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特表2022-525203脂肪酸シンターゼ、その阻害剤および修飾、ならびにその使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-05-11
(54)【発明の名称】脂肪酸シンターゼ、その阻害剤および修飾、ならびにその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/54 20060101AFI20220428BHJP
C12N 9/10 20060101ALI20220428BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20220428BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20220428BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220428BHJP
A61P 31/00 20060101ALI20220428BHJP
A61P 31/06 20060101ALI20220428BHJP
A61P 3/04 20060101ALI20220428BHJP
A61P 31/04 20060101ALI20220428BHJP
A61P 31/10 20060101ALI20220428BHJP
【ＦＩ】
C12N15/54
C12N9/10 ZNA
C12N1/19
A61K45/00
A61P35/00
A61P31/00
A61P31/06
A61P3/04
A61P31/04
A61P31/10
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021555473
(86)(22)【出願日】2020-03-20
(85)【翻訳文提出日】2021-10-27
(86)【国際出願番号】 EP2020057741
(87)【国際公開番号】W WO2020188074
(87)【国際公開日】2020-09-24
(31)【優先権主張番号】19163958.2
(32)【優先日】2019-03-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】598165611
【氏名又は名称】マックス－プランク－ゲゼルシャフト・ツア・フェルデルング・デア・ヴィッセンシャフテン・エー・ファオ
(74)【代理人】
【識別番号】100118902
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 修
(74)【代理人】
【識別番号】100106208
【弁理士】
【氏名又は名称】宮前 徹
(74)【代理人】
【識別番号】100196508
【弁理士】
【氏名又は名称】松尾 淳一
(74)【代理人】
【識別番号】100157923
【弁理士】
【氏名又は名称】鶴喰 寿孝
(72)【発明者】
【氏名】シャリ，アシュウィン
(72)【発明者】
【氏名】シュターク，ホルガー
(72)【発明者】
【氏名】シン，カシシュ
(72)【発明者】
【氏名】グラフ，ベンヤミン・モリッツ
【テーマコード（参考）】
4B050
4B065
4C084
【Ｆターム（参考）】
4B050CC05
4B050CC08
4B050DD01
4B050DD04
4B050FF01
4B050LL01
4B065AA72X
4B065AA72Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065CA24
4B065CA44
4C084AA17
4C084NA14
4C084ZA701
4C084ZA702
4C084ZB261
4C084ZB262
4C084ZB311
4C084ZB312
4C084ZB351
4C084ZB352
(57)【要約】
第一の側面において、本発明は、脂肪酸シンターゼタンパク質複合体の新規に同定されたガンマ・サブユニット由来の新規組換えポリペプチドに関する。さらに、これらの新規組換えポリペプチドを含む脂肪酸シンターゼタンパク質複合体、ならびにこれらのポリペプチドをコードする核酸分子を開示する。さらに、本発明記載のポリペプチドをコードする核酸分子を含有するか、または本発明記載のポリペプチドを発現する宿主細胞を記載する。さらに、新規に同定されたそのガンマ・サブユニットを含有する単離脂肪酸シンターゼタンパク質複合体を開示する。さらに、ＦＡＳタンパク質複合体中に存在するケトレダクターゼ、エノイルレダクターゼまたはマロニル／パルミトイルトランスフェラーゼのいずれかを阻害可能な候補化合物の適切性を決定するための方法、および前記酵素の阻害剤を設計するための方法を開示する。最後に、本発明は、阻害剤、および医薬適用におけるその使用に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号１のアミノ酸の少なくとも部分を含有する組換えポリペプチドであって、配列番号１のａａ１～ａａ１１２、配列番号１のａａ１１２よりもＣ末端に位置する挿入物であって、長さ少なくとも２５アミノ酸である前記挿入物を含み、随意に、配列番号１のａａ１１３～ａａ１５０のａａの少なくとも１つを前記挿入物のＣ末端に有する、前記組換えポリペプチド。
【請求項2】
配列番号１のアミノ酸１～アミノ酸１１２のアミノ酸を含む組換えポリペプチドであって、少なくとも２５アミノ酸の挿入物をさらに含有する前記組換えポリペプチド、または前記組換えポリペプチドの機能的断片、またはその相同体。
【請求項3】
請求項２記載の、少なくとも２５アミノ酸の挿入物を含有する配列番号１のアミノ酸を含む組換えポリペプチド、またはその機能的断片、またはその相同体。
【請求項4】
請求項１～３のいずれか一項記載の組換えポリペプチドであって、Ｎ末端からＣ末端に－配列番号１のアミノ酸１～アミノ酸１１２を含む、第一のユニット；
－配列番号１のアミノ酸１１３～１３２で構成される第二のユニットであって、配列番号１のアミノ酸１１２～１３２の１つの後に挿入される挿入物を含有する、前記の第二のユニット；および
－随意に、配列番号１のアミノ酸１３３～１５０を含む第三のユニット
で構成される、前記組換えポリペプチド；
または前記ポリペプチドの機能的断片、またはその相同体。
【請求項5】
先行する請求項のいずれか一項記載の組換えポリペプチドであって、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号１のａａ１～ａａ１１２、少なくとも２５アミノ酸、例えば少なくとも５０アミノ酸の挿入物、および配列番号２のａａ１３３～ａａ１５０からなる、前記組換えポリペプチド。
【請求項6】
請求項１または５の組換えポリペプチドであって、挿入物が酵素であり、特に酵素がデサチュラーゼ、チオエステラーゼ、オキシゲナーゼ、ヒドロキシラーゼ、シクロゲナーゼ、脂肪酸リアーゼより選択される、前記組換えポリペプチド。
【請求項7】
挿入物のサイズが最大６０ｋＤａ、例えば最大４０ｋＤａである、請求項１～６のいずれか一項の組換えポリペプチド。
【請求項8】
酵素、例えば脂肪酸シンターゼタンパク質複合体中に存在する酵素に対する調節活性を有するポリペプチドであってｉｖ）配列番号２の少なくとも６つの連続アミノ酸、例えば少なくとも８つの連続アミノ酸、例えば少なくとも１０の連続アミノ酸、またはその機能的断片、またはその相同体；あるいは
ｖ）配列番号３の少なくとも５つの連続アミノ酸、例えば少なくとも６つの連続アミノ酸、例えば少なくとも８つの連続アミノ酸、またはその機能的断片、またはその相同体；あるいは
ｖｉ）配列番号４の少なくとも６つの連続アミノ酸、例えば少なくとも８つの連続アミノ酸、例えば配列番号４の少なくとも１０、１２もしくは１４の連続アミノ酸、またはその機能的断片、またはその相同体
からなる、前記ポリペプチド。
【請求項9】
配列番号１のアミノ酸１～１３２で構成される組換えポリペプチド、またはその機能的断片、またはその相同体。
【請求項10】
請求項１～９のいずれか一項記載の組換えポリペプチドを含む、脂肪酸シンターゼタンパク質複合体。
【請求項11】
脂肪酸およびバイオ燃料の産生において使用するための、特に遊離脂肪酸、ケト脂肪酸、脂肪酸アルコール、環状脂肪酸および伸長脂肪酸の生物学的産生において使用するための、請求項１～請求項９の少なくとも１つの組換えポリペプチドを含有する、請求項１０の脂肪酸シンターゼタンパク質複合体。
【請求項12】
請求項１～９のいずれか一項記載のポリペプチドをコードする核酸分子。
【請求項13】
請求項１２記載の核酸分子を含有し、そして／または請求項１～９のいずれか一項記載のポリペプチドを発現する宿主細胞であって、特に、Ｉ型脂肪酸シンターゼを含有する微生物、例えば酵母である、前記宿主細胞。
【請求項14】
ケトレダクターゼ、特にＦＡＳタンパク質複合体中に存在するケトレダクターゼを阻害可能な候補化合物の適切性を決定するための方法であって：－水溶性ポリマー、特に非イオン性ポリマーまたはゼロ正味荷電のポリマー、例えばポリアルキレングリコール、ポリアミン、またはポリカルボキシレート、特にポリエチレングリコールを含有するリザーバー溶液中で、候補化合物を含有する、ケトレダクターゼ、特にＦＡＳタンパク質を結晶化するか、あるいは候補化合物を含有する、結晶化ケトレダクターゼ、特にＦＡＳタンパク質複合体を提供し；
－ケトレダクターゼ、特にＦＡＳタンパク質複合体の結晶構造を、２．８Åまたはそれ未満の解像度での回折分析によって決定し；
－前記分析に基づき、ケトレダクターゼ、特にＦＡＳタンパク質複合体のケトレダクターゼの阻害剤としての候補化合物の適切性を決定するか、あるいは
－ケトレダクターゼ、特にＦＡＳタンパク質複合体中に存在するケトレダクターゼを阻害可能な候補化合物を含有する、ケトレダクターゼ、特にＦＡＳタンパク質複合体を、低温電子顕微鏡分析のために調製し；
－前記ケトレダクターゼ、特にＦＡＳタンパク質複合体で、低温電子顕微鏡検査を実行し；
－ケトレダクターゼ、特にＦＡＳタンパク質複合体のケトレダクターゼの阻害剤としての候補化合物の適切性を決定する
工程を含む、前記方法。
【請求項15】
エノイルレダクターゼ、特にＦＡＳタンパク質複合体中に存在するエノイルレダクターゼを阻害可能である候補化合物の適切性を決定するための方法であって：－水溶性ポリマー、特に非イオン性ポリマーまたはゼロ正味荷電のポリマー、例えばポリアルキレングリコール、ポリアミン、またはポリカルボキシレート、特にポリエチレングリコールを含有するリザーバー溶液中で、候補化合物を含有する、エノイルレダクターゼ、特にＦＡＳタンパク質を結晶化するか、あるいは候補化合物を含有する、結晶化エノイルレダクターゼ、特にＦＡＳタンパク質複合体を提供し；
－エノイルレダクターゼ、特にＦＡＳタンパク質複合体の結晶構造を、２．８Åまたはそれ未満の解像度での回折分析によって決定し；
－前記分析に基づき、エノイルレダクターゼ、特にＦＡＳタンパク質複合体のエノイルレダクターゼの阻害剤としての候補化合物の適切性を決定するか、あるいは
－エノイルレダクターゼ、特にＦＡＳタンパク質複合体中に存在するエノイルレダクターゼを阻害可能な候補化合物を含有する、エノイルレダクターゼ、特にＦＡＳタンパク質複合体を、低温電子顕微鏡分析のために調製し；
－前記エノイルレダクターゼ、特にＦＡＳタンパク質複合体で、低温電子顕微鏡検査を実行し；
－エノイルレダクターゼ、特にＦＡＳタンパク質複合体のエノイルレダクターゼの阻害剤としての候補化合物の適切性を決定する
工程を含む、前記方法。
【請求項16】
マロニル／パルミトイルトランスフェラーゼ（ＭＰＴ）、特にＦＡＳタンパク質複合体中に存在するＭＰＴを阻害可能である候補化合物の適切性を決定するための方法であって：－水溶性ポリマー、特に非イオン性ポリマーまたはゼロ正味荷電のポリマー、例えばポリアルキレングリコール、ポリアミン、またはポリカルボキシレート、特にポリエチレングリコールを含有するリザーバー溶液中で、候補化合物を含有する、ＭＰＴ、特にＦＡＳタンパク質を結晶化するか、あるいは候補化合物を含有する、結晶化ＭＰＴ、特にＦＡＳタンパク質複合体を提供し；
－ＭＰＴ、特にＦＡＳタンパク質複合体の結晶構造を、２．８Åまたはそれ未満の解像度での回折分析によって決定し；
－前記分析に基づき、ＭＰＴ、特にＦＡＳタンパク質複合体のＭＰＴの阻害剤としての候補化合物の適切性を決定するか、あるいは
－ＭＰＴ、特にＦＡＳタンパク質複合体中に存在するＭＰＴを阻害可能な候補化合物を含有する、ＭＰＴ、特にＦＡＳタンパク質複合体を、低温電子顕微鏡分析のために調製し；
－前記ＭＰＴ、特にＦＡＳタンパク質複合体で、低温電子顕微鏡検査を実行し；
－ＭＰＴ、特にＦＡＳタンパク質複合体のＭＰＴの阻害剤としての候補化合物の適切性を決定する
工程を含む、前記方法。
【請求項17】
ケトレダクターゼ活性、特にＦＡＳタンパク質複合体中のケトレダクターゼ活性の阻害剤を設計するための方法であって－請求項６ ｉ）記載のポリペプチドのアミノ酸の少なくとも１つのランダムまたは部位特異的突然変異によって、請求項６ ｉ）に定義されるようなポリペプチドを突然変異させ
－ケトレダクターゼ活性、特にＦＡＳタンパク質複合体のケトレダクターゼ活性を阻害する適切性を決定する
工程を含む、前記方法。
【請求項18】
エノイルレダクターゼ活性、特にＦＡＳタンパク質複合体中のエノイルレダクターゼ活性の阻害剤を設計するための方法であって－請求項６ ｉｉ）記載のポリペプチドのアミノ酸の少なくとも１つのランダムまたは部位特異的突然変異によって、請求項６ ｉｉ）に定義されるようなポリペプチドを突然変異させ
－エノイルレダクターゼ活性、特にＦＡＳタンパク質複合体のエノイルレダクターゼ活性を阻害する適切性を決定する
工程を含む、前記方法。
【請求項19】
ＭＰＴ活性、特にＦＡＳタンパク質複合体中のＭＰＴ活性の阻害剤を設計するための方法であって－請求項６ ｉｉｉ）記載のポリペプチドのアミノ酸の少なくとも１つのランダムまたは部位特異的突然変異によって、請求項６ ｉｉｉ）に定義されるようなポリペプチドを突然変異させ
－ＭＰＴ活性、特にＦＡＳタンパク質複合体のＭＰＴ活性を阻害する適切性を決定する
工程を含む、前記方法。
【請求項20】
ケトレダクターゼ、特にＦＡＳタンパク質複合体中に存在するケトレダクターゼの阻害剤であって、請求項６ ｉ）のポリペプチド、あるいは請求項１４または１７にしたがって、ケトレダクターゼ、特にＦＡＳタンパク質複合体中に存在するケトレダクターゼの阻害剤として適切であると決定された候補化合物を含む、前記阻害剤。
【請求項21】
エノイルレダクターゼ、特にＦＡＳタンパク質複合体中に存在するエノイルレダクターゼの阻害剤であって、請求項６ ｉｉ）のポリペプチド、あるいは請求項１５または１８にしたがって、エノイルレダクターゼ、特にＦＡＳタンパク質複合体中に存在するエノイルレダクターゼの阻害剤として適切であると決定された候補化合物を含む、前記阻害剤。
【請求項22】
ＭＰＴ、特にＦＡＳタンパク質複合体中に存在するＭＰＴの阻害剤であって、請求項６ ｉｉ）のポリペプチド、あるいは請求項１６または１９にしたがって、ＭＰＴ、特にＦＡＳタンパク質複合体中に存在するＭＰＴの阻害剤として適切であると決定された候補化合物を含む、前記阻害剤。
【請求項23】
癌、感染性疾患、結核または肥満、細菌感染に対する抗生物質、特に結核、または酵母感染の予防または治療に使用するための、単独の、または組み合わせた、請求項２０～２２のいずれか一項記載の阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
１つの側面において、本発明は、脂肪酸シンターゼタンパク質複合体の新規に同定されたガンマ・サブユニットに由来する、新規組換えポリペプチドに関する。さらに、これらの新規組換えポリペプチドを含む脂肪酸シンターゼタンパク質複合体、ならびにこれらのポリペプチドをコードする核酸分子を開示する。さらに、本発明記載のポリペプチドをコードする核酸分子を含有するか、または本発明記載のポリペプチドを発現する宿主細胞を記載する。さらに、新規に同定されたそのガンマ・サブユニットを含有する単離脂肪酸シンターゼタンパク質複合体を開示する。さらに、ＦＡＳタンパク質複合体中に存在するケトレダクターゼ、エノイルレダクターゼまたはマロニル／パルミトイルトランスフェラーゼのいずれかを阻害することが可能な候補化合物の適切性を決定するための方法、および前記酵素の阻害剤を設計するための方法を開示する。最後に、本発明は、阻害剤および医薬適用におけるその使用に関する。
【背景技術】
【0002】
脂肪酸シンターゼは、脂肪酸合成を触媒する多酵素タンパク質である。これまでに、酵母における前記酵素は、アルファサブユニットにコードされるＡＣＰドメインによって、１つの機能ドメインから次の機能ドメインへと基質が渡される、２つの多機能サブユニットで構成される酵素系であると記載されている。脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）は、ＮＡＤＰＨの存在下で、アセチル－ＣｏＡおよびマロニル－ＣｏＡからのパルミテートの合成を触媒する。
【0003】
２つのクラスのＦＡＳが記載される。すなわち、Ｉ型ＦＡＳ系は、単一のまたは２つの巨大な多機能ポリペプチドを利用し、そして動物および真菌の両方に一般的である。Ｉ型脂肪酸シンターゼ系はまた、細菌のサブグループ、すなわちコリネバクテリウム（ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ）、マイコバクテリウム（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）、およびノカルジア（ｎｏｃａｒｄｉａ）でも見られうる。これらの細菌において、ＦＡＳ Ｉ系は、パルミチン酸を産生し、そして以下に記載するＦＡＳ ＩＩ系と協同で、より多様な脂質産物を産生する。
【0004】
ＩＩ型ＦＡＳは、古細菌および細菌で見られ、そして脂肪酸合成のための別個の単一機能酵素の使用によって特徴づけられる。ＦＡＳ ＩＩのこの経路の阻害剤は、抗生物質の可能性があるものとして、調べられている。Ｉ型ＦＡＳとしての酵母脂肪酸シンターゼは、２．６ＭＤａの樽型複合体として記載されており、そして２つのユニークな多機能サブユニット、αおよびβで構成される。前記αおよびβユニットは、α６β６構造で配置されると記載される。この酵素複合体の触媒活性は、α－およびβ－サブユニット間の酵素反応の協同系を伴う。酵素複合体は、脂肪酸合成の６つの機能中心からなると示されている。一般的に、ＦＡＳは、例えば乳癌等において上方制御されるため、癌を含む多様な疾患を治療するために適切なターゲットと見なされる。
【0005】
多数の研究室による構造研究によって、Ｉ型真菌脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）が、長さ２７０Åおよび幅２５０Åの樽型粒子を形成するＤ３対称２．６ＭＤａメガ酵素複合体であることが強固に確立されている（例えば、Ｊｅｎｎｉら， Ｓｃｉｅｎｃｅ． ３１６， ２５４－６１（２００７））。これらの初期の構造研究は、Ｓ．セレビシエ（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＦＡＳが、赤道中心ホイールを形成する２１０ｋＤａ α－サブユニットの６コピー（α６）、および粒子のドームを形成する２３０ｋＤａ β－サブユニットの６コピー（β６）で構成されることを示す（Ｉ． Ｂ． Ｌｏｍａｋｉｎ， Ｙ． Ｘｉｏｎｇ， Ｔ． Ａ． Ｓｔｅｉｔｚ， Ｃｅｌｌ． １２９， ３１９－３２（２００７））。飽和Ｃ１６～Ｃ１８脂肪酸鎖の合成に必要なすべての酵素活性は、α－およびβ－サブユニット内に存する。α－サブユニットは、ケトレダクターゼ（ＫＲ）、ケトシンターゼ（ＫＳ）およびホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ（ＰＰＴ）ドメインを含有し、β－サブユニットは、アセチルトランスフェラーゼ（ＡＴ）、エノイルレダクターゼ（ＥＲ）およびデヒドラターゼ（ＤＨ）ドメインを宿する。マロニル／パルミトイルトランスフェラーゼ（ＭＴＰ）ドメインは、β－サブユニットのまさにＣ末端側の部分によっておおむね形成されるが、α－サブユニットのＮ末端によって完成される。脂肪酸合成中、成長中の脂肪酸鎖は、これらの個々の酵素活性部位各々へ、アシルキャリアータンパク質（ＡＣＰ）ドメイン（α－サブユニット中に存する）によって反復シャトルされると考えられる。脂肪酸合成機構の学術的興味に加えて、脂肪酸は、ファインケミカルのバイオテクノロジー産生および再生可能資源由来のバイオ燃料の価値あるプラットフォーム化合物として浮上してきている。実際、酵母ＦＡＳの構築を伴うものを含めて、Ｉ型ＦＡＳメガ酵素は、タンパク質工学に供されて、例えば短鎖脂肪酸およびポリケチドの生成に成功してきている（Ｊ． Ｇａｊｅｗｓｋｉら， Ｎａｔ． Ｃｏｍｍｕｎ． ８， １－８（２０１７））。しかし、今日まで、反復シャトルプロセスに関する機械的および構造的詳細は明らかでないままであり、そしてその構造的決定要因はまったく捉えられておらず、これらのバイオテクノロジー的な努力に役立てるにはこうした詳細が必要である。最後に、脂肪酸生合成はまた、癌および肥満のような病気に関与することが知られており、したがって、脂肪酸合成に直接影響を及ぼすことができれば、実質的に橋渡し的に関与する（Ｄ． Ｗａｎｇ， Ｒ． Ｎ． Ｄｕｂｏｉｓ， Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． １０４， ３４３－５（２０１２））。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】Ｊｅｎｎｉら， Ｓｃｉｅｎｃｅ． ３１６， ２５４－６１（２００７）
