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特表2022-524515より強力なＮＫ細胞を設計するためのＳＴＡＴ３トランスクリプトーム
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-05-06
(54)【発明の名称】より強力なＮＫ細胞を設計するためのＳＴＡＴ３トランスクリプトーム
(51)【国際特許分類】
C12N 5/0783 20100101AFI20220425BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220425BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20220425BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20220425BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20220425BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20220425BHJP
A61K 31/7105 20060101ALI20220425BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20220425BHJP
【ＦＩ】
C12N5/0783
A61P35/00
A61P37/02
A61P43/00 121
A61K35/17 Z
A61P43/00 107
A61K48/00
A61K31/7105
C12N15/09 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021553146
(86)(22)【出願日】2020-03-09
(85)【翻訳文提出日】2021-09-07
(86)【国際出願番号】 US2020021737
(87)【国際公開番号】W WO2020185698
(87)【国際公開日】2020-09-17
(31)【優先権主張番号】62/815,625
(32)【優先日】2019-03-08
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】515041446
【氏名又は名称】リサーチ インスティテュート アット ネイションワイド チルドレンズ ホスピタル
【氏名又は名称原語表記】ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ ＡＴ ＮＡＴＩＯＮＷＩＤＥ ＣＨＩＬＤＲＥＮ’Ｓ ＨＯＳＰＩＴＡＬ
(74)【代理人】
【識別番号】100092783
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 浩
(74)【代理人】
【識別番号】100120134
【弁理士】
【氏名又は名称】大森 規雄
(72)【発明者】
【氏名】チャカラヴァティ，ニティン
(72)【発明者】
【氏名】リー，ディーン アンソニー
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C086
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AC14
4B065AC20
4B065BA30
4B065BB19
4B065BD39
4B065CA44
4C084AA13
4C084MA02
4C084NA05
4C084ZB071
4C084ZB261
4C084ZC751
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA02
4C086MA04
4C086NA05
4C086ZB07
4C086ZB22
4C086ZB26
4C086ZC75
4C087AA01
4C087AA02
4C087AA03
4C087BB37
4C087CA04
4C087CA20
4C087MA02
4C087NA05
4C087ZB07
4C087ZB22
4C087ZB26
4C087ZC75
(57)【要約】
いくつかの態様では、活性化されたＳＴＡＴ３トランスクリプトームを含む、増殖ＮＫ細胞組成物、ならびにそれらを使用して疾患を治療、阻害、低減、改善、および／または予防する方法が開示される。
【選択図】図３Ｂ
【選択図】図３Ｂ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
修飾ＳＴＡＴ３トランスクリプトームを含む、増殖修飾ナチュラルキラー細胞。
【請求項2】
１つ以上の差次的発現遺伝子を含み、差次的発現遺伝子は、ナイーブナチュラルキラー細胞における前記遺伝子の発現と比較して、発現が少なくとも約５０％増加または減少している、請求項１に記載の増殖修飾ナチュラルキラー細胞。
【請求項3】
前記ＳＴＡＴ３トランスクリプトームが、テロメア組織化に関与する１つ以上の差次的発現遺伝子を含む、請求項１に記載の増殖修飾ナチュラルキラー細胞。
【請求項4】
前記ＳＴＡＴ３トランスクリプトームが、有糸分裂の制御に関与する差次的発現遺伝子を含む、請求項１に記載の増殖修飾ナチュラルキラー細胞。
【請求項5】
前記ＳＴＡＴ３トランスクリプトームが、ＤＮＡ修復に関与する差次的発現遺伝子を含む、請求項１に記載の増殖修飾ナチュラルキラー細胞。
【請求項6】
前記ＳＴＡＴ３トランスクリプトームが、免疫に関与する差次的発現遺伝子を含む、請求項１に記載の増殖修飾ナチュラルキラー細胞。
【請求項7】
前記ＳＴＡＴ３トランスクリプトームが、サイトカインシグナル伝達に関与する差次的発現遺伝子を含む、請求項１に記載の増殖修飾ナチュラルキラー細胞。
【請求項8】
前記ＳＴＡＴ３トランスクリプトームが、解糖に関与する差次的発現遺伝子を含む、請求項１に記載の増殖修飾ナチュラルキラー細胞。
【請求項9】
前記ＳＴＡＴ３トランスクリプトームが、糖新生に関与する差次的発現遺伝子を含む、請求項１に記載の増殖修飾ナチュラルキラー細胞。
【請求項10】
前記ＳＴＡＴ３トランスクリプトームが、ｐ５３経路に関与する差次的発現遺伝子を含む、請求項１に記載の増殖修飾ナチュラルキラー細胞。
【請求項11】
前記ＳＴＡＴ３トランスクリプトームが、図３または図４に示される１つ以上の差次的発現遺伝子を含む、請求項１に記載の増殖修飾ナチュラルキラー細胞。
【請求項12】
前記ＳＴＡＴ３トランスクリプトームが、ＨＩＳＴ１Ｈ１Ｂ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＢ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＧ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＨ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＩ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＪ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＬ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＢ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＥ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＨ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＪ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＬ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＭ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＯ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｂ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｃ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｆ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｇ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｈ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｊ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ａ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｄ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｌ、ＨＩＳＴ２Ｈ３Ｃ、ＨＩＳＴ２Ｈ４Ｂ、ＨＩＳＴ３Ｈ２ＢＡ、ＨＩＳＴ３Ｈ２ＢＢ、ＡＢＣＡ１、ＡＫ５、ＡＳＣＬ２、Ｂ３ＧＡＴ１、ＣＡＣＮＡ２Ｄ２、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ２、ＥＮＰＰ５、ＦＢＬＮ２、ＦＣＲＬ３、ＧＮＡＬ、ＧＰＲＡＳＰ１、ＧＲＩＫ４、ＧＴＳＥ１、ＨＩＳＴ３Ｈ２ＢＢ、ＩＬ１Ｂ、ＩＴＧＡ２、ＫＩＦ１３Ａ、ＫＩＦ４Ａ、ＬＩＮＣ００５９９、ＬＯＮＲＦ３、ＬＲＲＮ３、ＭＳＣ－ＡＳ１、ＮＦＩＸ、ＮＵＡＫ１、ＮＵＡＫ２、ＰＣＤＨ１、ＰＬＸＮＡ４、ＲＡＤ５１、ＲＮＦ１５７、ＳＬＣ１Ａ７、ＳＰＯＮ２、ＴＹＭＳ、ＷＷＣ２、ＺＮＦ４４２、ＺＮＦ７２７、またはＺＳＣＡＮ１８を含む、差次的に発現された１つ以上の遺伝子を含む、請求項１に記載の増殖修飾ナチュラルキラー細胞。
【請求項13】
前記ナチュラルキラー細胞が、ＢＩＲＣＳ、ＭＫ１６７、ＴＯＰ２Ａ、ＣＫＳ２、およびＲＡＣＧＡＰｌからなる群から選択される、上方制御された１つ以上のタンパク質を含む、請求項１に記載の増殖修飾ナチュラルキラー細胞。
【請求項14】
前記ナチュラルキラー細胞が、ＰＴＣＨｌ、ＴＧＦＢ３、およびＡＴＭからなる群から選択される、下方制御された１つ以上のタンパク質を含む、請求項１に記載の増殖修飾ナチュラルキラー細胞。
【請求項15】
前記細胞が、前記ＮＫ細胞を、膜結合型ＩＬ－２１、ＩＬ－１５、および／または４－ＢＢＬを発現するように操作された形質膜小胞、エクソソーム、またはフィーダー細胞と接触させることによって、エクスビボで増殖される、請求項１に記載の増殖修飾ナチュラルキラー細胞。
【請求項16】
前記細胞が、前記ＮＫ細胞をＩＬ－２１、ＩＬ－１５、および／または４－ＢＢＬと接触させることによって、エクスビボで増殖される、請求項１に記載の増殖修飾ナチュラルキラー細胞。
【請求項17】
前記細胞が、前記ＮＫ細胞を、膜結合型ＩＬ－２１、ＩＬ－１５、および／または４－ＢＢＬを発現するように操作された形質膜小胞、エクソソーム、またはフィーダー細胞と接触させることによって、インビボで増殖される、請求項１に記載の増殖修飾ナチュラルキラー細胞。
【請求項18】
前記細胞が、前記ＮＫ細胞をＩＬ－２１、ＩＬ－１５、および／または４－ＢＢＬと接触させることによって、インビボで増殖される、請求項１に記載の増殖修飾ナチュラルキラー細胞。
【請求項19】
対象において癌を治療する方法であって、前記対象に、治療有効量の、請求項１～１８のいずれかに記載の増殖修飾ナチュラルキラー細胞を投与することを含む、方法。
【請求項20】
対象の免疫系を調節する方法であって、活性化されたＳＴＡＴ３トランスクリプトームを含む有効量の増殖修飾ナチュラルキラー細胞を投与することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【0001】
本出願は、２０１９年３月８日に出願された、米国仮特許出願第６２／８１５，６２５号の利益を主張し、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
【0002】
免疫療法は、免疫系を活性化または抑制することによる疾患の治療である。免疫系に由来する細胞は、免疫機能および特徴を改善することが意図される細胞ベースの療法として操作および修飾され得る。近年、免疫療法は、特に様々な形態の癌を治療するというその見込みにおいて、研究者、臨床医、および製薬会社にとって非常に関心の高いものとなっている。免疫調節レジメンは、感染症（微生物およびウイルス）疾患を治療する場合に耐性を生み出す可能性が低いことを含め、既存の薬物よりも少ない副作用を有することが多い。ＣＡＲ－Ｔアプローチなどの細胞ベースの療法は、標的化可能な抗原の入手不能性、産生および送達に関与するコスト、ならびに副作用などの様々な障壁を有する。
【0003】
従来の癌治療は、化学療法、手術、および／または放射線で癌細胞を殺滅または除去することに焦点を当てている。しかしながら、治療用免疫細胞の分野は、急速に成長しており、癌を治療、予防、またはその発症を遅延するために、従来の治療と併せて、またはいくつかの場合では、その代わりに使用することができる。リンパ球、マクロファージ、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）などのような免疫エフェクター細胞は、腫瘍細胞の表面上に発現される異常抗原を標的とすることによって、自然に協働して身体を癌から防御する。ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、多くの場合、ウイルス感染または悪性形質転換から生じる異常な細胞に対する防御の第一線であり、養子移入または潜在的なインビボ刺激によるＮＫ細胞機能の回復は、ＮＫ細胞数を増加させ、エフェクター機能を改善させるためにエクスビボ培養によって可能になる癌または他の疾患の有望な療法である。必要とされるのは、これらの療法における使用のためのＮＫ細胞を増殖および活性化する新しい改善された方法である。
【発明の概要】
【0004】
ナチュラルキラー細胞を増殖および修飾するための方法および組成物が開示され、修飾細胞は、以下により詳細に記載されるように、修飾、非天然存在ＳＴＡＴ３トランスクリプトームを任意選択的に含む。
【0005】
一態様では、様々な形態の操作された膜結合型ＩＬ－２１（ｍｂＩＬ－２１）の使用による、修飾されたＳＴＡＴ３トランスクリプトームを有する状態からなる、非天然存在を含む、増殖、および修飾ナチュラルキラー細胞が本明細書に開示される。一態様では、修飾ナチュラルキラー細胞は、ゲノムまたは遺伝子発現系の構造状態を人工的に操作することによって達成し、ナイーブナチュラルキラー細胞と比較される場合、改変されたエピジェネティクス、改変されたトランスクリプトミクス、ならびに／または外部刺激および増強された表現型に応答する改変された能力を有する修飾されたナチュラルキラー細胞をもたらすことができる。一態様では、増殖修飾ナチュラルキラー細胞は、テロメア組織化、有糸分裂の制御、ＤＮＡ修復、免疫、サイトカインシグナル伝達、改変された代謝、解糖、糖新生、細胞傷害性活性化、ｐ５３経路に関与する１つ以上の差次的発現遺伝子（例えば、これらに限定されないが、ＨＩＳＴ１Ｈ１Ｂ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＢ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＧ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＨ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＩ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＪ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＬ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＢ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＥ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＨ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＪ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＬ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＭ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＯ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｂ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｃ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｆ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｇ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｈ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｊ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ａ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｄ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｌ、ＨＩＳＴ２Ｈ３Ｃ、ＨＩＳＴ２Ｈ４Ｂ、ＨＩＳＴ３Ｈ２ＢＡ、ＨＩＳＴ３Ｈ２ＢＢ、ＡＢＣＡ１、ＡＫ５、ＡＳＣＬ２、Ｂ３ＧＡＴ１、ＣＡＣＮＡ２Ｄ２、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ２、ＥＮＰＰ５、ＦＢＬＮ２、ＦＣＲＬ３、ＧＮＡＬ、ＧＰＲＡＳＰ１、ＧＲＩＫ４、ＧＴＳＥ１、ＨＩＳＴ３Ｈ２ＢＢ、ＩＬ１Ｂ、ＩＴＧＡ２、ＫＩＦ１３Ａ、ＫＩＦ４Ａ、ＬＩＮＣ００５９９、ＬＯＮＲＦ３、ＬＲＲＮ３、ＭＳＣ－ＡＳ１、ＮＦＩＸ、ＮＵＡＫ１、ＮＵＡＫ２、ＰＣＤＨ１、ＰＬＸＮＡ４、ＲＡＤ５１、ＲＮＦ１５７、ＳＬＣ１Ａ７、ＳＰＯＮ２、ＴＹＭＳ、ＷＷＣ２、ＺＮＦ４４２、ＺＮＦ７２７、およびＺＳＣＡＮ１８を含む、図３または図４に開示されるそれらの遺伝子のいずれかなど）を含み得る修飾ＳＴＡＴ３トランスクリプトームを含み得る。
