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▶ ユニシテ エーファウ アクチェンゲゼルシャフトの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-05-11
(54)【発明の名称】細胞外小胞（ＥＶ）の血管新生促進能力の予測方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/68 20180101AFI20220428BHJP
A61P 17/02 20060101ALI20220428BHJP
A61P 9/10 20060101ALI20220428BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20220428BHJP
A61P 3/04 20060101ALI20220428BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20220428BHJP
A61P 13/12 20060101ALI20220428BHJP
A61K 35/12 20150101ALI20220428BHJP
A61K 31/7105 20060101ALI20220428BHJP
A61K 35/14 20150101ALI20220428BHJP
C12Q 1/686 20180101ALI20220428BHJP
C12N 5/071 20100101ALI20220428BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20220428BHJP
A61K 38/19 20060101ALI20220428BHJP
C12N 15/113 20100101ALN20220428BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/68
A61P17/02 ZNA
A61P9/10
A61P9/00
A61P3/04
A61P3/10
A61P13/12
A61K35/12
A61K31/7105
A61K35/14 Z
C12Q1/686 Z
C12N5/071
G01N33/53 M
G01N33/53 D
A61K38/19
C12N15/113 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021555496
(86)(22)【出願日】2020-03-13
(85)【翻訳文提出日】2021-11-04
(86)【国際出願番号】 IB2020052286
(87)【国際公開番号】W WO2020188433
(87)【国際公開日】2020-09-24
(31)【優先権主張番号】19163194.4
(32)【優先日】2019-03-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】518361044
【氏名又は名称】ユニシテ エーファウ アクチェンゲゼルシャフト
(74)【代理人】
【識別番号】100094569
【弁理士】
【氏名又は名称】田中 伸一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100103610
【弁理士】
【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦
(74)【代理人】
【識別番号】100109070
【弁理士】
【氏名又は名称】須田 洋之
(74)【代理人】
【識別番号】100119013
【弁理士】
【氏名又は名称】山崎 一夫
(74)【代理人】
【識別番号】100123777
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 さつき
(74)【代理人】
【識別番号】100111796
【弁理士】
【氏名又は名称】服部 博信
(74)【代理人】
【識別番号】100123766
【弁理士】
【氏名又は名称】松田 七重
(72)【発明者】
【氏名】ブリッツィ マリア フェリーチェ
(72)【発明者】
【氏名】カムッシ ジョヴァンニ
(72)【発明者】
【氏名】カヴァラリ クラウディア
【テーマコード（参考）】
4B063
4B065
4C084
4C086
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA05
4B063QQ03
4B063QQ08
4B063QQ15
4B063QQ52
4B063QR32
4B063QR62
4B063QS10
4B063QS13
4B063QS25
4B063QS33
4B063QS36
4B065AA93X
4B065BD15
4B065CA46
4C084BA44
4C084DB61
4C084NA14
4C084ZA361
4C084ZA362
4C084ZA701
4C084ZA702
4C084ZA811
4C084ZA812
4C084ZA891
4C084ZA892
4C084ZC351
4C084ZC352
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZA36
4C086ZA70
4C086ZA81
4C086ZA89
4C086ZC35
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB34
4C087BB35
4C087BB63
4C087BB64
4C087NA14
4C087ZA36
4C087ZA70
4C087ZA81
4C087ZA89
4C087ZC35
(57)【要約】
本発明は、細胞外小胞（ＥＶ）、好ましくは血液由来ＥＶの調製物の血管新生促進活性を予測するためのインビトロ方法であって、トランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦβ）及びマイクロＲＮＡ－１３０ａの含量の併用決定に基づく、前記方法に関する。強い血管新生促進活性を有すると予測される細胞外小胞（ＥＶ）の調製物を製造する方法、ならびに心血管疾患の危険性と関連する虚血性疾患、虚血性傷害及び病的状態の治療的処置に、又は創傷治療で使用するのに有効なそれらのＥＶ調製物も開示される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
細胞外小胞（ＥＶ）の組成物が血管新生促進活性を有するかどうかを予測する方法であって、（ａ）ＥＶの組成物中のｍｉＲ－１３０ａマイクロＲＮＡ含量を定量化するステップ、及び
（ｂ）ＥＶの組成物中のトランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦβ）含量を定量化するステップ、
（ｃ）ｍｉＲ－１３０ａ含量が第１の所定の値より高く、ＴＧＦβ含量が第２の所定の値より高いかどうかを判定するステップ
を含み、
ｍｉＲ－１３０ａ含量が前記第１の所定の値より高く、ＴＧＦβ含量が前記第２の所定の値より高い場合に、ＥＶの組成物が血管新生促進活性を有すると予測される、前記方法。
【請求項2】
ｍｉＲ－１３０ａ含量が、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（リアルタイムＰＣＲ）によってＣｔ値として定量化され、ｍｉＲ－１３０ａ含量とＣｔ値の間に逆相関がある、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記第１の所定の値がＣｔ値＜３０である、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
ＴＧＦβ含量がイムノアッセイによって、好ましくは酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によって測定される、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項5】
前記第２の所定の値が２３ｐｇ／１０10ＥＶのＴＧＦβの量である、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項6】
以下のステップ：－ＢｒｄＵ細胞増殖アッセイによってＥＶの組成物を試験することにより、組成物の値を得るステップ；
－ＢｒｄＵ細胞増殖アッセイによって陰性対照を試験することにより、陰性対照の値を得るステップ；
－ＢｒｄＵ細胞増殖アッセイによって陽性対照を試験することにより、陽性対照の値を得るステップ；
－以下の式を適用することによって、ＢｒｄＵ細胞増殖アッセイにおけるＥＶの組成物の血管新生促進活性％を計算するステップ：
【数1】
力価試験によってＥＶの組成物の血管新生促進活性を定量化するステップ（ｄ）をさらに含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項7】
以下のステップ：－管形成アッセイによってＥＶの組成物を試験することにより、組成物の値を得るステップ；
－管形成アッセイによって陰性対照を試験することにより、陰性対照の値を得るステップ；
－管形成アッセイによって陽性対照を試験することにより、陽性対照の値を得るステップ；
－以下の式を適用することによって、管形成アッセイにおけるＥＶの組成物の血管新生促進活性％を計算するステップ：
【数2】
力価試験によってＥＶの組成物の血管新生促進活性を定量化するステップ（ｄ）をさらに含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項8】
請求項６に記載のＢｒｄＵ細胞増殖アッセイと請求項７に記載の管形成インビトロアッセイの両方を含む力価試験によって、ＥＶの組成物の血管新生促進活性を定量化するステップ（ｄ）をさらに含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項9】
ＥＶ組成物が、少なくとも５０％の血管新生促進活性を有すると決定される、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項10】
ＥＶがヒト細胞由来である、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項11】
血管新生促進性細胞外小胞（ＥＶ）の調製物を製造する方法であって、－体液の複数の調製物から、又は細胞培養の条件培地からＥＶを単離するステップ；
－単離したＥＶから、１つ又は複数の所定の濃度のＥＶ試料を調製するステップ；
－請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法を用いて、各ＥＶ試料の血管新生促進活性を予測するステップ；
－ｍｉＲ－１３０ａ含量が第１の所定の値より高く、ＴＧＦβが第２の所定の値より高い試料を選択するステップを含み；及び
任意に２つ以上の活性なＥＶ試料をプールするステップを含んでもよく、
それによって、血管新生促進ＥＶの調製物を得る、前記方法。
【請求項12】
ｍｉＲ－１３０ａ含量がリアルタイムＰＣＲによってＣｔ値として定量化され、前記第１の所定の値がＣｔ値＜３０である、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記第２の所定の値が２３ｐｇ／１０10ＥＶのＴＧＦβ量である、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項14】
ＥＶ調製物が、少なくとも５０％の血管新生促進活性を有すると決定される、請求項１１～１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項15】
ＥＶがヒト細胞由来である、請求項１１～１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項16】