【非特許文献2】Ｉ． Ｂ． Ｌｏｍａｋｉｎ， Ｙ． Ｘｉｏｎｇ， Ｔ． Ａ． Ｓｔｅｉｔｚ， Ｃｅｌｌ． １２９， ３１９－３２（２００７）
【非特許文献3】Ｊ． Ｇａｊｅｗｓｋｉら， Ｎａｔ． Ｃｏｍｍｕｎ． ８， １－８（２０１７）
【非特許文献4】Ｄ． Ｗａｎｇ， Ｒ． Ｎ． Ｄｕｂｏｉｓ， Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． １０４， ３４３－５（２０１２）
【発明の概要】
【0007】
１つの側面において、本発明は、配列番号１のアミノ酸１～１３２の組換えポリペプチド、またはその機能的断片、またはその相同体に関する。さらに、配列番号１のアミノ酸を含み、少なくとも２０アミノ酸、例えば２５アミノ酸の挿入物をさらに含有する組換えポリペプチド、またはその機能的断片、またはその相同体を提供する。
【0008】
さらに、
ｉ）配列番号２の少なくとも６つの連続アミノ酸、例えば少なくとも８つの連続アミノ酸、例えば少なくとも１０の連続アミノ酸、またはその機能的断片、またはその相同体；あるいは
ｉｉ）配列番号３の少なくとも５つの連続アミノ酸、例えば少なくとも６つの連続アミノ酸、例えば少なくとも８つの連続アミノ酸、またはその機能的断片、またはその相同体；あるいは
ｉｉｉ）配列番号４の少なくとも６つの連続アミノ酸、例えば少なくとも８つの連続アミノ酸、例えば配列番号４の少なくとも１０、１２もしくは１４の連続アミノ酸、またはその機能的断片、またはその相同体
からなるポリペプチドを提供する。
ｉ）配列番号２の少なくとも６つの連続アミノ酸、例えば少なくとも８つの連続アミノ酸、例えば少なくとも１０の連続アミノ酸、またはその機能的断片、またはその相同体；あるいは
ｉｉ）配列番号３の少なくとも５つの連続アミノ酸、例えば少なくとも６つの連続アミノ酸、例えば少なくとも８つの連続アミノ酸、またはその機能的断片、またはその相同体；あるいは
ｉｉｉ）配列番号４の少なくとも６つの連続アミノ酸、例えば少なくとも８つの連続アミノ酸、例えば配列番号４の少なくとも１０、１２もしくは１４の連続アミノ酸、またはその機能的断片、またはその相同体
からなるポリペプチドを提供する。
【0009】
前記ポリペプチドは、酵素、例えばＦＡＳ複合体中に存在する酵素に対して改変する活性を有する。
さらに、本明細書に記載するような組換えポリペプチドを含む脂肪酸シンターゼタンパク質複合体を開示する。
さらに、本明細書に記載するような組換えポリペプチドを含む脂肪酸シンターゼタンパク質複合体を開示する。
【0010】
さらに、本発明記載のポリペプチドをコードする核酸分子、ならびに前記核酸分子を含有し、そして／または本発明記載のポリペプチドを発現する宿主細胞を記載する。さらに、記載するα－およびβ－サブユニットならびに配列番号１のポリペプチドを含有する単離脂肪酸シンターゼタンパク質複合体を請求する。前記単離脂肪酸シンターゼタンパク質複合体は、
ａ）脂肪酸シンターゼタンパク質複合体を含有する未精製試料を提供し；
ｂ）２５，０００～３５，０００ｘｇで、細胞破片を分離するため、第一の遠心分離工程を行い；
ｃ）第一の遠心分離工程から得た上清に、０％～２５％（ｗ／ｖ）の量のオスモライト、および随意にシステインのチオールアルキル化を可能にする化合物を補充し；
ｄ）５０，０００～１５０，０００ｘｇ、例えば８０，０００～１２０，０００ｘｇでの遠心分離によって、第二の遠心分離工程を行い；
ｅ）第二の遠心分離工程から得た上清を、沈殿のため、水溶性ポリマー、特に非イオン性ポリマーまたはゼロ正味荷電のポリマー、例えばポリアルキレングリコール、ポリアミン、またはポリカルボキシレートで処理し；
ｆ）前記ポリマー、例えばポリアルキレングリコールを含有しない緩衝剤中に再懸濁した後、ポリマーに基づく沈殿物、例えばポリアルキレングリコールに基づく沈殿物とともに、オスモライトを用いて密度勾配遠心分離を行い；
ｇ）随意に、工程ｅ）およびｆ）を１回または複数回反復し
ｈ）精製された脂肪酸シンターゼタンパク質複合体を得るため、脂肪酸シンターゼタンパク質複合体の水溶性ポリマーに基づく沈殿、例えばポリアルキレングリコールに基づく沈殿によって濃縮する
工程を含む方法によって得られうる。
ａ）脂肪酸シンターゼタンパク質複合体を含有する未精製試料を提供し；
ｂ）２５，０００～３５，０００ｘｇで、細胞破片を分離するため、第一の遠心分離工程を行い；
ｃ）第一の遠心分離工程から得た上清に、０％～２５％（ｗ／ｖ）の量のオスモライト、および随意にシステインのチオールアルキル化を可能にする化合物を補充し；
ｄ）５０，０００～１５０，０００ｘｇ、例えば８０，０００～１２０，０００ｘｇでの遠心分離によって、第二の遠心分離工程を行い；
ｅ）第二の遠心分離工程から得た上清を、沈殿のため、水溶性ポリマー、特に非イオン性ポリマーまたはゼロ正味荷電のポリマー、例えばポリアルキレングリコール、ポリアミン、またはポリカルボキシレートで処理し；
ｆ）前記ポリマー、例えばポリアルキレングリコールを含有しない緩衝剤中に再懸濁した後、ポリマーに基づく沈殿物、例えばポリアルキレングリコールに基づく沈殿物とともに、オスモライトを用いて密度勾配遠心分離を行い；
ｇ）随意に、工程ｅ）およびｆ）を１回または複数回反復し
ｈ）精製された脂肪酸シンターゼタンパク質複合体を得るため、脂肪酸シンターゼタンパク質複合体の水溶性ポリマーに基づく沈殿、例えばポリアルキレングリコールに基づく沈殿によって濃縮する
工程を含む方法によって得られうる。
【0011】
さらに、ケトレダクターゼ（ＫＲ）またはエノイルレダクターゼ（ＥＲ）またはマロニル／パルミトイルトランスフェラーゼ（ＭＰＴ）を阻害可能な候補化合物の適切性を決定するための方法、ならびに前記酵素の阻害剤、特に該酵素がＦＡＳタンパク質複合体の一部である場合の阻害剤を開示する。最後に、癌、感染性疾患を含むがまた、結核または肥満も含む多様な疾患の予防または治療における前記阻害剤の使用を記載する。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】Ｔｍａ１７ｐは、酵母脂肪酸シンターゼの真のγ－サブユニットを構成する。α－およびβ－サブユニットは、全体で、脂肪酸合成に必要なすべての酵素活性を含有する。アシルキャリアータンパク質（ＡＣＰ、黄色）、ケトレダクターゼ（ＫＲ、金色）、ケトシンターゼ（ＫＳ、橙色）およびホスホパンテテイントランスフェラーゼ（ＰＰＴ、マゼンタ）ドメインはα－サブユニット上に存する一方、アセチルトランスフェラーゼ（ＡＴ，青色）、エノイルレダクターゼ（ＥＲ、ティール）、デヒドラターゼ（ＤＨ、緑色）はβ－サブユニット上に存する。マロニル／パルミトイルトランスフェラーゼ（ＭＰＴ、カーキ）ドメインは、α－およびβ－サブユニットの両方によって構築される。
【図2-1】図２Ａ：野生型Ｓ．セレビシエ株由来のＦＡＳ精製のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。Ｓ３０（レーン２）およびＳ１００（レーン３）抽出物のアリコット、再懸濁ＰＥＧカット（レーン４）、第一、第二および第三のスクロース勾配のプール（レーン５、６および７）ならびに最終精製タンパク質調製（レーン７）および分子量マーカー（レーン１）を示す。２０ｋＤａの見かけの分子量を持つタンパク質の明らかな同時精製に注目されたい。
【図2-2】図２Ｂ：Δｔｍａ１７ Ｓ．セレビシエ株由来のＦＡＳ精製のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。（Ｄ）におけるものと同じ分画のアリコットを装填した。２０ｋＤａの見かけの分子量を持つタンパク質が存在しないことが注目され、これが実際にＴｍａ１７ｐであることが示される。
【図3】ΔＴｍａ１７ｐ－ＦＡＳおよび組換えＴｍａ１７ｐでのＦＡＳホロ酵素の再構築。上部左は、クーマシー染色非変性ゲルを示し、ΔＴｍａ１７ｐ－ＦＡＳおよびＴｍａ１７ｐの移動位置を示す。下部左パネルは、ゲルのΔＴｍａ１７ｐ－ＦＡＳ領域の蛍光検出を示し、ＦＡＳに結合したＴｍａ１７ｐを視覚化し、右パネルは、蛍光シグナルの定量的分析を示す。
【図4】ガンマ－サブユニットの結合に際してＦＡＳホロ酵素において誘発される構造相違。架橋質量分析（ＸＬ－ＭＳ）は、ＦＡＳホロ酵素（回転）コンホメーションにおいて見られるさらなる密集状態の解釈を可能にする。γ－サブユニットのＮ末端領域は、ＭＰＴドメインに近い中央部分でＥＲドメインに位置する一方、Ｃ末端部分はＫＲおよびＫＳドメインと接触するようである。
【図5】ＦＡＳホロ酵素におけるγ－サブユニットの機能。基質ＮＡＤＰＨに関するＦＡＳの基質濃度依存性。左のパネルは、ＮＡＤＰＨ濃度に対するΔＴｍａ１７ｐ－ＦＡＳ初期速度のプロットを示す。ΔＴｍａ１７ｐ－ＦＡＳのＮＡＤＰＨ依存性は双曲線性ではなく、そして基質活性化を示唆する。この振る舞いを記載するために利用される動力学モデルを、挿入図に示す。右のパネルは、ＮＡＤＰＨ濃度に対するΔＴｍａ１７ｐ－ＦＡＳ（黒色）およびＦＡＳホロ酵素（赤色）初期速度の重ね合わせを示す。ＦＡＳホロ酵素の場合の飽和動力学の変化に、そしてＮＡＤＰＨに関するＫＭａｐｐの増加に注目されたい（ΔＴｍａ１７ｐ－ＦＡＳ：ＫＭａｐｐ＝９．１±１．８μＭ、ＦＡＳホロ酵素ＫＭａｐｐ＝１５５±２９μＭ）。
【発明を実施するための形態】
【0013】
１つの側面において、組換えポリペプチドを提供する。本発明の１つの態様において、配列番号１のアミノ酸１～１３２からなる組換えポリペプチド、またはその機能的断片、またはその相同体を提供する。組換えポリペプチドは、それによって配列番号１の１３３～１５０が存在しなくなるように、さらなるアミノ酸をさらに有してもよい。
【0014】
本明細書において、用語「その機能的断片」は、それぞれ、言及されるポリペプチドまたは核酸分子と同じ機能性を有するポリペプチドを指す。すなわち、機能的断片は、本明細書に記載するようなポリペプチドの機能を有意に改変することなく、少なくとも１つのアミノ酸残基または少なくとも１つの核酸残基の欠失または置換を含有してもよい。
【0015】
本発明記載のポリペプチドには、誘導体として知られる断片もまた含まれ、ここで、単一のアミノ酸分子が異なるアミノ酸残基で置換されていてもよい。例えば、２位のアミノ酸は、システインの代わりにセリンであってもよい。さらに、単一の置換には、保存的アミノ酸置換が含まれる。当業者は、組換えポリペプチドの活性を有意に改変することのない、適切な置換をよく知っている。
【0016】
本明細書において、用語「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「構成される（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ ｏｆ）」は、「含まれている（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」または「含有している（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」と同義であり、そして包括的または無制限（ｏｐｅｎ ｅｎｄｅｄ）であり、そしてさらなる、言及されていないメンバー、要素および方法工程を排除しない。用語「含んでいる」、「含む」および「構成される」ならびに「含まれている」、「含まれる」または「含有している」、「含有する」は、本明細書において、用語「からなっている（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」、「なる（ｃｏｎｓｉｓｔ）」および「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｏｆ）」ならびに「構成される」を含むことが認識されるであろう。
【0017】
本明細書に引用されるすべての参考文献は、その全体が本明細書に援用される。特に、本明細書が特に言及するすべての参考文献の解説は、本明細書に援用される。
別に同定しない限り、技術的および科学的用語を含む本発明を開示する際に用いるすべての用語は、本発明が属する技術分野の一般の当業者によって理解されるような意味を有する。さらなる指針によって、用語定義は、本発明の解説をよりよく認識するために含まれる。
別に同定しない限り、技術的および科学的用語を含む本発明を開示する際に用いるすべての用語は、本発明が属する技術分野の一般の当業者によって理解されるような意味を有する。さらなる指針によって、用語定義は、本発明の解説をよりよく認識するために含まれる。
【0018】
本明細書において、類似の型、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」には、背景が別に明らかに示さない限り、単数および複数の参照対象の両方が含まれる。
用語「その相同体」は、他の種由来である、特に、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から得られた配列番号１の本明細書に記載するようなγ－ユニットとは別の酵母種に属する、本明細書に請求するような組換えポリペプチドを指す。その相同体には、他のサッカロミセス属種由来の、ならびに他の真核種、特に酵母および細菌種、例えばカンジダ（ｃａｎｄｉｄａ）、アスペルギルス（ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ヤロウィア（ｙａｒｒｏｗｉａ）、ペニシリウム（ｐｅｎｉｃｉｌｌｕｍ）、ロドスピリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｄｉｕｍ）、マイコバクテリウム（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）、ケトミウム（ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ）が含まれる。
用語「その相同体」は、他の種由来である、特に、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から得られた配列番号１の本明細書に記載するようなγ－ユニットとは別の酵母種に属する、本明細書に請求するような組換えポリペプチドを指す。その相同体には、他のサッカロミセス属種由来の、ならびに他の真核種、特に酵母および細菌種、例えばカンジダ（ｃａｎｄｉｄａ）、アスペルギルス（ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ヤロウィア（ｙａｒｒｏｗｉａ）、ペニシリウム（ｐｅｎｉｃｉｌｌｕｍ）、ロドスピリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｄｉｕｍ）、マイコバクテリウム（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）、ケトミウム（ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ）が含まれる。
【0019】
用語「組換え」は、天然には存在しないか、または以前、天然からは単離されていない、ポリペプチドを指す。
用語「候補化合物」は、小分子、化学的または生物学的分子であり、特にアミノ酸残基で構成されるかまたはアミノ酸残基を含む、分子を指す。
用語「候補化合物」は、小分子、化学的または生物学的分子であり、特にアミノ酸残基で構成されるかまたはアミノ酸残基を含む、分子を指す。
【0020】
用語「結晶」は、空間的に反復する方式での、任意の所定の単一分子または分子種の超分子集合を指す。それによって、分子または分子種は、原子が共有結合および／または非共有結合によって連結されていてもいなくても、任意の化学部分として定義されうる。
【0021】
本明細書において、用語「オスモライト」は、浸透圧に影響を及ぼす化合物を指す。例には、限定されるわけではないが、グリセロール、スクロース、糖一般、トリメチルアミン－Ｎ－オキシド（ＴＭＡＯ）およびエチレングリコールが含まれる。
【0022】
用語「ゼロ正味荷電のポリマー」は、数百ダルトンのサイズ範囲で、反復化学ユニットの連続共有付着によって構築されるポリマーを指す。ゼロ正味荷電の定義は、理想的には電子電荷をまったく持たない（陽性でも陰性でもない）反復ユニットの特性によって満たされる。電子電荷が存在する場合、これらはバランスが取れた方式で現れなければならず、すなわち２の値を持つ陽性電荷は、２の値を持つ陰性電荷によって拮抗されなければならない。拮抗電子電荷をもつこうした分子は、双性イオン種または双性化学物質と称される。
【0023】
用語「非イオン性ポリマー」は、数百ダルトンのサイズ範囲で、反復化学ユニットの連続共有付着によって構築される分子を指す。化学ユニットが電子電荷をまったく持たない場合、生じるポリマーは、非イオン性ポリマーと称される。
【0024】
非共有結合の例には、限定されるわけではないが、水素結合、静電相互作用およびファンデルワールス力が含まれる。結晶中の１つの分子の別のものに対する関係は、ブラベー格子に基づく厳密な対称ルールによって記載されうる。
【0025】
本明細書において、用語「阻害剤」は、生物学的活性を減少させることが可能な生物学的または化学的実体を含む化合物を指す。本発明の背景において、阻害剤は、ケトレダクターゼ活性、エノイルレダクターゼ活性および／またはＭＰＴ活性を減少させる生物学的または化学的分子である。特に、阻害剤は、少なくとも１０倍、例えば少なくとも２０倍、特に少なくとも５０倍、前記生物学的実体の「通常の」活性を減少させる実体である。
【0026】
別に示さない限り、用語ＦＡＳタンパク質複合体またはＦＡＳは、ＦＡＳ Ｉタンパク質複合体を指す。
用語「ＦＡＳタンパク質複合体」は、少なくとも３つの分子、すなわちＦＡＳ ＩのＦＡＳタンパク質複合体のα－サブユニット、β－サブユニット、および第三のユニット、例えば候補化合物、配列番号１のガンマ－サブユニットまたはその断片またはその相同体を含む本明細書に定義するようなポリペプチドで構成されるタンパク質複合体を指す。
用語「ＦＡＳタンパク質複合体」は、少なくとも３つの分子、すなわちＦＡＳ ＩのＦＡＳタンパク質複合体のα－サブユニット、β－サブユニット、および第三のユニット、例えば候補化合物、配列番号１のガンマ－サブユニットまたはその断片またはその相同体を含む本明細書に定義するようなポリペプチドで構成されるタンパク質複合体を指す。
【0027】
配列番号１のポリペプチドは、サッカロミセス・セレビシエ由来のＴＭＡ １７分子を指す。これまで、前記ポリペプチドは、ストレスに際して誘導され、そしてプロテアソーム集合に関連すると記載されてきている。
【0028】
本発明者らは、配列番号１のアミノ酸１～１３２の組換えポリペプチドまたはその機能的断片またはその相同体が、ＦＡＳ複合体中に存在した際、配列番号１の全長アミノ酸配列を含有するＦＡＳ複合体に比較して、より高いケトレダクターゼ活性を示すことを認識した。すなわち、本発明者らは、配列番号１のアミノ酸１３３～１５０がＦＡＳタンパク質複合体中のケトレダクターゼとの相互作用配列に相当すると認識した。以下に示すように、配列番号１の全長ポリペプチドの存在は、ＦＡＳタンパク質複合体中に存在する多様な酵素の活性において、制御性の役割を有する。
【0029】
さらなる態様において、配列番号１のａａ１～ａａ１１２を含む配列番号１の少なくとも部分、および配列番号１のａａ１１２よりＣ末端側に位置する挿入物を含有する、組換えポリペプチドを提供する。前記挿入物は、長さ少なくとも２５アミノ酸であり、随意に、前記組換えポリペプチドは、前記挿入物のＣ末端側に、配列番号１のａａ１１３～ａａ１５０のａａの少なくとも１つを有する。
【0030】
本発明のさらなる態様において、配列番号１のアミノ酸を含む組換えポリペプチドは、少なくとも１５、例えば少なくとも２０、例えば少なくとも２３、２５、２８、３０またはそれより多いアミノ酸の挿入物またはその機能的断片またはその相同体をさらに含有する。例えば、挿入物は、サイズが５ｋＤａ～２５ｋＤａのものである。
【0031】
すなわち、配列番号１のアミノ酸１～アミノ酸１１２のアミノ酸を含み、少なくとも２５のアミノ酸の挿入物をさらに含有する組換えポリペプチド、前記組換えポリペプチドの機能的断片、またはその相同体を提供する。