【0006】
任意の先行する態様のナチュラルキラー細胞も本明細書に開示され、下方制御対過剰発現遺伝子または上方制御対抑制遺伝子の比は、約１．５である。
【0007】
一態様では、本明細書に開示されるのは、任意の先行する態様の修飾ナチュラルキラー細胞であり、ナチュラルキラー細胞は、ＢＩＲＣＳ、ＭＫ１６７、ＴＯＰ２Ａ、ＣＫＳ２、およびＲＡＣＧＡＰｌからなる群から選択される上方制御された１つ以上のタンパク質を含む。
【0008】
任意の先行する態様の修飾ナチュラルキラー細胞も本明細書に開示され、ナチュラルキラー細胞は、ＰＴＣＨｌ、ＴＧＦＢ３、およびＡＴＭからなる群から選択される下方制御された１つ以上のタンパク質を含む。
【0009】
本開示はまた、任意の先行する態様の増殖、修飾されたナチュラルキラー細胞も包含し、細胞は、ＮＫ細胞をＩＬ－２１、ＩＬ－１５、および／または４－ＢＢＬと接触させることによって、インビボまたはエクスビボで増殖、修飾される。一態様では、ＩＬ－２１、ＩＬ－１５、および／または４－ＢＢＬは、フィーダー細胞、形質膜小胞、リポソーム、および／またはエクソソームの表面上に提供される。よって、一態様では、本明細書に開示されるのは、任意の先行する態様のナチュラルキラー細胞であり、細胞は、ＮＫ細胞を、膜結合型ＩＬ－２１、ＩＬ－１５、および／または４－ＢＢＬを発現するように操作された形質膜小胞、リポソーム、エクソソーム、またはフィーダー細胞と接触させることによって、インビボまたはエクスビボで増殖、修飾される。一態様では、ＩＬ－２１、ＩＬ－１５、および／または４－ＢＢＬとの接触は、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１５０分、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、３０、３２、３６、４２、４８、６０時間、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、４５、６０、６１、６２日、３、４、５、または６か月間起こり得る。
【0010】
また、対象において癌および／または転移を治療、阻害、低減、改善、および／または予防する方法であって、対象に治療有効量の、任意の先行する態様の増殖、修飾されたナチュラルキラー細胞を投与することを含む方法も本明細書に開示される。
【0011】
一態様では、本明細書に開示されるのは、対象の免疫系（例えば、免疫応答）を調節する（すなわち、増加または減少させる）方法であって、活性化された修飾ＳＴＡＴ３トランスクリプトームを含む、有効量の増殖、修飾ナチュラルキラー細胞を投与すること、または修飾ＳＴＡＴ３トランスクリプトームを活性化し、それによってインビボで修飾ＮＫ細胞を得ることによって、内因性ＮＫ細胞を活性化する薬剤を投与することを含む方法である。
【図面の簡単な説明】
【0012】
本明細書に組み込まれ、その一部を構成する添付の図面は、一部の実施形態を例示し、説明と共に、開示される組成物および方法を例示する。
【図1A】ナイーブおよびエクスビボ増殖、修飾ＮＫ細胞におけるゲノムワイドなＳＴＡＴ３結合を示す。図１Ａは、ＩＬ－２１刺激に応答してＳＴＡＴ３のリン酸化を示すウェスタンブロットを示す。ＮＫ細胞をＩＬ－２１で３０分間処理し、タンパク質を抽出し、ローディングコントロールとして総ＳＴＡＴ３、ホスホ－Ｙ７０５－ＳＴＡＴ３（ｐＳＴＡＴ３）、およびβ－アクチンについてブロットした。
【図1B】ナイーブおよびエクスビボ増殖、修飾ＮＫ細胞におけるゲノムワイドなＳＴＡＴ３結合を示す。図１Ｂは、刺激されたナイーブ（赤色）および増殖された遺伝子修飾（青色）ＮＫ細胞にわたってＳＴＡＴ３ ＣｈＩＰ－ｓｅｑピークサミット（ＭＡＣＳによって定義される）を示すＶｅｎｎ図を示す。
【図1C】ナイーブおよびエクスビボ増殖、修飾ＮＫ細胞におけるゲノムワイドなＳＴＡＴ３結合を示す。図１Ｃは、ＳＴＡＴ３がＩＬ－２１処理ＮＫ細胞においてそれ自体のプロモーターに結合することを示す。これは、ＳＴＡＴ３遺伝子の周囲のＳＴＡＴ３ ＣｈＩＰ－ｓｅｑタグ密度のゲノム図である。
【図1D】ナイーブおよびエクスビボ増殖、修飾ＮＫ細胞におけるゲノムワイドなＳＴＡＴ３結合を示す。図１Ｄは、ナイーブおよび増殖された遺伝子修飾ＮＫ細胞におけるＳＴＡＴ３結合部位（右モチーフ）の全リストからＨＯＭＥＲによって回収されるデノボモチーフを示す。
【図1E】ナイーブおよびエクスビボ増殖、修飾ＮＫ細胞におけるゲノムワイドなＳＴＡＴ３結合を示す。図１Ｅは、ＩＬ－２１で３０分間処理されたＮＫ細胞における全てのタンパク質コード遺伝子のＴＳＳの周りのＳＴＡＴ３結合の距離の空間分布およびヒートマップ表現を示す。
【図1F】ナイーブおよびエクスビボ増殖、修飾ＮＫ細胞におけるゲノムワイドなＳＴＡＴ３結合を示す。図１Ｆは、ＲｅｆＳｅｑ遺伝子に対するＳＴＡＴ３結合部位位置の分布を示す。結合部位の位置は、遠位プロモーター（ＴＳＳの－１～３ｋｂ上流）、近位プロモーター（－１～Ｏｋｂ）、５’ＵＴＲ、エクソン、イントロン、３’ＵＴＲ、近位下流（ＴＳＳの０～１ｋｂ下流）、遠位下流（ＴＳＳの１～３ｋｂ下流）、および遠位遺伝子間（遺伝子から＞３ｋｂ）に分けられる。
【図2A-1】（２Ａ）ナイーブおよび（２Ｂ）増殖された遺伝子修飾ＮＫ細胞におけるＳＴＡＴ３ ＣｈＩＰによって同定される遺伝子の遺伝子オントロジー（ＧＯ）分析を示す。生物学的プロセス（緑色）、分子機能（深紅色）、およびＰＡＮＴＨＥＲシグナル伝達経路（青色）を示す、ＧＲＥＡＴでのＳＴＡＴ３結合部位における全ての分析から生じる過剰に表現されたＧＯターム。
【図2B-1】（２Ａ）ナイーブおよび（２Ｂ）増殖された遺伝子修飾ＮＫ細胞におけるＳＴＡＴ３ ＣｈＩＰによって同定される遺伝子の遺伝子オントロジー（ＧＯ）分析を示す。生物学的プロセス（緑色）、分子機能（深紅色）、およびＰＡＮＴＨＥＲシグナル伝達経路（青色）を示す、ＧＲＥＡＴでのＳＴＡＴ３結合部位における全ての分析から生じる過剰に表現されたＧＯターム。
【図3A】ＩＬ－２１刺激ナイーブおよび増殖修飾ＮＫ細胞の全トランスクリプトーム分析を示す。図３Ａは、ＩＬ－２１刺激に応答した増殖およびナイーブＮＫ細胞の上方制御および下方制御転写物を表すボルケーノプロットを示す。個別の遺伝子の倍率変化の対数（ｘ軸）が、それらのｐ値の塩基１０に対する負の対数（ｙ軸）に対してプロットされる。正のｌｏｇ２（倍率変化）値は、ナイーブ細胞と比較した増殖ＮＫ細胞における上方制御を表し、負の値は、下方制御を表す。点線の上の丸は、多重検定について補正後ｐ＜０．０５で喘息と対照との間で差次的発現遺伝子を表す。
【図3B】ＩＬ－２１刺激ナイーブおよび増殖修飾ＮＫ細胞の全トランスクリプトーム分析を示す。図３Ｂは、全ての組み立てられた転写物断片の発現値を示す散布図を示す。発現は、上方制御転写物（緑色）および下方制御転写物（赤色）を含む、ＦＰＫＭのｌｏｇ２として示される。
【図3C-1】ＩＬ－２１刺激ナイーブおよび増殖修飾ＮＫ細胞の全トランスクリプトーム分析を示す。図３Ｃは、異なるドナーにわたる上位１００個の富化および枯渇転写物のヒートマップを示す。カラーコーディングは、ｄｏｇ変換されたリードカウント値に基づく。
【図4A】ＮＫ細胞機能に関連するｉｎｇｅｎｕｉｔｙ Ｐａｔｈｗａｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＩＰＡ）ベースのネットワークを示す。図４Ａは、ＩＬ－２１刺激、増殖、および修飾、ならびにナイーブＮＫ細胞において差次的に発現される遺伝子のリストのＩＰＡベースの経路分析を示す（Ｐ値：’．Ｓ ０．０１および倍率変化２：１．５）。
【図4B】ＮＫ細胞機能に関連するｉｎｇｅｎｕｉｔｙ Ｐａｔｈｗａｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＩＰＡ）ベースのネットワークを示す。図４Ｂは、細胞死および生存、感染疾患、細胞機能および維持、ならびに血液疾患に対応するＩＰＡソフトウェアで同定されるトップスコアの制御ネットワークを示す。エクスビボ増殖、活性化、およびよって修飾ＮＫ細胞において上方制御および下方制御される遺伝子（ナイーブのものと比較される場合）は、それぞれ、赤色および緑色ノード内に表示される。遺伝子間の実線および破線は、それぞれ、既知の直接および間接的遺伝子相互作用を表す。ノードの形状は、各遺伝子産物の機能クラス：転写制御因子（水平楕円）、膜貫通受容体（垂直楕円）、酵素（垂直菱形）、サイトカイン／成長を反映する。
【図5A】ＳＴＡＴ３結合が近傍遺伝子の発現を制御することを示す。Ｅｎｒｉｃｈｒによって計算される過剰に表現されたＧＯタームの選択されたカテゴリーの要約。（図５Ａ）上方制御遺伝子を使用して、ＧＯターム過剰表現を決定した。ＧＯカテゴリーは左側に列挙され、それらの関連するｌｏｇＩＯ ｐ値によってランク付けされる。
【図5B】ＳＴＡＴ３結合が近傍遺伝子の発現を制御することを示す。Ｅｎｒｉｃｈｒによって計算される過剰に表現されたＧＯタームの選択されたカテゴリーの要約。（図５Ｂ）下方制御遺伝子を使用して、ＧＯターム過剰表現を決定した。ＧＯカテゴリーは左側に列挙され、それらの関連するｌｏｇＩＯ ｐ値によってランク付けされる。
【図6】増殖、修飾ＮＫ細胞における、ＳＴＡＴ３媒介性経路の活性化を示す。ＲＮＡ－ｓｅｑデータを使用したＩＰＡによる機能的ネットワーク分析は、ＩＬ－２１刺激状態で４時間での細胞について示される。トップスコアの経路に関与する遺伝子（すなわち、ＩＦＮγシグナル伝達）およびＳＴＡＴ３経路とのそれらの相互作用が表される。赤色のノードは事例における上方制御を示し、緑色のノードは下方制御（アクター（正方形）、キナーゼ（逆三角形）、および複合体／群／その他（丸））を示す。
【図7】クロマチンの開口および遺伝子発現と直接的な相関を示すＡＴＡＣｓｅｑのプロットを示す。
【発明を実施するための形態】
【0013】
本発明の化合物、組成物、物品、デバイス、および／または方法が開示および説明する前に、それらは、特に明記しない限り、特定の合成方法または特定の組換えバイオテクノロジー方法に限定されず、特に明記しない限り、特定の試薬（当然、変化し得るため）に限定されないことを理解されたい。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、限定することを意図するものではないことも理解されたい。
【0014】
Ａ．定義
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形の「１つの」（「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」）は、文脈上別段明らかに指示されない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「薬学的担体」への言及は、２つ以上のそのような担体の混合物などを含む。
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形の「１つの」（「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」）は、文脈上別段明らかに指示されない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「薬学的担体」への言及は、２つ以上のそのような担体の混合物などを含む。
【0015】
本明細書では、範囲は、「約」ある特定の値から、および／または「約」別の特定の値まで、のように表現され得る。そのような範囲が表現される場合、別の実施形態は、ある特定の値から、および／または他の特定の値まで、を含む。同様に、値が近似値として表現される場合、先行詞の「約」を使用することによって、特定の値は別の実施形態を形成することが理解されよう。さらに、範囲の各終点は、他の終点と関連して、および他の終点とは独立して、両方とも重要であることが理解されよう。本明細書に開示されるいくつかの値が存在し、各値は、値自体に加えて、その特定の値を「約」として本明細書に開示されることも理解される。例えば、値「１０」が開示される場合、次いで「約１０」も開示される。当業者によって適切に理解されるように、値が「値以下」であることが開示される場合、「値以上」および値間の可能な範囲も開示されることも理解される。例えば、値「１０」が開示される場合、「１０以下」ならびに「１０以上」も開示される。また、本出願全体にわたって、データは、いくつかの異なる形式で提供され、このデータは、終点および始点、ならびにデータポイントの任意の組み合わせの範囲を表すことも理解される。例えば、特定のデータポイント「１０」および特定のデータポイント１５が開示される場合、１０と１５の間に加えて、１０超、１０以上、１０に等しい、１５未満、１５以下、および１５に等しいが開示されるとみなされることが理解される。また、２つの特定のユニット間の各ユニットも開示されることが理解される。例えば、１０および１５が開示される場合、１１、１２、１３、および１４も開示される。
【0016】
本明細書および添付の特許請求の範囲では、以下の意味を有するべく定義されたいくつかの用語を参照されたい。
【0017】
「任意選択的」または「任意選択的に」とは、後で説明する事象または状況が生じても生じなくてもよいことを意味し、説明には、当該事象または状況が生じる事例および生じない事例を含む。
【0018】
本発明の範囲から逸脱することなく、上記の細胞および方法において様々な変更を行うことができるため、上記の説明および以下に与えられる例に含有される全ての事項は、例示として解釈されるべきであり、限定的な意味で解釈されるべきではないことが意図される。
【0019】
「増加」は、より大きな量の症状、疾患、組成物、状態、または活性をもたらす任意の変化を指すことができる。増加は、統計的に有意な量の状態、症状、活性、組成物の任意の個別、中央値、または平均の増加であり得る。よって、増加は、増加が統計的に有意である限り、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００％の増加であり得る。
【0020】
「減少」は、より小さな量の症状、疾患、組成物、状態、または活性をもたらす任意の変化を指すことができる。物質を含む遺伝子産物の遺伝子出力が、物質を含まない遺伝子産物の出力と比較して少ない場合、物質は、遺伝子の遺伝子出力を減少させるとも理解される。また、例えば、減少は、症状が以前に観察されたものよりも少ないように、障害の症状の変化であり得る。減少は、統計的に有意な量の状態、症状、活性、組成物の任意の個別、中央値、または平均の減少であり得る。よって、減少は、減少が統計的に有意である限り、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００％の減少であり得る。
【0021】
「阻害する」、「阻害すること」、および「阻害」とは、活性、応答、状態、疾患、または他の生物学的パラメータを減少させることを意味する。これには、活性、応答、状態、または疾患の完全な除去が含まれ得るが、これらに限定されない。これはまた、例えば、天然または対照レベルと比較して、活性、応答、状態、または疾患の１０％低減を含んでもよい。よって、低減は、天然または対照レベルと比較して、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００％、またはその間の任意の量の低減であり得る。
【0022】
「低減する」または単語の他の形態、例えば、「低減すること」または「低減」とは、事象または特徴（例えば、腫瘍成長）の低下を意味する。これは典型的には、いくつかの標準値または期待値に関し、換言すれば、それは相対的であるが、標準値または相対値が参照されることが必ずしも必要ではないことが理解される。例えば、「腫瘍成長を低減する」とは、標準または対照と比較して、腫瘍の成長速度を低減することを意味する。
【0023】
「予防する」または単語の他の形態、例えば、「予防すること」または「予防」とは、特定の事象もしくは特徴を停止すること、特定の事象もしくは特徴の発生もしくは進行を安定もしくは遅延させること、または特定の事象もしくは特徴が生じる可能性を最小限に抑えることを意味する。予防するとは、典型的には、例えば、低減するよりも絶対的であるため、対照との比較を必要としない。本明細書で使用される場合、何かは予防されないが低減することができるが、低減される何かは予防することもできる。同様に、何かは低減されないが予防することができるが、予防される何かは低減することもできる。低減または予防が使用される場合、特に具体的に指示されない限り、他の単語の使用も明示的に開示されることが理解される。
【0024】
「対象」という用語は、投与または治療の標的である任意の個体を指す。対象は、脊椎動物、例えば、哺乳動物であり得る。一態様では、対象は、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、またはネコであり得る。対象は、モルモット、ラット、ハムスター、ウサギ、マウス、またはモグラであり得る。よって、対象は、ヒトまたは獣医患者であり得る。「患者」という用語は、臨床医、例えば、医師の治療下にある対象を指す。
【0025】
「治療上有効な」という用語は、疾患または障害の１つ以上の原因または症状を改善するのに十分な量の使用される組成物の量を指す。そのような改善は、必ずしも除去ではなく、低減または改変を必要とするだけである。
【0026】
