特表 2022-524393 スイッチング可能なキメラ抗原受容体で操作されたヒトナチュラルキラー細胞

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-05-02

(54)【発明の名称】スイッチング可能なキメラ抗原受容体で操作されたヒトナチュラルキラー細胞

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/0783 20100101AFI20220422BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20220422BHJP

   A61P 31/12 20060101ALI20220422BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20220422BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20220422BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20220422BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20220422BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20220422BHJP

   C12N 15/62 20060101ALN20220422BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20220422BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20220422BHJP

【ＦＩ】

C12N5/0783

A61P35/00

A61P31/12

A61K39/395 L

A61K39/395 S

A61K39/395 T

A61K35/17 Z

A61K48/00

A61P35/02

A61K47/68

C12N15/62 Z

C12N15/13

C12N15/12

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021553771

(86)(22)【出願日】2020-03-23

(85)【翻訳文提出日】2021-10-27

(86)【国際出願番号】 US2020024187

(87)【国際公開番号】W WO2020198128

(87)【国際公開日】2020-10-01

(31)【優先権主張番号】62/822,389

(32)【優先日】2019-03-22

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】508228061

【氏名又は名称】ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア

(71)【出願人】

【識別番号】504440959

【氏名又は名称】ザ スクリップス リサーチ インスティテュート

【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＳＣＲＩＰＰＳ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ

(74)【代理人】

【識別番号】100079108

【弁理士】

【氏名又は名称】稲葉 良幸

(74)【代理人】

【識別番号】100109346

【弁理士】

【氏名又は名称】大貫 敏史

(74)【代理人】

【識別番号】100117189

【弁理士】

【氏名又は名称】江口 昭彦

(74)【代理人】

【識別番号】100134120

【弁理士】

【氏名又は名称】内藤 和彦

(72)【発明者】

【氏名】カウフマン，ダン エス．

(72)【発明者】

【氏名】リ，シャオ－フア

(72)【発明者】

【氏名】ラボルダ，エドゥアルド

(72)【発明者】

【氏名】ヤング，トラビス

【テーマコード（参考）】

4B065

4C076

4C084

4C085

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AB01

4B065AC20

4B065BA02

4B065CA44

4C076AA95

4C076BB11

4C076CC07

4C076CC27

4C076CC35

4C076EE41

4C076EE59

4C076FF67

4C076FF68

4C084AA13

4C084NA05

4C084NA14

4C084ZB02

4C084ZB05

4C084ZB09

4C084ZB26

4C084ZB27

4C084ZB33

4C085AA14

4C085AA25

4C085BB01

4C085BB11

4C085CC08

4C085CC21

4C085DD62

4C085EE01

4C085GG01

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB37

4C087CA04

4C087CA12

4C087DA20

4C087DA32

4C087MA66

4C087ZB02

4C087ZB05

4C087ZB09

4C087ZB26

4C087ZB27

4C087ZB33

4C087ZC41

4C087ZC75

(57)【要約】

スイッチング可能なキメラ抗原受容体で操作されたナチュラルキラー細胞、製造方法、医薬組成物、ならびにがんおよびウイルス感染症の治療における使用方法。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

スイッチング可能なキメラ抗原受容体（ｓＣＡＲ）で操作されたナチュラルキラー（ＮＫ）細胞。

【請求項2】

前記ｓＣＡＲが、ペプチドネオアンチゲンエピトープ（ＰＮＥ）への結合に特異的な抗体ｓｃＦｖ領域を含む、請求項１に記載のＮＫ細胞。

【請求項3】

前記ｓＣＡＲが、ＮＫＧ２Ｄ膜貫通ドメイン、２Ｂ４共刺激ドメイン、およびＣＤ３ζ鎖をさらに含む、請求項２に記載のＮＫ細胞。

【請求項4】

前記ｓＣＡＲに結合したスイッチをさらに含み、前記スイッチが、がん抗原またはウイルス抗原への結合に特異的な抗がんまたは抗ウイルス抗体Ｆａｂ領域に融合したＰＮＥを含む、請求項３に記載のＮＫ細胞。

【請求項5】

前記がん抗原が、ＣＤ１９またはＦｒｉｚｚｌｅｄ７である、請求項５に記載のＮＫ細胞。

【請求項6】

前記ＮＫ細胞が、ヒト誘導多能性細胞に由来する、請求項１に記載のＮＫ細胞。

【請求項7】

対象におけるがんまたはウイルスを治療する方法であって、それを必要とする対象に、前記がんまたは前記ウイルスの抗原に対して活性化されたスイッチング可能なキメラ抗原受容体（ｓＣＡＲ）で操作された有効量のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を投与することを含む、方法。

【請求項8】

前記ｓＣＡＲが、ペプチドネオアンチゲンエピトープ（ＰＮＥ）への結合に特異的な抗体ｓｃＦｖ領域を含む、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

前記ｓＣＡＲが、ＮＫＧ２Ｄ膜貫通ドメイン、２Ｂ４共刺激ドメイン、およびＣＤ３ζ鎖をさらに含む、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記ｓＣＡＲが、スイッチに結合されることによって活性化され、前記スイッチが、それぞれ、前記がん抗原またはウイルス抗原への結合に特異的な抗がんまたは抗ウイルス抗体Ｆａｂ領域に融合されたＰＮＥを含む、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

前記がん抗原が、ＣＤ１９またはＦｒｉｚｚｌｅｄ７である、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記ＮＫ細胞が、同種異系である、請求項７に記載の方法。

【請求項13】

前記がんが、難治性である、請求項７に記載の方法。

【請求項14】

前記がんが、血液腫瘍または固形腫瘍である、請求項７に記載の方法。

【請求項15】

前記腫瘍が、リンパまたは卵巣である、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

前記方法が、前記がんまたはウイルスに対する治療量のモノクローナル抗体療法の投与をさらに含む、請求項７に記載の方法。

【請求項17】

請求項１～６のいずれか一項に記載のＮＫ細胞を含む、医薬組成物。

【請求項18】

ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を製造する方法であって、
スイッチング可能なキメラ抗原受容体（ｓＣＡＲ）を含む膜貫通タンパク質を呈するようにＮＫ細胞を操作することと、
前記ｓＣＡＲの後の活性化のために、前記操作されたＮＫ細胞を保存することと、を含む、方法。

【請求項19】

前記ｓＣＡＲが、ペプチドネオアンチゲンエピトープ（ＰＮＥ）への結合に特異的な抗体ｓｃＦｖ領域を含む、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

前記ｓＣＡＲが、ＮＫＧ２Ｄ膜貫通ドメイン、２Ｂ４共刺激ドメイン、およびＣＤ３ζ鎖をさらに含む、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

前記ｓＣＡＲをスイッチに結合させることによって前記ｓＣＡＲを活性化することをさらに含み、前記スイッチが、それぞれ、がん抗原またはウイルス領域への結合に特異的な抗がんまたは抗ウイルス抗体Ｆａｂ領域に融合されたＰＮＥを含む、請求項２０に記載の方法。

【請求項22】

前記がん抗原が、ＣＤ１９またはＦｒｉｚｚｌｅｄ７である、請求項２１に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年３月２２日に出願された米国仮出願第６２／８２２，３８９号の優先権の利益を主張し、その出願は参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

本発明は、操作された免疫療法に関する。

【背景技術】

【0003】

既存のＣＡＲ操作されたＴ細胞ベース（ＣＡＲ－Ｔ）の療法は、近年開発された最も成功した免疫療法アプローチの１つを表す。ほとんどのＣＡＲ－Ｔ細胞療法は、Ｂ細胞特異的抗原ＣＤ１９を標的とすることによって、血液悪性腫瘍を治療するために臨床的に使用されている。しかしながら、このアプローチは、Ｔ細胞の本質的な特性のいくつか（その使用を厳密に自己の患者に限定する同種異系反応性を含む）、および制御されていない増殖または制御されていないサイトカイン放出によって引き起こされる副作用のため、制限なしではない。一方、ＮＫ細胞は、患者固有の基準で適用する必要がなく、事前の感作を必要とせず、毒性が低いことが証明されている同種異系細胞傷害性エフェクター細胞として機能する。これらの理由のため、ＣＡＲで操作されたＮＫ（ＣＡＲ－ＮＫ）細胞は、代替のＣＡＲ細胞療法としてますます関心を集めている。しかしながら、他にも満たされていない課題が存在している。ほとんどの標的が非悪性細胞によって共有され、「標的上の、腫瘍外の」効果に起因する毒性を引き起こす可能性があるため、固形腫瘍に対するＣＡＲベースの療法の標的化は、真の腫瘍特異的抗原の欠如のために困難になっている。微調整可能なＣＡＲ療法は、この毒性を制限しながら、腫瘍をより良好に識別し、標的化するのに有用である。２つ目の課題は、患者のニーズを満たすためにＣＡＲ細胞製造速度を上げることが困難であることである。これは、従来のＣＡＲ細胞は、１つの標的に基づいて１つのＣＡＲで剛性形態で作られているためである。１つの特異性を有する各細胞バッチの調製には、時間、コスト、および高度な製造設備が必要であり、多くの場合、ほとんどの患者にとって治療が不可能になる。最近開発された、エフェクター細胞活性化機能を抗原認識機能から解離するｓＣＡＲは、これらのハードルを克服するように設計されている。

【0004】

養子細胞療法の１つの主要な目標は、治療細胞集団の抗腫瘍活性を正確に制御することである。ＦＤＡが承認した抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞（チサゲンレクロイセル（キムリア）およびアキシカブタジンシロルーセル（イエスカルタ））などの現在の戦略は非常に効果的であるが、著しい免疫抑制を有し、感染症にかかりやすい患者を誘発する長期的（おそらく永続的な）Ｂ細胞形成不全および低ガンマグロブリン血症につながる^１、２。加えて、ＣＡＲ媒介性サイトカイン放出症候群および神経毒性などの毒性は、制御が困難であり、場合によっては著しい罹患率および死亡率につながる可能性がある^１～３。ＣＡＲによって標的化された多くの腫瘍抗原は、十分に見直されているように、「標的上の、腫瘍外の」毒性をもたらす場合がある^１、２。例えば、結腸がんを有する患者におけるＣＡＲ－Ｔ細胞によるがん胎児性抗原の標的化は、正常な結腸組織の抗原認識に起因する重度の結腸炎をもたらした^４。残念ながら、抗Ｈｅｒ２ ＣＡＲ－Ｔ細胞による患者の治療は、肺細胞上のＨｅｒ２発現に起因する可能性が高い死に至る^５。同様に、ＡＭＬ抗原に対するＣＡＲもまた、ほとんどが正常な造血幹細胞によっても共有され、潜在的に骨髄形成不全の長期化をもたらす^６～８ため、問題である。ＣＡＲ－Ｔ細胞活性の制御は、自殺スイッチおよびＲＮＡベースのＣＡＲ発現などのオプションを使用して提案されている^{１、９～１１}。しかしながら、殺傷スイッチは、Ｔ細胞の活性化および増殖に対する制御を提供せず、潜在的に治療的なＣＡＲ－Ｔ細胞の不可逆的な排除をもたらす。ＲＮＡベースの系は、一過性のＣＡＲ発現のみをもたらし、抗腫瘍活性を低下させ、完全に動的で滴定可能なオン／オフ活性を捕捉しない^９、１０。

