▶ エンソル バイオサイエンス インコーポレイテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-05-09
(54)【発明の名称】新規ペプチドおよびその用途
(51)【国際特許分類】
C07K 7/06 20060101AFI20220426BHJP
A61K 38/08 20190101ALI20220426BHJP
A61P 1/18 20060101ALI20220426BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20220426BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20220426BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20220426BHJP
【ＦＩ】
C07K7/06 ZNA
A61K38/08
A61P1/18
A61P29/00
A61P43/00 111
A61P3/10
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021548177
(86)(22)【出願日】2020-03-05
(85)【翻訳文提出日】2021-08-17
(86)【国際出願番号】 KR2020003132
(87)【国際公開番号】W WO2020184901
(87)【国際公開日】2020-09-17
(31)【優先権主張番号】10-2019-0028654
(32)【優先日】2019-03-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】517255681
【氏名又は名称】エンソル バイオサイエンス インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100115200
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 修之
(72)【発明者】
【氏名】金 海 鎭
(72)【発明者】
【氏名】文 銀 貞
(72)【発明者】
【氏名】李 英 熏
【テーマコード（参考）】
4C084
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C084AA02
4C084AA07
4C084BA01
4C084BA08
4C084BA17
4C084BA23
4C084CA59
4C084NA14
4C084ZA661
4C084ZA662
4C084ZB111
4C084ZB112
4C084ZC351
4C084ZC352
4C084ZC411
4C084ZC412
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA15
4H045EA20
4H045FA34
4H045GA25
(57)【要約】
本発明は配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチド、または薬学的に許容可能なその塩と用途に関する。本発明によって膵島炎を効果的に治療または予防することができる。また、本発明によって第１型糖尿病を効果的に治療または予防することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチド、または薬学的に許容可能なその塩。
【請求項2】
請求項１に記載のペプチドまたは薬学的に許容可能なその塩を含む、膵島炎の治療または予防用薬学組成物。
【請求項3】
前記治療または予防はＩＦＮ－γ発現抑制、ＴＮＦ－α発現抑制、およびＴＧＦ－β１発現誘導の中から選ばれた一つ以上によるものである、請求項２に記載の薬学組成物。
【請求項4】
請求項１に記載のペプチドまたは薬学的に許容可能なその塩を含む第１型糖尿病の治療または予防用薬学組成物。
【請求項5】
前記第１型糖尿病は膵島炎によるものである、請求項４に記載の薬学組成物。
【請求項6】
前記治療または予防は前記膵島炎の生成抑制または減少から選ばれた一つ以上によるものである、請求項５に記載の薬学組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は新規ペプチドに関し、より詳細には新規ペプチドとその用途に関する。
【背景技術】
【0002】
膵臓のランゲルハンス島（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｉｓｌｅｔ）にリンパ性浸潤（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）が起きる現象を膵島炎（ｉｎｓｕｌｉｔｉｓ）という。膵島炎は窮極的にインシュリンを分泌するβ細胞（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃβ－ｃｅｌｌ）を破壊させて第１型糖尿病（Ｔｙｐｅ １ Ｄｉａｂｅｔｅｓ；Ｔ１Ｄ）を招き｛Lennon GP, Bettini M, Burton AR, Vincent E, Arnold PY, Santamaria P, Vignali DA. “T cell islet accumulation in type 1 diabetes is a tightly regulated, cell-autonomous event”. Immunity. 2009 Oct 16;31(4):643-53.など｝、膵島炎から膵臓を保護することによって第１型糖尿病が改善されることが報告されている｛Norman Ende, Ruifeng Chen, Alluru S. Reddi. “Effect of human umbilical cord blood cells on glycemia and insulitis in type 1 diabetic mice”. Biochemical and Biophysical Research Communications 325 (2004) 665-669.など｝。
【0003】
膵島炎の発生と抑制にはＩＦＮ－γ（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－ｇａｍｍａ、インターフェロン－ガンマ）、ＴＮＦ－α（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ－ａｌｐｈａ、腫瘍壊死因子－アルファ）、およびＴＧＦ－β１（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－ｂｅｔａ１，形質転換成長因子－ベータ１）のような多様なサイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）が関与すると知られている。ＩＦＮ－γによって膵島炎が発生すると知られており｛von Herrath MG, Oldstone MB. “Interferon-γ Is Essential for Destruction of β Cells and Development of Insulin-dependent Diabetes Mellitus”.J. Exp Med. 1997 Feb 3;185(3):531-9.など｝、ＴＮＦ－αによっても膵島炎が発生すると知られている｛Kyoungho Suk, Sunshin Kim, Yun-Hee Kim, Kyoung-Ah Kim, Inik Chang, Hideo Yagita, Minho Shong, Myung-Shik Lee. “IFN-γ/TNF-α Synergism as the Final Effector in Autoimmune Diabetes: A Key Role for STAT1/IFN Regulatory Factor-1 Pathway in Pancreatic β Cell Death”. J. Immunol April 1, 2001, 166 (7) 4481-4489.など｝。一方、ＴＧＦ－β１の発現増加によってはＮＯＤ（Ｎｏｎ－ｏｂｅｓｅ ｄｉａｂｅｔｉｃ）マウスを膵島炎から保護できると報告されている｛Piccirillo CA, Chang Y, Prud'homme GJ. “TGF-β1 Somatic Gene Therapy Prevents Autoimmune Disease in Nonobese Diabetic Mice” J. Immunol. 1998 Oct 15;161(8):3950-6.など｝。
【0004】
したがって、このような膵島炎に効果を示す物質の開発が必要である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0005】
（非特許文献１）Lennon GP, Bettini M, Burton AR, Vincent E, Arnold PY, Santamaria P, Vignali DA. T cell islet accumulation in type 1 diabetes is a tightly regulated, cell-autonomous event. Immunity. 2009 Oct 16;31(4):643-53.
（非特許文献２）Norman Ende, Ruifeng Chen, Alluru S. Reddi. “Effect of human umbilical cord blood cells on glycemia and insulitis in type 1 diabetic mice”. Biochemical and Biophysical Research Communications 325 (2004) 665-669.