「治療」という用語は、疾患、病理学的状態、または障害を治癒、改善、安定化、または予防する意図を有する患者の医学的管理を指す。この用語は、能動的治療、すなわち、疾患、病理学的状態、または障害の改善に特異的に向けられた治療を含み、また因果的治療、すなわち、関連する疾患、病理学的状態、または障害の原因の除去に向けられた治療を含む。加えて、この用語は、姑息的治療、すなわち、疾患、病理学的状態、または障害の治癒ではなく、症状の緩和のために設計された治療、予防的治療、すなわち、関連する疾患、病理学的状態、または障害の発症を最小限に抑えるか、または部分的に、もしくは完全に阻害することを目的とした治療、および支持的治療、すなわち、関連する疾患、病理学的状態、または障害の改善に向けられた別の特定の療法を補足するために使用される治療を含む。
【0027】
対象への「投与」には、対象に薬剤を導入または送達する任意の経路が含まれる。投与は、経口、局所、静脈内、皮下、経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）、筋肉内、関節内、非経口、動脈内、皮内、心室内、頭蓋内、腹腔内、病巣内、鼻腔内、直腸、膣、吸入による、移植リザーバー経由、非経口（例えば、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑液内、胸骨内、髄腔内、腹腔内、肝臓内、病巣内、および頭蓋内注射または注入技術）などを含む、任意の好適な経路によって実施することができる。本明細書で使用される「同時投与」（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ、ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ、ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ、またはａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ）は、化合物が、時間的に同じ時点で投与されるか、または本質的に互いの直後に投与されることを意味する。後者の場合、２つの化合物は、観察された結果が、時間的に同じ時点で投与された場合に得られる結果と区別できないような十分近い時間に投与される。「全身投与」とは、例えば、循環系またはリンパ系への入口を通して、対象の身体の広範な領域（例えば、身体の５０％超の領域）に薬剤を導入または送達する経路を介して、対象に薬剤を導入または送達することを指す。対照的に、「局所投与」は、投与点の領域またはそれに直接隣接する領域に薬剤を導入または送達し、治療上有意な量で薬剤を全身的に導入しない経路を介して、対象に薬剤を導入または送達することを指す。例えば、局所投与される薬剤は、投与点の局所的な近傍で容易に検出可能であるが、対象の身体の遠位部分では検出不能であるか、または無視できる量で検出可能である。投与には、自己投与および他者による投与が含まれる。
【0028】
「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」、およびそれらの文法的変形は、本明細書で使用される場合、１つ以上の疾患または状態の強度または頻度、疾患または状態の症状、あるいは疾患または状態の根本的な原因を、部分的または完全に予防、遅延、治癒、快癒、緩和、軽減（ｒｅｌｉｅｖｉｎｇ）、改変、治療（ｒｅｍｅｄｙｉｎｇ）、改善（ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｎｇ）、改善（ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ）、安定化、軽減（ｍｉｔｉｇａｔｉｎｇ）、および／または低減することを、意図または目的とする組成物の投与が含まれる。本発明による治療は、防止的、予防的、姑息的、または治療的に適用され得る。予防的治療は、発症前（例えば、癌の明らかな兆候の前）、早期発症中（例えば、癌の初期の兆候および症状時）、または確立された癌の発達後に対象に投与される。予防的投与は、疾患または感染の症状の兆候前の１日（数日）～数年間行われ得る。
【0029】
「ＮＫ細胞」という用語は、「ナチュラルキラー細胞」の略語であり、２つの用語は、本明細書で交換可能に使用される。
【0030】
ＮＫ細胞を説明するために本明細書で使用される「修飾」という用語は、エピゲノム、トランスクリプトーム、および／またはプロテオームが人工的であるように、人工的に改変されたエピゲノム、トランスクリプトーム、および／または人工的に改変されたプロテオームを有する細胞を指す。本明細書に記載の方法に供されていない、または本明細書に記載の操作された組成物と接触していないナイーブＮＫ細胞と比較して、改変されたエピゲノム、トランスクリプトーム、またはプロテオームのいずれか１つまたは全ては、人工的に改変された細胞機能をもたらすことができる。修飾ＮＫ細胞は、ナイーブＮＫ細胞に対して活性化されたＮＫ細胞であってもよく、またはナイーブＮＫ細胞と比較して、他の有益な特徴を有するＮＫ細胞であってもよい。「活性化」ＮＫ細胞は、増加したＮＫ細胞機能、例えば、増加した細胞傷害性、増加した寿命または生存、増加した生理学的持続、外部刺激に応答する改変された能力、増加した代謝などを反映する人工的に誘導された表現型を有する細胞である。本明細書に開示される修飾ＮＫ細胞は、必ずしも活性化ＮＫ細胞ではないが、活性化ＮＫ細胞は、修飾ＮＫ細胞である。
【0031】
本明細書で使用される場合、「遺伝子操作される」という用語は、遺伝子が、点変異、遺伝子挿入、遺伝子欠失、転位、またはＤＮＡ塩基対の配列の任意の変化などの遺伝子配列の特定の変化を使用することによってさらに修飾され得るナチュラルキラー細胞を説明する。ＤＮＡ塩基対配列の変化は、レトロウイルス法、レンチウイルス法、アデノウイルス（ＡＡＶ）法、Ｃｒｅ－ｌｏｘ法、メガヌクレアーゼ法、ＴＡＬＥＮ法、ＣＲＩＳＰＲに基づく（例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９）法、トランスポザーゼ法、化学的改変、または任意の他のＤＮＡ塩基対配列編集法などのウイルスベクターを通して導入されてもよい。
【0032】
本明細書で使用される場合、「差次的に発現される」という用語は、ＳＴＡＴ３トランスクリプトームの活性化で同定されるＳＴＡＴ３調節遺伝子の特徴を説明し、遺伝子の発現が、ナイーブＮＫ細胞と比較して少なくとも５０％増加（すなわち、上方制御）または減少（すなわち、下方制御）されること（すなわち、発現比の倍率変化≧１．５）を意味する。
【0033】
本出願全体を通して、様々な刊行物が参照される。これらの刊行物の開示は、本出願に関係する技術水準をより完全に説明するために参照により本出願に援用される。開示される参考文献はまた、参考文献に依る文章で論じられ、それらに含まれる材料について、個別にかつ具体的に参照により本明細書に援用される。
【0034】
Ｂ．組成物
開示される組成物を調製するために使用される成分、ならびに本明細書に開示される方法内で使用される組成物自体が開示される。これらおよび他の材料が本明細書に開示され、これらの材料の組み合わせ、サブセット、相互作用、群などが開示されるとき、これらの化合物のそれぞれの様々な個別および集合的な組み合わせおよび順列の具体的な参照が明示的に開示されない場合があるが、それぞれが本明細書に具体的に企図および記載されることが理解される。例えば、特定の修飾ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が開示され、議論され、修飾ＮＫ細胞を含むいくつかの分子に行われ得るいくつかの修飾が議論される場合、修飾ＮＫ細胞のそれぞれおよび全ての組み合わせおよび順列、ならびに具体的に反対のことが示されない限り可能である修飾が具体的に企図される。よって、分子Ａ、Ｂ、およびＣのクラス、ならびに分子Ｄ、Ｅ、およびＦのクラスが開示され、組み合わせ分子の例、Ａ－Ｄが開示される場合、次いで、それぞれが個別に列挙されない場合であっても、それぞれが個別および集合的に企図され、組み合わせＡ－Ｅ、Ａ－Ｆ、Ｂ－Ｄ、Ｂ－Ｅ、Ｂ－Ｆ、Ｃ－Ｄ、Ｃ－Ｅ、およびＣ－Ｆが開示されるとみなされることを意味する。同様に、これらの任意のサブセットまたは組み合わせも開示される。よって、例えば、Ａ－Ｅ、Ｂ－Ｆ、およびＣ－Ｅのサブグループは、開示されるとみなされるであろう。この概念は、開示される組成物を作製および使用する方法におけるステップを含むが、これらに限定されない、本出願の全ての態様に適用される。よって、実施され得る様々な追加ステップが存在する場合、これらの追加ステップのそれぞれが、開示される方法の任意の特定の実施形態または実施形態の組み合わせで実施され得ることが理解される。
開示される組成物を調製するために使用される成分、ならびに本明細書に開示される方法内で使用される組成物自体が開示される。これらおよび他の材料が本明細書に開示され、これらの材料の組み合わせ、サブセット、相互作用、群などが開示されるとき、これらの化合物のそれぞれの様々な個別および集合的な組み合わせおよび順列の具体的な参照が明示的に開示されない場合があるが、それぞれが本明細書に具体的に企図および記載されることが理解される。例えば、特定の修飾ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が開示され、議論され、修飾ＮＫ細胞を含むいくつかの分子に行われ得るいくつかの修飾が議論される場合、修飾ＮＫ細胞のそれぞれおよび全ての組み合わせおよび順列、ならびに具体的に反対のことが示されない限り可能である修飾が具体的に企図される。よって、分子Ａ、Ｂ、およびＣのクラス、ならびに分子Ｄ、Ｅ、およびＦのクラスが開示され、組み合わせ分子の例、Ａ－Ｄが開示される場合、次いで、それぞれが個別に列挙されない場合であっても、それぞれが個別および集合的に企図され、組み合わせＡ－Ｅ、Ａ－Ｆ、Ｂ－Ｄ、Ｂ－Ｅ、Ｂ－Ｆ、Ｃ－Ｄ、Ｃ－Ｅ、およびＣ－Ｆが開示されるとみなされることを意味する。同様に、これらの任意のサブセットまたは組み合わせも開示される。よって、例えば、Ａ－Ｅ、Ｂ－Ｆ、およびＣ－Ｅのサブグループは、開示されるとみなされるであろう。この概念は、開示される組成物を作製および使用する方法におけるステップを含むが、これらに限定されない、本出願の全ての態様に適用される。よって、実施され得る様々な追加ステップが存在する場合、これらの追加ステップのそれぞれが、開示される方法の任意の特定の実施形態または実施形態の組み合わせで実施され得ることが理解される。
【0035】
一態様では、活性化ＳＴＡＴ３トランスクリプトームを含む修飾ナチュラルキラー細胞が本明細書に開示される。
【0036】
ナチュラルキラー細胞は、免疫系の細胞傷害性リンパ球の一種である。ＮＫ細胞は、ウイルス感染細胞への迅速な応答を提供し、形質転換細胞に応答する。ＮＫ細胞とは対照的に、Ｔ細胞は、感染細胞の表面上の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子によって提示される病原体からペプチドを検出し、サイトカイン放出を誘発し、溶解またはアポトーシスを引き起こす。しかしながら、ＮＫ細胞は、病原体由来のペプチドがＭＨＣ分子上に存在するかにかかわらず、ストレスを受けた細胞を認識する能力を有するため、ユニークである。それらは、標的を殺滅するために事前の活性化を必要としないという初期の概念から「ナチュラルキラー」と名付けられた。ＮＫ細胞は、大顆粒リンパ球（ＬＧＬ）であり、骨髄で分化および成熟することが知られ、そこから次いで循環に入る。いくつかの態様では、ＮＫ細胞は、遺伝子操作ＣＡＲ ＮＫ細胞であり得るか、あるいは例えば、化学的もしくはウイルスベクター、またはベクター送達系を使用して達成される他の遺伝子挿入または欠失を含み得る。任意選択的に、標的化ゲノム編集技法、例えば、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、およびガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を使用したＣＲＩＳＰＲベースのものを使用してもよい。
【0037】
免疫療法中に多数の免疫細胞（例えば、メモリー様ＮＫ細胞、ＣＡＲ ＮＫ細胞、および活性化ＮＫ細胞を含むが、これらに限定されない、ＮＫ細胞など）を投与することができるために有用であるので、いくつかの実施形態では、修飾免疫細胞は、増殖免疫細胞である。増殖免疫細胞は、多数の免疫細胞を得るために、初期細胞集団から開始してエクスビボで成長させるものである。いくつかの実施形態では、増殖免疫細胞は、免疫応答を引き起こすことなく、対象に容易に投与することができる自家細胞である。しかしながら、いくつかの実施形態では、増殖免疫細胞は、同種免疫細胞であり、それらの固有の同種反応性は、利益であり得る。さらなる実施形態では、増殖免疫細胞は、免疫細胞が疾患組織を標的とするのを助けるために、キメラ抗原受容体を含むようにさらに遺伝子操作される。遺伝子操作されたナチュラルキラー細胞は、遺伝子挿入、遺伝子欠失、転位、または配列ＤＮＡ塩基対の任意の変化などの、遺伝子配列の操作された変化を通して産生され得る。ＤＮＡ塩基対配列の変化は、レトロウイルス法、レンチウイルス法、アデノウイルス（ＡＡＶ）法、Ｃｒｅ－ｌｏｘ法、メガヌクレアーゼ標的法、ジンクフィンガーヌクレアーゼ標的法、ＣＲＩＳＰＲに基づく（例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９標的法、トランスポザーゼ法、化学的改変、または任意の他のＤＮＡ塩基対配列編集法などのウイルスベクターを通して導入されてもよい。増殖免疫細胞の調製は、免疫細胞を活性化および増殖することの両方を含む。いくつかのサイトカイン（ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、Ｉ型ＩＦＮ、およびＴＧＦ－β）は、免疫細胞をエクスビボで修飾および増殖するために有用であることが示されている。例えば、いくつかの実施形態では、評価されるＮＫ細胞は、ＩＬ－２１増殖ＮＫ細胞である。したがって、一態様では、治療有効量の強力な免疫細胞を送達する前に、少なくとも１つの強力な免疫細胞を増殖することをさらに含む、免疫療法方法が本明細書に開示される。
【0038】
上述のように、本開示は、増殖され、修飾されたナチュラルキラー細胞に関する。増殖は、広義には、ＮＫ細胞の集団が増加するような、ＮＫ細胞のエクスビボ増殖を指す。活性化とは、本明細書に記載される様々な人工的手段および方法を通した、ＮＫ細胞のエピジェネティック、トランスクリプトーム、表現型状態を操作するための、ＮＫ細胞の刺激を指す。改変された表現型状態は、ナイーブＮＫ細胞と比較して、以下の修飾：改変された遺伝子制御（転写および翻訳）、エピジェネティクスによる改変されたインプリンティング、受容体表現型発現、改変された代謝、標的に対する改変された細胞傷害性、改変されたメモリー様表現型などのうちのいずれか１つ以上を含んでもよい。ＩＬ－２１担持フィーダー細胞、ＰＭ粒子、またはエクソソームによって刺激されるＮＫ細胞内の誘導された転写特徴は、プロテオーム特徴を通して顕在化し、さらに、代謝、細胞殺滅活性、および他の有用な機能のための改変されたユニークな機能表現型において証明することができる。本明細書に記載される修飾ＮＫ細胞は、例えば、末梢血単核細胞から増殖および活性化され得る。しかしながら、修飾ＮＫ細胞は、造血幹細胞または前駆細胞などの他のタイプの細胞から調製することもできる。初期血液または幹細胞は、胎盤、臍帯血、胎盤血、末梢血、脾臓、または肝臓などの様々な異なる供給源から単離することができる。他の供給源としては、ｉＰＳＣまたはＥＳＣから分化されるＮＫ細胞を挙げることができる。調製は、細胞培養培地中で行われる。好適な細胞培養培地は、当業者に既知である。修飾ＮＫ細胞は、細胞株として提供することができ、これは、細胞培養において維持することができる複数の細胞である。修飾ＮＫ細胞は、表現型が増殖時に娘細胞に伝播され得るように、ＩＬ－２１刺激によって、エピジェネティックパターンの変化を通してインプリントされ得る。そのような修飾ＮＫ細胞は、凍結保存され、次いで潜在的に、解凍後に再びさらに修飾され得る。よって、一態様では、治療有効量の強力な免疫細胞を送達する前に、少なくとも１つの強力な免疫細胞を修飾することをさらに含む、免疫療法方法が本明細書に開示される。いくつかの態様では、免疫細胞は、免疫細胞の効力を決定する方法を実施する前に、既知の方法を使用して対象から抽出されている。あるいは、免疫細胞は、細胞培養物の増殖から供給することができる。
【0039】
本出願全体を通して記載されるように、本明細書に開示されるナチュラルキラー細胞は、構造的に修飾されており、それらが増殖されるだけでなく、構造的に改変された人工トランスクリプトームおよび／またはプロテオームを有し、活性化され得ることを意味する。一態様では、修飾ＮＫ細胞が本明細書に開示され、修飾ＮＫ細胞は、ナイーブまたは予め処理されたＮＫ細胞をＩＬ－２１、ＩＬ－１５、および／または４－ＢＢＬと接触させることによって、インビボまたはエクスビボで修飾される。一態様では、ＩＬ－２１、ＩＬ－１５、および／または４－ＢＢＬは、１つ以上のフィーダー細胞、形質膜小胞、リポソーム、および／もしくはエクソソーム、またはそれらの任意の組み合わせの表面上に提供される。よって、一態様では、本明細書に開示されるのは、修飾ＮＫ細胞であり、修飾ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞を、膜結合型ＩＬ－２１、ＩＬ－１５、および／または４－ＢＢＬを発現するように操作される形質膜小胞、リポソーム、エクソソーム、もしくはフィーダー細胞、またはそれらの任意の組み合わせと接触させることによって、インビボまたはエクスビボで修飾される。
【0040】