【0005】

ｓＣＡＲ－Ｔ細胞を使用した以前の研究は、ｓＣＡＲ－Ｔ細胞、スイッチ、および標的細胞が全て、構造的に定義され、時間的に制御された様式で相互作用する免疫シナプスの選択的形成を示す。このｓＣＡＲ－Ｔ細胞系は、ＣＤ１９＋Ｂ細胞の悪性腫瘍の強力な殺傷を実証しており、これには、可溶性スイッチ成分の効果的な再投薬（ｓＣＡＲ－Ｔ細胞の単一の用量のみが投与される）を可能にして、再発疾患を治療するＴセントラルメモリー（Ｔｃｍ）集団の産生が含まれる^{１２、１３}。可溶性スイッチの使用はまた、ＣＡＲの会合の正確な滴定も可能にする。例えば、患者は、まず、ＣＲＳまたは神経毒性を最小限に抑えるために、低用量のスイッチで、次いで抗腫瘍活性を増加させるためにより高い後続用量で、治療され得る。加えて、この系は、単一の腫瘍抗原の損失による再発を防止するために、腫瘍細胞抗原の二重標的化を可能にするための複数のスイッチ構成要素の使用を容易に可能にする^{１２、１３}。現在までに、前臨床試験によっては、これらのｓＣＡＲ－Ｔ細胞がＣＤ１９^＋Ｂ細胞の悪性腫瘍を標的化および殺傷させるだけでなく、抗Ｈｅｒ２スイッチを有する乳がんおよび膵がんをも標的化および殺傷させることができることが実証されている^{１２～１５}。

【0006】

最後に、Ｓｙｎ－Ｎｏｔｃｈ系、「条件付きＣＡＲ」、他のスイッチ媒介性ＣＡＲ、ならびに他の系などの多くの他のＣＡＲベースの系が、治療に対する安全性および制御を維持しながら、固形腫瘍の標的化を改善するために提案されている^{２、１６～１８}。

【発明の概要】

【0007】

本開示は、スイッチング可能なキメラ抗原受容体（ｓＣＡＲ）で操作されたナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、その製造方法、および使用方法を提供する。

【0008】

実施形態では、本発明は、スイッチング可能なキメラ抗原受容体（ｓＣＡＲ）で操作されるナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を提供する。実施形態では、ｓＣＡＲは、ペプチドネオアンチゲンエピトープ（ＰＮＥ）への結合に特異的な抗体ｓｃＦｖ領域を含む。実施形態では、ｓＣＡＲは、ＮＫＧ２Ｄ膜貫通ドメイン、２Ｂ４共刺激ドメイン、および／またはＣＤ３ζ鎖（またはその突然変異）をさらに含む。実施形態では、ＮＫ細胞は、ｓＣＡＲに結合されたスイッチをさらに含み、スイッチは、がん抗原またはウイルス抗原への結合に特異的な抗がんまたは抗ウイルス抗体Ｆａｂ領域に融合されたペプチドネオアンチゲンエピトープ（ＰＮＥ）を含む。実施形態では、がん抗原は、ＣＤ１９またはＦｒｉｚｚｌｅｄ７である。実施形態では、本発明は、がんまたはウイルス抗原が、本明細書に開示される、または当該技術分野で知られるもののいずれであってもよいことを提供する。実施形態では、ＮＫ細胞は、ヒト誘導多能性細胞に由来する。

【0009】

実施形態では、本発明は、対象におけるがんまたはウイルスを治療する方法であって、それを必要とする対象に、がんまたはウイルスの抗原に対して活性化されたスイッチング可能なキメラ抗原受容体（ｓＣＡＲ）で操作された有効量のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を投与することを含む、方法を提供する。

【0010】

実施形態では、ｓＣＡＲは、ペプチドネオアンチゲンエピトープ（ＰＮＥ）への結合に特異的な抗体ｓｃＦｖ領域を含む。実施形態では、ｓＣＡＲは、ＮＫＧ２Ｄ膜貫通ドメイン、２Ｂ４共刺激ドメイン、およびＣＤ３ζ鎖をさらに含む。

【0011】

実施形態では、ｓＣＡＲは、スイッチに結合されることによってさらに活性化され、スイッチは、それぞれ、がん抗原またはウイルス抗原への結合に特異的な抗がんまたは抗ウイルス抗体Ｆａｂ領域に融合されたＰＮＥを含む。実施形態では、がん抗原は、ＣＤ１９またはＦｒｉｚｚｌｅｄ７である。実施形態では、本発明は、がんまたはウイルス抗原が、本明細書に開示される、または当該技術分野で知られるもののいずれであってもよいことを提供する。

【0012】

実施形態では、ＮＫ細胞は、同種異系である。実施形態では、がんは、難治性である。実施形態では、がんは、血液腫瘍または固形腫瘍である。実施形態では、腫瘍は、リンパまたは卵巣である。実施形態では、本発明は、がんが、開示されているかまたは既知のがんのいずれかであり得ることを提供する。実施形態では、本発明は、ウイルスが、開示されているかまたは既知のウイルスのいずれかであり得ることを提供する。

【0013】

実施形態では、本発明は、方法が、がんまたはウイルスに対する治療量のモノクローナル抗体療法の投与をさらに含み得ることを提供する。

【0014】

実施形態では、本発明は、本明細書に記載のＮＫ細胞を含む医薬組成物を提供する。実施形態では、本発明は、ｓＣＡＲ－ＮＫ細胞の細胞培養を提供する。

【0015】

実施形態では、本発明は、スイッチング可能なキメラ抗原受容体（ｓＣＡＲ）を含む膜貫通タンパク質を呈するようにＮＫ細胞を操作することと、ｓＣＡＲを後で活性化するために操作されたＮＫ細胞を保存することと、を含む、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を製造する方法を提供する。

【0016】

実施形態では、本発明は、ｓＣＡＲが、ペプチドネオアンチゲンエピトープ（ＰＮＥ）への結合に特異的な抗体ｓｃＦｖ領域を含む。実施形態では、ｓＣＡＲは、ＮＫＧ２Ｄ膜貫通ドメイン、２Ｂ４共刺激ドメイン、およびＣＤ３ζ鎖をさらに含む。

【0017】

実施形態では、本発明は、製造方法が、ｓＣＡＲをスイッチに結合させることによってｓＣＡＲを活性化することをさらに含み、スイッチが、それぞれ、がん抗原またはウイルス領域への結合に特異的な抗がんまたは抗ウイルス抗体Ｆａｂ領域に融合されたＰＮＥを含むこと、を提供する。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1】従来のＣＡＲとｓＣＡＲとの概略的な比較を示す。

【図2A】ＮＫ９２エフェクター細胞を使用して、ｓＣＡＲ媒介性抗腫瘍活性を示す。

【図2B】ＮＫ９２エフェクター細胞を使用して、ｓＣＡＲ媒介性抗腫瘍活性を示す。

【図3A】ｓＣＡＲ発現ＩＰＳＣにおける造血およびＮＫ細胞分化を示す。

【図3B】ｓＣＡＲ発現ＩＰＳＣにおける造血およびＮＫ細胞分化を示す。

【図4】ｉＰＳＣ－ＮＫ細胞におけるｓＣＡＲ媒介性抗腫瘍活性を示す。

【図5】ＩｎｃｕＣｙｔｅ殺傷アッセイを示す。

【図6】人工的に混合された細胞株を用いたインビトロ殺傷アッセイを示す。

【図7】全体を通して使用される異なるスイッチの構成を示す。

【図8】増加した濃度の抗ＣＤ１９スイッチの存在下でのＮａｌｍ６のＣＡＲ４－ＮＫ９２誘導殺傷（ｋｉｌｌｉｎｇ）を示す。

【図9A】標的細胞上のＡＭＬ抗原の抗原発現およびＡＭＬ細胞株上のスイッチ媒介性殺傷アッセイを示す。

【図9B】標的細胞上のＡＭＬ抗原の抗原発現およびＡＭＬ細胞株上のスイッチ媒介性殺傷アッセイを示す。

【図9C】標的細胞上のＡＭＬ抗原の抗原発現およびＡＭＬ細胞株上のスイッチ媒介性殺傷アッセイを示す。

【図10A】天然混合された細胞集団を有するＰＢＭＣにおけるスイッチ媒介性殺傷の抗原特異性の実証である。

【図10B】天然混合された細胞集団を有するＰＢＭＣにおけるスイッチ媒介性殺傷の抗原特異性の実証である。

【図10C】天然混合された細胞集団を有するＰＢＭＣにおけるスイッチ媒介性殺傷の抗原特異性の実証である。

【図11】従来のＣＤ１９－ＣＡＲ４とのｓＣＡＲ４の比較である。

【図12】ＳＢ－ｓＣＡＲ４－Ｐ２Ａ－ＧＦＰまたはＳＢ－ｓＣＡＲ４－ＩＲＥＳ－ＧＦＰのいずれかでトランスフェクトされたＮＫ９２細胞におけるＧＦＰおよびｓＣＡＲ４発現を示す。

【図13】抗Ｆｚｄ７またはコントロールスイッチのレベルの増加の存在下で、ＭＡ１４８細胞を、ＮＫ９２－ｓＣＡＲ－ＩＲＥＳまたはＮＫ９２－Ｐ２Ａ－ＧＦＰでトランスフェクトされたＷＴ ＮＫ９２またはＮＫ９２のいずれかで共培養されたインビボ共培養殺傷アッセイにおけるＮＫ９２－ｓＣＡＲ－ＩＲＥＳおよびＮＫ９２－Ｐ２Ａ－ＧＦＰの比較を示す。

【図14】トランスフェクトされたｉＰＳＣの表面におけるＧＦＰおよびｓＣＡＲ４の発現を示す。

【図15A】ｓＣＡＲ４－Ｐ２Ａ－ＧＦＰを発現するｉＰＳＣ由来のＮＫ細胞の再生を示す。

【図15B】ｓＣＡＲ４－Ｐ２Ａ－ＧＦＰを発現するｉＰＳＣ由来のＮＫ細胞の再生を示す。

【発明を実施するための形態】

【0019】

本発明は、血液悪性腫瘍および固形腫瘍の両方の難治性がんをより効果的に治療するために、ｓＣＡＲ－ＮＫ細胞と称される標的化されたＮＫ細胞ベースの治療モダリティを作成するように設計された、スイッチング可能なキメラ抗原受容体（ｓＣＡＲ）を有するナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の操作に関する。具体的には、ＮＫ細胞にｓＣＡＲを備えることにより、ＮＫ細胞は、密に滴定可能な方法で腫瘍を標的化することが可能であり、複数の腫瘍抗原を同時にまたは順次標的化することが可能である。したがって、この系は、改善された抗腫瘍殺傷を媒介し、免疫媒介性殺傷からの腫瘍エスケープ手段としての腫瘍抗原欠損の発生を防止し、患者に対する毒性を最小限に抑える。

