。

【0008】

他の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書に開示されるポリペプチドのいずれかをコードする核酸である。またさらなる態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書に開示される核酸のいずれかをコードするベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、プロモーターをコードする核酸配列をさらに含む。

【0009】

別の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書に開示されるポリペプチドのいずれか、本明細書に開示される核酸のいずれか、又は本明細書に開示されるベクターのいずれかを含む宿主細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、哺乳類宿主細胞、細菌宿主細胞、及び真菌宿主細胞からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、哺乳類細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。いくつかの実施形態では、細菌細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞である。いくつかの実施形態では、真菌細胞は、酵母細胞又は糸状菌細胞である。いくつかの実施形態では、酵母細胞は、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）の種である。本明細書に開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、真菌細胞は、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の種、アオカビ属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）の種、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）の種、クリソスポリウム属（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）の種、グリオクラジウム属（Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ）の種、コウジカビ属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の種、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）の種、ケカビ属（Ｍｕｃｏｒ）の種、アカパンカビ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）の種、ボタンタケ属（Ｈｙｐｏｃｒｅａ）の種；マイセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）の種、及びエメリセラ属（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ）の種からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、真菌細胞は、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、トリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ）、トリコデルマ・コニンギ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ハルチアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、フミコラ・グリセア（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｇｒｉｓｅａ）、クリソスポリウム・ルクノウェンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、コウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、クロカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・カワチ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｋａｗａｃｈｉ）、アスペルギルス・アクレアタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、アスペルギルス・ジャポニクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、ショウユコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ）、マイセリオフトラ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、及びアワモリコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）からなる群から選択される。

【0010】

さらなる態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書に開示されるポリペプチドのいずれかを産生するための方法であって、本明細書に開示される宿主細胞のいずれかを、ポリペプチドの産生に適した条件下で培養することを含む方法である。いくつかの実施形態では、この方法は、ポリペプチドを単離することをさらに含む。本明細書に開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、前記ポリペプチドは、前記１つ以上のアミノ酸修飾を含まないモノクローナルＩｇＧ１抗体重鎖ポリペプチドと比較して、少なくとも約５０％少ないタンパク質分解を示す。本明細書に開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、前記ポリペプチドは、検出可能なタンパク質分解を示さない。

【0011】

いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、タンパク質分解に対するその抵抗性を増大させるためにモノクローナルＩｇＧ１抗体重鎖ポリペプチドを修飾する方法であって、ポリペプチドのヒンジ領域内の１つ以上のアミノ酸残基を修飾することを含む方法である。いくつかの実施形態では、修飾は、アミノ酸位置２１６、２１７、２２２、２２６、及び／又は２３３のうちの１つ以上における修飾を含み、アミノ酸位置は、配列番号１における番号付けに従って番号付けされる。いくつかの実施形態では、修飾は、２１６Ｔ若しくはＶ；２１７Ｓ；２２２Ｃ、Ｄ、若しくはＥ；２２６Ｎ若しくはＰ；及び／又は２３４Ｒのうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、修飾は、２２７Ｐをさらに含む。本明細書に開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、修飾は、（ａ）Ｒ２１７Ｓ－Ｔ２２６Ｎ；（ｂ）Ｒ２１７Ｓ－Ｓ２２２Ｃ；（ｃ）Ｔ２１６Ｖ－Ｒ２１７Ｓ－Ｔ２２６Ｎ；（ｄ）Ｓ２２２Ｃ－Ｈ２２７Ｐ；（ｅ）Ｒ２１７Ｓ－Ｓ２２２Ｅ－Ｈ２２７Ｐ；（ｆ）Ｔ２１６Ｖ－Ｒ２１７Ｓ－Ｓ２２２Ｃ－Ｔ２２６Ｐ；（ｇ）Ｔ２２６Ｐ－Ｈ２２７Ｐ；（ｈ）Ｒ２１７Ｓ－Ｓ２２２Ｃ－Ｔ２２６Ｐ；（ｉ）Ｔ２１６Ｖ－Ｓ２２２Ｄ－Ｔ２２６Ｐ；（ｊ）Ｔ２１６Ｖ－Ｓ２２２Ｃ－Ｔ２２６Ｐ－Ｈ２２７Ｐ；（ｋ）Ｔ２１６Ｖ－Ｓ２２２Ｅ－Ｔ２２６Ｎ；（ｌ）Ｔ２１６Ｖ－Ｓ２２２Ｃ－Ｈ２２７Ｐ；（ｍ）Ｒ２１７Ｓ－Ｓ２２２Ｃ－Ｔ２２６Ｎ；（ｎ）Ｓ２２２Ｃ－Ｔ２２６Ｐ－Ｈ２２７Ｐ；（ｏ）Ｔ２１６Ｖ－Ｓ２２２Ｃ－Ｔ２２６Ｎ－Ｈ２２７Ｐ；（ｐ）Ｒ２１７Ｓ－Ｓ２２２Ｄ－Ｔ２２６Ｐ－Ｈ２２７Ｐ；（ｑ）Ｔ２１６Ｖ－Ｈ２２７Ｐ；（ｒ）Ｓ２２２Ｅ－Ｔ２２６Ｐ－Ｈ２２７Ｐ；（ｓ）Ｒ２１７Ｓ－Ｓ２２２Ｄ－Ｔ２２６Ｎ－Ｈ２２７Ｐ；（ｔ）Ｒ２１７Ｓ－Ｓ２２２Ｅ－Ｔ２２６Ｐ－Ｈ２２７Ｐ；（ｕ）Ｔ２１６Ｖ－Ｓ２２２Ｃ；（ｖ）Ｒ２１７Ｓ－Ｓ２２２Ｄ；（ｗ）Ｓ２２２Ｅ－Ｔ２２６Ｐ；（ｘ）Ｒ２１７Ｓ－Ｓ２２２Ｃ－Ｔ２２６Ｐ－Ｈ２２７Ｐ；（ｙ）Ｔ２１６Ｖ－Ｔ２２６Ｐ－Ｈ２２７Ｐ；（Ｚ）Ｔ２１６Ｖ－Ｓ２２２Ｄ－Ｈ２２７Ｐ；（ａａ）Ｔ２２６Ｎ－Ｈ２２７Ｐ；（ｂｂ）Ｓ２２２Ｄ－Ｔ２２６Ｎ－Ｈ２２７Ｐ；（ｃｃ）Ｒ２１７Ｓ－Ｓ２２２Ｅ－Ｔ２２６Ｎ；（ｄｄ）Ｒ２１７Ｓ－Ｔ２２６Ｎ－Ｈ２２７Ｐ；（ｅｅ）Ｒ２１７Ｓ－Ｓ２２２Ｅ－Ｔ２２６Ｎ－Ｈ２２７Ｐ；（ｆｆ）Ｔ２１６Ｖ－Ｒ２１７Ｓ－Ｈ２２７Ｐ；（ｇｇ）Ｔ２１６Ｖ－Ｓ２２２Ｅ－Ｔ２２６Ｐ－Ｈ２２７Ｐ；（ｈｈ）Ｔ２１６Ｖ－Ｓ２２２Ｃ－Ｔ２２６Ｎ；（ｉｉ）Ｒ２１７Ｓ－Ｔ２２６Ｐ－Ｈ２２７Ｐ；（ｊｊ）Ｔ２１６Ｖ－Ｔ２２６Ｐ；（ｋｋ）Ｓ２２２Ｅ－Ｔ２２６Ｎ－Ｈ２２７Ｐ；（ｌｌ）Ｓ２２２Ｅ－Ｈ２２７Ｐ；（ｍｍ）Ｒ２１７Ｓ－Ｓ２２２Ｅ－Ｔ２２６Ｐ；（ｎｎ）Ｒ２１７Ｓ－Ｔ２２６Ｐ；（ｏｏ）Ｔ２１６Ｖ－Ｓ２２２Ｄ；（ｐｐ）Ｒ２１７Ｓ－Ｓ２２２Ｃ－Ｈ２２７Ｐ；（ｑｑ）Ｔ２１６Ｖ－Ｓ２２２Ｅ－Ｔ２２６Ｎ－Ｈ２２７Ｐ；（ｒｒ）Ｓ２２２Ｃ－Ｔ２２６Ｎ－Ｈ２２７Ｐ；（ｓｓ）Ｔ２１６Ｖ－Ｒ２１７Ｓ－Ｓ２２２Ｃ－Ｔ２２６Ｎ－Ｈ２２７Ｐ；（ｔｔ）Ｒ２１７Ｓ－Ｓ２２２Ｄ－Ｔ２２６Ｐ；及び（ｕｕ）Ｓ２２２Ｄ－Ｔ２２６Ｎ（ｖｖ）からなる群から選択される組み合わせの修飾である。本明細書に開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、前記ポリペプチドは、前記１つ以上のアミノ酸修飾を含まないモノクローナルＩｇＧ１抗体重鎖ポリペプチドと比較して、少なくとも約５０％少ないタンパク質分解を示す。本明細書に開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、前記ポリペプチドは、検出可能なタンパク質分解を示さない。本明細書に開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、前記ポリペプチドは、前記１つ以上のアミノ酸修飾を含まないモノクローナルＩｇＧ１抗体重鎖ポリペプチドと比較して、増大した安定性を示す。

【0012】

さらなる態様において、本明細書で提供されるのは、本明細書に開示される方法のいずれかによって産生されたモノクローナルＩｇＧ１抗体重鎖ポリペプチドである。

【0013】

またさらなる態様において、本明細書で提供されるのは、ａ）本明細書に開示されるポリペプチドのいずれかを産生するための書面の説明書と、ｂ）１）本明細書に開示される核酸のいずれか；２）本明細書に開示されるベクターのいずれか；及び／又は３）本明細書に開示される宿主細胞のいずれかのうちの１つ以上とを含むキットである。

【0014】

別の態様において、本明細書で提供されるのは、本明細書に開示されるポリペプチドのいずれかを含むシリンジ、カニューレ、又はカテーテルである。

【0015】

本明細書に記載した態様と実施形態はそれぞれ、その実施形態又は態様の文脈により明示的に又は明確に除外されない限り、共に使用することが可能である。

【0016】

本明細書全体を通して、様々な特許、特許出願、及び他の種類の刊行物（例えば、学術雑誌論文、電子データベースエントリなど）が引用されている。本明細書に引用されたすべての特許、特許出願、及び他の刊行物の開示の全体を、すべての目的のために、参照によって本明細書に組み込む。

【図面の簡単な説明】

【0017】

【図1】Ｓｙｎａｇｉｓ ＨＣ重鎖ＳＥＬライブラリー構築のために使用されるＰエントリークローンを示す。

【0018】

【図2】発現ベクターｐＴＴＴｐｙｒ２－ＩＳｃｅＩ－Ｓｙｎａｇｉｓ ＨＣ＿Ｇｅｎｅａｒｔ＿ＳＥＬ重鎖を示す。

【0019】

【図3】ｃ２Ｇ４＿ＨＣ３ ＳＥＬライブラリー構築のために使用されるＰエントリークローンを示す。

【0020】

【図4】ｃ２Ｇ４＿ＨＣ３重鎖を産生するための発現ベクターを示す。

【0021】

【図5】ｃ２Ｇ４＿ＬＣ２軽鎖の発現カセットを示す。

【0022】

【図6】改変Ｃ２Ｇ４バリアント対野生型Ｃ２Ｇ４対照試料について、ヒンジクリッピングの減少を示すグラフを示す。ｘ軸はバンドの最終合計を示し、これは、計算されたクリッピングの範囲が有意なバンドに基づき、ノイズには基づかないことを確認するために使用される。描かれた実線はＷＴ試料の平均デルタクリッピングであり、破線は、平均ＷＴのプラス及びマイナス１標準偏差である。

【0023】

【図7】改変バリアント対野生型対照試料について、ヒンジクリッピングの減少を強調するグラフを示す。ｘ軸はバンドの最終合計を示し、これは、計算されたクリッピングの範囲が有意なバンドに基づき、ノイズには基づかないことを確認するために使用される。四角形のデータ点は、プールされたＷＴ－ヒンジ試料についてのものである。各データ点は、回収後にプールされたが、その後に独立して精製及びアッセイされた生物学的複製を表す。「＋」のデータ点は、抗原とのより強力な結合相互作用を有する既知のバリアントであるＨＣ：Ｗ１０５Ｆについてのものである。このバリアントは、野生型ヒンジ配列を有する。三角形のデータ点は、精製及びアッセイされる前にプールされなかった生物学的ＷＴ－ヒンジ複製である。円形のデータ点は、表４に記載される改変バリアントを表す。

【0024】

【図8】改変バリアント対野生型ヒンジ対照試料について、ヒンジクリッピングの減少を示すグラフを示す。ｘ軸はバンドの最終合計を示し、これは、計算されたクリッピングの範囲が有意なバンドに基づき、ノイズには基づかないことを確認するために使用される。

【0025】

【図9】抗ＲＳＶ及びＣ２Ｇ４のヒンジ領域のための配列アライメントを示す。

【発明を実施するための形態】

【0026】

本明細書に開示される本発明は、１つには、野生型（すなわち、天然に存在する）抗体ヒンジ領域ドメインが１つ以上の代替の置換アミノ酸を含むように改変されると、望ましくない抗体切断が排除又は低減されるという本発明者らの知見に基づいている。

【0027】

したがって、本明細書で提供されるのは、ＤＮＡ構築物、ベクター、抗体、ＤＮＡ構築物及び／又は切断抵抗性の抗体を発現する宿主細胞、並びに分泌を増強するため、及び／又は不必要な抗体切断を防止若しくは低減するための方法である。より具体的には、そしていくつかの非限定的な態様では、宿主細胞の産生中に抗体の切断（すなわち、クリッピング）を防止又は低減するために、改変抗体ヒンジ配列が抗体中に含められている。本明細書に開示される抗体は、本明細書に開示される改変ヒンジ配列を含まない抗体と比較して、より良好な分泌、安定性、及び／又は精製を示す。したがって、本開示は、抗体産生、特に治療用タンパク質の産生のための代替の改良された方法を提供し、これは、不必要な切断産物による汚染のリスクが制限された高レベルの精製抗体をもたらす。

【0028】

Ｉ．定義
用語「ポリペプチド」又は「タンパク質」は、その大きさにかかわらず、２０種の天然のアミノ酸のいずれかを含有するあらゆるポリマーを指すものとする。用語「タンパク質」は、比較的に大きいタンパク質に関して使用されることが多く、「ペプチド」は、小さいポリペプチドに関して使用されることが多いが、この分野におけるこれらの用語の使用は、しばしば重複する。したがって、用語「ポリペプチド」は、他に注記のない限り、一般に、タンパク質、ポリペプチド、及びペプチドを指す。本明細書では、アミノ酸残基についての従来の１文字又は３文字略号が使用される。

【0029】

用語「核酸」又は「ポリヌクレオチド」は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、一本鎖又は二本鎖及びその化学的改変物を包含する。用語「核酸」と「ポリヌクレオチド」は、本明細書では互換的に使用することができる。遺伝暗号は縮重しているので、ある特定のアミノ酸をコードするために２つ以上のコドンが使用されている可能性があり、本発明の対象物は、ある特定のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを包含する。

【0030】

本明細書で使用される場合、用語「抗体（単数）」及び「抗体（複数）」は、モノクローナル抗体、多特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダ化（ｃａｍｅｌｉｓｅｄ）抗体、キメラ抗体、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド連結Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、及び抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本明細書に開示される改変抗体に対する抗Ｉｄ抗体を含む）、並びに上記のいずれかのエピトープ結合断片を指す。特に、抗体は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な断片、すなわち抗原結合部位を含有する分子を含み、これらの断片は、限定はされないが、Ｆｃ領域又はその断片を含む別の免疫グロブリンドメインに融合されていても、されたいなくてもよい。本明細書に概説されるように、用語「抗体（単数）」及び「抗体（複数）」には、特に、本明細書に記載されるヒンジ領域バリアント、全長抗体、及び免疫グロブリンの免疫学的に活性な断片と又は他のタンパク質と融合された本明細書に記載される修飾ヒンジを含むヒンジバリアント－融合物が含まれる。このようなＦｃバリアント－融合物は、限定はされないが、ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合物、可変領域（例えば、ＶＬ及びＶＨ）－Ｆｃ融合物、ｓｃＦｖ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合物を含む。免疫グロブリン分子は、任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）又はサブクラスであり得る。

【0031】

本明細書で使用される場合、「ヒンジ領域」は、一般に、ヒトＩｇＧ１の２１２～２３８（ＥＵ番号付け）又は２２２～２５１（Ｋａｂａｔ番号付け）の区間と定義される。ヒンジはさらに、上部、中部及び下部ヒンジである３つの別個の領域に分けることができる。いくつかの実施形態では、ヒンジ領域は、配列番号１に示される配列のアミノ酸２１６～２３８の区間と定義される。他のＩｇＧアイソタイプのヒンジ領域は、いくつもの公的に入手可能である配列アライメントプログラムを用いて、ＩｇＧ１配列又は配列番号１に示される配列と整列され得る。

【0032】

抗体産生との関連で本明細書において互換的に使用される用語「タンパク質分解」、「タンパク質分解的な分解」、「切断」、及び「クリッピング」は、一般的に組換え宿主細胞（例えば、糸状菌宿主細胞）における抗体発現及び産生の望ましくない副産物であると考えられるより小さいポリペプチドへの、抗体ポリペプチド成分（例えば、抗体重鎖ポリペプチド）の不必要な分解を指す。いくつかの実施形態では、分解は、抗体重鎖ヒンジ領域に位置するペプチド結合の、酵素的又は化学的機構による切断によって起こり得る。代替の実施形態では、分解は、相同タンパク質又は異種タンパク質間の架橋の切断によって起こり得る。いくつかの実施形態では、タンパク質分解は、宿主細胞（例えば、真核生物、例えば、哺乳類又は真菌宿主細胞）における抗体発現の間に起こる。他の実施形態では、タンパク質分解は、抗体の単離及び／又は精製の間、或いはその後に起こる。

【0033】

「安定性」及び「安定した」は、所与の製造、調製、輸送及び貯蔵条件下における、凝集、分解又は断片化に対する製剤中の改変抗体の抵抗性を指す。改良された安定性を有する改変抗体は、所与の製造、調製、輸送及び貯蔵件下において生物活性を保持することとなる。改変抗体の安定性は、高速サイズ排除クロマトグラフィ（ＨＰＳＥＣ）、静的光散乱（ＳＬＳ）、フーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）、円二色性（ＣＤ）、尿素アンフォールディング技術、内因性トリプトファン蛍光、示差走査熱量測定、及び／又はＡＮＳ結合技術により測定されるように、凝集、分解又は断片化の度合いによって評価することができる。改変抗体の安定性は、同一条件下で同等の分子と比較され得る。また改変抗体の全体的な安定性は、単離した抗原分子又はそれを発現する細胞を用いて、例えばＥＬＩＳＡ及びラジオイムノアッセイを含む種々の免疫学的アッセイによって評価することもできる。

【0034】

ポリペプチドに関する用語「野生型の」、「野生型」、「親の」、又は「参照基準の」は、１つ以上のアミノ酸位置での人為的な置換、挿入、又は欠失を含まない、天然に存在するポリペプチドを指す。同様に、ポリヌクレオチドに関する用語「野生型の」、「野生型」、「親の」、又は「参照基準の」は、人為的なヌクレオシド変化を含まない、天然に存在するポリヌクレオチドを指す。しかし、野生型の、親の、又は参照基準のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、天然に存在するポリヌクレオチドに限定されず、野生型の、親の、又は参照基準のポリペプチドをコードするあらゆるポリヌクレオチドを包含する。

【0035】

本明細書で使用する場合、用語「天然に存在しない」は、自然界には見られないあらゆるもの（例えば、研究室で産生された組換え型の核酸及びタンパク質配列）、例えば野生型の核酸及び／又はアミノ酸配列の改変物を指す。いくつかの実施形態では、天然に存在しないポリペプチドは、相当する野生型の又は天然に存在するアミノ酸配列には見られないアミノ酸置換（すなわち変異）を含有する。

【0036】

本明細書で使用する場合、ポリペプチドの「誘導体」又は「バリアント」は、１つ以上のアミノ酸の、Ｃ末端及びＮ末端の一方又は両方への付加、アミノ酸配列中の１つ又はいくつかの異なる部位での１つ以上のアミノ酸の置換、ポリペプチドの一方若しくは両方の末端での又はアミノ酸配列中の１つ以上の部位での１つ以上のアミノ酸の欠失、又はアミノ酸配列中の１つ以上の部位での１つ以上のアミノ酸の挿入によって、前駆ポリペプチド（例えば、天然のポリペプチド）から得られるポリペプチドを意味する。

【0037】

本明細書で使用する場合、「バリアントポリヌクレオチド」は、バリアントポリペプチドをコードする、又は親のポリヌクレオチドとの指定された度合いの相同性／同一性を有する、又はストリンジェントな条件下で親のポリヌクレオチド又はその相補体とハイブリッド形成する。適切には、バリアントポリヌクレオチドは、親のポリヌクレオチド又は親のポリヌクレオチドの相補体との少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、さらには少なくとも９９％のヌクレオチド配列同一性を有する。同一性（パーセント）を決定するための方法は、当技術分野で公知である。

【0038】

用語「由来する」は、用語「に起因する」、「から得られる」、「から入手可能である」、「から単離される」、及び「から作製される」を包含し、一般に、ある指定された材料が、別の指定された材料に、その起源を見いだすか、又は別の指定された材料に関して説明することができる特徴を有することを示す。

【0039】

「制御配列」は、本明細書では、ポリヌクレオチド又は対象となるポリペプチドの発現にとって必要又は好都合であるすべての構成要素を含むと定義される。各制御配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列に対して天然又は外来であり得る。こうした制御配列には、限定はされないが、リーダー配列、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、シグナルペプチド配列、及び転写ターミネーターが含まれる。最低限、制御配列は、プロモーターと、転写及び翻訳停止シグナルを含む。制御配列は、制御配列とポリペプチドをコードする核酸配列のコード領域との連結を容易にする特定の制限部位を導入する目的で、リンカーを提供することができる。

【0040】

「作動可能に連結された」は、本明細書では、制御配列がポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドの発現を誘導又は調節するように、制御配列がＤＮＡ配列中のコード配列などのポリヌクレオチド又は対象となるポリペプチドと機能的な関係で（すなわち、相対的な位置に）適切に置かれた配置と定義される。

【0041】

用語「ＤＮＡ構築物」は、好適な宿主におけるタンパク質の発現を引き起こすことが可能な好適な制御配列に作動可能に連結されるＤＮＡ配列を意味する。こうした制御配列には、転写を引き起こすためのプロモーター、転写を制御するための任意のオペレーター配列、ｍＲＮＡ上の好適なリボソーム結合部位をコードする配列、エンハンサー、及び転写及び翻訳の停止を制御する配列が含まれ得る。