形質膜（ＰＭ）粒子は、細胞の形質膜から作製される小胞、または人工的に作製される小胞（すなわち、リポソーム）である。ＰＭ粒子は、脂質二重層または単に脂質の単一層を含有することができる。ＰＭ粒子は、単一ラメラ、多重ラメラ、または反転形態で調製することができる。ＰＭ粒子は、既知の形質膜調製プロトコル、またはその開示全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第９，６２３，０８２号に記載されるものなどのリポソームを調製するためのプロトコルを使用して、本明細書に記載されるｍｂＩＬ２１結合フィーダー細胞から調製することができる。特定の態様では、本明細書に開示されるＰＭ粒子は、平均直径が約１７０～約３００ｎｍの範囲である。
【0041】
エクソソームは、多くの、おそらく全ての真核生物流体に存在する細胞由来小胞である。エクソソームは、起源の細胞型を反映するＲＮＡ、タンパク質、脂質、および代謝産物を含有する。エクソソームの報告された直径は、３０～１００ｎｍである。エクソソームは、多胞体が形質膜と融合するときに細胞から放出されるか、または形質膜から直接放出されるかのいずれかである。いくつかの実施形態では、エクソソームは、癌細胞から得られる。いくつかの実施形態では、エクソソームは、白血病細胞エクソソームである。本開示は、免疫細胞の効力を決定するためにエクソソームを使用する文脈で与えられるが、他の細胞外小胞はまた、免疫細胞の効力を決定するために使用され得る。本明細書で使用される場合、「細胞外小胞」という用語には、任意の機序によって細胞から放出される全ての小胞が含まれるが、これらに限定されない。「細胞外小胞」は、多胞体から放出されるエクソソーム、および細胞表面から流出される微小胞を含む。「細胞外小胞」は、エキソサイトーシスまたはエクトサイトーシスによって作製される小胞を含む。「細胞外小胞」は、多胞体から放出されるエクソソーム、逆出芽、膜の分裂によって放出される小胞、アポトーシス小体によって放出される多胞体エンドソーム、エクトソーム、微小胞、微粒子、および小胞、ならびに形質膜成分を含有するハイブリッド小胞を包含する。細胞外小胞は、由来細胞に共通のタンパク質、核酸、脂質、および他の分子を含有することができる。
【0042】
一態様では、形質膜粒子、フィーダー細胞、リポソーム、エクソソーム、またはそれらの任意の組み合わせは、免疫細胞（例えば、ＮＫ細胞など）を刺激するフィーダー細胞から精製することができる。本明細書に開示される操作された形質膜粒子、操作されたフィーダー細胞、操作されたリポソーム、または操作されたエクソソームを作製する際に使用するための、特許請求された発明における使用のための免疫細胞刺激フィーダー細胞は、照射された自家もしくは同種末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、または照射されていない自家もしくは同種ＰＢＭＣ、ＲＰＭＩ８８６６、ＨＦＷＴ、７２１．２２１、Ｋ５６２細胞、ＥＢＶ－ＬＣＬ、１つ以上の膜結合型ＩＬ－２１、膜結合型ＩＬ－１５、膜結合型４－１ＢＢＬ、膜結合型ＯＸ４０Ｌおよび／もしくは膜ＴＮＦ－αでトランスフェクトされたＴ細胞（例えば、膜結合型ＩＬ－２１でトランスフェクトされたＴ細胞、膜結合型４－１ＢＢＬでトランスフェクトされたＴ細胞、膜結合型ＩＬ－１５および４－１ＢＢＬでトランスフェクトされたＴ細胞、膜結合型ＩＬ－２１および４－１ＢＢＬでトランスフェクトされたＴ細胞など）、膜結合型ＩＬ－２１でトランスフェクトされたＮＫ細胞（ＰＢＭＣ、ＲＰＭＩ８８６６、ＮＫ－９２、ＮＫ－９２ＭＩ、ＮＫ－ＹＴＳ、ＮＫ、ＮＫＬ、ＫＩＬ、ＫＩＬ Ｃ．２、ＮＫ ３．３、ＮＫ－ＹＳ、ＨＦＷＴ、Ｋ５６２細胞、自家癌細胞を含むが、これらに限定されない）、膜結合型４－１ＢＢＬでトランスフェクトされたＮＫ細胞（ＰＢＭＣ、ＲＰＭＩ８８６６、ＮＫ－９２、ＮＫ－９２ＭＩ、ＮＫ－ＹＴＳ、ＮＫ、ＮＫＬ、ＫＩＬ、ＫＩＬ Ｃ．２、ＮＫ ３．３、ＮＫ－ＹＳ、ＨＦＷＴ、Ｋ５６２細胞、自家癌細胞を含むが、これらに限定されない）、膜結合型ＩＬ－１５および４－１ＢＢＬでトランスフェクトされたＮＫ細胞（ＰＢＭＣ、ＲＰＭＩ８８６６、ＮＫ－９２、ＮＫ－９２ＭＩ、ＮＫ－ＹＴＳ、ＮＫ、ＮＫＬ、ＫＩＬ、ＫＩＬ Ｃ．２、ＮＫ ３．３、ＮＫ－ＹＳ、ＨＦＷＴ、Ｋ５６２細胞、自家癌細胞を含むが、これらに限定されない）、または膜結合型ＩＬ－２１および４－１ＢＢＬでトランスフェクトされたＮＫ細胞（ＰＢＭＣ、ＲＰＭＩ８８６６、ＮＫ－９２、ＮＫ－９２ＭＩ、ＮＫ－ＹＴＳ、ＮＫ、ＮＫＬ、ＫＩＬ、ＫＩＬ Ｃ．２、ＮＫ ３．３、ＮＫ－ＹＳ、ＨＦＷＴ、Ｋ５６２細胞、自家癌細胞を含むが、これらに限定されない）、ならびに他の非ＨＬＡもしくは低ＨＬＡ発現細胞株、もしくは患者由来原発腫瘍のいずれかであり得る。
【0043】
開示される方法で、または開示される修飾ＮＫ細胞を修飾するために使用される形質膜粒子、フィーダー細胞、リポソーム、エクソソーム、および／またはそれらの任意の組み合わせは、免疫細胞（例えば、ＮＫ細胞など）を増殖および／または活性化することを含む、修飾するための追加のエフェクター剤をさらに含むことができる。よって、一態様では、本明細書に開示されるのは、修飾ＮＫ細胞であり、開示される操作されたリポソーム、操作されたエクソソーム、操作されたフィーダー細胞、操作された形質膜粒子、またはそれらの任意の組み合わせを生成するために使用されるフィーダー細胞は、その細胞表面上に少なくとも１つの追加の免疫細胞エフェクター剤をさらに含み、少なくとも１つの追加の免疫細胞エフェクター剤は、サイトカイン、接着分子、または免疫細胞活性化剤（例えば、４－１ＢＢＬ、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＭＩＣＡ、ＬＦＡ－１、２Ｂ４、ＣＣＲ７、ＯＸ４０Ｌ、ＵＢＬＰ２、ＢＣＭ１／ＳＬＡＭＦ２、ＮＫＧ２Ｄアゴニスト、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ１５５、ＣＤ１１２、Ｊａｇｇｅｄ１、Ｊａｇｇｅｄ２、Ｄｅｌｔａ－１、Ｐｒｅｆ－１、ＤＮＥＲ、Ｊｅｄｉ、ＳＯＭ－１１、ウィングレス、ＣＣＮ３、ＭＡＧＰ２、ＭＡＧＰ１、ＴＳＰ２、ＹＢ－１、ＥＧＦＬ７、ＣＣＲ７、ＤＡＰ１２、およびＤＡＰ１０、Ｎｏｔｃｈリガンド、ＮＫｐ４６アゴニスト、ＮＫｐ４４アゴニスト、ＮＫｐ３０アゴニスト、他のＮＣＲアゴニスト、ＣＤ１６アゴニストなど）である。一態様では、少なくとも１つの追加の免疫細胞エフェクター剤は、ＩＬ－２１、４－１ＢＢＬ、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、および４－１ＢＢＬ、ＩＬ－２１およびＩＬ－１５、またはＩＬ－１５および４－１ＢＢＬを含む。したがって、一態様では、フィーダー細胞、当該フィーダー細胞によって生成される、リポソーム、形質膜粒子、エクソソーム、またはそれらの任意の組み合わせは、免疫細胞活性化剤（例えば、４－１ＢＢＬ、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＭＩＣＡ、ＬＦＡ－１、２Ｂ４、ＣＣＲ７、ＯＸ４０Ｌ、ＵＢＬＰ２、ＢＣＭ１／ＳＬＡＭＦ２、ＮＫＧ２Ｄアゴニスト、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ１５５、ＣＤ１１２、Ｊａｇｇｅｄ１、Ｊａｇｇｅｄ２、Ｄｅｌｔａ－１、Ｐｒｅｆ－１、ＤＮＥＲ、Ｊｅｄｉ、ＳＯＭ－１１、ウィングレス、ＣＣＮ３、ＭＡＧＰ２、ＭＡＧＰ１、ＴＳＰ２、ＹＢ－１、ＥＧＦＬ７、ＣＣＲ７、ＤＡＰ１２、およびＤＡＰ１０、Ｎｏｔｃｈリガンド、ＮＫｐ４６アゴニスト、ＮＫｐ４４アゴニスト、ＮＫｐ３０アゴニスト、他のＮＣＲアゴニスト、ＣＤ１６アゴニストなど）の任意の組み合わせの膜結合型バージョンを含むことができる。例えば、エクソソームまたは形質膜粒子は、それらの膜上にＩＬ－１５、ＩＬ－２１、および／または４－１ＢＢＬを有することができる。一態様では、ＮＫ細胞は、エクスビボ培養物に直接添加するか、ＮＫ細胞を受ける対象に投与するか、またはエクスビボもしくはインビボで培養においてフィーダー細胞、形質膜小胞、リポソーム、もしくはエクソソームによって分泌することができる、可溶性４－１ＢＢＬ、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＭＩＣＡ、ＬＦＡ－１、２Ｂ４、ＣＣＲ７、ＯＸ４０Ｌ、ＵＢＬＰ２、ＢＣＭ１／ＳＬＡＭＦ２、ＮＫＧ２Ｄアゴニスト、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ１５５、ＣＤ１１２、Ｊａｇｇｅｄ１、Ｊａｇｇｅｄ２、Ｄｅｌｔａ－１、Ｐｒｅｆ－１、ＤＮＥＲ、Ｊｅｄｉ、ＳＯＭ－１１、ウィングレス、ＣＣＮ３、ＭＡＧＰ２、ＭＡＧＰ１、ＴＳＰ２、ＹＢ－１、ＥＧＦＬ７、ＣＣＲ７、ＤＡＰ１２、およびＤＡＰ１０、Ｎｏｔｃｈリガンド、ＮＫｐ４６アゴニスト、ＮＫｐ４４アゴニスト、ＮＫｐ３０アゴニスト、他のＮＣＲアゴニスト、ＣＤ１６アゴニストで増殖することができる。よって、ＮＫ細胞は、エクスビボまたはインビボで増殖することができることが理解され、本明細書で企図される。
【0044】
免疫細胞は、サイトカインを産生するために誘導されるのに十分な期間、粒子またはエクソソームに曝露されなければならないことが理解され、本明細書で企図される。一態様では、免疫細胞の効力をアッセイする方法が本明細書に開示され、免疫細胞は、有効量の形質膜粒子、リポソーム、エクソソーム、またはそれらの任意の組み合わせ（操作された粒子、リポソーム、および／またはエクソソームを含むが、これらに限定されない）と、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１５０分、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、３０、３２、３６、４２、４８、６０時間、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、４５、６０、６１、６２日、３、４、５、または６か月間接触している。
【0045】
一態様では、修飾ＮＫ細胞の修飾ＳＴＡＴ３トランスクリプトームは、テロメア組織化、有糸分裂の制御、ＤＮＡ修復、免疫、サイトカインシグナル伝達、解糖、糖新生、ｐ５３経路に関与する１つ以上の差次的発現遺伝子（例えば、これらに限定されないが、ＨＩＳＴ１Ｈ１Ｂ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＢ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＧ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＨ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＩ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＪ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＬ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＢ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＥ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＨ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＪ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＬ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＭ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＯ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｂ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｃ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｆ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｇ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｈ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｊ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ａ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｄ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｌ、ＨＩＳＴ２Ｈ３Ｃ、ＨＩＳＴ２Ｈ４Ｂ、ＨＩＳＴ３Ｈ２ＢＡ、ＨＩＳＴ３Ｈ２ＢＢ、ＡＢＣＡ１、ＡＫ５、ＡＳＣＬ２、Ｂ３ＧＡＴ１、ＣＡＣＮＡ２Ｄ２、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ２、ＥＮＰＰ５、ＦＢＬＮ２、ＦＣＲＬ３、ＧＮＡＬ、ＧＰＲＡＳＰ１、ＧＲＩＫ４、ＧＴＳＥ１、ＨＩＳＴ３Ｈ２ＢＢ、ＩＬ１Ｂ、ＩＴＧＡ２、ＫＩＦ１３Ａ、ＫＩＦ４Ａ、ＬＩＮＣ００５９９、ＬＯＮＲＦ３、ＬＲＲＮ３、ＭＳＣ－ＡＳ１、ＮＦＩＸ、ＮＵＡＫ１、ＮＵＡＫ２、ＰＣＤＨ１、ＰＬＸＮＡ４、ＲＡＤ５１、ＲＮＦ１５７、ＳＬＣ１Ａ７、ＳＰＯＮ２、ＴＹＭＳ、ＷＷＣ２、ＺＮＦ４４２、ＺＮＦ７２７、およびＺＳＣＡＮ１８を含む、図３または図４に開示されるそれらの遺伝子のいずれかなど）を含むことができる。
【0046】
一態様では、下方制御対過剰発現遺伝子の比が約１．５である、本明細書に開示される修飾ＮＫ細胞のいずれかが本明細書に開示される。例えば、本明細書に開示される修飾ＮＫ細胞のいずれかは、ＢＩＲＣＳ、ＭＫ１６７、ＴＯＰ２Ａ、ＣＫＳ２、およびＲＡＣＧＡＰｌからなる群から選択される、上方制御された１つ以上のタンパク質を含み得る。修飾ＮＫ細胞も本明細書に開示され、ナチュラルキラー細胞は、ＰＴＣＨｌ、ＴＧＦＢ３、およびＡＴＭからなる群から選択される下方制御された１つ以上のタンパク質を含む。
【0047】
１．薬学的担体／薬学的製品の送達
上述のように、組成物は、薬学的に許容される担体中でインビボで投与することもできる。「薬学的に許容される」とは、任意の望ましくない生物学的効果を引き起こすことなく、またはそれと接触する薬学的組成物の他の構成要素のいずれとも有害な様式で相互作用することなく、生物学的にまたは別途望ましくないものではない材料、すなわち、核酸またはベクターと共に、対象に投与され得る材料、を意味する。担体は、当業者には周知であるように、活性成分の任意の分解を最小限に抑え、対象における任意の有害な副作用を最小限に抑えるために当然選択されるであろう。
上述のように、組成物は、薬学的に許容される担体中でインビボで投与することもできる。「薬学的に許容される」とは、任意の望ましくない生物学的効果を引き起こすことなく、またはそれと接触する薬学的組成物の他の構成要素のいずれとも有害な様式で相互作用することなく、生物学的にまたは別途望ましくないものではない材料、すなわち、核酸またはベクターと共に、対象に投与され得る材料、を意味する。担体は、当業者には周知であるように、活性成分の任意の分解を最小限に抑え、対象における任意の有害な副作用を最小限に抑えるために当然選択されるであろう。
【0048】
組成物は、経口的に、非経口的に（例えば、静脈内に）、筋肉内注射によって、腹腔内注射によって、経皮的に、体外的に、局所的に（局所鼻腔内投与または吸入剤による投与を含む）など、投与され得る。本明細書で使用される場合、「局所鼻腔内投与」とは、鼻孔の一方または両方を介して組成物を鼻および鼻道に送達することを意味し、噴霧機構もしくは液滴機構による、または核酸もしくはベクターのエアロゾル化による送達を含むことができる。吸入剤による組成物の投与は、噴霧または液滴機構による送達を介して鼻または口を通して行うことができる。送達は、挿管を介して呼吸器系の任意の領域（例えば、肺）に直接送達することもできる。必要とされる組成物の正確な量は、対象の種、年齢、体重、および一般状態、治療されるアレルギー障害の重症度、使用される特定の核酸またはベクター、その投与方法などに応じて、対象によって異なるであろう。したがって、全ての組成物に対して正確な量を指定することは不可能である。しかしながら、適切な量は、本明細書の教示を与える日常的な実験のみを使用して、当業者によって決定され得る。
【0049】
組成物の非経口投与は、使用される場合、概して、注射を特徴とする。注射剤は、液体溶液または懸濁液、注射前の液体中の懸濁液の溶液に適した固体形態、あるいはエマルジョンのいずれかとして、従来の形態で調製され得る。最近改訂された非経口投与のアプローチでは、一定の投与量が維持されるような徐放または持続放出系の使用を伴う。例えば、米国特許第３，６１０，７９５号を参照されたい（参照により本明細書に援用される）。
【0050】