（非特許文献３）von Herrath MG, Oldstone MB. “Interferon-γ Is Essential for Destruction of β Cells and Development of Insulin-dependent Diabetes Mellitus”. J. Exp Med. 1997 Feb 3;185(3):531-9.
（非特許文献４）Kyoungho Suk, Sunshin Kim, Yun-Hee Kim, Kyoung-Ah Kim, Inik Chang, Hideo Yagita, Minho Shong, Myung-Shik Lee. “IFN-γ/TNF-α Synergism as the Final Effector in Autoimmune Diabetes: A Key Role for STAT1/IFN Regulatory Factor-1 Pathway in Pancreatic β Cell Death”. J. Immunol April 1, 2001, 166 (7) 4481-4489.
（非特許文献５）Piccirillo CA, Chang Y, Prud'homme GJ. “TGF-β1 Somatic Gene Therapy Prevents Autoimmune Disease in Nonobese Diabetic Mice” J. Immunol. 1998 Oct 15;161(8):3950-6.
（非特許文献２）Norman Ende, Ruifeng Chen, Alluru S. Reddi. “Effect of human umbilical cord blood cells on glycemia and insulitis in type 1 diabetic mice”. Biochemical and Biophysical Research Communications 325 (2004) 665-669.
（非特許文献３）von Herrath MG, Oldstone MB. “Interferon-γ Is Essential for Destruction of β Cells and Development of Insulin-dependent Diabetes Mellitus”. J. Exp Med. 1997 Feb 3;185(3):531-9.
（非特許文献４）Kyoungho Suk, Sunshin Kim, Yun-Hee Kim, Kyoung-Ah Kim, Inik Chang, Hideo Yagita, Minho Shong, Myung-Shik Lee. “IFN-γ/TNF-α Synergism as the Final Effector in Autoimmune Diabetes: A Key Role for STAT1/IFN Regulatory Factor-1 Pathway in Pancreatic β Cell Death”. J. Immunol April 1, 2001, 166 (7) 4481-4489.
（非特許文献５）Piccirillo CA, Chang Y, Prud'homme GJ. “TGF-β1 Somatic Gene Therapy Prevents Autoimmune Disease in Nonobese Diabetic Mice” J. Immunol. 1998 Oct 15;161(8):3950-6.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明が解決しようとする一つの課題は、新規なペプチドを提供することにある。
【0007】
また、本発明が解決しようとする他の一つの課題は、本発明ペプチドの新規用途を提供することにある。
【0008】
本発明が解決しようとする課題は、以上で言及した課題に制限されず、言及されていないまた他の課題は以下の記載から当業者に明確に理解されることができる。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明は配列番号１のアミノ酸配列（ＹＧＡＧＡＧＡＧＹ）からなるペプチド、または薬学的に許容可能なその塩を提供する。
【0010】
前記アミノ酸配列のＹはチロシン（Ｔｙｒｏｓｉｎｅ；Ｔｙｒ）、Ｇはグリシン（Ｇｌｙｃｉｎｅ；Ｇｌｙ）、Ａはアラニン（Ａｌａｎｉｎｅ；Ａｌａ）を示す。
【0011】
前記ペプチドを構成するアミノ酸にはＬ－体、Ｄ－体、ＤＬ－体が存在し、本発明のペプチドを構成するアミノ酸はこれらをすべて含む。また、前記ＹはＴｙｒｏｓｉｎｅ、または４－ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅと称されるアミノ酸をすべて含む意味と解釈できるのは自明である。
【0012】
前記ペプチドは変異体を含むことにより、自然的変異または人工的変異によって主な活性に変化を与えることなく本発明のペプチド構造の一部が変異したものを含む。
【0013】
前記薬学的に許容可能な塩の例 は、塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、コハク酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、シュウ酸塩、メタンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩などを含み得る。
【0014】
本発明はまた、本発明のペプチドまたは薬学的に許容可能なその塩の用途、好ましくは膵島炎（ｉｎｓｕｌｉｔｉｓ）の治療または予防用途を提供する。治療は症状の改善、軽減などを包括する意味であり、予防は疾病以前の段階で疾病に発展することの抑制を包括する意味である。
【0015】
前記治療または予防はＩＦＮ－γ（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－ｇａｍｍａ、インターフェロン－ガンマ）発現抑制、ＴＮＦ－α（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ－ａｌｐｈａ、腫瘍壊死因子－アルファ）発現抑制、およびＴＧＦ－β１（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－ｂｅｔａ１，形質転換成長因子－ベータ１）発現誘導の中から選ばれた一つ以上によるものであり得る。
【0016】
前記ＩＦＮ－γ発現抑制はＩＦＮ－γｍＲＮＡ発現抑制であり得る。
【0017】
前記ＴＮＦ－α発現抑制はＴＮＦ－αｍＲＮＡ発現抑制であり得る。