血管新生促進療法によって正の影響を受ける疾患もしくは傷害の治療的処置で使用するための、又は創傷治療で使用するための、請求項１１～１５のいずれか１項に記載の方法によって得ることができる血管新生促進性細胞外小胞（ＥＶ）の調製物であって、リアルタイムＰＣＲによってＣｔ値として測定される調製物中のｍｉＲ－１３０ａ含量がＣｔ＜３０であり、調製物中のＴＧＦβ含量が＞２３ｐｇ／１０10ＥＶである、調製物。
【請求項17】
血管新生促進療法によって正の影響を受ける疾患もしくは傷害の治療的処置で使用するための、又は創傷治療で使用するための、リアルタイムＰＣＲによってＣｔ値として測定されるＣｔ＜３０のｍｉＲ－１３０ａ含量及び／又はＴＧＦβ含量＞２３ｐｇ／１０10ＥＶを有する、血管新生促進性細胞外小胞（ＥＶ）の調製物。
【請求項18】
ＥＶ調製物が、少なくとも５０％の血管新生促進活性を有する、請求項１６又は１７に記載の調製物。
【請求項19】
ＥＶが、生物学的流体に由来するか、又は細胞培養もしくは組織培養の条件培地に由来する、請求項１６～１８のいずれか１項に記載の使用のための調製物。
【請求項20】
生物学的流体が全血、血漿又は血清である、請求項１９に記載の使用のための調製物。
【請求項21】
ＥＶが健常なドナーの血清から、又は心血管危険因子を有する患者の血清から調製される、請求項２０に記載の使用のための調製物。
【請求項22】
疾患又は傷害が血管疾患もしくは傷害、又は心血管疾患の危険性と関係がある状態である、請求項１６～２１のいずれか１項に記載の使用のための調製物。
【請求項23】
疾患又は傷害が急性心筋梗塞、急性脳血管疾患、急性及び慢性の末梢動脈疾患、急性腎臓虚血、肥満及び糖尿病からなる群から選択される、請求項１６～２２のいずれか１項に記載の使用のための調製物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、細胞外小胞（ＥＶ）調製物（preparation）の血管新生促進活性（proangiogenic）の予測方法、そのＥＶ調製物及びその治療適用に関する。
【背景技術】
【0002】
細胞外小胞（ＥＶ）は、正常状態と病的状態の両方のほとんどすべての細胞型が放出する小さな小胞である。これは、細胞原形質膜の出芽によって生成される微小胞、及びエキソサイトーシスによってエンドソーム膜コンパートメントから生じるエキソソームを主に含む。最近の証拠により、ＥＶが様々な病態生理学的プロセスの媒介物として働き得ることが示唆される。循環ＥＶレベルの増大は、特に、糖尿病及び急性冠動脈症候群を有する患者において、血管の機能障害及び凝固性亢進と関係があり、これにより、心血管疾患に至らせる役割が示唆される。さらに、主に血小板及び内皮細胞に起源がある循環ＥＶのレベルの増大は、細胞機能障害の顕著な特徴として提唱されている。ＥＶは生物学的に活性なベクターとして働き、循環細胞と多くの細胞型、例えば内皮細胞との間の情報交換に関与することが広く報告されている。実際に、血小板に由来するＥＶはアテローム性動脈硬化症の病的発生で役割を果たすことも提唱されている。
ＥＶは、主に、典型的にはＥＶカーゴと称される、タンパク質、活性脂質及び細胞外ＲＮＡを送達することによって、生物学的媒介体として働く（Pathan M., et al. Vesiclepedia 2019: a compendium of RNA, proteins, lipids and metabolites in extracellular vesicles. (2019) Nucleic Acids Res. 47: D516-D519）。しかし、最も研究されているＥＶ媒介性の生物学的プロセスはｍｉＲ移行に依拠していた。ｍｉＲは、遺伝子発現を転写後調節する小分子非コードＲＮＡのクラスである。ｍｉＲは血清／血漿で安定して発現しており、その独特な発現パターンは、多くの臨床背景で疾患フィンガープリントとしての機能を果たすことが提唱されている。さらに、活性化された血小板が、ＥＶを使用して、機能的ｍｉＲを血管細胞中に移行させることができることが示されている。これは、次に、ＩＣＡＭ－１の発現及び血管の炎症反応を調節する。実際に、循環ＥＶカーゴの変化は、糖尿病における内皮及び平滑筋の細胞機能障害に関連することが示されている。
ＥＶは、主に、典型的にはＥＶカーゴと称される、タンパク質、活性脂質及び細胞外ＲＮＡを送達することによって、生物学的媒介体として働く（Pathan M., et al. Vesiclepedia 2019: a compendium of RNA, proteins, lipids and metabolites in extracellular vesicles. (2019) Nucleic Acids Res. 47: D516-D519）。しかし、最も研究されているＥＶ媒介性の生物学的プロセスはｍｉＲ移行に依拠していた。ｍｉＲは、遺伝子発現を転写後調節する小分子非コードＲＮＡのクラスである。ｍｉＲは血清／血漿で安定して発現しており、その独特な発現パターンは、多くの臨床背景で疾患フィンガープリントとしての機能を果たすことが提唱されている。さらに、活性化された血小板が、ＥＶを使用して、機能的ｍｉＲを血管細胞中に移行させることができることが示されている。これは、次に、ＩＣＡＭ－１の発現及び血管の炎症反応を調節する。実際に、循環ＥＶカーゴの変化は、糖尿病における内皮及び平滑筋の細胞機能障害に関連することが示されている。
【0003】
ますます増える証拠によって、ＥＶが潜在的な治療的、診断的及び予後的ツールとして働くことができることが示唆される。
心血管イベントの危険性の増大は、糖尿病及び肥満を患っている患者の共通の特色である。血管形成の障害は、これらの臨床背景において異常な血管再構築を説明する、関連する機構であると依然として考えられる。したがって、傷害組織の新血管新生を高めることは、患者の転帰を向上させるために必須であり続けている。心血管危険因子を有する患者において血管再構築を向上させるために、様々な治療手段が提案されてきている。しかし、これらは本当の利益を提供することができず、これによって、新規な処置選択が依然として必要とされることが示唆される。
ＷＯ２０１８０６９４０８は、強い血管新生促進活性を特徴とする、血液由来ＥＶの組成物を開示する。さらに、ＷＯ２０１８０６９４０８は、ＥＶの血管新生促進能力を測定することを可能にする試験を教示し、この試験は、インビトロで細胞増殖及び／又は管様構造形成を誘導するその能力についてＥＶを分析することを含む。
心血管イベントの危険性の増大は、糖尿病及び肥満を患っている患者の共通の特色である。血管形成の障害は、これらの臨床背景において異常な血管再構築を説明する、関連する機構であると依然として考えられる。したがって、傷害組織の新血管新生を高めることは、患者の転帰を向上させるために必須であり続けている。心血管危険因子を有する患者において血管再構築を向上させるために、様々な治療手段が提案されてきている。しかし、これらは本当の利益を提供することができず、これによって、新規な処置選択が依然として必要とされることが示唆される。
ＷＯ２０１８０６９４０８は、強い血管新生促進活性を特徴とする、血液由来ＥＶの組成物を開示する。さらに、ＷＯ２０１８０６９４０８は、ＥＶの血管新生促進能力を測定することを可能にする試験を教示し、この試験は、インビトロで細胞増殖及び／又は管様構造形成を誘導するその能力についてＥＶを分析することを含む。
【発明の概要】
【0004】
本発明は、ＥＶカーゴの組成が、これらの小胞が血管新生促進活性を示すかどうかの信頼できる予測的指標に相当するという発見に基づく。驚いたことに、以下の実験セクションで詳細に例示される本発明者らが行った実験的研究によって、ｍｉＲ－１３０ａの測定値と組み合わせて使用されるトランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦβ）の含量に基づいて、血管新生促進活性を有するＥＶを不活性な小胞と区別できることが明らかになった。実際に、ＲＯＣ解析から推定されるように、前述の測定値の組み合わせに基づいた試験は、感度と特異性の両方の点からＥＶの血管新生促進活性の識別の強い予測力を示し、それによって、血管新生促進療法によって正の影響を受ける疾患又は傷害の治療的処置で有効なＥＶの正確な選択を可能にする。
【0005】
したがって、本発明の第１の態様は、細胞外小胞（ＥＶ）の組成物が血管新生促進活性を有するかどうかを予測する方法であって、
（ａ）ＥＶの組成物中のｍｉＲ－１３０ａマイクロＲＮＡ含量を定量化するステップ、及び
（ｂ）ＥＶの組成物中のトランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦβ）含量を定量化するステップ、
（ｃ）ｍｉＲ－１３０ａ含量が第１の所定の値より高く、ＴＧＦβ含量が第２の所定の値より高いかどうかを判定するステップ
を含み、
ｍｉＲ－１３０ａ含量が前記第１の所定の値より高く、ＴＧＦβ含量が前記第２の所定の値より高い場合に、ＥＶの組成物が、血管新生促進活性を有すると予測される、前記方法である。
（ａ）ＥＶの組成物中のｍｉＲ－１３０ａマイクロＲＮＡ含量を定量化するステップ、及び
（ｂ）ＥＶの組成物中のトランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦβ）含量を定量化するステップ、
（ｃ）ｍｉＲ－１３０ａ含量が第１の所定の値より高く、ＴＧＦβ含量が第２の所定の値より高いかどうかを判定するステップ
を含み、
ｍｉＲ－１３０ａ含量が前記第１の所定の値より高く、ＴＧＦβ含量が前記第２の所定の値より高い場合に、ＥＶの組成物が、血管新生促進活性を有すると予測される、前記方法である。
【0006】
本明細書で使用する場合、用語「血管新生促進活性」は、血管新生及び／又は内皮細胞増殖の刺激又は増強を指す。
以下でさらに詳細に説明するように、本発明者らは、健常なドナー及び心血管危険因子を有する患者の血液から単離した血管新生促進に有効及び無効なＥＶにおいてマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）のマイクロアレイベースの発現プロファイリングを行い、驚いたことに、これらの小胞の血管新生促進活性とｍｉＲ－１３０ａの含量の間に有意な相関を見出した。さらなる研究によって、血管新生促進活性を有するＥＶは、非活性的なＥＶと比較して高い量のＴＧＦβタンパク質を含むことが明らかになった。
いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、本発明者らは、血管新生プロセスの促進においてｍｉＲ－１３０ａが果たす役割は、本発明者らが行ったＩＰＡ Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙバイオインフォマティクス解析によって明らかになったように、この分子と血管新生プロセスに関与するいくつかの遺伝子、例えば、ＫＤＲ、ＨＯＸＡ５、ＲＯＣＫ１、及びＥＰＨＢ６との相互作用によって説明することができると信じる。さらに、この解析の結果として、ＴＧＦβ及びＴＧＦＢＲ１もｍｉＲ－１３０ａの制御下にある遺伝子の中に見出され、これにより、生物学的に活性なＥＶの血管新生促進活性の推進におけるｍｉＲ－１３０ａとＴＧＦβの間の協力がさらに確証される。
以下でさらに詳細に説明するように、本発明者らは、健常なドナー及び心血管危険因子を有する患者の血液から単離した血管新生促進に有効及び無効なＥＶにおいてマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）のマイクロアレイベースの発現プロファイリングを行い、驚いたことに、これらの小胞の血管新生促進活性とｍｉＲ－１３０ａの含量の間に有意な相関を見出した。さらなる研究によって、血管新生促進活性を有するＥＶは、非活性的なＥＶと比較して高い量のＴＧＦβタンパク質を含むことが明らかになった。
いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、本発明者らは、血管新生プロセスの促進においてｍｉＲ－１３０ａが果たす役割は、本発明者らが行ったＩＰＡ Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙバイオインフォマティクス解析によって明らかになったように、この分子と血管新生プロセスに関与するいくつかの遺伝子、例えば、ＫＤＲ、ＨＯＸＡ５、ＲＯＣＫ１、及びＥＰＨＢ６との相互作用によって説明することができると信じる。さらに、この解析の結果として、ＴＧＦβ及びＴＧＦＢＲ１もｍｉＲ－１３０ａの制御下にある遺伝子の中に見出され、これにより、生物学的に活性なＥＶの血管新生促進活性の推進におけるｍｉＲ－１３０ａとＴＧＦβの間の協力がさらに確証される。
【0007】
本発明によれば、ｍｉＲ－１３０ａのヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＣＡＧＵＧＣＡＡＵＧＵＵＡＡＡＡＧＧＧＣＡＵ－３’（配列番号１）を含むか又はこれからなる。
本発明による方法では、ＥＶ組成物中のｍｉＲ－１３０ａの定量化は、好ましくは核酸ベースの増幅技法によって、より好ましくはリアルタイムＰＣＲによって行われる。
好ましい実施形態では、リアルタイムＰＣＲによって評価されるＥＶの組成物中のｍｉＲ－１３０含量は、閾値サイクル（Ｃｔ）値として測定される。
典型的には、リアルタイムＰＣＲによる核酸定量化は、対数スケールでサイクル数に対して増幅シグナル、例えば蛍光をプロットすることに依拠する。本明細書で使用する場合、用語「Ｃｔ値」は、増幅シグナルが核酸増幅反応の指数関数的フェーズの間にバックグラウンドレベルより高い強度に達するのに必要とされるＰＣＲサイクル数を指す。したがって、Ｃｔ値は、逆に、試料中に最初に存在する標的核酸の量に関係しており、すなわち、標的核酸の存在量が大きいほど、Ｃｔ値は小さくなる。リアルタイムＰＣＲ反応でバックグラウンドレベルを決定するための方法は十分に確立されており、当業者に既知である。
より詳細には、本発明者らは、健常な対象由来と患者由来の両方の血清ＥＶ（ｓＥＶ）においてＣｔ＞３０のＣｔ値として測定されるｍｉＲ１３０ａの含量が、血管新生促進無効小胞を予測する（インビトロ力価試験で測定される場合＜５０％）ことを観察した。
本発明による方法では、ＥＶ組成物中のｍｉＲ－１３０ａの定量化は、好ましくは核酸ベースの増幅技法によって、より好ましくはリアルタイムＰＣＲによって行われる。
好ましい実施形態では、リアルタイムＰＣＲによって評価されるＥＶの組成物中のｍｉＲ－１３０含量は、閾値サイクル（Ｃｔ）値として測定される。
典型的には、リアルタイムＰＣＲによる核酸定量化は、対数スケールでサイクル数に対して増幅シグナル、例えば蛍光をプロットすることに依拠する。本明細書で使用する場合、用語「Ｃｔ値」は、増幅シグナルが核酸増幅反応の指数関数的フェーズの間にバックグラウンドレベルより高い強度に達するのに必要とされるＰＣＲサイクル数を指す。したがって、Ｃｔ値は、逆に、試料中に最初に存在する標的核酸の量に関係しており、すなわち、標的核酸の存在量が大きいほど、Ｃｔ値は小さくなる。リアルタイムＰＣＲ反応でバックグラウンドレベルを決定するための方法は十分に確立されており、当業者に既知である。
より詳細には、本発明者らは、健常な対象由来と患者由来の両方の血清ＥＶ（ｓＥＶ）においてＣｔ＞３０のＣｔ値として測定されるｍｉＲ１３０ａの含量が、血管新生促進無効小胞を予測する（インビトロ力価試験で測定される場合＜５０％）ことを観察した。
【0008】
したがって、本発明の方法におけるＥＶ組成物は、所定の値より高いｍｉＲ１３０ａ含量を有すると決定される。好ましくは、本発明の方法におけるＥＶ組成物は、３５以下のＣｔ、より好ましくは３３以下のＣｔ、さらにより好ましくは３０以下のＣｔ、さらにより好ましくは、例えば、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８又は２９などの１０～２９の範囲内に含まれるＣｔのＣｔ値として測定される場合に、ｍｉＲ１３０ａ含量を有すると決定される。
好ましい実施形態では、本発明の方法におけるＥＶ組成物は、Ｃｔ＜３０のＣｔ値として測定される場合に、ｍｉＲ１３０ａ含量を有すると決定される。
好ましい実施形態では、ＥＶ中のｍｉＲ－１３０ａ内容物の量は、２-(ΔCt)方法を適用することによってＣｔ値として決定され、この方法は、Livak KJ and Schmittgen TD, “Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Schnittger C(T)) method” (2001) Methods 25: 402-408に記載されているように、試料の相対的倍数遺伝子発現を計算することを可能にする式に基づく。以下の実施例で詳細に例示されるように、デルタ－デルタＣｔ方法を使用するために、調べられるすべての遺伝子及びハウスキーピング遺伝子について測定されたＣｔ値を本発明者らは考慮した。全解析は異なるハウスキーピング遺伝子に基づいていたので、すべてのハウスキーピング遺伝子のＣｔ値（ヒトＵ＆ｓｎＲＮＡ、ＲＮＵ４３ ｓｎｏＲＮＡ、Ｈｍ／Ｍｓ／ＲＴ Ｕ１ ｓｎＲＮＡ）の平均を先に作製した。
好ましい実施形態では、本発明の方法におけるＥＶ組成物は、Ｃｔ＜３０のＣｔ値として測定される場合に、ｍｉＲ１３０ａ含量を有すると決定される。
好ましい実施形態では、ＥＶ中のｍｉＲ－１３０ａ内容物の量は、２-(ΔCt)方法を適用することによってＣｔ値として決定され、この方法は、Livak KJ and Schmittgen TD, “Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Schnittger C(T)) method” (2001) Methods 25: 402-408に記載されているように、試料の相対的倍数遺伝子発現を計算することを可能にする式に基づく。以下の実施例で詳細に例示されるように、デルタ－デルタＣｔ方法を使用するために、調べられるすべての遺伝子及びハウスキーピング遺伝子について測定されたＣｔ値を本発明者らは考慮した。全解析は異なるハウスキーピング遺伝子に基づいていたので、すべてのハウスキーピング遺伝子のＣｔ値（ヒトＵ＆ｓｎＲＮＡ、ＲＮＵ４３ ｓｎｏＲＮＡ、Ｈｍ／Ｍｓ／ＲＴ Ｕ１ ｓｎＲＮＡ）の平均を先に作製した。
【0009】
別の好ましい実施形態では、ＥＶ中のｍｉＲ－１３０ａ含量の定量化は、既知の量のｍｉＲ－１３０ａの検量線を使用し、未知の試料においてリアルタイムＰＣＲによって決定されたＣｔ値を、検量線を用いて内挿することによって達成される。
リアルタイムＰＣＲについて言及されるが、当技術分野で既知であるように、核酸増幅の他の方法が本発明の範囲内で使用され得ることが理解される。そのような方法としては、限定されないが、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）及びデジタルＰＣＲが挙げられる。
それらの研究で、本発明者らは、所定の値より低い、好ましくは２３ｐｇ／１０10ＥＶより低いＴＧＦβの含量を有する、健常な対象由来と患者由来の両方のｓＥＶは、血管新生促進不活性であると予測されることを見出した。
したがって、本発明の方法におけるＥＶ組成物は、所定の値より高い、好ましくは、２０ｐｇ／１０10ＥＶ～５０ｐｇ／１０10ＥＶの範囲内に含まれる値より高い、より好ましくは、２３ｐｇ／１０10ＥＶ～４０ｐｇ／１０10ＥＶの範囲内の値より高い、さらにより好ましくは例えば、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、又は３５ｐｇ／１０10ＥＶなどの２５ｐｇ／１０10ＥＶ～３５ｐｇ／１０10ＥＶの範囲内の値より高いＴＧＦβの含量を有すると決定される。
リアルタイムＰＣＲについて言及されるが、当技術分野で既知であるように、核酸増幅の他の方法が本発明の範囲内で使用され得ることが理解される。そのような方法としては、限定されないが、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）及びデジタルＰＣＲが挙げられる。
それらの研究で、本発明者らは、所定の値より低い、好ましくは２３ｐｇ／１０10ＥＶより低いＴＧＦβの含量を有する、健常な対象由来と患者由来の両方のｓＥＶは、血管新生促進不活性であると予測されることを見出した。
したがって、本発明の方法におけるＥＶ組成物は、所定の値より高い、好ましくは、２０ｐｇ／１０10ＥＶ～５０ｐｇ／１０10ＥＶの範囲内に含まれる値より高い、より好ましくは、２３ｐｇ／１０10ＥＶ～４０ｐｇ／１０10ＥＶの範囲内の値より高い、さらにより好ましくは例えば、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、又は３５ｐｇ／１０10ＥＶなどの２５ｐｇ／１０10ＥＶ～３５ｐｇ／１０10ＥＶの範囲内の値より高いＴＧＦβの含量を有すると決定される。
【0010】
好ましい実施形態では、本発明の方法におけるＥＶ組成物は、少なくとも２３ｐｇ／１０10ＥＶのＴＧＦβの含量を有すると決定される。
本発明の方法によれば、ＥＶ中のＴＧＦβタンパク質の定量化は、タンパク質分野で既知のものなど、任意の適切な方式で行うことができる。
好ましくは、ＥＶのＴＧＦβ含量はイムノアッセイによって測定される。例えば、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、化学発光イムノアッセイ（ＣＬＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、沈殿イムノアッセイ、粒子イムノアッセイ、競合的結合アッセイなどの任意の適切なイムノアッセイを使用することができる。より好ましくは、本発明の方法で使用されるイムノアッセイはＥＬＩＳＡアッセイである。明らかに、選択が当業者の技能内にある任意のタイプのイムノアッセイ形式の使用は、本発明の範囲内である。
上記の実施形態のすべてにおいて、ＥＶがヒト細胞に由来することも好ましい。
本発明の方法によれば、ＥＶ中のＴＧＦβタンパク質の定量化は、タンパク質分野で既知のものなど、任意の適切な方式で行うことができる。
好ましくは、ＥＶのＴＧＦβ含量はイムノアッセイによって測定される。例えば、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、化学発光イムノアッセイ（ＣＬＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、沈殿イムノアッセイ、粒子イムノアッセイ、競合的結合アッセイなどの任意の適切なイムノアッセイを使用することができる。より好ましくは、本発明の方法で使用されるイムノアッセイはＥＬＩＳＡアッセイである。明らかに、選択が当業者の技能内にある任意のタイプのイムノアッセイ形式の使用は、本発明の範囲内である。
上記の実施形態のすべてにおいて、ＥＶがヒト細胞に由来することも好ましい。
【0011】
本発明の方法の一実施形態によれば、ＥＶの組成物の血管新生促進活性は、インビトロ力価試験で定量化され、この試験は、ＢｒｄＵ細胞増殖アッセイもしくは管形成インビトロアッセイ、又はＢｒｄＵ細胞増殖アッセイと管形成インビトロアッセイの両方によってＥＶを試験することを含む。
好ましい実施形態では、力価試験は、以下のステップ：
－ＢｒｄＵ細胞増殖アッセイによってＥＶ組成物の活性を測定するステップ；
－ＢｒｄＵ細胞増殖アッセイによって陰性対照の活性を測定するステップ；
－ＢｒｄＵ細胞増殖アッセイによって陽性対照の活性を測定するステップ；
－以下の式を適用することによって、ＢｒｄＵ細胞増殖アッセイにおける組成物の活性％を計算するステップ：
を含む。
好ましい実施形態では、力価試験は、以下のステップ：
－ＢｒｄＵ細胞増殖アッセイによってＥＶ組成物の活性を測定するステップ；
－ＢｒｄＵ細胞増殖アッセイによって陰性対照の活性を測定するステップ；
－ＢｒｄＵ細胞増殖アッセイによって陽性対照の活性を測定するステップ；