材料は、溶液、懸濁液（例えば、微小粒子、リポソーム、または細胞に組み込まれる）中であってもよい。これらは、抗体、受容体、または受容体リガンドを介して、特定の細胞型を標的にし得る。以下の参考文献は、腫瘍組織に特定のタンパク質を標的にするための本技術の使用例である（Ｓｅｎｔｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，２：４４７－４５１，（１９９１）、Ｂａｇｓｈａｗｅ，Ｋ．Ｄ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，６０：２７５－２８１，（１９８９）、Ｂａｇｓｈａｗｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５８：７００－７０３，（１９８８）、Ｓｅｎｔｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，４：３－９，（１９９３）、Ｂａｔｔｅｌｌｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３５：４２１－４２５，（１９９２）、Ｐｉｅｔｅｒｓｚ ａｎｄ ＭｃＫｅｎｚｉｅ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ．Ｒｅｖｉｅｗｓ，１２９：５７－８０，（１９９２）、およびＲｏｆｆｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，４２：２０６２－２０６５，（１９９１））。ビヒクル、例えば、「ステルス」および他の抗体コンジュゲートリポソーム（結腸癌を標的化する脂質媒介性薬物を含む）、細胞特異的リガンドを通したＤＮＡの受容体媒介性標的化、リンパ球特異的腫瘍標的化、ならびにインビボでのマウス神経膠腫細胞の高度に特異的な治療用レトロウイルス標的化。以下の参考文献は、腫瘍組織に特定のタンパク質を標的にするための本技術の使用例である（Ｈｕｇｈｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４９：６２１４－６２２０，（１９８９）、およびＬｉｔｚｉｎｇｅｒ ａｎｄ Ｈｕａｎｇ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，１１０４：１７９－１８７，（１９９２））。一般に、受容体は、構成的またはリガンド誘導のいずれかのエンドサイトーシスの経路に関与する。これらの受容体は、クラスリン被覆ピット内でクラスター化し、クラスリン被覆小胞を介して細胞内に入り、受容体が選別される酸性化エンドソームを通過し、次いで細胞表面にリサイクルされるか、細胞内に貯蔵されるか、またはリソソーム中で分解されるかのいずれかである。内部移行経路は、栄養素の取り込み、活性化タンパク質の除去、巨大分子のクリアランス、ウイルスおよび毒素の日和見進入、リガンドの解離および分解、ならびに受容体レベルの制御などの様々な機能を果たす。多くの受容体は、細胞型、受容体濃度、リガンドの種類、リガンド価、およびリガンド濃度に応じて、２つ以上の細胞内経路に従う。受容体媒介性エンドサイトーシスの分子および細胞機構が概説されている（Ｂｒｏｗｎ ａｎｄ Ｇｒｅｅｎｅ，ＤＮＡ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １０：６，３９９－４０９（１９９１））。
【0051】
ａ）薬学的に許容される担体
抗体を含む組成物は、薬学的に許容される担体と治療的に組み合わせて使用することができる。
抗体を含む組成物は、薬学的に許容される担体と治療的に組み合わせて使用することができる。
【0052】
好適な担体およびそれらの製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（１９ｔｈ ｅｄ．）ｅｄ．Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ １９９５に記載される。典型的には、製剤を等張性にするために、適切な量の薬学的に許容される塩が製剤に使用される。薬学的に許容される担体の例としては、生理食塩水、リンガー溶液、およびデキストロース溶液が挙げられるが、これらに限定されない。溶液のｐＨは、好ましくは、約５～約８であり、より好ましくは約７～約７．５である。さらなる担体としては、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスなどの持続放出性調製物が挙げられ、マトリックスは、成形物品、例えば、フィルム、リポソーム、または微粒子の形態である。特定の担体が、例えば、投与経路および投与される組成物の濃度に応じて、より好ましい場合があることは、当業者には明らかであろう。
【0053】
薬学的担体は、当業者に既知である。これらは、最も典型的には、生理学的ｐＨでの滅菌水、生理食塩水、および緩衝液などの溶液を含む、ヒトへの薬物の投与のための標準的な担体である。組成物は、筋肉内または皮下投与することができる。他の化合物は、当業者によって使用される標準的な手順に従って投与されるであろう。
【0054】
薬学的組成物は、選択される分子に加えて、担体、増粘剤、希釈剤、緩衝剤、防腐剤、界面活性剤などを含み得る。薬学的組成物はまた、抗微生物剤、抗炎症剤、麻酔剤などのような１つ以上の活性成分を含んでもよい。
【0055】
薬学的組成物は、局所または全身治療が所望されるか、および治療される領域に応じて、いくつかの方法で投与され得る。投与は、局所的（眼科的、膣的、直腸的、鼻腔内）、経口的、吸入による、または非経口的、例えば、静脈内点滴、皮下、腹腔内、もしくは筋肉内注射によるものであり得る。開示される抗体は、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、腔内、または経皮投与することができる。
【0056】
非経口投与のための調製物としては、滅菌水性または非水性溶液、懸濁液、およびエマルジョンが挙げられる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルである。水性担体には、生理食塩水および緩衝媒体を含む、水、アルコール／水溶液、エマルジョン、または懸濁液が含まれる。非経口ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸リンガー、または固定油が挙げられる。静脈内ビヒクルとしては、流体および栄養補充剤、電解質補充剤（リンガーデキストロースに基づくものなど）などが挙げられる。例えば、抗微生物剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガスなどのような、防腐剤および他の添加剤もまた存在し得る。
【0057】
局所投与のための製剤としては、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、坐剤、スプレー、液体、および粉末が挙げられ得る。従来の薬学的担体、水性、粉末、または油性塩基、増粘剤などが必要または所望であり得る。
【0058】
経口投与のための組成物としては、粉末もしくは顆粒、水もしくは非水性媒体中の懸濁液もしくは溶液、カプセル、サシェ、または錠剤が挙げられる。増粘剤、香料、希釈剤、乳化剤、分散助剤、または結合剤が望ましい場合がある。
【0059】
組成物のいくつかは、潜在的に、塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸、およびリン酸などの無機酸、ならびにギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、およびフマル酸などの有機酸との反応によって、または水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウムなどの無機塩基、ならびにモノ－、ジ－、トリアルキル、およびアリールアミン、および置換エタノールアミンなどの有機塩基との反応によって形成される、薬学的に許容される酸または塩基付加塩として投与されてもよい。
【0060】
ｂ）治療的使用
組成物を投与するための有効な投与量およびスケジュールは、経験的に決定されてもよく、そのような決定を行うことは、当該技術分野の範囲内である。組成物の投与のための投与量範囲は、障害の症状が影響を受ける所望の効果を生じさせるのに十分に大きいものである。投与量は、望ましくない交差反応、アナフィラキシー反応などのような、有害副作用を引き起こすほど大きいべきではない。一般的に、投与量は、年齢、状態、性別、および患者における疾患の程度、投与経路、または他の薬物がレジメンに含まれるかによって変動し、当業者によって決定され得る。投与量は、任意の逆の兆候の場合には、個別の医師によって調整することができる。投与量は、変動し得、１日または数日間、１回以上の用量投与で投与され得る。ガイダンスは、所与のクラスの薬学的製品に適した投与量についての文献に見出すことができる。例えば、抗体のための適切な用量を選択する際のガイダンスは、抗体の治療的使用に関する文献、例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｆｅｒｒｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｎｏｇｅｓ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐａｒｋ Ｒｉｄｇｅ，Ｎ．Ｊ．，（１９８５）ｃｈ．２２ ａｎｄ ｐｐ．３０３－３５７、Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｈａｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７７）ｐｐ．３６５－３８９に見出すことができる。単独で使用される抗体の典型的な１日投与量は、上記の因子に応じて、１日当たり約１μｇ／ｋｇ～最大１００ｍｇ／ｋｇの体重以上の範囲であり得る。
組成物を投与するための有効な投与量およびスケジュールは、経験的に決定されてもよく、そのような決定を行うことは、当該技術分野の範囲内である。組成物の投与のための投与量範囲は、障害の症状が影響を受ける所望の効果を生じさせるのに十分に大きいものである。投与量は、望ましくない交差反応、アナフィラキシー反応などのような、有害副作用を引き起こすほど大きいべきではない。一般的に、投与量は、年齢、状態、性別、および患者における疾患の程度、投与経路、または他の薬物がレジメンに含まれるかによって変動し、当業者によって決定され得る。投与量は、任意の逆の兆候の場合には、個別の医師によって調整することができる。投与量は、変動し得、１日または数日間、１回以上の用量投与で投与され得る。ガイダンスは、所与のクラスの薬学的製品に適した投与量についての文献に見出すことができる。例えば、抗体のための適切な用量を選択する際のガイダンスは、抗体の治療的使用に関する文献、例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｆｅｒｒｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｎｏｇｅｓ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐａｒｋ Ｒｉｄｇｅ，Ｎ．Ｊ．，（１９８５）ｃｈ．２２ ａｎｄ ｐｐ．３０３－３５７、Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｈａｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７７）ｐｐ．３６５－３８９に見出すことができる。単独で使用される抗体の典型的な１日投与量は、上記の因子に応じて、１日当たり約１μｇ／ｋｇ～最大１００ｍｇ／ｋｇの体重以上の範囲であり得る。
【0061】
Ｃ．癌を治療する方法
修飾ＮＫ細胞、例えば、本明細書に開示される活性化修飾ＳＴＡＴ３トランスクリプトームを含むものは、免疫応答を調節することができることが理解され、本明細書で企図される。よって、一態様では、活性化ＳＴＡＴ３トランスクリプトームを含む有効量の修飾ＮＫ細胞を投与することを含む、対象の免疫系を調節する方法が本明細書に開示される。あるいは、本開示は、ＰＭ粒子、エクソソーム、またはそれらの任意の組み合わせなどの薬剤を、それを必要とする対象に投与して、内因性ＮＫ細胞を活性化ＳＴＡＴ３トランスクリプトームを有するＮＫ細胞の状態に刺激することによって、対象の免疫系を調節することを企図する。
修飾ＮＫ細胞、例えば、本明細書に開示される活性化修飾ＳＴＡＴ３トランスクリプトームを含むものは、免疫応答を調節することができることが理解され、本明細書で企図される。よって、一態様では、活性化ＳＴＡＴ３トランスクリプトームを含む有効量の修飾ＮＫ細胞を投与することを含む、対象の免疫系を調節する方法が本明細書に開示される。あるいは、本開示は、ＰＭ粒子、エクソソーム、またはそれらの任意の組み合わせなどの薬剤を、それを必要とする対象に投与して、内因性ＮＫ細胞を活性化ＳＴＡＴ３トランスクリプトームを有するＮＫ細胞の状態に刺激することによって、対象の免疫系を調節することを企図する。
【0062】
一態様では、免疫応答を調節することは、疾患状態に対して臨床的に有益な効果を有し、よって、疾患もしくは状態の治療剤として機能するか、または疾患もしくは状態を治療するために使用される別の療法を増強することができることが理解される。本開示の組成物を使用して、癌などの未制御な細胞増殖が生じる任意の疾患を治療することができる。開示される組成物を使用して治療することができる代表的であるが、非限定的な癌のリストは、以下の通りである：リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、菌状息肉症、ホジキン病、骨髄性白血病、膀胱癌、脳癌、神経系癌、頭頸部癌、頭頸部の扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌および非小細胞肺癌などの肺癌、神経芽細胞腫／神経膠芽腫、卵巣癌、皮膚癌、肝臓癌、黒色腫、口、咽頭、喉頭癌、および肺の扁平上皮細胞癌、子宮頸癌（ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ）、子宮頸癌（ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、乳癌、ならびに上皮癌、腎臓癌、泌尿生殖器癌、肺癌、食道癌、頭頸部癌、大腸癌、造血癌、精巣癌、結腸癌、直腸癌、前立腺癌、または膵臓癌。よって、一態様では、対象において癌および／または転移を治療、阻害、低減、改善、および／または予防する方法であって、対象に、治療有効量の、本明細書に開示される増殖ナチュラルキラー細胞を投与することを含む、方法が本明細書に開示される。
【実施例】
【0063】
以下の実施例は、当業者に、本明細書で特許請求される化合物、組成物、物品、デバイス、および／または方法の作製方法および評価方法の完全な開示および説明を提供するために示されるものであり、純粋に例示的であることを意図するものであって、本開示を限定するものではない。数値（例えば、量、温度など）に関して精度を保証するように努力がなされてはいるが、いくらかの誤差および偏差が考慮されるべきである。特に指定しない限り、部（ｐａｒｔｓ）は重量部であり、温度は℃、または周囲温度であり、圧力は、大気圧またはその付近である。
【0064】
１．実施例１：増殖性（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ）増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）中のＮＫ細胞における改変されたＳＴＡＴ３トランスクリプトームは、代謝、エピジェネティック、および生存ネットワークのリプログラミングにつながる
４０年超前のそれらの発見にもかかわらず、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、細胞療法におけるそれらの潜在性について最近になって注目を集めている。ＮＫ細胞は、先天性免疫系の重要な部分であり、微生物感染および腫瘍進行に対する宿主免疫において重要な役割を果たす。増え続ける臨床研究は、ＮＫ細胞に基づく免疫療法の有望な抗腫瘍効果を強調している。しかしながら、不十分な数および限られた寿命は、適応免疫療法におけるＮＫ細胞の適用を制限する障害である。サイトカインを含む、ＮＫ細胞の数および機能を増強するために、複数のアプローチが使用されている。以前に、我々は成功裏に、培養において最大６週間老化を受けることなく、膜結合型インターロイキン－２１（ｍｂＩＬ２１）を発現するフィーダー細胞との共培養後に、ロバストなＮＫ細胞増殖を実証した。しかしながら、ＩＬ－２１シグナル伝達の転写影響は、完全には評価されていない。
４０年超前のそれらの発見にもかかわらず、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、細胞療法におけるそれらの潜在性について最近になって注目を集めている。ＮＫ細胞は、先天性免疫系の重要な部分であり、微生物感染および腫瘍進行に対する宿主免疫において重要な役割を果たす。増え続ける臨床研究は、ＮＫ細胞に基づく免疫療法の有望な抗腫瘍効果を強調している。しかしながら、不十分な数および限られた寿命は、適応免疫療法におけるＮＫ細胞の適用を制限する障害である。サイトカインを含む、ＮＫ細胞の数および機能を増強するために、複数のアプローチが使用されている。以前に、我々は成功裏に、培養において最大６週間老化を受けることなく、膜結合型インターロイキン－２１（ｍｂＩＬ２１）を発現するフィーダー細胞との共培養後に、ロバストなＮＫ細胞増殖を実証した。しかしながら、ＩＬ－２１シグナル伝達の転写影響は、完全には評価されていない。
【0065】
ＩＬ－２１は、ＮＫ細胞の活性化、成熟、および増殖に不可欠なＩ型サイトカインである。しかしながら、ＮＫ細胞におけるＩＬ－２１の効果の基礎となる分子メカニズムは、まだ完全には理解されていない。ＩＬ－２１は、ヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）およびシグナル伝達兼転写活性化因子（ＳＴＡＴ）経路を介してシグナル伝達する。ＩＬ－２１のＩＬ－２１受容体への結合は、ＪＡＫのリン酸化およびＳＴＡＴ３の同時活性化をもたらす。リン酸化後、ＳＴＡＴ３は、核に転位し、ＩＬ－２１応答性遺伝子の転写を開始するホモダイマーを形成する。
【0066】
ＳＴＡＴ３は、炎症の負の制御因子であり、腫瘍においてＳＴＡＴ３を阻害することは、抗腫瘍免疫を増強することが示されている。対照的に、ＳＴＡＴ３は、ヒトＮＫ細胞発生におけるシグナル伝達カスケードの不可欠な部分であり、アポトーシス、生存、および増殖を伴う複数の機能を有する。ＳＴＡＴ３は、ＮＫ細胞溶解活性、およびＮＫ細胞と免疫系の他の構成要素との間の相互制御性相互作用を制御する経路のほぼ全ての駆動に関与する。ＳＴＡＴ３シグナル伝達は、ＮＫ細胞増殖および細胞傷害性の維持において、ヒトＮＫ細胞のｍｂＩＬ２１媒介性増殖に重要である。しかしながら、ゲノムワイドなレベルでは、エクスビボＮＫ細胞増殖に向けて遺伝子を調節するＳＴＡＴ３トランスクリプトームは全く報告されていない。
【0067】