【0018】
前記ＴＧＦ－β１発現誘導はＴＧＦ－β１ ｍＲＮＡ発現誘導であり得る。
【0019】
本発明はまた、本発明のペプチドまたは薬学的に許容可能なその塩の用途、好ましくは第１型糖尿病（Ｔｙｐｅ １ Ｄｉａｂｅｔｅｓ；Ｔ１Ｄ）の治療または予防用途を提供する。
【0020】
前記第１型糖尿病は膵島炎によるものであり得る。
【0021】
前記治療または予防は前記膵島炎の生成抑制または減少から選ばれた一つ以上によるものであり得る。
【0022】
前記治療または予防は血糖降下によるものであり得る。
【0023】
前記血糖降下は前記膵島炎の生成抑制または減少から選ばれた一つ以上によるものであり得る。
【0024】
また、本発明は本発明のペプチドまたは薬学的に許容可能なその塩を含む膵島炎の治療または予防用組成物を提供する。また、本発明は本発明のペプチドまたは薬学的に許容可能なその塩を含む第１型糖尿病の治療または予防用組成物を提供する。前記組成物は薬学組成物であり得る。
【0025】
前記組成物は本発明のペプチドまたは薬学的に許容可能なその塩を有効成分として含み得る。
【0026】
また、前記組成物は、薬剤学的に許容される添加剤をさらに含み、本発明のペプチドまたは薬学的に許容可能なその塩および前記添加剤からなる。
【0027】
本発明のペプチドはペプチド化学で通常使われる方法によって製造することができる。例えば、該当分野で広く知られた文献を参照して製造することができ、溶液相合成または固相合成などの方法によって製造することができる。
【0028】
ペプチド結合を形成するための方法の例は、アシルアジド法、アシルハライド法、アシルイミダゾール法、カルボジイミド法、ホスホニウム法、無水物法、混合無水物法、酸化－還元法、およびＷｏｏｄｗａｒｄ試薬Ｋを使用する方法などがある。
【0029】
縮合反応を行う前に、反応に関与しないカルボキシル基、アミノ基などを保護させることができ、縮合反応に関与するカルボキシル基などを当分野に公知された方法で活性化させることができる。
【0030】
カルボキシル基を保護する基の例は、メチル、tert－ブチル、アリール、ペンタフルオロフェニル、ベンジル、パラ－メトキシベンジル、およびメトキシエトキシメチルのようなエステル－形成基を含み得る。
【0031】
アミノ基を保護する基の例はトリチルカルボニル、アリールオキシカルボニル、シクロヘキシルオキシカルボニル、トリクロロエチルオキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、tert－ブトキシカルボニル、および／または９－フルオレニルメチルオキシカルボニルを含み得る。
【0032】
カルボキシル基の活性形態の例は混合無水物、アジド、アシルクロリドおよび活性エステル［アルコール（例えば、ペンタクロロフェノール、２，４－ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、ｐ－ニトロフェノール、Ｎ－ヒドロキシ－５－ノルボルネン－２，３－ジカルボキシイミド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ－ヒドロキシフタルアミド、または１－ヒドロキシベンゾトリアゾール）とのエステル］を含み得る。
【0033】
ペプチド結合を形成するための縮合反応に使用できる溶媒はベンゼン、トルエン、ヘキサン、アセトン、ニトロメタン、シクロヘキサン、エーテル、クロロホルム、ジクロロメタン、酢酸エチル、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ピリジン、ジオキサン、テトラヒドロフラン、水、メタノール、およびエタノールの単一溶媒またはこれらの混合溶媒を含み得る。
【0034】
反応温度は反応に一般的に使われる約－７０℃～１００℃の範囲であり得、より好ましくは－３０℃～３０℃の範囲であり得る。
【0035】
ペプチド保護基を除去する反応は保護基の種類によって異なるが、ペプチド結合に何ら影響を与えることなく保護基を離脱させることができる酸化合物、塩基化合物、または遷移金属などを用いて除去することができる。
【0036】
保護基を酸処理、例えば、塩化水素、臭化水素、フッ化水素、酢酸、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸、トリメチルクロロシラン、またはこれらの混合物で処理することによって除去させることができる。
【0037】
前記酸処理により保護基を除去する反応を行う場合、アニソール、フェノールまたはチオアニソールのような補助剤を添加して反応を促進させることができる。
【0038】
また、保護基を塩基処理、例えば、アンモニア、ジエチルアミン、ヒドラジン、モルホリン、Ｎ－メチルピロリジン、ピペリジン、炭酸ナトリウム、またはこれら塩基の混合物を用いて除去することができる。
【0039】
また、保護基を遷移金属処理、例えば、亜鉛、水銀、パラジウム／水素などを用いて除去することができる。
【0040】
反応完結後、通常のペプチド精製方法例えば、抽出、層分離、固体沈殿、再結晶またはカラムクロマトグラフィーによりペプチドを精製することができる。
【0041】
また、本発明のペプチドを通常の方法により変異体または薬学的に許容可能なその塩に転換させることができる。
【0042】
本発明によるペプチドは自動ペプチド合成機によって合成することができ、遺伝子操作技術によっても生産することができる。例えば、遺伝子操作により融合パートナーと本発明のペプチドからなる融合タンパク質をコーディングする融合遺伝子を製造し、それにより宿主微生物を形質転換させた後宿主微生物で融合タンパク質形態で発現させた後タンパク質分解酵素または化合物を用いて融合タンパク質から本発明のペプチドを切断、分離して所望するペプチドを生産することができる。
【0043】
前記ペプチド、または薬学的に許容可能なその塩の投与量は非経口投与時２４．３ｍｇ／日～４８６０ｍｇ／日であり、好ましくは４８．６ｍｇ／日～２４３０ｍｇ／日である。経口投与の場合、投与量は非経口投与量の５～１０倍である。１日１回または数回に分けて投与することも可能であり、このような投与量は成人（体重６０ｋｇ）基準であり得るが、体重、身体状態などによって変わるのは勿論である。本発明のペプチドまたは薬学的に許容可能なその塩を主に非経口的な方法で、例えば静脈注射または皮下注射、脊髄腔内投与、経皮投与、経鼻投与または直腸内投与により投与する。また、場合によって経口的に投与することができる。
【0044】
本発明のペプチドまたは薬学的に許容可能なその塩、または組成物は薬学的に許容される添加剤とともに製剤化して注射剤、坐剤、粉末、点鼻剤、顆粒、錠剤、経皮投与用パッチ剤の形態で作ることができる。
