特表 2022-524714 マイクロフルイディック押出

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-05-10

(54)【発明の名称】マイクロフルイディック押出

(51)【国際特許分類】

   A61L 27/24 20060101AFI20220427BHJP

   A61L 17/08 20060101ALI20220427BHJP

   A61L 27/58 20060101ALI20220427BHJP

   D01F 4/00 20060101ALI20220427BHJP

【ＦＩ】

A61L27/24

A61L17/08

A61L27/58

D01F4/00 A

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021544740

(86)(22)【出願日】2020-01-31

(85)【翻訳文提出日】2021-09-29

(86)【国際出願番号】 US2020016244

(87)【国際公開番号】W WO2020160491

(87)【国際公開日】2020-08-06

(31)【優先権主張番号】62/800,317

(32)【優先日】2019-02-01

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】521338503

【氏名又は名称】エンボディ，インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110002310

【氏名又は名称】特許業務法人あい特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】フランシス，マイケル，ピー．

(72)【発明者】

【氏名】セイヤー，ニコラス

(72)【発明者】

【氏名】ペトロワ，ステラ

【テーマコード（参考）】

4C081

4L035

【Ｆターム（参考）】

4C081AA14

4C081AB11

4C081AC02

4C081BA12

4C081BA13

4C081BA16

4C081BB07

4C081BB08

4C081CD121

4C081CD131

4C081CD141

4C081DA04

4C081DB01

4C081EA01

4L035AA04

4L035BB03

4L035EE05

(57)【要約】

コラーゲンを含む生体高分子繊維。この生体高分子繊維は、人の天然の腱および靭帯に匹敵する優れた極限引張強さ、弾性率および破断伸びを有する。この繊維は、実質的に円形、卵形、正方形、長方形、リボン状、三角形または不規則な形状であってもよい。この繊維は規則正しい縦配向構造を示し、この繊維は、細胞増殖の浸潤を可能にする。この繊維を含む移植可能な生体高分子足場および縫合糸だけでなく、この生体高分子繊維を製造するためのマイクロフルイディックおよび押出方法も提供される。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

コラーゲンを含む生体高分子繊維であって、以下の特徴
約１ＭＰａ～約１，７００ＭＰａの極限引張強さ、
約１０ＭＰａ～約２０，０００ＭＰａの弾性率、
伸び率約２パーセント～約４５パーセントの破断伸び、
約１０μｍ～約９０μｍの平均繊維径
の１つ以上を有し、
室温で少なくとも約１時間ＤＰＢＳに浸漬後、その強度を維持し、
規則正しい縦配向構造を示す、繊維。

【請求項2】

前記極限引張強さが約１ＭＰａ～約８００ＭＰａであり、
前記弾性率が約１０ＭＰａ～約７，５００ＭＰａであり、
前記平均繊維径が約１０μｍ～約３０μｍである、
請求項１に記載の生体高分子繊維。

【請求項3】

前記極限引張強さが約２５ＭＰａ～約１，７００ＭＰａであり、
前記弾性率が約１５，０００ＭＰａ～約２９，０００ＭＰａであり、
伸び率約７パーセント～約２０パーセントの破断伸びである、
請求項１に記載の生体高分子繊維。

【請求項4】

前記コラーゲンが、臨床用コラーゲン、アテロコラーゲン、テロコラーゲン、組換えコラーゲンまたはそれらのブレンドを含む、請求項１に記載の生体高分子繊維。

【請求項5】

前記コラーゲンが、１以上の生体許容性ポリマーをさらに含む、請求項１に記載の生体高分子繊維。

【請求項6】

室温、ＤＢＰＳ中での６ヶ月後に、または対象者への移植後に約６０ＭＰａ超の強度をさらに保持する、請求項１に記載の生体高分子繊維。

【請求項7】

グリオキサール、ＤＬ‐グリセルアルデヒドまたはそれらの組み合わせを含む架橋剤によって架橋される、請求項１に記載の生体高分子繊維。

【請求項8】

付着した腱細胞をさらに含み、前記腱細胞が、従来の哺乳動物細胞培養条件の温度、ｐＨおよび湿度での約７日間のインキュベーション後に少なくとも約７５％の細胞生存能力と少なくとも約９５％の細胞生存とを維持する、請求項１に記載の生体高分子繊維。

【請求項9】

実質的に円形、卵形、正方形、長方形、リボン状、三角形または不規則な形状の断面を有する、請求項１に記載の生体高分子繊維。

【請求項10】

２本～約１０，０００本の繊維からなる、請求項１に記載の生体高分子繊維の束。

【請求項11】

請求項１～９のいずれか１項に記載の生体高分子繊維または請求項１０に記載の生体高分子繊維の束を含む、軟部組織損傷の修復を支援するための移植可能な生体高分子足場。

【請求項12】

請求項１～９のいずれか１項に記載の生体高分子繊維を含む、織シート状支持体、パッチまたは装具。

【請求項13】

コラーゲンを酸溶液に溶解してコラーゲン溶液を作成するステップと、
第１直径を有する第１針を通して第１速度で前記コラーゲン溶液を送ると同時に、前記第１針を同軸に取り囲み、前記第１直径を超える第２直径を有し前記コラーゲン溶液の周囲のシースを形成する第２針を通して第２速度で形成緩衝液を送って同軸流を形成するステップであって、
前記第２針を通した前記基礎緩衝液の前記第２流量は、前記第１針を通した前記コラーゲン溶液の前記第１流量の少なくとも２倍である、ステップと、
繊維を形成するのに十分な時間と速度で、フィブリル形成浴を含む反応領域を通して前記同軸に流れるコラーゲンおよび形成緩衝液を送るステップと、
ある押出速度で前記コラーゲン繊維を脱水するステップと、
分子の配向を高め、前記繊維の直径を減少させるのに十分な、前記押出速度を超える第３速度で前記繊維をスプールに取り出すステップと、
を含む、生体高分子繊維を製造するための方法。

【請求項14】

コラーゲンを酸溶液に溶解してコラーゲン溶液を作成するステップと、
第１直径を有する第１針を通して第１速度で前記コラーゲン溶液を形成緩衝液に送るステップと、
繊維を形成するのに十分な時間と速度で、繊維形成浴を含む反応領域を通して前記コラーゲンおよび形成緩衝液を送るステップと、
ある押出速度で前記コラーゲン繊維を脱水するステップと、
分子の配向を高め、前記繊維の直径を減少させるのに十分な、前記押出速度の約２倍から前記押出速度の約１０倍の速度で前記繊維をスプールに取り出すステップと、
を含む、生体高分子繊維を製造するための方法。

【請求項15】

前記コラーゲン溶液を前記形成緩衝液に送る前に前記コラーゲン溶液を脱気することをさらに含む、請求項１３または請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

臨床用コラーゲンを酸溶液に溶解してコラーゲン溶液を作成するステップと、
第１針を通して第１体積流量で前記コラーゲン溶液を送って第１速度を生じさせると同時に、前記第１針を同軸に取り囲んで前記コラーゲン溶液の周囲のシースを形成する管内に第２速度で形成緩衝液を送って同軸流を形成するステップであって、
前記基礎緩衝液の速度は、前記第１針を通した前記コラーゲン溶液の前記第１速度の約２倍から約２０倍である、ステップと、
繊維を形成するのに十分な時間と速度で、フィブリル形成浴を含む反応領域を通して同軸に流れるコラーゲンおよび形成緩衝液を送るステップと、
ある押出速度で前記コラーゲン繊維を脱水するステップと、
分子の配向を高め、前記繊維の直径を減少させるのに十分な、前記押出速度を超える第３速度で前記繊維を取り出すステップと、
を含む、生体高分子繊維を製造するための方法。

【請求項17】

前記繊維をバーコレクターまたは平らなシリンダーに回収することをさらに含む、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

前記繊維を溝付きスプールに回収することをさらに含む、請求項１６に記載の方法。

【請求項19】

臨床用コラーゲンを酸溶液に溶解してコラーゲン溶液を作成するステップと、
ノズルを通して、前記溶液を、前記押出溶液を形成緩衝液の流動浴に送って繊維を形成するガイドに押し出すステップと、
前記形成緩衝液浴に形成された前記繊維を脱水するステップと、
前記繊維を回収するステップと、
を含む、生体高分子繊維を製造するための方法。

【請求項20】

前記繊維を回収する前に、前記繊維を乾燥するのに十分な時間、前記繊維に空気を送ることによって、前記脱水した繊維を乾燥することをさらに含む、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

グリオキサール、ＤＬ‐グリセルアルデヒドまたはそれらの組み合わせを含む架橋剤で前記繊維を架橋させ、前記架橋した繊維を乾燥することをさらに含む、請求項１９に記載の方法。

【請求項22】

臨床用コラーゲンを酸溶液に溶解してコラーゲン溶液を作成するステップと、
第１直径を有する第１針を通して第１速度で前記コラーゲン溶液を形成緩衝液に送るステップと、
繊維を形成するのに十分な時間と速度で、繊維形成浴を含む反応領域を通して前記コラーゲンおよび形成緩衝液を送るステップと、
ある押出速度で前記コラーゲン繊維を脱水するステップと、
１以上の段階で、分子の配向を高め、前記繊維の直径を減少させるのに十分な、前記押出速度の約２倍から前記押出速度の約１２倍の速度で、前記繊維をスプールに取り出すステップと、
を含む、生体高分子繊維を製造するための方法。

【請求項23】

グリオキサール、ＤＬ‐グリセルアルデヒドまたはそれらの組み合わせを含む架橋剤で前記繊維を架橋させ、前記架橋した繊維を乾燥することをさらに含む、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

請求項１３～請求項２３のいずれか１項に記載の方法によって製造される、生体高分子繊維。

【請求項25】

請求項２４に記載の生体高分子繊維を含む、軟部組織損傷の修復を支援するための移植可能な生体高分子足場。

【請求項26】

請求項２５に記載の生体高分子足場の前記移植を含む、軟部組織損傷の前記修復を支援するための方法。

【請求項27】

前記軟部組織が、靭帯、腱、腱・靭帯付着部、骨、筋肉、筋腱移行部、皮膚を含む結合組織、筋膜、内蔵、および眼を含む群から選択される、請求項２６に記載の方法。

【請求項28】

請求項２４に記載の生体高分子繊維を含む、縫合糸。

【請求項29】

吸収性である、請求項２８に記載の縫合糸。

【請求項30】

対象者に移植されると、前十字靱帯、アキレス腱および腱板などの関節における靭帯または腱の機械的負荷を支える、補強する、増大させる、または共同して負う、請求項２４に記載の生体高分子繊維を含む内部装具。

【請求項31】

対象者に移植されると、負傷した関節を、１つの骨を他の骨に接続することによって支え、任意選択で、健康な天然関節のものに実質的に匹敵するレベルに生体力学および等尺性を復元する、請求項２４に記載の生体高分子繊維を含む内部装具。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本願は、２０１９年２月１日に出願された出願番号６２／８００，３１７の同時係属出願の利益を主張するものであり、その開示は、参照によってその全体が本願に組み込まれる。

【0002】

政府の支援に関する陳述
本願で提示されるデータは、少なくとも一部分においてＤＡＲＰＡ契約書番号ＨＲ００１１‐１５‐９‐０００６の下での支援を受けた。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。

【背景技術】

【0003】

発明の背景
１．本開示の分野
本開示は、コラーゲン繊維の製造方法と、足場へのそれらの組み込み方法とに関し、また、このような繊維で製造される移植可能な生体適合性デバイスに関する。特に、本開示は、優れた機械強度、生体適合性および免疫特性を有するコラーゲン繊維の押出方法に関する。
２．先行技術の記載
コラーゲンは、微細な細網フィブリルの束からなる繊維状不溶性タンパク質である。コラーゲンタンパク質分子は、結合して、腱、靭帯および筋膜の、白色の輝く非弾性繊維を形成する。コラーゲンは、皮膚、骨、靭帯および軟骨を含む結合組織に見られる。

【0004】

特に、コラーゲンフィブリルは、結合して、靭帯および腱などの丈夫な結合組織を形成する。損傷を受けたコラーゲン身体部位（特に靭帯および腱を含む）を置換するための、体内で使用するコラーゲン含有組織を製造する多くの努力がなされている。損傷を受けた部位をこのような移植可能なデバイスで直接置換してもよく、また、損傷を受けた腱および靭帯などの軟部組織に足場を提供し、最終的にそれを置換するのに役立たせてもよい。

【0005】

このような製品は、複数の機能パラメータに対処することが必要な様々な難しい生体力学的環境で機能する必要がある。これらのパラメータは、たとえば、生体組織および体液との適合性、強度、柔軟性、ならびに生分解性を含む。

【0006】

上記の従来技術の欠点に対処するシステムおよび方法が、当技術分野で必要とされている。

【発明の概要】

【0007】

一側面において、本開示は、コラーゲンを含む生体高分子繊維に関し、この繊維は、以下の特徴
約１ＭＰａ～約１，７００ＭＰａの極限引張強さ、
約１０ＭＰａ～約２０，０００ＭＰａの弾性率、
伸び率約２パーセント～約４５パーセントの破断伸び、
約１０μｍ～約９０μｍの平均繊維径
の１つ以上を有し、
室温で少なくとも約１時間ＤＰＢＳに浸漬後、その強度を維持し、
そのフィラメントは規則正しい縦配向構造を示す。

【0008】

別の側面において、本開示は、２～約１０，０００の繊維を含む生体高分子繊維の束に関する。

【0009】

さらに別の側面において、本開示は、生体高分子繊維またはその束を含む、軟部組織損傷の修復を支援するための移植可能な生体高分子足場に関する。

【0010】

本開示は、生体高分子繊維を含む織シート状支持体、パッチまたは装具にも関する。

【0011】

さらに別の側面において、本開示は、生体高分子繊維を製造するための方法に関する。この方法は、
コラーゲンを酸溶液に溶解してコラーゲン溶液を作成するステップと、
第１直径を有する第１針を通して第１速度でコラーゲン溶液を送ると同時に、第１針を同軸に取り囲み、第１直径を超える第２直径を有し、コラーゲン溶液の周囲のシースを形成する第２針を通して第２速度で形成緩衝液を送って同軸流を形成するステップであって、
第２針を通した基礎緩衝液の第２流量は、第１針を通したコラーゲン溶液の第１流量の少なくとも２倍である、ステップと、
繊維を形成するのに十分な時間と速度で、フィブリル形成浴を含む反応領域を通して同軸に流れるコラーゲンおよび形成緩衝液を送るステップと、
ある押出速度でコラーゲン繊維を脱水するステップと、
分子の配向を高め、繊維の直径を減少させるのに十分な、前記押出速度を超える第３速度で繊維をスプールに取り出すステップと、を含む。

【0012】

別の側面において、本開示は、生体高分子繊維を製造するための方法に関する。この方法は、
コラーゲンを酸溶液に溶解してコラーゲン溶液を作成するステップと、
第１直径を有する第１針を通して第１速度でコラーゲン溶液を形成緩衝液に送るステップと、
繊維を形成するのに十分な時間と速度で、フィブリル形成浴を含む反応領域を通してコラーゲンおよび形成緩衝液を送るステップと、
ある押出速度でコラーゲン繊維を脱水するステップと、
分子の配向を高め、繊維の直径を減少させるのに十分な、前記押出速度の約２倍から前記押出速度の約１０倍の速度で繊維をスプールに取り出すステップと、を含む。

【0013】

さらに別の側面において、本開示は、生体高分子繊維を製造するための方法であって、
臨床用コラーゲンを酸溶液に溶解してコラーゲン溶液を作成するステップと、
第１針を通して第１体積流量でコラーゲン溶液を送って第１速度を出すと同時に、第１針を同軸に取り囲んでコラーゲン溶液の周囲のシースを形成する管内に第２速度で形成緩衝液を送って同軸流を形成するステップであって、
基礎緩衝液の速度は、第１針を通したコラーゲン溶液の第１速度の約２倍から約２０倍である、ステップと、
繊維を形成するのに十分な時間と速度で、フィブリル形成浴を含む反応領域を通して同軸に流れるコラーゲンおよび形成緩衝液を送るステップと、
ある押出速度でコラーゲン繊維を脱水するステップと、
分子の配向を高め、繊維の直径を減少させるのに十分な、前記押出速度を超える第３速度で繊維を取り出すステップと、を含む方法に関する。

【0014】

追加的な側面において、本開示は、生体高分子繊維を製造するための方法であって、
臨床用コラーゲンを酸溶液に溶解してコラーゲン溶液を作成するステップと、
ノズルを通して、溶液を、押出溶液を形成緩衝液の浴に送るガイドに押し出すステップと、
形成緩衝液浴に形成された繊維を脱水するステップと、
繊維を回収するステップと、を含む方法に関する。

【0015】

さらに追加的な側面において、本開示は、生体高分子繊維を製造するための方法であって、
臨床用コラーゲンを酸溶液に溶解してコラーゲン溶液を作成するステップと、
第１直径を有する第１針を通して第１速度でコラーゲン溶液を形成緩衝液に送るステップと、
繊維を形成するのに十分な時間と速度で、繊維形成浴を含む反応領域を通してコラーゲンおよび形成緩衝液を送るステップと、
ある押出速度でコラーゲン繊維を脱水するステップと、
１以上の段階で、分子の配向を高め、繊維の直径を減少させるのに十分な、前記押出速度の約２倍から前記押出速度の約１２倍の速度で繊維をスプールに取り出すステップと、を含む方法に関する。

【0016】

本開示は、生体高分子繊維を含む軟部組織損傷の修復を支援するための移植可能な生体高分子足場と、生体高分子足場の移植を含む軟部組織損傷の修復を支援するための方法とを提供する側面も含む。

【0017】

以下の図面および詳細な説明を精査すれば、本発明の他のシステム、方法、特徴および利点は、当業者に明らかであるかまたは明らかとなるであろう。そのような追加のシステム、方法、特徴および利点のすべては、本明細書と本概要とに含まれ、本発明の範囲内にあり、以下の特許請求の範囲によって保護されることが意図されている。

【0018】

本発明は、以下の図面と記述を参照することにより、より的確に理解することができる。図面における構成要素は、必ずしも縮尺どおりではなく、代わりに、本発明の原理を例示することに強調が置かれている。さらに、図面において、同様な参照番号は、異なる図面を通じて対応する部分を示す。

【図面の簡単な説明】

【0019】

【図1】図１は、本明細書に開示の方法の実施形態の模式図である。

【図2】図２は、本開示の一実施形態における、コラーゲン溶液の形成の第１ステップを示す模式図である。

【図3】図３は、本明細書に開示の方法の一実施形態における、コラーゲン製造における脱気装置の使用の模式図である。

【図4】図４は、本明細書に開示の方法の実施形態に使用するのに適した遠心分離機の模式図である。

【図5】図５は、本開示の一実施形態における遠心分離機の使用の模式図である。

【図6】図６は、一実施形態における、コラーゲン繊維を形成するために使用する同軸針の実施形態の模式図である。

【図7】図７は、本開示の一実施形態における、フィブリル形成浴を含むコラーゲン繊維反応領域の模式図である。

【図8】図８は、本開示の一実施形態における、脱水浴の模式的実施形態である。

【図9】図９は、脱水浴からコラーゲン繊維を分離するためのデバイスの実施形態の模式図である。

【図10】図１０は、本開示の一実施形態における繊維回収システムの模式図である。

【図11】図１１は、本開示の一実施形態における繊維回収スプールの模式図である。

【図12】図１２は、本開示の実施形態に従った終了処理の模式図である。

【図13】図１３は、本開示の一実施形態の方法の模式図である。

【図14】図１４は、本開示の一実施形態の方法の模式図である。

【図15】図１５は、本開示の製品を製造するための使用に適した機器の一実施形態の模式図である。

【図16】図１６は、図１５の機器の追加詳細を示す図である。

【図17】図１７は、本開示に使用する組成物を要約した表である。

【図18A】図１８Ａは、実施形態に使用する条件を要約した表である。

【図18B】図１８Ｂは、実施形態に使用する条件を要約した表である。

【図18C】図１８Ｃは、実施形態に使用する条件を要約した表である。

【図19】図１９は、本開示に関連する機械的特性を要約したグラフである。

【図20】図２０は、本開示に関連する別の機械的特性を要約したグラフである。

【図21】図２１は、本開示に関連するさらに別の機械的特性を要約したグラフである。

【図22】図２２は、本開示に従って製造される組成物の拡大画像である。

【図23】図２３は、本開示の実施形態の幅を要約したグラフである。

【図24】図２４は、本開示の実施形態の厚さを要約したグラフである。

【図25】図２５は、本開示の実施形態の機械的特性を要約したグラフである。

【図26】図２６は、本開示の実施形態の別の機械的特性を要約したグラフである。

【図27】図２７は、本開示の実施形態の機械的特性の関係を要約したグラフである。

【図28】図２８は、本開示の実施形態の別の機械的特性の関係を要約したグラフである。

【図29】図２９は、本開示の実施形態の特性を要約したグラフである。

【図30】図３０は、本開示の実施形態のカラー画像である。

【図31】図３１は、本開示の実施形態の特性を要約したグラフである。

【図32】図３２は、本開示の実施形態の別の特性を要約したグラフである。

【図33】図３３は、本開示の実施形態のさらに別の特性を要約したグラフである。

【図34】図３４は、本開示の一実施形態の拡大カラー画像である。

【図35】図３５は、マイクロファイバー製品の拡大カラー画像である。

【図36】図３６は、対照マイクロファイバー製品の拡大カラー画像である。

【図37】図３７は、本開示の一実施形態の特徴の画像である。

【図38】図３８は、本開示の一実施形態の特徴の画像である。

【図39】図３９は、本開示の実施形態の特徴を要約したグラフである。

【図40】図４０は、本開示の一実施形態のサイズがどのように時間とともに変化するかを要約したグラフである。

【図41】図４１は、本開示の一実施形態の機械的特性がどのように時間とともに変化するかを要約したグラフである。

【図42】図４２は、本開示の一実施形態の別の機械的特性がどのように時間とともに変化するかを要約したグラフである。

【図43】図４３は、本開示の一実施形態のさらに別の特性がどのように時間とともに変化するかを要約したグラフである。

【図44】図４４は、本開示の一実施形態のさらにまた別の特性がどのように時間とともに変化するかを要約したグラフである。

【図45】図４５は、比較情報を要約した表である。

【図46】図４６は、本開示の方法の実施形態を示す図である。

【図47】図４７は、本開示の一実施形態の性質と特性を要約した図である。

【図48】図４８は、本開示の一実施形態の性質と特性を要約した図である。

【図49】図４９は、本開示の一実施形態の性質と特性を要約した図である。

【図50】図５０は、本開示の一実施形態の性質と特性を要約した図である。

【図51】図５１は、本開示の一実施形態の性質と特性を要約した図である。

【図52】図５２は、本開示の一実施形態の性質と特性を要約した図である。

【図53】図５３は、本開示の一実施形態の性質と特性を要約した図である。

【図54】図５４は、本開示の一実施形態の性質と特性を要約した図である。

【図55】図５５は、本開示の一実施形態の性質と特性を要約した図である。

【図56】図５６は、本開示の一実施形態の性質と特性を要約した図である。

【図57】図５７は、本開示の一実施形態のＳＥＭ画像である。

【図58】図５８は、本開示の一実施形態のＳＥＭ画像である。

【発明を実施するための形態】

【0020】

一側面において、本開示は、コラーゲンを含む生体高分子繊維に関し、この繊維は、以下の特徴
約１ＭＰａ～約１，７００ＭＰａの極限引張強さ、
約１０ＭＰａ～約２０，０００ＭＰａの弾性率、
伸び率約２パーセント～約４５パーセントの破断伸び、
約１０μｍ～約９０μｍの平均繊維径
の１つ以上を有し、
室温で少なくとも約１時間ＤＰＢＳに浸漬後、その強度を維持し、
そのフィラメントは規則正しい縦配向構造を示す。

