▶ ユニバーサル シーケンシング テクノロジー コーポレイションの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-05-11
(54)【発明の名称】バイオポリマー同定のためのデバイスおよび方法
(51)【国際特許分類】
C12M 1/00 20060101AFI20220428BHJP
C12N 9/10 20060101ALN20220428BHJP
C07K 14/705 20060101ALN20220428BHJP
C07K 16/00 20060101ALN20220428BHJP
C07K 17/14 20060101ALN20220428BHJP
C07K 14/36 20060101ALN20220428BHJP
C12N 15/115 20100101ALN20220428BHJP
C12N 9/16 20060101ALN20220428BHJP
C12N 9/24 20060101ALN20220428BHJP
【ＦＩ】
C12M1/00 A
C12N9/10
C07K14/705
C07K16/00
C07K17/14
C07K14/36
C12N15/115 Z
C12N9/16 Z
C12N9/24
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021552243
(86)(22)【出願日】2020-02-28
(85)【翻訳文提出日】2021-10-29
(86)【国際出願番号】 US2020020504
(87)【国際公開番号】W WO2020180732
(87)【国際公開日】2020-09-10
(31)【優先権主張番号】62/812,736
(32)【優先日】2019-03-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】521391748
【氏名又は名称】ユニバーサル シーケンシング テクノロジー コーポレイション
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】ジャン， ペイミン
(72)【発明者】
【氏名】レイ， ミン
【テーマコード（参考）】
4B029
4B050
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B029AA08
4B029AA23
4B029AA27
4B029BB20
4B029FA12
4B050CC07
4B050KK07
4B050LL03
4H045AA40
4H045CA11
4H045DA50
4H045DA75
4H045DA89
4H045EA50
(57)【要約】
本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのテンプレートによって方向づけられた酵素による複製または合成に基づいて生体分子を配列決定または同定するためのナノ構造体デバイスおよび方法を提供する。１つの実施形態では、図８に示すように、１０～２０ｎｍのナノギャップを、半導体ナノファブリケーションテクノロジーによって、２つの電極間に作製し、これらの電極は、周囲が非特異的吸着を防止するための不活性化学物質で不動態化されており、ナノギャップの内部領域が化学反応のために露出されている。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
バイオポリマーを同定、特徴付け、または配列決定するためのシステムであって、（ａ）非伝導性基材；
（ｂ）前記非伝導性基材上に相互に隣り合わせに配置された第１の電極および第２の電極によって形成されたナノギャップ；
（ｃ）化学結合によって一方の端部を前記第１の電極に、そして他方の端部を前記第２の電極に付着させることによって前記ナノギャップを架橋しているナノ構造体であって、ここで、前記ナノ構造体が、デオキシリボ核酸（ＤＮＡナノ構造体）もしくはリボ核酸（ＲＮＡナノ構造体）のいずれかの核酸またはその組み合わせを含み、ここで、前記核酸の塩基が、いずれかの非天然型核酸塩基であるか、前記核酸が、非天然型核酸塩基と天然型核酸塩基との混合物を含む、ナノ構造体；
（ｄ）前記ナノ構造体に付着した生化学反応を行う酵素；
（ｅ）前記第１の電極と前記第２の電極との間に印加されるバイアス電圧；
（ｆ）前記ナノ構造体に付着した前記酵素によって惹起されたコンフォメーション変化によって引き起こされる前記ナノ構造体内の歪みに起因する前記ナノ構造体を介した電流変動を記録するためのデバイス；ならびに
（ｇ）前記バイオポリマーまたは前記バイオポリマーのサブユニットを同定するか特徴付けるデータ解析用ソフト
を含む、システム。
【請求項2】
前記非伝導性基材が、ケイ素、酸化ケイ素、窒化ケイ素（ｓｉｌｉｃｏｎ ａ ｎｉｔｒｉｄｅ）、ガラス、二酸化ハフニウム、他の金属酸化物、任意の非伝導性ポリマー薄膜、酸化ケイ素または窒化ケイ素または他の非伝導性コーティングを有するケイ素、窒化ケイ素コーティングを有するガラス、他の非伝導性有機材料、任意の非伝導性無機材料、およびその組み合わせからなる群より選択される、請求項１に記載のシステム。
【請求項3】
前記バイオポリマーが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、タンパク質、ペプチド、ポリサッカリド、前記バイオポリマーのうちのいずれかの天然型、改変型、または合成型のいずれか、およびその組み合わせからなる群より選択される、請求項１に記載のシステム。
【請求項4】
前記酵素が、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡヘリカーゼ、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡエキソヌクレアーゼ、逆転写酵素、ＲＮＡプライマーゼ、リボソーム、スクラーゼ、ラクターゼ、前記酵素のうちのいずれかの未変性のもの、変異されたもの、発現されたもの、または合成されたもののいずれか、およびその組み合わせからなる群より選択される、請求項１に記載のシステム。
【請求項5】
前記酵素が、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＹ、ＤＮＡポリメラーゼＰｏｌ Ｉ、Ｐｏｌ ＩＩ、Ｐｏｌ ＩＩＩ、Ｐｏｌ ＩＶ、およびＰｏｌ Ｖ、Ｐｏｌ α（アルファ）、Ｐｏｌ β（ベータ）、Ｐｏｌ σ（シグマ）、Ｐｏｌ λ（ラムダ）、Ｐｏｌ δ（デルタ）、Ｐｏｌ ε（イプシロン）、Ｐｏｌ μ（ミュー）、Ｐｏｌ Ι（イオタ）、Ｐｏｌ κ（カッパ）、ｐｏｌ η（イータ）、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ、テロメラーゼ、前記酵素のうちのいずれかの未変性のもの、変異されたもの、発現されたもの、または合成されたもののいずれか、およびその組み合わせからなる群より選択される、請求項４に記載のシステム。
【請求項6】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、未変性のもの、変異されたもの、発現されたもの、または合成されたもののいずれかのφ２９ＤＮＡポリメラーゼである、請求項４に記載のシステム。
【請求項7】
前記ナノギャップを形成する２つの電極が、約３ｎｍ～約１０００ｎｍの距離で分離されており；ここで、前記電極の端部が、幅約３ｎｍ～約１０００ｎｍおよび深さ約２ｎｍ～約１０００ｎｍの実質的に矩形の表面を有する、請求項１に記載のシステム。
【請求項8】
前記ナノギャップを形成する２つの電極が、約５ｎｍ～約５０ｎｍの距離で分離されており；ここで、前記電極の端部が、幅約１０ｎｍ～約３０ｎｍおよび深さ約５ｎｍ～約２０ｎｍの実質的に矩形の表面を有する、請求項１に記載のシステム。
【請求項9】
前記電極が、ａ）チオール、アミン、セレノール、および別の有機官能基と反応することができる金属電極；
ｂ）係留分子と反応して共有結合を形成することができる自己組織化単分子膜によって表面上で官能化され得る金属電極；
ｃ）前記係留分子と反応して共有結合を形成することができるシランで官能化され得る金属酸化物電極；または
ｄ）前記係留分子と反応して共有結合を形成することができる有機試薬で官能化され得る炭素電極を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項10】
前記電極および前記基材が、前記ナノギャップに面する端部表面を除いて絶縁層で不動態化されている、請求項１に記載のシステム。
