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▶ バイオミメティック セラピューティクス，リミテッド ライアビリティ カンパニーの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-05-11
(54)【発明の名称】骨癒合を増強するための血小板由来増殖因子製剤
(51)【国際特許分類】
A61L 27/22 20060101AFI20220428BHJP
A61L 27/12 20060101ALI20220428BHJP
A61L 27/02 20060101ALI20220428BHJP
A61L 27/36 20060101ALI20220428BHJP
A61L 27/24 20060101ALI20220428BHJP
【ＦＩ】
A61L27/22
A61L27/12
A61L27/02
A61L27/36 110
A61L27/36 311
A61L27/24
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021555291
(86)(22)【出願日】2020-03-16
(85)【翻訳文提出日】2021-11-15
(86)【国際出願番号】 US2020022992
(87)【国際公開番号】W WO2020186267
(87)【国際公開日】2020-09-17
(31)【優先権主張番号】62/818,104
(32)【優先日】2019-03-14
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】513149654
【氏名又は名称】バイオミメティック セラピューティクス，リミテッド ライアビリティ カンパニー
(74)【代理人】
【識別番号】110002860
【氏名又は名称】特許業務法人秀和特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】スンダララジ，シャラス
(72)【発明者】
【氏名】ショックリー，ロバート ケー．
(72)【発明者】
【氏名】ヤング，コナン エス．
(72)【発明者】
【氏名】ブラウニング，キャリー
【テーマコード（参考）】
4C081
【Ｆターム（参考）】
4C081AB02
4C081AB03
4C081AB04
4C081BA12
4C081BA13
4C081BB06
4C081CD122
4C081CD28
4C081CD29
4C081CF011
4C081CF021
4C081CF031
4C081CF21
4C081DB03
4C081DB04
4C081EA02
(57)【要約】
本開示は、骨癒合術、例えば脊椎固定術のために有用な血小板由来増殖因子の溶液および生体適合性マトリックスを含む改善された組成物を提供する。組成物は、有利には、約２：１の体積対重量（ｍＬ：ｇ）比でＰＤＧＦ溶液および生体適合性マトリックスを含み、その結果、組成物は、シリンジまたはカニューレを使用して骨癒合の部位に容易に適用することができる。特定の実施形態において、組成物は、脊椎固定ケージと組み合わせて脊椎固定術において有用である。本開示はまた、癒合術、例えば脊椎固定を行う方法、および癒合術用のキットを提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
生体適合性マトリックス中に配された血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）の溶液を含む組成物であって、前記生体適合性マトリックスが骨足場材料および生体適合性結合剤を含み、前記溶液が約０．０５ｍｇ／ｍＬ～約５ｍｇ／ｍＬの範囲内のＰＤＧＦ濃度を有し、かつ前記溶液および前記生体適合性マトリックスが約１：１～約２．５：１の範囲内の体積対質量比（ｍＬ：ｇ）で前記組成物中に存在する、組成物。
【請求項2】
前記体積対質量比（ｍＬ／ｇ）が約１．５：１～約２．５：１の範囲内である、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
前記体積対質量比（ｍＬ／ｇ）が約２：１である、請求項１に記載の組成物。
【請求項4】
前記足場材料が、多孔性リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、同種移植片およびこれらの組み合わせから選択される、請求項１～３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項5】
前記多孔性リン酸カルシウムが、リン酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイト、低結晶性ヒドロキシアパタイト、非晶質リン酸カルシウム、メタリン酸カルシウム、リン酸二カルシウム二水和物、リン酸七カルシウム、ピロリン酸カルシウム二水和物、ピロリン酸カルシウム、リン酸八カルシウムおよびこれらの混合物からなる群から選択される、請求項４に記載の組成物。
【請求項6】
前記リン酸カルシウムがβ－リン酸三カルシウムを含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項7】
前記骨足場材料がリン酸カルシウムおよび硫酸カルシウムを含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項8】
前記ＰＤＧＦが、約０．１ｍｇ／ｍｌ～約１．０ｍｇ／ｍｌの範囲内の濃度で前記溶液中に存在する、請求項１～７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項9】
前記ＰＤＧＦが約０．２ｍｇ／ｍｌ～約０．４ｍｇ／ｍｌの濃度で前記溶液中に存在する、請求項８に記載の組成物。
【請求項10】
前記ＰＤＧＦが約０．３ｍｇ／ｍｌの濃度で前記溶液中に存在する、請求項８に記載の組成物。
【請求項11】
前記ＰＤＧＦが、ＰＤＧＦ－ＡＡ、ＰＤＧＦ－ＢＢ、ＰＤＧＦ－ＡＢ、ＰＤＧＦ－ＣＣ、ＰＤＧＦ－ＤＤ、またはこれらの混合物もしくは誘導体を含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項12】
前記ＰＤＧＦがＰＤＧＦ－ＢＢを含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項13】
前記ＰＤＧＦがＰＤＧＦ－ＢＢからなる、請求項１～１２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項14】
前記ＰＤＧＦ－ＢＢが少なくとも６５％のインタクトなＰＤＧＦ－ＢＢを含む、請求項１２または１３、６８に記載の組成物。
【請求項15】
前記ＰＤＧＦ－ＢＢが組換えヒト（ｒｈ）ＰＤＧＦ－ＢＢである、請求項１２～１３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項16】
前記溶液が緩衝液中のＰＤＧＦを含む、請求項１～１５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項17】
前記溶液が緩衝液中のＰＤＧＦからなる、請求項１～１５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項18】
前記緩衝液が酢酸ナトリウムを含む、請求項１６または１７に記載の組成物。
【請求項19】
前記骨足場材料が、約５０ミクロン～約５０００ミクロンのサイズ、約５０ミクロン～約５０００ミクロンのサイズ、約１００ミクロン～約５０００ミクロンのサイズ、約１００ミクロン～約５０００ミクロンのサイズ、約１００ミクロン～約３００ミクロンのサイズ、約１００ミクロン～約３００ミクロンのサイズ、または約２５０ミクロン～約１０００ミクロンのサイズの範囲内の粒子を含む、請求項１～１８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項20】
前記骨足場材料が、約２５％より高い、約４０％より高い、約５０％より高い、約８０％より高い、または約９０％より高い多孔度を含む、請求項１～１９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項21】
前記骨足場材料がマクロ多孔性を含む、請求項１～２０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項22】
前記骨足場材料が、前記マトリックス中への細胞遊走を促す多孔度を有する、請求項１～２１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項23】
前記骨足場材料が、相互接続されたポアを含む、請求項１～２２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項24】
前記骨足場材料が吸収性である、請求項１～２３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項25】
前記生体適合性結合剤がコラーゲンを含む、請求項１～２４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項26】
前記生体適合性結合剤が、約１０重量パーセント～約４０重量パーセントの範囲内の量で前記生体適合性マトリックス中に存在する、請求項１～２５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項27】
前記生体適合性結合剤が、約１５重量パーセント～約３５重量パーセントの範囲内の量で前記生体適合性マトリックス中に存在する、請求項２６に記載の組成物。
【請求項28】
前記生体適合性結合剤が、約１５重量パーセント～約２５重量パーセントの範囲内の量で前記生体適合性マトリックス中に存在する、請求項２６に記載の組成物。
【請求項29】
前記生体適合性結合剤が、約２０重量パーセントの量で前記生体適合性マトリックス中に存在する、請求項２６に記載の組成物。
【請求項30】
前記生体適合性マトリックスがリン酸カルシウムおよびコラーゲンからなる、１～２９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項31】
所望の骨癒合の部位に請求項１～３０のいずれか１項に記載の組成物を投与することを含む、骨を癒合する方法。
【請求項32】
骨癒合の前記部位が関節である、請求項３１に記載の方法。
【請求項33】
骨癒合の前記部位が、足、足指、足首、膝、臀部、脊椎、肋骨、胸骨、鎖骨、関節、肩、肩甲骨、肘、手関節、手または手指にある、請求項３１または３２に記載の方法。
【請求項34】
骨癒合が脊椎固定におけるものである、請求項３１または３２に記載の方法。
【請求項35】
椎体の間に椎骨内スペーサーを置くことをさらに含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項36】
前記組成物が、前記椎体の間に前記椎骨スペーサーを置く前に前記椎骨スペーサー中に配される、請求項３５に記載の方法。
【請求項37】
前記椎体の間に前記スペーサーを置いた後に前記スペーサー中に前記組成物を配することをさらに含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項38】
前記脊椎固定術が椎体間固定術である、請求項３４～３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項39】
前記脊椎固定術が腰椎固定術である、請求項３４～３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項40】
骨癒合術における使用のためのキットであって、第１の容器中の生体適合性マトリックス、
第２の容器中のＰＤＧＦの溶液であって、前記生体適合性マトリックスおよび前記ＰＤＧＦの溶液が約１：１～約２．５：１の範囲内の体積対質量比（ｍＬ：ｇ）を有する、前記ＰＤＧＦの溶液、ならびに
ｉ）請求項１～２９のいずれか１項に記載の組成物を調製するため、およびｉｉ）骨癒合の部位に前記組成物を投与するための使用説明書
を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年３月１４日に出願された米国仮出願第６２／８１８，１０４号に対する優先権の利益を主張し、該仮出願の内容は参照により全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１９年３月１４日に出願された米国仮出願第６２／８１８，１０４号に対する優先権の利益を主張し、該仮出願の内容は参照により全体が本明細書に組み込まれる。
【0002】
技術分野
本開示は、概しては、生体適合性マトリックス中に血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）溶液を含む組成物、および骨癒合術、例えば脊椎固定におけるそれらの使用方法に関する。本開示は、これらの組成物を調製する方法および骨癒合用のキットをさらに提供する。
本開示は、概しては、生体適合性マトリックス中に血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）溶液を含む組成物、および骨癒合術、例えば脊椎固定におけるそれらの使用方法に関する。本開示は、これらの組成物を調製する方法および骨癒合用のキットをさらに提供する。
【背景技術】
【0003】
筋骨格の問題は、全ての年齢群および両方の性別において集団の全体に行きわたっている。Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｏｒｔｈｏｐｅｄｉｃ Ｓｕｒｇｅｏｎｓ（ＡＡＯＳ）の２００３年年次大会において提示された公開された論文によれば、米国人の半数は生涯の何らかの時点において骨折に対するサービスまたは骨癒合を必要とする。骨癒合は、患者の様々な関節と関連する筋骨格の問題を治療するために使用される整形外科手術の一般的な形態である。骨癒合は、２つの骨の間の関節の骨化の人工的な誘導を伴う。椎間板変性疾患、変形、不安定な脊椎外傷、または脊椎すべり症に起因する腰痛を有する患者において米国において年間で約１００，０００の腰椎固定手術が行われている。脊椎固定の失敗率は現在３０％もの高さである。様々な整形外科用デバイス、例えば椎弓根スクリュー、プレートおよびオステオバイオロジクスの使用は癒合率における向上に繋がっているが、脊髄手術の失敗は依然として深刻な問題のままである。人間および動物における脊椎固定は、背部痛、ならびに関連する頸部、腕、および脚の疼痛を含む神経の徴候を緩和するために行われ、病的な脊椎セグメントの固定および同じレベルにおける脊髄の除圧を一般に必要とする。