【0032】
組換えポリペプチドの１つの態様において、該ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に
－配列番号１のアミノ酸１～アミノ酸１１２を含む、第一のユニット；
－配列番号１のアミノ酸１１３～１３２で構成される第二のユニットであって、配列番号１のアミノ酸１１２～１３２の１つのアミノ酸の後に挿入される挿入物を含有する、前記の第二のユニット；および
－随意に、配列番号１のアミノ酸１３３～１５０を含む第三のユニット；
で構成される挿入物を有するポリペプチド、または前記ポリペプチドの機能的断片、またはその相同体である。
－配列番号１のアミノ酸１～アミノ酸１１２を含む、第一のユニット；
－配列番号１のアミノ酸１１３～１３２で構成される第二のユニットであって、配列番号１のアミノ酸１１２～１３２の１つのアミノ酸の後に挿入される挿入物を含有する、前記の第二のユニット；および
－随意に、配列番号１のアミノ酸１３３～１５０を含む第三のユニット；
で構成される挿入物を有するポリペプチド、または前記ポリペプチドの機能的断片、またはその相同体である。
【0033】
本発明によって、配列番号１のアミノ酸１１２の後および配列番号１のアミノ酸１３２の前のいずれか１つに挿入物があることが、残りのアミノ酸の相互作用特性に対する負の影響も回避するために特に有益でありうると認識されてきている。１つの態様において、記載する組換えポリペプチドには、前記挿入物を含有するアミノ酸１１３～１３２で構成される第二のユニットにおいて、アミノ酸１１３～１３２のアミノ酸の少なくとも１つまたはすべてが存在しない可能性があるポリペプチドが含まれる。１つの態様において、配列番号１の１１３～１３２のａａは存在しない。
【0034】
さらに、組換えポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号１のａａ１～ａａ１１２、少なくとも２５のアミノ酸、例えば少なくとも５０のアミノ酸の挿入物、および配列番号１のａａ１３３～ａａ１５０からなる。
【0035】
本発明の１つの態様において、本発明記載の組換えポリペプチド中に存在する挿入物は酵素である。特に、酵素は、デサチュラーゼ、チオエステラーゼ、オキシゲナーゼ、ヒドロキシラーゼ、シクロゲナーゼ、脂肪酸リアーゼより選択される。
【0036】
本発明記載のポリペプチド中に存在する挿入物は、最大６０ｋＤａ、例えば最大５０ｋＤａ、例えば４０ｋＤａ、３５ｋＤａ、３０ｋＤａ、最大２５ｋＤａ、最大２０ｋＤａのサイズを有してもよい。挿入物は、少なくとも上に言及するようなサイズを有し、すなわち少なくとも１５アミノ酸である。例えば、挿入物のサイズは、少なくとも２ｋＤａ、例えば少なくとも２．５ｋＤａ、例えば少なくとも３ｋＤａである。
【0037】
本発明の１つの態様において、ポリペプチドは、
ｉ）配列番号２の少なくとも６つの連続アミノ酸、例えば少なくとも８つの連続アミノ酸、例えば少なくとも１０の連続アミノ酸、またはその機能的断片、またはその相同体；あるいは
ｉｉ）配列番号３の少なくとも５つの連続アミノ酸、例えば少なくとも６つの連続アミノ酸、例えば少なくとも８つの連続アミノ酸、またはその機能的断片、またはその相同体；あるいは
ｉｉｉ）配列番号４の少なくとも６つの連続アミノ酸、例えば少なくとも８つの連続アミノ酸、例えば配列番号４の少なくとも１０、１２もしくは１４の連続アミノ酸、またはその機能的断片、またはその相同体
からなる。
ｉ）配列番号２の少なくとも６つの連続アミノ酸、例えば少なくとも８つの連続アミノ酸、例えば少なくとも１０の連続アミノ酸、またはその機能的断片、またはその相同体；あるいは
ｉｉ）配列番号３の少なくとも５つの連続アミノ酸、例えば少なくとも６つの連続アミノ酸、例えば少なくとも８つの連続アミノ酸、またはその機能的断片、またはその相同体；あるいは
ｉｉｉ）配列番号４の少なくとも６つの連続アミノ酸、例えば少なくとも８つの連続アミノ酸、例えば配列番号４の少なくとも１０、１２もしくは１４の連続アミノ酸、またはその機能的断片、またはその相同体
からなる。
【0038】
ｉ）～ｉｉｉ）下に言及するポリペプチドは、酵素活性を改変する、特に酵素活性を阻害するペプチドに相当する。前記酵素活性は、特に、ＦＡＳ複合体の酵素活性である。
配列番号２のアミノ酸は、ＦＡＳタンパク質複合体中に存在するケトレダクターゼとの相互作用界面に相当する。配列番号２のアミノ酸は、エノイルレダクターゼと相互作用するガンマ－ユニット中に存在するアミノ酸に相当し、そして配列番号４のアミノ酸は、ＦＡＳタンパク質複合体のＭＰＴと相互作用するガンマ－ユニットのアミノ酸に相当する。
配列番号２のアミノ酸は、ＦＡＳタンパク質複合体中に存在するケトレダクターゼとの相互作用界面に相当する。配列番号２のアミノ酸は、エノイルレダクターゼと相互作用するガンマ－ユニット中に存在するアミノ酸に相当し、そして配列番号４のアミノ酸は、ＦＡＳタンパク質複合体のＭＰＴと相互作用するガンマ－ユニットのアミノ酸に相当する。
【0039】
すなわち、配列番号２、３および４に言及する、上に定義するようなポリペプチドは、ＦＡＳタンパク質複合体の他のサブユニット中に存在するそれぞれの酵素活性と相互作用する、そしてしたがってこれらを制御する部分に相当する。
【0040】
本発明者らによって立証されるように、ＴＭＡ １７としてもまた知られるガンマ－サブユニットは、ＦＡＳタンパク質複合体の他のサブユニット、すなわちα－およびβ－サブユニットとの多様な相互作用部位を有する。
【0041】
さらなる側面において、本発明者らは、本発明記載の組換えポリペプチドを含む脂肪酸シンターゼタンパク質複合体を提供する。さらに、本発明記載の脂肪酸シンターゼタンパク質複合体は、当該技術分野に記載されるようなα－およびβ－サブユニットを含有する。
【0042】
以下に示すように、本発明者らは、驚くべきことに、ＦＡＳタンパク質複合体（ＦＡＳ Ｉ）中に存在するさらなるサブユニット、すなわち、以前は、プロテアソームまたはリボソームのみと相互作用することが知られていたＴｍａ１７ポリペプチドを同定する。
【0043】
本発明の１つの態様において、脂肪酸およびバイオ燃料の産生において使用するための、特に、遊離脂肪酸、ケト脂肪酸、脂肪酸アルコール、環状脂肪酸および伸長脂肪酸の生物学的産生において使用するための、本明細書に記載するような組換えポリペプチドを含有する、脂肪酸シンターゼタンパク質複合体を提供する。すなわち、特に挿入物を含有する、定義するような組換えポリペプチドを用いると、記載する配列内にさらなる酵素活性を導入することが可能である。前記酵素活性は、脂肪酸に対して作用して、したがって、ＦＡＳタンパク質複合体の産物をさらに変化させることを可能にする。本発明にしたがった、ＦＡＳタンパク質複合体上に存在する酵素の少なくとも１つに対して阻害活性を有する本発明記載のポリペプチドの場合、該複合体で行われる脂肪酸合成の工程の１つを阻害し、したがって、得られる産物を変化させることも可能である。
【0044】
当業者は、修飾されたまたは改変された脂肪酸残基に到達するための適切な挿入物をよく知っている。
さらなる態様において、本発明は、本発明記載のポリペプチドをコードする核酸分子に関する。核酸分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または他の分子、例えばＰＮＡ等を含む、当該技術分野に知られる核酸で構成されてもよい。さらに、記載するようなペプチドをコードする本発明記載の核酸配列を含むベクターを提供する。当業者は、適切なベクター系およびベクター、特に酵母ゲノム内への形質転換および組換えを含めて、真核細胞のトランスフェクションおよび形質導入を可能にするベクターをよく知っている。
さらなる態様において、本発明は、本発明記載のポリペプチドをコードする核酸分子に関する。核酸分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または他の分子、例えばＰＮＡ等を含む、当該技術分野に知られる核酸で構成されてもよい。さらに、記載するようなペプチドをコードする本発明記載の核酸配列を含むベクターを提供する。当業者は、適切なベクター系およびベクター、特に酵母ゲノム内への形質転換および組換えを含めて、真核細胞のトランスフェクションおよび形質導入を可能にするベクターをよく知っている。
【0045】
さらに、本発明は、本発明記載の核酸を含有し、そして／または本発明記載のポリペプチドを発現する宿主細胞に関する。１つの態様において、宿主細胞は、Ｉ型脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ Ｉ）を含有する微生物、例えば酵母である。
【0046】
さらなる態様において、単離脂肪酸シンターゼタンパク質複合体は：
ａ）脂肪酸シンターゼタンパク質複合体を含有する未精製試料を提供し；
ｂ）２５，０００～３５，０００ｘｇで、細胞破片を分離するため、第一の遠心分離工程を行い；
ｃ）第一の遠心分離工程から得た上清に、０％～２５％（ｗ／ｖ）の量のオスモライト、および随意にシステインのチオールアルキル化および／または還元を可能にする化合物を補充し；
ｄ）５０，０００～１５０，０００ｘｇ、例えば８０，０００～１２０，０００ｘｇでの遠心分離によって、第二の遠心分離工程を行い；
ｅ）第二の遠心分離工程から得た上清を、沈殿のため、水溶性ポリマー、特に非イオン性ポリマーまたはゼロ正味荷電のポリマー、例えばポリアルキレングリコール、ポリアミン、またはポリカルボキシレートで処理し；
ｆ）前記ポリマー、例えばポリアルキレングリコールを含有しない緩衝液中に再懸濁した後、ポリマーに基づく沈殿物、例えばポリアルキレングリコールに基づく沈殿物とともに、オスモライトを用いて密度勾配遠心分離を行い；
ｇ）随意に、工程ｅ）およびｆ）を１回または複数回反復し
ｈ）精製された脂肪酸シンターゼタンパク質複合体を得るため、脂肪酸シンターゼタンパク質複合体の水溶性ポリマーに基づく沈殿、例えばポリアルキレングリコールに基づく沈殿によって濃縮する
工程を含む方法によって得られうると記載される。
ａ）脂肪酸シンターゼタンパク質複合体を含有する未精製試料を提供し；
ｂ）２５，０００～３５，０００ｘｇで、細胞破片を分離するため、第一の遠心分離工程を行い；
ｃ）第一の遠心分離工程から得た上清に、０％～２５％（ｗ／ｖ）の量のオスモライト、および随意にシステインのチオールアルキル化および／または還元を可能にする化合物を補充し；
ｄ）５０，０００～１５０，０００ｘｇ、例えば８０，０００～１２０，０００ｘｇでの遠心分離によって、第二の遠心分離工程を行い；
ｅ）第二の遠心分離工程から得た上清を、沈殿のため、水溶性ポリマー、特に非イオン性ポリマーまたはゼロ正味荷電のポリマー、例えばポリアルキレングリコール、ポリアミン、またはポリカルボキシレートで処理し；
ｆ）前記ポリマー、例えばポリアルキレングリコールを含有しない緩衝液中に再懸濁した後、ポリマーに基づく沈殿物、例えばポリアルキレングリコールに基づく沈殿物とともに、オスモライトを用いて密度勾配遠心分離を行い；
ｇ）随意に、工程ｅ）およびｆ）を１回または複数回反復し
ｈ）精製された脂肪酸シンターゼタンパク質複合体を得るため、脂肪酸シンターゼタンパク質複合体の水溶性ポリマーに基づく沈殿、例えばポリアルキレングリコールに基づく沈殿によって濃縮する
工程を含む方法によって得られうると記載される。
【0047】
すなわち、本明細書に完全に含まれるＷＯ ２０１７／２１１７７５ Ａ１に詳細に記載されるように、該方法は、本明細書に記載するような、新規に同定されたガンマ－サブユニットを含むＦＡＳタンパク質複合体を単離することを可能にする。
【0048】
先行技術はＦＡＳタンパク質複合体を２つのサブユニットのみで構成される複合体と記載しているが、本発明者らは、ＷＯ ２０１１／２１１７７５ Ａ１に記載される方法を実行して、第三のサブユニットを含有するＦＡＳタンパク質複合体を得た。該サブユニットがＴｍａ１７ポリペプチドである。
【0049】
１つの態様において、ホスフィンに基づく還元剤、例えばトリカルボキシエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）の使用によって、システインの還元を行う。さらに、密度勾配を、室温、例えば１８℃～２２℃で行う。さらに、本発明の１つの態様において、精製工程中の塩濃度（組み合わせたＮａＣｌおよびＫＣｌ）を１５０ｍＭ未満に維持して、ガンマ－ユニットの解離を最小限にする。
【0050】
さらに、本発明は、ケトレダクターゼ、特にＦＡＳタンパク質複合体中に存在するケトレダクターゼを阻害可能な候補化合物の適切性を決定するための方法であって：
－水溶性ポリマー、特に非イオン性ポリマーまたはゼロ正味荷電のポリマー、例えばポリアルキレングリコール、ポリアミン、またはポリカルボキシレート、特にポリエチレングリコールを含有するリザーバー溶液中で、候補化合物を含有する、ケトレダクターゼ、特にＦＡＳタンパク質を結晶化するか、あるいは候補化合物を含有する、結晶化ケトレダクターゼ、特にＦＡＳタンパク質複合体を提供し；
－ケトレダクターゼ、特にＦＡＳタンパク質複合体の結晶構造を、２．８Åまたはそれ未満の解像度での回折分析によって決定し；
－前記分析に基づき、ケトレダクターゼ、特にＦＡＳタンパク質複合体のケトレダクターゼの阻害剤としての候補化合物の適切性を決定するか、あるいはそれとは別にまたは組み合わせて、
－ケトレダクターゼ、特にＦＡＳタンパク質複合体中に存在するケトレダクターゼを阻害可能な候補化合物を含有する、ケトレダクターゼ、特にＦＡＳタンパク質複合体を、低温電子顕微鏡分析のために調製し；
－前記ケトレダクターゼ、特にＦＡＳタンパク質複合体で、低温電子顕微鏡検査を実行し；
－ケトレダクターゼ、特にＦＡＳタンパク質複合体のケトレダクターゼの阻害剤としての候補化合物の適切性を決定する
工程を含む、前記方法に関する。
－水溶性ポリマー、特に非イオン性ポリマーまたはゼロ正味荷電のポリマー、例えばポリアルキレングリコール、ポリアミン、またはポリカルボキシレート、特にポリエチレングリコールを含有するリザーバー溶液中で、候補化合物を含有する、ケトレダクターゼ、特にＦＡＳタンパク質を結晶化するか、あるいは候補化合物を含有する、結晶化ケトレダクターゼ、特にＦＡＳタンパク質複合体を提供し；
－ケトレダクターゼ、特にＦＡＳタンパク質複合体の結晶構造を、２．８Åまたはそれ未満の解像度での回折分析によって決定し；
－前記分析に基づき、ケトレダクターゼ、特にＦＡＳタンパク質複合体のケトレダクターゼの阻害剤としての候補化合物の適切性を決定するか、あるいはそれとは別にまたは組み合わせて、
－ケトレダクターゼ、特にＦＡＳタンパク質複合体中に存在するケトレダクターゼを阻害可能な候補化合物を含有する、ケトレダクターゼ、特にＦＡＳタンパク質複合体を、低温電子顕微鏡分析のために調製し；
－前記ケトレダクターゼ、特にＦＡＳタンパク質複合体で、低温電子顕微鏡検査を実行し；
－ケトレダクターゼ、特にＦＡＳタンパク質複合体のケトレダクターゼの阻害剤としての候補化合物の適切性を決定する
工程を含む、前記方法に関する。
【0051】
さらに、本発明は、エノイルレダクターゼ、特にＦＡＳタンパク質複合体中に存在するエノイルレダクターゼを阻害可能である候補化合物の適切性を決定するための方法であって：
－水溶性ポリマー、特に非イオン性ポリマーまたはゼロ正味荷電のポリマー、例えばポリアルキレングリコール、ポリアミン、またはポリカルボキシレート、特にポリエチレングリコールを含有するリザーバー溶液中で、候補化合物を含有する、エノイルレダクターゼ、特にＦＡＳタンパク質を結晶化するか、あるいは候補化合物を含有する、結晶化エノイルレダクターゼ、特にＦＡＳタンパク質複合体を提供し；
－エノイルレダクターゼ、特にＦＡＳタンパク質複合体の結晶構造を、２．８Åまたはそれ未満の解像度での回折分析によって決定し；
－前記分析に基づき、エノイルレダクターゼ、特にＦＡＳタンパク質複合体のエノイルレダクターゼの阻害剤としての候補化合物の適切性を決定するか、あるいはそれとは別にまたは組み合わせて
－エノイルレダクターゼ、特にＦＡＳタンパク質複合体中に存在するエノイルレダクターゼを阻害可能な候補化合物を含有する、エノイルレダクターゼ、特にＦＡＳタンパク質複合体を、低温電子顕微鏡分析のために調製し；
－前記エノイルレダクターゼ、特にＦＡＳタンパク質複合体で、低温電子顕微鏡検査を実行し；
－エノイルレダクターゼ、特にＦＡＳタンパク質複合体のエノイルレダクターゼの阻害剤としての候補化合物の適切性を決定する
工程を含む、前記方法に関する。
－水溶性ポリマー、特に非イオン性ポリマーまたはゼロ正味荷電のポリマー、例えばポリアルキレングリコール、ポリアミン、またはポリカルボキシレート、特にポリエチレングリコールを含有するリザーバー溶液中で、候補化合物を含有する、エノイルレダクターゼ、特にＦＡＳタンパク質を結晶化するか、あるいは候補化合物を含有する、結晶化エノイルレダクターゼ、特にＦＡＳタンパク質複合体を提供し；
－エノイルレダクターゼ、特にＦＡＳタンパク質複合体の結晶構造を、２．８Åまたはそれ未満の解像度での回折分析によって決定し；
－前記分析に基づき、エノイルレダクターゼ、特にＦＡＳタンパク質複合体のエノイルレダクターゼの阻害剤としての候補化合物の適切性を決定するか、あるいはそれとは別にまたは組み合わせて
－エノイルレダクターゼ、特にＦＡＳタンパク質複合体中に存在するエノイルレダクターゼを阻害可能な候補化合物を含有する、エノイルレダクターゼ、特にＦＡＳタンパク質複合体を、低温電子顕微鏡分析のために調製し；
－前記エノイルレダクターゼ、特にＦＡＳタンパク質複合体で、低温電子顕微鏡検査を実行し；
－エノイルレダクターゼ、特にＦＡＳタンパク質複合体のエノイルレダクターゼの阻害剤としての候補化合物の適切性を決定する
工程を含む、前記方法に関する。
【0052】
さらに、本発明は、マロニル／パルミトイルトランスフェラーゼ（ＭＰＴ）、特にＦＡＳタンパク質複合体中に存在するＭＰＴを阻害可能である候補化合物の適切性を決定するための方法であって：
－水溶性ポリマー、特に非イオン性ポリマーまたはゼロ正味荷電のポリマー、例えばポリアルキレングリコール、ポリアミン、またはポリカルボキシレート、特にポリエチレングリコールを含有するリザーバー溶液中で、候補化合物を含有する、ＭＰＴ、特にＦＡＳタンパク質を結晶化するか、あるいは候補化合物を含有する、結晶化ＭＰＴ、特にＦＡＳタンパク質複合体を提供し；
－ＭＰＴ、特にＦＡＳタンパク質複合体の結晶構造を、２．８Åまたはそれ未満の解像度での回折分析によって決定し；
－前記分析に基づき、ＭＰＴ、特にＦＡＳタンパク質複合体のＭＰＴの阻害剤としての候補化合物の適切性を決定するか、あるいはそれとは別にまたは組み合わせて
－ＭＰＴ、特にＦＡＳタンパク質複合体中に存在するＭＰＴを阻害可能な候補化合物を含有する、ＭＰＴ、特にＦＡＳタンパク質複合体を、低温電子顕微鏡分析のために調製し；
－前記ＭＰＴ、特にＦＡＳタンパク質複合体で、低温電子顕微鏡検査を実行し；
－ＭＰＴ、特にＦＡＳタンパク質複合体のＭＰＴの阻害剤としての候補化合物の適切性を決定する
工程を含む、前記方法に関する。
－水溶性ポリマー、特に非イオン性ポリマーまたはゼロ正味荷電のポリマー、例えばポリアルキレングリコール、ポリアミン、またはポリカルボキシレート、特にポリエチレングリコールを含有するリザーバー溶液中で、候補化合物を含有する、ＭＰＴ、特にＦＡＳタンパク質を結晶化するか、あるいは候補化合物を含有する、結晶化ＭＰＴ、特にＦＡＳタンパク質複合体を提供し；
－ＭＰＴ、特にＦＡＳタンパク質複合体の結晶構造を、２．８Åまたはそれ未満の解像度での回折分析によって決定し；
－前記分析に基づき、ＭＰＴ、特にＦＡＳタンパク質複合体のＭＰＴの阻害剤としての候補化合物の適切性を決定するか、あるいはそれとは別にまたは組み合わせて
－ＭＰＴ、特にＦＡＳタンパク質複合体中に存在するＭＰＴを阻害可能な候補化合物を含有する、ＭＰＴ、特にＦＡＳタンパク質複合体を、低温電子顕微鏡分析のために調製し；
－前記ＭＰＴ、特にＦＡＳタンパク質複合体で、低温電子顕微鏡検査を実行し；
－ＭＰＴ、特にＦＡＳタンパク質複合体のＭＰＴの阻害剤としての候補化合物の適切性を決定する
工程を含む、前記方法に関する。
【0053】
すなわち、それぞれの酵素（ケトレダクターゼ、エノイルレダクターゼおよびＭＰＴ）を阻害可能な、特にＦＡＳタンパク質複合体中に存在する前記酵素を阻害可能な候補化合物を同定するために記載される方法には、前記酵素または前記酵素を含有するタンパク質複合体の結晶化、あるいはこれとは別にまたはこれと組み合わせて、低温電子顕微鏡によってそれぞれの酵素と相互作用する前記候補化合物を調べる工程のいずれかが含まれる。
【0054】
１つの態様において、候補化合物は、言及する酵素の少なくとも２つを阻害する、例えばケトレダクターゼおよびエノイルレダクターゼの両方を阻害する化合物であってもよい。
【0055】