【0021】

別の側面において、本開示は、生体高分子繊維を含む少なくとも１つの生体高分子シートを含む、軟部組織損傷の修復を支援するための移植可能な生体高分子足場に関し、この生体高分子は、コラーゲンを含み、以下の特徴
約１ＭＰａ～約１，７００ＭＰａの極限引張強さ、
約１０ＭＰａ～約２０，０００ＭＰａの弾性率、
伸び率約２パーセント～約４５パーセントの破断伸び、
約１０μｍ～約９０μｍの平均繊維径
の１つ以上を有し、
室温で少なくとも約１時間ＤＰＢＳに浸漬後、その強度を維持し、
そのフィラメントは規則正しい縦配向構造を示す。

【0022】

この繊維は、規則正しい縦配向構造を示し、対象者にこの繊維と本発明のこの繊維で製造されるデバイスとを移植した後の細胞浸潤を可能にする。

【0023】

別の側面において、本開示は、人の身体部位の修復または置換のための移植可能な生体高分子足場を含む。

【0024】

生体高分子繊維は、通常はコラーゲンで形成される。特に、テロコラーゲンは、通常は、任意の源（ヒト、ウシ、組換え体、クラゲなど）から得られる。絹フィブロイン、他の種類のコラーゲン（ＩＩ型コラーゲンなど）、フィブリン／フィブリノーゲン、基底膜タンパク質、ヒアルロン酸、ポリエチレンオキシド、ポリエチレングリコール、ポリカプロラクトン、ポリエチルネン、ポリヒドロキシ酪酸、ＰＤＬＡ、ＰＤＬＬＡおよび高分子量ＰＤＬＬＡ、ＰＬＧＡ、ならびにそれらのブレンドなどの生体許容性（ｂｉｏ‐ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ）ポリマーをコラーゲンとブレンドして生体高分子繊維を形成してもよい。

【0025】

さらに別の側面において、本開示は、コラーゲンを酸溶液に溶解してコラーゲン溶液を作成するステップを含む、生体高分子繊維を製造するための方法に関する。この方法の一実施形態において、次いで、第１直径を有する第１針を通して第１速度でコラーゲンを送って第１速度を出すと同時に、第１針を同軸に取り囲み、第１直径を超える第２直径を有し、コラーゲン溶液の周囲のシースを形成する第２針を通して第２体積流量で形成緩衝液を送って同軸流を形成する。第２針を通した形成バッファーの第２体積流量は、第１針を通したコラーゲン溶液の第１体積流量の少なくとも約２倍である。

【0026】

繊維を形成するのに十分な時間と速度で、フィブリル形成浴を含む反応領域を通して同軸に流れるコラーゲンおよび形成バッファーを送り、分子の配向を高め、繊維の直径を減少させるのに十分な、第１速度を超える第３速度で、通常は脱水浴を通して繊維が押し出される速度の２倍で、繊維をスプールに取り出す。次いで、繊維を架橋し、乾燥してもよい。

【0027】

さらに別の側面において、本開示は、生体高分子繊維を製造するための代替方法に関する。この実施形態において、コラーゲン溶液を調製して、形成バッファー浴などの繊維形成浴を含む反応領域に、繊維を形成するのに十分な時間と速度で注入する。繊維は、分子の配向を高め、繊維の直径を減少させる注入速度の約２倍から約１０倍の速度でスプールに取り出す。次いで、繊維を架橋し、乾燥してもよい。

【0028】

本開示の様々な実施形態において、コラーゲンまたはコラーゲンおよび他の適切な生体高分子は、生体高分子またはコラーゲン繊維に加工される。理解しやすいように、本開示の特徴はコラーゲンに関して述べる。しかしながら、本明細書に開示するタイプの繊維を得るために、コラーゲンは、様々な組み合わせと割合で適切な生体高分子とブレンドまたは混合してもよい。

【0029】

本明細書の全体を通して、洗浄と乾燥、または浸漬と乾燥などの、通常は典型的な製造工程時に一緒に行われると考えられるステップは、望ましい結果を実現するために必要に応じて行ってもよいし、または繰り返してもよい。たとえば、一実施形態において、組成物は、次のステップに進める前に、洗浄および乾燥してもよい。いくつかの実施形態において、材料は、次の処理工程に進める前に二度洗浄し、二度乾燥してもよく、また二度洗浄してから進めてもよい。

【0030】

他の実施形態において、第１洗浄または乾燥ステップは任意選択で行ってもよい。したがって、通常は洗浄してから乾燥する材料は、乾燥ステップに直接進み、それから次の処理工程に移行してもよい。当業者は、それらのステップを繰り返してもよく、または削除してもよい状況を認識することができる。

【0031】

これらの繊維で製造される足場などの構築物は、細胞内殖を可能にする。すなわち、繊維（および繊維で製造されるデバイス）が埋め込まれる様々なタイプの動物の細胞は、好ましくは足場の繊維と整列して、足場の孔内で増殖する。構築物および足場は、断裂したアキレス腱の対向部などの身体部位を再び付着させるために用いられる縫合糸などの、公知の修復機能のための代替物として使用してもよい単層品と多層品とを含む。裂けたまたは損傷を受けた腱の修復に使用するための支持構造体を提供するのに加えて、本開示の実施形態は、靭帯の修復にも適している。このように、足場または本発明を使用して支持体を提供してもよい他の例示的な靭帯は、ＡＣＬ、ＭＣＬ、ＰＣＬ、ＵＣＬならびに他のヒトおよび動物の靭帯を含む。本開示の製品が有用な他の手術は、特にそれ以外では部分断裂または完全断裂の再建が不可能または困難な、上方回旋筋腱板断裂の治療選択肢としての上方関節包再建術を含む。また、修復部位を覆って当該部位を強化するために多層シートを使用してもよい。

【0032】

特に、本開示の実施形態は、すべてのタイプの動物の靭帯、腱および他の軟部組織の修復に適している可能性がある。本開示のコラーゲン繊維は、たとえば、部分断裂のみを含む場合であっても、裂けた靭帯および腱を再接合するために使用してもよい。たとえば外科手術時に、単一の繊維での操作よりも操作が容易なように形状因子を改善するために、複数の繊維を、撚り合わせても、束ねても、編んでも、織り合わせても、または別様に配置してもよい。形状因子を改善することによって、繊維またはプラットフォームを正確に配置するのを容易にしてもよい。裂けた天然の身体部位の補強材または内部装具として役立つ他の形状因子を構築してもよい。装具は、１つの骨を他の骨に接続して関節を支える。通常、装具は、復元された天然関節の生体力学と等尺性とを有する等尺関節を形成する。

【0033】

本開示の実施形態を踏まえて製造されるコラーゲン繊維の効果は、たとえばウサギに行われた修復を研究することによって示してもよい。特に、ウサギ膝の補強材、内部装具およびかがり縫い構造は、本開示のコラーゲン繊維およびこの繊維で製造される構造の性質と特性とを評価するのに適している。

【0034】

図１は、コラーゲン繊維を製造するためのシステムおよび方法の一実施形態を示す。このシステムおよび方法は、４つのセクションまたは製造領域を含むとして説明してもよい。コラーゲン溶液は第１セクションで調製し、コラーゲン繊維は第２セクションで形成する。次いで、第３セクションでコラーゲン繊維を回収し、次いで、第４セクション、後処理または最終処理で後処理して湿潤コラーゲン繊維または乾燥コラーゲン繊維を得てもよい。

【0035】

図１に示すシステムおよび方法のステップは、次の４つのカテゴリーに分類してもよい。
カテゴリー 名称 含まれるステップ
１ コラーゲン溶液の調製 １０５～１２０
２ コラーゲン繊維の形成 １２５～１３０
３ コラーゲン繊維の回収 １３５～１５０
４ 後処理または最終処理 １５５～１８０
図１のステップ１０５で見られるように、コラーゲンを酸性溶液と混合し、ステップ１１０で十分に撹拌する。いくつかの実施形態において、酸は約０．０１Ｍ～約０．５０Ｍの酢酸である。他の実施形態において、酸は約０．０１Ｍ～約０．５０Ｍの塩酸である。溶液はステップ１１５で脱気し、次いでステップ１２０で遠心分離して残留気泡を除去してもよい。得られたコラーゲン溶液を針から押し出し、また、その針と同軸の、ステップ１２５で形成緩衝液を供給する第２針が存在してもよい。結果として生じる繊維の形成は、ステップ１３０の形成管によって継続してもよい。得られた製品は、形成されたコラーゲン繊維である。

【0036】

繊維は、次いで、回収システムに進む。このシステムにおいて、繊維をステップ１３５で形成緩衝液から分離し、ステップ１４０で脱水する。コラーゲン繊維を、ステップ１４５で回収し、ステップ１５０で風乾する。次いで、ステップ１５５、ステップ１６０、ステップ１６５およびステップ１７０で、図に示すように後処理を行ってもよい。スプール上で風乾したコラーゲン繊維を、ステップ１５５で架橋溶液に浸漬し、任意選択でステップ１６０で洗浄し、ステップ１６５で風乾し、ステップ１７０で乾燥して、乾燥した繊維を形成する。図１に一点鎖線で示すように、材料は、任意選択でステップ１６０で洗浄し、ステップ１６５で乾燥し、洗浄ステップ１６０に戻ってもよい。

【0037】

あるいは、コラーゲンを形成溶液浴に注入して繊維を形成する。このシステムにおいて、形成緩衝液の同軸注入のための第２針は必要ない。こうして注入されたコラーゲンを、ステップ１４０での脱水を経て回収システムに導入する。次いで、繊維を、処理工程の残りの部分に従って加工処理する。

【0038】

図１は、本開示の実施形態を実施するためのシステムおよび方法の一般図を示す。追加の詳細および開示は、本明細書の以下の特定の側面および実施形態に含まれている。

【0039】

一実施形態において、本開示は、コラーゲンを酸性溶液に溶解してコラーゲン溶液を作成するステップを含む、生体高分子繊維を製造するための方法に関する。次いで、第１直径を有する第１針を通して第１体積流量でコラーゲンを送って第１速度を出すと同時に、第１針を同軸に取り囲み、第１直径を超える第２直径を有し、コラーゲン溶液の周囲のシースを形成する第２針を通して第２体積流量で形成緩衝液を送って同軸流を形成する。第２針を通した形成バッファーの第２体積流量は、第１針を通したコラーゲン溶液の第１体積流量の少なくとも２倍である。

【0040】

繊維を形成するのに十分な時間と体積流量で、フィブリル形成浴を含む反応領域を通して同軸に流れるコラーゲンおよび形成バッファーを送り、第１速度を超える第３速度でスプールに繊維を取り出す。第３速度は、通常は脱水浴を通して繊維が押し出される速度の約２倍であり、分子の配向を高め、繊維の直径を減少させるのに十分である。次いで、繊維を架橋し、乾燥する。

【0041】

別の実施形態において、本開示は、生体高分子繊維を製造するための代替方法に関する。コラーゲン溶液を調製して、形成バッファー浴などのフィブリル形成浴を含む反応領域に、繊維を形成するのに十分な時間と速度で注入する。形成緩衝液の同軸流を形成する第２針は必要ない。代わりに、コラーゲン繊維をフィブリル形成浴に直接注入し、次いで脱水浴を通して運ぶ。繊維は、分子の配向を高め、繊維の直径を減少させる注入速度の約２倍から約４倍の速度でスプールに取り出すことによって運ぶ。次いで、繊維を架橋し、乾燥してもよい。

【0042】

方法１３００の実施形態を図１３に要約している。コラーゲン溶液は図に示すように調製する。ステップ１３０５でコラーゲン溶液を作成する。生体高分子をこのコラーゲンと混合してもよい。コラーゲンを酸性溶液に溶解して粘性溶液を作成する。ステップ１３１０でこの溶液を撹拌して、確実に十分な混合を行う。この混合溶液は、閉じ込められたガスを含んでいる可能性があり、したがってステップ１３１５で、脱気装置で１回以上脱気してもよい。次いで、ステップ１３２０で、図に示すようにコラーゲン溶液を遠心分離してもよい。任意選択で、溶液に閉じ込められたガスの容量を減らすために、図１の一点鎖線および図１３のフィーチャ１３１６で示しているように、脱気／遠心分離ステップを繰り返してもよい。

【0043】

こうして調製されたコラーゲン溶液は、ステップ１３２５に示されているように、繊維コアのシースとして機能する形成緩衝液との同軸押出によってコラーゲン繊維に形成される。形成緩衝液の体積流量は、通常は、コラーゲン形成の体積流量の少なくとも２倍である。この構成は、個々のフィブリルの形成を抑制し、繊維を伸ばして方向づけ、流れ誘導結晶化を繊維に付与することによって繊維の表面を滑らかにする可能性がある。

【0044】

次いで、コラーゲン繊維を回収する。ステップ１３３０でコラーゲン繊維の形成は完了しているため、次いで、コラーゲンを、ステップ１３３５で形成緩衝液から分離し、ステップ１３４０で脱水溶液で脱水する。次いで、ステップ１３４５で、脱水したコラーゲンを回転スプールに回収し、脱水溶液ステップ１３４０から繊維が供給される速度を超える速度で、通常は約２倍の速度で回転させることによって繊維をさらに伸ばす。次いで、こうして回収した繊維を、ステップ１３５０でスプール上で風乾する。

【0045】

代替実施形態において、コラーゲン溶液は、形成緩衝液への直接注入によってコラーゲン繊維に形成する。これにより、ステップ１３２５は省略される。繊維を、回収し、形成緩衝液から分離し、ステップ１３４０で脱水溶液中で脱水する。繊維は、ステップ１３４５で回転スプールに回収し、回転スプールは、形成速度の約２倍から形成速度の約４倍の速度で繊維を回収する。

【0046】

次いで、スプール上で風乾した繊維を後処理してもよい。ステップ１３５５で繊維を架橋溶液中で架橋してもよく、次いで、ステップ１３６０ですすいでもよい。次いで、繊維をステップ１３６５で風乾し、ステップ１３７０で乾燥して、乾燥した架橋コラーゲン繊維を得る。

【0047】

コラーゲン繊維の製造に使用する装置は、本開示の実施形態に従ったコラーゲン繊維の製造に使用する原料のいずれかによる攻撃に耐えるのに適した従来の構成材料によって作られている。金属、プラスチックおよび他の材料は、コラーゲン繊維の製造時に原料、中間体、溶媒および製品による攻撃に耐えるのに適した性質と特性とを有する。

【0048】

本開示の別の側面は、コラーゲン繊維に関し、この繊維は、以下の特徴
約１ＭＰａ～約１，７００ＭＰａの極限引張強さ、
約１０ＭＰａ～約２０，０００ＭＰａの弾性率、
伸び率約４パーセント～約１２パーセントの破断伸び、
約１６μｍ～約７０μｍの平均繊維径
の１つ以上を有し、
約１時間生体液に浸漬後、少なくともその強度を維持する。

【0049】

この繊維は規則正しい縦配向構造を示し、この繊維は細胞増殖の浸潤を可能にする。

【0050】

この実施形態の繊維は、本開示の実施形態の方法に従って製造する。コラーゲンは、多くの源から得てもよく、また様々な形態で得てもよい。コラーゲン繊維の質は、使用する原料の質に関連する可能性がある。いくつかの実施形態において、通常はウシコラーゲンを使用する。ウシコラーゲンは天然型であってもよく、または、凍結乾燥粉末であってもよい。

【0051】

ウシコラーゲン２０２は、酸性溶液への溶解によって粘性溶液２０３に加工してもよい。コラーゲン溶液を調製するために、塩酸などの鉱酸および酢酸などの有機酸のいずれを使用してもよい。たとえば、一実施形態において、無傷の末端テロペプチドを有するウシＩ型コラーゲンを、容器２１０中で約０．０１Ｍ酢酸～約０．５Ｍ酢酸２０１に溶解して、溶液中、約１６ｍｇ／ｍＬのコラーゲンを含む粘性溶液２０３を作成してもよい。溶液濃度は、溶液中、約１０ｍｇ／ｍＬのコラーゲン～溶液中、約１９ｍｇ／ｍＬのコラーゲンの範囲であってもよい。別の実施形態において、凍結乾燥された、末端テロペプチドが結合したウシＩ型真皮を、約０．０１Ｍ～約０．５Ｍの濃度を有するＨＣｌなどの鉱酸と混合して、溶液中、約１０ｍｇ／ｍＬのコラーゲン～約溶液中、１９ｍｇ／ｍＬのコラーゲンの濃度、通常は、溶液中、約１６ｍｇ／ｍＬのコラーゲンの濃度を有する溶液を作成する。

【0052】

実施形態において、コラーゲンは、少なくとも約１４時間、通常は少なくとも約１５時間、より一般的には少なくとも約１６時間溶解させる。いくつかの実施形態において、コラーゲン溶液３０１は、脱気装置３００内で脱気してコラーゲン溶液３０１から気泡を除去する。スクリーン３０４は、脱気装置のガス流出口３０３を通して脱気装置からコラーゲンが引き出されないことを確実にする。脱気装置３０３は、通常は約０ｐｓｉａ～約３ｐｓｉａの圧力で操作される。コラーゲン溶液は、最大約２脱気サイクル、通常は約１～約２サイクルにさらしてもよい。脱気は、繊維状コラーゲンの押し出しに干渉しそれを妨げる可能性のあるガス気泡を除去する。

【0053】

次いで、脱気したコラーゲンを、遠心分離機でさらに脱気してもよい。図４で、遠心分離機４００は、ボウル４０３が見えるように頂部４０８を開けて示してある。遠心分離する材料の管と、遠心分離機のバランスを図るために使用する管とを、回転ボウル４０９内のウェルに配置する。使用中に内部部品のいずれかが故障した場合でもあらゆる破片を封じ込めるように、ケース４０５は十分に頑丈である。

【0054】

図５は、格納ボウル５０１および蓋５０８を有する遠心分離機５００を示す。動きの矢印５０５で示すように、遠心分離機は反時計回りに高速で回転する。管５０２は、遠心分離前のコラーゲン溶液５０３を含む管を示す。図に示すように、コラーゲン溶液は均質であり、それを除けば均質なコラーゲン溶液５１２内に閉じ込められた気泡を有する。

【0055】

約４００ｒｃｆ～約４，０００ｒｃｆ、通常は約６００ｒｃｆ～約１，０００ｒｃｆ、より一般的には約７００ｒｃｆ～約８００ｒｃｆの相対遠心力またはｇ値での遠心分離は、約３分～約１５分以内に、通常は約４分～約１０分で、より一般的には約５分～約７分で、閉じ込めた気泡体積を本質的にゼロに減少させるのに適している。

【0056】

いくつかの実施形態において、ステップを交互に行うことによって一対の関連ステップを繰り返してもよい。たとえば、コラーゲンは、脱気装置３０３で１サイクル行い、次いで遠心分離機５００で５分間加工処理し、次いで脱気装置３０３に戻って１サイクル行い、次いで５分間遠心分離してもよい。この別法での操作は効率改善をもたらす可能性がある。この効率改善は、所与の量の気泡を達成するために、または線形処理よりも優れた結果を達成するために、より短い処理時間を利用して達成してもよい。

【0057】

次いで、コラーゲンを溶液と共押出してコラーゲン繊維を形成する。同軸流体のコアでのコラーゲン溶液の押出は、いくつかの実施形態において、コラーゲン繊維の形成を助けてもよい。

【0058】

本開示のいくつかの実施形態において、次いで、コラーゲンを同軸流針の中心に導入するとともに、形成緩衝液を外針に導入する。このようにして、形成緩衝液はコラーゲンの周囲のシースを形成する。図６に示すように、コラーゲン溶液６５０はポンプ６５５を通してポンプで送られ、コラーゲン流６０１として内針６０３に導入される。同時に、形成緩衝液６６０は、形成緩衝液流６０６として外針６０４に導入される。形成緩衝液がコラーゲンの中心コアの周囲のシースを形成するように、外針６０４は内針６０３と同軸である。材料が針を出て、フィブリル形成浴７０１（図７に示す）を含む反応領域に流入するとき、形成緩衝液６０７は、コラーゲン繊維６０２の周囲のシースを形成しており、このコラーゲン繊維６０２は固体繊維の形成を開始する。

【0059】

得られたコラーゲン繊維製品の直径は、下流処理によって中心針の内径よりも小さく製造される。中心針の直径は、完成繊維の標的直径よりも大きくてもよい。いくつかの実施形態において、中心針の内径は約０．０５ｍｍ～約１００ｍｍであり、いくつかの実施形態において、中心針の内径は約０．１ｍｍ～約５０ｍｍであり、さらに他の実施形態において、中心針の内径は約０．２ｍｍ～約２０ｍｍであり、さらに他の実施形態において、中心針の内径は約０．３ｍｍ～約１０ｍｍであり、より一般的には約０．３５ｍｍ～約５ｍｍである。いくつかの実施形態において、中心針のより狭い内径の範囲は、たとえば約０．０３ｍｍ～約１０ｍｍ、通常は約０．１０ｍｍ～約３ｍｍ、より一般的には約０．３０ｍｍ～約１ｍｍ、よりさらに一般的には約０．３５ｍｍ～約０．５０ｍｍである。

【0060】

いくつかの実施形態において、中心針の内径は、約０．３８ｍｍ～約０．４４ｍｍ、通常は約０．３９ｍｍ～約０．４３ｍｍ、より一般的には約０．４０ｍｍ～約０．４２ｍｍである。

【0061】

いくつかの実施形態において、形成緩衝液を供給するための周囲の同軸外針の内径は、一般的には中心針の内径の約１．９５倍から中心針の内径の約２．１５倍であり、一般的には中心針の内径の約２．００倍から中心針の内径の約２．１０倍であり、より一般的には中心針の内径の約２．０５倍である。

【0062】

実施形態において、形成緩衝液は、コラーゲン繊維の形成を助けるための任意の溶液であってもよい。形成緩衝液は、通常は、塩および緩衝剤を加えたＴＥＳ（２‐［（２‐ヒドロキシ‐１，１‐ビス（ヒドロキシメチル）エチル）アミノ］エタンスルホン酸またはＮ‐［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］‐２‐アミノエタンスルホン酸としても知られている）を含む溶液である。

【0063】

本開示のいくつかの実施形態において、形成緩衝液は、ＷＳＢ（３０ｍＭのＴＥＳ、４．１４ｍｇ／ｍＬのリン酸一ナトリウム二水和物、１２．１ｍｇ／ｍＬのリン酸二ナトリウム七水和物、１３５ｍＭのＮａＣｌおよび１０ｗ／ｖパーセントのＰＥＧ（ポリエチレングリコール）を含む溶液）である。類似した溶液も適切な可能性がある。

