ホーム > 特許ランキング > クイデル コーポレーション
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-05-10
(54)【発明の名称】自己抗体を検出するための組成物、キット、及び方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6897 20180101AFI20220427BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20220427BHJP
C12N 15/85 20060101ALN20220427BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20220427BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6897 Z ZNA
C12Q1/02
C12N15/85 Z
C12N15/12
【審査請求】未請求
【予備審査請求】有
(21)【出願番号】P 2021553379
(86)(22)【出願日】2020-03-11
(85)【翻訳文提出日】2021-10-29
(86)【国際出願番号】 US2020022140
(87)【国際公開番号】W WO2020185926
(87)【国際公開日】2020-09-17
(31)【優先権主張番号】62/817,458
(32)【優先日】2019-03-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】516282776
【氏名又は名称】クイデル コーポレーション
(74)【代理人】
【識別番号】100079108
【弁理士】
【氏名又は名称】稲葉 良幸
(74)【代理人】
【識別番号】100109346
【弁理士】
【氏名又は名称】大貫 敏史
(74)【代理人】
【識別番号】100117189
【弁理士】
【氏名又は名称】江口 昭彦
(74)【代理人】
【識別番号】100134120
【弁理士】
【氏名又は名称】内藤 和彦
(72)【発明者】
【氏名】イーガン，リチャード エル．
(72)【発明者】
【氏名】ミアオ，リン イホン
(72)【発明者】
【氏名】キム，ハンナ ジェイ．
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA18
4B063QQ03
4B063QR48
4B063QR59
4B063QR80
4B063QR90
4B063QS33
4B063QS36
4B063QX02
(57)【要約】
自己抗体が関与する甲状腺疾患の診断において有用なキット、組成物、及び方法が提供される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ａ）（ｉ）キメラ甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）受容体をコードするヌクレオチド配列を含む第１の発現ベクター、及び
（ｉｉ）レポーターをコードする合成ヌクレオチド配列を含む第２の発現ベクターであって、前記合成ヌクレオチド配列が、
（１）ｃＡＭＰ誘導性プロモーターに作動可能に結合しており；及び／又は
（２）異種ｃＡＭＰ結合タンパク質をさらにコードし、前記ｃＡＭＰ結合タンパク質が、前記レポーターに融合している第２の発現ベクター
により安定的に形質移入されたトランスジェニック細胞と；
（ｂ）細胞溶解剤を有さない反応緩衝液であって、任意選択で前記レポーターの基質を含む反応緩衝液と
を含むキットであって、
前記レポーターの発現が、細胞内シグナルと関連する、キット。
【請求項2】
ｃＡＭＰの存在が前記レポーターの発現を増加させ、それにより前記シグナルを向上させる、請求項１に記載のキット。
【請求項3】
前記異種結合部位へのｃＡＭＰの結合が、前記シグナルを向上させる前記レポーターの立体構造変化を誘導する、請求項１に記載のキット。
【請求項4】
前記キメラＴＳＨ受容体が、ヒトＴＳＨ受容体配列を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項5】
前記キメラＴＳＨ受容が、ＣｈＲ４である、請求項４に記載のキット。
【請求項6】
前記レポーターが、ルシフェラーゼポリペプチドを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項7】
前記ルシフェラーゼポリペプチドが、改変されたルシフェラーゼである、請求項６に記載のキット。
【請求項8】
前記改変されたルシフェラーゼが、循環置換されたルシフェラーゼである、請求項７に記載のキット。
【請求項9】
前記基質が、ルシフェリンを含む、請求項６～８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項10】
前記細胞内シグナルが、発光を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項11】
前記トランスジェニック細胞が、哺乳類細胞を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項12】
前記哺乳類細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又はヒトＲＤ細胞を含む、請求項１１に記載のキット。
【請求項13】
前記トランスジェニック細胞が、前記レポーターの基質をさらに含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項14】
前記反応緩衝液が、ポリエチレングリコール及びスクロースを含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項15】
前記反応緩衝液が、アルブミンをさらに含む、請求項１４に記載のキット。
【請求項16】
前記アルブミンが、ウシ血清アルブミンを含む、請求項１５に記載のキット。
【請求項17】
細胞溶解剤を含まない、請求項１～１６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項18】
サンプル中の甲状腺刺激及び／又は甲状腺遮断自己抗体を検出する方法であって、（ａ）トランスジェニック細胞を、甲状腺刺激及び／又は甲状腺遮断自己抗体を含むことが疑われるサンプルと接触させること、ここで、前記トランスジェニック細胞が、
（ｉ）キメラ甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）受容体をコードするヌクレオチド配列を含む第１の発現ベクター及び
（ｉｉ）レポーターをコードする合成ヌクレオチド配列を含む第２の発現ベクターであって、前記合成ヌクレオチド配列が、
（１）誘導性ｃＡＭＰ誘導性プロモーターに作動可能に結合しており、及び／又は
（２）異種ｃＡＭＰ結合タンパク質をさらにコードし、前記ｃＡＭＰ結合タンパク質は、前記レポーターに融合している第２の発現ベクター
により安定的に形質移入されている；及び
（ｂ）前記レポーターの発現と関連する細胞内シグナルを検出すること、
を含む方法。
【請求項19】
前記トランスジェニック細胞が、前記レポーターの基質をさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
前記接触ステップが、前記レポーターの基質を含む緩衝液中で接触させることを含む、請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項21】
前記緩衝液が、細胞溶解剤を含まない、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
前記トランスジェニック細胞を、前記接触ステップ前に前記レポーターについての前記基質に曝露するステップをさらに含む、請求項２０又は２１に記載の方法。
【請求項23】
前記接触ステップが、非希釈サンプルと接触させることを含む、請求項１８～２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項24】
検出ステップが、前記接触の２４０分後未満、１８０分後未満、９０分後未満、６０分後未満又は３０分後未満に実施される、請求項１８～２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項25】
前記トランスジェニック細胞及び前記サンプルを含む組成物から前記細胞内シグナルを検出する、請求項１８～２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項26】
前記組成物中の前記トランスジェニック細胞の少なくとも７５％が、検出時においてインタクトである、請求項２５に記載の方法。
【請求項27】
前記接触ステップが室温で実施される、請求項１８～２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項28】
前記トランスジェニック細胞を、前記接触ステップ前に解凍することをさらに含む、請求項１８～２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項29】
前記接触ステップが、前記解凍の１２０分後未満、９０分後未満、６０分後未満、３０分後未満又は５分後未満に実施される、請求項２８に記載の方法。
【請求項30】
前記接触ステップが、前記トランスジェニック細胞を対照の甲状腺刺激剤と接触させることをさらに含む、請求項１８～２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項31】
前記トランスジェニック細胞を前記サンプルと接触させる前に、前記トランスジェニック細胞が前記対照の甲状腺刺激剤と接触される、請求項３０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
[0001] 本出願は、参照により全体として本明細書に援用される２０１９年３月１２日に出願された米国仮特許出願第６２／８１７，４５８号の利益を主張する。
[0001] 本出願は、参照により全体として本明細書に援用される２０１９年３月１２日に出願された米国仮特許出願第６２／８１７，４５８号の利益を主張する。
【0002】
技術分野
[0002] 本明細書に記載の主題は、自己抗体が関与する甲状腺疾患の診断において有用なキット、組成物、及び方法に関する。
[0002] 本明細書に記載の主題は、自己抗体が関与する甲状腺疾患の診断において有用なキット、組成物、及び方法に関する。
【背景技術】
【0003】
背景
[0003] 甲状腺機能不全は、一般集団における成人の推定１～１０パーセントを冒す。多くの甲状腺疾患、例としてグレーブス病、橋本甲状腺炎、甲状腺機能亢進症、甲状腺機能低下症（新生児甲状腺機能低下症を含む）、非甲状腺腫性甲状腺機能低下症、甲状腺機能正常又は甲状腺機能低下自己免疫性甲状腺炎、及び原発性粘液水腫、及び特発性粘液水腫は、甲状腺上に存在する受容体を認識し、それに結合する自己抗体（甲状腺刺激免疫グロブリン（ＴＳＩ）及び／又は甲状腺遮断免疫グロブリン（ＴＢＩ）の作用を伴い、甲状腺ホルモン産生の不所望な変化をもたらす。
[0003] 甲状腺機能不全は、一般集団における成人の推定１～１０パーセントを冒す。多くの甲状腺疾患、例としてグレーブス病、橋本甲状腺炎、甲状腺機能亢進症、甲状腺機能低下症（新生児甲状腺機能低下症を含む）、非甲状腺腫性甲状腺機能低下症、甲状腺機能正常又は甲状腺機能低下自己免疫性甲状腺炎、及び原発性粘液水腫、及び特発性粘液水腫は、甲状腺上に存在する受容体を認識し、それに結合する自己抗体（甲状腺刺激免疫グロブリン（ＴＳＩ）及び／又は甲状腺遮断免疫グロブリン（ＴＢＩ）の作用を伴い、甲状腺ホルモン産生の不所望な変化をもたらす。
【0004】
[0004] 診断技術はそれらの自己抗体を検出するために利用可能である一方、それらの技術の多くは、煩雑で労力を要し、ＴＳＩとＴＢＩとを区別し得ず、及び／又は十分な感度及び／又は特異度を欠く。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0005】
簡単な概要
[0005] 以下に記載され、説明される以下の態様及びその実施形態は、例示的及び説明的なものであり、範囲を限定するものではないことを意図している。
[0005] 以下に記載され、説明される以下の態様及びその実施形態は、例示的及び説明的なものであり、範囲を限定するものではないことを意図している。
【0006】
[0006] 本開示は、甲状腺刺激抗体（ＴＳＩ）及び甲状腺遮断抗体（ＴＢＩ）を検出し、及び／又はそれらを区別するためのキット、組成物、及び方法を提供する。
【0007】
[0007] 一態様において、第１の発現ベクター及び第２の発現ベクターにより安定的に形質移入されたトランスジェニック細胞と、細胞溶解剤を有さない反応緩衝液であって、任意選択でレポーターについての基質を含む反応緩衝液とを含むキットが提供される。これらの提供されるキットにおいて、第１の発現ベクターは、キメラ又は野生型ＴＳＨ受容体をコードするヌクレオチド配列を含む一方、第２の発現ベクターは、レポーターをコードする合成ヌクレオチド配列を含み、合成ヌクレオチド配列は、（１）誘導性ｃＡＭＰ誘導性プロモーターに作動可能に結合しており、及び／又は（２）異種ｃＡＭＰ結合タンパク質をさらにコードし、ｃＡＭＰ結合タンパク質は、レポーターに融合している。これらの提供されるキットにおいて、レポーターの発現は、検出される細胞内シグナルと関連する。
【0008】
[0008] 一部の実施形態において、細胞内シグナルは、トランスジェニック細胞を溶解させずに検出する。他の実施形態において、細胞内シグナルは細胞内で産生させ、細胞外で検出する。他の実施形態において、レポーターは、基質との触媒反応時にシグナルを細胞内で産生するレポーターを生成するために継続的に発現されるタンパク質である。
【0009】
[0009] 別の態様において、サンプル中の甲状腺刺激及び／又は甲状腺遮断自己抗体を検出する方法であって、（ａ）トランスジェニック細胞を、甲状腺刺激及び／又は甲状腺遮断自己抗体を含むことが疑われるサンプルと接触させ、トランスジェニック細胞は、第１の発現ベクター及び第２の発現ベクターにより安定的に形質移入されていることと、（ｂ）レポーターの発現と関連する細胞内シグナルを検出することとを含む方法が提供される。これらの提供される方法において、第１の発現ベクターは、キメラ又は野生型ＴＳＨ受容体をコードするヌクレオチド配列を含む一方、第２の発現ベクターは、レポーターをコードする合成ヌクレオチド配列を含み、合成ヌクレオチド配列は、（１）ｃＡＭＰ誘導性プロモーターに作動可能に結合しており、及び／又は（２）異種ｃＡＭＰ結合タンパク質をさらにコードし、ｃＡＭＰ結合タンパク質は、レポーターに融合している。
【図面の簡単な説明】
【0010】
図面の簡単な説明