【0042】

用語「融合ＤＮＡ構築物」又は「融合核酸」は、共に作動可能に連結され、且つ融合ポリペプチドをコードする、５’～３’のいくつかのポリヌクレオチド配列（例えば、限定はされないが、シグナル配列をコードするＤＮＡ分子、担体タンパク質をコードするＤＮＡ分子、ＫＥＸ２部位をコードするＤＮＡ分子、及び対象となるポリペプチドをコードするＤＮＡ分子）を含む核酸を指す。

【0043】

「ベクター」は、核酸を１つ以上の細胞型に導入するように設計されたポリヌクレオチド配列を指す。ベクターには、クローニングベクター、発現ベクター、シャトルベクター、プラスミド、ファージ粒子、カセットなどが含まれる。

【0044】

「発現ベクター」は、異種ＤＮＡ断片を外来細胞に組み込み発現させる能力を有するベクターを指す。多くの原核生物及び真核生物発現ベクターが、市販品として入手可能なである。

【0045】

「プロモーター」又は「プロモーター配列」は、コード領域などの対象となるポリヌクレオチドの発現のための宿主細胞によって認識される核酸配列である。一般に、プロモーター配列は、対象となるポリヌクレオチドの発現を媒介する転写制御配列を含有する。プロモーターは、変異、切断型、及びハイブリッドプロモーターを含めて、選択される宿主細胞において転写活性を示すあらゆる核酸配列であり得、宿主細胞に対して相同の又は異種の細胞外又は細胞内のポリペプチドをコードする遺伝子から得ることができる。

【0046】

用語「シグナル配列」は、タンパク質を細胞からの分泌のための分泌系に誘導する、タンパク質のアミノ末端のアミノ酸の配列を指す。シグナル配列は、タンパク質の分泌の前に、タンパク質から切断される。ある種の場合には、シグナル配列は、「シグナルペプチド」又は「リーダーペプチド」と称することができる。シグナル配列の定義は、機能的なものである。成熟形態の細胞外タンパク質は、シグナル配列を欠いている（これは、分泌プロセス中に切除される）。

【0047】

本明細書で使用される用語「担体タンパク質」は、宿主細胞からのポリペプチドの分泌に対して機能する又はフォールディング及び分泌を容易にするタンパク質を指す。例示的な担体タンパク質について、以下でより詳細に論じる。

【0048】

対象細胞、核酸、ポリペプチド／酵素、又はベクターに関して使用される場合、用語「組換え型の」は、対象が、その天然の状態から改変されていることを示す。したがって、例えば、組換え型の細胞は、天然の（非組換え型の）形態の細胞内には見られない遺伝子を発現するか、又は天然の遺伝子を、自然界に見られるのとは異なるレベルで若しくは異なる条件下で発現する。組換え型の核酸は、１つ以上のヌクレオチドが天然の配列と異なり得る、及び／又は発現ベクター中で異種配列、例えば異種プロモーター、分泌を可能にするシグナル配列などに作動可能に連結されている。組換え型のポリペプチド／酵素は、１つ以上のアミノ酸が天然の配列と異なり得る、及び／又は異種配列と融合されている。抗体重鎖をコードする核酸を含むベクターは、例えば、組換え型のベクターである。

【0049】

本明細書で使用する場合、「微生物」は、細菌、真菌、ウイルス、原生動物、及び他の微生物又は顕微鏡的微生物を指す。

【0050】

「宿主株」又は「宿主細胞」は、ポリペプチド、特に本開示によって包含される組換え型の融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター又はＤＮＡ構築物のための好適な宿主を意味する。具体的実施形態では、宿主株は、糸状菌細胞又は哺乳類細胞であり得る。用語「宿主細胞」には、細胞とプロトプラストとの両方が含まれる。

【0051】

用語「糸状菌」は、すべての糸状形態の真菌亜門（ｓｕｂｄｉｖｉｓｉｏｎ Ｅｕｍｙｃｏｔｉｎａ）を指す（Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｓ，Ｃ．Ｊ．（１９６２），ＩＮＴＲＯＤＵＣＴＯＲＹ ＭＹＣＯＬＯＧＹ，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと）。これらの真菌は、キチン、グルカン、及び他の複合多糖から構成される細胞壁を有する栄養菌糸体を特徴とする。本明細書に開示される糸状菌は、酵母とは形態学的に、生理学的に、且つ遺伝学的異なる。糸状菌による栄養増殖は、菌糸伸長によるものであり、炭素異化は、絶対的好気性である。

【0052】

用語「培養すること」は、微生物細胞の集団を、液体又は固体の培地中で、好適な条件下で増殖させることを指す。

【0053】

ポリヌクレオチド又はポリペプチドに関する用語「異種」は、宿主細胞中に天然には存在しないポリヌクレオチド又はポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、タンパク質は、商業的に重要な工業用タンパク質であり、いくつかの実施形態では、異種タンパク質は、治療用タンパク質である。この用語は、天然に存在する遺伝子、変異した遺伝子、及び／又は合成遺伝子によってコードされるタンパク質を包含することが意図される。

【0054】

ポリヌクレオチド又はタンパク質に関する用語「相同の」は、宿主細胞中に天然に存在するポリヌクレオチド又はタンパク質を指す。

【0055】

本明細書で使用される用語「回収される」、「単離される」、及び「分離される」は、それが関連する少なくとも１種の構成成分から取り出されたタンパク質（例えば、対象となるポリペプチド）、細胞、核酸、又はアミノ酸を指す。

【0056】

本明細書で使用する場合、細胞に関して使用される用語「形質転換された」、「安定に形質転換された」、及び「トランスジェニック」は、細胞が、そのゲノムに組み込まれた非天然の（例えば異種）核酸配列又は天然の（例えば相同の）核酸配列の追加のコピーを有するか、又は複数世代を通してして維持されるエピソームプラスミドを有することを意味する。

【0057】

本明細書で使用する場合、用語「発現」は、遺伝子の核酸配列に基づいてポリペプチドが産生されるプロセスを指す。このプロセスには、転写と翻訳の両方が含まれる。

【0058】

用語「分泌されたタンパク質」は、タンパク質分泌中に細胞から放出されるポリペプチドの領域を指す。

【0059】

用語「分泌」は、宿主細胞中の膜を横断するタンパク質の、細胞外空間及び周囲の培地への選択的移動を指す。

【0060】

ある種の範囲は、本明細書では、用語「約」が前に付く数値を伴って提供される。用語「約」は、本明細書では、それが前に付く厳密な数、並びにこの用語が前に付く数に近い又はほぼ同じである数についての文字による補助を提供するために使用される。ある数が、具体的に列挙された数に近い又はほぼ同じである数かどうかの決定においては、列挙されていないその近い又はほぼ同じ数も、それが存在する文脈において、具体的に列挙された数の実質的等価物を提供する数であり得る。例えば、数値に関して、用語「約」は、この用語が文脈の中で他に具体的に定義されない限り、その数値－１０％～＋１０％の範囲を指す。

【0061】

本明細書で使用する場合、文脈によって他に明確に指示されない限り、単数の用語「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」には、複数の指示内容が含まれる。

【0062】

特許請求の範囲を、何らかの任意要素を除外するために起草できることにさらに留意されたい。したがって、この記述は、請求項要素の記述、又は「消極的な」限定の使用に関連して、「唯一」、「～のみ」などのような排他的な用語法の使用のための先行詞としての役割を果たすものとする。

【0063】

用語「本質的に～からなる」は、本明細書で使用する場合、この用語の後の構成成分が、組成物全体の重量に対して３０％未満であり、且つ構成成分の作用又は活性に寄与又は干渉しない総量の他の公知の構成成分の存在下である組成物を指すことにも留意されたい。

【0064】

用語「～を含む」が、本明細書で使用する場合、限定はされないが、用語「～を含む」の後の構成成分を含むことを意味することにさらに留意されたい。用語「～を含む」の後の構成成分は、必要とされる又は必須であるが、構成成分を含む組成物は、他の必須ではない又は任意の構成成分をさらに含むことができる。

【0065】

用語「～からなる」が、本明細書で使用する場合、用語「～からなる」の後の構成成分を含み、且つこれに限定されることを意味することにも留意されたい。したがって、用語「～からなる」の後の構成成分は、必要とされる又は必須であり、且つ他の構成成分は組成物中には存在しない。

【0066】

本明細書全体を通して与えられるあらゆる最大数値制限には、あらゆるより低い数値制限が、あたかもこうしたより低い数値制限が本明細書に明示的に書かれているかのように含まれるものとする。本明細書全体を通して与えられるあらゆる最小数値制限には、あらゆるより高い数値制限が、あたかもこうしたより高い数値制限が本明細書に明示的に書かれているかのように含まれることとなる。本明細書全体を通して与えられるあらゆる数値範囲には、こうしたより広い数値範囲の範囲内にあるあらゆるより狭い数値範囲が、あたかもこうしたより狭い数値範囲が本明細書にすべて明示的に書かれているかのように含まれることとなる。

【0067】

本明細書で他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術及び科学用語は、本発明が属する分野の技術者によって共通に理解されるのと同じ意味を有する。

【0068】

用語の他の定義は、本明細書全体を通して明らかとなり得る。

【0069】

ＩＩ．組成物
Ａ．改変抗体
本明細書で提供されるのは、発現及び／又は切断特性が改良された修飾ヒンジ領域を有する天然に存在しない抗体、その断片、又はそのバリアントである。修飾ヒンジ領域は、野生型抗体ヒンジと比べて、限定はされないが、安定性、柔軟性、長さ、立体構造、電荷、切断（例えば、タンパク質分解的切断）に対する抵抗性、及び疎水性を含む、ヒンジの特徴の１つ以上における変更を示し得る。本明細書に開示される修飾ヒンジ領域は、例えば、野生型ヒンジへの修飾の導入などの当技術分野において周知の方法によって生成され得る。修飾ヒンジ領域を生成するために利用され得る修飾には、限定はされないが、アミノ酸の挿入、欠失、置換、及び再配列が含まれる。前記ヒンジの修飾及び開示される修飾されたヒンジ領域は一緒に、本明細書では「ヒンジ修飾」又は単に「修飾ヒンジ」と呼ばれる。本明細書に開示される修飾ヒンジ領域は、限定はされないが、抗体及びその断片を含む、選択される分子に組み込むことができる。

【0070】

本明細書で実証されるように、修飾ヒンジを含む分子は、修飾ヒンジを除いて同じアミノ酸配列を有する分子、例えば、野生型ヒンジを含む以外は同じアミノ酸配列を有する分子などと比較して、宿主細胞の産生及び／又は精製中にタンパク質分解の低減又は排除を示し得る。本明細書で実証されるように、修飾ヒンジを含む分子は、修飾ヒンジを除いて同じアミノ酸配列を有する分子、例えば、野生型ヒンジを含む以外は同じアミノ酸配列を有する分子などと比較して、改良された安定性及び／又は貯蔵（すなわち、増大された貯蔵期間）並びに切断に対する抵抗性を有し得る。

【0071】

一実施形態では、改変抗体は少なくとも修飾ヒンジ（例えば、１つ以上のアミノ酸の挿入、欠失、置換、又は再配列を含むヒンジ領域）を有することができ、前記改変抗体は、同等の分子と比べて、改良された安定性及び／又は切断に対する抵抗性を有する。

【0072】

本明細書に開示される改変抗体はヒンジ修飾を含む抗体バリアントを包含し、前記修飾は、限定はされないが、安定性、切断（例えば、タンパク質分解的切断）に対する抵抗性、柔軟性、長さ、立体構造、電荷及び疎水性を含む、ヒンジの１つ以上の特徴を変更する。また本明細書に開示される改変抗体は修飾ヒンジを含むバリアントを包含し、前記修飾ヒンジは、野生型ヒンジと比べて、限定はされないが、安定性、柔軟性、長さ、立体構造、電荷及び疎水性を含む、１つ以上の変更された特徴を示す。開示される修飾ヒンジは、例えば、野生型ヒンジへの修飾の導入などの当技術分野において周知の方法によって生成され得る。修飾ヒンジの生成において利用され得るヒンジ修飾には、限定はされないが、１つ以上のアミノ酸残基の挿入、欠失、反転及び置換が含まれる。挿入及び／又欠失及び／又は置換の組み合わせも修飾ヒンジを生成するために使用され得ることは、当業者により認識されるであろう。

【0073】

特定の実施形態では、改変抗体は、ヒンジ内の少なくとも１つのアミノ酸残基の置換であるヒンジ修飾を包含する。一実施形態では、少なくとも１つ、又は少なくとも２つ、又は少なくとも３つ、又は少なくとも４つ、又は少なくとも５つ、又は少なくとも１０、又は少なくとも１５のアミノ酸残基がヒンジ内で置換される。一実施形態では、置換は、上部ヒンジにおいて行われる。別の実施形態では、置換は、中部ヒンジにおいて行われる。別の実施形態では、置換は、下部ヒンジにおいて行われる。さらに別の実施形態では、置換は、限定はされないが、上部ヒンジ、中部ヒンジ及び下部ヒンジを含む、２つ以上の位置において行われる。

【0074】

さらに別の実施形態では、改変抗体はヒンジ領域内に少なくとも１つの置換を含み、置換は、２１６、２１７、２２２、２２６、２２７、及び／又は２３４からなる群から選択されるアミノ酸位置（ここで、アミノ酸位置は、配列番号１における番号付けに従って番号付けされる）、或いは２１３位、２１４位、２２１位、２２３位、２２４位、及び／又は２３１位（ここで、番号付けシステムは、Ｋａｂａｔに記載されるようなＥＵインデックスのものである）、或いは２２３位、２２４位、２３２位、２３６位、２３７位、及び／又は２４４位（ここで、番号付けシステムは、Ｋａｂａｔに記載されるようなＫａｂａｔインデックスのものである）に位置する。ヒンジ修飾の任意の組み合わせは表１に記載されており、実施形態として特に企図される。

【表1】

【0075】

一実施形態では、本明細書に開示される改変抗体は、野生型ヒンジと比べてヒンジの柔軟性が変更（例えば、増大又は減少）された修飾ヒンジを含む。ヒンジの柔軟性が変更された修飾ヒンジは、野生型ヒンジへの特定の修飾の組込みによって生成され得る。ヒンジの柔軟性を増大させるヒンジ修飾には、限定はされないが、柔軟性を増大させる１つ以上のアミノ酸残基（例えば、グリシン）による１つ以上のアミノ酸残基の置換、ジスルフィド結合を形成することができないアミノ酸残基（例えば、セリン、アラニン、グリシン）による、ジスルフィド結合の形成に関与するシステインの置換、高度の局所柔軟性を可能にする１つ以上のアミノ酸残基（例えば、グリシン）の挿入、及びポリペプチドの剛性を増大させる１つ以上のアミノ酸残基（例えば、プロリン）の欠失が含まれる。ヒンジの柔軟性を減少させるヒンジ修飾には、限定はされないが、ポリペプチドの剛性を増大させる１つ以上のアミノ酸残基（例えば、プロリン）による１つ以上のアミノ酸残基の置換、ジスルフィド結合を形成することができるアミノ酸残基（例えば、システイン）による、ジスルフィド結合を形成することができないアミノ酸残基（例えば、セリン、アラニン、グリシン）の置換、ポリペプチドの剛性を増大させる１つ以上のアミノ酸残基（例えば、プロリン）の挿入、及び柔軟性を増大させる１つ以上のアミノ酸残基（例えば、グリシン）の欠失が含まれる。

【0076】

具体的な実施形態では、本明細書に開示される改変抗体は、野生型ヒンジと比べてヒンジの立体構造が変更された修飾ヒンジを含む。ヒンジの立体構造が変更された修飾ヒンジは、特定の修飾を野生型ヒンジに組み込むことによって生成することができる。ヒンジの立体構造を変更するヒンジ修飾には、限定はされないが、より大きくより嵩高の側鎖を有するアミノ酸残基（例えば、トリプトファン、プロリン）に対する、小さい側鎖を有する１つ以上のアミノ酸残基（例えば、アラニン、グリシン）の置換、小さい側鎖を有するアミノ酸残基（例えば、アラニン、グリシン）に対する、より大きくより嵩高の側鎖を有する１つ以上のアミノ酸残基（例えば、トリプトファン、プロリン）の置換、ヒンジ内での２つ以上のアミノ酸残基の反転、大きい又は嵩高の側鎖を有する１つ以上のアミノ酸残基（例えば、トリプトファン、プロリン）の挿入又は欠失が含まれる。加えて、ヒンジの長さ及び／又は柔軟性を変更するヒンジ修飾も、立体構造の変更をもたらし得る。

【0077】

具体的な実施形態では、本明細書に開示される改変抗体は、ＩｇＧ２ａラクダ様修飾を有する修飾ヒンジを含む。ラクダ様修飾を有する修飾ヒンジは、野生型ヒンジの一部をラクダＩｇＧ２ａヒンジの一部で置換することによって生成され得る。代替的に、又は任意選択的に、ラクダ様修飾を有する修飾ヒンジは、ヒンジ内の１つ以上のアミノ酸残基を、ラクダＩｇＧ２ａヒンジ内で見出される対応するアミノ酸残基で置換することによって生成することができる。ラクダ様修飾を有する修飾ヒンジは、付加的なアミノ酸置換及び／又は挿入及び／又は欠失を組み込むこともできる。加えて、ヒンジのラクダ様修飾は、限定はされないが、長さ、柔軟性、立体構造、電荷、及び疎水性を含む、ヒンジの特徴を変更することができる。

【0078】

別の実施形態では、本明細書に開示される改変抗体は、野生型ヒンジと比べて電荷が変更された修飾ヒンジを含む。電荷が変更された修飾ヒンジは、特定の修飾を野生型ヒンジに組み込むことによって生成することができる。ヒンジの電荷を変更するヒンジ修飾には、限定はされないが、電荷を有するアミノ酸残基（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン）に対する、中性電荷を有する１つ以上のアミノ酸残基（例えば、バリン、トレオニン）の置換、中性電荷（例えば、バリン、トレオニン）又は負電荷（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）を有するアミノ酸残基に対する、正電荷を有する１つ以上のアミノ酸残基（例えば、リジン、アルギニン）の置換、中性電荷（例えば、バリン、トレオニン）又は正電荷（例えば、リジン、アルギニン）を有するアミノ酸残基に対する、負電荷を有する１つ以上のアミノ酸残基（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）の置換、及び１つ以上の荷電アミノ酸残基（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン）の挿入又は欠失が含まれる。

【0079】

別の具体的な実施形態では、本明細書に開示される改変抗体は、野生型ヒンジと比べて、疎水性が変更（例えば、増大又は減少）された修飾ヒンジを含む。疎水性が変更された修飾ヒンジは、特定の修飾を野生型ヒンジに組み込むことによって生成することができる。ヒンジの疎水性を変更するヒンジ修飾には、限定はされないが、親水性アミノ酸残基（例えば、セリン、トレオニン、チロシン）に対する１つ以上の疎水性アミノ酸残基（例えば、バリン、ロイシン）の置換、疎水性アミノ酸残基（例えば、バリン、ロイシン）に対する１つ以上の親水性アミノ酸（例えば、セリン、トレオニン、チロシン）の置換、及び１つ以上の疎水性又は親水性アミノ酸残基（例えば、バリン、ロイシン、セリン、トレオニン、チロシン）の挿入又は欠失が含まれる。

【0080】

任意の所与のヒンジ修飾がヒンジの２つ以上の特徴を変更し得ることは、当業者により認識されるであろう。例えば、１つ以上のプロリン残基のヒンジへの付加は、ヒンジの長さを増大させ、それと同時に、潜在的に柔軟性を減少させるヒンジ修飾をもたらす。同様に、アスパラギン酸によるグリシン残基の置換は、ヒンジの電荷及び疎水性の両方を変更することができる。他の組み合わせは上記に記載されており、さらに他の組み合わせは、当業者に明らかであろう。

【0081】

特に、任意のヒンジ修飾を行う前に、ヒンジ内に存在するアミノ酸残基の性質を分析することを選択し得ることが企図される。当業者は、場合により、ヒンジの１つ以上の特徴（例えば、柔軟性、長さ、立体構造、電荷及び疎水性）が野生型ヒンジと比べて変更されるように、対象となる抗体がヒンジ内に適切なアミノ酸配列を既に有していることを認識するであろう。この状況では、付加的なヒンジ修飾は、さらなる修飾が望ましい場合にのみ導入されることとなる。上記及び表１に記載される特定のアミノ酸残基に加えて、ヒンジの特徴を変化させるために、いくつかの付加的なアミノ酸残基がヒンジにおいて挿入、欠失及び／又は置換され得ることは、当業者には明らかであろう。類似の特性を有するアミノ酸残基のファミリーは当技術分野において定義されており、いくつかの例が表２に示される。

【表2】

【0082】

特に、上記のヒンジの前記修飾のために保存的アミノ酸置換が行われ得ることが企図される。「保存的アミノ酸置換」が、機能的に等価なアミノ酸を置換するアミノ酸置換を指すことは、当技術分野において周知である。保存的アミノ酸変化は、結果として得られるペプチドのアミノ酸配列にサイレントな変化をもたらす。例えば、同様の極性を有する１つ以上のアミノ酸は機能的等価物として作用し、ペプチドのアミノ酸配列内にサイレントな変更をもたらす。電荷中性であり、且つより小さい残基で残基を置き換える置換も、残基が異なる群のものであっても「保存的置換」と考えることができる（例えば、より小さいイソロイシンによるフェニルアラニンの置換）。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当技術分野において定義されている。保存的アミノ酸置換のいくつかのファミリーは、表２（上記）に示される。

【0083】

用語「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸類似体又はバリアントの使用も指す。表現型的にサイレントなアミノ酸置換を行う方法に関するガイダンスは、Ｂｏｗｉｅ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｅｓｓａｇｅ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ，”（１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３０６－１３１０）において提供される。

【0084】

本明細書に開示される改変抗体の安定性は、その生物学的機能及び／又は活性を変更することができるポリペプチドの様々な異なる特徴を測定することによって調べることができる。このような特徴の非限定的な例としては、凝集、断片化、タンパク質修飾（例えば、アセチル化、グリコシル化、メチル化、リン酸化）の有無、生物活性、及びマルチサブユニット複合体の解離が挙げられる。一般的に、これらの特徴の１つ以上は、一連の所定の条件下で、ある期間にわたってモニター（すなわち、測定）される。開示される改変抗体の安定性は、ポリペプチドの安定性を決定するために当技術分野において知られているインビトロ安定性アッセイを用いて特徴付けることができる。このようなアッセイには、限定はされないが、ポリペプチドのサイズ及び／又は活性をモニターするアッセイを用いてポリペプチドの完全性を経時的にモニターすることが含まれる。改変抗体の安定性は、溶液中において又は固体として調べることができる。加えて、安定性は、限定はされないが金属イオン及びプロテアーゼなどの、抗体の安定性に影響を与えることが知られている成分の存在下でモニターすることができる。