【0045】
薬学的に許容される添加剤は当業者に良く知られている様々な因子によって適用されるが、例えば用いられた特定の生理活性物質、その濃度、安定性および意図された生体利用性；治療しようとする疾患および疾病または状態；治療を受ける個体、年齢、大きさおよび一般的な状態；組成物を投与するために用いられる経路、例えば鼻腔、口腔、眼球、局所、経皮および筋肉などの要因を考慮しなければならないが、これに制限されない。一般的に経口投与経路以外の生理活性物質の投与に用いられる薬剤学的に利用可能な添加剤にはＤ５Ｗ（水中の５％ブドウ糖）、デキストロースおよび生理学的塩を容積の５％以内で含む水溶液を含み、病巣内局所注射の場合、治療効果を増進させ、かつ持続時間を増加させるために様々な注射可能なヒドロゲル（ｈｙｄｒｏｇｅｌ）を使用することができる。また、薬学的に利用可能な添加剤は保存剤および抗酸化剤のような活性成分の安定性を補強させる得る追加成分を含み得る。本発明のペプチドまたは薬学的に許容可能なその塩、または組成物は該当分野の適切な方法で製剤化することができ、製剤化に関して該当分野に広く知られた文献を参照し、各疾患によってまたは成分によって好ましく製剤化することができる。
【0046】
本発明のペプチドを生理食塩水溶液に保管することができ、マンニトールまたはソルビトールの添加後アンプル（ａｍｐｏｕｌｅ）に凍結乾燥させることができ、これを投与するために使用する際には生理食塩水に溶解させることができる。
【0047】
本発明はまた、本発明のペプチドまたは薬学的に許容可能なその塩を投与を必要とする人間を含む哺乳類に投与する段階を含む膵島炎の治療または予防法を提供する。また、本発明は本発明のペプチドまたは薬学的に許容可能なその塩を投与を必要とする人間を含む哺乳類に投与する段階を含む第１型糖尿病の治療または予防法を提供する。また、本発明は本発明のペプチドまたは薬学的に許容可能なその塩の膵島炎の治療または予防用製剤製造のための用途を提供する。また、本発明は本発明のペプチドまたは薬学的に許容可能なその塩の第１型糖尿病の治療または予防用製剤製造のための用途を提供する。前記投与されるペプチドまたは薬学的に許容可能なその塩は有効量のペプチドまたは薬学的に許容可能なその塩であり得る。
【0048】
別途の言及がない限り、本発明のペプチドまたは薬学的に許容可能な塩、用途、組成物、方法で言及された内容は互いに矛盾しない限り、同一性の範囲で互いに同一に適用される。
【発明の効果】
【0049】
本発明によって膵島炎を効果的に治療または予防することができる。また、本発明によって第１型糖尿病を効果的に治療または予防することができる。
【図面の簡単な説明】
【0050】
【図1】実施例１のペプチドが膵島炎の生成抑制または減少に及ぼす影響を分析した結果を示すグラフである。
【図2】実施例１のペプチドが血糖降下に及ぼす影響を分析した結果を示すグラフである。
【図3】実施例１のペプチドがＩＦＮ－γ発現抑制、およびＴＮＦ－α発現抑制に及ぼす影響を分析した結果を示すグラフである。
【図4】実施例１のペプチドがＴＧＦ－β１発現誘導に及ぼす影響を分析した結果を示すグラフである。
【図5】比較例１および比較例２のペプチドがＩＦＮ－γ発現抑制、およびＴＮＦ－α発現抑制に及ぼす影響を分析した結果を示すグラフである。
【図6】比較例１および比較例２のペプチドがＴＧＦ－β１発現誘導に及ぼす影響を分析した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0051】
以下、実施例、比較例、および製造例によって本発明をより詳細に説明するが、下記実施例および製造例は本発明を例示するためのものであり、本発明の内容は下記実施例や製造例によって限定されるものではない。
【0052】
以下、実施例などで使用した試薬は、市販されている最上品を使用し、別途の言及がない限り、Ｓｉｇｍａ－ａｌｄｒｉｃｈ社から購入したものを使用した。
【0053】
＜実施例１＞ペプチドの製造
下記の表１に記載されたペプチドはソリッドフェーズペプチド合成法を用いて製造した。具体的にはＦｍｏｃ（９－ｆｌｕｏｒｅｎｙｌ－ｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）化学的性質を用いたソリッドフェーズ法（ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ｍｅｔｈｏｄ）を用いて合成した。
下記の表１に記載されたペプチドはソリッドフェーズペプチド合成法を用いて製造した。具体的にはＦｍｏｃ（９－ｆｌｕｏｒｅｎｙｌ－ｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）化学的性質を用いたソリッドフェーズ法（ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ｍｅｔｈｏｄ）を用いて合成した。
【0054】
より具体的に、よく乾燥された反応器に固相樹脂（Ｗａｎｇ ｒｅｓｉｎ；Ｓｉｇｍａ－ａｌｄｒｉｃｈ社）０．５５ｍｍｏｌ／ｇ、ジメチルホルムアミド（ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ，ＤＭＦ）５ｍｌ、Ｆｍｏｃ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ １．１ｍｍｏｌ、およびＯ－Ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ－ｕｒｏｎｉｕｍ－ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏ－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＨＢＴＵ）０．５５ｍｍｏｌを投入して室温で２時間の間攪拌してＦｍｏｃ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－レジンを合成し、合成したレジンを濾過した後、ジメチルホルムアミドで洗浄した。洗浄したレジンに２０％ピペリジン（ジメチルホルムアミド溶解）溶液８ｍｌを投入して室温で３０分間攪拌してＦｍｏｃ（ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ ｇｒｏｕｐ）がＤｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎされたＴｙｒ（ｔＢｕ）－レジンを合成した。合成したＴｙｒ（ｔＢｕ）－レジンを濾過してジメチルホルムアミドで洗浄した。
【0055】