【0020】

本発明では、異なる技術を独自の方法で組み合わせて、最初にＮＫ細胞特異的ｓＣＡＲを作製し、次いでＮＫ細胞をＮＫ－ｓＣＡＲで遺伝子操作して、可能性のある治療用細胞産物として特有のｓＣＡＲ－ＮＫ細胞を作製する。この新しいタイプの細胞は、ＣＡＲ－Ｔ細胞およびＮＫ細胞の最良の形質を統合して、正常細胞に対するより良好な有効性、汎用性、用量制御性、および最小限の毒性を媒介する。実施形態では、臨床的に使用されるＮＫ細胞株であるＮＫ９２細胞、ならびにヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ－ＮＫ）に由来するＮＫ細胞を使用して、ｓＣＡＲ－ＮＫ細胞のプロタイプを実証する。しかしながら、本発明は、他の幹細胞型から生成された、または末梢血もしくは臍帯血から単離された、もしくは産生されたＮＫ細胞を含む、他の型のＮＫ細胞の使用を含む。

【0021】

本発明は、ペプチドネオエピトープ（ＰＮＥ）に融合された腫瘍抗原特異的Ｆａｂ分子からなる新規の組換え抗体ベースの二機能性スイッチ系（ＰＮＥ特異的スイッチング可能ＣＡＲ（ｓＣＡＲ）によってのみ認識される）を使用することによって、ＮＫ細胞媒介性免疫療法の抗腫瘍活性および安全性を向上させる。

【0022】

追加のデータは、（固形腫瘍を標的とするための）抗ＦＺＤ７スイッチおよび（ＡＭＬのための）抗ＣＬＬ１スイッチの効果的な使用を実証する。したがって、この系は、血液悪性腫瘍および固形腫瘍の両方に広く適用可能である。本発明の焦点はがん細胞の標的化および治療であるが、ウイルス感染症はまた、本発明を使用して、がん抗原の代わりにウイルス抗原を用いて治療され得る。

【0023】

ｓＣＡＲ発現ｉＰＳＣ－ＮＫ細胞と組み合わせた本スイッチング可能ＣＡＲ系は、効果的な患者療法に容易に変換するための最も実現可能で広く適用可能な戦略である。

【0024】

既存の技術は、「従来の」ＣＡＲ－Ｔ細胞、ｓＣＡＲ発現Ｔ細胞およびＣＡＲ－ＮＫ細胞を含む。ｓＣＡＲ－ＮＫ細胞は、（従来のＣＡＲ－Ｔ細胞およびｓＣＡＲ－Ｔ細胞の場合のように）患者マッチングされる必要のない同種異系エフェクター細胞として機能することによって、これらのアプローチに改善を加える。加えて、本発明は、標的化において最大の柔軟性を可能にすることによって、他のＣＡＲ－ＮＫ細胞に改善を加える。ｓＣＡＲ系は、ｉＰＳＣ由来ＣＡＲ－ＮＫ細胞と組み合わされる。この組み合わせは、可溶性スイッチと組み合わせた１つの標準化された同種異系エフェクター細胞集団を利用して、普遍的な細胞療法アプローチを生み出すための最大の柔軟性を提供し、なぜなら、これは、ＮＫ細胞が個々の患者に由来する必要がないためであり、かつ可溶性スイッチが、新しいエフェクター細胞集団を操作する必要なしに、本質的に任意の腫瘍抗原（または複数の腫瘍抗原）を標的化するために使用され得るためである。

【0025】

加えて、腫瘍抗原欠損エスケープ変異形は、２つ（またはそれ以上）の腫瘍抗原に対するスイッチと組み合わせたｓＣＡＲ－ｉＰＳＣ－ＮＫ細胞により予防され得る。スイッチ媒介性標的化はまた、治療用モノクローナル抗体（抗Ｈｅｒ２、抗ＥＧＦＲなど）と組み合わせて、腫瘍をより効果的に標的化し、殺傷させ得る。

【0026】

本発明は、血液悪性腫瘍および固形腫瘍の両方の治療のための同じｓＣＡＲ発現ｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞の使用を可能にする。このようにして、ｓＣＡＲ－ｉＰＳＣ－ＮＫ細胞は、当該分野におけるパラダイムシフトの影響をもたらすことができる「既製の」細胞免疫療法のための普遍的な戦略を再び提供する。

【0027】

実施形態では、本発明は、スイッチング可能なキメラ抗原受容体（ｓＣＡＲ）で操作されるナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を提供する。実施形態では、ｓＣＡＲは、ペプチドネオアンチゲンエピトープ（ＰＮＥ）への結合に特異的な抗体ｓｃＦｖ領域を含む。実施形態では、ｓＣＡＲは、ＮＫＧ２Ｄ膜貫通ドメイン、２Ｂ４共刺激ドメイン、およびＣＤ３ζ鎖をさらに含む。実施形態では、ｓＣＡＲは、ＣＤ８ａ細胞外ドメイン、ＣＤ２８、ＣＤ１６、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６の膜貫通ドメイン、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＤＡＰ１０、およびＤＡＰ１２の細胞質シグナル伝達ドメインを含むが、これらに限定されない、代替シグナル伝達ドメインを含む^（１９）。

【0028】

実施形態では、ＮＫ細胞は、ｓＣＡＲに結合されたスイッチをさらに含み、スイッチは、がん抗原またはウイルス抗原への結合に特異的な抗がんまたは抗ウイルス抗体Ｆａｂ領域に融合されたＰＮＥを含む。実施形態では、がん抗原は、ＣＤ１９またはＦｒｉｚｚｌｅｄ７である。実施形態では、本発明は、がんまたはウイルス抗原が、本明細書に開示される、または当該技術分野で知られるもののいずれであってもよいことを提供する。

【0029】

実施形態では、ＮＫ細胞は、ヒト誘導多能性細胞に由来する。実施形態では、本発明は、ｓＣＡＲ－ＮＫ細胞の細胞培養を提供する。

【0030】

実施形態では、本発明は、対象におけるがんまたはウイルスを治療する方法であって、それを必要とする対象に、がんまたはウイルスの抗原に対して活性化されたスイッチング可能なキメラ抗原受容体（ｓＣＡＲ）で操作された有効量のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を投与することを含む、方法を提供する。

【0031】

実施形態では、ｓＣＡＲは、ペプチドネオアンチゲンエピトープ（ＰＮＥ）への結合に特異的な抗体ｓｃＦｖ領域を含む。実施形態では、ｓＣＡＲは、ＮＫＧ２Ｄ膜貫通ドメイン、２Ｂ４共刺激ドメイン、およびＣＤ３ζ鎖をさらに含む。

【0032】

実施形態では、ｓＣＡＲ－ＮＫ細胞は、スイッチに結合することによってさらに活性化され、スイッチは、それぞれ、がん抗原またはウイルス抗原への結合に特異的な抗がんまたは抗ウイルス抗体Ｆａｂ領域に融合されたＰＮＥを含む。実施形態では、がん抗原は、ＣＤ１９またはＦｒｉｚｚｌｅｄ７である。実施形態では、本発明は、がんまたはウイルス抗原が、本明細書に開示される、または当該技術分野で知られるもののいずれであってもよいことを提供する。

【0033】

実施形態では、スイッチは、がんまたはウイルス抗原を標的とするＦａｂ断片以外の結合分子を使用することができる。実施形態では、天然抗原相互作用タンパク質ドメインを使用して、特定の抗原に結合する。^（２６）実施形態では、タンパク質は、リガンド結合時に免疫応答を活性化する活性化受容体を天然に発現する。実施形態では、ＮＫ細胞は、リガンド結合時に、アダプター分子ＤＡＰ１０を介して免疫細胞を活性化し、それによって細胞増殖、炎症促進性サイトカイン産生、および標的細胞排除を引き起こす、活性化受容体であるナチュラルキラー群２、メンバーＤ（ＮＫＧ２Ｄ）を発現する。ＮＫＧ２Ｄリガンド（ＮＫＧ２ＤＬ）は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ関連鎖ＡおよびＢ（それぞれ、ＭＩＣＡおよびＭＩＣＢ）、ならびに６つの独自の長さ１６結合タンパク質（ＵＬＢＰ１－６）を含む。実施形態では、他のＮＫ細胞活性化受容体が使用され得る。他のＮＫ細胞活性化受容体の例としては、天然細胞傷害性受容体（ＮＣＲ）、ＤＮＡＸ付属分子－１（ＤＮＡＭ１）および活性化キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＡＲ）が挙げられる。

【0034】

実施形態では、ＮＫ細胞は、同種異系である。実施形態では、がんは、難治性である。実施形態では、がんは、血液腫瘍または固形腫瘍である。実施形態では、腫瘍は、リンパまたは卵巣である。実施形態では、本発明は、がんが、開示されているかまたは既知のがんのいずれかであり得ることを提供する。実施形態では、本発明は、ウイルスが、開示されているかまたは既知のウイルスのいずれかであり得ることを提供する。

【0035】

実施形態では、本発明は、方法が、がんまたはウイルスに対する治療量のモノクローナル抗体療法の投与をさらに含み得ることを提供する。

【0036】

実施形態では、本発明は、本明細書に記載のＮＫ細胞を含む医薬組成物を提供する。実施形態では、本発明は、ｓＣＡＲ－ＮＫ細胞の細胞培養を提供する。

【0037】

実施形態では、本発明は、ナチュラルキラーｓＣＡＲ－ＮＫ細胞を製造する方法であって、スイッチング可能なキメラ抗原受容体（ｓＣＡＲ）を含む膜貫通タンパク質を呈するようにＮＫ細胞を操作することと、ｓＣＡＲを後で活性化するために操作されたＮＫ細胞を保存することと、を含む方法を提供する。

【0038】

実施形態では、本発明は、ｓＣＡＲが、ペプチドネオアンチゲンエピトープ（ＰＮＥ）への結合に特異的な抗体ｓｃＦｖ領域を含む。実施形態では、ｓＣＡＲは、ＮＫＧ２Ｄ膜貫通ドメイン、２Ｂ４共刺激ドメイン、およびＣＤ３ζ鎖をさらに含む。

【0039】

実施形態では、本発明は、製造方法が、ｓＣＡＲをスイッチに結合させることによってｓＣＡＲを活性化することをさらに含み、スイッチが、それぞれ、がん抗原またはウイルス領域への結合に特異的な抗がんまたは抗ウイルス抗体Ｆａｂ領域に融合されたＰＮＥを含むこと、を提供する。