【0085】

一実施形態では、本明細書に開示される改変抗体は、修飾ヒンジを含む抗体又はＦｃ融合タンパク質であり、前記修飾ヒンジは、修飾ヒンジを欠いている同等の分子と比べて、安定性を改良するか、又は切断に対して抵抗性であるか、又は切断する傾向が少ない。このような抗体には、修飾ヒンジを生成するように修飾され得るヒンジを含有するＩｇＧ分子が含まれる。したがって、本明細書に開示される改変抗体は、好ましくは特異的に抗原に結合する（すなわち、特異的な抗原－抗体結合をアッセイするために当技術分野において周知のイムノアッセイにより決定されるように、非特異的結合を競合排除する）、修飾ヒンジを組み込んだ任意の抗体分子を含むことができる。このような抗体には、限定はされないが、ポリクローナル、モノクローナル、二重特異性、多特異性、ヒト、ヒト化、キメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ジスルフィド連結Ｆｖ、並びに、ＶＬ若しくはＶＨドメイン、又はさらに抗原に特異的に結合する相補性決定領域（ＣＤＲ）のいずれかを含有する、特定の場合にはヒンジ領域含有ポリペプチドを含有するか又はそれに融合するように改変された断片が含まれる。

【0086】

また本明細書には、改良された安定性を有する改変抗体が開示される。特定の実施形態では、修飾ヒンジ領域を含む抗体は、同等の分子よりも切断に対して抵抗性である。具体的な実施形態では、改変抗体は、ヒンジにおける金属イオン媒介性の切断、特にカチオンイオン媒介性の切断に対してより抵抗性である。一実施形態では、改変抗体は、修飾ヒンジ領域を欠いている同等の分子よりも、切断に対して少なくとも２倍、又は少なくとも３倍、又は少なくとも５倍、又は少なくとも１０倍、又は少なくとも５０倍、又は少なくとも１００倍抵抗性である。別の実施形態では、本明細書に開示される改変抗体は、修飾ヒンジ領域を欠いている同等の分子よりも、切断に対して少なくとも１０％、又は少なくとも２０％、又は少なくとも３０％、又は少なくとも４０％、又は少なくとも５０％、又は少なくとも６０％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも１００％、又は少なくとも１５０％、又は少なくとも２００％抵抗性である。

【0087】

本明細書に開示される改変抗体は、同等の分子と比べて、哺乳類（特に、ヒト）におけるインビボ半減期（例えば、血清半減期）の増大、インビボ（例えば、血清半減期）及び／又はインビトロ（例えば、貯蔵寿命）での安定性の増大、及び／又は融解温度（Ｔｍ）の上昇を含む、他の変更された特徴を有し得ることが企図される。一実施形態では、本明細書に開示される改変抗体は、１５日よりも長い、２０日よりも長い、２５日よりも長い、３０日よりも長い、３５日よりも長い、４０日よりも長い、４５日よりも長い、２か月よりも長い、３か月よりも長い、４か月よりも長い、又は５か月よりも長いインビボ半減期を有する。別の実施形態では、改変抗体は、１５日よりも長い、３０日よりも長い、２か月よりも長い、３か月よりも長い、６か月よりも長い、又は１２か月よりも長い、又は２４か月よりも長い、又は３６か月よりも長い、又は６０か月よりも長いインビトロ半減期を有する（例えば、液体又は粉末製剤）。さらに別の実施形態では、改変抗体は、約６０℃、６５℃、７０℃、７５℃、８０℃、８５℃、９０℃、又は９５℃よりも高いＴｍ値を有する。

【0088】

また特に、本明細書に開示される改変抗体は、とりわけ、限定はされないが、血清半減期の増大、結合親和性の増大、免疫原性の低下、産生の増大、ＡＤＣＣ又はＣＤＣ活性の増強又は低下、グリコシル化及び／又はジスルフィド結合の変更、並びに結合特異性の修飾を含む好ましい特徴を有する抗体をもたらす、１つ以上の付加的なアミノ酸残基の置換、変異及び／又は修飾を含有し得ることも企図される。

【0089】

本明細書に開示される改変抗体は、限定はされないが、エフェクター機能を変更する修飾を含む、他の修飾と組み合わせることができる。例えば、抗体又は融合物において相加的、相乗的、又は新規の特性を提供するために、本明細書に開示される改変抗体と、他の修飾とを組み合わせることである。このような修飾は、ＣＨ１、ＣＨ２、若しくはＣＨ３ドメイン又はこれらの組み合わせにおけるものであり得る。改変抗体は、これらが組み合わせられる修飾の特性を増強することが企図される。例えば、改変抗体（例えば、本明細書に開示される修飾ヒンジ領域を有する改変抗体のいずれか）が、野生型Ｆｃ領域を含む同等の分子よりも高い親和性でＦｃγＲＩＩＩＡに結合することが知られている変異体と組み合わせられると、変異体との組み合わせは、ＦｃγＲＩＩＩＡ親和性におけるより大きい倍率の増強をもたらす。

【0090】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される改変抗体は、１つ以上の改変グリコフォーム、すなわち、改変ヒンジ領域を含む分子に共有結合した炭水化物組成物を含む。改変グリコフォームは、限定はされないが、エフェクター機能の増強又は低減を含む、様々な目的のために有用であり得る。改変グリコフォームは、当業者に知られている任意の方法によって、例えば、改変された又はバリアント発現株を使用することによって、１つ以上の酵素、例えばβ（１，４）－Ｎ－アセチルグルコサミン転移酵素ＩＩＩ（ＧｎＴＩ１１）との同時発現によって、種々の生物又は種々の生物由来の細胞株において修飾ヒンジ領域を含む分子を発現させることによって、或いは修飾ヒンジ領域を含む分子が発現された後に炭水化物を修飾することによって生成され得る。改変グリコフォームを生成するための方法は当技術分野において知られており、限定はされないが、Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ，１９９９，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １７：１７６－１８０；Ｄａｖｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００１７ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ７４：２８８－２９４；Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ，２００２，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７７：２６７３３－２６７４０；Ｓｈｉｎｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７８：３４６６－３４７３）米国特許第６，６０２，６８４号明細書；米国特許出願第１０／２７７，３７０号明細書；米国特許出願第１０／１１３，９２９号明細書；ＰＣＴ国際公開第００／６１７３９Ａ１号パンフレット；ＰＣＴ国際公開第０１／２９２２４６Ａ１号パンフレット；ＰＣＴ国際公開第０２／３１１１４０Ａ１号パンフレット；ＰＣＴ国際公開第０２／３０９５４Ａ１号パンフレット；Ｐｏｔｉｌｌｅｇｅｎｔ^ＴＭｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｂｉｏｗａ，Ｉｎｃ．Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）；ＧｌｙｃｏＭＡｂ^ＴＭｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＧＬＹＣＡＲＴ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＡＧ，Ｚｕｒｉｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に記載されるものが含まれる。例えば、国際公開第０００６１７３９号パンフレット；ＥＡ０１２２９１２５号明細書；米国特許出願公開第２００３０１１５６１４号明細書；Ｏｋａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００４，ＪＭＢ，３３６：１２３９－４９を参照されたい。

【0091】

本明細書に開示される改変抗体は、可変領域、Ｆｃ領域、及び修飾ヒンジ（例えば、本明細書に開示される修飾ヒンジ領域のいずれか）を含む抗体を含むことが企図される。改変抗体は、少なくとも１つの抗原に特異的に結合する可変ドメイン又はその断片を、修飾ヒンジを組み込んだＦｃ領域と組み合わせることによって「新規に」産生され得る。或いは、改変抗体は、抗原に結合するＦｃ領域含有抗体のヒンジを修飾することによって産生され得る。

【0092】

本明細書に開示される修飾ヒンジ領域と共に使用するために企図される抗体タイプは、限定はされないが、合成抗体、モノクローナル抗体、組換えで産生された抗体、細胞内抗体、多特異性抗体、二重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、合成抗体、単鎖ＦｖＦｃ（ｓｃＦｖＦｃ）、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、及び抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体を含むことができる。特に、本明細書に開示される方法において使用される抗体には、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分が含まれる。免疫グロブリン分子は、任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）又はサブクラスの免疫グロブリン分子であり得る。

【0093】

本明細書に開示される改変抗体は、トリ及び哺乳類（例えば、ヒト、マウス、ロバ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、又はニワトリ）を含む、あらゆる動物起源に由来することができる。具体的な実施形態では、抗体は、ヒト又はヒト化モノクローナル抗体である。本明細書で使用される場合、「ヒト」抗体はヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含むと共に、ヒト免疫グロブリンライブラリーから又はヒト遺伝子由来の抗体を発現するマウスから単離された抗体を含む。

【0094】

本明細書に開示される抗体は単一特異性、二重特異性、三重特異性であることができ、或いはより多い多特異性を有することもできる。多特異性抗体は所望の標的分子の異なるエピトープに特異的に結合してもよいし、或いは標的分子と、異種エピトープ、例えば、異種ポリペプチド又は固体支持材料との両方に特異的に結合してもよい。例えば、国際公開第９４／０４６９０号パンフレット；国際公開第９３／１７７１５号パンフレット；国際公開第９２／０８８０２号パンフレット；国際公開第９１／００３６０号パンフレット；及び国際公開第９２／０５７９３号パンフレット；Ｔｕｔｔ，ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０－６９；米国特許第４，４７４，８９３号明細書、同第４，７１４，６８１号明細書、同第４，９２５，６４８号明細書、同第５，５７３，９２０号明細書、及び同第５，６０１，８１９号明細書；並びにＫｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７）を参照されたい。本明細書に開示される修飾ヒンジを組み込んだ、３つ以上の結合価を有する抗体が企図される。例えば、三重特異性抗体を作製することができる。例えば、Ｔｕｔｔ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）を参照されたい。

【0095】

本明細書で企図される改変抗体は、ラクダ化（ｃａｍｅｌｉｚｅｄ）単一ドメイン抗体を含む単一ドメイン抗体も包含する（例えば、Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２６：２３０；Ｎｕｔｔａｌｌ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｃｕｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１：２５３；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ ａｎｄ Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ，１９９９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．２３１：２５；国際公開第９４／０４６７８号パンフレット及び国際公開第９４／２５５９１号パンフレット；米国特許第６，００５，０７９号明細書を参照のこと）。

【0096】

本明細書に開示される改変抗体はさらに、抗体様及び抗体－ドメイン融合タンパク質を包含することができる。抗体様分子は、所望の結合特性を備えて生成された任意の分子であり、例えば、ＰＣＴ公開国際公開第０４／０４４０１１号パンフレット；国際公開第０４／０５８８２１号パンフレット；国際公開第０４／００３０１９号パンフレット及び国際公開第０３／００２６０９号パンフレットを参照されたい。抗体－ドメイン融合タンパク質は、Ｆｃドメイン又は可変ドメインなどの１つ以上の抗体ドメインを組み込み得る。例えば、異種ポリペプチドは、Ｆａｂ断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、Ｆ（ａｂ）_２断片、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、ＶＨ ＣＤＲ、ＶＬ ＣＤＲ、又はそれらの断片に融合又はコンジュゲートされ得る。多数の抗体－ドメイン分子が当技術分野において知られており、限定はされないが、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）（ｄｓＦｖ）_２（Ｂｅｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８１：４７５－８３）；ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）（ｓｃＦｖ－ＣＨ３融合タンパク質のホモダイマー）（Ｐｅｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ ３６２：３６７－９）、４価ジ－ダイアボディ（Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，２００３ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２７９：２１９－３２）、Ｂｓ（ｓｃＦｖ）４－ＩｇＧと呼ばれる４価二重特異性抗体（Ｚｕｏ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１３：３６１－３６７が含まれる。Ｆｃドメイン融合物は、免疫グロブリンのＦｃ領域、特に、修飾ヒンジを含むＦｃ領域と、限定はされないが、リガンド、酵素、受容体のリガンド部分、接着タンパク質、又は他の何らかのタンパク質若しくはドメインを含む、一般にタンパク質であり得る融合パートナーとを組み合わせる。例えば、Ｃｈａｍｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １４：５２－６０；Ａｓｈｋｅｎａｚｉ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ９：１９５－２００；Ｈｅｉｄａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５，ＦＡＳＥＢ Ｊ．９：１４０－５を参照されたい。ポリペプチドを抗体部分に融合又はコンジュゲートさせるための方法は、当技術分野において周知である。例えば、米国特許第５，３３６，６０３号明細書、同第５，６２２，９２９号明細書、同第５，３５９，０４６号明細書、同第５，３４９，０５３号明細書、同第５，４４７，８５１号明細書、及び同第５，１１２，９４６号明細書；欧州特許第３０７，４３４号明細書及び欧州特許第３６７，１６６号明細書；ＰＣＴ公開国際公開第９６／０４３８８号パンフレット及び国際公開第９１／０６５７０号パンフレット；Ａｓｈｋｅｎａｚｉ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１０５３５－１０５３９；Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：５５９０－５６００；並びにＶｉｌ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１１３３７－１１３４１を参照されたい。

【0097】

特に企図される他の分子は、例えば、免疫ドメイン及び／又はモノマードメインなどの小さい改変タンパク質ドメインである（例えば、米国特許出願公開第２００３０８２６３０号明細書及び同第２００３１５７５６１号明細書を参照のこと）。免疫ドメインは、抗体の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含有し、モノマードメインは、既知の天然に存在する非抗体ドメインファミリー、特にタンパク質細胞外ドメインに基づき、これは、保存スキャフォールド及び可変結合部位を含有し、一例は、リガンド結合に関与するＬＤＬ受容体Ａドメインである。このようなタンパク質ドメインは、例えば、シャペロニン又は金属イオンの存在とは関係なく又はその補助が限られていても、正確にフォールドすることができる。この能力は、新しいタンパク質環境に挿入されたときに、ドメインのミスフォールディングを回避し、それにより、特定の標的に対するタンパク質ドメインの結合親和性を保存する。タンパク質ドメインの可変結合部位は、例えば、ランダム変異誘発、部位特異的変異誘発などの種々の多様性生成方法を用いて、そして例えば、再帰的エラープローンＰＣＲ、再帰的組換えなどの定向進化方法によってランダム化される。種々の多様性生成方法の詳細については、米国特許第５，８１１，２３８号明細書；同第５，８３０，７２１号明細書；同第５，８３４，２５２号明細書；ＰＣＴ公開国際公開第９５／２２６２５号パンフレット；国際公開第９６／３３２０７号パンフレット；国際公開第９７／２００７８号パンフレット；国際公開第９７／３５９６６号パンフレット；国際公開第９９／４１３６８号パンフレット；国際公開第９９／２３１０７号パンフレット；国際公開第００／００６３２号パンフレット；国際公開第００／４２５６１号パンフレット；及び国際公開第０１／２３４０１号パンフレットを参照されたい。変異誘発されたタンパク質ドメインは次に、例えば、少なくとも１０１０のバリアントのライブラリーを生成し、その後のパニング及びスクリーニングによる、意図される標的に対する改良された親和性及び効力を有するタンパク質ドメインの単離を容易にすることができる、ファージディスプレイなどのディスプレイシステムを用いて発現される。このような方法は、ＰＣＴ公開国際公開第９１／１７２７１号パンフレット；国際公開第９１／１８９８０号パンフレット；国際公開第９１／１９８１８号パンフレット；国際公開第９３／０８２７８号パンフレットに記載されている。付加的なディスプレイシステムの例は、米国特許第６，２８１，３４４号明細書；同第６，１９４，５５０号明細書；同第６，２０７，４４６号明細書；同第６，２１４，５５３号明細書及び同第６，２５８，５５８号明細書に記載されている。これらの方法を利用して、サブｎＭの結合親和性（Ｋｄ）及びブロッキング機能（ＩＣ５０）を有する高多様性の改変タンパク質ドメインを急速に生成することができる。同定されたら、約４～１５アミノ酸長さの天然タンパク質リンカーを用いて、２～１０個のこのような改変タンパク質ドメインを互いに連結させて、結合タンパク質を形成することができる。個々のドメインは、使用／疾患兆候に応じて、単一タイプのタンパク質又はいくつかを標的とすることができる。改変タンパク質ドメインは次に、修飾ヒンジ、例えば、本明細書に開示される修飾ヒンジ領域のいずれかを含有する抗体中のＦｃ領域に連結され得る。

【0098】

修飾ヒンジ（例えば、本明細書に開示される修飾ヒンジのいずれか）を当技術分野において既に記載されている抗体に導入することも企図される。修飾ヒンジが導入された抗体は、例えば、限定はされないが、ＫＳ１／４汎癌（ｐａｎ－ｃａｒｃｉｎｏｍａ）抗原（Ｐｅｒｅｚ ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ，１９９０，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４２：３６６２－３６６７；Ｂｕｍａｌ，１９８８，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ７（４）：４０７－４１５）、卵巣癌抗原（ＣＡｌ２５）（Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５１（２）：４６８－４７５）、前立腺性酸性ホスファート（ｐｒｏｓｔａｔｉｃ ａｃｉｄ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）（Ｔａｉｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８（１６）：４９２８）、前立腺特異的抗原（Ｈｅｎｔｔｕ ａｎｄ Ｖｉｈｋｏ，１９８９，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１６０（２）：９０３－９１０；Ｉｓｒａｅｌｉ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：２２７－２３０）、メラノーマ関連抗原ｐ９７（Ｅｓｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｌ．８１（６）：４４５－４４６）、メラノーマ抗原ｇｐ７５（Ｖｉｊａｙａｓａｒｄａｈｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７１（４）：１３７５－１３８０）、高分子量メラノーマ抗原（ＨＭＷ－ＭＡＡ）（Ｎａｔａｌｉ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｃａｎｃｅｒ ５９：５５－６３；Ｍｉｔｔｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８６：２１３６－２１４４）、前立腺特異的膜抗原、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）（Ｆｏｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１３：２９４）、多形性上皮ムチン抗原、ヒト乳脂肪球抗原、結腸直腸腫瘍関連抗原、例えば、ＣＥＡ、ＴＡＧ－７２（Ｙｏｋａｔａ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：３４０２－３４０８）、ＣＯ１７－１Ａ（Ｒａｇｎｈａｍｍａｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ５３：７５１－７５８）；ＧＩＣＡ １９－９（Ｈｅｒｌｙｎ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：１３５）、ＣＴＡ－１及びＬＥＡ、バーキットリンパ腫抗原－３８．１３、ＣＤ１９（Ｇｈｅｔｉｅ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｂｌｏｏｄ ８３：１３２９－１３３６）、ヒトＢリンパ腫抗原－ＣＤ２０（Ｒｅｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｂｌｏｏｄ ８３：４３５－４４５）、ＣＤ３３（Ｓｇｏｕｒｏｓ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．３４：４２２－４３０）、メラノーマ特異的抗原、例えば、ガングリオシドＧＤ２（Ｓａｌｅｈ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１，３３９０－３３９８）、ガングリオシドＧＤ３（Ｓｈｉｔａｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３６：３７３－３８０）、ガングリオシドＧＭ２（Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１２：１０３６－１０４４）、ガングリオシドＧＭ３（Ｈｏｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：５２４４－５２５０）、腫瘍特異的移植タイプの細胞表面抗原（ＴＳＴＡ）、例えば、ウイルスに誘発される腫瘍抗原（Ｔ抗原ＤＮＡ腫瘍ウイルス及びＲＮＡ腫瘍ウイルスのエンベロープ抗原を含む）、癌胎児性抗原－アルファ－フェトプロテイン、例えば、結腸のＣＥＡ、膀胱腫瘍癌胎児性抗原（Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｃａｎｃｅｒ．Ｒｅｓ．４５：２２１０－２１８８）、分化抗原、例えば、ヒト肺癌抗原Ｌ６、Ｌ２０（Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４６：３９１７－３９２３）、線維肉腫の抗原、ヒト白血病Ｔ細胞抗原－Ｇｐ３７（Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａ－Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｊ．ｏｆ Ｉｍｍｕｎ．１４１：１３９８－１４０３）、ネオ糖タンパク質、スフィンゴ脂質、乳癌抗原、例えば、ＥＧＦＲ（上皮増殖因子受容体）、ＨＥＲ２抗原（ｐ１８５^ＨＥＲ２）、多形性上皮ムチン（ＰＥＭ）（Ｈｉｌｋｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１７：３５９）、悪性ヒトリンパ球抗原－ＡＰＯ－１（Ｂｅｒｎｈａｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４５：３０１－３０４）、分化抗原（Ｆｅｉｚｉ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１４：５３－５７）、例えば、胎児赤血球において見出されるＩ抗原、成人赤血球において見出される初期内胚葉Ｉ抗原、着床前胚、胃腺癌において見出されるＩ（Ｍａ）、乳房上皮において見出される Ｍ１８、Ｍ３９、骨髄細胞において見出されるＳＳＥＡ－１、ＶＥＰ８、ＶＥＰ９、Ｍｙｌ、ＶＩＭ－Ｄ５、結腸直腸癌において見出されるＤ_１５６－２２、ＴＲＡ－１－８５（血液型Ｈ）、結腸腺癌において見出されるＣ１４、肺腺癌において見出されるＦ３、胃癌において見出されるＡＨ６、Ｙハプテン、胚性癌細胞において見出されるＬｃ^ｙ、ＴＬ５（血液型Ａ）、Ａ４３１細胞において見出されるＥＧＦ受容体、膵癌において見出されるＥ_１シリーズ（血液型Ｂ）、胚性癌細胞において見出されるＦＣ１０．２、胃腺癌抗原、腺癌において見出されるＣＯ－５１４（血液型Ｌｅ^ａ）、腺癌において見出されるＮＳ－１０、ＣＯ－４３（血液型Ｌｅ^ｂ）、Ａ４３１細胞のＥＧＦ受容体において見出されるＧ４９、結腸腺癌において見出されるＭＨ２（血液型ＡＬｅ^ｂ／Ｌｅ^ｖ）、結腸癌において見出される１９．９、胃癌ムチン、骨髄細胞において見出されるＴ_５Ａ_７、メラノーマにおいて見出されるＲ_２４、胚性癌細胞において見出される４．２、Ｇ_Ｄ３、Ｄ１．１、ＯＦＡ－１、Ｇ_Ｍ２、ＯＦＡ－２、Ｇ_Ｄ２、及びＭ１：２２：２５：８、並びに４～８細胞段階の胚において見出されるＳＳＥＡ－３及びＳＳＥＡ－４を含む、癌又は腫瘍抗原に特異的に結合し得る。一実施形態では、抗原は、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫からのＴ細胞受容体由来ペプチドである（Ｅｄｅｌｓｏｎ，１９９８，Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｊｏｕｒｎａｌ ４：６２を参照のこと）。

