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特表2022-525136パーキンソン病を処置するための遺伝子治療組成物および方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-05-11
(54)【発明の名称】パーキンソン病を処置するための遺伝子治療組成物および方法
(51)【国際特許分類】
A61K 48/00 20060101AFI20220428BHJP
A61K 38/44 20060101ALI20220428BHJP
A61K 38/50 20060101ALI20220428BHJP
A61K 38/51 20060101ALI20220428BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20220428BHJP
A61P 25/16 20060101ALI20220428BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20220428BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20220428BHJP
C12N 15/86 20060101ALI20220428BHJP
C12N 15/55 20060101ALI20220428BHJP
C12N 15/11 20060101ALI20220428BHJP
C12N 15/864 20060101ALI20220428BHJP
C12N 15/867 20060101ALI20220428BHJP
C12N 7/01 20060101ALN20220428BHJP
【ＦＩ】
A61K48/00
A61K38/44
A61K38/50
A61K38/51
A61K35/76
A61P25/16
A61P25/28
A61P43/00 105
C12N15/86 Z ZNA
C12N15/55
C12N15/11 Z
C12N15/864 100Z
C12N15/867 Z
C12N7/01
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021555083
(86)(22)【出願日】2020-03-10
(85)【翻訳文提出日】2021-11-08
(86)【国際出願番号】 IB2020052073
(87)【国際公開番号】W WO2020183374
(87)【国際公開日】2020-09-17
(31)【優先権主張番号】62/816,170
(32)【優先日】2019-03-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/871,007
(32)【優先日】2019-07-05
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】521412412
【氏名又は名称】サイオ ジーン セラピーズ インコーポレイテッド
(71)【出願人】
【識別番号】521412423
【氏名又は名称】オックスフォード バイオメディカ （ユーケー） リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】コーコラン， ギャビン
(72)【発明者】
【氏名】ストーン， ミシェル
(72)【発明者】
【氏名】ミトロファヌス， キリアコス
(72)【発明者】
【氏名】スチュワート， ハンナ
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA93Y
4B065AA95X
4B065AA95Y
4B065AA97X
4B065AA97Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA01
4B065BA02
4B065CA27
4B065CA31
4B065CA44
4C084AA02
4C084AA13
4C084BA44
4C084DC22
4C084DC23
4C084DC26
4C084NA05
4C084ZA151
4C084ZA152
4C084ZB211
4C084ZB212
4C087AA01
4C087AA02
4C087BC83
4C087CA12
4C087NA05
4C087ZA15
4C087ZB21
(57)【要約】
神経変性疾患または内因性ドーパミンレベルが対象中において低下する疾患に罹患している前記対象における運動機能を改善し、ジスキネジアを軽減する方法であって、（ｉ）チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）をコードするヌクレオチド配列、（ｉｉ）ＧＴＰ－シクロヒドロラーゼＩ（ＣＨ１）をコードするヌクレオチド配列、（ｉｉｉ）芳香族アミノ酸ドーパデカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）をコードするヌクレオチド配列、またはこれらの任意の組み合わせを含む核酸構築物を含む有効量のウイルスベクターを前記対象に投与することを含む、方法。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
神経変性疾患または内因性ドーパミンレベルが対象中において低下する疾患に罹患している前記対象における運動機能を改善し、ジスキネジアを軽減する方法であって、（ｉ）チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）をコードするヌクレオチド配列、（ｉｉ）ＧＴＰ－シクロヒドロラーゼＩ（ＣＨ１）をコードするヌクレオチド配列、（ｉｉｉ）芳香族アミノ酸ドーパデカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）をコードするヌクレオチド配列、またはこれらの任意の組み合わせを含む核酸構築物を含む有効量のウイルスベクターを前記対象の脳に投与することを含む、方法。
【請求項2】
前記神経変性疾患または内因性ドーパミンレベルが低下する疾患がパーキンソン病である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
パーキンソン病に罹患している対象における運動機能を処置または改善し、ジスキネジアを軽減する方法であって、（ａ）（ｉ）チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）をコードするヌクレオチド配列、（ｉｉ）ＧＴＰ－シクロヒドロラーゼＩ（ＣＨ１）をコードするヌクレオチド配列、（ｉｉｉ）芳香族アミノ酸ドーパデカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）をコードするヌクレオチド配列またはこれらの任意の組み合わせを含む核酸構築物を含むウイルスベクターと、（ｂ）薬学的に許容され得る賦形剤とを含む治療有効量の組成物を前記対象の脳に投与することを含む、方法。
【請求項4】
前記対象がＬ－ドパまたはＬＥＤ治療を受けている、請求項２または３に記載の方法。
【請求項5】
前記対象のＬ－ドパまたはＬＥＤ治療用量が、投与前の前記対象のＬ－ドパまたはＬＥＤ治療用量と比較して、前記核酸構築物の投与後３ヶ月以内に減少する、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記平均Ｌ－ドパまたはＬＥＤ治療用量が、投与後３ヶ月に、ベースラインから少なくとも１０％、少なくとも１２％、少なくとも１４％、少なくとも１５％、少なくとも１６％、少なくとも１７％、少なくとも１８％または少なくとも１９％減少する、請求項４～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記ウイルスベクターが、１×１０６ＴＵ／対象～５×１０８ＴＵ／対象の目標用量で投与される、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記目標用量が、約４×１０６ＴＵ／対象～８×１０６ＴＵ／対象、８×１０６ＴＵ／対象～４×１０７ＴＵ／対象または１×１０７ＴＵ／対象～５×１０８ＴＵ／対象である、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
投与が１回投与である、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記投与が注入による被殻への投与である、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
（ｉ）チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）をコードするヌクレオチド配列と、（ｉｉ）ＧＴＰ－シクロヒドロラーゼＩ（ＣＨ１）をコードするヌクレオチド配列と、（ｉｉｉ）芳香族アミノ酸ドーパデカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）をコードするヌクレオチド配列とを含み、ＴＨをコードする前記ヌクレオチド配列は、ＴＨをコードする前記ヌクレオチド配列とＣＨ１をコードする前記ヌクレオチド配列が融合タンパク質ＴＨ－ＣＨ１をコードするように、ＣＨ１をコードする前記ヌクレオチド配列に連結されている、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
前記核酸構築物が、ＴＨ－Ｌ－ＣＨ１－ＩＲＥＳ－ＡＡＤＣ；
ＡＡＤＣ－Ｌ－ＴＨ－Ｌ－ＣＨ１；
ＴＨ－Ｌ－ＣＨ１－Ｌ－ＡＡＤＣ；
またはＴＨ－Ｌ－ＣＨ１－Ｌ－ＡＡＤＣ；
を含み、
ここで、Ｌはリンカーコード配列であり、ＩＲＥＳは内部リボソーム進入部位であり、Ｐはプロモーターである、
請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
前記核酸構築物がＴＨ－Ｌ－ＣＨ１－ＩＲＥＳ－ＡＡＤＣを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記核酸構築物が、（ｉ）チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）をコードするヌクレオチド配列と、（ｉｉ）ＧＴＰ－シクロヒドロラーゼＩ（ＣＨ１）をコードするヌクレオチド配列と、（ｉｉｉ）芳香族アミノ酸ドーパデカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）をコードするヌクレオチド配列とを含み、ＴＨをコードする前記ヌクレオチド配列は、ＴＨをコードする前記ヌクレオチド配列とＣＨ１をコードする前記ヌクレオチド配列が融合タンパク質ＴＨ－ＣＨ１をコードするように、ＣＨ１をコードする前記ヌクレオチド配列に連結されており、前記構築物は、ＴＨ－Ｌ－ＣＨ１－ＩＲＥＳＡＡＤＣまたはＴＨ－Ｌ－ＣＨ１－Ｐ－ＡＡＤＣを含み、ここで、Ｌはリンカーコード配列であり、ＩＲＥＳは内部リボソーム進入部位であり、Ｐはプロモーターである、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
前記リンカー（Ｌ）がコドン最適化されていない、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
前記リンカー（Ｌ）が、配列番号１または配列番号３として示される配列を含む、請求項１２～１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
前記核酸構築物が、構成的プロモーター、組織特異的プロモーターまたはこれらの組み合わせから選択されるプロモーター（Ｐ）をさらに含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
前記プロモーターが、ＣＭＶプロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーターまたはチミジンキナーゼプロモーターである、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
前記ウイルスベクターが、レンチウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルスベクターである、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項20】
前記ウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
前記ウイルスベクターがウイルス粒子である、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項22】
前記ウイルス粒子がＥＩＡＶベクター粒子であり、ＶＳＶ－Ｇで偽型化されている、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
前記ウイルスベクターが、薬学的に許容され得る賦形剤および／または希釈剤を含む医薬組成物として製剤化される、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項24】
前記対象における運動機能が、ベースラインと比較して、投与３ヶ月後のＵＰＤＲＳ－ＩＩＩ（運動）ＯＦＦスコアの少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％または少なくとも４０％の増加によって示されるように改善される、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項25】
以下：（ａ）ベースラインと比較して、投与３ヶ月後に、日常生活に支障となるジスキネジアを伴うハウザー日記ＯＮ時間の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％または少なくとも８５％の減少；（ｂ）ベースラインと比較して、投与３ヶ月後に、ＵＰＤＲＳ－ＩＶスコアの少なくとも５０％の減少、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％または少なくとも７４％の減少、および（ｃ）ベースラインと比較して、投与３ヶ月後に、ラッシュジスキネジアスコアの少なくとも１０％、少なくとも１２％、少なくとも１５％、少なくとも１８％の改善、の１またはそれより多くによって示されるように、ジスキネジアが前記対象において減少する、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項26】
振戦、運動緩徐、筋肉硬直、姿勢および／もしくは平衡障害、自動運動の喪失、発話困難、微細運動技能の困難またはこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される前記対象における１またはそれより多くの症状をさらに改善する、請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項27】
投与後３ヶ月以内に、投与前における前記対象のベースラインと比較して、前記対象が、改善された運動機能、減少したジスキネジアおよび減少したＬ－ドパまたはＬＥＤ治療用量を投与後に有する、請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年３月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／８１６，１７０号および２０１９年７月５日に出願された米国仮特許出願第６２／８７１，００７号の恩典を主張し、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１９年３月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／８１６，１７０号および２０１９年７月５日に出願された米国仮特許出願第６２／８７１，００７号の恩典を主張し、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0002】
ＥＦＳ－ＷＥＢを介して電子的に提出された配列表の参照
本出願ととともに提出された電子的に提出される配列表（名称：４２２６＿０３８ＰＣ０２＿ｓｅｑＬｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、サイズ：４，０４４バイト；作成日：２０２０年３月１０日）の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願ととともに提出された電子的に提出される配列表（名称：４２２６＿０３８ＰＣ０２＿ｓｅｑＬｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、サイズ：４，０４４バイト；作成日：２０２０年３月１０日）の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0003】
分野
本開示は、パーキンソン病の処置のためにウイルスベクター粒子を使用して送達されるドーパミン合成経路に関与する酵素活性をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子治療組成物に関する。
本開示は、パーキンソン病の処置のためにウイルスベクター粒子を使用して送達されるドーパミン合成経路に関与する酵素活性をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子治療組成物に関する。
【背景技術】
【0004】
背景
パーキンソン病（ＰＤ）は、黒質におけるドーパミン作動性神経細胞の喪失を特徴とする中枢神経系（ＣＮＳ）の神経変性障害である。これは最終的に、線条体におけるドーパミン枯渇をもたらし、重度の運動障害を引き起こす。ほとんどの患者のＰＤの原因は不明であり、これは「孤発性」または「特発性」ＰＤと呼ばれる。世界中で６３０万人がＰＤを有すると推定されており、ほとんどの人が６０歳後に症状を発症するが、１０人に約１人は５０歳前に診断される（欧州パーキンソン病協会のウェブサイト：ｗｗｗ．ｅｐｄａ．ｅｕ．ｃｏｍ／ｅｎ／ｐｄ－ｉｎｆｏ／で入手可能）。女性よりもわずかに多くの男性が罹患する。
パーキンソン病（ＰＤ）は、黒質におけるドーパミン作動性神経細胞の喪失を特徴とする中枢神経系（ＣＮＳ）の神経変性障害である。これは最終的に、線条体におけるドーパミン枯渇をもたらし、重度の運動障害を引き起こす。ほとんどの患者のＰＤの原因は不明であり、これは「孤発性」または「特発性」ＰＤと呼ばれる。世界中で６３０万人がＰＤを有すると推定されており、ほとんどの人が６０歳後に症状を発症するが、１０人に約１人は５０歳前に診断される（欧州パーキンソン病協会のウェブサイト：ｗｗｗ．ｅｐｄａ．ｅｕ．ｃｏｍ／ｅｎ／ｐｄ－ｉｎｆｏ／で入手可能）。女性よりもわずかに多くの男性が罹患する。
【0005】
ＰＤの疾患進行を停止させるための根治的処置も治療も存在しない。現在の処置選択肢には、薬理学的アプローチおよび外科的アプローチが含まれる。疾患の初期段階は、末梢におけるＬ－ドパまたはドーパミンの分解を停止させることを目的とするＬ－ドパ（ドーパミンの前駆体）治療、ドーパミンアゴニストおよび酵素阻害剤などの経口ドーパミン系処置によって効果的に管理することができる。約５年の経口ドーパミン系処置後に、とりわけ長期間の間欠的使用後に、患者の５０％が、ジスキネジアなどの運動障害を発症する。例えば、疾患が進行するにつれて、Ｌ－ドパ治療は運動障害の処置において効果がより低くなり、重度の副作用を有するより高い用量を使用することが必要になる。
【0006】
ＰＤの中期から後期に経口薬が効かなくなり始めると、標準的なケアは存在しない。この段階では、脳深部刺激（ＤＢＳ）、Ｄｕｏｄｏｐａ（登録商標）（レボドパ／カルビドパの併用）およびアポモルヒネ（ドーパミンアゴニスト）ポンプを含む、運動機能を制御するための、および運動性低下発症を軽減するためのより侵襲的な外科療法が導入される。
【発明の概要】
【0007】
発明の態様の概要
本開示の特定の態様は、神経変性疾患または内因性ドーパミンレベルが対象中において低下する疾患に罹患している対象における運動機能を改善し、ジスキネジアを軽減する方法であって、（ｉ）チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）をコードするヌクレオチド配列、（ｉｉ）ＧＴＰ－シクロヒドロラーゼＩ（ＣＨ１）をコードするヌクレオチド配列、（ｉｉｉ）芳香族アミノ酸ドーパデカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）をコードするヌクレオチド配列、またはこれらの任意の組み合わせを含む核酸構築物を含む有効量のウイルスベクターを対象に投与することを含む、方法に関する。いくつかの実施形態において、神経変性疾患または内因性ドーパミンレベルが低下する疾患がパーキンソン病である。
本開示の特定の態様は、神経変性疾患または内因性ドーパミンレベルが対象中において低下する疾患に罹患している対象における運動機能を改善し、ジスキネジアを軽減する方法であって、（ｉ）チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）をコードするヌクレオチド配列、（ｉｉ）ＧＴＰ－シクロヒドロラーゼＩ（ＣＨ１）をコードするヌクレオチド配列、（ｉｉｉ）芳香族アミノ酸ドーパデカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）をコードするヌクレオチド配列、またはこれらの任意の組み合わせを含む核酸構築物を含む有効量のウイルスベクターを対象に投与することを含む、方法に関する。いくつかの実施形態において、神経変性疾患または内因性ドーパミンレベルが低下する疾患がパーキンソン病である。
【0008】