－以下の式を適用することによって、ＢｒｄＵ細胞増殖アッセイにおける組成物の活性％を計算するステップ：
【数1】
【0012】
本実施形態によれば、本発明の方法は、以下のステップ：
－組成物の値を得るために、ＢｒｄＵ細胞増殖アッセイによってＥＶの組成物を試験するステップ；
－陰性対照の値を得るために、ＢｒｄＵ細胞増殖アッセイによって陰性対照を試験するステップ；
－陽性対照の値を得るために、ＢｒｄＵ細胞増殖アッセイによって陽性対照を試験するステップ；
－以下の式を適用することによって、ＢｒｄＵ細胞増殖アッセイにおけるＥＶの組成物の血管新生促進活性％を計算するステップ：
を含む力価試験によってＥＶ組成物の血管新生促進活性を定量化するステップ（ｄ）をさらに含む。
－組成物の値を得るために、ＢｒｄＵ細胞増殖アッセイによってＥＶの組成物を試験するステップ；
－陰性対照の値を得るために、ＢｒｄＵ細胞増殖アッセイによって陰性対照を試験するステップ；
－陽性対照の値を得るために、ＢｒｄＵ細胞増殖アッセイによって陽性対照を試験するステップ；
－以下の式を適用することによって、ＢｒｄＵ細胞増殖アッセイにおけるＥＶの組成物の血管新生促進活性％を計算するステップ：
【数2】
【0013】
ＢｒｄＵアッセイは、好ましくは、マトリゲルに播種されたＨＭＥＣ細胞を使用する。ＢｒｄＵ細胞増殖アッセイでは、血清（好ましくは１０％血清）が陽性対照に添加される。陰性対照は陽性対照と同じ培地であるが、血清の添加がない。ＢｒｄＵアッセイは、好ましくは標的細胞あたり１００００個のＥＶの濃度に基づく。
別の好ましい実施形態では、力価試験は、以下のステップ：
－管形成アッセイによって、ＥＶ組成物の活性を測定するステップ；
－管形成アッセイによって、陰性対照の活性を測定するステップ；
－管形成アッセイによって、陽性対照の活性を測定するステップ；
－以下の式を適用することによって、管形成アッセイにおける組成物の活性％を計算するステップ：
を含む。
別の好ましい実施形態では、力価試験は、以下のステップ：
－管形成アッセイによって、ＥＶ組成物の活性を測定するステップ；
－管形成アッセイによって、陰性対照の活性を測定するステップ；
－管形成アッセイによって、陽性対照の活性を測定するステップ；
－以下の式を適用することによって、管形成アッセイにおける組成物の活性％を計算するステップ：
【数3】
【0014】
本実施形態によれば、本発明の方法は、以下のステップ：
－組成物の値を得るために、管形成アッセイによってＥＶの組成物を試験するステップ；
－陰性対照の値を得るために、管形成アッセイによって陰性対照を試験するステップ；
－陽性対照の値を得るために、管形成アッセイによって陽性対照を試験するステップ；
－以下の式を適用することによって、管形成アッセイにおけるＥＶの組成物の血管新生促進活性％を計算するステップ：
を含む力価試験によってＥＶ組成物の血管新生促進活性を定量化するステップ（ｄ）をさらに含む。
管形成インビトロアッセイは、好ましくは、ＨＵＶＥＣ細胞を使用する。管形成インビトロアッセイでは、ＶＥＧＦ、好ましくは１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦが陽性対照に添加される。陰性対照は陽性対照と同じ培地であるが、ＶＥＧＦ添加がない。管形成インビトロアッセイは、好ましくは、標的細胞あたり５００００個のＥＶの濃度に基づく。
－組成物の値を得るために、管形成アッセイによってＥＶの組成物を試験するステップ；
－陰性対照の値を得るために、管形成アッセイによって陰性対照を試験するステップ；
－陽性対照の値を得るために、管形成アッセイによって陽性対照を試験するステップ；
－以下の式を適用することによって、管形成アッセイにおけるＥＶの組成物の血管新生促進活性％を計算するステップ：
【数4】
管形成インビトロアッセイは、好ましくは、ＨＵＶＥＣ細胞を使用する。管形成インビトロアッセイでは、ＶＥＧＦ、好ましくは１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦが陽性対照に添加される。陰性対照は陽性対照と同じ培地であるが、ＶＥＧＦ添加がない。管形成インビトロアッセイは、好ましくは、標的細胞あたり５００００個のＥＶの濃度に基づく。
【0015】
より好ましい実施形態では、陽性対照の活性と比較して所与のＥＶ組成物の活性を試験するために、ＢｒｄＵ細胞増殖アッセイと管形成インビトロアッセイの両方が使用され、この場合、ＢｒｄＵ細胞増殖アッセイ及び管形成アッセイからの平均活性値％が比較される。
本実施形態によれば、本発明の方法は、上記のようなＢｒｄＵ細胞増殖アッセイと管形成インビトロアッセイの両方を含む力価試験によって、ＥＶの組成物の血管新生促進活性を定量化するステップ（ｄ）をさらに含む。
ＥＶの測定された活性が、陽性対照の測定された活性の所定のパーセンテージを超える、例えば、陽性対照の測定された活性の＞５０％である場合、試験したＥＶ調製物は活性であると考えられる。
したがって、本発明の方法におけるＥＶ組成物は、好ましくは、少なくとも５０％の血管新生促進活性を有すると決定される。
さらに、上記の予測的試験は、体液の複数の調製物から、又は細胞培養の条件培地から単離されたＥＶをスクリーニングするのに、及びさらなる処理のために血管新生促進的に活性な調製物を特定するのに適している。
本実施形態によれば、本発明の方法は、上記のようなＢｒｄＵ細胞増殖アッセイと管形成インビトロアッセイの両方を含む力価試験によって、ＥＶの組成物の血管新生促進活性を定量化するステップ（ｄ）をさらに含む。
ＥＶの測定された活性が、陽性対照の測定された活性の所定のパーセンテージを超える、例えば、陽性対照の測定された活性の＞５０％である場合、試験したＥＶ調製物は活性であると考えられる。
したがって、本発明の方法におけるＥＶ組成物は、好ましくは、少なくとも５０％の血管新生促進活性を有すると決定される。
さらに、上記の予測的試験は、体液の複数の調製物から、又は細胞培養の条件培地から単離されたＥＶをスクリーニングするのに、及びさらなる処理のために血管新生促進的に活性な調製物を特定するのに適している。
【0016】
したがって、本発明の第二の態様は、血管新生促進性細胞外小胞（ＥＶ）の調製物を製造する方法であって、
－体液の複数の調製物から、又は細胞培養の条件培地からＥＶを単離するステップ；
－所定の濃度のＥＶで、単離したＥＶから１つ又は複数の試料を調製するステップ；
－上記の方法を用いて、各ＥＶ試料の血管新生促進活性を予測するステップ；
－ｍｉＲ－１３０ａ含量が前記第１の所定の値より高く、ＴＧＦβが前記第２の所定の値より高い試料を選択するステップ；及び任意に
－２つ以上の活性なＥＶ試料をプールするステップ
を含み、
それによって、血管新生促進ＥＶの調製物を得る、方法である。
健常なドナー又は心血管危険因子を有する患者の血清又は他の血液成分に由来するＥＶは、インビトロ及びインビボで血管新生促進シグナルを誘導することができ、この効果は、ｓＥＶがプールされている場合でさえも失われない。
前述のように、それらの研究で、本発明者らは、それぞれ、第１及び第２の所定の値より高いｍｉＲ－１３０ａ及びＴＧＦβの含量を有すると決定されたＥＶ組成物は、強い血管新生促進性状を有すると予測されることを見出した。これらの特色は、ＥＶ組成物を、心血管疾患の危険性と関連する虚血性疾患、虚血性傷害及び病的状態の処置で使用するのに、又は創傷治療における使用に特に適したものにする。
－体液の複数の調製物から、又は細胞培養の条件培地からＥＶを単離するステップ；
－所定の濃度のＥＶで、単離したＥＶから１つ又は複数の試料を調製するステップ；
－上記の方法を用いて、各ＥＶ試料の血管新生促進活性を予測するステップ；
－ｍｉＲ－１３０ａ含量が前記第１の所定の値より高く、ＴＧＦβが前記第２の所定の値より高い試料を選択するステップ；及び任意に
－２つ以上の活性なＥＶ試料をプールするステップ
を含み、
それによって、血管新生促進ＥＶの調製物を得る、方法である。
健常なドナー又は心血管危険因子を有する患者の血清又は他の血液成分に由来するＥＶは、インビトロ及びインビボで血管新生促進シグナルを誘導することができ、この効果は、ｓＥＶがプールされている場合でさえも失われない。
前述のように、それらの研究で、本発明者らは、それぞれ、第１及び第２の所定の値より高いｍｉＲ－１３０ａ及びＴＧＦβの含量を有すると決定されたＥＶ組成物は、強い血管新生促進性状を有すると予測されることを見出した。これらの特色は、ＥＶ組成物を、心血管疾患の危険性と関連する虚血性疾患、虚血性傷害及び病的状態の処置で使用するのに、又は創傷治療における使用に特に適したものにする。
【0017】
したがって、本発明の第三の態様は、リアルタイムＰＣＲによってＣｔ値として測定された調製物中のｍｉＲ－１３０ａ含量が３５以下のＣｔであり、ＴＧＦβ含量が２０ｐｇ／１０10ＥＶ～５０ｐｇ／１０10ＥＶの範囲内に含まれる値より高い、血管新生促進療法によって正の影響を受ける疾患もしくは傷害の治療的処置で使用するための、又は創傷治療で使用するための、血管新生促進性細胞外小胞（ＥＶ）の調製物である。
好ましくは、本発明の血管新生促進ＥＶの調製物中のＴＧＦβ含量は、２３ｐｇ／１０10ＥＶ～４０ｐｇ／１０10ＥＶの範囲内、より好ましくは、例えば、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、又は３５ｐｇ／１０10ＥＶなどの２５ｐｇ／１０10ＥＶ～３５ｐｇ／１０10ＥＶの範囲内に含まれる値より高い。
好ましい実施形態では、本発明の血管新生促進ＥＶの調製物中のＴＧＦβ含量は、＞２３ｐｇ／１０10ＥＶである。
好ましくは、リアルタイムＰＣＲによってＣｔ値として測定された、本発明の血管新生促進ＥＶの調製物中のｍｉＲ－１３０ａ含量は、３３以下のＣｔ、さらにより好ましくは、３０以下のＣｔ、さらにより好ましくは、例えば、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８又は２９などの１０～２９の範囲内に含まれるＣｔである。
好ましくは、本発明の血管新生促進ＥＶの調製物中のＴＧＦβ含量は、２３ｐｇ／１０10ＥＶ～４０ｐｇ／１０10ＥＶの範囲内、より好ましくは、例えば、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、又は３５ｐｇ／１０10ＥＶなどの２５ｐｇ／１０10ＥＶ～３５ｐｇ／１０10ＥＶの範囲内に含まれる値より高い。
好ましい実施形態では、本発明の血管新生促進ＥＶの調製物中のＴＧＦβ含量は、＞２３ｐｇ／１０10ＥＶである。
好ましくは、リアルタイムＰＣＲによってＣｔ値として測定された、本発明の血管新生促進ＥＶの調製物中のｍｉＲ－１３０ａ含量は、３３以下のＣｔ、さらにより好ましくは、３０以下のＣｔ、さらにより好ましくは、例えば、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８又は２９などの１０～２９の範囲内に含まれるＣｔである。
【0018】
好ましい実施形態では、リアルタイムＰＣＲによってＣｔ値として測定された、本発明の血管新生促進ＥＶの調製物中のｍｉＲ－１３０ａ含量はＣｔ＜３０である。
より好ましい実施形態では、本発明による血管新生促進ＥＶの調製物において、リアルタイムＰＣＲによってＣｔ値として測定されたｍｉＲ－１３０ａ含量はＣｔ＜３０であり、ＴＧＦβ含量は＞２３ｐｇ／１０10ＥＶである。
本発明の第四の態様は、前述の製造方法によって得ることができる、上記で定義された本発明に従った使用のための血管新生促進性細胞外小胞（ＥＶ）の調製物である。
本発明によるＥＶ調製物で処置される心血管疾患の危険性と関係がある状態は、好ましくは血管再構築の障害、より好ましくは、肥満、糖尿病、脂質異常症又は高血圧を特徴とする。
好ましい実施形態では、本発明によるＥＶ調製物は、急性心筋梗塞、急性脳血管疾患、急性及び慢性の末梢動脈疾患、急性腎臓虚血、肥満及び糖尿病からなる群から選択される疾患の処置において使用するのに適する。