【0040】

既存のｓＣＡＲモジュールを採用し、ＮＫ９２およびｉＰＳ由来ＮＫ細胞（ｉＰＳ－ＮＫ）を含むＮＫ細胞に操作した。図１Ａ～１Ｃに示されるように、ヒンジおよび膜貫通ドメインを介して一緒に融合された腫瘍抗原認識エクトドメイン（ｓｖＦｃ）および細胞内活性化ドメインから構成される従来のＣＡＲ（図１Ａ）と比較して、ｓＣＡＲ（図１Ｂ）は、一般に、ｓｖＦｃの特異性が、腫瘍抗原ではなく、酵母ＧＣＮ４タンパク質に由来する１４ａａの一般的なペプチド、すなわち、ペプチドネオアンチゲンエピトープ（ＰＮＥ）を対象とすることを除いて、類似のドメイン表示から構成されるために、異なる。ＰＮＥは、モノクローナル抗体（Ｆａｂ）のその融合断片と共に、抗原特異性を決定する「スイッチ」分子として機能する。この柔軟なスイッチを有することにより、ｓＣＡＲ系は、ＣＡＲ細胞の調製を、一般的であり、どの腫瘍抗原を標的とすべきかに依存しないことを可能にする。加えて、ｓＣＡＲ細胞がすでに患者に投与された後であっても、抗原標的のリダイレクションを可能にする。また、スイッチ依存性は、ＣＡＲの活性をより正確に制御することを可能にし、この制御は、適切な投与によってＣＡＲ療法の現在の合併症を減少させることが予測される。さらに、すでに簡単に述べたように、ＮＫ細胞の細胞傷害効果を腫瘍細胞により良好に促進するために、本発明で構築したｓＣＡＲは、次いで、ＮＫＧ２Ｄ膜貫通ドメイン、２Ｂ４共刺激ドメイン、およびＣＤ３ζ鎖からなる、ＮＫ細胞最適化ＣＡＲ４シグナル伝達モチーフと組み合わされる、ＰＮＥ特異的ｓｃＦｖを含有する（ＣＡＲ４と称される、図１Ｃ）。これらのモチーフをｓＣＡＲ系に組み込むことは、ＮＫ細胞の機能をさらに増強するであろう。

【0041】

ｓＣＡＲ発現ＮＫ細胞の産生のためのＮＫ９２細胞およびｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞の両方が使用されている。ｉＰＳＣ由来のＮＫ細胞を使用することのいくつかの利点がある。これらの細胞は、正常なＮＫ細胞表現型および遺伝子発現プロファイルを有する（一方、ＮＫ９２細胞は異数性であり、患者に投与する前に照射されなければならない）。ｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞の産生は現在、臨床スケールでｃＧＭＰ条件下で行われ得る。したがって、ｓＣＡＲ発現ｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞は、本質的に無制限の供給で産生することができる均一な集団を提供する。ＮＫ細胞は特定の患者に適合させる必要がない（すなわち、同種異系エフェクター細胞として機能する）ため、可溶性抗腫瘍スイッチと組み合わせたｓＣＡＲ発現ｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞の標準化された集団を使用して、１つの標準化された「既製の」ＮＫ細胞産物とは異なる腫瘍を標的化することができる。これは、標的化細胞ベースの療法に対する「普遍的」アプローチを提供する。さらに、同じｓＣＡＲ発現ＮＫ細胞を有する複数のスイッチを使用することによって、２つ以上の腫瘍抗原を標的化することができる。

【0042】

本発明は、（１）本発明に記載のがんの治療モダリティとして、（２）感染症の治療モダリティとして（ＨＩＶ感染細胞上のｇｐ１２０などのウイルス感染した細胞上の抗原を標的とすることによって）商業的に適用され得る。本発明の概念実証研究における説明および選択された抗原は、がんに基づいているが、本発明の有用性は、がん性細胞およびウイルス感染細胞を殺傷させるＮＫ細胞のメカニズムが類似しているため、感染症、特にウイルス感染症に容易に移行され得る；ならびに（３）抗原の発見および検証に関する研究のためのツールとして、商業的に適用され得る。ＣＡＲベースのがん免疫療法の将来的な成功は、信頼性の高いがん特異的抗原の発見に大きく依存する。ゲノム学、表面プロテオミクス、およびバイオインフォマティクスの現在の進歩により、表面がん抗原をこれまで以上に迅速に発見することが可能になる。従来のＣＡＲ療法に依存すると、大規模な抗原候補を用いてＣＡＲ療法を検証するための増大する需要に対応することは不可能であろう。本発明のｓＣＡＲ－ＮＫ細胞は、細胞ベースの免疫療法のための真に普遍的なアプローチを提供する。

【0043】

ｓＣＡＲ－ＮＫ系を使用する可能性のある標的としては、固形腫瘍、血液悪性腫瘍、およびウイルス感染の標的が含まれるが、これらに限定されない。

【0044】

固形腫瘍のスイッチ標的の例としては、ＡＣｈＲ（胎児アセチルコリン受容体）、Ｂ７－Ｈ４、ＣＡＩＸ（炭酸脱水酵素ＩＸ）、ＣＤ１３３（プロミニン－１）、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４７（インテグリン関連タンパク質またはＩＡＰ）、ＣＤ７０（複数の疾患カテゴリーで使用）、ＣＥＡ（がん胎児性抗原）、ｃ－Ｍｅｔ（ｃ－間葉上皮移行因子）、ＤＬＬ３（Ｄｅｌｔａ－ｌｉｋｅ３）、ＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ（ＩＩＩ型変異上皮成長因子受容体、ＥｐＣＡＭ（上皮細胞接着分子）、ＥｐｈＡ２（エリスロポエチン産生肝細胞がんＡ２）、ＥｒｂＢ２、ＦＡＰ（線維芽細胞活性化タンパク質）、ＦＲａ（葉酸受容体アルファ）、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ７（Ｆｚｄ７）、ＧＤ２（ガングリオシドＧＤ２）、ＧＰＣ３（グリピカン－３）、ＧＵＣＹ２Ｃ（グアニリルシクラーゼＣ）、ＨＥＲ１（ヒト上皮成長因子受容体１）、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２、ヒト上皮成長因子２）、ＩＣＡＭ－１（細胞間接着分子１）、ＩＬ１１Ｒα（インターロイキン１１受容体ａ）、ＩＬ１３Ｒα２（インターロイキン１３受容体ａ２）、Ｌ１－ＣＡＭ（ヒトＬ１細胞接着分子、ＣＤ１７１）、ＬｅＹ（ルイスＹ抗原）、ＭＡＧＥ（メラノーマ関連抗原）、ＭＣＡＭ（ＣＤ１４６）（メラノーマ細胞接着分子）、メソテリン、ＭＵＣ１（ムチン１）、ＭＵＣ１６エクト（ムチン１６）、ＮＫＧ２ＤＬ（ナチュラルキラーグループ２メンバーＤリガンド）、ＮＹ－ＥＳＯ－１（がん／精巣抗原１）、ＰＤ－Ｌ１（Ｂ７－Ｈ１）（ＣＤ２７４）、ＰＳＣＡ（前立腺幹細胞抗原）、ＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原）、ＲＯＲ１（受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体）（複数の疾患カテゴリーで使用）、ＴＡＧ７２（腫瘍関連糖タンパク質－７２）、およびＶＥＧＦＲ（血管内皮増殖因子受容体１）が含まれるが、これらに限定されない。

【0045】

血液悪性腫瘍のスイッチ標的の例としては、ＢＣＭＡ（Ｂ細胞成熟抗原）、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８（シンデカン－１）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４（複数の疾患カテゴリーで使用）、ＣＤ７、ＣＤ７０（複数の疾患カテゴリーで使用）、ＣＬＬ１、ＣＳ１（連結セグメント１）、カッパ軽鎖、およびＲＯＲ１（受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体）（複数の疾患カテゴリーで使用）が含まれるが、これらに限定されない。

【0046】

ウイルス感染のスイッチ標的の例としては、ＨＩＶ（エンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０）、ＣＤ４（複数の疾患カテゴリーで使用）、ＨＢＶ（ＨＢｓＡｇ－Ｂ型肝炎表面抗原）、ＥＢＶ（ＬＭＰ１－潜在膜タンパク質１）、ＣＭＶ（ｇＢ－糖タンパク質Ｂ）、およびＨＣＶ（糖タンパク質Ｅ２）が含まれるが、これらに限定されない。

【0047】

本明細書で言及されるすべての刊行物、特許、および特許出願は、個々の刊行物、特許、または特許出願が各々参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されているかの如く同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。

【0048】

別様に定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術および科学用語は、本発明の分野における当業者が通常理解しているものと同様の意味を有する。本明細書で記載されるものと同様または同等のあらゆる方法および材料が、本発明の実施で使用され得るのであるが、例示的な方法、装置および材料が、本明細書に記載されている。

【0049】

本発明の実施は、特に明記しない限り、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来の技術を使用し、これらは当業者の技量の範囲内である。そのような技法については、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９）、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）、Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，１９８７）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９８７，ａｎｄ ｐｅｒｉｏｄｉｃ ｕｐｄａｔｅｓ）、ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４）、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ ｅｄ．，（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ ２００３）、およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２２ｔｈ ｅｄ．，（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ ａｎｄ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ａｔ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２０１２）などの文献に十分に説明されている。

【0050】

本明細書で使用されるとき、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「それによって特徴付けられる」、またはそれらの任意の他の変形は、明示的に示される任意の限定に従って、列挙される構成要素の非排他的な網羅を包含することが意図されている。例えば、融合タンパク質、医薬組成物、および／または要素（例えば、構成要素、特徴、またはステップ）の列挙を「含む」方法は、必ずしもそれらの要素（または構成要素、またはステップ）のみに限定されないが、明示的に列挙されていない、または融合タンパク質、医薬組成物、および／もしくは方法に固有の他の要素（または構成要素、またはステップ）を含み得る。

【0051】

本明細書で使用する場合、移行句「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｏｆ）」および「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」は、指定されていない任意の要素、ステップ、または構成要素を除外する。例えば、特許請求の範囲で使用される「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｏｆ）」または「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」は、特許請求の範囲で具体的に列挙される構成要素、材料、またはステップに限定され、それに通常関連付けられる不純物（すなわち、所与の構成要素内の不純物）は除かれる。「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｏｆ）」または「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という語句が、前文の直後ではなく、請求項の本文の条項に現れる場合、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｏｆ）」または「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という語句は、その条項に記載される要素（または構成要素もしくはステップ）のみを限定し、他の要素（または構成要素）は、請求項全体から除外されない。

【0052】

本明細書で使用する場合、移行句「本質的に～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ）」および「本質的に～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」は、これらの追加の材料、ステップ、特徴、構成要素、または要素が、請求される発明の基本的かつ新規の特徴に実質的に影響を及ぼさないことを条件として、文字通り開示されるものに加えて、材料、ステップ、特徴、構成要素、または要素を含む融合タンパク質、医薬組成物、および／または方法を定義するために使用される。用語「～から本質的になる」は、「～を含む」と「～からなる」との中間を占める。

【0053】

本発明またはその好ましい実施形態の要素を紹介するとき、冠詞「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、および「ｓａｉｄ」は、要素のうちの１つ以上が存在することを意味することが意図される。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「有する」という用語は、包括的であることを意図し、列記される要素以外の追加の要素が存在する可能性があることを意味する。