本開示のいくつかの態様は、パーキンソン病に罹患している対象における運動機能を処置または改善し、ジスキネジアを軽減する方法であって、（ａ）（ｉ）チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）をコードするヌクレオチド配列、（ｉｉ）ＧＴＰ－シクロヒドロラーゼＩ（ＣＨ１）をコードするヌクレオチド配列、（ｉｉｉ）芳香族アミノ酸ドーパデカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）をコードするヌクレオチド配列またはこれらの任意の組み合わせを含む核酸構築物を含むウイルスベクターと、（ｂ）薬学的に許容され得る賦形剤とを含む治療有効量の組成物を対象に投与することを含む、方法に関する。
【0009】
いくつかの実施形態において、対象は、Ｌ－ドパまたはレボドパ換算用量（ＬＥＤ）治療を受けている。いくつかの実施形態において、対象の一日Ｌ－ドパまたはＬＥＤ治療用量は、投与前の対象のＬ－ドパまたはＬＥＤ治療用量と比較して、核酸構築物の投与後３ヶ月以内に減少する。いくつかの実施形態において、平均一日Ｌ－ドパまたはＬＥＤ治療用量は、投与後３ヶ月に、ベースラインから少なくとも１０％、少なくとも１２％、少なくとも１４％、少なくとも１５％、少なくとも１６％、少なくとも１７％、少なくとも１８％、少なくとも１９％または少なくとも２０％減少する。
【0010】
いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、１×１０６ＴＵ／対象～５×１０８ＴＵ／対象の目標用量で投与される。いくつかの実施形態において、目標用量は、約４×１０６ＴＵ／対象～８×１０６ＴＵ／対象、８×１０６ＴＵ／対象～４×１０７ＴＵ／対象または１×１０７ＴＵ／対象～５×１０８ＴＵ／対象である。
【0011】
いくつかの実施形態において、投与は１回投与である。いくつかの実施形態において、投与は脳に対する投与である。いくつかの実施形態において、投与は注入による被殻への投与である。
【0012】
いくつかの実施形態において、核酸構築物は、（ｉ）チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）をコードするヌクレオチド配列と、（ｉｉ）ＧＴＰ－シクロヒドロラーゼＩ（ＣＨ１）をコードするヌクレオチド配列と、（ｉｉｉ）芳香族アミノ酸ドーパデカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）をコードするヌクレオチド配列とを含み、ＴＨをコードするヌクレオチド配列は、ＴＨをコードするヌクレオチド配列とＣＨ１をコードするヌクレオチド配列が融合タンパク質ＴＨ－ＣＨ１をコードするように、ＣＨ１をコードするヌクレオチド配列に連結されている。
【0013】
いくつかの実施形態において、核酸構築物は、
ＴＨ－Ｌ－ＣＨ１－ＩＲＥＳ－ＡＡＤＣ；
ＡＡＤＣ－Ｌ－ＴＨ－Ｌ－ＣＨ１；
ＴＨ－Ｌ－ＣＨ１－Ｌ－ＡＡＤＣ；
またはＴＨ－Ｌ－ＣＨ１－Ｌ－ＡＡＤＣ；
を含み、
ここで、Ｌはリンカーコード配列であり、ＩＲＥＳは内部リボソーム進入部位であり、Ｐはプロモーターである。
ＴＨ－Ｌ－ＣＨ１－ＩＲＥＳ－ＡＡＤＣ；
ＡＡＤＣ－Ｌ－ＴＨ－Ｌ－ＣＨ１；
ＴＨ－Ｌ－ＣＨ１－Ｌ－ＡＡＤＣ；
またはＴＨ－Ｌ－ＣＨ１－Ｌ－ＡＡＤＣ；
を含み、
ここで、Ｌはリンカーコード配列であり、ＩＲＥＳは内部リボソーム進入部位であり、Ｐはプロモーターである。
【0014】
いくつかの実施形態において、核酸構築物はＴＨ－Ｌ－ＣＨ１－ＩＲＥＳ－ＡＡＤＣを含む。
【0015】
いくつかの実施形態において、核酸構築物は、（ｉ）チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）をコードするヌクレオチド配列と、（ｉｉ）ＧＴＰ－シクロヒドロラーゼＩ（ＣＨ１）をコードするヌクレオチド配列と、（ｉｉｉ）芳香族アミノ酸ドーパデカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）をコードするヌクレオチド配列とを含み、ＴＨをコードするヌクレオチド配列は、ＴＨをコードするヌクレオチド配列とＣＨ１をコードするヌクレオチド配列が融合タンパク質ＴＨ－ＣＨ１をコードするように、ＣＨ１をコードするヌクレオチド配列に連結されており、構築物は、ＴＨ－Ｌ－ＣＨ１－ＩＲＥＳ－ＡＡＤＣまたはＴＨ－Ｌ－ＣＨ１－Ｐ－ＡＡＤＣを含み、ここで、Ｌはリンカーコード配列であり、ＩＲＥＳは内部リボソーム進入部位であり、Ｐはプロモーターである。
【0016】
いくつかの実施形態において、リンカー（Ｌ）は、配列番号１または配列番号３として示される配列を含む。いくつかの実施形態において、核酸構築物は、構成的プロモーター、組織特異的プロモーターまたはこれらの組み合わせから選択されるプロモーター（Ｐ）をさらに含む。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ＣＭＶプロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーターまたはチミジンキナーゼプロモーターである。
【0017】
いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターはウイルス粒子である。いくつかの実施形態において、ウイルス粒子はＥＩＡＶベクター粒子であり、ＶＳＶ－Ｇで偽型化されている。
【0018】
いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、薬学的に許容され得る賦形剤および／または希釈剤を含む医薬組成物として製剤化される。
【0019】
いくつかの実施形態において、対象における運動機能は、ベースラインと比較して、投与３ヶ月後のＵＰＤＲＳ－ＩＩＩ（運動）ＯＦＦスコアの少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％または少なくとも５０％の増加によって示されるように改善される。
【0020】
いくつかの実施形態において、対象におけるジスキネジアは、（ａ）ベースラインと比較して、投与３ヶ月後に、日常生活に支障となるジスキネジアを伴うハウザー日記ＯＮ時間の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％または少なくとも９０％の減少；（ｂ）ベースラインと比較して、投与３ヶ月後に、ＵＰＤＲＳ－ＩＶスコアの少なくとも５０％の減少、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７４％または少なくとも７５％の減少、および（ｃ）ベースラインと比較して、投与３ヶ月後に、ラッシュジスキネジアスコアの少なくとも１０％、少なくとも１２％、少なくとも１５％、少なくとも１８％、少なくとも２０％または少なくとも２５％の改善、の１またはそれより多くによって示されるように減少する。
【0021】
いくつかの実施形態において、方法は、振戦、運動緩徐、筋肉硬直、姿勢および／もしくは平衡障害、自動運動の喪失、発話困難、微細運動技能の困難またはこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される対象における１またはそれより多くの症状をさらに改善する。
【0022】
いくつかの実施形態において、投与後３ヶ月以内に、投与前における対象のベースラインと比較して、対象は、改善された運動機能、減少したジスキネジアおよび減少したＬ－ドパまたはＬＥＤ治療用量を投与後に有する。
【図面の簡単な説明】
【0023】
【0024】
【0025】
【0026】
【図4A-4B】４Ａ～４Ｂは、（Ａ）パートＡ：用量漸増および（Ｂ）パートＢ：模倣手術手順と比較した拡大コホートを含む第２相臨床試験デザインを示す。
【0027】
【0028】
【0029】
【0030】
【0031】
【図9A】９Ａ～９Ｄ。図９Ａは、Ｌｅｎｔｉ－ＰＤの低用量コホートならびに以前の臨床試験からのＰｒｏＳａｖｉｎ（登録商標）の低、中および高用量コホートおよびシャム対照についての、３ヶ月目および６ヶ月目でのＵＰＤＲＳパートＩＩＩ ＯＦＦスコアのベースラインからの変化を示す。図９Ｂおよび９Ｃは、Ｌｅｎｔｉ－ＰＤの低用量コホートおよびＰｒｏＳａｖｉｎ（登録商標）のすべてのコホートについての、３ヶ月目および６ヶ月目での、下位尺度（Ｂ）日常生活動作および（Ｃ）治療の合併症にわたるベースラインからのＵＰＤＲＳ ＯＦＦ変化を示す。図９Ｄは、ＰｒｏＳａｖｉｎ（登録商標）と比較したＰＤＱ－３９サマリーインデックスの結果を示す。ＰＤＱ－３９は、パーキンソン病に特異的な健康関連の質を評価する質問票である。患者は、６ヶ月の時点で、ＵＰＤＲＳ ＩＩ日常生活動作「ＯＦＦ」スコアでベースラインから１９．５ポイント、ＵＰＤＲＳ ＩＶ治療の合併症「ＯＦＦ」スコアでベースラインから３ポイント、およびＰＤＱ－３９サマリーインデックススコアでベースラインから３２．１ポイントの平均改善を経験した。
【図9B-9C】９Ａ～９Ｄ。図９Ａは、Ｌｅｎｔｉ－ＰＤの低用量コホートならびに以前の臨床試験からのＰｒｏＳａｖｉｎ（登録商標）の低、中および高用量コホートおよびシャム対照についての、３ヶ月目および６ヶ月目でのＵＰＤＲＳパートＩＩＩ ＯＦＦスコアのベースラインからの変化を示す。図９Ｂおよび９Ｃは、Ｌｅｎｔｉ－ＰＤの低用量コホートおよびＰｒｏＳａｖｉｎ（登録商標）のすべてのコホートについての、３ヶ月目および６ヶ月目での、下位尺度（Ｂ）日常生活動作および（Ｃ）治療の合併症にわたるベースラインからのＵＰＤＲＳ ＯＦＦ変化を示す。図９Ｄは、ＰｒｏＳａｖｉｎ（登録商標）と比較したＰＤＱ－３９サマリーインデックスの結果を示す。ＰＤＱ－３９は、パーキンソン病に特異的な健康関連の質を評価する質問票である。患者は、６ヶ月の時点で、ＵＰＤＲＳ ＩＩ日常生活動作「ＯＦＦ」スコアでベースラインから１９．５ポイント、ＵＰＤＲＳ ＩＶ治療の合併症「ＯＦＦ」スコアでベースラインから３ポイント、およびＰＤＱ－３９サマリーインデックススコアでベースラインから３２．１ポイントの平均改善を経験した。
【図9D】９Ａ～９Ｄ。図９Ａは、Ｌｅｎｔｉ－ＰＤの低用量コホートならびに以前の臨床試験からのＰｒｏＳａｖｉｎ（登録商標）の低、中および高用量コホートおよびシャム対照についての、３ヶ月目および６ヶ月目でのＵＰＤＲＳパートＩＩＩ ＯＦＦスコアのベースラインからの変化を示す。図９Ｂおよび９Ｃは、Ｌｅｎｔｉ－ＰＤの低用量コホートおよびＰｒｏＳａｖｉｎ（登録商標）のすべてのコホートについての、３ヶ月目および６ヶ月目での、下位尺度（Ｂ）日常生活動作および（Ｃ）治療の合併症にわたるベースラインからのＵＰＤＲＳ ＯＦＦ変化を示す。図９Ｄは、ＰｒｏＳａｖｉｎ（登録商標）と比較したＰＤＱ－３９サマリーインデックスの結果を示す。ＰＤＱ－３９は、パーキンソン病に特異的な健康関連の質を評価する質問票である。患者は、６ヶ月の時点で、ＵＰＤＲＳ ＩＩ日常生活動作「ＯＦＦ」スコアでベースラインから１９．５ポイント、ＵＰＤＲＳ ＩＶ治療の合併症「ＯＦＦ」スコアでベースラインから３ポイント、およびＰＤＱ－３９サマリーインデックススコアでベースラインから３２．１ポイントの平均改善を経験した。
【0032】
【発明を実施するための形態】
【0033】
詳細な説明
定義
以下の定義および方法は、本発明をより明確に定義し、本発明の実施において当業者に指針を与えるために提供される。本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」または「ａｎ」または「ｔｈｅ」は、文脈が明確に反対の意味を指示しなければ、複数表記を含むことに留意しなければならない。したがって、例えば、「酵素（ａｎ ｅｎｚｙｍｅ）」という表記は、複数の酵素を含む。
定義
以下の定義および方法は、本発明をより明確に定義し、本発明の実施において当業者に指針を与えるために提供される。本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」または「ａｎ」または「ｔｈｅ」は、文脈が明確に反対の意味を指示しなければ、複数表記を含むことに留意しなければならない。したがって、例えば、「酵素（ａｎ ｅｎｚｙｍｅ）」という表記は、複数の酵素を含む。
【0034】
本明細書で使用される場合、いくつかの実施形態において、「ベクター」という用語は、核酸（例えば、ＤＮＡ）セグメントをある細胞から別の細胞に移す核酸分子に関して使用される。「媒体」または「送達ベクター」という用語は、「ベクター」と互換的に使用されることがある。任意の形態の媒体またはベクターがこの定義の中に包含されることが意図される。例えば、ベクター（例えば、ウイルスベクター）には、ウイルス粒子、プラスミド、トランスポゾンなどが含まれるが、これらに限定されない。
【0035】
第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的関係で配置されている場合、第１の核酸配列は第２の核酸配列と「機能的に連結」されている。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼせば、プロモーターはコード配列に機能的に連結されている。一般に、機能的に連結されたＤＮＡ配列は連続しており、２つのタンパク質コード領域を連結する必要がある場合には、同じ読み枠内にある。
【0036】
「変異体」という用語は、野生型配列からの１またはそれを超えるアミノ酸の変動を含む酵素を含む。例えば、変異体は、１またはそれを超えるアミノ酸の付加、欠失または置換を含むことができる。いくつかの実施形態において、変異体は、人工的に（例えば、部位特異的変異誘発によって）作製され得る。
【0037】
本明細書において、「相同体」という用語は、ドーパミン合成酵素と一定の相同性を有するタンパク質を意味する。本明細書において、「相同性」という用語は、「同一性」と同義であり得る。
【0038】
「対象」という用語は、「患者」と互換的に使用することができる。本開示の対象には、ヒトおよび動物（例えば、ブタ、ウシ、イヌ、ウマ、ロバ、マウス、ハムスター、サル）対象が含まれるが、これらに限定されない。
【0039】
核酸構築物
本開示のある特定の態様は、それぞれが酵素をコードする１つ、２つまたは３つの関心対象のヌクレオチド配列（ＮＯＩ）を含むヌクレオチド配列を含む核酸構築物に関する。核酸構築物は、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列、例えば合成ＲＮＡ／ＤＮＡ配列、組換えＲＮＡ／ＤＮＡ配列（すなわち、組換えＤＮＡ技術の使用によって調製される）、ｃＤＮＡ配列、部分ゲノムＤＮＡ配列などであり得、これらの組み合わせを含む。本開示は、本開示の核酸構築物を含むベクター、例えばプラスミドも包含する。
本開示のある特定の態様は、それぞれが酵素をコードする１つ、２つまたは３つの関心対象のヌクレオチド配列（ＮＯＩ）を含むヌクレオチド配列を含む核酸構築物に関する。核酸構築物は、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列、例えば合成ＲＮＡ／ＤＮＡ配列、組換えＲＮＡ／ＤＮＡ配列（すなわち、組換えＤＮＡ技術の使用によって調製される）、ｃＤＮＡ配列、部分ゲノムＤＮＡ配列などであり得、これらの組み合わせを含む。本開示は、本開示の核酸構築物を含むベクター、例えばプラスミドも包含する。
【0040】
いくつかの実施形態において、核酸構築物中のＮＯＩは、ドーパミン合成に関与する酵素をコードする。チロシンをレボドパ（Ｌ－ドパ）に変換する酵素チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）およびシクロヒドロラーゼ１（ＣＨ１）、ならびにＬ－ドパをドーパミンに変換する芳香族Ｌ－アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）を含む内因性ドーパミン合成を示す模式図が図１に示されている。いくつかの実施形態において、ＮＯＩは、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、ＧＴＰ－シクロヒドロラーゼＩ（ＣＨ１）、芳香族アミノ酸ドーパデカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）またはこれらの機能的断片をコードする。いくつかの実施形態において、核酸構築物は、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、ＧＴＰ－シクロヒドロラーゼＩ（ＣＨ１）、芳香族アミノ酸ドーパデカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）、またはこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される酵素をコードする核酸を含む。それぞれ受託番号がＸ０５２９０、Ｕ１９５２３およびＭ７６１８０である３つの完全長酵素すべての配列が利用可能である。
【0041】
いくつかの実施形態において、ＮＯＩは、ドーパミン合成酵素の全部または一部をコードすることができる。例えば、ＮＯＩは、酵素活性を保持するタンパク質の切断されたバージョン（truncated version）をコードすることができる。完全長ＴＨは、触媒ドメイン、四量体化ドメインおよびＮ末端調節ドメインを含む。いくつかの実施形態において、本開示の構築物のＴＨをコードするＮＯＩは、触媒ドメインおよび四量体化ドメインを含有するが、機能的なＮ末端調節ドメインを欠く切断されたＴＨをコードする。いくつかの実施形態において、切断されたＴＨは、完全長酵素の活性を制限し得るドーパミンによるフィードバック阻害を回避する。
【0042】
いくつかの実施形態において、ＮＯＩは、ドーパミン合成酵素の変異体、相同体またはバリアントをコードすることができる。
【0043】
いくつかの実施形態において、相同配列は、アミノ酸またはヌクレオチドレベルで、野生型または参照配列と少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であり得る。いくつかの実施形態において、相同体は、野生型または参照配列と同じ活性部位などを含み、またはコードする。同一性比較は、例えば、ＢＬＡＳＴソフトウェアを使用して実施され得る。
【0044】
いくつかの実施形態において、ＮＯＩの１またはそれより多くは、コドン最適化されている。いくつかの実施形態において、ＮＯＩの１またはそれより多くは、コドン最適化されていない。
リンカー
リンカー
【0045】
本開示のある特定の態様は、例えば本開示のレンチウイルスベクターゲノムを含むウイルスベクターであって、ドーパミン合成酵素をコードする３つのＮＯＩを含む本開示の核酸構築物を含む、ウイルスベクターに関する。いくつかの実施形態において、ゲノムが酵素アミノ酸配列を含む融合タンパク質をコードするように、ＮＯＩの少なくとも２つはリンカーコード配列（Ｌ）によって連結されている。
【0046】
いくつかの実施形態において、適切なリンカーは、グリシン－セリンリピートなどのアミノ酸リピートを含み得る。リンカーの目的は、酵素の正しい形成および／または機能を可能にすることである。リンカーは、その目的を達成するために十分に柔軟であり、十分に長くなければならない。ＮＯＩは異なる酵素をコードすることができるので、リンカーは両方の酵素の機能を可能にする。柔軟なリンカーのコード配列は、それが翻訳休止を促進し、したがってＮＯＩのタンパク質産物の独立した折り畳みを促進するように選択され得る。
【0047】
いくつかの実施形態において、適切なリンカーには、下記に開示されるリンカーが含まれるが、本開示は、これらの特定のリンカーに限定されない。
１．Ｓｏｍｉａら、１９９３ ＰＮＡＳ ９０，７８８９に記載されている（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）３（配列番号２）。
２．（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）５（配列番号４）。
３．酵母のＨＳＦ－１由来の（Ａｓｎ－Ｐｈｅ－Ｉｌｅ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－Ｇｌｕ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ－Ｉｌｅ－Ｉｌｅ－Ａｒｇ－Ｇｌｎ－Ｌｙｓ－Ｇｌ－ｙ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ａｓｎ）（配列番号５）、Ｗｉｅｄｅｒｒｅｃｈｔら、１９８８ Ｃｅｌｌ ５４，８４１を参照。
４．ＰＯＵ特異的なＯＣＴ－１由来の（Ａｓｎ－Ｌｅｕ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｌｅｕ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ａｓｎ－Ｓｅｒ－Ｐｒｏ－Ｇｌ－ｙ－Ｉｌｅ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｌｅｕ－Ｓｅｒ）（配列番号６）、Ｄｅｋｋｅｒら、１９９３ Ｎａｔｕｒｅ ３６２，８５２およびＳｔｕｒｍら、１９８８ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖ．２，１５８２を参照。
５．ＲＧＤ含有ラミニンペプチド由来の（Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｔｈｒ－Ｐｈｅ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ａｓｎ－Ｐｒｏ－ＧｌｎＧｌｙ）（配列番号７）、Ａｕｍａｉｌｌｙら、１９９０ ＦＥＥＳ Ｌｅｔｔ．２６２，８２参照。
６．ＬＤＶ含有リンカー由来の（Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｉｌｅ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｔｈｒ－Ｇｌｙ－ＧｌｙＳｅｒ－Ｓｅｒ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）（配列番号８）、Ｗｉｃｋｈａｍら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １９９５ ２，７５０を参照。