【0099】

いくつかの実施形態では、修飾ヒンジは、抗フルオレセインモノクローナル抗体、４－４－２０内に導入させることができる（Ｋｒａｎｚ ｅｔ ａｌ．，１９８２ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７（１２）：６９８７－６９９５）。他の実施形態では、修飾ヒンジは、Ｂ細胞上のＣＤ２０細胞表面リンタンパク質を認識するマウス－ヒトキメラ抗ＣＤ２０モノクローナル抗体２Ｈ７内に導入される（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１３９：３５２１－６）。さらに他の実施形態では、修飾ヒンジは、Ｃａｒｔｅｒら（１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：４２８５－９）により記載されるような、ヒト上皮増殖因子受容体２（ｐ１８５ＨＥＲ２）に対するヒト化抗体（Ａｂ４Ｄ５）内に導入される。さらに他の実施形態では、修飾ヒンジは、ヒト化抗ＴＡＧ７２抗体（ＣＣ４９）内に導入される（Ｓｈａ ｅｔ ａｌ．，１９９４ Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒ．９（４）：３４１－９）。他の実施形態では、修飾ヒンジは、リンパ腫の処置に使用されるリツキサン（Ｒｉｔｕｘａｎ）内に導入される。

【0100】

いくつかの実施形態では、修飾ヒンジ（例えば、本明細書に開示されるタンパク質分解的切断に対する抵抗性を付与する修飾ヒンジのいずれか）は、限定はされないが、ＥＧＦＲに対するキメラ化（ｃｈｉｍｅｒｉｚｅｄ）モノクローナル抗体であるＥｒｂｉｔｕｘ^ＴＭ（ＩＭＣ－Ｃ２２５としても知られている）（ＩｍＣｌｏｎｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）；転移性乳癌患者の処置のためのヒト化抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体であるＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）（トラスツズマブ）（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｃａｌｉｆ．）；血塊形成の予防のための血小板上の抗糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体であるＲＥＯＰＲＯ（登録商標）（アブシキシマブ）（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ）；急性腎臓同種移植拒絶の予防のための免疫抑制ヒト化抗ＣＤ２５モノクローナル抗体であるＺＥＮＡＰＡＸ（登録商標）（ダクリズマブ）（Ｒｏｃｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を含む、癌抗原又は細胞表面受容体に特異的な治療用モノクローナル抗体内に導入することができる。他の例は、ヒト化抗ＣＤ１８Ｆ（ａｂ’）_２（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）；ヒト化抗ＣＤ１８Ｆ（ａｂ’）_２であるＣＤＰ８６０（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ，ＵＫ）；ＣＤ４と融合した抗ＨＩＶｇｐ１２０抗体であるＰＲＯ５４２（Ｐｒｏｇｅｎｉｃｓ／Ｇｅｎｚｙｍｅ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｓ）；抗ＣＤ１４抗体であるＣ１４（ＩＣＯＳ Ｐｈａｒｍ）；ヒト化抗ＶＥＧＦＩｇＧ１抗体（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）；マウス抗ＣＡ１２５抗体であるＯＶＡＲＥＸ^ＴＭ（Ａｌｔａｒｅｘ）；マウス抗１７－ＩＡ細胞表面抗原ＩｇＧ２ａ抗体であるＰＡＮＯＲＥＸ^ＴＭ（Ｇｌａｘｏ Ｗｅｌｌｃｏｍｅ／Ｃｅｎｔｏｃｏｒ）；キメラ抗ＥＧＦＲＩｇＧ抗体であるＩＭＣ－Ｃ２２５（ＩｍＣｌｏｎｅ Ｓｙｓｔｅｍ）；ヒト化抗αＶβ３インテグリン抗体であるＶＩＴＡＸＩＮ^ＴＭ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ／ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）；ヒト化抗ＣＤ５２ＩｇＧ１抗体であるＣａｍｐａｔｈ １Ｈ／ＬＤＰ－０３（Ｌｅｕｋｏｓｉｔｅ）；ヒト化抗ＣＤ３３ＩｇＧ抗体であるＳｍａｒｔ Ｍ１９５（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌａｂ／Ｋａｎｅｂｏ）；キメラ抗ＣＤ２０ＩｇＧ１抗体であるＲＩＴＵＸＡＮ^ＴＭ（ＩＤＥＣ Ｐｈａｒｍ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｒｏｃｈｅ／Ｚｅｔｔｙａｋｕ）；ヒト化抗ＣＤ２２ＩｇＧ抗体であるＬＹＭＰＨＯＣＩＤＥ^ＴＭ（Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ）；ヒト化抗ＨＬＡ抗体であるＳｍａｒｔ ＩＤ１０（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌａｂ）であり；ＯＮＣＯＬＹＭ^ＴＭ（Ｌｙｍ－１）は、放射標識マウス抗ＨＬＡ ＤＲ抗体であり（Ｔｅｃｈｎｉｃｌｏｎｅ）；抗ＣＤ１１ａは、ヒト化ＩｇＧ１抗体であり（Ｇｅｎｅｔｅｃｈ／Ｘｏｍａ）；ＩＣＭ３は、ヒト化抗ＩＣＡＭ３抗体であり（ＩＣＯＳ Ｐｈａｒｍ）；ＩＤＥＣ－１１４は、霊長類化（ｐｒｉｍａｔｉｚｅｄ）抗ＣＤ８０抗体であり（ＩＤＥＣ Ｐｈａｒｍ／Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ）；ＺＥＶＡＬＩＮ^ＴＭは、放射標識マウス抗ＣＤ２０抗体であり（ＩＤＥＣ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ ＡＧ）；ＩＤＥＣ－１３１は、ヒト化抗ＣＤ４０Ｌ抗体であり（ＩＤＥＣ／Ｅｉｓａｉ）；ＩＤＥＣ－１５１は、霊長類化抗ＣＤ４抗体であり（ＩＤＥＣ）；ＩＤＥＣ－１５２は、霊長類化抗ＣＤ２３抗体であり（ＩＤＥＣ／Ｓｅｉｋａｇａｋｕ）；ＳＭＡＲＴ抗ＣＤ３は、ヒト化抗ＣＤ３ＩｇＧであり（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌａｂ）；５Ｇ１．１は、ヒト化抗補体因子５（Ｃ５）抗体であり（Ａｌｅｘｉｏｎ Ｐｈａｒｍ）；ＩＤＥＣ－１５１は、霊長類化抗ＣＤ４ＩｇＧ１抗体であり（ＩＤＥＣ Ｐｈａｒｍ／ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ）；ＭＤＸ－ＣＤ４は、ヒト抗ＣＤ４ＩｇＧ抗体であり（Ｍｅｄａｒｅｘ／Ｅｉｓａｉ／Ｇｅｎｍａｂ）；ＣＤＰ５７１は、ヒト化抗ＴＮＦ－αＩｇＧ４抗体であり（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）；ＬＤＰ－０２は、ヒト化抗α４β７抗体であり（ＬｅｕｋｏＳｉｔｅ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）；ＯｒｔｈｏＣｌｏｎｅ ＯＫＴ４Ａは、ヒト化抗ＣＤ４ＩｇＧ抗体であり（Ｏｒｔｈｏ Ｂｉｏｔｅｃｈ）；ＡＮＴＯＶＡ^ＴＭは、ヒト化抗ＣＤ４０ＬＩｇＧ抗体であり（Ｂｉｏｇｅｎ）；ＡＮＴＥＧＲＥＮ^ＴＭは、ヒト化抗ＶＬＡ－４ＩｇＧ抗体であり（Ｅｌａｎ）；ＭＤＸ－３３は、ヒト抗ＣＤ６４（ＦｃγＲ）抗体であり（Ｍｅｄａｒｅｘ／Ｃｅｎｔｅｏｎ）；ｒｈｕＭａｂ－Ｅ２５は、ヒト化抗ＩｇＥＩｇＧ１抗体であり（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｎｏｒｖａｒｔｉｓ／Ｔａｎｏｘ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）；ＩＤＥＣ－１５２は、霊長類化抗ＣＤ２３抗体であり（ＩＤＥＣ Ｐｈａｒｍ）；ＡＢＸ－ＣＢＬは、マウス抗ＣＤ－１４７ＩｇＭ抗体であり（Ａｂｇｅｎｉｘ）；ＢＴＩ－３２２は、ラット抗ＣＤ２ＩｇＧ抗体であり（Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ／Ｂｉｏ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ）；Ｏｒｔｈｏｃｌｏｎｅ／ＯＫＴ３は、マウス抗ＣＤ３ＩｇＧ２ａ抗体であり（ｏｒｔｈｏ Ｂｉｏｔｅｃｈ）；ＳＩＭＵＬＥＣＴ^ＴＭは、キメラ抗ＣＤ２５ＩｇＧ１抗体であり（Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｐｈａｒｍ）；ＬＤＰ－０１は、ヒト化抗β_２－インテグリンＩｇＧ抗体であり（ＬｅｕｋｏＳｉｔｅ）；抗ＬＦＡ－１は、マウス抗ＣＤ１８Ｆ（ａｂ’）_２であり（Ｐａｓｔｅｕｒ－Ｍｅｒｉｅｕｘ／Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ）；ＣＡＴ－１５２は、ヒト抗ＴＧＦ－β_２抗体であり（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ａｂ Ｔｅｃｈ）；及びＣｏｒｓｅｖｉｎ Ｍは、キメラ抗第ＶＩＩ因子抗体である（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ）。

【0101】

いくつかの実施形態では、改変抗体又はその機能性断片は、抗ＲＳウイルス（ＲＳＶ）抗体、抗エボラウイルス抗体、抗凝集βアミロイド（Ａβ）抗体、抗ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗体、抗単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）抗体、抗精子抗体（例えば、抗ヒト避妊抗原（ＨＣＡ）抗体）、及び抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体である。

【0102】

さらに別の実施形態では、本明細書に開示される改変抗体は、限定はされないが、上記に記載されるものを含む既知の治療用抗体と同じ抗原に特異的に結合することができるが、ただしいくつかの実施形態では、改変抗体の可変領域は、前記治療用抗体のものではない。他の実施形態では、改変抗体の可変領域は、治療用抗体のものと同一である。

【0103】

１．シグナル配列
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される改変抗体は、シグナル配列を含むことができる。シグナル配列は、宿主細胞（例えば、糸状菌宿主細胞）からのタンパク質分泌を容易にする、あらゆるシグナル配列であり得る。特定の実施形態では、改変抗体は、融合タンパク質が産生されることとなる宿主細胞から高度に分泌されることが公知であるタンパク質のためのシグナル配列を含むことができる。用いられるシグナル配列は、改変抗体が産生されることとなる宿主細胞に対して内在性又は非内在性であり得る。

【0104】

好適なシグナル配列は、当技術分野で公知である（例えば、Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９９０ ８：４３５－４４０；及びＰａｌｏｈｅｉｍｏ ｅｔ ａｌ，Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ２００３ ６９：７０７３－７０８２を参照のこと）。好適なシグナル配列の非限定的な例としては、セロビオヒドロラーゼＩ、セロビオヒドロラーゼＩＩ、エンドグルカナーゼＩ、ＩＩ、及びＩＩＩ、α－アミラーゼ、アスパルチルプロテアーゼ、グルコアミラーゼ、フィターゼ、マンナナーゼ、α及びβグルコシダーゼ、ウシキモシン、ヒトインターフェロン及びヒト組織プラスミノーゲン活性化因子、及び合成のコンセンサス真核生物シグナル配列のもの、例えばＧｗｙｎｎｅ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５：７１３－７１９によって記載されたものが挙げられる。

【0105】

いくつかの実施形態では、宿主細胞としてトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）（例えばＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ））が用いられるならば、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）マンナナーゼＩ（Ｍａｎ５Ａ、若しくはＭＡＮＩ）、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）セロビオヒドロラーゼＩＩ（Ｃｅｌ６Ａ若しくはＣＢＨＩＩ）、エンドグルカナーゼＩ（Ｃｅｌ７ｂ若しくはＥＧＩ）、エンドグルカナーゼＩＩ（Ｃｅｌ５ａ若しくはＥＧＩＩ）、エンドグルカナーゼＩＩＩ（Ｃｅｌ１２Ａ若しくはＥＧＩＩＩ）、キシラナーゼＩ若しくはＩＩ（ＸｙｎＩＩａ若しくはＸｙｎＩＩｂ）、又はＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）セロビオヒドロラーゼＩ（Ｃｅｌ７ａ又はＣＢＨＩ）のシグナル配列又は担体を、改変抗体中で用いることができる。

【0106】

他の実施形態では、宿主細胞としてコウジカビ属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）（例えばクロカビ（Ａ．ｎｉｇｅｒ））が用いられるならば、クロカビ（Ａ．ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ（ＧｌａＡ）又はアルファアミラーゼのシグナル配列又は担体を、融合ポリペプチド中で用いることができる。クロカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）とアワモリコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）のグルコアミラーゼは、同一のアミノ酸配列を有する。２つの形態の酵素が、一般に、培養上清中で認識される。ＧＡＩは、全長形態（アミノ酸残基１～６１６）であり、ＧＡＩＩは、アミノ酸残基１～５１２を含む天然のタンパク分解性断片である。ＧＡＩは、伸長されたリンカー領域によって連結された２つの別のドメインとして折り畳まれることが公知である。これらの２つのドメインは、４７１残基の触媒ドメイン（アミノ酸１～４７１）及び１０８残基のデンプン結合ドメイン（アミノ酸５０９～６１６）であり、２つのドメインの間のリンカー領域は、３６残基（アミノ酸４７２～５０８）である。ＧＡＩＩは、デンプン結合ドメインを欠いている。Ｌｉｂｂｙ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ７：１１０９－１１１４を参照されたい。いくつかの実施形態では、担体タンパク質として使用され、シグナル配列を含むグルコアミラーゼは、コウジカビ属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）又はトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）グルコアミラーゼの触媒ドメインとの９５％、９６％、９７％、９８％、及び９９％よりも大きい配列同一性を有することとなる。用語「触媒ドメイン」は、タンパク質の触媒活性を有する、タンパク質のアミノ酸配列の構造的部分又は領域を指す。

【0107】

２．担体
特定の実施形態では、シグナル配列は、そのＮ末端にシグナル配列を含有する「担体」を含むことができ、ここで、担体は、少なくとも、細胞に対して内在性であり、且つ細胞により効率的に分泌されるタンパク質のＮ末端部分である。特定の実施形態では、シグナル配列及び担体タンパク質は、同じ遺伝子から得られる。いくつかの実施形態では、シグナル配列及び担体タンパク質は、異なる遺伝子から得られる。

【0108】

担体タンパク質は、分泌されるポリペプチドの成熟配列のすべて又は一部を含むことができる。いくつかの実施形態では、全長の分泌されたポリペプチドが使用される。しかし、分泌されるポリペプチドの機能性部分を用いることもできる。本明細書で使用する場合、分泌されるポリペプチドの「部分」又は文法的等価物は、切断されていても正常な立体配置に折り畳まれるその能力を保持する、切断された分泌されたポリペプチドを意味する。

【0109】

場合により、分泌ポリペプチドのトランケーションは、機能性タンパク質が生物学的機能を保持することを意味する。いくつかの実施形態では、分泌ポリペプチドの触媒ドメインが使用されるが、他の機能性ドメイン、例えば基質結合ドメインも使用され得る。一実施形態では、担体タンパク質としてグルコアミラーゼ（例えば、クロカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）由来のグルコアミラーゼ）が使用される場合、機能性部分は酵素の触媒ドメインを保持し、アミノ酸１～４７１を含む（参照によってその開示が本明細書に組み込まれる国際公開第０３０８９６１４号パンフレット、例えば実施例１０を参照のこと）。別の実施形態では、担体タンパク質としてＣＢＨ Ｉ（すなわち、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）由来のＣＢＨ Ｉ）が使用される場合、機能性部分は酵素の触媒ドメインを保持する。参照によってその開示が本明細書に組み込まれる国際公開第０５０９３０７３号パンフレットの図の配列番号１が参照され、そこでは、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）ＣＢＨ１シグナル配列、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ＣＢＨ１触媒ドメイン（触媒コア又はコアドメインとも呼ばれる）及びＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ＣＢＨ１リンカーをコードする配列が開示される。いくつかの実施形態では、シグナル配列を含むＣＢＨ１担体タンパク質は、参照によってその開示が本明細書に組み込まれる国際公開第０５０９３０７３号パンフレットの図２の配列番号１と９５％、９６％、９７％、９８％及び９９％よりも大きい配列同一性を有することとなる。

【0110】

一般に、担体タンパク質が、切断されたタンパク質であるならば、これは、Ｃ末端が切断されている（すなわち、損なわれていないＮ末端を含有する）。或いは、担体タンパク質は、Ｎ末端が切断されている、又は、場合によっては、機能性部分を残すようにして両端が切断されている可能性がある。一般に、担体タンパク質を含む分泌されたタンパク質のこうした部分は、分泌されたタンパク質、いくつかの実施形態では、分泌されたタンパク質のＮ末端部分の、５０％超、７０％超、８０％超、及び９０％超を含む。いくつかの実施形態では、担体タンパク質は、触媒ドメインに加えて、リンカー領域を含むこととなる。いくつかの実施形態では、ＣＢＨＩタンパク質のリンカー領域の部分を、担体タンパク質に使用することができる。

【0111】

いくつかの実施形態では、分泌配列として機能性のシグナル配列を含む第１のアミノ酸配列が、第１のＤＮＡ分子によってコードされる。担体タンパク質を含む第２のアミノ酸配列は、第２のＤＮＡ配列によってコードされる。しかし、上に記載した通り、シグナル配列と担体タンパク質は、同じ遺伝子から得ることができる。

【0112】

３．抗体コンジュゲート及び誘導体
本明細書に開示される改変抗体はどれも、修飾された（すなわち、共有結合のように（ｓｕｃｈ ｔｈａｔ ｃｏｖａｌｅｎｔ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）、任意のタイプの分子の抗体への共有結合による）誘導体を含むことができる。限定としてではないが例えば、抗体誘導体には、例えば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、既知の保護／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解的切断、細胞リガンド又は他のタンパク質への連結などによって修飾された抗体が含まれる。多数の化学修飾はどれも、限定はされないが、特異的な化学切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などを含む、既知の技術によって実行され得る。

【0113】

インビボ半減期が増大された抗体又はその断片は、前記抗体又は抗体断片に、高分子量ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのポリマー分子を結合させることによって生成され得る。ＰＥＧは、多機能性リンカーの有無にかかわらず、前記抗体又は抗体断片のＮ又はＣ末端へのＰＥＧの部位特異的コンジュゲーションによって、或いはリジン残基上に存在するイプシロン－アミノ基を用いて、前記抗体又は抗体断片に結合させることができる。生物活性の最小限の損失をもたらす線状又は分枝状ポリマーの誘導体化が使用されるであろう。コンジュゲーションの度合いは、ＰＥＧ分子の抗体への適正なコンジュケーションを保証するために、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及び質量分析によって密接にモニターされ得る。未反応ＰＥＧは、例えば、サイズ排除又はイオン交換クロマトグラフィによって、抗体－ＰＥＧコンジュゲートから分離され得る。

【0114】

さらに、抗体又は抗体断片をインビボでより安定にするため、又はインビボでより長い半減期を持たせるために、抗体はアルブミンにコンジュゲートされ得る。その技術は当技術分野において周知であり、例えば、国際公開第９３／１５１９９号パンフレット、国際公開第９３／１５２００号パンフレット、及び国際公開第０１／７７１３７号パンフレット；並びに欧州特許第４１３，６２２号明細書を参照されたい。本発明は、限定はされないが、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、融合タンパク質、核酸分子、小分子、模倣薬剤、合成薬物、無機分子、及び有機分子を含む１つ以上の部分にコンジュゲート又は融合された抗体又はその断片の使用を包含する。

【0115】

本発明は、融合タンパク質を生成するために異種タンパク質又はポリペプチド（又はその断片、例えば、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０又は少なくとも１００のアミノ酸のポリペプチド）に組換えで融合又は化学的にコンジュゲートされた（共有結合及び非共有結合を含む）抗体又はその断片の使用を包含する。融合は、必ずしも直接的でなくてもよく、リンカー配列を介して行われてもよい。例えば、抗体は、特定の細胞表面受容体に特異的な抗体に、その抗体を融合又はコンジュゲートさせることによって、インビトロ又はインビボのいずれかで異種ポリペプチドを特定の細胞型に向けるために使用され得る。また異種ポリペプチドに融合又はコンジュゲートされた抗体は、当技術分野において既知の方法を用いて、インビトロイムノアッセイ及び精製方法においても使用され得る。例えば、国際公開第９３／２１２３２号パンフレット；欧州特許第４３９，０９５号明細書；Ｎａｒａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．３９：９１－９９；米国特許第５，４７４，９８１号明細書；Ｇｉｌｌｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２，ＰＮＡＳ ８９：１４２８－１４３２；及びＦｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：２４４６－２４５２を参照されたい。

【0116】

本発明はさらに、抗体断片に融合又はコンジュゲートされた異種タンパク質、ペプチド又はポリペプチドを含む組成物を含む。例えば、異種ポリペプチドは、Ｆａｂ断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、Ｆ（ａｂ）_２断片、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、ＶＨＣＤＲ、ＶＬＣＤＲ、又はそれらの断片に融合又はコンジュゲートされ得る。ポリペプチドを抗体部分に融合又はコンジュゲートさせるための方法は、当技術分野において周知である。例えば、米国特許第５，３３６，６０３号明細書、同第５，６２２，９２９号明細書、同第５，３５９，０４６号明細書、同第５，３４９，０５３号明細書、同第５，４４７，８５１号明細書、及び同第５，１１２，９４６号明細書；欧州特許第３０７，４３４号明細書及び欧州特許第３６７，１６６号明細書；国際公開第９６／０４３８８号パンフレット及び国際公開第９１／０６５７０号パンフレット；Ａｓｈｋｅｎａｚｉ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１０５３５－１０５３９；Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：５５９０－５６００；並びにＶｉｌ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１１３３７－１１３４１を参照されたい。

【0117】

例えば、抗原（例えば、上記）に特的に結合する抗体の付加的な融合タンパク質は、遺伝子シャフリング、モチーフシャフリング、エクソンシャフリング、及び／又はコドンシャフリング（集合的に「ＤＮＡシャフリング」と称される）の技術によって生成され得る。ＤＮＡシャフリングは、本明細書に開示される改変抗体又はその断片（例えば、より高い親和性及びより低い解離速度を有する抗体又はその断片）の活性を変更するために使用され得る。一般的に、米国特許第５，６０５，７９３号明細書；同第５，８１１，２３８号明細書；同第５，８３０，７２１号明細書；同第５，８３４，２５２号明細書；及び同第５，８３７，４５８号明細書、並びにＰａｔｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：７２４－３３；Ｈａｒａｙａｍａ，１９９８，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６（２）：７６－８２；Ｈａｎｓｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８７：２６５－７６；並びにＬｏｒｅｎｚｏ ａｎｄ Ｂｌａｓｃｏ，１９９８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２４（２）：３０８－３１３を参照されたい。抗体若しくはその断片、又はコードされた抗体若しくはその断片は、組換えの前に、エラープローンＰＣＲ、ランダムヌクレオチド挿入又は他の方法によるランダム変異誘発を受けることによって変更され得る。抗体又は抗体断片をコードするポリヌクレオチドの１つ以上の部分（この部分は、抗原に特異的に結合する）は、１つ以上の異種分子の１つ以上の成分、モチーフ、セクション、パート、ドメイン、断片などを用いて組み換えることができる。