【請求項11】
前記絶縁層が、不活性化学物質の単分子膜または多分子層のいずれかを含むか、不活性化学物質の単分子膜または多分子層によって不動態化されている、請求項１０に記載のシステム。
【請求項12】
前記不活性化学物質が、金属表面の不動態化のための１１－メルカプトウンデシル－ヘキサエチレングリコール（ＣＲ－１）、ならびに基材表面の不動態化のためのアミノプロピルトリエトキシシラン（ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌｔｒｉｅｔｈｏｘｙｓａｌｉｎｅ）（ＣＲ－２）およびＮ－ヒドロキシスクシンイミジル２－（ω－Ｏ－メトキシ－ヘキサエチレングリコール）アセタート（ＣＲ－３）を含む、請求項１１に記載のシステム。
【請求項13】
前記非天然型核酸塩基が、以下：（ａ）ハチモジ核酸塩基；
（ｂ）サイズを拡大したヌクレオベース；
（ｃ）非水素結合ヌクレオベース；
（ｄ）ユニバーサル塩基；および
（ｅ）その組み合わせ
からなる群より選択される、請求項１に記載のシステム。
【請求項14】
前記核酸ナノ構造体が、以下：（ａ）対合されなかったか対合しない核酸塩基；または
（ｂ）有機超伝導体
のうちの１つまたはその組み合わせを含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項15】
前記核酸ナノ構造体が、直鎖状もしくは環状のＤＮＡ（ＤＮＡナノ構造体）、または直鎖状もしくは環状のＲＮＡ（ＲＮＡナノ構造体）、またはその組み合わせのいずれかから自己組織化する、請求項１に記載のシステム。
【請求項16】
前記核酸ナノ構造体が、以下：（ａ）らせん型または非らせん型のいずれかの直鎖状ＤＮＡ二重鎖構造体、直鎖状ＲＮＡ二重鎖構造体、直鎖状核酸分子ワイヤ、またはその組み合わせが含まれるが、これらに限定されない実質的に一次元の幾何学的配置；
（ｂ）実質的に矩形の構造体、実質的に正方形の構造体、実質的に三角形の構造体、実質的に円形の構造体、またはその組み合わせが含まれるが、これらに限定されない実質的に二次元の幾何学的配置；および
（ｃ）実質的に円柱形の構造体、実質的に中空管の構造体、実質的に柱形様の構造体、実質的に束ねた柱様の（ｂｕｎｄｌｅ－ｏｆ－ｃｏｌｕｍｎ）構造体を含む幾何学的配置、実質的にスタッキングされた二次元構造体を含む幾何学的配置、実質的に折りたたまれたオリガミ様構造体を含む幾何学的配置、またはその組み合わせが含まれるが、これらに限定されない実質的に三次元の幾何学的配置
の構成のうちの１つまたはその組み合わせを有する、請求項１に記載のシステム。
【請求項17】
前記ナノ構造体が以下：ａ．アミド結合、グアニジニウム結合、またはトリアゾール結合を含む非リン酸骨格；
ｂ．糖修飾されたヌクレオシドまたはヌクレオシドアナログ；
ｃ．ヌクレオベース修飾されたヌクレオシドまたはヌクレオシドアナログ；および／または
ｄ．ヌクレオベースアナログ
を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項18】
前記ナノ構造体が以下：ａ．電極に付着するように構成された官能基；および／または
ｂ．前記酵素を固定するように構成された官能基
を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項19】
前記電極に付着するように構成された官能基が、以下：（ａ）ヌクレオシドの糖環上のチオール；
（ｂ）ヌクレオシドのヌクレオベース上のチオールおよびセレノール；
（ｃ）ヌクレオシド上の脂肪族アミン；および／または
（ｄ）ヌクレオシド上のカテコール；
（ｅ）ＲＸＨまたはＲＸＸＲであって、式中、Ｒは、脂肪族または芳香族の基であり；Ｘはカルコゲンであり、ＳおよびＳｅが好ましい、ＲＸＨまたはＲＸＸＲ；および／または
（ｆ）塩基カルコゲン化ヌクレオシド
を含み、
前記酵素を固定するように構成された官能基が、以下：
（ａ）化学合成または酵素合成によってＤＮＡまたはＲＮＡに組み込まれるアミン官能化ヌクレオシド；
（ｂ）化学合成または酵素合成によってＤＮＡおよびＲＮＡに組み込まれるシクロオクチンおよび／または誘導体で官能化されたヌクレオシド；および／または
（ｃ）化学合成または酵素合成によってＤＮＡおよびＲＮＡに組み込まれるカテコール官能化ヌクレオシド
を含む、請求項１８に記載のシステム。
【請求項20】
前記係留分子が、以下：（ａ）多価結合を介して金属表面と相互作用するように構成された分子；
（ｂ）三価結合を介して金属表面と反応するように構成されたトライポッド構造体；および
（ｃ）テトラフェニルメタンコアから構成される分子であって、ここで、そのフェニル環のうちの３つが、－ＣＨ２ＳＨまたは－ＣＨ２ＳｅＨで官能化されており、第４のフェニル環が、アジド、カルボン酸、ボロン酸、および／またはＤＮＡおよび／またはＲＮＡナノ構造体に組み込まれた官能基と反応するように構成された有機基で官能化されている、分子
のうちの１つまたはその組み合わせを含む、請求項９に記載のシステム。
【請求項21】
前記係留分子が、以下：（ａ）Ｎ－複素環カルベン（ＮＨＣ）；
（ｂ）溶液中で電気化学的方法によってカソード電極に選択的に堆積されるように構成された金属錯体中のＮ－複素環カルベン（ＮＨＣ）；
（ｃ）有機溶液および／または水溶液中で両方の金属電極上に堆積されるように構成されたＮ－複素環カルベン（ＮＨＣ）；および
（ｄ）アミン、カルボン酸、チオール、ボロン酸、および／または付着するように構成された任意の有機基を含む官能基を含むＮ－複素環カルベン（ＮＨＣ）
のうちの１つまたはその組み合わせを含む、請求項９に記載のシステム。
【請求項22】
前記金属錯体が、Ａｕ、Ｐｄ、Ｐｔ、Ｃｕ、Ａｇ、Ｔｉ、および／または別の遷移金属を含む、請求項２１に記載のシステム。
【請求項23】
前記核酸ナノ構造体を支持し、かつ安定化するために前記ナノギャップの底部に固定されるように構成されたタンパク質をさらに含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項24】
前記ナノギャップの非伝導性底部が、タンパク質を固定するための化学試薬で官能化されており、ここで、前記化学試薬が、（ａ）酸化物表面と反応するように構成されたシラン；
（ｂ）酸化物表面と反応するように構成されたシラトラン；
（ｃ）シラトランおよび官能基を含むマルチアームリンカー；
（ｄ）アダマンタンコアを含む４アームリンカー；
（ｅ）２つのシラトランおよび２つのビオチン部分を含む４アームリンカー；および／または
（ｆ）アダマンタンコアならびにシラトランおよび有機官能基を含む４アームリンカー
を含む、請求項２３に記載のシステム。
【請求項25】
前記タンパク質が、抗体、受容体、アプタマー、およびその組み合わせからなる群より選択される、請求項２３に記載のシステム。
【請求項26】
前記タンパク質がストレプトアビジンまたはアビジンであり、前記核酸ナノ構造体がビオチンで官能化されている、請求項２３に記載のシステム。
【請求項27】
前記酵素が、前記ナノ構造体に付着されるように構成された直交性官能基を含む組換えＤＮＡポリメラーゼまたは組換え逆転写酵素である、請求項１に記載のシステム。
【請求項28】
前記組換えＤＮＡポリメラーゼが以下：（ａ）前記ＤＮＡナノ構造体上のクリック反応のために構成されたＮ末端および／またはＣ末端の有機基；
（ｂ）前記ＤＮＡナノ構造体上のクリック反応のために構成された非天然型、修飾型、または合成型のアミノ酸；
（ｃ）前記ＤＮＡナノ構造体上のクリック反応のために構成されたＮ末端および／またはＣ末端のアジド基；および／または
（ｄ）前記ＤＮＡナノ構造体および／またはＲＮＡナノ構造体上のクリック反応のために構成された２－アミノ－６－アジドヘキサン酸（６－アジド－Ｌ－リジン）
を含む、請求項２７に記載のシステム。
【請求項29】
前記核酸ナノ構造体が以下：（ａ）ヌクレオシドであって、その糖環またはヌクレオベースがクリック反応のために構成された有機基で官能化された、ヌクレオシド；および／または
（ｂ）ヌクレオシドであって、その糖環またはヌクレオベースがクリック反応のために構成されたアセチレン基で官能化された、ヌクレオシド
を含む、請求項２８に記載のシステム。
【請求項30】
前記組換え逆転写酵素が以下：（ａ）前記ＤＮＡナノ構造体上のクリック反応のために構成されたＮ末端および／またはＣ末端の有機基；
（ｂ）前記ＤＮＡナノ構造体上のクリック反応のために構成された非天然型、修飾型、または合成型のアミノ酸；