【0004】
脊椎の隣接する椎体（ＶＢ）の骨癒合は、椎間板疾患を治療するための解決策として現在使用されている。疾患のある椎間板組織は除去され、隣接する椎体の終板は郭清され、２つのレベルを安定化させるためのケージの形態の堅固な固定化がＶＢの間に埋め込まれる。治癒は、ケージハードウェアの全体を通じてＶＢの間の新たな骨の形成と共に進行する。多くの場合、骨移植が行われ、ケージの間隙を越えた骨癒合を確実にし、および患者のために脊椎を安定化させて、疼痛を和らげ、多くの場合に患者をある程度の活動に復帰させることができる。共存症患者において、ＶＢの間の間隙を越えた骨癒合を達成することは難しい場合があり、骨治癒反応を増強するために骨伝導性および骨誘導性移植片が使用される。
【0005】
椎体間および後外側の両方の脊椎固定では、脊椎固定のために必要な骨を生成するために生物学的骨誘導剤が使用される。現行の標準治療は、腸骨稜または他の骨性部位から骨を回収して骨誘導性移植片材料を得ることである。よって、患者は、脊椎固定手術自体に加えて、通常は腸骨稜から、移植片を回収するための手術も受けなければならない。腸骨稜からの骨移植片の回収は術後疼痛を伴い、これは２５％までの患者において持続し得る。この治療方法に関連する他の欠点は、感染症のリスクの増加、骨自家移植片材料の利用可能性および品質、ならびにドナー部位罹患に起因して引き起こされる患者の不便である。
【0006】
よって、骨癒合術において有用な改善された骨移植片組成物に対する必要性が存在する
。さらには、脊椎固定術の間に脊椎固定ケージに容易に提供することができる移植片組成物に対する必要性が存在する。また、脊椎固定術の間および後にケージ中に残存し、それにより、ケージの外側の組織への移植片材料の運動を低減させ、その結果、移植片および任意の骨伝導性または骨誘導性の剤が固定部位に局在化したままとなることができる組成物。最後に、自家移植片回収の必要性をなくすことができる組成物は有用である。本開示はこれらの必要性に対処する。
。さらには、脊椎固定術の間に脊椎固定ケージに容易に提供することができる移植片組成物に対する必要性が存在する。また、脊椎固定術の間および後にケージ中に残存し、それにより、ケージの外側の組織への移植片材料の運動を低減させ、その結果、移植片および任意の骨伝導性または骨誘導性の剤が固定部位に局在化したままとなることができる組成物。最後に、自家移植片回収の必要性をなくすことができる組成物は有用である。本開示はこれらの必要性に対処する。
【発明の概要】
【0007】
本開示は、１つの実施形態において、生体適合性マトリックス中に配された血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）の溶液を含む組成物であって、生体適合性マトリックスが骨足場材料および生体適合性結合剤を含み、溶液が約０．０５ｍｇ／ｍＬ～約５ｍｇ／ｍＬの範囲内のＰＤＧＦ濃度を有し、かつ溶液および生体適合性マトリックスが約１：１～約２．５：１の範囲内の体積対質量比（ｍＬ：ｇ）で組成物中に存在する、組成物を提供する。
【0008】
一部の実施形態において、生体適合性マトリックスに対するＰＤＧＦの溶液の体積対質量比（ｍＬ／ｇ）は約１．５：１～約２．５：１の範囲内であり、他の実施形態において、生体適合性マトリックスに対するＰＤＧＦの溶液の体積対質量比（ｍＬ／ｇ）は約２：１である。
【0009】
一部の実施形態において、足場材料は、多孔性リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、同種移植片およびこれらの組み合わせから選択される。
【0010】
一部の実施形態において、多孔性リン酸カルシウムは、リン酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイト、低結晶性ヒドロキシアパタイト、非晶質リン酸カルシウム、メタリン酸カルシウム、リン酸二カルシウム二水和物、リン酸七カルシウム、ピロリン酸カルシウム二水和物、ピロリン酸カルシウム、リン酸八カルシウムおよびこれらの混合物からなる群から選択され、他の実施形態において、リン酸カルシウムはβ－リン酸三カルシウムを含む。
【0011】
さらに他の実施形態において、骨足場材料はリン酸カルシウムおよび硫酸カルシウムを含む。
【0012】
一部の実施形態において、ＰＤＧＦは、約０．１ｍｇ／ｍｌ～約１．０ｍｇ／ｍｌ、約０．２ｍｇ／ｍｌ～約０．４ｍｇ／ｍｌ、または約０．３ｍｇ／ｍｌの範囲内の濃度で溶液中に存在する。
【0013】
一部の実施形態において、ＰＤＧＦは、ＰＤＧＦ－ＡＡ、ＰＤＧＦ－ＢＢ、ＰＤＧＦ－ＡＢ、ＰＤＧＦ－ＣＣ、ＰＤＧＦ－ＤＤ、またはこれらの混合物もしくは誘導体を含む。一部の実施形態において、ＰＤＧＦはＰＤＧＦ－ＢＢを含み、他の実施形態において、ＰＤＧＦはＰＤＧＦ－ＢＢからなる。一部の実施形態において、ＰＤＧＦ－ＢＢは少なくとも６５％のインタクトなＰＤＧＦ－ＢＢを含む。さらに他の実施形態において、ＰＤＧＦ－ＢＢが組換えヒト（ｒｈ）ＰＤＧＦ－ＢＢである、請求項１２～１３のいずれか１項に記載の組成物。
【0014】
一部の実施形態において、溶液は緩衝液中のＰＤＧＦを含み、他の実施形態において、溶液は緩衝液中のＰＤＧＦからなる。一部の実施形態において、緩衝液は酢酸ナトリウムを含む。
【0015】
一部の実施形態において、骨足場材料は、約５０ミクロン～約５０００ミクロンのサイズ、約５０ミクロン～約５０００ミクロンのサイズ、約１００ミクロン～約５０００ミク
ロンのサイズ、約１００ミクロン～約５０００ミクロンのサイズ、約１００ミクロン～約３００ミクロンのサイズ、約１００ミクロン～約３００ミクロンのサイズ、または約２５０ミクロン～約１０００ミクロンのサイズの範囲内の粒子を含む。
ロンのサイズ、約１００ミクロン～約５０００ミクロンのサイズ、約１００ミクロン～約３００ミクロンのサイズ、約１００ミクロン～約３００ミクロンのサイズ、または約２５０ミクロン～約１０００ミクロンのサイズの範囲内の粒子を含む。
【0016】
一部の実施形態において、骨足場材料は、約２５％より高い、約４０％より高い、約５０％より高い、約８０％より高い、または約９０％より高い多孔度を含む。
【0017】
一部の実施形態において、骨足場材料はマクロ多孔性を含む。
【0018】
一部の実施形態において、骨足場材料は、マトリックス中への細胞遊走を促す多孔度を有する。
【0019】
一部の実施形態において、骨足場材料は、相互接続されたポアを含む。
【0020】
一部の実施形態において、骨足場材料は吸収性である。
【0021】
一部の実施形態において、生体適合性結合剤はコラーゲンを含む。
【0022】
一部の実施形態において、生体適合性結合剤は、約１０重量パーセント～約４０重量パーセントの範囲内の量で生体適合性マトリックス中に存在し、他の実施形態において、生体適合性結合剤は、約１５重量パーセント～約３５重量パーセント、約１５重量パーセント～約２５重量パーセント、または約２０重量パーセントの範囲内の量で生体適合性マトリックス中に存在する。
【0023】
一部の実施形態において、生体適合性マトリックスはリン酸カルシウムおよびコラーゲンからなる。
【0024】
他の実施形態において、本開示は、所望の骨癒合の部位に上記の任意の実施形態の組成物を投与することを含む、骨を癒合する方法を提供する。一部の実施形態において、骨癒合の部位は関節中にある。一部の実施形態において、骨癒合は、足、足指、足首、膝、臀部、脊椎、肋骨、胸骨、鎖骨、関節、肩、肩甲骨、肘、手関節、手または手指において為される。一部の実施形態において、骨癒合は脊椎固定である。
【0025】
一部の実施形態において、方法は、椎体の間に椎骨内スペーサーを配することをさらに含む。一部の実施形態において、組成物は、椎体の間に椎骨スペーサーを挿入する前に椎骨スペーサー中に配される。他の実施形態において、
【0026】
方法は、椎体の間にスペーサーを挿入した後にスペーサー中に組成物を配することをさらに含む。
【0027】
一部の実施形態において、脊椎固定術は椎体間固定術であり、他の実施形態において、脊椎固定術は腰椎固定術である。
【0028】
本開示はさらに、骨癒合術における使用のためのキットであって、第１の容器中の生体適合性マトリックス；第２の容器中のＰＤＧＦの溶液であって、生体適合性マトリックスおよびＰＤＧＦの溶液が約１：１～約２．５：１の範囲内の体積対質量比（ｍＬ：ｇ）を有する、ＰＤＧＦの溶液；ならびにｉ）上述の任意の実施形態に記載されるものを調製するため、およびｉｉ）骨癒合の部位に組成物を投与するための使用説明書を含む、キットを提供する。
【図面の簡単な説明】
【0029】
【図4A】図４Ａ～４Ｃは、脊椎固定用のヒツジモデルにおける生体力学試験の結果を要約するグラフである。屈曲伸展の可動域（図４Ａ）、側屈の可動域（図４Ｂ）、および軸回転の可動域（図４Ｃ）を、自家移植片、コラーゲン／β－ＴＣＰマトリックスを伴うｒｈＰＤＧＦ－ＢＢの組成物、ｒｈＰＤＧＦを伴わないコラーゲン／β－ＴＣＰマトリックス、または空のケージのいずれかを与えたヒツジで試験した。図４Ｄは、図４Ａ～４Ｃ中のグラフのキーである。
【図4B】図４Ａ～４Ｃは、脊椎固定用のヒツジモデルにおける生体力学試験の結果を要約するグラフである。屈曲伸展の可動域（図４Ａ）、側屈の可動域（図４Ｂ）、および軸回転の可動域（図４Ｃ）を、自家移植片、コラーゲン／β－ＴＣＰマトリックスを伴うｒｈＰＤＧＦ－ＢＢの組成物、ｒｈＰＤＧＦを伴わないコラーゲン／β－ＴＣＰマトリックス、または空のケージのいずれかを与えたヒツジで試験した。図４Ｄは、図４Ａ～４Ｃ中のグラフのキーである。
【図4C】図４Ａ～４Ｃは、脊椎固定用のヒツジモデルにおける生体力学試験の結果を要約するグラフである。屈曲伸展の可動域（図４Ａ）、側屈の可動域（図４Ｂ）、および軸回転の可動域（図４Ｃ）を、自家移植片、コラーゲン／β－ＴＣＰマトリックスを伴うｒｈＰＤＧＦ－ＢＢの組成物、ｒｈＰＤＧＦを伴わないコラーゲン／β－ＴＣＰマトリックス、または空のケージのいずれかを与えたヒツジで試験した。図４Ｄは、図４Ａ～４Ｃ中のグラフのキーである。
【図4D】図４Ａ～４Ｃは、脊椎固定用のヒツジモデルにおける生体力学試験の結果を要約するグラフである。屈曲伸展の可動域（図４Ａ）、側屈の可動域（図４Ｂ）、および軸回転の可動域（図４Ｃ）を、自家移植片、コラーゲン／β－ＴＣＰマトリックスとｒｈＰＤＧＦ－ＢＢとの組成物、ｒｈＰＤＧＦを含まないコラーゲン／β－ＴＣＰマトリックス、または空のケージのいずれかを与えたヒツジで試験した。図４Ｄは、図４Ａ～４Ｃ中のグラフのキーである。
【図6】図６は、自家移植片、コラーゲン／β－ＴＣＰマトリックスとｒｈＰＤＧＦ－ＢＢとの組成物、ｒｈＰＤＧＦを含まないコラーゲン／β－ＴＣＰマトリックス、または空のケージを用いて治療されたヒツジからの中矢状平面のＭｉｃｒｏＣＴスキャンの写真画像である。
【図7A】図７Ａ～７Ｃは、脊椎固定用のヒツジモデルの組織形態計測分析を要約するグラフである。平均骨パーセンテージ（図７Ａ）、平均軟組織パーセンテージ（図７Ｂ）および平均空き空間パーセンテージ（図７Ｃ）を分析した。
【図7B】図７Ａ～７Ｃは、脊椎固定用のヒツジモデルの組織形態計測分析を要約するグラフである。平均骨パーセンテージ（図７Ａ）、平均軟組織パーセンテージ（図７Ｂ）および平均空き空間パーセンテージ（図７Ｃ）を分析した。
【図7C】図７Ａ～７Ｃは、脊椎固定用のヒツジモデルの組織形態計測分析を要約するグラフである。平均骨パーセンテージ（図７Ａ）、平均軟組織パーセンテージ（図７Ｂ）および平均空き空間パーセンテージ（図７Ｃ）を分析した。
【図8】図８は、自家移植片、コラーゲン／β－ＴＣＰマトリックスとｒｈＰＤＧＦ－ＢＢとの組成物、ｒｈＰＤＧＦを含まないコラーゲン／β－ＴＣＰマトリックス、または空のケージを用いて治療されたヒツジからの中矢状平面の組織学的切片の写真画像である。
【図12A】図１２Ａおよび図１２Ｂは、β－ＴＣＰ／Ｃｏｌ ３．０ｍｇのｒｈＰＤＧＦ－ＢＢを用いた４日目について示される、Ｋｉ６７（図１２Ａ）およびフォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）（図１２Ｃ）についてのＩＦ染色の代表的な画像である。
【図12B】図１２Ａおよび図１２Ｂは、β－ＴＣＰ／Ｃｏｌ ３．０ｍｇのｒｈＰＤＧＦ－ＢＢを用いた４日目について示される、Ｋｉ６７（図１２Ａ）およびフォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）（図１２Ｃ）についてのＩＦ染色の代表的な画像である。
【図13A】図１３Ａおよび図１３Ｂは、術後４、７、１０および２１日目において示される、Ｋｉ６７（図１３Ａ）およびｖＷＦ（図１３Ｂについての定量化されたＩＦ染色を描写するグラフである。図１３Ｃは図１３Ａおよび図１３Ｂのキーである。
【発明を実施するための形態】
【0030】
本開示は、生体適合性マトリックス中にＰＤＧＦの溶液を含む組成物、および骨癒合術、特には脊椎固定術のためにそれらを使用する方法を提供する。約２：１のＰＤＧＦ溶液の体積：生体適合性マトリックスの質量の比（ｍＬ：ｇ）で提供される場合、組成物は、濃いペーストであり、治療が必要な部位にカニューレまたは針を通じて適用することができる。一部の実施形態において、生体適合性マトリックスおよびＰＤＧＦを含む溶液は、約１：１～約２．５：１、約１．５：１～約２．５：１、または約２：１の範囲内の体積対質量比（ｍＬ：ｇ）で組成物中に存在する。一部の実施形態において、組成物は、ケージまたは椎間スペーサーと組み合わせて使用される。組成物は、郭清された椎体の間のケージの埋め込みの前またはケージが脊椎固定手術の間に椎体の間に置かれた後のいずれかにケージの内腔の内側に配されてもよい。
【0031】
椎体間固定は、通常は椎間板により占有される領域中の椎骨の間に骨移植片（例えば本発明の組成物）を置く。脊椎固定のための準備において、椎間板は全体的に除去されてもよい。デバイスは、脊椎アライメントおよび椎間板高さを維持するために椎骨の間に置かれてもよい。椎間デバイスは、例えば、スペーサーであってもよい。
【0032】