１．Ｓｏｍｉａら、１９９３ ＰＮＡＳ ９０，７８８９に記載されている（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）３（配列番号２）。
２．（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）５（配列番号４）。
３．酵母のＨＳＦ－１由来の（Ａｓｎ－Ｐｈｅ－Ｉｌｅ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－Ｇｌｕ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ－Ｉｌｅ－Ｉｌｅ－Ａｒｇ－Ｇｌｎ－Ｌｙｓ－Ｇｌ－ｙ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ａｓｎ）（配列番号５）、Ｗｉｅｄｅｒｒｅｃｈｔら、１９８８ Ｃｅｌｌ ５４，８４１を参照。
４．ＰＯＵ特異的なＯＣＴ－１由来の（Ａｓｎ－Ｌｅｕ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｌｅｕ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ａｓｎ－Ｓｅｒ－Ｐｒｏ－Ｇｌ－ｙ－Ｉｌｅ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｌｅｕ－Ｓｅｒ）（配列番号６）、Ｄｅｋｋｅｒら、１９９３ Ｎａｔｕｒｅ ３６２，８５２およびＳｔｕｒｍら、１９８８ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖ．２，１５８２を参照。
５．ＲＧＤ含有ラミニンペプチド由来の（Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｔｈｒ－Ｐｈｅ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ａｓｎ－Ｐｒｏ－ＧｌｎＧｌｙ）（配列番号７）、Ａｕｍａｉｌｌｙら、１９９０ ＦＥＥＳ Ｌｅｔｔ．２６２，８２参照。
６．ＬＤＶ含有リンカー由来の（Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｉｌｅ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｔｈｒ－Ｇｌｙ－ＧｌｙＳｅｒ－Ｓｅｒ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）（配列番号８）、Ｗｉｃｋｈａｍら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １９９５ ２，７５０を参照。
【0048】
いくつかの実施形態において、以下のＧＳ１５柔軟なリンカーを使用することができる。（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）３。（配列番号２）。ＧＳ５、ＧＳ１５およびＧＳ３０リンカーも適切であり得る。
【0049】
いくつかの実施形態において、核酸構築物は２つのリンカーを含む、例えば、１つの融合タンパク質として発現されるために３つすべての酵素が連結され、２つの同一でないリンカーコード配列を選択することができ、あるいはリンカー配列は同一であり得る。リンカー配列は、アミノ酸レベルで同一であり得るが、それらのコード核酸配列は、遺伝暗号の縮重のために異なり得る。
【0050】
いくつかの実施形態において、ＴＨ遺伝子とＣＨ１遺伝子間の改変ＧＳ１５リンカーコード配列（ＧＳ１５ｍｏｄ）が使用される。いくつかの実施形態において、本開示のヌクレオチド配列において使用されるリンカーコード配列は、ヒト使用のためにコドン最適化されていない、ＧＳ５、ＧＳ１５およびＧＳ３０をコードするものなどのリンカーコード配列の改変された形態であり得る。
【0051】
いくつかの実施形態において、リンカーコード配列は、以下の配列を含むことができる：ＧＧＡＧＧＴＧＧＣＧＧＧＴＣＣＧＧＧＧＧＣＧＧＧＧＧＴＡＧＣＧＧＴＧＧＣＧＧＧＧＧＣＴＣＣ（配列番号１）。
【0052】
いくつかの実施形態において、ヌクレオチド配列は、配列番号２として示されるアミノ酸配列を有するリンカーをコードすることができ、ヌクレオチド配列は、配列番号３に示される配列に対する配列を含むことができる。（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）３（配列番号２）；ＧＧＧＧＧＡＧＧＣＧＴＡＧＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＧＧＣＴＣＣＧＧＣＧＧＡＧＧＣＧＧＧＡＧＣ（配列番号３）。
【0053】
いくつかの実施形態において、構築物は、配列番号１として示されている配列を含むことができる。
【0054】
ＩＲＥＳ
ｍＲＮＡ中のオープンリーディングフレームの間に配置されている場合、ＩＲＥＳは、ＩＲＥＳエレメントでのリボソームの進入を促進し、続いて下流の翻訳の開始を促進することによって、下流のオープンリーディングフレームの翻訳を可能にする。レトロウイルスベクターにおけるＩＲＥＳエレメントの使用が研究されている（例えば、国際公開第９３／０３１４号を参照）。レンチウイルスベクターにおいて使用するための適切なＩＲＥＳ配列は、国際公開第０２／２９０６５号に記載されている。いくつかの実施形態において、本開示の核酸構築物はＩＲＥＳを含む。いくつかの実施形態において、核酸構築物は、ＴＨ－Ｌ－ＣＨ１－ＩＲＥＳ－ＡＡＤＣを含む。
ｍＲＮＡ中のオープンリーディングフレームの間に配置されている場合、ＩＲＥＳは、ＩＲＥＳエレメントでのリボソームの進入を促進し、続いて下流の翻訳の開始を促進することによって、下流のオープンリーディングフレームの翻訳を可能にする。レトロウイルスベクターにおけるＩＲＥＳエレメントの使用が研究されている（例えば、国際公開第９３／０３１４号を参照）。レンチウイルスベクターにおいて使用するための適切なＩＲＥＳ配列は、国際公開第０２／２９０６５号に記載されている。いくつかの実施形態において、本開示の核酸構築物はＩＲＥＳを含む。いくつかの実施形態において、核酸構築物は、ＴＨ－Ｌ－ＣＨ１－ＩＲＥＳ－ＡＡＤＣを含む。
【0055】
プロモーター
いくつかの実施形態において、ＩＲＥＳは、例えばＡＡＤＣ遺伝子の発現を制御するために、プロモーターによって置き換えることができる。ＡＡＤＣ発現がＩＲＥＳの制御下にある構成（configuration）においては、ＡＡＤＣレベルがドーパミン産生を制限し得る。
いくつかの実施形態において、ＩＲＥＳは、例えばＡＡＤＣ遺伝子の発現を制御するために、プロモーターによって置き換えることができる。ＡＡＤＣ発現がＩＲＥＳの制御下にある構成（configuration）においては、ＡＡＤＣレベルがドーパミン産生を制限し得る。
【0056】
ＮＯＩの発現は、制御配列、例えばプロモーター／エンハンサーおよびその他の発現調節シグナルを使用して制御することができる。原核生物プロモーターおよび真核細胞中で機能的なプロモーターを使用することができる。組織特異的または刺激特異的プロモーターを使用することができる。２またはそれを超える異なるプロモーター由来の配列エレメントを含むキメラプロモーターを使用することもできる。
【0057】
いくつかの実施形態において、適切な促進配列は、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、レトロウイルスおよびサルウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムに由来するものまたはアクチンプロモーターもしくはリボソームタンパク質プロモーターなどの哺乳動物細胞プロモーターに由来するものを含む強力なプロモーターである。遺伝子の転写は、エンハンサー配列をベクター中に挿入することによってさらに増加させることができる。エンハンサーは、相対的に方向および位置に依存しない；しかしながら、複製起点の後期側（ｌａｔｅ ｓｉｄｅ）のＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ １００～２７０）およびＣＭＶ初期プロモーターエンハンサーなどの真核細胞ウイルス由来のエンハンサーを使用し得る。エンハンサーは、プロモーターに対して５’または３’の位置でベクター中にスプライスされ得るが、好ましくはプロモーターから５’の部位に位置する。いくつかの実施形態において、本開示の核酸構築物はＣＭＶプロモーターを含む。
【0058】
プロモーターは、適切な宿主中での発現を確実にするためのまたは増加させるための特徴をさらに含むことができる。例えば、特徴は、保存領域、例えば、プリブノーボックスまたはＴＡＴＡボックスであり得る。プロモーターは、ヌクレオチド配列の発現レベルに影響を及ぼす（例えば、維持する、増強する、減少させる）ための他の配列を含有することさえ可能である。適切な他の配列としては、Ｓｈｌ－イントロンまたはＡＤＨイントロンが挙げられる。その他の配列としては、温度、化学物質、光またはストレス誘導性要素などの誘導性要素が挙げられる。また、転写または翻訳を増強するための適切な要素が存在し得る。
【0059】
いくつかの実施形態において、プロモーターは、例えば、構成的または組織特異的であり得る。
【0060】
構成的プロモーター
いくつかの例において、好適な構成的プロモーターとしては、ＣＭＶプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）およびチミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーターが挙げられる。
いくつかの例において、好適な構成的プロモーターとしては、ＣＭＶプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）およびチミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーターが挙げられる。
【0061】
組織特異的プロモーター
いくつかの例では、適切な組織特異的プロモーターには、シナプシン１、エノラーゼ、α－カルシウム／カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼＩＩおよびＧＦＡＰが含まれる。
いくつかの例では、適切な組織特異的プロモーターには、シナプシン１、エノラーゼ、α－カルシウム／カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼＩＩおよびＧＦＡＰが含まれる。
【0062】
融合物
ある特定の実施形態において、ウイルスベクター、例えばレンチウイルスベクターは、ＴＨ、ＣＨＩおよび／またはＡＡＤＣをコードするＮＯＩを含む本開示の核酸構築物を含む。３つのうちの２つ、または３つすべての酵素は、例えば、柔軟なリンカーを使用することによって融合することができる。２つの酵素が融合される場合、第３の酵素をコードするＮＯＩは、例えばＩＲＥＳによって、融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列に機能的に連結されることができる。ＩＲＥＳは、融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列に対して５’または３’に配置され得る。あるいは、第３の酵素をコードするＮＯＩは、プロモーターに機能的に連結されることができる。
ある特定の実施形態において、ウイルスベクター、例えばレンチウイルスベクターは、ＴＨ、ＣＨＩおよび／またはＡＡＤＣをコードするＮＯＩを含む本開示の核酸構築物を含む。３つのうちの２つ、または３つすべての酵素は、例えば、柔軟なリンカーを使用することによって融合することができる。２つの酵素が融合される場合、第３の酵素をコードするＮＯＩは、例えばＩＲＥＳによって、融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列に機能的に連結されることができる。ＩＲＥＳは、融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列に対して５’または３’に配置され得る。あるいは、第３の酵素をコードするＮＯＩは、プロモーターに機能的に連結されることができる。
【0063】
いくつかの実施形態において、
【0064】
その順序でＣＨ１に連結されたＴＨを有する構築物（すなわち、ＴＨ－ＣＨ１融合タンパク質を形成する）は、高い絶対レベルのカテコールアミン産生を与え；
【0065】
いずれかの順序で連結されたＡＡＤＣおよびＴＨを有する構築物（すなわち、ＡＡＤＣ－ＴＨまたはＴＨ－ＡＡＤＣ融合タンパク質を形成する）は、Ｌ－ドパのドーパミンへの極めて効率的な変換を与える。
【0066】
いくつかの実施形態において、本開示の核酸構築物は、ＣＴではなく、ＴＣの順序でＴＨとＣＨ１の融合物をコードすることができる。
【0067】
いくつかの実施形態において、核酸構築物は、以下から選択することができる。
ＴＨ－Ｌ－ＣＨ１－ＩＲＥＳ－ＡＡＤＣ；
ＡＡＤＣ－Ｌ－ＴＨ－Ｌ－ＣＨ１；
ＴＨ－Ｌ－ＣＨ１－Ｌ－ＡＡＤＣ；
ＴＨ－Ｌ－ＣＨ１－Ｐ－ＡＡＤＣ；
ＴＨ－Ｌ－ＡＡＤＣ－ＩＲＥＳ－ＣＨ１；
ＡＡＤＣ－Ｌ－ＴＨ－ＩＲＥＳ－ＣＨ１；および
ＴＨ１－Ｌ－ＡＡＤＣ－Ｌ－ＣＨ１；
Ｌ＝リンカーコード配列
ＩＲＥＳ：内部リボソーム進入部位
Ｐ＝プロモーター
ＴＨ－Ｌ－ＣＨ１－ＩＲＥＳ－ＡＡＤＣ；
ＡＡＤＣ－Ｌ－ＴＨ－Ｌ－ＣＨ１；
ＴＨ－Ｌ－ＣＨ１－Ｌ－ＡＡＤＣ；
ＴＨ－Ｌ－ＣＨ１－Ｐ－ＡＡＤＣ；
ＴＨ－Ｌ－ＡＡＤＣ－ＩＲＥＳ－ＣＨ１；
ＡＡＤＣ－Ｌ－ＴＨ－ＩＲＥＳ－ＣＨ１；および
ＴＨ１－Ｌ－ＡＡＤＣ－Ｌ－ＣＨ１；
Ｌ＝リンカーコード配列
ＩＲＥＳ：内部リボソーム進入部位
Ｐ＝プロモーター
【0068】
上述のように、野生型ＴＨは、触媒ドメイン、四量体化ドメインおよびＮ末端調節ドメインを含む。
【0069】
いくつかの実施形態において、ＴＨをコードするＮＯＩは、触媒ドメインおよび四量体化ドメインを含有するが、機能的なＮ末端調節ドメインを欠く切断されたＴＨをコードすることができる。
【0070】
いくつかの実施形態において、ＴＨの切断されたバージョンが、ＧＳ１５リンカーを介してＣＨ１に融合される。
【0071】
ウイルスベクター
いくつかの実施形態において、本開示は、本開示によるヌクレオチド構築物配列を含むレンチウイルスベクターゲノムまたはアデノ随伴ウイルスベクターゲノムなどのウイルスベクターゲノムの使用に関する。本開示は、このようなゲノムを含むウイルスベクター産生系およびベクター粒子も提供する。
いくつかの実施形態において、本開示は、本開示によるヌクレオチド構築物配列を含むレンチウイルスベクターゲノムまたはアデノ随伴ウイルスベクターゲノムなどのウイルスベクターゲノムの使用に関する。本開示は、このようなゲノムを含むウイルスベクター産生系およびベクター粒子も提供する。
【0072】
いくつかの実施形態において、本開示のウイルスベクターは、任意の適切なウイルスから誘導され得、または誘導可能であり得る。いくつかの実施形態において、組換えウイルス粒子は、関心対象のヌクレオチド配列（ＮＯＩ）で標的細胞を形質導入することができる。
【0073】
レトロウイルス粒子の場合、細胞内に入ると、ベクター粒子からのＲＮＡゲノムはＤＮＡに逆転写され、標的細胞のゲノム中に組み込まれる。
【0074】
レンチウイルスベクター
レンチウイルスは、レトロウイルスというより大きな群の一部である。レンチウイルスの詳細なリストは、Ｃｏｆｆｉｎら（１９９７）”Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ”Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ Ｅｄｓ：Ｊ Ｍ Ｃｏｆｆｉｎ，Ｓ Ｍ Ｈｕｇｈｅｓ，Ｈ Ｅ Ｖａｒｍｕｓ ｐｐ ７５８－７６３）に見出され得る。手短に言えば、レンチウイルスは、霊長類群と非霊長類群に分けることができる。霊長類レンチウイルスの例としては、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の原因因子であるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が挙げられるが、これらに限定されない。非霊長類レンチウイルスの群には、原型「遅発性ウイルス」ビスナ／マエディウイルス（ＶＭＶ）ならびに関連するヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）およびウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）が含まれる。
レンチウイルスは、レトロウイルスというより大きな群の一部である。レンチウイルスの詳細なリストは、Ｃｏｆｆｉｎら（１９９７）”Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ”Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ Ｅｄｓ：Ｊ Ｍ Ｃｏｆｆｉｎ，Ｓ Ｍ Ｈｕｇｈｅｓ，Ｈ Ｅ Ｖａｒｍｕｓ ｐｐ ７５８－７６３）に見出され得る。手短に言えば、レンチウイルスは、霊長類群と非霊長類群に分けることができる。霊長類レンチウイルスの例としては、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の原因因子であるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が挙げられるが、これらに限定されない。非霊長類レンチウイルスの群には、原型「遅発性ウイルス」ビスナ／マエディウイルス（ＶＭＶ）ならびに関連するヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）およびウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）が含まれる。
【0075】
レンチウイルスは、分裂細胞および非分裂細胞の両方に感染する能力を有するという点で、レトロウイルス科の他のメンバーとは異なる（Ｌｅｗｉｓら（１９９２）ＥＭＢＯ Ｊ １１（８）：３０５３－３０５８）およびＬｅｗｉｓ ａｎｄ Ｅｍｅｒｍａｎ（１９９４）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６８（１）：５１０－５１６）。これに対して、ＭＬＶなどの他のレトロウイルスは、例えば筋肉、眼、脳、肺および肝臓組織を構成する細胞などの非分裂細胞やゆっくり分裂する細胞には感染することができない。
【0076】
ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）は、レトロウイルス科のレンチウイルス属のメンバーである。野生型ＥＩＡＶウイルスは、核タンパク質コアを含有するエンベロープに包まれた球状のビリオンへとパッケージングされる二量体ＲＮＡゲノム（一本鎖、正の極性）を有する。野生型ＥＩＡＶゲノムの複製は、逆転写および宿主細胞ゲノム中への組み込みを介して起こる。ゲノムは、構造タンパク質ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖをコードする３つの遺伝子、ならびに組み込まれたウイルスゲノムの各末端に長鎖末端反復配列（ＬＴＲ）を含む。すべてのレトロウイルスに共通するｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ配列に加えて、ＥＩＡＶゲノムはいくつかの短いオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む。これらの短いＯＲＦは、多重スプライシングされたｍＲＮＡから翻訳される。ＯＲＦ Ｓ１は転写トランス活性化因子ｌａｔをコードする。ＯＲＦ Ｓ２は機能が未知のタンパク質をコードし、ＯＲＦ Ｓ３はｒｅｖタンパク質をコードするようである。ｒｅｖは、ｇａｇ、ｐｏｔおよびｅｎｖの効率的な発現のために必要とされると考えられる。ｒｅｖは、ＥＩＡＶではｅｎｖ遺伝子内に位置するｒｅｖ応答配列（ＲＲＥ）として知られるＲＮＡ配列と相互作用することによって転写後に作用する。
【0077】
ＥＩＡＶの野生型ゲノムは、Ｒ配列（ゲノムの各末端における短い反復）；Ｕ５配列（Ｒ配列の直後に存在する固有の配列エレメント）；Ｕ３配列（構造タンパク質の下流に位置する固有の配列エレメント）；組み込まれたプロウイルスの転写開始を制御するプロモーターエレメント；パッケージング配列（本明細書では、パッケージング部位またはパッケージング信号と互換的に呼ばれる）；および５’－スプライスドナー部位を含むいくつかのシス作用配列も含有する。
【0078】
レンチウイルスベクターは、本明細書で使用される場合、レンチウイルスから誘導可能な少なくとも１つの成分部分を含むベクター、例えば送達ベクターであり得る。好ましくは、その成分部分は、ベクターが細胞に感染する、遺伝子を発現する、または複製される生物学的機序に関与する。
【0079】
レトロウイルスおよびレンチウイルスゲノムの基本的な構造は、５’ＬＴＲおよび３’ＬＴＲなどの多くの共通する特徴を共有し、それらの間またはそれらの中には、ゲノムをパッケージングすることを可能にするパッケージングシグナル、プライマー結合部位、宿主細胞ゲノム中への組み込みを可能にする付着部位、ならびにパッケージング成分をコードするｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子（これらは、ウイルス粒子の集合のために必要とされるポリペプチドである）が位置している。レンチウイルスは、ＨＩＶ中のｒｅｖおよびＲＲＥ配列などのさらなる特徴を有し、それらは、組み込まれたプロウイルスのＲＮＡ転写物を感染した標的細胞の核から細胞質へと効率的に搬出することを可能にする。