【図1】[0010]図１は、ＴＳＩ／ＴＢＩについての本開示のインビボアッセイから得られた無溶媒サンプル対希釈サンプル（正常、低ＴＳＩ、及び高ＴＳＩ）についてのシグナル対バックグラウンド比（Ｓ／Ｂ）を示す（実施例１参照）。
【図2】[0011]図２は、洗浄ステップを含むプロトコルと洗浄ステップを除外するプロトコルとを比較する実験からの結果を示す。図２は、ＴＳＩ／ＴＢＩについての本開示のインビボアッセイから得られたサンプル（正常、低ＴＳＩ、及び高ＴＳＩ）についてのシグナル対バックグラウンド比を示す（実施例１参照）。
【図3A】[0012]図３Ａは、一晩の細胞播種ステップを含むプロトコルと２時間の細胞播種ステップを含むプロトコルとを比較する実験からの結果を示す。図３Ａは、抗体スタンダード（甲状腺刺激抗体Ｍ２２）を使用したタイトレーション曲線及び計算ＥＣ５０値を示す。
【図3B】[0012]図３Ｂは、一晩の細胞播種ステップを含むプロトコルと２時間の細胞播種ステップを含むプロトコルとを比較する実験からの結果を示す。図３Ｂは、４つの陰性（ＮＳ１、ＮＳ２、ＮＳ３、及びＮＳ４）及び４つの陽性（ＰＳ１、ＰＳ２、ＰＳ３、及びＰＳ４）サンプルについてのシグナル対参照比を示す。
【図3C】[0012]図３Ｃは、一晩の細胞播種ステップを含むプロトコルと２時間の細胞播種ステップを含むプロトコルとを比較する実験からの結果を示す。図３Ｃは、陰性サンプルの平均値に対する倍率応答として計算されたそれぞれの陽性サンプルについての応答を示す（実施例１参照）。
【図4A】[0013]図４Ａは、２時間の細胞播種ステップを含むプロトコルと細胞を解凍直後又はすぐ後に使用するプロトコルとを比較する実験からの結果を示す。図４Ａは、Ｍ２２スタンダードから得られたタイトレーション曲線及び計算ＥＣ５０値を示す。
【図4B】[0013]図４Ｂは、２時間の細胞播種ステップを含むプロトコルと細胞を解凍直後又はすぐ後に使用するプロトコルとを比較する実験からの結果を示す。図４Ｂは、４つの陰性（ＮＳ１、ＮＳ２、ＮＳ３、及びＮＳ４）及び４つの陽性（ＰＳ１、ＰＳ２、ＰＳ３、及びＰＳ４）についてのシグナル対参照比を示す。
【図4C】[0013]図４Ｃは、２時間の細胞播種ステップを含むプロトコルと細胞を解凍直後又はすぐ後に使用するプロトコルとを比較する実験からの結果を示す。図４Ｃは、陰性サンプルの平均値に対する倍率応答として計算されたそれぞれの陽性サンプルについての応答を示す（実施例１参照）。
【図6】[0017]図６は、本開示のＴＳＩアッセイの特異度を評価するための実験からの結果を示し、甲状腺遮断抗体（Ｋ１７０）又は甲状腺刺激抗体（Ｍ２２）の段階希釈物に対して実施された本開示のＴＳＩアッセイを使用して観察されたシグナル応答比（ＳＲＲ）を示す（実施例１参照）。
【図7】[0018]図７は、迅速ＴＳＩアッセイからの結果のリアルタイム測定値を示す。正常血清及び３つのＴＳＩ陽性サンプルを、本開示の迅速アッセイにより試験した。結果（％ＳＲＲ）は、１０分ごとに９０分まで測定されたＲＬＵデータを使用して計算した（実施例１参照）。
【図8】[0019]図８は、ＴＳＨＲ遮断抗体がＣｈＲ４キメラＴＳＨＲ受容体とも反応するか否かを評価するための実験からの結果を示す。図８は、本開示のＴＳＩアッセイにおいて観察された甲状腺遮断抗体Ｋ１７０、３Ｈ１０、及び４Ｃ１の阻害パーセントを示す（実施例２参照）。
【図9】[0020]図９は、異なるインキュベーション時間（１０分間、２０分間、３０分間、４０分間、５０分間、６０分間、７０分間、８０分間、又は９０分間）を有するプロトコルを比較する実験からの結果を示す。それぞれの時点についての最初の３つのバー（サンプルＤＬＳ００４、ＤＬＳ０５２、及びＤＬＳ０３４）は正常サンプルからのシグナルに対応し；それぞれの時点についての最後の４つのバー（サンプルＤＬＳ０７９、ＤＬＳ０６０、ＤＬＳ０１６、及びＤＬＳ１２２）はＴＳＩ陽性サンプルからのシグナルに対応する（実施例２参照）。
【図10】[0021]異なる密度のＣＨＯ－ＣｈＲ４／２２Ｆトランスジェニック細胞に対するＴＳＨＲ遮断抗体Ｋ１７０から得られたタイトレーション曲線及び計算ＩＣ５０値を示す（実施例３参照）。
【図11A】[0022]図１１Ａは、本開示の方法の感度を決定するために設計された実験からの結果を示す。図１１Ａは、本開示のアッセイについて、及びTHYRETAIN（登録商標）ＴＳＩアッセイについてのタイトレーション曲線及び計算ＥＣ５０値を示す。本開示の方法を使用してＭ２２スタンダードから得られたシグナルは、THYRETAIN（登録商標）ＴＳＩアッセイを使用して得られたものよりも約１０倍高かった。２つのアッセイの分析的感度は類似していた（実施例４参照）。
【図11B】[0022]図１１Ｂは、本開示の方法の感度を決定するために設計された実験からの結果を示す。図１１Ｂは、本開示のアッセイについて、及びTHYRETAIN（登録商標）ＴＳＩアッセイについてのタイトレーション曲線及び計算ＥＣ５０値を示す。本開示の方法を使用してＭ２２スタンダードから得られたシグナルは、THYRETAIN（登録商標）ＴＳＩアッセイを使用して得られたものよりも約１０倍高かった。２つのアッセイの分析的感度は類似していた（実施例４参照）。
【図12】[0023]図１２は、異なるインキュベーション条件（１）室温で９０分間（「ＲＴ９０」）又は（２）３７℃で１時間、次いで室温で３０分間（「３７℃－６０／ＲＴ３０」）を使用した臨床（ヒト血清）サンプルにおける結果を示す。比較のため、図１２は、THYRETAIN（登録商標）ＴＳＩアッセイを使用した同じサンプルに対する結果も示す（実施例５参照）。
【図13】[0024]図１３は、ＣＨＯ－ＣｈＲ４／２２Ｆトランスジェニック細胞又は予備平衡ＣＨＯ－ＣｈＲ４／２２Ｆトランスジェニック細胞のいずれかを使用したアッセイからのエンドポイント測定値、及び比較のため、THYRETAIN（登録商標）ＴＳＩアッセイからの結果を示す（実施例５参照）。
【図14A】[0025]図１４Ａは、ＣＨＯ－ＣｈＲ４／２２Ｆトランスジェニック細胞又は予備平衡ＣＨＯ－ＣｈＲ４／２２Ｆトランスジェニック細胞のいずれかを使用したアッセイからの速度論的測定値、及び比較のため、THYRETAIN（登録商標）ＴＳＩアッセイからの結果を示し、速度論的測定値は、インキュベーション時間の５～９０分間の種々の時点において採取した（実施例５参照）。
【図14B】[0025]図１４Ｂは、ＣＨＯ－ＣｈＲ４／２２Ｆトランスジェニック細胞又は予備平衡ＣＨＯ－ＣｈＲ４／２２Ｆトランスジェニック細胞のいずれかを使用したアッセイからの速度論的測定値、及び比較のため、THYRETAIN（登録商標）ＴＳＩアッセイからの結果を示し、速度論的測定値は、インキュベーション時間の５～９０分間の種々の時点において採取した（実施例５参照）。
【図14C】[0025]図１４Ｃは、ＣＨＯ－ＣｈＲ４／２２Ｆトランスジェニック細胞又は予備平衡ＣＨＯ－ＣｈＲ４／２２Ｆトランスジェニック細胞のいずれかを使用したアッセイからの速度論的測定値、及び比較のため、THYRETAIN（登録商標）ＴＳＩアッセイからの結果を示し、速度論的測定値は、インキュベーション時間の５～９０分間の種々の時点において採取した（実施例５参照）。
【図14D】[0025]図１４Ｄは、ＣＨＯ－ＣｈＲ４／２２Ｆトランスジェニック細胞又は予備平衡ＣＨＯ－ＣｈＲ４／２２Ｆトランスジェニック細胞のいずれかを使用したアッセイからの速度論的測定値、及び比較のため、THYRETAIN（登録商標）ＴＳＩアッセイからの結果を示し、速度論的測定値は、インキュベーション時間の５～９０分間の種々の時点において採取した（実施例５参照）。
【図15A】[0026]図１５Ａは、１３０個の抗甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）抗体陽性血清サンプルにおける％ＳＲＲを示す。THYRETAIN（登録商標）ＴＳＩアッセイからの結果を示す図１５Ａにおいて、黒色点線は、１４０％ＳＲＲのアッセイカットオフを示す。
【図15B】[0026]図１５Ｂは、１３０個の抗甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）抗体陽性血清サンプルにおける％ＳＲＲを示す。本開示のＴＳＩアッセイからの結果を示す図１５Ｂにおいて、紫色点線は、３１％ＳＲＲの仮アッセイカットオフを示す（実施例６参照）。
【発明を実施するための形態】
【0011】
詳細な説明
[0032] 本開示は、甲状腺ホルモン遮断免疫グロブリン（ＴＢＩ）及び／又は甲状腺刺激免疫グロブリン（ＴＳＩ）を検出するためのキット、組成物、及び方法を提供する。ＴＳＩ及び／又は甲状腺遮断免疫グロブリン（ＴＢＩ）を検出する当該技術分野において公知の方法と比較して、本開示の方法は、少ないステップ及び短い検査所要時間を伴う一方、ＴＳＩ及び／又はＴＢＩについての感度及び特異度を保持する。例えば、本開示のキット、組成物、及び方法は、ＴＳＩ及び／又はＴＢＩの検出を細胞溶解なしで可能とし、そのことは、処理時間を低減させるだけでなく、エンドポイント測定に加えて経時的な速度論的測定も可能とする。
[0032] 本開示は、甲状腺ホルモン遮断免疫グロブリン（ＴＢＩ）及び／又は甲状腺刺激免疫グロブリン（ＴＳＩ）を検出するためのキット、組成物、及び方法を提供する。ＴＳＩ及び／又は甲状腺遮断免疫グロブリン（ＴＢＩ）を検出する当該技術分野において公知の方法と比較して、本開示の方法は、少ないステップ及び短い検査所要時間を伴う一方、ＴＳＩ及び／又はＴＢＩについての感度及び特異度を保持する。例えば、本開示のキット、組成物、及び方法は、ＴＳＩ及び／又はＴＢＩの検出を細胞溶解なしで可能とし、そのことは、処理時間を低減させるだけでなく、エンドポイント測定に加えて経時的な速度論的測定も可能とする。
【0012】
[0033] これらの特徴部は、とりわけ、本開示のキット、組成物、及び方法の大規模使用を可能とする。さらに、本開示のキット、組成物、及び方法は、種々の状況においてより広範な潜在的使用者によりアクセス可能である。
【0013】
Ｉ．定義
[0034] 数値に関して本明細書において使用される用語「約」及び「およそ」は、本明細書において、特に記述がない限り、又は文脈から特に明らかでない限りその数値（超の又は未満の）いずれかの方向の２０％、１０％、５％、又は１％の範囲内に収まる数を含めるために使用される（そのような数が考えられる値の１００％を超過する場合を除く）。
[0034] 数値に関して本明細書において使用される用語「約」及び「およそ」は、本明細書において、特に記述がない限り、又は文脈から特に明らかでない限りその数値（超の又は未満の）いずれかの方向の２０％、１０％、５％、又は１％の範囲内に収まる数を含めるために使用される（そのような数が考えられる値の１００％を超過する場合を除く）。
【0014】
[0035] 本明細書において使用される用語「ポリペプチド」は、一般に、少なくとも３つのアミノ酸のポリマーのその当該技術分野において認識される意味を有する。しかしながら、この用語は、具体的な機能クラスのポリペプチド、例えば、ルシフェラーゼポリペプチドなども指す。それぞれのそのようなクラスについて、本明細書は、定義された配列を有する既知の参照ポリペプチドを指し得る。しかしながら、当業者は、用語「ポリペプチド」が、参照ポリペプチドの完全配列を有するポリペプチドを包含するだけでなく、そのような完全ポリペプチドの機能的断片（すなわち、少なくとも１つの活性を保持する断片）を表すポリペプチドも包含するように十分に一般的であることを認識する。さらに、当業者は、タンパク質配列が一般に、活性の破壊なしの多少の置換を許容することを理解する。さらに、タンパク質配列の循環置換も活性を保持し得る。したがって、活性を保持し、少なくとも約３０～４０％の全体的な配列同一性（例として、循環置換）、多くの場合約５０％、６０％、７０％、又は８０％超を共有し、さらに通常は非常に高い同一性、多くの場合１つ以上の高度に保存された領域において９０％、又はさらには９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％超の少なくとも１つの領域を含み、通常、同じクラスの別のポリペプチドとともに、少なくとも３～４つ、多くの場合最大２０個以上のアミノ酸を包含する任意のポリペプチドは、本明細書において使用される関連用語「ポリペプチド」に包含される。当業者は、本明細書に参照される種々のポリペプチドの配列を分析することにより類似及び／又は同一の他の領域を同定することができる。
【0015】
ＩＩ．キット
[0036] 一態様において、甲状腺刺激免疫グロブリン（ＴＳＩ）及び／又は甲状腺遮断免疫グロブリン（ＴＢＩ）を検出するためのキットが提供される。キットは、一般に、（ａ）第１の発現ベクター及び第２の発現ベクターにより安定的に形質移入されたトランスジェニック細胞及び／又は（ｂ）細胞溶解剤を有さない反応緩衝液を含む。一般に、第１の発現ベクターは、キメラ甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）受容体をコードするヌクレオチド配列を含み、第２の発現ベクターは、レポーターをコードし、（ｉ）ｃＡＭＰ誘導性プロモーターに作動可能に結合しており、及び／又は（ｉｉ）異種ｃＡＭＰ結合タンパク質をさらにコードする合成ヌクレオチド配列を含み、ｃＡＭＰ結合タンパク質は、レポーターに融合している。一部の実施形態において、提供されるキットは、さらに１つのスタンダード又は対照試薬をさらに含む。提供されるキットは、一部の実施形態において細胞溶解剤を含まず、細胞溶解剤とともに使用されるものではない。
[0036] 一態様において、甲状腺刺激免疫グロブリン（ＴＳＩ）及び／又は甲状腺遮断免疫グロブリン（ＴＢＩ）を検出するためのキットが提供される。キットは、一般に、（ａ）第１の発現ベクター及び第２の発現ベクターにより安定的に形質移入されたトランスジェニック細胞及び／又は（ｂ）細胞溶解剤を有さない反応緩衝液を含む。一般に、第１の発現ベクターは、キメラ甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）受容体をコードするヌクレオチド配列を含み、第２の発現ベクターは、レポーターをコードし、（ｉ）ｃＡＭＰ誘導性プロモーターに作動可能に結合しており、及び／又は（ｉｉ）異種ｃＡＭＰ結合タンパク質をさらにコードする合成ヌクレオチド配列を含み、ｃＡＭＰ結合タンパク質は、レポーターに融合している。一部の実施形態において、提供されるキットは、さらに１つのスタンダード又は対照試薬をさらに含む。提供されるキットは、一部の実施形態において細胞溶解剤を含まず、細胞溶解剤とともに使用されるものではない。
【0016】
[0037] キットを本明細書にさらに記載される方法に従って使用する場合、トランスジェニック細胞は、キメラＴＳＨＲをその細胞表面上に発現する。ＴＳＩ及び／又はＴＢＩへの結合時、トランスジェニック細胞中のｃＡＭＰレベルは増加し、それは、（１）レポーターの発現及び／又は（２）レポーターを含む融合タンパク質へのｃＡＭＰの結合をもたらす。一部の実施形態において、融合タンパク質へのｃＡＭＰの結合はレポーターの立体構造変化をもたらし、立体構造変化はレポーターの検出を可能とし、又はレポーターの検出可能性を増加させる。