【0064】

コラーゲン溶液の流量および形成緩衝液の流量は、押出針内および、フィブリル形成浴を含む反応領域内で形成緩衝液シースがそのまま維持されるように調整する。形成緩衝液の速度も、コラーゲン繊維に伸びを与えて繊維の質を改善するように、コラーゲン溶液の速度を超えるように設定する。実際、これによって、コラーゲンは、キンクおよび他の物理的形状異常を伴わない比較的まっすぐで連続的な繊維を形成するように促される。いくつかの実施形態において、繊維は実質的に円形、卵形、正方形、長方形、リボン状、三角形、または不規則な形状であってもよい。

【0065】

本開示の実施形態において、繊維形成浴を含む針反応領域内の形成緩衝液の速度は、コラーゲン溶液の速度より大きい。形成緩衝液は、コラーゲン溶液を中和してフィブリル形成を助けるために使用される。さらに、コラーゲン流を引っ張るかまたは伸ばすために、より高速の形成緩衝液を使用するが、これによって、流れ誘導結晶化と呼ばれるプロセスでコラーゲンモノマーの整列を助ける伸長場が作られる。この整列が、コラーゲンを重合させ、得られた製品の強度増加を助ける。

【0066】

いくつかの実施形態において、針内の形成緩衝液の体積流量は、針内のコラーゲン溶液の体積流量の約５倍から針内のコラーゲン溶液の体積流量の約１０倍であり、通常は針内のコラーゲン溶液の体積流量の約７倍から針内のコラーゲン溶液の体積流量の約９倍であり、より一般的には針内のコラーゲン溶液の体積流量の約７．５倍から針内のコラーゲン溶液の体積流量の約８．５倍である。特に、針内のコラーゲン溶液の体積流量の８倍が効果的である。

【0067】

実施形態において、図７に示すように、コラーゲン流７０２および形成緩衝液シース７０７は反応システム７００のフィブリル形成浴７０１を含む反応領域に入る。反応領域は、形成管などの、反応領域７０１を形成する構造物を有していてもよい。しかしながら、通常は、構造物は存在する必要はない。フィブリル形成浴７０１を含む反応領域を通してこの流れが流れるとき、コラーゲン繊維は重合を継続して、コラーゲン繊維製品を形成する。コラーゲン繊維７５２および形成緩衝液７０２は、フィブリル形成浴７０１を含む反応領域から流れ出る。

【0068】

実施形態において、コラーゲンの速度は、コラーゲンに、約１５秒～約６０秒、通常は約２０秒～約５０秒、より一般的には約２５秒～約４０秒の反応時間または重合時間を与えるように調整される。

【0069】

図８に示すように、実施形態において、重合期の終了時に、フィブリル形成浴７０１を含む反応領域から流れが出て行くときに、形成緩衝液８０８からコラーゲン繊維８５２が形成され、分離される。過剰な形成緩衝液は深皿８０１に流入する。脱水システム８００は、形成緩衝液８０８を深皿８０１に受け止め、コラーゲン繊維８５２を脱水浴８０２に導入するように設計されている。

【0070】

脱水溶液は、コラーゲン繊維から水を除去する機会を与え、繊維径を減少させ、フィブリル形成を助ける。実施形態において、脱水溶液は、約１０パーセントエタノール～約３５パーセントエタノールのミリＱ水溶液を含み、通常は約１５パーセントエタノール～約３０パーセントエタノールのミリＱ水溶液を含み、より一般的には約１５パーセントエタノール～約２５パーセントエタノールのミリＱ水溶液を含む。当業者は、ミリＱ水（Ｍｉｌｌｉ‐Ｑ水とも書く）が、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ社（米国マサチューセッツ州バーリントン）から入手できる装置で製造される、高度に精製された水であることを認識している。

【0071】

コラーゲン繊維８５２は、脱水浴８０２を約１０秒～約５０秒、通常は約１５秒～約４５秒、より一般的には約２０秒～約４０秒通過する。その期間を通じて、コラーゲン繊維８５２は脱水浴８０２に浸漬されたままである。脱水浴８０２の容量は、ポンプで送られる形成緩衝液の１分あたりの容量の約４００倍からポンプで送られる形成緩衝液の１分あたりの容量の約８００倍であり、通常は、ポンプで送られる形成緩衝液の１分あたりの容量の約４５０倍からポンプで送られる形成緩衝液の１分あたりの容量の約７５０倍であり、より一般的には、ポンプで送られる形成緩衝液の１分あたりの容量の約５００倍からポンプで送られる形成緩衝液の１分６０１あたりの容量の約７００倍である。

【0072】

図９は、脱水されたコラーゲン繊維がそこから取り除かれる、脱水浴の端部を示す。図９に示す実施形態に見られるように、脱水されたコラーゲン繊維９３０は、リング９２０に繋がれたフック９１０の位置で脱水浴８０２から取り除かれる。図に示すように、フック９１０は、リング９２０によって脱水浴８０２中に保持される。フック９１０は、脱水されたコラーゲン繊維から脱水浴を取り除くのを助けるのに役立つ。脱水されたコラーゲン繊維９３０は、図１０に示されているように、スプール１００１の回転によって矢印９４０の方向に上方に引っ張られる。スプール１００１（図１０）の回収速度はコラーゲン繊維９３０の押出流量を超えるため、フック９２０または同様なデバイスが、コラーゲン繊維を脱水浴８０２中に浸漬したままにするのを確実にするのに適している。脱水されたコラーゲン繊維９３０は、脱水浴の高さより上に持ち上げられるため、脱水されたコラーゲン繊維９３０から流体の液滴９０５が落下するのを見ることができる。

【0073】

図１０は、脱水した繊維の、スプール１００１への回収を示す。実施形態において、スプール１００１は、矢印１０１６で示すように、モータ１０１１によって時計回り方向に回転される。スプール１００１は、約１．５～約３、通常は約１．７５～約２．５、より一般的には約１．９０～２．２０の延伸比を与える速度で回転される。同様に、スプール１００２は同じ速度で回転される。延伸比は、スプール速度と押出速度との間の比である。このように、フック９１０の位置で上方に繊維を引っ張る、第１コラーゲン繊維１０５０への張力が存在する。次いで、繊維は、脱水浴８０２の壁の上に引っ張られ、それからスプール１００１に引っ張り出される。

【0074】

あるいは、本開示のいくつかの実施形態において、コラーゲンは、図７に示すように、同軸流を形成するための図６の同軸針を使用せずに、フィブリル形成浴に直接導入する。逆に、コラーゲン溶液８５２が針から繊維形成浴８７０に直接注入されるときにコラーゲン繊維が形成され、その後、本開示の代替実施形態である同軸形成方法と同様にして加工処理が進む。コラーゲン注入のための針のサイズは、同軸注入方法のための針のサイズと同様に選択され、他の実施形態と同様に、繊維はフィブリル形成浴を通して引っ張られ、次いで脱水浴に引き込まれる。しかしながら、図１０のスプール１００１は、繊維形成速度の約２倍から繊維形成速度の約４倍、通常は繊維形成速度の約２．５倍から繊維形成速度の約３．５倍、より一般的には繊維形成速度の約２．７５～３．２５の引き込み速度を与える速度で回転される。次いで、他の実施形態と同様に後処理が実施される。

【0075】

矢印１０２０は、スプール上に繊維の単一層を形成するように、脱水浴８０２の端部に対してスプール１００１が平行移動している間の、いくつかの実施形態における時間の経過を示す。これにより、スプールの回転は同じ速度で継続し、スプール１００２が本質的に一杯になるまで、スプールの平行移動に伴って繊維１０５２に張力がかけられる。時間の矢印１０３０は、繊維の供給が尽きるまでの時間の経過を示す。次いで、スプール１０５５を回収してもよい。平行移動速度は、スプール上の繊維間の間隔を調整するために調整してもよい。

【0076】

スプールを回転させるときに繊維への張力が維持されるのを確実にするために、図１１に示すように、通常は、繊維はいくつかの実施形態で使用するスプール１１１０などのスプールの表面の全体に接触している。しかしながら、スプールは、スプール１１１０と同様な連続面を有する必要はない。他の実施形態では、多数のロッドがスプールの長さに沿って延びていることができるだろう。複数のロッドで形成されるこのようなスプールの１つは、図１１のスプール１１２０であり、このスプール１１２０は、第１ロッド１１２５、第２ロッド１１２６および第３ロッド１１２７を含む。これらのロッドは、その上にコラーゲンを巻くための十分な表面を提供する。

【0077】

本開示の繊維を、化学的に後処理してもよい。図１２は、可能な後処理工程を示す。実施形態において、コラーゲン繊維を含むスプール１２１０は、１２２０において、少なくとも約１５分間、通常は少なくとも約２０分間、より一般的には少なくとも約３０分間、風乾される。繊維を含む風乾された管１２１０を、次いで、架橋のための容器に入れる。通常は、本開示の実施形態における容器は、必要な架橋剤の量を減らすために架橋容器の容量を最小限にする。したがって、図１２に示すように、シリンダー１２３０は、１２３１に示されているように、円筒スプール１２１０を覆うのに必要な架橋流体の量を含む。実施形態において、繊維１メートルあたりの架橋溶液の容量は少なくとも約３μＬ、通常は少なくとも約４．５μＬ、より一般的には少なくとも約６μＬである。

【0078】

本開示の繊維は、アミノ基を備えるように官能基化してもよく、またコラーゲンのように、アルデヒドと架橋できるアミノ基を含んでいてもよい。通常は、短鎖アルデヒドを使用し、より一般的にはグリオキサール（ＧＬＹ）または他の従来の架橋試薬。たとえば、１‐エチル‐３‐（３‐ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、Ｎ‐ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、ゲニピン、グリセルアルデヒド、グルタルアルデヒド、ｏ‐デキストラン、ならびに低分子量プロシアニジンおよび高分子量プロシアニジンなどの架橋剤を使用してもよい。あるいは、繊維がカルボキシルで官能基化されている場合、架橋のためにＥＤＣおよび他のカルボジイミドを使用してもよい。イソシアネートは、ＯＨ基とアミンの両方に反応する。そのため、イソシアネート系架橋剤は、媒体の安定性と強度を改善するために、たとえば官能基化されたＰＤＬＬＡ（ＯＨ基と他のＯＨ基とを連結する）内でＯＨ基を互いに架橋するために使用してもよい。イソシアネートも、コラーゲンのＮＨ_２基（すなわちアミン基）を介して、官能基化されたＰＤＬＬＡ内のＯＨ基とコラーゲンとを結合するために使用してもよい。さらに、光架橋剤を使用することもできる。

【0079】

以下の反応順序は、本開示の実施形態に使用可能な例示的な架橋反応である。これらの例示的な反応のそれぞれにおいて、Ｐ＝ポリマーである（これらの反応における繊維である）。

【0080】

【化1】

【0081】

特に、グリオキサールは、本開示の実施形態における適切な架橋を提供する。本開示の実施形態において、７０パーセントエタノールと３０パーセントミリＱ水との溶液中に１０ｍＭグリオキサールを含む溶液を架橋に使用する。所望の架橋度と機能性とを提供するために、これらの成分の濃度または割合は変えてもよい。

【0082】

本開示の実施形態において、架橋溶液として、シースに０．２５ｍＭ ＥＤＣ溶液を使用してもよい。

【0083】

いくつかの実施形態において、図１２に示すように、管およびスプール１２３１は、矢印１２３５によって模式的に示されるように回転される。たとえば、ローラーを使用して管およびスプールを約１ＲＰＭで回転させてもよい。回転は、所望の架橋度を得るのに十分な時間継続させる。いくつかの実施形態において、所望の架橋度を得るためには少なくとも約２４時間で十分である。架橋時間の増加は、繊維内の結合強度を増し、得られる製品の安定性を改善する。したがって、いくつかの実施形態において、材料は、少なくとも約４８時間、通常は少なくとも約７２時間架橋させてもよい。およそ約１ヶ月の架橋時間が架橋強度をさらに増すことが見出された。容器は、コイル全体が架橋流体に浸ることを確実にする任意の方法で動かしてもよい。

【0084】

いくつかの実施形態において、次いで、架橋コラーゲン繊維１２１１を含むスプールを管から取り出し、すすぎタンク１２４０および矢印１２２１で示されているように、任意選択で、約１０分間ミリＱ水すすぎ液に入れる。次いで、すすいだスプールおよび繊維１２１２を、過剰なグリオキサールを不活化するのに十分な時間、１００ｍＭグリシンを含む浴１２５０に入れる。通常は、１０分で十分である。グリオキサールの除去は、繊維の細胞毒性を低下させるのに役立つ。必要に応じてまたは適切であれば、他の架橋剤を同様に除去してもよい。

【0085】

すすぎステップが省略される実施形態において、スプールおよび繊維１２１３は、グリシン浴１２５０でグリシンに入れる。繊維を乾燥するための加工処理は、すすぎステップの実施形態と同様に行う。

【0086】

グリシン浴からのコラーゲン繊維１２１４を含むスプールは、次いで、タンク１２６０で再度、ミリＱ水ですすぐ。実施形態において、グリシンを除去するのには１０分で十分である。次いで、１２７０でスプールおよび繊維１２１５を約１時間風乾してから、乾燥室１２８０に約２４時間入れる。次いで、図１２の乾燥した柔軟な繊維１２１７を回収する。

【0087】

本開示の実施形態は、生体高分子繊維を製造するための、図１３の方法１３００に関する。実施形態において、コラーゲンを酸溶液に溶解して（１３０５）、コラーゲン溶液を作成する（１３１０）。いくつかの実施形態において、コラーゲンに適合性生体高分子が含まれる。次いで、コラーゲン溶液を脱気し（１３１５）、次いで遠心分離して（１３２０）コラーゲン溶液を得てもよい。

【0088】

次いで、コラーゲン溶液は、形成緩衝液をシースとして共押出する（１３２５）。第１直径を有する第１針を通して第１速度でコラーゲン溶液を送ると同時に、第１針を同軸に取り囲み、第１直径を超える第２直径を有し、コラーゲン溶液の周囲のシースを形成する第２針を通して第２速度で形成緩衝液を送って同軸流を形成する。第２針を通した基礎緩衝液の第２速度は、第１針を通したコラーゲン溶液の第１速度の少なくとも２倍である。

【0089】

いくつかの実施形態において、中心針の内径は約０．０５ｍｍ～約１００ｍｍであり、いくつかの実施形態において、中心針の内径は約０．１ｍｍ～約５０ｍｍであり、さらに他の実施形態において、中心針の内径は約０．２ｍｍ～約２０ｍｍであり、さらに他の実施形態において、中心針の内径は約０．３ｍｍ～約１０ｍｍであり、より一般的には約０．３５ｍｍ～約５ｍｍである。いくつかの実施形態において、中心針のより狭い内径の範囲は、たとえば約０．０３ｍｍ～約１０ｍｍ、通常は約０．１０ｍｍ～約３ｍｍ、より一般的には約０．３０ｍｍ～約１ｍｍ、よりさらに一般的には約０．３５ｍｍ～約０．５０ｍｍである。

【0090】

いくつかの実施形態において、中心針の内径は、約０．３８ｍｍ～約０．４４ｍｍ、通常は約０．３９ｍｍ～約０．４３ｍｍ、より一般的には約０．４０ｍｍ～約０．４２ｍｍである。

【0091】

いくつかの実施形態において、形成緩衝液を供給するための周囲の同軸外針の内径は、一般的には中心針の内径の約１．９５倍から中心針の内径の約２．１５倍であり、一般的には中心針の内径の約２．００倍から中心針の内径の約２．１０倍であり、より一般的には中心針の内径の約２．０５倍である。

【0092】

実施形態において、形成緩衝液は、コラーゲン繊維の形成を助けるための任意の溶液であってもよい。形成緩衝液は、通常は、塩および緩衝剤を加えたＴＥＳ（２‐［（２‐ヒドロキシ‐１，１‐ビス（ヒドロキシメチル）エチル）アミノ］エタンスルホン酸またはＮ‐［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］‐２‐アミノエタンスルホン酸としても知られている）を含む溶液である。

【0093】

本開示のいくつかの実施形態において、形成緩衝液は、ＷＳＢ（３０ｍＭのＴＥＳ、４．１４ｍｇ／ｍＬのリン酸一ナトリウム二水和物、１２．１ｍｇ／ｍＬのリン酸二ナトリウム七水和物、１３５ｍＭのＮａＣｌおよび１０ｗ／ｖパーセントのＰＥＧ（ポリエチレングリコール）を含む溶液）である。類似した溶液も適切な可能性がある。

【0094】

いくつかの実施形態において、針内の形成緩衝液の体積流量は、針内のコラーゲン溶液の体積流量の約５倍から針内のコラーゲン溶液の体積流量の約１０倍であり、通常は針内のコラーゲン溶液の体積流量の約７倍から針内のコラーゲン溶液の体積流量の約９倍であり、より一般的には針内のコラーゲン溶液の体積流量の約７．５倍から針内のコラーゲン溶液の体積流量の約８．５倍である。特に、針内のコラーゲン溶液の体積流量の８倍が効果的である。

【0095】

実施形態において、同軸に流れるコラーゲンおよび形成緩衝液は、繊維を形成するのに十分な時間と速度で、フィブリル形成浴を含む反応領域を通して流れる（１３３０）。次いで、形成されたコラーゲン繊維を形成緩衝液から分離し（１３３５）、脱水溶液に入れる（１３４０）。脱水溶液は、コラーゲン繊維から水を除去する機会を与え、繊維径を減少させ、フィブリル形成を助ける。実施形態において、脱水溶液は、約１０パーセントエタノール～約３５パーセントエタノールのミリＱ水溶液を含み、通常は約１５パーセントエタノール～約３０パーセントエタノールのミリＱ水溶液を含み、より一般的には約１５パーセントエタノール～約２５パーセントエタノールのミリＱ水溶液を含む。

【0096】

いくつかの実施形態において、分子の配向を高め、繊維の直径を減少させるのに十分な、第１速度を超える第３速度でスプールに繊維を取り出す（１３４５）。この速度は、通常は脱水浴を通して繊維が流れる速度の少なくとも約２倍である。

【0097】

他の実施形態において、ステップ１３２５は省略し、同軸シース形成は使用しない。代わりに、コラーゲン溶液を形成緩衝液に注入し、回収スプールを回転させ、注入速度の約２倍から注入速度の約４倍の速度で繊維を引っ張る速度を提供することによって、形成緩衝液および脱水液を通して刺激する。次いで、可能な後処理を含むステップの残りの部分を実施する。

【0098】

実施形態において、ステップ１３５０での短い風乾時間の後に、ステップ１３５５で繊維を架橋する。通常は、架橋は、グリオキサール溶液中、架橋を達成するのに十分な時間撹拌して実施する。実施形態において、繊維はスプールに残す。必要な架橋剤の量を減らすために、一般的には架橋容器の容量を最小限にする。

【0099】

架橋材料は任意の適切な架橋剤であってもよい。特に、グリオキサールは、本開示の実施形態における適切な架橋を提供する。本開示の実施形態において、７０パーセントエタノールと３０パーセントミリＱ水との溶液中に１０ｍＭグリオキサールを含む溶液を架橋に使用する。所望の架橋度と機能性とを提供するために、これらの成分の濃度または割合は変えてもよい。実施形態において、繊維１メートルあたりの架橋溶液の容量は、少なくとも約３μＬ、通常は少なくとも約４．５μＬ、より一般的には少なくとも約６μＬである。多くの場合、架橋量を達成するのに、２４時間の架橋時間が適している。しかしながら、通常は、少なくとも約４８時間の架橋時間が架橋の増加をもたらし、少なくとも約７２時間の時間がよりさらなる架橋を提供する。

【0100】

次いで、架橋コラーゲン繊維を含むスプールを架橋容器から取り出し、本開示のいくつかの実施形態において、ミリＱ水すすぎ液に約１０分間入れる。他の実施形態において、スプールはすすぐ必要はない。次いで、ステップ１３６０で、スプールおよび繊維は、過剰なグリオキサールを不活化するのに十分な時間、１００ｍＭグリシン浴を含む浴に入れる。通常は１０分で十分である。グリオキサールの除去は、繊維の細胞毒性を低下させるのに役立つ可能性がある。

【0101】

グリオキサールを架橋剤として使用しない場合、他の処理工程を採用してもよい。当業者は、これらの他の架橋システムに適した適切な後処理工程を認識するであろう。

【0102】

次いで、実施形態において、グリシン浴からのコラーゲン繊維を含むスプールを、ステップ１３６５でミリＱ水で再度すすぐ。実施形態において、グリシンを除去するのには１０分で十分である。次いで、ステップ１２７０でスプールおよび繊維１２１４を約１時間風乾してから、約２４時間乾燥室に入れる（１３７０）。乾燥した柔軟な繊維を回収する。

【0103】

本開示の実施形態において、製造される繊維は、コラーゲンを含む生体高分子繊維である。この生体高分子繊維は、以下の特徴
約２０ＭＰａ～約１７０ＭＰａの極限引張強さ、
約２００ＭＰａ～約３，５００ＭＰａの弾性率、
伸び率約４パーセント～約１２パーセントの破断伸び、
約１６μｍ～約７０μｍの乾燥後の平均繊維径
の１つ以上を有し、
生体液に約１時間浸漬後、少なくともその強度を維持する。

【0104】

この繊維は規則正しい縦配向構造を示し、この繊維は細胞増殖の浸潤を可能にする。

【0105】

別の側面において、本開示は、軟部組織損傷の修復を支援するための、または人の身体部位の修復または置換のための、移植可能な生体高分子足場に関する。この足場は、生体高分子繊維を含む少なくとも１つの生体高分子シートを含み、この生体高分子は、以下の特徴
約２０ＭＰａ～約１７０ＭＰａの極限引張強さ、
約２００ＭＰａ～約３，５００ＭＰａの弾性率、
伸び率約４パーセント～約１２パーセントの破断伸び、
約１６μｍ～約７０μｍの、リン酸緩衝生理食塩水溶液への約１時間の浸漬後の平均繊維径
の１つ以上を有するコラーゲンおよび生体高分子繊維を含み、
生体液に約２４時間浸漬後、少なくともその強度を維持する。

【0106】

この繊維は規則正しい縦配向構造を示し、この繊維は細胞増殖の浸潤を可能にする。このシートは、使用時の取り扱いの便宜のために、典型的方法で配置された繊維を含む。たとえば、単一の繊維は、その小さな直径のために使用が極めて困難であろう。したがって、身体部位の修復または置換に適した繊維含有製品を提供するために、単一の繊維より大きい足場または構造体を形成するのが必要または適切である。したがって、たとえば、コラーゲン繊維を含む撚り糸を形成するために、いくつかの繊維を編み合わせることができる。このような撚り糸は、たとえば、靱帯または腱の断裂をかがり縫いするのに役立つ可能性がある。これらおよび他の使用は、使用者に明らかになるであろう。

【0107】

本開示の全体を通して、ランダムに集めた繊維１０本について、性質と特性とに関する試験を実施する。強度試験は、繊維１０本と、約０．３Ｎ～約２Ｎの負荷とを用いて実施する。

【0108】

本明細書で指摘したように、コラーゲン繊維の安定性は、生体溶液中に少なくとも１時間置いた後でさえ維持される。さらに、少なくとも約４８時間、さらには７２時間にわたって架橋時間を継続することによって実現されるさらなる架橋は、繊維の膨潤を著しく減少させ、負荷容量を維持または増加させる。