【0080】
プロウイルスでは、ウイルス遺伝子の両端には、長鎖末端反復配列（ＬＴＲ）と呼ばれる領域に挟まれている。ＬＴＲは、エンハンサー－プロモーター配列およびポリアデニル化シグナルとして働くことによって転写に関与しており、それによって、ウイルス遺伝子の発現を制御する。
【0081】
ＬＴＲ自体は、Ｕ３、ＲおよびＵ５と称される３つの要素に分割することができる同一の配列である。Ｕ３は、ＲＮＡの３’末端に固有の配列に由来する。Ｒは、ＲＮＡの両端で反復される配列に由来し、Ｕ５は、ＲＮＡの５’末端に固有の配列に由来する。３つの要素の大きさは、異なるレトロウイルス間でかなり変動し得る。
【0082】
複製欠損レンチウイルスベクターゲノムでは、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖは存在しなくてもよく、または機能しなくてもよい。
【0083】
本開示の典型的なレンチウイルスベクターでは、複製のために必須の１またはそれを超えるタンパク質コード領域の少なくとも一部がウイルスから除去され得る。これにより、ウイルスベクターは複製欠損となる。標的非分裂宿主細胞に形質導入することができる、および／またはそのゲノムを宿主ゲノム中に組み込むことができるＮＯＩを含むベクターを作製するために、ウイルスゲノムの一部はＮＯＩによっても置き換えられ得る。
【0084】
一実施形態においては、レンチウイルスベクターは、その全体が本明細書に組み込まれる国際公開第２００７／０７１９９４号に開示されているものなどの非組込み型ベクターである。
【0085】
いくつかの実施形態において、ベクターは、ウイルスＲＮＡがないまたはそれを欠いている配列を送達する能力を有する。さらなる実施形態において、送達されるべきＲＮＡのパッケージングを確実にするために、送達されるべきＲＮＡ上に位置する異種結合ドメイン（ｇａｇに対して異種）およびｇａｇまたはｐｏｌ上の同族結合ドメインを使用することができる。これらのベクターはいずれも、国際公開第２００７／０７２０５６号に記載されている。
【0086】
レンチウイルスベクターは、「非霊長類」ベクター、すなわち、霊長類、特にヒトには主に感染しないウイルスに由来するベクターであり得る。
【0087】
いくつかの実施形態において、ウイルスベクターはＥＩＡＶに由来し得る。ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子に加えて、ＥＩＡＶは、３つの他の遺伝子：ｔａｔ、ｒｅｖおよびＳ２をコードする。ＴａｔはウイルスＬＴＲの転写活性化因子として作用し（Ｄｅｒｓｅ ａｎｄ Ｎｅｗｂｏｌｄ（１９９３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９４（２）：５３０－５３６およびＭａｕｒｙら（１９９４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２００（２）：６３２－６４２）、Ｒｅｖはｒｅｖ応答配列（ＲＲＥ）を介してウイルス遺伝子の発現を調節および調整する（Ｍａｒｔａｒａｎｏら、（１９９４）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６８（５）：３１０２－３１１１）。これらの２つのタンパク質の作用機序は、霊長類ウイルスにおける類似の機序と概ね似ていると考えられている（Ｍａｒｔａｒａｎｏら、（１９９４）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６８（５）：３１０２－３１１１）。Ｓ２の機能は未知である。さらに、膜貫通タンパク質の開始部においてｅｎｖコード配列にスプライシングされたｔａｔの第１のエクソンによってコードされるＥＩＡＶタンパク質、Ｔｔｍが同定されている（Ｂｅｉｓｅｌら（１９９３）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６７（２）：８３２－８４２）。
【0088】
「組換えレンチウイルスベクター」という用語は、パッケージング成分の存在下で、標的細胞に感染することができるウイルス粒子へのＲＮＡゲノムのパッケージングを可能にするのに十分なレンチウイルスの遺伝情報を有するベクターを指す。標的細胞の感染は、逆転写および標的細胞ゲノム中への組み込みを含み得る。組換えレンチウイルスベクターは、ベクターによって標的細胞に送達されるべき非ウイルスコード配列を担持する。組換えレンチウイルスベクターは、最終標的細胞内で感染性レンチウイルス粒子を産生するための独立した複製を行うことができない。通常、組換えレンチウイルスベクターは、機能的ｇａｇ－ｐｏｌおよび／またはｅｎｖ遺伝子および／または複製に必須のその他の遺伝子を欠く。本開示のベクターは、分割イントロン（ｓｐｌｉｔ－ｉｎｔｒｏｎ）ベクターとして構成され得る。分割イントロンベクターは、ＰＣＴ特許出願公開第９９／１５６８３号に記載されている。
【0089】
いくつかの実施形態において、本開示の組換えレンチウイルスベクターは、最小のウイルスゲノムを有し得る。
【0090】
本明細書で使用される場合、「最小のウイルスゲノム」という用語は、非必須要素を除去し、必須要素を保持するようにウイルスベクターが操作されており、それにより標的宿主細胞に関心対象のヌクレオチド配列を感染させるため、形質導入するため、ならびに送達するために必要とされる機能を提供することを意味する。この戦略のさらなる詳細は、本発明者らの国際公開第９８／１７８１５号に見出すことができる。
【0091】
本開示のいくつかの態様において、ベクターは自己不活化ベクターである。いくつかの態様において、自己不活化レトロウイルスベクターは、３’ＬＴＲのＵ３領域中の転写エンハンサーまたはエンハンサーおよびプロモーターを欠失させることによって構築されている。一巡のベクター逆転写および組み込みの後、これらの変化は５’および３’ＬＴＲの両方の中にコピーされ、転写的に不活性なプロウイルスを産生する（Ｙｕら（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８３：３１９４－３１９８；ＤｏｕｇｈｅｒｔｙおよびＴｅｍｉｎら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：１１９７－１２０１；Ｈａｗｌｅｙ（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：２４０６－２４１０およびＹｅｅら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：９５６４－９５６８）。しかしながら、このようなベクター中のＬＴＲの内部にある任意のプロモーターは依然として転写活性を有する。この戦略は、内部に配置された遺伝子からの転写に対するウイルスＬＴＲ中のエンハンサーおよびプロモーターの影響を排除するために使用されている。このような影響には、転写の増加（Ｊｏｌｌｙら（１９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１１：１８５５～１８７２）または転写の抑制（Ｅｍｅｒｍａｎ ａｎｄ Ｔｅｍｉｎ（１９８４）Ｃｅｌｌ ３９：４４９－４６７）が含まれる。この戦略は、３’ＬＴＲからゲノムＤＮＡ内への下流転写を排除するためにも使用され得る（Ｈｅｒｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｆｆｉｎ（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３６：８４５－８４８）。これは、内因性癌遺伝子の偶発的活性化を防止することが極めて重要であるヒト遺伝子治療において特に関心が持たれる。
【0092】
しかしながら、宿主細胞／パッケージング細胞内でウイルスゲノムを産生するために使用されるプラスミドベクターは、宿主細胞／パッケージング細胞中でゲノムの転写を指示するためにレンチウイルスゲノムに機能的に連結された転写調節制御配列も含む。これらの調節配列は、転写されたレンチウイルス配列、すなわち５’Ｕ３領域に付随する天然配列であり得、または別のウイルスプロモーター、例えばＣＭＶプロモーターなどの異種プロモーターであり得る。一部のレンチウイルスゲノムは、効率的なウイルス産生のために追加の配列を必要とする。例えば、ＨＩＶの場合には、ｒｅｖおよびＲＲＥ配列が含まれることが好ましい。しかし、ｒｅｖおよびＲＲＥの必要性は、ｇａｇ－ｐｏｌのコドン最適化（国際公開第０１／７９５１８号に記載されている）および／またはＬＴＲの下流かつ内部プロモーターの上流にオープンリーディングフレームを含めること（国際公開第０３／０６４６６５号に記載されている）によって低減または排除され得、例えば、本明細書に開示されている特定の構築物においてはｎｅｏが使用されているが、当業者は任意の適切なオープンリーディングフレームを使用することができる。ｒｅｖ／ＲＲＥ系と同じ機能を果たす代替配列も公知である。例えば、ｒｅｖ／ＲＲＥ系の機能的類似体が、マソン・ファイザー・サルウイルスにおいて見出されている。この要素は、構成的輸送要素（ＣＴＥ）として知られており、ゲノム中にＲＲＥ型配列を含み、感染細胞中の因子と相互作用すると考えられている。この細胞因子は、ｒｅｖ類似体と考えることができる。したがって、ＣＴＥは、ｒｅｖ／ＲＲＥ系の代替として使用され得る。公知であるまたは利用可能となる任意の他の機能的等価物が、本開示にとって適切であり得る。例えば、ＨＴＬＶ－ＩのＲｅｘタンパク質がＨＩＶ－１のＲｅｖタンパク質を機能的に置き換え得ることも公知である。ＲｅｖおよびＲｅｘは、ＩＲＥ－ＢＰと同様の効果を有することも公知である。
【0093】
本開示によるレンチウイルスベクターは、好ましくはドーパミン合成経路に関与する３つの酵素をコードする、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）由来の自己不活化最小レンチウイルスベクターを含み得る。このようなベクターによってコードされるタンパク質は、切断された形態のヒトチロシンヒドロキシラーゼ遺伝子（ＴＨのフィードバック調節に関与するＮ末端１６０アミノ酸を欠く）、ヒト芳香族Ｌ－アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）およびヒトＧＴＰ－シクロヒドロラーゼ１（ＧＴＰ－ＣＨ１）遺伝子を含み得る。ベクターは、以下をコードする３つのプラスミドによる細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞）の一過性形質移入によって作製することができる。（１）本明細書に記載されているベクターゲノム（２）合成ＥＩＡＶ ｇａｇ／ｐｏｌ発現ベクター（ｐＥＳＧＰＫ、国際公開第０１／７９５１８号および国際公開第０５／２９０６５号）および（３）ＶＳＶ－Ｇエンベロープ発現ベクター（ｐＨＧＫ）。
【0094】
パッケージング配列
「パッケージング配列」または「ｐｓｉ」と互換的に呼ばれる「パッケージング信号」という用語は、ウイルス粒子形成中にレンチウイルスＲＮＡ鎖のキャプシド封入のために必要とされる非コードシス作用配列に関して使用される。ＨＩＶ－１では、この配列は、主要スプライスドナー部位（ＳＤ）の上流から少なくともｇａｇ開始コドンまで広がる遺伝子座にマッピングされている。
「パッケージング配列」または「ｐｓｉ」と互換的に呼ばれる「パッケージング信号」という用語は、ウイルス粒子形成中にレンチウイルスＲＮＡ鎖のキャプシド封入のために必要とされる非コードシス作用配列に関して使用される。ＨＩＶ－１では、この配列は、主要スプライスドナー部位（ＳＤ）の上流から少なくともｇａｇ開始コドンまで広がる遺伝子座にマッピングされている。
【0095】
本明細書中で使用される場合、「伸長されたパッケージング信号」または「伸長されたパッケージング配列」という用語は、ｇａｇ遺伝子内へのさらなる伸長を伴ったｐｓｉ配列周囲の配列の使用を指す。これらの追加のパッケージング配列を含めることにより、ウイルス粒子中へのベクターＲＮＡの挿入の効率を増加させ得る。
【0096】
偽型化
いくつかの実施形態において、本開示のレンチウイルスベクターは偽型化されている。これに関して、偽型化は１またはそれを超える利点を与えることができる。例えば、レンチウイルスベクターでは、ＨＩＶをベースとするベクターのｅｎｖ遺伝子産物は、ＣＤ４と呼ばれるタンパク質を発現する細胞のみに感染するようにこれらのベクターを限定する。しかし、これらのベクター中のｅｎｖ遺伝子が他のウイルス由来のｅｎｖ配列で置換されれば、これらのベクターはより広い感染スペクトルを有し得る（Ｖｅｒｍａ ａｎｄ Ｓｏｍｉａ（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ ３８９（６６４８）：２３９－２４２）。例として、Ｍｉｌｌｅｒらは、両種指向性レトロウイルス４０７０Ａ由来のエンベロープを用いてＭｏＭＬＶベクターを偽型化した（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：４３１－４３７）。他の者は、ＶＳＶ由来の糖タンパク質を用いてＨＩＶをベースとするレンチウイルスベクターを偽型化した（Ｖｅｒｍａ ａｎｄ Ｓｏｍｉａ（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ ３８９（６６４８）：２３９－２４２）。
いくつかの実施形態において、本開示のレンチウイルスベクターは偽型化されている。これに関して、偽型化は１またはそれを超える利点を与えることができる。例えば、レンチウイルスベクターでは、ＨＩＶをベースとするベクターのｅｎｖ遺伝子産物は、ＣＤ４と呼ばれるタンパク質を発現する細胞のみに感染するようにこれらのベクターを限定する。しかし、これらのベクター中のｅｎｖ遺伝子が他のウイルス由来のｅｎｖ配列で置換されれば、これらのベクターはより広い感染スペクトルを有し得る（Ｖｅｒｍａ ａｎｄ Ｓｏｍｉａ（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ ３８９（６６４８）：２３９－２４２）。例として、Ｍｉｌｌｅｒらは、両種指向性レトロウイルス４０７０Ａ由来のエンベロープを用いてＭｏＭＬＶベクターを偽型化した（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：４３１－４３７）。他の者は、ＶＳＶ由来の糖タンパク質を用いてＨＩＶをベースとするレンチウイルスベクターを偽型化した（Ｖｅｒｍａ ａｎｄ Ｓｏｍｉａ（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ ３８９（６６４８）：２３９－２４２）。
【0097】
いくつかの実施形態において、Ｅｎｖタンパク質は、変異体Ｅｎｖタンパク質または操作されたＥｎｖタンパク質などの改変されたＥｎｖタンパク質である。改変は、標的化能力を導入するために、または毒性を低減するために、または別の目的のために作製または選択され得る（Ｍａｒｉｎら（１９９６）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７０（５）：２９５７－２９６２；Ｎｉｌｓｏｎら（１９９６）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ３（４）：２８０－２８６；およびＦｉｅｌｄｉｎｇら（１９９８）Ｂｌｏｏｄ ９１（５）：１８０２－１８０９およびこれらの中で引用されている参考文献）。
【0098】
いくつかの実施形態において、ベクターは、例えば、狂犬病Ｇタンパク質またはＶＳＶ－Ｇタンパク質の少なくとも一部をコードする遺伝子を用いて偽型化されることができる。
【0099】
ＶＳＶ－Ｇ
いくつかの実施形態において、ラブドウイルスである水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のエンベロープ糖タンパク質（Ｇ）は、レンチウイルスを含むある特定のレトロウイルスを偽型化することができることが示されているエンベロープタンパク質である。
いくつかの実施形態において、ラブドウイルスである水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のエンベロープ糖タンパク質（Ｇ）は、レンチウイルスを含むある特定のレトロウイルスを偽型化することができることが示されているエンベロープタンパク質である。
【0100】
レトロウイルスのエンベロープタンパク質の非存在下においてＭｏＭＬＶをベースとするレトロウイルスベクターを偽型化するその能力は、Ｅｍｉら（１９９１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：１２０２－１２０７）によって最初に示された。国際公開第９４／２９４４４０号は、レトロウイルスベクターがＶＳＶ－Ｇで首尾よく偽型化され得ることを教示している。これらの偽型化されたＶＳＶ－Ｇベクターは、広範囲の哺乳動物細胞を形質導入するために使用され得る。より最近では、Ａｂｅら、（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ７２（８）：６３５６－６３６１は、ＶＳＶ－Ｇの添加によって非感染性レトロウイルス粒子を感染性にすることができることを教示している。
【0101】
Ｂｕｒｎｓら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：８０３３－８０３７）は、ＶＳＶ－Ｇを用いてレトロウイルスであるＭＬＶを首尾よく偽型化し、これにより、その天然型のＭＬＶと比較して変化した宿主域を有するベクターが得られた。ＶＳＶ－Ｇで偽型化されたベクターは、哺乳動物細胞だけでなく、魚、爬虫類および昆虫に由来する細胞株にも感染することが示されている（Ｂｕｒｎｓら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：８０３３－８０３７）。ＶＳＶ－Ｇで偽型化されたベクターは、様々な細胞株に対して従来の両種指向性エンベロープよりも効率的であることも示されている（Ｙｅｅら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：９５６４－９５６８およびＥｍｉら（１９９１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：１２０２－１２０７）。ＶＳＶ－Ｇタンパク質の細胞質尾部はレトロウイルスのコアと相互作用することができるので、ＶＳＶ－Ｇタンパク質は、ある特定のレンチウイルスおよびレトロウイルスを偽型化するために使用することもできる。
【0102】
ＶＳＶ－Ｇタンパク質などの非レンチウイルスの偽型化エンベロープの提供は、感染性を失うことなくベクター粒子を高力価に濃縮できるという利点をもたらす（Ａｋｋｉｎａら（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：２５８１－２５８５）。レンチウイルスおよびレトロウイルスエンベロープタンパク質は、おそらく２つの非共有結合的に連結されたサブユニットからなるので、超遠心分離中の剪断力に明らかに耐えることができない。サブユニット間の相互作用は、遠心分離によって破壊され得る。比較すると、ＶＳＶ糖タンパク質は単一の単位から構成されている。したがって、ＶＳＶ－Ｇタンパク質偽型化は潜在的な利点を提供し得る。
【0103】
国際公開第００／５２１８８号は、膜結合型ウイルスエンベロープタンパク質として水疱性口内炎ウイルス－Ｇタンパク質（ＶＳＶ－Ｇ）を有する偽型化されたレトロウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターの安定した産生細胞株からの作製を記載しており、ＶＳＶ－Ｇタンパク質の遺伝子配列を提供している。
【0104】
ロスリバーウイルス
ロスリバーウイルスのエンベロープは、非霊長類レンチウイルスベクター（ＦＩＶ）を偽型化するために使用されており、全身投与後に主に肝臓を形質導入した（Ｋａｎｇら（２００２）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７６（１８）：９３７８－９３８８．）。効率は、ＶＳＶ－Ｇ偽型化ベクターで得られたものより２０倍大きく、肝毒性を示唆する肝酵素の血清レベルによって測定したところ、より低い細胞傷害性を生じさせることが報告された。
ロスリバーウイルスのエンベロープは、非霊長類レンチウイルスベクター（ＦＩＶ）を偽型化するために使用されており、全身投与後に主に肝臓を形質導入した（Ｋａｎｇら（２００２）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７６（１８）：９３７８－９３８８．）。効率は、ＶＳＶ－Ｇ偽型化ベクターで得られたものより２０倍大きく、肝毒性を示唆する肝酵素の血清レベルによって測定したところ、より低い細胞傷害性を生じさせることが報告された。
【0105】
ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）は、蚊によって拡散されるアルファウイルスであり、オーストラリアの熱帯および温帯地域特有に蔓延している。マレーバレーリバー系の平原では血清有病率が２７～３７％に達するが、温帯沿岸地域の通常の集団における抗体率は低い傾向がある（６％～１５％）。１９７９年から１９８０年にかけて、ロスリバーウイルスが太平洋諸島において流行した。この疾患はヒト間では伝染せず、致死的ではなく、最初の症状は、患者の約半数における疲労と嗜眠を伴う関節痛である（Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（２００７）Ｅｄｓ．ＫｎｉｐｅおよびＨｏｗｌｅｙ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＷｉｌｋｉｎｓ）。
【0106】
バキュロウイルスＧＰ６４