例えば、候補化合物は、本明細書に記載するような、言及する阻害性ペプチド配列を含有するペプチドライブラリーであって、それによって、これらの配列がランダム突然変異または部位特異的突然変異によってランダム化されている前記ライブラリーから得られてもよい。問題の酵素、特に酵素、ケトレダクターゼ、エノイルレダクターゼまたはＭＰＴの１つに結合する候補化合物を選択し、そしてガンマ－サブユニット内に導入し、こうして、それぞれの酵素に対する阻害活性を決定することを可能にする。もちろん、候補化合物にはまた、ガンマ－サブユニットの天然阻害ユニットの阻害性干渉を安定化させる化合物も含まれる。当業者は、候補化合物の有用性を決定するためのライブラリーおよび方法をよく知っている。
【0056】
別の側面において、ＦＡＳタンパク質複合体中に存在する酵素活性の阻害剤の設計のための方法を同定する。すなわち、ケトレダクターゼ活性、特に、ＦＡＳタンパク質複合体中のケトレダクターゼ活性の阻害剤の設計のための方法であって、
－配列番号２の少なくとも６つの連続アミノ酸、例えば少なくとも８つの連続アミノ酸、例えば少なくとも１０の連続アミノ酸のポリペプチド、またはその機能的断片、またはその相同体を、前記ポリペプチドのアミノ酸の少なくとも１つのランダムまたは部位特異的突然変異によって突然変異させ、
－ケトレダクターゼ活性、特にＦＡＳタンパク質複合体のケトレダクターゼ活性を阻害する適切性を決定する
工程を含む、前記方法を提供する。
－配列番号２の少なくとも６つの連続アミノ酸、例えば少なくとも８つの連続アミノ酸、例えば少なくとも１０の連続アミノ酸のポリペプチド、またはその機能的断片、またはその相同体を、前記ポリペプチドのアミノ酸の少なくとも１つのランダムまたは部位特異的突然変異によって突然変異させ、
－ケトレダクターゼ活性、特にＦＡＳタンパク質複合体のケトレダクターゼ活性を阻害する適切性を決定する
工程を含む、前記方法を提供する。
【0057】
別の態様において、エノイルレダクターゼ活性、特に、ＦＡＳタンパク質複合体中のエノイルレダクターゼ活性の阻害剤の設計のための方法であって、
－配列番号３の少なくとも５つの連続アミノ酸、例えば少なくとも６つの連続アミノ酸、例えば少なくとも８つの連続アミノ酸のポリペプチド、またはその機能的断片、またはその相同体を、前記ポリペプチドのアミノ酸の少なくとも１つのランダムまたは部位特異的突然変異によって突然変異させ、
－エノイルレダクターゼ活性、特にＦＡＳタンパク質複合体のエノイルレダクターゼ活性を阻害する適切性を決定する
工程を含む、前記方法を提供する。
－配列番号３の少なくとも５つの連続アミノ酸、例えば少なくとも６つの連続アミノ酸、例えば少なくとも８つの連続アミノ酸のポリペプチド、またはその機能的断片、またはその相同体を、前記ポリペプチドのアミノ酸の少なくとも１つのランダムまたは部位特異的突然変異によって突然変異させ、
－エノイルレダクターゼ活性、特にＦＡＳタンパク質複合体のエノイルレダクターゼ活性を阻害する適切性を決定する
工程を含む、前記方法を提供する。
【0058】
最後に、ＭＰＴ活性、特に、ＦＡＳタンパク質複合体中のＭＰＴ活性の阻害剤の設計のための方法であって、
－配列番号４の少なくとも６つの連続アミノ酸、例えば少なくとも８つの連続アミノ酸、例えば配列番号４の少なくとも１０、１２もしくは１４の連続アミノ酸のポリペプチド、またはその機能的断片、またはその相同体を、前記ポリペプチドのアミノ酸の少なくとも１つのランダムまたは部位特異的突然変異によって突然変異させ、
－ＭＰＴ活性、特にＦＡＳタンパク質複合体のＭＰＴ活性を阻害する適切性を決定する
工程を含む、前記方法を提供する。
－配列番号４の少なくとも６つの連続アミノ酸、例えば少なくとも８つの連続アミノ酸、例えば配列番号４の少なくとも１０、１２もしくは１４の連続アミノ酸のポリペプチド、またはその機能的断片、またはその相同体を、前記ポリペプチドのアミノ酸の少なくとも１つのランダムまたは部位特異的突然変異によって突然変異させ、
－ＭＰＴ活性、特にＦＡＳタンパク質複合体のＭＰＴ活性を阻害する適切性を決定する
工程を含む、前記方法を提供する。
【0059】
設計には、本明細書に定義するようなポリペプチドの改変または修飾が含まれる。すなわち、こうしたものとしてのアミノ酸残基が異なるアミノ酸残基で置換されてもよいし、あるいは核酸残基が修飾されてもよい。さらなる修飾には、アミノ酸残基の少なくとも１つの化学的修飾が含まれ、これはクリックケミストリーを可能にし、したがって、酵素中に存在する相互作用対応物への共有結合を構築する。したがって、一過性または永続的阻害が達成されてもよい。さらに、マイケル反応またはマイケル付加における受容体を含むように阻害剤を修飾してもよい。さらに、阻害剤は、それぞれの酵素の相互作用対応物に存在するＬｙｓまたはＨｉｓと反応可能なシッフ塩基構築部分を含有してもよい。
【0060】
さらに、本発明は、ケトレダクターゼ、エノイルレダクターゼおよび／またはＭＰＴの阻害剤を提供する。前記阻害剤は、言及する酵素活性を阻害する、すなわち、ＫＲ、ＥＲおよびＭＰＴ活性を阻害する３つの阻害部分すべてを含有する阻害剤であってもよい。前記阻害剤の設計は、それぞれの部分が酵素的対応物と相互作用しうるようなものである。これは、特に、ＦＡＳタンパク質複合体中に存在する酵素活性の少なくとも２つ、例えばＭＰＴおよびＥＲまたはＭＰＴおよびＫＲ、ならびにＥＲおよびＫＲの組み合わせ、あるいは３つの酵素活性すべての阻害剤に関して当てはまる。
【0061】
さらに、組み合わせて、本明細書に定義するようなポリペプチドまたは阻害剤の両方を含有するＦＡＳタンパク質複合体を想定することが可能である。すなわち、ＦＡＳタンパク質複合体は、挿入物を含有する組換えポリペプチドのガンマ・サブユニットを含むＦＡＳタンパク質複合体であってもよく、同時に言及する酵素活性の少なくとも１つの阻害剤が存在してもよい。さらに、本発明のさらなるポリペプチドには、配列番号１のポリペプチド中に、配列番号２、３および４の配列またはその断片の少なくとも１つが存在しないポリペプチドが含まれる。前記ポリペプチドは、根底にあるガンマ－サブユニットの構造を維持するために、さらなるセグメント（単数または複数）を含有してもよい。当業者は、望ましい阻害特性を有するそれぞれのポリペプチドの適切性を確実にするために存在する必要があるアミノ酸をよく知っている。例えば、ＭＰＴ阻害部位は、中性、塩基性および／または極性アミノ酸残基で置換される。
【0062】
最後に、本発明は、癌、感染性疾患、結核、肥満、細菌感染に対する抗生物質、特に結核、または酵母感染の予防または治療において使用するための本発明記載の阻害剤を提供する。
【0063】
ＦＡＳタンパク質複合体、ＦＡＳ ＩまたはＦＡＳ ＩＩのいずれかの阻害剤の適切性が当該技術分野において論じられる。その結果、本発明の阻害剤は、疾患の治療に適した阻害剤に相当し、ここでＦＡＳタンパク質複合体は、前記疾患または障害の予防または治療のためのターゲット分子である。
【0064】
酵母脂肪酸シンターゼ・ガンマ・サブユニットの発見
酵母ＦＡＳによる反復シャトルを支配する構造的決定要因をメカニズム的に調べるため、本発明者らはまず、酵母、Ｓ．セレビシエ由来の、高い活性の生化学的および構造的に均質なＦＡＳを生じるであろう生化学的精製法を確立することを試みた。この目的のため、本発明者らは、本発明者らが２０Ｓおよび２６Ｓプロテアソームに関して以前報告したクロマトグラフィ不使用精製法をＦＡＳに適応させた（Ｊ． Ｓｃｈｒａｄｅｒら， Ｓｃｉｅｎｃｅ． ３５３， ５９４－８（２０１６））。このアプローチは、直交精製工程として、分画ＰＥＧ沈殿および密度勾配遠心分離に頼る。例えばＷＯ２０１７／２１１７７５ Ａ１を参照されたい。これは、一定の（低い）イオン強度で非常に穏やかな精製を可能にし、Ｓ．セレビシエ細胞の２２３ｇの湿重量から、１５～２０ｍｇの電気泳動的に純粋なＦＡＳを生じる。驚くべきことに、これらの精製条件下で、本発明者らは、２０ｋＤａの見かけの分子量を持つタンパク質が、再現可能にＦＡＳと同時精製されることを見出した（図２ａ）。トリプシン消化物のタンデム質量分析は、このタンパク質をＴｍａ１７ｐと同定した。
酵母ＦＡＳによる反復シャトルを支配する構造的決定要因をメカニズム的に調べるため、本発明者らはまず、酵母、Ｓ．セレビシエ由来の、高い活性の生化学的および構造的に均質なＦＡＳを生じるであろう生化学的精製法を確立することを試みた。この目的のため、本発明者らは、本発明者らが２０Ｓおよび２６Ｓプロテアソームに関して以前報告したクロマトグラフィ不使用精製法をＦＡＳに適応させた（Ｊ． Ｓｃｈｒａｄｅｒら， Ｓｃｉｅｎｃｅ． ３５３， ５９４－８（２０１６））。このアプローチは、直交精製工程として、分画ＰＥＧ沈殿および密度勾配遠心分離に頼る。例えばＷＯ２０１７／２１１７７５ Ａ１を参照されたい。これは、一定の（低い）イオン強度で非常に穏やかな精製を可能にし、Ｓ．セレビシエ細胞の２２３ｇの湿重量から、１５～２０ｍｇの電気泳動的に純粋なＦＡＳを生じる。驚くべきことに、これらの精製条件下で、本発明者らは、２０ｋＤａの見かけの分子量を持つタンパク質が、再現可能にＦＡＳと同時精製されることを見出した（図２ａ）。トリプシン消化物のタンデム質量分析は、このタンパク質をＴｍａ１７ｐと同定した。
【0065】
ＦＡＳの生化学的研究の５０年間近く、酵母ＦＡＳのさらなるタンパク質サブユニットは記載されてこなかった。Ｔｍａ１７ｐは、以前、細胞翻訳またはプロテアソーム集合に関与することが記載されてきている（Ｔ． Ｃ． Ｆｌｅｉｓｃｈｅｒら， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． ２０， １２９４－１３０７（２００６））。しかし、勾配の４０Ｓ領域中のＦＡＳとＴｍａ１７ｐの同時精製および同時沈降は、直接の生化学的相互作用を示唆する。したがって、本発明者らは、Ｔｍａ１７ｐが実際にＦＡＳの真の相互作用因子であることを確立するため、一連の対照実験を行った。まず、本発明者らは、ＦＡＳと同時精製される２０ｋＤａタンパク質がＴｍａ１７ｐであることの同定を交差検証した。このため、本発明者らはΔｔｍａ１７ノックアウト酵母株を生成し、そして上記と同じプロトコルを用いて、この株からＦＡＳを精製し、匹敵する量のＦＡＳを得た。しかし、図２ｂに示すように、Δｔｍａ１７株からＦＡＳを精製した際、精製ＦＡＳ分画からは２０ｋＤａバンドが欠けており、タンデム－ＭＳ結果を裏付けた。次に、本発明者らは、ＦＡＳとＴｍａ１７ｐの相互作用の生化学的安定性を調べた。この目的のため、野生型株から精製したＦＡＳを、５０ｍＭ ＫＣｌ、１５０ｍＭ ＫＣｌ、または２５０ｍＭ ＫＣｌのいずれかを含有する密度勾配上に装填した。Ｔｍａ１７ｐは、２５０ｍＭ ＫＣｌでＦＡＳから定量的に解離し、これは、組換えＴｍａ１７ｐと同じ方式で、スクロース密度勾配の上部分画中のＴｍａ１７ｐの沈降を生じる。１５０ｍＭ ＫＣｌでは、ＦＡＳと同時精製されたＴｍａ１７ｐのおよそ半量が解離する一方、５０ｍＭ ＫＣｌでは、同時精製されたＴｍａ１７ｐはＦＡＳと堅固に会合したままであり、そして４０Ｓ領域中にＦＡＳとともに同時沈降した。第三に、本発明者らは、ΔＴｍａ１７ｐ－ＦＡＳへの組換えＴｍａ１７ｐの添加が、ＦＡＳ－Ｔｍａ１７ｐ複合体を再構成しうるかどうかを調べた。このため、ΔＴｍａ１７ｐ－ＦＡＳを、増加する量の蛍光標識した組換えＴｍａ１７ｐとインキュベーションし、そしてアガロースゲル上の非変性ゲル電気泳動によって分析した後、ＦＡＳ結合したＴｍａ１７ｐの蛍光を定量化した。この設定において、標識Ｔｍａ１７ｐは前線の近くに移動する一方、ＦＡＳの移動は２．６ＭＤａの天然分子量のため、かなり遅延していた。ＦＡＳにＴｍａ１７ｐが結合すると、その移動度はＦＡＳと共移動する位置へのシフトを生じる。この実験によって、ＦＡＳへのＴｍａ１７ｐの正の協同結合が明らかになり、Ｋ０．５＝２．１±０．２μＭであり、そしてｎＨ＝２．１±０．３のヒル係数であり、多数コピーのＴｍａ１７ｐが１つのＦＡＳ分子に同時に結合可能であることが示唆される。総合すると、これらの実験は、Ｔｍａ１７ｐが酵母ＦＡＳの弱く会合する複合的な（ｉｎｔｅｇｒａｌ）サブユニットであることを示す。Ｔｍａ１７ｐは酵母において広く保存されており、そしてＦＡＳを精製するために当該技術分野で以前、比較的高塩の条件が使用されていたため、ＦＡＳサブユニットと同定されるのを逃れていたようである。これ以降、本発明者らはＴｍａ１７ｐをＦＡＳ γ－サブユニットと称し、そしてγ－サブユニットに結合したＦＡＳをＦＡＳホロ酵素と称する。
ガンマ・サブユニットは回転ＦＡＳコンホメーションを安定化させる
Ｔｍａ１７ｐがＦＡＳの真正のγ－サブユニットを構成することが確立されたため、本発明者らは、γ－サブユニットの結合がＦＡＳの構造に影響を及ぼすかどうかを検討した。したがって、本発明者らは、ΔＴｍａ１７ｐ－ＦＡＳの結晶を成長させ、該結晶は単純単斜晶系空間群Ｐ２１に属し、単位格子定数はａ＝２１７．６Å、ｂ＝３４７．６Å、ｃ＝２６５．３Å、β＝１０７．９°であり、非対称単位中に単一のΔＴｍａ１７ｐ－ＦＡＳを含有し、そしてＸ線を２．９Åに回折させた。以前報告された（Ｍ． Ｌｅｉｂｕｎｄｇｕｔら， Ｓｃｉｅｎｃｅ． ３１６， ２８８－９０（２００７））３．１ÅのＳ．セレビシエ構造を用いて分子置換によって構造を解き、そしてＰＰＴおよびＡＣＰドメインを含む分子全体で優れた電子密度が明らかになった。ＳＴＡＲＡＮＩＳＯサーバーでの回折データの分析は、穏やかな異方性を示した。データの異方性切り捨て（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）は、モデルの精密化を改善し、より低い平均Ｂ因子および１９．２％／２１．１％のＲ／Ｒｆｒｅｅを生じた。本発明者らはまた、低温ＥＭによって、包括的解像で、１４４，５２６の粒子からΔＴｍａ１７ｐ－ＦＡＳ構造を得ることが可能であり、０．１４３ ＦＳＣ基準を用いて、適用（ａｐｐｌｉｅｄ）Ｄ３対称で２．９Å、適用Ｃ３対称で３．０Å、そして非対称再構築で３．３Åであり、小規模の局所解像相違があった。ΔＴｍａ１７ｐ－ＦＡＳ結晶モデルを、３つのＥＭマップすべてに対して精密化し、そして結晶構造に関して１Åの全体のｒ．ｍ．ｓ．ｄ．であるが、異なる対称再構築で０．２Å未満のｒ．ｍ．ｓ．ｄ．のモデルを生じた。次いで、本発明者らは図３において、上述のような組換えγ－サブユニットとともにΔＴｍａ１７ｐ－ＦＡＳを再構成することによって、ＦＡＳホロ酵素の構造を決定した。γ－サブユニットの飽和条件で、本発明者らは、包括的解像で、１１０，５９７の単一粒子から低温ＥＭ構造を再構築可能であり、０．１４３ ＦＳＣ基準を用いて、適用Ｄ３対称で２．８Å、適用Ｃ３対称で２．９Å、そして非対称再構築で３．２Åであり、小規模の局所解像相違があった。ＦＡＳホロ酵素低温ＥＭ構造の品質はΔＴｍａ１７ｐ－ＦＡＳ構造のものに匹敵し、そして等しく信頼性があるモデル構築が可能であった。本発明者らはまた、ＦＡＳホロ酵素の結晶を得ることも可能であり、これは、単純単斜晶系空間群Ｐ２１に属し、単位格子定数はａ＝２３４．９Å、ｂ＝４３０．３Å、ｃ＝４２２．６Å、β＝９７°であり、非対称単位中に２つのＦＡＳホロ酵素を含有し、そしてＸ線を４．６Å解像に回折させた。本発明者らは、Ｃαトレースの信頼性があるモデリングを可能にする、上述のΔＴｍａ１７ｐ－ＦＡＳ結晶構造を用いた分子置換によって、ＦＡＳホロ酵素の結晶構造を解いた。３つの（対称および非対称）低温ＥＭマップすべてに対して精密化したＦＡＳホロ酵素のモデルは、結晶構造に関して０．８Åの全体のｒ．ｍ．ｓ．ｄ．であるが、異なる対称再構築で０．２Å未満のｒ．ｍ．ｓ．ｄ．のモデルを生じた。ΔＴｍａ１７ｐ－ＦＡＳおよびＦＡＳホロ酵素の両方の低温ＥＭおよびＸ線結晶から得られるモデルの間の類似性は、γ－サブユニット結合の構造的影響の、信頼性があり、そして決定的な解釈を可能にする。これらの知見は、低温ＥＭ構造の決定において、結晶の接触および課される（ｉｍｐｏｓｅｄ）対称性からは独立しており、そして構造データのロバストな交差検証を提供する。
ガンマ・サブユニットによる動的ＡＣＰドメインの移動
ΔＴｍａ１７ｐ－ＦＡＳとＦＡＳホロ酵素の低温ＥＭおよび結晶構造両方の構造比較によって、いくつかの相違が明らかになった：１）ＦＡＳホロ酵素構造のβ－サブユニットは、隣接するβ－サブユニットが出会うドーム頂上で、中央３倍対称軸に対して～１５°回転する。これは、ＡＴドメインの内向きのシフト、ＭＰＴドメインの外向きのシフト、および１０ÅのＦＡＳホロ酵素構造の全体の圧縮を生じる。ＦＡＳ β－サブユニットのこの回転は、ＦＡＳホロ酵素の酵素ドメイン内のコンホメーション変化よりも、主に、剛体運動によって駆動されるようである。２）ΔＴｍａ１７ｐ－ＦＡＳ構造において、すべてのＡＣＰドメインはＫＳ部位の近傍に見られ、これは以前、ＦＡＳ結晶構造において報告されたものと同じ位置である（Ｐ． Ｊｏｈａｎｓｓｏｎら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ． Ｓ． Ａ． １０５， １２８０３－１２８０８（２００８））。驚くべきことに、対照的に、ＦＡＳホロ酵素低温ＥＭ構造において、すべてのＡＣＰドメインがＡＴドメイン近傍に見られる。このＡＣＰドメイン位置は、ＦＡＳホロ酵素結晶構造の陽性差密度マップ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｄｅｎｓｉｔｙ ｍａｐ）およびオミットマップ（ｏｍｉｔ ｍａｐ）によって容易に検証される。３）本発明者らは、ＦＡＳホロ酵素低温ＥＭ構造中のＡＣＰドメインの直下にコイルドコイルセグメントとしてモデリング可能なさらなる密度があることを見出し、これはΔＴｍａ１７ｐ－ＦＡＳ低温ＥＭおよびＸ線結晶構造には欠けていた。この観察を、ＦＡＳホロ酵素結晶構造の陽性差密度マップおよびオミットマップで交差検証し、そしてこれはγ－サブユニットに相当するようである。本発明者らは、ＦＡＳホロ酵素の架橋質量分析（ＸＬ－ＭＳ）によって、この仮説を試験した（図４）。ＸＬ－ＭＳは、γ－サブユニットのＮ末端部分とＥＲドメインの相互作用、ＭＰＴドメインに対するγ－サブユニットの中央部分の空間的近接、およびγ－サブユニットのＣ末端部分とＫＲおよびＫＳドメインの会合を明らかにした。ＸＬ－ＭＳ結果、および低温ＥＭマップにおける側鎖密度に対応する構造特徴によって導かれ、本発明者らはＦＡＳと会合するγ－サブユニットの原子モデルを構築可能であった。ＦＡＳホロ酵素内のγ－サブユニットの相互作用の様式をより詳しく検討すると、Ｎ末端部分はＥＲ活性部位を塞ぐ一方、γ－サブユニットのＣ末端１８残基はＫＲドメイン活性部位を占め、両ドメインにおけるＮＡＤＰＨ結合に対する立体競合が示唆された。さらに、γ－サブユニットの２つのα－らせんを連結する１６アミノ酸のループセグメントは、ＦＡＳホロ酵素のＥＭおよび結晶構造マップのどちらにおいてもほとんど解像されていないが、ＭＰＴドメインに隣接する位置を占める可能性が高い。
ガンマ・サブユニットの機能的およびコンホメーション的影響
では、ＦＡＳホロ酵素におけるγ－サブユニットの生化学的機能とは何だろうか。今日までの酵母ＦＡＳの大部分の酵素研究は、γ－サブユニットの非存在下で行われているため、このタンパク質は、酵素活性自体には必要ではない。ＦＡＳホロ酵素内のγ－サブユニットの結合の構造様式は、損なわれていない基質結合を通じたＦＡＳホロ酵素内の酵素活性の部分的阻害を示唆し、そしてしたがって、レダクターゼ活性に最も顕著な影響を有すると予期される。これを試験するため、本発明者らは、定常状態動力学を分析し、そしてすべての基質、特にアセチル－ＣｏＡ、マロニル－ＣｏＡおよびＮＡＤＰＨの多様な濃度に関して、ΔＴｍａ１７ｐ－ＦＡＳの基質代謝回転速度を測定した。この分析によって、アセチル－ＣｏＡおよびマロニル－ＣｏＡの両方に関する飽和動力学が明らかになり、その結合は、γ－サブユニットの飽和量を添加することによって部分的に阻害された。γ－サブユニットの結合は、アセチル－ＣｏＡに関して２倍減少したアフィニティ、そしてマロニル－ＣｏＡの場合は４倍減少したアフィニティを生じた。対照的に、ＮＡＤＰＨの異なる濃度での速度の分析はより複雑であり、そしてＥ（酵素）、Ｓ（基質）、ＥＳ（同族酵素基質複合体）、ＳＥ（非同族または弱いアフィニティの酵素基質複合体）、ＳＥＳ（同時に存在する非同族／弱いアフィニティおよび同族酵素基質複合体）を伴うΔＴｍａ１７ｐ－ＦＡＳの場合の基質依存性活性化モデルを示唆した（図５）。しかし、ＦＡＳホロ酵素は、ＮＡＤＰＨに関する古典的な双曲線性ミカエリス・メンテン依存性を示した。γ－サブユニットの飽和濃度では、ＮＡＤＰＨのＫＭ ａｐｐはΔＴｍａ１７ｐ－ＦＡＳに比較して増加する（図５）。総合すると、本明細書に記載する動力学データおよび構造知見によって、細胞代謝の相違に順応するために、ＮＡＤＰＨ基質依存性のダイナミックレンジが広がるように、ＦＡＳホロ酵素内の酵素活性、特にレダクターゼ活性に、γ－サブユニットが部分的に影響を及ぼすことが示される。これは、細胞が、ＮＡＤＰＨおよびＮＡＤＰ＋の増進された濃度レジームに渡ってＦＡＳ活性を制御することを可能にする。
ガンマ・サブユニットは回転ＦＡＳコンホメーションを安定化させる
