▶ エムアイアール サイエンティフィック，エルエルシーの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-05-02
(54)【発明の名称】前立腺がんを予測するための方法およびその使用
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6813 20180101AFI20220422BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20220422BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220422BHJP
A61P 13/08 20060101ALI20220422BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20220422BHJP
G01N 33/50 20060101ALI20220422BHJP
G01N 33/15 20060101ALI20220422BHJP
G01N 33/574 20060101ALI20220422BHJP
C12N 15/11 20060101ALN20220422BHJP
C12Q 1/6837 20180101ALN20220422BHJP
C12Q 1/686 20180101ALN20220422BHJP
C12M 1/00 20060101ALN20220422BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20220422BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6813 Z ZNA
A61K45/00
A61P35/00
A61P13/08
G01N33/53 M
G01N33/50 Z
G01N33/15 Z
G01N33/574 Z
C12N15/11 Z
C12Q1/6837 Z
C12Q1/686 Z
C12M1/00 A
C12N15/09 200
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021553304
(86)(22)【出願日】2020-03-14
(85)【翻訳文提出日】2021-10-18
(86)【国際出願番号】 US2020022862
(87)【国際公開番号】W WO2020190819
(87)【国際公開日】2020-09-24
(31)【優先権主張番号】62/819,325
(32)【優先日】2019-03-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/978,184
(32)【優先日】2020-02-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】518436124
【氏名又は名称】エムアイアール サイエンティフィック，エルエルシー
(74)【代理人】
【識別番号】100079108
【弁理士】
【氏名又は名称】稲葉 良幸
(74)【代理人】
【識別番号】100109346
【弁理士】
【氏名又は名称】大貫 敏史
(74)【代理人】
【識別番号】100117189
【弁理士】
【氏名又は名称】江口 昭彦
(74)【代理人】
【識別番号】100134120
【弁理士】
【氏名又は名称】内藤 和彦
(72)【発明者】
【氏名】テニスウッド，マーティン
(72)【発明者】
【氏名】ディレンツォ，アルバート グレゴリー
(72)【発明者】
【氏名】ワン，ウェイ－リン ウィニー
【テーマコード（参考）】
2G045
4B029
4B063
4C084
【Ｆターム（参考）】
2G045AA26
2G045CB03
2G045DA13
2G045DA14
2G045FB02
4B029AA23
4B029BB20
4B029FA15
4B029GA08
4B063QA19
4B063QQ03
4B063QQ52
4B063QR55
4B063QR66
4B063QS34
4B063QX02
4C084AA17
4C084NA05
4C084NA14
4C084ZA81
4C084ZB26
(57)【要約】
本発明は、前立腺がんを有する患者を診断、予後診断、モニタリング、および治療するための組成物および方法に関する。特に、本発明は、臨床的に有意な前立腺がんを特定するための発現シグネチャーとしてのｍｉＲＮＡおよびｓｎｏＲＮＡの使用に関する。
【選択図】図４
【選択図】図４
【特許請求の範囲】
【請求項1】
前立腺がんのリスクがある対象をスクリーニングするための方法であって、（ｉ）前記対象から生物学的サンプルを得ることと、
（ｉｉ）前記生物学的サンプルからの小分子非コードＲＮＡ（ｓｎｃＲＮＡ）のシグネチャー集合の総発現プロファイルを検出することであって、
前記シグネチャーｓｎｃＲＮＡの集合の総発現プロファイルを検出することが、前記生物学的サンプルから得られたｓｎｃＲＮＡに由来するｃＤＮＡの各々に特異的なハイブリダイズプローブを含み、
前記ハイブリダイズプローブのうちの少なくとも１つが、配列番号１～２８０からなる群から選択される、検出することと、
（ｉｉｉ）前立腺がんを有しないか、または前立腺がんを有する標的集団からのトレーニングデータセットにおける配列番号１～２８０の総発現プロファイルを比較することにより、前記対象からの配列番号１～２８０の前記総発現プロファイルを相関させることと、
（ｉｖ）上記（ｉｉｉ）から得られた結果に基づいて、対象が前立腺がんのリスクを有する可能性を判断することと、を含む、方法。
【請求項2】
前立腺がんのリスクがあると判断された前記対象におけるｓｎｃＲＮＡの発現を再分析し、無痛性（低悪性度、ＧＧ１）または中もしくは高悪性度（ＧＧ２～ＧＧ５）の前立腺がんを有する標的集団からのトレーニングデータセットにおける配列番号２８１～５６０の総発現プロファイルと比較することにより、無痛性（低悪性度、ＧＧ１）または中もしくは高悪性度（ＧＧ２～ＧＧ５）の前立腺がんを有するとして前記対象をさらに分類する、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
侵攻性（中もしくは高悪性度、ＧＧ２～ＧＧ５）の前立腺がんを有すると判断された前記対象におけるｓｎｃＲＮＡの発現を再分析し、低／中等度リスク（ＧＧ１～ＧＧ２）または侵攻性（高悪性度、ＧＧ３～ＧＧ５）の前立腺がんを有する標的集団からのトレーニングセットにおける配列番号５６１～８４０の総発現プロファイルと比較することにより、低／中悪性度（ＧＧ２～ＧＧ５）または侵攻性（高悪性度、ＧＧ３～ＧＧ５）の前立腺がんを有するとして前記対象をさらに分類する、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
侵攻性（中もしくは高悪性度、ＧＧ２～ＧＧ５）の前立腺がんを有するとして分類された前記対象が、根治的前立腺切除術、前立腺の近接照射療法、前立腺の放射線療法、ネオアジュバントホルモン療法およびアジュバントホルモン療法のうちの１つ以上で治療される、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記生物学的サンプルが、無細胞尿である、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
前記生物学的サンプルが、尿中エクソソームである、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
前記生物学的サンプルが、尿中エクソソームから抽出されたｓｎｃＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
前記ｓｎｃＲＮＡが、ｍｉＲＮＡ、Ｃ／ＤボックスｓｎｏＲＮＡ、Ｈ／ＡＣＡボックスｓｎｏＲＮＡ、ｓｃａＲＮＡ、ｐｉＲＮＡおよびｌｎｃＲＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
前記ｓｎｃＲＮＡが、ｍｉＲＮＡおよびｓｎｏＲＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項10】
前立腺がんのリスクがある対象をスクリーニングするための前記方法が、Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＰＣａ（ＰＣａ）試験を実施することを含み、前記ＰＣａ試験が、（ｉ）情報価値のある配列について、Ｏｐｅｎ Ａｒｒａｙプラットフォーム上で、配列番号１～２８０のｓｎｃＲＮＡ配列を調べるステップと、
（ｉｉ）前記配列すべての前記総発現プロファイル、および第１の分類アルゴリズムに含まれる配列間の相互作用を検査するＳｅｎｔｉｎｅｌスコアを求めるステップと、
（ｉｉｉ）前記情報価値のある配列についての（ｉｉ）における前記Ｓｅｎｔｉｎｅｌスコアを、前立腺がんを有するか、または前立腺がんを有しないことが知られている患者からのトレーニングデータセットについて得られたＳｅｎｔｉｎｅｌスコアと比較するステップと、
（ｉｖ）前記対象が前立腺がんを有するのか、前立腺がんを有しないのかを判断するステップと、を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項11】
無痛性もしくは低悪性度（ＧＧ－１）または中もしくは高悪性度（ＧＧ－２～ＧＧ－５）の前立腺がんを有するとして分類される前立腺がんを有する対象をスクリーニングするための前記方法が、Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）臨床的有意性（ＣＳ）試験を実施することを含み、前記ＣＳ試験が、（ｉ）情報価値のある配列の異なるセットについて、Ｏｐｅｎ Ａｒｒａｙプラットフォーム上で、第２ラウンドで、配列番号２８１～５６０のｓｎｃＲＮＡを調べるステップと、
（ｉｉ）前記配列すべての前記総発現プロファイル、および第２の分類アルゴリズムに含まれる配列間の相互作用を検査するＳｅｎｔｉｎｅｌスコアを求めるステップと、
（ｉｉｉ）前記情報価値のある配列についての前記（ｉｉ）におけるＳｅｎｔｉｎｅｌスコアを、患者ＧＧ１前立腺がんおよびＧＧ２～ＧＧ－５前立腺がんからのトレーニングデータセットについて得られたＳｅｎｔｉｎｅｌスコアと比較するステップと、
（ｉｖ）前記対象がＧＧ１前立腺がんを有するのか、またはＧＧ２～ＧＧ－５前立腺がんを有するのかを判断するステップと、を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
無痛性もしくは低悪性度（ＧＧ１）または中もしくは高悪性度（ＧＧ－２～ＧＧ－５）の前立腺がんを有するとして分類される前立腺がんを有する対象をスクリーニングするための前記方法が、Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）高悪性度（ＨＧ－試験を実施することを含み、前記ＣＳ試験が、（ｉ）情報価値のある配列の異なるセットについて、Ｏｐｅｎ Ａｒｒａｙプラットフォーム上で、第３ラウンドで、配列番号５６１～８４０のｓｎｃＲＮＡを調べるステップと、
（ｉｉ）前記配列すべての前記総発現プロファイル、および第３の分類アルゴリズムに含まれる配列間の相互作用を検査するＳｅｎｔｉｎｅｌスコアを求めるステップと、
（ｉｉｉ）前記情報価値のある配列についての前記（ｉｉ）におけるＳｅｎｔｉｎｅｌスコアを、患者低／中悪性度（ＧＧ１～ＧＧ２）の前立腺がんおよび高悪性度（ＧＧ３～ＧＧ－５）の前立腺がんからのトレーニングデータセットについて得られたＳｅｎｔｉｎｅｌスコアと比較するステップと、
（ｉｖ）前記対象が低／中悪性度（ＧＧ１～ＧＧ２）の前立腺がんを有するのか、または高悪性度（ＧＧ３～ＧＧ－５）の前立腺がんを有するのかを判断するステップと、を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記検出するステップが、マイクロアレイ法、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、ポリメラーゼ連鎖反応、核酸ハイブリダイゼーション、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項14】
前立腺がんのリスクがある対象におけるｓｎｃＲＮＡシグネチャーの集合の前記総発現プロファイルが、前立腺がんを有しない対象におけるｓｎｃＲＮＡ（配列番号１～２８０）のシグネチャー集合の前記総発現プロファイルよりも高いまたは低い、ｓｎｃＲＮＡ（配列番号１～２８０）のシグネチャー集合の総発現プロファイルの組み合わせである、請求項１に記載の方法。
【請求項15】
中／高悪性度（ＧＧ２～ＧＧ５）の前立腺がんを有する対象におけるｓｎｃＲＮＡシグネチャーの集合の前記総発現プロファイルが、無痛性もしくは低悪性度（ＧＧ１）前立腺がんを有する対象におけるｓｎｃＲＮＡ（配列番号２８１～５６０）のシグネチャー集合の前記総発現プロファイルよりも高いまたは低い、ｓｎｃＲＮＡ（配列番号２８１～５６０）シグネチャーの集合の総発現プロファイルの組み合わせである、請求項１に記載の方法。
【請求項16】
対象が前立腺がんであるか否かを診断するための方法であって、（ｉ）対象から生物学的サンプルを得ることと、
（ｉｉ）前記生物学的サンプルからの小分子非コードＲＮＡ（ｓｎｃＲＮＡ）のシグネチャー集合の総発現プロファイルを検出することであって、
前記シグネチャーｓｎｃＲＮＡの集合の総発現プロファイルを検出することが、前記生物学的サンプルから得られたｓｎｃＲＮＡに由来するｃＤＮＡの各々に特異的なハイブリダイズプローブを含み、
前記ハイブリダイズプローブが、配列番号１～２８０からなる群から選択される、検出することと、
（ｉｉｉ）前立腺がんを有しないか、または前立腺がんを有する標的集団からのトレーニングデータセットにおける配列番号１～２８０の発現を比較することにより、前記対象からの配列番号１～２８０の発現を相関させることと、
（ｉｖ）上記（ｉｉｉ）から得られた結果に基づいて、対象が前立腺のリスクを有する可能性を判断することと、を含む、方法。
【請求項17】
前立腺がんのリスクがあると判断された前記対象を再分析し、無痛性または侵攻性の前立腺がんを有する標的集団からのトレーニングデータセットにおける配列番号２８１～５６０の発現と比較することにより、無痛性（低悪性度、ＧＧ１）または中もしくは高悪性度（ＧＧ２～ＧＧ５）の前立腺がんのいずれかを有するとして前記対象をさらに分類する、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
中もしくは高悪性度（ＧＧ２～ＧＧ５）の前立腺がんのリスクがあると判断された前記対象を再分析し、低／中悪性度（ＧＧ１～ＧＧ２）の前立腺がんを有する標的集団からのトレーニングデータセットにおける配列番号５６１～８４０の発現と比較することにより、無痛性（低／中悪性度、ＧＧ１～ＧＧ２）または侵攻性もしくは高悪性度（ＧＧ３～ＧＧ５）の前立腺がんのいずれかを有するとして前記対象をさらに分類する、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
中もしくは高悪性度または侵攻性の前立腺がんを有するとして分類された前記対象が、根治的前立腺切除術、前立腺の近接照射療法、前立腺の放射線療法、ネオアジュバントホルモン療法およびアジュバントホルモン療法のうちの１つ以上で治療される、請求項１６および１７に記載の方法。
【請求項20】
前記生物学的サンプルが、無細胞尿である、請求項１６に記載の方法。
【請求項21】
前記生物学的サンプルが、尿中エクソソームである、請求項１６に記載の方法。
【請求項22】
前記生物学的サンプルが、尿中エクソソームから抽出されたｓｎｃＲＮＡである、請求項１６に記載の方法。
【請求項23】
前記ｓｎｃＲＮＡが、ｍｉＲＮＡ、Ｃ／ＤボックスｓｎｏＲＮＡ、Ｈ／ＡＣＡボックスｓｎｏＲＮＡ、ｓｃａＲＮＡ、ｐｉＲＮＡおよびｌｎｃＲＮＡを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項24】
前記ｓｎｃＲＮＡが、ｍｉＲＮＡおよびｓｎｏＲＮＡである、請求項１６に記載の方法。
【請求項25】
前記シグネチャーｓｎｃＲＮＡの集合の前記総発現プロファイルが、無痛性前立腺の生物学的サンプルにおける前記シグネチャーｓｎｃＲＮＡの集合の発現レベルよりも高いのか、または低いのかについて分析することをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項26】
前立腺がんのリスクがある対象を診断するための前記方法が、Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）前立腺がん（ＰＣａ）試験を実施することを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項27】
無痛性／低悪性度（ＧＧ－１）または中／高等度リスク（ＧＧ２～ＧＧ５）の前立腺がんを有するとして対象を診断するための前記方法が、Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）臨床的有意性（ＣＳ）試験を実施することを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項28】
低／中悪性度（ＧＧ－１～ＧＧ２）または高等度リスク（ＧＧ３～ＧＧ５）の前立腺がんを有するとして対象を診断するための前記方法が、Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）高悪性度（ＨＧ）試験を実施することを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項29】
前記診断するステップが、マイクロアレイ法、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、ポリメラーゼ連鎖反応、核酸ハイブリダイゼーション、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項30】