バキュロウイルスＧＰ６４タンパク質は、臨床および商業用途のために必要とされる高力価ウイルスの大規模生産において使用されるウイルスベクターのための、ＶＳＶ－Ｇに代わる魅力的な手段であることが示されている（Ｋｕｍａｒ Ｍ，Ｂｒａｄｏｗ Ｂ Ｐ，Ｚｉｍｍｅｒｂｅｒｇ Ｊ（２００３）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１４（１）：６７－７７）。ＶＳＶ－Ｇ－偽型化ベクターと比較して、ＧＰ６４偽型化ベクターは、類似の広い指向性および類似の天然の力価を有する。ＧＰ６４発現は細胞を死滅させないので、ＧＰ６４を構成的に発現する２９３Ｔベースの細胞株を作製することができる。
バキュロウイルスＧＰ６４タンパク質は、臨床および商業用途のために必要とされる高力価ウイルスの大規模生産において使用されるウイルスベクターのための、ＶＳＶ－Ｇに代わる魅力的な手段であることが示されている（Ｋｕｍａｒ Ｍ，Ｂｒａｄｏｗ Ｂ Ｐ，Ｚｉｍｍｅｒｂｅｒｇ Ｊ（２００３）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１４（１）：６７－７７）。ＶＳＶ－Ｇ－偽型化ベクターと比較して、ＧＰ６４偽型化ベクターは、類似の広い指向性および類似の天然の力価を有する。ＧＰ６４発現は細胞を死滅させないので、ＧＰ６４を構成的に発現する２９３Ｔベースの細胞株を作製することができる。
【0107】
狂犬病Ｇ
本開示では、ベクターは、狂犬病Ｇタンパク質またはその変異体、バリアント、相同体もしくは断片の少なくとも一部で偽型化され得る。
本開示では、ベクターは、狂犬病Ｇタンパク質またはその変異体、バリアント、相同体もしくは断片の少なくとも一部で偽型化され得る。
【0108】
狂犬病Ｇタンパク質およびその変異体に関する教示は、国際公開第９９／６１６３９号ならびにRose et al (1982) J. Virol. 43:361-364, Hanham et al (1993) J. Virol. 67:530-542; Tuffereau et al (1998) J. Virol. 72:1085-1091, Kucera et al (1985) J. Virol. 55:158-162; Dietzschold et al (1983) PNAS 80:70-74; Seif et al (1985) J. Virol. 53:926-934; Coulon et al (1998) J. Virol. 72:273-278; Tuffereau et al (1998) J. Virol. 72:1085-10910; Burger et al (1991) J. Gen. Virol. 72:359-367; Gaudin et al (1995) J. Virol. 69:5528-5534; Benmansour et al (1991) J. Virol. 65:4198-4203; Luo et al (1998) Microbiol. Immunol. 42:187-193, Coll (1997) Arch. Virol. 142:2089-2097; Luo et al (1997) Virus Res. 51:35-41; Luo et al (1998) Microbiol. Immunol. 42:187-193; Coll (1995) Arch. Virol. 140:827-851; Tuchiya et al (1992) Virus Res. 25:1-13; Morimoto et al (1992) Virology 189:203-216; Gaudin et al (1992) Virology 187:627-632; Whitt et al (1991) Virology 185:681-688; Dietzschold et al (1978) J. Gen. Virol. 40:131-139; Dietzschold et al (1978) Dev. Biol. Stand. 40:45-55; Dietzschold et al (1977) J. Virol. 23:286-293およびOtvos et al (1994) Biochim. Biophys. Acta 1224:68-76.に見出され得る。狂犬病Ｇタンパク質は、欧州特許第０４４５６２５号明細書にも記載されている。
【0109】
代替エンベロープ
レンチウイルスベクターを偽型化するために使用することができる他のエンベロープとしては、モコラ、エボラ、４０７０ＡおよびＬＣＭＶ（リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス）が挙げられる。
レンチウイルスベクターを偽型化するために使用することができる他のエンベロープとしては、モコラ、エボラ、４０７０ＡおよびＬＣＭＶ（リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス）が挙げられる。
【0110】
アデノ随伴ウイルスベクター
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターはパッケージング能力が限られており、したがって、効率的に送達され得る遺伝子の数に悪影響を及ぼすことが当技術分野において公知であった。しかしながら、現在では、この制限はＡＡＶ血清型に依存することが知られている。例えば、ＡＡＶ５およびＡＡＶ７血清型のキャプシドは、最大８ｋｂのゲノムをパッケージングすることができる。この研究は、米国特許第７，９４３，３７４号に記載されている。さらに、米国特許出願公開第２００９／０２１４４７８号は、最大９ｋｂまでのパッケージング能力を有するＡＡＶ２／５組換えベクターを記載している。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターはパッケージング能力が限られており、したがって、効率的に送達され得る遺伝子の数に悪影響を及ぼすことが当技術分野において公知であった。しかしながら、現在では、この制限はＡＡＶ血清型に依存することが知られている。例えば、ＡＡＶ５およびＡＡＶ７血清型のキャプシドは、最大８ｋｂのゲノムをパッケージングすることができる。この研究は、米国特許第７，９４３，３７４号に記載されている。さらに、米国特許出願公開第２００９／０２１４４７８号は、最大９ｋｂまでのパッケージング能力を有するＡＡＶ２／５組換えベクターを記載している。
【0111】
ＡＡＶベクターの特徴は、当業者に周知である。例えば、ＡＡＶベクターは広い宿主域を有し、比較的低い免疫原性で分裂細胞と非分裂細胞の両方を形質導入する。シス作用性ＡＡＶエレメント、末端逆位反復配列（ＩＴＲ）、ＤＮＡパッケージングシグナルおよび複製起点のみをそのままにして、すべてのＡＡＶウイルス遺伝子を遺伝子カセットで置き換える方法も周知である。例えば、Ｍｕｓａｔｏｖら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２００２，７６（２４）を参照。ＡＡＶ遺伝子産物であるＲｅｐおよびＣａｐならびにその他のアクセサリータンパク質が別に（ｉｎ ｔｒａｎｓ）与えられると、ＡＡＶは産生細胞中でパッケージングされ得る。ＡＡＶパッケージング系は記載されている。例えば、米国特許第５，１３９，９４１号を参照。非ＡＡＶアクセサリー機能は、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルスおよびワクシニアウイルスなどの公知のヘルパーウイルスのいずれによっても供給され得る。このようなＡＡＶパッケージング系は、例えば、米国特許第４，７９７，３６８号；米国特許第５，１３９，９４１号；米国特許第５，８６６，５５２号；米国特許第６，００１，６５０号；米国特許第６，７２３，５５１号に記載されている。
【0112】
コドン最適化
いくつかの実施形態において、本開示において使用されるポリヌクレオチド（核酸構築物、ＮＯＩおよび／またはベクター成分の全部または一部を含む）は、コドン最適化され得る。コドン最適化は、国際公開第９９／４１３９７号および国際公開第０１／７９５１８号に以前に記載されている。異なる細胞は、特定のコドンの使用が異なる。このコドンバイアスは、細胞型における特定のｔＲＮＡの相対存在量のバイアスに対応する。コドンが対応するｔＲＮＡの相対存在量と一致するように調整されるように配列中のコドンを変更することによって、発現を増加させることが可能である。同様に、対応するｔＲＮＡが特定の細胞型において稀であることが知られているコドンを意図的に選択することによって、発現を減少させることが可能である。したがって、さらなる程度の翻訳の制御が利用可能である。
いくつかの実施形態において、本開示において使用されるポリヌクレオチド（核酸構築物、ＮＯＩおよび／またはベクター成分の全部または一部を含む）は、コドン最適化され得る。コドン最適化は、国際公開第９９／４１３９７号および国際公開第０１／７９５１８号に以前に記載されている。異なる細胞は、特定のコドンの使用が異なる。このコドンバイアスは、細胞型における特定のｔＲＮＡの相対存在量のバイアスに対応する。コドンが対応するｔＲＮＡの相対存在量と一致するように調整されるように配列中のコドンを変更することによって、発現を増加させることが可能である。同様に、対応するｔＲＮＡが特定の細胞型において稀であることが知られているコドンを意図的に選択することによって、発現を減少させることが可能である。したがって、さらなる程度の翻訳の制御が利用可能である。
【0113】
ＨＩＶおよび他のレンチウイルスを含む多くのウイルスは、多数の稀なコドンを使用し、これらを一般的に使用される哺乳動物コドンに対応するように変更することによって、哺乳動物産生細胞中での関心対象の遺伝子、例えばＮＯＩまたはパッケージング成分の発現の増加を達成することができる。コドン使用頻度表は、哺乳動物細胞および様々な他の生物について当技術分野で公知である。
【0114】
ウイルスベクター成分のコドン最適化は、多くの他の利点を有する。その配列の変化のために、産生細胞／パッケージング細胞中でのウイルス粒子の集合のために必要とされるウイルス粒子のパッケージング成分をコードするヌクレオチド配列は、該ヌクレオチド配列から除去されたＲＮＡ不安定性配列（ＩＮＳ）を有する。同時に、パッケージング成分に対するアミノ酸配列コード配列は、これらの配列によってコードされるウイルス成分が同じままであるように、またはパッケージング成分の機能が損なわれないように少なくとも十分に類似するように保持される。レンチウイルスベクターでは、コドン最適化は、搬出のためのＲｅｖ／ＲＲＥの必要性も克服し、最適化された配列をＲｅｖ非依存性にする。コドン最適化は、ベクター系内の異なる構築物間（例えば、ｇａｇ－ｐｏｌおよびｅｎｖオープンリーディングフレーム中の重複領域間）での相同組換えも低下させる。いくつかの実施形態において、コドン最適化の全体的な効果は、ウイルス力価の顕著な増加および改善された安全性である。
【0115】
いくつかの実施形態において、ＩＮＳに関連するコドンのみがコドン最適化される。しかしながら、いくつかの実施形態において、配列は、いくつかの例外、例えばｇａｇ－ｐｏｌのフレームシフト部位を包含する配列を除いて、その全体がコドン最適化されている（下記参照）。
【0116】
ｇａｇ－ｐｏｌ遺伝子は、ｇａｇ－ｐｏｌタンパク質をコードする２つの重複する読み枠を含む。両タンパク質の発現は、翻訳中のフレームシフトに依存する。このフレームシフトは、翻訳中のリボソーム「翻訳スリップ」の結果として生じる。この翻訳スリップは、少なくとも一部は、ＲＮＡ二次構造によるリボソームの失速によって引き起こされると考えられている。このような二次構造は、ｇａｇ－ｐｏｌ遺伝子中のフレームシフト部位の下流に存在する。ＨＩＶの場合、重複領域は、ｇａｇの始まりの下流にあるヌクレオチド１２２２（ヌクレオチド１はｇａｇ ＡＴＧのＡである）からｇａｇの終わり（ｎｔ １５０３）まで広がる。その結果、フレームシフト部位および２つの読み枠の重複領域にまたがる２８１ ｂｐ断片は、好ましくはコドン最適化されない。この断片を保持することにより、ｇａｇ－ｐｏｌタンパク質のより効率的な発現が可能になる。
【0117】
ＥＩＡＶの場合、重複の開始はｎｔ １２６２であると解されている（ヌクレオチド１はｇａｇ ＡＴＧのＡである）。重複の末端は１４６１ ｂｐにある。フレームシフト部位およびｇａｇ－ｐｏｌ重複が確実に保存されるようにするために、野生型配列はｎｔ １１５６から１４６５まで保持されている。
【0118】
例えば、好都合な制限部位を収容するために、最適なコドン使用からの誘導を施すことができ、保存的アミノ酸変化がｇａｇ－ｐｏｌタンパク質中に導入され得る。
【0119】
一実施形態において、コドン最適化は、少量発現される哺乳動物遺伝子に基づく。各コドンの３番目の塩基、時には２番目および３番目の塩基を変化させ得る。
【0120】
遺伝暗号の縮重性のために、多数のｇａｇ－ｐｏｌ配列が当業者によって達成され得ることが理解される。また、コドン最適化されたｇａｇ－ｐｏｌ配列を生成するための出発点として使用することができる多くのレトロウイルスバリアントが記載されている。レンチウイルスのゲノムは極めて可変的であり得る。例えば、依然として機能的であるＨＩＶ－１の多くの準種が存在する。これはＥＩＡＶにも当てはまる。これらのバリアントは、形質導入過程の特定の一部を強化するために使用され得る。ＨＩＶ－１バリアントの例は、Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｅｃｕｒｉｔｙによって運営されているＨＩＶデータベースで見出され得る。ＥＩＡＶクローンの詳細は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）データベースで見出され得る。
【0121】
コドン最適化されたｇａｇ－ｐｏｌ配列に対する戦略は、任意のレトロウイルスに関して使用することができる。これは、ＥＩＡＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＣＡＥＶ、ＶＭＲ、ＳＩＶ、ＨＩＶ－１およびＨＩＶ－２を含むすべてのレンチウイルスに適用される。さらに、この方法は、ＨＴＬＶ－１、ＨＴＬＶ－２、ＨＦＶ、ＨＳＲＶおよびヒト内因性レトロウイルス（ＨＥＲＶ）、ＭＬＶおよび他のレトロウイルス由来の遺伝子の発現を増加させるために使用することができる。
【0122】
コドン最適化は、ｇａｇ－ｐｏｌ発現をＲｅｖ非依存性にすることができる。しかしながら、レンチウイルスベクターにおける抗ｒｅｖ因子またはＲＲＥ因子の使用を可能にするためには、ウイルスベクター生成系を完全にＲｅｖ／ＲＲＥ非依存性にすることが必要である。したがって、ゲノムも改変される必要がある。これは、ベクターゲノム成分を最適化することによって達成される。有利には、これらの改変によって、産生細胞中および形質導入された細胞中の両方において、すべての追加のタンパク質が存在しないより安全な系の作製ももたらされる。
【0123】
活性
本開示のある特定の態様において、本開示の融合構築物は、機能的ドーパミン合成酵素を産生し、国際公開第０２／２９０６５号に記載されているＩＲＥＳ配列によって隔てられたドーパミン合成酵素をコードする３つの遺伝子のすべてを有する構築物を使用して得られるレベルと比較すると、ドーパミン産生の増加を引き起こすことができる。
本開示のある特定の態様において、本開示の融合構築物は、機能的ドーパミン合成酵素を産生し、国際公開第０２／２９０６５号に記載されているＩＲＥＳ配列によって隔てられたドーパミン合成酵素をコードする３つの遺伝子のすべてを有する構築物を使用して得られるレベルと比較すると、ドーパミン産生の増加を引き起こすことができる。
【0124】
いくつかの実施形態において、本開示のベクターは、細胞内で発現されたときに、国際公開第２００１／０４４３３号に記載されているベクターｐＯＮＹＫ１より増加したＬ－ドパおよび／またはドーパミン産生を引き起こすことができる。
【0125】
本開示のベクターは、ドーパミンおよび／またはＬ－ドパ産生の少なくとも２、３、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、８０、８０、９０、１００、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、２００、５００、１０００倍の増加を与えることができる。
【0126】
本開示のベクターは、例えばＨＥＫ２９３Ｔ細胞またはＰＣ－１２細胞において発現された場合に、ｐＯＮＹＫ１と比較すると、増加したＬ－ドパおよび／またはドーパミン産生を引き起こすことができる。
【0127】
ドーパミンまたはＬ－ドパの産生は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などの当技術分野で公知の数多くの方法のいずれによっても測定することができる。
【0128】
理論に拘束されることを望むものではないが、本発明者らは、コードされるタンパク質が物理的に互いに近接しており、それによって互いとの相互作用を促進するので、Ｌ－ドパおよび／またはドーパミン合成が融合タンパク質によって増加されることを示唆する。各酵素の物理的な近接は、ある酵素から別の酵素への効率的な代謝物の流れを促進して、最大のＬ－ドパまたはドーパミン産生を可能にし得るので、これは、ドーパミン生合成経路の酵素にとって特に有利である。
【0129】
いくつかの実施形態において、本開示の融合構築物は、ベースラインと比較して、改善されたＬ－ドパ産生および改善されたドーパミン産生を提供し、いくつかの実施形態では、ＰｒｏＳａｖｉｎ（登録商標）などの他の構築物と比較される。
【0130】
医薬組成物および投薬
本開示の、核酸構築物を含むウイルスベクター、例えばレンチウイルスベクター（例えば、Ｌｅｎｔｉ－ＰＤ）は、医薬組成物の形態で提供することができる。医薬組成物は、遺伝子療法によって個体を処置するために使用することができ、組成物は、治療有効量の本開示の構築物を含むウイルスベクター、例えばレンチウイルスベクター（例えば、Ｌｅｎｔｉ－ＰＤ）を含む。
本開示の、核酸構築物を含むウイルスベクター、例えばレンチウイルスベクター（例えば、Ｌｅｎｔｉ－ＰＤ）は、医薬組成物の形態で提供することができる。医薬組成物は、遺伝子療法によって個体を処置するために使用することができ、組成物は、治療有効量の本開示の構築物を含むウイルスベクター、例えばレンチウイルスベクター（例えば、Ｌｅｎｔｉ－ＰＤ）を含む。
【0131】
いくつかの実施形態において、ウイルス調製物は超遠心分離によって濃縮することができる。いくつかの実施形態において、レンチウイルスベクターは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際公開第２００９／１５３５６３号に開示されている方法のいずれに従っても処理することができる。
【0132】
治療有効量のウイルスベクターは、ウイルスベクターが臨床的に適切な効果を提供するように、本開示の核酸構築物を標的細胞集団または標的組織に送達するのに十分な量である。有効量は、対象の種、年齢、体重、健康、および標的とされるべき組織などの因子に依存し得、したがって動物および組織間で異なり得る。医薬組成物は、ヒト対象を処置するために使用することができる。いくつかの実施形態において、対象は、神経変性疾患または対象においてドーパミンレベルが低下する疾患に罹患している。いくつかの実施形態において、ヒトはパーキンソン病、例えば両側性特発性パーキンソン病に罹患している。
【0133】
いくつかの実施形態において、医薬組成物は、本開示のウイルスベクター、例えばレンチウイルス粒子を含む。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターの用量は、少なくとも１０６の形質導入単位（ＴＵ）、例えば、１×１０６ＴＵ～５×１０８ＴＵ（両端を含む）を含むことができる。ＴＵは、例えば、組み込み（ＤＮＡ）力価アッセイを使用して、組み込み事象の数に基づいて計算することができる。ベクター力価は、標準的なＨＥＫ２９３Ｔ細胞株に対して滴定された（ｔｉｔｒｅｄ）ベクター強度に対してｍＬ当たりのＴＵ（ＴＵ／ｍＬ）で、または対象に送達される目標用量（ＴＵ／対象）（例えば、ベクターの目標強度に対して計算される）として表すことができる。
【0134】
いくつかの実施形態において、目標用量は、２×１０６ＴＵ／対象～２×１０８ＴＵ／対象、３×１０６ＴＵ／対象～２×１０８ＴＵ／対象；４×１０６ＴＵ／対象～２×１０８ＴＵ／対象、５×１０６ＴＵ／対象～２×１０８ＴＵ／対象、６×１０６ＴＵ／対象～２×１０８ＴＵ／対象、７×１０６ＴＵ／対象～２×１０８ＴＵ／対象、８×１０６ＴＵ／対象～２×１０８ＴＵ／対象または９×１０６ＴＵ／対象～２×１０８ＴＵ／対象を含む。
【0135】
いくつかの実施形態において、目標用量は、１×１０７ＴＵ／対象～１×１０８ＴＵ／対象；２×１０７ＴＵ／対象～１×１０８ＴＵ／対象；３×１０７ＴＵ／対象～１×１０８ＴＵ／対象；４×１０７ＴＵ／対象～１×１０８ＴＵ／対象、５×１０７ＴＵ／対象～１×１０８ＴＵ／対象、６×１０７ＴＵ／対象～１×１０８ＴＵ／対象、７×１０７ＴＵ／対象～１×１０８ＴＵ／対象、８×１０７ＴＵ／対象～１×１０８ＴＵ／対象または９×１０７ＴＵ／対象～１×１０８ＴＵ／対象を含む。
【0136】
いくつかの実施形態において、総目標用量は、１×１０７ＴＵ／対象～２×１０７ＴＵ／対象、２×１０７ＴＵ／対象～３×１０７ＴＵ／対象、３×１０７ＴＵ／対象～４×１０７ＴＵ／対象、４×１０７ＴＵ／対象～５×１０７ＴＵ／対象、５×１０７ＴＵ／対象～６×１０７ＴＵ／対象、６×１０７ＴＵ／対象～７×１０７ＴＵ／対象、７×１０７ＴＵ／対象～８×１０７ＴＵ／対象、８×１０７ＴＵ／対象～９×１０７ＴＵ／対象または９×１０７ＴＵ／対象～１×１０８ＴＵ／対象を含む。
【0137】
いくつかの実施形態において、目標用量は、約１×１０６ＴＵ／対象～５×１０８ＴＵ／対象、４×１０６ＴＵ／対象～８×１０６ＴＵ／対象；８×１０６ＴＵ／対象～４×１０７ＴＵ／対象；または１×１０７ＴＵ／対象～５×１０８ＴＵ／対象である。いくつかの実施形態において、目標用量は、約１．５×１０７ＴＵ／ｍＬ～５×１０７ＴＵ／ｍＬである。