Ｔｍａ１７ｐがＦＡＳの真正のγ－サブユニットを構成することが確立されたため、本発明者らは、γ－サブユニットの結合がＦＡＳの構造に影響を及ぼすかどうかを検討した。したがって、本発明者らは、ΔＴｍａ１７ｐ－ＦＡＳの結晶を成長させ、該結晶は単純単斜晶系空間群Ｐ２１に属し、単位格子定数はａ＝２１７．６Å、ｂ＝３４７．６Å、ｃ＝２６５．３Å、β＝１０７．９°であり、非対称単位中に単一のΔＴｍａ１７ｐ－ＦＡＳを含有し、そしてＸ線を２．９Åに回折させた。以前報告された（Ｍ． Ｌｅｉｂｕｎｄｇｕｔら， Ｓｃｉｅｎｃｅ． ３１６， ２８８－９０（２００７））３．１ÅのＳ．セレビシエ構造を用いて分子置換によって構造を解き、そしてＰＰＴおよびＡＣＰドメインを含む分子全体で優れた電子密度が明らかになった。ＳＴＡＲＡＮＩＳＯサーバーでの回折データの分析は、穏やかな異方性を示した。データの異方性切り捨て（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）は、モデルの精密化を改善し、より低い平均Ｂ因子および１９．２％／２１．１％のＲ／Ｒｆｒｅｅを生じた。本発明者らはまた、低温ＥＭによって、包括的解像で、１４４，５２６の粒子からΔＴｍａ１７ｐ－ＦＡＳ構造を得ることが可能であり、０．１４３ ＦＳＣ基準を用いて、適用（ａｐｐｌｉｅｄ）Ｄ３対称で２．９Å、適用Ｃ３対称で３．０Å、そして非対称再構築で３．３Åであり、小規模の局所解像相違があった。ΔＴｍａ１７ｐ－ＦＡＳ結晶モデルを、３つのＥＭマップすべてに対して精密化し、そして結晶構造に関して１Åの全体のｒ．ｍ．ｓ．ｄ．であるが、異なる対称再構築で０．２Å未満のｒ．ｍ．ｓ．ｄ．のモデルを生じた。次いで、本発明者らは図３において、上述のような組換えγ－サブユニットとともにΔＴｍａ１７ｐ－ＦＡＳを再構成することによって、ＦＡＳホロ酵素の構造を決定した。γ－サブユニットの飽和条件で、本発明者らは、包括的解像で、１１０，５９７の単一粒子から低温ＥＭ構造を再構築可能であり、０．１４３ ＦＳＣ基準を用いて、適用Ｄ３対称で２．８Å、適用Ｃ３対称で２．９Å、そして非対称再構築で３．２Åであり、小規模の局所解像相違があった。ＦＡＳホロ酵素低温ＥＭ構造の品質はΔＴｍａ１７ｐ－ＦＡＳ構造のものに匹敵し、そして等しく信頼性があるモデル構築が可能であった。本発明者らはまた、ＦＡＳホロ酵素の結晶を得ることも可能であり、これは、単純単斜晶系空間群Ｐ２１に属し、単位格子定数はａ＝２３４．９Å、ｂ＝４３０．３Å、ｃ＝４２２．６Å、β＝９７°であり、非対称単位中に２つのＦＡＳホロ酵素を含有し、そしてＸ線を４．６Å解像に回折させた。本発明者らは、Ｃαトレースの信頼性があるモデリングを可能にする、上述のΔＴｍａ１７ｐ－ＦＡＳ結晶構造を用いた分子置換によって、ＦＡＳホロ酵素の結晶構造を解いた。３つの（対称および非対称）低温ＥＭマップすべてに対して精密化したＦＡＳホロ酵素のモデルは、結晶構造に関して０．８Åの全体のｒ．ｍ．ｓ．ｄ．であるが、異なる対称再構築で０．２Å未満のｒ．ｍ．ｓ．ｄ．のモデルを生じた。ΔＴｍａ１７ｐ－ＦＡＳおよびＦＡＳホロ酵素の両方の低温ＥＭおよびＸ線結晶から得られるモデルの間の類似性は、γ－サブユニット結合の構造的影響の、信頼性があり、そして決定的な解釈を可能にする。これらの知見は、低温ＥＭ構造の決定において、結晶の接触および課される（ｉｍｐｏｓｅｄ）対称性からは独立しており、そして構造データのロバストな交差検証を提供する。
ガンマ・サブユニットによる動的ＡＣＰドメインの移動
ΔＴｍａ１７ｐ－ＦＡＳとＦＡＳホロ酵素の低温ＥＭおよび結晶構造両方の構造比較によって、いくつかの相違が明らかになった：１）ＦＡＳホロ酵素構造のβ－サブユニットは、隣接するβ－サブユニットが出会うドーム頂上で、中央３倍対称軸に対して～１５°回転する。これは、ＡＴドメインの内向きのシフト、ＭＰＴドメインの外向きのシフト、および１０ÅのＦＡＳホロ酵素構造の全体の圧縮を生じる。ＦＡＳ β－サブユニットのこの回転は、ＦＡＳホロ酵素の酵素ドメイン内のコンホメーション変化よりも、主に、剛体運動によって駆動されるようである。２）ΔＴｍａ１７ｐ－ＦＡＳ構造において、すべてのＡＣＰドメインはＫＳ部位の近傍に見られ、これは以前、ＦＡＳ結晶構造において報告されたものと同じ位置である（Ｐ． Ｊｏｈａｎｓｓｏｎら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ． Ｓ． Ａ． １０５， １２８０３－１２８０８（２００８））。驚くべきことに、対照的に、ＦＡＳホロ酵素低温ＥＭ構造において、すべてのＡＣＰドメインがＡＴドメイン近傍に見られる。このＡＣＰドメイン位置は、ＦＡＳホロ酵素結晶構造の陽性差密度マップ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｄｅｎｓｉｔｙ ｍａｐ）およびオミットマップ（ｏｍｉｔ ｍａｐ）によって容易に検証される。３）本発明者らは、ＦＡＳホロ酵素低温ＥＭ構造中のＡＣＰドメインの直下にコイルドコイルセグメントとしてモデリング可能なさらなる密度があることを見出し、これはΔＴｍａ１７ｐ－ＦＡＳ低温ＥＭおよびＸ線結晶構造には欠けていた。この観察を、ＦＡＳホロ酵素結晶構造の陽性差密度マップおよびオミットマップで交差検証し、そしてこれはγ－サブユニットに相当するようである。本発明者らは、ＦＡＳホロ酵素の架橋質量分析（ＸＬ－ＭＳ）によって、この仮説を試験した（図４）。ＸＬ－ＭＳは、γ－サブユニットのＮ末端部分とＥＲドメインの相互作用、ＭＰＴドメインに対するγ－サブユニットの中央部分の空間的近接、およびγ－サブユニットのＣ末端部分とＫＲおよびＫＳドメインの会合を明らかにした。ＸＬ－ＭＳ結果、および低温ＥＭマップにおける側鎖密度に対応する構造特徴によって導かれ、本発明者らはＦＡＳと会合するγ－サブユニットの原子モデルを構築可能であった。ＦＡＳホロ酵素内のγ－サブユニットの相互作用の様式をより詳しく検討すると、Ｎ末端部分はＥＲ活性部位を塞ぐ一方、γ－サブユニットのＣ末端１８残基はＫＲドメイン活性部位を占め、両ドメインにおけるＮＡＤＰＨ結合に対する立体競合が示唆された。さらに、γ－サブユニットの２つのα－らせんを連結する１６アミノ酸のループセグメントは、ＦＡＳホロ酵素のＥＭおよび結晶構造マップのどちらにおいてもほとんど解像されていないが、ＭＰＴドメインに隣接する位置を占める可能性が高い。
ガンマ・サブユニットの機能的およびコンホメーション的影響
では、ＦＡＳホロ酵素におけるγ－サブユニットの生化学的機能とは何だろうか。今日までの酵母ＦＡＳの大部分の酵素研究は、γ－サブユニットの非存在下で行われているため、このタンパク質は、酵素活性自体には必要ではない。ＦＡＳホロ酵素内のγ－サブユニットの結合の構造様式は、損なわれていない基質結合を通じたＦＡＳホロ酵素内の酵素活性の部分的阻害を示唆し、そしてしたがって、レダクターゼ活性に最も顕著な影響を有すると予期される。これを試験するため、本発明者らは、定常状態動力学を分析し、そしてすべての基質、特にアセチル－ＣｏＡ、マロニル－ＣｏＡおよびＮＡＤＰＨの多様な濃度に関して、ΔＴｍａ１７ｐ－ＦＡＳの基質代謝回転速度を測定した。この分析によって、アセチル－ＣｏＡおよびマロニル－ＣｏＡの両方に関する飽和動力学が明らかになり、その結合は、γ－サブユニットの飽和量を添加することによって部分的に阻害された。γ－サブユニットの結合は、アセチル－ＣｏＡに関して２倍減少したアフィニティ、そしてマロニル－ＣｏＡの場合は４倍減少したアフィニティを生じた。対照的に、ＮＡＤＰＨの異なる濃度での速度の分析はより複雑であり、そしてＥ（酵素）、Ｓ（基質）、ＥＳ（同族酵素基質複合体）、ＳＥ（非同族または弱いアフィニティの酵素基質複合体）、ＳＥＳ（同時に存在する非同族／弱いアフィニティおよび同族酵素基質複合体）を伴うΔＴｍａ１７ｐ－ＦＡＳの場合の基質依存性活性化モデルを示唆した（図５）。しかし、ＦＡＳホロ酵素は、ＮＡＤＰＨに関する古典的な双曲線性ミカエリス・メンテン依存性を示した。γ－サブユニットの飽和濃度では、ＮＡＤＰＨのＫＭ ａｐｐはΔＴｍａ１７ｐ－ＦＡＳに比較して増加する（図５）。総合すると、本明細書に記載する動力学データおよび構造知見によって、細胞代謝の相違に順応するために、ＮＡＤＰＨ基質依存性のダイナミックレンジが広がるように、ＦＡＳホロ酵素内の酵素活性、特にレダクターゼ活性に、γ－サブユニットが部分的に影響を及ぼすことが示される。これは、細胞が、ＮＡＤＰＨおよびＮＡＤＰ＋の増進された濃度レジームに渡ってＦＡＳ活性を制御することを可能にする。
【0066】
さらに、本明細書記載の構造データは、γ－サブユニットの結合が、ＦＡＳメガ酵素のコンホメーション・ランドスケープに影響を及ぼすことを示す。軸方向に配置されたＡＣＰドメインを伴う、回転し、圧縮されたコンホメーションは、γ－サブユニットの存在下で支持され、一方、赤道面に位置するＡＣＰドメインを伴う非回転コンホメーションは、γ－サブユニットの非存在下で採用される。この仮説に取り組むため、本発明者らは、まず、ΔＴｍａ１７ｐ－ＦＡＳ内へのγ－サブユニットの滴定が、回転し、圧縮されたコンホメーションを採用する単一粒子の分画の増加を引き起こすかどうかを調べた。この目的に向けて、本発明者らは、γ－サブユニットの異なる量で再構成されたＦＡＳホロ酵素のいくつかの低温ＥＭデータセットを収集した。本発明者らは、次いで、各個々のデータセットから３Ｄ構造を精密化し、そして非回転または回転コンホメーションのいずれかの集団に対応する粒子の相対存在量を分析した。定量化によって、再構成に用いたγ－サブユニットの量と回転コンホメーションの明らかな相関が示された。ΔＴｍａ１７ｐ－ＦＡＳ試料において、選択した粒子の２％は回転状態に対応する一方、これはγ－サブユニットの６倍過剰で８８％に、そして１２倍モル過剰で９５％に増加する。
【0067】
定量的方式で、γ－サブユニットの結合によって誘導されるコンホメーション変化を評価するため、本発明者らは、次に、エネルギー・ランドスケープの計算と組み合わせた、以前、本発明者らが確立した３Ｄ分類の低温ＥＭ法を適用した（Ｄ． Ｈａｓｅｌｂａｃｈら， Ｃｅｌｌ． １７２， ４５４－４５８．ｅ１１（２０１８））。この目的のため、本発明者らは、中央ホイールに相当するマスクで、個々のデータセットの３Ｄ構造をまず精密化したところ、非回転および回転構造の両方において、コンホメーションの区別は不能であった。各個々のデータセットにおいて、ドームによって占められるコンホメーション空間に関する洞察を得るため、本発明者らは、次いで、以前得られた中央ホイールのアラインメントパラメータにもっぱら頼り、各６，５００の粒子のバッチにおいて、アラインメントなしに３Ｄ分類を行った。こうして得られた個々の３Ｄクラスを、個々に精密化して、その有効性を確実にし、そして続いて、３Ｄ主成分分析（ＰＣＡ）に供した。この３Ｄ ＰＣＡの第一の固有ベクトルは、ドームの圧縮を記載する一方、第二の固有ベクトルは、ドームの顕著な回転を示す。本発明者らは、各３Ｄクラス中の粒子数の正確な知識を持っているため、本発明者らはＰＣＡの第一および第二の固有ベクトルによって定義される座標系内で、ボルツマン補間（Ｂｏｌｔｚｍａｎｎ ｉｎｔｅｒｐｏｌａｔｉｏｎ）を実行することによって、エネルギー・ランドスケープをマッピング可能である。各個々のデータセットに関するエネルギー・ランドスケープは、γ－サブユニットの結合および後に続くＦＡＳホロ酵素の形成が、回転コンホメーションの採用を生じるという観察を再現した。さらに、エネルギー・ランドスケープは、γ－サブユニットの結合が、非回転コンホメーションへのアクセスを制限するエネルギー障壁の形成を生じることを示す。
【0068】
最初の原理証明実験を行い、γ－サブユニットが実際に、ＦＡＳチャンバー内にタンパク質を導入する足場として用いられうることが明らかに示されている。この実験の論理的根拠は以下のとおりである：γ－サブユニットのコイルドコイルおよびＫＲ結合セグメントの間（残基、１１４～１３２）の柔軟なリンカーセグメントを、小分子蛍光タンパク質ＵｎａＧの単一（サイズ１５ｋＤａ）コピー、または２（サイズ３０ｋＤａ）コピーのいずれかで置換した。生じたＵｎａＧ－γ－サブユニット融合タンパク質を、次いで、Δγ－ＦＡＳと再構成し、そして混合物をスクロース密度勾配上で分画した。ＵＶ照射下で勾配を画像化し、分画し、そして個々の分画をＳＤＳ－ＰＡＧＥに供して、４０Ｓ範囲中で、ＦＡＳと同時沈降するそれぞれのＵｎａＧ－γ－サブユニット融合タンパク質の比率を明らかにした。対照においては、ＦＡＳとともに沈降するタンパク質はなかった。対照的に、単一ＵｎａＧ－γ－サブユニット融合構築物の場合、緑色蛍光の実質的な増加が見られると同時に、ＵｎａＧ－γ－サブユニット融合タンパク質のかなりの比率は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ中、ＦＡＳと同時沈降することが見出されている。二重ＵｎａＧ－γ－サブユニット融合タンパク質の場合、蛍光のある程度の増加を見ることが可能であり、ＦＡＳ対照に比較して増加しているが、単一ＵｎａＧ－γ－サブユニット融合構築物の場合よりも少なかった。二重ＵｎａＧ－γ－サブユニット融合タンパク質Δγ－ＦＡＳ再構成実験のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析によって、ＦＡＳと再構成された二重ＵｎａＧ－γ－サブユニット融合タンパク質の量は、単一ＵｎａＧ－γ－サブユニット融合タンパク質に比較して減少していることが明らかになっている。
【0069】
総合すると、この原理証明実験によって、ＦＡＳドーム内に酵素モジュールを導入する足場としてγ－サブユニットを用いる戦略は、原理上、タンパク質に関して働くことが明らかになっている。
【0070】
この原理証明実験をさらに行った。大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）チオエステラーゼＡ（ＴｅｓＡ）をコードする配列でγ－サブユニットの残基１１４～１３２を置換することにより、ＴｅｓＡ－γ－サブユニット融合物を生成した。チオエステラーゼの機能は、アシルキャリアータンパク質に共有結合している脂質鎖の認識、および触媒加水分解後の遊離脂肪酸（ＦＦＡ）への放出にある。ＦＦＡは、産業的に、ファインケミカルの非常に重要な合成前駆体に相当する。ＴｅｓＡ－γ－サブユニット融合タンパク質構築物を大腸菌において組換え的に産生し、そしてほぼ均一に精製した。ＴｅｓＡ－γ－サブユニット融合タンパク質は、上述の単一ＵｎａＧ－γ－サブユニット融合タンパク質と類似の効率で、Δγ－ＦＡＳと再構成可能であった。活性アッセイは、Δγ－ＦＡＳと再構成された上述のＴｅｓＡ－γ－サブユニット融合タンパク質において、ＴｅｓＡの活性を決定する。
結論
本明細書において、酵母ＦＡＳメガ酵素複合体の新規γ－サブユニットの同定を示し、該サブユニットは、ＦＡＳを精製するために比較的高い塩条件が使用されていたため、これまでに検出を逃れてきた可能性が最も高い。以前はリボソームに会合するとして（Ｔｍａ１７ｐとして）、またはプロテアソーム集合に関与するとして（Ａｄｃ１７ｐとして）のいずれかで特徴づけられてきたγ－サブユニットは、現在、酵母において細胞脂肪酸生合成と関連して確固として提案されうる。γ－サブユニットとＦＡＳの観察される弱い相互作用は、潜在的に、非特異的結合を示唆しうる。しかし、これは以下の実験的証拠から確固として排除されうる：１）低温ＥＭおよびＸ線結晶の両方による構造的解明によって、γ－サブユニットが、ＦＡＳによって採用されるコンホメーション・ランドスケープに直接影響を及ぼし、γ－サブユニットの非存在下では優先的に非回転状態が占め、そしてγ－サブユニットの結合によって回転状態が安定化されることが示される。γ－サブユニットの結合は、ＦＡＳが非回転コンホメーションを達成するためのエネルギー障壁を導入するようである。２）非回転および回転状態をより緊密に調べると、前者は当該技術分野に以前記載されたようなＫＳドメインに隣接した位置を占めるＡＣＰドメインと関連する一方、ＡＴドメインに隣接するＡＣＰ位置は後者の状態の特徴であることが示される。３）回転状態構造の徹底的な研究によって、ＡＴドメインに配置されるＡＣＰドメインの近傍にさらなる密度が同定された。ＸＬ－ＭＳおよびモデル構築を用いて、本発明者らは、γ－サブユニットに対して、このコイルドコイル形状の密度を明確に割り当てることが可能であった。本発明者らはさらに、γ－サブユニットのＮ末端の２４残基が、ＥＲ活性部位を立体的に塞ぐと決定することが可能であり、そしてγ－サブユニットのＣ末端の１８残基が、ＫＲ活性部位を占め、そしてＮＡＤＰＨ結合に関して立体的に競合すると突き止めることが可能であった。４）これらの知見は、ＦＡＳホロ酵素のレダクターゼ活性の調節を示唆し、本発明者らは図５における定常状態酵素動力学によってこれを確認可能であった。ＦＡＳホロ酵素に関して、本発明者らは、γ－サブユニットの存在下で、ＮＡＤＰＨに対する結合アフィニティの１５倍の減少および飽和の提示、ならびに古典的ミカエリス・メンテン動力学を見出した。γ－サブユニットの非存在下では、動力学機構はより複雑であり、そしてＮＡＤＰＨに対するアフィニティはより強い。これらの結果は、γ－サブユニットのさらなる機能が、脂肪酸合成をＮＡＤＰＨの細胞存在量にカップリングさせることでありうることを示す。
結論
本明細書において、酵母ＦＡＳメガ酵素複合体の新規γ－サブユニットの同定を示し、該サブユニットは、ＦＡＳを精製するために比較的高い塩条件が使用されていたため、これまでに検出を逃れてきた可能性が最も高い。以前はリボソームに会合するとして（Ｔｍａ１７ｐとして）、またはプロテアソーム集合に関与するとして（Ａｄｃ１７ｐとして）のいずれかで特徴づけられてきたγ－サブユニットは、現在、酵母において細胞脂肪酸生合成と関連して確固として提案されうる。γ－サブユニットとＦＡＳの観察される弱い相互作用は、潜在的に、非特異的結合を示唆しうる。しかし、これは以下の実験的証拠から確固として排除されうる：１）低温ＥＭおよびＸ線結晶の両方による構造的解明によって、γ－サブユニットが、ＦＡＳによって採用されるコンホメーション・ランドスケープに直接影響を及ぼし、γ－サブユニットの非存在下では優先的に非回転状態が占め、そしてγ－サブユニットの結合によって回転状態が安定化されることが示される。γ－サブユニットの結合は、ＦＡＳが非回転コンホメーションを達成するためのエネルギー障壁を導入するようである。２）非回転および回転状態をより緊密に調べると、前者は当該技術分野に以前記載されたようなＫＳドメインに隣接した位置を占めるＡＣＰドメインと関連する一方、ＡＴドメインに隣接するＡＣＰ位置は後者の状態の特徴であることが示される。３）回転状態構造の徹底的な研究によって、ＡＴドメインに配置されるＡＣＰドメインの近傍にさらなる密度が同定された。ＸＬ－ＭＳおよびモデル構築を用いて、本発明者らは、γ－サブユニットに対して、このコイルドコイル形状の密度を明確に割り当てることが可能であった。本発明者らはさらに、γ－サブユニットのＮ末端の２４残基が、ＥＲ活性部位を立体的に塞ぐと決定することが可能であり、そしてγ－サブユニットのＣ末端の１８残基が、ＫＲ活性部位を占め、そしてＮＡＤＰＨ結合に関して立体的に競合すると突き止めることが可能であった。４）これらの知見は、ＦＡＳホロ酵素のレダクターゼ活性の調節を示唆し、本発明者らは図５における定常状態酵素動力学によってこれを確認可能であった。ＦＡＳホロ酵素に関して、本発明者らは、γ－サブユニットの存在下で、ＮＡＤＰＨに対する結合アフィニティの１５倍の減少および飽和の提示、ならびに古典的ミカエリス・メンテン動力学を見出した。γ－サブユニットの非存在下では、動力学機構はより複雑であり、そしてＮＡＤＰＨに対するアフィニティはより強い。これらの結果は、γ－サブユニットのさらなる機能が、脂肪酸合成をＮＡＤＰＨの細胞存在量にカップリングさせることでありうることを示す。
【0071】
結論として、ＦＡＳホロ酵素のγ－サブユニットの同定から生じる機械的関連に加えて、いくつかの明らかに重要なバイオテクノロジー的な関連が生じる。１）ＦＡＳレダクターゼ活性に関する、γ－サブユニットによって誘発される阻害効果を考慮すると、γ－サブユニット遺伝子の遺伝子欠失を含む酵母株は、酵母による脂肪酸およびバイオ燃料のバイオテクノロジー的産生に有益であろう。２）野生型脂肪酸シンターゼ、例えばデサチュラーゼが存在しない、既知のおよび設計された酵素モジュールを、ＦＡＳ反応チャンバー内に導入するため、天然γ－サブユニット構造足場を利用することが予見されうる。特に、コイルドコイルのＣ末端およびＫＲ結合セグメントの間のリンカーセグメントの置換が、この目的のために運命づけられているようである。３）遺伝子操作、セグメント化およびアフィニティ成熟によって、γ－サブユニットのＥＲおよびＫＲ結合セグメントが汎用脂肪酸シンターゼ阻害剤内に含まれるよう操作し、そして利用することが可能になりうる。こうした化合物は、結核、肥満および癌を含む多様な病気の治療に有益であろう。
方法
ＦＡＳに対するγ－サブユニットの結合アフィニティ