対象において前立腺がんを治療するための方法であって、（ｉ）患者から生物学的サンプルを得ることと、
（ｉｉ）前記生物学的サンプルからの小分子非コードＲＮＡ（ｓｎｃＲＮＡ）のシグネチャー集合の総発現プロファイルを検出することであって、
前記シグネチャーｓｎｃＲＮＡの集合の総発現プロファイルを検出することが、前記生物学的サンプルから得られたｓｎｃＲＮＡに由来するｃＤＮＡの各々に特異的なハイブリダイズプローブを含み、
前記ハイブリダイズプローブが、配列番号１～２８０からなる群から選択される、検出することと、
（ｉｉｉ）
（ａ）前立腺がんを有しないか、または前立腺がんを有する標的集団からのトレーニングデータセットにおける配列番号１～２８０の発現を比較し、
（ｂ）上記（ａ）から得られた結果に基づいて、前立腺がんを有する対象においてがんを有する可能性を判断することにより、前記対象からの配列番号１～２８０の発現を相関させることと、
（ｉｖ）無痛性もしくは低等度リスク（ＧＧ１）の前立腺がんを有する標的集団からのトレーニングデータセットにおける配列番号２８１～５６０の総発現プロファイルを比較することによって、前立腺がんを有する前記対象からの配列番号２８１～５６０の総発現プロファイルを再分析して、無痛性もしくは低等度リスク（ＧＧ１）または中／高悪性度（ＧＧ２～ＧＧ５）の前立腺がんのいずれかを有するとして前記対象をさらに分類することと、
（ｖ）中／高悪性度（ＧＧ２～ＧＧ５）の前立腺がんを有する前記対象を、（ａ）根治的前立腺切除術、（ｂ）前立腺の近接照射療法、（ｃ）前立腺の放射線療法、（ｄ）ネオアジュバントホルモン療法、（ｅ）アジュバントホルモン療法、および（ｆ）それらの組み合わせのうちの１つ以上で治療することと、を含む、方法。
【請求項31】
前記生物学的サンプルが、無細胞尿である、請求項３０に記載の方法。
【請求項32】
前記生物学的サンプルが、尿中エクソソームである、請求項３０に記載の方法。
【請求項33】
前記生物学的サンプルが、尿中エクソソームから抽出されたｓｎｃＲＮＡである、請求項３０に記載の方法。
【請求項34】
前記ｓｎｃＲＮＡが、ｍｉＲＮＡ、Ｃ／ＤボックスｓｎｏＲＮＡ、Ｈ／ＡＣＡボックスｓｎｏＲＮＡ、ｓｃａＲＮＡ、ｐｉＲＮＡおよびｌｎｃＲＮＡを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項35】
前記ｓｎｃＲＮＡが、ｍｉＲＮＡおよびｓｎｏＲＮＡを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項36】
前立腺がんのリスクがある対象を治療するための前記方法が、Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＰＣａ（ＰＣａ）試験を実施することを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項37】
無痛性／低悪性度（ＧＧ１）または中／高悪性度（ＧＧ２～ＧＧ５）の前立腺がんを有するとして対象を分類する前記対象を治療するための前記方法が、Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）臨床的有意性（ＣＳ）試験を実施することを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項38】
前記検出するステップが、マイクロアレイ法、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、ポリメラーゼ連鎖反応、核酸ハイブリダイゼーション、またはそれらの組み合わせを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項39】
前立腺がんを有すると診断された対象におけるｓｎｃＲＮＡのシグネチャー集合の前記総発現プロファイルが、前立腺がんを有しない対象における前記ｓｎｃＲＮＡ（配列番号１～２８０）のシグネチャー集合の前記総発現プロファイルよりも高いまたは低い、前記ｓｎｃＲＮＡ（配列番号１～２８０）のシグネチャー集合の総発現プロファイルの組み合わせである、請求項３０に記載の方法。中／高悪性度（ＧＧ２～ＧＧ－５）の前立腺がんを有する対象におけるｓｎｃＲＮＡのシグネチャー集合の前記総発現プロファイルが、無痛性もしくは低悪性度（ＧＧ１）の前立腺がんを有する対象における前記ｓｎｃＲＮＡ（配列番号２８１～８４０）のシグネチャー集合の前記総発現プロファイルよりも高いまたは低い、前記ｓｎｃＲＮＡ（配列番号２８１～８４０）のシグネチャー集合の総発現プロファイルの組み合わせである、請求項３０に記載の方法。
【請求項40】
対象ががんを有するのか、がんを有しないのかを判断し、がんを有する前記対象を、（ｉ）無痛性（低悪性度、ＧＧ１）、（ｉｉ）中もしくは高悪性度（ＧＧ２～ＧＧ５）、（ｉｉｉ）低／中等度リスク（ＧＧ１～Ｇ２）、または（ｉｖ）侵攻性（高悪性度、ＧＧ３～ＧＧ５）の前立腺がんを有するとして分類するためのシステムであって、（ｉ）
（ａ）情報価値のある配列について、第１のＯｐｅｎ Ａｒｒａｙプラットフォーム上で、配列番号１～２８０のｓｎｃＲＮＡ配列を調べ、
（ｂ）配列番号１～２８０の前記配列すべての前記総発現プロファイルおよび第１の分類アルゴリズムに含まれる配列間の相互作用を検査するＳｅｎｔｉｎｅｌスコアを求め、
（ｃ）前記情報価値のある配列についての前記（ｂ）におけるＳｅｎｔｉｎｅｌスコアを、前立腺がんを有するか、または前立腺がんを有しないことが知られている患者からのトレーニングデータセットにおいて得られたＳｅｎｔｉｎｅｌスコアと比較し、
（ｄ）前記対象が前立腺がんを有するのか、前立腺がんを有しないのかを判断するように構成された、第１のプロセッサであって、
前立腺がんを有すると判断された前記対象が、無痛性（低悪性度、ＧＧ１）または中もしくは高悪性度（ＧＧ２～ＧＧ５）の前立腺がんを有するとして分類される、第１のプロセッサと、
（ｉｉ）
（ａ）情報価値のある配列について、第２のＯｐｅｎ Ａｒｒａｙプラットフォーム上で、配列番号２８１～５６０のｓｎｃＲＮＡ配列を調べ、
（ｂ）配列番号２８１～５６０の前記配列すべての前記総発現プロファイルおよび第２の分類アルゴリズムに含まれる配列間の相互作用を検査するＳｅｎｔｉｎｅｌスコアを求め、
（ｃ）前記情報価値のある配列についての（ｆ）における前記Ｓｅｎｔｉｎｅｌスコアを、無痛性（低悪性度、ＧＧ１）または高悪性度（ＧＧ２～ＧＧ５）の前立腺がんを有することが知られている患者からのトレーニングデータセットにおいて得られたＳｅｎｔｉｎｅｌスコアと比較し、
（ｄ）前記対象が無痛性（低悪性度、ＧＧ１）の前立腺がんを有するのか、または高悪性度（ＧＧ２～ＧＧ５）の前立腺がんを有するのかを判断するように構成された、第２のプロセッサであって、
高悪性度（ＧＧ２～ＧＧ５）の前立腺がんを有すると判断された前記対象が、低／中等度リスク（ＧＧ１～ＧＧ２）または侵攻性（高悪性度、ＧＧ３～ＧＧ５）の前立腺がんを有するとしてさらに分類される、第２のプロセッサと、
（ｉｉｉ）
（ａ）情報価値のある配列について、第３のオープンアレイプラットフォーム上で、配列番号５６１～８４０のｓｎｃＲＮＡ配列を調べ、
（ｂ）配列番号５６１～８４０の前記配列すべての前記総発現プロファイルおよび第３の分類アルゴリズムに含まれる配列間の相互作用を検査するＳｅｎｔｉｎｅｌスコアを求め、
（ｃ）前記情報価値のある配列についての（ｊ）における前記Ｓｅｎｔｉｎｅｌスコアを、低／中等度リスク（ＧＧ１～ＧＧ２）または侵攻性（高悪性度、ＧＧ３～ＧＧ５）の前立腺がんを有することが知られている患者からのトレーニングデータセットにおいて得られたＳｅｎｔｉｎｅｌスコアと比較し、
（ｄ）前記対象が、低／中等度リスク（ＧＧ１～ＧＧ２）を有するのか、または侵攻性（高悪性度、ＧＧ３～ＧＧ５）を有するのかを判断するように構成された、第３のプロセッサと、を含む、システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年２月１８日に出願された米国仮特許出願第６２／９７８，１８４号および２０１９年３月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／８１９，３２５号の利益を主張するものであり、これらは参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２０年２月１８日に出願された米国仮特許出願第６２／９７８，１８４号および２０１９年３月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／８１９，３２５号の利益を主張するものであり、これらは参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【0002】
本発明は、前立腺がんを有する患者を診断、予後診断、モニタリング、および治療するための組成物および方法に関する。具体的には、本発明は、臨床的に有意な前立腺がんを特定するための発現シグネチャーとしてのｍｉＲＮＡおよびｓｎｏＲＮＡなどの小分子非コードＲＮＡ（ｓｎｃＲＮＡ）の使用に関する。
【背景技術】
【0003】
現在の前立腺がんのスクリーニング方法には、直腸指診とそれに続く前立腺特異抗原（ＰＳＡ）検査が含まれる。前者は侵襲的であり、後者は対象からの血液サンプルの採取を必要とする。
【0004】
疑わしいＤＲＥを有するおよび／またはＰＳＡレベルが上昇している患者は、体系的な１２針コア生検または磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）ガイド下の標的針生検を受ける。この標準的な診断戦略は、侵襲的で不正確であり、重大な費用のかかる罹患率、特に細菌感染症と関連している。
【0005】
ＰＳＡ検査には重大な欠点がある。前立腺がんを示すことに加えて、ＰＳＡレベルの上昇はまた、尿路感染症または前立腺炎（炎症、または前立腺もしくは良性前立腺肥大症（ＢＰＨ））を示している可能性がある。この検査は前立腺がんを過剰診断し、多くの男性が不必要にコア針生検を受ける。次いで、生検中に収集された前立腺組織が病理医によって検査され、疾患の悪性度を評価するグリソンスコアが割り当てられる。グリソンスコアは、２つの数値の合計である：（１）最も一般的な病理学における腫瘍の悪性度についての病理医の判断に基づいて病理医によって割り当てられた一次悪性度、（２）二番目に顕著な病理学における腫瘍の悪性度の判断に基づいた二次悪性度。各領域に、出現している腫瘍の侵攻性の程度に基づいて１～５のスコアが割り当てられ、２つの数値が合計されて、最終的なグリソンスコアが得られる。細胞が正常に近いように見える腫瘍には低いグリソンスコア（６以下、グリソン３＋３として報告）が割り当てられ、細胞が正常な前立腺の細胞と明らかに異なるように見える腫瘍には高いグリソンスコアが割り当てられる（７以上）。低いグリソンスコアに基づく低悪性度の腫瘍は、侵攻性である可能性が低くなり、一方、グリソンスコアが高い腫瘍は、侵攻性で転移する可能性が高くなる。グリソンスコアリングシステムには、実施以来問題となっている局面がある。最も注目すべきは、グリソン３＋４およびグリソン４＋３の腫瘍がいずれもグリソン７として報告されるという事実であるが、これらのグループの臨床転帰は明らかに異なる。この問題を解消するために、悪性度のグループ化と呼ばれるグリソンスコアの最近の改良が採用されている（悪性度グループ１（ＧＧ１）にはグリソン３＋３、ＧＧ２にはグリソン３＋４、ＧＧ３にはグリソン４＋３、ＧＧ４にはグリソン４＋４、およびＧＧ５にはグリソン５＋４以上が含まれる）。スコアリングシステムへのこの変更により、前立腺がんの組織病理学の報告が単純化され、「グリソン７」腫瘍と関連する曖昧さが解消され、結果の分類がより簡単になった。
【0006】
「上昇した」ＰＳＡ（＞３ｎｇ／ｍＬ）に基づいてコア針生検を推奨される患者の約５０～７０％は生検が陰性であり、ＰＳＡ＜３ｎｇ／ｍＬの男性の１４％は前立腺がんを有しているが、ＰＳＡレベルが低いため、定期的に生検を受けていない。ＰＳＡスクリーニングとコア針生検との組み合わせは侵襲的であり、パフォーマンス特性が低いため、医師と患者は治療オプションの選択のベースとなる信頼できる手段がない。その結果、多くの男性が不必要に臨床的介入、非常に多くの場合には前立腺切除術を選択する。また、グリソンスコアの「ゴールドスタンダード」自体が前立腺腫瘍の進行の信頼できる指標ではないため、新たな予後診断ツールの開発を妨げる。
【0007】
この問題は少なくとも３０年前から認識されている。これは、今日でも大きな問題である。その間に、倍数性、核形態および核マトリックス構造、マイクロアレイベースのトランスクリプトーム分析、ＤＮＡメチル化状況、およびＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＳファミリー融合などの遺伝子融合の検出を含む、侵攻性疾患の予後マーカーを開発する多くの試みが見られた。これらの方法論のいずれも、前立腺腫瘍の進行の指標としてグリソンスコアよりも有意に優れていることが証明されていない。さらに、それらの方法論は、がんの病期または悪性度を適切に特定しない。
【0008】
ｍＲＮＡ発現プロファイルを使用してがんの状態を区別するように設計された試験が開発されている。しかしながら、各々重大な欠点がある。まず、ほんのわずかな例外を除いて、これらのアッセイは根治的前立腺切除術試料に由来する腫瘍材料を使用していたため、せいぜい早期腫瘍再発を予測する程度である。継続的な臨床決定に関連する術後の臨床決定を行うのに潜在的に有用である一方、それらは手術前に前立腺がんの悪性度を区別するには役立たない。第二に、これらのゲノムアプローチの多くは、アンドロゲン受容体（ＡＲ）調節遺伝子発現、上皮－間質相互作用、および細胞周期など、前立腺がんの進行に関与している特定の経路に焦点を当てている。これらのアッセイは、すべての前立腺腫瘍が共通の経路に沿って進行することを前提としている。他の市販のバイオマーカーアッセイは、遺伝子の小さなサブセットのリアルタイムＰＣＲによって生成されたｍＲＮＡ発現プロファイルを使用する。
【0009】
今日まで、前立腺がんにおけるｓｎｃＲＮＡのゲノムワイドなトランスクリプトーム研究はほとんどなかった。１つの研究では、（ｉ）新たに凍結した根治的前立腺切除術サンプルおよび（ｉｉ）ＳａｎｇｅｒのｍｉＲＢａｓｅ ｖ．１０．１（Ｗｅｌｌｃｏｍｅ Ｓａｎｇｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）にカタログ化されている７２３個のヒトｍｉＲＮＡを含有するＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘのｍｉＲＮＡ（登録商標）ｖ．２マイクロアレイ上でのＩｌｌｕｍｉｎａ／Ｓｏｌｅｘａディープシーケンシングおよびマイクロアレイ分析を使用して、同じ患者からの隣接する正常組織におけるｍｉＲＮＡおよびｓｎｏＲＮＡシグネチャーを比較した。この研究は、前立腺がんおよび腫瘍周囲の良性組織において発現するｓｎｃＲＮＡの補体を比較するための貴重なデータセットを提供するが、臨床的介入前の腫瘍の進行の予後診断を行うおよび／またはそれを予測するｓｎｃＲＮＡのパネルの合理的な設計には役立たない。また、この技術は、手術後にのみ利用可能であり、診断に使用することができない顕微解剖された瞬間冷凍材料を必要とするため、一般的なスクリーニング技術としても障害がある。
【0010】
したがって、前立腺がんを予測し、スクリーニングし、分類する改善された方法が必要である。本開示は、高感度かつ特異的である前立腺がんの存在または不在をスクリーニングするための非侵襲的（不必要なコア針生検を排除または低減することによる）方法に関する。
【0011】
この方法はまた、疾患の診断、分類、予後診断、ならびにその進行および治療のモニタリングに有用な疾患管理のためのプラットフォームを提供する。開示された方法は、Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＰＣａ、Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＣＳ、およびＳｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＨＧ試験と組み合わせて、尿中エクソソームから単離された少なくとも２００個の小分子非コードＲＮＡ（ｓｎｃＲＮＡ）の大規模なセットの調査に基づいている。Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＰＣａ、Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＣＳ、およびＳｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＨＧ試験は、Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＰＣａ試験では前立腺がん（ＮＥＰＣ）の徴候がないか、もしくは前立腺がん（ＧＧ１～ＧＧ５）を有する；Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＣＳ試験では、低悪性度のがん（ＧＧ１）と、中悪性度および高悪性度のがん（ＧＧ２～ＧＧ５）を有する；ならびにＳｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＨＧ試験では、低悪性度および良好な中悪性度のがん（ＧＧ１＋ＧＧ２）と、良好でない中悪性度および高悪性度のがん（ＧＧ３～ＧＧ５）を有する大規模な標的集団からカタログ化されたｓｎＲＮＡ配列のアルゴリズム分析および比較に基づいている。単一の尿サンプルに対して実施することができる３つのＳｅｎｔｉｎｅｌ（商標）試験を使用して、患者が前立腺がんを有するか否か、および前立腺がんの患者がアクティブサーベイランスプロトコルでモニタリングできる低悪性度もしくは良好な中悪性度の疾患を有するのか、または即時治療が必要な高悪性度の疾患を有するのかを順次判断する。