【0109】

以下の実施例は、本開示の実施形態の例であって、何ら限定を意味するものではない。

【0110】

実施例１
末端テロペプチドが無傷のＩ型ウシコラーゲンをパッケージから取り出し、０．０５Ｍ酢酸と混合して、１６ｍｇ／ｍＬのコラーゲン濃度を有する粘性溶液を作成した。この溶液にコラーゲンを１６時間溶解させ、続いて数サイクルの脱気を行った。脱気の前後に、５分間、約７５０ｒｃｆで遠心分離して過剰な気泡を除去した。コラーゲンを５ｍＬのシリンジに吸引し、次いで、同軸針（コラーゲン入口の内径０．４１ｍｍ、形成緩衝液入口の内径０．８４ｍｍ）の中心のルアーフィッティングに取り付けた。次いでコラーゲンシリンジと同軸針をシリンジポンプ上に配置し、６０μＬ／分でポンプで送った。

【0111】

形成緩衝液のｐＨを８．０±０．１に調整し、覆われたビーカーに入れた。形成緩衝液は、３０ｍＭ ＴＥＳ、４．１４ｍｇ／ｍＬリン酸一ナトリウム二水和物、１２．１ｍｇ／ｍＬリン酸二ナトリウム七水和物、１３５ｍＭ ＮａＣｌおよび１０パーセントｗ／ｖ ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）を含む溶液であり、湿式紡糸緩衝液としても知られているＷＳＢであった。

【0112】

チューブをビーカーの下部と蠕動ポンプを通して配置し、次いで、ルアーフィッティングを通じて同軸外針に取り付け、これによってコラーゲンの外側シース流を形成した。形成緩衝液を使用してコラーゲン溶液を中和し、フィブリル形成を助けた。形成緩衝液は５００μＬ／分で流した。コラーゲン流を引っ張るかまたは伸ばすために、より高速の形成緩衝液も使用し、流れ誘導結晶化と呼ばれるプロセスでコラーゲンモノマーの整列を助ける伸長場を作成した。この整列が、コラーゲンをのより容易な重合を助け、最終製品の強度を増加させた。

【0113】

コラーゲン流と形成緩衝液流を、フィブリル形成浴を含む反応領域に入れ、そこで、重合して長鎖を形成する時間を繊維に与えた。フィブリル形成浴を含む反応領域は、使用した形成緩衝液をリザーバに受け止め、２０％エタノールおよび８０％ミリＱ水を通して繊維をおおよそ４５ｃｍ移動させる脱水浴の入口で終わる。この浴は、コラーゲン繊維から水を除去するのを助け、その直径を減少させ、フィブリル形成を助けた。この浴は、幅２．５ｃｍであり、おおよそ３００ｍＬの溶液を保持した。

【0114】

浴を通して繊維が移動した後、次いで繊維を、長さが３００ｍｍであり、おおよそ５ＲＰＭで回転し、それによっておおよそ２の延伸比（スプール速度と押出速度との間の比）を与える５０ｍｍ径のスプールに巻き付けた。この延伸比は、分子の配向をさらに高めるのを助け、繊維径を減少させて最終的に強度を増加させた。繊維間の間隔を変えるためにスプールの平行移動速度を調整した。

【0115】

スプールを少なくとも１５分間風乾させてから、架橋のための円筒管に入れた。この管の内径は、完全な浸漬に必要な架橋剤を減らすために、スプールの外径に近かった。７０パーセントエタノールおよび３０パーセントミリＱ水の１０ｍＭグリオキサール溶液を１２０ｍＬ調製し、この管に注いだ。次いで、スプールをこの管に入れた。次いで、この管とスプールを、おおよそ１ＲＰＭで２４時間ローラー上に配置した。

【0116】

２４時間後、スプールを管から取り出し、ミリＱ浴に１０分間入れた。次いで、スプールを１００ｍＭグリシン浴に１０分間入れて過剰なグリオキサールを不活化して細胞毒性の低下を助け、続いて最後のミリＱ水浴に１０分間入れて残りのグリシンを除去した。次いで、スプールと繊維をおおよそ１時間風乾してから、乾燥室に２４時間入れた。

【0117】

乾燥後、繊維は乾燥し柔軟であった。これによって、足場を構築するための有用な形状への処理が容易になる。得られた繊維の平均直径は２５μｍであり、ＰＢＳへの半時間の浸漬後の引張強さはおおよそ１００ＭＰａであった。リン酸緩衝生理食塩水としても知られているＰＢＳは、生物学研究に広く使用されている緩衝液である。ＰＢＳは、リン酸水素二ナトリウム、塩化ナトリウムを含む水性塩溶液であり、製剤によっては、塩化カリウムおよびリン酸二水素カリウムを含む。この緩衝液は、一定のｐＨを維持するのに役立つ。この溶液の浸透圧濃度およびイオン濃度は、人体の浸透圧濃度およびイオン濃度と適合する（すなわち等張である）。

【0118】

アミノ酸類、塩化カルシウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウムおよびリン酸一ナトリウム、グルコース、ならびにビタミン類である葉酸、ニコチンアミド、リボフラビンおよびＢ_１２を含む細胞培養用合成培地であるＤＭＥＭ中３７℃での７日間の安定性試験は、元の強度のおおよそ２５％の低下を示す。ＤＭＥＭは、ｐＨ指示用に鉄およびフェノールレッドも含む。

【0119】

本実施例は、本特許請求の範囲の範囲内の方法に従った、本特許請求の範囲の範囲内の繊維の製造を例示する。この繊維によって、人の身体部位の修復または置換のための、本特許請求の範囲に従った足場が製造される。

【0120】

実施例２
末端テロペプチドが無傷のＩ型ウシコラーゲンをパッケージから取り出し、１０ｍＭ塩酸と混合して、１６ｍｇ／ｍＬのコラーゲン濃度を有する粘性溶液を作成した。この溶液にコラーゲンを１６時間溶解させ、続いて７３３ｒｃｆで５分間遠心分離した。２分間脱気して過剰な気泡を除去し、次いで７３３ｒｃｆで１０分間再度遠心分離する。コラーゲンを２０ｍＬのシリンジに吸引し、次いで同軸針（コラーゲン入口の内径０．４１ｍｍ）の中心のルアーフィッティングに取り付けた。次いでコラーゲン針をシリンジポンプ上に配置し、５０μＬ／分でポンプで送った。

【0121】

形成緩衝液のｐＨを８．０±０．１に調整し、長い浴に入れた。形成緩衝液は、３０ｍＭ ＴＥＳ、４．１４ｍｇ／ｍＬリン酸一ナトリウム二水和物、１２．１ｍｇ／ｍＬリン酸二ナトリウム七水和物、１３５ｍＭ ＮａＣｌおよび１０パーセントｗ／ｖ ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）を含む溶液であり、湿式紡糸緩衝液としても知られているＷＳＢであった。

【0122】

形成緩衝液を使用してコラーゲン溶液を中和し、フィブリル形成を助けた。コラーゲンは、形成緩衝液にポンプで送られ、浴を通して導かれる。コラーゲン形成緩衝液は、重合して長鎖を形成する時間を繊維に与える反応領域を含む。フィブリル形成浴を含む反応領域は、それを通して繊維が導かれる、２０％エタノールおよび８０％ミリＱ水の脱水浴の入口で終わる。この浴は、コラーゲン繊維から水を除去するのを助け、その直径を減少させ、フィブリル形成を助けた。浴はいずれも幅２．５ｃｍであり、おおよそ３００ｍＬの溶液を保持した。

【0123】

浴を通して繊維が移動した後、次いで繊維を、長さが３００ｍｍであり、おおよそ１０ＲＰＭで回転し、それによって少なくともおおよそ２の延伸比（スプール速度と押出速度との間の比）を与える５０ｍｍ径のスプールに巻き付けた。この延伸比は、分子の配向をさらに高めるのを助け、繊維径を減少させて最終的に強度を増加させた。繊維間の間隔を変えるためにスプールの平行移動速度を調整した。

【0124】

スプールを少なくとも１５分間、１時間以下風乾させてから、架橋のための円筒管に入れた。この管の内径は、完全な浸漬に必要な架橋剤を減らすために、スプールの外径に近かった。７０パーセントエタノールおよび３０パーセントミリＱ水の１０ｍＭグリオキサール溶液を１２０ｍＬ調製し、この管に注いだ。次いで、スプールをこの管に入れた。次いで、この管とスプールを、おおよそ１ＲＰＭで少なくとも２４時間から最大７２時間、ローラー上に配置した。

【0125】

２４時間後または最大７２時間後、スプールを管から取り出し、おおよそ１時間風乾してから、乾燥室に２４時間入れた。

【0126】

乾燥後、繊維は乾燥し柔軟であった。これによって、足場を構築するための有用な形状への処理が容易になる。得られた繊維の平均湿潤直径は３０μｍであり、ＰＢＳへの半時間の浸漬後の引張強さはおおよそ１２０ＭＰａであった。リン酸緩衝生理食塩水としても知られているＰＢＳは、生物学研究に広く使用されている緩衝液である。ＰＢＳは、リン酸水素二ナトリウム、塩化ナトリウムを含む水性塩溶液であり、製剤によっては、塩化カリウムおよびリン酸二水素カリウムを含む。この緩衝液は、一定のｐＨを維持するのに役立つ。この溶液の浸透圧濃度およびイオン濃度は、人体の浸透圧濃度およびイオン濃度と適合する（すなわち等張である）。

【0127】

アミノ酸類、塩化カルシウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウムおよびリン酸一ナトリウム、グルコース、ならびにビタミン類である葉酸、ニコチンアミド、リボフラビンおよびＢ_１２を含む細胞培養用合成培地であるＤＭＥＭ中３７℃での７日間の安定性試験は、元の強度のおおよそ２５％の低下を示す。ＤＭＥＭは、ｐＨ指示用に鉄およびフェノールレッドも含む。

【0128】

本実施例は、本特許請求の範囲の範囲内の方法に従った、本特許請求の範囲の範囲内の繊維の製造を例示する。この繊維によって、人の身体部位の修復または置換のための、本特許請求の範囲に従った足場が製造される。

【0129】

追加開示および比較情報
本開示の実施形態において、マイクロフルイディクス押出コラーゲンマイクロファイバー（これは次にグリオキサールまたはＤＬ‐グリセルアルデヒド（ＤＬＧ）などの無害な生体架橋剤で架橋することができる）を形成するために、臨床用アテロコラーゲンおよびテロコラーゲンを使用してもよい。これらの架橋繊維は、試験した他の５０の架橋戦略よりも著しく強く、天然のヒトアキレス腱および前十字靱帯の強度を超える、３００ＭＰａ近い水和極限引張強さと３ＧＰａ超のモジュラスを示した。グリオキサールで架橋した繊維は、培養下での３～６ヶ月間を通して、なお初期耐荷力の５０％を保持した。ラットに移植されたコラーゲン繊維は、生体適合性を示し、その繊維に沿って成長する整列した新たな宿主生成コラーゲンの産生を促進し、グリオキサール架橋の場合は、再生促進性Ｍ２マクロファージ応答の上昇を促進した。本開示の実施形態は、従来の合成材料を含む他の架橋繊維と比較して治癒における著しい改善を示し、本開示の実施形態を、強固なコラーゲン縫合糸を生成するための、または靱帯、腱または他の軟組織修復のデバイスに使用するための、優れた繊維にした。

【0130】

腱および靱帯の修復に適した材料を作る試みは、未だに適切な製品を製造するに至っていない。これまで、たとえば軟部組織の閉鎖または結合のための縫合糸、装具またはグラフトとしての自家移植片、同種移植片および合成材料は、重大な臨床上の限界を有していることが見いだされている。死んだ、脱細胞化した、および化学的に処理したインプラントなどの同種移植片は、組み込むのに時間がかかる場合があり、炎症性であり、場合により治癒を遅らせる可能性がある（Ｓｅｏｎ，ＳｏｎｇおよびＰａｒｋ，２００６年）。合成グラフトは、酸性副生成物に分解されて周辺組織を損傷する場合がある（Ｔａｙｌｏｒら，１９９４年；ｖａｎ Ｓｌｉｅｄｒｅｇｔら，１９９４年；Ｍａｔｓｕｓｕｅら，１９９５年）。合成グラフトは、腱または靭帯の機械的特性または材料特性にしばしば適合せず（Ｈｏｇａｎら，２０１５年）、関節裂隙に用いる場合、ストレスライザーの生成と消耗性の非等尺性を与える可能性がある。自家移植術は、手術時間と、自己組織を復元するためのもう一つの手術の必要性に起因する関連外傷（たとえば出血、感染リスク）とを増やし、そのプロセスにおけるさらなる外傷の原因となる（Ｃｈｅｎら，２００９年；Ｐｅｒｒｏｎｅら，２０１７年）。自家移植術または同種移植術を用いる関節再建は、早発性変形性関節症のより高い発症頻度と重症度をさらにもたらし、それによって生活の質に影響を与える（Ｌｅｉｔｅｒら，２０１４年；Ｓｍｉｔｈら，２０１４年；Ｐｅｒｒｏｎｅら，２０１７年）。外傷後変形関節症の増加速度は、退役軍人らにとって重要な問題となっている（Ｓｈｏｗｅｒｙら，２０１６年）。

【0131】

腱および靱帯の修復縫合糸と吸収性縫合糸のための理想的で強固な生体材料の製造において、まだ対処されていない必要性が残っている。生体適合性を改善し、炎症を減少させ、特に成形外科適応症のための強固な合成材料から摩耗性を減少させるための試みにおいて、コラーゲンコーティングを有する合成非吸収性縫合糸（たとえばコラーゲンコートＦｉｂｅｒＷｉｒｅ（登録商標））が使用可能になっている。

【0132】

Ｉ型コラーゲンからの架橋繊維押出は、強固な製品を生む可能性がある。しかしながら、これらの製品は不十分であり、生物学的な欠点、強度の欠点および他の欠点を示す。たとえば、ほとんどの架橋剤には細胞毒性があり、身体に対して異物である強い化学薬剤を使用し、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）が認可または承認した、現在注目されている製品にも使用されておらず、臨床応用のためのそれらの使用をより難しくしている。ＡＣＬまたはＡＴの修復の増強におけるそれらの可能な使用に加えて、編んだコラーゲン繊維は、高く均一な張力特性、一貫した均一な直径、生体適合性、および再生能を有する調節可能な吸収を有することが示された場合、一般手術、眼手術および形成外科・美容外科のための縫合糸として使用される可能性を有する。

【0133】

本開示の実施形態は、フィラメントでの、および薄いリボン状構造での臨床Ｉ型コラーゲンのマイクロファイバーを製造するための新規マイクロフルイディック押出システムに関する。本開示の実施形態は、厳しい機械的生化学的細胞適合性と生体適合性基準を満たし、本開示の繊維の実施形態に特に生物医学用途のための特性を持たせている。本開示の実施形態は、有用な製品を製造するために必要な中規模から大規模までの分子規模の秩序を示すため、本明細書に記載のこれらのコラーゲン繊維は、高度なコラーゲン縫合糸ベースの生体材料が医学における手術の分野全体で有益な可能性を有する、腱および靱帯の修復、創傷閉鎖ならびに他の適応症に潜在的用途を有する。

【0134】

図１４は、本開示の実施形態に記載のコラーゲンマイクロファイバーの製造と適切な製品の可能な生物医学用途とを模式的に示す。ステップ１４０１で凍結乾燥コラーゲンを酸に溶解して、コラーゲン分子１４０２を得る。押出マイクロファイバー１４０３をスピナレット１４０４で撚り合わせて、撚り合わせたマイクロファイバー１４０５を形成する。このマイクロファイバーは、集合させた分子コラーゲン１４０６を含む。このコラーゲンは、ステップ１４０７でスプールしてもよい。

【0135】

コラーゲンは、より適切には、個々の繊維を撚り合わせるかまたは編むことによって形成される３次元構造で使用してもよい。次に、編んだ繊維１４１１または撚り合わせた繊維１４０５は、患者の膝１４１２の前十字靱帯（ＡＣＬ）での裂傷１４１５を縫合するために使用してもよい。コラーゲンＡＣＬ縫合糸１４１４は、裂傷を修復するために使用し、またコラーゲン皮膚縫合糸１４１５は、創傷を閉鎖するために使用してもよい。

【0136】

撚り合わせるか否かに関わらず、任意の本数の繊維を合わせて束を形成してもよく、また束は、より大きな束に集合させてもよい。たとえば、束は、２本の繊維～約１０，０００本の繊維、または約４本の繊維～約６，０００本の繊維、通常は約８本の繊維～約４，０００本の繊維、より一般的には約１２本の繊維～約２，０００本の繊維を含んでもよい。次いで、束を、撚り合わせるかまたは別様にして組み合わせて、より大きな束を形成してもよい。組み合わせる束は、等しい本数の繊維を有する必要はない。

【0137】

束は、束内の繊維の本数によって表してもよい。たとえば、５本の繊維束はペンタ繊維と呼んでもよい、８本の繊維はオクタ繊維を生むだろう、など。このような束を製造するために、他の数のノズルまたは押出機を備えるシステムおよび装置を使用してもよい。

【0138】

図１５および図１６は、コラーゲン繊維を得るための方法と、その反応を実施することができるシステムとを示す。本開示の実施形態において、最大２％（ｗ／ｖ）の臨床用凍結乾燥テロコラーゲン（Ｔｅｌｏ）またはアテロコラーゲン（Ａｔｅｌｏ）（Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社、カリフォルニア州）またはメタクリル化コラーゲン（Ａｄｖａｎｃｅｄ ＢｉｏＭａｔｒｉｘ社、カリフォルニア州）を、撹拌して、０．０５Ｍまでの酸（最も一般的には、酢酸または塩酸）に終夜溶解した。システム１５００に示すように、酸性化したコラーゲン１５０１を、次にノズルシステムの中心を通してポンプで送った。このシステムは、同軸上に配置された導管または針１５０３を含んでもよい。塩を含む中和アルカリ性形成リン酸緩衝液（塩化ナトリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸一ナトリウムおよびＮ‐トリス（ヒドロキシメチル）メチル‐２‐アミノエタンスルホン酸）およびＰＥＧ（ポリエチレングリコール）を、同軸導管１５０３の外側部分のシステムを通してポンプで送った１５０１。形成緩衝液は、コラーゲンが導入される速度の約５倍から約２０倍、通常は約８倍～１５倍、最も一般的には約１０倍の体積流量で流れ、それによってタンパク質を伸ばして部分的に整列させ、得られた繊維１５０４に機械強度を付与した。繊維は、２０％水性エタノールの浴１５０５に入る前、形成管を通過するときに、より固くなった。繊維の脱水に加えて、この浴は残留形成緩衝液を除去するのに役立ち、それによって、得られたコラーゲンマイクロファイバーの強度と安定性の改善に寄与した。脱水１５０６の後、マイクロファイバー１５０７は、２バーデバイス１５０８に回収してもよい。他の適切な回収デバイスも使用できる。

【0139】

いくつかの実施形態において、酸性化したコラーゲン繊維を、形成浴に入れる前に、押出によって形成してもよい。たとえば、酸性化したコラーゲン繊維は、スピナレット１４０４の使用によって形成してもよい。いくつかの実施形態において、酸性化したコラーゲンの複数のシリンジを、同時に形成してもよい。

【0140】

図４６は、酸性化したコラーゲン繊維を形成するためにシリンジのアレイを使用するシステム４６００を示す。システム４６００が高スループットシステムであることを考慮にいれてもよい。本開示のいくつかの実施形態において、臨床用コラーゲンは、酸とコラーゲンとに対して不活性な材料で作られている密閉容器中で酸（酢酸または、ＨＣｌなどの鉱酸）に溶解する。ポリプロピレンは、このような材料の１つである。コラーゲンおよび酸の容量は、十分な混合を促進するために、通常は密閉容器の容量の約５０％未満である。溶液は、終夜、または約１６時間～３０時間、通常は約１５時間～約２０時間撹拌する。次いで、溶液を遠心分離して脱気する。

【0141】

次いで、脱気した溶液をシリンジに入れる。使用するシリンジの数は、同時に形成する繊維の本数に等しい。図４６のシステム４６００は、回転可能プレート４６０１に取り付けた８つのシリンジからの出口の使用を示す。各シリンジのプランジャーは、繊維が本質的に等しい量押し出されることを確実にするために、プレート（図示せず）によってシリンジのバレルに押し込まれている。酸性化したコラーゲンは、第１ノズル４６０２を通して押されて第１繊維４６１２を形成し、第２ノズル４６０３を通して押されて第２繊維４６１３を形成し、第３ノズル４６０４を通して押されて第３繊維４６１４を形成し、第４ノズル４６０５を通して押されて第４繊維４６１５を形成し、第５ノズル４６０６を通して押されて第５繊維４６１６を形成し、そして残りのノズルを通して押される。いくつかの実施形態では、必ずしもすべてのノズルを使用しない。本開示の実施形態において、回転可能プレート４６０１に取り付けるノズルは、より多くても、より少なくてもよい。

【0142】

繊維は、ガイド４６３０で収集し、形成緩衝液浴４６４０に投入する。繊維は、押出後に捕らえておく。いくつかの実施形態において、回転可能プレート４６０１は、撚り合わせた繊維を製造するために、いずれかの方向に回転してもよい。システム４６００において、回転可能プレート４６０１は、ロゼットノッチ４６２１と噛み合わせたドライブプレート４６２０の回転によって回転させてもよい。任意の適切な駆動システムを使用してもよい。いくつかの実施形態において、回転可能プレート４６０１は回転させず、したがって、得られる繊維の束は撚り合わされない。しかしながら、繊維を脱水するとき、そして繊維をコレクターに巻くまで、束は、テンショナーによる張力を受けて繊維束を維持する。通常は、特に湿潤繊維に関して、溝付きシリンダーが適切なコレクターである。

【0143】

図１６は、ノズルシステム１６００の詳細を示す。ポンプ１５０２は、二軸針１５０３の中心針に、酸性化した液体のコラーゲン１６２０をポンプで送る。緩衝液は、シース溶液とも呼ばれ、１６１０から、流れ矢印１６１１に向けて二軸針１５０３の外針に導入し、それによって、重合プロセスが進行するに従って、コラーゲンマイクロファイバー１５０４を形成する。コラーゲン流体は、伸張流のシース流体１６１１によって収束される。針の詳細図は、酸性化した液体コラーゲン１６２０がどのようにして低速矢印の方向に移動し、次いで高速矢印１６３０およびより高速の矢印１６４０で示すように速度が増加するかを示す。同様に、シース流体は速度矢印１６１１、矢印１６３５、および矢印１６４５の方向に移動した。反応剤の流れは矢印１６５０の方向に進み、ここでシェーディングは、燐酸塩を含む緩衝液（シース）流体１６７０が、どのようにコラーゲン溶液と相互作用し、コラーゲン流から水１６８０を除去するかを示す。

【0144】

マイクロファイバー１５０７をデバイス１５０８上に回収した後、それらを半時間風乾し、続いて様々な実験条件で架橋した。押出および架橋時に使用される化学薬剤は、図１７の表１に含まれる。