この目的のために、我々は、ＳＴＡＴ３によって制御される分子事象をよりよく理解するために、ＩＬ－２１での刺激の前および後に、静止ヒト末梢血（ナイーブ）およびエクスビボ増殖ヒトＮＫ細胞に対してＳＴＡＴ３ ＣｈＩＰ－ｓｅｑおよびＲＮＡ－ｓｅｑを実施した。ケモカインおよびサイトカイン発現、細胞増殖、ならびに遊走を制御するＳＴＡＴ３媒介性トランスクリプトームのこの知識は、ＮＫ細胞に基づく免疫療法の活性を改善するために貴重である。ここで、ゲノムワイドな分析方法および計算データ統合の組み合わせは、ＮＫ細胞増殖の前および後に直接的および間接的なＳＴＡＴ３標的を同定する。
【0068】
ａ）材料および方法
（１）ＰＢＭＣ取得およびＮＫ細胞調製
匿名化正常ドナーバフィーコートは、Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅｄ Ｃｒｏｓｓ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｎｔｅｒ（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ、ＯＨ）から得た。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、健康なドナーバフィーコート試料からＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅでの遠心分離によって精製した。新鮮なＮＫ細胞は、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐヒトＮＫ細胞富化カクテル（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、ＢＣ、Ｃａｎａｄａ）で≧９５％純度（ＣＤ３－ＣＤ１６／５６＋）に精製した。いくつかの事例では、ＮＫ細胞は、ＣｈＩＰ－ｓｅｑおよびＲＮＡ－ｓｅｑ分析前に、増殖後＜１％ＣＤ３＋にさらに精製した。
（１）ＰＢＭＣ取得およびＮＫ細胞調製
匿名化正常ドナーバフィーコートは、Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅｄ Ｃｒｏｓｓ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｎｔｅｒ（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ、ＯＨ）から得た。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、健康なドナーバフィーコート試料からＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅでの遠心分離によって精製した。新鮮なＮＫ細胞は、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐヒトＮＫ細胞富化カクテル（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、ＢＣ、Ｃａｎａｄａ）で≧９５％純度（ＣＤ３－ＣＤ１６／５６＋）に精製した。いくつかの事例では、ＮＫ細胞は、ＣｈＩＰ－ｓｅｑおよびＲＮＡ－ｓｅｑ分析前に、増殖後＜１％ＣＤ３＋にさらに精製した。
【0069】
（２）ＮＫ細胞エクスビボ増殖
Ｋ５６２ベースのフィーダー細胞（ＣＳＴＸ００２）は、ＣＤ１３７ＬおよびｍｂＩＬ２１を発現するように親Ｋ５６２の遺伝子修飾によって産生した。ＮＫ細胞は、１００ＩＵ／ｍＬのｒｈＩＬ－２の存在下、フィーダー細胞での毎週の刺激によって、インビトロでＰＢＭＣから増殖した。細胞は、示されるように、１０％ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）、２ｍＭのｌ－グルタミン（Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｃｅｌｌｇｒｏ／Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）で補足されたＲＰＭＩ １６４０（Ｃｅｌｌｇｒｏ／Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）中で、サイトカインありまたはなしで培養した。
Ｋ５６２ベースのフィーダー細胞（ＣＳＴＸ００２）は、ＣＤ１３７ＬおよびｍｂＩＬ２１を発現するように親Ｋ５６２の遺伝子修飾によって産生した。ＮＫ細胞は、１００ＩＵ／ｍＬのｒｈＩＬ－２の存在下、フィーダー細胞での毎週の刺激によって、インビトロでＰＢＭＣから増殖した。細胞は、示されるように、１０％ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）、２ｍＭのｌ－グルタミン（Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｃｅｌｌｇｒｏ／Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）で補足されたＲＰＭＩ １６４０（Ｃｅｌｌｇｒｏ／Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）中で、サイトカインありまたはなしで培養した。
【0070】
（３）試薬
組換えヒトＩＬ－２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）はＮｏｖａｒｔｉｓ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｎｄ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｅａｓｔ Ｈａｎｏｖｅｒ、ＮＪ）から、ＩＬ－２１はＰｅｐｒｏＴｅｃｈ（Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ、ＮＪ）から購入した。
組換えヒトＩＬ－２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）はＮｏｖａｒｔｉｓ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｎｄ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｅａｓｔ Ｈａｎｏｖｅｒ、ＮＪ）から、ＩＬ－２１はＰｅｐｒｏＴｅｃｈ（Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ、ＮＪ）から購入した。
【0071】
（４）ＳＴＡＴ３リン酸化のウェスタンブロット分析
ＩＬ－２１（２０ｎｇ／ｍｌ）での刺激後、細胞は、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を有するＲＩＰＡ溶解緩衝液中で溶解し、１５，０００ｘｇで４℃で１５分間遠心分離した。上清は、ＳＤＳ還元試料緩衝液中で沸騰させ、ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、次いでポリフッ化ビニリデン膜上に電気泳動転写した。５％乾燥脂肪スキムミルクを含有するＴＢＳＴ（２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０）中でブロックした後、膜を一次抗体で一晩４℃でプローブした。この研究で使用される抗体は、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）からの抗リン－ＳＴＡＴ３（Ｔｙｒ－７０５）、抗ＳＴＡＴ３、および抗β－アクチンであった。膜は、ＴＢＳＴで広範囲に洗浄し、ホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲート抗マウスまたは抗ウサギ抗体と室温で１時間インキュベートした。膜は、ＴＢＳＴで１５分間２回洗浄した。ブロットは、製造業者の指示に従って、Ａｍｅｒｓｈａｍ ＥＣＬウエスタンブロッティング検出試薬（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ－Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ、ＭＡ）を使用して視覚化した。
ＩＬ－２１（２０ｎｇ／ｍｌ）での刺激後、細胞は、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を有するＲＩＰＡ溶解緩衝液中で溶解し、１５，０００ｘｇで４℃で１５分間遠心分離した。上清は、ＳＤＳ還元試料緩衝液中で沸騰させ、ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、次いでポリフッ化ビニリデン膜上に電気泳動転写した。５％乾燥脂肪スキムミルクを含有するＴＢＳＴ（２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０）中でブロックした後、膜を一次抗体で一晩４℃でプローブした。この研究で使用される抗体は、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）からの抗リン－ＳＴＡＴ３（Ｔｙｒ－７０５）、抗ＳＴＡＴ３、および抗β－アクチンであった。膜は、ＴＢＳＴで広範囲に洗浄し、ホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲート抗マウスまたは抗ウサギ抗体と室温で１時間インキュベートした。膜は、ＴＢＳＴで１５分間２回洗浄した。ブロットは、製造業者の指示に従って、Ａｍｅｒｓｈａｍ ＥＣＬウエスタンブロッティング検出試薬（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ－Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ、ＭＡ）を使用して視覚化した。
【0072】
（５）クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）アッセイ
ナイーブおよび増殖ＮＫ細胞は、サイトカインを含まない培地において一晩静止させ、次いでＩＬ－２１（２０ｎｇ／ｍｌ）で３０分間刺激した。次いで、ＮＫ細胞は、１％ホルムアルデヒドで１５分間固定し、０．１２５Ｍのグリシンでクエンチした。クロマチンは、溶解緩衝液の添加、続いてＤｏｕｎｃｅホモジナイザーによる破壊によって単離した。溶解物は超音波処理し、ＤＮＡは３００～５００ｂｐの平均長に剪断した。ゲノムＤＮＡ（インプット）は、クロマチンのアリコートをＲＮａｓｅ、プロテイナーゼＫ、および脱架橋のための熱で処理し、続いてエタノール沈殿を行うことによって調製した。ペレットは再懸濁し、得られたＤＮＡはＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計で定量化した。元のクロマチン体積への外挿は、総クロマチン収率の定量化を可能にした。
ナイーブおよび増殖ＮＫ細胞は、サイトカインを含まない培地において一晩静止させ、次いでＩＬ－２１（２０ｎｇ／ｍｌ）で３０分間刺激した。次いで、ＮＫ細胞は、１％ホルムアルデヒドで１５分間固定し、０．１２５Ｍのグリシンでクエンチした。クロマチンは、溶解緩衝液の添加、続いてＤｏｕｎｃｅホモジナイザーによる破壊によって単離した。溶解物は超音波処理し、ＤＮＡは３００～５００ｂｐの平均長に剪断した。ゲノムＤＮＡ（インプット）は、クロマチンのアリコートをＲＮａｓｅ、プロテイナーゼＫ、および脱架橋のための熱で処理し、続いてエタノール沈殿を行うことによって調製した。ペレットは再懸濁し、得られたＤＮＡはＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計で定量化した。元のクロマチン体積への外挿は、総クロマチン収率の定量化を可能にした。
【0073】
クロマチンのアリコート（１０μｇ）は、プロテインＡアガロースビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でプレクリアした。目的のゲノムＤＮＡ領域は、ＳＴＡＴ３に対する（２μｇの）抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ｓｃ－４８２、Ｌｏｔ Ｃ０８１６）を使用して単離した。複合体を洗浄し、ＳＤＳ緩衝液でビーズから溶出し、ＲＮａｓｅおよびプロテイナーゼＫ処理に供した。架橋は、６５℃で一晩のインキュベーションによって逆転し、ＣｈＩＰ ＤＮＡは、フェノール－クロロホルム抽出およびエタノール沈殿によって精製した。
【0074】
（６）ＣｈＩＰ配列決定（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）
Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定ライブラリーは、エンドポリッシング、ｄＡ付加、およびアダプターライゲーションの標準的な連続酵素ステップによってＣｈＩＰおよびインプットＤＮＡから調製した。最終的なＰＣＲ増幅ステップ後、得られたＤＮＡライブラリーは、ＩｌｌｕｍｉｎａのＮｅｘｔＳｅｑ ５００（７５ｎｔリード、シングルエンド）で定量化および配列決定した。リードは、ＢＷＡアルゴリズム（デフォルト設定）を使用して、ヒトゲノム（ｈｇ３８）にアラインさせた。重複リードを除去し、一意的にマッピングされたリード（マッピング品質≧２５）のみをさらなる分析に使用した。アラインメントは、それらの３’末端で、サイズ選択ライブラリー内の平均ゲノム断片長である２００ｂｐの長さまでインシリコで伸長し、ゲノムに沿って３２－ｎｔビンに割り当てた。得られたヒストグラム（ゲノム「シグナルマップ」）は、ｂｉｇＷｉｇファイルに保存した。ピーク位置は、ｐ値＝１ｅ－７のカットオフでＭＡＣＳアルゴリズム（ｖ２．１．０）を使用して決定した。
Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定ライブラリーは、エンドポリッシング、ｄＡ付加、およびアダプターライゲーションの標準的な連続酵素ステップによってＣｈＩＰおよびインプットＤＮＡから調製した。最終的なＰＣＲ増幅ステップ後、得られたＤＮＡライブラリーは、ＩｌｌｕｍｉｎａのＮｅｘｔＳｅｑ ５００（７５ｎｔリード、シングルエンド）で定量化および配列決定した。リードは、ＢＷＡアルゴリズム（デフォルト設定）を使用して、ヒトゲノム（ｈｇ３８）にアラインさせた。重複リードを除去し、一意的にマッピングされたリード（マッピング品質≧２５）のみをさらなる分析に使用した。アラインメントは、それらの３’末端で、サイズ選択ライブラリー内の平均ゲノム断片長である２００ｂｐの長さまでインシリコで伸長し、ゲノムに沿って３２－ｎｔビンに割り当てた。得られたヒストグラム（ゲノム「シグナルマップ」）は、ｂｉｇＷｉｇファイルに保存した。ピーク位置は、ｐ値＝１ｅ－７のカットオフでＭＡＣＳアルゴリズム（ｖ２．１．０）を使用して決定した。
【0075】
（７）ＲＮＡ－ｓｅｑ試料調製および配列決定
トータルＲＮＡは、トータルＲＮＡ精製プラスキット（Ｎｏｒｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｋ、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ）を使用して、ＩＬ－２１刺激ナイーブおよび増殖ＮＫ細胞から精製した。得られたトータルＲＮＡは、Ｎａｎｏｄｒｏｐ ＮＤ－１０００分光光度計で定量化し、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ－２１００デバイス（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）で純度および完全性について確認し、配列決定についてＮａｔｉｏｎｗｉｄｅ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌでのゲノミクスコアに提出した。ライブラリーは、製造業者によって推奨されるプロトコルに従ってＴｒｕＳｅｑ ＲＮＡ試料調製キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ．）を使用して調製した。ライブラリー品質は、Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｄ１０００ ＳｃｒｅｅｎＴａｐｅ Ａｓｓａｙキットを使用してＡｇｉｌｅｎｔ ４２００ Ｔａｐｅｓｔａｔｉｏｎを介して決定し、ＫＡＰＡ ｑＰＣＲ（ＫＡＰＡ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）によって定量化した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ４０００プラットフォームを使用して、ライブラリーあたり約６，０００～８，０００万のペアエンド１５０ｂｐ配列リードを生成した。
トータルＲＮＡは、トータルＲＮＡ精製プラスキット（Ｎｏｒｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｋ、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ）を使用して、ＩＬ－２１刺激ナイーブおよび増殖ＮＫ細胞から精製した。得られたトータルＲＮＡは、Ｎａｎｏｄｒｏｐ ＮＤ－１０００分光光度計で定量化し、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ－２１００デバイス（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）で純度および完全性について確認し、配列決定についてＮａｔｉｏｎｗｉｄｅ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌでのゲノミクスコアに提出した。ライブラリーは、製造業者によって推奨されるプロトコルに従ってＴｒｕＳｅｑ ＲＮＡ試料調製キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ．）を使用して調製した。ライブラリー品質は、Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｄ１０００ ＳｃｒｅｅｎＴａｐｅ Ａｓｓａｙキットを使用してＡｇｉｌｅｎｔ ４２００ Ｔａｐｅｓｔａｔｉｏｎを介して決定し、ＫＡＰＡ ｑＰＣＲ（ＫＡＰＡ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）によって定量化した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ４０００プラットフォームを使用して、ライブラリーあたり約６，０００～８，０００万のペアエンド１５０ｂｐ配列リードを生成した。