【0118】

さらに、抗体又はその断片は、精製を容易にするために、マーカー配列、例えばペプチドに融合され得る。特定の実施形態では、マーカーアミノ酸配列は、ヘキサ－ヒスチジンペプチド、例えば、特にｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，Ｃａｌｉｆ．，９１３１１）において提供されるタグであり、その多くは市販品として入手可能である。Ｇｅｎｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８２１－８２４に記載されるように、例えば、ヘキサ－ヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な精製を提供する。精製に有用な他のペプチドタグには、限定はされないが、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピトープに対応する赤血球凝集素「ＨＡ」タグ（Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｃｅｌｌ ３７：７６７）及び「フラグ」タグが含まれる。

【0119】

他の実施形態では、本明細書に開示される改変抗体又はその類似体若しくは誘導体は、診断用又は検出可能な薬剤にコンジュゲートされる。このような抗体は、特定の治療の効力を決定するなどの臨床検査手順の一部として、癌の発症又は進行をモニター又は予知するために有用であり得る。このような診断及び検出は、限定はされないが、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ－ガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼなど（限定はされない）の種々の酵素；ストレプトアビジン／ビオチン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎｌｂｉｏｔｉｎ）及びアビジン／ビオチンなど（限定はされない）の補欠分子族；ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙｎａｔｅ）、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド又はフィコエリトリンなど（限定はされない）の蛍光材料；ルミノールなど（限定はされない）の発光材料；ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びエクオリンなど（限定はされない）の生物発光材料；ヨウ素（^１３１Ｉ、^１２５Ｉ、^１２３Ｉ、^１２１Ｉ）、炭素（^１４Ｃ）、硫黄（^３５Ｓ）、トリチウム（^３Ｈ）、インジウム^１１５Ｉｎ、^１１３Ｉｎ、^１１２Ｉｎ、^１１１Ｉｎ）、及び及びテクネチウム（^９９Ｔｃ）、タリウム（^２０１Ｔｉ）、ガリウム（^６８Ｇａ、^６７Ｇａ）、パラジウム（^１０３Ｐｄ）、モリブデン（^９９Ｍｏ）、キセノン（_１３３Ｘｅ）、フッ素（^１８Ｆ）、^１５３Ｓｍ、^１７７Ｌｕ、^１５９Ｇｄ、^１４９Ｐｍ、^１４０Ｌａ、^１７５Ｙｂ、^１６６Ｈｏ、^９０Ｙ、^４７Ｓｃ、^１８６Ｒｅ、^１８８Ｒｅ、^１４２Ｐｒ、^１０５Ｒｈ、^９７Ｒｕ、^６８Ｇｅ、^５７Ｃｏ、^６５Ｚｎ、^８５Ｓｒ、^３２Ｐ、^１５３Ｇｄ、^１６９Ｙｂ、^５１Ｃｒ、^５４Ｍｎ、^７５Ｓｅ、^１１３Ｓｎ、及び^１１７スズなど（限定はされない）の放射性材料；種々の陽電子放出断層撮影を用いる陽電子放出金属、非放射性（ｎｏｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ）常磁性金属イオン、並びに放射標識されるか又は特定の放射性同位体にコンジュゲートされた分子を含む、検出可能な物質に抗体をカップリングさせることによって達成することができる。

【0120】

治療薬にコンジュゲートされた本明細書に開示される改変抗体又はその断片の使用も企図される。抗体又はその断片は、細胞毒（例えば、細胞分裂阻害剤又は細胞破壊剤）、治療薬又は放射性金属イオン（例えば、アルファ－放射体）などの治療的部分にコンジュゲートされ得る。細胞毒又は細胞毒性薬は、細胞にとって有害な任意の薬剤を含む。例としては、リボヌクレアーゼ、モノメチルオーリスタチンＥ及びＦ、パクリタキセル、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ ａｎｔｈｒａｃｉｎ ｄｉｏｎｅ）、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１－デヒドロテストステロン（ｄｅｈｙｄｒｏｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ）、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン、エピルビシン、及びシクロホスファミド、並びにそれらの類似体又は相同体が挙げられる。治療薬には、限定はされないが、代謝拮抗薬（例えば、メトトレキサート、６－メルカプトプリン、６－チオグアニン、シタラビン、５－フルオロウラシルデカルバジン（ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ））、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパクロラムブシル（ｔｈｉｏｅｐａ ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、メルファラン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）及びロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロトスフアミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、並びにシスジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前は、ダウノマイシン）及びドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前は、アクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、及びアントラマイシン（ＡＭＣ））、及び抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチン及びビンブラスチン）が含まれる。治療的部分のより広範なリストは、参照によって本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開国際公開第０３／０７５９５７号パンフレットにおいて見出すことができる。

【0121】

さらに、抗体又はその断片は、所与の生物学的応答を修飾する治療薬又は薬物部分にコンジュゲートされ得る。治療薬又は薬物部分は、古典的な化学的治療薬に限定されると解釈されてはならない。例えば、薬物部分は、所望の生物活性を有するタンパク質又はポリペプチであり得る。このようなタンパク質は、例えば、アブリン、リシンＡ、オンコナーゼ（Ｏｎｃｏｎａｓｅ）（又は別の細胞傷害性ＲＮａｓｅ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素、コレラ毒素、若しくはジフテリア毒素などの毒素；腫瘍壊死因子、α－インターフェロン、β－インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、アポトーシス剤、例えば、ＴＮＦ－α、ＴＮＦ－β、ＡＩＭ Ｉ（国際公開第９７／３３８９９号パンフレットを参照のこと）、ＡＩＭ ＩＩ（国際公開第９７／３４９１１号パンフレットを参照のこと）、Ｆａｓリガンド（Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６：１５６７）、及びＶＥＧＩ（国際公開第９９／２３１０５号パンフレットを参照のこと）、血栓剤若しくは抗血管新生薬、例えば、アンジオスタチン若しくはエンドスタチンなどのタンパク質；又は、例えば、リンホカイン（例えば、インターロイキン－１（「ＩＬ－１」）、インターロイキン－２（「ＩＬ－２」）、インターロイキン－６（「ＩＬ－６」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ－ＣＳＦ」）、及び顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ－ＣＳＦ」））、若しくは成長因子（例えば、成長ホルモン（「ＧＨ」））などの生物学的応答調節物質を含み得る。

【0122】

さらに、抗体は、放射性金属イオン（例えば、上記の放射性材料を参照のこと）をコンジュゲートするのに有用な放射性材料又は大環状キレート剤などの治療的部分にコンジュゲートさせることができる。特定の実施形態では、大環状キレート剤は１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”－四酢酸（ＤＯＴＡ）であり、これは、リンカー分子を介して抗体に接続され得る。このようなリンカー分子は当技術分野において一般的に知られており、Ｄｅｎａｒｄｏ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４：２４８３；Ｐｅｔｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１０：５５３；及びＺｉｍｍｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２６：９４３に記載されている。

【0123】

治療的部分を抗体及び関連分子にコンジュゲートさせるための技術は周知である。この部分は、限定はされないが、アルデヒド／シッフ連結、スルフィドリル（ｓｕｌｐｈｙｄｒｙｌ）連結、酸に不安定な連結、ｃｉｓ－アコチニル連結、ヒドラゾン連結、酵素分解可能な連結を含む、当技術分野において既知の任意の方法によって、抗体にコンジュゲートされ得る（一般的に、Ｇａｒｎｅｔｔ，２００２，Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ ５３：１７１を参照のこと）。治療的部分を抗体にコンジュゲートさせるための技術はよく知らており、例えば、Ａｒｎｏｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｏｆ Ｄｒｕｇｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ”，ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｒｅｉｓｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．２４３－５６（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９８５）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ”，ｉｎ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（２ｎｄ Ｅｄ．），Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．６２３－５３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．１９８７）；Ｔｈｏｒｐｅ，“Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｒｒｉｅｒｓ Ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｇｅｎｔｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ”，ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐｉｎｃｈｅｒａ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．４７５－５０６（１９８５）；“Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｕｓｅ Ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ”，ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂａｌｄｗｉｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．３０３－１６（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９８５）、及びＴｈｏｒｐｅ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２：１１９を参照されたい。

【0124】

抗体及び関連分子をポリペプチド部分に融合又はコンジュゲートさせるための方法は、当技術分野において知られている。例えば、米国特許第５，３３６，６０３号明細書；同第５，６２２，９２９号明細書；同第５，３５９，０４６号明細書；同第５，３４９，０５３号明細書；同第５，４４７，８５１号明細書、及び同第５，１１２，９４６号明細書；ＥＰ３０７，４３４号明細書；ＥＰ３６７，１６６号明細書；ＰＣＴ公開国際公開第９６／０４３８８号パンフレット及び国際公開第９１／０６５７０号パンフレット；Ａｓｈｋｅｎａｚｉ ｅｔ ａｌ．，１９９１，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８８：１０５３５；Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊ ｌｍｍｕｎｏｌ １５４：５５９０；並びにＶｉｌ ｅｔ ａｌ．，１９９２，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８９：１１３３７を参照されたい。部分への抗体の融合は、必ずしも直接的でなくてもよく、リンカー配列を介して行われてもよい。このようなリンカー分子は当技術分野において一般的に知られており、Ｄｅｎａｒｄｏ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ４：２４８３；Ｐｅｔｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ １０：５５３；Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ ２６：９４３；Ｇａｒｎｅｔｔ，２００２，Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ ５３：１７１に記載されている。

【0125】

また抗体は、固体支持体に結合されていてもよく、これは、標的抗原のイムノアッセイ又は精製のために特に有用である。このような固体支持体は、限定はされないが、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル又はポリプロピレンを含む。

【0126】

改変抗体（例えば、本明細書に開示されるもののいずれか）にコンジュゲートされる治療的部分又は薬物は、対象における特定の障害に対して所望の予防又は治療効果を達成するように選択されるべきである。臨床医又は他の医療関係者は、どの治療的部分又は薬物を改変抗体にコンジュゲートさせるかを決定する際に、以下の：疾患の性質、疾患の重症度、及び対象の状態を考慮するべきである。

【0127】

Ｂ．ポリヌクレオチド
本明細書に開示される組成物及び方法の別の態様は、本明細書に開示される改変抗体のいずれかなどの改変抗体をコードするポリヌクレオチド又は核酸配列である。

【0128】

プロモーター；シグナル配列をコードする第１のＤＮＡ分子；担体タンパク質をコードする第２のＤＮＡ分子；抗体（例えば、重鎖及び／又は軽鎖）又はその機能性断片をコードする第３のＤＮＡ分子を作動可能な連結状態で含む、上記で開示される改変抗体をコードする融合ＤＮＡ構築物が、本明細書で提供される。融合ＤＮＡ構築物の構成要素は、あらゆる順序で存在することができる。遺伝暗号は、公知であるので、これらの核酸の設計及び産生は、本明細書に開示される改変抗体の説明を前提とすると、十分に当技術分野の範囲内である。ある種の実施形態では、核酸は、特定の宿主細胞中での改変抗体の発現のためにコドン最適化することができる。例えば哺乳類細胞及び糸状菌の多くの種について、コドン使用表が利用可能であるので、対象改変抗体をコードするコドン最適化された核酸の設計及び産生は、十分に当技術分野の範囲内であろう。

【0129】

Ｃ．プロモーター
宿主細胞（例えば、糸状菌宿主細胞）における核酸の転写を誘導するのに適したプロモーターの例は、コウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、リゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテイナーゼ、クロカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）中性アルファ－アミラーゼ、クロカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）酸安定性アルファ－アミラーゼ（Ｋｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ（１９９０）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ １７：２０３－２１２；Ｇｉｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｇｅｎｅ ７９：１０７－１１７）、クロカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）又はアワモリコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）グルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）（Ｎｕｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，（１９８４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．４：２３０６－２３１５；Ｂｏｅｌ Ｅ．ｅｔ ａｌ．，（１９８４）ＥＭＢＯ Ｊ．３：１５８１－１５８５）、リゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）リパーゼ、コウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）アルカリ性プロテアーゼ、コウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）トリオースリン酸イソメラーゼ、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）アセトアミダーゼ（Ｈｙｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：１４３０－１４３９）、フザリウム・ベネナタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）アミログルコシダーゼ、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）トリプシン様プロテアーゼ（国際公開第９６／００７８７号パンフレット）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）セロビオヒドロラーゼＩ（Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８４）ＥＰＡ ＥＰＯ ０１３７２８０）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）セロビオヒドロラーゼＩＩ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩＩ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩＩＩ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩＶ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＶ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）キシラナーゼＩ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）キシラナーゼＩＩ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）ベータ－キシロシダーゼに対する遺伝子から得られるプロモーター、並びにＮＡ２－ｔｐｉプロモーター（クロカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）中性アルファ－アミラーゼとコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）トリオースリン酸イソメラーゼに対する遺伝子由来のプロモーターのハイブリッド）；並びにその変異、切断型、及びハイブリッドプロモーターである。Ｙｅｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：１４７０－１４７４；Ｍｕｌｌａｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，（１９８５）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９９：３７－４５；Ｌｏｃｋｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｇｅｎｅ ３３：１３７－１４９；Ｍａｃｋｎｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｃｅｌｌ ４６：１４３－１４７；Ｈｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３：１４３０－１４３９も参照されたい。より高等な真核生物プロモーター、例えばＳＶ４０初期プロモーター（Ｂａｒｃｌａｙ ｅｔ ａｌ（１９８３）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３：２１１７－２１３０）も有用であり得る。プロモーターは、恒常的又は誘導性プロモーターであり得る。例示的なプロモーターとしては、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）セロビオヒドロラーゼＩ又はＩＩ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩ、ＩＩ又はＩＩＩ、及びトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）キシラナーゼＩＩが挙げられる。

【0130】

Ｄ．ベクター
本明細書に開示される改変抗体のいずれかをコードするポリヌクレオチドは、ベクター、例えば、ファージ、プラスミド、ウイルス、又はレトロウイルスベクター中に存在することができる。ある種の実施形態では、ベクターは、糸状菌細胞において対象融合ポリペプチドを発現させるための発現ベクターであり得る。

【0131】

組換え型のタンパク質の発現のためのベクターは、当技術分野で周知である（Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ，Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９５；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）。

【0132】

融合ＤＮＡ構築物は、例えばその開示が参照によって本明細書に組み込まれる欧州特許出願公開第０２１５５９４号明細書に概ね記載されているのと同様に、周知の技術を使用して構築することができる。

【0133】

対象となるポリペプチド（例えば免疫グロブリン）をコードする天然又は合成のポリヌクレオチド断片を、宿主細胞（例えば、糸状菌宿主細胞）への導入及び宿主細胞中での複製を可能にする異種の核酸構築物又はベクターに組み込むことができる。

【0134】

ＤＮＡ構築物、より具体的には融合ＤＮＡ構築物が作製されたら、これを、当技術分野で公知であるような、あらゆる数のベクターに組み込むことができる。ＤＮＡ構築物は、いくつかの実施形態では、プロモーター配列を含むこととなるが、他の実施形態では、ベクターが、形質転換されることとなる宿主において機能性の他の調節配列、例えば、リボソーム結合部位、転写開始及び停止配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化シグナル、エンハンサー、及び／又はアクチベーターを含むこととなる。いくつかの実施形態では、改変抗体をコードするポリヌクレオチドは、プロモーター、シグナル配列、及び担体タンパク質を含むベクターの適切な制限エンドヌクレアーゼ部位に、標準の手順によって挿入される。こうした手順及び関連のサブクローニング手順は、当業者の知識の範囲内であるとみなされる。

【0135】

転写を終結させるための、発現宿主によって認識されるターミネーター配列は、発現されることとなる改変抗体をコードする融合ＤＮＡ構築物の３’末端に作動可能に連結させることができる。当業者は、糸状菌などの宿主細胞と共に使用することができる様々なターミネーター配列をよく知っている。非限定的な例としては、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）ｔｒｐＣ遺伝子（Ｙｅｌｔｏｎ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：１４７０－１４７４）由来のターミネーター、又はクロカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ遺伝子（Ｎｕｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２３０６－２３５３）由来のターミネーター、又はトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）セロビオヒドロラーゼＩ遺伝子由来のターミネーターが挙げられる。

【0136】

ポリアデニル化配列は、転写されたものが発現宿主によって認識された場合に、転写されたｍＲＮＡにポリアデノシン残基を付加するＤＮＡ配列である。例としては、Ａ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）ｔｒｐＣ遺伝子（Ｙｅｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１；１４７０－１４７４）；クロカビ（Ａ．ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ遺伝子（Ｎｕｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２３０６－２３１５）；コウジカビ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）又はクロカビ（Ａ．ｎｉｇｅｒ）アルファアミラーゼ遺伝子、及びリゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）カルボキシルプロテアーゼ遺伝子由来のポリアデニル化配列が挙げられる。

【0137】

さらなる実施形態では、融合ＤＮＡ構築物、又は融合ＤＮＡ構築物を含むベクターは、形質転換された宿主細胞の選択を可能にする選択可能マーカー遺伝子を含有することとなる。選択マーカー遺伝子は、当技術分野で周知であり、使用される宿主細胞と共に変化することとなる。選択可能マーカーの例としては、限定はされないが、抗菌薬耐性を与えるもの（例えば、ハイグロマイシン、ブレオマイシン、クロラムフェニコール、及びフレオマイシン）が挙げられる。栄養選択マーカーなどの代謝的優位性を与える遺伝子も使用することができる。これらのマーカーのある種のものとして、ａｍｄＳが挙げられる。また、栄養要求性の欠陥を補完する遺伝子をコードする配列も、選択マーカーとして使用することができる（例えばｐｙｒ４欠損Ａ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アワモリコウジカビ（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ）、又はトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）のｐｙｒ４補完、及びａｒｇＢ欠損株のａｒｇＢ補完）。Ｋｅｌｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（１９８５）ＥＭＢＯ Ｊ．４：４７５－４７９；Ｐｅｎｔｔｉｌａ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｇｅｎｅ ６１：１５５－１６４、及びＫｉｎｇｈｏｒｎ ｅｔ ａｌ（１９９２）Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ Ｆｕｎｇｉ，Ｂｌａｃｋｉｅ Ａｃａｄｅｍｉｃ ａｎｄ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ，Ｃｈａｐｍａｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ，Ｌｏｎｄｏｎ（そのそれぞれの開示が参照によって本明細書に組み込まれる）を参照されたい。

【0138】

Ｅ．宿主細胞
発現カセット又はベクターは、改変抗体をコードする対応するポリヌクレオチドをその後発現する好適な発現宿主細胞に導入することができる。

【0139】

好適な宿主細胞としては、あらゆる微生物の細胞（例えば、細菌、原生生物、藻類、真菌（例えば、酵母若しくは糸状菌）、又は他の微生物の細胞）が挙げられ、また、好適な宿主細胞は、細菌、酵母、又は糸状菌の細胞であり得る。真菌の発現宿主は、例えば、エタノール源（ｅｔｈａｎｏｌｏｇｅｎ）としての役割を果たすこともできる酵母であり得る。適したものはまた、マウス（例えば、ＮＳ０）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、又はベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞株などの、哺乳類の発現宿主である。昆虫細胞又はウイルス発現系（例えば、Ｍ１３、Ｔ７ファージ、又はラムダなどのバクテリオファージ、又はバキュロウイルスなどのウイルス）などの他の真核生物宿主も、ポリペプチドを産生するために適している。

【0140】

好適な細菌の属の宿主細胞には、限定はされないが、大腸菌属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラルストニア属（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、及びストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）の細胞が含まれる。好適な細菌の種の細胞には、限定はされないが、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・スタッツェリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｅｉ）、スタフィロコッカス・カルノーサス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｒｎｏｓｕｓ）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、及びストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）の細胞が含まれる。

【0141】

好適な酵母の属の宿主細胞には、限定はされないが、サッカロミケス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、クリベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、及びファフィア属（Ｐｈａｆｆｉａ）の細胞が含まれる。好適な酵母の種の細胞には、限定はされないが、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、Ｐ．カナデンシス（Ｐ．ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）、クリベロミセス・マルキシアナス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、及びファフィア・ロドジマ（Ｐｈａｆｆｉａ ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）の細胞が含まれる。

【0142】

好適な糸状菌の宿主細胞には、すべての糸状形態の真菌亜門（ｓｕｂｄｉｖｉｓｉｏｎ Ｅｕｍｙｃｏｔｉｎａ）が含まれる。好適な糸状菌属の細胞には、限定はされないが、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、コウジカビ属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、オーレオバシディウム属（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、ブエルカンデラ属（Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ）、セリポリオプシス属（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ）、クリソスポリウム属（Ｃｈｒｙｓｏｐｏｒｉｕｍ）、ヒトヨタケ属（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）、カワラタケ属（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ）、コリナスクス属（Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ）、ケトミウム属（Ｃｈａｅｒｔｏｍｉｕｍ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、フィロバシディウム属（Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、ジベレラ属（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ）、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、マグナポルテ属（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、ケカビ属（Ｍｕｃｏｒ）、マイセリオフトラ属（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ケカビ属（Ｍｕｃｏｒ）、ネオカリマスティクス属（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）、アカパンカビ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペシロマイセス属（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、アオカビ属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ファネロカエテ属（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）、フレビア属（Ｐｈｌｅｂｉａ）、ピロミセス属（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、ヒラタケ属（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ）、スキタリジウム属（Ｓｃｙｔａｌｄｉｕｍ）、スエヒロタケ属（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、スポロトリクム属（Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ）、タラロミセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、タラロミセス属（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、ティエラビア属（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、ホウロクタケ属（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）、及びトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の細胞が含まれる。