【0145】

図１８の表２に示すグループのｉｎ ｓｉｔｕ架橋（化学架橋または酵素架橋）は、図１８に示す各架橋剤の量を、図１８に示された時間、酸性化したコラーゲン混合物に溶解することによって行った。一部の材料の架橋に関する濃度と時間は、図１８に示す特定の参考文献から入手した。図１８は、強度の比較を要約している。イタリック体の条件は、回収方法の最適化後の特性評価のために選択した。次いで、ｉｎ ｓｉｔｕ架橋コラーゲンからのマイクロファイバーを２バーデバイスに押し出し、図１５に示すように、ピンと張ったまま保管した。図１８は、架橋剤が、約５ｍＭ～約５００ｍＭ、通常は約１０ｍＭ～約５００ｍＭ、より一般的には約２５ｍＭ～約２５０ｍＭの量で使用できることも示している。

【0146】

しかしながら、より一般的には、未架橋マイクロファイバーは、短い間隔の溝を有する固体スプール１１１０（図１１参照）に回収してもよい。マイクロファイバーを、ピンと張ったまま、これらの溝に直接回収した。スプールへの回収は、通常は、２バーデバイスよりも効率的である。未架橋マイクロファイバーのスプールは、２バーデバイスに使用したように、７０％水性エタノール中で化学的に架橋させた。架橋剤溶液に入れたマイクロファイバースプールを含む管は、図１２に示すように、ローラー上に配置し、１ｒｐｍで回転させてマイクロファイバーの均一な架橋を確実にした。

【0147】

押出後の化学架橋のために、２バーデバイス１５０８または溝付きローラー１１１０に押し出した未架橋またはｉｎ ｓｉｔｕ架橋のピンと張ったコラーゲンマイクロファイバーを半時間風乾し、次いで架橋剤溶液の７０％エタノール溶液に浸漬し、低速度のロッカー上に配置した。水性エタノール媒体は、架橋時間を通してマイクロファイバーが脱水状態を保つことを確実にする。架橋後、さらなる試験を行うまで、マイクロファイバーをデシケーター中に保存した。

【0148】

いくつかの実施形態において、コラーゲン繊維は、回収時に湿潤しているかまたは湿っている。このような場合には、繊維は、特に回収時にそれらが接触することができる場合に、互いにはり付く傾向にある可能性がある。したがって、いくつかの実施形態において、２バーまたはマルチバーコレクターデバイスは、繊維が他の繊維に接触する前に繊維を乾燥することが可能であるため、用いることが有利な可能性がある。いくつかの実施形態において、溝付きローラーは、１つの溝に１本の繊維のみが回収され、繊維同士の接触が起きないようにされるため、湿潤繊維の回収に特に有用である。

【0149】

いくつかの実施形態において、繊維は、繊維が脱水浴を離れた後、回収される前に、繊維の上にガス（通常は空気）を吹き付けることによって乾燥してもよい。繊維は脱水浴とコレクターとの間で懸下され、コレクターは、平らなシリンダー、ボビン、または任意の他の適切なコレクターであってもよい。繊維は、乾燥しているため、互いに離しておく必要はない。

【0150】

いくつかの実施形態において、繊維は、室温でかつスピードバッグで０．２５ｍ／秒～約１０ｍ／秒、通常は約１ｍ／秒～約４ｍ／秒、より一般的には約２ｍ／秒で、繊維の上に室温で空気を通過させることによって乾燥してもよい。乾燥空気の速度は、繊維を割いたり、分離させたり、または切断したりほど高くするべきではない。空気は、繊維を乾燥させるのにかかるおよその時間、通常は繊維を約１メートル移動させるのにかかる時間に等しい時間、通過させる。乾燥空気は、開放系または循環システムで、送風機によって動かしてもよい。いくつかの実施形態において、回収デバイス、たとえばボビンまたは平らなシリンダー。シリンダーは、形成速度の約１倍～約９倍の引き込み速度で回転させる。この環境で、本質的に無限に長い繊維が製造される可能性がある。

【0151】

架橋マイクロファイバーの脱水加熱処理（ＤＨＴ）は、前述のようなグリオキサールでのさらなる架橋の有無にかかわらず、１１０℃の真空下で１、３および５日間、弛緩した押出マイクロファイバーを脱水することを含む。

【0152】

紫外線照射（ＵＶＲ）媒介架橋のために、メタクリル化コラーゲンを押出に使用した。次いで、押出マイクロファイバーを、３６５ｎｍ照射ＵＶ光源に２０分間さらした。次いで、これらのマイクロファイバーをデシケーターに入れるか、または１０ｍＭグリオキサールを含む７０％水性エタノールでさらに架橋した。

【0153】

単一のマイクロファイバーは、一貫して取り扱うには繊細過ぎるので、単一のマイクロファイバーの機械的特性は、カートリッジ上の個々のマイクロファイバーの断面積とマイクロファイバーの既知量とを平均して極限引張強さ（ＵＴＳ）、モジュラスおよび破断時の歪み（％）を測定する、「個別繊維」試験方法を使用して得た。２バー回収装置１５０８は円筒形のマイクロファイバーをもたらしたが、固体溝付きスプール上に回収したマイクロファイバーは、薄いリボン状であった。リボン状コラーゲン繊維の幅は、約１０μｍ～約７０μｍ、通常は約１５μｍ～約６０μｍ、より一般的には約２０μｍ～約５０μｍである。リボン状コラーゲン繊維の厚さは、約４μｍ～２０μｍ、通常は約５μｍ～約１８μｍ、最も一般的には約６μｍ～約１７μｍである。

【0154】

幅は、Ａｘｉｏ Ｖｅｒｔ．Ａ１モデル（Ｚｅｉｓｓ社、ドイツ）などの倒立光学顕微鏡およびＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨシェアウェア、メリーランド州ベセスダ）を使用して、個別の長さ１．５インチの３つのマイクロファイバー上の１０の異なる箇所で得た画像を解析することによって測定した。走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を使用したマイクロファイバー束の断面像を使用し、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアを使用して、マイクロファイバーの厚さを測定した。本開示のコラーゲンマイクロファイバーの実施形態のｉｎ ｖｉｖｏでの性能に関連すると考えられる厳しい機械試験の要求を満たすために、Ｇｅｎｔｌｅｍａｎら，２００３年に開示されているような、我々のマイクロファイバー試料に湿潤張力試験を行うための高スループット法を使用してもよい。

【0155】

浴および試料保持システムを使用して、カートリッジ内の束の湿潤引張強さ機械試験を行った。このシステムは、本開示の押出マイクロファイバーの実施形態の浸漬時に、５分ごとに試料を処理しながら３０分間の浸漬を行うことが可能であった。浸漬流体は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社から入手できるＧｉｂｃｏ社のダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）であってもよい。通常は、ＭＴＳ基準モデル４２（ミネソタ州エデン・プレイリー）での一軸引張試験により、最低限４つのカートリッジを１ｍｍ／ｓの引張速度で、室温で機械的に湿潤試験して応力‐歪み曲線を得た。処理パラメータを最適化しつつ個別繊維試験を行って迅速に結果を出した。

【0156】

浴および試料保持システムは、流体中で試験する材料を覆うために十分に充填された浴を含む。流体は、Ｇｉｂｃｏ社のダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）であってもよい。試験時に、試料ホルダーは、張力試験機の対向端のあご部によって流体中に保持した。試験は、あご部を互いから離して動かすことによって行った。

【0157】

本開示の湿潤実施形態のＵＴＳは、通常は約１ＭＰａ～約８００ＭＰａ、通常は約７５ＭＰａ～約４００ＭＰａ、より一般的には約９０ＭＰａ～約３５０ＭＰａ、よりさらに一般的には約１００ＭＰａ～約３２５ＭＰａである。本開示の湿潤実施形態のモジュラスは、約１０ＭＰａ～約７，５００ＭＰａ、通常は約１００ＭＰａ～約６，０００ＭＰａ、より一般的には約１，０００～４，０００ＭＰａである。

【0158】

本開示の乾燥実施形態のＵＴＳは、通常は約２５ＭＰａ～約１，９００ＭＰａ、通常は約１００ＭＰａ～約１，８００ＭＰａ、より一般的には約５０００ＭＰａ～約１，７００ＭＰａ、よりさらに一般的には約１，２００ＭＰａ～約１，７００ＭＰａである。本開示の乾燥実施形態のモジュラスは、約１４，０００ＭＰａ～約２０，０００ＭＰａ、通常は約１５，０００ＭＰａ～約１９，０００ＭＰａ、より一般的には約１５，５００～１８，５００ＭＰａである。

【0159】

湿潤および乾燥繊維の特定の実施形態の比較試験は、湿潤繊維の約１～約７５５ＭＰａの極限引張強さに対する乾燥繊維の約２５～約１６５０ＭＰａの極限引張強さ、湿潤繊維の約１０～７，２００ＭＰａの弾性率に対する乾燥繊維の約１５，９５０～約１８，６００ＭＰａの弾性率、乾燥繊維の約２～約４１％の破断伸びに対する乾燥繊維の約９～約１４％の破断伸び、湿潤繊維の約１４～約８２μｍの平均繊維径に対する乾燥繊維の約１０～約７０μｍの平均繊維径という相対的範囲を示した。

【0160】

ＳＥＭイメージングを用いて、未架橋および架橋押出マイクロファイバーの断面と縦の微細構造特性とを求めた。Ｚｅｉｓｓ Ｅｖｏ １０顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ社）を使用して、ビーム強度１０ｋＶでＳＥＭイメージングを行った。断面については、マイクロファイバー束をＤＰＢＳに３０分間浸漬し、ＳＥＭスタブ上で１時間乾燥し、スパッタコーティングして、イメージングを行った。

【0161】

ＴＥＭについては、Ｔｅｌｏ ＧＬＹグループ（グリオキサールで架橋したテロコラーゲン）からの乾燥マイクロファイバーを、蒸留水を使用して再水和した。次いで、これらを２％グルタルアルデヒド（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ペンシルベニア州）および４％パラホルムアルデヒド（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ社、マサチューセッツ州）中、室温で３０分間固定した。続いて、カコジル酸緩衝液（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を使用して洗浄を２回（各洗浄１０分）行った。これに続いて、１％四酸化オスミウム（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）中で３０分間インキュベーションを行い、カコジル酸緩衝液で１回洗浄し、蒸留水で２回（それぞれ１０分）洗浄した。一連の昇順濃度のエタノール（それぞれ、３０％、５０％、７０％および９５％で１０分間１回、１００％で１０分間２回洗浄）での脱水を行った。次いで、マイクロファイバーをエタノールとプロピレンオキシド（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）の混合物の１：１混合物に１０分間２回浸し、続いて１００％プロピレンオキシド処理を１０分間行った。これらの試料を１：１ ＥＰＯＮ ８１２：プロピレンオキシド（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）中に終夜放置した。ＥＰＯＮ ８１２はグリセロール系脂肪族エポキシ樹脂である。翌日、４：１ ＥＰＯＮ ８１２：プロピレンオキシドに試料を４時間浸し、１００％ＥＰＯＮ ８１２に移して終夜インキュベートした。翌日、試料を新たなＥＰＯＮ ８１２樹脂に移し、弾丸カプセル（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）に組み込み、６０℃で１２時間重合させた。モールドを薄い切片にし、ＴＥＭ（型番Ｊｅｏｌ １２３０、Ｊｅｏｌ ＵＳＡ社、マサチューセッツ州）を使用してイメージングを行った。これらの値を測定するための代替法を使用してもよい。

【0162】

架橋マイクロファイバーの遊離アミノ基の量を評価するためにニンヒドリン試験を使用してもよい。このために、未架橋および架橋マイクロファイバーをそれぞれ１４～１６ｃｍの長さに切った。同時に、製造業者のプロトコルに従って、様々な既知濃度の標準アミノ酸（グリシン（Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ社））の０．０５％酢酸溶液を調製した。マイクロファイバー試料とグリシン溶液を、ニンヒドリン溶液（Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ社）中で２０分間加熱し、続いて室温まで少なくとも１．５時間冷却した。次いで、試料およびグリシン標準品のそれぞれに９５％エタノールを加えた。これらの試料の吸光度を、紫外・可視分光光度計（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉ３、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社、バージニア州ノーフォーク市オールドドミニオン大学）によって５７０ｎｍで記録した。他の方法の試験を使用してもよい。

【0163】

様々な既知のグリシン濃度の吸光度を使用して検量線を作成した。未架橋試料（Ｍｕｘ）と架橋（Ｍｃ）マイクロファイバーにおける遊離アミノ基の量は、溶液の吸光度に比例し、かかる量は、作成したグリシンの検量線から求めた。架橋の程度を算出するために、以下の式１を使用した。

【0164】

【数1】

示差走査熱量測定（ＤＳＣ）およびフーリエ変換赤外（ＦＴＩＲ）分光法を用いて、Ｉ型コラーゲンに特徴的なアミド結合が存在するかどうかを測定した。マイクロファイバーの試験は、示差走査熱量計（ＤＳＣ２５００、ＴＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、デラウェア州）を使用して行い、ＦＴＩＲ分光法は、Ｐｌａｔｉｎｕｍ ＡＴＲ（Ｂｒｕｃｋｅｒ社、マサチューセッツ州ビレリカ）で行った。ＦＴＩＲスペクトルを使用して、波長１２３５ｃｍ^－１、１５６０ｃｍ^－１および１６５０ｃｍにおける、Ｉ型コラーゲンに特徴的なアミド結合の３つの主要なピークの存在を確認した。未架橋および架橋マイクロファイバーは、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ＦＴＩＲバイオインフォマティクスソフトウェア（Ｏｐｅｒａｎｔ社、ウィスコンシン州マディソン）を使用してピークのシフトを評価することによって、出発材料と比較した。

【0165】

単一繊維での押出マイクロフルイディック繊維、１５０本のマイクロファイバーの束（コーテッドバイクリル４‐０（Ｅｔｈｉｃｏｎ社、ニュージャージー州）縫合糸によってつなぎ止め、１０ｍｍの最終サイズに切ったもの）または前述の機械試験に用いたカートリッジを、ＳＴＥＲＲＡＤ化学的インジケータ（４ＭＤ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社、ニュージャージー州レイクウッド）を含むタイベックポーチ内にシールして、２０ＫＧｙ＋１～２ＫＧｙの標的線量を使用する電子ビーム滅菌（Ｓｔｅｒｉ‐Ｔｅｋ社、カリフォルニア州フリーモント）に送付した。

【0166】

滅菌したグリオキサールおよびＤＬ‐グリセルアルデヒド架橋マイクロファイバーを腱細胞増殖培地中で３０分間水和し、ポリ（２‐メタクリル酸ヒドロキシエチル）（ｐＨＥＭＡ）（Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ社）でプレコートした２４ウェルプレートに入れた。２万５千個のヒト腱細胞（ＺｅｎＢｉｏ社、ノースカロライナ州）（１００μｌの腱細胞増殖培地中）を、３連で、滅菌したマイクロファイバーに播種した。播種後、細胞を１時間付着させ、続いて５００μｌの腱細胞増殖培地をさらに加えた。１２日後、マイクロファイバーに付着した腱細胞を、製造業者のプロトコルに従って、生細胞染色剤のＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ（商標）Ｇｒｅｅｎ ＣＭＦＤＡ（５‐クロロメチルフルオレセインジアセテート）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で染色した。次いで、試料を４％パラホルムアルデヒドを使用して固定し、続いて核染色剤のＤＡＰＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で染色して、共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏ Ｏｂｓｅｒｖｅｒ Ｚ１、Ｚｅｉｓｓ社）を使用して、マイクロファイバー上に付着した腱細胞を視覚化した。

【0167】

ヒト腱細胞に対する押出マイクロファイバーの実施形態の細胞毒性（または細胞生存能力）を、ＣｙＱｕａｎｔ乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）細胞毒性アッセイキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）およびＭＴＴアッセイキット（Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ社）を使用し、製造業者のプロトコルに従って評価した。簡潔に言えば、アッセイ用の最適な播種密度を測定した後、４８ウェルプレートの各ウェルに７×ｌ０^３個の腱細胞をプレーティングし、３７℃、５％ＣＯ_２に維持した加湿インキュベーター内の腱細胞増殖培地中で２４時間増殖させた。滅菌したマイクロファイバー束を細胞培養培地中で１０分間すすぎ、各ウェルの腱細胞上に配置した。プラスチック上で増殖させた腱細胞（細胞のみ）を（細胞生存または生存能力の）陽性対照として使用した。ジブチルジチオカルバミン酸亜鉛（ＺＤＢＣ）フィルムおよび１０ｍＭグリオキサール薬液を（細胞生存または生存能力の）陰性対照として用いた。エチコンバイクリル縫合糸は、押出マイクロファイバー束をつなぎ止めるために使用しているため、エチコンバイクリル縫合糸の影響もこの実験で評価した。製造業者のプロトコルに記載されているように、最大および自発的ＬＤＨ放出を評価するために、試料を含まずに腱細胞を播種したウェルを準備した。試料を７日間インキュベートしてから、培地へのＬＤＨの放出を評価した。製造業者のプロトコルに従って、ＬＤＨアッセイを使用して％細胞毒性を算出した。次いで、％細胞生存を、１００－％細胞毒性として算出した。本開示の実施形態において、％細胞生存性は、少なくとも約９４％、通常は少なくとも約９５％、より一般的には少なくとも約９６％、最も一般的には少なくとも約９７％である。９８％または９９％細胞生存性を達成することも可能である。製造業者のプロトコルに従って、ＭＴＴアッセイを使用して％細胞生存能力を算出した。本開示の実施形態において、％細胞生存能力は、少なくとも約７０％、通常は少なくとも約８０％、より一般的には少なくとも約８５％、最も一般的には少なくとも約９０％である。他の適切な試験方法が使用可能である。

【0168】

本開示の押出マイクロファイバーの実施形態とともに増殖した生腱細胞の健康状態および生存能力も、製造業者のプロトコルに従って、ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（商標）アッセイ（Ｂｉｏ‐Ｒａｄ社、カリフォルニア州ハーキュリーズ）を使用して評価した。

【0169】

架橋マイクロファイバー束実施形態をラットに皮下移植した。すべての外科手術は、ＩＳＯ １０９９３‐６に従い、オールドドミニオン大学（バージニア州ノーフォーク）の施設内動物管理使用委員会（ＩＡＣＵＣ：Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）に承認されたプロトコルに従って行い、ｎ＝３で、架橋コラーゲンマイクロファイバー束（前述のように調製し滅菌した）またはコラーゲンコートＦｉｂｅｒＷｉｒｅ（登録商標）（縫合糸対照）を雌スプラーグ・ドーリー・ラットの皮下に埋め込んだ。ラットはイソフルラン吸入で麻酔した。脇腹の毛をそり、Ｎａｉｒ除毛クリームを塗布して、手術部位から毛を除去した。脇腹部位に背側切開を行い、止血鉗子を使用してインプラント用のポケットを作成した。足場をポケットに設置した後、縫合糸を使用して切開を閉じた。４週間後、組織採取のために、ラットを人道的に安楽死させた。

【0170】

４週目で摘出したマイクロファイバー外植片を４％パラホルムアルデヒド（アルファ・エイサー社）で２４時間固定し、次いでＤＰＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に移した。試料を厚さ５μｍに切片化し、連続切片をヘマトキシリン＆エオジン（ＨＥ）およびＩＤＥＸＸ社（ウェストサクラメント）製マッソン・トリクロームで染色した。偏光顕微鏡法を使用して、インプラント周辺の組織のコラーゲン構成をイメージングした。

【0171】

抗体の製造業者によって提供された標準プロトコルを用いて、我々のインプラントの周辺の天然組織におけるＣＣＲ７（Ｍ１）の存在およびＣＤ１６３（Ｍ２）マクロファージの表現型を検出するために、連続切片に免疫標識も行った。簡潔に言えば、脱パラフィン後、抗原採取（ｐＨ６の１０ｍＭクエン酸緩衝液で２０分間煮沸）、透過処理および、２．５％ウマ血清でのブロッキング後に、スライドをＣＤ１６３（Ｍ２マクロファージ表現型）、またはＣＣＲ７（Ｍ１マクロファージ表現型）のいずれかについて染色した。Ｍ２マクロファージ標識であるマウス抗ラットＣＤ１６３（＃ＭＣＡ３４２ＧＡ、ＢｉｏＲａｄ社、カリフォルニア州）を１：３０に希釈して、加湿室で終夜インキュベートした。インキュベーション後、スライドをＰＢＳで洗浄し、１：５０希釈のヤギ抗マウス二次抗体（＃Ａ‐１１００５、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）とともに、室温暗所で１時間インキュベートした。Ｍ１マクロファージ標識であるＣＣＲ７をＰＢＳで１：５０に希釈し、終夜インキュベートした（＃ＭＡ５‐３１９９２、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）。翌日、ＰＢＳ洗浄ステップ（３回）後、ヤギ抗ウサギ蛍光抗体（＃Ａ３２７４０、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を１：２００の濃度でスライドに塗布し、室温暗所で１時間放置した。一次対照のために、血清でブロックしたスライドをＩｇＧマウス（１：３０）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）およびヤギ抗マウス二次抗体（１：５０）またはＩｇＧウサギ（１：２００）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）およびヤギ抗ウサギ二次抗体（１：２００）のいずれかで染色した。二次対照のために、血清でブロックしたスライドを二次蛍光抗体のみで染色した。すべての抗体はブロッキング血清で希釈した。すべてのスライドは、核をＤＡＰＩで５分間染色し、ＰＢＳで洗浄し、ＶｅｃｔａＭｏｕｎｔ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ社、カリフォルニア州）を使用して乗せ、視覚化および分析を行った。

【0172】

免疫標識したスライドを倒立顕微鏡（Ａｘｉｏ Ｖｅｒｔ．Ａ１モデル、Ｚｅｉｓｓ社）を使用して検査し、イメージングした。同じ暴露条件で試験スライドおよび対照スライド（データは示さず）の蛍光画像を取得した。試験試料の画像を評価した。定量分析を行って、Ｍ１のみ、Ｍ２のみ、Ｍ１およびＭ２、ならびに／またはＭ１／Ｍ２表現型なしを発現している細胞数を求めた。ここで、インプラントおよび天然組織（２～３細胞層）の境界面におけるおおよそ２０～３０μｍの画像（試験試料１つについて３画像を分析した）１つについて４～５領域を高出力顕微鏡視野（４０×拡大）を使用して分析した。ＤＡＰＩ染色した核を数えることによって細胞の総数を測定した。各マーカーについて陽性標識された細胞数も数えた。特異的マーカーで標識された細胞の割合を、その領域の細胞の総数の割合として測定した。

【0173】

本開示の実施形態について、長期安定性試験も行った。Ｔｅｌｏ ＧＬＹマイクロファイバーは、カートリッジに張力をかけて脱スプールした。前述のように滅菌した６つのカートリッジを水和して機械的試験を行って、マイクロファイバーの機械的特性を得た後、３７℃および５％ＣＯ_２を維持したインキュベーター内の細菌および真菌汚染を抑制するために、１％ Ｇｉｂｃｏ（登録商標）抗生物質‐抗真菌薬（ＡＢＡＭ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を添加したイーグルの最小必須培地（ＥＭＥＭ）（ＡＴＣＣ社、バージニア州）を含むペトリ皿で、滅菌したカートリッジの残りの部分をインキュベートした。実験の期間を通じて、カートリッジが無菌で汚染のない培地に常に浸漬され、それによって水和が維持されていることを確認した。１週目、１ヶ月目、３ヶ月目および６ヶ月目に、浸漬した６つのカートリッジを取り出してＭＴＳ試験を行った。同時に、経時的なマイクロファイバーの膨潤の程度を測定するために、マイクロファイバーの直径を測定した（前述のように）。