洗浄したＴｙｒ（ｔＢｕ）－レジンにジメチルホルムアミド５ｍｌ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ １．１ｍｍｏｌ、およびＯ－Ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ－ｕｒｏｎｉｕｍ－ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏ－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＨＢＴＵ）０．５５ｍｍｏｌを投入して室温で２時間の間攪拌してＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－レジンを合成し、合成したレジンを濾過した後、ジメチルホルムアミドで洗浄した。洗浄したレジンに２０％ピペリジン（ジメチルホルムアミド溶解）溶液８ｍｌを投入して室温で３０分間攪拌してＦｍｏｃがＤｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎされたＧｌｙ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－レジンを合成した。合成したＧｌｙ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－レジンを濾過してジメチルホルムアミドで洗浄した。このような過程を経てグリシンとチロシンの間のペプチド結合を形成した。
【0056】
その後、Ｆｍｏｃ－Ａｌａ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｌａ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｌａ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－ＯＨを順に使用、グリシンとチロシンの間のペプチド結合形成過程と同じ過程を繰り返し、表１に記載されたアミノ酸配列を有するペプチド－レジン化合物を製造した。
【0057】
その後、トリフルオロ酢酸（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）と水を９５：５（ｖ／ｖ）の比率で混合した溶液１０ｍｌを入れて室温で３時間の間攪拌した後濾過して得られた濾過液にジエチルエーテル（ｄｉｅｔｈｙｌｅｔｈｅｒ）を投入して固体を結晶化させた。生成された固体を濾過してジエチルエーテルで洗浄して乾燥して表１に記載されたアミノ酸配列を有する粗（ｃｒｕｄｅ）ペプチド化合物を合成した。
【0058】
粗（ｃｒｕｄｅ）ペプチド化合物はＳｈｉｍａｄｚｕ ５ｍｍ Ｓｈｉｍｐａｋ ＯＤＳ Ｃ１８ ｃｏｌｕｍｎ（２０ｘ２５０ｍｍ）を用いて逆相高速液体クロマトグラフィー（ｒｅｖｅｒｓｅ－ｐｈａｓｅ ＨＰＬＣ；ＲＰ－ＨＰＬＣ）方法で精製、凍結乾燥して実施例１のペプチドを白色固体形態で収得した。
【0059】
精製されたペプチドはＳｈｉｍｐａｋ ５ｍｍ ＯＤＳ Ｃ１８ｃｏｌｕｍｎ（４．６ｘ２５０ｍｍ）を用いて分析用逆相高速液体クロマトグラフィー（ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ＲＰ－ＨＰＬＣ）方法で確認し、分子量はマトリックス－補助レーザー脱離イオン化マススペクトロメーター｛ｍａｔｒｉｘ－ａｓｓｉｓｔｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ （ＭＡＬＤＩ）－ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ｝（Ａｘｉｍａ ＣＦＲ，Ｋｒａｔｏｓ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ，Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ，ＵＫ）を用いて確認した。
表１においてＹはチロシン（Ｔｙｒｏｓｉｎｅ；Ｔｙｒ）、Ｇはグリシン（Ｇｌｙｃｉｎｅ；Ｇｌｙ）、Ａはアラニン（Ａｌａｎｉｎｅ；Ａｌａ）を示す。
【表1】
【0060】
＜実施例２＞ペプチド効果の確認
２－１．膵島炎の生成抑制または減少効果の確認
実施例１のペプチドが膵島炎（ｉｎｓｕｌｉｔｉｓ）生成を抑制または減少させることを実験により確認した。
２－１．膵島炎の生成抑制または減少効果の確認
実施例１のペプチドが膵島炎（ｉｎｓｕｌｉｔｉｓ）生成を抑制または減少させることを実験により確認した。
【0061】
実験動物は８週齢の雌ＮＯＤ／ＳｈｉＬｔＪ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂ）を使用した。ＮＯＤ（Ｎｏｎ－ｏｂｅｓｅ ｄｉａｂｅｔｉｃ）マウスは膵島炎および第１型糖尿病発生動物モデルであり、平均的に１８週齢になると第１型糖尿病が発病し、３０週齢まで９０％が発病すると知られている。Ｏｓｏｎｇ先端医療産業振興財団動物実験倫理委員会（Ｋｂｉｏ－ＩＡＣＵＣ ２０１８－０６６）の承認後、すべての動物はＳＰＦバリア（ｂａｒｒｉｅｒ）条件で飼育した。一週間の順化期間を設け、明暗周期は１２時間（０８：００消灯－２０：００点灯）とした。温度は２０±２℃、相対湿度は６０～８０％であり、腸内微生物の発生によって糖尿発病が阻害され得るため、水はＨＣｌを用いてｐＨ２．８～３．２に調整して実験動物に供給した。
【0062】
準備した実験動物の尾の端部分に一週間に一回ずつ傷をつけて血を一滴取り出して血糖測定器（Ｒｏｃｈｅ，Ａｃｃｕ－ＣＨＥＫ Ｐｅｒｆｏｒｍａ）を用いて血糖を測定した。測定された血糖数値が２５０ｍｇ／ｄＬ以上で、それから３日目に再測定した血糖数値も２５０ｍｇ／ｄＬ以上の場合は第１型糖尿病が発病したと見て実験を行った。
【0063】
第１型糖尿病が発病した実験動物二匹を実施例１の処理群として選抜し、実施例１のペプチド（５ｍｇ／ｋｇ）を皮下（Ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ；Ｓ．Ｃ）に１００μｌずつ投与を始めた。投与は１４日間毎朝、夕方に投与して血糖測定器で血糖を測定し、血糖が２５０ｍｇ／ｄＬ以下に減少すると投与を中断した。また、第１型糖尿病が発病した実験動物二匹を陰性対照群として選抜し、実施例１のペプチドの代わりにＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ，Ｗｅｌｇｅｎｅ）を投与したことを除いては実施例１の処理群と同一に処理した。１４日目の日、血糖数値が２５０ｍｇ／ｄＬ未満の実験動物一匹を正常群として選抜し、第１型糖尿病が発病した実験動物と第１型糖尿病が発病しなかった実験動物のＩｎｓｕｌｉｔｉｓ Ｓｃｏｒｅを比較するために使用した。