椎間デバイスは、例えば、プラスチックまたはチタンから作られていてもよい。固定が次に椎骨の終板の間で起こる。椎体間固定の種類としては、前方腰椎椎体間固定（ＡＬＩＦ）、後方腰椎椎体間固定（ＰＬＩＦ）、および片側進入腰椎後方椎体間固定（ＴＬＩＦ）が挙げられる。一部の実施形態において、固定は、固定化（ｆｉｘａｔｉｏｎ）と呼ばれる方法により増大され、該方法は、金属スクリュー（椎弓根スクリュー、多くの場合はチタン製）、ロッドもしくはプレート、スペーサー、またはケージを置いて椎骨を安定化させ、それにより骨癒合を促すことを意味する。固定の過程では、外的なブレイシング（装具）が使用されてもよい。
【0033】
後外側固定は、脊椎の背部における横突起（ｔｒａｎｓｖｅｒｓｅ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ）の間に骨移植片を置く。これらの椎骨は次に、椎骨の各側において金属棒に結合している各椎骨の椎弓根を通じてスクリューおよび／またはワイヤーを用いて適所に固定化されてもよい。
【0034】
定義
本明細書において使用される場合、脊椎固定を「促進する（ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ）」または「促す（ｆａｃｉｌｉｔａｔｉｎｇ）」は、脊椎固定術の臨床的進行に望ましく影響するように設計された臨床的介入を指す。臨床的介入の望ましい効果としては、例えば、固定の部位における骨密度の程度の増加および／または骨形成の加速（例えば骨密度の加速）、固定の部位における骨結合もしくは骨架橋の程度の増加および／または骨結合もしくは骨架橋の加速、骨癒合部位における骨の組成および／または構造における改善（例えば、骨癒合部位において天然の骨に密接に似通ったものになること）の１つまたは複数が挙げられるがこれらに限定されない。
本明細書において使用される場合、脊椎固定を「促進する（ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ）」または「促す（ｆａｃｉｌｉｔａｔｉｎｇ）」は、脊椎固定術の臨床的進行に望ましく影響するように設計された臨床的介入を指す。臨床的介入の望ましい効果としては、例えば、固定の部位における骨密度の程度の増加および／または骨形成の加速（例えば骨密度の加速）、固定の部位における骨結合もしくは骨架橋の程度の増加および／または骨結合もしくは骨架橋の加速、骨癒合部位における骨の組成および／または構造における改善（例えば、骨癒合部位において天然の骨に密接に似通ったものになること）の１つまたは複数が挙げられるがこれらに限定されない。
【0035】
本明細書において使用される場合、「有効量」という用語は、必要な用量および時間的期間においての、少なくとも所望の治療結果を達成するために有効な量を指す。有効量は、１つまたは複数の投与において提供され得る。
【0036】
本明細書における「約」値またはパラメーターへの言及はまた、その値またはパラメーター自体に向けられた実施形態を含む（かつそれを記載する）。
【0037】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に他に指し示さなければ、複数への言及を含む。例えば、「ＰＤＧＦホモ二量体」（ａ ”ＰＤＧＦ ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ”）への言及は１つまたは複数のＰＤＧＦホモ二量体への言及であり、当業者に公知のその均等物などを含む。
【0038】
本明細書に記載の発明の全ての態様および実施形態は、「含む」、「からなる」および「から本質的になる」態様および実施形態を含み得ることが理解される。記載される要素「から本質的になる」方法または組成物は、特定のステップまたは材料ならびにそれらの方法および組成物の基本的かつ新規の特徴に実質的に影響しないもののみを含むことが理解されるべきである。
【0039】
「骨足場材料（ｂｏｎｅ ｓｃａｆｆｏｌｄｉｎｇ ｍａｔｅｒｉａｌ）」および「骨代用剤（ｂｏｎｅ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）」は本開示において交換可
能に使用される。
能に使用される。
【0040】
「体積対質量比」は、本明細書において使用される場合、グラム（ｇ）での生体適合性マトリックスの質量に対するミリリットル（ｍＬ）でのＰＤＧＦの体積の比を指す。例えば、体積対質量比は、約１：１～約２．５：１、約１．５：１～約２．５：１、約１．７５：１～約２．２５：１、または約２：１の範囲内であることができる。例示的な実施形態は、例えば、約２ｍＬのＰＤＧＦ溶液および約１ｇの生体適合性マトリックス、約１．５ｍＬのＰＤＧＦおよび約０．７５ｇの生体適合性マトリックス、または約１ｍＬのＰＤＧＦ溶液および約０．５ｇの生体適合性マトリックスを含んでもよい。
【0041】
ＰＤＧＦ溶液
１つの実施形態において、脊椎固定術用の組成物は、ＰＤＧＦを含む溶液および生体適合性マトリックスを含み、溶液は生体適合性マトリックス中に配されまたは組み込まれる。一部の実施形態において、ＰＤＧＦは、約０．０１ｍｇ／ｍｌ～約１０ｍｇ／ｍｌ、約０．０５ｍｇ／ｍｌ～約５ｍｇ／ｍｌ、または約０．１ｍｇ／ｍｌ～約１．０ｍｇ／ｍｌの範囲内の濃度で溶液中に存在する。ＰＤＧＦは、各範囲の上限および下限を含めて、これらの記載される範囲内の任意の濃度で溶液中に存在してもよい。他の実施形態において、ＰＤＧＦは、以下の濃度：約０．０５ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ、約０．１５ｍｇ／ｍｌ、約０．２ｍｇ／ｍｌ、約０．２５ｍｇ／ｍｌ、約０．３ｍｇ／ｍｌ、約０．３５ｍｇ／ｍｌ、約０．４ｍｇ／ｍｌ、約０．４５ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ、約０．５５ｍｇ／ｍｌ、約０．６ｍｇ／ｍｌ、約０．６５ｍｇ／ｍｌ、約０．７ｍｇ／ｍｌ、約０．７５ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌ、約０．８５ｍｇ／ｍｌ、約０．９ｍｇ／ｍｌ、約０．９５ｍｇ／ｍｌ、または約１．０ｍｇ／ｍｌのいずれか１つで溶液中に存在する。これらの濃度は単純に特定の実施形態の例であること、ならびにＰＤＧＦの濃度は、各範囲の上限および下限を含めて、上記の濃度範囲のいずれか以内であってもよいことが理解されるべきである。
１つの実施形態において、脊椎固定術用の組成物は、ＰＤＧＦを含む溶液および生体適合性マトリックスを含み、溶液は生体適合性マトリックス中に配されまたは組み込まれる。一部の実施形態において、ＰＤＧＦは、約０．０１ｍｇ／ｍｌ～約１０ｍｇ／ｍｌ、約０．０５ｍｇ／ｍｌ～約５ｍｇ／ｍｌ、または約０．１ｍｇ／ｍｌ～約１．０ｍｇ／ｍｌの範囲内の濃度で溶液中に存在する。ＰＤＧＦは、各範囲の上限および下限を含めて、これらの記載される範囲内の任意の濃度で溶液中に存在してもよい。他の実施形態において、ＰＤＧＦは、以下の濃度：約０．０５ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ、約０．１５ｍｇ／ｍｌ、約０．２ｍｇ／ｍｌ、約０．２５ｍｇ／ｍｌ、約０．３ｍｇ／ｍｌ、約０．３５ｍｇ／ｍｌ、約０．４ｍｇ／ｍｌ、約０．４５ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ、約０．５５ｍｇ／ｍｌ、約０．６ｍｇ／ｍｌ、約０．６５ｍｇ／ｍｌ、約０．７ｍｇ／ｍｌ、約０．７５ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌ、約０．８５ｍｇ／ｍｌ、約０．９ｍｇ／ｍｌ、約０．９５ｍｇ／ｍｌ、または約１．０ｍｇ／ｍｌのいずれか１つで溶液中に存在する。これらの濃度は単純に特定の実施形態の例であること、ならびにＰＤＧＦの濃度は、各範囲の上限および下限を含めて、上記の濃度範囲のいずれか以内であってもよいことが理解されるべきである。
【0042】
ＰＤＧＦの様々な量が本発明の組成物において使用されてもよい。使用されるＰＤＧＦの量は、一部の実施形態において、以下の範囲：約１μｇ～約５０ｍｇ、約１０μｇ～約２５ｍｇ、約１００μｇ～約１０ｍｇ、または約２５０μｇ～約５ｍｇ内の量を含む。
【0043】
本開示の一部の実施形態におけるＰＤＧＦまたは他の増殖因子の濃度は、米国特許第６，２２１，６２５号明細書、同第５，７４７，２７３号明細書、および同第５，２９０，７０８号明細書（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるような酵素結合イムノアッセイ、またはＰＤＧＦ濃度を決定するための当該技術分野において公知の任意の他のアッセイを使用することにより決定することができる。本明細書において提供される場合、ＰＤＧＦのモル濃度は、ＰＤＧＦ二量体の分子量（ＭＷ）（例えば、ＰＤＧＦ－ＢＢ；ＭＷ 約２５ｋＤａ）に基づいて決定される。
【0044】
ＰＤＧＦは、ＰＤＧＦホモ二量体および／またはヘテロ二量体を含んでもよく、これらの二量体としては、ＰＤＧＦ－ＡＡ、ＰＤＧＦ－ＢＢ、ＰＤＧＦ－ＡＢ、ＰＤＧＦ－ＣＣ、ＰＤＧＦ－ＤＤ、ならびにこれらの混合物および誘導体が挙げられる。一部の実施形態において、ＰＤＧＦはＰＤＧＦ－ＢＢを含む。別の実施形態において、ＰＤＧＦは組換えヒト（ｒｈ）ＰＤＧＦ、例えばｒｈＰＤＧＦ－ＢＢを含む。
【0045】
ＰＤＧＦは、一部の実施形態において、天然の供給源から得ることができる。他の実施形態において、ＰＤＧＦは組換えＤＮＡ技術により製造することができる。他の実施形態において、ＰＤＧＦまたはその断片は、当業者に公知のペプチド合成技術、例えばペプチド固相合成を使用して製造されてもよい。天然の供給源から得られる場合、ＰＤＧＦは生体液に由来することができる。生体液は、一部の実施形態によれば、血液を含む、生きた
生物に関連する任意の処理済みまたは非処理の流体を含むことができる。
生物に関連する任意の処理済みまたは非処理の流体を含むことができる。
【0046】
生体液はまた、別の実施形態において、血液成分を含むことができ、血液成分としては、血小板濃縮物（ＰＣ）、アフェレーシスされた血小板、多血小板血漿（ＰＲＰ）、血漿、血清、新鮮凍結血漿（ＦＦＰ）、およびバフィコート（ＢＣ）が挙げられる。生体液は、さらなる実施形態において、血漿から分離され、かつ生理学的流体に再懸濁された血小板を含むことができる。
【0047】
ＰＤＧＦが組換えＤＮＡ技術により製造される場合、単一の単量体（例えば、ＰＤＧＦ
Ｂ鎖またはＡ鎖）をコードするＤＮＡ配列は、一部の実施形態において、その後にホモ二量体（例えばＰＤＧＦ－ＢＢまたはＰＤＧＦ－ＡＡ）を製造するために、発現のための培養された原核または真核細胞に挿入することができる。他の実施形態において、ＰＤＧＦヘテロ二量体は、ヘテロ二量体の両方の単量体単位をコードするＤＮＡ配列を培養された原核または真核細胞に挿入すること、および翻訳された単量体単位が細胞によりプロセシングされてヘテロ二量体（例えばＰＤＧＦ－ＡＢ）が製造されることを可能とすることにより生成することができる。商業的に入手可能なＧＭＰ組換えＰＤＧＦ－ＢＢはＣｈｉｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、Ｃａｌｉｆ．）から得ることができる。研究グレードのｒｈＰＤＧＦ－ＢＢは、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、Ｍｉｎｎ．）、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、Ｃａｌｉｆ．）、およびＣｈｅｍｉｃｏｎ， Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ、Ｃａｌｉｆ．）を含む複数の供給元から得ることができる。
Ｂ鎖またはＡ鎖）をコードするＤＮＡ配列は、一部の実施形態において、その後にホモ二量体（例えばＰＤＧＦ－ＢＢまたはＰＤＧＦ－ＡＡ）を製造するために、発現のための培養された原核または真核細胞に挿入することができる。他の実施形態において、ＰＤＧＦヘテロ二量体は、ヘテロ二量体の両方の単量体単位をコードするＤＮＡ配列を培養された原核または真核細胞に挿入すること、および翻訳された単量体単位が細胞によりプロセシングされてヘテロ二量体（例えばＰＤＧＦ－ＡＢ）が製造されることを可能とすることにより生成することができる。商業的に入手可能なＧＭＰ組換えＰＤＧＦ－ＢＢはＣｈｉｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、Ｃａｌｉｆ．）から得ることができる。研究グレードのｒｈＰＤＧＦ－ＢＢは、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、Ｍｉｎｎ．）、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、Ｃａｌｉｆ．）、およびＣｈｅｍｉｃｏｎ， Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ、Ｃａｌｉｆ．）を含む複数の供給元から得ることができる。
【0048】
本発明の一部の実施形態において、ＰＤＧＦはＰＤＧＦ断片を含む。一部の実施形態において、ｒｈＰＤＧＦ－Ｂは、完全Ｂ鎖の以下の断片：アミノ酸配列１～３１、１～３２、３３～１０８、３３～１０９、および／または１～１０８を含む。ＰＤＧＦのＢ鎖の完全なアミノ酸配列（１～１０９）は、米国特許第５，５１６，８９６号明細書（その開示は参照により全体が本明細書に組み込まれる）の図１５において提供されている。本発明のｒｈＰＤＧＦ－ＢＢ組成物はインタクトなｒｈＰＤＧＦ－Ｂ（１～１０９）およびその断片の組み合わせを含んでもよいことが理解されるべきである。ＰＤＧＦの他の断片、例えば米国特許第５，５１６，８９６号明細書に開示されるものが用いられてもよい。１つの実施形態によれば、ｒｈＰＤＧＦ－ＢＢは少なくとも６５％のインタクトなｒｈＰＤＧＦ－Ｂ（１～１０９）を含む。別の実施形態において、ｒｈＰＤＧＦ－ＢＢは、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％のインタクトなｒｈＰＤＧＦ－Ｂ（１～１０９）を含む。ＰＤＧＦを製造する方法は米国特許出願公開第２０１４０３０８３３２号明細書（その内容は参照により全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【0049】