【発明の概要】
【0012】
一態様において、本開示は、前立腺がんの対象をスクリーニングするための方法であって、（ｉ）対象から生物学的サンプルを得ることと、（ｉｉ）生物学的サンプルからの小分子非コードＲＮＡ（ｓｎｃＲＮＡ）のシグネチャー集合の総発現プロファイルを検出することであって、ｓｎｃＲＮＡの集合が、配列番号１～２８０を含む、検出することと、（ｉｉｉ）前立腺がん（ＮＥＰＣ）の徴候を有しないか、または前立腺がんを有する標的集団からのトレーニングデータセットにおける配列番号１～２８０の総発現プロファイルを比較することにより、対象からの配列番号１～２８０の総発現プロファイルを相関させることと、（ｉｖ）（ｉｉｉ）の結果に基づいて、ＮＥＰＣとして、または前立腺がんを有するとして対象を分類することと、を含む、方法を提供する。この手順は、Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＰＣａ試験において具体化される。
【0013】
さらに別の態様において、本開示は、がんを有すると診断された患者が低悪性度（ＧＧ１）を有するのか、または中もしくは高悪性度の疾患（ＧＧ２～ＧＧ５）を有するのかを判断する方法であって、（ｉ）対象から生物学的サンプルを得ることと、（ｉｉ）生物学的サンプルからの小分子非コードＲＮＡ（ｓｎｃＲＮＡ）のシグネチャー集合の総発現プロファイルを検出することであって、ｓｎｃＲＮＡの集合が、配列番号２８１～５６０を含む、検出することと、（ｉｉｉ）低等度リスク、低悪性度（ＧＧ１）または中および高悪性度、中および高等度リスクの前立腺がん（ＧＧ２～ＧＧ５）を有することが分かっている標的集団からのトレーニングデータセットにおける配列番号２８１～５６０の総発現プロファイルを比較することにより、対象からの配列番号２８１～５６０の総発現プロファイルを相関させることと、（ｉｖ）（ｉｉｉ）から得られた結果に基づいて、ＧＧ１またはＧＧ２～ＧＧ５として対象を分類することと、を含む、方法を提供する。この手順は、Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＣＳ試験において具体化される。
【0014】
さらに別の態様において、本開示は、がんを有すると診断された患者が高悪性度（ＧＧ３～ＧＧ５）を有するのか、または（低もしくは中悪性度の疾患（ＧＧ１＋ＧＧ２）を有するのかを判断する方法であって、（ｉ）対象から生物学的サンプルを得ることと、（ｉｉ）生物学的サンプルからの小分子非コードＲＮＡ（ｓｎｃＲＮＡ）のシグネチャー集合の総発現プロファイルを検出することであって、ｓｎｃＲＮＡの集合が、配列番号５６１～８４０を含む、検出することと、（ｉｉｉ）高悪性度、高等度リスクの前立腺がん（ＧＧ３～ＧＧ５）または低もしくは中等度リスクのがん（ＧＧ１＋ＧＧ２）を有することが分かっている標的集団からのトレーニングデータセットにおける配列番号５６１～８４０の総発現プロファイルを比較することにより、対象からの配列番号５６１～８４０の総発現プロファイルを相関させることと、（ｉｖ）（ｉｉｉ）から得られた結果に基づいて、ＧＧ３～ＧＧ５またはＧＧ１＋ＧＧ２として対象を分類することと、を含む、方法を提供する。この手順は、Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＨＧ試験において具体化される。
【0015】
さらに別の態様において、本開示は、前立腺がんを治療するための方法であって、（ｉ）対象から生物学的サンプルを得ることと、（ｉｉ）生物学的サンプルからの小分子非コードＲＮＡ（ｓｎｃＲＮＡ）のシグネチャー集合の総発現プロファイルを検出することであって、ｓｎｃＲＮＡの集合が、配列番号１～８４０を含む、検出することと、（ｉｉｉ）ＮＥＰＣ、ＧＧ１、ＧＧ２、ＧＧ３、ＧＧ４またはＧＧ５の前立腺がんを有する標的集団からのトレーニングデータセットにおける配列番号２８１～８４０の総発現プロファイルを比較することにより、対象からの配列番号１～８４０の総発現プロファイルを相関させることと、（ｉｖ）（ｉｉｉ）から得られた結果に基づいて、低－中悪性度の前立腺がん（ＧＧ１～ＧＧ２）または高悪性度の前立腺がん（ＧＧ３～ＧＧ５）を有するとして対象を分類することと、（ｖ）１つ以上の化学療法剤、ホルモン、免疫療法、放射線、凍結療法、手術またはそれらの組み合わせを施すことにより、高等度リスクの前立腺がんを有するとして分類された対象を治療することと、を含む、方法を提供する。
【0016】
さらなる態様において、本開示は、前立腺がんを有する対象の生存、疾患再発、または治療に対する応答の可能性を判断するための方法であって、（ｉ）対象から生物学的サンプルを得ることと、（ｉｉ）生物学的サンプルからの小分子非コードＲＮＡ（ｓｎｃＲＮＡ）のシグネチャー集合の総発現プロファイルを検出することであって、ｓｎｃＲＮＡの集合が、配列番号１～８４０を含む、検出することと、（ｉｉｉ）処理後の配列番号１～８４０の凝集発現プロファイルを処理前のものと比較することと、（ｉｖ）前立腺がん（ＮＥＰＣ）の徴候がないか、または前立腺がんを有する標的集団からのトレーニングデータセットにおける配列番号１～８４０の総発現プロファイルと、悪性度グループ１、２、３または４～５の標的集団からのトレーニングデータセットにおける配列番号１～８４０の凝集発現プロファイルとを比較することによって、対象からの配列番号１～８４０の総発現プロファイルを相関させることと、（ｖ）前立腺がんの治療を受けた被験者の生存、疾患再発、または治療に対する応答の可能性を判断することと、を含む、方法を提供する。
【0017】
一態様において、本開示は、対象の将来の前立腺がんを予測するための方法であって、（ｉ）対象から生物学的サンプルを得ることと、（ｉｉ）生物学的サンプルからの小分子非コードＲＮＡ（ｓｎｃＲＮＡ）のシグネチャー集合の総発現プロファイルを検出することであって、ｓｎｃＲＮＡの集合が、配列番号１～２８０を含む、検出することと、（ｉｉｉ）悪性度グループ１、２，３または４～５を有する標的集団からの標的集団からのトレーニングデータセットにおける配列番号１～２８０の総発現プロファイルを比較することにより、対象からの配列番号１～２８０の総発現プロファイルを相関させることと、（ｉｖ）（ｉｉｉ）から得られた結果に基づいて、対象が悪性度グループ２～５の前立腺がんを有するリスクを有する可能性を判断することと、（ｉｖ）１つ以上の化学療法剤、ホルモン、免疫療法、放射線、凍結療法、手術またはそれらの組み合わせを施すことにより、侵攻性前立腺がんを発症する高いリスクが予測される対象を治療することと、を含む、方法を提供する。
【0018】
別の態様において、本開示は、患者ががんを有しないのか、がんを有するのかを判断し、がんを有する対象を、（ｉ）無痛性（低悪性度、ＧＧ１）、（ｉｉ）中もしくは高悪性度（ＧＧ２～ＧＧ５）、（ｉｉｉ）低／中等度リスク（ＧＧ１～ＧＧ２）、または（ｉｖ）侵攻性（高悪性度、ＧＧ３～ＧＧ５）の前立腺がんとして分類するためのシステムであって、（ａ）情報価値のある配列についてｓｎｃＲＮＡ配列を調べ、（ｂ）Ｓｅｎｔｉｎｅｌスコアを判断し、比較して、対象が前立腺がんを有するのか、前立腺がんを有しないのかを判断し、前立腺がんの病期グループを分類するように構成された少なくとも３つのプロセッサを含む、システムを提供する。
【図面の簡単な説明】
【0019】
特許または出願ファイルには、カラーで作成された少なくとも１つの図面が含まれている。カラー図面を有する本特許または特許出願公開の写しは、要求に応じて、必要手数料を支払うことにより、官庁から提供される。
【図1】エクソソームは、初期のエンドソームにおいて形成され、細胞から放出される小さな細胞外の膜結合小胞である。エクソソームには、細胞の生物学を反映するタンパク質、ｍＲＮＡ、および一連のｓｎｃＲＮＡ［ｍｉＲＮＡとＣ／ＤボックスおよびＨ／ＡＣＡボックスの核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）］が含まれている。
【図2】市販のキットを使用して、無細胞尿を患者から採取する。尿中のエクソソームを捕捉し、ＲＮＡをエクソソームから抽出する。ＲＮＡ収量はＱｕｂｉｔアッセイ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して測定し、サンプル品質はＡｇｉｌｅｎｔ２１００バイオアナライザーを使用して評価する。得られたｓｎｃＲＮＡレベルは、ｍｉＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＰＣａ、Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＣＳ、またはＳｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＨＧ試験用に特別に設計されたカスタムメイドのＯｐｅｎＡｒｒａｙ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）プレートを使用して調べる。調べる（Ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｅ）は、生物学的サンプル中の多数の配列を同時に分析するための一般的な技術用語である。次に、ｓｎｏＲＮＡおよびｍｉｃｒｏＲＮＡ（まとめてｓｎｃＲＮＡと呼ばれる）の増幅曲線の結果の読み取り値を分析し、使用して、患者を診断する。がんが存在する場合は、疾患を分類し、それに応じて治療をモニタリングする。
【図3】複数のエンティティを使用して偏りのない統計的アプローチを確立し、重要な相互作用を特定して個々のｓｎｃＲＮＡおよびｓｎｃＲＮＡの組み合わせを特定し、悪性度のグループ化または前立腺がんの表現型を相関させることの複雑さを示している。（［０００４８］～［０００５１］を参照）。
【図4】前立腺がんを有する疑いのある患者のスクリーニングおよび診断の概略図を示している。 患者はまず、３層のＳｅｎｔｉｎｅｌ（商標）分析用の尿サンプルを提供する。総尿中エクソソームＲＮＡを抽出し、Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＰＣａ試験に固有のｓｎｃＲＮＡ（配列番号１～２８０）、Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＣＳ試験に固有のｓｎｃＲＮＡ（配列番号２８１～５６０）、およびＳｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＨＧ試験に固有のｓｎｃＲＮＡ（配列番号５６１～８４０）の発現について調べる。発現シグネチャーを使用して、患者を、前立腺がんを有する患者と有しない患者に分類する（Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＰＣａ試験、第１層）。スコアが陰性の患者は、モニタリングのために１２か月ごとに再訪する。 第２層では、Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＰＣａスコアが陽性の患者（前立腺がんの患者）を、Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＣＳ試験を使用して、臨床的に有意でない（ＧＧ１）腫瘍または臨床的に有意な腫瘍（ＧＧ２～ＧＧ５）に分類する二次分析にかける。臨床的に有意でない（ＧＧ１）腫瘍の患者は、腫瘍がＧＧ２以上に進行していないことを確認するために、アクティブサーベイランス（ＡＳ）が推奨され、四半期ごとのＳｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＣＳ試験で継続的にモニタリングされる。臨床的に有意な腫瘍（ＧＧ２～ＧＧ５）を有する患者は、即時治療のために紹介される。 一部の患者については、第３の分類層であるＳｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＨＧ試験により、ＧＧ１～ＧＧ２腫瘍またはＧＧ３～ＧＧ５腫瘍を有するとして患者をさらに分類する。この試験は、即時介入が必要なＧＧ３～ＧＧ５がんの患者を特定するように設計されている。ＧＧ１またはＧＧ２の患者を四半期ごとにＳｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＨＧ試験でモニタリングして、ＧＧ３に進行し、故に治療的介入が必要な患者を特定することができる。Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＣＳおよびＳｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＨＧの可用性は、患者と医療提供者の両方に、治療の意思決定のための個別化情報を提供する。
【図5】Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＰＣａ実験の出力を示している。ＰＣａ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ研究では、十分に特徴づけられた組織病理を有する非常に慎重に規定された患者コホートを使用して［ＮＥＰＣ＝８９；がん（ＧＧ１～ＧＧ５）＝１４６］、ｍｉＲ４．０マイクロアレイ上で調べた６，５９９個のｓｎｃＲＮＡの中で最も情報価値のある配列を特定する。図５（左パネル）：トレーニングデータセット内の非がん（ＮＥＰＣ）およびがん（ＧＧ１～ＧＧ５）の状態の散布図。正のＤｉｓｃｏｖｅｒｙ ＰＣａスコアは前立腺がんを有することを示し、負のＤｉｓｃｏｖｅｒｙＰＣａスコアはがんがないことを示す。コア生検の組織病理学によって判断されたがんの状態は、青（非がん）と赤（がん）の円で示されている。図５（右パネル）：Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＰＣａ試験の情報価値のあるｓｎｃＲＮＡの識別。独自の選択アルゴリズムを使用して、非がんとがんの状態とを区別するための最も情報価値のあるｓｎｃＲＮＡエンティティの識別（上位３５個が表示され、各円は単一のエンティティを表す）。結果として得られたＳｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＰＣａ試験は、棒グラフに示されているように、６０個のｓｎｏＲＮＡエンティティと８５個のｍｉＲＮＡエンティティで構成される１４５個の最も情報価値のあるｓｎｃＲＮＡ配列を含む２８０個のｓｎｃＲＮＡを調べる。緑：ｍｉＲＮＡエンティティ、黄色：ｓｎｏＲＮＡエンティティ。
【図6】（左パネル）Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＣＳ実験の出力を示している。ＣＳ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ研究では、十分に特徴づけられた組織病理を有する非常に慎重に規定された患者コホートを使用して［ＧＧ１＝９０；ＧＧ２～ＧＧ５＝５６］、ｍｉＲ４．０マイクロアレイ上で調べた６，５９９個のｓｎｃＲＮＡの中で最も情報価値のある配列を特定する。正のＤｉｓｃｏｖｅｒｙ ＣＳスコアは、ＧＧ２～ＧＧ５のがん（黄色の円）を有することを示し、負のＤｉｓｃｏｖｅｒｙ ＣＳスコアは、ＧＧ１のがんを有することを示す。（緑色の円）図６（右パネル）：Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＣＳ試験の情報価値のあるｓｎｃＲＮＡの識別。独自の選択アルゴリズムを使用して、ＧＧ１のがんとＧＧ２～ＧＧ５のがんとを区別するための最も情報価値のあるｓｎｃＲＮＡエンティティの識別（上位３５個が表示され、各円は単一のエンティティを表す）。結果として得られたＳｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＣＳ試験は、棒グラフに示されているように、６６個のｓｎｏＲＮＡエンティティと１３０個のｍｉＲＮＡエンティティで構成される１４５個の最も情報価値のあるｓｎｃＲＮＡ配列を含む２８０個のｓｎｃＲＮＡを調べる。緑：ｍｉＲＮＡエンティティ、黄色：ｓｎｏＲＮＡエンティティ。
【図7】（左パネル）Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＨＧ実験の出力を示している。ＨＧ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ研究では、十分に特徴づけられた組織病理を有する非常に慎重に規定された患者コホートを使用して［ＧＧ１＋ＧＧ２＝１８１；ＧＧ３～ＧＧ５＝５５］、ｍｉＲ４．０マイクロアレイ上で調べた６，５９９個のｓｎｃＲＮＡの中で最も情報価値のある配列を特定する。正のＤｉｓｃｏｖｅｒｙ ＨＧスコアは、ＧＧ３～ＧＧ５のがん（紫色の円）を有することを示し、負のＤｉｓｃｏｖｅｒｙ ＨＧスコアは、ＧＧ１＋ＧＧ２のがんを有することを示す（茶色の円）。図７（右パネル）：Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＨＧ試験の情報価値のあるｓｎｃＲＮＡの識別。独自の選択アルゴリズムを使用して、ＧＧ１のがんとＧＧ２～ＧＧ５のがんとを区別するための最も情報価値のあるｓｎｃＲＮＡエンティティの識別（上位３５個が表示され、各円は単一のエンティティを表す）。結果として得られたＳｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＣＳ試験は、棒グラフに示されているように、６６個のｓｎｏＲＮＡエンティティと１３０個のｍｉＲＮＡエンティティで構成される１９６個の最も情報価値のあるｓｎｃＲＮＡ配列を含む２８０個のｓｎｃＲＮＡを調べる。緑：ｍｉＲＮＡエンティティ、黄色：ｓｎｏＲＮＡエンティティ。