（ｃ）前記ＤＮＡナノ構造体上のクリック反応のために構成されたＮ末端および／またはＣ末端のアジド基；および／または
（ｄ）前記ＤＮＡナノ構造体および／またはＲＮＡナノ構造体上のクリック反応のために構成された２－アミノ－６－アジドヘキサン酸（６－アジド－Ｌ－リジン）
を含む、請求項２７に記載のシステム。
【請求項31】
前記生化学反応が以下：（ａ）テンプレートとしてのＤＮＡおよび基質としてのＤＮＡヌクレオチドを使用してＤＮＡポリメラーゼによって触媒される反応；および／または
（ｂ）テンプレートとしてのＲＮＡおよび基質としてのＤＮＡヌクレオチドを使用して逆転写酵素によって触媒される反応
を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項32】
前記ＤＮＡヌクレオチドが、（ａ）ＤＮＡ／ＲＮＡヌクレオシドのポリリン酸塩；
（ｂ）有機分子でタグ付けされたＤＮＡ／ＲＮＡヌクレオシドのポリリン酸塩；
（ｃ）インターカレーターでタグ付けされたＤＮＡ／ＲＮＡヌクレオシドのポリリン酸塩；
（ｄ）副溝結合剤でタグ付けされたＤＮＡ／ＲＮＡヌクレオシドのポリリン酸塩；および／または
（ｅ）薬物分子でタグ付けされたＤＮＡ／ＲＮＡヌクレオシドのポリリン酸塩
を含み、
ここで、前記ポリリン酸塩は２またはそれを超えるリン酸単位を含む、請求項３１に記載のシステム。
【請求項33】
前記ポリリン酸塩が、以下：（ａ）前記ＤＮＡナノ構造体に結合する１，８－ナフタルイミドでタグ付けされたＤＮＡヌクレオシドの六リン酸塩；または
（ｂ）前記ＤＮＡナノ構造体に結合する１，８－ナフタルイミドの誘導体でタグ付けされたＤＮＡヌクレオシドの六リン酸塩
のうちの１つまたはその組み合わせである、請求項３２に記載のシステム。
【請求項34】
複数のナノギャップを含み、各ナノギャップが、電極対、酵素、ナノ構造体、および請求項１に記載の単一のナノギャップに関連する任意の特徴を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項35】
前記複数のナノギャップが、約１００～約１億個のナノギャップ、好ましくは約１０，０００個とおよそ１００万個との間のナノギャップのアレイを含む、請求項３４に記載のシステム。
【請求項36】
前記核酸ナノ構造体が、ホリディジャンクション（ＨＪ）、マルチアームジャンクション、ダブルクロスオーバー（ＤＸ）タイル、トリプルクロスオーバー（ＴＸ）タイル、並行クロスオーバー（ＰＸ）、テンセグリティ・トライアングル、シックスヘリックスバンドル、および一本鎖環状ＤＮＡ、およびその組み合わせのオリガミモチーフ、ならびに二重鎖、ヘアピン、９０°－キンク、キッシング－ループ、オープン型三方向ジャンクション、オープン型四方向ジャンクション、スタッキング型三方向ジャンクション、または三方向ループ、およびその組み合わせを有するＤＮＡタイル様構造体を含むＤＮＡナノ構造体からなる群より選択される、請求項１に記載のシステム。
【請求項37】
バイオポリマーを同定するか、特徴付けるか、配列決定するための方法であって、（ａ）非伝導性基材を提供する工程；
（ｂ）第１の電極および第２の電極を前記基材上に隣り合わせに配置することによってナノギャップを構築する工程；
（ｃ）前記ナノギャップを架橋するのに十分な長さのナノ構造体を提供する工程であって、ここで、前記ナノ構造体が、デオキシリボ核酸（ＤＮＡナノ構造体）またはリボ核酸（ＲＮＡナノ構造体）のいずれかの核酸またはその組み合わせを含み、ここで、前記核酸の塩基が、いずれかの非天然型核酸塩基であるか、前記核酸が、非天然型核酸塩基と天然型核酸塩基との混合物を含む、工程；
（ｄ）前記バイオポリマーと生化学反応を行う酵素を提供する工程；
（ｅ）前記ナノ構造体の一方の端部を前記ナノギャップの前記第１の電極に付着させ、他方の端部を前記第２の電極に付着させ、ここで、前記ナノギャップは架橋されており、次いで、前記酵素を前記ナノ構造体に付着させるか；あるいは、前記酵素を前記ナノ構造体に付着させ、次いで、前記ナノ構造体を前記ナノギャップに付着させる工程；
（ｆ）前記第１の電極と前記第２の電極との間のバイアス電圧を提供する工程；
（ｇ）前記ナノ構造体に付着した前記酵素によって惹起されたコンフォメーション変化によって引き起こされる前記ナノ構造体内の歪みに起因する前記ナノ構造体を介した電流変動を記録するためのデバイスを提供する工程；ならびに
（ｈ）前記バイオポリマーまたは前記バイオポリマーのサブユニットを特徴付けるか同定するために使用されるデータ解析用ソフトを提供する工程
を含む、方法。
【請求項38】
前記非伝導性基材が、ケイ素、酸化ケイ素、窒化ケイ素、ガラス、二酸化ハフニウム、別の金属酸化物、任意の非伝導性ポリマー薄膜、酸化ケイ素または窒化ケイ素または別の非伝導性コーティングを有するケイ素、窒化ケイ素コーティングを有するガラス、別の非伝導性有機材料、任意の非伝導性無機材料、およびその組み合わせからなる群より選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項39】
前記バイオポリマーが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、タンパク質、ペプチド、ポリサッカリド、前記バイオポリマーのうちのいずれかの天然型、改変型、または合成型のいずれか、およびその組み合わせからなる群より選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項40】
前記酵素が、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡヘリカーゼ、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡエキソヌクレアーゼ、逆転写酵素、ＲＮＡプライマーゼ、リボソーム、スクラーゼ、ラクターゼ、前記酵素のうちのいずれかの未変性のもの、変異されたもの、発現されたもの、または合成されたもののいずれか、およびその組み合わせからなる群より選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項41】
前記酵素が、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｇポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＹ、ＤＮＡポリメラーゼＰｏｌ Ｉ、Ｐｏｌ ＩＩ、Ｐｏｌ ＩＩＩ、Ｐｏｌ ＩＶ、およびＰｏｌ Ｖ、Ｐｏｌ α（アルファ）、Ｐｏｌ β（ベータ）、Ｐｏｌ σ（シグマ）、Ｐｏｌ λ（ラムダ）、Ｐｏｌ δ（デルタ）、Ｐｏｌ ε（イプシロン）、Ｐｏｌ μ（ミュー）、Ｐｏｌ Ι（イオタ）、Ｐｏｌ κ（カッパ）、ｐｏｌ η（イータ）、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ、テロメラーゼ、前記酵素のうちのいずれかの未変性のもの、変異されたもの、発現されたもの、または合成されたもののいずれか、およびその組み合わせからなる群より選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項42】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、未変性のもの、変異されたもの、発現されたもの、または合成されたもののいずれかのφ２９ＤＮＡポリメラーゼである、請求項４０に記載の方法。
【請求項43】
前記ナノギャップを形成する２つの電極が、約３ｎｍ～約１０００ｎｍの距離で分離されており；ここで、前記電極の端部が、幅約３ｎｍ～約１０００ｎｍおよび深さ約２ｎｍ～約１０００ｎｍの実質的に矩形の表面を有する、請求項３７に記載の方法。
【請求項44】
前記ナノギャップを形成する２つの電極が、約５ｎｍ～約５０ｎｍの距離で分離されており；ここで、前記電極の端部が、幅約１０ｎｍ～約３０ｎｍおよび深さ約５ｎｍ～約２０ｎｍの実質的に矩形の表面を有する、請求項３７に記載の方法。
【請求項45】
前記電極が、以下：ｅ）チオール、アミン、セレノール、および別の有機官能基と反応することができる金属電極；
ｆ）係留分子と反応して共有結合を形成することができる自己組織化単分子膜によって表面上で官能化され得る金属電極；
ｇ）前記係留分子と反応して共有結合を形成することができるシランで官能化され得る金属酸化物電極；または