【0174】

対応のない両側ｔ検定を使用して、任意の２グループ間の特性または特徴における有意差を評価した。二元配置分散分析と、それに続くテューキーの事後多重比較検定も使用して、図１７の表１の様々な架橋剤グループについてＵＴＳの差異を評価した。下記の追加詳細に記載されているように、普通の一元配置分散分析に続くダネットの多重比較検定も、健康と生存能力の差異を評価するために行った。アプリオリに、ｐ値＜０．０５を有意と定義した。すべての検定はＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７を使用して行った。すべてのパラメータは平均値±標準誤差（Ｓ．Ｅ．Ｍ．）で示している。

【0175】

追加実施例
本開示の製品および方法の実施形態を行うことによって実施例を得た。以降の試験のためのコラーゲンマイクロファイバーを一定に生成するために、図１５および図１６のロバストなマイクロフルイディック押出装置を設計し、使用した。このアプローチは、架橋異常のない連続的なマイクロファイバーの生成をもたらした。

【0176】

コラーゲンマイクロファイバーを強化し、安定化させるための、広範囲の、従来の、新規の、および組み合わせの架橋条件をスクリーニングした。図１８の表２は、架橋剤の一覧と、前述の試験方法を使用して未架橋マイクロファイバーと比較した、架橋マイクロファイバーの５０タイプの平均ＵＴＳを示す。このデータは、様々な架橋剤／架橋プロトコル（ｉｎ ｓｉｔｕまたは押出後の架橋、架橋剤濃度の範囲および架橋時間）が、程度の差はあれ、マイクロファイバーのＵＴＳに影響を与えることを示した。それらの架橋剤で試験したすべての条件の中で著しく高い平均ＵＴＳを示した架橋条件には、図１８の表２において星印を付けた（ｐ＜０．０１）。

【0177】

図１８に示すように、グリオキサール（押出後１０ｍＭで７２時間、１２１．２±７ＭＰａ）およびＤＬ‐グリセルアルデヒド（押出後２５ｍＭで７２時間、１２８±１２ＭＰａ）などの押出後の化学薬剤による架橋手順は、未架橋マイクロファイバー（６．１±１ＭＰａ）よりも２０倍近く大きいＵＴＳを示すマイクロファイバーを生成した。特に、本押出装置を使用したマイクロフルイディックマイクロファイバーにＥＤＣおよびＥＤＣ／ＮＨＳを使用した架橋は、ＵＴＳ値（それぞれ１６．６±２ＭＰａおよび３０．２±１ＭＰａ）をもたらしたが、これは前述のグリオキサールおよびＤＬ‐グリセルアルデヒドグループよりも著しく低かった。重酒石酸コリン（１ｍＭまたは１００ｍＭ）、ＥＧＣＧ（２００ｍＭおよび１ｍＭ）およびＤ‐ソルビトール（２００ｍＭ）などの化学架橋剤を使用したｉｎ ｓｉｔｕ架橋は、未架橋マイクロファイバーと比較してＵＴＳの有意な減少（ｐ＜０．０１）をもたらした。押出後のＤＨＴ（３日、１６．２±１ＭＰａ）などの物理的架橋技術も、未架橋マイクロファイバーよりも強いマイクロファイバーをもたらしたが、前述のグリオキサールおよびＤＬ‐グリセルアルデヒドを使用する化学架橋グループよりも弱かった。押出後のメタクリル化コラーゲンマイクロファイバーのＵＶＲ処理（１．９±０．２ＭＰａ）も、未架橋コラーゲンマイクロファイバーよりも著しく弱い繊維をもたらした（ｐ＜０．０１）。

【0178】

グリオキサールを使用する押出マイクロファイバーが、ＵＴＳが最も高かったので、様々な時点で１０ｍＭグリオキサールを使用して、いくつかのｉｎ ｓｉｔｕ（Ｌ‐リジンまたはＤ‐ソルビトール）または別様の架橋繊維（ＤＨＴおよびＵＶＲ）の追加の架橋を行った。グリオキサールを使用する追加の架橋は、すべてのこれらのグループのＵＴＳを増加させたが、最も有意な増加（ｐ＜０．０１）は、Ｌ‐リジン（１０ｍＭ、２時間）／グリオキサール（１０ｍＭ、２４時間）（９６．９±５ＭＰａ）およびＵＶＲ（０．３時間）／グリオキサール（１０ｍＭ、２４時間）（８６．６±１０ＭＰａ）グループで認められた。

【0179】

次に、図１９、図２０および図２１を参照して、図１８の表２において試験した架橋剤グループからの典型的なマイクロファイバーの機械的特性を、ヒトＡＣＬ（ＮｏｙｅｓおよびＧｒｏｏｄ，１９７６年；Ｐｅｔｅｒｓら，２０１８年）、アキレス腱（Ｗｒｅｎら，２００１年）および真皮（Ｇａｌｌａｇｈｅｒら，２０１２年）について報告されている値と比較した。図１９は、グラフ１９００で、ＵＴＳ（ＭＰＡ）を示す。図２０のグラフ２０００は、モジュラスＩ ＭＰａを要約し、図２１のグラフ２１００は、破断時の歪み％に関する。ＡＣＬ値は、線１９３０、線２０３０および線２１３０で示す。ＡＴ値は、線１９１０、線２０１０および線２１１０で示し、真皮値は、線１９２０、２０２０および２１２０で示す。各結果は単一のマイクロファイバーに関する。図１９に示す結果は、架橋グループのいくつか、特に、ｉｎ ｓｉｔｕで１０ｍＭ Ｌ‐リジンの有り無しでの１０ｍＭグリオキサールと、２５ｍＭ ＤＬ‐グリセルアルデヒドとのコラーゲンマイクロファイバーの平均ＵＴＳが、ヒトＡＣＬ、ＡＴおよび真皮に関して報告されたＵＴＳ以上であることを明らかにした。

【0180】

これらのチャートは、前述のように押し出されたマイクロファイバーの機械的特性が、架橋シナリオを変えることによって、ヒト前十字靱帯（ＡＣＬ）、ヒトアキレス腱（ＡＴ）およびヒト真皮の機械的特性に適合するか、かつ／またはそれを超えるように調整することができることを明らかにしている。データは、少なくとも４回の同一反復試験で採取し、エラーバーは標準誤差を示す。

【0181】

実施例３～実施例６まで
比較例１、２および３
図１８の表２、図１９、図２０および図２１に示す一次スクリーニングからの、イタリック体で示す４つの架橋条件は、さらなる評価のために、機械的性能、処理時間、および／またはコストなどの顕著な要件を要因として考慮している。本明細書において、以下の繊維が例示されている。

【0182】

実施例３は、１０ｍＭグリオキサールで７２時間架橋したテロコラーゲン（Ｔｅｌｏ ＧＬＹ）である。実施例４は、２５ｍＭ ＤＬ‐グリセルアルデヒドで２４時間架橋したテロコラーゲン（Ｔｅｌｏ ＤＬＧ）である。実施例５は、１０ｍＭグリオキサールで２４時間架橋したアテロコラーゲン（Ａｔｅｌｏ ＧＬＹ）である。実施例６は、２５ｍＭ ＤＬ‐グリセルアルデヒドで７２時間架橋したアテロコラーゲン（Ａｔｅｌｏ ＤＬＧ）である。比較例１は、０．２５ｍＭ ＥＤＣで２４時間架橋したテロコラーゲン（Ｔｅｌｏ ＥＤＣ）である。これらのグループを、未架橋マイクロファイバー（比較例２）および乾燥Ｔｅｌｏ ＧＬＹ繊維（比較例３）と比較した。Ｔｅｌｏ ＥＤＣグループ（比較例ｌ）は、この分野で広く使用されている無害な架橋剤であるため（Ｃｏｒｎｗｅｌｌら，２００７年；Ｅｎｅａら，２０１１年；Ａｈｍａｄら，２０１５年）、比較のために使用した。さらに、材料特性をさらに最適化するために、２バーデバイス１５０８と比較して、溝付き固体スプール１１１０への高い引き込み回収（原料供給と比較して高い回収速度）を使用して、図２２に示す薄いリボン状マイクロファイバーを生成した。

【0183】

図２２は、微細構造的特徴を描写した実施例３のＴｅｌｏ ＧＬＹマイクロファイバーの画像を示す。フレームＡは、単一の乾燥押出架橋マイクロファイバーの光学顕微鏡画像である。フレームＢおよびフレームＣは、様々な倍率での単一の乾燥マイクロファイバーのＳＥＭ画像である。フレームＤは、ＰＢＳに３０分間浸漬した束ねたマイクロファイバーの断面を示す。フレームＤは、本明細書に記載の、図１５および図１６に示す新規マイクロフルイディック装置の実施形態を使用した押出と、それに続く架橋戦略が、矢印２２０６で示すように、一貫性のある均一な薄いリボン状マイクロファイバーを製造したことの構造詳細と証拠を明らかにしている。フレームＢの矢印２２０１および矢印２２０２は、乾燥マイクロファイバーの縦の軸に沿った隙間と隆起を示している。フレームＣの矢印２２０４および矢印２２０５は、湿潤マイクロファイバーの繊維状サブ繊維構造を示している。フレームＥ、フレームＦおよびフレームＧは、押出マイクロファイバーの縦のＴＥＭ画像である。

【0184】

架橋化学の最適化および回収方法の変更が、図２３、図２４、図２５、図２６、図２７および図２８に要約しているように、機械的特性における有意差につながった。前述の浴および試料保持システムにおいて張力試験を行った。図２２のフレームＡ、フレームＢおよびフレームＣにおいて、実施例３に示されるような典型的な画像から測定される、図２３および図２４のＤＰＢＳに浸漬されたリボン状コラーゲンマイクロファイバーの幅および厚さを使用して、図２５のグラフ２５００の改善されたＵＴＳおよび、図２６のグラフ２６００のモジュラスを算出した。実施例３、実施例４、実施例５および実施例６を、比較例１、比較例２および比較例３と同様に試験した。

【0185】

表示２４０２で示すように、湿潤未架橋（３４．１±２μｍ）リボン状コラーゲンマイクロファイバーと比較して、湿潤Ａｔｅｌｏ ＧＬＹ（３９．２±１μｍ）およびＴｅｌｏ ＥＤＣ（４６．４±２μｍ）リボン状コラーゲンマイクロファイバーは、著しく広い幅を示した（ｐ＜０．０５）。同様に、図２３の表示２３０１および図２３の表示２３０３で示すように、湿潤Ａｔｅｌｏ ＧＬＹリボン状コラーゲンマイクロファイバーは、未架橋リボン状コラーゲンマイクロファイバー（９．２±０．５μｍ）よりも著しく厚かった（１１．９±０．５μｍ）（ｐ＜０．０１）。ＤＰＢＳへの浸漬によるリボン状コラーゲンマイクロファイバーの、Ｔｅｌｏ ＧＬＹ（１１．１±０．５μｍ）、Ｔｅｌｏ ＤＬＧ（８．６±０．２μｍ）およびＡｔｅｌｏ ＤＬＧ（１０．９±０．４μｍ）の厚さとＴｅｌｏ ＧＬＹ（３６．１±０．７μｍ）、Ｔｅｌｏ ＤＬＧ（３５．４±０．８μｍ）およびＡｔｅｌｏ ＤＬＧ（３１．１±１μｍ）の幅は、未架橋リボン状コラーゲン繊維のものと類似していた。図２５のグラフ２５００で示されたＵＴＳの最も大きな変化は、未架橋リボン状コラーゲン繊維に認められ、表示２５０４で確認される平均ＵＴＳおよび、図２６のグラフ２６００において表示２６０４で確認されるモジュラスは、６．１±１ＭＰａおよび１１９．８±２３ＭＰａから、３５．８±３ＭＰａおよび７０１±５３ＭＰａに増加した。Ｔｅｌｏ ＧＬＹ（それぞれ、１２１±７ＭＰａ ＵＴＳおよび１１０３±６３ＭＰａモジュラス～２９９±１５ＭＰａおよび３４３１±８６ＭＰａへ）およびＡｔｅｌｏ ＤＬＧ（それぞれ、１２８ＭＰａ ＵＴＳおよび１７３４±７９ＭＰａモジュラス～２３１±１８ＭＰａおよび３４０８±１８５ＭＰａへ）などのグループからのリボン状コラーゲンマイクロファイバーは、図２７のグラフ２７００に示す平均ＵＴＳおよび、図２８のグラフ２８００に示すモジュラスにおいて少なくとも２倍増を示した。試験したすべてのグループについて、破断時の歪み（％）の変化はなかった。

【0186】

溝付き固体スプールからのすべての押出リボン状コラーゲンマイクロファイバーの張力特性において有意な増加が認められた。未架橋リボン状コラーゲンマイクロファイバーグループは、他の架橋剤グループと比較して、平均ＵＴＳおよびモジュラスにおいて最も高い倍率変化を示した。実施例３～実施例６および比較例１～比較例３までのそれぞれについて、図２７のグラフ２７００は、図１９、図２０および図２１に示すデータと比較してＵＴＳの有意な倍率変化を示し、図２８のグラフ２８００は、図１９、図２０および図２１の図に示すデータと比較してモジュラスの有意な倍率変化を示す。

【0187】

対応のない両側ｔ検定を使用して、図２３、図２４、図２５、図２６、図２７、図２８、図２９、図３０、図３１、図３２、図３３、図３７、図３８および図３９における任意の２つのグループ間の有意差を評価した。二元配置分散分析と、それに続くテューキーの事後多重比較検定と対応のない両側ｔ検定を使用して、図１７の表１の様々な架橋剤グループについてのＵＴＳの差異の評価を行った。以下の追加詳細で述べられているように、通常の一元配置分散分析と、それに続くダネットの多重比較検定を行って、図３１、図３２および図３３の差異を評価した。アプリオリに、ｐ値＜０．０５を有意と定義した。すべての検定はＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７を使用して行った。すべてのパラメータは平均値±標準誤差（Ｓ．Ｅ．Ｍ．）で示している。

【0188】

結果は平均±標準誤差で示すが、これは、２以上の個別の実験からの３回の反復試験を表す。表示２３０１は、ｐ＜０．０５を示す。表示２４０２および表示２５０２は、ｐ＜０．０１を示す。表示２３０３は、ｐ＜０．００５を示す。表示２５０４および表示２６０４は、ｐ＜０．０００１を示す。

【0189】

本開示の実施形態について、光学顕微鏡、ＳＥＭおよびＴＥＭイメージングを用いて、マイクロファイバーの微細構造を測定した。他の種類のイメージングを使用してもよい。実施例３において、グリオキサール架橋テロコラーゲンマイクロファイバーを特徴付けた。図２２のフレームＡで示す光学顕微鏡法イメージングおよび、図２２のフレームＢのＳＥＭイメージングは、縦の軸に沿った乾燥マイクロファイバーの均質な幅を裏付けた。縦の断片の図２２のフレームＢおよび高倍率ＳＥＭ（図２２のフレームＣ）イメージングは、図２２のフレームＤで示すように、乾燥マイクロファイバー内の隆起および隙間の平行配向を明らかにした。図２２のフレームＤは、ＤＰＢＳで浸漬した押出架橋マイクロファイバー束の、ＳＥＭを使用した断面の特徴を強調している。これらの画像は、矢印２２０６で示されているように、明白な繊維状サブ繊維構造を有する外部の滑らかな表面の微細構造的特徴を明らかにしている。これは、押出架橋マイクロファイバーが、一貫性のある薄いリボン状であることを示す。天然結合組織における分子からナノスケールまでのコラーゲン配向が我々の架橋マイクロファイバーにおいて再現されているというさらなる証拠が、図２２の、フレームＥ、フレームＦおよびフレームＧのＴＥＭイメージングから明らかにされている。

【0190】

架橋の程度を生化学的に評価するために、架橋マイクロファイバーの実施形態の生化学的、生物物理学的特徴付けであるニンヒドリン試験を使用した。結果を図２９のグラフ２９０１に示す。実施例３のＴｅｌｏ ＧＬＹ（８６±１％）と実施例６のＡｔｅｌｏ ＤＬＧ（８２±３％）マイクロファイバーは、実施例５のＡｔｅｌｏ ＧＬＹ（６８±４％）と実施例４のＴｅｌｏ ＤＬＧ（５９±６％）と比較して著しく高い架橋の程度を示しており、これは、長時間の架橋が架橋効率を改善したことを強調している。

【0191】

押出コラーゲンマイクロファイバーのタンパク質一次構造および二次構造も評価した。酸性化した出発材料のＳＤＳ‐ＰＡＧＥ分析は、コラーゲンα、βおよびγ一次鎖の存在を裏付けた。しかしながら、マイクロファイバーを酸に溶解することができなかったため、マイクロファイバーの酸抽出物中のコラーゲンを検出することができなかった。

【0192】

示差走査熱量測定（ＤＳＣ）の測定を用いた押出マイクロファイバーの生物物理学的特徴付けは、グラフ２９０１で試験した試料と同じ試料についての図２９のグラフ２９０２に示されるように、未架橋のマイクロファイバーグループと架橋のマイクロファイバーグループとの間での、融解温度の有意でない増加を明らかにした。しかしながら、押出マイクロファイバーの平均融解温度（７４±３℃）（グラフ２９０２の線２９３０）は、ヒトＡＴのもの（グラフ２９０２の線２９２０）（６０℃）よりも著しく高く（Ｗｉｅｇｎａｄ，ＰａｔｃｚａｉおよびＬｏｒｉｎｃｚｙ，２０１７年）、これは、より大きな全体的な構造安定性を示す（Ｓａｎｃｈｅｚ‐Ｒｕｉｚ，１９９５年）。図２９のグラフ２９０３のＦＴＩＲスペクトルは、アミドＩ（～１６５０ｃｍ^－１）領域、アミドＩＩ（～１５６０ｃｍ^－１）領域、アミドＩＩＩ（～１２３５ｃｍ^－１）領域、アミドＡ（～３２８５ｃｍ^－１）領域およびアミドＢ（～２９１７ｃｍ^－１）領域において有意なピークシフトを示さず、これは押出後および、本開示に用いた架橋プロセス後にマイクロファイバーの二次構造に変化はないことを示す。グラフ２９０１のデータは平均値±標準誤差で示され、２つの個別の実験からの３回の反復試験を表す。グラフ２９０１において、表示２９１０はｐ＜０．０５であることを示している。

【0193】

図３０の図解３０００のイラスト３００１および３００２と、図３１、図３２および図３３に示すように、本開示の実施形態の押出マイクロファイバーの細胞付着、代謝活性および細胞毒性も測定した。これらの図は、実施例３～実施例６、比較例２および他の試料を含む。ヒト腱細胞を用いて、前述のように、コラーゲン繊維の細胞適合性を評価した。細長い形状のＴｅｌｏ ＧＬＹマイクロファイバーへの腱細胞の付着（実施例５）を図３０のイラスト３００１に示す。Ｔｅｌｏ ＧＬＹマイクロファイバーに播種した腱細胞の約７０％が、１２日後に付着したままであった。実施例３～実施例６、比較例１および他の試料について図３１に要約しているように、陽性対照（細胞のみのグループ）と比較して、ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ蛍光によって、７日以上、腱細胞の代謝活性に有意な変化は認められなかった。しかしながら、選択した繊維グループからのマイクロファイバーとともに増殖している細胞の代謝活性は、陰性対照（１０ｍＭグリオキサール化学薬剤およびＺＤＢＣフィルム）の代謝活性よりも著しく高かった（ｐ＜０．０５）。図３２に示すように、ＭＴＴ試薬を用いてアッセイしたとき、マイクロファイバーとともにインキュベートした腱細胞の生存能力は、プラスチック上で増殖した腱細胞（１００％）と比較して７５％～８５％であった。陰性対照（１０ｍＭ ＧＬＹ化学薬剤およびＺＤＢＣフィルム）は、「細胞のみ」、Ｔｅｌｏ ＤＬＧ（実施例４）、Ａｔｅｌｏ ＧＬＹ（実施例５）およびＴｅｌｏ ＧＬＹ（実施例３）のグループよりも、著しく低い（ｐ＜０．００５）腱細胞の生存率を示した。ＬＤＨアッセイ（図３３）を用いた場合、Ａｔｅｌｏ ＤＬＧおよびＴｅｌｏ ＤＬＧを除くすべての押出マイクロファイバーグループが、「細胞のみ」のグループと類似した腱細胞生存能力を誘発したことを除けば、同様な結果が認められた。図３３の表示３３０３で示すように、７日間の終了時に、１０ｍＭ ＧＬＹ化学薬剤グループには、培地へのＬＤＨ放出を試験するに足りる腱細胞（ＮＤ）がなかった。創傷閉鎖に通常推奨される市販のコーティングされたエチコン製バイクリル縫合糸と比較した。本開示のマイクロファイバーの実施形態は、ＬＤＨおよびＭＴＴアッセイの両方（図３２および図３２）を用いた場合、この縫合糸よりも著しく低い細胞毒性（ｐ＜０．００５）を示すという結果が示された。全体として、複数のアッセイを用いて押出マイクロファイバーの細胞適合性を立証した。

【0194】

特に、画像３００１および画像３００２は、それぞれＤＡＰＩ（矢印３００５）および生細胞染色剤（ＣＭＦＤＡ、矢印３００３で示されている）を用いた、細胞質伸長および伸長した核を示す、Ｔｅｌｏ ＧＬＹマイクロファイバー（実施例３）に付着したヒト腱細胞の典型的な共焦点像を示す。図３１は、細胞のみのグループと比較して、ＡｌａｍａｒＢｌｕｅを用いてアッセイし、７日間インキュベートした後に、架橋マイクロファイバーとともにインキュベートしたヒト腱細胞の代謝活性に有意な変化がないことを示す。代謝活性は、マイクロファイバーグループと比較して、陰性対照（ＺＤＢＣフィルムおよび１０ｍＭ ＧＬＹ化学薬剤）およびバイクリル縫合糸とともにインキュベートした腱細胞において著しく低かった。図３２に要約しているＭＴＴアッセイ結果は、細胞のみのグループと比較して、マイクロファイバーグループとともにインキュベートした腱細胞の生存能力は低下するが、陰性対照と比較すれば有意な増加を示すことを明らかにした。一方で、図３３に示すＬＤＨアッセイ結果は、陰性対照だけでなく、Ａｔｅｌｏ ＤＬＧ（実施例６）およびＴｅｌｏ ＤＬＧ（実施例４）マイクロファイバーグループの細胞生存の有意な減少を示している。ＭＴＴおよびＬＤＨアッセイは、両方とも、腱細胞でのインキュベーションの７日後に行った。図３２および図３３のすべてのデータは、細胞のみのグループに対して正規化している。表示３３０３における（ＮＤ）は、１０ｍＭグリオキサール化学薬剤処理グループが、アッセイの終了時点で、ＬＤＨを検出するためには細胞数が不十分な著しい増殖抑制があったことを示す。これらの図において、表示３１０１および表示３３０１は、ｐ＜０．０５であることを示し、表示３２０２は、ｐ＜０．０１であることを示し、表示３１０３および表示３２０３は、ｐ＜０．００５であることを明らかにし、表示３２０４および表示３３０４は、ｐ＜０．０００１であることを明らかにしている）。