より好ましい実施形態では、本発明による血管新生促進ＥＶの調製物において、リアルタイムＰＣＲによってＣｔ値として測定されたｍｉＲ－１３０ａ含量はＣｔ＜３０であり、ＴＧＦβ含量は＞２３ｐｇ／１０10ＥＶである。
本発明の第四の態様は、前述の製造方法によって得ることができる、上記で定義された本発明に従った使用のための血管新生促進性細胞外小胞（ＥＶ）の調製物である。
本発明によるＥＶ調製物で処置される心血管疾患の危険性と関係がある状態は、好ましくは血管再構築の障害、より好ましくは、肥満、糖尿病、脂質異常症又は高血圧を特徴とする。
好ましい実施形態では、本発明によるＥＶ調製物は、急性心筋梗塞、急性脳血管疾患、急性及び慢性の末梢動脈疾患、急性腎臓虚血、肥満及び糖尿病からなる群から選択される疾患の処置において使用するのに適する。
【0019】
細胞外小胞は多くの異なる細胞型－いわゆるドナー細胞－によって生成され、生物学的流体（biological fluid）及び細胞又は組織培養物中に遍在的に存在する。したがって、本発明によれば、ＥＶの組成物は、任意の適切な細胞型から、好ましくは有核哺乳動物細胞から、より好ましくは幹細胞から、さらにより好ましくは成体幹細胞から得ることができる。
本明細書の文脈内で、表現「成体幹細胞」は、胚盤胞の内部細胞塊から単離される「胚性幹細胞」とは対照的に、成体組織から単離される幹細胞を意味することが意図される。成体幹細胞は「体性幹細胞」としても知られている。
代替の実施形態によれば、本発明に従った使用のためのＥＶ調製物は、生物学的流体から、又は細胞もしくは組織培養条件培地から単離される。
好ましくは、本発明に従った使用のためのＥＶ調製物は、血液成分、より好ましくは全血、血漿又は血清（ｓＥＶ）から単離される。
一実施形態では、血管新生促進ＥＶは健常なドナーの献血から調製される。
別の実施形態では、血管新生促進ＥＶは、患者の献血、より好ましくは心血管危険因子を有する患者から調製される。
本明細書の文脈内で、表現「成体幹細胞」は、胚盤胞の内部細胞塊から単離される「胚性幹細胞」とは対照的に、成体組織から単離される幹細胞を意味することが意図される。成体幹細胞は「体性幹細胞」としても知られている。
代替の実施形態によれば、本発明に従った使用のためのＥＶ調製物は、生物学的流体から、又は細胞もしくは組織培養条件培地から単離される。
好ましくは、本発明に従った使用のためのＥＶ調製物は、血液成分、より好ましくは全血、血漿又は血清（ｓＥＶ）から単離される。
一実施形態では、血管新生促進ＥＶは健常なドナーの献血から調製される。
別の実施形態では、血管新生促進ＥＶは、患者の献血、より好ましくは心血管危険因子を有する患者から調製される。
【0020】
より好ましい実施形態では、心血管危険因子を有する患者の血液から調製される血管新生促進ＥＶは、同じ患者の処置のための医薬としての使用に適する。
さらに、上記の実施形態のすべてにおいて、本発明の調製物は医薬調製物でもよく、これは、上記で定義された血管新生促進ＥＶならびに医薬的に許容可能な賦形剤及び／又は担体及び／又は希釈剤を含む。担体、ビヒクル又は希釈剤及び任意の他の賦形剤の選択は、特に、選択される医薬剤形、投与経路及び投与レジメン、ならびに患者の特徴及び治療される疾患を考慮すれば、当業者の技能の範囲内である。
本発明は、例示のためのみに提供され、添付の図面を参照する以下の実施例からより良く理解されるであろう。
さらに、上記の実施形態のすべてにおいて、本発明の調製物は医薬調製物でもよく、これは、上記で定義された血管新生促進ＥＶならびに医薬的に許容可能な賦形剤及び／又は担体及び／又は希釈剤を含む。担体、ビヒクル又は希釈剤及び任意の他の賦形剤の選択は、特に、選択される医薬剤形、投与経路及び投与レジメン、ならびに患者の特徴及び治療される疾患を考慮すれば、当業者の技能の範囲内である。
本発明は、例示のためのみに提供され、添付の図面を参照する以下の実施例からより良く理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0021】
【図1-1】ＮａｎｏｓｉｇｈｔによるｓＥＶの特徴付けの結果を示す図である。（Ａ）患者の個々の群（健常なドナー（Ｈ）、肥満（Ｄ）、糖尿病（Ｏ）、糖尿病／肥満（Ｏ／Ｄ）及び虚血性（ＩＣ）患者）に言及するＮＴＡ解析の代表的な画像。
【図1-2】ＮａｎｏｓｉｇｈｔによるｓＥＶの特徴付けの結果を示す図である。（Ｂ）個々の対象のそれぞれ（健常なドナー、肥満（Ｄ）、糖尿病（Ｏ）、糖尿病／肥満（Ｏ／Ｄ）及び虚血性（ＩＣ）患者）に対する平均サイズ値をともなう、ＮＴＡサイズ分布を示すドットプロットグラフ。（Ｃ）患者の個々の群からの血清から回収されたＥＶの数を報告するヒストグラム。Ｄ＝糖尿病；Ｏ＝肥満；ＯＤ＝肥満／糖尿病；ＩＣ＝虚血性患者。＊ｐ＜０．０５肥満及び虚血性患者対健常な対象；（一元配置ＡＮＯＶＡ、それに続く多重比較検定）（ｎ＝９患者／群）。
【図2】健常なドナー及び患者からの血清ＥＶのインビトロ及びインビボでの血管新生促進活性を示す図である。（Ａ）有効ｓＥＶ及び無効ｓＥＶに応答した血管形成を示す代表的な顕微鏡写真。各数は個々の対象から調製されたｓＥＶを示す（上部パネル＝無効ｓＥＶ；下部パネル＝有効ｓＥＶ）（ＯＤを除いて群ごとにｎ＝３。３回の独立した実験で同じ試料を使用した）。（Ｂ）血管形成のインビボ定量解析の結果。各実験条件について、マトリゲルの１０切片で血管を数えた。データは、未処置マウス（Ｃ）（ｎ＝３）において、又はＥＶの以下の調製物で処置したマウスにおいて数えた血管の平均数を示す：健常なドナーからの血管新生促進無効ｓＥＶ（ｉ－ｓＥＶ）、健常なドナーからの血管新生促進有効ｓＥＶ（ｅ－ｓＥＶ）；糖尿病患者からの血管新生促進無効ｓＥＶ（Ｄ ｉ－ｓＥＶ）、糖尿病患者からの血管新生促進有効ｓＥＶ（Ｄ ｅ－ｓＥＶ）；肥満患者からの血管新生促進無効ｓＥＶ（Ｏ ｉ－ｓＥＶ）、肥満患者からの血管新生促進有効ｓＥＶ（Ｏ ｅ－ｓＥＶ）；糖尿病／肥満患者からの血管新生促進無効ｓＥＶ（ＯＤ ｉ－ｓＥＶ）、糖尿病／肥満患者からの血管新生促進有効ｓＥＶ（ＯＤ ｅ－ｓＥＶ）；虚血性患者からの血管新生促進無効ｓＥＶ（ＩＣ ｉ－ｓＥＶ）、虚血性患者からの血管新生促進有効ｓＥＶ（ＩＣ ｅ－ｓＥＶ）。＊ｐ＜０．０５健常なｅ－ｓＥＶ対健常なｉ－ｓＥＶ；§ｐ＜０．０５糖尿病ｅ－ｓＥＶ対糖尿病ｉ－ｓＥＶ；＃ｐ＜０．０５肥満ｅ－ｓＥＶ対肥満ｉ－ｓＥＶ；゜ｐ＜０．０５糖尿病／肥満のｅ－ｓＥＶ対糖尿病／肥満ｉ－ｓＥＶ；＋ｐ＜０．０５虚血性ｅ－ｓＥＶ対虚血性ｉ－ｓＥＶ虚血性；（一元配置ＡＮＯＶＡ、それに続く多重比較検定）。（ＯＤを除いて群ごとにｎ＝３。３回の独立した実験で同じ試料を使用した）。（原倍率：×２００；スケールバー：１２μｍ）。
【図3-1】ｓＥＶの血管新生促進活性が、そのＴＧＦβ含量と相関することを示す図である。グラフは、各群（健常なドナー、糖尿病）の個々の対象から調製した血清ＥＶの試料から得られたデータを報告する。患者の各群について、上部の曲線はｐｇ／１０10ＥＶとしてのｓＥＶで測定されたＴＧＦβ含量を指し、一方で、下部の曲線はインビトロ力価試験で測定された血管新生促進活性の％を指す。点線は、血管新生促進に有効及び無効なｓＥＶに対するＴＧＦβ＞２３ｐｇ／１０10ＥＶのカットオフを示す。各数は個々の患者に対応する（群ごとにｎ＝３）。
【図3-2】ｓＥＶの血管新生促進活性が、そのＴＧＦβ含量と相関することを示す図である。グラフは、各群（肥満及び虚血性患者）の個々の対象から調製した血清ＥＶの試料から得られたデータを報告する。患者の各群について、上部の曲線はｐｇ／１０10ＥＶとしてのｓＥＶで測定されたＴＧＦβ含量を指し、一方で、下部の曲線はインビトロ力価試験で測定された血管新生促進活性の％を指す。点線は、血管新生促進に有効及び無効なｓＥＶに対するＴＧＦβ＞２３ｐｇ／１０10ＥＶのカットオフを示す。各数は個々の患者に対応する（群ごとにｎ＝３）。
【図4-1】ｓＥＶにおけるｍｉＲＮＡ発現プロファイリングの結果を示す。（Ａ）個々の患者及び健常な対象からの血管新生促進に有効（黒丸）及び無効（白丸）なｓＥＶにおいてｍｉＲ－１３０ａについて測定したＣｔ値の分布。４０－Ｃｔとして結果を報告する。
【図4-2】ｓＥＶにおけるｍｉＲＮＡ発現プロファイリングの結果を示す。（Ｂ）経路のネットワーク解析はｍｉＲ－１３０ａと正に相関した。データはＤＩＡＮＡ ｍｉＲｐａｔｈ解析から得た。少なくとも１５遺伝子を含む経路のみを選択した。
【図5】（Ａ）ｍｉＲ－１３０ａとｍＲＮＡ標的の間のネットワーク解析を示す図である。線は、ＩＰＡソフトウェアによって予測される遺伝子とｍｉＲ－１３０ａの間の相互作用を示す：間接的相互作用（点線）、直接的相互作用（実線）。四角はＴＧＦβ及びＴＧＦＢＲを含む。円は血管新生に関与する遺伝子（ＫＤＲ、ＥＰＨＢ６、ＲＯＣＫ１、ＨＯＸＡ５）を含む。（Ｂ）受信者動作特性（Ｒｅｃｅｉｖｉｎｇ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）（ＲＯＣ）曲線及び対応する曲線下面積（ＡＵＣ）は、ｍｉＲ－１３０ａ及びＴＧＦβが無効小胞から血管新生促進有効ｓＥＶを区別する予測能力を有することを示す。ＲＯＣ解析については、すべての患者及び健常な対象からのｓＥＶから得られた結果を考慮した。ＡＵＣ値ならびに標準誤差、Ｐ値及び閾値をＲＯＣ曲線の下の表に報告する。
【実施例】
【0022】
１．方法
１．１患者
本発明者らが行った研究では、心血管危険因子を有する３６人の患者及び９人の性別が一致した健常なボランティアを含んでいた。特に、９人の糖尿病患者（Ｄ：ｎ＝９）、９人の肥満患者（Ｏ：ｎ＝９）、９人の糖尿病及び肥満患者（ＯＤ：ｎ＝９）、ならびに９人の虚血性患者（下肢虚血について外科的処置を受けている患者）（ＩＣ：ｎ＝９）を調べた。すべての糖尿病患者は、インスリンで処置されていなかった。すべてのヒト実験は、欧州の指針及び方針に従って行い、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｕｒｉｎ、Ｉｔａｌｙの倫理委員会によって承認された。すべての患者からの血清は、クリニックへの入院後に（Ｄ、Ｏ、ＯＤ）、及び虚血性患者（ＩＣ）については外科手術の前に得た。インフォームドコンセントをすべての患者から得た。健常なドナー（ｎ＝９）からのヒト血清は、インフォームドコンセント及び血液バンクの内部審査会による承認の後に、「Ｃｉｔｔａ ｄｅｌｌａ Ｓａｌｕｔｅ ｅ ｄｅｌｌａ Ｓｃｉｅｎｚａ ｄｉ Ｔｏｒｉｎｏ」の血液バンクによって提供された。
１．１患者
本発明者らが行った研究では、心血管危険因子を有する３６人の患者及び９人の性別が一致した健常なボランティアを含んでいた。特に、９人の糖尿病患者（Ｄ：ｎ＝９）、９人の肥満患者（Ｏ：ｎ＝９）、９人の糖尿病及び肥満患者（ＯＤ：ｎ＝９）、ならびに９人の虚血性患者（下肢虚血について外科的処置を受けている患者）（ＩＣ：ｎ＝９）を調べた。すべての糖尿病患者は、インスリンで処置されていなかった。すべてのヒト実験は、欧州の指針及び方針に従って行い、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｕｒｉｎ、Ｉｔａｌｙの倫理委員会によって承認された。すべての患者からの血清は、クリニックへの入院後に（Ｄ、Ｏ、ＯＤ）、及び虚血性患者（ＩＣ）については外科手術の前に得た。インフォームドコンセントをすべての患者から得た。健常なドナー（ｎ＝９）からのヒト血清は、インフォームドコンセント及び血液バンクの内部審査会による承認の後に、「Ｃｉｔｔａ ｄｅｌｌａ Ｓａｌｕｔｅ ｅ ｄｅｌｌａ Ｓｃｉｅｎｚａ ｄｉ Ｔｏｒｉｎｏ」の血液バンクによって提供された。
【0023】
１．２．研究の承認