ｈ）前記係留分子と反応して共有結合を形成することができる有機試薬で官能化され得る炭素電極
を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項46】
前記電極および前記基材を、前記ナノギャップに面する端部表面を除いて絶縁層で不動態化する工程をさらに含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項47】
前記絶縁層が、不活性化学物質の単分子膜または多分子層を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項48】
前記不活性化学物質が、金属表面の不動態化のための１１－メルカプトウンデシル－ヘキサエチレングリコール（ＣＲ－１）、ならびに基材表面の不動態化のためのアミノプロピルトリエトキシシラン（ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌｔｒｉｅｔｈｏｘｙｓａｌｉｎｅ）（ＣＲ－２）およびＮ－ヒドロキシスクシンイミジル２－（ω－Ｏ－メトキシ－ヘキサエチレングリコール）アセタート（ＣＲ－３）を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項49】
前記非天然型核酸塩基が、以下：（ａ）ハチモジ核酸塩基；
（ｂ）サイズを拡大したヌクレオベース；
（ｃ）非水素結合ヌクレオベース；および
（ｄ）ユニバーサル塩基
のうちの１つまたはその組み合わせを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項50】
前記核酸ナノ構造体が、以下：（ａ）対合されなかったか対合しない核酸塩基；および
（ｂ）有機超伝導体
のうちの１つまたはその組み合わせを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項51】
前記核酸ナノ構造体が、直鎖状もしくは環状のＤＮＡ（ＤＮＡナノ構造体）、または直鎖状もしくは環状のＲＮＡ（ＲＮＡナノ構造体）、またはその組み合わせのいずれかから自己組織化する、請求項３７に記載の方法。
【請求項52】
前記核酸ナノ構造体が、以下：（ｄ）らせん型または非らせん型のいずれかの直鎖状ＤＮＡ二重鎖構造体、直鎖状ＲＮＡ二重鎖構造体、直鎖状核酸分子ワイヤ、またはその組み合わせが含まれるが、これらに限定されない実質的に一次元の幾何学的配置；
（ｅ）実質的に矩形の構造体、実質的に正方形の構造体、実質的に三角形の構造体、実質的に円形の構造体、またはその組み合わせが含まれるが、これらに限定されない実質的に二次元の幾何学的配置；および
（ｆ）実質的に円柱形の構造体、実質的に中空管の構造体、実質的に柱形様の構造体、実質的に束ねた柱様の構造体を含む幾何学的配置、実質的にスタッキングされた二次元構造体を含む幾何学的配置、実質的に折りたたまれたオリガミ様構造体を含む幾何学的配置、またはその組み合わせが含まれるが、これらに限定されない実質的に三次元の幾何学的配置
の構成のうちの１つまたはその組み合わせを有する、請求項３７に記載の方法。
【請求項53】
前記ナノ構造体が以下：ａ．アミド結合、グアニジニウム結合、またはトリアゾール結合を含む非リン酸骨格；
ｂ．糖修飾されたヌクレオシドまたはヌクレオシドアナログ；
ｃ．ヌクレオベース修飾されたヌクレオシドまたはヌクレオシドアナログ；および／または
ｄ．ヌクレオベースアナログ
を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項54】
前記ナノ構造体が以下：ａ．電極に付着するように構成された官能基；および／または
ｂ．前記酵素を固定するように構成された官能基
を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項55】
前記電極に付着するように構成された官能基が、以下：（ａ）ヌクレオシドの糖環上のチオール；
（ｂ）ヌクレオシドのヌクレオベース上のチオールおよびセレノール；
（ｃ）ヌクレオシド上の脂肪族アミン；および／または
（ｄ）ヌクレオシド上のカテコール；
（ｅ）ＲＸＨまたはＲＸＸＲであって、式中、Ｒは、脂肪族または芳香族の基であり；Ｘはカルコゲンであり、ＳおよびＳｅが好ましい、ＲＸＨまたはＲＸＸＲ；
（ｆ）塩基カルコゲン化ヌクレオシド
を含み、
前記酵素を固定するように構成された官能基が、以下：
（ａ）化学合成または酵素合成によってＤＮＡおよびＲＮＡに組み込まれるアミン官能化ヌクレオシド；
（ｂ）化学合成または酵素合成によってＤＮＡおよびＲＮＡに組み込まれるシクロオクチンおよび／または誘導体で官能化されたヌクレオシド；および／または
（ｃ）化学合成または酵素合成によってＤＮＡおよびＲＮＡに組み込まれるカテコール官能化ヌクレオシド
を含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項56】
前記係留分子が、以下：（ａ）多価結合を介して金属表面と相互作用するように構成された分子；
（ｂ）三価結合を介して金属表面と反応するように構成されたトライポッド構造体；および
（ｃ）テトラフェニルメタンコアから構成される分子であって、ここで、そのフェニル環のうちの３つが、－ＣＨ２ＳＨおよび－ＣＨ２ＳｅＨで官能化されており、第４のフェニル環が、アジド、カルボン酸、ボロン酸、および／またはＤＮＡおよび／またはＲＮＡナノ構造体に組み込まれた官能基と反応するように構成された有機基で官能化されている、分子
のうちの１つまたはその組み合わせを含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項57】
前記係留分子が、以下：（ａ）Ｎ－複素環カルベン（ＮＨＣ）；
（ｂ）溶液中で電気化学的方法によってカソード電極に選択的に堆積されるように構成された金属錯体中のＮ－複素環カルベン（ＮＨＣ）；
（ｃ）有機溶液および／または水溶液中で両方の金属電極上に堆積されるように構成されたＮ－複素環カルベン（ＮＨＣ）；および
（ｄ）アミン、カルボン酸、チオール、ボロン酸、および／または付着するように構成された任意の有機基を含む官能基を含むＮ－複素環カルベン（ＮＨＣ）
のうちの１つまたはその組み合わせを含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項58】
前記金属錯体が、Ａｕ、Ｐｄ、Ｐｔ、Ｃｕ、Ａｇ、Ｔｉ、および／または別の遷移金属を含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項59】
前記核酸ナノ構造体を支持し、かつ安定化するために前記ナノギャップの底部に固定されるように構成されたタンパク質を提供する工程をさらに含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項60】
前記ナノギャップの非伝導性底部を、タンパク質を固定するための化学試薬で官能化する工程をさらに含み、ここで、前記化学試薬が、（ｇ）酸化物表面と反応するように構成されたシラン；
（ｈ）酸化物表面と反応するように構成されたシラトラン；
（ｉ）シラトランおよび官能基を含むマルチアームリンカー；
（ｊ）アダマンタンコアを含む４アームリンカー；
（ｋ）２つのシラトランおよび２つのビオチン部分を含む４アームリンカー；および／または
（ｌ）アダマンタンコアならびにシラトランおよび有機官能基を含む４アームリンカー
を含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項61】
前記タンパク質が、抗体、受容体、アプタマー、およびその組み合わせからなる群より選択される、請求項５９に記載の方法。
【請求項62】
前記タンパク質がストレプトアビジンまたはアビジンであり、前記核酸ナノ構造体がビオチンで官能化されている、請求項５９に記載の方法。
【請求項63】
前記酵素が、前記ナノ構造体に付着されるように構成された直交性官能基を有する組換えＤＮＡポリメラーゼまたは組換え逆転写酵素である、請求項３７に記載の方法。
【請求項64】
前記組換えＤＮＡポリメラーゼが以下：（ａ）前記ＤＮＡナノ構造体上のクリック反応のために構成されたＮ末端および／またはＣ末端の有機基；
（ｂ）前記ＤＮＡナノ構造体上のクリック反応のために構成された非天然型、修飾型、または合成型のアミノ酸；
（ｃ）前記ＤＮＡナノ構造体上のクリック反応のために構成されたＮ末端および／またはＣ末端のアジド基；および／または