【0076】
各試料からの配列決定リードは、スプライス認識アライナーＳＴＡＲのバージョン２．５．２ｂを使用して、ＮＣＢＩからのホモサピエンス参照のＧＲＣｈ３８．ｐ９アセンブリにアラインさせた。機能カバレッジカウントは、ＮＣＢＩからのアセンブリに付属したＧＦＦファイルを使用して、ＨＴＳｅｑで計算した。ＧＦＦからの機能タイプ、エクソン、および機能識別子、遺伝子ｉｄのデフォルトオプションを使用して、ＲＮＡ－Ｓｅｑ分析のために機能を同定した。試料調製およびアラインメントのための品質管理チェックは、ＮＣＢＩからのアセンブリに付属した機能表によって定義される各機能クラスにアラインされるＳＴＡＲのマッピング品質メトリックおよびリード数を使用してリードのタイプをカウントするカスタムＰｅｒｌスクリプトを使用して実施した。差次的発現分析は、ＤＥＳｅｑ２を使用するカスタムＲスクリプトを使用して実施した。有意に差次的に発現した機能は、絶対値≧１．５の倍率変化および調整されたｐ値≦０．１０（１０％ＦＤＲ）の基準で同定した。
【0077】
（８）統合的オミックスデータ分析
分子ネットワーク相互作用の同定およびＲＮＡレベルでの差次的発現遺伝子の経路分析は、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ Ｐａｔｈｗａｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ（Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して完了した。直接的および間接的な関係を有するＩｎｇｅｎｕｉｔｙナレッジベース（遺伝子のみ）を使用し、ヒトで実験的に観察された分子および／または関係のみを考慮した。
分子ネットワーク相互作用の同定およびＲＮＡレベルでの差次的発現遺伝子の経路分析は、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ Ｐａｔｈｗａｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ（Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して完了した。直接的および間接的な関係を有するＩｎｇｅｎｕｉｔｙナレッジベース（遺伝子のみ）を使用し、ヒトで実験的に観察された分子および／または関係のみを考慮した。
【0078】
ｂ）結果
（１）ＮＫ細胞におけるＳＴＡＴ３結合部位のゲノムワイドな同定
ナイーブおよび増殖ＮＫ細胞におけるＩＬ－２１によるＳＴＡＴ３リン酸化に応答してＳＴＡＴ３によって結合した領域をインビボで特徴付けるために、我々は、ＣｈＩＰ－ｓｅｑによってＳＴＡＴ３結合断片を配列決定した。このため、初代ＮＫ細胞は、まずＩＬ－２１（２０ｎｇ／ｍＬ）で３０分間処理され、ロバストなＳＴＡＴ３リン酸化が観察されたが、リン酸化ＳＴＡＴ３は、ＩＬ－２１の不在下では検出不能であった（図１Ａ）。これらの所見は、ＩＬ－２１がＮＫ細胞において強力かつ持続的なＳＴＡＴ３リン酸化を誘導するという以前の所見を裏付ける。次に、ＳＴＡＴ３のクロマチン免疫沈降は、ＩＬ－２１処理されたナイーブ細胞および増殖細胞の両方において、高スループット配列決定と組み合わされた。断片化クロマチンは、対照ＣｈＩＰ－ｓｅｑライブラリーを生成する非免疫沈降トータルインプットＤＮＡであったので、免疫沈降させ、ＤＮＡディープ配列決定した。ピーク同定は、対照ライブラリーと比較して、ＣｈＩＰ－ｓｅｑ（ＭＡＣＳ）富化についてモデルベースの分析を使用して実施した。ＳＴＡＴ３免疫沈降対インプット比較における閾値ｐ値＜１０－７および＜２０％偽発見率（ＦＤＲ）を使用して、我々は、それぞれ、ＩＬ－２１処理ナイーブ細胞および増殖ＮＫ細胞において、ＳＴＡＴ３によって結合された２，１６２および４，８７６個のピークを同定し、転写開始部位（ＴＳＳ）に関してそれらをヒトゲノムにマッピングした。増殖ＮＫ細胞では約１８００個が、ナイーブＮＫ細胞では約６５０個がＴＳＳ（－５００～＋１００ｎｔ）に関連付けられた。ＴＳＳ－遠位ピークは、遺伝子内、近接遺伝子内（ＴＳＳから＜２０Ｋｂ）、および遠位遺伝子内（＞２０Ｋｂ）として定義された（図１Ｂ）。全体として、データは、ＮＫ細胞におけるＩＬ－２１刺激がｐＳＴＡＴ３のプロモーターへの優先的な結合をもたらすことを示す。
（１）ＮＫ細胞におけるＳＴＡＴ３結合部位のゲノムワイドな同定
ナイーブおよび増殖ＮＫ細胞におけるＩＬ－２１によるＳＴＡＴ３リン酸化に応答してＳＴＡＴ３によって結合した領域をインビボで特徴付けるために、我々は、ＣｈＩＰ－ｓｅｑによってＳＴＡＴ３結合断片を配列決定した。このため、初代ＮＫ細胞は、まずＩＬ－２１（２０ｎｇ／ｍＬ）で３０分間処理され、ロバストなＳＴＡＴ３リン酸化が観察されたが、リン酸化ＳＴＡＴ３は、ＩＬ－２１の不在下では検出不能であった（図１Ａ）。これらの所見は、ＩＬ－２１がＮＫ細胞において強力かつ持続的なＳＴＡＴ３リン酸化を誘導するという以前の所見を裏付ける。次に、ＳＴＡＴ３のクロマチン免疫沈降は、ＩＬ－２１処理されたナイーブ細胞および増殖細胞の両方において、高スループット配列決定と組み合わされた。断片化クロマチンは、対照ＣｈＩＰ－ｓｅｑライブラリーを生成する非免疫沈降トータルインプットＤＮＡであったので、免疫沈降させ、ＤＮＡディープ配列決定した。ピーク同定は、対照ライブラリーと比較して、ＣｈＩＰ－ｓｅｑ（ＭＡＣＳ）富化についてモデルベースの分析を使用して実施した。ＳＴＡＴ３免疫沈降対インプット比較における閾値ｐ値＜１０－７および＜２０％偽発見率（ＦＤＲ）を使用して、我々は、それぞれ、ＩＬ－２１処理ナイーブ細胞および増殖ＮＫ細胞において、ＳＴＡＴ３によって結合された２，１６２および４，８７６個のピークを同定し、転写開始部位（ＴＳＳ）に関してそれらをヒトゲノムにマッピングした。増殖ＮＫ細胞では約１８００個が、ナイーブＮＫ細胞では約６５０個がＴＳＳ（－５００～＋１００ｎｔ）に関連付けられた。ＴＳＳ－遠位ピークは、遺伝子内、近接遺伝子内（ＴＳＳから＜２０Ｋｂ）、および遠位遺伝子内（＞２０Ｋｂ）として定義された（図１Ｂ）。全体として、データは、ＮＫ細胞におけるＩＬ－２１刺激がｐＳＴＡＴ３のプロモーターへの優先的な結合をもたらすことを示す。
【0079】
ＳＴＡＴ３は、それ自体の転写、それ自体の発現を安定化するように働く多くの転写因子（ＴＦ）に特有の正の自己制御パターンを制御する。我々は、ＩＬ－２１刺激ナイーブおよび増殖ＮＫ細胞におけるＳＴＡＴ３遺伝子自体のプロモーターで明確なピークを同定し（図１Ｃ）、既知のＳＴＡＴ３制御遺伝子を同定するためのＳＴＡＴ３ ＣｈＩＰ－ｓｅｑライブラリーの良好な品質を示した。我々は、ＨＯＭＥＲを使用してデノボモチーフ発見のために全てのＳＴＡＴ３結合ピークを走査し、プロトタイプＳＴＡＴ３ホモダイマーモチーフＴＴＣＣｎＧＧＡＡを回収した（図１Ｄ）が、優性配向は、ナイーブと比較して増殖ＮＫ細胞において逆転された。プロモーター領域の５ｋｂ以内のピークについて、我々は、増殖ＮＫ細胞において、ナイーブよりも高いＳＴＡＴ３ホモダイマーモチーフ頻度を見出した（図１Ｅ）。最後に、ＳＴＡＴ３モチーフの位置に関して、我々は、増殖ＮＫ細胞における転写活性領域（ＴＡＲ）へのＳＴＡＴ３結合の３～５倍の増加があったことを見出した（図１Ｆ）。遠位遺伝子間結合には差異はなく、ＴＡＲ結合が増殖ＮＫ細胞において優先的に増加したことを示す。分析は、ＳＴＡＴ３結合ピークのリストが、ヒトＮＫ細胞のエクスビボ増殖中の活性ＳＴＡＴ３遺伝子制御を正確に反映する高品質のデータセットであることを示す。
【0080】
（２）生物学的プロセスに関連するＳＴＡＴ３結合部位
ＧＲＥＡＴを使用して、ＳＴＡＴ３結合部位のゲノムワイドな機能特性を解釈した。遺伝子オントロジー（ＧＯ）タームを使用して機能的アノテーションを導出するほとんどのツールが、遺伝子に近接する遺伝子または結合事象のセットに基づいて計算する（よって、ほとんどの結合事象を廃棄する）のに対し、ＧＲＥＡＴは、ゲノムの非ランダム分布を考慮し、特にＣｈＩＰ－ｓｅｑデータのゲノムワイドな分析に適している。ＧＲＥＡＴは、標準的なＧＯターム富化方法を上回ることが示されており、ＳＴＡＴ３結合部位のセットに対する分析は、主要免疫機能の明確な富化を報告している。図２は、様々なカテゴリー（ＧＯ生物学的プロセス、ＧＯ分子機能、ＰＡＮＴＨＥＲ経路、ＭＳｉｇＤＢ経路）に関連する遺伝子セット富化値を示す。分子機能富化に対する上位のオントロジーは、ナイーブおよび増殖ＮＫ細胞の両方におけるＲＮＡ－結合、－代謝、および－ヘリカーゼ活性であった。ＭＳｉｇＤＢ経路カテゴリーでは、「ＮＫ細胞媒介性細胞傷害性」および「サイトカインシグナル伝達」を含む、複数の免疫関連経路は、ナイーブＮＫ細胞において富化されることが見出されたが、ｍＲＮＡプロセシング、細胞周期、およびサイトカインシグナル伝達オントロジーは、増殖ＮＫ細胞において明らかに富化された。ＰＡＮＴＨＥＲ経路カテゴリーを見ると、アポトーシス、インターロイキンシグナル伝達、およびＪＡＫ－ＳＴＡＴシグナル伝達に関連するタームが過剰発現され、増殖ＮＫ細胞におけるＩＬ－２１／ＪＡＫ／ＳＴＡＴ３経路の役割が、細胞増殖および生存を調節し、それ自体のシグナル伝達経路を強化することであることを示した。ＧＯ生物学的プロセスカテゴリーは、ナイーブＮＫ細胞における免疫応答、ならびに増殖ＮＫ細胞におけるウイルス応答および細胞増殖に関する観点で富化された。総じて、ＧＲＥＡＴ分析は、ナイーブおよび増殖ＮＫ細胞で観察されるＳＴＡＴ３結合事象が、免疫細胞機能および細胞成長を制御することを示す証拠を提供した。
ＧＲＥＡＴを使用して、ＳＴＡＴ３結合部位のゲノムワイドな機能特性を解釈した。遺伝子オントロジー（ＧＯ）タームを使用して機能的アノテーションを導出するほとんどのツールが、遺伝子に近接する遺伝子または結合事象のセットに基づいて計算する（よって、ほとんどの結合事象を廃棄する）のに対し、ＧＲＥＡＴは、ゲノムの非ランダム分布を考慮し、特にＣｈＩＰ－ｓｅｑデータのゲノムワイドな分析に適している。ＧＲＥＡＴは、標準的なＧＯターム富化方法を上回ることが示されており、ＳＴＡＴ３結合部位のセットに対する分析は、主要免疫機能の明確な富化を報告している。図２は、様々なカテゴリー（ＧＯ生物学的プロセス、ＧＯ分子機能、ＰＡＮＴＨＥＲ経路、ＭＳｉｇＤＢ経路）に関連する遺伝子セット富化値を示す。分子機能富化に対する上位のオントロジーは、ナイーブおよび増殖ＮＫ細胞の両方におけるＲＮＡ－結合、－代謝、および－ヘリカーゼ活性であった。ＭＳｉｇＤＢ経路カテゴリーでは、「ＮＫ細胞媒介性細胞傷害性」および「サイトカインシグナル伝達」を含む、複数の免疫関連経路は、ナイーブＮＫ細胞において富化されることが見出されたが、ｍＲＮＡプロセシング、細胞周期、およびサイトカインシグナル伝達オントロジーは、増殖ＮＫ細胞において明らかに富化された。ＰＡＮＴＨＥＲ経路カテゴリーを見ると、アポトーシス、インターロイキンシグナル伝達、およびＪＡＫ－ＳＴＡＴシグナル伝達に関連するタームが過剰発現され、増殖ＮＫ細胞におけるＩＬ－２１／ＪＡＫ／ＳＴＡＴ３経路の役割が、細胞増殖および生存を調節し、それ自体のシグナル伝達経路を強化することであることを示した。ＧＯ生物学的プロセスカテゴリーは、ナイーブＮＫ細胞における免疫応答、ならびに増殖ＮＫ細胞におけるウイルス応答および細胞増殖に関する観点で富化された。総じて、ＧＲＥＡＴ分析は、ナイーブおよび増殖ＮＫ細胞で観察されるＳＴＡＴ３結合事象が、免疫細胞機能および細胞成長を制御することを示す証拠を提供した。
【0081】
（３）ナイーブおよび増殖ＮＫ細胞における差次的遺伝子発現
ＩＬ－２１刺激に応答してＮＫ細胞活性のユニークなかつ共通のシグネチャーを定義するために、我々は、ＮＫ細胞のトランスクリプトーム全体を研究した。高スループットＲＮＡ配列決定（ＲＮＡ－ｓｅｑ）を使用して、５人のドナーにおける静止ならびにＩＬ－２１刺激ナイーブおよび増殖ＮＫ細胞の発現プロファイルを調査した（図３）。各試料について約６０００～８０００万のペアエンド１５０ｂｐ配列リードからなる、約１０億ｂｐを配列決定した。各試料からの配列決定リードは、スプライス認識アライナーＳＴＡＲのバージョン２．５．２ｂを使用して、ＮＣＢＩからのホモサピエンス参照のＧＲＣｈ３８．ｐ９アセンブリにアラインさせた。リードの約９６％をヒトゲノムに正常にアラインさせた。ナイーブおよび増殖ＮＫ細胞からのＲＮＡ－ｓｅｑライブラリーを組み合わせた後、我々は、それぞれ転写物の７９％および７８％を明確に組み立てることができた。
ＩＬ－２１刺激に応答してＮＫ細胞活性のユニークなかつ共通のシグネチャーを定義するために、我々は、ＮＫ細胞のトランスクリプトーム全体を研究した。高スループットＲＮＡ配列決定（ＲＮＡ－ｓｅｑ）を使用して、５人のドナーにおける静止ならびにＩＬ－２１刺激ナイーブおよび増殖ＮＫ細胞の発現プロファイルを調査した（図３）。各試料について約６０００～８０００万のペアエンド１５０ｂｐ配列リードからなる、約１０億ｂｐを配列決定した。各試料からの配列決定リードは、スプライス認識アライナーＳＴＡＲのバージョン２．５．２ｂを使用して、ＮＣＢＩからのホモサピエンス参照のＧＲＣｈ３８．ｐ９アセンブリにアラインさせた。リードの約９６％をヒトゲノムに正常にアラインさせた。ナイーブおよび増殖ＮＫ細胞からのＲＮＡ－ｓｅｑライブラリーを組み合わせた後、我々は、それぞれ転写物の７９％および７８％を明確に組み立てることができた。
【0082】
我々は、ＲＮＡ－ｓｅｑによってナイーブおよび増殖ＮＫ細胞のトランスクリプトームを分析した。我々は、センス鎖から１４，１８３個のＲＮＡ転写物を検出し、これらから我々は、偽差次的発現を回避するために、発現のレベル（ＦＰＫＭ）が＞１であったＲＮＡのみを検討した。次いで、我々は、ＳＴＡＴ３調節遺伝子を定義する任意の閾値を設定し、ＳＴＡＴ３の活性化は、発現の５０％超の増加または減少（倍率変化比＞１．５）をもたらした。約７，９５１個の転写物は、ナイーブ細胞と比較して、増殖ＮＫ細胞において差次的に発現された（図３Ａ）。
【0083】
我々は、増殖／ナイーブＦＰＫＭ発現比が＞１．５であった２，９３８個の過剰発現遺伝子、および倍率変化比が＜１．５であった５，０１３個の下方制御遺伝子を見出した（図３Ｂ、図３Ｃに示される上位１００個の差次的発現遺伝子）。よって、増殖ＮＫ細胞におけるＳＴＡＴ３刺激の最も頻繁な効果は、遺伝子発現の下方制御であった。これらの差次的に発現された転写物が関与する生物学的経路を調査するために、我々は、次に、ＧＯ遺伝子セットを使用して遺伝子セット富化分析（Ｅｎｒｉｃｈｒ）を実施して、各サブセット内の関連を同定した。ＩＬ－２１での刺激後の増殖対ナイーブＮＫ細胞における下方制御遺伝子のうち、ＧＯ分析は、いくつかの統計的に有意なカテゴリー、主に「転写制御」を示した。一方、増殖ＮＫ細胞において上方制御された遺伝子は、「ＤＮＡ代謝プロセス」、「有糸分裂の制御」、「ミトコンドリアＡＴＰ合成」、「解糖」、および「ｐ５３経路」などの細胞成長カテゴリーにおいてより有意に富化された（図３Ｄ）。
【0084】
我々は、ＩＰＡパッケージ（ＱＩＡＧＥＮ Ｒｅｄｗｏｏｄ Ｃｉｔｙ）を使用して、差次的発現遺伝子（ＤＥＧ）が属する経路を同定し、これらのＤＥＧを接続するシグナル伝達ネットワークの存在を調査した。いくつかの経路は、４，２７５個のＤＥＧのデータセットにおいて有意に富化された（図４Ａ）。最も富化された経路の中には、酸化的リン酸化、ヌクレオチド除去修復（ＮＥＲ）経路、サーチュインシグナル伝達経路、細胞周期、およびグランザイムＡシグナル伝達があった。差次的に発現されたｍＲＮＡ遺伝子も、ＩＰＡソフトウェアで遺伝子制御ネットワークに群化された。我々は、様々な機能に関連する２５の制御ネットワークを発見し、トップスコアのものは、細胞死および生存、感染疾患、細胞機能および維持、ならびに血液疾患のそれであった（図４Ｂ）。
【0085】
次いで、我々は、ＳＴＡＴ３のゲノムワイドな結合パターンを発現データ（ＲＮＡ－ｓｅｑ）と統合して、ＳＴＡＴ３が制御する遺伝子に対して有する主要な効果を解き明かした。ＳＴＡＴ３結合部位は、ＲＮＡ－ｓｅｑデータに従って最も近い発現遺伝子（ＴＳＳ）にアノテートし、最も近いＴＳＳまでの距離にビニングした。ＳＴＡＴ３結合部位のほぼ約５０％は、優先的に遺伝子本体内にあり、約１０％のみが最も近いＴＳＳから２００ｋｂを超える距離で見出される。ＩＬ－２１刺激に対する遺伝子発現の変化の全体的な見解を得るために、有意な結合差を有するＳＴＡＴ３結合領域が同定された後、我々は、それらを近傍遺伝子と関連付け、次いで差次的に制御された転写物は、Ｅｎｒｉｃｈｒを使用して過剰に表現されたＧＯタームについて調査された（図５）。細胞分裂、アポトーシス、およびＤＮＡ損傷応答に関連するＧＯ生物学的プロセスカテゴリーを有する遺伝子は、ナイーブ細胞と比較して、増殖ＮＫ細胞において富化された（図５Ａ）。一方、クロマチンリモデリング、ヌクレオソーム分解、および転写の負の制御に関連するＧＯタームは、ナイーブ細胞において富化された（図５Ｂ）。これらの経路の発現は、ＮＫ細胞を急速に増殖させ、ＩＬ－２１刺激がそれらの新鮮な対応物よりも強力である理由を説明する。
【0086】
ｃ）考察
ＮＫ細胞は、膨大な表現型および機能的多様性を有する先天性リンパ球である。それらは、先天性免疫系の主要なプレーヤーであり、ウイルス感染、病原体、および腫瘍細胞に対する即時エフェクター細胞であり、養子免疫療法での使用に有望なツールとなっている。しかしながら、ＮＫ細胞は、循環血液リンパ球の５～１５％しか損なわず、よって、養子ＮＫ細胞免疫療法の主要な障害は、十分な細胞数を得ることである。この文脈において、エクスビボ培養は、ＮＫ細胞の数を増加させ、臨床応用前にそれらの抗腫瘍潜在性を改善するための魅力的な選択肢である。以前に、我々は、ＳＴＡＴ３が、これらの増殖ＮＫ細胞における遺伝子発現を制御するキーシグナル伝達因子であることを示した。ＮＫ細胞上のＩＬ－２１ＲへのＩＬ－２１の結合は、ＳＴＡＴ３を活性化し、ＩＬ－２１は、増殖ＮＫ細胞におけるＳＴＡＴ３のリン酸化を誘導し、３０分後に最大応答を有し、６時間までにベースラインに戻る。