【0054】

２つ以上の項目の列挙において「および／または」という用語が使用される場合、列挙された項目のいずれか１つを単独で使用しても、または列挙された項目のいずれか１つ以上と組み合わせて使用してもよいことを意味する。例えば、「Ａおよび／またはＢ」という表現は、ＡおよびＢの一方または両方、すなわち、Ａのみ、Ｂのみ、またはＡとＢの組み合わせを意味することが意図される。「Ａ、Ｂおよび／またはＣ」という表現は、Ａのみ、Ｂのみ、Ｃのみ、ＡとＢの組み合わせ、ＡとＣの組み合わせ、ＢとＣの組み合わせ、またはＡとＢとＣの組み合わせを意味することが意図される。

【0055】

本明細書に記載される本発明の態様および実施形態は、態様および実施形態「からなること」および／または「から本質的になること」を含むことが理解される。

【0056】

範囲形式での説明は、便宜上かつ簡潔さのためにすぎず、本発明の範囲に対する柔軟性のない制限として解釈されるべきではないことを理解されたい。したがって、範囲の説明は、考えられるすべての部分範囲とその範囲内の個々の数値が具体的に開示されているとみなされるべきである。例えば、１～６などの範囲の説明は、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６などの部分範囲、ならびにその範囲内の個々の数字、例えば、１、２、３、４、５、および６が具体的に開示されているとみなされるべきである。このことは、範囲の幅に関係なく適用される。また、本明細書では、値または範囲は、「約」、「約」１つの特定の値から、および／または「約」別の特定の値まで、として表されうる。そのような値または範囲が表される場合、開示される他の実施形態は、１つの特定の値から、および／または他の特定の値まで、列挙された特定の値を含む。同様に、先行詞「約」を使用することによって値が近似値として表される場合、特定の値が別の実施形態を形成することが理解されよう。本明細書で開示される値がいくつかあり、各値が、本明細書では、値自体に加えて、「約」その特定の値としても開示されることがさらに理解されよう。実施形態では、「約」は、例えば、列挙された値の１０％以内、列挙された値の５％以内、または列挙された値の２％以内を意味するために使用されうる。

【0057】

本明細書で使用する場合、「患者」または「対象」は、治療されるヒトまたは動物の対象を意味する。

【0058】

本明細書で使用する場合、「医薬組成物」という用語は、薬学的に許容される組成物を指し、組成物は、医薬的活性剤を含み、いくつかの実施形態では、薬学的に許容される担体をさらに含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、医薬的活性剤および担体の組み合わせであり得る。

【0059】

「組み合わせ」という用語は、１つの投薬単位形態における固定された組み合わせか、または併用投与のためのパーツのキットのいずれかを指し、１つ以上の活性化合物および組み合わせパートナー（例えば、「治療薬」または「補助薬剤」とも呼ばれる、以下で説明される別の薬物）が、独立して同時にまたは時間間隔内で別々に投与され得る。いくつかの状況では、組み合わせパートナーは協同的効果、例えば、相乗効果を示す。本明細書で使用される「併用投与（ｃｏ－ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）」または「併用投与（ｃｏｍｂｉｎｅｄ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）」などの用語は、選択された組み合わせパートナーを、それを必要とする単一の対象（例えば、患者）に投与することが包含されることを意味し、薬剤が必ずしも同じ投与経路または同じ時間で投与されるわけではない治療レジメンが含まれることを意図する。本明細書で使用される「医薬の組み合わせ」という用語は、２つ以上の活性成分の混合または組み合わせにより得られ、活性成分の組み合わせが固定されているものも固定されていないものも含まれる製品を意味する。「固定された組み合わせ」という用語は、活性成分、例えば、化合物および組み合わせパートナーの両方が単一の実体または用量の形態で同時に患者に投与されることを意味する。「固定されていない組み合わせ」という用語は、活性成分、例えば、化合物および組み合わせパートナーの両方が、特定の時間的制約を設けることなく別々の実体として同時に（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ）、同時に（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔｌｙ）、または連続して患者に投与されることを意味し、ここで、そのような投与により、２つの化合物が治療上有効な濃度で患者の体内で提供される。後者は、カクテル療法、例えば、３つ以上の活性成分の投与にも適用される。

【0060】

本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される」という用語は、動物、より具体的にはヒトおよび／または非ヒト哺乳動物での使用に安全な他の製剤に加えて、連邦政府もしくは州政府の規制当局によって承認されていること、または米国薬局方、一般に認められている他の薬局方に収載されていることを意味する。

【0061】

本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、脱メチル化化合物と共に投与される、賦形剤、希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバント、および／またはビヒクルを指す。そのような担体は、水および油などの無菌液体であってよく、油としては、石油、動物、植物、または合成に由来する油、例えば、落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油等、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒が挙げられる。ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの張度を調整するための薬剤もまた、担体であり得る。担体と組み合わせて組成物を作成する方法は、当業者に既知である。いくつかの実施形態では、「薬学的に許容される担体」という用語は、医薬投与に適合する、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、等張剤、および吸収遅延剤などを含むことを意図する。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体および薬剤の使用は、当技術分野で周知である。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ ｅｄ．，（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ ２００３）を参照のこと。従来の媒体または薬剤が活性化合物と適合しない場合を除き、組成物におけるそのような使用が企図される。

【0062】

本明細書で使用する場合、「治療的に有効な」は、疾患および医学的状態に関連する症状を、治療もしくは改善する、または何らかの方法で軽減するのに十分な薬学的に活性な化合物の量を指す。方法に関して使用される場合、方法は、疾患または状態に関連する症状を、治療もしくは改善する、または何らかの方法で軽減するのに十分有効である。例えば、疾患に関して有効量とは、その発症を阻止または予防するのに十分な量であるか、あるいは疾患病状が始まっている場合は、その疾患の進行を緩和する、改善する、安定化させる、逆戻りさせるもしくは疾患の進行を遅らせる、またはその疾患の病理学的結果を低減させる量である。いずれの場合も、有効量は単回投与で与えても分割投与で与えてもよい。

【0063】

本明細書で使用する場合、「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」、または「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」という用語は、患者の疾患に関連する症状を少なくとも改善することを包含し、改善とは、広い意味で使用され、治療されている疾患または状態に関連するパラメータ、例えば、症状の大きさが少なくとも低減することを指す。したがって、「治療」には、疾患、障害、または病的状態、または少なくともそれらに関連する症状が、完全に抑制される（例えば、発生が予防される）かまたは停止され（ｓｔｏｐｐｅｄ）（例えば、停止（ｔｅｒｍｉｎａｔｅｄ））、患者がそれ以上その状態、または少なくともその状態を特徴付ける症状に苦しむことがないようにする状況が含まれる。

【0064】

本明細書で使用する場合、および別途指定されない限り、「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」、「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」、および「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」という用語は、疾患もしくは障害の発症、再発もしくは拡散、またはそれらの１つ以上の症状の予防を指す。ある特定の実施形態では、これらの用語は、症状の発症前に、特に本明細書で提供される疾患または障害のリスクがある対象への、１つ以上の他の追加の活性剤の有無によらず、本明細書で提供される化合物または剤形での治療またはその投与を指す。用語は、特定の疾患の症状の抑制または低減を包含する。ある特定の実施形態では、疾患の家族歴を有する対象は、予防レジメンの可能性のある候補である。ある特定の実施形態では、再発症状の履歴を有する対象も、予防のための可能性のある候補である。この点で、「予防」という用語は、「予防的治療」という用語と互換的に使用され得る。

【0065】

本明細書で使用する場合、および別段の定めがない限り、化合物の「予防有効量」は、疾患もしくは障害を予防するのに、またはその再発を予防するのに十分な量である。予防有効量の化合物は、疾患の予防における予防的利益を提供する、単独でまたは１つ以上の他の薬剤と組み合わせた治療剤の量を意味する。「予防有効量」という用語は、全体的な予防を改善するか、または別の予防剤の予防有効性を増強する量を包含し得る。本明細書で使用する場合、および別途指定されない限り、「対象」という用語は、本明細書では、霊長類（例えば、ヒト）、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウスなどを含むが、これらに限定されない、哺乳類などの動物を含むように定義される。特定の実施形態では、対象は、ヒトである。「対象」および「患者」という用語は、本明細書では、例えば、ヒトなどの哺乳類対象を指して互換的に使用される。

【0066】

本明細書で使用する場合、「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、抗原に免疫学的に結合する抗原結合部位を含有する分子を指す。抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ｄＡｂ（ドメイン抗体）、一本鎖、Ｆ_ａｂ、Ｆ_ａｂ’およびＦ_{（ａｂ’）２}断片、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、ならびにＦ_ａｂ発現ライブラリを含むが、これらに限定されない。基本的な抗体構造単位は、四量体を含むことが知られている。各四量体は、２つの同一のポリペプチド鎖対から構成され、各対は、１つの「軽い」鎖（約２５ｋＤａ）および１つの「重い」鎖（約５０～７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、主に抗原認識を担う約１００～１１０個以上のアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、主にエフェクター機能を担う定常領域を画定する。一般に、ヒトから得られる抗体分子は、分子内に存在する重鎖の性質によって互いに異なる、クラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、およびＩｇＤのいずれかに関する。ある特定のクラスは、同様に、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、および他のものなどのサブクラスを有する。さらに、ヒトにおいて、軽鎖は、カッパ鎖またはラムダ鎖であってもよい。

【0067】

本明細書で使用される「抗体」という用語は、それらが、目的の標的抗原部位およびそのアイソフォームへの結合の所望の生物学的活性を示す限り、モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、および抗体断片を包含する。「抗体断片」という用語は、完全長抗体の部分、概して、その抗原結合または可変領域を含む。抗体のＦｃ、Ｆｖ、およびＦａｂ領域は、当該技術分野で周知である。本明細書で使用される「抗体」という用語は、ヒト抗体、ラット抗体、マウス抗体、ウサギ抗体などを含むが、これらに限定されず、合成的に作製され得るかまたは天然に存在し得る、任意の種およびリソースに由来する任意の抗体を包含する。

【0068】

本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体を指し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、少量で存在し得る可能性のある天然に存在する変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は、非常に特異的であり、単一の抗原部位に対して方向付けられる。さらに、異なる決定基（エピトープ）に対して方向付けられる異なる抗体を典型的に含む従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して方向付けられる。「モノクローナル抗体」はまた、当該技術分野で知られる技術を使用して、ファージ抗体ライブラリから単離され得る。

【0069】

本明細書におけるモノクローナル抗体は、それらが所望の生物学的活性を示す限り、重鎖および／または軽鎖の部分が、特定の種に由来するか、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一であるか、または相同である一方で、鎖の残りは、別の種に由来するか、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体、およびかかる抗体の断片における対応する配列と同一であるか、または相同である、「キメラ」抗体（免疫グロブリン）を含む。本明細書で使用する場合、「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」は、第２のポリペプチドに動作可能に連結された第１のポリペプチドを含む。キメラタンパク質は、任意選択で、第１または第２のポリペプチドに動作可能に連結された第３、第４もしくは第５または他のポリペプチドを含み得る。キメラタンパク質は、２つ以上の異なるポリペプチドを含み得る。キメラタンパク質は、同じポリペプチドの複数のコピーを含み得る。キメラタンパク質はまた、１つ以上のポリペプチドにおける１つ以上の変異を含み得る。キメラタンパク質の作製方法は、当該技術分野で周知である。