動物研究は、実験動物の管理と使用に関するイタリア国立衛生研究所の指針（Ｉｔａｌｉａｎ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ）（プロトコール番号：４９０／２１０５－ＰＲ）に従って行った。マウスは、欧州実験動物科学協会連盟の指針（Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ）及びＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｕｒｉｎの倫理委員会に従って飼育した。すべての実験は、関連する指針及び規制に従って行った。
動物研究は、実験動物の管理と使用に関するイタリア国立衛生研究所の指針（Ｉｔａｌｉａｎ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ）（プロトコール番号：４９０／２１０５－ＰＲ）に従って行った。マウスは、欧州実験動物科学協会連盟の指針（Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ）及びＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｕｒｉｎの倫理委員会に従って飼育した。すべての実験は、関連する指針及び規制に従って行った。
【0024】
１．３．血清ＥＶの単離
ヒトの血液は、健常ドナー及び患者ドナーから静脈穿刺によって得た。ドナーごとに合計で９ｍｌの血清を各ドナーから回収し、－８０℃で保存した。解凍後、３０００ｇで遠心分離して残屑を除去した後、１００．０００×ｇで２時間の超遠心分離によって全ＥＶを単離し、精製した。ペレットをＰＢＳで１回洗浄し、１００．０００×ｇ、４℃で１時間遠心分離した。試料は、新鮮な状態で使用したか、又は８０℃で保存した後に解凍した。
ヒトの血液は、健常ドナー及び患者ドナーから静脈穿刺によって得た。ドナーごとに合計で９ｍｌの血清を各ドナーから回収し、－８０℃で保存した。解凍後、３０００ｇで遠心分離して残屑を除去した後、１００．０００×ｇで２時間の超遠心分離によって全ＥＶを単離し、精製した。ペレットをＰＢＳで１回洗浄し、１００．０００×ｇ、４℃で１時間遠心分離した。試料は、新鮮な状態で使用したか、又は８０℃で保存した後に解凍した。
【0025】
１．４ ナノ粒子追跡解析
４０５ｎｍのレーザー及びＮＴＡ２．３解析ソフトウェアを備えたＮａｎｏＳｉｇｈｔ ＬＭ１０システム（ＮａｎｏＳｉｇｈｔ Ｌｔｄ．、Ａｍｅｓｂｕｒｙ、ＵＫ）を使用して、ナノ粒子追跡解析（ＮＴＡ）によって、ｓＥＶを解析して、それらの寸法及びプロファイルを明らかにした。１４のカメラレベル設定ですべての取得を行い、各試料について、３０秒の持続時間の３つのビデオを記録した。１ｍｌの小胞非含有生理溶液（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ Ｋａｂｉ、Ｒｕｎｃｏｒｎ、ＵＫ）中にｓＥＶを希釈した（１：１０００）。ＮＴＡの取得後設定を最適化し、試料全体にわたって一定に維持し、次いで、各ビデオを解析して、ＥＶのサイズ、分布及び濃度を測定した。
４０５ｎｍのレーザー及びＮＴＡ２．３解析ソフトウェアを備えたＮａｎｏＳｉｇｈｔ ＬＭ１０システム（ＮａｎｏＳｉｇｈｔ Ｌｔｄ．、Ａｍｅｓｂｕｒｙ、ＵＫ）を使用して、ナノ粒子追跡解析（ＮＴＡ）によって、ｓＥＶを解析して、それらの寸法及びプロファイルを明らかにした。１４のカメラレベル設定ですべての取得を行い、各試料について、３０秒の持続時間の３つのビデオを記録した。１ｍｌの小胞非含有生理溶液（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ Ｋａｂｉ、Ｒｕｎｃｏｒｎ、ＵＫ）中にｓＥＶを希釈した（１：１０００）。ＮＴＡの取得後設定を最適化し、試料全体にわたって一定に維持し、次いで、各ビデオを解析して、ＥＶのサイズ、分布及び濃度を測定した。
【0026】
１．５ ｓＥＶの血管新生アッセイ
一次大血管内皮細胞（ＥＣ）及び毛細血管内皮細胞（ＨＭＥＣ）をＬｏｎｚａ（Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から購入し、製造者の指示書に記載されているように培養した。インビトロ血管新生力価試験及びインビボ血管新生試験は、以前に記載されているように（Cavallari C. et al, “Serum-derived extracellular vesicles (EVs) impact on vascular remodeling and prevent muscle damage in acute hind limb ischemia” (2017) Sci Rep. 7(1):8180）行った。手短に言えば、５×１０4ｓＥＶ／標的細胞をインビトロ研究全体を通して施した。ＢｒｄＵ及びインビトロ管形成アッセイを使用して、単一試料からのｓＥＶをその血管新生促進活性について評価した。５０％の％カットオフ値に従って、すべての解析群のＥＶを、血管新生促進活性ＥＶ又は血管新生促進不活性ＥＶに分類した。
インビボ血管新生は、以前に記載されているように（Lopatina T. et al, “Platelet-derived growth factor regulates the secretion of extracellular vesicles by adipose mesenchymal stem cells and enhances their angiogenic potential” (2014) Cell Commun Signal. 12:26）、血管の増殖を測定することによって評価した。手短に言えば、ＥＣ（１×１０6細胞／注射）をｓＥＶ（１×１０6個のＥＣあたり５×１０10ＥＶ）と一晩インキュベートした。次いで、雄の重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）マウス（６週齢）に皮下注射した。同数の非刺激ＥＣを陰性対照として使用した。マトリゲルプラグを７日目に回収し、固定し、トリクローム染色方法を使用して染色した。以前に記載されているように（Lopatina T. et al, “Platelet-derived growth factor regulates the secretion of extracellular vesicles by adipose mesenchymal stem cells and enhances their angiogenic potential” (2014) Cell Commun Signal. 12:26）、血管管腔領域を決定した。
一次大血管内皮細胞（ＥＣ）及び毛細血管内皮細胞（ＨＭＥＣ）をＬｏｎｚａ（Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から購入し、製造者の指示書に記載されているように培養した。インビトロ血管新生力価試験及びインビボ血管新生試験は、以前に記載されているように（Cavallari C. et al, “Serum-derived extracellular vesicles (EVs) impact on vascular remodeling and prevent muscle damage in acute hind limb ischemia” (2017) Sci Rep. 7(1):8180）行った。手短に言えば、５×１０4ｓＥＶ／標的細胞をインビトロ研究全体を通して施した。ＢｒｄＵ及びインビトロ管形成アッセイを使用して、単一試料からのｓＥＶをその血管新生促進活性について評価した。５０％の％カットオフ値に従って、すべての解析群のＥＶを、血管新生促進活性ＥＶ又は血管新生促進不活性ＥＶに分類した。
インビボ血管新生は、以前に記載されているように（Lopatina T. et al, “Platelet-derived growth factor regulates the secretion of extracellular vesicles by adipose mesenchymal stem cells and enhances their angiogenic potential” (2014) Cell Commun Signal. 12:26）、血管の増殖を測定することによって評価した。手短に言えば、ＥＣ（１×１０6細胞／注射）をｓＥＶ（１×１０6個のＥＣあたり５×１０10ＥＶ）と一晩インキュベートした。次いで、雄の重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）マウス（６週齢）に皮下注射した。同数の非刺激ＥＣを陰性対照として使用した。マトリゲルプラグを７日目に回収し、固定し、トリクローム染色方法を使用して染色した。以前に記載されているように（Lopatina T. et al, “Platelet-derived growth factor regulates the secretion of extracellular vesicles by adipose mesenchymal stem cells and enhances their angiogenic potential” (2014) Cell Commun Signal. 12:26）、血管管腔領域を決定した。
【0027】
１．６ ＴＧＦβ ＥＬＩＳＡアッセイ
製造者の指示書に従って、固相サンドイッチ酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｅｓ ＴＧＦ－β１キット、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、健常な対象及び患者の血清試料から単離されたＥＶ中のＴＧＦβ含量を測定した。実験は、１ｘ１０11ＥＶを含む試料に対して３連で行った。アッセイで得られた着色生成物の強度は、４５０ｎｍの吸光度でＥＬＩＳＡ ｉＭａｒｋ（商標）マイクロプレート吸光度リーダー（Ｂｉｏ Ｒａｄ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて決定した。ＥＶ調製物中に存在するＴＧＦβの濃度は、ｐｇ／１０10ＥＶとして表した。
製造者の指示書に従って、固相サンドイッチ酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｅｓ ＴＧＦ－β１キット、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、健常な対象及び患者の血清試料から単離されたＥＶ中のＴＧＦβ含量を測定した。実験は、１ｘ１０11ＥＶを含む試料に対して３連で行った。アッセイで得られた着色生成物の強度は、４５０ｎｍの吸光度でＥＬＩＳＡ ｉＭａｒｋ（商標）マイクロプレート吸光度リーダー（Ｂｉｏ Ｒａｄ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて決定した。ＥＶ調製物中に存在するＴＧＦβの濃度は、ｐｇ／１０10ＥＶとして表した。
【0028】
１．７ ｍｉＲＮＡ発現プロファイリング
ｓＥＶに含まれるｍｉＲＮＡの発現プロファイル（いわゆる、ｍｉＲＮｏｍｅ）は、製造者によって推奨されるプロトコールに従って、ｍｉＲＮｏｍｅ ｍｉｃｒｏＲＮＡ Ｐｒｏｆｉｌｅｒｓ ＱｕａｎｔｉＭｉｒ（ＳＢＩ、Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、１１４０種のマイクロＲＮＡに対してリアルタイムＰＣＲによって評価した。キットは、各プレート上に標準化シグナルとして３種の内在参照ＲＮＡ（ヒトＵ６ ｓｎＲＮＡ、核小体低分子ＲＮＡ ＲＮＵ４３及びＨｍ／Ｍｓ／Ｒｔ Ｕ１ ｓｎＲＮＡ）を含む、ヒトマイクロＲＮＡについて予めフォーマットされたプレート中でのアッセイを含む。
ｓＥＶに含まれるｍｉＲＮＡの発現プロファイル（いわゆる、ｍｉＲＮｏｍｅ）は、製造者によって推奨されるプロトコールに従って、ｍｉＲＮｏｍｅ ｍｉｃｒｏＲＮＡ Ｐｒｏｆｉｌｅｒｓ ＱｕａｎｔｉＭｉｒ（ＳＢＩ、Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、１１４０種のマイクロＲＮＡに対してリアルタイムＰＣＲによって評価した。キットは、各プレート上に標準化シグナルとして３種の内在参照ＲＮＡ（ヒトＵ６ ｓｎＲＮＡ、核小体低分子ＲＮＡ ＲＮＵ４３及びＨｍ／Ｍｓ／Ｒｔ Ｕ１ ｓｎＲＮＡ）を含む、ヒトマイクロＲＮＡについて予めフォーマットされたプレート中でのアッセイを含む。