ＦＡＳに対するγ－サブユニットの結合アフィニティを決定するため、製造者の推奨にしたがって、γ－サブユニットをＮＨＳ－ローダミン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で標識した後、脱塩カラムを通過させて、過剰な未反応色素を除去した。異なる濃度のＮＨＳ－ローダミン標識γ－サブユニットを、総反応体積４０μｌで、アッセイ緩衝液中、１５．３８ｐｍｏｌのΔＴｍａ１７ｐ－ＦＡＳに対して滴定した。混合物を３０℃で３０分間インキュベーションした。次いで、各反応１０μｌを１．５％（ｗ／ｖ）アガロースゲル（０．５ＸＴＢＥ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２）上に装填し、そして７５ｍＡ、４℃で２時間泳動した。γ－サブユニット－ＦＡＳ複合体からの蛍光シグナルを、Ａｍｅｒｓｈａｍ ｉｍａｇｅｒ ６００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて画像化し、そしてＩｍａｇｅＪを用いて定量化した（Ｊ． Ｓｃｈｉｎｄｅｌｉｎら， Ｎａｔ． Ｍｅｔｈｏｄｓ． ９， ６７６－６８２（２０１２））。ヒル等式を用いて、γ－サブユニットの解離定数を計算した。
γ－サブユニットの塩濃度依存性解離
０、１００、または２００ｍＭ ＫＣｌのいずれかを補充し、１０ｍＭ ＤＴＴを含有する精製緩衝液中、線形１０～４５％（ｗ／ｖ）スクロース勾配上に、ＦＡＳホロ酵素（０．５２ｍｇ）を装填した。勾配を１２０，０００ｘｇ、４℃で１６時間遠心分離し、そして２００μｌ分画で採取した。次いで、３つの塩濃度での勾配のすべての分画をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した。
ＦＡＳホロ酵素の調製用再構成
ＦＡＳホロ酵素の再構成のため、１００倍過剰のγ－サブユニットを４μＭ ΔＴｍａ１７ｐ－ＦＡＳに添加し、そして３０℃で３０分間インキュベーションした。次いで、タンパク質を、１０ｍＭ ＤＴＴを含有する精製緩衝液中、１０～４５％（ｗ／ｖ）スクロース勾配上に装填し、そして次いで６４，０００ｘｇ、４℃で１６時間遠心分離した。勾配を４００μｌ分画で採取した。次いで、本発明者らはＳＤＳ－ＰＡＧＥを用いて、ＦＡＳホロ酵素を含有する分画を同定した。選択した分画をプールし、そして４０％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ４００の添加によって沈殿させた。遠心分離（３０，０００ｘｇ、３０分）後、上清を除去し、そして沈殿物を、１０％（ｗ／ｖ）スクロース、１０ｍＭ ＤＴＴおよび０．０１％（ｗ／ｖ）ＬＭＮＧを含有する精製緩衝液中に再懸濁して、最終濃度を１０ｍｇ／ｍｌとした。
ＥＭ試料調製
ΔＴｍａ１７ｐ－ＦＡＳおよびＦＡＳホロ酵素複合体の両方を、タンパク質濃度０．５ｍｇ／ｍｌで用いて、ＥＭグリッドを調製した。Ｑｕａｎｔｉｆｏｉｌ（３、５／１）（Ｑｕａｎｔｉｆｏｉｌ、ドイツ・イエナ）グリッドに付着させた連続カーボンフィルムに、粒子を４℃で２分間吸着させた。次いで、グリッドを、Ｖｉｔｒｏｂｏｔ Ｍａｒｋ ＩＶ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、ドイツ）プランジ・フリーザーに移し、ここで、４℃および１００％湿度で８秒間、ブロッティングした後、ガラス化した（ｖｉｔｒｉｆｉｅｄ）。γ－サブユニット滴定実験のため、１．５ｍｇ／ｍｌのΔＴｍａ１７ｐ－ＦＡＳ溶液を用い、そして組換え精製γ－サブユニットを０、２、６、２４、および９６倍過剰で滴定した。タンパク質混合物を３０℃で３０分間インキュベーションし、そして次いで、４℃に維持した。各試料４μｌを、新鮮にグロー放電したＱｕａｎｔｉｆｏｉｌ Ｒ１．２／１．３穴あきカーボングリッド（Ｑｕａｎｔｉｆｏｉｌ Ｍｉｃｒｏ Ｔｏｏｌｓ、ドイツ・イエナ）に適用した後、上述のようにプランジ凍結した。
低温ＥＭデータ収集および画像プロセシング
Ｆａｌｃｏｎ３（統合モード）カメラまたはＫ２サミット（計測モード）カメラ（Ｇａｔａｎ， Ｉｎｃ．）のいずれかを用い、３００ｋＶで操作するＴｉｔａｎ Ｋｒｉｏｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上でデータを獲得した。データ収集およびプロセシング統計を表Ｓ３に要約する。獲得した動画をモーション補正し、そしてすべてのフレームを５ｘ５パッチに分割して、Ｍｏｔｉｏｎ ｃｏｒ２（Ｓ． Ｑ． Ｚｈｅｎｇら， Ｎａｔ． Ｍｅｔｈｏｄｓ． １４， ３３１－３３２（２０１７））を用いて照射量加重した（ｄｏｓｅ ｗｅｉｇｈｔｅｄ）。アラインメントしたフレームを用いて、顕微鏡写真ごとにＧＣＴＦ（Ｋ． Ｚｈａｎｇ， Ｊ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． １９３， １－１２（２０１６））を用いたＣＴＦ推定を行った。Ｇａｕｔｏｍａｔｃｈ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｍｒｃ－ｌｍｂ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｋｚｈａｎｇ／Ｇａｕｔｏｍａｔｃｈ／）を用いて、粒子選択を行った。別に明記しない限り、すべての続く画像プロセシング工程を、Ｒｅｌｉｏｎ ３．０（Ｊ． Ｚｉｖａｎｏｖら， Ｅｌｉｆｅ． ７（２０１８）、ｄｏｉ：１０．７５５４／ｅＬｉｆｅ．４２１６６）を用いて実行した。抽出した粒子を、３ラウンドの参照なしの２Ｄ分類に供して、劣った／空の画像を除去した。残った粒子を、Ｄ３対称性を用い、中央ホイール周囲のマスクで精密化した。ＥＭＤＢ－１６２３に、３０Åまでの低域フィルターをかけ、そしてこれをすべての３Ｄ精密化および３Ｄ分類法の参照として用いた。次いで、２つのドーム周囲のマスクを伴い、精密化粒子をアラインメントなしに分類した。ドームのコンホメーションは、得られた異なるクラス間で一定であったが、分類のために用いた粒子の～５０～６０％からなる１つのクラスのみでよく解像された。最適解像を示す３Ｄクラス由来の粒子を選択し、そして以前行ったように、３Ｄ精密化および分類のもう１回のラウンドに用いた。データをさらに３つの主なクラスに分類した。それぞれのクラスに属する粒子を精密化して、３．５Åまたはそれ未満の解像度で構造を生じた。３つのクラスすべてが匹敵する解像度であったが、局所解像度は、特に分子のドーム領域中では非常に異なっていた。１つのクラスのみが、分子全体で高い解像度詳細を示した。最後に、このクラスに属する粒子を選択し、そしてＣＴＦ精密化（およびＦＡＳホロ酵素データセットに関する粒子洗練）、その後、３Ｄ精密化を実行するために用いた。異なる対称性（Ｃ１、Ｃ３またはＤ３対称性）を適用することによって最終精密化工程を実行して、適用される対称性のために導入されうるいかなる構造的アーチファクトに関してもチェックした。
エネルギー・ランドスケープ
最初の分類工程まで、上述のようにデータをプロセシングした。この分析のため、～１００，０００の粒子のバッチを１５のクラスに分類した。各クラスに属する粒子を選択し、そしていかなるマスクも適用することなく、再び精密化した。各データセット（総数１６５）由来の精密化３Ｄ体積を次いで、以前記載されたようなコンホメーション・ランドスケープ分析に用いた（Ｄ． Ｈａｓｅｌｂａｃｈら， Ｎａｔ． Ｃｏｍｍｕｎ． ８， １－８（２０１７））。分子の中央ホイールを参照ポイントとして、３Ｄ体積をまず、ＵＳＣＦ Ｃｈｉｍｅｒａ中でアラインメントした（Ｅ． Ｆ． Ｐｅｔｔｅｒｓｅｎら， Ｊ． Ｃｏｍｐｕｔ． Ｃｈｅｍ． ２５， １６０５－１６１２（２００４））。さらなる工程をＣＯＷソフトウェアパッケージソフト（ｗｗｗ．ｃｏｗ－ｅｍ．ｄｅ）中で行った。３Ｄ体積を標準化し、そして２０Åにフィルタリングした。次いで、本発明者らは３Ｄ主成分分析（ＰＣＡ）を実行して、異なる試料間のモーションの主な様式を得た。データにおける分散に相当する、生じた固有ベクトルを、有意性減少に基づいてソーティングし、そして次いで、以下の等式
方法
ＦＡＳに対するγ－サブユニットの結合アフィニティ
ＦＡＳに対するγ－サブユニットの結合アフィニティを決定するため、製造者の推奨にしたがって、γ－サブユニットをＮＨＳ－ローダミン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で標識した後、脱塩カラムを通過させて、過剰な未反応色素を除去した。異なる濃度のＮＨＳ－ローダミン標識γ－サブユニットを、総反応体積４０μｌで、アッセイ緩衝液中、１５．３８ｐｍｏｌのΔＴｍａ１７ｐ－ＦＡＳに対して滴定した。混合物を３０℃で３０分間インキュベーションした。次いで、各反応１０μｌを１．５％（ｗ／ｖ）アガロースゲル（０．５ＸＴＢＥ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２）上に装填し、そして７５ｍＡ、４℃で２時間泳動した。γ－サブユニット－ＦＡＳ複合体からの蛍光シグナルを、Ａｍｅｒｓｈａｍ ｉｍａｇｅｒ ６００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて画像化し、そしてＩｍａｇｅＪを用いて定量化した（Ｊ． Ｓｃｈｉｎｄｅｌｉｎら， Ｎａｔ． Ｍｅｔｈｏｄｓ． ９， ６７６－６８２（２０１２））。ヒル等式を用いて、γ－サブユニットの解離定数を計算した。
γ－サブユニットの塩濃度依存性解離
０、１００、または２００ｍＭ ＫＣｌのいずれかを補充し、１０ｍＭ ＤＴＴを含有する精製緩衝液中、線形１０～４５％（ｗ／ｖ）スクロース勾配上に、ＦＡＳホロ酵素（０．５２ｍｇ）を装填した。勾配を１２０，０００ｘｇ、４℃で１６時間遠心分離し、そして２００μｌ分画で採取した。次いで、３つの塩濃度での勾配のすべての分画をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した。
ＦＡＳホロ酵素の調製用再構成
ＦＡＳホロ酵素の再構成のため、１００倍過剰のγ－サブユニットを４μＭ ΔＴｍａ１７ｐ－ＦＡＳに添加し、そして３０℃で３０分間インキュベーションした。次いで、タンパク質を、１０ｍＭ ＤＴＴを含有する精製緩衝液中、１０～４５％（ｗ／ｖ）スクロース勾配上に装填し、そして次いで６４，０００ｘｇ、４℃で１６時間遠心分離した。勾配を４００μｌ分画で採取した。次いで、本発明者らはＳＤＳ－ＰＡＧＥを用いて、ＦＡＳホロ酵素を含有する分画を同定した。選択した分画をプールし、そして４０％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ４００の添加によって沈殿させた。遠心分離（３０，０００ｘｇ、３０分）後、上清を除去し、そして沈殿物を、１０％（ｗ／ｖ）スクロース、１０ｍＭ ＤＴＴおよび０．０１％（ｗ／ｖ）ＬＭＮＧを含有する精製緩衝液中に再懸濁して、最終濃度を１０ｍｇ／ｍｌとした。
ＥＭ試料調製
ΔＴｍａ１７ｐ－ＦＡＳおよびＦＡＳホロ酵素複合体の両方を、タンパク質濃度０．５ｍｇ／ｍｌで用いて、ＥＭグリッドを調製した。Ｑｕａｎｔｉｆｏｉｌ（３、５／１）（Ｑｕａｎｔｉｆｏｉｌ、ドイツ・イエナ）グリッドに付着させた連続カーボンフィルムに、粒子を４℃で２分間吸着させた。次いで、グリッドを、Ｖｉｔｒｏｂｏｔ Ｍａｒｋ ＩＶ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、ドイツ）プランジ・フリーザーに移し、ここで、４℃および１００％湿度で８秒間、ブロッティングした後、ガラス化した（ｖｉｔｒｉｆｉｅｄ）。γ－サブユニット滴定実験のため、１．５ｍｇ／ｍｌのΔＴｍａ１７ｐ－ＦＡＳ溶液を用い、そして組換え精製γ－サブユニットを０、２、６、２４、および９６倍過剰で滴定した。タンパク質混合物を３０℃で３０分間インキュベーションし、そして次いで、４℃に維持した。各試料４μｌを、新鮮にグロー放電したＱｕａｎｔｉｆｏｉｌ Ｒ１．２／１．３穴あきカーボングリッド（Ｑｕａｎｔｉｆｏｉｌ Ｍｉｃｒｏ Ｔｏｏｌｓ、ドイツ・イエナ）に適用した後、上述のようにプランジ凍結した。
低温ＥＭデータ収集および画像プロセシング
Ｆａｌｃｏｎ３（統合モード）カメラまたはＫ２サミット（計測モード）カメラ（Ｇａｔａｎ， Ｉｎｃ．）のいずれかを用い、３００ｋＶで操作するＴｉｔａｎ Ｋｒｉｏｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上でデータを獲得した。データ収集およびプロセシング統計を表Ｓ３に要約する。獲得した動画をモーション補正し、そしてすべてのフレームを５ｘ５パッチに分割して、Ｍｏｔｉｏｎ ｃｏｒ２（Ｓ． Ｑ． Ｚｈｅｎｇら， Ｎａｔ． Ｍｅｔｈｏｄｓ． １４， ３３１－３３２（２０１７））を用いて照射量加重した（ｄｏｓｅ ｗｅｉｇｈｔｅｄ）。アラインメントしたフレームを用いて、顕微鏡写真ごとにＧＣＴＦ（Ｋ． Ｚｈａｎｇ， Ｊ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． １９３， １－１２（２０１６））を用いたＣＴＦ推定を行った。Ｇａｕｔｏｍａｔｃｈ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｍｒｃ－ｌｍｂ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｋｚｈａｎｇ／Ｇａｕｔｏｍａｔｃｈ／）を用いて、粒子選択を行った。別に明記しない限り、すべての続く画像プロセシング工程を、Ｒｅｌｉｏｎ ３．０（Ｊ． Ｚｉｖａｎｏｖら， Ｅｌｉｆｅ． ７（２０１８）、ｄｏｉ：１０．７５５４／ｅＬｉｆｅ．４２１６６）を用いて実行した。抽出した粒子を、３ラウンドの参照なしの２Ｄ分類に供して、劣った／空の画像を除去した。残った粒子を、Ｄ３対称性を用い、中央ホイール周囲のマスクで精密化した。ＥＭＤＢ－１６２３に、３０Åまでの低域フィルターをかけ、そしてこれをすべての３Ｄ精密化および３Ｄ分類法の参照として用いた。次いで、２つのドーム周囲のマスクを伴い、精密化粒子をアラインメントなしに分類した。ドームのコンホメーションは、得られた異なるクラス間で一定であったが、分類のために用いた粒子の～５０～６０％からなる１つのクラスのみでよく解像された。最適解像を示す３Ｄクラス由来の粒子を選択し、そして以前行ったように、３Ｄ精密化および分類のもう１回のラウンドに用いた。データをさらに３つの主なクラスに分類した。それぞれのクラスに属する粒子を精密化して、３．５Åまたはそれ未満の解像度で構造を生じた。３つのクラスすべてが匹敵する解像度であったが、局所解像度は、特に分子のドーム領域中では非常に異なっていた。１つのクラスのみが、分子全体で高い解像度詳細を示した。最後に、このクラスに属する粒子を選択し、そしてＣＴＦ精密化（およびＦＡＳホロ酵素データセットに関する粒子洗練）、その後、３Ｄ精密化を実行するために用いた。異なる対称性（Ｃ１、Ｃ３またはＤ３対称性）を適用することによって最終精密化工程を実行して、適用される対称性のために導入されうるいかなる構造的アーチファクトに関してもチェックした。
エネルギー・ランドスケープ
最初の分類工程まで、上述のようにデータをプロセシングした。この分析のため、～１００，０００の粒子のバッチを１５のクラスに分類した。各クラスに属する粒子を選択し、そしていかなるマスクも適用することなく、再び精密化した。各データセット（総数１６５）由来の精密化３Ｄ体積を次いで、以前記載されたようなコンホメーション・ランドスケープ分析に用いた（Ｄ． Ｈａｓｅｌｂａｃｈら， Ｎａｔ． Ｃｏｍｍｕｎ． ８， １－８（２０１７））。分子の中央ホイールを参照ポイントとして、３Ｄ体積をまず、ＵＳＣＦ Ｃｈｉｍｅｒａ中でアラインメントした（Ｅ． Ｆ． Ｐｅｔｔｅｒｓｅｎら， Ｊ． Ｃｏｍｐｕｔ． Ｃｈｅｍ． ２５， １６０５－１６１２（２００４））。さらなる工程をＣＯＷソフトウェアパッケージソフト（ｗｗｗ．ｃｏｗ－ｅｍ．ｄｅ）中で行った。３Ｄ体積を標準化し、そして２０Åにフィルタリングした。次いで、本発明者らは３Ｄ主成分分析（ＰＣＡ）を実行して、異なる試料間のモーションの主な様式を得た。データにおける分散に相当する、生じた固有ベクトルを、有意性減少に基づいてソーティングし、そして次いで、以下の等式
【0072】
【化1】
【0073】
式中、すべての体積
【0074】
【化2】
【0075】
は平均体積
【0076】
【化3】
【0077】
、および線形係数ａｉ，ｊを乗じた固有ベクトルｅｉの線形結合として記載される
を用いて、各３Ｄ体積を記載するために用いた。コンホメーション・ランドスケープを計算するため、それぞれ、ＦＡＳドームの圧縮および回転のモーションを示す、第一（ｅ１）および第二（ｅ２）の固有ベクトルを選択した。各クラスに属する粒子数を用いて、ボルツマン因子（κＢＴ）の倍数として自由エネルギーを計算した。
を用いて、各３Ｄ体積を記載するために用いた。コンホメーション・ランドスケープを計算するため、それぞれ、ＦＡＳドームの圧縮および回転のモーションを示す、第一（ｅ１）および第二（ｅ２）の固有ベクトルを選択した。各クラスに属する粒子数を用いて、ボルツマン因子（κＢＴ）の倍数として自由エネルギーを計算した。
【0078】
【化4】
【0079】
式中、Ｔは絶対温度であり、κＢはボルツマン定数であり、ｐｉは状態ｉの粒子数であり、そしてｐ０は最も多い状態の粒子の数である。インプット３Ｄ体積に寄与する等式（１）にしたがって計算されるｅ１およびｅ２の一次係数は、ランドスケープのｘおよびｙ座標に相当する一方、ｚ軸は各クラスの自由エネルギーに相当する。
結晶化および安定化
Ｃｒｙｓｔａｌｇｅｎ懸滴拡散プレート（Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ドイツ）中、１μｌタンパク質＋１μｌ結晶化緩衝液Ａを、結晶化緩衝液Ａの７５０μｌのリザーバー上で混合することによって、１０％スクロース（ｗ／ｖ）、１０ｍＭ ＤＴＴおよび０．０１％（ｗ／ｖ）ＬＭＮＧを含有する精製緩衝液中のΔＴｍａ１７ｐ－ＦＡＳを７ｍｇ／ｍｌで結晶化した。ＦＡＳホロ酵素に関しては、７倍モル過剰のγ－サブユニット（ΔＴｍａ１７ｐ－ＦＡＳに用いた緩衝液中）をΔＴｍａ１７ｐ－ＦＡＳの７ｍｇ／ｍｌタンパク質溶液に添加し、そして３０℃で３０分間インキュベーションした。次いで、Ｃｈｒｙｓｃｈｅｍシッティングドロップ蒸気拡散プレート（Ｈａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、米国アリソヴィエホ）中、１μｌタンパク質＋１μｌ結晶化緩衝液Ｂを、結晶化緩衝液Ｂの５００μｌのリザーバー上で混合することによって、再構成された複合体を結晶化した。結晶は成長するために１８℃で３～７日間を要し、そして通常、サイズはおよそ１５０ｘ２００ｘ２００μｍであった。
結晶化および安定化
Ｃｒｙｓｔａｌｇｅｎ懸滴拡散プレート（Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ドイツ）中、１μｌタンパク質＋１μｌ結晶化緩衝液Ａを、結晶化緩衝液Ａの７５０μｌのリザーバー上で混合することによって、１０％スクロース（ｗ／ｖ）、１０ｍＭ ＤＴＴおよび０．０１％（ｗ／ｖ）ＬＭＮＧを含有する精製緩衝液中のΔＴｍａ１７ｐ－ＦＡＳを７ｍｇ／ｍｌで結晶化した。ＦＡＳホロ酵素に関しては、７倍モル過剰のγ－サブユニット（ΔＴｍａ１７ｐ－ＦＡＳに用いた緩衝液中）をΔＴｍａ１７ｐ－ＦＡＳの７ｍｇ／ｍｌタンパク質溶液に添加し、そして３０℃で３０分間インキュベーションした。次いで、Ｃｈｒｙｓｃｈｅｍシッティングドロップ蒸気拡散プレート（Ｈａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、米国アリソヴィエホ）中、１μｌタンパク質＋１μｌ結晶化緩衝液Ｂを、結晶化緩衝液Ｂの５００μｌのリザーバー上で混合することによって、再構成された複合体を結晶化した。結晶は成長するために１８℃で３～７日間を要し、そして通常、サイズはおよそ１５０ｘ２００ｘ２００μｍであった。
【0080】
Ｒｕｍｅｄ（登録商標）Ｅ１００インキュベーター（Ｒｕｂａｒｔｈ Ａｐｐａｒａｔｅ ＧｍｂＨ、ドイツ）を用いて、４８時間に渡って、線形方式で温度を次第に下げることによって、得られた結晶を４℃に移した。以下のように、安定化および脱水法を行った：１）ドロップを開封し、そして２μｌのリザーバー溶液をドロップに添加した。次いで、２μｌの結晶安定化緩衝液（ΔＴｍａ１７ｐ－ＦＡＳに関してはＡ、ＦＡＳホロ酵素に関してはＢ）を添加した。２）５％（ｖ／ｖ）エチレングリコールを含有する結晶安定化緩衝液２μｌを添加した後、ドロップから溶液２μｌを除去した。次いで、５％（ｖ／ｖ）エチレングリコールを含有する結晶安定化緩衝液２μｌを再びドロップに添加した。１０％そして次いで２０％（ｖ／ｖ）エチレングリコールを含有する結晶安定化緩衝液でこの方法を反復した。３）リザーバー溶液を、２５％（ｖ／ｖ）エチレングリコールを含有する結晶安定化緩衝液に対して交換し、そしてドロップを再密封した。次いで、１６時間、過剰な蒸気拡散によって、結晶を平衡化させた。