【0070】

ヒトにおけるモノクローナル抗体の潜在的な免疫原性を回避するために、所望の機能を有するモノクローナル抗体は、好ましくは、ヒトであり、またはヒト化される。非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化された」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有するキメラ抗体である。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）からの超可変領域残基によって置き換えられる、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体に見られない残基を含み得る。これらの修飾を行って、抗体性能をさらに洗練させる。

【0071】

「抗原結合部位」または「結合部分」という用語は、抗原結合に関与する抗体分子の部分を指す。抗原結合部位は、重鎖（「Ｈ」）および軽鎖（「Ｌ」）のＮ末端可変（「Ｖ」）領域のアミノ酸残基によって形成される。「超可変領域」と称される、重鎖および軽鎖のＶ領域内の３つの非常に発散した延伸部は、「フレームワーク領域」または「ＦＲ」として知られる、より保存された隣接延伸部の間に介在される。したがって、「ＦＲ」という用語は、免疫グロブリン内の超可変領域の間に、およびそれに隣接して天然に見出されるアミノ酸配列を指す。抗体分子では、軽鎖の３つの超可変領域および重鎖の３つの超可変領域は、３次元空間内で互いに相対的に配置されて、抗原結合表面を形成する。抗原結合表面は、結合抗原の三次元表面に相補的であり、重鎖および軽鎖の各々の３つの超可変領域は、「相補的決定領域」または「ＣＤＲ」と称される。各ドメインへのアミノ酸の割り当てについては、Ｋａｂａｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９８７ ａｎｄ １９９１））、またはＣｈｏｔｈｉａ ＆ Ｌｅｓｋ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７）、Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７８－８８３（１９８９）を参照されたい。ＣＤＲの同定のためのガイドラインは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／＃ｃｄｒｉｄで入手可能である。

【0072】

本明細書で使用する場合、「エピトープ」という用語は、抗体またはＴ細胞受容体に特異的に結合することができる抗原の任意のタンパク質決定基を含む。エピトープ決定基は、通常、アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面グルーピングからなり、通常、特定の三次元構造特性、ならびに特定の電荷特性を有する。例えば、抗体は、ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端ペプチドに対して産生され得る。抗体は、解離定数が１μＭ以下、好ましくは１００ｎＭ以下、最も好ましくは１０ｎＭ以下である場合に、抗原に特異的に結合すると言われる。本明細書で使用する場合、「ペプチドネオアンチゲンエピトープ（ＰＮＥ）」という用語は、免疫系によって以前に認識されなかった任意のエピトープを含む。ＰＮＥは、腫瘍特異的変異抗原（ネオ抗原）を有する腫瘍細胞を標的とするために使用され得、個別化された免疫療法を可能にする。

【実施例】

【0073】

ｓＣＡＲ発現ＮＫ細胞。ｓＣＡＲ系は以前にＴ細胞でのみ試験されていたため、ＮＫ９２細胞で発現された抗ＣＤ１９ ｓＣＡＲの初期概念実証試験を実施した。ＮＫ９２は、新規のＮＫ細胞－ＣＡＲ構築物を試験するために以前に使用されてきたＮＫ細胞株である^１９。ここで、ｓＣＡＲは、ＮＫ細胞内シグナル伝達経路の活性化を媒介し、ＮＫ細胞で発現されるＣＡＲ－Ｔ細胞構築物と比較してＮＫ－ＣＡＲ抗腫瘍活性を向上させる、上述のＣＡＲ４ ＮＫ細胞シグナル伝達ドメインを含むように再設計された^１９。ＣＤ１９^＋ Ｒａｊｉ Ｂ細胞リンパ性白血病（血液悪性腫瘍モデル）またはＦＺＤ７^＋ ＭＡ１４８卵巣がん細胞株（固形腫瘍モデル）のいずれかの特異的殺傷を媒介する抗ＣＤ１９スイッチおよび抗ＦＺＤ７スイッチの両方の有効性が実証された（図２Ａ～２Ｂ）。抗ＣＤ１９スイッチについて、抗ＣＤ１９スイッチが、ＣＤ１９欠失したＲａｊｉ細胞およびＣＤ１９陰性Ｋ５６２細胞を使用して存在する場合にのみ、殺傷の特異性が示された（図２Ａおよびデータは示されない）。図２Ｂは、異なるＦｚｄ７スイッチの存在下でのｓＣＡＲ４－ＮＫ９２細胞によるＭＡ１４８細胞の殺傷を示す。

【0074】

ＭＡ－１４８モデルでは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を再び使用して、ＦＺＤ７陰性（ＭＡ１４８ＫＯ細胞）を誘導して、特異的ＦＺＤ７会合を実証した。興味深いことに、ＮＫ９２－ｓＣＡＲ４と組み合わせた６つのＦＺＤ７スイッチのうち５つは、ＭＡ１４８細胞の抗原特異的殺傷を媒介することができたが、ＦＤＺ７陰性ＭＡ１４８ ＫＯ細胞は媒介できなかった。予想されるように、ＷＴスイッチを欠くＰＮＥは、ＮＫ９２細胞上のｓＣＡＲ４に結合せず、ＭＡ１４８細胞の殺傷を媒介しなかった。

【0075】

ｓＣＡＲ発現ｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞の誘導および機能の成功。ｓＣＡＲがＮＫ９２細胞内で発現することに成功し、機能することができることが確認された後、ｓＣＡＲ構築物をヒトｉＰＳＣ内で発現させた。ここでは、ＵＣＢ由来のｉＰＳＣライン（ＵｉＰＳＣ）を使用した。ＵｉＰＳＣを、ゼオシンによって選択されたＰｉｇｇｙＢａｃ－ｓＣＡＲ４でトランスフェクトし、ｓＣＡＲの安定した発現をＧＦＰ発現によって同定した。次に、ＵｉＰＳＣを、前述の２段階分化プロセスを使用して、成熟ＮＫ細胞に分化させた^{１９～２２}。段階Ｉでは、ＣＤ３４^＋ＣＤ３１^＋およびＣＤ３４^＋ＣＤ４３^＋造血前駆細胞の発達によって示されるように、定義されたサイトカインで培養されたｓＣＡＲトランスフェクトｉＰＳＣが造血分化を促進する。次に、これらの造血前駆細胞は、安定したＣＡＲ発現を示すＣＤ５６^＋ＣＤ４５^＋ＮＫ細胞に分化され（ＧＦＰ^＋）（図３Ａ～３Ｂ）、以前の研究のように、ＣＤ５６、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、Ｋｉｒ、Ｆａｓ、およびＴＲＡＩＬの発現を有する正常な表現型を有する^{１９、２０、２３}。

【0076】

図３Ａ～３Ｂ。ｓＣＡＲ発現ｉＰＳＣにおける造血およびＮＫ細胞分化。図３Ａは、以前の研究^{１９、２０}に見られるように、ｓＣＡＲ発現ｉＰＳＣに由来するＣＤ３４＋ＣＤ３１＋およびＣＤ３４＋ＣＤ４３＋細胞を示す正常な血液内皮細胞分化を示す。図３Ｂは、ｓＣＡＲ発現ｉＰＳＣからの正常なＮＫ細胞の発達を示し、９５％超のＣＤ４５＋ＣＤ５６＋ＮＫ細胞および６０％超のｓＣＡＲ＋ＣＤ５６＋ＮＫ細胞を示す。これらのｉＰＳＣ－ＮＫ細胞を、前述のように、９５％超の均一なＣＤ５６＋ＮＫ細胞集団に拡張する^{１９、２０}。

【0077】

ｓＣＡＲ発現ｉＰＳＣ－ＮＫ細胞の抗腫瘍活性。ＮＫ９２－ｓＣＡＲ４細胞と同様に、ｉＰＳＣ－ＮＫ－ｓＣＡＲ４細胞は、２つのＦＤＺ７特異的スイッチ（２１０８－ＣＴＢＶおよび２１０６－ＬＣＣＴ）の存在下で、腫瘍細胞株ＭＡ１４８の抗原特異的殺傷を媒介することができたが、ＭＡ１４８細胞でＦＤＺ７がノックアウトされた場合はそうではなかった（図４）。

【0078】

図４。ｉＰＳＣ－ＮＫ細胞におけるｓＣＡＲ媒介性抗腫瘍活性。ｉＰＳＣ－ＮＫ－ｓＣＡＲ４細胞を、１ｎＭの抗ＦＺＤ７スイッチＣＴＢＶおよびＬＣＣＴまたはＷＴ陰性対照スイッチの存在下で、［親ＭＡ１４８細胞（左）またはＭＡ１４８－ＦＤＺ７ ＫＯ細胞（右）のいずれか標的細胞と共培養した（図１のように）。これらの研究は、ＦＺＤ７＋標的（左）の有効なｓＣＡＲ＋抗ＦＺＤ７－スイッチ媒介性殺傷を実証するが、ＦＺＤ７－標的（右）を実証しない。

【0079】

ＮＫ－ｓＣＡＲ－ＮＫ９２細胞による腫瘍細胞のスイッチ媒介性殺傷は、蛍光顕微鏡下で３５時間にわたって直接観察され得る。殺傷は、ＩｎｃｕＣｙｔｅベースのアッセイを使用して定量的に測定され得る（図５）。具体的には、図５は、Ｆｚｄ７特異的スイッチＣＴＢＶ（２１０８）および対照スイッチ（２１０２）の存在下での、ｓＣＡＲ４－ＮＫ細胞によるＭＡ１４８細胞のＩｎｃｕＣｙｔｅ殺傷アッセイを示す。

【0080】

最後に、異なる抗原特異性を有するがん細胞を混合した培養物では、スイッチの抗原特異性によって決定される選択的殺傷が実証された（図６）。具体的には、図６は、ＭＡ１４８およびＫ５６２－ＣＤ１９の両方を含有する混合共培養物中の標的細胞のスイッチ媒介性抗原特異的殺傷を示す。両方のスイッチは、混合培養物（左）において、別々の培養物（右）におけるものと同等のレベルで特異的な殺傷を誘導した。

【0081】

共に、このｓＣＡＲ－ＮＫ細胞戦略は、ＣＡＲ媒介活性の綿密な制御を可能にする。さらに、この系は、腫瘍細胞上の複数の抗原を標的化するための柔軟性を提供し、疾患再発につながる可能性のある抗原欠損エスケープ変異体を潜在的に予防する。

【0082】

ＮＫ９２発現ｓＣＡＲ４を有する抗ＣＤ１９スイッチの試験。Ｂ細胞白血病に関するＣＡＲ－ＮＫ研究は、当初の１つのスイッチ（すなわち、ＬＣＮＴ）から、ＰＮＥペプチドを欠く対照スイッチを含む合計１０個の抗ＣＤ１９スイッチに拡張されている（図７、Ｒｏｄｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ．２０１６）。ＰＮＥ生着の位置に従って命名された構成には、以下が含まれる：ＷＴ（ＰＮＥを含まないＦａｂのみ）、ＨＣＮＴ（重鎖Ｎ末端（一価））、ＬＣＮＴ（軽鎖Ｎ末端（一価））、ＮＴＢＶ（Ｎ末端二価（両方の鎖））、ＬＣＣ１（軽鎖Ｃ１）、ＨＣＣ１（重鎖Ｃ１）、Ｃ１ＢＶ（Ｃ１二価（両方の鎖））、ＨＣＣＴ（重鎖Ｃ末端）、ＬＣＣＴ（軽鎖Ｃ末端）、およびＣＴＢＶ（Ｃ末端二価（両方の鎖））。