【0029】
手短に述べると、Ｈｉｇｈ－Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）を使用して、１００ｎｇのＲＮＡを逆転写した。すべてのｑＲＴ－ＰＣＲ反応は、以下の条件下で、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（商標）リアルタイムＰＣＲシステムで行った：９５℃で１５秒（ＰＣＲの最初の活性化ステップ）、続いて４０サイクルにわたって３ステップサイクル（９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、７０℃で３０秒）。スクリーニングでは、上記の力価試験で血管新生促進活性（ｎ＝３）及び血管新生促進不活性（ｎ＝３）と評価された健常な対象の血清から収集されたｓＥＶについて、ｍｉＲＮｏｍｅをプロファイリングした。解析する各ｓＥＶ試料に対して、ｍｉＲＮＡに対するＣｔ値を外挿した。有効なｓＥＶ集団と無効なｓＥＶ集団の両方の異なる試料（ｎ＝３）からのＣｔの平均を示すＣｔを内在参照ＲＮＡに対して標準化し、２-(ΔCt)値に変換した（Livak KJ and Schmittgen TD, “Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method” (2001) Methods 25: 402-408）。
【0030】
ｍｉＳｃｒｉｐｔ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して、健常なドナー及び患者からのｓＥＶに対してｍｉＲＮＡの検証を行った。手短に言えば、ｓＥＶ試料から単離した１００ｎｇの投入ＲＮＡをｍｉＳｃｒｉｐｔ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用して逆転写し、このようにして得られたｃＤＮＡを使用して、目的のｍｉＲＮＡを検出及び定量化した。実験は、製造業者のプロトコール（Ｑｉａｇｅｎ）によって記載されているように、反応ごとに３ｎｇのｃＤＮＡを使用して３連で実施した。すべての患者由来のｓＥＶで以下のｍｉＲＮＡがスクリーニングされた：ｍｉＲ－１２６（配列番号２）、ｍｉＲ－２１（配列番号３）、ｍｉＲ－２９６－３ｐ（配列番号４）、ｍｉＲ－２１０（配列番号５）、ｍｉＲ－１３０ａ（配列番号１）、ｍｉＲ－２７ａ（配列番号６）、ｍｉＲ－２９ａ（配列番号７）、ｍｉＲ－１９１（配列番号８）。内部対照としてＲＮＵ６Ｂ及びＲＮＵ４３参照遺伝子を使用して、ｑＲＴ－ＰＣＲで得られた増幅データを標準化した。標的配列及び内在対照の増幅効率は、ほぼ等しいことが示された。
【0031】
１．８ ｍｉＲＮＡ ＥＶ内容物の経路及び標的予測解析
ＥＶ ｍｉＲＮＡの標的予測及び生物学的経路濃縮解析を行うために、ウェブベースのプログラムＤＩＡＮＡｍｉｒＰａｔｈを使用した（Collino F. et al, “Exosome and Microvesicle-Enriched Fractions Isolated from Mesenchymal Stem Cells by Gradient Separation Showed Different Molecular Signatures and Functions on Renal Tubular Epithelial Cells” (2017) Stem Cell Rev.(2):226-43）。ｍｉｃｒｏＴ－ＣＤＳアルゴリズムを選択して、デフォルトの閾値（ｍｉｃｒｏＴ＝０．８）を使用してＥＶ由来ｍｉＲＮＡの標的を予測した。すべての既知の京都遺伝子ゲノム百科事典（Ｋｙｏｔｏ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅｓ）（ＫＥＧＧ）経路に対してＰ値＜０．０１を示す生物学的経路のみを、有意に濃縮されたと考えた。Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ ＩＰＡ経路解析を使用して、ｍｉＲ－１３０ａに対する標的遺伝子を予測した。本発明者らは、ｍｉＲＮＡ Ｔａｒｇｅｔ Ｆｉｌｔｅｒ ｔｏｏｌ ｏｎ ＩＰＡ （Ｑｉａｇｅｎ： ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｑｉａｇｅｎ－ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ－ｐａｔｈｗａｙ－ａｎａｌｙｓｉｓ／）をセットアップして、ｍｉＲ－１３０ａを予測されるｍＲＮＡ標的と関連付けた。
ＥＶ ｍｉＲＮＡの標的予測及び生物学的経路濃縮解析を行うために、ウェブベースのプログラムＤＩＡＮＡｍｉｒＰａｔｈを使用した（Collino F. et al, “Exosome and Microvesicle-Enriched Fractions Isolated from Mesenchymal Stem Cells by Gradient Separation Showed Different Molecular Signatures and Functions on Renal Tubular Epithelial Cells” (2017) Stem Cell Rev.(2):226-43）。ｍｉｃｒｏＴ－ＣＤＳアルゴリズムを選択して、デフォルトの閾値（ｍｉｃｒｏＴ＝０．８）を使用してＥＶ由来ｍｉＲＮＡの標的を予測した。すべての既知の京都遺伝子ゲノム百科事典（Ｋｙｏｔｏ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅｓ）（ＫＥＧＧ）経路に対してＰ値＜０．０１を示す生物学的経路のみを、有意に濃縮されたと考えた。Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ ＩＰＡ経路解析を使用して、ｍｉＲ－１３０ａに対する標的遺伝子を予測した。本発明者らは、ｍｉＲＮＡ Ｔａｒｇｅｔ Ｆｉｌｔｅｒ ｔｏｏｌ ｏｎ ＩＰＡ （Ｑｉａｇｅｎ： ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｑｉａｇｅｎ－ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ－ｐａｔｈｗａｙ－ａｎａｌｙｓｉｓ／）をセットアップして、ｍｉＲ－１３０ａを予測されるｍＲＮＡ標的と関連付けた。
【0032】
１．９ ＲＯＣ解析
主要なデータは、参照標準（ＲＳ）とみなされる２つの調査群「真の血管新生促進活性ｓＥＶ」／「真の血管新生促進不活性ｓＥＶ」に対する平均、標準偏差（ＳＤ）、中央値及び９５％信頼区間として提示される。ｍｉＲ－１３０ａ及びＴＧＦβに対する予測性を評価するために、ＲＯＣ曲線を使用してＲＳの達成を評価した（Grund B and Sabin C. “Analysis of biomarker data: logs, odds ratios, and receiver operating characteristic curves” (2010) Curr Opin HIV AIDS 5(6):473-9）。Ｃｔ値として測定されたｍｉＲ－１３０ａの含量及びｐｇ／１０10ＥＶとして測定されたＴＧＦβの含量に基づいて、ｓＥＶ組成物を以下のカテゴリーに分類した：
１．ｍｉＲ－１３０ａ Ｃｔ値≧３０を示すｓＥＶは、血管新生促進無効ｓＥＶと考えられた；
２．ＴＧＦβ含量＜２３ｐｇ／１０10ＥＶを示すｓＥＶは、血管新生促進無効ｓＥＶと考えられた。
ＲＳで定義された「真の血管新生促進不活性ｓＥＶ」を予測するための上記の基準に対するＲＯＣ曲線解析に基づくカットオフスコアの「優秀さ」を評価するために、予測能力を２つの基準のそれぞれについて別々に、及び「シリーズ」アプローチによって２つの基準を組み合わせることの両方によって評価した（「血管新生促進無効ｓＥＶ」は、両方の測定について血管新生促進無効であるｓＥＶ、「非血管新生促進無効ｓＥＶ」は、２つの基準のうちの少なくとも１つについて「非血管新生促進無効ｓＥＶ」である小胞とする）。
解析は、感度（Ｓｅ）、特異性（Ｓｐ）及び陽性尤度比（ＬＨ＋）［「真の血管新生促進有効ｓＥＶ」と比較して、「血管新生促進無効ｓＥＶ」「真の血管新生促進無効ｓＥＶ」として特定する確率］ならびに相対的９５％信頼区間値に基づいていた。
主要なデータは、参照標準（ＲＳ）とみなされる２つの調査群「真の血管新生促進活性ｓＥＶ」／「真の血管新生促進不活性ｓＥＶ」に対する平均、標準偏差（ＳＤ）、中央値及び９５％信頼区間として提示される。ｍｉＲ－１３０ａ及びＴＧＦβに対する予測性を評価するために、ＲＯＣ曲線を使用してＲＳの達成を評価した（Grund B and Sabin C. “Analysis of biomarker data: logs, odds ratios, and receiver operating characteristic curves” (2010) Curr Opin HIV AIDS 5(6):473-9）。Ｃｔ値として測定されたｍｉＲ－１３０ａの含量及びｐｇ／１０10ＥＶとして測定されたＴＧＦβの含量に基づいて、ｓＥＶ組成物を以下のカテゴリーに分類した：
１．ｍｉＲ－１３０ａ Ｃｔ値≧３０を示すｓＥＶは、血管新生促進無効ｓＥＶと考えられた；
２．ＴＧＦβ含量＜２３ｐｇ／１０10ＥＶを示すｓＥＶは、血管新生促進無効ｓＥＶと考えられた。
ＲＳで定義された「真の血管新生促進不活性ｓＥＶ」を予測するための上記の基準に対するＲＯＣ曲線解析に基づくカットオフスコアの「優秀さ」を評価するために、予測能力を２つの基準のそれぞれについて別々に、及び「シリーズ」アプローチによって２つの基準を組み合わせることの両方によって評価した（「血管新生促進無効ｓＥＶ」は、両方の測定について血管新生促進無効であるｓＥＶ、「非血管新生促進無効ｓＥＶ」は、２つの基準のうちの少なくとも１つについて「非血管新生促進無効ｓＥＶ」である小胞とする）。
解析は、感度（Ｓｅ）、特異性（Ｓｐ）及び陽性尤度比（ＬＨ＋）［「真の血管新生促進有効ｓＥＶ」と比較して、「血管新生促進無効ｓＥＶ」「真の血管新生促進無効ｓＥＶ」として特定する確率］ならびに相対的９５％信頼区間値に基づいていた。
【0033】
１．１０ 統計解析
データは、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６．０ Ｄｅｍｏプログラムを使用して解析した。結果は、そうでないと報告されない限り、平均±ＳＤ又は±ＳＥＭとして表す。統計解析は、一元配置ＡＮＯＶＡ、続いて、チューキーの事後又は多重比較、２群比較のためのスチューデントのｔ検定、及び必要に応じてニューマン－クールズ多重比較検定を使用して行った。統計的有意性のカットオフはｐ＜０．０５（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）に設定した。
データは、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６．０ Ｄｅｍｏプログラムを使用して解析した。結果は、そうでないと報告されない限り、平均±ＳＤ又は±ＳＥＭとして表す。統計解析は、一元配置ＡＮＯＶＡ、続いて、チューキーの事後又は多重比較、２群比較のためのスチューデントのｔ検定、及び必要に応じてニューマン－クールズ多重比較検定を使用して行った。統計的有意性のカットオフはｐ＜０．０５（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）に設定した。
【0034】
２．結果
２．１ 血清ＥＶの特徴付け