【0195】

本開示の押出マイクロファイバーの実施形態の生体適合性を評価するために、実施例３～実施例６（Ａｔｅｌｏ ＤＬＧ、Ｔｅｌｏ ＤＬＧ、Ｔｅｌｏ ＧＬＹおよびＡｔｅｌｏ ＧＬＹ）の選択した４つの架橋剤グループの滅菌したマイクロファイバー束を、ＩＳＯ １０９９３‐６に従ってラットに皮下移植した。図２３、図２４、図２５、図２６、図２７および図２８における４つの架橋剤グループのそれぞれから移植したマイクロファイバー束と、縫合糸対照（コラーゲンコートＦｉｂｅｒＷｉｒｅ（登録商標））グループは、図３４、図３５および図３６に示す、様々な程度の細胞浸潤、新生血管、コラーゲン沈着および組織リモデリングを特徴とする別個の宿主組織の反応を誘発した。中でも、グリオキサール架橋マイクロファイバーグループ（Ｔｅｌｏ（ＧＬＹ）（実施例３）またはＡｔｅｌｏ（ＧＬＹ）（実施例５））は、ＤＬ‐グリセルアルデヒド（Ｔｅｌｏ ＤＬＧ（実施例４）またはＡｔｅｌｏ ＤＬＧ（実施例６））架橋グループと比較して弱い炎症誘発性反応を示した。図３４の横断画像３４０１および縦画像３４０２に示すＴｅｌｏ ＧＬＹ（実施例３）グループの典型的なＨＥ染色画像は、横断画像３６０１および縦画像３６０２を含む、図３６に示す縫合糸対照と比較して著しく高い細胞浸潤を示した。図３６の縫合糸対照は、マイクロファイバーインプラントと比較して、４週目に強い炎症反応を誘発した。

【0196】

図３５の画像３５０１において、Ｔｅｌｏ（ＧＬＹ）（実施例３）マイクロファイバーインプラントの周りの天然組織において新しく形成されたコラーゲンの沈着をマッソン・トリクローム染色によって視覚化した。マッソン・トリクローム染色した縦の断片は、図３５の画像３５０２に示し、また図３６の画像３６０２の偏光イメージングは、マイクロファイバーの周りに組織的に新しく形成されたコラーゲンの沈着を示す。

【0197】

ＨＥ染色切片（図３４の画像３４０１の黄色矢印）の高倍率断面像で見られるように、マイクロファイバーインプラント内および周辺組織において血管および毛細血管が同定された。

【0198】

図３４、図３５および図３６は、４週目における、Ｔｅｌｏ ＧＬＹ（実施例３）グループのラット皮下インプラントの典型的な画像である。画像３４０１および画像３５０１は、図３４のＨＥおよび図３５のマッソン・トリクロームの横断断片を示す染色スライド上で、矢印３４１０によって識別されるマイクロファイバーｍを示す。挿入画像３４９０は、ＨＥインプラントの断片全体を示し、挿入画像３４９５は、画像３４０１で示された部分を示す。同様に、挿入画像３５９０は、マッソン・トリクロームインプラントの断片全体を示し、挿入画像３５９５は、画像３５０１で示された部分を示す。画像３４０１および画像３５０１は、いずれも、著しい細胞浸潤を示す。図３４の矢印３４２０は、インプラント内の血管を指し示す。画像３６０１は、ＨＥ染色を用いて、対照試料であるコラーゲンコートＦｉｂｅｒＷｉｒｅ（登録商標）における無視できる細胞浸潤を示す。画像３４０２はＨＥを示し、画像３５０３２は、マイクロファイバーインプラントの縦断片のマッソン・トリクローム染色を示す。図３６の偏光画像３６０２は、配向したマイクロファイバーおよび、インプラントの周囲に新しく形成されたコラーゲンを示す。画像３４０２、画像３５０２および画像３６０２は、インプラントの周囲の天然組織における新しい配向したコラーゲンの形成を示す。画像３６０１の凡例「縫合糸対照」は、コラーゲンコートＦｉｂｅｒＷｉｒｅ（登録商標）を示す。

【0199】

免疫染色を用いて、４つの架橋剤グループからのマイクロファイバーインプラントの周囲の天然組織におけるマクロファージ分極の程度を測定した。図３７および図３８は、４週目における、Ｔｅｌｏ ＧＬＹ（実施例３）マイクロファイバーインプラントの周囲のラットの天然組織におけるＣＣＲ７（Ｍ１）（図３７の画像３７００）およびＣＤ１６３（Ｍ２）（図３８の画像３８００）マクロファージ表現型の発現パターンを示す典型的な免疫蛍光画像である。図３８は、Ｍ１およびＭ２の両方、Ｍ１のみ、Ｍ２のみ、またはＭ１／Ｍ２表現型なしを発現したマクロファージの割合の定量化を示す。図３９のグラフ３９００に示すように、グリオキサール架橋グループ（Ｔｅｌｏ（ＧＬＹ）（実施例３）およびＡｔｅｌｏ（ＧＬＹ）（実施例５））は、ＤＬ‐グリセルアルデヒド架橋グループ（Ｔｅｌｏ ＤＬＧ（実施例４）およびＡｔｅｌｏ ＤＬＧ（実施例６））と比較して、Ｍ１およびＭ２表現型を発現するマクロファージの著しく高い割合（約４０％）を示した。さらに、Ｔｅｌｏ（ＧＬＹ）（実施例３）グループとＡｔｅｌｏ（ＧＬＹ）（実施例５）グループとの間で、Ｔｅｌｏ ＧＬＹインプラントは、Ｍ２のみの表現型（６％）を発現する細胞の小さなサブセットを誘発したのに対し、グループの残りは、無視できるＭ２のみの表現型（Ａｔｅｌｏ ＧＬＹ（０．２％）、Ｔｅｌｏ ＤＬＧ（０％）およびＡｔｅｌｏ ＤＬＧ（０％）（図３９））を示した。グリオキサール架橋グループ（Ｔｅｌｏ ＧＬＹ（２４％）およびＡｔｅｌｏ ＧＬＹ（１９％））と比較して、ＤＬ‐グリセルアルデヒド架橋グループ（Ｔｅｌｏ ＤＬＧ（６４％）およびＡｔｅｌｏ ＤＬＧ（５８％））において、Ｍ１表現型を有する細胞の割合が著しく高かった。前述のように、適切な対照の染色は、無視できる非特異的バックグラウンド染色を示した（図示せず）。縫合糸対照試料の切片化アーチファクトおよび、著しいバックグラウンド染色は、これらの試料に対してこの分析を行うことを困難にした。

【0200】

典型的な免疫蛍光画像３７００および免疫蛍光画像３８００は、矢印３８４０で示されるマイクロファイバーであるＴｅｌｏ（ＧＬＹ）（実施例３）に対する４週目における宿主マクロファージ応答の例を示す。黄色矢印３７１０および黄色矢印３８１０は、Ｍ１およびＭ２の両方を発現している細胞の例を示す。オレンジ色矢印３７２０およびオレンジ色矢印３８２０は、Ｍ１のみを発現している細胞の例を示す。白色矢印３７３０および白色矢印３８３０は、Ｍ２のみの表現型を発現している細胞を示す。矢印３８４０は、ｍによって示されるマイクロファイバー束を指し示す。図３９のグラフ３９００は、架橋マイクロファイバーの４グループについて、Ｍ１およびＭ２、Ｍ１のみ、Ｍ２のみ、またはＭ１／Ｍ２表現型なしを発現している細胞の％を示す。この分析からの結果は、試験したすべてのマイクロファイバーグループにおける再生促進性Ｍ２マクロファージ表現型の開始を示す。グリオキサールで架橋した繊維グループは、ＤＬ‐グリセルアルデヒド架橋繊維グループと比較して、Ｍ１およびＭ２表現型を有する細胞の高い割合を示した。さらに、Ｔｅｌｏ ＧＬＹグループは、わずかだが有意なＭ２のみのマクロファージのサブセットを有していた。グラフ３９００において、表示３９０１は、ｐ＜０．０５であることを明らかにし、表示３９０２は、ｐ＜０．０１であることを示し、表示３９０３は、ｐ＜０．００５であることを示す）。

【0201】

本開示のマイクロファイバーの実施形態の培地中での長期水和反応の、機械的特性と膨潤の程度とに対する影響を測定した。Ｔｅｌｏ（ＧＬＹ）（実施例３）マイクロファイバーが、最適な機械的特性、細胞適合性および生体適合性を示したため、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの生理的条件を模倣して、長期安定性についてこのグループをさらに試験した。ＥＭＥＭ（イーグルの最小必須培地）でのインキュベーションは、図４０のグラフ４０００で示すように、６ヶ月目で５３％（３６．４±１．１μｍ（０日目）～５６．０±１．６μｍ（６ヶ月目）まで）のマイクロファイバー幅の増加をもたらした。このグラフは、経時的な湿潤マイクロファイバーの膨潤の程度を示す。この膨潤は、機械的特性の著しい低下を伴う。図４１のグラフ４１００は、破断時の平均力が６ヶ月目でその初期値から５４％減少したことを示す。平均ＵＴＳ（図４２のグラフ４２００）およびモジュラス（図４３のグラフ４３００）も、６ヶ月目で開始時点から８２％減少した。インキュベーションの０日目から６ヶ月目の間で破断伸び（％）に有意な変化はなかった（図４４のグラフ４４００）。

【0202】

このように、図４０、図４１、図４２、図４３および図４４は、Ｔｅｌｏ ＧＬＹマイクロファイバーが安定であり、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの生物学的環境を模倣した条件下（３７℃、５％ＣＯ_２に維持した加湿インキュベーター中、無菌細胞培養培地）でインキュベートしたとき、６ヶ月目まで溶解しなかったことを示す。

【0203】

これらの図からわかるように、加湿インキュベーター中、３７℃、５％ＣＯ_２で１週目、１ヶ月目、３ヶ月目および６ヶ月目に評価した、無菌ＥＭＥＭ中、張力下でインキュベートしたＴｅｌｏ ＧＬＹマイクロファイバーの機械的安定性は、０日目と比較して、６ヶ月目の終了時に、Ｔｅｌｏ ＧＬＹマイクロファイバーは５０％膨潤し（図４０）、破断強度は６０％低下し（図４１）、ＵＴＳは８０％低下し（図４２）、モジュラスは８０％低下した（図４３）。しかしながら、６ヶ月目の終了時に、％破断時の歪みに有意な変化はなかった（図４４）。これらの図に示すすべての値は、０日目の１の値に対して正規化している。これらの図の連続線は、読者へのガイドとしてのみ役立たせるために目視により描いたものである。データは平均値±標準誤差で示し、これは少なくとも５回の反復試験を表す。

【0204】

ＳＤＳ‐ＰＡＧＥを用いて、コラーゲン出発材料（凍結乾燥したテロコラーゲンまたはアテロコラーゲン）と、未架橋および架橋マイクロファイバーを比較した。コラーゲン出発材料は、終夜撹拌後に、５０ｍＭ ＨＣｌに容易に溶解した。しかしながら、押出マイクロファイバーは０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で溶液にならず、したがってバンドを示さなかった。マイクロファイバーの酸抽出物中のコラーゲンの有無を確認するために、これらの抽出物を出発材料および前染色分子量マーカー（ＨｉＭａｒｋ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州）の溶液とともに勾配ゲル（３％～８％）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で電気泳動した。ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州）を用いてゲルを染色し、次いで脱イオン水ですすいでそれらを脱染した。次いで、ゲルを白色光で投影し、すべての目に見えるタンパク質バンドを調べた。このように、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥは、最大ＵＴＳと未架橋繊維とを有するグループからの押出繊維が、約１１５ｋＤａ領域のモノマー領域、約２３０ｋＤａ領域のダイマー領域および約４６０ｋＤａ領域のトリマー領域に特徴的なバンドを有するＩ型コラーゲンフィンガープリントを示す酸性化した出発材料と比較して、酸加水分解に耐性を示したことを明らかにしている。

【0205】

図４５は、本開示の実施形態と比較した、文献に掲載された最も性能の高い（水和）架橋コラーゲン繊維のいくつかの機械的張力特性を要約している。

【0206】

要約すると、本開示は、天然の縫合糸から操作された結合組織に至るまでの、適応症に使用する生体適合性繊維として精度、一貫性およびスケーラビリティを有するＩ型コラーゲンマイクロファイバーを製造するための新規マイクロフルイディック押出プロセスに関する。本開示は、本開示のバイオ製造したグリオキサール架橋テロコラーゲンマイクロファイバーの実施形態が、従来の架橋コラーゲン押出マイクロファイバーよりも優れた乾燥および湿潤張力特性を示すことを明らかにする（ＰａｕｌおよびＢａｉｌｅｙ，２００３年；ＣａｒｕｓｏおよびＤｕｎｎ，２００４年；Ｚｅｕｇｏｌｉｓ，ＰａｕｌおよびＡｔｔｅｎｂｕｒｒｏｗ，２００９年；Ｅｎｅａら，２０１１年）。

【0207】

従来の研究の多くは、水和繊維について張力試験を行ったかどうかを報告してないか、または乾燥繊維についての疑わしく紛らわしい結果を示しているか、または十分に水和されている場合はその繊維がどのようにして湿潤されたかを開示してないか、であるが、本明細書における本開示の実施形態の結果は、比較のために、またこの分野における成長のために重要な詳細な試験方法とともに、最適化された架橋繊維の乾燥および水和特性を提供する。

【0208】

溝付きドラムへの繊維の回収は、すべての架橋マイクロファイバーの構造的および機械的水和特性に著しい変化をもたらした（図２２、図２３、図２４、図２５、図２６、図２７、および図２８参照）。機械的に、改善されたこの強度は、ＡＣＬ、アキレス腱、真皮または任意の他の柔らかい結合組織よりも強い繊維張力特性をもたらす、かって繊維であったリボンへのテンパリング、菲薄化および改善された分子の配向に関連する可能性がある。

【0209】

本開示の実施形態において、架橋機構の効率の程度の測定が重視される。不十分な架橋は、より低い引張強さをもたらす場合があるが、化学薬剤の架橋剤の過剰使用は、細胞毒性を引き起こす、マイクロファイバーの表面への架橋剤の残留物をもたらす場合がある。ニンヒドリン試験（図３６）は、最大架橋度を有するグループが７２時間架橋グループ（Ｔｅｌｏ ＧＬＹおよびＡｔｅｌｏ ＤＬＧ）であり、これは引張強さの有意な増加にも関連していたことを明らかにした。アルデヒドを用いる架橋の化学的構造は、強固な分子結合をもたらす、コラーゲン内の機能性アミノ基とのシッフ塩基型化合物の形成を含む（Ｆａｔｈｉｍａら，２００４年）。

【0210】

押出マイクロファイバーの実施形態の化学分析は、これらが酸加水分解にさらに耐性を示すことを明らかにした。本明細書で開示されるマイクロフルイディクス機器または装置は、凍結乾燥された出発材料よりも高い化学的安定性を有するマイクロファイバーを生成したが、これは、安定な高次構造をもたらす、マイクロファイバー内のコラーゲン分子の密充填を示唆し、また、低い内部水分含量を示唆する。このような高次構造は、天然結合組織において報告されている（Ｂｅｎｊａｍｉｎ，ＫａｉｓｅｒおよびＭｉｌｚ，２００８年；Ｗａｎｇ，ＧｕｏおよびＬｉ，２０１２年）。押出マイクロファイバーにおける二次構造の完全性は、図２９に示すＦＴＩＲ分析から確認したが、これはまた、押出プロセスまたは架橋技術のどちらもコラーゲンを変性させなかったことも示唆する。

【0211】

バイオミメティクスにおけるコラーゲンの架橋は、張力特性を改善するのに役立つ可能性があるが、架橋に用いる化学薬剤（たとえばグルタルアルデヒド）の分解が中毒性を示すことがある（Ｇｏｕｇｈ，ＳｃｏｔｃｈｆｏｒｄおよびＤｏｗｎｅｓ，２００２年；Ｕｍａｓｈａｎｋａｒ，ＫｕｍａｒｉおよびＭｏｈａｎａｎ，２０１２年）。やや低い細胞毒性を示す他の化学薬剤の中で、コラーゲンマイクロファイバーにとって、架橋剤としてのＥＤＣまたはＥＤＣ／ＮＨＳが、一般的な基礎研究選択肢である（Ｅｎｅａら，２０１１年；Ａｈｍａｄら，２０１５年；Ｓｈｅｐｈｅｒｄら，２０１５年）。しかしながら、引張強さにおける改善はほとんど見られず、これらの古典的架橋剤による広く知られている中毒作用が存在するため、結合組織修復に使用するためには、それらはほとんど適していなかった。我々は、本研究において、ＵＳＦＤＡ認可に一般的に必要な標準的なＩＳＯ １０９９３試験に従って、高度に細胞適合性であり（図３０、図３１、図３２および図３３参照）、図３４、図３５および図３６に示すように）ｉｎ ｖｉｖｏで生体適合性である、グリオキサールまたはグリセルアルデヒドのいずれかで化学的に架橋した、機械的に優れた押出コラーゲンマイクロファイバーの開発を明らかにする。さらに、グリオキサールで架橋したコラーゲンマイクロファイバーは、酸加水分解に耐性を示し、ほぼ分子レベルに至るまで微細構造的特徴が明らかとなり、細胞培養培地中で少なくとも６ヶ月間安定を維持し、単一のマイクロファイバーの能力は、最初の耐荷力のおよそ約３０％～約５０％、通常は約４０％を維持し、天然ＡＣＬよりも大きいＵＴＳを維持する（図４０、図４１、図４２、図４３および図４４参照）。

【0212】

本明細書に記載の創傷治癒におけるコラーゲンベースのマイクロファイバーまたはコラーゲンベースの編んだ縫合糸を使用するＡＣＬまたはアキレス腱の縫合修復の強化には、組織を機械的に維持するだけでなく、合理的な速度で組織のリモデリングも促進するコラーゲンベースの材料を必要とする（Ｄｕｎｎ，ＡｖａｓａｒａｌａおよびＺａｗａｄｓｋｙ，１９９３年）。これらの化学的に架橋したマイクロファイバーの細胞毒性、炎症反応および再生応答に対する影響を立証するｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏ生体適合性試験が重要である。本開示の押出マイクロファイバー束の実施形態は細胞適合性であり、ヒト腱細胞に対して最小限の毒性を示した。本開示のマイクロフルイディック押出マイクロファイバーは、ヒト腱細胞の付着をさらに支持し、結合組織で認められるような、伸長した形状が想定される（Ｂｅｎｊａｍｉｎ，２０１０年）。生体適合性は、「非繊維性創傷治癒、再建および組織一体化を局所的に引き起こしガイドする」インプラントの能力と定義された（Ｒａｔｎｅｒ，２０１１年）。架橋マイクロファイバー束インプラントは、ラットに皮下移植後４週目に、低度（グリオキサールグループ）から中等度（グリセルアルデヒドグループ）の炎症反応を示し、グリオキサール‐テロコラーゲングループでは、再生促進性応答の開始を示した。さらに、長期安定性データおよびラット組織像は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで少なくとも６ヶ月目まで、ｉｎ ｖｉｖｏで少なくとも４週目までマイクロファイバーの安定性を示した。このように、本開示の実施形態は、ｉｎ ｖｉｖｏで少なくとも約１ヶ月間、ｉｎ ｖｉｔｒｏで少なくとも約３ヶ月間、最長約６ヶ月間、強度を維持することができる。

【0213】

マクロファージは、たとえば材料の移植時に組織損傷に対する応答として宿主において活性化される単核細胞の異種混合体である（Ｍｏｓｓｅｒ，２００３年；ＧｏｒｄｏｎおよびＴａｙｌｏｒ，２００５年）。インプラントと宿主組織との境界面におけるマクロファージ表現型分極（Ｋａｓｎｅｒら，２００９年；Ｂｒｏｗｎら，２０１２年）は、炎症誘発性シグナルおよび、外科用インプラントに応じた組織修復およびリモデリングに向けての移行を克服する宿主の潜在能力を判定するのに重要である。マクロファージ表現型は、炎症誘発性シグナルを有するＭ１（または「古典的」活性化）および、免疫調節特性または組織リモデリング特性を有するＭ２（または「選択的」活性化）として広く特徴付けられている（Ｍｉｌｌｓら，２０００年）。しかしながら、活性化マクロファージは、Ｍ１からＭ２へ、そしてＭ２からＭ１へ、表現型を容易に切り替えることができる可塑性を有していることに注意することが重要である。この可塑性は、局所的な微小環境の変化によって引き起こされる（Ｐｏｒｃｈｅｒａｙら，２００５年；Ｓｔｏｕｔら，２００５年）。これによって、マクロファージは、Ｍ１およびＭ２表現型の両方の移行特性を採用することも可能である（ＢｒｏｗｎおよびＢａｄｙｌａｋ，２０１３年）。本開示の実施形態において、Ｍ１、Ｍ１およびＭ２、またはＭ２表現型を示す細胞の割合を測定した。これらの測定は、以下を示唆した。（１）移植４週目で、グリオキサール架橋グループは、Ｍ１およびＭ２またはＭ２のみの表現型をより多く有する細胞を有し、これは組織リモデリング応答が４週目に宿主によって開始されていることを示唆している。これは、グリオキサールグループからのマイクロファイバーが大部分生体適合性であることを示唆している。我々の知る限り、免疫応答のこのような詳細な分析は、架橋コラーゲンマイクロファイバーを用いてはなされていない。

【0214】

創傷治癒のための縫合糸へのコラーゲンの組み込みは課題となっていた。しかしながら、本開示は、効果的な製品の製造のための方法および装置を提供する。本明細における研究のための対照として、コラーゲンコートＦｉｂｅｒＷｉｒｅ（登録商標）非吸収性縫合糸（市場で入手可能な唯一のコラーゲンベースの合成縫合糸）を用いた。このＦｉｂｅｒＷｉｒｅ（登録商標）は、インプラントの周囲で天然組織の内殖または再生をほとんど示さない限定的な細胞浸潤を示した。対照的に、縫合糸様束の形態の、本開示のグリオキサール架橋コラーゲンマイクロファイバーの実施形態は、周辺組織に新しく形成されたコラーゲンを伴う著しい細胞浸潤を示したが、これは再生治癒を示唆する。

【0215】

本開示の実施形態は、グリオキサールで架橋した臨床品質のＩ型コラーゲン繊維のマイクロフルイディック押出が、従来報告されている他のバイオ製造プロセスによって製造される純粋コラーゲンを超える模範的な引張強さ、構造安定性、細胞適合性および生体適合性を示すことを明らかにする。コラーゲン繊維を安定化させるためのグリオキサールの使用は、付加的なコラーゲンマイクロファイバーのバイオ製造のための、臨床的に意義がある安全で有効な方法を提供する。これらの最適化されたコラーゲンマイクロファイバーは、人の健康を著しく改善するために設計された、外科用縫合糸、靭帯への内部装具、組織工学で作られた靭帯、腱および他の強固な繊維組織にわたる、多様な生体医学的応用に容易に加工することができる。