【0017】
Ａ．トランスジェニック細胞
１．第１の発現ベクター
[0038] 第１の発現ベクターは、キメラ甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）受容体（キメラＴＳＨＲ）をコードするヌクレオチド配列を含む。一般に、そのようなキメラＴＳＨＲは、ＴＳＩ、ＴＢＩ、又はその両方に結合する。一部の実施形態において、キメラＴＳＨＲは、ヒトＴＳＨＲ（ｈＴＳＨＲ）の一部及び別の受容体の一部を含む。例えば、キメラＴＳＨＲは、ヒトＴＳＨＲ（ｈＴＳＨＲ）及び黄体形成ホルモン絨毛性ゴナドトロピン受容体（ＬＨ－ＣＧＲ）のキメラであり得る。好適なｈＴＳＨＲ／ＬＨ－ＣＧＲキメラ受容体の非限定的な例としては、（１）ラットＬＨ－ＣＧＲからの等価残基により置換されているアミノ酸残基８～１６５を有するキメラ受容体（以下、「ＣｈＲ１」）；（２）ラットＬＨ－ＣＧＲからの等価残基により置換されているアミノ酸残基９０～１６５を有するキメラ受容体）（以下、「ＣｈＲ２」）、（３）ラットＬＨ／ＣＧＲからの等価残基により置換されているｈＴＳＨＲのアミノ酸残基２６２～３３５を有するキメラ受容体（以下、「ＣｈＲ３」）；及び（４）ラット黄体形成ホルモン／絨毛性ゴナドトロピン受容体（ＬＨ／ＣＧＲ）からの残基２６２～３３４により置換されているｈＴＳＨＲのアミノ酸残基２６２～３６８を有するキメラ受容体、以下、「ＣｈＲ４」）が挙げられる（例えば、全内容が参照により本明細書に援用される米国特許第９，７３９，７７５号参照）。好適なＴＳＨＲの非限定的な例は、ヌクレオチド配列が配列番号１の及び図２０にも提供されるヌクレオチド配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７．５％、又は１００％同一であるＴＳＨＲである。
１．第１の発現ベクター
[0038] 第１の発現ベクターは、キメラ甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）受容体（キメラＴＳＨＲ）をコードするヌクレオチド配列を含む。一般に、そのようなキメラＴＳＨＲは、ＴＳＩ、ＴＢＩ、又はその両方に結合する。一部の実施形態において、キメラＴＳＨＲは、ヒトＴＳＨＲ（ｈＴＳＨＲ）の一部及び別の受容体の一部を含む。例えば、キメラＴＳＨＲは、ヒトＴＳＨＲ（ｈＴＳＨＲ）及び黄体形成ホルモン絨毛性ゴナドトロピン受容体（ＬＨ－ＣＧＲ）のキメラであり得る。好適なｈＴＳＨＲ／ＬＨ－ＣＧＲキメラ受容体の非限定的な例としては、（１）ラットＬＨ－ＣＧＲからの等価残基により置換されているアミノ酸残基８～１６５を有するキメラ受容体（以下、「ＣｈＲ１」）；（２）ラットＬＨ－ＣＧＲからの等価残基により置換されているアミノ酸残基９０～１６５を有するキメラ受容体）（以下、「ＣｈＲ２」）、（３）ラットＬＨ／ＣＧＲからの等価残基により置換されているｈＴＳＨＲのアミノ酸残基２６２～３３５を有するキメラ受容体（以下、「ＣｈＲ３」）；及び（４）ラット黄体形成ホルモン／絨毛性ゴナドトロピン受容体（ＬＨ／ＣＧＲ）からの残基２６２～３３４により置換されているｈＴＳＨＲのアミノ酸残基２６２～３６８を有するキメラ受容体、以下、「ＣｈＲ４」）が挙げられる（例えば、全内容が参照により本明細書に援用される米国特許第９，７３９，７７５号参照）。好適なＴＳＨＲの非限定的な例は、ヌクレオチド配列が配列番号１の及び図２０にも提供されるヌクレオチド配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７．５％、又は１００％同一であるＴＳＨＲである。
【0018】
[0039] 一般に、キメラＴＳＨＲは、プロモーターに作動可能に結合している。一部の実施形態において、プロモーターは、構成的プロモーターである。
【0019】
２．第２の発現ベクター
[0040] 第２の発現ベクターは、本明細書にさらに記載されるレポーターをコードする合成ヌクレオチド配列を含む。
[0040] 第２の発現ベクターは、本明細書にさらに記載されるレポーターをコードする合成ヌクレオチド配列を含む。
【0020】
[0041] 一般に、合成ヌクレオチド配列は、プロモーターに作動可能に結合している。一部の実施形態において、合成ヌクレオチド配列は、構成的プロモーターに作動可能に結合している。
【0021】
[0042] 一部の実施形態において、合成ヌクレオチド配列は、ｃＡＭＰ誘導性プロモーターに作動可能に結合しており；したがって、一部の実施形態において、ｃＡＭＰの存在はレポーターの発現を誘導する。
【0022】
[0043] 一部の実施形態において、合成ヌクレオチド配列は、異種ｃＡＭＰ結合タンパク質をさらにコードし、ｃＡＭＰ結合タンパク質は、レポーターに融合している。一部のそのような実施形態において、ｃＡＭＰの存在はｃＡＭＰ結合タンパク質への結合によりレポーターの立体構造変化を誘導し、立体構造変化はレポーターの活性増加に対応する。
【0023】
３．細胞系
[0044] 安定的形質移入細胞を生成するために多数の細胞系、例として、タンパク質発現系の構成成分として使用される細胞系が好適である。一部の実施形態において、トランスジェニック細胞は、哺乳類細胞を含む。好適な哺乳類細胞系の非限定的な例としては、腺癌ヒト肺胞基底上皮細胞（例えば、Ａ５４９細胞）、アフリカザル（African monkey）腎細胞（例えば、ＣＯＳ及びＶｅｒｏ細胞）、ベビーハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、マウス骨髄腫細胞（例えば、Ｊ５５８Ｌ、ＮＳ０、及びＳｐ２／０細胞）、ヒト骨肉腫細胞（例えば、Ｕ２ＯＳ）、ヒト乳癌細胞（例えば、ＭＣＦ－７）、ヒト子宮頸癌細胞（例えば、ＨｅＬａ）、ヒト胎児腎細胞（例えば、ＨＥＫ２９３）、ヒト線維肉腫細胞（例えば、ＨＴ１０８０）、ヒト肝癌細胞（例えば、ＨｅｐＧ２）、ヒト横紋筋肉腫ＲＤ細胞（「ヒトＲＤ細胞」）、ヒト網膜芽細胞腫細胞（例えば、ＳＯ－Ｒｂ５及びＹ７９）、マウス胚性癌細胞（例えば、Ｐ１９）、マウス線維芽細胞（例えば、Ｌ９２９及びＮＩＨ３Ｔ３）、マウス神経芽腫細胞（例えば、Ｎ２ａ）、及び上記細胞系の任意の誘導体が挙げられる。
[0044] 安定的形質移入細胞を生成するために多数の細胞系、例として、タンパク質発現系の構成成分として使用される細胞系が好適である。一部の実施形態において、トランスジェニック細胞は、哺乳類細胞を含む。好適な哺乳類細胞系の非限定的な例としては、腺癌ヒト肺胞基底上皮細胞（例えば、Ａ５４９細胞）、アフリカザル（African monkey）腎細胞（例えば、ＣＯＳ及びＶｅｒｏ細胞）、ベビーハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、マウス骨髄腫細胞（例えば、Ｊ５５８Ｌ、ＮＳ０、及びＳｐ２／０細胞）、ヒト骨肉腫細胞（例えば、Ｕ２ＯＳ）、ヒト乳癌細胞（例えば、ＭＣＦ－７）、ヒト子宮頸癌細胞（例えば、ＨｅＬａ）、ヒト胎児腎細胞（例えば、ＨＥＫ２９３）、ヒト線維肉腫細胞（例えば、ＨＴ１０８０）、ヒト肝癌細胞（例えば、ＨｅｐＧ２）、ヒト横紋筋肉腫ＲＤ細胞（「ヒトＲＤ細胞」）、ヒト網膜芽細胞腫細胞（例えば、ＳＯ－Ｒｂ５及びＹ７９）、マウス胚性癌細胞（例えば、Ｐ１９）、マウス線維芽細胞（例えば、Ｌ９２９及びＮＩＨ３Ｔ３）、マウス神経芽腫細胞（例えば、Ｎ２ａ）、及び上記細胞系の任意の誘導体が挙げられる。
【0024】
[0045] 一部の実施形態において、哺乳類細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（その任意の誘導体を含む）又はヒトＲＤ細胞（その任意の誘導体を含む）を含む。ＣＨＯ細胞系誘導体の非限定的な例としては、ＣＨＯ－Ｋ１、ＣＨＯ ｐｒｏ－３、及びＤＨＦＲ欠損細胞系、例えば、ＤＵＫＸ－Ｘ１１及びＤＧ４４が挙げられる。
【0025】
[0046] 一部の実施形態において、トランスジェニック細胞は、レポーターについての基質をさらに含む。
【0026】
Ｂ．レポーター及び基質
[0047] 一部の実施形態において、レポーターの存在は、トランスジェニック細胞を溶解させずに検出することができる。例えば、レポーター自体が、検出可能部分、例えば、蛍光標識を含み得る。或いは又はさらに、レポーターは基質に結合し、又は作用し得、基質へのレポーターの結合又は作用は細胞内で検出可能である。例えば、レポーターは、基質への作用が細胞内で検出可能な酵素を含み得る。
[0047] 一部の実施形態において、レポーターの存在は、トランスジェニック細胞を溶解させずに検出することができる。例えば、レポーター自体が、検出可能部分、例えば、蛍光標識を含み得る。或いは又はさらに、レポーターは基質に結合し、又は作用し得、基質へのレポーターの結合又は作用は細胞内で検出可能である。例えば、レポーターは、基質への作用が細胞内で検出可能な酵素を含み得る。
【0027】
[0048] 一部の実施形態において、レポーターは、光放出レポーター、例えば、化学発光又は生物発光レポーターである。例えば、レポーターは、基質への作用が光放出する酵素を含み得る。
【0028】
[0049] 例えば、レポーターは、ルシフェラーゼポリペプチド、例えば、限定されるものではないが、ホタルルシフェラーゼ（例えば、フォティヌス・ピラリス（Photinus pyralis）ルシフェラーゼ）、ウミシイタケ属（Renilla）ルシフェラーゼ（例えば、ウミシイタケ（Renilla reformis）ルシフェラーゼ）、ガウシア属（Gaussia）ルシフェラーゼ（例えば、ガウシア・プリンセプス（Gaussia princeps）ルシフェラーゼ）、オキヒオドシエビ属（Oplophorus）ルシフェラーゼ（例えば、オキヒメヒオドシエビ（Oplophorus gracilirostris）ルシフェラーゼ）、又はそのバリアント若しくは組み合わせを含み得る。一部の実施形態において、レポーターは、改変されたルシフェラーゼである。改変されたルシフェラーゼの例としては、限定されるものではないが、それぞれの全内容が参照により本明細書に援用される米国特許第５，６７０，３５６号；同第７，７２９，１１８号；及び同第８，００８，００６号に記載のものが挙げられる。一部の実施形態において、改変されたルシフェラーゼは、循環置換されたルシフェラーゼである。
【0029】
[0050] 一部の実施形態において、ルシフェラーゼポリペプチドの立体構造変化は、ルシフェラーゼ活性の増加と関連する。
【0030】
[0051] 一部の実施形態において、提供されるキットは、レポーターについての基質をさらに含む。基質は、別個の試薬として提供することができる。或いは又はさらに、基質は、別の試薬の一部として提供することができる。例えば、本明細書に挙げられるトランスジェニック細胞は、基質を含み得る。
【0031】
[0052] レポーターに適切な任意の基質を使用することができる。一部の実施形態において、基質は、細胞膜を介して細胞質中に拡散し得る。一部の実施形態において、基質は、細胞膜を介して細胞質中に能動的に輸送される。
【0032】
[0053] 例えば、レポーターがルシフェラーゼポリペプチドを含む場合、基質は、任意の対応するルシフェリンであり得る。ルシフェラーゼポリペプチドがルシフェリンを酸化して励起分子（例えば、オキシルシフェリン）を生成し得、次いでそれが基底状態に緩和する場合に光放出する場合、ルシフェリンは「対応するルシフェリン」である。
【0033】
[0054] 例えば、Ｄ－ルシフェリン又はその誘導体は、種々のルシフェラーゼポリペプチド、例として、ホタルルシフェラーゼについての基質であり得る。別の例として、セレンテラジン又はその誘導体は、種々のルシフェラーゼポリペプチド、例として、ウミシイタケ属（Renilla）ルシフェラーゼ、ガウシア属（Gaussia）ルシフェラーゼ、及びオキヒオドシエビ属（Oplophorus）ルシフェラーゼについての基質であり得る。
【0034】
Ｃ．反応緩衝液
[0055] 反応緩衝液は細胞溶解剤を欠き、一般に、塩の混合物を含む。例えば、反応緩衝液は、ＣａＣｌ２、ＫＣｌ、ＫＨ２ＰＯ４、ＭｇＳＯ４、Ｎａ２ＨＰＯ４、ＮａＨＣＯ３、ＮａＣｌ、ＨＥＰＥＳ（４－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－１－エタンスルホン酸）、又はそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される塩を含み得る。一部の実施形態において、反応緩衝液は、ＣａＣｌ２、ＫＣｌ、ＫＨ２ＰＯ４、ＭｇＳＯ４、Ｎａ２ＨＰＯ４、及びＨＥＰＥＳを含む。一部の実施形態において、反応緩衝液は、ＣａＣｌ２、ＫＣｌ、ＫＨ２ＰＯ４、ＭｇＳＯ４、Ｎａ２ＨＰＯ４、ＮａＨＣＯ３、及びＮａＣｌを含む。
[0055] 反応緩衝液は細胞溶解剤を欠き、一般に、塩の混合物を含む。例えば、反応緩衝液は、ＣａＣｌ２、ＫＣｌ、ＫＨ２ＰＯ４、ＭｇＳＯ４、Ｎａ２ＨＰＯ４、ＮａＨＣＯ３、ＮａＣｌ、ＨＥＰＥＳ（４－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－１－エタンスルホン酸）、又はそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される塩を含み得る。一部の実施形態において、反応緩衝液は、ＣａＣｌ２、ＫＣｌ、ＫＨ２ＰＯ４、ＭｇＳＯ４、Ｎａ２ＨＰＯ４、及びＨＥＰＥＳを含む。一部の実施形態において、反応緩衝液は、ＣａＣｌ２、ＫＣｌ、ＫＨ２ＰＯ４、ＭｇＳＯ４、Ｎａ２ＨＰＯ４、ＮａＨＣＯ３、及びＮａＣｌを含む。
【0035】
[0056] 反応緩衝液は、塩の混合物に加え、１つ以上の成分も含み得る。例えば、一部の実施形態において、反応緩衝液は、スクロースをさらに含む。一部の実施形態において、反応緩衝液は、少なくとも５ｇ／Ｌ、少なくとも１０ｇ／Ｌ、少なくとも１５ｇ／Ｌ、又は少なくとも２０ｇ／Ｌのスクロースを含む。一部の実施形態において、反応緩衝液は、多くとも１００ｇ／Ｌ、多くとも９０ｇ／Ｌ、多くとも８０ｇ／Ｌ、多くとも７０ｇ／Ｌ、多くとも６０ｇ／Ｌ、多くとも５０ｇ／Ｌ、多くとも４０ｇ／Ｌのスクロース、多くとも３０ｇ／Ｌ、又は多くとも２０ｇ／Ｌのスクロースを含む。一部の実施形態において、反応緩衝液は、５ｇ／Ｌ～１００ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ～９０ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ～８０ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ～７０ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ～６０ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ～５０ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ～４０ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ間、又は１０ｇ／Ｌ～３０ｇ／Ｌのスクロースを含む。一部の実施形態において、反応緩衝液は、約５ｇ／Ｌ、約７．５ｇＬ、約１０ｇ／Ｌ、約１２．５ｇ／Ｌ、約１５ｇ／Ｌ、約１７．５ｇ／Ｌ、約２０ｇ／Ｌ、約２２．５ｇ／Ｌ、約２５ｇ／Ｌ、約２７．５ｇ／Ｌ、約３０ｇ／Ｌ、約３２．５ｇ／Ｌ、約３５ｇ／Ｌ、約３７．５ｇ／Ｌ、約４０ｇ／Ｌ、約４２．５ｇ／Ｌ、約４５ｇ／Ｌ、約４７．５ｇ／Ｌ、約５０ｇ／Ｌ、約５５ｇ／Ｌ、約６０ｇ／Ｌ、約６５ｇ／Ｌ、約７０ｇ／Ｌ、又は約７５ｇ／Ｌのスクロースを含む。