【0143】

好適な糸状菌種の細胞には、限定はされないが、アワモリコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・フォエティダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・ジャポニクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、クロカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、コウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、クリソスポリウム・ルクノウェンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、フザリウム・バクトリジオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・セレアリス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｅｒｅａｌｉｓ）、フザリウム・クルックウェレンセ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ）、フザリウム・クルモラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フザリウム・グラミネアラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フザリウム・グラミヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｕｍ）、フザリウム・ヘテロスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・ネグンジ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｎｅｇｕｎｄｉ）、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・レチクラタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、フザリウム・ロゼウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ）、フザリウム・サンブシヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ）、フザリウム・サルコクロウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓａｒｃｏｃｈｒｏｕｍ）、フザリウム・スポロトリキオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・スルフレウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｍ）、フザリウム・トルロスム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｓｕｍ）、フザリウム・トリコセキオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・ベネナタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、ブエルカンデラ・アズスタ（Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ ａｄｕｓｔａ）、セリポリオプシス・アネイリナ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ａｎｅｉｒｉｎａ）、セリポリオプシス・アネイリナ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ａｎｅｉｒｉｎａ）、セリポリオプシス・カレギエア（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ｃａｒｅｇｉｅａ）、セリポリオプシス・ギルベセンス（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ｇｉｌｖｅｓｃｅｎｓ）、セリポリオプシス・パノシンタ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ｐａｎｎｏｃｉｎｔａ）、セリポリオプシス・リブロサ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ｒｉｖｕｌｏｓａ）、セリポリオプシス・スブルファ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ｓｕｂｒｕｆａ）、セリポリオプシス・サブバーミスポラ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ－ｓｕｂｖｅｒｍｉｓｐｏｒａ）、ネナガヒトヨタケ（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ ｃｉｎｅｒｅｕｓ）、アラゲカワラタケ（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ ｈｉｒｓｕｔｕｓ）、フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、フミコラ・ラヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）、ムコール・ミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）、マイセリオフトラ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、ニューロスポラ・インターメディア（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、ペニシリウム・プルプロゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ・ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ）、ペニシリウム・カネセンス（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃａｎｅｓｃｅｎｓ）、ペニシリウム・ソリタム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｏｌｉｔｕｍ）、ペニシリウム・フニクロスム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ）、白色腐朽菌（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、フレビア・ラジエート（Ｐｈｌｅｂｉａ ｒａｄｉａｔｅ）、エリンギ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｅｒｙｎｇｉｉ）、タラロミセス・フラバス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ－ｆｌａｖｕｓ）、ティエラビア・テレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、フルイカワラタケ（Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｖｉｌｌｏｓａ）、カワラタケ（Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）、トリコデルマ・ハルチアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・コニンギ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トトリコデルマ・ロンギブラキアタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、及びトリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ）の細胞が含まれる。

【0144】

対象となるある特定の宿主における分泌されるタンパク質に関連するプロモーター及び／又はシグナル配列は、その宿主又は他の宿主における改変抗体の異種産生及び分泌に使用するための候補である。非限定的な例として、糸状菌系では、セロビオヒドロラーゼＩ（ｃｂｈ１）、グルコアミラーゼＡ（ｇｌａＡ）、ＴＡＫＡ－アミラーゼ（ａｍｙＡ）、キシラナーゼ（ｅｘｌＡ）、ｇｐｄＡ－プロモーターｃｂｈ１、ｃｂｈｌｌ、エンドグルカナーゼ遺伝子ｅｇ１－ｅｇ５、Ｃｅｌ６１Ｂ、Ｃｅｌ７４Ａ、ｇｐｄプロモーター、Ｐｇｋ１、ｐｋｉ１、ＥＦ－１アルファ、ｔｅｆ１、ｃＤＮＡ１、及びｈｅｘ１に対する遺伝子を駆動するプロモーターが適しており、たくさんの様々な微生物（例えば、クロカビ（Ａ．ｎｉｇｅｒ）、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）、コウジカビ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）、アワモリコウジカビ（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ）、Ａ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ））から得ることができる。

【0145】

いくつかの実施形態では、改変抗体をコードするポリヌクレオチドは、細胞外（又はペリプラズム）空間への組換え型ポリペプチドの分泌をもたらす好適な相同又は異種シグナル配列をコードするポリヌクレオチドと組換えによって結合され、それによって、細胞上清（又はペリプラズム空間若しくはライセート）における直接的な検出が可能になる。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、他のグラム陰性細菌、及び当技術分野で公知の他の微生物に適したシグナル配列には、ＨｌｙＡ、ＤｓｂＡ、Ｐｂｐ、ＰｈｏＡ、ＰｅｌＢ、ＯｍｐＡ、ＯｍｐＴ、又はＭ１３ファージＧｉｌｌ遺伝子の発現を駆動するものが含まれる。枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、グラム陽性微生物、及び当技術分野で公知の他の微生物については、好適なシグナル配列には、さらに、ＡｐｒＥ、ＮｐｒＢ、Ｍｐｒ、ＡｍｙＡ、ＡｍｙＥ、Ｂｌａｃ、ＳａｃＢの発現を駆動するものが含まれ、出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）又は他の酵母については、キラー毒素、Ｂａｒ１、Ｓｕｃ２、接合因子アルファ、Ｉｎｕ１Ａ、又はＧｇｐｌｐシグナル配列が含まれる。シグナル配列は、いくつかのシグナルペプチダーゼによって切断する、したがって、発現されたタンパク質のその他の部分から除去することができる。

【0146】

いくつかの実施形態では、改変抗体は、単独で、又はＮ又はＣ末端に位置する追加のペプチド、タグ、又はタンパク質（例えば、６ＸＨｉｓ、ＨＡ、又はＦＬＡＧタグ）との融合体として発現される。好適な融合体は、アフィニティ精製又は検出を容易にするタグ、ペプチド、又はタンパク質（例えば、６ＸＨｉｓ、ＨＡ、キチン結合タンパク質、チオレドキシン、又はＦＬＡＧタグ）、並びに標的ベータ－グルコシダーゼの発現、分泌、又はプロセシングを容易にするものを含む。ＫＥＸ２に加えて、さらなる好適なプロセシング部位には、エンテロキナーゼ、ＳＴＥ１３、又はインビボ又はインビトロでの切断のための当技術分野で公知の他のプロテアーゼ切断部位が含まれる。

【0147】

改変抗体をコードするポリヌクレオチドは、限定はされないが、電気穿孔法、脂質媒介性の形質転換又は遺伝子導入（「リポフェクション」）、化学的に媒介される遺伝子導入（例えば、ＣａＣｌ及び／又はＣａＰ）、酢酸リチウム媒介性の（例えば、宿主－細胞プロトプラストの）形質転換、微粒子銃「遺伝子銃」形質転換、ＰＥＧ媒介性の（例えば、宿主－細胞プロトプラストの）形質転換、プロトプラスト融合（例えば、細菌又は真核生物のプロトプラストを使用する）、リポソーム媒介性形質転換、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）、アデノウイルス若しくは他のウイルス、又はファージ形質転換又は形質導入を含めた、いくつかの形質転換方法によって、発現宿主細胞に導入することができる。

【0148】

ＩＩＩ．方法
Ａ．抗体を生成するための方法
本明細書に開示される改変抗体（すなわち、上記のような修飾ヒンジを組み込んだ抗体）は、抗体の合成のために当技術分野において既知の任意の方法、特に、化学合成又は組換え発現技術によって産生され得る。

【0149】

特定の抗原を認識するポリクローナル抗体は、当技術分野において周知の種々の手順によって産生され得る。例えば、限定はされないが、ウサギ、マウス、ラットなどを含む種々の宿主動物に、抗原又はその免疫原性断片が投与されて、抗原に特異的なポリクローナル抗体を含有する血清の産生を誘発することができる。宿主種に応じて免疫学的応答を増大させるために、種々のアジュバントが使用されてもよく、限定はされないが、フロイント（完全及び不完全）、ミネラルゲル、例えば、水酸化アルミニウム、界面活性物質、例えば、リゾレシチン、プルロニック（登録商標）ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルション、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、並びに潜在的に有用なヒトアジュバント、例えば、ＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）及びコリネバクテリウム・パルブム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）が含まれる。このようなアジュバントも当技術分野において周知である。

【0150】

モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え体、及びファージディスプレイ技術、又はこれらの組み合わせの使用を含む、当技術分野において既知の様々な種類の技術を用いて作製することができる。例えば、モノクローナル抗体は、当技術分野において既知のものを含むハイブリドーマ技術を用いて産生され、例えば、Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ ｅｄ．１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ、ｅｔ ａｌ．，ｉｎ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ５６３－６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８１）において教示され得る。本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマ技術を介して産生される抗体に限定されない。用語「モノクローナル抗体」は、それが産生される方法ではなく、あらゆる真核生物、原核生物、又はファージクローンを含む単一クローンに由来する抗体を指す。

【0151】

ハイブリドーマ技術を用いた特異的抗体の産生及びスクリーニングのための方法はルーチン的であり、当技術分野において周知である。簡単には、マウスを抗原又はその免疫原性断片により免疫化することができ、免疫応答が検出されたら、例えば、投与された抗原に特異的な抗体がマウス血清中で検出されたら、マウス脾臓が摘出され、脾細胞が単離される。次に、脾細胞は、周知の技術によって、任意の適切な骨髄腫細胞、例えば、ＡＴＣＣから入手可能な細胞株ＳＰ２０からの細胞に融合される。さらに、ＲＩＭＭＳ（反復免疫化、複数部位）技術を使用して、動物を免疫化することができる（Ｋｉｌｐａｔｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １６：３８１－９）。ハイブリドーマが選択され、限定希釈によってクローニングされる。次に、ハイブリドーマクローンは、当技術分野において既知の方法によって、本発明のポリペプチドに結合することができる抗体を分泌する細胞についてアッセイされる。陽性ハイブリドーマクローンによりマウスを免疫化することによって、高レベルの抗体を通常含有する腹水を生成することができる。

【0152】

したがって、モノクローナル抗体は、抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を培養することによって生成することができ、ここで、ハイブリドーマは、抗原又はその免疫原性断片で免疫化したマウスから単離された脾細胞を骨髄腫細胞と融合させてから、投与された抗原に結合することができる抗体を分泌するハイブリドーマクローンについて、融合物から得られるハイブリドーマをスクリーニングすることによって生成され得る。

【0153】

本明細書に開示される改変抗体は、さらに、そのヒンジ領域に新規のアミノ酸残基を含有することができる。改変抗体は、当業者に周知の多数の方法によって生成され得る。非限定的な例としては、抗体コード領域（例えば、ハイブリドーマ由来）を単離し、単離した抗体コード領域に本発明の１つ以上のヒンジ修飾を導入することが挙げられる。或いは、可変領域は、修飾ヒンジ領域（例えば、本明細書に開示されるもののいずれか）をコードするベクターにサブクローニングされ得る。付加的な方法及び詳細は以下に提供される。

【0154】

特異的抗原を認識する抗体断片は、当業者に知られている任意の技術によって生成され得る。例えば、本発明のＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片は、パパイン（Ｆａｂ断片をもたらす）又はペプシン（Ｆ（ａｂ’）２断片をもたらす）などの酵素を用いて、免疫グロブリン分子のタンパク質分解的切断によって産生され得る。Ｆ（ａｂ’）２断片は、可変領域、軽鎖定常領域及び重鎖のＣＨ１ドメインを含有する。さらに、本明細書に開示される改変抗体は、当技術分野において既知の種々のファージディスプレイ法を用いて生成することもできる。

【0155】

ファージディスプレイ法において、機能性抗体ドメインは、それをコードするポリヌクレオチド配列を保有するファージ粒子の表面に提示される。特に、ＶＨ及びＶＬドメインをコードするＤＮＡ配列は、動物ｃＤＮＡライブラリー（例えば、リンパ系組織のヒト又はマウスｃＤＮＡライブラリー）から増幅される。ＶＨ及びＶＬドメインをコードするＤＮＡは、ＰＣＲによって、ｓｃＦｖリンカーと共に組み換えられ、ファージミドベクター（例えば、ｐＣＡＮＴＡＢ６又はｐＣｏｍｂ３ＨＳＳ）にクローニングされる。ベクターは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に電気穿孔され、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）はヘルパーファージに感染される。これらの方法で使用されるファージは、通常、ｆｄ及びＭ１３を含む繊維状ファージであり、ＶＨ及びＶＬドメインは、一般に、ファージ遺伝子ＩＩＩ又は遺伝子ＶＩＩＩのいずれかに組換えで融合される。対象となる抗原エピトープに結合する抗原結合ドメインを発現するファージは、例えば、標識抗原、又は固体表面若しくはビーズに結合若しくは捕獲された抗原を用いて、抗原により選択又は同定され得る。本明細書に開示される改変抗体を作るために使用可能なファージディスプレイ法の例としては、Ｂｒｉｎｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８２：４１－５０；Ａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８４：１７７－１８６；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：９５２－９５８；Ｐｅｒｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｇｅｎｅ １８７：９－１８；Ｂｕｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５７：１９１－２８０；ＰＣＴ公開国際公開第９０／０２８０９号パンフレット、国際公開第９１／１０７３７号パンフレット、国際公開第９２／０１０４７号パンフレット、国際公開第９２／１８６１９号パンフレット、国際公開第９３／１１２３６号パンフレット、国際公開第９５／１５９８２号パンフレット、国際公開第９５／２０４０１号パンフレット、及び国際公開第９７／１３８４４号パンフレット；並びに米国特許第５，６９８，４２６号明細書、同第５，２２３，４０９号明細書、同第５，４０３，４８４号明細書、同第５，５８０，７１７号明細書、同第５，４２７，９０８号明細書、同第５，７５０，７５３号明細書、同第５，８２１，０４７号明細書、同第５，５７１，６９８号明細書、同第５，４２７，９０８号明細書、同第５，５１６，６３７号明細書、同第５，７８０，２２５号明細書、同第５，６５８，７２７号明細書、同第５，７３３，７４３号明細書、及び同第５，９６９，１０８号明細書に開示されるものが挙げられる。

【0156】

上記の参考文献に記載されるように、ファージ選択の後、ファージからの抗体コード領域を単離し、ヒト抗体を含む全抗体又は任意の他の所望の抗原結合断片を生成するために使用し、例えば以下に記載されるように、哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、及び細菌を含む任意の所望の宿主において発現させることが可能である。また、国際公開第９２／２２３２４号パンフレット；Ｍｕｌｌｉｎａｘ ｅｔ ａｌ．，１９９２，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １２（６）：８６４－８６９；Ｓａｗａｉ ｅｔ ａｌ．，１９９５，ＡＪＲＩ ３４：２６－３４；及びＢｅｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１－１０４３に開示されるものなど、当技術分野において既知の方法を用いて、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２断片を組換えで産生させるための技術も使用することができる。

【0157】

全抗体を生成するために、ＶＨ又はＶＬヌクレオチド配列、制限部位、及び制限部位を保護するためのフランキング配列を含むＰＣＲプライマーを使用して、ｓｃＦｖクローンにおいてＶＨ又はＶＬ配列を増幅させることができる。当業者に知られているクローニング技術を利用して、ＰＣＲ増幅ＶＨドメインをＶＨ定常領域、例えば、ヒトガンマ定常領域を発現するベクターにクローニングすることができ、ＰＣＲ増幅ＶＬドメインをＶＬ定常領域、例えば、ヒトカッパ又はラムダ定常領域を発現するベクターにクローニングすることができる。定常領域は、修飾ヒンジ（例えば、本明細書に開示される修飾ヒンジのいずれか）を含むことが企図される。特定の実施形態では、ＶＨ又はＶＬドメインを発現させるためのベクターは、プロモーター、分泌シグナル、可変及び定常ドメインの両方のためのクローニング部位、並びにネオマイシンなどの選択マーカーを含む。またＶＨ及びＶＬドメインは、所望の定常領域を発現する１つのベクターにクローニングされてもよい。次に、重鎖転換ベクター及び軽鎖転換ベクターは、当業者に知られている技術を用いて、全長抗体、例えばＩｇＧを発現する安定な又は一過性の細胞株を生成するために、細胞株に同時導入される。

【0158】

キメラ抗体は、抗体の異なる部分が異なる免疫グロブリン分子に由来する分子である。キメラ抗体を産生するための方法は、当技術分野において知られている。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２；Ｏｉ ｅｔ ａｌ．，１９８６，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４；Ｇｉｌｌｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １２５：１９１－２０２；並びに米国特許第５，８０７，７１５号明細書、同第４，８１６，５６７号明細書、同第４，８１６３９７号明細書、及び同第６，３１１，４１５号明細書を参照されたい。

【0159】

ヒトにおける抗体のインビボ使用及びインビトロ検出アッセイを含むいくつかの使用については、ヒト又はキメラ抗体を使用することが好ましいことがある。完全ヒト抗体は、ヒト対象の治療的処置のために特に望ましい。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを用いる上記のファージディスプレイ法を含む、当技術分野において既知の様々な方法によって作製され得る。米国特許第４，４４４，８８７号明細書及び同第４，７１６，１１１号明細書；並びにＰＣＴ公開国際公開第９８／４６６４５号パンフレット、国際公開第９８／５０４３３号パンフレット、国際公開第９８／２４８９３号パンフレット、国際公開第９８／１６６５４号パンフレット、国際公開第９６／３４０９６号パンフレット、国際公開第９６／３３７３５号パンフレット、及び国際公開第９１／１０７４１号パンフレットも参照されたい。

【0160】

ヒト化抗体は、所定の抗原に結合することができ、且つ実質的にヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有するフレームワーク領域と、実質的に非ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有するＣＤＲとを含む、抗体若しくはそのバリアント又はそれらの断片である。ヒト化抗体は、ＣＤＲ領域の全て又は実質的に全てが非ヒト免疫グロブリン（すなわち、ドナー抗体）のものに相当し、且つフレームワーク領域の全て又は実質的に全てがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、少なくとも１つ、通常は２つの可変ドメイン（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂｃ、Ｆｖ）の実質的に全てを含む。具体的な実施形態では、ヒト化抗体は、通常はヒト免疫グロブリンのものである免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部も含む。通常、抗体は、軽鎖と、重鎖の少なくとも可変ドメインとの両方を含有することとなる。また抗体は、重鎖のＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、及びＣＨ４領域を含み得る。ヒト化抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＥを含むあらゆるクラスの免疫グロブリン、並びにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含むあらゆるアイソタイプから選択することができる。通常、定常ドメインは、ヒト化抗体が細胞毒活性を示すことが望ましい場合には補体固定定常ドメインであり、そのクラスは通常ＩｇＧ．ｓｕｂ．１である。このような細胞毒活性が望ましくない場合、定常ドメインはＩｇＧ．ｓｕｂ．２クラスであり得る。ヒト化抗体は２つ以上のクラス又はアイソタイプからの配列を含むことができ、所望のエフェクター機能を最適化するために特定の定常ドメインを選択することは、当技術分野における通常の技能の範囲内である。親配列に正確に対応しなくてもよいヒト化抗体のフレームワーク及びＣＤＲ領域、例えば、ドナーＣＤＲ又はコンセンサスフレームワークは、少なくとも１つの残基の置換、挿入又は欠失によって、その部位のＣＤＲ又はフレームワーク残基がコンセンサス又はインポート抗体のいずれにも対応しないように変異誘発され得る。しかしながら、このような変異は広範囲には及ばないであろう。通常、ヒト化抗体残基の少なくとも７５％、より多くの場合９０％、又は９５％超は、親フレームワーク領域（ＦＲ）及びＣＤＲ配列のものに対応することとなる。ヒト化抗体は、限定はされないが、ＣＤＲグラフティング（欧州特許第２３９，４００号明細書；国際公開第９１／０９９６７号パンフレット；並びに米国特許第５，２２５，５３９号明細書、同第５，５３０，１０１号明細書、及び同第５，５８５，０８９号明細書）、ベニヤリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）又はリサーフェイシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（欧州特許第５９２，１０６号明細書及び欧州特許第５１９，５９６号明細書；Ｐａｄｌａｎ，１９９１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２８（４／５）：４８９－４９８；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ７（６）：８０５－８１４；並びにＲｏｇｕｓｋａ ｅｔ ａｌ．，１９９４，ＰＮＡＳ ９１：９６９－９７３）、チェーンシャフリング（ｃｈａｉｎ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）（米国特許第５，５６５，３３２号明細書）、並びに、例えば、米国特許第６，４０７，２１３号明細書、米国特許第５，７６６，８８６号明細書、国際公開第９３１７１０５号パンフレット、Ｔａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：１１１９－２５（２００２）、Ｃａｌｄａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１３（５）：３５３－６０（２０００）、Ｍｏｒｅａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０（３）：２６７－７９（２０００）、Ｂａｃａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（１６）：１０６７８－８４（１９９７）、Ｒｏｇｕｓｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．９（１０）：８９５－９０４（１９９６）、Ｃｏｕｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５（２３ Ｓｕｐｐ）：５９７３ｓ－５９７７ｓ（１９９５），Ｃｏｕｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５（８）：１７１７－２２（１９９５）、Ｓａｎｄｈｕ ＪＳ，Ｇｅｎｅ １５０（２）：４０９－１０（１９９４）、及びＰｅｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３５（３）：９５９－７３（１９９４）に開示される技術を含む、当技術分野において既知の様々な技術を用いて産生され得る。多くの場合、フレームワーク領域内のフレームワーク残基は、ＣＤＲドナー抗体からの対応する残基によって置換されて、抗原結合を変更、好ましくは改良することとなる。これらのフレームワーク置換は、当技術分野において周知の方法、例えば、ＣＤＲ及びフレームワーク残基の相互作用をモデリングして、抗原結合及び配列比較のために重要なフレームワーク残基を同定し、特定の位置において普通でないフレームワーク残基を同定することによって同定される（例えば、Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，５８５，０８９号明細書；及びＲｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３を参照のこと）。

【0161】

またヒト抗体は、機能性内在性免疫グロブリンを発現することはできないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現することができるトランスジェニックマウスを用いて産生され得る。例えば、ヒト重鎖及び軽鎖免疫グロブリン遺伝子複合体は、ランダムに又は相同組換えによって、マウス胚幹細胞に導入され得る。或いは、ヒト可変領域、定常領域、及び多様性領域も、ヒト重鎖及び軽鎖遺伝子に加えて、マウス胚幹細胞に導入され得る。マウス重鎖及び軽鎖免疫グロブリン遺伝子は、相同組換えによるヒト免疫グロブリン座位の導入によって、別々に又は同時に非機能性にされ得る。特に、ＪＨ領域のホモ接合型欠失は、内在性抗体産生を防止する。修飾された胚幹細胞は増殖され、胚盤胞にマイクロインジェクトされて、キメラマウスが作製される。次に、キメラマウスは繁殖され、ヒト抗体を発現するホモ接合子孫を生じさせる。トランスジェニックマウスは、通常の方法で、選択された抗原又はその免疫原性断片により免疫化される。抗原に対するモノクローナル抗体は、従来のハイブリドーマ技術を用いて、免疫化されたトランスジェニックマウスから得ることができる。トランスジェニックマウスが保持するヒト免疫グロブリン導入遺伝子はＢ細胞分化中に再配列し、続いてクラススイッチ及び体細胞変異を受ける。したがって、このような技術を用いて、治療的に有用なＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ及びＩｇＥ抗体を産生させることが可能である。ヒト抗体を産生するためのこの技術の概要については、Ｌｏｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｈｕｓｚａｒ（１９９５，Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５－９３）を参照されたい。ヒト抗体及びヒトモノクローナル抗体を産生するためのこの技術及びこのような抗体を産生するためのプロトコルの詳細な議論については、例えば、国際公開第９８／２４８９３号パンフレット、国際公開第９６／３４０９６号パンフレット、及び国際公開第９６／３３７３５号パンフレット；並びに米国特許第５，４１３，９２３号明細書、同第５，６２５，１２６号明細書、同第５，６３３，４２５号明細書、同第５，５６９，８２５号明細書、同第５，６６１，０１６号明細書、同第５，５４５，８０６号明細書、同第５，８１４，３１８号明細書、及び同第５，９３９，５９８号明細書を参照されたい。