ＮＫ細胞は、膨大な表現型および機能的多様性を有する先天性リンパ球である。それらは、先天性免疫系の主要なプレーヤーであり、ウイルス感染、病原体、および腫瘍細胞に対する即時エフェクター細胞であり、養子免疫療法での使用に有望なツールとなっている。しかしながら、ＮＫ細胞は、循環血液リンパ球の５～１５％しか損なわず、よって、養子ＮＫ細胞免疫療法の主要な障害は、十分な細胞数を得ることである。この文脈において、エクスビボ培養は、ＮＫ細胞の数を増加させ、臨床応用前にそれらの抗腫瘍潜在性を改善するための魅力的な選択肢である。以前に、我々は、ＳＴＡＴ３が、これらの増殖ＮＫ細胞における遺伝子発現を制御するキーシグナル伝達因子であることを示した。ＮＫ細胞上のＩＬ－２１ＲへのＩＬ－２１の結合は、ＳＴＡＴ３を活性化し、ＩＬ－２１は、増殖ＮＫ細胞におけるＳＴＡＴ３のリン酸化を誘導し、３０分後に最大応答を有し、６時間までにベースラインに戻る。
【0087】
増殖後のＮＫ細胞活性を調節するＳＴＡＴ３制御遺伝子の同一性を明らかにするために、ここで我々は、ＩＬ－２１刺激に関する、ヒトナイーブおよびエクスビボ増殖ＮＫ細胞の両方におけるＳＴＡＴ３結合部位の最初のゲノムワイドマップを報告する。ＣｈＩＰ－ｓｅｑは、インビボで転写因子によって制御される遺伝子を特定するための最も強力で直接的な手段であり、より良いカバレッジ、より高い解像度、およびより少ないノイズを提供する。ほとんどのＳＴＡＴ３結合部位は、遺伝子体内または隣接領域に優先的に位置し、ＳＴＡＴ３結合は通常、進化的に保存されたゲノム領域で生じる。我々は、ＩＬ－２１刺激に対する増殖ＮＫ細胞に特異的な３，５０１の高品質ＳＴＡＴ３結合部位を同定し、７９２もまた、ナイーブ細胞において同定し、１３２２の結合領域は、両方で類似しており、これはリン酸化ＳＴＡＴ３が増殖中に非常に特異的な転写応答を発揮することを示す。さらに、ＧＲＥＡＴ分析は、細胞成長および免疫機能（例えば、「インターロイキンシグナル伝達」、「ＪＡＫ－ＳＴＡＴシグナル伝達経路」、ＮＫ細胞媒介性細胞傷害性、サイトカインシグナル伝達、およびアポトーシス）におけるＳＴＡＴ３結合部位の関与についての強力な証拠を提供した。これらの観察は、ＳＴＡＴ３がＮＫ細胞において免疫活性化の役割を有し、ＳＴＡＴ３リン酸化がＮＫ細胞の増殖、および細胞傷害性を制御するという以前の報告を支持する。
【0088】
複数の試験について補正した後、広範囲の機能的役割を示す６，４６４個の遺伝子は、増殖ＮＫ細胞とナイーブＮＫ細胞との間で有意な差次的発現を示した。例えば、増殖ＮＫ細胞において最も高い発現遺伝子のうちの１つは、アポトーシス阻害（ＩＡＰ）遺伝子ファミリーのメンバーであり、アポトーシス細胞死を防止する負の制御タンパク質をコードする、ＢＩＲＣ５（サバイビン）であった。興味深いことに、ＢＩＲＣ５は、ＮＫ細胞の発生に必須であり、ＮＫ細胞集団におけるＢＩＲＣ５の高発現は、骨髄で観察されており、先天性リンパ球発生におけるＢＩＲＣ５の非冗長的な役割と一致していた。ＢＩＲＣ５遺伝子の細胞特異的欠失を有するマウスでは、ＮＫ細胞の定常状態集団は、重度に低減した。所見は、ＮＫ細胞の増殖および成熟におけるＢＩＲＣ５の重要な役割を強調し、支持する。さらに、ＭＫＩ６７（Ｋｉ－６７）、ＴＯＰ２Ａ、ＣＫＳ２、およびＲＡＣＧＡＰ１を含む細胞生存および増殖のためのいくつかのプロモーターは、ＩＬ－２１によって上方制御されたが、ＰＴＣＨ１、ＴＧＦＢ３、およびＡＴＭなどの抗増殖性またはアポトーシス促進性タンパク質は、下方制御された。よって、遺伝子発現シグネチャーは、サイトカイン刺激後のＮＫ細胞の改善した機能活性と一致する。
【0089】
全ゲノムプロファイリングアプローチの組み合わせは、ナイーブＮＫ細胞と増殖ＮＫ細胞との間の発現において異なる、全遺伝子のほぼ２０％の近くに差次的ＳＴＡＴ３結合部位を示し、ＳＴＡＴ３が増殖ＮＫ細胞サブタイプによって示されるロバストな成長および細胞傷害性の制御因子であることを示す。ＳＴＡＴ３結合および発現結果は、それによってＳＴＡＴ３がＮＫ細胞における成長および成熟を促進するために生物学的経路を制御する、可能なモデルを示す。増加した近傍ＳＴＡＴ３結合を有する増殖ＮＫ細胞において上方制御される遺伝子のオントロジー分析は、ＳＴＡＴ３が細胞増殖、より高い解糖代謝、分裂、および免疫応答を促進することを示す（図５Ａ）。さらに、その経路パートナーおよび上流シグナル伝達分子を上方制御し、コロニー刺激因子経路とのクロストークを促進することによって、ＩＦＮγの継続的な高発現を確保する（図６）。最も重要なことに、ＳＴＡＴ３は、アポトーシス耐性の多くのメカニズムを強力に上方制御する。これらの効果は、相乗効果を発揮し、エクスビボ増殖中に増加した細胞増殖およびＮＫ細胞の活性化をもたらす可能性が高い。
【0090】
ＮＫ細胞の増殖の遺伝学、エピジェネティクス、トランスクリプトーム、およびプロテオームへのそのような新規の洞察、ならびにヒトＮＫ細胞へのＩＬ－２１の影響の理解は、養子ＮＫ細胞療法におけるエクスビボ増殖ＮＫ細胞の実施を促進する。さらに、これらの結果は、治療抵抗性悪性腫瘍について、例えば、ＣＡＲまたは他の修飾で、より効果的な修飾ＮＫ細胞を生成するための、かなりの数の妥当な標的分子を同定するためのデータを提供する。
【0091】
２．実施例２：差次的制御遺伝子は、エピジェネティックに制御されるか、またはエピジェネティック制御因子である
我々は、ＲＮＡｓｅｑナイーブ対増殖比較から上位２００個の差次的発現遺伝子を取り出し、次いでＡＴＡＣｓｅｑナイーブ対増殖比較からの差次的発現遺伝子の別のリストにおいてそれらの遺伝子を検索した。３８個のＲＮＡｓｅｑ遺伝子もまたＡＴＡＣｓｅｑリストに含まれた。よって、増殖ＮＫ細胞における差次的発現遺伝子の１９％は、エピジェネティック変化によって影響される。
我々は、ＲＮＡｓｅｑナイーブ対増殖比較から上位２００個の差次的発現遺伝子を取り出し、次いでＡＴＡＣｓｅｑナイーブ対増殖比較からの差次的発現遺伝子の別のリストにおいてそれらの遺伝子を検索した。３８個のＲＮＡｓｅｑ遺伝子もまたＡＴＡＣｓｅｑリストに含まれた。よって、増殖ＮＫ細胞における差次的発現遺伝子の１９％は、エピジェネティック変化によって影響される。
【0092】
我々は次いで、ＲＮＡｓｅｑのＤＥＳｅｑＳｃｏｒｅを、ＡＴＡＣｓｅｑからのｌｏｇ２倍率変化でプロットし、クロマチンの開口および遺伝子発現と直接的な相関があったかを確認した。３８個の遺伝子のうちの３個を除く全ては、高い統計的有意性で、予想される方向に相関した（図７）。したがって、クロマチンアクセシビリティのエピジェネティック制御は、増殖ＮＫ細胞における遺伝子発現の調節と高度に相関している。
【0093】
２００個の上位差次的発現遺伝子のうち、それらの２７個がヒストンであり、それらの１個のみが上記の他の３８個の遺伝子に含まれる。これは、増殖ＮＫ細胞における上位２００個の差次的制御遺伝子のうちの１／３（６５）が、エピジェネティック制御因子であるか、またはエピジェネティック制御されているかのいずれかであることを意味する。これらの遺伝子は：ＨＩＳＴ１Ｈ１Ｂ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＢ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＧ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＨ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＩ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＪ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＬ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＢ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＥ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＨ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＪ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＬ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＭ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＯ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｂ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｃ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｆ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｇ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｈ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｊ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ａ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｄ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｌ、ＨＩＳＴ２Ｈ３Ｃ、ＨＩＳＴ２Ｈ４Ｂ、ＨＩＳＴ３Ｈ２ＢＡ、ＨＩＳＴ３Ｈ２ＢＢ、ＡＢＣＡ１、ＡＫ５、ＡＳＣＬ２、Ｂ３ＧＡＴ１、ＣＡＣＮＡ２Ｄ２、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ２、ＥＮＰＰ５、ＦＢＬＮ２、ＦＣＲＬ３、ＧＮＡＬ、ＧＰＲＡＳＰ１、ＧＲＩＫ４、ＧＴＳＥ１、ＨＩＳＴ３Ｈ２ＢＢ、ＩＬ１Ｂ、ＩＴＧＡ２、ＫＩＦ１３Ａ、ＫＩＦ４Ａ、ＬＩＮＣ００５９９、ＬＯＮＲＦ３、ＬＲＲＮ３、ＭＳＣ－ＡＳ１、ＮＦＩＸ、ＮＵＡＫ１、ＮＵＡＫ２、ＰＣＤＨ１、ＰＬＸＮＡ４、ＲＡＤ５１、ＲＮＦ１５７、ＳＬＣ１Ａ７、ＳＰＯＮ２、ＴＹＭＳ、ＷＷＣ２、ＺＮＦ４４２、ＺＮＦ７２７、およびＺＳＣＡＮ１８である。
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Ｎｉ，Ｌ．，Ｗａｎｇ，Ｌ．，Ｙａｏ，Ｃ．，Ｎｉ，Ｚ．，Ｌｉｕ，Ｆ．，Ｇｏｎｇ，Ｃ．，Ｚｈｕ，Ｘ．，Ｙａｎ，Ｘ．，Ｗａｔｏｗｉｃｈ，Ｓ．Ｓ．，Ｌｅｅ，Ｄ．Ａ．，ａｎｄ Ｚｈｕ，Ｓ．（２０１７）．Ｔｈｅ ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｖａｌｐｒｏｉｃ ａｃｉｄ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ＮＫＧ２Ｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＳＴＡＴ３ ａｎｄ ＨＤＡＣ３．Ｓｃｉ Ｒｅｐ ７，４５２６６．
Ｐｒｅｅｔｈｙ，Ｓ．，Ｄｅｄｅｅｐｉｙａ，Ｖ．Ｄ．，Ｓｅｎｔｈｉｌｋｕｍａｒ，Ｒ．，Ｒａｊｍｏｈａｎ，Ｍ．，Ｋａｒｔｈｉｃｋ，Ｒ．，Ｔｅｒｕｎｕｍａ，Ｈ．，ａｎｄ Ａｂｒａｈａｍ，Ｓ．Ｊ．Ｋ．（２０１７）．Ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ ａｓ ａ ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ ｔｏｏｌ ｔｏ ｔａｃｋｌｅ ｃａｎｃｅｒ－Ａ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｓｏｕｒｃｅｓ，ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｅｓ，ａｎｄ ｐｏｔｅｎｔｉａｌｓ．Ｉｎｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３６，２２０－２３２．
Ｒａｊｂｈａｎｄａｒｙ，Ｓ．，Ｚｈａｏ，Ｍ．Ｆ．，Ｚｈａｏ，Ｎ．，Ｌｕ，Ｗ．Ｙ．，Ｚｈｕ，Ｈ．Ｂ．，Ｘｉａｏ，Ｘ．，Ｄｅｎｇ，Ｑ．，ａｎｄ Ｌｉ，Ｙ．Ｍ．（２０１３）．Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ＩＬ－２１ ｅｎｈａｎｃｅｄ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ＣＩＫ ｃｅｌｌｓ ｓｉｇｎａｌｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ＳＴＡＴ－３ ａｎｄ ＳＴＡＴ５ｂ ｐａｔｈｗａｙｓ．Ａｓｉａｎ Ｐａｃ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ Ｐｒｅｖ １４，５８２５－５８３１．
Ｓｏｍａｎｃｈｉ，Ｓ．Ｓ．，ａｎｄ Ｌｅｅ，Ｄ．Ａ．（２０１６）．Ｅｘ Ｖｉｖｏ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ ＮＫ Ｃｅｌｌｓ Ｕｓｉｎｇ Ｋ５６２ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｔｏ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｂｏｕｎｄ ＩＬ２１．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １４４１，１７５－１９３．
Ｓｐｏｌｓｋｉ，Ｒ．，ａｎｄ Ｌｅｏｎａｒｄ，Ｗ．Ｊ．（２００８）．Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－２１：ｂａｓｉｃ ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２６，５７－７９．
Ｖｉｖｉｅｒ，Ｅ．，Ｔｏｍａｓｅｌｌｏ，Ｅ．，Ｂａｒａｔｉｎ，Ｍ．，Ｗａｌｚｅｒ，Ｔ．，ａｎｄ Ｕｇｏｌｉｎｉ，Ｓ．（２００８）．Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ９，５０３－５１０．
Ｗａｎｇ，Ｘ．，Ｌｅｅ，Ｄ．Ａ．，Ｗａｎｇ，Ｙ．，Ｗａｎｇ，Ｌ．，Ｙａｏ，Ｙ．，Ｌｉｎ，Ｚ．，Ｃｈｅｎｇ，Ｊ．，ａｎｄ Ｚｈｕ，Ｓ．（２０１３）．Ｍｅｍｂｒａｎｅ－ｂｏｕｎｄ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－２１ ａｎｄ ＣＤ１３７ ｌｉｇａｎｄ ｉｎｄｕｃｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｈｕｍａｎ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ＳＴＡＴ－３ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７２，１０４－１１２．
Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，Ｌｉｕ，Ｔ．，Ｍｅｙｅｒ，Ｃ．Ａ．，Ｅｅｃｋｈｏｕｔｅ，Ｊ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｄ．Ｓ．，Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，Ｂ．Ｅ．，Ｎｕｓｂａｕｍ，Ｃ．，Ｍｙｅｒｓ，Ｒ．Ｍ．，Ｂｒｏｗｎ，Ｍ．，Ｌｉ，Ｗ．，ａｎｄ Ｌｉｕ，Ｘ．Ｓ．（２００８）．Ｍｏｄｅｌ－ｂａｓｅｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＣｈＩＰ－Ｓｅｑ （ＭＡＣＳ）．Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ ９，Ｒ１３７．
Ｚｈｕ，Ｓ．，Ｐｈａｔａｒｐｅｋａｒ，Ｐ．Ｖ．，Ｄｅｎｍａｎ，Ｃ．Ｊ．，Ｓｅｎｙｕｋｏｖ，Ｖ．Ｖ．，Ｓｏｍａｎｃｈｉ，Ｓ．Ｓ．，Ｎｇｕｙｅｎ－Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｈ．Ｔ．，Ｍａｃｅ，Ｅ．Ｍ．，Ｆｒｅｅｍａｎ，Ａ．Ｆ．，Ｗａｔｏｗｉｃｈ，Ｓ．Ｓ．，Ｏｒａｎｇｅ，Ｊ．Ｓ．，Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｓ．Ｍ．，ａｎｄ Ｌｅｅ，Ｄ．Ａ．（２０１４）．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＮＫＧ２Ｄ ｉｎ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ ｉｓ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ ＳＴＡＴ３ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ．Ｂｌｏｏｄ １２４，４０３－４１１．
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図1E】
【図1F】
【図2A-1】
【図2A-2】
【図2A-3】
【図2A-4】
【図2B-1】
【図2B-2】
【図2B-3】
【図2B-4】
【図3A】
【図3B】
【図3C-1】
【図3C-2】
【図3C-3】
【図3D】
【図4A】
【図4B】
【図5A】
【図5B】
【図6】
【図7】
【国際調査報告】