【0036】
[0057] 一部の実施形態において、反応緩衝液は、少なくとも１０ｍＭ、少なくとも２０ｍＭ、少なくとも３０ｍＭのスクロース、少なくとも４０ｍＭ、少なくとも５０ｍＭ、少なくとも７５ｍＭ、又は少なくとも１００ｍＭのスクロースを含む。一部の実施形態において、反応緩衝液は、多くとも３００ｍＭ、多くとも２７５ｍＭ、多くとも２５０ｍＭ、多くとも２２５ｍＭ、多くとも２００ｍＭ、多くとも１７５ｍＭ、多くとも１５０ｍＭ、少なくとも１２５ｍＭ、多くとも１００ｍＭ、多くとも９０ｍＭ、多くとも８０ｍＭ、多くとも７０ｍＭ、多くとも６０ｍＭ、又は多くとも５０ｍＭのスクロースを含む。一部の実施形態において、反応緩衝液は、１０ｍＭ～３００ｍＭ、２０ｍＭ～２００、３０ｍＭ～１５０ｍＭのスクロース、３０ｍＭ～１２５ｍＭ、又は３０ｍＭ～１００ｍＭのスクロースを含む。一部の実施形態において、反応緩衝液は、約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約４０ｍＭ、約４５ｍＭ、約５０ｍＭ、約６０ｍＭ、約７０ｍＭ、約８０ｍＭ、約９０ｍＭ、約１００ｍＭ、約１２０ｍＭ、約１４０ｍＭ、約１６０ｍＭ、約１８０ｍＭ、約２００ｍＭ、又は約２２０ｍＭのスクロースを含む。
【0037】
[0058] 一部の実施形態において、反応緩衝液は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、例えば、１００～２０，０００の分子量を有するＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ－１００、ＰＥＧ－２００、ＰＥＧ－３００、Ｐｅｇ－４００、ＰＥＧ－６００、ＰＥＧ－１０００、ＰＥＧ－１５００、ＰＥＧ－２０００、ＰＥＧ－２０５０、ＰＥＧ－３０００、ＰＥＧ－３３５０、ＰＥＧ－４０００、ＰＥＧ－４６００、ＰＥＧ－６０００、ＰＥＧ－８０００、ＰＥＧ－１０，０００、ＰＥＧ－１２，０００、ＰＥＧ－２０，０００又はそれらの混合物）をさらに含む。一部の実施形態において、反応緩衝液は、少なくとも０．５％のＰＥＧ、少なくとも１％のＰＥＧ、少なくとも２％のＰＥＧ、少なくとも３％のＰＥＧ、少なくとも４％のＰＥＧ、少なくとも５％のＰＥＧ、少なくとも６％のＰＥＧ、少なくとも７％のＰＥＧ、又は少なくとも８％のＰＥＧを含む。一部の実施形態において、反応緩衝液は、多くとも１２％のＰＥＧ、多くとも１１％のＰＥＧ、多くとも１０％のＰＥＧ、多くとも９％のＰＥＧ、多くとも８％のＰＥＧ、多くとも７％のＰＥＧ、多くとも６％のＰＥＧ、又は多くとも５％のＰＥＧを含む。一部の実施形態において、反応緩衝液は、０．５％～１２％のＰＥＧ、１％～１０％のＰＥＧ、又は２％～６％のＰＥＧを含む。一部の実施形態において、反応緩衝液は、約０．５％、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、又は約８％のＰＥＧを含む。
【0038】
[0059] 一部の実施形態において、反応緩衝液は、アルブミン、例えば、ウシ血清アルブミンを含む。一部の実施形態において、反応緩衝液は、少なくとも０．５％、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、又は少なくとも５％のアルブミンを含む。一部の実施形態において、反応緩衝液は、多くとも１２％、多くとも１０％、多くとも８％、多くとも６％、多くとも４％、又は多くとも２％のアルブミンを含む。
【0039】
[0060] 一部の実施形態において、反応緩衝液は、塩、ＰＥＧ、スクロース、及びアルブミンを含む。一部の実施形態において、反応緩衝液は、塩、ＰＥＧ、及びスクロースを含むがアルブミンを含まない。一部の実施形態において、反応緩衝液は、塩及びＰＥＧを含むが、スクロースもアルブミンも含まない。
【0040】
[0061] 反応緩衝液配合物の非限定的な例としては、全内容が参照により本明細書に援用される米国特許第９，７３９，７７５号（その中で「刺激媒体」と称される）に開示される配合物が挙げられる。
【0041】
[0062] 一部の実施形態において、反応緩衝液は、野生型又はキメラＴＳＨＲ受容体へのＴＳＨの結合を阻害し、それにより例えば、試験血液サンプル中の正常生理学的又は高レベルのＴＳＨの存在に起因する偽シグナルを妨げる試薬を含む。ＴＳＨ阻害剤は、ＴＳＨに特異的に結合する抗体、又は野生型若しくはキメラＴＳＨＲへのＴＳＨの結合をＴＳＨＲに結合せずに遮断する他の薬剤であり得、したがってＴＳＨからの干渉もＴＳＨ遮断試薬からの干渉もなしでアッセイの進行を可能とする。
【0042】
Ｄ．対照及びスタンダード
[0063] 一部の実施形態において、提供されるキットは、１つ以上の対照の甲状腺刺激剤及び／又は１つ以上の対照の甲状腺遮断剤をさらに含む。本明細書において使用される対照の甲状腺刺激剤という用語は、哺乳類細胞上で発現されるＴＳＨＲを刺激することが公知の薬剤を指す。ＴＳＨＲへの対照の甲状腺刺激剤の結合は、ｃＡＭＰ上方調節を含む細胞内シグナリングイベントを誘導する。好適な対照の甲状腺刺激剤の例としては、限定されるものではないが、甲状腺刺激抗体（例えば、Ｍ２２抗ＴＳＨＲ ｍＡｂ及びＮＩＢＳＣ０８／２０４（甲状腺刺激抗体についてのＷＨＯ国際スタンダード）及び甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）（例えば、ウシＴＳＨ）が挙げられる。本明細書において使用される対照の甲状腺遮断剤という用語は、例えば、ＴＳＨＲへのＴＳＨ結合を妨げることにより、又はＴＳＨＲに結合し、それにより刺激剤、例えば、ＴＳＩ特異的抗体の結合を阻害することにより哺乳類細胞上で発現されるＴＳＨＲの作用を遮断することが公知の薬剤を指す。好適な対照の甲状腺刺激剤の例としては、限定されるものではないが、甲状腺遮断抗体、例えば、３Ｈ１０及びＫ１７０が挙げられる。
[0063] 一部の実施形態において、提供されるキットは、１つ以上の対照の甲状腺刺激剤及び／又は１つ以上の対照の甲状腺遮断剤をさらに含む。本明細書において使用される対照の甲状腺刺激剤という用語は、哺乳類細胞上で発現されるＴＳＨＲを刺激することが公知の薬剤を指す。ＴＳＨＲへの対照の甲状腺刺激剤の結合は、ｃＡＭＰ上方調節を含む細胞内シグナリングイベントを誘導する。好適な対照の甲状腺刺激剤の例としては、限定されるものではないが、甲状腺刺激抗体（例えば、Ｍ２２抗ＴＳＨＲ ｍＡｂ及びＮＩＢＳＣ０８／２０４（甲状腺刺激抗体についてのＷＨＯ国際スタンダード）及び甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）（例えば、ウシＴＳＨ）が挙げられる。本明細書において使用される対照の甲状腺遮断剤という用語は、例えば、ＴＳＨＲへのＴＳＨ結合を妨げることにより、又はＴＳＨＲに結合し、それにより刺激剤、例えば、ＴＳＩ特異的抗体の結合を阻害することにより哺乳類細胞上で発現されるＴＳＨＲの作用を遮断することが公知の薬剤を指す。好適な対照の甲状腺刺激剤の例としては、限定されるものではないが、甲状腺遮断抗体、例えば、３Ｈ１０及びＫ１７０が挙げられる。
【0043】
[0064] 一部の実施形態において、提供されるキットは、１つ以上の対照サンプル、例えば、ＴＳＩ若しくはＴＢＩを欠く対照陰性サンプル、対照の甲状腺遮断剤を含む対照陰性サンプル、及び／又はＴＳＩ、ＴＢＩ、若しくは対照の甲状腺刺激剤を含む対照陽性サンプルを含む。好適な対照陰性サンプルの非限定的な例としては、ＴＳＩ及びＴＢＩについて陰性であることが既知の血清サンプル、臨床サンプル（例えば、ヒト血清サンプル）、ＴＳＩ及びＴＢＩを欠く人工組成物、対照の甲状腺遮断剤を含むことが既知の臨床サンプル、又は対照の甲状腺遮断剤を含む人工サンプルが挙げられる。好適な対照陽性サンプルの非限定的な例としては、ＴＳＩ、ＴＢＩ、若しくは対照の甲状腺刺激剤によりスパイクされた血清サンプル；ＴＳＩ及び／又はＴＢＩについて陽性であることが既知の臨床サンプル（例えば、ヒト血清サンプル）、又はＴＳＩ、ＴＢＩ、若しくは対照の甲状腺刺激剤によりスパイクされた人工組成物が挙げられる。
【0044】
[0065] 一部の実施形態において、提供されるキットは、例えば、サンプル中のＴＳＩ及び／又はＴＢＩの量を定量するための定量スタンダード又はスタンダードのセットを含む。スタンダードは、既知の量又は濃度の薬剤、例えば、対照の甲状腺刺激剤及び／又は対照の甲状腺遮断剤により特徴付けすることができる。キットは、スタンダードを希釈してスタンダードのセットを作製するための説明書を含み得、又はキットは、それぞれ異なる既知の量又は濃度の薬剤を有するスタンダードのセットを含み得る。
【0045】
[0066] 提供される方法に従って使用される場合、一部の実施形態において、少なくとも１つの対照サンプル又はスタンダードは、他のサンプルと並行して処理する。
【0046】
ＩＩＩ．アッセイ法
[0067] 一態様において、甲状腺刺激免疫グロブリン（ＴＳＩ）及び／又は甲状腺遮断免疫グロブリン（ＴＢＩ）を検出する方法が提供される。提供される方法は、一般に、（ａ）トランスジェニック細胞（本明細書に記載）を、甲状腺刺激及び／又は甲状腺遮断自己抗体を含むことが疑われるサンプルと接触させるステップと、（ｂ）レポーターの発現と関連する細胞内シグナルを検出するステップとを含む。
[0067] 一態様において、甲状腺刺激免疫グロブリン（ＴＳＩ）及び／又は甲状腺遮断免疫グロブリン（ＴＢＩ）を検出する方法が提供される。提供される方法は、一般に、（ａ）トランスジェニック細胞（本明細書に記載）を、甲状腺刺激及び／又は甲状腺遮断自己抗体を含むことが疑われるサンプルと接触させるステップと、（ｂ）レポーターの発現と関連する細胞内シグナルを検出するステップとを含む。
【0047】
[0068] 一部の実施形態において、接触ステップは、レポーターについての基質を含む緩衝液中で接触させることを含む。緩衝液は、一般に、細胞溶解剤を除外し、例えば、上記の任意の反応緩衝液であり得る。
【0048】
[0069] 一部の実施形態において、提供される方法は、トランスジェニック細胞を、接触ステップ前にレポーターについての基質に曝露するステップをさらに含む。
【0049】
[0070] サンプルは、本明細書にさらに記載される任意の対象から得ることができる。一部の実施形態において、サンプルは、血清を含む。一部の実施形態において、サンプルは、非希釈サンプルである。
【0050】
[0071] 一部の実施形態において、検出ステップは、接触ステップの２４０分後以下（約２４０分後又はそれ未満）、１８０分後以下、９０分後以下、６０分後以下、３０分後以下、１５分後以下、又は５分後以下に実施する。例えば、一部の実施形態において、検出ステップは、接触ステップの２４０分後未満、１８０分後未満、９０分後未満、又は６０分後未満に実施する。一部の実施形態において、検出ステップは、接触ステップの約５分～約６０分後、例えば、約１０分後、約１５分後、２０分後、約２５分後、約３０分後、約３５分後、約４０分後、約４５分後、約５０分後、約５５分後、又は約６０分後に実施する。
【0051】
[0072] 一部の実施形態において、検出ステップは、接触ステップ後にトランスジェニック細胞又はサンプルを添加も除去もせずに実施する。したがって、一部の実施形態において、細胞内シグナルは、トランスジェニック細胞及びサンプルを含む組成物から検出する。一部の実施形態において、組成物中のトランスジェニック細胞の少なくとも一部（例えば、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％）は、検出時においてインタクトである（すなわち、溶解していない）。
【0052】
[0073] 一部の実施形態において、検出ステップは、接触ステップ後に基質を添加も除去もせずに実施する。一部の実施形態において、検出ステップは、接触ステップ後に基質、トランスジェニック細胞、又はサンプルのいずれも添加も除去もせずに実施する。
【0053】
[0074] 一部の実施形態において、接触ステップは、室温において（例えば、完全に室温において）実施する。一部の実施形態において、方法は完全に室温において実施し、すなわち、方法における全てのステップを室温において実施する。
【0054】
[0075] 一部の実施形態において、提供される方法は、トランスジェニック細胞を接触ステップ前に解凍することをさらに含む。一部の実施形態において、接触ステップは、前記解凍の１２０分後未満、９０分後未満、６０分後未満、又は３０分後未満に実施する。
【0055】
[0076] 一部の実施形態において、提供される方法は、マルチウェルプレート、例えば、９６ウェルプレート、３８４ウェルプレートなど、例えば、黒色、白色、透明底を有する白色プレート又は透明プレートを使用して実施する。一部の実施形態において、提供される方法は、白色プレートを使用して実施する。一部の実施形態において、提供される方法は、非コート又は非処理プレート上で実施する。
【0056】
Ａ．ＴＳＩの検出
[0077] 一部の実施形態において、提供される方法を使用してＴＳＩを検出する。これらの実施形態において、キメラＴＳＨＲはＴＳＩに結合し、さらにＴＢＩに結合しても結合しなくてもよく、サンプルはＴＳＩを含むことが疑われ、ＴＢＩも含むことが疑われていても疑われていなくてもよい。
[0077] 一部の実施形態において、提供される方法を使用してＴＳＩを検出する。これらの実施形態において、キメラＴＳＨＲはＴＳＩに結合し、さらにＴＢＩに結合しても結合しなくてもよく、サンプルはＴＳＩを含むことが疑われ、ＴＢＩも含むことが疑われていても疑われていなくてもよい。
【0057】
[0078] 提供される方法を使用してＴＳＩを検出する場合、ＴＳＩを含むことが疑われるサンプルからのシグナルは、一般に、対照ベースライン値に対して比較する。対照ベースライン値よりも大きいシグナルは、ＴＳＩの存在を示し得る。
【0058】
[0079] 対照ベースライン値は（例えば、提供されるキット中に含まれる説明書において）提供することができ、又はそれは、トランスジェニック細胞及び基質を含有するが、ＴＳＩを含有しない対照ウェルから得ることができる。例えば、対照ウェルは、（１）ＴＳＩを含まず、ＴＳＩを含むことが疑われるサンプルと並行して処理することが意図される対照サンプル；及び／又は（２）ＴＳＩを含むことが疑われるサンプルと並行して処理されることを必要としない組成物を含む。或いは又はさらに、対照ウェルはサンプルを欠き得るが、他の点ではＴＳＩを含むことが疑われるサンプルと並行して処理する。