【0162】

さらに、本明細書に開示される改変抗体は、次に、当業者に周知の技術を用いて、受容体を「模倣する」抗イディオタイプ抗体を生成するために利用することができる（例えば、Ｇｒｅｅｎｓｐａｎ ＆ Ｂｏｎａ，１９８９，ＦＡＳＥＢ Ｊ．７（５）：４３７－４４４；及びＮｉｓｓｉｎｏｆｆ，１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（８）：２４２９－２４３８を参照のこと）。例えば、そのリガンドに結合して、受容体の結合を競合的に阻害する（当技術分野において周知であり、以下に議論されるアッセイにより決定される）本発明の抗体は、リガンドを「模倣し」、結果として受容体及び／又はそのリガンドに結合して中和する抗イディオタイプを生成するために使用することができる。このような中和抗イディオタイプ又はこのような抗イディオタイプのＦａｂ断片は、リガンド及び／又はその受容体を中和するために、治療レジメンにおいて使用することができる。改変抗体又はその断片をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの使用を用いる方法が本明細書において提供される。

【0163】

一実施形態では、抗原に特異的に結合する抗体をコードするヌクレオチド配列が得られ、本明細書に開示される改変抗体を生成するために使用される。ヌクレオチド配列は、ハイブリドーマクローンＤＮＡの配列決定から得ることができる。特定の抗体又はそのエピトープ結合断片をコードする核酸を含有するクローンは入手できないが、抗体分子又はそのエピトープ結合断片の配列が分かっていれば、免疫グロブリンをコードする核酸は、化学的に合成することもできるし、或いは、適切な供給源（例えば、抗体ｃＤＮＡライブラリー、又は抗体を発現するように選択されたハイブリドーマ細胞などの抗体を発現する任意の組織若しくは細胞から作製されたｃＤＮＡライブラリー、又はその組織若しくは細胞から単離された核酸、好ましくはポリＡ＋ＲＮＡ）から、配列の３’及び５’末端にハイブリッド形成する合成プライマーを用いるＰＣＲ増幅によって、又は特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを用いてクローニングして、例えば、抗体をコードするｃＤＮＡライブラリーからのｃＤＮＡクローンを同定することによって得ることもできる。ＰＣＲにより生成された増幅核酸は次に、当技術分野において周知の任意の方法を用いて、複製可能なクローニングベクターにクローニングされ得る。

【0164】

抗体のヌクレオチド配列が決定されたら、抗体のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列の操作のために当技術分野において周知の方法、例えば、組換えＤＮＡ技術、部位特異的変異誘発、ＰＣＲなど（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ，Ｅｎｇｌａｎｄ，１９９８）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，２００１）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄ．Ｌａｎｅ，ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８８）；及びＵｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄ．Ｌａｎｅ，ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９９９）に記載される技術を参照のこと）を用いて、例えば、抗体の所望の領域に欠失、及び／又は挿入を導入することによって、異なるアミノ酸配列を有する抗体を生成するように操作され得る。

【0165】

具体的な実施形態では、ルーチン的な組換えＤＮＡ技術を用いて、ＣＤＲの１つ以上がフレームワーク領域内に挿入される。フレームワーク領域は、限定はされないが、ヒトフレームワーク領域（例えば、ヒトフレームワーク領域のリストについては、Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７８：４５７－４７９を参照のこと）を含む、天然に存在する又はコンセンサスフレームワーク領域であり得る。フレームワーク領域及びＣＤＲの組み合わせにより生成されるポリヌクレオチドは、抗原に特異的に結合する抗体をコードすることが企図される。一実施形態では、上記で議論されるように、フレームワーク領域において１つ以上のアミノ酸置換を行うことができ、特定の実施形態では、アミノ酸置換は、抗体のその抗原への結合を改良する。さらに、このような方法を使用して、１つ以上の鎖内ジスルフィド結合を欠いた抗体分子を生成するために、鎖内ジスルフィド結合に関与する１つ以上の可変領域システイン残基のアミノ酸置換又は欠失を行うことができる。ポリヌクレオチドに対する他の変更は本発明によって包含され、当技術分野の技能の範囲内である。

【0166】

このようなスクリーニング法から同定される抗体のヒンジを上記のように修飾して、修飾ヒンジ、例えば、上記で開示されたもののいずれかを組み込んだ抗体を生成することができる。さらに、本明細書に開示される改変抗体は、限定はされないが、炎症性疾患、自己免疫疾患、骨代謝関連障害、血管新生関連障害、感染、及び癌を含む、疾患、障害、感染の予防、管理及び処置に有用であることが企図される。このような抗体は、本明細書に開示される方法及び組成物において使用することができる。

【0167】

Ｂ．組換え発現
本明細書に開示される改変抗体、並びに誘導体、類似体又はその断片（例えば、本発明の抗体又は融合タンパク質）のいずれかの組換え発現は、改変抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターの構築を必要とする。改変抗体をコードするポリヌクレオチドが得られたら、当技術分野において周知の技術を用いる組換えＤＮＡ技術によって、改変抗体の産生のためのベクターを作製することができる。したがって、改変抗体をコードするヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドを発現させることによりタンパク質を作製するための方法が本明細書に記載される。当業者によく知られている方法を使用して、改変抗体コード配列並びに適切な転写及び翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、例えば、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術、及びインビボ遺伝子組換えが含まれる。

【0168】

発現ベクターは従来の技術によって宿主細胞に導入され、次に、遺伝子導入された細胞は従来の技術によって培養され、改変抗体（例えば、本明細書に開示されるもののいずれか）が産生される。二本鎖抗体を含む改変抗体の発現のための特定の実施形態では、重鎖及び軽鎖の両方をコードするベクターは、免疫グロブリン分子全体の発現のために宿主細胞において同時発現され得る。

【0169】

Ｃ．医薬組成物の投与
また本明細書で提供されるのは、本明細書に開示される改変抗体（例えば、本明細書に開示される修飾ヒンジ領域を含む任意の抗体）のいずれかを含む方法及び医薬組成物である。さらに、本明細書で提供されるのは、有効量の少なくとも１つの本明細書に開示される改変抗体、又は少なくとも１つの本明細書に開示される改変抗体を含む医薬組成物を対象に投与することによって、疾患、障害又は感染に関連する１つ以上の症状の処置、予防、及び改善の方法である。一態様において、改変抗体は、実質的に精製される（すなわち、その効果を限定するか、又は望ましくない副作用をもたらす物質を実質的に含まない）。具体的な実施形態では、対象は、非霊長類（例えば、雌ウシ、ブタ、ニワトリ又は他の家禽、ウマ、ネコ、イヌ、ラットなど）及び霊長類（例えば、カニクイザルなどのサル、及びヒト）を含む哺乳類などの動物である。具体的な実施形態では、対象はヒトである。さらに別の特定の実施形態では、本発明の抗体は、対象と同じ種に由来する。

【0170】

組成物の投与経路は、処置される状態によって決まる。例えば、全身性障害、例えば、転移したリンパ性癌又は腫瘍の処置のために静脈注射が好ましいことがある。投与される組成物の薬用量は、標準的な用量応答研究と共に、過度の実験を行わなくても当業者によって決定され得る。これらの決定を行う際に考慮すべき関連状況には、処置される状態（単数又は複数）、投与される組成物の選択、個々の患者の年齢、体重、及び応答、並びに患者の症状の重症度が含まれる。状態に応じて、組成物は、経口的、非経口的、鼻腔内、経膣的、経直腸的、舌側、舌下、頬側、口腔内（ｉｎｔｒａｂｕｃｃａｌｌｙ）及び／又は経皮的に、患者に投与することができる。

【0171】

したがって、経口、舌側、舌下、頬側及び口腔内投与用に設計された組成物は、過度の実験を行わなくても、例えば、不活性希釈剤又は食用担体を用いて、当技術分野において周知の手段によって作製することができる。組成物はゼラチンカプセル内に封入されるか、又は錠剤に圧縮され得る。治療的経口投与のために、本発明の医薬組成物は賦形剤と合わせられ、錠剤、ペレット、トローチ、カプセル、エリキシル剤、懸濁液、シロップ、ウエハ、チューインガムなどの形態で使用され得る。さらなる実施形態では、組成物は、動物飼料中に包含され得る。

【0172】

錠剤、丸薬、カプセル、トローチなどは、結合剤、レシピエント、崩壊剤、潤滑剤、甘味剤、及び／又は香味剤も含有し得る。結合剤のいくつかの例としては、微結晶性セルロース、トラガカントガム及びゼラチンが挙げられる。賦形剤の非限定的な例としては、デンプン及びラクトースが挙げられる。崩壊剤のいくつかの例としては、アルギン酸、コーンスターチなどが挙げられる。潤滑剤の例としては、ステアリン酸マグネシウム及びステアリン酸カリウムが挙げられる。流動化剤の一例は、コロイド状二酸化ケイ素である。甘味剤のいくつかの非限定的な例としては、スクロース、サッカリンなどが挙げられる。香味剤の例としては、ペパーミント、サリチル酸メチル、オレンジフレーバーなどが挙げられる。これらの種々の組成物の調製において使用される材料は、薬学的に純粋であり、且つ使用される量において無毒性でなければならない。

【0173】

本明細書に開示される医薬組成物は、例えば、静脈内、筋肉内、くも膜下腔内及び／又は皮下注射などによって非経口的に投与することができる。非経口投与は、本明細書に開示される組成物を溶液又は懸濁液中に包含させることによって達成することができる。このような溶液又は懸濁液は、無菌希釈剤、例えば、注射用水、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール及び／又は他の合成溶媒も含み得る。非経口製剤は、例えばベンジルアルコール及び／又はメチルパラベンなどの抗菌剤、例えばアスコルビン酸及び／又は重亜硫酸ナトリウムなどの酸化防止剤、並びにＥＤＴＡなどのキレート剤も含み得る。酢酸、クエン酸及びリン酸などの緩衝液、並びに塩化ナトリウム及びデキストロースなどのなどの浸透圧調整剤も添加され得る。非経口調製物は、ガラス又はプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジ及び／又は複数回投与バイアル内に封入することができる。直腸投与は、組成物を直腸及び／又は大腸内に投与することを含む。これは、坐薬及び／又は浣腸を用いて達成することができる。坐薬製剤は、当技術分野において既知の方法によって作製することができる。経皮投与は、皮膚を通しての組成物の経皮吸収を含む。経皮製剤は、パッチ、軟膏、クリーム、ゲル、膏薬などを含む。本明細書に開示される改変抗体含有組成物は、患者に鼻腔投与することができる。本明細書で使用される場合、鼻腔内に投与すること又は鼻腔投与は、組成物を患者の鼻道及び／又は鼻腔の粘膜に投与することを含む。

【0174】

本明細書に開示される改変抗体含有組成物は、疾患、障害、又は感染に関連する１つ以上の症状を予防、処置、又は改善するための本発明の方法に従って使用することができる。本発明の医薬組成物は無菌であり、対象への投与に適した形態であることが企図される。

【0175】

一実施形態では、本明細書に開示される改変抗体含有組成物は、内毒素及び／又は関連の発熱物質を実質的に含まない、パイロジェンフリーの製剤である。内毒素は、微生物内に局在し、微生物が分解又は死滅したときに放出される毒素を含む。また発熱物質は、細菌及び他の微生物の外膜に由来する発熱性の熱安定性物質（糖タンパク質）も含む。これらの物質はいずれも、ヒトに投与されると発熱、低血圧及びショックを引き起こし得る。潜在的な悪影響のために、少量の内毒素でも、静脈投与される医薬品溶液から除去することが有利である。食品医薬品局（「ＦＤＡ」）は、静脈内薬物投与について、１時間の単一期間に体重１キログラムにつき１用量当たり５内毒素単位（ＥＵ）の上限を設定している（Ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ Ｆｏｒｕｍ ２６（１）：２２３（２０００））。治療用タンパク質が体重１キログラム当たり数百又は数千ミリグラムの量で投与される場合、モノクローナル抗体と同様であるように、微量でも内毒素を除去することが有利である。具体的な実施形態では、組成物中の内毒素及び発熱物質レベルは、１０ＥＵ／ｍｇ未満、又は５ＥＵ／ｍｇ未満、又は１ＥＵ／ｍｇ未満、又は０．１ＥＵ／ｍｇ未満、又は０．０１ＥＵ／ｍｇ未満、又は０．００１ＥＵ／ｍｇ未満である。

【0176】

さらに、本明細書で提供されるのは、疾患、障害、又は感染に関連する１つ以上の症状を予防、処置、又は改善するための方法であり、前記方法は、（ａ）本明細書に開示される改変抗体の１つ以上を含む、１回分の予防的又は治療的に有効な量の組成物を、それを必要としている対象に投与することと、（ｂ）１つ以上の次の用量の前記改変抗体を投与して、継続的に抗原に結合する望ましいレベル（例えば、約０．１～約１００μｇ／ｍｌ）の改変抗体の血漿濃度を維持することとを含む。具体的な実施形態では、改変抗体の血漿濃度は、１０μｇ／ｍｌ、１５μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、３０μｇ／ｍｌ、３５μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌ、４５μｇ／ｍｌ又は５０μｇ／ｍｌに維持される。具体的な実施形態では、投与すべき改変抗体の前記有効量は、１用量当たり少なくとも１ｍｇ／ｋｇ～８ｍｇ／ｋｇである。別の具体的な実施形態では、投与すべき改変抗体の前記有効量は、１用量当たり少なくとも４ｍｇ／ｋｇ～８ｍｇ／ｋｇである。さらに別の特定の実施形態では、投与すべき改変抗体の前記有効量は、１用量当たり５０ｍｇ～２５０ｍｇである。さらに別の特定の実施形態では、投与すべき改変抗体の前記有効量は、１用量当たり１００ｍｇ～２００ｍｇである。

【0177】

また本明細書で提供されるのは、疾患、障害、又は感染に関連する１つ以上の症状を予防、処置、又は改善するためのプロトコルであり、本明細書に開示される改変抗体のいずれかは、治療法（例えば、予防又は治療薬）と組み合わせて使用される。本明細書に開示される改変抗体は、現在標準の及び実験的な化学療法を含む他の癌療法を増強及び相乗化する、その有効性を強化する、その耐性を向上させる、及び／又はそれによって引き起こされる副作用を低減することができる。本発明の併用療法は、相加的効力、相加的治療効果又は相乗効果を有する。本発明の併用療法は、疾患、障害、又は感染に関連する１つ以上の症状を予防、処置、又は改善するために本明細書に開示される改変抗体と共に利用される治療法（例えば、予防又は治療薬）のより低い薬用量を可能にし、及び／又は、疾患、障害、若しくは感染を有する対象のクオリティオブライフを向上させ、及び／又は予防若しくは治療効果を達成するために前記対象にこのような予防又は治療薬を投与する頻度の低下を可能にする。さらに、本発明の併用療法は、現在の単剤療法及び／又は現存の併用療法の実施に関連する不必要な又は有害な副作用を低減又は回避し、これは次に、治療プロトコルに関する患者のコンプライアンスを向上させる。本明細書に開示される改変抗体と組み合わせて利用することができる多数の分子は、当技術分野において周知である。例えば、ＰＣＴ公開国際公開第０２／０７０００７号パンフレット；国際公開第０３／０７５９５７号パンフレット及び米国特許出願公開第２００５／０６４５１４号明細書を参照されたい。

【0178】

ＩＶ．キット
さらに、本明細書で提供されるのは、疾患、障害、又は感染に関連する１つ以上の症状をモニター、診断、予防、処置、又は改善するのに使用するために、１つ以上の容器内に、検出可能な薬剤、治療薬又は薬物にコンジュゲート又は融合された抗原に特異的に結合する、変更（例えば、改良）された安定性、及び／又は低下されたタンパク質分解的切断の可能性を有する本明細書に開示される改変抗体の１つ以上を含むキットである。

【0179】

本発明は、実例の目的で提供され且つ限定する目的ではない、以下の実施例を参照することによって、さらに理解することができる。

【実施例】

【0180】

実施例１：部位評価ライブラリーの産生及び評価
Ａ．抗ＲＳＶ ＨＣ重鎖のためのプラスミド及び部位評価構築
ＲＳウイルス（パリビズマブ又はＳｙｎａｇｉｓ）に対するモノクローナル抗体の重鎖のための配列は、コドン最適化され、ＧｅｎｅＡｒｔ ＧｍＨ（Ｇｅｒｍａｎｙ）によって合成された。真菌細胞内での発現中のＫｅｘ２フーリン様プロテアーゼによる分解の可能性を防止するために、重鎖内の第２１６位のリジンを、トレオニン（Ｋ２１６Ｔ）に変異させた。最初に、ｃ２Ｇ４及び抗ＲＳＶ ＨＣの合成配列を、そのリンカー領域（１－４７９ ａａ）と共に、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）天然セロビオヒドロラーゼＩ（ＣＢＨ１）の触媒コアの後ろにそれぞれクローニングした。担体パートナーから成熟抗体鎖を放出させるために、リンカーとＨＣとの間にＫｅｘ２切断部位を導入した。

【0181】

次いで、ｃｂｈＩ－ＨＣ＿Ｓｙｎａｇｉｓの融合構築物を、ｐＤｏｎｏｒ２２１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）へのＧａｔｅｗａｙ（登録商標）ＢＰ組換えクローニングを可能にするためにａｔｔＢ１及びａｔｔＢ２部位で伸長させた遺伝子特異的プライマーを用いるＰＣＲによって増幅した。図１に示す通り、プラスミドｐＥｎｔｒｙ－ＳｙｎａｇｉｓＨＣ＿Ｇｅｎｅａｒｔ＿ＳＥＬを、４６６－７２５ ａａ位置（ＣｂｈＩ Ｍｅｔからカウントしている）での部位評価（ＳＥＬ）ライブラリーの構築のための鋳型として、供給業者ＢａｓｅＣｌｅａｒ（Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）によって使用した。ａａ位置ごとの変異バリアントの平均数は、およそ１７であった。変異した配列を、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）ＬＲ組換え技術を介して、ｐＴＴＴｐｙｒ２－ＩＳｃｅＩデスティネーションベクターにさらにクローニングし、最終の発現プラスミドｐＴＴＴｐｙｒ２－ＩＳｃｅＩ－ＳｙｎａｇｉｓＨＣ＿Ｇｅｎｅａｒｔ＿ＳＥＬ（図１）をもたらした。

【0182】

この発現ベクターは、対象となる遺伝子の強力な誘導性発現を可能にするＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｃｂｈＩプロモーター及びターミネーター領域と、ウリジンを添加しない最少培地での形質転換体の増殖を与えるＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｐｙｒ２選択マーカーを含有する。このプラスミドは、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）由来のテロメア領域により、真菌細胞内で自律的に維持される。プラスミドを、市販品として入手可能な大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳ）内で増殖させ、精製し、配列確認し、９６ウェルＭＴＰにそれぞれ配列させ、下に記載する通りの真菌の形質転換のために使用した。

【0183】

ｐＥｎｔｒｙ－Ｓｙｎａｇｉｓ＿ＬＣ＿Ｇｅｎｅａｒｔプラスミドを、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）ＢＰ組換えクローニングを介して構築し、上に記載したのと同様の方式で、ｐＴｒｅｘ６ｇデスティネーションベクターを用いてさらに組換え、発現ベクターｐＴｒｅｘ６ｇ－Ｓｙｎａｇｉｓ＿ＬＣをもたらした。このベクターは、軽鎖を発現するＰＣＲ断片を産生するための鋳型としての役割を果たした（図４）。

【0184】

国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０２１６８５号（その開示は、参照によってその全体が本明細書中に組み込まれる）に記載されるように、抗ＲＳＶ抗体を作製した。抗単純ヘルペスウイルス抗体（ＨＳＶ０８）、抗ＨＩＶ抗体（ＶＲＣ０１）、及び抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体（トラスツズマブ）を同様の方法で作製した。

【0185】

Ｂ．真菌宿主株構築及び形質転換
発現カセットは、ＣＢＨ１プロモーター、ＣＢＨ１コア、ＣＢＨ１リンカーによって連結される抗体ＨＣ及びＬＣ、及びＣＢＨ１のプロセシングのためのｋｅｘ２配列、ＣＢＨ１ターミネーター、並びに真菌細胞にクロリムロンエチルへの抵抗性を与えるａｌＳマーカーからなる。ＳＥＬバリアントのためにｐｙｒ２マーカーが利用可能になるように、スクリーニング株を作成するためにａｌＳマーカーを使用した。この完全発現カセットを、ＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ産物を、精製し、５００～１０００ｎｇ／μＬに濃縮した。以下に記載されるように、この発現カセットを、多重コピーで、宿主Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ゲノムにランダムに組み込んだ。

【0186】

形質転換のために使用された宿主Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）株は、主なセルラーゼ及びキシラナーゼについて欠失させた。この株を、標準のＰＥＧ－プロトプラスト形質転換方法を使用して形質転換させた。２５０μｌの総体積中におよそ１０μｇのＤＮＡと５×１０^６個のプロトプラストを含有する形質転換混合物を、２ｍＬの２５％ ＰＥＧ溶液で処理し、２体積の１．２Ｍソルビトール／１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５／１０ｍＭ ＣａＣｌ２溶液で希釈し、１Ｍソルビトール、１ｇ／Ｌウリジン、７５ｍｇ／Ｌクロリムロンエチル（最少培地中）を含有する２６ｍＬの２％低融点アガロースと混合し、あらかじめ注がれた１．５％アガロース、１Ｍソルビトール（最少培地中）を含有する４枚の１０ｃｍペトリ皿に分配した。十分な増殖後、各皿の形質転換体を観察し、それぞれのコロニーを、１．５％寒天、１ｇ／Ｌウリジン、７５ｍｇ／Ｌクロリムロンエチルを含有する新たな１０ｃｍペトリ皿に、安定性を評価する余地を与えるために皿あたり４つ選び取った。安定なコロニーの表現型は、平滑縁を伴う同心円状の増殖である。安定な形質転換体が観察され、十分に胞子形成されたら、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（ＵＳＡ）からの軽鎖特異的抗体ペルオキシダーゼコンジュゲートを用いるウエスタンブロット分析によってＬＣの発現レベルを評価するために、胞子を回収し、液体培養物の植菌のために使用した。ＬＣの高発現レベルを有する１つの形質転換体＃ＬＣ６は、重鎖ＳＥＬライブラリーのさらなる発現のためのスクリーニング宿主としての役割を果たした。