【0216】

実施例７
コラーゲン溶液および形成緩衝液を調製した。１．６％（ｗ／ｖ）の濃度の溶液を作成するのに十分な量の臨床用凍結乾燥アテロコラーゲン（Ｓｙｍａｔｅｓｅ社、フランス）をポリプロピレン密閉容器中で０．０５Ｍ酢酸に溶解した。この溶液を、室温で終夜、１８０ｒｐｍで撹拌した。均一な混合を確実にするために、溶液の全量は、容器の容量の半分未満にした。翌日に、酸性化したコラーゲン混合物を、７３０ｇで５分間、遠心分離機でスピンダウンした。溶液を２分間脱気し、７３０ｇで１０分間スピンダウンして気泡を除去した。得られた酸性化したアテロコラーゲンを、８つの２０ｍＬシリンジ（Ｈｓｗ（登録商標）Ｎｏｒｍ‐Ｊｅｃｔ（登録商標）無菌ルアーロックシリンジ、ＶＷＲ社）に吸い上げ、図４６に示す高出力コラーゲンマイクロファイバー押出装置で直接使用した。

【0217】

形成緩衝液を調製するために、１００ｍｌのミリＱ水に、１０ｇｍのＰＥＧ（ポリエチレングリコール）（３５ＫＤａ、ＣｈｅｍＣｒｕｚ社）、０．６８６ｇｍのＴＥＳ（Ｎ‐トリス（ヒドロキシメチル）メチル‐２‐アミノエタンスルホン酸）（Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ社）、０．７９０ｇｍの塩化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ社）、０．４１４ｇｍのリン酸一ナトリウム（Ｂａｋｅｒ Ａｎａｌｙｚｅｄ）および１．２１ｇｍのリン酸二ナトリウム（Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ社）を加えた。この混合物を、撹拌プレート上のガラスビーカーに入れ、室温で終夜、４００ｒｐｍで撹拌した。翌日に、１０Ｍ水酸化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ社）を添加することによってこの溶液のｐＨを８に調整し、次いで溶液を、０．４５μｍフィルターを使用して濾過した。

【0218】

押出の日に、ミリＱ水８００ｍｌにエタノール（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）２００ｍｌを混合して、脱水浴用の２０％エタノール溶液を得た。

【0219】

図４６は、酸性化したアテロコラーゲンが加工処理されるシステム４６００の一部を示す。シリンジアレイポンプを、回転可能プレート４６０１および全８つのシリンジと協働するように取り付けた。撚り合わせの有り無しで繊維束試料を製造した。繊維束は、形成浴を通して移動し、緩衝溶液が酸を中和してフィブリルを形成するときに強固になった。次いで、撚り合わせた束と撚り合わせていない束とを、２０％水性エタノール脱水浴に入れ、そこで水を除去し、繊維をさらに強化した。浴の末端で溝付きスプール（図示せず）に束が付着するまで、テンショニングリグで繊維束に一定の張力をかける。繊維における張力は、強度と安定性のために、コラーゲンを引っ張り、構築するのに役立った。次いで、スプールしたコラーゲンを乾燥し、グリオキサールで架橋し、３Ｄグラフトの作成に用いた。

【0220】

押出後の化学架橋のために、未架橋のピンと張ったコラーゲン繊維束を大きな溝付きスプールに回収し、半時間風乾し、次いで大きなアクリル管中で架橋剤溶液の７０％エタノール溶液に浸漬し、次いで１ｒｐｍのロッカーに配置した。水性エタノール媒体は、架橋時間を通してマイクロファイバーが脱水されたままであることを確実にする。架橋後、さらなる試験を行うまで、マイクロファイバーをデシケーター中に保存した。

【0221】

使用した化学架橋剤は、１０ｍＭの濃度の、ジアルデヒドであるグリオキサールであった。アルデヒドを用いる架橋の化学的構造は、コラーゲン内の機能性アミノ基とのシッフ塩基型化合物の形成を含み、これは強固な分子結合をもたらす。

【0222】

このように製造される単一の繊維束の機械的特性は、カートリッジ上の個々の繊維束の断面積および繊維束の既知量を平均し、極限引張強さ（ＵＴＳ）、モジュラスおよび破断時の歪み（％）を測定する「個別繊維」試験方法を使用して得た。繊維の直径は、倒立顕微鏡（Ａｘｉｏ Ｖｅｒｔ．Ａ１モデル、Ｚｅｉｓｓ社、ドイツ）およびＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨシェアウェア、メリーランド州ベセスダ）を使用して、個別の長さ１．５インチの３つの繊維束上の１０の異なる箇所で得た画像を解析することによって測定した。

【0223】

図４７～図５１は、様々な試験条件下での、すなわち撚り合わせない繊維および撚り合わせた繊維に関しての、繊維束の機械試験の結果を示す。繊維タイプ間で有意差はなかった。図５２～図５６は、様々な時点での、グリオキサールで架橋後の撚り合わせない繊維束の機械試験の結果を示す。ピーク負荷（図５３）およびＵＴＳ（図５５）において有意差水準はｐ＜０．０１（^＊＊）であり、モジュラス（図５４）およびＵＴＳ（図５５）において有意差水準はｐ＜０．００１（^＊＊＊＊）であった。

【0224】

図５７は、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて得たマイクロファイバー束の断面像である。図５７は、２つのマルチ繊維束の構造を示す。第１束５７０１および第２繊維束５７０２は８本の繊維を含む。第１束５７０１は、第１繊維５７１０、第２繊維５７２０および第３繊維５７３０を明らかに示す。図５７はまた、第２繊維５７２０の第２末端５７２１、第３繊維５７３０の第３末端５７２１および、これ以外でははっきりと識別できない繊維の第４末端５７３９をはっきりと示す。面５７０５は、第１繊維束のすべての繊維の末端である。

【0225】

第２繊維束５７０２は、第５繊維５７４０と第５末端５７４１、第６繊維５７５０と第６末端５７５１、第７繊維５７６０と第７末端５７６１および、これ以外でははっきりと識別できない繊維の第８末端５７４９を示す。表面５７０６は、第２繊維束５７０２のすべての繊維の末端である。

【0226】

図５８は、オクタ繊維束のＳＥＭ画像である。

【0227】

本発明の様々な実施形態について述べてきたが、説明は例示を目的としたものであり、限定するものではなく、本発明の範囲内にあるさらに多くの他の実施形態および実施態様が可能であることは、当業者には明らかであろう。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲およびその均等物によってのみ限定されるものである。また、添付の特許請求の範囲の範囲内で様々な修正および変更を加えることもできる。

【0228】

参考文献
以下の記事および特許権を含む、本明細書で示されたすべての文献は、参照によってその全体が本願に組み込まれる。

PCT Application No. 1PCT/US2018/000119, attached hereto as Appendix A; and
PCT Application No. PCT/US2018/57412, attached hereto as Appendix B;

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【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18A】

【図18B】

【図18C】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【図36】

【図37】

【図38】

【図39】

【図40】

【図41】

【図42】

【図43】

【図44】

【図45】

【図46】

【図47】

【図48】

【図49】

【図50】

【図51】

【図52】

【図53】

【図54】

【図55】

【図56】

【図57】

【図58】

【手続補正書】

【提出日】2022-03-28

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

押し出されたコラーゲン繊維であって、
複数の押し出されたサブ繊維を含み、前記サブ繊維はグリオキサールで架橋されている、繊維。

【請求項2】

前記繊維は、規則正しい縦配向構造を示す、請求項１に記載の繊維。

【請求項3】

以下の特徴の1つまたは複数を有している、請求項２に記載の繊維。
（ａ）約1MPaから約1,700MPaの極限引張強さ、
（ｂ）約10MPaから約20,000MPaの弾性率、
（ｃ）約2パーセントから約45パーセントの破断伸び、
（ｄ）約10μmから約90μmの平均繊維径、
（ｅ）ダルベッコりん酸緩衝液（DPBS）に室温で少なくとも約1時間浸した後もその強度を維持する、
（ｆ）3か月間の培養で、初期の耐荷重能力の50％を保持する、
（ｇ）in vivoでの再生促進性M2マクロファージ応答の上昇を促進する。

【請求項4】

前記繊維は、少なくとも約８５パーセントの架橋度を有するテロコラーゲン、または少なくとも約６５パーセントの架橋度を有するアテロコラーゲンである、請求項３に記載の繊維。

【請求項5】

前記極限引張強さは約25MPaから約1,700MPaの範囲にあり、
前記弾性率は約15,000MPaから約29,000MPaの範囲にあり、または
前記破断伸びは約7％から約20％の範囲にある、請求項3に記載の繊維。

【請求項6】

前記コラーゲンは、臨床グレードのコラーゲン、アテロコラーゲン、テロコラーゲン、組換えコラーゲン、およびそれらの組み合わせからなる群の中から選択されたコラーゲンである、請求項２に記載の繊維。

【請求項7】

前記コラーゲンは、1つまたは複数の生体許容性ポリマーをさらに含む、請求項２に記載の繊維。

【請求項8】

前記繊維は、ダルベッコりん酸緩衝液（DPBS）に室温で少なくとも約6か月後浸した後も、約60MPaを超える強度を維持する、請求項２に記載の繊維。

【請求項9】

付着した腱細胞をさらに含み、前記腱細胞は、従来の哺乳動物細胞培養条件の温度、ｐＨおよび湿度での約７日間のインキュベーションの後に少なくとも約７５％の細胞生存能力および少なくとも約９５％の細胞生存を維持する、請求項２に記載の繊維。

【請求項10】

前記繊維は、実質的に円形、卵形、正方形、長方形、リボン状、三角形、または不規則な形状の断面を有する、請求項２に記載の繊維。

【請求項11】

複数の繊維が、束ねられた、編まれた、または織り交ぜられた形状因子によって関連付けられている、請求項２に記載の複数の繊維。

【請求項12】

前記形状因子は束である、請求項１１に記載の複数の繊維。

【請求項13】

前記束の中のコラーゲン繊維はねじれている、請求項１２に記載の複数の繊維。

【請求項14】

前記束の中のコラーゲン繊維はねじれていない、請求項１２に記載の複数の繊維。

【請求項15】

前記形状因子は編まれたものである、請求項１１に記載の複数の繊維。

【請求項16】

前記形状因子は織られたものである、請求項１１に記載の複数の繊維。

【請求項17】

前記コラーゲンは、臨床グレードのコラーゲン、アテロコラーゲン、テロコラーゲン、組換えコラーゲン、およびそれらの組み合わせからなる群の中から選択される、請求項１１に記載の複数の繊維。

【請求項18】

付着した腱細胞をさらに含み、前記腱細胞は、従来の哺乳動物細胞培養条件の温度、ｐＨおよび湿度での約７日間のインキュベーションの後に少なくとも約７５％の細胞生存能力および少なくとも約９５％の細胞生存を維持する、請求項１１に記載の複数の繊維。

【請求項19】

前記繊維は、ダルベッコりん酸緩衝液（DPBS）に室温で少なくとも約6か月後浸した後も、約60MPaを超える強度を維持する、請求項１１に記載の複数の繊維。

【請求項20】

前記繊維は、対象者に移植してから6か月後、約60MPaを超える強度を維持する、請求項１１に記載の複数の繊維。

【請求項21】

前記コラーゲンが、1つまたは複数の生体許容性ポリマーをさらに含む、請求項１１に記載の複数の繊維。

【請求項22】

複数の押し出されたコラーゲン繊維であって、当該繊維は、束の形状因子によって関連付けられており、
前記繊維のサブ繊維がグリオキサールで架橋されており、
前記繊維は、規則正しい縦配向構造を示し、
前記押し出されたコラーゲン繊維は、以下の特徴のうちの１つまたは複数を有する、複数の繊維。
（ａ）約1MPaから約800MPaの極限引張強さ、
（ｂ）約10MPaから約7,500MPaの弾性率、
（ｃ）約10μmから約30μmの平均繊維径。

【請求項23】

前記束の中の繊維はねじれている、請求項２２に記載の複数の繊維。

【請求項24】

前記繊維はねじれていない、請求項２２に記載の複数の繊維。

【請求項25】

前記コラーゲンは、臨床グレードのコラーゲン、アテロコラーゲン、テロコラーゲン、組換えコラーゲン、およびそれらの組み合わせからなる群の中から選択される、請求項２２に記載の複数の繊維。

【請求項26】

付着した腱細胞をさらに含み、前記腱細胞は、従来の哺乳動物細胞培養条件の温度、ｐＨおよび湿度での約７日間のインキュベーションの後に少なくとも約７５％の細胞生存能力および少なくとも約９５％の細胞生存を維持する、請求項２２に記載の複数の繊維。

【請求項27】

２本～約１０，０００本の繊維を含む、請求項２５に記載の複数の繊維。

【請求項28】

前記繊維は、ダルベッコりん酸緩衝液（DPBS）に室温で少なくとも約6か月後浸した後も、約60MPaを超える強度を維持する、請求項２２に記載の複数の繊維。

【請求項29】

前記繊維は、対象者に移植してから6か月後、約60MPaを超える強度を維持する、請求項２２に記載の複数の繊維。

【請求項30】

前記コラーゲンは、1つまたは複数の生体許容性ポリマーをさらに含む、請求項２２に記載の複数の繊維。

【手続補正2】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０２２７

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0227】

本発明の様々な実施形態について述べてきたが、説明は例示を目的としたものであり、限定するものではなく、本発明の範囲内にあるさらに多くの他の実施形態および実施態様が可能であることは、当業者には明らかであろう。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲およびその均等物によってのみ限定されるものである。また、添付の特許請求の範囲の範囲内で様々な修正および変更を加えることもできる。
本発明の精神および範囲は、添付する特許請求の範囲の中に存在するが、本願の出願時に特許請求の範囲として存在し、その一部は補正により削除された、以下の［予備的な特許請求の範囲］の中にも潜在する。この［予備的な特許請求の範囲］の記載事項は、本願明細書の開示に含まれるものとする。
［予備的な特許請求の範囲］
［予備請求項１］
コラーゲンを含む生体高分子繊維であって、以下の特徴
約１ＭＰａ～約１，７００ＭＰａの極限引張強さ、
約１０ＭＰａ～約２０，０００ＭＰａの弾性率、
伸び率約２パーセント～約４５パーセントの破断伸び、
約１０μｍ～約９０μｍの平均繊維径
の１つ以上を有し、
室温で少なくとも約１時間ＤＰＢＳに浸漬後、その強度を維持し、規則正しい縦配向構造を示す、繊維。
［予備請求項２］
前記極限引張強さが約１ＭＰａ～約８００ＭＰａであり、
前記弾性率が約１０ＭＰａ～約７，５００ＭＰａであり、
前記平均繊維径が約１０μｍ～約３０μｍである、
予備請求項１に記載の生体高分子繊維。
［予備請求項３］
前記極限引張強さが約２５ＭＰａ～約１，７００ＭＰａであり、
前記弾性率が約１５，０００ＭＰａ～約２９，０００ＭＰａであり、
伸び率約７パーセント～約２０パーセントの破断伸びである、
予備請求項１に記載の生体高分子繊維。
［予備請求項４］
前記コラーゲンが、臨床用コラーゲン、アテロコラーゲン、テロコラーゲン、組換えコラーゲンまたはそれらのブレンドを含む、予備請求項１に記載の生体高分子繊維。
［予備請求項５］
前記コラーゲンが、１以上の生体許容性ポリマーをさらに含む、予備請求項１に記載の生体高分子繊維。
［予備請求項６］
室温、ＤＢＰＳ中での６ヶ月後に、または対象者への移植後に約６０ＭＰａ超の強度をさらに保持する、予備請求項１に記載の生体高分子繊維。
［予備請求項７］
グリオキサール、ＤＬ‐グリセルアルデヒドまたはそれらの組み合わせを含む架橋剤によって架橋される、予備請求項１に記載の生体高分子繊維。
［予備請求項８］
付着した腱細胞をさらに含み、前記腱細胞が、従来の哺乳動物細胞培養条件の温度、ｐＨおよび湿度での約７日間のインキュベーション後に少なくとも約７５％の細胞生存能力と少なくとも約９５％の細胞生存とを維持する、予備請求項１に記載の生体高分子繊維。
［予備請求項９］
実質的に円形、卵形、正方形、長方形、リボン状、三角形または不規則な形状の断面を有する、予備請求項１に記載の生体高分子繊維。
［予備請求項１０］
２本～約１０，０００本の繊維からなる、予備請求項１に記載の生体高分子繊維の束。
［予備請求項１１］
予備請求項１～９のいずれか１項に記載の生体高分子繊維または予備請求項１０に記載の生体高分子繊維の束を含む、軟部組織損傷の修復を支援するための移植可能な生体高分子足場。
［予備請求項１２］
予備請求項１～９のいずれか１項に記載の生体高分子繊維を含む、織シート状支持体、パッチまたは装具。
［予備請求項１３］
コラーゲンを酸溶液に溶解してコラーゲン溶液を作成するステップと、
第１直径を有する第１針を通して第１速度で前記コラーゲン溶液を送ると同時に、前記第１針を同軸に取り囲み、前記第１直径を超える第２直径を有し前記コラーゲン溶液の周囲のシースを形成する第２針を通して第２速度で形成緩衝液を送って同軸流を形成するステップであって、前記第２針を通した前記基礎緩衝液の前記第２流量は、前記第１針を通した前記コラーゲン溶液の前記第１流量の少なくとも２倍である、前記ステップと、
繊維を形成するのに十分な時間と速度で、フィブリル形成浴を含む反応領域を通して前記同軸に流れるコラーゲンおよび形成緩衝液を送るステップと、
ある押出速度で前記コラーゲン繊維を脱水するステップと、
分子の配向を高め、前記繊維の直径を減少させるのに十分な、前記押出速度を超える第３速度で前記繊維をスプールに取り出すステップと、を含む、生体高分子繊維を製造するための方法。
［予備請求項１４］
コラーゲンを酸溶液に溶解してコラーゲン溶液を作成するステップと、
第１直径を有する第１針を通して第１速度で前記コラーゲン溶液を形成緩衝液に送るステップと、
繊維を形成するのに十分な時間と速度で、繊維形成浴を含む反応領域を通して前記コラーゲンおよび形成緩衝液を送るステップと、
ある押出速度で前記コラーゲン繊維を脱水するステップと、
分子の配向を高め、前記繊維の直径を減少させるのに十分な、前記押出速度の約２倍から 前記押出速度の約１０倍の速度で前記繊維をスプールに取り出すステップと、
を含む、生体高分子繊維を製造するための方法。
［予備請求項１５］
前記コラーゲン溶液を前記形成緩衝液に送る前に前記コラーゲン溶液を脱気することをさらに含む、予備請求項１３または予備請求項１４に記載の方法。
［予備請求項１６］
臨床用コラーゲンを酸溶液に溶解してコラーゲン溶液を作成するステップと、
第１針を通して第１体積流量で前記コラーゲン溶液を送って第１速度を生じさせると同時に、前記第１針を同軸に取り囲んで前記コラーゲン溶液の周囲のシースを形成する管内に第２速度で形成緩衝液を送って同軸流を形成するステップであって、前記基礎緩衝液の速度は、前記第１針を通した前記コラーゲン溶液の前記第１速度の約２倍から約２０倍である、ステップと、
繊維を形成するのに十分な時間と速度で、フィブリル形成浴を含む反応領域を通して同軸に流れるコラーゲンおよび形成緩衝液を送るステップと、
ある押出速度で前記コラーゲン繊維を脱水するステップと、
分子の配向を高め、前記繊維の直径を減少させるのに十分な、前記押出速度を超える第３速度で前記繊維を取り出すステップと、
を含む、生体高分子繊維を製造するための方法。
［予備請求項１７］
前記繊維をバーコレクターまたは平らなシリンダーに回収することをさらに含む、予備請求項１６に記載の方法。
［予備請求項１８］
前記繊維を溝付きスプールに回収することをさらに含む、予備請求項１６に記載の方法。
［予備請求項１９］
臨床用コラーゲンを酸溶液に溶解してコラーゲン溶液を作成するステップと、
ノズルを通して、前記溶液を、前記押出溶液を形成緩衝液の流動浴に送って繊維を形成するガイドに押し出すステップと、
前記形成緩衝液浴に形成された前記繊維を脱水するステップと、
前記繊維を回収するステップと、
を含む、生体高分子繊維を製造するための方法。
［予備請求項２０］
前記繊維を回収する前に、前記繊維を乾燥するのに十分な時間、前記繊維に空気を送ることによって、前記脱水した繊維を乾燥することをさらに含む、予備請求項１９に記載の方法。
［予備請求項２１］
グリオキサール、ＤＬ‐グリセルアルデヒドまたはそれらの組み合わせを含む架橋剤で前記繊維を架橋させ、前記架橋した繊維を乾燥することをさらに含む、予備請求項１９に記載の方法。
［予備請求項２２］
臨床用コラーゲンを酸溶液に溶解してコラーゲン溶液を作成するステップと、
第１直径を有する第１針を通して第１速度で前記コラーゲン溶液を形成緩衝液に送るステップと、
繊維を形成するのに十分な時間と速度で、繊維形成浴を含む反応領域を通して前記コラーゲンおよび形成緩衝液を送るステップと、
ある押出速度で前記コラーゲン繊維を脱水するステップと、
１以上の段階で、分子の配向を高め、前記繊維の直径を減少させるのに十分な、前記押出速度の約２倍から前記押出速度の約１２倍の速度で、前記繊維をスプールに取り出すステップと、
を含む、生体高分子繊維を製造するための方法。
［予備請求項２３］
グリオキサール、ＤＬ‐グリセルアルデヒドまたはそれらの組み合わせを含む架橋剤で前記繊維を架橋させ、前記架橋した繊維を乾燥することをさらに含む、予備請求項２２に記載の方法。
［予備請求項２４］
予備請求項１３～予備請求項２３のいずれか１項に記載の方法によって製造される、生体高分子繊維。
［予備請求項２５］
予備請求項２４に記載の生体高分子繊維を含む、軟部組織損傷の修復を支援するための移植可能な生体高分子足場。
［予備請求項２６］
予備請求項２５に記載の生体高分子足場の前記移植を含む、軟部組織損傷の前記修復を支援するための方法。
［予備請求項２７］
前記軟部組織が、靭帯、腱、腱・靭帯付着部、骨、筋肉、筋腱移行部、皮膚を含む結合組織、筋膜、内蔵、および眼を含む群から選択される、予備請求項２６に記載の方法。
［予備請求項２８］
予備請求項２４に記載の生体高分子繊維を含む、縫合糸。
［予備請求項２９］
吸収性である、予備請求項２８に記載の縫合糸。
［予備請求項３０］
対象者に移植されると、前十字靱帯、アキレス腱および腱板などの関節における靭帯または腱の機械的負荷を支える、補強する、増大させる、または共同して負う、予備請求項２４に記載の生体高分子繊維を含む内部装具。
［予備請求項３１］
対象者に移植されると、負傷した関節を、１つの骨を他の骨に接続することによって支え、任意選択で、健康な天然関節のものに実質的に匹敵するレベルに生体力学および等尺性を復元する、予備請求項２４に記載の生体高分子繊維を含む内部装具。

【国際調査報告】