【0059】
Ｂ．ＴＢＩの検出
[0080] 一部の実施形態において、提供される方法を使用してＴＢＩを検出する。これらの実施形態において、キメラＴＳＨＲはＴＢＩに結合し、さらにＴＳＩに結合しても結合しなくてもよく、サンプルは、ＴＢＩを含むことが疑われ、さらにＴＳＩを含むことが疑われていても疑われなくてもよい。
[0080] 一部の実施形態において、提供される方法を使用してＴＢＩを検出する。これらの実施形態において、キメラＴＳＨＲはＴＢＩに結合し、さらにＴＳＩに結合しても結合しなくてもよく、サンプルは、ＴＢＩを含むことが疑われ、さらにＴＳＩを含むことが疑われていても疑われなくてもよい。
【0060】
[0081] 一般に、提供される方法を使用してＴＢＩを検出する場合、接触ステップは、トランスジェニック細胞を、第１の発現ベクターによりコードされるキメラＴＳＨＲに結合する対照の甲状腺刺激剤（本明細書にさらに記載）と接触させることをさらに含む。一部の実施形態において、トランスジェニック細胞をサンプルと接触させる前に、トランスジェニック細胞を対照の甲状腺刺激剤と接触させる。
【0061】
[0082] 一般に、アッセイを実施してＴＢＩを検出する場合、ＴＢＩを含むことが疑われるサンプルからのシグナルは、対照ベースライン値に対して比較する。サンプルと関連するシグナルが対照ベースライン値と比較して低減する場合、サンプルは、ＴＢＩを含み得る。
【0062】
[0083] 対照ベースライン値は（例えば、提供されるキット中に含まれる説明書において）提供することができ、又はそれは、甲状腺刺激剤、トランスジェニック細胞、及び基質を含有するが、ＴＢＩを含有しない対照ウェルから得ることができる。例えば、対照ウェルは、（１）ＴＢＩを含まず、ＴＢＩを含むことが疑われるサンプルと並行して処理されることが意図される対照サンプル；及び／又は（２）ＴＢＩを含むことが疑われるサンプルと並行して処理されることを必要としない組成物を含む。或いは又はさらに、対照ウェルはサンプルを欠き得るが、他の点ではＴＢＩを含むことが疑われるサンプルと並行して処理することができる。
【0063】
ＩＶ．用途
[0084] 本明細書に提供されるキット、組成物、及び方法を使用して甲状腺刺激免疫グロブリン（ＴＳＩ）及び／又は甲状腺遮断抗体（ＴＢＩ）を検出することができる。この検出は、ＴＳＨＲに対する自己抗体、例えば、ＴＳＩ及び／又はＴＢＩの存在と関連する１つ以上の疾患の診断において有用であり得る。
[0084] 本明細書に提供されるキット、組成物、及び方法を使用して甲状腺刺激免疫グロブリン（ＴＳＩ）及び／又は甲状腺遮断抗体（ＴＢＩ）を検出することができる。この検出は、ＴＳＨＲに対する自己抗体、例えば、ＴＳＩ及び／又はＴＢＩの存在と関連する１つ以上の疾患の診断において有用であり得る。
【0064】
[0085] 一部の実施形態において、サンプルは、自己免疫性甲状腺疾患を有することが疑われ、又はそれを発症するリスクがある対象から得る。一部の実施形態において、自己免疫性甲状腺疾患は、ＴＳＩの存在と関連する。一部の実施形態において、自己免疫性甲状腺疾患は、ＴＢＩの存在と関連する。一部の実施形態において、自己免疫性甲状腺疾患は、ＴＳＩ及びＴＢＩの両方の存在と関連する。一部の対象は２つ以上の障害を有し得、又はそれらの障害は経時的にも変化し得、その結果、それらの系中の任意の自己抗体のプロファイルは経時的に変化し、例えば、優勢なあるタイプの自己抗体から別のタイプに（例えば、ＴＳＩからＴＢＩに又はその逆）スイッチする。
【0065】
[0086] 例えば、甲状腺機能亢進症は、ＴＳＩの産生と関連することが多い。甲状腺機能亢進症により特徴付けられる疾患の非限定的な例は、グレーブス病である。
【0066】
[0087] 一部の甲状腺機能低下障害は、ＴＢＩと関連する。甲状腺機能低下障害の例としては、限定されるものではないが、橋本病、新生児甲状腺機能低下症、非甲状腺腫性甲状腺機能低下症、原発性粘液水腫、及び特発性粘液水腫が挙げられる。
【0067】
[0088] 一部の実施形態において、サンプルを得る対象は、哺乳類である。一部の実施形態において、対象は、ヒトである。
【0068】
[0089] 一部の実施形態において、サンプルは、血液又は血清サンプルである。
【0069】
Ｖ．関連キット及び方法
[0090] 当業者は、本開示が、ＴＳＨシグナリング活性を改変するＴＳＨＲ自己抗体に加え、他の生物分子の検出及びスクリーニングのためのさらに他の産物を作出するための十分な指針を提供することを認識する。例えば、本明細書の教示に照らして、当業者は、Ｇタンパク質共役細胞表面受容体（ＧＰＣＲ）を介して効果を付与する細胞内シグナリングに対する効果を有し、細胞内ｃＡＭＰレベルの変化をもたらす刺激若しくは遮断抗体、又は他の刺激若しくは遮断剤を検出するための細胞ベースレポーターアッセイ系を構築することができる。
[0090] 当業者は、本開示が、ＴＳＨシグナリング活性を改変するＴＳＨＲ自己抗体に加え、他の生物分子の検出及びスクリーニングのためのさらに他の産物を作出するための十分な指針を提供することを認識する。例えば、本明細書の教示に照らして、当業者は、Ｇタンパク質共役細胞表面受容体（ＧＰＣＲ）を介して効果を付与する細胞内シグナリングに対する効果を有し、細胞内ｃＡＭＰレベルの変化をもたらす刺激若しくは遮断抗体、又は他の刺激若しくは遮断剤を検出するための細胞ベースレポーターアッセイ系を構築することができる。
【0070】
[0091] ＧＰＣＲは、種々の細胞外刺激に応答する統合膜タンパク質の大きなファミリーである。それぞれのＧＰＣＲは特異的リガンドに結合し、その刺激により活性化され、それは小分子カテコールアミン、脂質、又は神経伝達物質から大型タンパク質ホルモンまでサイズが変動する。ＧＰＣＲ、例えば、ＴＳＨ受容体がその細胞外リガンドＴＳＨにより活性化される場合、立体構造変化が受容体において誘導され、それは付着細胞内へテロ三量体Ｇタンパク質複合体に伝達される。ｃＡＭＰ依存性経路において、活性化されたタンパク質Ｇｓアルファサブユニットは、アデニリルシクラーゼと呼ばれる酵素に結合し、それを活性化させ、次いでそれはＡＴＰの環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）への変換を触媒する。
【0071】
[0092] セカンドメッセンジャーｃＡＭＰの濃度の増加又は減少は、例えば、関連ＧＰＣＲも発現する宿主トランスジェニック細胞内のｃＡＭＰ誘導性プロモーターレポーター構築物により検出することができる。或いは、ｃＡＭＰの濃度の増加又は減少は、改変／異種ｃＡＭＰ結合タンパク質の使用により検出することができ、ｃＡＭＰ結合タンパク質は、検出及び／又は定量することができるレポーター部分に融合している。
【0072】
[0093] 広範なペプチド及びポリペプチド部分を、受容体のシグナル伝達活性を実質的に破壊せずにＧＰＣＲ分子のＮ又はＣ末端のいずれかに付加することができることが公知である。その観察は、本開示に記載のＴＳＨＲ系に加え、他の検出系の構築を許容する。
【0073】
[0094] 一態様において、ＧＰＲＣが１つ以上の結核菌（Mycobacterium tuberculosis）（ＴＢ）抗原を有する融合タンパク質を含むように改変される場合、シグナリングカスケード（例えば、ｃＡＭＰシグナル）を誘発するための改変／キメラＧＰＣＲを用いる本明細書に記載の細胞ベース検出系を使用することが可能である。次いで、この系は、例えば、対象の血液中に存在し得る抗体を検出し得、抗ＴＢ抗体は、レポーター細胞の表面上のキメラＧＰＣＲ融合受容体のＴＢ抗原部分に結合し得、抗ＴＢ抗体結合は、融合タンパク質のＧＰＣＲシグナリング部分の活性化又は抑制をもたらし、ｃＡＭＰ産生の増加又は減少を誘発する。
【0074】
[0095] キメラＧＰＣＲ分子上のＴＢ抗原に結合する抗ＴＢ抗体に応答するｃＡＭＰ産生の増加又は減少の評価は、例えば、ｃＡＭＰ感受性プロモーターレポーター構築物、或いは好適なレポーター部分に融合している環状ＡＭＰ結合タンパク質を使用することにより検出することができる。
【0075】
[0096] さらに他の実施形態において、この同じ原理を使用して、トランスジェニック検出器細胞がＴ細胞特異的応答を誘発するＴＢ抗原により活性化された特異的Ｔ細胞を検出することを可能とする本明細書に記載の系の改変バージョンを使用することが可能である。このアプローチは、細胞媒介免疫応答を開始させる任意の抗原について機能する。
【0076】
[0097] インターフェロン－γ（ＩＦＮ－γ又はガンマ）放出アッセイ（ＩＧＲＡ）、例えば、潜在性（ＬＴＢＩ）及び活動性結核（ＴＢ）の両方の診断のためのＩＧＲＡも、本明細書に記載の方法及びキットとともに使用される場合、使用される。ＩＧＲＡは、Ｔリンパ球が特異的抗原に曝露された場合にＩＦＮ－γを放出し、それをＥＬＩＳＡタイプアッセイにより定量するという事実に依存する。種々の市販のＩＧＲＡが、ＴＢ感染の診断に利用可能である。例えば、QIAGEN（登録商標）QuantiFERON（登録商標）－ＴＢ Goldアッセイは、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）抗原に対応する２つの合成ペプチドの混合物に応答して産生されるＩＦＮ－γの量を定量するための全血試験である。さらに、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）特異的抗原への曝露に応答して血液サンプル中でインターフェロン－ガンマを産生する抗抗酸菌エフェクターＴ細胞の数を計数するOxford Immunotec Ltd. T-SPOT.TB（商標）ＩＧＲＡも利用可能である。
【0077】
ＶＩ．阻害抗ＴＳＨＲ自己抗体（ＴＢＩ）の同定
[0098] 甲状腺遮断免疫グロブリン（ＴＢＩ）は、甲状腺刺激ホルモン受容体（ＴＳＨＲ）に結合し、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）の作用を阻害する自己抗体である。ＴＢＩの存在は橋本病をもたらすが、ＴＢＩは橋本病の唯一の原因ではない。
[0098] 甲状腺遮断免疫グロブリン（ＴＢＩ）は、甲状腺刺激ホルモン受容体（ＴＳＨＲ）に結合し、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）の作用を阻害する自己抗体である。ＴＢＩの存在は橋本病をもたらすが、ＴＢＩは橋本病の唯一の原因ではない。
【0078】
[0099] 甲状腺刺激免疫グロブリン（ＴＳＩ）と甲状腺遮断免疫グロブリン（ＴＢＩ）とを区別する能力は、簡易な免疫アッセイではなく生物学的試験系を要求する。それというのも、ＴＳＩ及びＴＢＩ自己抗体の両方がＴＳＨＲに結合し、ゆえに阻害生物学的効果と刺激生物学的効果とを区別するものとしてこのタイプの血清学的検出系を無効にするためである。ＴＳＨＲに対する自己抗体の生物学的効果について試験する生物学的試験系が要求される。
【0079】
[0100] 本開示は、本明細書に記載の細胞ベース生物学的アッセイプロトコルの改変を提供し、改変プロトコルは、ＴＳＩ自己抗体と対照的にＴＢＩ自己抗体を特異的に区別する。これらのプロトコルは、以下の改変を含む。
【0080】
[0101] （１）細胞ベースアッセイ時、制御数のＴＳＩ特異的モノクローナル抗体（ＭＡｂ）を、患者血清の小アリコートを含有する試験ウェルに添加する。
【0081】
[0102] （２）患者試験血清中のＴＢＩ自己抗体の不存在下で、細胞ベース生物学的試験系の刺激／活性化及びレポーターの検出が存在し、陰性シグナルと命名される所定のレポーターシグナル範囲をもたらす。
【0082】
[0103] （３）患者試験血清中のＴＢＩ自己抗体の存在下で、アッセイは、３０％以上のレポーターシグナルの損失（シグナルの阻害）を示す。レポーター活性のこの低減は、対象の血清中のＴＢＩ自己抗体の存在を示す。
【0083】
[0104] 所定の「ＴＢＩ陰性シグナル」と比較したレポーターシグナルの３０％の低減は、一実施形態にすぎない。それというのも、レポーター活性の任意の統計的に有意な低減は、患者血清中のＴＢＩ自己抗体の存在についての陽性試験としても企図されるためである。例えば、ＴＢＩ自己抗体の存在を示す他の定量的閾値としては、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、又は少なくとも８０％のレポーター活性の任意の低減を挙げることができる。
【実施例】
【0084】
実施例
実施例１
甲状腺刺激免疫グロブリン（ＴＳＩ）を検出するためのアッセイ
[0105] この実施例は、サンプル中の甲状腺刺激免疫グロブリン（ＴＳＩ）を検出する改善方法の開発を記載する。本明細書に開示される改善方法において、サンプルを、（１）細胞表面上でキメラ甲状腺刺激ホルモン受容体（ＴＳＨＲ）受容体と、（２）ｃＡＭＰ結合タンパク質に融合している改変されたルシフェラーゼとを発現する二重トランスジェニック細胞とインキュベートする。例えば、サンプル中の甲状腺刺激免疫グロブリンへのキメラＴＳＨＲ受容体の結合は、トランスジェニック細胞内のｃＡＭＰシグナリングをもたらす。ｃＡＭＰはｃＡＭＰ結合タンパク質に結合し、それは改変されたルシフェラーゼの立体構造変化を引き起こし、それは改変されたルシフェラーゼの活性を向上させる。改変されたルシフェラーゼがその基質を開裂させる場合、光シグナルが生成される。次いで、シグナルをインキュベーション混合物から細胞を溶解させずに読み取る。
実施例１
甲状腺刺激免疫グロブリン（ＴＳＩ）を検出するためのアッセイ
[0105] この実施例は、サンプル中の甲状腺刺激免疫グロブリン（ＴＳＩ）を検出する改善方法の開発を記載する。本明細書に開示される改善方法において、サンプルを、（１）細胞表面上でキメラ甲状腺刺激ホルモン受容体（ＴＳＨＲ）受容体と、（２）ｃＡＭＰ結合タンパク質に融合している改変されたルシフェラーゼとを発現する二重トランスジェニック細胞とインキュベートする。例えば、サンプル中の甲状腺刺激免疫グロブリンへのキメラＴＳＨＲ受容体の結合は、トランスジェニック細胞内のｃＡＭＰシグナリングをもたらす。ｃＡＭＰはｃＡＭＰ結合タンパク質に結合し、それは改変されたルシフェラーゼの立体構造変化を引き起こし、それは改変されたルシフェラーゼの活性を向上させる。改変されたルシフェラーゼがその基質を開裂させる場合、光シグナルが生成される。次いで、シグナルをインキュベーション混合物から細胞を溶解させずに読み取る。
【0085】
[0106] したがって、この方法は、とりわけ、経時的な速度論的測定（例えば、均一リアルタイムアッセイ）を可能とする。さらに、この方法は自動化と適合性であり、他のＴＳＩ及び／又は甲状腺遮断免疫グロブリン（ＴＢＩ）検出アッセイよりもかなり短い検査所要時間を有する。例えば、この方法に従って実施されるアッセイは、プロトコルの開始から９０分間以下で結果の読取を可能とし得る。
【0086】
Ａ．材料及び方法