（ｄ）前記ＤＮＡナノ構造体および／またはＲＮＡナノ構造体上のクリック反応のために構成された２－アミノ－６－アジドヘキサン酸（６－アジド－Ｌ－リジン）
を含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項65】
前記核酸ナノ構造体が以下：（ａ）ヌクレオシドであって、その糖環またはヌクレオベースがクリック反応のために構成された有機基で官能化された、ヌクレオシド；および／または
（ｂ）ヌクレオシドであって、その糖環またはヌクレオベースがクリック反応のために構成されたアセチレン基で官能化された、ヌクレオシド
を含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項66】
前記組換え逆転写酵素が以下：（ａ）前記ＤＮＡナノ構造体上のクリック反応のために構成されたＮ末端および／またはＣ末端の有機基；
（ｂ）前記ＤＮＡナノ構造体上のクリック反応のために構成された非天然型、修飾型、または合成型のアミノ酸；
（ｃ）前記ＤＮＡナノ構造体上のクリック反応のために構成されたＮ末端および／またはＣ末端のアジド基；および／または
（ｄ）前記ＤＮＡナノ構造体および／またはＲＮＡナノ構造体上のクリック反応のために構成された２－アミノ－６－アジドヘキサン酸（６－アジド－Ｌ－リジン）
を含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項67】
前記生化学反応が以下：（ａ）テンプレートとしてのＤＮＡおよび基質としてのＤＮＡヌクレオチドを使用してＤＮＡポリメラーゼによって触媒される反応；および／または
（ｂ）テンプレートとしてのＲＮＡおよび基質としてのＤＮＡヌクレオチドを使用して逆転写酵素によって触媒される反応
を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項68】
前記ＤＮＡヌクレオチドが、（ａ）ＤＮＡ／ＲＮＡヌクレオシドのポリリン酸塩；
（ｂ）有機分子でタグ付けされたＤＮＡ／ＲＮＡヌクレオシドのポリリン酸塩；
（ｃ）インターカレーターでタグ付けされたＤＮＡ／ＲＮＡヌクレオシドのポリリン酸塩；
（ｄ）副溝結合剤でタグ付けされたＤＮＡ／ＲＮＡヌクレオシドのポリリン酸塩；および／または
（ｅ）薬物分子でタグ付けされたＤＮＡ／ＲＮＡヌクレオシドのポリリン酸塩
を含み、
ここで、前記ポリリン酸塩は２またはそれを超えるリン酸単位を含む、
請求項６７に記載の方法。
【請求項69】
前記ポリリン酸塩が、以下：（ｃ）前記ＤＮＡナノ構造体に結合する１，８－ナフタルイミドでタグ付けされたＤＮＡヌクレオシドの六リン酸塩；および
（ｄ）前記ＤＮＡナノ構造体に結合する１，８－ナフタルイミドの誘導体でタグ付けされたＤＮＡヌクレオシドの六リン酸塩
のうちの１つまたはその組み合わせである、請求項６８に記載の方法。
【請求項70】
前記核酸ナノ構造体が、ホリディジャンクション（ＨＪ）、マルチアームジャンクション、ダブルクロスオーバー（ＤＸ）タイル、トリプルクロスオーバー（ＴＸ）タイル、並行クロスオーバー（ＰＸ）、テンセグリティ・トライアングル、シックスヘリックスバンドル、および一本鎖環状ＤＮＡ、またはその組み合わせのオリガミモチーフ、ならびに二重鎖、ヘアピン、９０°－キンク、キッシング－ループ、オープン型三方向ジャンクション、オープン型四方向ジャンクション、スタッキング型三方向ジャンクション、または三方向ループ、またはその組み合わせを有するＤＮＡタイル様構造体を含むＤＮＡナノ構造体からなる群より選択される、請求項３７に記載の方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明の実施形態は、電子信号を用いたバイオポリマーの配列決定または同定のためのシステム、方法、デバイス、および組成物に関する。より具体的には、本開示は、酵素活性（複製が含まれる）に電子的に基づいてバイオポリマーを検出するためのシステムの構築を教示する実施形態を含む。本発明のバイオポリマーには、天然型または合成型のいずれかのＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡオリゴ、タンパク質、ペプチド、ポリサッカリドなどが含まれるが、これらに限定されない。酵素には、天然型、変異型、または合成型のいずれかのＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡヘリカーゼ、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡエキソヌクレアーゼ、逆転写酵素、ＲＮＡプライマーゼ、リボソーム、スクラーゼ、ラクターゼなどが含まれるが、これらに限定されない。以下において、主にＤＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡポリメラーゼを考察し、本発明の概念を説明するために使用する。
【背景技術】
【0002】
酵素合成によるＤＮＡ配列決定は、サンガーのＤＮＡ鎖伸長停止法まで遡ることができ、この方法は、標的配列のｉｎ ｖｉｔｒｏ複製中にＤＮＡポリメラーゼによってＤＮＡにジデオキシヌクレオチドを選択的に組み込むというものである１，２。この酵素アプローチは、ハイスループットまたはリアルタイムの次世代配列決定（ＮＧＳ）に発展している３，４。ＮＧＳはヒトゲノムの配列決定にかかるコストを１０００ドルの範囲まで削減したが、最近のデータではこのコスト削減は下限に達している（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｇｏｖ／２７５６５１０９／ｔｈｅ－ｃｏｓｔ－ｏｆ－ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ－ａ－ｈｕｍａｎ－ｇｅｎｏｍｅ）。制限因子の１つとしては、ＮＧＳが精巧な機器を必要とする光学的なシグナル検出に依存しており、この機器はかさ高く、かつ高価であることが挙げられる。
【0003】
ポリメラーゼによるＤＮＡ合成の電気的読み取りはラベルフリー検出によって後押しされ５、ゲノム配列決定で使用されるプラットフォームにまで進展している６。近年の進歩は、電気的アプローチがＭｉｎｌＯＮシークエンサー（ｗｗｗ．ｎａｎｏｐｏｒｅｔｅｃｈ．ｃｏｍ）などの携帯型デバイスで有り得、このデバイスは、ＤＮＡ配列決定のためにタンパク質ナノポアを通過したイオン電流の変化を測定し、ナノポアを通過するＤＮＡのトランスロケーションの制御にＤＮＡヘリカーゼを使用することを示す７。しかしながら、タンパク質ナノポアによる配列決定は、低い精度でしか実現できていない（１回の読み取りで８５％８）。Ｇｕｎｄｌａｃｈおよびその同僚らは、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓポーリンＡ（ＭｓｐＡとして公知）から構成されるタンパク質ナノポアにおけるイオン電流の遮断が４つのヌクレオチド（クアドロマー）の収集された事象であって、したがって４４（すなわち、２５６）種類のクアドロマーが存在する可能性があり、このことが、かなりの数の冗長な電流レベルを発揮することを実証した９，１０。イオン電流がナノポアの内側の範囲を超えるヌクレオチドに影響を受けるので１１、配列決定のための原子レベルの薄さのナノポアでは、単一ヌクレオチドの解像度を達成できるとは考えられないかもしれない。
【0004】
Ｃｏｌｌｉｎｓおよびその同僚らは、ＤＮＡ合成をモニタリングするためのＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片が係留された単層カーボンナノチューブ（ＳＷＣＮＴ）電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）デバイスが報告されている１２，１３。この方法では、ヌクレオチドがＤＮＡ鎖に組み込まれたときに、平均ベースライン電流未満のΔＩ（ｔ）の短期間の逸脱が記録された。酵素によって異なるヌクレオチドが組み込まれることによりΔＩが変化する。この方法を、ＤＮＡの配列決定に使用できる可能性がある。カーボンナノチューブは、六角格子に固定されたたった１層の炭素原子から作製された材料である。剛性の化学構造のために、その感知は、主に、タンパク質付着部位付近の荷電側鎖の静電気的なゲーティングの挙動に依存し得る。しかしながら、デバイスに使用されるカーボンナノチューブの長さは０．５～１．０μｍであり１４、単一のタンパク質分子をデバイス上に再現可能にマウントすることは困難である。先行技術の発明（ＷＯ２０１７／０２４０４９号）は、ＤＮＡ配列決定のためのナノスケールの電界効果トランジスタ（ｎａｎｏＦＥＴ）を権利主張しており、前述のトランジスタは、ＤＮＡポリメラーゼが固定されており、そのヌクレオチド出口領域が、組み込まれたヌクレオチドを識別するために標識されたポリリン酸を有するヌクレオチド組を有するカーボンナノチューブゲートに配向されている（図１）。