【0064】
１４日目の日に血糖測定後、実験動物から膵臓を摘出して１０％ Ｎａｔｕｒａｌ ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｆｏｒｍａｌｉｎ（１０％ ＮＢＦ，ｓｉｇｍａ，ＨＴ５０１１）に入れて固定させた後Ｐａｒａｆｆｉｎ ｂｌｏｃｋを製作した。固定させた膵臓組織をｓｌｉcｅ製作してヘマトキシリン＆エオシン（Ｈ＆Ｅ、ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ ａｎｄ ｅｏｓｉｎ）染色して光学顕微鏡で観察して膵島炎の生成を確認した。膵島炎の程度によって４段階に分け、０段階は膵島炎が観察されない段階、１段階はランゲルハンス島の周囲に膵島炎が観察される段階、２段階は７５％未満の膵島炎が観察される段階、３段階は７５％以上の膵島炎が観察される段階に設定した。実施例１の処理群は二匹のｉｓｌｅｔ個数を測定し、それぞれのｉｓｌｅｔを膵島炎段階によって分類してＩｎｓｕｌｉｔｉｓ Ｓｃｏｒｅを算定した後、ｉｓｌｅｔの総個数のうちそれぞれの膵島炎段階に該当するｉｓｌｅｔ数を百分率で示した。陰性対照群および正常群も実施例１の処理群と同様の方法によりＩｎｓｕｌｉｔｉｓ Ｓｃｏｒｅを算定した後、ｉｓｌｅｔの総個数のうちそれぞれの膵島炎段階に該当するｉｓｌｅｔ数を百分率で示した。その結果を図１に示した。
【0065】
図１は実施例１のペプチドが膵島炎の生成抑制または減少に及ぼす影響を分析した結果を示すグラフである。図１のｘ軸はそれぞれの群を表し、ｙ軸はＩｎｓｕｌｉｔｉｓ Ｓｃｏｒｅ｛Ｉｎｓｕｌｉｔｉｓ（％ｏｆ ｉｓｌｅｔｓ）｝を表す。図１で、Ｓｃｏｒｅ ０は０段階、Ｓｃｏｒｅ １は１段階、Ｓｃｏｒｅ ２は２段階、Ｓｃｏｒｅ ３は３段階を意味する。
【0066】
図１から分かるように、実施例１の処理群は陰性対照群に比べて最も深刻な段階である３段階の比率が減少し、インシュリン分泌が可能な０～２段階の比率は増加した。特に、実施例１の処理群は陰性対照群に比べて膵島炎が起きない０段階の比率が約２倍増加したことを確認することができる。このような結果から、実施例１のペプチドが膵島炎の生成を抑制して膵島炎を減少させて膵島炎の治療に効果があることがわかる。また、実施例１の処理群は正常群に比べても０段階の比率がさらに高い。したがって、実施例１のペプチドが膵島炎の発生を抑制することが分かるので、実施例１のペプチドが膵島炎の治療だけでなく予防にも効果があることがわかる。
【0067】
結果的に 、本発明のペプチドは膵島炎の治療および／または予防の効果があることがわかる。
【0068】
２－２．血糖降下効果の確認
実施例１のペプチドが第１型糖尿病（Ｔｙｐｅ １ Ｄｉａｂｅｔｅｓ；Ｔ１Ｄ）に効果があることを確認するために、実施例１のペプチドが第１型糖尿病が発病した実験動物で血糖降下効果を示すことを実験により確認した。
実施例１のペプチドが第１型糖尿病（Ｔｙｐｅ １ Ｄｉａｂｅｔｅｓ；Ｔ１Ｄ）に効果があることを確認するために、実施例１のペプチドが第１型糖尿病が発病した実験動物で血糖降下効果を示すことを実験により確認した。
【0069】
具体的には、２－１．の実験動物のうち実施例１の処理群および陰性対照群に対する血糖数値を分析し、実施例１のペプチドの血糖降下効果を確認した。その結果を図２に示した。
【0070】
図２は実施例１のペプチドが血糖降下に及ぼす影響を分析した結果を示すグラフである。ｘ軸は投与後の日数｛（Ｔｉｍｅ ａｆｔｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ（ｄ）｝を表し、ｙ軸は血糖｛Ｂｌｏｏｄ Ｇｌｕｃｏｓｅ（ｍｇ／ｄＬ）｝を表す。
【0071】
図２から分かるように、実施例１の処理群の二匹（実施例１－１および実施例１－２）は血糖が大幅に減少した後正常血糖を維持するが、陰性対照群の二匹（陰性対照群－１および陰性対照群－２）は血糖が持続的に増加することがわかる。
【0072】
このような結果から、本発明のペプチドが血糖降下に効果があることを確認することができる。本発明のペプチドが第１型糖尿病が発病したマウスの血糖を降下させて正常血糖を維持させる効果を奏するので、本発明のペプチドが血糖降下によって第１型糖尿病の治療または予防が可能であると見られる。また、先立って確認した通り本発明のペプチドが膵島炎の生成を抑制して減少させるので、そのような作用によって第１型糖尿病の治療および／または予防効果を奏することができ、血糖降下効果を奏すると見ることができる。
【0073】
結果的に、本発明のペプチドによって第１型糖尿病の治療および／または予防が可能であることがわかる。
【0074】
２－３．ＩＦＮ－γ発現抑制、ＴＮＦ－α発現抑制、およびＴＧＦ－β１発現誘導効果の確認
実施例１のペプチドが膵島炎と関連するサイトカイン｛ＩＦＮ－γ（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－ｇａｍｍａ、インターフェロン－ガンマ）、ＴＮＦ－α（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ－ａｌｐｈａ、腫瘍壊死因子－アルファ）、およびＴＧＦ－β１（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－ｂｅｔａ１，形質転換成長因子－ベータ１）｝に及ぼす影響を確認した。ＩＦＮ－γ、およびＴＮＦ－αの発現によって膵島炎が発生すると知られており、ＴＧＦ－β１の発現増加が膵島炎から膵臓を保護する効果があることが知られている。したがって、実施例１のペプチドがＩＦＮ－γおよびＴＮＦ－αの発現を抑制するかどうかを確認し、ＴＧＦ－β１の発現を誘導するかどうかを確認することによって膵島炎に効果を奏するかどうかを調べた。
実施例１のペプチドが膵島炎と関連するサイトカイン｛ＩＦＮ－γ（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－ｇａｍｍａ、インターフェロン－ガンマ）、ＴＮＦ－α（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ－ａｌｐｈａ、腫瘍壊死因子－アルファ）、およびＴＧＦ－β１（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－ｂｅｔａ１，形質転換成長因子－ベータ１）｝に及ぼす影響を確認した。ＩＦＮ－γ、およびＴＮＦ－αの発現によって膵島炎が発生すると知られており、ＴＧＦ－β１の発現増加が膵島炎から膵臓を保護する効果があることが知られている。したがって、実施例１のペプチドがＩＦＮ－γおよびＴＮＦ－αの発現を抑制するかどうかを確認し、ＴＧＦ－β１の発現を誘導するかどうかを確認することによって膵島炎に効果を奏するかどうかを調べた。