Ｘ線回折データ収集
磁気ピン上にマウントしたＳｐｉｎｅ Ｌｉｔｈｏｌｏｏｐｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎｓ、英国サフォーク、またはＪｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ドイツ・イエナ）中に結晶を採取し、そして液体窒素中でプランジ冷却することによってガラス化した。ＭＤ３垂直スピンドル回折計（ＥＭＢＬおよびＡｒｉｎａｘ、フランス・モアラン）およびＥＩＧＥＲ １６Ｍ検出装置（Ｄｅｃｔｒｉｓ、スイス・バーデン）を用いて、ＰＥＴＲＡ ＩＩＩストレージリング（ＤＥＳＹ、ドイツ・ハンブルグ）で、ＥＭＢＬビームラインＰ１４上でデータを収集した。白色ビーム回折レンズ・トランスフォーケーター（ｔｒａｎｓｆｏｃａｔｏｒ）およびスリットを用いて、結晶寸法にマッチする均質なＸ線ビームを得た（Ｊ． Ｓｃｈｒａｄｅｒら， Ｓｃｉｅｎｃｅ． ３５３， ５９４－８（２０１６））。ＸＤＳプログラムパッケージで、回折データをスケーリングし、そして統合した（Ｗ． Ｋａｂｓｃｈ， ＩＵＣｒ， ＸＤＳ． Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ． Ｓｅｃｔ． Ｄ Ｂｉｏｌ． Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ． ６６， １２５－１３２（２０１０））。
Ｘ線構造決定
サッカロミセス・セレビシエＦＡＳ構造（ＰＤＢ ＩＤ：２ＵＶ８）を用いて、ＭＯＬＲＥＰ（Ａ． Ｖａｇｉｎ， Ａ． Ｔｅｐｌｙａｋｏｖ， Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ． Ｓｅｃｔ． Ｄ Ｂｉｏｌ． Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ． ６６， ２２－２５（２０１０））で分子置換を実行することによって、ΔＴｍａ１７ｐ－ＦＡＳの初期相を決定した。モデルを構築し、そしてＣｏｏｔ（Ｐ． Ｅｍｓｌｅｙ， Ｋ． Ｃｏｗｔａｎ Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ． Ｓｅｃｔ． Ｄ Ｂｉｏｌ． Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ． ６０， ２１２６－２１３２（２００４））中で反復手動モデル構築を、そしてＲｅｆｍａｃ５（Ｇ． Ｎ． Ｍｕｒｓｈｕｄｏｖら， Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ． Ｄ． Ｂｉｏｌ． Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ． ６７， ３５５－６７（２０１１））中で精密化を数ラウンド行って最適化した。最後に、ＴＬＳ精密化を行い、ここで、個々の酵素ドメインによって、各ＴＬＳドメインを定義した。得られた構造は、１９．４％／２１．４％（Ｒ／Ｒｆｒｅｅ）で優れた立体化学を示す。ＳＴＡＲＡＮＩＳＯサーバーでの回折データの分析は、穏やかな異方性を示した。これは、異方性スケーリングおよびデータの切り捨てがモデルのより優れた精密化を可能にするはずであることを示唆した。これは実際に当てはまり、そしてより低い平均のＢ因子および１９．２％／２１．１％（Ｒ／Ｒｆｒｅｅ）の最終モデルを生じた。
Ｘ線回折データ収集
磁気ピン上にマウントしたＳｐｉｎｅ Ｌｉｔｈｏｌｏｏｐｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎｓ、英国サフォーク、またはＪｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ドイツ・イエナ）中に結晶を採取し、そして液体窒素中でプランジ冷却することによってガラス化した。ＭＤ３垂直スピンドル回折計（ＥＭＢＬおよびＡｒｉｎａｘ、フランス・モアラン）およびＥＩＧＥＲ １６Ｍ検出装置（Ｄｅｃｔｒｉｓ、スイス・バーデン）を用いて、ＰＥＴＲＡ ＩＩＩストレージリング（ＤＥＳＹ、ドイツ・ハンブルグ）で、ＥＭＢＬビームラインＰ１４上でデータを収集した。白色ビーム回折レンズ・トランスフォーケーター（ｔｒａｎｓｆｏｃａｔｏｒ）およびスリットを用いて、結晶寸法にマッチする均質なＸ線ビームを得た（Ｊ． Ｓｃｈｒａｄｅｒら， Ｓｃｉｅｎｃｅ． ３５３， ５９４－８（２０１６））。ＸＤＳプログラムパッケージで、回折データをスケーリングし、そして統合した（Ｗ． Ｋａｂｓｃｈ， ＩＵＣｒ， ＸＤＳ． Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ． Ｓｅｃｔ． Ｄ Ｂｉｏｌ． Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ． ６６， １２５－１３２（２０１０））。
Ｘ線構造決定
サッカロミセス・セレビシエＦＡＳ構造（ＰＤＢ ＩＤ：２ＵＶ８）を用いて、ＭＯＬＲＥＰ（Ａ． Ｖａｇｉｎ， Ａ． Ｔｅｐｌｙａｋｏｖ， Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ． Ｓｅｃｔ． Ｄ Ｂｉｏｌ． Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ． ６６， ２２－２５（２０１０））で分子置換を実行することによって、ΔＴｍａ１７ｐ－ＦＡＳの初期相を決定した。モデルを構築し、そしてＣｏｏｔ（Ｐ． Ｅｍｓｌｅｙ， Ｋ． Ｃｏｗｔａｎ Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ． Ｓｅｃｔ． Ｄ Ｂｉｏｌ． Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ． ６０， ２１２６－２１３２（２００４））中で反復手動モデル構築を、そしてＲｅｆｍａｃ５（Ｇ． Ｎ． Ｍｕｒｓｈｕｄｏｖら， Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ． Ｄ． Ｂｉｏｌ． Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ． ６７， ３５５－６７（２０１１））中で精密化を数ラウンド行って最適化した。最後に、ＴＬＳ精密化を行い、ここで、個々の酵素ドメインによって、各ＴＬＳドメインを定義した。得られた構造は、１９．４％／２１．４％（Ｒ／Ｒｆｒｅｅ）で優れた立体化学を示す。ＳＴＡＲＡＮＩＳＯサーバーでの回折データの分析は、穏やかな異方性を示した。これは、異方性スケーリングおよびデータの切り捨てがモデルのより優れた精密化を可能にするはずであることを示唆した。これは実際に当てはまり、そしてより低い平均のＢ因子および１９．２％／２１．１％（Ｒ／Ｒｆｒｅｅ）の最終モデルを生じた。
【0081】
精密化ΔＴｍａ１７ｐ－ＦＡＳ結晶構造を用いて、ＦＡＳホロ酵素回折データに関するＭＯＬＲＥＰでの分子置換によって、初期相を決定した。得られた密度マップは、ΔＴｍａ１７ｐ－ＦＡＳ構造よりも、ＦＡＳホロ酵素モデルにより優れて相関することが見出された（低温ＥＭで決定した場合）。したがって、本発明者らは、Ｘ線データの初期精密化において、ＦＡＳホロ酵素低温ＥＭモデル由来のα－およびβ－サブユニットのモデルを用いた。特に、精密化前に、ＡＣＰドメインおよびγ－サブユニットを構造から除去して、相バイアスが導入されるのを回避した。Ｒｅｆｍａｃ５における数ラウンドの剛体精密化後、それぞれ、ＡＴおよびＥＲドメインに隣接するＡＣＰドメインおよびγ－サブユニットに相当する差密度は容易に同定可能であった。次いで、欠けているドメインをそれぞれの密度内に配置した後、ＣｏｏｔおよびＲｅｆｍａｃ５を用いて、さらなる精密化ラウンドを行った。ＦＡＳホロ酵素構造の解像のため、本発明者らはポリ－Ａｌａトレースのみとして、構造をデポジットすることを選択した。
ＥＭモデル構築
結晶学ΔＴｍａ１７ｐ－ＦＡＳモデルを、低温ＥＭによって決定されたΔＴｍａ１７ｐ－ＦＡＳおよびＦＡＳホロ酵素構造の両方の最初のモデルとして用いた。これを、ＵＣＳＦ Ｃｈｉｍｅｒａを用いて、剛体としてＥＭ密度内にドッキングさせた。上記を参照されたい。次いで、Ｒｅｆｍａｃ５中で、さらなるラウンドの剛体精密化を行った。次いで、モデルは、Ｃｏｏｔにおける手動モデリングおよびＲｅｆｍａｃ５における精密化を数ラウンド経た。Ｒｏｂｅｔｔａ（Ｄ． Ｅ． Ｋｉｍら， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３２， Ｗ５２６－３１（２００４））予測サーバーを用いて、配列相同性に基づいて、γ－サブユニットのいくつかのモデルを生成した。これらのすべてを、ＵＣＳＦ Ｃｈｉｍｅｒａを用い、ＦＡＳホロ酵素中、「追加密度」内にドッキングした。次いで、ベストフィットを含むモデルを、架橋データならびに可視である側鎖密度に基づいて、密度内に手動モデリングした。確信を持ってはモデリング不能である非構造化領域（６０～７６、１１４～１３２）がこのタンパク質には２つあった。
ＥＭモデル構築
結晶学ΔＴｍａ１７ｐ－ＦＡＳモデルを、低温ＥＭによって決定されたΔＴｍａ１７ｐ－ＦＡＳおよびＦＡＳホロ酵素構造の両方の最初のモデルとして用いた。これを、ＵＣＳＦ Ｃｈｉｍｅｒａを用いて、剛体としてＥＭ密度内にドッキングさせた。上記を参照されたい。次いで、Ｒｅｆｍａｃ５中で、さらなるラウンドの剛体精密化を行った。次いで、モデルは、Ｃｏｏｔにおける手動モデリングおよびＲｅｆｍａｃ５における精密化を数ラウンド経た。Ｒｏｂｅｔｔａ（Ｄ． Ｅ． Ｋｉｍら， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３２， Ｗ５２６－３１（２００４））予測サーバーを用いて、配列相同性に基づいて、γ－サブユニットのいくつかのモデルを生成した。これらのすべてを、ＵＣＳＦ Ｃｈｉｍｅｒａを用い、ＦＡＳホロ酵素中、「追加密度」内にドッキングした。次いで、ベストフィットを含むモデルを、架橋データならびに可視である側鎖密度に基づいて、密度内に手動モデリングした。確信を持ってはモデリング不能である非構造化領域（６０～７６、１１４～１３２）がこのタンパク質には２つあった。
【0082】
モデルの最終精密化および検証のため、本発明者らは、最高の解像度を有するため、Ｄ３対称性を用いて再構築されたマップを用いた。精密化モデルおよびマップの間のフーリエシェル相関（ＦＳＣ）を計算した（ＦＳＣｓｕｍ）。また、第一の非フィルターハーフマップを用いて、モデルを精密化した。次いでこのモデルを、第一のハーフマップ（ＦＳＣｗｏｒｋ）ならびに第二のハーフマップ（ＦＳＣｆｒｅｅ）に比較して、過剰適合の徴候をチェックした。Ｐｙｍｏｌ（Ｌ． Ｓｃｈｒоｅｄｉｎｇｅｒ、バージョン１．８”（２０１５））、ＣｈｉｍｅｒａおよびＣｈｉｍｅｒａＸ（Ｔ． Ｄ． Ｇｏｄｄａｒｄら， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ． ２７， １４－２５（２０１８））を用いて、すべての図を作成した。
材料
標準的な化学物質をＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（ドイツ・タウフキルヘン）から得た。界面活性剤をＡｎａｔｒａｃｅ（米国モーミー）から得て、結晶化プレートをＨａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（米国アリソヴィエホ）およびＪｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（ドイツ・イエナ）から得て、ＬｉｔｈｏｌｏｏｐｓをＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎｓ（英国サフォーク）およびＪｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（ドイツ・イエナ）から得た。Ｒｕｂａｒｔｈ Ａｐｐａｒａｔｅ ＧｍｂＨ（ドイツ・ハノーバー）のＲｕｍｅｄ（登録商標）Ｅ１００インキュベーターを用いて、結晶化プレートを４℃に移した。ＥＭグリッドはＱｕａｎｔｉｆｏｉｌ（ドイツ・イエナ）のものであった。Ｓ．セレビシエ細胞を、Ｉｎｆｏｒｓ ＧｍｂＨ（ドイツ・デリッチ）の２５０Ｌ発酵装置中で増殖させ、酵母細胞をＲｅｔｓｃｈ（ドイツ・ハーン）のＺＭ２００ミル中ですりつぶし、Ａｖｅｓｔｉｎ（ドイツ・マンハイム）のＥｍｕｌｓｉｆｌｅｘ Ｃ３流動化装置（ｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）を用いて大腸菌細胞を破壊し、そしてＡｍｅｒｓｈａｍ ｉｍａｇｅｒ ６００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ドイツ・ミュンヘン）を用いて、非変性ゲルからの蛍光を測定した。
方法
酵母培養
標準プロトコル（２７）にしたがって、すべての酵母操作を行った。サッカロミセス・セレビシエ株ＢＪ２１６８（ＭＡＴａ ｐｒｃ１－４０７ ｐｒｂ１－１１２２ ｐｅｐ４－３ ｌｅｕ２ ｔｒｐ１ ｕｒａ３－５２ ｇａｌ２）およびｔｍａ１７Δ ＢＪ２１６８（ＭＡＴａ ｐｒｃ１－４０７ ｐｒｂ１－１１２２ ｐｅｐ４－３ ｌｅｕ２ ｔｒｐ１ ｕｒａ３－５２ ｇａｌ２ ｔｍａ１７：：ｋａｎＭＸ）を本研究に用いた。Ｉｎｆｏｒｓ ２５０リットル発酵装置中、ＹＰＤ培地中で細胞を増殖させ、そして９～１０のＯＤ６００の後期対数期に採取した。続いて、細胞を冷ｄｄＨ２Ｏで洗浄し、そして次いで、細胞１グラム当たり２ｍｌの緩衝液を添加するように、２０％（ｗ／ｖ）スクロースを含有する２Ｘ精製緩衝液中に再懸濁した。次いで、細胞をビーズとして、液体窒素中でフラッシュ凍結し、そしてさらなる使用まで、－８０℃で保存した。
酵母ＦＡＳの精製
ヒト２０Ｓおよび２６Ｓプロテアソームの精製のために以前開発されたプロトコルから、精製戦略を適応させた（Ｄ． Ｈａｓｅｌｂａｃｈら， Ｎａｔ． Ｃｏｍｍｕｎ． ８， １－８（２０１７））。本発明者らは７００ｇの凍結細胞ビーズ（酵母の２３３ｇ湿細胞重量に対応する）で開始して、Ｒｅｔｓｃｈ ＺＭ２００ミルを用いて、これを液体窒素中で細かい粉末になるまですりつぶした。すりつぶした粉末を３７℃の水槽中で融解し、１０ｘストックから０．３３ｘ濃度まで精製緩衝液を補充し、その後、スクロース粉末を２０％（ｗ／ｖ）まで、塩化ベンズアミジンを１０ｍＭまで、そしてＰＭＳＦを１ｍＭまで（プロパノール中の１００ｍＭストック溶液から）添加した。抽出物を磁気スターラー上、２５℃で３０分間インキュベーションした後、４℃、３０，０００ｘｇで３０分間遠心分離した。遠心分離後、各３層のチーズクロスおよびミラクロス（ｍｉｒａｃｌｏｔｈ）を通じて上清をろ過してＳ３０酵母細胞抽出物を得た。これに対して、オクチルグルコースネオペンチルグリコール（ＯＧＮＧ）（１０％（ｗ／ｖ）ストックから）を最終濃度０．２％（ｖ／ｖ）まで添加して、そして抽出物を３０℃で３０分間インキュベーションした後、１００，０００ｘｇ、４℃で１時間遠心分離した。上清を再び、各３層のチーズクロスおよびミラクロスを通じてろ過した。こうして清澄化したＳ１００抽出物をポリエチレングリコール（ＰｏｌｙＥｔｈｙｌｅｎｅＧｌｙｃｏｌ）４００（ＰＥＧ；数字はＰＥＧポリマーの平均分子量を示す）で示差的沈殿に供した。ＰＥＧ４００を２０％（ｖ／ｖ）の濃度で酵母Ｓ１００抽出物に添加しながら１８℃で攪拌し、そして３０分間インキュベーションした。沈殿したタンパク質を３０，０００ｘｇ、４℃で３０分間遠心分離することによって除去した。次いで、上述のように、ＰＥＧ４００の濃度を３０％（ｖ／ｖ）に上昇させることによって、上清を沈殿させた。ＦＡＳを含有するこの工程の沈殿物を、３０，０００ｘｇ、４℃で３０分間遠心分離することによって回収し、そして２％（ｗ／ｖ）スクロース、１０ｍＭ ＤＴＴおよび０．０１％（ｗ／ｖ）ラウリルマルトースネオペンチルグリコール（ＬＭＮＧ）を含有する精製緩衝液中に、軌道振盪装置中、１８℃で再懸濁した。再懸濁された物質を、１０ｍＭ ＤＴＴを含有する精製緩衝液中、１０～４５％（ｗ／ｖ）線形スクロース勾配上に装填し、１００，０００ｘｇ、４℃で１６時間遠心分離した。勾配を１ｍｌ分画で採取した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥを利用して、ＦＡＳを含有する分画を同定した。選択した分画をプールし、そして４０％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ４００を添加することによって沈殿させた。遠心分離（３０，０００ｘｇ、３０分間）後、上清を除去し、そして沈殿物を、２％（ｗ／ｖ）スクロース、１０ｍＭ ＤＴＴおよび０．０１％（ｗ／ｖ）ＬＭＮＧを含有する精製緩衝液中に再懸濁した。再懸濁された物質を、１０ｍＭ ＤＴＴを含有する精製緩衝液中、線形１０～４５％（ｗ／ｖ）スクロース勾配上に装填し、そして７９，０００ｘｇ、４℃で１６時間遠心分離した。ＦＡＳを含有する分画をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって同定し、プールし、そして５０μＭマロニルＣｏＡおよび１００μＭ ＮＡＤＰＨの存在下、１８℃で３０分間サイクリングした。タンパク質を沈殿させ、そして４０％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ４００の添加によって濃縮し、そして２％（ｗ／ｖ）スクロース、１０ｍＭ ＤＴＴおよび０．０１％（ｗ／ｖ）ＬＭＮＧを含有する精製緩衝液中に再懸濁した。別のラウンドの、１０ｍＭ ＤＴＴを含有する精製緩衝液中、線形１０～４５％（ｗ／ｖ）スクロース勾配を行い、６０，０００ｘｇ、４℃で１６時間遠心分離し、そして続いて４０％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ４００でＦＡＳ分画を再沈殿させることが必要であり、１０％スクロース（ｗ／ｖ）、１０ｍＭ ＤＴＴおよび０．０１％（ｗ／ｖ）ＬＭＮＧを含有する精製緩衝液中に、～１５ｍｇ／ｍｌの最終精製タンパク質調製物を得た。ＢＳＡ標準を用いたブラッドフォードアッセイ（ＢｉｏＲａｄ、ドイツ・ミュンヘン）によって、タンパク質濃度を決定した。この方法は、再現性を伴って、１５～２０ｍｇの精製酵母ＦＡＳの収量を生じた。
γ－サブユニットの発現および精製
γ－サブユニットを、ｐＥＴ１５１／Ｄ－ＴＯＰＯ（登録商標）プラスミド（Ｇｅｎｅａｒｔ、レーゲンスブルク）内に合成遺伝子としてクローニングし、そしてＢＬ２１ Ｓｔａｒ（ＤＥ３）コンピテント細胞において、Ｎ末端Ｈｉｓ６－ＴＥＶタグとともに発現させた。０．５のＯＤ６００に到達するまで、１８０ｒｐｍで振盪しながら、形質転換細胞を３７℃で増殖させ、次いで、温度を１８℃に下げ、そして温度低下の１時間後、０．５ｍＭ ＩＰＴＧの添加によって、γ－サブユニットの発現を誘導した。γ－サブユニットを１８℃および１８０ｒｐｍで１６時間発現させた。遠心分離（５０００ｘｇ、１５分間、４℃）によって細胞を採取し、冷ｄｄＨ２Ｏで洗浄し、そして－８０℃で保存した。
材料
標準的な化学物質をＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（ドイツ・タウフキルヘン）から得た。界面活性剤をＡｎａｔｒａｃｅ（米国モーミー）から得て、結晶化プレートをＨａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（米国アリソヴィエホ）およびＪｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（ドイツ・イエナ）から得て、ＬｉｔｈｏｌｏｏｐｓをＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎｓ（英国サフォーク）およびＪｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（ドイツ・イエナ）から得た。Ｒｕｂａｒｔｈ Ａｐｐａｒａｔｅ ＧｍｂＨ（ドイツ・ハノーバー）のＲｕｍｅｄ（登録商標）Ｅ１００インキュベーターを用いて、結晶化プレートを４℃に移した。ＥＭグリッドはＱｕａｎｔｉｆｏｉｌ（ドイツ・イエナ）のものであった。Ｓ．セレビシエ細胞を、Ｉｎｆｏｒｓ ＧｍｂＨ（ドイツ・デリッチ）の２５０Ｌ発酵装置中で増殖させ、酵母細胞をＲｅｔｓｃｈ（ドイツ・ハーン）のＺＭ２００ミル中ですりつぶし、Ａｖｅｓｔｉｎ（ドイツ・マンハイム）のＥｍｕｌｓｉｆｌｅｘ Ｃ３流動化装置（ｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）を用いて大腸菌細胞を破壊し、そしてＡｍｅｒｓｈａｍ ｉｍａｇｅｒ ６００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ドイツ・ミュンヘン）を用いて、非変性ゲルからの蛍光を測定した。