[0107] チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞に、２つのプラスミドを一過的に形質移入した：GLOSENSOR（商標）（Promegaから入手可能）ルシフェラーゼ及びｃＡＭＰ受容体（「ｐ２２Ｆ」）をコードする第１のプラスミド、並びに甲状腺刺激ホルモン受容体（ＴＳＨＲ）をコードする第２のプラスミド。あるＣＨＯ細胞セットに、野生型ＴＳＨＲをコードするプラスミド（ｐＴＳＨＲ－ＷＴ）を形質移入し；別のＣＨＯ細胞セットに、ＣｈＲ４、ヒトＴＳＨＲ配列を含むキメラＴＳＨＲ及びラット黄体形成ホルモン受容体（ＬＨＲ）配列をコードするプラスミド（「ｐＣｈＲ４」）を形質移入した。ＣｈＲ４は、それぞれの内容が参照により本明細書に援用される米国特許第８，９８６，９３７号及び米国特許第９，７３９，７７５号に記載されている。
[0107] チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞に、２つのプラスミドを一過的に形質移入した：GLOSENSOR（商標）（Promegaから入手可能）ルシフェラーゼ及びｃＡＭＰ受容体（「ｐ２２Ｆ」）をコードする第１のプラスミド、並びに甲状腺刺激ホルモン受容体（ＴＳＨＲ）をコードする第２のプラスミド。あるＣＨＯ細胞セットに、野生型ＴＳＨＲをコードするプラスミド（ｐＴＳＨＲ－ＷＴ）を形質移入し；別のＣＨＯ細胞セットに、ＣｈＲ４、ヒトＴＳＨＲ配列を含むキメラＴＳＨＲ及びラット黄体形成ホルモン受容体（ＬＨＲ）配列をコードするプラスミド（「ｐＣｈＲ４」）を形質移入した。ＣｈＲ４は、それぞれの内容が参照により本明細書に援用される米国特許第８，９８６，９３７号及び米国特許第９，７３９，７７５号に記載されている。
【0087】
[0108] 両方のタイプの形質移入細胞（ｗｔ ＴＳＨＲにより形質移入された細胞及びＣｈＲ４により形質移入されたものに対して並行アッセイを実施した。以下のサンプルを試験した：２ｍＩＵ／ｍＬのｂＴＳＨを含み、含有するサンプル、３つのＴＳＩ陽性血清サンプル、及び陰性対照としての正常血清サンプル。３つのＴＳＩ陽性サンプルは、THYRETAIN（登録商標）ＴＳＩアッセイからの結果に基づき選択し、それらは２８５％、３７６％及び５０１％の％ＳＲＲ値を示した（THYRETAIN（登録商標）ＴＳＩカットオフは１４０％ＳＲＲである）。６％のｃＡＭＰ試薬を有する反応緩衝液をアッセイブランクとして使用し、結果をシグナル対ブランク（Ｓ／Ｂ）比として報告した。ｐ２２Ｆ／ｐＴＳＨＲ－ｗｔにより形質移入された細胞は、ｐ２２Ｆ／ｐＣｈＲ４により形質移入された細胞よりもｂＴＳＨ刺激に対する有意に高い生物学的応答を示したが、両方の受容体は、低ＴＳＩ陽性サンプルを用いて試験した場合、類似の活性を示した（データ示さず）。
【0088】
[0109] 中又は高ＴＳＩ陽性サンプルを用いると、ＴＳＨＲ－ｗｔ形質移入細胞よりもＴＳＨＲ－ＣｈＲ４形質移入細胞について高いＳ／Ｂ比が観察された。この実験を繰り返した場合、類似の結果が得られた（データ示さず）。一過的形質移入結果に基づき、ＴＳＨＲ－ＣｈＲ４受容体を本アッセイにおけるさらなる開発のために選択した。
【0089】
[0110] ルシフェラーゼレポーター及びＣｈＲ４受容体の両方を発現する安定的形質移入細胞系を生成するため、ｐ２２Ｆ及びｐＣｈＲ４プラスミドを制限酵素消化により直鎖化し、ＣＨＯ Ｋ１細胞中に同時形質移入した。選択後、細胞をＴＳＨＲ刺激アッセイにおいてＴｓＡｂ Ｍａｂ Ｍ２２を使用してスクリーニングした。６つのクローンを、Ｍ２２誘導発光のレベルに基づき限定希釈によるさらなるクローニングのために選択した。単一クローン（２Ｃ１Ｅ３）が最大のシグナル対バックグラウンド比を有し、それをアッセイ開発のために選択した。細胞を、アッセイにおける後続の使用のためにバイアル又はマイクロタイタープレートウェル（例えば、黒色又は白色９６ウェルプレート）中のいずれかで冷凍した。
【0090】
[0111] ＣｈＲ４受容体のゲノム統合は、全長ＴＳＨＲ遺伝子に基づき設計されたプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅及び増幅産物のシーケンシングにより確認した。ＰＣＲ産物は、２．１ｋｂの予測サイズを有するＴＳＨＲ－ＣｈＲ４安定的細胞系のテンプレートのみから得た。受容体配列を確認するため、ＰＣＲ産物をシーケンシングし、Clone Managerソフトウェアを使用して分析した。ＰＣＲ産物の推定アミノ酸配列を、予測ＴＳＨＲ ＣｈＲ４タンパク質配列及びＴＳＨＲ野生型（ｗｔ）タンパク質配列に対してアラインした。配列アラインメント結果は、細胞系のゲノム中のＴＳＨＲ－ＣｈＲ４遺伝子の統合を裏付けた。細胞を解凍し、基質を含有する反応緩衝液と混合し、９６ウェルマイクロタイタープレートに移し、又はその中で保持し、実験に応じて以下にさらに記載されるとおり取り扱った。パートＢ～Ｅに記載の実験の多くについて、白色９６ウェルプレートを使用した。
【0091】
[0112] ＴＳＩ陰性（「正常」）、低ＴＳＩ、及び高ＴＳＩ血清サンプルを非希釈（「無溶媒」）、１：２希釈、又は１：４希釈で試験した。ＴＳＩレベルをTHYRETAIN（登録商標）TSI Reporter Bioassay Kit（Quidel Corporation, Athens, Ohio）（「THYRETAIN（登録商標）」ＴＳＩアッセイ）により決定し、表１に従って「正常」、「低ＴＳＩ」、「中ＴＳＩ」、又は「高ＴＳＩ」と割り当てた。
【0092】
【表1】
【0093】
Ｂ．サンプル希釈
[0113] サンプル希釈ステップが必要とされたか否かを試験するため、ＣＨＯ－ＣｈＲ４／２２Ｆ細胞をプレート上に一晩（約１７～１８時間）播種し、ＣＨＯ成長培地中でインキュベートし、次いで培地を除去した。反応緩衝液中１００マイクロリットルの６％のGLOSENSOR（商標）基質をそれぞれのウェルに添加した。１０マイクロリットルのサンプルをそれぞれのウェルに２つ組で添加した。本実施例において試験されたサンプルは正常血清、低ＴＳＩ、又は高ＴＳＩであり、それぞれを非希釈（「無溶媒」）、１：２希釈、及び１：４希釈で試験した。
[0113] サンプル希釈ステップが必要とされたか否かを試験するため、ＣＨＯ－ＣｈＲ４／２２Ｆ細胞をプレート上に一晩（約１７～１８時間）播種し、ＣＨＯ成長培地中でインキュベートし、次いで培地を除去した。反応緩衝液中１００マイクロリットルの６％のGLOSENSOR（商標）基質をそれぞれのウェルに添加した。１０マイクロリットルのサンプルをそれぞれのウェルに２つ組で添加した。本実施例において試験されたサンプルは正常血清、低ＴＳＩ、又は高ＴＳＩであり、それぞれを非希釈（「無溶媒」）、１：２希釈、及び１：４希釈で試験した。
【0094】
[0114] プレートを３７℃において１時間までインキュベートし、次いで室温に移した。次いで、ルミノメーターの読取値をそれぞれのウェルから採取した。
【0095】
[0115] 表２及び図１は、全てのサンプルからの結果を示す。１００超のシグナル対バックグラウンド比が全ての高ＴＳＩサンプル（「無溶媒」サンプルを含む）から得られた一方、比は低ＴＳＩ及び正常血清サンプルについて有意により低かった。さらにアッセイは、アッセイが希釈サンプルにおいて区別し得るものと少なくとも同程度に、非希釈（「無溶媒」）サンプルにおいてサンプル（例えば、高ＴＳＩ対低ＴＳＩ又は低ＴＳＩ対正常）を区別した。
【0096】
【表2】
【0097】
[0116] したがって、このアッセイはサンプル希釈ステップを要求しない。
【0098】
Ｃ．細胞播種後の洗浄
[0117] ＣＨＯ－ＣｈＲ４／２２Ｆ細胞を、実施例１のパートＢに上記のとおり播種した。１０マイクロリットルの非希釈サンプルを、それぞれのウェルに２つ組で添加した。一部のウェルについて、播種された細胞単層を、サンプルを添加する前に反応緩衝液により洗浄した。他のウェルについて、サンプルを添加する前に洗浄ステップを使用しなかった。プレートを３７℃において１時間までインキュベートし、次いで室温に移した。室温において３０分後、ルミノメーターの読取値をそれぞれのウェルから採取した。
[0117] ＣＨＯ－ＣｈＲ４／２２Ｆ細胞を、実施例１のパートＢに上記のとおり播種した。１０マイクロリットルの非希釈サンプルを、それぞれのウェルに２つ組で添加した。一部のウェルについて、播種された細胞単層を、サンプルを添加する前に反応緩衝液により洗浄した。他のウェルについて、サンプルを添加する前に洗浄ステップを使用しなかった。プレートを３７℃において１時間までインキュベートし、次いで室温に移した。室温において３０分後、ルミノメーターの読取値をそれぞれのウェルから採取した。
【0099】
[0118] 図２は、この実験からの結果を示す。図２が示すとおり、洗浄ステップの排除は正常サンプルと低ＴＳＩサンプルと高ＴＳＩサンプルとを区別するアッセイの能力に影響しなかった。したがって、このアッセイは洗浄ステップを要求しない。
【0100】
Ｄ．細胞播種
[0119] 播種時間の低減がアッセイ性能に影響するか否かを評価するため、ＣＨＯ－ＣｈＲ４／２２Ｆ細胞を実施例１、パートＢに記載のとおり一晩又は２時間のいずれかで播種した。１０マイクロリットルの非希釈正常又はＴＳＩ陽性サンプルを、それぞれのウェルに２つ組で添加した。さらに、タイトレーション曲線を作成するため、Ｍ２２スタンダードを１つのウェルセットに添加した。プレートを３７℃において１時間までインキュベートし、次いで室温に移した。室温において３０分後、次いで、ルミノメーターの読取値をそれぞれのウェルから採取した。
[0119] 播種時間の低減がアッセイ性能に影響するか否かを評価するため、ＣＨＯ－ＣｈＲ４／２２Ｆ細胞を実施例１、パートＢに記載のとおり一晩又は２時間のいずれかで播種した。１０マイクロリットルの非希釈正常又はＴＳＩ陽性サンプルを、それぞれのウェルに２つ組で添加した。さらに、タイトレーション曲線を作成するため、Ｍ２２スタンダードを１つのウェルセットに添加した。プレートを３７℃において１時間までインキュベートし、次いで室温に移した。室温において３０分後、次いで、ルミノメーターの読取値をそれぞれのウェルから採取した。
【0101】
[0120] 図３Ａは、Ｍ２２スタンダードから得られたタイトレーション曲線及び計算ＥＣ５０値を示す。図３Ｂは、４つの陰性及び４つの陽性サンプルについてのシグナル対参照比を示す。図３Ｃは、陰性サンプルの平均値に対する倍率応答として計算されたそれぞれの陽性サンプルについての応答を示す。両方のアッセイ（一晩又は２時間の細胞播種）は、ＴＳＩ陽性サンプルから正常サンプルを区別し得た（図３Ｂ）。さらに、ＴＳＩ陽性サンプルについてのシグナルの倍率増加は、両方のアッセイ間で同等であった（図３Ｃ）。
【0102】
[0121] したがって、アッセイは、２時間の低減細胞播種時間を用いても適切に機能した。
【0103】
[0122] 任意の細胞播種が必要かどうかを評価するため、同様の実験セットを実施し、但し一部のＣＨＯ－ＣｈＲ４／２２Ｆ細胞を基質及び反応緩衝液とのインキュベーションの２時間前に播種した一方、一部のＣＨＯ－ＣｈＲ４／２２Ｆ細胞を解凍直後に基質及び反応緩衝液中で直接懸濁させた。
【0104】
[0123] 図４Ａは、Ｍ２２スタンダードから得られたタイトレーション曲線及び計算ＥＣ５０値を示す。図４Ｂは、４つの陰性及び４つの陽性サンプルについてのシグナル対参照比を示す。図４Ｃは、陰性サンプルの平均値に対する倍率応答として計算されたそれぞれの陽性サンプルについての応答を示す。両方のアッセイは、正常サンプルとＴＳＩ陽性サンプルとを区別する能力に関して（図５Ｂ）、及び正常サンプルからの値に対する倍率変化に関して（図５Ｃ）同等に機能した。
【0105】
[0124] これらの結果は、本開示の方法が細胞播種ステップを要求しないことを示唆する。
【0106】
Ｅ．インキュベーション条件
[0125] インキュベーション条件を最適化するため、ＣＨＯ－ＣｈＲ４／２２Ｆ細胞を基質及び反応緩衝液とインキュベートするための２つの条件を比較する実験セットを実施した。解凍直後、ＣＨＯ－ＣｈＲ４／２２Ｆ細胞を反応緩衝液中で６％のGLOSENSOR（商標）中で再懸濁させ、マイクロウェルに添加した。１０マイクロリットルの非希釈正常又はＴＳＩ陽性サンプルをそれぞれのマイクロウェルに添加し、得られた混合物を（１）３７℃において１時間、次いで室温において３０分間又は（２）室温において９０分間のいずれかでインキュベートした。ルミノメーターの読取値をインキュベーション期間の終了時に読み取った。実施例１のパートＣ及びＤに記載の実験に関して、Ｍ２２スタンダードもアッセイしてタイトレーション曲線を確立した。
[0125] インキュベーション条件を最適化するため、ＣＨＯ－ＣｈＲ４／２２Ｆ細胞を基質及び反応緩衝液とインキュベートするための２つの条件を比較する実験セットを実施した。解凍直後、ＣＨＯ－ＣｈＲ４／２２Ｆ細胞を反応緩衝液中で６％のGLOSENSOR（商標）中で再懸濁させ、マイクロウェルに添加した。１０マイクロリットルの非希釈正常又はＴＳＩ陽性サンプルをそれぞれのマイクロウェルに添加し、得られた混合物を（１）３７℃において１時間、次いで室温において３０分間又は（２）室温において９０分間のいずれかでインキュベートした。ルミノメーターの読取値をインキュベーション期間の終了時に読み取った。実施例１のパートＣ及びＤに記載の実験に関して、Ｍ２２スタンダードもアッセイしてタイトレーション曲線を確立した。
【0107】
[0126] 図５Ａは、Ｍ２２スタンダードから得られたタイトレーション曲線及び計算ＥＣ５０値を示す。図５Ｂは、４つの陰性及び４つの陽性サンプルについてのシグナル対参照比を示す。図５Ｃは、陰性サンプルの平均値に対する倍率応答として計算されたそれぞれの陽性サンプルについての応答を示す。両方のインキュベーション条件下、アッセイは正常サンプルとＴＳＩ陽性サンプルとを区別し得（図５Ｂ）、正常サンプルからの値に対する倍率変化は２つのアッセイ条件間で同等であった（図５Ｃ）。
【0108】
[0127] インキュベーション期間の短縮がアッセイ性能に影響を与えるか否かを評価するため、一連の実験に、室温における種々のインキュベーション時間（１０分間、２０分間、３０分間、４０分間、５０分間、６０分間、７０分間、８０分間、又は９０分間）を用いた。図６は、これらの実験からの結果を示す。それぞれの時点についての最初の３つのバー（サンプルＤＬＳ００４、ＤＬＳ０５２、ＤＬＳ０３４）は正常サンプルからのシグナルに対応し；それぞれの時点についての最後の４つのバー（サンプルＤＬＳ０７９、ＤＬＳ０６０、ＤＬＳ０１６、及びＤＬＳ１２２）は、ＴＳＩ陽性サンプルからのシグナルに対応する。図６が示すとおり、ＴＳＩ陽性サンプルからのシグナルは、室温においてわずか３０分程度のインキュベーション時間でＴＳＩ陰性サンプルからのシグナルと区別することができる。予測されるとおり、正常及びＴＳＩ陽性サンプル間の分離は、一般に、試験された時点にわたりインキュベーション時間の増加につれて増加した。
【0109】
Ｆ．迅速ＴＳＩアッセイの開発