【0075】
実施例２－１．と同様の方法により準備した実験動物の尾の端部分に一週間に一回ずつ傷をつけて血を一滴取り出し、血糖測定器（Ｒｏｃｈｅ，Ａｃｃｕ－ＣＨＥＫ Ｐｅｒｆｏｒｍａ）を用いて血糖を測定した。血糖が「ｈｉｇｈ」（６００ｍｇ／ｄＬ以上）であることを確認し、マウスを頸椎脱臼させた後脾臓（ｓｐｌｅｅｎ）を摘出した。５０ｍｌチューブ上にｃｅｌｌ ｓｔｒａｉｎｅｒ（ＢＤ、３５２３５０）を載せ、摘出した脾臓組織をｃｅｌｌ ｓｔｒａｉｎｅｒに入れて注射器の後部分を用いて透過させた後透過した細胞があるチューブにＨＢＳＳ（Ｈａｎｋｓ’ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を添加して細胞を水洗して遠心分離（１，０００ｒｐｍ、５分）して上層液を除去した。１ｍｌ ＨＢＳＳを入れて細胞を懸濁して１Ｘ ＲＢＣ ｌｙｓｉｓバッファ（Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、００－４３３３－５７）を１０ｍｌ入れて弱く振り混ぜた後氷中に５分間置いた後遠心分離（１，０００ｒｐｍ、５分）し上層液を除去して１０ｍｌ ＲＢＣ ｌｙｓｉｓバッファをもう一度入れて氷で５分間置いた後もう一度遠心分離（１，０００ｒｐｍ、５分）して上層液を除去した後１０ｍｌ ＨＢＳＳで二回細胞を水洗した。最後の遠心分離（１，０００ｒｐｍ、５分）後１ｍｌ ＨＢＳＳを入れて細胞を懸濁して５０μｌの細胞をｔｒｙｐａｎ ｂｌｕｅ溶液と１：１倍率で希釈してヘモサイトメーター（Ｈｅｍｏｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）を用いて細胞個数を確認した。分離した脾臓細胞（ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅｓ）を６－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに一ウェル（ｗｅｌｌ）当たり１ｘ１０７個ずつ１０％ ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ，Ｃｏｒｎｉｎｇ、３５－０１５－ＣＶ）が含有されたＲＰＭＩ－１６４０（Ｗｅｌｇｅｎｅ，ＬＭ０１１－０１）培地２ｍｌを用いて入れ、Ｔ細胞の活性を誘導するための２ｎｇ／ｍｌ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＣＤ２８（Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、１６－０２８１－８２）を添加した。同時に実施例１のペプチド１００μＭを処理するが、ＩＦＮ－γとＴＮＦ－αの発現変化を確認するためには３時間、ＴＧＦ－β１の発現変化を確認するためには７２時間の間３７℃、５％ ＣＯ２のインキュベーターで処理した。
【0076】
処理後細胞遠心分離（１，０００ｒｐｍ、５分）して上層液を除去し、５ｍｌ ＴRIｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１５５９６－０１８）を入れてピペットして細胞を溶解した後５分間常温に置いた。１００μｌ ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍを添加して激しく混ぜた後常温で２分間置いた。その後、遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、１５分）を行い最も上に位置した上層液のみを注意深く新しい１．５ｍｌ ｅ－ｔｕｂｅに移した後３００μｌ ｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌを添加して弱く振り混ぜた後常温に１０分間置いた。遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、１５分）して上層液を除去し、ＤＥＰＣ（Ｄｉｅｔｈｙｌ ｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ）を処理した水（ＬＰＳ ｓｏｌｕｔｉｏｎ，ＣＢＷ００４）に希釈した７０％エタノールを５００μｌ入れて水洗した後、遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、１０分）して上層液を除去して蓋を開けて残っているエタノールを蒸発させた。３０μｌのＤＥＰＣを処理した水を入れてＲＮＡを溶出してＲＮＡ定量を実施した。
【0077】
定量した１ｍｇのＲＮＡを用いてｃＤＮＡ合成キット（ＥＬＰＩＳｂｉｏ，ＥＢＴ－１５１２）の実験方法によりｃＤＮＡを合成した後ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）キット（ＳｏｌＧｅｎｔ、ＳＥＦ０１－Ｍ５０Ｈ）内の方法により、サイトカイン発現変化差の定量的判断のためのハウスキーピング遺伝子（ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ ｇｅｎｅ）ＧＡＰＤＨと各サイトカイン（ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＴＧＦ－β１）のｃＤＮＡを増幅させた。その後２％アガロースゲルにＰＣＲ産物を電気泳動してＤＮＡバンドを確認してイメージＪ（Ｉｍａｇｅ Ｊ）プログラムを用いて定量し、定量値をＧＡＰＤＨに対する比で計算した。対照群は実施例１のペプチドとａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＣＤ２８の代わりにＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ，Ｗｅｌｇｅｎｅ）を処理したことを除いては実施例１の処理群と同一に処理し、陰性対照群は実施例１のペプチドの代わりにＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ，Ｗｅｌｇｅｎｅ）を処理したことを除いては実施例１の処理群と同一に処理した。その結果を図３および図４に示した。各サイトカインのＰＣＲをするためのｐｒｉｍｅｒ配列は表２に表記した。
表２においてｔはチミン（Ｔｈｙｍｉｎｅ）、ａはアデニン（Ａｄｅｎｉｎｅ）、ｃはシトシン（Ｃｙｔｏｓｉｎｅ）、ｇはグアニン（Ｇｕａｎｉｎｅ）を示す。