【0083】

これらのＣＤ１９スイッチは、アネキシンＶ／７ＡＡＤ殺傷アッセイ（ＢＩＯＬＥＧＥＮＤ（登録商標））においてＮＫ９２－ｓＣＡＲ４で試験されている。全てのスイッチは、対照ＷＴスイッチと著しい対照をなすスイッチ濃度依存的様式で、ＮＫ９２－ｓＣＡＲ４によるＮａｌｍ６細胞の殺傷を媒介した（図８、群＋／－ＳＥＭあたりｎ＝３または４）。具体的には、図８は、増加した濃度の抗ＣＤ１９スイッチの存在下でのＮａｌｍ６のＣＡＲ４－ＮＫ９２誘発性殺傷を示す。各スイッチの殺傷ＥＣ_５０は、表１に示されるように、Ｐｒｉｚｍによって計算される。

【表1】

該当なし

【0084】

興味深いことに、これらのスイッチは、ＮＫ９２細胞媒介性殺傷においては、Ｒｏｄｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ ２０１６によって以前に記載されたｓＣＡＲ－Ｔ細胞誘発性細胞傷害におけるものとはわずかに異なる相対的な動態を示し、Ｔ細胞において決定されるスイッチの相対的な有効性がＮＫ細胞に対して直接翻訳できないことを示唆している。

【0085】

ＡＭＬ。本発明は、標的に対する追加の血液悪性腫瘍として、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）に拡張された。このため、スイッチは、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、およびＣＬＬ１からなる３つのＡＭＬ関連抗原に対して操作された。図９Ａ～９Ｃは、ＡＭＬ細胞株Ｍｏｌｍ１４（図９Ａ）、ＨＬ６０（図９Ｂ）およびＭｏｌｍ１３におけるこれらの抗原の表面発現、ならびにこれらのスイッチによって媒介される殺傷の相対レベルを、異なるｓＣＡＲ４－ＮＫ９２対Ｍｏｌｍ１４（図９Ａ）もしくはＨＬ６０比率（図９Ｂ）で、または異なる濃度のスイッチで示す（図９Ｃ）。ＨＬ６０（図９Ｂ）およびＭｏｌｍ１３（図９Ｃ）からの結果は、殺傷に対する感受性と、標的細胞上で発現される抗原のレベルとの間の正の相関を示唆しているようである。ここで、非特異的スイッチ対照として、抗ＣＤ１９および抗Ｆｚｄ７スイッチを使用した。

【0086】

過去には、異なる抗原特異性を有する細胞を人工的に混合し、これらの設定においてスイッチが特異的な殺傷を媒介し得ることが示された。より自然な環境でのスイッチ依存性抗原特異性をさらに例示するために、３人の独立したドナーの市販のＰＢＭＣ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）を使用し、ｓＣＡＲ４－ＮＫ９２細胞を含有する共培養物中での殺傷アッセイ、ならびに抗ＣＤ３３もしくは抗ＣＤ１９スイッチのいずれか、または両方を行った。抗ＣＤ３３または抗ＣＤ１９スイッチがそれぞれ存在する場合にのみ、マクロファージ／単球（発現ＣＤ３３）またはＢ細胞（発現ＣＤ１９）のいずれかの特異的な殺傷が観察された（図１０Ａ～１０Ｃ）。ＣＤ３３およびＣＤ１９はこれらの細胞上では発現されないため、エフェクター細胞およびスイッチの存在はＴ細胞に影響を与えなかった。ＰＮＥを欠くＷＴ ＣＤ１９スイッチを使用した場合、マクロファージ／単球またはＢ細胞の殺傷は最小限であった。

【0087】

従来のＣＡＲとのｓＣＡＲの比較。従来のＣＡＲと比較して、ｓＣＡＲ系の有効性を評価するために、２つのインビトロ殺傷アッセイをヘッドトゥーヘッドで実行した（ＥＴ＝１：１；群＋／－ＳＤあたりｎ＝３）。１つのアッセイにおいて、共培養物は、ＲａｊｉまたはＮａｌｍ６ Ｂリンパ腫細胞株、エフェクターｓＣＡＲ４－ＮＫ９２細胞、および１０ｐＭ抗ＣＤ１９スイッチＣＴＢＶのいずれかを含有していた。第２のアッセイでは、ＣＤ１９－ＣＡＲ４－ＮＫ９２細胞を、Ｒａｊｉ細胞またはＮａｌｍ６細胞のいずれかと直接共培養した。図１１は、平均細胞毒性レベルを示す。Ｒａｊｉに対するスイッチおよびｓＣＡＲ４によって媒介される細胞傷害性は、従来のＣＡＲによって媒介されるものよりもわずかに低いが、Ｎａｌｍ６の殺傷は、両方のＣＡＲ系について同等である。同様の比較をまた、卵巣抗原Ｆｚｄ７およびＡＭＬ抗原を標的として使用して行う。

【0088】

ｓＣＡＲ４－Ｐ２Ａ－ＧＦＰコンストラクト。ＧＦＰを使用してｓＣＡＲの発現をより良好に監視するために、ｓＣＡＲ４がペプチドＰ２ＡとＧＦＰに対してフレーム内で融合させた（図示せず）構築物を操作して、ｓＣＡＲ４とＧＦＰのバイシストロン性発現を促進する既存のＩＲＥＳ断片を置き換えた。ｓＣＡＲ４－Ｐ２Ａ－ＧＦＰでトランスフェクトしたＮＫ９２細胞においては、ＩＲＥＳ含有構築物と同様のレベルのインビトロ細胞毒性が解明された。図１２は、ＧＦＰ発現のレベルを示す。具体的には、ＳＢ－ｓＣＡＲ４－Ｐ２Ａ－ＧＦＰまたはＳＢ－ｓＣＡＲ４－ＩＲＥＳ－ＧＦＰのいずれかでトランスフェクトしたＮＫ９２細胞におけるＧＦＰおよびｓＣＡＲ４発現。ＷＴ ＮＫ９２との比較を行った。ｓＣＡＲ４の発現をＦｃ－ＰＮＥ－ＡＦ６４７で測定した。

【0089】

図１３は、異なる抗Ｆｚｄ７スイッチの存在下で、ｓＣＡＲ４－Ｐ２ＡＧＦＰおよびｓＣＡＲ４－ＩＲＥＳ－ＧＦＰのいずれかを発現するＮＫ９２細胞によって誘導されるＭＡ１４８細胞のインビトロ殺傷のヘッドトゥーヘッド比較を示す。

【0090】

この構築物を使用して、ｉＰＳＣをトランスフェクトし、成熟したＮＫ細胞の再生を目指した。ｓＣＡＲ４－Ｐ２Ａ－ＧＦＰトランスフェクトされたｉＰＳＣにおけるｓＣＡＲ４の発現は、Ｆｃ－ＮＰＥ－ＡＦ６４７を使用してＦＡＣＳによって検出することができるが、そのレベルは、ＮＫ９２細胞におけるものよりも低かった（図１４）。

【0091】

ｓＣＡＲ４－Ｐ２Ａ－ＧＦＰトランスフェクトされたｉＰＳＣは、その多能性を保持し（図１５Ａ）、造血前駆細胞に分化した（図１５Ｂ）。成熟ＮＫ細胞は再分化中であり、その腫瘍細胞を殺傷させる効果について試験される。

【0092】

本発明の結果は、驚くべきものであり、かつ有利であった。本発明に先立って、記載されたスイッチング可能なＰＮＥ系がＮＫ細胞を使用してどのように機能するかについて認識するための示唆または試みは以前になされていなかった。以前の系はＴ細胞に対して利用されてきたが、いくつかの因子は、本発明のｓＣＡＲ－ＮＫ細胞系を、任意のｓＣＡＲ－Ｔ細胞系とは別に設定する。

【0093】

本発明に先立って、ＮＫ細胞とＴ細胞との間の有意な違いのために、スイッチング可能なＰＮＥ系がＮＫ細胞を使用して機能することは明らかではなかった。細胞表面上の密度または持続時間のいずれかに起因して、ｓＣＡＲの発現は、ＮＫ細胞とＴ細胞とで異なる可能性があり、これは、細胞がスイッチおよび標的細胞とどのように会合するかに影響を与える可能性がある。さらに、ＮＫ細胞およびＴ細胞は、活性化、シグナル伝達調節、および標的細胞との相互作用のために異なるセットの表面受容体を使用する。したがって、これらの異なる受容体および共受容体相互作用では、スイッチがＴ細胞とどのように作用するかに基づいて、ＮＫ細胞をどのように会合させるかを予測することは可能ではない。具体的には、ｓＣＡＲ４－ＮＫ９２細胞媒介性Ｒａｊｉ細胞殺傷における異なるＣＤ１９スイッチ間の殺傷動態は、Ｔ細胞会合Ｎａｌｍ６細胞殺傷におけるものとは異なっていた（Ｒｏｄｇｅｒｓ，ｅｔ ａｌ ２０１６）。本発明に示されるように、Ｔ細胞の最も効率的なスイッチは、必ずしもＮＫ細胞についての最も効率的なスイッチではなく、逆もまた同様であった。この相違が、異なる表面受容体トポロジーの影響、またはＮＫ細胞とＴ細胞との間のｓＣＡＲ発現レベルに起因するかどうかは認識されていない。

【0094】

本発明では、ｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞における発現のためのｓＣＡＲ遺伝子ベクターの最適化も実施した。具体的には、ｓＣＡＲ遺伝子をサイレンシングから守るために、発現プラスミド（ＰｉｇｇｙＢａｃ）にインスレーター配列を含める必要があったが、ＮＫ９２細胞株におけるｓＣＡＲ発現にはそのようなインスレーターは必要なかった。ＮＫ９２細胞では、ＮＫ９２細胞におけるｓＣＡＲ４の効率的な発現は、はるかに小さいベクター（ＳｌｅｅｐｉｎｇＢｅａｕｔｙ系）を使用して容易に達成された。また、代替レポータータンパク質として、ＧＦＰ発現は、２つのタンパク質が、ｓＣＡＲ４－ＩＲＥＳ－ＧＦＰの構成におけるＩＲＥＳ断片によって媒介されるバイシストロニック様式で発現された場合に、ＮＫ９２細胞上のｓＣＡＲ４の発現を忠実に表した。対照的に、ＧＦＰ発現は、同じ構成を有するｉＰＳＣまたはｉＰＳＣ－ＮＫ細胞におけるｓＣＡＲ４の発現を正しく示さなかった。ｉＰＳＣにおける発現系を改善するために、新しい構築物が操作され、ＩＲＥＳ断片がＰ２Ａ切断部位と置き換えられた。この新しい構築物では、ＧＦＰおよびｓＣＡＲ４の両方が、操作されたｉＰＳＣで検出された（図１４）。