[0128] Ｍ２２及びＴＳＩ陽性血清サンプルの両方を使用して最適な細胞密度、サンプル容量、アッセイ温度、及びインキュベーション時間を決定した。２ｍＩＵ／ｍＬにおけるｂＴＳＨを使用してアッセイ参照対照を調製し、アッセイ結果をシグナル対参照比（％ＳＲＲ）として報告した。アッセイを均一フォーマットで３つの主要なステップのみを用いて実施した。最初に、１０μｌのそれぞれのサンプルを白色９６ウェルプレートの２つ組ウェルに添加する。次いで、ＣＨＯ－ＣｈＲ４／２２Ｆ細胞の１つのバイアルを３７℃において解凍し、６％のルシフェラーゼ基質を含有する１０ｍＬの反応緩衝液に移す。最後に、１００μｌの細胞懸濁液（６．５×１０５個の細胞／ｍｌ）をそれぞれのウェル中に分注する。プレートを室温において保持し、発光を１０分ごとに９０分まで測定する。図７のデータは、ＴＳＡｂ陽性サンプルについての％ＳＲＲ値が時間を増加させる一方、陰性サンプルの％ＳＲＲ値が一定のままであることを示す。
[0128] Ｍ２２及びＴＳＩ陽性血清サンプルの両方を使用して最適な細胞密度、サンプル容量、アッセイ温度、及びインキュベーション時間を決定した。２ｍＩＵ／ｍＬにおけるｂＴＳＨを使用してアッセイ参照対照を調製し、アッセイ結果をシグナル対参照比（％ＳＲＲ）として報告した。アッセイを均一フォーマットで３つの主要なステップのみを用いて実施した。最初に、１０μｌのそれぞれのサンプルを白色９６ウェルプレートの２つ組ウェルに添加する。次いで、ＣＨＯ－ＣｈＲ４／２２Ｆ細胞の１つのバイアルを３７℃において解凍し、６％のルシフェラーゼ基質を含有する１０ｍＬの反応緩衝液に移す。最後に、１００μｌの細胞懸濁液（６．５×１０５個の細胞／ｍｌ）をそれぞれのウェル中に分注する。プレートを室温において保持し、発光を１０分ごとに９０分まで測定する。図７のデータは、ＴＳＡｂ陽性サンプルについての％ＳＲＲ値が時間を増加させる一方、陰性サンプルの％ＳＲＲ値が一定のままであることを示す。
【0110】
Ｇ．まとめ
[0129] 本開示の方法は、他のＴＳＩ又はＴＢＩ検出アッセイに特徴的ないくつかのステップを除去し、ＴＳＩ及び／又はＴＢＩを短い検査所要時間及び簡便なプロトコルで検出する。本開示の方法の総検査所要時間は、他のＴＳＩ又はＴＢＩ検出アッセイに特徴的な２１～２２時間の検査所要時間と比較して約６０分間又は６０分未満まで有意に減少する。
[0129] 本開示の方法は、他のＴＳＩ又はＴＢＩ検出アッセイに特徴的ないくつかのステップを除去し、ＴＳＩ及び／又はＴＢＩを短い検査所要時間及び簡便なプロトコルで検出する。本開示の方法の総検査所要時間は、他のＴＳＩ又はＴＢＩ検出アッセイに特徴的な２１～２２時間の検査所要時間と比較して約６０分間又は６０分未満まで有意に減少する。
【0111】
実施例２
甲状腺刺激抗体を検出するためのアッセイの特異度
[0130] 実施例１に記載の本開示のＴＳＩアッセイの特異度を評価するため、甲状腺遮断抗体（Ｋ１７０）及び甲状腺刺激抗体（Ｍ２２）の段階希釈物を同時に試験した。図８に示されるとおり、本開示のＴＳＩアッセイはＭ２２刺激に極めて感受性であり、５０ｎｇ／ｍＬにおいてプラトーに達した。対照的に、Ｋ１７０は１０００ｎｇ／ｍＬの最大試験濃度においても本開示のＴＳＩアッセイにおいてルシフェラーゼ活性を誘導しなかった（図８）。
甲状腺刺激抗体を検出するためのアッセイの特異度
[0130] 実施例１に記載の本開示のＴＳＩアッセイの特異度を評価するため、甲状腺遮断抗体（Ｋ１７０）及び甲状腺刺激抗体（Ｍ２２）の段階希釈物を同時に試験した。図８に示されるとおり、本開示のＴＳＩアッセイはＭ２２刺激に極めて感受性であり、５０ｎｇ／ｍＬにおいてプラトーに達した。対照的に、Ｋ１７０は１０００ｎｇ／ｍＬの最大試験濃度においても本開示のＴＳＩアッセイにおいてルシフェラーゼ活性を誘導しなかった（図８）。
【0112】
[0131] ＣｈＲ４受容体は、THYRETAIN（登録商標）ＴＳＩアッセイにおいて刺激抗体Ｍ２２及び遮断抗体Ｋ１７０の両方と相互作用することが示されている。甲状腺遮断抗体が本開示のＴＳＩアッセイにおいてＣｈＲ４受容体と相互作用するか否かを決定するため、１０ｎｇ／ｍＬのＭ２２を段階希釈（１０００ｎｇ／ｍＬ～２ｎｇ／ｍＬ）Ｋ１７０並びに２つの他のマウスＴＳＨＲ遮断抗体３Ｈ１０（DSMZ, Braunschweig, Germany）及び４Ｃ１（Santa Cruz BioTech, Dallas, Taxes）と混合した。３つ全ての遮断抗体は、ＣｈＲ４受容体のＭ２２誘導活性に対する阻害効果を有したが、Ｋ１７０の遮断活性は他の２つのマウス遮断抗体と比較して有意に強力であった（図９）。
【0113】
[0132] これらの結果は、Furmaniak et al. (Auto Immun Highlights, 2013, 4(1):11-26)及びNunez et al. (J Mol. Endocrinol. 2012, 49(2):137-151)により示される、異なる機能活性を有するＴＳＨＲ抗体がＴＳＨＲの凹表面上の重複結合部位を有するという結論を支持する。ＴＳＨＲ遮断抗体はｃＡＭＰの細胞内濃度の変化を引き起こさないため、本開示のＴＳＩアッセイはＴＳＨＲ阻害抗体、又はＴＢＩの正味阻害効果のみを、両方のタイプの抗体がサンプル中に共存する場合、検出し得る。
【0114】
[0133] しかしながら、これらの結果は、本開示のアッセイを迅速均一ＴＢＩアッセイとして使用し、又はそれに発展させることができることを実証する。
【0115】
実施例３
甲状腺遮断自己抗体を検出するためのアッセイ
[0134] 本実施例は、サンプル中の甲状腺遮断免疫グロブリン（ＴＢＩ）を検出する方法を実証する。
甲状腺遮断自己抗体を検出するためのアッセイ
[0134] 本実施例は、サンプル中の甲状腺遮断免疫グロブリン（ＴＢＩ）を検出する方法を実証する。
【0116】
[0135] サンプル及び３つのアッセイ対照（参照、陽性及び陰性）をマルチウェルマイクロタイタープレートに２つ組で添加する（ウェル当たり１０μＬ）。最適濃度のウシＴＳＨを含有する反応緩衝液（ＲＢ）を、プレートのそれぞれのウェルに添加する（ウェル当たり５０μＬ）。
【0117】
[0136] 実施例１に記載のとおり生成されたＣＨＯ－ＣｈＲ４／２２Ｆ細胞を解凍し、１２％のGLOSENSOR（商標）基質を含有するＲＢ中で再懸濁させる。５０マイクロリットルの細胞懸濁液をプレートのそれぞれのウェルに添加し；GLOSENSOR（商標）基質の最終濃度は６％である。
【0118】
[0137] ルミノメーターの読取値を実施例１に記載のとおりそれぞれのウェルから採取し、但し以下の改変を施す。
【0119】
[0138] サンプルを添加した後、ウシＴＳＨ（甲状腺刺激ホルモン）をそれぞれのウェルに添加する（１つ以上の対照ウェルを除く）。以下の対照も使用する：
（１）「陽性対照」：サンプルを含まないが、ＴＳＨＲ遮断抗体（例えば、３Ｈ１０又はＫ１７０）、ＣＨＯ細胞、GLOSENSOR（商標）基質、及び反応緩衝液を含む少なくとも１つのウェル。
（２）「陰性対照」：ＴＳＨＲ遮断抗体もいかなるサンプルも含まないが、ＣＨＯ細胞、GLOSENSOR（商標）基質、正常血清、及び反応緩衝液を含む少なくとも１つのウェル。
（３）「参照対照」：ＴＳＨＲ遮断抗体もいかなるサンプルも含まないが、ウシＴＳＨ、ＣＨＯ細胞、GLOSENSOR（商標）基質、及び反応緩衝液を含む少なくとも１つのウェル。
（１）「陽性対照」：サンプルを含まないが、ＴＳＨＲ遮断抗体（例えば、３Ｈ１０又はＫ１７０）、ＣＨＯ細胞、GLOSENSOR（商標）基質、及び反応緩衝液を含む少なくとも１つのウェル。
（２）「陰性対照」：ＴＳＨＲ遮断抗体もいかなるサンプルも含まないが、ＣＨＯ細胞、GLOSENSOR（商標）基質、正常血清、及び反応緩衝液を含む少なくとも１つのウェル。
（３）「参照対照」：ＴＳＨＲ遮断抗体もいかなるサンプルも含まないが、ウシＴＳＨ、ＣＨＯ細胞、GLOSENSOR（商標）基質、及び反応緩衝液を含む少なくとも１つのウェル。
【0120】
[0139] サンプルを含有するウェルからのシグナルを、以下の式１を使用して参照対照ウェルからのシグナルと比較する。陰性対照に対するシグナルの減少は、サンプル中のＴＢＩの存在を示す。
【数1】
【0121】
[0140] 図１０は、Ｋ１７０ ＴＳＨＲ遮断抗体を含有するサンプルに対するアッセイから得られたタイトレーション曲線及び計算ＩＣ５０値を示す。それぞれの曲線は、異なる密度のＣＨＯ－ＣｈＲ４／２２Ｆトランスジェニック細胞に対するタイトレーション曲線を表す。
【0122】
実施例４
アッセイの再現性及び感度
[0141] 本開示の方法の再現性及び感度を決定するため、アッセイを以下のサンプル１）反応緩衝液のみ（ブランク）、２）２ｍＩＵ／ｍＬにおける正常ヒト血清中ウシＴＳＨ（「参照サンプル」）；３）正常（ＴＳＩ陰性）サンプル；４）ＴＳＩ陽性サンプル；及び５）正常血清中３ｎｇ／ｍＬのＭ２２を含有するサンプルのレプリケートに対して繰り返した。
アッセイの再現性及び感度
[0141] 本開示の方法の再現性及び感度を決定するため、アッセイを以下のサンプル１）反応緩衝液のみ（ブランク）、２）２ｍＩＵ／ｍＬにおける正常ヒト血清中ウシＴＳＨ（「参照サンプル」）；３）正常（ＴＳＩ陰性）サンプル；４）ＴＳＩ陽性サンプル；及び５）正常血清中３ｎｇ／ｍＬのＭ２２を含有するサンプルのレプリケートに対して繰り返した。
【0123】
[0142] アッセイを実施例１のパートＥに記載のとおり実施し（以下「改変ＴＳＩアッセイ」）、インキュベーション期間は全て室温において１０分間～９０分間の範囲であった。
【0124】
[0143] 表３は、％ＣＶを含む結果のまとめを提示する。表３に示されるとおり、ＲＬＵ及び％ＳＲＲの両方についての％ＣＶは、それぞれのサンプルについて８．１％以下であった。
【0125】
【表3】
【0126】
[0144] 本開示のアッセイの感度を評価するため、１）実施例１のパートＥに記載のとおり実施され、インキュベーション期間が室温における６０分間であるアッセイを使用して；及び２）THYRETAIN（登録商標）ＴＳＩアッセイを製造業者のプロトコルに従って使用してＭ２２スタンダードを評価した。
【0127】
[0145] １００ｎｇ／ｍＬの量のＭ２２抗体を７つの濃度に段階希釈し、両方のアッセイにおいて同時に試験した。
【0128】
[0146] 図１１Ａ～１１Ｂは、それぞれ本開示のアッセイについて及びTHYRETAIN（登録商標）ＴＳＩアッセイについてのタイトレーション曲線及び計算ＥＣ５０値を示す。本開示の方法を使用してＭ２２抗体スタンダードから得られたシグナルは、THYRETAIN（登録商標）ＴＳＩアッセイを使用して得られたものよりも約１０倍高かったが、２つのアッセイからの用量応答曲線は極めて類似していた。改変ＴＳＩアッセイについてのＥＣ５０値は４．７ｎｇ／ｍＬであり、THYRETAIN（登録商標）ＴＳＩアッセイについては約５．５ｎｇ／ｍＬであり、２つのアッセイの分析的感度が類似することを示した。
【0129】
[0147] これらの結果は、本開示の方法が再現性があり、THYRETAIN（登録商標）ＴＳＩアッセイと同程度に感受性であることを示す。
【0130】
実施例５
臨床サンプルにおけるＴＳＩ検出
[0148] 臨床サンプルに対する本開示の方法の性能を評価するため、及びアッセイ条件を最適化するため、アッセイを臨床血清サンプルに対して実施例１のパートＥに記載のとおり実施し、但し以下に説明されるとおりわずかに改変した。比較のため、THYRETAIN（登録商標）TSI Reporter Bioassay Kit（Quidel, Athens, Ohio）（「THYRETAIN（登録商標）ＴＳＩアッセイ」）も使用してそれぞれのサンプルを試験した。
臨床サンプルにおけるＴＳＩ検出
[0148] 臨床サンプルに対する本開示の方法の性能を評価するため、及びアッセイ条件を最適化するため、アッセイを臨床血清サンプルに対して実施例１のパートＥに記載のとおり実施し、但し以下に説明されるとおりわずかに改変した。比較のため、THYRETAIN（登録商標）TSI Reporter Bioassay Kit（Quidel, Athens, Ohio）（「THYRETAIN（登録商標）ＴＳＩアッセイ」）も使用してそれぞれのサンプルを試験した。
【0131】
サンプル
[0149] 本実施例に記載の実験は、THYRETAIN（登録商標）ＴＳＩアッセイにより決定されたヒト患者からの９つの「正常」（ＴＳＩについて陰性）血清サンプル、９つの「低ＴＳＩ」血清サンプル、５つの「中ＴＳＩ」血清サンプル、及び５つの「高ＴＳＩ」血清サンプルを使用した（表１参照）。
[0149] 本実施例に記載の実験は、THYRETAIN（登録商標）ＴＳＩアッセイにより決定されたヒト患者からの９つの「正常」（ＴＳＩについて陰性）血清サンプル、９つの「低ＴＳＩ」血清サンプル、５つの「中ＴＳＩ」血清サンプル、及び５つの「高ＴＳＩ」血清サンプルを使用した（表１参照）。
【0132】
インキュベーション条件
[0150] ある実験セットにおいて、ＣＨＯ－ＣｈＲ４／２２Ｆトランスジェニック細胞をサンプル（並びにGLOSENSOR（商標）基質及び反応緩衝液）と（１）室温において９０分間（「ＲＴ９０」）又は（２）３７℃において１時間、次いで室温において３０分間（「３７℃－６０／ＲＴ３０」）インキュベートした。他の条件は実施例１のパートＥに記載のとおりとした。
[0150] ある実験セットにおいて、ＣＨＯ－ＣｈＲ４／２２Ｆトランスジェニック細胞をサンプル（並びにGLOSENSOR（商標）基質及び反応緩衝液）と（１）室温において９０分間（「ＲＴ９０」）又は（２）３７℃において１時間、次いで室温において３０分間（「３７℃－６０／ＲＴ３０」）インキュベートした。他の条件は実施例１のパートＥに記載のとおりとした。
【0133】
[0151] 図１２は、両方のインキュベーション条件について及びTHYRETAIN（登録商標）ＴＳＩアッセイについての結果を示す。図１２が示すとおり、正常及び「低ＴＳＩ」サンプル間の分離は、３７℃－６０／ＲＴ３０アッセイよりもＲＴ９０アッセイについて明らかだった。さらに、ＲＴ９０及び３７℃－６０／ＲＴ３０アッセイの両方は、一般に、THYRETAIN（登録商標）ＴＳＩアッセイよりも良好に「高ＴＳＩ」サンプルを区別した。
【0134】
予備平衡
[0152] 別の実験セットにおいて、アッセイを臨床血清サンプルに対して（１）ＣＨＯ－ＣｈＲ４／２２Ｆ細胞（実施例１に記載）及び（２）６％のGLOSENSOR（商標）基質により２時間予備平衡し、次いで冷凍し、続いてアッセイにおける使用のために解凍したＣＨＯ－ＣｈＲ４／２２Ｆ細胞を使用して実施した。この実験セットにおいて、細胞を室温において９０分間インキュベートした。
[0152] 別の実験セットにおいて、アッセイを臨床血清サンプルに対して（１）ＣＨＯ－ＣｈＲ４／２２Ｆ細胞（実施例１に記載）及び（２）６％のGLOSENSOR（商標）基質により２時間予備平衡し、次いで冷凍し、続いてアッセイにおける使用のために解凍したＣＨＯ－ＣｈＲ４／２２Ｆ細胞を使用して実施した。この実験セットにおいて、細胞を室温において９０分間インキュベートした。