【図8A-8C】Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＰＣａ試験を使用した尿中エクソソームｓｎｃＲＮＡのハイスループットＯｐｅｎＡｒｒａｙ（商標）調査の臨床的検証を示す。１４３６人の男性（Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＰＣａフェーズで特定されたｓｎｃＲＮＡの調査を相互検証するために使用されたトレーニンググループにおける８３６人の対象と、検証研究で使用された６００人の独立した対象）の症例対照研究からのデータが示されている。
【図8A】６００人の患者（非がん３００人；がん３００人）を検査する検証グループセットにおけるがん状態の散布図。非がん（黒丸）およびがん（緑丸）患者の分類であって、Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＰＣａスコアが正の場合は前立腺がんを有することを示し、Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＰＣａスコアが負の場合はがんがないことを示す。
【図8B】６００人の患者を検査する検証グループセットにおけるがん状態のソートされたプロット。非がん（黒丸）およびがん（緑丸）患者の分類であって、Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＰＣａスコアが正の場合は前立腺がんを有することを示し、Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＰＣａスコアが負の場合はがんがないことを示す。
【図8C】Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＰＣａ試験の受信者操作曲線（ＲＯＣ）。図８Ａおよび８Ｂに示す試験グループ中の６００人の患者の分析に関するＲＯＣ曲線は、様々なユーザー定義の偽陰性率を連続して計算する（１－特異度）ことによって計算した。表６に報告されているパフォーマンス特性（［０００１１２］を参照）は、ユーザー定義の偽陰性率０．０５（赤で表示）からであった。
【図9A-9C】Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＣＳ試験を使用した尿中エクソソームｓｎｃＲＮＡのハイスループットＯｐｅｎＡｒｒａｙ（商標）調査の臨床的検証を示す。１４３６人の男性（Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＣＳフェーズで特定されたｓｎｃＲＮＡの調査を相互検証するために使用されたトレーニンググループにおける８３６人の対象と、検証研究で使用された６００人の独立した対象）の症例対照研究からのデータが示されている。
【図9A】３００人の前立腺がん患者（ＧＧ１－低悪性度１４６人およびＧＧ２～ＧＧ５中および高悪性度１５４人）を検査する検証グループセットにおけるがん状態の散布図。低悪性度（青緑色の円）ならびに中および高悪性度のがん（オレンジ色の円）患者の分類であり、正のＳｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＣＳスコアの場合は高悪性度の前立腺がんを有することを示し、負のＳｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＣＳスコアの場合は低悪性度のがんを示す。
【図9B】３００人の前立腺がん患者を検査する、図９Ａに示すような検証グループセットにおけるがん状態のソートされたプロット。低悪性度（青緑色の円）および高悪性度のがん（オレンジ色の円）患者の分類であり、正のＳｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＣＳスコアの場合は高悪性度の前立腺がんを有することを示し、負のＳｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＣＳスコアの場合は低悪性度のがんを示す。
【図9C】Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＣＳ試験の受信者操作曲線（ＲＯＣ）。図９Ａおよび９Ｂに示すような３００人の前立腺がん患者の分析に関するＲＯＣ曲線は、様々なユーザー定義の偽陰性率を連続して計算する（１－特異度）ことによって計算した。表６に報告されているパフォーマンス特性（［０００１１２］を参照）は、ユーザー定義の偽陰性率０．０５（赤で表示）からであった。
【図10A-10C】Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＨＧ試験を使用した尿中エクソソームｓｎｃＲＮＡのハイスループットＯｐｅｎＡｒｒａｙ（商標）調査の臨床的検証を示す。１４３６人の男性（Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＨＧフェーズで特定された同じｓｎｃＲＮＡの調査を相互検証するために使用されたトレーニンググループにおける８３６人の対象と、検証研究で使用された６００人の独立した対象）の症例対照研究からのデータが示されている。
【図10A】３００人の前立腺がん患者（ＧＧ１＋ＧＧ２低悪性度２００人およびＧＧ３～ＧＧ５中および高悪性度１００人）を検査する検証グループセットにおけるがん状態の散布図。低悪性度（青緑色の円）ならびに中および高悪性度のがん（オレンジ色の円）患者の分類であり、正のＳｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＣＳスコアの場合は高悪性度の前立腺がんを有することを示し、負のＳｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＣＳスコアの場合は低悪性度のがんを示す。
【発明を実施するための形態】
【0020】
本主題は、本開示の一部を形成する以下の詳細な説明を参照することにより、より容易に理解することができる。本発明は、本明細書に記載および／または示される特定の製品、方法、条件またはパラメータに限定されず、使用される用語は、例としてのみ特定の態様および実施形態を説明することを目的としており、特許請求された発明を限定することを意図しない。
【0021】
本開示は、対象における前立腺がんをスクリーニング、診断および治療するための方法に関する。本方法は、（１）前立腺がんの状態が不明な男性患者を分類し、（２）患者からの生物学的サンプル中の前立腺がんの悪性度を正確に区別するための堅牢な試験を提供する。本方法は、患者の生物学的サンプルからのｓｎｃＲＮＡの集合の総発現プロファイルの検出および相関に基づいて、患者が前立腺がんを有するか否かを、Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＰＣａ試験を使用して判断する。前立腺がんを有すると特定された患者の場合、Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）臨床的有意性（ＣＳ）試験を使用して、エクソソームｓｎｃＲＮＡをさらに調べ、臨床的に有意または侵攻性（ＧＧ２～ＧＧ５）の前立腺がんを有する患者を、臨床的に有意でないか、または無痛性（ＧＧ１）の前立腺がんを有する患者から区別し、Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）高悪性度（ＨＧ）試験を使用して、高悪性度、高等度リスク（ＧＧ３～ＧＧ５）の前立腺がんを有する患者を特定する。
【0022】
開示された方法は、個々の配列の重要な相互作用および目的の表現型に最もよく相関する配列の組み合わせを特定するために開発された偏りのない統計的アプローチに基づいている。このアプローチは、（ｉ）ｍＲＮＡに対するｍｉＲＮＡの修飾効果、および（ｉｉ）リボソームＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびその他の核ＲＮＡの転写後修飾による、ｍＲＮＡの翻訳可能性に対するｓｎｏＲＮＡの影響に基づいており、タンパク質の機能および表現型を変化させる新たなタンパク質産物をもたらす。
【0023】
開示された計算／統計的アプローチは、尿中エクソソームｓｎｃＲＮＡを分析して、ｓｎｃＲＮＡ間の重要な関連を非常に詳細に分析し、前立腺がんの表現型を正確に予測するＳｅｎｔｉｎｅｌ配列を特定する。これは、添付の図３に示されている。例えば、単一エンティティ分析では、個々のｓｎｃＲＮＡの発現レベルは、前立腺がんの悪性度グループ（表現型）と相関している。各ｓｎｃＲＮＡエンティティには、２つの情報価値のある結果がある。対照の病状（例えば、がんがない）と比較したエンティティの発現レベルの増加または発現レベルの低下である。２つの表現型間で発現に変化がないということは、（１）どちらの表現型とも関連がなく、（２）エンティティがどちらの表現型のマーカーとしても有用でないことを示している。したがって、単一のエンティティを分析に使用した場合、情報価値のある結果は２つだけであり、可能なすべてのｓｎｃＲＮＡ相互作用はまだ探求されていない。
【0024】
２つのエンティティの分析では、２つのエンティティ間の可能なすべての相互作用の表現の変化の関連を調べると、８つの異なる情報価値のある結果と１つの情報価値のない結果が得られる（どちらのエンティティも表現型の点で異なって発現していない場合）（図３の「２つのエンティティの調査」を参照）。したがって、Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）試験との関連では、２つのｓｎｃＲＮＡエンティティの可能なすべての組み合わせと特定の悪性度グループとの関連を比較すると、ｓｎｃＲＮＡのペアと悪性度グループとの間の有意義な関連につながる８つの異なる方式がある。これにより、ｓｎｃＲＮＡの発現レベルと悪性度のグループ化との間の隠れた関連を明らかにする、より詳細な分析が提供される。
【0025】
３つまたは４つ以上のｓｎｃＲＮＡエンティティの同じアプローチを使用すると、ｓｎｃＲＮＡの発現と表現型（悪性度のグループ化）との関連の非常に詳細な分析を提供するため、疾患状態が不明な患者を評価し、アルゴリズムによって選択された尿中エクソソームｓｎｃＲＮＡの発現レベルを使用して個々の疾患状態を予測することを可能にする。
【0026】
Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＰＣａおよびＳｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＨＧ試験、Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＣＳプラットフォームの開発
Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＰＣａ試験は、シグネチャーｓｎｃＲＮＡ（つまり、ｍｉＲＮＡおよびｓｎｏＲＮＡ配列）レベルの集合の分析に基づく分類プラットフォームまたはアルゴリズムである。各配列の予測値は、前立腺生物学における配列の事前に決定された生物学的役割とは別個のデータ駆動型選択アルゴリズムを介して規定される。選択アルゴリズムは、以下からなるデータセット上でトレーニングされる：（１）前立腺がんとは関係のない状態について泌尿器科で提示された対照対象；（２）生検結果に基づいて前立腺がんを有しないことが分かっている前立腺がんの疑いのある対象；および（３）前立腺がんと診断され、そのコア針生検組織病理学が悪性度グループ１～５（ＧＧ１～ＧＧ５）として報告された患者。
Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＰＣａ試験は、シグネチャーｓｎｃＲＮＡ（つまり、ｍｉＲＮＡおよびｓｎｏＲＮＡ配列）レベルの集合の分析に基づく分類プラットフォームまたはアルゴリズムである。各配列の予測値は、前立腺生物学における配列の事前に決定された生物学的役割とは別個のデータ駆動型選択アルゴリズムを介して規定される。選択アルゴリズムは、以下からなるデータセット上でトレーニングされる：（１）前立腺がんとは関係のない状態について泌尿器科で提示された対照対象；（２）生検結果に基づいて前立腺がんを有しないことが分かっている前立腺がんの疑いのある対象；および（３）前立腺がんと診断され、そのコア針生検組織病理学が悪性度グループ１～５（ＧＧ１～ＧＧ５）として報告された患者。
【0027】
Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）試験用の堅牢なデータセットを確立するために、これらのトレーニングセットの患者の尿中エクソソームから得られたエクソソームｓｎｃＲＮＡを、ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘのｍｉＲ４．０マイクロアレイを使用して調べ、発現シグネチャーを定義した。十分に特徴づけられた組織病理を有する選択された対象を使用するこれらの研究は、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＰＣａ試験、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＣＳ試験、およびＤｉｓｃｏｖｅｒｙ ＨＧ試験と呼ばれる。「非がん」グループに含まれる患者は、泌尿器腫瘍学とは関係のない問題について泌尿器科クリニックで診察を受けた同年齢の男性、および前立腺がん（ＮＥＰＣ）の徴候を示さなかった１つ以上の１２針診断コア針生検を受けた男性から慎重に選択した。「がん」コホートの患者については、各腫瘍のコア針生検の病理学的悪性度グループ分類を徹底的に評価した。これらの慎重に選択された患者のグループ（非がん、およびがんの様々な段階にあるがんグループ）は、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＰＣａ、ＣＳおよびＨＧ試験の開発におけるトレーニングセットを形成する。Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ実験に使用された２３５人の患者の人口統計を表４に示す（［０００１０３］～［０００１０４］を参照）。
【0028】
選択アルゴリズム
がんと非がんを区別する最も情報価値のあるｓｎｃＲＮＡ配列を、前立腺がんを有しない患者（ＮＥＰＣ）と前立腺がんを有する患者（ＧＧ１～ＧＧ５）との間でどのｓｎｃＲＮＡ配列が異なって表されるかを判断する選択アルゴリズムを使用して識別した。これは、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＰＣａ試験について以下に例示される。選択アルゴリズムは、尿中エクソソームｓｎｃＲＮＡのレベルが、慎重に定義された病理を有する大規模な参加者集団［ＮＥＰＣを有する対象８９人と、がん（ＧＧ１～ＧＧ５）を有する患者１４６人］の疾患の病理学的病期（がん／非がん）とどの程度よく相関しているかを試験する。選択アルゴリズムは、ｍｉＲ４．０アレイ上で調べた６，５９９個のｓｎｃＲＮＡの各々が、腫瘍の既知の病理とどの程度よく相関しているかを個別に評価する。多くのｓｎｃＲＮＡは協調的に調節されるため、アルゴリズムは２つのｓｎｃＲＮＡ、３つのｓｎｃＲＮＡ、または４つのｓｎｃＲＮＡのすべての組み合わせを評価し、その後、疾患の病理における個々のｓｎｃＲＮＡの重要度を評価するためのリーブワンアウト戦略を使用して個々のｓｎｃＲＮＡを検査する。予想されるように、選択アルゴリズムから６，５９９個のｓｎｃＲＮＡ配列の大半を除外しても、どちらの病理とも異なって関連付けられないため、前立腺がんを有する場合と有しない場合の区別に影響はない。ｓｎｃＲＮＡｓ評価の影響は、図５（右パネル）に示す重要度プロットを使用して視覚化することができる。重要度プロットは次のことを示している：（１）いくつかのエクソソームｓｎｃＲＮＡは異なる病理において異なるレベルで存在する、（２）ｓｎｃＲＮＡはｓｎｏＲＮＡおよびｍｉＲＮＡであり、１つのタイプのｓｎｃＲＮＡが開示された分析には不十分であることを示している、（３）アルゴリズムを使用した診断は、分類評価において２８０個を超えるｓｎｃＲＮＡ配列では変化しない。
がんと非がんを区別する最も情報価値のあるｓｎｃＲＮＡ配列を、前立腺がんを有しない患者（ＮＥＰＣ）と前立腺がんを有する患者（ＧＧ１～ＧＧ５）との間でどのｓｎｃＲＮＡ配列が異なって表されるかを判断する選択アルゴリズムを使用して識別した。これは、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＰＣａ試験について以下に例示される。選択アルゴリズムは、尿中エクソソームｓｎｃＲＮＡのレベルが、慎重に定義された病理を有する大規模な参加者集団［ＮＥＰＣを有する対象８９人と、がん（ＧＧ１～ＧＧ５）を有する患者１４６人］の疾患の病理学的病期（がん／非がん）とどの程度よく相関しているかを試験する。選択アルゴリズムは、ｍｉＲ４．０アレイ上で調べた６，５９９個のｓｎｃＲＮＡの各々が、腫瘍の既知の病理とどの程度よく相関しているかを個別に評価する。多くのｓｎｃＲＮＡは協調的に調節されるため、アルゴリズムは２つのｓｎｃＲＮＡ、３つのｓｎｃＲＮＡ、または４つのｓｎｃＲＮＡのすべての組み合わせを評価し、その後、疾患の病理における個々のｓｎｃＲＮＡの重要度を評価するためのリーブワンアウト戦略を使用して個々のｓｎｃＲＮＡを検査する。予想されるように、選択アルゴリズムから６，５９９個のｓｎｃＲＮＡ配列の大半を除外しても、どちらの病理とも異なって関連付けられないため、前立腺がんを有する場合と有しない場合の区別に影響はない。ｓｎｃＲＮＡｓ評価の影響は、図５（右パネル）に示す重要度プロットを使用して視覚化することができる。重要度プロットは次のことを示している：（１）いくつかのエクソソームｓｎｃＲＮＡは異なる病理において異なるレベルで存在する、（２）ｓｎｃＲＮＡはｓｎｏＲＮＡおよびｍｉＲＮＡであり、１つのタイプのｓｎｃＲＮＡが開示された分析には不十分であることを示している、（３）アルゴリズムを使用した診断は、分類評価において２８０個を超えるｓｎｃＲＮＡ配列では変化しない。
【0029】
Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＣＳ試験（低等度リスクの前立腺がん（ＧＧ１）と、中および高等度リスクの前立腺がん（ＧＧ２～ＧＧ５）とを区別する）の情報価値のある配列は、適切な悪性度グループおよび同じ選択戦略を使用して特定した（図６）。この分析のための患者集団には、ＮＥＰＣを有する対象８９人およびがん（ＧＧ１～ＧＧ５）患者１４６人が含まれていた。］
【0030】
（低および中等度リスク（ＧＧ１＋ＧＧ２）の前立腺がんと、高悪性度、高等度リスク（ＧＧ３～ＧＧ５）の前立腺がんとを区別するＤｉｓｃｏｖｅｒｙ ＨＧ試験の情報価値のある配列も同様に判断した（図７）。この分析のための患者集団には、ＧＧ１＋ＧＧ２がん患者１８１人およびＧＧ３～ＧＧ５がん患者５５人が含まれていた。（図７）。
【0031】
一部のｓｎｃＲＮＡは試験間で共通であるが、疾患状態の分類におけるそれらの相対的な重要度は試験ごと（つまり、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＰＣａ試験、ＣＳ試験およびＨＧ試験）に異なることに留意することが重要である。
【0032】
各試験について、最も情報価値のある２８０個のｓｎｃＲＮＡ配列番号１～８４０）を使用して、カスタマイズされたＯｐｅｎＡｒｒａｙ（商標）プラットフォームを設計した。各Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）試験用のＯｐｅｎＡｒｒａｙ（商標）プラットフォームを、１４３６人の患者を対象とした大規模な症例対照研究でさらに検証した。Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＰＣａ試験、Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＣＳ試験、およびＳｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＨＧ試験のトレーニングと検証に使用された対象の人口統計を表５に示す（［０００１０９］～［０００１１０］を参照）。検証データセットを特定するために、６００人の対象の層化無作為サンプルを選択した。残りの８３６人の対象は、トレーニングデータセットとした。６００人の患者の検証サンプルは、生検陰性の対象と生検陽性の対象が同数（各３００人）であり、生検陽性の症例のうち、２００人がＧＧ１＋ＧＧ２（ＧＧ１が１４６人とＧＧ２が５４人）ならびに１００人がＧＧ３～ＧＧ５であるように層化した。
【0033】
前立腺がんを特定するためのＳｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＰＣａ試験
Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＰＣａ試験、Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＣＳ試験、およびＳｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＨＧ試験は、疾患状態が不明な各患者のｓｎｃＲＮＡ発現シグネチャーを入力とし、Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）スコアを生成する分類アルゴリズムに基づいている。疾患状態が不明な（ただし、発現シグネチャーは分かっている）将来の患者を分類するための感度を、ユーザー定義のレベル（通常９５％以上）で制御する（トレーニングデータセットの相互検証から得た）所定のカットオフ値と、このスコアを比較して、参加者を分類する。
Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＰＣａ試験、Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＣＳ試験、およびＳｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＨＧ試験は、疾患状態が不明な各患者のｓｎｃＲＮＡ発現シグネチャーを入力とし、Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）スコアを生成する分類アルゴリズムに基づいている。疾患状態が不明な（ただし、発現シグネチャーは分かっている）将来の患者を分類するための感度を、ユーザー定義のレベル（通常９５％以上）で制御する（トレーニングデータセットの相互検証から得た）所定のカットオフ値と、このスコアを比較して、参加者を分類する。
【0034】
Ｓｅｎｔｉｎｅｌ ＰＣａスコアを、将来の患者に対する感度を例えば９５％の望ましいレベルで制御する計算されたカットオフと比較して、ＰＣａ試験で前立腺がんを有するのか、有しないのかを区別する（図７）。Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＰＣａ試験は、２８０個のｓｎｃＲＮＡ（Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＰＣａ試験で特定）を利用し、そのうち１４５個の固有のｓｎｃＲＮＡ（６０個のｍｉＲＮＡと８５個のｓｎｏＲＮＡ）が非常に情報価値がある。これは、前立腺がんを有するのか、有しないのかに患者を分けるために使用される分類境界を定義する。カットオフは、患者をがん／非がんに分けるＳｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＰＣａスコアが、患者を２０回中１９回（つまり、９５％の感度で）がんを有するとして正しく分類するように、アルゴリズムによって判断される。
【表1-1】
【表1-2】
【表1-3】
【表1-4】
【表1-5】
【表1-6】
【表1-7】
【表1-8】
【表1-9】
【表1-10】
【表1-11】
【表1-12】
【0035】
低悪性度（無痛性）の前立腺がんを特定するためのＳｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＣＳ試験
Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）臨床的有意性（ＣＳ）試験は、同様の分類アルゴリズムを使用して、計算されたカットオフと比較されるＳｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＣＳスコアを生成する。カットオフは、将来の患者に対する感度を望ましいレベル（９５％）で制御し、臨床的に有意ながん（ＧＧ２～ＧＧ５）（Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＣＳスコアがカットオフ以上の場合）と臨床的に有意でないがん（ＧＧ１）（Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＣＳスコアがカットオフよりも小さい場合）とを区別する。アルゴリズムは、Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＰＣａ試験のトレーニングに使用されるデータセットにおいて前立腺がんを有することが分かっている患者のサブセットのみを使用してトレーニングされる。同様に、分類アルゴリズムを使用して、Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＣＳ試験の発現シグネチャーを定義するための基礎として２８０個のｓｎｃＲＮＡを使用した。Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＣＳ試験は、（Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＣＳ試験で特定された２８０個のｓｎｃＲＮＡを利用し、そのうち１３５個の固有のｓｎｃＲＮＡ（１３０個のｍｉＲＮＡと６６個のｓｎｏＲＮＡ）が非常に情報価値がある。
Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）臨床的有意性（ＣＳ）試験は、同様の分類アルゴリズムを使用して、計算されたカットオフと比較されるＳｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＣＳスコアを生成する。カットオフは、将来の患者に対する感度を望ましいレベル（９５％）で制御し、臨床的に有意ながん（ＧＧ２～ＧＧ５）（Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＣＳスコアがカットオフ以上の場合）と臨床的に有意でないがん（ＧＧ１）（Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＣＳスコアがカットオフよりも小さい場合）とを区別する。アルゴリズムは、Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＰＣａ試験のトレーニングに使用されるデータセットにおいて前立腺がんを有することが分かっている患者のサブセットのみを使用してトレーニングされる。同様に、分類アルゴリズムを使用して、Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＣＳ試験の発現シグネチャーを定義するための基礎として２８０個のｓｎｃＲＮＡを使用した。Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＣＳ試験は、（Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＣＳ試験で特定された２８０個のｓｎｃＲＮＡを利用し、そのうち１３５個の固有のｓｎｃＲＮＡ（１３０個のｍｉＲＮＡと６６個のｓｎｏＲＮＡ）が非常に情報価値がある。
【表2-1】
【表2-2】
【表2-3】
【表2-4】
【表2-5】
【表2-6】
【表2-7】
【表2-8】
【表2-9】
【表2-10】
【表2-11】
【表2-12】
【表2-13】
【0036】
高悪性度の前立腺がん患者を特定するためのＳｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＨＧ試験
前立腺がんを有するとして分類された個人の場合、同様のアプローチを使用して、ＧＧ１＋ＧＧ２（低および良好な中等度リスクのがん）と、好ましくない中および高等度リスクの前立腺がん（ＧＧ３～ＧＧ５）とを区別するＳｅｎｔｉｎｅｌ（商標）高悪性度（ＨＧ）をトレーニングおよび検証した。特定されたこれらの情報価値のある配列は、Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＨＧ試験の基礎を形成する。追加の分析により、ｓｎｃＲＮＡの同じコホートを使用して、がん患者をＧＧ３～５（高等度リスクがん）からＧＧ１＋ＧＧ２（低および中等度リスクのがん）に分けることが可能であることが実証された。この生物統計分析は、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＨＧ試験によって特定された２８０個のｓｎｃＲＮＡを利用するＳｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＨＧ試験の基礎を形成し、そのうち２８０個の固有のｓｎｃＲＮＡ（１９１個のｍｉＲＮＡと８９個のｓｎｏＲＮＡ）が非常に情報価値がある。
前立腺がんを有するとして分類された個人の場合、同様のアプローチを使用して、ＧＧ１＋ＧＧ２（低および良好な中等度リスクのがん）と、好ましくない中および高等度リスクの前立腺がん（ＧＧ３～ＧＧ５）とを区別するＳｅｎｔｉｎｅｌ（商標）高悪性度（ＨＧ）をトレーニングおよび検証した。特定されたこれらの情報価値のある配列は、Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＨＧ試験の基礎を形成する。追加の分析により、ｓｎｃＲＮＡの同じコホートを使用して、がん患者をＧＧ３～５（高等度リスクがん）からＧＧ１＋ＧＧ２（低および中等度リスクのがん）に分けることが可能であることが実証された。この生物統計分析は、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＨＧ試験によって特定された２８０個のｓｎｃＲＮＡを利用するＳｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＨＧ試験の基礎を形成し、そのうち２８０個の固有のｓｎｃＲＮＡ（１９１個のｍｉＲＮＡと８９個のｓｎｏＲＮＡ）が非常に情報価値がある。
【表3-1】
【表3-2】
【表3-3】
【表3-4】
【表3-5】
【表3-6】
【表3-7】
【表3-8】
【表3-9】
【表3-10】
【表3-11】
【表3-12】
【表3-13】
【0037】
Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＰＣａ試験、ＣＳ試験、およびＨＧ試験でのｓｎｃＲＮＡの選択は、ＰＳＡ、グリソンスコア、または生物学的経路分析とは無関係であるため、完全に偏りがない。その理由として、コア針生検が陽性もしくは陰性（ＰＣａ試験）である参加者のコホート、またはＣＳ試験のための進行性疾患（ＧＧ３～５）もしくは非進行性疾患（ＰＣａの徴候なし、もしくはＧＧ１－１）のいずれかを有するとして分類された患者（ＧＧ３～５）で構成される独立したトレーニングセットから得たｓｎｃＲＮＡレベルを使用してアルゴリズムが検証されたためである。（表４、［０００１０３］～［０００１０４］および表５、［０００１０９］～［０００１１０］を参照）、この統計的手法は、タイプ１エラー（偽陰性）とタイプ２エラー（偽陽性）の両方を最小限に抑え、試験を確実にする。非がんと低悪性度のがん、低悪性度のがんと中悪性度のがん、および中悪性度の疾患と高悪性度の疾患とを厳密に区別する。分析で使用されたアルゴリズムに基づいて、記載された発明は、偽陰性がなく、非常に低い（＜５％）偽陽性率を有する。
【0038】
上記の３つの試験に基づいて、ＯｐｅｎＡｒｒａｙ（商標）プラットフォームは、３つの試験の感度と特異度を損なうことなく、尿中エクソソームから抽出されたｓｎｃＲＮＡの単一サンプルに存在する情報価値のあるＲＮＡエンティティを順次調べる。
【0039】
一態様において、本開示は、前立腺がんを診断するための方法であって、臨床的に有意な腫瘍と無痛性の腫瘍とを区別し、調べたサブセットｓｎｃＲＮＡに基づくデータを、独立したトレーニングデータセットに基づいて検証されたアルゴリズムに入れることを可能にするプラットフォームを含む、方法を提供する。
【0040】
一態様では、男性患者の前立腺がんを診断するための方法は、（１）患者から生物学的サンプルを得ることと、（２）配列番号１～２８０からなる群から選択される複数の核酸またはハイブリダイズプローブに結合するシグネチャー小分子非コードＲＮＡ（ｓｎｃＲＮＡ）の集合の総発現プロファイルを検出することと、（３）ＰＣａ試験を使用してシグネチャーｓｎｃＲＮＡの集合の総発現プロファイルを相関させて、患者が前立腺がんのリスクを有するか否か、つまり、前立腺がんの徴候がないのか、または前立腺がんを有するのかを判断する。
【0041】
別の態様において、本開示は、それを使用して前立腺がんをスクリーニングするための方法を提供する。さらに別の態様では、本開示は、対象における前立腺の確率を予測するための方法を提供する。
【0042】
前立腺がんのリスクがあると特定された（つまり、前立腺がんを有すると判断された）患者の場合、Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）臨床的有意性（ＣＳ）試験を使用してサンプルを再分析し、臨床的に有意または侵攻性の前立腺がん（ＧＧ２～ＧＧ５）の患者を、臨床的に有意でないまたは無痛性（ＧＧ１）前立腺がんの患者から区別する。一実施形態において、複数のシグネチャーｓｎｃＲＮＡもしくはシグネチャーｓｎｃＲＮＡの集合の総発現プロファイルまたは組み合わせた発現プロファイルが、前立腺がんの生物学的サンプルにおける総発現プロファイル以上である場合、患者は侵攻性の前立腺がんを有すると特定される。あるいは、シグネチャーｓｎｃＲＮＡの集合の総発現プロファイルが、低悪性度の前立腺がんの生物学的サンプルにおける総発現プロファイル以下である場合、患者は、低悪性度の前立腺がんを有すると特定される。
【0043】
一実施形態において、生物学的サンプルには、前立腺組織、血液、血漿、血清、尿、尿上清、尿細胞ペレット、脳脊髄液、精液、前立腺分泌物、および前立腺細胞が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、生物学的サンプルは尿サンプルである。さらに別の実施形態において、サンプルは、尿サンプルから単離されたエクソソームである。好ましい実施形態において、サンプルは、尿サンプルに由来するエクソソームから単離されたｓｎｃＲＮＡである。
【0044】
エクソソームは、真核細胞のエンドソーム区画に由来する小さな細胞外小胞（ＥＶ）である。それらは、血液、尿、精液、および脳脊髄液などの体液中に見られる。エクソソームの生合成はよく理解されていない。しかしながら、それらは、初期エンドソーム経路が分岐して、エクソソーム経路の最初の段階である後期エンドソームおよび多小胞エンドソームを形成する時点で生じることが一般に認められている。エクソソームには、細胞の細胞質と核小体領域にそれぞれ由来するｍｉＲＮＡと核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）を含むｓｎｃＲＮＡが含有されている。腫瘍微小環境におけるエクソソームおよびＥＶの存在は、前立腺がんおよび他のがんを含む多くの腫瘍タイプの悪性腫瘍と関連している。
【0045】
特定の実施形態において、エクソソームから単離されたｓｎｃＲＮＡは、精液、血液、前立腺分泌物、および脳脊髄液に由来する。さらなる実施形態において、エクソソームは、前立腺がん細胞、リンパ球、および前立腺組織からの細胞を含むがん細胞から単離される。
【0046】