一部の実施形態において、ＰＤＧＦは精製することができる。精製されたＰＤＧＦは、本明細書において使用される場合、本発明の溶液への組み込みの前に約９５重量％より高いＰＤＧＦを有する組成物を含む。溶液は任意の薬学的に許容される溶液であってもよい。他の実施形態において、ＰＤＧＦは実質的に精製することができる。実質的に精製されたＰＤＧＦは、本明細書において使用される場合、本発明の溶液への組み込みの前に約５重量％～約９５重量％のＰＤＧＦを有する組成物を含む。一部の実施形態において、実質的に精製されたＰＤＧＦは、本発明の溶液への組み込みの前に約６５重量％～約９５重量％のＰＤＧＦを有する組成物を含む。他の実施形態において、実質的に精製されたＰＤＧＦは、本発明の溶液への組み込みの前に、約７０重量％～約９５重量％、約７５重量％～約９５重量％、約８０重量％～約９５重量％、約８５重量％～約９５重量％、または約９０重量％～約９５重量％のＰＤＧＦを有する組成物を含む。精製されたＰＤＧＦおよび実質的に精製されたＰＤＧＦは足場および結合剤に組み込まれてもよい。
【0050】
さらなる実施形態において、ＰＤＧＦは部分的に精製することができる。部分的に精製されたＰＤＧＦは、本明細書において使用される場合、多血小板血漿（ＰＲＰ）、新鮮凍結血漿（ＦＦＰ）、またはＰＤＧＦを製造するために収集および分離を要求する任意の他の血液製造物の文脈におけるＰＤＧＦを有する組成物を含む。本発明の実施形態は、ホモ二量体およびヘテロ二量体を含む、本明細書において提供される任意のＰＤＧＦアイソフォームは精製または部分的に精製できることを想定する。ＰＤＧＦ混合物を含有する本発明の組成物は、部分的に精製された割合でＰＤＧＦアイソフォームまたはＰＤＧＦ断片を含有してもよい。部分的に精製されたおよび精製されたＰＤＧＦは、一部の実施形態において、米国特許出願第１１／１５９，５３３号明細書（公開番号：２００６００８４６０２）に記載されるように調製することができる。
【0051】
一部の実施形態において、ＰＤＧＦを含む溶液は、ＰＤＧＦを水性媒体中または１つもしくは複数の緩衝液中に可溶化することにより形成される。本発明のＰＤＧＦ溶液における使用のために好適な緩衝液は、炭酸塩、リン酸塩（例えばリン酸緩衝食塩水）、ヒスチジン、酢酸塩（例えば酢酸ナトリウム）、酸性緩衝液、例えば酢酸およびＨＣｌ、ならびに有機緩衝液、例えばリジン、Ｔｒｉｓ緩衝液（例えばトリス（ヒドロキシメチル）アミノエタン）、Ｎ－２－ヒドロキシエチルピペラジン－Ｎ’－２－エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、および３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）を含むことができるがこれらに限定されない。緩衝液は、ＰＤＧＦとの生物学的適合性および望ましくないタンパク質修飾を妨害する緩衝液の能力に基づいて選択することができる。緩衝液はさらに、宿主組織との適合性に基づいて選択することができる。一部の実施形態において、酢酸ナトリウム緩衝液が使用される。緩衝液は、異なるモル濃度、例えば、約０．１ｍＭ～約１００ｍＭ、約１ｍＭ～約５０ｍＭ、約５ｍＭ～約４０ｍＭ、約１０ｍＭ～約３０ｍＭ、もしくは約１５ｍＭ～約２５ｍＭ、またはこれらの範囲内の任意のモル濃度で用いることができる。一部の実施形態において、酢酸緩衝液が約２０ｍＭのモル濃度で用いられる。
【0052】
別の実施形態において、ＰＤＧＦを含む溶液は、凍結乾燥されたＰＤＧＦを水中に可溶化することにより形成され、可溶化の前にＰＤＧＦは適切な緩衝液から凍結乾燥される。
【0053】
ＰＤＧＦを含む溶液は、本発明の実施形態によれば、約３．０～約８．０の範囲内のｐＨを有することができる。一部の実施形態において、ＰＤＧＦを含む溶液は、約５．０～約８．０、約５．５～約７．０、もしくは約５．５～約６．５の範囲内、またはこれらの範囲内の任意の値のｐＨを有する。ＰＤＧＦを含む溶液のｐＨは、同じ実施形態において、ＰＤＧＦまたは任意の他の所望の生物学的活性剤の長期化された安定性および有効性と適合することができる。ＰＤＧＦは酸性環境においてより安定なことがある。したがって、１つの実施形態によれば、本発明はＰＤＧＦ溶液の酸性保存製剤を含む。この実施形態によれば、ＰＤＧＦ溶液は、好ましくは、約３．０～約７．０または約４．０～約６．０のｐＨを有する。ＰＤＧＦの生物学的活性は、しかしながら、中性ｐＨ範囲を有する溶液中で最適化することができる。したがって、さらなる実施形態において、本発明はＰＤＧＦ溶液の中性ｐＨ製剤を含む。この実施形態によれば、ＰＤＧＦ溶液は、約５．０～約８．０、約５．５～約７．０、または約５．５～約６．５のｐＨを有する。本発明の方法によれば、酸性ＰＤＧＦ溶液は中性ｐＨ組成物に再製剤化される。本発明の好ましい実施形態によれば、溶液中で利用されるＰＤＧＦはｒｈ－ＰＤＧＦ－ＢＢである。さらなる実施形態において、ＰＤＧＦ含有溶液のｐＨは、生体適合性マトリックスへのＰＤＧＦの結合速度論を最適化するために変更することができる。
【0054】
ＰＤＧＦを含む溶液のｐＨは、一部の実施形態において、本明細書に記載の緩衝液により制御することができる。様々なタンパク質は、安定するｐＨ範囲が異なる。タンパク質安定性は主に、等電点およびタンパク質上の電荷により反映される。ｐＨ範囲は、タンパ
ク質の立体配座構造ならびにタンパク質分解、加水分解、酸化、およびタンパク質の構造および／または生物学的活性に対する改変をもたらすことができる他のプロセスに対するタンパク質の感受性に影響を与えることができる。
ク質の立体配座構造ならびにタンパク質分解、加水分解、酸化、およびタンパク質の構造および／または生物学的活性に対する改変をもたらすことができる他のプロセスに対するタンパク質の感受性に影響を与えることができる。
【0055】
一部の実施形態において、ＰＤＧＦを含む溶液は追加の成分、例えば他の生物学的活性剤をさらに含むことができる。他の実施形態において、ＰＤＧＦを含む溶液は、細胞培養培地、他の安定化タンパク質、例えばアルブミン、抗菌剤、プロテアーゼ阻害剤［例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコール－ビス（ベータ－アミノエチルエーテル）－Ｎ、Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸（ＥＧＴＡ）、アプロチニン、イプシロン－アミノカプロン酸（ＥＡＣＡ）など］および／または他の増殖因子、例えば線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、またはＰＤＧＦ－ＡＡ、ＰＤＧＦ－ＢＢ、ＰＤＧＦ－ＡＢ、ＰＤＧＦ－ＣＣおよび／もしくはＰＤＧＦ－ＤＤの組成物を含む他のＰＤＧＦをさらに含むことができる。
【0056】
生体適合性マトリックス
組成物は生体適合性マトリックスを含む。一部の実施形態において、生体適合性マトリックスは１つまたは複数の骨足場および１つまたは複数の生体適合性結合剤を含む。
組成物は生体適合性マトリックスを含む。一部の実施形態において、生体適合性マトリックスは１つまたは複数の骨足場および１つまたは複数の生体適合性結合剤を含む。
【0057】
骨足場材料
生体適合性マトリックスは、本発明の一部の実施形態によれば、骨足場材料を含む。骨足場材料および骨代用剤という用語は本開示において交換可能に使用されることが理解されるべきである。骨足場材料は、新たな骨および組織成長が起こるためのフレームワークまたは足場を提供する。骨代用剤は、骨を永久的または一時的に置き換えるために使用することができるものである。埋め込み後に、骨代用剤は身体により保持されることができ、またはそれは身体により吸収されて骨で置き換えられることができる。例示的な骨代用剤としては、例えば、リン酸カルシウム（例えば、リン酸三カルシウム、例えばβ－リン酸三カルシウム（β－ＴＣＰ）、ヒドロキシアパタイト、低結晶性ヒドロキシアパタイト、非晶質リン酸カルシウム、メタリン酸カルシウム、リン酸二カルシウム二水和物、リン酸七カルシウム、ピロリン酸カルシウム二水和物、ピロリン酸カルシウム、およびリン酸八カルシウム）、硫酸カルシウム、および同種移植片（例えば石灰化骨、石灰化除タンパク質化異種移植片、または脱灰骨（例えば、脱灰凍結乾燥皮質もしくは海綿骨）、ならびにこれらの任意の組み合わせが挙げられる。
生体適合性マトリックスは、本発明の一部の実施形態によれば、骨足場材料を含む。骨足場材料および骨代用剤という用語は本開示において交換可能に使用されることが理解されるべきである。骨足場材料は、新たな骨および組織成長が起こるためのフレームワークまたは足場を提供する。骨代用剤は、骨を永久的または一時的に置き換えるために使用することができるものである。埋め込み後に、骨代用剤は身体により保持されることができ、またはそれは身体により吸収されて骨で置き換えられることができる。例示的な骨代用剤としては、例えば、リン酸カルシウム（例えば、リン酸三カルシウム、例えばβ－リン酸三カルシウム（β－ＴＣＰ）、ヒドロキシアパタイト、低結晶性ヒドロキシアパタイト、非晶質リン酸カルシウム、メタリン酸カルシウム、リン酸二カルシウム二水和物、リン酸七カルシウム、ピロリン酸カルシウム二水和物、ピロリン酸カルシウム、およびリン酸八カルシウム）、硫酸カルシウム、および同種移植片（例えば石灰化骨、石灰化除タンパク質化異種移植片、または脱灰骨（例えば、脱灰凍結乾燥皮質もしくは海綿骨）、ならびにこれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【0058】
骨足場材料は、一部の実施形態において、少なくとも１つのリン酸カルシウムを含む。一部の実施形態において、リン酸カルシウムはβ－ＴＣＰを含む。他の実施形態において、骨足場材料は複数のリン酸カルシウムを含む。骨足場材料としての使用のために好適なリン酸カルシウムは、本発明の一部の実施形態において、０．５～２．０の範囲内のカルシウム対リン原子比を有する。一部の実施形態において、骨足場材料は同種移植片を含む。
【0059】
一部の実施形態において、生体適合性マトリックスは、生体適合性結合剤または骨同種移植片、例えば脱灰凍結乾燥骨同種移植片（ＤＦＤＢＡ）もしくは粒子状脱灰骨マトリックス（ＤＢＭ）と共にまたはそれを伴わずにリン酸カルシウム粒子を含んでもよい。別の実施形態において、生体適合性マトリックスは骨同種移植片、例えばＤＦＤＢＡまたはＤＢＭを含んでもよい。実施形態において、生体適合性マトリックスは生体吸収性である。一部の実施形態において、生体適合性マトリックスは同種移植片、例えばＤＦＤＢＡまたは粒子状ＤＢＭを含む。
【0060】
骨足場材料としての使用のために好適なリン酸カルシウムの非限定的な例としては、非晶質リン酸カルシウム、リン酸一カルシウム一水和物（ＭＣＰＭ）、リン酸一カルシウム無水物（ＭＣＰＡ）、リン酸二カルシウム二水和物（ＤＣＰＤ）、リン酸二カルシウム無水物（ＤＣＰＡ）、リン酸八カルシウム（ＯＣＰ）、α－リン酸三カルシウム、β－ＴＣＰ、ヒドロキシアパタイト（ＯＨＡｐ）、低結晶性ヒドロキシアパタイト、リン酸四カルシウム（ＴＴＣＰ）、デカリン酸七カルシウム、メタリン酸カルシウム、ピロリン酸カルシウム二水和物、ピロリン酸カルシウム、炭酸カルシウムリン酸塩、またはこれらの任意の混合物が挙げられる。
【0061】
別の実施形態において、骨代用剤は多孔性組成物を有する。多孔性は、インプラント材料中への細胞遊走および浸潤を促し、その結果、浸潤している細胞は細胞外骨マトリックスを分泌することができるので望ましい特徴である。多孔性はまた、血管新生のためのアクセスを提供する。多孔性はまた、活性物質の吸収および放出の増強の他に、細胞－マトリックス相互作用の増加のための大きい表面積を提供する。組成物は、埋め込みのために好適な形状（例えば、スフェア、シリンダー、もしくはブロック）で提供することができ、または使用の前にサイズ調整および成形することができる。好ましい実施形態において、骨代用剤はリン酸カルシウム（例えば、β－ＴＣＰ）である。多孔性骨足場材料は、一部の実施形態によれば、約１μｍ～約１ｍｍの範囲内の直径を有するポアを含むことができる。一部の実施形態において、骨足場材料は、約１００μｍ～約１ｍｍの範囲内の直径を有するマクロポアを含む。別の実施形態において、骨足場材料は、約１０μｍｍ～約１００μｍの範囲内の直径を有するメソポアを含む。さらなる実施形態において、骨足場材料は、約１０μｍ未満の直径を有するマイクロポアを含む。本発明の実施形態は、マクロポア、メソポア、およびマイクロポアまたはこれらの任意の組み合わせを含む骨足場材料を想定する。一部の実施形態において、骨足場材料は、相互接続されたポアを含む。一部の実施形態において、骨足場材料は、相互接続されていないポアを含む。一部の実施形態において、骨足場材料は、相互接続されたおよび相互接続されていないポアを含む。
【0062】
多孔性骨足場材料は、一部の実施形態において、約２５％より高いまたは約４０％より高い多孔度を有する。別の実施形態において、多孔性骨足場材料は、約５０％より高い、約６０％より高い、約６５％より高い、約７０％より高い、約８０％より高い、または約８５％より高い多孔度を有する。さらなる実施形態において、多孔性骨足場材料は、約９０％より高い多孔度を有する。一部の実施形態において、多孔性骨足場材料は、足場材料中への細胞遊走を促す多孔度を含む。
【0063】
一部の実施形態において、骨足場材料は複数の粒子を含む。骨足場材料は、例えば、複数のリン酸カルシウム粒子を含むことができる。骨足場材料の粒子は、一部の実施形態において、骨足場について本明細書において提供されるポア直径および多孔度のいずれかを個々に示すことができる。他の実施形態において、骨足場材料の粒子は、骨足場材料について本明細書において提供されるポア直径および多孔度のいずれかを有するマトリックスを生成するために会合を形成することができる。
【0064】
骨足場粒子は、ｍｍ、μｍまたはサブミクロン（ｎｍ）のサイズであってもよい。骨足場粒子は、一部の実施形態において、約１μｍ～約５ｍｍの範囲内の平均直径を有する。他の実施形態において、粒子は、約１ｍｍ～約２ｍｍ、約１ｍｍ～約３ｍｍ、または約２５０μｍ～約７５０μｍの範囲内の平均直径を有する。骨足場粒子は、別の実施形態において、約１００μｍ～約３００μｍの範囲内の平均直径を有する。さらなる実施形態において、粒子は約７５μｍ～約３００μｍの範囲内の平均直径を有する。追加の実施形態において、骨足場粒子は、約２５μｍ未満、約１μｍ未満、および一部の場合には約１ｍｍ未満の平均直径を有する。一部の実施形態において、骨足場粒子は約１００μｍ～約５ｍｍまたは約１００μｍ～約３ｍｍの範囲内の平均直径を有する。他の実施形態において、