【0005】
別の発明（ＵＳ２０１７／００４４６０５号）は、２つの個別の電極を架橋するバイオポリマー上に固定されたポリメラーゼを使用してＤＮＡおよびＲＮＡを配列決定するための電子センサデバイスを権利主張している（図２）。また、回路を完成させるために単一の酵素を陽極および陰極の両方に直接配線することができ、その結果、全ての電流が分子を流れるはずである（ＵＳ２０１８／０３０５７２７号、ＷＯ２０１８／２０８５０５号）。それにもかかわらず、酵素は、電極に対して２つを超える接続点を有し得る。
【0006】
固有の塩基スタッキング構造のために、ＤＮＡを、電荷移動（ＣＴ）のための微細な分子ワイヤにするので、ＤＮＡは分子エレクトロニクスにおいて多くの注目を集めている。また、ＤＮＡの配列および長さはプログラム可能であり、エラーのない自己組織化したナノ構造体（ＤＮＡオリガミ（ＤＮＡ ｏｒｉｇａｍｉ）など）を形成することができ、高価な微細加工技術を必要としないので、ナノスケールの集積回路の理想的な候補となる。この１０年間で、ナノ構造体の構築のための核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡ）のプログラミングされた自己組織化が開発されている１５，１６。一般に、複雑なＤＮＡナノ構造体は、ホリディジャンクション（Ｈｏｌｌｉｄａｙ ｊｕｎｃｔｉｏｎ）１７，１８、マルチアームジャンクション（ｍｕｌｔｉ－ａｒｍ ｊｕｎｃｔｉｏｎ）１９、ダブル（ＤＸ）およびトリプルクロスオーバー（ＴＸ）タイル２０，２１、並行クロスオーバー（ｐａｒａｎｅｍｉｃ ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ））（ＰＸ）２２、テンセグリティ・トライアングル（ｔｅｎｓｅｇｒｉｔｙ ｔｒｉａｎｇｌｅ）２３、シックスヘリックスバンドル（ｓｉｘ－ｈｅｌｉｘ ｂｕｎｄｌｅ）２４、および一本鎖環状ＤＮＡまたはＤＮＡオリガミなどの分子モチーフから出発して組み立てられる（図３）２５。これらのＤＮＡモチーフを用いて、種々のサイズおよび形状の調整可能なナノ構造体を容易に構築することができる。ＤＮＡナノ構造体は、カーボンナノチューブより剛性が低いが、ＤＮＡ二重鎖または分子ワイヤよりも剛性が高い。また、ＤＮＡナノ構造体を、ＤＮＡ二重鎖と同様に官能化することができる。ＤＮＡナノ構造体は、所望の伝導率、電流変動、または他の電気的性質を有するように設計された構造を有する電子バイオセンサの構築のための固有のブレッドボードを提供する。１０×６０ｎｍ２のＴＸタイルナノ構造体は、相対湿度９０％の４５～５５ｎｍのナノギャップ内のコンダクタンスの測定値は約７０ｐＳであった２６。したがって、ＤＮＡナノ構造体によって架橋されたナノギャップを使用して、分子の電子的検出または同定のためのナノバイオデバイスを構築することができる。ＤＮＡナノ構造体の伝導率をその配列、構成、および構造力学によって調整することができると考えられる。同様に、ＲＮＡナノ構造体は、ＲＮＡモチーフ（図４）を用いた自己組織化によって構築される２７，２８。ＲＮＡは、ＤＮＡと比較して構造および機能がさらに一層多用途であり、その二重鎖はＤＮＡ対応物より熱力学的に安定である。したがって、ＲＮＡナノ構造体は、対応するＤＮＡナノ構造体の代替物であり得る。ＲＮＡが電子移動を媒介することもできることが実証されている２９。
【0007】
標準的なヌクレオベースを超えるＤＮＡをプログラミングするために、最近、Ｓｔｅｖｅｎ Ｂｅｎｎｅｒおよびその同僚らは、ハチモジシステム（Ｈａｃｈｉｍｏｊｉ ｓｙｓｔｅｍ）と呼ばれる８ヌクレオチドＤＮＡ／ＲＮＡ遺伝子システムを作出した５６。４つの天然に存在するＤＮＡヌクレオチドＡ、Ｃ、Ｇ、およびＴに加えて、Ｓｔｅｖｅｎ Ｂｅｎｎｅｒらは、さらに４つの非天然型ＤＮＡヌクレオチドＰ、Ｂ、Ｓ、Ｚを作製した。前述のヌクレオチドにおいて、Ｇ：Ｃ対およびＡ：Ｔ対と同様にＰはＺと対合し（Ｐ：Ｚ）、ＢはＳと対合し（Ｂ：Ｓ）、ここで、ＰおよびＢはプリンアナログであり、ＺおよびＳはピリミジンアナログであり、Ｐは２－アミノ－８－（１’－β－Ｄ－２’－デオキシリボフラノシル）－イミダゾ－［１，２ａ］－１，３，５－トリアジン－［８Ｈ］－４－オンであり、Ｂは６－アミノ－９［（１’－β－Ｄ－２’－デオキシリボフラノシル）－４－ヒドロキシ－５－（ヒドロキシメチル）－オキソラン－２－イル］－１Ｈ－プリン－２－オンであり、Ｓは３－メチル－６－アミノ－５－（１’－β－Ｄ－２’－デオキシリボフラノシル）－ピリミジン－２－オンであり、Ｚは６－アミノ－３－（１’－β－Ｄ－２’－デオキシリボフラノシル）－５－ニトロ－１Ｈ－ピリジン－２－オンである（図５および参考文献番号５６を参照のこと）。これらの新規のヌクレオチドは、４つの天然型ヌクレオチドに類似の二重らせんを形成することができ、これらを混合して８種の塩基ＧＡＣＴＺＰＳＢを有するＤＮＡ二重らせんを形成することもでき、これをＤＮＡポリメラーゼによって複製することができる。天然型ＤＮＡでは、Ｇ：Ｃ対は３つの水素結合を有するが、Ａ：Ｔ対は２つの水素結合のみを有する。対照的に、Ｐ：Ｚ対およびＢ：Ｓ対は両方とも３つの水素結合を有し（図５）、そのため、これらの非天然型塩基を用いて形成されたＤＮＡ二重鎖は、天然型ＤＮＡを用いて形成されたＤＮＡ二重鎖より安定かつ伝導性が高いと予想することができる。非天然型ヌクレオチドから作製されたＲＮＡについても同じことが言え、４つのＤＮＡ塩基ＰＢＳＺ（Ｐ：２－アミノ－８－（１’－β－Ｄ－リボフラノシル）－イミダゾ－［１，２ａ］－１，３，５－トリアジン－［８Ｈ］－４－オン、Ｂ：６－アミノ－９［（１’－β－Ｄ－リボフラノシル）－４－ヒドロキシ－５－（ヒドロキシメチル）－オキソラン－２－イル］－１Ｈ－プリン－２－オン、Ｓ：２－アミノ－１－（１’－β－Ｄ－リボフラノシル）－４（１Ｈ）－ピリミジノン、およびＺ：６－アミノ－３－（１’－β－Ｄ－リボフラノシル）－５－ニトロ－１Ｈ－ピリジン－２－オン、ここで、Ｓは天然型ＲＮＡにおけるＵに似ている）がＲＮＡ塩基になる（参考文献番号５６を参照のこと）。
【0008】
最近の研究において、溶液中のＤＮＡポリメラーゼＩはＰＸモチーフに結合した場合のＫｄが約２２０ｎＭであり、ＤＸモチーフに結合した場合のＫｄが約１３μＭであることが報告されている３０。それにもかかわらず、ＰＸモチーフは、ポリメラーゼ伸長のための基質として機能することができなかった。ＤＮＡ配列決定のために、φ２９ＤＮＡポリメラーゼは、種々のプラットフォームで使用される酵素である９，３１，３２。アミノ酸配列の類似性および特異的な阻害剤に対するその感受性に基づいて、φ２９ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの真核生物タイプファミリーＢに属する３３。任意の他のＤＮＡポリメラーゼのように、φ２９ＤＮＡポリメラーゼは、伸長中のＤＮＡ鎖の３’－ＯＨ基上にｄＮＭＰ単位をテンプレートに方向づけて逐次的に付加し、ミスマッチしたｄＮＭＰ挿入を１０４～１０６倍区別できる３４。さらに、φ２９ＤＮＡポリメラーゼは、３’－５’エキソヌクレオリシス（すなわち、ミスマッチしたプライマー－末端が優先的に分解されるＤＮＡ鎖の３’末端からのｄＮＭＰ単位の放出）を触媒し、複製忠実度をさらに向上させる３５～３７。φ２９ＤＮＡポリメラーゼのプルーフリーディング活性、鎖置換、および処理能力は、その固有の構造に起因し得る（図６）３８～４０。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0009】
【特許文献1】国際出願第２０１７／０２４０４９号
【特許文献2】国際出願第２０１８／２０８５０５号
【図面の簡単な説明】
【0010】
【0011】
【0012】
【0013】
【0014】
【0015】
【0016】
【0017】
【0018】
【0019】
【0020】
【0021】
【0022】
【0023】
【0024】
【0025】
【0026】
【0027】
【0028】
【0029】
【0030】
【0031】
【0032】
【0033】
【0034】
【発明を実施するための形態】