【0138】
いくつかの実施形態において、目標用量は、約２×１０６ＴＵ／対象、約１．４×１０７ＴＵ／対象、約１．５×１０７ＴＵ／対象、約１．６×１０７ＴＵ／対象、約１．７×１０７ＴＵ／対象、約１．８×１０７ＴＵ／対象、約１．９×１０７ＴＵ／対象、約２×１０７ＴＵ／対象、約２．１×１０７ＴＵ／対象、約２．２×１０７ＴＵ／対象、約２．３×１０７ＴＵ／対象、約２．４×１０７ＴＵ／対象または約２．５×１０７ＴＵ／対象である。
【0139】
いくつかの実施形態において、目標ベクター用量強度は、５×１０６ＴＵ／ｍＬ～５×１０８ＴＵ／ｍＬ、５×１０６ＴＵ／ｍＬ～５×１０７ＴＵ／ｍＬ、１×１０７ＴＵ／ｍＬ～５×１０７ＴＵ／ｍＬ、１．５×１０７ＴＵ／ｍＬ～５×１０７ＴＵ／ｍＬまたは５×１０７ＴＵ／ｍＬ～５×１０８ＴＵ／ｍＬを含む。
【0140】
いくつかの実施形態において、総目標ベクター用量は、被殻内に直接、制御された速度（例えば、約２～４μＬ／分）で、複数の少容量（例えば、５０～２００μＬ）で、対象に投与される。
【0141】
組成物は、必要に応じて、薬学的に許容され得る担体、賦形剤または希釈剤を含み得る。医薬担体、賦形剤または希釈剤の選択は、意図される投与経路および標準的な薬学の慣行に関して選択することができる。医薬組成物は、担体、賦形剤または希釈剤として（またはこれらに加えて）、任意の適切な結合剤（複数可）、滑沢剤（複数可）、懸濁化剤（複数可）、コーティング剤（複数可）、可溶化剤（複数可）および標的部位中へのウイルスの侵入を補助または増加させ得る他の担体剤を含み得る。いくつかの実施形態において、本開示の医薬組成物は、等張化剤、凍結保存助剤、ｐＨ緩衝剤、ｐＨ調整剤またはこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される賦形剤を含む。いくつかの実施形態において、等張化剤は塩化ナトリウムを含む。いくつかの実施形態において、凍結保存助剤は、マンニトールおよび／またはスクロースを含む。いくつかの実施形態において、ｐＨ緩衝剤はトロメタミン（ＴＲＩＳ）を含む。いくつかの実施形態において、ｐＨ調整剤は塩酸（ＨＣｌ）を含む。いくつかの実施形態において、希釈剤は水である。
【0142】
投与
いくつかの実施形態において、本開示の構築物を含むウイルスベクター（例えば、Ｌｅｎｔｉ－ＰＤ）は、例えば尾状核被殻中への注射によって脳に投与される。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは感覚運動被殻への注射によって投与される。いくつかの実施形態において、ベクターは、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，３３９，５１２号に開示されている方法のいずれかに従って、脳に連続的に注入される。
いくつかの実施形態において、本開示の構築物を含むウイルスベクター（例えば、Ｌｅｎｔｉ－ＰＤ）は、例えば尾状核被殻中への注射によって脳に投与される。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは感覚運動被殻への注射によって投与される。いくつかの実施形態において、ベクターは、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，３３９，５１２号に開示されている方法のいずれかに従って、脳に連続的に注入される。
【0143】
いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、非ドーパミン作動性神経細胞中でのコードされたタンパク質の発現を可能にするＰＤ対象の感覚運動被殻中への局所的両側性定位注入によって投与される。いくつかの実施形態において、投与は、複数の少容量（例えば、５０～２００μＬ）で、制御された速度（約２～４μＬ／分、例えば３μＬ／分）にて、被殻内に直接、第１の半球中の１つ～６つ、例えば３つの路および第２の半球中の１つ～６つ、例えば３つの路を介して為される。
【0144】
ウイルスベクターは、半球当たり１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたはそれを超える路を介して投与することができる。
【0145】
いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターのための以前に記載された投与系として投与することができ（Ｊａｒｒａｙａら（２００９）Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ １４：１（２）２－４）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。例えば、ウイルスベクター組成物は、路の底部に一定分量（２～４μＬ）を投与し、針を少し引き抜いた後、第２の一定分量（２～４μＬ）を投与し、針をさらに少し引き抜き（２回目）、次いで、第３の一定分量（２～４μＬ）を投与することによって、不連続的なまたは「点状の」様式で投与することができ、このようにして、一定分量が各穿刺経路に沿って３点で堆積され、合計約１０μＬを送達する。
【0146】
使用の方法
本開示のある特定の態様は、（ａ）運動機能を改善すること、（ｂ）ジスキネジアを軽減すること、および／または（ｃ）対象のＬ－ドパもしくはＬＥＤの１日用量の低減を可能にすることの１またはそれより多くをパーキンソン病に罹患している対象に提供する方法であって、本明細書に開示される核酸構築物を含むウイルスベクター（例えば、Ｌｅｎｔｉ－ＰＤ）を、該ウイルスベクターを必要とする対象に投与することを含む方法に関する。
本開示のある特定の態様は、（ａ）運動機能を改善すること、（ｂ）ジスキネジアを軽減すること、および／または（ｃ）対象のＬ－ドパもしくはＬＥＤの１日用量の低減を可能にすることの１またはそれより多くをパーキンソン病に罹患している対象に提供する方法であって、本明細書に開示される核酸構築物を含むウイルスベクター（例えば、Ｌｅｎｔｉ－ＰＤ）を、該ウイルスベクターを必要とする対象に投与することを含む方法に関する。
【0147】
本開示のある特定の態様は、本明細書に開示される構築物を含むウイルスベクターを投与することを含む、運動機能を改善するおよび／またはジスキネジアを患っている対象におけるジスキネジアを軽減させる方法に関する。
【0148】
ＰＤの薬理学的処置に影響を及ぼす主要な問題の１つは、Ｌ－ドパ治療をいつ開始するかを決定することである。早期投与は最大の臨床的利益を与えることが示されているが、Ｌ－ドパによる長期処置は不快な運動副作用を伴うことが知られている。その結果、多くの医師は、初期治療としてＬ－ドパの実施を遅らせることを好む。しかしながら、Ｌ－ドパは、副作用としてジスキネジアを誘発する。
【0149】
いくつかの実施形態において、対象は、神経変性疾患または内因性ドーパミンレベルが対象中において低下する疾患に罹患している。いくつかの実施形態において、対象はパーキンソン病を有する。いくつかの実施形態において、対象はＬ－ドパ（レボドパとしても知られている）治療を受けている。いくつかの実施形態において、対象はレボドパ換算用量（ＬＥＤ）治療を受けている。いくつかの実施形態において、対象にはカルビドパも投与される。
【0150】
いくつかの実施形態において、Ｌ－ドパまたはＬＥＤ治療を受けている患者に投与されると、本明細書に開示されている核酸構築物を含むウイルスベクター（例えば、Ｌｅｎｔｉ－ＰＤ）は、症状の漸減を向上させ、Ｌ－ドパまたはＬＥＤ治療の投与に伴うジスキネジアを低減させながら、Ｌ－ドパの１日投与量を低減させることを可能にする。この併用処置は、パーキンソン病患者の運動機能性の改善をもたらし、薬理学的治療によって誘発される運動の変動も改善する。この組み合わせは、ジスキネジア、「オン－オフ」およびウェアリング・オフ現象を特に減少させる。いくつかの実施形態において、ジスキネジアの減少は、「ＯＦＦ」および「ＯＮ」状態でラッシュジスキネジア評価尺度（ＲＤＲＳ）を使用して、ベースラインからの評価尺度に基づいて判定される。
【0151】
いくつかの実施形態において、ジスキネジアは、以下：（ａ）ベースラインと比較して、投与３ヶ月後に、日常生活に支障となるジスキネジアを伴うハウザー日記ＯＮ時間（Hauser diary ON time）の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％または少なくとも９０％の減少；（ｂ）ベースラインと比較して、投与３ヶ月後に、ＵＰＤＲＳ－ＩＶスコアの少なくとも５０％の減少、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７４％または少なくとも７５％の減少、および（ｃ）ベースラインと比較して、投与３ヶ月後に、ラッシュジスキネジアスコアの少なくとも１０％、少なくとも１２％、少なくとも１５％、少なくとも１８％、少なくとも２０％または少なくとも２５％の改善、の１またはそれより多くによって示されるように、前記対象において減少する。
【0152】
いくつかの実施形態において、運動機能に対する臨床的な標準化された測定、例えば、ＵＰＤＲＳ－ＩＩＩ（運動）ＯＦＦスコアが、本開示の核酸構築物を含むウイルスベクター（例えば、Ｌｅｎｔｉ－ＰＤ）の投与後に改善される。いくつかの実施形態において、運動機能は、ベースラインと比較して、投与３ヶ月後の平均ＵＰＤＲＳ－ＩＩＩ（運動）ＯＦＦスコアの少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４２％、少なくとも４５％または少なくとも５０％の増加によって示されるように改善される。いくつかの実施形態において、運動機能は、ベースラインと比較して、投与３ヶ月後の平均ＵＰＤＲＳ－ＩＩＩ（運動）ＯＦＦスコアの少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２２、少なくとも２５、少なくとも３０または少なくとも３５ポイントの増加によって示されるように改善される。
【0153】
いくつかの実施形態において、投与後約３ヶ月に、対象の平均ＵＰＤＲＳ ＯＦＦ総スコアは、ベースラインから少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５５％または少なくとも６０％改善する。いくつかの実施形態において、対象のベースラインＵＰＤＲＳパートＩＩＩ（運動）ＯＦＦスコアは、３０～６０である。
【0154】
いくつかの実施形態において、本開示の核酸構築物を含むウイルスベクター（例えば、Ｌｅｎｔｉ－ＰＤ）の投与後に、ＵＰＤＲＳ－ＩＩ（日常生活動作）ＯＦＦスコアが改善される。いくつかの実施形態において、ベースラインと比較して、投与３ヶ月後の平均ＵＰＤＲＳ－ＩＩ ＯＦＦスコアの少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４２％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％または少なくとも８０％の増加によって示されるように、ＵＰＤＲＳ－ＩＩ ＯＦＦスコアが改善される。いくつかの実施形態において、運動機能は、ベースラインと比較して、投与３ヶ月後の平均ＵＰＤＲＳ－ＩＩ ＯＦＦスコアの少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２２、少なくとも２５、少なくとも３０または少なくとも３５ポイントの増加によって示されるように改善される。
【0155】
いくつかの実施形態において、本開示の核酸構築物を含むウイルスベクター（例えば、Ｌｅｎｔｉ－ＰＤ）の投与後に、ＵＰＤＲＳ－ＩＶ（治療の合併症）ＯＦＦスコアが改善される。いくつかの実施形態において、ベースラインと比較して、投与３ヶ月後の平均ＵＰＤＲＳ－ＩＶ ＯＦＦスコアの少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４２％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％または少なくとも８０％の増加によって示されるように、ＵＰＤＲＳ－ＩＶ ＯＦＦスコアが改善される。いくつかの実施形態において、運動機能は、ベースラインと比較して、投与３ヶ月後の平均ＵＰＤＲＳ－ＩＩ ＯＦＦスコアの少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０または少なくとも１２ポイントの増加によって示されるように改善される。
【0156】
いくつかの実施形態において、本開示のウイルスベクターは、神経学的状態を処置するために使用することができる。例えば、ベクターは、パーキンソン病（ＰＤ）などの神経変性疾患の処置および／または予防に有用であり得る。疾患は、対象におけるＬ－ドパおよび／またはドーパミンの産生によって処置可能であり得る。疾患は、パーキンソン病、例えば、両側性特発性パーキンソン病であり得る。いくつかの実施形態において、処置は、ＰＤの後期段階のためのものであり、例えば、経口Ｌ－ドパ処置に対して難治性になった患者における処置である。
【0157】
本明細書に記載されているある特定の構築物は、Ｌ－ドパの産生を増加させ、および／またはドーパミンの産生を増加させる。Ｌ－ドパの増加された産生は、残存するＡＡＤＣ酵素活性を保持し、したがってＬ－ドパをドーパミンに変換することが少なくとも部分的に可能である患者において有用であり得る。これらの患者は、従来のＬ－ドパ処置に対して感受性であり得る。例えば、ＴＨ－Ｌ－ＣＨ１－ＩＲＥＳ－ＡＡＤＣ構築物は、高レベルのドーパミンおよびＬ－ドパの両方を産生したのに対して、ＴＨ－Ｌ－ＡＡＤＣ－ＩＲＥＳ－ＣＨ１およびＡＡＤＣ－Ｌ－ＴＨ－Ｌ－ＣＨ１は、Ｌ－ドパと比較してより高レベルのドーパミンを産生した。
【0158】
ドーパミンの増加した産生は、Ｌ－ドパを処理するのに十分な内因性ＡＡＤＣ活性を欠き、したがって従来のＬ－ドパ処置に対する感受性がより低い後期患者において有用であり得る。
【0159】
いくつかの実施形態において、対象はＬ－ドパまたはＬＥＤ治療（ＬＥＤ＝Ｌ－ドパ換算用量の薬物）中である。いくつかの実施形態において、対象は、Ｌ－ドパまたはＬＥＤ治療を受けている。いくつかの実施形態において、対象のＬ－ドパまたはＬＥＤ治療用量は、本開示の核酸構築物の投与前の対象のＬ－ドパまたはＬＥＤ治療用量と比較して、本開示の核酸構築物（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）を含むウイルスベクターの投与後に減少する。いくつかの実施形態において、平均１日（average daily）Ｌ－ドパまたはＬＥＤ治療用量は、本開示の核酸構築物を含むウイルスベクターの投与３ヶ月後に、ベースラインから少なくとも１０％、少なくとも１２％、少なくとも１４％、少なくとも１５％、少なくとも１６％、少なくとも１７％、少なくとも１８％、少なくとも１９％、少なくとも２０％または少なくとも２５％減少する。
【0160】
いくつかの実施形態において、本開示の方法は、パーキンソン病の１またはそれを超える症状を改善する。いくつかの実施形態において、１またはそれを超える症状は、振戦、運動緩徐、筋肉硬直、姿勢および／または平衡障害、自動運動の喪失、発話困難ならびに微細運動技能の困難からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、症状は、振戦または揺れを含み、通常は四肢、しばしば手または指において始まる。いくつかの実施形態において、症状は、運動緩徐（鈍化した動き）を含む。時が経過するにつれて、パーキンソン病は、対象の動きを遅くして、単純な作業が困難になり、時間を要するようになる。いくつかの実施形態において、症状は、筋肉硬直、例えば、対象の身体の任意の部分における筋肉のこわばりを含む。こわばった筋肉は、痛みを伴い、可動域を制限することがある。いくつかの実施形態において、症状は、姿勢および／または平衡障害を含む。いくつかの実施形態において、症状は、発話困難を含む。いくつかの実施形態において、症状は、微細運動技能、例えば筆記の困難を含む。
【0161】
ここで、実施例によって本開示をさらに説明するが、実施例は本開示を実施する上で当業者を補助するのに役立つことが意図されており、決して本発明の範囲を限定することが意図されているわけではない。
【実施例】
【0162】
［実施例１］
「Ｌｅｎｔｉ－ＰＤ」は、非病原性野生型ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に基づく非複製非霊長類組換えレンチウイルスベクター（ＬＶ）である。野生型ＥＩＡＶゲノムは６つの異なる遺伝子単位を有するが、これらのＥＩＡＶ配列の大部分（約９０％）が除去されて、元のウイルスゲノムの１０％未満を含有し、天然のウイルスプロモーターまたはエンハンサーのいずれも含有せず、ＥＩＡＶゲノム中またはパッケージング系中のいずれにもアクセサリータンパク質のコード領域が存在しない複製欠損最小ベクター系が作製された。Ｌｅｎｔｉ－ＰＤは、切断型のヒトチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、ヒトＧＴＰ－シクロヒドロラーゼ１（ＣＨ１）およびヒト芳香族Ｌ－アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）をコードするドーパミン酵素融合プラスミドを含有する。Ｌｅｎｔｉ－ＰＤ構築物を図２Ａに示す。
「Ｌｅｎｔｉ－ＰＤ」は、非病原性野生型ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に基づく非複製非霊長類組換えレンチウイルスベクター（ＬＶ）である。野生型ＥＩＡＶゲノムは６つの異なる遺伝子単位を有するが、これらのＥＩＡＶ配列の大部分（約９０％）が除去されて、元のウイルスゲノムの１０％未満を含有し、天然のウイルスプロモーターまたはエンハンサーのいずれも含有せず、ＥＩＡＶゲノム中またはパッケージング系中のいずれにもアクセサリータンパク質のコード領域が存在しない複製欠損最小ベクター系が作製された。Ｌｅｎｔｉ－ＰＤは、切断型のヒトチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、ヒトＧＴＰ－シクロヒドロラーゼ１（ＣＨ１）およびヒト芳香族Ｌ－アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）をコードするドーパミン酵素融合プラスミドを含有する。Ｌｅｎｔｉ－ＰＤ構築物を図２Ａに示す。
【0163】
ＰｒｏＳａｖｉｎ（登録商標）は、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）ベースのＬＶである。ＰｒｏＳａｖｉｎ（登録商標）も、コード配列ＴＨ、ＡＡＤＣおよびＣＨ１を含むトリシストロン性構築物を含有し、この構築物中では、これらのコード配列は２つの内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）によって機能的に連結されている。ＰｒｏＳａｖｉｎ（登録商標）の構築物を図２Ｂに示す。
【0164】
ＰｒｏＳａｖｉｎ（登録商標）構築物とＬｅｎｔｉ－ＰＤ構築物との相違には、Ｌｅｎｔｉ－ＰＤでは、発現を増強するためにＣＨ１がプロモーターにより近接するように動かされており、Ｌｅｎｔｉ－ＰＤでは、共局在化を確実にするためにＴＨとＣＨ１が柔軟なリンカーによって連結されていることが含まれる。
【0165】
プラスミドを調製するために、より最近ではｐＯＮＹ８．９．４ＴＹ（ＫａｎＲ遺伝子を含有する）として記載されている最小のｐＯＮＹＫ１ゲノムプラスミド（Ｊａｒｒａｙａら、２００９，Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １，２ｒａ４）を使用した。このプラスミドは、ｐＯＮＹ８．０Ｔを基礎とするものであり、ｐＯＮＹ８．０Ｔは、Ａｚｚｏｕｚ Ｍら（Ａｚｚｏｕｚら、２００２ Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２２，１０３０２－１０３１２）によってより詳細に記載されている。簡単に記載すると、ｐＯＮＹＫ１は、（順番に）Ｎｅｏ、内部ＣＭＶプロモーター、切断され、コドン最適化されたヒトチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、ＥＭＣＶ内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、コドン最適化されたヒト芳香族アミノ酸ドーパデカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）、ポリオウイルスＩＲＥＳ、ＧＴＰ－シクロヒドロラーゼＩ（ＧＴＰ－ＣＨ１）およびウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含有するカセットがその中に挿入されたＥＩＡＶ ＳＩＮベクターゲノムである。合成されたＤＮＡ（ＧｅｎｅＡｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の領域をトリシストロン性カセット中に挿入し、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ領域および第１の遺伝子の終止コドンをＧＳ１５リンカーで置き換えることによって、２つの融合された遺伝子（ＴＨおよびＣＨ１）と１つのＰＶ ＩＲＥＳエレメントとを含有するＬｅｎｔｉ－ＰＤ融合プラスミドを作製した。ＧＳ１５リンカーは、３回繰り返された、１個のセリンアミノ酸が後続する４個のグリシンアミノ酸をコードし、１５アミノ酸のリンカーを生じる。このＧＳ１５リンカーのＤＮＡ配列は以下のとおりである。
ＧＧＧＧＧＡＧＧＣＧＧＴＡＧＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＧＧＣＴＣＣＧＧＣＧＧＡＧＧＣＧＧＧＡＧＣ（配列番号３）。
ＧＧＧＧＧＡＧＧＣＧＧＴＡＧＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＧＧＣＴＣＣＧＧＣＧＧＡＧＧＣＧＧＧＡＧＣ（配列番号３）。