骨足場粒子は、約２５０μｍ～約２ｍｍ、約２５０μｍ～約１ｍｍ、約２００μｍ～約３ｍｍの範囲内の平均直径を有する。粒子はまた、約１ｎｍ～約１０００ｎｍ、約５００ｎｍ未満または約２５０ｎｍ未満の範囲内であってもよい。
骨足場粒子は、約２５０μｍ～約２ｍｍ、約２５０μｍ～約１ｍｍ、約２００μｍ～約３ｍｍの範囲内の平均直径を有する。粒子はまた、約１ｎｍ～約１０００ｎｍ、約５００ｎｍ未満または約２５０ｎｍ未満の範囲内であってもよい。
【0065】
骨足場粒子は、一部の実施形態において、約１μｍ～約５ｍｍの範囲内の直径を有する。他の実施形態において、粒子は、約１ｍｍ～約２ｍｍ、約１ｍｍ～約３ｍｍ、または約２５０μｍ～約７５０μｍの範囲内の直径を有する。骨足場粒子は、別の実施形態において、約１００μｍ～約３００μｍの範囲内の直径を有する。さらなる実施形態において、粒子は約７５μｍ～約３００μｍの範囲内の直径を有する。追加の実施形態において、骨足場粒子は、約２５μｍ未満、約１μｍ未満、および一部の場合には約１ｍｍ未満の直径を有する。一部の実施形態において、骨足場粒子は約１００μｍ～約５ｍｍまたは約１００μｍ～約３ｍｍの範囲内の直径を有する。他の実施形態において、骨足場粒子は、約２５０μｍ～約２ｍｍ、約２５０μｍ～約１ｍｍ、約２００μｍ～約３ｍｍの範囲内の直径を有する。粒子はまた、約１ｎｍ～約１０００ｎｍ、約５００ｎｍ未満または約２５０ｎｍ未満の範囲内であってもよい。
【0066】
一部の実施形態において、骨足場材料は、成形可能（ｍｏｌｄａｂｌｅ）、押し出し可能（ｅｘｔｒｕｄａｂｌｅ）、かつ／または注射可能である。成形可能、押し出し可能、かつ／または注射可能な骨足場材料は、脊椎固定術の間の、骨中の標的部位中およびその周囲、ならびに所望の骨癒合の部位における骨の間における本開示の組成物の効率的な配置を促すことができる。一部の実施形態において、成形可能な骨足場材料は、スパチュラまたは同等のデバイスを用いて骨癒合の部位に適用することができる。一部の実施形態において、骨足場材料は流動性である。流動性骨足場材料は、一部の実施形態において、針またはカニューレを有するシリンジを通じて骨癒合の部位に適用することができる。一部の実施形態において、骨足場材料はインビボで硬化する。
【0067】
一部の実施形態において、骨足場材料は生体吸収性である。骨足場材料は、一部の実施形態において、インビボ埋め込み後１年以内に少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％または９０％吸収されることができる。別の実施形態において、骨足場材料は、インビボ埋め込みの１、３、６、９、１２、または１８か月以内に少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％または９０％吸収されることができる。生体吸収性は、（１）マトリックス材料の性質（すなわち、その化学的構成、物理的構造およびサイズ）、（２）マトリックスが置かれる身体内の位置、（３）使用されるマトリックス材料の量、（４）患者の代謝状態（糖尿病／非糖尿病、骨粗鬆症、喫煙者、高齢、ステロイドの使用など）、（５）治療される傷害の程度および／または種類、ならびに（６）マトリックスに加えての他の材料、例えば他の骨同化、異化および抗異化因子の使用に依存する。
【0068】
生体適合性結合剤
生体適合性結合剤（ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ ｂｉｎｄｅｒ）は、一部の実施形態によれば、合わせた物質の間の粘着を促進するように作動可能な材料を含むことができる。生体適合性結合剤は、例えば、生体適合性マトリックスの形成において骨足場材料の粒子間の付着を促進することができる。
生体適合性結合剤（ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ ｂｉｎｄｅｒ）は、一部の実施形態によれば、合わせた物質の間の粘着を促進するように作動可能な材料を含むことができる。生体適合性結合剤は、例えば、生体適合性マトリックスの形成において骨足場材料の粒子間の付着を促進することができる。
【0069】
生体適合性結合剤は、一部の実施形態において、コラーゲン、多糖、核酸、炭水化物、タンパク質、ポリペプチド、合成ポリマー、ポリ（α－ヒドロキシ酸）、ポリ（ラクトン）、ポリ（アミノ酸）、ポリ（無水物）、ポリウレタン、ポリ（オルトエステル）、ポリ（無水物－コ－イミド）、ポリ（オルトカルボネート）、ポリ（α－ヒドロキシアルカノエート）、ポリ（ジオキサノン）、ポリ（ホスホエステル）、ポリ乳酸、ポリ（Ｌ－ラクチド）（ＰＬＬＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド）（ＰＤＬＬＡ）、ポリグリコリド（ＰＧ
Ａ）、ポリ（ラクチド－コ－グリコリド（ＰＬＧＡ）、ポリ（Ｌ－ラクチド－コ－Ｄ，Ｌ－ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド－コ－炭酸トリメチレン）、ポリグリコール酸、ポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）、ポリ（イプシロン－カプロラクトン）、ポリ（δ－バレロラクトン）、ポリ（γ－ブチロラクトン）、ポリ（カプロラクトン）、ポリアクリル酸、ポリカルボン酸、ポリ（アリルアミン塩酸塩）、ポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロリド）、ポリ（エチレンイミン）、ポリプロピレンフマレート、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリエチレン、ポリメチルメタクリレート、炭素繊維、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（エチルオキサゾリン）、ポリ（エチレンオキシド）－コ－ポリ（プロピレンオキシド）ブロックコポリマー、ポリ（エチレンテレフタレート）ポリアミド、ならびにこれらのコポリマーおよび混合物を含むことができる。
Ａ）、ポリ（ラクチド－コ－グリコリド（ＰＬＧＡ）、ポリ（Ｌ－ラクチド－コ－Ｄ，Ｌ－ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド－コ－炭酸トリメチレン）、ポリグリコール酸、ポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）、ポリ（イプシロン－カプロラクトン）、ポリ（δ－バレロラクトン）、ポリ（γ－ブチロラクトン）、ポリ（カプロラクトン）、ポリアクリル酸、ポリカルボン酸、ポリ（アリルアミン塩酸塩）、ポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロリド）、ポリ（エチレンイミン）、ポリプロピレンフマレート、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリエチレン、ポリメチルメタクリレート、炭素繊維、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（エチルオキサゾリン）、ポリ（エチレンオキシド）－コ－ポリ（プロピレンオキシド）ブロックコポリマー、ポリ（エチレンテレフタレート）ポリアミド、ならびにこれらのコポリマーおよび混合物を含むことができる。
【0070】
生体適合性結合剤は、他の実施形態において、アルギン酸、アラビアガム、グアーガム、キサンタンガム、ゼラチン、キチン、キトサン、キトサン酢酸塩、キトサン乳酸塩、コンドロイチン硫酸塩、レシチン、Ｎ，Ｏ－カルボキシメチルキトサン、ホスファチジルコリン誘導体、デキストラン（例えば、アルファ－シクロデキストリン、ベータ－シクロデキストリン、ガンマ－シクロデキストリン、またはデキストラン硫酸ナトリウム）、フィブリン糊、レシチン、グリセロール、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸ナトリウム、セルロース（例えば、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、またはヒドロキシエチルセルロース）、グルコサミン、プロテオグリカン、デンプン（例えば、ヒドロキシエチルデンプンまたは可溶性デンプン）、乳酸、プルロン酸（ｐｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、グリセロリン酸ナトリウム、グリコーゲン、ケラチン、シルク、ならびにこれらの誘導体および混合物を含むことができる。
【0071】
一部の実施形態において、結合剤はコラーゲンを含む。一部の実施形態において、コラーゲンはＩ型コラーゲンを含む。一部の実施形態において、コラーゲンはウシＩ型コラーゲンを含む。一部の実施形態において、生体適合性結合剤はヒアルロン酸を含む。
【0072】
一部の実施形態において、生体適合性結合剤は水溶性である。水溶性結合剤は、生体適合性マトリックスの埋め込みのすぐ後に生体適合性マトリックスから溶解し、それによりマクロ多孔性を生体適合性マトリックスに導入することができる。マクロ多孔性は、本明細書において議論される場合、アクセスを増強し、結果として、インプラント部位における破骨細胞および骨芽細胞のリモデリング活性を増強することにより、インプラント材料の骨伝導性を増加させることができる。
【0073】
一部の実施形態において、生体適合性結合剤は、生体適合性マトリックスの約１重量パーセント～約７０重量パーセント、約５重量パーセント～約５０重量パーセント、約１０重量パーセント～約４０重量パーセント、約１５重量パーセント～約３５重量パーセント、または約１５重量パーセント～約２５重量パーセントの範囲内の量で生体適合性マトリックス中に存在することができる。さらなる実施形態において、生体適合性結合剤は、生体適合性マトリックスの約２０重量パーセントの量で存在することができる。
【0074】
骨足場材料および生体適合性結合剤を含む生体適合性マトリックスは、一部の実施形態によれば、流動性、成形可能、かつ／または押し出し可能であることができる。そのような実施形態において、生体適合性マトリックスはペーストの形態であることができる。ペーストの形態の生体適合性マトリックスは、一部の実施形態において、生体適合性結合剤により互いに接着した骨足場材料の粒子を含むことができる。
【0075】
ペーストまたはパテの形態の生体適合性マトリックスは、所望のインプラント形状に成形することができ、または埋め込み部位の輪郭に成形することができる。一部の実施形態
において、ペーストまたはパテの形態の生体適合性マトリックスは、シリンジまたはカニューレを用いて埋め込み部位に注入することができる。
において、ペーストまたはパテの形態の生体適合性マトリックスは、シリンジまたはカニューレを用いて埋め込み部位に注入することができる。
【0076】
一部の実施形態において、ペーストまたはパテの形態の生体適合性マトリックスは硬化せず、埋め込み後に流動性かつ成形可能な形態を保持する。他の実施形態において、ペーストまたはパテは埋め込み後に硬化することができ、それによりマトリックスの流動性および成形可能性を低減させることができる。
【0077】
骨足場材料および生体適合性結合剤を含む生体適合性マトリックスはまた、一部の実施形態において、所定の形状において提供することができ、該形状としては、ブロック、スフェア、もしくはシリンダーまたは任意の所望の形状、例えば鋳型もしくは適用部位により定義される形状が挙げられる。
【0078】
骨足場材料および生体適合性結合剤を含む生体適合性マトリックスは、一部の実施形態において、上記のように生体吸収性である。生体適合性マトリックスは、そのような実施形態において、インビボ埋め込みの１年以内に吸収されることができる。別の実施形態において、骨足場材料および生体適合性結合剤を含む生体適合性マトリックスは、インビボ埋め込みの１、３、６、または９か月以内に吸収されることができる。生体吸収性は、（１）マトリックス材料の性質（すなわち、その化学的構成、物理的構造およびサイズ）、（２）マトリックスが置かれる身体内の位置、（３）使用されるマトリックス材料の量、（４）患者の代謝状態（糖尿病／非糖尿病、骨粗鬆症、喫煙者、高齢、ステロイドの使用など）、（５）治療される傷害の程度および／または種類、ならびに（６）マトリックスに加えての他の材料、例えば他の骨同化、異化および抗異化因子の使用に依存する。
【0079】
以下は、β－ＴＣＰを含む骨足場材料およびコラーゲンを含む生体適合性結合剤を参照して特定の実施形態を記載するが、本発明の他の実施形態は、β－ＴＣＰを他の骨足場材料（例えば別のリン酸カルシウム、硫酸カルシウム、もしくは同種移植片）で置換することにより、かつ／またはコラーゲンを他の結合剤で置換することにより製造されてもよいことが理解されるべきである。
【0080】
β－ＴＣＰを含む骨足場材料
一部の実施形態において、生体適合性マトリックスとしての使用のための骨足場材料はβ－ＴＣＰを含むことができる。β－ＴＣＰは、一部の実施形態によれば、種々の直径の多方向かつ相互接続されたポアを有する多孔性構造を含むことができる。一部の実施形態において、β－ＴＣＰは、相互接続されたポアに加えて複数のポケットおよび様々な直径の相互接続されていないポアを含む。β－ＴＣＰの多孔性構造は、一部の実施形態において、約１００μｍ～約１ｍｍの範囲内の直径を有するマクロポア、約１０μｍ～約１００μｍの範囲内の直径を有するメソポア、および約１０μｍ未満の直径を有するマイクロポアを含む。β－ＴＣＰのマクロポアおよびマイクロポアは骨誘導および骨伝導を促すことができ、それと共にマクロポア、メソポアおよびマイクロポアは、流体の伝達および栄養の輸送を可能にして、β－ＴＣＰ生体適合性マトリックスの全体を通じた骨再成長をサポートすることができる。