エクソソームを単離するための方法は当技術分野で周知であり、エクソソームＲＮＡ単離キット（Ｎｏｒｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｋ Ｃｏｒｐ．、カナダ、オンタリオ）などのキットを使用して実施することができる。ｓｎｃＲＮＡの収量は、蛍光光度計（Ｑｕｂｉｔ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって定量化することができ、単離されたｓｎｃＲＮＡの品質は、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００バイオアナライザーを使用して評価される。
【0047】
単離されたエクソソームから抽出されたＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｃａＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、およびｅｘＲＮＡを含む低分子非コードＲＮＡ（ｓｎｃＲＮＡ）と総称される低分子ＲＮＡの混合物である。それらのサイズ（＜２００ヌクレオチド）のために、ｓｎｃＲＮＡは、例えば、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織または尿を含む生物学的サンプルから容易に抽出される。ｓｎｃＲＮＡは、固定または抽出中には分解されないため、ＦＦＰＥ組織からのｍＲＮＡの抽出に固有の問題が回避される。生物学的サンプルからの約１０ｎｇのｓｎｃＲＮＡの収量は、上記のＮｏｒｇｅｎのエクソソームＲＮＡ単離キットを使用する複数の分析に十分である。
【0048】
抽出されたｓｎｃＲＮＡはｃＤＮＡに逆転写され、ｃＤＮＡはＲＮＡよりも安定しているため、より長期間の保存が可能である。得られたｃＤＮＡは、シグネチャーｓｎｃＲＮＡプローブもしくはゲノムアレイもしくはマイクロアレイチップ（ｍｉＲ４．０アレイ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）など）の選択されたセットまたは集合とハイブリダイズして、さらに分析を行う。情報価値のあるｓｎｃＲＮＡプローブのセットの選択は、ＰＳＡ、グリソンスコア、または生物学的経路とは無関係である。シグネチャーｓｎｃＲＮＡの選択されたセットまたは集合は、配列番号１～２８０、２８１～５６０および５６１～８４０を含む。セット内のｓｎｃＲＮＡ配列またはプローブの数は、１４５～１９６の範囲であり、Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＰＣａ、Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＣＳ、およびＳｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＨＧ試験を実行するには、２８０個以下のｓｎｃＲＮＡ配列が好ましい。試験は、アルゴリズムに最大２８０個のｓｎｃＲＮＡ配列が追加されているため、より正確である。分析に２８０個を超えるｓｎｃＲＮＡ配列を追加しても、アッセイの精度は向上しない。
【0049】
リアルタイムＰＣＲまたはＲＴ－ＰＣＲは、しばしばｑＰＣＲまたはＲＴ－ｑＰＣＲとして知られ、標的配列の絶対量を定量化するため、またはサンプル間の標的配列の相対量を比較するために実施される。ＲＴ－ｑＰＣＲは、増幅中に放出される標的固有の（プローブ）蛍光シグナルを介して、標的の増幅をリアルタイムでモニタリングする。バックグラウンド蛍光は、標的に対して配列特異的プローブを使用しているにもかかわらず、ほとんどのＲＴ－ｑＰＣＲ反応中に発生するため、バックグラウンド蛍光シグナルの問題は、リアルタイムＰＣＲにおける２つの値を考慮することで対処することができる：（１）閾値ライン（Ｃｔ）および（２）サイクルの定量化（Ｃｑ）。値。閾値ライン（Ｃｔ）は、反応がバックグラウンドレベルを超える蛍光強度に達したときの検出レベルである。これは、反応曲線が指数関数的フェーズを開始する点（変曲点）である。Ｃｑまたはサイクル定量値は、サンプルの反応曲線が閾値ラインと交差するＰＣＲサイクル数である。したがって、Ｃｑ，の値は、サンプルから実際のシグナルを検出するのにかかったサイクル数、つまりイベントまでの時間を示す。イベントは蛍光の飽和であり、検出の最大レベルを示す。ＲＴ－ｑＰＣＲの実行により各サンプルの反応曲線が得られるため、多くのＣｑ値がある。ＰＣＲサイクラーのソフトウェアは、サンプルの各々のＣｑ値を計算してグラフ化する。値はサンプル中の標的核酸の量に反比例し、サンプル中の標的コピーの数と相関する。Ｃｑ値がより低い（通常は２９サイクル未満）場合は、標的配列の量が多いことを示す。逆に、Ｃｑ値が高い（３８サイクルを超える）場合は、サンプル中の標的核酸の量が少ないことを示す。しかしながら、反応曲線の傾きが最大のときにＣｑを使用するのではなく、傾きがゼロになったときにイベントまでの時間値を得ることができる。一実施形態において、ｓｎｃＲＮＡは、ＲＴ－ｑＰＣＲを使用して調べられる。別の実施形態において、ｓｎｃＲＮＡは、ｑＰＣＲを使用して調べられる。さらなる実施形態において、尿中エクソソームから単離されたｓｎｃＲＮＡは、製造業者の指示に従って、ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘのＧｅｎｅＣｈｉｐ（商標）ｍｉＲＮＡ ４．０アレイを使用して調べられる。
【0050】
トレーニングセットから得られたこれらの情報価値のある配列（通常は２８０個の配列）は、ＯｐｅｎＡｒｒａｙプラットフォームに転送される。次に、状態が不明な患者サンプルがＯｐｅｎＡｒｒａｙプラットフォーム上で調べられ、分類アルゴリズムを使用してＳｅｎｔｉｎｅｌスコアが判断される。患者の状態はＳｅｎｔｉｎｅｌスコアから判断される。
【0051】
一実施形態では、前立腺がんの状態が不明な患者からのｓｎｃＲＮＡレベルをＯｐｅｎＡｒｒａｙプラットフォーム上で調べ、次に、疾患状態が不明な患者からのＳｅｎｔｉｎｅｌスコアをトレーニングセットのスコアと比較して、患者の状態を判断することができる。
【0052】
一実施形態において、例えば、ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘのＧｅｎｅＣｈｉｐ（商標）ｍｉＲＮＡ ４．０アレイ上でＲＴ－ｑＰＣＲを使用して、前立腺疾患の状態が不明な患者（試験サンプル）からの試験サンプル中のｓｎｃＲＮＡレベルの分析から得られたデータを、健康な患者（がんの徴候なし）または前立腺がんを有する対象から得られた健康な細胞からのデータと比較することができる。試験サンプルからのｓｎｃＲＮＡレベルの分析から得られたデータを、健康な（非がん）および非健康な（泌尿生殖器がんを有する）患者を分析することによって確立された臨床ベースラインと比較することもでき、非健康な患者を、様々な特定のがんのタイプにさらに分類することができ、これを、特定のがんのタイプ（例えば、前立腺がんなど）の様々な段階または重症度、および特定の疾患の様々な段階にさらに分類することができる。一実施形態では、ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘのＧｅｎｅＣｈｉｐ（商標）ｍｉＲＮＡ ４．０アレイ上でＲＴ－ｑＰＣＲを使用して試験サンプル中のｓｎｃＲＮＡ発現の分析から得られたデータを、健康な患者（がんの徴候なし）からのデータと比較するか、またはこのデータを、健康な（非がん）患者と非健康な（前立腺がんを有する）患者を分析することによって確立された臨床ベースラインと比較し、非健康な患者を、前立腺がんの様々な段階（ＧＧ１およびＧＧ２～ＧＧ５、またはＧＧ１＋２およびＧＧ３～ＧＧ５）にさらに分類する。
【0053】
いくつかの実施形態において、本方法は、ＯｐｅｎＡｒｒａｙ（商標）技術（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、ｓｎｃＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ）のパネルを調べる。ＯｐｅｎＡｒｒａｙ（商標）技術は、４８個のサブアレイを有する顕微鏡スライドサイズのプレートを使用する。各サブアレイには６４個の貫通孔があり、各孔の直径は３００μｍ、深さは３００μｍである。表面張力を介して試薬を貫通孔内に保持するために、孔は親水性および疎水性コーティングで処理されている。ＯｐｅｎＡｒｒａｙ（商標）技術は、３，０７２個の貫通孔（４８×６４）を備えており、多数のサンプル、アッセイ、またはその両方を使用するリアルタイムＰＣＲ研究を合理化するためのシステムを提供する。したがって、このシステムは、微量のサンプルおよび試薬を使用して、遺伝子発現用サンプルを短時間で大量に処理することを可能にする。本方法は、各ｓｎｃＲＮＡの発現レベルと生検（少なくとも１２コア針生検）の等級付けに依存するアルゴリズムを採用している。前立腺がんの場合、方法論は、血清前立腺特異抗原（ＰＳＡ）レベル、グリソンスコア（どちらも有意義な腫瘍進行マーカーではない）、または患者の年齢とは無関係である。この方法論は、生物学的経路の分析とも無関係である。本発明の方法は、対象から単離されたｓｎｃＲＮＡ（例えば、尿サンプル、尿エクソソーム、または前立腺組織サンプル）を使用して、男性を、前立腺がんを有する人（無痛性（臨床的に有意でない）または侵攻性（臨床的に有意である）の両方）と有しない人に層化する。この方法論は、前立腺がんの主要なスクリーニングアッセイとして血清ＰＳＡの代わりに使用することができる。
【0054】
一態様では、本開示は、病理（グリソンスコア）、腫瘍体積、またはＰＳＡに依存しない分類アルゴリズムに供される、調べたシグネチャーｓｎｃＲＮＡの集合の総発現プロファイルに基づいて臨床的に有意な前立腺がんを区別する方法を提供する。がんの転帰が分かっている患者の生物学的サンプルから抽出されたＲＮＡは、逆転写され、ｓｎｃＲＮＡを含む全ゲノムアレイ（例えば、ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘのＧｅｎｅＣｈｉｐ ｍｉＲ４．０など）に対してハイブリダイズされる。臨床的に有意な前立腺腫瘍において特異的に調節される小分子非コードＲＮＡが特定される。一実施形態において、配列番号２８１～５６１のプローブにハイブリダイズするｓｎｃＲＮＡを特定するＯｐｅｎ Ａｒｒａｙからのシグナルの絶対値が、臨床的に有意な（ＧＧ２～５）前立腺がん腫瘍に見られる総発現プロファイルと比較される。別の実施形態において、配列番号５６１～８４０のプローブにハイブリダイズするｓｎｃＲＮＡを特定するＯｐｅｎ Ａｒｒａｙからのシグナルの総計値が、臨床的に低い悪性度および良好な中間悪性度（ＧＧ１＋ＧＧ２）と、良好でない中悪性度および高悪性度（ＧＧ３～ＧＧ５）の前立腺がん腫瘍に見られる絶対発現プロファイルと比較される。
【0055】
開示された方法は、尿サンプルが受け取られてからＳｅｎｔｉｎｅｌスコアを得るまでの７２～９６時間での前立腺がんの予後の堅牢かつ正確な判断を提供する。別の実施形態において、配列番号２８１～５６０および５６１～８４０に結合する特定されたｓｎｃＲＮＡの総発現プロファイルが、臨床的に有意な前立腺がんにおけるｓｎｃＲＮＡの総発現プロファイルと比較される。別の実施形態において、配列番号２８１～５６０および５６１～８４０に結合する、調べた特定されたｓｎｃＲＮＡの総発現プロファイルが、臨床的に有意な前立腺がんにおけるｓｎｃＲＮＡの総発現プロファイルと比較される。さらなる実施形態において、配列番号２８１～５６０および５６１～８４０に結合する特定されたｓｎｃＲＮＡの総発現プロファイルが、臨床的に有意な前立腺がんサンプルにおけるｓｎｃＲＮＡの総発現プロファイルと比較される。その結果、適切な治療オプション（またはその欠如）を開始することができる。
【0056】
相対的総発現プロファイルという用語は、同じ意味で使用される。少なくとも複数のｓｎｃＲＮＡの総発現プロファイルが組み合わされ、臨床的に有意な前立腺がん組織における同じ総発現プロファイルと比較される。いくつかの実施形態において、少なくとも４０個のｓｎｃＲＮＡが組み合わされ、臨床的に有意な前立腺がん組織における同じ総発現プロファイルと比較される。いくつかの実施形態において、少なくとも９０個のｓｎｃＲＮＡが組み合わされ、臨床的に有意な前立腺がん組織における同じ総発現プロファイルと比較される。いくつかの実施形態において、少なくとも１５０個のｓｎｃＲＮＡが組み合わされ、臨床的に有意な前立腺がん組織における同じ総発現プロファイルと比較される。いくつかの実施形態において、少なくとも２００個のｓｎｃＲＮＡが組み合わされ、臨床的に有意な前立腺がん組織における同じ総発現プロファイルと比較される。好ましい実施形態において、少なくとも２２４個のｓｎｃＲＮＡおよび２８０個以下のｓｎｃＲＮＡが組み合わされ、臨床的に有意な前立腺がん組織における同じ総発現プロファイルと比較される。特定の実施形態において、低悪性度の前立腺がん組織における総発現プロファイルと比較してより高い総発現プロファイルは、患者が侵攻性の前立腺がんを有し、治療が必要であることを示す。他の実施形態において、低悪性度の前立腺がん組織における総発現プロファイル以下の総発現プロファイルは、患者が侵攻性の前立腺がんを有しておらず、モニタリングは必要であるが治療は不必要であることを示す。
【0057】
いくつかの実施形態において、選択されたｓｎｃＲＮＡの総発現プロファイルは、ｓｎｃＲＮＡの様々なタイプの調節された発現の総計である。調節された発現は、健康な前立腺組織、低悪性度の前立腺がん組織、または高悪性度の前立腺がん組織などの他の組織／腫瘍タイプにおける同じｓｎｃＲＮＡと比較して、発現プロファイルを増減させることができる。
【0058】
他の実施形態において、選択されたｓｎｃＲＮＡの総発現プロファイルは、特定のｓｎｃＲＮＡの減少した総発現プロファイルの総計、ならびに同じ組織サンプル中の他のｓｎｃＲＮＡの増加した総発現プロファイルの総計であり得る。例えば、シグネチャーｓｎｃＲＮＡの集合の進行スコアまたは総発現プロファイルには、別の組織タイプまたは同じ組織サンプル中の他のｓｎｃＲＮＡと比較して、総発現プロファイルが減少した１つ以上のｓｎｃＲＮＡが含まれ、残りのｓｎｃＲＮＡの１つ以上は、同じ組織サンプル中の別の組織タイプまたは他のｓｎｃＲＮＡと比較して増加した総発現レベルを示す。特異的に調節されたｓｎｃＲＮＡの集合の総発現プロファイルは、前立腺腫瘍が臨床的に有意であるか否かを示す洗練された、偏りのない指標となる。正常組織と比較して、単に個々の標的分子の存在もしくは不在、または単純な増加または減少を評価するだけの他の方法とは異なり、開示された方法は、前立腺組織サンプルの真に偏りのない、独立した、多変量分析を提供し、それにより、前立腺がん腫瘍が臨床的に有意であるか否かについての驚くほど正確な診断を可能にする。
【0059】
いくつかの態様において、本方法は、転移およびがんの病期分類をモニタリングするためのシグネチャーｓｎｃＲＮＡの集合の総発現プロファイルの使用を提供する。
【0060】
別の態様では、本開示は、開示された分類アルゴリズムを使用して調べられ、分析されるシグネチャーｓｎｃＲＮＡの集合の総発現プロファイルに基づいて泌尿器悪性腫瘍を検出するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、悪性腫瘍は前立腺のがんである。
【0061】
本開示は、前立腺がんを有する患者の臨床転帰を予測するためのアルゴリズムに基づく分子診断アッセイを提供する。１つ以上のｓｎｃＲＮＡの発現レベルを単独で使用することも、機能遺伝子サブセットに配置して、臨床転帰の可能性を予測するために使用可能な定量的スコアを計算することもできる。
【0062】
「定量的スコア」は、開示されたｓｎｃＲＮＡもしくはｓｎｃＲＮＡサブセットの特定の発現プロファイルと前立腺がん患者の臨床転帰の可能性との相関など、より複雑な定量的情報の分析を単純化もしくは開示もしくは通知するのに役立つ、算術的または数学的に計算された数値である。定量的スコアは、特定のアルゴリズムを適用することによって求めることができる。開示された方法において定量的スコアを計算するために使用されるアルゴリズムは、ｓｎｃＲＮＡの発現プロファイル値をグループ化することができる。ｓｎｃＲＮＡのグループ化は、本明細書で考察されるグループのように、生理学的機能または構成要素の細胞の特性によるｓｎｃＲＮＡの相対的寄与についての知識に少なくとも部分的に基づいて実施され得る。ｓｎｃＲＮＡグループの定量的スコア（「ｓｎｃＲＮＡグループスコア」またはＳｅｎｔｉｎｅｌ（商標）スコア）を求めることができる。さらに、グループの形成は、定量的スコアに対する、遺伝子または遺伝子サブセットの様々な総発現プロファイルの寄与の数学的重み付けを容易にすることができる。生理学的プロセスまたは構成要素の細胞の特性を表すｓｎｃＲＮＡまたはｓｎｃＲＮＡｓグループの重み付けは、がんの病理およびがんの再発またはアップグレード／アップステージなどの臨床転帰に対する当該プロセスまたは特性の寄与を反映することができる。本発明は、定量的スコアを計算するためのいくつかのアルゴリズムを提供する。例えば、本開示における分類アルゴリズムは、異なる疾患状態を区別するためのＳｅｎｔｉｎｅｌスコアを開発するために同様に機能する。分類アルゴリズムは、臨床的に有意な疾患状態と有意でない疾患状態のトレーニングデータセットから様々なｓｎｃＲＮＡ配列を選択する。
【0063】
一方、選択アルゴリズムは、尿中エクソソームｓｎｃＲＮＡの総発現プロファイルが、既知の病理を有する大規模な参加者集団において、疾患の病理学的病期（がん／非がん）とどの程度よく相関するかを試験する。選択アルゴリズムは、ｍｉＲ４．０アレイ上で調べた６，５９９個のｓｎｃＲＮＡの各々が、参加者の既知の病理とどの程度よく相関しているかを個別に評価する。次に、ｍｉＲ４．０アレイによって調べられた６，５９９個のｓｎｃＲＮＡのうちの２つのｓｎｃＲＮＡ、３つのｓｎｃＲＮＡ、または４つのｓｎｃＲＮＡのすべての組み合わせを繰り返し評価し、その後、疾患の病理学におけるリーブワンアウト戦略を使用して個々のｓｎｃＲＮＡを検査する。次に、Ｏｐｅｎ Ａｒｒａｙを使用して選択したｓｎｃＲＮＡを調べることにより、疾患状態が不明な患者のＳｅｎｔｉｎｅｌスコアを求め、このスコアをトレーニングデータセットからのスコアと比較することにより、臨床状態を判断する。本発明の一実施形態において、定量的スコアの増加は、陰性の臨床転帰の可能性の増加を示す。