【0095】

最後に、ＮＫ細胞会合スイッチは、標的細胞と対峙するとき、抗原保有細胞を結合する強度においてＴ細胞接合スイッチとは異なるように挙動し得、したがって、異なるレベルの有効性を誘発する。要約すると、ｓＣＡＲ４をｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞内に操作することにより、それ自体独自の特徴を有する全く異なる治療用細胞製品が作製された。

【0096】

全体として、本発明の新規のｉＰＳＣ－ｓＣＡＲ４－ＮＫ細胞産物は、ＮＫ細胞の固有の特性、ならびにＮＫとｓＣＡＲ系の組み合わせによる新しい属性により、従来技術のいずれよりも有意な利点を提供する。スイッチ系およびＮＫ細胞の組み合わせは、真の既製（同種異系）治療アプローチの産生を強化するが、Ｔ細胞を使用した同じ組み合わせはそうではない。ＮＫ細胞はそれ自体が同種異系エフェクター細胞であり、その１つのバッチを拡張し、保存し、潜在的に無制限の数の患者に使用することができることを意味する。対照的に、Ｔ細胞は、自己細胞として機能するため、望ましくない毒性の副作用を回避するために、患者特有の方法で使用される必要がある。異なるスイッチを使用することによって、ｓＣＡＲ発現ｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞は、一度だけ操作され、異なる患者の両方に使用されるだけでなく、異なる腫瘍標的にも使用される必要がある。すなわち、この系は、ｓＣＡＲ発現ｉＰＳＣ－ＮＫ細胞が一度だけ操作される必要があり、任意の腫瘍抗原またはウイルス発現抗原に対する可能性のある任意の患者での使用を可能にすることを意味する。

【0097】

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３．Ｂｒｕｄｎｏ ＪＮ，Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ ＪＮ．Ｔｏｘｉｃｉｔｉｅｓ ｏｆ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔ ｃｅｌｌｓ：ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ．Ｂｌｏｏｄ．２０１６；１２７（２６）：３３２１－３３３０．
４．Ｐａｒｋｈｕｒｓｔ ＭＲ，Ｙａｎｇ ＪＣ，Ｌａｎｇａｎ ＲＣ，ｅｔ ａｌ．Ｔ ｃｅｌｌｓ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｃａｎ ｍｅｄｉａｔｅ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ ｂｕｔ ｉｎｄｕｃｅ ｓｅｖｅｒｅ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｃｏｌｉｔｉｓ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１１；１９（３）：６２０－６２６．
５．Ｍｏｒｇａｎ ＲＡ，Ｙａｎｇ ＪＣ，Ｋｉｔａｎｏ Ｍ，Ｄｕｄｌｅｙ ＭＥ，Ｌａｕｒｅｎｃｏｔ ＣＭ，Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ＳＡ．Ｃａｓｅ ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ａ ｓｅｒｉｏｕｓ ａｄｖｅｒｓｅ ｅｖｅｎｔ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｔｈｅ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ ｗｉｔｈ ａ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｒｅｃｏｇｎｉｚｉｎｇ ＥＲＢＢ２．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１０；１８（４）：８４３－８５１．
６．Ｇｉｌｌ Ｓ，Ｔａｓｉａｎ ＳＫ，Ｒｕｅｌｌａ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ ａｎｄ ｍｙｅｌｏａｂｌａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ．Ｂｌｏｏｄ．２０１４；１２３（１５）：２３４３－２３５４．
７．Ｋｅｎｄｅｒｉａｎ ＳＳ，Ｒｕｅｌｌａ Ｍ，Ｓｈｅｓｔｏｖａ Ｏ，ｅｔ ａｌ．ＣＤ３３－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｅｘｈｉｂｉｔ ｐｏｔｅｎｔ ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ ｈｕｍａｎ ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ．２０１５；２９（８）：１６３７－１６４７．
８．Ｂｅｙａｒ－Ｋａｔｚ Ｏ，Ｇｉｌｌ Ｓ．Ｎｏｖｅｌ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ Ａｃｕｔｅ Ｍｙｅｌｏｉｄ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１８；２４（２２）：５５０２－５５１５．
９．Ｂｅａｔｔｙ ＧＬ，Ｈａａｓ ＡＲ，Ｍａｕｓ ＭＶ，ｅｔ ａｌ．Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｍＲＮＡ－Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｔ Ｃｅｌｌｓ Ｉｎｄｕｃｅ Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ Ｓｏｌｉｄ Ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２０１４；２（２）：１１２－１２０．
１０．Ｃｕｍｍｉｎｓ ＫＤ，Ｆｒｅｙ Ｎ，Ｎｅｌｓｏｎ ＡＭ，ｅｔ ａｌ．Ｔｒｅａｔｉｎｇ Ｒｅｌａｐｓｅｄ／Ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ（ＲＲ） ＡＭＬ ｗｉｔｈ Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ Ａｎｔｉ－ＣＤ１２３ ＣＡＲ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｔ Ｃｅｌｌｓ．Ｂｌｏｏｄ．２０１７；１３０（Ｓｕｐｐｌ１）：１３５９－１３５９．
１１．Ｄｉａｃｏｎｕ Ｉ，Ｂａｌｌａｒｄ Ｂ，Ｚｈａｎｇ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｃａｓｐａｓｅ－９ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ Ｍｏｄｕｌａｔｅｓ ｔｈｅ Ｔｏｘｉｃｉｔｉｅｓ ｏｆ ＣＤ１９－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ－Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｔ Ｃｅｌｌｓ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１７；２５（３）：５８０－５９２．
１２．Ｒｏｄｇｅｒｓ ＤＴ，Ｍａｚａｇｏｖａ Ｍ，Ｈａｍｐｔｏｎ ＥＮ，ｅｔ ａｌ．Ｓｗｉｔｃｈ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ＣＡＲ－Ｔ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ Ｂ－ｃｅｌｌ ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２０１６；１１３（４）：Ｅ４５９－４６８．
１３．Ｖｉａｕｄ Ｓ，Ｍａ ＪＳＹ，Ｈａｒｄｙ ＩＲ，ｅｔ ａｌ．Ｓｗｉｔｃｈａｂｌｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｖｅｒ ｉｎ ｖｉｖｏ ＣＡＲ Ｔ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ，Ｂ ｃｅｌｌ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ，ａｎｄ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｍｏｒｙ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２０１８；１１５（４６）：Ｅ１０８９８－Ｅ１０９０６．
１４．Ｃａｏ Ｙ，Ｒｏｄｇｅｒｓ ＤＴ，Ｄｕ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｓｗｉｔｃｈａｂｌｅ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔ Ｃｅｌｌｓ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ．Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ．２０１６；５５（２６）：７５２０－７５２４．
１５．Ｒａｊ Ｄ，Ｙａｎｇ ＭＨ，Ｒｏｄｇｅｒｓ Ｄ，ｅｔ ａｌ．Ｓｗｉｔｃｈａｂｌｅ ＣＡＲ－Ｔ ｃｅｌｌｓ ｍｅｄｉａｔｅ ｒｅｍｉｓｓｉｏｎ ｉｎ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｄｕｃｔａｌ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｇｕｔ．２０１８．
１６．Ｍｏｒｓｕｔ Ｌ，Ｒｏｙｂａｌ ＫＴ，Ｘｉｏｎｇ Ｘ，ｅｔ ａｌ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｃｕｓｔｏｍｉｚｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｅｎｓｉｎｇ ａｎｄ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｂｅｈａｖｉｏｒｓ Ｕｓｉｎｇ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｎｏｔｃｈ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｃｅｌｌ．２０１６；１６４（４）：７８０－７９１．
１７．Ｌｉｍ ＷＡ，Ｊｕｎｅ ＣＨ．Ｔｈｅ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌｓ ｔｏ Ｔｒｅａｔ Ｃａｎｃｅｒ．Ｃｅｌｌ．２０１７；１６８（４）：７２４－７４０．
１８．Ｃｈｏ ＪＨ，Ｃｏｌｌｉｎｓ ＪＪ，Ｗｏｎｇ ＷＷ．Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ ａｎｄ Ｌｏｇｉｃａｌ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｃｅｌｌ．２０１８；１７３（６）：１４２６－１４３８．ｅ１４１１．
１９．Ｌｉ Ｙ，Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ ＤＬ，Ｍｏｒｉａｒｉｔｙ ＢＳ，Ｋａｕｆｍａｎ ＤＳ．Ｈｕｍａｎ ｉＰＳＣ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｗｉｔｈ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ Ｅｎｈａｎｃｅ Ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ Ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．２０１８；２３（２）：１８１－１９２ ｅ１８５．
２０．Ｋｎｏｒｒ ＤＡ，Ｎｉ Ｚ，Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ Ｄ，ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ－Ｓｃａｌｅ Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌｓ Ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ．ＳＴＥＭ ＣＥＬＬＳ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０１３；２（４）：２７４－２８３．
２１．Ｂｏｃｋ ＡＭ，Ｋｎｏｒｒ Ｄ，Ｋａｕｆｍａｎ ＤＳ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｅｘｐａｎｓｉｏｎ，ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＮＫ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ（ｈＥＳＣｓ） ａｎｄ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ（ｉＰＳＣｓ）．Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ．２０１３（７４）：ｅ５０３３７．
２２．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ ＤＬ，Ｂｅｎｄｚｉｃｋ Ｌ，Ｐｒｉｂｙｌ Ｌ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｏｖａｒｉａｎ Ｃａｎｃｅｒ．ＳＴＥＭ ＣＥＬＬＳ．２０１６；３４（１）：９３－１０１．
２３．Ｎｉ Ｚ，Ｋｎｏｒｒ ＤＡ，Ｂｅｎｄｚｉｃｋ Ｌ，Ａｌｌｒｅｄ Ｊ，Ｋａｕｆｍａｎ ＤＳ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＣＤ４ζ ｂｙ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌｓ Ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｉｍｐｒｏｖｅｓ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｂｕｔ Ｄｏｅｓ Ｎｏｔ Ｅｎｈａｎｃｅ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＨＩＶ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ Ｉｎ Ｖｉｖｏ．ＳＴＥＭ ＣＥＬＬＳ．２０１４；３２（４）：１０２１－１０３１．
２４．Ｊｕｎｅ ＣＨ，Ｓａｄｅｌａｉｎ Ｍ．Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０１８；３７９（１）：６４－７３．
２５．ＰＳ Ｗｏｌｌ，ＣＨ Ｍａｒｔｉｎ，ＪＳ Ｍｉｌｌｅｒ，ＤＳ Ｋａｕｆｍａｎ．Ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ ＮＫ ｃｅｌｌｓ ａｃｑｕｉｒｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｎｄ ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１７５（２００５），ｐｐ．５０９５－５１０３．
２６．Ｄｅｎｇ Ｘ，Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＮＫＧ２Ｄ ＣＡＲ－Ｔ ｃｅｌｌｓ ａｇａｉｎｓｔ ｈｕｍａｎ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ａｍ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１９；９（５）：９４５－９５８．

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3A】

【図3B】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15A】

【図15B】

【国際調査報告】