一部の実施形態において、生体適合性マトリックスとしての使用のための骨足場材料はβ－ＴＣＰを含むことができる。β－ＴＣＰは、一部の実施形態によれば、種々の直径の多方向かつ相互接続されたポアを有する多孔性構造を含むことができる。一部の実施形態において、β－ＴＣＰは、相互接続されたポアに加えて複数のポケットおよび様々な直径の相互接続されていないポアを含む。β－ＴＣＰの多孔性構造は、一部の実施形態において、約１００μｍ～約１ｍｍの範囲内の直径を有するマクロポア、約１０μｍ～約１００μｍの範囲内の直径を有するメソポア、および約１０μｍ未満の直径を有するマイクロポアを含む。β－ＴＣＰのマクロポアおよびマイクロポアは骨誘導および骨伝導を促すことができ、それと共にマクロポア、メソポアおよびマイクロポアは、流体の伝達および栄養の輸送を可能にして、β－ＴＣＰ生体適合性マトリックスの全体を通じた骨再成長をサポートすることができる。
【0081】
多孔性構造の構成において、β－ＴＣＰは、一部の実施形態において、２５％より高いまたは約４０％より高い多孔度を有することができる。他の実施形態において、β－ＴＣＰは、５０％より高い、約６０％より高い、約６５％より高い、約７０％より高い、約７５％より高い、約８０％より高い、または約８５％より高い多孔度を有することができる。さらなる実施形態において、β－ＴＣＰは、約９０％より高い多孔度を有することができる。一部の実施形態において、（β－ＴＣＰは、β－ＴＣＰ中への細胞遊走を促す多孔度を有することができる。
【0082】
一部の実施形態において、骨足場材料はβ－ＴＣＰ粒子を含む。β－ＴＣＰ粒子は、一部の実施形態において、β－ＴＣＰについて本明細書において提供されるポア直径および多孔度のいずれかを個々に示すことができる。他の実施形態において、骨足場材料のβ－ＴＣＰ粒子は、骨足場材料について本明細書において提供されるポア直径または多孔度のいずれかを有するマトリックスを生成するために会合を形成することができる。多孔度は、その後の骨形成のためにマトリックス中への細胞遊走および浸潤を促してもよい。β－ＴＣＰ粒子は、一部の実施形態において、約１μｍ～約５ｍｍの範囲内の平均直径を有する。他の実施形態において、β－ＴＣＰ粒子は、約１ｍｍ～約２ｍｍ、約１ｍｍ～約３ｍｍ、約２５０μｍ～約７５０μｍ、約２５０μｍ～約１ｍｍ、約２５０μｍ～約２ｍｍ、または約２００μｍ～約３ｍｍの範囲内の平均直径を有する。別の実施形態において、β－ＴＣＰ粒子は約１００μｍ～約３００μｍの範囲内の平均直径を有する。さらなる実施形態において、β－ＴＣＰ粒子は約７５μｍ～約３００μｍの範囲内の平均直径を有する。追加の実施形態において、β－ＴＣＰ粒子は、約２５μｍ未満の平均直径、約１μｍ未満、または約１ｍｍ未満の平均直径を有する。一部の実施形態において、β－ＴＣＰ粒子は約１００μｍ～約５ｍｍまたは約１００μｍ～約３ｍｍの範囲内の平均直径を有する。
【0083】
β－ＴＣＰ粒子を含む生体適合性マトリックスは、一部の実施形態において、埋め込みのために好適な形状（例えば、スフェア、シリンダー、またはブロック）で提供することができる。他の実施形態において、β－ＴＣＰ骨足場材料は、成形可能、押し出し可能、かつ／または注射可能であり、それにより、脊椎固定術の間に所望の骨癒合の標的部位中およびその周辺におけるマトリックスの配置を促すことができる。流動性マトリックスは、シリンジ、チューブ、もしくはスパチュラまたは同等のデバイスを通じて適用されてもよい。流動性β－ＴＣＰ骨足場材料は、一部の実施形態において、シリンジおよび針またはカニューレを通じて骨癒合の部位に適用することができる。一部の実施形態において、β－ＴＣＰ骨足場材料はインビボで硬化する。
【0084】
β－ＴＣＰ骨足場材料は、一部の実施形態によれば、生体吸収性である。一部の実施形態において、β－ＴＣＰ骨足場材料は、インビボ埋め込み後１年で少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、または８５％吸収されることができる。別の実施形態において、β－ＴＣＰ骨足場材料は、インビボ埋め込み後１年で約９０％より高く吸収されることができる。
【0085】
β－ＴＣＰおよびコラーゲンを含む生体適合性マトリックス
一部の実施形態において、生体適合性マトリックスはβ－ＴＣＰ骨足場材料および生体適合性コラーゲン結合剤を含むことができる。コラーゲン結合剤との組み合わせのために好適なβ－ＴＣＰ骨足場材料は、本明細書において上記に提供されるものと合致する。
一部の実施形態において、生体適合性マトリックスはβ－ＴＣＰ骨足場材料および生体適合性コラーゲン結合剤を含むことができる。コラーゲン結合剤との組み合わせのために好適なβ－ＴＣＰ骨足場材料は、本明細書において上記に提供されるものと合致する。
【0086】
コラーゲン結合剤は、一部の実施形態において、Ｉ型、ＩＩ型、およびＩＩＩ型コラーゲンを含めて、任意の種類のコラーゲンを含むことができる。一部の実施形態において、コラーゲン結合剤は、コラーゲンの混合物、例えばＩ型およびＩＩ型コラーゲンの混合物を含む。他の実施形態において、コラーゲン結合剤は生理的条件下で可溶性である。骨または筋骨格組織に存在する他の種類のコラーゲンが用いられてもよい。組換え、合成および天然に存在する形態のコラーゲンが本発明において使用されてもよい。
【0087】
生体適合性マトリックスは、一部の実施形態によれば、コラーゲン結合剤を用いて互いに接着した複数のβ－ＴＣＰ粒子を含むことができる。コラーゲン結合剤との使用のために好適なβ－ＴＣＰ粒子は、本明細書に記載の任意のβ－ＴＣＰ粒子を含むことができる。一部の実施形態において、コラーゲン結合剤との組み合わせのために好適なβ－ＴＣＰ粒子は約１μｍ～約５ｍｍの範囲内の平均直径を有する。別の実施形態において、コラー
ゲン結合剤との組み合わせのために好適なβ－ＴＣＰ粒子は、約１μｍ～約１ｍｍ、約１ｍｍ～約２ｍｍ、約１ｍｍ～約３ｍｍ、約２５０μｍ～約７５０μｍ、約２５０μｍ～約１ｍｍ、約２５０μｍ～約２ｍｍ、約２００μｍ～約１ｍｍ、または約２００μｍ～約３ｍｍの範囲内の平均直径を有する。β－ＴＣＰ粒子は、他の実施形態において、約１００μｍ～約３００μｍの範囲内の平均直径を有する。さらなる実施形態において、コラーゲン結合剤との組み合わせのために好適なβ－ＴＣＰ粒子は約７５μｍ～約３００μｍの範囲内の平均直径を有する。追加の実施形態において、コラーゲン結合剤との組み合わせのために好適なβ－ＴＣＰ粒子は、約２５μｍ未満、および約１ｍｍ未満または約１μｍ未満の平均直径を有する。一部の実施形態において、コラーゲン結合剤との組み合わせのために好適なβ－ＴＣＰ粒子は約１００μｍ～約５ｍｍまたは約１００μｍ～約３ｍｍの範囲内の平均直径を有する。β－ＴＣＰ粒子は、一部の実施形態において、コラーゲン結合剤により互いに接着して、多孔性構造を有する生体適合性マトリックスを生成することができる。一部の実施形態において、β－ＴＣＰ粒子およびコラーゲン結合剤を含む生体適合性マトリックスは、約１μｍ～約１ｍｍの範囲内の直径を有するポアを含むことができる。β－ＴＣＰ粒子およびコラーゲン結合剤を含む生体適合性マトリックスは、約１００μｍ～約１ｍｍの範囲内の直径を有するマクロポア、約１０μｍ～１００μｍの範囲内の直径を有するメソポア、および約１０μｍ未満の直径を有するマイクロポアを含むことができる。
ゲン結合剤との組み合わせのために好適なβ－ＴＣＰ粒子は、約１μｍ～約１ｍｍ、約１ｍｍ～約２ｍｍ、約１ｍｍ～約３ｍｍ、約２５０μｍ～約７５０μｍ、約２５０μｍ～約１ｍｍ、約２５０μｍ～約２ｍｍ、約２００μｍ～約１ｍｍ、または約２００μｍ～約３ｍｍの範囲内の平均直径を有する。β－ＴＣＰ粒子は、他の実施形態において、約１００μｍ～約３００μｍの範囲内の平均直径を有する。さらなる実施形態において、コラーゲン結合剤との組み合わせのために好適なβ－ＴＣＰ粒子は約７５μｍ～約３００μｍの範囲内の平均直径を有する。追加の実施形態において、コラーゲン結合剤との組み合わせのために好適なβ－ＴＣＰ粒子は、約２５μｍ未満、および約１ｍｍ未満または約１μｍ未満の平均直径を有する。一部の実施形態において、コラーゲン結合剤との組み合わせのために好適なβ－ＴＣＰ粒子は約１００μｍ～約５ｍｍまたは約１００μｍ～約３ｍｍの範囲内の平均直径を有する。β－ＴＣＰ粒子は、一部の実施形態において、コラーゲン結合剤により互いに接着して、多孔性構造を有する生体適合性マトリックスを生成することができる。一部の実施形態において、β－ＴＣＰ粒子およびコラーゲン結合剤を含む生体適合性マトリックスは、約１μｍ～約１ｍｍの範囲内の直径を有するポアを含むことができる。β－ＴＣＰ粒子およびコラーゲン結合剤を含む生体適合性マトリックスは、約１００μｍ～約１ｍｍの範囲内の直径を有するマクロポア、約１０μｍ～１００μｍの範囲内の直径を有するメソポア、および約１０μｍ未満の直径を有するマイクロポアを含むことができる。
【0088】
β－ＴＣＰ粒子およびコラーゲン結合剤を含む生体適合性マトリックスは、約２５％より高いまたは４０％より高い多孔度を有することができる。別の実施形態において、生体適合性マトリックスは、約５０％より高い、約６０％より高い、約６５％より高い、約７０％より高い、約８０％より高い、または約８５％より高い多孔度を有することができる。さらなる実施形態において、生体適合性マトリックスは、約９０％より高い多孔度を有することができる。多孔性は、その後の骨形成のためにマトリックス中への細胞遊走および浸潤を促す。
【0089】
β－ＴＣＰ粒子を含む生体適合性マトリックスは、一部の実施形態において、生体適合性マトリックスの約１重量パーセント～約７０重量パーセント、約５重量パーセント～約５０重量パーセント、約１０重量パーセント～約４０重量パーセント、約１５重量パーセント～約３５重量パーセント、または約１５重量パーセント～約２５重量パーセントの範囲内の量でコラーゲン結合剤を含むことができる。さらなる実施形態において、コラーゲン結合剤は、生体適合性マトリックスの約２０重量パーセントの量で存在することができる。
【0090】
β－ＴＣＰ粒子およびコラーゲン結合剤を含む生体適合性マトリックスは、一部の実施形態によれば、流動性、成形可能、かつ／または押し出し可能であることができる。そのような実施形態において、生体適合性マトリックスはペーストまたはパテの形態であることができる。ペーストまたはパテは、所望のインプラント形状に成形することができ、または埋め込み部位の輪郭に成形することができる。一部の実施形態において、β－ＴＣＰ粒子およびコラーゲン結合剤を含むペーストまたはパテの形態の生体適合性マトリックスは、シリンジまたはカニューレを用いて埋め込み部位に注入することができる。
【0091】
一部の実施形態において、β－ＴＣＰ粒子およびコラーゲン結合剤を含むペーストまたはパテの形態の生体適合性マトリックスは、埋め込まれたときに流動性の形態を保持することができる。他の実施形態において、ペーストまたはパテは埋め込み後に硬化することができ、それによりマトリックス流動性を低減させることができる。
【0092】
β－ＴＣＰ粒子およびコラーゲン結合剤を含む生体適合性マトリックスは、一部の実施形態において、所定の形状、例えばブロック、スフェア、またはシリンダーで提供するこ
とができる。
とができる。
【0093】
β－ＴＣＰ粒子およびコラーゲン結合剤を含む生体適合性マトリックスは吸収性であることができる。一部の実施形態において、β－ＴＣＰ粒子およびコラーゲン結合剤を含む生体適合性マトリックスは、インビボ埋め込み後１年で少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、または９０％吸収されることができる。別の実施形態において、このマトリックスは、インビボ埋め込み後１、３、６、９、１２、または１８か月以内に少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％または９０％吸収されることができる。
【0094】
ＰＤＧＦを含む溶液は、本発明の実施形態による脊椎固定術における骨癒合を促進するための組成物を製造するために、生体適合性マトリックス中に配することができる。
【0095】
生体適合性マトリックス中へのＰＤＧＦ溶液の組み込み
本発明は、骨癒合術における使用のための組成物を製造する方法を提供する。一部の実施形態において、骨の癒合を促進するための組成物を製造する方法は、ＰＤＧＦを含む溶液を提供すること、生体適合性マトリックスを提供すること、およびその溶液を生体適合性マトリックスに組み込むことを含む。組み合わせのために好適なＰＤＧＦ溶液および生体適合性マトリックスは、本明細書において上記されるものと合致する。
本発明は、骨癒合術における使用のための組成物を製造する方法を提供する。一部の実施形態において、骨の癒合を促進するための組成物を製造する方法は、ＰＤＧＦを含む溶液を提供すること、生体適合性マトリックスを提供すること、およびその溶液を生体適合性マトリックスに組み込むことを含む。組み合わせのために好適なＰＤＧＦ溶液および生体適合性マトリックスは、本明細書において上記されるものと合致する。
【0096】
一部の実施形態において、ＰＤＧＦ溶液は、生体適合性マトリックスをＰＤＧＦ溶液に浸漬することにより生体適合性マトリックスに組み込むことができる。ＰＤＧＦ溶液は、別の実施形態において、生体適合性マトリックスをＰＤＧＦ溶液に注入することにより生体適合性マトリックスに組み込むことができる。一部の実施形態において、ＰＤＧＦ溶液を注入することは、ＰＤＧＦ溶液をシリンジに組み込むことおよびＰＤＧＦ溶液を生体適合性マトリックス中に排出して生体適合性マトリックスに飽和させることを含むことができる。
【0097】
溶液を生体適合性マトリックスに組み込む方法の実施形態が図１Ａ～１Ｆに描写される。ＰＤＧＦの溶液がシリンジのバレルに注入される（図１Ａ）。生体適合性マトリックスを含有する第２のシリンジもまた提供される（図１Ｂ）。ＰＤＧＦの溶液を含有するシリンジが、生体適合性マトリックスを含有するシリンジに挿入され、ＰＤＧＦ溶液が、生体適合性マトリックスを含有するシリンジに移されて、生体適合性マトリックスを含水（hydrate）させる（図１Ｃ）。ＰＤＧＦ溶液を移した後に、含水させた生体適合性マトリッ
クスは任意選択的に時間的期間、例えば１～１０分にわたり静置されてもよい（図１Ｄ）。シリンジが次に、例えばメス－メス（ｆｅｍａｌｅ－ｔｏ－ｆｅｍａｌｅ）ルアーロックコネクターを用いて、互いに接続され、その結果、互いと流体連通する（図１Ｅ）。生体適合性マトリックスおよびＰＤＧＦの溶液が次に、含水させた生体適合性マトリックスを数サイクルにわたりシリンジ間で行ったり来たりするように移すことにより混合される（図２）。一部の実施形態において、均質なペーストを形成させるために、内容物は少なくとも５、１０、２０、またはより多くのサイクルにわたり移される。混合後、含水させたマトリックスは任意選択的に、手術部位に適用する前に数分間静置されてもよい（図１Ｆ）。