【0064】
定量的スコアおよび累積的または絶対的な総発現プロファイルに基づいて、治療方法を判断することもできる。前立腺がんを治療する方法には、前立腺組織の完全な外科的除去のための手術、有効量の放射線の投与、および前立腺がんの治療のための治療有効量の薬物の投与、または上記の組み合わせが含まれる。
【0065】
本発明の方法の実施によって提供されるアルゴリズムに基づくアッセイおよび関連情報は、前立腺がんにおける最適な治療の意思決定を容易にする。例えば、このような臨床ツールを使用すると、医師が侵攻性のがんを有する可能性が低い患者を特定することを可能にするため、３か月、６か月、または１２か月ごとの定期的なフォローアップまたはアクティブサーベイランスを除いて、さらなる医学的介入は必要ない。非がん患者は、年に一度のフォローアップのために医学的介入を再度受けることを必要としない。侵攻性がんを発症するリスクがある患者は、１つ以上の化学療法剤（例えば、タキソテール、カバジタキセル、ドセタキセル、ミトキサントロン、エピルビシン、パクリタキセルおよびエストラムスチンなど）、ホルモン療法（例えば、リュープロレリン、ゴセレリン、およびトリプトレリンなどのテストステロンの産生を防ぐためのホルモン放出ホルモンアゴニスト、またはテストステロンががん細胞に到達するのを防ぐ抗アンドロゲン薬、例えば、ビカルタミンデおよびニルタミド）、免疫療法、放射線、凍結療法、手術またはそれらの組み合わせによる治療を含むがこれらに限定されない医学的介入を必要とする。
【0066】
治療を受ける患者は、開示された方法を使用してモニタリングされ、治療に対する患者の応答を判断する。一態様において、本開示は、治療に対する患者の応答を判断する方法であって、（ｉ）患者から生物学的サンプルを得ることと、（ｉｉ）生物学的サンプルからの小分子非コードＲＮＡ（ｓｎｃＲＮＡ）のシグネチャー集合の総発現プロファイルを検出することであって、ｓｎｃＲＮＡの集合が配列番号１～２８０、２８１～５６０および５６１～８４０を含む、検出することと、（ｉｉｉ）配列番号１～２８０、２８１～５６０および５６１～８４０の総発現プロファイルを、治療前のものと比較することによって治療後の対象からの配列番号１～２８０、２８１～５６０および５６１～８４０のｓｎｃＲＮＡの総発現プロファイルを相関させることと、（ｉｖ）患者が治療対して応答するか否か、および治療法の変更が必要であるか否かを判断することと、を含む、方法を提供する。一実施形態において、本方法は、次いで、上記（ｉｉｉ）からのｓｎｃＲＮＡのシグネチャー集合の結果として生じる総発現プロファイルを、悪性度グループが分かっている前立腺を有する標的集団からの大規模なトレーニングデータセットについてのｓｎｃＲＮＡのシグネチャー集合の総発現プロファイルと比較し、シグネチャーｓｎｃＲＮＡの集合の総発現プロファイルおよびその悪性度グループのＳｅｎｔｉｎｅｌスコアに基づき、（ａ）患者の前立腺がんが安定している（悪性度グループと比較して明らかな変化がない）か否か、（ｂ）患者が治療に応答する、すなわち患者が良くなる（結果が、より低い悪性度グループの腫瘍に類似した腫瘍を示す）か否か、または（ｃ）患者が応答しない（結果がより高い悪性度グループの腫瘍に類似している腫瘍を示す場合、患者が悪化する）か否かを判断する。治療法の変更には、投与される化学療法剤、放射線、免疫療法剤またはホルモンの濃度または量の調整、使用される薬剤のうちの１つ以上の添加または除去が含まれるが、これらに限定されない。
【0067】
別の態様では、本開示は、トレーニングデータセットの配列番号１～２８０、２８１～５６０、および５６１～８４０の総発現プロファイルと患者の以前のプロファイルとを比較することによって、配列番号１～２８０、２８１～５６０、および５６１～８４０を含むシグネチャーｓｎｃＲＮＡの集合の総発現プロファイルに基づいて、疾患の再発、疾患の進行、または生存の可能性を判断するための方法を提供する。
【0068】
別の態様において、本開示は、患者ががんを有しないのか、がんを有するのかを判断し、がんを有する対象を、（ｉ）無痛性（低悪性度、ＧＧ１）、（ｉｉ）中もしくは高悪性度（ＧＧ２～ＧＧ５）、（ｉｉｉ）低／中等度リスク（ＧＧ１～ＧＧ２）、または（ｉｖ）侵攻性（高悪性度、ＧＧ３～ＧＧ５）の前立腺がんとして分類するためのシステムであって、（ａ）情報価値のある配列についてｓｎｃＲＮＡ配列を調べ、（ｂ）Ｓｅｎｔｉｎｅｌスコアを判断し、比較して、対象が前立腺がんを有するのか、前立腺がんを有しないのかを判断し、がんを有すると判断された対象を、様々な悪性度グループ（例えば、低悪性度、中／高悪性度、低／中等度リスク、または侵攻性悪性度のがん）に分類するように構成された少なくとも３つのプロセッサを含む、システムを提供する。がんの徴候がないと判断された対象は、医学的介入を必要とせず、年に一度フォローアップのために再訪する。低悪性度または低／中悪性度の前立腺がんを有すると判断された対象は、３、６、または１２か月ごとの定期的なフォローアップまたはアクティブサーベイランスを除いて、医学的介入を必要とせず、中悪性度／高悪性度または侵攻性の前立腺がんを有すると判断された対象は、医学的介入を必要とする。
【実施例】
【0069】
本発明のこの態様および他の態様を、以下の非限定的な例によってさらに例証する。
【0070】
実施例１
研究対象集団：
Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＰＣａおよびＳｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＣＳ試験の開発および検証には、２つの独立した患者コホートを使用した。がんを有するか、またはがんを有しないとして患者を分類するためのＳｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＰＣａを開発するべく使用した２３３人の参加者の臨床的特性および人口統計学的特性は、シグネチャーｓｎＲＮＡの集合の統計分析に基づいていた。がんを有するとして分類された患者の場合、Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＣＳ試験を使用して、ＧＧ１（無痛性、低等度リスクのがん）の患者を、ＧＧ２～５（それぞれ中、高等度リスクおよび侵攻性のがん）から区別する。Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＣＳ試験はまた、腫瘍をＧＧ１とＧＧ２～５とに分類するための第２の分類アルゴリズムを使用するシグネチャーｓｎｃＲＮＡの別の集合の統計分析に基づいている。両方の試験のｓｎｃＲＮＡを、ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘのｍｉＲ４．０アレイによって調べる。
研究対象集団：
Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＰＣａおよびＳｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＣＳ試験の開発および検証には、２つの独立した患者コホートを使用した。がんを有するか、またはがんを有しないとして患者を分類するためのＳｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＰＣａを開発するべく使用した２３３人の参加者の臨床的特性および人口統計学的特性は、シグネチャーｓｎＲＮＡの集合の統計分析に基づいていた。がんを有するとして分類された患者の場合、Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＣＳ試験を使用して、ＧＧ１（無痛性、低等度リスクのがん）の患者を、ＧＧ２～５（それぞれ中、高等度リスクおよび侵攻性のがん）から区別する。Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＣＳ試験はまた、腫瘍をＧＧ１とＧＧ２～５とに分類するための第２の分類アルゴリズムを使用するシグネチャーｓｎｃＲＮＡの別の集合の統計分析に基づいている。両方の試験のｓｎｃＲＮＡを、ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘのｍｉＲ４．０アレイによって調べる。
【0071】
尿の収集および処理
Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＰＣａおよびＣＳ試験の開発のための尿サンプル、および米国を拠点とする後ろ向き研究のコホートは、２つの臨床サイトであるＡｌｂａｎｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ（米国、ニューヨーク州アルバニー）およびＳＵＮＹ Ｄｏｗｎｓｔａｔｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ（米国、ニューヨーク州ブルックリン）で、臨床検査のための訪問日に収集した。後ろ向き研究の残りのサンプルは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｅａｌｔｈ Ｎｅｔｗｏｒｋ（カナダ、トロント）のＧＵＢｉｏＢａｎｋから取得され、－２０℃で凍結されてｍｉＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃの研究所へ大量に出荷された。患者の情報は、各参加サイトの治験審査委員会によって承認されたとおりに収集され、匿名化された。前立腺がんの診断は、コア針生検の組織病理学的等級付けによって得られた。コアあたりの腫瘍のパーセンテージと陽性コアの数を使用して、悪性度グループ（ＧＧ）を評価した。
Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＰＣａおよびＣＳ試験の開発のための尿サンプル、および米国を拠点とする後ろ向き研究のコホートは、２つの臨床サイトであるＡｌｂａｎｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ（米国、ニューヨーク州アルバニー）およびＳＵＮＹ Ｄｏｗｎｓｔａｔｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ（米国、ニューヨーク州ブルックリン）で、臨床検査のための訪問日に収集した。後ろ向き研究の残りのサンプルは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｅａｌｔｈ Ｎｅｔｗｏｒｋ（カナダ、トロント）のＧＵＢｉｏＢａｎｋから取得され、－２０℃で凍結されてｍｉＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃの研究所へ大量に出荷された。患者の情報は、各参加サイトの治験審査委員会によって承認されたとおりに収集され、匿名化された。前立腺がんの診断は、コア針生検の組織病理学的等級付けによって得られた。コアあたりの腫瘍のパーセンテージと陽性コアの数を使用して、悪性度グループ（ＧＧ）を評価した。
【0072】
尿サンプルを遠心分離して、遊離細胞と破片を除去した。ＲＮＡは、エクソソームＲＮＡ単離キット（Ｎｏｒｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｋ、ＯＮ）を使用して、製造元の指示に従って抽出した。ｓｎｃＲＮＡの収量は蛍光光度計（Ｑｕｂｉｔ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で定量化し、ＲＮＡサンプルは分析まで－８０℃で保存した。
【0073】
全エクソソームｓｎｃＲＮＡのマイクロアレイ分析
ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘのＧｅｎｅＣｈｉｐ（商標）ｍｉＲ４．０アレイを使用して、製造元の指示に従って、ｓｎｃＲＮＡを調べた。これらのアレイ上で分析された２３５人の患者のＭＡＩＭＥ準拠の生データファイルは、ＮＣＢＩのＧｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓに保管されている。（Ｅｄｇａｒ Ｒ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓ：ＮＣＢＩ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｒｒａｙ ｄａｔａ ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ ２００２ ３０：２０７）。トレーニングセットにおける６，５９９個のｓｎｃＲＮＡを、ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘのＧｅｎｅＣｈｉｐ（商標）ｍｉＲＮＡ４．０アレイ上で調べた。
ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘのＧｅｎｅＣｈｉｐ（商標）ｍｉＲ４．０アレイを使用して、製造元の指示に従って、ｓｎｃＲＮＡを調べた。これらのアレイ上で分析された２３５人の患者のＭＡＩＭＥ準拠の生データファイルは、ＮＣＢＩのＧｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓに保管されている。（Ｅｄｇａｒ Ｒ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓ：ＮＣＢＩ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｒｒａｙ ｄａｔａ ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ ２００２ ３０：２０７）。トレーニングセットにおける６，５９９個のｓｎｃＲＮＡを、ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘのＧｅｎｅＣｈｉｐ（商標）ｍｉＲＮＡ４．０アレイ上で調べた。
【0074】
各参加者について調べた小分子非コードＲＮＡエンティティは、独自の選択および分類アルゴリズムを使用して分析された。がんの対象と非がんの対象（配列番号１～２８０）、および悪性度グループ１の患者と悪性度グループ２～５の患者を区別するための最も情報価値のある配列を特定した。（配列番号２８１～８４２）
【0075】
ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ＯｐｅｎＡｒｒａｙ（商標）に基づくエクソソームｓｎｃＲＮＡの調査
選択したｍｉＲＮＡのｃＤＮＡ合成、前増幅：エクソソームｍｉＲＮＡの分析では、製造元によって推奨されるように、ＴａｑＭａｎ（商標）ＭｉｃｒｏＲＮＡ逆転写キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、３つの特定のｍｉＲＮＡステムループプライマープールを使用した個別の反応において総ｓｎｃＲＮＡを逆転写した。ｍｉＲＮＡのｃＤＮＡプールを、１６サイクル（９５℃で１０分間、５５℃で２分間、７２℃で２分間、９５℃で１５秒間および６０℃で４分間を１６サイクル繰り返し、９９．９℃で１０分間）の間、前増幅プライマープールで個別に濃縮し、製造元の推奨に従って５６個のエンティティを含む３つのサブアレイのＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ＯｐｅｎＡｒｒａｙ（商標）上で調べた。
選択したｍｉＲＮＡのｃＤＮＡ合成、前増幅：エクソソームｍｉＲＮＡの分析では、製造元によって推奨されるように、ＴａｑＭａｎ（商標）ＭｉｃｒｏＲＮＡ逆転写キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、３つの特定のｍｉＲＮＡステムループプライマープールを使用した個別の反応において総ｓｎｃＲＮＡを逆転写した。ｍｉＲＮＡのｃＤＮＡプールを、１６サイクル（９５℃で１０分間、５５℃で２分間、７２℃で２分間、９５℃で１５秒間および６０℃で４分間を１６サイクル繰り返し、９９．９℃で１０分間）の間、前増幅プライマープールで個別に濃縮し、製造元の推奨に従って５６個のエンティティを含む３つのサブアレイのＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ＯｐｅｎＡｒｒａｙ（商標）上で調べた。
【0076】
選択したｓｎｏＲＮＡのｃＤＮＡ合成、前増幅、および調査：全ｓｎｃＲＮＡを、製造元により推奨されるように、単一の前増幅プライマープール（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を備えた大容量ｃＤＮＡ逆転写キットを使用して逆転写した。ｓｎｏＲＮＡのｃＤＮＡ産物を、前増幅（９５℃で１０分間、９５℃で１５秒間、および６０℃で４分間をそれぞれ１４サイクルと１８サイクル繰り返し、９９℃で１０分間）によって濃縮し、５６個のエンティティを含む２つのサブアレイ上で調べた。
【0077】
統計分析：
Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＰＣａ試験は、コア針生検が陽性または陰性である参加者のコホートでトレーニングされた分類アルゴリズムに基づいている。分類アルゴリズムは、疾患状態が不明な参加者のｓｎｃＲＮＡ発現シグネチャーを入力とし、Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）スコアを生成する。疾患状態が不明な（ただし、発現シグネチャーは分かっている）将来の患者を分類するための感度を、ユーザー定義のレベル（通常９５％以上）で維持する所定のカットオフ値と、このＳｅｎｔｉｎｅｌ（商標）スコアを比較して、参加者を分類する。第２の分類アルゴリズムであるＳｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＣＳ試験は、Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＰＣａ試験と同様に動作する。しかしながら、Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＣＳ試験の分類アルゴリズムは、低悪性度（ＧＧ１）として分類された患者のコホートと、良好な中～高悪性度の前立腺がん（ＧＧ２～ＧＧ５）として分類された第２の患者のコホートでトレーニングされる。第３の分類アルゴリズムであるＳｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＨＧ試験は、低等度および良好な中等度リスク（ＧＧ１＋ＧＧ２）の前立腺がんであると判断された患者のコホートと、良好でない中等度リスクおよび高等度リスク（ＧＧ３～ＧＧ５）として特徴付けられる第２のコホートでトレーニングされる。
Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＰＣａ試験は、コア針生検が陽性または陰性である参加者のコホートでトレーニングされた分類アルゴリズムに基づいている。分類アルゴリズムは、疾患状態が不明な参加者のｓｎｃＲＮＡ発現シグネチャーを入力とし、Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）スコアを生成する。疾患状態が不明な（ただし、発現シグネチャーは分かっている）将来の患者を分類するための感度を、ユーザー定義のレベル（通常９５％以上）で維持する所定のカットオフ値と、このＳｅｎｔｉｎｅｌ（商標）スコアを比較して、参加者を分類する。第２の分類アルゴリズムであるＳｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＣＳ試験は、Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＰＣａ試験と同様に動作する。しかしながら、Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＣＳ試験の分類アルゴリズムは、低悪性度（ＧＧ１）として分類された患者のコホートと、良好な中～高悪性度の前立腺がん（ＧＧ２～ＧＧ５）として分類された第２の患者のコホートでトレーニングされる。第３の分類アルゴリズムであるＳｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＨＧ試験は、低等度および良好な中等度リスク（ＧＧ１＋ＧＧ２）の前立腺がんであると判断された患者のコホートと、良好でない中等度リスクおよび高等度リスク（ＧＧ３～ＧＧ５）として特徴付けられる第２のコホートでトレーニングされる。
【0078】
Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）試験パラダイムは、２つまたは３つの層で動作する。第一に、参加者の尿からのｓｎｃＲＮＡシグネチャーを使用して、Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＰＣａ試験の分類ルールに入力し、がんが存在するか否かを判断する。第二に、がんと診断された患者について、Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＣＳ試験は、がんが低等度リスク（ＧＧ１）であるか否かを判断する。第三に、Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＨＧ試験は、腫瘍が良好でない中または高等度リスク（ＧＧ３～ＧＧ５）であるか否かを判断する。（図４を参照）
【表4】
【0079】
表４は、Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）試験の開発に使用されるトレーニングデータセットを確立した。２３５人の患者のうち、「非がん」コホートに含まれる患者（８９人の患者）は、泌尿器腫瘍学とは関係のない問題について泌尿器科クリニックで診察を受けた同年齢の男性（ｎ＝５８）、および前立腺がんの徴候を示さない１つ以上の１２針診断コア針生検を受けた男性（ｎ＝３０）から慎重に選択した。
【0080】
「がん」コホートの患者（ｎ＝１４６）は、コア針生検の組織病理学に基づいて選択した。１４６人の「がん」コホートのうち、９０人の患者がＧＧ１がんとして分類され、５６人の患者がＧＧ２～５として分類された。
【0081】
「情報価値のある」結果とそうでない結果を分けるために独自の選択アルゴリズムを使用して調べたトレーニングデータセットからの６，５９９個のマイクロアレイ配列のうち、情報価値があるのは４００～６００個のみである。結果は、各配列が追加されたときにアルゴリズムに影響を与えるｓｎｃＲＮＡ配列を意味し、疾患状態が不明な対象が前立腺がんを有するのか、有しないのか、およびがんの段階（無痛性対侵攻性）を予測する。
【0082】
使用される統計分析は、他の配列の条件付け後にのみ観察される結果との隠れた関連を持つ配列を特定する機能に基づいている。４００～６００個の情報価値のあるｓｎｃＲＮＡ配列のうち、２８０個のｓｎｃＲＮＡ配列を、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＰＣａ試験（図５）、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＨＧ試験（図７）およびＤｉｓｃｏｖｅｒｙ ＣＳ試験（図６）の発現シグネチャーを定義するための基礎として分類アルゴリズムで使用した。次に、最も重要であると考えられる、情報価値のあるｓｎｃＲＮＡのサブセットを、各試験で特定した（それぞれ図５、図７および図６（右パネル））。
【0083】
これらの２８０のｓｎｃＲＮＡを組み合わせて、Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＰＣａおよびＣＳ試験の基礎となるＯｐｅｎＡｒｒａｙ（商標）プラットフォームを設計した。Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＰＣａ試験には、疾患状態が不明な対象を前立腺がんまたは前立腺非がんとして分類するための、８４個の固有のｓｎｃＲＮＡ（６０個のｍｉＲＮＡと２４個のｓｎｏＲＮＡ）の総発現プロファイルが組み込まれている。同様に、Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＣＳ試験では、１３５個の固有のｓｎｃＲＮＡ（１０５個のｍｉＲＮＡと３０個のｓｎｏＲＮＡ）を使用して、前立腺がんを有する対象をＧＧ１（無痛性）の前立腺がんまたはＧＧ２～ＧＧ５（侵攻性）の前立腺がんとしてさらに分類する。さらに、６１個のｓｎｃＲＮＡ（２５個のｍｉＲＮＡと３６個のｓｎｏＲＮＡ）が両方の試験で情報価値がある。ＯｐｅｎＡｒｒａｙ（商標）プラットフォームは、２つの試験の感度と特異度を損なうことなく、尿中エクソソームから抽出されたｓｎｃＲＮＡの単一サンプルに存在する情報価値のあるＲＮＡエンティティを順次調べる。
【0084】
実施例２
症例対照の患者コホートにおけるＳｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＰＣａ試験、Ｓｅｎｔｉｎｅ１（商標）ＣＳ試験、およびＳｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＨＧ試験の検証
ＯｐｅｎＡｒｒａｙ（商標）プラットフォームを使用するＳｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＰＣａ試験およびＳｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＣＳ試験のパフォーマンス特性を、１４３６人の患者を対象とした症例対照研究において確立した（表５）。
症例対照の患者コホートにおけるＳｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＰＣａ試験、Ｓｅｎｔｉｎｅ１（商標）ＣＳ試験、およびＳｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＨＧ試験の検証
ＯｐｅｎＡｒｒａｙ（商標）プラットフォームを使用するＳｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＰＣａ試験およびＳｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＣＳ試験のパフォーマンス特性を、１４３６人の患者を対象とした症例対照研究において確立した（表５）。
【表5】
【0085】
Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＰＣａ試験のパフォーマンス特性を、人口統計が表５に示されている６００人の男性の症例対照コホートにおいて判断した。Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＰＣａスコアの散布図を図８Ａに示し、対応する受信者操作曲線（ＲＯＣ）曲線を図８Ｃに示す。表６に要約されているように、Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＰＣａ試験では、２８１／３００人の患者ががんを有するとして、２７５／３００人の患者ががんを有しないとして正しく分類される（感度９３．７％、特異度９１．７％）。
【0086】
Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＣＳ試験のパフォーマンス特性を、６００人の男性の試験コホートにおいて判断した。Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＣＳスコアの散布図を図９Ａに示し、対応する受信者操作曲線（ＲＯＣ）曲線を図９Ｃに示す。表６に要約されているように、Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＣＳ試験では、１４３／１５４人の患者が高悪性度（ＧＧ３～ＧＧ５）として、１３２／１４３人が高悪性度ではないとして正しく分類される（感度９２．９％、特異度９０．４％）。
【0087】
Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＨＧ試験のパフォーマンス特性を、６００人の男性の試験コホートにおいて判断した。Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＨＧスコアの散布図を図１０Ａに示し、対応する受信者操作曲線（ＲＯＣ）曲線を図１０Ｃに示す。表６に要約されているように、Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＣＳ試験では、９４／１００人の患者が高悪性度（ＧＧ３～ＧＧ５）として、１９１／２００人が高悪性度ではない（ＧＧ１＋ＧＧ２）として正しく分類される（感度９４％、特異度９５．５％）。
【表6】
【0088】
実施例３
Ｓｃｅｉｎｔｉｆｉｃ Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）プラットフォームを使用して臨床的に有意でないＰＣａを特定するための安全性および科学的妥当性の研究
臨床研究の目的は、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＰＣａ試験およびＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＣＳ試験のパフォーマンス特性を検証して、（１）生検が実施される、前立腺がんの疑いのある５０～８０歳の男性の中で前立腺がん患者を特定し、（２）臨床的に有意な前立腺がん（悪性度２以上）の５０～８０歳の男性を、臨床的に有意でない前立腺がん（悪性度グループ１）の男性から区別することである。これらの分類は、コア針生検および根治的前立腺切除術（利用可能な場合）の結果と比較される。感度、特異度、陽性および陰性的中率が確立される。この研究は、前向き研究、観察的研究、および非介入的研究である。情報を与えられた（ｉｎｆｏｒｍｅｄ）参加者は、研究の過程で２つ以上の尿サンプルを提供し、関連する匿名化された臨床データを研究チームと共有することに同意する。
Ｓｃｅｉｎｔｉｆｉｃ Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）プラットフォームを使用して臨床的に有意でないＰＣａを特定するための安全性および科学的妥当性の研究
臨床研究の目的は、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＰＣａ試験およびＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＣＳ試験のパフォーマンス特性を検証して、（１）生検が実施される、前立腺がんの疑いのある５０～８０歳の男性の中で前立腺がん患者を特定し、（２）臨床的に有意な前立腺がん（悪性度２以上）の５０～８０歳の男性を、臨床的に有意でない前立腺がん（悪性度グループ１）の男性から区別することである。これらの分類は、コア針生検および根治的前立腺切除術（利用可能な場合）の結果と比較される。感度、特異度、陽性および陰性的中率が確立される。この研究は、前向き研究、観察的研究、および非介入的研究である。情報を与えられた（ｉｎｆｏｒｍｅｄ）参加者は、研究の過程で２つ以上の尿サンプルを提供し、関連する匿名化された臨床データを研究チームと共有することに同意する。
【0089】
コア針生検が実施され、そうでなければ包含および除外基準を満たしている、前立腺がんの疑いのある５０～８０歳の参加者が登録され、Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＰＣａ／ＣＳ試験用の尿サンプルを提供する。この研究では、分類アルゴリズムを使用して、開示された方法に基づくＳｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＰＣａ試験およびＳｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＣＳ試験の特性を評価し、将来の前立腺がん患者を特定し、臨床的に有意であるか、または臨床的に有意でないとして前立腺がんを分類する。
【0090】
がんの「ゴールドスタンダード」評価は、コア針生検の結果から行われる。コアが陽性でない参加者は「非がん」と指定される。１つ以上のコアにがんがある参加者は、がんのあるすべてのコアの組織病理学が悪性度グループ１以下である場合、「臨床的に有意でない」前立腺がんを有すると指定される。任意のコアの悪性度グループが２～５の場合、参加者は「臨床的に有意な」前立腺がんを有すると指定される。
【0091】
登録された各研究参加者は、１年間追跡される。参加者は各訪問中に尿サンプルを提供し、再生検、ＰＳＡ結果、および根治的前立腺切除術（臨床ケアの一部として施された場合）からの病理報告を含むすべての関連する臨床データが得られる。可能な場合は、フォローアップ結果が結果分析に使用される。提供された尿サンプルごとに、Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＰＣａ試験およびＣＳ試験を行い、利用可能な１年間のフォローアップ結果のデータと比較して、試験の感度、特異度、陽性および陰性的中率を通知する。
【0092】
分類アルゴリズムは、１－αで示される事前に指定されたレベル以上で感度を制御することによって機能を採用した。例えば、この設計で想定されている値はα＝０．０５であるため、母集団感度は少なくとも９５％である。αの値は、試験の偽陰性率を表す、つまり、試験は真に陽性の患者に対して（誤って）陰性であることに注意されたい。
【0093】
感度を制御するためにＳｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＰＣａスコアのカットオフがどのように計算されるかを説明するために、トレーニングデータセットの各参加者について、Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＰＣａスコアは、トレーニングデータセットの残りのメンバーとその小分子非コードＲＮＡ（ｓｎｃＲＮＡ）配列のみを使用して計算される。つまり、トレーニングデータセットにおける各患者の真の疾患状態は盲検化され、それによって将来の患者の分類の設定を模倣する。次に、Ｓｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＰＣａ試験で使用されるカットオフが計算され、前立腺がんを有するトレーニングデータセットにおける患者に対する経験的感度は、将来の患者の母集団感度に関して少なくとも１－αの９５％片側上限信頼区間を提供する値に対応する。
【0094】
トレーニングデータセットから事前に求めたＳｅｎｔｉｎｅｌ（商標）ＰＣａスコアのこのカットオフを使用して、感度、特異度、陽性および陰性的中率の対応する値は、盲検化された各生検結果を使用して、つまり、参加者のｓｎｃＲＮＡ配列のみを使用して、この提案された研究で生じた独自の参加者データに関して、対応する９５％上限信頼区間とともに計算される。これらのエラー率は、疾患状態が不明な将来の患者の分類を参照していることに注意されたい。
【0095】
本明細書に引用されるあらゆる特許、特許出願公開、または科学刊行物は、その全体が参照により組み込まれる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【配列表】
【国際調査報告】