【0166】
ＶＳＶ－ＧエンベロープおよびＥＩＡＶ合成Ｇａｇ／Ｐｏｌプラスミドを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中でのウイルスベクター産生のために使用した。組み込み（ＤＮＡ）力価アッセイによって、形質導入単位／ｍｌ（ＴＵ／ｍｌ）でのベクター力価を推定した。
【0167】
Ｌｅｎｔｉ－ＰＤは、ＰｒｏＳａｖｉｎ（登録商標）と比較して、インビトロにおいて初代ヒト神経細胞中でドーパミンおよびＬ－ドパの産生のより大きな増加を達成した（図３）。
【0168】
［実施例２］
第２相パーキンソン病試験（低用量－コホート１）
両側性特発性パーキンソン病（ＰＤ）を有する対象（４８～７０歳）において、Ｌｅｎｔｉ－ＰＤの第２相試験（ＳＵＮＲＩＳＥ－ＰＤ、ＮＣＴ０３７２０４１８）を開始した。診断は、英国パーキンソン病学会（ＰＤＳ）ブレインバンク基準を使用して行ったが、１人を超える罹患した血縁者を有する対象を特に除外しなかった。臨床試験研究設計のパートＡは、図４Ａに示されている用量漸増部分である。臨床試験研究のパートＢは、図４Ｂに示されているような拡大コホート対模倣手術手順部分である。
第２相パーキンソン病試験（低用量－コホート１）
両側性特発性パーキンソン病（ＰＤ）を有する対象（４８～７０歳）において、Ｌｅｎｔｉ－ＰＤの第２相試験（ＳＵＮＲＩＳＥ－ＰＤ、ＮＣＴ０３７２０４１８）を開始した。診断は、英国パーキンソン病学会（ＰＤＳ）ブレインバンク基準を使用して行ったが、１人を超える罹患した血縁者を有する対象を特に除外しなかった。臨床試験研究設計のパートＡは、図４Ａに示されている用量漸増部分である。臨床試験研究のパートＢは、図４Ｂに示されているような拡大コホート対模倣手術手順部分である。
【0169】
Ｌｅｎｔｉ－ＰＤは、ドーパミン合成のために必要とされる一群の酵素をコードするための単一のレンチウイルスベクターを介して、３つの酵素：切断型のヒトチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、ヒトＧＴＰ－シクロヒドロラーゼ１（ＣＨ１）およびヒト芳香族Ｌ－アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）をコードする遺伝子を送達する。
【0170】
進行中の第２相試験の用量漸増部分の用量レベル１コホートにおいて、２名の対象に４．２×１０６ＴＵのＬｅｎｔｉ－ＰＤを投与し、Ｌｅｎｔｉ－ＰＤの最低計画用量を試験した。この「低用量」コホート（用量レベル１）からの３ヶ月目データを収集した。このコホートは、低用量でＬｅｎｔｉ－ＰＤの１回投与を受けた進行したパーキンソン病の対象２名を含んでいた。
【0171】
以下のもの：マンニトール（１．０％ ｗ／ｖ）、トロメタミン（ＴＲＩＳ）（２０ｍＭ）、スクロース（１．０％）、塩化ナトリウム（１００ｍＭ）、塩酸（ｐＨ ７．３になるように適量）および注射用水を用いて、線条体注入のための液体生成物としてＬｅｎｔｉ－ＰＤを製剤化した。
【0172】
非ドーパミン作動性神経細胞中でのコードされたタンパク質の発現を可能にするＰＤ対象の感覚運動被殻中への局所的両側性定位注入によって、Ｌｅｎｔｉ－ＰＤを対象に送達した。少容量（１００μＬ）で、制御された速度（約３μＬ／分）にて、被殻内に直接、Ｌｅｎｔｉ－ＰＤが投与され、第１の半球中の３つの路および第２の半球中の３つの路を介して為された。
【0173】
統一パーキンソン病評価尺度（ＵＰＤＲＳ）スコアは、０から１９９の範囲の医師によって評価される尺度であり、より低いスコアは改善を示す。ＵＰＤＲＳパートＩＩＩ（運動）ＯＦＦスコアは、パーキンソン病における運動機能の客観的で十分に検証された尺度である。対象が経口レボドパ治療を休止している間に、ＯＦＦスコアを評価した。対象がレボドパ「ＯＦＦ」状態にある間に対象を評価することによって、バックグラウンド医療処置の潜在的な交絡作用なしに治療の利益を捕捉するようにＵＰＤＲＳ ＯＦＦスコアを設計した。ＵＰＤＲＳパートＩＩＩ（運動）ＯＦＦスコアを通じて反映された進行を図５に示す。用量レベル１の対象は、３０～６０のベースラインＵＰＤＲＳパートＩＩＩ（運動）ＯＦＦスコアを有していた。
【0174】
「ＯＦＦ」／「ＯＮ」臨床評価およびＰＥＴ評価のために、対象はＰＤ薬物療法を中止した。最後のＬ－ドパ用量は、「ＯＦＦ」評価の少なくとも１２時間前でなければならない。「ＯＮ」評価については、効果的な「ＯＮ」応答を達成するのに十分なＬ－ドパの負荷用量（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ ｄｏｓｅ）が対象に与えられ、これは通常、対象の通常の朝の用量の１００％～１５０％である。対象および検査者による判断によって良好な「ＯＮ」応答に達した時点で、「ＯＮ」評価を記録した。タイミングは、投与の少なくとも１時間後であった。試験中にＬ－ドパ治療に対する対象の必要性が減少した場合、研究者はＬ－ドパ負荷用量をそれに応じて調整した。
【0175】
３ヶ月で、用量レベル１コホート中の対象は、Ｌｅｎｔｉ－ＰＤを受けた後、ベースラインからの５５％の改善に相当する、５４．５ポイントの平均ＵＰＤＲＳ ＯＦＦ総スコア改善を経験した。
【0176】
複数のＵＰＤＲＳ下位尺度にわたる一貫した改善も観察された。対象は、図６に示されているように運動検査下位尺度（ＵＰＤＲＳパートＩＩＩ ＯＦＦ）に関してベースラインから２５ポイントの改善、図７Ａに示されているように日常生活下位尺度（ＵＰＤＲＳパートＩＩ ＯＦＦ）に関してベースラインから２２ポイントの改善、および図７Ｂに示されているように治療の合併症下位尺度（ＵＰＤＲＳパートＩＶ ＯＦＦ）に関してベースラインから７ポイントの改善を経験した。
【0177】
６ヶ月で、対象は、図９Ａに示されているように運動検査下位尺度（ＵＰＤＲＳパートＩＩＩ ＯＦＦ）に関してベースラインから１７ポイントの改善、図９Ｂに示されているように日常生活下位尺度（ＵＰＤＲＳパートＩＩ ＯＦＦ）に関してベースラインから１９．５ポイントの改善、および図９Ｃに示されているように治療の合併症下位尺度（ＵＰＤＲＳパートＩＶ ＯＦＦ）に関してベースラインから３ポイントの改善を経験した。さらに、ベースラインから３ヶ月および６ヶ月への変化を評価するためにＰＤＱ－３９調査を実施した。ＰＤＱ－３９は、パーキンソン病に特異的な健康関連の質を評価する質問票である。対象は、図９Ｄに示されているように、ＰｒｏＳａｖｉｎ（登録商標）と比較して３２．１ポイントの６ヶ月平均改善を経験する。これは、およそ６５％のベースラインからの平均総スコア改善に相当し、３ヶ月の時点で測定されたベースラインからの約３７％の改善から上昇した。これらのデータは、直接比較の臨床試験ではなく、治験間比較に基づいている。
【0178】
Ｌｅｎｔｉ－ＰＤおよびＰｒｏＳａｖｉｎ（登録商標）はいずれも、ドーパミン生合成経路中の同一の３つの酵素をコードする。ＰｒｏＳａｖｉｎ（登録商標）を用いた別個の完了した第Ｉ／ＩＩ相試験は、非盲検用量漸増試験（ＰＳ１／００１／０７、ＥｕｄｒａＣＴ ２００７－００１１０９－２６）であり、この試験の対象は、処置後最長１０年間、ＰｒｏＳａｖｉｎ（登録商標）の安全性および耐容性を監視するように設計された長期追跡試験（ＰＳ１／００１／０９、ＥｕｄｒａＣＴ ２００９－０１７２５３－３５）に参加するように勧められた。
【0179】
最低用量コホート（４．２×１０６ＴＵの総用量）中の、Ｌｅｎｔｉ－ＰＤで処置された両対象は、以前に試験されたＰｒｏＳａｖｉｎ（登録商標）のあらゆる用量コホート中で観察された平均改善よりも大きな、ＵＰＤＲＳパートＩＩＩ ＯＦＦスコアの個々の改善を示した。まとめると、これらの結果は、以前に試験されたＰｒｏＳａｖｉｎ（登録商標）の最高用量（１．０×１０８ＴＵの総用量）と比較して、３ヶ月でのＬｅｎｔｉ－ＰＤに対してより大きな有効性を示唆する。この研究から得られたＬｅｎｔｉ－ＰＤについての、および以前の臨床試験から得られたＰｒｏＳａｖｉｎ（登録商標）についてのＵＰＤＲＳ尺度に関する結果の詳細な要約を以下の表１に示す。
【表1】
【0180】
対象は、レボドパを含むＰＤ薬物療法を管理するための標準的な臨床ケアを継続した。３ヶ月目の時点で、平均レボドパ換算用量（ＬＥＤ）は、用量レベル１の対象では２０８ｍｇ減少した。これは、ベースラインから１９％の平均減少に相当する。
【0181】
用量レベル１の対象は、対象が経口レボドパを服用している間の日常生活動作中の機能的障害の客観的評価であるラッシュジスキネジア評価尺度ＯＮスコアによって測定されるジスキネジアの１８％の改善も経験した。表１に示されているように、治療の合併症の中で特にジスキネジアの身体障害および持続期間を捉えるＵＰＤＲＳパートＩＶのスコアも改善された。さらに、結果は、試験された最低用量のＬｅｎｔｉ－ＰＤが、以前に試験された最高用量のＰｒｏＳａｖｉｎ（登録商標）より実質的に大きな生物学的活性を有したことを裏付けている。
【0182】
主観的対象日記（ハウザー患者日記）を用量レベル１の対象から収集した。対象によって記録された日記の内容には変動が存在したが、両対象は、ベースラインから３．５時間（５７％）の平均減少で、ジスキネジアを伴う日記ＯＮ時間の改善を示した。日常生活に支障となる（ｔｒｏｕｂｌｅｓｏｍｅ）ジスキネジアを伴う日記ＯＮ時間においても一貫した利益が観察され、ベースラインからの１．３時間（８７％）の平均減少であった。主観的対象日記（subjective subject diary）およびレボドパ換算用量（ＬＥＤ）の結果を図８に要約する。
【0183】
被殻内での一定したドーパミン作動性緊張レベルの維持は、Ｌ－ドパおよびドーパミンアゴニスト治療のレベルを低下させ、より長い「ＯＮ」期間およびより短い「ＯＦＦ」期間を有する持続的な運動矯正を与える可能性を提供する。
【0184】
これらの結果は、Ｌｅｎｔｉ－ＰＤが、進行したパーキンソン病を有する対象において、運動機能の改善（例えば、３ヶ月で達成されたＵＰＤＲＳ－ＩＩＩ（運動）ＯＦＦベネフィットの２５ポイント（４２％）の増加、および６ヶ月で達成されたＵＰＤＲＳ－ＩＩＩ（運動）ＯＦＦベネフィットの１７ポイント（２９％）の増加）とジスキネジアの減少（例えば、日常生活に支障となるジスキネジアを伴う日記ＯＮ時間の８７％の減少；３ヶ月でのＵＰＤＲＳ－ＩＶの７４％の低下、６ヶ月でのＵＰＤＲＳ－ＩＶの３２％の低下、およびラッシュジスキネジアの１８％の改善）の両方を提供することを示唆する。
【0185】
さらに、患者が報告したハウザー日記を６ヶ月の時点で収集した。平均して、患者は、２．７時間のジスキネジアなしのＯＮ時間のベースラインからの改善、ジスキネジアありのＯＮ時間の３．９時間の改善、０．３時間の日常生活に支障となるジスキネジアなしのＯＮ時間の改善、１．５時間の日常生活に支障となるジスキネジアありのオン時間の改善、および０．９時間のＯＦＦ時間の悪化を経験した。６ヶ月目の時点で、平均レボドパ換算１日用量（ＬＥＤＤ）は２３３ｍｇ減少し、これはベースラインからの２１％の平均減少に相当する。手順またはベクター投与に関連する重篤な有害事象は観察されず、Ｌｅｎｔｉ－ＰＤは一般に良好に耐容された。対象の第２コホートにおいて試験されるべき総用量は１．４×１０７ＴＵである。
【0186】
［実施例３］
パーキンソン病研究のための霊長類モデル
ＰＤのＭＰＴＰマカクモデルでのＬｅｎｔｉ－ＰＤの有効性を評価するために、霊長類研究を行った。Ｌｅｎｔｉ－ＰＤの安全性を評価するために、別個のＧＬＰ研究を霊長類において行った。有効性試験には、試験開始時に４～５歳の１６匹の雄のカニクイザルが含まれた。動物を５つの実験群に分けた。ベクター投与後６ヶ月で、すべての処置された動物は、対照と比較して臨床評価スコアおよび自発運動活性の有意な改善を示し、Ｌｅｎｔｉ－ＰＤ高用量（ＨＤ）群で最も高い回復が観察された。本研究において用いられたベクター調製物が表２に示されており、投与量が表３に示されている。各研究群において、Ｌｅｎｔｉ－ＰＤ全用量または１／５用量、ＰｒｏＳａｖｉｎ（登録商標）、ＥＩＡＶ－ＬａｃＺまたはＥＩＡＶ－Ｎｕｌｌで４匹の動物を処置した。ＥＩＡＶ－ＬａｃＺ群とＥＩＡＶ－ｎｕｌｌベクター群の両方を対照群として使用した。各群に対して使用された投与量の概要が表３に詳述されている。
パーキンソン病研究のための霊長類モデル
ＰＤのＭＰＴＰマカクモデルでのＬｅｎｔｉ－ＰＤの有効性を評価するために、霊長類研究を行った。Ｌｅｎｔｉ－ＰＤの安全性を評価するために、別個のＧＬＰ研究を霊長類において行った。有効性試験には、試験開始時に４～５歳の１６匹の雄のカニクイザルが含まれた。動物を５つの実験群に分けた。ベクター投与後６ヶ月で、すべての処置された動物は、対照と比較して臨床評価スコアおよび自発運動活性の有意な改善を示し、Ｌｅｎｔｉ－ＰＤ高用量（ＨＤ）群で最も高い回復が観察された。本研究において用いられたベクター調製物が表２に示されており、投与量が表３に示されている。各研究群において、Ｌｅｎｔｉ－ＰＤ全用量または１／５用量、ＰｒｏＳａｖｉｎ（登録商標）、ＥＩＡＶ－ＬａｃＺまたはＥＩＡＶ－Ｎｕｌｌで４匹の動物を処置した。ＥＩＡＶ－ＬａｃＺ群とＥＩＡＶ－ｎｕｌｌベクター群の両方を対照群として使用した。各群に対して使用された投与量の概要が表３に詳述されている。
【0187】
ＧＬＰ安全性研究では、年齢が３～５歳で、体重が２．１～３．６ｋｇの６匹の雄および６匹の雌の健康なカニクイザルを研究に採用した。対照（ＴＳＳＭ緩衝液）群と試験Ｌｅｎｔｉ－ＰＤ群に動物を均等に分けた。ＧＬＰ毒物学研究のための研究群およびベクターの割り当てを表４に示す。
【表2】
【表3】
【表4】
【0188】
臨床スコア
有効性研究は、欧州（ＥＵ指令８６／６０９／ＥＥＣ）に従って実施した。動物の苦痛を最小限に抑えるためにあらゆる努力がなされ、動物の世話は、非ヒト霊長類の健康管理および飼育に熟練した獣医および動物技術者によって監督された。平均年齢２．５±０．１歳および平均体重３．４８±０．１ ｋｇの１６匹の成体雄カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ、Ｓｉｃｏｍｂｒｅｃ、Ｐｈｉｌｉｐｐｉｎｅｓにより供給）を、食物および水に自由にアクセスできる標準的な環境条件下（１２時間明暗サイクル、温度：２２±１°Ｃ、湿度：５０％）で飼育した。ＭＰＴＰ中毒後、すべての研究動物がパーキンソン症状を発症し、すべての群にわたって臨床評価スコア（ＣＲＳ）の同様の増加が観察された（図１０Ａを参照）。
有効性研究は、欧州（ＥＵ指令８６／６０９／ＥＥＣ）に従って実施した。動物の苦痛を最小限に抑えるためにあらゆる努力がなされ、動物の世話は、非ヒト霊長類の健康管理および飼育に熟練した獣医および動物技術者によって監督された。平均年齢２．５±０．１歳および平均体重３．４８±０．１ ｋｇの１６匹の成体雄カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ、Ｓｉｃｏｍｂｒｅｃ、Ｐｈｉｌｉｐｐｉｎｅｓにより供給）を、食物および水に自由にアクセスできる標準的な環境条件下（１２時間明暗サイクル、温度：２２±１°Ｃ、湿度：５０％）で飼育した。ＭＰＴＰ中毒後、すべての研究動物がパーキンソン症状を発症し、すべての群にわたって臨床評価スコア（ＣＲＳ）の同様の増加が観察された（図１０Ａを参照）。
【0189】
ベクター投与後、ＥＩＡＶ－Ｎｕｌｌ群は安定してパーキンソン病様（Parkinsonian）のままであり、スコアはすべての時点にわたってベースラインと同様であった。他のすべての処置群（ＰｒｏＳａｖｉｎ（登録商標）、Ｌｅｎｔｉ－ＰＤ ＬＤ、Ｌｅｎｔｉ－ＰＤ ＨＤ）に関しては、ＣＲＳの進行性の改善が６ヶ月の評価期間にわたって観察された。３つの群はすべて、２～６ヶ月のすべての時点で、ＥＩＡＶ－Ｎｕｌｌ対照群からのＣＲＳの有意な差を示した。反復測定ＡＮＯＶＡ分析は、有意な群効果（ｐ＝０．０００１）および時間効果（ｐ＜０．０００１）を実証した。フィッシャーのＬＳＤ事後分析により、すべての処置群がＥＩＡＶ－Ｎｕｌｌベクター対照群と有意に異なることが明らかになった（ＰｒｏＳａｖｉｎ（登録商標）、ｐ＝０．０００５；Ｌｅｎｔｉ－ＰＤ ＨＤ、ｐ＝０．００１；Ｌｅｎｔｉ－ＰＤ ＬＤ、ｐ＝０．００１）。
【0190】
運動活性
ベースライン、ＭＰＴＰ中毒後ならびに３ヶ月および６ヶ月でのベクター投与後に、すべての動物に対して運動活性のビデオをベースとした定量を行った。ＭＰＴＰ中毒後、すべての研究動物は、総移動距離（ＴＤＭ）によって評価した場合、平均自発運動活性の少なくとも９０％＋／－の減少を示した（図１０Ｂ参照）。ベクター投与後３および６ヶ月で、３つの処置群すべてが、ＭＰＴＰ後の値と比較してＴＤＭの増加を示した。Ｌｅｎｔｉ－ＰＤ ＨＤ群は、両時点でＴＤＭの最大の改善を示した（３ヶ月で８７％＋／－１および６ヶ月で９１％＋／－１）。ＭＰＴＰ後の値からの百分率変化として運動活性の差を見る反復測定ＡＮＯＶＡは、有意な群効果（ｐ＝０．０００３）、時間効果（ｐ＜０．０００１）および時間群効果（ｐ＜０．０００１）を示した。ＬＳＤ事後分析により、すべての処置群がＥＩＡＶ－Ｎｕｌｌベクター対照群と有意に異なることが明らかになった（ＰｒｏＳａｖｉｎ（登録商標）、ｐ＝０．００１；Ｌｅｎｔｉ－ＰＤ ＬＤ、ｐ＝０．００２；Ｌｅｎｔｉ－ＰＤ ＨＤ、ｐ＜０．００１）。
ベースライン、ＭＰＴＰ中毒後ならびに３ヶ月および６ヶ月でのベクター投与後に、すべての動物に対して運動活性のビデオをベースとした定量を行った。ＭＰＴＰ中毒後、すべての研究動物は、総移動距離（ＴＤＭ）によって評価した場合、平均自発運動活性の少なくとも９０％＋／－の減少を示した（図１０Ｂ参照）。ベクター投与後３および６ヶ月で、３つの処置群すべてが、ＭＰＴＰ後の値と比較してＴＤＭの増加を示した。Ｌｅｎｔｉ－ＰＤ ＨＤ群は、両時点でＴＤＭの最大の改善を示した（３ヶ月で８７％＋／－１および６ヶ月で９１％＋／－１）。ＭＰＴＰ後の値からの百分率変化として運動活性の差を見る反復測定ＡＮＯＶＡは、有意な群効果（ｐ＝０．０００３）、時間効果（ｐ＜０．０００１）および時間群効果（ｐ＜０．０００１）を示した。ＬＳＤ事後分析により、すべての処置群がＥＩＡＶ－Ｎｕｌｌベクター対照群と有意に異なることが明らかになった（ＰｒｏＳａｖｉｎ（登録商標）、ｐ＝０．００１；Ｌｅｎｔｉ－ＰＤ ＬＤ、ｐ＝０．００２；Ｌｅｎｔｉ－ＰＤ ＨＤ、ｐ＜０．００１）。
【0191】
生体内分布
ＧＬＰ安全性研究における各動物から、バフィーコートの試料を収集し、２週目および４週目に分析し、血漿試料を収集し、処置後２週目にｑＰＣＲまたはｑＲＴ－ＰＣＲ分析によってベクターの存在について分析した。研究の終わりに、測定された多種多様な組織および臓器重量に対して完全な肉眼的および顕微鏡的検査を行った。脳外のベクター存在のためにさらなる組織および体液試料も収集し、Ｌｅｎｔｉ－ＰＤベクターまたは導入遺伝子の成分に対する抗体応答のウェスタンブロット分析のために研究全体を通して定期的な採血を行った。ベクターまたは緩衝液の投与前および投与後に得られた試料に対して、完全な臨床化学および尿分析も行った。全身生体内分布分析は、ベクター関連ＲＮＡおよびＤＮＡ配列がＬｅｎｔｉ－ＰＤ処置動物由来からの生物学的試料の大部分において検出されなかったことを示した。ベクター関連ＤＮＡ配列は、アッセイの定量下限を下回るレベルで少数の試料においてのみ検出された。血漿中でのベクター粒子（ＲＮＡ）転移または持続および脳脊髄液中の流出は存在しなかった。ベクター関連ＲＮＡまたはＤＮＡ配列の一貫したまたは強固な存在の兆候は存在しなかった。
ＧＬＰ安全性研究における各動物から、バフィーコートの試料を収集し、２週目および４週目に分析し、血漿試料を収集し、処置後２週目にｑＰＣＲまたはｑＲＴ－ＰＣＲ分析によってベクターの存在について分析した。研究の終わりに、測定された多種多様な組織および臓器重量に対して完全な肉眼的および顕微鏡的検査を行った。脳外のベクター存在のためにさらなる組織および体液試料も収集し、Ｌｅｎｔｉ－ＰＤベクターまたは導入遺伝子の成分に対する抗体応答のウェスタンブロット分析のために研究全体を通して定期的な採血を行った。ベクターまたは緩衝液の投与前および投与後に得られた試料に対して、完全な臨床化学および尿分析も行った。全身生体内分布分析は、ベクター関連ＲＮＡおよびＤＮＡ配列がＬｅｎｔｉ－ＰＤ処置動物由来からの生物学的試料の大部分において検出されなかったことを示した。ベクター関連ＤＮＡ配列は、アッセイの定量下限を下回るレベルで少数の試料においてのみ検出された。血漿中でのベクター粒子（ＲＮＡ）転移または持続および脳脊髄液中の流出は存在しなかった。ベクター関連ＲＮＡまたはＤＮＡ配列の一貫したまたは強固な存在の兆候は存在しなかった。
【0192】
毒性学
Ｌｅｎｔｉ－ＰＤに対する毒性の評価は、死亡率、臨床徴候、体重および定性的な食物消費に基づいた。さらに、眼底検査、心電図検査および血圧測定によって、生存時評価を行った。優良試験所規範（ＧＬＰ）毒性学研究では、正常な健康なカニクイザルにおけるＬｅｎｔｉ－ＰＤベクターの両側性線条体内送達の耐容性を調査した。この試験に使用されたベクターは、優良医薬品製造基準（ＧＭＰ）製造プロセスを使用して作製した。２６週間の観察期間にわたって、Ｌｅｎｔｉ－ＰＤは、耐容性が良好であり、臨床徴候も異常な所見も認められないことが実証された。身体検査および活動の評価、ジスキネジア評点および行動のスコアリングは、Ｌｅｎｔｉ－ＰＤ関連の効果を明らかにしなかった。さらに、体重、食欲、眼底検査、心電図（ＥＣＧ）、血圧、臨床病理、肉眼的所見または臓器重量に処置関連の変化は存在しなかった。Ｌｅｎｔｉ－ＰＤの処置に関連すると考えられる顕微鏡的所見は、注射部位における色素性マクロファージ浸潤を伴う／伴わない、最小から軽度の血管周囲単核細胞浸潤であった。これらは、全身的な所見と一切関連がなかった。