クスは任意選択的に時間的期間、例えば１～１０分にわたり静置されてもよい（図１Ｄ）。シリンジが次に、例えばメス－メス（ｆｅｍａｌｅ－ｔｏ－ｆｅｍａｌｅ）ルアーロックコネクターを用いて、互いに接続され、その結果、互いと流体連通する（図１Ｅ）。生体適合性マトリックスおよびＰＤＧＦの溶液が次に、含水させた生体適合性マトリックスを数サイクルにわたりシリンジ間で行ったり来たりするように移すことにより混合される（図２）。一部の実施形態において、均質なペーストを形成させるために、内容物は少なくとも５、１０、２０、またはより多くのサイクルにわたり移される。混合後、含水させたマトリックスは任意選択的に、手術部位に適用する前に数分間静置されてもよい（図１Ｆ）。
【0098】
追加の生物学的活性剤を含む組成物
手術において骨癒合を促進および／または促すための本明細書に記載の組成物は、一部の実施形態によれば、ＰＤＧＦに加えて１つまたは複数の生物学的活性剤をさらに含むことができる。ＰＤＧＦに加えて本発明の組成物に組み込むことができる生物学的活性剤は、有機分子、無機材料、タンパク質、ペプチド、核酸（例えば、遺伝子、遺伝子断片、小挿入物（ｓｍａｌｌ ｉｎｓｅｒｔ）リボ核酸［ｓｉ－ＲＮＡ］、遺伝子調節配列、核転
写因子、およびアンチセンス分子）、核タンパク質、多糖（例えば、ヘパリン）、糖タンパク質、ならびにリポタンパク質を含むことができる。例えば、抗がん剤、抗生物質、鎮痛剤、抗炎症剤、免疫抑制剤、酵素阻害剤、抗ヒスタミン剤、ホルモン、筋肉弛緩剤、プロスタグランジン、栄養因子、骨誘導性タンパク質、増殖因子、およびワクチンを含む、本発明の組成物に組み込むことができる生物学的活性化合物の非限定的な例は米国特許出願第１１／１５９，５３３号明細書（公開番号：２００６００８４６０２）に開示されている。一部の実施形態において、本発明の組成物に組み込むことができる生物学的活性化合物は、骨誘導性因子、例えばインスリン様増殖因子、線維芽細胞増殖因子、または他のＰＤＧＦを含む。他の実施形態によれば、本発明の組成物に組み込むことができる生物学的活性化合物は、好ましくは、骨誘導性および骨刺激性因子、例えば骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ＢＭＰ模倣物、カルシトニン、カルシトニン模倣物、スタチン、スタチン誘導体、または副甲状腺ホルモンを含む。好ましい因子としてはまた、プロテアーゼ阻害剤の他に、ビスホスホン酸塩、およびＮＦ－ｋＢリガンドの受容体活性化因子（ＲＡＮＫ）リガンドに対する抗体を含めて、骨吸収を減少させる骨粗鬆症治療が挙げられる。
手術において骨癒合を促進および／または促すための本明細書に記載の組成物は、一部の実施形態によれば、ＰＤＧＦに加えて１つまたは複数の生物学的活性剤をさらに含むことができる。ＰＤＧＦに加えて本発明の組成物に組み込むことができる生物学的活性剤は、有機分子、無機材料、タンパク質、ペプチド、核酸（例えば、遺伝子、遺伝子断片、小挿入物（ｓｍａｌｌ ｉｎｓｅｒｔ）リボ核酸［ｓｉ－ＲＮＡ］、遺伝子調節配列、核転
写因子、およびアンチセンス分子）、核タンパク質、多糖（例えば、ヘパリン）、糖タンパク質、ならびにリポタンパク質を含むことができる。例えば、抗がん剤、抗生物質、鎮痛剤、抗炎症剤、免疫抑制剤、酵素阻害剤、抗ヒスタミン剤、ホルモン、筋肉弛緩剤、プロスタグランジン、栄養因子、骨誘導性タンパク質、増殖因子、およびワクチンを含む、本発明の組成物に組み込むことができる生物学的活性化合物の非限定的な例は米国特許出願第１１／１５９，５３３号明細書（公開番号：２００６００８４６０２）に開示されている。一部の実施形態において、本発明の組成物に組み込むことができる生物学的活性化合物は、骨誘導性因子、例えばインスリン様増殖因子、線維芽細胞増殖因子、または他のＰＤＧＦを含む。他の実施形態によれば、本発明の組成物に組み込むことができる生物学的活性化合物は、好ましくは、骨誘導性および骨刺激性因子、例えば骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ＢＭＰ模倣物、カルシトニン、カルシトニン模倣物、スタチン、スタチン誘導体、または副甲状腺ホルモンを含む。好ましい因子としてはまた、プロテアーゼ阻害剤の他に、ビスホスホン酸塩、およびＮＦ－ｋＢリガンドの受容体活性化因子（ＲＡＮＫ）リガンドに対する抗体を含めて、骨吸収を減少させる骨粗鬆症治療が挙げられる。
【0099】
追加の生物学的活性剤の送達のための標準的なプロトコールおよびレジメンは当該技術分野において公知である。追加の生物学的活性剤は、インプラント部位への適切な用量の剤の送達を可能とする量で本発明の組成物に導入することができる。ほとんどの場合に、用量は、実施者に公知かつ問題とする特定の剤に適用可能なガイドラインを使用して決定される。本発明の組成物に含められる追加の生物学的活性剤の量は、状態の種類および程度、特定の患者の全体的な健康状態、生物学的活性剤の処方、放出速度論、ならびに生体適合性マトリックスの生体吸収性などの変数に依存し得る。任意の特定の追加の生物学的活性剤のための用量および投薬頻度を最適化するために、標準的な臨床試験が使用されてもよい。
【0100】
脊椎固定術において骨癒合を促進するための組成物は、一部の実施形態によれば、自己骨髄、自己血小板抽出物、および合成骨マトリックス材料を含む、ＰＤＧＦへの他の骨移植材料の追加をさらに含むことができる。
【0101】
癒合術を行う方法
本発明はまた、骨癒合術、例えば脊椎固定術を行う方法を提供する。一部の実施形態において、脊椎固定術を行う方法は、生体適合性マトリックスに組み込まれたＰＤＧＦ溶液を含む組成物を提供することおよび所望の脊椎固定の部位に組成物を適用することを含む。生体適合性マトリックスに組み込まれたＰＤＧＦ溶液を含む組成物は、例えば、所望の脊椎固定の部位に詰めることができる。一部の実施形態において、組成物は、骨癒合部位中の骨の全表面領域と組成物が接触するように詰めることができる。組成物は、さらに、癒合した骨をさらに強化するために骨癒合部位の近傍に適用されてもよい。
本発明はまた、骨癒合術、例えば脊椎固定術を行う方法を提供する。一部の実施形態において、脊椎固定術を行う方法は、生体適合性マトリックスに組み込まれたＰＤＧＦ溶液を含む組成物を提供することおよび所望の脊椎固定の部位に組成物を適用することを含む。生体適合性マトリックスに組み込まれたＰＤＧＦ溶液を含む組成物は、例えば、所望の脊椎固定の部位に詰めることができる。一部の実施形態において、組成物は、骨癒合部位中の骨の全表面領域と組成物が接触するように詰めることができる。組成物は、さらに、癒合した骨をさらに強化するために骨癒合部位の近傍に適用されてもよい。
【0102】
一部の実施形態において、方法は、ケージを使用することを含む。組成物は、癒合の所望の部位への挿入の前にケージの内側の空間に適用されてもよく、あるいは、ケージは癒合の所望の部位に置かれてもよく、かつ組成物が次にケージの内側の空間に適用される。例示的なケージが図３Ａに示され、本開示の例示的な組成物で満たされたケージが図３Ｃに示される。さらに、癒合の部位にケージを固定するために固定化ハードウェアもまた使用されてもよい（図３Ｂ）。
【0103】
頸部、胸部、腰部、および仙椎領域を含めて、脊椎の任意の部分における椎骨が、本発明の組成物および方法を使用して癒合されてもよい。
【0104】
別の実施形態において、本発明の方法は、脊椎固定術において骨結合を加速させることを含み、骨結合を加速させることは、生体適合性マトリックス中に配されたＰＤＧＦ溶液
を含む組成物を提供することおよびそれを適用することを含む。
を含む組成物を提供することおよびそれを適用することを含む。
【0105】
以下の実施例は本発明をさらに説明するためのものであるが、それと同時に、本発明のいかなる限定も構成しない。反対に、本明細書の記載を読んだ後に、本発明の精神から離れることなく当業者に示唆され得る様々な実施形態、その改変および均等物をとることができることが明確に理解されるべきである。
【実施例】
【0106】
実施例１：β－ＴＣＰ／コラーゲンマトリックス中にｒｈＰＤＧＦ－ＢＢを含む組成物の調製
２０％／８０％ ｗ／ｗのウシコラーゲン／β－リン酸三カルシウムマトリックスと組み合わせた２０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ ６．０溶液中の０．３ｍｇ／ｍｌの組換えヒト血小板由来増殖因子（ｒｈＰＤＧＦ－ＢＢ）の製剤。２：１の体積／質量比で混合された場合、製剤は、治療が必要な部位に１４Ｇカニューレまたは針を通じて適用することができる濃いペーストとなる。
２０％／８０％ ｗ／ｗのウシコラーゲン／β－リン酸三カルシウムマトリックスと組み合わせた２０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ ６．０溶液中の０．３ｍｇ／ｍｌの組換えヒト血小板由来増殖因子（ｒｈＰＤＧＦ－ＢＢ）の製剤。２：１の体積／質量比で混合された場合、製剤は、治療が必要な部位に１４Ｇカニューレまたは針を通じて適用することができる濃いペーストとなる。
【0107】
０．５ｇのマトリックス（２０：８０のｗ／ｗ比のウシコラーゲン／β－ＴＣＰ）および２０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ ６．０中の０．３ｍｇ／ｍＬのｒｈＰＤＧＦ－ＢＢの溶液１ｍＬを使用して試験製剤を調製した。０．５ｇのマトリックスおよび１．０ｍＬの２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ ６．０を用いて対照品を同様に調製した。１８ゲージ針を備えた１０ｍＬのシリンジを使用して、バイアルからシリンジのバレルに１．０ｍＬのＰＤＧＦ溶液を吸引した（図１Ａ）。０．５ｇのβ－ＴＣＰ／コラーゲンマトリックスを含有する第２のシリンジを数回タップしてマトリックスをほぐし、シリンジキャップを除去した（図１Ｂ）。ｒｈＰＤＧＦ－ＢＢ溶液を含有するシリンジの針を、β－ＴＣＰ／コラーゲンマトリックスを含有するシリンジの針ハブに挿入し、マトリックスを含有するシリンジにｒｈＰＤＧＦ－ＢＢ溶液を移した（図１Ｃ）。ｒｈＰＤＧＦ溶液が移されている間に、ｒｈＰＤＧＦ溶液がマトリックスのできるだけ多くを含水させるように針をマトリックス含有シリンジの針ハブから徐々に外してもよい。ｒｈＰＤＧＦ－ＢＢ溶液の全てを移した後に、空のシリンジを除去し、含水させたβ－ＴＣＰ／コラーゲンマトリックスを含有するシリンジの針にキャップを再び置いた（図１Ｄ）。含水させたマトリックスを少なくとも２分間静置した。メス－メスルアーロックコネクターを使用して、前にｒｈＰＤＧＦ溶液が含まれていた空のシリンジを、含水させたマトリックスを含有するシリンジに接続した（図１Ｅ）。含水させたマトリックスを次に２０サイクル（１サイクルは、マトリックスを空のシリンジに入れ、次に元々のシリンジに戻すこととして定義される）にわたり２つのシリンジの間で行ったり来たりするように移して、均質なペーストを形成させた。図２は、ペーストを形成させるために２つのシリンジの間で含水させたマトリックスを移すプロセスを描写する図式である。ペーストを最後に１つのシリンジに完全に移した。シリンジのプランジャーを穏やかに引くことにより、混合プロセスの間に蓄積した圧力を緩和してもよい。空のシリンジおよびメス－メスルアーロックコネクターを、含水させたマトリックスを含有するシリンジから除去した。シリンジ中に残存する空気を排気し、１４ゲージブラントカニューレを取り付けた（図１Ｆ）。
【0108】
実施例２：ヒツジモデルにおける腰椎固定の評価
Ａ．研究の設計
ヒツジは形状および長さにおいてヒトと同等の脊髄構造を有するので、ヒツジモデルをこの研究のために選択した。追加的に、ヒツジは、ヒトと類似した骨治癒プロセスを持つ。よって、ヒツジモデルは腰椎固定の許容されるトランスレーショナルモデルとなる。
Ａ．研究の設計
ヒツジは形状および長さにおいてヒトと同等の脊髄構造を有するので、ヒツジモデルをこの研究のために選択した。追加的に、ヒツジは、ヒトと類似した骨治癒プロセスを持つ。よって、ヒツジモデルは腰椎固定の許容されるトランスレーショナルモデルとなる。
【0109】
合計で３２匹のヒツジにＬ２－Ｌ３およびＬ４－Ｌ５レベルでの腰椎椎体間固定を行った。動物を４つの治療群に分け、ＰＥＥＫ椎体間固定ケージを、自家骨移植片（群１）、
実施例１に記載されるようなコラーゲン／β－ＴＣＰと組み合わせたｒｈＰＤＧＦ－ＢＢ（群２）、もしくは酢酸ナトリウムビヒクルを伴うコラーゲン／β－ＴＣＰ（群３）で満たし、またはＰＥＥＫケージを空とした（群４）。例示的なＰＥＥＫ脊椎固定ケージを図３Ａに描写し、固定化ハードウェアを図３Ｂに描写している。実施例１に記載されるようなコラーゲン／β－ＴＣＰと組み合わせたｒｈＰＤＧＦ－ＢＢで満たしたケージを図３Ｃに描写している。治療の割り当ては動物間で無作為化し、癒合レベルは各治療群について等しく分布させた。動物は研究の間に自由に歩き回ることおよび自由に食事することを許容され、術後８週または１６週のいずれかで屠殺した。屠殺後に、非破壊的運動学的生体力学試験、マイクロコンピュータ断層撮影および組織学を通じて脊椎固定の質を評価した。
実施例１に記載されるようなコラーゲン／β－ＴＣＰと組み合わせたｒｈＰＤＧＦ－ＢＢ（群２）、もしくは酢酸ナトリウムビヒクルを伴うコラーゲン／β－ＴＣＰ（群３）で満たし、またはＰＥＥＫケージを空とした（群４）。例示的なＰＥＥＫ脊椎固定ケージを図３Ａに描写し、固定化ハードウェアを図３Ｂに描写している。実施例１に記載されるようなコラーゲン／β－ＴＣＰと組み合わせたｒｈＰＤＧＦ－ＢＢで満たしたケージを図３Ｃに描写している。治療の割り当ては動物間で無作為化し、癒合レベルは各治療群について等しく分布させた。動物は研究の間に自由に歩き回ることおよび自由に食事することを許容され、術後８週または１６週のいずれかで屠殺した。屠殺後に、非破壊的運動学的生体力学試験、マイクロコンピュータ断層撮影および組織学を通じて脊椎固定の質を評価した。
【0110】
Ｂ．結果
ｉ．生体力学