【0035】
本発明は、バイオポリマーの配列決定または同定のためのナノ構造体デバイスおよび方法を提供する。本開示は、種々の実施形態の説明を通して本発明を実証するために単一のＤＮＡ分子の配列決定を使用する。また、本発明は、異なる実施形態において種々の代表的なデバイス、装置、および方法の具体的な技術的詳細を提供しているが、これらは説明のみを目的とし、物理的な寸法および配置、化学的な組成および構造、処理の手順およびパラメーター、または任意の他の適用可能な条件を制限することを意図せず、本出願の範囲を決して制限するものではない。
【0036】
１つの実施形態では、図８に示すように、１０～２０ｎｍのナノギャップを、半導体ナノファブリケーションテクノロジーによって、２つの電極間に作製し、これらの電極は、周囲が非特異的吸着を防止するための不活性化学物質で不動態化されており、ナノギャップの内部領域が化学反応のために露出されている。ＤＮＡタイル構造は、ナノギャップを架橋するために電極に係留されており、ＤＮＡタイル構造上にＤＮＡポリメラーゼ（例えば、φ２９ＤＮＡポリメラーゼ）が固定されている。配列決定のために、標的ＤＮＡ（テンプレート）がデバイス内で複製される。複製プロセス中に、ヌクレオチドが、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長中のＤＮＡ鎖に組み込まれる。機械的には、ヌクレオチドの組み込みは、ポリメラーゼのコンフォメーション変化が伴う（図９）４１。ポリメラーゼがＤＮＡタイルに直接付着するので、コンフォメーション変化がタイルの構造を妨害し、それによって電流の変動が起こり、この変動を異なるヌクレオチドの組み込みを同定するためのシグネチャとして使用する。
【0037】
いくつかの実施形態では、本発明は、２つの電極の間に３ｎｍ～１０００ｎｍ、好ましくは５ｎｍ～１００ｎｍ、より好ましくは１０ｎｍ～３０ｎｍの範囲のサイズのナノギャップを作製する方法を提供する。第１に、本発明は、電子ビームリソグラフィ（ＥＢＬ）を使用して、非伝導性基材の上部に金属ナノワイヤ（Ａｕ（金）、Ｐｄ（パラジウム）、およびＰｔ（白金）のナノワイヤなど）を生成する。例えば、図１０に示すように、１０００×１０×１０ｎｍ（長さ×幅×高さ）の寸法の金ナノワイヤ（３）を、ＥＢＬによって酸化ケイ素（ＳｉＯ２）基材（１）上または窒化ケイ素（Ｓｉ３Ｎ４）の層でコーティングしたケイ素基材上に作製し、標準的なフォトリソグラフィ技術によって大型の金属接点パッド（２）に接続する。ナノワイヤの長さは、１００ｎｍ～１００μｍ、好ましくは１μｍ～１０μｍであり；幅は、５ｎｍ～１００ｎｍ、好ましくは１０ｎｍ～３０ｎｍであり；高さ（厚さ）は、３ｎｍ～１００ｎｍ、好ましくは５ｎｍ～２０ｎｍである。また、ナノワイヤのアレイを、ナノインプリンティング４２または他のナノファブリケーション技術によって作製することができる。その後に、金属表面を１１－メルカプトウンデシル－ヘキサエチレングリコール（ＣＲ－１）４３との反応によって不動態化して単分子膜を形成させ、酸化ケイ素表面を、アミノプロピルトリエトキシシラン（ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌｔｒｉｅｔｈｏｘｙｓａｌｉｎｅ）（ＣＲ－２）で最初に処理し、その後にＮ－ヒドロキシスクシンイミジル２－（ω－Ｏ－メトキシ－ヘキサエチレングリコール）アセタート（ＣＲ－３）と反応させる。最後に、不動態化したナノワイヤをＥＢＬまたはヘリウム収束イオンビームミリング（Ｈｅ－ＦＩＢ）４４によって切断して１０～２０ｎｍのナノギャップを生成し、切断領域内の酸化ケイ素および電極の側壁を露出させる。あるいは、ナノワイヤまたは複数のナノワイヤを、不動態化の代わりに絶縁薄層で被覆するか、絶縁薄層で被覆した後に不動態化することができる。
【0038】
いくつかの実施形態では、ＤＮＡナノ構造体を使用して、ナノギャップを架橋する。図８に示すように、１０ｎｍのナノギャップを４鎖ＤＮＡタイルによって架橋する４５。自己組織化によって溶液中で異なる形状およびサイズを有するＤＮＡナノ構造体を形成させる方法は多数存在する４６～４８。
【0039】
１つの実施形態では、非天然型ＤＮＡ塩基（ＰＢＳＺ）を使用して、ナノギャップを架橋するナノ構造体を構築する。Ｇ／Ｃ塩基を有する二重らせんＤＮＡがＡおよびＴヌクレオチドのみを含むものよりも良好な導体であることが周知である。グアニン塩基の容易な酸化により、電荷担体（ホール）を作製することが可能である。ＤＮＡを介した電荷輸送は、塩基の最高被占分子軌道（ＨＯＭＯ）を介したホール輸送に支配されると考えられ、これは、これらの軌道が塩基の最低空分子軌道（ＬＵＭＯ）よりも電極のフェルミ準位に近いからである５７。図５に示すように、非天然型の塩基対Ｚ：Ｐは、そのエネルギーがＡ：Ｔ塩基対のエネルギーより高いＨＯＭＯを有し、塩基対Ｓ：Ｂは、そのエネルギーがＧ：Ｃ塩基対のエネルギーより高いＨＯＭＯを有する。したがって、これらの非天然型塩基対から構成されるＤＮＡ分子の伝導率は、天然型塩基対から構成されるＤＮＡ分子より高い。
【0040】
１つの実施形態では、非天然型ＤＮＡ塩基（ＰＢＳＺ）を使用して、ナノギャップを架橋する伝導性線状分子ワイヤを構築する。線状分子ワイヤは、簡潔ならせんＤＮＡ二重鎖（二本鎖ＤＮＡ）から作製される。線状分子ワイヤは、ポリメラーゼまたは他の酵素を付着または接続するための修飾型ヌクレオチド（複数可）を含み得る。分子ワイヤの構築に非天然型ＤＮＡ塩基を使用することの１つの利点は、その伝導率がより高い可能性があることである。
【0041】
１つの実施形態では、非天然型ＤＮＡ塩基（ＰＢＳＺ）を、二次元または三次元のいずれかで、分離不可能な単一構造または分離可能な多重構造の複合体のいずれかのより複雑な伝導性分子ナノ構造体の構築において使用する。
【0042】
別の実施形態では、非天然型ＤＮＡ塩基（ＰＢＳＺ）を天然型塩基（ＡＣＧＴ）と混合して、簡潔な線状伝導性分子ワイヤ、または二次元もしくは三次元のいずれかで、分離不可能な単一構造もしくは分離可能な多重構造の複合体のいずれかのナノギャップを架橋するより複雑な伝導性分子ナノ構造体のいずれかを構築する。例えば、ＨＯＭＯエネルギーが高いという特徴を活用するために天然型Ｃ：Ｇ対＋非天然型Ｓ：Ｂ対を使用してＤＮＡナノ構造体を構築することができ；さらに、ＤＮＡナノ構造体の望ましい構造変化を誘導するための比較的弱い塩基対合エネルギー状態を使用するために、天然型Ａ：Ｔ対を含めて６ヌクレオチドＤＮＡナノ構造体を形成することができる。別の例は、より複雑な（より調整可能であるか、高精度の配列決定を達成する可能性が高まることを意味する）８ヌクレオチドＤＮＡナノ構造体を形成することである。
【0043】
いくつかの実施形態では、本発明は、核酸ベースの分子ワイヤ（かならずしもらせん型ではない）を形成するための非天然型のサイズが拡大された核塩基を提供する（図７）５８。天然に存在するヌクレオベースと比較して、これらのサイズが拡大された塩基は、より大きなπ共役を有し、それにより良好なヌクレオベーススタッキングを提供し、より効率的な電荷輸送をもたらす。
【0044】
いくつかの実施形態では、本発明は、核酸ベースの分子ワイヤの一部としての非水素結合ヌクレオベースを提供する（図７）。これらのヌクレオベースはその周囲の変化に対する感度がより高く、分子ワイヤを生物検知または化学検知により感受性にする。
【0045】
１つの実施形態では、本発明は、これらのヌクレオベースのうちのいずれかと無差別に塩基対合することができるユニバーサル塩基としてピレン（Ｐｙ、図７）を使用する。その大きなπ共役のために、伝導率を増加させるために水素結合ヌクレオベースの代わりにピレンを分子ワイヤに挿入することができる。
【0046】
１つの実施形態では、バイオポリマーの配列決定または同定に好ましい構造変化を達成するために、対合されなかったか対合しない核酸塩基（複数可）をＤＮＡナノ構造体に挿入して、意図的に構造を不連続にすることができる。
【0047】
また、本発明は、前述のＤＮＡナノ構造体を電極に付着させる方法を提供する。１つの実施形態では、図１１に示すように、ＤＮＡナノ構造体は、その５’末端に５’－メルカプトヌクレオシドを保有し、その３’末端に３’－メルカプトヌクレオシドを保有する。ヌクレオシドは、デオキシリボヌクレオシド（Ｒ＝Ｈ）およびリボヌクレオシド（Ｒ＝ＯＨ）である。さらに、硫黄原子を、電子輸送のためのより良好なアンカーであり得るセレンに置換することができる４９。
【0048】