方法
酵母培養
標準プロトコル（２７）にしたがって、すべての酵母操作を行った。サッカロミセス・セレビシエ株ＢＪ２１６８（ＭＡＴａ ｐｒｃ１－４０７ ｐｒｂ１－１１２２ ｐｅｐ４－３ ｌｅｕ２ ｔｒｐ１ ｕｒａ３－５２ ｇａｌ２）およびｔｍａ１７Δ ＢＪ２１６８（ＭＡＴａ ｐｒｃ１－４０７ ｐｒｂ１－１１２２ ｐｅｐ４－３ ｌｅｕ２ ｔｒｐ１ ｕｒａ３－５２ ｇａｌ２ ｔｍａ１７：：ｋａｎＭＸ）を本研究に用いた。Ｉｎｆｏｒｓ ２５０リットル発酵装置中、ＹＰＤ培地中で細胞を増殖させ、そして９～１０のＯＤ６００の後期対数期に採取した。続いて、細胞を冷ｄｄＨ２Ｏで洗浄し、そして次いで、細胞１グラム当たり２ｍｌの緩衝液を添加するように、２０％（ｗ／ｖ）スクロースを含有する２Ｘ精製緩衝液中に再懸濁した。次いで、細胞をビーズとして、液体窒素中でフラッシュ凍結し、そしてさらなる使用まで、－８０℃で保存した。
酵母ＦＡＳの精製
ヒト２０Ｓおよび２６Ｓプロテアソームの精製のために以前開発されたプロトコルから、精製戦略を適応させた（Ｄ． Ｈａｓｅｌｂａｃｈら， Ｎａｔ． Ｃｏｍｍｕｎ． ８， １－８（２０１７））。本発明者らは７００ｇの凍結細胞ビーズ（酵母の２３３ｇ湿細胞重量に対応する）で開始して、Ｒｅｔｓｃｈ ＺＭ２００ミルを用いて、これを液体窒素中で細かい粉末になるまですりつぶした。すりつぶした粉末を３７℃の水槽中で融解し、１０ｘストックから０．３３ｘ濃度まで精製緩衝液を補充し、その後、スクロース粉末を２０％（ｗ／ｖ）まで、塩化ベンズアミジンを１０ｍＭまで、そしてＰＭＳＦを１ｍＭまで（プロパノール中の１００ｍＭストック溶液から）添加した。抽出物を磁気スターラー上、２５℃で３０分間インキュベーションした後、４℃、３０，０００ｘｇで３０分間遠心分離した。遠心分離後、各３層のチーズクロスおよびミラクロス（ｍｉｒａｃｌｏｔｈ）を通じて上清をろ過してＳ３０酵母細胞抽出物を得た。これに対して、オクチルグルコースネオペンチルグリコール（ＯＧＮＧ）（１０％（ｗ／ｖ）ストックから）を最終濃度０．２％（ｖ／ｖ）まで添加して、そして抽出物を３０℃で３０分間インキュベーションした後、１００，０００ｘｇ、４℃で１時間遠心分離した。上清を再び、各３層のチーズクロスおよびミラクロスを通じてろ過した。こうして清澄化したＳ１００抽出物をポリエチレングリコール（ＰｏｌｙＥｔｈｙｌｅｎｅＧｌｙｃｏｌ）４００（ＰＥＧ；数字はＰＥＧポリマーの平均分子量を示す）で示差的沈殿に供した。ＰＥＧ４００を２０％（ｖ／ｖ）の濃度で酵母Ｓ１００抽出物に添加しながら１８℃で攪拌し、そして３０分間インキュベーションした。沈殿したタンパク質を３０，０００ｘｇ、４℃で３０分間遠心分離することによって除去した。次いで、上述のように、ＰＥＧ４００の濃度を３０％（ｖ／ｖ）に上昇させることによって、上清を沈殿させた。ＦＡＳを含有するこの工程の沈殿物を、３０，０００ｘｇ、４℃で３０分間遠心分離することによって回収し、そして２％（ｗ／ｖ）スクロース、１０ｍＭ ＤＴＴおよび０．０１％（ｗ／ｖ）ラウリルマルトースネオペンチルグリコール（ＬＭＮＧ）を含有する精製緩衝液中に、軌道振盪装置中、１８℃で再懸濁した。再懸濁された物質を、１０ｍＭ ＤＴＴを含有する精製緩衝液中、１０～４５％（ｗ／ｖ）線形スクロース勾配上に装填し、１００，０００ｘｇ、４℃で１６時間遠心分離した。勾配を１ｍｌ分画で採取した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥを利用して、ＦＡＳを含有する分画を同定した。選択した分画をプールし、そして４０％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ４００を添加することによって沈殿させた。遠心分離（３０，０００ｘｇ、３０分間）後、上清を除去し、そして沈殿物を、２％（ｗ／ｖ）スクロース、１０ｍＭ ＤＴＴおよび０．０１％（ｗ／ｖ）ＬＭＮＧを含有する精製緩衝液中に再懸濁した。再懸濁された物質を、１０ｍＭ ＤＴＴを含有する精製緩衝液中、線形１０～４５％（ｗ／ｖ）スクロース勾配上に装填し、そして７９，０００ｘｇ、４℃で１６時間遠心分離した。ＦＡＳを含有する分画をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって同定し、プールし、そして５０μＭマロニルＣｏＡおよび１００μＭ ＮＡＤＰＨの存在下、１８℃で３０分間サイクリングした。タンパク質を沈殿させ、そして４０％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ４００の添加によって濃縮し、そして２％（ｗ／ｖ）スクロース、１０ｍＭ ＤＴＴおよび０．０１％（ｗ／ｖ）ＬＭＮＧを含有する精製緩衝液中に再懸濁した。別のラウンドの、１０ｍＭ ＤＴＴを含有する精製緩衝液中、線形１０～４５％（ｗ／ｖ）スクロース勾配を行い、６０，０００ｘｇ、４℃で１６時間遠心分離し、そして続いて４０％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ４００でＦＡＳ分画を再沈殿させることが必要であり、１０％スクロース（ｗ／ｖ）、１０ｍＭ ＤＴＴおよび０．０１％（ｗ／ｖ）ＬＭＮＧを含有する精製緩衝液中に、～１５ｍｇ／ｍｌの最終精製タンパク質調製物を得た。ＢＳＡ標準を用いたブラッドフォードアッセイ（ＢｉｏＲａｄ、ドイツ・ミュンヘン）によって、タンパク質濃度を決定した。この方法は、再現性を伴って、１５～２０ｍｇの精製酵母ＦＡＳの収量を生じた。
γ－サブユニットの発現および精製
γ－サブユニットを、ｐＥＴ１５１／Ｄ－ＴＯＰＯ（登録商標）プラスミド（Ｇｅｎｅａｒｔ、レーゲンスブルク）内に合成遺伝子としてクローニングし、そしてＢＬ２１ Ｓｔａｒ（ＤＥ３）コンピテント細胞において、Ｎ末端Ｈｉｓ６－ＴＥＶタグとともに発現させた。０．５のＯＤ６００に到達するまで、１８０ｒｐｍで振盪しながら、形質転換細胞を３７℃で増殖させ、次いで、温度を１８℃に下げ、そして温度低下の１時間後、０．５ｍＭ ＩＰＴＧの添加によって、γ－サブユニットの発現を誘導した。γ－サブユニットを１８℃および１８０ｒｐｍで１６時間発現させた。遠心分離（５０００ｘｇ、１５分間、４℃）によって細胞を採取し、冷ｄｄＨ２Ｏで洗浄し、そして－８０℃で保存した。
【0083】
精製のため、７グラムの細胞を４２ｍｌの再懸濁緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、０．２ｍＭ ＰＭＳＦ、１０ｍＭベンズアミジン）に再懸濁した。２Ｕ／ｍｌ ＤＮアーゼおよび０．３３ｍｇ／ｍｌリゾチームを添加した後、懸濁物を４℃で３０分間インキュベーションした。Ａｖｅｓｔｉｎ Ｅｍｕｌｓｉｆｌｅｘ Ｃ３流動化装置（Ａｖｅｓｔｉｎ、ドイツ・マンハイム）に、１５，０００ＰＳＩで２回通過させることによって、細胞を溶解した。得られた溶解物を遠心分離し（３０分間、５０，０００ｇ、４℃）、そして０．４５μｍ孔サイズ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）のＭｉｎｉｓａｒｔ ＮＭＬ Ｐｌｕｓセルロースアセテートフィルターを通じてろ過した。清澄化された溶解物を、２０カラム体積（ＣＶ）の再懸濁緩衝液であらかじめ平衡化されたＮｉ－ＮＴＡ重力カラム（５ｍｌベッド体積）上に装填した。カラムを２０ＣＶ再懸濁緩衝液で洗浄した後、２０ＣＶの洗浄緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール、０．２ｍＭ ＰＭＳＦ、１０ｍＭベンズアミジン）で洗浄した。結合したγ－サブユニットを溶出させるため、５ＣＶの溶出緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾール、０．２ｍＭ ＰＭＳＦ、１０ｍＭベンズアミジン）を適用し、そして２ｍｌ分画で収集した。溶出分画をＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析し、γ－サブユニット含有分画をプールし、そしてタンパク質濃度を測光法で決定した（ＭＷ＝１７．４ｋＤａ、ε２８０＝５９６０）。Ｎ末端Ｈｉｓ６－ＴＥＶタグを切断するため、ＴＥＶ－プロテアーゼを１：５０の酵素対タンパク質比でタンパク質に添加した後、５ｌ透析緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、５ｍＭ β－ＭＥ、１００ｍＭ ＮａＣｌ）中、４℃で一晩透析した。消化されたγ－サブユニットを、２０ＣＶ透析緩衝液であらかじめ平衡化されたＮｉ－ＮＴＡカラムに適用した。フロースルーを２ｍｌ分画に収集し、そして単一分画をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した。純粋γ－サブユニットを含有する分画をプールし、そして１０ｋＤａ ＭＷＣＯ Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ １５遠心分離濃縮装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて、最終濃度２０ｍｇ／ｍｌに濃縮した。最終タンパク質をアリコットし、液体窒素中で凍結し、そして－８０℃で保存した。
【0084】
さらなる動力学および構造研究のため、精製γ－サブユニットを融解し、そして６～８ｋＤａ ＭＷＣＯ透析装置ミニＤ－チューブ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて、４℃で動力学アッセイ緩衝液中に透析した。
定常状態動力学
基質代謝回転中、ＮＡＤＰＨ消費を監視することによって、Ｖ－７５０ ＵＶ－可視光分光光度計（Ｊａｓｃｏ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で動力学測定を行った。本発明者らは３つのＦＡＳ基質：ＮＡＤＰＨ、アセチル－ＣｏＡおよびマロニル－ＣｏＡすべてに関する基質濃度依存性を分析した。商業的アセチル－ＣｏＡおよびマロニル－ＣｏＡを、調製用カラム（ＭＮ Ｎｕｃｌｅｏｄｕｒ（登録商標）１００－５－Ｃ１８、２５０ｍｍｘ２１ｍｍ、５μｍ、流速：１０ｍｌ／分）を用いた逆相（ＲＰ）－ＨＰＬＣ（ＡＥＫＴＡ ＢＡＳＩＣ ９００、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）によってさらに精製した。ＵＶ吸収を２１５ｎｍ、２６０ｎｍおよび２８０ｎｍで検出し、そしてＡ（水＋０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ）からＢ（７９．９％アセトニトリル（ｖ／ｖ）＋２０％ ｄｄＨ２Ｏ＋０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ）の線形勾配で精製を行った。対応する基質のピーク分画を収集し、凍結乾燥し、そして使用するまで－８０℃で保存した。
定常状態動力学
基質代謝回転中、ＮＡＤＰＨ消費を監視することによって、Ｖ－７５０ ＵＶ－可視光分光光度計（Ｊａｓｃｏ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で動力学測定を行った。本発明者らは３つのＦＡＳ基質：ＮＡＤＰＨ、アセチル－ＣｏＡおよびマロニル－ＣｏＡすべてに関する基質濃度依存性を分析した。商業的アセチル－ＣｏＡおよびマロニル－ＣｏＡを、調製用カラム（ＭＮ Ｎｕｃｌｅｏｄｕｒ（登録商標）１００－５－Ｃ１８、２５０ｍｍｘ２１ｍｍ、５μｍ、流速：１０ｍｌ／分）を用いた逆相（ＲＰ）－ＨＰＬＣ（ＡＥＫＴＡ ＢＡＳＩＣ ９００、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）によってさらに精製した。ＵＶ吸収を２１５ｎｍ、２６０ｎｍおよび２８０ｎｍで検出し、そしてＡ（水＋０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ）からＢ（７９．９％アセトニトリル（ｖ／ｖ）＋２０％ ｄｄＨ２Ｏ＋０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ）の線形勾配で精製を行った。対応する基質のピーク分画を収集し、凍結乾燥し、そして使用するまで－８０℃で保存した。
【0085】
本発明者らは基質ストック濃度を測光的に決定した（ＮＡＤＰＨ：ε３４０＝６２２０Ｍ－１ｃｍ－１、ε３７１＝２６３１．８±６．５Ｍ－１ｃｍ－１；アセチル－ＣｏＡ：ε２６０＝１５．４００Ｍ－１ｃｍ-１；マロニル－ＣｏＡ：ε２６０＝１５４００Ｍ－１ｃｍ－１）。
【0086】
λ＝３４０ｎｍでのＮＡＤＰＨ吸収における時間依存性変化の測定によって、多様なアセチル－およびマロニル－ＣｏＡ濃度での脂肪酸合成初期速度を決定した。アセチル－ＣｏＡに関する濃度依存性を研究するため、マロニル－ＣｏＡ（１２０μＭ）、およびＮＡＤＰＨ（３６０μＭ）を一定に維持する一方、アセチル－ＣｏＡ濃度を０～１８０μＭまで変化させた。マロニル－ＣｏＡの場合、アセチル－ＣｏＡ（１８０μＭ）およびＮＡＤＰＨ（３６０μＭ）を一定に維持する一方、マロニルＣｏＡ濃度を０～１８０μＭまで変化させた。ＮＡＤＰＨの対応する分析に関しては、ＮＡＤＰＨ飽和は、高い吸光度のために３４０ｎｍでは分析不能であるため、本発明者らはλ＝３７１ｎｍの波長で測定を実行しなければならなかった。２５４μＭのγ－サブユニットを含みまたは含まずに、３０℃で３０分間、０．２５４μＭ ＦＡＳを含有するタンパク質ストック溶液をインキュベーションすることによって、すべての動力学測定を行った。単一酵素反応は、１２．７μＭ γ－サブユニットを含むまたは含まない１２．７ｎＭ ＦＡＳ、非特異的緩衝タンパク質としての０．２ｍｇ／ｍｌリゾチーム、動力学アッセイ緩衝液、それぞれの必要な基質濃度および１０％（ｗ／ｖ）スクロースを含有した。単一反応をあらかじめ混合し、そしてインキュベーションした（１分間、３０℃）。マロニル－ＣｏＡを添加することによって酵素反応を開始し、そして３０℃で測定した。得られたデータを、ミカエリス・メンテン等式、ヒル等式、または基質活性化を実装する修飾ミカエリス・メンテン等式を含む異なる動力学モデルに適合させた。
架橋質量分析
本発明者らは、架橋質量分析によって、精製ＦＡＳホロ酵素を分析した。タンパク質複合体を、１ｍＭのＢＳ３架橋剤（ＤＭＳＯ中の１００ｍＭストックより）と３０℃で３０分間インキュベーションした。１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０（１Ｍストックより）で反応をクエンチした。１０ｍＭジチオスレイトールおよび４０ｍＭヨードアセトアミドで、それぞれ、タンパク質を還元し、そしてアルキル化した。１Ｍ尿素の存在下、１：５０の酵素対タンパク質比で、タンパク質をトリプシンによって３７℃で一晩消化した。最終濃度０．５％（ｖ／ｖ）まで添加されたトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）でペプチドを酸性化し、製造者の指示にしたがってＭｉｃｒｏＳｐｉｎカラム（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ）上で脱塩し、そして真空乾燥させた。５０μＬの５０％アセトニトリル／０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ中にペプチドを再懸濁した後、ペプチドサイズ排除（ＳｕｐｅｒｄｅｘＰｅｐｔｉｄｅ ３．２／３００カラム、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって、架橋された種を濃縮した。５０μＬの分画を収集し、そして最初に溶出したもの、および架橋されたペプチド対を含有するものを、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって分析した。
架橋質量分析
本発明者らは、架橋質量分析によって、精製ＦＡＳホロ酵素を分析した。タンパク質複合体を、１ｍＭのＢＳ３架橋剤（ＤＭＳＯ中の１００ｍＭストックより）と３０℃で３０分間インキュベーションした。１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０（１Ｍストックより）で反応をクエンチした。１０ｍＭジチオスレイトールおよび４０ｍＭヨードアセトアミドで、それぞれ、タンパク質を還元し、そしてアルキル化した。１Ｍ尿素の存在下、１：５０の酵素対タンパク質比で、タンパク質をトリプシンによって３７℃で一晩消化した。最終濃度０．５％（ｖ／ｖ）まで添加されたトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）でペプチドを酸性化し、製造者の指示にしたがってＭｉｃｒｏＳｐｉｎカラム（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ）上で脱塩し、そして真空乾燥させた。５０μＬの５０％アセトニトリル／０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ中にペプチドを再懸濁した後、ペプチドサイズ排除（ＳｕｐｅｒｄｅｘＰｅｐｔｉｄｅ ３．２／３００カラム、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって、架橋された種を濃縮した。５０μＬの分画を収集し、そして最初に溶出したもの、および架橋されたペプチド対を含有するものを、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって分析した。
【0087】
社内パッキングしたＣ１８カラム（ＲｅｐｒｏＳｉｌ－Ｐｕｒ １２０ Ｃ１８－ＡＱ、１．９μｍ孔サイズ、７５μｍ内径、３０ｃｍ長、Ｄｒ． Ｍａｉｓｃｈ ＧｍｂＨ）を装備したＤｉｏｎｅｘ ＵｌｔｉＭａｔｅ ３０００ ＵＨＰＬＣ系にカップリングしたＯｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ Ｌｕｍｏｓ Ｔｒｉｂｒｉｄ質量分析計（どちらもＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上、技術的２つ組で、第一の複製物の架橋ペプチドを測定した。以下の勾配を適用することによって試料を分離した：可動相Ａは、０．１％ギ酸（ｖ／ｖ）からなり、可動相Ｂは８０％アセトニトリル／０．０８％ギ酸（ｖ／ｖ）からなった。５％Ｂで開始し、１２、１５または２０％Ｂまで３分以内に増加させ（分画による）、その後、４８％Ｂに４５分以内に連続増加させ、次いで、Ｂを９０％で８分間一定に維持した。各流動後、カラムを再び５％Ｂに２分間平衡化させた。流速を３００ｎＬ／分に設定した。１２０，０００の解像度、６０ｍｓの注入時間（ＩＴ）および５ｘ１０５の自動化利得制御（ＡＧＣ）ターゲットで、オービトラップ（ＯＴ）中、ＭＳ１調査スキャンを獲得した。ダイナミックエクスクルージョン（ＤＥ）を１０ｓに設定し、そして３～８の間のチャージ状態のみを断片化に関して考慮した。２０の最も豊富な前駆体イオンのＯＴ中、解像度３０，０００、ＩＴ １２０ｍｓおよびＡＧＣターゲット５ｘ１０４で、ＭＳ２スペクトルを獲得した。３０％標準化衝突エネルギー（ＮＣＥ）で、より高いエネルギーの衝突解離（ＨＣＤ）によって断片化を強制した。第二の複製物を以下の変化を伴って処理した：本発明者らはＱ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦ－Ｘ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用い、ＭＳ１では、ＩＴを５０ｍｓに、そしてＡＧＣターゲットを１ｘ１０６に設定した。ＭＳ２では、ＩＴを１２８ｍｓに、そしてＡＧＣターゲットを１ｘ１０５に設定した。ＤＥは３０ｍｓを含んだ。ここで、３０の最も豊富な前駆体イオンを断片化に関して考慮した。
【0088】
．ｒａｗファイルを．ｍｇｆ形式（シグナル対ノイズ比１．５、１０００～１００００Ｄａ前駆体質量）に変換するために、ＰｒｏｔｅｏｍｅＤｉｓｃｏｖｅｒｅｒ １．４（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いた。生成された．ｍｇｆファイルをｐＬｉｎｋ ｖ．１．２３（Ｂ． Ｙａｎｇら， Ｎａｔ． Ｍｅｔｈｏｄｓ． ９， ９０４－９０６（２０１２））に供して、架橋ペプチドを同定した。ここで、固定されたものとしてシステインのカルバミドメチル化を、可変修飾としてメチオニンの酸化を伴い、デフォルトセッティングを適用し、ＦＤＲは０．０１にセットされた。第一の複製物内のＦＡＳおよびＴＭＡ１７の間の内部架橋のスペクトルを手動で評価した。第二の複製物に関して、３のスコアカットオフ（元来のｐＬｉｎｋスコアの－ｌоｇ１０変換）を適用し、そして１より多い架橋ペプチドスペクトルマッチ（ＣＳＭ）によって支持される架橋のみを考慮した。
【図1】
【図2-1】
【図2-2】
【図3】
【図4】
【図5】
【配列表】
【国際調査報告】