６Ｎｍの純粋なモーメント荷重の下で屈曲－伸展、左右の側屈、ならびに左右の軸回転において、解剖されたＬ２－Ｌ３およびＬ４－Ｌ５の機能的脊髄単位に対して非破壊的運動学的試験を行った。全体的に、８週の時点から１６週の時点へと全ての主要な方向において全ての治療群において運動における統計的に有意な低減があった。いかなる運動平面においても８週または１６週の時点内において治療群間で統計的に有意な差異はなかった。生体力学の結果を図４Ａ～Ｃに描写している（屈曲伸展、図４Ａ；側屈、図４Ｂ；軸回転、図４Ｃ；キー、図４Ｄ）。２元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）、α＝０．０５。同様の文字は統計的に有意な差異を指し示す。
ｉ．生体力学
６Ｎｍの純粋なモーメント荷重の下で屈曲－伸展、左右の側屈、ならびに左右の軸回転において、解剖されたＬ２－Ｌ３およびＬ４－Ｌ５の機能的脊髄単位に対して非破壊的運動学的試験を行った。全体的に、８週の時点から１６週の時点へと全ての主要な方向において全ての治療群において運動における統計的に有意な低減があった。いかなる運動平面においても８週または１６週の時点内において治療群間で統計的に有意な差異はなかった。生体力学の結果を図４Ａ～Ｃに描写している（屈曲伸展、図４Ａ；側屈、図４Ｂ；軸回転、図４Ｃ；キー、図４Ｄ）。２元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）、α＝０．０５。同様の文字は統計的に有意な差異を指し示す。
【0111】
ｉ． ＭｉｃｒｏＣＴ
ケージのコア領域に対してμＣＴ分析を行った。ＭｉｃｒｏＣＴを介してＰＥＥＫ椎体間ケージ内の骨体積および密度を評価した。８週の時点から１６週の時点で、全ての治療群について椎体間ケージ内の骨体積分率において統計的に有意な増加があった（図５Ａ）。治療レベルにおいて、コラーゲン／β－ＴＣＰおよび空の治療は、自家移植片およびコラーゲン／β－ＴＣＰと組み合わせたｒｈＰＤＧＦ－ＢＢでの治療と比較して有意により低い骨体積分率を実証したが、いずれかの時点内で治療群間の骨体積分率における統計的に有意な差異はなかった。（図５Ｂ）。２元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）、α＝０．０５。同様の文字は統計的に有意な差異を指し示す。
ケージのコア領域に対してμＣＴ分析を行った。ＭｉｃｒｏＣＴを介してＰＥＥＫ椎体間ケージ内の骨体積および密度を評価した。８週の時点から１６週の時点で、全ての治療群について椎体間ケージ内の骨体積分率において統計的に有意な増加があった（図５Ａ）。治療レベルにおいて、コラーゲン／β－ＴＣＰおよび空の治療は、自家移植片およびコラーゲン／β－ＴＣＰと組み合わせたｒｈＰＤＧＦ－ＢＢでの治療と比較して有意により低い骨体積分率を実証したが、いずれかの時点内で治療群間の骨体積分率における統計的に有意な差異はなかった。（図５Ｂ）。２元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）、α＝０．０５。同様の文字は統計的に有意な差異を指し示す。
【0112】
骨密度分率、分析した全体積の密度に対して正規化された骨密度の測定値を、各椎体間ケージ内で定量化した。より大きい骨強化（ｂｏｎｅ ｃｏｎｓｏｌｉｄａｔｉｏｎ）は、１により近い数値により表される。再び、８週の時点から１６週の時点で、全ての治療群について骨密度分率において有意な向上があった。治療レベルにおいて、コラーゲン／β－ＴＣＰと組み合わせたｒｈＰＤＧＦ－ＢＢでの治療は、コラーゲン／β－ＴＣＰおよび空の治療と比較して統計的に向上した骨密度分率を結果としてもたらした。さらに、１６週において、自家移植片骨を用いて治療された動物は、空のＰＥＥＫケージを用いて治療された動物と比較して有意に向上した骨密度分率を実証し、コラーゲン／β－ＴＣＰと組み合わせたｒｈＰＤＧＦ－ＢＢを用いて治療された動物は、コラーゲン／β－ＴＣＰ単独または空のＰＥＥＫケージのいずれかを用いて治療された動物と比較して有意に向上した骨密度分率を実証した。
【0113】
インプラントのコア、前部、および後部表面、ならびに周囲の骨を示すために、組織学的切片は、典型的には、椎体間デバイスを通じて矢状面において取られる。図６に見られるように、椎体間ケージを通じた中矢状断面は両方の時点において各治療群についての典型的な骨形成を示す。骨含有量は、両方の時点において、自家移植片治療動物と、コラーゲン／β－ＴＣＰを含むｒｈＰＤＧＦ－ＢＢを用いて治療された動物との間で類似していた。コラーゲン／β－ＴＣＰのみを用いて治療された群または治療なしの群においてより
少ない骨形成が見られた。
少ない骨形成が見られた。
【0114】
ｉｉｉ．組織形態計測
ＰＥＥＫケージにより囲まれた癒合領域の組織形態計測評価を行って、各治療における骨、軟組織、および空の領域の量を定量化した。平均骨パーセンテージは、８週と比較して１６週において全ての治療群について有意により高かった。コラーゲン／β－ＴＣＰと組み合わせたｒｈＰＤＧＦ－ＢＢを用いて治療された動物は、８週または１６週において、自家移植片治療動物と比較して骨の有意に異なる量を示さなかったが、コラーゲン／β－ＴＣＰを単独で用いて治療された動物は、８週において、自家移植片治療動物と比較して有意により少ない骨を結果としてもたらした。平均軟組織パーセンテージは、８週と比較して１６週において、全ての治療群について有意により低かった。コラーゲン／β－ＴＣＰと組み合わせたｒｈＰＤＧＦ－ＢＢまたはコラーゲン／β－ＴＣＰ単独のいずれかを用いて治療された動物は、８週において自家移植片治療動物と比較して軟組織の有意により多い量を示した。これらの差異は１６週の時点において存在しなかった。椎体間ケージ内の平均空き空間は、早い時点と比較して遅い時点において、全ての治療群について有意により大きかった。時点内で治療群間での有意な差異は観察されなかった。治療レベルにおいて、骨、軟組織、または空き空間パーセンテージの観点で、自家移植片、およびコラーゲン／β－ＴＣＰと組み合わせたｒｈＰＤＧＦ－ＢＢでの治療の間で統計的に有意な差異はなかった。結果を図７Ａ～７Ｃに要約している。２元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）、α＝０．０５。同様の文字は統計的に有意な差異を指し示す。（平均骨パーセンテージ、図７Ａ；平均軟組織パーセンテージ、図７Ｂ；平均空き空間パーセンテージ、図７Ｃ）。
ＰＥＥＫケージにより囲まれた癒合領域の組織形態計測評価を行って、各治療における骨、軟組織、および空の領域の量を定量化した。平均骨パーセンテージは、８週と比較して１６週において全ての治療群について有意により高かった。コラーゲン／β－ＴＣＰと組み合わせたｒｈＰＤＧＦ－ＢＢを用いて治療された動物は、８週または１６週において、自家移植片治療動物と比較して骨の有意に異なる量を示さなかったが、コラーゲン／β－ＴＣＰを単独で用いて治療された動物は、８週において、自家移植片治療動物と比較して有意により少ない骨を結果としてもたらした。平均軟組織パーセンテージは、８週と比較して１６週において、全ての治療群について有意により低かった。コラーゲン／β－ＴＣＰと組み合わせたｒｈＰＤＧＦ－ＢＢまたはコラーゲン／β－ＴＣＰ単独のいずれかを用いて治療された動物は、８週において自家移植片治療動物と比較して軟組織の有意により多い量を示した。これらの差異は１６週の時点において存在しなかった。椎体間ケージ内の平均空き空間は、早い時点と比較して遅い時点において、全ての治療群について有意により大きかった。時点内で治療群間での有意な差異は観察されなかった。治療レベルにおいて、骨、軟組織、または空き空間パーセンテージの観点で、自家移植片、およびコラーゲン／β－ＴＣＰと組み合わせたｒｈＰＤＧＦ－ＢＢでの治療の間で統計的に有意な差異はなかった。結果を図７Ａ～７Ｃに要約している。２元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）、α＝０．０５。同様の文字は統計的に有意な差異を指し示す。（平均骨パーセンテージ、図７Ａ；平均軟組織パーセンテージ、図７Ｂ；平均空き空間パーセンテージ、図７Ｃ）。
【0115】
組織学的切片を図８に描写している。椎体間ケージを通じたこれらの中矢状断面は、両方の時点において各治療群における典型的な骨形成を再び示す。検体は、図６に示されるＭｉｃｒｏＣＴ再現と同じである。骨含有量は、両方の時点において、自家移植片治療動物、およびコラーゲン／β－ＴＣＰを含むｒｈＰＤＧＦ－ＢＢを用いて治療された動物の間で類似していた。コラーゲン／β－ＴＣＰのみを用いて治療された群または治療なしの群において、より少ない骨形成が見られた。
【0116】
実施例３：前臨床ラット傍脊椎インプラント安全性モデルにおけるｒｈＰＤＧＦ－ＢＢに対する宿主炎症応答の評価
インビボでβ－リン酸三カルシウム（ＴＣＰ）／コラーゲンマトリックス担体と組み合わせて送達した場合のｒｈＰＤＧＦ－ＢＢの神経炎症性宿主応答を、この実施例において評価した。８０匹のＦｉｓｃｈｅｒ Ｆ３４４雌ラットに、両側傍脊椎筋肉切除を伴うＬ４－５後外側固定を行い、４種類のインプラントのいずれかを用いて移植を行った：１）腸骨稜「自家移植片」（同系ドナーから取られた同種移植片）、２）酢酸ナトリウム緩衝液を含むβ－ＴＣＰ／ウシコラーゲンマトリックス（β－ＴＣＰ／Ｃｏｌ）、３）０．３ｍｇのｒｈＰＤＧＦ－ＢＢを含むβ－ＴＣＰ／Ｃｏｌ、および４）３．０ｍｇのｒｈＰＤＧＦ－ＢＢを含むβ－ＴＣＰ／Ｃｏｌ。
インビボでβ－リン酸三カルシウム（ＴＣＰ）／コラーゲンマトリックス担体と組み合わせて送達した場合のｒｈＰＤＧＦ－ＢＢの神経炎症性宿主応答を、この実施例において評価した。８０匹のＦｉｓｃｈｅｒ Ｆ３４４雌ラットに、両側傍脊椎筋肉切除を伴うＬ４－５後外側固定を行い、４種類のインプラントのいずれかを用いて移植を行った：１）腸骨稜「自家移植片」（同系ドナーから取られた同種移植片）、２）酢酸ナトリウム緩衝液を含むβ－ＴＣＰ／ウシコラーゲンマトリックス（β－ＴＣＰ／Ｃｏｌ）、３）０．３ｍｇのｒｈＰＤＧＦ－ＢＢを含むβ－ＴＣＰ／Ｃｏｌ、および４）３．０ｍｇのｒｈＰＤＧＦ－ＢＢを含むβ－ＴＣＰ／Ｃｏｌ。
【0117】
術後４、７、１０、および２１日目に動物の磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）およびマルチプレックス血清サイトカイン定量化を行った。脊椎および隣接する軟組織を回収し、組織学的評価のために処理し、Ｋｉ６７＆フォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）で染色して免疫蛍光によりそれぞれ細胞増殖および血管新生を評価した。
【0118】
この研究において評価したサイトカインを表１に列記する。
【0119】
【表1】
【0120】
４つのサイトカイン（ＧＭ－ＣＳＦ、ＥＧＦ、ＧＲＯ／ＫＣ／ＣＩＮＣ－１、およびＭＩＰ－２）はいずれの検体についても最小検出可能濃度を満たさず、さらなる評価から除外した。Ｌｕｍｉｎｅｘ ｘＭＡＰ技術により分析した残りの２３の血清サイトカインのうちの２０は、時点により分離された場合に治療群の間で有意な差異を示さなかった。高用量ｒｈＰＤＧＦ－ＢＢおよび自家移植片群における血清サイトカインレベルを経時的な倍数変化として表す（図９）。対照およびｒｈＰＤＧＦ－ＢＢ治療動物の間で表１に列記される他のサイトカインの血清レベルにおいて臨床的に有意な差異は見出されなかった。
【0121】
ＭＲＩ評価において、いずれの時点においても治療群の間で流体蓄積における統計的に有意な差異は見出されなかった。経時的なＴ２強調ＭＲＩ画像上の高強度領域の平均体積を図１０に描写している。Ｌ４－Ｌ５椎間板空間における腰椎の代表的なＴ２強調軸方向ＭＲＩスライスの画像を図１１に示す。高強度の自動セグメント化領域を表すオーバーレイは炎症の領域を指し示した。
【0122】
図１２Ａおよび図１２Ｂは、β－ＴＣＰ／Ｃｏｌ ３．０ｍｇのｒｈＰＤＧＦ－ＢＢを用いた４日目について示される、Ｋｉ６７（図１２Ａ）およびｖＷＦ（図１２Ｂ）についてのＩＦ染色の代表的な画像である。ＴｉｓｓｕｅＧｎｏｓｔｉｃ組織学的顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）を用いてスライスをイメージングし、ソフトウェアＴｉｓｓｕｅＦＡＸＳ（Ｚｅｉｓｓ）／ＮＩＳ ｅｌｅｍｅｎｔｓ（Ｎｉｋｏｎ）を使用して処理してシグナルを定量化した。術後４、７、１０および２１日目において示されたＫｉ６７およびフォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）についての定量化されたＩＦ染色。
【0123】
チューキー事後検定を伴うＡＮＯＶＡを使用して各時点において群の間でＫｉ６７（図１３Ａ）およびｖＷＦ（図１３Ｂ）の定量化された蛍光シグナルを比較した。１０日目において、腸骨稜自家移植片、および０．３ｍｇのｒｈＰＤＧＦ－ＢＢを含むβ－ＴＣＰ／Ｃｏｌの間で、Ｋｉ６７シグナルにおける有意な差異があった（ｐ＝０．０１３）。他の治療群の間で統計的に有意な差異はなかった。
【0124】
この前臨床傍脊椎インプラント安全性モデルにおいて、低用量および高用量のいずれのｒｈＰＤＧＦ－ＢＢもラットにおいて神経炎症応答を誘導しなかった。間葉系細胞のための強い分裂促進剤および走化性剤としてのその役割にもかかわらず、この研究は、炎症性サイトカインにおけるいかなる有意なアップレギュレーションも、ＭＲＩ上での局所的な
組織炎症の増加も、免疫蛍光により評価された血管新生関連マーカーにおける生物学的に有意な差異も実証しなかった。
組織炎症の増加も、免疫蛍光により評価された血管新生関連マーカーにおける生物学的に有意な差異も実証しなかった。
【0125】
本明細書に開示される全ての参考文献は参照により全体が本明細書に組み込まれる。
本開示の特定の実施形態を記載したが、以下の特許請求の範囲において記載される場合を除いて、そのような実施形態は本発明の範囲に対する限定として解釈されることは意図されない。
本開示の特定の実施形態を記載したが、以下の特許請求の範囲において記載される場合を除いて、そのような実施形態は本発明の範囲に対する限定として解釈されることは意図されない。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図1E】
【図1F】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図5A】
【図5B】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12A】
【図12B】
【図13A】
【図13B】
【図13C】
【国際調査報告】