別の実施形態では、本発明は、ＤＮＡナノ構造体の末端をＲＸＨおよびＲＸＸＲ（式中、Ｒは、脂肪族または芳香族の基であり；Ｘはカルコゲンであり、ＳおよびＳｅが好ましい）で官能化する方法を提供する。
【0049】
いくつかの実施形態では、本発明は、電極へ付着させるためにＤＮＡナノ構造体に組み込むことができる塩基カルコゲン化ヌクレオシドを提供する（図１２）。ヌクレオベースを介してＤＮＡを電極に接続すると糖部分を介した場合よりも電気的接触が効率的になることが実証されている５０。
【0050】
１つの実施形態では、本発明は、金属電極への付着のための係留原子としての硫黄（Ｓ）またはセレン（Ｓｅ）のいずれかおよびＤＮＡナノ構造体の付着のためのカルボキシル基を有するテトラフェニルメタンを含むトライポッドアンカーを提供する（図１３、ａ）。一方で、ＤＮＡナノ構造体の末端を、トライポッドへの付着のためのアミノ官能化ヌクレオシド（図１３、ｂ）で修飾する。
【0051】
また、本発明は、アジド－アルキンクリック反応を介して金属電極をＤＮＡナノ構造体に付着することが可能なアジドで官能化された別のトライポッド（図１４、ａ）を提供する。したがって、本発明は、ＤＮＡナノ構造体の末端を修飾するためのシクロオクチンで官能化されたヌクレオシド（図１４、ｂ）を提供する。
【0052】
また、本発明は、ボロン酸で官能化されたトライポッド（図１５、ａ）およびＤＮＡナノ構造体の末端を修飾するためのジオールで官能化されたヌクレオシド（図１５、ｂ）を提供する。したがって、以前の開示（米国仮特許出願第６２／７７２，８３７号）に開示のように、ＤＮＡナノ構造体は、ボロン酸のジオールとの反応を介して金属電極に付着される。
【0053】
１つの実施形態では、本発明は、ナノギャップ内で２つの電極のうちの１つをＮ－複素環カルベン（ＮＨＣ）で選択的に官能化する方法を提供する。図１６に示すように、５－カルボキシ－１，３－ジイソプロピル－１Ｈ－ベンゾ［ｄ］イミダゾール－２－カルベンは、溶液中でのその金属錯体の電気化学的還元によって金電極に堆積される５１。ＮＨＣのカルボキシル基は、カルボキシル基が活性化エステルに変換されることによる係留点として使用される。したがって、アミンおよびチオールでそれぞれ官能化された末端を有するＤＮＡナノ構造体は、ＮＨＣ電極と反応するためのそのアミン官能化末端および、裸の金電極と直接反応するためのそのチオール官能化末端によってナノギャップに架橋する。
【0054】
本発明は、ナノ構造体がナノギャップの底部に接触することを防止する方法を提供する。図１７に示すように、単一のストレプトアビジン分子を、ビオチン化ＤＮＡタイルをストレプトアビジンに接続することができるように、ビオチン化４アームリンカーを介してナノギャップに固定し、次いで、上記の方法のうちの１つによって電極に付着させる。また、本発明は、４アームリンカーであって、ストレプトアビジンの固定のために、そのうちの２つのアームがビオチンで官能化されており、他の２つがシラトランで官能化されている、４アームリンカー（図１８、ａ）を提供する。４アームリンカーは、分子力学計算によると四面体の幾何学的配置を有するようである（図１８、ｂ）。２つのビオチン部分は、ストレプトアビジンと相互作用して二価の複合体を形成する。ストレプトアビジン固定のために、シラトラン部分は、最初に酸化ケイ素と反応して４アームリンカーを表面上に固定し、その後にストレプトアビジンが表面に付加される。
【0055】
別の実施形態では、本発明は、ＤＮＡナノ構造体の構築のためにホスホルアミダイト化学を介してＤＮＡに組み込むことができるビオチン化ヌクレオシドを提供する（図１９）。
【0056】
いくつかの実施形態では、本発明は、ＤＮＡポリメラーゼをＤＮＡナノ構造体に付着させる方法を提供する。本発明は、複数の特異的部位でＤＮＡポリメラーゼの標準的なアミノ酸の代わりに非天然型アミノ酸（ＵＡＡ）を用いるために多部位特異的変異誘発法５２および遺伝暗号拡大技術５３の両方を使用する。図２０に示すように、Ｗ２７７（１０）およびＫ４７９（１１）の代わりにｐ－アジドフェニルアラニンを用いたφ２９ＤＮＡポリメラーゼ変異体が発現される。ＵＡＡ ｐ－アジドフェニルアラニンを、クリック反応によるポリメラーゼ固定のための係留部位として使用し、ａａＲＳは、その組み込みが容易になるように既に進化されている５３，５４。φ２９ＤＮＡポリメラーゼ変異体は、Ｎ末端にＭＬＶＰＲＧ（１２）およびＣ末端にＬＰＸＴＧ－Ｈｉｓ６（１３）のペプチド配列を有するようにさらに発現される。このような方法で、酵素のその２つの末端をペプチドで修飾することができる。図２１は、ソルターゼＡを使用して酵素にペプチドを付着させるプロセスを示す５５。プライマー－テンプレートＤＮＡおよび入来ヌクレオチド基質と複合体化したφ２９ＤＮＡポリメラーゼの構造を観察することにより、タンパク質のＣ末端（１４）がＤＮＡに非常に近接していることが認められ（図２２）、それにより、タンパク質中のＤＮＡの任意の移動がＤＮＡナノ構造体にドミノ効果を引き起こし、その結果として電流が変動し得ることが示唆され、これをＤＮＡヌクレオチド組み込み事象のシグネチャとして使用することができる。したがって、ＤＮＡナノ構造体を微調整すれば単一塩基解像度を達成し得る。
【0057】
１つの実施形態では、本発明は、銅触媒の存在下でクリック反応を介してＤＮＡポリメラーゼを付着するためのＤＮＡナノ構造体を構築するためにＤＮＡに組み込むことができるアセチレンを含むヌクレオシドを提供する（図２３）。
【0058】
１つの実施形態では、本発明は、ＤＮＡナノ構造体と相互作用する異なるＤＮＡインターカレーターでタグ付けされた修飾型ヌクレオチド（ｄＮ６Ｐ）を提供する（図２４）。これらの修飾型ヌクレオチドを、ＤＮＡ内にＤＮＡヌクレオチドを組み込むためのＤＮＡポリメラーゼの基質として使用する。第１に、ＤＮＡポリメラーゼは、標的ＤＮＡテンプレートおよびヌクレオシドポリリン酸塩と複合体を形成し、これはインターカレータータグのＤＮＡナノ構造体との相互作用も安定化させる。ヌクレオチドが標的ＤＮＡに組み込まれた場合、ヌクレオチドはインターカレーターでタグ付けされた五リン酸塩を放出する。静電反発力がインターカレーターのＤＮＡとの相互作用を不安定化するので、タグ付けされた五リン酸塩が溶液中に放出される。かかるプロセスは、ＤＮＡナノ構造体のコンダクタンスを変化させるであろう。各ｄＮ６Ｐが異なるインターカレーターを保有するので、異なるヌクレオチドが組み込まれると異なる電流変動が生じると考えられ、この電流変動をＤＮＡに組み込まれたヌクレオチドを同定するために使用することができる。
【0059】
上記開示の実施形態における方法のほとんどは、ＲＮＡ配列決定に適用される。１つの実施形態では、図２５に示すように、再度操作されたモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（Ｍ－ＭＬＶ ＲＴ）を、ＲＮＡ逆転写のためにＤＮＡタイルに固定する。ポリ（ｄＴ）でプライミングしたＲＮＡ標的がデバイスに導入されたとき、ＤＮＡヌクレオチドはポリ（ｄＴ）プライマーに組み込まれる。このプロセスでは、各組み込みによってポリメラーゼのコンフォメーションが変化し、それにより、電流が変動する。組み込みを継続すると一連の電気信号が記録され、解析プログラムを使用してこの記録からＲＮＡ配列を推定する。
総論：
本明細書中に記載の全ての刊行物、特許、および他の文書は、その全体が参考として援用される。
総論：
本明細書中に記載の全ての刊行物、特許、および他の文書は、その全体が参考として援用される。
【0060】
別段の定義がない限り、本明細書中で使用した全ての技術用語および科学用語は、本発明に属する当業者によって一般的に理解されている意味を有する。本発明を種々の実施形態によって説明し、これらの実施形態がかなり詳細に説明されているが、出願人は本出願の範囲を制限することを意図してない。さらなる利点および修正点が当業者に明らかであろう。したがって、本発明は、そのより広い態様において、詳細な情報、代表的なデバイス、装置、および方法、ならびに表示および記載した例に制限されない。したがって、出願人の一般的な発明に関する概念の主旨を逸脱することなく、かかる詳細な情報から逸脱してよい。
参考文献
参考文献
【化1】
【化2】
【化3】
【化4】
【化5】
【化6】
【化7】
【図1-1】
【図1-2】
【図2-1】
【図2-2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【国際調査報告】