【表2】
【0078】
図３は実施例１のペプチドがＩＦＮ－γ発現抑制、およびＴＮＦ－α発現抑制に及ぼす影響を分析した結果を示すグラフであり、図４は実施例１のペプチドがＴＧＦ－β１発現誘導に及ぼす影響を分析した結果を示すグラフである。図３および図４のｘ軸はそれぞれ対照群｛（－）｝、陰性対照群（ａｎｔｉ－ＣＤ２８）、実施例１の処理群（ａｎｔｉ－ＣＤ２８＋実施例１）を示し、図３および図４のｙ軸はｍＲＮＡ発現量をＧＡＰＤＨに対する比｛ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ／ＧＡＰＤＨ（％）｝で示した。
【0079】
図３から分かるように、膵島炎を発生させると知られているＩＦＮ－γとＴＮＦ－αの発現量を確認した結果、それぞれの発現量が陰性対照群に比べて減少したことを確認することができる。したがって、実施例１のペプチドがＩＦＮ－γとＴＮＦ－αの発現を抑制することが分かり、これにより膵島炎が発生することを抑制することができ、膵島炎の治療および／または予防効果を奏することがわかる。
【0080】
図４から分かるように、膵島炎からの膵臓保護に影響を及ぼすと知られているＴＧＦ－β１の発現量を確認した結果、発現量が陰性対照群に比べて増加した。したがって、実施例１のペプチドがＴＧＦ－β１の発現を誘導することが分かり、これにより膵臓を膵島炎から保護することができ、膵島炎の治療および／または予防効果を奏することがわかる。
【0081】
したがって、実施例１のペプチドはＩＦＮ－γ発現抑制、ＴＮＦ－α発現抑制、および／またはＴＧＦ－β１発現誘導によって膵島炎の治療および／または予防効果を奏することがわかる。
【0082】
結局、本発明のペプチドまたは薬学的に許容可能なその塩はＩＦＮ－γ発現抑制、ＴＮＦ－α発現抑制、および／またはＴＧＦ－β１発現誘導によって膵島炎の治療および／または予防効果を奏することがわかる。その結果、本発明のペプチドまたは薬学的に許容可能なその塩は第１型糖尿病の治療および／または予防が可能であることがわかる。
【0083】
＜比較例１および比較例２＞ペプチドの製造
実施例１のペプチドが一部分によっても活性を示すかどうかを調べるために、実施例１のペプチドのアミノ酸配列の一部に該当するアミノ酸配列を有する比較例１のペプチド、および比較例２のペプチドを準備した。比較例１のペプチド、および比較例２のペプチドはそれぞれ実施例１のペプチドのアミノ酸配列（ＹＧＡＧＡＧＡＧＹ）のうちＣ－末端から順に６個のアミノ酸からなるペプチド（ＧＡＧＡＧＹ）、およびＮ－末端から順に６個のアミノ酸からなるペプチド（ＹＧＡＧＡＧ）である。比較例１のペプチド、および比較例２のペプチドは表３に記載されたアミノ酸配列に基づいて、実施例１のペプチドと同様の方法により製造した。
表３においてＹはチロシン（Ｔｙｒｏｓｉｎｅ；Ｔｙｒ）、Ｇはグリシン（Ｇｌｙｃｉｎｅ；Ｇｌｙ）、Ａはアラニン（Ａｌａｎｉｎｅ；Ａｌａ）を示す。
実施例１のペプチドが一部分によっても活性を示すかどうかを調べるために、実施例１のペプチドのアミノ酸配列の一部に該当するアミノ酸配列を有する比較例１のペプチド、および比較例２のペプチドを準備した。比較例１のペプチド、および比較例２のペプチドはそれぞれ実施例１のペプチドのアミノ酸配列（ＹＧＡＧＡＧＡＧＹ）のうちＣ－末端から順に６個のアミノ酸からなるペプチド（ＧＡＧＡＧＹ）、およびＮ－末端から順に６個のアミノ酸からなるペプチド（ＹＧＡＧＡＧ）である。比較例１のペプチド、および比較例２のペプチドは表３に記載されたアミノ酸配列に基づいて、実施例１のペプチドと同様の方法により製造した。
【表3】
【0084】
＜比較実験＞比較例１および比較例２のペプチド効果の確認
以下では、比較例１および比較例２のペプチドが実施例１のペプチドのようにＩＦＮ－γ発現抑制、ＴＮＦ－α発現抑制、およびＴＧＦ－β１発現誘導効果を奏するかどうかを調べるための実験を実施した。
以下では、比較例１および比較例２のペプチドが実施例１のペプチドのようにＩＦＮ－γ発現抑制、ＴＮＦ－α発現抑制、およびＴＧＦ－β１発現誘導効果を奏するかどうかを調べるための実験を実施した。
【0085】
【0086】
図５は比較例１および比較例２のペプチドがＩＦＮ－γ発現抑制、およびＴＮＦ－α発現抑制に及ぼす影響を分析した結果を示すグラフであり、図６は比較例１および比較例２のペプチドがＴＧＦ－β１発現誘導に及ぼす影響を分析した結果を示すグラフである。図５および図６のｘ軸はそれぞれ対照群｛（－）｝、陰性対照群（ａｎｔｉ－ＣＤ２８）、比較例１の処理群（ａｎｔｉ－ＣＤ２８＋比較例１）、比較例２の処理群（ａｎｔｉ－ＣＤ２８＋比較例２）を示し、図５および図６のｙ軸はｍＲＮＡ発現量をＧＡＰＤＨに対する比｛ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ／ＧＡＰＤＨ（％）｝で示した。
【0087】
図５から分かるように、膵島炎を発生させると知られているＩＦＮ－γとＴＮＦ－αの発現量を確認した結果、比較例１の処理群および比較例２の処理群は陰性対照群に比べてそれぞれの発現量の大きな変化はなく、比較例２の処理群はＴＮＦ－αの発現量がかえって増加したことを確認することができる。また、図６から分かるように、膵島炎からの膵臓保護に影響を及ぼすと知られているＴＧＦ－β１の発現量を確認した結果、比較例１の処理群および比較例２の処理群は陰性対照群に比べて発現量の大きな変化はないことを確認することができる。このような結果から、比較例１と比較例２のペプチドは実施例１のペプチドとは異なりＩＦＮ－γ発現抑制、ＴＮＦ－α発現抑制、およびＴＧＦ－β１発現誘導効果を奏することができないことがわかる。
【0088】
以上の結果から、実施例１のペプチドは一部でない全体でＩＦＮ－γ発現抑制、ＴＮＦ－α発現抑制、およびＴＧＦ－β１発現誘導効果を奏し、膵島炎ないし第１型糖尿病に効果を奏することがわかる。
【0089】
＜製造例１＞注射液剤の製造
実施例１と同様の方法で製造したペプチド１０ｍｇをＰＢＳに溶解させて溶液１ｍｌを作る。作られた溶液は注射剤用アンプルに充填して注射液剤を製造する。
実施例１と同様の方法で製造したペプチド１０ｍｇをＰＢＳに溶解させて溶液１ｍｌを作る。作られた溶液は注射剤用アンプルに充填して注射液剤を製造する。
【産業上の利用可能性】
【0090】
本発明によって膵島炎を効果的に治療または予防することができる。また、本発明によって第１型糖尿病を効果的に治療または予防することができる。したがって、本発明は産業上の利用可能性を有する。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【国際調査報告】