【0187】

Ｓｙｎａｇｉｓ ＨＣバリアントを用いるすべてのハイスループット形質転換は、Ｂｉｏｍｅｋロボット（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，ＵＳＡ）を使用する２４ウェルＭＴＰフォーマットで、ロボット制御によって実施した。バリアントを有するプラスミドは、あらかじめ決定された配置に従って配列された９６ウェルフォーマットで、供給業者から受け取った。５０μｌの総体積中におよそ１μｇのＤＮＡと５ｘ１０^６個のスクリーニング宿主＃ＬＣ６のプロトプラストとを含有する形質転換混合物を、２００μｌの２５％ ＰＥＧ溶液で処理し、１体積の１．２Ｍソルビトール／１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５／１０ｍＭ ＣａＣｌ_２溶液で希釈し、ロボット制御によって２４ウェルＭＴＰに再配列し、１Ｍソルビトール（最少培地中）を含有する１ｍｌの３％低融点アガロース中に注いだ。十分な増殖後、各ウェルからの形質転換体を一緒にプールし、最少培地を有する新たな２４ウェル寒天皿に乗せた。胞子形成されたら、胞子を回収し、液体培養物の植菌のために使用した。

【0188】

国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０２１６８５号（その開示は、参照によってその全体が本明細書中に組み込まれる）に記載されるように、抗ＲＳＶ抗体のための真菌宿主株の構築及び形質転換を行った。抗単純ヘルペスウイルス抗体（ＨＳＶ０８）、抗ＨＩＶ抗体（ＶＲＣ０１）、及び抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体（トラスツズマブ）のための宿主株の構築及び形質転換を同様の方法で実施した。

【0189】

Ｃ．徐放性の２４ウェルＭＴＰにおける真菌発酵
十分に高い抗体力価をもたらすために、１０^５～１０^６個のＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）胞子を、連続的産生を確実にするために発酵中に培地中でゆっくりと放出されるラクトースとあらかじめ混合されたＳｙｌｇａｒｄ １７０エラストマー（Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＵＳＡより）から構成されるカスタムメイドの（ｃｕｓｔｏｍｅｒ ｍａｄｅ）２４ウェルＭＴＰに植菌した。培養株を、１６ｇ／Ｌグルコース、９ｇ／Ｌカザミノ酸、１０ｇ／Ｌ（ＮＨ４）２ＳＯ４、４．５ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、１ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、１ｇ／Ｌ ＣａＣｌ２＊２Ｈ２Ｏ、３３ｇ／Ｌ ＰＩＰＰＳ緩衝液［ｐＨ ５．５］、０．２５％ Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）微量元素（１００％：１７５ｇ／Ｌクエン酸（無水）、２００ｇ／Ｌ ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、１６ｇ／Ｌ ＺｎＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、３．２ｇ／Ｌ ＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ、１．４ｇ／Ｌ ＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ、０．８ｇ／Ｌ Ｈ３ＢＯ３）を含有する１．２５ｍｌの培地中で増殖させた。

【0190】

プレートを、２００ｒｐｍ及び２８Ｃで、８０％湿度で、５０ｍｍの振盪幅を用いて、Ｉｎｆｏｒｓシェーカー中でインキュベートした。５～６日の増殖の後、培養物を、９６ウェルディープウェルＭＴＰにフォーマットし直し、９６ウェルマイクロタイターフィルタープレート（０．２μｍ親水性ＰＶＤＦ膜、Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｔｅｗｋｓｂｕｒｙ ＭＡ）を使用して濾過した。プレートを、Ａｘｙｇｅｎハーフディープウェルプレート（Ｐ－ＤＷ－１１－Ｃ）で凍結した。

【0191】

Ｄ．ｍｉｎｉＳＥＬスクリーン
プラスミド及びライブラリー構築：エボラウイルスに対するＺｍａｐ ｃ２Ｇ４モノクローナル抗体のヒト化バージョンの配列は、コドン最適化され、ＧｅｎｅＡｒｔ ＧｍＨ（Ｇｅｒｍａｎｙ）によって合成された。真菌細胞内での発現中のＫｅｘ２フーリン様プロテアーゼによる分解の可能性を防止するために、重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）の両方から全てのＫＲ部位を除去した。最初に、ｃ２Ｇ４ ＨＣ及びＬＣの合成配列を、そのリンカー領域（１－４７９ａａ）と共に、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）天然セロビオヒドロラーゼＩの触媒不活性コアの後ろにそれぞれクローニングした。担体パートナーから成熟抗体鎖を放出させるために、リンカーとＨＣ又はＬＣのいずれかとの間にＫｅｘ２切断部位ＳＶＡＶＥＫＲを導入した。

【0192】

次いで、ｃｂｈＩ－ｃ２Ｇ４＿ＨＣ３及びｃｂｈＩ－ｃ２Ｇ４＿ＬＣ２の融合構築物を、ｐＤｏｎｏｒ２２１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）へのＧａｔｅｗａｙ（登録商標）ＢＰ組換えクローニングを可能にするためにａｔｔＢ１及びａｔｔＢ２部位で伸長させた遺伝子特異的プライマーを用いるＰＣＲによって増幅した。図３に示す通り、プラスミドｐＥｎｔｒｙ－ＣｂｈＩｘ－ｃ２Ｇ４＿ＨＣ３を、２１７－２３６ａａ位置（成熟ＨＣにおけるカウント）での部位評価（ＳＥＬ）ライブラリーの構築のための鋳型として、供給業者ＢａｓｅＣｌｅａｒ（Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）によって使用した。各ａａ位置当たりの変異バリアントの数は１３～１９の間で異なり、平均数は１６を上回った。変異バリアントを、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）ＬＲ組換え技術を介して、ｐＴＴＴｐｙｒ２デスティネーションベクターにさらにクローニングし、最終の発現プラスミドｐＴＴＴｐｙｒ２－ＣＢＨＩ－ｃ２Ｇ４＿ＨＣ３（図３）をもたらした。

【0193】

この発現ベクターは、対象となる遺伝子の強力な誘導性発現を可能にするＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｃｂｈＩプロモーター及びターミネーター領域と、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）ａｍｄＳと、ウリジンの非存在下でアセトアミドを含む最少培地での形質転換体の増殖を与えるＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｐｙｒ２選択マーカーとを含有する。このプラスミドは、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）由来のテロメア領域により、真菌細胞内で自律的に維持される。複製プラスミドの使用は形質転換の頻度増大をもたらし、組込み真菌形質転換で観察される遺伝子座依存性発現という問題を回避する。プラスミドを、市販品として入手可能な大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳ）内で増殖させ、精製し、配列確認し、９６ウェルＭＴＰにそれぞれ配列させ、下に記載する通りの真菌の形質転換のために使用した。

【0194】

ｐＥｎｔｒｙ－ＣｂｈＩｘ－ｃ２Ｇ４＿ＬＣ２プラスミドを、上に記載したのと同様の方式で、ｐＴｒｅｘ６ｇデスティネーションベクターを用いて組み換え、発現ベクターｐＴｒｅｘ６ｇ－ＣｂｈＩｘ－ｃ２Ｇ４＿ＬＣ２をもたらした。このベクターは、ｃｂｈＩプロモーターによって駆動され、真菌細胞にクロリムロンエチルへの抵抗性を与えるａｌＳマーカーに連結される、ｃ２Ｇ４＿ＬＣ２を発現するＰＣＲ断片を産生するための鋳型としての役割を果たした（図４）。

【0195】

真菌株及び形質転換：Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）におけるｃ２Ｇ４＿ＨＣ３重鎖ＳＥＬライブラリーのスクリーニングの前に、十分なレベルのｃ２Ｇ４＿ＬＣ２軽鎖を発現する中間株＃Ｃ１を構築した。この目的で、標準のＰＥＧ－プロトプラスト形質転換方法を用いて、主なセルラーゼ及びキシラナーゼについて欠失させたＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）株に軽鎖発現断片をランダムに組み込んだ。ｃ２Ｇ４＿ＬＣ２に結合されたａｌＳマーカーの存在のために５０～８０ｍｇ／Ｌのクロリムロンエチルに対して抵抗性の形質転換体を、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（ＵＳＡ）からの軽鎖特異的抗体ペルオキシダーゼコンジュゲートを用いてＥＬＩＳＡ及びウエスタンブロットアッセイの組み合わせにより、ＬＣ発現についてスクリーニングした。ウエスタンブロットにおいてＬＣの強力なシグナルを有する、＃Ｃ１と呼ばれる１つの形質転換体は、ｃ２Ｇ４＿ＨＣ３ＳＥＬライブラリーのさらなる発現のための宿主としての役割を果たした。

【0196】

ｃ２Ｇ４＿ＨＣ３バリアントを用いるすべてのハイスループット形質転換は、Ｂｉｏｍｅｋロボット（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，ＵＳＡ）を使用する２４ウェルＭＴＰフォーマットで、ロボット制御によって実施した。バリアントを有するプラスミドは、あらかじめ決定された配置に従って配列された９６ウェルフォーマットで、供給業者から受け取った。５０μｌの総体積中におよそ１μｇのＤＮＡと５ｘ１０^６個のスクリーニング株＃Ｃ１のプロトプラストとを含有する形質転換混合物を、２００μｌの２５％ ＰＥＧ溶液で処理し、１体積の１．２Ｍソルビトール／１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５／１０ｍＭ ＣａＣｌ２溶液で希釈し、ロボット制御によって２４ウェルＭＴＰに再配列し、１Ｍソルビトール（最少培地中）を含有する１ｍｌの３％低融点アガロース中に注いだ。十分な増殖後、各ウェルからの形質転換体を一緒にプールし、唯一の窒素源として１０ｍＭアセトアミドを含有する最少培地を有する新たな２４ウェル寒天皿に乗せた。胞子形成されたら、胞子を回収し、液体培養物の植菌のために使用した。

【0197】

徐放性の２４ウェルＭＴＰにおける真菌発酵：十分に高い抗体力価をもたらすために、１０^５～１０^６個のＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）胞子を、連続的産生を確実にするために発酵中に培地中でゆっくりと放出されるラクトースとあらかじめ混合されたＳｙｌｇａｒｄ １７０エラストマー（Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＵＳＡより）から構成されるカスタムメイドの（ｃｕｓｔｏｍｅｒ ｍａｄｅ）２４ウェルＭＴＰに植菌した。培養物を、１６ｇ／Ｌグルコース、９ｇ／Ｌカザミノ酸、１０ｇ／Ｌ（ＮＨ４）２ＳＯ４、４．５ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、１ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、１ｇ／Ｌ ＣａＣｌ２＊２Ｈ２Ｏ、３３ｇ／Ｌ ＰＩＰＰＳ緩衝液［ｐＨ ５．５］、０．２５％ Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）微量元素（１００％：１７５ｇ／Ｌクエン酸（無水）、２００ｇ／Ｌ ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、１６ｇ／Ｌ ＺｎＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、３．２ｇ／Ｌ ＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ、１．４ｇ／Ｌ ＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ、０．８ｇ／Ｌ Ｈ３ＢＯ３）を含有する１．２５ｍｌの培地中で増殖させた。

【0198】

プレートを、２００ｒｐｍ及び２８Ｃで、８０％湿度で、５０ｍｍの振盪幅を用いて、Ｉｎｆｏｒｓシェーカー中でインキュベートした。５～６日の増殖の後、培養物を、９６ウェルディープウェルＭＴＰにフォーマットし直し、９６ウェルマイクロタイターフィルタープレート（０．２μｍ親水性ＰＶＤＦ膜、Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｔｅｗｋｓｂｕｒｙ ＭＡ）を使用して濾過した。清澄化された試料を、抗体の発現について分析した。

【0199】

実施例２：切断に対する抵抗性についての抗体ヒンジバリアントの評価
クリッピングアッセイ：この方法は、宿主細胞からの発現及び精製の後の抗体タンパク質分解の量を測定する。実施例１で産生された精製抗体バリアントの濃度を、総タンパク質のためのＢＣＡアッセイ（Ｃ２Ｇ４試料）、又はＦＲＥＴアッセイ（抗ＲＳＶ、ＨＳＶ０８、ＶＲＣ０１、及びトラスツズマブ試料）のいずれかによって決定した。ＢＣＡアッセイは、製造業者（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ２３２２５）によって記載されるように実施した。次に、Ｃ２Ｇ４抗体を６０ｐｐｍに基準化し、ＦＲＥＴ定量化抗体を１２０ｐｐｍに基準化した。抗体のいくつかは、その精製濃度が他の抗体を基準化した濃度よりも低かったことから、基準化しなかった。基準化のために使用した希釈緩衝液は、精製後の抗体の溶液と同じｐＨ及び濃度のグリシン－Ｔｒｉｓ緩衝液であった。

【0200】

ヒンジクリッピングが観察される同じ条件下で、空のＣｅｌｌｕｌｉｇｈｔｅｒ宿主株をＤａｓｇｉｐに流し込んだ。上清を単離し、およそ１０倍に濃縮した。

【0201】

Ｃ２Ｇ４抗体については、１００μＬの６０ｐｐｍのタンパク質基準化試料をＣｏｒｎｉｎｇ ３６０５プレートに添加した。ＦＲＥＴ定量化抗体については、抗体試料をＣｏｒｎｉｎｇ ３６０５プレートに添加する前に、Ｍｉｌｉ－Ｑ水で４倍に希釈した。次に、１０μＬの濃縮ｃｅｌｌｕｌｉｇｈｔｅｒブロスを各ウェル添加して、ヒンジクリッピング反応を開始させた。プレートをＢｉｏＲａｄ Ｍｉｃｒｏｓｅａｌ Ｂで密封し、２５℃でＥｐｐｅｎｄｏｒｆサーモミキサー内に入れた。振盪させながらプレートを１００分間インキュベートした。３６０５プレート内で５０μＬの反応混合物及び５０μＬのプロテアーゼ阻害剤カクテルを混合することにより、反応をクエンチした。プロテアーゼ阻害剤カクテルは、１０Ｘ推奨希釈率である最終濃度のＥＤＴＡが添加されたＨａｌｔ^ＴＭプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｆｉｓｈｅｒ ７８４３０）であった。次に、これらのストレス負荷試料を、ウエスタン分析により処理されるまで氷上で貯蔵した。反応の場合と同じ希釈率であるが濃縮ブロスを含まない抗体試料のアリコートを、ストレス負荷試料と同じ比率でプロテアーゼ阻害剤カクテルと混合して、Ｔ_０時点（ストレス無負荷）を生成した。

【0202】

ストレス無負荷及びストレス負荷試料をウエスタンブロットによりヒンジクリッピングについて分析した。試料をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｅ－ＰＡＧＥ ４８ウェル８％ゲルに流し、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｉＢｌｏｔ ２によりニトロセルロース膜へ移動させ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｉＢｉｎｄ Ｆｌｅｘを用いて探査した。より正確な比較のために、所与のバリアントのためのストレス無負荷及びストレス負荷試料を、４８ウェルゲルの同じ列に互いに隣り合わせに流した。ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ^ＴＭＷｅｓｔ（Ｔｈｅｒｍｏ ３４０７６）と共に、抗ヒトＦｃ－ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ Ａ０１７０）を使用して試料を探査した。ＢｉｏＲａｄ ＣｈｅｍｉＤｏｃ ＭＰ及びそのソフトウェアにより、ブロットを可視化し、定量化した。クリップされた割合は、一番下のバンド（クリップされたＨＣからのＦｃ断片）の体積を３つの断片（ＣＢＨ１－ＨＣ、成熟ＨＣ、Ｆｃ断片）の合計で割ることによって計算した。報告されたヒンジクリッピングのデルタは、試料を濃縮Ｃｅｌｌｕｌｉｇｈｔｅｒブロスと共にインキュベートする前とインキュベートした後のヒンジクリッピングパーセントの差である。

【0203】

Ｄ．精製：プレートを、冷凍庫から冷蔵室に移動して、試料を４℃で一晩、徐々に解凍した。精製前に、増殖したＷＴ試料をプレートから取り除き、これらの試料をプールした。ウェルあたり１ｍＬのプールされたＷＴ、プールされた低結合対照、プールされた高結合対照、及びプールされたベクターのみ（同じ株においてＣＢＨ１を発現するベクター）試料を、指定されたウェルに添加した。これらのライブラリープレート物は、２連で増殖させ、これらの対照は、両方のプレートに添加した。これらのプレートを、２分間、やさしくゆすって、ウェル内の流体を均質化させ、続いて、１分間遠心分離を行って、あらゆる沈殿をペレット化させた。

【0204】

ロボットは、４つのライブラリープレートを一度に処理した。ロボットは、プロテインＡ樹脂への抗体結合を向上させるために、５０μＬの１Ｍ ＫＰｉ（ｐＨ７）を添加して、上清のｐＨを上昇させた。次いで、ロボットは、未精製材料（最大８８０μＬ／ウェル）を、４つのプレートから、２２０μＬのプロテインＡ樹脂（ＰＢＳ中）であらかじめ満たした２ｍＬフィルタープレート（Ｐａｌｌ ８２７５）に移した。次いで、これらのフィルタープレートを、５分間、シェーカーでゆすった。次いで、プレート物を、１０００ｇでの２分間の遠心分離によって濾過し、フロースルーを、試料がそこから移された空の回収プレートに収集した。この材料は、定量化後まで保管した。フィルタープレートを、ロボットの台に戻し、２連の増殖プレート物を、同じフィルタープレートに添加した。これらのプレート物を、前回と同様にインキュベート及び遠心分離した。次いで、樹脂を、８８０μＬのＰＢＳ緩衝液で洗浄した。これらのプレートを、１分間ゆすり、次いで、１０００ｇで２分間遠心分離した。フロースルーを捨て、プレートを、第２のＰＢＳ洗浄のために、ロボットに戻した。第２の洗浄後、プレートを、溶離プログラムを実行するロボットに移動した。

【0205】

溶離プログラムは、４つのプレートを一度に処理した。このプログラムは、試料が溶離されることとなる清浄なハーフディープウェルプレートに、１１μＬの中和緩衝液（１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ９）を添加した。次いで、このプログラムは、フィルタープレートに、４４０μＬの溶離緩衝液（１００ｍＭグリシン ｐＨ２．７）を添加した。次いで、プレートを、設定７で１分間ゆすり、次いで、遠心分離（１０００ｇ、２分間）によって、新たに準備した回収プレートへと濾過した。遠心分離後、中和緩衝液の適切な混合を確実にするために、試料プレートを１分間ゆすった。

【0206】

結果：Ｃ２Ｇ４抗体については、図６に示されるように、ヒンジ領域において修飾されていない成熟抗体と比較して著しく少ない抗体クリッピングをもたらす、いくつかのヒンジ配列バリアントを同定した。これらのバリアントと、アッセイされたヒンジクリッピングの減少との完全なリストは表３に示される。

【表3】

【0207】

表３に示されるＣ２Ｇ４抗体においてクリッピングを低減することが見出された置換を、図７及び図８に示されるように抗ＲＳＶ抗体のヒンジに導入すると、これらの変異も、ヒンジ領域において修飾されていない成熟抗体と比較して著しく少ない抗体クリッピングをもたらし、これらのヒンジ置換が複数の抗体にわたってクリッピングを低減することが実証された。これらのＣ２Ｇ４バリアントと、アッセイされたヒンジクリッピングの減少との完全なリストは、表４に示される。

【表4-1】

【表4-2】

【0208】

Ｃ２Ｇ４抗体においてクリッピングを低減することが見出された選り抜きの置換を、抗単純ヘルペスウイルス抗体（ＨＳＶ０８）、抗ＨＩＶ抗体（ＶＲＣ０１）、及び抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体（トラスツズマブ）のヒンジに導入すると、これらの変異も、ヒンジ領域において修飾されていない成熟抗体と比較して著しく少ない抗体クリッピングをもたらし、これらのヒンジ置換が複数の抗体にわたってクリッピングを低減することがさらに実証された（表５）。

【表5】

【0209】

実施例３：切断に対する抵抗性についてのＣＨＯ発現抗体ヒンジバリアントの評価
ＣＨＯ産生抗ＲＳＶバリアント：チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞発現バリアントは、Ｂｉｏｎｏｖａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）から得た。このバリアントは精製されて、ＰＢＳ緩衝液中で届けられた。Ｓｙｎａｇｉｓを用いるＦＲＥＴアッセイによって濃度を測定し、バリアントを前と同じＴｒｉｓ－Ｇｌｙで１２０ｐｐｍに希釈した。

【0210】

ＦＲＥＴ定量化アッセイ及び基準化：Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６ ＮＨＳエステル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａ２０１０２）により、タンパク質Ａ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ７７６７４）を標識化した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ ＮＨＳエステル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａ２０１００）により、タンパク質Ｌ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ７７６８０）を標識化した。標識タンパク質Ａ及びタンパク質Ｌを、１０７ｍＭ ＫＰｉ ｐＨ７により、適切なダイナミックレンジを有する本発明者らの標準曲線のためのＦＲＥＴシグナルをもたらす比率で希釈した。標準曲線は、ＡｂｂＶｉｅからの市販のＳｙｎａｇｉｓであった。Ｃｏｒｎｉｎｇ ３６０５プレートにおいて、４０μＬのタンパク質Ａ及びＬ溶液を１０μＬの精製抗体試料と混合した。プレート上のＦＲＥＴシグナルを読み取り（ｅｘ：４８５ｎｍ ｅｍ：５９０ｎｍ カットオフ：５９０ｎｍ）、未知のものの濃度は、Ｓｙｎａｇｉｓ標準曲線から決定した。試料を２連で流した。

【0211】

データを分析した後、プレートを１２０ｐｐｍに基準化した。希釈緩衝液は同じｐＨのＴｒｉｓ－Ｇｌｙ緩衝液であり、濃度は精製試料におけるものである。１２０ｐｐｍ未満のウェルについては、希釈せずにそのまま使用した。結果は表６に示される。示されるように、ＣＨＯ発現抗ＲＳＶバリアントは、野生型抗体ヒンジと比較して著しく少ないクリッピングを示した。

【表6】

配列

【化1】

Ｓｙｎａｇｉｓ ＨＣのヌクレオチド配列：

【化2】

Ｓｙｎａｇｉｓ ＨＣのアミノ酸配列：

【化3】

Ｓｙｎａｇｉｓ ＬＣのヌクレオチド配列：

【化4】

Ｓｙｎａｇｉｓ ＬＣのアミノ酸配列：

【化5】

ｃ２Ｇ４＿ＨＣ３のヌクレオチド配列：

【化6】

ｃ２Ｇ４＿ＬＣ２のアミノ酸配列：

【化7】

ｃ２Ｇ４＿ＬＣ２のヌクレオチド配列：

【化8】

ｃ２Ｇ４＿ＨＣ３ ＬＣのアミノ酸配列：

【化9】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【配列表】

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