Ｌｅｎｔｉ－ＰＤに対する毒性の評価は、死亡率、臨床徴候、体重および定性的な食物消費に基づいた。さらに、眼底検査、心電図検査および血圧測定によって、生存時評価を行った。優良試験所規範（ＧＬＰ）毒性学研究では、正常な健康なカニクイザルにおけるＬｅｎｔｉ－ＰＤベクターの両側性線条体内送達の耐容性を調査した。この試験に使用されたベクターは、優良医薬品製造基準（ＧＭＰ）製造プロセスを使用して作製した。２６週間の観察期間にわたって、Ｌｅｎｔｉ－ＰＤは、耐容性が良好であり、臨床徴候も異常な所見も認められないことが実証された。身体検査および活動の評価、ジスキネジア評点および行動のスコアリングは、Ｌｅｎｔｉ－ＰＤ関連の効果を明らかにしなかった。さらに、体重、食欲、眼底検査、心電図（ＥＣＧ）、血圧、臨床病理、肉眼的所見または臓器重量に処置関連の変化は存在しなかった。Ｌｅｎｔｉ－ＰＤの処置に関連すると考えられる顕微鏡的所見は、注射部位における色素性マクロファージ浸潤を伴う／伴わない、最小から軽度の血管周囲単核細胞浸潤であった。これらは、全身的な所見と一切関連がなかった。
【0193】
上記の明細書で言及されたすべての刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。本開示の記載された方法および系の様々な改変および変形が、本開示の範囲および精神から逸脱することなく、当業者には明らかである。本開示は特定の好ましい実施形態に関連して説明されてきたが、権利が請求されている発明はそのような特定の実施形態に不当に限定されるべきではないことが理解されるべきである。実際に、分子生物学、ウイルス学、神経生物学または関連分野の当業者に明らかである、本発明を実施するための記載された態様の様々な改変は、以下の特許請求の範囲内に属することが意図される。
【0194】
（項目１）
神経変性疾患または内因性ドーパミンレベルが対象中において低下する疾患に罹患している前記対象における運動機能を改善し、ジスキネジアを軽減する方法であって、（ｉ）チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）をコードするヌクレオチド配列、（ｉｉ）ＧＴＰ－シクロヒドロラーゼＩ（ＣＨ１）をコードするヌクレオチド配列、（ｉｉｉ）芳香族アミノ酸ドーパデカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）をコードするヌクレオチド配列、またはこれらの任意の組み合わせを含む核酸構築物を含む有効量のウイルスベクターを前記対象に投与することを含む、方法。
（項目２）
前記神経変性疾患または内因性ドーパミンレベルが低下する疾患がパーキンソン病である、項目１に記載の方法。
（項目３）
パーキンソン病に罹患している対象における運動機能を処置または改善し、ジスキネジアを軽減する方法であって、（ａ）（ｉ）チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）をコードするヌクレオチド配列、（ｉｉ）ＧＴＰ－シクロヒドロラーゼＩ（ＣＨ１）をコードするヌクレオチド配列、（ｉｉｉ）芳香族アミノ酸ドーパデカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）をコードするヌクレオチド配列またはこれらの任意の組み合わせを含む核酸構築物を含むウイルスベクターと、（ｂ）薬学的に許容され得る賦形剤とを含む治療有効量の組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
（項目４）
前記対象がＬ－ドパまたはＬＥＤ治療を受けている、項目２または３に記載の方法。
（項目５）
前記対象のＬ－ドパまたはＬＥＤ治療用量が、投与前の前記対象のＬ－ドパまたはＬＥＤ治療用量と比較して、前記核酸構築物の投与後３ヶ月以内に減少する、項目１～４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
前記平均Ｌ－ドパまたはＬＥＤ治療用量が、投与後３ヶ月に、ベースラインから少なくとも１０％、少なくとも１２％、少なくとも１４％、少なくとも１５％、少なくとも１６％、少なくとも１７％、少なくとも１８％または少なくとも１９％減少する、項目４～５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
前記ウイルスベクターが、１×１０６ＴＵ／対象～５×１０８ＴＵ／対象の目標用量で投与される、項目１～６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
前記目標用量が、約４×１０６ＴＵ／対象～８×１０６ＴＵ／対象、８×１０６ＴＵ／対象～４×１０７ＴＵ／対象または１×１０７ＴＵ／対象～５×１０８ＴＵ／対象である、項目７に記載の方法。
（項目９）
投与が１回投与である、項目１～８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
投与が脳に対する投与である、項目１～９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
前記投与が注入による被殻への投与である、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
（ｉ）チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）をコードするヌクレオチド配列と、（ｉｉ）ＧＴＰ－シクロヒドロラーゼＩ（ＣＨ１）をコードするヌクレオチド配列と、（ｉｉｉ）芳香族アミノ酸ドーパデカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）をコードするヌクレオチド配列とを含み、ＴＨをコードする前記ヌクレオチド配列は、ＴＨをコードする前記ヌクレオチド配列とＣＨ１をコードする前記ヌクレオチド配列が融合タンパク質ＴＨ－ＣＨ１をコードするように、ＣＨ１をコードする前記ヌクレオチド配列に連結されている、項目１～１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
前記核酸構築物が、
ＴＨ－Ｌ－ＣＨ１－ＩＲＥＳ－ＡＡＤＣ；
ＡＡＤＣ－Ｌ－ＴＨ－Ｌ－ＣＨ１；
ＴＨ－Ｌ－ＣＨ１－Ｌ－ＡＡＤＣ；
またはＴＨ－Ｌ－ＣＨ１－Ｌ－ＡＡＤＣ；
を含み、
ここで、Ｌはリンカーコード配列であり、ＩＲＥＳは内部リボソーム進入部位であり、Ｐはプロモーターである、
項目１～１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
前記核酸構築物がＴＨ－Ｌ－ＣＨ１－ＩＲＥＳ－ＡＡＤＣを含む、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記核酸構築物が、（ｉ）チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）をコードするヌクレオチド配列と、（ｉｉ）ＧＴＰ－シクロヒドロラーゼＩ（ＣＨ１）をコードするヌクレオチド配列と、（ｉｉｉ）芳香族アミノ酸ドーパデカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）をコードするヌクレオチド配列とを含み、ＴＨをコードする前記ヌクレオチド配列は、ＴＨをコードする前記ヌクレオチド配列とＣＨ１をコードする前記ヌクレオチド配列が融合タンパク質ＴＨ－ＣＨ１をコードするように、ＣＨ１をコードする前記ヌクレオチド配列に連結されており、前記構築物は、ＴＨ－Ｌ－ＣＨ１－ＩＲＥＳ－ＡＡＤＣまたはＴＨ－Ｌ－ＣＨ１－Ｐ－ＡＡＤＣを含み、ここで、Ｌはリンカーコード配列であり、ＩＲＥＳは内部リボソーム進入部位であり、Ｐはプロモーターである、項目１～１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
前記リンカー（Ｌ）がコドン最適化されていない、項目１３～１５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７）
前記リンカー（Ｌ）が、配列番号１または配列番号３として示される配列を含む、項目１３～１６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８）
前記核酸構築物が、構成的プロモーター、組織特異的プロモーターまたはこれらの組み合わせから選択されるプロモーター（Ｐ）をさらに含む、項目１～１７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
前記プロモーターが、ＣＭＶプロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーターまたはチミジンキナーゼプロモーターである、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記ウイルスベクターが、レンチウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルスベクターである、項目１～１９のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１）
前記ウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記ウイルスベクターがウイルス粒子である、項目１～２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２３）
前記ウイルス粒子がＥＩＡＶベクター粒子であり、ＶＳＶ－Ｇで偽型化されている、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記ウイルスベクターが、薬学的に許容され得る賦形剤および／または希釈剤を含む医薬組成物として製剤化される、項目１～２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
前記対象における運動機能が、ベースラインと比較して、投与３ヶ月後のＵＰＤＲＳ－ＩＩＩ（運動）ＯＦＦスコアの少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％または少なくとも４０％の増加によって示されるように改善される、項目１～２４のいずれか一項に記載の方法。
（項目２６）
以下：（ａ）ベースラインと比較して、投与３ヶ月後に、日常生活に支障となるジスキネジアを伴うハウザー日記ＯＮ時間の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％または少なくとも８５％の減少；（ｂ）ベースラインと比較して、投与３ヶ月後に、ＵＰＤＲＳ－ＩＶスコアの少なくとも５０％の減少、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％または少なくとも７４％の減少、および（ｃ）ベースラインと比較して、投与３ヶ月後に、ラッシュジスキネジアスコアの少なくとも１０％、少なくとも１２％、少なくとも１５％、少なくとも１８％の改善、の１またはそれより多くによって示されるように、ジスキネジアが前記対象において減少する、項目１～２５のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
振戦、運動緩徐、筋肉硬直、姿勢および／もしくは平衡障害、自動運動の喪失、発話困難、微細運動技能の困難またはこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される前記対象における１またはそれより多くの症状をさらに改善する、項目１～２６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
投与後３ヶ月以内に、投与前における前記対象のベースラインと比較して、前記対象が、改善された運動機能、減少したジスキネジアおよび減少したＬ－ドパまたはＬＥＤ治療用量を投与後に有する、項目１～２７のいずれか一項に記載の方法。
神経変性疾患または内因性ドーパミンレベルが対象中において低下する疾患に罹患している前記対象における運動機能を改善し、ジスキネジアを軽減する方法であって、（ｉ）チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）をコードするヌクレオチド配列、（ｉｉ）ＧＴＰ－シクロヒドロラーゼＩ（ＣＨ１）をコードするヌクレオチド配列、（ｉｉｉ）芳香族アミノ酸ドーパデカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）をコードするヌクレオチド配列、またはこれらの任意の組み合わせを含む核酸構築物を含む有効量のウイルスベクターを前記対象に投与することを含む、方法。
（項目２）
前記神経変性疾患または内因性ドーパミンレベルが低下する疾患がパーキンソン病である、項目１に記載の方法。
（項目３）
パーキンソン病に罹患している対象における運動機能を処置または改善し、ジスキネジアを軽減する方法であって、（ａ）（ｉ）チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）をコードするヌクレオチド配列、（ｉｉ）ＧＴＰ－シクロヒドロラーゼＩ（ＣＨ１）をコードするヌクレオチド配列、（ｉｉｉ）芳香族アミノ酸ドーパデカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）をコードするヌクレオチド配列またはこれらの任意の組み合わせを含む核酸構築物を含むウイルスベクターと、（ｂ）薬学的に許容され得る賦形剤とを含む治療有効量の組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
（項目４）
前記対象がＬ－ドパまたはＬＥＤ治療を受けている、項目２または３に記載の方法。
（項目５）
前記対象のＬ－ドパまたはＬＥＤ治療用量が、投与前の前記対象のＬ－ドパまたはＬＥＤ治療用量と比較して、前記核酸構築物の投与後３ヶ月以内に減少する、項目１～４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
前記平均Ｌ－ドパまたはＬＥＤ治療用量が、投与後３ヶ月に、ベースラインから少なくとも１０％、少なくとも１２％、少なくとも１４％、少なくとも１５％、少なくとも１６％、少なくとも１７％、少なくとも１８％または少なくとも１９％減少する、項目４～５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
前記ウイルスベクターが、１×１０６ＴＵ／対象～５×１０８ＴＵ／対象の目標用量で投与される、項目１～６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
前記目標用量が、約４×１０６ＴＵ／対象～８×１０６ＴＵ／対象、８×１０６ＴＵ／対象～４×１０７ＴＵ／対象または１×１０７ＴＵ／対象～５×１０８ＴＵ／対象である、項目７に記載の方法。
（項目９）
投与が１回投与である、項目１～８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
投与が脳に対する投与である、項目１～９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
前記投与が注入による被殻への投与である、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
（ｉ）チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）をコードするヌクレオチド配列と、（ｉｉ）ＧＴＰ－シクロヒドロラーゼＩ（ＣＨ１）をコードするヌクレオチド配列と、（ｉｉｉ）芳香族アミノ酸ドーパデカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）をコードするヌクレオチド配列とを含み、ＴＨをコードする前記ヌクレオチド配列は、ＴＨをコードする前記ヌクレオチド配列とＣＨ１をコードする前記ヌクレオチド配列が融合タンパク質ＴＨ－ＣＨ１をコードするように、ＣＨ１をコードする前記ヌクレオチド配列に連結されている、項目１～１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
前記核酸構築物が、
ＴＨ－Ｌ－ＣＨ１－ＩＲＥＳ－ＡＡＤＣ；
ＡＡＤＣ－Ｌ－ＴＨ－Ｌ－ＣＨ１；
ＴＨ－Ｌ－ＣＨ１－Ｌ－ＡＡＤＣ；
またはＴＨ－Ｌ－ＣＨ１－Ｌ－ＡＡＤＣ；
を含み、
ここで、Ｌはリンカーコード配列であり、ＩＲＥＳは内部リボソーム進入部位であり、Ｐはプロモーターである、
項目１～１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
前記核酸構築物がＴＨ－Ｌ－ＣＨ１－ＩＲＥＳ－ＡＡＤＣを含む、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記核酸構築物が、（ｉ）チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）をコードするヌクレオチド配列と、（ｉｉ）ＧＴＰ－シクロヒドロラーゼＩ（ＣＨ１）をコードするヌクレオチド配列と、（ｉｉｉ）芳香族アミノ酸ドーパデカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）をコードするヌクレオチド配列とを含み、ＴＨをコードする前記ヌクレオチド配列は、ＴＨをコードする前記ヌクレオチド配列とＣＨ１をコードする前記ヌクレオチド配列が融合タンパク質ＴＨ－ＣＨ１をコードするように、ＣＨ１をコードする前記ヌクレオチド配列に連結されており、前記構築物は、ＴＨ－Ｌ－ＣＨ１－ＩＲＥＳ－ＡＡＤＣまたはＴＨ－Ｌ－ＣＨ１－Ｐ－ＡＡＤＣを含み、ここで、Ｌはリンカーコード配列であり、ＩＲＥＳは内部リボソーム進入部位であり、Ｐはプロモーターである、項目１～１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
前記リンカー（Ｌ）がコドン最適化されていない、項目１３～１５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７）
前記リンカー（Ｌ）が、配列番号１または配列番号３として示される配列を含む、項目１３～１６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８）
前記核酸構築物が、構成的プロモーター、組織特異的プロモーターまたはこれらの組み合わせから選択されるプロモーター（Ｐ）をさらに含む、項目１～１７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
前記プロモーターが、ＣＭＶプロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーターまたはチミジンキナーゼプロモーターである、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記ウイルスベクターが、レンチウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルスベクターである、項目１～１９のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１）
前記ウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記ウイルスベクターがウイルス粒子である、項目１～２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２３）
前記ウイルス粒子がＥＩＡＶベクター粒子であり、ＶＳＶ－Ｇで偽型化されている、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記ウイルスベクターが、薬学的に許容され得る賦形剤および／または希釈剤を含む医薬組成物として製剤化される、項目１～２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
前記対象における運動機能が、ベースラインと比較して、投与３ヶ月後のＵＰＤＲＳ－ＩＩＩ（運動）ＯＦＦスコアの少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％または少なくとも４０％の増加によって示されるように改善される、項目１～２４のいずれか一項に記載の方法。
（項目２６）
以下：（ａ）ベースラインと比較して、投与３ヶ月後に、日常生活に支障となるジスキネジアを伴うハウザー日記ＯＮ時間の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％または少なくとも８５％の減少；（ｂ）ベースラインと比較して、投与３ヶ月後に、ＵＰＤＲＳ－ＩＶスコアの少なくとも５０％の減少、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％または少なくとも７４％の減少、および（ｃ）ベースラインと比較して、投与３ヶ月後に、ラッシュジスキネジアスコアの少なくとも１０％、少なくとも１２％、少なくとも１５％、少なくとも１８％の改善、の１またはそれより多くによって示されるように、ジスキネジアが前記対象において減少する、項目１～２５のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
振戦、運動緩徐、筋肉硬直、姿勢および／もしくは平衡障害、自動運動の喪失、発話困難、微細運動技能の困難またはこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される前記対象における１またはそれより多くの症状をさらに改善する、項目１～２６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
投与後３ヶ月以内に、投与前における前記対象のベースラインと比較して、前記対象が、改善された運動機能、減少したジスキネジアおよび減少したＬ－ドパまたはＬＥＤ治療用量を投与後に有する、項目１～２７のいずれか一項に記載の方法。
【図1】
【図2A-2B】
【図3】
【図4A-4B】
【図5】
【図6】
【図7A-7B】
【図8】
【図9A】
【図9B-9C】
【図9D】
【図10A-10B】
【配列表】
【国際調査報告】