本発明者らが行った研究では、健常個体に由来するｓＥＶの９試料及び患者コホートに由来するｓＥＶの３６試料をそれらの数及びサイズについて調べた。ｓＥＶのサイズの分布は、健常個体と患者の間でいかなる有意差も示さなかった（図１Ａ及びＢ）。観察された平均粒径は約１３８ｎｍであった。患者のｓＥＶの数は健常な対象よりも高かった（図１Ｃ）。肥満及び虚血性患者で、有意に高いレベルのｓＥＶが検出された（図１Ｃ）。
２．１ 血清ＥＶの特徴付け
本発明者らが行った研究では、健常個体に由来するｓＥＶの９試料及び患者コホートに由来するｓＥＶの３６試料をそれらの数及びサイズについて調べた。ｓＥＶのサイズの分布は、健常個体と患者の間でいかなる有意差も示さなかった（図１Ａ及びＢ）。観察された平均粒径は約１３８ｎｍであった。患者のｓＥＶの数は健常な対象よりも高かった（図１Ｃ）。肥満及び虚血性患者で、有意に高いレベルのｓＥＶが検出された（図１Ｃ）。
【0035】
２．２患者に由来する血清ＥＶの血管新生促進活性
異なる患者群に由来するｓＥＶの血管新生活性をインビトロで評価するために、上記の実施例１．３に記載されているように力価試験を行った。５０％を超える平均値を示すｓＥＶの組成物を血管新生促進活性と考えた。
異なる患者群からの血管新生促進に有効及び無効なｓＥＶを使用して、血管新生力価試験の結果をインビボで検証した（図２Ａ～Ｂ）。
異なる患者群に由来するｓＥＶの血管新生活性をインビトロで評価するために、上記の実施例１．３に記載されているように力価試験を行った。５０％を超える平均値を示すｓＥＶの組成物を血管新生促進活性と考えた。
異なる患者群からの血管新生促進に有効及び無効なｓＥＶを使用して、血管新生力価試験の結果をインビボで検証した（図２Ａ～Ｂ）。
【0036】
２．３ ｓＥＶ中のＴＧＦβ含量及びその血管新生能力
ｓＥＶ中のＴＧＦβ含量が、その血管新生能力を説明することができるかどうかを調査するために、本発明者らは、健常な対象ならびに患者（糖尿病、肥満、糖尿病／肥満及び虚血性患者）の血清試料から単離されたＥＶに対してＥＬＩＳＡアッセイを行った。図３に示すように、ｓＥＶ組成物中で測定されたＴＧＦβの含量は、患者コホート及び健常なドナーにおいて、これらの小胞の血管新生促進能力と有意に相関する。２３ｐｇ／１０10ＥＶのＴＧＦβの濃度に相当するカットオフ値を、ＴＧＦβ含量＜２３ｐｇ／１０10ＥＶを有するＥＶは血管新生促進不活性である可能性が高いという知見に基づいて、血管新生促進有効ＥＶと無効小胞を区別すると判断した。
ｓＥＶ中のＴＧＦβ含量が、その血管新生能力を説明することができるかどうかを調査するために、本発明者らは、健常な対象ならびに患者（糖尿病、肥満、糖尿病／肥満及び虚血性患者）の血清試料から単離されたＥＶに対してＥＬＩＳＡアッセイを行った。図３に示すように、ｓＥＶ組成物中で測定されたＴＧＦβの含量は、患者コホート及び健常なドナーにおいて、これらの小胞の血管新生促進能力と有意に相関する。２３ｐｇ／１０10ＥＶのＴＧＦβの濃度に相当するカットオフ値を、ＴＧＦβ含量＜２３ｐｇ／１０10ＥＶを有するＥＶは血管新生促進不活性である可能性が高いという知見に基づいて、血管新生促進有効ＥＶと無効小胞を区別すると判断した。
【0037】
２．４ ｓＥＶのｍｉＲＮｏｍｅプロファイル
健常なドナー（各３試料）からの血管新生促進に有効及び無効なｓＥＶに対する、本発明者らが行ったｍｉＲＮｏｍｅ解析は、最も差次的に発現しているとして８種の血管－ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲ－１２６、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－２９６－３ｐ、ｍｉＲ－２１０、ｍｉＲ－１３０ａ、ｍｉＲ－２７ａ、ｍｉＲ－２９ａ、ｍｉＲ－１９１を特定した。特に、血管新生促進能を有するｓＥＶにおいて、ｍｉＲ－１２６、ｍｉＲ－１３０ａ、ｍｉＲ－２７ａ及び２９６－３ｐはアップレギュレートされていたが、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－２９ａ、ｍｉＲ－１９１及びｍｉＲ－２１０はダウンレギュレートされていた。
ＥＶにおけるｍｉＲＮＡ発現レベルの観察された違いが、それらの機能活性と関連するかどうかを調査するために、本発明者らは、個々の健常なドナー及び患者に由来するｓＥＶにおける選択されたｍｉＲＮＡの発現を、インビトロ力価試験で測定したこれらの小胞の血管新生促進活性のレベルと比較することによって研究を行った。発現解析はリアルタイムＰＣＲ（カットオフＣｔ値３０）によって行った。図４Ａに示すように、個々の対象（健常なドナー及び患者）からのＥＶ中のｍｉＲ－１３０ａについて測定したＣｔ値の分布は、これらのＥＶ試料に対して行った血管新生力価試験の結果と有意に相関する。特に、Ｃｔ＞３０のＣｔ値として測定されたｍｉＲ１３０ａの含量を有するＥＶは、血管新生促進無効である確率がより高いことが観察された。
健常なドナー（各３試料）からの血管新生促進に有効及び無効なｓＥＶに対する、本発明者らが行ったｍｉＲＮｏｍｅ解析は、最も差次的に発現しているとして８種の血管－ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲ－１２６、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－２９６－３ｐ、ｍｉＲ－２１０、ｍｉＲ－１３０ａ、ｍｉＲ－２７ａ、ｍｉＲ－２９ａ、ｍｉＲ－１９１を特定した。特に、血管新生促進能を有するｓＥＶにおいて、ｍｉＲ－１２６、ｍｉＲ－１３０ａ、ｍｉＲ－２７ａ及び２９６－３ｐはアップレギュレートされていたが、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－２９ａ、ｍｉＲ－１９１及びｍｉＲ－２１０はダウンレギュレートされていた。
ＥＶにおけるｍｉＲＮＡ発現レベルの観察された違いが、それらの機能活性と関連するかどうかを調査するために、本発明者らは、個々の健常なドナー及び患者に由来するｓＥＶにおける選択されたｍｉＲＮＡの発現を、インビトロ力価試験で測定したこれらの小胞の血管新生促進活性のレベルと比較することによって研究を行った。発現解析はリアルタイムＰＣＲ（カットオフＣｔ値３０）によって行った。図４Ａに示すように、個々の対象（健常なドナー及び患者）からのＥＶ中のｍｉＲ－１３０ａについて測定したＣｔ値の分布は、これらのＥＶ試料に対して行った血管新生力価試験の結果と有意に相関する。特に、Ｃｔ＞３０のＣｔ値として測定されたｍｉＲ１３０ａの含量を有するＥＶは、血管新生促進無効である確率がより高いことが観察された。
【0038】
興味深いことに、本発明者らは、Shalaby SM. et al, “Serum miRNA-499 and miRNA-210: A potential role in early diagnosis of acute coronary syndrome” IUBMB Life. 2016;68(8):673-82で以前に記載されているように、患者に由来するｓＥＶ中でｍｉＲ－２１０の濃縮も見出した。しかし、ｓＥＶ中のｍｉＲ－２１０含量とこれらの小胞の血管新生促進活性の間に、有意な相関は検出されなかった。
ＤＩＡＮＡ ｍｉｒｐａｔｈ解析は、少なくとも１５遺伝子を含む経路を選択することによって、ｍｉＲ－１３０ａを使用して調べた。再度、数ある中で、ＴＧＦβ経路に関与する遺伝子の有意な濃縮が検出された（図４Ｂ）。
ｍｉＲ－１３０ａ標的遺伝子に対するＩＰＡによって予測されたネットワークは、血管新生プロセスに強く関係するいくつかの遺伝子、例えば、ＫＤＲ、ＨＯＸＡ５、ＲＯＣＫ１、ＥＰＨＢ６を特定した（図５Ａ）。さらに、ＴＧＦβ及びＴＧＦＢＲ１遺伝子がｍｉＲ－１３０ａ相互作用体の中に見出された。全体的に見て、上記の結果は、ｓＥＶ媒介性作用機構におけるＴＧＦβシグナリング経路の寄与をさらに裏付ける。
ＤＩＡＮＡ ｍｉｒｐａｔｈ解析は、少なくとも１５遺伝子を含む経路を選択することによって、ｍｉＲ－１３０ａを使用して調べた。再度、数ある中で、ＴＧＦβ経路に関与する遺伝子の有意な濃縮が検出された（図４Ｂ）。
ｍｉＲ－１３０ａ標的遺伝子に対するＩＰＡによって予測されたネットワークは、血管新生プロセスに強く関係するいくつかの遺伝子、例えば、ＫＤＲ、ＨＯＸＡ５、ＲＯＣＫ１、ＥＰＨＢ６を特定した（図５Ａ）。さらに、ＴＧＦβ及びＴＧＦＢＲ１遺伝子がｍｉＲ－１３０ａ相互作用体の中に見出された。全体的に見て、上記の結果は、ｓＥＶ媒介性作用機構におけるＴＧＦβシグナリング経路の寄与をさらに裏付ける。
【0039】
２．５ ｓＥＶ中のｍｉＲ－１３０ａ及びＴＧＦβの含量は「真の血管新生促進無効」ｓＥＶを特定するための有用な予測マーカーに相当する。
本発明者らは、受信者動作特性（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ Ｏｐｅｒａｔｏｒ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）（ＲＯＣ）解析を行って、ｓＥＶ中のｍｉＲ－１３０ａ及びＴＧＦβの含量が血管新生促進能を示すｓＥＶと無効小胞を区別する予測能力を有するかどうかを評価した。図５Ｂに図示されるＲＯＣ曲線から推測されるように、ｍｉＲ－１３０ａとＴＧＦβの両方が、ＲＳによって特定される「真の血管新生促進無効ｓＥＶ」の優れた予測基準であり、統計学的に有意なＡＵＣ値を示す。
本発明者らは、受信者動作特性（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ Ｏｐｅｒａｔｏｒ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）（ＲＯＣ）解析を行って、ｓＥＶ中のｍｉＲ－１３０ａ及びＴＧＦβの含量が血管新生促進能を示すｓＥＶと無効小胞を区別する予測能力を有するかどうかを評価した。図５Ｂに図示されるＲＯＣ曲線から推測されるように、ｍｉＲ－１３０ａとＴＧＦβの両方が、ＲＳによって特定される「真の血管新生促進無効ｓＥＶ」の優れた予測基準であり、統計学的に有意なＡＵＣ値を示す。
【0040】
両方の基準は、「血管新生促進無効」、ＲＳによって特定される「真の血管新生促進無効ｓＥＶ」として特定するために、優れた感度を示した。これは、ＬＨ＋＝１．８８ ＩＣ９５％ １．４９～２．２７、ｍｉＲ－１３０ａに対して（Ｓｅ＝０．９４ ０．７３～０．９９のＩＣ９５％）及びＴＧＦβに対して（Ｓｅ＝０．８８ ＩＣ９５％ ０．６６～０．９７）によって、特に明らかであり、さらに強調される。しかし、両方の測定について低い特異性値が検出された（ｍｉＲ－１３０ａ：Ｓｐ＝０．５０；ＴＧＦβ Ｓｐ＝０．６４）。
２つの基準を「シリーズで」組み合わせることによって、すなわち、両方の基準で「血管新生促進無効」と定義されるｓＥＶを「血管新生促進無効」とみなすことによって、優れたレベルの感度及び特異性値の増加が検出された（Ｓｐ＝０．７５；Ｓｅ＝０．８２）。以下の表１に報告するＬＨ＋値はこれらの結果をさらに裏付ける。
２つの基準を「シリーズで」組み合わせることによって、すなわち、両方の基準で「血管新生促進無効」と定義されるｓＥＶを「血管新生促進無効」とみなすことによって、優れたレベルの感度及び特異性値の増加が検出された（Ｓｐ＝０．７５；Ｓｅ＝０．８２）。以下の表１に報告するＬＨ＋値はこれらの結果をさらに裏付ける。
【0041】
表１
ｍｉＲ－１３０ａ及びＴＧＦβ１を「シリーズで」組み合わせる試験。２つの基準を「シリーズで」組み合わせて得られた値のリスト（ｍｉＲ－１３０ａとＴＧＦβ１の両方の基準でＥＶ「血管新生促進無効」と定義されるｓＥＶを「血管新生促進無効」とみなす）。
ｍｉＲ－１３０ａ及びＴＧＦβ１を「シリーズで」組み合わせる試験。２つの基準を「シリーズで」組み合わせて得られた値のリスト（ｍｉＲ－１３０ａとＴＧＦβ１の両方の基準でＥＶ「血管新生促進無効」と定義されるｓＥＶを「血管新生促進無効」とみなす）。
【表1】
【図1-1】
【図1-2】
【図2】
【図3-1】
【図3-2】
【図4-1】
【図4-2】
【図5】
【配列表】
【国際調査報告】