【0135】
[0153] 図１３及び図１４Ａ～１４Ｄは、ＣＨＯ－ＣｈＲ４／２２Ｆ細胞又は予備平衡ＣＨＯ－ＣｈＲ４／２２Ｆ細胞を使用した実施例１に記載のアッセイからの測定値を示す。比較のため、図１３及び１４Ａ～Ｄは、THYRETAIN（登録商標）ＴＳＩアッセイからの結果も示す。図１０はエンドポイント測定値を示し、図１４Ａ～１４Ｄは、５～９０分間のインキュベーション時間の間の種々の時点において採取された速度論的測定値を示す。表４～６（図１７～１９）は、THYRETAIN（登録商標）TSI Reporter BioAssayキットを使用して得られた（表４；図１７）、並びにＣＨＯ－ＣｈＲ４／２２Ｆ細胞及び予備平衡ＣＨＯ－ＣｈＲ４／２２Ｆ細胞を使用した本開示のアッセイについてのシグナル対応答比についてのまとめデータを示す；それぞれ表５（図１８）及び表６（図１９）参照。
【0136】
[0154] 図１３並びに表４（図１７）及び表５（図１８）が示すとおり、基質による細胞の予備平衡は、アッセイの感度を増加させた。図１４において、陰性サンプルからのシグナルは経時的に減少する傾向がある一方、ＴＳＩ陽性サンプルからのシグナルは経時的に増加する傾向があった。さらに、両方のアッセイ（ＣＨＯ－ＣｈＲ４／２２Ｆ細胞及び予備平衡ＣＨＯ－ＣｈＲ４／２２Ｆ細胞を使用）は、THYRETAIN（登録商標）ＴＳＩアッセイと少なくとも同程度に機能した。「高ＴＳＩ」サンプルについて、本開示のアッセイはTHYRETAIN（登録商標）ＴＳＩアッセイよりも大きいシグナルを生じさせた；図１３参照、並びに表４（図１７）及び表５（図１８）を表３と比較されたい。
【0137】
結論
[0155] したがって、本開示の方法は、正常、低ＴＳＩ、中ＴＳＩ、及び高ＴＳＩ臨床サンプルを、THYRETAIN（登録商標）ＴＳＩアッセイの結果と質的に類似し、又はそれよりも良好な結果で区別し得る。これらの結果は、（１）本方法が細胞を室温においてインキュベートする場合でも正常サンプルとＴＳＩ陽性臨床サンプルとを区別し得ること；及び（２）基質による細胞の予備平衡がアッセイ感度の向上をもたらしたことも実証する。
[0155] したがって、本開示の方法は、正常、低ＴＳＩ、中ＴＳＩ、及び高ＴＳＩ臨床サンプルを、THYRETAIN（登録商標）ＴＳＩアッセイの結果と質的に類似し、又はそれよりも良好な結果で区別し得る。これらの結果は、（１）本方法が細胞を室温においてインキュベートする場合でも正常サンプルとＴＳＩ陽性臨床サンプルとを区別し得ること；及び（２）基質による細胞の予備平衡がアッセイ感度の向上をもたらしたことも実証する。
【0138】
実施例６
臨床サンプルに対する本開示のＴＳＩアッセイからの結果と、THYRETAIN（登録商標）ＴＳＩアッセイからの結果との間の相関
[0156] 臨床サンプルに対する本開示のＴＳＩアッセイの性能をさらに評価するため、THYRETAIN（登録商標）ＴＳＩアッセイにおいて陰性と試験された１４５個のヒト血清サンプルを測定することにより本開示のＴＳＩアッセイについての暫定カットオフ値を決定した。本開示のＴＳＩについてのこの暫定アッセイカットオフは３１％ＳＲＲ（１４５個の正常血清サンプルの平均％ＳＲＲ値＋２×標準偏差）であると計算され、この値をカットオフとして使用してＴＳＩ陽性サンプルを同定した。
臨床サンプルに対する本開示のＴＳＩアッセイからの結果と、THYRETAIN（登録商標）ＴＳＩアッセイからの結果との間の相関
[0156] 臨床サンプルに対する本開示のＴＳＩアッセイの性能をさらに評価するため、THYRETAIN（登録商標）ＴＳＩアッセイにおいて陰性と試験された１４５個のヒト血清サンプルを測定することにより本開示のＴＳＩアッセイについての暫定カットオフ値を決定した。本開示のＴＳＩについてのこの暫定アッセイカットオフは３１％ＳＲＲ（１４５個の正常血清サンプルの平均％ＳＲＲ値＋２×標準偏差）であると計算され、この値をカットオフとして使用してＴＳＩ陽性サンプルを同定した。
【0139】
[0157] 自己免疫性甲状腺疾患（ＡＩＴＤ）を有する非選択患者からのサンプルに対する本開示のアッセイの性能を評価するため、甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）抗体について陽性の１３０個のヒト血清サンプルを、本開示のＴＳＩ及びTHYRETAIN（登録商標）ＴＳＩアッセイの両方により試験した。３１％超の％ＳＲＲ値を有するサンプルを、本開示のＴＳＩアッセイにおいてＴＳＩについて陽性と同定した。THYRETAIN（登録商標）ＴＳＩアッセイ説明書に従い、１４０％超の％ＳＲＲ値を有するサンプルをＴＳＩについて陽性と同定した。２つのアッセイからの結果は、それら１３０個のサンプルについて同等であり、それは２つのバイオアッセイ間の陽性及び陰性一致率（ＰＰＡ及びＮＰＡ）がそれぞれ９６％（９５％ＣＩ：０．７９～０．９９）及び９５％（９５％ＣＩ：０．９０～０．９８）であったという事実により証明されるとおりであった（表７並びに図１５Ａ及び１５Ｂ）。２つのアッセイからの結果は強力な相関を示し、本開示のＴＳＩアッセイにより生成された％ＳＲＲ値が同じ高ＴＳＩ陽性サンプルについてTHYRETAIN（登録商標）アッセイにより生成されたものよりもかなり高いという事実にかかわらず、相関係数Ｒ値は０．７１であった（データ示さず）。
【0140】
【表4】
【0141】
実施例７
本開示のＴＳＩアッセイによる甲状腺刺激抗体の定量的検出
[0158] 本開示のＴＳＩアッセイを使用してＴＳＩを定量的に検出することができるか否かを決定するため、ＴＳＩについての３つの濃度のＷＨＯ国際スタンダードを使用して３点スタンダードパネルを開発した。正常血清をマトリックスとして使用してスタンダードパネルを調製し、ＴＳＩ陽性血清サンプルとともに４日間試験した。それぞれのＴＳＩ陽性サンプルのＴＳＩ濃度を、同じプレートにおいて作成された標準曲線から導いた式に基づき計算し、４つの異なる日に実施された４つの実験から得られたデータについて％ＣＶを決定した。４日間で作成された４つ全ての標準曲線は再現性があり、決定係数値は０．９９超であった（図１６）。低、中及び高（ＴＳＩ）陽性サンプルについての計算ＴＳＩ濃度はまた、１０％未満の％ＣＶ値と一致した（表８）。これらのデータは、本開示のＴＳＩアッセイが患者サンプルにおけるＴＳＩの定量的測定に使用される潜在性を有することを示す。
本開示のＴＳＩアッセイによる甲状腺刺激抗体の定量的検出
[0158] 本開示のＴＳＩアッセイを使用してＴＳＩを定量的に検出することができるか否かを決定するため、ＴＳＩについての３つの濃度のＷＨＯ国際スタンダードを使用して３点スタンダードパネルを開発した。正常血清をマトリックスとして使用してスタンダードパネルを調製し、ＴＳＩ陽性血清サンプルとともに４日間試験した。それぞれのＴＳＩ陽性サンプルのＴＳＩ濃度を、同じプレートにおいて作成された標準曲線から導いた式に基づき計算し、４つの異なる日に実施された４つの実験から得られたデータについて％ＣＶを決定した。４日間で作成された４つ全ての標準曲線は再現性があり、決定係数値は０．９９超であった（図１６）。低、中及び高（ＴＳＩ）陽性サンプルについての計算ＴＳＩ濃度はまた、１０％未満の％ＣＶ値と一致した（表８）。これらのデータは、本開示のＴＳＩアッセイが患者サンプルにおけるＴＳＩの定量的測定に使用される潜在性を有することを示す。
【0142】
【表5】
【図1】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11A】
【図11B】
【図12】
【図13】
【図14A】
【図14B】
【図14C】
【図14D】
【図15A】
【図15B】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2021-01-12
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ａ）（ｉ）キメラ甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）受容体をコードするヌクレオチド配列を含む第１の発現ベクター、及び
（ｉｉ）レポーターをコードする合成ヌクレオチド配列を含む第２の発現ベクターであって、前記合成ヌクレオチド配列が、
（１）ｃＡＭＰ誘導性プロモーターに作動可能に結合しており；及び／又は
（２）異種ｃＡＭＰ結合タンパク質をさらにコードし、前記ｃＡＭＰ結合タンパク質が、前記レポーターに融合している第２の発現ベクター
により安定的に形質移入された、凍結されているトランスジェニック細胞と；
（ｂ）細胞溶解剤を有さない反応緩衝液であって、任意選択で前記レポーターの基質を含む反応緩衝液と
を含むキットであって、
前記レポーターの発現が、細胞内シグナルと関連する、キット。
【請求項2】
ｃＡＭＰの存在が前記レポーターの発現を増加させ、それにより前記シグナルを向上させる、請求項１に記載のキット。
【請求項3】
前記異種結合部位へのｃＡＭＰの結合が、前記シグナルを向上させる前記レポーターの立体構造変化を誘導する、請求項１に記載のキット。
【請求項4】
前記キメラＴＳＨ受容体が、ヒトＴＳＨ受容体配列を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項5】
前記キメラＴＳＨ受容が、ＣｈＲ４である、請求項４に記載のキット。
【請求項6】
前記レポーターが、ルシフェラーゼポリペプチドを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項7】
前記ルシフェラーゼポリペプチドが、改変されたルシフェラーゼである、請求項６に記載のキット。
【請求項8】
前記改変されたルシフェラーゼが、循環置換されたルシフェラーゼである、請求項７に記載のキット。
【請求項9】
前記基質が、ルシフェリンを含む、請求項６～８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項10】
前記細胞内シグナルが、発光を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項11】
前記トランスジェニック細胞が、哺乳類細胞を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項12】
前記哺乳類細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又はヒトＲＤ細胞を含む、請求項１１に記載のキット。
【請求項13】
前記トランスジェニック細胞が、前記レポーターの基質をさらに含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項14】
前記反応緩衝液が、ポリエチレングリコール及びスクロースを含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項15】
前記反応緩衝液が、アルブミンをさらに含む、請求項１４に記載のキット。
【請求項16】
前記アルブミンが、ウシ血清アルブミンを含む、請求項１５に記載のキット。
【請求項17】
細胞溶解剤を含まない、請求項１～１６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項18】
サンプル中の甲状腺刺激及び／又は甲状腺遮断自己抗体を検出する方法であって、（ａ）
（ｉ）キメラ甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）受容体をコードするヌクレオチド配列を含む第１の発現ベクター及び
（ｉｉ）レポーターをコードする合成ヌクレオチド配列を含む第２の発現ベクターであって、前記合成ヌクレオチド配列が、
（１）誘導性ｃＡＭＰ誘導性プロモーターに作動可能に結合しており、及び／又は
（２）異種ｃＡＭＰ結合タンパク質をさらにコードし、前記ｃＡＭＰ結合タンパク質は、前記レポーターに融合している第２の発現ベクター
により安定的に形質移入されているトランスジェニック細胞を解凍すること；
（ｂ）解凍されたトランスジェニック細胞を、甲状腺刺激及び／又は甲状腺遮断自己抗体を含むことが疑われるサンプルと接触させること；及び
（ｃ）前記レポーターの発現と関連する細胞内シグナルを検出すること、
を含む方法。
【請求項19】
前記トランスジェニック細胞が、前記レポーターの基質をさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
前記接触ステップが、前記レポーターの基質を含む緩衝液中で接触させることを含む、請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項21】
前記緩衝液が、細胞溶解剤を含まない、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
前記トランスジェニック細胞を、前記接触ステップ前に前記レポーターについての前記基質に曝露するステップをさらに含む、請求項２０又は２１に記載の方法。
【請求項23】
前記接触ステップが、非希釈サンプルと接触させることを含む、請求項１８～２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項24】
検出ステップが、前記接触の２４０分後未満、１８０分後未満、９０分後未満、６０分後未満又は３０分後未満に実施される、請求項１８～２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項25】
前記トランスジェニック細胞及び前記サンプルを含む組成物から前記細胞内シグナルを検出する、請求項１８～２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項26】
前記組成物中の前記トランスジェニック細胞の少なくとも７５％が、検出時においてインタクトである、請求項２５に記載の方法。
【請求項27】
前記接触ステップが室温で実施される、請求項１８～２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項28】
前記トランスジェニック細胞を、前記接触ステップ前に解凍することをさらに含む、請求項１８～２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項29】
前記接触ステップが、前記解凍の１２０分後未満、９０分後未満、６０分後未満、３０分後未満又は５分後未満に実施される、請求項２８に記載の方法。
【請求項30】
前記接触ステップが、前記トランスジェニック細胞を対照の甲状腺刺激剤と接触させることをさらに含む、請求項１８～２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項31】
前記トランスジェニック細胞を前記サンプルと接触させる前に、前記トランスジェニック細胞が前記対照の甲状腺刺激剤と接触される、請求項３０に記載の方法。
【国際調査報告】